Diversidade E Produção De Antimicrobianos Dos Fungos Decompositores De Madeira Submersa Em Lagos Da Região Do Baixo Rio Tapajós – Pará

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE

E BIOTECNOLOGIA DA REDE BIONORTE

DIVERSIDADE E PRODUÇÃO DE ANTIMICROBIANOS DOS FUNGOS DECOMPOSITORES DE MADEIRA SUBMERSA EM LAGOS DA REGIÃO DO BAIXO RIO TAPAJÓS – PARÁ.

EVELEISE SAMIRA MARTINS CANTO

MANAUS - AM JUNHO/2020

EVELEISE SAMIRA MARTINS CANTO

DIVERSIDADE E PRODUÇÃO DE ANTIMICROBIANOS DOS FUNGOS DECOMPOSITORES DE MADEIRA SUBMERSA EM LAGOS DA REGIÃO DO BAIXO RIO TAPAJÓS – PARÁ.

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE, na

Universidade Federal do Amazonas, como requisito para a obtenção do título de Doutora em Biodiversidade e Biotecnologia, área de concentração, Biotecnologia.

Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza

MANAUS – AM JUNHO/2020 II

III

EVELEISE SAMIRA MARTINS CANTO

DIVERSIDADE E PRODUÇÃO DE ANTIMICROBIANOS DOS FUNGOS DECOMPOSITORES DE MADEIRA SUBMERSA EM LAGOS DA REGIÃO DO BAIXO RIO TAPAJÓS – PARÁ

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE, na Universidade Federal do Amazonas, como requisito para a obtenção do título de Doutora em Biodiversidade e Biotecnologia, área de concentração Biotecnologia.

Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza

MANAUS JUNHO – 2020

Á meus filhos Luiza e Pedro Canto e ao meu esposo

André Canto que são meus alicerces e o principal motivo de meu sucesso.

Aos meus irmãos, e em especial minha mãe, Antônia do Socorro de Jesus Martins, pelo amor e incentivo em todos os momentos da minha vida; V

AGRADECIMENTOS

Á Deus, por me conduzir e me fortalecer em todos os momentos dessa caminhada;

Ao Professor Dr. João Vicente Braga de Souza, meu orientador, pelas valiosas orientações, ensinamentos, compreensão e companheirismo não só na elaboração da tese mas também pela força nos momentos mais difíceis.

A Dra. Ana Cláudia Alves Corte pela importante amizade, companheirismo, carinho e ensinamentos e por me guiar na encantadora área de taxonomia de fungos;

Ao Professor Dr. Steven E. Zelski, Flávia Rodrigues Barbosa, Huzefa Haja, Josiane Santana Monteiro pelas orientações, ensinamentos e confiança na elaboração dos artigos gerados neste trabalho;

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Universidade Estadual do Amazonas (UEA) que ofereceram oportunidade para aperfeiçoamento profissional;

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo incentivo financeiro à presente pesquisa.

A todos os professores das disciplinas ministradas e em especial a equipe do laboratório da Dra. Maria Francisca Simas pelos ensinamentos valiosos;

A Universidade Federal do Oeste do Pará (UFOPA) e os laboratórios: Gestão Ambiental, Ficologia, Genética, Laboratório Multidisciplinar de Biologia Aplicada, Laboratório de bacteriologia (profa. Silvia Katrine Rabelo) e ao professor Carlos Vildoso, pelo apoio e incentivo para a realização deste trabalho;

Aos técnicos da UFOPA, Jhéssica Frota, Gilmara Oliveira, Cleberson Eduardo, Fernando, Waldinete e Djanira pelo apoio em vária etapas deste trabalho.

Aos coordenadores do Bionorte, Dr. Spartaco Astolfi Filho e Dr. Jair Max Furtado Maia, pela orientação e confiança na realização deste trabalho;

Aos amigos, Dra. Aya Sadahiro, Dr. Maurício M. Ogusku, Dra. Luciana Fujimoto; Dra. Júlia Ignez Salém, pela amizade, inspiração, ensinamentos dados desde o período do mestrado até a conclusão do doutorado.

A minha querida amiga Alita Mussa, pelo carinho, amizade, alegrias e ensinamentos. Uma amizade eterna.

A Dra. Kátia Cruz, pela amizade e companheirismo nos momentos alegres e difíceis dessa jornada.

Aos professores da Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia BIONORTE, pelos conhecimentos obtidos; VI

Aos integrantes da Família Micologia em especial, Walter Oliva, Ralyvan Araújo, Juliana Gomes, D. Eliane e Raimundo pelo apoio, incentivo, companheirismo e ajuda nesta jornada;

A todos os companheiros do Laboratório de Micobacteriologia, pelo apoio em muitos momentos;

Ao Laboratório de Fitoquímica do INPA em especial Dra. Cecília, Layla, David, Leomara e Isabel, pelas importantes orientações e ensinamentos na etapa final deste trabalho.

A amiga Merciane Sena, pelo carinho, compreensão e companheirismo nos momentos que mais precisei;

Aos meus sobrinhos em especial Rômulo Martins, pela companhia, amizade e abrigo neste período de muito trabalho.

Aos meus familiares Evaldo, Elena, Evaldina, Genezio, Rose, Paulo, Enilson, Evaldisa, Elan, Luciene, Evandra, Flávio, Erilson Helena, Mônica, Valério, Lenora, pelo carinho e palavra de incentivo.

Aos meus filhos Luiza e Pedro Canto, pelo amor, carinho e compreensão das necessárias ausências para que eu pudesse finalizar esta grande jornada;

A meu esposo André Canto, pelo amor, compreensão, ensinamentos, conselhos e incentivo em todos os momentos.

Á todos, que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho.

VII

Se eu vi mais longe, foi por estar de pé sobre ombros de gigantes! Isaac Newton

VIII

RESUMO

Os ecossistemas aquáticos são locais que abrigam diversidade de espécies com potencial biotecnológico como os fungos decompositores de madeira submersa em água de rios da região amazônica, as quais precisam ser desvendadas. O objetivo geral da presente tese foi investigar a diversidade e produção de antimicrobianos de fungos decompositores de madeira submersa em ambientes aquáticos em Santarém-Pará. A presente tese contêm 3 capítulos: O primeiro capítulo possui as informações quanto a composição e a diversidade de fungos decompositores de madeira submersa em dois lagos do estado do Pará; O segundo capítulo possui a informações sobre a avaliação da produção de antimicrobianos por fungos decompositores de madeira submersa em lagos da Amazônia brasileira; O terceiro capítulo possui avaliação da composição química do extrato de Fusarium C12 com atividade antimicrobiana. Quanto a metodologia realizada, no estudo da diversidade (capítulo um), foram realizadas coletas de madeira em decomposição dos Lagos Juá e Maicá (Santarém-Pará), foram identificados por exame direto da madeira e por cultura seguida de sequenciamento genético os táxons dos fungos presentes nessas amostras. Para o estudo de avaliação de produção de antimicrobianos pelos fungos cultiváveis (capítulo dois), foram realizados bioprocessos e os filtrados das culturas foram submetidos a fracionamento e bioensaios para avaliar a atividade antimicrobianas frente a E. coli e S. aureus. Para investigar a composição química do extrato do isolado Fusarium solani LM6281 (capítulo três) foram realizados procedimentos de fracionamento químico e análises cromatográficas, espectrométricas. Quanto aos resultados obtidos observou-se que: Capítulo I - Frente a amostragem realizada, foram identificados os táxons no lago Juá (10 sexuais e 13 assexuais, táxon mais frequente Xylomyces giganteus) e do lago do Maicá (17 sexuais e 9 assexuais, táxon mais frequente Thielavia sp.). No lago Juá e Maicá os índices de diversidade foram respectivamente H ': 2.6514 e H': 2.8174 e o índice de Sørensen entre esses lagos foi de somente 0.3673.; Capítulo II - Os filtrados de cultura dos isolados Fluviatispora C34, Morosphaeriaceae C18, Monodictys C15 e Fusarium C12 apresentaram antibacteriana e especificamente o filtrado de cultura do isolado Fusarium C12 destacou-se apresentando CIM de 50 µg/mL frente as cepas S. aureus; e Capítulo III- Fusarium C12 foi identificado como Fusarium solani LM6281 e os ensaios preliminares de CCD de extrato bruto de acetato de etila do cultivo de F. solani LM6281 sugeriram a presença de terpenos, quinonas, fenólicos e de flavonoides e os espectros de RMN de 1H sugeriram a presença de metabólitos como flavonoides e chalconas. O fracionamento da fração orgânica de acetato por cromatografia de coluna aberta resultando em 112 frações que foram analisadas por CCD. A análise por CCD produziu informação que permitiu selecionar 30 frações com componentes majoritários e que puderam ser unidas em 4 frações com perfis cromatográficos semelhantes/similares. A bioautografia demonstrou que todas as 4 frações obtidas apresentaram atividade antibacteriana e permitiu a identificação do Rf das frações ativas frente a S. aureus.

Palavras-chave: Biodiversidade; Fungos de água doce; Amazônia; Substâncias bioativas.

ABSTRACT

Aquatic ecosystems harbor a large species diversity with biotechnological potential, such as wood-decomposing fungi submerged in rivers in Amazon region, which need to be discovered. The general objective of this work was to investigate the diversity and production of antimicrobials from submerged wood decomposing fungi in aquatic environments in Santarém-Pará. This thesis contains 3 chapters: The first chapter contains information the composition and diversity of submerged wood decomposing fungi in two lakes in the state of Pará; The second chapter contains information the evaluation of the production of antimicrobials by decomposing fungi of submerged wood in lakes in the Brazilian Amazon; The third chapter has an evaluation of the chemical composition of the Fusarium C12 extract with antimicrobial activity. The methodology was carried out, in the study of diversity (chapter one), collections of decomposing wood were made from the Juá and Maicá Lakes (Santarém-Pará), and were identified by direct examination of the wood and by culture followed by genetic sequencing of fungal taxa present in these samples. The evaluation of antimicrobials production by cultivable fungi (chapter two), bioprocesses were carried out and the filtrates of the cultures were subjected to fractionation and bioassays to evaluate the antimicrobial activity against E. coli and S. aureus. To investigate the chemical composition of Fusarium solani LM6281 isolate (chapter three), chemical fractionation procedures and chromatographic, spectrometric analyzes were performed. Regarding the results obtained, it was observed that: Chapter I - In view of the sampling performed, the taxa were identified in Lake Juá (10 sexual and 13 asexual, most frequent taxon Xylomyces giganteus) and Lake Maicá (17 sexual and 9 asexual, taxon most frequent Thielavia sp.). In Lake Juá and Maicá, the diversity indexes were H ': 2.6514 and H': 2.8174, respectively, and the Sørensen index between these lakes was only 0.3673 .; Chapter II - The culture filtrates of the Fluviatispora C34, Morosphaeriaceae C18, Monodictys C15 and Fusarium C12 isolates presented antibacterial and specifically the culture filtrate of the Fusarium C12 isolate stood out with a 50 µg / mL MIC against the S. aureus strains; and Chapter III- Fusarium C12 was identified as Fusarium solani LM6281 and the preliminary CCD assays of crude ethyl acetate extract from the cultivation of F. solani LM6281 suggested the presence of terpenes, quinones, phenolics and flavonoids and the NMR spectra of 1H suggested the presence of metabolites such as flavonoids and chalcones. The fractionation of the organic acetate fraction by open column chromatography resulting in 112 fractions that were analyzed by CCD. The analysis by CCD produced information that allowed to select 30 fractions with major components and that could be joined in 4 fractions with similar/similar chromatographic profiles. Bioautography demonstrated that all 4 fractions obtained showed antibacterial activity and allowed the identification of the RF of the active fractions against S. aureus.

Keywords: Biodiversity; Freshwater fungi; Amazon; bioactive substances.

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1

Figura 1: Mapa da localização do Lago Juá e Maicá pertencentes a bacia do baixo rio Tapajós, Santarém, Pará, Brasil, Fonte: Lima, J.L...... 45

Figura 2: Local de coleta do lago Juá (a), Local de coleta do lago Maicá (b), Amostras de madeira (c), Ascomata na superfície da madeira (d), Asco de Dothideomycete sp. em água (e), Colônias em MEA (ágar extrato de malte) após 14 dias de incubação a 25 ° C (f), Cultura em ágar (g)...... 46

Figura 3: Curva de acumulação do número de táxons de fungos encontrados em relação ao esforço amostral de coleta de fragmentos submersos de madeira decomposta nos lagos Juá e Maicá, Santarém, Pará, Brasil...... 50

Capítulo 2

Figura 1. Morfologia das culturas dos fungos decompositores isolados de madeira submersa nos lagos Juá e Maicá, Pará-Brasil...... 64

Figura 2. Distribuição dos componentes para a realização da CIM do extrato teste em acetato de etila dos isolados fúngicos frente a bactérias patogênicas...... 67

Figura 3. Efeito dos extratos de fungos acetato de etila Morosphaeriaceae C18 (A) e Fusarium C12 (B), sobre a viabilidade de fibroblasto de pulmão humano MRC5, utilizando o ensaio do Alamar blue em diferentes concentrações após 24 h de tratamento. Os resultados estão expressos como média ± D.P.M da porcentagem de células viáveis comparado ao controle de três experimentos independentes. Os valores de CI50% (intervalo de confiança de 95%) das amostras foram calculados por regressão não-linear utilizando o teste estatístico ANOVA. *p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo quando considerado ao controle. Foi utilizado o Programa GraphPad Prisma versão 6.0 para análise dos dados...... 71

Capítulo 3

Figura 1. Fluxograma demostrando o fracionamento do extrato AcOEt de Fusarium solani LM6281...... 84

Figura 2. Morfologia macroscópica e microscópica da colônia de Fusarium solani LM6281 cultivado em ágar BDA A: micélio vegetativo (verso); B: pigmento (reverso); C: micromorfologia...... 86

Figura 3. Análise filogenética molecular pelo método de máxima verossimilhança. A análise envolveu 24 sequências de nucleotídeos. Todas as posições que contêm lacunas e dados em falta foram eliminadas. As análises foram realizadas em MEGA6...... 87

Figura 4. Placas de CCDC do extrato acetato de etila bruto de Fusarium solani LM6281 reveladas com diferentes reveladores químicos e físicos...... 88

Figura 5. Espectros de RMN de 1H do extrato bruto de acetato de etila do fungo Fusarium solani LM6281...... 89 Figura 6. Cromatografia em camada delgada comparativa das frações obtidas pela cromatografia em coluna aberta de Fusarium solani LM6281...... 90

Figura 7. Cromatografia em camada delgada com o sistema de solventes (visível) e ensaio de ensaio de bioautografia revelada com solução de cloreto de trifeniltetrazolium (TTC). Mostrando as frações separadas com atividade frente a S. aureus ATCC 25923. Sistemas de solventes a: DCM 100%, b: DCM:ACT (9:1), c: HEX:ACT (9:1); d: DCM:ACT (9:1)...... 91

XII

LISTA DE TABELAS

REVISÃO DA LITERATURA

Tabela 1. Principais espécies de fungos presentes em madeira submersa em ambientes aquáticos amazônicos...... 24

Tabela 2. Substâncias antimicrobianas produzidas por fungos em ambientes dulcícolas...... 29

Capítulo 1

Tabela 1. Caracterização dos parâmetros físico-químicos da água do Lago Juá e Maicá no momento da coleta das amostras de madeira, Santarém, Pará- Brasil...... 50

Tabela 2. Código de cepas fúngicas e similaridade (ITS Barcode) de 14 táxons isolados de amostras de madeira submersa coletadas nos Lagos Juá e Maicá, Santarém, Pará, Brasil...... 51

Tabela 3. Frequência dos táxons observada em amostras de madeira submersa coletadas nos Lagos Juá e Maicá, Santarém, Pará, Brasil...... 51

Tabela 4. Composição e diversidade (índices: H, E e S) da comunidade de fungos presentes em amostras dos Lagos Juá e Maicá, Santarém, Pará, Brasil……………………………………………………………....…………………...52

Capítulo 2

Tabela 1. Atividade antimicrobiana dos extratos AcOEt dos fungos isolados de madeira submersa em decomposição nos lagos Juá e Maicá, Pará, Brasil...... 69

Tabela 3. Valores de viabilidade celular das substâncias na linhagem MRC-5, após 24 horas de exposição. Os dados estão representados como CI50 (intervalo de confiança de 95%)...... 71

Capítulo 3

Tabela 1: Sistema utilizado no fracionamento do extrato AcOEt de Fusarium solani LM6281...... 84

Tabela 3: Substâncias com atividade biológica obtidas de extratos do fungo Fusarium solani...... 92 XIII

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL ...... 14

2. REVISÃO DA LITERATURA – ARTIGO DE REVISÃO - Fungos presentes nos ecossistemas de água doce da Amazônia: uma potencial fonte de antimicrobianos ...... 18 2.1 INTRODUÇÃO ...... 19 2.1.2 Ecossistemas aquáticos na Amazônia ...... 19 2.1.2 Fungos de água doce ...... 20 2.1.3 Fungos aquáticos como fonte de antimicrobianos ...... 25 2.2 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 29 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 30

4. OBJETIVOS ...... 41 4.1 Objetivo Geral ...... 41 4.2 Objetivos Específicos ...... 41 5. APRESENTAÇÃO DOS CAPÍTULOS ...... 42

6. CAPÍTULO 1- ARTIGO: COMPOSIÇÃO E DIVERSIDADE DE FUNGOS DECOMPOSITORES DE MADEIRA SUBMERSA EM DOIS LAGOS DA AMAZÔNIA BRASILEIRA NO ESTADO DO PARÁ...... 43

7. CAPÍTULO 2 - ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE FUNGOS ISOLADOS DE MADEIRA SUBMERSA EM DECOMPOSIÇÃO NOS LAGOS JUÁ E MAICÁ (PARÁ-BRASIL)...... 62

8. CAPÍTULO 3 - CARATERIZAÇÃO QUÍMICA DAS FRAÇÕES COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA PRODUZIDAS POR Fusarium solani LM6281 . 79

9. CONCLUSÕES GERAIS ...... 98

10. APÊNDICES ...... 99

1. INTRODUÇÃO GERAL

O Brasil é um país que possui cerca de 20% da biodiversidade mundial, a qual está localizada na floresta Amazônica (MARTINS; JARSIM, 2018). O bioma Amazônia com 4.196.943 km2 de área, possui a maior bacia hidrográfica com volume significativo de água doce do planeta (BRASIL 2007; GARCIA-CHEVESICH et al., 2017) contendo uma variedade importante de ambientes aquáticos compostos por grandes rios, lagos e áreas de várzea caracterizadas por áreas úmidas inundadas periodicamente (APRILE et al., 2013). Os ambientes aquáticos abrigam populações microbianas grandes e diversas, que garantem seu funcionamento e sustentabilidade (ZINGER; GOBET; POMMIER, 2012). Inseridos nesta população, estão os fungos aquáticos pertencentes aos filos Blastocladiomycota, Chytridiomycota, Ascomycota e Basidiomycota. Fazendo parte destes, há quatro grupos de fungos que se destacam como importantes decompositores presentes em ambientes de água doce. São eles: os hifomicetos aquáticos (~ 300 espécies, ascomicetos mitospóricos) (Hawksworth, 2001), fungos aero-aquáticos (~ 90 espécies, ascomicetos mitospóricos), os ascomicetos de água doce (~ 600 espécies, ascomicetos sexuais) e os fungos zoospóricos (blastocladiomicetos e quitridiomicetos), que produzem zoósporos flagelados como parte de seu ciclo de vida (TSUI et al., 2016). Em ambientes aquáticos, esses fungos têm grande importância na decomposição de material vegetal submerso, e sua biomassa também pode servir como alimento para invertebrados e outros microrganismos (SRI-INDRASUTDHI et al., 2010; KRAUSS et al., 2011; JONES & PANG 2012). Estes organismos decompositores, transferem matéria orgânica diretamente para os níveis tróficos superiores aquáticos (WONG et al., 1998; HAWKSWORTH, 2001; SHEARER et al., 2007). Pesquisas sobre diversidade de fungos em ambientes aquáticos no Brasil iniciaram com Schoenlein-Crusius & Milanez (1989), Schoenlein-Crusius & Milanez (1990) e Schoenlein-Crusius & Milanez (1998) que realizaram estudos sobre hifomicetos de água doce na região sudeste. No estado do Pará, foram desenvolvidos desde 2015, estudos taxonômicos descrevendo as espécies de hifomicetos Fusticeps lampadiformis e F. papillatus (MONTEIRO & GUSMÃO, 2013). No estado do Amazonas em 2015, foram descritos novos registros dos táxons Tricladium curvisporum Descals, Condylospora flexuosa Nawawi e Kuthub., C. spumigena Nawawi e Dwayaangam cornuta Descals. Em 2016, Cortez et al. relata 25 táxons, dos quais 16 foram ascomicetos sexuais e 9 15 ascomicetos assexuais. Recentemente, Canto et al. (2020), publicou 41 táxons sendo 9 primeiros registros para a Amazônia brasileira, este estudo evidencia que há uma diversidade rica e equilibrada, fornecendo informações sobre a dinâmica de fungos de água doce em habitats de águas claras e indica como a comunidade é distribuída nos lagos da Amazônia. Além dos estudos em diversidade dos fungos decompositores de madeira submersa em água doce, os quais são alvos promissores para descoberta de novos táxons, é necessário enfatizar a importância de estudos que avaliem o potencial biotecnológicos desses, em especial o potencial na produção de novos antimicrobianos. Novos antimicrobianos são necessários devido o surgimento de resistência microbiana aos principais fármacos utilizados no tratamento de doenças infecciosas, principalmente as ocasionadas por bactérias (GUIMARÃES; DA SILVA MOMESSO; PUPO, 2010; HOLMES et al., 2016). A resistência bacteriana, é atualmente um problema de saúde pública mais relevante que se acelera devido a processos seletivos pela presença de fármacos no meio ambiente (agricultura), pela automedicação e pelo uso indiscriminado e inadequado dos antibióticos em ambientes hospitalares (LAXMINARAYAN et al., 2013; HOLMES et al., 2016). Nesse contexto, pesquisas têm sido realizadas investigando a produção de antimicrobianos por fungos em ambientes dulcícolas (KRAUSS et al., 2011). Como exemplo, Fisher et al., (1988) apresentam o composto “quinaphthin”, um metabólito secundário produzido por um hifomiceto aero-aquático Helicoon richonis (Boud.) Linder, com ação antibiótica contra bactérias Gram positivas. No trabalho de Poch et al. (1992), o fungo Kirschsteiniothelia sp., produziu a naftoquinona “kirschsteinin” que apresentou atividade antibiótica frente a Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus. Gulis & Stephanovich (1999) avaliaram a atividade antibacteriana frente a cepas Gram positivas e negativas (Escherichia coli, Erwinia carotovora carotovora, E. carotovora atroseptica, E. herbicola, Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, Xanthomonas campestris, Bacillus cereus, B. mycoides, B. polymyxa, B. subtilis, Micrococcus luteus e Staphylococcus saprophyticus) dos fungos Dimorphospora foliicola Tubaki, Flagellospora sp. e Mycocentrospora sp. Oh et al., (2003), isolaram do fungo aquático Massarina tunicata quatro novos análogos da rosigenina (massarigeninas) com atividade antibacterinas (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) e antifúngicas (Candida albicans, Aspergillus flavus e Fusarium verticillioide). Sati & Singh (2014) testaram extratos do hifomiceto Anguillospora longissima que apresentou atividade antibacteriana 16

(Escherichia coli, Erwinia chrysanthemi, Agrobacterium tumefaciens e Xanthomonas phaseoli e Bacillus subtilis) e Raja et al., (2015), estudaram o gênero Minutisphaera o qual apresentou metabólito secundários com atividade antibacteriana frente a cepas Staphylococcus aureus e Mycobacterium smegmatis. Apesar dos estudos existentes, poucos investigaram a diversidade de fungos decompositores de madeira submersa na Amazônia e a produção de antimicrobianos por esses organismos. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo investigar a diversidade e a produção de antimicrobianos dos fungos decompositores de madeira submersa em lagos da Amazônia brasileira, estado do Pará.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

APRILE, F. et al. Application of Hydrological and Limnological studies on Building Model for Water circulation of Meromictic Black Water Lakes at the Central. International Research Journal of Environment Sciences, v. 2, n. 7, p. 58–63, 2013. BRASIL. Áreas Prioritárias para a Conservação, Uso Sustentável e Repartição de Benefícios da Biodiversidade Brasileira: Atualização - Portaria MMA n°9, de 23 de janeiro de 2007. [s.l: s.n.]. FISHER, P. J. et al. Quinaphthin, a new antibiotic, produced by Helicoon richonis. Transactions of the British Mycological Society, v. 90, n. 3, p. 499–502, 1988. GARCIA-CHEVESICH, P. A. et al. Forest management and the impact on water resources: A review of 13 countries. [s.l: s.n.]. GUIMARÃES, D. O.; DA SILVA MOMESSO, L.; PUPO, M. T. Antibióticos: Importância terapêutica e perspectivas para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes. Quimica Nova, v. 33, n. 3, p. 667–679, 2010. GULIS, V. I.; STEPHANOVICH, A. I. Antibiotic effects of some aquatic hyphomycetes. Mycological Research, v. 103, n. 1, p. 111–115, 1999. HAWKSWORTH, D. L. Fungal EcologyJohn Wiley & Sons, , 2001. (Nota técnica). HOLMES, A. H. et al. Understanding the mechanisms and drivers of antimicrobial resistance. The Lancet, v. 387, n. 10014, p. 176–187, 2016. JONES, E. B. G.; PANG, K. L. Tropical aquatic fungi. Biodiversity and Conservation, v. 21, n. 9, p. 2403–2423, 2012. KRAUSS, G. J. et al. Fungi in freshwaters: Ecology, physiology and biochemical potential. FEMS Microbiology Reviews, v. 35, n. 4, p. 620–651, 2011. LAXMINARAYAN, R. et al. Antibiotic resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases, v. 13, n. 12, p. 1057–1098, 2013. MARTINS, M. B.; JARSIM, M. A. G. Reflexões em Biologia da Conservação. Belém: Museu Paraense Emílio Goeld, 2018. MONTEIRO, J. S.; GUSMÃO, L. F. P. An emendation of Fusticeps and two new species from the Brazilian Amazon Forest. Mycotaxon, v. 123, n. 1, p. 431–437, 2013. 17

OH, H. et al. New bioactive rosigenin analogues and aromatic polyketide metabolites from the freshwater aquatic fungus Massarina tunicata. Journal of Natural Products, v. 66, n. 1, p. 73–79, 2003. POCH, G. K.; GLOER, J. B.; SHEARER, C. A. New bioactive metabolites from a freshwater isolate of the fungus Kirschsteiniothelia sp. Journal of Natural Products, v. 55, n. 8, p. 1093–1099, 1992. RAJA, H. A. et al. Minutisphaerales ( Dothideomycetes , Ascomycota ): A new order of freshwater ascomycetes including a new family , Minutisphaeraceae , and two new species. Mycologia, v. 107, n. 4, p. 845–862, 2015. SATI, S. C.; SINGH, L. Bioactivity of root endophytic freshwater hyphomycetes anguillospora longissima (Sacc. & Syd.) Ingold. The Scientific World Journal, v. 2014, p. 1–5, 2014. SCHOENLEIN-CRUSIUS, I. H.; MILANEZ, A. I. Sucessão fúngica em folhas de Ficus microcarpa L.F. submersas no lago situado no Parque Estadual das fontes do Ipiranga, São Paulo/SP. Narratives of Therapists’ Lives, v. 20, n. 1, p. 95–101, 1989. SCHOENLEIN-CRUSIUS, I. H.; MILANEZ, A. I. Hyphomycetes aquáticos no Estado de São Paulo, Brasil. Revista Brasileira de Botanica, v. 13, p. 61–68, 1990. SCHOENLEIN-CRUSIUS, I. H.; MILANEZ, A. I. Fungos microscópicos da Mata Atlântica de Paranapiacaba, São Paulo, Brasil. Revista Brasileira de Botânica, v. 21, n. 1, p. 73–79, 1998. SHEARER, C. A. et al. Fungal biodiversity in aquatic habitats. Biodiversity and Conservation, v. 16, n. 1, p. 49–67, 2007. SRI-INDRASUTDHI, V. et al. Wood-inhabiting freshwater fungi from Thailand: Ascothailandia grenadoidia gen. et sp. nov., Canalisporium grenadoidia sp. nov. with a key to Canalisporium species (Sordariomycetes, Ascomycota). Mycoscience, v. 51, n. 6, p. 411–420, 2010. TSUI, C. K. M.; BASCHIEN, C.; GOH, T. Biology and Ecology of Freshwater Fungi. In: Biology of Microfungi. [s.l: s.n.]. p. 285–313. WONG, M. K. M. et al. Role of fungi in freshwater ecosystems. Biodiversity and Conservation, v. 7, n. 9, p. 1187–1206, 1998. ZINGER, L.; GOBET, A.; POMMIER, T. Two decades of describing the unseen majority of aquatic microbial diversity. Molecular Ecology, v. 21, n. 8, p. 1878–1896, 2012.

2. REVISÃO DA LITERATURA – ARTIGO DE REVISÃO - Fungos presentes nos ecossistemas de água doce da Amazônia: uma potencial fonte de antimicrobianos

A revisão da literatura está apresentada em formato de artigo que será submetido a revista Acta Botânica Brasílica.

Eveleise Samira Martins Cantoa, Walter Oliva Pinto Filho Segundob, Ana Cláudia Alves Cortezb, Flavia Rodrigues Barbosac, Josiane Santana Monteirod, João Vicente Braga de Souzab aPrograma de Pós-Graduação da Rede de Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia

Legal – Bionorte, Manaus, Amazonas, Brasil. Universidade Federal do Oeste do Pará, UFOPA, Santarém, Pará Brasil. bInstituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, INPA, Laboratório de Micologia, Manaus, Amazonas. cInstituto de Ciências Naturais, Humanas e Sociais, Universidade Federal de Mato Grosso, UFMT, Sinop, Mato Grosso dCoordenação de Botânica, Museu Paraense Emílio Goeldi – MPEG, Belém, Pará

Autor para correspondência: [email protected]; [email protected]

RESUMO

A micobiota aquática ainda é pouco conhecida, principalmente na Amazônia, porém estima-se que existam diversos fungos capazes de produzir compostos com atividade antimicrobiana. O objetivo da presente revisão foi discutir sobre a diversidade de fungos em ambientes de água doce especialmente na Amazônia, assim como revisar sobre o potencial de fungos aquáticos em produzir compostos com atividade antimicrobiana. Para isso, foi realizado um levantamento bibliográfico na literatura existente em banco de dados como, Pubmed, Researchgate, Science Direct, Google Acadêmico e Scielo, utilizando os descritores “fungal freshwater, fungal biodiversity e fungal antimicrobial”. A presente revisão da literatura traz informações sobre a diversidade da Amazônia, sobre os tipos da hidrografia regional, sobre a diversidade de fungos aquáticos e sobre a produção de antimicrobianos por fungos aquáticos. O potencial para a descoberta de novos compostos antimicrobianos na Amazônia existe, no entanto, esse potencial é limitado pelo baixo número de especialistas dedicados a essa temática.

Palavras Chave: Ascomycota, Biocompostos, Fungos Aquáticos, Região Amazônica.

2.1 INTRODUÇÃO

Na Amazônia está a maior bacia de água doce do mundo, com uma imensa diversidade biológica. No entanto, seus microrganismos e suas interações com outros seres são pouco conhecidos (Souza et al. 2004). Sabe-se que os microrganismos têm imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção dos ecossistemas e que há previsões de até um trilhão de espécies de microrganismos existentes globalmente (Locey & Lennon 2016; Hawksworth & Gardens 2017). A importância dos avanços da biotecnologia e da agricultura moderna derivam de recentes descobertas em genética, fisiologia e metabolismo de microrganismos, que constituem uma fonte importante de substâncias naturais com propriedades bioativas desejáveis e com grande potencial para aplicação biotecnológica (Suryanarayanan et al. 2009; Hyde et al. 2019). Os fungos se destacam pela capacidade de produzir uma grande quantidade de metabólitos secundários de interesse farmacêutico, comumente usados na medicina, como antimicrobianos, além de outras substâncias de interesse econômico, como enzimas, vitaminas, aminoácidos e esteróides (Budhiraja et al. 2013). Novos desafios estão sendo realizados no sentido de explorar ambientes ainda pouco estudados como os ambientes dulcícolas, sendo estes considerados ricos em biodiversidade (Penaluna et al. 2017), especialmente os rios e lagos localizados na região amazônica. Fatores como acessibilidade, dimensão geográfica, diferentes tipos de águas e grandes extensões de rios precisam ser considerados para o desenvolvimento de pesquisas nesta região. Portanto, este artigo tem como objetivo fazer uma breve revisão de estudos relacionados à importância de conhecer a diversidade de fungos em ambientes de água doce especialmente na Amazônia brasileira, assim como demonstrar seu potencial em produzir compostos com atividade antimicrobiana.

2.1.2 Ecossistemas aquáticos na Amazônia

Os ambientes aquáticos são amplamente distribuídos mundialmente e apresentam maior riqueza de espécies quando comparados a outros ecossistemas (Dudgeon et al. 2006). Dentre os vários tipos de corpos d’água existentes, os rios estão entre os ecossistemas mais dinâmicos, diversos e complexos do planeta (Strayer & Dudgeon 2010). 20

Os ecossistemas aquáticos são classificados pelo seu fluxo de água, podendo ser lóticos, lênticos, híbridos ou artificiais (Odum 2012). Os ambientes lóticos são caracterizados como águas que mantêm um fluxo constante que inclui fontes, rios e córregos; enquanto os lênticos são ecossistemas aquáticos permanentes ou estáticos, como lagos, lagoas e pântanos (Wurzbacher et al. 2010); artificiais ou híbridos são representados por barragens e reservatórios, respectivamente (Kumar et al. 2011; Jones & Pang, 2012). Nos ecossistemas lóticos, o fluxo permite um aumento na oxigenação da água, essencial para a biologia dos organismos aquáticos e sua diversidade, enquanto nos ecossistemas lênticos o fluxo é variável (Fiorucci & Filho 2005; Medeiros et al. 2009). O bioma Amazônia com 4.196.943 km2 de área, possui a maior bacia hidrográfica com volume significativo de água doce do planeta, a bacia Amazônica, (Brasil 2007; Garcia- Chevesich et al. 2017) contendo uma variedade importante de ambientes aquáticos compostos por grandes rios, lagos e áreas de várzea caracterizadas por áreas úmidas inundadas periodicamente (Aprile et al. 2013). Esses ecossistemas exercem grande influência na circulação atmosférica e na geração de chuvas localmente e em outras regiões do Brasil, principalmente no Nordeste (Garcia-Chevesich et al. 2017). Nesses ambientes, a maior fonte de carbono e matéria orgânica vem de materiais vegetais alóctones, como folhas, troncos, flores, frutas e galhos que podem ser transportados pela chuva, vento ou outras formas de dispersão (Abelho, 2001; Diez et al. 2001). A bacia Amazônica possui uma grande diversidade de ambientes que estão relacionados ao tamanho da área de drenagem, heterogeneidade fitofisionômica, diferenças geológicas e geomorfológicas nas áreas de captação, que são responsáveis pela notável diferença na composição físico-química das águas (Junk 1979), o que levou Sioli (1984) a definir diferentes tipos de águas (clara, preta e brancas). Ressalta-se que a biodiversidade vem sofrendo perdas significativas devido a ações antropogênicas que liberam sedimentos e poluentes, além do desmatamento, o que causa sérios problemas que levam à diminuição da evaporação; baixa precipitação e mudanças negativas no ciclo hidrológico (Fearnside 2006; Dellamatrice & Monteiro 2014; Oliveira et al. 2017; Llopart et al. 2018).

2.1.2 Fungos de água doce

Para a definição de fungos aquáticos, Park (1972) os caracterizou de acordo com o grau de adaptação, denominando-os como fungos residentes, quando completam seu 21 ciclo de vida na água e os transeuntes, os quais são transportados para esse ambiente pela chuva, vento ou outras formas de dispersão. Os fungos aquáticos são pertencentes aos filos Blastocladiomycota, Chytridiomycota, Ascomycota e Basidiomycota. São eles: os hifomicetos aquáticos (~ 300 espécies, ascomicetos mitospóricos) (Hawksworth, 2001), fungos aero-aquáticos (~ 90 espécies, ascomicetos mitospóricos), os ascomicetos de água doce (~ 600 espécies, ascomicetos sexuais) e os fungos zoospóricos (blastocladiomicetos e quitridiomicetos), que produzem zoósporos flagelados como parte de seu ciclo de vida (Tsui et al. 2016). Wong et al. (1998) considerou os fungos aquáticos em três grupos principais: fungos ingoldianos que geralmente ocorrem em folhas em decomposição; ascomicetos e hifomicetos aquáticos, que ocorrem em materiais lenhosos e submersos; e quitrídios e oomicetos (atualmente em Straminipila), incluindo aqueles que causam doenças. Quanto a importância ecológica, os fungos aquáticos possuem importância na decomposição de material vegetal submerso, e sua biomassa também pode servir como alimento para invertebrados e outros microrganismos (Sri-indrasutdhi et al. 2010; Krauss et al. 2011; Jones & Pang 2012). Estes organismos, em ambientes de água doce são importantes na decomposição do material vegetal, pois transferem matéria orgânica diretamente para os níveis tróficos superiores aquáticos (Wong et al. 1998; Hawksworth, 2001; Shearer et al. 2007). Além da importância na decomposição da matéria orgânica, os fungos de água doce, são potencialmente bioindicadores de qualidade ambiental (Bai et al. 2018) e podem ser seriamente afetados pelos efeitos das mudanças climáticas que podem gerar consequências severas na ciclagem de nutrientes e energia nos níveis tróficos (Wurzbacher et al. 2014; Baschien & Hyde 2018). Ações antrópicas como desmatamento, criações de represas etc., influenciam significativamente na quantidade de diferentes detritos lenhosos que entram nesses ambientes, alterando a diversidade aquática, durante o processo de decomposição da madeira (Hyde et al. 2015). Além da participação dos fungos na decomposição da matéria orgânica aquática, pode-se perceber que há um processo de adaptação nestes ambientes. Muitos ascomicetos sexuais de água doce, possuem morfologia que está diretamente relacionada com sua capacidade de dispersão e adesão dos ascósporos ao substrato. Como exemplo, ascósporos com várias bainhas mucilaginosas, apêndices ou paredes ornamentadas, Annulatascus velatispora K.D. Hyde, Fluviatispora spp., Caryospora spp., Massarina spp., Phaeosphaeria spp., Pleospora scirpicola (DC) P. Karst. e Rebentischia sp. (Ingold 1956; Shearer 1993b). Outro exemplo de adaptação são os apresentados por hifomicetos 22 aero-aquáticos, que podem apresentar formas diferenciadas de conídios que permitem sua flutuação na água: helicoidais (Helicoon e Helicomyces) e propágulos de formas irregulares (Cancellidium, Nidulispora) que são capazes de armazenar ar e facilitar sua dispersão na superfície da água (Goh & Hyde 1996). Em se tratando de decomposição de madeira em água doce, ressalta-se a maior presença dos ascomicetos sexuais com mais de 200 espécies (Hawksworth 2001) ocorrendo em substratos herbáceos e principalmente na madeira em decomposição (Vijaykrishna & Hyde, 2006; Shearer et al. 2007). Também, relata-se a presença destes em macrófitas mortas submersas (Fallah & Shearer, 2001). A definição de ascomicetos de água doce foi realizada por Shearer (1993), designando todos os ascomicetos sexuais que ocorrem em substratos submersos ou parcialmente submersos em hábitats aquáticos. Esses organismos são capazes de quebrar importantes compostos de carbono em detritos vegetais como a celobiose, a hemicelulose e o amido (Bucher et al. 2004). Os ascomicetos sexuais são os principais recicladores nos ecossistemas aquáticos, apresentam adaptações nestes ambientes (Pearman et al. 2010), amaciam detritos lenhosos através da quebra enzimática dos principais polímeros vegetais (celulose, hemicelulose e lignina) e acumulam biomassa fúngica aumentando a palatabilidade e o valor nutritivo do substrato para os consumidores (Dudley & Anderson 1982; Bärlocher 2009; Srivastava et al., 2014; Hyde et al. 2016; Tsui et al., 2016; Duarte et al. 2019; Gulis et al. 2019). A composição e a colonização de fungos presentes na madeira em decomposição nos ambientes aquáticos, podem ser influenciadas por interações competitivas entre espécies de fungos (Fryar et al. 2005) e até mesmo entre procariotos (Mille-Lindblom et al. 2006; Johnston et al. 2016). Esta competição estimula a produção de substâncias com propriedades antagônicas que podem ser importantes para os estágios de colonização microbiana e alvo para pesquisas de compostos naturais (Sati & Arya 2010; Johnston et al. 2016). A maior parte dos trabalhos de fungos aquáticos foram realizados em regiões temperadas na América do Norte, Reino Unido, Europa, Chile e Japão (Ingold 1954; Fallah & Shearer, 2001; Tanaka et al. 2005; Shearer et al. 2007). Pesquisas de fungos aquáticos foram realizadas principalmente em ambientes lênticos e lóticos de regiões temperadas (Zelski et al. 2011a; Zelski et al. 2011b; Almeida et al. 2012; Hu et al. 2013). Investigações sobre ascomicetos assexuais de água doce em ambientes tropicais são realizadas desde 1956 com estudos no Havaí, Nigéria, Uganda, Indonésia (Ingold 1956, 23

Ingold 1958; Anastasiou, 1963), Jamaica (Hudson & Ingold, 1960) e Índia (Iqbal & Webster 1973). Shearer (1993) listou 288 ascomicetos em água doce e apontou que as classes mais comumente encontradas em ambientes de água doce eram Leotiomycetes, Dothideomycetes e Sordariomycetes (Barbosa et al. 2013; Zhang & Wang, 2015). Com resultados de estudos de fungos anamórficos de água doce realizados na Malásia e Hong Kong, Goh & Hyde (1997) listou-se 280 espécies em 143 gêneros em locais tropicais. A maioria das pesquisas sobre este grupo de fungos está relacionada a ambientes lóticos, especialmente em substratos de plantas lenhosas, em regiões temperadas como Inglaterra, Hong Kong, Reino Unido, Filipinas (Shearer & Webster 1991; Goh & Hyde 1999; Kanel et al. 2002; Tsui et al. 2003), e em regiões tropicais como o rio Kali, sudoeste da Índia (Sridhar & Sudheep 2011). Observa-se também, que os ambientes lênticos ainda são pouco explorados, porém há trabalhos que foram realizados na Austrália, Filipinas e China (Cail et al. 2002; Luo et al. 2004). Pesquisas sobre diversidade de fungos em ambientes aquáticos no Brasil iniciaram com Schoenlein-Crusius & Milanez (1989), Schoenlein-Crusius & Milanez (1990) e Schoenlein-Crusius & Milanez (1998) que realizaram estudos sobre hifomicetos de água doce na região sudeste de São Paulo, incluindo a Mata Atlântica e o planalto costeiro, bem como no Cerrado (Schoenlein-Crusius 2002) e em águas urbanas (Moreira & Schoenlein-Crusius 2012; Schoenlein-Crusius et al. 2014; Schoenlein-Crusius et al. 2016). Na região nordeste do Brasil podemos destacar os estudos de Barbosa et al. (2008), Almeida et al. (2012), Moreira & Schoenlein-crusius (2012), Barbosa et al. (2013), Fiuza (2013), Cruz et al. (2014), e Silva et al. (2014) que relataram fungos em materiais submersos no bioma Caatinga, descrevendo novos táxons e espécies raras em ambientes lóticos. Na Amazônia, os primeiros estudos publicados sobre diversidade foram relatados por Zelski et al. (2011a; 2011b; 2015). Esses estudos descreveram novos táxons para a Amazônia peruana envolvidos na decomposição de madeira submersa. Na Amazônia brasileira, Monteiro & Gusmão (2013), estudaram fungos anamórficos no estado do Pará. No estado do Amazonas Fiuza et al. (2015) relataram novos registros de fungos ingoldianos presentes em riachos e Cortez et al. (2016) relataram fungos associados à deterioração da madeira em um ambiente lêntico. Trabalhos recentes sobre comunidades de fungos em ambientes aquáticos no Brasil, foram publicados como uma revisão de fungos ingoldianos, que descreveu 85 espécies de fungos, sendo 19 da Amazônia, 53 da Mata Atlântica, 39 da Caatinga e 21 do bioma Cerrado (Fiuza et al. 2017) e o hifomiceto 24 em água doce do Parque Estadual de Ilhabela, cidade de São Paulo (Moro et al. 2018). Canto et al. (2020), destaca a diversidade de fungos decompositores de madeira submersa em dois lagos do estado do Pará e descreve 41 táxons sendo 9 táxons como primeiros registros para a Amazônia brasileira, indicando que há uma diversidade rica e equilibrada. Este estudo fornece mais informações sobre a dinâmica de fungos de água doce em habitats de águas claras e indica como a comunidade é distribuída nos lagos da Amazônia brasileira. A Tabela 1, apresenta as principais espécies de fungos encontradas em madeira submersas em ambientes aquáticos amazônicos.

Tabela 1. Principais espécies de fungos presentes em madeira submersa em ambientes aquáticos amazônicos. PAÍS ESPÉCIE REFERÊNCIAS Chaetorostrum quincemilensis Zelski, Raja, A.N. Mill (Zelski et al. 2011) & Shearer, Natipusilla bellaspora Raja, Shearer & A.N. Mill. (Raja et al. 2012)

Annulatascus velatisporus K.D. Hyde Candelabrum broccchiatum Tubaki (Shearer et al. 2015) Peru Cancellidium applanatum Tubaki Conioscypha peruviana Zelski, Raja, A.N. Mill & Shearer (Zelski et al. 2015) Conioscypha gracilis (Munk) Zelski, Raja, A.N. Mill. & Shearer

Fusticeps laevisporus Matsush (Matsushima 1993) Natipusilla decorospora A. Ferrer, A.N. Mill. Natipusilla naponensis A. Ferrer, A.N. Mill. et (Ferrer et al. 2011)

Equador Shearer (Zelski et al. 2011; Cortez Longicollum biappendiculatum F.R. Barbosa, Raja, et al. 2016; Canto et al. A.N. Mill & Shearer 2020) Torrentispora pilosa (Barbosa et al. 2013) Vertexicola ascoliberatus Arachnophora combuensis J.S. Monteiro, R.F. (Monteiro et al. 2014) Castañeda & Gusmão

Exserticlava aquatica L.T. Carmo, C.R. Silva, Careli, (Carmo et al. 2019) S.M. Leão, Feletti & Gusmão

Xylomyces giganteus Goh, W. H. Ho, K. D. Hyde & Brasil K. M. Tsui Pseudoxylomyces elegans (Goh, W. H. Ho, K. D. Hyde & K. M. Tsui), Kaz. Tanaka & Hiray Cancellidium applanatum Tubaki (Canto et al. 2020) Acrogenospora sphaerocephala, (Berk. & Broome) M. B. Ellis Potamomyces armatisporus K. D. Hyde

2.1.3 Fungos aquáticos como fonte de antimicrobianos

O conhecimento da biodiversidade e a bioprospecção de novos compostos de origem microbiana se tornaram um dos principais focos em estudos biotecnológicos, pois o uso desses organismos na busca de soluções nas áreas de alimentos, saúde, meio ambiente e indústria, vem crescendo rapidamente no cenário mundial (Raja et al. 2018). Devido ao surgimento de resistência microbiana aos principais fármacos utilizados no tratamento de doenças principalmente as ocasionadas por bactérias, surge a busca de novos compostos com atividades antibióticas (Guimarães et al. 2010; Holmes et al. 2016). A resistência bacteriana, é atualmente um problema de saúde pública mais relevante, que se acelera devido a processos seletivos pela presença de fármacos no meio ambiente (agricultura) e pelo uso indiscriminado e inadequado dos antibióticos em ambientes hospitalares (Laxminarayan et al. 2013; Holmes et al. 2016). A resistência bacteriana aos antibióticos pode ser mediada por vários mecanismos, o primeiro envolve a modificação ou destruição enzimática do antibiótico como exemplo a enzima β- lactamase produzida por bactérias a qual hidrolisa os anéis beta-lactâmicos das penicilinas e das cefalosporinas pela quebra da ligação amina, desempenhando um papel fundamental na resistência intrínseca de bactérias aos antibióticos ß-lactâmicos (Barbosa et al. 1999; Cox & Wright, 2013). O segundo mecanismo, envolve a membrana externa bacteriana servindo como uma barreira entre o ambiente externo e seu citoplasma. A permeabilidade da membrana de bactérias Gram-negativas, envolve a presença de proteínas chamadas de porinas, (Zgurskaya et al. 2016) que são canais específicos que permitem a passagem de substâncias para o espaço periplasmático e, em seguida, para o interior da célula como exemplo, a resistência da bactéria Pseudomonas aeruginosa ao Imipenem devido a uma alteração nas porinas presentes na membrana celular externa) (ANVISA, 2007). O terceiro envolve o efluxo ativo dos antibióticos das células bacterianas, no qual ocorre a ejeção e antibióticos do meio intracelular para o meio extracelular através de proteínas de membrana onde a síntese é codificada pelo gene TET exemplificado pela resistência da família Enterobacteriaceae às tetraciclinas (Cox & Wright, 2013; Loureiro et al. 2016). O quarto, se baseia em alterações nas moléculas alvo dos antibióticos, de modo a impedir a ocorrência de qualquer efeito inibitório ou bactericida, constituindo um dos mais importantes mecanismos de resistência. As bactérias podem adquirir um gene que codifica um novo produto resistente ao antibiótico, 26 substituindo o alvo original exemplificado pelo Staphylococcus aureus resistente à meticilina (ANVISA, 2007). Dentre as bactérias Gram-positivas resistentes a antibióticos estão as causadoras de infecções estafilocócicas que tem se tornado um grande desafio à saúde pública. Este grupo, está envolvido nas principais infecções hospitalares em humanos, pois além de se tratar de microrganismos com grande potencial de virulência, as opções de tratamento têm sido reduzidas a partir do surgimento da resistência à penicilina, à meticilina e vancomicina (Stryjewski & Corey, 2014). Dentre estas bactérias está S. aureus resistente a meticilina – MRSA, que pode apresentar altos índices de mortalidade (Zhang et al., 2015). Determina-se como MRSA (do inglês Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) às linhagens de S.aureus que não respondem ao tratamento com antibióticos β- lactâmicos com exceção das cefalosporinas de quinta geração. Esta resistência é mediada pela proteína de ligação à penicilina 2A (PBP 2A) codificada pelo gene mecA que funciona como um alvo alternativo resistente à inibição pelo antibiótico, permitindo a formação da camada de peptidoglicano da parede celular, impedindo a morte bacteriana (Paterson et al. 2014). Com relação às bactérias Gram-negativas resistentes a antibióticos, destacam-se as pertencentes à família Enterobacteriacea em especial a Escherichia coli, produtora de β-lactamase de espectro estendido (ESBL – Extended Spectrum β-lactamases). Estas cepas, podem resultar em infecções graves deixando os pacientes com opções terapêuticas limitadas ou inexistentes (Blair et al., 2015; Loureiro et al., 2016; Tartari et al., 2017). Além da E. coli, a literatura relata Klebsiella spp. que também é uma dos principais reservatórias dos genes que codificam ESBL dentro do ambiente hospitalar (Tartari et al., 2017). Há grandes preocupações a respeito destes microrganismos que produzem ESBL pois, podem se disseminar de paciente para pacientes assim como, permitir o surgimento de cepas policlonais em decorrência da transmissão de material genéticos entre gêneros distintos de bacilos Gram-negativos (Paterson & Bonomo, 2005). As β-lactamases que hidrolisam os carbapenens pertencem às classes A (penicilinases), B (metalo-β- lactamase) e D (oxacilinases) (Bertoncheli & Horner, 2008). As β-lactamases de espectro estendido (ESBLs) medeiam a resistência a todas as penicilinas, cefalosporinas (por exemplo ceftazidima, cefotaxima e ceftriaxona) e aztreonam (Baptista, 2013). É importante mencionar que, várias bactérias Gram-positivas e Gram-negativas produzem β-lactamases de espectro estendido (ESBLs), que é um dos tipos enzima codificadas por genes plasmidiais como o CTX-M, conferindo resistência a todas as penicilinas e 27 cefalosporinas de terceira geração, mas não as cefamicinas e carbapenêmicos (Blair et al. 2015). Portanto, em decorrência do cenário de rápido desenvolvimento de cepas bacterinas patogênicas resistentes, torna-se necessário acelerar o processo de descoberta de novos antibióticos que atuam por diferentes mecanismos de ação (Guimarães et al., 2010). As pesquisas com biocompostos produzidos por fungos se expandiram desde a descoberta de antimicrobianos de origem fúngica em 1929, quando Alexander Fleming descreveu o antagonismo de Penicillium chrysogenum Thom, produzindo penicilina contra uma bactéria. Desde então, várias pesquisas com fungos principalmente terrestres, têm sido realizadas para obter enzimas extracelulares, ácidos orgânicos e antibióticos (Hyde et al. 2019). No caso de ambientes aquáticos, os fungos de origem marinha também estão sendo apontados como novos recursos para a produção bioativa (Habbu et al. 2016; Samuel et al. 2018), desde a descoberta da cefalosporina antimicrobiana do fungo Acremonium chrysogenum (Thirum. & Sukapure) W. Gams, que foi o primeiro composto bioativo encontrado no ambiente marinho. Alguns estudos relatam compostos antimicrobianos originários de fungos colonizando substratos lenhosos que degradam lentamente a lignina (Bugni & Ireland 2004). Esses compostos têm uma ampla gama de atividades, tais como: atividades antibacteriana, antidiabética, antifúngica, anti- inflamatória, antiprotozoária, antituberculose, antiviral, antitumoral e citotóxica, muitas das quais podem ser atribuídas a enzimas específicas produzidas por fungos presentes nesses ambientes (Mayer et al. 2017). O primeiro produto natural antimicrobiano de um organismo marinho foi obtido a partir do fungo Halocyphina villosa Kohlm. & E. Kohlm., um basidiomiceto em substratos lenhosos, relatado em 1981. Esta pesquisa mostra que a fermentação desse isolado resultou na produção do metabólito siccayne, assim como a espécie Arthrinium spp. Além de apresentar atividade antifúngica, esse metabólito também possui atividades antioxidantes e celulolíticas (Hong et al. 2015). Pesquisas têm mostrado a importância de estudos que evidenciam o potencial biotecnológico de fungos de água doce (Krauss et al. 2011). Dentro deste contexto, fungos anamórficos (ingoldianos hifomicetos aero-aquáticos) foram alvo de estudos que demonstraram a produção de substâncias com potencial antimicrobiano e biorremediador, devido à resistência a diversas variações ambientais em especial antropogênicas (Harrigan et al. 1995; Krauss et al. 2011). Estudo realizado por Fisher et al. (1988) apresenta o composto quinaphthin (fórmula molecular C20H10O7), um metabólito secundário produzido por um hifomiceto aero-aquático Helicoon richonis (Boud.) Linder, 28 coletado de madeira em decomposição. Este composto tem ação antibiótica contra bactérias Gram positivas e o patógeno protozoário Trichomonas vaginalis. Adriaenssens et al. (1994), descreveram quimicamente o composto quinaphthin como um binaphthyl quinonoid um metabólito secundário de Helicoon richonis (Boud.) Linder. A espécie Kirschsteiniothelia sp., isolada de madeira submersa em água doce, foi descrita no trabalho de Poch et al. (1992) onde foi descoberto vários novos metabólitos bioativos como um novo dímero citotóxico da naftoquinona kirschsteinin que apresentou atividade antibiótica frente a Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus. Gulis & Stephanovich (1999) avaliaram a atividade antimicrobiana de compostos dos fungos ingoldianos coletados de madeira, Dimorphospora foliicola Tubaki, Flagellospora sp. e Mycocentrospora sp. e verificaram atividade antibacteriana e o fungo Articulospora tetracladia Ingold, onde também apresentou atividades antivirais contra o bacteriófago T4 e o vírus influenza. Oh et al. (2003), isolaram do fungo aquático de água doce Massarina tunicata quatro novos análogos da rosigenina (massarigeninas A-D) e dois novos metabólitos secundários derivados do policetídeo aromático (massarininas A e B). Esses compostos apresentaram atividades antibacterianas contra Bacillus subtilis (ATCC 6051), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Candida albicans (ATCC 14053), Aspergillus flavus (NRRL 6541) e Fusarium verticillioides (NRRL 25457). Em estudos de Sati & Singh (2014) foram testados extratos do hifomiceto Anguillospora longissima um endofítico extraído da raiz em água doce, o qual foi avaliado seu potencial antibacteriano contra cinco cepas, Gram-positivas (Bacillus subtilis MTCC 121) e Gram- negativas (Agrobacterium tumefaciens MTCC 609, Escherichia coli MTCC 40, Erwinia chrysanthemum e Xanthomonas pseudomonas). Em pesquisa anterior realizada por Harrigan et al. (1995) o fungo A. longissimi já havia sido descrito como produtor de uma substância denominada Anguilosporal (fórmula molecular C5H22O3). Esta substância apresentou atividade antibacteriana (Staphylococcus aureus ATCC 29213) e antifúngica (Candida albicans ATCC 90029). Em estudos realizados por Raja et al. (2015), o gênero Minutisphaera apresentou cinco metabólitos secundários (quatro eram dipeptídeos e um policetídeo aromático) com atividade antimicrobiana contra várias bactérias e fungos, dentre estas cepas estão Staphylococcus aureus e Mycobacterium smegmatis. Contudo verifica-se que a maioria dos estudos relacionados a fungos presentes em material lenhoso em água doce, estão focados na taxonomia. A Tabela 2 lista alguns fungos produtores de substâncias com atividade antimicrobiana em ambientes dulcícolas.

Tabela 2. Substâncias antimicrobianas produzidas por fungos em ambientes dulcícolas. Espécie de Fungo Atividade biológica Referências Massarina aquatica J. Webster Antifúngico Fisher &Anson (1983) Sporobolomyces roseus Kluyver & C.B. Niel Kirschsteiniothelia sp. Antibacteriano e antifúngico Poch et al. (1992) Helicoon richonis (Boud.) Linder Antibacteriano e antifúngico Adriaenssens et al. (1994) Anguillospora longissima (Sacc. & Antifúngico Harrigan et al. (1995) P. Syd.) Ingold e A. crassa Ingold Massarina spp. Antibiótico Oh et al. (1999) Clavariopsis aquatica De Wild. Antibiótico - antiviral Gulis & Stephanovich Articulospora tetracladia Ingold (1999) Chloridium sp. e Sporoschisma Antifúngico Oh et al. (2003) mirabile Berk & Broome

Ressalta-se que os fungos presentes em ambientes de água doce podem ter biossíntese diferente da realizada por fungos terrestres (Gulis & Stephanovich, 1999), devido a diferentes características desses ambientes como temperatura, salinidade, competição e nutrientes (Hong et al. 2015; Habbu et al. 2016; Balabanova et al. 2018; Youssef et al. 2019). No entanto, estudos genômicos enfatizam que o potencial metabólico secundário de fungos ainda está consideravelmente subestimado (Wiemann & Keller, 2014). Portanto, a busca de compostos de origem natural com capacidades antibacteriana, antifúngicas e antivirais nesses ambientes têm sido alvos de estudos, devido ao surgimento de patógenos resistentes a medicamentos tradicionais (Akpotu et al. 2017; Alkhulaifi et al. 2019).

2.2 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Fungos em ambientes aquáticos são importantes recursos para busca de novos compostos. Os ambientes de água doce da Amazônia, especialmente, são promissores na busca de substâncias antimicrobianas oriundas de fungos decompositores, dada a peculiaridade de seus habitats e as diferentes interferências antrópicas e ecológicas que podem favorecer a competição entre consórcios microbianos e, consequentemente, a produção de compostos com ações antagônicas. É importante enfatizar que muitos desses compostos, devem ser submetidos a estudos em animais e humanos para determinar sua eficácia e toxicidade. Também, são sugeridos estudos que elucidem a fisiologia desses 30 organismos para entender as necessidades de seu desenvolvimento in vitro, facilitando a obtenção de compostos de interesse biotecnológico.

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abelho, M., 2001. From Litterfall to Breakdown in Streams: A Review. Sci. World J. 1, 656–680. https://doi.org/10.1100/tsw.2001.103

Adriaenssens, P., Anson, A.E., Begley, M.J., Fisher, P.J., Orrell, K.G., Webster, J., Whitehurst, J.S., 1994. Quinaphthin, a binaphthyl quinonoid secondary metabolite produced by Helicoon richonis. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 2007–2010. https://doi.org/10.1039/p19940002007

Akpotu, M.O., Eze, P.M., Abba, C.C., Umeokoli, B.O., Nwachukwu, C.U., Okoye, F.B.C., Esimone, C.O., 2017. Antimicrobial activities of secondary metabolites of endophytic fungi isolated from Catharanthus roseus. J. Heal. Sci. 7, 15–22. https://doi.org/10.17532/jhsci.2017.421

Alkhulaifi, M.M., Awaad, A.S., AL-Mudhayyif, H.A., Alothman, M.R., Alqasoumi, S.I., Zain, S.M., 2019. Evaluation of antimicrobial activity of secondary metabolites of fungi isolated from Sultanate Oman soil. Saudi Pharm. J. 27, 401–405. https://doi.org/10.1016/j.jsps.2018.12.009

Almeida, D.A.C., Barbosa, F.R., Gusmão, L.F.P., 2012. Alguns fungos conidiais aquáticos-facultativos do bioma Caatinga. Acta Bot. Brasilica 26, 924–932. https://doi.org/10.1590/S0102-33062012000400021

Anastasiou, C.J., 1964. Some Aquatic Fungi Imperfecti from Hawaii. Pacific Sci. 36, 202–206.

ANVISA, 2007. Módulo 3: Resistência Microbiana - Mecanismos e Impacto Clínico. Antimicrob. - Base Teóricas e Uso Clínico.

Aprile, F., Darwich, A.J., Siqueira, G.W., Santos, F.R.R., 2013. Application of Hydrological and Limnological studies on Building Model for Water circulation of Meromictic Black Water Lakes at the Central. Int. Res. J. Environ. Sci. 2, 58–63. https://doi.org/2319-1414

Bai, Y., Wang, Q., Liao, K., Jian, Z., Zhao, C., Qu, J., 2018. Fungal Community as a Bioindicator to Reflect Anthropogenic Activities in a River Ecosystem. Front. Microbiol. 9, 1–11. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.03152

Balabanova, L., Slepchenko, L., Son, O., Tekutyeva, L., 2018. Biotechnology potential of marine fungi degrading plant and algae polymeric substrates. Front. Microbiol. 9, 1–15. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01527

Baptista, M.G.D.F.M., 2013. Mecanismos de Resistência aos Antibióticos. Diss. Mestrado, Lisboa, Univ. Lusófona Humanidades e Tecnol. Fac. Ciências e Tecnol. da Saúde 51. 31

Barbosa, F.R., Gusmão, L.F.P., Raja, H.A., Shearer, C.A., 2013. New species and new records of freshwater ascomycetes from brazil and costa rica. Mycologia 105, 335– 343. https://doi.org/10.3852/12-054

Barbosa, F.R., Raja, H.A., Shearer, C.A., Gusmão, L.F.P., 2013. Some freshwater fungi from the Brazilian semi-arid region, including two new species of hyphomycetes. Cryptogam. Mycol. 34, 243–258. https://doi.org/10.7872/crym.v34.iss2.2013.243

Barbosa, R.C., Correia e Silva, C.M., Hizukn, S.M., Cavassin, E.D., Perugini, M.R.E., 1999. Beta-lactamase de espectro estendido: prevalência e comparação de métodos de screening. Semin. Ciências Biológicas e da Saúde 20, 17. https://doi.org/10.5433/1679-0367.1999v20n2p17

Barlocher, F., 1985. The role of fungi in the nutrition of stream invertebrates. Bot. J. Linn. Soc. 91, 83–94. https://doi.org/10.1111/j.1095-8339.1985.tb01137.x

Bärlocher, F., 2009. Reproduction and dispersal in aquatic hyphomycetes. Mycoscience 50, 3–8. https://doi.org/10.1007/s10267-008-0449-x

Baschien, C., Hyde, K.D., 2018. Special issue on freshwater ascomycetes and other aquatic fungi. Mycol. Prog. 17, 509–510. https://doi.org/10.1007/s11557-018-1399- 0

Bertoncheli, C. de M., Horner, R., 2008. A review on metallo-beta-lactamases. Rev. Bras. Ciencias Farm. 44, 577–599.

Blair, J.M.A., Webber, M.A., Baylay, A.J., Ogbolu, D.O., Piddock, L.J.V., 2015. Molecular mechanisms of antibiotic resistance. Nat. Rev. Microbiol. 13, 42–51. https://doi.org/10.1038/nrmicro3380

Braga, G.U.L., Destéfano, R.H.R., Messias, C.L., 1999. Protease Production During Growth and Autolysis of Submerged Metarhizium anisopliae Cultures. Rev. Microbiol. 30, 107–113. https://doi.org/10.1590/S0001-37141999000200004

Brasil, 2007. Áreas Prioritárias para a Conservação, Uso Sustentável e Repartição de Benefícios da Biodiversidade Brasileira: Atualização - Portaria MMA n°9, de 23 de janeiro de 2007, Série Biodiveridade e Florestas. https://doi.org/10.1007/s13398- 014-0173-7.2

Bucher, V.V.C., Hyde, K.D., Pointing, S.B., Reddy, C.A., 2004. Production of wood decay enzymes, mass loss and lignin solubilization in wood by marine ascomycetes and their anamorphs. Fungal Divers. 15, 1–14.

Budhiraja, A., Nepali, K., Sapra, S., Gupta, S., Kumar, S., Dhar, K.L., 2013. Bioactive metabolites from an endophytic fungus of Aspergillus species isolated from seeds of Gloriosa superba Linn. Med. Chem. Res. 22, 323–329. https://doi.org/10.1007/s00044-012-0032-z

Bugni, T.S., Ireland, C.M., 2004. Marine-derived fungi: a chemically and biologically diverse group of microorganisms. Nat. Prod. Rep. 21, 143–163. https://doi.org/10.1039/b301926h

Cafêu, M.C., Silva, G.H., Teles, H.L., Bolzani, V.D.S., Araújo, Â.R., Young, M.C.M., 32

Pfenning, L.H., 2005. Substâncias antifúngicas de Xylaria sp., um fungo endofítico isolado de Palicourea marcgravii (Rubiaceae). Quim. Nova 28, 991–995. https://doi.org/10.1590/S0100-40422005000600011

Cail, L., Tsui2, C.K.M., Zhangl, K., Hyde2, K.D., Cai, L., Tsui, C.K.M., Zhang, K., Hyde, K.D., 2002. Aquatic fungi from Lake Fuxian, Yunnan, China. Fungal Divers. 9, 57– 70.

Canto, E.S.M., Cortez, A.C.A., Monteiro, J.S., Barbosa, F.R., Zelski, S., Souza, J.V.B. de, 2020. Composition and Diversity of Fungal Decomposers of Submerged Wood in Two Lakes in the Brazilian Amazon State of Par a. Int. J. Microbiol. 2020, 1–9. https://doi.org/https://doi.org/10.1155/2020/6582514

Carmo, L.T. do, Santos, D.C. dos, Silva, C.R., Ferreira, S.M.L., Thamara Arão Feletti, L.F.P.G., 2019. Exserticlava aquatica sp. nov., a microfungus from the Brazilian Amazon. Mycotaxon 134, 731–735.

Cortez, A.C.A., Sanches, M.A., Zelski, S.E., Souza, J.V.B., 2016. A comparison of the freshwater fungal community during the non-rainy and rainy seasons in a small black water lake in Amazonas, Brazil. J. Food, Agric. Environ. 14, 156–161.

Cox, G., Wright, G.D., 2013. Intrinsic antibiotic resistance: Mechanisms, origins, challenges, and solutions. Int. J. Med. Microbiol. 303, 287–292. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2013.02.009

Cruz, A., MARQUES, M., Gusmão, L., 2014. Conidial fungi from the semi-arid Caatinga Biome of Brazil. A new species of Dictyochaeta. Mycosphere 4, 701–705. https://doi.org/10.5943/mycosphere/4/4/6

Dellamatrice, P.M., Monteiro, R.T.R., 2014. Principais aspectos da poluição de rios brasileiros por pesticidas. Rev. Bras. Eng. Agrícola e Ambient. 18, 1296–1301. https://doi.org/10.1590/1807-1929/agriambi.v18n12p1296-1301

Diez, J.R., Elosegi, A., Pozo, J., 2001. Woody debris in North Iberian streams: Influence of geomorphology, vegetation, and management. Environ. Manage. 28, 687–698. https://doi.org/10.1007/s002670010253

Duarte, S., Antunes, B., Trabulo, J., Seena, S., Cássio, F., Pascoal, C., 2019. Intraspecific diversity affects stress response and the ecological performance of a cosmopolitan aquatic fungus. Fungal Ecol. 41, 218–223. https://doi.org/10.1016/j.funeco.2019.06.001

Dudgeon, D., Arthington, A.H., Gessner, M.O., Kawabata, Z.I., Knowler, D.J., Lévêque, C., Naiman, R.J., Prieur-Richard, A.H., Soto, D., Stiassny, M.L.J., Sullivan, C.A., 2006. Freshwater biodiversity: Importance, threats, status and conservation challenges. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 81, 163–182. https://doi.org/10.1017/S1464793105006950

Dudley, T., Anderson, N., 1982. A Survey of Invertebrates associated with Wood Derbis in Aquatic Habitats. Oregon Agric. Exp. Stn. Tech. Pap. No. 6419 1–19.

Fallah, P.M., Shearer, C.A., 2001. Freshwater ascomycetessco: species from north temperate lakes in Wisconsin. Mycologia 93, 566–602. 33

Fearnside, P.M., 2006. Desmatamento na Amazônia: dinâmica, impactos e controle. Acta Amaz. 36, 395–400. https://doi.org/10.1590/S0044-59672006000300018

Ferrer, A., Miller, A.N., Shearer, C.A., 2011. Minutisphaera and Natipusilla: Two new genera of freshwater dothideomycetes. Mycologia 103, 411–423. https://doi.org/10.3852/10-177

Fiorucci, A.R., Filho, E.B., 2005. Oxigênio dissolvido: propriedades e solubilidade. Química Nov. na Esc. 22, 10–16.

Fisher, P.J., Anson, A.E., 1983. Antifungal effects of Massarina aquatica growing on oak wood. Trans. - Br. Mycol. Soc. 81, 523–527. https://doi.org/10.1016/S0007- 1536(83)80120-X

Fisher, P.J., Anson, A.E., Webster, J., Adriaenssens, P., Whitehurst, J.S., 1988. Quinaphthin, a new antibiotic, produced by Helicoon richonis. Trans. Br. Mycol. Soc. 90, 499–502. https://doi.org/10.1016/s0007-1536(88)80166-9

Fiuza, P., 2013. Ingoldian fungi from semiarid Caatinga biome of Brazil. The genus Campylospora. Mycosphere 4, 559–565. https://doi.org/10.5943/mycosphere/4/3/9

Fiuza, P.O., Cantillo-Pérez, T., Gulis, V., Gusmão, L.F.P., 2017. Ingoldian fungi of Brazil: Some new records and a review including a checklist and a key. Phytotaxa 306, 171–200. https://doi.org/10.11646/phytotaxa.306.3.1

Fiuza, P.O., de Paiva Ottoni-Boldrini, B.M., Monteiro, J.S., Catena, N.R., Hamada, N., Gusmão, L.F.P., 2015. First records of Ingoldian fungi from the Brazilian Amazon. Rev. Bras. Bot. 38, 615–621. https://doi.org/10.1007/s40415-015-0157-7

Fryar, S.C., Booth, W., Davies, J., Hodgkiss, I.J., Hyde, K.D., 2005. Evidence of in situ competition between fungi in freshwater. Fungal Divers. 18, 59–71.

Garcia-Chevesich, P.A., Neary, D.G., Scott, D.F., Benyon, T.R., 2017. Forest management and the impact on water resources: A review of 13 countries, IHP - VIII / Technical Document No. 37. https://doi.org/10.1016/j.jvcir.2009.03.002

Goh, T., Hyde, K.D., 1996. Biodiversity of freshwater fungi. J. Ind. Microbiol. 17, 328– 345. https://doi.org/10.1007/BF01574764

Goh, T.K., Hyde, K.D., 1999. Fungi on submerged wood and bamboo in the Plover Cove. Fungal Divers. 3, 57–85.

Goh, T.K., Hyde, K.D., 1997. The generic distinction between Chaetopsina and Kionochaeta, with descriptions of two new species. Mycol. Res. 101, 1517–1523. https://doi.org/10.1017/S0953756297004292

Guimarães, D.O., Da Silva Momesso, L., Pupo, M.T., 2010. Antibióticos: Importância terapêutica e perspectivas para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes. Quim. Nova 33, 667–679. https://doi.org/10.1590/S0100-40422010000300035

Gulis, V., Su, R., Kuehn, K.A., 2019. Fungal Decomposers in Freshwater Environments, in: The Structure and Function of Aquatic Microbial Communities. Springer Nature Switzerland AG, Hattiesburg, pp. 121–155. https://doi.org/10.1007/978-3-030- 34

16775-2_5

Gulis, V.I., Stephanovich, A.I., 1999. Antibiotic effects of some aquatic hyphomycetes. Mycol. Res. 103, 111–115. https://doi.org/10.1017/S095375629800690X

Habbu, P., Warad, V., Shastri, R., Madagundi, S., Kulkarni, V.H., 2016. Antimicrobial metabolites from marine microorganisms. Chin. J. Nat. Med. 14, 101–116. https://doi.org/10.1016/S1875-5364(16)60003-1

Harrigan, G.G., Armentrout, B.L., Gloer, J.B., Shearer, C.A., 1995. Anguillosporal, a new antibacterial and antifungal metabolite from the freshwater fungus anguillospora longissima. J. Nat. Prod. 58, 1467–1469. https://doi.org/10.1021/np50123a022

Hawksworth, D., Gardens, R.B., 2017. Fungal Diversity Revisited: 2.2 to 3.8 Million Species. The Fungal Kingdom 79–95. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.funk- 0052-2016

Hawksworth, D.L., 2001. Fungal Ecology. Encycl. Life Sci.

Holmes, A.H., Moore, L.S.P., Sundsfjord, A., Steinbakk, M., Regmi, S., Karkey, A., Guerin, P.J., Piddock, L.J.V., 2016. Understanding the mechanisms and drivers of antimicrobial resistance. Lancet 387, 176–187. https://doi.org/10.1016/S0140- 6736(15)00473-0

Hong, J.H., Jang, S., Heo, Y.M., Min, M., Lee, Hwanhwi, Lee, Y.M., Lee, Hanbyul, Kim, J.J., 2015. Investigation of marine-derived fungal diversity and their exploitable biological activities. Mar. Drugs 13, 4137–4155. https://doi.org/10.3390/md13074137

Hu, D.M., Liu, F., Cai, L., 2013. Biodiversity of aquatic fungi in China. Mycology 4, 125–168. https://doi.org/10.1080/21501203.2013.835752

Hudson, H.J., Ingold, C.T., 1960. Aquatic hyphomycetes from Jamaica. Trans. Br. Mycol. Soc. 43, 469–478, IN1. https://doi.org/10.1016/S0007-1536(60)80029-0

Hyde, K.D., Fryar, S., Tian, Q., Bahkali, A.H., Xu, J., 2015. Lignicolous freshwater fungi along a north e south latitudinal gradient in the Asian / Australian region ; can we predict the impact of global warming on biodiversity and function ? Fungal Ecol. 1– 9. https://doi.org/10.1016/j.funeco.2015.07.002

Hyde, K.D., Hongsanan, S., Jeewon, R., Al., E., 2016. Fungal diversity notes 367–490: taxonomic and phylogenetic contributions to fungal taxa. Fungal Divers. 80. https://doi.org/10.1007/s13225-016-0373-x

Hyde, K.D., Xu, J., Rapior, S., et al. 2019. The amazing potential of fungi: 50 ways we can exploit fungi industrially. Fungal Divers. 97, 1–136. https://doi.org/10.1007/s13225-019-00430-9

Ingold, C.T., 1958. Aquatic Hyfhomycetes from Uganda and Rhodesia. Trans. Br. Mycol. Soc. 41, 109–114. https://doi.org/10.1016/S0007-1536(58)80014-5

Ingold, C.T., 1956. Stream Spora in Nigeria. Trans. Br. Mycol. Soc. 39, 108–110. https://doi.org/doi:10.1016/S0007-1536(56)80058-2 35

Ingold, C.T., 1954. Aquatic ascomycetes: Discomycetes from Lakes. Trans. Br. Mycol. Soc. 37, 1–18. https://doi.org/10.1016/s0007-1536(54)80059-3

Iqbal, S.H., Webster, J., 1973. The trapping of aquatic hyphomycete spores by air bubbles. Trans. Br. Mycol. Soc. 60, 37–48. https://doi.org/10.1016/S0007- 1536(73)80057-9

Johnston, S.R., Boddy, L., Weightman, A.J., 2016. Bacteria in decomposing wood and their interactions with wood-decay fungi. FEMS Microbiol. Ecol. 92. https://doi.org/10.1093/femsec/fiw179

Jones, E.B.G., Pang, K.L., 2012. Tropical aquatic fungi. Biodivers. Conserv. 21, 2403– 2423. https://doi.org/10.1007/s10531-011-0198-6

Junk, W.J., 1979. Recursos hídricos da região amazônica: utilização e preservação. Acta Amaz. 9, 37–51.

Kane, D.F., Tam, W.Y., Jones, E.B.G., 2002. Fungi colonising and sporulating on submerged wood in the River Severn, UK. Fungal Divers. 10, 45–55.

Krauss, G.J., Solé, M., Krauss, G., Schlosser, D., Wesenberg, D., Bärlocher, F., 2011. Fungi in freshwaters: Ecology, physiology and biochemical potential. FEMS Microbiol. Rev. 35, 620–651. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2011.00266.x

Kumar, J., Dubey, S., Ram, M.K., 2011. Aquatic Environment / Ecosystem- Components, Structure and Functions. Aqua Int.

Laxminarayan, R., Duse, A., Wattal, C., et al. Antibiotic resistance-the need for global solutions. Lancet Infect. Dis. 13, 1057–1098. https://doi.org/10.1016/S1473- 3099(13)70318-9

Llopart, M., Reboita, M., Coppola, E., Giorgi, F., da Rocha, R., de Souza, D., 2018. Land Use Change over the Amazon Forest and Its Impact on the Local Climate. Water 10, 1–12. https://doi.org/10.3390/w10020149

Locey, K.J., Lennon, J.T., 2016. Scaling laws predict global microbial diversity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 5970–5975. https://doi.org/10.1073/pnas.1521291113

Loureiro, R.J., Roque, F., Teixeira Rodrigues, A., Herdeiro, M.T., Ramalheira, E., 2016. Use of antibiotics and bacterial resistances: Brief notes on its evolution. Rev. Port. Saude Publica 34, 77–84. https://doi.org/10.1016/j.rpsp.2015.11.003

Luo, J., Yin, J.F., Cai, L., Zhang, K.Q., Hyde, K.D., 2004. Freshwater fungi in Lake Dianchi, a heavily polluted lake in Yunnan, China. Fungal Divers. 16, 93–112.

Mayer, A.M.S., Rodríguez, A.D., Taglialatela-Scafati, O., Fusetani, N., 2017. Marine pharmacology in 2012–2013: Marine compounds with antibacterial, antidiabetic, antifungal, anti-inflammatory, antiprotozoal, antituberculosis, and antiviral activities; affecting the immune and nervous systems, and other miscellaneous mechanisms of action. Mar. Drugs 15, 1–61. https://doi.org/10.3390/md15090273

Matsushima, T., 1993. Matsushima Mycological Memoirs, n. 7. ed. Published by the author, Kobe, Japão. 36

Medeiros, A.O., Pascoal, C., Graça, M.A.S., 2009. Diversity and activity of aquatic fungi under low oxygen conditions. Freshw. Biol. 54, 142–149. https://doi.org/10.1111/j.1365-2427.2008.02101.x

Mille-Lindblom, C., Fischer, H., Tranvik, L.J., 2006. Antagonism between bacteria and fungi: Substrate competition and a possible tradeoff between fungal growth and tolerance towards bacteria. Oikos 113, 233–242. https://doi.org/10.1111/j.2006.0030-1299.14337.x

Monteiro, J.S., Gusmão, L.F.P., 2013. An emendation of Fusticeps and two new species from the Brazilian Amazon Forest. Mycotaxon 123, 431–437. https://doi.org/10.5248/123.431

Monteiro, J.S., Gusmão, L.F.P., Castañeda-Ruiz, R.F., 2014. A new species of Arachnophora from submerged wood in the Amazon rainforest, Brazil. Mycotaxon 128, 127–130. https://doi.org/10.5248/128.127

Moreira, C.G., Schoenlein-crusius, I.H., 2012. Nova espécie e novos registros para o Brasil de hifomicetos em folhedo submersos coletados no Parque Municipal. Hoehnea 39, 521–527.

Moro, L.B., Delgado, G., Schoenlein-crusius, I.H., 2018. Freshwater hyphomycetes from Ilhabela State Park, Brazil. Curr. Res. Environ. Appl. Mycol. 8, 204–216. https://doi.org/10.5943/cream/8/2/5

Odum, E.P., 1969. The strategy of ecosystem development. Science (80). 169, 262–270.

Oh, H., Kwon, T.O., Gloer, J.B., Marvanová, L., Shearer, C.A., 1999. Tenellic acids A- D: New bioactive diphenyl ether derivatives from the aquatic fungus Dendrospora tenella. J. Nat. Prod. 62, 580–583. https://doi.org/10.1021/np980496m

Oh, H., Swenson, D.C., Gloer, J.B., Shearer, C.A., 2003. New bioactive rosigenin analogues and aromatic polyketide metabolites from the freshwater aquatic fungus Massarina tunicata. J. Nat. Prod. 66, 73–79. https://doi.org/10.1021/np020342d

Oliveira, T.S., Filho Andrade, V.S., Rocha, V.M., Menezes, J.S., 2017. The impacts of deforestation and burning of anthropogenic climate of the Brazilian amazon: A Review. Rev. Geográfica Acadêmica 11, 157–181.

Park, D., 1972. On the ecology of heterotrophic micro-organisms in freshwater. Trans. Br. Mycol. Soc. 58, 291–299. https://doi.org/10.1016/S0007-1536(72)80157-8

Paterson, D.L., Bonomo, R.A., 2005. Extended-Spectrum β-Lactamases: a Clinical Update. Clin. Microbiol. Rev. 18, 657–686. https://doi.org/10.1128/CMR.18.4.657

Paterson, G.K., Morgan, F.J.E., Harrison, E.M., Cartwright, E.J.P., Török, M.E., Zadoks, R.N., Parkhill, J., Peacock, S.J., Holmes, M.A., 2014. Prevalence and characterization of human mecC methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates in England. J. Antimicrob. Chemother. 69, 907–910. https://doi.org/10.1093/jac/dkt462

Pearman, J.K., Taylor, J.E., Kinghorn, J.R., 2010. Fungi in aquatic habitats near St Andrews in Scotland. Mycosphere 1, 11–21. 37

Penaluna, B.E., Olson, D.H., Flitcroft, R.L., Weber, M.A., Bellmore, J.R., Wondzell, S.M., Dunham, J.B., Johnson, S.L., Reeves, G.H., 2017. Aquatic biodiversity in forests: a weak link in ecosystem services resilience. Biodivers. Conserv. 26, 3125– 3155. https://doi.org/10.1007/s10531-016-1148-0

Poch, G.K., Gloer, J.B., Shearer, C.A., 1992. New bioactive metabolites from a freshwater isolate of the fungus Kirschsteiniothelia sp. J. Nat. Prod. 55, 1093–1099. https://doi.org/10.1021/np50086a010

Raja, H.A., Miller, A.N., Shearer, C.A., 2012. Freshwater ascomycetes: Natipusillaceae, a new family of tropical fungi, including Natipusilla bellaspora sp. nov. From the Peruvian Amazon. Mycologia 104, 569–573. https://doi.org/10.3852/11-150

Raja, H.A., El-Elimat, T., Oberlies, N.H., Shearer, C.A., Miller, A.N., Tanaka, K., Hashimoto, A., Fournier, J., 2015. Minutisphaerales (Dothideomycetes, Ascomycota): A new order of freshwater ascomycetes including a new family, Minutisphaeraceae , and two new species. Mycologia 107, 845–862. https://doi.org/10.3852/15-013

Raja, H.A., Shearer, C.A., Tsui, C.K., 2018. Freshwater Fungi. https://doi.org/10.1002/9780470015902.a0027210 Rodrigues Barbosa, F., Pascholati Gusmão, L.F., Raja, H.A., Shearer, C.A., 2008. Annulatascus apiculatus sp. nov., a new freshwater ascomycete from the semi-arid Caatinga biome of Brazil. Mycotaxon 106, 403–407. https://doi.org/http://dx.doi:10.3852/12-054

Samuel, P., Maheswari, M., Vijayakumar, J., Selvarathinam, T., Amirtharaj, K., Deenathayalan, R., 2018. Bio-prospecting of marine-derived fungi with special reference to production of keratinase enzyme - A need-based optimization study. J. Appl. Biol. Biotechnol. 6, 35–41. https://doi.org/10.7324/JABB.2018.60306

Sati, S.C., Arya, P., 2010. Antagonism of some aquatic hyphomycetes against plant pathogenic fungi. Scientific World Journal. 10, 760–765. https://doi.org/10.1100/tsw.2010.80

Sati, S.C., Singh, L., 2014. Bioactivity of root endophytic freshwater hyphomycetes Anguillospora longissima (Sacc. & Syd.) Ingold. Sci. World J. 2014, 1–5. https://doi.org/10.1155/2014/707368

Schoenlein-Crusius, I.H., 2002. Aquatic hyphomycetes from Cerrado regions in the satate of São Paulo, Brazil. Mycotaxon 81, 457–462.

Schoenlein-Crusius, I.H., Diniz, B.F., Costa, R.T. da, Sabino, A.P.R., Moro, L.B., Boro, M., Ishida, C.M., Jesus, A.L. de, Pires-Zottarelli, C.L.A., 2016. Diversity of conidial fungi and some abiotic variables of the water after the reopening of the Pirarungaua stream in the Jardim Botânico, São Paulo, São Paulo State, Brazil. Hoehnea 43, 57– 75. https://doi.org/10.1590/2236-8906-58/2015

Schoenlein-Crusius, I.H., Milanez, A.I., 1998. Fungos microscópicos da Mata Atlântica de Paranapiacaba, São Paulo, Brasil. Rev. Bras. Botânica 21, 73–79. https://doi.org/10.1590/s0100-84041998000100007 38

Schoenlein-Crusius, I.H., Milanez, A.I., 1990. Hyphomycetes aquáticos no Estado de São Paulo, Brasil. Rev. Bras. Bot. 13, 61–68.

Schoenlein-Crusius, I.H., Milanez, A.I., 1989. Sucessão fúngica em folhas de Ficus microcarpa L.F. submersas no lago situado no Parque Estadual das fontes do Ipiranga, São Paulo/SP. Narrat. Ther. Lives 20, 95–101. https://doi.org/10.1055/s- 2008-1040325

Schoenlein-Crusius, I.H., Moreira, C.G., Takahashi, J.P., Gomes, E.P.C., 2014. Riqueza dos fungos ingoldianos e aquáticos facultativos no Parque Municipal do Ibirapuera, São Paulo, SP, Brasil. Hoehnea 41, 61–76. https://doi.org/10.1590/s2236- 89062014000100006

Shearer, C.A., 1993a. The Freshwater Ascomycetes. Nov. Hedwigia 56, 1–33.

Shearer, C.A., 1993b. A New Species of Kirschsteiniothelia (Pleosporales) with an Unusual Fissitunicate Ascus. Mycologia 85, 963–969. https://doi.org/10.2307/3760680

Shearer, C.A., Descals, E., Kohlmeyer, B., Kohlmeyer, J., Marvanová, L., Padgett, D., Porter, D., Raja, H.A., Schmit, J.P., Thorton, H.A., Voglymayr, H., 2007. Fungal biodiversity in aquatic habitats. Biodivers. Conserv. 16, 49–67. https://doi.org/10.1007/s10531-006-9120-z

Shearer, C.A., Webster, J., 1991. Aquatic hyphomycete communities in the river Teign. IV. Twig colonization. Mycol. Res. 95, 413–420. https://doi.org/10.1016/S0953- 7562(09)80839-3

Shearer, C.A., Zelski, S.E., Raja, H.A., Schmit, J.P., Miller, A.N., Janovec, J.P., 2015. Distributional patterns of freshwater ascomycetes communities along an Andes to Amazon elevational gradient in Peru. Biodivers. Conserv. 24, 1877–1897. https://doi.org/10.1007/s10531-015-0911-y

Silva, S.S., Izabel, T.S.S., Gusmão, L.F.P., 2014. Fungos conidiais associados a substratos vegetais submersos em algumas áreas do bioma Caatinga. Rodriguésia 65, 527–538.

Sioli, H., 1984. The Amazon: limnology and landscape ecology of a migth tropical river and it´s basin., Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-94- 009-6542-3

Souza, A.Q.L., Duarte, A., Souza, L. et al. 2004. Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas da amazônia: Palicourea longiflora ( aubl .) rich e Strychnos cogens bentham. Acta Amaz. 34, 185–195.

Sri-indrasutdhi, V., Boonyuen, N., Suetrong, S., Chuaseeharonnachai, C., Sivichai, S., Gareth Jones, E.B., Suetrong, S., 2010. Wood-inhabiting freshwater fungi from Thailand: Ascothailandia grenadoidia gen. et sp. nov., Canalisporium grenadoidia sp. nov. with a key to Canalisporium species (Sordariomycetes, Ascomycota). Mycoscience 51, 411–420. https://doi.org/10.1007/s10267-010-0055-6

Sridhar, K.R., Sudheep, N.M., 2011. The Spatial Distribution of Fungi on Decomposing Woody Litter in a Freshwater Stream, Western Ghats, India. Microb. Ecol. 61, 635– 39

645. https://doi.org/10.1007/s00248-011-9803-1

Strayer, D.L., Dudgeon, D., 2010. Freshwater biodiversity conservation: recent progress and future challenges. J. North Am. Benthol. Soc. 29, 344–358. https://doi.org/10.1899/08-171.1

Stryjewski, M.E., Corey, G.R., 2014. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: An evolving pathogen. Clin. Infect. Dis. 58, 10–19. https://doi.org/10.1093/cid/cit613

Suryanarayanan, T.S., Thirunavukkarasu, N., Govindarajulu, M.B., Sasse, F., Jansen, R., Murali, T.S., 2009. Fungal endophytes and bioprospecting. Fungal Biol. Rev. 23, 9– 19. https://doi.org/10.1016/j.fbr.2009.07.001

Tanaka, K., Hatakeyama, S., Harada, Y., 2005. Three new freshwater ascomycetes from rivers in Akkeshi, Hokkaido, northern Japan. Mycoscience 46, 287–293. https://doi.org/10.1007/s10267-005-0248-6

Tartari, E., Abbas, M., Pires, D., de Kraker, M.E.A., Pittet, D., 2017. World Health Organization SAVE LIVES: Clean Your Hands global campaign ‘Fight antibiotic resistance it’s in your hands’’.’ Clin. Microbiol. Infect. 23, 596–598. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2017.04.021

Tsui, C.K.M., Baschien, C., Goh, T., 2016. Biology and Ecology of Freshwater Fungi, in: Biology of Microfungi. pp. 285–313. https://doi.org/10.1007/978-3-319-29137-6

Tsui, C.K.M., Hodgkiss, I.J., Hyde, K.D., 2003. Three new species of Aquaticola (Ascomycetes) from tropical freshwater habitats. Nov. Hedwigia 77, 161–168. https://doi.org/10.1127/0029-5035/2003/0077-0161

Vijaykrishna, D., Hyde, K.D., 2006. Inter- and intra-stream variation of lignicolous freshwater fungi in tropical Australia. Fungal Divers. 21, 203–224.

Wiemann, P., Keller, N.P., 2014. Strategies for mining fungal natural products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 41, 301–313. https://doi.org/10.1007/s10295-013-1366-3

Wong, M.K.M., Goh, T.K., Hodgkiss, I.J., Hyde, K.D., Ranghoo, V.M., Tsui, C.K.M., Ho, W.H., Wong, W.S.W., Yuen, T.K., 1998. Role of fungi in freshwater ecosystems. Biodivers. Conserv. 7, 1187–1206. https://doi.org/10.1023/A:1008883716975

Wurzbacher, C., Rösel, S., Rychła, A., Grossart, H.P., 2014. Importance of saprotrophic freshwater fungi for pollen degradation. PLoS One 9. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094643

Wurzbacher, C.M., Bärlocher, F., Grossart, H.P., 2010. Fungi in lake ecosystems. Aquat. Microb. Ecol. 59, 125–149. https://doi.org/10.3354/ame01385

Youssef, F.S., Ashour, M.L., Singab, A.N.B., Wink, M., 2019. A comprehensive review of bioactive peptides from marine fungi and their biological significance. Mar. Drugs 17. https://doi.org/10.3390/md17100559

Zelski, S. E., Raja, H.. A., Miller, A.N., Shearer, C.A., 2011a. Chaetorostrum quincemilensis, gen. et sp. nov., a new freshwater ascomycete and its Taeniolella- 40

like anamorph from Peru. Mycosphere 2, 593–600. https://doi.org/10.5943/mycosphere-2-5-9

Zelski, S.E., Raja, H.A., Miller, A.N., Barbosa, F.R., Gusmão, L.F.P., Shearer, C.A., 2011b. Longicollum biappendiculatum gen. et sp. nov., a new freshwater ascomycete from the Neotropics. Mycosphere 2, 539–545.

Zelski, S.E., Raja, H.A., Miller, A.N., Shearer, C.A., 2015. Conioscypha peruviana sp. nov., its phylogenetic placement based on 28S rRNA gene, and a report of Conioscypha gracilis comb. nov. from Peru. Mycoscience 56, 319–325. https://doi.org/10.1016/j.myc.2014.09.002

Zgurskaya, H.I., López, C.A., Gnanakaran, S., 2016. Permeability Barrier of Gram- Negative Cell Envelopes and Approaches to Bypass It. ACS Infect. Dis. 1, 512–522. https://doi.org/10.1021/acsinfecdis.5b00097

Zhang, N., Wang, Z., 2015. Pezizomycotina: Sordariomycetes and Leotiomycetes, in: Systematics and Evolution. pp. 57–81. https://doi.org/10.1007/978-3-662-46011-5

Zhang, S., Sun, X., Chang, W., Dai, Y., Ma, X., 2015. Systematic review and meta- analysis of the epidemiology of vancomycin-intermediate and heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus isolates. PLoS One 10, 1–22. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0136082

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo Geral

✓ Investigar a diversidade e a produção de antimicrobianos dos fungos decompositores de madeira submersa em lagos da Amazônia brasileira, estado do Pará.

4.2 Objetivos específicos

✓ Estudar a diversidade de fungos decompositores de madeira submersa de dois lagos (Juá e Maicá) da região amazônica; ✓ Avaliar a potencial produção de antimicrobianos dos fungos isolados através de bioprocessos; ✓ Obter frações orgânicas contendo metabólitos antimicrobianos e investigar substâncias com atividade antimicrobiana produzidas por fungos decompositores de madeira.

5. APRESENTAÇÃO DOS CAPÍTULOS

Os materiais, metodologias, resultados e discussões dessa presente tese estão apresentados na forma de capítulos:

CAPÍTULO 1 – Composição e diversidade de fungos decompositores de madeira submersa em dois lagos da Amazônia brasileira, estado do Pará.

Esse capítulo está em forma de artigo e foi submetido e aceito no periódico (Apêndice 10.1) International Journal of Microbiology, vol. 2020.

CAPÍTULO 2 – Atividade antimicrobiana de extratos de fungos decompositores de madeira submersa em lagos da Amazônia brasileira. Esse capítulo está em forma de artigo e será submetido ao Journal of Applied Microbiology

CAPÍTULO 3 – Caraterização química das frações com atividade antibacteriana produzidas por Fusarium solani LM6281 Esse capítulo está em forma de artigo e será submetido ao Journal of Applied Microbiology

6. CAPÍTULO 1- ARTIGO: COMPOSIÇÃO E DIVERSIDADE DE FUNGOS DECOMPOSITORES DE MADEIRA SUBMERSA EM DOIS LAGOS DA AMAZÔNIA BRASILEIRA NO ESTADO DO PARÁ.

Esse artigo está no formato Hindawi, submetido a revista International Journal of Microbiology e foi aceite em 4 de março de 2020 (Apêndice 10.1)

Eveleise Samira Martins Canto 1, Ana Cláudia Alves Cortez 2, Josiane Santana Monteiro3, Flavia Rodrigues Barbosa4, Steven Zelski5 e João Vicente Braga de Souza 2

1 Programa de Pós-Graduação da Rede de Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal—Bionorte, Manaus, Amazonas, Brasil. Universidade Federal do Oeste do Pará, UFOPA, Santarém, Pará Brasil.

2 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, INPA, Laboratório de Micologia, Manaus, Amazonas.

3 Museu Paraense Emilio Goeldi -MPEG, Belém, Pará.

4 Universidade Federal de Mato Grosso, UFMT, Sinop, Mato Grosso

5 Miami University, Department of Biological Sciences, Middletown, Ohio, USA.

Autor correspondente Steven Zelski; [email protected]

RESUMO Os ecossistemas aquáticos nas florestas tropicais têm uma alta diversidade de microrganismos, incluindo fungos, importantes decompositores de madeira submersa. Apesar da importância desse grupo ecológico de fungos, a literatura é escassa sobre a diversidade de fungos de água doce dos ambientes da Amazônia brasileira. O objetivo deste trabalho foi descrever a composição e diversidade de fungos presentes em madeira submersa em dois lagos da Amazônia Brasileira (Pará). Fragmentos de madeira em decomposição (30 amostras por lago) foram coletados nos lagos Juá e Maicá. As amostras de madeira, foram analisadas por 6 meses quanto à presença de estruturas fúngicas reprodutivas. Os fungos observados na madeira, foram identificados morfologicamente e por sequenciamento da região ITS do rDNA. Foram identificados 23 táxons no lago Juá (10 sexuais e 13 assexuais) e 26 táxons no lago Maicá (17 sexuais e 9 assexuais. No lago Juá e Maicá os índices de diversidade foram respectivamente H ': 2.6514 e H': 2.8174. O índice de Sørensen das comunidades de fungos entre os lagos estudados foi de 0,3673. Este estudo é o primeiro a descrever a diversidade de fungos de dois importantes ambientes aquáticos no Pará, Brasil.

Palavras-chave: Biodiversidade, Ecossistemas aquáticos, Decomposição, Ascomicetos de água doce, decomposição.

INTRODUÇÃO

Os fungos de água doce incluem espécies que habitam a água durante todo ou parte do seu ciclo de vida ou qualquer espécie adaptada para colonizar substrates predominantemente aquáticos ou semi-aquáticos na natureza [1]. Esses organismos apresentam grande importância Ambiental, pois servem como agentes chave na decomposição de material vegetal submerso em decomposição. A biomassa fúngica é uma fonte de nutrição para outros organismos nos ecossistemas aquáticos [2, 3]. A atividade enzimática fúngica também modifica os substratos das plantas para torná-las mais palatáveis aos trituradores e raspadores [4]. Ascomicetes de água doce são um grupo de fungos que participam ativamente da decomposição de detritos lenhosos submersos [5, 6].Esse grupo é polifilético, com a maioria das espécies pertencentes ao subfilo Pezizomycotina nas classes Leotiomycetes, Sordariomycetes e Dothideomycetes [2,7]. Membros dos Eurotiomycetes [8] e Orbiliomycetes [9] são menos comuns. Shearer & Raja [10] relataram que os ascomicetos de água doce são distribuídos em relativamente poucas ordens: Helotiales, Pleosporales, Sordariales, Savoryellales, Microascales, Eurotiales e Jahnulales. O número de táxons conhecidos aumentou nos últimos anos devido a amostragens mais amplas e ao uso de métodos moleculares para identificação [11, 12]. A bacia amazônica é sem dúvida a rede mais complexa de habitats aquáticos do planeta [13]. Essa vasta região contém uma variedade de ambientes aquáticos que incluem grandes rios, lagos, pântanos e planícies inundadas sazonalmente [13, 14]. Os ecossistemas aquáticos podem ser classificados em três tipos principais: água clara [15], água branca [16], e água preta [14, 17]. As características da água como temperatura, oxigênio dissolvido e quantidade de matéria orgânica podem influenciar a diversidade de espécies de fungos de água doce [18]. Os primeiros estudos publicados de fungos de água doce nas águas da Amazônia (Peru) foram realizados por Matsushima em rios de água branca [19]. Estudos mais recentes descreveram novas espécies de ascomicetes na Amazônia peruana [20-24] e nos estados brasileiros do Pará [25, 26] e Amazonas [27, 28]. Em geral, a comunidade microbiana da região amazônica ainda é pouco explorada, e estudos descrevendo a diversidade e ecologia de fungos na região amazônica são urgentemente necessários. Portanto, busca-se investigar novos ambientes, como o rio Tapajós, um dos maiores afluentes de águas claras do rio Amazonas [17]. Contudo, torna-se necessário 45 estudar ambientes que tenham conexão direta a este rio e que possuem diferentes tipos de composições físico-químicas como o lago Maicá e Juá pois, ações antrópicas podem alterar esses habitats e ocasionar a perda de importantes informações. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo descrever a composição e diversidade de fungos presentes em madeira em decomposição submersa em dois lagos na bacia do rio Tapajós, em Santarém, no estado do Pará.

MATERIAIS E MÉTODOS

Locais do estudo

As amostras de madeira submersa em decomposição foram coletadas no Lago Juá (2º25'57"S, 54º 46'39"W) e Lago Maicá (2º27'29.0"S, 54º 40'10.8"W). O lago Juá recebe águas que drenam de um igarapé e do rio Tapajós, considerado um rio de águas claras. O lago Maicá em período de águas baixas, possui influência das águas do rio Amazonas caracterizado com rio de águas brancas [14] (Figures 1 e 2(a) 2(b)).

Figura 1: Mapa da localização do Lago Juá e Maicá pertencentes a bacia do baixo rio Tapajós, Santarém, Pará, Brasil, Fonte: Lima, J.L.

Caracterização da Água

As variáveis fisico-químicass foram medidas utilizando uma sonda multiparamétrica Profline 197i WTW (Wellheim, Germany). Os parâmetros, temperatura (°C), pH, condutividade elétrica (μS), concentração de oxigênio dissolvido (mg/L) e turbidez (NTU) foram registrados para cada coleta de amostras. 46

Coleta de amostras

Uma única coleta foi realizada em cada local no lago Juá em outubro de 2017 e novembro de 2017 no lago Maicá. Em cada local, foram coletados 30 fragmentos de madeira submersos que apresentavam sinais de decomposição ativa. Os comprimentos das amostras variaram de 6 a 22 cm e os diâmetros variaram de 6 a 15 cm (Figura 2 (c)). Esses substratos foram transportados em sacos plásticos seláveis (20 cm × 10 cm), com uma pequena quantidade de água local, para o Laboratório de Ensino Multidisciplinar em Biologia Aplicada - Labio, Universidade Federal do Oeste do Pará (UFOPA). No laboratório, as amostras foram lavadas delicadamente com água corrente, colocadas em câmaras úmidas (caixas plásticas com toalhas de papel úmidas) e incubadas à temperatura ambiente com 12/12 h de luz/escuridão.

Isolamento e identificação de fungos presentes em madeira submersa A cada dez dias, durante seis meses, um estereomicroscópio Stemi DV4 (Zeiss) foi utilizado para procurar estruturas fúngicas nas amostras de madeira coletadas. As estruturas encontradas foram transferidas, com agulhas de dissecção, para lâminas de microscópio contendo água destilada e lamínula. A identificação dos ascomicetes sexuais foi realizada com base na micromorfologia de ascomata, hamatécio, asco e ascósporos 47 usando um microscópio Axioskop 40 (Zeiss), como descrito anteriormente [22, 29, 30]. Solução aquosa de lactofenol azul de algodão foi usada para determinar as reações de coloração do aparelho de asco apical. Ascomicetos assexuais foram identificados através da investigação dos tipos de conidiogênese, conidióforo e conídios, usando um microscópio Axioskop 40 (Zeiss). O isolamento dos fungos foi realizado através da transferência das estruturas dos fungos para a superfície do Ágar Água Antibiótico (20 g / L ágar e 250 mg / L de cloranfenicol), Ágar Batata Dextrose - BDA (Kasvi) e Ágar Extrato de Malte - MEA (extrato de malte 30 g / L, peptona micológica 5g / L e 15g / L ágar, pH 5.4 ± 0.2). As colônias desenvolvidas foram transferidas e Ágar PYG (1.25 g / L peptona, 1.25 g / L extrato de levedura, 5 g / L glicose, 250 mg / L cloranfenicol e 18 g / L ágar) [22] (Figuras 2(d)-2(g)).

Extração de DNA, amplificação e sequenciamento A extração do DNA foi realizada de acordo com o protocolo de Ferrer et al. [31]. Os fungos foram cultivados em tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo batata e dextrose (120 g de batata, 10 g de dextrose e 1000 mL de água destilada) por 10 dias e transferidos para tubos Eppendorf (2 mL) contendo 500 μL de tampão de lise (2.5mg SDS, 7.0 mg NaCl, 3.65 mg EDTA, 20 mL de Tris-HCl, 100 mL de água destilada) e 5 μL de β- mercaptoethanol). Os microtubos foram submetidos a congelamento (-20 °C) e aquecimento (65 °C por 1 h), a fim de romper as estruturas celulares. Em seguida, 500 μL de uma solução de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (v / v / v: 25/24/1) foram adicionados aos microtubos e agitados no vórtex até obter uma suspensão homogênea. A suspensão foi então centrifugada (14.000 rpm, 15 min) e o sobrenadante foi transferido para um novo microtubo (1,5 mL). Foi adicionado isopropanol ao sobrenadante em igual volume e a mistura foi homogeneizada e incubada a -20 °C durante a noite para precipitar o DNA. O DNA precipitado foi centrifugado (14.000 rpm por 15 minutos), lavado duas vezes com etanol a 70% e ressuspenso em 100 μL de água destilada estéril. Os dados moleculares foram coletados sequenciando a região ITS do rDNA de acordo com o procedimento de White et al. [32] . A reação produziu um volume final de 50 μl, consistindo em tampão de PCR (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl 2, 0.5 μM of ITS-1 (5 ’'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ’ ’) and ITS-4 (5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’), 200 μM dNTPs, 1.5 U Taq DNA polimerase, e 100 ng de DNA fúngico. A termociclagem foi realizada em um sistema Applied Biosystems ProFlex PCR com desnaturação inicial a 94 °C por 5 min, seguida por 35 ciclos de 48 desnaturação do DNA a 94 °C por 1 min, aquecimento a 55 °C por 1 min e extensão a 72 °C por 2 min, e uma extensão final a 72 °C por 10 min. Dois controles positivos e um controle negativo também foram testados. A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1,5% em tampão 1x TBE (base Tris 100 mM, ácido bórico 100 mM e EDTA 2 mM, pH 8,0), além de 10 μL / 100 ml de Siber Green SYBR® Safe e os fragmentos amplificados foram visualizados sob luz UV. Os produtos de amplificação foram purificados usando uma solução de polietilenoglicol-PEG (10 g de polietilenoglicol 800, 7,3 g de NaCl e 35 mL de água) como descrito anteriormente [33]. Volumes semelhantes das soluções de PEG e amplicons foram transferidos para microtubos (1,5 mL), homogeneizados e incubados (37 ° C por 15 min). A mistura foi então centrifugada (15 min a 6.000 rpm), o sobrenadante foi descartado, o precipitado foi lavado duas vezes com etanol a 70% e ressuspenso em água. A reação de sequenciamento foi realizada usando o kit BigDye® (Applied Biosystems). A sequência foi realizada no analisador genético Seq 3130 (Applied Biosystems) as quais foram comparadas com as depositadas no GenBank (base de dados que incorpora sequências de DNA de todas as fontes públicas disponíveis) (Tabela 2).

Riqueza, diversidade e equitabilidade da comunidade de fungos

O número de indivíduos foi determinado em cada amostra de madeira pela presença ou ausência de um táxon. Neste estudo, um indivíduo foi quantificado em uma base por substrato. No entanto, vários táxons geralmente foram encontrados para colonizar substratos individuais. Foram calculados para cada lago estudado: Frequência, riqueza (número de espécies), diversidade alfa (α) e similaridade para cada ambiente. Para caracterizar a diversidade da comunidade de fungos, foi empregado o índice de diversidade de Shannon-Weaver (H') [34]. Este índice descreve a diversidade com um valor mais alto, significando maior heterogeneidade e maior diversidade. A fórmula abaixo foi usada para realizar estes cálculos:

H’= - Σ (pi)*( log2 pi ) Onde pin= ni/N ni= é o número individual do i-ésimo táxon; N= o número individual de todos os táxons. 49

Além disso, para interpretar o índice de Shannon-Weaver, o índice de equitabilidade (E) foi calculado. Este índice representa a uniformidade do número de indivíduo por taxa. A equitabilidade tende a 0 quando um táxon domina a comunidade, e se aproxima de 1, quando todos os táxons têm a mesma abundância. O índice é expresso pela seguinte formula:

E = H ' ln S Onde: H’ = é o índice de Shannon-Weaver Index baseado no número de indivíduos e S = é o número de táxon presente na amostra. Para avaliar as diferenças nas comunidades de fungos nos dois lagos estudados, a similaridade foi calculada usando o índice de Sørensen (S ') com valores variando de 0 (sem similaridade) a um (semelhança absoluta). Isso foi calculado usando a seguinte fórmula: S’ = ___2c____ a+b

Onde: a = é o número total de táxons coletados no Lago Juá b = é o número de táxons coletado no Lago Maicá c = é o número de táxons comuns em ambos os lagos Para determinar se o tamanho da amostra foi suficiente para descrever a diversidade dos locais de coleta, a curva de acumulação dos táxons encontrados nas amostras de madeira submersa decomposta nos dois lagos em estudo, foi analisada pela razão entre o número de novos táxons. e o número de amostras de madeira. A curva permitiu avaliar, se o esforço amostral realizado, foi significativo para descrever a diversidade. As analises estatísticas foram executadas utilizando o programa PAST versão 3.2 [35].

RESULTADOS

Características físico-químicas da água dos lagos Os valores dos parâmetros físico-químicos aferidos no momento da coleta em cada ambiente aquático estudado, estão listados na Tabela 1.

Tabela 1. Caracterização dos parâmetros físico-químicos da água do Lago Juá e Maicá no momento da coleta das amostras de madeira, Santarém, Pará-Brasil. Parâmetros Lago Juá Lago Maicá pH 4.9±0.2 6.7±0.2 Condutividade elétrica (µS) 9.3±0.2 42±0.2 Temperatura da água (ºC) 30±0.1 30±0.1

Total O2 (mg/L) 7.8±0.1 6.5±0.1 Turbidez (NTU) 30±0.1 26.9±0.1

Tamanho amostral

As curvas de acumulação obtidas para as amostras dos Lagos Juá e Maicá mostram que o número de táxons não atingiu a assíntota, sugerindo que não foi possível coletar adequadamente as espécies fúngicas de água doce (Figura 3) e que coletas adicionais podem ser necessárias.

Identificação dos fungos

Foram identificados morfologicamente, 23 táxons diferentes no Lago Juá, sendo 43,5% (n = 10) sexuais (5 Dotideomicetos e 5 Sordariomicetos) e 56,5% (n = 13) assexuados. No Lago Maicá, 26 táxons foram identificados morfologicamente, dos quais 65,4% (n = 17) eram sexuais (4 dotideomicetos e 13 sordariomicetos) e 34,6% (n = 9) eram assexuais. Realizamos estudos de análise de DNA com apenas 14 táxons (Tabela 2) pois, não foi possível investigar todos os táxons devido a maioria deles serem fungos não cultiváveis, não permitindo assim a extração de DNA. Os dados da sequência ITS foram obtidos com sucesso e utilizados para corroborar a identificação morfológica (Tabela 3). 51

Tabela 2. Código de cepas fúngicas e similaridade (ITS Barcode) de 14 táxons isolados de amostras de madeira submersa coletadas nos Lagos Juá e Maicá, Santarém, Pará, Brasil Código Táxons Nº de acesso Similaridade MT017512 Pseudallescheria boydii KJ653823.1 100% MT017513 Curvularia clavata MF038179.1 99,15% MT017519 Curvularia clavata MF038179.1 100% MT017518 Curvularia petersonii NR_158448.1 97,15% MT017514 Cladosporium holotolerans MN826823.1 97,84% MT017515 Simplicidiella nigra NR_164383.1 91,3% MT017516 Jattaea sp. KT823783.1 90,46% MT017517 Jattaea sp. EU770223.1 90,32% MT017520 Bionectria sp. GU827483.1 99,41% MT017523 Gonytrichum macroladum MH857954.1 98,34% MT017524 Fusarium solani JN882257.1 99,12% MT017525 Helicascus thalassioideus KP637162.1 90,02% MT017522 Cladophialophora saturnica NR_111278.1 99,46% MT017521 Calosphaeriales sp. KR817246.1 99,04%

Tabela 3. Frequência dos táxons observada em amostras de madeira submersa coletadas nos Lagos Juá e Maicá, Santarém, Pará, Brasil. Lago Juá Lago Maicá

Táxons FRE FRE FAB FAB (%) (%)

Xylomyces giganteus Goh, W.H. Ho, K.D. Hyde & K.M. Tsui 18 15 0 0

Pseudoxylomyces elegans (Goh, W.H. Ho, K.D. Hyde & K.M. Tsui), 13 11 0 0 Kaz. Tanaka & Hiray

Teratosphaeriaceae MT017518** 11 9 0 0 Pleosporaceae MT017518** 11 9 0 0 Fluviatispora sp. 11 9 0 0

Cancellidium applanatum Tubaki 9 7 1 1 Cumulospora sp.* 7 6 0 0 Cordana terrestres (Timonin) M. Hern.-Rest., Gené & Guarro 7 6 0 0 Chloridium sp. 5 4 5 6 Lasiosphaeria sp. 4 3 0 0 Jobellisia sp.* 4 3 0 0

Aquaticola sp. 3 2 6 7 Taeniolella sp.* 3 2 2 2 Morosphaeriaceae MT017525 ** 2 2 6 7 Microascaceae MT017512 ** 2 2 0 0 Diaporthales sp.1 MT017516; MT017517 ** 2 2 0 0 Gonytrichum sp. MT017523* ** 2 2 0 0 Monodictys sp. 2 2 0 0 Unidentified Pleosporales 3 1 1 5 6 Acrogenospora sphaerocephala, (Berk. & Broome) M.B. Ellis 1 1 1 1 Cladophialophora sp. MT017522** 1 1 0 0 Curvularia sp. MT017513; MT017519 ** B.L. Jain 1 1 1 1 Stilbella sp.* 1 1 0 0 Dothideomycetes sp. 0 0 3 4 52

Dothideomycetes sp.1 0 0 3 4 Thielavia sp.* 0 0 9 11 Longicollum biappendiculatum Zelski, F.R. Barbosa, Raja, A.N. Mill & 0 0 7 8 Shearer Submersisphaeria sp. 0 0 6 7 Annulatascus - like sp. 0 0 5 6 Savoryellales sp. 0 0 3 4 Aniptodera sp. 0 0 2 2 Pseudohalonectria - like sp.* 0 0 2 2 Annulatascaceae - like sp. 0 0 2 2 Ophioceras - like sp.* 0 0 2 2 Sordariomycete sp. MT017521** 0 0 2 2 Nectriaceae sp.2 MT017520** 0 0 2 2 Cladosporiaceae MT017514** 0 0 2 2 Nectriaceae MT017524** 0 0 1 1 Potamomyces armatisporus K.D. Hyde 0 0 2 2 Helicosporium sp. 0 0 1 1 Sporoschisma sp. 0 0 3 4 TOTAL 121 100 84 100 *Primeiros registros para a Amazônia brasileira. BAR: frequência absoluta; FRE: frequência relativa. ** Sequências obtidas ITS.

Riqueza, diversidade e equitabilidade

No lago Juá, os índices de diversidade (H ') e equitabilidade (E) atingiram 2,65 e 0,616255, respectivamente. Nesse período, os cinco táxons mais frequentes foram Xylomyces giganteus (18%), Pseudoxylomyces elegans (11%), Pleosporaceae

MT017518, Fluviatispora sp. e Teratosphaeriaceae MT017515 (9%). No Lago Maicá, os índices de diversidade e equitabilidade alcançaram 2,82 e 0,643588 respectivamente. Neste lago, os táxons mais frequentes foram Thielavia sp. (11%), Longicollum biappendiculatum (8%), Submersisphaeria sp., Aquaticola sp. e Morosphaeriaceae MT017515 (7%). O índice de Sørensen das comunidades de fungos entre os dois lagos estudados foram 0.3673. Oito táxons foram comuns aos dois ambientes. Informações sobre a riqueza, diversidade e equitabilidade dos táxons observadas nos dois lagos são descritas na Tabela 4. Tabela 4. Composição e diversidade (índices: H, E e S) da comunidade de fungos presentes em amostras dos Lagos Juá e Maicá, Santarém, Pará, Brasil. Lago Juá Lago Maicá Amostragem Outubro 2017 Novembro 2017 Tamanho da Amostra 30 30 Número de Ascomicetos 51 67 (sexual) 53

Número de Ascomicetos 70 14 (assexual) Média do número de táxons 4.0 2.8 por amostra Táxons únicos 15 18 Sobreposição em ambos os 8 lagos Cinco táxons mais comuns Xylomyces giganteus 18 Thielavia sp. 9 (11%); (18%); Pseudoxylomyces elegans Longicollum 13 (11%); biappendiculatum, 7 (8%); Pleosporaceae MT017518 Submersisphaeria sp., 11 (9%), Fluviatispora sp. 11 (9%) Aquaticola sp., Teratosphaeriacea Morosphaeriaceae MT017525 MT017515 11 (9%). 6 (7%) Riqueza de espécies (R) 23 26 Shannon-Weaver (H’) 2.65 2.82 Equitabilidade (E) 0.616255 0.643588 Sørensen (S’) 0.3673

DISCUSSÃO

Na presente pesquisa, descrevemos a diversidade de fungos associados à decomposição da madeira em lagos pertencentes ao rio Tapajós (Pará-Brasil). Este é um estudo importante, pois é o primeiro a descrever a diversidade desses organismos nos lagos da região do rio Tapajós. Nas condições experimentais, ambos os lagos apresentaram alta diversidade e poucas similaridades entre os táxons. O lago Juá apresentou baixo pH (4,9 ± 0,2) e baixa condutividade elétrica (9,3 ± 0,2 μS). Os resultados destes parâmetros já era esperado, pois o lago Juá recebe influências do rio Tapajós [15, 36]. Sua turbidez foi de 30 ± 0,1 NTU, talvez devido à interferência direta de ações antrópicas, como a disposição de águas residuais em decorrência à proximidade com a área urbana de Santarém. O Lago Maicá apresentou pH neutro (6,7 ± 0,2) e alta condutividade elétrica (42 ± 0.2 μS). Esses valores podem ser atribuídos à influência do rio Amazonas durante a estação das cheias [14]. Este rio, possui pH alcalino, alta condutividade elétrica e alta turbidez devido à grande quantidade de sedimentos provenientes das regiões Andinas [15, 16]. Ressalta-se que é importante conhecer as características da água nos estudos de diversidade de fungos aquáticos, pois estudos anteriores, demonstraram que fatores como pH, nutrientes, tipo de substrato, 54 geomorfologia dos rios e sazonalidade, podem afetar as comunidades de fungos em ambientes aquáticos. [37-39]. A curva de acumulação não apresentou estabilidade após a coleta de 20 a 25 amostras de cada lago estudado (Juá e Maicá, respectivamente), sugerindo que coletas adicionais podem ser necessárias, porém permitiu acessar uma estimativa da diversidade local. Luo et al. [40] coletaram 100 amostras de grama e bambu do Lago Dianchi, na Tailândia, durante quatro eventos de amostragem durante um período de um ano e alcançou assíntota em 50 e 70 amostras. Hu et al. [41] coletaram 100 amostras de um lago represado e 90 amostras em um riacho, obtendo a estabilização da curva em 60 e 80 amostras, respectivamente. Cortez [28] coletou 60 fragmentos de madeira submersa em um lago na região de Iranduba (Amazonas, Brasil) em dois períodos do ciclo sazonal, obtendo um platô de espécies em 15 amostras coletadas no período não chuvoso. Neste estudo, 30 amostras por lago foram suficientes para se aproximar de um platô para a diversidade local. Nos lagos Juá e Maicá, observou-se 23 e 26 táxons, respectivamente. O número de táxons únicos foi de 15 e 18 no lago Juá e Maicá, respectivamente (Tabela 3). Esses resultados são semelhantes aos observados por Cortez [28], que identificou 25 táxons em um lago de águas negras no estado do Amazonas. Quando comparado a outros trabalhos [41-43], o número total de táxons neste estudo foi menor. Este resultado pode estar relacionado a diferenças no número de amostras por período, na quantidade de coletas realizadas e nos tipos de ambientes estudados. Além disso, estudos anteriores afirmaram que fatores físico-químicos da água desempenham um papel importante na riqueza de ascomicetos presentes na água doce e podem ser um interferente nesses lagos [44]. O lago Juá apresentou maior riqueza de fungos assexuais (56,5%) e Maicá de fungos sexuais (65,4%). No lago Juá, estes resultados podem estar relacionados à influência de um riacho que drena para esse ambiente, aumentando a frequência desse táxon no lago [45,46]. No lago Maicá, a riqueza de espécies sexuais foi maior. Esses resultados se assemelham aos relatados por Hu et al. [41], que encontraram maior riqueza de ascomicetos sexuais em um ambiente lêntico. Cortez [28], também encontrou resultados semelhantes e atribuiu esses resultados à ação pluviométrica, pois neste trabalho ela afirma que a água da chuva pode transportar fungos do solo ou da vegetação para o lago. Os cinco táxons mais frequentes no Lago Juá foram Pseudoxylomyces elegans, Xylomyces giganteus, Pleosporaceae MT017518, Fluviatispora sp., e Teratosphaeriaceae 55

MT017515. No Lago Maicá, os cinco táxons mais frequentes foram Thielavia sp., Longicollum biappendiculatum, Submersisphaeria sp., Aquaticola sp., e Morosphaeriaceae MT017525. Aquaticola sp. e Longicollum biappendiculatum foram os táxons mais frequentes descritos por Cortez [28]. Abdel-Aziz [43] em um estudo sobre hastes submersas de Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud, listou sete espécies comuns neste estudo (Aniptodera sp., Annulatascus-like, Aquaticola sp., Ophioceras sp., Pseudohalonectria sp., Thielavia sp., e Monodictys-like). Raja et al. [42], em ambientes de água doce da Península da Flórida, compartilharam cinco gêneros (Aniptodera, Ophioceras., Submersisphaeria, Fluviatispora e Longicollum). Observou-se que esses táxons ocorreram em ambientes lênticos e lóticos. De acordo com Shearer et al. [24], a composição de espécies de ascomicetos de água doce é semelhante entre a Flórida, a América do Sul tropical (Peru) e o Sudeste Asiático. A espécie Cancellidium applanatum, encontrada nos lagos Juá e Maicá, também foi relatada por Zelski et al. [22] em uma pesquisa com ascomicetos presentes em madeira submersa em habitats de água doce no Peru. Esta espécie é considerada generalista e pode ocorrer em substratos herbáceos e lenhosos de habitats lóticos e lênticos. Assim como Monodictys sp., esta espécie pode ser considerada resistente a períodos secos [47], e sua presença não é surpreendente, considerando que o lago Juá também passa por períodos consideráveis de seca. Além destes táxons, também relata-se a presença de Acrogenospora sphaerocephala a qual foi recentemente descrita sobre material foliar em rios e córregos no bioma Caatinga, bem como em madeira submersa em um lago em Manaus, Amazonas [5, 28]. Contudo, nove táxons foram identificados como novos registros para a Amazônia brasileira, como apresentado na Tabela 2. O Lagos Juá e Maicá apresentaram índices de diversidade de H’ = 2.65 e 2.82, respectivamente. Hu et al. [41] compararam um lago artificial e um córrego na Tailândia, obtendo índices de diversidade de 2,34 e 3,68, respectivamente, indicando que fatores como a composição da floresta ripária, represamento de rios e ações antropogênicas podem afetar a comunidade e a diversidade de fungos em habitats de água doce. Cortez [28] estudaram a diversidade em um lago no estado do Amazonas, fazendo comparações sazonais e obtendo índices de 2,60 na estação chuvosa e 2,13 na estação não chuvosa. Este estudo inferiu que a sazonalidade pode afetar a diversidade de fungos. No Nilo, Abdel-Aziz [43] também realizaram comparações sazonais, com índices de 3,08 e 2,44 para inverno e verão, respectivamente. Hyde et al. [48] enfatizou que o número de táxons 56 por amostra de madeira é maior nos trópicos do que nos habitats temperados. De acordo com Graça et al. [49], a variação nas baixas taxas de diversidade em áreas tropicais e subtropicais pode estar relacionada a questões ecológicas e metodológicas. Os índices de diversidade do presente trabalho são semelhantes aos encontrados em outros ambientes lênticos (média ~ 2,8) e corroboram a afirmação de que a diversidade em ambientes lóticos é maior (média ~ 4.60) [41, 50-52]. O índice de similaridade de Sørensen (0.3673) revelou baixa similaridade entre os lagos estudados. Isso pode ser devido às diferenças estruturais e físico-químicas encontradas durante o estudo, responsáveis pela composição da micota nos ecossistemas aquáticos. [37, 38, 53]. De acordo com Leff [54], a composição microbiana é afetada nos córregos e rios pelo fluxo unidirecional da água (que é refletido nas estratégias de vida dos organismos), mistura e aeração da água e pela importância de materiais alóctones. Estudos sobre fungos que decompõem madeira submersa em ambientes aquáticos na região amazônica são incipientes. Assim, o presente trabalho foi motivado a contribuir para o conhecimento da diversidade de fungos aquáticos na região oeste do Pará. Os resultados mostram que, há uma diversidade rica e equilibrada. Este estudo, fornece informações sobre a dinâmica de fungos em habitats de águas claras e indica como a comunidade se distribui em ambos os lagos. Ressalta-se, que mais estudos são necessários para fortalecer essa linha de pesquisa e aumentar as informações disponíveis sobre biogeografia, ecologia e taxonomia de espécies de ascomicetos em água doce na Amazônia brasileira.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Wong, M. K. M., Goh, T. K., Hodgkiss, I. J., Hyde, K. D., Ranghoo, V. M., Tsui, C. K. M., et al., (1998). Role of fungi in freshwater ecosystems. Biodiversity and Conservation, 7(9), 1187–1206. https://doi.org/10.1023/A:1008883716975 2. Jones, E. B. G., & Pang, K. L. (2012). Tropical aquatic fungi. Biodiversity and Conservation, 21(9), 2403–2423. https://doi.org/10.1007/s10531-011-0198-6 3. Grossart, H., & Rojas-jimenez, K. (2016). Aquatic fungi : targeting the forgotten in microbial ecology. Current Opinion in Microbiology, 31, 140–145. https://doi.org/10.1016/j.mib.2016.03.016 4. Gulis, V., Kuehn, K., & Suberkropp, K. (2006). The role of fungi in carbon and nitrogen cycles in freshwater ecosystems. In G. M. Gadd (ed.), Fungi in 57

biogeochemical cycles. Cambridge University Press, pp 404–435. 5. Barbosa, F. R., Raja, H. A., Shearer, C. A., & Gusmão, L. F. P. (2013). Some freshwater fungi from the Brazilian semi-arid region, including two new species of hyphomycetes. Cryptogamie, Mycologie, 34(3), 243–258. https://doi.org/10.7872/crym.v34.iss2.2013.243 6. Fiuza, P. O., Costa, L. A., Medeiros, A. O., Gulis, V., Fernando, L., & Gusmão, P. (2019). Diversity of freshwater hyphomycetes associated with leaf litter of Calophyllum brasiliense in streams of the semiarid region of Brazil. Mycological Progress, 18, 907–920. https://doi.org/https://doi.org/10.1007/s11557-019-01501-6 7. Blackwell, M. (2011). The fungi: 1, 2, 3 ... 5.1 million species? American Journal of Botany, 98(3), 426–438. https://doi.org/10.3732/ajb.1000298 8. Liu, X., Udayanga, D., Luo, Z., Chen, L., Zhou, D., Su, H. Y., & Hyde, K. D. (2015). Backbone tree for Chaetothyriales with four new species of Minimelanolocus from aquatic habitats. Fungal Biology, 119(11), 1046–1062. https://doi.org/10.1016/j.funbio.2015.08.005 9. Swe, A., Jeewon, R., Pointing, S. B., & Hyde, K. D. (2009). Diversity and abundance of nematode-trapping fungi from decaying litter in terrestrial , freshwater and mangrove habitats. Biodiversity and Conservation, 1695–1714. https://doi.org/10.1007/s10531-008-9553-7 10. Shearer, C. A., & Raja, H. A. (2010). Freshwater Ascomycetes. Retrieved April 16, 2019, from http://fungi.life.illinois.edu/ 11. Hongsanan, S., Maharachchikumbura, S. S. N., & Hyde, K. D. (2017). An updated phylogeny of Sordariomycetes based on phylogenetic and molecular clock evidence. Fungal Diversity, 84(3), 25–41. https://doi.org/10.1007/s13225-017-0384-2 12. Zhang, H., Dong, W., Hyde, K. D., Maharachchikumbura, S. S. N., Hongsanan, S., Bhat, D. J., Al-Sadi, A. M. (2017). Towards a natural classification of Annulatascaceae-like taxa: introducing Atractosporales ord. nov. and six new families. Fungal Diversity, Fungal Diversity, 85(1), 75–110. https://doi.org/10.1007/s13225-017-0387-z 13. Aprile, F., Darwich, A. J., Siqueira, G. W., & Santos, F. R. R. (2013). Application of hydrological and limnological studies on building model for water circulation of meromictic black water lakes at the central. International Research Journal of Environment Sciences, 2(7), 58–63. https://doi.org/2319-1414 14. Sioli, H. (1983). The Amazon: limnology and landscape ecology of a migth tropical river and it’s basin. Monographie Biologicae, Springer Science & Business Media 58

ed., (Vol. 56). Local: xx. https://doi.org/10.1007/978-94-009-6542-3 15. Konhauser, K. O., Fyfe, W. S., & Kronberg, B. I. (1994). Multi-element chemistry of some Amazonian waters and soils. Chemical Geology, 111(1–4), 155–175. 16. Aucour, A., Tao, F., Moreira-turcq, P., & Seyler, P. (2003). The Amazon River: behaviour of metals (Fe, Al, Mn) and dissolved organic matter in the initial mixing at the Rio Negro/Solimões confluence. Chemical Geology, 197, 271–285. https://doi.org/10.1016/S0009-2541(02)00398-4 17. Latrubesse, E. M., Arima, E. Y., Dunne, T., Park, E., Baker, V. R., Horta, F. M., et al., (2017). Damming the rivers of the Amazon basin. Nature Publishing Group, 546(7658), 363–369. https://doi.org/10.1038/nature22333 18. Chauvet, E., Cornut, J., Sridhar, K. R., Selosse, M.-A., & Bärlocher, F. (2016). Beyond the water column : aquatic hyphomycetes outside their preferred habitat. Fungal Ecology, 19, 112–127. https://doi.org/10.1016/j.funeco.2015.05.014 19. Matsushima, T. (1993). Matsushima Mycological Memoirs (n. 7). Kobe, Japão: Published by the author. 20. Zelski, S. E., Raja, H. A., Miller, A. N., Barbosa, F. R., Gusmão, L. F. P. & Shearer, C. A. (2011). Longicollum biappendiculatum gen. et sp . nov ., a new freshwater ascomycete from the Neotropics. Mycosphere, (2), 539–545. 21. Zelski, S. E., Raja, H. . A., Miller, A. N., & Shearer, C. A. (2011). Chaetorostrum quincemilensis, gen. et sp. nov., a new freshwater ascomycete and its Taeniolella- like anamorph from Peru. Mycosphere, 2(5), 593–600. https://doi.org/10.5943/mycosphere-2-5-9 22. Zelski, S. E., Balto, J. A., Do, C., Raja, H. A., Miller, A. N., & Shearer, C. A. (2014). Phylogeny and morphology of dematiaceous freshwater microfungi from Peru. IMA Fungus, 5(2), 425–438. https://doi.org/10.5598/imafungus.2014.05.02.07 23. Zelski, S. E., Raja, H. A., Miller, A. N., & Shearer, C. A. (2015). Conioscypha peruviana sp. nov., its phylogenetic placement based on 28S rRNA gene, and a report of Conioscypha gracilis comb. nov. from Peru. Mycoscience, 56(3), 319–325. https://doi.org/10.1016/j.myc.2014.09.002 24. Shearer, C. A., Zelski, S. E., Raja, H. A., Schmit, J. P., Miller, A. N., & Janovec, J. P. (2015). Distributional patterns of freshwater ascomycetes communities along an Andes to Amazon elevational gradient in Peru. Biodiversity and Conservation, 24(8), 1877–1897. https://doi.org/10.1007/s10531-015-0911-y 25. Santos, R.F., Sotão, H.M.P., Monteiro, J.S., Gusmão, L.F.P., Gutiérrez, A.H., 2018. 59

Conidial fungi associated with leaf litter of red cedar (Cedrela odorata) in Belém, Pará (eastern Brazilian Amazon). Acta Amazonica, 48(3), 230–238. https://doi.org/10.1590/1809-4392201704411 26. Monteiro, J. S., & Gusmão, L. F. P. (2013). An emendation of Fusticeps and two new species from the Brazilian Amazon Forest. Mycotaxon, 123(1), 431–437. https://doi.org/10.5248/123.431 27. Fiuza, P. O., de Paiva Ottoni-Boldrini, B. M., Monteiro, J. S., Catena, N. R., Hamada, N., & Gusmão, L. F. P. (2015). First records of Ingoldian fungi from the Brazilian Amazon. Brazilian Journal of Botany, 38(3), 615–621. https://doi.org/10.1007/s40415- 015-0157-7 28. Cortez, A. C. A. (2016). Influência da sazonalidade e do modo de coleta na diversidade de fungos decompositores de madeira submersa de ambientes aquáticos da região amazônica (Tese de doutorado), Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brasil. https://tede.ufam.edu.br/bitstream/tede/5632/5/Tese%20- %20Ana%20Claudia%20A.%20Cortez.pdf 29. Cai, L., Hyde, K.D., Tsui, C. K. M. (2006). Genera of Freshwater Fungi. 1st ed. Hyde, KD, editor. The University of Hong Kong: Fungal diversity Press. 30. Seifert, K., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. (2011). The genera of hyphomycetes. Persoonia, 27, 119–129. http://dx.doi.org/10.3767/003158511X617435 31. Ferrer, C., F. Colom, S. Frasés, E. Mulet, J. L. Abad, & J. L. Alió. (2001). Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S ribosomal DNA typing in ocular infections. Journal of Clinical Microbiology 39, 2873-2879. https://doi.org/10.1128/JCM.39.8.2873-2879.2001 32. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., & Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In N. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky, & T. White (Eds.), PCR Protocols: A guide to methods and applications (pp. 315–322). New York: Academic Press. 33. Dunn, I. S., & Blattner, F. R. (1987). Charons 36 to 40: multi enzyme, high capacity, recombination deficient replacement vectors with polylinkers and polystuffers. Nucleic Acids Research, 15(6), 2677–2698. 34. Krebs, C. J. (1989). Ecological Methodology. In: University of British Columbia (Ed.), (2rd.) Harper & Row, New York. 60

35. Hammer, O., Harper, D. A. T., & Ryan, P. D. (2001). PAST : Paleontological statistics software package for education and data analysis. Paleontologia Electronica, 4(1), 1–9. 36. Duncan, W. P., & Fernandes, M. N. (2010). Physiochemical characterization of the white, black, and clearwater rivers of the Amazon Basin and its implications on the distribution of freshwater stingrays (Chondrichthyes, Potamotrygonidae). Pan- American Journal of Aquatic Sciences, 5(3), 454–464. 37. Duarte, S., Bärlocher, F., Trabulo, J., & Cássio, F. (2014). Stream-dwelling fungal decomposer communities along a gradient of eutrophication unraveled by 454 pyrosequencing. Fungal Diversity, 70(1), 127–148. https://doi.org/10.1007/s13225- 014-0300-y 38. Heino, J., Tolkkinen, M., Pirttil, A. M., & Aisala, H. (2014). Microbial diversity and community – environment relationships in boreal streams. Biogeography, 41(12), 2234–2244. https://doi.org/10.1111/jbi.12369 39. Song, P., Tanabe, S., Yi, R., Kagami, M., Liu, X., & Ban, S. (2018). Fungal community structure at pelagic and littoral sites in Lake Biwa determined with high- throughput sequencing. Limnology, 19(2), 241–251. https://doi.org/10.1007/s10201- 017-0537-8 40. Luo, J., Yin, J. F., Cai, L., Zhang, K. Q., & Hyde, K. D. (2004). Freshwater fungi in Lake Dianchi, a heavily polluted lake in Yunnan, China. Fungal Diversity, 16, 93– 112. 41. Hu, D. M., Cai, L., Chen, H., Bahkali, A. H., & Hyde, K. D. (2010). Fungal diversity on submerged wood in a tropical stream and an artificial lake. Biodiversity and Conservation, 19(13), 3799–3808. https://doi.org/10.1007/s10531-010-9927-5 42. Raja, H. a., Schmit, J. P., & Shearer, C. A. (2009). Latitudinal, habitat and substrate distribution patterns of freshwater ascomycetes in the Florida Peninsula. Biodiversity and Conservation, 18(2), 419–455. https://doi.org/10.1007/s10531-008-9500-7 43. Abdel-Aziz, F. A. (2016). Freshwater fungi from the River Nile, Egypt. Mycosphere, 7(5), 741–756. https://doi.org/10.5943/mycosphere/7/6/4 44. Graça, M. A. S., Ferreira, V., Canhoto, C., Encalada, A. C., Guerrero-Bolaño, F., Wantzen, K. M., & Boyero, L. (2015). A conceptual model of litter breakdown in low order streams. International Review of Hydrobiology, 100(1), 1–12. https://doi.org/10.1002/iroh.201401757 45. Bärloche, F. and Kendrick, B. (1974). Dynamics of the fungal popula- tion on leaves 61

in a stream. Journal ofEcology, 62(3): 761–79. 46. Webster, J.; Descals, E. (1981). Morphology, distribution and ecology of conidial fungi in freshwater habitats. In: Dekker M (ed) Biology of Conidial Fungi,vol. 1, pp. 459–468. New York: Academic Press. 47. Hyde, K. D., Fryar, S., Tian, Q., Bahkali, A. H., & Xu, J. (2016). Lignicolous freshwater fungi along a north e south latitudinal gradient in the Asian / Australian region; can we predict the impact of global warming on biodiversity and function ? Fungal Ecology, 19, 190–200. https://doi.org/10.1016/j.funeco.2015.07.002 48. Hyde, K. D., Hongsanan, S., Jeewon, R., Bhat, D. J., McKenzie, E. H. C., Jones, E. B. G.,et al., (2016). Fungal diversity notes 367–490: taxonomic and phylogenetic contributions to fungal taxa. Fungal Diversity, 80(1), 1–270. https://doi.org/10.1007/s13225-016-0373-x 49. Graça, M. A. S., Hyde, K., & Chauvet, E. (2016). Aquatic hyphomycetes and litter decomposition in tropical - subtropical low order streams. Fungal Ecology, 19, 182– 189. https://doi.org/10.1016/j.funeco.2015.08.001 50. Hyde, Kevin D; Goh, T. K. (1998). Fungi on submerged wood in Lake Barrine , north Queensland , 102(6), 739–749. 51. Goh, T. K., & Hyde, K. D. (1999). Fungi on submerged wood and bamboo in the Plover Cove. Fungal Diversity, 3, 57–85. 52. Ho, W. H., Hyde, K. D., & Hodgkiss, I. J. (2001). Fungal communities on submerged wood from streams in Brunei, Hong Kong , and Malaysia. The British Mycological Society, 105(12), 1492–1501. https://doi.org/10.1017?S095375620100507X 53. Wurzbacher, C., Rösel, S., Rychła, A., & Grossart, H. P. (2014). Importance of saprotrophic freshwater fungi for pollen degradation. Plos One, 9(4), 1–12. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094643 54. Leff, L. G. (2019). Freshwater Habitats. Encyclopedia of Microbiology, 4e, 1-4. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-809633-8.90678-2 1 62

7. CAPÍTULO 2 - ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE FUNGOS ISOLADOS DE MADEIRA SUBMERSA EM DECOMPOSIÇÃO NOS LAGOS JUÁ E MAICÁ (PARÁ-BRASIL).

Eveleise Samira Martins Canto 1, Ana Cláudia Alves Cortez 2, João Vicente Braga de Souza 2 1 Programa de Pós-Graduação da Rede de Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal—BIONORTE, Manaus, Amazonas, Brasil. Universidade Federal do Oeste do Pará, UFOPA, Santarém, Pará Brasil. 2 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, INPA, Laboratório de Micologia, Manaus, Amazonas.

Correspondência a ser endereçada para Eveleise Canto: [email protected]; João V. Souza: [email protected]

RESUMO Ambientes de água doce são locais que abrigam uma vasta diversidade microbiana que ainda é inexplorada, principalmente quando se refere aos fungos aquáticos decompositores de madeira submersa. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi investigar antimicrobianos produzidos por fungos decompositores de madeira submersa em lagos da Amazônia brasileira. Os fungos obtidos de fragmentos de madeira submersa em dois lagos, Juá e Maicá no Oeste do Pará, foram submetidos a bioprocessos e os filtrados de cultura foram avaliados quanto a atividade antimicrobiana frente as cepas S. aureus (MRSA) ATCC 43300, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 e E. coli (ESBL). A citotoxicidade do extrato foi avaliada frente a linhagem MRC-5 de fibroblastos humanos em ensaio de dose-resposta. Os filtrados de cultura dos isolados Fluviatispora C34, Morosphaeriaceae C18, Monodictys C15 e Fusarium C12 apresentaram atividade antibacteriana e especificamente o extrato bruto do isolado Fusarium C12 destacou-se apresentando CIM de 50 µg/mL frente as cepas S. aureus. A citotoxicidade dos extratos brutos, Morosphaeriaceae C18 apresentou CI50% superior a 50 µg/mL não sendo tóxico e Fusarium C12 apresentou de 34,521 µg/mL. Portanto, o presente trabalho, demonstrou que os fungos decompositores de madeira submersa possuem capacidade de produzir substâncias com ação antibacteriana, sugerindo que esses podem ser uma fonte promissora de novas substâncias bioativas de importância farmacêutica.

Palavras-chave: Metabólitos secundários, decompositores de madeira, antimicrobianos.

INTRODUÇÃO

O compromisso político de combater a resistência antimicrobiana aumentou significativamente nos últimos anos, nos níveis global, regional e nacional (1). O surgimento de cepas de patógenos resistentes a fármacos tradicionais, se intensificou devido ao uso indiscriminado de antimicrobianos tanto nos setores agroindustrial, quanto na medicina humana (2–4). Principalmente para a saúde humana, surgem infecções difíceis de obter tratamento devido as cepas microbianas resistentes a vários medicamentos tradicionais, como Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE), Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina e Enterobacteriaceae produtoras de beta-lactamases (5). A resistência microbiana surge dentro de um organismo através de processos evolutivos, pois os microrganismos desenvolveram mecanismos genéticos robustos que impedem sua destruição (6). Um exemplo de resistência microbiana que teve um efeito severo na saúde humana, foi a desenvolvida por bactérias produtoras da enzima beta-lactamases, que tem como alvo os anéis beta-lactâmicos de fármacos antimicrobianos. Esses anéis estão presentes nos antibióticos os quais apresentam baixa toxicidade e são usados para tratar uma ampla variedade de infecções (5). Com isso, a busca alternativa de novas substâncias de origem microbiana com atividade biológica, tem se tornado alvos de vários estudos. Bactérias, actinobactérias e fungos ascomicetos, são potenciais produtores de substâncias com atividade biológica (7). Estas substâncias, consideradas metabólitos secundários, são produzidas por microrganismos em respostas às condições ambientais (8), possuem atividade biológicas de relevantes interesses farmacêuticos tais como anti-inflamatórias, anticâncer, antioxidantes e antimicrobiana (8–11). Os fungos destacam-se como um dos principais organismos produtores de antibióticos e um dos grupo mais diversificado (12). O número total de produtos fúngicos bioativos é de aproximadamente 8.600, representando 38% de todos os produtos microbianos (7). Segundo Lal et al. (13) estão entre as espécies de fungos os ascomicetos e os fungos imperfeitos, considerados os produtores mais frequentes com cerca de 6.400 substâncias produzidas. Dentre estes ascomicetos, estão os mais comuns com suas substâncias isoladas: Aspergillus (950), Penicillium (900) e Fusarium (350). Além deles, várias outras espécies filamentosas e endofíticas (Trichoderma, Phoma, Alternaria, 64

Acremonium e Stachybotrys) também são bons produtores, cada uma com várias centenas de substâncias bioativas. A composição e a colonização de fungos na madeira em decomposição em ambientes de água doce, pode ser influenciada por interações competitivas entre espécies de fungos (14) e até mesmo entre procariotos (15,16). Esta competição, estimula a produção de substâncias com propriedades antagônicas, que podem ser importantes para os estágios de colonização microbiana e também alvo para pesquisas de compostos naturais (17,18). Vários estudos apresentaram a importâncias de fungos de água doce na produção de antimicrobianos como Quinaphthin (Helicoon richonis), Anguillosporal (Anguillospora longíssima) substâncias bioativas variadas de Kirschsteiniothelia, Massarilactonas A e B (Massarina tunicata) (19–22). Estudos relacionados a fungos de água doce com potencial biotecnológico ainda são incipientes na região amazônica e o presente trabalho é pioneiro em realizar esta investigação. Portanto, o objetivo da presente pesquisa, foi investigar antimicrobianos produzidos por fungos decompositores de madeira submersa provenientes de lagos da Amazônia brasileira.

MATERIAIS E MÉTODOS

Isolados fúngicos

Um total de 40 cultura fúngicas obtidas de fragmentos de madeira submersa em dois lagos, Juá e Maicá no Oeste do Pará, foram utilizadas no bioprocesso para obtenção de antimicrobianos. Algumas culturas de fungos selecionadas para o bioprocesso estão representadas na Figura 1.

Figura 1. Morfologia das culturas dos fungos decompositores isolados de madeira submersa nos lagos Juá e Maicá, Pará-Brasil.

Cepas padrão

Foram utilizadas cepas bacterianas Gram positivas S. aureus ATCC 43300 (MRSA), S. aureus ATCC 25923 e Gram negativas E. coli ATCC 25922 e E. coli (ESBL) (amostra clínica). Subcultivadas em ágar sangue de carneiro (Biomerieux®) e ágar MacConkey (Biomerieux®) e posteriormente incubadas à temperatura de 35 °C por até 24 horas.

Obtenção dos caldos e preparo dos extratos fúngicos para os testes antimicrobianos

Os isolados fúngicos foram cultivados em placas de Petri contendo BDA (Ágar batata dextrose) em temperatura ambiente por 7 a 10 dias. Os bioprocessos consistiram em cultivos dos fungos em caldo para obtenção de metabólito secundários os quais, foram realizados em triplicata seguindo o protocolo descrito por De Lima et al., (2011) com algumas modificações. Utilizou-se, Erlenmeyer (150 mL) contendo 50 mL de caldo batata dextrose (120 g/L de batata, 10 g/L de dextrose). Esse meio foi inoculado com 1x104 esporos/ml dos fungos e foram incubados em condições estáticas por 14 dias ao abrigo da luz e em temperatura ambiente, somando um volume total de 2,5 L de caldo utilizado. Após esse período, o caldo foi submetido à filtração (filtro qualitativo tipo celulose Whatman n.4) e mantido em congelamento a - 4ºC. Os filtrados foram descongelados em temperatura ambiente e extraídos com à partição líquido/líquido com o solvente acetato de etila (AcOEt) – (SYNTH®) na proporção 1:1 em seguida, o solvente foi submetido ao evaporador rotatório (Fisatom, modelo 550, Brasil) a 60 rpm sob a temperatura de 30 °C e a massa obtida foi diluída em DMSO a 10% na proporção de 3,2 mg/ml.

Determinação da atividade antimicrobiana

Ensaio de difusão em ágar

Os screening para as atividades antimicrobianas foram realizados pelo método de difusão em ágar conforme a CLSI (2012), EUA: norma M02-A11 (Padrões de Desempenho Antimicrobiano para Testes de Sensibilidade em Disco) com adaptações descritas a seguir. Foram feitos poços de 6 mm de diâmetro no meio de cultura ágar 66

Muller Hinton (Kasvi®) em placas de Petri, com o auxílio de uma ponteira de 1000 µL estéril. Para a preparação do inóculo bacteriano com turvação de 0,5 da escala de MacFarland, foi utilizado o espectrofotômetro DensiCHECKTM-plus (Biomerieux®) no comprimento de onda de 625 nm, com absorbância variando entre 0,08 a 0,1 (Organização Pan-americana da Saúde [OPAS]; Agência de Vigilância Sanitária [ANVISA]; Secretaria de Vigilância em Saúde [SVS], 2006). A suspensão padronizada continha aproximadamente 1-2 x 108 UFC/mL. Posteriormente, a suspensão bacteriana foi semeada na superfície do ágar Mueller Hinton (Kasvi®) (4 mm de espessura), com o uso de um swab estéril em três direções distintas. Poços de 6 mm de diâmetro, foram feitos no ágar e adicionadas alíquotas de 100 μL dos extratos acetato de etila. Os ensaios foram feitos em triplicata. Para o controle positivo de formação do halo de inibição, foram utilizados 50 μg/mL de oxacilina para S. aureus ATCC 43300 (MRSA), S. aureus ATCC 25923 e 50 μg/mL de amoxicilina para E. coli ATCC 25922 e E. coli (ESBL) amostra clínica. Para o controle negativo, foi utilizado DMSO a 10%. Após um período de pré-incubação de 2 h à temperatura ambiente, que permite a difusão dos extratos antes do início do desenvolvimento dos microrganismos (29), as placas foram incubadas em aerobiose a 36 ºC por 16-18h. A leitura foi realizada medindo os halos de inibição.

Determinação da concentração inibitória mínima

De acordo com as análises biológicas dos extratos dos fungos, dois isolados foram selecionados para a obtenção de extratos em maior quantidade e a determinação da CIM desses. Os fungos foram submetidos ao bioprocesso na mesma condição descrita no item anterior, no entanto, totalizando 2.500 mL de meio de cultura líquido. Após os bioprocessos, foram realizadas as extrações dos caldos metabólitos como descritos anteriormente e esses foram submetidos a determinação da Concentração inibitória mímina (CIM). A CIM foi determinada utilizando o método de microdiluição, de acordo como descrito pela “Clinical and Laboratory Standards Institute” – CLSI (2012) modificada, EUA: norma M7-A9 (Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição para Bactéria de Crescimento Aeróbico), com as mesmas bactérias utilizadas na técnica de difusão. As soluções estoque dos extratos acetato de etila dos fungos, foram preparadas na concentração inicial de 3,2 mg/mL, dissolvidos em 67

DMSO a 10%. A oxacilina foi controle positivo para as cepas de Staphilococus e amoxicilina para cepas de Escherichia, (ambas com concentração 50 a 0,048 μL/mL). Os extratos de fungos foram utilizados nas concentrações decrescentes que variaram de 1600 a 1,56 μL/mL. Foi adicionado 10 μL de inóculo bacteriano na concentração de 107 UFC/mL. A incubação foi realizada por 16 a 20 horas a 37°C. Os ensaios foram realizados em duplicata e a leitura foi realizada após o período de incubação, mediante composição visual, com o controle de crescimento positivo e revelada com Alamar Blue. Para determinar atividade bactericida ou bacteriostática, o poço que apresentou inibição de crescimento bacteriano foi inoculado em ágar Muller Hinton e incubado a 35ºC por 24 horas. A Figura 2 apresenta a distribuição dos componentes na microplaca de 96 poços. Cada amostra foi testada em duplicata.

Figura 2. Distribuição dos componentes para a realização da CIM do extrato teste em acetato de etila dos isolados fúngicos frente a bactérias patogênicas. Fonte: Adaptado do Laboratório de Micologia do INPA, 2019.

Teste de Citotoxicidade in vitro

Preparo das amostras

Os testes de citotoxicidade foram realizados com as amostras Fusarium C12 e Morosphaeriaceae C18 no Laboratório de Atividade Biológica – BIOPHAR, na Universidade Federal do Amazonas – UFAM. Utilizou-se linhagem celular MRC-5 (fibroblasto de pulmão humano) cultivada em meio de cultivo DMEM alta glicose, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico, mantidas em incubadora de CO2 a 37C e atmosfera contendo 5% de CO2. As amostras foram solubilizadas em solvente DMSO em concentração de 10µg/mL, e para o ensaio as amostras foram diluídas em meio de cultura nas concentrações 50, 20 e 1µg/mL. A concentração final de DMSO não excedeu a 0,2%.

Ensaio de citotoxicidade O bioensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Ahmed e colaboradores (30) com o intuito de analisar a viabilidade celular das células da linhagem MRC-5 na presença de diferentes concentrações das amostras testadas. As células foram cultivadas em garrafa de cultura com meio DMEM alta glicose completo, e para o teste transferidas para placas de 96 poços na concentração celular de 0,5 x 104 células/ poço. A o placa foi então mantida em cultura por 24 horas em incubadora de CO2 a 37 C com atmosfera de 5 % de CO2. Após este tempo, foi adicionada a amostra nas devidas concentrações supramencionadas e a placa permaneceu em cultura por 24 horas nas mesmas condições. O grupo controle negativo recebeu no poço a mesma quantidade de DMSO 0,2% e como controle positivo o fármaco padrão Doxorrubicina nas concentrações de 0.312, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 e 20 µg/mL. Decorrido 24h de tratamento, foi acrescentado dez microlitros da solução de uso de Alamar Blue (solução estoque 0,4% -1:20 em meio de cultura sem soro fetal bovino) em cada poço da placa. Após 3 h de metabolização de exposição ao Alamar Blue, retirando da estufa meia hora antes do término, a fluorescência foi medida usando-se um leitor de microplacas Elisa (marca Beckman e Coulter). Os dados foram analisados em relação ao controle utilizando o Programa de estatística GraphPad Prisma versão 6.0.

RESULTADOS

Bioprocessos foram realizados, com a finalidade de investigar, a produção de metabólitos secundários produzidos por fungos isolados de madeira em decomposição nos lagos Juá e Maicá. Os extratos de todos os isolados dos fungos, foram testados quanto à atividade antimicrobiana pelo método de difusão variante poços. Na Tabela 1, pôde-se observar a porcentagem de caldos de bioprocessos ativos. Quatro extratos (10%) apresentaram atividade antimicrobiana frente a pelo menos um microrganismo, com zonas de inibição que variaram de 8 a 21 mm. Dos 4 extratos testados, verificou-se que todos apresentaram halos de inibição às cepas de E. coli ATCC 25922 sensível e produtoras de beta-lactamases (ESBL) amostra clínica, 2 destes extratos inibiram cepas de S. aureus ATCC 25923 e resistente a meticilina (MRSA). Os extratos dos táxons Fluviatispora C34 e Monodicty C15 apresentaram halos de inibição às cepas E. coli ATCC 25922 sensível e ESBL e os extratos de Morosphaeriaceae C18 e Fusarium LM6281 apresentaram ampla atividade contra as 4 cepas bacterianas testadas.

Tabela 1. Atividade antimicrobiana dos extratos AcOEt dos fungos isolados de madeira submersa em decomposição nos lagos Juá e Maicá, Pará, Brasil. Halo de inibição (mm) dos Antimicrobianos Bactérias Táxons S. aureus E. coli E. coli S. aureus ATCC ATCC ATCC ESBL 43300 (MRSA) 25923 25922 Cepa clínica Acrogenospora sphaerocephala, (Berk. & - - - - Broome) M.B. Ellis C55 Aniptodera C43 - - - - Annulatascaceae-like C44 - - - - Aquaticola C53 - - - - Cancellidium applanatum Tubaki C03 - - - - Chloridium C38 - - - - Cladophialophora C20 - - - - Cladosporiaceae C41 Cordana terrestres (Timonin) M. Hern.- - - - - Rest., Gené & Guarro C17 Cumulospora C60 - - - - Curvularia C02 - - - - Diaporthales C01 - - - - Dothideomycetes C27 - - - - Dothideomycetes C14 - - - - Fluviatispora C34 - - 9 8 Fusarium C12 36 32 21 20 Gonytrichum C16 - - - - Helicosporium C46 - - - - Jobellisia C61 - - - - Lasiosphaeria C62 - - - - 70

Longicollum biappendiculatum Zelski, F.R. Barbosa, Raja, A.N. Mill & Shearer - - - - C63 Microascaceae C64 - - - - Monodictys C15 - - 12 13 Morosphaeriaceae C18 18 14 12 13 Nectriaceae C47 - - - - Ophioceras-like C65 - - - - Pleosporaceae C66 - - - - Potamomyces armatisporus K. D. Hyde - - - - C59 Pseudohalonectria-like C58 - - - - Pseudoxylomyces elegans (Goh, W. H. Ho, K. D. Hyde & K. M. Tsui), Kaz. - - - - Tanaka & Hiray C57 Savoryellales C67 - - - - Sordariomycetes C49 - - - - Sporoschisma C68 - - - - Stilbella C08 - - - - Submersisphaeria C69 - - - - Taeniolella C35 - - - - Teratosphaeriaceae C42 - - - - Thielavia C43 - - - - Unidentified Pleosporales C45 - - - - Xylomyces giganteus Goh, W. H. Ho, K. - - - - D. Hyde & K. M. Tsui C30 23 18 32 30 Controle Positivo (Oxa) (Oxa) (Amo) (Amo) Controle Negativo (DMSO 10%) - - - - TOTAL DE ISOLADOS 40 2 2 4 4

Os extratos AcOEt que apresentaram atividade inibitória no teste preliminar de triagem, foram analisados quanto às suas MICs por métodos de diluição (Tabela 2). O extrato de Fusarium C12 apresentou menor valor de CIM (50 µg/mL) frente as cepas S. aureus ATCC 29923 e ATCC 43300 (MRSA) e CIM de 100 µg/mL frente as cepas de E. coli ATCC 25922 e E. coli (ESBL) cepa clínica.

Tabela 2. Concentração Inibitória Mínima (CIM em μg/mL) do extrato AcOEt dos fungos isolados com atividade antimicrobiana pelo método de microdiluição em caldo e controles positivos com antimicrobianos comerciais. Cepas bacterianas e CIM dos extratos teste (µg/ml) S. aureus ATCC S. aureus ATCC E. coli ATCC E. coli (ESBL) Extratos teste 25923 43300 (MRSA) 25922 Cepa clínica Fusarium 50 µg/mLc 50 µg/mLt 100 µg/mLc 100 µg/mLt C12 Morosphaeriaceae 200 µg/mLt 100 µg/mLt - 200 µg/mLt C18 71

Fluviatispora sp. - - 200 µg/mLc 200 µg/mLt C34 Monodictys sp. 200 µg/mLc 200 µg/mLt 200 µg/mLt 200 µg/mLt C15 Controle positivo 0,1 µg/mL 0,1 µg/mL - - OXA Controle positivo - - 6,25 µg/mL 12,5 µg/mL AMO Controle negativo - - - - DMSO 10% OXA: oxacilina; AMO: amoxicilina; t: bacteriostático; c: bactericida.

Para a avaliação da citotoxicidade in vitro dos dois extratos mais representativos nos testes de atividade antimicrobiana (Fusarium C12 e Morosphaeriaceae C18), determinou-se a viabilidade celular das células da linhagem MRC-5 na presença de diferentes concentrações das amostras testada, após 24 horas de exposição. Os resultados obtidos apresentando o percentual de morte celular (%) e seu respectivo desvio padrão estão representados nas Tabela 3 e na Figura 3 A e B. Tabela 3. Valores de viabilidade celular das substâncias na linhagem MRC-5, após 24 horas de exposição. Os dados estão representados como CI50 (intervalo de confiança de 95%).

AMOSTRAS CI50 µg/mL (Intervalo de Confiança)* Linhagem Celular MRC5

Fusarium C12 34,52 (26,63 - 44,75)*

Morosphaeriaceae C18 >50

Doxorrubicina 0.20 (0.1662 – 0.4345)*

C18 A C12 Morosphaeriaceae C18 Fusarium C12 B 150 150 * 100 100

50 50

Alamar blue Methods blue Alamar

Cell Viability (%) MRC5 Viability Cell Cell Viability (%) MRC5 Viability Cell 0 0 0 1 0 1 50 20 50 20 ______Concentration (g/mL) Concentration (g/mL)

Figura 3. Efeito dos extratos AcOEt dos fungos Morosphaeriaceae C18 (A) e Fusarium C12 (B), sobre a viabilidade de fibroblasto de pulmão humano MRC5, utilizando o ensaio do Alamar blue em diferentes concentrações após 24 h de tratamento. Os resultados estão expressos como média ± D.P.M da porcentagem de células viáveis comparado ao controle de três experimentos independentes. Os valores de CI50% 72

(intervalo de confiança de 95%) das amostras foram calculados por regressão não-linear utilizando o teste estatístico ANOVA. *p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo quando considerado ao controle. Foi utilizado o Programa GraphPad Prisma versão 6.0 para análise dos dados.

De acordo com os resultados obtidos no teste de citotoxicidade dos extratos, os metabólitos de Morosphaeriaceae C18 não interferiram na viabilidade celular de MRC5 quando testado nas concentrações de 50, 20 e 1µg/mL apresentando CI50% superior a 50 µg/mL, dessa forma não sendo tóxica para as concentrações testadas. No entanto,

Fusarium C12 quando testado nas mesmas condições apresentou CI50% de 34,521 µg/mL.

DISCUSSÃO As informações do presente trabalho demonstram que os isolados Morosphaeriaceae C18, Fluviatispora C34, Monodictys C15, e Fusarium C12 produziram filtrados de cultura contendo antimicrobianos, com destaque a atividade antimicrobiana do extrato AcOEt de Fusarium C12. Trata-se de um importante trabalho, que de forma inédita, procura novos antimicrobianos produzidos por fungos decompositores de madeiras submersas de fungos da Amazônia. Esses dados são uma potencial fonte de novos antimicrobianos, sendo dessa forma, uma resposta a resistência bacteriana reconhecida como uma grande ameaça à saúde humana (31). O fungo sexual Morosphaeriacea C18, apresentou halo de inibição com atividade antibacteriana frente as cepas Gram-positivas e Gram-negativas testadas. Sendo também observada a presença de pigmento (amarelo escuro) em CBD. Este táxon faz parte da família Morosphaeriaceae a qual é composta atualmente por quatro gêneros: Aquilomyces, Clypeoloculus, Helicascus e Morosphaeria (32,33). Um estudo envolvendo atividade biológicas deste grupo, isolou de culturas líquidas, novas lactonas produzidas por um fungo marinho da espécie Helicascus kanaloanus Kohlmeyer (ATCC 18591) (34). Destaca-se também, uma pesquisa com a espécie Massarina tunicata Shearer & Fallah, onde foi isolada duas lactonas derivadas de policetídeos. Vários desses metabólitos, mostraram atividade antibiótica contra bactérias Gram-positivas (22) . As lactonas, tem sido alvo de várias pesquisas pois, são metabólitos secundários encontrados em numerosas organismos e possui ampla atividade biológicas como antiinflamatórias, antitumorais, atividade citotóxica, antibacteriana, antimalárica, neurotóxica, fungicida dentre outras (35–38). O extrado de Fluviatispora C34, apresentou atividade antimicrobiana frente a cepas de E. coli sensível ATCC 25922 e ESBL (cepa clínica), assim como CIM de 200 µg/mL para ambas as cepas (atividade bactericida e bacteriostática, respectivamente). 73

Este fungo faz parte da família Halosphaeriaceae, e até o momento não se tem relatos de pesquisas com atividade biológica. No entanto, estudos envolvendo ascomicetos sexuais, também mostram importantes substâncias com atividade antimicrobiana. Em destaque, o fungo Annulatascus triseptatus membro da família Annulatascaceae (Sordariales), ocorre geralmente em detritos lenhosos submersos em habitats lóticos na América do Norte e na Costa Rica, Escócia e Venezuela. Desta espécie, obteve-se oito novas substâncias que foram denominados de anularinas a qual apresentaram atividade antimicrobiana frente a Bacillus subtilis (ATCC 6051), S. aureus (ATCC 29213), Candida albicans (ATCC 90029) e Aspergillus flavus (NRRL 6541), (37). Pesquisas anteriores também com fungos sexuais, relatam atividade antagônica dos gêneros de água doce Pseudohalonectria e Ophioceras apresentando atividade antimicrobiana contra cepas fúngicas e bacterianas (39). No presente trabalho, o extrato AcOEt do hifomiceto Monodictys C15 apresentou atividade antibacteriana contra cepas de E. coli ATCC 25922 e cepa clínica (halos de inibição de 12±1 e 13±1 mm respectivamente) e CIM de 200 µg/mL (atividades bactericidas e bacteriostáticas) frente a todas as 4 cepas testadas. Este relato é o segundo a descrever a ação antimicrobiana deste gênero, pois a primeira pesquisa foi realizada por Visalakchi & Muthumary (40), onde Monodictys castaneae, um endofítico extraído de Cedrus sp. apresentou pigmento em Czapek e atividade antimicrobiana frente às cepas patogênicas Staphylococcus aureus (21,4 ± 0,34 mm), Klebsiella pneumoniae (20,0 ± 0,32 mm), Salmonella typhi (20,3). ± 0,32 mm) e Vibrio cholerae (20,7 ± 0,33 mm). O extrato AcOEt de Fusarium C12 no presente trabalho, ao ser comparados com os demais extratos, apresentou maior halo de inibição frente as 4 cepas testadas pelo método dos poços e apresentou menor CIM (50 µg/mL) frente as cepas Gram-positivas S. aureus ATCC 29923 (bactericida) e ATCC 43300 (MRSA) (bacteriostático) e às cepas Gram-negativas E. coli ATCC 25922 (bactericida) e ESBL (bacteriostático) ambas com CIM 100 µg/mL. Este fungo também apresentou pigmentos (laranja) em CBD e CCZ. Pesquisas ressaltam o gênero Fusarium como patógeno de plantas e o citam como produtor de toxinas, no entanto, em um estudo realizado com Fusarium moniliforme fungo endofítico obtido da planta medicinal Colocasia esculenta, obteve-se halo de inibição dos extratos em acetato de etila testados frente a E. coli (20 mm) e S. aureus (17 mm) (41). Outra pesquisa envolveu Fusarium chlamydosporum e Fusarium nygamai obtidos de solo em Sultanato de Omã (Ásia), os quais apresentaram atividade frente a 74 cepas bacterianas Gram-negativas e Gram-positiva assim como em leveduras do gênero Candida (42). Não há uma padronização para a CIM de produtos naturais, porém a literatura relata que a CIM inferior a 1 mg/mL pode ser considerada com potencial antimicrobiano (43). Holetz et al. (44), utilizaram padrões de valores de CIM: inferior a 100 μg/mL (potente inibidor), variando 100-500 μg/mL (inibidor moderado), 500-1000 μg/mL (fraco inibidor) e acima de 1000 μg/mL foram considerados sem atividade. Portanto, seguindo estes padrões, o presente trabalho apresentou valores que variaram de potente atividade a atividade moderada. O ensaio de citotoxicidade realizado demonstrou que o extrato AcOEt de Morosphaeriaceae C18 não apresentou citotoxicidade para células da linhagem MRC-5, no entanto, para Fusarium C12 o teste apresentou atividade citotóxica moderada. Em um estudo de Langseth et al., (45) relata as espécies de Fusarium produtoras de diferentes tricotecenos e outras toxinas e indica a variação na citotoxicidade, tanto entre diferentes espécies deste gênero, quanto dentro de cada espécie. Esses resultados sugerem que, novos testes sejam realizados para os dois táxons, tanto do extrato bruto quanto nas frações obtidas, pois esta espécie tem potencial produção de composto bioativos como relatado no presente trabalho. Portanto, o presente trabalho sugere que Fluviatispora C34, Monodictys C15, Morosphaeriaceae C18 e Fusarium C12 como fungos que apresentam atividade antibacterianas frente a importantes bactérias patogênicas. Estudos envolvendo fungos decompositores de madeira submersa em ambientes dulcícolas, necessitam de avaliações quanto aos aspectos físicos, químicos e biológicos para elucidar e otimizar produção de compostos bioativos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. World Health Organization. Antibacterial Agents in clinical development: An analysis of the antibacterial clinical development pipeline, including tuberculosis. No. WHO/EMP/IAU/2017.11. 2017. 4–44 p.

2. Guimarães DO, Da Silva Momesso L, Pupo MT. Antibióticos: Importância terapêutica e perspectivas para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes. Quim Nova. 2010;33(3):667–79.

3. Bordignon SE, Carvalho JC De, Gelinski JMLN, Luís A, Soccol VT, Soccol CR. Natural Antimicrobial Compounds. In: Biotechnological Production Of Natural 75

Ingredients For Food Industry. 2016. p. 406–34.

4. John B. Sutherland, Rafii F, Lay JO, Williams AJ. Strategies to Prevent the Spread of AR Rapid Analytical Methods to Identify Antibiotic ‐ Resistant Bacteria. In: José‐Luis Capelo‐Martınez and Gilberto Igrejas, editor. Antibiotic drug resistance. First. John Wiley & Sons, Inc.; 2019. p. 535–66.

5. Aminov RI. The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature. Environ Microbiol. 2009;11(12):2970–88.

6. Holmes AH, Moore LSP, Sundsfjord A, Steinbakk M, Regmi S, Karkey A, et al. Understanding the mechanisms and drivers of antimicrobial resistance. Lancet. 2016;387(10014):176–87.

7. Bérdy J. Bioactive Microbial metabolites: A Personal View. J Antibiot (Tokyo) [Internet]. 2005;58(1):1–26. Available from: https://0-www-nature- com.pugwash.lib.warwick.ac.uk/articles/ja20051.pdf

8. Morais JF, Yoshimoto M, Rhoden SA, Pamphile JA. Bioprospecção de microrganismos produtores de compostos bioativos com atividade antitumoral. Rev UNINGÁ Rev. 2014;17(1):27–34.

9. Chen CJ, Zhou YQ, Liu XX, Zhang WJ, Hu SS, Lin LP, et al. Antimicrobial and anti-inflammatory compounds from a marine fungus Pleosporales sp. Tetrahedron Lett [Internet]. 2015;56(45):6183–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.tetlet.2015.09.079

10. Hyde KD, Xu J, Rapior S, Jeewon R, Lumyong S, Niego AGT, et al. The amazing potential of fungi: 50 ways we can exploit fungi industrially. Fungal Divers [Internet]. 2019;97(1):1–136. Available from: https://doi.org/10.1007/s13225- 019-00430-9

11. Kim JW, Choi HG, Song JH, Kang KS, Shim SH. Bioactive secondary metabolites from an endophytic fungus Phoma sp. PF2 derived from Artemisia princeps Pamp. J Antibiot (Tokyo) [Internet]. 2019;72(3):174–7. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/s41429-018-0131-2

12. Ho WH, Pui CT, Hyde KD. Induction of antibiotic production of freshwater fungi using mix-culture fermentation. Fungal Divers [Internet]. 2003;12:45–51. Available from: https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0- 4243108396&partnerID=40&md5=0bf3f2eb8c078303d96b5b2e083af7b9

13. Lal M, Tia N, Dutta D, Das MD. Bioactive metabolites obtained from endophytes bacterial isolate. Int J Innov Res Sci Eng Technol. 2016;5(7).

14. Fryar SC, Booth W, Davies J, Hodgkiss IJ, Hyde KD. Evidence of in situ competition between fungi in freshwater. Fungal Divers. 2005;18(June 2014):59– 71.

15. Johnston SR, Boddy L, Weightman AJ. Bacteria in decomposing wood and their interactions with wood-decay fungi. FEMS Microbiol Ecol. 2016;92(11).

16. Mille-Lindblom C, Fischer H, Tranvik LJ. Antagonism between bacteria and 76

fungi: Substrate competition and a possible tradeoff between fungal growth and tolerance towards bacteria. Oikos. 2006;113(2):233–42.

17. Sati SC, Arya P. Antagonism of some aquatic hyphomycetes against plant pathogenic fungi. ScientificWorldJournal. 2010;10(May 2010):760–5.

18. Johnston SR, Boddy L, Weightman AJ. No Title. 2016;(07906199939):1–14.

19. Fisher PJ, Anson AE. Antifungal effects of Massarina aquatica growing on oak wood. Trans - Br Mycol Soc [Internet]. 1983;81(3):523–7. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0007-1536(83)80120-X

20. Harrigan GG, Armentrout BL, Gloer JB, Shearer CA. Anguillosporal, a new antibacterial and antifungal metabolite from the freshwater fungus anguillospora longissima. J Nat Prod. 1995;58(9):1467–9.

21. Poch GK, Gloer JB, Shearer CA. New bioactive metabolites from a freshwater isolate of the fungus Kirschsteiniothelia sp. J Nat Prod. 1992;55(8):1093–9.

22. Oh H, Swenson DC, Gloer JB, Shearer CA. New bioactive rosigenin analogues and aromatic polyketide metabolites from the freshwater aquatic fungus Massarina tunicata. J Nat Prod. 2003;66(1):73–9.

23. Almer RD, Segedin BP. Some aquatic hyphomycetes from new zealand streams. New Zeal J Bot. 1985;23(2):273–99.

24. Qazi MA, Kanwal T, Jadoon M, Ahmed S, Fatima N. Isolation and characterization of a biosurfactant-producing Fusarium sp. BS-8 from oil contaminated soil. Biotechnol Prog. 2014;30(5):1065–75.

25. Shekhar S, Sundaramanickam A, Balasubramanian T. Biosurfactant producing microbes and their potential applications: A review. Crit Rev Environ Sci Technol. 2015;45(14):1522–54.

26. Reis CBL dos, Morandini LMB, Bevilacqua CB, Bublitz F, Ugalde G, Mazutti MA, et al. First report of the production of a potent biosurfactant with α,β-trehalose by Fusarium fujikuroi under optimized conditions of submerged fermentation. Brazilian J Microbiol [Internet]. 2018;49:185–92. Available from: https://doi.org/10.1016/j.bjm.2018.04.004

27. Sanches M, Santos R, Cortez A, Mariner R, Souza J. Biosurfactant Production by Fusarium oxysporum LM 5634 Using Peels from the fruit of Bactris gasipaes (Kunth) as Substrate. Biotechnol J Int. 2018;21(1):1–9.

28. Silva ACS da S, Santos PN dos, Silva TAL e, Andrade RFS, Campos-Takaki GM. Biosurfactant production by fungi as a sustainable alternative. Agric Microbiol / Rev Artic [Internet]. 2018;85:1–12. Available from: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1808- 16572016000100203&lang=pt%0Ahttps://bibliotecadigital.ucc.edu.co/discovery/ fulldisplay?docid=doaj_soai_doaj_org_article_a6058c47ff234d878cf66c8a9c468 b3a&context=PC&vid=57UCC_INST:57UCC_INST&lang

29. Alves EG, Vinholis AHC, Casemiro LA, Furtado NAJC, Silva MLA, Cunha WR, 77

et al. Estudo comparativo de técnicas de screening para avaliação da atividade antibacteriana de extratos brutos de espécies vegetais e de substâncias puras. Quim Nova. 2008;31(5):1224–9.

30. Ansar Ahmed S, Gogal RM, Walsh JE. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J Immunol Methods. 1994;170(2):211–24.

31. Capita R, Alonso-Calleja C. Antibiotic-Resistant Bacteria: A Challenge for the Food Industry. Crit Rev Food Sci Nutr. 2013;53(1):11–48.

32. Devadatha B, Sarma VV, Jeewon R, Jones EBG. Morosphaeria muthupetensis sp. nov. (Morosphaeriaceae) from India: Morphological characterization and multigene phylogenetic inference. Bot Mar. 2018;61(4):395–405.

33. Jones EBG, Suetrong S, Sakayaroj J, Bahkali AH, Abdel-Wahab MA, Boekhout T, et al. Classification of marine Ascomycota, Basidiomycota, Blastocladiomycota and Chytridiomycota. Fungal Divers. 2015;73(1).

34. Poch GK, Gloer JB. Helicascolides a and b: New lactones from the marine fungus helicascus kanaloanus. J Nat Prod. 1989;52(2):257–60.

35. Ruiz-reyes E, Suarez M. Lactonas sesquiterpénicas. Diversidad estructural y sus actividades biológicas. Rev CENIC Ciencias Biológicas. 2015;46(1):9–24.

36. Youssef FS, Ashour ML, Singab ANB, Wink M. A comprehensive review of bioactive peptides from marine fungi and their biological significance. Mar Drugs. 2019;17(10).

37. Li C, Nitka M V., Gloer JB, Campbell J, Shearer CA. Annularins A-H: New Polyketide Metabolites from the Freshwater Aquatic Fungus Annulatascus triseptatus. J Nat Prod. 2003;66(10):1302–6.

38. Xu Y, Zhou T, Zhang S, Espinosa-Artiles P, Wang L, Zhang W, et al. Diversity- oriented combinatorial biosynthesis of benzenediol lactone scaffolds by subunit shuffling of fungal polyketide synthases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(34):12354–9.

39. Asthana A, Shearer CA. Antagonistic Activity of Pseudohalonectria and Ophioceras. Mycologia. 1990;82(5):554–61.

40. Visalakchi S, Muthumary J. Antimicrobial activity of the new endophytic Monodictys castaneae SVJM139 pigment and its optimization. African J Microbiol Res. 2009;4(1):038–44.

41. Somwanshi PM, Bodhankar MG. Antimicrobial Activity of Endopytic Penicillium sp . and Fusarium moniliforme against MDR Human Pathogens. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 2015;4(5):358–61.

42. Alkhulaifi MM, Awaad AS, AL-Mudhayyif HA, Alothman MR, Alqasoumi SI, Zain SM. Evaluation of antimicrobial activity of secondary metabolites of fungi isolated from Sultanate Oman soil. Saudi Pharm J [Internet]. 2019;27(3):401–5. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jsps.2018.12.009 78

43. Juiz PJL, Campos MJA, Uetanabaro APT, Alves RJC, Lucchese AM. Atividade antimicrobiana do óleo essencial de Ocimum americanum e Ocimum basilicum sobre periodontopatógenos. Brazilian J Periodontol. 2016;26(4):7–14.

44. Holetz FB, Pessini GL, Sanches NR, Cortez AG, Nakamura CV, Prado B, et al. Screening of Some Plants Used in the Brazilian Folk Medicine for the Treatment of Infectious Diseases. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002;97(7):1027–31.

45. Langseth W, Bernhoft A, Rundberget T, Kosiak B, Gareis M. Mycotoxin production and cytotoxicity of Fusarium strains isolated from Norwegian cereals. Mycopathologia. 1998;144(2):103–13.

8. CAPÍTULO 3 - CARATERIZAÇÃO QUÍMICA DAS FRAÇÕES COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA PRODUZIDAS POR Fusarium solani LM6281

Eveleise Samira Martins Canto 1, Ana Cláudia Alves Cortez 2, Laila Pedrosa3, David Ribeiro da Silva3, Cecília Verônica Nunes3, João Vicente Braga de Souza 2 1 Programa de Pós-Graduação da Rede de Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal—Bionorte, Manaus, Amazonas, Brasil. Universidade Federal do Oeste do Pará, UFOPA, Santarém, Pará Brasil. 2 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, INPA, Laboratório de Micologia, Manaus, Amazonas. 3 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA – Fitoquímica COTEI/Lab. de Bioprospecção e Biotecnologia Correspondence should be addressed to Eveleise Canto: [email protected]; João V.Souza: [email protected]

RESUMO Este estudo relata a investigação química dos metabólitos com atividade antimicrobiana produzidos pelo isolado Fusarium solani LM6281, fungo isolado de madeira em decomposição em lago da Amazônia brasileira. O isolado fúngico, até então denominado Fusarium 12, foi identificado taxonomicamente por suas características morfológicas e pelo sequenciamento da região ITS do DNAr. Um bioprocesso foi realizado e o extrato orgânico bruto (acetato de etila) foi obtido e caracterizado por CCD e de RMN de H1. Em adição, o extrato orgânico bruto (acetato de etila) foi submetido a um fracionamento cromatográfico em coluna aberta guiado por bioatividade (bioautografia) permitindo identificar frações ativas frente a S. aureus ATCC 25923. Quanto aos resultados, o estudo da morfologia e sua sequência de nucleotídeos da região ITS do DNAr identificou o isolado como pertencente a espécie Fusarium solani, recebendo a codificação de isolado LM6281 da Coleção de microrganismos de interesse médico do INPA. Os ensaios preliminares de CCD de extrato bruto de acetato de etila sugeriram a presença de terpenos, quinonas, fenólicos e de flavonoides e os espectros de RMN de H1 sugeriram a presença de metabólitos como flavonoides e chalconas. Em seguida, foi realizado o fracionamento do extrato por cromatografia em coluna aberta resultando em 112 frações que foram analisadas por CCD. A análise por CCD, produziu informação que permitiu selecionar 30 frações com componentes majoritários e que puderam ser unidas em 4 frações com perfis cromatográficos/químicos semelhantes/similares. A bioautografia demonstrou que todas as 4 frações obtidas, apresentaram atividade antibacteriana e permitiu a identificação do Rf das substâncias ativas frente a S. aureus. A investigação realizada permitiu concluir que o extrato etílico do cultivo de Fusarium solani LM6281 apresenta substâncias com atividade antimicrobiana frente S. aureus ATCC 25923 e em adição a CCD/bioautografia permitiu descrever as características cromatográficas das frações ativas.

Palavras chaves: Fungos aquáticos, metabólitos secundários, decompositores

INTRODUÇÃO

A resistência bacteriana, é atualmente um problema de saúde pública relevante, que se acelera devido a processos seletivos pela presença de fármacos no meio ambiente (agricultura) e pelo uso indiscriminado e inadequado dos antibióticos em ambientes hospitalares [1], [2]. Destaca-se o patógeno Staphylococcus aureus, uma bactéria Gram- positiva que conseguiu evoluir e adquirir resistência a quase todos os antibióticos usados para tratá-la [3]. Esta bactéria, apresentou resistência a penicilina em 1942, anos posteriores detectou-se resistência a eritromicina, estreptomicina e tetraciclinas e em 1961 resistência a meticilina sendo denominado com a sigla MRSA a qual ainda é atualmente um problema de saúde pública [4], [5]. A resistência envolveu a expressão de uma transpeptidase (PBP2a) com afinidade reduzida para todos os agentes beta- lactâmicos disponíveis, incluindo penicilina [6]. Diante deste cenário, o conhecimento da biodiversidade e a bioprospecção de novos fármacos de origem microbiana se tornaram um dos principais focos em estudos biotecnológicos [7], e a exploração desses microrganismos em ambiente ainda pouco explorados é um recurso promissor [8]–[12] Os fungos presentes em nichos ecológicos incomuns ou especializados como os ambientes de água doce, possuem potencial em serem a fonte de novos metabólitos secundários os quais são importantes para a sobrevivência e adaptação desses organismos nestes ambientes [13], [14]. Por conta disto, metabólitos secundários de ocorrência natural são considerados compostos principais que podem ser usados para a descoberta de novos medicamentos [15]. O presente trabalho, destaca o fungo Fusarium solani LM6281, este gênero pode ser encontrado em todo o mundo sendo considerados produtor de várias substâncias tóxicas para diversos organismos como micotoxinas, fitotoxinas, antimicrobianos, pigmentos, enzimas entre outras [16]. Em ambientes de água doce, o gênero Fusarium, pode estar presente em amostras de materiais lenhosos, principalmente quando há disponibilidade de açúcares nestes substratos e condições aeroaquáticas [5, 6]. Pesquisas anteriores mostram que o extrato em acetato de etila deste gênero apresentada atividade biológicas importantes tais como, antifúngicas, inseticidas e citotóxica em especial a atividade antibacteriana frente a cepas gram negativas como E. coli e Gram-positivas como S. aureus [19]–[22]. No entanto, a caracterização química de fações ativas de F. solani ainda precisa ser mais investigada [21]. Contudo, habitats aquáticos amazônicos guardam uma ampla diversidade fúngica potenciais produtoras de novos biocompostos, em especial o gênero Fusarium. Este 81 gênero representa um recurso importante para a prospecção de novos antibióticos auxiliando no tratamento de doenças causadas por bactérias patogênicas. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo realizar investigação química dos metabólitos com atividade antimicrobiana produzidos por Fusarium solani LM6281, fungo isolado de madeira em decomposição em um lago do estado do Pará-Brasil.

MATERIAIS E MÉTODOS

Cultivo e identificação taxonômica do Fusarium solani LM6281

O fungo Fusarium solani LM6281 foi cultivado em triplicata em placas de Petri com ágar batata dextrose (BDA: DIFCO) e encubadas por 7 dias em temperatura ambiente. Durante esse período, foi acompanhado o surgimento das hifas fúngicas que foram transferidas para novas placas de Petri com meio BDA. Posteriormente ao isolamento, o fungo foi submetido à conservação em água destilada/Castellani: cinco pedaços de meio (4-6 mm2) contendo o crescimento fúngico foram transferidos para tubos de penicilina de 10 mL contendo 5 mL de água destilada estéril, fechados com tampa de borracha e armazenados à temperatura ambiente. A cultura foi depositada na Coleção de Microrganismos de Interesse Médico (INPA), com código de depósito LM6281. Para as observações macromorfológicas o fungo foi semeado em um ponto central em placas de Petri com meio BDA para a análise da colônia, tipo de borda, raio de crescimento, relevo, textura, coloração, presença de pigmentos, entre outros. Para a análise micromorfologia foi realizada a técnica de microcultivo de Ridell, que consiste em um fragmento de ágar BDA (20x20x10 mm) foi semeado com o fungo e colocado sob uma lamínula estéril (22x22 mm). Esse fragmento foi incubado em uma placa de Petri a 25 ºC por 14 dias. Após esse período, a lamínula foi retirada com o auxílio de uma pinça, cuidadosamente, e sobre a lâmina estéril foi adicionado uma gota de corante azul de lactofenol - algodão. As estruturas foram visualizadas em microscópio óptico com objetiva de 40x para o tipo de hifas, presença e formato de esporos [23]. O fungo foi submetido ao bioprocesso para a obtenção dos metabólitos secundários, análises da atividade antimicrobiana por bioautografia, cromatografia e ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio - RMN de 1H.

Identificação molecular Fusarium solani LM6281

Para a identificação molecular o fungo foi subcultivado em caldo batata por 7 dias e o DNA fúngico foi extraído do micélio utilizando o protocolo Ferrer et al. [24]. Em seguida, foram amplificadas as regiões do DNAr ITS (Espaço interno transcrito). Os produtos de PCR foram purificados. As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando o sequenciador e os primers ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'). As sequências genômicas fornecidas pelo sequenciador foram analisadas pelo programa BLASTn frente a base de dados National Center for Biotechnology Information website (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Sendo somente aceitas as identificações com pelo menos 95% de similaridade. As sequências destes grupos foram alinhadas juntamente com as sequências do GenBank em software de programa ClustalW no MEGA6 [25].

Produção e análises químicas do extrato bruto em acetato de etila

Bioprocesso e obtenção dos extratos fúngicos

Para o isolamento das substâncias produzidas por Fusarium solani LM6281, foi realizado bioprocessos da cultura fúngica como descrito por De Lima et al., (2011) inserindo modificações. Os bioprocessos foram realizados em Erlenmeyer (1000 mL) contendo 2,500 mL de caldo batata dextrose (120 g/L de batata, 10 g/L de dextrose). Esse meio foi inoculado com 1x104 esporos/mL dos fungos e foram incubados em condições estáticas por 15 dias ao abrigo da luz e em temperatura ambiente, somando um volume total de 2,5 L de caldo utilizado. Após esse período, o caldo foi submetido à filtração (filtro qualitativo tipo celulose Whatman n.4) e mantido em congelamento a -4ºC. Os filtrados foram descongelados em temperatura ambiente e reunidos e extraídos com à partição líquido/líquido adicionando-os em funil de separação de 1000 mL e em seguida realizando extrações em triplicata com o solvente acetato de etila (AcOEt) – (SYNTH®). O solvente foi submetido ao evaporador rotatório (Fisatom, modelo 550, Brasil) a 60 rpm sob a temperatura de 30 °C e posteriormente o extrato obtido foi pesado em balança de precisão analítica totalizando 215 mg.

Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC)

O extrato foi analisado por CCDC para se obter informações sobre as classes químicas presentes. Foi solubilizado com 1 mL de AcOEt e aplicados aproximadamente 10 μL na superfície da placa cromatográfica de sílica G60 F254 com superfície oposta de alumínio (5 cm x 5 cm), com auxílio de capilares de vidro. Em seguida, as cromatoplacas foram eluídas em cuba cromatográfica previamente saturada com diferentes sistemas de solventes orgânicos em combinações binárias utilizados como fase móvel (5 mL do sistema HEX/DCM (40:60 – v/v)). Após eluição, as placas foram visualizadas sob luz ultravioleta (UV, revelador físico), nos comprimento de onda (λ) 254 e 365 nm e reveladas com diversos reagentes químicos tais como: Ce(SO4)2 (sulfato cérico) para detecção de terpenos, anisaldeído sulfúrico (revelador universal), FeCl3 (cloreto férrico) para detecção de substâncias fenólicas, AlCl3 (cloreto de alumínio) e NP/PEG (solução etanólica com 1% de 2-aminoetil difenilborinato/solução etanólica com 5% de polietilenoglicol) para confirmar a presença de fenólicos com especificidade para flavonoides e ácidos fenólicos, KOH para a confirmação da presença de quinonas e reagente de Dragendorff para revelação de alcaloides. Com isso, foi possível estabelecer uma estratégia para a separação e purificação das moléculas presentes no extrato em análise.

Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H do extrato AcOEt bruto do fungo Fusarium solani LM6281, foram obtidos por espectrômetro Brucker BioSpin AG, modelo Fourier 300 Ultrashield, 300 MHz, utilizando 15 mg do extrato solubilizado em 500 L de clorofórmio deuterado (CDCl3, sendo adicionado TMS como referência interna (sinal em 0,00 ppm) para o deslocamento químico dos sinais de ressonância nos espectros. Os espectros de hidrogênios foram obtidos na frequência de 300 MHz, processados e exportados do programa TopSpinTM, versão 4.0.6.

Fracionamento do extrato acetato de etila

Visando o isolamento das substâncias, o extrato acetato de etila (AcOEt 686 mg) do fungo Fusarium solani LM6281 (FC12-AcOEt) foi submetido a um fracionamento em cromatografia em coluna aberta (CCA) (h x ϕ = 63,0 x 3,5 cm) utilizando sílica gel (200 g) como fase estacionária (h x Ø = 15,5 x 0.8 cm) (Sigma-Aldrich® G60 F254) e eluída 84 com misturas dos solventes Hexano (Hex), Diclorometano (DCM) e Metanol (MeOH), utilizando um volume de 200 mL para cada mistura de gradiente (Tabela 1), onde foram obtidas 112 frações submetidas a analise por CCDC [26].

Tabela 1: Sistema utilizado no fracionamento do extrato AcOEt de Fusarium solani LM6281. Fração: FC12- AcOEt Massa da Amostra: 686 mg h x Ø da coluna: 33,5 x 2,0 cm Massa da sílica: 50 g Volume de eluente utilizado: 200 mL Sistema de eluição Frações coletadas HEX/DCM 90:10 1-8 HEX/DCM 80:20 9-13 HEX/DCM 70:30 14-20 HEX/DCM 60:40 21-63 HEX/DCM 1:1 64-75 HEX/DCM 40:60 76-85 HEX/DCM 20:80 86-92 DCM 100% 93-101 DCM/MeOH 90:10 102-106 DCM/MeOH 70:30 107-108 DCM/MeOH 1:1 109-110 MeOH 100% 111-112

Após análises em CCDC as frações que apresentaram semelhança foram reunidas, resultando em 7 frações. A partir destas frações, 4 foram selecionadas (70-76, 78-79, 92- 96 e 103-104) para serem analisadas por CCDC e bioautografia. A Figura 1, mostra o principal fracionamento realizado.

Figura 1. Fluxograma demostrando o fracionamento do extrato AcOEt de Fusarium solani LM6281.

A bioautografia do isolado Fusarium solani LM6281 foi realizada com as 4 frações reunidas pelas técnicas cromatográficas utilizando as cepas S. aureus ATCC 85

25923. Para isso, preparou-se as placas CCDC na medida de 7 x 10 cm e aplicou-se 10 µL (1000 µg) da fração (AcOEt), reservando uma área para a aplicação do controle positivo, oxacilina (solução 30 µg/mL) para a cepa S. aureus ATCC.

Após a eluição desenvolvida com sistemas de solventes de diferentes polaridades: DCM 100%, DCM:ACT (9:1), HEX:ACT (9:1), as placas foram secas à temperatura ambiente e posteriormente observadas sob luz UV (365 nm e 254 nm). Para a realização da Bioautografia pelo método de ágar-overley, as placas CCD foram depositadas em placas de petri e cobertas com o volume de meio Agar Mueller Hinton contendo a solução de Cloreto de trifeniltetrazólio - TTC (1%) e o inóculo bacteriano (500 µL/mL) com turvação de 0,5 da escala de MacFarland. Este inóculo foi previamente preparado utilizando espectrofotômetro (QUIMIS®) nos comprimentos de onda de 625 nm e absorbância entre 0,008 a 0,01. As placas foram incubadas a 37º C por 24 horas. A atividade foi detectada através da formação do halo de inibição (esbranquiçado) contra um fundo roxo. Após identificar a fração com atividade antimicrobiana, calculou- se o índice de retenção (IR), que é a razão entre distância percorrida pelo solvente e a distância percorrida pela fração, de cada halo de inibição [27].

RESULTADOS

Identificação taxonômica do Fusarium solani LM6281.

Com base na caracterização morfológica da colônia macroscópica (colônia: tipo de borda, raio de crescimento, relevo, textura, coloração; tipo de hifas, presença e formato de esporos) e microscópica, obteve-se descrição compatível com o gênero Fusarium. A Figura 2 mostra a morfologia macroscópica e microscópica do isolado LM6281. As características macroscópicas do isolado fúngico podem variar em diferentes meios e condições de cultivo. As descrições aqui mencionadas, são baseadas na morfologia do crescimento do isolado em BDA a 28 °C após 7 a 10 dias de incubação. O isolado revelou crescimento rápido em placas de BDA. As colônias eram planas, algodonosas, inicialmente brancas e mais tarde ficaram rosa claro, com micélios brancos se espalhando marginalmente (Figura 2A). A coloração indicou a formação de esporodóquios, uma manta de hifas compreendendo conidióforos acima de sua superfície, resultando na produção de amplos clamidoconídios. O reverso das placas exibiu tons de rosa claro 86

(Figura 2B). Em microscópio ópico, foi observada produção de hifas septadas e hialinas típicas e microconídios em forma de fuso de 0 a 3 septos. Entretanto, havia abundância de macroconídios fusiformes (em forma de banana), contendo 3 a 5 septados (Figura 2C).

B C A

Figura 2. Morfologia macroscópica e microscópica da colônia de Fusarium solani LM6281 cultivado em ágar BDA. A: micélio vegetativo (verso); B: pigmento (reverso); C: micromorfologia.

Identificação molecular de Fusarium solani LM6281. A análise filogenética molecular do isolado de Fusarium solani LM6281, mostrou uma estreita relação com o gênero Fusarium, compartilhando 99% de similaridade com outros membros do gênero Fusarium, disponíveis no banco de dados NCBI GenBank (Figura 2). A sequência nucleotídica de 496 pb obtida após amplificação e sequenciamento foi submetida ao NCBI GenBank obtendo o número de acesso (MT017524). A Figura 3 apresenta a árvore filogenética pelo método de máxima verossimilhança. 87

Análise cromatográfica do extrato AcOEt bruto

O extrato acetato de etila do fungo Fusarium solani LM6281 foi analisado e comparado por CCDC com o objetivo de investigar a complexidade química do extrato e semelhança das classes químicas presentes no mesmo (Figura 4).

Anisaldeído sulfúrico NP/PEG AlCl3 Visível 254 nm 365 nm KOH Ce(SO4)2 FeCl3 Visível 365 nm DRAG Visível 365 nm

A B C D E F G H I J K

HEX/DCM 4:6 Figura 4. Placas de CCDC do extrato AcOEt bruto de Fusarium solani LM6281 reveladas com diferentes reveladores químicos e físicos.

Os resultados da CCD realizada com o extrato bruto AcOEt determinaram a presença de terpenos (A-C, E) quando revelados com Anisaldeído sulfúrico (coloração lilás) e quando revelado com sulfato cérico (coloração marrom). A revelação com Hidróxido de potássio (KOH) (D), mostrou resultados negativo para a presença de quinonas (coloração rosa). Observou-se a indicação da presença de terpenos e flavonóides (E) característicos pelo surgimento de manchas roxas e amarelas respectivamente, quando revelados com Sulfato cérico (Ce(SO4)2). Para identificação de fenólicos, a placa foi revelada com a solução de Cloreto férrico (FeCl3) (F), o teste foi positivo pois ocorreu a presença de coloração azul escuro, geralmente associada à taninos. Observou-se também a presença de substâncias fluorescentes sob a luz UV, no comprimento de onda de 365 nm, um indicativo da presença de cromóforos ou duplas ligações conjugadas (C, H, K). Verificou-se também a presença e flavonoides quando revelados com Cloreto de

Alumínio (AlCl3) (J, K) e NP/PEG (solução metanólica com 1% de 2-aminoethyl diphenylborinate (p/v) + solução etanólica com 5% de polietilenoglicol (p/v)) (G, H), esse último, confirmando a parte fenólica de possíveis flavonoides, observadas por fluorescência intensificada. A possível presença de alcaloides no extrato teste, foi detectada quando a placa foi revelada com o reagente de Dragendorff (I), pois surgiram manchas alaranjadas. Portanto, o extrato analisado por CCDC apresentou riqueza química revelando uma grande quantidade de possíveis substâncias a serem isoladas.

Análise dos extratos acetato de etila por Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio – RMN 1H

O extrato acetato de etila bruto do fungo Fusarium solani LM6281 foi analisado por RMN de 1H. O espectro está apresentado na Figura 5.

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Chemical Shift (ppm)

Figura 5. Espectros de RMN de 1H do extrato bruto em AcOEt do fungo Fusarium solani LM6281.

O extrato apresentou sinais na região de 11,3 a 13,6 ppm, característicos de hidrogênios de hidroxilas queladas a oxigênios de carbonilas, que podem ser atribuídos a classes de metabólitos como flavonoides e chalconas, os quais podem apresentar atividade antioxidante. Na região de 3,5 a 4 ppm há sinais característicos de metoxilas (singletos agudos), provavelmente ligadas às chalconas. A região de 6 a 7,5 ppm apresentou sinais de hidrogênios ligados à anéis aromáticos, o que corrobora fortemente com a presença de flavonoides e chalconas, visto que esses são isoprenoides. Em 0,5 a 3 ppm, são visualizados sinais característicos de CH, CH2, CH3 sem distinção de formatos e na região 1,26 ppm há longas cadeias de CH2.

Coluna cromatográfica aberta Obteve-se como resultados da cromatografia em coluna aberta, 112 frações que foram submetidas a CCD utilizando-se os sistemas de eluição adequados e posteriormente 90

foram reveladas com anisaldeído sulfúrico e (Ce(SO4)2, também visualizadas nas luzes UV (365 e 254 nm). Com isso, foi possível selecionar 16 frações e posteriormente uni- las e trabalhar com 4 reuniões de frações: 70-76 (19,9 mg); 78 e 79 (4,5 mg); 92-96 (16 mg) e 103 e 104 (56,3 mg). Essas reuniões de frações foram selecionadas para dar continuidade na investigação, pois apresentaram as substâncias majoritárias, como demonstradas nas CCDCs realizadas (Figura 6).

Anisaldeído Ce(SO4)2 365nm 254nm Visível Visível

HEX:DCM 6:4

HEX:DCM 3:7 *

DCM:ACET 95:5

Figura 6. Cromatografia em camada delgada comparativa das frações selecionadas obtidas pela cromatografia em coluna aberta de Fusarium solani LM6281. 91

Os resultados da CCD realizada com as frações isoladas que foram reunidas mostraram a presença de terpenos quando revelados com anisaldeído sulfúrico (coloração lilás) e quando revelado com sulfato cérico (coloração marrom).

Cromatografia em camada delgada (CCD) e Bioautografia das frações reunidas frente a cepa S. aureus ATCC 25923 Para determinar o sistema cromatográfico foi realizada a CCD utilizando solventes e sistemas de solventes de diferentes polaridades (a – d) e para determinação do valor do Rf das substâncias de interesse foram realizadas bioautografias (Tabela 2). A Tabela 2, mostra as frações utilizadas, a fase móvel adequada, valores de Rf e classes de compostos elucidados com os reveladores específicos.

Tabela 2. Análise por cromatografia em camada delgada e bioautografia das frações reunidas de Fusarium solani LM6281 frente a S. aureus ATCC 25923 com os solventes e sistemas de solventes utilizados na fase móvel e valores de Rf das zonas com atividade antimicrobiana. Solvente e sistemas Valor Rf - Revelador Número de Classes de Fração de eluição (fase banda com Físico (UV) bandas compostos móvel) atividade 365 nm 70-76 (a) DCM 100% 1 0,87 Terpenos 365 nm 78-79 (b) DCM:ACT (9:1) 1 0,83 Taninos Compostos 365 nm 92-96 (c) HEX:ACT (9:1) 1 0,70 fenólico 0,25; 0,5; 0,5; 365 nm 103-104 (d) DCM:ACT (9:1) 5 Alcaloides 0,6; 0,7

Os sistemas de solventes apresentaram bandas de separação nas placas cromatográficas revelada em UV a 365 nm e a bioautografia permitiu determinar quais apresentaram atividade antimicrobiana frente a S. aureus ATCC 25923 (Figura 7).

a b c d

70-76 78-79 92-96 103-104 Figura 7. Cromatografia em camada delgada com o sistema de solventes (visível) e ensaio de bioautografia revelada com solução de cloreto de trifenil tetrazolium (TTC). Mostrando as frações separadas com atividade frente a S. aureus ATCC 25923. Sistemas de solventes a: DCM 100%, b: DCM:ACT (9:1), c: HEX:ACT (9:1); d: DCM:ACT (9:1). Fonte: a autora.

DISCUSSÃO No presente trabalho, o extrato etílico bruto de F. solani LM6281 apresentou atividade antibiótica frente a cepa S. aureus ATCC 25923 e as sub-frações puderam ser evidenciadas e caracterizadas quimicamente. Este resultado, corrobora com os relatados na literatura que descrevem extratos obtidos em acetato de etila dessa espécie com atividade biológicas diversas dentre as quais estão as antimicrobianas [21], [28], [29]. A investigação de extratos do gênero Fusarium que possuem atividade antibacteriana ainda foram previamente relatadas. A Tabela 3, mostra algumas substâncias obtidas de Fusarium solani e suas atividades biológicas previamente estudadas.

Tabela 3: Substâncias com atividade biológica obtidas de extratos do fungo Fusarium solani. Substâncias Atividade biológica Referências fusalanipirona antimicrobiana Abraham & Arfmann, [30] ácido fusárico citotóxica Bacon et al., [31] paclitaxel e fusaproliferina citotóxica Chakravarthi et al., [32] dioxinivalenol citotóxica El-Banna et al., [33] Tricoteceno (solaniol) e Toxina T-2, diace- micotoxina Ishii et al., [28] toxyscirpenol 7-desmetil-fusarina C antibacteriana Kyekyeku, et al., [21] solaniol 14-de-O-metil-lasiodiplodina 3,5-di-hidroxi-7- (8-hidroxinonil) benzoato de etilo; antibacteriana Shiono et al., [29] etil-3,5-di-hidroxi-7- (6,8-di-hidroxinonil) citotóxica benzoato 7-etilbenzoato- O ácido 7-heptanóico camptotecina , 10-hidroxicamptotecina, anticâncer Shweta et al., [34] 9-metoxicamptotecina três derivados de naftopiranodionas Sem descrição Tatum et al., [35] fusarabina, javanicina Sem descrição Tatum et al., [36]

Os ensaios de CCD e RMN de 1H, sugeriram a presença de terpenos, quinonas, fenólicos e em específico flavonoides e chalconas no extrato bruto de acetado de etila. Estudos prévios realizados com F. solani, relatam substâncias identificadas em frações de acetato de etila como: 7-desmetil-fusarina C [21], Tricoteceno (solaniol) e Toxina T- 2, diace-toxyscirpenol [28], 14-de-O-metil-lasiodiplodina; 3,5-di-hidroxi-7-(8- hidroxinonil) benzoato de etilo; etil-3,5-di-hidroxi-7- (6,8-di-hidroxinonil) benzoato; 7- etilbenzoato-O-ácido 7-heptanóico [29]. Estas substâncias, apresentaram atividades antibacterianas frente a cepas gram positivas e gram negativas. As substâncias paclitaxel e fusaproliferina foram descritas com suas atividades citotóxicas [32]. O presente trabalho é o primeiro a relatar a possível produção de chalconas em frações do extrato de F. solani. 93

Chalconas, são consideradas precursoras chave das sínteses flavonoides e isoflavonoides de cadeia aberta, nos quais os dois anéis aromáticos são unidos por um sistema carbonil α, β -insaturado de três carbonos [37]. De acordo com trabalhos anteriores, foi detectada atividade antimicrobiana das chalconas oriundas de Aspergillus flavus frente às cepas bacterianas S. aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiela pneumoniae, assim como atividade antifúngica [38]. O fracionamento guiado por bioatividade (bioautografia) revelou 4 frações com atividade frente a S. aureus MRSA, as quais apresentaram as classes químicas terpenos e compostos fenólicos como os taninos e alcaloides. De acordo com a literatura, os terpenos são classes de produtos naturais com maior número de substâncias descritas e com grande diversidade estrutural [39]. Dentre este grupo está a fusalanipirona, um monoterpenóide produzido por F. solani [30] com atividade antimicrobiana. Em outras espécies também foi relatada a hidroquinona ganomicina sesquiterpenóide, obtida dos micélios de Ganoderma pfeifferi Bres., sendo capazes de inibir o desenvolvimento de S. aureus e outras bactérias resistentes à meticilina [40]. Os compostos fenólicos que também estavam presentes nas demais frações ativas, apresentam ação antimicrobianas. Estes compostos, também são relatados apresentando propriedades antioxidantes e fisiológicas como anti-inflamatória, antialérgica, cardioprotetora entre outros benefícios [41]. Os compostos fenólicos podem se dividir em flavonóides (antocianinas, flavonóis e seus derivados), ácidos fenólicos (ácidos benzóico, cinâmico e seus derivados) e cumarinas [42]. No presente trabalho também evidenciou-se os taninos, pertencentes também a este grupo, estão presentes em vegetais, definidos como polímeros fenólicos solúveis em água e que também apresentam atividade antimicrobiana devido a ligação com proteínas e adesinas (proteínas e polissacarídeos da parede celular dos microrganismos) [43]. No entanto, pesquisas anteriores, descrevem várias espécies de fungos filamentosos, em especial F. solani, produzindo ácido tânico (o mais comum dos galotaninos) que induz a produção da enzima tanase, a qual hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis produzindo ácido gálico e glicose e que também possui atividade antimicrobiana[29, 30]. Contudo, o presente trabalho apresenta as seguintes limitações: a) No período de estudo, não foi possível a identificação das substâncias produzidas por F. solani LM6281 responsáveis pela atividade antibacteriana, b) ensaios de bioatividade/bioautografia não foram realizados frente a cepas Gram-negativas. As substâncias ativas, presentes nas 94 frações do extrato etílico do fungo F. solani LM6281, ainda estão em fase de elucidação estrutural e serão bases para estudos posteriores, contribuindo para o melhor entendimento da estruturação química e biológica do gênero Fusarium. A descoberta de novas substâncias ativas como os antibióticos naturais são recursos importante para o tratamento de doenças causadas por bactérias resistentes em especial S. aureus resistente a meticilina (MRSA) [46]. Esses antibióticos, geralmente possuem estruturas químicas complexas importantes para as interações específicas nas bactérias patogênicas [47]. O presente trabalho demonstrou que o extrato etílico bruto do cultivo de Fusarium solani LM6281 apresenta substâncias com atividade antimicrobiana frente S. aureus ATCC 25923. Os ensaios químicos sugeriram o envolvimento de terpenos, quinonas, compostos fenólicos, flavonoides e chalconas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] R. Laxminarayan et al., “Antibiotic resistance-the need for global solutions,” Lancet Infect. Dis., vol. 13, no. 12, pp. 1057–1098, 2013.

[2] A. H. Holmes et al., “Understanding the mechanisms and drivers of antimicrobial resistance,” Lancet, vol. 387, no. 10014, pp. 176–187, 2016.

[3] M. E. Stryjewski and G. R. Corey, “Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: An evolving pathogen,” Clin. Infect. Dis., vol. 58, no. SUPPL. 1, pp. 10–19, 2014.

[4] M. Finland, “Emergence of Antibiotic-Resistant Bacteria,” N. Engl. J. Med., vol. 253, no. 21, pp. 909–922, 1955.

[5] W. Brumfitt and J. Hamilton-Miller, “Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,” N. Engl. J. Med., vol. 320, no. 18, pp. 11889–1196, 1989.

[6] B. Hartman and A. Tomasz, “Altered penicillin-binding proteins in methicillin- resistant strains of Staphylococcus aureus,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 19, no. 5, pp. 726–735, 1981.

[7] S. B. Pointing, “Feasibility of bioremediation by white-rot fungi,” Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 57, no. 1–2, pp. 20–33, 2001.

[8] P. M. Fallah and C. A. Shearer, “Freshwater ascomycetessco : species from north temperate lakes in Wisconsin,” Mycologia, vol. 93, no. 3, pp. 566–602, 2001.

[9] H. Oh, T. O. Kwon, J. B. Gloer, L. Marvanová, and C. A. Shearer, “Tenellic acids A-D: New bioactive diphenyl ether derivatives from the aquatic fungus Dendrospora tenella,” J. Nat. Prod., vol. 62, no. 4, pp. 580–583, 1999.

[10] H. Oh, D. C. Swenson, J. B. Gloer, and C. A. Shearer, “New bioactive rosigenin 95

analogues and aromatic polyketide metabolites from the freshwater aquatic fungus Massarina tunicata,” J. Nat. Prod., vol. 66, no. 1, pp. 73–79, 2003.

[11] P. Adriaenssens et al., “Quinaphthin, a binaphthyl quinonoid secondary metabolite produced by helicoon richonis,” J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, no. 14, pp. 2007– 2010, 1994.

[12] P. J. Fisher, A. E. Anson, J. Webster, P. Adriaenssens, and J. S. Whitehurst, “Quinaphthin, a new antibiotic, produced by Helicoon richonis,” Trans. Br. Mycol. Soc., vol. 90, no. 3, pp. 499–502, 1988.

[13] L. Miao and P. Y. Qian, “Antagonistic antimicrobial activity of marine fungi and bacteria isolated from marine biofilm and seawaters of Hong Kong,” Aquat. Microb. Ecol., vol. 38, no. 3, pp. 231–238, 2005.

[14] J. B. Gloer, “The chemistry of fungal antagonism and defense,” Can. J. Bot., vol. 73, no. Suppl. 1, 1995.

[15] A. A. Hamed, M. S. Abdel-Aziz, M. Fadel, and M. F. Ghali, “Research article Antidermatophytes from bioactive secondary metabolites of local,” J. Innov. Pharm. Biol. Sci., vol. 3, no. 2, pp. 155–165, 2016.

[16] T. E. Sondergaard et al., “Fast Screening of Antibacterial Compounds from Fusaria,” Toxins (Basel)., vol. 8, no. 12, pp. 1–9, 2016.

[17] L. G. Willoughby and J. F. Archer, “The fungal spora of a freshwater stream and its colonization pattern on wood,” Freshw. Biol., vol. 3, no. 3, pp. 219–239, 1973.

[18] A. C. Chamier, P. A. Dixon, and S. A. Archer, “The spatial distribution of fungi on decomposing alder leaves in a freshwater stream,” Oecologia, vol. 64, no. 1, pp. 92–103, 1984.

[19] P. M. Somwanshi and M. G. Bodhankar, “Antimicrobial Activity of Endopytic Penicillium sp . and Fusarium moniliforme against MDR Human Pathogens,” Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci., vol. 4, no. 5, pp. 358–361, 2015.

[20] F. Rasekhi, M. Tajick, H. Rahimian, and S. Sharifimehr, “Some of phytotoxic and antimicrobial compounds extracted from culture filtrates of Fusarium proliferatum FP85,” J. Biodivers. Environ. Sci., vol. 4, no. 5, pp. 245–251, 2014.

[21] J. O. Kyekyeku et al., “Antibacterial secondary metabolites from an endophytic fungus, Fusarium solani JK10,” Fitoterapia, vol. 119, no. February, pp. 108–114, 2017.

[22] C. X. Jiang et al., “Isolation, Identification, and Activity Evaluation of Chemical Constituents from Soil Fungus Fusarium avenaceum SF-1502 and Endophytic Fungus Fusarium proliferatum AF-04,” J. Agric. Food Chem., vol. 67, no. 7, pp. 1839–1846, 2019.

[23] C. S. Lacaz, E. Porto, J. E. C. Martins, E. M. Heins-Vaccari, and N. Takahashi de Melo, Book Review, vol. 44, no. 5. 2002.

[24] C. Ferrer, F. Colom, S. Frase, E. Mulet, J. L. Abad, and J. L. Alio, “Detection and 96

identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5 . 8S ribosomal DNA yyping in ocular infections,” vol. 39, no. 8, pp. 2873–2879, 2001.

[25] K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, and S. Kumar, “MEGA6 : Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6 . 0,” pp. 1–5, 2013.

[26] P. S. Collins, C.H., Braga, G.I., Bonato, Fundamentos de cromatografia, Editora da. Campinas, 2006.

[27] M. O. Hamburger and G. A. Cordell, “A direct bioautographic Tlc assay for compounds possessing antibacterial activity,” J. Nat. Prod., vol. 50, no. I, pp. 19– 22, 1987.

[28] K. Ishii, K. Sakai, Y. Ueno, H. Tsunoda, and M. Enomoto, “Solaniol, a toxic metabolite of Fusarium solani.,” Appl. Microbiol., vol. 22, no. 4, pp. 718–720, 1971.

[29] Y. Shiono et al., “New metabolites produced by Fusarium solani T-13 isolated from a dead branch,” Phytochem. Lett., vol. 17, pp. 232–237, 2016.

[30] W.-R. Abraham and H.-A. Arfmann, “Fusalanipyrone,” Phytochemistry, vol. 27, no. 10, pp. 3310–3311, 1988.

[31] C. W. Bacon, J. K. Porter, W. P. Norred, and J. F. Leslie, “Production of fusaric acid by Fusarium species,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 62, no. 11, pp. 4039– 4043, 1996.

[32] B. V. S. K. Chakravarthi, P. Das, K. Surendranath, A. A. Karande, and C. Jayabaskaran, “Production of paclitaxel by Fusarium solani isolated from Taxus celebica,” J. Biosci., vol. 33, no. 2, pp. 259–267, 2008.

[33] A. A. El-Banna, P. M. Scott, and P. Y. Lau, “Formation of trichothecenes by Fusarium solani var. coeruleum and Fusarium sambucinum in potatoes,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 47, no. 5, pp. 1169–1171, 1984.

[34] S. Shweta et al., “Endophytic fungal strains of Fusarium solani, from Apodytes dimidiata E. Mey. ex Arn (Icacinaceae) produce camptothecin, 10- hydroxycamptothecin and 9-methoxycamptothecin,” Phytochemistry, vol. 71, no. 1, pp. 117–122, 2010.

[35] J. H. Tatum, R. A. Baker, and R. E. Berry, “Metabolites of Fusarium solani,” Phytochemistry, vol. 28, no. 1, pp. 283–284, 1989.

[36] J. H. Tatum and R. A. Baker, “Naphthoquinones produced by Fusarium solani isolated from citrus,” Phytochemistry, vol. 22, no. 2, pp. 543–547, 1983.

[37] S. Venturelli, M. Burkard, M. Biendl, U. M. Lauer, J. Frank, and C. Busch, “Prenylated chalcones and flavonoids for the prevention and treatment of cancer,” Nutrition, vol. 32, no. 11–12, pp. 1171–1178, 2016.

[38] G. Vanangamudi, M. Subramanian, and G. Thirunarayanan, “Synthesis, spectral linearity, antimicrobial, antioxidant and insect antifeedant activities of some 2,5- dimethyl-3-thienyl chalcones,” Arab. J. Chem., vol. 10, pp. S1254–S1266, 2017. 97

[39] M. de F. O. Almeida, “Estudos químicos e biológicos de fungos endofíticos de Gustavia sp.,” 2014.

[40] R. A. A. Mothana, R. Jansen, W. D. Jülich, and U. Lindequist, “Ganomycins A and B, new antimicrobial farnesyl hydroquinones from the basidiomycete Ganoderma pfeifferi,” J. Nat. Prod., vol. 63, no. 3, pp. 416–418, 2000.

[41] P. V. Del Ré and N. Jorge, “Especiarias como antioxidantes naturais: Aplicações em alimentos e implicação na saúde,” Rev. Bras. Plantas Med., vol. 14, no. 2, pp. 389–399, 2012.

[42] A. King and G. Young, “Characteristics and occurrence of phenolic phytochemicals,” Journal of the American Dietetic Association, vol. 99, no. 2. pp. 213–218, 1999.

[43] E. Haslam, “Natural polyphenols (vegetable tannins) as drugs: Possible modes of action,” J. Nat. Prod., vol. 59, no. 2, pp. 205–215, 1996.

[44] V. Battestin, L. K. Matsuda, and G. A. Macedo, “Fontes E Aplicações De Taninos E Tanases Em Alimentos,” Aliment. Nutr., vol. 15, no. 1, pp. 63–72, 2004.

[45] G. A. Macedo, L. K. Matsuda, and V. Battestin, “Seleção de fungos produtores de tanase em resíduos vegetais ricos em taninos,” Ciência e Agrotecnologia, vol. 29, no. 4, pp. 833–838, 2005.

[46] E. L. Palavecino, “Clinical, epidemiologic, and laboratory aspects of methicillin- resistant staphylococcus aureus infections,” in Methods in Molecular Biology, vol. 2069, J. Y., Ed. New York, NY, 2020, pp. 1–28.

[47] D. O. Guimarães, “Prospecção química e biológica em fungos endofíticos associados a Viguiera arenaria (Asteraceae) Prospecção química e biológica em fungos endofíticos associados a Viguiera arenaria (Asteraceae),” p. 208, 2006.

9. CONCLUSÕES GERAIS

✓ Frente a amostragem realizada, foram identificados os táxons no lago Juá (10 sexuais e 13 assexuais, táxon mais frequente Xylomyces giganteus) e do lago do Maicá (17 sexuais e 9 assexuais, táxon mais frequente Thielavia sp.). No lago Juá e Maicá os índices de diversidade foram respectivamente H ': 2.6514 e H': 2.8174 e o índice de Sørensen entre esses lagos foi de somente 0.3673.

✓ Os extratos AcOEt dos isolados Fluviatispora C34, Morosphaeriaceae C18, Monodictys C15 e Fusarium C12 apresentaram antibacteriana e especificamente o extrato do isolado Fusarium C12 destacou-se apresentando CIM de 50 µg/mL frente as cepas S. aureus.

✓ Fusarium C12 foi identificado como Fusarium solani LM6281.

✓ Os ensaios preliminares de CCD de extrato bruto de AcOEt do cultivo de Fusarium solani LM6281 sugeriram a presença de terpenos, quinonas, fenólicos e de flavonoides e os espectros de RMN de 1H sugeriram a presença de metabólitos como flavonoides e chalconas.

✓ O fracionamento do extrato AcOEt por cromatografia de coluna aberta resultou em 112 frações que foram analisadas por CCD. A análise por CCD, produziu informação que permitiu selecionar 30 frações com componentes majoritários e que puderam ser unidas em 4 frações com perfis cromatográficos semelhantes/similares. A bioautografia demonstrou que todas as 4 frações obtidas apresentaram atividade antibacteriana e permitiu a identificação do Rf das frações ativas frente a S. aureus.

10. APÊNDICES

10.1 Carta de aceite e artigo publicado

100

Artigo publicado – Capítulo 1 Composition and diversity of fungal decomposers of submerged wood in two lakes in the Brazilian Amazon state of Pará. Este capítulo foi Aceito em 4 de Março de 2020; Publicado em 9 April 2020 no International Journal of Microbiology, Vol. 2020.

101

102

103

104

105

106

107

108

109

10.2 Capítulo 1. Árvore filogenética baseada nas sequências ITS do rDNA analisadas pelo Método de Máxima Verossimilhança – ML, realizadas pelo MEGA6.

110

10.3 Capítulo 2. Produção de pigmento e biossurfactantes por fungos decompositores de madeira submersa em lagos da Amazônia brasileira. MEIOS EM CALDO Biossurfactantes TÁXONS CBS CCZ E24(%) Acrogenospora sphaerocephala, (Berk. & - NT NT Broome) M.B. Ellis C55 Aniptodera C43 - NT NT

Annulatascaceae-like C44 - NT NT

Aquaticola C53 + + 33,0±1

Cancellidium applanatum Tubaki C03 - NT NT

Chloridium C38 - NT NT Cladophialophora C20 - NT NT Cladosporiaceae C41 - NT NT Cordana terrestres (Timonin) M. Hern.- - NT NT Rest., Gené & Guarro C17 Cumulospora C60 - NT NT Curvularia C02 - NT NT Diaporthales C01 + + 50,0±1 Dothideomycetes C27 + - NT Dothideomycetes C14 + NT NT Fluviatispora C34 + - 56,0±1 Fusarium C12 + + 64,0±1 Gonytrichum C16 - NT NT Helicosporium C46 - NT NT Jobellisia C61 - NT NT Lasiosphaeria C62 - NT NT

Longicollum biappendiculatum Zelski, F.R. + + NT Barbosa, Raja, A.N. Mill & Shearer C63 Microascaceae C64 + - NT Monodictys C15 + + - Morosphaeriaceae C18 + - 60,0±1 Nectriaceae C47 - NT NT Ophioceras sp. - NT NT Pleosporaceae C66 - NT NT Potamomyces armatisporus K.D. Hyde C59 - NT NT Pseudohalonectria like. C58 - NT NT Pseudoxylomyces elegans (Goh, W.H. Ho, K.D. Hyde & K.M. Tsui), Kaz. Tanaka & - NT NT Hiray C57 Savoryellales C67 - NT NT Sordariomycetes C49 - NT NT Sporoschisma C58 - NT NT Stilbella C08 - NT NT Submersisphaeria C59 - NT NT 111

Taeniolella C35 - NT NT Teratosphaeriaceae C42 - NT NT Thielavia C34 - NT NT Unidentified Pleosporales C45 - NT NT Xylomyces giganteus Goh, W.H. Ho, K.D. + + NT Hyde & K.M. Tsui C30 TOTAL DE ISOLADOS 40 11 6 5

CBD: Caldo Batata Dextrose; CCZ: Caldo Czapek; NT: Não testado; +: positivo, -: negativo.

112

10.4 Resumos de congresso e palestras

IX Congresso Brasileiro de Micologia

HIFOMICETOS ENCONTRADOS EM MADEIRAS SUBMERSAS EM LAGOS DO BAIXO TAPAJÓS, PARÁ, BRASIL.

Eveleise Samira Martins Cantor1; Ana Cláudia Alves Cortez,2; Josiane Santana Monteiro 3; João Vicente Braga de Souza 2

Resumo

Os hifomicetos são fungos anamorfos essenciais para a cadeia alimentar em ambientes aquáticos, participando da decomposição da matéria orgânica submersa. São caracterizados por sua reprodução assexuada, formando conídios que podem ser ou não adaptados ao ambiente aquático. Este trabalho teve como objetivo investigar a diversidade de hifomicetos associados à madeira em decomposição submersa em lagos da região do baixo Tapajós, Pará, Brasil. Para isso, foi realizada uma coleta de 60 madeiras em decomposição submersas nos lagos Juá e Maicá, nos meses de novembro e dezembro de 2017. As amostras foram depositadas em sacos plásticos e encaminhadas ao Laboratório de Ensino Multidisciplinar de Biologia Aplicada - Labio da Universidade Federal do Oeste do Pará – Ufopa. Os blocos de madeira foram lavados em água corrente e depositados em câmaras úmidas em temperatura ambiente por quatro meses. Durante a incubação, as madeiras foram observadas em estereomicroscópio e lâminas dos fungos foram confeccionadas para observação em microscópio de luz. Os fungos foram identificados através da análise de estruturas com importância taxonômica e tipos de conidiogênese, com auxílio de literatura específica. Foram identificados 15 táxons de hifomicetos nos lagos amostrados: Xylomyces elegans, X. giganteus, Cancellidium applanatum, Cumulospora sp., Cordana terrestris, Gonytrichum chlamidosporium, Chloridium sp., Monodictys sp., Stilbella sp., Acrogenospora sphaerocephala, Cladophialophora sp., Curvularia clavata, Dendryphiopsis atra, Potamomyces armatisporus e Helicosporium sp. Sendo Cumulospora sp. e Stilbella sp. primeiros registros para Amazônia brasileira. Estudos sobre fungos decompositores de madeira submersa são incipientes na região amazônica, e estes dados contribuem para ampliar o conhecimento da diversidade de fungos em ambientes aquáticos na região do baixo Tapajós.

Palavras-chave: Amazônia, Ambientes aquáticos, Fungos.

Apoio: Capes.

113

7o. Congresso sobre Diversidade Microbiana da Amazônia

Fungos coletados em madeira submersa nos lagos Juá e Maicá em Santarém-Pará

Eveleise Samira Martins Canto1; Rafael Almeida1; Ana Clara Ribeiro Morais1; Ana Cláudia Alves Cortez2; João Vicente Braga de Souza2

Resumo

Os ecossistemas aquáticos são locais que abrigam diversidade de espécies com potencial biotecnológico como os fungos decompositores de madeira submersa em água de rios da região amazônica. O objetivo do presente trabalho foi investigar a diversidade de fungos presentes em madeiras em decomposição submersa em dois lagos (Juá e Maicá) situados na região do baixo rio Tapajós, Santarém-Pará. Os parâmetros físico-químicos da água no momento das coletas foram mensurados e posteriormente, 30 fragmentos de madeira foram selecionados em cada ambiente e transportados ao laboratório da Universidade Federal do Oeste do Pará - UFOPA. A cada sete dias, durante seis meses, os fungos que se desenvolveram nas madeiras, foram isolados. Foram identificados 207 indivíduos. No lago do Juá, foram coletados 121 indivíduos correspondendo a 23 táxons do Filo Ascomycota distribuídos em 12 fungos anamorfos e 11 Ascomycetes. Os valores dos índices de diversidade Shannon-Weaver (H’) e equitabilidade (E) foram 2,7031 e 0,648953, respectivamente. No lago do Maicá, obteve-se 86 indivíduos distribuídos em 26 táxons do filo Ascomycota, sendo cinco anamórficos e 21 Ascomycetes. Com relação às análises de diversidade, obteve-se Shannon-Weaver (H’): 2,8174 e equitabilidade (E) 0,643588. O índice de similaridade de sorense foi de 0, 3265, demonstrando que os ambientes não são similares entre si. O Lago do Maicá apresentou maior diversidade de táxons.

Palavras-chave: biodiversidade, fungos de água doce, região Amazônica.

114

1º Congresso de Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia e IV Workshop de Integração ICTs & Empresas – Bionorte

Produção de pigmentos por fungos decompositores de madeira submersa em lagos do Oeste do Pará

Eveleise Samira Martins Canto, Nathalia Naiara Maciel Marinho, Vanessa dos Santos Bentes, Jhéssica Caetano Frota, Ana Cláudia Alves Cortez, João Vicente Braga de Souza

O desenvolvimento de processos que permitam a produção de pigmentos naturais por microrganismos, tem se tornado alvo mundial, pois podem substituir corantes artificiais que acarretam riscos à saúde. Esses corantes, podem ser aplicados em vários setores industriais tais como, alimentícios, farmacêuticos e têxtil. Os fungos decompositores de madeira são considerados potenciais produtores de substâncias de interesse biotecnológico por degradarem lentamente o substrato e competirem com outros microrganismos assim como, produzir metabólitos secundários com ampla variação de colorações. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar por bioprocessos a produção de pigmentos por fungos decompositores de madeira submersa em lagos do Oeste do Pará. Portanto, foram analisadas 40 amostras fúngicas obtidas de fragmentos de madeira submersa nos lagos, Juá e Maicá localizados em Santarém, Pará. Os fungos foram isolados em Ágar Batata Dextrose (BDA) e Ágar Extrato de Malte (MEA) para a obtenção de culturas puras. Para o bioprocesso, utilizou-se Erlenmeyer (125 mL) contendo 50 mL de Caldo Batata Dextrose - CBD (120 g/L de batata, 10 g/L de dextrose) onde foi inoculado 1x104 esporos/mL. Os bioprocessos foram feitos em triplicata a temperatura ambiente em condições estáticas por 15 dias ao abrigo da luz. Após esse período, os caldos foram submetidos à filtração (filtro qualitativo tipo celulose Whatman n.4). Os filtrados foram extraídos com à partição líquido/líquido com o solvente acetato de etila na proporção 1:10. A mistura foi mantida em mesa agitadora por 4 horas à 150 rpm e em seguida separada a fase orgânica do solvente. As culturas que apresentaram pigmentação em CBD foram inoculadas em tubo contendo Ágar Czapeck Dox - ACZ (Kasvi) por 15 dias. Após esse período, foi investigada a presença de pigmentos difundidos no meio de cultura. Também, foi verificada a presença de pigmentos solúveis em acetato de etila. Esse solvente foi colocado nos tubos, sobre as culturas os quais foram agitados por 30 segundos e mantidos à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, o solvente foi retirado e a presença de cor no solvente foi avaliada visualmente. Observou- se ao final dos bioprocessos realizados em CBD a presença de pigmento em 25% (10) dos filtrados brutos assim como nos solventes utilizados. De 10 cepas que apresentaram pigmento em CBD 6 apresentaram pigmentos em ACZ as quais obteve-se também extrações de pigmentos com o acetato de etila. As culturas fúngicas que apresentaram pigmentos tanto em CBD quanto em ACZ foram referentes aos táxons Aquaticola sp., Diaporthales, Hipocrealis, Longicollum biappendiculatum Zelski, F.R. Barbosa, Raja, A.N. Mill & Shearer, Monodictys sp. e Xylomyces giganteus Goh, W.H. Ho, K.D. Hyde & K.M. Tsui. Os bioprocessos dos táxons Dothideomycetes sp., Fluviatispora sp., Helicascus sp. e Microascaceae apresentaram pigmento apenas em CBD. Os pigmentos apresentaram colorações vinho, vermelha, marrom, laranja e amarela. Estes resultados mostram que fungos decompositores de madeira submersa em lagos de água doce podem ser potenciais produtores de pigmentos e ressaltam que mais estudos necessitam ser realizados para otimizar as metodologias utilizadas.

Palavras-chaves: Colorantes, bioprocessos e fungos de água doce 115

Palestras

116