Universidad Central Del Ecuador Facultad De Medicina Veterinaria Y Zootecnia Carrera De Medicina Veterinaria Y Zootecnia

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

“ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE ANÁLISIS DE FUSIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN PARA LA DETECCIÓN DE Babesia EN GARRAPATAS UTILIZANDO POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDOS”.

Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar el Título de Médico Veterinario Zootecnista

KARLA ANDREA VASCO AGUAS

TUTOR: Dr. Luis Vasco Campaña

Quito, enero, 2013

RECONOCIMIENTOS

Agradezco al Instituto de Microbiología de la Universidad San Francisco de Quito, por el apoyo logístico, formación y confianza brindados durante esta investigación; especialmente a Gabriel Trueba y a Sonia Zapata por su guía y motivación, y a Jorge Chiriboga y Carolina Proaño por sus valiosos consejos.

Un reconocimiento para quienes facilitaron el trabajo de campo en diferentes zonas de nuestro país: Dr. Gildo Velasco, Ing. Xavier Freire, Dr. Ramiro González, Edison Defaz, Oscar Lamiña, Félix Lara, Xavier Naranjo y Miguel Jervis.

Gratifico la ayuda de los doctores Richar Rodríguez y Luis Vasco por el interés, apoyo e importantes aportes académicos y logísticos brindados en este estudio.

Agradezco también a mis padres y hermanas que con cariño y ejemplo contribuyen a mi crecimiento profesional y personal, impregnándome de la fuerza necesaria para alcanzar mis metas.

Finalmente, agradezco a Andrés Valencia, por acompañarme en esta importante etapa, brindándome su apoyo, cariño y fortaleza en todo momento.

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ÍNDICE GENERAL LISTADO DE TABLAS ...... viii LISTADO DE FIGURAS ...... ix LISTADO DE GRÁFICOS ...... xii LISTADO DE ANEXOS ...... xiii

RESUMEN ...... xiv ABSTRACT ...... xv

INTRODUCCIÓN ...... 1

CAPÍTULO I ...... 5 REVISIÓN DE LITERATURA...... 5 Sinonimias ...... 5 Historia (Babesiosis bovina) ...... 5 Etiología...... 5 Transmisión ...... 8 Ciclo biológico de Babesia...... 8 Patogenia ...... 11 Período de Incubación ...... 13 Signos Clínicos ...... 13 Lesiones post mortem ...... 14 Diagnóstico ...... 14 Características Moleculares de Babesia ...... 22 Tratamiento ...... 25 Prevención y Control ...... 26 Epidemiología ...... 26

CAPÍTULO II ...... 28 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 28 MATERIALES: ...... 28 MÉTODOS ...... 31

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CAPÍTULO III ...... 40 RESULTADOS ...... 40

CAPÍTULO IV ...... 49 DISCUSIÓN ...... 49

CAPÍTULO V...... 55 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...... 55 CONCLUSIONES ...... 55 RECOMENDACIONES ...... 56

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 57 BIBLIOGRAFIA ...... 57 NETGRAFÍA ...... 66

ANEXOS ...... 68

HOJA DE VIDA ...... 82

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LISTADO DE TABLAS 1. Tabla 1. Principales marcadores moleculares utilizados en la identificación de Babesia (Ríos et. al, 2011)...... 24 2. Tabla 2. Fármacos utilizados en el tratamiento de la babesiosis bovina...... 25 3. Tabla 3. Primers utilizados en RT-PCR y PCR convencional para la detección de Babesia bovis y Babesia bigemina...... 35 4. Tabla 4. Concentraciones de reactivos para PCR convencional ... 36 5. Tabla 5. Protocolo de Ciclado de la PCR para la detección de Babesia bovis y Babesia bigemina ...... 36 6. Tabla 6. Reactivos y concentraciones para el Master Mix para Q- PCR en el Light Cycler® 1,5 de ROCHE...... 37 7. Tabla 7. Protocolo de Ciclado de Q-PCR en el LightCycler® 1.5. . 38 8. Tabla 8. Reactivos y concentraciones utilizados en el termociclador CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD). .. 39 9. Tabla 9. Protocolo de Ciclado de Q-PCR en el termociclador CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD). .. 39 10. Tabla 10. Listado de las especies de Rhipicephalus identificadas en los sitios de muestreo...... 41 11. Tabla 11. Detalle de los resultados obtenidos por PCR para la detección de Babesia bovis y Babesia bigemina...... 45 12. Tabla 12. Resultados de los secuenciamientos analizados en el BLAST...... 46 13. Tabla 13. Guía práctica para identificación de géneros de garrapatas de la familia Ixodidae...... 69 14. Tabla 14. Resultados de la Cuantificación de ADN...... 76

LISTADO DE FIGURAS 1. Fig 1. Diagrama de un zoito de Babesia sp. mostrando el conoide, roptrias y microenemas (Cordero del Campillo M., 1999) ...... 6 2. Fig 2. Árbol genético de 45 especies de Babesia y Theileria (Criado-Fornelio et al., 2003)...... 7 3. Fig 3. Ciclo biológico de Babesia bovis (Mosqueda et. al, 2012). . 10 4. Fig 4. Mecanismos de acción patógena de babesiosis bovina (Cordero del Campillo, 1999)...... 12 5. Fig 5. Especies del parásito en el huésped y tejidos...... 16 6. Fig 6. Ciclo de amplificación de la PCR (de Padro E., 2010)...... 20 7. Fig 7. Esquema de amplificación de ADN por PCR (Grothusen H, 2008) ...... 20 8. Fig 8. Visualización de un producto de PCR convencional (de Padro E., 2010)...... 21 9. Fig 9. Mecanismo de detección y lectura de los resultados con PCR en tiempo real...... 22 10. Fig 10. Mapa cromosómico de Babesia bovis cepa Tejas T2Bo. .. 23 11. Fig 11. Productos de la PCR múltiple con los primers Bbigemina- 18meltF2-R2. en gel de Agarosa al 3% corrido por 30 minutos a 90 voltios...... 42 12. Fig 12. Productos de la PCR con los primers Bbovis-18meltF2-R2 en gel de Agarosa al 3% corrido por 30 minutos a 90 voltios...... 42 13. Fig 13. Productos de la PCR múltiple con los primers Bbigemina- 18smeltF3-R3 y Bbovis-18meltF3-R3 en gel de Agarosa al 3% corrido 40 minutos a 90 voltios...... 43 14. Fig 14. Mapa de los cantones muestreados (en gris) donde se indica la distribución de las especies de Babesia encontradas. .... 44 15. Fig 15. Árbol filogenético de las secuencias de K-117 y K-123 comparadas con las de Babesia bigemina obtenidas en el GenBank (Babesia bigemina isolate biLushi 18S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: JX495402.; Babesia bigemina genotype E 18S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank:

HQ688689.1; Babesia bigemina strain 493 18S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: HQ840959.1)...... 47 16. Fig 16. Árbol filogenético de las secuencias de K-2, K-36 y K-79 comparadas con las de Babesia bovis obtenidas en el GenBank (Babesia bovis isolate boLushi 18S ribosomal RNA gene, partial sequence, GenBank: JX495403.1; Babesia bovis strain Nef 1 18S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: EU407240.1). . 47 17. Fig 17. Curvas de Amplificación en PCR en tiempo real de un fragmento del gen 18S ARN ribosomal de los controles positivos de Babesia bovis y Babesia bigemina. Mientras menor es el valor del ciclo en el que la curva de amplificación sobrepasa el umbral (línea horizontal de color verde), mayor es la cantidad inicial de ADN diana (RFU = Unidades de Fluorescencia)...... 48 18. Fig 18. Picos de Disociación de Amplificación de un fragmento del gen 18S ARN mediante PCR en tiempo real. Temperatura de disociación del producto de Babesia bigemina: 75ºC. Temperatura de disociación del producto de Babesia bovis: 81ºC. No se visualizan dímeros de primer...... 48 19. Fig 19. Hembra Rhipicephalus (Boophilus) microplus, vista dorsal (Walker A. et. al, 2003)...... 70 20. Fig 20. Macho Rhipicephalus (Boophilus) microplus, vista dorsal a la izquierda, coxa en la parte superior derecha, y placas ventrales en la parte inferior derecha (Walker A. et. al, 2003)...... 71 21. Fig 21. Hembra Rhipicephalus (Boophilus) annulatus, vista dorsal (Walker A. et. al, 2003)...... 72 22. Fig 22. Macho Rhipicephalus (Boophilus) annulatus vista dorsal a la izquierda, coxa en la parte superior derecha, y placas ventrales en la parte inferior derecha (Walker A. et. al, 2003)...... 73 23. Fig 23. Vistas dorsal y ventral de machos de Rhipicephalus microplus...... 74 24. Fig 24. Vista dorsal y ventral de hembras Rhipicephalus microplus...... 75

25. Fig 25. Mapas de distribución de las Babesiosis bovina en el semestre de julio a diciembre del 2010. WAHID OIE© 2012...... 80 26. Fig 26. Mapas de distribución de las Babesiosis bovina en el semestre de enero a junio del 2011. WAHID OIE© 2012...... 80 27. Fig 27. Mapas de distribución de las Babesiosis bovina en el semestre de julio a diciembre del 2011. WAHID OIE© 2012...... 81 28. Fig 28. Mapas de distribución de las Babesiosis bovina en el semestre de enero a junio del 2012. WAHID OIE© 2012...... 81

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LISTADO DE GRÁFICOS 1. Gráfico 1. Número de predios donde se colectaron garrapatas, agrupados por zona geográfica...... 40 2. Gráfico 2. Número de muestras positivas y negativas a Babesia bovis y Babesia bigemina...... 43 3. Gráfico 3. Presencia de las dos especies de Babesia expresado en número de predios positivos por zona de recolección...... 43

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LISTADO DE ANEXOS 1. Anexo A. Principales herramientas de identificación morfológica de las garrapatas...... 69 2. Anexo B. Fotografías de los especímenes identificados en este estudio...... 74 3. Anexo C. Cuantificación de ADN de muestras analizadas...... 76 4. Anexo D. Incidencia de la Babesiosis bovina en Latinoamérica. Número de nuevos focos de la enfermedad notificados a la WAHID© OIE entre enero del 2010 y junio del 2012...... 79

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“Estandarización de la técnica de análisis de fusión de alta resolución para la detección de Babesia en garrapatas utilizando polimorfismos de nucleótidos”.

Autora: Karla Andrea Vasco Aguas. Tutor: Dr. Luis Vasco Campaña Cooperador: Gabriel Trueba PhD. Enero, 2013. RESUMEN La babesiosis bovina es una enfermedad transmitida por garrapatas producida por protozoarios del género Babesia. Es endémica en zonas tropicales y subtropicales donde tiene gran importancia veterinaria y económica. Se conoce muy poco sobre su presencia en el Ecuador. El objetivo de este estudio fue detectar las especies B. bovis y B. bigemina en garrapatas Rhipicephalus microplus, estandarizando 2 técnicas de PCR, una convencional y otra en tiempo real, las cuales están basadas en la detección de ADN, siendo los métodos de diagnóstico más sensibles y fiables en la actualidad. Se colectaron 1307 garrapatas de bovinos en 56 localidades de las provincias de Esmeraldas, Santo Domingo de los Tsáchilas, Santa Elena, Pichincha, Imbabura, Napo, Sucumbíos y Galápagos. Los especímenes fueron identificados morfológicamente, donde se seleccionaron garrapatas Rh. microplus para la extracción de ADN con el Kit de Qiagen y posterior análisis por PCR para la detección fragmentos de 70 pb del gen 18S ARN ribosomal de B. bovis y B. bigemina. En PCR-RT se realizó el análisis de curvas de fusión para diferenciar especies, generándose picos de disociación a 75°C para B. bigemina y 81°C para B. bovis. Se identificó a la garrapata Rh. microplus en el 91% de los predios, en las cuatro regiones del Ecuador. Se analizaron 100 muestras con PCR convencional detectándose 15, 20 y 8 muestras positivas a Babesia bovis, Babesia bigemina y coinfecciones, respectivamente; en las regiones costa, sierra y oriente, con excepción de la región insular. Se secuenciaron muestras positivas obteniéndose porcentajes de identidad del 100% para B. bovis y B. bigemina. En conclusión, los protocolos de PCR desarrollados en este estudio son específicos para ambas especies de Babesia y altamente sensibles, siendo herramientas útiles en el diagnóstico de esta enfermedad, cuya presencia en el Ecuador ha sido comprobada molecularmente en esta investigación.

PALABRAS CLAVE: BABESIA, GARRAPATA, RHIPICEPHALUS MICROPLUS, PCR, PCR EN TIEMPO REAL.

"Standardization of melting curve analysis for the detection of Babesia in ticks using nucleotide polymorphisms"

ABSTRACT Bovine babesiosis is a tick-borne disease caused by protozoa of the genus Babesia. It is endemic in tropical and subtropical zones where there is a veterinary and economical importance. There is very little known about the presence in Ecuador. The objective of this study was to detect the species B. bovis and B. bigemina in ticks Rhipicephalus microplus, standardizing two techniques of PCR, one conventional and the other in real-time, which are based on the detection of DNA, being the diagnostic methods most sensitive and reliable at present. 1307 ticks from cattle were collected in 56 locations of the provinces: Esmeraldas, Santo Domingo de los Tsachilas, Santa Elena, Pichincha, Imbabura, Napo, Sucumbios and Galapagos. The specimens were morphologically identified where ticks Rh. microplus were selected for DNA extraction with the Qiagen Kit and posterior analysis by PCR to detect fragments 70 bp of the gene 18S RNA ribosomal of B. bovis and B. bigemina. In RT-PCR the melting curve analysis differentiated species, generating peaks of disassociation at 75°C for B. bigemina and 81°C for B. bovis. The Rh. microplus tick was identified in 91% of the farms within the four regions of Ecuador. Conventional PCR was used to analyze 100 samples detecting 15, 20 and 8 positive samples of Babesia bovis, Babesia bigemina and coinfections, respectively; in the coastal, mountain, and eastern regions, with the exception of the island region. Positive samples were sequenced, obtaining 100% of identity percentages for B. bovis and B. bigemina. In conclusion, the protocols of developed PCR in this study are specific to both species of Babesia and are highly sensitive, being useful tools in the diagnosis of this disease, of which the presence in Ecuador has been molecularly tested in this study.

KEYWORDS: BABESIA, TICK, RHIPICEPHALUS MICROPLUS, PCR, REAL-TIME PCR.

INTRODUCCIÓN

La babesiosis bovina es una enfermedad transmitida por garrapatas producida por protozoarios del género Babesia. Las especies más prevalentes en el mundo son Babesia bovis y Babesia bigemina (OIE, 2010), las cuales se distribuyen en regiones tropicales y subtropicales donde habita su principal vector, la garrapata del género Rhipicephalus (Boophilus) (CFSPH, 2008). Se estima que más de 1,2 billones de bovinos alrededor del mundo están expuestos a la babesiosis (Bock, 2004), siendo la enfermedad transmitida por artrópodos de mayor importancia en el ganado vacuno a nivel mundial (CFSPH, 2008).

América Latina es una área de riesgo permanente para el desarrollo de garrapatas y enfermedades que transmiten, con más de 264 millones de bovinos amenazados en países del MERCOSUR (FAO, STAT, 2005; Cortés-Vecino, 2011).

El impacto económico que generan las garrapatas y enfermedades que transmiten en la industria ganadera se atribuye a la morbilidad, mortalidad, abortos, pérdida en la producción de carne y leche e impidiendo el mejoramiento genético en zonas endémicas (Mosqueda et. al, 2012). A ello se le añade el costo elevado del control de las garrapatas, la detección de la enfermedad, la prevención, el tratamiento y su impacto en el comercio internacional del ganado (Chulmin et. al, 2007; Bock, 2004).

El control químico del vector se ha ido complicando con el desarrollo de resistencias a los acaricidas. La FAO determinó que la resistencia de Rh. microplus a organofosforados, carbamatos, lactonas macrocíclicas, piretroides sintéticos y amitraz está ampliamente distribuida a nivel global (Nari et. al 2003). Ecuador no ha comunicado casos de resistencia, sin embargo, la falta de diagnóstico, no significa necesariamente la ausencia

del fenómeno; sino que, es la consecuencia directa de la falta de disponibilidad de técnicas diagnósticas (Nari et. al, 2003).

En Brasil, los costos producidos por las garrapatas y las enfermedades que transmiten llegan a más de $2 billones de dólares anuales (Grisi et. al, 2002). En Argentina es de $100 millones de dólares anuales (Spath et. al, 1990). En Uruguay se estiman pérdidas por $ 32.7 millones de dólares al año, de los cuales el 4,5% se deben a acciones del estado, 6.3% por concepto de cueros dañados por garrapatas, 44.6% por gastos del productor en tratamientos garrapaticidas, 31.1% en disminución de producción de kilos de carne por hemoparásitos y 12.8% debido a tratamientos y muertes por hemoparásitos (Solari, 2006). En Colombia las pérdidas son de aproximadamente $6,95 millones de dólares anuales (Lobo, 1982) y en Bolivia las pérdidas por la muerte de animales positivos a la babesiosis bovina ascienden a $19.800 dólares (Ávila, 2005).

En Brasil la seroprevalencia de la babesiosis bovina es alta. En cuatro municipios de Río de Janeiro se determinó un 92.77% de seropositividad para B. bovis y 98.79% para B. bigemina (Madruga, et. al, 2000). Estudios más recientes confirman seroprevalencias en el rango del 56.4 al 95.5% para B. bovis y del 53 al 91.3% para B. bigemina (Barros et. al, 2005; Trinidade et. al, 2010).

En Venezuela se determinó una seroprevalencia en el rango del 64.8 al 81.8% para B. bigemina y del 55 al 73.4% para B. bovis (Toro,1990).

En Colombia la seroprevalencia va del 42 al 84% (Cortés-Vecino, 2011) y se ha determinado que un gran número de hatos tienen estabilidad enzoótica, donde al menos el 75% de los bovinos entre 3 y 9 meses de edad son serorreactivos para Babesia spp. (Osorio et. al, 2010).

Perú ha reportado 4 nuevos focos de la enfermedad a la OIE entre el 2011 y 2012 (WAHID, 2012) y se conoce que el principal agente es Babesia bigemina habiendo sido también notificada Babesia bovis (Rojas, 1990).

En Bolivia un estudio realizado en el departamento de La Paz, determinó la presencia de Babesia spp. en el 3,13% de muestras (Mercado et. al, 2011), mientras que otro estudio llevado a cabo en el departamento de Santa Cruz determinó el 17% de muestras de sangre positivas a Babesia bovis y 0,5% positivas a Babesia bigemina (Ávila, 2005).

En el Ecuador, se conoce que la enfermedad es endémica, pero se han realizado muy pocos estudios sobre su presencia y distribución. En el 2004 en la provincia de Esmeraldas se determinó una prevalencia de babesiosis del 14.47% (Mina, 2004) y en el mismo año en la provincia del Guayas, se reportó una prevalencia del 4.67% para B. bigemina (Lalama, 2004). En el 2010 se notificó su presencia en los Ríos (WAHID, 2012). En el 2011 Pazmiño determinó la presencia de B. bovis en la Empresa Metropolitana del rastro de Quito, con un 29,29% de muestras positivas por IFI y de 0,71% a frotis sanguíneo.

Estos estudios fueron realizados con técnicas muy pocos sensibles, como el frotis sanguíneo y la inmunofluorescencia, los cuales son más adecuados para el diagnóstico de babesiosis aguda, per’o su limitada sensibilidad no permite su uso en estudios epidemiológicos, donde es necesario identificar a los animales portadores.

La oportuna detección y tratamiento de la babesiosis son herramientas importantes para su control. El diagnóstico del parásito mediante métodos de microscopía sigue siendo el más económico, rápido y ampliamente utilizado, aunque su sensibilidad y especificidad son limitados (Mosqueda et. al, 2012). Más recientemente se han desarrollado métodos inmunológicos que ofrecen un diagnóstico más rápido y sensible, sin embargo, estas técnicas están sujetas a la aparición de reacciones cruzadas entre B. bovis y B. bigemina y la falta de discriminación entre la exposición anterior y la infección actual (OIE, 2010). Los métodos de detección basados en la identificación de ácidos nucleicos y su amplificación, como la PCR y sus variantes, son las técnicas más sensibles y fiables disponibles en la actualidad, cuyo desarrollo está en

auge debido al proyecto del genoma de B. bovis y B. bigemina que se encuentra en curso (Mosqueda et. al, 2012).

Esta investigación tiene por objetivo estandarizar un protocolo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en tiempo real, para detectar y diferenciar especies de Babesia bigemina y Babesia bovis a través del análisis de curvas de fusión, utilizando polimorfismos de nucleótidos de un fragmento de 70 bp del gen 18S ARN ribosomal; así como detectar estas secuencias genómicas con PCR convencional, en garrapatas del género Rhipicephalus (Boophilus) recolectadas en diferentes zonas del Ecuador.

CAPÍTULO I REVISIÓN DE LITERATURA

A. Sinonimias: Piroplasmosis, fiebre de garrapatas, fiebre de Texas, fiebre del agua roja, ranilla roja, fiebre hematúrica, malaria bovina, tristeza bovina, fiebre bovina o tocazón.

B. Historia (Babesiosis bovina).- La babesiosis fue reportada por primera vez en 1888 por Viktor Babes en Rumania, quien identificó al parásito tras analizar muestras sanguíneas de bovinos con signos de anemia hemolítica y hemoglobinuria. En 1893 Theobald Smith y Frederick Kilborne demostraron que la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) annulatus era la responsable de trasmitir la enfermedad en los bovinos (Smith & Kilborne, 1977). Con esta información se establecieron las bases para la elaboración del exitoso programa de erradicación de la babesiosis, a través de la eliminación de las garrapatas del ganado en los Estados Unidos, que culminó en 1943 (Graham & Hourrigan, 1977).

C. Etiología 1. Características fisiológicas y estructurales de Babesia spp.- Son apicomplexa típicos con reproducción alternante (sexual-asexual) y complejo apical, aunque incompleto (sin conoide, pero con roptrias, anillo polar y, a veces, con microtúbulos subpeculares y micronemas) (Fig 1). Los gametos no tienen flagelos y en el hospedador vertebrado (hospedador intermedio) se producen divisiones asexuales binarias o merogónicas. Se nutren por pinocitosis, a partir de los glóbulos rojos, cuya hemoglobina hidrolizan, sin dejar pigmentos, al contrario de lo que ocurre con Plasmodium. Metabolizan la glucosa dando lugar a la formación de ácido láctico, así como la manosa, el inositol y las proteínas. En los glóbulos rojos, aparecen en forma oval, ameboide, redondeada y más frecuentemente piriforme (de aquí el nombre de piroplasmas). El movimiento de estos zoítos se realiza por deslizamiento y contracciones

corporales (Cordero del Campillo, 1999).

Fig 1. Diagrama de un zoito de Babesia sp. mostrando el conoide, roptrias y microenemas (Cordero del Campillo M., 1999)

Las especies de Babesia son de diferente tamaño según la especie. Anteriormente, estos parásitos se habían agrupado como babesias pequeñas (de 1 a 2.5 µm), como Babesia bovis, y babesias grandes (de 2,5 a 5 µm), como Babesia bigemina que puede abarcar el diámetro total del eritrocito (Coetzer, 2004). Sin embargo, hoy la identificación se basa especialmente en patrones isoenzimáticos, diferencias antigénicas y ADN propio de cada especie (Coetzer, 2004).

2. Clasificación taxonómica.- El género Babesia pertenece al phylum Apicomplexa, un linaje eucariota a principios de la ramificación, que se caracteriza por la presencia de un complejo apical y un citoesqueleto único distinto de la de otros eucariotas (Gordon, 2005). Dominio: Eucaryota Reino: Protista Subreino: sin clasif. (Alveolata, Biciliata, Neozoa o Protozoo) Filo: Apicomplexa Clase: Aconoidasida Subclase: Piroplasmea Orden: Piroplasmida Superfamilia: Babesioidea Familia: Babesiidae Género: Babesia

Criado-Fornelio et al. (2003) usaron el gen 18S rARN para analizar filogenéticamente a los piroplasmas, clasificándolos en 5 clados (Fig.2), cuyo nombre propuesto hasta el momento carece de valor taxonómico.

Fig 2. Árbol genético de 45 especies de Babesia y Theileria (Criado-Fornelio et al., 2003).

(1) Archaeopiroplasmidos: Grupo de Babesia microti con Babesia rodhaini, Babesia felis, Babesia leo y Theileria annae.

(2) Prototheileridos: Grupo de Theilerias de USA occidental.

(3) Theileridos: Grupo Theileria, conteniendo a todas las especies de Theileria de los bovinos (Bock R. et. al, 2004).

(4) Babesidos: Grupo de especies que incluyen Babesia canis y Babesia gibsoni de cánidos junto con Babesia divergens y Babesia odocoilei.

(5) Ungulibabesidos: Grupo compuesto principalmente por especies de Babesia de ungulados: Babesia caballi, Babesia bigemina, Babesia ovis, Babesia bovis y Babesia sp. del ganado.

Las especies de Babesia que se encuentran con mayor frecuencia en el ganado bovino son B. bovis, B. bigemina y B. divergens. Otras especies que pueden infectar al ganado bovino son Babesia major, Babesia ovata, Babesia occultans y Babesia jakimovi (CFSPH, 2008).

D. Transmisión Las especies de Babesia se transmiten mediante garrapatas que se infectan al ingerir parásitos que se encuentran en la sangre del bovino infectado. Los principales vectores de B. bigemina son Rhipicephalus microplus (anteriormente Boophilus microplus) y Rhipicephalus annulatus (anteriormente Boophilus annulatus). Rhipicephalus decoloratus, Rhipicephalus geigyi y Rhipicephalus evertsi también transmiten esta especie. Los principales vectores de B. bovis son R. microplus y R. annulatus, pero R. geigyi también puede ser un vector.

B. divergens se transmite principalmente a través de Ixodes ricinus. B jakimovi también se puede transmitir a través de una especie de Ixodes.

Haemaphysalis punctata transmite Babesia major, Haemaphysalis longicornis transmite Babesia ovata y Hyalomma marginatum transmite Babesia occultans (CFSPH, 2008).

La babesiosis también se puede transmitir entre animales por inoculación directa, mientras que moscas y fómites contaminados por sangre infectada no tienen gran importancia en la transmisión (CFSPH, 2008).

E. Ciclo biológico de Babesia Babesia spp. utiliza estrategias de adaptación que le han permitido desarrollar interacciones de larga duración con sus hospedadores; la parasitemia baja en el vertebrado, así como la transmisión transovárica y transestadial en la garrapata permiten una equilibrada dinámica que

permite la persistencia de Babesia spp. a largo plazo en el ecosistema (Chauvin et. al, 2009).

1. Desarrollo en hospederos vertebrados.- El bovino se infecta tras la mordedura de la garrapata por la inoculación de esporozoitos Babesia spp. con la saliva. Los esporozoitos penetran directamente en los eritrocitos, donde se desarrollan todas las fases del parásito. Primero se producen dos merozoitos por fisión binaria, después se lisa el glóbulo rojo y cada merozoito invade un nuevo eritrocito produciéndose merogonias sucesivamente. La multiplicación es asíncrona y se pueden presentar varias etapas de división del parásito en el torrente sanguíneo al mismo tiempo (Chauvin et. al, 2009) (Fig 3).

2. Desarrollo en el hospedero garrapata.- Cuando los eritrocitos infectados con Babesia son ingeridos por las garrapatas, la mayoría de los parásitos se degeneran y se destruyen, sin embargo, algunos estadios específicos del parásito (''pre-gametocitos'') sobreviven para desarrollarse en gametocitos (Chauvin et. al, 2009). Los gametos se fusionan en el lumen del tracto digestivo de la de garrapata para formar un zigoto alargado de 8 a 10 µm de longitud que lleva un organelo similar al pico de una cabeza flecha, que facilita su penetración en las células del intestino medio (Chauvin, et. al, 2009). Una vez que el zigoto de Babesia se ha internalizado, el orgánulo punta de flecha se desintegra y el cigoto se transforma en una fase móvil, denominada oocineto. El oocineto escapa del epitelio del intestino medio e invade los tejidos del cuerpo de la garrapata, incluyendo los ovarios donde muchos huevos son infectados con Babesia (transmisión transovárica) (CFSPH, 2008). Posteriormente Babesia se multiplica asexualmente, continuando como esporogonia y el desarrollo de numerosas kinetos (esporoquinetos); la infección con Babesia se va adquiriendo durante una etapa de la vida a la siguiente (la transmisión transestadial). Algunos kinetos invaden las glándulas salivales de las garrapatas, donde se desarrollan en esporozoitos. Los esporozoitos representan la fase infecciosa del parásito en el huésped mamífero. Los parásitos B. bovis generalmente pueden ser infecciosos 2

a 3 días posteriores a que se prenden a las larvas de las garrapatas y se pueden transmitir a través de las larvas (CFSPH, 2008). En R. microplus, B. bovis no sobrevive más allá del estadio larval. Por el contrario, B. bigemina madura aproximadamente 9 días después de que la larva de garrapata se prende y sólo se transmite a través de ninfas y adultos (CFSPH, 2008) (Fig 3).

Fig 3. Ciclo biológico de Babesia bovis (Mosqueda et. al, 2012).

F. Patogenia

1. Factores que condicionan la patogenia a) Hospedador: Edad (más patógeno en adultos que en terneros de 6 a 9 meses). Raza (más sensibles los Bos taurus que los Bos indicus). Alimentación, sanidad y estado fisiológico (mal nutrición, enfermedades concomitantes, gestación, parto, inmunodepresión), inmunización previa (endémica o vacunación) (Cordero del Campillo, 1999).

b) Parásito: Especie (B. bovis es más patógena que B. bigemina); cepa e incluso aislado; tropismo del parásito (localización en SNC es más patógeno que en órganos o tejidos menos nobles); capacidad de multiplicación (Cordero del Campillo, 1999).

c) Medio ambiente: Presencia e intensidad de los vectores competentes, que modifican la dosis del inóculo inyectado en cada toma de sangre por parte de éstos, como el ritmo y dosis de reinfección que se producirá (Cordero del Campillo, 1999).

2. Mecanismos de acción patógena En la babesiosis se pueden desarrollar diferentes tipos de acciones patógenas, tales como: acción mecánica (rotura de glóbulos rojos); acción tóxica (liberación y excreción de productos tóxicos tras el metabolismo de los zoítos, demostrada a nivel de SNC) y acción expoliadora en cuanto compite por determinadas sustancias del organismo hospedador (hemoglobina) (Cordero del Campillo, 1999).

La enfermedad aguda se caracteriza por la hemólisis, el edema, la anemia y la trombosis. Se forman inmunocomplejos que al depositarse sobre la membrana basal de los epitelios, dan lugar a los procesos vasculares y digestivos característicos de la enfermedad. Los eritrocitos (parasitados o no) marcados por el complemento, son fagocitados por macrófagos que reconocen a aquellos hematíes y los capturan produciendo trombos, los

cuales se refuerzan por la unión de glóbulos rojos entre sí, cuya pared ha sido modificada por procesos autoinmunitarios (depósito de complemento en la superficie de las células sanguíneas). Además, como consecuencia de las sustancias enzimáticas (esterasas y proteasas), liberadas por los zoítos en los hematíes, se produce la pérdida de productos de degradación del fibrinógeno (PDF); al incrementarse la cantidad de fibrinógeno, la fibrina facilita la formación de trombos, dando lugar a fenómenos de coagulación intravascular diseminada (CID), favorecida por formación de calicreína, por activación de precalicreína que se encuentra de manera natural en la sangre (Cordero del Campillo, 1999). Las proteasas también activan macrófagos para liberar histamina y 5- hydroxytryptamina, causando vasodilatación, hipotensión, aumento de la permeabilidad capilar, edema y colapso vascular. Evidencia de laboratorio sugiere que Babesia spp. induce una leucocitosis para liberar radicales libres de oxígeno, los cuales son tóxicos y contribuyen al daño endotelial y al aumento de los efectos de estasis circulatorio e hipotensión (Coetzer, 2004). La anemia hemolítica progresiva se desarrolla durante el curso de la infección por Babesia, sin embargo esta no es el principal factor durante la fase aguda de la enfermedad pero estará presente en casos más prolongados (Coetzer, 2004).

a) Liberación de esterasas y proteasas → CID (coagulación intravascular diseminada)

b) Destrucción de eritrocitos → ANEMIA

c) Fenómenos de autoinmunidad (inmunopatología) → formación de inmunocomplejos → eritrofagocitosis → ANEMIA

d) Activación de la calicreína Aumento de la permeabilidad vascular ↓ Vasodilatación → pérdida PDF (Productos de degradación del Fibrinógeno) → microtrombos → CID ↓ Estasis circulatorio → edema → ANOXIA ↓ Fenómenos de CHOQUE

e) Destrucción de eritrocitos → ANEMIA → ANOXIA Fagocitosis eritrocitos parasitados o no → ANEMIA → ANOXIA Aumento de formas inmaduras de eritrocitos → ANOXIA

f) Formación de inmunocomplejos →trombos → ANEMIA →ANOXIA

Fig 4. Mecanismos de acción patógena de babesiosis bovina (Cordero del Campillo, 1999).

G. Período de Incubación Los síntomas de las infecciones de B. bigemina y B. bovis generalmente aparecen 2 a 3 semanas después de la infestación con garrapatas. Después de la inoculación directa en sangre, el período de incubación puede ser de tan sólo 4 a 5 días para B. bigemina y de 10 a 12 días para B. bovis (CFSPH, 2008).

H. Signos Clínicos Las manifestaciones clínicas se caracterizan por una anemia hemolítica, la cual varía dependiendo del agente (especie de Babesia) y del hospedador (edad, inmunidad). B. bovis es generalmente más patógena que B. bigemina o B. divergens. Los animales infectados desarrollan una inmunidad de por vida contra la reinfección con la misma especie u otras especies debido a la reacción cruzada (OIE, 2010). La mayoría de los casos de babesiosis se observan en adultos, y los animales menores de 9 meses generalmente no presentan síntomas.

Los principales signos clínicos son: fiebre alta, anorexia, ataxia e incoordinación, mucosas pálidas, ictericia, producción de orina rojo oscura o café (hemoglobinuria), shock circulatorio, en casos raros signos nerviosos asociados al secuestro de eritrocitos infectados en los capilares del cerebro. En casos agudos la parasitemia máxima (porcentaje de eritrocitos infectados) es frecuentemente menor al 1% para Babesia bovis mientras que en el caso de Babesia bigemina excede el 10% pudiendo llegar al 30% (OIE, 2010).

Puede observarse diarrea o estreñimiento y manifestarse un síndrome de insuficiencia respiratoria con disnea en animales afectados gravemente. La fiebre puede producir abortos en vacas preñadas y los toros a veces presentan una disminución temporal de la fertilidad. Parte del ganado bovino puede aparecer echado con movimientos involuntarios en las piernas; la mayoría de los animales con signos nerviosos, muere (CFSPH, 2008).

I. Lesiones post mortem Las lesiones se relacionan con hemólisis intravascular, anemia e ictericia. Las mucosas generalmente están pálidas o ictéricas; la sangre puede parecer diluida y acuosa; también puede aparecer ictericia en el omento, grasa abdominal y tejidos subcutáneos. El bazo se agranda notoriamente con una consistencia pulposa y friable y una coloración oscura. El hígado puede estar agrandado con una coloración oscura o ictérica y la vesícula biliar distendida con bilis espesa y granular. Los riñones generalmente tienen un color rojo oscuro o negro y la vejiga generalmente contiene orina rojiza amarronada; sin embargo, en algunos casos, la orina puede ser normal. Ocasionalmente, los pulmones presentan signos de edema pulmonar. Otros órganos, incluido el corazón y el cerebro, pueden presentar petequias o equimosis, o estar congestionados y la superficie del cerebro puede tener un aspecto rosado (CFSPH, 2008; OIE, 2009).

J. Diagnóstico

1. Clínico.- Se sospecha de babesiosis en bovinos que presentan fiebre, anemia, ictericia y hemoglobinuria (OIE, 2009).

2. Diagnóstico diferencial.- La babesiosis se asemeja a otras enfermedades que producen fiebre y anemia hemolítica. El diagnóstico diferencial incluye anaplasmosis, tripanosomiasis, teileriosis, leptospirosis, hemoglobinuria bacilar, eperitrozoonosis, intoxicación por colza e intoxicación crónica por cobre. La rabia y otras encefalitis también pueden considerarse en el ganado bovino con signos del SNC (CFSPH, 2008).

3. Análisis de laboratorio.- La babesiosis se puede diagnosticar por la identificación de los parásitos en sangre o tejidos, pruebas serológicas, métodos experimentales y técnicas moleculares como la PCR (CFSPH, 2008; Mosqueda, et. al, 2012).

a) Métodos de detección microscópica.- La identificación de diferentes estadíos del parásito en los hospedadores vertebrados y artrópodos puede realizarse por diagnóstico directo.

(1) Frotis sanguíneos finos y de gota gruesa.- Los frotis finos de sangre fueron el primer método para detectar parásitos en muestras clínicas y son los más ampliamente usados (Fig 5). Los frotis gruesos son útiles en la detección de pequeñas cantidades de parásitos, pues se analiza una cantidad diez veces mayor que en el frotis fino, sin embargo, la identificación de especies se realiza de mejor manera con frotis finos. Habitualmente se utiliza la coloración de Giemsa o naranja de acridina. También se describen la inmunofluorescencia y la identificación por inmunoperoxidasa. Babesia se puede identificar bajo un microscopio con el lente de inmersión (100X), donde se observan todos los estadios divisionales del parásito (Mosqueda et. al, 2012). La sensibilidad es de un parásito por 106 glóbulos rojos (Bose et al., 1995; OIE, 2010).

(2) Frotis de cerebro.- Cuando un bovino ha muerto y se presume que sufrió de babesiosis con la presencia de signos nerviosos, se puede identificar al parásito mediante improntas de la corteza cerebral teñidas igual que en frotis sanguíneos. Casi el cien por ciento de los eritrocitos presentes en los capilares del cerebro están infectados. Los frotis de otros órganos como el riñón o el hígado también puede llevarse a cabo con buenos resultados (Mosqueda, et. al, 2012).

(3) Pruebas de hemolinfa.- La garrapata tras succionar la sangre de un bovino infectado ingiere los parásitos, que pronto invaden el lumen del intestino y posteriormente la hemolinfa de las garrapatas infectando a varios órganos. En este caso se toma una gota de hemolinfa y se le realiza un frotis regular donde el diagnóstico se basa en la observación de los kinetos, que tienen forma vermicular. La prueba de hemolinfa requiere un microscopista experimentado ya que las garrapatas en áreas endémicas tienen una muy baja cantidad de kinetos (Mosqueda, et. al, 2012).

Fig 5. Especies del parásito en el huésped y tejidos. A) Babesia bigemina en eritrocitos bovinos. Frotis teñido con Giemsa. B) Babesia bovis en eritrocitos bovinos. Frotis teñido con Giemsa. C) Babesia microti en eritrocitos de ratón. Frotis teñido con Giemsa. D) Kinetos de Babesia bigemina en hemolinfa de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Frotis teñido con Giemsa. E) Babesia bovis en capilar cerebral de bovino. Sección histológica de cerebro con Giemsa. F) Detección de anticuerpos contra Babesia bigemina por la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI). 100X. (Mosqueda et. al, 2012)

b) Métodos inmunológicos

(1) Prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT).- Se basa en el reconocimiento de antígenos del parásito con los anticuerpos del suero de los animales testeados. Es fiable en la identificación de portadores infectados o anteriormente expuestos, pues tiene un buen nivel de especificidad y sensibilidad (Burridge, 1973; Jonhston, et. al, 1973). Puede discriminar entre especies de Babesia aunque se ha reportado reacción cruzada (Goodger, 1971).

(2) Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).- Tiene la ventaja de que se puede leer un gran número de muestras con facilidad y presenta mayor especificidad de la IFAT. Hay varias versiones de ELISA para la detección de varias especies de Babesia incluyendo B. bovis, B. bigemina, B. divergens, B. caballi, B. canis, B. gibsoni y B. microti (Weiland, 1986; Purnell et. al, 1976; Waltisbuhl, 1987). Evalúa la presencia de anticuerpos anti-Babesia utilizando un conjugado anti-IgG

con una enzima, por lo general de peroxidasa. Con esta prueba, es posible detectar anticuerpos hasta cuatro años después de una infección simple. Deberían producirse de un 95-100% de reacciones positivas con animales inmunes a B. bovis, 1.2% de reacciones falsos positivos con suero negativo y <2% de reacciones falsos positivos con animales inmunes a B. bigemina (OIE, 2010).

(3) Prueba de inmunocromatografía (ICT).- Es un dispositivo de diagnóstico rápido que detecta los anticuerpos contra un antígeno específico impregnado en una tira de nitrocelulosa utilizando una pequeña cantidad de suero. Es muy fácil de realizar y leer, no utiliza ningún equipo especial, por lo que se puede implementar en el campo y tiene un bajo costo comparable con otras técnicas, es una prueba rápida (sólo diez a quince minutos) y muy estable frente a diferentes temperaturas. Han sido desarrollados para Babesia bovis, B. bigemina, B. caballi, B. gibsoni y B. microti (Luo et. al, 2011; Kim et. al, 2007; Jia et. al, 2007; Verdida et. al, 2005; Huang, 2006).

c) Cultivos In vitro.- Se han utilizado para demostrar la presencia de portadores de Babesia spp. (Holman et. al, 1993), y B. bovis. La parasitemia mínima detectable podría ser baja (10-10) (Friedhoff & Bose, 1994), por lo que es un método muy sensible, con 100% de especificidad, para la demostración de la infección (OIE, 2010).

d) Inoculación en animales.- Se hace mediante la transfusión de aproximadamente 500 ml de sangre por vía intravenosa en la yugular de un becerro esplenectomizado libre de Babesia. Este método es engorroso y caro, y, obviamente, no es adecuado para uso en diagnóstico de rutina. Se han utilizado para demostrar la presencia de B. divergens (Zintl et al, 2003).

e) Métodos moleculares Los métodos moleculares están dirigidos a la detección de ácidos nucleicos del parásito, demostrando una sensibilidad y especificidad muy

altas, cuyo enfoque se ha ido desarrollando en la detección de especies de Babesia en sus hospedadores y vectores.

(1) Sondas de ADN.- Fueron el primer método desarrollado para detectar el ADN de Babesia en sangre. La detección se lleva a cabo por autorradiografía, quimioluminiscencia o un sustrato colorimétrico. Con esta técnica se ha detectado Babesia en tejidos de garrapatas y en portadores infectados (Hodgson et, al, 1992; Ramos et. al, 1992). Esta metodología toma varios días y precisa de técnicos especializados.

(2) Línea de hibridación de transferencia inversa (RLB).- Permite la detección de múltiples géneros, especies o cepas en una muestra de sangre o tejido. Este método ha sido utilizado para la detección de varias especies de Babesia como: B. bovis, B. bigemina, B. divergens, B. major, B. motasi, B. crassa y B. caballi. Se usa principalmente para la detección combinada de diferentes géneros y especies en estudios epidemiológicos (Gubbels et. al, 1999; Almeria et. al, 2002; Butler et. al, 2008; Niu et. al, 2009; Schnittger et. al; 2004).

(3) Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP).- LAMP es un método de detección que amplifica ADN bajo condiciones isotérmicas con una alta eficiencia, especificidad y velocidad. Se basa en el uso de cuatro cebadores diseñados específicamente para amplificar seis secuencias diferentes en el mismo ADN diana, con la ayuda de una ADN polimerasa isotérmica. La especificidad de la amplificación es alta. No requiere de electroforesis y ni fotodocumentación posterior, pero puede ser visto directamente mediante fluoróforos como el SYBER-green y el Bromuro de Etidio (Mosqueda, et. al, 2012). Con esta técnica se han detectado varias especies de Babesia incluyendo las cepas bovinas (Iseki et. al, 2007). Para Babesia bovis y B. bigemina el nivel de detección se aumentó hasta 103 y 105, respectivamente, en comparación con PCR convencional (Iseki et. al, 2007). Es una técnica con muchas ventajas sobre otras basadas en la detección de ácidos nucleicos y puede ser

ventajoso en los países en vías de desarrollo o laboratorios donde se carece de equipos especializados.

(4) Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).- Desde 1992 se ha desarrollado esta técnica que ha permitido determinar con una alta sensibilidad (1000 veces más sensible que la microscopía, 1 parasito en 109 glóbulos rojos) y alta especificidad para varias especies de Babesia (Criado-Fornelio, 2007). Sin embargo, requiere de tiempo, dinero y personal capacitado. Es útil como prueba confirmatoria y regulatoria, y en algunos casos como marcador de cepas vacunales.

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN. Para realizar la técnica se necesitan: los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), dos cebadores

(en inglés, primers), iones divalentes MgCl2, una solución tampón (buffer) de la ADN polimerasa, ADN polimerasa (la más común es la polimerasa Taq), ADN molde y un termociclador (Rådström et. al, 2004).

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. El inicio consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96°C necesaria para que se activen las ADN polimerasas. La desnaturalización permite la separación de las dos cadenas de ADN y se da entre los 94- 95°C. El alineamiento es la unión del cebador a su secuencia complementaria en el ADN molde, para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68°C. La extensión o elongación de la cadena, consiste en la síntesis de una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde por parte de la polimerasa, la cual añade los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad es de 72°C. La elongación final es una etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74°C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple

restante sea totalmente amplificado. Finalmente la fase de conservación se lleva a cabo a 4-15°C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo (OIE, 2008) (Fig 6; Fig 7).

Fig 6. Ciclo de amplificación de la PCR (de Padro E., 2010).

Fig 7. Esquema de amplificación de ADN por PCR (Grothusen H, 2008)

El producto PCR, amplicón o amplímero puede detectarse utilizando varios procedimientos. El más común utiliza electroforesis en gel de agarosa y tiñendo el ADN con un tinte intercalado no específico, como el bromuro de etidio (OIE, 2008) (Fig 8).

Fig 8. Visualización de un producto de PCR convencional (de Padro E., 2010).

(5) PCR en tiempo real (RT-PCR).- Es una técnica que amplifica y cuantifica un fragmento de ADN específico, que es observado en tiempo real mediante la detección de una señal fluorescente emitida durante la amplificación. Tiene muchas ventajas sobre la PCR convencional, ya que no requiere un análisis post-PCR, es más rápido, no genera gastos debido a un análisis electroforético o foto- documentación y permite identificar con una alta probabilidad los productos de PCR a partir de su temperatura de fusión (denominado valor Tm, del inglés “melting temperatura”). La primera RT-PCR descrita para la cuantificación de Babesia fue en 2003 cuando se utilizó SYBR Green para cuantificar la transcripción del gen rap-1 de Babesia bigemina (Suárez et. al, 2003). Se han publicado varios protocolos para la cuantificación de B. bovis y B. bigemina (Buling et. al, 2007; Kim et. al; 2007; Bhoora et. al, 2010; Ramos et. al, 2011). Se ha reportado que la sensibilidad de RT- PCR es cuatro veces mayor que PCR convencional (Chiang, et. al, 1996). Probablemente, la única desventaja de esta metodología es el alto costo de los equipos, que duplica o triplica el costo de una máquina de PCR convencional (Fig 9).

Fig 9. Mecanismo de detección y lectura de los resultados con PCR en tiempo real.

K. Características Moleculares de Babesia

1. Secuencia genómica.- Actualmente la Universidad Estatal de Washington está llevando a cabo los proyectos del genoma de Babesia bovis y Babesia bigemina. Hasta el momento se ha estudiado el genoma de Babesia bovis cepa Tejas T2Bo, el cual está constituido por cuatro cromosomas (Fig. 10) (Brayton K. et. al, 2007).

El cromosoma 1, el más pequeño, contiene un gran espacio físico, flanqueado por dos grandes cóntigos de 821.816 pares de bases (pb) y 285.379 pb de longitud. Los cromosomas 2 y 3 están conformados por 1.729.419 y 2.593.321 pb de longitud, respectivamente y el cromosoma 4 que contiene un espacio que no se ha resuelto y un cóntigo de 1.149 pb que separa dos cóntigos de 827.912 pb y 1.794.700 (Brayton K. et. al, 2007).

Fig 10. Mapa cromosómico de Babesia bovis cepa Tejas T2Bo. (Washington State University, 2012).

2. Marcadores Moleculares.- Los principales marcadores moleculares utilizados en la identificación de B. bovis y B. bigemina son: el gen BNMK, Bv80, BvVA1, Citocromo b, Factor de elongación 1α, msa-1, msa-2, RAP-1, CT-SPR, rARN y SBP 1,2,3 (Tabla 1). Su utilización en la detección de las babesias bovinas varía dependiendo de la región geográfica de estudio, el grado de conservación del gen y los resultados de estudios previos que concluyen su utilidad diagnóstica (Ríos et. al, 2011).

Tabla 1. Principales marcadores moleculares utilizados en la identificación de Babesia (Ríos et. al, 2011).

Marcador Ubicación Gen Descripción Autor, año molecular geográfica

Subunidad esencial de los Gen de la microtúbulos. Los fragmentos N- Caccio et. al, beta-tubulina terminales de las tubulinas α y β están Beta-tubulin Italia muy conservados. Sus porcentajes de 2000 identificación son del 99,9%. Región del genoma nuclear de B. bovis que codifica una proteína Gen BNMK, ribosomal homóloga L35 (b/35) y un BNMK Silins et al, 1996 Australia L35 (b/35) nucleósido monofosfato quinasa (BNMK). Corresponden a proteínas de las Lew et al, 1997 Australia roptrias del merozoito. Se han Figueroa et al, utilizado para demostrar la Bv80 1998 México Familia génica heterogeneidad entre aislamientos de Quintao-Silva et Bv Babesia bovis fenotípicamente al, 2007 Brasil diferentes y que por procesos de atenuación puede revertir a un Bv80 y Bock et al, 2000 Australia fenotipo virulento. BvVA1

Gen de la proteína mitocondrial. Gen Buling et al, conservado con mayor número de Gen del Citocromo 2007 España copias que los genes ribosomales, lo citocromo b que sugiere mayor sensibilidad. Se b Salem et al, USA reportó 100% de identidad. 2006 Codifica una proteína expresada de manera abundante, clave en la traducción de proteínas eucariotas. En Gen del factor Babesia bovis el EF-1α, contiene dos Factor de Suarez et al, de elongación genes EF-1α idénticos (‘A’ y ‘B’) y se elongación Australia 2006 alfa (EF- 1α). ha confirmado que ambos genes EF- 1α 1α son transcritos en los merozoitos y son muy conservados en esta especie. Genes presentes en Babesia bovis msa-1 y Borgonio et al, México que codifican para las proteínas msa-2c 2008 antigénicas presentes en la superficie Gen msa-1 y del merozoito (msa) involucradas en msa-2c la invasión del parásito a los Pérez-Llaneza msa2 Argentina eritrocitos de la especie bovina. Sus et al, 2010 porcentajes de identidad son del 22%- 99,7%. Proteínas asociadas a roptrias. Alto RAP-1/CT- Gen RAP grado de conservación entre cepas de Silva et al, 2009 Portugal B. bovis pero no para B. bigemina. STR

Componente pequeño de los Luo et al, 2005 ribosomas. Los datos del 18s ARN Salih et al, 2007 China son ampliamente utilizados en análisis M’ghirbi et al, Sudán Subunidad moleculares y filogenéticos. Su ritmo rARN 2008 Túnez pequeña ARNr evolutivo es lento siendo un gen altamente conservado. Tiene un alto Adham et al, Egipto nivel de sensibilidad, y reportes de 2009 Pakistán identidad cercanos al 100%. Durrani, 2008

Gen de la La proteína está en los órganos del SBP 1,2,3 Ruef et al, 2000 México complejo apical de Babesia. Contiene proteína del Ghana una región conservada en las cepas SBP2-RAP Aboulaila et al, cuerpo esférico Mongolia de B. bovis de Texas, México y 1 2009 (SBP) 1-2-3 Australia. Brasil

L. Tratamiento El control de la babesiosis bovina se puede realizar mediante la inmunización, drogas anti-babesiales o por una combinación de estas (Suárez, et. al, 2011). En zonas endémicas, los animales enfermos deben ser tratados con un fármaco eficaz tan pronto como sea posible (Vial et. al, 2006; CFSPH, 2011). La terapia de apoyo puede ser necesaria en casos graves de babesiosis mediante transfusiones sanguíneas, anti- inflamatorios no esteroideos, eliminación de garrapatas, hierro, dextrosa, vitaminas (complejo B), purgantes, y reemplazo de fluidos (Zintl A. et. al, 2003). En la tabla 2 se describen los fármacos antibabesiales desarrollados para el tratamiento de la babesiosis bovina.

Tabla 2. Fármacos utilizados en el tratamiento de la babesiosis bovina.

Babesia Uso Compuesto Nombre químico Dosis Vía Referencia spp. actual Imidocarb 3,3’-bis (2-imidazolin- B. bovis 1-3 mg IM Si Kuttler, K. 2-yl)-carbanalidae B. bigemina kg-1 SC 1981 B. divergens B. caballi Aceturato de 4,4´(azoamino) B. bovis 3-5 mg IM Si Kuttler, K. diminazeno dibenzamidine B. bigemina kg-1 1981 B. divergens B. caballi Nerolidol cis-3,7,11-Trimethyl- B. bovis 10μM - En estudio AbouLaila, 1,6,10-dodecatrien-3- B. bigemina 25 μM M, et. al, ol B. ovata 2010c. B. caballi Artesunate 3R,5aS,6R,8aS,9R,10 B. bovis 2.6 μM - En estudio Goo, Y., et. S,12R,12aR)- B. gibsoni 10 μg ml-1 AL, 2010. decahydrido-3,6,9- B. caballi 10 mg kg- trymetyl-3,12-epoxy- B. microti 1 12H-pyranol(4,4/l-1,2- benzodioepin-10-ol hydrogen succinate Triclosan 2’,4’,4’-tricloro-2’- B. bovis 100μg ml- - En estudio Bork, S. hydroxyphenil ether B. bigemina 1 et.al, 2003. B. caballi 50 μg ml-1 Epoxomicin α´,β´-epoxyketone B. bovis 10 nM - En estudio Aboulaila, B. bigemina 5 nM M. et.al , B. ovata 0.05-0.5 2010b. B. caballi mg kg-1 B. microti Gossypol 1,1’,6,6’,7,7’- B. bovis 100Μm - En estudio Bork, S. hexahydroxy-5,5’- et.al, diisopropyl- 2004.. 3,3‘dimethyl [2,2’- binaphthaleneI8,8‘- dicarboxaldehyde. Atovaquone 1,4- B. divergens 1 mg kg-1 - En estudio Pudney, M hydroxynaphthoquinon et.al, 1997. e IM: Intramuscular; SC: Subcutáneo (Mosqueda J et. al., 2012).

M. Prevención y Control El control de la piroplasmosis se basa en: 1. Control estratégico de la garrapatas (OIE, 2009). 2. Quimioterapia en los animales infectados. La estabilidad endémica natural no es confiable como única estrategia de control, puesto que ésta puede verse afectada por el clima, los factores relacionados con los huéspedes y el manejo. En zonas endémicas, los animales enfermos se deben tratar lo antes posible con antiparasitarios (CFSPH, 2008). 3. Reducir la exposición a los vectores, evitando áreas donde las garrapatas están presentes (Cordero del Campillo M., 1999). 4. Cuarentena de los animales infectados o provenientes de zonas endémicas (Coetzer, 2004). 5. Inspección y certificación de que los animales estuvieron libres de garrapatas antes de permitir su movilización (OIE, 2009). 6. Inmunización natural (el ganado desarrolla una larga inmunidad después de una infección con B. bovis o B. bigemina) o mediante vacunas específicas para Babesia o para el control del vector (OIE, 2009). 7. Utilización de ganado bovino genéticamente resistente, como Bos indicus (Coetzer, 2004). 8. Testear y sacrificar a los animales infectados (Coetzer, 2004).

N. Epidemiología La babesiosis bovina se puede encontrar en cualquier lugar donde existan garrapatas, siendo más frecuente en zonas tropicales y subtropicales. B. bovis y B. bigemina son particularmente importantes en Asia, África, América Central y del Sur, partes del Sur de Europa y Australia (WAHID, 2012). B. bigemina está más distribuida que B. bovis en África. B. divergens es un parásito importante en partes de Europa, incluyendo al Reino Unido, España y el norte de Europa. Su vector, I. ricinus, puede sobrevivir desde el norte de Escandinavia hacia el Mediterráneo. B. major se puede encontrar en algunas regiones de Europa, Noroeste de África y

Asia, y en China. B. ovata se ha descrito en Japón, China y otras partes del este asiático. B. occultans se informó en África, y B. jakimovi en Siberia (CFSPH, 2008).

CAPÍTULO II MATERIALES Y MÉTODOS

A. MATERIALES:

1. Recolecciones de garrapatas (campo): - Pinza anatómica - Pinza entomológica - Frascos plásticos de boca ancha - Guantes de manejo (látex) - Equipo de sujeción del animal (sogas de 6 m y de 9 m) - Etanol al 97% - Banderas blancas de franela (2 x 1 m) - 1 lupa - Mandil, cofia, mascarilla - Overol - Botas de caucho

2. Identificación morfológica de los especímenes (laboratorio): - Cajas petri - Estereomicroscopio - Clave dicotómica para garrapatas (Walker et. al, 2003) - Tubos para microcentrífuga (1,5 ml) - Pipeta plástica - Pinzas entomológicas - Algodón - Papel bond (1 x 2 cm) - Lápiz - Marcador permanente - Mangos para bisturí #3 - Hojas de bisturí

3. Extracción de ADN - Kit de extracción de ADN, Dneasy blood & tissue (Qiagen®). o Columnas DNeasy Mini Spin en tubos de colección de 2 ml o Tubos de colección de 2 ml o Buffer ATL o Buffer AL o Buffer AW1 (concentrado) o Buffer AW2 (concentrado) o Buffer AE o Proteinasa K o Instructivo (Handbook) - Etanol de grado molecular al 97% - Vórtex - Microcentrífuga 5415D (Eppendorf ) - Baño maría (Shel Lab) - Tubos de microcentrífuga 2 ml

4. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) - Gotaq flexi DNA polimerasa (Promega®) - Buffer de PCR 5 X de Gotaq flexi DNA polimerasa (Promega®)

- MgCl2 25 mM de Gotaq flexi DNA polimerasa (Promega®) - Ultra Pure distilled water DNAse, RNAse free (Gifco®) - Desoxirribonucleótidos (dNTPs) (Invitrogen®) - Primers Bovismelt_F2 y R2 y Bovismelt_F3 y R3 específicos para Babesia bovis - Primers Bigemina melt_F2 y R2 y Bigemina melt_F3 y R3 específicos para Babesia bigemina - Taq DNA polimerasa (Invitrogen®) - Buffer de PCR 10 X de Taq DNA polimerasa (Invitrogen®)

- MgCl2 50 mM de Taq DNA polimerasa (Invitrogen®) - iQ SYBR Green Supermix (BIO-RAD®) - Bloques de hielo para tubos de PCR

- Cámara de acrílico anticontaminante - Tubos de PCR de 0,2 ml - Tubos de PCR de 0,5 ml - ADN de Babesia bigemina y Babesia bovis (Controles positivos) - Termociclador PTC-100 (MJ Research®) - TERMOCICLADOR CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD®)

5. Electroforesis de ADN: - Agarosa (Invitrogen®)

- TBE 1 X (Tris Base, Ácido Bórico, EDTA 2H20 disodio, NaOH 5 M, HCl 1 M, Agua destilada) - Bromuro de Etidio 1 M - Buffer de DNA - Trackit 50 bp (Invitrogen®) - Cámara de Electroforesis Horizontal® 58, Gibco Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus (Life Technologies™). - Fuente de poder FB300 (Fisher Scientific®) - Fotodocumentador Kodak® Electrophoresis documentation and analysis system (EDAS) 290 - Trans iluminador con luz UV (Vilbert Lourmat)

6. Materiales generales: - Agitador magnético - Autoclave - Balanza analítica (OHAUS®) - Cajas para tubos de microcentrífuga - Computador - Congeladora - Cuaderno - Destilador de agua - Gradillas plásticas para tubos de microcentrífuga - Hielo químico

- Imán para agitador magnético - Matraces - Medidor de pH - Microondas - Micropipeta 100 – 1000 µl (Labnet®) - Micropipeta de 20-200 µl (Rainin®) - Micropipeta de 10 – 100 µl (Labnet®) - Micropipeta de 0,5 – 10 µl (Labnet®) - NanoDrop 1000 (Termo Scientific®) - Parafilm - Porta pipetas - Probetas de 10, 100 y 1000 ml - Puntas de pipeta de 10 µl con y sin filtro - Puntas de pipeta de 100 µl con y sin filtro - Puntas de pipeta de 1000 µl con y sin filtro - Toallas de papel

B. MÉTODOS

1. Colección de muestras:

a) Tipo de muestra: Garrapatas de ganado bovino.

b) Área de estudio: Se tomaron muestras de garrapatas del ganado bovino en el Camal Metropolitano de Quito y en las cuatro regiones del país. En la Costa las provincias: Esmeraldas, Santo Domingo de los Tsáchilas, Santa Elena; en la Sierra: Pichincha (San Miguel de los Bancos, Puerto Quito, Pedro Vicente Maldonado) e Imbabura (Ibarra); en el Oriente: Napo y Sucumbíos y en la Región Insular: Puerto Baquerizo Moreno.

c) Instrucciones previas a la toma la muestra: Se realizó la toma de muestras en dos poblaciones: animales libres (en fincas) y animales que iban a ser faenados (en el camal).

Para la toma de muestras en fincas se solicitó el consentimiento de los dueños de los bovinos informando el objetivo principal del estudio. Se contó con el equipo de manejo y sujeción adecuados para precautelar tanto la bioseguridad del personal como el bienestar animal.

Para la recolección de garrapatas de bovinos faenados en el camal, se solicitó la autorización del encargado del área. Se utilizó la indumentaria adecuada (cofia, mandil, mascarilla, botas) y se colectaron las garrapatas en el área de "corte de patas y cabeza", después del desangre. d) Descripción del procedimiento de toma de muestra:

(1) Recolección de garrapatas sobre el animal. Se revisaron al/los bovinos, de cabeza a cola y se recolectaron entre 1 y 20 garrapatas de cada animal, dependiendo de la carga ectoparasitaria, tomando el cuerpo de las garrapatas con una pinza anatómica o con los dedos índice y pulgar (con guantes), realizando varios movimientos hacia arriba con una fuerza moderada, hasta que las piezas bucales de la garrapata cedan. Se colocaron las garrapatas vivas en frascos pastilleros, un frasco por cada grupo de garrapatas obtenido de cada bovino. Se rotularon los frascos con datos como: zona (cantón, Ej: Pedro Vicente Maldonado), nombre del sitio (Ej: Finca La Marlene), # del bovino (Ej: bovino 1), fecha de recolección (Ej: 10 de enero de 2011), nombre del propietario (opcional).

Los especímenes se conservaron vivos dentro de los frascos a temperatura ambiente por un máximo de dos días, hasta su posterior identificación y procesamiento en el laboratorio de entomología de la USFQ.

(2) Método de bandera o barrido (flagging). Se seleccionaron potreros con pastos secos en donde el ganado

estuvo pastoreando. Se utilizó una manta blanca (2 x 1 m) cuyo extremo anterior estaba unido a un palo de madera de 1,2 m con cuerdas en sus extremos para desplazar la tela sobre la vegetación. Se realizaron recorridos en aproximadamente 20 m2 de terreno en forma de zigzag y al final de cada recorrido se recogieron las garrapatas adheridas a la tela y se depositaron en recipientes plásticos de boca ancha con etanol al 97% rotulados como anteriormente se indicó hasta su identificación en el laboratorio.

2. Identificación morfológica de las garrapatas.- Las garrapatas vivas se colocaron en una caja petri y bajo un estereoscopio se las clasificó morfológicamente en base a una clave dicotómica (Anexo A). Se las separó por género, sexo y estadío. Para preservar los órganos internos y extraer la mayor cantidad de hemolinfa de las garrapatas, se diseccionaron los especímenes con bisturí. Se conservaron en etanol al 97% a -20°C en tubos de microcentrífuga de 2ml rotulados con la información de procedencia, fecha de colección y especie de garrapatas.

3. Extracción de ADN.- Para la extracción de ADN se utilizó el Kit Dneasy blood & tissue (spin-column) (Qiagen®). Cada pool de garrapatas fue lavado 3 veces con agua destilada, luego con etanol absoluto y se les dejó secar sobre una toalla de papel cerca de un mechero. Se colocaron entre 1 y 4 especímenes adultos y ninfas o 50 larvas, equivalentes a 25 mg aproximadamente, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril. Se añadieron 20 µl de Buffer ATL y se trituró la garrapata con un pilón. Se añadieron 180 µl de Buffer ATL y 20 µl de proteinasa K. Se mezcló con ayuda de un vórtex e incubó a 56°C por una hora. Se agitó en el vórtex durante 15 segundos. Se añadieron 200 µl de Buffer AL a la muestra y se homogenizó por agitación. Se añadieron 200 µl de etanol de grado molecular (96-100%) y se mezcló por agitación. Se incubó a 70°C por 10 minutos. Se tomó aproximadamente 700 µl de la mezcla anterior y se transfirió a la columna colocada en un tubo de colección de 2 ml y se centrifugó a 8000 rpm por 1 minuto. Se desechó el tubo de colección con

el fluido y se colocó la columna en un nuevo tubo de colección de 2 ml. Se añadieron 500 µl de Buffer AW1 y se centrifugó por 1 minuto a 8000 rpm. Se desechó el tubo de colección con el fluido y se colocó la columna en un nuevo tubo de colección de 2 ml. Se añadieron 500 µl de Buffer AW2 y se centrifugó por 3 minutos a 14000 rpm para secar la membrana DNeasy. Se desechó el tubo de colección con el fluido y se colocó la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se colocaron 200 µl de Buffer AE directamente sobre la membrana DNeasy y se incubó a temperatura ambiente por 5 minutos. Se centrifugó durante 1 minuto a 8000 rpm para enjuagar. Se rotularon los tubos con el número correspondiente de cada muestra. El ADN de las muestras se conservó a -20°C en cajas correctamente rotuladas.

4. Cuantificación de ADN.- Las muestras de ADN se analizaron en el espectrofotómentro NanoDrop 1000 (Termo Scientific®) para determinar su calidad, pureza y concentración (ng/µl). Se seleccionaron la muestras cuyo ADN tuvo mejor calidad (ratio 260/280 ~ 1,8; y ratio 260/230 entre 1,8 a 2,2) y se realizaron diluciones de estas muestras para obtener una concentración final de 50 ng/µl.

5. Detección de ADN de Babesia bovis y Babesia bigemina.- Los primers utilizados (Tabla 3) fueron diseñados por Gabriel Trueba en el 2010 para la diferenciación de las especies de Babesia bovis y B. bigemina mediante la PCR en tiempo real por diferencias de temperaturas de melting. Fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. Estos cebadores, amplifican fragmentos específicos del gen 18S ARN ribosomal de Babesia bovis y Babesia bigemina. Para la estandarización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizaron controles positivos de Babesia bovis y Babesia bigemina proporcionados por Dr. Jimmy Vargas del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia.

Tabla 3. Primers utilizados en RT-PCR y PCR convencional para la detección de Babesia bovis y Babesia bigemina.

Tamaño Secuencia NOMBRE Secuencia del Primer del Diana amplicón

Bbigemina-18smeltF2 Gen 18S ARN AAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTC 70 pb ribosomal de Babesia Bbigemina-18smeltR2 bigemina AACCAACAAAATAGAACCAAGGTC 70 pb

Bbovis-18meltF2 Gen 18S ARN cggcggAATAACCTTGTATGACCCTGTCGT 70 pb ribosomal de Bbovis-18meltR2 Babesia bovis CGTTCCTATTAACCATTACCCAA 70 pb

Para determinar la presencia de Babesia bovis se realizó una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con los primers Bbovis-18meltF2 y R2 que amplifican un fragmento de 70 pb, al primer forward se le añadió una abrazadera o clamp de guanina y citosina en el extremo 5’ que a más de mejorar su rendimiento y especificidad, contribuye en un aumento de temperatura de melting o disociación. Para la detección de Babesia bigemina se realizó otra PCR con los primers específicos Bbigemina- 18smeltF2-R2 que igualmente amplifican un fragmento de 70 pb.

La mezcla de las reacciones de amplificación fue preparada dentro de una cámara de acrílico esterilizada con HCl al 0,1 M y Etanol al 70%. En un volumen final de 10 µl de mezcla por reacción, se agregó buffer de PCR a una concentración final de 1X, 0,05 U/µl de enzima Taq Polimerasa, 2 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs y 0,3 µM de cada primer; a este mix se le añadió 1 µl ADN en concentración de 50 ng/µl (Tabla 4). El termociclador PTC-100 (MJ Research) fue programado con un paso de desnaturalización inicial de 5 minutos a 94°C, seguido de 5 ciclos de desnaturalización a 94°C por 30 segundos, anclaje de primers a 55°C por 30 segundos y extensión a 72°C por 30 segundos y luego por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 30 segundos, anclaje de primers a 60°C por 30 segundos y extensión a 72°C por 30 segundos, terminando con un paso de extensión final a 72°C por 5 minutos. A más de las muestras analizadas, se utilizaron controles positivos de Babesia bovis y Babesia bigemina y agua de grado molecular como controles negativos (Tabla 5).

También se llevó a cabo una PCR múltiple con los primers Bbovis- 18meltF3-R3 que amplifican un fragmento de 85 pb del gen 18S ARN ribosomal de Babesia bovis y Bbigemina-18smeltF3-R3 que amplifican un fragmento de 54 pb del gen 18S ARN ribosomal de Babesia bigemina.

El protocolo de ciclado fue programado con un paso de desnaturalización inicial de 5 minutos a 94°C, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94°C por 30 segundos, anclaje de primers a 60°C por 30 segundos y extensión a 72°C por 30 segundos terminando con un paso de extensión final a 72°C por 5 minutos. A más de las muestras analizadas, se utilizaron controles positivos de Babesia bovis y Babesia bigemina y agua de grado molecular como controles negativos.

Tabla 4. Concentraciones de reactivos para PCR convencional REACTIVO Conc. Final Vol. 1 reac PCR Buffer 1 X 2,00 µl

MgCl2 2 mM 0,80 µl dNTPs 0,2 mM 1,00 µl GoTaq DNA Promega 0,05 U/µl 0,10 µl Primer Forward 0,3 µM 0,30 µl Primer Reverse 0,3 µM 0,30 µl

Mol. Grade H2O 4,50 µl Volumen Total Mater Mix 9,00 µl ADN 1,00 µL / rxn

Tabla 5. Protocolo de Ciclado de la PCR para la detección de Babesia bovis y Babesia bigemina # Paso Condiciones 1 Desnaturalización inicial 94 °C x 5 min 2 Desnaturalización 94 °C x 30 seg 3 Annealing 55 °C x 30 seg 4 Extensión 72 °C x 30 seg 5 # Ciclos Ir al paso 2 por 5 ciclos 6 Desnaturalización 94 °C x 30 seg 7 Annealing 60 °C x 30 seg 8 Extensión 72 °C x 30 seg 9 # Ciclos Ir al paso 6 por 33 ciclos 10 Extensión final 72 °C x 5 min 11 Enfriamiento (Fin) 15 °C x ∞

6. Electroforesis de ADN.- Todos los productos de PCRs se corrieron en geles de agarosa al 3% que contenían 0,02% de Bromuro de etidio, a 90 Voltios por 30 minutos. Se usó el marcador de peso molecular TrackIt 50 bp (Invitrogen, USA) para determinar el tamaño de la banda de los productos amplificados.

7. Secuenciamiento.- Se reamplificaron 3 muestras positivas para Babesia bovis y 2 para Babesia bigemina, cuyos productos se enviaron a Functional Biosciences, Inc. en los Estados Unidos, para su secuenciamiento con la finalidad de confirmar la amplificación de dichas especies de Babesia.

8. Estandarización de PCR cuantitativo.

1) TERMOCICLADOR Light Cycler® 1.5 (ROCHE).- Se realizaron múltiples ensayos en el termociclador Light Cycler® 1.5 de ROCHE, utilizando un volumen de 10 µl por reacción (9 µl de Master Mix y 1 µl de ADN) (Tabla 6).

Tabla 6. Reactivos y concentraciones para el Master Mix para Q-PCR en el Light Cycler® 1,5 de ROCHE. REACTIVO CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN INICIAL FINAL Buffer PCR 10 X 1 X MgCl2 50 mM 2 mM dNTPs 1 mM 0,2 mM Taq Platinum (Invitrogen®) 5 U/ul 0,04 mM SYBR Green 10 X 1 X Primers 10 µM 0,3 µM Agua de grado molecular

Se programó el protocolo descrito en la Tabla 6, en el programa LightCycler Versión 4.1. Se preparó el Master Mix de PCR (Tabla 7) y se colocó en capilares de vidrio de 20 µl (específicos para el termociclador). Se añadió 1 µl de ADN en cada capilar respectivamente. Se sellaron los capilares con el sellador de LightCycler (capping tool). Se pusieron los capilares en el carrusel del termociclador e inició la Q-PCR. Los resultados se reflejaron gráficamente en curvas de cinética de

fluorescencia (proporcionales al aumento de ADN) en cada ciclo para cada una de las muestras y controles.

Tabla 7. Protocolo de Ciclado de Q-PCR en el LightCycler® 1.5. PASO CONDICIONES Desnaturalización inicial 94°C por 5 minutos 94°C por 30 segundos Amplificación 60 °C por 30 segundos (44 ciclos) 72 °C por 30 segundos Extensión Final 72°C por 5 minutos 95°C por 0 segundos Melting 60°C por 30 segundos 97°C por 0 segundos Enfriamiento

2) TERMOCICLADOR CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD).- Se utilizó el iQ SYBR Green Supermix (BIO-RAD) para la PCR en tiempo real, el cual contiene reactivos suficientes para la PCR y la enzima polimerasa “hot-start” ITAQ DNA™. El Master Mix de PCR se repartió en tubos de Q-PCR de tapa plana y se añadió 1 µl de ADN en cada tubo respectivamente (Tabla 8). El protocolo de ciclado se programó en el CFX Manager™ Software, mediante la introducción de la secuencia de los primers utilizados. Se inició con un paso de desnaturalización de 95°C por 3 minutos, seguido de 44 ciclos de desnaturalización a 95°C por 30 segundos, anclaje de primers a 57,2°C para Babesia bovis y 55,5°C para Babesia bigemina por 30 segundos y extensión a 72°C por 30 segundos. Finalmente se programó el análisis de curvas de disociación (Melt-Curve) de 65°C a 95°C con un incremento de 0,5°C cada 0,05 segundos (Tabla 9). Los resultados se reflejaron gráficamente en curvas de cinética de fluorescencia (proporcionales al aumento de ADN) en cada ciclo para cada una de las muestras y controles.

Tabla 8. Reactivos y concentraciones utilizados en el termociclador CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD).

REACTIVO Conc. Inicial Conc. Final Vol. 1 reac iQ SYBR Green Super Mix 2 X 1 X 5,00 µl Primer Forward 10 µM 0,5 µM 0,50 µl Primer Reverse 10 µM 0,5 µM 0,50 µl

Mol. Grade H2O 3,00 µl Volumen Total Mater Mix 9,00 µl ADN 1,00 µL / rxn

Tabla 9. Protocolo de Ciclado de Q-PCR en el termociclador CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD).

PASO CONDICIONES Babesia bovis Babesia bigemina Desnaturalización inicial 95°C por 3 minutos 95°C por 3 minutos Amplificación 95°C por 30 segundos 95°C por 30 segundos (44 ciclos) 57,2 °C por 30 segundos 55,5 °C por 30 segundos 72 °C por 30 segundos 72 °C por 30 segundos Lectura de la placa Lectura de la placa Curvas de Derretimiento Melt Curve: 65,0°C a 95,0°C Incremento de 0,5°C cada 0,05 segundos Lectura de la placa Enfriamiento

CAPÍTULO III RESULTADOS

1) Colección de las muestras: Se recolectaron garrapatas de 56 propiedades distribuidas en las cuatro regiones del Ecuador: 8 de la Costa, 14 de la Sierra, 22 del Oriente y 2 de la Región Insular. Adicionalmente se tomaron muestras de 10 propietarios (con diversos orígenes) en el Camal Metropolitano de Quito (Gráfico 1).

CAMAL DMQ 10

REGIÓN INSULAR 2

ORIENTE 22

SIERRA 14

COSTA 8

0 5 10 15 20 25 # de sitios de recolección

Gráfico 1. Número de predios donde se colectaron garrapatas, agrupados por zona geográfica.

El método de recolección de garrapatas “sobre el animal” fue más efectivo que el método de barrido (flagging). Está última técnica presentó dificultades como el tipo de pasto, presencia de lluvias, época de baja densidad de garrapatas y mayor tiempo de recolección. Se recolectaron larvas y ninfas únicamente en cinco sitios de muestreo: Pedro Vicente Maldonado (2 fincas), San Miguel de los Bancos (2 fincas) y Santa Elena (1 finca).

2) Identificación morfológica de las garrapatas.- Dentro del género Rhipicephalus se identificaron únicamente Rhipicephalus (Boophilus) microplus, los cuales fueron ampliamente distribuidos en los sitios de muestreo, encontrándose en 51 de los 56 predios analizados (Tabla 10). No se encontró Rhipicephalus annulatus ni otras especies de garrapatas.

Tabla 10. Listado de las especies de Rhipicephalus identificadas en los sitios de muestreo.

Especies de Región Sitio de Muestreo Rhipicephalus identificadas

Santa Elena (Vueltas Largas, Chanduy, Colonche) Rhipicephalus microplus

Santa Elena (Manglar Alto) Ausentes* COSTA Santo Domingo Tsáchilas (El Laurel, Palma Sola, San Rhipicephalus microplus Jacinto)

Esmeraldas (Santo Domingo del Onzole) Rhipicephalus microplus

Imbabura, La Florida (Fincas 1, 2, 3, 4) Rhipicephalus microplus

Pichincha, San Miguel de Los Bancos, (Fincas 1 y 2) Rhipicephalus microplus

Pichincha, Pedro Vicente Maldonado (Finca 1, Feria: SIERRA Rhipicephalus microplus Bov. 1,2)

Pichincha, Pedro Vicente Maldonado (Finca 2,3,4) Ausentes*

Pichincha, Puerto Quito (Bosque de Oro, El Edén) Rhipicephalus microplus

Napo: Cosanga, Baeza, Borja, Sumaco, Linares (fincas 1-5), Sardinas (fincas 1-5), Santa Rosa, El Rhipicephalus microplus ORIENTE Chaco (Ficas 1,2)

Sucumbios (Fincas 1-4) Rhipicephalus microplus

REGIÓN Galápagos, El Progreso (Cerro Verde, Tres palos) Rhipicephalus microplus INSULAR

Ibarra (Propietario 1) Rhipicephalus microplus

Santo Domingo de los Tsáchilas (Propietarios Rhipicephalus microplus CAMAL 2,3,6,7,8,9,10) DMQ Propietario 4 (Sucumbíos) Rhipicephalus microplus

Propietario 5 (Santo Domingo de los Tsáchilas) Ausentes* *Se identificaron garrapatas del género Amblyomma cajennense.

3) Extracción de ADN: Se extrajo entre 1 y 9 muestras de ADN por cada predio muestreado, dependiendo del número de garrapatas colectadas. En total se extrajo ADN de 135 pools de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus), de los cuales se seleccionaron 100 muestras de ADN (Anexo C).

4) Especificidad de los primers: Se realizaron ensayos para determinar la especificidad de los primers utilizando controles positivos de Babesia bigemina y de Babesia bovis. Los primers Bbigemina-18smeltF2-R2 amplificaron únicamente el control de B. bigemina mientras que no amplificó el de B. bovis (Fig 11). De igual manera los primers Bbovis-18meltF2-R2 amplificaron únicamente para B. bovis (Fig 12). No se produjeron bandas inespecíficas ni dímeros de primers.

Fig 11. Productos de la PCR múltiple con los primers Bbigemina-18meltF2- R2. en gel de Agarosa al 3% corrido por 30 minutos a 90 voltios.

Fig 12. Productos de la PCR con los primers Bbovis-18meltF2-R2 en gel de Agarosa al 3% corrido por 30 minutos a 90 voltios.

Mientras que los primers Bbigemina-18smeltF3-R3 y Bbovis- 18meltF3-R3 amplificaron para ambas especies de Babesia, por lo cual fueron descartados para los posteriores análisis (Fig 13).

Fig 13. Productos de la PCR múltiple con los primers Bbigemina- 18smeltF3-R3 y Bbovis-18meltF3-R3 en gel de Agarosa al 3% corrido 40 minutos a 90 voltios.

5) Detección de ADN de Babesia: De las 100 muestras analizadas 20 fueron positivas para Babesia bigemina, 15 para Babesia bovis, 8 presentaron coinfección (positivas para B. bovis y B. bigemina) y 57 fueron negativas (Gráficos 2,3; Fig 14; Tabla 11).

60 57 50 40 30 20 15 20 8

# demuestras # 10 0 Babesia bovis Babesia Coinfección Negativas bigemina

Gráfico 2. Número de muestras positivas y negativas a Babesia bovis y Babesia bigemina.

0 Santo Esme- Domin- San Pedro Santa Camal Napo, Napo Napo, raldas, go de Miguel Vicente Napo, Elena, Puerto Metro- Imba- El Sardi- Santa Eloy los de Los Maldo- Linares Vueltas Quito polita- bura Chaco nas Rosa Alfaro Tsáchi- Bancos nado Largas no las Babesia bovis 0 1 2 2 4 1 2 0 1 0 5 1 Babesia bigemina 1 0 2 3 2 1 5 1 0 1 6 0

Gráfico 3. Presencia de las dos especies de Babesia expresado en número de predios positivos por zona de recolección.

Fig 14. Mapa de los cantones muestreados (en gris) donde se indica la distribución de las especies de Babesia encontradas.

Tabla 11. Detalle de los resultados obtenidos por PCR para la detección de Babesia bovis y Babesia bigemina. # Positivas # Positivas Zona de Cod. muestras # Localidad Babesia Babesia recolección analizadas muestras bigemina bovis Chanduy K66,K68,K69 3 0 0 Santa Colonche K70,K71,K72 3 0 0 Elena Vueltas Largas K73,K75,K77 3 0 3 Santo Domingo del Esmeraldas Onzole K117,K118 2 1 0 Santo San Jacinto K123,K124 2 1 0 Domingo Palma Sola K125,K126 2 0 0 de los Tsáchilas Laurel K127,128 2 0 0 San Miguel de Los Recinto Ganaderos K2,K3,K5,K8 Bancos Orenses (Fincas 1,2) K10,K11,K13,K14 8 2 3 Puerto Bosque de Oro K15,K16 2 0 0 Quito El Edén (Km 140) K19,K21,K24 3 0 1 Pedro Paraíso Escondido K78,K79,K82 3 0 1 Vicente Feria ganadera K27,K28,K29, Maldonado (bov.1,2) K31,K35,K36 6 3 2 Ibarra, La Florida Imbabura K110,K111,113,114,11 (Fincas 1-4) 2,115,116 7 0 1 K84, K85,K86, K87, Linares (Fincas 1-5) K88,K89, K90,K91 8 5 2 El Chaco (Fincas 1- 2) K92,K93, K94,K95 4 2 2 Napo K96,K97, K98,K99, K100,K101, K102,K103, K104,K105, Sardinas (Fincas 1-6) K106,K107 12 4 4 Santa Rosa K108,K109 2 0 1 K129,K130, Sucumbíos Sucumbíos (Fincas K131,K132, K133, 1-4) K134,135 7 0 0 El Progreso (Tres Galápagos K121,K122, Palos, Cerro Verde) K119,K120 4 0 0 Ibarra K39,K40,K42 3 0 2 Camal Santo Domingo de Metropoli- los Tsáchilas K43,K44, K49,48,K47, tano DMQ (Propietarios K60,K59, K61,K62, 2,3,6,7,8,9,10) K63,K64,K65 12 4 5 Sucumbíos K56,K52 2 1 1 TOTAL 100 23 28

6) Análisis de secuencias. - El secuenciamiento de los productos de PCR resultó en la amplificación de la zona deseada del gen 18S ribosomal de las especies de Babesia bovis y Babesia bigemina. Para ello se analizaron las secuencias obtenidas con el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) y se determinó un alto porcentaje de identidad con las especies de Babesia amplificadas (Tabla 12).

Igualmente se realizó un árbol filogenético usando el método de Neighbor Joining tipo “bootstrap” con 500 réplicas, para cada especie, en comparación con secuencias del GenBank análogas y Plasmodium vivax como control externo. En el caso de Babesia bigemina todas fueron homólogas (Fig 15), mientras que en las secuencias de Babesia bovis hubieron diferencias (Fig 16), posiblemente por el pequeño tamaño de la secuencia, errores de lectura del secuenciamiento o por variaciones genéticas.

Tabla 12. Resultados de los secuenciamientos analizados en el BLAST.

BLAST sequence Código de Secuencia Código de muestra % de Descripción acceso al identidad GenBank

GCCCGCCCGCCCAATA Babesia bovis strain Nef 1 18S EU407240.1 83 % ACCTTGTATGACCCTGT ribosomal RNA gene, partial sequence K-36 CGTCATTTTTGTTGGGT Babesia bovis isolate Merida clone 8 AATGGTTAATAGGAAC HQ264124.1 G 18S ribosomal RNA gene, partial 100 % sequence

Babesia bovis isolate NR6 clone 4I 18S CCGCGCAAATAACCTT HQ264126.1 100% GTATGACCCTGTCGTA ribosomal RNA gene, partial sequence K-79 CCTATACATGGCGCCT CATACATGTTATTGCGG Babesia bovis isolate Mexico 18S ribosomal RNA gene, partial CGGACGGG EF643466.1 100% sequence

GCGCCCCAATAACCTT Babesia bovis strain Nef 1 18S EU407240.1 93% GTATGACCCTGTCGTA ribosomal RNA gene, partial sequence K-2 CCGTTGGTTCACTTGG GTAATGATTAGTAGGAA Babesia bovis isolate Tamaulipas 2 18S EF643472.1 GC ribosomal RNA gene, partial sequence 93%

Babesia bigemina isolate biLushi 18S JX495402 AAGCAGACTTTTGTCTT ribosomal RNA gene, partial sequence 100% GAATACTTCAGCATGG K-123 AATAATAGAGTAGGAC CTTGGTTCTAT Babesia bigemina isolate hlj444 18S JQ993421.2 ribosomal RNA gene, partial sequence 100%

AAGCAGACTTTTGTCTT GAATACTTCAGCATGG Babesia bigemina strain 493 18S K-117 HQ840959.1 100% AATAATAGAGTAGGAC ribosomal RNA gene, partial sequence CTTGGTTCTAT

Babesia bigemina biLushi Babesia bigemina K-123 Babesia bigemina genotype E 18S ribosomal RNA gene partial sequence Babesia bigemina K-117 Babesia bigemina strain 493 18S ribosomal RNA gene partial sequence Plasmodium vivax SV6

0.5 Fig 15. Árbol filogenético de las secuencias de K-117 y K-123 comparadas con las de Babesia bigemina obtenidas en el GenBank (Babesia bigemina isolate biLushi 18S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: JX495402.; Babesia bigemina genotype E 18S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: HQ688689.1; Babesia bigemina strain 493 18S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: HQ840959.1). .

55 Babesia bovis K-2 Babesia bovis K-79 63 Babesia bovis strain Nef 1 18S ribosomal RNA gene partial sequence Babesia bovis boLushi Babesia bovis K-36 Plasmodium vivax SV6

0.05 Fig 16. Árbol filogenético de las secuencias de K-2, K-36 y K-79 comparadas con las de Babesia bovis obtenidas en el GenBank (Babesia bovis isolate boLushi 18S ribosomal RNA gene, partial sequence, GenBank: JX495403.1; Babesia bovis strain Nef 1 18S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: EU407240.1).

7) Estandarización de la Técnica de Análisis de Curvas de Disociación (Melt-MAMA). El termociclador de PCR en tiempo real Light Cycler® 1.5 (ROCHE) no amplificó los controles de Babesia en ninguno de los ensayos, determinándose posteriormente fallas en la calibración del aparato que impidieron continuar con los análisis. Sin embargo, el ensayo realizado en el equipo CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD), con el Supermix iQ SYBR Green Supermix (BIO-RAD) para la PCR en tiempo real permitió amplificar las secuencias deseadas (Fig 17) y observar las curvas de melting específicas para cada especie de Babesia con diferencias de temperatura marcadas. Se determinó una Tm de 75 °C para Babesia bigemina y una Tm de 81 °C para Babesia bovis (Fig 18).

Fig 17. Curvas de Amplificación en PCR en tiempo real de un fragmento del gen 18S ARN ribosomal de los controles positivos de Babesia bovis y Babesia bigemina. Mientras menor es el valor del ciclo en el que la curva de amplificación sobrepasa el umbral (línea horizontal de color verde), mayor es la cantidad inicial de ADN diana (RFU = Unidades de Fluorescencia).

Fig 18. Picos de Disociación de Amplificación de un fragmento del gen 18S ARN mediante PCR en tiempo real. Temperatura de disociación del producto de Babesia bigemina: 75ºC. Temperatura de disociación del producto de Babesia bovis: 81ºC. No se visualizan dímeros de primer.

CAPÍTULO IV DISCUSIÓN

Se evidenció la amplia distribución de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, vector de la babesiosis bovina, en las cuatro regiones del Ecuador, siendo la principal especie de garrapata encontrada en 51 de los 56 predios muestreados. No se encontró otra especie del género Rhipicephalus, concordando con Guglielmone et. al. 1995, quien afirma que solo dos especies de este género se han establecido en América, Rh. microplus y Rh. annulatus. La primera, presente en todos los países de América Latina con excepción de Chile, mientras que Rh. annulatus, se considera restricta al noreste de México, aunque ha sido comunicada, posiblemente por error, en varios países de la región (Guglielmone, 2004).

No se encontró este género de garrapatas en la parroquia Manglar Alto de la provincia de Santa Elena, en tres propiedades del Recinto 10 de Agosto de Pedro Vicente Maldonado y en un grupo de muestras del Camal Metropolitano que provenían de Santo Domingo de los Tsáchilas. En estos sitios se identificaron garrapatas del género Amblyomma sp.

El método de extracción de ADN de garrapatas realizado con el Kit de Qiagen para sangre y tejidos, fue 100% efectivo para las hembras adultas, cuyas concentraciones de ADN variaron entre 8,5 ng/µl y 1852,96 ng/µl con relaciones de absorbancia 260/280 y 260/230 dentro de los rangos óptimos, lo que sugiere una alta pureza del ADN y ausencia de inhibidores de la PCR (Anexo C). En tanto que, en el caso de los machos y larvas la eficiencia de la técnica de extracción de ADN llegó al 40%, debido al grueso exoesqueleto quitinoso y la difícil manipulación durante la ruptura mecánica, por lo que los tejidos no pudieron ser totalmente degradados y la concentración del ADN varió de -0,03 ng/µl a 8,07 ng/µl

con ratios 260/280 y 260/230 por fuera de los valores óptimos, que sugieren una mala calidad de ADN y presencia de inhibidores. Halos et. al, 2004 confirma que la eficacia de la extracción de ADN de garrapatas depende de una correcta lisis mecánica de los especímenes, determinando un 77% de eficacia de la técnica enzimática utilizada en este estudio, mientras que técnicas que implementan métodos de trituración más efectivos como el método de trituración con perlas, proteinasa K y el Kit de Qiagen y el método de extracción de ADN por trituración en un mortero, proteinasa K y fenol-cloroformo alcanzan un 100% y 97% de eficacia respectivamente.

Es importante tomar en cuenta que la calidad del ADN incide directamente en la eficiencia de la amplificación por PCR. La extracción de ADN de garrapatas ha sido una problemática (Mauel et. al, 1999; Schwartz et. al, 1997) pues parece ser altamente susceptible a la degradación (Hill et. al, 2003; Hubbard et. al., 1995) y a la posible presencia de inhibidores de la Taq polimerasa (Parola et. al, 2001; Schwartz et. al, 1997; Hubbard, et. al., 1995). Para examinar la calidad del ADN de garrapatas se sugiere realizar un control interno previo a la diagnosis del patógeno, es decir, una amplificación por PCR de una sección del genoma de las garrapatas para descartar la presencia de inhibidores y falsos negativos (Sparagano et. al, 1999).

El uso de PCR en este estudio asegura una alta sensibilidad y especificidad de los resultados. La especificidad de las técnicas de PCR estandarizadas, fue probada con ADN proveniente de cultivos puros de ambas especies de Babesia y secuenciamiento genético de muestras positivas, asegurando una alta fiabilidad de estos métodos moleculares para el diagnóstico de la babesiosis bovina.

Se comprobó que la PCR en tiempo real es una técnica más rápida, sencilla y segura que la PCR convencional. Con este método, la diferenciación de especies de Babesia se realizó a través del análisis de curvas de fusión, donde el fragmento de Babesia bigemina, con una

concentración de guanina-citocina del 36%, generó una Tm de 75°C, mientras que Babesia bovis, con una mayor concentración de guanina- citocina (48%), presentó una Tm de 81°C (Fig. 18). La diferencia de 6°C entre las temperaturas de fusión de los fragmentos amplificados fue igual a la diferencia planteada teóricamente, comprobándose la efectividad de la técnica.

Chiang et. al. 1996, demuestra que la tecnología de PCR en tiempo real es cuatro veces más sensible que la PCR convencional para el diagnóstico de la babesiosis, recomendando su uso en posteriores investigaciones. Sin embargo, el alto costo de esta técnica molecular fue un impedimento para el análisis de muestras en esta investigación.

Mediante PCR convencional se determinó que el 43% de las muestras de garrapatas recolectadas y analizadas en este estudio fueron positivas a la babesiosis bovina. En promedio se analizaron 2 muestras por predio y de los 46 sitios estudiados 19 fueron negativos (43,3%) a ambas especies de Babesia, sin descartarse su presencia en estas zonas debido al reducido número de muestras analizadas por propiedad. De las 100 muestras analizadas, 15 fueron positivas a Babesia bovis, 20 a Babesia bigemina y 8 estuvieron coinfectadas (tabla 11).

Se observó la coexistencia de Babesia bovis y Babesia bigemina en las regiones costa, sierra y oriente con la excepción de la región insular donde los resultados fueron negativos (fig 14).

Se detectó Babesia bovis en Santa Elena (Vueltas Largas), Imbabura y Puerto Quito; mientras que B. bigemina estuvo presente en la parroquia San Jacinto del Búa de la provincia de Santo Domingo de los Tsáchilas, en la parroquia Santa Rosa de la provincia del Napo y en el cantón Eloy Alfaro de la provincia de Esmeraldas, y las dos especies de Babesia coexistieron en San Miguel de los Bancos, Pedro Vicente Maldonado, y en las parroquias de Linares y Sardinas de la Provincia del Napo. No se detectó Babesia en las garrapatas colectadas en Galápagos y en Sucumbíos.

Este es el primer estudio en el Ecuador donde se comprueba la presencia de Babesia bovis y Babesia bigemina en el vector mediante PCR. Estudios anteriores analizan la presencia de babesiosis bovina en sangre, utilizando técnicas menos sensibles como la inmunofluorescencia y el frotis sanguíneo.

En el 2004, Mina reportó la presencia de babesiosis bovina en la provincia de Esmeraldas, información que se corrobora en este estudio con la detección de Babesia bigemina en una de las 2 muestras analizadas pertenecientes al Cantón Eloy Alfaro. Pazmiño (2011) determinó la presencia de B. bovis en el Camal del Distrito Metropolitano de Quito (CDMQ), detectando un 29,29% de muestras positivas a IFI y de 0,71% a frotis sanguíneo. En nuestro estudio se analizaron 17 muestras de garrapatas procedentes del CDMQ, de las cuales 5 fueron positivas a Babesia bigemina y 6 a Babesia bovis.

En el 2012, Hernández analiza la presencia de Babesia bovis en 350 muestras de sangre de 17 fincas de Santo Domingo Tsáchilas mediante frotis y PCR convencional sin detectar muestras positivas. En nuestro estudio tampoco se detectó Babesia bovis en esta provincia, pero se determinó la presencia de Babesia bigemina en una finca perteneciente a la parroquia de San Jacinto del Búa. Por otro lado, de 12 muestras del Camal del Distrito Metropolitano de Quito, que provenían de esta provincia, 4 fueron positivas a Babesia bigemina y 5 a Babesia bovis.

La dificultad y falta de control en la movilización y cuarentena de los animales han facilitado la dispersión y adaptación de garrapatas en todas las regiones del país, afectando a bovinos más susceptibles genéticamente, donde las garrapatas y enfermedades que transmiten representan un problema de grandes proporciones económicas y sanitarias.

La cuarentena y vigilancia de los animales en zonas endémicas, así como la utilización de ganado bovino genéticamente resistente, como Bos

indicus, son algunos métodos de prevención y control de la babesiosis, sin embargo, la colaboración de los ganaderos en estos programas se vuelve primordial (Coetzer, 2004).

El control de la babesiosis requiere tener un diagnóstico completo de la situación para optimizar el diseño de las estrategias de control. Conocer la dinámica poblacional, la situación de estabilidad o inestabilidad enzoótica, prevalencia del vector, perfil de sensibilidad a garrapaticidas y control integral de las poblaciones de garrapatas (Solari, 2006).

La babesiosis puede llegar a ser erradicada mediante el control estratégico de las garrapatas debido a que Rhipicephalus tiene un solo hospedero y es el único vector de la enfermedad en nuestro país. La erradicación puede ser aplicable en zonas aisladas del Ecuador, como las Islas Galápagos, donde las garrapatas representan uno de los principales problemas pecuarios.

El control de estos ectoparásitos y de las enfermedades que transmiten se ha ido dificultando debido al desarrollo de resistencia a los garrapaticidas, fenómeno que no ha sido comunicado oficialmente en el Ecuador (Nari et. al 2003) pero que se ha convertido un problema creciente.

Actualmente una alternativa para el control de las garrapatas es la inmunización, para lo cual existen vacunas formuladas con el antígeno Bm86 de células intestinales de Rh. microplus. Existen tres vacunas contra la garrapata común del bovino, TickGard, TickGard Plus®, y GAVAC (Willadsen et. al, 1997; Nava et. al, 2003). Sin embargo, los resultados dispares en condiciones de campo han limitado su uso. Recientemente, Patarroyo en el 2011 anunció una vacuna con eficacia del 85% en animales estabulados (Anónimo, 2011).

También existen vacunas para prevenir la anaplasmosis y la babesiosis bovinas, como la vacuna Anabasan®-LIMOR, que fue aprobada en Colombia en el año 2000 (Viscaíno et. al, 2004). La inmunización en edades tempranas asegura una protección larga y duradera tanto para B.

bovis como para B. bigemina (Goff et. al, 2003). En el Ecuador ninguna de estas vacunas ha sido introducida en el mercado.

En nuestro país se debe seguir investigando y generando información sobre las garrapatas y enfermedades que trasmiten, que estén orientadas a la ejecución de planes de acción eficaces, colectivos y viables que incluyan a todos los factores de riesgo de la problemática.

CAPÍTULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

A. CONCLUSIONES 1. Se evidenció la amplia distribución del vector de la babesiosis bovina, la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, en las cuatro regiones del Ecuador, encontrándose en 51 de 56 propiedades muestreadas, es decir, en el 91% de las mismas. 2. La estandarizaron de protocolos de PCR convencional y el análisis de 100 extractos de ADN en garrapatas, permitió detectar que el 15%, 20% y 8% fueron positivas a Babesia bovis, Babesia bigemina y coinfecciones, respectivamente; en las regiones costa, sierra y oriente, con excepción de la región insular. 3. La calidad de ADN obtenido a partir de las garrapatas, permitió obtener una elevada especificidad de la PCR estandarizada la cual fue corroborada mediante secuenciamiento genético de muestras positivas, el mismo que proporcionó porcentajes de identidad de hasta el 100% para Babesia bovis y Babesia bigemina mediante análisis en el BLAST. 4. Se diferenció Babesia bovis y Babesia bigemina a través de la estandarización de la técnica de análisis de curvas de disociación con PCR en tiempo real, cuyas diferencias de temperatura de fusión se debieron a polimorfismos de nucleótidos de fragmentos de 70 pb del gen 18S ARN ribosomal amplificados.

B. RECOMENDACIONES

1. Estudiar la filogenia de poblaciones de garrapatas del género Rhipicephalus (Boophilus) microplus de nuestro país y confirmar su identificación morfológica mediante análisis genéticos. 2. Continuar realizando estudios comparativos de la sensibilidad de PCR convencional vs. PCR en tiempo real desarrollados en este estudio. 3. Emplear técnicas de extracción de ADN de las garrapatas que incluyan un buen método de lisis mecánica y determinar su calidad mediante la amplificación de un control interno. 4. Realizar investigaciones encaminadas al conocimiento de estabilidad enzoótica de la babesiosis, distribución, prevalencia y dinámica de su vector, determinación de resistencias a los garrapaticidas, efectividad de vacunas para garrapatas y enfermedades que transmiten en nuestro medio, determinación de pérdidas económicas causadas por garrapatas y enfermedades que transmiten, entre otras, que ayuden a elaborar planes de control y prevención acordes con la realidad nacional. 5. Impulsar la inclusión, el desarrollo y la comprensión de nuevas tecnologías y métodos de diagnóstico cada vez más sensibles y específicos como herramientas fundamentales en el control de las enfermedades.

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ANEXOS

Anexo A. Principales herramientas de identificación morfológica de las garrapatas. Tabla 13. Guía práctica para identificación de géneros de garrapatas de la familia Ixodidae.

Fig 19. Hembra Rhipicephalus (Boophilus) microplus, vista dorsal (Walker A. et. al, 2003).

Fig 20. Macho Rhipicephalus (Boophilus) microplus, vista dorsal a la izquierda, coxa en la parte superior derecha, y placas ventrales en la parte inferior derecha (Walker A. et. al, 2003).

Fig 21. Hembra Rhipicephalus (Boophilus) annulatus, vista dorsal (Walker A. et. al, 2003).

Fig 22. Macho Rhipicephalus (Boophilus) annulatus vista dorsal a la izquierda, coxa en la parte superior derecha, y placas ventrales en la parte inferior derecha (Walker A. et. al, 2003).

Anexo B. Fotografías de los especímenes identificados en este estudio.

Fig 23. Vistas dorsal y ventral de machos de Rhipicephalus microplus.

Fig 24. Vista dorsal y ventral de hembras Rhipicephalus microplus.

Anexo C. Cuantificación de ADN de muestras analizadas.

Tabla 14. Resultados de la Cuantificación de ADN. Relación de Relación de Procedencia Concentración Código absorbancia absorbancia ng/µl 260/280 260/230 K-1 18,97 2 1,28 K-2 690,17 2,09 2,23 K-3 674,8 2,1 2,32 K-4 542,77 2,04 2,23 Pichincha, San Miguel de Los K-5 2,02 2,24 Bancos, (Finca 1) 588,99 K-6 273,67 2,09 2,36 K-7 262,36 2,07 2,29 K-8 31,66 1,82 2,18 K-9 40,52 2,02 1,81 K-10 821,97 2,16 2,22 K-11 1811,72 2,11 2,25 Pichincha, San Miguel de Los K-12 2,12 2,23 Bancos, (Finca 2) 1313,12 K-13 1852,96 2,09 2,14 K-14 16,9 1,88 2,18 Pichincha, Puerto Quito, Bosque K-15 15,51 2,07 2,13 de Oro K-16 10,4 2,08 1,59 K-17 133,71 2,1 2,55 K-18 317,85 2,08 2,5 K-19 41,22 2,19 2,93 K-20 33,15 1,98 3,04 K-21 495,08 2,01 2,29 Pichincha, Puerto Quito, El Edén K-22 928,66 2,05 2,2 K-23 328,12 1,87 2,34 K-24 950,11 2,09 2,21 K-25 808,17 2,06 2,17 K-26 380,55 2,09 2,43 K-27 450,11 2,07 2,32 Pichincha, Pedro Vicente K-28 1283,85 2,06 2,15 Maldonado (Feria, Bovino 1) K-29 24,23 2,02 1,66 K-30 1291,33 2,08 2,23 K-31 761,88 2,07 2,15 K-32 276,73 2,07 2,21 Pichincha, Pedro Vicente K-33 97,62 1,28 0,33 Maldonado (Feria, Bovino 2) K-34 520,84 2,04 2,3 K-35 7,4 2,26 -1,05 K-36 505,18 1,99 2,33 K-37 56,5 1.712 1.413 K-38 63,5 1,67 0,948 K-39 725 1,99 2.385 Camal DMQ Propietario 1 (Ibarra) K-40 614 2,026 2,33 K-41 137,5 1,74 1,07 K-42 13,8 2,091 1,84 Camal DMQ Propietario 2 (Santo K-43 531,76 1,94 2,13 Domingo de los Tsáchilas) K-44 76 1,83 1,118 K-45 959,86 2,1 2,26 K-46 327,5 2,04 2,472 Camal DMQ Propietario 3 (Santo K-47 2,015 2,27 Domingo de los Tsáchilas) 395 K-48 176 1,892 2,271 K-49 32,5 1,512 0,57

Relación de Relación de Procedencia Concentración Código absorbancia absorbancia ng/µl 260/280 260/230 K-50 722,5 1,909 2,388 K-51 1009,08 2,07 2,2 K-52 330,5 2,034 2,494 K-53 58 1,221 0,266 Camal DMQ Propietario 4 K-54 2,008 2,405 (Sucumbíos) 359,5 K-55 19,5 1,556 3,305 K-56 92,5 1,869 2,251 K-57 23 1,442 1,045 K-58 91 1,896 2,251 Camal DMQ Propietario 6 (Santo K-59 833,36 2,08 2,25 Domingo de los Tsáchilas) K-60 65 1,78 1,15 Camal DMQ Propietario 7 (Santo K-61 91,5 2,033 1,011 Domingo de los Tsáchilas) K-62 93,5 1,889 2,527 Camal DMQ Propietario 8 (Santo Domingo de los Tsáchilas) K-63 226 1,889 2.027 Camal DMQ Propietario 9 (Santo Domingo de los Tsáchilas) K-64 383 1,929 2,409 Camal DMQ Propietario 10 (Santo Domingo de los Tsáchilas) K-65 210,73 1,98 2,08 K-66 343,76 2,06 2,06 K-67 239,56 2,02 2,43 Santa Elena, Chanduy K-68 436,51 2,05 2,28 K-69 6,28 3,47 105,01 K-70 489,19 2,06 2,33 Santa Elena, Colonche K-71 361,33 2,05 2,32 K-72 -0,03 0,02 0,01 K-73 187,09 2,1 2,32 K-74 12,87 2,18 4,41 Santa Elena, Vueltas Largas K-75 35,56 2,09 1,97 K-76 8,07 5,18 1,16 K-77 751,63 2,01 2,17 K-78 964,32 2,06 2,16 Pichincha, Pedro Vicente K-79 710,69 2,1 2,16 Maldonado (Finca 1) K-80 791,23 2,09 2,29 K-81 730,74 2,07 2,36 K-82 9,38 2,28 1,59 K-83 1,68 1,77 0,48 Napo, Linares (Finca 1) K-84 129,06 2,06 2,42 K-85 470,7 2,03 2,27 Napo, Linares (Finca 2) K-86 452,18 2,04 2,27 Napo, Linares (Finca 3) K-87 347,75 2,04 2,31 K-88 371,61 2,01 2,35 Napo, Linares (Finca 4) K-89 490,46 1,94 2,23 K-90 583,01 1,95 2,23 Napo, Linares (Finca 5) K-91 93,55 2,02 1,96 K-92 496,71 2 2,19 Napo, El Chaco (Finca 1) K-93 222,65 1,9 2,02 K-94 40,82 2,06 1,71 Napo, El Chaco (Finca 2) K-95 176,26 1,98 2,18 K-96 131,97 2,08 2,17 Napo, Sardinas (Finca 1) K-97 143,98 2,01 2,15 Tabla 14 (cont.)

Relación de Relación de Procedencia Concentración Código absorbancia absorbancia ng/µl 260/280 260/230 K-98 97,22 2,02 2,36 Napo, Sardinas (Finca 2) K-99 64,01 1,87 2,17 K-100 63,18 1,82 1,89 Napo, Sardinas (Finca 3) K-101 50,16 1,72 1,2 K-102 140,93 1,91 1,81 Napo, Sardinas (Finca 4) 1,88 1,61 K-103 91,72 1,94 1,97 K-104 102,67 2,01 2,34 Napo, Sardinas (Finca 5) K-105 114,02 1,84 1,95 K-106 200,12 1,99 2,31 Napo, Sardinas (Finca 6) K-107 335,02 1,97 2,11 K-108 313,41 1,98 2,27 Napo, Santa Rosa K-109 308,56 1,97 2,27 K-110 305,92 2,05 2,15 Imbabura, La Florida (Finca 1) K-111 173,96 1,99 2,32 Imbabura, La Florida (Finca 2) K-112 173,97 2,04 2,31 K-113 378,43 2,1 2,01 Imbabura, La Florida (Finca 3) K-114 119,29 1,92 1,76 K-115 96,9 1,76 1,26 Imbabura, La Florida (Finca 4) K-116 56,67 1,825 1,613 Esmeraldas, Santo Domingo del K-117 25 1,932 2,319 Onzole K-118 185,5 2,009 2,583 Galápagos, El Progreso (Tres K-119 108,5 1,982 2,725 palos) K-120 109 1,98 2,247 Galápagos, El Progreso (Cerro K-121 100 2 2,448 Verde) K-122 153 2,04 2,914 Santo Domingo Tsáchilas, San K-123 51 1,89 3,043 Jacinto K-124 8,5 1,917 2,516 Santo Domingo Tsáchilas, Palma K-125 80,5 1,982 2,577 sola K-126 167,5 2,014 2,558 Santo Domingo Tsáchilas, El K-127 208,5 1,987 3,14 Laurel K-128 78,5 1,97 3,25 K-129 65 1,923 2,778 Sucumbíos (Finca 1) K-130 75 1,886 3,27 K-131 41,5 1,429 2,448 Sucumbíos (Finca 2) K-132 35 1,6 0,76 Sucumbíos (Finca 3) K-133 3,8 1,945 2,932 K-134 107 1,961 2,008 Sucumbíos (Finca 4) K-135 126,5 260/280 260/230 Tabla 14 (cont.)

Anexo D. Incidencia de la Babesiosis bovina en Latinoamérica. Número de nuevos focos de la enfermedad notificados a la WAHID© OIE entre enero del 2010 y junio del 2012. PAÍS 2010 2011 2012 Argentina +0 +0 +0 Bolivia +0 9 … Brasil 3048 2863 … Chile 0 0 0 Colombia 182 296 152 Ecuador 1 0 0 Guyana ? … … Guyana Francesa 0 0 0 México +? +0 … Paraguay +0 +0 … Perú ? 3 1 Surinam +.. +.. +.. Trinidad y Tobago 0 0 0 Uruguay 22 11 4 Venezuela +.. … …

... No hay información disponible para esta enfermedad 0 Enfermedad ausente\n ? Se sospecha la enfermedad pero no ha sido confirmada +? Presencia de la infección pero sin signos clínicos +.. Enfermedad presente sin datos cuantitativos + Enfermedad presente con datos cuantitativos, pero el número de focos es desconocido +0 Enfermedad limitada a una o varias zonas +?0 Infección/Infestación limitada a una o varias zonas ?0 Sospecha de la enfermedad sin confirmación limitada a una o varias zonas

HOJA DE VIDA

DATOS INFORMATIVOS

. Apellidos: VASCO AGUAS . Nombres: KARLA ANDREA . Lugar y fecha de nacimiento: Quito, 27 de diciembre de 1987. . Estado civil: Soltera . N° de cédula de ciudadanía: 200005417-7 . Números telefónicos: 0996-281-067/ 0999-880-641 . Correo electrónico: [email protected]

FORMACIÓN ACADÉMICA

EDUCACIÓN SUPERIOR: MEDICA VETERINARIA Y ZOOTECNISTA; Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Universidad Central del Ecuador; Quito, enero/2013.

EDUCACIÓN SECUNDARIA: BACHILLER EN CIENCIAS ESPECIALIZACIÓN QUÍMICO BIOLÓGICAS; Colegio Nacional Experimental Femenino Espejo, 1999- 2005; Quito, 14 de julio de 2005.

EDUCACIÓN PRIMARIA: Escuela Fiscal de Niñas Ciudad de Cuenca. 1993-1999.

DISTINCIONES

. AYUDANTE DE CÁTEDRA DE PATOLOGÍA E HISTOLOGÍA. Laboratorios de Patología e Histología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador.

Jefes: (1) Dr. Clímaco Egas y Dr. Eduardo Vásconez (01 de febrero al 31 de diciembre del 2009) (2) Dr. Bolívar Ricaurte y Dra. Ana Cevallos (01 de abril al 31 de diciembre del 2010).

. VOCAL ESTUDIANTIL PRINCIPAL DEL CONSEJO DIRECTIVO. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. 2010-2011. . REPRESENTANTE ESTUDIANTIL PARA EL CONSEJO DE FACULTAD. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. 2007-2008. . MEJOR ESTUDIANTE DEL TERCER AÑO. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. 2007-2008. . MEJOR ESTUDIANTE DEL SEGUNDO AÑO. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. 2006-2007. . MEJOR ESTUDIANTE DEL PRIMER AÑO. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. 2005-2006.