Aus der Abteilung für Psychiatrie und Psychotherapie im Kindes- und Jugendalter, Universitätsklinik für Psychiatrie und Psychosomatik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Direktor: Prof. Dr. E. Schulz
WIRKUNG VON SEKRETIN AUF NEUROTRANSMITTER IM HIPPOKAMPUS DER RATTE
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2003 VON ANDRÉ KUNTZ
Geboren in Thionville (F)
Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters Erster Gutachter: PD Dr. rer. nat. H.-W. Clement Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Dr. med. D. van Calker Jahr der Promotion: 2006
MEINEN ELTERN GEWIDMET I INHALTSVERZEICHNIS ______
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VI
TABELLENVERZEICHNIS VII
GLEICHUNGSVERZEICHNIS VII
1 EINLEITUNG 1
1.1 SEKRETIN 4 1.1.1 GESCHICHTE 4 1.1.2 STRUKTUR 5 1.1.3 SYNTHESE 6 1.1.4 FUNKTIONSWEISE VON SEKRETIN 6 1.1.5 KLINISCHE ANWENDUNG VON SEKRETIN 7 1.1.6 SEKRETINREZEPTOREN 8 1.1.7 SEKRETIN BEI VERSCHIEDENEN SPEZIES 9 1.1.8 ZNS 10 1.1.9 FUNKTION IM GASTROINTESTINALTRAKT 12 1.1.10 SEKRETIN/ VIP/ PACAP-SUPERFAMILIE 13 1.1.11 HYPOKRETINE/OREXINE 14 1.1.12 AUTISMUS 15 1.1.12.1 Geschichte des Autismus 15 1.1.12.2 Häufigkeit 16 1.1.12.3 Krankheitsbild 16 1.1.12.4 Ursachen und Komorbidität 17 1.1.12.5 Therapie 17 1.2 NEUROTRANSMITTER UND AUTISMUS 20 1.2.1 GLUTAMAT 21 1.2.2 GABA 24 1.2.3 KATECHOLAMINE 25 1.2.3.1 Noradrenalin und Adrenalin 26 1.2.3.2 Dopamin 29 1.2.3.3 Katecholamine und Autismus 30 1.2.4 SEROTONIN 31 1.3 CARNITIN UND ACYLCARNITINE 33 1.4 HIPPOKAMPUS 35 1.4.1 ANATOMIE 35 1.4.2 FUNKTION 36 1.4.3 HIPPOKAMPUS BEI AUTISTISCHEN PATIENTEN 37
2 ZIEL DER VORLIEGENDEN ARBEIT 39
3 MATERIAL 40
3.1 CHEMIKALIEN 40 3.2 VERWENDETE HPLC-SÄULEN 41 3.3 EINGESETZTE GERÄTE UND ZUBEHÖR 41
II INHALTSVERZEICHNIS ______
4 METHODEN 44
4.1 HERSTELLEN DER ELUENTEN FÜR HPLC 44 4.1.1 HPLC-ELUENT 1 44 4.1.2 HPLC-ELUENT 2 45 4.1.3 HPLC-ELUENT 3 45 4.1.4 HPLC-ELUENT 4 46 4.2 EINFÜHRUNG IN DIE MIKRODIALYSE 46 4.2.1 ENTWICKLUNG DER MIKRODIALYSE 46 4.2.2 PRINZIPIEN DER MIKRODIALYSE 48 4.3 IN VITRO-MIKRODIALYSE 49 4.3.1 GRUNDLAGEN 49 4.3.2 VERSUCHSAUFBAU UND -BEDINGUNGEN 50 4.4 TIEREXPERIMENTELLE GEWINNUNG DER PROBEN 51 4.5 IN VIVO MIKRODIALYSEVERSUCHE 51 4.5.1 VORBEREITUNG 51 4.5.2 DURCHFÜHRUNG DER OPERATION 51 4.5.3 DURCHFÜHRUNG DER MESSUNGEN 52 4.6 HPLC 53 4.6.1 GRUNDLAGEN 53 4.6.2 HPLC–INSTRUMENTATION 53 4.6.3 PHASENUMKEHR-HPLC (REVERSED PHASE CHROMATOGRAPHIE) 55 4.6.4 MESSWERTERFASSUNG MITTELS ANALOG-DIGITALWANDLER UND MILLENIUM-SOFTWARE 56 4.7 ELEKTROCHEMISCHE DETEKTION 56 4.7.1 EINFÜHRUNG 56 4.7.2 ARTEN VON ELEKTROCHEMISCHER DETEKTION 58 4.7.3 PRINZIP DER ELEKTROCHEMISCHEN DETEKTION 59 4.8 BESTIMMUNG VON KATECHOLAMINEN, SEROTONIN UND DEREN METABOLITEN MITTELS HPLC UND ELEKTROCHEMISCHER DETEKTION 60 4.9 BESTIMMUNG VON GABA, GLUTAMAT UND ASPARTAT MITTELS HPLC UND FLUORESZENZDETEKTION 61 4.10 TANDEM-MS 62 4.11 STATISTIK 66
5 ERGEBNISSE 67
5.1 CHROMATOGRAMME DER VERSCHIEDENEN TRENNUNGSMETHODEN 67 5.1.1 METHODE 1 67 5.1.2 METHODE 2 68 5.1.3 METHODE 3 70 5.1.4 METHODE 4 71 5.1.4.1 Teilstandard A nach Methode 4 71 5.1.4.2 Teilstandard B nach Methode 4 72 5.1.5 EINFLUSS DER RINGER-LÖSUNG AUF DAS CHROMATOGRAMM 72 5.2 ERGEBNISSE DER IN VITRO MIKRODIALYSE-VORVERSUCHE ZUR ERMITTLUNG DER IN VITRO RECOVERY 74 5.2.1 IN VITRO RECOVERY VON AMINOSÄUREN 74 5.2.2 RECOVERY VON KATECHOLAMINEN, INOSITOLEN UND METABOLITEN 75 5.3 ERGEBNISSE DER IN VIVO MIKRODIALYSEUNTERSUCHUNGEN 77 5.3.1 UNTERSUCHUNG MITTELS TANDEM MS 77 5.3.1.1 Mittelwerte der extrazellulären Konzentration der Aminosäuren 77 5.3.1.2 Einzelne Ergebnisse der Tandem MS-Untersuchungen 78
III INHALTSVERZEICHNIS ______
5.3.2 ACYLCARNITINE 80 5.3.2.1 Isovalerylcarnitin (C 5) 82 5.3.2.2 Einfach ungesättigtes Dicarboxy-Isovalerylcarnitin (C5;1-DC) 83 5.3.2.3 Dicarboxy-Octanoylcarnitin (C 8-DC) 84 5.3.2.4 Einfach ungesättigtes Decanoylcarnitin (C 10;1) 85 5.3.2.5 Einfach ungesättigtes Hydroxy-Decanoylcarnitin (C10;1-OH) 86 5.3.2.6 Hydroxy-Dodecanoylcarnitin (C12-OH) 87 5.3.3 UNTERSUCHUNG MITTELS HPLC UND FLUORESZENZDETEKTION 88 5.3.3.1 GABA 88 5.3.3.2 Glutamat 89 5.3.4 METHODENVERGLEICH TANDEM-MS UND HPLC 90 5.3.4.1 Glutamat 91 5.3.4.2 Aspartat 92 5.3.5 UNTERSUCHUNG VON KATECHOLAMINEN UND INDOLAMINEN MITTELS HPLC UND ELEKTROCHEMISCHER DETEKTION 93 5.3.5.1 Noradrenalin 95 5.3.5.2 Adrenalin 96 5.3.5.3 5-Hydroxyindolessigsäure 97 5.3.5.4 Homovanillinsäure 98 5.3.5.5 Dopamin 99 5.3.5.6 Serotonin 100 5.3.5.7 3-MT 101 5.3.5.8 5-HIAA/ 5-HT-Ratio 102 5.3.5.9 3-MT/ Dopamin- Ratio 103
6 DISKUSSION 104
7 ZUSAMMENFASSUNG 130
8 LITERATUR 131
9 ANHANG 166
9.1 DANKSAGUNG 166 9.2 LEBENSLAUF 167 9.3 ORIGINALBEITRAG 168 9.4 POSTERBEITRÄGE 168 9.5 ERKLÄRUNG ÜBER BETEILIGUNG DRITTER 170
IV ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ______
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
3-MT 3-Methoxytyramin 5-HIAA 5-Hydroxyindol-3-Essigsäure (5-Hydroxy-indole-3-acetic acid) 5-HT 5-Hydroxytryptamin ADOS Autism Diagnostic Observation Schedule AMPA α-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazol Propionsäure (α-amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) APUD Aufnahme und Decarboxylierung von Aminvorstufen (amine precursor uptake and decarboxylation) CA Ammonshorn (Cornu ammonis)
CaCl2 Calziumchlorid cAMP Zyklisches Adenosinmonophosphat (cyclic adenosine monophosphate)
CO2 Kohlendioxid COMT Catechol-O-Methyltransferase (EC 2.1.1.6) DOPAC 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (3,4-Dihydroxy-phenlyacetic Acid) DSM-IV Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders- Fourth Edition g Gramm GABA γ-Aminobuttersäure (γ-amino-butyric acid) GABA-T GABA-Transaminase (EC 2.6.1.19) GAD Glutamatdecarboxylase (EC 4.1.1.15) GHRH Growth hormone releasing hormone GIP Gastric inhibitory polypeptide GLP-1 Glucagon-like peptide-1 GLP-2 Glucagon-like peptide-2 GRF Growth hormone releasing factor h Stunde
HClO4 Perchlorsäure Hcrt Hypokretin (hypocretine) He Helium HPLC Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography) HVA Homovanillinsäure (4-Hydroxy-3-Methoxy-Phenyl-acetic acid) i.c.v. Intracerebroventrikulär
V ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ______i.p. Intraperitoneal i.v. Intravenös
IC50 Mittlere inhibitorische Konzentration ICD 10 The International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems, tenth revision
IP3 Inositol 1,4,5-Triphosphat KCl Kaliumchlorid kg Kilogramm L-DOPA L-3,4-Dihydroxyphenyl-Alanin m/z Quotient Masse / Ladung MAO Monoaminoxidase (EC 1.4.3.4) mg Milligramm MgCl Magnesiumchlorid MHPG 4-Hydroxy-3-Methoxyphenyl-Glykol min Minute mM milli-Mol mRNA Messenger-Ribonukleinsäure (messenger-ribo-nuclein acid) MW Mittelwert
Na2-EDTA Dinatrium-Ethylendinitrotetraessigsäure NaCl Natriumchlorid NMDA N-Methyl-D-Aspartat OPA Ortho-phthaldialdehyd p Wahrscheinlichkeit PACAP Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide PHM Peptide histidine methionine PKA Proteinkinase A (EC 2.7.1.37) PKC Proteinkinase C (EC 2.7.10) PNMT Phenylethanolamin-N-methyltransferase (EC 2.1.1.28) PRP PACAP-related peptide SEM Standardfehler des Mittelwertes (standard error of the mean) SSAD Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.24) Tandem-MS Tandem-Massenspektroskopie TTX Tetrodotoxin VIP Vasoaktives intestinales Polypeptid ZNS Zentralnervensystem
VI ABBILDUNGSVERZEICHNIS ______
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
ABBILDUNG 1: ZUSAMMENSETZUNG VON SEKRETIN AUS EINZELNEN AMINOSÄUREN 5 ABBILDUNG 2: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG EINES 7-TM-REZEPTORS 9 ABBILDUNG 3: SEKRETIN/VIP/PACPA-SUPERFAMILIE 14 ABBILDUNG 4: GENE DER SEKRETIN/VIP/ PACAP-SUPERFAMILIE 14 ABBILDUNG 5: VEREINFACHTE SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES STOFFWECHSELS VON GLUTAMAT UND GABA 25 ABBILDUNG 6: HAUPTSTOFFWECHSEL DER KATECHOLAMINE 28 ABBILDUNG 7: HAUPTSTOFFWECHSEL VON SEROTONIN 33 ABBILDUNG 8: DARSTELLUNG DES HIPPOKAMPUS IM RATTENHIRN 36 ABBILDUNG 9: SCHEMATISCHE ABBILDUNG EINER MIKRODIALYSESONDE 49 ABBILDUNG 10: CMA/120 SYSTEM FÜR FREI BEWEGLICHE VERSUCHSTIERE 52 ABBILDUNG 11: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES AUFBAUS EINER HPLC-ANLAGE 56 ABBILDUNG 12: ELEKTROCHEMISCHER DETEKTOR „ANTEC LEYDEN INTRO“ 59 ABBILDUNG 13: SCHEMATISCHE ABBILDUNG EINER ELEKTRODE EINES ELEKTROCHEM. DETEKTORS 59 ABBILDUNG 14: BEISPIEL FÜR EIN TANDEM-MASSENSPEKTROSKOPIE-SPEKTRUM 65 ABBILDUNG 15: CHROMATOGRAMM NACH METHODE 1 67 ABBILDUNG 16: CHROMATOGRAMM NACH METHODE 2 68 ABBILDUNG 17: GRAPHISCHE GEGENÜBERST. DER RETENTIONSZEITEN DER EINZELNEN SUBSTANZEN 69 ABBILDUNG 18: ABHÄNGIGK. DER RETENTIONSZ. NACH METHODE 3 VON FLUSSRATE UND PH DES ELUENTEN 70 ABBILDUNG 19: CHROMATOGRAMM NACH METHODE 3 70 ABBILDUNG 20: TEILSTANDARD A NACH METHODE 4 71 ABBILDUNG 21: TEILSTANDARD B NACH METHODE 4 72 ABBILDUNG 22: VERSCHIEDENE KOMPONENTEN DER RINGER-LÖSUNG IM CHROMATOGRAMM 72 ABBILDUNG 23: BEEINFL. DER MESSUNG VON DOPAC BZW. MHPG DURCH DAS MIKRODIALYSEPERFUSAT 73 ABBILDUNG 24: IN VITRO RECOVERY VON ASPARTAT, GABA UND GLUTAMAT 74 ABBILDUNG 25: IN VITRO RECOVERY VON KATECHOLAMINEN, SEROTONIN UND METABOLITEN 76 ABBILDUNG 26: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON CITRULLIN 78 ABBILDUNG 27: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON ASPARTAT 79 ABBILDUNG 28: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON C5 82 ABBILDUNG 29: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON C 5,1-DC 83 ABBILDUNG 30: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. A. D. EXTRAZELL. KONZ. VON C8-DC 84 ABBILDUNG 31: EFFEKT VON SEKRETIN I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON C10;1 85 ABBILDUNG 32: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. A.D. EXTRAZELL. KONZ. VON C10;1-OH 86 ABBILDUNG 33: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. A.D. EXTRAZELL. KONZ. VON C12-OH 87 ABBILDUNG 34: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON GABA 88 ABBILDUNG 35: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ.VON GLUTAMAT 89 ABBILDUNG 36: HPLC- BESTIMMUNG DES EFFEKTS VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELLULÄRE KONZENTRATION VON GLUTAMAT 91 ABBILDUNG 37: TANDEM-MS-BESTIMMUNG DES EFFEKTS VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELLULÄRE KONZENTRATION VON GLUTAMAT 91 ABBILDUNG 38: HPLC-BESTIMMUNG DES EFFEKTS VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELLULÄRE KONZENTRATION VON ASPARTAT 92 ABBILDUNG 39: TANDEM-MS-BESTIMMUNG DES EFFEKTS VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELLULÄRE KONZENTRATION VON ASPARTAT 92 ABBILDUNG 40: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON NORADRENALIN 95
VII TABELLENVERZEICHNIS ______
ABBILDUNG 41: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON ADRENALIN 96 ABBILDUNG 42: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON 5-HIAA 97 ABBILDUNG 43: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON HVA 98 ABBILDUNG 44: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON DOPAMIN 99 ABBILDUNG 45: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL.KONZ. VON SEROTONIN 100 ABBILDUNG 46: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DIE EXTRAZELL. KONZ. VON 3-MT 101 ABBILDUNG 47: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DAS VERHÄLTNIS VON 5-HIAA ZU 5-HT 102 ABBILDUNG 48: EFFEKT VON SEKRETIN 30 KU/KG I.P. AUF DAS VERHÄLTNIS 3-MT ZU DOPAMIN 103
TABELLENVERZEICHNIS
TABELLE 1: ÜBERSICHT ÜBER BISLANG VERÖFFENTLICHTE STUDIEN ÜBER SEKRETIN UND AUTISMUS 4 TABELLE 2: STRUKTUR VON SEKRETIN BEI VERSCHIEDENEN SPEZIES 10 TABELLE 3: ÜBERSICHT ÜBER DIE FUNKTIONEN VON SEKRETIN IM GASTROINTESTINALTRAKT 13 TABELLE 4: KONZENTRATIONEN DER IN DER STANDARD-LÖSUNG ENTHALTENEN SUBSTANZEN 55 TABELLE 5: SUBSTANZEN AUS CHROMATOGRAMM 1 UND RETENTIONSZEITEN 68 TABELLE 6: ÜBERBLICK ÜBER STANDARD UND RETENTIONSZEITEN NACH METHODE 2 69 TABELLE 7: ÜBERSICHTSTABELLE ÜBER DIE IN VITRO RECOVERY V. ASPARTAT, GABA UND GLUTAMAT 75 TABELLE 8: ÜBERSICHTSTAB. ÜBER DIE IN VITRO RECOVERY VON KATECHOL., SEROTONIN UND METABOLITEN 75 TABELLE 9: EXTRAZELL. KONZ. DER UNTERSUCHTEN AMINOSÄUREN IM DIALYSAT (ZEIT T=O MIN) 77 TABELLE 10: KONZENTRATIONEN DER UNTERSUCHTEN ACYLCARNITINE IM DIALYSAT. 81 TABELLE 11: VERGLEICH DER MIT HPLC UND TANDEM-MS ERMITTELTEN EXTRAZELLULÄREN KONZENTRATIONEN VON ASPARTAT UND GLUTAMAT 93 TABELLE 12: ÜBERSICHT ÜBER DIE KONZENTR. DER MIT HPLC UND ELEKTROCHEMISCHER DETEKTION ANALYSIERTEN SUBSTANZEN ZUM ZEITPUNKT T=O (ANGABEN ALS MW UND SEM) 94
GLEICHUNGSVERZEICHNIS
GLEICHUNG 1: FORMEL ZUR BESTIMMUNG DER RELATIVEN RECOVERY 50 GLEICHUNG 2: FORMEL ZUR BERECHNUNG DES BEI DER ELEKTROCHEM. DETEKTION ENTSTEHENDEN STROMS 57 GLEICHUNG 3: STROM BEI DER ELEKTROCHEMISCHEN DETEKTION 57
- 1 - EINLEITUNG ______
1 EINLEITUNG
Ist Autismus heilbar? So lautete der Titel eines 1978 erschienen Buches (Schmauch, 1978). Seit der Erstbeschreibung des Autismus durch Kanner und Asperger in den 40er Jahren steht diese Frage im Fokus kinder- und jugendpsychiatrischen Interesses (Kanner, 1943; Asperger, 1944). Autismus ist eine komplexe Erkrankung, deren Ätiologie bislang nicht hinreichend geklärt werden konnte. Ebenso steht trotz vielversprechender Ansätze bislang keine Therapie zur Verfügung, welche eine kurative Behandlung der Krankheit erlaubt. Angesichts der gegenwärtig limitierten therapeutischen Mittel geben neue Erkenntnisse, welche die Möglichkeit einer baldigen effektiven Therapie des autistischen Krankheitsbildes eröffnen, sowohl in der Fachwelt als auch bei den betroffenen Angehörigen Anlass zu Hoffnung auf einen Durchbruch in der Erforschung der Autismustherapie. Die Etablierung neuer Therapieverfahren bedarf dabei insbesondere einer kritischen und sorgfältigen Forschung, um Nutzen und Risiken der Verfahren für die betroffenen Patienten hinreichend zu evaluieren (Übersicht bei Lev und Human, 2005). Sekretin erregte im Herbst 1998 durch einen Bericht über die Behandlung des fünfjährigen autistischen Jungen Parker Beck mit Sekretin das Aufsehen der Öffentlichkeit (BBC News, 1998). Parker Beck zeigte Symptome, die für das Vorliegen eines frühkindlichen Autismus sprachen: er hatte deutlich eingeschränkte kommunikative Fähigkeiten, im Kontakt mit anderen Menschen vermied er zumeist den direkten Blickkontakt und verhielt sich gegenüber seiner Umwelt verschlossen und distanziert. Seine Umwelt erlebte ihn als ein in seiner eigenen Welt - von der Außenwelt isoliert- lebendes Kind. Parker litt außerdem an einer chronischen Diarrhoe, die bislang nicht durch Zoeliakie, Proteinintoleranz oder andere Malabsorptions-Syndrome erklärt werden konnte. Zur diagnostischen Abklärung wurde bei ihm ein Pankreas-Stimulationstest, der sogenannte Sekretintest, durchgeführt. Im Rahmen dieses Tests wurde dem Jungen intravenös Sekretin injiziert. Den Berichten zufolge sei die Diarrhoe einige Tage nach der Injektion weitgehend abgeklungen. Sein zuvor gestörtes, unruhiges Schlafverhalten habe sich binnen weniger Tage normalisiert. Vor allem aber zeigte sich nach ca. fünf Wochen eine deutliche Besserung seiner autistischen Symptomatik: Parker benutzte nun einen Wortschatz von mehreren hundert Wörtern, sprach in kurzen Sätzen und beantwortete Fragen. Hinsichtlich seines Kontaktverhaltens zeigte er eine deutliche Öffnung gegenüber seiner Umwelt (Beck et al., 1998). Im gleichen Jahr berichteten Horvath et al. über insgesamt drei Kinder mit einer ähnlichen Entwicklung nach Sekretingabe (Horvath et al., 1998). Bei allen drei Kindern konnte eine im Vergleich zu nicht autistischen Kindern erhöhte pankreatikobiliäre Sekretion nach Sekretininfusion beobachtet werden (7,5 bis 10ml/min. im Vergleich zu 1 bis 2ml/min. vor Sekretininjektion). Dieser Veröffentlichung folgte eine Vielzahl an Studien zur Überprüfung der Wirksamkeit von Sekretin bei Autismus, welche jedoch bislang keinen endgültigen Beweis für die Wirksamkeit von Sekretin bei
- 2 - EINLEITUNG ______autistischen Patienten erbringen konnten. Tabelle 1 zeigt eine Übersicht der bislang veröffentlichten Studien, die die Wirkung von Sekretin bei Autisten untersuchten. Obwohl nach der Studie von Horvath et al. (Horvath et al., 1998) eine signifikante Wirksamkeit von Sekretin bei autistischen Patienten nicht nachgewiesen werden konnte (neuere Übersichtsarbeiten: Esch und Carr, 2004; Kern et al., 2004; Sturmey, 2005), wurden in den USA zahlreiche autistische Kinder mit Sekretininjektionen in einem Dosisbereich von 0,5-0,75 CU/kg Körpergewicht bei einem Injektionsintervall von ca. 2 Wochen behandelt (Rimland, 1998; Rimland, 1999). Zahlreiche, zumeist anekdotische Berichte beschrieben Behandlungserfolge mit Sekretin. Erstmalig beantragte die US-amerikanische Firma Repligen die Zulassung für Sekretin zur Behandlung des Autismus. Nach hoffnungsvollen Ergebnissen in Phase II erhielt Repligen 2002 von der Food and Drug Administration (FDA) eine Genehmigung zur Durchführung von Phase III der klinischen Prüfung von Sekretin zur Behandlung des Autismus. Phase II wurde mit insgesamt 126 Kindern im Alter von drei bis vier Jahren durchgeführt. Jeder Patient erhielt innerhalb von neun Wochen drei Injektionen Sekretin bzw. Placebo. Es zeigte sich bei Kindern im Alter von drei bis vier Jahren ein signifikant stärkeres Ansprechen auf Sekretin als bei der Gruppe der fünf- bis sechsjährigen Kinder (n=57, p>0,20) (n=67, p<0,01). Der Effekt wurde mit dem diagnostischen Erhebungsbogen ADOS bestimmt. Die Toleranz von Sekretin wird im Allgemeinen auch nach dreimaliger Gabe als gut beschrieben. In einer Follow-up Studie erhielten 87 Patienten 6 zusätzliche Dosen Sekretin über insgesamt 18 Wochen (www.repligen.com); die Phase III-Studie konnte die positiven Resultate der Phase-II-Studie hingegen nicht bestätigen. Eine neuere japanische Studie hingegen beschreibt Verbesserungen von Kommunikations- und Sprachverhalten bei 8 von 14, aber auch eine Verstärkung von hyperkinetischem Verhalten und Stereotypien bei einigen der untersuchten autistischen Kinder und Jugendlichen nach intravenöser Applikation von Sekretin (Toda et al., 2004). Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass neuere Studien auf einen möglichen Effekt von Sekretin bei schizophrenen Patienten hindeuten (Alamy et al., 2004; Sheitman et al., 2004; www.repligen.com). Trotz des Fehlens statistisch signifikanter Ergebnisse wurde auch hier bei einzelnen Patienten eine Verbesserung von Aufmerksamkeit (Sheitman et al., 2004) und Kontaktverhalten (Alamy et al., 2004) 6-48h nach Injektion von Sekretin beobachtet. Alamy et al. geben in ihrem Fallbericht eine Wirkdauer von ca. 1 Woche an (Alamy et al., 2004), die von Sheitman et al. beschriebenen Wirkungen hielten zwischen 12h und 5 Tagen an (Sheitman et al., 2004).
- 3 - EINLEITUNG ______
N STUDIEN GEMESSENE PATIENTEN AUTOR (ALTER IN DOSIS RESULTATE - TYP PARAMETER JAHREN)
Chez et Zweiteilige Effekt von Sekretin 56 (Durchschnitt 2 IU/kg Keine signifikanten Effekte gegen- Studie, OL, auf autistische Kin- al., 2000 6;4 J) Sekretin über der Placebogruppe PL, CO der
2 CU / kg Effekt von Sekretin 21 (3-8J, Carey et synthet. Keine signifikanten Effekte gegen- DB, PL, ED auf das Verhalten au- Durchschnitt humanes über der Kontrollgruppe al., 2002 tistischer Kinder 5J) Sekretin Effekt von Sekretin Coniglio auf Sozial- und 2 CU/kg, 60 (3-10J; Keine signifikanten Effekte gegen- DB, PL, ED Kommunikations- porcines et al., Durchschnitt 7J) über der Kontrollgruppe 2001 verhalten autistischer Sekretin Kinder Effekt von Sekretin Corbett Keine R, DB, PL, auf Sprache und Ver- Keine signifikanten Effekte gegen- 12 Dosis- et al., CO, ED halten autistischer über der Placebogruppe angaben 2001 Kinder Effekt von Sekretin Dunn- auf Sozial-, Kom- 2 CU/kg R, DB, PL, Keine signifikanten Effekte gegen- munikationsverhalten 95 (2–7J) porcines Geier et ED über der Placebogruppe al., 2000 und soziale Interak- Sekretin tion 2 IU/kg Horvath Effekt von Sekretin (porcines Verbessertes Sprach- und Sozial- Fallberichte auf das Verhalten au- 3 (3-5 J) oder et al., verhalten 1998 tistischer Kinder humanes Sekretin) Porcines Effekt von Sekretin Horvath Sekretin 65 % herabgesetzte Permeabilität, auf die intestinale 20 (keine DB, PL, ED (keine 10% unverändert, 25% erhöhte et al., Permeabilität von au- Altersang.) Dosierungs Permeabilität 1999 tistischen Kindern angaben) Positive Response auf Sekretin von Effekt von Sekretin 19 (3-10J, 2 CU/ kg autistischen Kindern mit Diarrhoe Kern et auf Kommunikation, DB, PL, CO Durchschnitt porcines im Vergleich zu autistischen Sprache und Sozial- al., 2002 6;4J) Sekretin Patienten ohne Diarrhoe und zur verhalten Kontrollgruppe Lamson Effekt von transder- 1 CU/kg Sistieren der Diarrhoe, Fortschritte und malem Sekretin auf humanes Fallbericht 1 (2;6J) im Sprach- und Kommunikations- das Verhalten eines Sekretin als Plaza, verhalten 2001 autistischen Kindes Gel Effekt von Sekretin 2 CU/kg auf Verhalten und humanes Levy et R, CO, DB, Keine signifikanten Effekte gegen- kommunikative 62 (3-8) synthe- PL, ED über der Kontrollgruppe al., 2003 Fähigkeiten autis- tisches tischer Kinder Sekretin Effekt von Sekretin auf den Gastrointes- 15 von 20 Patienten zeigten eine Light- tinaltrakt bei autis- 3 CU/kg Verbesserung des Stuhlgangs bzw. dale et OL, ED tischen Kindern mit 20 (3–6J) porcines ein Sistieren der Diarrhoe; 83% der al., 2001 gastrointestinalen Sekretin Eltern beobachteten Verbesser- Beschwerden ungen im Sprachverhalten
- 4 - EINLEITUNG ______
N STUDIEN GEMESSENE PATIENTEN AUTOR (ALTER IN DOSIS RESULTATE - TYP PARAMETER JAHREN) Effekt von synthe- 2 IU/kg, tischem humanem Molloy et synthet. Keine signifikanten Effekte gegen- DB, PL, CO Sekretin auf Sprache 42 humanes über der Kontrollgruppe al., 2002 und Verhalten autis- Sekretin tischer Kinder 2 CU/ kg Owley et R, DB, PL, Wirksamkeit von Se- 20 (3-12J; Keine signifikanten Effekte gegen- porcines ED, CO kretin bei Autismus Durchschn. 6,2J) über der Placebogruppe al., 1999 Sekretin Effekt von Sekretin auf autistische Kin- Roberts 2 ml/kg R, DB, PL, der; Untersuchung, Keine signifikanten Unterschiede 64 (2–7J) porcines et al., MD (2) ob bestimmte Unter- gegenüber der Kontrollgruppe Sekretin 2001 gruppen mehr von Sekretin profitieren Sandler Effekt von Sekretin 0,4 µg/kg Keine signifikanten Effekte gegen- DB, PL, ED auf autistische Pa- 60 (3–14J) synthet. et al., über der Placebogruppe 1999 tienten Sekretin Spon- Effekt von Sekretin 3,4 CU/kg DB, PL, MD Keine signifikanten Effekte gegen- auf das Verhalten au- 6 humanes heim et (1-3), CO über der Placebo- Kontrollgruppe al., 2002 tistischer Kinder Sekretin Verbesserung der Funktionsfähig- Wirksamkeit von Se- Toda et keit in sozialen Beziehungen, des kretin auf die Symp- Kommunikations- und Sprachver- al., 2004 tomatik von autis- keine (nur Abstract ED, OL 14 (9-14) haltens, bei mehreren Kindern hin- tischen Kindern und Angabe verfügbar, gegen Verstärkung von von hyper- Jugendlichen mit Au- Artikel auf kinetischem Verhalten und Stereo- tismus japanisch) typien Effekt von biolo- 2 CU/kg, gischem und synthe- Weder synthetisches noch biolo- Unis et synthet. DB, PL, ED tischem Sekretin auf 85 (3-12J) gisches Sekretin zeigten eine signi- Sekretin al., 2002 autistische Sympto- fikante Symptombesserung (0,4 µg/kg) matik Tabelle 1: Übersicht über die bislang veröffentlichten Studien über Sekretin und Autismus (DB= Doppelblind, PL= Placebokontrolliert; ED= Einfachdosis; MD= Mehrfachdosis; CO= Crossover; R= Randomisiert; OL= Open label)
1.1 SEKRETIN
1.1.1 GESCHICHTE
1902 entdeckten der englische Arzt und Physiologe Ernst Henry Starling (1866-1927) und der Physiologe William Maddock Bayliss (1866-1924), dass das Pankreas nach Durchschneiden aller afferenten Nervenfasern noch funktionsfähig blieb. Das Pankreas sezernierte Verdauungsfermente, sobald der säurehaltige Mageninhalt den Darm erreichte. Darüber hinaus beobachteten sie, dass die intravenöse Injektion von einem aus jejunaler Mukosa gewonnenen Extrakt ebenfalls eine pankreale Sekretion zur Folge hatte. Starling und Bayliss fanden heraus, dass die Dünndarmschleimhaut unter dem Einfluss der Magensäure einen Stoff absonderte, den sie später „Sekretin“ nannten (Bayliss und Starling, 1902). Mit dieser einfachen Beobachtung war es den beiden Forschern gelungen, eine bisher
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1.1.2 STRUKTUR
Sekretin ist ein aus 27 Aminosäuren bestehendes C-terminales Peptid mit einem Molekulargewicht von 3055 Dalton und der empirischen Formel C13H22N44O43 (Mutt et al., 1970). Auf Grund seiner Zusammensetzung aus Aminosäuren gehört es zur Gruppe der Peptidhormone. Die Richtigkeit der Struktur konnte von Bodanszky und Williams 1967 nachgewiesen werden (Bodanszky und Williams, 1967). Abbildung 1 zeigt die Zusammensetzung von Sekretin.
Sekretin
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-
Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2.
Abbildung 1: Zusammensetzung von Sekretin aus einzelnen Aminosäuren
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Sekretin ist strukturell eng verwandt mit anderen Peptiden wie Glukagon, Vasoaktives intestinales Peptid (VIP), Gastric inhibitory polypeptide (GIP), Growth hormone releasing hormone (GHRH) und Pituitary adenylate cyclase activating protein (PACAP), mit denen Sekretin N-terminale Aminosäuren gemeinsam hat (Bell, 1986). Neben der Verwandtschaft zu den Substanzen der Sekretin/VIP/Glukagon Familie konnten de Lecea et al. eine strukturelle Verwandtschaft von Sekretin mit den 1998 entdeckten Hypokretinen 1 und 2 aufzeigen (de Lecea et al., 1998).
1.1.3 SYNTHESE
Sekretin wird hauptsächlich von endokrinen Zellen des proximalen Dünndarms, den sogenannten S-Zellen produziert (Polak et al., 1971). Die S-Zellen gehören zum APUD-System (amine precursor uptake and decarboxylation- System) des Verdauungstraktes. Als APUD-System bezeichnet man ein peripheres endokrines Zellsystem, dessen Gemeinsamkeit in der Aufnahme und Decarboxylierung von Aminvorstufen und der Speicherung der Amine in spezifischen Granula, d.h. der Bildung von Peptidhormonen, liegt. APUD-Zellen sind neuroektodermalen Ursprungs. Wegen ihres neuroektodermalen Ursprungs können sie in verschiedene Richtungen sezernieren: direkt in eine Ganglienzelle (neurokrin), über Axone in den Blutstrom (neuroendokrin), direkt in die Blutbahn (endokrin) und schließlich in die unmittelbare Nachbarschaft (parakrin). Zum APUD-Zellsystem gehören Zellen in Hypothalamus, Hypophyse, Pinealdrüse, Nebenschilddrüse, endokrinaktive Zellen der Plazenta, die Zellen des Pankreasinselsystems, die endokrinaktiven Zellen der Magen-Darm- Schleimhaut und der Lunge, die C-Zellen der Schilddrüse, Zellen des Nebennierenmarks, des Sympathikus und schliesslich Melanoblasten. Darüber hinaus wird Sekretin von β-Zellen des Pankreas (Wheeler et al., 1992) und im ZNS (Mutt et al., 1979, Itoh et al., 1991) gebildet. Die Literatur beschreibt weiterhin das Vorkommen von Sekretin in den Hoden (Monts et al., 1995), dem Herzen, der Lunge und den Nieren (Ohta et al., 1992). Lee et al. gehen davon aus, dass Sekretin auch im Zerebellum endogen gebildet und freigesetzt wird (Lee et al., 2005a).
1.1.4 FUNKTIONSWEISE VON SEKRETIN
Die Wirkung von Sekretin auf die Zielorgane wird primär durch Aktivierung der Adenylatzyklase mit Bildung von Adenosin-3',5'-zyklischem Monophosphat (cAMP) und Aktivierung der cAMP- abhängigen Proteinkinase A (PKA) ausgeübt (McGill et al., 1994). Sekretin stimuliert die Aktivierung von cAMP über G-Protein gekoppelte Rezeptoren (Fremeau et al., 1983). Hohe Konzentrationen von
Sekretin können auch die Bildung von Inositol 1,4,5-Triphosphat (IP3) mit intrazellulärer Freisetzung von Ca2+ und einer Aktivierung von Proteinkinase C anregen (Trimble et al., 1987).
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Im Gastrointestinaltrakt konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass sowohl die Ausschüttung von Sekretin als auch seine Aktivität durch vagale Afferenzen moduliert werden können (Kwon et al., 1999). Vagotomie bzw. der cholinerge Antagonist Atropin inhibieren in physiologischen Dosen die Sekretion des Pankreas nach Einwirkung von Sekretin bei Menschen (You et al., 1982) und Hunden (Singer et al., 1981). Mittels Autoradiographie konnten Sekretinrezeptoren auf afferenten vagalen Fasern nachgewiesen werden (Wang et al., 1995). Auf zellulärer Ebene erhöht Sekretin die Erregbarkeit von Neuronen des Nucleus tractus solitarii im Rückenmark von Ratten und fördert dort die Aktivierung von nonselektiven Kationen-Strömen, wohingegen der Netto-Kalium-Fluss unbeeinflusst bleibt; damit zeigten Yang et al. erstmals einen direkten Effekt von Sekretin auf spezifische Ionenkanäle (Yang B et al., 2004).
1.1.5 KLINISCHE ANWENDUNG VON SEKRETIN
Klinisch wird Sekretin vor allem im diagnostischen Bereich eingesetzt, therapeutische Anwendung findet Sekretin im klinischen Alltag bislang nicht.
Diagnostische Einsatzbereiche von Sekretin sind unter anderem:
• Untersuchung der exokrinen Pankreasfunktionen, insbesondere zur Diagnostik einer chronischen Pankreatitis (Geoghegan und Pappas, 1997) • Diagnostik des Pankreaskarzinoms • Diagnostik des Insulinoms (Tanaka et al., 2002) • mittels selektiver arterieller Injektion von Sekretin werden Gastrinome in der duodenalen Submukosa detektiert (Takasu et al., 1998) • Diagnostik von Gastrinomen in Pankreas oder extrapankrealen Geweben (Isenberg et al., 1972)
Auf den Sekretintest soll im Folgenden kurz eingegangen werden: Sekretin wird vornehmlich zur Differentialdiagnostik bei Hypergastrinämie zum Ausschluss eines Gastrinoms eingesetzt. Bei einem Gastrinom führt eine Sekretinapplikation zur Stimulation der Gastrinsekretion, nicht jedoch bei anderen Formen einer Hypergastrinämie. Nach 12-stündiger Nahrungskarenz wird zunächst der Gastringehalt im Serum bestimmt. Nach Injektion von Sekretin als Bolus (2 kU/kg Körpergewicht) wird die Reaktion des Serumgastrinspiegels auf die Sekretininjektion anhand weiterer Blutentnahmen nach 2, 5, 10, 15 und 30min. bestimmt. Bei einem Gastrinom kommt es in der Regel zu einem Anstieg des Serumgastrinspiegels auf mehr als 200ng/l (Norm <100ng/l) (Classen et al., 2003).
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1.1.6 SEKRETINREZEPTOREN
Rezeptoren der Sekretinfamilie finden sich sowohl beim Menschen als auch im gesamten Tierreich. Vor allem in den 80er Jahren konzentrierten sich mehrere Gruppen auf die Erforschung des Sekretinrezeptors (Robberecht et al., 1982; Gespach et al., 1981). Der Sekretinrezeptor besteht aus 427 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von ca. 48000 Dalton (Henriksen und Schaffalitzky de Muckadell, 2002). Er gehört zur Gruppe der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, die schätzungsweise bis zu 80% der derzeit bekannten intrazellulären Proteine ausmachen (Cardoso et al., 2005). Die Gemeinsamkeit der G-Protein gekoppelten Rezeptoren besteht in ihrem Aufbau aus sieben transmembranösen Helices, jeweils drei extrazellulären und drei intrazellulären Schleifen, einer extrazellulären N-terminalen und einer intrazellulären C-terminalen Domäne. Der Sekretinrezeptor gilt aufgrund seiner charakteristischen Struktur als Prototyp der Sekretinrezeptor-Familie (Harmar, 2001), zu der alle G-Protein gekoppelten Rezeptoren mit sieben transmembranösen Domänen gehören: unter anderem Rezeptoren für VIP, PACAP, GIP, Glukagon, Glucagon-like Peptide (Sherwood et al., 2000), Rezeptoren für insgesamt 21 Peptide werden derzeit zur Sekretin-Rezeptorfamilie gezählt (Cardoso et al., 2005). Der Sekretinrezeptor wurde als erster Rezeptor der Sekretinsuperfamilie geklont (Ishihara et al., 1991). Der aus 116-147 Aminosäuren bestehenden N-terminalen Domäne kommt eine wichtige Funktion bei Ligandenbindung und Aktivierung des Rezeptors zu (Holtmann et al., 1995): sie enthält drei bis vier Cysteinreste, zwei Tryptophanreste und auch ein Aspartat, die besondere Bedeutung für die Ligandenbindung an den Hormonrezeptoren haben (Harmar, 2001). Der zytoplasmatischen C-terminalen Domäne wird eine Beteiligung an der Desensibilisierung des Rezeptors mittels Phosphorylierung durch die G-Protein gekoppelte Rezeptorkinase zugeschrieben (Holtmann et al., 1996 b). Erstmals konnte 1991 die für den Sekretin-Rezeptor codierende cDNA geklont werden (Ishihara et al., 1991), später wurden auch Sekretinrezeptoren von Menschen (Chow, 1995; Patel et al., 1995) und von Kaninchen (Svoboda et al., 1998) geklont. Der Sekretinrezeptor zeigt eine hohe Bindungsaffinität zu radiomarkiertem Sekretin mit IC50 von 1nmol/l Sekretin (IC50=mittlere inhibitorische Konzentration) und zu VIP mit IC50 von 1µmol/l. Analysen von kompetitiven Bindungskurven am Sekretinrezeptor legen die Existenz von multiplen Sekretinrezeptoren nahe (Ulrich et al., 1998).
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Abbildung 2: Schematische Darstellung eines 7-TM-Rezeptors Die Abbildung zeigt eine schematische Darstellung der Struktur eines Rezeptors mit 7 transmembranösen Helices (7-TM-Rezeptoren). Alle Rezeptoren der Sekretinfamilie gehören zu den G-Protein gekoppelten 7-TM- Rezeptoren. Sieben transmembranöse Helices (7-TM) formen dabei einen zylindrischen Bogen und werden verstärkt durch Disulfidbrücken. Die so entstehenden Domänen können Bindestellen für Liganden bereitstellen. (Quelle: Aghajanian und Sanders-Bush, 2002).
1.1.7 SEKRETIN BEI VERSCHIEDENEN SPEZIES
Sekretin konnte bei zahlreichen Spezies nachgewiesen werden. In zeitlicher Reihenfolge wurde Sekretin bei folgenden Spezies entdeckt: Schwein, Huhn, Kuh, Mensch, Hund und Ratte (Ng et al., 2002). Im Verlauf der Evolution wurden nur wenige Aminosäuren ausgetauscht (siehe Tabelle 2). Humane Sekretinrezeptoren zeigen eine hohe Affinität zu Sekretin, jedoch nur eine geringe Affinität zu VIP. Sekretinrezeptoren bei Ratten hingegen binden sowohl Sekretin als auch VIP mit etwa gleich grosser Affinität, jedoch bewirkt nur die hochaffine Bindung von Sekretin an diesem Rezeptor eine biologische Reaktion, während VIP nur an Bindungsstellen mit niedriger Affinität zum Rezeptor wirkt (Holtmann et al., 1996 a). Einen interessanten Interspeziesvergleich zwischen Ratten, Mensch und Katze unternahmen Koves et al.: Mensch und Ratte zeigten beide Immunreaktivität für Sekretin in Purkinje-Zellen, zerebellarem Kortex, zentralen Nuclei Cerebelli, Pyramidenzellen des Motorkortex und primären sensorischen Neuronen, während beim Menschen zusätzlich Immunreaktivität für Sekretin in Hippokampus, Amygdala und sensorischen Neuronen beschrieben wurde (Koves et al., 2004).
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STRUKTUR VON SEKRETIN BEI VERSCHIEDENEN SPEZIES Mensch HSDGTFTSELSRLREGARLQRLLQGLV Schwein/Schaf/Kuh/Guineaschwein HSDGTFTSELSRLRDSARLQRLLQGLV Hund HSDGTFTSELSRLRESARLQRLLQGLV Kaninchen HSDGTLTSELSRLRDRARLQRLLQGLV Ratte HSDGTFTSELSRLQDSARLQRLLQGLV Huhn HSDGLFTSEYSKMRGNAQVQKFIQNLM
Tabelle 2: Struktur von Sekretin bei verschiedenen Spezies Die Tabelle zeigt die Aminosäuresequenzen von Sekretin bei verschiedenen Spezies verglichen mit humanem Sekretin. Fettgedruckt erscheinen die vom humanen Sekretin abweichenden Aminosäuren (nach Sherwood et al., 2000).
1.1.8 ZNS
SEKRETIN UND SEKRETINREZEPTOREN IM ZNS
Durch die Veröffentlichung von Horvath et al. erlebte die Frage nach der Bedeutung von Sekretin im ZNS eine Renaissance (Horvath et al., 1998). Erst mehr als 70 Jahre nach seiner Entdeckung beschäftigte man sich eingehender mit der Frage der zentralnervösen Bedeutung von Sekretin. Erste Studien belegten in den 70er/80er Jahren das Vorkommen von Sekretin im ZNS. Das Vorkommen von Sekretin wurde sowohl in der Peripherie als auch im ZNS beschrieben (Fremeau et al., 1983; Itoh et al., 1991; Koves et al., 2002). Sekretin kann die Bluthirnschranke passieren (Banks et al., 2002; Goulet et al., 2003; Dogrukol-Ak et al., 2004). Der G-Protein gekoppelte Sekretinrezeptor wird sowohl in der Peripherie als auch im ZNS exprimiert (Ishihara et al., 1991; Nozaki et al., 2002). Erstmals wurde Immunreaktivität von Sekretin im Gehirn der Ratten 1979 beschrieben (Mutt et al., 1979). Nach ersten negativen Befunden (Kopin et al., 1990) wurde schliesslich auch die Expression von Sekretin-mRNA im ZNS des Menschen nachgewiesen (Whitmore et al., 2000). Sekretinrezeptoren wurden in tierexperimentellen Studien mittels I-125 markiertem Sekretin entdeckt (Fremeau et al., 1983; Nozaki et al., 2002): Fremeau et al. untersuchten das Bindeverhalten von radioaktiv markiertem 125 I-Sekretin im Hirn von Ratten und beschrieben die größte spezifische Bindung von Sekretin im Zerebellum, eine mittlere Bindung in Kortex, Thalamus, Striatum, Hippokampus und Hypothalamus, die niedrigste in Mittelhirn und Medulla/ Ponsregion (Fremeau et al., 1983). Diese Erkenntnisse wurden durch spätere Studien erweitert: Nozaki et al. untersuchten mittels in vitro-Autoradiographie mit (125)-I-Sekretin gefrorene Hirnschnitte und beobachteten ein hohes Bindeverhalten von Sekretin im Tractus Nuclei solitarii, im laterodorsalen Nucleus thalamicus und im Nucleus accumbens, schwächer zeigte sich das Bindeverhalten von Sekretin in Hippokampus, Putamen, Zerebellum, Gyrus cingulatus und im
- 11 - EINLEITUNG ______orbitalen Kortex (Nozaki et al., 2002). Die Northern-Blot-Analyse ermöglichte durch die Messung von Sekretin-Vorläuferpeptiden in Medulla oblongata und anderen Hirnarealen den Nachweis der Existenz von Sekretin im Gehirn (Itoh et al., 1991; Whitmore et al., 2000). Ng et al. beschrieben in einer weiteren Northern-Blot-Analyse das Vorkommen von Sekretinrezeptoren im gesamten ZNS (Ng et al., 2002). Eine neuere Studie erbrachte starke Anhaltspunkte für die endogene Freisetzung von Sekretin im Zerebellum (Lee et al., 2005a). Die intravenöse Gabe von Sekretin aktiviert die c-FOS-Expression in zahlreichen Hirnregionen, unter anderem dem Nucleus tractus solitarius und dem dorsalen motorischen Nucleus des Nervus Vagus (Goulet et al., 2003). Tay et al. untersuchten in mehreren Hirnregionen der Ratte, inwieweit die Expression von Sekretin und Sekretin mRNA in verschiedenen Entwicklungsstadien (7 bis 60 die postnatal) variiert: Sekretin wurde in Hippokampus, Area postrema, Nukleus Tractus solitarius, Zerebellum und den zentralen Amygdala exprimiert, im Zerebellum fand sich in allen Altersstufen die höchste Expression von Sekretin, Sekretin mRNA war am höchsten im Tractus nucleus solitarii exprimiert. Im Hippokampus und den meisten anderen Hirnregionen fand sich im Vergleich zu späteren Entwicklungszeitpunkten in den ersten zwei bis drei postnatalen Lebenswochen die höchste Expression von Sekretin (Tay et al., 2004).
VERHALTENSMODIFIZIERENDE WIRKUNG VON SEKRETIN
Verhaltensmodifizierende Wirkungen von Sekretin werden in mehreren Studien beschrieben: Charlton beobachtete bei Ratten nach i.c.v. Injektion von Sekretin neben einer Bewegungsverlangsamung und einer Abflachung der Atmung auch eine Abnahme des Interesses der Tiere an Veränderungen in ihrer Umwelt (Charlton, 1983). Bei Mäusen vermochte Sekretin die Wirkung einer Einzeldosis Morphin aufzuheben (Babarczy et al., 1995). Letztlich zeigten Horvath et al., wie bereits beschrieben, eine Wirkung von Sekretin auf die Symptomatik autistischer Kinder (Horvath et al., 1998). Intraperitoneal verabreichtes Sekretin konnte bei Ratten die Schreckreaktion auf Angstreize signifikant senken (Myers et al., 2004).
EINFLUSS VON SEKRETIN AUF STOFFWECHSELPROZESSE IM GEHIRN
Sekretin erhöht die cAMP- Konzentration in einer Vielzahl von Hirnregionen (van Calker et al., 1980; Fremeau et al., 1986), spezifisch werden Hippokampus und Hypothalamus stimuliert (Karelson et al., 1995). Van Calker et al. beschrieben einen Anstieg von cAMP nach Sekretinapplikation in kultivierten Glioblasten von Mäusen (van Calker et al., 1980), Yasuda et al. in kultivierten Schwannzellen des Ischiasnervs (Yasuda et al., 1998). In PC12-Zellen (=Phäochromozytomzellen) der Ratte stimuliert Sekretin die Tyrosinkinase, ein wichtiges Enzym im Syntheseweg der Katecholamine (Roskoski et al.,
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1989). Eine Verbindung zwischen katecholaminergem System und Sekretin wurde bereits 1979 aufgezeigt (Fuxe et al., 1979). Dass Sekretin auch in andere Transmittersysteme eingreift, zeigten Yung und Mitarbeiter (Yung et al., 2001): sie wiesen die Expression von Sekretin und Sekretinrezeptor in spezifischen neuronalen Populationen des zerebellaren Kortex nach. Darüber hinaus zeigten sie, dass Sekretin selektiv die GABAerge Transmission in Purkinjezellen über einen präsynaptischen und cAMP-abhängigen Mechanismus verstärkt. Sie postulieren, dass Sekretin als retrograder Messenger und Gegenspieler von Glutamat fungieren könnte (Yung et al., 2001). Lee et al. erweiterten die Theorie von Yung et al. um einen Zwischenschritt: danach soll Sekretin in einem ersten Schritt die Freisetzung von Glutamat fördern, welches dann über auf den Korbzellen befindliche präsynaptische AMPA-Rezeptoren die Freisetzung von GABA erleichtert (Lee et al., 2005a). In den Amygdala der Ratte aktiviert peripher verabreichtes Sekretin die Synthese von c-FOS (Goulet et al., 2003), einem Marker für neuronale Aktivität (Dragunow und Faull, 1989).
1.1.9 FUNKTION IM GASTROINTESTINALTRAKT
Sekretin wird vor allem in duodenalen S-Zellen gebildet, S-Zellen finden sich in abnehmender Häufung bis 90cm distal des Pylorus, distal davon wird kein Sekretin mehr sezerniert. Stimulus für die Sekretion von Sekretin durch die S-Zellen ist ein Absinken des duodenalen pH unter den Schwellenwert von 4.5. Sekretin stimuliert vor allem die pankreale Sekretion von Wasser und Bikarbonationen und neutralisiert den sauren Inhalt des Duodenum (Watanable et al., 1986). Im Duodenum erleichtert Sekretin die Sekretion von Bikarbonat und epidermalem Wachstumsfaktor aus Brunner-Drüsen (Ulrich et al., 1998). Weiterhin unterstützt Sekretin die Wirkung von Cholezystokinin, welches -stimuliert durch Wasser, Bikarbonat und Fette- die pankreale Hormonsekretion anregt, die Gallenblasenkontraktur fördert und die Darmmotilität beschleunigt (Rausch et al., 1985). Sekretin fördert darüber hinaus die duktale Gallensekretion durch direkte Interaktion mit Cholangiozyten, erhöht die Bikarbonatkonzentration im Gallensaft (McGill et al., 1994), regt Cholangiozyten zur Exozytose an und fördert das Pankreaswachstum (Dembinski und Johnson, 1980). Sekretin stimuliert weiterhin die Sekretion von Pepsinogen, inhibiert Magensaftproduktion und Magenentleerung. Neben einem pH-Abfall im Duodenum kann die Sekretion von Sekretin unter anderem auch durch langkettige Fettsäuren, Oligopeptide und Peptone stimuliert werden. Li et al. zeigten 1990 die Existenz eines Sekretin-Releasing-Peptids auf (Li et al., 1990), dessen Freisetzung über afferente vagale Bahnen beeinflusst wird (Li et al., 1995). Afferente vagale Bahnen sind auch an der Kontrolle physiologischer Funktionen von Sekretin beteiligt (Li et al., 1995; You und Chey, 1988).
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Sekretin hat, wie die meisten Peptidhormone, eine Halbwertzeit von nur wenigen Minuten: die Halbwertzeit von intravenös injiziertem Sekretin im Kreislaufsystem des Menschen beträgt 4.06 +/- 0.82min. (Kolts und McGuigan, 1977). Sekretin wird zu 30 % durch die Nieren ausgeschieden, zum Teil durch die Leberzellen und auch durch Enzyme im Blut metabolisiert.
FUNKTIONEN VON SEKRETIN IN PHYSIOLOGISCHEN DOSEN • Sekretion von Wasser und Elektrolyten im Pankreas STIMULATION • Sekretion von Wasser und Elektrolyten in der Galle • Magenentleerung INHIBITION • Sekretion von Magensäure • Motilität des Duodenum
FUNKTIONEN VON SEKRETIN IN HÖHEREN DOSEN • Kontraktion des unteren Ösophagussphinkters • Freisetzung von Insulin • Sekretion aus duodenalen Brunner-Drüsen STIMULATION • renale Exkretion von Wasser und Elektrolyten • Schlagvolumen des Herzens • Splanchnischer Blutfluss • Lipolyse in Fettzellen Tabelle 3: Übersicht über die Funktionen von Sekretin im Gastrointestinaltrakt (nach Henriksen und Schaffalitzky de Muckadell, 2002)
1.1.10 SEKRETIN/ VIP/ PACAP-SUPERFAMILIE
Aufgrund einer grossen strukturellen Ähnlichkeit der Aminosäuresequenzen von Sekretin mit anderen gastrointestinalen und zentralnervösen Peptiden fasst man heute Sekretin und verwandte Peptide zu einer Familie von Peptiden zusammen, der sog. Sekretin/VIP/PACAP-Superfamilie, zu der beim Menschen neben Sekretin PACAP, GIP, GHRH, PHI, PHM, Glukagon, GLP 1, GLP 2 und GIP gehören (Sherwood et al., 2000). Die Bezeichnung dieser Peptidfamilie folgt keiner einheitlichen Nomenklatur, vielmehr finden sich in der Literatur unterschiedliche Bezeichnungen für diese Peptidefamilie, z.B. „VIP-secretin family“ (Robberecht et al., 1985), „secretin-VIP-glucagon family“ (Bodanszky und Bodanszky, 1986), "secretin/VIP/PACAP family“ (Nowak et al., 2000) und andere. Eine strukturelle Verwandtschaft bzw. Ähnlichkeit konnte auch für die kodierenden Gene der einzelnen Peptide der Sekretinfamilie aufgezeigt werden (Sherwood et al., 2000). Unterschiede zwischen den Peptidhormonen zeigen sich vor allem in ihren N-terminalen Aminosäuren. Mitglieder der Sekretin/VIP/PACAP-Superfamilie finden sich in zahlreichen Spezies während der gesamten Evolution des Lebens auf der Erde (Sherwood et al., 2000, vgl. auch Kapitel 1.1.7).
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Abbildung 3: Sekretin/VIP/PACAP-Superfamilie Die einzelnen Teile der Sekretin/VIP/PACAP-Superfamilie, die auch beim Menschen vorkommen, sind nach Länge der Aminosäureketten angeordnet. Neun Peptide sind bioaktiv, nur bei PRP konnte man bislang keine Bioaktivität feststellen. Hauptanteil an der Bioaktivität trägt die N-terminale Region, die aus den ersten 27 Aminosäuren besteht (Quelle: Sherwood et al., 2000).
Abbildung 4: Gene der Sekretin/VIP/ PACAP-Superfamilie Sechs Gene codieren für neun bioaktive Hormone (Quelle: Sherwood et al., 2000)
1.1.11 HYPOKRETINE/OREXINE
Sekretin zeigt strukturelle Ähnlichkeiten mit den erst vor wenigen Jahren entdeckten Hypokretinen bzw. Orexinen (de Lecea et al., 1998). Da Hypokretine (=Orexine) fast gleichzeitig von zwei Forschergruppen entdeckt und benannt wurden, sind heute zwei Namen geläufig („Hypokretine“ und „Orexine“): de Lecea et al. benannten die neu entdeckten Peptide aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu Sekretin und ihrer Verbindung zum Hypothalamus "Hypokretin-1" und "Hypokretin-2". Im gleichen Jahr entdeckten Sakurai et al., dass zentral verabreichte Orexine die Nahrungsaufnahme von Ratten stimulieren und benannten sie daher nach dem griechischen Wort “Orexis“ (=Hunger) „Orexin A“ und „Orexin B“. Sie schrieben ihnen die Funktion von Appetitstimulatoren zu (Sakurai et al., 1998).
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Hypokretin-1 (Hcrt 1) bzw. Orexin A besteht aus 38 Aminosäuren, von denen neun mit Sekretin übereinstimmen; Hypokretin-2 (Hcrt 2) bzw. Orexin B besteht ebenfalls aus 38 Aminosäuren mit 14 übereinstimmenden Aminosäuren. Beide Peptide werden nur im dorsalen und lateralen Hypothalamus gefunden. Im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der Sekretinfamilie fehlt bei ihnen der His- oder Tyr- Rest am N-terminalen Ende. Ihre Identität wird nach der C-terminalen Region definiert (Sherwood et al., 2000). Der Hypokretinrezeptor gehört ebenfalls zu den G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Funktionell wird den Hypokretinen eine Beteiligung an Energiehomöosthase, Schlafregulation (Chemelli et al., 1999; Willie et al., 2001) und Ernährungsverhalten im Sinne einer Appetitstimulation (Sakurai et al., 1998) zugeschrieben.
1.1.12 AUTISMUS
Erst durch die Beobachtungen von Horvath et al., dass Sekretin bei autistischen Kinder zur Symptomverbesserung führte (Horvath et al., 1998), wurden auch die Forschungsbemühungen um eine Aufklärung des zentralen Wirkmechanismus von Sekretin forciert. Da im Rahmen der vorliegenden Arbeit die zentrale Wirkung von Sekretin auch vor dem Hintergrund einer möglichen Wirksamkeit von Sekretin bei der Behandlung des Autismus untersucht wurde, soll im Folgenden auf die Erkrankung des Autismus im Kontext neurochemischer Prozesse und Veränderungen eingegangen werden.
1.1.12.1 Geschichte des Autismus
Kanner und Asperger gelten als Begründer des Terminus „Autismus“ (Kanner, 1943; Asperger, 1944). In der Literatur finden sich jedoch bereits Jahrzehnte vorher Beschreibungen der Krankheit. Bereits 1898 beschrieb Barr einen 22-jährigen Mann mit außergewöhnlichem Gedächtnis und einer durch Echolalie geprägten Sprache (Barr, 1898). De Sanctis und Heller berichteten über Kinder mit autistischen Verhaltensweisen und bezeichneten die Störung frei nach Kraepelins „Dementia praecox“ als „Dementia infantilis“ (Kraepelin, 1904; De Sanctis, 1908; Heller, 1908). Bleuler prägte 1924 den Begriff der „Schizophrenie“, der für die Betroffenen von weniger stigmatisierendem Charakter als die „Dementia praecox“ sein sollte (Bleuler, 1924). Erst Kanner führte 1943 den Begriff des „frühkindlichen Autismus“ ein und löste damit den bis dahin für autistische Patienten gebräuchlichen Begriff der „kindlichen Schizophrenie“ ab (Kanner, 1943). Etwa zeitgleich beschrieb Asperger 1944 das isolierte Verhalten dieser Kinder, die jedoch im Gegensatz zu den von Kanner beschriebenen Patienten eine normale frühkindliche Sprachentwicklung durchlaufen hatten (Asperger, 1944).
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1.1.12.2 Häufigkeit
Autismus betrifft ca. vier bis fünf Kinder auf 10.000 Einwohner. Dabei variieren die Zahlen in der Literatur erheblich. Fombonne untersuchte epidemiologische Studien über Autismus aus den Jahren 1966 bis 1998 und gab als Mittelwert von 23 Studien eine mittlere Prävalenz von 5,2 auf 10000 Einwohner bei durch Verbesserung der diagnostischen Möglichkeiten und veränderten Definitionen der Krankheit im Laufe der Jahre steigender Prävalenzrate an (Fombonne, 1999). Die nach 1989 durchgeführten Studien wiesen eine mittlere Prävalenz von 7,2 auf 10000 Einwohner auf. Rutter geht sogar von einem Anstieg der Inzidenz von 4/10000 vor 40 Jahren auf 30-60/10000 aus, der seiner Ansicht nach auf verbesserte diagnostische Massnahmen und eine Sensibilisierung von Bevölkerung und medizinischem Personal für diese Erkrankung zurück zu führen sei (Rutter, 2005). Autismus betrifft viermal häufiger das männliche wie das weibliche Geschlecht. Mädchen mit Autismus entwickeln häufiger eine gegenüber männlichen Patienten schwerere Symptomatik.
1.1.12.3 Krankheitsbild
Der frühkindliche Autismus zählt zu den tiefgreifenden Entwicklungsstörungen. Er manifestiert sich vor dem vollendeten dritten Lebensjahr und persistiert in der Regel während der gesamten Lebenszeit (Kanner, 1946). Der frühkindliche Autismus weist ein breites Spektrum unterschiedlicher Symptome auf und zeigt hinsichtlich seiner Ausprägung zahlreiche Variationen (Wing, 1996). Der ICD 10 als international gebräuchliches Klassifikationssystem setzt die Manifestation folgender Symptome vor dem dritten Lebensjahr voraus (Weltgesundheitsorganisation, 1999): Manifestation von Auffälligkeiten in der rezeptiven oder expressiven Sprache, der Entwicklung selektiver sozialer Zuwendung oder der reziproken sozialen Interaktion, des funktionalen oder symbolischen Spielens vor dem dritten Lebensjahr. Daneben müssen folgende Kriterien erfüllt sein: Qualitative Auffälligkeiten der gegenseitigen sozialen Interaktion. Dazu zählen Blickkontakt, Mimik, Körperhaltung sowie die Unfähigkeit, Beziehungen zu Gleichaltrigen aufzunehmen, spontan Freude, Interessen oder Tätigkeiten mit anderen zu teilen. Qualitative Auffälligkeiten der Kommunikation Darunter werden die verspätete bzw. vollständig gestörte Entwicklung der gesprochenen Sprache, mangelnde Fähigkeiten in der verbalen Kommunikation und Stereotypien in der gesprochenen Sprache gefasst. Begrenzte, repetitive und stereotype Verhaltensmuster, Aktivitäten mit gewöhnlich mehreren stereotypen und begrenzten Interessen, die in Inhalt und Schwerpunkt abnorm sind; es kann sich aber auch um ein oder mehrere Interessen ungewöhnlicher Intensität und Begrenztheit handeln bzw. offensichtlich zwanghafte Anhänglichkeit an spezifische, nicht
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funktionale Handlungen, Rituale oder stereotype und repetitive motorische Manirismen sowie vorwiegende Beschäftigung mit Teilobjekten im Spiel.
1.1.12.4 Ursachen und Komorbidität
Dem autistischen Krankheitsbild werden eine Vielzahl ätiologischer Faktoren zugeschrieben. Die Mehrheit der Erkrankungen lässt sich jedoch nicht hinreichend auf einen einzigen ätiologischen Faktor zurückführen (Bailey et al., 1996; Gillberg und Coleman, 2000), obwohl Autismus zu den am intensivst erforschten Krankheiten der heutigen Kinder- und Jugendpsychiatrie zählt (Malhotra und Gupta, 1999). Trottier et al. beschrieben als „ätiologischen Konsens“ eine Mischung aus umweltbedingten frühen Schädigungen und genetischer Prädisposition (Trottier et al., 1999). Zur Zeit werden folgende Faktoren diskutiert: • genetische Einflüsse • zerebrale Schädigungen und Funktionsstörungen • biochemische Besonderheiten • Störungen kognitiver Prozesse und der Sprachentwicklung • Störungen der emotionalen Entwicklung (Remschmidt, 2002). Rutter fokussiert in einem jüngeren Artikel vor allem die Bedeutung der genetischen Einflüsse für die Pathogenese des Autismus (Rutter, 2005). Häufige komorbide Störungen sind unter anderem Konzentrations- und Aufmerksamkeitsdefizite im Sinne einer hyperkinetischen Störung, Selbstverletzungen, Störungen der Sauberkeitsentwicklung, Eß- und Schlafprobleme, Sprachdefizite, epileptische Anfälle in etwa 25 bis 40% der Fälle, intellektuelle Behinderung und Verzögerung der motorischen Entwicklung.
1.1.12.5 Therapie
Die derzeit zur Verfügung stehenden therapeutischen Möglichkeiten erlauben noch keine kurative Heilung der Patienten, sondern ermöglichen bislang nur die symptomatische Behandlung einzelner Krankheitssymptome, eine Unterstützung der Erkrankten im Alltag und eine Erleichterung ihrer Integration in die Gesellschaft, wenngleich die derzeit angewandten therapeutischen Interventionen eine zunehmend bessere Behandlung dieser Patientengruppe ermöglicht (Übersicht: Bodfish, 2004). Zur Verfügung steht neben pharmakotherapeutischen Interventionen ein breites Spektrum an unterschiedlichen Maßnahmen, unter anderem psychotherapeutische, Rehabilitations- und Eingliederungsmaßnahmen. Verhaltenstherapeutische Interventionen zielen beispielsweise darauf ab, autistische Patienten beim Erlernen sozialer Verhaltensmuster und beim Aufbau kommunikativer und sozialer Fertigkeiten zu unterstützen und störende Verhaltensmuster abzubauen (Steinhausen und von Aster, 1999). Besondere
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Bedeutung für den Verlauf der Krankheit hat die Frühförderung autistischer Patienten. Daneben werden zahlreiche therapeutische Verfahren wie Musiktherapie, Logopädie, sensorische Integration, auditorische Integration, Heilpädagogik, Spieltherapie bis hin zu neueren Verfahren wie der sehr kostenintensiven Delphintherapie angeboten (Übersicht bei Weiss, 2002). Pharmakologische Interventionsmöglichkeiten werden vor allem symptombezogen eingesetzt und müssen auf die individuelle Symptomatik des Patienten abgestimmt werden. Die Pharmakotherapie des Autismus sollte dabei nicht Monotherapie sein, sondern als Baustein in ein ganzheitlich therapeutisches Gesamtkonzept eingebunden werden (Remschmidt, 2002). Seit dem Beginn der Erforschung pharmakotherapeutischer Interventionen des Autismus in den 60er Jahren wurden zahlreiche Substanzen auf ihre Wirksamkeit bei Autisten untersucht. Dazu gehören auch LSD (lysergic acid diethylamide), Levodopa, Trijodthyronin, Imipramin unter anderem Zahlreiche Untersuchungen liessen das notwendige Mass an diagnostischer Präzision und ein adäquates Studiendesign vermissen. Trotz der Weiterentwicklung der pharmakologischen Methoden ist eine kurative Therapie im eigentlichen Sinne noch nicht möglich (zusammenfassend McDougle, 2002; Palermo und Curatolo, 2004). Im Folgenden sollen die wichtigsten pharmakologischen Ansätze zur Behandlung des Autismus beschrieben werden:
Opiatantagonisten (Naltrexon) Ende der 80er Jahre wurde das Potential des Opiatantagonisten Naltrexon untersucht. Die Behandlung autistischer Kinder mit Opiatantagonisten basiert auf der Annahme, dass eine Vielzahl autistischer Symptome wie z.B. vermindertes Schmerzempfinden, selbstverletzendes Verhalten, sozialer Rückzug, sowie die Unfähigkeit, Emotionen zu vermitteln. Tatsächlich konnte eine Erhöhung von Opiaten im Liquor autistischer Kinder festgestellt werden (Gillberg et al., 1985). Studien konnten den Nutzen von Naltrexon bei der Behandlung autistischer Kinder bislang jedoch nicht hinreichend nachweisen. Zwar zeigen sich beispielsweise bei Leboyer et al. und einigen zumeist kleineren open label Studien positive Wirkungen von Naltrexon, doch konnten grössere Studien einen Nutzen von Naltrexon auf die autistischen Kernsymptome nicht belegen (Leboyer et al., 1992; Willemsen-Swinkels et al., 1995).
Neuroleptika Die Anwendung von Neuroleptika, vor allem von Haloperidol, basiert auf der Annahme einer Beteiligung des dopaminergen Systems an der Pathogenese des Autismus. Neuroleptika blockieren vor allem postsynaptische Dopaminrezeptoren. Klinisch zeigt sich die Wirkung von Neuroleptika vor allem in einer Abnahme von Unruhe, Erregungszuständen, Stereotypien und sozialem Rückzug (Campbell et al., 1982). Der Einsatz von Haloperidol wird jedoch durch die hohe Rate von Spätdyskinesien (ca. 20 %) limitiert.
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Atypische Neuroleptika Wegen des geringeren Auftretens von Nebenwirkungen sind in den letzten Jahren die neueren, atypischen Neuroleptika verstärkt untersucht worden. Im Vergleich zu konventionellen Neuroleptika zeigen sie eine bessere Verträglichkeit, vor allem kommt es seltener zum Auftreten von Früh- oder Spätdyskinesien. Vor allem Clozapin, Risperidon, Olanzapin und Quetiapin wurden im Zusammenhang mit Autismus untersucht (McDougle et al., 2000). • Clozapin Nur wenige Studien haben bislang die Anwendung von Clozapin bei Autisten untersucht.
Clozapin wirkt vor allem auf 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT3, Dopamin D1-D4-Rezeptoren antagonistisch (McDougle, 2002). Angesichts risikoreicher Nebenwirkungen wie Agranulozytose und epileptischer Anfälle wird eine Medikation mit Clozapin im Zusammenhang mit Autismus jedoch kritisch betrachtet (McDougle, 2002). • Risperidon
Risperidon ist ein potenter 5-HT2A/D2- Antagonist. In mehr als 40 Studien wurde bislang seine Wirksamkeit beim Autismus untersucht. Die bislang umfangreichste Studie mit 101 Kindern (n=49 Risperidon; n=52 Placebo) zeigte vor allem ein gutes Ansprechen der Medikation auf aggressive Verhaltensstörungen und selbstverletzendes Verhalten bei geringer Nebenwirkungsrate (McCracken et al., 2002, positive Ergebnisse im Sinne einer Besserung der Verhaltensparameter bei guter Verträglichkeit zeigten sich bei Shea et al., 2004). Es liegen jedoch noch keine Langzeitstudien vor, die eine Aussage über die Langzeitwirkung von Risperidon auf autistische Kinder treffen können. • Quetiapin Quetiapin wurde bislang nur von zwei Gruppen untersucht: in einer open label-Studie untersuchten Martin et al. die Wirkung von Quetiapin an 6 männlichen Autisten im Alter von 6;2 bis 15;3 Jahren. Quetiapin zeigte nur bei 2 Kindern positive Effekte, während ein Kind epileptische Anfälle entwickelte, drei Kinder keine Response zeigten bzw. sediert wirkten (Martin et al., 1999). In der zweiten Studie (12 Wochen open-label-Studie, 9 Patienten im Alter von 10-17J) zeigte sich bei 2 von 9 untersuchten Kindern und Jugendlichen ein positives Ansprechen auf Seroquel (Findling et al., 2004).
Stimulanzien (Ritalin) Methylphenidat wird vor allem zur Behandlung des hyperkinetischen Syndroms eingesetzt. Hyperaktivität ist eine häufige komorbide Erkrankung des Autismus. Wenige kontrollierte Studien konnten anhand des Conners-Verhaltensbeobachtungsbogens positive Effekte von Methylphenidat bei Autisten belegen, während die autistische Symptomatik selbst jedoch unbeeinflusst blieb (McDougle,
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2002). Methylphenidat kann also bei einer Untergruppe autistischer Kinder mit komorbidem Auftreten einer Hyperaktivitätsproblematik hilfreich sein. Wegen einer möglichen Verstärkung der Rückzugssymptomatik sollte Methylphenidat vorsichtig eingesetzt werden (Handen et al., 2000). Serotoninwiederaufnahmehemmer (SSRI) Die Anwendung von SSRI bei autistischen Menschen erfolgte aus der Beobachtung heraus, dass die Anwendung von SSRI bei der Behandlung von Zwangsstörungen und motorischen Stereotypien förderlich sein kann (McDougle, 2002; Moore et al., 2004). Die Forschung hat bislang jedoch keine eindeutigen Beweise für die Wirksamkeit von SSRI bei der Behandlung des Autismus erbracht (McDougle, 2002), zumal die Zwangssymptomatik der Zwangsstörung nicht mit dem stereotypen Verhalten autistischer Menschen gleichgesetzt werden kann (McDougle et al., 1995). Autistische Stereotypien konnten in einer Studie mit Clomipramin positiv beeinflusst werden (Gordon et al., 1993), der Einsatz ist jedoch wegen des gehäuften Auftretens von Nebenwirkungen, unter anderem auch von extrapyramidalmotorischen Symptomen (Sokolski et al., 2004), vor allem bei jüngeren Kindern limitiert (McDougle, 2002). In einer Übersichtsarbeit beschreiben Moore et al. SSRI als im Einzelfall wirksame Therapie, deren Wirkung sich bei Autisten auf Stereotypien, soziale Interaktion, Umgang mit Veränderungen und Spannungen erstrecken kann (Moore et al., 2004). Zusammenfassend zeigt sich, dass die medikamentöse Therapie des Autismus noch nicht hinreichend erforscht ist und der Einsatz bisheriger Behandlungsmöglichkeiten im Einzelfall kritisch abgewogen werden muss, um das bei den meisten Stoffgruppen vorhandene Risiko der Entwicklung von zum Teil gravierenden Nebenwirkungen weitest möglich zu minimieren.
1.2 NEUROTRANSMITTER UND AUTISMUS
Bereits seit mehreren Jahrzehnten werden Neurotransmittersysteme im Kontext mit Autismus erforscht, wenngleich bis heute kein homogenes Bild aus der Literatur abzuleiten ist, da sich die einzelnen Studien zum Teil in ihren Aussagen deutlich widersprechen (Überischt Gillberg und Coleman, 2000). Gut belegt ist eine Verbindung zwischen Autismus und den Neurotransmittern Glutamat (Kap. 1.2.1), GABA (Kap. 1.2.2) und Serotonin (Kap. 1.2.4), für Katecholamine zeigen sich ebenfalls Hinweise für eine Beteiligung am Autismus (Kap. 1.2.3) (Übersicht bei Polleux und Lauder, 2004).
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1.2.1 GLUTAMAT
GLUTAMATERGE TRANSMISSION L-Glutamat ist neben L-Aspartat einer der wichtigsten exzitatorischen Neurotransmitter im ZNS. Glutamat und Aspartat zählen zu den nicht essentiellen Aminosäuren, d.h., sie werden vom Körper selbst synthetisiert und müssen nicht mit der Nahrung zugeführt werden. Die exzitatorische Wirkung von Glutamat auf zentrale Neuronen wurde erstmals in den 50er Jahren beschrieben (Hayashi, 1954), während es erst in den 80er Jahren gemeinhin als Neurotransmitter anerkannt wurde (Broman et al., 2000). Glutamat liegt in hohen Konzentrationen in weiten Bereichen des Gehirns vor. Glutamat und Aspartat sind neben ihrer Funktion als Neurotransmitter an einer Vielzahl von metabolischen Prozessen im Gehirn beteiligt: unter anderem dienen sie Zellen als Substrat für Energiemetabolismus und Proteinsynthese.
METABOLISMUS Der Metabolismus von Glutamat ist komplex und umfasst im Gehirn neben Neuronen auch Gliazellen (Broman et al., 2000). Glutamat kann über verschiedene metabolische Wege synthetisiert werden; dabei sind Synthese und Abbau von Glutamat direkt in den zerebralen Energiemetabolismus involviert: Glucose ist einer der wichtigsten Vorläufersubstanzen von Glutamat. Glucose tritt über die Bluthirnschranke in das Gehirn ein: ein Teil der Glucose wird glykolytisch von Astrozyten zu Laktat metabolisiert, welches in den Extrazellularraum freigesetzt und von Neuronen aufgenommen wird (Tsacopoulos und Magistretti, 1996). Derart sollen etwa 85-95 % der Serum-Glucose, die die Bluthirnschranke passieren, metabolisiert werden. Laktat wird wiederum von Neuronen aufgenommen und zu Pyruvat metabolisiert und tritt so in den sogenannten Zitrat-Zyklus ein. Eine Vielzahl von Aminosäuren wird aus Zwischenprodukten des Zitrat-Zyklus synthetisiert. Oftmals stammen die für die Synthese von Aminosäuren erforderlichen Aminogruppen von den Aminogruppenträgern Glutamat und Glutamin. Einige Aminosäuren werden über Transaminasereaktionen gebildet: Alanin wird aus Pyruvat, Aspartat aus Oxalacetat und Glutamat aus α-Ketoglutarat gebildet. Die Synthese von Glutamat besteht vorwiegend aus einer einstufigen Transaminierungsreaktion. α- Ketoglutarat wird zu Glutamat durch hoch aktive Transmaminasen metabolisiert, vor allem die Aspartattransaminase, die Aspartat als Aminogruppendonator, und die Alaninaminotransferase, die Alanin als Aminogruppendonator verwendet (Broman et al., 2000); daneben spielen auch andere Aminosäuren, unter anderem Leucin, als Aminogruppendonatoren eine Rolle (Yudkoff, 1997). Bei der Glutamatsynthetasereaktion wird Glutamat zunächst durch Reaktion mit ATP unter Bildung des Intermediärs γ-Glutamylphosphat aktiviert. NH3 verdrängt anschliessend die Phosphatgruppe und es entsteht Glutamin (Forth, 2004).
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In GABAergen Neuronen wird GABA in den sogenannten GABA-Shunt eingeschleust und zu GABA, Succinat-Semialdehyd und Succinyl-CoA metabolisiert. Glutamin wird zu Glutamat amidiert. Das vor allem in Astrozyten und Oligodendrozyten lokalisierte Enzym Glutaminsynthetase katalysiert dabei die Bildung von Glutamin aus Glutamat über eine Amidierungsreaktion (Broman et al., 2000). Beim Abbau werden die proteinogenen Aminosäuren, zu denen auch Glutamat gehört, in einem ersten Schritt zu den entsprechenden α-Ketosäuren umgewandelt, wobei der Aminostickstoff auf α- Ketoglutarat unter Bildung von Glutamat übertragen wird. Letzteres kann durch dehydrierende Desaminierung unter der Wirkung von Glutamat-Dehydrogenase zu Ammoniak und α-Ketoglutarat gespalten werden. Glutamat kommt eine wichtige Funktion bei der Speicherung von Gedächtnisinhalten, der Ausbildung neuronaler Strukturen wie Axonen und Dendriten und eine Beteiligung bei der Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen, beispielsweise der Alzheimerschen Demenz zu. Eine Mitbeteiligung an der Entstehung der Schizophrenie wird diskutiert (Dingledine et al., 1988; Monaghan et al., 1989; Lees, 1996; Ozawa et al., 1998). Freigesetztes Glutamat übt seine Wirkung über Glutamatrezeptoren aus, die im Gehirn von Säugetieren und auch dem Menschen in nahezu allen Strukturen des ZNS anzutreffen sind. Man unterteilt Glutamatrezeptoren in zwei verschiedene Klassen: • Ionotrope Glutamatrezeptoren sind an Kationenkanäle gekoppelt und bewirken eine direkte und schnelle synaptische Übertragung. Ionotrope Rezeptoren zeigen unterschiedliche Affinitäten zu verschiedenen synthetischen Agonisten. Nach der Affinität unterscheidet man drei Subgruppen o α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA)-Rezeptoren o N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren o Kainat-Rezeptoren • Metabotrope Glutamatrezeptoren wirken indirekt mittels intrazellulärer Botenstoffe. An allen Rezeptoren wirkt L-Glutamat agonistisch (Nakanishi, 1992). Aspartat ist ein gesicherter Agonist an Glutamatrezeptoren. Diskutiert werden daneben auch Cystein und Homocysteinsäure. Der einzige natürlich vorkommende Antagonist an Glutamatrezeptoren ist Kynurensäure, welche ebenfalls in Astrozyten synthetisiert wird.
GLUTAMAT UND AUTISMUS In der Literatur wird eine Beteiligung von Glutamat an mehreren Erkrankungen des ZNS beschrieben, darunter Schlaganfall, chronischer Schmerz, Depression, Drogenabhängigkeit, Epilepsie, Parkinson, Schizophrenie und seit einigen Jahren auch der Autismus (Trist, 2000). Eine exzessiv hohe Glutamatkonzentration hat einen toxischen Effekt auf die nachgeschaltete Zelle und kann deren
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Untergang bewirken (Atlante et al., 2001). Regionen des ZNS, denen in neuropathologischen oder bildgebenden Untersuchungen eine Funktion bei der Genese oder Aufrechterhaltung des Autismus zugewiesen werden, sind zugleich Ursprungsstellen für glutamaterge Neuronen (Cotman und Monaghan, 1987; McDonald, 1996). Mehrere Studien belegen erhöhte Glutamatplasmaspiegel bei Autisten: Moreno-Fuenmayor et al. fanden bei einer Untersuchung an 14 autistischen Kindern bei acht Kindern einen erhöhten Glutamatspiegel im Blut (Moreno-Fuenmayor et al., 1996, ähnlich bei Aldred et al., 2003 mit zusätzlicher Erhöhung der Plasmaspiegel von Phenylalanin, Asparagin, Tyrosine, Alanine und Lysin). Carlsson postuliert eine Beteiligung des glutamatergen Systems an der Genese des Autismus (Carlsson, 1998). In einer Metaanalyse untersuchte Carlsson die Daten von 24 Studien im Hinblick auf Parallelen zwischen den in der Literatur beschriebenen Verhaltensänderungen nach Gabe von
Glutamatantagonisten, Serotoninrezeptor 5-HT2A-Agonisten und den Symptomen autistischer Patienten. Sie fand dabei folgende Gemeinsamkeiten: • verzerrte visuelle/auditive/taktile und olfaktorische Wahrnehmung • herabgesetzte Schmerzempfindlichkeit • Störungen der Propriozeption, d.h., der Körperwahrnehmung • gestörtes Zeitempfinden • Schwierigkeiten in der Anpassung an neue Situationen • Depersonalisation • Stimmungsinstabilität, Angst, Panik • Sozialer Rückzug • Zeichen eines gesteigerten Sympathikotonus, wie z.B. gesteigerte Herzfrequenz Schwierigkeiten des Kurzzeit-/Ultrakurzzeitgedächtnisses, motorische Stereotypien, aggressive Verhaltensausprägungen sowie Blickstarre und Dystonie wurden bei Autisten und auch nach Gabe von Glutamatantagonisten beschrieben. Basierend auf diesen Beobachtungen stellte Carlsson 1998 die Hypothese auf, dass Autismus eine hypoglutamaterge Störung sei (Carlsson, 1998). Bei der Behandlung von Mäusen mit NMDA-Antagonisten wurden folgende auch bei Autisten auftretende Verhaltensauffälligkeiten beobachtet: ein eingeschränktes Verhaltensrepertoire und die Unfähigkeit, das einmal eingeschlagene Verhalten zu ändern (Carlsson und Carlsson 1989). NMDA- Rezeptor-Antagonisten erhöhen wiederum den Umsatz von Serotonin im ZNS (Waters et al., 1996). Weiterhin fand man bei an Monoamin verarmten Mäusen, bei denen durch Einsatz eines NMDA- Rezeptor-Antagonisten ein hypoglutamaterger Zustand hergestellt wurde, eine deutliche Response auf
LSD, d.h., einem 5-HT2A Rezeptor-Agonisten, im Sinne einer Stimulation der motorischen Ansprechbarkeit (Carlsson et al., 1999). Hollander beschreibt Ähnlichkeiten zwischen dem Verhalten Zwangserkrankter und dem ritualistischen, repetitiven Verhaltensmuster autistischer Patienten im
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Hinblick auf eine beiden Störungen gemeinsame Behandlungsmöglichkeit mit Serotoninwiederauf- nahmehemmern (Hollander, 1998). Vor allem im Hinblick auf die Bedeutung von Glutamat bei der Schizophrenie (Kim et al., 1981; Carlsson und Carlsson, 1990), der Zwangserkrankung (Carlsson, 2000) und möglicherweise beim Autismus (Carlsson, 1998) ist in diesem Zusammenhang die Frage nach dem Einfluss von Sekretin auf den Glutamatmetabolismus interessant.
1.2.2 GABA
GABAERGE TRANSMISSION γ-Aminobuttersäure (GABA) ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im ZNS und wird von ca. 30-40% aller Synapsen im Gehirn als Transmitter verwendet (Iversen und Bloom, 1972). Der GABA-Metabolismus wird vor allem durch zwei Pyridoxalphosphat-abhängige Enzyme kontrolliert: Glutamatdecarboxylase (GAD) und GABA-Transaminase (GABA-T). Die Biosynthese von GABA erfolgt durch Decarboxylierung von Glutamat durch das Enzym Glutamatdecarboxylase, wie bereits in Kapitel 1.2.1 beschrieben. Die GABA-Synthese ist heterogen und komplex: in Synaptosomen der Ratte wird GABA aus α-Ketoglutarat gebildet, während es in zerebralem Kortex und Hippokampus vor allem aus Glutamin gebildet wird (Kaneko, 2000). GABA wird zum Teil in benachbarten Gliazellen gespeichert und dort zu Glutamin metabolisiert, aus dem in der präsynaptischen Zelle bei Bedarf Glutamat gebildet werden kann. Mittels der GABA-Transaminase wird GABA zu Succinat-Semialdehyd katabolisiert, Succinat- Semialdehyd wiederum wird durch die Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase (SSAD) zu Succinat (Bernsteinsäure) oxidiert. GABAerge Projektionen werden hauptsächlich von Interneuronen ausgebildet. Es gibt allerdings auch sogenannte "long-axoned GABA cells", die beispielsweise vom Striatum in die Substantia nigra projizieren. Dysfunktionen des GABAergen Systems sind für die Entstehung zahlreicher neurologischer und psychiatrischer Krankheiten verantwortlich. Als Beispiele seien die Epilepsie, Erkrankungen aus dem schizophrenen Formenkreis und die Alzheimersche Demenz genannt.
GABA-Rezeptoren werden in verschiedene Klassen eingeteilt:
• Ionotrope GABAA- und GABAC-Rezeptoren
• Metabotrope GABAB-Rezeptoren (als Übersicht siehe Enna und Bowery, 1996). Im Zerebellum der Ratte fungiert Sekretin als retrograder Messenger und erleichtert die GABA- Transmission (Yung et al., 2001). Neben den glutamatergen Neuronen stellen die GABAergen Neuronen die dominierende Zellpopulation im Gehirn dar. Eine verminderte GABAerge Neuronen- und Rezeptordichte wird unter anderem im limbischen System und im Kortex schizophrener Patienten beschrieben.
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O
N H 2 NH2 NH2 N H 2 COOH Glutamat- COOH Glutaminase Decarboxylase COOH COOH Glutamin Glutamat GABA
Abbildung 5: Vereinfachte schematische Darstellung des Stoffwechsels von Glutamat und GABA
GABA UND AUTISMUS Dhossche et al. fanden bei autistischen Patienten im Alter von 5 bis 15 Jahren erhöhte GABA- Plasmaspiegel. Sie stellten die Hypothese auf, dass GABA zukünftig als diagnostischer Marker zur Erkennung des Autismus Verwendung finden könnte (Dhossche et al., 2002). Cohen beschrieb nach Einsatz des GABA-Agonisten Imipramin bei Autisten eine Reduktion des GABA-Plasmaspiegels um ein Drittel und beobachtete eine Verbesserung der verbal-kommunikativen Fähigkeiten und eine Milderung von repetitiv-stereotypen Verhaltensmustern (Cohen, 2002). Menold et al. fanden bei
Autisten Polymorphismen auf dem Gen, welches für die Untereinheit GABRG3 des GABAA- Rezeptors kodiert (Menold et al., 2001). Das Gen liegt auf Chromosom 15q11-q13, für das bereits in anderen Studien ein Zusammenhang mit dem Autismus aufgezeigt wurde (Martin et al., 2000; Bass et al., 2000; Buxbaum et al., 2002; Silva et al., 2002; Dykens et al., 2004; McCauley et al., 2004). Konträr dazu fanden Maestrini et al. keine Korrelation zwischen Chromosom 15q11-q13 und Autismus (Maestrini et al., 1999).
1.2.3 KATECHOLAMINE
Katecholamine sind biogene Amine, die als Gemeinsamkeit eine Dihydroxystruktur am Phenylring aufweisen. Die Synthese zum Noradrenalin erfolgt sowohl in den Vesikeln der Nervenendigungen von Neuronen, die Noradrenalin als Neurotransmitter freisetzen, als auch im Nebennierenmark. Die Lokalisation von monoaminergen Neuronen im Gehirn und damit auch eine detaillierte Beschreibung zerebraler monaminerger Stoffwechselwege wurde erst in den 60er Jahren durch die Entwicklung von histochemischen Fluoreszenzmethoden durch Hillarp et al. möglich (Falck et al., 1962). Mit dieser Technik gelang es Dahlström und Fuxe, monoaminerge Zellgruppen zu klassifizieren. Noradrenerge und dopaminerge Kernen bezeichneten sie mit dem Buchstaben A (A1-A7 bzw. A8-A15), während serotonergen Kerne der Buchstabe B (B1-B9) und adrenergen der Buchstabe C (C1-C3) zugeordnet wurde (Dahlström und Fuxe, 1964).
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KATECHOLAMINERGE TRANSMISSION Die für das Zentralnervensystem wichtigsten Katecholamine sind Noradrenalin, Dopamin und Adrenalin. Noradrenalin fungiert sowohl als Transmitter der postganglionär-sympathischen Neurone als auch als Neurotransmitter im ZNS. Noradrenerge Neuronen finden sich vor allem in Pons und Medulla oblongata mit grösster Dichte im Locus coeruleus. Noradrenalin ist an der Regulation des Schlaf-/Wachrhythmus, der Nahrungsaufnahme sowie an der Regulation von Kreislauffunktionen beteiligt (Forth et al., 2004). Adrenalin spielt als Neurotransmitter im ZNS im Vergleich zu Noradrenalin eine eher untergeordnete Rolle. Seine Neuronen finden sich vor allem in der Medulla oblongata.
1.2.3.1 Noradrenalin und Adrenalin
Katecholamine wirken sowohl auf das periphere als auch auf das zentrale Nervensystem exzitatorisch und inhibitorisch. Die vielfältigen Funktionen der Katecholamine reichen von der Atem-/ Kreislaufregulation bis hin zur Regulation der psychomotorischen Aktivität. Exzitatorische Effekte werden beispielsweise auf die glatte Blutgefässmuskulatur, inhibitorische Effekte unter anderem auf Magenwand und Bronchialbaum der Lungen ausgeübt.
SYNTHESE Erster Schritt bei der Synthese von Katecholaminen ist die Synthese der Aminosäure L-Tyrosin. L- Tyrosin wird in der Leber aus Phenylalanin unter Beteiligung der Phenylalaninhydroxylase synthetisiert. Tyrosin wird über die Bluthirnschranke zu katecholaminergen Neuronen transportiert. Das Enzym Tyrosinhydroxylase katalysiert in einem nächsten Schritt die Hydroxylierung von L- Tyrosin zu L-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA). Tyrosinhydroxylase findet sich in allen katecholaminproduzierenden Neuronen. L-DOPA wird dann durch die L-Aminosäuren Decarboxylase zu Dopamin decarboxyliert. Die Dopamin-β-Hydroxylase konvertiert Dopamin in Noradrenalin. Die Phenylethanolamin N-Methyl Transferase (PNMT) katalysiert schliesslich über eine N-Methylierung die Bildung von Adrenalin aus Noradrenalin. Katecholamine werden in präsynaptischen Vesikeln gespeichert. Sie werden großteils aus dem synaptischen Spalt in katecholaminerge Neuronen und Gliazellen wieder aufgenommen. Ein Teil des Noradrenalins, welches aus präsynaptischen noradrenergen Neuronen freigesetzt wird, wird über einen Wiederaufnahmemechanismus wieder in die Zelle aufgenommen.
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REZEPTOREN Katecholaminerge Rezeptoren werden nach Ahlquist in zwei Unterkategorien unterteilt, in α- und β- adrenerge Rezeptoren, die sich hinsichtlich ihrer Affinität für Adrenalin und Noradrenalin unterscheiden (Ahlquist, 1948). Sie gehören ebenfalls zu den G-Protein gekoppelten intrazellulären Rezeptoren. Alle vier Subtypen kommen sowohl in der Peripherie als auch im Zentralnervensystem vor. • α-adrenerge Rezeptoren werden unterteilt in:
o α1- Adrenozeptoren finden sich vor allem postsynaptisch an glatter Muskulatur und Myokardzellen und wirken dort i.S. einer Muskelkontraktion.
o α2- Adrenozeptoren sind präsynaptisch an postganglionären sympathischen, Noradrenalin freisetzenden und an Acetylcholin freisetzenden parasympathischen
Nervenfaserenden lokalisiert. Clonidin als α2-Rezeptoragonist z.B. wurde zur Behandlung der hyperaktiven Symptomatik bei Autisten untersucht, konnte sich jedoch auf Grund von Toleranzentwicklung nicht behaupten (Buitelaar und Willemsen-Swinkels, 2000) • β-adrenerge Rezeptoren stimulieren die Adenylatzyklase und werden unterteilt in:
o β1- Rezeptoren stimulieren das Herz, die Niere zur Freisetzung von Renin und die Lipolyse im Fettgewebe .
o β2- Rezeptoren mindern den Tonus glatter Muskulatur unter anderem in Bronchialtrakt und Uterus, sie steigern die Insulinfreisetzung im Pankreas, die Glykogenolyse in Leber und Skelettmuskel und die Lipolyse im Fettgewebe.
o β3- Rezeptoren sind funktionell in den Lipidmetabolismus involviert
ABBAU Wiederaufnahme von freigesetztem Noradrenalin in die Zelle ist der Hauptmechanismus beim Abbau von Katecholaminen. Über hoch affine Transporter werden Katecholamine in die Neuronen zurückgeschleust. Noradrenalin und Dopamin werden dabei hauptsächlich durch zwei Enzyme metabolisiert: • Die mitochondriale MAO (Monoaminoxidase) konvertiert Katecholamine in korrespondierende Aldehyde: o Noradrenalin wird zu Dihydroxymandelsäure (DOMA), o Dopamine zu Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) metabolisiert. • Die im Zytoplasma und im synaptischen Spalt vorkommende COMT (Katechol-O- Methyltransferase) methyliert eine der OH-Gruppen der Katecholamine.
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o Noradrenalin wird zum Endprodukt 3-Methoxy-4-Hydroxymandelsäure (=Vanillinmandelsäure, VMA) umgewandelt. o Dopamin wird über 3-Methoxy-Tyramin (3-MT) zu Homovanillinsäure (HVA) metabolisiert . COOH
N H 2 H O L-Tyrosin
Tyrosinhydroxylase
H O COOH
N H 2 H O COOH H O L-DOPA MAO/AldOx H O COMT Aromatische DOPAC Aminosäuren- Decarboxylase
H O CH OH NH CH OH NH 2 2 2 2 COOH COMT MAO/AldOx H O H O OH DOPAMIN 3-MT HVA
Dopamin- β -Hydroxylase OH
OH O OH H O OH C H O NH 2 CH OH H 2 CH OH 2 O CH2OH H O C MAO COMT H H O HO H O Noradrenalin DHPG MHPG
PNMT AldRed OH
H O NH OH CH 3 CH OH 2 H O COOH Adrenalin H O VMA Abbildung 6: Hauptstoffwechsel der Katecholamine AldDH=Aldehyddehydrogenase; AldOx= Aldehydoxidase; AldRed= Aldehydreduktase; COMT= Catechol-O- Methyltransferase; DHPG=3,4-Dihydroxyphenylglycol; MAO=Monoaminoxidase; MHPG=3-Methoxy-4- hydroxyphenylglycol; PNMT=Phenylethanolamin-N-methyltransferase, VMA= Vanillinmandelsäure.
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1.2.3.2 Dopamin
Dopamin bzw. Dihydroxyphenylethylamin ist einer der wichtigsten katecholaminergen Neurotransmitter im Gehirn von Säugetieren und des Menschen. Erst mit dem Nachweis von signifikanten Mengen von Dopamin im ZNS durch Montacu erlangte Dopamin Bedeutung als eigenständiger Neurotransmitter (Montacu, 1957). Dopamin kontrolliert eine Vielzahl von Funktionen: es hat unter anderem Teil an der Regulation von Lokomotion, Kognition, Emotionen und Nahrungsaufnahmen. In der Peripherie übt es vielfältige Wirkungen auf kardiovaskuläre Funktionen, Katecholaminfreisetzung, Hormonsekretion, Gefässtonus, Nierenfunktion und gastrointestinale Motilität aus. Dysfunktionen des dopaminergen Systems finden sich bei verschiedenen Erkrankungen, wie etwa dem Parkinson-Syndrom, dem Gilles-de la Tourette Syndrom und der Hyperprolaktinämie (Missale et al., 1998). Dopaminantagonisten werden unter anderem zur Behandlung der Schizophrenie eingesetzt. Dopamin-Rezeptoren sind G-Protein gekoppelte 7-TM-Rezeptoren. Beschrieben sind insgesamt 5 verschiedene Subtypen: D1-, D2-, D3-, D4- und D5-Rezeptoren. Die Dopaminrezeptoren unterscheiden sich vor allem hinsichtlich ihrer Wirkung auf das Second Messenger-System. D1- und D5-Rezeptoren stimulieren G-Protein gekoppelt die Adenylatzyklase. D2-, D3- und D4-Rezeptoren hemmen über G- Proteine die Adenylatzyklase oder öffnen K+-Kanäle (Forth et al., 2004). Dabei kann Dopamin seine eigene Freisetzung über präsynaptische D2-Autorezeptoren hemmen. Anteilmässig überwiegen D1- und D2-Rezeptoren. Dopamin selbst wirkt vor allem auf D1-, D2- und D3-Rezeptoren, während
Clozapin selektiv D4-Rezeptoren blockiert (Forth et al., 2004). Dopaminerge Neuronen sind vor allem im Mittel- und Zwischenhirn lokalisiert. Drei wichtige zentrale Systeme sind: das nigro-striatale Dopaminsystem: ist in der Substantia nigra lokalisiert und hemmt im Corpus striatum cholinerge Interneurone. Bei der Parkinsonkrankheit kommt es zur Degeneration dieses Systems. das mesolimbische Dopaminsystem: ist im Mittelhirn lokalisiert und projiziert zum limbischen System, zur zingulären und entorhinealen Hirnregion und zum Frontalhirn. Diesem System wird eine Beteiligung an Suchterkrankungen sowie auch an der Wirkung von Dopaminantagonisten zugeschrieben. das tuberoinfundibuläre System: ist im Nucleus infundibularis lokalisiert und projiziert in die Eminentia mediana. Dopamin gelangt von hier in die Adenohypophyse und wirkt dort inhibitorisch auf die Freisetzung von Prolaktin.
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SYNTHESE Wie in Abbildung 6 illustriert, ist die Dopaminsynthese eng mit der Synthese von Noradrenalin und Adrenalin verbunden: Dopamin ist unter anderem Vorläuferpeptid von Noradrenalin und Adrenalin. Geschwindigkeitslimitierender Schritt ist die Umwandlung von L-Tyrosin zu L-Dihydroxyphenyl- alanin (L-DOPA) durch das Enzym Tyrosinhydroxylase (TH). Die Tyrosinhydroxylase kommt nur im Nebennierenmark und in Katecholaminneuronen vor. Unter Einwirkung der aromatischen L- Aminosäuren Decarboxylase (=Dopadecarboxylase), die im Gegensatz zur Tyrosinhydroxylase ubiquitär im Körper vorkommt, wird L-DOPA zu Dopamin verstoffwechselt. Aus dem Axoplasma wird es in Vesikel transportiert.
ABBAU Ähnlich wie Noradrenalin und Adrenalin wird auch Dopamin aus dem Extrazellularraum in Zellen aufgenommen und hier entweder in Vesikeln gespeichert oder metabolisiert. Wie in Abbildung 6 graphisch dargestellt, wird Dopamin vor allem über zwei Enzyme metabolisiert:
• die mitochondriale Monoaminoxidase (MAO): man unterscheidet zwei Formen: MAOA und
MAOB. In katecholaminergen Nervenendigungen findet sich nur MAOA. • die zytoplasmale Catechol-O-Methyltransferase (COMT): sie fehlt in katecholaminergen Neuronen. (Forth et al., 2004) Hauptabbauprodukte von Dopamin sind: • 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) wird aus Dopamin in zwei Schritten gebildet: o MAO desaminiert Dopamin zum 3,4-Dihydroxyphenylaldehyd o unter Wirkung der Aldehydreduktase wird schliesslich DOPAC gebildet. • 3-Methoxytyramin (3-MT): Dopamin wird durch die COMT zu 3-MT methyliert. • Sowohl DOPAC als auch 3-MT können zu HVA metabolisiert werden: o DOPAC unter Beteiligung der COMT o 3-MT kann nach oxidativer Desaminierung und Oxidation des entstehenden Aldehyds zu HVA metabolisiert werden. Dieser Nebenweg spielt jedoch keine besondere Rolle im Abbau von Dopamin (Forth et al., 2004).
1.2.3.3 Katecholamine und Autismus
In der Literatur finden sich widersprüchliche Angaben zu Katecholaminen bei Autisten (Übersicht bei Polleux und Lauder, 2004). Lake et al. fanden bei Autisten im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte Plasmanoradrenalinspiegel (Lake et al., 1977). Minderaa et al. konnten diese Beobachtung nicht bestätigen (Minderaa et al., 1994). Erhöhte Plasmaspiegel an Adrenalin und Noradrenalin werden von Gillberg und Coleman berichtet (Gillberg und Coleman, 2000). Hollander et al. untersuchten die
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Wirksamkeit von Venlafaxin, einem Wiederaufnahmehemmer von Noradrenalin, Serotonin und in geringem Grade auch von Dopamin, an autistischen Patienten: sechs von zehn Patienten zeigten eine positive Response auf Venlafaxin in Bezug auf Stereotypien, soziale Defizite, Kommunikation, Sprechverhalten, Aufmerksamkeit und Hyperaktivität (Hollander et al., 2000). Ein signifikant höheres Verhältnis von Homovanillinsäure zu MHPG wurde in der Zerebrospinalflüssigkeit von autistischen Patienten gefunden, das Gillberg und Svennerholm auf ein Ungleichgewicht von dopaminergem und adrenergem System zurückführen (Gillberg und Svennerholm, 1987). Serumtyrosin, der Vorläufer von Noradrenalin, war bei autistischen Patienten mit neurologischer Begleitsymptomatik erhöht, nicht aber bei Autisten ohne neurologische Anzeichen (Visconti et al., 1994). Die Noradrenalinsynthese des Gehirns hängt von der Tyrosinkonzentration im ZNS ab, welche im Serum durch das molare Verhältnis von Tyrosin zu den Aminosäuren Tryptophan, Phenylalanin, Leuzin, Isoleuzin und Valin wiedergespiegelt wird (Voog und Eriksson, 1992). Eine mögliche Relevanz des dopaminergen Systems bei autistischen Patienten erschliesst sich aus Beobachtungen in tierexperimentellen Studien, dass das dopaminerge System eine tragende Rolle bei Hyperaktivität und stereotypen Verhaltensweisen spielt (Buitelaar und Willemsen-Swinkels, 2000). Ernst et al. berichteten 1997 beispielsweise über eine niedrige präfrontale dopaminerge Aktivität bei autistischen Kindern, während Gillberg und Svennerholm hohe Konzentrationen am Dopaminmetaboliten Homovanillinsäure in der Zerebrospinalflüssigkeit von autistischen Kindern angeben, was eine hohe Dopaminsynthese vermuten lässt (Gillberg und Svennerholm, 1987; Ernst et al., 1997). Pyridoxin (Vitamin B6) konnte bei einigen autistischen Kindern zu einer Symptommilderung durch Senkung des Dopaminspiegels über eine erhöhte DBH-Aktivität (DBH=Dopamin-ß-hydroxylase) führen (Gillberg und Coleman, 2000)- eine Verbindung zwischen DBH-Gen, DBH und Autismus wird in der Literatur disuktiert (Garnier et al., 1986; Robinson et al., 2001; Jones et al., 2004). Dopaminantagonisten wie beispielsweise Haloperidol können bei Autisten zur Verbesserung motorischer Stereotypien beitragen (Lewis, 1996).
1.2.4 SEROTONIN
Rapport und Mitarbeiter entdeckten in Hirnextrakten eine Substanz, die in peripheren Geweben eine vasokonstriktorische Wirkung entfaltete (Rapport et al., 1948). Auf Grund der vasoaktiven Wirkung bezeichneten sie diese Substanz als „Serotonin“. Serotonin beeinflusst die Aktivität einer Vielzahl physiologischer Systeme. Dazu gehören das kardiovaskuläre System, die Atmung, die Thermoregulation und auch eine Vielzahl von Verhaltensprozessen (Lucki, 1998). Serotonerge Neuronen finden sich zum grössten Teil im Hirnstamm. Sie werden nach Dahlström und Fuxe in 9 verschiedene Zellgruppen (Nomenklatur: B1-B9) unterteilt, die wiederum zu 2 Gruppen zusammengefasst werden (Dahlström und Fuxe, 1964):
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• eine inferiore Gruppe (B1-B4) (v.a. in Medulla oblongata: sie umfasst die Nulcei raphe magnus, obscurus und pallidus). • eine superiore Gruppe (B5-B9) innerviert den grössten Teil des Vorderhirns (Pons, Mesencephalon, Nucleus raphe medianus, Nuclues caudalis).
SYNTHESE UND METABOLISMUS 5-Hydroxytryptamin (5-HT, Serotonin) wird aus der Aminosäure Tryptophan über die Zwischenstufe 5-Hydroxytryptophan synthetisiert. Der Abbau von Serotonin erfolgt über die Monoaminoxidase zum Zwischenprodukt 5-Hydroxaindolacetaldehyd, welches wiederum mittels der Aldehydehydrogenase zum 5-Hydroxyindolacetat (5-HIAA) metabolisiert wird.
REZEPTOREN Für Serotonin sind sowohl G-Protein gekoppelte als auch Ionenkanal-Rezeptoren bekannt (Meyerhof et al., 1993). Bislang kennt man sieben Serotoninrezeptorgruppen mit insgesamt 15 Untergruppen (Aghajanian und Sanders-Bush, 2002).
FUNKTIONEN Die physiologischen Funktionen von Serotonin umfassen unter anderem die Regulation von kardiovaskulären Funktionen, zirkadianem Rhythmus, Futter- und Sexualverhalten, Schmerzempfindlichkeit, Lernen und Gedächtnis sowie Aggressionsverhalten (Lucki, 1998). Serotonin beeinflusst unter anderem Melatoninsynthese und Aldosteronregulation. Pharmakologisch kann der Serotoninhaushalt unter anderem über MAO-Inhibitoren, selektive Serotoninwiederaufnahmehemmer (SSRI) und Trizyklische Antidepressiva beeinflusst werden.
SEROTONIN UND AUTISMUS Serotonin wird eine Beteiligung an mehreren psychiatrischen Erkrankungen wie Depression, Schizophrenie und auch dem Autismus zugeschrieben (Cook und Leventhal, 1996; Lucki, 1998). Erhöhte Plasmaspiegel von Serotonin als funktionell wichtigem Neurotransmitter und an der embryonalen Hirnbildung beteiligtem Cofaktor wurden bei ca. 30% der untersuchten autistischen Personen gefunden (Gillberg und Coleman, 2000; Buitelaar und Willemsen-Swinkels, 2000). Schain et al. wiesen bereits 1961 eine Hyperserotoninämie bei Autisten nach (Schain und Freedman, 1961). Im Gehirn autistischer Kinder findet sich im Vergleich zu gesunden Kindern ein höherer Serotoninspiegel (Chugani et al., 1999). Pharmakologische Interventionen mit Serotoninwiederaufnahmehemmern oder mit kombinierten Dopamin-(D2) und Serotoninantagonisten wie Risperidon zeigen gute Ergebnisse in der Behandlung einzelner Symptome des autistischen Krankheitsbilds (Buitelaar und Willemsen- Swinkels, 2000; McCracken et al., 2002). Die genaue Rolle von Serotonin beim Autismus ist jedoch bislang noch ungeklärt.
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HO HO NH2 NH2
Aromatische COOH NH Aminosäuren - NH Decarboxylase 5-Hydroxytryptophan 5-Hydroxytryptamin
Tryptophan-5- MAO Hydroxylase
HO NH 2 CHO
COOH NH NH
Tryptophan 5-Hydroxyindolacetaldehyd
Aldehyd- dehydrogenase
HO COOH
NH
5-Hydroxyindolessigsäure Abbildung 7: Hauptstoffwechsel von Serotonin
1.3 CARNITIN UND ACYLCARNITINE
STRUKTUR UND FUNKTION Carnitin (β-Hydroxy-g-Trimethylammoniumbutyrat) ist ein wasserlösliches Molekül, welches in der Natur als weit verbreiteter Bestandteil vieler höherer Organismen vorkommt. 1905 wurde es erstmals aus Fleischextrakt isoliert, 1927 wurde seine Struktur aufgedeckt, 1952 wurde seine essentielle Rolle bei der β-Oxidation von langkettigen Fettsäuren beschrieben (Bremer, 1983). In biologischen Flüssigkeiten und Geweben findet man Carnitin - als freie Form, als sog. Freies Carnitin, - und in veresterter Form, den sog. Acylcarnitinen Der Anteil des veresterten Carnitins kann in Abhängigkeit von äußeren Bedingungen wie Ernährung, Trainings- oder Gesundheitszustand deutlich variieren. Den größten Anteil an den Carnitinestern nimmt Acetylcarnitin ein (Engel und Rebouche, 1984). Von den beiden Enantiomeren (D und L) ist nur das L-Enantiomer biologisch aktiv.
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SYNTHESE UND METABOLISMUS Carnitin wird vor allem mit Fleisch und Fisch aus der Nahrung aufgenommen (Rebouche et al., 1992), aber auch endogen aus proteingebundenem Lysin und Methionin in Leber, Hirn und Nieren synthetisiert (Vesci et al., 1995). Carnitin wird im Säugetierorganismus bis auf einen kleinen Anteil, der von Darmbakterien verstoffwechselt wird, nicht metabolisiert (Bieber, 1988). Sowohl endogene Substanzen als auch viele Xenobiotika bilden mit Carnitin spezifische Konjugate, die über den Urin ausgeschieden werden können (Quistad et al., 1986).
FUNKTIONEN Funktionell kommt Carnitin und den Acylcarnitinen vor allem eine Schlüsselfunktion bei der mitochondrialen Fettsäureoxidation zu, durch die Fettsäuren in Energie umgewandelt werden. In einem ersten Schritt werden Fettsäuren vom Zytosol in die Mitochondrien transportiert. Dabei wird zunächst durch Aktivierung der Fettsäuren mit Coenzym A und Kopplung an Carnitin Acylcarnitin gebildet. Dieser Prozess wird auch „Carnitin-Shuttle“ genannt . Mehrere Enzyme sind am Transport der Fettsäuren in die mitochondriale Matrix beteiligt: • Carnitin-Palmityl-Transferase I • Carnitin-Acylcarnitin-Translokase • Carnitin-Palmityl-Transferase II besteht. Bei der β-Oxidation werden die langen Kohlenstoffketten der Fettsäuren in Acetyl-CoA-Einheiten gespalten, welche anschließend in den Zitratzyklus eingeschleust und zu FADH2 und NADH metabolisiert werden. Die in FADH2 und NADH gespeicherte Energie wird durch die oxidative Phosphorylierung zur Produktion von ATP, also zur Energiegewinnung genutzt. Der Zitratzyklus nimmt an fast allen Prozessen teil, durch die Zellen aus Nährstoffen Energie erzeugen (Voet et al., 2002). Der Anteil der β-Oxidation ist in Neuronen des Zentralnervensystems im Vergleich zu peripheren Geweben jedoch gering. Weitere Funktionen von Carnitin sind die Entgiftung und Elimination selektiver Acyl-Reste, die Modulation der intrazellulären CoA-Homöosatase und der Transport von Acyl-Einheiten in die Mitochondrien. Störungen des Fettsäure- und Aminosäurestoffwechsels werden in der Mehrzahl durch mitochondrial lokalisierte Enzymdefekte verursacht, haben in der Regel eine eingeschränkte metabolische Energiegewinnung zur Folge und führen häufig bereits im Neugeborenen- oder Kleinkindalter zu schweren Stoffwechselentgleisungen (Gempel et al., 1999), unter anderem wird auch eine Beteiligung am plötzlichen Kindstod diskutiert (Perper und Ahdab-Barmada, 1992).
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1.4 HIPPOKAMPUS
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt einer peripheren Sekretinapplikation auf den Neurotransmitterstoffwechsel im Hippokampus untersucht. Als ein im Zusammenhang mit Autismus interessantes Areal wurde der Hippokampus gewählt, da er sowohl an der Verhaltenssteuerung als auch an wichtigen kognitiven Leistungen wie Gedächtnis und Lernen beteiligt ist. Darüber hinaus konnten auch bei autistischen Patienten strukturelle Veränderungen des Hippokampus aufgezeigt werden (Aylward et al., 1999; Leontovich et al., 1999; Otsuka et al., 1999, zusammenfassend Bauman und Kemper, 2005).
1.4.1 ANATOMIE
Der Hippokampus bildet den äusseren Ring des limbischen Systems. Er wird üblicherweise in drei Teile unterteilt: • Der Hippokampus proper (bestehend aus: CA1, CA2 und CA3) • Der Gyrus dentatus, das Subiculum, das Präsubiculum, das Parasubiculum und der
entorhinale Kortex werden als HIPPOKAMPALE FORMATION zusammengefasst und zeichnen sich durch eine C-förmige Struktur im Gehirn aus. Sie zieht von den rostrodorsal gelegenen Septumkernen des basalen Vorderhirnes über und hinter das Diencephalon nach ventrocaudal in den Temporallappen (Amaral und Witter, 1989). Eine Besonderheit der hippokampalen Formation liegt im schichtartigen Aufbau der axonalen Verbindungen. Außerdem liegen die oben genannten Regionen hintereinander, was zur Ausbildung eines Schaltkreises führt. Schon die 1911 durchgeführten Golgi- Studien von Ramón y Cajal und die Untersuchungen von Lorente de Nó gaben Auskunft über die Projektionen in der hippokampalen Formation (Lorento de Nó, 1933; 1934). Weitere Arbeiten von Blackstad et al., Hjorth-Simonsen und Amaral und Witter trugen zum weiteren Verständnis der hippokampalen Formation mit ihrem zellulären Aufbau und ihren axonalen Verbindungen bei (Blackstad et al., 1970; Hjorth-Simonsen, 1973; Amaral und Witter, 1989).
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Abbildung 8: Darstellung des Hippokampus im Rattenhirn (Quelle: Amaral und Witter, 1989)
1.4.2 FUNKTION
Dem Hippokampus kommt nach heutiger Ansicht eine maßgebliche Rolle bei der Speicherung von Gedächtnisinhalten sowie der Ausprägung von Emotionen zu. • Der Hippokampus ist zusammen mit benachbarten Arealen des Temporallappen an der Objekterkennung beteiligt. • Besondere Bedeutung hat der Hippokampus bei der Speicherung von Rauminhalten, wie sie etwa für die Bewegung im dreidimensionalen Raum notwendig sind. o Dabei kommt dem rechten Hippokampus die Aufgabe der Repräsentation der dreidimensionalen Umwelt im Gehirn zu. Gleichzeitig dient er auch der Orientierung, indem er ermöglicht, bereits gespeicherte Rauminformationen abzurufen. o Die Speicherung von Sprachinformationen, Menschen oder Objekten obliegt dagegen mehr dem linken Hippokampus (Kandel et al., 2000). Darüber hinaus wird dem Hippokampus eine Schlüsselfunktion bei der Konstruktion von komplexen und flexiblen Bedeutungsinhalten zugesprochen. Der Hippokampus diene im späteren Leben der Modifikation und der Erweiterung dieser Funktionen. Finde sich im Laufe der Entwicklung eine Schädigung des Hippokampus, so komme es zu typischen autistischen Symptomen (DeLong, 1992). Frühe Theorien über die zentrale Kontrolle der Emotionen sahen den Hippokampus als Hauptkoordinationsstelle zwischen Kortex und Hypothalamus an. Heute jedoch wird diese Funktion vor allem den Amygdala zugesprochen. Der Hippokampus dient hier vor allem als Schnittstelle zwischen Assoziationskortex und Amygdala, d.h., er fungiert als Relaisstation der aufgenommenen Informationen zur Weiterverarbeitung in den Amygdala (Kandel et al., 2000).
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1.4.3 HIPPOKAMPUS BEI AUTISTISCHEN PATIENTEN
Einige Autoren sehen den Hippokampus als Sitz der Primärlesion bei autistischen Patienten (Boucher und Warrington 1976, DeLong, 1992). DeLong stellte die Hypothese auf, dass Autismus Folge einer Entwicklungsstörung des Hippokampus sei. Danach ist der Hippokampus für die Entwicklung von Sprachsyntax, Semantik und für die Bildung von Sprache zuständig. Dem Hippokampus komme dabei eine besondere Rolle bei der Integration von Erfahrung und Lernen zu (DeLong, 1992). Aylward et al. fanden bei 14 autistischen Jugendlichen und Erwachsenen kleinere Volumina von Amygdala und Hippokampus vor (Aylward et al., 1999). Sparks et al. fanden in einer MR-Untersuchung an 45 autistischen Patienten einen beidseitig vergrößerten Hippokampus und Amygdala bei insgesamt vergrößertem zerebralem Durchmesser vor (Sparks et al., 2002). Piven et al. fanden dagegen in einer Magnetresonanzstudie kein signifikant verändertes Hippokampusvolumen bei einer Gruppe von 36 autistischen Patienten im Vergleich zur aus 35 Probanden bestehenden Kontrollgruppe (Piven et al., 1998). Schumann et al. dagegen beschrieben eine Lateralisierung der Hippokampusvergrösserung in Abhängigkeit vom zusätzlichen Vorhandensein einer geistigen Behinderung: der rechte Hippokampus war bei autistischen Kinder sowohl mit als auch ohne geistige Behinderung, der linke Hippokampus war nur bei autistischen Kindern ohne geistige Behinderung vergrössert (Schumann et al., 2004). Rojas et al. beschrieben eine signifikante Vergrösserung des Hippokampus bei Autisten und deren Eltern im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe (Rojas et al., 2004). Einen Versuch der Subkategorisierung von autistischen Kindern anhand unterschiedlicher MRI Befunde der Hippokampus- und Amygdalaregion unternahmen jüngst Hrdlicka et al. (Hrdlicka et al., 2005). Blatt et al. zeigten im Rahmen einer quantitativen autoradiographischen Studie eine signifikante Reduktion der GABAergen Rezeptoren im Hippokampus bei autistischen Patienten auf (Blatt et al., 2001). Mehrere Autoren beschrieben eine erhöhte Zelldichte und eine reduzierte Neuronengröße bei autistischen Patienten (Bauman und Kemper, 1985; Abell et al., 1999; Otsuka et al., 1999; Bauman und Kemper, 2005). Man fand im Hippokampus autistischer Patienten eine verminderte Anzahl von CA 4- Neuronen und reduzierte dendritische Verzweigungen an CA 4- und CA 1-Neuronen, die nach Ansicht von DeLong und anderen Autoren Ausdruck einer eingeschränkten Hirnreifung sein könnten und zu einer veränderten Verarbeitung von sensorischen Informationen, Gedächtnisinhalten führen könnten (DeLong, 1992; Raymond et al., 1996). DeLong und Heinz beschrieben vier Kinder mit bilateraler hippokampaler Sklerose, die trotz adäquater motorischer und sensorischer Funktionen deutliche Auffälligkeiten in Sprachentwicklung (bzw. bereits erworbene Sprachfähigkeiten wieder verloren), der Entwicklung sozialer Fähigkeiten und im Anpassungsverhalten zeigten (DeLong und Heinz, 1998). In einer weiteren Studie wurden jungen Ratten Verletzungen am Hippokampus bzw. an den Amygdalae am Tag 7 bzw. 21 nach der Geburt zugefügt. Vor allem die 7-Tage-Gruppe entwickelte Verhaltensauffälligkeiten in Form von motorischen Stereotypien und herabgesetztem
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Angstverhalten. Daenen et al. folgerten daraus, dass spezifische Verletzungen von Hippokampus oder Amygdala als potentielle Tiermodelle des Autismus fungieren könnten (Daenen et al., 2002). Mori et al. untersuchten 29 autistische Patienten im Alter von 5 bis 15 Jahren mittels Protonenmagnet- resonanzspektroskopie und verglichen die Ergebnisse mit einer Kontrollgruppe. Bei Autisten fand sich unter anderem eine signifikant reduzierte Signalintensität in der linken hippokampal-amygdaloiden Region (Mori et al., 2001). Saitoh et al. beobachteten bei Autisten im Alter von 29 Monaten bis 4 Jahren eine signifikant verkleinerte Area dentata (Saitoh et al., 2001).
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2 ZIEL DER VORLIEGENDEN ARBEIT
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die bislang nur wenig erforschte Wirkung von i.p appliziertem Sekretin auf den Stoffwechsel verschiedener Neurotransmitter zu untersuchen. Basierend auf der Veröffentlichung über die Wirksamkeit von Sekretin bei autistischen Patienten (Horvath et al., 1998) und vor dem Hintergrund der bisher weitgehend unerforschten Funktion von Sekretin im zentralen Nervensystem soll die vorliegende Arbeit zum tieferen Verständnis der Funktionen von Sekretin im ZNS beitragen. Ein weiteres Anliegen dieser Arbeit war, die Suche nach dem bislang physiologisch und biochemisch nicht geklärten Wirkmechanismus von Sekretin bei autistischen Patienten zu unterstützen, um im Interesse dieser Patienten und deren Angehörigen einen Beitrag zur Erforschung des therapeutischen Potentials von Sekretin zu leisten. Mittels Mikrodialysetechnik sollte der Stoffwechsel von Neurotransmittern unter dem Einfluss von i.p. appliziertem Sekretin im Hippokampus der Ratte untersucht werden. Die Mikrodialysetechnik erlaubt ein in vivo-Monitoring der extrazellulären Stoffwechselprozesse von Neurotransmittern. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag dabei auf der Erforschung der Wirkung von Sekretin auf die wichtigsten exzitatorischen und inhibitorischen Neurotransmitter Glutamat und GABA sowie auf serotonerges, dopaminerges und noradrenerges Neurotransmittersystem. Die Auswahl fiel auf diese Neurotransmittersysteme, da sich in der Literatur Hinweise finden, die eine Beteiligung der von uns untersuchten Neurotransmitter an Entstehung und Entwicklung des autistischen Krankheitsbilds annehmen lassen. Darüber hinaus basieren mehrere pharmakotherapeutische Behandlungsansätze auf der Annahme eines gestörten Gleichgewichts verschiedener Transmittersysteme bei Autisten: unter anderem stellte Carlson 1998 (Carlsson, 1998) die Hypothese auf, dass Autismus eine hypoglutamaterge Erkrankung sei und stützte seine Hypothese mit Ergebnissen tierexperimenteller Untersuchungen (Carlsson et al., 1999). Auf Grund der Heterogenität der Erkrankung und auch der bislang ungeklärten Frage nach ihren Entstehungsmechanismen existieren bislang nur Ansätze für Tiermodelle des Autismus. Daher wurden die tierexperimentellen Untersuchungen an der gesunden Lewis-Ratte durchgeführt. Der Hippokampus wurde gewählt, da er sowohl an der Verhaltenssteuerung als auch an wichtigen kognitiven Leistungen wie Gedächtnis und Lernen beteiligt ist. Darüber hinaus konnten auch strukturelle Veränderungen des Hippokampus bei autistischen Patienten aufgezeigt werden (Hoon und Reis, 1992; Aylward et al., 1999; Leontovich et al., 1999; Otsuka et al., 1999).
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3 MATERIAL
3.1 CHEMIKALIEN
• γ-Aminobuttersäure (GABA), Sigma A 5835, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • 1-Butanol, Best.Nr. 1.01990.1000, Merck, Darmstadt • 1-Octansulfonsäure Natriumsalz Monohydrat (EC No. 2261954), Fluka 74884, Fluka- Chemie, Neu-Ulm • 3,4-Dihydroxyphenlyessigsäure (DOPAC), Sigma D 9128, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • 3-Methoxytyramin HCL Hydrochlorid (3MT), ICN 84376, ICN Biomedicals GmbH, Eschwege • 4-Hydroxy-3-Methoxy-Mandelsäure, Sigma H 0131, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • 4-Hydroxy-3-Methoxy-Phenylessigsäure (HVA), Sigma H 1252, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • 4-Hydroxy-3-Methoxyphenyl-Glykol (MHPG), Sigma H 1377, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • 5-Hydroxyindol-3-Essigsäure (5-HIAA), Sigma H 8876, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • 5-Hydroxytryptamin (Serotonin), Sigma H 7752, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • Acetonitril, Best.Nr. 1.00030.2500, Merck, Darmstadt • Acetylchlorid, Best.Nr. 1.00031.025, Merck, Darmstadt • Adrenalin (4- (1-Hydroxy-2-(methylamino)ethyl)-1,2,-benzenediol), Sigma E 1635, Sigma- Aldrich GmbH, Deisenhofen • Ameisensäure 98 %, Best.Nr.1.00264, Merck, Darmstadt • Amino Acid Referente Standard, Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Andover, USA • Calciumchlorid- Dihydrat zur Analyse, Best.Nr. K1.02382.0500, Merck, Darmstadt • DL-Aspartat, Sigma A 9006, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • DL-Noradrenalin, Fluka 74470, Fluka- Chemie, Neu- Ulm • Free Carnitine and Acylcarnitine Reference Standards, Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Andover, USA • Kaliumchlorid zur Analyse, Best.Nr. 4936.0500, Merck, Darmstadt • L-3,4-Dihydroxyphenyl-Alanin (L-DOPA), Sigma D 9628, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • L-Glutamat, Sigma G 1251, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • Methanol, Merck, Best.Nr. S1.06007.2504, Merck, Darmstadt
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• Natriumacetat Anhydrat, Best.Nr. 1.06268, Merck, Darmstadt • Natriumchlorid zur Analyse, Best.Nr. K785404, Merck, Darmstadt • Neo Gen stable isotope Kit A, Cambridge Isotope Laboratories, Cambridge, USA • Ortho- Phosphorsäure 85%, Best.Nr. 1.00573.1000, Merck, Darmstadt • Perchlorsäure 70%, Best.Nr. 30755, Riedel-de Häen, Seelze • Ringer-Lösung, (8,6g NaCl/l, 0,3g KCl/l, 0,33g CaCl/l), Best.Nr. 1829.99.99, Delta Pharma, Pfullingen • Salzsäure, Best.Nr. 109057, Merck, Darmstadt • Titriplex III (Ethylendinitrilotetraessigsäure, Dinatriumsalz-Dihydrat), Best.Nr. 1.08418.0100, Merck, Darmstadt • Triethylamin, Sigma T 0886, Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen • Zitronensäure– Anhydrat, Best.Nr. 1.00247.1000, Merck, Darmstadt
3.2 VERWENDETE HPLC-SÄULEN
• Supelcosil LC 18, 150 x 4,7 mm, Korngrösse 3 µm, Best.Nr. 58985, Supelco, Deisenhofen • Varian Chrompack Chrom Super 5 B, 100 x 3 mm, Best.Nr. 28224 (Column No. 143020) mit Vorsäule (10x2 mm), Best.Nr. CP 28141, Varian, Darmstadt • Vertex HPLC-Säule, 125 x 3 mm, gefüllt mit Nucleosil 120, C 18 Säule mit 3µm Partikelgrösse mit integrierter Vorsäule, Best.Nr. B607 Y 98, Knauer, Berlin
3.3 EINGESETZTE GERÄTE UND ZUBEHÖR
Mikropräzisionswaagen (Sartorius AG, Göttingen) • Scaltec Mikropräzisionswaage SBC 22 • Scaltec Mikropräzisionswaage SBC 51 Reinstwasseranlage (Millipore GmbH, Eschborn) • Millipore Milli-Q gradient • Millipore Quantum™ Cartridge, Best.Nr. QTUM000EX • Millipore Filter HAWP04700 0,45 µm, White HYWP, 47 mm HPLC Pumpen & Zubehör • Waters HPLC Pumpe 501, Waters, USA • Waters HPLC Pumpe 510, Waters, USA • Thermo-Finnigan Thermoquest P100, Thermo Finnigan, San José, USA • Gynkothek, Dionex P 680 Pumpe, Gynkothek, München • Degaser GT 103, Gynkothek. München
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• Thermoquest, P/N 625-20, SS-Tubing 1,59 mm x ID 50mm, Thermo Finnigan, San Jose, USA • Rheodyne Einspritzventil mit 20 µl Schleife (Metallkapillare), Rheodyne, USA • Hamilton Spritze 50µl, Hamilton- Bonaduz, Schweiz Pipetten • Feinpipetten der Fa. Eppendorf: 10µl, 20µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 500 µl, 1000 µl, Eppendorf, Hamburg • Feinpipetten der Fa. Gilson: Pipetman 100µl, 200µl, 1000 µl, Gilson ABIMED, Langenfeld • Ratiolab Pipetta 2, 1000µl, Ratiolab, Dreieich • Pipettieraufsätze der Fa. Eppendorf, Hamburg pH-Meter • pH-Meter WTW pH 530 mit pH-Elektrode, WTW, Weinheim • pH-Pufferlösungen der Fa. Merck, Darmstadt o pH 4,0: Best.Nr. 1.09475.0500 o pH 7,0: Best.Nr. 1.09477.0500 o pH 9,0: Best.Nr. 1.09476.0500 • Kalium-Chlorid-Lösung (3mol/l), Best.Nr. 22040, Zitt Thoma, Freiburg Elektrochemischer Detektor (Antec Leyden, Leiden (NL) • Elektrochemischer Detektor Antec Leyden intro mit • Elektrochemische Flowcell Antec Leyden VT 03 mit glassy carbon Elektrode • Referenzelektrode Antec Leyden Typ Ag/AgCl Magnetrührer (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen) • IKAMAG Reo Reagenzglasschüttler • Vibrofix VF1, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen • Whirlomixer, Scientific Industries International, New York, USA Verbrauchsmaterialien • 50 ml Zentrifugen Röhrchen, Labcon, San Rafael, CA 94901 USA • Duran-Glasbehälter, Messzylinder und Glaskolben von Fa. Schott, Mainz • Falcon Blue Max konische Röhrchen, 15 ml, Becton Dickinson, Frankreich • Gewindeflasche 5 ml, Best.Nr. VT 1101211, A-Z Analytik, Langen • Pasteurpipetten 150mm, Best.Nr. 747715, Brand GmbH & Ko KG, Wertheim • Wico M, 8 mm Schraubkappe, WIC 43950, Wicom GmbH, Heppenheim
- 43 - MATERIAL ______
Ultraschallbad (Bandelin electronic, Berlin) • Bandelin Sonorex RK510 S Mikrodialysegeräte und Zubehör (CMA Microdialysis, Schweden) • Mikrodialysepumpe CMA 100 • Stativ zum Halten der Mikrodialyseinjektionsnadel. • Vials • Tubing Adapter • FEP-Tubing, 1,2µl *100m • Mikrodialysespritze Exmire Typ 1 Tandem-MS • PE Sciex Api 365, LC-MS/MS • Autosampler Perkin Elmer Series 200 • Software (Applied Biosystems, Langen): Analysesoftware: Analyst Software Auswertungssoftware: Chemoview Verdampfer (Pierce Reacti Therm, Rockford, USA) • Heating module Papierschreiber • ABB SE 120 Papierschreiber, ABB Goerz/Metrawatt, Österreich Gaschromatographie-Ofen • Kelvitron T, Heraeus Instruments, USA HPLC-Software • Millenium, Waters, USA Weitere Software • C-Design 3.0 Chemie-Zeichenprogramm • Microsoft Word 8.0, Textverarbeitung, Microsoft, USA • Microsoft Excel 8.0 Tabellenkalkulation, Microsoft, USA • Jandel-Scientific Sigmaplot V
- 44 - METHODEN ______
4 METHODEN
Von den in Kapitel 4 beschriebenen Methoden wurden die im Folgenden Genannten durchgeführt von: • Herr PD Dr. Clement führte die tierexperimentellen Untersuchungen in der Abteilung für chirurgische Forschung der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg durch. • Die Durchführung der Messungen mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion im Neurochemischen Labor der Abteilung für Kinder- und Jugendpsychiatrie der Universitätsklinik Würzburg unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Gerlach wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit veranlasst. Dennoch sollen diese Methoden im Einzelnen beschrieben und deren Ergebnisse als Teil dieser Arbeit aufgeführt werden, da sie im Fall der tierexperimentellen Untersuchungen grundlegender Baustein für diese Arbeit waren und das Verständnis der Techniken für die Interpretation der vorliegenden Ergebnisse von fundamentaler Bedeutung ist. Zum anderen konnten die Analysen mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion nicht selbständig durchgeführt werden, da die technischen Voraussetzungen hierzu nicht vorlagen.
4.1 HERSTELLEN DER ELUENTEN FÜR HPLC
Vorbereitung der Eluentenherstellung • In der Reinstwasseranlage werden 5l Reinwasser vorbereitet. • Die Mikropräzisionswaagen werden kalibriert. • Der pH-Meter wird mit Kalibrationslösungen auf pH 4, 7 und 9 eingestellt.
4.1.1 HPLC-ELUENT 1
Inhaltsstoffe
4,2l Reinwasser, 41,015g Na-Acetat Anhydrat, 2,11g Octansulfonsäure Monohydrat, 0,088g Na2-
EDTA (x2 H20), 100 % Essigsäure, 800ml Methanol, Filterpapier der Porengrösse 0,45µm. Herstellen des Eluenten a) Abwiegen von 41,015g Na-Acetat Anhydrat, 2,11g Octansulfonsäure Monohydrat und
0,058g Na2-EDTA (x2 H20). b) Auflösen der Substanzen in ca. 4,2l Reinwasser in einem 5l Becher. c) Die Lösung wird auf dem Magnetrührer durchmischt. d) Die pH-Elektrode wird am 5l-Becher fixiert, der pH wird unter Rühren gemessen. e) Der pH wird mit 100 % Essigsäure auf 4,38 eingestellt. f) Es werden 800ml 16 % Methanol hinzugefügt und mit der Lösung vermischt.
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g) Die Lösung wird filtriert (Filtergrösse mit Porenweite 0,45µm). h) Der Eluent wird in 1- oder 2l Duran Flaschen abgefüllt. i) Der Eluent wird über 30min. im Ultraschallbad entlüftet. j) Der Eluent wird über 2-3 Wochen bei ca. 4°C gelagert.
4.1.2 HPLC-ELUENT 2
Inhaltsstoffe
4,2l Reinwasser, 33,5g Zitronensäure Anhydrat, 37,0g Na-Acetat Anhydrat, 1,25g Na2EDTA (x2 H20), 0,50g Octansulfonsäure Monohydrat, 200ml Methanol, Filterpapier der Porengrösse 0,45µm. Herstellen des Eluenten
a) Abwiegen von 33,5g Zitronensäure Anhydrat, 22,30g Na-Acetat Anhydrat, 1,25g Na2EDTA
(x2 H20) und 0,5416g Octansulfonsäure Monohydrat. b) Auflösen der Substanzen in 5l Reinwasser in einem 5l Becher. c) Die Lösung wird auf dem Magnetrührer durchmischt. d) Die pH-Elektrode wird am 5l-Becher fixiert, der pH wird unter Rühren gemessen. e) Der pH wird mit 100 % Essigsäure auf 4,15 eingestellt. f) Es werden 800ml Methanol hinzugefügt und mit der Lösung vermischt. g) Die Lösung wird filtriert (Filtergrösse mit Porenweite 0,45µm). h) Der Eluent wird in 1- oder 2l Duran Flaschen abgefüllt. i) Der Eluent wird über 30min. im Ultraschallbad entlüftet. j) Der Eluent wird über 2-3 Wochen bei ca. 4°C gelagert.
4.1.3 HPLC-ELUENT 3
Inhaltsstoffe
4,2l Reinwasser, 0,5g Na2EDTA (x2 H20), 0,7041g Octansulfonsäure Monohydrat, 30ml Triethylamin, Orthophosphorsäure 85 %, 175ml Acetonitril, Filterpapier der Porengrösse 0,45µm. Herstellen des Eluenten
a) Abwiegen von 0,5g Na2 EDTA (FW: 372,2 g/mol) und 0,7041g Octansulfonsäure Monohydrat (FW: 234,29 g/mol). b) Auflösen der Substanzen in 5l Reinwasser in einem 5l Becher. c) Hinzufügen von 30ml Triethylamin. d) Die Lösung wird auf dem Magnetrührer durchmischt. e) Die pH-Elektrode wird am 5l-Becher fixiert, der pH wird unter Rühren gemessen. f) Der pH wird mit konzentrierter 85% Orthophosphorsäure auf pH=2,85 eingestellt. g) Die Lösung wird filtriert (Filtergrösse mit Porenweite 0,45µm).
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h) Der leere 5l Messkolben wird mit 175ml Acetonitril angefüllt. i) Die Kolbenflasche wird mit dem filtrierten Eluenten bis zur 5l-Marke gefüllt. j) Der Eluent wird in der Kolbenflasche bei 500U/min. ca. 10min. auf dem Magnetrührer durchmischt. k) Der Eluent wird in 1- oder 2l Duran Flaschen abgefüllt. l) Der Eluent wird über 30min. im Ultraschallbad entlüftet. m) Der Eluent wird über 2-3 Wochen bei ca. 4°C gelagert.
4.1.4 HPLC-ELUENT 4
Inhaltsstoffe 4,2l Reinwasser, 41,015g Na-Acetat Anhydrat, 2,11g Octansulfonsäure Monohydrat, 0,088g
Na2EDTA (x2 H20), 100% Essigsäure, 800ml Methanol, Filterpapier der Porengrösse 0,45µm. Herstellen des Eluenten a) Abwiegen von 41,015g Na-Acetat Anhydrat, 2,11g Octansulfonsäure Monohydrat und
0,058g Na2-EDTA (x2 H20). b) Auflösen der Substanzen in ca. 4,2l Reinwasser in einem 5l Becher. c) Die Lösung wird auf dem Magnetrührer durchmischt. d) Die pH-Elektrode wird am 5l-Becher fixiert, der pH wird unter Rühren gemessen. e) Der pH wird mit 100% Essigsäure auf 4,93 eingestellt. f) Es werden 800ml Methanol hinzugefügt und mit der Lösung vermischt. g) Die Lösung wird filtriert (Filtergrösse mit Porenweite 0,45µm). h) Der Eluent wird in 1- oder 2l Duran Flaschen abgefüllt. i) Der Eluent wird über 30min. im Ultraschallbad entlüftet. j) Der Eluent wird über 2-3 Wochen bei ca. 4°C gelagert.
4.2 EINFÜHRUNG IN DIE MIKRODIALYSE
4.2.1 ENTWICKLUNG DER MIKRODIALYSE
Die Untersuchung neurochemischer Prozesse geht bis ans Ende des 19. Jahrhunderts zurück, die Entwicklung des in-vivo Monitoring von neurochemischen Prozessen hat ihren Ursprung in den 50er Jahren. Der Begriff „Dialyse“ entstammt dem griechischen Wort „dialysis“, welches mit „Auflösen“, „Loslösen“ übersetzt werden kann. Grundsätzlich ist die Dialyse ein Verfahren zur Abtrennung niedermolekularer von hochmolekularen Teilchen aus Lösungen mit Hilfe einer semipermeablen
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Membran, die die Passage von Molekülen bis zu einer membranabhängigen Maximalgrösse vom Ort höherer zum Ort niedrigerer Konzentration erlaubt. Dabei ermöglicht die Mikrodialyse das in vivo- Monitoring verschiedenster Substanzen im Extrazellularraum der meisten Gewebe und Organe, unter anderem auch im Gehirn. Die Mikrodialyse wurde aus einer Reihe von Vorstufen der Mikrodialyse, unter anderem der Push- Pull-Kanüle der Voltametrie entwickelt. Die in den frühen 60-er Jahren entwickelte Push-Pull-Kanüle gestattete als erste Technik, neurochemische Prozesse im intakten Gehirn zu untersuchen. Aus der Push-Pull-Kanüle entwickelte sich in mehreren Zwischenschritten die moderne Mikrodialyse. Als eine der ersten Gruppen beschrieben Bito et al. die Mikrodialyse als Möglichkeit, freie Aminosäuren und Elektrolyte mittels einer semipermeablen Membran direkt aus Blut und zerebraler Extrazellulärflüssigkeit von Hunden zu sammeln (Bito et al., 1966). Die Idee, innerhalb eines Organismus ein künstliches Milieu zu schaffen, deren Zusammensetzung weitestgehend mit der ihrer extrazellulären Umgebung übereinstimmt, war richtungsweisend für die weitere Entwicklung der Mikrodialysetechnik. Wenige Jahre später entwickelten Delgado et al. die sog. Dialytrode, eine Kanüle mit einem kleinen, permeablen Säckchen am Ende, die den heutigen Dialysesonden bereits sehr ähnlich war: sie bestand aus zwei parallelen Metallröhrchen, die zusammen die sog. „push-pull-Kanüle“ bildeten (Delgado et al., 1972). Der entscheidende Vorstoss in der Entwicklung der Mikrodialysetechnik gelang der schwedischen Arbeitsgruppe um Ungerstedt (Ungerstedt, 1984; Ungerstedt und Pycock, 1974). Ungerstedt führte erstmals die Verwendung von Dialysesonden ein, die durch Kopfhaut und Schädelknochen direkt in das ZNS eingeführt werden konnten. Parallel zur Mikrodialyse wurde eine analytische Methode in Form der HPLC entwickelt, die über genügend Sensitivität verfügte, um die Messung von endogenen Katecholaminen zu ermöglichen. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der Mikrodialysetechnik von der zunächst noch sehr einfach gestalteten Hohlkanüle mit hohem Verletzungsrisiko der umgebenden Strukturen zum heutigen wesentlich atraumatischeren doppelröhrigen Mikrodialysekatheter stellt der heutigen Forschung ein effizientes Verfahren zum in vivo-Monitoring von Neurotransmittern zur Verfügung. Gegenüber älteren Modellen des in-vivo Monitorings von Neurotransmittern erlaubt die Mikrodialyse auch die Messung an frei beweglichen Tieren. Die Mikrodialyse kann auch zur Einleitung von Pharmaka oder anderen Substanzen verwandt werden. Mittels der Mikrodialysetechnik ist es möglich, in pharmakokinetischen Studien eine Korrelation der extrazellulären Konzentrationen einer oder mehrerer Substanzen zu Verhalten und auch zu metabolischen Veränderungen aufzuzeigen (Blanco et al., 2001). Die Membran verhindert einen direkten Kontakt zwischen Perfusionsflüssigkeit und Hirngewebe und stellt somit auch einen Schutz gegen Infektionen oder andere Turbulenzen dar. Als Nachteil der Technik kann wie bei jeder invasiven Technik die Traumatisierung des umgebenden Gewebes gesehen werden. Eine korrekte Operationstechnik ist daher für die Sammlung des Dialysats und auch die spätere Auswertung entscheidend (De Boer und Abercrombie, 1996).
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4.2.2 PRINZIPIEN DER MIKRODIALYSE
Der Mikrodialyse liegt ein Stoffaustausch zwischen zwei Kompartimenten mit unterschiedlichen Konzentrationsgradienten einzelner Substanzen nach dem Prinzip der Diffusion zugrunde (Benveniste und Hansen, 1991). Voraussetzung ist, dass der Stofftransport zwischen den Kompartimenten vor allem durch einen Diffusionsprozess ausgelöst wird (Benveniste und Hansen, 1991). Zunächst wird eine Mikrodialysesonde invasiv in das zu untersuchende Gewebe eingebracht: sie besteht aus einem doppellumigen Tubussystem, welches an seiner Spitze von einer feinen, semipermeablen Membran umgeben wird (vgl. Abbildung 9 und Abbildung 10). Die Mikrodialysesonde wird kontinuierlich von einer sogenannten Perfusionslösung durchspült: dabei handelt es sich um eine Lösung, die im Vergleich zur Extrazellulärflüssigkeit des umgebenden Gewebes möglichst isoton sein soll, um einen Nettofluss einzelner Substanzen zwischen Perfusat und Extrazellulärflüssigkeit zu verhindern. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Mikrodialysesonde mit isotoner Ringer-Lösung perfundiert, da diese von ihrer Zusammensetzung weitgehend dem Milieu der extrazellulären Flüssigkeit im umgebenden Hirnparenchym entspricht (Benveniste et al., 1984; Linthorst et al., 1994). Die Perfusionsflüssigkeit selbst sollte keine der zu untersuchenden Substanzen enthalten, um eine Verfälschung der Messergebnisse zu vermeiden. Ort der Diffusion ist die semipermeable Membran: aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzung beider Flüssigkeiten entsteht ein Konzentrationsgradient einzelner Substanzen zwischen Perfusat und Extrazellulärflüssigkeit, der eine Diffusionsbewegung der Moleküle durch die Dialysemembran vom Ort höherer zum Ort niedrigerer Konzentration auslöst. Die Porengrösse der semipermeablen Membran ist dabei entscheidend, welche Moleküle zwischen beiden Kompartimenten ausgetauscht werden. Durch die Wahl der Parameter der Dialysemembran, vor allem der Porengrösse, kann eine Verunreinigung der Matrix der Probe weitgehend vermieden werden, zugleich wird auch eine sehr sensitive Analyse der Proben möglich. Der Diffusionsprozess wird in vivo zusätzlich durch folgende Faktoren beeinflusst: • Diffusion im umliegenden Gewebe • Temperatur • Gewebeschädigungen • aktive Elimination durch Metabolismus oder Aufnahme der Substanz in die Zelle. Über einen Auslassschlauch wird das Perfusat in Vials aufgefangen und anschliessend der Analytik zugeführt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das Dialysat in Fraktionen zu je 25µl in Mikrodialysevials aufgefangen, anschliessend bei –80°C eingefroren und später mittels HPLC bzw. Tandem-MS analysiert.
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Einlass Auslass
Stahlschaft
Sondenspitze mit Membran
Abbildung 9: Schematische Abbildung 10: Prinzip der Mikrodialyse und Implantation Abbildung einer Mikrodialysesonde der Mikrodialysesonde (modifiziert nach: www.microdialysis.se) Dargestellt wird eine Mikrodialysesonde, welche mit Zahnzement auf der Schädeloberfläche befestigt wird. Über die Einflussöffnung fliesst das Perfusat bis zur Spitze der Sonde. Hier diffundieren Substanzen durch eine semipermeable Membran und werden im Mikrodialysat durch die Ausflussöffnung nach aussen geleitet. Charakteristisch für die Mikrodialysesonde ist die Doppelröhren- konstruktion (modifiziert nach: Hernandez et al., 1986).
4.3 IN VITRO-MIKRODIALYSE
4.3.1 GRUNDLAGEN
Die „Wiederfindungsrate“ (englisch: „recovery“) ist eine entscheidende Grösse bei der Interpretation von Mikrodialysemessungen. Unter der „Wiederfindungsrate“ versteht man das Verhältnis zwischen den Konzentrationen einer Substanz in der durch die Mikrodialyse gewonnen Probe und einem Vergleichsmedium (Benveniste, 1989; Benveniste und Hansen, 1991). Die Dialyseeigenschaften der Mikrodialysesonden variieren in Abhängigkeit von der untersuchten Substanz und deren Diffusionseigenschaften. Bei der Mikrodialyse wird kein tatsächliches Konzentrationsgleichgewicht zwischen Dialysat und Extrazellulärflüssigkeit erreicht (Benveniste et al., 1989), unter konstanten experimentellen Bedingungen kann für die Recovery jedoch nahezu ein steady state erreicht werden. Die relative Recovery repräsentiert eine konstante Fraktion extrazellulärer Flüssigkeit und kann durch in vitro Recovery Experimente bestimmt werden (Clement et al., 1998). Sie wird berechnet als Quotient aus der Konzentration der Substanz im Dialysat und der Konzentration der Substanz im untersuchten Medium.
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Konzentration der untersuchten Substanz im Mikrodialysat Relative Recovery= Konzentration der untersuchten Substanz im untersuchten Medium Gleichung 1: Formel zur Bestimmung der relativen Recovery
Da dieser Prozess von einer einfachen Diffusion abhängig ist, ist die Transferrate durch die Membran unter konstanten experimentellen Bedingungen äquivalent für alle Konzentrationen.
Die Recovery einer Mikrodialysemessung wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst: • sie ist in der Regel direkt proportional zum Diffusionskoeffizienten der jeweiligen Substanz • sie steigt bei sinkender Perfusionsrate • sie ist direkt proportional zur Grösse und zum Porendurchmesser (englisch: „cut off") der Membran • sie ist temperaturabhängig: man geht davon aus, dass der Diffusionskoeffizient pro Zentigrad Celsius etwa um 1-2% ansteigt (Benveniste et al., 1989; Benveniste und Hansen, 1991). • sie ist abhängig von der Länge der Sonde Die absolute Recovery bezeichnet die pro Zeiteinheit gemessene Gesamtmenge einer Substanz. Die absolute Recovery steigt mit zunehmender Mikrodialyse-Flussrate an (Petersen, 1997; Hashimoto et al., 1998). Mit Hilfe der in vitro Recovery können unter anderem die optimale Flussrate sowie die relative Recovery nach Experimenten bestimmt werden; weiterhin können auch die individuellen quantitativen und qualititativen Unterschiede zwischen einzelnen Mikrodialysesonden erfasst werden.
4.3.2 VERSUCHSAUFBAU UND -BEDINGUNGEN
Mikrodialysepumpe: CMA 100, CMA Microdialysis, Schweden, Flussrate: 1,25 µl/min. Mikrodialysekanüle und -zubehör: CMA Probe 12, mit Verbindungsschläuchen, Eppen- dorfröhrchen, Standardsubstanzen für NA, MHPG, DOPAMIN, DOPAC, 3-MT, 5-HT, 5-HIAA, HVA, GABA, Glutamat, Aspartat, 75% Ethanol, Ringer-Lösung. Temperatur: Raumtemperatur von 22°C. Stativ von Stereotaxiegestell als Halterung für die Mikrodialysekanülen.
VERSUCHSDURCHFÜHRUNG Vor Beginn der Messungen wurden die Mikrodialysesonden vom Typ CMA 12 jeweils an einem Stativ befestigt und anschliessend über 20min. mit Ringer-Lösung perfundiert. Dann wurde bei kontinuierlichem Fluss von 1,25µl/min (CMA 100 Mikrodialysepumpe) das Standardgemisch
- 51 - METHODEN ______dialysiert. Das Dialysat wurde in jeweils neun Fraktionen à 25µl pro Mikrodialysesonde gesammelt und anschliessend entweder direkt analysiert oder bis zur Analyse bei –80°C tiefgefroren.
4.4 TIEREXPERIMENTELLE GEWINNUNG DER PROBEN
VERSUCHSTIERE Die Experimente wurden ausschließlich mit männlichen, 10-12 Wochen alten Lewis-Ratten durchgeführt (Gewicht ca. 250-375g; Charles River, Germany). Die Tiere wurden bis zu den Versuchen im Tierraum bei einer Temperatur von +21 ± 1°C in Kunststoffkäfigen gehalten. Die Regulation der Beleuchtung wurde dabei an einen 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus mit Hellphasen von 6.00h bis 18.00h angepasst. Die Ratten hatten Zugang zu Wasser und Futter ad libitum. Die Experimente wurden in der Hell-Phase durchgeführt.
4.5 IN VIVO MIKRODIALYSEVERSUCHE
4.5.1 VORBEREITUNG
VORBEREITUNG DES STEREOTAXIEGESTELLS Vor Versuchsbeginn werden die Injektionskanüle in einem Makromanipulator fixiert, dessen Position sich mittels einer Nonius-Skala auf 0,1mm genau ablesen lässt. Die Spitze des Makromanipulators wird dabei genau auf den interauralen Nullpunkt des Stereotaxiegestells eingestellt. Die Koordinaten der drei Bewegungsrichtungen werden anschliessend notiert (A steht dabei für anterior, L für lateral und V für Vertikal). Die ermittelten Daten werden später als relativer Nullpunkt zu den aus dem Stereotaxieatlas ermittelten absoluten Daten addiert (Paxinos und Watson, 1982).
VORBEREITUNG DER TIERE Die Tiere werden direkt vor Beginn der Operation durch eine 3,8% Isofluran-Inhalationsnarkose in einer verschlossenen Glasbox unter Zufuhr von Sauerstoff betäubt. Nach der Anästhesie werden die Tiere im Stereotaxiegestell fixiert. Mit Hilfe einer Beatmungsmaske wird die Anästhesie durchgeführt. Am vorderen Ende der Beatmungsmaske befindet sich ein Zuleitungsschlauch, durch welchen ein Gemisch aus Sauerstoff und Isofluran (2%) geleitet wird, um die Narkose für die Dauer der Operation aufrecht zu erhalten. Isofluran wird von den Tieren gut vertragen und wird weithin bei in vivo Mikrodialyseversuchen verwendet (Patel et al., 1994).
4.5.2 DURCHFÜHRUNG DER OPERATION
Die Kopfhaut wird desinfiziert und durch einen Mediansagittalschnitt von den Augen bis hinter die Ohren eröffnet, aufgeklappt und mittels Arterienklemmen seitlich fixiert. Anschliessend wird die
Galea aponeurotica und das Periost mit dreiprozentigem H2O2 entfernt. Dies dient gleichzeitig als
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Wundreinigung. Die auftretenden Blutungen werden durch Verödung der Gefässe gestillt. Das Zielgebiet wird auf dem Schädel des Tieres markiert, mittels einer Minibohrmaschine mit Ringbohrer wird dann ein kreisrundes Loch von etwa 2mm in das markierte Zielgebiet gebohrt und anschliessend wird der Knochendeckel mit Hilfe einer Pinzette abgehoben. Dann wird eine Mikrodialysesonde mit Hilfe eines Manipulators auf das Stereotaxiegestell aufgesetzt und unter Sicht vorsichtig bis wenige mm über die Dura abgesenkt. Mit Hilfe einer Führungskanüle wird die CMA 12 Mikrodialysekanüle (Länge 1,0 mm, Durchmesser 0,24 mm, Carnegy Medicine, Sweden) in den linken Hippokampus vorgeschoben. Zur Lokalisation der Implantationsposition dienen dabei die Koordinaten von Paxinos und Watson (Paxinos und Watson, 1982): A: 5,2 mm; L: 2,0mm; V: 6,5mm. Die gesamte Operation wird unter Isofluran- Anästhesie (2%) durchgeführt. Zur Fixierung der Kanüle dienen zwei Schrauben, welche in den Schädelknochen geschraubt werden, sowie Prothesenkunststoff.
4.5.3 DURCHFÜHRUNG DER MESSUNGEN
Als Perfusionsmittel wurde isotone Ringer-Lösung verwendet (NaCl 140mM; KCl 3,0mM; CaCl2
1,2mM; MgCl2 1,0mM; Pudovkina et al., 2001), die mit einer Flussrate von 1,25µl/min. perfundiert wurde. Die Experimente begannen unmittelbar nach Ende der Operation. Während der Messungen konnten sich die Ratten in einem runden, halbkugelförmigen, oben geöffneten Gefäss frei bewegen.
Abbildung 10: CMA/120 System für frei bewegliche Versuchstiere Das Dialysat wurde in Fraktionen von je 25µl im Abstand von jeweils 20min. gesammelt. Nach jeweils sechs Fraktionen wurde den Versuchstieren intraperitoneal Sekretin (Secrelux, Goldham) in einer Dosierung von 30U/kg Körpergewicht verabreicht, was 8,7µg Sekretinpentahydrochlorid/kg Körpergewicht entspricht. Der Kontrollgruppe wurde Kochsalzlösung appliziert. Nach der Injektion wurden nochmals sechs Fraktionen gesammelt. Nach Ende eines Versuchs wurden die Versuchtiere jeweils in einem Glasbehälter durch die
Einleitung von CO2 getötet. Um die richtige Positionierung der Kanüle zu überprüfen, wurde den Tieren das Hirn entnommen und eingefroren. Serielle Koronarschnitte mit einer Schichtdicke von 20µm wurden mit Cresylviolett gefärbt. Anhand der Färbung wurde die Position gemäss den Angaben des Atlas von Paxinos und Watson bestimmt (Paxinos und Watson, 1982).
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4.6 HPLC
4.6.1 GRUNDLAGEN
HPLC (high pressure liquid chromatography) gehört zu den chromatographischen Trennverfahren. Die Chromatographie ist ein Trennverfahren, durch das Substanzgemische in einzelne Bestandteile aufgetrennt werden, die dann in einem zweiten Schritt detektiert werden können. Mit Hilfe der Chromatographie ist eine Auftrennung verschiedener Substanzen sowohl nach qualitativen als auch quantitativen Gesichtspunkten möglich. Dabei wird ein Probengemisch mittels einer Pumpe zwischen zwei Phasen im chromatographischen Bett (Trennsäule) verteilt: eine Hilfsphase ruht (Stationäre Phase), eine zweite (Mobile Phase) strömt daran im chromatographischen Bett vorbei. Die ruhende oder auch Stationäre Phase bezeichnet ein zur „Adsorption“ fähiges Material in Form von festen Teilchen, behandelten Oberflächen oder flüssigkeitsbelegten Trägern. Als strömende oder auch Mobile Phase bzw. Elutionsmittel wird bei der Flüssigkeitschromatographie eine Flüssigkeit, bei der Gaschromatographie ein Gas verwendet. Grundlage der chromatographischen Trennung ist, dass einzelne in der mobilen Phase gelöste Substanzen in der stationären Phase charakteristische Wanderungsgeschwindigkeiten zeigen, die auf eine unterschiedliche Affinität der einzelnen Substanzen zur stationären Phase zurückgeführt werden können. Daraus ergeben sich für die einzelnen Substanzen unterschiedliche Retentionszeiten innerhalb der stationären Phase, anhand derer die Substanzen dann nach Detektion durch einen Detektor identifiziert werden können. Eine Quantifizierung ist über eine Berechnung der Fläche bzw. der Höhe des jeweiligen Peaks möglich (Meyer, 1999).
4.6.2 HPLC–INSTRUMENTATION
Ein einfaches isokratisches HPLC–System besteht aus folgenden Komponenten (isokratisch bezeichnet die konstante Zusammensetzung des Elutionsmittels, der Mobilen Phase während der Chromatographie. Davon zu unterscheiden ist das Gradientenprinzip, bei welchem sich während der Arbeiten das Elutionsmittel durch Zumischen anderer Komponenten verändert): Basis einer HPLC-Einheit ist die HPLC-Säule (Stationäre Phase), deren Aufgabe die Trennung der Substanzen ist, während Aufgabe der übrigen Einheiten die Bereitstellung und Aufrechterhaltung von gleichbleibenden chromatographischen Bedingungen, der Detektion der Substanzen sowie Erfassung und Auswertung der Daten ist.
- 54 - METHODEN ______
PUMPE Mit Hilfe einer Pumpe wird das Elutionsmittel mit den darin gelösten Probenbestandteilen durch das System gepumpt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Doppelkolbenpumpe verwendet. Der Einsatz einer Doppelkolbenpumpe hat den Vorteil, dass die Flussrate auch gegen hohen Druck sehr gleichmäßig gesteuert werden kann. Das Fliessmittel wird hierbei direkt von einem aus Saphir bestehenden Kolben verdrängt. Bei der Doppelkolbentechnik arbeiten zwei durch eine Exzenterscheibe voneinander getrennte Saphirkolben reziprok zueinander, wodurch ein kontinuierlicher Fluss des Elutionsmittels gewährleistet werden kann. Da die Flussrate des Elutionsmittels während der Messungen konstant sein muss, um korrekte reproduzierbare Messergebnisse zu erhalten, wurde die an der Pumpe eingestellte Flussrate regelmäßig überprüft, indem vor den Messungen während einer definierten Zeit t=10 min. der Fluss des Elutionsmittels in einem Messzylinder gemessen und die Flussrate anschliessend in ml/min berechnet wurde.
PULSATIONSDÄMPFER Da trotz der Zweikolbentechnik Restpulsationen bestehen bleiben, welche durch das reziproke Arbeiten der Kolben entstehen und bei der elektrochemischen Detektion stören würden, wurde zwischen Pumpe und Detektor ein Pulsationsdämpfer eingebaut, welcher sich aus einem druckfesten Edelstahlbehälter und einer integrierten Membran zusammen setzt, um die Pulsationen nach dem Prinizp des Windkessels zu dämpfen und so für einen gleichmässigen Fluss zu sorgen. Der Pulsationsdämpfer war mit Elutionsmittel gefüllt.
INJEKTIONSSYSTEM Um die zu untersuchenden Proben in das System einbringen zu können, wurde ein Sechswege- Rheodyne-Injektionsventil verwendet, welches die Injektion einer Probe mittels Hamilton-Spritze in eine Probenschleife eines definierten Volumens, hier 20µl, gestattet. Durch Umschalten des Sechswege-Ventils wird die Probe in den Eluentenkreislauf und somit in die Säule gespült. Wichtig ist, stets einen Probenüberschuss in den Probengeber zu spritzen, um eine Kontamination der analytischen Säule mit Luft zu vermeiden.
ANALYTISCHE SÄULE Zur chromatographischen Trennung wurde eine Trennsäule von 15cm Länge und 4,6mm Durchmesser (Supelcosil LC 18, Supelco) verwendet. Die Stahlsäule war mit Reversed phase Silica 1 der Partikelgröße 3µm als stationärer Phase gefüllt.
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PROBEN UND STANDARDS Bei den Messungen wurden regelmäßig wässrige Standardlösungen eingesetzt, die mit Aqua bidest bzw. 70% Perchlorsäure (HClO4) als Verdünnungslösung hergestellt wurden. Die im Rahmen der Messungen verwendeten Standards wiesen dabei folgende Konzentrationen auf:
SUBSTANZ KONZENTRATION 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) 200pg/20µl DL-Noradrenalin 200pg/20µl Adrenalin 200pg/20µl Dopamin 200pg/20µl 5-Hydroxyindol-3-Essigsäure (5-HIAA) 200pg/20µl 4-Hydroxy-3-Methoxy-Phenylessigsäure (HVA) 200pg/20µl 5-Hydroxytryptamin (Serotonin) 500pg/20µl 3-Methoxytyramin HCL Hydrochlorid (3-MT) 500pg/20µl
Tabelle 4: Konzentrationen der in der Standard-Lösung enthaltenen Substanzen
Für die In vitro-Rückgewinnungsversuche mit GABA und Glutamat wurden Standards mit folgenden Konzentrationen verwendet. • GABA (γ-amino-Buttersäure): 16,7ng/20µl • L-Glutamat: 167ng/20µl Sämtliche Lösungen und Proben wurden bei -80°C aufbewahrt.
FILTRATION DER ELUENTEN Die Filtration sämtlicher, in der HPLC eingesetzter Lösungsmittel durch 0,45µm regenerierte Zellulose dient dem Schutz der Pumpen und der Trennsäule vor größeren Schmutzpartikeln. Die Zellulosefilter eignen sich gleichermaßen für Wasser und organische Lösungsmittel.
4.6.3 PHASENUMKEHR-HPLC (REVERSED PHASE CHROMATOGRAPHIE)
Von Reversed phase Chromatographie spricht man, wenn die stationäre Phase weniger polar, also hydrophob, ist, während es sich bei der Mobilen Phase um eine polare Flüssigkeit handelt, etwa wie im Rahmen der vorliegenden Arbeit in Form einer Mischung aus Wasser und Methanol oder Acetonitril. Bei der Phasenumkehr-HPLC sind die Silanol-Gruppen an der Oberfläche der Silica der Trennsäule durch aliphatische Kohlenwasserstoffketten (z.B. C 18) substituiert. Die Phasenumkehr- HPLC wird besonders in der Analytik monoaminerger Transmitter verwandt, da sie kurze Analysezeiten ermöglicht. Dabei werden Probesubstanzen von der Reversed-phase Oberfläche umso
- 56 - METHODEN ______stärker festgehalten, je weniger löslich sie in Wasser sind. Die Retentionszeit steigt mit zunehmender Anzahl der Kohlenstoffatome in einer Verbindung. Bei der Reversed-phase-Chromatographie finden zumeist Trägermaterialien mit n-Octyl-(RP8-), c-(Typen) oder n-Octadecylgruppen (RP18-, C18- Typen) Anwendung. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine C18-Säule verwendet.
4.6.4 MESSWERTERFASSUNG MITTELS ANALOG-DIGITALWANDLER UND
MILLENIUM-SOFTWARE
Die quantitative Auswertung des Detektorensignals erfolgt durch den Digital/Analog-Wandler und die nachgeschaltete Recheneinheit. Der Digital/Analog-Wandler wandelt das analoge Signal des elektrochemischen Detektors in ein digitales Signal um. In der Recheneinheit erfolgt die Speicherung und Analyse der Chromatogramme. Chromatographische Signale werden quantitativ mittels Peakhöhenmessung oder Peakflächenberechnung ausgewertet. Bei gut aufgelösten Signalen sind in der Regel beide Messwerte zueinander proportional. Bei einer schlechten Signalauflösung erfolgt eine quantitative Bestimmung in der Regel über eine Auswertung der Peakhöhen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde vorwiegend eine Bestimmung über die Ausmessung der Peakhöhe vorgenommen.
Abbildung 11: Schematische Darstellung des Aufbaus einer HPLC-Anlage
4.7 ELEKTROCHEMISCHE DETEKTION
4.7.1 EINFÜHRUNG
Die elektrochemische Detektion wurde bereits 1952 durch Kemula (Kemula, 1952) angewandt. Erst durch Adams et al. gelang der elektrochemischen Detektion 1973 der Durchbruch als Standardverfahren zur Analytik von Katecholaminen und Ascorbinsäure (Kissinger et al., 1973). Seit dieser Zeit findet die elektrochemische Detektion breite Anwendung in der Pharmazeutik, der Farbstoff-, Karzinogen-, Insektizid– und Neurotransmitter-Analyse. Die elektrochemische Detektion basiert auf dem Prinzip, dass elektroaktive Komponenten bei einem gewissen Potential oxidiert
- 57 - METHODEN ______werden können und dabei Elektronen freisetzen, die wiederum als Strom gemessen werden können (Hjemdahl, 1987). Bei der elektrochemischen Detektion werden Analyte oxidiert, reduziert oder es werden sekundäre Reaktionen des Elektrodenmaterials mit der jeweiligen Substanz gemessen (Rabenstein und Saetre, 1977). Die elektrochemische Detektion setzt eine elektrochemische Aktivität der zu untersuchenden Substanz voraus, d.h., die jeweilige Substanz muss in der Lage sein, Elektronen im Sinne des Prinzips von Oxidation und Reduktion abgeben oder aufnehmen zu können. Elektrodenmaterial und Ladungseigenschaften des Eluenten, also des Fließmittels geben dabei einen bestimmten Potential- Bereich vor, innerhalb dessen dieser Prozess abläuft. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Glassy carbon Elektroden verwendet, deren Potential in einem Bereich von +2,4V bis –0,2V liegt. Innerhalb dieses Bereichs lassen sich eine Vielzahl an Verbindungen oxidieren: • Katecholamine werden in Chinone überführt • Substanzen mit Indolgruppen (Serotonin, 5-HIAA) werden in korrespondierende Chinon- Imine überführt. Bei den jeweiligen Oxidationsprozessen werden Elektronen freigesetzt; aus der Freisetzung von Elektronen resultiert wiederum ein Strom, der sich proportional zur Konzentration der jeweiligen Substanz verhält. Levich stellte folgende Formel zur Beschreibung des entstehenden Stromes auf (Levich, 1962):
iL= K x n x F x Va x Cb
Gleichung 2: Formel zur Berechnung des bei der elektrochem. Detektion entstehenden Stroms iL= der aus Oxidation oder Reduktion resultierende Strom (A); K= Zell-Konstante (die Zell-Konstante ist abhängig vom Diffusionskoeffizienten der zu analysierenden Substanz, von der Viskosität des Eluenten und der Oberfläche und Beschaffenheit Elektrode; n= Anzahl der Elektronen, welche am Oxidations- /Reduktionsprozess beteiligt sind; F= Faradaysche Konstante; Va= Volumen/Fluss in ml/s; Cb= Konzentration der elektroaktiven Substanz
Im Regelfall geht man von gleichbleibenden Zellbedingungen und gleichbleibender Flussrate aus, so dass sich K und Vag und F ebenfalls als Konstanten darstellen lassen. Fasst man nun das Produkt aus
K, Vag und F als neue Konstante B zusammen, so ergibt sich folgende vereinfachte Gleichung:
iL= B x Cb
Gleichung 3: Strom bei der elektrochemischen Detektion iL= der aus Oxidation oder Reduktion resultierende Strom (A); B= Produkt aus K, Va und F; Cb=Konzentration der elektroaktiven Substanz Es ergibt sich somit ein direkt proportionales Verhältnis zwischen gemessenem Strom und Konzentration der analysierten Substanz.
- 58 - METHODEN ______
4.7.2 ARTEN VON ELEKTROCHEMISCHER DETEKTION
Man unterscheidet zwei Arten von elektrochemischer Detektion: • Coulometrische Detektion • Amperometrische Detektion Im Rahmen der vorliegenden Arbeit fand die Coulometrische Detektion Anwendung. Daher soll im Folgenden näher auf diese eingegangen werden.
COULOMETRISCHE DETEKTION Während bei der amperometrischen Detektion tatsächlich nur ca. 5-10% der in der Lösung enthaltenen Substanz oxidiert werden, werden bei der coulometrischen Detektion bis zu 100% erfasst. Die Flussrate ist in der Regel geringer als bei der amperometrischen Detektion, jedoch wird mit deutlich größeren aktiven Elektrodenflächen gearbeitet, um eine Effizienz von bis zu 100% erreichen zu können. Bei der elektrochemischen Detektion läuft in einer Detektorzelle eine elektrochemische Reaktion ab. Die Detektorzelle besteht aus drei Elektroden: • einer Arbeitselektrode • einer Referenzelektrode • einer Hilfselektrode. Zwischen Arbeits- und Referenzelektrode liegt ein wählbares Potential. Durch die elektrochemische Reaktion entsteht ein Strom, welcher über die Hilfselektrode abgeleitet wird. Dadurch bleibt das Potential zwischen Arbeits- und Referenzelektrode unbeeinflusst. Die Arbeitselektrode besteht in der Regel aus Glaskohlenstoff (glassy carbon), Kohlepaste oder amalgamiertem Gold. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Arbeitselektrode aus glassy carbon verwandt. Für die elektrochemische Detektion muss die mobile Phase leitend sein. In der Regel verläuft die elektrochemische Reaktion in einer Ausbeute von 1-10%, d.h., der grösste Anteil der Probe verlässt unverändert die Zelle.
- 59 - METHODEN ______
Abbildung 12: Elektrochemischer Detektor Abbildung 13: Schematische Abbildung einer „Antec Leyden intro“ Elektrode eines elektrochemischen Detektors (Quelle: http://www.antecleyden.com)
4.7.3 PRINZIP DER ELEKTROCHEMISCHEN DETEKTION
Da bei der Analyse mit Hilfe elektrochemischer Detektion in der Praxis vorwiegend oxidative Prozesse Anwendung finden, soll die elektrochemische Detektion am Beispiel der oxidativen Prozesse erläutert werden.
OXIDATION Bei der Oxidation einer Komponente findet ein Elektronentransfer vom Molekül zur Elektrodenoberfläche statt. Oxidative Applikationen beinhalten zwei Vorteile: • Sauerstoff ist nicht elektrochemisch aktiv. • Solide Elektroden können verwendet werden. Die Arbeitselektroden werden bei oxidativen Applikationen zumeist auf Carbonbasis hergestellt und bestehen typischerweise aus einem anisotropen Festkörper wie dem im Rahmen der vorliegenden Arbeit verwendeten glassy carbon.
- 60 - METHODEN ______
HINTERGRUNDSTROM Der Hintergrundstrom ist primär ein faradayischer Strom, der durch die Oxidation (bzw. Reduktion) von elektroaktiven Verunreinigungen der mobilen Phase verursacht wird. Häufige Quellen solcher Hintergrundströme sind: • Sauerstoff verursacht eine Reduktion. • Eisenspuren führen zu einer Oxidation. • Metallionen rufen eine Reduktion hervor. Dabei steht der Hintergrundstrom in einem exponentiell-proportionalen Verhältnis zum gewählten Potential. Je höher der Hintergrundstrom ist, desto stärker fällt auch das störende Rauschen ins Gewicht. Daher ist streng auf Reinheit und Gasfreiheit des Eluenten zu achten, da bereits geringe Mengen an Luft oder Verunreinigung durch die genannten Stoffe zu einem Anstieg des Basislinienrauschens bzw. zu einer Basisliniendrift führen können. Ein höheres Basisrauschen wiederum führt zu einer erniedrigten Sensitivität und einem erhöhten Detektionslimit.
4.8 BESTIMMUNG VON KATECHOLAMINEN, SEROTONIN UND DEREN
METABOLITEN MITTELS HPLC UND ELEKTROCHEMISCHER DETEKTION
Zur Förderung der mobilen Phase wurde eine Hochdruckpumpe (Gynkothek High Precision Pump Model 680, Gynkothek, München) bei einem Arbeitsdruck von ca. 200bar auf einen konstanten Fluss von 1,0ml/min. eingestellt. Die Injektion des Probenmaterials (20µl) erfolgte mit einer von 0-50µl fein dosierbaren Hamiltonspritze (Firma Hamilton-Bonaduz, Schweiz) über einen Probengeber (Firma Rheodyne, USA) und eine 20µl Probenschleife. Zur chromatographischen Trennung wurde eine Trennsäule von 15cm Länge und 4,6mm Durchmesser (Supelcosil LC 18, Supelco) verwendet. Die Stahlsäule wurde mit Reversed phase Silica 1 der Partikelgröße 3µm als stationärer Phase gefüllt. Ein Austausch der analytischen Säule bzw. der gesamten Messmethode wurde erforderlich, da die von uns anfänglich angewandte Methode auf Grund einer fehlenden Konstanz in der Trenneigenschaft der Säulen zu Gunsten der jetzigen Methode aufgegeben werden musste, um eine qualitativ hochwertige Trennung zu erhalten. Die Messung der Katecholamine erfolgte mit einem elektrochemischen Detektor des Typs Antec Leyden intro (Antec Leyden, Niederlande) mit einer Fliesszelle des Typs VT 03 und glassy carbon Elektrode des gleichen Herstellers eingesetzt. Die Detektion erfolgte bei einem gleichbleibenden Hintergrundstrom zwischen 2 und 3,3nA. Mit Hilfe eines Digital-Analog-Wandlers und des Integrationsprogrammes Millenium (Firma Waters) wurden die analog ermittelten Daten in digitale Signale umgewandelt und auf dem nachgeschalteten Rechner dargestellt. Die zu messenden Konzentrationen wurden sowohl über die Integration der Peakflächen als auch über die Peakhöhen
- 61 - METHODEN ______bestimmt, wobei der Schwerpunkt im Rahmen der vorliegenden Arbeit auf der Ermittlung der Peakhöhen lag. Die Mobile Phase setzte sich zusammen aus 41,01g Na-Acetat Anhydrat, 3,11g Octansulfonsäure Monohydrat, 0,058g Na2-EDTA, 800ml 16% Methanol 800ml 16% Methanol (Merck, Darmstadt), 4,2 l Wasser (Aqua ad injectabile, Millipore, Eschborn) und wurde mit 85%iger Phosphorsäure (Merck) auf einen pH von 4,92 titriert. Die Mobile Phase blieb während mindestens drei Wochen stabil. Sie wurde in einen Behälter ausgeleitet, es fand also kein Rückfluss des Eluenten in das System statt. Die Entgasung der Mobilen Phase erfolgte durch den Degaser GT 103 (Gynkothek, München). Die externen Standards für die gemessenen Substanzen wurden in Konzentrationen zwischen 50- 500pg/20µl hergestellt und jeweils mit 70% Perchlorsäure bzw. Aqua bidest verdünnt. Der elektrochemische Detektor wurde mit folgenden Einstellungen betrieben: Arbeitselektroden- potential: 0,751mV, Temperatur: Heater off, Filter: 5, Verstärkung: 1nA/V. Die Flussrate der Pumpe betrug 1,0 ml/min.
4.9 BESTIMMUNG VON GABA, GLUTAMAT UND ASPARTAT MITTELS HPLC
UND FLUORESZENZDETEKTION
Die Messung der Katecholamine wurde vom Neurochemischen Labor der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie im Kindes- und Jugendalter der Universität Würzburg unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Gerlach durchgeführt. Zur Bestimmung der Aminosäuren Aspartat, GABA und Glutamat diente ein Hochdruckflüssigkeits- Chromatographie-Systems mit Fluoreszenz-Detektion (Gerlach et al., 1996). Die Methode basiert auf einer vorgeschalteten Vorsäulenderivatisierung mit Orthophthaldialdehyd (OPA) und einem automatisierten HPLC- System, welches sich aus folgenden Einzelteilen der Firma Kontron, Neufahrn zusammensetzt: einer Pumpe des Typs 325, einem Autosampler des Typs 465, einem SFM 25 Fluoreszenzdetektor und einer nachgeschalteten Integrationseinheit mit Recheneinheit des Typs 450- MT2. Die Detektion erfolgte durch Messung der Fluoreszenzemission bei 450 nm bei einer Anregungswellenlänge von 300nm. Ein Aliquot des Überstands wurde mit 0,1molarer Salzsäure 10- fach verdünnt. 5ml davon wurden mit 30ml OPA Reagenz (Firma Grom Analytik, Herrenberg) vermischt und 10-fach mit 1-molarem Borat Puffer (pH 10,7) verdünnt. 20ml des entstehenden Gemischs wurden direkt in das HPLC- System injiziert. Die Konzentrationen wurden mit Hilfe eines externen Standards anhand der Peakhöhe bestimmt.
- 62 - METHODEN ______
FLUORESZENZDETEKTION VON AMINOSÄUREN NACH DERIVATISIERUNG MIT
ORTHOPHTHALDIALDEHYD (OPA) In nativer Form sind Aminosäuren in der Regel nur schwach chromophor, d.h., sie absorbieren kein ultraviolettes Licht. Für chemische Analysen mittels der Fluoreszenzdetektion müssen sie demnach zunächst im Sinne einer Derivatisierung modifiziert werden. Die derivatisierten Produkte können dann von den Detektoren mit deutlich höherer Sensitivität analysiert werden, da sich mit der Derivatisierung ihr Fluoreszenzverhalten, d.h., ihre Fähigkeit, ultraviolettes Licht zu absorbieren, verändert. Die erste automatisierte automatische Aminosäure-Analyse wurde von Moore et al. beschrieben. Der Einsatz von Ninhydrin erbrachte blaue oder braun-gelbe Reagenzien (Moore et al., 1958). Heute werden neben diesem noch andere Verfahren (Stobaugh et al., 1983; Jacobs et al., 1986; Jacobs, 1987; de Montigny et al., 1987) verwandt. Von den verschiedenen erhältlichen fluorogenen Reagenzien ist das Orthophthaldialdehyd (OPA) von seiner Bedeutung für die Analytik von Aminosäuren das herausragendste (Roth, 1971). Derivatisierende Agenzien richten ihre Wirkung in der Regel bei Aminosäuren auf die Amingruppe. Aminosäuren, welche mit OPA konjugiert werden, weisen eine zusätzliche Carboxylgruppe auf, welche die Optimierung der Gradientenelution der HPLC vereinfacht. Der grösste Vorteil von OPA ist, dass es selbst keine intrinsische Fluoreszenz zeigt.
4.10 TANDEM-MS
Die Messungen der Aminosäuren mittels Tandem-MS konnten im Stoffwechsellabor der Universitätskinderklinik der Universität Freiburg mit freundlicher Unterstützung durch die Arbeitsgruppe von Herrn Dr. Lehnert durchgeführt werden.
GRUNDLAGEN Mit Hilfe der Massenspektroskopie ist es möglich, Molekülmassen im Hochvakuum zu analysieren. Mit kleinsten Substanzmengen kann die Molekülmasse und sogar die Elementarzusammensetzung einer Verbindung bestimmt werden. Das Prinzip eines Massenspektrometers beruht auf der Bewegung von Ionen in elektrischen oder magnetischen Feldern. Der Prozess lässt sich in drei Unterprozesse aufteilen: • Zunächst muss eine Probe des Analyten ionisiert werden. • Anschliessend erfolgt die Auftrennung nach dem Masse-Ladungs-Quotient der entstandenen Ionen im Vakuum. • Letzter Schritt ist die Detektion.
- 63 - METHODEN ______
AUFBAU EINES MASSENSPEKTROMETERS Ein Massenspektrometer setzt sich aus drei miteinander verbundenen Einheiten zusammen: • Einer Ionenquelle, in der die zu analysierende Substanz in gasförmige Ionen überführt wird. Die Ionenquelle dient also der Ionenerzeugung. • Einem Massenanalysator, in dem die Trennung der Ionen nach ihrem Masse-Ladungs- Quotienten (m/z) erfolgt. • Einem Detektor, der die ankommenden Ionensignale verstärkt, analysiert und in digitale Signale umwandelt. So können dann die relativen Mengen der gebildeten Ionen abgelesen werden.
IONISATION Die Ionisierung der Analytmoleküle erfolgt in der Regel über Aufnahme oder Verlust eines Elektrons. Um diesen Zustand zu erreichen, gibt es verschiedene Methoden, bei denen die Fragmentation der Moleküle während der Ionisation unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Tripel- Quadrupol Tandem- Massenspektrometer verwendet, der nach dem Prinzip der Elektronen-Spray-Ionisation arbeitet.
ELEKTROSPRAY IONISATION (ESI) Elektrospray bezeichnet die Dispersion einer Flüssigkeit in eine Vielzahl kleiner geladener Tröpfchen mit Hilfe eines elektrostatischen Feldes. Lange Zeit konnten Proben wegen des Problems des Vakuumerhalts in der Ionenquelle nur in fester oder gasförmiger Form in ein Massenspektrometer eingeführt werden. Erst die Möglichkeit der Verdampfung und Ionisierung von flüssigen Proben unter Atmosphärendruck erlaubte auch die Verwendung flüssiger Proben und die Kopplung von Massenspektrometern mit Flüssigkeitschromatographischen Trennmethoden, wie LC bzw. HPLC.
IONISIERUNGSPRINZIP Das zu Grunde liegende Prinzip der ESI ist der Transfer von Ionen aus der Lösung in die Gasphase durch die Desolvatisierung des Analyten. Dies erfolgt in vier Schritten: 1.Bildung von kleinen, geladenen Tröpfchen aus dem Elektrolyten. 2.Kontinuierlicher Lösungsmittelverlust dieser Tröpfchen durch Verdampfen, wobei die Ladungs- dichte an der Tröpfchenoberfläche zunimmt. 3.Wiederholter spontaner Zerfall der Tröpfchen in Mikrotröpfchen (Coulomb- Explosionen). 4.Desolvatisierung der Analytmoleküle beim Transfer in das Massenspektrometer. Nach der Ionenerzeugung in der Ionenquelle erfolgt eine Auftrennung im Massenanalysator nach dem Masse-zu-Ladungs-Quotienten (m/z) der Ionen. Diese Auftrennung kann durch unterschiedliche Methoden erfolgen, die auch unterschiedlich gut mit den einzelnen Ionisierungsmöglichkeiten in Einklang zu bringen sind.
- 64 - METHODEN ______
QUADRUPOL Bei Quadrupolanalysatoren handelt es sich um eine Konstruktion aus vier stabförmigen Metallelektroden, zwischen denen ein kombiniertes Wechsel-Gleichspannungsfeld erzeugt wird, dessen Spannung in Abhängigkeit vom zu analysierenden Ion gewählt wird: dadurch ensteht ein für ein Ion spezifischer Masse-zu-Ladungs-Quotient (m/z). Dieses Feld kann nur von Ionen mit einem entsprechenden m/z-Verhältnisses auf einer stabilen oszillierenden Bahn durchlaufen werden, während Ionen mit einem abweichenden m/z-Verhältnis auf instabilen Bahnen durch das Feld fliegen und durch Kollisionen mit den Metallstäben gestoppt werden. Der maximale Massenbereich der Quadrupolanalysatoren liegt bei einem m/z-Verhältnis von 4000. Die erzielbare Auflösung liegt zwischen 500 und 5000.
TRIPLE QUADRUPOL In einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer dient der erste Quadrupol zur Massenanalyse der
Ionen, der zweite zum Hindurchleiten durch eine mit Gas (N2, He oder Ar) gefüllte Kollisionskammer und der dritte wiederum zum Scannen der Ionen. Diese Anordnung erlaubt neben einfacher Massenspektrometrie eine gezielte Fragmentierung in der Kollisionszelle und die Massenanalyse der Fragmente (auch Tochterionen genannt), man spricht von MS/MS (bzw. MS-MS) oder Tandem-MS.
NEUTRALER VERLUST Die Masse von Molekülen wird in Dalton angegeben. Dabei entspricht ein Dalton dem zwölften Teil eines Kohlenstoffatoms. Massenspektrometer messen das Verhältnis der Masse zur Ladung bevorzugt von Ionen, weniger von neutralen Molekülen. Ein neutrales Wassermolekül hat die gleiche Anzahl an positiv geladenen Protonen wie an negativ geladenen Elektronen. Das Anhängen eines Protons in Form eines Wasserstoffatoms an ein neutrales Wassermolekül erzeugt als Ergebnis ein positiv + geladenes Hydronium-Ion (H3O ). Der Verlust eines Protons lässt aus dem neutralen Wassermolekül ein negativ geladenes Hydroxidion (OH)- entstehen. Einheit für Ladung ist z. Das Hydronium-Ion hat also z=+1, das negativ geladene Hydroxidion z=-1. Im Rahmen der Tandem-MS-Untersuchung lässt sich ein Molekül beim Verlust einer spezifischen Menge an Dalton anhand seines Masse-/ Ladungsquotienten (m/z) identifizieren. Der Term neutraler Verlust bezieht sich dabei auf den Verlust eines ungeladenen Molekülfragments. Das neutrale Molekül kann eine Aminosäure, Phosphorsäure oder ein anderes niedriggewichtiges Molekül sein. Das neutrale Molekül wird gebildet, wenn aus einer Acetyl- oder Phosphatgruppe ein Wassermolekül abgespalten wird. Dieser Prozess findet in der Kollisionszelle statt. Der neutrale Verlust von 102 Dalton kann zur Detektion von Aminosäuren genutzt werden.
- 65 - METHODEN ______
Abbildung 14: Beispiel für ein Tandem-Massenspektroskopie-Spektrum Die Abbildung zeigt das Spektrum eines Tandem-MS Scans für den neutralen Verlust von 102 Dalton. (1) gibt den Namen des Profils an. (2) Die Y-Achse repräsentiert die für ein bestimmtes Masse-Ladungs- Verhältnis ermittelte Intensität, d.h., die Anzahl an Ionen. Die Ionenintensität für ein beliebiges Masse/Ladungsverhältnis wird in Relation zum höchsten ermittelten Masse- /Ladungsverhältnis ausgedrückt. Diese Verhältnis wird in Prozent ausgedrückt. (3) Die x-Achse repräsentiert das Masse- /Ladungsverhältnis für einen definierten Massebereich. Die Anwesenheit von Ionen in einem bestimmten Massebereich manifestiert sich als vertikaler Ausschlag (Peak). (4) Dieser Beispiel- Peak ist der höchste ermittelte und wird daher als 100% gesetzt. (5) Dieser Peak wird als Relation des höchsten Peak (s. Punkt 4) angegeben. (modifiziert nach Chace et al., 1996).
DURCHFÜHRUNG DER MESSUNGEN • Jeweils 7 µl Mikrodialysat werden in ein Probengefäß gegeben. • Hinzugegeben werden 200µl Neo Gen stable isotope Kit A (Cambridge Isotope Laboratories, USA); das entstehende Gemisch wird auf dem Reagenzglasschüttler durchmischt. • Der Überstand wird mit Stickstoff bei 55 ºC im Heating module (Peirce Reacti Therm) verdampft. Wichtig ist, dass die gesamte Flüssigkeit verdampft. • Nun werden jeweils 120µl 3-molare Lösung 11 hinzugegeben und auf dem Reagenzglas- schüttler durchmischt. • Die dabei entstandene Lösung wird im Gaschromatographie-Ofen (Kelvitron T, Firma Heraeus Instruments, USA) über 15 min. bei 65ºC erhitzt.
1 100 ml Lösung 1 enthalten: 60ml Butanol, 20 ml Acetylnitril und 20 ml aqua bidest
- 66 - METHODEN ______
• Der Überstand wird erneut mit Stickstoff bei 65 ºC im Heating module (Pierce Reacti Therm) verdampft. • Hinzugegeben werden 200 µl der Lösung 22 und auf dem Reagenzglasschüttler durchmischt. Die derart vorbereiteten Proben wurden in den Autosampler Perkin Elmer Series 200 gegeben und anschliessend mit dem PE Sciex API 365 Tandem- Massenspektrometer analysiert. Gemessen wird der neutrale Verlust von 102 Dalton (Chace et al., 1993). Die Daten wurden mit Hilfe der „Analyst Software“ analysiert, mit der Software „Chemoview“ der Fa. Applied Biosystems, Langen ausgewertet und anschliessend in Form einer Microsoft Excel-Tabelle gespeichert. Die Messungen wurden in Kooperation mit Dr. Lehnert von der Universitäts-Kinderklinik der Universität Freiburg durchgeführt.
4.11 STATISTIK
Um die Ergebnisse auf statistische Signifikanz zu überprüfen, wurde der Student t-Test eingesetzt. Zur Durchführung des t-Tests wurden die Statistikfunktionen der Programme Microsoft Excel, V. 8,0 und Jandel-Scientific Sigmaplot V eingesetzt. Der Durchschnitt der sechs Vorproben vor Sekretinapplikation diente als Kontrolle und wurde als 100% definiert. Alle Werte wurden in Prozentangabe ± Standardabweichung dargestellt. Der Grad der Signifikanz wurde in Form von Sternen dargestellt. Dabei war *=p<0,05 bzw,**=p<0,01 (Pudovkina et al., 2001).
2 Lösung 2 enthält folgende Bestandteile: Aqua bidest + Acetonitril (1:1 vol/vol) + 0,025 % Ameisensäure
- 67 - ERGEBNISSE ______
5 ERGEBNISSE
5.1 CHROMATOGRAMME DER VERSCHIEDENEN TRENNUNGSMETHODEN
Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem, die extrazellulären Konzentrationen von Katecholaminen und Indolaminen sowie deren Metaboliten mittels HPLC und elektrochemischer Detektion zu bestimmen, wie in Kapitel 4.8 ausführlich dargestellt wurde. Im Verlauf dieser Arbeit wurden insgesamt vier verschiedene Trennverfahren eingesetzt (siehe auch Kapitel 4.1), auf die im Folgenden eingegangen werden soll. Zur Analyse der aus den tierexperimentellen Untersuchungen gewonnenen Proben wurde letztlich Methode 4 eingesetzt, die aus Methode 1 weiter entwickelt wurde.
5.1.1 METHODE 1
Abbildung 15 zeigt ein Chromatogramm der Methode 1, welche mit einem Papierschreiber der Firma Metawatt aufgezeichnet wurde. Das Chromatogramm zeigt einen Standard, der insgesamt acht Substanzen enthielt. L-DOPA war aufgrund der mit dem Injektionspeak zusammenfallenden Retentionszeit nicht darstellbar. Tabelle 5 gibt einen Überblick über die im Chromatogramm dargestellten Substanzen (mit Angabe der Retentionszeiten).
Abbildung 15: Chromatogramm nach Methode 1 Der gemessene Standard enthält in der Reihenfolge der abgebildeten Peaks folgende Substanzen: L-DOPA (50pg/20 µl), DOPAC (50 pg/20 µl), Noradrenalin (50 pg/20 µl), Adrenalin (50 pg/ 20µl), 5 HIAA (100 pg/20µl), HVA (100pg/20µl), Dopamin (50 pg/20µl und 5-HT (500 pg/20µl). Schreibergeschwindigkeit 10mm/min.
- 68 - ERGEBNISSE ______
GETESTETE RETENTIONSZEIT SUBSTANZ DOPAC 2,9min. Noradrenalin 3,2min. Adrenalin 3,9min. 5-HIAA 4,3min. HVA 5,6min. DOPAMIN 7,0min. 5-HT 15,2min.
Tabelle 5: Substanzen aus Chromatogramm 1 und Retentionszeiten
5.1.2 METHODE 2
Um eine Verkürzung der Retentionszeiten zu erreichen, wurde Methode 1 nach ausführlicher Literaturrecherche durch Methode 2 ersetzt. Damit war nun eine Verkürzung der Retentionszeit auf ca. 6-7min. bei gleichzeitig guter Trennbarkeit von insgesamt 9 der 10 im Standard vorhandenen Substanzen möglich. Abbildung 16 zeigt das Chromatogramm eines mit Methode 2 gemessenen Standards. Tabelle 6 gibt einen Überblick über die Retentionszeiten der untersuchten Substanzen bei Methode 2. Erstmals wurde hier die Milleniumsoftware mit nachgeschalteter Recheneinheit eingesetzt.
260,00
8 6 240,00 0, 4
220,00
200,00 3 5 0, 180,00 1
160,00
V 0 2 m 6 9 5 140,00 0 5, 7 6, 4 1 1 , 1 5, 7 6 1 4 7, 2 5 120,00 9 7 7, 6 1 1, 2 100,00 80,00
60,00
40,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 Minutes
Abbildung 16: Chromatogramm nach Methode 2 Der Standard enthält folgende Substanzen jeweils in einer Konzentration von 200 pg/20µl (dargestellt in der Reihenfolge ihres zeitlichen Auftretens im Chromatogramm): NA, A, MHPG, DOPAC; Dopamin, 5-HIAA, HVA, 5-HT, 3-MT.
- 69 - ERGEBNISSE ______
GETESTETE RETENTIONSZEIT SUBSTANZ Noradrenalin 1,1min. Adrenalin 1,4min. MHPG 1,6min. DOPAC 1,8min. DOPAMIN 2,2min. 5-HIAA 4,1min. HVA 4,5min. 3-MT 5,7min. 5-HT 6,6min. Tabelle 6: Überblick über Standard und Retentionszeiten nach Methode 2
Beim Einsatz neuer Säulen des gleichen Fabrikats und Modells zeigte sich, dass mit den Säulen der neuen Charge nach Methode 2 keine Fortführung der Messungen unter gleichen Bedingungen möglich war, da mit der neuen Charge der Säulen eine Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten nicht mehr gewährleistet werden konnte. Abbildung 17 zeigt die Verschiebungen in den Retentionszeiten zwischen den beiden Säulenchargen auf. Vor allem die Überlappung der Retentionszeiten einzelner Substanzen machte die Etablierung einer neuen Methode notwendig.
Gegenüberstellung neue und alte Säulencharge
7
Noradrenalin 6
Adrenalin
5 MHPG
DOPAC 4
DOPAMIN
3 5-HIAA
Retentionszeit in min HVA 2
3-MT
1 5-HT
0 Retentionszeit alte Säulencharge Retentionszeit neue Säulencharge
Abbildung 17: Graphische Gegenüberstellung der Retentionszeiten der einzelnen Substanzen Dargestellt wird die Retentionszeitverschiebung beim Wechsel von der alten zur neuen Säulencharge. Erkennbar wird die Überlappung einzelner Substanzen bei der neuen Charge, die keine adäquate Trennung der Substanzen mehr zuließ.
- 70 - ERGEBNISSE ______
5.1.3 METHODE 3
Da die Trennung nach Methode 2 mit der neuen Säulencharge nicht mehr reproduzierbar war, etablierten wir Methode 3. Um die Trennung der Methode 3 weiter zu optimieren, wurden der pH des Eluenten und schliesslich die Flussrate justiert.
Retentionszeiten in Abhängigkeit vom pH des Eluenten und der Flussrate
14
12
10 NA MHPG 8 DOPAMIN DOPAC 3-M T 6 5-HT 5-HIAA HVA Retentionszeit t(R) in min 4
2
0 pH 2,85 flow 1 ml/min 2,85 flow pH 1 ml/min 2,99 flow pH 1 ml/min 3,11 flow pH 1 ml/min 3,24 flow pH 1 ml/min 3,59 flow pH pH 3,43 flow 1 ml7min 3,43 flow pH pH 3,66 flow 0,8ml/min 3,66 flow pH pH 3,59 flow 0,8 ml/min 0,8ml/min 3,63 flow pH
Abbildung 18: Abhängigkeit der Retentionsz. nach Methode 3 von Flussrate und pH des Eluenten Die Y-Achse gibt die Retentionszeiten der in der Legende genannten Substanzen unter wechselnden Bedingungen der Methode 3 wieder. Die x-Achse beschreibt dabei den wechselnden pH bzw. die Flussrate des Eluenten.
Ringer Ringer 2400,00 N oradrenalin MHPG 3,297 2200,00 2,54 Dopam in 2000,00 Adrenalin 6,668 3,801 1800,00 HVA 6,282 1600,00 5-HIAA 4,556 1400,00
5-HT 3-MT 1200,00 13,377 17,028 mV 1000,00 800,00 600,00
400,00 Ringer Ringer
200,00 0,00
-200,00
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00 16,00 17,00 18,00 19,00 20,00 Minutes
Abbildung 19: Chromatogramm nach Methode 3 Im oberen Teil der Abbildung ist ein Chromatogramm dargestellt, welches mittels Methode 3 erstellt wurde. Der gemessene Standard enthält für alle gemessenen Substanzen Konzentrationen in Höhe von 200pg/20µl. Der untere Teil der Abbildung zeigt denselben Standard einfach verdünnt mit Ringer-Lösung. Deutlich sichtbar sind hier die Peaks bei 2,5 und bei 4min , die durch die Ringer-Lösung selbst verursacht werden und als Störartefakte die Messung der Proben beeinträchtigen.
- 71 - ERGEBNISSE ______
5.1.4 METHODE 4
Da bei Methode 3 im Zusammenhang mit der Ringer-Lösung Störpeaks auftraten, wurde Methode 4 etabliert. Methode 4 wurde aus Methode 1 weiterentwickelt. Auch hier zeigte sich gegenüber Methode 1, dass die Säuleneigenschaften bei identischem Modell und Fabrikat hinsichtlich ihrer Trenneigenschaften mit dem Wechsel der Charge erheblich variieren können. Durch Veränderung der Zusammensetzung des Eluenten konnte schliesslich eine Trennbarkeit der Substanzen erreicht werden. Um bei der Messung des Standards eine bessere Übersichtlichkeit zu erzielen, wurden die im Standard enthaltenen Substanzen auf zwei verschiedene Teilstandards (A und B) aufgeteilt. Dopamin ist in beiden Teilstandards enthalten und dient als gemeinsame Kontrollsubstanz. Anhand von Dopamin können die ermittelten Retentionszeiten miteinander verglichen werden.
5.1.4.1 Teilstandard A nach Methode 4
Ringer Ringer 2400,00 N oradrenalin MHPG 3,297 2200,00 2,54 Dopam in 2000,00 Adrenalin 6,668 3,801 1800,00 HVA 6,282 1600,00 5-HIAA 4,556 1400,00
5-HT 3-MT 1200,00 13,377 17,028 mV 1000,00 800,00 600,00 400,00 Ringer Ringer
200,00 0,00 -200,00
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00 16,00 17,00 18,00 19,00 20,00 Minutes
Abbildung 20: Teilstandard A nach Methode 4 Teilstandard A enthält folgenden Substanzen: NA: 200 pg,/20µl, A: 200 pg/20 µl, Dopamin: 200 pg/20µl, 5-HT: 500 pg/20µl.
- 72 - ERGEBNISSE ______
5.1.4.2 Teilstandard B nach Methode 4
1800,00 1700,00 1600,00 1500,00 DOPAC 1400,00 2,35 1300,00
1200,00 Dopamin mV 1100,00 6,59
HVA 1000,00 5-HIAA 3-MT 3,85 3,27 15,06 900,00 800,00
700,00
600,00
500,00 400,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00 16,00 Mi nutes
Abbildung 21: Teilstandard B nach Methode 4 Teilstandard B enthält folgenden Substanzen: DOPAC: 200 pg/20µl, 5-HIAA: 200 pg/20µl, HVA: 200 pg/20µl, Dopamin: 200 pg/20µl, 3-MT: 500 pg/20µl.
5.1.5 EINFLUSS DER RINGER-LÖSUNG AUF DAS CHROMATOGRAMM
Abbildung 22 veranschaulicht den Einfluss der Ringer-Lösung auf das Chromatogramm. Gegenüber der Injektion von Aqua bidest erzeugen die einzelnen Komponenten der Ringer-Lösung eigene Peaks, die mit den zu messenden Substanzen interferieren können.
1800,00 1700,00 1600,00 1500,00 1400,00 1300,00 1200,00 1100,00 mV1000,00 900,00 800,00 700,00 600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 1,40 1,60 1,80 2,00 2,20 2,40 2,60 2,80 3,00 3,20 3,40 3,60 Minutes
Abbildung 22: Verschiedene Komponenten der Ringer-Lösung im Chromatogramm Gepunktete Linie: CaCl, halbgestrichelte Linie: Aqua bidest; schwarze durchgezogene Linie: Ringer-Lösung; gestrichelte Linie: KCl; durchgezogene Linie: NaCl.
- 73 - ERGEBNISSE ______
Abbildung 23 zeigt die Interaktion der verwendeten Ringer-Lösung mit dem Peak von DOPAC bzw. MHPG. Der Anfangspeak der Ringer-Lösung fällt mit dem Peak von DOPAC bzw. MHPG zusammen. Dabei lässt sich DOPAC bzw. MHPG über einer Schwellenkonzentration von ca. 25 pg/20µl noch messen. Unterhalb dieser Schwellenkonzentration überragt der Ringer-Peak den Peak von DOPAC bzw. MHPG, so dass eine Messung dieses Peaks auf Grund des zeitlich identischen Peaks der Ringer-Lösung nicht mehr möglich ist.
800,00 700,00
600,00
500,00
400,00 mV 300,00
200,00
100,00 0,00
-100,00
-200,00 1,00 1,10 1,20 1,30 1,40 1,50 1,60 1,70 1,80 1,90 2,00 2,10 2,20 2,30 2,40 2,50 2,60 2,70 2,80 2,90 3,00 Minutes
Abbildung 23: Beeinfl. der Messung von DOPAC bzw. MHPG durch das Mikrodialyseperfusat Bei Messungen fiel auf, dass die Ringer-Lösung zwei charakteristische Peaks, bei 2,4 und 2,6min, hervorruft. Der erste Peak fällt also zeitgleich DOPAC zusammen. Die Abbildung zeigt eine DOPAC- Verdünnungsreihe (DOPAC verdünnt mit Ringer-Lösung). Sie wurde durchgeführt, um die Wechselwirkung zwischen DOPAC und der Ringerlösung zu untersuchen. Das Detektionslimit für DOPAC beträgt demnach ca. 20-30 pg/20µl. Die durchgezogene Linie kennzeichnet die Messung von Aqua bidest, die gepunktete Linie stellt mit Ringer verdünntes DOPAC mit einer Konzentration von 50 pg/20µl, die gestrichelte Linie eine mit Ringer-Lösung verdünnte DOPAC- Lösung von ca. 30pg/20µl dar, die kräftigere durchgezogene Linie mit prominentem Peak am Ende repräsentiert die Ringer-Lösung.
- 74 - ERGEBNISSE ______
5.2 ERGEBNISSE DER IN VITRO MIKRODIALYSE-VORVERSUCHE ZUR
ERMITTLUNG DER IN VITRO RECOVERY
Die Recovery ist bei der Mikrodialyse von verschiedenen Faktoren abhängig: von der dialysierten Substanz und auch auch von der verwendeten Kanüle. Die Prozentangaben über die In vitro Recovery in der Literatur zeigen grosse Schwankungen (Richter et al., 1999). Mit zunehmender Perfusionsgeschwindigkeit sinkt die Recovery der einzelnen Substanz exponentiell ab. Aus diesem Grund ist eine stabile, möglichst schwankungsfreie Pumpe notwendig, um Konzentrations- schwankungen durch Schwankung der Perfusionsgeschwindigkeit auszuschließen (Connelly, 1999).
FAKTOREN, DIE DIE MIKRODIALYSE BEEINFLUSSEN KÖNNEN (CONNELLY, 1999): • Länge und Durchmesser der Membran • pH • Flussrate • Molekulargewicht und Struktur der • Temperatur Substanz • Stabilität der Substanz bei Temperatur • Bindungsverhalten der Substanz an der und pH des Perfusionsmediums Dialysemembran
5.2.1 IN VITRO RECOVERY VON AMINOSÄUREN
Abbildung 24 zeigt die für die genannten Substanzen ermittelte relative Recovery in %.
In vitro Recovery einzelner Aminosäuren
12
10
8
6
4 Recovery in % 2
0 Aspartat GABA Glutam at
Abbildung 24: In vitro Recovery von Aspartat, GABA und Glutamat Dargestellt ist die im Rahmen der in vitro Recovery-Versuche ermittelten Recovery-Werte für Aspartat, GABA und Glutamat. Die x-Achse gibt einen Überblick über die ermittelten Substanzen. Die y-Achse gibt die relative Recovery in % wieder. N=18.
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Tabelle 7 zeigt die ermittelten Werte für die In vitro Recovery von Aspartat, GABA und Glutamat. Es wurden jeweils 18 Proben über in vitro Recovery bestimmt und zusätzlich 10 Standardproben gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte sowie die mittleren Standardabweichungen der In vitro Messungen und der Standardmessungen. Die Recovery ergibt sich als Quotient aus dem Mittelwert der In vitro Recovery Messungen und dem Mittelwert der Standardmessungen x 100.
SUBSTANZ NIN VITRO MWIN VITRO STABWIN NSTAN- MWSTANDA STABWSTANDARDS RECOVERY
MESSUNGEN MESSUNGEN IN VITRO MESSUNGEN DARDS RDS IN µMOL/L IN µMOL/L IN % µMOL/L IN µMOL/L
Aspartat 18 0,94 0,32 10 10,44 0,89 9,03 GABA 18 0,45 0,15 10 8,68 0,88 5,22 Glutamat 18 28,67 3,37 10 255,60 43,43 11,22 Tabelle 7: Übersichtstabelle über die In vitro Recovery von Aspartat, GABA und Glutamat.
5.2.2 RECOVERY VON KATECHOLAMINEN, INOSITOLEN UND
METABOLITEN
Tabelle 8 gibt einen Überblick über die In vitro Recovery Versuche zur Ermittlung der Recovery der genannten Substanzen. Es wurden jeweils 18 Proben über in vitro Recovery bestimmt und zusätzlich 10 Standardproben gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte sowie die mittleren Standardabweichungen der In vitro Messungen und der Standardmessungen als durch die Integrationssoftware ermittelte Peakhöhe. Die Recovery ergibt sich als Quotient aus dem Mittelwert der In vitro Recovery Messungen und dem Mittelwert der Standardmessungen x 100.
SUBSTANZ N IN VITRO MWIN VITRO STABW IN NSTANDARDS MW STABW IN RECOVERY
MESSUNGEN MESSUNGEN VITRO MESSUNGEN STANDARDS VITRO MESSUNGEN IN % (ANGABE (ANGABE (ANGABE (ANGABE ALS ALS ALS ALS PEAKHÖHE) PEAKHÖHE) PEAKHÖHE) PEAKHÖHE)
NA 18 44222 16239 10 591209 096337 07,48 DOPAMIN 18 57865 10365 10 642652 141143 09,00 DOPAC 18 59683 09607 10 705793 310662 08,46 3-MT 18 52640 14968 10 711819 103681 07,39 5-HIAA 18 51380 13521 10 505212 085612 10,17 5-HT 18 36092 13521 10 505212 085612 09,06 HVA 18 62815 17552 10 844057 496123 07,44 Tabelle 8: Übersichtstab. über die In vitro Recovery von Katechol., Serotonin und Metaboliten
- 76 - ERGEBNISSE ______
Die folgende Abbildung 25 zeigt die für die genannten Substanzen ermittelte relative Recovery in %.
In vitro Recovery einzelner Substanzen
12 10 8 6 4
Recovery in % 2 0
IN C T M -HT M 3- 5 HVA MHPG -HIAA DOPA 5 DOPA
Abbildung 25: In vitro Recovery von Katecholaminen, Serotonin und Metaboliten Dargestellt sind die untersuchten Substanzen bei n=18. Die x-Achse gibt einen Überblick über die ermittelten Substanzen. Die y-Achse gibt die relative Recovery in % wieder.
- 77 - ERGEBNISSE ______
5.3 ERGEBNISSE DER IN VIVO MIKRODIALYSEUNTERSUCHUNGEN
5.3.1 UNTERSUCHUNG MITTELS TANDEM MS
5.3.1.1 Mittelwerte der extrazellulären Konzentration der Aminosäuren
Dargestellt sind in der folgenden Tabelle die Mittelwerte der extrazellulären Konzentrationen der mittels Tandem-MS gemessenen Aminosäuren zum Zeitpunkt t=0min., die aus den Einzelwerten der Sekretin- (n=5) und der Kontrollgruppe (n=5) ermittelt wurden. Einheit ist µMol/l. Daneben findet sich der Standardfehler des Mittelwertes (SEM) bei n=10 in µMol/l. Eine exakte Aussage über die extrazellulären Konzentrationen von Glutamat, Aspartat und Guanin ist nicht möglich, da das im Rahmen dieser Arbeit angewandte Tandem-MS-Verfahren keine sichere Trennung von Glutamin und Glutamat, Asparagin und Aspartat erlaubt.
AMINOSÄURE MW SEM (N=10) (µM/L) (µM/L) Alanin 14,30 1,97 Arginin 2,64 0,38 Aspartat/Asparagin 2,11 0,22 Citrullin 0,77 0,14 GABA 2,40 0,28 Glutamat/Glutamin 8,76 1,71 Glycin 6,22 0,51 Guanin 36,20 3,17 Methionin 1,73 0,18 Ornithin 1,38 0,22 Phenylalanin 1,67 0,22 Tyrosin 1,35 0,19 Valin 37,38 4,11 Xle (Leucin/Isoleucin) 5,74 0,37
Tabelle 9: Extrazell. Konzentrationen der untersuchten Aminosäuren im Dialysat (Zeit t=0 min)
- 78 - ERGEBNISSE ______
5.3.1.2 Einzelne Ergebnisse der Tandem MS-Untersuchungen
5.3.1.2.1 Citrullin
Die i.p. Injektion von Sekretin zum Zeitpunkt t=0min. führte zu keinem signifikanten Anstieg des extrazellulären Citrullin im Hippokampus (Clement et al., 2002; Kuntz et al., 2001; 2002; 2003). Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Sekretingruppe bewirkte das injizierte Sekretin keine signifikante bzw. in Abbildung 26 sichtbare Veränderung des Citrullin- spiegels im Extrazellularraum. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären Citrullinkonzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 0,77µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 0,14µMol/l.
250
200
150
100
50 Citrullin (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (m in.)
Abbildung 26:Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Citrullin im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0.05, **p<0,01. Kontrolle -Ο- Sekretin -•-
- 79 - ERGEBNISSE ______
5.3.1.2.2 Aspartat
Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Die i.p. Injektion von Sekretin zum Zeitpunkt t=0min. führte zu keinem signifikanten Anstieg des extrazellulären Aspartat im Hippokampus (Clement et al., 2002; Kuntz et al., 2001; 2002; 2003). Zwar lässt sich aus der graphischen Darstellung in Abbildung 27 ein Anstieg des Aspartatspiegels in der Sekretingruppe ablesen, doch ist dieser Anstieg gegenüber der Kontrollgruppe nicht signifikant. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären Aspartatkonzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 2,11µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 0,22 µMol/l.
140
120
100
80 von Vorlauf)
60
40 Aspartat (% (% Aspartat 20
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 27: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Aspartat im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0.05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 80 - ERGEBNISSE ______
5.3.2 ACYLCARNITINE
Die Messung der Acylcarnitine mittels Tandem-MS wurde in der Universitäts-Kinderklinik der Universität Freiburg durchgeführt. Zur Messung fand ein interner Standard Verwendung, der bei der Aufbereitung der Proben beigegeben wurde. Dargestellt sind in der folgenden Tabelle 10 die Mittelwerte der ermittelten Konzentrationen der mittels Tandem-MS gemessenen Acylcarnitine zum Zeitpunkt t=0min., die aus den Einzelwerten der Sekretin- (n=5) und der Kontrollgruppe (n=5) ermittelt wurden. Einheit ist µMol/l. Daneben findet sich der Standardfehler des Mittelwertes bei n=10 in µMol/l.
MW SEM ACYLCARNITIN (µMol/l) (µMol/l) Benzoylcarnitin 16,0 4,62 Freies Carnitin (C0) 289,0 83,42 Acetylcarnitin (C2) 239,0 68,99 Propionylcarnitin (C3) 61,4 17,72 Butyrylcarnitin (C4) 28,9 8,34 Dicarboxy-Butyrylcarnitin (C4-DC) 16,9 4,88 Hydroxy-Butyrylcarnitin (C4-OH) 21,6 6,23 Isovalerylcarnitin (C-5) 16,1 4,65 Dicarboxy-Isovalerylcarnitin (C 5-DC) 12,3 3,55 Hydroxy Dicarboxy- Isovalerylcarnitin (C5-DC-OH) 12,3 3,55 Hydroxy-Isovalerylcarnitin (C5-OH) 33,9 9,78 Einfach ungesättigtes Isovalerylcarnitin (C 5;1) 28,6 8,26 Einfach ungesättigtes Dicarboxy-Isovalerylcarnitin (C 5;1-DC) 19,1 5,51 Hexanoylcarnitin (C6) 239,0 68,99 Dicarboxy- Hexanoylcarnitin (C6-DC) 15,8 4,56 Hydroxy- Hexanoylcarnitin (C6-OH) 16,0 4,62 Einfach ungesättigtes Hexanoylcarnitin (C 6;1) 168,0 48,50 Einfach ungesättigtes Dicarboxy- Hexanoylcarnitin (C 6;1-DC) 14,8 4,27 Octanoylcarnitin (C 8) 24,0 6,93 Dicarboxy-Octanoylcarnitin (C8-DC) 14,0 4,04 Hydroxyoctanoylcarnitin (C8-OH) 12,4 3,58 Einfach ungesättigtes Octanoylcarnitin (C8;1) 20,4 5,89
- 81 - ERGEBNISSE ______
MW SEM ACYLCARNITIN (µMol/l) (µMol/l) Einfach ungesättigtes Hydroxyoctanoylcarnitin (C8;1-OH) 20,4 5,89 Decanoylcarnitin (C10) 15,8 4,56 Dicarboxy- Decanoylcarnitin (C10-DC) 14,7 4,24 Hydroxy-Decanoylcarnitin (C10-OH) 17,9 5,17 Einfach ungesättigtes Decanoylcarnitin (C10;1) 20,3 5,86 Einfach ungesättigtes Dicarboxy- Decanoylcarnitin (C10;1-DC) 18,3 5,28 Einfach ungesättigtes Hydroxy-Decanoylcarnitin (C10;1-OH) 15,2 4,39 Zweifach ungesättigtes Decanoylcarnitin (C10;2) 21,7 6,26 Dodecanoylcarnitin (C12) 13,7 3,95 Dicarboxy- Dodecanoylcarnitin (C12-DC) 13,5 3,89 Hydroxy-Dodecanoylcarnitin (C12-OH) 15,0 4,33 Einfach ungesättigtes Dodecanoylcarnitin (C12;1) 13,3 3,84 Einfach ungesättigtes Dicarboxy- Dodecanoylcarnitin (C12;1-DC) 13,5 3,90 Einfach ungesättigtes Hydroxy-Dodecanoylcarnitin (C12;1-OH) 14,5 4,18 Tetradecanoylcarnitin (C14) 16,5 4,76 Hydroxy- Tetradecanoylcarnitin (C14-OH) 20,0 5,77 Einfach ungesättigtes Tetradecanoylcarnitin (C14;1) 14,2 4,10 Einfach ungesättigtes Hydroxy- Tetradecanoylcarnitin (C14;1-OH) 54,4 15,70 Zweifach ungesättigtes Tetradecanoylcarnitin (C14;2) 13,9 4,01 Hexadecanoylcarnitin, auch Palmitoylcarnitin (C16) 397,0 114,60 Hydroxy- Hexadecanoylcarnitin (C16-OH) 18,3 5,28 Einfach ungesättigtes Hexadecanoylcarnitin (C16;1) 18,9 5,46 Zweifach ungesättigtes Hexadecanoylcarnitin (C16;2) 18,6 5,37 Octadecanoylcarnitin (C18) 12,9 3,72 Einfach ungesättigtes Octadecanoylcarnitin (C18;1) 16,0 4,62 Zweifach ungesättigtes Octadecanoylcarnitin (C18;2) 18,5 5,34
Tabelle 10: Konzentrationen der untersuchten Acylcarnitine im Dialysat.
Die Abkürzungen stehen für: CNummer= Acylcarnitin mit entsprechender Anzahl an Kohlenstoff (C)-Atomen; „1“ bedeutet einfach ungesättigt durch eine Doppelbindung; „2“ bedeutet zweifach ungesättigt; DC= Dicarboxylgruppe; OH= Hydroxygruppe.
- 82 - ERGEBNISSE ______
5.3.2.1 Isovalerylcarnitin (C 5)
Abbildung 28 zeigt die Wirkung einer Sekretininjektion auf die Konzentration von Isovalerylcarnitin im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Die Abbildung zeigt ab dem Zeitpunkt t=20min. einen Anstieg des Spiegels an Isovalerylcarnitin in der Kontrollgruppe, während der Spiegel in der Sekretingruppe abfällt. Signifikante Unterschiede finden sich zu den Zeitpunkten t=60min. und t=80min. (p<0,05). Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der ermittelten Isovalerylcarnitin- Konzentration im Hippokampus beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 16,1µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 3,5µMol/l.
200
* * 150
100
50 C 5 (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 28: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazellulären Konzentrationen von C5 im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0.05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 83 - ERGEBNISSE ______
5.3.2.2 Einfach ungesättigtes Dicarboxy-Isovalerylcarnitin (C5;1-DC)
Abbildung 29 zeigt die Wirkung einer Sekretininjektion auf die Konzentration von einfach ungesättigtem Dicarboxy-Isovalerylcarnitin im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Zum Zeitpunkt t=20min. ist ein Anstieg der Konzentration an einfach ungesättigtem Dicarboxy-Isovalerylcarnitin in der Sekretingruppe zu beobachten, der seinen Höhepunkt bei t=40min. erreicht und zum Zeitpunkt t=60min. wieder abfällt. Der Spiegel an einfach ungesättigtem Dicarboxy-Isovalerylcarnitin bleibt über die gesamte restliche Zeit des Versuchs gegenüber der Kontrollgruppe erhöht. Ein signifikanter Unterschied der Sekretingruppe gegenüber der Kontrollgruppe findet sich zum Zeitpunkt t=40min. (p<0,05). Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der gemessenen Konzentration an einfach ungesättigtem Dicarboxy-Isovalerylcarnitin im Hippokampus beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 19,1µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 5,5µMol/l.
250 *
200
150
100
50 C 5;1-DC (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 29: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. a. d. extrazellulären Konzentrationen von C5;1-DC im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0.05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 84 - ERGEBNISSE ______
5.3.2.3 Dicarboxy-Octanoylcarnitin (C 8-DC)
Abbildung 30 zeigt die Wirkung einer Sekretininjektion auf die Konzentration von Dicarboxy- Octanoylcarnitin im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Die Graphik zeigt ab dem Zeitpunkt t=20min. einen Anstieg des Spiegels an Dicarboxy-Octanoylcarnitin in der Sekretingruppe. Die Konzentration an Dicarboxy-Octanoylcarnitin bleibt in der Sekretingruppe gegenüber der Kontrollgruppe erhöht. Signifikante Unterschiede finden sich zu den Zeitpunkten t=60min. (p<0,05) und t=120min. (p<0,01). Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der ermittelten Konzentration an Dicarboxy-Octanoylcarnitin im Hippokampus beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 14µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 4,0µMol/l.
250
* ** 200
150
100
50 C 8-DC (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 30: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. a. d. extrazellulären Konzentrationen von C8-DC im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0.05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 85 - ERGEBNISSE ______
5.3.2.4 Einfach ungesättigtes Decanoylcarnitin (C 10;1)
Abbildung 31 zeigt die Wirkung einer Sekretininjektion auf die Konzentration von einfach ungesättigtem Decanoylcarnitin im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Die Graphik zeigt ab dem Zeitpunkt t=20min. einen Anstieg des Spiegels an einfach ungesättigtem Decanoylcarnitin in der Sekretingruppe. Im Zeitpunkt t=80min. findet sich ein gegenüber der Kontrollgruppe signifikanter Unterschied der Konzentrationen an C 10 1 (p< 0.05). Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der ermittelten Konzentration an einfach ungesättigtem Decanoylcarnitin im Hippokampus beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 20µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 5,8µMol/l.
250 *
200
150
100
50 C 10;1 (% von Vorlauf) (% C 10;1
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 31: Effekt von Sekretin i.p. auf die extrazellulären Konzentrationen von C10;1 im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion (30kU/kg KG) erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0.05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 86 - ERGEBNISSE ______
5.3.2.5 Einfach ungesättigtes Hydroxy-Decanoylcarnitin (C10;1-OH)
Abbildung 32 zeigt die Wirkung einer Sekretininjektion auf die Konzentration von einfach ungesättigtem Hydroxy-Decanoylcarnitin im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Die Graphik zeigt ab dem Zeitpunkt t=20min. einen Anstieg des Spiegels an einfach ungesättigtem Hydroxy- Decanoylcarnitin in der Sekretingruppe, der seinen Gipfel zum Zeitpunkt t=40min. erfährt, jedoch nicht signifikant ist. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der ermittelten Konzentration an einfach ungesättigtem Hydroxy-Decanoylcarnitin im Hippokampus beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 15,2µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 6,3µMol/l.
250
200
150
100
50 C 10;1-OH (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 32: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. a.d. extrazell. Konzentrationen von C10;1-OH im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0.05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 87 - ERGEBNISSE ______
5.3.2.6 Hydroxy-Dodecanoylcarnitin (C12-OH)
In Abbildung 33 wird die Wirkung von Sekretin auf den Konzentrationsverlauf von Hydroxy- Dodecanoylcarnitin im Hippokampus der Ratte dargestellt. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Die extrazellulären Konzentrationen der Sekretingruppe steigen zum Zeitpunkt t=20min. an, d.h., 20min. nach Injektion des Sekretins. Nach Erreichen des Höhepunkts bei t=40min. fällt die Konzentration wieder ab, bleibt jedoch gegenüber der Kontrollgruppe erhöht. Zum Zeitpunkt t=100min. findet sich bei der Sekretingruppe ein signifikanter Unterschied der Konzentration von Hydroxy-Dodecanoylcarnitin gegenüber der Kontrollgruppe (p<0.05). Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der gemessenen Hydroxy- Dodecanoylcarnitin- Konzentration im Hippokampus beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 15µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 4,3µMol/l.
300
200 von Vorlauf) *
100 C 12-OH (% C 12-OH
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (m in.)
Abbildung 33: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. a.d. extrazellulären Konzentrationen von C12-OH im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 88 - ERGEBNISSE ______
5.3.3 UNTERSUCHUNG MITTELS HPLC UND FLUORESZENZDETEKTION
5.3.3.1 GABA
Die i.p. Injektion von Sekretin zum Zeitpunkt t=0min. führte nach 60min. zu einem signifikanten Anstieg des extrazellulären GABA im Hippokampus (Clement et al., 2002; Kuntz et al., 2001; 2002; 2003). Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Die durch den student t-test ermittelte Signifikanz beträgt zum Zeitpunkt t=60min. und t=80min. p<0,05. Der GABA– Spiegel der Kontrollgruppe unterliegt einem kontinuierlichen Konzentrationsgefälle, während es bei der Sekretingruppe bereits nach 20min. zu einem in Abbildung 34 sichtbaren, wenngleich nicht signifikanten Anstieg des GABA-Spiegels kommt. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären GABA- Konzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 2,40µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 0,28µMol/l. Unter Berücksichtigung der in vitro- Recovery für GABA von 5,22% ergibt sich eine extrazelluläre Konzentration von GABA von 46,0µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 5,36µMol/l.
200
* 150 *
100
50 GABA GABA (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Z e it (m in .)
Abbildung 34: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von GABA im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 89 - ERGEBNISSE ______
5.3.3.2 Glutamat Die i.p. Injektion von Sekretin zum Zeitpunkt t=0min. führte nach 60 und 80min. zu einem signifikanten Anstieg der extrazellulären Konzentrationen von Glutamat im Hippokampus (Clement et al., 2002; Kuntz et al., 2001; 2002; 2003). Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Die durch den student t-Test ermittelte Signifikanz beträgt zum Zeitpunkt t=60min. und t=80min. p<0,05. Der Glutamat– Spiegel der Kontrollgruppe unterliegt einem kontinuierlichen Konzentrationsgefälle, während es bei der Sekretingruppe bereits nach 20min. zu einem in der Graphik sichtbaren, wenngleich nicht signifikanten Anstieg des Glutamat-Spiegels kommt. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären Glutamatkonzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 4,73 µMol/l bei einer mittleren Standardabweichung von 1,09 µMol/l. Unter Berücksichtigung einer in vitro Recovery von 11,22% ergibt sich eine extrazelluläre Konzentration von Glutamat von 42,15 µMol/l bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 9,71 µMol/l.
200
** 150
100
50 Glutamat (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 35: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Glutamat im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 90 - ERGEBNISSE ______
5.3.4 METHODENVERGLEICH TANDEM-MS UND HPLC
Glutamat und Aspartat wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit unabhängig voneinander durch zwei verschiedene Methoden bestimmt. Anlass der doppelten Bestimmung der beiden Substanzen war eine fehlende Trennbarkeit von Glutamin und Glutamat im Rahmen der Tandem- MS- Untersuchungen. Um zu gewährleisten, dass die Messungen auch tatsächlich den extrazellulären Gehalt der Aminosäuren Aspartat und Glutamat wiederspiegeln, wurde nach der Tandem-MS noch die Messung der Aminosäuren mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion durchgeführt. Dabei fällt auf, dass die Verläufe der Glutamatuntersuchungen (Abbildung 36 und Abbildung 37) sich ähneln, in beiden Untersuchungen kommt es im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einem signifikanten Anstieg der extrazellulären Konzentrationen von Glutamat. Die Aspartatuntersuchungen (Abbildung 38 und Abbildung 39) zeigen jedoch unterschiedliche Verläufe. Bei der HPLC- Untersuchung (Abbildung 38) kommt es initial in beiden Gruppen zu einem Abfall der Konzentrationen, während die Tandem- MS- Untersuchung (Abbildung 41) einen konstanten Verlauf der extrazellulären Konzentrationen von Aspartat in beiden Gruppen zeigt. Tabelle 11 stellt die mit beiden Methoden ermittelten extrazellulären Konzentrationen von Aspartat und Glutamat einander gegenüber. Mittels Tandem-MS wurden sowohl für Aspartat als auch für Glutamat höhere extrazelluläre Konzentrationen nachgewiesen als mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion (Aspartat: Faktor: 2,42; Glutamat: Faktor 1,85).
- 91 - ERGEBNISSE ______
5.3.4.1 Glutamat
5.3.4.1.1 Glutamatbestimmung mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion
200
* * 150
100
50 Glutamat--HPLC (% von Vorlauf) von (% Glutamat--HPLC 0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Z eit (m in.)
Abbildung 36: HPLC- Bestimmung des Effekts von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Glutamat im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
5.3.4.1.2 Glutamatbestimmung mittels Tandem-MS
200
* * * * * * 150
100
50
Glutamat--Tandem-MS(% von Vorlauf) von Glutamat--Tandem-MS(% 0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Z e it (m in .)
Abbildung 37: Tandem-MS-Bestimmung des Effekts von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Glutamat im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 92 - ERGEBNISSE ______
5.3.4.2 Aspartat
5.3.4.2.1 Messung von Aspartat mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion
200
150
100
50
Aspartat--HPLC (% von Vorlauf) von (% Aspartat--HPLC 0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Z e it (m in .)
Abbildung 38: HPLC-Bestimmung des Effekts von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Aspartat im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
5.3.4.2.2 Messung von Aspartat mittels Tandem-MS
200
150
100
50 Aspartat--Tandem-MS (% von Vorlauf) von (% Aspartat--Tandem-MS 0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Z e it (m in .)
Abbildung 39: Tandem-MS-Bestimmung des Effekts von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Aspartat im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 93 - ERGEBNISSE ______
HPLC TANDEM-MS MW DER SEM (N=12) MW DER SEM (N=12) IN SUBSTANZ EXTRAZELL. IN µMOL/L EXTRAZELL. µMOL/L KONZ. IN KONZ. IN µMOL/L µMOL/L Aspartat 0,87 0,20 2,11 0,22 Glutamat 4,73 1,09 8,76 1,71 Tabelle 11: Vergleich der mit HPLC und Tandem-MS ermittelten extrazellulären Konzentrationen von Aspartat und Glutamat in µMol/l, daneben die SEM in µMol/l. Die in-vitro Recovery wurde in dieser Tabelle nicht berücksichtigt. MW=Mittelwert.
5.3.5 UNTERSUCHUNG VON KATECHOLAMINEN UND INDOLAMINEN
MITTELS HPLC UND ELEKTROCHEMISCHER DETEKTION
Die Katecholamine wurden mittels HPLC und elektrochemischer Detektion gemessen, wie bereits in Kapitel 4 ausführlich beschrieben. Vor Beginn der Messungen und nach den Messungen wurden jeweils Standard A, Standard B und Ringer-Lösung injiziert, um die Substanzen anhand der Retentionszeiten ermitteln und um Retentionszeitverschiebungen erkennen zu können. Anhand des Quotienten aus Peakhöhe des Standards mit bekannten Konzentrationen der gemessenen Substanzen und Peakhöhe der Substanzen in den gemessenen Proben konnten die Konzentrationen relativ zum Standard bestimmt werden. Bei den Messungen ergaben sich folgende Probleme: Die zum Teil nur sehr niedrigen Konzentrationen einzelner Substanzen erschwerten eine adäquate Peakzuordnung, da die einzelnen Peaks sich nur wenig vom Hintergrundrauschen abhoben. Es ist also davon auszugehen, dass die in der Extrazellularflüssigkeit vorhandenen Substanzen nur in unter oder leicht über der Detektionsschwelle der angewandten Messmethode liegenden Konzentrationen vorlagen und damit nicht oder nur schwach als Peak darstellbar waren. Dies trift insbesondere für Noradrenalin zu, in schwächerem Masse auch für Serotonin und 3-MT, deren Detektionsschwelle deutlich unter den restlichen Substanzen lag. Die verwendeten Standards enthielten acht verschiedene Substanzen. Die Mikrodialysesonde wurde mit Ringer-Lösung gespült, die ihrerseits mehrere elektrochemisch aktive Elektrolyte enthält: Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calziumchlorid.
- 94 - ERGEBNISSE ______
Substanz Mittelwert SEM Molekulargewicht
Noradrenalin 001,97 01,8 169,2 Adrenalin 030,2 19,3 183,2 5-HIAA 214,5 93,9 191,2 HVA 027,2 16,2 182,2 Dopamin 014,3 08,5 153,1 5-HT 058,9 38,7 176,2 3-MT 044,7 16,4 167,1 Tabelle 12: Übersicht über die Konzentrationen der mit HPLC und elektrochemischer Detektion analysierten Substanzen zum Zeitpunkt t=0 (Angaben als MW und SEM)
- 95 - ERGEBNISSE ______
5.3.5.1 Noradrenalin
Abbildung 40 zeigt die Wirkung einer i.p. Injektion von Sekretin auf die extrazelluläre Konzentration von Noradrenalin im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Nach der Sekretininjektion zum Zeitpunkt t=0min. zeigt sich der Konzentrationsverlauf der Kontrollgruppe, der NaCl i.p. verabreicht wurde, als gegenüber der Sekretingruppe erhöht, während die Konzentration von Noradrenalin in der Sekretingruppe nicht oder nur mäßig ansteigt. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären Noradrenalin- Konzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 1,97pg/20µl bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 1,80pg/20µl.
300
200
100
0 Noradrenalin (% von Vorlauf) (% von Noradrenalin
-100 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 40: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazell. Konzentration von Noradrenalin im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 96 - ERGEBNISSE ______
5.3.5.2 Adrenalin
Abbildung 41 zeigt die Wirkung einer i.p. Injektion von Sekretin auf die extrazelluläre Konzentration von Adrenalin im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Beide Gruppen zeigen einen kontinuierlichen Konzentrationsabfall ohne statistisch signifikanten Unterschied. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären Adrenalin-Konzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 30,2pg/20µl bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 19,3pg/20µl.
300
200
100 Adrenalin (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 41: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Adrenalin im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 97 - ERGEBNISSE ______
5.3.5.3 5-Hydroxyindolessigsäure
Abbildung 42 zeigt die Wirkung einer i.p. Injektion von Sekretin auf die extrazelluläre Konzentration von 5-Hydroxyindolessigsäure im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Beide Gruppen zeigen zunächst einen Konzentrationsanstieg. Nach der i.p. Sekretininjektion findet sich ab dem Zeitpunkt t=60min. in der Sekretingruppe eine weitgehende Konstanz der Konzentration an 5- Hydroxyindolessigsäure, während in der Kontrollgruppe ein weiterer Anstieg der Konzentration zu beobachten ist. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären 5- Hydroxyindolessigsäure-Konzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 214,5pg/20µl bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 93,9pg/20µl.
250
200
150
100
50 5-HIAA (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 42: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von 5-HIAA im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 98 - ERGEBNISSE ______
5.3.5.4 Homovanillinsäure
In Abbildung 43 wird der Konzentrationsverlauf von Homovanillinsäure nach Injektion von Sekretin bzw. NaCl dargestellt. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Eine statistische Signifikanz lässt sich nicht belegen. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären Homovanillinsäure-Konzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 27,2pg/20µl bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 16,2pg/20µl.
300
250
200
150
100 HVA (% von Vorlauf) 50
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 43: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von HVA im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 99 - ERGEBNISSE ______
5.3.5.5 Dopamin
Abbildung 44 zeigt die Wirkung einer i.p. Injektion von Sekretin bzw. NaCl auf die extrazelluläre Konzentration von Dopamin im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/ kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Beide Gruppen zeigen zunächst einen Konzentrationsabfall. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären Dopamin- Konzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 14,3pg/20µl bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 8,5pg/20µl.
300
250
200
150
100
50 Dopamin (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 44: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Dopamin im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 100 - ERGEBNISSE ______
5.3.5.6 Serotonin
Abbildung 45 zeigt die Wirkung einer i.p. Injektion von Sekretin bzw. NaCl auf die extrazelluläre Konzentration von Serotonin im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen lässt sich nicht belegen. Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der extrazellulären Serotonin- Konzentration beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 58,9pg/20µl bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 38,7pg/20µl.
250
200
150
100
50 Serotonin (% von Vorlauf)
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 45: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von Serotonin im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 101 - ERGEBNISSE ______
5.3.5.7 3-MT
Abbildung 46 zeigt die Wirkung einer Sekretin- bzw. NaCl- Injektion auf die extrazelluläre Konzentration von 3-MT im Hippokampus der Ratte. Der Kontrollgruppe wurde zum Zeitpunkt t=0min. physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%), der Sekretingruppe porcines Sekretin (30 klinische Einheiten Secrelux®/kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert. Zum Zeitpunkt t=20min. ist ein gegenüber der Kontrollgruppe, der NaCl verabreicht wurde, statistisch signifikanter Anstieg der Konzentration an Serotonin in der Sekretingruppe zu beobachten (p<0,01). Der aus Kontroll- und Sekretingruppe ermittelte Mittelwert der gemessenen 3-MT -Konzentration im Hippokampus beträgt zum Zeitpunkt t=0min. 44,7pg/20µl bei einem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 16,4pg/20µl.
250 ** 200
150
100
3-MT (% von Vorlauf) 50
0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 46: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf die extrazelluläre Konzentration von 3-MT im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als MW ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 102 - ERGEBNISSE ______
5.3.5.8 5-HIAA/ 5-HT-Ratio
Abbildung 47 zeigt die Wirkung einer Sekretin- bzw. NaCl- Injektion auf das Verhältnis der extrazellulären Konzentrationen von 5-HIAA und 5-HT. Dargestellt sind die Quotienten der extrazellulären Konzentrationen von 5-HIAA und 5-HT. Zum Zeitpunkt t=80min. ist bei der Sekretingruppe ein Anstieg des Quotienten aus 5-HIAA und 5-HT zu beobachten, der jedoch nicht signifikant ist.
400
300
200
100
5-HIAA/5-HT Ratio (% von Vorlauf) 0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 47: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf das Verhältnis von 5-HIAA zu 5-HT im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als Quotient der extrazellulären Konzentrationen von 5-HIAA und 5-HT ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 103 - ERGEBNISSE ______
5.3.5.9 3-MT/ Dopamin- Ratio
Abbildung 48 zeigt die Wirkung einer Sekretin- bzw. NaCl- Injektion auf das Verhältnis der extrazellulären Konzentrationen von 3-MT und Dopamin. Dargestellt sind die Quotienten der extrazellulären Konzentrationen von 3-MT und Dopamin. Zum Zeitpunkt t=20min. findet sich bei der Sekretingruppe ein statistisch signifikanter Anstieg des Verhältnisses von 3-MT und Dopamin (p<0,05).
250 *
200
150
100
50
3-MT/Dopamin Ratio (% von Vorlauf) 0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (min.)
Abbildung 48: Effekt von Sekretin 30 kU/kg i.p. auf das Verhältnis 3-MT zu Dopamin im Hippokampus der Ratte nach in vivo Mikrodialyse im Vergleich zur Kontrolle (NaCl). Die Injektion erfolgte zum Zeitpunkt t=0min. Die Daten sind dargestellt als Quotient der extrazelluläre Konzentrationen von 3-MT und Dopamin ± S.E.M., n=5, *p<0,05, **p<0,01. Kontrolle: -Ο- Sekretin -•-
- 104 - DISKUSSION ______
6 DISKUSSION
Die Funktion von Sekretin im Zentralnervensystem ist auch 100 Jahre nach Entdeckung dieses Hormons durch Bayliss und Starling (Bayliss und Starling, 1902) nur wenig bekannt. Erst durch die Diskussion, ob Sekretin als in der Presse gepriesenes „Wundermittel“ zur Therapie des Autismus eingesetzt werden könne, gelangte die Frage nach den zentralen Wirkungen von Sekretin wieder verstärkt in den Fokus neuropharmakologischer Forschung (Horvath et al., 1998; Ng et al., 2002). Wenngleich die zum Thema „Sekretin und Autismus“ veröffentlichten Studien bislang keinen endgültigen Nachweis für die Wirksamkeit von Sekretin bei der Behandlung des autistischen Krankheitsbilds erbringen konnten (unter anderem Owley et al., 2001; Lightdale et al., 2001; Chez et al., 2000; Roberts et al., 2001; Coniglio et al., 2001; Kern et al., 2002; Unis et al., 2002), finden sich dennoch in einzelnen Studien Aussagen über die Wirksamkeit von Sekretin bei der Subgruppe der autistischen Patienten mit gastrointestinaler Begleitsymptomatik (Horvath et al., 1998; Kern et al., 2002). Darüber hinaus konnte die Firma Repligen in einer Phase II Studie zur Zulassung von Sekretin als therapeutisches Mittel zur Behandlung des Autismus eine signifikante Verbesserung sozialer und sprachlicher Funktionen bei der mit Sekretin behandelten Gruppe der 2;6 bis 4 Jahre alten Patienten feststellen, während bei den älteren Kindern kein signifikanter Effekt zu beobachten war, wenngleich die im Anschluss durchgeführte Phase III-Studie die positiven Ergebnisse von Phase II nicht bestätigen konnte (www.repligen.com; s. auch Kap.1). Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung von Sekretin auf den Stoffwechsel von Neurotransmittern im Hippokampus der Ratte. Der Schwerpunkt der Arbeit richtet sich auf die Untersuchung der Wirkung von Sekretin auf den zerebralen Stoffwechsel von Aminosäuren- hier vor allem auf GABA und Glutamat- und von Neurotransmittern des noradrenergen, des dopaminergen und des serotonergen Neurotransmittersystems. Dabei knüpft diese Arbeit an vorherige Literaturangaben an, die eine Beteiligung dieser Neurotransmittersysteme an Genese und Krankheitsbild des Autismus postulierten (zusammenfassend bei Gillberg und Coleman, 2000; Polleux und Lauder, 2004). Auf die einzelnen Neurotransmitter soll an späterer Stelle ausführlich eingegangen werden.
TIERMODELLE Bei der Untersuchung von neurochemischen Fragestellungen ist es zunächst von besonderer Wichtigkeit, Analogien vom Tiermodell zum menschlichen Organismus herstellen zu können. Auf Grund der Heterogenität der Erkrankung und der fehlenden Kenntnis einer exakten ätiologischen Zuordnung kausaler Faktoren zum Krankheitsbild des Autismus existiert bislang jedoch kein allgemein gültiges Tiermodell für Autismus. Zur Erforschung von Sekretin hat sich die Ratte in früheren Studien jedoch bereits bewährt (unter anderem Fremeau et al., 1983; Charlton, 1983; Samson
- 105 - DISKUSSION ______et al., 1984; Nozaki et al., 2002; Koves et al., 2004; Tay et al., 2004). Sekretin der Ratte unterscheidet sich nur in drei Aminosäuren von humanem Sekretin (Sherwood et al., 2000), zudem zeigt sich hinsichtlich der Verteilung von Sekretin im ZNS eine grosse Übereinstimmung zwischen Mensch und Ratte (Koves et al., 2004). Insbesondere vor dem Hintergrund der Frage nach einem anatomischen bzw. biochemischen Korrelat sozialen Verhaltens und seiner Defizite (Übersicht bei Lim et al., 2005) werden und wurden zahlreiche Tiermodelle des Autismus diskutiert, jedoch konnte sich bislang vor allem aufgrund der Komplexität der Thematik kein Modell durchsetzen (Übersicht bei Murcia et al., 2005). Im Folgenden sollen die unterschiedlichen pathogenetischen Ansätze exemplarisch vorgestellt werden. Einige Gruppen gehen davon aus, dass Läsionen spezifischer Hirnareale zu autistoiden Verhaltsmustern führen können, z.B. soll eine Verletzung von Hippokampus und Amygdala am siebten Tag der Entwicklung autismusähnliche Symptome bei Ratten hervorrufen (Daenen et al., 2002; ähnlich Diergaarde et al., 2004, jedoch mit nachfolgender sozialer Isolation der Ratte); Caston et al. diskutieren Meerschweinchen mit angeborenen Defekten des Zerebellums als Tiermodell (Caston et al., 1998). Andere Autoren fokussieren neurochemische Aspekte: Winslow geht von einer Verbindung von Defiziten im Sozialverhalten und niedrigen Oxytocinspiegeln im Liquor von Rhesusaffen aus (Winslow, 2005). Kahne et al. behandelten Ratten im frühen Gestationsalter mit dem Serotoninagonisten 5-Methoxytryptamin (5-MT) und bezogen sich damit auf die hyperserotonerge Theorie des Autismus (Kahne et al., 2002). Eine Infektion als mögliche Ursache des Autismus wird unter anderem von Pletnikov et al. und Fatemit et al. favorisiert (Pletnikov et al., 2002, ähnlich Fatemi et al., 2005; Übersicht: Libbey et al., 2005). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Mikrodialyseuntersuchungen an der gesunden Ratte durchgeführt, da derzeit kein allgemein gültiges Tiermodell des Autismus zur Verfügung steht.
MIKRODIALYSETECHNIK Die Mikrodialysetechnik hat sich seit ihrer Einführung in den 80er Jahren zur Bestimmung der extrazellulären Konzentrationen von Neurotransmittern etabliert. Vor allem das hohe zeitliche Auflösungsvermögen und die Möglichkeit, neurochemische Prozesse in vivo beobachten zu können, sind für die Erforschung des Neurotransmitterhaushalts im ZNS von großer Relevanz (Ungerstedt, 1991). Bei der Interpretation der Ergebnisse müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden: • Durch die Implantation der Sonde kommt es zu kleinen Verletzungen des umliegenden Gewebes mit nachfolgenden zellulären Reaktionen im Gehirn der Ratte wie beispielsweise Gliose, Ödeme, Nekrosen und Blutungen (Humpel et al., 1996). Weiterhin werden in der Literatur eine intracerebroventrikuläre Drucksteigerung und auch eine Erhöhung der
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Kapillarpermeabilität nach Implantation von Mikrodialysesonden beschrieben (Elmquist und Sawchuk, 1997). Die mechanische Schädigung der Zellen kann zu einem Ausstrom von Neurotransmittern, Aminosäuren und Ionen führen, welcher wiederum einen direkten Einfluss auf die spannungsabhängige Aktivität der intakten Neurone haben kann (Elmquist und Sawchuk, 1997). Diese Faktoren können ihrerseits die freie Diffusion der Substanzen beeinträchtigen. • Weiterhin kann es zu einer Verminderung von lokaler Durchblutung und Glucosemetabolismus kommen (Benveniste et al., 1987). • Die Implantation der Mikrodialysesonde hat Einfluss auf die Bluthirnschranke, dessen Ausmass und Bedeutung jedoch in der Literatur widersprüchlich angegeben wird: Groothius et al. zeigten in einer autoradiographischen Untersuchung eine erhöhte Permeabilität der Bluthirnschranke für die Testsubstanzen 14C-α-Aminoisobuttersäure, 14-C-Sucrose und 14C- Dextran auf, die nach beispielsweise initial bis zu 25-fach erhöhter Passage von 14C-α- Aminoisobuttersäure auch nach 28 Tagen noch zu beobachten war (Groothius et al., 1998), während die Bluthirnschranke in anderen Studien während der ersten 30 min. (Benveniste et al., 1984) bzw. 80min. (Tossman and Ungerstedt, 1986) nach der Implantation intakt blieb. In der vorliegenden Arbeit wurden die Experimente unmittelbar im Anschluss an die Implantation der Mikrodialysekanüle durchgeführt. Nach Ansicht von Benveniste und Diemer spielen die beschriebenen Faktoren nur eine untergeordnete Rolle (Benveniste und Diemer, 1987). Bereits ca. 30min. postoperativ komme es zu einer Normalisierung der Spiegel an den im Extrazellularraum vorhandenen Substanzen (Hillered et al., 1990).
KONFUNDIERENDE EFFEKTE VON OPERATION UND ANÄSTHESIE Um den Einfluss der Anästhesie auf den Stoffwechsel der Neurotransmitter so gering wie möglich zu halten, wurden die Experimente an der frei beweglichen Ratte durchgeführt. Die Tiere wurden zunächst während der Operation mit Isofluran anästhesiert: Isofluran zeigt im Tierexperiment eine gute Verträglichkeit und findet breite Anwendung bei Mikrodialyseuntersuchungen (Patel et al., 1994). Charakteristisch für Isofluran sind eine schnelle Verteilung im Körper über den Lungenkreislauf und ein schneller Abbau nach Ende der Anästhesie (Wenker, 1999). Isofluran interagiert mit Neurotransmittern im Zentralnervensystem, da es seine Wirkung hauptsächlich im ZNS entfaltet. Hauptangriffspunkt der Inhalationsnarkotika sollen dabei vor allem GABAA-Rezeptoren im Zentralnervensystem sein (Olsen, 2002); der genaue Wirkmechanismus ist jedoch noch nicht hinreichend geklärt. In der Literatur werden Einflüsse von Isofluran auf verschiedene Neurotransmittersysteme beschrieben: eine Reduktion der Exzitation und ein Anstieg der Inhibition im Kortex von Säugetieren (Larsen und Langmoen, 1998), eine Reduktion der vesikulären und der nicht
- 107 - DISKUSSION ______vesikulären Glutamatfreisetzung (Larsen et al., 1994, Larsen et al., 1998), eine Erhöhung der Wiederaufnahme von Glutamat in Neuronen (Larsen et al., 1997) und Astrozyten (Miyazaki et al., 1997), eine Beeinflussung des Stoffwechsels der monoaminergen Neurotransmitter (zusammenfassend Anzawa et al., 2001), Freisetzung und Wiederaufnahme von GABA (Minchin, 1981), Freisetzung von Dopamin (Salord et al., 1997) und eine Inhibition der Dopaminaufnahme im Striatum der Ratte (El Maghrabi und Eckenhoff, 1993). Möglicherweise sind die initialen Veränderungen der extrazellulären Konzentrationen einzelner Neurotransmitter auf die Wirkung von Operation und Anästhesie zurückzuführen. Durch das Nachlassen der Wirkung der Anästhesie könnte es zu einer Normalisierung der extrazellulären Konzentrationen der Neurotransmitter kommen. Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich bei einigen der untersuchten Substanzen (unter anderem Aspartat, Abbildung 27, Glutamat, Abbildung 35, Noradrenalin, Abbildung 40, Adrenalin, Abbildung 41, HVA, Abbildung 43) eine initiale Erhöhung der Konzentrationen im Extrazellularraum. Möglicherweise sind diese initialen Veränderungen unter anderem auch auf Operation und / oder Anästhesie zurück zu führen. Um einen Effekt der Anästhesie auf den zerebralen Neurotransmitterhaushalt stärker minimieren zu können, sollte in zukünftigen Studien ein größerer zeitlicher Abstand zwischen Operation und Beginn der Mikrodialyseuntersuchungen berücksichtigt werden. Linthorst et al. beispielsweise begannen erst 6-9 Tage nach der Implantation mit den Messungen (Linthorst et al., 1994).
BESTIMMUNG DER NEUROTRANSMITTER UND METABOLITEN IM MIKRODIALYSAT
HPLC Bei der Bestimmung von Katecholaminen und Indolaminen im Mikrodialysat hat sich vor allem die Kombination von elektrochemischer Detektion und HPLC bewährt (Patel et al., 1994). Diese Kombination bietet den Vorteil einer guten Auflösung bei niedriger Detektionsgrenze. Nachteil sind im Chromatogramm vorkommende Störpeaks und die Schwierigkeit der Zuordnung der Substanzen zu einzelnen Peaks des Chromatogramms. Die Zuordnung der einzelnen Substanzen zu den ermittelten Peaks wird durch die Verwendung von Standardlösungen mit definierten Konzentrationen der jeweiligen Substanz möglich (s. Kapitel 4 und 5). Dennoch kann nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass weitere im Mikrodialysat enthaltene Substanzen im Chromatogramm identische Peaks erzeugen. Dieses Problem stellte sich im Rahmen der vorliegenden Arbeit bei der Bestimmung von DOPAC und MHPG: hier war eine Trennung beider Substanzen mit der vorliegenden Trennungsmethode nicht möglich, da beide Substanzen im Chromatogramm die gleiche Retentionszeit zeigten und auch im Hippokampus der Ratte vorkommen (unter anderem Yamashita et al., 1998). Eine chromatographische Trennung von DOPAC als wichtigem Metaboliten des Dopaminstoffwechsels und MHPG als Metabolit des
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Noradrenalinmetabolismus war somit nicht möglich. Eine weitere Überschneidung konnte zwischen den Retentionszeiten von DOPAC/MHPG und Komponenten der Ringer-Lösung (KCl und NaCl) beobachtet werden (vgl. Abbildung 23). Aufgrund der beschriebenen Überschneidungen der Retentionszeiten sind die Messungen von DOPAC und MHPG letztlich nicht verwertbar. NA, 3-MT und 5-HT waren im Chromatogramm zum Teil ebenfalls nur schwach darstellbar, da die Peaks die Basislinie meist nur wenig überragten und nur vom anfallenden Hintergrundrauschen zu unterscheiden waren. Ausgewertet wurden im Rahmen dieser Studie nur Peaks mit einem Peak zu Rausch-Verhältnis grösser als 3:1.
TANDEM-MS Tandem-MS ist als ein zur Bestimmung extrazellulärer Konzentrationen von Aminosäuren geeignetes Verfahren anerkannt (Chace et al., 1993; 1996). Im Rahmen dieser Studie war eine Trennung von Glutamat und Glutamin bzw. Aspartat und Asparagin mittels Tandem-MS nicht möglich; somit konnte auch keine exakte Aussage über die extrazellulären Konzentrationen von Glutamat bzw. Aspartat getroffen werden, die sich von Glutamin bzw. Asparagin nur durch ihre endständigen Gruppen (Asparagin und Glutamin: Amidgruppe, Aspartat und Glutamat: Carboxalgruppe) unterscheiden und deren Molekulargewicht nur um jeweils 0,98 Dalton voneinander abweicht (Glutamat: 147,13 Dalton; Glutamin: 146,15 Dalton; Aspartat: 133,10 Dalton und Asparagin: 132,12 Dalton). Daher wurden die extrazellulären Konzentrationen von Glutamat und Aspartat – neben GABA - zur Kontrolle nochmals mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion bestimmt. HPLC und Fluoreszenzdetektion ist ein seit mehreren Jahrzehnten anerkanntes Verfahren zur Analyse von GABA und Glutamat (Roth, 1971; Bianchi et al., 1999). Graphisch zeigen sich für Glutamat bei beiden Methoden ähnliche Verläufe (s. Kapitel 5.3.4.1), während sich bei Aspartat (s. Kapitel 5.3.4.2) graphisch deutliche Unterschiede darstellen: bei der Bestimmung mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion kommt es zunächst zu einem initialen Abfall der extrazellulären Konzentrationen von Aspartat bei beiden Gruppen, der bei der Bestimmung mittels Tandem-MS nicht zu beobachten ist. Im Vergleich beider Methoden ergaben sich bei der Bestimmung von Aspartat und Glutamat mittels Tandem-MS höhere Konzentrationen als bei der Bestimmung mittels HPLC (Glutamat: Faktor 1,85; Aspartat: Faktor 2,42). Dies ist wahrscheinlich darauf zurück zu führen, dass sich die mittels Tandem- MS ermittelten Konzentrationen von Aspartat und Glutamat aufgrund der fehlenden Trennbarkeit von Aspartat/Asparagin und Glutamat/Glutamin als Summe der Konzentrationen von Aspartat und Asparagin resp. Glutamat und Glutamin darstellten, während dieser kumulative Effekt bei der Bestimmung mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion entfiel.
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STATISTISCHE VERFAHREN Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den extrazellulären Konzentrationen der gemessenen Substanzen zwischen den mit Sekretin behandelten Tieren und den Kontrolltieren wurde mit dem studen t-test ermittelt. Zweifelsohne kann im Falle der vorliegenden Arbeit kritisch angemerkt werden, dass keine Korrektur des α-Wertes erfolgt ist. Multiple t-tests führen zu einer α-Fehler-Inflation, die einer Korrektur bedarf, einer sog. α-Fehler-Korrektur, die nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden kann, beispielsweise mittels Bonferoni-Korrektur, mit Hilfe derer das Fehlerniveau für die einzelnen t-tests herabgesetzt wird,. Bei einer Anzahl n unabhängiger t-tests beträgt der α-Fehler p=(1- α)n. Eine hypothesenüberprüfende Studie würde ein derartiges Vorgehen erfordern. Die vorgelegte Arbeit ist hingegen vielmehr als Hypothesen generierende, explorative Untersuchung an einer definierten Stichprobe von 12 Versuchstieren anzusehen, jedoch nicht als Hypothesen überprüfende Studie, die eine bestehende Hypothese bestätigt oder widerlegt. Aufgrund der geringen Stichprobengrösse (n=12) wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auf eine post-hoc-Korrektur des α-Fehlers verzichtet. Die im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse und formulierten Hypothesen sollten in weiteren Studien kritisch überprüft werden.
ACYLCARNITINE Ursprünglich war die Bestimmung von Carnitin und Acylcarnitinen nicht im Studiendesign dieser Arbeit vorgesehen. Da jedoch eine parallele Bestimmung von Aminosäuren und Acylcarnitinen in der Universitäts-Kinderklinik der Universität Freiburg möglich war und aufgrund der sich dann bei der Auswertung ergebenden zum Teil statistisch signifikanten Ergebnisse wurden die Acylcarnitine in die vorliegende Arbeit mit aufgenommen. Die Bestimmung von Carnitin und Acylcarnitinen mittels Tandem-MS ist ein anerkanntes Verfahren (Millington et al., 1992). Die Kombination von In-Vivo Mikrodialyse und Tandem- Massenspektrometrie wurde erstmals in den frühen 90er Jahren beschrieben (Deterding et al., 1992). Auch die Kombination von Mikrodialyse und Massenspektrometrie als Methode zur Bestimmung von Substanzen im Gehirn der Ratte zur Bestimmung von verschiedenen Substanzen wird in der Literatur mehrfach beschrieben (Prokai et al., 2001), unter anderem im Zusammenhang mit der Bestimmung von Acetylcholin (Hows et al., 2002) und Nukleosiden (Zhu et al.,2000). Die Bestimmung von Carnitin und seinen Estern mittels Mikrodialyse und Tandem-MS wurde hingegen bislang nur in einer Studie beschrieben (Zhu et al., 2000): Zhu et al. untersuchten die extrazellulären Konzentrationen von Acetylcholin im Striatum der Ratte und identifizierten in der striatalen Extrazellulärflüssigkeit neben Acetylcholin und Cholin zusätzlich unter anderem Carnitin und seinen Ester Acetylcholin (Zhu et al., 2000). Im Gegensatz zur vorliegenden Untersuchung beschränkte sich die Studie von Zhu et al. jedoch auf die Bestimmung von freiem Carnitin und Acetylcarnitin, die restlichen längerkettigen
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Acylcarnitine blieben unberücksichtigt. Quantitative Angaben über die extrazellulären Konzentrationen von Acetylcarnitin und Carnitin im striatalen Mikrodialysat werden in der Studie von Zhu et al. hingegen nicht angegeben (Zhu et al., 2000). Carnitin akkumuliert vor allem in Neuronen des zerebralen Kortex und bildet Acylderivate. In Neuronen des erwachsenen Hirns liegt Carnitin etwa zu 80 % in freier Form und zu 10-15 % als Acetylcarnitin vor. Längerkettige Acylcarnitine machen etwa einen Anteil von ca. 10% am Gesamtcarnitin aus (Wawrzencyk et al., 1995). Carnitin passiert die Bluthirnschranke als freies Carnitin (Mroczkowska et al., 2000) und wird von neuronalen Zellen aufgenommen (Nalecz et al., 1995; Wawrzenczyk et al., 2001). Die Konzentration an Carnitin ist dabei im Gehirn im allgemeinen geringer als in peripheren Geweben, eine Ausnahme stellt lediglich der Hypothalamus dar (Bresolin et al., 1982). Diskutiert wird unter anderem auch, ob Carnitin und seinen Estern auch eine Funktion als Neurotransmitter zukommt (Falchetto et al., 1971). Shug et al. zeigten ein sehr heterogenes Verteilungsmuster von Carnitin im Gehirn von Kaninchen auf mit höchsten Konzentrationen im zerebellaren Kortex (43,13+/- 2,55 nmol/g gefrorenens Gewebe) und niedrigsten Konzentrationen im Hippokampus (11,74 +/- 1,15 nmol/g gefrorenes Gewebe) (Shug et al., 1982). Konzentrationen im ZNS von Ratten werden für Gesamtcarnitin bei Deutsch et al. mit 7-8 nMol/g Nassgewicht angegeben (Deutsch et al., 2000). Das Vorkommen von Acylcarnitinen wurde in der Literatur in Plasma (Chace et al., 2003: Konzentrationen von Freiem Carnitin), Serum (Kushnir et al., 2002) und Zerebrospinalflüssigkeit (Rubio et al., 1998) beschrieben. Grundsätzlich sind die im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelten Bestimmungen der Acylcarnitine im hippokampalen Mikrodialysat kritisch zu bewerten, da -wie bereits dargestellt- mit Ausnahme einer Studie (Zhu et al., 2000) keine Vergleichsdaten aus vorherigen Untersuchungen vorliegen und somit die Aussagekraft dieser Ergebnisse nicht sicher beurteilt werden kann. Zu den einzelnen Ergebnissen: Statistisch signifikante Ergebnisse zeigten sich im Rahmen der vorliegenden Untersuchung bei einfach ungesättigtem Dicarboxy-Isovalerylcarnitin (C5; 1-DC) (statistisch signifikanter Anstieg der Sekretingruppe zum Zeitpunkt t=40min., vgl. Abbildung 29), bei Dicarboxy-Octanoylcarnitin (C8-DC) (statistisch signifikanter Anstieg der Sekretingruppe zu den Zeitpunkten t=60 und t=120 min.; vgl. Abbildung 30), schwächer ausgeprägt beim einfach ungesättigten Decanoylcarnitin (C10;1) mit statistisch signifikantem Anstieg der extrazellulären Konzentrationen zum Zeitpunkt t=80 min. (vgl. Abbildung 31). Im Falle von Hydroxy-Dodecanoylcarnitin finden sich statistisch signifikante Unterschiede zwischen Sekretin- und Kontrollgruppe zum Zeitpunkt t= 100 min. (vgl. Abbildung 33). Bei Isovalerylcarnitin (C 5) kommt es in der Sekretingruppe zu den Zeitpunkten t=60 und 80 min. zu einem statistisch signifikanten Abfall der extrazellulären Konzentrationen (vgl. Abbildung 28). Auch bei einfach ungesättigtem Hydroxy-Decanoylcarnitin (vgl. Abbildung 32), zweifach ungesättigtem Decanoylcarnitin und Dodecanoylcarnitin lassen sich vergleichbare Trends beobachten, wenngleich
- 111 - DISKUSSION ______der Anstieg der extrazellulären Konzentrationen nach Sekretinapplikation nicht signifikant ist (die zugehörigen Graphen wurden aufgrund der fehlenden statistischen Signifikanz nicht in die Arbeit aufgenommen, sollen jedoch zur vollständigen Darstellung Erwähnung finden). Die dargestellten Ergebnisse lassen einen Effekt von Sekretin auf die extrazellulären Konzentrationen der genannten Acylcarnitine im Hippokampus und möglicherweise auf den Fettsäurestoffwechsel annehmen, auch wenn die vorliegenden Ergebnisse auf Grund der bereits beschriebenen fehlenden Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit Voruntersuchungen nur sehr vorsichtig interpretiert werden können und dürfen. Die extrazellulären Konzentrationen von Carnitin wurden im Rahmen dieser Untersuchungen nicht beeinflusst, hingegen finden sich signifikante Ergebnisse bei einzelnen seiner Ester. Nach Durchsicht der Literatur ist dies die erste Studie, die einen Zusammenhang zwischen Sekretin und Carnitin bzw. Acylcarnitinen im Zentralnervensystem beschreibt. Inwieweit die vorliegenden Ergebnisse tatsächlich auf einen Effekt von Sekretin auf den Fettsäurestoffwechsel zurück zu führen ist, lässt sich aufgrund fehlender Vergleichsangaben bzw. Vorstudien nicht schlüssig beurteilen, hingegen finden sich in der Literatur Hinweise, die eine Beeinflussung des Fettsäurestoffwechsels durch andere Mitglieder der VIP/Sekretinfamilie andeuten. VIP als verwandtes Peptid stimuliert z.B. in Enterozyten von Ratten die Oxidation von langen Fettsäuren durch Erhöhung des Transports der Fettsäuren in die Mitochondrien (Vidal et al., 1989). Vidal et al. vermuteten, dass dieser Effekt auf eine Aktivierung der Adenylatzyklase zurückzuführen sei. Ihre Annahme stützten sie auf die Beobachtung, dass mit Forskolin, einem direkten Stimulans der cAMP- Produktion, vergleichbare Effekte erzielt werden konnten. Die gezielte Störung von für PACAP codierende Gene kann durch eine Störung des Lipid-und Kohlenhydratmetabolismus bereits in den ersten postnatalen Wochen zum Tod führen (Gray et al., 2001). Ein Zusammenhang zwischen Autismus und Carnitin/Acylcarnitinen im Sinne eines relativen Carnitinmangels bei Autisten (Filipek et al., 2004) bzw. auch die Hypothese des Autismus als eine mitochondriale Erkrankung werden in der Literatur diskutiert (Lombard, 1998; Clark-Taylor und Clark-Taylor, 2004). Unklar bleibt auch, welchen Ursprungs die im Rahmen dieser Studie ermittelten Konzentrationen von Carnitin und Acylcarnitinen sind. Eine potentielle Verletzung der Bluthirnschranke im Rahmen der Mikrodialyseexperimente könnte zu einem Übertritt von Carnitin und Acylcarnitinen über die verletzte Blut-Hirnschranke in den Extrazellularraum führen. Zukünftige Studien sollten die vorliegenden Ergebnisse überprüfen und den dargestellten, noch ungeklärten Fragen Rechnung tragen.
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PASSAGE VON SEKRETIN ÜBER DIE BLUTHIRNSCHRANKE Sekretin wurde den Tieren mittels intraperitonealer Injektion verabreicht. Eine zentrale Wirksamkeit von Sekretin bei peripherer Verabreichung erfordert die Passage der Bluthirnschranke bzw. allgemeiner formuliert den Übertritt der Substanz vom peripheren Kreislaufsystem ins Zentralnervensystem. Die Bluthirnschranke als spezialisiertes Mikrovaskularsystem erlaubt die direkte Passage von kleineren Molekülen wie Sauerstoff, Wasser oder Kohlendioxid. Durch Diffusion können fettlösliche Moleküle die Membran passieren. Nicht fettlösliche Moleküle können über spezielle Transportsysteme durch die Bluthirnschranke geschleust werden (Begley, 1994). Für Sekretin als ein aus 27 Aminosäuren bestehendes wasserlösliches Molekül ist bislang kein spezifischer Transporter bekannt. Peptide und Proteine können unter physiologischen Bedingungen in der Regel das Endothel der Kapillaren der Bluthirnschranke nicht überqueren (Bickel et al., 2001). Die Fähigkeit, die Bluthirnschranke zu überwinden, wurde für das verwandte PACAP bereits 1996 aufgezeigt (Banks et al., 1996). Eine innerhalb von 24 verabreichte systemische Gabe von PACAP vermag einen durch Unterbindung von vier Gefässen verursachten Neuronenverlust im Hippokampus wieder rückgängig zu machen (Uchida et al., 1996). Banks et al. zeigten an vier Wochen alten Mäusen die Fähigkeit von radioaktiv markiertem 131 I- Sekretin-Analogon, die Bluthirnschranke zu passieren und fanden in allen Hirnregionen zwischen 0,118 und 0,295% des peripher injizierten, radioaktiv markierten 131 I-Sekretin-Analogon wieder; Sekretin passierte als intaktes Molekül die Bluthirnschranke und konnte vor allem jedoch in Hypothalamus, Hippokampus, Bulbus olfactorius und Zerebrospinalflüssigkeit bestimmt werden (Banks et al., 2002). Banks et al. postulierten, dass das Sekretinanalogon die Bluthirnschranke über ein sättigbares Transportsystem passiert, während die vaskuläre Bluthirnschranke, ähnlich wie bei VIP (Dogrukol-Ak et al., 2003), durch transmembranöse Diffusion überquert wird (Banks et al., 2002; Übersicht Dogrukol-Ak et al., 2004). Einen alternativen Zugangsweg von peripher verabreichtem Sekretin über eine Aktivierung von Neuronen in der Area postrema vor schlugen Goulet et al. 2003 vor (Goulet et al., 2003; ähnlich auch Connors und Crowell, 1999). Goulet et al. zeigten, dass i.v. verabreichtes Sekretin bei Ratten die Expression von FOS-Protein in den zentralen Amygdala, der Area postrema und auch anderen Hirnarealen induziert. Daraus folgerten sie, dass Sekretin möglicherweise aus dem Blut in die Area postrema tritt und dort die Expression von FOS-Protein induziert (Goulet et al., 2003). Die Area postrema gehört zu den Zirkumventrikulären Organen, bei denen als Besonderheit die Bluthirnschranke in der Wand der Blutgefässe nicht ausgebildet ist (Frick et al., 1992). Für VIP als verwandte Substanz konnten autoradiographisch Rezeptoren in der Area postrema nachgewiesen werden (Shaffer und Moody, 1986; Martin et al., 1987; Wiedermann et al., 1988). Eine neuere Studie fokussiert stärker auf eine vagusvermittelte Wirkung von Sekretin: Yang et al. beobachteten eine Aktivierung von c-Fos in mehreren Hirnregionen (unter anderem in Amygdala,
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Area postrema und Nucleus dorsalis Nervus vagi) nach i.p. Injektion von Sekretin (100mikrog/kg), die nach subdiaphragmaler Vagotomie mit Ausnahme der Area postrema in den meisten Arealen jedoch deutlich nachliess. Ausserdem zeigten sie, dass Sekretin die Tyrosinhydroxylase im Nucleus tractus solitarii aktiviert. Yang et al. gehen davon aus, dass peripher verabreichtes Sekretin katecholaminerge Neuronen in Nucleus tractus solitarii und auch in Medulla, Pons und limbischem System über einen vagusabhängigen Capsaicin-resistenten Übertragungsweg beeinflusst. Demnach soll peripher verabreichtes Sekretin seine Wirkung im Zentralnervensystem sowohl vagusvermittelt über Sekretinrezeptoren auf vagalen Afferenzen als auch über die Area postrema als Zugangsweg entfalten können (Yang H et al., 2004). Das Zusammenspiel von Sekretin und anderen Peptiden mit dem Vagusnerv ist bereits seit den 70er Jahren Gegenstand der Forschung (unter anderem Moreland und Johnson, 1971): nach Kwon et al. ist der axonale vagale Transport von entscheidender Bedeutung für die peripheren Wirkungen von Sekretin (Kwon et al., 1999). Die Sekretion von Magensäure durch Sekretin wird wahrscheinlich über vagale Afferenzen herabgesetzt (Li et al., 1998). Für PACAP konnten Ozawa et al. dieses Phänomen bestätigen: hier führte die zentrale Applikation von PACAP zu einer Erhöhung der gastrointestinalen Motilität, die wiederum durch Vagotomie geblockt werden konnte (Ozawa et al., 1999). Die Freisetzung von PACAP wird beispielsweise nach Vagotomie für eine Übergangszeit nahezu vollständig aufgehoben (Becker et al., 1979). Die Bedeutung des Vagus bei der Vermittlung von Effekten peripherer Wirkstoffe auf zentrale Mechanismen untersuchten 1994 unabhängig eine französische und eine amerikanische Forschungsgruppe: sie beschrieben eine zytokin-vermittelte neurale afferente Verbindung zwischen Immunsystem und Gehirn, die nach Ansicht dieser Autoren für Reaktionen wie Fieber, Aktivierung neuroendokriner Mechanismen und Verhaltensänderungen verantwortlich sein können (Dantzer, 1994; Watkins et al., 1995), der Nervus vagus wird hier als möglicher Zugangsweg für Zytokine aus dem Bauchraum ins ZNS diskutiert (Maier et al., 1998). So könnten nach Ge et al. vagale Afferenzen immunogene Informationen zu einer in der Medulla oblongata lokalisierten sogenannten medullären viszeralen Zone transportieren, von der aus Projektionen zu zentralen amygdaloiden Kernen ausgehen (Ge et al., 2001). Goldbach et al. gehen vom Konzept der Signalübertragung immunogener Informationen zum Gehirn über zirkulierende Zytokine aus, welche Reaktionen wie Fieber auslösen können. Die Verabreichung von bakteriellen Lipopolysachariden kann derartige Reaktionen auslösen (Goldbach et al., 1997), eine subdiaphragmale Vagotomie kann das Auslösen von Fieber nach intraperitonealer Injektion von bakteriellen Lipopolysachariden verhindern (Watkins et al., 1995). Nach Goldbach et al. soll vor allem der Art der Verabreichung eine zentrale Bedeutung zukommen: die Immunreaktion nach intraperitonealer Applikation soll dabei besonders stark durch eine Vagotomie beeinflusst werden (Goldbach et al., 1997; Bluthe et al., 1996b), während bei anderen Verabreichungsarten wie intravenöser oder subkutaner Injektion kein Einfluss nachweisbar ist (Dantzer et al., 1998). Geht man
- 114 - DISKUSSION ______davon aus, dass auch bei den im Rahmen der vorliegenden Arbeit beobachteten Wirkungen von Sekretin auf den Neurotransmitterstoffwechsel im Hippokampus der Nervus vagus involviert ist und dabei auch die Art der Verabreichung eine wichtige Rolle spielt, dann sollten die unterschiedlichen Verabreichungsformen in nachfolgenden Studien untersucht und miteinander verglichen werden. Konsman et al. beobachteten z.B., dass eine subdiaphragmale Vagotomie nach i.p.-Injektion von LPS zur Unterdrückung der FOS-Expression in limbischen Strukturen führte und die zu erwartende LPS- induzierte Verhaltensmodifikation ausblieb (Konsman et al., 2000; ähnlich Luheshi et al., 2000). Nach Bluthe et al. wird die verhaltensmodifizierende Wirkung von peripher verabreichtem Interleukin durch Vagotomie abgeschwächt, während die Wirkung der zentralen Applikation unbeeinflusst bleibt (Bluthe et al., 1996a); hier zeigen sich also deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Applikationsformen. Möglicherweise übt auch Sekretin seine Wirkung auf ähnlichem Weg aus. Eine Verbindung zwischen Zytokinen und Sekretin wurde von Zamir et al. nachgewiesen: eine künstlich erzeugte Sepsis führte bei Ratten zu einem Anstieg der Sekretinplasmaspiegel (Zamir et al., 1992). Interleukine und Zytokine spielen bei der Pathogenese der Sepsis eine herausragende Rolle. Immunmodulatorische Wirkungen konnten auch für andere Mitglieder der Hormonfamilie belegt werden. VIP und PACAP beispielsweise zeigen immunmodulatorische Aktivität: sie unterdrücken die Produktion von proinflammatorischen Stoffen wie Zytokinen, Chemokinen und Stickstoffoxid (NO) und stimulieren die Produktion von antiinflammatorischen Zytokinen und Interleukin-10 (Ganea und Delgado, 2002). Der genaue Mechanismus ist jedoch letztlich nicht geklärt. Zukünftige Studien werden sowohl den Mechanismus der vagusvermittelten Sekretinwirkung als auch seinen Einfluss auf die unterschiedlichen Hirnregionen klären müssen. Die Tiere erhielten Sekretin i.p. (Secrelux®/ Goldham) in einer Dosis von 30 klinischen Einheiten/ kg KG. Dies entspricht 8,7µg Sekretinpentahydrochlorid/kg. Die tierexperimentell ermittelte intrazerebrale Sekretinkonzentration beträgt im Gehirn der Ratte regional unterschiedlich zwischen 7 ng/g und 130 ng/g Nassgewicht bei 15,4 ng/g im Hippokampus (Samson et al., 1984). Nach i.v. Infusion von 10 µg Sekretin beobachteten Samson et al. einen signifikanten Anstieg von Prolaktin (Samson et al., 1984). Charlton beobachtete Verhaltensänderungen bei der Ratte nach i.v. Injektion von 5µg/kg Sekretin (Charlton, 1983). In der Studie von Myers et al. führte eine i.v. Injektion von 0,4 µg/kg zu einer signifikanten Reduktion einer Schreckreaktion (Myers et al., 2004). Conter et al. beschrieben einen Anstieg der pankrealen Sekretion und auch eine signifikante Zunahme des Pankreasvolumens von 59,7µl auf 65,8µl nach i.c.v. Injektion von Sekretin (5ng/kg KG). Gegenüber der intravenösen Injektion war dabei nur ein Zehntel der Dosis erforderlich, um einen vergleichbaren Effekt zu erzielen (Conter et al., 1996, Strand, 1999). Im Hinblick auf die erwähnten Vorstudien ist anzunehmen, dass die im Rahmen dieser Arbeit verabreichte Dosis an Sekretin ausreicht, um einen zentralen Effekt im Hippokampus der Ratte zu erzeugen.
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EFFEKT VON SEKRETIN AUF GABA Die vorliegenden Messungen von GABA und Glutamat ergaben einen signifikanten Anstieg der extrazellulären Konzentrationen von GABA und Glutamat nach i.p. Injektion von Sekretin zum Zeitpunkt t=60min. In der Literatur finden sich vergleichbare Konzentrationen von extrazellulärem hippokampalem GABA (Pena und Tapia, 2000; Rakovska et al., 1998: 0,185mikromol/l ; Giovannini et al., 2001). Die Aussagekraft eines quantitativen Vergleichs von mittels Mikrodialyse ermittelten extrazellulären Konzentrationen zwischen einzelnen Studien ist in der Regel begrenzt, da die ermittelten extrazellulären Konzentrationen von einer Vielzahl an experimentspezifischen und Mikrodialyse-immanenten Faktoren beeinflusst werden, beispielsweise durch die Art der Anästhesie und den Zeitpunkt der Experimente. Für die meisten Fragestellungen sind die quantitativen Angaben der extrazellulären Konzentrationen von Neurotransmittern jedoch von eher untergeordneter Bedeutung; vielmehr richtet sich der Fokus auf die relative Reaktion einzelner Transmittersysteme auf einen externen Stimulus wie etwa die Applikation einer pharmakologisch wirksamen Substanz. In der Literatur wird die Aussagekraft exakter quantitaver Angaben extrazellulärer Konzentrationen von Neurotransmittern ebenfalls kritisch diskutiert (Übersicht: Justice, 1993; Kehr, 1993). Ein Vergleich der Konzentrationen mit den Angaben anderer Studien soll hier vor allem deskriptiver Natur sein. Einen Einfluss von Sekretin auf das gabaerge System im Zerebellum der Ratte zeigten Yung et al. in einer 2001 veröffentlichten Studie: Sekretin erleichterte im Zerebellum der Ratte selektiv den GABAergen Input auf Purkinjezellen über einen präsynaptischen cAMP-abhängigen Mechanismus (Yung et al., 2001). Lee et al. erweitern die Beobachtungen von Yung et al. (2001): sie beobachteten in einer Patchclampstudie an Purkinjezellen des Zerebellums, dass der Effekt von Sekretin auf die postsynaptischen Ströme von Purkinjezellen bei Zugabe des Glutamatantagonisten CNQX deutlich schwächer ausfällt, nicht jedoch vollständig blockiert wird. Basierend auf ihren Beobachtungen stellten sie die Hypothese auf, dass Sekretin die Freisetzung von GABA möglicherweise über eine Aktivierung präsynaptischer AMPA-Rezeptoren erleichtert (Lee et al., 2005). Demnach hätte Sekretin im Zerebellum sowohl einen Effekt auf die Freisetzung von Glutamat als auch indirekt auf die von GABA. Während GABA im reifen Hirn der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter ist, beeinflusst es während der Entwicklungsphase vermutlich als neurotropher Faktor neurale Differenzierung und Wachstum sowie die Organisation zerebraler Kreisläufe (Olsen, 2002). In der Literatur finden sich auf mehreren Ebenen des GABAergen Systems Schnittstellen mit dem Autismus: Polymorphismen der Glutamatdecarboxylase (Fatemi et al., 2002) könnten die Synthese von GABA beeinträchtigen.
GABA-Rezeptoren sind durch Polymorphismen an der β-3-Untereinheit des GABAA-Rezeptors (Martin et al., 2000; Menold et al., 2001; Buxbaum et al., 2002) und durch eine von Blatt et al. beobachtete niedrigere Dichte hippokampaler GABAA-Rezeptoren vermutlich in das Krankheitsbild
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des Autismus involviert (Blatt et al., 2001). Die β-3-Untereinheit des GABAA-Rezeptors wird am stärksten in Kleinhirn, Hippokampus und pyriformem Kortex exprimiert (Wisden und Seeburg, 1992).
GABAA-Rezeptoren sind Bindungsstellen für Benzodiazepine, Barbiturate und auch für Alkohol, Anästhetika und Neurosteroide (Olsen, 2002), d.h. für psychisch und verhaltensmodulatorisch wirksame Substanzen. Partielle Agonisten an GABAA-Benzodiazepinbindestellen werden im Zusammenhang mit einer Verbesserung der Gedächtnisfunktionen diskutiert (Olsen, 2002). GABA ist Teil eines komplexen Mechanismus von gegenseitigen Wechselwirkungen verschiedener Neurotransmittersysteme. Im Hippokampus interagiert GABA unter anderem mit dem noradrenergen (Fillenz, 1990), dem serotonergen (Pei et al., 1989) und auch dem dopaminergen System (Missale et al., 1998). Ein Ungleichgewicht im GABAergen System könnte demnach weitreichende Auswirkungen auf den gesamten Neurotransmitterhaushalt autistischer Menschen ausüben. In der Literatur beschreiben mehrere Autoren einen möglichen Zusammenhang zwischen Autismus und Purkinjezellen (Riva und Giorgi, 2000). Ein von Pletnikov et al. entwickeltes Tiermodell geht von einer viral bedingten selektiven Zerstörung der Purkinjezellen in der frühen Entwicklungsphase von Ratten aus (Pletnikov et al., 1999). Wenn Sekretin auf demselben Weg wie im Zerebellum (Yung et al., 2001; Lee et al., 2005a) die Freisetzung von Glutamat und von GABA auch im Hippokampus fördert, könnte die Erhöhung des GABA-Spiegels für den Effekt von Sekretin bei Autisten mitverantwortlich sein. Nach den vorliegenden Ergebnissen ist ein Effekt von Sekretin auf die GABA-Freisetzung anzunehmen. Yung et al. entwickelten folgendes Modell, durch welches sie die beobachtete Wirkung von Sekretin im Zerebellum herleiteten. Danach wird Sekretin im Soma synthetisiert und zu den Dendriten der Purkinjezellen transportiert. Nach Freisetzung bindet es an Sekretinrezeptoren auf der präsynaptischen Membran oder auf der Membran der Purkinjezelle und aktiviert die Adenylatzyklase der präsynaptischen Zelle. Die dadurch erhöhten cAMP- Spiegel erleichtern die GABA-Freisetzung. Das freigesetzte GABA bindet an ionotrope GABAA-Rezeptoren auf der Membran der Purkinjezelle. Chloridionen treten in die Purkinjezellen ein. Dies wiederum führt zu einer Generation von inhibitorischen postsynaptischen Strömen (IPSC) (Yung et al., 2001); nach Lee et al. könnte daneben auch eine Aktivierung von glutamatergen AMPA-Rezeptoren zur erleichterten Freisetzung von GABA führen (Lee et al., 2005; s. oben). VIP als verwandte Substanz steigert die GABA-Freisetzung im Hippokampus über präsynaptische VIP-Rezeptoren (Wang et al., 1997). VIP-Rezeptor 1 (VPAC 1) reagiert neben VIP auch auf Sekretin und PACAP mit einer Steigerung der cAMP (Vaudry et al., 2000). VIP-1 Rezeptoren finden sich im Gehirn vor allem im Kortex und im Hippokampus (Usdin et al., 1994). VIP-und PACAP-Rezeptoren üben einen starken Effekt auf die Adenylatzyklase aus (McCulloch et al., 2002). Denkbar wäre auch, dass Sekretin hier am VIP-Rezeptor bindet und so die in dieser Arbeit beobachtete erhöhte GABA- Freisetzung induziert.
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EFFEKT VON SEKRETIN AUF GLUTAMAT In der Literatur werden zum Teil vergleichbare Konzentrationsbereiche angegeben (Rakovska et al., 1998; Venero und Borell, 1999; Pena und Tapia, 2000), während die Konzentrationsangaben von Rowley et al., 1997 (Pentorbital/Chloralhydratanästhesie) mit 0,031mikromol/l deutlich niedrigerer und die von Giovannini et al., 1998 (Chloralhydratanästhesie) mit 563 mikromol/l deutlich höher ausfallen. Möglicherweise sind diese Unterschiede -neben anderen Faktoren- auch auf Unterschiede in der Anästhesie zurück zu führen: Verwendung fanden beispielsweise Halothan (Pena und Tapia, 2000), Pentorbital (Venero und Borell, 1999), Chloralhydrat (Rakovska et al., 1998; Giovannini et al., 1998) und eine Mischanästhesie aus Pentorbital und Chloralhydrat (Rowley et al., 1997). Unsere in vivo-Mikrodialyseuntersuchungen ergaben neben einem signifikanten Anstieg von GABA einen signifikanten Anstieg von Glutamat in der Sekretingruppe. Eine Injektion mit damit verbundener Bewegung der Ratte führt beim Tier zu einer Stressreaktion. Bewegung bzw. Stress kann zu einem signifikanten Anstieg der extrazellulären Konzentrationen von Glutamat im Hippokampus der Ratte führen (Bland et al., 1999). Eine spontane bewegungsabhängige Komponente könnte einen initialen Anstieg des Glutamats demnach mit beeinflussen. Die vorliegenden Daten können einen Anstieg des extrazellulären Glutamatspiegels jedoch erst nach einer Stunde dokumentieren. Stress als beeinflussender Faktor kann somit weitgehend vernachlässigt werden. Die vorliegenden Daten könnten die Hypothese stützen, dass das glutamaterge System im Zusammenhang mit Autismus gesehen werden kann. Mehrere Autoren erbrachten in den vergangenen Jahren Belege für eine Verbindung zwischen Veränderungen im glutamatergen System und dem autistischen Krankheitsbild. Maria Carlsson stellte mit ihrer Theorie vom Autismus als einer hypoglutamatergen Störung als eine der ersten AutorInnen eine Verbindung zwischen Autismus und dem glutamatergen System her. Sie beschrieb in ihrem Reviewartikel Parallelen zwischen der Symptomatik von mit NMDA-Antagonisten behandelten gesunden Probanden und Autisten (Carlsson, 1998). Diese Beobachtung wird durch ein hypoglutamaterges Tiermodell gestützt, bei welchem die Tiere eine autismusähnliche Symptomatik in Form einer veränderten Gewöhnung an neue Situationen, einer Aufmerksamkeitsstörung sowie einem eingeschränkten Verhaltensrepertoire zeigen (Nilsson et al., 2001). Tsai et al. fanden bei schizophrenen Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden niedrige Konzentrationen an Glutamat und Aspartat im frontalen Kortex und einen niedrigen Glutamatspiegel im Hippokampus (Tsai et al., 1995). Möglicherweise sorgt der Anstieg von Glutamat, welcher durch Sekretin im Hippokampus hervorgerufen wird, für eine Verbesserung der Symptomatik. Weiterhin werden genetische Veränderungen der Glutamatrezeptoren 6 (Jamain et al., 2002) und der AMPA Glutamatrezeptoren im Zerebellum von Autisten (Purcell et al., 2001) sowie des metabotrophen Glutamatrezeptor 8 (Serajee et al., 2003) beschrieben. Diese Rezeptortypen finden sich auch im Hippokampus (Coyle et al., 2002; Glutamatrezeptor 8: Malherbe et al., 1999).
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Glutamatrezeptoren finden sich in besonderem Maße in Hirnregionen, bei denen eine Verbindung mit dem autistischen Krankheitsbild nachgewiesen wurde, vor allem in Hippokampus und Zerebellum (Ozawa et al., 1998). Glutamat spielt darüber hinaus eine wichtige Rolle bei der Bildung der Zytoarchitektur während der Entwicklung und der Reifung der Hirnformation, indem es an der Regulation des neuronalen Wachstums und der Sympathogenese beteiligt ist (Johnston, 1995). Während der Entwicklungsphase verändern sich Verteilung, Elektrophysiologie und molekulare Charakteristik der Glutamatrezeptoren. Eine Veränderung der Glutamattransmission kann während dieser Phase einschneidende Veränderungen für das Individuum nach sich ziehen (Johnston, 1995). Im erwachsenen Hirn ist der NMDA-Rezeptor am Prozess der Langzeitpotenzierung beteiligt (englisch=“long term potentiation“). Die Langzeitpotenzierung ist unter anderem an den Prozessen des Lernens und des Gedächtnisses beteiligt. Lernen und Gedächtnis wiederum werden zu einem grossen Teil vom Hippokampus gesteuert (Malenka und Nicoll, 1999). Denkbar wäre, dass durch die Sekretininjektion im Hippokampus über eine Freisetzung von Glutamat eine Langzeitpotenzierung induziert wird und es so zu der in der Literatur beschriebenen Langzeitwirkung von Sekretin bei autistischen Kindern kommt (Horvath et al., 1998). Glutamattransporter entsorgen freigesetztes Glutamat und halten die Konzentration von Glutamat auf 2µMol/l; sie finden sich in Oligodendrozyten, Neuronen, Mikroglia und Astrozyten. Quantitativ sind die Transporter in Astrozyten am bedeutendsten für die Glutamatregulation in Synapsen und Extrazellularraum (Magistretti und Ransom, 2002). Interessant ist in diesem Zusammenhang, inwieweit beide Systeme miteinander interagieren, da die vorliegende Studie einen Anstieg beider Transmitter im Hippokampus zeigt, d.h. sowohl der inhibitorischen als auch der exzitatorischen Komponente. Die Angaben über den Einfluss von Glutamat auf die Freisetzung von GABA sind jedoch widersprüchlich. Einerseits kann Glutamat über AMPA-Rezeptoren auf die Freisetzung von GABA inhibitorisch wirken (Coyle et al., 2002), andererseits führte die zentrale Applikation von Glutamat in einer Studie von Cossart et al. zu einer Freisetzung von GABA über die Aktivierung präsynaptischer Kainatrezeptoren (Cossart et al., 2001). Auch über metabotrope Glutamatrezeptoren kann die Freisetzung von GABA im Hippokampus gesteigert werden (Saransaari und Oja, 2001). Durch In-vitro-Studien an Hippokampusgewebe konnte gezeigt werden, dass Glutamat und Glutamatantagonisten die Freisetzung von GABA fördern (Janaky et al., 1994). Für das Zerebellum erbrachten vor allem zwei neueren Studien Hinweise für eine mögliche Verbindung von Sekretin, glutamatergem und gabaergem System: nach der Hypothese von Lee et al. wirkt Sekretin über eine Aktivierung von präsynaptischen AMPA-Rezeptoren auf die Freisetzung von GABA (Lee et al., 2005a), nach einer anderen Studie soll Glutamat in der Synapse zwischen Interneuron und Purkinjezelle als retrograder Messanger fungieren und die GABA- Freisetzung über eine Aktivierung präsynaptischer NMDA-Rezeptoren erleichtern (Duguid und Smart, 2004).
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Unklar bleibt jedoch der Angriffspunkt von Sekretin auf das glutamaterge System im Hippokampus. PACAP als weiteres Mitglied der Sekretinfamilie hat exzitatorische Wirkung auf NMDA-Rezeptoren in kortikalen Neuronen und in sympathischen präganglionären Neuronen der neugeborenen Ratte. In hippokampalen CA 1 Synapsen reduziert PACAP-38 in hohen Konzentrationen das exzitatorische postsynaptische Feldpotential (EPSP). Roberto et al. gehen davon aus, dass PACAP 38 am Phänomen der Langzeitpotenzierung und der Modulation synaptischer Übertragung beteiligt ist, denen eine wichtige Funktion bei der Bildung von Gedächtnisinhalten zukommt (Roberto et al., 2001).
ADRENALIN Im Rahmen der vorliegenden Arbeit fand sich keine signifikante Änderung der Adrenalinspiegel nach Applikation von Sekretin. Adrenalin selbst ist nicht ZNS-gängig und spielt im Gegensatz zu Noradrenalin im ZNS als Neurotransmitter keine übergeordnete Rolle. Adrenalin wurde erstmals in den 50er Jahren im Gehirn von Fröschen identifiziert (Carlsson, 1959). Adrenerge Neuronen finden sich im Gehirn vornehmlich in der Medulla oblongata (Lew et al., 1977); von dort projizieren sie in verschiedene Hirnareale inklusive limbischen Arealen, zu denen auch der Hippokampus gehört (Lew et al., 1977). Die Synthese von Adrenalin im ZNS ist von der Phenylethanolamin N-Methyl- Transferase abhängig, die Adrenalin aus Noradrenalin synthetisiert. Eine hohe Aktivität der Phenylethanolamin N-Methyl Tansferase findet sich in Hypothalamus, Locus coeruleus, Septum, zentralem Thalamus und den Amygdala (Lew et al., 1977). Mefford et al. fanden in einer humanen Postmortemstudie hohe Spiegel an Adrenalin in Hypothalamus, medialem Thalamus, Septum und in der Umgebung des dritten Ventrikels, jedoch niedrige Spiegel in Hippokampus, Neokortex und Basalganglien (Mefford et al., 1978, Übersichtsarbeit bei Mefford, 1988; ähnlich Samson et al., 1990). Im Gehirn der Ratte finden sich Konzentrationen von 30ng/g Gewebe im Hypothalamus und 6,9ng/g Gewebe im Hirnstamm (Fuller und Hemrick-Luecke, 1983). Man geht davon aus, dass die Konzentration von Noradrenalin im ZNS etwa 10-fach höher ist als die von Adrenalin. In der Literatur schwanken die Angaben der extrazellulären Konzentrationen von Adrenalin in menschlichem Liquor zwischen 1pg/ml (entspricht 0,02pg/20µl) (Mefford, 1988) und 20pg/ml an (entspricht 0,4 pg/20µl) (Christensen et al., 1980). In einem Vergleich der regionalen Verteilung von Adrenalin im Gehirn von Hund und Mensch zeigte sich in beiden Fällen eine Betonung von Hypothalamus (N. ventromedialis des Hundes: 447 +/- 211 ng/g Nassgewicht, beim Menschen: 136+/-55ng/g Nassgewicht), während nur sehr niedrige Konzentrationen von Adrenalin im Hippokampus gefunden wurden (Hund: 2,1+/- 1,0; Mensch: 0,9 +/- 0,4 ng/g Nassgewicht) (Übersichtsarbeit: Mefford, 1988). Der Anteil von Adrenalin an den Gesamtkatecholaminen im Hirnstamm der Ratte reduziert sich im Laufe der Entwicklung von 30-50% während der Gestationsphase bis hin zu einem Erwachsenenanteil von 2-3%, bedingt durch die
- 120 - DISKUSSION ______während des Entwicklungsprozesses zunehmende Bedeutung des noradrenergen Systems (Foster et al., 1987). Die vorliegenden Messungen der vorliegenden Studie belegen eine ca. 16-fach höhere Konzentration von Adrenalin gegenüber Noradrenalin im Extrazellularraum. Daher ist anzunehmen, dass bei der Implantation der Mikrodialysekanüle die Bluthirnschranke verletzt wurde und Adrenalin aus dem Blut in den Extrazellularraum übergetreten ist, welche die im Vergleich zu Noradrenalin hohe Konzentration an Adrenalin in der Extrazellularflüssigkeit hervorrief.
NORADRENALIN Die Konzentrationsangaben vergleichbarer Studien divergieren im Vergleich zur vorliegenden Studie um den Faktor 0,28 bis 10,7 (vergleichbare Konzentrationen bei Page und Abercrombie, 1999; 3,6- fach niedrigere Konzentrationen bei Piacentini et al., 2003; 4,7-fach höhere Werte bei Isogawa et al., 2000; 4,9-fach höhere Konzentrationen bei Abercrombie et al., 1988; ca. 10,7-fach höhere extrazelluläre Konzentrationen bei Zhang et al., 1995), Unterschiede zwischen den einzelnen Studien. zeigen sich auch hinsichtlich des Zeitpunktes der Mikrodialyseuntersuchungen und der Art der verwendeten Anästhetika: Piacentini et al. beispielsweise begannen erst 12 h nach der Operation mit den Messungen und verwendeten Diazepam und Ketaminhydrochlorid (Piacentini et al., 2003), Isogawa et al. verabreichten Chloralhydrat (400mg /kg KG) intraperitoneal und begannen erst 5 Tage nach Operation mit den Dialysemessungen (Isogawa et al., 2000). Die im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Noradrenalin-Konzentrationen lagen nur wenig über der mit der angewandten HPLC Methode darstellbaren Nachweisgrenze; die Peaks hoben sich nur wenig vom in der Basislinie sichtbaren Hintergrundrauschen ab und waren dadurch nur sehr schwach darstellbar. Pudovkina et al. verifizierten den neurogenen Ursprung von Noradrenalin mittels Ca2+-freier Perfusionslösung und mittels Anwendung von TTX. Beide Substanzen führten zu einer Senkung des extrazellulären Noradrenalins im Locus coeruleus (Pudovkina et al., 2001). Die Untersuchung des neuronalen Ursprungs von Noradrenalin und seinen Transmittern sollte in zukünftigen Studien berücksichtigt werden. Noradrenerge Neuronen sind auf mehrere Stellen in Pons und Medulla konzentriert (A1-A7) (Dahlström und Fuxe, 1964), der prominenteste unter ihnen ist der Locus coeruleus (LC, A6 und A4), der in der grauen Substanz der Pons lokalisiert ist. Über große Bahnen projizieren noradrenerge Neuronen zu den meisten Hirnarealen, unter anderem auch zum Hippokampus (Fillenz, 1990). Hippokampale Projektionen üben dabei einen großen Einfluss auf die hippokampalen Funktionen aus (Vertes und Kocsis 1997; Leranth und Vertes 1999).
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DOPAMIN, 3-MT UND HVA Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein punktueller, wenngleich statistisch signifikanter Anstieg (p<0,01) von 3-MT zum Zeitpunkt t=20 min. nach Sekretininjektion beobachtet (vgl. Abbildung 46), während Dopamin und HVA unbeeinflusst blieben. Vergleichbare Konzentrationen an Dopamin finden sich bei Isogawa et al. und bei Zhang et al. (Isogawa et al., 2000; Zhang et al., 1995; Osborne et al., 1990 fanden im Striatum vergleichbare Konzentrationen; Dawson et al., 2001 gaben 10,1-fach niedrigere extrazelluläre Konzentrationen an). In vivo Mikrodialyse ist ein anerkanntes Verfahren zur Bestimmung der extrazellulären Konzentrationen von Dopamin und seinen Metaboliten im Hirn der Ratte (Benveniste und Huttemeier, 1990). 3-MT gilt als Indikator für die extrazelluläre Freisetzung von Dopamin im Hippokampus, DOPAC als Indikator für den intraneuronalen Dopaminmetabolismus (Westerink et al., 1987; Chaprusta et al., 1994). 3-MT, dessen Anteil am gesamten Dopaminumsatz im Striatum der Ratte etwa 20-30% beträgt (Wood et al., 1987; Vergleichsdaten zum Hippokampus liegen nicht vor), wird als extraneuronaler Metabolit unter Mitwirkung der COMT aus Dopamin metabolisiert und durch die MAO zu HVA verstoffwechselt. Die Präsenz von COMT wurde mittels Immunfluoreszenzstudien in Oligodendrozyten, Astrozyten und dem Plexus choroideus nachgewiesen (Kaplan et al., 1979). Der zerebrale Dopaminstoffwechsel unterliegt multiplen Einflüssen: unter anderem wird die Dopaminfreisetzung auch durch exzitatorische Neurotransmitter aktiviert (Legault et al., 2000). Der Anstieg von 3-MT könnte durch eine Aktivierung der Catechol-O-Methyltransferase hervorgerufen worden sein; dieses Ergebnis sollte jedoch im Rahmen einer weiteren Studie kritisch überprüft werden, da die Aussagekraft des nur punktuellen, wenngleich statistisch signifikanten Anstiegs der extrazellulären Konzentrationen von 3-MT bei gleichzeitig hohem Standardfehler (vgl. Kapitel 5.3.5.7) begrenzt ist. Beim verwandten Peptid PACAP sind Effekte auf den Dopaminstoffwechsel in der Literatur belegt (unter anderem Arbogast und Voogt, 1994; Isobe et al., 1996; Anderson und Curlewis, 1998; Hamelink et al., 2002). Das Sekretingen SCT ist auf dem mit Autismus und Aufmerksamkeitsstörung (ADS) assoziierten Chromosom 11p15.5 unter anderem kolokalisiert mit kodierenden Genen für den
Dopaminrezeptor D4 (Yamagata et al., 2002), der sich in hoher Dichte auch in Neuronen des Hippokampus findet. Wechselwirkungen mit dem gabaergen System sind möglich, beispielsweise konnten hippokampale Neuronen als GABAerge Interneuronen identifiziert werden (Missale et al., 1998).
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SEROTONIN UND 5-HIAA Die extrazellulären Konzentrationen von Serotonin bleiben von der Sekretininjektion unbeeinflusst, in der Darstellung der 5-HT/5-HIAA-Ratio deutet sich jedoch ein diskreter Anstieg des Serotoninmetaboliten 5-HIAA zum Zeitpunkt t=80min. an, der aber statistisch nicht signifikant ist. Dies könnte auf einen erhöhten Umsatz von Serotonin hinweisen. Die basalen Konzentrationen von 5- HIAA entsprechen in etwa denen von vergleichbaren Studien (West et al., 1991; Yoshioka et al., 1992), während die im Rahmen dieser Studie ermittelten Serotoninkonzentrationen im Vergleich zu Literaturangaben deutlich höher ausfallen (Stancampiano et al., 1997: Faktor 6,3; West et al., 1991: Faktor: 13,4; Yoshioka et al., 1992: Faktor 24,7; Adell et al., 1996: Faktor: 61,8). Mikrodialyse als Methode zur Bestimmung von Serotonin und seinen Metaboliten an frei beweglichen Ratten wird in der Literatur mehrfach beschrieben (unter anderem Korte-Bouws et al., 1996; Wegener et al., 2001; Wegener et al., 2003). Extrazelluläre Serotoninkonzentrationen spiegeln in der Regel die Nettobilanz aus Freisetzung und zellulärer Serotonin-Wiederaufnahme wieder, die Bedeutung von extrazellulärem 5-HIAA ist jedoch noch nicht hinreichend geklärt und wird kontrovers diskutiert. Da die extrazellulären Spiegel von Serotonin und 5-HIAA unterschiedlich auf verhaltensmodifikatorische oder pharmakologische Einflüsse reagieren, folgern einige Autoren, dass extrazelluläres 5-HIAA kein absoluter Indikator für den Stoffwechsel von Serotonin (Linthorst et al., 1994; Peñalva et al., 2002), sondern vielmehr ein Maß für die Neusynthese von Serotonin sei (Kuhn et al., 1986). Auerbach et al. sehen dagegen vor allem in den extrazellulären Konzentrationen von 5-HT, nicht jedoch in denen von 5-HIAA einen zuverlässigen Parameter für eine durch Depolarisation induzierte Freisetzung von Serotonin, da die Konzentrationen von 5-HIAA und 5-HT in deren eigenen Untersuchungen nur selten miteinander korrelierten (Auerbach et al., 1990). Cespuglio et al. nehmen die extrazellulären Konzentrationen von 5-HIAA im Gehirn der Ratte als direktes Mass für freigesetztes Serotonin (Cespuglio et al., 1986). Serotonin spielt nach derzeitigem Kenntnisstand eine wichtige Rolle bei der Modulation kognitiver Prozesse sowie vermutlich auch des Lernens und des Gedächtnisses. Unklar ist jedoch, welche Prozesse auf welche Art und Weise dazu beitragen (Pineyro und Blier, 1999). Interessant ist, dass eine intraperitoneale Injektion von 10 mg/kg Tianeptin, eine Substanz, die die Aufnahme von Serotonin in die Zelle erleichtert, ähnlich wie in der vorliegenden Studie zu einem ansteigenden 5-HIAA-Spiegel bei gleichbleibendem Serotoninspiegel im Hippokampus der Ratte führt, außerdem zu einem Anstieg der extrazellulären Konzentrationen von Dopamin und DOPAC (Fattaccini et al., 1990; Puig et al., 1993). Eine Injektion der doppelten Dosis hatte jedoch einen gegenteiligen Effekt auf die extrazelluläre Konzentration von 5-HT im Hippokampus. Der beobachtete Anstieg von 5-HIAA wurde hier als Anstieg des intrazellulären Umsatzes von Serotonin nach erhöhter Serotoninaufnahme gedeutet. Serotonin unterdrückt in hippokampalen Pyramidenzellen sowohl inhibitorische als auch
- 123 - DISKUSSION ______exzitatorische synaptische Potentiale (Aghajanian und Sanders-Bush, 2002). Serotonin reduziert nach Aghajanian die glutamaterge Transmission über eine präsynaptische Reduktion des Ca2+-Einstroms. Daneben konnte auch ein möglicher inhibitorischer Effekt auf GABAerge inhibitorische Interneurone des Hippokampus nachgewiesen werden, also eine Beeinflussung des GABAergen Systems im Hippokampus (Aghajanian und Sanders-Bush, 2002). Sekretin könnte also auch über eine Beeinflussung des Serotoninhaushalts auf die glutamaterge und GABAerge Neurotransmission einwirken und so möglicherweise zu den in der vorliegenden Arbeit beobachteten Effekte wie auch zu einer Verbesserung der Symptomatik autistischer Patienten führen.
SEROTONIN UND AUTISMUS In einer neueren Studie ergab sich eine interessante Parallele zu der vorliegenden Arbeit. Toda et al. untersuchten an 14 autistischen Kindern und Jugendlichen neben klinischen Parametern auch die Liquorspiegel von HVA und 5-HIAA vor und 4 Wochen nach einer intravenöse Gabe von Sekretin: bei 8 Patienten zeigten sich im ADI-R (Autism Diagnostic Interview-Revised), einem diagnostischen Instrument zur Erfassung autistischer Symptome, Verbesserungen im Bereich des Kommunikations- und Sprachverhaltens; bei denselben Patienten konnte -ähnlich wie in der vorliegenden Studie- auch ein diskreter Anstieg von 5-HIAA beobachtet werden, der jedoch nicht signifikant war (Toda et al., 2004: leider ist nur das Abstract verfügbar, der Originalartikel wurde in japanischer Sprache verfasst). Aufgrund eines nicht auszuschliessenden Effekts von Sekretin auf das serotonerge System soll im Folgenden der Zusammenhang zwischen Autismus und serotonergem System skiziiert werden. Mehr als 350 Studien beschreiben einen Zusammenhang zwischen serotonergem System und Autismus (gemäss Pubmed-Recherche). Der Schwerpunkt liegt dabei zum einen auf einer wahrscheinlich familiär gehäuften Hyperserotoninämie (Anderson et al., 1987; 1990; gegensätzlich Hérault et al., 1996), die bei bis zu mehr als 30% der von Autismus betroffenen Menschen vorkommen soll (Hanley et al., 1977; Minderaa et al., 1989; Anderson et al., 1990), deren Genese und pathogenetische Bedeutung jedoch letztlich nicht geklärt sind (Boullin et al., 1982; Anderson et al., 1987; Cook et al., 1993; Minderaa et al., 1987), zumal sie auch bei geistig behinderten Menschen ohne Autismus beobachtet wurde (Partington et al., 1973) und die Thrombozyten-Serotoninkonzentrationen durch ihre Abhängigkeit von den Kovariablen Alter, Geschlecht und Rasse nur bedingt vergleichbar sind (McBride et al., 1998). Auch ist eine Korrelation von Blutserotoninspiegel und klinischem Schweregrad in der Literatur umstritten (positive Korrelation bei Herault et al., 1996; gegensätzlich dazu jedoch Cuccaro et al., 1993). Neuere Studien fokussieren vor allem auf Polymorphismen des Promotorgens für den Serotonintransporter 5-HTT bei Autisten (5-Hydroxytryptamin-Transporter) (Cook et al., 1997; Yirmiya et al., 2001; Anderson et al., 2002; Kim et al., 2002; widersprüchliche Angaben finden sich bei Zhong et al., 1999), deren Einfluss jedoch als zu gering zur Erklärung der bei Autisten beobachteten Hyperserotoninämie erachtet wird (Persico et al., 2002; Betancur et al., 2002), zumal
- 124 - DISKUSSION ______sich aus der reinen Beobachtung des Allels des Serotonintransporterpromotorgens noch kein erhöhtes Risiko für Autismus ableiten lasse (Tordjman et al., 2001). Serotonin- bzw. 5-HIAA-Liquorkonzentrationen sind beim Autismus hingegen nicht verändert (Gillberg und Svennerholm, 1987; Narayan et al., 1993). Geht man nun vom Paradigma des Hyperserotonismus aus, der sich bislang jedoch vor allem auf periphere Serotoninkonzentrationen bezieht, könnte ein erhöhter 5-HIAA-Spiegel im Extrazellularraum für einen erhöhten Serotoninumsatz im Hippokampus sprechen und derart möglicherweise eine Senkung von Serotonin induzieren. 5-HT2A-Agonisten wie LSD oder Mescalin rufen, wie bereits für Glutamatantagonisten beschrieben, autismusähnliche Symptome hervor (Carlsson, 1998). Die Serotoninsynthese selbst ist entwicklungsabhängig: während bei gesunden Kindern eine im Vergleich zu Erwachsenen bis zum 5. Lebensjahr zweifach höhere zerebrale Serotoninsynthese ab dem 5. Lebensjahr langsam auf das Erwachsenenniveau absinkt, kommt es bei Autisten nur zu einer Reduktion auf das 1,5-fache des Erwachsenenniveaus (Chugani et al., 1999). Die genaue Rolle von Serotonin im komplexen Gefüge der Neurotransmitter im Zentralnervensystem ist jedoch bis heute ungeklärt: beispielsweise führt eine Aktivierung von GABAA-Rezeptoren im Hippokampus von frei beweglichen Ratten entweder zu einem Anstieg, einem Gleichbleiben oder einem Abfall des Serotoninspiegels (Pei et al., 1989). Eine Beeinflussung des Serotoninhaushalts im ZNS durch andere Neuropeptide wurde ebenfalls aufgezeigt: PYY und Pankreatisches Polypeptid inhibieren die kortikale Serotoninfreisetzung (Schlicker et al., 1991), während Substanz P und Neurokinin A zu einem Anstieg führen (Iverfeldt et al., 1990).
MÖGLICHE URSACHE DER THERAPEUTISCHEN EFFEKTE VON SEKRETIN BEIM
AUTISMUS Sekretin gehört der Sekretin- Superfamilie an, einer Familie von Peptiden, die eine starke strukturelle Homologie untereinander sowie zum Teil auch eine Kreuzreaktivität einzelner Substanzen mit Rezeptoren anderer Substanzen dieser Familie zeigen (Übersicht bei Sherwood et al., 2000). Vor allem VIP und PACAP sind hinsichtlich ihrer vielfältigen Funktionen sehr gut untersucht. Dabei zeigt diese Familie einige sehr interessante Parallelen, die möglicherweise auch in anderen, bislang nicht miteinander korrelierenden Aspekten eine Gemeinsamkeit der Peptide annehmen lässt. Charakteristisch für diese Familie von Peptiden ist eine Beziehung sowohl zum Zentralnervensystem als auch zum Gastrointestinaltrakt (Sherwood et al., 2000). Alle neun Hormone finden sich im Magen, im Pankreas werden Glukagon, GLP-1 (kleine Mengen), GLP-2 (kleine Mengen in Säugetieren), PACAP, GRF und Sekretin gebildet. Acht von neun Hormonen dieser Familie lassen sich auch im Gehirn nachweisen, bei GIP konnte bislang jedoch weder eine mRNA des Rezeptors noch GIP selbst nachgewiesen werden. Rezeptoren sind für acht von neun Hormonen mit Ausnahme von PHM
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(Peptide Histidine-Methionin) bekannt. PACAP und VIP haben eine ähnlich hohe Affinität zum PACAP-1 und zum PACAP-2-Rezeptor (Sherwood et al., 2000). Für den VIP-1 Rezeptor konnte eine Kreuzreaktivität mit Sekretin nachgewiesen werden (Usdin et al., 1994). Der Sekretin-Rezeptor zeigt eine große Ähnlichkeit zum PACAP 1 Rezeptor (PAC1-R) (Vaudry et al., 2000). Eine Kolokalisation in VIP-Neuronen findet sich zu 30% für GABA (Sloviter, 1987) und zu etwa 85% für Acetylcholin, daneben zum Teil auch für Arginin-Vasopressin (AVP) und gastrin releasing peptide (GRP) (Zhou et al., 1995), was auf eine Interaktion der verschiedenen Systeme schließen lässt. VIP-Neuronen unterliegen serotonergen und GABAergen Einflüssen. In der Hypophyse beeinflusst VIP neben PHM und Sekretin (Vijayan et al., 1979) die Freisetzung von Prolaktin, ACTH, Wachstumshormon, luteinisierendem Hormon (LH) und GABA (Duvilanski et al., 1990). Die beobachteten Veränderungen der extrazellulären Konzentrationen von GABA, möglicherweise auch von anderen Transmittern, könnten auch über eine Kreuzreaktion von Sekretin mit VIP-Rezeptoren erklärt werden. In der Hypophyse beispielsweise kann VIP die dopaminerge Inhibition der Prolaktinfreisetzung auslösen (Balsa et al., 1996). VIP hat Teil an der Hirnentwicklung und fungiert im ZNS als Neurotransmitter und Neuromodulator (Nelson et al., 2001). Im ZNS ist VIP an der Regulation der frühen Entwicklung des embryonalen ZNS sowie an Neurogenese und Astrozytogenese beteiligt (Gressens et al., 1993). Trotz der strukturellen Homologie sind diese Wachstumsfunktionen bei PACAP nicht bekannt. Veränderungen von VIP-Rezeptoren konnten beispielsweise im Hippokampus von Patienten mit Temporallappenepilepsie gefunden werden (de Lanerolle et al., 1995). Wie kann aber die von Horvath et al. mit zwei bis fünf Wochen angegebene Wirkdauer von Sekretin bei autistischen Kindern erklärt werden (Horvath et al., 1998)? Kolts und McGuigan geben die Halbwertszeit von Sekretin bei intravenöser Applikation im menschlichen Blutkreislauf mit t½=4,06±0,82min. an (Kolts und McGuigan, 1977). Da die vorliegende Arbeit letztlich durch die Studie von Horvath et al. angeregt wurde, sollen im Folgenden verschiedene Erklärungsansätze für die Wirkung von Sekretin sowie seine verlängerte Wirkdauer bei Autisten dargestellt werden (Horvath et al., 1998). Ein möglicher Erklärungsansatz für eine verlängerte Wirkdauer von Sekretin ist eine Beeinflussung der synaptischen Plastizität durch Sekretin. Als Beispiel kann VIP angeführt werden, welches BDNF (brain derived neurotrophic factor) induziert. BDNF kann die synaptische Plastizität beeinflussen (Pellegri et al., 1998; Ying et al., 2002) und wird als ein wichtiger Faktor für die Integrität von neuronalen Populationen sowohl im Hippokampus als auch in den Amygdala exprimiert (Quartu et al., 1999), es hat Anteil an der für Lernen und Gedächtnis essentiellen Langzeitpotenzierung (Lu und Chow, 1999). Denkbar wäre eine ähnliche Wirkung von Sekretin über eine Kreuzreaktivität mit VIP- Rezeptoren. Andere Autoren untersuchten das Verhalten von Sekretin in Anwesenheit von Phospholipiden (Gandhi et al., 2001; 2002). Amphipathische Peptide wie Sekretin oder VIP verändern in organischen
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Lösungen ihre Struktur und bilden Mizellen (Robinson et al., 1982). Gandhi et al. zeigten, dass Sekretin in Anwesenheit von Phospholipiden im Extrazellularraum metastabile Mizellen bildet (Gandhi et al., 2002), wodurch Sekretin in vivo stabilisiert und der enzymatische Abbau verhindert oder verzögert werden könnte, wie es von Gololobov bereits für VIP gezeigt wurde (Gololobov et al., 1998). Dadurch könnte die Bioaktivität von Sekretin um ein Mehrfaches erhöht werden und das mizellare Sekretin könnte an den Zielzellen länger als die monomere Form von Sekretin wirken (Gandhi et al., 2002). Parallele Resultate sind bereits für VIP bekannt: VIP interagiert mit stabilisierten Phospholipidmizellen in vivo und bildet eine α-Helix Struktur. α-Helix-VIP steigerte in vivo die Bioaktivität von VIP in der Gegenwart von Phospholipiden (Gololobov et al., 1998; Onyuksel et al., 1999). Einige Autoren gehen davon aus, dass Sekretin über eine Linderung der gastrointestinalen Begleitsymptomatik zu einer Verbesserung der autistischen Kernsymptomatik führt. Tatsächlich werden in der Literatur Stuhlunregelmässigkeiten (Goodwin et al., 1971), niedrige Serumkonzentration an α-1-Antitrypsin (Walker-Smith und Andrews, 1972), eine veränderte intestinale Permeabilität (D´Eufemia et al., 1996), ileale Lymphknotenhyperplasie und unspezifische Kolitiden (Wakefield et al., 1998) als mögliche Begleiterscheinungen des Autismus beschrieben. Bei Autisten mit gastrointestinaler Begleitsymptomatik lassen sich eine signifikant erhöhte Dicke der Basalmembran (Furlano et al., 2001) sowie ein gehäuftes Vorkommen von entzündlichen Prozessen im oberen und im unteren Intestinaltrakt finden (Horvath und Perman, 2002). I.v. verabreichtes Sekretin kann bei Autisten mit gastrointestinaler Begleitsymptomatik zu einem gesteigerten pankreatikobiliären Fluss führen (Horvath et al., 1999). Welch et al. konnten aufzeigen, dass eine intestinale Entzündung tastsächlich zu einer gesteigerten Aktivität von c-FOS-Gen unter anderem in Hypothalamus und Amygdala führt, eine Einzelgabe von Sekretin zeigte konnte jedoch keine Besserung der entzündungsbedingten Veränderungen herbeiführen (Welch et al., 2005). Von den bisher vorliegenden Studien, die Sekretin bei Autisten untersuchten, unterteilten lediglich Kern et al. den Patientenpool in eine Gruppe mit chronischer Diarrhoe und eine Gruppe ohne gastrointestinale Begleitsymptomatik; bei den anderen Studien genügte die diagnostische Erfassung des Autismus als Eingangskriterium (unter anderem Owley et al., 1999; Sandler et al., 1999; Chez et al., 2000). Kinder mit chronischer Diarrhoe zeigten hier im Vergleich zur Placebogruppe eine signifikante Verbesserung der hyperaktiven Symptomatik (Kern et al., 2002). Kern et al. gehen davon aus, dass Sekretin zu einer Erhöhung der Integrität der Darmwand führt und so über eine Verbesserung der gastrointestinalen Begleitsymptomatik auch die autistische Symptomatik positiv beeinflussen kann (Kern et al., 2002). Eine mögliche Bedeutung von Sekretin im Laufe der Entwicklung ist noch weitgehend unbekannt. In der Phase-II-Studie der Firma Repligen zeigte sich ein stärkeres Ansprechen von Sekretin bei Kindern
- 127 - DISKUSSION ______im Alter von drei bis vier Jahren als bei der Gruppe der fünf- bis sechsjährigen (www.repligen.com). Tay et al. demonstrierten ein unterschiedliches Vorkommen von Sekretinreaktivität im Gehirn von Ratten in den ersten beiden postnatalen Wochen im Vergleich zu späteren Entwicklungsstadien (Tay et al., 2004), auch bei VIP konnte eine altersabhängige Immunreaktivität in menschlichen Ganglienneuronen beobachtet werden (Roudenok et al., 1999). Möglicherweise kommt es im Laufe der Entwicklung bei autistischen Kindern zu Anomalien im zerebralen Sekretinstoffwechsel, die durch eine Gabe von Sekretin zumindest kurzzeitig ausgeglichen werden können; Belege hierzu gibt es jedoch in der Literatur bislang nicht. Die vorliegende Arbeit fokussierte die Untersuchung der Wirkung von Sekretin auf den hippokampalen Neurotransmitterstoffwechsel, nach neueren Studien jedoch wirkt intravenös verabreichtes Sekretin auch auf die benachbarten Amygdala. Goulet et al. demonstrierten, wie bereits beschrieben, dass intravenös verabreichtes Sekretin (40µg/kg KG) in Neuronen der zentralen Amygdala, der Area postrema und dem Nucleus supraopticus zu einem signifikanten Anstieg an c- Fos-Protein als Marker neuronaler Aktivität führt (Goulet et al., 2003). Die Messungen fanden hier 30, 60, 120 und 360min. nach Sekretininjektion statt. Ein ähnlicher, wenngleich schwächerer Effekt auf die zentralen Amygdala und die Area postrema konnte nach intravenöser Gabe des verwandten Peptids VIP beobachtet werden (Goulet et al., 2003). Beim Menschen beschrieben Yurgelun-Todd et al. in einer bislang unveröffentlichten Magnetresonanzstudie an 12 erwachsenen gesunden Probanden eine verstärkte Aktivierung der Amygdala beim Anblick furchtsamer Gesichter nach intravenöser Gabe von Sekretin im Vergleich zu einem gleichbleibenden Aktivierungsstatus beim Anblick fröhlicher Gesichter (Yurgelun-Todd et al., 2004) und wiesen damit erstmals neuroaktive Funktion von Sekretin beim Menschen nach, zugleich belegten sie eine Wirkung von Sekretin in den Amygdala, d.h., in einem Hirnareal, welches im komplexen Geschehen sozialer Funktionen des Menschen eine Schlüsselposition einnimmt. Myers et al. beschrieben 2004 einen dosisbhängigen Effekt von Sekretin (beste Ergebnisse bei 10µg/kg) auf die angstprovozierte Schreckreaktion ("fear potentiated startle reaction") von Ratten, eine Reaktion, die ebenfalls den Amygdala zugeschrieben wird (Myers et al., 2004; eine vergleichbare Wirkung ist unter anderem für Diazepam belegt: Davis, 1979). Die Amygdala bilden zusammen mit dem limbischen Assoziationskortex und dem Hippokampus das limbische System und sind –wie auch der Hippokampus- mit dem limbischen Assoziationskortex verbunden (Bauman und Kemper, 1985). Den Amygdala werden zusammen mit dem Hippokampus massgebliche Funktionen bei der Erkennung und der Interpretation emotionaler Erlebnisinhalte, der Beeinflussung der emotionalen Ansprechbarkeit sowie beim Erlernen emotionaler Inhalte zugeschrieben. Die Bedeutung der Amygdala für soziale Funktionen kann an mehreren Beispielen skizziert werden: an der Urbach-Wiethe-Krankheit erkrankte Patienten, die mit amygdaloider Verkalkung einhergeht, verlieren die Fähigkeit zum Erkennen angstbesetzter Gesichtsausdrücke und
- 128 - DISKUSSION ______zum Deuten mehrerer emotionaler Inhalte in einem einzigen Gesichtsausdruck (Allman und Brothers, 1994). Ähnlich sind Patienten mit traumatischer Schädigung der Amygdala funktionell eingeschränkt beim Dekodieren von Gesichtsausdrücken (Young et al., 1995). Autistische Patienten zeigen ähnliche Schwierigkeiten, soziale und emotionale Informationen aus Gesichtern und Gesichtsausdrücken ablesen und interpretieren (Adolphs et al., 1994; 2001) sowie Gesichter wiedererkennen bzw. die Blickrichtung anderer Menschen adäquat einschätzen zu können (Howard et al., 2001). Die massgeblich von Baron-Cohen et al. etablierte Amygdalatheorie des Autismus geht von einer fehlerhaften intrauterinen Entwicklung der Amygdala bei autistischen Personen aus (Baron-Cohen et al., 2000). Schumann et al. beschrieben in einer MRI-Studie eine Vergrösserung des Amygdalavolumens bei autistischen Kindern; interessanter ist jedoch, dass das bei normaler Entwicklung beobachtete Wachstum der Amygdala bei Autisten auszubleiben scheint (Schumann et al., 2004). Die Amygdala gehören im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Modulation neuroendokriner Aktivität zu den einflussreichsten Hirnregionen (Van de Kar und Blair, 1999). Hippokampus und Amygdala zeigen die Gemeinsamkeit, dass beide Areale kognitive Signale in neuroendokrine Aktivität umwandeln (Lathe, 2001) und nach Stimulation neuroendokrine Reaktionen hervorrufen können. Auch wurde das Phänomen der Langzeitpotenzierung bei beiden Regionen beschrieben (Racine et al., 1983). Hippokampus und Amygdala beeinflussen sich gegenseitig, z.B. kann eine Verletzung von amygdaloiden Nuclei bzw. eine Injektion einer Substanz in die Amygdala das hippokampale Lernen entscheidend beeinflussen (Abe, 2001). Eine mögliche Verbindung der beiden Hirnareale wird zwischen CA1 und perirhinalem Kortex beschrieben, durch welchen die Aktivität des Hippokampus zu den Amygdala weitergeleitet werden kann (Stoop und Pralong, 2000). Auf Grund der zahlreichen mit den Amygdala verbundenen interessanten Literaturangaben stellen die Amygdala perspektivisch für folgende Studien ein interessantes Zielgebiet dar, um auch dort die Wirkung von Sekretin auf den Neurotransmitterstoffwechsel zu untersuchen. Ein neuer interessanter Aspekt ergibt sich durch zwei Arbeiten, die eine Wirkung von peripher verabreichtem Sekretin auf schizophrene Patienten im Sinne einer temporären Verbesserung von Kommunikationsverhalten und Aufmerksamkeit beschreiben, wenngleich sich auch hier eine statistische Signifikanz der beschriebenen Effekte bislang nicht verifizieren liess (Alamy et al., 2004; Sheitman et al., 2004; vgl. auch Kapitel 1). Parallelen zwischen Autismus und Schizophrenie zeigen sich unter anderem in der Beteiligung der Amygdala (Darius und Stahl, 2005): bei beiden Erkrankungen zeigen sich bei den Erkrankten Defizite im Bereich des Erkennens und Wertens von Emotionen und auch von mimischen Ausdrücken, Funktionen, die unter anderem den Amygdala zugeschrieben werden können. Möglicherweise hat Sekretin bei beiden Erkrankungen ähnliche Ansatzpunkte in den Amygdala, die die Parallelen in der Wirkung von Sekretin erklären könnten. Auch bei der Schizophrenie gibt es Hinweise für eine Beteiligung des glutamatergen Systems an der
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Pathogenese der Erkrankung: die bereits in den 80er Jahren beschriebene hypoglutamaterge Theorie der Schizophrenie basiert auf der Beobachtung, dass die Gabe von nonkompetitiven NMDA- Rezeptorantagonisten wie Ketamin und Phenzyclidin (PCP) schizophrenie-ähnliche Symptome sowohl in Form einer Negativ- als auch Positivsymptomatik auslösen kann (Übersicht bei Jentsch und Roth, 1999). Beide Erkrankungen zeigen zudem ein breites Spektrum an Symptomen: so lassen sich Parallelen zwischen der Negativsymptomatik schizophren Erkrankter und einigen Symptomen des Autismus erkennen: beispielsweise kann bei beiden Erkrankungen ein starker sozialer Rückzug wie auch eine Einschränkung der sozialen und kommunikativen Fähigkeiten beobachtet werden, die zwar entwicklungsgeschichtlich andere Verläufe, phänomenologisch jedoch Ähnlichkeiten zeigen. Möglicherweise kann Sekretin bei beiden Erkrankungen einer bislang noch nicht definierten Untergruppe der Erkrankten bei Teilaspekten der Erkrankung Linderung verschaffen. Zusammenfassend beeinflusst Sekretin den Stoffwechsel von Neurotransmittern im Hippokampus mit Fokus auf dem Wechselspiel der inhibitorischen und exzitatorischen Neurotransmitter GABA und Glutamat. Im Hinblick auf eine mögliche Wirksamkeit von Sekretin bei autistischen Kindern kann nach den vorliegenden Ergebnissen angenommen werden, dass Sekretin im Hippokampus unter anderem über eine Beeinflussung des GABA-/Glutamatstoffwechsels wirkt. Eine Beteiligung des dopaminergen und noradrenergen Systems wird durch die vorliegenden Daten (vor allem 3-MT) angedeutet, lässt sich jedoch anhand der Ergebnisse dieser Studie nicht sicher belegen. Für das serotonerge System konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Sekretin- und Kontrollgruppe festgestellt werden. Dennoch lässt der im Rahmen dieser Arbeit beobachtete Anstieg des Metaboliten 5-HIAA sowie des 5-HIAA/5-HT-Quotienten eine Beteiligung auch des serotonergen Systems an der Wirkung von Sekretin im Hippokampus der Ratte vermuten. Die vorliegenden Ergebnisse geben unter Berücksichtigung anderer Arbeiten Grund zur Annahme, dass sich auch Sekretin -neben VIP und PACAP- im Gefüge der Sekretin/Glukagon/VIP-Superfamilie in die Reihe der multifunktionalen Peptide mit Wirkungen sowohl im Gastrointestinaltrakt als auch im Zentralnervensystem einreihen lässt. Eine mögliche therapeutische Anwendbarkeit von Sekretin bzw. anderen Peptiden dieser Familie muss noch durch weitere Studien verifiziert werden. Das ubiquitäre Vorkommen von Sekretin im Zentralnervensystem lässt angesichts der nur punktuell erforschten Funktionen von Sekretin in einigen wenigen Hirnarealen viele Fragen über die Funktionen von Sekretin unbeantwortet. Hinsichtlich seiner Funktionen beim Autismus ist fraglich, inwieweit die bislang veröffentlichten Studien die Heterogenität des autistischen Krankheitsbildes (Wing, 1996) berücksichtigen. Die vorliegende Studie fokussierte den Hippokampus. Interessant wird sicherlich auch eine Ausweitung der Erforschung der zentralen Wirkungen von Sekretin auf andere Hirnareale sein, wie mehrere Studien am Beispiel der Amygdala zeigten (unter anderem Goulet et al., 2003; Myers, 2004). .
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7 ZUSAMMENFASSUNG
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Wirkung von Sekretin auf den Stoffwechsel der Neurotransmitter im Gehirn der Ratte. Auslöser zur Durchführung dieser Arbeit war eine amerikanische Studie, in welcher bei autistischen Kindern fünf Wochen nach einmaliger intravenöser Sekretinapplikation eine deutliche Symptomverbesserung beobachtet werden konnte. Anhand von Literaturangaben, die einen Zusammenhang mit Autismus belegten, wurden der Hippokampus als zu untersuchendes Areal und Aminosäuren, Katecholamine sowie Indolamine als zu untersuchende Substanzen ausgewählt. Grundlage der Arbeit bildeten tierexperimentelle Untersuchungen an frei beweglichen Ratten. Dabei wurden Mikrodialysesonden in den Hippokampus eingeführt und Fraktionen im Abstand von 20min. über einen Zeitraum von 4h mit einer Vorlaufzeit von 2h gesammelt. Verglichen wurden jeweils die Konzentrationen der gemessenen Substanzen vor und nach Sekretingabe (30 klinische Einheiten/ kg Körpergewicht intraperitoneal) im Vergleich zur Kochsalz- Kontrolle. Die Bestimmung von Aminosäuren und Acylcarnitinen erfolgte mittels Tandem- Massenspektrometrie. Glutamat, gamma-Aminobuttersäure und Aspartat wurden mittels Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie und Fluoreszenzdetektion bestimmt. Zur Analyse der Katecholamine und Indolamine fand die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion Anwendung. Zunächst wurde dabei eine neue Methode als Weiterentwicklung einer bestehenden Methode entwickelt, mit welcher Katecholamine und Indolamine analysiert werden konnten. Die Gabe von Sekretin führte im Hippokampus zu einem Anstieg von Noradrenalin sowie 5-Hydroxy- indol-3-Essigsäure, der jedoch nicht signifikant war, während bei den anderen Substanzen kein Unterschied zwischen den mit Sekretin und den mit NaCl-Lösung behandelten Tieren zu beobachten war. Bei Glutamat und gamma-Aminobuttersäure konnte ein signifikanter Anstieg der extrazellulären Konzentrationen nach Sekretinapplikation beobachtet werden. Bei einigen Acylcarnitinen, darunter Benzoylcarnitin und Isovalerylcarnitin zeigte sich ebenfalls ein signifikanter Anstieg der gemessenen Konzentrationen nach Sekretingabe. Erstmals wurden auch längerkettige Acylcarnitine mittels Mikrodialyse bestimmt, die Bestimmung von Carnitin und Acetylcarnitin mittels Mikrodialyse wurde einmalig 1999 beschrieben. Zukünftige Studien sollten die vorliegenden Ergebnisse daher überprüfen. In der Gesamtschau der Ergebnisse konnte ein Effekt der intraperitonealen Injektion von Sekretin vor allem auf die Neurotransmitter gamma-Aminobuttersäure und Glutamat im Hippokampus gezeigt werden. Damit ist unter Berücksichtigung der bisherigen Literaturangaben davon auszugehen, dass auch Sekretin ähnlich wie die anderen Mitglieder der Sekretinfamilie sowohl periphere als auch zentrale Wirkungen ausübt. Zukünftige Studien sollten die Frage nach einer zerebralen Wirkung von Sekretin auf andere Hirnareale ausweiten und auch den Einfluss unterschiedlicher Verabreichungs- formen (intravenös, intracerebroventrikulär) auf die zentralen Wirkungen von Sekretin untersuchen.
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- 166 - ANHANG ______
9 ANHANG
9.1 DANKSAGUNG
Mein Dank gilt all denjenigen, die es mir ermöglicht haben, meine Dissertation an der Albert-Ludwig- Universität Freiburg durchzuführen.
Herrn Prof. Dr. Schulz danke ich für die freundliche Überlassung dieser interessanten und vielseitigen neurochemischen Fragestellung, die mich sowohl mit dem Krankheitsbild des Autismus sowie auch mit der Vielfalt und Komplexität neurochemischer Fragestellungen vertraut machte. Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Clement, der mir stets mit nahezu unerschöpflicher Geduld mit Rat und Tat zur Seite stand sowie ein offenes Ohr für die Belange seines Doktoranden hatte. Weiterhin danke ich ihm für die sehr gute Betreuung, die Durchführung der tierexperimentellen Untersuchungen, die zahlreichen Anregungen und auch für seine konstruktive Kritik. Herrn Dr. Hennighausen danke ich für die Unterstützung bei der statistischen Auswertung der Daten. Bei Herrn Prof. Dr. Gerlach sowie Herrn Burger von der Universität Würzburg bedanke ich mich für die freundliche Messung von GABA und Glutamat. Bei Herrn Dr. Lehnert, der mittlerweile pensioniert wurde, und Herrn Alexander Hoch bedanke ich mich für die Hilfestellung bei den Messungen der Aminosäuren und der Acylcarnitine. Herrn Prof. Dr. Wesemann aus Marburg danke ich für das Korrekturlesen dieser Arbeit und für seine konstruktive Kritik. Bei Herrn Prof. Dr. Dr. van Calker möchte ich mich für die konstruktive Kritik und das Erstellen des
Zweitgutachtens bedanken. Herzlich möchte ich meinen Eltern für ihre grosse Unterstützung und Ermutigung während meines gesamten Studiums und während meiner Dissertation danken. Herzlicher Dank gilt meinem Vater, der so unermüdlich nach kleinen Fehlern gesucht hat und die Arbeit mehrfach korrekturgelesen hat. Danken möchte ich auch meinen Freunden für die Unterstützung und Hilfe vor und während der Zeit der Dissertation. Für die Korrektur der Arbeit möchte ich mich besonders bei Stefan, Stefan, Arvind und Karin bedanken. Für die Unterstützung bei technischen Belangen möchte ich mich herzlich bei Herrn Dr. Rudolph Heger bedanken. Grossen Dank an die Mitarbeiterinnen des Neurochemischen Routinelabors der Kinder- und Jugendpsychiatrie, Frau Karin Gyufgo, Frau Eugenia Potapova und Frau Ritva Atmanspacher für die gute Einarbeitung und Unterstützung während meiner Arbeit.
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9.2 LEBENSLAUF
ANDRÉ KUNTZ
Geburtsdatum und –ort 2. November 1970 in Thionville/Frankreich 1977-1981 Grundschule: St. Blasius Schule in Frickhofen 1981-1990 Fürst-Johann-Ludwig Schule Hadamar 1990 Abitur 1990-1991 Zivildienst im Rettungsdienst des DRK Limburg Oktober 1991 Beginn des Jurastudiums an der Justus-Liebig-Universität in Giessen April 1993 Beginn des Medizinstudiums an der Justus-Liebig-Universität in Giessen August 1995 Ärztliche Vorprüfung Oktober 1995-Juni 1996 Austauschjahr an der Universität von Valencia (E) August 1997 Famulatur im Fach Chirurgie am St. Anna-Krankenhaus in Hadamar März 1998 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note „2“ August 1998 Famulatur im Fach Innere Medizin an der Clinique La Prairie in Montreux (CH) September 1998 Famulatur im Fach Neurologie an der Clinica Universitaria dell´ Università di Bologna (I) März 1999 Famulatur im Fach Neurologie an der Clinique hôpital universitaire vaudoise in Lausanne (CH) September 1999 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note „2“ Oktober 1999– Praktisches Jahr am Klinikum der Justus-Liebig-Universität Giessen mit September 2000 Wahlfach Psychosomatik Oktober 2000 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note „1“ (Gesamtnote: „1,7“) Januar 2001-Juni 2002 Tätigkeit als Arzt im Praktikum an der Abteilung für Kinder- und Jugendpsychiatrie der Albert-Ludwigs Universität Freiburg Juni 2002- Juni 2003 Tätigkeit als wissenschaftlicher Assistent an der Abteilung für Kinder- und Jugendpsychiatrie der Albert-Ludwigs Universität Freiburg Seit August 2003 Tätigkeit als Assistenzarzt an der Psychiatrischen Universitätsklinik Zürich, „Burghölzli“ (CH)
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9.3 ORIGINALBEITRAG
Kuntz A, Clement HW, Lehnert W, van Calker D, Hennighausen K, Gerlach M, Schulz E (2004). Effects of secretin on extracellular amino acid concentrations in rat hippocampus. Journal of Neural Transmission, 111(7), 931-939.
9.4 POSTERBEITRÄGE
Kuntz A, Clement HW, Lehnert W, Haberstroh J , van Calker D, Berger M, Schulz E (2001). Wirkung von Sekretin auf die in vivo Freisetzung von Aminosäuren im Hippokampus der Ratte. 8. wissenschaftliche Arbeitstagung biologische Kinder- und Jugendpsychiatrie. Frankfurt/Main, 5.-7. Dezember, 2001.
Clement HW, Kuntz A, Lehnert W, Schulz E (2002). In vivo Freisetzung von Neurotransmittern im Hippokampus der Ratte nach Gabe von Sekretin. XXVII. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Kinder- und Jugendpsychiatrie. Berlin, 4.-6. April, 2002.
Kuntz A, Clement HW, Lehnert W, Haberstroh J, van Calker D, Gerlach M, Hennighausen K, Berger M, Schulz E (2002). In vivo release of glutamate in rat hippocampus after application of secretin. ENEA 2002, 10th Meeting of the European Neuroendocrine Association. München, 12.-14. September 2002.
Kuntz A, Clement HW, Lehnert W, Haberstroh J ,van Calker D, Gerlach M, Hennighausen K, Berger M, Schulz E (2002). Wirkung von Sekretin auf die in vivo Freisetzung von Aminosäuren im Hippokampus der Ratte. 9. wissenschaftliche Arbeitstagung biologische Kinder- und Jugendpsychiatrie. Würzburg, 25.-26. November 2002.
Kuntz A, Clement HW, Lehnert W, Gerlach M, Hennighausen K, Schulz E (2003). Wirkung von Sekretin auf die in vivo Freisetzung von Aminosäuren im Hippokampus der Ratte. Gemeinsamer Wissenschaftlicher Kongress der Deutschen Gesellschaft für Kinder- und Jugendpsychiatrie und Psychotherapie, des Berufsverbandes der Ärzte für Kinder- und Jugendpsychiatrie und Psychotherapie in Deutschland sowie der Österreichischen Gesellschaft für Kinder- und Jugendneuropsychiatrie und der Schweizerischen Gesellschaft für Kinder- und Jugendpsychiatrie und Psychotherapie – DGKJP. Wien, 2.–5. April 2003.
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FOLGENDER POSTERBEITRAG WURDE MIT DEM ERSTEN POSTERPREIS AUSGEZEICHNET:
Clement HW, Kuntz A, Lehnert W, Schulz E (2002). In vivo Freisetzung von Neurotransmittern im Hippokampus der Ratte nach Gabe von Sekretin. XXVII. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Kinder- und Jugendpsychiatrie. Berlin, 4.-6. April, 2002.
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9.5 ERKLÄRUNG ÜBER BETEILIGUNG DRITTER
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Humanmedizin der Albert-Ludwigs Universität Freiburg zur Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „Wirkung von Sekretin auf Neurotransmitter im Hippokampus der Ratte“ an der Abteilung für Psychiatrie und Psychotherapie im Kindes- und Jugendalter unter Leitung von Herrn Prof. Dr. E Schulz, ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Zürich, den 10. November 2005