TFIIH complex in transcription mediated by RNA polymerase II and RNA polymerase III Anton Zadorin To cite this version: Anton Zadorin. TFIIH complex in transcription mediated by RNA polymerase II and RNA poly- merase III. Biochemistry, Molecular Biology. Université de Strasbourg, 2012. English. NNT : 2012STRAJ035. tel-00759395 HAL Id: tel-00759395 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00759395 Submitted on 30 Nov 2012 HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. UNIVERSITÉ DE STRASBOURG ÉCOLE DOCTORALE « des Sciences de la Vie et de la Santé » IGBMC - CNRS UMR 7104 - Inserm U 964 THÈSE présentée par : Anton ZADORIN soutenue le : 28 Septembre 2012 pour obtenir le grade de : Docteur de l’université de Strasbourg Discipline/ Spécialité : Sciences du Vivant/ Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie Le complexe TFIIH dans la transcription effectuée par l'ARN polymérase II et l'ARN polymérase III THÈSE dirigée par : Dr EGLY Jean-Marc DR INSERM, IGBMC, Strasbourg RAPPORTEURS : Dr DAEGELEN Dominique DR INSERM, Institut Cochin, Paris Dr SCHUMACHER Björn DR, université de Cologne Pr LAUGEL Vincent PUPH, CHU de Strasbourg To Rexy Contents Contents i R´esum´ede la th`esede doctorat en fran¸cais iii Introduction 1 I Literature Review 4 1 Transcription by Pol II 5 1.1 DNA-directed RNA polymerase II ............. 5 1.2 Promoters of class II genes ................. 7 1.3 General transcription factors . 10 1.4 Pol II transcription cycle . 11 1.5 Chromatin and Pol II transcription . 14 2 TFIIH | a multifunctional complex 21 2.1 The composition of TFIIH . 21 2.2 TFIIH in transcription ................... 27 2.3 TFIIH in NER ....................... 28 2.4 Human disorders induced by mutations in XPD gene . 30 3 SIRT1 histone deacetylase 32 4 Transcription by Pol III 34 4.1 DNA-directed RNA polymerase III . 34 4.2 Genes transcribed by Pol III . 34 4.3 Promoter elements of class III genes . 35 4.4 Termination of class III gene transcription . 37 4.5 Transcription factors .................... 38 CONTENTS ii 4.6 Regulation of Pol III activity . 43 5 Interplay between Pol II and Pol III transcription ma- chinery 45 5.1 TBP as a universal transcription factor . 45 5.2 Pol II, its factors and chromatin marks near class III genes 46 II Results 49 6 XPD/CS mutations and regulation of housekeeping genes 50 6.1 Publication 1 ........................ 50 7 TFIIH complex and transcription of class III genes 88 7.1 Publication 2 ........................ 88 Summary 108 Conclusion 112 Acknowledgements 114 Bibliography 115 List of Symbols and Abbreviations 123 R´esum´ede la th`esede doctorat en fran¸cais Le complexe TFIIH dans la transcription effectu´eepar Pol II et Pol III Dans l'organisme des mammif`eres,il existe trois ARN polym´erasesADN- d´ependantes principales design´eescomme Pol I, Pol II et Pol III. La premi`eretranscrit la plupart des g`enesde l'ARNr, la deuxi`emeest re- sponsable de la transcription des g`enescodant les prot´eineset de cer- tains g`enesde l'ARN non codant, et la troisi`emeest n´ecessairepour la synth`esede l'ARNr 5S, des ARNt et quelques autres petits ARN non codants. Les g`eneseux-m^emessont group´esdans un classe I, classe II ou classe III selon la polym´erasequi les transcrit. Le TFIIH est un complexe prot`eiquequi, au d´ebut,a ´et´ecaract´eris´ecomme un facteur g´en´eralde transcription de Pol II. Plus tard, il a ´et´emontr´eparticiper au m´ecanismede r´eparationpar excision de nucl´eotides(NER), ainsi qu'^etreun facteur transcriptionnel de Pol I [44]. Il est constitu´ed'un cœur contenant les sous-unit´esXPB, p62, p52, p44, p34, p8, qui est reli´epar la sous-unit´eXPD au sous-complexe CAK compos´ede CDK7, cycline H et MAT1. Certaines mutations des prot´einesde TFIIH provo- quent des maladies g´en´etiquesrares avec un risque 1000 fois plus ´elev´e que la normale de d´evelopper un cancer (xeroderma pigmentosum ou XP) ou/et des anomalies s´ev´eresdu d´eveloppement (le syndrome de Cockayne ou CS, la trichothiodystrophie, le syndrome COFS). Un pe- tit nombre de mutations sp´ecifiquesdans les g´enes XPB et XPD cause le ph´enotype combin´eXP/CS [4, 9, 26, 82]. La s´ev´erit´edu XP/CS est d´etermin´eepar le lien inh´erent entre la transcription et la NER. XPB et XPD sont deux h´elicasesdu complexe TFIIH, et leur activit´e (`adiff´erents degr´es)est n´ecessairepour la fusion de l'ADN au cours de la NER et pour l'ouverture du promoteur dans la transcription de Pol I RESUME EN FRANCAIS iv et de Pol II. Bien que la contribution de la carence de la r´eparationde l'ADN au ph´enotype du XP/CS soit irr´efutable,ces mutations causent la d´er´egulationde plusieurs voies transcriptionnelles. Au niveau cellu- laire, les cellules XP/CS partagent le m^emearr^etglobal transcriptionnel soutenu apr`esl'irradiation UV [9]. Pour les cellules CS, il a ´et´ed´emontr´e que cet arr^etprovenait d'un probl´emede remod´elisationde la chroma- tine [18, 69, 27]. Partie I. L'analyse mol´eculairedes mutations dans le XPD li´eesau ph´enotype XP-D/CS L'objectif de ces recherches f^utde mieux comprendre comment les cel- lules r´einitient la transcription apr`esune irradiation UV, et d'´etudier le m´ecanisme de l'arr^et global dans les cellules avec les mutations sp´ecifiquesdans le g`ene XPD provoquant le ph´enotype XP-D/CS. En utilisant la m´ethode de transcription inverse suivie d'une PCR quanti- tative, nous avons montr´eque les cellules XP-D/CS ne pouvaient pas r´e-initient la transcription des g´enes constitutifs tels que DHFR ou GAPDH, apr`esune irradiation UV. D'autre part, les cellules de type sauvage (WT) et les cellules NER-d´efectueusesposs´edant seulement les traits du XP ´etaient capables de le faire. Nous avons aussi observ´e que les cellules XP-D/CS ´etaient incapables de transactiver les g`enes induits par les r´ecepteursnucl´eaires(NR) apr´esune irradiation UV, alors que les autres cellules NER-d´efectueusestransactivaient les m^emes g`enesdans les m^emesconditions. Par contre, la transcription du g`ene GADD45α (p53-d´ependant), ainsi que d'autres g`enesinduits par le stress (ATF3, p21, et MDM2 ), n'est pas inhib´eedans les cellules XP-D/CS. Cette conclusion ´etaitconfirm´ee`apartir de s´equen¸cagehaut d´ebitde transcriptome (RNA-seq). Tandis que les cellules WT, 24 heures apr`es une irradiation UV, recouvraient presque enti`erement le profil initial de transcription, et un mutant XPD poss´edant seulement les traits XP fai- sait cela d'une fa¸conmoins effective, la transcription dans les cellules XP-D/CS restait compl`etement d´er´egl´eeavec une partie consid´erablede g`enesdont l'expression ´etait´elev´ee.Nos r´esultatsindiquent que l'arr^et transcriptionnel des g`enesconstitutifs dans le ph´enotype XP-D/CS peut ^etrenon seulement un sous-produit de l'absence de r´eparationde l'ADN mais aussi une cons´equencedu blocage de l'ARN pol II par les l´esions de l'ADN comme cela ´etaitsuppos´eauparavant. A cet effet, nous ´etionsint´eress´es`asavoir comment les mutations dans XPD perturbaient la formation du complexe transcriptionnel. Pour RESUME EN FRANCAIS v cela, nous avons ´etudi´ele recrutement des facteurs de transcription sur le promoteur DHFR, en utilisant la technique d'immunopr´ecipitationde la chromatine (ChIP) suivie d'une PCR quantitative. Dans les cellules WT, Pol II et tous les facteurs basals se dissocient rapidement du promoteur apr`esirradiation et sont de nouveau recrut´es6 heures apr`esl'irradiation UV. Dans les cellules XP-D/CS, la pr´esencede Pol II sur le promoteur DHFR atteint 30% de celle initiale apr`es12 heures, et ne retrouve pas un niveau normal m^eme24 heures apr`esirradiation. Cela nous a in- cit´e`aexaminer les changements dans les modifications de chromatine sur les promoteurs des g`enesconstitutifs dans les cellules XP-D/CS. L'analyse par ChIP des cellules WT nous a permis de d´ecouvrirque le promoteur DHFR accumulait les modifications H3K9ac, H4K16ac, H3K4me3 et H3K79me2 apr`esirradiation. Ces marques positives de transcription sont en accord avec la pr´esencede Pol II sur ces g`enes. Au contraire, le promoteur DHFR dans les cellules XP-D/CS poss`ede un niveau bas de certaines de ces marques chromatiniennes `amettre en parall`eleavec l'absence Pol II et le niveau faible d'ARNm. De la m^eme fa¸con,nous avons d´etect´el'accumulation de marques d'h´et´erochromatine comme H3K9me2 et l'histone H1 sur le promoteur DHFR apr`esl'UV, alors que dans les cellules WT, leur niveau ne soit pas ´elev´e. Puisque H3K9ac et H4K16ac sont des substrats pour la d´eac´etylase SIRT1 [83], nous avons ´etudi´e sa pr´esence sur le promoteur DHFR par ChIP. Nous avons d´etect´eun niveau ´elev´ede SIRT1 sur ce pro- moteur dans les cellules XP-D/CS apr`sl'UV, alors que dans les cel- lules WT, l'enrichissement de la SIRT1 ´etaitinsignifiant.