Quantitative Genexpressionsanalysen Humaner Dopaminerger Neurone
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Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie (Dr. biol. hum.) der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Quantitative Genexpressionsanalysen humaner dopaminerger Neurone nach Lasermikrodissektion aus post-mortem Mittelhirngewebe von Morbus Parkinson Patienten und Kontrollen eingereicht von Falk Schlaudraff aus Lüneburg Ulm, 2010 durchgeführt am Institut für Allgemeine Physiologie (Leitung Prof. Paul Dietl) Arbeitsgruppe Molekulare Neurophysiologie unter Leitung und Betreuung von Prof. Dr. Birgit Liss an der Universität Ulm Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Birgit Liss 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Dietmar Thal Tag der Promotion: 26.07.2010 Widmung für meine lieben Eltern und Jessica Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ________________________________________________ i Abkürzungsverzeichnis __________________________________________ vi 1. Einleitung ___________________________________________________ 1 1.1 Morbus Parkinson ______________________________________________________ 1 1.2 Physiologie und Pathophysiologie des Morbus Parkinson _______________________ 2 1.2.1 Der Neurotransmitter Dopamin ________________________________________ 2 1.2.2 Aufbau und Funktion des dopaminergen Systems __________________________ 2 1.2.2.1 Aufbau des humanen dopaminergen Mittelhirnsystems ________________________ 3 1.2.2.2 Neuroanatomie des murinen dopaminergen Mittelhirnsystems __________________ 4 1.2.2.3 Die Basalganglienschleife und Dopamin ___________________________________ 5 1.2.3 Differentielle Vulnerabilität dopaminerger Mittelhirnneurone ________________ 7 1.3 Ursachen und Pathomechanismen des PD ___________________________________ 8 1.3.1 Auswahl der Kandidatengene für die Genexpressionsstudien des PD ___________ 9 1.3.1.1 Monogenetische Formen des PD __________________________________________ 9 1.3.1.2 Dopamin-assoziierte Gene______________________________________________ 12 1.3.1.3 Mikro RNA und Genregulation __________________________________________ 16 1.3.1.4 Aktivitätskontrolle dopaminerger Mittehirnnurone ___________________________ 17 1.3.1.5 Markergene: PD und DA unabhängig, Vulnerabilität und neuronal ______________ 21 1.3.1.6 Kandidatengene aus Mausmodellen mit PD-assoziierter dysregulierter mRNA- Expression ________________________________________________________________ 21 1.4 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit _______________________________________ 24 2. Material und Methoden ______________________________________ 26 2.1 Material _____________________________________________________________ 26 2.1.1 Geräte und Hardware _______________________________________________ 26 2.1.2 Verbrauchsmaterial ________________________________________________ 27 2.1.3 Verwendete Chemikalien ____________________________________________ 27 2.1.4 Geninformationen __________________________________________________ 28 2.1.5 Oligonukleotide (Primer, Probes)______________________________________ 30 2.1.5.1 Humane TaqMan Assays und miScript-SYBRgreen Assay ____________________ 30 i Inhaltsverzeichnis 2.1.5.2 Murine TaqMan-, miScript- und SYBRgreen-Assays ________________________ 32 2.1.5.3 Murine Primer für die qualitative Multiplex-Nested PCR _____________________ 33 2.1.6 Lösungen und Masteransätze _________________________________________ 34 2.1.7 Humanes Hirngewebe ______________________________________________ 36 2.1.8 Murines Hirngewebe _______________________________________________ 39 2.2 Methoden ____________________________________________________________ 40 2.2.1 Generelles Schema zur real-time qPCR individueller Zellen nach UV-LMD ____ 40 2.2.2 Hirngewebepräparation _____________________________________________ 42 2.2.2.1 Präparation von nativem, murinem Hirngewebe _____________________________ 42 2.2.2.1a Cochlea-Präparation _________________________________________________ 42 2.2.2.2 Präparation von humanem Hirngewebe ___________________________________ 43 2.2.2.3 Anfertigung von Gefrierschnitten mittels eines Gefriermikrotoms ______________ 43 2.2.2.4 Fixieren und Färben von Gefrierschnitten __________________________________ 44 2.2.2.5 Kryoasservieren von Gefrierschnitten _____________________________________ 44 2.2.3 Kontaktfreie UV-Lasermikrodissektion (UV-LMD) _______________________ 45 2.2.4 Molekularbiologische Methoden zur real-time qPCR-basierter Genexpressionsanalyse __________________________________________________ 48 2.2.4.1 pH-Wertbestimmung von Hirngewebe ____________________________________ 48 2.2.4.2 Nukleinsäure-Isolation ________________________________________________ 49 2.2.4.2a Isolation totaler RNA _________________________________________________ 49 2.2.4.2b Isolation kleiner RNAs (miRNA) _______________________________________ 50 2.2.4.2c Nukleinsäureisolation aus PFA-fixiertem Gewebe __________________________ 50 2.2.4.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren _____________________________ 51 2.2.4.4 RNA-Qualitätsbestimmung: RIN-Analyse und Small RNA Analyse mittels Agilent- Technologie _______________________________________________________________ 52 2.2.4.5 Zelllyse von UV-LMD Proben und cDNA-Synthese aus mRNAs und miRNAs ____ 54 2.2.4.6 Präzipitation zur Aufreinigung von RNA und cDNA _________________________ 55 2.2.4.7 Polymerase-Kettenreaktion _____________________________________________ 55 2.2.4.7a qualitative Multiplex-Nested PCR _______________________________________ 56 2.2.4.7b Agarose-Gelelektrophorese ____________________________________________ 57 2.2.4.7c Quantitative real-time PCR ____________________________________________ 58 ii Inhaltsverzeichnis 2.2.4.7c-1 Sondenspezifische Detektion _________________________________________ 59 2.2.4.7c-2 Fluoreszenzdetektion mittels SYBRgreen real-time PCR___________________ 60 2.3 Datenverarbeitung, Datenanalyse und Statistik_______________________________ 63 2.3.1 Primerdesign mit Oligo 6 ____________________________________________ 63 2.3.2 Auswertung von real-time qPCR Daten _________________________________ 64 2.3.2.1 Verwendete Standards und Standardkurven ________________________________ 64 2.3.2.2 Assayperformance-Analysen ____________________________________________ 65 2.3.2.3 Berechnung der relativen Quantität aus real-time qPCR-Daten _________________ 66 2.3.2.4 Berechnung der Relation und fold difference aus real-time qPCR Daten __________ 67 2.3.3 Datenanalyse und Software für die Datenanalyse (Excel und R) _____________ 68 3. Ergebnisse__________________________________________________ 69 3.1 Charakterisierung und Qualitätskontrolle des humanen Hirngewebes _____________ 69 3.2 Optimierung der UV-LMD Methodik ______________________________________ 73 3.2.1 Vergleich verschiedener Ablationsmethoden und Objektträger ______________ 74 3.2.2 Erweiterung der UV-LMD-Methodik __________________________________ 76 3.2.2.1 Genexpression muriner Girk-Kanäle im Cerebellum _________________________ 76 3.2.2.2 UV-LMD muriner Darmkrypten für CGH-Analysen _________________________ 78 3.2.3 Etablierung der UV-LMD-Methodik für Einzelzellen aus PFA-fixiertem Gewebe __________________________________________________ 79 3.2.4 Etablierung paralleler mRNA- und miRNA-Expressionsanalyse _____________ 82 3.4 Real-time qPCR Assay-Etablierung für standardisierte Analysen humaner Einzelzellen _____________________________________________________ 84 3.4.1 Performance humaner real-time qPCR-Assays ___________________________ 84 3.4.2 Untersuchung des Einflusses von Fixier- und Färbeprozedur auf die RNA-Qualität von Hirngewebeschnitten ____________________________________ 87 3.4.3 Evaluation von Sensitivität und Spezifität der real-time qPCR-Assays ________ 88 3.5 Genexpressionsanalyse individueller humaner dopaminerger Mittelhirnneurone ____ 90 3.5.1 Evaluation der TH-Genexpression verschiedener Assayserien _______________ 90 3.5.2 Vergleichende Expressionsanalysen von Mittelhirngewebe versus UV-LMD- dissektierte NM-positive DA Mittelhirnneurone ______________________________ 94 3.5.3 Expressionsanalysen Dopamin-assoziierter Gene _________________________ 96 3.5.4 Expressionsanalysen von Ionenkanälen _________________________________ 99 iii Inhaltsverzeichnis 3.5.5 Genexpressionsanalysen von PARK-Genen und Genen, die in anderen Studien zur PD-Pathogenese identifiziert wurden ___________________________________ 102 3.5.6 Genexpressionsratios von Genen mit verwandter Funktion_________________ 104 3.5.7 Geschlechtsspezifische Genxpressionsunterschiede in DA Mittelhirnneuronen von PD-Patienten und Kontrollen _________________________ 106 4. Diskussion _________________________________________________ 107 4.1 Methodische Aspekte _________________________________________________ 108 4.1.1 Makroskopie des humanen Mittelhirngewebes __________________________ 108 4.1.2 Gewebezusammenstellung für die humanen Studien ______________________ 108 4.1.3 Qualitätsmerkmale des Ausgangsmaterials _____________________________ 109 4.1.3.1 Der RIN-Wert als RNA-Qualitätsmaßstab ________________________________ 109 4.1.3.2 pH-Wert, PMI, Anteil kleiner RNAs und RIN-Wert-Korrelationen _____________ 111 4.1.3.3 Ausschluss von Gewebematerial von den Genexpressionsanalysen _____________ 112 4.2 Optimierung der UV-LMD real-time qPCR Methodik für die Genexpressionsanalysen von UV-LMD-dissektierten Proben _________________________________________ 113 4.2.1 Optimierung, Erweiterung und Validierung der UV-LMD-Methode _________ 113 4.2.2.1 Erweiterte Anwendung der UV-LMD-Methode ____________________________