Two-Phase Electrophoresis of Biomolecules
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
Two-Phase Electrophoresis of Biomolecules Vom Fachbereich Maschinenbau an der Technischen Universität Darmstadt zur Erlangung des Grades eines Doktor-Ingenieurs (Dr.-Ing.) genehmigte Dissertation vorgelegt von Dipl.-Ing. Götz Münchow aus Reinbek Berichterstatter: Prof. Dr. Steffen Hardt (Technische Universität Darmstadt) Mitberichterstatter: Prof. Dr. Jörg Peter Kutter (Technical University of Denmark) Tag der Einreichung: 29. Mai 2009 Tag der mündlichen Prüfung: 17. Juli 2009 Darmstadt 2009 D17 TWO-PHASE ELECTROPHORESIS OF BIOMOLECULES Cells moving around a gas bubble. von Götz Münchow För miene Familje. Abstract Existing microfluidic separation technologies for biomolecules commonly rely on single phase liquid systems as well as on electrophoresis. But microfluidics also facilitates the generation of stable, well-controlled and immiscible liquid-liquid two-phase arrangements, since interfacial forces usually dominate over volume forces. The present work combines these approaches and reports on protein and cell transport as well as on enrichment and separation phenomena discovered in various experiments with a novel microfluidic setup for continuous-flow two-phase electrophoresis. Therefore, phase boundaries of aqueous two- phase systems are formed within a microchannel in flow direction and the characteristic partition behavior of proteins and cells is manipulated and tuned by applying an electric field perpendicular to the phase boundary. The two immiscible phases which separately are injected into a microchannel are taken from aqueous polyethylene glycol (PEG) - dextran systems. Different ways are possible to induce an electric field within a microchannel, but it was found out that electrodes have to be decoupled from the two-phase flow and especially hydrogels can be utilized as adequate ion conductors. Thus bubble generation inside the microchannel is prevented and a stable two- phase flow is guaranteed. In contrast to macroscopic systems, microfluidic setups allow detailed investigations of local effects at the phase boundary. The results of the experiments show that the diffusive as well as the electrophoretic transport behavior of proteins between the laminated liquid phases is strongly influenced by their partition coefficients. Furthermore, effects of the phase boundary itself, like electric double layers, are negligible in this case. This derived knowledge helps to design specific two-phase partition and enrichment procedures combined with electric fields for future studies. Besides a detailed examination of the transport behavior of proteins a continuous separation of proteins from cells is presented. While proteins in presence of an external electric field pass the boundary and leave the phase they have been initially dissolved in almost completely, lymphoblastoid cells can be retained, thus allowing a stable and continuous separation of these two kinds of biomolecules. And finally, further kinds of fluid combinations such as water and propylene carbonate are presented, supporting an enrichment of proteins at the phase boundary. II Zusammenfassung Bestehende mikrofluidische Techniken zur Separation von Biomolekülen basieren üblicherweise auf einphasigen Flüssigkeitssystemen sowie auf Elektrophorese. Da die Grenzflächenkräfte in der Regel die Volumenkräfte dominieren, ermöglichen die Gesetzmäßigkeiten der Mikrofluidik aber auch die Erzeugung von stabilen, gut kontrollierbaren Anordnungen von nicht mischbaren flüssig-flüssig Zweiphasensystemen. Die vorliegende Arbeit kombiniert die oben genannten Ansätze und beschreibt den Transport von Proteinen und Zellen sowie Anreicherungs- und Separationsphänomene, die während unterschiedlichster Experimente in einem neuartigen, mikrofluidischen Aufbau für kontinuierliche Zweiphasenelektrophorese ermittelt worden sind. Dafür werden Grenzflächen wässriger Zweiphasensysteme innerhalb eines Mikrokanals in Flussrichtung erzeugt und das charakteristische Partitionierungsverhalten von Proteinen und Zellen durch ein zusätzliches elektrisches Feld senkrecht zur Phasengrenze manipuliert bzw. neu eingestellt. Die zwei nicht mischbaren Flüssigkeitsphasen, jede für sich in den Mikrokanal injiziert, werden wässrigen Zweiphasensystemen entnommen, die aus Polyethylenglykol (PEG) und Dextran bestehen. Es bestehen unterschiedliche Möglichkeiten, ein elektrisches Feld im Mikrokanal zu erzeugen. Es wurde aber ermittelt, dass die Elektroden von dem Zweiphasensystem entkoppelt werden müssen und besonders Hydrogel als adäquater Ionenleiter verwendet werden kann. Dadurch ist es möglich, die Bildung von Gasblasen innerhalb des Mikrokanals zu unterbinden und einen stabilen Zweiphasenfluss zu garantieren. Im Gegensatz zu makroskopischen Systemen, erlauben mikroskopische Systeme eine detaillierte Untersuchung von lokalen Effekten direkt an der Phasengrenze. Dabei zeigen die Ergebnisse der Experimente, dass das diffusive als auch das elektrophoretische Transportverhalten von Proteinen zwischen den Flüssigkeitslamellen maßgeblich durch deren Partitionierungskoeffizienten beeinflusst wird. Außerdem sind Effekte, die durch die eigentliche Phasengrenze verursacht werden, wie z.B. durch eine elektrische Doppelschicht, in diesem Fall vernachlässigbar. Das durch die vorliegende Arbeit erlangte Wissen hilft dabei, für unterschiedliche Zielstellungen bestimmte Partitionierungs- und Anreicherungsprozeduren innerhalb von mit elektrischen Feldern gekoppelten Zweiphasensystemen zu designen. Neben der detaillierten Untersuchung der Transporteigenschaften der Proteine wird außerdem eine kontinuierliche Separation von Proteinen und Zellen beschrieben. In diesem Fall passieren die Proteine bei Vorhandensein eines elektrischen Feldes die Phasengrenze und verlassen vollständig die Phase, in der sie ursprünglich gelöst waren. Im Gegensatz dazu werden lymphoblastoide Zellen an der Phasengrenze zurückgehalten, was eine stabile und kontinuierliche Separation dieser beiden Biomoleküle ermöglicht. Schließlich werden noch weitere Fluidkombinationen, wie z.B. Wasser - Propylencarbonat, vorgestellt, die ebenso eine Anreicherung von Proteinen an der Phasengrenze ermöglichen. III Content 1 Introduction 1 1.1 Microfluidic Technologies 1 1.2 Downscaling Effects 2 1.3 Microfluidic Devices for Chemical Analysis and Separation 4 1.4 Aim and Structure of the Thesis 6 2 Biological Samples 9 2.1 Proteins 9 2.1.1 Protein Separation Methods 11 2.1.2 Protein Enrichment 12 2.1.3 Protein Labeling 12 2.2 Cells 13 2.2.1 Cell Separation Methods 14 2.2.2 Cell Labeling 14 3 Aqueous Two-Phase Systems 17 3.1 Fundamentals 17 3.2 Phase Separation and Diagrams 17 3.3 Preparation of Aqueous Tow-Phase Systems 19 3.4 Ion Distribution and Conductivity 21 3.5 Separation of Biomolecules 21 3.5.1 Hydrophobic Affinity Partitioning 22 4 Electrophoresis 25 4.1 Fundamentals 25 4.2 Proteins 27 4.3 Cells 27 5 Hydrodynamic Flow in Microchannels 29 5.1 Governing Equations 29 5.2 Non-dimensional Numbers 29 5.3 Two-Phase Flow 30 5.3.1 Liquid-Liquid Flow 30 6 Experimental Setup and Methods 35 6.1 Measurement Setup 35 6.2 Fluidic Setup 36 6.3 Fluidic Connections 37 6.4 Fluorescence Detection 39 6.5 Electric Connections and Electrodes 41 V 7 Fabrication of Microfluidic Chips 43 7.1 Construction and Manufacturing 43 7.2 Electrodes 45 7.2.1 Integrated Electrodes 45 7.2.2 Decoupled Electrodes 49 7.3 Sealing of Channel Network 57 8 Aqueous Two-Phase Flow 59 8.1 Flow Patterns and Flow Stability 59 8.2 Viscosity Adjustment 64 8.3 Phase Separation 66 9 Transport of Biomolecules in Microchannels 69 9.1 Diffusive Transport 69 9.2 Active Transport by Integrated Electrodes 69 9.2.1 Influence of Voltage Shape 73 9.3 Active Transport by Decoupled Electrodes 74 9.3.1 Dialysis Membranes 74 9.3.2 Hydrogels 76 9.3.3 Interface Instabilities 77 9.3.4 Buffer Reservoir 78 10 Diffusive Protein Transport 81 10.1 Introduction 81 10.2 Adapted Microfluidic Setup 82 10.3 Single Phase Diffusion 83 10.4 Diffusion across Phase Boundary 84 10.5 Theoretical Background 84 10.6 Results 86 10.6.1 Diffusion in Single Phase Systems 86 10.6.2 Protein Diffusion Across the Interface 88 10.7 Conclusion 91 11 Active Transport and Enrichment of Proteins 93 11.1 Introduction 93 11.2 Standard Aqueous Two-Phase System 93 11.3 Modified Aqueous Two-Phase System 99 11.3.1 Effect of PEG-Palmitate 99 11.3.2 Effect of Molecular Weights 103 11.4 Comparison to Existing Theories and Discussion 105 VI 12 Separation of Proteins and Cells 113 12.1 Cells in Aqueous Two-Phase Systems 113 12.2 Active Separation 113 12.3 Results 114 12.4 Conclusion 116 13 Further Two-Phase Systems 117 13.1 Propylene Carbonate-Water Two-Phase System 117 13.2 Oil-Water Two-Phase System 118 14 Conclusion and Outlook 121 14.1 Conclusion 121 14.2 Outlook 122 Acknowledgement 123 List of Abbreviations 124 References 126 Publications 139 VII 1 Introduction Over the last decades, analytical chemistry and, in particular, separation technology encountered an intensive trend towards miniaturization. This section introduces those trends and provides insight into the opportunities for microfluidics. Moreover, some governing scaling laws are discussed and an overview of realized microfluidic systems belonging to this field of research is given. The section closes with an outline of the aim and structure of this thesis. 1.1 Microfluidic Technologies Similar to the very miniaturization that has revolutionized the world of electronics with the invention of the transistor, over the last two decades the development of microfluidics has led to novel and innovative