UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE ANÁLISIS DE FUSIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN PARA LA DETECCIÓN DE Babesia EN GARRAPATAS UTILIZANDO POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDOS”. Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar el Título de Médico Veterinario Zootecnista KARLA ANDREA VASCO AGUAS TUTOR: Dr. Luis Vasco Campaña Quito, enero, 2013 ii RECONOCIMIENTOS Agradezco al Instituto de Microbiología de la Universidad San Francisco de Quito, por el apoyo logístico, formación y confianza brindados durante esta investigación; especialmente a Gabriel Trueba y a Sonia Zapata por su guía y motivación, y a Jorge Chiriboga y Carolina Proaño por sus valiosos consejos. Un reconocimiento para quienes facilitaron el trabajo de campo en diferentes zonas de nuestro país: Dr. Gildo Velasco, Ing. Xavier Freire, Dr. Ramiro González, Edison Defaz, Oscar Lamiña, Félix Lara, Xavier Naranjo y Miguel Jervis. Gratifico la ayuda de los doctores Richar Rodríguez y Luis Vasco por el interés, apoyo e importantes aportes académicos y logísticos brindados en este estudio. Agradezco también a mis padres y hermanas que con cariño y ejemplo contribuyen a mi crecimiento profesional y personal, impregnándome de la fuerza necesaria para alcanzar mis metas. Finalmente, agradezco a Andrés Valencia, por acompañarme en esta importante etapa, brindándome su apoyo, cariño y fortaleza en todo momento. iii iv v vi ÍNDICE GENERAL LISTADO DE TABLAS ............................................................................. viii LISTADO DE FIGURAS ............................................................................. ix LISTADO DE GRÁFICOS ......................................................................... xii LISTADO DE ANEXOS ............................................................................ xiii RESUMEN ............................................................................................... xiv ABSTRACT ............................................................................................... xv INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1 CAPÍTULO I ............................................................................................... 5 REVISIÓN DE LITERATURA..................................................................... 5 Sinonimias ........................................................................................... 5 Historia (Babesiosis bovina) ................................................................ 5 Etiología............................................................................................... 5 Transmisión ......................................................................................... 8 Ciclo biológico de Babesia................................................................... 8 Patogenia .......................................................................................... 11 Período de Incubación ....................................................................... 13 Signos Clínicos .................................................................................. 13 Lesiones post mortem ....................................................................... 14 Diagnóstico ........................................................................................ 14 Características Moleculares de Babesia ........................................... 22 Tratamiento ....................................................................................... 25 Prevención y Control ......................................................................... 26 Epidemiología .................................................................................... 26 CAPÍTULO II ............................................................................................ 28 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 28 MATERIALES: ................................................................................... 28 MÉTODOS ........................................................................................ 31 vii CAPÍTULO III ........................................................................................... 40 RESULTADOS ......................................................................................... 40 CAPÍTULO IV ........................................................................................... 49 DISCUSIÓN ............................................................................................. 49 CAPÍTULO V............................................................................................ 55 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................... 55 CONCLUSIONES .............................................................................. 55 RECOMENDACIONES ..................................................................... 56 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 57 BIBLIOGRAFIA .................................................................................. 57 NETGRAFÍA ...................................................................................... 66 ANEXOS .................................................................................................. 68 HOJA DE VIDA ........................................................................................ 82 viii LISTADO DE TABLAS 1. Tabla 1. Principales marcadores moleculares utilizados en la identificación de Babesia (Ríos et. al, 2011). ................................ 24 2. Tabla 2. Fármacos utilizados en el tratamiento de la babesiosis bovina. ........................................................................................... 25 3. Tabla 3. Primers utilizados en RT-PCR y PCR convencional para la detección de Babesia bovis y Babesia bigemina. ......................... 35 4. Tabla 4. Concentraciones de reactivos para PCR convencional ... 36 5. Tabla 5. Protocolo de Ciclado de la PCR para la detección de Babesia bovis y Babesia bigemina ................................................ 36 6. Tabla 6. Reactivos y concentraciones para el Master Mix para Q- PCR en el Light Cycler® 1,5 de ROCHE. ..................................... 37 7. Tabla 7. Protocolo de Ciclado de Q-PCR en el LightCycler® 1.5. 38 8. Tabla 8. Reactivos y concentraciones utilizados en el termociclador CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD). .. 39 9. Tabla 9. Protocolo de Ciclado de Q-PCR en el termociclador CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD). .. 39 10. Tabla 10. Listado de las especies de Rhipicephalus identificadas en los sitios de muestreo.................................................................... 41 11. Tabla 11. Detalle de los resultados obtenidos por PCR para la detección de Babesia bovis y Babesia bigemina. ......................... 45 12. Tabla 12. Resultados de los secuenciamientos analizados en el BLAST. .......................................................................................... 46 13. Tabla 13. Guía práctica para identificación de géneros de garrapatas de la familia Ixodidae. ................................................. 69 14. Tabla 14. Resultados de la Cuantificación de ADN. ...................... 76 ix LISTADO DE FIGURAS 1. Fig 1. Diagrama de un zoito de Babesia sp. mostrando el conoide, roptrias y microenemas (Cordero del Campillo M., 1999) ............... 6 2. Fig 2. Árbol genético de 45 especies de Babesia y Theileria (Criado-Fornelio et al., 2003). ......................................................... 7 3. Fig 3. Ciclo biológico de Babesia bovis (Mosqueda et. al, 2012). 10 4. Fig 4. Mecanismos de acción patógena de babesiosis bovina (Cordero del Campillo, 1999). ....................................................... 12 5. Fig 5. Especies del parásito en el huésped y tejidos. .................... 16 6. Fig 6. Ciclo de amplificación de la PCR (de Padro E., 2010). ...... 20 7. Fig 7. Esquema de amplificación de ADN por PCR (Grothusen H, 2008) ............................................................................................. 20 8. Fig 8. Visualización de un producto de PCR convencional (de Padro E., 2010). ............................................................................ 21 9. Fig 9. Mecanismo de detección y lectura de los resultados con PCR en tiempo real. ...................................................................... 22 10. Fig 10. Mapa cromosómico de Babesia bovis cepa Tejas T2Bo. .. 23 11. Fig 11. Productos de la PCR múltiple con los primers Bbigemina- 18meltF2-R2. en gel de Agarosa al 3% corrido por 30 minutos a 90 voltios. ........................................................................................... 42 12. Fig 12. Productos de la PCR con los primers Bbovis-18meltF2-R2 en gel de Agarosa al 3% corrido por 30 minutos a 90 voltios. ....... 42 13. Fig 13. Productos de la PCR múltiple con los primers Bbigemina- 18smeltF3-R3 y Bbovis-18meltF3-R3 en gel de Agarosa al 3% corrido 40 minutos a 90 voltios. ..................................................... 43 14. Fig 14. Mapa de los cantones muestreados (en gris) donde se indica la distribución de las especies de Babesia encontradas. .... 44 15. Fig 15. Árbol filogenético de las secuencias de K-117 y K-123 comparadas con las de Babesia bigemina obtenidas en el GenBank (Babesia bigemina isolate biLushi 18S ribosomal RNA gene, partial sequence