Tese, E Em Particular

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS

ARIANA ALVES RODRIGUES

DIVERSIDADE E PROSPECÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS ASSOCIADAS À CANA-DE- AÇÚCAR SOB MANEJO ORGÂNICO: METODOLOGIAS CLÁSSICAS E MOLECULARES A SERVIÇO DA AGROECOLOGIA

GOIÂNIA – GOIÁS 2018

ARIANA ALVES RODRIGUES

DIVERSIDADE E PROSPECÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS ASSOCIADAS À CANA-DE- AÇÚCAR SOB MANEJO ORGÂNICO: METODOLOGIAS CLÁSSICAS E MOLECULARES A SERVIÇO DA AGROECOLOGIA

Texto apresentado à Universidade Federal de Goiás, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Ciências Ambientais, para a obtenção do título de Doutor. Orientador: Prof. Dr. José Daniel Gonçalves Vieira.

GOIÂNIA – GOIÁS 2018.

S Sd Sd Sd Sd Sd Sd

Sd Sd Sd Sd

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Rui Francisco Rodrigues e Laide Candida Alves Rodrigues por me apoiarem e amarem incondicionalmente ao longo de toda a minha vida.

As minhas tias, Maria Martins Rodrigues e Janayna Aparecida Martins Rodrigues por sempre estarem presentes em minha vida.

As minhas avós, Isaltina Martins Rodrigues (In memoriam) e Delurdes Candida Vieira (In memoriam) que partiram no meio da caminhada, mas que em sua simplicidade torceram por mim.

A todos os brasileiros que permitiram que eu desfrutasse do privilégio de estudar em uma Universidade Federal, mesmo quando seu contexto social difícil não os permitiu frequentar uma universidade.

AGRADECIMENTOS

A todos que contribuíram diretamente e indiretamente para a realização desta tese, e em particular:

A Deus pela força espiritual e por manter minha sanidade mental para que eu conseguisse concluir este trabalho.

Aos meus pais, Rui Francisco Rodrigues e Laide Candida Alves Rodrigues por serem meu referencial e o meu apoio. Agradeço por terem auxiliado durante a jornada, sobretudo na parte experimental e financeira.

As minhas tias, Maria Martins Rodrigues e Janayna Aparecida Martins Rodrigues que tanto torceram por mim e me apoiaram.

Aos meus irmãos, Juliana da Silva Dias, Lucas Antônio Rodrigues e Marina Vieira Alves que foram meu suporte emocional. Obrigada por acreditarem em mim, mesmo quando eu não acreditava.

Ao professor Dr. José Daniel Gonçalves Vieira, por aceitar me orientar desde o mestrado. Obrigada por ter me ensinado lições valiosas sobre a vida e a pesquisa. Você é meu exemplo de humanidade e de que a pesquisa pode ser divertida. Obrigada por me ensinar a mais valiosa das lições: confiar em mim mesma e ser independente.

Ao professor Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho, por ter me auxiliado com a parte de não cultiváveis, abrindo seu laboratório para uma pessoa desconhecida e esclarecendo minhas dúvidas sempre que necessário. O senhor é um dos modelos de como a ciência deve ser feita.

Ao professor Dr. Sergio Tadeu Sibov, por ter me orientado no artigo da disciplina oficinas em análise ambiental e por ser sempre tão prestativo e por auxiliar em diversos pontos deste trabalho.

Ao técnico Me Paulo Roberto Faria por ter auxiliado com os experimentos de casa de vegetação e por sua postura alegre e acolhedora, nos auxiliando em tudo que foi possível.

A professora Drª. Daniela de Melo e Silva pelas contribuições na banca de qualificação, pela solicitude e por ser um exemplo de humildade e humanidade.

A Drª. Keili Maria Cardoso de Souza pela amizade e pelas contribuições ao longo de toda a tese.

Aos professores Dr. Paulo De Marco Júnior e Drª. Agustina Rosa Echeverría pelas contribuições inestimáveis a minha formação.

A professora Drª. Lara Stefânia Netto de Oliveira Leão Vasconcelos por toda sua gentileza desde a minha graduação.

Ao professor Dr. Fernando Dini Andreote e ao Dr. Pedro Avelino Maia de Andrade por terem me recebido em seu laboratório e me instigado ao trabalho com a diversidade de não cultiváveis.

A professora Drª. Maria Carolina Quecine Verdi, pela gentileza em ceder cepas de bactérias fixadoras de nitrogênio utilizadas como controle neste estudo.

Ao professor Dr. Paulo Marçal Fernandes por ceder as sementes orgânicas de milho.

Ao Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) por cederem a cepa de Fusarium moniliforme utilizada.

A Super Soldas por custear parte das despesas com o sequenciamento de nova geração.

A Goiasa-Goiatuba Álcool Ltda, a Jalles Machado, a Raízen e a escola de Agronomia (UFG) por permitirem e auxiliarem nas coletas.

A Sifaeg por abrir a negociação junto as usinas canavieiras viabilizando as coletas.

Ao Centro de Genômica Funcional ESALQ-USP e a Laboratório de Sequenciamento de DNA da Universidade Católica de Brasília pelo sequenciamento do material.

Ao Dr. Patrick Schloss, criador do Mothur, por ter respondido várias das minhas dúvidas sobre a utilização do programa.

A Drª. Aysha Jussara Ivonilde Carrin, uma grande amiga e colaboradora. Agradeço pelas inúmeros reagentes cedidos e pelas boas horas de conversa.

Ao Me. Bruno Francesco Rodrigues de Oliveira, o meu modelo de pesquisador dedicado e de amor à pesquisa. Um dos grandes achados desse doutorado que pretendo levar para a vida. Agradeço imensamente a amizade e por me ensinar tanto do ponto de vista científico. Agradeço em especial pelo auxílio na reta final.

Ao Me. Renan de Souza Soares, meu querido amigo. Obrigada por toda a ajuda na construção deste trabalho. Obrigada por todos os bons momentos passados dentro e fora do laboratório. Com toda certeza você fez com que esses quatro anos fossem mais suaves.

Ao Me. Marcus Vinicius Forzani Araújo que caminhou junto comigo durante o doutorado. Obrigado por me arrancar sempre boas risadas e por toda a contribuição na parte experimental. Você foi fundamental na construção deste trabalho.

A Igor Daniel Alves Ribeiro, uma das pessoas mais dedicadas e “incríveis” que tive a oportunidade de conhecer. Agradeço a companhia e suas contribuições para a realização deste trabalho.

Ao Me. Luann Guilherme Vieria dos Reis, pessoa mais “deboísta” de todas. Obrigada pela companhia ao longo da caminhada e por todo o apoio.

A Me. Raylanne Pereira Gomes por todos os conselhos e por ter me estimulado a chegar até aqui.

A Camila Trindade Catulio por ter tornado a convivência no laboratório tão divertida. Obrigada por ser a grande relações públicas do LAMAB.

A Me. Lia Costa Pinto Wentzel, Me. Petain José Ferreira Neto, Me. Thaís Maitan Vieira e Me. Anna Paula Santos Almeida Rotta, pela companhia e gentileza ao longo de toda a minha jornada.

As amigas, Alessandra Clementino dos Santos, Tatiana Telles e Denise Rodrigues da Cunha que mesmo a distância davam seu apoio e foram tantas vezes meu “muro das lamentações”.

Aos responsáveis técnicos pelo Laboratório Multiusuários do curso de Biotecnologia/UFG, os mestres Elaine Jacob da Silva Carmo e Alex Wilkerson Ferreira Borges por me auxiliarem sempre que necessário.

Aos colegas do programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais.

Aos professores da banca examinadora (qualificação e defesa) pelas contribuições.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais (CIAMB) pelo apoio financeiro.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudos.

RESUMO

A atual forma de cultivo da cana-de-açúcar leva a redução da biodiversidade e gera uma série de impactos ambientais. Pensando na questão ambiental, várias estratégias têm sido desenvolvidas para tornar esse cultivo menos impactante ao meio ambiente, e uma delas refere-se ao cultivo orgânico. Os micro-organismos associados ao manejo orgânico são essenciais na transformação e liberação de nutrientes aos vegetais. Dentre os micro-organismos associados ao cultivo orgânico, as rizobactérias promotoras do crescimento vegetal (RPCV) são capazes de promover o crescimento vegetal em processos como a biofertilização, bioestimulação e biocontrole. O presente estudo teve por objetivo avaliar a diversidade e o potencial metabólico de comunidades rizosféricas associadas à cana-de-açúcar sob manejo orgânico, prospectar RPCV associadas a canaviais e avaliar in vitro seu potencial em promover o crescimento vegetal. Amostras de rizosfera de cana-de-açúcar, da variedade CTC4, cultivada sob regime orgânico e tradicional, tiveram seu DNA extraído e sequenciado. As sequências obtidas foram tratadas com o software mothur e a diversidade alfa foi acessada com as métricas Shannon e Chao1. A diversidade beta foi verificada com a métrica Bray-Curtis e a análise de coordenadas principais (PCoA). O potencial funcional das comunidades foi predito com o programa PICRUSt. Para a prospecção microbiana, foram isolados micro-organismos rizosféricos das variedades IAC 911099 e CTC4, cultivadas sob manejo orgânico. As rizobactérias diazotroficas foram isoladas em meio NFB e Burk, já as actinobactérias em meio International Streptomyces Project (ISP-2) e ágar amido caseína (AMC). Os micro-organismos isolados foram triados in vitro quanto a capacidade de produção de ácido indol ácetico (AIA), solubilização de fosfato, fixação de nitrogênio, produção de amônia, cianeto de hidrogênio (HCN), celulases, quitinase e antagonismo frente ao Fusarium moniliforme. A diversidade alfa não alterou em função do manejo (p>0.05), entretanto, puderam ser observadas diferenças na diversidade beta de comunidades associadas aos manejos convencional e orgânico de uma mesma usina. Em relação à análise funcional, nas duas usinas amostradas, os genes relacionados a fixação de nitrogênio foram mais expressos em fazendas sob cultivo orgânico. Dos micro-organismos prospectados, 81 eram diazotróficas de crescimento rápido e 21 actinobactérias. Esses micro-organismos estavam distribuidos em 14 gêneros. Destes, 45.6% das diazotróficas de crescimento rápido e 29% das actinobactérias foram capazes de fixar nitrogênio. Ademais, foram encontradas bactérias, oriundas das duas variedades e das duas usinas avaliadas, capazes de produzir AIA, solubilizar fosfato, produzir amônia, celulases e quitinases.

Membros dos Burkholderia e Streptomyces foram capazes de inibir o crescimento do fungo fitopatogênico F. moniliforme. Os micro-organismos prospectados apresentam potencial como inoculantes nos processos de biofertilização, bioestimulação e biocontrole e sugere-se o uso de bactérias do gênero Burkholderia e do gênero Streptomyces, por suas habilidades em promover o biocontrole, em conjunto com bacterias do gênero Sphingobium e Rhizobium que apresentam habilidades em promover o crescimento vegetal via fixação de nitrogênio, solubilização de fosfato e produção de AIA.

PALAVRAS-CHAVE: Rizobactérias; tradicional; orgânico; diversidade; promoção do crescimento vegetal.

ABSTRACT

The current way of sugarcane cultivation leads to the reduction of biodiversity and generates a series of environmental impacts. Thinking about the environmental issue, several strategies have been developed to make this crop less harmfull to the environment and one of these strategies refers to organic farming. The microorganisms associated with organic management are essential in the transformation and release of nutrients to plants. Among the microorganisms associated with organic cultivation, plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) can promote plant growth in processes such as biofertilization, biostimulation and biocontrol. The present study aimed to evaluate the diversity and metabolic potential of rhizospheric communities associated with sugarcane under organic management, prospect PGPR associated with sugarcane and evaluate in vitro their potential to promote plant growth. Samples of sugarcane rhizosphere, variety CTC4, cultivated under organic and traditional management, had their DNA extracted and sequenced. The sequences obtained were analyzed with the mothur software and the alpha diversity was accessed with the Shannon and Chao1 metrics. The beta diversity was verified with the Bray- Curtis index and with principal coordinates analysis (PCoA). The functional potential of communities was predicted with the PICRUSt software. For microbial prospecting, rhizospheric microorganisms of the varieties IAC 911099 and CTC4, cultivated under organic management, were isolated. The diazotrophic rhizobacteria were isolated in NFB and Burk medium, and the actinobacteria in ISP and SCA medium. The isolated microorganisms were screened in vitro for plant growth promotion traids such as indole-acetic acid (IAA), phosphate solubilization, nitrogen fixation, ammonia production, hydrogen cyanide (HCN) production, cellulases production, chitinase production and for Fusarium moniliforme antagonism. The alpha diversity did not change due to management (p> 0.05), however, differences in the beta diversity were observed between organic and conventional samples. In relation to functional analysis, in the two places analyzed, the genes related to nitrogen fixation were more expressed in farms under organic cultivation. Of the microorganisms prospected, 81 were fast-growing diazotrophic and 21 actinobacteria. These microorganisms were distributed in 14 genera. Of these, 45.6% of the fast- growing diazotrophic and 29% of the actinobacteria were able to fix nitrogen. In addition, were found bacteria capable of producing IAA, solubilizing phosphate, producing ammonia, cellulases and chitinases. Members of Burkholderia and Streptomyces were able to inhibit the growth of phytopathogenic fungus F. moniliforme. The prospected microorganisms present potential as

inoculants in the biofertilization, biostimulation and biocontrol processes and it is suggested the use of bacteria of the genus Burkholderia and the genus Streptomyces for their abilities to promote biocontrol, together with bacteria of the genus Sphingobium and Rhizobium that have abilities to promote plant growth through nitrogen fixation, phosphate solubilization and IAA production.

KEYWORDS: Rhizobacteria; traditional management; organic management; diversity; plant growth promotion.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Subdivisões da rizosfera: endorizosfera, rizoplano e ectorizosfera 33 Figura 2. Elementos condicionadores da rizosfera em sistemas agrícolas 35 CAPÍTULO 1 Figura 1. Afiliação taxonômica em nível de filo e sua abundância percentual de acordo com os grupos tradicional e orgânico de cada usina de amostras de 84 rizosfera de cana-de-açúcar. Onde: OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B. Figura 2. Proporção da dissimilaridade (Bray-Curtis) entre as comunidades microbianas de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional, visualizada com a análise de coordenadas principais (PCoA). Onde, OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B. 86 Figura 3. Análise canônica das coordenadas principais (CAP) do efeito dos fatores edáficos sobre as comunidades bactérias de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional. Onde, OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B. 91 Figura 4. Metagenomas preditos pelo software PICRUSt diferencialmente expressas ao nível 2 do banco de dados KEGG. A figura apresenta as funções diferencialmente expressas, quando comparadas as duas usinas pelo teste t de Welch's com correção do valor de p de Benjamini–Hochber (p<0.05). Onde: A 92 representa a Usina A e B representa a Usina B. Figura 5. Genes relacionados a promoção do crescimento vegetal diferencialmente expressos (teste t de Welch's, com correção do valor de p de Benjamini–Hochber (p<0.05) na rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo tradicional e orgânico. (A) Usina A. (B) Usina B. 93 Figura suplementar 1. Afiliação taxonômica em nível de filo e sua abundância percentual nas amostras de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e 119 tradicional. Figura suplementar 2. Curvas de rarefação de OTUs a 97% oriundas de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional. 120 CAPÍTULO 3 Figura 1. Árvore filogenética baseada nas sequências 16 rRNA de actinobactérias oriundas da rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico. Empregou-se o método de Neighbor-Joining com 1000 replicas. A barrra indica 0.01 substituições por posição de nucleotídeos. Somente valores de bootstrap acima de 50% são mostrados. 164 APÊNDICE I Figure 1. Results of the plant growth promotion test in Zea mays L. A - KRB 1.2; B - negative control; C - KRC 2.2; D - KRZ5. 180

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1 Tabela 1. Geolocalização e características de manejo das fazendas amostradas 79 Tabela 2. Estimativa da riqueza (Chao1) e diversidade (Shannon) a nível de OTUs entre amostras de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo tradicional e orgânico 85 oriundas de duas usinas¹. Tabela 3. Analise da abundância diferencial de filos e famílias na Usina A. O valor de p foi ajustado com a correção de Benjamini- Hochberg (FDR). 89 Tabela 4. Analise da abundância diferencial de filos e famílias na Usina B. O valor de p foi ajustado com a correção de Benjamini-Hochberg (FDR). 90 Tabela suplementar 1. Análise físico-química de rizosfera de cana-de-açúcar cultivada sob manejo tradicional e orgânico*. 109 Tabela suplementar 2. Informação das sequências e da cobertura do sequenciamento de amostras oriundas de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional. 111 Tabela suplementar 3. Abundâncias relativas dos filos em rizosferas sob manejo tradicional e orgânico (Planilha do excel adicionada ao MS Word) 112 Tabela suplementar 4. Abundâncias relativas de famílias em rizosferas sob manejo tradicional e orgânico (Planilha do excel adicionada ao MS Word) 112 Tabela suplementar 5. Comparação da beta-diversidade entre os grupos por análise permutacional das variâncias (PERMANOVA) utilizando o índice de Bray- Curtis. 113 Tabela suplementar 6. Analise da abundância diferencial de OTUs influenciada pelo manejo por usina (OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B). (Planilha do excel adicionada ao MS Word) 113 Tabela suplementar 7. Correlação entre as OTUs e os fatores edáficos. Foram consideradas somente as correlações medianas e fortes (R >0.5 ou < - 0.5). (Planilha do excel adicionada ao MS Word) 113 Tabela suplementar 8. Lista dos genes codificadores de enzimas ligados aos fatores de promoção do crescimento vegetal selecionados e abundância desses genes em amostras de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo tradicional e orgânico. (Planilha do excel adicionada ao MS Word) 114 CAPÍTULO 2 Tabela 1. Identificação das rizobactérias isoladas baseada na comparação com sequências da região 16S rRNA depositadas no banco de dados do GenBank 132 Tabela 2. Valores da produção in vitro de fatores de promoção do crescimento vegetal por bactérias diazotróficas isoladas de cana-de-açúcar sob manejo orgânico 133 Capítulo 3 Tabela 1. Valores da produção in vitro de fatores de promoção do crescimento vegetal diretos por actinobactérias isoladas de cana-de-açúcar sob manejo 159 orgânico. Tabela 2. Valores da produção in vitro de fatores de promoção do crescimento vegetal indiretos por actinobactérias isoladas de cana-de-açúcar sob manejo 162 orgânico

Tabela 3. Identificação de actinobactérias isoladas de rizosfera de cana-de-açúcar sob regime orgânico. 164 APÊNDICE I Table 1. Number of bacteria obtained by isolation from leaves, stem, roots and rhizosphere of the RB 867515 sugarcane variety and production of growth- promoting factors 177 Table 2. Number of IAA-producing isolates associated with sugarcane after 24, 48 and 72 h of growth on 10 % TSB media, in the presence of tryptophan 178 Table 3. Number of phosphate solubilizers according to their degree of solubilization and origin 178 Table 4. Summary of plant growth promotion factors in vitro of the bacterial isolates selected for growth promotion tests in maize 179 Table 5. Identification of the 7 bacterial isolates from sugarcane by comparing the partial sequence of the 16S rRNA coding region to sequences available in the GenBank database 179 Table 6. Growth promotion of Zea mays L. by bacterial isolates associated with sugarcane 180

LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES

% porcento ACC 1-aminociclopropano-1-carboxilato AIA Ácido indol ácetico

AlPO4 Fosfato de alumínio AMC Ágar amido caseína AN Ágar nutriente Anf Nitrogenase ferro ANOVA Analise de variância B Boro

C2H2 Acetileno

C2H4 Etileno Ca Cálcio CA Convencional usina A

Ca3(PO4)2 Tricálcio fosfato CAP Análise canônica das coordenadas principais CB Convencional usina B

CH4 Metano cm Centímetros

CO2 Dióxido de carbono CONAB Companhia Nacional de Abastecimento CTC Capacidade de troca de cátions efetiva Cu Cobre DGGE Gel de gradiente desnaturante EPS Exopolissacarídeos extracelulares FDR False discovery rate

FePO4 Fosfato ferroso FeS Centros de ferro-enxofre - H2PO4 Fosfato monobásico HCN Cianeto de hidrogênio 2- HPO4 Fosfato dibásico IBD Instituto Biodinâmico de Certificações ISP International Streptomyces Project K Potássio KEGG Enciclopédia Kyoto de genes e genomas KO Ortólogos KEGG LB Luria-Bertani Mg Magnésio

min Minutos ml Mililitros mm Milímetros Mo Molibdênio MO Matéria orgânica MoFe Centro protéico de ferro-molibdénio N Nitrogênio N2 Gás nitrogênio

N2O Óxido nitroso

NaN3 Azida de sódio NBRIP National Botanical Research Institute's phosphate growth medium

NH3 Amônia Nif Nitrogenase ferro-molibdénio NSTI Nearest Sequenced Taxon Index OA Orgânica usina A OB Orgânica usina B ºC Graus Celsius UTO Unidades taxonômicas operacionais P Fósforo PCoA Análise de coordenadas principais PCR Polimerase chain reaction PERMANOVA Análise permutacional das variâncias PERMDISP Análise permutacional das dispersões multivariadas Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of PICRUSt Unobserved States 2- PO4 Aníon fosfato PVK Meio Pikovskaya qPCR Reação em cadeia polimerase quantitativa RBPV Rizobactérias promotoras do crescimento vegetal RPCVe Rizobactérias promotoras do crescimento vegetal extracelulares RPCVi Rizobactérias promotoras do crescimento vegetal intracelulares S Enxofre s Segundos SB Soma das bases SIFAEG Sindicato da Indústria de Fabricação de Etanol do Estado de Goiás T-RFLP Polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição TS Subclassificação do solo TSA Ágar triptona de soja UFC Unidades formadoras de colônias v/v Volume por volume

Vnf Nitrogenase ferro-vanádio Zn Zinco μg Microgramas μl Microlitros

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 23 2 OBJETIVOS ...... 26

2.1 OBJETIVO GERAL ...... 26 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ...... 26 3 REFERENCIAL TEÓRICO ...... 27

3.1 PANORAMA DA CANA-DE-AÇÚCAR NO BRASIL ...... 27 3.2 FERTILIZAÇÃO E MANEJO ...... 29 3.3 MICRO-ORGANISMOS DE INTERESSE AGRICOLA ...... 32 3.4 A RIZOSFERA ...... 32 3.5 ESTRUTURA E DIVERSIDADE MICROBIANA DA RIZOSFERA ...... 34 3.6 RIZOBACTÉRIAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO VEGETAL (RPCV) ...... 37 3.6.1 Biofertilização...... 38 3.6.1.1 Fixação biológica de nitrogênio ...... 38 3.6.1.2 Solubilização de fosfatos ...... 40 3.6.1.3 Sideróforos ...... 40 3.6.1.4 Exopolissacarídeos ...... 41 3.6.2 Fitoestimulação ...... 41 3.6.2.1 Auxinas ...... 42 3.6.2.2 Inibidores do etileno ...... 42 3.6.3 Biocontrole ...... 43 3.7 PROSPECÇÃO DE RPCV CULTIVÁVEIS ...... 44 4 ESTRUTURA DA TESE ...... 49 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 50 CAPÍTULO 1: MUDANÇAS NA ESTRUTURA E FUNÇÃO DA COMUNIDADE MICROBIANA DA RIZOSFERA DE CANA-DE-AÇÚCAR EM RESPOSTA AO MANEJO ORGÂNICO...... 74 INTRODUÇÃO ...... 76 MATERIAIS E METODOS ...... 78 RESULTADOS ...... 83 DISCUSSÃO ...... 93 AGRADECIMENTOS ...... 98 REFERÊNCIAS ...... 98 CAPÍTULO 2: ISOLAMENTO E PROSPECÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS ASSOCIADAS A CANA-DE-AÇÚCAR SOB MANEJO ORGÂNICO...... 122 RESUMO ...... 123 INTRODUÇÃO ...... 123 MATERIAL E MÉTODOS ...... 125 RESULTADOS ...... 130 DISCUSSÃO ...... 135 AGRADECIMENTOS ...... 140 REFERÊNCIAS ...... 140 CAPÍTULO 3: ISOLAMENTO E SCREENING DE ACTINOBACTÉRIAS ORIUNDAS DE RIZOSFERA DE CANA-DE-AÇÚCAR ORGÂNICA PORTADORAS DE MÚLTIPLOS FATORES DE PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETAL ...... 150 RESUMO ...... 151

INTRODUÇÃO ...... 152 MATERIAL E MÉTODOS ...... 153 RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 158 AGRADECIMENTOS ...... 166 REFERÊNCIAS ...... 166 APÊNDICE I: ISOLATION AND SELECTION OF PLANT GROWTH-PROMOTING BACTERIA ASSOCIATED WITH SUGARCANE...... 173 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 184

1 INTRODUÇÃO

A cana-de-açúcar é uma das culturas mais importantes para o agronegócio brasileiro. A previsão é que somente na safra 2017/2018 sejam produzidas 635,6 milhões de toneladas, sendo o estado de Goiás o segundo maior produtor com 10% da produção nacional (CONAB, 2017). Essa cultura é uma das fontes mais rentáveis para a produção de etanol e açúcar, entretanto, a forma tradicional de manejo desse cultivo leva a emissão de gases do efeito estufa, degradação do solo, contaminação das águas, redução da biodiversidade e avanço da fronteira agrícola (SILVA; MIZIARA, 2011; MARQUES et al., 2012). A preocupação com a sustentabilidade motivou o interesse em formas alternativas de agricultura que sejam menos impactantes ao meio ambiente. Entre as possíveis alternativas está a agricultura orgânica (CROWDER; REGANOLD, 2015). A agricultura orgânica pressupõe a não utilização de insumos químicos inorgânicos, tais como adubos, pesticidas, sendo esses substituídos por insumos orgânicos naturais e por pautas que preservem a biodiversidade (KAUR; REDDY, 2013; FOTEINIS; CHATZISYMEON, 2016). Tanto a agricultura orgânica como a tradicional é dependente das inúmeras espécies de fungos e bactérias que coexistem com os vegetais, seja vivendo no interior dos tecidos vegetais (endofíticos) ou vivendo na região do solo aderida as raízes (rizosféricos) (PARIONA-LLANOS et al., 2010; BHARDWAJ et al., 2014; VEJAN et al., 2016). Os micro-organismos rizosféricos reagem aos exsudatos liberados pelas raízes e em contrapartida, interagem com o vegetal de forma deletéria, neutra ou benéfica. Essas interações influenciam no crescimento e desenvolvimento vegetal, bem como na dinâmica da disponibilidade dos nutrientes e na defesa contra agentes bióticos e abióticos externos (MORGAN et al., 2005; MUNEES; KHAN, 2009). Há grande interesse nas rizobactérias com efeitos positivos para o vegetal, sendo denominadas rizobactérias promotoras do crescimento vegetal (RPCV) As RPCV são capazes de promover o crescimento vegetal por um ou mais mecanismos e são classificadas, quanto a sua atuação, em biofertilizantes, fitoestimuladoras e biopesticidas. Os biofertilizantes são aqueles micro-organismos capazes de aumentar o aporte de nutriente para os vegetais, disponibilizando nutrientes importantes como o fosfato, o nitrogênio e o ferro. Podem atuar como fitoestimuladores, produzindo compostos orgânicos que regulam o crescimento dos tecidos vegetais, dentre os quais se destacam: o ácido indol-ácetico (AIA), as citocicinas, as giberilinas e os inibidores da produção de etileno (NIHORIMBERE et al., 2011; TAHA et al., 2016). As bactérias que atuam no biocontrole produzem metabolitos com atividade antagonista a patógenos tais como antibióticos, enzimas e compostos voláteis (GLICK, 2012).

Devido à grande importância da cana-de-açúcar no Brasil e no mundo, diversos estudos foram conduzidos a fim de isolar e prospectar RPCV associadas à cana-de-açúcar sob manejo tradicional (HASSAN et al., 2010; CASTRO-GONZÁLEZ et al., 2011; LIN et al., 2012; LIRA-CADETE et al., 2012; PAUNGFOO-LONHIENNE et al., 2014; TAM; DIEP, 2015; SOLANKI et al., 2017). O esforço de prospecção está especialmente vinculado as bactérias capazes de fixar nitrogênio (diazotróficas), uma vez que, os adubos nitrogenados sintéticos têm alto custo e causam impacto ambiental em diversas esferas (KARAGÖZ et al., 2012). Além disso, estima-se que até 60% do nitrogênio (N) acumulado pela cana-de-açúcar no Brasil advenha da fixação de nitrogênio (LIMA et al., 2011). Numerosos avanços foram obtidos quanto à inoculação de bactérias diazotróficas em consórcio em cana-de-açúcar sob manejo tradicional. Os organismos Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae, H. rubrisubalbicans, Azospirillum amazonense e Burkholderia tropica são reconhecidos por sua habilidade em promover, em conjunto, o crescimento de diversas variedades de cana-de-açúcar (OLIVEIRA et al., 2002; MORAIS et al., 2011; SILVA et al., 2012). Já a prospecção de RPCV em associação à cana-de-açúcar sob manejo orgânico ainda é pouco explorado (OLIVEIRA, 2009) e constitui-se como um vasto campo para pesquisas. Estudos dessa categoria são extremamente necessários, uma vez que a agricultura orgânica é extremamente dependente da microbiota natural do solo para a liberação de nutrientes ao vegetal. Apesar de todos os esforços de isolamento e caracterização de RPCV, estima-se que somente 1% de toda a diversidade possa ser cultivada em meios de cultura tradicionais, limitando os métodos tradicionais de bioprospecção. Além disso, as técnicas tradicionais de cultivo limitam o entendimento da relação dos micro-organismos com os fatores bióticos e abióticos do ambiente em que habitam (TORSVIK; OVEREAS, 2012). Nesse sentido, as ferramentas moleculares independentes de cultivo baseadas em PCR, tais como a eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE), o polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (T-RFLP), reação em cadeia polimerase quantitativa (qPCR) e o sequenciamento em larga escala da região do 16S rRNA, permitiram diversos avanços no entendimento de como a biodiversidade se relaciona com os fatores ambientais (FOTI et al., 2007; GAO; TAO, 2012; ZHOU AND WU, 2012). Em especial, o sequenciamento em larga escala da região 16S rRNA, permite identificar membros de comunidades microbianas utilizando as regiões hipervariáveis do gene ribossomal 16S. Constitui-se como uma ferramenta robusta, permitindo a detecção de organismos que estão pouco abundantes em comunidades complexas (CAPORASO et al., 2012; TIKHONOV et al., 2015). O emprego dessa técnica permitiu uma melhor compreensão da composição da diversidade microbiana 24

em solos cultivados com cana-de-açúcar, bem como sua relação com os fatores físico-químicos do solo, formas de manejo e aspectos biogeográficos (DA COSTA et al., 2014; DE SOUZA et al., 2016; DURRER et al., 2016; GUMIERE et al., 2016). A associação entre o manejo orgânico e a biodiversidade, bem como sua diferenciação do cultivo tradicional, dos micro-organismos rizosféricos de cana-de-açúcar ainda não foi documentado. Para outras culturas, estudos com técnicas moleculares, aliadas ao estudo da biomassa microbiana, permitiram inferir que os sistemas orgânicos são capazes de melhorar a saúde e a qualidade do solo, ao passo que aumentam a riqueza de espécies microbianas (ARAÚJO et al., 2008; LUPATINI et al., 2017). Mais recentemente, ferramentas como o Tax4fun e o PICRUSt permitiram predizer algumas capacidades funcionais das comunidades a partir de marcadores moleculares como o 16S rRNA. De forma mais barata e acessível, essas ferramentas permitiram estudar a capacidade metabólica de diversas comunidades avançando assim o conhecimento não só da estrutura taxonômica de uma comunidade, mas de como os meios bióticos e abióticos influenciam na diversidade metabólica das comunidades (LANGILLE et al., 2013; AßHAUER et al., 2015). Embora os métodos moleculares independentes de cultivos, baseado em genes marcadores, sejam excelentes para fornecer um panorama da diversidade bacteriana, eles não são capazes de fornecer informações que permitam que esses micro-organismos sejam isolados e testados como candidatos a futuros inoculantes (BALDANI et al., 2014). Dentro deste aspecto, o presente estudo é inédito, pois visa o isolamento e prospecção de micro-organismos rizosféricos associados à cana-de- açúcar sob manejo orgânico e em paralelo, estudar como o manejo influencia a nível taxonômico e metabólico as comunidades microbianas. Admitem-se as hipóteses: a) A composição microbiana da rizosfera irá variar de acordo com o manejo. Dessa forma, alguns micro-organismos ou determinados potenciais metabólicos estarão mais abundantes/presentes em um determinado sistema de manejo, enquanto no outro estarão menos frequentes/ausentes. b) A prospecção de RPCV, com múltiplos fatores de promoção do crescimento vegetal, associados aos canaviais goianos sob manejo orgânico permite a seleção de micro- organismos com potencial para aplicação nas práticas agrícolas, de forma a melhorar a saúde do solo e a produtividade.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a diversidade e potencial metabólico de comunidades rizosféricas associadas a cana-de- açúcar sob manejo orgânico, prospectar RPCV associadas a canaviais e avaliar in vitro seu potencial em promover o crescimento vegetal.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Distinguir as diferenças taxonômicas entre comunidades rizosféricas oriundas de cana-de- açúcar sob manejo tradicional e orgânico por meio do sequenciamento em larga escala da região V3-V4 do gene 16S rRNA. • Identificar as diferenças funcionais, de interesse agrícola, entre comunidades rizosféricas oriundas de cana-de-açúcar sob manejo tradicional e orgânico por meio das ferramentas PICRUSt e STAMP. • Isolar rizobactérias diazotróficas de crescimento rápido e actinobactérias rizoféricas associadas a cana-de-açúcar sob manejo orgânico. • Avaliar as potencialidades dos micro-organismos cultiváveis como promotores de crescimento vegetal, através da avaliação in vitro da produção de AIA, fixação de nitrogênio, solubilização de fosfato, produção de cianeto de hidrogênio (HCN), amônia, celulases, quitinases e antagonismo frente à Fusarium moniliforme. • Identificar os isolados que apresentarem múltiplas características de promoção do crescimento vegetal in vitro.

3 REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 PANORAMA DA CANA-DE-AÇÚCAR NO BRASIL

A cana-de-açúcar é uma gramínea semi-perene, pertencente à família Poaceae e gênero Saccharum, caracterizada pela boa adaptação aos climas tropicais e alto teor de sacarose (VELÁZQUEZ et al., 2008; KRUASUWAN; THAMCHAIPENET, 2016). O gênero Saccharum é composto por seis espécies, S. spontaneum Linnaeus, S. robustum Brandes e Jeswit ex Grassl., S. officinarum Linnaeus, S. barberi Jeswit, S. sinensis Roxb. e S. edule Hassk, sendo a espécie S. officinarum L. a mais difundida comercialmente (LOPES, 2016). Originária da Nova Guiné, a cana-de-açúcar foi trazida para o Brasil em 1532 por Martim Afonso de Sousa, tendo importância histórica e econômica durante todo o desenvolvimento do país (BRASIL, 2007). Incialmente instalada no nordeste do Brasil, essa cultura ficou concentrada até a década de 80, nas regiões nordeste e sudeste. Os incentivos governamentais para ocupação do centro- oeste brasileiro e a criação do Programa Nacional do Álcool (Pró-Álcool) em 1975, foram os grandes instigadores para a expansão da cana-de-açúcar para a região Centro-Oeste, além de fortalecer o cultivo da cana-de-açúcar no Sudeste, especialmente no estado de São Paulo (MEURER et al., 2015; PEREIRA et al., 2016). Concomitante ao amplo investimento no setor, os avanços das técnicas de melhoramento vegetal permitiram que número de variedades plantadas subisse de seis, na década de 1970, para as mais de 500 variedades hoje disponíveis (NÓBREGA; DORNELAS, 2006). Os programas de melhoramento genético desenvolveram variedades altamente produtivas, capazes de se adaptar a vários tipos de solo e climas, resistentes a pragas e doenças, tolerantes ao estresse hídrico e mais adaptadas aos diferentes tipos de manejo, bem como a colheita mecanizada. O desenvolvimento dessas variedades permitiu que a cana-de-açúcar se expandisse para as mais diversas regiões brasileiras. (DE MORAIS et al., 2015). O Brasil é atualmente o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, seguido por países como Índia, China, Paquistão, México e Austrália. Estima-se que durante a safra 2017/2018 foram plantados 87.380,00 quilômetros quadrados e serão produzidos 635,6 milhões de toneladas. A região centro-sul é responsável pela maior parte da produção brasileira, representando 87,9% da produção nacional. O estado de São Paulo detém 52% da produção nacional, seguido pelo estado de Goiás com 10% e por Minas Gerais com 9% (BRASIL, 2007; CONAB, 2015; CONAB, 2017).

Goiás ocupa cenário de destaque na produção nacional de cana-de-açúcar, com 36 usinas em atividade. A cultura de cana-de-açúcar está presente em 193 municípios goianos, ocupando um total de 9080 quilometros quadrados. O relevo e a topografia do estado auxiliam na implantação da mecanização e consequentemente na redução do custo da mão de obra. Além disso, o estado ainda apresenta fotoperíodo adequado ao cultivo e índices pluviométricos altos (MARQUES et al., 2012; CONAB, 2015; SIFAEG, 2018). A cana-de-açúcar produzida no Brasil é destinada primariamente a produção de açúcar e álcool. Seus resíduos e sub-produtos são empregados na fabricação de cachaça, rapadura, açúcar mascavo, ração animal, fertilizantes e na geração de energia elétrica (INUI-KISHI et al., 2012; SILVA F. B. et al., 2016). O aumento da demanda mundial por combustíveis renováveis e menos impactantes ao meio ambiente alavancaram o setor sucro-alcooleiro, fazendo do Brasil o maior produtor mundial de açúcar e o segundo maior produtor de bioetanol, ficando atrás dos Estados Unidos que produzem bioetanol a partir de milho (MENDES et al., 2007; MARIN et al., 2016). A geração de bioetanol a partir da cana-de-açúcar é menos dispendiosa, já que toda a energia consumida durante seu processamento é oriunda de seus próprios resíduos, além disso, a cultura pode perdurar no campo por cinco anos, gerando cinco ciclos (BRASIL, 2007). O uso do bioetanol resulta na redução das emissões dos gases do efeito estufa, especialmente o dióxido de carbono (CO2). A principal explicação para tal fato é que a emissão do CO2, decorrente da queima do bagaço da cana-de-açúcar e do bioetanol, é compensada pela alta taxa de absorção de

CO2 por fotossíntese pela cana-de-açúcar das próximas safras (GOLDEMBERG et al., 2008; SILVA M. A. S. et al., 2013). Apesar da estreita relação com a diminuição do lançamento de gases do efeito estufa, um dos potenciais problemas do cultivo da cana-de-açúcar é o avanço da fronteira agrícola sobre as vegetações nativas. Estima-se que o solo e as plantas armazenem três vezes mais carbono do que o disponível na atmosfera. O processo de retirada da mata nativa, além de emitir gases do efeito estufa, reduz a biodiversidade e os habitats (BANSCHBACH; LETOVSKY, 2010; INUI-KISHI et al., 2012). A conversão de biomas nativos em canaviais tem sido observada em diversos biomas, inclusive o cerrado. No estado de Goiás a maior parte da área plantada está localizada na região sul e sudeste do estado, todavia, a demanda pelo aumento da produção tem empurrado a fronteira agrícola para a região central do estado, que é caracterizada por uma proporção bastante representativa de Cambissolos. Esses solos, muitas vezes em áreas nativas de cerrado, apresentam menor potencial para cultivo intensivo e maior susceptibilidade a erosão. Existe ainda a necessidade de correção desses solos e grande demanda por adubação (SEVERIANO et al., 2009; CARDOZO et al., 2016; 28

LANA et al., 2016). Outro fenômeno recorrente é a conversão de pastagem e outras culturas em cana-de-açúcar, entretanto, essa estratégia tem se mostrado mais factível por ser mais barata e por causar menos impacto ambiental ao evitar a conversão de áreas de vegetação nativa (EGESKOG et al., 2016).

3.2 FERTILIZAÇÃO E MANEJO

A cana-de-açúcar tem sido cultivada na maioria dos estados brasileiros, em diferentes tipos de solo e sujeita a influência de diversos fatores bióticos e abióticos que são próprios de cada região, levando a diferentes níveis de produtividade (CUNHA et al., 2016). O ambiente ideal para a produção canavieira resulta da soma de diversos fatores. As características físicas e químicas do solo, o clima, a genética do vegetal, fornecimento de água, controle das pragas e as práticas de manejo podem influenciar de forma direta ou indireta na produtividade da cana-de-açúcar (SILVA K. et al., 2016). A cana-de-açúcar apresenta uma grande demanda por nutrientes, sendo esses nutrientes disponibilizados via adubação. Durante o processo são fornecidos os macronutrientes: nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K), cálcio (Ca), enxofre (S) e magnésio (Mg); e os micronutrientes: boro (B), cobre (Cu), molibdênio (Mo) e zinco (Zn). Apesar dos avanços nas práticas de manejo, a cana-de- açúcar é a segunda cultura nacional que mais demanda o uso de fertilizantes químicos, em especial o nitrogênio e o fósforo (ORLANDO FILHO, 1993; SIMÕES-NETO et al., 2009; BIGATON, 2014). O nitrogênio configura-se como o elemento vital na produção de cana-de-açúcar, sendo proveniente de fontes orgânicas e inorgânicas. Dentre as fontes orgânicas destacam-se: a palhada remanescente, a matéria orgânica do solo e a reserva nitrogenada contida no próprio colmo durante o plantio, já as fontes inorgânicas são representadas pelos fertilizantes nitrogenados sintéticos. A forma alternativa de aquisição do nitrogênio é via fixação biológica de nitrogênio, desempenhada por diversos micro-organismos (DELGADO et al., 2016; LEITE, 2016). Os reservatórios de nitrogênio presentes na matéria orgânica do solo estão disponíveis em pequenas quantidades, havendo a necessidade de suplementação, com os fertilizantes nitrogenados sintéticos, que são mais facilmente assimilados pelos vegetais. Embora a quantidade de fertilizantes nitrogenados sintéticos utilizados nas lavouras brasileiras seja pequena (50 kg N/ha) quando comparada ao utilizado em outros países (120 a 300 kg N/ha), o custo desse e de outros insumos agrícolas é alto e seu rendimento é baixo. Estima-se que 50% do nitrogênio aplicado seja perdido por lixiviação ou pela transformação em formas gasosas, seja pela desnitrificação (redução para formas

gasosas N2 e N2O mediada por micro-organismos) ou pela volatilização (perda na forma de NH3) (HUNGRIA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; CASTRO-GONZALEZ et al., 2011). A produção dos fertilizantes nitrogenados sintéticos requer grandes quantidades de combustíveis fósseis, poluem as águas e emitem gases do efeito estufa, tais como: dióxido de carbono (CO2), metano (CH4) e o

óxido nitroso (N2O) (IKEDA et al., 2014; SCHULTZ et al., 2014; MARIN et al., 2016). O fósforo, assim como o nitrogênio, é um elemento essencial na formação de diversas biomoléculas e estruturas celulares, sendo indispensável ao crescimento vegetal. Sua ausência é fator limitante para a produtividade da cana-de-açúcar, apresentando grande importância no enraizamento do vegetal. Em geral, o fósforo está presente em baixa quantidade nos solos brasileiros, sendo necessárias altas doses de fertilizantes fosfatados para o aumento da produtividade (SANTOS et al., 2011; MARRA et al., 2012). Diferente dos fertilizantes nitrogenados, que são aplicados de 2 a 3 vezes por safra, os compostos fosfatados são aplicados uma única vez e são absorvidos pelo vegetal em seus estágios iniciais. Parte do fosfato aplicado nas lavouras é convertido em frações insolúveis, tornando-se indisponíveis aos vegetais (VESSEY, 2003; CHIEN et al., 2011). A aplicação de fertilizantes fosfatados inorgânicos ainda se sobressai sobre os orgânicos. Em geral, os fosfatos orgânicos devem ser convertidos em fosfatos inorgânicos antes de se tornarem disponíveis aos vegetais, sendo um processo lento. Um dos processos que auxiliam na absorção de fosfato pelos vegetais é a solubilização de fosfato mediada por bactérias (CHIEN et al., 2011; DE SOUZA et al., 2015). Durante décadas o uso desses insumos agrícolas predominou no cultivo da cana-de-açúcar sob manejo tradicional. Além da preocupação ambiental, a preocupação com os custos e com o destino dos rejeitos do setor sucro-alcooleiro impulsionou a utilização dos rejeitos da cana-de-açúcar dentro do próprio cultivo (LANA et al., 2016; PEDULA et al., 2016). Dentre os principais produtos incorporados estão a torta de filtro, a vinhaça e o lodo de esgoto. A torta de filtro é a mistura de bagaço moído e do lodo resultante do tratamento do caldo. É rica em fósforo, mas apresenta outros nutrientes como o nitrogênio, cálcio, potássio, magnésio e alguns micronutrientes (SANTOS et al., 2011). A vinhaça é um líquido residual proveniente da fermentação do álcool, contém matéria orgânica e minerais como o potássio, cálcio e magnésio. É um rejeito extremamente volumoso, cujo volume é 15 vezes maior do que o volume de álcool produzido. Concomitante ao uso da torta e da vinhaça, utiliza-se o lodo de esgoto como fonte nitrogenada. No que tange o uso dessas substâncias, ainda há a discussão sobre sua segurança ambiental, embora essas práticas já estejam bem

consolidadas e tenham ajudado a reduzir o grande aporte de rejeitos da indústria sulcro-álcooleira (SILVA et al., 2007; TASSO et al., 2007; SORATTO et al., 2010). Toda preocupação com o meio ambiente e com os impactos causados pela agricultura tradicional, bem como o aumento da demanda por produtos agroecológicos têm impulsionado o estabelecimento da agricultura orgânica. A agricultura orgânica baseia-se em uma forma de cultivo que abole o uso de compostos sintéticos como os fertilizantes, pesticidas, hormônios e outros aditivos químicos. Adotam práticas como a rotação de culturas, utilização de resíduos orgânicos provenientes da agricultura e de outros setores, adubos animais e vegetais, uso de rochas minerais moídas, controle biológico de pragas e capina (LI et al., 2012; KAUR; REDDY, 2013; FOTEINIS; CHATZISYMEON, 2016). No caso específico da cana-de-açúcar orgânica, além da utilização da torta de filtro, lodo e vinhaça, podem ser incorporados ao processo: produtos de compostagem, os resíduos dos biodigestores, estercos animais e verdes e fontes fosfatadas naturais tais como o calcário e rochas moídas. Mesmo com a utilização de produtos naturais, a adubação nos sistemas orgânicos é feita depois de uma criteriosa análise de solo. Também são levadas em conta, as concentrações de nutrientes de cada material a ser utilizado como adubo, bem como a as taxas de conversão dos adubos orgânicos em materiais inorgânicos a serem absorvidos pelos vegetais (BARBOSA, 2010). Todas as técnicas e princípios da agricultura orgânica no Brasil são regulamentados pela Lei nº 10.831 de 23 de dezembro de 2003 (BRASIL, 2003). A garantia da qualidade de um produto orgânico se dá por certificações. Essas certificações estabelecem a garantia ao consumidor de que o produto adquirido é realmente oriundo de produção orgânica e isento de fertilizantes químicos. Além disso, o processo de certificação inspeciona e orienta os produtores quando às práticas a serem adotadas (TONDO et al., 2007). Estima-se que o mercado brasileiro de orgânicos movimentou cerca de R$ 2,5 bilhões em 2016. A área de produção de orgânicos no Brasil engloba 950 mil hectares, com destaque a produção de cana-de-açúcar, que representa 23% de toda a agricultura orgânica. No estado de Goiás, duas usinas cultivam a cana-de-açúcar sob manejo orgânico, sendo responsáveis pela inserção de Goiás nos mercados internos e externos de açúcar orgânico (BRASIL, 2015; SIFAEG, 2016). A conversão total ou parcial de um sistema convencional em orgânico requer inicialmente a redução do uso de insumos químicos, com a posterior substituição destes por outros de origem biológica. Além disso, a conversão deve ser executada por tempo suficiente para que os resíduos de fertilizantes e defensivos associados ao manejo tradicional sejam eliminados (GLIESSMAN, 2009; BORGES, 2013). A adoção do sistema orgânico promove a melhoria do solo e o aumento da 31

biodiversidade, pois permite o retorno de pequenos animais a região plantada e diminui significativamente a dependência externa de fertilizantes industrializados (AGUIAR, 2002). Um dos grandes diferenciais do cultivo orgânico é assumir o solo como fundamental na manutenção do sistema. O solo desempenha muitas funções agroecológicas importantes, atua como importante reservatório de nutrientes e é responsável pela ciclagem dos nutrientes e pela promoção da saúde do vegetal (HENNERON et al., 2014). Os micro-organismos presentes no solo são muito importantes para a manutenção da saúde do solo, pois estão envolvidos na decomposição e ciclagem de nutrientes. Por participarem de tantos processos, admite-se que a agricultura orgânica seja dependente dos micro-organismos e dos processos que desempenham no solo, sobretudo, os micro- organismos envolvidos na promoção do crescimento vegetal (LI et al., 2012; ORR et al., 2012; BHARDWAJ et al., 2014).

3.3 MICRO-ORGANISMOS DE INTERESSE AGRÍCOLA

Embora os micro-organismos apresentem um destaque maior dentro do contexto da agricultura orgânica, desempenham papel importante em qualquer modelo de agricultura. Um exemplo importante é o fato da cana-de-açúcar brasileira ser cultivada com uma menor necessidade de fertilizantes nitrogenados sintéticos. Sugere-se que esse fato ocorra em detrimento da ação de bactérias fixadoras de nitrogênio que ocorram naturalmente no solo e no interior dos vegetais (PARIONA-LLANOS et al., 2010). As bactérias podem estabelecer com os vegetais uma serie de relações ecológicas. Essas relações podem ser deletérias, neutras ou benéficas (NISSINEN et al., 2012). As bactérias benéficas são capazes de estimular o crescimento vegetal, reduzir a infecção por patógenos e aumentar a tolerância do hospedeiro ao stress biótico e abiótico. Os micro-organismos que interagem diretamente com o vegetal podem estar localizados na superfície dos tecidos vegetais (epifíticos), podem habitar o interior dos tecidos vegetais (endofíticos) ou zona de solo adjacente as raízes (rizosfera) (COMPANT et al., 2010; PASSARI et al., 2015).

3.4 A RIZOSFERA

O termo rizosfera deriva do grego, onde "rhiza" significa raiz e "sphere" significa influência e foi apresentado por Hiltner em 1904. De uma forma mais ampla, pode ser definida como a fina camada de solo que está diretamente em contato com as raízes e que é influenciado por elas,

distinguindo-se do solo plantado (bulk soil), já que este está fora da influência radicular (HILTNER, 1904; MORGAN et al., 2005; KARAGÖZ et al., 2012). A rizosfera é subdividida em três regiões: a endorizosfera, que inclui o endoderma e o córtex da raiz, sendo que os micro-organismos habitam a região entre as células; o rizoplano, que corresponde a superfície das raízes e as partículas de solo fortemente aderidas a ela e a ectorizosfera, que se refere a região do solo imediatamente adjacente as raízes (Figura 1) (MCNEAR, 2012; DESHMUKH; SHINDE, 2016).

Figura 1. Subdivisões da rizosfera: endorizosfera, rizoplano e ectorizosfera.

Fonte: Adaptado de Bulgarelli et al (2013)

A rizosfera é o habitat de bactérias, fungos, nematóides, protozoários, algas e alguns artrópodes. As bactérias que habitam a rizosfera são chamadas de rizobácterias. Esses micro- organismos são capazes de estabelecer diversas associações com os vegetais, podendo permanecer na rizosfera ou colonizar o interior das raízes, passando a ser endofíticas (COMPANT et al., 2010; NIHORIMBERE et al., 2011; CARVALHO et al., 2016). O processo de recrutamento de bactérias para a rizosfera se inicia pela rizodeposição, que é caracterizado pela secreção de diversos compostos pela rizoderme e pela coifa, chamados de exsudatos. Há também, a liberação de uma população especializada de células marginais da coifa que contribuem na liberação de compostos não particulados, incluído no grupo dos exsudatos (NGUYEN,

2003; BULGARELI et al., 2013). Os exsudatos radiculares são compostos por uma gama de moléculas orgânicas e inorgânicas que incluem: grandes quantidades de carbono fixados via fotossíntese, água, açúcares, íons inorgânicos, purinas, nucleosídeos vitaminas, aminoácidos, ácidos orgânicos, alguns antimicrobianos, mucilagem e compostos voláteis. O exsudato liberado contém cerca de 11% do carbono líquido fixado por fotossíntese e cerca de 10-16% do nitrogênio total (VACHERON et al., 2013; AHEMAD; KIBRET, 2014; NOUMAVO et al., 2016). As atividades das raízes e seus exsudatos modificam as características físico-químicas do solo, diminuem a pressão parcial de oxigênio e enviam uma serie de sinais que são capazes de atrair as comunidades microbianas hábeis a se proliferar na rizosfera. As comunidades microbianas do solo são atraídas para a rizosfera por serem em sua maioria organotróficas e pelo fato de o solo, quando se encontra fora da influência das raízes serem um ambiente limitado em compostos orgânicos (JONES et al., 2009; BULGARELI et al., 2013; SHRIVASTAVA, 2016). A capacidade das bactérias em colonizar a rizosfera depende de sua habilidade quimiotáxica em responder ao exsudato e a presença de adesinas, fimbrias e pili. Neste contexto, algumas proteínas de superfície são fatores fundamentais no processo. Além disso, é necessário que as bactérias sejam capazes de metabolizar algum dos componentes do exsudato (DE WEERT et al., 2002). Ademais, a rizosfera constitui-se como um ambiente complexo e competitivo, no qual micro-organismos benéficos e deletérios, que foram atraídos e capazes de colonizar as raízes, disputam espaço, nutrientes e interagem com o vegetal. Além disso, a rizosfera é palco de importantes fenômenos, mediados pelas rizobactérias, como a promoção do crescimento vegetal, ciclagem dos minerais, produção de metabolitos secundários, resistência a metais pesados e degradação de xenobióticos (DANHORN; FUQUA, 2007).

3.5 ESTRUTURA E DIVERSIDADE MICROBIANA DA RIZOSFERA

Por ser um ambiente extremamente rico em nutrientes, a rizosfera é uma zona altamente populosa e complexa. Enquanto a população do solo (bulk soil) é de 108 micro-organismos por grama, a da rizosfera está na casa de 1011 grama de solo. Apesar de ser mais populosa, a comunidade microbiana da rizosfera é menos diversa que a observada no bulk soil. A diferença na proporção e na estrutura entre as comunidades de bulk soil e rizosfera é denominada "efeito rizosfera". O vegetal é capaz de modular a comunidade rizosférica ao liberar compostos ativos capazes de estimular ou reprimir determinados grupos microbianos (BERG; SMALLA, 2001; GARBEVA et al., 2008; DOORNBOS et al., 2012; PRASHAR et al., 2014; SIKORSKI, 2015).

Além do papel das raízes na liberação do exsudato, outros fatores relacionados ao vegetal, tais como o estágio do desenvolvimento e a variedade do vegetal também são capazes de contribuir para o aparecimento de grupos dominantes na rizosfera (SMALLA et al., 2001). Além disso, padrões distintos de populações podem ser observados em diferentes regiões das raízes, dessa forma, a comunidade microbiana associada a zona meristemática (coifa) será diferente da encontra nas raízes secundárias ou da encontrada na zona pilífera (LUGTENBERG; KAMILOVA, 2009; NIHORIMBERE et al., 2011). Em menor escala, os atributos físicos e químicos do solo também são capazes de contribuir para a diversidade microbiana da rizosfera. O solo é a matriz, da qual os micro-organismos são recrutados para a rizosfera, portanto, fatores como o tipo de solo, salinidade, pH, quantidade de matéria orgânica, distribuição dos nutrientes e práticas de manejo como a fertilização, irrigação e o controle de pragas também são capazes de influenciar a composição da rizosfera (Figura 2) (RANGARAJAN et al., 2002; IBEKWE et al., 2010; CHAPARRO et al., 2012; UROZ et al., 2013; PRASHAR et al., 2014; CALDWELL et al., 2015).

Figura 2. Elementos condicionadores da rizosfera em sistemas agrícolas.

Fonte: Adaptado de Philippot et al (2013)

A maioria dos estudos que abordam a rizosfera de cana-de-açúcar é com micro-organismos cultiváveis e em geral, se destinam a captar as rizobactérias promotoras do crescimento vegetal ou as bactérias patógenas. Nesses estudos são utilizados meios de cultura para grupos específicos, o que pode negligenciar os grupos dominantes associados a rizosfera (ARMANHI et al., 2018). Dentre as promotoras do crescimento vegetal, os gêneros Agrobacterium, Gluconacetobacter,

Stenotrophomonas, Azospirillum, Burkholderia, Klebsiella, Enterobacter, Bacillus, Rhizobium e Streptomyces são os mais recuperados nos manejos tradicionais (CASTRO-GONZÁLEZ et al., 2011; LIN et al., 2012; BENEDUZI et al., 2013; PAUNGFOO-LONHIENNE et al., 2014; TAM; DIEP, 2015; RODRIGUES et al., 2016; SOLANKI et al., 2017). Mesmo dentro do estudo dos promotores do crescimento vegetal haverá limitações, uma vez que a maioria das bactérias da rizosfera são viáveis, mas não são cultiváveis. Além disso, alguns micro-organismos estão em uma relação mutualística e não podem ser cultivados isoladamente (BAREA et al., 2005; BHAT, 2013). Ao longo das últimas décadas diversas ferramentas moleculares foram desenvolvidas e utilizadas para captar a diversidade da rizosfera. Ferramentas de fingerprint baseadas em PCR como a eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) e o polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (T-RFLP) são amplamente utilizadas em estudos com cana-de-açúcar e foram importantes para aumentarem o entendimento da relação da rizosfera com os fatores bióticos e abióticos. Entretanto, essas técnicas não fornecem a afiliação taxonômica e conseguem captar somente as comunidades microbianas dominantes limitando sua utilização, sendo complementadas, em geral, pelo sequenciamento em larga escala do gene marcador 16S rRNA (LAGOS et al., 2015). O desenvolvimento do sequenciamento em larga escala do gene marcador 16S rRNA permitiu uma melhor caracterização das comunidades microbianas da rizosfera. Constitui-se como uma ferramenta robusta que permite a detecção de comunidades que estão pouco abundantes em ambientes complexos (CAPORASO et al., 2012). Com essa ferramenta, foi possível determinar, por exemplo, que os filos Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes e Acidobacteria se configuram como a mais abundantes na rizosfera de uma série de vegetais (MANTER et al., 2010; UROZ et al., 2010; GOTTEL et al., 2011; İNCEOĞLU et al., 2011; BOUFFAUD et al., 2012; BULGARELLI et al., 2012; LAGOS et al., 2015), incluindo a rizosfera de cana-de-açúcar (PISA et al., 2011; DA COSTA et al., 2014; LOPES et al., 2016; ARMANHI et al., 2018). Existem várias formas de transformar as informações obtidas via amplificação do 16S rRNA em inferências sobre a diversidade. A quantidade de unidades taxonômicas operacionais (UTO) formadas em uma determinada amostra de rizosfera pode ser utilizada como indicador da diversidade microbiana. As UTOs são formadas por sequências que foram agrupadas baseadas em sua similaridade por meio da utilização de bancos de dados específicos e algoritmos de clusterização. Admite-se que sequências que foram agrupadas em uma UTO representam micro-organismos filogeneticamente semelhantes. A contagem de UTOs provê uma estimativa direta da riqueza genética. Dessa forma, quanto mais UTOs geradas por amostra, maior a riqueza daquele fragmento de rizosfera (HE et al., 2015; NGUYEN et al., 2016; MAHONEY et al., 2017). 36

Além das UTOs, os índices de Shannon e Simpson são utilizados para estimar a diversidade microbiana. Esses índices levam em conta tanto a uniformidade quanto a abundância das espécies presentes em uma única amostra, se diferenciando por sua fundamentação teórica e interpretação. Já os índices Chao 1 e ACE, são índices de riqueza e predizem a diversidade a partir das medidas parciais da contagem de UTO, sendo dependentes do tamanho da amostra. Todos os índices acima apresentados correspondem a métricas da diversidade alfa. A diversidade alfa é aquela que descreve a diversidade em uma única amostra e não apresenta sentido se avaliada isoladamente. Dessa forma, os índices de diversidade alfa de uma amostra de comunidade rizosférica devem ser comparados estatisticamente com outros. Essa comparação também pode acontecer por grupos de amostras (MORRIS et al., 2014; VALVERDE et al., 2016). Já a diversidade beta tem sido utilizada para descrever o grau da diferença entre as amostras e pode ser útil em revelar aspectos da ecologia microbiana que não são aparentes apenas olhando a composição das amostras individualmente. Essas métricas são robustas e diferentemente da diversidade alfa, não são sensíveis ao baixo número de sequências em uma amostra ou aos erros do sequenciamento. As métricas da diversidade beta podem ser quantitativas, utilizando a abundância das sequências (Bray-Curtis ou UniFrac weighted) ou podem ser qualitativas, utilizando a presença/ ausência das sequências (Jaccard ou Unifrac unweighted) (GOODRICH et al., 2014; MAHONEY et al., 2017) Ferramentas como o Tax4fun e o PICRUSt permitiram a utilização de um marcador molecular, como o 16S rRNA, para predizer a composição funcional de comunidades microbiabas (LANGILLE et al., 2013; AßHAUER et al., 2015). Essas ferramentas podem ser empregadas em amostras de bulk soil e de rizosfera com grande taxa de acerto. Estudos que se propuseram a utilizar essas ferramentas com as sequências obtidas a partir de rizosfera de cana-de-açúcar buscaram compreender os mecanismos de interação entre os micro-organismos e os vegetais (LOPES et al., 2016) ou tentaram compreender os mecanismos de promoção do crescimento vegetal por rizobactérias (MAHONEY et al., 2017).

3.6 RIZOBACTÉRIAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO VEGETAL (RPCV)

Rizobactérias que apresentam a capacidade de beneficiar o crescimento vegetal são denominadas RPCV e podem ser classificadas quanto ao seu local de atuação em rizobactérias promotoras do crescimento vegetal extracelulares (RPCVe) e rizobactérias promotoras do crescimento vegetal intracelulares (RPCVi). As RPCVi são encontradas no interior das células e

conhecidas por serem simbiontes e produzirem nódulos, cujo objetivo é fixação biológica de nitrogênio em leguminosas. Dentre as principais espécies de RPCVi associada aos vegetais estão os membros da família Rhizobiaceae e as bactérias do gênero Frankia. Em vegetais não pertencentes ao grupo das leguminosas, como a cana-de-açúcar, serão encontradas somente as RPCVe as RPCV, as quais podem ser encontradas na ectorizosfera, no rizoplano ou no espaço entre as células do córtex. Exibem uma grande variedade taxonômica e dentre as inúmeras RPCVe, as mais frequentemente recuperadas pertencem aos gêneros: Agrobacterium, Arthrobacter, Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Caulobacter, Chromobacterium, Erwinia, Flavobacterium, Micrococcous, Pseudomonas e Serratia (HAYAT et al., 2010; BHATTACHARYYA; JHA, 2012; AHEMAD; KIBRET, 2014; GUPTA et al., 2015). As RPCV podem promover o crescimento vegetal de forma direta ou indireta. Os mecanismos diretos (biofertilização e fitoestimulação) facilitam a absorção/disponibilização de nutrientes aos vegetais e incluem: a fixação de nitrogênio, solubilização de minerais e a síntese de fitormônios. Já os mecanismos indiretos (biocontrole) referem-se à inibição de fitopatógenos, nos quais se destacam: a produção de antibióticos, sideróforos, amônia, biosurfactantes, HCN e enzimas hidrolíticas (GOPALAKRISHNAN et al., 2012; GUPTA et al., 2015).

3.6.1 Biofertilização

As RPCV capazes de aumentar a oferta de nutrientes aos vegetais são chamadas de biofertilizantes. Os mecanismos mais conhecidos e estudados da biofertilização são: a fixação de nitrogênio, a solubilização de fosfato, a produção de sideróforos e a produção de exopolissacarídeos (SINGH et al., 2011).

3.6.1.1 Fixação biológica de nitrogênio

O nitrogênio é elemento fundamental no metabolismo vegetal, participando da constituição de ácidos nucléicos, proteínas, aminoácidos e da clorofila (SORATTO et al., 2010). Esse elemento está pouco disponível nos solos de forma natural e para suprir a demanda dos vegetais por esse nutriente, o solo é suplementado com fertilizantes nitrogenados sintéticos ou naturais. Embora o nitrogênio atmosférico (N2) esteja amplamente distribuído em sua forma gasosa, as plantas não são capazes de absorvê-lo diretamente devido à presença de uma ligação covalente tripla entre os dois átomos de

nitrogênio. O nitrogênio do solo é absorvido pelas raízes somente na forma de amônia e/ou nitrato (SANTI et al., 2013; KUMAR et al., 2014; SANTOS et al., 2015).

A fixação biológica de nitrogênio envolve a conversão do gás N2 em amônia. A amônia pode sofrer subsequente mineralização para nitrito, que também é absorvido. As bactérias que fixam nitrogênio são chamadas diazotróficas e podem estar associadas ao tecido radicular (simbiontes) ou apresentar vida livre. A forma mais eficiente de fixação de nitrogênio envolve a formação de nódulos no tecido radicular pelos simbiontes, já as bactérias de vida livre fixam quantidades menores de nitrogênio, mas são igualmente importantes na manutenção das culturas. Acredita-se que os diversos vegetais e suas respectivas variedades selecionem diferentes grupos de diazotróficos mais adequados e convenientes a sua sobrevivência (SILVA et al., 2013; SHIN et al., 2016). Os diazotróficos de vida livre, além de fixarem nitrogênio, podem adotar inúmeras estratégias para obtenção de nitrogênio, uma vez que estão expostos a uma grande variedade de fontes nitrogenadas. Esses organismos são capazes de utilizar fontes inorgânicas do elemento, disponíveis no solo e/ou captá-lo de moléculas orgânicas de baixo e alto peso molecular. O nitrogênio inorgânico constitui a forma mais simples de aquisição de nitrogênio, enquanto a fixação de nitrogênio e a aquisição de fontes orgânicas tem alto custo energético (NORMAN; FRIESEN, 2017). A fixação biológica de nitrogênio acontece em muitas espécies e é mediada pela enzima nitrogenase, que corresponde a um complexo enzimático extremamente conservado. Existem três tipos de nitrogenases, a nitrogenase ferro-molibdênio (Nif), a nitrogenase ferro-vanádio (Vnf) e a nitrogenase que contém apenas ferro (Anf), sendo a Nif a mais comumente encontrada. Embora apresentem metais diferentes em sua composição, a estrutura e funcionamento das nitrogenases são bastante semelhantes, inclusive o fato de sua atividade ser sensível ao oxigênio (NUNES et al., 2003; DAHAL et al., 2017). As nitrogenases são capazes de aceitar uma gama de substratos e catalisar inúmeras reações que incluem, a conversão de N2 e do óxido nitroso (N2O) em amônia, a redução dos prótons (H+) a H2, a redução da azida de sódio (NaN3) a N2 e amônia, além de reduzir o acetileno

(C2H2) a etileno (C2H4) (BODDEY et al., 2007). A Nif é uma enzima complexa que apresenta dois componentes: a nitrogenase, composta por um centro protéico de ferro-molibdénio (MoFe) e a dinitrogenase redutase, contendo centros de ferro-enxofre (FeS) (GABY; BUCKLEY, 2014; LEVY-BOOTH et al., 2014). O componente nitrogenase é codificado pelos genes nifD e nifK, já a dinitrogenase redutase é codificada pelo gene nifH. Além destes, diversos outros genes do complexo nif participam da regulação gênica do processo. Por serem altamente conversados ao longo das espécies, os genes do complexo nif têm sido

utilizados como marcadores para o estudo da ecologia de diazotróficos (GABY; BUCKLEY, 2012; DAI et al., 2014).

3.6.1.2 Solubilização de fosfatos

O fosforo, assim como o nitrogênio, é um dos elementos mais importantes na formação de biomoléculas, logo é requerido em grandes quantidades pelos vegetais. O cultivo da cana-de-açúcar demanda grandes quantidades de fosfato, sendo esses adquiridos via suplementação com adubação fosfatada (LIRA-CADETE et al., 2012). Grande parte do fosfato suplementado é rapidamente imobilizado, sendo convertido em formas insolúveis que são incapazes de serem absorvidos pelos vegetais (WALPOLA; YOON, 2013). O fosfato só pode ser absorvido pelos vegetais se estiver na - 2- forma solúvel e em duas formas, o fosfato monobásico (H2PO4 ) e o dibásico (HPO4 ). Os micro- organismos solubilizadores de fosfato são aqueles capazes de converter o fosfato insolúvel, como o tricálcio fosfato (Ca3(PO4)2), fosfato de alumínio (AlPO4), e fosfato ferroso (FePO4), em formas solúveis (VESSEY, 2003; DE SOUZA et al., 2015). O principal mecanismo pelo qual as bactérias solubilizam fosfato é a produção de ácidos, dos quais destacam-se: o ácido lático, acético, isobutírico, isovalérico e itacônico. Esses ácidos são liberados extracelularmente e são capazes de agir nas formas insolúveis do mineral. A dissolução do 2- fosfato mineral pode ser resultado da troca de ânions, onde o ânion fosfato (PO4 ) é trocado por um ânion ácido ou pode haver quelação aos íons ferro e alumínio associados com o fosfato. (KHAN et al., 2007; ESPOSITO-POLESI, 2011; WALPOLA; YOON, 2013). Outro processo importante desempenhado pelos micro-organismos do solo é a mineralização, que corresponde a conversão de formas orgânicas de fosfato em fontes inorgânicas. Em geral, essa reação de mineralização é mediada pelos micro-organismos de solo produtores de fosfatases, fitases e C-P liases (RODRÍGUEZ; FRAGA, 1999; KAUR; REDDY, 2013). A solubilização e a mineralização são dois mecanismos que podem coexistir em um mesmo micro-organismo (LI et al., 2008). Além da solubilização de fosfato é importante ressaltar que muitos micro-organismos são capazes de solubilizar potássio (K) e zinco (Zn), que também se constituem como importantes elementos para a agricultura (SUMAN et al., 2016).

3.6.1.3 Sideróforos

O ferro é um elemento necessário tanto para o crescimento vegetal quanto para o microbiano. Embora seja abundante é pouco disponível, pois está presente na natureza na forma férrica (Fe3+), que é insolúvel (FGAIER; EBERL, 2011; VEJAN et al., 2016). Alguns micro-organismos desenvolveram a capacidade de secretar compostos chamados sideróforos, que são capazes de captar o ferro formando um complexo sideróforo-ferro. Os síderoforos são pequenas moléculas de baixo peso molecular com grande afinidade e especificidade por quelar ou se ligar ao ferro. O complexo sideróforo-ferro é solúvel, sendo geralmente absorvido pelos micro-organismos ou em menor quantidade pelos vegetais (GAONKAR; BHOSLE, 2013; NAVEED et al., 2013). Mesmo que os sideróforos sejam considerados biofertilizantes, também se enquadram na categoria de agentes de biocontrole. O fato de adsorverem o ferro faz com que esse elemento fique indisponível para os outros micro-organismos, podendo apresentar eficiência na contenção de patógenos sobretudo, na rizosfera (YU et al., 2011).

3.6.1.4 Exopolissacarídeos

Os exopolissacarídeos extracelulares (EPS) são produzidos por uma gama de micro- organismos, sendo liberados extracelularmente na região da rizosfera. De aspecto gelatinoso, apresentam em sua constituição uma série de carboidratos e lipídeos, permitindo ao micro-organismo e como consequência ao vegetal, uma melhor adaptação frente a diversos estresses abióticos, tais como o hídrico, salino e de temperatura. Têm sido reportados como modificadores do volume do solo, aumentando a agregação da rizosfera e melhorando a disponibilidade de nutrientes as plantas. A presença do EPS também tem efeito sobre a retenção de água, fazendo com que os vegetais sofram os efeitos da dessecação mais lentamente. (PAUL; LADE, 2014; SHIVA et al., 2016).

3.6.2 Fitoestimulação

A fitoestimulação refere-se à produção, por micro-organismos, de substâncias químicas (hormônios/enzimas) que atuam como mensageiros capazes de estimular o crescimento vegetal e a resposta do vegetal ao meio ambiente. Esses compostos têm natureza orgânica e são efetivos em pequenas concentrações. São responsáveis por alterar a arquitetura da raiz e promover o desenvolvimento vegetal, sendo divididos em cinco categorias: auxinas, giberilinas, citocininas, inibidores do etileno e ácido abscísico (BABALOLA, 2010; BHATTACHARYYA; JHA, 2012).

3.6.2.1 Auxinas

As auxinas são produzidas naturalmente pelos vegetais e por alguns micro-organismos, sendo responsáveis pelo crescimento e desenvolvimento vegetal (GOSWAMI et al., 2015). As auxinas atuam na divisão, no elongamento celular e na diferenciação tecidual (DI et al., 2015). O AIA é a auxina mais predominante e participa de diversos processos que incluem: divisão e diferenciação celular, germinação de sementes, taxa de crescimento do xilema e da raiz, formação das raízes laterais e adventícias, além de ser um mecanismo de resposta a luz e a gravidade (SHOKRI; EMTIAZI, 2010; AHEMAD; KIBRET, 2014). Estima-se que cerca de 80% das rizobactérias sejam produtoras de AIA, contudo, tanto as rizobactérias quanto os endofíticos são capazes de produzir AIA em quantidades suficientes para promover efeitos no vegetal. A produção de AIA varia bastante entre as espécies e cepas, sendo influenciada pelo tipo de vegetal, condições de cultivo e a disponibilidade de substratos (HAYAT et al., 2010). Das vias mais comuns para a produção de AIA, as quatro principais estão associadas ao triptofano, que é o precursor do AIA formado nessas vias. A via alternativa é independente de triptofano e acredita-se que seja uma vantagem possuí-la, dada à flexibilidade metabólica (LIN; XU, 2013). Sugere-se ainda, que essa molécula atue como sinalizador, sendo um mecanismo bastante importante de interação entre a bactéria e as plantas (SPAEPEN; VANDERLEYDEN, 2011).

3.6.2.2 Inibidores do etileno

O etileno é um hormônio encontrado em todos os vegetais superiores e é responsável pela resposta dos vegetais a uma gama de estresses bióticos e abióticos. O etileno afeta o crescimento de órgãos vegetais como as raízes, caule, folhas, flores e frutos e influenciam a relação da planta com alguns de seus micro-organismos, incluindo a capacidade de nodulação pelos rizóbios. A produção de etileno pode ser ativada na presença de metais pesados, excesso ou falta de água, altas concentrações de sal, presença de compostos químicos orgânicos e inorgânicos, temperaturas extremas, radiação ultravioleta, dano às estruturas vegetais e a presença de fitopatógenos (nematóides, bactérias e fungos) (GRICHKO; GLICK, 2001; GLICK, 2014). Algumas horas após um evento estressante, o vegetal libera pequenas concentrações de etileno, chamado de pico benéfico. Essa liberação seria responsável por ativar a resposta do vegetal ao agente estressor, como por exemplo, a transcrição de genes que codificam as proteínas de defesa. Uma segunda liberação, chamada pico deletério, ocorre cerca de 72 horas após o evento estressante,

no qual grandes quantidades do hormônio são produzidas e atuam em processos como a senescência, clorose e queda das folhas (GLICK et al., 2007). O 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) é a molécula precursora do etileno e as reservas teciduais dessa molécula são totalmente consumidas após o pico benéfico. Durante o pico deletério, as moléculas de ACC são novamente produzidas e liberadas. Alguns micro-organismos em situações de estresse são capazes de produzir e liberar a enzima ACC deaminase. A ACC deaminase é capaz de clivar o ACC em alfa-cetobutirato e amônia. A produção dessa enzima é capaz de reduzir os efeitos negativos do etileno e permitir que o vegetal se adapte melhor as condições de estresse (DUAN et al., 2009; ONOFRE-LEMUS, 2009).

3.6.3 Biocontrole

O biocontrole refere-se à prevenção dos efeitos deletérios causados por patógenos, seja produzindo substâncias com efeito antagônico aos patógenos ou aumentando a resistência do vegetal ao ataque. Constituem-se alternativas ecologicamente viáveis, minimizando os efeitos da contaminação do solo por fungicidas e outros pesticidas (GOUDJAL et al., 2014; SUMAN et al., 2016). Dentre os principais mecanismos caracterizados como biocontrole destacam-se: a produção de metabólitos (antimicrobianos, enzimas líticas, compostos voláteis, ácido cianídrico (HCN) e sideróforos), competição por nutrientes com os patógenos e indução da resistência sistêmica do vegetal (AHEMAD; KIBRET, 2014). A produção de substâncias com ação antimicrobiana é o mecanismo de biocontrole mais estudado. Diversos tipos de antifúngicos e antibacterianos são produzidos por vários gêneros bacterianos. Hassan, Afghan e Hafeez (2010) estudando o patógeno Colletotrichum falcatum, observaram a produção de substâncias com ação antifúngica por bactérias dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Ochrobacterum e Stenotrophomonas. O gênero Streptomyces também é considerado bastante promissor como agente de biocontrole. Grande parte dos antimicrobianos disponíveis hoje no mercado foi isolado desse gênero (BOUBETRA et al., 2013; NAIR; PADMAVATHY, 2014). Somado a ação antibiótica, os micro-organismos podem produzir substâncias voláteis como a amônia e o HCN. O HCN é altamente tóxico para os micro-organismos mesmo a concentrações baixas, já a amônia participa indiretamente como modulador no controle de patógenos. Além disso, há indícios que a amônia possa ser uma das fontes de nitrogênio para a planta hospedeira (MARQUES et al., 2010; SINGH et al., 2011).

Várias enzimas como as quitinases, celulases, lipases, proteases, peroxidases, β-1-3- glucanases são capazes de atacar a parede celular de patógenos, diminuindo o stress biótico sofrido pelo vegetal. Outro mecanismo muito comum é a indução da resistência sistêmica, ativada por uma série de micro-organismos, incluindo bactérias gram-positivas e gram-negativas. Alguns metabólitos produzidos por esses micro-organismos são capazes de ativar respostas nos vegetais, os fazendo mais resistentes a agressões futuras por patógenos. Os micro-organismos, podem ainda, competir por espaço e nutrientes, colonizando rapidamente o vegetal e impedindo a instalação de patógenos (MIRANSARI, 2001; NOUMAVO et al., 2016).

3.7 PROSPECÇÃO DE RPCV CULTIVÁVEIS

Uma das abordagens mais clássicas para o estudo das RPCV refere-se ao uso de técnicas dependentes de cultivo. Nesse sentido, o Brasil e em especial a pesquisadora Dr Johanna Döbereiner obtiveram muitos avanços sobre o estudo da microbiota da rizosfera de cana-de-açúcar. Partiram dela trabalhos que possibilitaram o isolamento do micro-organismo Beijerinckia fluminensis, um dos primeiros diazotróficos encontrados em gramíneas (DÖBEREINER; RUSCHEL, 1958; BALDANI et al., 1997). Sua equipe também foi responsável pelo desenvolvimento do meio NFb, que permitiu o isolamento das cepas Azospirillum lipoferum e A. brasilense. A partir desse ponto e com o auxílio de técnicas como a redução do acetileno (que mede a atividade da nitrogenase), incorporação do isótopo 15 N2 e o balanço de nitrogênio total, houve o desenvolvimento do estudo de fixação biológica de nitrogênio em não-leguminosas em vários grupos pelo Brasil (DÖBEREINER et al., 1972; RUSCHEL et al., 1975; FREITAS et al., 1984; BODDEY; URQUIAGA,1992; URQUIAGA et al., 1992; BALDANI; BALDANI, 2005). De forma geral, a prospecção de micro-organismos de rizosfera de cana-de-açúcar inicia-se com o questionamento norteador do trabalho. A partir da delimitação do que se quer prospectar, amparada por uma profunda revisão da literatura e por uma necessidade do cotidiano, parte-se para o planejamento experimental. A fase de planejamento deve conter um esboço do que será coletado, número amostral e informações complementares que também devem ser avaliadas. Do ponto de vista prático, a ideia central da prospecção está em extrair os micro-organismos do sistema, cultivá-los em laboratório, realizar vários testes de cunho morfológico, bioquímico e/ou genético e selecionar os melhores para uma possível aplicação em campo (BARRIUSO et al., 2008).

O ideal durante o estudo de RPCV cultiváveis é que a rizosfera seja obtida de vegetais sem sinais de ataque por pragas, doenças ou de deficiências nutricionais (SOUZA et al., 2004). Isso é interessante para evitar o isolamento de contaminantes ou de espécies patógenas, já que muitas dessas bactérias podem produzir fatores de promoção do crescimento vegetal. O patógeno Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi, por exemplo, é capaz de produzir grandes quantidades de AIA in vitro (STIJN; VANDERLEYDEN, 2011). Após a verificação da sanidade vegetal, durante as coletas, deve ser observada uma distância máxima de 5 mm da raiz, a fim de não isolar micro-organismos que estejam fora da influência radicular (DOS SANTOS, 2012). Após a coleta do material, métodos de dispersão devem ser utilizados para dissociar os micro-organismos das partículas de solo e maximizar o isolamento. Nesse sentido, a incubação do solo em tampões fosfatados e salinos sob agitação é frequentemente utilizada (BARRIUSO et al., 2008; MENDES et al., 2007; KAVAMURA et al., 2013). O passo seguinte envolve o inóculo da suspensão de solo em meios de cultura. Nessa lógica, poderão ser utilizados meios de cultura seletivos e não seletivos. Os meios de cultura não seletivos estão envolvidos em estudos em que se deseja isolar uma porção maior da diversidade presente na rizosfera (MENDES et al., 2007; RODRIGUES et al., 2016). Para esse fim são utilizados meios como ágar nutriente (AN) (DAMODARAN et al., 2013), Luria-Bertani (LB) (MAJEED et al., 2015) ou ágar triptona de soja (TSA) (EL-SAYED et al., 2014). Meios não seletivos também podem ser utilizados em estudos que almejam quantificar a comunidade microbiana de cultiváveis, através da contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) (LIOTTI et al., 2018). O mais habitual em estudos de prospecção de RPCV associadas à cana-de-açúcar é a utilização de meios seletivos para a captação de porções especificas da diversidade, capazes de produzir algum dos fatores de promoção do crescimento vegetal. Esses mesmos meios podem ser utilizados para quantificar grupos específicos por meio da contagem de UFC. Como a fixação de nitrogênio e a solubilização de fosfato são as características mais desejadas no estudo das RPCV (MIRZA et al., 2001; KHAN et al., 2007; LIN et al. 2012), há a preferência por empregar meios seletivos para essas características. Entre os principais meios livres de nitrogênio utilizados afim de isolar diazotróficas destacam-se: o meio NFB e LGI para o isolamento do gênero Azospirillum (DÖBEREINER; DAY, 1976; BALDANI, 1984) o meio JNFb para o isolamento de bactérias pertencentes ao gênero Herbaspirillum e Sphingomonas (BALDANI et al., 1992; VIDEIRA et al., 2009); LGI-P para o isolamento do gênero Gluconacetobacter (CAVALCANTE; DÖBEREINER, 1988); JMV para o isolamento do gênero Burkholderia (BALDANI et al., 2000) e o meio Burk, associado a uma gama 45

de espécies (PARK et al., 2005). Embora esses meios tenham sido desenvolvidos para as espécies citadas acima, o isolamento de outros gêneros já foi descrito (TAULÉ et al., 2012; BENEDUZI et al., 2013). Como a nitrogenase é bastante sensível ao oxigênio (DAHAL et al., 2017), o ideal é que o isolamento de diazotróficos seja realizado inicialmente em meios de cultura semi-sólidos ou em meios de cultura sólidos com concentração de oxigênio menor que 2% (MIRZA; RODRIGUES, 2012). Já os meios mais comumente utilizados para o isolamento de micro-organismos solubilizadores de fosfato são o National Botanical Research Institute's phosphate growth medium (NBRIP) (NAUTIYAL, 1999) e o meio Pikovskaya (PVK) (PIKOVSKAYA, 1948). Outro grupo bastante estudado em cana-de-açúcar são as actinobactérias e os meios comumente empregados para seu isolamento são os meios do International Streptomyces Project (ISP) (SHIRLING; GOTTLIEB, 1966) e o ágar amido caseína (AMC) (WELLINGTON; CROSS, 1983). Após o inóculo, as placas devem ser monitoradas rotineiramente e as colônias que forem surgindo transferidas para um novo meio. Os micro-organismos devem então ser purificados até que se obtenham “isolados”, que correspondem a um único morfotipo bacteriano. Após o isolamento e purificação, esses micro-organismos devem ser armazenados em glicerol (20% a 50%; v/v) ou liofilizados para a posterior identificação e testes de caracterização morfológica, bioquímica e molecular, bem como os estudos de promoção do crescimento vegetal, in vitro, em casas de vegetação e no campo (AZEVEDO, 1998; BALDANI et al., 2014). A prospecção dos fatores de promoção do crescimento vegetal, in vitro, geralmente recebem a denominação de screening ou triagem e têm por objetivo selecionar os micro-organismos mais hábeis a promover o crescimento vegetal em casa de vegetação e em campo. Dentro dessa perspectiva, os micro-organismos são triados quando a sua capacidade de agirem como biofertilizantes, fitoestimuladores e agentes de biocontrole. Dentre as principais características buscadas dentro dessas classificações estão: a fixação de nitrogênio, a solubilização de fosfato, a produção de sideróforos, a produção de AIA, a produção de ACC deaminase, a produção de compostos voláteis (amônia e HCN), a produção de enzimas (celulases, quitinases) e os testes de antagonismo frente a diversas cepas patógenas indicadoras (BHATTACHARYYA; JHA, 2012; DA COSTA et al., 2013; BAEZ-ROGELIO et al., 2017). Há inúmeras técnicas para se buscar in vitro essas características. A fixação de nitrogênio, por exemplo, pode ser acessada pelo cultivo dos micro-organismos em meios semi-sólidos livres de nitrogênio, pela técnica de redução do acetileno, amplicação dos genes nif e/ou a incorporação do 15 isótopo de N2 (GTARI et al., 2012). A solubilização de fosfato é avaliada usualmente pelo 46

crescimento dos micro-organismos em meios sólidos que contêm uma fonte de fosfato insolúvel ou de modo quantitativo por espectrofotometria com o emprego do reagente vandato-molibidato (PIKOVSKAYA, 1948; NAUTIYAL, 1999; SILVA, 2009). A produção de AIA, por outro lado, pode ser verificada por método colorimétrico (passível de quantificação por espectrofotometria) ou por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) (GORDON; WEBER, 1951; HARIKRISHNAN et al., 2014). A produção de amônia emprega métodos colorimétricos (CAPPUCCINO; SHERMAN, 1992; DEY et al., 2004), enquanto a produção de HCN, AAC deaminase, sideróforos, celulases, quitinases e o antagonismo contra patógenos são realizadas em meios de cultura sólidos. Nestes ensaios existe a possibilidade de: o substrato da enzima ser utilizado como única fonte de carbono (ACC deaminase, celulases e quitinases), o micro-organismo ao incorporar algum reagente do meio modificar sua cor (sideróforo), haver a produção de compostos voláteis que modificam a cor de um reagente depositado em papel filtro na tampa da placa (HCN) e o inóculo do micro-organismo teste inibir o crescimento de algum patógeno que foi co-inoculado (antagonismo) (BAKKER; SCHIPPERS, 1987; SCHWYN; NEILANDS, 1987; GLICK, 1995; CATTELAN, 1999; KASANA et al., 2008; EL-SAYED et al., 2014). A afiliação taxonômica dos micro-organismos pode ser realiza em todos os micro-organismos isolados, gerando assim um trabalho de diversidade de cultiváveis ou pode ser realizada nos micro- organismos que apresentaram melhor desempenho in vitro. A identificação dos micro-organismos isolados usualmente é feita via amplificação e sequenciamento parcial da região do gene 16S rRNA. Entretanto, técnicas utilizando cromatografia gasosa para detecção de ácidos graxos, coloração de Gram e o perfil de consumo de diversos substratos também são empregados (SASSER, 1990, ADZITEY et al., 2013; BARBOSA et al., 2015; AL-DHABAAN; BAKHALI, 2017). A seleção dos micro-organismos e sua aplicação em testes em casa de vegetação vão depender do objetivo que se deseja alcançar. Se objetivo for o biocontrole, a seleção dos micro- organismos deve se pautar em priorizar micro-organismos que apresentaram as melhores atividades antagônicas e produção de fatores indiretos da promoção do crescimento vegetal (DINESH et al., 2015; YANTI, et al., 2017). Em casos em que se deseja o crescimento vegetal propriamente dito, a seleção deve se basear em micro-organismos que apresentem as melhores atividades como biofertilizantes e fitoestimulantes (AMBROSINI et al., 2012; KAVAMURA et al., 2013; RODRIGUES et al., 2016). A promoção do crescimento vegetal em casa de vegetação pode acontecer devido a mais de um dos fatores triados in vitro. Nesse contexto é interessante a seleção daqueles organismos que 47

apresentam múltiplas características de promoção do crescimento, pois esses apresentam maiores chances de se adaptar as mais diversas condições ambientais e de solo (RANA et al., 2011). Embora a seleção de micro-organismos com múltiplas características de promoção do crescimento vegetal seja interessante, nem sempre um bom produtor de fosfato, produzirá grandes quantidades de AIA. Dessa forma, usar micro-organismos em consórcio em detrimento da inoculação com cepas individuais pode ser uma boa alternativa (DIAS et al., 2009; HUNGRIA et al., 2013). O primeiro desafio da aplicação de um micro-organismo promotor de crescimento vegetal em campo refere-se a escolha de uma formulação (matriz) que seja passível de armazenamento e que ao mesmo tempo mantenha os micro-organismos viáveis até sua aplicação em campo. O micro- organismo inoculado deve ser capaz de sobreviver no solo, visto que o solo no qual ele foi inoculado é diferente daquele em que ele foi isolado. Além disso, o micro-organismo inoculado deve ser capaz de colonizar a rizosfera, interagir positivamente com os exsudatos radiculares e ser capaz de sobreviver à produção de agentes antimicrobianos adversos por outros micro-organismos da rizosfera e pela própria planta (MOREIRA et al., 2010; DA SILVA et al., 2012; DE SOUZA et al., 2015). Ademais, as bactérias promotoras do crescimento vegetal utilizadas como inoculantes exibem diversas vantagens em comparação aos pesticidas e fertilizantes sintéticos: (1) são capazes de reduzir os impactos ambientais causados pelos pesticidas e fertilizantes sintéticos, (2) São efetivos em pequenas concentrações e são capazes de se multiplicar (3) São regulados pelos vegetais e pelos demais micro-organismos do solo, (4) se decompõem com mais facilidade (BERG, 2009).

4 ESTRUTURA DA TESE

A tese apresenta-se subdividida em três capítulos e um apêndice organizados na forma de artigos científicos e está disposta da seguinte forma:

Capítulo 1. Mudanças na estrutura e função da comunidade microbiana da rizosfera de cana-de- açúcar em resposta ao manejo orgânico. Este estudo almejou avaliar o comportamento da comunidade rizosférica a nível taxonômico e funcional em resposta ao manejo orgânico e verificar como os atributos do solo contribuíam para o processo. A versão final deste artigo será submetida, provavelmente, a revista Frontiers in plant Science.

Capítulo 2. Isolamento e prospecção de rizobactérias diazotróficas associadas a cana-de-açúcar sob manejo orgânico. O estudo almejou isolar e identificar rizobactérias diazotróficas associadas a cana- de-açúcar sob manejo orgânico oriundas de duas usinas localizadas no estado de Goiás, Brasil e avaliar a produção in vitro de fatores de promoção de crescimento vegetal produzidos por esses micro-organismos. A versão em inglês do artigo foi submetida em março de 2018 a revista Anais da Academia Brasileira de Ciências.

Capítulo 3. Isolamento e screening de actinobactérias oriundas de rizosfera de cana-de-açúcar orgânica portadoras de múltiplos fatores de promoção do crescimento vegetal. O estudo almejou isolar e selecionar in vitro actinobactérias com múltiplas características de promoção do crescimento vegetal associadas à rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico oriundo de duas usinas localizadas no estado de Goiás, Brasil. A versão em inglês do artigo foi submetida em março de 2018 a revista International Journal of Microbiology Research.

Apêndice I: Isolation and selection of plant growth-promoting bacteria associated with sugarcane. Consta, na integra, o artigo publicado em junho de 2016 na revista Pesquisa Agropecuária Tropical e desenvolvido durante a disciplina de oficinas em análise ambiental. Versa sobre o isolamento e prospecção de bactérias de cana-de-açúcar sob manejo tradicional e sua aplicação como bioinoculantes de milho. Embora não faça parte do escopo principal do trabalho, foi um importante direcionador para os trabalhos com cana-de-açúcar orgânica.

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AßHAUER, K. P. et al. Tax4Fun: predicting functional profiles from metagenomic 16S rRNA data. Bioinformatics, v. 31, n. 17, p. 2882-2884, 2015.

ADZITEY, F.; HUDA, N.l.; ALI, G. R. R. Molecular techniques for detecting and typing of bacteria, advantages and application to foodborne pathogens isolated from ducks. 3 Biotech, v. 3, n. 2, p. 97- 107, 2013.

AGUIAR, M. M. de. Produção orgânica de café gera lucros e satisfação. Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v. 23, n. 214, p. 1- 4, 2002.

AHEMAD, M.; KIBRET, M. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: Current perspective. Journal of King Saud University - Science, v. 26, n. 1, p. 1–20, 2014.

AL-DHABAAN, F. A. M.; BAKHALI, A. H. Analysis of the bacterial strains using Biolog plates in the contaminated soil from Riyadh community. Saudi journal of biological sciences, v. 24, n. 4, p. 901-906, 2017.

AMBROSINI, A. et al. Screening of plant growth promoting rhizobacteria isolated from sunflower (Helianthus annuus L.). Plant and soil, v. 356, n. 1-2, p. 245-264, 2012.

ARAÚJO, A. S. F.; SANTOS, V. B.; MONTEIRO, R. T. R. Responses of soil microbial biomass and activity for practices of organic and conventional farming systems in Piauí state, Brazil. European Journal of Soil Biology, v. 44, n. 2, p. 225–230, 2008.

ARMANHI, J. S. L. et al. A community-based culture collection for targeting novel plant growth- promoting bacteria from the sugarcane microbiome. Frontiers in Plant Science, v. 8, 2018.

AZEVEDO, J. L. Microrganismos endofíticos. Ecologia microbiana, p. 117-137, 1998.

BAEZ‐ROGELIO, A. et al. Next generation of microbial inoculants for agriculture and bioremediation. Microbial biotechnology, v. 10, n. 1, p. 19-21, 2017.

BABALOLA, O. O. Beneficial bacteria of agricultural importance. Biotechnology Letters, v. 32, n. 11, p. 1559–1570, 2010.

BAKKER, A.W.; SCHIPPERS, B. Microbial cyanide production in the rhizosphere in relation to potato yield reduction and Pseudomonas spp-mediated plant growth-stimulation. Soil Biology and Biochemistry, v. 19, n. 4, p. 451-457, 1987.

BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D. History on the biological nitrogen fixation research in graminaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 77, n. 3, p. 549-579, 2005.

BALDANI, J. I. et al. A 4th Azospirillum species from cereal roots. Anais da Academia Brasileira de Ciências. p. 365-365, 1984.

BALDANI, J. I. et al. Recent advances in BNF with non-legume plants. Soil Biology and Biochemistry, v. 29, n. 5-6, p. 911-922, 1997.

BALDANI, J. I. et al. The art of isolating nitrogen-fixing bacteria from non-leguminous plants using N-free semi-solid media: a practical guide for microbiologists. Plant and soil, v. 384, n. 1-2, p. 413- 431, 2014.

BALDANI, V. L. D. et al. Identification and ecology of Herbaspirillum seropedicae and the closely related Pseudomonas rubrisubalbicans. SYMBIOSIS-REHOVOT, v. 12, p. 65-65, 1992.

BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J. Inoculation of rice plants with the endophytic diazotrophs Herbaspirillum seropedicae and Burkholderia spp. Biology and Fertility of Soils, v. 30, n. 5-6, p. 485-491, 2000.

BANSCHBACH, V. S.; LETOVSKY, R. The Use of Corn versus Sugarcane to Produce Ethanol Fuel: A Fermentation Experiment for Environmental Studies. The American Biology Teacher, v. 72, n. 1, p. 31–36, 2010.

BARBOSA, E. C. et al. Isolamento, identificação e avaliação das atividades enzimática e antibacteriana de micro-organismos endofíticos de Hyptis suaveolens (L.) Poit. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, v.11 n.22; p. 3036 2015. p. 3036–3055, 2015.

BARBOSA, L. A. Impacto de sistemas de cultivo orgânico e convencional da cana-de-açúcar nos atributos do solo. Brasília, 2010. 80 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia). Universidade de Brasília.

BAREA, J. M. et al. Microbial co-operation in the rhizosphere. Journal of experimental botany, v. 56, n. 417, p. 1761-1778, 2005.

BARRIUSO, J. et al. Ecology, genetic diversity and screening strategies of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). Journal of Plant nutrition, p. 1-17, 2008.

BENEDUZI, A. et al. Diversity and plant growth promoting evaluation abilities of bacteria isolated from sugarcane cultivated in the South of Brazil. Applied Soil Ecology, v. 63, n.1, p. 94–104, 2013.

BERG, G. Plant–microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture. Applied microbiology and biotechnology, v. 84, n. 1, p. 11- 18, 2009.

BERG, G.; SMALLA, K. Plant species and soil type cooperatively shape the structure and function of microbial communities in the rhizosphere. FEMS microbiology ecology, v. 68, n. 1, p. 1-13, 2009.

BHARDWAJ, D. et al. Biofertilizers function as key player in sustainable agriculture by improving soil fertility, plant tolerance and crop productivity. Microbial cell factories, v. 13, n. 1, p. 66, 2014.

BHATTACHARYYA, P. N.; JHA, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Emergence in agriculture. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 28, n.4, p. 1327 -1350, 2012.

BIGATON, A. D. Diversidade de bactérias e arquéias em solos cultivados com cana-de-açúcar: um enfoque biogeográfico. 2014. 95f. Tese de doutorado (Doutor em Microbiologia Agrícola). Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Piracicaba, São Paulo.

BODDEY, L. H. et al. Avaliação da fixação biológica de N2 associada a leguminosas e não- leguminosas utilizando a técnica da redução do acetileno: história, teoria e prática. Embrapa Agrobiológia; Seropédica, RJ, 2007. 43 p.

BODDEY, R. M.; URQUIAGA, S. Calculations and assumptions involved in the use of the A-value and 15N isotope dilution techniques for the estimation of the contribution of plant-associated biological N2 fixation. Plant and Soil, Dordrecht, v. 145, p. 151- 155, 1992.

BORGES, L. A. B. Atributos químicos, acúmulo de carbono e nitrogênio e nutrição da cana- de-açúcar orgânica em Latossolo de Cerrado. Goiânia, 2013. 129 f. Tese (Doutorado em Agronomia). Universidade Federal de Goiás.

BOUFFAUD, M. L. et al. Is diversification history of maize influencing selection of soil bacteria by roots?. Molecular ecology, v. 21, n. 1, p. 195-206, 2012.

BOUBETRA, D. et al. Taxonomy and chemical characterization of new antibiotics produced by Saccharothrix SA198 isolated from a Saharan soil. Microbiological Research, v. 168, n. 4, p. 223– 230, 2013.

BRASIL. Lei n.º 10.831, de 23 de dezembro de 2003, dispõe sobre a agricultura orgânica e dá outras providências. Diário Oficial da União. Poder Executivo, Brasília, DF, 24 dez. 2003.

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Balanço nacional de cana -de- açúcar e agroenergia. Secretaria de Produção e Agroenergia – Brasília: MAPA/SPAE, 2007.139 p.

BRASIL. Economia e Emprego. Agricultura orgânica deve movimentar R$ 2,5 bi em 2016. 2015. Disponível em: . Acesso em: junho de 2016.

BHAT, A. K. Preserving microbial diversity of soil ecosystem: a key to sustainable productivity. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, v. 2, n. 8, p. 85-101, 2013.

BULGARELLI, D. et al. Revealing structure and assembly cues for Arabidopsis root-inhabiting bacterial microbiota. Nature, v. 488, n. 7409, p. 91, 2012.

CALDWELL, A. C. et al. Prokaryotic diversity in the rhizosphere of organic, intensive, and transitional coffee farms in Brazil. PloS one, v. 10, n. 6, p. e0106355, 2015.

CAPORASO, J. G. et al. The Western English Channel contains a persistent microbial seed bank. The ISME journal, v. 6, n. 6, p. 1089, 2012.

CAPPUCCINO, J. C.; SHERMAN, N. Microbiology: a laboratory manual. 3. ed. New York: Benjamin/Cummings Pub. Co., 1992. p. 125-179.

CARDOZO, N. P.; BORDONAL, R. DE O.; LA SCALA, N. Greenhouse gas emission estimate in sugarcane irrigation in Brazil: Is it possible to reduce it, and still increase crop yield? Journal of Cleaner Production, v.112, n. 2016, p. 3988-3997, 2016.

CARVALHO, T. L. G. et al. Nice to meet you: genetic, epigenetic and metabolic controls of plant perception of beneficial associative and endophytic diazotrophic bacteria in non-leguminous plants. Plant Molecular Biology, v. 90, n. 6, p. 561–574, 2016.

CASTRO-GONZÁLEZ, R. et al. High diversity of culturable Burkholderia species associated with sugarcane. Plant and Soil, v. 345, n. 1, p. 155–169, 2011.

CATTELAN, A. J. Métodos quantitativos para determinação de características bioquímicas e fisiológicas associadas com bactérias promotoras de crescimento vegetal. Embrapa Soja; Londrina, PR, 1999. 36 p.

CAVALCANTE, V. A.; DOBEREINER, J. A new acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium associated with sugarcane. Plant and soil, v. 108, n. 1, p. 23-31, 1988.

CHAPARRO, J. M. et al. Manipulating the soil microbiome to increase soil health and plant fertility. Biology and Fertility of Soils, v. 48, n. 5, p. 489-499, 2012.

CHIEN, S. H. et al. Agronomic and environmental aspects of phosphate fertilizers varying in source and solubility: An update review. Nutrient Cycling in Agroecosystems, v.89, n.2, p.229-255, 2011.

COMPANT, S.; CLÉMENT, C.; SESSITSCH, A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biology and Biochemistry, v. 42, n. 5, p. 669–678, 2010.

CONAB- Companhia Nacional de Abastecimento. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Acompanhamento da safra brasileira – cana-de-açúcar, v. 2 - Safra 2015/16, n. 3 - terceiro levantamento. Brasília-DF. 2015. 65 p. Disponível em: http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/15_12_17_09_03_29_boletim_cana_portugue s_-_3o_lev_-_15-16.pdf. Acesso em junho 2016.

CONAB- Companhia Nacional de Abastecimento. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Acompanhamento da safra brasileira – cana-de-açúcar, v. 4 - Safra 2017/18, n. 3 - terceiro levantamento. Brasília-DF. 2017. 81 p. Disponível em: http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/18_01_08_09_08_38_cana_dezembro_novo.p df. Acesso em janeiro 2018.

CROWDER, D. W.; REGANOLD, J. P. Financial competitiveness of organic agriculture on a global scale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 112, n. 24, p. 7611–7616, 2015.

CUNHA, F. N. et al. Yield of sugarcane submitted to nitrogen fertilization and water depths by subsurface drip irrigation. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, v. 20, n. 9, p. 841-846, 2016.

DA COSTA, D. P. et al. Composição diferencial das comunidades bacterianas na rizosfera de variedades de Cana-De-Açúcar. Revista Brasileira de Ciencia do Solo, v. 38, n. 6, p. 1694–1702, 2014.

DA COSTA, P. B. et al. The effects of different fertilization conditions on bacterial plant growth promoting traits: guidelines for directed bacterial prospection and testing. Plant and soil, v. 368, n. 1-2, p. 267-280, 2013.

DA SILVA, M. F. et al. Survival of endophytic bacteria in polymer-based inoculants and efficiency of their application to sugarcane. Plant and Soil, v. 356, n. 1–2, p. 231–243, 2012.

DAHAL, B. et al. Diversity of free-Living nitrogen fixing Streptomyces in soils of the badlands of South Dakota. Microbiological research, v. 195, p. 31-39, 2017.

DAI, Z. et al. Identification of nitrogen-fixing genes and gene clusters from metagenomic library of

acid mine drainage. PLoS ONE, v. 9, n. 2, p. 1–9, 2014.

DAMODARAN, T. et al. Isolation of salt tolerant endophytic and rhizospheric bacteria by natural selection and screening for promising plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) and growth vigour in tomato under sodic environment. African Journal of Microbiology Research, v. 7, n. 44, p. 5082-5089, 2013.

DANHORN, T.; FUQUA, C. Biofilm Formation by Plant-Associated Bacteria. Annual Review of Microbiology, v. 61, n. 1, p. 401–422, 2007.

DE MORAIS, L. K. et al. Melhoramento genético de cana-de-açúcar. Aracaju, SE: Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2015. 38 p.

DE SOUZA, R.; AMBROSINI, A.; PASSAGLIA, L. M. P. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology, v.38, n.4, p. 401-419, 2015.

DE SOUZA, R. S. C.et al. Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome. Scientific Reports, v. 6, n. February, p. 1–15, 2016.

DE WEERT, S. et al. Flagella-driven chemotaxis towards exudate components is an important trait for tomato root colonization by Pseudomonas fluorescens. Molecular Plant-Microbe Interactions, v. 15, n. 11, p. 1173-1180, 2002.

DEY, R. K. K. P. et al. Growth promotion and yield enhancement of peanut (Arachis hypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria. Microbiological research, v. 159, n. 4, p. 371-394, 2004.

DELGADO, O. M.; MEJIVAR, J. C.; MUÑOZ, F. Influence of management systems on the nitrogen mineralization and fertilization of sugarcane. Revista Facultad Nacional de Agronomía, v. 69, n. 1, p. 7755–7762, 2016.

DESHMUKH, P.; SHINDE, S. Beneficial Role of Rhizosphere Mycoflora in the Field of Agriculture: An Overview. International Journal of Science and Research. v.5, n.8, p. 529 - 533, 2016.

DI, D. W. et al. The biosynthesis of auxin: how many paths truly lead to IAA? Plant Growth

Regulation, v. 78, n. 222, p. 275–285, 2015.

DIAS, A. C. F et al. Isolation of micropropagated strawberry endophytic bacteria and assessment of their potential for plant growth promotion. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 25, n. 2, p. 189-195, 2009.

DINESH, R. et al. Isolation, characterization, and evaluation of multi-trait plant growth promoting rhizobacteria for their growth promoting and disease suppressing effects on ginger. Microbiological research, v. 173, p. 34–43, 2015.

DÖBEREINER, J.; DAY, J. M. Associative symbioses in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites. In: Proceedings of the 1st international symposium on nitrogen fixation. Washington State University Press Pullman, 1976. p. 518-538.

DÖBEREINER, J.; DAY, J.M.; DART, P.J. Nitrogenase activity in the rhizosphere of sugar cane and some other tropical grasses. Plant and Soil, v. 37, p. 191-196, 1972.

DÖBEREINER, J.; RUSCHEL, A. P. Uma nova espécie de Beijerinckia. Revista de Biologia, Lisboa, v. 1, p. 261-272, 1958.

DOORNBOS, R. F.; VAN LOON, L. C.; BAKKER, P. A. Impact of root exudates and plant defense signaling on bacterial communities in the rhizosphere. A review. Agronomy for Sustainable Development, v. 32, n. 1, p. 227-243, 2012.

DOS SANTOS, I. B. et al. Diazotrophic bacteria associated to roots of sugarcane: inorganic phosphate solubilization and the salinity tolerance. Bioscience Journal, v. 28, n. 1, p. 142-149, 2012.

DUAN, J. et al. 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase genes in rhizobia from southern saskatchewan. Microbial Ecology, v. 57, n. 3, p. 423–436, 2009.

DURRER, A. et al. The drivers underlying biogeographical patterns of bacterial communities in soils under sugarcane cultivation. Applied Soil Ecology, v. 110, p. 12-20, 2016.

EGESKOG, A. et al. Actions and opinions of Brazilian farmers who shift to sugarcane—an interview-based assessment with discussion of implications for land-use change. Land Use Policy, v. 57, n. August, p. 594–604, 2016.

EL-SAYED, W. S. et al. In vitro antagonistic activity, plant growth promoting traits and phylogenetic affiliation of rhizobacteria associated with wild plants grown in arid soil. Frontiers in microbiology, v. 5, p. 651, 2014.

ESPOSITO-POLESI, N. P. Microrganismos endofíticos e a cultura de tecidos vegetais: quebrando paradigmas. Revista Brasileira de Biociências, v. 9, n. 4, p. 533–541, 2011.

FGAIER, H.; EBERL, H. J. Antagonistic control of microbial pathogens under iron limitations by siderophore producing bacteria in a chemostat setup. Journal of Theoretical Biology, v. 273, n. 1, p. 103–114, 2011.

FOTEINIS, S.; CHATZISYMEON, E. Life cycle assessment of organic versus conventional agriculture. A case study of lettuce cultivation in Greece. Journal of Cleaner Production, v. 112, p. 2462–2471, 2016.

FOTI, M. et al. Diversity, activity, and abundance of sulfate-reducing bacteria in saline and hypersaline soda lakes. Applied and environmental microbiology, v. 73, n. 7, p. 2093-2100, 2007.

FREITAS, J.R.et al. Estimation of N2-fixation by sugar cane, Saccharum sp. and soybean, Glycine max, grown in soil with 15N labelled organic matter. Plant and Soil, v. 82, p. 257-261, 1984.

GABY, J. C.; BUCKLEY, D. H. A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria. Database: the journal of biological databases and curation, v. 2014, p. 1–8, 2014.

GABY, J. C.; BUCKLEY, D. H. A comprehensive evaluation of PCR primers to amplify the nifH gene of nitrogenase. PLoS ONE, v. 7, n. 7, p. 1-7, 2012.

GAO, D.; TAO, Y.. Current molecular biologic techniques for characterizing environmental microbial community. Frontiers of Environmental Science & Engineering, v. 6, n. 1, p. 82-97, 2012.

GAONKAR, T.; BHOSLE, S. Effect of metals on a siderophore producing bacterial isolate and its implications on microbial assisted bioremediation of metal contaminated soils. Chemosphere, v. 93, p. 1835–1843, 2013.

GARBEVA, P.; VAN ELSAS, J. D.; VAN VEEN, J. A. Rhizosphere microbial community and its response to plant species and soil history. Plant and soil, v. 302, n. 1-2, p. 19-32, 2008.

GLICK, B. R. The enhancement of plant growth by free-living bacteria. Canadian journal of microbiology, v. 41, n. 2, p. 109-117, 1995.

GLICK, B. R. Plant growth-promoting bacteria: mechanisms and applications. Scientifica, v. 2012, p. 1- 10, 2012.

GLICK, B. R. Bacteria with ACC deaminase can promote plant growth and help to feed the world. Microbiological Research, v. 169, n. 1, p. 30–39, 2014.

GLICK, B. R. et al. Promotion of plant growth by ACC deaminase-producing soil bacteria. European Journal of Plant Pathology, v. 2007, p. 329–339, 2007.

GLIESSMAN, S. R. Agroecologia: processos ecológicos em agricultura sustentável. 4.ed. Porto Alegre: Editora Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2009.

GOLDEMBERG, J.; COELHO, S. T.; GUARDABASSI, P. The sustainability of ethanol production from sugarcane. Energy Policy, v. 36, n. 6, p. 2086–2097, 2008.

GOODRICH, J. K. et al. Conducting a microbiome study. Cell, v. 158, n. 2, p. 250-262, 2014.

GOPALAKRISHNAN, S. et al. Plant growth-promoting traits of biocontrol potential bacteria isolated from rice rhizosphere. SpringerPlus, v. 1, n. 71, p. 1–7, 2012.

GOSWAMI, D.; THAKKER, J. N.; DHANDHUKIA, P. C. Simultaneous detection and quantification of indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA) produced by rhizobacteria from l-tryptophan (Trp) using HPTLC. Journal of Microbiological Methods, v. 110, n. 1, p. 7–14, 2015.

GOUDJAL, Y. et al. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off and promotion of tomato plant growth by endophytic actinomycetes isolated from native plants of Algerian Sahara. Microbiological Research, v. 169, n. 1, p. 59–65, 2014.

GOTTEL, N. R. et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of Populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and environmental microbiology, v. 77, n. 17, p. 5934-5944, 2011.

GORDON, S. A.; WEBER, R. P. Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant physiology, v. 26, n. 1, p. 192, 1951.

GRICHKO, V. P.; GLICK, B. R. Amelioration of flooding stress by ACC deaminase-containingplant growth-promoting bacteria. Plant Physiology and Biochemistry, v. 39, n. 1, p. 11-17, 2001.

GTARI, M. et al. Phylogenetic perspectives of nitrogen-fixing actinobacteria. Archives of microbiology, v. 194, n. 1, p. 3-11, 2012.

GUMIERE, T. et al. Biogeographical patterns in fungal communities from soils cultivated with sugarcane. Journal of Biogeography, v. 43, n. 10, p. 2016–2026, 2016.

GUPTA, G. et al. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR): Current and Future Prospects for Development of Sustainable Agriculture. Journal of Microbial & Biochemical Technology, v. 7, n. 2, p. 96–102, 2015.

HASSAN, M. N.; AFGHAN, S.; HAFEEZ, F. Y. Suppression of red rot caused by Colletotrichum falcatum on sugarcane plants using plant growth-promoting rhizobacteria. BioControl, v. 55, n. 4, p. 531–542, 2010.

HAYAT, R. et al. Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: A review. Annals of Microbiology, v. 60, n. 4, p. 579–598, 2010.

HE, Y. et al. Stability of operational taxonomic units: an important but neglected property for analyzing microbial diversity. Microbiome, v. 3, n. 1, p. 20, 2015.

HILTNER, L. T. U. Neuere Erfahrungen und Probleme auf dem Gebiet der Bodenbakteriologie und unter besonderer Berucksichtigung der Grundungung und Brache. Arb. Dtsch. Landwirt. Ges., v.

98, p. 59-78, 1904.

HENNERON, L. et al. Fourteen years of evidence for positive effects of conservation agriculture and organic farming on soil life. Agronomy for Sustainable Development, v. 35, n. 1, p. 169–181, 2014.

HUNGRIA, M.; CAMPO, R. J.; MENDES, I. de C. Fixação biológica do nitrogênio na cultura da soja. Embrapa Soja; Brasília, DF, 2001. 48p.

HUNGRIA, M.; NOGUEIRA, M. A.; ARAUJO, R. S. Co-inoculation of soybeans and common beans with rhizobia and azospirilla: strategies to improve sustainability. Biology and Fertility of Soils, v. 49, n. 7, p. 791-801, 2013.

IBEKWE, A. M. et al. Bacterial diversity in cucumber (Cucumis sativus) rhizosphere in response to salinity, soil pH, and boron. Soil Biology and Biochemistry, v. 42, n. 4, p. 567-575, 2010.

IKEDA, S. et al. Low nitrogen fertilization adapts rice root microbiome to low nutrient environment by changing biogeochemical functions. Microbes and environments / JSME, v. 29, n. 1, p. 50–9, 2014.

İNCEOĞLU, Ö. et al. Comparative analysis of bacterial communities in a potato field as determined by pyrosequencing. PLoS One, v. 6, n. 8, p. e23321, 2011.

INUI-KISHI, R. N. et al. Phosphorus solubilizing and IAA production activities in plant growth promoting rhizobacteria from brazilian soils under sugarcane cultivation. ARPN Journal of Engineering and Applied Sciences, v. 7, n. 11, p. 1446–1454, 2012.

JONES, D. L.; NGUYEN, C.; FINLAY, R. D. Carbon flow in the rhizosphere: carbon trading at the soil–root interface. Plant and Soil, v. 321, n. 1-2, p. 5-33, 2009.

KARAGÖZ, K. et al. Characterization of plant growth-promoting traits of bacteria isolated from the rhizosphere of grapevine grown in alkaline and acidic soils. European Journal of Soil Biology, v. 50, n. 5, p. 144–150, 2012.

KASANA, R. C. et al. A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine. Current microbiology, v. 57, n. 5, p. 503-507, 2008.

KAUR, G.; REDDY, M. S. Phosphate solubilizing rhizobacteria from an organic farm and their influence on the growth and yield of maize (Zea mays L.). The Journal of General and Applied Microbiology, v. 59, n. 4, p. 295–303, 2013.

KAVAMURA, V. N. et al. Screening of Brazilian cacti rhizobacteria for plant growth promotion under drought. Microbiological research, v. 168, n. 4, p. 183-191, 2013.

KHAN, M. S.; ZAIDI, A.; WANI, P. A. Role of phosphate-solubilizing microorganisms in sustainable agriculture—a review. Agronomy for sustainable development, v. 27, n. 1, p. 29-43, 2007.

KRUASUWAN, W.; THAMCHAIPENET, A. Diversity of Culturable Plant Growth-Promoting Bacterial Endophytes Associated with Sugarcane Roots and Their Effect of Growth by Co- Inoculation of Diazotrophs and Actinomycetes. Journal of Plant Growth Regulation,v. 35, n.1. p. 1-14, 2016.

KUMAR, M. Bacteria involving in nitrogen fixation and their evolutionary correlation. International Journal of Current Microbiology, p. 824-830, 2014.

LAGOS, L. et al. Current overview on the study of bacteria in the rhizosphere by modern molecular techniques: a mini‒review. Journal of soil science and plant nutrition, v. 15, n. 2, p. 504-523, 2015.

LANA, R. M. Q. et al. Evaluation of chemical attributes of soil under different management systems of sugarcane in an area of expansion. Bioscience Journal, v. 32, n. 3, p. 611-618, 2016.

LANGILLE, M. G. I. et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature biotechnology, v. 31, n. 9, p. 814, 2013.

LEITE, J. M. Eficiência agronômica da adubação nitrogenada associada à aplicação de substâncias húmicas em cana-de-açúcar. 2016. 130f. Tese de doutorado (Doutor em Microbiologia Agrícola). Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Piracicaba, São Paulo.

LEVY-BOOTH, D. J.; PRESCOTT, C. E.; GRAYSTON, S. J. Microbial functional genes involved in nitrogen fixation, nitrification and denitrification in forest ecosystems. Soil Biology and Biochemistry, v. 75, p. 11–25, 2014. 62

LI, J. H. et al. Genetic diversity and potential for promotion of plant growth detected in nodule endophytic bacteria of soybean grown in Heilongjiang province of China. Soil Biology and Biochemistry, v. 40, n. 1, p. 238–246, 2008.

LI, R. et al. Pyrosequencing Reveals the Influence of Organic and Conventional Farming Systems on Bacterial Communities. PLoS ONE, v. 7, n. 12, p. 1-12, 2012.

LIMA, R. C. et al. Caracterização Fenotípica de Bactérias Diazotróficas Endofíticas Isoladas de Cana de Açúcar. Revista Facultad Nacional de Agronomía - Mendellín, v. 64, n. 1, p. 5803–5813, 2011.

LIN, L. et al. Plant Growth-Promoting Nitrogen-Fixing Enterobacteria Are in Association with Sugarcane Plants Growing in Guangxi, China. Microbes Environment, v. 27, n. 4, p. 391–398, 2012.

LIOTTI, R. G. et al. Diversity of cultivable bacterial endophytes in Paullinia cupana and their potential for plant growth promotion and phytopathogen control. Microbiological Research, v. 207, p. 8-18, 2018.

LIRA-CADETE, L. et al. Bactérias Associadas a Plantas De Cana-De-Açúcar Capazes De Solubilizar Fosfato Inorgânico. Bioscience Journal, v. 28, n.1, p. 122–129, 2012.

LOPES, D. O. P. Categorias de resistência de genótipos de Saccharum spp. à cigarrinha (Hemiptera: Cercopidae) da Raiz. 2016. 54f. Tese (Doutorado em Agronomia)- Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual de São Paulo, Jaboticabal.

LOPES, L. D.; PEREIRA E SILVA, M. C.; ANDREOTE, F. D. Bacterial abilities and adaptation toward the rhizosphere colonization. Frontiers in microbiology, v. 7, p. 1341, 2016.

LUPATINI, M. et al.Soil microbiome is more heterogeneous in organic than in conventional farming system. Frontiers in Microbiology, v. 7, n. JAN, p. 1–13, 2017.

LUGTENBERG, B.; KAMILOVA, F. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annual review of microbiology, v. 63, p. 541-556, 2009.

MAGNANI, G. S. et al. Diversity of endophytic bacteria in Brazilian sugarcane. Genetics and

Molecular Research, v. 9, n. 1, p. 250–258, 2010.

MAJEED, A. et al. Isolation and characterization of plant growth-promoting rhizobacteria from wheat rhizosphere and their effect on plant growth promotion. Frontiers in microbiology, v. 6, p. 198, 2015.

MANTER, D. K. et al. Pyrosequencing reveals a highly diverse and cultivar-specific bacterial endophyte community in potato roots. Microbial ecology, v. 60, n. 1, p. 157-166, 2010.

MARIN, F. R. et al. Prospects for Increasing Sugarcane and Bioethanol Production on Existing Crop Area in Brazil. BioScience, v. 66, n. 4, p. 307-316, 2016.

MAHONEY, A. K.; YIN, C.; HULBERT, S. H. Community structure, species variation, and potential functions of rhizosphere-associated bacteria of different winter wheat (Triticum aestivum) cultivars. Frontiers in plant science, v. 8, p. 132, 2017.

MARQUES, D. M. F. et al. Produção e preço da cana-de-açúcar em Goiás. Conjuntura Econômica Goiana, v. 23, n. 1, p. 32-43, 2012.

MARQUES, A. P. G. C. et al. Assessment of the plant growth promotion abilities of six bacterial isolates using Zea mays as indicator plant. Soil Biology and Biochemistry, v. 42, n. 8, p. 1229-1235, 2010.

MARRA, L. M. et al. Solubilização de fosfatos por bactérias e sua contribuição no crescimento de leguminosas e gramíneas. Plant and Soil, v. 357, n.1, p. 289-307, 2012.

MCNEAR, D.H. The rhizosphere: rottes, soil and everything in between. Nature Reviews Microbiology, v. 4, n. 3, p. 1–13, 2012.

MENDES, R. et al. Diversity of cultivated endophytic bacteria from sugarcane: genetic and biochemical characterization of Burkholderia cepacia complex isolates. Applied and Environmental Microbiology, v. 73, n. 22, p. 7259–7267, 2007.

MEURER, P. A. S. et al. Análise da Agroindústria Canavieira nos Estados do Centro-Oeste do Brasil a partir da Matriz de Capacidades Tecnológicas. Revista de Economia e Sociologia Rural, v. 53, n. 1, p. 159–178, 2015.

MIRANSARI, M. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). Encyclopedia of Genetics, v. 63, n. May 2015, p. 49, 2001.

MIRZA, M. S. et al. Isolation, partial characterization, and the effect of plant growth-promoting bacteria (PGPB) on micro-propagated sugarcane in vitro. Plant and Soil, v. 237, n. 1, p. 47-54, 2001.

MIRZA, B. S.; RODRIGUES, J. L. M. Development of a direct isolation procedure for free-living diazotrophs under controlled hypoxic conditions. Applied and environmental microbiology, v. 78, n. 16, p. 5542-5549, 2012.

MORAIS, L. K. et al Evaluation of Performance of Sugarcane Genotypes Inoculated With Endophytic Diazotrophic Bacteria. Balancing Sugar and Energy Production in Developing Countries. Sustainable Technologies and Marketing Strategies, v. 95, p. 92–95, 2011.

MOREIRA, F. M. S. et al. Bactérias diazotróficas associativas: diversidade, ecologia e potencial de aplicações. Comunicata Scientiae, v. 1, n. 2, p. 74, 2010.

MORGAN, J. A. W.; BENDING, G. D.; WHITE, P. J. Biological costs and benefits to plant– microbe interactions in the rhizosphere. Journal of experimental botany, v. 56, n. 417, p. 1729- 1739, 2005.

MORRIS, E. K. et al. Choosing and using diversity indices: insights for ecological applications from the German Biodiversity Exploratories. Ecology and evolution, v. 4, n. 18, p. 3514-3524, 2014.

MUNEES, A.; KHAN, M. S. Effect of insecticide-tolerant and plant growth-promoting Mesorhizobium on the performance of chickpea grown in insecticide stressed alluvial soils. Journal of Crop Science and Biotechnology, v. 12, n. 4, p. 213-222, 2009.

NAIR, D. N.; PADMAVATHY, S. Impact of Endophytic Microorganisms on Plants, Environment and Humans. The scientific World Journal, v. 2014, n.1, p. 1-11, 2014.

NAUTIYAL, C. S. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEMS microbiology Letters, v. 170, n. 1, p. 265-270, 1999.

NAVEED, M. et al. The endophyte Enterobacter sp. FD17: A maize growth enhancer selected based on rigorous testing of plant beneficial traits and colonization characteristics. Biology and Fertility of

Soils, v. 50, n. 2, p. 249–262, 2013.

NGUYEN, C. Rhizodeposition of organic C by plants: mechanisms and controls. Agronomie, v. 23, n. 5-6, p. 375-396, 2003.

NGUYEN, N. P. et al. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ biofilms and microbiomes, v. 2, p. 1-8, 2016.

NIHORIMBERE, V. et al. Beneficial effect of the rhizosphere microbial community for plant growth and health. Biotechnologie Agronomie Societe Et Environnement, v. 15, n. 2, p. 327–337, 2011.

NISSINEN, R. M.; MÄNNISTÖ, M. K.; VAN ELSAS, J. D. Endophytic bacterial communities in three arctic plants from low arctic fell tundra are cold-adapted and host-plant specific. FEMS Microbiology Ecology, v. 82, n. 2, p. 510–522, 2012.

NÓBREGA, J. C. M. de; DORNELAS, M. C. Biotecnologia e Melhoramento da Cana-de-Açúcar. In: SEGATO, S. V., et al. (Org.). Atualização em Produção de Cana-de-Açúcar. Piracicaba, SP: 2006. cap. 2, p. 39-56.

NORMAN, J. S.; FRIESEN, M. L. Complex N acquisition by soil diazotrophs: how the ability to release exoenzymes affects N fixation by terrestrial free-living diazotrophs. The ISME journal, v. 11, n. 2, p. 315, 2017.

NOUMAVO, P. A. et al. Plant growth promoting rhizobacteria: Beneficial effects for healthy and sustainable agriculture. African Journal of Biotechnology, v. 15, n. 27, p. 1452–1463, 2016.

NUNES, F. S.; RAIMONDI, A. C.; NIEDWIESKI, A. C. Fixação de nitrogênio: estrutura, função e modelagem bioinorgânica das nitrogenases. Química Nova, v. 26, n. 6, p. 872-879, 2003.

OLIVEIRA, A. L. M. et al. The effect of inoculating endophytic N2-fixing bacteria on micropropagated sugarcane plants. Plant and Soil, v. 242, n. 2, p. 205–215, 2002.

OLIVEIRA, Z. M. de. Rizobactérias promotoras de crescimento vegetal, isoladas de cana-de- açúcar sob fertilização orgânica e/ou convencional. 2009. 165 f. 2009. Tese de Doutorado. Tese (Doutorado)-Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo.

ONOFRE-LEMUS, J. et al. ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) deaminase activity, a widespread trait in Burkholderia species, and its growth-promoting effect on tomato plants. Applied and Environmental Microbiology, v. 75, n. 20, p. 6581-6590, 2009.

ORLANDO FILHO, J. Calagem e adubação da cana-de-açúcar. In: CÂMARA, G.M.S. & OLIVEIRA, E.A.M. (editores.). Produção de cana-de-açúcar. Piracicaba: FEALQ/USP, 1993. p.133-146.

ORR, C. H. et al. Impacts of Organic and Conventional Crop Management on Diversity and Activity of Free-Living Nitrogen Fixing Bacteria and Total Bacteria Are Subsidiary to Temporal Effects. PLoS ONE, v. 7, n. 12, p. 1-12, 2012.

PARIONA-LLANOS, R. et al. Influence of organic fertilization on the number of culturable diazotrophic endophytic bacteria isolated from sugarcane. European Journal of Soil Biology, v. 46, n. 6, p. 387–393, 2010.

PARK, M. S. et al. Isolation and characterization of bacteria associated with two sand dune plant species, Calystegia soldanella and Elymus mollis. The Journal of Microbiology, v. 43, n. 3, p. 219- 227, 2005.

PASSARI, A. K. et al. In vitro and in vivo plant growth promoting activities and DNA fingerprinting of antagonistic endophytic actinomycetes associates with medicinal plants. PLoS One, v. 10, n. 9, p. 1–19, 2015.

PAUNGFOO-LONHIENNE, C. et al. A new species of Burkholderia isolated from sugarcane roots promotes plant growth. Microbial Biotechnology, v. 7, n. 2, p. 142–154, 2014.

PAUL, D.; LADE, H. Plant-growth-promoting rhizobacteria to improve crop growth in saline soils: A review. Agronomy for Sustainable Development, v. 34, n. 4, p. 737–752, 2014.

PEDULA, R. O. et al. Growth analysis of sugarcane inoculated with diazotrophic bacteria and nitrogen fertilization. African Journal of Agricultural Research, v. 11, n. 30, p. 2786–2795, 2016.

PEREIRA, G. G. DE S. et al. Custo de produção de cana-de-açúcar no Estado do Mato Grosso do Sul. Revista iPecege, v. 1, n. 1, p. 81–102, 2016.

PIKOVSKAYA, R. I. Mobilization of phosphorus in soil in connection with vital activity of some microbial species. Mikrobiologiya, v. 17, p. 362-370, 1948.

PISA, G. et al. Diversity of 16S rRNA genes from bacteria of sugarcane rhizosphere soil. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 44, n. 12, p. 1215–1221, 2011.

PRASHAR, P.; KAPOOR, N.; SACHDEVA, S. Rhizosphere: its structure, bacterial diversity and significance. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, v. 13, n. 1, p. 63-77, 2014.

RANA, A. et al. Identification of multi-trait PGPR isolates and evaluating their potential as inoculants for wheat. Annals of microbiology, v. 61, n. 4, p. 893-900, 2011.

RANGARAJAN, S.; SALEENA, L. M.; NAIR, S. Diversity of Pseudomonas spp. isolated from rice rhizosphere populations grown along a salinity gradient. Microbial ecology, v. 43, n. 2, p. 280-290, 2002.

RODRÍGUEZ, H.; FRAGA, R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnology advances, v. 17, n.1, p.319-339, 1999.

RUSCHEL, A.P.; HENIS, Y.; SALATI, E. Nitrogen 15N traing of N-fixation with soil- grown sugar cane seedlings. Soil Biology and Biochemistry, v. 7, p. 181- 182, 1975.

SANTI, C.; BOGUSZ, D.; FRANCHE, C. Biological nitrogen fixation in non-legume plants. Annals of Botany, v. 111, n. 5, p. 743–767, 2013.

SANTOS, D. H. et al. Technological quality of sugarcane under fertilization with filter cake enriched with soluble phosphate. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, v. 15, n. 5, p. 443–449, 2011.

SANTOS, J. DA S. et al. Inoculation and Isolation of Plant Growth-Promoting Bacteria in Maize Grown in Vitória Da Conquista, Bahia, Brazil. Revista Brasileira de Ciência do Solo, v. 39, n. 1, p. 78–85, 2015.

SASSER, M. Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids. 1990.

SCHULTZ, N. et al. Inoculation of sugarcane with diazotrophic bacteria. Revista Brasileira de Ciência do Solo, v. 38, n. 2, p. 407–414, 2014.

SEVERIANO, E. C. et al. Potencial de uso e qualidade estrutural de dois solos cultivados com cana- de-açúcar em Goianésia (GO). Revista Brasileira de Ciência do Solo, v. 33, n.1, p. 159-168, 2009.

SHIN, W. et al. Role of Diazotrophic Bacteria in Biological Nitrogen Fixation and Plant Growth Improvement. Korean Journal of Soil Science and Fertilizer, v. 49, n. 1, p. 17–29, 2016.

SHIRLING, E. T.; GOTTLIEB, D. Methods for characterization of Streptomyces species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 16, n. 3, p. 313-340, 1966.

SHIVA, S. et al. Enhancement of drought stress tolerance in crops by plant growth promoting rhizobacteria. Microbiological Research, v. 184, p. 13–24, 2016.

SHOKRI, D.; EMTIAZI, G. Indole-3-acetic acid (IAA) production in symbiotic and non-symbiotic nitrogen-fixing bacteria and its optimization by taguchi design. Current Microbiology, v. 61, n. 3, p. 217–225, 2010.

SHRIVASTAVA, U. P. Plant Microbe Interaction in Rhizosphere. International Journal of Graduate Research and Review, v. 1, n.1, p. 10-24, 2016.

SIFAEG- Sindicato da Industria de fabricação de etanol do estado de Goiás. Mapa das Usinas. 2018. Disponível em: < http://www.sifaeg.com.br/mapadasusinas/ > Acesso em fevereiro 2018.

SIFAEG- Sindicato da Industria de fabricação de etanol do estado de Goiás. Relação das unidades produtoras de etanol e açúcar do estado de Goiás associadas ao SIFAEG. 2016. 8p. Disponível em: < http://www.sifaeg.com.br/wp-content/uploads/2016/08/RELA%C3%87%C3%83O-DAS- USINAS-ASSOCIADAS-COMPACTADA-ATUALIZADA-EM-AGOSTO-2016.pdf> Acesso em junho 2016.

SIKORSKI, J. The prokaryotic biology of soil. Soil Organisms, v. 87, n. 1, p. 1-28, 2015.

SILVA, A. A.; MIZIARA, F. Avanço do setor sucroalcooleiro e expansão da Fronteira Agrícola em Goiás. Pesquisa Agropecuária Tropical, Goiânia, v. 41, n. 3, p. 399-407, 2011.

SILVA, F. B. et al. Nutrição e adubação da cana-de-açúcar. Revista conexão eletrônica. v. 13, n.1, p. 1-12, 2016.

SILVA, F. C. (Ed.). Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Embrapa Informação Tecnológica; Rio de Janeiro: Embrapa Solos, 2009.

SILVA, K. et al. Diversity and capacity to promote maize growth of bacteria isolated from the Amazon region. Acta Amazonica, v. 46, n. 2, p. 111-118, 2016.

SILVA, M. A. et al. Photosynthetic capacity and water use efficiency in sugarcane genotypes subject to water deficit during early growth phase. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 56, n. 5, p. 735–748, 2013.

SILVA, M. C. P. et al. Temporal Dynamics of Abundance and Composition of Nitrogen-Fixing Communities across Agricultural Soils. Plos One, v. 8, n. 9, p. 1–15, 2013.

SILVA, M. A. S.; GRIEBELER, N. P.; BORGES, L. C. Uso de vinhaça e impactos nas propriedades do solo e lençol freático\Use of stillage and its impact on soil properties and groundwater. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, v. 11, n. 1, p. 108–114, 2007.

SILVA, M. F.; DE SOUZA ANTÔNIO, C.; DE OLIVEIRA, P. J.; XAVIER, G. R.; RUMJANEK, N. G.; DE BARROS SOARES, L. H.; REIS, V. M. Survival of endophytic bacteria in polymer-based inoculants and efficiency of their application to sugarcane. Plant and Soil, v. 356, n. 1–2, p. 231– 243, 2012.

SIMÕES-NETO, D. E. et al. Extração de fósforo em solos cultivados com cana-de-açúcar e suas relações com a capacidade tampão. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, Campina Grande, v. 13, p. 840–848, 2009.

SINGH, J. S.; PANDEY, V. C.; SINGH, D. P. Efficient soil microorganisms: A new dimension for sustainable agriculture and environmental development. Agriculture, Ecosystems and Environment, v. 140, n. 3–4, p. 339–353, 2011.

SMALLA, K. et al. Bulk and rhizosphere soil bacterial communities studied by denaturing gradient gel electrophoresis: plant-dependent enrichment and seasonal shifts revealed. Applied and environmental microbiology, v. 67, n. 10, p. 4742-4751, 2001. 70

SOLANKI, M. K. et al. Intercropping in Sugarcane Cultivation Influenced the Soil Properties and Enhanced the Diversity of Vital Diazotrophic Bacteria. Sugar Tech, v. 19, n. 2, p. 136–147, 2017.

SORATTO, R. P. et al. Fontes alternativas e doses de nitrogênio no milho safrinha em sucessão à soja. Revista Ciencia Agronomica, v. 41, n. 4, p. 511–518, 2010.

SOUZA, A. Q. L. de et al. Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas da amazônia: Palicourea longiflora (aubl.) rich e Strychnos cogens bentham. Acta amazônica, v. 34, n. 2, p. 185-195, 2004.

SPAEPEN, S.; VANDERLEYDEN, J. Auxin and plant-microbe interactions. Cold Spring Harbor perspectives in biology, v. 3, n. 4, p. 1-13, 2011.

SUMAN, A.; YADAV, A. N.; VERMA, P. Endophytic microbes in crops: diversity and beneficial impact for sustainable agriculture. In: SINGH, D. P.; SINGH, H. B.; PRABHA, R. Microbial inoculants in sustainable agricultural productivity. Maunath Bhanjan: Springer, 2016. p. 117-143.

SCHWYN, B.; NEILANDS, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical biochemistry, v. 160, n. 1, p. 47-56,1987.

TAHA, R. S.; MAHDI, A. H. A.; ABD EL-RAHMAN, H. A. Effect of Biofertilizers as a Partial Substitute for Mineral Fertilizers on Growth, Anatomical Structure, Mineral Elements and Yield of Wheat under Newly Reclaimed Soil Conditions. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, v. 5, n. 8, p. 458–469, 2016.

TAM, H. M.; DIEP, C. N. Isolation and Identification of Rhizospheric Bacteria in Sugarcane (Saccharum spp. L.) Cultivated on Acrisols and Ferrasols of Dong Nai Province, the Southeast of Vietnam. American Journal of Life Sciences, v. 3, n. 2, p. 109–118, 2015.

TASSO, L. et al. Produtividade e qualidade de Cana-de-Açúcar cultivada em solo tratado com lodo de esgoto, Vinhaça e adubos minerais. Engenharia Agrícola Jaboticabal, v. 27, n. 1, p. 276–283, 2007.

TAULÉ, C. et al. The contribution of nitrogen fixation to sugarcane (Saccharum officinarum L.), and the identification and characterization of part of the associated diazotrophic bacterial community. Plant and Soil, v. 356, n. 1–2, p. 35–49, 2012. 71

TIKHONOV, M.; LEACH, R. W.; WINGREEN, N. S. Interpreting 16S metagenomic data without clustering to achieve sub-OTU resolution. The ISME journal, v. 9, n. 1, p. 68, 2015.

TONDO, I. S. P.; DA SILVA, J. F. M.; SHIKIDA, P. F. A. Produção de açúcar orgânico: uma análise econômica. 16p. 2007. Disponível em: http://www.ecopar.ufpr.br/artigos/a_024.pdf. Acesso em junho de 2016.

TORSVIK, V.; OVREÅS, L. Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems. Current opinion in microbiology, v. 5, n. 3, p. 240-245, 2002.

URQUIAGA, S.; CRUZ, K. H. S.; BODDEY, R. M. Contribution of nitrogen fixation to sugar cane: nitrogen-15 and nitrogen balance estimates. Soil Science Society of America Journal, v.56, p. 105- 114, 1992.

UROZ, S. et al. Pyrosequencing reveals a contrasted bacterial diversity between oak rhizosphere and surrounding soil. Environmental Microbiology Reports, v. 2, n. 2, p. 281-288, 2010.

UROZ, S. et al. Functional assays and metagenomic analyses reveals differences between the microbial communities inhabiting the soil horizons of a Norway spruce plantation. PLoS One, v. 8, n. 2, p. e55929, 2013.

VACHERON, J. et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Frontiers in plant science, v. 4, n. 9, p. 356-370, 2013.

VALVERDE, J. R.; GULLÓN, S.; MELLADO, R. P. Looking for Rhizobacterial Ecological Indicators in Agricultural Soils Using 16S rRNA metagenomic Amplicon Data. PloS one, v. 11, n. 10, p. e0165204, 2016.

VEJAN, P. et al. Role of Plant Growth Promoting Rhizobacteria in Agricultural Sustainability—A Review. Molecules, v. 21, n. 5, p. 573-583, 2016.

VELÁZQUEZ, E. et al. Genetic diversity of endophytic bacteria which could be find in the apoplastic sap of the medullary parenchym of the stem of healthy sugarcane plants. Journal of Basic Microbiology, v. 48, n. 2, p. 118–124, 2008.

VESSEY, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil, v.255, n.2,

p.571-586, 2003.

VIDEIRA, S. S. et al. Occurrence and diversity of nitrogen-fixing Sphingomonas bacteria associated with rice plants grown in Brazil. FEMS microbiology letters, v. 293, n. 1, p. 11-19, 2009.

WALPOLA, B. C.; YOON, M. In vitro solubilization of inorganic phosphates by phosphate solubilizing microorganisms. African Journal of Microbiology Research, v. 7, n. 27, p. 3534– 3541, 2013.

WELLINGTON, E. M. H.; CROSS, T. Taxonomy of antibiotic producing Actinomycetes and new approaches to their selective isolation. Progress in industrial microbiology, v. 17, p. 7-36, 1983.

YANTI, Y. et al. Screening of rhizobacteria from rhizosphere of healthy chili to control bacterial wilt disease and to promote growth and yield of chili. Biodiversitas, v. 18, n. 1, p. 1–9, 2017.

YU, X. et al. The siderophore-producing bacterium, Bacillus subtilis CAS15, has a biocontrol effect on Fusarium wilt and promotes the growth of pepper. European Journal of Soil Biology, v. 47, n. 2, p. 138–145, 2011.

ZHOU, X.; WU, F. p-Coumaric acid influenced cucumber rhizosphere soil microbial communities and the growth of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen. PloS one, v. 7, n. 10, p. e48288, 2012.

CAPÍTULO 1: Mudanças na estrutura e função da comunidade microbiana da rizosfera de cana-de-açúcar em resposta ao manejo orgânico.

MUDANÇAS NA ESTRUTURA E FUNÇÃO DA COMUNIDADE MICROBIANA DA RIZOSFERA DE CANA-DE-AÇÚCAR EM RESPOSTA AO MANEJO ORGÂNICO. Rodrigues, A. A.1; Vieira, J. D. G.1

1Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia, Departamento de Microbiologia, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Brasil.

Resumo

A agricultura orgânica aumenta os indicadores de qualidade do solo, tais como o estado de nutrientes, o potencial produtivo e a atividade microbiana. Em especial, as comunidades microbianas da rizosfera, que interagem intimamente com o vegetal em fenômenos como a promoção do crescimento vegetal, são passíveis de serem alteradas quanto a sua estrutura e função em decorrência do manejo orgânico. Dessa forma, almejamos investigar a resposta das comunidades bacterianas de rizosfera de cana-de-açúcar ao manejo orgânico, avaliar a contribuição do perfil físico-químico do solo na diversidade microbiana e verificar como o manejo se reflete no caráter funcional no ambito da promoção do crescimento vegetal. Para tal, utilizamos o sequenciamento em larga escala da região V3-V4 do gene 16S rRNA e a predição de metagenomas. Não foram observadas diferenças nas métricas de diversidade α (Shannon e Chao) em função do manejo, entretanto, a análise de coordenadas principais (PCoA) a partir da dissimilaridade de Bray-Curtis (diversidade β) revelaram que amostras referentes ao manejo orgânico se distinguiam das oriundas do manejo tradicional. Os filos Proteobacteria, Actinobacteria e Gemmatimonadetes foram enriquecidos no manejo orgânico. Genes ligados a fixação de nitrogênio foram mais expressos em associação ao manejo orgânico. A agricultura orgânica da cana-de-açúcar é capaz de modular em conjunto com os atributos do solo a diversidade microbiana da rizosfera e de estimular a fixação biológica de nitrogênio.

Palavras-chave: Agricultura orgânica, atributos físico-químicos, diversidade, fixação de nitrogênio

INTRODUÇÃO

A agricultura orgânica no Brasil é um setor em expansão e deriva do aumento da demanda por produtos orgânicos nos mercados nacionais e internacionais (Georges and Blanc, 2013; Duarte et al., 2017). O país constitui-se como a quarta maior área plantada com orgânicos do mundo (Blanc and Kledal, 2012) e em especial, a produção de cana-de-açúcar orgânica constitui-se como um mercado promissor, com a produção de 219,947 toneladas de açúcar orgânico na safra 2017/2018 (Brasil, 2018). A agricultura orgânica é considerada uma alternativa mais ambientalmente amigável do que a agricultura tradicional ao aumentar a qualidade do solo e otimizar a ciclagem de nutrientes e em paralelo, abolir o uso de agroquímicos sintéticos e de fertilizantes a base de petróleo (Xia et al., 2015). Emprega os resíduos da própria cadeia agrícola, produtos naturais regionais, estercos animais e verde e a rotação de culturas para garantir a autossuficiência em nitrogênio e a fertilidade em longo prazo. Além disso, realiza o controle de ervas daninhas, doenças e pragas por práticas como o uso de predadores naturais, capina e a utilização de agentes de biológicos de controle (Reganold, 1988; Condron et al., 2000; Rigby and Cáceres, 2001). Os resultados observados com a agricultura orgânica se devem principalmente ao aumento dos indicadores da qualidade do solo, tais como o estado de nutrientes, o potencial produtivo e a atividade microbiana (Reganold et al., 2010; Kaur and Reddy, 2014). Os micro-organismos participam naturalmente em processos como a formação do solo, decomposição da matéria orgânica, ciclagem dos nutrientes (Nannipieri et al., 2003), supressão de patógenos do solo e a promoção do crescimento vegetal (Garbeva et al., 2004). Entretanto, em sistemas agroecológicos, desempenhem papel fundamental na disponibilização de nutrientes ao vegetal, uma vez que grandes quantidades de matéria orgânica são utilizadas e sua ação na liberação dos nutrientes é extremamente necessária (Wang et al., 2012). Dentre os micro-organismos presentes no solo, os da rizosfera, que pode ser definida como a zona do solo adjacente e sob a influência das raízes (Philippot et al., 2013), são aqueles que mais interagem com o vegetal, apresentando efeito no seu crescimento (Ahmad et al., 2008), nutrição (Darrah, 1993) e saúde (Berendsen et al., 2012). A rizosfera apresenta-se como um dos sistemas mais heterogêneos e complexos do planeta (Ahkami et al., 2017), no qual a sobrevivência do vegetal depende da aquisição de nutrientes do solo, resiliência a uma gama de estresses bióticos e abióticos e da interação com os micro-organismos do solo, que interagem entre si e com o vegetal. Dessa forma, a rizosfera de cada vegetal configura-se como um ambiente que possui características biológicas, físicas e químicas únicas (Jones and Hinsinger, 2008).

Essa complexidade se estende a estrutura e composição das comunidades microbianas habitantes da rizosfera e essas, por sua vez, são determinadas por uma série de fatores abióticos e bióticos (Prashar et al., 2014). Uma das forças moduladoras da diversidade microbiana na rizosfera refere-se à liberação de exsudatos (Vacheron et al., 2013; Ahemad and Kibret, 2014), que são, por sua vez, influenciados pela espécie (Turner et al., 2013), genótipo (Bakker et al., 2012) e pelo estágio de desenvolvimento do vegetal (Chaparro et al., 2014). Fatores edáficos, como o pH, conteúdo de argila e fatores regionais, como a geografia e o clima, também são capazes de impactar na diversidade microbiana (Coleman-Derr et al., 2016; Nuccio et al., 2016). Ademais, a intervenção antropogênica via manejo do solo por plantio direto (Mirás-Avalos et al., 2011), pesticidas (Singh et al., 2015), herbicidas (Newman et al., 2016) e fertilizantes (Silva et al., 2017), também é capaz de modificar a composição e funcionalidade da microbiota da rizosfera. Nesse sentido, estudos utilizando metodologias dependentes e independentes de cultivo, demonstraram abundâncias relativas de filos e famílias diferentes entre os manejos orgânicos e tradicionais (Li et al., 2012; Pershina et al., 2015; Vega-Avila et al., 2015; Lupatini et al., 2017) e a presença, no manejo orgânico, de comunidades conhecidas por sua capacidade de degradação de compostos orgânicos complexos (Hartmann et al., 2015) e que participam da ciclagem de nutrientes (Wang et al., 2016). Além disso, observou-se que no manejo orgânico, os agentes naturais de biocontrole eram beneficiados (Schmid et al., 2011). A aplicação de fertilizantes orgânicos aumentou a diversidade de bactérias produtoras de ácido-3-indol acético no solo (Yuan et al. 2011), enquanto Surapat e colaboradores (2013) isolaram um maior número de bactérias solubilizadoras associadas ao cultivo orgânico. Em especial, a cana-de-açúcar cultivada sob regime tradicional constitue-se como um sistema integrado, haja vista que rejeitos orgânicos da cadeia produtiva de açúcar e etanol, como a torta de filtro, lodo de esgoto e a vinhaça foram incorporadas ao cultivo (Santos et al., 2011; Lana et al., 2016). Nesse sentido, diversos avanços foram obtidos em relação ao entendimento da diversidade microbiana na rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo tradicional (Da Costa et al., 2014; De Souza et al., 2016) e de como a fertilização nitrogenada e fosfatada (orgânica e inorgânica) tem impacto sobre a diversidade da rizosfera (Pisa et al., 2011; Paungfoo-Lonhienne et al., 2015; Arruda et al., 2016), entretanto, o conhecimento sobre essa diversidade associada ao manejo totalmente orgânico ainda é escasso. Além do estudo da diversidade, é recomendado ponderar sobre os fatores de promoção do crescimento vegetal, haja vista o papel crucial desempenhado pelas rizobactérias na liberação de nutrientes na agricultura orgânica (Wang et al., 2012). A maioria dos estudos sobre a promoção do 77

crescimento vegetal em sistemas agroecológicos está pautada em métodos dependentes de cultivo o que torna seu alcance limitado (Torsvik and Øvreås, 2002). Nesse sentido, técnicas baseadas em dados de ecologia microbiana podem ser úteis para esse tipo de abordagem (Armanhi et al., 2018). Ferramentas de predição de metagenoma como o PICRUSt (Langille et al., 2013) podem ser incorporadas para revelar qual o impacto do manejo sobre os fatores de promoção do crescimento vegetal e na ciclagem dos nutrientes. Para avaliar as diferenças entre comunidades rizosféricas de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional, nós investigamos a diversidade bacteriana via sequenciamento de alto rendimento da região V3-V4 do gene 16S RNA e inferimos as funcionalidades preditas relacionadas a promoção do crescimento vegetal em ambos os cultivos. Usando essa abordagem combinada ganhamos um maior entendimento de como o manejo orgânico se diferencia do tradicional, como os fatores edáficos contribuem no processo e quais são as principais características de promoção do crescimento vegetal que são afetadas pelo manejo orgânico.

MATERIAIS E METODOS

Caracterização da área e coletas de amostras de rizosfera

As amostras de rizosfera foram coletadas em fazendas, cultivadas com a variedade CTC4, pertencentes a duas usinas de processamento de cana-de-açúcar localizadas nos municípios de Goiatuba (19º 00’ 023” S; 049º 40’ 319” W) e Goianésia (15º 20’ 241” S; 048º 54’ 253” W), Goiás, Brasil. As duas usinas são as únicas com certificação pelo Instituto Biodinâmico de Certificações (IBD) para produção de cana-de-açúcar sob manejo orgânico no estado de Goiás, Brasil e encontram- se a uma distância de 412 km uma da outra. As coletas foram realizadas no período de dezembro de 2015 a janeiro de 2016. Em cada usina, que receberam as denominações A e B, foram coletadas 12 amostras, sendo 6 amostras de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo tradicional e 6 amostras sob manejo orgânico, totalizando 24 amostras. As formas de manejo (irrigação, fertilização, controle de plantas daninhas e de pragas) foram fornecidas pelas usinas e encontram-se dispostas na tabela 1, juntamente com a geolocalização das fazendas amostradas. Em relação às coletas em fazendas sob manejo orgânico, foram escolhidas aquelas cujo cultivo orgânico já ocorria há pelos menos seis anos. Foram amostrados vegetais sem evidências visíveis de doenças, ataque de pragas ou de deficiências nutricionais. Após a retirada dos vegetais do solo, a parte área foi removida e a raiz agitada vigorosamente para remoção do solo excedente. As amostras de rizosfera foram coletadas na

profundidade de 20 cm da base do vegetal. Considerou-se como rizosfera, o solo aderido à raiz, numa distância máxima de 5 mm (Santos et al., 2012). Após as coletas, as amostras foram armazenadas em sacos esterilizados e encaminhadas ao laboratório onde foram mantidas a 4 ºC até a extração de DNA que se deu no dia seguinte. Todas as coletas foram realizadas em solos classificados como Latossolos vermelhos (classificação Brasileira), com diversas subclassificações. As análises físico-química dos solos, que incluíram os valores de pH, fósforo (P), potássio (K), cálcio (Ca), magnésio (Mg), Alumínio (Al e H/Al), matéria orgânica (MO), soma das bases (SB) e capacidade de troca de cátions efetiva (CTC) foram disponibilizados pelas empresas e estão dispostos na Tabela suplementar 1. As métricas dos elementos do solo, depois de avaliadas quanto a sua normalidade e homogeneidade das variâncias, foram submetidas à análise de variância (ANOVA) e ao teste de comparação de Tukey para determinar se o manejo impactava nos atributos físico-químicos do solo.

Tabela 1. Geolocalização e características de manejo das fazendas amostradas.

Geolocalização da Herbicida/controle de Usina Regime² Irrigação Fertilização fazenda pragas 18º 00’ 012” S; 049º Nitrato de amônia, 40’ 364” W (3)¹ água e Hexaron, Round UP / A CONV fosfato químico, torta de vinhaça químico 18º 06’ 758” S; 049º filtro 36’ 619” W (3) 18º 05’ 275” S; 049º 39’ 299” W (3) água e Composto, pó de rocha, Capina,enxada A ORG 18º 03’ 248” S; 049º vinhaça cinzas, torta de filtro rotativa/biológico 41’ 099” W (3) 15º 19’ 943” S; 048º Nitrato de amônia, NPK 53’ 752” W (3) Hexaron, Round UP / B CONV água 18-06-24, fosfato químico 15º 15’ 432” S; 049º químico, torta de filtro 00’ 963” W (3) 15º 14’ 092” S; 048º 58’ 716” W (3) água e Composto, pó de rocha, Capina,enxada B ORG 15º 14’ 239” S; 048º vinhaça cinzas, torta de filtro rotativa/biológico 59’ 872” W (3) ¹ Número de amostras coletadas por geolocalização. ²Conv= Convencional; Org=Orgânico

Extração de DNA

A extração do DNA total foi realizada a partir de 0.25 g da rizofera com o kit PowerSoil DNA isolation kit® (Mo Bio, USA), segundo as recomendações do fabricante. As extrações foram realizadas em triplicata e posteriormente, unidas em um único tubo. A integridade e pureza do DNA foram avaliadas em gel de agarose a 1,2% e a concentração do DNA determinada por fluorometria no Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). O material genético foi mantido em freezer a -4 ºC até a preparação para o sequenciamento.

Sequenciamento do gene 16S rRNA

O estudo das comunidades bacterianas foi baseado no sequenciamento da região variável V3- V4 do gene 16S rRNA. Para a preparação das bibliotecas, foram utilizados as sequências de primers, ( foward 5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG- 3’) e ( reverse 5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATC TAATCC-3’) (Klindworth et al., 2013). A primeira reação de PCR foi calculada para um volume final de 25 μl, com 2.5 μl de DNA genômico (5 ng/μl), 5 μl de primer foward (1 μM), 5 μl de primer reverse (1 μM) e 12.5 μl de 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix (Kapa Biosystems). A amplificação foi conduzida seguindo a ciclagem: 95 ºC por 3 min, seguido de 25 ciclos de 95 ºC por 30 s, 55 ºC por 30 s, 72 ºC por 30 s e elongamento final a 72 ºC por 5 minutos. A segunda reação de PCR, na qual foram adicionados os primers de índice Nextera XT, foi calculada para um volume final de 50 ul, com 5 μl de DNA produzido na primeira reação, 5 μl de Nextera XT Index Primer 1, 5 μl de Nextera XT Index Primer 2, 25 μl de 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix (Kapa Biosystems) e 10 μl de água ultrapura. A amplificação foi conduzida por 8 ciclos, nas mesmas condições de temperaturas e tempos descritos para a primeira reação de PCR. Os amplicons foram purificados com as esferas magnéticas AMPure® XP (Beckman coulter) e os adaptadores de sequenciamento Illumina e barcodes de índice-duplos foram incluídos para cada amostra. As amostras foram agrupadas, quantificadas e sequenciadas na plataforma Illumina MiSeq (V3, 2 x 300).

Processamento das sequências bacterianas de 16S rRNA

As sequências já demultiplexadas e sem os barcodes foram obtidas na plataforma online BaseSpace® (Illumina) e processadas com o programa mothur v.1.39.5 (Schloss et al., 2009)

seguindo o tutorial MiSeq SOP (Kozich et al., 2013) com algumas modificações (Texto Suplementar 1). Resumidamente, contigs foram formados a partir de reads paired-end e subsequentemente, filtrados baseado em seu tamanho e qualidade (maxambig = 0, minlength = 250, maxlength = 460). Sequências idênticas (duplicadas) foram unidas com o comando unique.seqs. As sequências únicas foram alinhadas ao SILVA, que corresponde a um banco de dados de alinhamento de genes 16S rRNA ( Pruesse et al., 2007) e agrupadas (pre.cluster) de acordo com sua abundância com sequências similares que continham no máximo duas diferenças (mismatch) com outras sequências (diffs=2). As sequências quiméricas foram detectadas e removidas com os comandos chimera.vsearch e remove.seqs. As sequências singletons foram removidas com o comando split.abund, de forma a reduzir o número de sequências únicas. O comando remove.lineage foi utilizado para remover as possíveis sequências de cloroplastos, mitocôndrias, arqueias, eucariotos e desconhecidas. O algoritmo average neighbor foi utilizado para agrupar as sequências com 97% de similaridade em unidades taxonômicas operacionais (OTUs). Em seguida, a classificação taxonômica das OTUs foi realizada com base no banco de dados GreenGenes (v 13.8) (DeSantis et al., 2006) com um cutoff de 80%.

Composição da comunidade microbiana e análise estatística

A cobertura do sequenciamento foi avaliada por meio da curva de rarefação e do índice de cobertura Good, calculados no mothur (Texto Suplementar 1). As amostras foram normalizadas por subamostragem para 11254 reads, que corresponde ao tamanho da menor amostra. A tabela de OTU normalizada foi utilizada para calcular a porcentagem da abundância de filos e famílias de acordo com os grupos: orgânica usina A (OA), convencional usina A (CA), orgânica usina B (OB) e convencional usina B (CB), na ferramenta on line MicrobiomeAnalyst (Dhariwal et al., 2017). As métricas referente ao número de OTUs observadas (sobs), riqueza das comunidades (Chao 1) e a diversidade das comunidades (Shannon) foram calculadas a nível de OTU no mothur utilizando o comando summary.single (Texto Suplementar 1). As análises estatísticas da diversidade alfa foram conduzidas com o pacote vegan (Oksanen et al., 2018) na plataforma R (R Core Team, 2017). A homogeneidade da variância e a normalidade das amostras foram verificadas com o teste de Levene e o teste de Shapiro-Wilk, respectivamente. Em seguida, a Analise de Variância (ANOVA) e o teste de Tukey honest significant teste (TukeyHSD) para múltiplas comparações foram aplicados. O método de Benjamini-Hochberg para controle da taxa de descoberta falsa (False Discovery Rate -FDR) foi empregado em múltiplas comparações (Benjamini and Hochberg, 1995).

A diversidade beta foi visualizada por meio da análise de coordenadas principais (PCoA) a partir da dissimilaridade de Bray-Curtis (Bray and Curtis, 1957) com os pacotes phyloseq (McMurdie and Holmes, 2013) e ggplot2 (Wickham, 2009) do R. A análise permutacional das variâncias (PERMANOVA) foi empregada para determinar as diferenças na estrutura da comunidade (Bray- Curtis) entre os grupos amostrados, utilizando a função adonis do pacote vegan. A análise permutacional das dispersões multivariadas (PERMDISP) foi empregada para testar a heterogeneidade da estrutura da comunidade de acordo com os grupos. A extensão DESeq2 (Love et al., 2014), implementada no pacote phyloseq do R, foi utilizada para determinar as contribuições de grupos taxonômicos (OTUs) para as diferenças observadas na PERMANOVA e PCoA. O pacote DESeq2 emprega um método estatístico que detecta diferencialmente a expressão genica (mudança do log2-fold na abundância relativa de cada OTU) baseada na distribuição binomial negativa. Esse método foi reportado como hábil e preciso na detecção da abundância diferencial em vários tipos de biblioteca de metagenomas (McMurdie and Holmes, 2014; Dhariwal et al., 2017). Foram consideradas na análise abundâncias diferenciais superiores a 1.0 e valor de p <0.0, com a correção do valor de p de Benjamini–Hochberg. O teste de Mantel com 999 permutações foi realizado a partir da função mantel do pacote vegan e teve por objetivo avaliar a existência de correlação entre a composição da comunidade microbiana e os atributos químicos e físicos do solo. Em seguida, correlações individuais foram calculadas entre os atributos do solo e a comunidade do solo por meio da correlação de Pearson. O teste foi conduzido em OTUs com no mínimo 0.5% de abundância em pelo menos uma das amostras, a uma significância de 5% (p<0.05) e as correlações consideradas positivas foram aquelas com valores de R >0.5 ou < - 0.5. A análise canônica das coordenadas principais (CAP) foi obtida com pacotes phyloseq e vegan do R, e foi utilizada para demonstrar como os fatores edáficos condicionam a diversidade microbiana. Em seguida, um teste de permutação (permutations=1000) foi conduzido sob o modelo CAP para calcular o efeito significativo dos fatores.

Predição do perfil funcional da comunidade bacteriana utilizando o gene marcador 16S rRNA

O software PICRUSt (Langille et al., 2013) foi utilizado para inferir as prováveis funções a partir da reconstrução de um metagenoma predito utilizando como base as bibliotecas de 16S rRNA. Para tal, a tabela com as informações das OTUs e a tabela com a taxonomia foram convertidas em um arquivo BIOM (versão 0.9.1) e subsequentemente, convertido para a versão 1.0.0 (Texto suplementar 1). O PICRUSt foi utilizado na ferramenta on line Galaxy server

(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy). As amostras foram normalizadas (Normalize By Copy Number) e em seguida tiveram sua função predita (Predict Metagenome e Categorize by function). As informações funcionais foram anotadas de acordo com o nível 3 do banco de dados da Enciclopédia Kyoto de genes e genomas (KEGG) (Kanehisa and Goto, 2000). Os valores do Nearest Sequenced Taxon Index (NSTI) foram calculados e utilizados para avaliar a precisão das predições. As predições foram importadas para o para o softaware STAMP (Park et al., 2014), onde as inferências funcionais foram avaliadas. Os ortólogos KEGG (KO) relacionados aos mecanismos de promoção do crescimento vegetal (Solubilização de fosfato, produção de fitohormônios, ACC deaminase, produção de sideróforos, fixação e metabolismo do nitrogênio, mecanismos indiretos) foram selecionados a partir do banco de dados KEGG e da literatura (Cecagno et al., 2015; Tsurumaru et al., 2015; Liu et al., 2016). Os genes relacionados a essas habilidades foram comparados por usina e de acordo com o manejo (OA X CA e OB X CB) pelo teste de t de Welch’s (Park et al., 2014) com a correção do valor de p de Benjamini–Hochberg.

RESULTADOS

Cobertura, riqueza, diversidade e composição das comunidades microbianas

A partir das 24 amostras de rizosfera sequenciadas utilizando o gene marcador 16S rRNA, região V3-V4, foram obtidos 761,054 reads de alta qualidade, com média de 31,711 reads por amostra (variando de 11,254 a 55,017 reads). Esses reads foram clusterizados, a 97% de similaridade, em 48,549 OTUs, com média de 2,023 OTUs por amostra (Tabela suplementar 2). Não foram observadas diferenças entre o número de OTUs recuperadas nos manejos orgânicos e tradicional (ANOVA; TukeyHSD, p>0.05, ajustado com FDR), entretanto, o número de OTUs recuperadas variou entre as usinas avaliadas (ANOVA; TukeyHSD, p<0.05, ajustado com FDR) (Tabela suplementar 2). As 33,787 OTUs obtidas após a normalização por subamostragem estavam distribuídas em 35 filos (Tabela suplementar 3) e 131 famílias (Tabela suplementar 4). Com média de 1,682 OTUs para o grupo OA, 1,619 OTUs para CA, 1,239 OTUs para OB e 1,092 OTUs para CB. Os filos, Proteobacteria (OA: 35.85%, CA: 32.15%, OB: 40,23%, CB: 40.51%), Acidobacteria (OA: 16.70%, CA: 26.53%, OB: 14.80%, CB: 19.27%), Actinobacteria (OA: 13.22%, CA: 10.15%, OB: 18.61%, CB: 16.95%), Planctomycetes (OA: 7.88%, CA: 8.07%, OB: 6.69%, CB: 5.61%) e Chloroflexi (OA: 7.36%, CA: 5.91%, OB: 7.33%, CB: 6.48%), foram os mais abundantes em todos os grupos avaliados (Figura 1; Figura suplementar 1; Tabela suplementar 3). Como o filo

Proteobacteria foi o mais abundante, exploramos as suas classes e verificou-se que a classe AlfaProteobacteria era dominante (OA: 34.22%, CA: 30.00%, OB: 39.46%, CB: 39.74%) e correspondia a maior fatia da diversidade entre todas as classes. Já em nível de família, destacam-se entre as mais abundantes: Sphingomonadaceae (OA: 9.54%, CA: 5.89%, OB: 14.90%, CB: 18.79%), Hyphomicrobiaceae (OA: 7.04%, CA: 5.89%, OB: 9.76%, CB: 5.99%), Bradyrhizobiaceae (OA: 3.73%, CA: 2.83%, OB: 4.37%, CB: 5.19%) e Koribacteraceae_unclassified (OA: 4.47%, CA: 8.89%, OB: 2.94%, CB: 6.95%) (Tabela suplementar 4).

Figura 1. Afiliação taxonômica em nível de filo e sua abundância percentual de acordo com os grupos tradicional e orgânico de cada usina de amostras de rizosfera de cana-de-açúcar. Onde: OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B.

A cobertura de sequenciamento foi considerada suficiente para estudo da diversidade, com índices de cobertura Good variando entre 96-99% (Tabela suplementar 1) e com curvas de rarefação satisfatórias (Tabela suplementar 2; Figura suplementar 2). A diversidade alfa das comunidades foi avaliada estimando-se sua riqueza, pelo índice de Chao1 e sua diversidade pelo índice de Shannon. O índice de Chao1 variou entre 1,331.60 a 2,872.44 e não foram observadas diferenças (ANOVA; TukeyHSD, p>0.05, ajustado com FDR) entre as amostras provenientes do manejo orgânico e

tradicional. O mesmo foi observado com os índices de Shannon, que variaram entre 4.64 a 6.28 e não diferiram (ANOVA; TukeyHSD, p>0.05, ajustado com FDR) em função do tipo de manejo (Tabela 2). Por outro lado, a riqueza e a diversidade das amostras foram significativamente (ANOVA; TukeyHSD, p<0.05, ajustado com FDR) impactadas pela usina amostrada (Tabela 2; Figura Suplementar 2a e 2b). Durante a avaliação das métricas de diversidade alfa, não foi observada (ANOVA), interações significativas entre o tipo de solo e o manejo por usina.

Tabela 2. Estimativa da riqueza (Chao1) e diversidade (Shannon) a nível de OTUs de amostras de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo tradicional e orgânico oriundas de duas usinas¹. Amostra Localização² Chao1 Shannon C2C1 CA 2633,00 ± 172,53a 6,04 ± 0,03a C2C2 CA 2089,62 ± 142,51a 5,79 ± 0,03a C2C4 CA 2645,50 ± 192,22a 6,04 ± 0,03a C2O2 OA 2872,44 ± 178,12a 6,21 ± 0,03a C2O3 OA 2460,67 ± 164,86a 5,99 ± 0,03a C2O4 OA 2215,47 ± 172,05a 5,75 ± 0,03a C3C1 CB 1785,76 ± 147,91b 5,34 ± 0,04b C3C2 CB 1960,20 ± 149,41b 5,54 ± 0,04b C3C3 CB 1453,63 ± 119,61b 5,15 ± 0,04b C3O1 OB 2095,20 ± 144,36b 5,44 ± 0,03b C3O2 OB 1722,86 ± 127,56b 5,36 ± 0,04b C3O3 OB 1642,38 ± 108,26b 5,26 ± 0,04b C4C2 CA 2682,03 ± 186,99a 6,11 ± 0,03a C4C3 CA 2247,67 ± 158,61a 5,97 ± 0,03a C4C4 CA 2573,06 ± 175,62a 6,05 ± 0,03a C4O1 OA 2729,90 ± 186,42a 6,21 ± 0,03a C4O2 OA 2111,40 ± 131,60a 5,77 ± 0,04a C4O3 OA 2694,32 ± 152,24a 6,28 ± 0,03a C9C1 CB 1596,47 ± 138,15b 4,79 ± 0,04b C9C2 CB 1331,60 ± 104,46b 4,78 ± 0,04b C9C4 CB 1636,69 ± 147,34b 4,64 ± 0,05b C9O1 OB 1996,54 ± 134,36b 5,60 ± 0,04b C9O2 OB 1398,34 ± 90,27b 5,11 ± 0,04b C9O3 OB 1587,17 ± 110,37b 5,17 ± 0,04b ¹. Diferentes letras na mesma coluna indicam diferença (p<0.05) detectadas pelo teste de Tukey HSD com a correção FDR; ². OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B.

Estrutura da comunidade e seus determinantes

A PCoA foi utilizada para visualizar a proporção de dissimilaridade (distância) (Bray-Curtis) entre as comunidades. Observou-se que, em nível de OTU (97%), as amostras haviam clusterizado mais fortemente por usina. Na usina A, as amostras se separaram de acordo com o manejo, enquanto na usina B, as amostras referente ao manejo orgânico estavam mais agrupadas quando comparadas ao manejo tradicional (Figura 2).

Figura 2. Proporção de dissimilaridade (Bray-Curtis) entre as comunidades microbianas de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional, visualizada com a análise de coordenadas principais (PCoA). Onde, OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B.

A PERMANOVA foi então utilizada para verificar se as amostras variavam de acordo com o manejo por usina (biogeo: OA, CA, OB, CB) e se a subclassificação de solo (TS) também era responsável pelo observado no PCoA. Nesse sentido, observou-se que as variáveis manejo por usina (PERMANOVA: df = 3, F = 7.0546, p = 0.000999) e subclassificação do solo (PERMANOVA: df = 4, F = 3.4847, p = 0.000999) afetavam em conjunto a diversidade (Tabela suplementar 5). O fator manejo por usina, explica 42% da variação encontrada no PCoA, enquanto a subclassificação de solo explica 27%. Os demais 31% não podem ser explicados considerando essas duas variáveis. Além da 86

diferença na variação, houve diferença na dispersão (PERMDISP: p<0.05) entre os grupos OB e CB (PERMDISP: Pairwise comparisons OB X CB, p= 0.036897), reforçando o padrão encontrado no PCoA. Os demais grupos não apresentaram diferença na dispersão. Para avaliar quais grupos microbianos eram predominantes em cada tipo de cultivo, a distribuição binomial negativa foi utilizada (DESeq2). Ao avaliarmos como o manejo por usina (biogeo) impacta na dissimilaridade das amostras, observamos que 164 OTUs (p<0.01, ajustado com FDR) estavam diferencialmente abundantes entre os 4 grupos amostrais avaliados (Tabela suplementar 6). Para uma avaliação mais precisa, a forma como o manejo impacta na rizosfera foi investigado por usina. Na usina A, a abundância diferencial de 54 OTUs (p<0.01, ajustado com FDR) foram diferentes nos manejos orgânicos e tradicionais. Os filos, Actinobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Proteobacteria e o candidato a filo TM7 foram mais abundantes no manejo orgânico, enquanto os filos Acidobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes foram mais abundantes no manejo tradicional. Famílias como Hyphomicrobiaceae, Rhodospirillaceae, Beijerinckiaceae, Nitrospiraceae, Nocardioidaceae, Solibacteraceae, Sphingomonadaceae e Streptosporangiaceae foram enriquecidas no manejo orgânico. Enquanto, Acidobacteriaceae, Koribacteraceae, Micrococcaceae, Sphingobacteriaceae, Thermogemmatisporaceae, Thermomonosporaceae estavam mais presentes associados ao sistema tradicional da usina A (Tabela 3). Seguindo o observado no PCoA e no PERMDISP, a Usina B apresentou um menor número (27) de OTUs (p<0.01, ajustado com FDR) diferencialmente abundantes em detrimento do manejo. Os filos, Actinobacteria, Chloroflexi, Cyanobacteria, Gemmatimonadetes e Proteobacteria foram os mais abundantes no manejo orgânico, enquanto Acidobacteria, e os candidato a filos AD3 e WPS-2 estavam associados ao manejo tradicional. A família Micromonosporaceae e Propionibacteriaceae foram observadas como diferencialmente abundantes no manejo orgânico, enquanto Cellulomonadaceae, Ktedonobacteraceae, Micrococcaceae e Thermomonosporaceae, estavam mais associadas ao manejo tradicional (Tabela 4). Observou-se que a níveis taxonômicos mais altos (Filo), o perfil das OTUs mais abundantemente era semelhante em razão do manejo e que a níveis taxonômicos mais baixos (família) era diferenciado, o que reforça a separação observada no mapa no quesito usina.

OTUs e propriedades do solo

A maioria das propriedades físico-químicas dos solos avaliados não se alteram em função do manejo (ANOVA, p>0.05), sendo o K, o único elemento diferente entre manejos orgânicos (OA e 87

OB) e convencionais (CA e CB) (ANOVA; TukeyHSD, p<0.05) nas duas usinas. O Al é mais abundante no sistema convencional da usina B (CB) (ANOVA; TukeyHSD, p<0.05). Já a MO difere entre as usinas (ANOVA; TukeyHSD, p<0.05) (Tabela suplementar 1). O teste de Mantel foi executado a fim de verificar a correlação entre a comunidade microbiana e os parâmetros físico- químicos do solo. Nesse sentido, observou-se que a comunidade microbiana estava relacionada com os atributos físico-químicos do solo (R= 0.25, p=0.009), o que explica parte a interação entre a subclassificação do solo e a diversidade observados na PERMANOVA. Os atributos físico-químicos avaliados se correlacionaram positivamente (R >0.5) ou negativamente (R < -0.5) com 19 das OTUs (Tabela suplementar 7). O K e o Mg foram os elementos que mais se correlacionaram com OTUs, se correlacionando com 6 e 7 OTUs, respectivamente. Algumas OTUs foram influenciadas por mais de um fator edáfico. A OTU 00011, pertencente ao gênero Mycobacterium e a OTU00034, pertencente à família Intrasporangiaceae se correlacionam positivamente com o pH, P e K. Já a OTU00018, do gênero Edaphobacter se correlaciona negativamente com o K e o Mg, e positivamente com o Al. O membro da família Ellin6075 (OTU00036) se correlaciona negativamente com o Ca, Al e a SB, enquanto a OTU00039, relacionada ao gênero Phenylobacterium se correlaciona positivamente com o Al e negativamente com o Ca e a SB. As demais OTUs se relacionam com um ou dois dos fatores avaliados. O CAP foi utilizado como modelo de ordenação restrita para demonstrar como os fatores edáficos impactavam na diversidade. A direção dos vetores indica a variação máxima relacionada ao fator avaliado, enquanto o tamanho do vetor indica a força da correlação. Nesse aspecto, os maiores vetores K e Mg, são aqueles que se correlacionaram com o maior número de OTUs no teste de correlação de Pearson. Pela direção dos vetores Mg e Cálcio estão relacionado ao grupo convencional da Usina A, enquanto a MO se relaciona com a diversidade da orgânica da usina A. Em contraponto, fatores como P, Al, pH e K, estão relacionados a parte da comunidade orgânica e convencional da usina B. Ademais, os efeitos observados no gráfico são significativos (P<0.01) e sugerem que os efeitos edáficos são responsáveis, juntamente com o manejo, por explicar uma fatia da diversidade.

Tabela 3. Análise da abundância diferencial de filos e famílias na Usina A. O valor de p foi ajustado com a correção de Benjamini- Hochberg (FDR).

Filos abundantes no sistema orgânico (Usina A) Famílias abundantes no sistema orgânico (Usina A) nº de nº de OTUs Filo log2FC padj OTUs Filo Família log2FC padj 4 Acidobacteria 4.47875 <0.001 1 Proteobacteria Beijerinckiaceae 5.36364 <0.001 3 Actinobacteria 2.56979 <0.001 4 Proteobacteria Hyphomicrobiaceae 3.27296 <0.001 3 Chloroflexi 5.63902 <0.001 1 Nitrospirae Nitrospiraceae 5.30494 <0.001 3 Gemmatimonadetes 3.51028 <0.001 1 Actinobacteria Nocardioidaceae 1.74785 <0.001 1 Nitrospirae 5.30494 <0.001 2 Proteobacteria Rhodospirillaceae 3.00827 <0.001 2 Planctomycetes 3.74846 <0.001 1 Acidobacteria Solibacteraceae 6.28568 <0.001 10 Proteobacteria 4.15751 <0.001 1 Proteobacteria Sphingomonadaceae 3.25673 <0.001 2 TM7 5.23160 <0.001 1 Actinobacteria Streptosporangiaceae 3,14847 <0.001

Filos abundantes no sistema convencional (Usina A) Famílias abundantes no sistema convencional (Usina A) nº de nº de OTUs Filo log2FC padj OTUs Filo Família log2FC padj 9 Acidobacteria -5.89496 <0.001 1 Acidobacteria Acidobacteriaceae -3.37536 <0.001 2 Actinobacteria -2.38958 <0.001 4 Acidobacteria Koribacteraceae -3.28882 <0.001 1 Bacteroidetes -6.47554 <0.001 1 Actinobacteria Micrococcaceae -2.99951 <0.001 3 Chloroflexi -4.74474 <0.001 1 Bacteroidetes Sphingobacteriaceae -6.47554 <0.001 1 Gemmatimonadetes -4.24368 <0.001 2 Chloroflexi Thermogemmatisporaceae -4.89576 <0.001 7 Planctomycetes -4.24065 <0.001 1 Actinobacteria Thermomonosporaceae -1.77965 <0.001 2 Proteobacteria -3.12020 <0.001 1 WPS-2 -5.72773 <0.001

Tabela 4. Análise da abundância diferencial de filos e famílias na Usina B. O valor de p foi ajustado com a correção de Benjamini-Hochberg (FDR).

Filos abundantes no sistema orgânico (Usina B) Famílias abundantes no sistema orgânico (Usina B) nº de nº de OTUs Filo log2FC padj OTUs Filo Família log2FC padj 4 Actinobacteria 5.66710 <0.001 2 Actinobacteria Micromonosporaceae 5.66074 <0.001 3 Chloroflexi 4.35895 <0.001 1 Actinobacteria Propionibacteriaceae 5.61031 <0.001 1 Cyanobacteria 5.21269 <0.001 1 Gemmatimonadetes 4.85026 <0.001 1 Planctomycetes 4.55130 <0.001 4 Proteobacteria 4.02132 <0.001 1 TM7 4.63940 <0.001

Filos abundantes no sistema convencional (Usina B) Famílias abundantes no sistema convencional (Usina B) nº de nº de OTUs Filo log2FC padj OTUs Filo Família log2FC padj 2 Acidobacteria -3.74338 <0.001 2 Actinobacteria Cellulomonadaceae -2.70339 <0.001 3 Actinobacteria -3.27162 <0.001 1 Chloroflexi Ktedonobacteraceae -5.48921 <0.001 1 AD3 -4.41611 <0.001 1 Actinobacteria Micrococcaceae -3.08491 <0.001 1 Chloroflexi -5.48921 <0.001 1 Actinobacteria Thermomonosporaceae -4.02654 <0.001 1 Planctomycetes -3.21962 <0.001 2 Proteobacteria -4.88317 <0.001 1 TM7 -5.30843 <0.001 1 WPS-2 -6.02818 <0.001

Figura 3. Análise canônica das coordenadas principais (CAP) do efeito dos fatores edáficos sobre as comunidades bacterianas de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional. Onde, OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B.

Predição funcional de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional

A análise do gene marcador 16S rRNA apresenta informações importantes sobre como a diversidade se relaciona com o manejo e com os fatores edáficos, entretanto, não consegue prover informação sobre sua funcionalidade. Nesse sentido, o programa PICRUSt foi utilizado para predizer a funcionalidade a partir do 16S rRNA. A partir da predição dos metagenomas, 6,910 possíveis genes foram obtidos. A acurácia da predição foi avaliada com o valor de NSTI, que teve média de 0.19 ± 0.02, valores próximos aos encontrados para solo (média NSTI=0.17 ± 0.02 d.p) pela equipe desenvolvedora do programa (Langille et al., 2013), reforçando a acurácia da predição. Ao nível de classificação 2 do KEGG, genes relacionados ao metabolismo de lipídeos, nucleotídeos, de aminoácidos e de terpenóides foram diferencialmente expressos entre as usinas. O mesmo foi observado para genes relacionados à tradução, processamento da informação genética e degradação de xenobióticos (Figura 4). Dessa forma, observa-se que houve separação entre as

funcionalidades das usinas, acompanhando a separação taxonômica a nível de usina observada no PCoA.

Figura 4. Metagenomas preditos pelo software PICRUSt diferencialmente expressas ao nível 2 do banco de dados KEGG. A figura apresenta as funções diferencialmente expressas, quando comparadas as duas usinas pelo teste t de Welch's com correção do valor de p de Benjamini–Hochber (p<0.05). Onde: A representa a Usina A e B representa a Usina B.

Para verificar como o manejo influência nas funções preditas relacionadas as habilidades de promoção do crescimento vegetal, selecionamos 79 genes envolvidos na solubilização e absorção de fosfato, biossíntese de fitohormônios, produção de ACC deaminase, produção de sideróforos, fixação de nitrogênio e no biocontrole (Tabela suplementar 8) e avaliamos como esses genes se comportavam em função do manejo em cada usina (Figura 5). Seis genes estão diferencialmente expressos no manejo orgânico na usina A, sendo que 5 deles se relacionam com a fixação de nitrogênio K02591 (nifK), K02586 (nifD), K02588 (nifH), K02585 (nifB) e K02596 (nifX), e um está envolvido na produção de acetoína K03366 (butA). Já na usina B, observou-se um maior número de genes diferencialmente expressos. Assim como na usina A, todos foram diferencialmente expressos no manejo orgânico. Em sua maioria (10), estão relacionados a fixação de nitrogênio K02592 (nifN), K02596 (nifX), K02595 (nifW), K02593 (nifT), K02585 (nifB), K02594 (nifV), K02587 (nifE), K03839 (nifF), K02597 (nifZ) ou ao metabolismo do nitrogênio K01915 (gnlA). Os demais relacionam-se a produção de ACC deaminase (K01505), produção de β-1,3-glucanase (K01210) e produção de sideróforo (K02361).

Figura 5. Genes relacionados a promoção do crescimento vegetal diferencialmente expressos (teste t de Welch's, com correção do valor de p de Benjamini–Hochber (p<0.05) na rizosfera de cana-de- açúcar sob manejo tradicional e orgânico. (A) Usina A. (B) Usina B.

DISCUSSÃO

Admite-se que o cultivo orgânico tenha impacto positivo no solo, sobretudo em sua microbiota, almejando processos como a aquisição de nutrientes, a supressão de patógenos e estimulação do crescimento vegetal (Henneron et al., 2015; Xia et al., 2015). Nesse âmbito, o presente estudo acessou a microbiota associada à rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo tradicional e orgânico e buscou as diferenças na sua abundância, taxonomia e funcionalidade.

Mesmo com grandes diferenças entre as práticas adotadas entre a agricultura orgânica e convencional, não foram observadas diferenças entre os manejos dentro de uma mesma usina em relação ao número de OTUs observadas (sobs) e as métricas de riqueza (Chao1) e diversidade (Shannon). Entretanto, essas métricas alteraram em função das usinas avaliadas. O mesmo foi observado por Pershina et al. (2015) ao avaliar como o manejo impactava a diversidade alfa em campos de trigo. No referido estudo, a diversidade alfa variou ao comparar as regiões cultivadas com regiões de floresta, entretanto, a diversidade alfa entre manejos orgânicos e tradicional não apresentou diferenças. Sugerimos que pelo fato de a cana-de-açúcar apresentar um longo histórico de adubação orgânica concomitante a química em manejos tradicionais, com a adição de compostos como vinhaça, torta de filtro e lodo (Vitti and Mazza, 2002), o estado nutritivo do solo se mantenha estável e a uniformidade e a riqueza das espécies sejam semelhantes quanto a seus índices, mas variem em função da diversidade beta, como foi observado neste estudo. Hartmann et al (2015), observaram que solos que recebem somente adubação orgânica apresentam profundas diferenças em relação a solos onde a adubação é exclusivamente mineral, entretanto, em sistemas integrados, em que compostos orgânicos e químicos são administradas as diferenças são menores. As diferenças observadas, nas diversidades alfa e beta, entre as usinas são explicadas por um conjunto de fatores. Peiffer e colaboradores (2013) encontraram diferenças significativas entre a rizosfera de milho plantadas em diferentes regiões, todavia, somente o fator distância geográfica não era o único elemento capaz de explicar completamente as variações na diversidade alfa e beta nessas regiões. Além do fator biogeográfico, que corresponde à análise da diversidade em função da distribuição espacial, aspectos específicos de cada usina e suas práticas agrícolas (clima, relevo, quantidade e tipo de insumos aplicados), bem como os fatores edáficos são responsáveis pela alteração da diversidade (Green and Bohannan, 2006; Durrer et al., 2016; Xia et al., 2016). Dentre os filos predominantes encontrados neste estudo, destacaram-se: Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Planctomycetes e Chloroflexi. Os filos, Proteobacteria, Acidobacteria e Actinobacteria são os mais comumente encontrados associados a vários estudos que avaliam a rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo tradicional (Pisa et al., 2011; Da Costa et al., 2014; Lopes et al., 2016; Armanhi et al., 2018). Os demais filos apresentam uma maior flexibilidade. Filos como Planctomycetes e Chloroflexi que foram mais predominantes neste estudo, foram menos abundantes em outros estudos que avaliaram a diversidade em rizosfera de cana-de-açúcar (Pisa et al., 2011; Da Costa et al., 2014), o que reforça a ideia de que a composição microbiana da rizosfera é

multifacetada e influenciada por aspectos próprios de cada vegetal, por práticas locais, fatores biogeográficos e componentes edáficos. Neste estudo, em nível de OTU, os padrões observados no PCoA e confirmados pela PERMANOVA e PERMDISP, corroboram com a ideia de que a diversidade microbiana é, em parte, influenciada pela forma de agricultura. A forma de manejo como uma das forças de ação na rizosfera também foi encontrada em outros estudos. Em rizosfera de café, observou-se uma grande diferença entre a diversidade de amostras oriundas da agricultura intensiva (INT) em comparação a amostras de agricultura orgânica de longo prazo (ORG) (Caldwell et al., 2015). Em rizosfera de parreiras, os filos Firmicutes, Acidobacteria, Verrucomicrobia e Planctomyces foram enriquecidos no manejo orgânico, enquanto os filos Proteobacteria e Bacteroidetes foram mais abundantes no manejo tradicional (Vega-Avila et al., 2015). Ao analisarmos a abundância diferencial dos filos pela ferramenta DESeq2, observamos que os filos Proteobacteria, Actinobacteria e Gemmatimonadetes foram mais abundantes no manejo orgânico das duas usinas, enquanto o filo Acidobacteria e o candidato a filo WPS-2 foram diferencialmente abundantes no manejo tradicional. O filo Proteobacteria já foi reportado como mais abundante em solos tratados com três tipos de esterco verde (Zhang et al., 2017) e em solos que recebiam esterco e lodo (Hartmann et al., 2015). Dentro das classes pertencentes ao filo Proteobacteria, a classe Alfaproteobacteria foi a mais predominante. Essa classe tem sido associada à presença de fertilização orgânica (Ferreira et al., 2009; Li et al., 2012), reforçando os achados deste estudo. O filo Actinobacteria também já foi relatado como mais abundante em solos que recebiam esterco animal (Wessén et al., 2010). O filo Actinobacteria está amplamente disponível no solo e é metabolicamente versátil, sendo capaz de utilizar e degradar uma ampla gama de substâncias. Apresenta importante papel na ciclagem dos nutrientes, participando dos ciclos biogeoquímicos e na degradação da matéria orgânica. São capazes de colonizar a rizosfera e de competir com outros micro-organismos no solo através da biossíntese de compostos antimicrobianos (Bulgarelli et al., 2013; Barka et al., 2016), o que facilitaria sua adaptação nos sistemas orgânicos. Além disso, os filos Proteobacteria e Actinobacteria responderam positivamente a adição de substratos orgânicos contendo carbono no solo (Eilers et al., 2010), o que auxiliaria sua presença em solos cultivados sob manejo orgânico. Já o filo Gemmatimonadetes foi encontrado de forma mais abundante em solos adubados com compostos (Chaudhry et al., 2012), o que também é uma realidade na adubação orgânica da cana-de-açúcar.

Embora os membros do filo Acidobacteria sejam considerados como oligotróficos (apresentam melhor crescimento em ecossistemas limitados em nutrientes), esses micro-organismos têm sido encontrados em maior abundância em manejos tradicionais (Pershina et al., 2015) ou associados a combinação de fertilização orgânica e inorgânica (Li et al., 2017). Sugerimos que isso ocorra, pois apesar de crescerem melhor em ecossistemas mais pobres, não são reconhecidos pela degradação de moléculas complexas, embora contenham essa informação em seu genoma (Kielak et al., 2016), o que dificultaria sua adaptação em ambientes com alta carga de matéria orgânica. Nem sempre a classificação das OTUs é possível a níveis taxonômicos mais baixos, entretanto, das que foram passíveis de classificação, encontramos algumas famílias diferencialmente abundantes de acordo com o manejo por usina. Sob manejo orgânico encontramos, como diferencialmente abundantes, famílias importantes no ciclo do nitrogênio e carbono (Gardner et al., 2011), como a família Hyphomicrobiaceae. Sugerimos que a presença dessa família associada à agricultura orgânica pode estar relacionada à necessidade de degradação de compostos orgânicos mais complexos para a liberação de elementos importantes para o crescimento celular, como o nitrogênio e o carbono. Em canaviais convencionais, esses elementos seriam mais facilmente adquiridos ao serem administrados via adubação inorgânica. A família Hyphomicrobiaceae, juntamente com as famílias Sphingomonadaceae, Rhodospirillaceae (mais abundantes no manejo orgânico) e Sphingobacteriaceae (mais abundante no manejo tradicional) têm sido frequentemente encontradas na rizosfera e são conhecidas por terem membros que são capazes de promover o crescimento vegetal (De Souza, 2016). Reforça-se dessa forma, que independente do cultivo, serão recrutados para a rizosfera, os indivíduos que forem mais benéficos ao vegetal (Bulgarelli et al., 2013). Embora o manejo seja responsável por parte da variação observada, ele não foi a única força capaz de modular a estrutura da rizosfera das amostras avaliadas. A subclassificação do solo e seus atributos físico-químicos também contribuíram estatisticamente para o observado. A avaliação baseada na subclassificação do tipo do solo foi empregada e avaliada neste estudo, pois englobam características não cobertas pelas análises físico-químicas como a textura, estrutura, quantidade de areia e argila e a estabilidade (EMBRAPA SOLOS, 2013). Em relação à subclassificação do solo, observamos que essa métrica interferiu na diversidade beta, mas não na alfa. Complementando a ação da subclassificação do tipo do solo, as características químicas e físicas do solo se correlacionaram com 19 das OTU e somente os elementos K e Al variaram em função do manejo por usina. O tipo de solo em conjunto com suas propriedades físico-químicas pode beneficiar certos tipos de micro-organismos criando nichos específicos, o que exerce influência na 96

habilidade das raízes em recrutar indivíduos para a rizosfera (Lareen et al., 2016). O complexo sistema formado pelas características do solo pode ainda, influenciar na fisiologia vegetal e na exsudação radicular, levando a modificação da microbiota da rizosfera (Philippot et al., 2013). E dentre os atributos físico-químicos, o pH é aquele que mais condiciona a diversidade (Lauber et al., 2008; Lauber et al.,2009), embora os outros elementos também impactem na diversidade. Em específico, o sistema orgânico também é capaz de modificar as propriedades físico-químicas do solo e como consequência sua microbiota. Quando se insere um adubo orgânico no solo, os micro- organismos que estão no adubo podem se proliferar no solo. Em contraponto, o sistema orgânico pode favorecer as espécies heterotróficas que já estão disponíveis no solo (Bettiol et al., 2002; Puglisi et al., 2013). A análise do sequenciamento em larga escala da região V3-V4, nos permitiu um melhor entendimento sobre como os fatores edáficos e o manejo atuam sobre a distribuição taxonômica. Embora tenhamos feito algumas inferências sobre a função desses organismos baseado nas informações disponíveis na literatura a cerca das famílias, softwares como o PICRUSt são capazes de fornecer informações com maior acurácia. Neste sentido, Zarraonaindia et al. (2015) encontraram grande similaridade entre os metagenomas preditos pelo PICRUSt e os metagenomas sequenciados, validando o método utilizado neste estudo. Observou-se que além das diferenças entre as diversidades, alfa e beta, as usinas também apresentavam diferenças no contexto funcional, corroborando com a força do elemento “usina” obtido neste estudo. Selecionamos genes relacionados à promoção do crescimento vegetal e avaliamos se eles se encontravam diferencialmente expressos entre os cultivos orgânico e tradicional dentro de cada usina. A promoção do crescimento vegetal por rizobactérias é um efeito extremamente desejado, haja vista que seriam uma boa alternativa para redução de patógenos e biodisponibilização de nutrientes na agricultura orgânica (Gardener and Fravel, 2002). As rizobctérias promotoras do crescimento vegetal estimulam o crescimento vegetal por um ou mais mecanismos, podendo atuar na disponibilização de nutrientes como o fosfato, o nitrogênio, na produção de fitohormônios ou como agentes de biocontrole (Nihorimbere et al., 2011, Glick, 2012). De todos os fatores de promoção do crescimento vegetal avaliados, a fixação de nitrogênio foi a mais associada ao manejo orgânico. Vários genes relacionados à nitrogenase foram diferencialmente expressos nas usinas A e B em associação ao manejo orgânico. Na usina B, ainda foram observadas associadas ao manejo orgânico a expressão diferencial dos genes que codificam a ACC deaminase e a 1-3,glucanase. Esses achados, encontram-se em concordância com outros descritos na literatura. Orr et al (2012) e Chinnadurai et al (2014), relataram que a fertilização 97

orgânica se correlacionava com um aumento das cópias de NifH. Isso pode ser explicado, pelo fato de que na agricultura convencional o uso de fertilizantes a base de nitrato ou amônio, provêem uma fonte de nitrogênio facilmente absorvível. Já na agricultura orgânica, as fontes nitrogenadas derivam apenas da rotação de culturas e da adubação via composto ou estercos, sendo fundamental a ação dos micro-organismos em processos de dissimilação desses compostos a aminoácidos, amônia ou nitrato, formas que são absorvidas pelo vegetal (Ye et al., 2017; Tsvetkov et al., 2018). No entanto, a fixação biológica de nitrogênio é menos dispendiosa energeticamente, do que a aquisição de nitrogênio a partir de moléculas orgânicas complexas (Norman and Friesen, 2017). Como a ACC deaminase está presente em situações de estresses bióticos e abióticos (Glick, 2012), sugere-se que sua presença em sistemas orgânicos acontece, devido a esse tipo de cultivo apresentar baixas quantidades de nutrientes de fácil assimilação, constituindo por si só uma forma de estresse. Já a 1-3,glucanase está associada ao biocontrole (Hayat et al., 2010) e sua presença no solos sob agricultura orgânica é interessante, uma vez que os agentes químicos para controle de doenças vegetais não podem ser utilizados. Analisados em conjunto, os resultados obtidos neste estudo revelam que embora o manejo tenha um grande impacto no comportamento da rizosfera, os fatores edáficos (subclassificação de solo e propriedades físico-químicas) também são responsáveis por moldar a rizosfera. Observamos que a regionalidade (relevo, clima, volume de chuvas), as práticas de manejo próprias de cada usina (quantidade e tipo de produtos aplicados) e o fator biogeográfico foram os responsáveis pela grande diferença nas diversidades alfa e beta observadas entre usinas. Ademais, verificou-se que o manejo orgânico tem efeito sobre a promoção do crescimento vegetal, sobretudo no que tange a fixação biológica de nitrogênio.

AGRADECIMENTOS

A Goiasa-Goiatuba Álcool Ltda por permitirem e auxiliarem a coleta de solo rizosférico. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo fornecimento de bolsa de estudos ao primeiro autor.

REFERÊNCIAS

Ahkami, A. H., White III, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. (2017). Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere 3: 233-243.

Ahmad, F., Ahmad, I., Khan, M. S. (2008). Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiological research 163(2) 173-181.

Ahemad, M., Kibret, M. (2014). Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: current perspective. Journal of King Saud University-Science 26(1): 1-20.

Armanhi, J. S. L., de Souza, R. S. C., de Brito Damasceno, N., de Araújo, L. M., Imperial, J., Arruda, P. (2017). A community-based culture collection for targeting novel plant growth-promoting bacteria from the sugarcane microbiome. Frontiers in Plant Science 8: 1-17.

Arruda, B., Rodrigues, M., Soltangheisi, A., Richardson, A. E., Andreote, F. D., & Pavinato, P. S. (2016). Biological and morphological traits of sugarcane roots in relation to phosphorus uptake. Journal of soil science and plant nutrition 16(4): 901-915.

Bakker, M. G., Manter, D. K., Sheflin, A. M., Weir, T. L., Vivanco, J. M. (2012). Harnessing the rhizosphere microbiome through plant breeding and agricultural management. Plant and Soil 360(1): 1-13.

Barka, E. A., Vatsa, P., Sanchez, L., Gaveau-Vaillant, N., Jacquard, C., Klenk, H. P., Clément, C., Ouhdouch, Y., Van Wezel, G. P. (2016). Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews 80(1), 1-43.

Benjamini, Y., Hochberg, Y. (1995). Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the royal statistical society. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological) 57: 289-300.

Bettiol, W., Ghini, R., Galvão, J. A. H., Ligo, M. A. V., Mineiro, J. L. D. C. (2002). Soil organisms in organic and conventional cropping systems. Scientia Agricola 59(3): 565-572.

Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. (2012). The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in plant science 17(8): 478-486.

Blanc, J., Kledal, P. R. (2012). The Brazilian organic food sector: Prospects and constraints of facilitating the inclusion of smallholders. Journal of Rural Studies 28(1): 142-154.

Borges, L., Madari, B. E., Leandro, W. M., Fernandes, P. M., da Silva, E. A., da Silva, M. R., da Silva, M. A. S. (2015). Nutritional state and productivity of organic sugarcane in Goiás, Brazil. Journal of Agronomy 14 (1): 6-14.

Brasil, Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento (MAPA). (2018) Produção de Açúcar por Tipo - Safra 2017/18. Disponível em: http://www.agricultura.gov.br/assuntos/sustentabilidade/agroenergia/arquivos- producao/copy16_of_ac_prodtipo_1718.pdf.

Bray, J. R., Curtis, J. T. (1957) An ordination of upland forest communities of southern Wisconsin. Ecol Monogr 27: 325–349.

Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., van Themaat, E. V. L., Schulze-Lefert, P. (2013). Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual review of plant biology 64: 807- 838.

Caldwell, A. C., Silva, L. C. F., da Silva, C. C., Ouverney, C. C. (2015). Prokaryotic diversity in the rhizosphere of organic, intensive, and transitional coffee farms in Brazil. PloS one 10(6): 1-17.

Cecagno, R., Fritsch, T. E., Schrank, I. S. (2015). The plant growth-promoting bacteria Azospirillum amazonense: genomic versatility and phytohormone pathway. BioMed research international 2015: 1-7.

Chaparro, J. M., Badri, D. V., Vivanco, J. M. (2014). Rhizosphere microbiome assemblage is affected by plant development. The ISME journal 8(4): 790-803.

Chaudhry, V., Rehman, A., Mishra, A., Chauhan, P. S., Nautiyal, C. S. (2012). Changes in bacterial community structure of agricultural land due to long-term organic and chemical amendments. Microbial ecology 64(2): 450-460.

Chinnadurai, C., Gopalaswamy, G., Balachandar, D. (2014). Long term effects of nutrient management regimes on abundance of bacterial genes and soil biochemical processes for fertility sustainability in a semi-arid tropical Alfisol. Geoderma 232: 563-572.

Coleman‐Derr, D., Desgarennes, D., Fonseca‐Garcia, C., Gross, S., Clingenpeel, S., Woyke, T., North, G, Visel, A., Partida-Martinez, L. P., Tringe, S. G. (2016). Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytologist 209(2): 798-811.

Condron, L. M., Cameron, K. C., Di, H. J., Clough, T. J., Forbes, E. A., McLaren, R. G., Silva, R. G. (2000). A comparison of soil and environmental quality under organic and conventional farming systems in New Zealand. New Zealand Journal of Agricultural Research 43(4): 443-466.

100

Da Costa, D. P., Cavalcante Franco Dias, A., Durrer, A., Maia de Andrade, P. A., Gumiere, T., Dini Andreote, F. (2014). Composição diferencial das comunidades bacterianas na rizosfera de variedades de cana-de-açúcar. Revista Brasileira de Ciência do Solo 38(6): 1694-1702.

Darrah, P. R. (1993). The rhizosphere and plant nutrition: a quantitative approach. Plant and Soil 155(1): 1-20.

De Souza, R. S. C., Okura, V. K., Armanhi, J. S. L., Jorrín, B., Lozano, N., Da Silva, M. J., González-Guerrero, M., de Araújo, L. M. A., Verza, N. C., Bagheri, H. C., Imperial, J., Arruda, P. (2016). Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome. Scientific reports 6: 1-15.

DeSantis, T. Z., Hugenholtz, P., Larsen, N., Rojas, M., Brodie, E. L., Keller, K., Huber, T., Dalevi, D., Hu, P., Andersen, G. L. (2006). Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology 72(7): 5069-5072.

Dhariwal, A., Chong, J., Habib, S., King, I. L., Agellon, L. B., Xia, J. (2017). MicrobiomeAnalyst: a web-based tool for comprehensive statistical, visual and meta-analysis of microbiome data. Nucleic acids research 45: W180-W188.

Duarte, F. C., Cardoso, M. D. G., Santiago, W. D., Machado, A. M. R., Nelson, D. L. (2017). Brazilian organic sugarcane spirits: physicochemical and chromatographic profile. Revista Ciência Agronômica 48(2): 288-295.

Durrer, A., Gumiere, T., Taketani, R. G., da Costa, D. P., e Silva, M. D. C. P., & Andreote, F. D. (2016). The drivers underlying biogeographical patterns of bacterial communities in soils under sugarcane cultivation. Applied Soil Ecology 110: 12-20.

Embrapa Solos (2013). Sistema brasileiro de classificação de solos. Centro Nacional de Pesquisa de Solos: Rio de Janeiro. 342 p.

Eilers, K. G., Lauber, C. L., Knight, R., Fierer, N. (2010). Shifts in bacterial community structure associated with inputs of low molecular weight carbon compounds to soil. Soil Biology and Biochemistry, 42(6), 896-903.

Ferreira, E. P. B., Nunes, M. U. C., Xavier, G. R., Rumjanek, N. G. (2009). Perfis de PCR-DGGE de comunidades bacterianas associadas ao rizoplano de milho sob diferentes doses de adubação com compostos orgânicos. Bioscience Journal 25(3): 41-50.

101

Garbeva, P. V., Van Veen, J. A., Van Elsas, J. D. (2004). Microbial diversity in soil: selection of microbial populations by plant and soil type and implications for disease suppressiveness. Annu. Rev. Phytopathol. 42: 243-270.

Gardener, B. B. M., Fravel, D. R. (2002). Main content area Biological Control of Plant Pathogens: Research, Commercialization, and Application in the USA. Plant Health Progress 3: 207-209.

Gardner, T., Acosta-Martinez, V., Senwo, Z., Dowd, S. E. (2011). Soil rhizosphere microbial communities and enzyme activities under organic farming in Alabama. Diversity 3(3): 308-328.

Georges, I., Blanc, J. (2013). L'émergence de l'agriculture biologique au Brésil: une aubaine pour l'agriculture familiale? Le cas de producteurs de la ceinture verte de la ville de São Paulo. Autrepart (1): 121-137.

Glick, B. R. (2012). Plant growth-promoting bacteria: mechanisms and applications. Scientifica 2012: 1-15.

Green, J., Bohannan, B. J. (2006). Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in ecology & evolution 21(9): 501-507.

Hartmann, M., Frey, B., Mayer, J., Mäder, P., Widmer, F. (2015). Distinct soil microbial diversity under long-term organic and conventional farming. The ISME journal 9(5): 1177.

Hayat, R., Ali, S., Amara, U., Khalid, R., Ahmed, I. (2010). Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: a review. Annals of Microbiology 60(4): 579-598.

Henneron, L., Bernard, L., Hedde, M., Pelosi, C., Villenave, C., Chenu, C., Bertrand, M., Girardin, C., Blanchart, E. (2015). Fourteen years of evidence for positive effects of conservation agriculture and organic farming on soil life. Agronomy for sustainable development 35(1): 169-181.

Jones, D. L., Hinsinger, P. (2008). The rhizosphere: complex by design. Plant and soil 321: 1-6.

Kanehisa, M., Goto, S. (2000). KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research 28(1): 27-30.

Kaur, G., Reddy, M. S. (2014). Role of phosphate-solubilizing bacteria in improving the soil fertility and crop productivity in organic farming. Archives of Agronomy and Soil Science 60(4): 549-564.

102

Kielak, A. M., Barreto, C. C., Kowalchuk, G. A., van Veen, J. A., Kuramae, E. E. (2016). The ecology of Acidobacteria: moving beyond genes and genomes. Frontiers in microbiology 7: 1-16.

Klindworth, A., Pruesse, E., Schweer, T., Peplies, J., Quast, C., Horn, M., Glöckner, F. O. (2013). Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic acids research 41(1), e1-e11.

Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. (2013). Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied and Environmental Microbiology 79(17): 5112-20.

Lana, R. M. Q., Maia, L. O. R., de Vasconcelos, A. C. P., de Moraes, E. R., Siqueira, T. P., Silva, A. A. (2016). Evaluation of chemical attributes of soil under different management systems of sugarcane in an area of expansion. Bioscience Journal 32(3): 611-618.

Langille, M. G., Zaneveld, J., Caporaso, J. G., McDonald, D., Knights, D., Reyes, J. A., Clemente, J. C., Burkepile, D. E., Thurber, R. L. V., Knight, R., Beiko, R. G., Huttenhower, C. (2013). Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature biotechnology 31(9), 814 - 821.

Lareen, A., Burton, F., Schäfer, P. (2016). Plant root-microbe communication in shaping root microbiomes. Plant molecular biology 90(6): 575-587.

Lauber, C. L., Hamady, M., Knight, R., Fierer, N. (2009). Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale. Applied and environmental microbiology 75(15): 5111-5120.

Lauber, C. L., Strickland, M. S., Bradford, M. A., Fierer, N. (2008). The influence of soil properties on the structure of bacterial and fungal communities across land-use types. Soil Biology and Biochemistry 40(9): 2407-2415.

Li, R., Khafipour, E., Krause, D. O., Entz, M. H., de Kievit, T. R., Fernando, W. D. (2012). Pyrosequencing reveals the influence of organic and conventional farming systems on bacterial communities. PloS one 7(12): 1-12.

Li, F., Chen, L., Zhang, J., Yin, J., Huang, S. (2017). Bacterial community structure after long-term organic and inorganic fertilization reveals important associations between soil nutrients and specific taxa involved in nutrient transformations. Frontiers in microbiology 8: 1-12.

103

Liu, W., Wang, Q., Hou, J., Tu, C., Luo, Y., Christie, P. (2016). Whole genome analysis of halotolerant and alkalotolerant plant growth-promoting rhizobacterium Klebsiella sp. D5A. Scientific reports 6: 1-10.

Lopes, L. D., Pereira e Silva, M. D. C., Andreote, F. D. (2016). Bacterial abilities and adaptation toward the rhizosphere colonization. Frontiers in microbiology 7: 1-13.

Love, M. I., Huber, W. Anders, S. (2014). Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq. 2. Genome Biol 15: 31–21.

Lupatini, M., Korthals, G. W., de Hollander, M., Janssens, T. K., Kuramae, E. E. (2017). Soil microbiome is more heterogeneous in organic than in conventional farming system. Frontiers in microbiology 7: 1-13.

McMurdie, P. J., Holmes, S. (2013). phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PloS one 8(4): 1-11.

McMurdie, P. J., Holmes, S. (2014). Waste not, want not: why rarefying microbiome data is inadmissible. PLoS computational biology 10(4): 1-12.

Mirás-Avalos, J. M., Antunes, P. M., Koch, A., Khosla, K., Klironomos, J. N., Dunfield, K. E. (2011). The influence of tillage on the structure of rhizosphere and root-associated arbuscular mycorrhizal fungal communities. Pedobiologia 54(4): 235-241.

Nannipieri, P., Ascher, J., Ceccherini, M., Landi, L., Pietramellara, G., Renella, G. (2003). Microbial diversity and soil functions. European journal of soil science 54(4): 655-670.

Newman, M. M., Hoilett, N., Lorenz, N., Dick, R. P., Liles, M. R., Ramsier, C., Kloepper, J. W. (2016). Glyphosate effects on soil rhizosphere-associated bacterial communities. Science of the Total Environment 543: 155-160.

Nihorimbere, V., Ongena, M., Smargiassi, M., Thonart, P. (2011). Beneficial effect of the rhizosphere microbial community for plant growth and health. Biotechnologie, Agronomie, Société et Environnement 15(2): 327-337

Norman, J. S., Friesen, M. L. (2017). Complex N acquisition by soil diazotrophs: how the ability to release exoenzymes affects N fixation by terrestrial free-living diazotrophs. The ISME journal 11(2): 315-326.

104

Nuccio, E. E., Anderson‐Furgeson, J., Estera, K. Y., Pett‐Ridge, J., Valpine, P., Brodie, E. L., Firestone, M. K. (2016). Climate and edaphic controllers influence rhizosphere community assembly for a wild annual grass. Ecology 97(5): 1307-1318.

Oksanen, J., Guillaume, F. B., Friendly, M., Kindt, R., Legendre, P., McGlinn, D., Minchin, P. R., O'Hara, R. B., Simpson, G. L., Solymos, P., Henry, M., Stevens, H., Szoecs, E., Wagner, H. (2018). Package ‘vegan’. Community ecology package, version, 2.4-6. URL https://CRAN.R- project.org/package=vegan

Orr, C. H., Leifert, C., Cummings, S. P., Cooper, J. M. (2012). Impacts of organic and conventional crop management on diversity and activity of free-living nitrogen fixing bacteria and total bacteria are subsidiary to temporal effects. PLoS One 7(12):1-13.

Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. (2014). STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics 30(21): 3123-3124.

Paungfoo-Lonhienne, C., Yeoh, Y. K., Kasinadhuni, N. R. P., Lonhienne, T. G., Robinson, N., Hugenholtz, P., Ragan, M. A., Schmidt, S. (2015). Nitrogen fertilizer dose alters fungal communities in sugarcane soil and rhizosphere. Scientific reports 5: 1-6.

Peiffer, J. A., Spor, A., Koren, O., Jin, Z., Tringe, S. G., Dangl, J. L., Buckler, E. S., Ley, R. E. (2013). Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences 110(16): 6548-6553.

Pershina, E., Valkonen, J., Kurki, P., Ivanova, E., Chirak, E., Korvigo, I., Provorov, N., Andronov, E. (2015). Comparative analysis of prokaryotic communities associated with organic and conventional farming systems. PloS one 10(12): 1-16.

Pisa, G., Magnani, G. S., Weber, H., Souza, E. M., Faoro, H., Monteiro, R. A., Daros, E., Baura, V., Bespalhok, J. P., Pedrosa, F. O., Cruz, L. M. (2011). Diversity of 16S rRNA genes from bacteria of sugarcane rhizosphere soil. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 44(12), 1215- 1221.

Prashar, P., Kapoor, N., Sachdeva, S. (2014). Rhizosphere: its structure, bacterial diversity and significance. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 13(1): 63-77.

Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., Van Der Putten, W. H. (2013). Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology 11(11): 789.

Pruesse, E., Quast, C., Knittel, K., Fuchs, B. M., Ludwig, W., Peplies, J., Glöckner, F. O. (2007). SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic acids research 35(21): 7188-7196.

Puglisi, E., Pascazio, S., Suciu, N., Cattani, I., Fait, G., Spaccini, R., Crecchio, C., Piccolo, A., Trevisan, M. (2013). Rhizosphere microbial diversity as influenced by humic substance amendments and chemical composition of rhizodeposits. Journal of Geochemical Exploration 129: 82-94.

105

R Core Team. (2017) R: A Language and Environment for Statistical Computing. http://www.R- project.org.

Reganold, J. P. (1988). Comparison of soil properties as influenced by organic and conventional farming systems. American Journal of Alternative Agriculture 3(4): 144–155.

Reganold, J. P., Andrews, P. K., Reeve, J. R., Carpenter-Boggs, L., Schadt, C. W., Alldredge, J. R., Ross, C. F., Davies, N. M., Zhou, J. (2010). Fruit and soil quality of organic and conventional strawberry agroecosystems. PloS one 5(9): 1-14.

Rigby, D., Cáceres, D. (2001). Organic farming and the sustainability of agricultural systems. Agricultural systems 68(1): 21-40.

Santos, D. H., Silva, M. D. A., Tiritan, C. S., Foloni, J. S., Echer, F. R. (2011). Technological quality of sugarcane under fertilization with filter cake enriched with soluble phosphate. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental 15(5): 443-449.

Santos, I. B., Lima, D. R. M., Barbosa, J. G., Oliveira, J. T. C., Freire, F. J., Kuklinsky-Sobral J. (2012). Diazotrophic Bacteria Associated to Roots of Sugarcane: Inorganic Phosphate Solubilization and the Salinity Tolerance. Bioscience Journal 28: 142–149.

Schloss, P. D., Westcott, S. L., Ryabin, T., Hall, J. R., Hartmann, M., Hollister, E. B., Lesniewski, R. A., Oakley, B. B., Parks, D. H., Robinson, C. J., Sahl, J. W., Stres, B., Thallinger, G. G., Van Horn, D. J., Weber, C. F. (2009). Introducing mothur: open-source, platform-independent, community- supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and environmental microbiology 75(23): 7537-7541.

Silva, U. C., Medeiros, J. D., Leite, L. R., Morais, D. K., Cuadros-Orellana, S., Oliveira, C. A., Lana, U. G. P., Gomes, E. A., Dos Santos, V. L. (2017). Long-Term Rock Phosphate Fertilization Impacts the Microbial Communities of Maize Rhizosphere. Frontiers in microbiology, 8, 1266.

Singh, S., Gupta, R., Sharma, S. (2015). Effects of chemical and biological pesticides on plant growth parameters and rhizospheric bacterial community structure in Vigna radiata. Journal of hazardous materials 291: 102-110.

Schmid, F., Moser, G., Müller, H., Berg, G. (2011). Functional and structural microbial diversity in organic and conventional viticulture: organic farming benefits natural biocontrol agents. Applied and environmental microbiology 77(6): 2188-2191.

106

Surapat, W., Pukahuta, C., Rattanachaikunsopon, P., Aimi, T., Boonlue, S. (2013). Characteristics of phosphate solubilization by phosphate-solubilizing bacteria isolated from agricultural chili soil and their efficiency on the growth of chili (Capsicum frutescens L. cv. Hua Rua). Chiang Mai J Sci 40(1): 11-25.

Torsvik, V., Øvreås, L. (2002). Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems. Current opinion in microbiology 5(3): 240-245.

Tsurumaru, H., Okubo, T., Okazaki, K., Hashimoto, M., Kakizaki, K., Hanzawa, E., Hihoyuki, T., Asanome, N., Takana, F, Sekiyama, Y., Ikeda, S., Minamisawa, K. (2015). Metagenomic analysis of the bacterial community associated with the taproot of sugar beet. Microbes and environments 30(1), 63-69.

Tsvetkov, I., Atanassov, A., Vlahova, M., Carlier, L., Christov, N., Lefort, F., Rusanov, k., Badjakov, I., Dincheva, I., Tchmitchian, M., Rakleova, G., Georgieva, L., Tamm, L., Iantcheva, A., Herforth- Rahmé, J., Paplomatas, E., Atanassov, I. (2018). Plant organic farming research–current status and opportunities for future development. Biotechnology & Biotechnological Equipment: 1-20.

Turner, T. R., Ramakrishnan, K., Walshaw, J., Heavens, D., Alston, M., Swarbreck, D., Osbourn, A., Grant, A., Poole, P. S. (2013). Comparative metatranscriptomics reveals kingdom level changes in the rhizosphere microbiome of plants. The ISME journal 7(12): 2248.

Vacheron, J., Desbrosses, G., Bouffaud, M. L., Touraine, B., Moënne-Loccoz, Y., Muller, D., Legendre, L., Winieswski-Dyé, F., Prigent-Combaret, C. (2013). Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Frontiers in plant science 4: 1-10.

Vega-Avila, A. D., Gumiere, T., Andrade, P. A. M., Lima-Perim, J. E., Durrer, A., Baigori, M., Vazquez, F., Andreote, F. D. (2015). Bacterial communities in the rhizosphere of Vitis vinifera L. cultivated under distinct agricultural practices in Argentina. Antonie van Leeuwenhoek 107(2): 575- 588.

Vitti, G. C., Mazza, J. A. (2002). Planejamento, estratégias de manejo e nutrição da cultura de cana- de-açúcar. Piracicaba: Potafos, 169.

Wang, S., Li, Z., Fan, G. (2012). Soil quality and microbes in organic and conventional farming systems. African Journal of Microbiology Research 6(24): 5077-5085.

Wang, W., Wang, H., Feng, Y., Wang, L., Xiao, X., Xi, Y., Luo, X., Sun, R., Ye, X., Huang, Y., Zhang, Z., Zhang, Z. (2016). Consistent responses of the microbial community structure to organic farming along the middle and lower reaches of the Yangtze River. Scientific reports 6: 1-11.

107

Wessén, E., Hallin, S., Philippot, L. (2010). Differential responses of bacterial and archaeal groups at high taxonomical ranks to soil management. Soil Biology and Biochemistry 42(10): 1759-1765.

Wickham, H. (2009). ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer-Verlag New York.

Xia, Y., DeBolt, S., Dreyer, J., Scott, D., Williams, M. A. (2015). Characterization of culturable bacterial endophytes and their capacity to promote plant growth from plants grown using organic or conventional practices. Frontiers in plant science 6: 1-10.

Xia, Z., Bai, E., Wang, Q., Gao, D., Zhou, J., Jiang, P., Wu, J. (2016). Biogeographic distribution patterns of bacteria in typical Chinese forest soils. Frontiers in microbiology 7: 1-17.

Yuan, C. L., Mou, C. X., Wu, W. L., Guo, Y. B. (2011). Effect of different fertilization treatments on indole-3-acetic acid producing bacteria in soil. Journal of soils and sediments 11(2): 322-329.

Ye, J., Perez, P. G., Zhang, R., Nielsen, S., Huang, D., Thomas, T. (2017). Effects of different C/N ratios on bacterial compositions and processes in an organically managed soil. Biology and Fertility of Soils 54(1): 137-147.

Zarraonaindia, I., Owens, S. M., Weisenhorn, P., West, K., Hampton-Marcell, J., Lax, S. Bokulich, N. A., Mills, D. A., Martin, G., Taghavi, S., Lelie, D. V. D., Gilbert, J. A. (2015). The soil microbiome influences grapevine-associated microbiota. MBio 6(2): 1-10.

Zhang, X., Zhang, R., Gao, J., Wang, X., Fan, F., Ma, X., Yin, H., Zhang, C., Deng, Y. (2017). Thirty-one years of rice-rice-green manure rotations shape the rhizosphere microbial community and enrich beneficial bacteria. Soil Biology and Biochemistry 104: 208-217.

108

MATERIAL SUPLEMENTAR

Tabela suplementar 1. Análise físico-química de rizosfera de cana-de-açúcar cultivada sob manejo tradicional e orgânico*.

Amostra Usina Manejo¹ Ap² Ts3 pH4 P5 K6 Ca7 Mg8 Al9 H_AL10 MO11 SB12 CTC13 C2C1 A conv C LVDFR 4.8 5.6 0.05a 2.4 1 0b 3.8 2.2b 3.46 8.36 C2C2 A conv C LVDFR 4.8 5.6 0.05a 2.4 1 0b 3.8 2.2b 3.46 8.36 C2C4 A conv C LVDFR 4.8 5.6 0.05a 2.4 1 0b 3.8 2.2b 3.46 8.36 C2O2 A org D LVDF 4.8 3.2 0.24b 1.7 0.8 0b 1.9 1.2b 2.83 4.4 C2O3 A org D LVDF 4.8 3.2 0.24b 1.7 0.8 0b 1.9 1.2b 2.83 4.4 C2O4 A org D LVDF 4.8 3.2 0.24b 1.7 0.8 0b 1.9 1.2b 2.83 4.4 C4C2 A conv C LVEF 5.3 5.9 0.11a 2.1 0.8 0.1b 3 3b 2.1 6 C4C3 A conv C LVEF 5.3 5.9 0.11a 2.1 0.8 0.1b 3 3b 2.1 6 C4C4 A conv C LVEF 5.3 5.9 0.11a 2.1 0.8 0.1b 3 3b 2.1 6 C4O1 A org B LVDF 5.7 11.9 0.39b 2.9 1 0b 2.9 2.4b 4.3 7.2 C4O2 A org B LVDF 5.7 11.9 0.39b 2.9 1 0b 2.9 2.4b 4.3 7.2 C4O3 A org B LVDF 5.7 11.9 0.39b 2.9 1 0b 2.9 2.4b 4.3 7.2 C3C1 B conv D LVMA 4.5 7.8 0.06a 1.16 0.70 0.64a 5 26.8a 1.92 6.92 C3C2 B conv D LVMA 4.5 7.8 0.06a 1.16 0.70 0.64a 5 26.8a 1.92 6.92 C3C3 B conv D LVMA 4.5 7.8 0.06a 1.16 0.70 0.64a 5 26.8a 1.92 6.92 C3O1 B org D LVE 5.19 6 0.30b 2.07 0.80 0.00b 2.2 19.3a 3.17 5.37 C3O2 B org D LVE 5.19 6 0.30b 2.07 0.80 0.00b 2.2 19.3a 3.17 5.37 C3O3 B org D LVE 5.19 6 0.30b 2.07 0.80 0.00b 2.2 19.3a 3.17 5.37 C9C1 B conv E LVDF 4.3 2.6 0.04a 0.20 0.12 0.76a 3.1 15.5a 0.36 3.46 C9C2 B conv E LVDF 4.3 2.6 0.04a 0.20 0.12 0.76a 3.1 15.5a 0.36 3.46 C9C4 B conv E LVDF 4.3 2.6 0.04a 0.20 0.12 0.76a 3.1 15.5a 0.36 3.46 C9O1 B org D LVMT 4.8 3.2 0.22b 0.92 0.52 0.25b 2.9 13.4a 1.65 4.55 C9O2 B org D LVMT 4.8 3.2 0.22b 0.92 0.52 0.25b 2.9 13.4a 1.65 4.55 109

C9O3 B org D LVMT 4.8 3.2 0.22b 0.92 0.52 0.25b 2.9 13.4a 1.65 4.55

*Diferentes letras na mesma coluna indicam diferença (p<0.05) detectadas pelo teste de Tukey HSD. 1. Conv = convencional; Org= orgânico 2. Ap= Ambiente de produção 3. Ts=Tipo de solo. Latossolo vermelho distroférrico- LVDFR; Latossolo vermelho distrófico- LVDF; Latossolo vermelho eutroférrico- LVEF; Latossolo vermelho mesoálico- LVMA; Latossolo vermelho eutrófico- LVE; Latossolo vermelho mesotrofico- LVMT.. 5. P (mg/dm³) = fosforo 6. K (Cmolc/dm³) =Potássio 7. Ca (Cmolc/dm³) = Cálcio 8. Mg (Cmolc/dm³) = Magnésio 9. Al (Cmolc/dm³) = Alumínio 10. H/Al (Cmolc/dm³) 11. MO= Matéria organica 12. SB (Cmolc/dm³) = Soma das bases 13. CTC (Cmolc/dm³) = Capacidade de Troca de Cátions Efetiva

110

Tabela suplementar 2. Informação das sequências e da cobertura do sequenciamento de amostras oriundas de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional.

Antes da normalização Depois da normalização Amostra Biogeo¹ Coverage² nseqs³ sobs4* nseqs³ sobs4* C2C1 CA 0.988827 47525 2794a 11254 1736a C2C2 CA 0.973525 22852 1848a 11254 1430a C2C4 CA 0.985619 41095 2547a 11254 1658a C2O2 OA 0.984156 46641 3184a 11254 1894a C2O3 OA 0.975751 28496 2376a 11254 1635a C2O4 OA 0.972036 23173 1916a 11254 1417a C3C1 CB 0,99166 55017 2126b 11254 1167b C3C2 CB 0.990813 53663 2236b 11254 1309b C3C3 CB 0.984692 24171 1292b 11254 1011b C3O1 OB 0.98703 42174 2239b 11254 1421b C3O2 OB 0.980282 22872 1561b 11254 1200b C3O3 OB 0.975653 19181 1464b 11254 1199a C4C2 CA 0.986022 44712 2723a 11254 1710a C4C3 CA 0.974722 26070 2082a 11254 1502a C4C4 CA 0.984211 43448 2751a 11254 1675a C4O1 OA 0.9819 37349 2690a 11254 1769a C4O2 OA 0.979494 24091 1930a 11254 1494a C4O3 OA 0.974718 27411 2585a 11254 1880a C9C1 CB 0.986399 32056 1513b 11254 1052b C9C2 CB 0.981348 19623 1164b 11254 952b C9C4 CB 0.987001 32773 1541b 11254 1060b C9O1 OB 0.982371 24051 1769b 11254 1401b

111

C9O2 OB 0.967066 11356 1066b 11254 1063b C9O3 OB 0.962058 11254 1152b 11254 1152b Total=761,054 Total= 48,549 Total =33,787 Média=31,710 Média= 2,023 Média=1,408

¹. OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B. ². Estimativa de cobertura Good ³ Número de sequências obtidas; 4 Número de OTUs observadas; *Diferentes letras na mesma coluna indicam diferença (p<0.05) detectadas pelo teste de Tukey HSD.

Tabela suplementar 3. Abundâncias relativas dos filos em rizosferas sob manejo tradicional e orgânico (Planilha do excel adicionada ao MS Word)

Microsoft Excel Worksheet

Tabela suplementar 4. Abundâncias relativas de famílias em rizosferas sob manejo tradicional e orgânico (Planilha do excel adicionada ao MS Word)

112

Tabela suplementar 5. Comparação da beta-diversidade entre os grupos por análise permutacional das variâncias (PERMANOVA) utilizando o índice de Bray-Curtis. Df SumsOfSqs MeanSqs F.Model R² Pr(>F) Biogeo. 3 1.3854 0.46181 7.0546 0.41414 0.000999*** TS 4 0.9125 0.22812 3.4847 0.27276 0.000999*** Residuals 16 1.0474 0.06546 0.31310 Total 23 3.3453 1.00000

Tabela suplementar 6. Analise da abundância diferencial de OTUs influenciada pelo manejo por usina (OA= Orgânica Usina A; CA= Convencional Usina A; OB = Orgânica Usina B; CB= Convencional Usina B). (Planilha do excel adicionada ao MS Word)

Microsoft Excel Worksheet Tabela suplementar 7. Correlação entre as OTUs e os fatores edáficos. Foram consideradas somente as correlações medianas e fortes (R >0.5 ou < - 0.5). (Planilha do excel adicionada ao MS Word)

Microsoft Excel Worksheet Tabela suplementar 8. Lista dos genes codificadores de enzimas ligados aos fatores de promoção do crescimento vegetal selecionados e abundância desses genes em amostras de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo tradicional e orgânico. (Planilha do excel adicionada ao MS Word)

113

Microsoft Excel Worksheet

114

Texto suplementar 1. Códigos de processamento das sequências obtidas pela amplificação e sequenciamento do marcador 16S rRNA

Processamento inicial make.file(inputdir=/home/metagenomica/ariana2, type=fastq, prefix=stability) make.contigs(file=/home/metagenomica/ariana2/stability.files, processors=1) summary.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.fasta) screen.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.fasta, group=/home/metagenomica/ariana2/stability.contigs.groups, maxambig=0, maxlength=460) summary.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.fasta) unique.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.fasta) count.seqs(name=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.names, group=/home/metagenomica/ariana2/stability.contigs.good.groups) align.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.fasta, reference=/home/metagenomica/ariana2/silva.v3v4.fasta) summary.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.ali gn, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.count_table) screen.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.align, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.count_table, summary=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.summary, start=2, end=17012, maxhomop=8) summary.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.ali gn, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.count_table) filter.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.a lign, vertical=T, trump=.) unique.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good .filter.fasta, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.good.count_table) pre.cluster(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.f ilter.unique.fasta, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.count _table, diffs=2)

115

chimera.vsearch(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique. good.filter.unique.precluster.fasta, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.count_table, dereplicate=t) remove.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.goo d.filter.unique.precluster.fasta, accnos=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniq ue.precluster.denovo.vsearch.accnos) summary.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.go od.filter.unique.precluster.pick.fasta, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.denovo.vsearch.pick.count_table) split.abund(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good. filter.unique.precluster.pick.fasta, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.denovo.vsearch.pick.count_table, cutoff=1) classify.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.goo d.filter.unique.precluster.pick.abund.fasta, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.denovo.vsearch.pick.abund.count_table, reference=/home/metagenomica/ariana2/Trainset9_032012.pds/trainset9_032012.pds.fa sta, taxonomy=/home/metagenomica/ariana2/Trainset9_032012.pds/trainset9_032012.pds.ta x, cutoff=80) remove.lineage(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.g ood.filter.unique.precluster.pick.abund.fasta, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.denovo.vsearch.pick.abund.count_table, taxonomy=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.u nique.precluster.pick.abund.pds.wang.taxonomy, taxon=Chloroplast-Mitochondria- unknown-Archaea-Eukaryota) summary.tax(taxonomy=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.uniqu e.good.filter.unique.precluster.pick.abund.pds.wang.pick.taxonomy, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.denovo.vsearch.pick.abund.pick.count_table) dist.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.fil ter.unique.precluster.pick.abund.pick.fasta, cutoff=0.20) cluster.split(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good .filter.unique.precluster.pick.abund.pick.fasta, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu 116

e.precluster.denovo.vsearch.pick.abund.pick.count_table, taxonomy=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.u nique.precluster.pick.abund.pds.wang.pick.taxonomy, splitmethod=classify, taxlevel=6, cutoff=0.03) make.shared(list=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good. filter.unique.precluster.pick.abund.pick.an.unique_list.list, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.denovo.vsearch.pick.abund.pick.count_table, label=0.03) classify.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.goo d.filter.unique.precluster.pick.abund.pick.fasta, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.denovo.vsearch.pick.abund.pick.count_table, template=/home/metagenomica/ariana2/gg_13_8_99.fasta, taxonomy=/home/metagenomica/ariana2/gg_13_8_99.gg.tax, cutoff=80) classify.otu(list=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.fi lter.unique.precluster.pick.abund.pick.an.unique_list.list, taxonomy=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.u nique.precluster.pick.abund.pick.gg.wang.taxonomy, count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.denovo.vsearch.pick.abund.pick.count_table, label=0.03, cutoff=80, basis=otu, probs=F) sub.sample(shared=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.goo d.filter.unique.precluster.pick.abund.pick.an.unique_list.shared)

Cobertura/diversidade alfa summary.single(shared/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique. good.filter.unique.precluster.pick.abund.pick.an.unique_list.shared, label=0.03, calc=coverage-nseqs-sobs) summary.single(shared=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.uniqu e.good.filter.unique.precluster.pick.abund.pick.an.unique_list.0.03.subsample.shared, label=0.03, calc=-nseqs-sobs-bergerparker-chao-shannon-ace-simpson) rarefaction.single(shared=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.uniq ue.good.filter.unique.precluster.pick.abund.pick.an.unique_list.shared, calc=sobs, freq=100)

Para phyloseq get.oturep(list=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filt er.unique.precluster.pick.abund.pick.an.unique_list.list, fasta=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.pick.abund.pick.fasta, 117

count=/home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.uniqu e.precluster.denovo.vsearch.pick.abund.count_table, label=0.03, method=abundance) fora do mothur: sed 's/M02913.*\t//' /home/metagenomica/ariana2/stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precl uster.pick.abund.pick.an.unique_list.0.03.rep.fasta >> rep2.fasta sed -e 's/|.*//g' rep2.fasta >> rep3.fasta dist.seqs(fasta=/home/metagenomica/ariana2/rep3.fasta, output=lt) tree.shared(phylip=/home/metagenomica/ariana2/rep3.phylip.dist)

Input Picrust make.biom(shared=C:\Users\arian\Desktop\biom\stability.shared, label=0.03, reftaxonomy=C:\Users\arian\Desktop\biom\gg_13_8_99.gg.tax, constaxonomy=C:\Users\arian\Desktop\biom\stability.trim.contigs.good.unique.good.fil ter.unique.precluster.pick.pick.an.unique_list.0.03.cons.taxonomy, picrust=C:\Users\arian\Desktop\biom\97_otu_map.txt)

No Qiime virtual box biom validate-table -i stability.shared.0.03.biom biom convert --table-type="OTU table" -i stability.shared.0.03.biom -o stability.shared.0.03.txt --to-tsv --header-key taxonomy biom convert -i stability.shared.0.03.txt -o org.biom --table-type="OTU table" --to-json --process-obs-metadata taxonomy

118

Figura suplementar 1. Afiliação taxonômica em nível de filo e sua abundância percentual nas amostras de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional.

119

Figura suplementar 2. Curvas de rarefação de OTUs a 97% oriundas de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico e tradicional.

120

Figura suplementar 3. Box plots da diversidade alfa de comunidades bacterianas de rizosfera sob manejo orgânico e tradicional oriundas de duas usinas. (A) Índice de Shannon. (B) Índice de Chao1.

121

122

CAPÍTULO 2: Isolamento e prospecção de rizobactérias diazotróficas associadas a cana-de-açúcar sob manejo orgânico.

122 123

ISOLAMENTO E PROSPECÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS

ASSOCIADAS À CANA-DE-AÇÚCAR SOB MANEJO ORGÂNICO.

Ariana Alves Rodrigues¹; José Daniel Gonçalves Vieira¹ 1. Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia (LAMAB), Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Avenida Universitária, s/n, Campus I, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil, 74605-050

RESUMO

Os micro-organismos associados ao manejo orgânico são essenciais na transformação e liberação de nutrientes aos vegetais. O presente estudo teve como objetivo isolar, identificar e caracterizar rizobactérias diazotróficas promotoras do crescimento vegetal associadas a cana-de-açúcar sob manejo orgânico. Para tal, a rizosfera das variedades IAC 911099 e CTC4 orgânicas foram amostradas e inoculadas nos meios livres de nitrogênio NFb e Burk. Os micro-organismos isolados foram triados in vitro quanto à capacidade de produção de fatores de promoção do crescimento vegetal. Foram isoladas 81 bactérias e destas, 45.6% foram positivas para o gene nifH e produziram pelo menos um dos fatores de promoção do crescimento vegetal avaliados. A produção de ácido indol-3-ácetico foi encontrada em 46% dos isolados, já a solubilização de fosfato foi observada em 86.5%. Nenhum isolado foi produtor de cianeto de hidrogênio, enquanto 81% foram produtores de amônia, 19% produziram celulases e 2.7% quitinases. Micro- organismos do gênero Burkholderia foram capazes de inibir o crescimento de Fusarium moniliforme in vitro. Os micro-organismos produtores de fatores de crescimento vegetal associados à cana-de-açúcar orgânica, sobretudo, os gêneros Burkholderia, Sphingobium, Rhizobium e Enterobacter, podem constituir-se de alternativas ambientalmente amigáveis para melhora da produção de cana-de-açúcar.

Palavras-chave: agricultura orgânica, rizobactérias, nifH, ácido indol-ácetico, solubilização de fosfato, Fusarium moniliforme.

INTRODUÇÃO

123 124

O uso de fertilizantes derivados do petróleo e pesticidas químicos é prática comum na agricultura. Diante do cenário atual, o uso desses insumos é indispensável, encarece o cultivo e associado à expansão das áreas agriculturáveis, causa uma serie de impactos ambientais (Goldemberg et al. 2008, Severiano et al. 2009, Schultz et al. 2014). Nesse sentido, tem crescido o interesse por alternativas mais baratas e ambientalmente menos impactantes, que reduzam ou substituam o uso desses implementos na agricultura tradicional (Crowder and Reganold 2015, Kanchiswamy et al. 2015). A utilização de rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (RPCV) é uma das alternativas para reduzir o uso de fertilizantes sintéticos e produtos de fontes não renováveis, apresentando baixo custo de produção/implantação (Sadeghi et al. 2012, Szilagyi-Zecchin et al. 2014). As RPCV correspondem a bactérias que habitam a rizosfera, a zona de solo imediatamente adjacente à raiz, e que são capazes de promover o crescimento vegetal por um ou mais mecanismos (Noumavo et al. 2016). Seu uso é comumente adotado na agricultura tradicional e empiricamente na agricultura orgânica, uma vez que esta é extremamente dependente das transformações dos nutrientes mediada pela microbiota natural do solo (Pariona-Llanos et al. 2010, Bhardwaj et al. 2014, Jarvan and Edesi, 2015). As RPCV podem promover o crescimento vegetal aumentando a disponibilidade de nutrientes para o vegetal através da fixação de nitrogênio, solubilização de minerais e adsorção de ferro (Kukla et al. 2014). Podem produzir fitoestimuladores, como o ácido indol-acetico (AIA), ácido giberilinico, citocininas e 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) deaminase, que estimulam o desenvolvimento da raiz e o crescimento dos tecidos vegetais (Sgroy et al. 2009). Ainda desempenham papel fundamental como biopesticidas, através da produção de metabólitos com ação antibiótica, podendo ainda participar na degradação de poluentes orgânicos (Ahemad and Kibret 2014). Devido à importância biológica do nitrogênio na constituição de biomoléculas, o alto custo e o impacto ambiental causado pela produção dos fertilizantes nitrogenados sintéticos, as bactérias que fixam nitrogênio (diazotróficas) são alvos de interesse (Karagöz et al. 2012). Esses micro-organismos são capazes de converter o nitrogênio molecular (N2) em amônia (NH3), forma nitrogenada absorvida pelo vegetal. Essa conversão é mediada, na maioria das vezes, pela enzima ferro-molibdênio (FeMo) nitrogenase, que é codificada pelos genes do complexo nif (nifH, nifD, nifK). Por serem altamente conservados ao longo das espécies, os genes do complexo nif, podem

124 125

ser utilizados como evidencia indireta da presença da nitrogenase e como marcadores moleculares na triagem de organismos diazotróficos (Dai et al. 2014, Ji et al. 2014, Kumar 2014, MacKellar et al. 2016). As RPCV diazotróficas associadas à cana-de-açúcar apresentam uma grande diversidade taxonômica, destacando-se importantes gêneros como Herbaspirillum, Pantoea, Burkholderia, Azospirillum e Glucononacetobacter (Lin et al. 2012, Gopalakrishnan et al. 2015, Tam and Diep 2015). Nesse contexto, diversos estudos tem sido conduzidos a fim de isolar bactérias diazotróficas associadas a cana-de-açúcar sob manejo tradicional e caracterizar os fatores de promoção do crescimento vegetal produzido por esses organismos (Luvizotto et al. 2010, Lima et al. 2011, Beneduzi et al. 2013, Kruasuwan and Thamchaipenet 2016). Entretanto, o estudo sobre RPCV diazotróficas associadas à cana-de-açúcar sob manejo orgânico é escasso. Existe grande interesse nesse grupo, uma vez que um dos maiores desafios da agricultura orgânica é a limitação de nitrogênio no solo, já que compostos nitrogenados sintéticos são abolidos (Wongphatcharachai et al. 2015). Deste modo, as RPCV que apresentam múltiplos fatores de promoção de crescimento vegetal, podem se tornar uma alternativa viável em práticas de biofertilização, fitoestimulação e biocontrole em canaviais orgânicos. O presente estudo teve por objetivos isolar e identificar rizobactérias diazotróficas associadas a cana-de-açúcar sob manejo orgânico oriundas de duas usinas localizadas no estado de Goiás, Brasil e avaliar a produção de fatores de promoção de crescimento vegetal produzidos por esses micro-organismos.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolamento dos micro-organismos O isolamento microbiano foi conduzido a partir de solo rizosférico de duas variedades de cana-de-açúcar (IAC 911099 e CTC4), cultivadas sob manejo orgânico, oriundas de fazendas pertencentes a duas usinas localizadas nos municípios de: Goiatuba (19º 00’ 023” S; 049º 40’ 319” W) e Goianésia (15º 20’ 241”S; 048º 54’ 253” W), Goiás, Brasil. As coletas foram realizadas no período de outubro/2015 a janeiro/2016, sendo que cada variedade foi coletada em quatro fazendas distintas com três repetições. Optou-se por fazendas que tiveram suas touceiras plantadas em diferentes anos (2009, 2012, 2013 e 2014) e em estádios fenológicos distintos, a fim de obter a maior heterogeneidade possível.

125 126

As raízes, com o solo rizosférico aderido, foram acondicionadas em sacos plásticos esterilizados e armazenadas a 4 ºC até o processamento que foi feito no dia posterior as coletas. Considerou-se como solo rizosférico aquele que estava intimamente ligado as raízes numa distância máxima de 5 mm da raiz, sendo cuidadosamente removido com o auxílio de uma espátula esterilizada (Santos et al. 2012). Para o isolamento de bactérias potencialmente diazotróficas, 1.0 g de solo rizosférico foi incubado em 100 mL de tampão fosfato (0.8% NaCl; 0.02% KCl; 0.14% Na2HPO4, 0.024%

KH2PO4; pH 7.4), sob agitação de 130 rpm a 30ºC, por uma hora. A suspensão obtida foi diluída serialmente e as concentrações de 10-3, 10-4 e 10-5 inoculadas em triplicata nos meios semi- sólidos livres de nitrogênio, NFb (Dobereiner et al. 1976) e meio de Burk (Park et al. 2005). Os meios foram incubados a 30ºC por 14 dias. Após o crescimento, em forma de película difusa abaixo da superfície do meio semi-sólido, os micro-organismos foram repicados para novos meios semi-sólidos. Após três repiques em meios semi-sólidos, os micro-organismos foram transferidos para os meios sólidos correspondentes. O isolamento e purificação dos micro- organismos se deram por esgotamento em meio sólido. Micro-organismos cujas colônias apresentavam a mesma morfologia e que haviam sido isolados da mesma fazenda foram descartados. Depois de isoladas, todas as colônias foram transferidas para placas de ágar nutriente a fim de verificar possíveis morfotipos bacterianos que haviam sido isolados simultaneamente nos dois meios utilizados. Após a obtenção de colônias puras, as amostras foram conservadas em glicerol 20% (m/v), em freezer a -20ºC.

Extração de DNA A extração de DNA foi realizada a partir do crescimento dos micro-organismos em caldo Luria-Bertani (LB) por 24 horas a 30 ºC. Para a extração de DNA utilizou-se o kit UltraClean®Microbial DNA Isolation Kit da MoBio, conforme recomendações do fabricante.

Amplificação do gene nifH Para confirmação do potencial diazotrófico, o gene que codifica a subunidade nitrogenase redutase do complexo enzimático nitrogenase (nifH) foi amplificado. A reação de PCR do gene nifH foi conduzida utilizando-se os oligonucleotídeos iniciadores PolF

126 127

(TGCGAYCCSAARGCBGACTC) e PolR (ATSGCCATCATYTCRCCGGA) que geram um produto de aproximadamente 360 pares de base (Poly et al. 2001). A reação foi preparada para 10 µL de volume final, consistindo de: Tampão para Taq polimerase 1X, 2.3 mM de MgCl2, 0.25 mM de cada dNTP, 1.0 µM de cada primer, 0.2 U de Taq DNA polimerase e 1.0 µL de DNA molde (50 ng). A amplificação foi conduzida em termociclador com a seguinte ciclagem: desnaturação inicial a 94 ºC por 5 minutos; seguidos de 35 de ciclos de desnaturação a 94 ºC por 45 segundos, anelamento a 57 ºC por 30 segundos, extensão a 72 ºC por 30 segundos e extensão final a 72ºC por 1 minuto. O produto da reação foi verificado em gel de agarose a 1,2% (m/v). Como controle positivo utilizou-se a cepa fixadora de nitrogênio Azospirillum brasilense.

Identificação das rizobactérias diazotróficas Todas as bactérias cujo gene nifH pode ser amplificado, foram identificadas a partir do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. A reação foi preparada para um volume final de 50

µL, contendo: Tampão para Taq polimerase 1X, 1.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP, 0.2 mM de cada primer, 2.5 U de Taq DNA polimerase e 1 µL de DNA molde (50 ng). A região do 16S foi amplificada utilizando-se os primers 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) e 1541R (5’- AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’) (Lane 1991). O DNA foi amplificado em termociclador, seguindo as condições: desnaturação inicial a 95 ºC por 3 minutos; seguidos de 30 de ciclos de desnaturação a 94 ºC por 1 minuto, anelamento a 55 ºC por 30 segundos, extensão a 72 ºC por 30 segundos e extensão final a 72ºC por 10 minutos. Os produtos amplificados tiveram sua integridade confirmada em gel de agarose a 1.2% e purificados com isopropanol e etanol utilizando o método descrito por Sambrook and Russell (2001). O sequenciamento foi conduzido na plataforma ABI 3130xl (Applied Biosystems), utilizando o BigDye terminator cycle sequencing kit e os oligonucleotideos iniciadores: 27 F, 530F (5'-TGA CTG ACT GAG TGC CAG CMG CCG CGG-3') e 519R (5’–GTN TTA CNG CGG CKG CTG –3’) (Lane 1991). Os reads obtidos a partir do sequenciamento de cada micro-organismo foram avaliados quanto a sua qualidade. Após, as sequências (reads) foram unidas em uma sequência única (contig). Essas etapas foram realizadas no software CodonCode Aligner versão 6.0.2. A seguir, as sequências foram comparadas com as depositadas no banco de 16S rRNA do NCBI (National

127 128

Center for Biotechnology Information) utilizando a ferramenta BLASTn (Altschul et al. 1990). As sequências identificadas foram depositadas no banco de dados de 16S rRNA do NCBI sob os números de acesso: MG429815 a MG429819; MG459255 a MG459472 e MG459472.

Triagem in vitro da produção de fatores de promoção do crescimento vegetal Os micro-organismos positivos para o gene nifH, foram triados in vitro quanto a capacidade de produção de AIA, solubilização de fosfato, produção de amônia, cianeto de hidrogênio (HCN), celulases, quitinases e antagonismo frente a Fusarium moniliforme. Todas as avaliações foram feitas em triplicata e os resultados correspondem às médias das triplicatas.

Produção de AIA A habilidade das rizobactérias em produzir AIA foi determinada quantitativamente pelo método descrito por Gordon e Weber (1951) com modificações. Os micro-organismos foram 8 −1 ajustados a uma concentração de 10 células mL (OD550nm =0.1) e inoculados em caldo soja tripticaseína (TSB) a 10%, suplementados com 5mM de L-triptofano. Após 24, 48 e 72 horas, alíquotas do crescimento foram retiradas, centrifugadas por 12 minutos a 10.000 xg. O reagente de Salkowisk (35% ácido perclórico; 1 mL de FeCl3 a 0,5M) foi acrescido ao sobrenadante das culturas na proporção de 1:1 (v:v) e a solução incubada a temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Após a incubação, a absorbância da solução foi lida em espectrofotômetro a 530 nm. A determinação da concentração de AIA foi obtida pela comparação dos resultados com a curva padrão construída a partir de soluções de AIA comercial (0 µg mL-1;1.0 µg mL-1;5.0 µg mL-1;10 µg mL-1;25 µg mL-1;50 µg mL-1;75 µg mL-1;100 µg mL-1;150 µg mL-1;200 µg mL-1). Os resultados foram expressos em µg mL-1.

Solubilização de fosfato A solubilização de fosfato foi determinada de forma quantitativa de acordo com Nautiyal 8 −1 (1999). Os micro-organismos foram ajustados a concentração de 10 células mL (OD550nm =0.1) e inoculados, em triplicata, em caldo NBRIP (Nautiyal 1999). As amostras foram incubadas por 7 dias a 30ºC, sob agitação de 130 rpm. Após a incubação, alíquotas de 1000 µL foram centrifugadas a 10000 xg por 5 minutos. O conteúdo de fósforo solúvel foi determinado pela adição do reagente molibidato-vandato (5.0% molibidato de amônio; 0.25% vanadato de amônio)

128 129

ao sobrenadante, nas proporções de: 200 µL de sobrenadante, 200 µL do reagente e 600 µL de água destilada. As leituras das soluções foram realizadas em espectrofotômetro com comprimento de onda de 420 nm. As concentrações de fosfato solúvel, expressas em µg mL-1, foram obtidas por comparação com a curva padrão construída a partir de uma solução estoque de -1 -1 - KH2PO4 (0.0875%) e várias concentrações de fosfato solúvel (0 µg mL ;1.0 µg mL ;5.0 µg mL 1;8.0 µg mL-1;10 µg mL-1;12 µg mL-1;15 µg mL-1;18 µg mL-1;20 µg mL-1;50 µg mL-1;75 µg mL- 1).

Produção de amônia e HCN Para avaliação da produção de amônia, os micro-organismos foram inoculados em água peptonada e incubados a 30 ºC, por 7 dias. Após centrifugação a 10.000 xg por 10 minutos, ao sobrenadante foi acrescido o reagente de Nessler (10% HgI2; 7.0% KI; 50% solução aquosa NaOH a 32%), na proporção de 2:1 (v/v) (Cappucino and Sherman 1996). O desenvolvimento de uma cor castanha é indicativo de produção de amônia (Dey el al. 2004). A produção de HCN foi determinada conforme técnica descrita por Cattelan (1999) com modificações. Os isolados foram inicialmente crescidos por 24 horas em TSA a 10% suplementado com 0.4% de glicina. Após o crescimento, foi depositado, na tampa das placas, papel filtro (Whatman nº1) embebido com uma solução de ácido pícrico (0.5 % de ácido pícrico e

2.0% de Na2CO3). As placas foram novamente incubadas por 48 horas. A reação positiva de produção de HCN pôde ser visualizada pela mudança de coloração do papel, que passa a ser acastanhado (Walpola and Yoon 2013).

Produção de quitinases e celulases A habilidade dos isolados em produzir quitinases foi verificada em concordância com o descrito por Cattelan (1999). Para tal, os micro-organismos foram cultivados por 14 dias a 30ºC em meio livre de nitrogênio (MNL), suplementado com 8.0 g L-1 de quitina coloidal, 0.78 g L-1 -1 de NH4NO3 e 15 g L de ágar. A adição de quitina gera turbidez ao meio e a habilidade do micro-organismo em degradá-la gera um halo claro ao redor da colônia. A avaliação da produção de celulases foi realizada cultivando os micro-organismos em meio mínimo acrescido de carboximetilcelulose (CMC) (Stamford et al. 1998). Após crescimento a 30º C, por 48 horas, as placas foram cobertas com solução de lugol a 0.3% e a presença de

129 130

halos claros ao redor da colônia foram indicativos de produção de celulases (Kasana et al. 2008). Para todas as enzimas avaliadas, o índice enzimático (IE) foi determinado, dividindo-se o tamanho do halo, pelo tamanho da colônia.

Antagonismo frente a F. moniliforme As bactérias foram avaliadas in vitro quanto a capacidade de inibir o fungo fitopatógeno F. moniliforme, segundo a metodologia descrita por El-Sayed et al (2014) com modificações. Os micro-organismos foram inicialmente cultivados em caldo TSA a 30 ºC, por 48 horas. Após, foram inoculados em duas estrias paralelas, distantes em 1.5 cm da borda, em ágar dextrose batata. No centro da placa foi disposto um disco de 5 mm de diâmetro com o crescimento do fungo, previamente cultivado por 7 dias a 30º C em ágar dextrose batata. Após sete dias a capacidade dos isolados em inibir o crescimento do fungo foi avaliada, medindo-se a distância entre a colônia bacteriana e a colônia fúngica. Como controle negativo, utilizou-se uma placa sem inoculo bacteriano.

Analise estatística Os dados obtidos a partir dos testes in vitro foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e a comparação das médias através do teste de Scott-Knott a 5.0% de significância no software Sisvar, versão 5.6 (Ferreira 2011). Quando necessário, os dados que não apresentavam variâncias homogêneas ou distribuição normal foram corrigidos com a função logarítmica (log).

RESULTADOS

Isolamento e identificação dos micro-organismos Foram isoladas 81 bactérias de rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico em meios de cultura livres de nitrogênio. Para fins de nomenclatura dos isolados, a primeira letra correspondeu ao meio de isolamento (B=Burk e N=NFB), a segunda letra a variedade (C= CTC4 e U=IAC 911099) e os números correspondem, respectivamente, a fazenda e a ordem de repique (Tabela 1). Quanto à origem, 57.3% das bactérias foram isoladas da variedade CTC4 e 42.7% da variedade IAC 911099. Foi possível amplificar o gene nifH em 45.6% dos isolados. Todas as bactérias cujo gene nifH pôde ser amplificado, produziram pelo menos mais um mecanismo de

130 131

promoção do crescimento vegetal, as caracterizando como rizobactérias portadoras de múltiplos fatores de promoção do crescimento vegetal. Os trinta e sete micro-organismos diazotróficos identificados pelo sequenciamento parcial do gene 16S rRNA foram distribuídos em 13 gêneros (Tabela 1). O tamanho do fragmento obtido variou entre 473 a 1467 pares de bases e a similaridade entre 97 e 99% (Tabela 1). Os gêneros mais encontrados foram Burkholderia, Bacillus e Rhizobium com 15, 6 e 3 isolados, respectivamente. Ademais, foram identificadas bactérias pertencentes aos gêneros: Cupriavidus (n=2), Dyella (n=1), Enterobacter (n=2), Erwinia (n=1), Flavobacterium (n=1), Methylobacterium (n=1), Mitsuaria (n=1), Sphingobium (n=2), Sphingomonas (n=1) e Variovorax (n=1). A classificação dos isolados NC92, BC26, BC23, NU45, NU92, NU32, BU97, BU32, BU92, NC93, BC91 e BU24 se deu em nível de espécie, suportado por valores de 99% de similaridade (Tabela 1). Todos os micro-organismos do gênero Bacillus foram isolados da variedade CTC4, sendo encontrado na maioria das fazendas utilizadas para o isolamento. Já o gênero Burkholderia foi mais observado associado a variedade IAC 911099 (Tabela 1). O micro-organismo Sphingobium yanoikuyae (BU32 e BU92) foi isolado de localidades distintas e da mesma variedade, enquanto o micro-organismo Rhizobium tropici (BC91 e BU24) foi isolado de localidades e variedades distintas (Tabela 1).

Triagem in vitro da produção de fatores de promoção do crescimento vegetal A produção de AIA foi observada em 46% dos isolados diazotróficos avaliados. As concentrações de AIA produzidas variaram de 0.5 a 36.15 µg mL-1 em 24 horas, de 0.5 a 59.48 µg mL-1 em 48 horas e 0.23 a 87.07 µg mL-1 em 72 horas (Tabela 2). Em 72 horas, a maior parte dos isolados produziu mais que 20 µg mL-1 de AIA. O maior valor de AIA foi produzido pelo organismo Sphingobium yanoikuyae (BU32), seguido por micro-organismos dos gêneros Sphingobium (BU92), Sphingomonas (BC44), Enterobacter (NC25 e NU33) e Rhizobium (NC24).

131 132

Tabela 1. Identificação das rizobactérias isoladas baseada na comparação com sequências da região 16S rRNA depositadas no banco de dados do GenBank.

Identificação Tamanho Espécie mais próxima Similaridade Número de Número de do isolado* do acesso da deposito fragmento espécie mais próxima BC211 1171 Burkholderia sp. 97% NR_026462.1 MG459286 BC23 961 Bacillus aryabhattai 99% NR_115953.1 MG459285

BC26 473 Bacillus megaterium 99% NR_117473.1 MG459284

BC27 1443 Bacillus sp. 97 % NR_116873.1 MG459283 BC28 1071 Bacillus sp. 98% NR_148626.1 MG459282 BC42 1255 Cupriavidus sp. 98% NR_113619.1 MG459281 BC43 1246 Burkholderia sp. 98% NR_041720.1 MG459280 BC44 522 Sphingomonas sp. 99% NR_113637.1 MG459279 BC91 1183 Rhizobium tropici 99% NR_102511.1 MG459278 BC93 723 Burkholderia sp. 97 % NR_102890.1 MG459277 BC95 1241 Burkholderia sp. 99% NR_042632.1 MG459276

BU23 1239 Burkholderia sp. 98% NR_126274.1 MG459275 BU24 1170 Rhizobium tropici 99% NR_102511.1 MG459274

BU32 777 Sphingobium yanoikuyae 99% NR_113730.1 MG429815 BU92 1197 Sphingobium yanoikuyae 99% NR_113730.1 MG459272 BU95 1229 Burkholderia sp. 99% NR_136496.1 MG459271 BU96 1266 Dyella sp. 97% NR_043258.1 MG459270 BU97 1258 Burkholderia vietnamiensis 99% KF114029.1 MG459269 BU98 1138 Burkholderia sp. 97% NR_114491.1 MG459268

NC24 724 Rhizobium sp. 97 % FN645738.1 MG459267

NC25 1233 Enterobacter sp. 97% NR_146667.2 MG459266 NC26 1467 Flavobacteriumsp. 97 % NR_134727.1 MG459265 NC27 1168 Bacillus sp. 97% NR_118442.1 MG459472 NC29 1118 Cupriavidus sp. 97 % NR_113619.1 MG459264 NC43 535 Erwinia sp. 97 % NR_074869.1 MG459263 NC49 1253 Methylobacterium sp. 99% NR_074244.1 MG459262 NC92 631 Bacillus megaterium 99 % NR_117473.1 MG429816 NC93 1090 Variovorax soli 99% NR_043811.1 MG459261

NC97 755 Burkholderia sp. 99% NR_104975.1 MG429817 NU21 1406 Burkholderia sp. 99% NR_113645.1 MG459260

NU31 1082 Burkholderia sp. 99% NR_114491.1 MG459259 NU32 770 Burkholderia gladioli 99% NR_113629.1 MG429818 NU33 1376 Enterobacter sp. 99% KF010362.1 MG459258 NU41 769 Mitsuaria sp. 98% NR_114070.1 MG429819 NU45 1279 Burkholderia ambifaria 99% NR_074687.1 MG459257 NU92 1197 Burkholderia cepacia 99% NR_114491.1 MG459256 NU93 1339 Burkholderia sp. 99% NR_114491.1 MG459255

* Na nomenclatura dos isolados N/B correspondem ao meio de isolamento (NFB e Burk) e C/U correspondem a variedade (C= CTC4 e U= IAC1099).

132 133

A habilidade de solubilizar fosfato está presente em 86.5% dos isolados avaliados, variando entre 1.82 a 53.78 µg mL-1 (Tabela 2). Os micro-organismos do gênero Burkholderia, se destacaram na solubilização de fosfato, solubilizando 53.78 µg mL-1 (NC97), 50.08 µg mL-1 (NU93), 50.03 µg mL-1 (BU95), 45.82 µg mL-1 (NU92) e 44.8 µg mL-1 (BC43). Ressalta-se que os organismos Sphingobium yanoikuyae (BU32), Rhizobium sp. (NC24), Enterobacter sp. (NC25) e Enterobacter sp. (NU33) além de serem os melhores produtores de AIA, também foram eficientes para a solubilização de fosfato (Tabela 2). A produção de amônia foi detectada em 81% dos isolados, sendo o segundo fator de promoção do crescimento vegetal mais encontrado, logo após a solubilização de fosfato. Além da capacidade de fixação de nitrogênio, a produção de amônia foi a único fator de promoção do crescimento vegetal observado para os isolados, Methylobacterium sp. (NC49), Mitsuaria sp. (NU41) e Variovorax soli (NC93). Não foi observada a produção de HCN por nenhum isolado. Os produtores de celulases corresponderam a 19% dos isolados, com índices enzimáticos variando entre 1.5 e 3.41. A maioria dos isolados produtores de celulases pertencem ao gênero Bacillus (BC23, BC26, BC27, BC28 e NC27), entretanto, representantes dos gêneros Flavobacterium (NC26) e Sphingobium (BU32) também foram produtores da enzima (Tabela 2). Somente o isolado Dyella sp. (BU96) foi produtora de quitinases, com índice enzimático de 2.8 (Tabela 2). A capacidade de inibir o crescimento do fungo patógeno F. moniliforme foi observado em 21.7% dos isolados. Todos os isolados com antagonismo frente ao fungo patógeno pertencem ao gênero Burkholderia. Os isolados NC97, BU95, NU21, NU31 e NU45 apresentaram a maiores distâncias entre a colônia fúngica e a bacteriana (Tabela 2). Ressalta-se que nem todos os micro- organismos que apresentaram antagonismo frente ao fungo foram produtores de mecanismos indiretos de crescimento vegetal (amônia, HCN, celulases e quitinases) responsáveis pelos ataques aos patógenos.

Tabela 2. Valores da produção in vitro de fatores de promoção do crescimento vegetal por bactérias diazotróficas isoladas de cana-de-açúcar sob manejo orgânico1.

133 134

Isolado AIA (µg mL-1) Fosfato (µg mL-1) Amo Cel2 Quit2 Ant3 24h 48h 72h BC211 0 0 0 26.29g + - - - BC23 0 0 0 18.11f + 2.71a - - BC26 0 0 0 13.36e - 3.41a - - BC27 0 0 0 12.59e + 2.20a - - BC28 0 0 0 3.32b + 2.00a - - BC42 0 0 0 1.82a + - - - BC43 0 0 1.19b 44.81i + - - - BC44 0 27.46f 48.65h 0 + - - - BC91 0 0 9.85e 10.20d - - - - BC93 0 0 0 26.57g - - - - BC95 4.49c 16.25e 14.04f 29.12g + - - - BU23 0 0 0 27.67g + - - - BU24 2.47b 3.25b 6.06d 6.66c + - - - BU32 36.15e 43.22g 87.07h 34.29h - 3.00a - - BU92 25.84e 59.48g 63.68h 0 + - - - BU95 0 0 0 50.03i + - - 6a BU96 0 0 0 9.64d + - 2.8a - BU97 0 0 4.15c 10.57d + - - 3b BU98 0 11.55d 30.23g 26.98g + - - - NC24 23.59e 48.73g 64.52h 33.23h + - - - NC25 22.81e 50.52g 80.42h 38.56h + - - - NC26 0 0 0 16.14f + 1.50a - - NC27 0 0 0 24.96g - 2.60a - - NC29 0 0 0 15.64f + - - - NC43 0 0 23.29g 35.32h + - - - NC49 0 0 0 0 + - - - NC92 0 0 0 6.54c + - - - NC93 0 0 0 0 + - - - NC97 0.5a 0.5a 3.37c 53.78i - - - 7a NU21 0 0 0 38.89h + - - 5a NU31 0 0 0.23a 32.98h + - - 5a NU32 0 0 0 15.09f - - - - NU33 28.49e 37.85f 77.41h 34.37h + - - - NU41 0 0 0 0 + - - - NU45 0 2.25b 2.9c 15.45f + - - 4a NU92 8.92d 9.29d 9.63e 45.82i + - - 3b NU93 0 0 0 50.08i + - - 2c

AIA= produção de ácido 3-indol-ácetico; Fosfato= solubilização de fosfato; Amo= Amônia; Cel= Celulase; Quit= Quitinase; Ant= antagonismo. 1.Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. 2. Os valores expressos correspondem ao índice enzimático que é obtido dividindo-se o diâmetro do halo pelo da colônia. A marcação “-“ indica crescimento bacteriano sem a formação de halo. 3. Os valores apresentados correspondem a distância entre a colônia fúngica e bacteriana. A marcação “-” indica que a bactéria não foi antagônica frente ao fungo.

134 135

DISCUSSÃO

No presente estudo foram isolados 81 micro-organismos oriundos de cana-de-açúcar sob manejo orgânico, utilizando os meios semi-sólidos livres de nitrogênio NFb e Burk. Embora o meio NFb facilite o isolamento de bactérias do gênero Azospirillum (Kuss et al. 2007), diversos estudos empregando esse meio têm descrito o isolamento de outros gêneros como Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Burkholderia, Bacillus. Enterobacter, Klebsiella, Pantoea e Pseudomonas (Ambrosini et al. 2012, Thanh and Diep 2014). Já o meio de Burk não apresenta especificidade, sendo associado a uma gama de espécies fixadoras (Park et al. 2005). Os meios semi-sólidos livres de nitrogênio são considerados ideais para o isolamento e triagem de bactérias diazótroficas. A concentração reduzida de ágar determina uma condição microaerófila que é ideal para a ação da nitrogenase, cuja ação é reduzida em altas concentrações de oxigênio (Baldani et al. 2014). O isolamento e aplicação de bactérias diazotróficas em culturas sob regime orgânico é extremamente interessante do ponto de vista agrícola, visto que a grande limitação do cultivo orgânico se refere ao aporte de nitrogênio. Os micro-organismos diazotróficos poderiam ser aplicados como substitutos aos fertilizantes sintéticos (Wongphatcharachai et al. 2015) ou em associação com os estercos animal e vegetal, usualmente utilizados como fonte nitrogenadas nos cultivos orgânicos (Hirel et al. 2011). O gene nifH, por ser conservado ao longo das espécies, é frequentemente utilizado como marcador molecular para o rastreio de bactérias fixadoras de nitrogênio (Raymond et al. 2004; Gaby and Buckley 2012) e pode ser amplificado em 45.6% dos isolados deste estudo. O fato do gene nifH não ter sido amplificado, não significa que o micro-organismo não seja fixador. A sequência dos principais primers amplamente utilizados, em sua maioria constituídos por bases degeneradas, são desenhados para flanquear a mesma região ou sítios sobrepostos, tornando seu alcance restrito (Poly et al. 2001, Zehr et al. 2003). Além disso, nem todos os organismos possuem a nitrogenase ferro-molibdênio (Nif), existem ainda outras nitrogenases que se diferenciam pelo metal que contém em sua estrutura, a exemplo da nitrogenase ferro-vanádio (Vnf) ou da nitrogenase ferro (Anf) (Dahal et al. 2017). Existem ainda, micro-organismos capazes de crescer em meios livres de nitrogênio e não serem fixadores. Sugere-se que esses organismos possam incorporar amônia ou outras espécies de nitrogênio em concentrações muito baixas ou que sejam capazes de utilizar frações fixadas por

135 136

outros organismos (Beneduzi et al. 2013, MacKellar et al. 2016). Ademais, ressalta-se que a amplificação do gene nifH tem caráter confirmatório, mas não consegue quantificar o nitrogênio fixado, sendo recomendado o uso de técnicas como a redução do acetileno (ARA) e a 15 incorporação do isótopo de N2 (Gtari et al., 2012). O gênero mais encontrado neste estudo, Burkholderia, está amplamente distribuído na natureza, sendo frequentemente encontrado associado à cana-de-açúcar sob manejo tradicional (Luvizotto et al. 2010, Castro-Gonzalez et al. 2011). Sob o ponto de vista da agricultura orgânica, a família Burkholderiaceae e genes nifH foram mais abundantes em solos agriculturáveis abundantes em esterco suíno (Xun et al. 2018). Além da sua capacidade em fixar nitrogênio, sugere-se que a promoção do crescimento vegetal desempenhada por esses organismos esteja associada à produção de AIA, solubilização de fosfatos e inibição dos patógenos in vitro (Paungfoo-Lonhienne et al. 2014). O gênero Bacillus, o segundo mais encontrado neste estudo, também tem sido descrito em associação com cana-de-açúcar sob manejo tradicional e apresenta potencial na produção de enzimas de interesse agronômico (Beneduzi et al. 2008, Madhaiyan et al. 2011, Pisa et al. 2011). Os demais gêneros encontrados, têm em sua maioria, sido descritos associados cana-de-açúcar sob manejo tradicional ou a solos agriculturáveis (Nicolaisen et al. 2008, Burbano et al. 2011, Anand et al. 2012, Bers et al. 2012, Santi-Ferrara et al. 2012, Fischer et al. 2012, Lin et al. 2012; Hoang et al. 2015, Solanki et al. 2017). A presença de Bacillus e Burkoholderia como grupos mais predominantes também foi observada por Xia et al (2015), que avaliou a distribuição taxonômica de bactérias de milho, melão, pimenta e tomate sob sistema orgânico. Oliveira (2009) utilizando meios seletivos para fixadores de nitrogênio, incluindo o NFb, encontrou uma gama de micro-organismos rizosfericos associados a canaviais sob manejo orgânico em São Paulo, destacando-se as espécies: Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Burkholderia e Beijerinckia. Esse mesmo estudo encontrou ainda outras espécies como Agrobacterium, Azozpirillum, Bosea, Bradyrhizobium, Brucella, Cohnella, Erwinia, Gluconacetobacter, Rhizobium, Stenotrophomonas, Variovorax e Xanthomonas. As similaridades e divergências deste estudo, em relação ao estudo conduzido por Oliveira (2009), reforçam a idéia de que mesmo que espécies dos gêneros Enterobacter, Burkholderia e Rhizobium sejam ubíquas, fatores como idade do vegetal, variedade, exsudatos

136 137

radiculares, manejo e atributos químicos e físicos do solo podem influenciar na distribuição da comunidade e nas espécies encontradas (Beneduzi et al. 2008, Santi-Ferrara et al. 2012; Beneduzi et al. 2013; Noumavo et al. 2016). Portanto, para cada região avaliada podem ser encontrados padrões distintos de distribuição de micro-organismos diazotróficos e isso é interessante à luz da prospecção de RPCV. Menos da metade dos isolados avaliados produziram AIA e foi observada ampla variedade taxonômica figurando entre os melhores produtores. Além disso, alguns indivíduos de um mesmo gênero produziram valores distintos de AIA, sendo classificados em grupos diferentes de acordo com teste de Scot-Knott a 5.0% de probabilidade. As cepas de Enterobacter sp NC25 e NU33, produziram 80.42 e 77.41 mg mL-1, respectivamente, valores semelhantes aos encontrados por Rodrigues et al (2016) ao avaliar em 72 horas cepas de Enterobacter sp. oriundas rizosfera de cana-de-açúcar sob regime tradicional. Embora a produção de AIA seja uma característica comumente encontrada entre as rizobactérias (Sagar et al. 2017), os diferentes tipos de fertilizantes impactam no número de bactérias no solo e na diversidade de bactérias produtoras de AIA. Em sistemas onde se retira o fertilizante químico ou se aplica fertilizante orgânico, o número e a diversidade de bactérias cultiváveis produtoras de AIA aumenta. O uso de fertilizantes orgânicos melhora a estrutura da comunidade microbiana, além de selecionar micro-organismos benéficos (Yuan et al. 2011, Duangpaeng et al. 2012). Além de ser a auxina mais ativa, acredita-se que o AIA seja fisiologicamente ativo em pequenas concentrações, dessa forma, mesmo organismos que produziram pequenas frações de AIA podem contribuir para a sanidade vegetal ( Hayat et al. 2010, Vejan et al. 2016). A produção de AIA leva ao elongamento das raízes laterais, além de aumentar sua área de superfície e tamanho, o que eleva o aporte de água e nutrientes ao vegetal (Brandl and Lindow, 1998, Vessey 2003). A habilidade de solubilizar fosfato foi a característica mais encontrada nas bactérias diazotróficas avaliadas neste estudo, com destaque para as bactérias do gênero Burkholderia. Inui-Kushi et al (2012) ao avaliar rizobactérias de cana-de-açúcar sob manejo tradicional, verificou que de dez bactérias de gêneros distintos, as do gênero Burkholderia, eram as que apresentavam os maiores índices de solubilização de fosfato.

137 138

Embora não seja uma característica obrigatória do gênero Burkholderia, diversas espécies do gênero têm sido associadas à variados níveis de solubilização de fosfato e a capacidade de acidificação da rizosfera (Castro-Gonzalez et al. 2011). Ao estudar o impacto do manejo orgânico na diversidade de bactérias solubilizadoras de fosfato em pimenta (Capsicum frutescens L. cv. Hua Rua), Surapat et al (2013), encontraram que a maior parte dos seus isolados solubilizadoras de fosfato foram recuperadas de sistemas orgânicos e, em sua maioria, do gênero Burkholderia. O mecanismo mais conhecido de solubilização de fosfato envolve acidificação do meio. Os vegetais por si só têm capacidade de acidificar a rizosfera levando a solubilização de fosfato, entretanto, essa capacidade é bastante limitada (Hamdali et al. 2008). Sugere-se que mesmo o fosfato sendo solubilizado em pequenas quantidades por bactérias, ainda corresponda a grande parte do fosfato solúvel que é disponibilizado ao vegetal, sobretudo nos cultivos orgânicos que são amplamente dependentes da microbiota natural do solo e que apresentam grandes quantidades de fosfatos orgânicos (Pariona-Llanos et al. 2010). A produção de amônia é bastante comum entre as rizobactérias, conforme observado por este estudo e pelos estudos conduzidos por Joseph et al (2007) e Gayathri et al (2010). Já a produção de HCN é rara, fato igualmente encontrado por Kavamura et al (2013) ao avaliar bactérias oriundas de cactáceas. A amônia e o HCN são compostos voláteis que atuam como agentes de biocontrole. Além de atuar na resposta a patógenos, acredita-se que a amônia possa ser utilizada como fonte de suplementação de nitrogênio pela planta hospedeira (Marques et al. 2010, Passari et al. 2015, Joseph et al. 2007). Estudo conduzido por Marques et al (2010) encontraram que a produção de amônia estava correlacionada positivamente com o acúmulo de nitrogênio e fósforo, elongamento das raízes e dos caules e o aumento de biomassa em milho. O presente estudo encontrou que a maior parte dos isolados produtores de celulases pertenciam ao gênero Bacillus, semelhante ao encontrado por Zhao et al (2015). Os micro- organismos do gênero Bacillus produtores de celulases estão amplamente distribuídos na rizosfera de cana-de-açúcar. Acredita-se que participem na degradação de detritos celulolíticos originários do próprio vegetal e consequentemente da ciclagem dos elementos (Ratón et al. 2012). Além do potencial de inibição de patógenos, a produção de celulases em rizobactérias tem papel importante na penetração desses organismos no vegetal hospedeiro durante a colonização (Pariona-Llanos et al. 2010).

138 139

O isolado BU96 do gênero Dyella foi o único capaz de degradar a quitina. Micro- organismos desse gênero já foram isolados de solo e descritos como degradadores de quitina (Lee and Lee 2009). Embora a presença de bactérias quitinolíticas seja ubíqua, estima-se que somente 1% das rizobactérias isoladas de trigo, arroz e milho apresentem potencial quitinolítico (Someya et al. 2011), o que reforça baixo número de quitinolíticos encontrado neste estudo. As enzimas líticas celulases e quitinases são consideradas fatores limitantes ao crescimento de fungos patogênicos, pois sua ação lítica é capaz de causar degradação da matriz estrutural da parede celular fúngica (El-Sayed et al. 2014). A cana-de-açúcar é atacada por uma série de patógenos tais como vírus, bactérias, nematoides, insetos e fungos. Esses organismos causam uma série de perdas na produtividade (Zhang et al. 2015). Dentre as principais espécies de fungos que atacam a cana de açúcar destaca- se o fungo F. moniliforme, que causa modificações na morfologia das folhas e do colmo em variedades não tolerantes a praga (Lin et al. 2014, Lin et al. 2015). Nesse sentido, as rizobactérias já foram reportadas como agentes de biocontrole frente a cepas patogênicas de F. moniliforme (Hebbar et al. 1992, Figueroa-López et al. 2016). Bactérias do gênero Burkholderia se destacaram quanto a inibição do patógeno F. moniliforme. Diversas bactérias pertencentes ao gênero Burkholderia isoladas de diversos ambientes, como o tomate (Omar et al. 2006), cevada (Simonetti et al. 2018) e de solo da região amazônica (Silva et al. 2012), demonstraram igualmente serem capazes de inibir o crescimento de cepas fitopatógenas de Fusarium. Admite-se que alguns micro-organismos do gênero Burkholderia produzam o antibiótico pirrolnitrina, que é inibidor da cadeia respiratória de fungos (Parke and Gurian-Sherman 2001). Recomenda-se que bactérias candidatas a inoculantes apresentem o maior número de fatores de promoção do crescimento vegetal in vitro possíveis, haja vista que apresentam uma probabilidade maior de sobrevivência em campo devido a capacidade de utilização de diversos substratos (Rana et al. 2011). Tal fato foi contemplado no presente estudo. Sobressaíram-se nesse estudo, os isolados: Sphingobium yanoikuyae (BU32), Rhizobium sp. (NC24), Enterobacter sp. (NC25) e Enterobacter sp. (NU33) por sua capacidade de produzir AIA concomitante a habilidade de solubilizar fosfato e os micro-organismos do gênero Burkholderia: NC97, BU95, NU31, NU21 e NU92 por sua capacidade simultânea em solubilizar fosfato e promover o

139 140

biocontrole. Ademais, sugere-se que sejam aplicados em estudos posteriores de forma mista em avaliações em casa de vegetação e em campo.

AGRADECIMENTOS A Jalles Machado e a Goiasa-Goiatuba Álcool Ltda por permitirem e auxiliarem a coleta de solo rizosférico. Ao Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) por ceder a cepa de Fusarium moniliforme utilizada no estudo. A professora doutora Maria Carolina Quecine Verdi (EsalQ- USP) por gentilmente ceder a cepa de Azospirillum brasilense utilizada como controle positivo. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo fornecimento de bolsa de estudos ao primeiro autor. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais (CIAMB) pelo auxílio financeiro.

REFERÊNCIAS

AHEMAD M AND KIBRET M. 2014. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: Current perspective. J King Saud Univ, Sci 26: 1–20.

ALTSCHUL S F, GISH W, MILLER W, MYERS EW AND LIPMAN D J. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Bio 215: 403-410.

AMBROSINI A, BENEDUZI A, STEFANSKI T, PINHEIRO FG, VARGAS L K AND PASSAGLIA LMP. 2012. Screening of plant growth promoting Rhizobacteria isolated from sunflower (Helianthus annuus L.). Plant Soil 356: 245–264.

ANAND S, SANGWAN N, LATA P, KAUR J, DUA A, SINGH AK AND LAL R. (2012). Genome sequence of Sphingobium indicum B90A, a hexachlorocyclohexane-degrading bacterium. J Bacteriol 194: 4471–4472.

BALDANI JI, REIS VM, VIDEIRA SS, BODDEY LH AND BALDANI VLD. 2014. The art of isolating nitrogen-fixing bacteria from non-leguminous plants using N-free semi-solid media: a practical guide for microbiologists. Plant Soil 384: 413–431.

BENEDUZI A, MOREIRA F, COSTA PB, VARGAS LK, LISBOA BB, FAVRETO R AND PASSAGLIA LMP. 2013. Diversity and plant growth promoting evaluation abilities of bacteria isolated from sugarcane cultivated in the South of Brazil. Appl Soil Ecol 63: 94–104.

BENEDUZI A, PERES D, DA COSTA PB, BODANESE ZANETTINI MH AND PASSAGLIA LMP. 2008. Genetic and phenotypic diversity of plant-growth-promoting bacilli isolated from wheat fields in southern Brazil. Res Microbiol 159: 244–250.

140 141

BERS K, SNIEGOWSKI K, DE MOT R AND SPRINGAEL D. 2012. Dynamics of the linuron hydrolase libA gene pool size in response to linuron application and environmental perturbations in agricultural soil and on-farm biopurification systems. Appl Environ Microbiol 78: 2783–2789.

BHARDWAJ, D., ANSARI, M. W., SAHOO, R. K., & TUTEJA, N. (2014). Biofertilizers function as key player in sustainable agriculture by improving soil fertility, plant tolerance and crop productivity. Microb Cell Fact 13: 66.

BRANDL MT AND LINDOW SE. 1998. Contribution of indole-3-acetic acid production to the epiphytic fitness of Erwinia herbicola. Appl Environ Microbiol 64: 3256-3263.

BURBANO CS, LIU Y, RÖSNER KL, REIS VM, CABALLERO-MELLADO J, REINHOLD- HUREK B AND HUREK T. 2011. Predominant nifH transcript phylotypes related to Rhizobium rosettiformans in field-grown sugarcane plants and in Norway spruce. Environ Microbiol Rep 3: 383–389.

CAPPUCCINO JG AND SHERMAN N. 1996. Microbiology: A Laboratory Manual. 6. ed. New York: The Benjamin/ Cummings Publishing Company, 208 p.

CATTELAN AJ. 1999. Métodos quantitativos para determinação de características bioquímicas e fisiológicas associadas com bactérias promotoras de crescimento vegetal. Londrina: Embrapa Soja, 36 p.

CASTRO-GONZALEZ R, MARTINEZ-AGUILAR L, RAMIREZ-TRUJILLO A, ESTRADA- DE LOS SANTOS P AND CABALLERO-MELLADO J. 2011. High diversity of culturable Burkholderia species associated with sugarcane. Plant Soil 345: 155–169.

CROWDER DW AND REGANOLD JP. 2015. Financial competitiveness of organic agriculture on a global scale. Proc Natl Acad Sci USA 112: 7611–7616.

DAHAL B, NANDAKAFLE G, PERKINS L AND BRÖZEL VS. 2017. Diversity of free-Living nitrogen fixing Streptomyces in soils of the badlands of South Dakota. Microbiol Res 195: 31–39.

DAI Z, GUO X, YIN H, LIANG Y, CONG J AND LIU X. 2014. Identification of nitrogen-fixing genes and gene clusters from metagenomic library of acid mine drainage. PLoS ONE 9: 1–9.

DEY R, PAL KK, BHATT DM AND CHAUHAN SM. 2004. Growth promotion and yield enhancement of peanut (Arachis hypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria. Microbiol Res 159: 371–94

DING J, ZHANG Y, DENG Y, CONG J, LU H, SUN X AND YANG Y. 2015. Integrated metagenomics and network analysis of soil microbial community of the forest timberline. Sci Rep 5: 1-10.

141 142

DOBEREINER J, MARRIEL IE AND NERY M. 1976. Ecological distribution of Spirillum lipoferum Beijerinck. Can J Microbiol 22: 1464-1473.

DUANGPAENG A, PHETCHARAT P, CHANTHAPHO S, BOONKANTONG N AND OKUDA N. 2012. The study and development of endophytic bacteria for enhancing organic rice growth. Procedia Eng 32: 172–176.

EL-SAYED WS, AKHKHA A, EL-NAGGAR MY AND ELBADRY M. 2014. In vitro antagonistic activity, plant growth promoting traits and phylogenetic affiliation of rhizobacteria associated with wild plants grown in arid soil. Front Microbiol 5: 1–11.

FERREIRA DF. 2011. Sisvar: a computer statistical analysis system. Cienc. Agrotecnol. 35: 1039-1042.

FIGUEROA-LÓPEZ AM, CORDERO-RAMÍREZ JD, MARTÍNEZ-ÁLVAREZ JC, LÓPEZ- MEYER M, LIZÁRRAGA-SÁNCHEZ GJ, FÉLIX-GASTÉLUM R AND MALDONADO- MENDOZA IE. 2016. Rhizospheric bacteria of maize with potential for biocontrol of Fusarium verticillioides. SpringerPlus 5: 330.

FISCHER D, PFITZNER B, SCHMID M, SIMÕES-ARAÚJO JL, REIS VM, PEREIRA W AND HARTMANN A. 2012. Molecular characterisation of the diazotrophic bacterial community in uninoculated and inoculated field-grown sugarcane (Saccharum sp.). Plant Soil 356: 83–99.

GABY JC AND BUCKLEY DH. 2012. A comprehensive evaluation of PCR primers to amplify the nifH gene of nitrogenase. PLoS ONE 7: 1-12.

GAYATHRI S, SARAVANAN D, RADHAKRISHNAN M, BALAGURUNATHAN R AND KATHIRESAN K. 2010. Bioprospecting potential of fast growing endophytic bacteria from leaves of mangrove and salt-marsh plant species. Ind J Biotechnol 9: 397–402.

GTARI M, GHODHBANE-GTARI F, NOUIOUI I, BEAUCHEMIN N AND TISA LS. 2012. Phylogenetic perspectives of nitrogen-fixing actinobacteria. Arch. Microbiol 194: 3-11.

GOLDEMBERG J, COELHO ST AND GUARDABASSI P. 2008. The sustainability of ethanol production from sugarcane. Energy Policy 36: 2086-2097.

GOPALAKRISHNAN S, SRINIVAS V, ALEKHYA G AND PRAKASH B. 2015. Effect of plant growth-promoting Streptomyces sp. on growth promotion and grain yield in chickpea (Cicer arietinum L). 3 Biotech 5: 1–8.

GORDON SA AND WEBER RP. 1951. Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant Physiol 26: 192-195.

142 143

HAMDALI H, HAFIDI M, VIROLLE MJ AND OUHDOUCH Y. 2008. Rock phosphate- solubilizing Actinomycetes: Screening for plant growth-promoting activities. World J Microbiol Biotechnol 24: 2565–2575.

HAYAT R, ALI S, AMARA U, KHALID R AND AHMED I. 2010. Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: A review. Ann Microbiol 60: 579–598.

HEBBAR KP, DAVEY AG AND DART PJ. 1992. Rhizobacteria of maize antagonistic to Fusarium moniliforme, a soil-borne fungal pathogen: isolation and identification. Soil Biol and Biochem 24: 979-987.

HIREL B, TÉTU T, LEA PJ AND DUBOIS F. 2011. Improving nitrogen use efficiency in crops for sustainable agriculture. Sustainability 3: 1452–1485.

HOANG VA, KIM YJ, NGUYEN NL, KANG CH, KANG JP, SINGH P AND YANG DC. 2015. Microbacterium rhizomatis sp. nov., a b-glucosidase-producing bacterium isolated from rhizome of Korean mountain ginseng. Int J Syst Evol Microbiol 65: 3196–3202.

INUI-KISHI RN, KISHI LT, PICCHI SC, BARBOSA JC, LEMOS MTO, MARCONDES J AND LEMOS EGM. 2012. Phosphorus solubilizing and iaa production activities in plant growth promoting rhizobacteria from brazilian soils under sugarcane cultivation. ARPN J Eng Appl Sci 7: 1446–1454.

JÄRVAN M AND EDESI L. 2015. Nitrogen cycle bacteria in soils of organically and conventionally managed crop rotations. Zemdirbyste-Agriculture, 102: 15–22.

JI SH, GURURANI MA AND CHUN SC. 2014. Isolation and characterization of plant growth promoting endophytic diazotrophic bacteria from Korean rice cultivars. Microbiol Res 169: 83- 98.

JOSEPH B, PATRA RR AND LAWRENCE R. 2007. Characterization of plant growth promoting rhizobacteria associated with chickpea (Cicer arietinum L.). Int J Plant Prod 1: 141– 151.

KANCHISWAMY CN, MALNOY M AND MAFFEI ME. 2015. Bioprospecting bacterial and fungal volatiles for sustainable agriculture. Trends Plant Sci 20: 206–211.

KANG SM, JOO GJ, HAMAYUN M, NA CI, SHIN DH, KIM HY AND LEE IJ. 2009. Gibberellin production and phosphate solubilization by newly isolated strain of Acinetobacter calcoaceticus and its effect on plant growth. Biotechnol Lett 31: 277–281.

KARAGÖZ K, ATEŞ F, KARAGÖZ H, KOTAN R AND ÇAKMAKÇI R. 2012. Characterization of plant growth-promoting traits of bacteria isolated from the rhizosphere of grapevine grown in alkaline and acidic soils. Eur J Soil Biol 50: 144–150.

143 144

KASANA RC, SALWAN R, DHAR H, DUTT S AND GULATI A. 2008. A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine. Curr. Microbiol 57: 503-507.

KAVAMURA VN, SANTOS SN, SILVA JL, PARMA MM, ÁVILA LA, VISCONTI A AND MELO IS. 2013. Screening of Brazilian cacti rhizobacteria for plant growth promotion under drought. Microbiol Res 168: 183–191.

KRUASUWAN W AND THAMCHAIPENET A. 2016. Diversity of Culturable Plant Growth- Promoting Bacterial Endophytes Associated with Sugarcane Roots and Their Effect of Growth by Co-Inoculation of Diazotrophs and Actinomycetes. J Plant Growth Regul 4: 1074-1087.

KUKLA M, POCINICZAK T AND PIOTROWSKA-SEGET Z. 2014. Diversity of endophytic bacteria in Lolium perenne and their potential to degrade petroleum hydrocarbons and promote plant growth. Chemosphere 117: 40–46.

KUMAR M. 2014. Bacteria involving in nitrogen fixation and their evolutionary correlation. Int J Curr Microbiol App Sci 3: 824–830.

KUSS AV, KUSS VV, LOVATO T AND FLÔRES ML. 2007. Fixação de nitrogênio e produção de ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesqui Agropecu Bras 42: 1459–1465.

LANE D. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: STACKEBRANDT E AND GOODFELLOW M. (Eds), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. Chichester: John Wiley & Sons, p. 115–147.

LEE DW AND LEE SD. 2009. Dyella marensis sp. nov., isolated from cliff soil. Int J Syst Evol Microbiol 59: 1397–1400.

LIMA RC, KOZUSNY-ANDREANI DI, ANDREANI JUNIOR R AND FONSECA L. 2011. Caracterização Fenotípica de Bactérias Diazotróficas Endofíticas Isoladas de Cana de Açúcar. Revista Facultad Nacional de Agronomía - Mendellín 64: 5803–5813.

LIN L, LI Z, HU C, ZHANG X, CHANG S, YANG L AND AN Q. 2012. Plant Growth- Promoting Nitrogen-Fixing Enterobacteria Are in Association with Sugarcane Plants Growing in Guangxi, China. Microbes Environ 27: 391–398.

LIN Z, XU S, QUE Y, WANG J, COMSTOCK JC, WEI J AND ZHANG M. 2014. Species- specific detection and identification of Fusarium species complex, the causal agent of sugarcane pokkah boeng in China. PLoS ONE 9: 1–13.

144 145

LIN Z, YUJUAN Z, YOUXIONG Q AND RUKAI C. 2015. Characterization of Fusarium Verticillioide Isolates from Pokkah Boeng on Sugarcane and The Disease Incidence In Field. Journal of Microbiology & Experimentation 5: 61-68.

LUVIZOTTO DM, MARCON J, ANDREOTE FD, DINI-ANDREOTE F, NEVES AA C, ARAÚJO WL AND PIZZIRANI-KLEINER AA. 2010. Genetic diversity and plant-growth related features of Burkholderia spp. from sugarcane roots. World J Microbiol Biotechnol 26: 1829–1836.

MACKELLAR D, LIEBER L, NORMAN JS, BOLGER A, TOBIN C, MURRAY JW AND PRELL J. 2016. Streptomyces thermoautotrophicus does not fix nitrogen. Sci Rep 6: 1-12.

MADHAIYAN M, POONGUZHALI S, LEE JS, LEE KC AND HARI K. 2011. Bacillus rhizosphaerae sp. nov., an novel diazotrophic bacterium isolated from sugarcane rhizosphere soil. Antonie van Leeuwenhoek 100: 437–444.

MARQUES APGC, PIRES C, MOREIRA H, RANGEL AOSS AND CASTRO PML. 2010. Assessment of the plant growth promotion abilities of six bacterial isolates using Zea mays as indicator plant. Soil Biol Biochem 42: 1229–1235.

NAUTIYAL CS. 1999. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEMS Microbiol Lett 170: 265–270.

NICOLAISEN MH, BÆLUM J, JACOBSEN CS AND SØRENSEN J. 2008. Transcription dynamics of the functional tfdA gene during MCPA herbicide degradation by Cupriavidus necator AEO106 (pRO101) in agricultural soil. Env Microbiol 10: 571–579.

NOUMAVO PA, AGBODJATO NA BABA-MOUSSA F, ADJANOHOUN A AND BABA- MOUSSA L. 2016. Plant growth promoting rhizobacteria: Beneficial effects for healthy and sustainable agriculture. Afr J Biotechnol 15: 1452–1463.

OLIVEIRA ZMD. 2009. Rizobactérias promotoras de crescimento vegetal isoladas de cana-de- açúcar sob fertilização orgânica e/ou convencional (Doctoral thesis, Universidade de São Paulo), 165 p.

OMAR I, O’NEILL TM AND ROSSALL S. 2006. Biological control of Fusarium crown and root rot of tomato with antagonistic bacteria and integrated control when combined with the fungicide carbendazim. Plant Pathol 55: 92–99.

PARIONA-LLANOS R, IBANEZ SFF, SOTO GHH AND BARBOSA HR. 2010. Influence of organic fertilization on the number of culturable diazotrophic endophytic bacteria isolated from sugarcane. Eur J Soil Biol 46: 387–393.

145 146

PARK M, KIM C, YANG J, LEE H, SHIN W, KIM S AND SA T. 2005. Isolation and characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops of Korea. Microbiol Res 160: 127–133.

PARKE JL AND GURIAN-SHERMAN D. 2001. Diversity of the Burkholderia cepacia complex and Implications for Risk Assessment of Biological Control Strains. Annual Rev Phytopathol 39: 225–258.

PASSARI AK, MISHRA VK, GUPTA VK, YADAV MK, SAIKIA R AND SINGH BP. 2015. In vitro and in vivo plant growth promoting activities and DNA fingerprinting of antagonistic endophytic actinomycetes associates with medicinal plants. PLoS ONE 10: 1–19.

PAUNGFOO-LONHIENNE C, LONHIENNE TGA, YEOH YK, WEBB RI, LAKSHMANAN P, CHAN CX AND HUGENHOLTZ P. 2014. A new species of Burkholderia isolated from sugarcane roots promotes plant growth. Microb Biotechnol 7: 142–154.

PISA G, MAGNANI GS, WEBER H, SOUZA EM, FAORO H, MONTEIRO RA AND CRUZ LM. 2011. Diversity of 16S rRNA genes from bacteria of sugarcane rhizosphere soil. Braz J Med Biol Res 44: 1215–1221.

POLY F, MONROZIER LJ, BALLY R. 2001. Improvement in the RFLP procedure for studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in soil. Res Microbiol 152:95-103.

RANA A, SAHARAN B, JOSHI M, PRASANNA R, KUMAR K AND NAIN L. 2011. Identification of multi-trait PGPR isolates and evaluating their potential as inoculants for wheat. Ann Microbiol 61: 893–900.

RATÓN TMO, YANO R, IOCHEVET E, FLOH S AND JESU M. 2012. Isolation and characterisation of aerobic endospore forming Bacilli from sugarcane rhizosphere for the selection of strains with agriculture potentialities. World J Microbiol Biotechnol 28: 1593–1603.

RAYMOND J, SIEFERT JL, STAPLES CR, BLANKENSHIP RE. 2004.The natural history of nitrogen fixation. Mol Biol Evol 21: 541–554.

RODRIGUES AA, FORZANI MV, SOARES RDS, SIBOV ST AND VIERA JDG. 2016. Isolation and selection of plant growth-promoting bacteria associated with sugarcane 1. Pesq Agropec Trop 46: 149–158.

RONG X, GUREL FB, MEULIA T AND GARDENER BBM. 2012. Draft genome sequences of the biocontrol bacterium Mitsuaria sp. strain H24L5A. J Bacteriol 194: 734–735.

SADEGHI A, KARIMI E, DAHAJI PA, JAVID MG, DALVAND Y AND ASKARI H. 2012. Plant growth promoting activity of an auxin and siderophore producing isolate of Streptomyces under saline soil conditions. World J Microbiol Biotechnol 28: 1503–1509.

146 147

SAGAR A, DEBBARMA V, ABRAHAM T, SHUKLA PK AND RAMTEKE PW. 2017. Functional Diversity of Soil Bacteria from Organic Agro Ecosystem. Int J Curr Microbiol App Sci 6: 3500–3518.

SAMBROOK JR AND RUSSELL D. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Q Rev Biol 76: 348-349.

SANTI FERRARA FI, OLIVEIRA ZM, GONZALES HHS, FLOH EIS AND BARBOSA HR. 2012. Endophytic and rhizospheric enterobacteria isolated from sugar cane have different potentials for producing plant growth-promoting substances. Plant Soil 353: 409–417.

SANTOS IB, LIMA DRM, BARBOSA JG, OLIVEIRA JTC, FREIRE FJ AND KUKLINSKY- SOBRAL J. 2012. Diazotrophic Bacteria Associated To Roots of Sugarcane: Inorganic Phosphate Solubilization and the Salinity Tolerance. Bioscience Journal 28: 142–149.

SCHULTZ N, SILVA JA, SOUSA JS, MONTEIRO RC, OLIVEIRA RP, CHAVES VA AND URQUIAGA S. 2014. Inoculation of sugarcane with diazotrophic bacteria. Rev Bras Cienc Solo 38: 407–414.

SEVERIANO EC, DE OLIVEIRA GC, CURI N AND DIAS JÚNIOR MS. 2009. Potencial de uso e qualidade estrutural de dois solos cultivados com cana-de-açúcar em Goianésia (GO). Rev Bras Cienc Solo 33: 159–168.

SGROY V, CASSN F, MASCIARELLI O, DEL PAPA MF, LAGARES A AND LUNA V. 2009. Isolation and characterization of endophytic plant growth-promoting (PGPB) or stress homeostasis-regulating (PSHB) bacteria associated to the halophyte Prosopis strombulifera. Appl Microbiol Biotechnol 85: 371–381.

SILVA K, CASSETARI AS, SILVA LA, DE BRANDT E, PINNOCK E, VANDAMME P AND SOUZA MFM. 2012. Diazotrophic Burkholderia species isolated from the Amazon region exhibit phenotypical, functional and genetic diversity. Syst Appl Microbiol 35: 253–262.

SILVA MF, SOUZA AC, OLIVEIRA PJ, XAVIER GR, RUMJANEK NG, SOARES LHB AND REIS VM. 2012. Survival of endophytic bacteria in polymer-based inoculants and efficiency of their application to sugarcane. Plant Soil 356: 231–243.

SIMONETTI E, ROBERTS IN MONTECCHIA MS, GUTIERREZ-BOEM FH, GOMEZ FM AND RUIZ JA. 2018. A novel Burkholderia ambifaria strain able to degrade the mycotoxin fusaric acid and to inhibit Fusarium spp. growth. Microbiol Res 206: 50–59.

SOLANKI MK, WANG Z, WANG FY, LI CN, LAN TJ, SINGH RK AND LI YR. 2017. Intercropping in Sugarcane Cultivation Influenced the Soil Properties and Enhanced the Diversity of Vital Diazotrophic Bacteria. Sugar Tech 19: 136–147.

147 148

SOMEYA N, IKEDA S, MOROHOSHI T, TSUJIMOTO MN, YOSHIDA T, SAWADA H AND TSUCHIYA K. 2011. Diversity of Culturable Chitinolytic Bacteria from Rhizospheres of Agronomic Plants in Japan. Microbes Environ 26: 7–14.

STAMFORD TL, ARAÚJO JM AND STAMFORD NP. 1998. Atividade enzimática de micro- organismos isolados de jacatupé (Pachyrhizus erosos L. Urban). Ciênc Tecnol Aliment 18: 382- 385.

SURAPAT W, PUKAHUTA C, RATTANACHAIKUNSOPON P, AIMI T AND BOONLUE S. 2013. Characteristics of phosphate solubilization by phosphate-solubilizing bacteria isolated from agricultural chili soil and their efficiency on the growth of chili (Capsicum frutescens L. cv. Hua Rua). Chiang Mai J Sci 40: 11–25.

SZILAGYI-ZECCHIN VJ, IKEDA AC, HUNGRIA M, ADAMOSKI D, KAVA-CORDEIRO V, GLIENKE C AND GALLI-TERASAWA LV. 2014. Identification and characterization of endophytic bacteria from corn (Zea mays L.) roots with biotechnological potential in agriculture. AMB Express 4: 1-10.

TAM HM AND DIEP CN. 2015. Isolation and Identification of Rhizospheric Bacteria in Sugarcane (Saccharum spp. L.) Cultivated on Acrisols and Ferrasols of Dong Nai Province, the Southeast of Vietnam. Am J Life Sci 3: 109–118.

THANH DTN. 2014. Isolation, Characterization and Identification of Endophytic Bacteria in Maize (Zea mays L.) Cultivated on Acrisols of the Southeast of Vietnam. Am J Life Sci 2: 224- 236.

VEJAN P, ABDULLAH R, KHADIRAN T, ISMAIL S AND NASRULHAQ BA. 2016. Role of Plant Growth Promoting Rhizobacteria in Agricultural Sustainability—A Review. Mol 21: 573 - 583.

VESSEY JK. 2003. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil 255: 571- 586.

WALPOLA BC AND YOON M. 2013. In vitro solubilization of inorganic phosphates by phosphate solubilizing microorganisms. Afr. J. Microbiol. Res 7: 3534-3541.

WONGPHATCHARACHAI M, STALEY C, WANG P, MONCADA KM, SHEAFFER CC AND SADOWSKY MJ. 2015. Predominant populations of indigenous soybean-nodulating Bradyrhizobium japonicum strains obtained from organic farming systems in Minnesota. J Appl Microbiol 118: 1152–1164.

XIA Y, DEBOLT S, DREYER J, SCOTT D AND WILLIAMS MA. 2015. Characterization of culturable bacterial endophytes and their capacity to promote plant growth from plants grown using organic or conventional practices. Front Plant Sci 6: 1-10.

148 149

XUN W, LI W, HUANG T, REN Y, XIONG W, MIAO Y, WEI R, LI D, SHEN Q AND ZHANG R. 2018. Long-term agronomic practices alter the composition of asymbiotic diazotrophic bacterial community and their nitrogen fixation genes in an acidic red soil. Biol Fertil Soils 2018: 1–11.

YUAN CL, MOU CX, WU WL AND GUO YB. 2011. Effect of different fertilization treatments on indole-3-acetic acid producing bacteria in soil. J. Soils Sediments 11: 322-329.

ZEHR JP, JENKINS BD, SHORT SM AND STEWARD GF. 2003. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison. Environ Microbiol 5: 539–554.

ZHANG C, WANG J, TAO H, DANG X, WANG Y, CHEN M AND WANG Z. 2015. FvBck1, a component of cell wall integrity MAP kinase pathway, is required for virulence and oxidative stress response in sugarcane Pokkah Boeng pathogen. Front Microbiol 6: 1–12.

ZHAO L, XU Y, LAI X, SHAN C, DENG Z AND JI Y. 2015. Screening and characterization of endophytic Bacillus and Paenibacillus strains from medicinal plant Lonicera japonica for use as potential plant growth promoters. Braz J Microbiol 46: 977–989.

149 150

CAPÍTULO 3: Isolamento e rastreamento de actinobactérias oriundas de rizosfera de cana-de-açúcar orgânica portadoras de múltiplos fatores de promoção do crescimento vegetal

150 151

ISOLAMENTO E RASTREAMENTO DE ACTINOBACTÉRIAS ORIUNDAS DE RIZOSFERA DE CANA-DE-AÇÚCAR ORGÂNICA PORTADORAS DE MÚLTIPLOS FATORES DE PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETAL

Ariana Alves Rodrigues¹*; José Daniel Gonçalves Vieira¹. 1. Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia (LAMAB), Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Avenida Universitária, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil, 74605-050.

RESUMO

As actinobactérias rizosféricas associadas ao cultivo orgânico são fundamentais na ciclagem dos nutrientes e na promoção do crescimento vegetal. O estudo teve como objetivo isolar e selecionar, in vitro, actinobactérias com múltiplos fatores de promoção do crescimento vegetal associadas a rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico. Os isolados foram avaliados quanto a sua capacidade de produzir ácido-3-indol-ácetico (AIA), solubilizar fosfato, crescer em meios livres de nitrogênio, produzir amônia, cianeto de hidrogênio (HCN), celulases, quitinases e inibir o crescimento do fungo fitopatogênico Fusarium moniliforme. Dos 21 isolados, 57% produziram pelo menos um dos fatores de promoção do crescimento avaliados. Os isolados ABC92 e ABC32 produziram 60.28 e 55.36 µg mL-1 de ácido indol-3-ácetico (AIA) em 21 dias, já os isolados ANC48 e ANU34 foram os melhores solubilizadores, solubilizando 8.93 e 8.92 µg mL-1 de fosfato, respectivamente. 29% dos micro-organismos foram capazes de crescer em meios livres de nitrogênio e 24% foram produtores de amônia. Os isolados ABC31, ANC48 e ANU49 foram capazes de inibir o crescimento do fungo fitopatogênico F. moniliforme. Todas as actinobactérias identificadas nesse estudo pertenciam ao gênero Streptomyces e apresentaram potencial como agentes de promoção do crescimento vegetal por produzirem múltiplos fatores de promoção do crescimento vegetal. Palavras-chaves: Rizosfera, cana-de-açúcar orgânica, AIA, Solubilização de fosfato, Meio livre de nitrogênio, Amônia, Fusarium moniliforme, Streptomyces.

151 152

INTRODUÇÃO

No Brasil, embora predomine o modelo convencional de produção de cana-de-açúcar, a aceitação e demanda por produtos oriundos da agricultura orgânica tem impulsionado o aumento de áreas destinadas à produção orgânica dessa cultura (Araújo et al., 2008; Duarte et al., 2017). O sistema orgânico de produção não utiliza agroquímicos sintéticos e fertilizantes derivados do petróleo, os substituindo por adubos de origem animal e vegetal, rotação de culturas e o controle biológico de pragas. Enfatiza o uso de recursos naturais regionais e o reaproveitamento de subprodutos da agricultura, garantindo a produtividade do solo, a nutrição vegetal e o controle pragas, minimizando os impactos ambientais negativos como a perda da biodiversidade, de nutrientes e a degradação do solo (Condron et al., 2000; Xia et al., 2015; Rahmann et al., 2016; Lori et al., 2017). A agricultura orgânica leva ao aumento da qualidade do solo e de sua biodiversidade, ao passo que é dependente da ciclagem de nutrientes conduzida pelos micro-organismos e seus processos. Como o aporte de matéria orgânica nos sistemas orgânicos é alto, as comunidades microbianas são essenciais na transformação e liberação dos nutrientes necessários para o crescimento vegetal (Garbeva et al., 2004; Das and Dkhar, 2010; Wang et al., 2012; Jarvan and Edesi, 2015). Além do seu papel na ciclagem dos nutrientes e como decompositores (Sousa et al., 2008), os micro-organismos do solo apresentam potencial na promoção do crescimento vegetal (Vessey, 2003; Khalid et al., 2004; Ahemad and Kibret, 2014). As rizobactérias promotoras do crescimento vegetal (RPCV) são micro-organismos colonizadores da rizosfera, porção do solo aderido às raízes e amplamente influenciadas por seus exsudatos, capazes de contribuir para a produtividade e saúde vegetal (Walker et al., 2003; Bhattacharya and Jha, 2012; Anwar et al., 2016; Viaene et al., 2016). Os mecanismos pelos quais as rizobactérias são capazes de promover o crescimento vegetal são classificados em diretos e indiretos. Os mecanismos diretos envolvem a liberação de nutrientes para o vegetal (solubilização de fosfato e fixação de nitrogênio), liberação de diversos hormônios vegetais (ácido indol-3- ácetico (AIA), giberilinas, citocininas) e controle de estresse abiótico (ACC-deaminase). Os mecanismos indiretos relacionam-se com a proteção do vegetal a pragas, através da produção de substâncias com ação antimicrobiana ou exoenzimas, indução a resistência sistêmica do vegetal e

152 153

competição por nutrientes e nichos ecológicos (Glick et al., 1998; Ryu et al., 2005; Martínez- Viveros et al., 2010; Vejan et al., 2016). Dentre os diversos grupos microbianos que habitam a rizosfera de cana-de-açúcar os mais descritos correspondem as bactérias gram-negativas (Inui-Kishi et al., 2012; Beneduzi et al., 2013, Rodrigues et al., 2016; Silva et al., 2016), entretanto, os micro-organismos gram-positivos sobretudo os com alto conteúdo de C+G, como as actinobactérias, também apresentam potencial uso como inoculantes (Francis et al., 2010). Membros do filo Actinobacteria são comumente encontrados na rizosfera, com uma população de 106-109 células por grama de solo (Barka et al., 2016). São bastante conhecidos por sua capacidade de produção de enzimas e metabólitos secundários (Kim et al., 2012; Alekhya and Gopalakrishnan, 2016). Em associação com vegetais têm sido descritos como importantes agentes de biocontrole e produção de diversas substâncias antimicrobianas (Getha and Vikineswary, 2002; Srividya et al., 2012; Yandigeri et al., 2015). O gênero Streptomyces é o mais descrito em relação às actinobactérias com capacidade de promover o crescimento vegetal, sendo associados à produção de AIA (Jog et al., 2014), solubilização de fosfato (Hamdali et al., 2012), fixação de nitrogênio (Dahal et al., 2017), produção de enzimas e de substâncias antifúngicas (Brzezinska et al., 2013; Bui, 2014). O conhecimento a respeito da associação entre actinobactérias e sistemas orgânicos, bem como a sua bioprospecção, ainda é pouco documentado (Adamovic et al., 2015; Velmourougane, 2016). Diante da estreita relação entre o cultivo orgânico e a liberação de nutrientes por micro- organismos de solo, as actinobactérias constituem ótimos alvos de prospecção. Por serem, em sua maioria, filamentosas aderem em maior extensão as partículas do solo, maximizando a liberação de nutrientes. Ademais, são esporuladas e capazes de resistir a condições adversas, são facilmente isoladas e amplamente distribuídas nos solos (Sousa et al., 2008; Hamdali et al., 2008). Este estudo almejou isolar e selecionar in vitro actinobactérias com múltiplas características de promoção do crescimento vegetal associadas a rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico oriundo de duas usinas localizadas no estado de Goiás, Brasil.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolamento de actinobactérias cultiváveis

153 154

Amostras de solo rizosférico foram obtidas no período de outubro de 2015 a janeiro de 2016, oriundas das variedades comerciais, IAC 911099 e CTC4, cultivadas sob regime orgânico para a produção de açúcar. Os solos amostrados pertenciam a fazendas localizadas em duas usinas de processamento de cana-de açúcar localizadas no estado de Goiás, Brasil (19º 00’ 023” S; 049º 40’ 319” W e 15º 20’ 241”S; 048º 54’ 253” W). Os vegetais foram arrancados do solo e a parte aérea removida. As raízes com solo aderido foram acondicionadas em sacos plásticos esterilizados e armazenados a 4 ºC até o processamento, que se deu no dia seguinte a amostragem. As raízes foram vigorosamente agitadas para a remoção do solo excedente. O solo rizosférico foi coletado com o auxílio de uma espátula esterilizada, a uma distância máxima de 5 mm da raiz (Santos et al., 2012). As amostras de solo foram aquecidas a 40 ºC por 5 horas, para facilitar o isolamento de actinobactérias e minimizar o crescimento de outros morfotipos bacterianos de crescimento rápido. Um grama de solo rizosférico foi diluído em 100 mL de tampão fosfato (0.8% NaCl;

0.02% KCl; 0.14% Na2HPO4, 0.024% KH2PO4; pH 7.4) e mantido sob agitação de 130 rpm por uma hora. Após a incubação, a suspensão foi serialmente diluída e as concentrações de 10-3, 10-4 e 10-5 inoculadas nos meios Ágar amido caseína (AMC) (Wellington and Cross, 1983) e ágar ISP-2 (Shirling and Gottlieb, 1966), suplementados com 50 µg mL-1 de nistatina, para inibir o crescimento de fungos (Anwar et al., 2016). As placas foram incubadas por 21 dias a 30 ºC e monitoradas diariamente. As colônias características de actinobactérias foram transferidas para um novo meio de cultivo e purificadas nos mesmos meios de isolamento. Depois de purificadas, as actinobactérias foram estocadas em glicerol a 20% (m/v) e mantidas a -20ºC em freezer.

Screening dos fatores de promoção do crescimento vegetal Produção de AIA Para avaliar a capacidade das actinobactérias em produzir AIA, os isolados foram inoculados em ágar ISP-2 e cultivados por 14 dias. Plugs de 5 mm, proveniente do crescimento em ISP-2, foram inoculadas em 100 mL de meio extrato de levedura triptona (YT) (Goudjal et al. 2013), suplementado com 5 mM de L-triptofano. Os frascos foram incubados em shaker sob

154 155

agitação de 130 rpm, a 28 ºC por 21 dias. Após 7, 14 e 21 dias, alíquotas de 2000 µL foram centrifugadas a 4.000 rpm por 30 minutos. A determinação da concentração de AIA seguiu o método colorimétrico descrito por Gordon and Weber (1951). Ao sobrenadante foi adicionado o reagente de Salkowisk (35% ácido perclórico; 1.0 mL de FeCl3 a 0.5M) na proporção de 1:1 (v:v). A solução foi incubada por 30 minutos e sua absorbância lida em espectrofotômetro a 530 nm. Os resultados foram expressos em µg mL-1 e determinados a partir da comparação com a curva padrão, obtida a partir de soluções de AIA comercial (0 µg mL-1;1 µg mL-1;5 µg mL-1;10 µg mL-1;25 µg mL-1;50 µg mL-1;75 µg mL-1;100 µg mL-1;150 µg mL-1;200 µg mL-1).

Solubilização de fosfato A habilidade de solubilizar fosfato foi avaliada pelo método descrito por Nautiyal (1999), com modificações. Plugs de 5mm, proveniente do crescimento prévio das actinobactérias por 14 dias em meio ISP-2, foram inoculados em frascos contendo 100 mL de caldo NBRIP (Nautiyal, 1999). As amostras foram incubadas por 14 dias a 28ºC, em shaker sob agitação de 130 rpm. Após 7 e 14 dias, alíquotas de 2000 µL centrifugadas a 10.000 xg por 5 minutos. Ao sobrenadante foi adicionado o reagente molibidato-vandato (5.0% molibidato de amônio; 0.25% vanadato de amônio) na proporção de 200 µL de sobrenadante, 200 µL do reagente e 600 µL de água destilada (Nosrati et al., 2014). A absorbância da solução foi lida em espectrofotômetro a um comprimento de onda de 420 nm. Os resultados foram expressos em µg mL-1 e determinados a partir da comparação com a curva padrão. A curva padrão foi obtida a partir de uma solução -1 estoque de KH2PO4 (0.0875%, m/v) e várias concentrações de fosfato solúvel (0 µg mL ;1.0 µg mL-1;5.0 µg mL-1;8.0 µg mL-1;10 µg mL-1;12 µg mL-1;15 µg mL-1;18 µg mL-1;20 µg mL-1;50 µg mL-1;75 µg mL-1).

Crescimento em meio livre de nitrogênio Os isolados foram inicialmente cultivados por 7 dias em caldo ISP-2, a 30ºC, em shaker sob agitação de 130 rpm. Alíquotas do crescimento foram centrifugadas a 10.000 xg por 10 minutos e o sobrenadante descartado. As células foram ressuspensas em solução salina (0.85%, m/v), inoculadas nos meios semi-sólidos livres de nitrogênio NFb (Dobereiner et al., 1976) e Burk (Park et al., 2005) e incubadas a 30ºC por 7 dias. Os micro-organismos foram repicados

155 156

para novos meios semissólidos por 5 vezes consecutivas para confirmar a capacidade de crescimento em ambiente livre de nitrogênio.

Produção de amônia (NH3) e ácido cianídrico (HCN)

A avalição da produção de NH3 seguiu o método colorimétrico descrito por Cappucino and Sherman (1996). As actinobactérias foram inoculadas em frascos contendo 50 mL de água peptonada e cultivadas por 7 dias a 30 ºC, sob rotação de 130 rpm. Após a incubação, alíquotas do sobrenadante foram transferidas para uma microplaca e a cada poço acrescido o reagente de

Nessler (10% HgI2; 7% KI; 50% solução aquosa NaOH a 32%), na proporção de 2:1 (v/v). O controle positivo constituiu-se de uma solução de sulfato de amônio (50 µg mL-1). A produção de amônia é evidenciada pela modificação de coloração da solução, que se torna acastanhada (Dey el al., 2004). Para a produção de HCN, as actinobactérias foram inoculadas em ágar soja tripticaseínas (TSA) a 10%, suplementado com 0.4% de glicina. Sob a tampa das placas foi adicionado papel filtro (Whatman nº1) embebido com uma solução de ácido pícrico (0.5 % de ácido pícrico e 2.0% de Na2CO3). As placas foram incubadas por 14 dias a 30ºC. O desenvolvimento de uma coloração acastanhada no papel filtro foi indicativo da produção de HCN (Walpola and Yoon, 2013).

Produção de enzimas: quitinases e celulases Para a avaliação da produção de quitinases, as actinobactérias foram inoculadas em meio -1 -1 livre de nitrogênio (MNL), suplementado com 8.0 g L de quitina coloidal, 0.78g L de NH4NO3 e 15 g L-1 de ágar (Cattelan, 1999). As placas foram incubadas a 30ºC por 14 dias. Foram consideradas produtoras de quitinase, aquelas em que foi observado um halo claro ao redor da colônia. Para a verificação da produção de celulases, as actinobactérias foram cultivadas em meio mínimo (Stamford et al., 1998), acrescido de carboximetilcelulose a 1.0% (CMC). Após crescimento a 30º C por 14 dias, as placas foram tratadas com solução de lugol a 0.3% (Kasana et al., 2008). Após a avaliação da produção de quitinases e celulases, o índice enzimático (IE) foi calculado, correspondendo a razão entre o diâmetro do halo pelo diâmetro da colônia.

Atividade antagônica frente a Fusarium monoliforme

156 157

As actinobactérias foram avaliadas quanto a capacidade de inibir o crescimento do fungo fitopatógeno F. moniliforme, segundo a metodologia adaptada de El-Sayed et al (2014). Para o teste, as actinobactérias foram inoculadas em duas estrias paralelas e próximas as margens de uma placa contendo ágar dextrose batata (PDA). Após o crescimento a 30ºC por 7 dias, discos de 5 mm de diâmetro do crescimento prévio do fungo em ADB foram depositados no centro das placas. As placas foram novamente incubadas a 30ºC por 7 dias e quando presente, o halo de inibição aferido.

Analise estatística Todos os testes foram realizados em triplicata e os resultados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott, a 5.0% de significância, no software SISVAR® versão 5.3 (Ferreira, 2011).

Identificação das multi-trait actinobactérias As actinobactérias que durante a triagem in vitro foram capazes de produzir mais de um fator de promoção do crescimento vegetal foram identificadas pela amplificação parcial do gene 16S rRNA. As actinobactérias foram cultivadas em caldo ISP-2 por 48 horas, em shaker a 30ºC e agitação de 130 rpm. A extração de DNA foi realizada empregando álcool-isoamilico e clorofórmio, conforme metodologia descrita por Van Soolingen et al (1994). A reação de PCR foi preparada para 50 µL, contendo: Tampão para Taq polimerase 1X, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP, 0.2 mM de cada primer, 2.5 U de Taq DNA polimerase e 1.0 µL de DNA molde (50 ng). Foram utilizados os oligonucleotideos iniciadores 27F (5’-AGAGTTTGATCLCTGGCTC AG-3’) e 1541R (5’- AAGGAGGTGATCCAGCC-3’) (Lane, 1991). A amplificação do material genético ocorreu em termociclador, seguindo as condições: desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos; seguidos de 30 de ciclos de desnaturação a 95 ºC por 1 minuto, anelamento a 55 ºC por 1 minuto, extensão a 72 ºC por dois minutos. A extensão final foi realizada a 72 ºC por 10 minutos. Os amplicons gerados foram avaliados quanto a sua integridade em gel de agarose a 1,2% e purificados com isopropanol e etanol (Sambrook and Russell, 2001). O sequenciamento foi conduzido na plataforma ABI 3130xl (Applied Biosystems), utilizando os oligonucleotídeos iniciadores: 27F, 530F (5’– GTGCCAGCMGCCGCGG –3’), 519R (5’–GWATTACCGCGGCKGCTG –3’), 907R (5’–

157 158

CCGTCAATTCMTTTRAGTTT–3’), 926F (5’-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3’) e 1541R (Lane, 1991). As sequências obtidas foram checadas quanto a sua qualidade e unidas no software CodonCode Aligner ® versão 6.0.2. A identificação das sequências se deu por comparação com as sequências disponíveis no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) através do algoritmo BLASTn (Altschul et al., 1990). Após identificadas, as sequências foram depositadas no banco de dados de 16S rRNA do NCBI sob os números de acesso: MG388303, MG494375, MG494376, MG388199, MG388202, MG494383, MG388200, MG388201, MG494377. Para fins de filogenia, as sequências foram alinhadas com a ferramenta ClustalW (Higgins et al., 1994) no software MEGA 7.0.212 (Kumar et al., 2016) e os dendogramas construídos utilizando o método de Neighbor-Joining (Saitou and Nei, 1987) de acordo com o modelo de Jukes-Cantor (Jukes and Cantor, 1969) com 1000 réplicas de bootstrap.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram isoladas 21 actinobactérias a partir da rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico, sendo 58% oriundas da variedade CTC4 e 42% da variedade IAC1099. A produção de pelo menos um dos fatores de promoção do crescimento vegetal triados in vitro foi observada em 57% dos isolados (Tabela 1 e 2). A ocorrência de actinobactérias na rizosfera é bastante comum, sendo constantemente associados a capacidade de promover o crescimento vegetal, seja por aumentar a disponibilidade dos nutrientes ou por atuarem no biocontrole (Sinma et al., 2015; Trujillo et al., 2015). A literatura é divergente quanto ao número de actinobactérias cultiváveis recuperados de sistemas orgânicos. Estudo conduzido por Wang et al (2017) observou que a quantidade de Phospholipid-derived fatty acids (PLFA) oriundos de actinobactérias foram superiores em sistemas com maior aporte de matéria orgânica. Já Velmourougane (2016) não observou diferenças entre o número de actinobactérias cultiváveis entre os sistemas orgânico e convencional. A produção de AIA pelos actinobactérias variaram de 2.52 a 35.99 µg mL-1 em 7 dias, 3.13 a 50.45 µg mL-1 em 14 dias e 5.33 a 60.28 µg mL-1 em 21 dias (Tabela 1). As maiores produções de AIA por actinobactérias foram observadas aos 21 dias, pelos isolados ABC92 e ABC32. Para os isolados ABC21, ABC33 e ANC48 a produção de AIA só pôde ser detectada aos

158 159

14 dias, enquanto a produção do isolado ANU34 foi detectada aos 21 dias, indicando uma produção tardia do hormônio. Os resultados obtidos nesse estudo foram similares aos encontrados por Anwar et al (2016), quando comparados sob a ótica das mesmas concentrações de L- triptofano e do mesmo tempo de incubação. Em geral, a produção de AIA por actinobactérias é moderada quando comparada a outros filos bacterianos associados aos vegetais (Narayana et al., 2009; Nimnoi et al., 2010). Contudo, a liberação constante de AIA, mesmo em pequenas concentrações no solo, é responsável pelo crescimento lateral e desenvolvimento das raízes adventícias. Além do papel no crescimento tecidual vegetal, o AIA liberado pode agir como sinalizador para produção de metabólitos secundários e esporulação de actinobactérias (Matsukawa et al., 2007; Glick, 2012; Duca et al., 2014). A solubilização de fosfato foi avaliada em dois períodos, variando entre 1.23 a 6.39 µg mL-1 em 7 dias e 2.04 a 8.93 µg mL-1 em 14 dias (Tabela 1). Os melhores resultados foram dos isolados ANC48 e ANU34. Ressalta-se que os melhores solubilizadores de fosfato não foram os melhores produtores de AIA. Jog et al (2014), também encontraram actinobactérias rizosfericas capazes de solubilizar fosfato e concomitantemente produzir AIA. Esses autores reforçam a ideia de bactérias que participam da ciclagem dos nutrientes sejam interessantes durante a escolha de um candidato a inoculante.

Tabela 1. Valores da produção in vitro de fatores de promoção do crescimento vegetal diretos por actinobactérias isoladas de cana-de-açúcar sob manejo orgânico1.

159 160

Isolado² AIA (µg.mL-1) Solubilização de fosfato Crescimento em (µg.mL-1) meio livre de 7 dias 14 dias 21 dias 7 dias 14 dias nitrogênio³ ABC21* - 3.94c 13.73c 2.40b 3.58b B ABC31* 2.52b 27.20b 29.00b 1.60b 3.08b B ABC32* 25.95a 50.45a 55.36a 1.92b 2.33c B ABC33* - 3.13c 5.51d 1.23b 2.04c B ABC92* 35.99a 42.43a 60.28a 5.20a 3.97b B ABU33# 6.35b 23.21b 32.24b - - B ANC21* ------ANC48* - 4.64c 32.18b 5.12a 8.93a N/B ANU48# ------ANU34# - - 5.33d 6.39a 8.92a N ANU49# 3.12b 3.80c 17.95c 1.55b 3.90b N ANU50# ------

Mesmo que a solubilização de fosfato seja influenciada pelos exsudatos produzidos pelo vegetal (Glick, 1995), no presente estudo, não foram encontradas diferenças estatísticas entre a solubilização de fosfato de isolados de diferentes variedades (Tabela 1). Os achados sobre a quantidade de fosfato solubilizado por actinobactérias na literatura são bastante variáveis (Hamdali et al., 2012; Jog et al., 2014; Sinma et al., 2015; Kruasuwan and Thamchaipenet, 2016). Essas diferenças relacionam-se com o tipo de técnica empregada, a fonte de fósforo empregada ou as unidades nas quais são expressas a solubilização de fosfato (Salcedo et al., 2014). Dessa forma, alguns valores obtidos in vitro neste e em outros estudos podem estar subestimados. O fósforo é um elemento essencial para o crescimento vegetal e é rapidamente convertido em formas insolúveis no solo. As bactérias solubilizadoras de fosfato são aquelas capazes reagir com os ligantes do fosfato tais como o alumínio, o ferro, o cálcio e o magnésio, liberando o fosfato para a utilização pelo vegetal (Chung et al., 2005; Shen et al., 2011; Gupta et al., 2012). Dentre os diversos mecanismos responsáveis pela solubilização de fosfato em bactérias, o mais comum entre as actinobactérias é a produção de ácidos orgânicos tais como piruvato, succinato, malato, lactato, α-cetoglutarato e oxalato (Surapat et al., 2012; Jog et al., 2016). A habilidade de crescimento em meios livres de nitrogênio foi observada em 29% dos isolados e em sua maioria, os isolados cresceram em meio Burk (Tabela 1). Os meios NFb e meio

160 161

de Burk não foram desenvolvidos para o isolamento de actinobactérias (Dobereiner et al., 1976; Park et al., 2005), entretanto, demonstraram ser meios que podem ser utilizados na triagem do potencial diazotrófico de bactérias desse filo. Nesse sentido, os meios semi-sólidos favorecem a triagem de micro-organismos diazotróficos, uma vez que a fixação de nitrogênio da maioria dos organismos requer baixas concentrações de oxigênio molecular (Mirza and Rodrigues, 2012). O nitrogênio é um dos elementos mais importante na formação de macromoléculas biológicas. Por isso, sua falta é limitante para os mais diversos cultivos, sobretudo nos cultivos orgânicos onde o uso de compostos nitrogenados sintéticos não é recomendado (Wongphatcharachai et al., 2015). Nesse sentido é fundamental a prospecção dos micro- organismos fixadores de nitrogênio. Os organismos fixadores de nitrogênio, também chamados de diazotróficos, são capazes de converter o gás nitrogênio em amônia que é absorvida pelos vegetais (Jin et al., 2014; Souza et al., 2015). Dentre os actinobactérias o gênero Frankia é bastante conhecido por suas habilidades em fixar nitrogênio, tanto em vida livre quanto em simbiose (Sellstedt et al., 2013). Além do gênero Frankia, diversos outros gêneros de actinobactérias já tiveram seu crescimento relatado em meios livres de nitrogênio, tais como: Mycobacterium (Zakhia et al., 2006), Micromonospora (Valdes et al, 2005), Agromyces (Zakhia et al., 2006) e Streptomyces (Pankratove and Dedysh, 2009). O uso de meios semi-sólidos livres de nitrogênio é a base para o isolamento de bactérias diazotróficas, entretanto, é necessário confirmar e quantificar a quantidade de nitrogênio fixada. As técnicas de redução de acetileno, incorporação de N15 e amplificação do gene nifH têm sido utilizadas para confirmar e quantificar a fixação de nitrogênio (Gtari et al., 2012; Baldani et al., 2014). Quanto ao gênero Streptomyces, somente um relato recente de Dahal et al (2017) confirmaram a capacidade do gênero em fixar nitrogênio através da amplificação dos genes nifH e incorporação do N15. Embora os actinobactérias sejam produtores de AIA, solubilizem fosfato e fixem nitrogênio, a literatura os descreve principalmente como produtores de compostos bioativos, tais como antimicrobianos e enzimas (Wan et al., 2008; Li et al., 2012). Em relação aos mecanismos indiretos de promoção vegetal, nenhum dos isolados foi capaz de produzir HCN e quitinase (Tabela 2). A produção de amônia foi detectada em 24% dos isolados (Tabela 2). Damle and Kulkarni (2014) ao isolarem e triarem a capacidade de actinobactérias oriundas da planta medicinal Withania somnifera, encontraram diversas cepas de Streptomyces capazes de produzir

161 162

NH3. A amônia teria dois papéis na promoção do crescimento vegetal, um deles se refere a capacidade de auxiliar no aumento da biomassa vegetal (Marques et al., 2010) e também atuaria na defesa contra patógenos oportunistas (Babalola, 2010). A produção de celulases foi observada em 57% das actinobactérias avaliadas. O IE observado variou de 1.24 a 3.71, sendo o maior índice obtido pelo isolado ABC32 (Tabela 2). Vale ressaltar que das características avaliadas nesse estudo, essa foi a que apresentou o maior número de isolados produtores. A produção de enzimas hidrolíticas por actinobactérias é bastante comum, sendo o gênero Streptomyces o mais comumente relatado (Jog et al., 2012; Mohanta, 2014; Sreevidya et al., 2016). A produção dessas enzimas estaria ligada primariamente ao papel das actinobactérias como decompositores. Essas enzimas participam também na proteção contra patógenos, visto que auxiliam no processo de quebra da parede celular de patógenos fúngicos e bacterianos, cuja composição inclui compostos como quitina, glucana e celulose (Jog et al., 2016; Sathya et al., 2017). A capacidade de inibir o crescimento do fungo patógeno F. moniliforme foi observado em 24% dos isolados. Os isolados ABC31, ANC48 e ANU49 foram capazes de inibir completamente o crescimento do fungo, enquanto os isolados ABU33 e ANU34 inibiram somente a formação do micélio aéreo (Tabela 2). Kruasuwan and Tamchaipenet (2016), ao estudar bactérias isoladas de raízes de cana-de-açúcar também encontraram actinobactérias capazes de inibir o crescimento do patógeno F. moniliforme. Os resultados do presente estudo são bastante promissores, haja vista que no cultivo orgânico não é permitido o uso de antifúngicos sintéticos, sendo a aplicação desses micro-organismos uma possível forma de controle biológico.

Tabela 2. Valores da produção in vitro de fatores de promoção do crescimento vegetal indiretos por actinobactérias isoladas de cana-de-açúcar sob manejo orgânico1.

162 163

4 Isolado² HCN NH3 Quitinase³ Celulase³ Antagonismo

ABC21* - - - 1.33c - ABC31* - - - 2.36b 5a ABC32* - - - 3.71a - ABC33* - + - 1.58c - ABC92* - + - 2.79b - ABU33# - - - 1.24c ami ANC21* - - - 1.38c - ANC48* - + - 2.66b 4a ANU48# - - - 2.84b - ANU34# - + - 2.02b ami ANU49# - + - 2.43b 4a ANU50# - - - 2.00b -

1.Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. 2. (*) actinobactérias isoladas da variedade CTC4; (#) actinobactérias isoldas da variedade IAC 911099. 3. Os valores expressos correspondem ao índice enzimático que é obtido dividindo-se o tamanho do halo. pelo da colônia. A marcação (-) indica crescimento bacteriano sem a formação de halo. 4. Os valores apresentados correspondem a distância entre a colônia fúngica e bacteriana. A marcação (-) indica que a bactéria não foi antagônica ao fungo. Ami =aerial mycelium inhibition.

O gênero Streptomyces têm sido o mais descrito na produção de metabólitos antifúngicos contra diversas cepas patogênicas de Fusarium sp., sendo reportado em: banana (Getha et al., 2005), pepino (Wang et al., 2016) e em plantas ornamentais (Lecomte et al., 2016). O provável mecanismo de ação desse gênero frente ao fungo patógeno está relacionado à produção de metabólitos extracelulares que causam tumidez e distorção das hifas, levando a lise dessas estruturas. Além disso, esses metabólitos promovem a inibição da germinação de esporos (Getha and Vikineswary, 2002). Os isolados que foram capazes de produzir in vitro mais de um fator de promoção do crescimento vegetal foram identificados pelo sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. Todas as actinobactérias foram identificadas como pertencentes ao gênero Streptomyces (Tabela 3). As relações filogenéticas dos isolados demonstraram que todos pertencem ao gênero Streptomyces, entretanto, representam espécies distintas (Figura 1), conforme os diferentes morfotipos encontrados durante o isolamento. Foi possível identificar o isolado ABC21 em nível de espécie, sendo esse pertencente a espécie Streptomyces griseoplanus com 99% de similaridade (Tabela 3). A identificação é reforçada pela afiliação filogenética do isolado, sustentado por um valor de 96 de bootstrap (Figura 1).

163 164

Tabela 3. Identificação de actinobactérias isoladas de rizosfera de cana-de-açúcar sob regime orgânico.

Identificação Identificação Similaridade Número de acesso da Número de do isolado espécie mais próxima depósito¹ Streptomyces ABC21 99% KT820005.1

griseoplanus MG388303

ABC31 Streptomyces sp. 98% NR_043346.1 MG494375

ABC32 Streptomyces sp. 92% KX010107.1 MG494376 ABC33 Streptomyces sp. 99% DQ663186.1 MG388199 ABC92 Streptomyces sp. 99% KJ995861.1 MG388202

ABU33 Streptomyces sp. 99% AB448717.1 MG494383 ANC48 Streptomyces sp. 98% AB695175.1 MG388200 ANU34 Streptomyces sp. 98% HQ876061.1 MG388201 ANU49 Streptomyces sp. 98% KX618421.1 MG494377 1. Número de depósito no banco de dados de 16S do NCBI

O filo Actinobacteria tem sido descrito como um dos mais frequentes associado aos solos cultivados com cana-de-açúcar (Durrer et al., 2016) e a sua rizosfera (Pisa et al., 2011). O gênero Streptomyces é o mais numeroso e estudado dentro do filo Actinobacteria e têm sido empregado em diversos estudos de potencial no crescimento vegetal (Franco-Correa et al., 2010; Gopalakrishnan et al., 2014; Gopalakrishnan et al., 2015).

Figura 1. Arvore filogenetica baseada nas sequências 16 rRNA de actinobactérias oriundas da rizosfera de cana-de-açúcar sob manejo orgânico. Empregou-se o metodo de Neighbor-Joining com 1000 replicas. A barrra indica 0.01 substituições por posição de nucleotídeos. Somente valores de bootstrap acima de 50% são mostrados.

164 165

Os nove isolados identificados nesse estudo, apresentam não só potencial como agentes de biocontrole, mas também são interessantes do ponto de vista de liberação de nutrientes para o vegetal, haja vista que em sua maioria são capazes de crescer em meios livres de nitrogênio, solubilizam fosfato e produzem AIA. Embora a dinâmica entre os micro-organismos e os vegetais em sistemas orgânicos seja pouco esclarecida, estudos de prospecção como o apresentado, são extremamente necessários considerando que um dos pilares desse sistema de produção é a utilização otimizada dos recursos naturais. Estudos futuros de aplicação desses organismos em casa de vegetação e em campo são imprescindíveis para verificar

165 166

quantitativamente a melhora na produção vegetal. Ademais, sugere-se que para sistemas orgânicos micro-organismos do gênero Streptomyces sp. sejam empregados em associação com outros gêneros de promoção do crescimento vegetal.

AGRADECIMENTOS A Jalles Machado e a Goiasa-Goiatuba Álcool Ltda por permitirem e auxiliarem a coleta de solo rizosférico. Ao Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) por ceder a cepa de Fusarium utilizada no estudo. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo fornecimento de bolsa de estudos ao primeiro autor. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais (CIAMB) pelo auxílio financeiro.

REFERÊNCIAS Adamovic, D., I. Djalovic, and Mrkovacki, N. 2015. Microbial abundance in rhizosphere of medicinal and aromatic plant species in conventional and organic growing systems. Ratarstvo I Povrtarstvo. 52(1): 1–6. Ahemad, M., and Kibret, M. 2014. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: Current perspective. J. King Saud Univ., Sci. – Science. 26(1): 1–20. Alekhya, G., and Gopalakrishnan, S. 2016. Plant growth-promotion by Streptomyces spp. in sorghum (Sorghum bicolor L.). Afr. J. Biotechnol.15(33): 1781–1788. Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and Lipman, D. J. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol.. 215(3): 403-410. Anwar, S., B. Ali and Sajid, I. 2016. Screening of rhizospheric actinomycetes for various in-vitro and in-vivo plant growth promoting (PGP) traits and for agroactive compounds. Front. Microbiol., 7(8): 1–11. Araújo, A. S. F., V. B. Santos and Monteiro, R. T. R. 2008. Responses of soil microbial biomass and activity for practices of organic and conventional farming systems in Piauí state, Brazil. Eur. J. Soil Biol. 44(2): 225–230. Babalola, O. O., 2010. Beneficial bacteria of agricultural importance. Biotechnol. Lett. 32(11): 1559–1570. Baldani, J. I., V. M. Reis, S. S. Videira, L. H. Boddey and Baldani, V. L. D. 2014. The art of isolating nitrogen-fixing bacteria from non-leguminous plants using N-free semi-solid media: a practical guide for microbiologists. Plant soil. 384(2): 413-431. Barka, E. A., P. Vatsa, L. Sanchez, N. Gaveau-Vaillant, C. Jacquard, H. P. Klenk, Y. Ouhdouch and Van Wezel, G. P. 2016. Taxonomy, Physiology, and Natural Products of Actinobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80(1): 1–43. Beneduzi, A., F. Moreira, P. B. Costa, L. K. Vargas, B. B. Lisboa, R. Favreto and Passaglia, L. M. P. 2013. Diversity and plant growth promoting evaluation abilities of bacteria isolated from sugarcane cultivated in the South of Brazil. Appl Soil Ecol. 63, 94–104. Bhattacharyya, P. N., and Jha, D. K. 2012. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Emergence in agriculture. World J. Microbiol. Biotechnol. 28(4): 1327-1350.

166 167

Brzezinska, M. S., U. Jankiewicz and Walczak, M. 2013. Bio- degradation of chitinous substances and chitinase production by the soil actinomycete Streptomyces rimosus. Int Biodeter Biodegr. 84, 104–110. Bui, H., 2014. Isolation of cellulolytic bacteria, including actinomycetes, from coffee exocarps in coffee producing areas in Vietnam. Int. J. Recycl. Org. Waste Agric. 48, 1–8 Cappuccino, J. G. and Sherman, N. 1996. Microbiology: A Laboratory Manual. 6. ed. The Benjamin/ Cummings Publishing Company, New York. Pp. 208. Cattelan, A. J., 1999. Métodos quantitativos para determinação de características bioquímicas e fisiológicas associadas com bactérias promotoras de crescimento vegetal. Embrapa Soja, Londrina. Pp. 1-36. Chung, H., M. Park, M. Madhaiyan, S. Seshadri, J. Song, H. Cho and Sa T. 2005. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of Korea. Soil Biol. Biochem. 37, 1970–1974. Condron, L. M., K. C. Cameron, H. J. Di, T. J. Clough, E. A. Forbes, R. G. McLaren and Silva R. G. 2000. A comparison of soil and environmental quality under organic and conventional farming systems in New Zealand. N. Z. J. Agric. Res. 43(4): 443–466. Damle, N. R. K. S., 2014. In vitro screening of rhizomicroflora from the rhizosphere of Withania Somnifera for multiple plant growth promoting. Avishkar – Solapur University Research Journal. 3, 52–60. Dahal, B., G. NandaKafle, L. Perkins and Brözel V. S. 2017. Diversity of free-Living nitrogen fixing Streptomyces in soils of the badlands of South Dakota. Microbiol. Res. 195, 31- 39. Das, B. B., and Dkhar, M. S. 2010. Rhizosphere microflora of soybean as affected by organic amendments in Meghalaya. NeBio. 1, 1–7. Dey, R., K. K. Pal., D. M. Bhatt and Chauhan S. M. 2004. Growth promotion and yield enhancement of peanut (Arachis hypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria. Microbiol. Res.159, 371–94 Dobereiner, J.; I. E. Marriel and Nery, M. 1976. Ecological distribution of Spirillum lipoferum Beijerinck. Can. J. Microbiol. 22(10): 1464-1473. Duarte, F. C., M. G. Cardoso, W. D. Santiago, A. M. R. Machado and Nelson D. L. 2017. Brazilian organic sugarcane spirits: Physicochemical and chromatographic profile. Rev. Cienc. Agron. 48(2): 288–295. Duca D., J. Lorv, C. L. Patten, D. Rose and Glick B. R. 2014. Indole-3-acetic acid in plant-microbe interactions. Antonie Van Leeuwenhoek. 136, 85–125 Durrer, A., T. Gumiere, R. G. Taketani, D. P. Costa, M. C. Pereira e Silva and Andreote F. D. 2016. The drivers underlying biogeographical patterns of bacterial communities in soils under sugarcane cultivation. Appl Soil Ecol. 110, 12–20. El-Sayed, W. S., A. Akhkha, M. Y. El-Naggar and Elbadry M. 2014. In vitro antagonistic activity, plant growth promoting traits and phylogenetic affiliation of rhizobacteria associated with wild plants grown in arid soil. Front. Microbiol. 5, 1-11. Francis, I., M. Holsters and Vereecke, D. 2010. The Gram-positive side of plant-microbe interactions. Appl. Microbiol. 12(1): 1–12. Franco-Correa, M., A. Quintana, C. Duque, C. Suarez, M. X. Rodríguez and Barea J. M. 2010. Evaluation of actinomycete strains for key traits related with plant growth-promotion and mycorrhiza helping activities. Appl Soil Ecol. 45, 209–217. Ferreira, D. F., 2011. Sisvar: a computer statistical analysis system. Cienc. Agrotecnol. 35(6): 1039-1042.

167 168

Garbeva, P., J. A. Van Veen and Van Elsas, J. D. 2004. Microbial diversity in soil: Selection of Microbial Populations by Plant and Soil Type and Implications for Disease Suppressiveness. Annu. Rev. Phytopathol. 42(1): 243–270. Getha, K., and Vikineswary, S. 2002. Antagonistic effects of Streptomyces violaceusniger strain G10 on Fusarium oxysporum f.sp. cubense race 4: Indirect evidence for the role of antibiosis in the antagonistic process. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28(6): 303–310. Getha, K., S. Vikineswary, W. H. Wong, T. Seki, A. Ward and Goodfellow M. 2005. Evaluation of Streptomyces sp. strain g10 for suppression of Fusarium wilt and rhizosphere colonization in pot-grown banana plantlets. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 32(1): 24–32. Glick, B. R., 1995. The enhancement of plant-growth by free-living bacteria. Can. J. Microbiol. 41, 109–117. Glick, B. R., D. M. Penrose and Li, J. 1998. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth-promoting bacteria. J. Theor. Biol. 190, 63–68. Glick, B. R., 2012. Plant growth-promoting bacteria: mechanisms and applications. Scientifica. 2012, 1–15. Gordon, S. A. and Weber, R.P. 1951. Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant Physiol. 26, 192-195. Goudjal, Y., O. Toumatia, N. Sabaou, M. Barakate, F. Mathieu and Zitouni A. 2013. Endophytic actinomycetes from spontaneous plants of Algerian Sahara: Indole-3-acetic acid production and tomato plants growth promoting activity. World J. Microbiol. Biotechnol. 29(10): 1821–1829. Gopalakrishnan, S., S. Vadlamudi, P. Bandikinda, A. Sathya, R. Vijayabharathi, O. Rupela, H. Kudapa, K. Katta and Varshney R. K. 2014. Evaluation of Streptomyces strains isolated from herbal vermicompost for their plant growth-promotion traits in rice. Microbiol Res. 169, 40–48. Gopalakrishnan S., V. Srinivas, G. Alekhya, B. Prakash, H. Kudapa, A. Rathore and Varshney R. K. 2015. The extent of grain yield and plant growth enhancement by plant growth- promoting broad-spectrum Streptomyces sp. in chickpea. Springerplus 4, 31. Gtari, M., F. Ghodhbane-Gtari, I. Nouioui, N. Beauchemin and Tisa L. S. 2012. Phylogenetic perspectives of nitrogen-fixing actinobacteria. Arch. Microbiol. 194(1): 3-11. Gupta, M., S. Kiran, A. Gulati, B. Singh and Tewari R. 2012. Isolation and identification of phosphate solubilizing bacteria able to enhance the growth and aloin-A biosynthesis of Aloe barbadensis Miller. Microbiol. Res. 167, 358– 363. Hamdali, H., M. Hafidi, M. J. Virolle and Ouhdouch Y. 2008. Rock phosphate- solubilizing Actinomycetes: Screening for plant growth-promoting activities. World J. Microbiol. Biotechnol. 24(11): 2565–2575. Hamdali, H., K. Moursalou, G. Tchangbedji, Y. Ouhdouch and Hafidi M. 2012. Isolation and characterization of rock phosphate solubilizing actinobacteria from a Togolese phosphate mine. Afr. J. Biotechnol. 11, 312–320. Higgins, D., J. Thompson, T. Gibson, J. D. Thompson, D. G. Higgins and Gibson T. J. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix, choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673– 4680. Inui-Kishi, R. N., L. T. Kishi, S. C. Picchi, J. C. Barbosa, M. T. O. Lemos, J. Marcondes and Lemos E. G. M. 2012. Phosphorus solubilizing and iaa production activities in plant growth promoting rhizobacteria from brazilian soils under sugarcane cultivation. ARPN J. Eng. Appl. Sci. 7(11): 1446–1454.

168 169

Järvan, M., and Edesi, L. 2015. Nitrogen cycle bacteria in soils of organically and conventionally managed crop rotations. Zemdirbyste-Agriculture. 102(1): 15–22. Jin, H., X. Y. Yang, Z. Q. Yan, Q. Liu, X. Z. Li, J. X. Chen and Qin B. 2014. Characterization of rhizosphere and endophytic bacterial communities from leaves, stems and roots of medicinal Stellera chamaejasme L. Syst. Appl. Microbiol. 37(5): 376–385. Jog, R., G. Nareshkumar and Rajkumar, S. 2012. Plant growth promoting potential and soil enzyme production of the most abundant Streptomyces spp. from wheat rhizosphere. J. Appl. Microbiol. 113(5): 1154–1164. Jog, R., M. Pandya, G. Nareshkumar and Rajkumar S. 2014. Mechanism of phosphate solubilization and antifungal activity of Streptomyces spp. isolated from wheat roots and rhizosphere and their application in improving plant growth. Microbiol. 160(2014): 778–788. Jog, R.; G. Nareshkumarand Rajkumar, S. 2016. Enhancing soil health and plant growth promotion by actinomycetes. In: Subramaniam, G., S. Arumugam and Rajendran, V., Plant Growth Promoting Actinobacteria. Springer Singapore, pp. 33-45. Jukes, T. H., and Cantor, C. R. 1969. Evolution of protein molecules. In: Munro, H. N. Mammalian Protein Metabolism. Academic Press, New York. Pp. 21-132. Kasana, R. C., R. Salwan, H. Dhar, S. Dutt, and Gulati A. 2008. A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine. Curr. Microbiol. 57(5): 503-507. Khalid, A., M. Arshad and Zahir, Z. A. 2004. Screening plant growth-promoting rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. J. Appl. Microbiol. 96(3): 473–480. Kim, T. U., S. Cho, J. H. Han, Y. M. Shin, H. B. Lee and Kim S. B. 2012. Diversity and physiological properties of root endophytic actinobacteria in native herbaceous plants of Korea. J. Microbiol. 50(1): 50–57. Kruasuwan, W., and Thamchaipenet, A. 2016. Diversity of Culturable Plant Growth- Promoting Bacterial Endophytes Associated with Sugarcane Roots and Their Effect of Growth by Co-Inoculation of Diazotrophs and Actinomycetes. J. Plant Growth Regul. 35(4): 1–14. Kumar, S., G. Stecher and Tamura, K. 2016. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 33(7): 1870-1874. Lane, D. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt, E. and Goodfellow, M. (eds) Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. John Wiley & Sons, Chichester. Pp. 115–147. Lecomte, C., C. Alabouvette, V. Edel-Hermann, F. Robert and Steinberg C. 2016. Biological control of ornamental plant diseases caused by Fusarium oxysporum: A review. Biol. Control.101, 17-30. Li, Q., P. Ning, L. Zheng, J. Huang, G. Li and Hsiang T. 2012. Effects of volatile substances of Streptomyces globisporus JK-1 on control of Botrytis cinerea on tomato fruit. Biol Control. 61, 113–120. Lori, M., S. Symnaczik, P. Mäder, G. De Deyn and Gattinger A. 2017. Organic farming enhances soil microbial abundance and activity-A meta-analysis and meta-Regression. PLoS ONE. 12(7): 1-25. Marques, A. P. G. C., C. Pires, H. Moreira, A. O. S. S. Rangel and Castro P. M. L. 2010. Assessment of the plant growth promotion abilities of six bacterial isolates using Zea mays as indicator plant. Soil Biol. Biochem. 42(8): 1229–1235.

169 170

Martínez-Viveros, O., M. Jorquera, D. Crowley, G. Gajardo and Mora M. 2010. Mechanisms and Practical Considerations Involved in Plant Growth Promotion by Rhizobacteria. J. Soil Sci. Plant Nutr. 10(3): 293–319. Matsukawa, E., Y. Nakagawa, Y. Iimura and Hayakawa M. 2007. Stimulatory effect of indole-3-acetic acid on aerial mycelium formation and antibiotic production in Streptomyces spp. Actinomycetologica. 21, 32–39. Mirza, B. S., and Rodrigues, J. L. M. 2012. Development of a direct isolation procedure for free-living diazotrophs under controlled hypoxic conditions. Appl. Environ. Microbiol. 78(16): 5542–5549. Mohanta, Y. K., 2014. Isolation of Cellulose-Degrading Actinomycetes and Evaluation of their Cellulolytic Potential. Bioengineering and Bioscience, 2(1), 1–5. Narayana, K.J., P. Peddikotla, S. J. K. Palakodety, V. Yenamandra and Muvva V. 2009 Indole-3-acetic acid production by Streptomyces albidoflavus. J. Biol. Res. 11, 49–55 Nautiyal, C.S. 1999. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEMS Microbiol. Lett. 170, 265–270. Nimnoi, P., N. Pongslip and Lumyong, S. 2010. Endophytic actinomycetes isolated from Aquilaria crassna Pierre ex Lec and screening of plant growth-promoter production. World J. Microbiol. Biotechnol. 26, 193–203. Nosrati, R., P. Owlia, H. Saderi, I. Rasooli and Malboobi M. A. 2014. Phosphate solubilization characteristics of efficient nitrogen fixing soil Azotobacter strains. Iran J Microbiol. 6, 285-295. Pankratov, T.A., and Dedysh, S.N. 2009. Cellulolytic Streptomycetes from Sphagnum peat bogs and factors controlling their activity. Microbiology. 78, 227–233. Park, M., C. Kim, J. Yang, H. Lee, W. Shin, S. Kim, and Sa T. 2005. Isolation and characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops of Korea. Microbiol. Res. 160(2): 127–133. Pisa, G., G. S. Magnani, H. Weber, E. M. Souza, H. Faoro, R. A. Monteiro and Cruz L. M. 2011. Diversity of 16S rRNA genes from bacteria of sugarcane rhizosphere soil. Braz. J. Med. Biol. Res. 44(12): 1215–1221. Rahmann, G., M. R. Ardakani, P. Bàrberi, H. Boehm, S. Canali, M. Chander, E. Rembia and Zanoli R. 2016. Organic Agriculture 3.0 is innovation with research. Organic Agriculture. 7(3): 169-197. Rodrigues, A. A., M. V. Forzani, R. S. Soares, S. T. Sibov and Vieira, J. D. G. 2016. Isolation and selection of plant growth-promoting bacteria associated with sugarcane. Pesqui. Agropecu. Trop. 46(2): 149–158. Ryu, C.M., C. H. Hu, R. D. Locy and Kloepper J. W. 2005. Study of mechanisms for plant growth promotion elicited by rhizobacteria in Arabidopsis thaliana. Plant Soil. 268(1), 285–292. Salcedo, L. D. P., C. Prieto and Correa, M. F. 2014. Screening phosphate solubilizing actinobacteria isolated from the rhizosphere of wild plants from the Eastern Cordillera of the Colombian Andes. Afr. J. Microbiol. Res. 8(8), 734-742. Saitou, N., and Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406-425. Sambrook, J. R., and Russell, D. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Q. Rev. Biol. 76(3): 348-349.

170 171

Santos, I. B., D. R. M. Lima, J. G. Barbosa, J. T. C. Oliveira, F. J. Freire and Kuklinsky- Sobral J. 2012. Diazotrophic Bacteria Associated to Roots of Sugarcane: Inorganic Phosphate Solubilization and the Salinity Tolerance. Bioscience Journal. 28(1): 142–149. Sathya, A., R. Vijayabharathi and Gopalakrishnan, S. 2017. Plant growth-promoting actinobacteria: a new strategy for enhancing sustainable production and protection of grain legumes. 3 Biotech. 7(2): 1–10. Sellstedt, A., and Richau, K. H. 2013. Aspects of nitrogen-fixing actinobacteria, in particular free-living and symbiotic Frankia. FEMS Microbiol. Lett. 342(2): 179–186. Shen, J., L. Yuan, J. Zhang, H. Li, Z. Bai, X. Chen and Zhang F. 2011. Phosphorus Dynamics: From Soil to Plant. Plant Physiol. 156(3): 997–1005. Shirling, E. B., and Gottlieb, D. 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. Int J Syst Bacteriol. 16, 313-340. Silva, M. D. O., F. J. Freire, J. Kuklinsky-sobral, C. A. Oliveira, M. Betânia, S. Freire and De V. X. 2016. Bacteria associated with sugarcane in Northeastern Brazil. Afr. J. Microbiol. Res. 10(37): 1586–1594. Sinma, K., T. Nurak and Khucharoenphaisan, K. 2015. Potentiality of Endophytic Actinomycetes Isolated from Sugar Cane. KMITL Science and Technology Journal. 15(2): 88– 97. Sousa, C. D. S., A. C. F. Soares and Garrido, M. D. S. 2008. Characterization of Streptomycetes with potential to promote plant growth and biocontrol. Sci. Agric. 65, 50–55. Souza, R., A. Ambrosini and Passaglia, L. M. P. 2015. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genet. Mol. Biol. 38(4): 401–419. Sreevidya, M., S. Gopalakrishnan, H. Kudapa and Varshney R. K. 2016. Exploring plant growth-promotion actinomycetes from vermicompost and rhizosphere soil for yield enhancement in chickpea. Braz. J. Microbiol., 47(1): 390–392. Srividya, S., A. Thapa, D. V. Bhat, K. Golmei and Nilanjan D. 2012. Streptomyces sp. 9p as effective biocontrol against chili soilborne fungal phytopathogens. Eur. J. Exp. Biol. 2, 163– 173. Stamford, T. L., J. M. Araújo and Stamford N. P. 1998. Atividade enzimática de micro- organismos isolados de jacatupé (Pachyrhizus erosos L. Urban). Ciênc. Tecnol. Aliment. 18(4): 382-385. Surapat, W., C. Pukahuta, P. Rattanachaikunsopon, T. Aimi and Boonlue S. 2013. Characteristics of phosphate solubilization by phosphate-solubilizing bacteria isolated from agricultural chili soil and their efficiency on the growth of chili (Capsicum frutescens L. cv. Hua Rua). Chiang Mai J. Sci. 40(1): 11–25. Trujillo, M. E., R. Riesco, P. Benito and Carro L. 2015. Endophytic Actinobacteria and the Interaction of Micromonospora and Nitrogen Fixing Plants. Front Microbiol. 6, 1–15. Van Soolingen, D., P. E. De Haas, P. W. Hermans and Van Embden J. D. 1994. DNA Fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis. Methods Enzymol. 235, 196-205. Vejan, P., R. Abdullah, T. Khadiran, S. Ismail, and Nasrulhaq B. A. 2016. Role of plant growth promoting rhizobacteria in agricultural sustainability-a review. Molecules. 21(5): 573. Velmourougane, K., 2016. Impact of Organic and Conventional Systems of Coffee Farming on Soil Properties and Culturable Microbial Diversity. Scientifica, 2016, 1–9. Vessey, J. K., 2003. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil, 255, 571–586.

171 172

Viaene, T., S. Langendries, S. Beirinckx, M. Maes and Goormachtig S. 2016. Streptomyces as a plant’s best friend? FEMS Microbiol. Ecol. 92(8), 1–10. Valdes, M., N. O. Perez, P. E. Santos, J. Caballero-Mellado, J. J. Pena-Cabriales, P. Normand and Hirsch A. M. 2005. Non-Frankia actinomycetes isolated from surface-sterilized roots of Casuarina equisetifolia fix nitrogen. Appl. Environ. Microbiol. 71, 460–466. Walker, T. S., H. P. Bais, E. Grotewold, J. M. Vivanco, T. S. Walker, H. P. Bais and Vivanco J. M. 2003. Root Exudation and Rhizosphere Biology. Plant Physiol. 132(1): 44–51. Walpola, B. C., and Yoon, M. 2013. In vitro solubilization of inorganic phosphates by phosphate solubilizing microorganisms. Afr. J. Microbiol. Res. 7, 3534-3541. Wan, M., G. Li, J. Zhang, D. Jiang and Huang H. C. 2008. Effect of volatile substances of Streptomyces platensis F-1 on control of plant fungal diseases. Biol. Control. 46, 552–559. Wang, B., W. Liu, X. Liu, A. E. Franks, Y. Teng and Luo, Y. (2017). Comparative analysis of microbial communities during enrichment and isolation of DDT-degrading bacteria by culture-dependent and independent methods. Sci. Total Environ. 590–591, 297–303. Wang, S., Z. Li and Fan, G. 2012. Soil quality and microbes in organic and conventional farming systems. Afr. J. Microbiol. Res. 6(24): 5077–5085. Wang, S., Y. Liang, T. Shen, H. Yang and Shen B. 2016. Biological characteristics of Streptomyces albospinus CT205 and its biocontrol potential against cucumber Fusarium wilt. Biocontrol Science and Technology. 26(7): 951–963. Wellington, E. M. H., and Cross, T. 1983. Taxonomy of antibiotic producing Actinomycetes and new approaches to their selective isolation. Prog. Ind. Microbiol. 17, 7-36. Wongphatcharachai, M., C. Staley, P. Wang, K. M. Moncada, C. C. Sheaffer and Sadowsky M. J. 2015. Predominant populations of indigenous soybean-nodulating Bradyrhizobium japonicum strains obtained from organic farming systems in Minnesota. J. Appl. Microbiol. 118(5): 1152–1164. Xia, Y., S. DeBolt, J. Dreyer, D. Scott and Williams M. A. 2015. Characterization of culturable bacterial endophytes and their capacity to promote plant growth from plants grown using organic or conventional practices. Front. Plant Sci. 6, 1-10. Yandigeri, M. S., N. Malviya, M. K. Solanki, P. Shrivastava and Sivakumar G. 2015 Chitinolytic Streptomyces vinaceusdrappus S5MW2 isolated from Chilika lake, India enhances plant-growth and biocontrol efficacy through chitin supplementation against Rhizoctonia solani. World J. Microbiol. Biotechnol. 31(8): 1217–1225. Zakhia, F., H. Jeder, A. Willems, M. Gillis, B. Dreyfus and Lajudie P. 2006. Diverse bacteria associated with root nodules of spontaneous legumes in Tunisia and first report for nifH- like gene within the genera Microbacterium and Starkeya. Microb. Ecol. 51(3): 375–393.

172 173

APÊNDICE I: Isolation and selection of plant growth-promoting bacteria associated with sugarcane.

173 174

174

175

176

177

178

179

180

181

182

183

183 184

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

As hipoteses admitidas no inicio deste estudo se mostraram parcialmente verdadeiras. O manejo é uma das forças capazes de provocar mudanças efetivas na diversidade microbiana. Filos como Proteobacteria, Actinobacteria e Gemmatimonadetes foram mais abundantes no manejo orgânico, enquanto os filos Acidobacteria e o candidato a filo WPS-2 foram enriquecidos no manejo tradicional. Além disso, genes relacionados a fixação de nitrogênio foram mais abundantes no manejo orgânico. Entretanto, somente o manejo não é capaz de explicar todas as alterações encontradas neste estudo. O manejo, o genótipo vegetal, os fatores biogeográficos, as caracteristicas edáficas e as particularidades próprias de cada usina atuam em conjunto deteminando as características particulares de cada local. Vale ressaltar que isso reforça a informação encontrada durante o isolamento das cultivaveis, o isolamento de micro-organismos deve ser levar em conta a fertilização e a regionalização. Em termos de cultiváveis, foram encontrados 14 gêneros distintos. Dentre os quais se destacaram Burkholderia, Bacillus, Rhizobium e Streptomyces portadores de múltiplos fatores de promoção do crescimento vegetal. A maioria dos organismos encontrados neste estudo foi capaz de fixar nitrogênio, a característica mais almejada de uma RPCV associada ao cultivo orgânico. Além de apresentarem outras características desejáveis como a capacidade de produção de AIA, habilidade em solubilizar fosfato e atuarem como agentes de biocontrole. Ademais, esses micro- organismos poderiam ser incorporados em conjunto como inoculantes agricolas para sistemas orgânicos. Entretanto, são necessários testes em casa de vegetação e em campo para verificar a capacidade desses micro-organismos em colonizar a rizosfera e sobreviver à competição existente no solo.

184