Université d'Ottawa University of Ottawa The Production of Phenolics-Degmding Enzymes in Submerged and Solid State Fermentation and the Decrease in Pheaolic Content of Cano1a Meal using the White-Rot Fungus Pleurotus ostreatus A Thesis Submitted to the School of Graduate Studies and Research in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Applied Science In the Department of Chernical Engineering University of Ottawa National Library Bibliothèque nationale du Canada Acquisitions and Acquisitions et Bibliographie Services services bibliographiques 395 Wellington Street 395. rue Wellington OnawaON KlAOFJQ ORawaON KlAW Canada Canada The author has granted a non- L'auteur a accordé une Licence non exclusive licence allowing the exclusive permettant à la National Libraxy of Canada to Bibliothèque nationale du Canada de reproduce, loan, distribute or sell reproduire, prêter, distribuer ou copies of this thesis in microform, vendre des copies de cette thèse sous paper or electronic formats. la forme de microfiche/film~de reproduction sur papier ou sur fonnaî électronique. The author retauis ownership of the L'auteur conserve la propriété du copyright in this thesis. Neither the droit d'auteur qui protège cette thèse. thesis nor substantial extracts f?om it Ni la thèse ni des extraits substantiels may be printed or otherwise de celle-ci ne doivent être imprimés reproduced without the author's ou autrement reproduits sans son permission. autorisation. Abstract Canola meal (CM) is a by-pduct of canola oil production. Because of the high nutritional composition CM bas, it is often used as a protein source for livestock feeding. However, its usage is Mted due to the presence of sow undesirable compounds in CM, such as glucosinolates, phytic acid and phenolic wmpounds (mainly siuapic acid esters- SAE). Phenolic compounds ducethe digestibility of proteins in CM, and they are also responsible for the datk color and bittemess of the meal. The objectives of this research project were: 1) to study the production of phenolics-degrading enzymes secreted by the white-rot huigus Pleurotus ostireutus in submerged and solid state fermentation processes; 2) to examine the degradation of phenolic compounds in CM during solid state process. The effects of some operating parameters on enzyme production were investigated during the submerged process. It was found that the growth of biomass and enzyme production depended on the initial glucose concentration. An optimum of 4% was found for the enzyme production. An increase in inoculum concentration helped the initial biomass growth. However, the maximum enzyme activity was not found in the cuhve with the largest amount of inoculum. In the study of the effect of oxygen concentration, it was found that inhibition of enzyme production occurred at high concentrations of oxygen. Among the five chemical inducers tested, 2,s-xylidine was found to cause the highest increase in enzyme production, around 1.8 folds. When the effect of CM was studied, an optimum of 3% of CM was found for the enzyme production during the submerged process. Enzyme prepared hm the submerged process was characterized using three substrates, sinapic acid (SA), sinapine (SIN) and sinapaldehyde (SALD). The results showed that the enzyme was inhibited by high concentrations of aii three substrates. The optimum pH values were 4.4, 5.0 and 4.7, using SA, SIN and SALD as the substrates, respectively. The optima temperatures for enzyme activity were in the range of 40°C to 60°C for ali three substrates. The production of eqeand degradation of phenolics during solid state process were studied. The effst of moisture content was important for enzyme production and the optimum was around 60%- However, the highest rate of SAE degradation was found in the culture with the highest moistute content tested, at 75%. The highest enzyme activity was in the culture with the lowest inoculum concentration tested. The results indicated that rapid growth of biomass in later stage of the process helped the production of enzyme. An increase in homogenization time resulted in increases in biomass and enzyme production. However, the effect was not obvious on SAE degradation. Larger particle size of the CM favored the production of enzyme, biomass and the degradation of SAE. Three surfactants, Triton X-100, Tween 80 and sodium oleate, were tested for their effects on the solid state process. Sodium oleate was found to cause the highest increase in enzyme production, at about 40%. Modeling of biomass and enzyme production, as well as SAE degradation during solid state process have been attempted. The modeling equations were based on a logistic kinetic equaîion for biomass production. These equations were not able to fit al1 experimental data weii. Better fitting was found when there was a short or no lag phase in biomass growth during the solid state process. Résumé Les tourteaux de canola (CM) sont des sous-produits du procéd6 de pressage des graines oltagineuses de canola. Étant domé leur contenu élevé en valeur nutritive, ils sont utilisés comme source de protéines dans l'alimentation animale. Cependant, leur usage est 1-td dû B la présence de composés indésirables tels des glucosinates, de i'acide phytique et des composés phholiques (principalement les estères de l'acide sinapique, SAE). La présence de composés phénoliques occasionne la digestion difncile des protéines présente dans les tourteaux et sont également responsables de la coioration foncée et du goût amère des tourteaux. Les objectifs de ce projet étaient: 1) d'étudier la production d'enzymes dégradantes des composés phénoliques par la moisissure Pleurotus ostreatur en milieu de culture submergée et en milieu de culture solide; 2) d'étudier la dégradation des composés phénoliques présents dans les tourteaux de canola en milieu de cuiture solide. Les effets de certains paramètres d'opération sur la production d'enzyme ont été étudiés lors du procédé en milieu de culture submergée. Il a été démontré que la croissance de biomasse ainsi que la production d'enzyme dépendent de la concentration initiale de glucose dans le milieu de culture. La production d'enzyme est optimum à une concentration de glucose de 4%. Une augmentation de la concentration initiale de biomasse aide à la croissance initiale mais l'activité enzymatique maximum n'a pas été observée en milieu contenant la plus grande quantité de biomasse. Lors de l'étude de l'effet de la concentration d'oxygène, il a été démontré que la production d'enzyme est inhibée à des concentrations d'oxygène élevées. Parmi les 5 inducteurs chimiques testés, 2,5-xylidine provoque la plus grande augmentation de production d'enzyme, ce par un facteur d'environ 1-8. Lorsque l'effet des tourteaux de canola a été étudié, un optimum de 3% de CM a été obtenu pour la production d'enzyme en culture submergée. La charactérisation d'enzyme produite a partir de cultures submergées était effectuée en utilisant trois substrats: l'acide sinapique (SA), le sinapine (SIN), et .-- Ill l'aldéhyde de l'acide sinapique (SALD). Les résultats démontrent que l'enyme est inhibée par des concentmiions tlevées & chacun de ces substrats, Les pH optimum sont respectivement de 4.4, 5.0 et 4.7 en utilisant SA, SIN, et SALD comme substrat- Les températures optimum pour l'activité eiiymstique varient entre 4û°C et 6û°C pour les trois substrats, La production d'enyme et la dégradation des composés phénoliques lors du procédé en milieu de culture solide ont été 6tudiées. L'effet du contenu en eau était important pour la production d'enzyme et roptimum a été déteminé wmme étant un contenu d'eau de 60%. Par contre, le taux de dégradation de SAE le plus élevé a étd observé dans les cultures contenant la plus grande quantité d'eau testée, soit 75%. L'activité enzymatique la plus étevée a été observée dans les cultures contenant la plus petite quantité de biomasse initiale. Les résultats indiquent que la croissance rapide de biomasse dans les stages avancés du procéâé aide it la production d'enzyme. Une augmentation du temps d'homogénisation résulte en une augmentation de biomasse et de production d'enzyme mais ces effets ne sont pas évidents sur la dégradation de SAE. Une grosseur de particules plus élevée des tourteaux de canola favorise la production d'enzyme, la croissance de biomasse et la dégradation de SAE. Trois sdactants, Triton X-100, Tween 80 et le sodium d'oléate ont été testés pour leurs effets sur le procédé en milieu de culture solide. Le sodium d'olkate cause la plus gande augmentation dans la production d'enyme, ce a 40%. La modélisation de la croissance de biomasse et de la production d'enzyme, ainsi que de la dégradation de SAE lors du procédé en milieu de culture solide ont été tenté. Les équations étaient basées sur l'équation logistique de la cinétique de la croissance de biomasse. Ces équations n'ont pas été efficaces à représenter toutes les données expérimentales. De meiliews résultats ont été obtenus lorsque la période latente de croissance était courte ou absente. Acknowledgements 1 would iike to express my gratitude to Dr. Dwnjak for his guidance and encouragement throughout this project. I would like to thank the Natural Science and Engineering Reseamh Council (NSERC) for its scholarship. Many th& are also extended to Mr. Jeff Woods, Mr. Hasan Atiyeh and Ms. My-Hanh Luu, for their help and encouragement. 1 am forever thanlcflll to my patents, my sister Jinghong and my fnend Yidong for their love, support and encouragement. Abbreviations ABTS - 2J'~aPnobi~3~thylbenthiau,line-6-sulfonicacid)