Identification of Novel Cellular Factors Involved in HIV-1 Latency
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Identification of novel cellular factors involved in HIV-1 latency Vorgelegt beim Fachbereich Biologie der Technischen Universität Darmstadt zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium Dissertation von Alexandra Borch 1. Referentin: Prof. Dr. Beatrix Süß 2. Referent: Prof. Dr. Alexander Löwer 3. Referent: Prof. Dr. Klaus Cichutek Darmstadt 2019 Die vorliegende Arbeit wurde unter der Leitung von Prof. Dr. Klaus Cichutek in der Arbeitsgruppe von Dr. Renate König „Host-Pathogen Interactions“ am Paul-Ehrlich-Institut in Langen angefertigt. Die Betreuung seitens der Technischen Universität Darmstadt erfolgte durch Prof. Dr. Beatrix Süß vom Fachbereich Biologie. Borch, Alexandra Identification of novel cellular factors involved in HIV-1 latency Beim Fachbereich Biologie, Technische Universität Darmstadt Jahr der Veröffentlichung der Dissertation auf TUprints:2020 URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-112896 Datum der Einreichung: 02.10.2019 Datum der mündlichen Prüfung: 13.12.2019 Veröffentlicht unter CC BY-SA 4.0 International https://creativecommons.org/licenses/ Summary Summary Despite ongoing efforts, HIV-1 (the causative agent of AIDS) remains an unresolved health threat. Even though current therapy approaches efficiently block ongoing viral replication they cannot cure the infection due to the presence of a latent reservoir. It is of crucial importance to understand that this viral reservoir can fuel new rounds of viral replication and spread the infection. The viral reservoir is defined as cells (best-characterized are resting memory CD4+ T cells) harboring a replication-competent provirus while not producing new progeny virus, a state that can be reversed. Strategies to eradicate the viral reservoir include the so-called ‘shock and kill’ approach, which is a two-step process, aiming in the first step to reactivate the latent reservoir, leading to the production of new viruses. In a second step, denoted as ‚kill’, death of those virus-producing cells is induced by specific cells of the immune system. The identification of host factors involved in HIV-1 latency formation and maintenance is therefore a crucial step to support this and also other strategies. This current study aimed at validating novel host factors involved in HIV-1 latency. For this, the results of a genome-wide siRNA screen performed in HEK293T cells infected with a single- cycle HIV-1 reporter virus expressing luciferase (HIVluc), served as starting point. This model elucidates potential host factors important for HIV-1 transcriptional processes and is per se not a model for HIV-1 latency, as luciferase is constantly expressed from the viral promoter. Nevertheless, we hypothesize that there is a certain overlap in host factors, which not only have an influence on HIV-1 transcription but also on latency formation/maintenance. This assumption was confirmed by publications on two host factors, namely BRD4 and CYLD, which were reported to be important for the maintenance of HIV-1 latency but were also identified in the primary screen to influence HIV-1 luciferase expression. Two differential approaches were followed to choose and validate initial screening hits: For the first approach, follow-up hits were chosen based on their capability to bind and/or modify chromatin. This selection criterion is based on the importance of the chromatin environment for the formation and maintenance of HIV-1 latency. In a first set of experiments, the initial screening setup was recapitulated for a selection of hits and TRRAP, an adaptor protein found in multiprotein chromatin complexes and involved in epigenetic regulation of transcription, was reconfirmed as hit. Further experiments aimed to identify a potential role of TRRAP in HIV-1 latency. For this, J-Lat cells, a Jurkat derived latency cell model, were depleted of TRRAP by shRNA or siRNA and stimulated with various latency reversing agents (LRAs) to test for an additive effect on latency. Despite intensive testing, a clear involvement of TRRAP on latency could not be definitely determined. I Summary In the second approach, follow-up hits were chosen based on the availability of commercially available compounds, which target the respective primary hits. This approach is here referred to as druggability. Several compounds were chosen and tested for their potential action on latency reversal alone or in combination with LRAs. Auranofin was identified to enhance reversal of latency when applied in combination with all tested LRAs, i.e. TNFα, prostratin, SAHA or sodium butyrate in J-Lat cells and in combination with SAHA and sodium butyrate when tested in U1 cells. Following the identification of auranofin, compounds affecting the same proposed targets, i.e. PRDX5, and its upstream pathway member, i.e. TXNRD1, involved in the thioredoxin pathway, were tested. Whereas none of the additional compounds recapitulated the exact effect of auranofin, diminazene was identified to also have an effect on latency reversal, which was most effective when applied in combination with either TNFα or prostratin. This effect was much stronger than the one seen for auranofin, but was cell line specific as the effect was only seen in J-Lat but not in U1 cells. Verification of auranofin’s (and diminazene’s) proposed targets was tested by siRNA-mediated silencing, demonstrating a marginal increase in latency reversal, pointing towards the involvement of the associated system in latency reversal. Based on literature, auranofin targets the thioredoxin system involved in reactive oxygen species (ROS) detoxification and reduction of oxidized proteins. This process is crucial for the integrity of the cell. Diminazene, on the other hand, is likely to target the polyamine homeostasis, which participates in a plethora of processes and interactions. An imbalance in polyamines might also lead to a higher level of oxidized products, potentially linking it to the cellular redox state. Whether those pathways are interconnected needs to be determined in future studies. Nevertheless, both the redox system and the polyamine homeostasis are of crucial importance for the cell with a wide range of possible consequences upon their perturbation, which are likely to affect the proviral state. In summary, in an unbiased systems-level approach, we identified two compounds that mediate latency reversal in combination with other LRAs. We propose further investigation of the two systems targeted by those compounds, which have not been (extensively) studied for an involvement in HIV-1 latency as they could support the targeting of the latent reservoir. II Zusammenfassung Zusammenfassung Trotz anhaltender Bemühungen bleibt HIV-1 (der Erreger von AIDS) eine ungelöste Gesundheitsbedrohung. Gegenwärtige Therapieansätze blockieren effizient den viralen Lebenszyklus, können die Infektion jedoch nicht heilen, aufgrund des Vorhandenseins eines latenten Reservoirs. Es ist von entscheidender Bedeutung zu verstehen, daß das latente Reservoir neue Runden viraler Replikation initiieren und damit die Infektion weiter verbreiten kann. Das latente Reservoir ist definiert als Zellen (am besten charakterisiert sind ruhende CD4+ T-Gedächtniszellen), die replikationskompetentes Provirus in ihrem Genom beherbergen können, ohne aktiv neue Viren zu produzieren, wobei dieser Zustand umkehrbar ist. Zu den Strategien der Reservoir Beseitigung gehört unter anderem der sogenannte "shock and kill" Ansatz, bei dem es sich um einen zweistufigen Prozess handelt, der im ersten Schritt darauf abzielt, das latente Reservoir zu reaktivieren und neue Viren zu produzieren. In einem zweiten Schritt, der als "kill" bezeichnet wird, wird der Tod dieser virusproduzierenden Zellen durch bestimmte Zellen des Immunsystems induziert. Die Identifikation von Wirtsfaktoren, die an der Etablierung und Aufrechterhaltung von HIV-1-Latenz beteiligt sind, ist daher ein entscheidender Schritt für diesen Therapieansatz (und andere). Diese Studie hatte zum Ziel, Wirtsfaktoren zu validieren, die an HIV-1-Latenz beteiligt sind. Als Ausgangspunkt dienten hierzu die Ergebnisse eines genomweiten siRNA-Screenings in HEK293T-Zellen, die infiziert waren mit einem HIV-1 Reportervirus das Luciferase exprimiert. Dieses Modell deckt Wirtsfaktoren auf, die potenziell an HIV-1 Transkription und Translation beteiligt sind, und ist an sich kein HIV-1 Latenzmodel, da Luciferase ständig vom viralen Promotor exprimiert wird. Dennoch gehen wir davon aus, dass es eine Überlappung von Wirtsfaktoren gibt, die nicht nur eine Rolle bei der HIV-1 Transkription spielen, sondern auch an der HIV-1 Latenz Etablierung/Beibehaltung. Diese Annahme wurde durch Veröffentlichungen von zwei Wirtsfaktoren bestätigt, nämlich BRD4 und CYLD, die Einfluss auf HIV-1-Latenz nehmen und ebenfalls im primären Screening identifiziert wurden. Für die Auswahl und Validierung primärer Screening-Treffer wurden zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt: Für den ersten Ansatz wurden Folgetreffer auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, Chromatin zu binden und/oder zu modifizieren, ausgewählt. Dieses Auswahlkriterium basiert auf der Bedeutung der Chromatinumgebung für die Bildung und Aufrechterhaltung der HIV-1 Latenz. In einer ersten Reihe von Experimenten wurde das primäre Screening-Experiment rekapituliert und TRRAP, ein Adaptorprotein, das in Multiprotein Chromatinkomplexen vorkommt und an der epigenetischen Transkriptionsregulation beteiligt ist, wurde erneut als III Zusammenfassung Treffer bestätigt. Weitere Experimente zielten darauf ab, eine mögliche Rolle von TRRAP in