Anxiété, Éthylisme, Motivation Et Performance Cognitive À La Suite D'une Réduction De La Sérotonine Cérébrale Chez L

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ANXIÉTÉ, ÉTHYLISME, MOTIVATION ET PERFORMANCE COGNITIVE À LA SUITE D’UNE RÉDUCTION DE LA SÉROTONINE CÉRÉBRALE CHEZ LES SOURIS MUTANTES TPH2

Thèse

Francis Lemay

Doctorat en psychologie – Recherche et intervention (Orientation clinique) Philosophiæ doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

Résumé

Les troubles affectifs tels que l’anxiété et la dépression majeure sont les troubles psychiatriques les plus diagnostiqués au monde. Parmi leurs causes potentielles figurent le stress chronique et des dysfonctions du système nerveux central, telles que des mutations génétiques. Une mutation de l’enzyme tryptophane hydroxylase 2, responsable de la première étape de la synthèse de la sérotonine cérébrale, a été associée chez l’humain à une forme sévère de dépression majeure à comorbidités multiples. La présente thèse propose d’étudier les effets comportementaux de cette mutation chez la souris. Dans un premier article, deux paradigmes expérimentaux servent à évaluer l’anxiété de souris mutantes (HO) et de souris contrôles (WT) et une tâche d’apprentissage spatial mesure la performance cognitive de ces souris. La réaction anxieuse et les performances cognitives des souris sont

également observées suite à un stress chronique récent de contention d’une durée de deux heures par jour, pendant quatre jours consécutifs. Le second article examine la motivation des souris HO à consommer du sucrose ou de la quinine, ainsi que leur préférence pour l’alcool et leur motivation à en consommer. Les expériences effectuées démontrent que les souris HO sont plus anxieuses et présentent des déficits de performance cognitive plus importants que les souris WT. Ces dernières réagissent au stress chronique par des comportements anxieux et des performances cognitives similaires à ceux des souris HO non stressées. Les souris HO ne sont pas affectées par le stress. La motivation appétitive

(sucrose) et aversive (quinine) des souris HO ne diffère pas de celle des souris WT et leur préférence pour l’alcool est la même. Cependant, lorsque la solution d’alcool est mélangée

à de la quinine, la rendant amère et aversive, les souris HO en consomment davantage que les souris WT, ce qui suggère une motivation accrue pour l’alcool. Ces résultats renforcent

iii l’idée qu’un lien entre l’anxiété et la consommation d’alcool serait modulé par la sérotonine et suggèrent que les déficits cognitifs consécutifs à une réduction de la sérotonine sont modulés en partie par l’anxiété résultante. Les implications de l’absence de réponse au stress des souris HO sont également discutées.

Summary

Affective disorders such as anxiety and major depression are the most frequently diagnosed psychiatric disorders in the world. Among their potential causes are chronic stress and central nervous system dysfunctions, such as genetic mutations. A mutation in the rate limiting enzyme of brain serotonin synthesis, tryptophan hydroxylase 2, was associated with a severe form of major depression with multiple comorbidities in humans. The present thesis proposes to study the behavioral effects of this mutation in mice. In a first article, the anxiety level of mutant mice (HO) was assessed using two experimental paradigms. Their cognitive performances were also observed using a spatial learning task. Then, the anxious reactions and cognitive performances of mice were assessed following a recent restraint chronic stress which lasted two hours per day for four straight days. In a second article, their motivation to drink sucrose or quinine, as well as their preference for alcohol and their motivation for drinking it in aversive conditions were assessed. The experiments demonstrate that HO mice were more anxious and presented deficits in cognitive performances when compared to mice not carrying the mutation (WT). WT mice reacted to chronic stress by showing anxious behaviors and cognitive performances similar to those of unstressed HO mice, whereas HO were not affected by stress. The motivation of HO mice did not differ from that of WT for sucrose and quinine, and their preference for alcohol was similar. However, when the alcohol solution was mixed with quinine, making it bitter and aversive, HO mice consumed more of it than WT, suggesting a higher level of motivation for alcohol. These results reinforce the notion that the link between anxiety and alcohol consumption is modulated by serotonin and suggest that cognitive deficits observed

v following serotonin reduction would be partly modulated by the resulting anxiety. The implications of HO mice’s absence of response to chronic stress are also discussed.

Table des matières

Résumé ...... iii Summary ...... v Table des matières ...... vii Index des figures ...... xi Index des tableaux ...... xiii Remerciements ...... xvii Avant-propos ...... xxi CHAPITRE 1 ...... 1 1.1 Objectifs de la thèse ...... 2 1.2 Anxiété ...... 2 1.2.1 Anxiété et dépression ...... 8 1.2.2 Anxiété et consommation d’alcool ...... 9 1.2.3 Anxiété et cognition ...... 11 1.2.4 Anxiété et neurotransmetteurs, cognition, consommation d’alcool ...... 15 1.3 Sérotonine ...... 16 1.3.1 Rôles possibles pour la sérotonine ...... 19 1.3.2 Théories du rôle de la sérotonine ...... 23 1.4 Tryptophane hydroxylase ...... 33 1.4.1 Tph2 chez l’humain ...... 37 1.4.2 Tph2 chez la souris ...... 40 1.5 Problématique et hypothèses ...... 59 CHAPITRE 2 ...... 63 2.1 Résumé ...... 64 2.2 Abstract ...... 65 2.3 Acknowledgements ...... 66 2.4 Introduction ...... 67 2.5 Materials and Methods ...... 70 2.5.1 Animals ...... 70 2.5.2 Chronic Stress Protocol ...... 71 2.5.3 Anxiety Tests ...... 71

vii

2.5.4 H-Maze Test ...... 72 2.5.5 Statistical analyses ...... 76 2.6 Results ...... 76 2.6.1 Light-dark Emergence Test...... 76 2.6.2 Elevated Plus Maze Test ...... 77 2.6.3. H-Maze Test ...... 78 2.7 Discussion ...... 80 2.7.1 Anxiety ...... 80 2.7.2 Cognitive performance ...... 83 2.7.3 Effects of anxiety on cognitive performance ...... 84 2.8 References ...... 87 2.9 Figures ...... 97 2.10 Figure captions ...... 106 CHAPITRE 3 ...... 107 3.1 Résumé ...... 108 3.2 Abstract ...... 109 3.3 Acknowledgements ...... 110 3.4 Introduction ...... 111 3.5 Materials and Methods ...... 114 3.5.1 Animals ...... 114 3.5.2 Sucrose preference and quinine aversion tests ...... 114 3.5.3 Test of sucrose preference with different concentrations...... 116 3.5.4 Alcohol preference tests ...... 116 3.6 Results ...... 119 3.6.1 Sucrose preference and quinine aversion tests ...... 119 3.6.2 Test of sucrose preference with different concentrations...... 119 3.6.3 Alcohol preference tasks...... 120 3.7 Discussion ...... 123 3.8 References ...... 126 3.9 Figures ...... 134 3.10 Figure captions ...... 140 CHAPITRE 4 ...... 141 4.1 Synthèse générale des résultats ...... 142 viii

4.2 Intégration des résultats ...... 148 4.3 Modèle animal et observations chez l’humain ...... 156 4.4 Recherches futures et implications cliniques ...... 160 4.5 Conclusion ...... 163 Références (introduction et conclusion) ...... 167

Index des figures

CHAPITRE 1

Figure 1.1 Résumé des causes, signes et conséquences de l’anxiété normale et pathologique...... 7

Figure 1.2 Chaîne biochimique de la synthèse et la dégradation de la 5-HT ...... 18

Figure 1.3 L’innervation sérotoninergique dans le cerveau humain ...... 19

Figure 1.4 Appareil d’émergence noirceur-lumière...... 43

Figure 1.5 Labyrinthe en croix surélevé...... 51

CHAPITRE 2

Figure 2.1 Rules to be learned on each phase of the H-Maze task...... 97

Figure 2.2 Results from the light-dark emergence test...... 98

Figure 2.3 Illustration of the Genotype X Stress interaction for time spent in the illuminated compartment on the light-dark emergence test ...... 99

Figure 2.4 Results from the elevated plus maze test...... 100

Figure 2.5 Illustration of the Genotype X Stress interaction for time spent in the open arms during the elevated plus maze test ...... 101

Figure 2.6 Numbers of mice per group having completed each phase of the H-Maze test...... 102

Figure 2.7 Response patterns on the H-Maze test for one representative mouse per group ...... 103

Figure 2.8 Perseveration errors in the H-Maze, across the three phases. Data are means ± S.E.M...... 104

Figure 2.9 Illustration of the Genotype X Stress interaction for perseveration errors in the H-Maze...... 105

CHAPITRE 3

Figure 3.1 Schema of the first four versions of the alcohol preference tests...... 134

Figure 3.2 Results from the Sucrose preference and quinine aversion tests (means ± S.E.M.) ...... 135

Figure 3.3 Preference ratios in the test of Sucrose preference with different concentrations (means ± S.E.M.)...... 136

Figure 3.4 Mice’s drinking preferences on the Basic alcohol preference test and the Post- withdrawal with quinine test (means ± S.E.M.)...... 137

Figure 3.5 Mice’s drinking preferences on the Alcohol-quinine test and the Alcohol- quinine and post-withdrawal test with only quinine (means ± S.E.M.) ...... 138

Figure 3.6 Mice’s drinking preferences on the Long-term alcohol-quinine test (means ± S.E.M.) ...... 139

xii

Index des tableaux

CHAPITRE 1

Tableau 1.1 Résumé des théories explicatives du rôle de 5-HT dans le comportement ...... 32

Tableau 1.2 Résumé des résultats chez les souris mutantes Tph2...... 57

xiii

À la mémoire de Nicolas Perreault. Pour avoir partagé avec moi toutes ces expériences, Pour m’avoir laissé tous ces souvenirs inoubliables, Et pour ces18 années d’une amitié si enrichissante : merci.

Remerciements

Je tiens à remercier chacun des membres de mon comité pour l’aide apportée tout au long du processus ayant mené à la rédaction de cette thèse. Tout d’abord, François Doré, mon directeur, qui m’a permis de profiter de sa grande expérience en recherche. Il a su me faire profiter de son sens de la planification quand je m’éparpillais de façon chaotique. Sa disponibilité et l’efficacité avec laquelle il arrive à fournir des corrections de textes sont parmi ses qualités indéniables en tant que directeur. Cependant, ses encouragements, son aptitude à me faire prendre de la distance avec mon projet et son sens de l’humour sont ce que j’ai le plus appréciés chez lui.

Martin Beaulieu est devenu mon co-directeur au printemps 2010. Je serai toujours reconnaissant envers lui pour m’avoir accueilli et intégré dans son laboratoire et pour m’avoir sorti du cul-de-sac administratif dans lequel je me trouvais à l’époque. Il est un chercheur passionné qui a su être un facteur de motivation constant tout au long de notre collaboration, en me présentant d’innombrables idées et suggestions pour des expériences.

J’ai énormément apprécié nos nombreuses discussions matinales sur la politique, la culture américaine et les chats.

Sonia Goulet a été d’une aide précieuse au fil des années : elle m’a fourni de nombreuses suggestions afin d’améliorer mon projet, tout en m’aidant à garder le cap et à demeurer un chercheur rigoureux. Je dois aussi la remercier pour les nombreuses opportunités d’emploi qu’elle m’a offertes et qui ont grandement contribué à bonifier mon expérience universitaire. Matthieu Guitton a été un membre clé de mon comité de thèse, ayant fréquemment souligné des éléments à modifier dans mon manuscrit et apporté des

xvii suggestions d’expériences. Son œil critique aiguisé, sa rigueur et sa passion pour la recherche ont été des atouts indéniables.

Merci à tous les étudiants qui sont passés dans le laboratoire de Martin Beaulieu à un moment ou à un autre de mon parcours (Karen, Véronique, Laure, Joëlle, Thomas,

Camille, Arash, Placido, Ghazal, Morgane, Alexandre, Adeline, Stella et Annie; j’espère n’oublier personne). Vous avez su m’offrir l’aide, la distraction et le divertissement dont j’avais besoin, aux moments où j’en avais besoin. Merci aussi à Claude Lamarre, Nathalie

Bouchard et Kathye Aubé. Vous avez été des personnes ressources incomparables.

Un merci très spécial à Olivier Potvin et Geneviève Thibaudeau pour avoir été des mentors patients et passionnés lorsque j’ai été initié aux neurosciences comportementales.

Sans votre influence, je n’aurais probablement pas poursuivi dans cette voie.

Je tiens également à souligner les contributions de Mélissa Dion, Catherine

Jourdain, Jean Levasseur-Moreau, Carolyne Jean et Mélodie-Ève Gauvin-Juteau, qui ont

été mes auxiliaires de recherche au fil des années. Merci, car sans vous, j’aurais difficilement pu maintenir un sain équilibre travail-famille-loisirs.

Je ne peux passer sous silence l’aide du Conseil de recherche en sciences et génie du

Canada, qui m’a soutenu financièrement avec des bourses tout au long de mes études doctorales. Merci à vous!

À l’extérieur de l’université, j’ai eu la chance de pouvoir compter sur un réseau social d’une qualité inégalée. Je tiens donc à remercier tous mes amis, les plus anciens comme les plus récents, ceux que je côtoie régulièrement comme ceux que j’ai perdus de vue. Vous avez été mon échappatoire, ma récompense et mon inspiration à me dépasser pendant ces quatre dernières années. Merci à toute ma famille et à ma belle-famille, mais surtout à mes parents, pour s’être intéressés à mon projet et pour m’avoir soutenu xviii

moralement. Vos mots d’encouragement ont toujours été appréciés et le sont encore aujourd’hui.

Enfin, je tiens à remercier tout particulièrement ma conjointe, qui a eu la lourde tâche d’endurer mes périodes d’angoisse, de déprime, de colère, d’impatience et de frustration depuis que nous nous fréquentons. Elle a également brillamment partagé avec moi plusieurs périodes d’enthousiasme, de succès et d’exaltation. Claudine a été une complice extraordinaire dans les meilleurs moments, un pilier sans égal dans les pires, mais surtout, une copine présente et tolérante, malgré tous mes travers. Pour toutes ces raisons et bien d’autres, je la considère comme la personne idéale pour être ma partenaire de vie.

xix

Avant-propos

Les expériences constituant le corps de cette thèse sont présentées sous la forme de deux articles dont je suis le premier auteur. Dans le cadre de leur préparation, j’ai élaboré la problématique et planifié les expériences, j’ai effectué celles-ci avec l’aide d’auxiliaires, puis j’ai fait les analyses statistiques, interprété les résultats et effectué la rédaction. Mon directeur et mon co-directeur sont mes co-auteurs dans les deux cas. Les articles sont en cours de correction et seront bientôt soumis à des périodiques scientifiques.

xxi

CHAPITRE 1

Introduction

1.1 Objectifs de la thèse Cette thèse propose d’étudier une mutation rare, associée à la dépression chez l’être humain et responsable d’une réduction importante de la production de sérotonine cérébrale.

Les objectifs sont d’établir le rôle de cette mutation dans l’anxiété, la cognition, la réponse au stress chronique, la consommation d’alcool et la motivation, en utilisant des souris portant une version similaire de la mutation. Le choix des thèmes abordés en lien avec la mutation est fait en fonction des données épidémiologiques démontrant le rôle majeur de l’anxiété, ainsi que de plusieurs des phénotypes comportementaux lui étant les plus couramment associés, dans les enjeux actuels de santé publique. Ce choix a également été fait en lien avec la littérature sur la mutation, qui laisse entrevoir, chez l’humain, des pistes prometteuses pour l’étude du thème de l’anxiété et de ses comorbidités fréquentes, considérant les données et les théories attribuant à la sérotonine un rôle dans ces comportements. L’anxiété pathologique est la catégorie de troubles mentaux avec le taux de prévalence le plus élevé au monde en ce moment, et est hautement comorbide avec les troubles de l’humeur, seconde catégorie la plus représentée dans la population

(Demyttenaere et al., 2004). Il est donc utile de se pencher sur les déterminants génétiques et environnementaux des comportements anxieux, ainsi que des phénotypes pathologiques associés tels que l’éthylisme, la réponse au stress et les déficits cognitifs.

1.2 Anxiété L’anxiété est un concept qui a été analysé de plusieurs points de vue dans les sciences de la santé et du comportement (Akiskal, 1998; Belzung & Griebel, 2001; Berg,

1952; Cattell, 1964; Cattell, Shrader, & Barton, 1974; Grossman, Labedzki, Butcher, &

Dellea, 1996; Segers & Mertens, 1977). Cattell et Scheier (1958) résument ainsi les

éléments principaux de plusieurs des définitions de l’anxiété : une expérience émotionnelle qualitativement déplaisante, liée à la prévision d’un danger imminent (qui peut être un objet ou un événement de nature précise ou vague) ou à des caractéristiques de la personnalité d’un sujet. Elle serait un signal physiologique qui traduit la mobilisation de l’organisme en vue d’affronter une menace, ainsi que les traces restantes de cette mobilisation, suivant l’affrontement. Elle peut être induite par des stimuli extrêmes, ayant la possibilité d’atteindre à la vie d’un sujet, ou par des stimuli d’une gravité moins intense, par exemple, des chocs électriques répétés. De plus, l’état d’anxiété peut être temporaire ou relativement chronique (Cattell & Scheier, 1958).

Les réactions d’un sujet à l’anxiété peuvent comporter des paramètres physiologiques (p. ex., une augmentation de la fréquence cardiaque et de la pression sanguine), cognitifs (scénarios catastrophiques, inquiétudes) et comportementaux

(inhibition des comportements en cours et évitement actif de la source de danger). La peur et l’anxiété sont des mécanismes d’alarme adaptatifs pour un organisme. L’anxiété devient pathologique quand elle est inadaptée, i.e. quand elle est excessive, incontrôlable, qu’elle n’est pas déclenchée par des stimuli externes spécifiques ou qu’elle est associée à un certain nombre de signes, incluant la modification des comportements (par exemple, évitement de stimuli ou de lieux, modification de routines, etc. ; Bourin, Petit-Demouliere,

Dhonnchadha, & Hascoet, 2007). Pour établir le caractère pathologique de l’anxiété, un critère couramment utilisé est de déterminer si la réponse comportementale émise est exagérée ou sans commune mesure avec la situation réelle (American Psychiatric

Association, 2002; Murphy & Leighton, 2009; Ohl, Arndt, & van der Staay, 2008; Roth &

Argyle, 1988).

Parmi les causes potentielles de l’anxiété, il y a les stresseurs chroniques de la vie quotidienne (McWilliams, Cox, & Enns, 2003; Rawana, 2013), de même que les

événements de vie marquants ou traumatisants (Davidson, Tupler, Wilson, & Connor,

1998; Goenjian et al., 2000). Des sources fréquemment rapportées d’anxiété sont, par exemple, la maladie physique, les conflits interpersonnels, des menaces perçues à son bien-

être personnel, la culpabilité, l’incertitude et l’isolement social (Cattell & Scheier, 1958).

Ces facteurs, de nature environnementale, interagissent avec des facteurs biologiques propres aux individus comme leur fonctionnement neuronal (Connor & Davidson, 1998) et leur génétique, modulant ainsi leur susceptibilité à ressentir l’anxiété (Shekhar, Truitt,

Rainnie, & Sajdyk, 2005). Cette interaction entre les facteurs environnementaux et biologiques existe également chez les animaux (Benaroya-Milshtein et al., 2004), chez qui le stress chronique peut être modélisé par la contention physique, l’isolement social, la domination par des congénères agressifs, la malpropreté ou la surpopulation de leur cage de résidence, ou une combinaison de ces facteurs. Ces conditions entraînent fréquemment des modifications du comportement des animaux en laboratoire et produisent chez eux des conduites anxieuses (Patterson, Ducharme, Anisman, & Abizaid, 2010; Zhu et al., 2011) ou une consommation accrue d’alcool (Conrad & Winder, 2011). Le stress, chronique ou aigu, a un effet certain sur l’organisme, humain ou animal, le prédisposant à ressentir de l’anxiété

à un niveau pathologique (McEwen, 2004). Plusieurs expériences effectuées sur des rongeurs démontrent que le stress chronique tend à augmenter les conduites anxieuses

(Bourin, et al., 2007; Evans, Sun, McGregor, & Connor, 2012). Il faut cependant noter que chez l’humain, de nombreuses caractéristiques psychologiques représentent également des facteurs de susceptibilité pour l’anxiété, comme le style d’attachement, le lieu de contrôle et le style attributionnel (Chorpita & Barlow, 1998).

Tel que mentionné précédemment, l’anxiété s’exprime de nombreuses façons ; elle peut être liée plus ou moins directement à une menace précise ou diffuse, ou être de nature plus idiosyncrasique. Il est donc important d’en distinguer deux formes, soit l’anxiété chronique (trait anxiety) et l’anxiété réactionnelle (state anxiety). La première correspond aux dispositions ou vulnérabilités individuelles à ressentir l’anxiété, une mesure qui peut

être considérée comme une composante de la personnalité. La seconde se traduit par des changements temporaires dans l’état émotionnel d’un organisme, comme une appréhension soudaine et des inquiétudes, accompagnés d’une augmentation de l’activité du système nerveux autonome sympathique et de l’axe hypothalamo-pituitaire-adrénal en réaction à un stimulus interne ou externe, réel ou imaginé. La plupart des tests mesurant l’anxiété chez les animaux servent à évaluer l’anxiété réactionnelle, en raison de l’effet de nouveauté induit par la situation expérimentale (Cattell & Scheier, 1961; Hodgues & Spielberger,

1969; Spilelberger, 1966). Les deux types d’anxiété sont hautement corrélés chez l’humain

(autour de .70) et sont tous deux plus élevés chez les sujets souffrant de troubles anxieux que dans la population générale (Gros, Antony, Simms, & McCabe, 2007; Hodgues &

Spielberger, 1969; Kabacoff, Segal, Hersen, & Van Hasselt, 1997).

Par ailleurs, des systèmes de classification nosologique, comme le DSM-IV

(American Psychiatric Association, 2002), présentent l’anxiété pathologique sous la forme de syndromes variés tels que le trouble de stress post-traumatique, les phobies, le trouble d’anxiété généralisée et le trouble obsessionnel-compulsif. Plusieurs études

épidémiologiques révèlent que les troubles anxieux sont largement répandus dans la population, avec des taux de prévalence variant de 7% à 60%, selon l’entrevue diagnostique utilisée pour diagnostiquer les individus, les tailles des échantillons sondés, la répartition des sexes des participants et la région du monde où une étude est menée (Grant et al., 2004;

Kessler et al., 1994; Regier, Narrow, & Rae, 1990). Cependant, la duplication du sondage national des comorbidités présente un taux de prévalence récent et fiable pour les troubles anxieux en Amérique du Nord, soit 18.1% (National Institute of Mental Health des États-

Unis ; Kessler, Chiu, Demler, Merikangas, & Walters, 2005). Ceci fait des troubles anxieux la catégorie diagnostique la plus représentée, devant les troubles de l’humeur à 9.5%

(Kessler, et al., 2005). Ce même sondage révèle d’ailleurs que les divers syndromes anxieux ont des taux de comorbidité très élevés entre eux. Les troubles anxieux sont considérés comme étant parmi les plus coûteux en termes d’heures de travail perdues et de baisse de productivité aux États-Unis (Goetzel, Hawkins, Ozminkowski, & Wang, 2003), en plus de figurer parmi les meilleurs prédicteurs d’invalidité pour les maladies mentales, tout de suite après les troubles de l’humeur et juste avant la dépendance à l’alcool

(Sanderson & Andrews, 2002 ; pour un résumé des causes, signes et conséquences de l’anxiété, voir Figure 1.1).

Figure 1.1 Résumé des causes, signes et conséquences de l’anxiété normale et

pathologique.

1.2.1 Anxiété et dépression Des études épidémiologiques révèlent également que les troubles de l’humeur et les troubles anxieux, qui sont chacun associés à des taux élevés d’invalidité, ont tendance à coexister chez un même individu. En effet, selon une étude récente menée aux Pays-Bas,

67% des individus souffrant d’un trouble de l’humeur souffrent d’un trouble anxieux comorbide et 75% affirment en avoir déjà eu un. Chez les individus atteints d’un trouble anxieux, ce sont 63% qui souffrent également d’un trouble de l’humeur comorbide, pour

81% qui révèlent en avoir déjà eu un (Lamers et al., 2011). Comparativement aux personnes atteintes d’un seul trouble, celles présentant des comorbidités sont plus susceptibles de développer d’autres troubles, présentent des symptômes depuis plus longtemps, et ces symptômes sont plus sévères (Hofmeijer-Sevink et al., 2012).

Étant donné les taux de comorbidité élevés des troubles anxieux et des troubles de l’humeur, certains chercheurs proposent un modèle statistique multivarié, basé sur la prévalence des troubles dans la population américaine, permettant d’expliquer la co- occurrence des troubles mentaux apparaissant le plus fréquemment (Eaton et al., 2011;

Krueger, 1999; Krueger & Markon, 2006). Dans ce modèle, les troubles anxieux et les troubles de l’humeur sont regroupés sous la catégorie des troubles internalisés, avec la sous-catégorie « peur », qui inclut les phobies simple et sociale ainsi que le trouble panique, et la sous-catégorie « détresse » qui inclut la dépression majeure, la dysthymie, le trouble d’anxiété généralisée et le trouble de stress post-traumatique. En somme, bien qu’ils soient séparés dans les manuels diagnostiques, les troubles anxieux et les troubles de l’humeur sont très fréquemment exprimés chez les mêmes personnes et pourraient partager des origines biologiques (Coccaro, Ong, Seroczynski, & Bergeman, 2012) et cognitives

(Watson & Kendall, 1989) importantes.

1.2.2 Anxiété et consommation d’alcool Il existe également des liens entre l’anxiété et la consommation excessive d’alcool, voire la dépendance à cette substance (Kushner et al., 2012). Entre un tiers et la moitié des patients traités pour l’alcoolisme en Angleterre souffrent ou présentent un historique de trouble anxieux et dans certains échantillons de patients alcooliques, près de 60% présentent des symptômes importants d’anxiété (Reis, 1989). Selon certaines hypothèses, des symptômes de panique et d’anxiété généralisée peuvent facilement être confondus avec ceux d’un sevrage à l’alcool, comme par exemple des crampes musculaires, de la tachycardie, de la sudation et des nausées. Cependant, chez plus des deux tiers des personnes souffrant d’une comorbidité anxiété-abus de substance, le trouble anxieux apparaît plusieurs années avant la consommation problématique d’alcool (Marquenie, et al.,

2007; Merikangas, et al., 1998; Merikangas, Risch, & Weissman, 1994; Reis, 1989). Les sondages épidémiologiques indiquent également que la présence d’un trouble anxieux prédisposerait un individu à souffrir de dépendance à l’alcool, alors que la relation inverse n’est pas statistiquement validée (Marquenie, et al., 2007).

Dans plusieurs cas, il semblerait qu’un phénomène d’auto-médicamentation soit à l’origine de la consommation chez les personnes anxieuses : elles ressentent un soulagement à court terme des symptômes anxieux lors de la consommation d’alcool, puis consomment davantage, dans l’optique de faire définitivement disparaître les symptômes

(Bolton, Cox, Clara, & Sareen, 2006; Bolton, Robinson, & Sareen, 2009; Robinson, Sareen,

Cox, & Bolton, 2009). Dès les années 1950, une hypothèse basée sur la théorie du conditionnement opérant soutenait que la consommation d’alcool ou de drogues servirait à réduire la tension (Conger, 1956; Stockwell, Hodgson, & Rankin, 1982). Selon cette hypothèse, la consommation servirait de renforcement négatif permettant d’échapper à un

9 stimulus inconditionnel aversif, soit les sensations désagréables causées par l’activation physiologique du corps en période de stress. Cependant, une fois le processus enclenché, même si les symptômes anxieux peuvent éventuellement se dissiper, les symptômes de sevrage à l’alcool, qui sont très similaires à certains des symptômes physiques ressentis en période d’anxiété, deviennent saillants (Roelofs, 1985). Le besoin de consommer se fait à nouveau sentir, afin de dissiper les sensations désagréables du sevrage à l’alcool, et ainsi s’installeraient les comportements d’abus et, possiblement, la dépendance (Cappell, Roach,

& Poulos, 1981; Hinson & Siegel, 1980; Poulos, Hinson, & Siegel, 1981; Siegel, 1979,

1983). Des théories plus récentes postulent également que ce processus de renforcement négatif est central dans l’apparition et le maintien des comportements d’abus et de dépendance à l’alcool (Koob, 2013). Enfin, une étude prospective récemment publiée présente des données intéressantes qui viennent appuyer ces modèles. Cette étude expose le fait que s’auto-médicamenter avec de l’alcool pour réduire la sévérité des symptômes d’un trouble de l’humeur est associé à des risques trois fois plus élevés de développer une dépendance et que celle-ci soit persistante. Cette association ne varie pas significativement selon le sexe, l’âge ou l’origine ethnique des participants, mais est plus forte chez les participants présentant un trouble de l’humeur plus sévère ou un autre trouble affectif comorbide, notamment, un trouble anxieux (Crum, et al., 2013).

Une composante motivationnelle importante entre également en jeu dans le comportement éthylique. Un modèle intéressant (Ooteman, Koeter, Verheul, Schippers, &

Van den Brink, 2006) indique que deux types de motivation peuvent expliquer le comportement de consommation abusive d’alcool : la motivation à réduire la tension et la motivation à augmenter les émotions positives (Cooper, Frone, Russell, & Mudar, 1995;

Cox & Klinger, 1988). Les deux types de motivation sont hautement corrélés chez les

individus souffrant de dépendance ou d’abus à l’alcool. Cependant, le niveau d’anxiété perçue par les patients alcooliques est faiblement corrélé à leur motivation positive pour la consommation (Ooteman, et al., 2006). L’anxiété serait donc davantage associée à une motivation à réduire la tension, ce qui concorde avec les théories du renforcement négatif.

Malheureusement, les auteurs de l’article ne font pas mention de la présence ou de l’absence de troubles anxieux comorbides dans leur échantillon de patients alcooliques.

Dans les modèles animaux de dépendances, il est généralement recommandé de tenir compte du niveau de motivation des sujets pour la substance. Une façon fréquemment utilisée pour ce faire est de soumettre les animaux à une conséquence négative à chaque fois qu’ils ont accès à la substance (Deroche-Gamonet, Belin, & Piazza, 2004; Markou et al., 1993; Robinson, 2004).

1.2.3 Anxiété et cognition En plus d’être associée à la dépression et à la consommation d’alcool, l’anxiété, normale ou pathologique, a également des liens importants avec la performance dans des tâches cognitives. L’une des hypothèses sur ce phénomène est que la sécrétion de glucocorticoïde cortisol lors des périodes d’anxiété prolongée causerait à long terme des dommages importants à plusieurs structures du cerveau. Les auteurs de cette hypothèse se basent sur des dommages observés aux dendrites des neurones hippocampiques et amygdaliens à la suite de l’exposition à des stresseurs chroniques (McEwen & Sapolsky,

1995). Chez les rongeurs, des expériences vont sensiblement dans le même sens. Le stress chronique entraîne une augmentation de l’inflammation du cortex frontal et de l’hippocampe des rats (Munhoz et al., 2006) ; une augmentation du stress oxydatif cellulaire dans les mêmes structures et une apoptose plus élevée, restreinte au cortex frontal

(Filipovic et al., 2011) ; une régulation à la baisse de gènes responsables de la prolifération

(Anapc7), de la croissance (CsnK1g1) et de la survie cellulaires (Hdac3), ainsi que de l’inhibition de l’apoptose (Dido1), dans le cortex frontal des souris (Tordera et al., 2011).

Une étude chez l’humain (Lee et al., 2007) appuie partiellement cette hypothèse de dommages cérébraux dus au stress et montre que les résultats à des tests psychométriques chez des personnes âgées sont négativement corrélés avec le taux de cortisol salivaire. En effet, un taux de cortisol plus élevé est associé à des résultats plus faibles sur le plan du langage, de la vitesse de traitement, de la coordination œil-main, du fonctionnement exécutif général, de la mémoire verbale et visuelle, ainsi que de l’apprentissage verbal.

Cependant, l’anxiété auto-rapportée serait davantage corrélée à la baisse de performance d’individus anxieux qu’au taux de cortisol salivaire (Lee, et al., 2007).

La manipulation du niveau d’anxiété auto-rapportée avant la passation d’épreuves neuropsychologiques module la performance des participants dans des tâches d’apprentissage, de mémoire verbale et de mémoire de travail (Gass & Curiel, 2011).

Toutefois, le niveau de cortisol n’est pas corrélé aux résultats aux épreuves neuropsychologiques (Leininger & Skeel, 2012; Vedhara et al., 2003). De même, dans une

étude où l’anxiété était induite chez des hommes sans diagnostic psychiatrique, l’anxiété ne causait pas de déficit d’apprentissage verbal, de mémoire, de raisonnement logique, ni de mémoire de travail verbale ou visuelle (Hoffman & Al'Absi, 2004). Une autre étude

(Waldstein, Ryan, Jennings, Muldoon, & Manuck, 1997) n’a pu établir aucune corrélation entre des résultats à des tests d’anxiété et des scores à des épreuves neuropsychologiques mesurant l’attention, l’apprentissage, la mémoire, la flexibilité cognitive et la coordination

œil-main.

Bien que la relation entre anxiété et déficit cognitif ne soit pas facile à démontrer chez des personnes saines, le tableau semble plus clair chez les individus souffrant de psychopathologies. En effet, les personnes souffrant de troubles anxieux ou de l’humeur présentent, dans plusieurs cas, des déficits importants dans des tâches faisant appel aux fonctions exécutives et à la mémoire visuelle (Castaneda, Tuulio-Henriksson, Marttunen,

Suvisaari, & Lonnqvist, 2008). La présence d’un trouble anxieux comorbide à une problématique dépressive entraîne une performance inférieure à celle d’individus souffrant de dépression majeure sans comorbidité (Kizilbash, Vanderploeg, & Curtiss, 2002). De même, les individus souffrant de traumatismes cranio-cérébraux développent fréquemment des troubles anxieux, des troubles de l’humeur, ainsi que divers déficits cognitifs (Lima,

Simao Filho, Abib Sde, & de Figueiredo, 2008). Ces difficultés sont persistantes et difficilement dissociables, certains individus se plaignant encore d’anxiété, de déprime et de troubles mnésiques 18 mois à 6 ans après le traumatisme (Jackson et al., 2007; King &

Kirwilliam, 2011).

La théorie de l’efficacité du traitement cognitif (processing efficiency theory), ainsi que sa version mise à jour, la théorie du contrôle attentionnel (attentional control theory), fournissent des pistes de réflexion pour expliquer les déficits de performance cognitive associés à l’anxiété (Eysenck & Calvo, 1992; Eysenck, Derakshan, Santos, & Calvo, 2007).

Selon ces théories, deux types d’attention sont nécessaires pour compléter avec succès une tâche cognitive : l’attention centrée sur les stimuli et l’attention dirigée vers un but.

L’attention centrée sur les stimuli produit des comportements réflexes, relativement automatiques et rapides. L’attention dirigée vers un but, quant à elle, permet de se centrer sur l’objectif principal de la tâche, ce qui permet de mettre en place de nouvelles stratégies

13 afin d’atteindre un objectif pour lequel la séquence comportementale adéquate n’est pas encore automatisée.

Ces deux types d’attention doivent être relativement équilibrés selon la nature de la tâche. Cependant, l’anxiété aurait tendance à augmenter la contribution de l’attention centrée sur les stimuli au détriment de l’attention dirigée vers un but. Ce déséquilibre aurait pour effet de nuire aux performances des individus anxieux dans une tâche faisant appel à l’administrateur central, fonction chargée de la manipulation de l’information en mémoire de travail (Baddeley, 2001). Plus la demande faite à l’administrateur central est forte, plus l’effet délétère de l’anxiété est observable. L’effet de l’anxiété serait également évident dans les tâches où les fonctions exécutives d’inhibition et de flexibilité cognitive (shifting) sont requises. L’inhibition bloque l’émission d’une réponse habituelle à un stimulus. Un exemple classique d’inhibition est le test de Stroop, dans lequel apparaît le nom d’une couleur : la tâche consiste à nommer la couleur de l’encre avec laquelle le mot est écrit plutôt que de lire le nom de couleur écrit. La flexibilité cognitive est requise lorsqu’on doit passer relativement rapidement d’une réponse apprise à une autre. : par exemple, additionner trois (opération n + 3) à chaque chiffre donné, pour ensuite devoir soustraire quatre (opération n - 4) à chaque chiffre suivant un signal. Un autre exemple est tourner à répétition à gauche à un embranchement, pour plus tard devoir tourner à droite au même embranchement (Miyake et al., 2000). Enfin, l’anxiété nuirait à la fonction de mise à jour, mais uniquement dans des conditions stressantes. Cette fonction consiste à manipuler activement de l’information en mémoire de travail afin de sélectionner les éléments essentiels et ignorer ceux qui ne le sont pas, par opposition à emmagasiner passivement toute information. Les théories de l’efficacité du traitement et du contrôle attentionnel ont

été appuyées par plusieurs expériences qui confirment l’effet délétère de l’anxiété sur les

fonctions exécutives (Derakshan, Smyth, & Eysenck, 2009; Elliman, Green, Rogers, &

Finch, 1997; Eysenck, et al., 2007; Williams, Vickers, & Rodrigues, 2002).

1.2.4 Anxiété et neurotransmetteurs, cognition, consommation d’alcool Trois neurotransmetteurs jouent un rôle particulièrement important dans l’anxiété : la noradrénaline (NA), l’acide gamma-aminobutyrique (GABA) et la sérotonine (5- hydroxytryptamine ou 5-HT ; Stahl, 1996). Cette thèse ne se penchera pas spécifiquement sur les rôles de la NA et du GABA. La 5-HT affecte à la fois les comportements liés à l’anxiété, à la consommation d’alcool et au fonctionnement cognitif. D’ailleurs, le système sérotoninergique est l’une des cibles de nombreux traitements pharmacologiques de diverses problématiques anxieuses (Gerard, Liard, Crochard, Goni, & Millet, 2012;

Hollingworth, Burgess, & Whiteford, 2010). Les inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (ISRS) sont des traitements efficaces pour ces troubles.

Des études sur les effets thérapeutiques d’antidépresseurs chez des patients souffrant d’anxiété et de dépression comorbides à la consommation d’alcool suggèrent que la 5-HT serait l’un des principaux dénominateurs communs entre la consommation d’alcool et l’anxiété, à la fois chez l’humain et chez l’animal (Armeli, Conner, Covault, Tennen, &

Kranzler, 2008; McBride, Murphy, Lumeng, & Li, 1990; Tollefson, 1989, 1991). Certains chercheurs ont établi un lien entre d’une part, l’anxiété et la consommation d’alcool et d’autre part, la 5-HT, intégrant à leurs résultats des données sur la motivation pour les effets appétitifs et aversifs de l’alcool (Armeli, Conner, Covault, Tennen, & Kranzler,

2008). De plus, des liens ont été établis entre les comportements compulsifs et les comportements impulsifs, dont font partie l’abus et les dépendances à l’alcool (Fineberg et al., 2010). Les comportements compulsifs incluent, entre autres, les compulsions des

15 individus atteints de troubles obsessionnels-compulsifs, alors que les comportements impulsifs regroupent notamment le jeu pathologique, qui est également traité par l’administration d’ISRS (Dannon, Lowengrub, Gonopolski, Musin, & Kotler, 2005; Grant,

Kim, & Potenza, 2003; Hollander et al., 1998). Ces types de comportement seraient le résultat d’un déficit de la flexibilité cognitive, une fonction exécutive, et un tel déficit serait dû à une réduction des niveaux de 5-HT cérébrale (Homberg, 2012; Roiser, Muller, Clark,

& Sahakian, 2007).

En raison de son rôle important dans les traitements pharmacologiques de l’anxiété et la consommation pathologique d’alcool, la 5-HT apparaît donc comme un substrat neurobiologique particulièrement intéressant dans l’analyse des liens entre l’anxiété, la consommation d’alcool et le fonctionnement exécutif.

1.3 Sérotonine La 5-HT est étudiée depuis la première moitié du XXème siècle, d’abord comme amine du système digestif (Negri, 2006), puis ensuite pour son rôle dans la vasoconstriction

(Rapport, Green, & Page, 1948) et plus tard, pour sa fonction de neurotransmetteur dans les comportements et la cognition (Aprison & Ferster, 1961; Hehman, Vonderahe, & Peters,

1961; Woolley, 1955; Woolley & Shaw, 1954a, 1954b). Les neurones sérotoninergiques prennent leur origine dans les noyaux du raphé, situés dans le tronc cérébral du cerveau, puis projettent ensuite dans la plupart des régions sous-corticales et corticales, dont le cortex préfrontal, l’hypothalamus, l’hippocampe, l’amygdale et le striatum. Le système sérotoninergique est l’un des plus diffus du système nerveux central, avec des projections très répandues (Azmitia & Segal, 1978).

La 5-HT est un dérivé de l’acide aminé tryptophane obtenu par l’alimentation.

Parmi les sources importantes de tryptophane se retrouvant couramment dans l’alimentation, il y a les blancs d’œufs, l’orge, le poisson, les fèves de soja, les graines de tournesol, la viande rouge et la volaille (Pintér-Szakacs & Molnár-Perl, 1990; Ravindran &

Bryden, 2005). Une fois ingéré, cet acide aminé est intégré au plasma sanguin et peut se rendre dans le système nerveux. La synthèse de la 5-HT s’effectue en deux étapes: le tryptophane est d’abord converti en 5-hydroxytryptophane (5-HTP) par l’enzyme tryptophane hydroxylase, puis 5-HTP est converti en 5-HT par l’enzyme 5-HTP décarboxylase. La synthèse de la 5-HT est limitée par la disponibilité du tryptophane dans le fluide extracellulaire, de sorte qu’une alimentation déficiente en tryptophane réduit drastiquement sa synthèse et par conséquent, sa présence dans le système nerveux (Bear,

Connors, & Paradiso, 1996).

Suite à sa libération par la terminaison axonale, ce neurotransmetteur est ramené au neurone d’origine par un transporteur spécifique à la 5-HT (5-HTT). Une fois retournée dans le bouton synaptique, la 5-HT est insérée dans une vésicule synaptique en vue d’être libérée à nouveau ou est dégradée en acide 5-hydroxyindoléacétique (5-HIAA) par l’enzyme monoamine oxydase (MAO ; voir Figure 1.2). Les ISRS fonctionnent en inactivant 5-HTT, menant ainsi à une augmentation de la 5-HT extracellulaire et à une désensibilisation des autorécepteurs somatodendritiques 5-HT1A, deux résultantes de leur activité qui sont soupçonnées d’être les mécanismes d’action antidépresseur et anxiolytique de ces médicaments (Gardier, Malagie, Trillat, Jacquot, & Artigas, 1996; Stahl, 1996,

1998).

Figure 1.2 Chaîne biochimique de la synthèse et la dégradation de la 5-HT.

(Source de l’image originale : http://en.wikipedia.org/wiki/File:Serotonin_biosynthesis.svg, publiée par l’utilisateur NEUROtiker sous la license « Creative Commons Attribution-

Share Alike 3.0 Unported », qui en autorise sa modification et sa distribution

[http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.en])

1.3.1 Rôles possibles pour la sérotonine Pour résumer : 1) les neurones sérotoninergiques et les systèmes neuronaux innervés par ces axones sont largement répandus dans le cerveau (voir Figure 1.3) ; 2) les médicaments améliorant le comportement, l’affect et la cognition influencent le fonctionnement du système sérotoninergique et sont des traitements efficaces pour de nombreux troubles psychiatriques ; et 3) les individus souffrant de troubles psychiatriques présentent souvent des anomalies du système sérotoninergique. (Heninger, 1997).

Figure 1.3 L’innervation sérotoninergique dans le cerveau humain. Les cercles noirs représentent les noyaux à partir desquels l’innervation origine et les flèches représentent les principaux faisceaux de neurones efférents (Source de l’image originale: Nutt et al., 1999).

Parmi les nombreux troubles comportementaux et psychiatriques pour lesquels un rôle est attribué à la 5-HT, il faut mentionner l’agressivité (Birger et al., 2003; Huber,

Smith, Delago, Isaksson, & Kravitz, 1997; Kulikov, Osipova, Naumenko, & Popova, 2005;

Osipova, Kulikov, & Popova, 2009), l’autisme (Boylan, Blue, & Hohmann, 2007;

Silverman, Yang, Lord, & Crawley, 2010), la dépendance aux drogues (Dahl et al., 2006;

Nielsen et al., 2008; Reuter et al., 2007; Tanaka et al.), mais également l’anxiété (Baldwin

& Rudge, 1995; Reuter, Kuepper, & Hennig, 2007) et la dépression (An et al., 2008;

Coppen, 1967; Harvey et al., 2004; Illi et al., 2009; Neumeister, 2003). Malgré la popularité et la longévité de l’hypothèse selon laquelle la 5-HT jouerait un rôle central dans la dépression, certains chercheurs s’y opposent (Heninger, Delgado, & Charney, 1996;

Lacasse & Leo, 2005). Selon eux, le fait que la réduction des symptômes passe par une augmentation des taux de 5-HT ne signifie pas nécessairement que les taux de 5-HT sont réduits chez ceux qui souffrent de dépression. Une façon de l’illustrer est qu’une éruption cutanée se traite en appliquant une crème stéroïdienne, mais que cela ne signifie pas nécessairement que l’éruption ait été causée par une carence d’hormones stéroïdiennes

(Delgado & Moreno, 2000). De plus, un lien de causalité n’a pu être établi entre la réduction de 5-HT et le déclenchement d’un épisode dépressif majeur chez l’humain.

La 5-HT est aussi associée à la mémoire (Harrison et al., 2004; Roiser, et al., 2007) et à des fonctions exécutives telles que l’inhibition, l’attention et la flexibilité cognitive

(Evers, van der Veen, Fekkes, & Jolles, 2007; Harrison, Everitt, & Robbins, 1999;

Matrenza et al., 2004; Osinsky et al., 2009; Rogers, 2011; Walderhaug et al., 2002). Des expériences révèlent cependant qu’au niveau cognitif, le rôle du système sérotoninergique semble limité à certaines fonctions précises. Des injections intra-cérébro-ventriculaires de

5,7-DHT ou de para-chlorophénylalanine (p-CPA) affectent la mémoire de travail des rats

dans le labyrinthe en Y (tâche d’alternance spontanée) et le labyrinthe radial, mais pas leur mémoire de référence dans le labyrinthe radial et le test d’évitement passif après 24 h

(Hritcu, Clicinschi, & Nabeshima, 2007). Ce dernier test consiste à placer un rongeur dans la partie éclairée d’un appareil à deux compartiments, dont l’un est éclairé et l’autre, sombre. Cependant, le compartiment sombre, qui attire généralement davantage les rongeurs, est doté d’un plancher électrifié qui envoie une décharge lorsque le rongeur s’y rend. Après un premier essai où le rongeur reçoit un choc en traversant du côté sombre, il est possible d’évaluer la mémoire ou l’impulsivité du rongeur en le plaçant à nouveau dans l’appareil, quelques heures ou quelques jours plus tard, et en comptant le temps qu’il passe dans le compartiment éclairé avant de traverser au compartiment sombre. Il semblerait donc que le système sérotoninergique soit davantage impliqué dans la mémoire spatiale

épisodique ou quasi-épisodique1 pour les tâches limitées dans le temps que dans la mémoire spatiale procédurale, fréquemment associée à l’apprentissage de règles (Squire, Knowlton,

& Musen, 1993 ; Josef van der Staay, 1999 ; Jakubowska-Dogru, Gumusbas, & Kara,

2003). Suite à des lésions hippocampiques, des dissociations similaires des déficits mnésiques entre mémoire de travail et mémoire de référence sont également observées

(Olton, Becker, & Handelmann, 1979 ; Niewoehner, et al., 2007).

Le système sérotoninergique joue aussi un rôle dans la composante incitatrice

(incentive) de la motivation, qui consiste en l’attrait exercé par un renforçateur. Le concept d’incitateur est souvent placé en opposition à la composante tendance (drive) de la motivation, qui se définit plutôt comme un besoin, ou manque, auquel cas les actions posées ont pour objectif de rétablir l’homéostasie (Wise, 2004). Par exemple, des rats

1 Il est à noter que dans le cas d’animaux, on parle de mémoire quasi-épisodique, par opposition à mémoire épisodique chez l’humain, en raison de la controverse entourant l’existence d’un tel type de mémoire chez l’animal (Dere, Kart-Teke, Huston, & De Souza Silva, 2006; Morris, 2001).

21 soumis à la même privation de nourriture pour la même durée (même tendance ou

« drive ») se déplacent plus vite dans un labyrinthe pour une grande quantité que pour une petite quantité de renforcement alimentaire (Zeaman, 1949). L’élévation des taux de 5-HT est généralement associée à un niveau de motivation incitatrice plus élevé, alors que l’inverse se produit lorsque les taux de 5-HT sont réduits (Adriani et al., 2012; Cools,

Blackwell, et al., 2005; Roiser et al., 2006; Tran-Nguyen, Baker, Grote, Solano, &

Neisewander, 1999). Cependant, la stimulation des récepteurs 5-HT1 et 5-HT7 du noyau accumbens, suite à l’injection bilatérale de 5-Carboxamidotryptamine (5-CT) à une dose de

4 μg par hémisphère, réduit la motivation à appuyer sur un levier pour un renforcement alimentaire chez le rat (Pratt, Schall, & Choi, 2012). Dans la même expérience, la stimulation des récepteurs 5-HT2C du noyau accumbens par injection de fumarate RO 60-

0175 n’a pas d’effet sur la motivation des rats à obtenir le renforcement. L’inhibition de la fonction de l’enzyme tryptophane hydroxylase par injections de p-CPA ne réduit pas la motivation des rats à escalader une barrière élevée pour aller chercher un renforcement, bien qu’elle mène à des déficits d’apprentissage et à une tendance à préférer les petits renforcements immédiats au lieu des gros renforcements différés (Denk et al., 2005;

Izquierdo et al., 2012). Il est évident que le système sérotoninergique joue un rôle dans divers processus motivationnels. La nature précise de ce rôle demeure, cependant, peu définie.

Une étude à cas unique qui décrit le traitement d’un patient atteint d’une maladie génétique très rare, la déficience en sepiaptérine réductase, illustre à quel point une interaction entre le système sérotoninergique et ceux d’autres neurotransmetteurs est probablement nécessaire dans le cas de plusieurs fonctions (Leu-Semenescu et al., 2010).

La déficience en sepiaptérine réductase fait en sorte que celui qui en souffre présente un

déficit important de 5-HT et de dopamine (DA). Dans l’étude mentionnée, le patient a commencé à recevoir des traitements à la L-DOPA, un précurseur de la DA, dès l’âge de 5 ans, de sorte qu’il n’a vraisemblablement pas souffert des symptômes associés à une DA réduite après cet âge, outre une légère bradykinésie. Cependant, le patient dormait en moyenne deux fois dans le courant de chaque journée et passait 2 h par nuit éveillé. À l’adolescence, il a développé un besoin incontrôlable de manger à plusieurs reprises pendant la journée et la nuit, sans crises de boulimie, moyens de compensation, culpabilité ou altération de son image corporelle (donc, en absence de trouble alimentaire). À l’âge de

27 ans, il fut diagnostiqué d’un trouble de l’attention et d’un QI dans la moyenne faible

(déficits de la flexibilité cognitive et de la découverte de règles, erreurs de persévération ; aucun déficit en mémoire de travail ou à long terme). Après l’initiation d’un traitement au

5-HTP, précurseur de la 5-HT, le sommeil du patient s’est amélioré; il a réduit son nombre de siestes dans la journée; son comportement alimentaire s’est normalisé; il a perdu 12 kg en 8 mois sans suivre de diète ; ses troubles attentionnels et exécutifs se sont estompés ; et son QI est remonté dans la moyenne. Les auteurs ne mentionnent pas d’autres symptômes chez le patient. Ce cas clinique suggère donc qu’il est possible que le rôle généralement attribué à 5-HT dans diverses anomalies comportementales puisse être partagé avec d’autres systèmes de neurotransmetteurs.

1.3.2 Théories du rôle de la sérotonine Plusieurs théories ont été proposées afin d’expliquer l’effet de la 5-HT sur le comportement, ainsi que ses liens avec la dépression, l’anxiété et les fonctions cognitives.

Ces théories tentent d’apporter une explication aux résultats, souvent contradictoires, obtenus chez l’humain et chez l’animal dans des expériences visant à moduler les taux de

5-HT. Il demeure néanmoins très difficile pour les chercheurs et théoriciens d’arriver à un consensus sur le principe sous-tendant les nombreux effets de ce neurotransmetteur dans la performance cognitive, le comportement et les émotions. Quatre théories récentes seront ici sommairement présentées : la théorie de la régulation des processus émotionnels et comportementaux ; la théorie de la modulation de la fuite ; la théorie de l’évaluation des récompenses futures ; et la théorie du modulateur de la prise de décision.

La théorie de la régulation des processus émotionnels et comportementaux (Cools,

Roberts, & Robbins, 2008) postule que le système sérotoninergique module la réponse de l’amygdale et des régions frontales connexes en réaction aux stimuli menaçants. Cette conclusion s’appuie sur le fait qu’une sensibilité accrue aux stimuli menaçants est fréquente chez plusieurs personnes souffrant de troubles anxieux ou de l’humeur. De plus, des résultats d’imagerie par résonance magnétique indiquent que la réduction expérimentale des taux de 5-HT chez des participants augmente l’activation de l’amygdale (Cools, Calder, et al., 2005), alors que l’augmentation des taux de 5-HT réduit cette même activation

(Harmer, Mackay, Reid, Cowen, & Goodwin, 2006).

Selon ce modèle, les résultats déficitaires d’individus soumis à une réduction de 5-

HT dans des tâches exécutives, mnésiques, ou d’apprentissage seraient dus principalement

à l’augmentation anormale de l’impact attendu des punitions. Le conditionnement de peur signalé, dépendant de l’amygdale, serait amélioré par une réduction de la 5-HT chez le rat, ce qui appuie également les postulats de cette théorie (Wilkinson, Humby, Robbins, &

Everitt, 1995). Ainsi, la 5-HT aurait un rôle de médiateur de l’erreur prédictive de la punition, en modulant le traitement aversif de l’information effectué par l’amygdale. Plus la

5-HT est en quantités élevées, plus la prédiction de punition est faible, alors que moins elle est élevée, plus la prédiction de punition est certaine. Dans un système motivationnel

intégré, le système sérotoninergique aurait un rôle clé dans la composante aversive en opposition au système dopaminergique mésolimbique, qui serait central dans la composante appétitive (Cools, Nakamura, & Daw, 2011).

Cependant, des résultats d’expériences sur l’animal suggèrent que cette théorie ne rend pas complètement compte du rôle de la 5-HT dans la cognition. En effet, la réduction de la 5-HT améliore la performance dans une tâche go-go pour rats (tourner à gauche dans un labyrinthe en T quand un indicateur clignote rapidement; tourner à droite quand l’indicateur clignote lentement ; Ward, Wilkinson, Robbins, & Everitt, 1999). Par ailleurs, elle affecte négativement la performance dans une tâche go - no go (avancer lorsqu’un indicateur clignote rapidement et arrêter lorsqu’il clignote lentement ; Harrison, et al.,

1999). Ce résultat appuierait plutôt une conception selon laquelle la 5-HT jouerait un rôle dans l’impulsivité et le contrôle des réponses comportementales, les deux tâches comportant la même conséquence pour l’absence d’une bonne réponse (en l’occurrence, le non renforcement du rat). En outre, la réduction de la 5-HT chez des marmosets entraîne un comportement de persévération dans une tâche d’inversion dans laquelle le membre d’une paire de stimuli visuels, qui était renforcé jusque-là, ne l’est plus, l’autre membre de la paire étant maintenant renforcé. Cependant, les réponses des marmosets ne sont pas affectées si le stimulus préalablement renforcé est remplacé par un stimulus nouveau

(Clarke, Walker, Dalley, Robbins, & Roberts, 2007). Les auteurs de la théorie ont donc révisé celle-ci pour postuler que le système sérotoninergique affecterait principalement le fonctionnement du cortex préfrontal et modulerait donc le contrôle de l’inhibition comportementale. Ceci influencerait en même temps le fonctionnement de structures voisines, telles que l’amygdale, dans la régulation émotionnelle. Ils concluent que le traitement aversif rehaussé, le comportement désinhibé ou impulsif et la vulnérabilité

25 accrue aux stresseurs sont fréquemment observés en co-occurrence dans divers troubles affectifs, ce qui expliquerait le fonctionnement des médicaments sérotoninergiques dans le traitement de ces troubles (Cools, et al., 2008).

La théorie de la modulation de la fuite (Tops, Russo, Boksem, & Tucker, 2009) est basée sur le modèle de Deakin, originalement élaboré pour expliquer le rôle de la 5-HT dans deux psychopathologies précises, soit la dépression majeure et le trouble de personnalité antisociale (Deakin, 2003). Selon cette théorie, étant donné le large spectre de comportements dans lesquels la 5-HT est impliquée (Lucki, 1998), l’unique façon de bien conceptualiser son rôle est d’associer son système neuronal à une tendance primitive, conservée au fil de l’évolution, et qui intègre une grande variété de fonctions comportementales. Le système sérotoninergique inciterait à rechercher la sécurité et le confort et agirait en opposition au système dopaminergique prenant origine dans l’aire tegmentale ventrale, qui serait un élément-clé du système de motivation et de recherche active de récompenses. Un exemple serait le comportement alimentaire dans lequel la 5-HT jouerait un rôle dans la satiété, motivant la terminaison du comportement alimentaire et le retrait de l’activité pour amorcer la digestion.

Dans le cas de l’anxiété, la tendance à la fuite impliquerait une aversion à la stimulation intense, comme certaines sensations physiques désagréables, et se manifesterait de façon observable par un évitement des sources intenses de son et de lumière. Par conséquent, un taux élevé de 5-HT stimulerait la production de comportements associés à l’anxiété, soit l’évitement. Au niveau social, le système sérotoninergique aurait un rôle inhibiteur sur le système noradrénergique prenant origine dans le locus coeruleus, lequel jouerait un rôle important dans les comportements agressifs intraspécifiques (Tse & Bond,

2006). Étant dépendant d’une bonne alimentation, le tryptophane serait, dans la nature,

l’acide aminé le plus susceptible de manquer à l’organisme. Une réduction de la 5-HT déclencherait un système de survie par la désinhibition du système noradrénergique, ce qui inciterait à l’adoption de comportements agressifs afin de pouvoir obtenir davantage de nourriture, source du tryptophane. Dans les troubles dépressifs, les individus déficients en

5-HT auraient de la difficulté à se retirer de contextes où ils sont malheureux ou sous- stimulés pour se placer dans des contextes où ils réussiraient à se calmer et ressentir du bien-être et du renforcement. Enfin, la 5-HT encouragerait les comportements prosociaux en stimulant le retrait vers des groupes sociaux apaisants lorsqu’en état de déséquilibre.

Toutefois, il serait simpliste d’englober toutes les fonctions comportementales de la 5-HT à l’aide du seul concept de tendance, surtout lorsque les effets neuromodulateurs d’autres neurotransmetteurs (acétylcholine, NA, DA) doivent être pris en compte (Tops, et al.,

2009).

La théorie de modulation de la fuite permet d’expliquer plusieurs comportements associés à la 5-HT, notamment des comportements associés à l’alimentation, à l’agressivité,

à la dépression majeure et aux comportements prosociaux. Cependant, peu de données empiriques robustes permettent de soutenir cette théorie dans le cas de l’anxiété. La majorité des données récentes suggèrent que l’anxiété serait associée à des taux réduits de

5-HT (Carver & Miller, 2006). De plus, les comportements attribués à des taux normaux de

5-HT par Tops et ses collaborateurs (Tops, et al., 2009) réfèrent à une augmentation de l’évitement des stimuli anxiogènes, ce qui est plus typique de l’anxiété (Rapee &

Heimberg, 1997). De plus, le concept de tendance à la fuite ne permet pas vraiment d’attribuer un rôle à la 5-HT dans la cognition. Enfin, cette théorie peut difficilement expliquer l’effet de la 5-HT dans l’association entre l’anxiété et la consommation d’alcool.

La théorie de l’évaluation des récompenses futures (Schweighofer, Tanaka, & Doya,

2007) ne rend compte que de l’une des fonctions du système sérotoninergique dans le comportement, soit l’actualisation des délais, c’est-à-dire l’aptitude à sélectionner une récompense différée de plus grande qualité au détriment d’une récompense moins avantageuse, mais plus imminente. Ici, le système sérotoninergique interviendrait dans le fonctionnement d’une unité de contrôle de l’évaluation du délai de récompense et inhiberait donc l’impulsivité. La théorie de l’évaluation des récompenses futures est basée sur le modèle de l’impulsivité d’Evenden (1999), intégrant trois composantes : 1) une discrimination sensorielle peu fiable, principalement en ce qui a trait à l’attention et la préparation ; 2) des réponses prématurées dans des situations qui requièrent de retarder l’action ; et 3) le choix de petits renforçateurs imminents plutôt que de plus gros renforçateurs différés. Dans la théorie de Schweighofer et ses collaborateurs, c’est cette troisième composante qui réfère à l’impulsivité (Schweighofer, et al., 2007).

Un exemple d’observation qui concorde avec cette théorie est que les rats qui ont subi une réduction de 5-HT choisissent rarement une récompense importante et différée lorsqu’ils ont également la possibilité d’obtenir une récompense faible et immédiate

(Wogar, Bradshaw, & Szabadi, 1993). Inversement, des taux plus élevés de 5-HT augmentent la fréquence de choix différés avantageux (Bizot, Le Bihan, Puech, Hamon, &

Thiebot, 1999). Bien que cette théorie ne postule pas que les individus dépressifs soient impulsifs, l’état dépressif est conçu comme une situation dans laquelle le sujet dépressif ne s’efforce pas d’aller chercher un renforçateur différé, quelle que soit sa distance temporelle.

Par conséquent, les sources de satisfaction s’avèrent excessivement rares, voire inexistantes, ce qui maintiendrait le trouble (Schweighofer, et al., 2007). Des résultats antérieurs viennent également soutenir la théorie et permettent de l’appliquer à des

problématiques liées au système sérotoninergique, tant chez l’humain que chez le rongeur

(Poulos, Parker, & Le, 1996; Reynolds, 2006; Winstanley, Dalley, Theobald, & Robbins,

2003). Ceux-ci démontrent une corrélation forte entre la réduction de 5-HT, ainsi que la consommation excessive d’alcool et l’impulsivité. De plus, l’injection d’agonistes de la 5-

HT a mené à une réduction des deux types de conduite.

Les rongeurs à qui des antagonistes des récepteurs sérotoninergiques ont été injectés

éprouvent des difficultés dans les tâches où ils doivent inhiber leurs comportements, comme les protocoles d’évitement passif (Galeotti, Ghelardini, & Bartolini, 2000). Par contre, ils s’améliorent dans les mêmes tâches suite à la consommation de tryptophane

(Khaliq, Haider, Ahmed, Perveen, & Haleem, 2006). Le type d’impulsivité dans ces expériences concorde davantage avec la seconde composante du modèle d’Evenden

(réponses prématurées alors qu’il est préférable de retarder l’action) qu’avec la troisième.

Bien que l’impulsivité soit effectivement une composante de l’anxiété chez certaines personnes, le cadre très spécifique de cette théorie permet difficilement d’expliquer en quoi la 5-HT peut avoir une influence sur d’autres composantes de l’anxiété.

Selon la théorie du modulateur de la prise de décisions (Homberg, 2012), le système sérotoninergique permet d’intégrer les informations sensorielles et émotionnelles internes et externes, que ces informations soient attendues ou non, ce qui mène à un état de vigilance affectant positivement divers processus décisionnels. Cette théorie s’inscrit dans le même courant que la théorie de la régulation des processus émotionnels et comportementaux de

Cools et collaborateurs (Cools, et al., 2008), et tente d’englober certaines observations que cette dernière ne réussit pas à expliquer. La théorie s’appuie sur des données indiquant que la 5-HT affecterait les performances dans diverses tâches exécutives.

Chez des sujets humains (Evers, Cools, et al., 2005; Evers, Tillie, et al., 2005) et animaux (van der Plasse et al., 2007), une réduction de 5-HT est associée à des déficits dans diverses tâches d’inversion des apprentissages mesurant la flexibilité cognitive et un traitement par les ISRS améliore la performance dans ces tâches (Brigman et al., 2010).

Suite à une réduction de la 5-HT chez l’humain, le changement attentionnel basé sur la dimension (attentional set-shifting), classiquement mesuré par le test de classement des cartes du Wisconsin (Wisconsin Card Sorting Test ; WCST), est négativement affecté

(Rogers et al., 1999). L’équivalent du même test chez le rongeur est la tâche de changement attentionnel intra- et extra-dimensionnel, qui consiste, par exemple, à faire creuser des souris dans des bols avec des odeurs, des textures ou des substances de creusage variées.

Dans cette tâche, des inversions d’apprentissage intra-dimensionnels (par exemple, l’odeur de cumin devient renforcée après que l’odeur de cannelle l’ait été pendant plusieurs essais), des changements attentionnels intra-dimensionnels (par exemple, le sable et le riz étaient les substances de creusage et le renforcement était déterminé par celles-ci, mais elles sont remplacées par du papier effiloché et des billes de plastique) et des changements attentionnels extra-dimensionnels (le renforcement était précédemment déterminé par l’odeur, mais devient dépendant de la texture) sont imposés aux rongeurs (Birrell & Brown,

2000; Colacicco, Welzl, Lipp, & Wurbel, 2002). Les lésions frontales nuisent à la performance des rongeurs dans cette tâche (Bissonette et al., 2008; Garner, Thogerson,

Wurbel, Murray, & Mench, 2006), tout comme le stress chronique et l’inhibition pharmacologique de la synthèse de 5-HT (Lapiz-Bluhm, Soto-Pina, Hensler, & Morilak,

2009). Cependant, les données sur le rôle de la 5-HT dans la tâche de changement attentionnel intra- et extra-dimensionnel sont contradictoires, les performances de rats ayant

été améliorées par des antagonistes (Hatcher et al., 2005) et par des agonistes (Burnham et al., 2010) des récepteurs 5-HT6.

La 5-HT jouerait également un rôle dans l’actualisation des délais (Crockett, Clark,

Lieberman, Tabibnia, & Robbins, 2010), tel que postulé par Schweighofer et ses collègues

(Schweighofer, et al., 2007). Enfin, la 5-HT a un rôle reconnu dans deux autres fonctions exécutives : l’inhibition de la réponse (Puumala & Sirvio, 1998), qui est déficitaire en cas de réduction de 5-HT, et la dévaluation des renforcements (Nonkes et al., 2010), qui cesse d’être observée chez les rats lorsque leurs taux de 5-HT sont augmentés.

Selon Homberg, une réduction importante des taux de 5-HT mènerait un individu à adopter un comportement automatique, centré sur le stimulus, son cortex préfrontal n’exerçant pas son plein contrôle sur les structures sous-corticales. Par contre, des taux normaux ou élevés de 5-HT permettraient d’adopter un comportement adaptatif, centré sur le but, le cortex préfrontal exerçant un contrôle sur les agissements. Les conduites adaptées seraient liées à l’état général de vigilance du sujet, généré par l’intégration d’informations utiles du point de vue motivationnel, rôle postulé pour la 5-HT (Homberg, 2012). Ce modèle de déficits exécutifs liés à la flexibilité cognitive s’appliquerait bien à l’impulsivité ainsi qu’aux comportements compulsifs, notamment ceux observés dans le trouble obsessionnel compulsif, actuellement reconnu comme un trouble anxieux, de même que la consommation excessive d’alcool (Fineberg, et al., 2010 ; pour un récapitulatif des théories, voir le Tableau 1.1).

Tableau 1.1 Résumé des théories du rôle de 5-HT dans le comportement Théories Auteurs et Rôles de 5-HT Faiblesse(s) Force(s) années Régulation Cools, Roberts - Réduit activation Expériences sur - Révision postulats des processus et Robbins, d'amygdale et rongeurs (go-go et go- (accent mis sur cortex émotionnels et 2008 augmente activation no go) et marmosets préfrontal et inhibition comporte- de cortex frontal face (inversion des comportementale) : mentaux à stimuli menaçants. apprentissages avec - Meilleure explication - Faibles taux de 5-HT ou sans nouveauté) d'importance du = déficits exécutifs, contredisent postulats traitement aversif, des mnésiques et originaux, car impact comportements d'apprentissage, en prédit des punitions désinhibés ou impulsifs raison d’augmentation n'est plus suffisant et de vulnérablité aux de l'importance pour expliquer ces stresseurs comorbides prédite d'impact des comportements avec troubles affectifs. punitions. - Bonne explication de l'efficacité des ISRS pour le traitement.

Modulation de Tops, Russo, - Incite à recherche de - Contredit les Permet d'expliquer le la fuite Boksem et sécurité et confort. données selon rôle de 5-HT dans Tucker, 2009 -P. ex., évitement de lesquelles faibles taux alimentation, stimuli anxiogènes et de 5-HT sont associés agressivité, inhibition de à comportements comportements comportements anxieux. prosociaux et agressifs. -Aide peu à expliquer dépression majeure. déficits performance cognitive. -Permet difficilement d'établir liens entre anxiété et consommation d'alcool.

Tableau 1.1 Résumé des théories du rôle de 5-HT dans le comportement (suite) Théories Auteurs et Rôles de 5-HT Faiblesse(s) Force(s) années Évaluation des Schweighofer, - Inhibe impulsivité - Données - Permet d'expliquer récompenses Tanaka et dans situations de expérimentales maintien de dépression futures Doya, 2007 renforcement différé. attribuent rôle à majeure, alcoolisme et -Basé sur 3ème 5-HT dans deuxième impulsivité. composante du composante du - Données en modèle d'impulsivité modèle d'Evenden : comportement animal d'Evenden (1999), réponses prématurées permettent de choix de petits lorsqu'il est préférable confirmer la validité du renforçateurs de retarder l'action. modèle. imminents au lieu de -Théorie insuffisante gros renforçateurs pour expliquer différés. influence de la 5-HT dans l'anxiété, outre impulsivité.

Modulation de Homberg, - Permet intégration Données - S’appuie sur des la prise de 2012 d'informations contradictoires quant données obtenues décisions sensorielles et aux fonctions des chez l'humain et émotionnelles, récepteurs l'animal. internes et externes, sérotoninergiques -Englobe de manière attendues et s'intègrent plus large les postulats inattendues. difficilement à la des théories de Cools -Mène à un état de théorie. et al. (2008) et vigilance affectant Schweighofer et al. positivement plusieurs (2007). processus -Permet d'expliquer le décisionnels. rôle de 5-HT dans comportements impulsifs, compulsions, anxiété et consommation d’alcool.

1.4 Tryptophane hydroxylase Plusieurs méthodes ont été utilisées pour moduler les taux de 5-HT chez des sujets humains et animaux et étudier le rôle de ce neurotransmetteur dans le comportement et la cognition. Bon nombre des expériences chez l’humain sur le rôle de la 5-HT dans le comportement et la cognition ont utilisé des diètes faibles en tryptophane (pour un exemple, voir Delgado et al., 1990) ou étudié l’effet de drogues agissant sur les taux de 5-

HT. Cependant, ces moyens ne produisent que des réductions intermédiaires et transitoires des taux de 5-HT ou entraînent aussi la modification des taux d’autres neurotransmetteurs

(Blier, 2001; Reith, Li, & Yan, 1997; van Donkelaar et al., 2011). Les expériences sur les animaux font fréquemment usage de drogues agissant sur la sécrétion de 5-HT (comme le p-CPA) et des lésions expérimentales des noyaux du raphé à l’aide de la toxine 5,7- dihydroxytryptamine (5,7-DHT), des méthodes qui ne peuvent évidemment pas être utilisées chez l’humain.

Les progrès de la recherche dans le domaine de la biologie moléculaire permettent maintenant de cibler des gènes précis contribuant à la synthèse des neurotransmetteurs.

L’utilisation de souris knockouts (chez lesquelles un gène a été retiré) ou de knockins (chez lesquelles un gène mutant a été introduit) permet de mieux modéliser les déficits des humains souffrant de réduction de 5-HT, et permet également un excellent contrôle des variables environnementales en conditions expérimentales (Homberg, 2012). Les lésions du raphé, les diètes réduites en tryptophane et les réductions pharmacologiques de 5-HT ne reproduisent pas bien les symptômes des personnes souffrant de réduction de 5-HT. Ces personnes ne subissent pas nécessairement de carences alimentaires en tryptophane et ne sont pas forcément cérébrolésées. Elles peuvent cependant être porteuses de mutations génétiques qui, au fil de leur développement, mettent probablement en place des mécanismes compensatoires que les approches non génétiques peuvent difficilement reproduire (Berger et al., 2012). Les mutations des gènes associés à la synthèse de 5-HT seraient donc des pistes à privilégier afin d’étudier le rôle des neurotransmetteurs dans diverses psychopathologies.

Les deux gènes codant pour la synthèse de l’enzyme tryptophane hydroxylase, soit

Tryptophane hydroxylase 1 (Tph1) et Tryptophane hydroxylase 2 (Tph2), sont très

prometteurs pour l’étude de la réduction génétique des taux de 5-HT. Ensemble, ils sont responsables de la synthèse de deux isoformes de cette enzyme entrant en jeu dans la transformation du tryptophane en 5-HT dans la quasi-totalité de l’organisme (Breidenthal,

White, & Glatt, 2004; Craig, Boularand, Darmon, Mallet, & Craig, 1991; Park, Stone,

Baker, Kim, & Joh, 1994; Walther et al., 2003; Zhang, Beaulieu, Sotnikova, Gainetdinov,

& Caron, 2004).

Tph2 serait principalement exprimé dans le système nerveux central (Zhang, et al.,

2004) alors que Tph1 contribuerait à la synthèse de la 5-HT ailleurs dans le corps

(principalement dans les intestins et le sang ; Chen et al., 2001; Gershon, 2005), de même que dans la glande pinéale (Patel, Pontrello, & Burke, 2004). L’expression de mutations du gène Tph1 est associée à certains troubles psychiatriques tels que la schizophrénie (Allen et al., 2008), le trouble bipolaire (Bellivier et al., 1998) et la dépression (Mann et al., 1997;

Roy, Nielsen, Rylander, Sarchiapone, & Segal, 1999). Certains des troubles associés à des mutations de Tph1 ont été attribués à des anomalies sérotoninergiques chez la mère des porteurs de la mutation, plutôt qu’au génotype lui-même. Une étude chez les souris démontre que les taux de 5-HT périphériques de la mère jouent un rôle important dans le développement du cerveau et d’autres tissus corporels ; les bébés de mères homozygotes knockout Tph1 présentant des anomalies que les bébés d’hétérozygotes et de souris de type sauvage (des membres de la même portée ne portant pas la mutation) n’avaient pas (Cote et al., 2007). La 5-HT sanguine, contenue dans les plaquettes, serait probablement celle qui contribue au bon développement du fœtus, car elle peut traverser les barrières placentaire et hémato-encéphalique.

Une attention plus particulière a été portée au rôle du gène Tph2 dans les troubles psychiatriques étant donné le lieu de son expression restreint au système nerveux central.

Plusieurs anomalies comportementales telles que l’autisme (Coon et al., 2005), le risque suicidaire (Ke, Qi, Ping, & Ren, 2006; Yoon & Kim, 2009), le trouble déficitaire de l’attention (Sheehan et al., 2005), le trouble bipolaire (Van Den Bogaert et al., 2006), la consommation, parfois abusive, d’alcool (Agrawal et al., 2011) et des troubles affectifs tels que l’anxiété et la dépression péripartum (Lin, Ko, Chang, Yeh, & Sun, 2009) seraient liés

à des mutations du gène Tph2. Cependant, d’autres données ne confirment pas le lien entre le gène Tph2 et plusieurs de ces anomalies comportementales (De Luca et al., 2005; Gacek,

Conner, Tennen, Kranzler, & Covault, 2008; Johansson et al., 2010; Mossner et al., 2006;

Mouri et al., 2009; Sheehan, Hawi, Gill, & Kent, 2007). Un lien a été établi entre une mutation de Tph2 chez l’humain et la gravité des symptômes anxieux dans des échantillons d’individus dépendants à l’alcool (Serretti et al., 2009). Il pourrait donc exister un lien entre une mutation de Tph2, ainsi que l’anxiété et la consommation d’alcool.

Le génotypage de 48 individus dans le cadre d’une étude sur la prise de risque

(Williams et al., 2003) a permis de déceler une mutation précise de Tph2, soit le polymorphisme à nucléotide unique G1463A qui voit remplacer le 1463ème nucléotide sur la séquence d’acide nucléique, habituellement guanine, par un nucléotide adénine sur l’ARN du gène. G1463A entraîne une modification des protéines qu’elle produit, soit les enzymes tryptophane hydroxylase du cerveau, dans laquelle l’acide aminé histidine substitue arginine à la 441ème position de leur séquence (R441H ; Zhang, et al., 2004;

Zhang, Beaulieu, Gainetdinov, & Caron, 2005; Zhang, et al., 2005a).

Les enzymes Tph1 et Tph2 font partie de la grande famille des acides aminés hydroxylases aromatiques qui inclut également la tyrosine hydroxylase (TH) et la phénylalanine hydroxylase (PAH; Hufton, Jennings, & Cotton, 1995). La structure des quatre acides aminés est donc très similaire. TH est en charge de la conversion de l’acide

aminé L-tyrosine en L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), un précurseur de la dopamine. PAH catalyse l’hydroxylation de phénylalanine afin que la tyrosine puisse être générée. L’alignement des séquences d’acides aminés dans ces enzymes chez les humains, les rats et les souris révèle que le 441ième acide aminé de la séquence est hautement conservé d’une espèce à l’autre sous la forme d’arginine. Une mutation (R408W) à la position correspondante sur PAH, qui remplace l’arginine par le tryptophane, semble abolir l’activité de PAH et serait associée à 10% des cas de phénylcétonurie (Scriver et al., 2003).

Cette découverte a poussé des chercheurs à examiner davantage la mutation G1463A de

Tph2, qui mène à la synthèse de protéines mutées R441H. L’introduction de cette mutation a mené à une réduction de ≈ 80% de la 5-HT dans des cellules phéochromocytomes (PC12) de rats et causé une réduction de ≈ 40 à ≈ 80% des taux de 5-HTP, indicateur de la production de 5-HT, dans le tissu de cerveaux de souris. Des résultats similaires ont été obtenus avec des cellules embryonnaires humaines (de reins) HEK 293 (Cichon et al.,

2008; McKinney, Turel, Winge, Knappskog, & Haavik, 2009). Bien que le lien entre Tph2 et plusieurs troubles psychiatriques soit relativement controversé, le polymorphisme à nucléotide unique G1463A serait à tout le moins associé à une forme rare de dépression majeure.

1.4.1 Tph2 chez l’humain Suite aux résultats obtenus sur les cellules PC12 en laboratoire, Zhang et ses collaborateurs (Zhang, et al., 2005a) ont évalué la fréquence d’apparition du polymorphisme à nucléotide unique G1463A du gène Tph2 dans trois populations humaines, soit des individus sans troubles psychiatriques (n = 219), des individus souffrant de dépression majeure (n = 87) et des individus souffrant de trouble bipolaire (n = 60).

Dans cet échantillon, neuf participants du groupe des patients dépressifs, trois participants du groupe contrôle et aucun participant du groupe des patients bipolaires étaient porteurs de l’allèle mutant 1463A. La fréquence d’apparition du gène mutant était significativement plus élevée chez le groupe dépressif que chez le groupe contrôle et il n’y avait aucune différence significative entre le groupe contrôle et les participants bipolaires.

Parmi les neuf participants dépressifs ciblés, six étaient porteurs d’allèles hétérozygotes (1463G/1463A) et trois, d’allèles homozygotes (1463A/1463A). De plus, sept d’entre eux avaient des antécédents familiaux de dépendance (à l’alcool ou autres drogues) ou de maladie mentale, six avaient fait des tentatives de suicide ou avaient déjà eu des idées suicidaires et quatre présentaient des symptômes de troubles anxieux sous- cliniques. L’un des points les plus intéressants observés chez ces neuf participants est que sept d’entre eux ne répondaient pas au traitement par inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (ISRS) alors que les deux autres y répondaient, mais uniquement aux plus hautes doses prescriptibles. Quant aux trois participants contrôles porteurs de la mutation, aucun trouble psychiatrique ne leur a été diagnostiqué. Cependant, ils présentaient tous des symptômes cliniques comorbides à la dépression : celui qui portait les allèles homozygotes avait des symptômes d’anxiété généralisée, alors que les deux portant des allèles hétérozygotes présentaient des symptômes de dépression et avaient des antécédents familiaux de maladie mentale et d’abus de substances. Les porteurs de l’allèle mutant

étaient donc plus à risque pour certains troubles mentaux que les non porteurs.

D’autres groupes de recherche se sont penchés sur la fréquence d’apparition du polymorphisme à nucléotide unique G1463A chez diverses populations humaines souffrant de troubles de l’humeur (Glatt et al., 2005; Van Den Bogaert et al., 2005; Zhou et al.,

2005). Ces études épidémiologiques incluant plusieurs milliers de participants n’ont pas

permis de retrouver l’allèle mutant parmi les échantillons, ce qui laisse supposer que cette mutation est probablement très rare chez l’humain et ne peut pas être associée directement à la dépression majeure, mais peut-être plutôt à un sous-type de sévérité élevée (Blakely,

2005). En réponse à ces travaux, les auteurs de l’étude originale (Zhang et al., 2005b) ont fourni des détails expliquant la relative fréquence de la mutation dans leur échantillon : les participants étaient tous âgés de plus de 60 ans, les patients psychiatriques étaient très sévèrement atteints et, dans plusieurs cas, étaient réfractaires aux traitements classiques.

Parmi les neuf participants du groupe dépressif portant l’allèle mutant, cinq étaient soumis régulièrement à une thérapie électro-convulsive alors qu’au total, 16 patients sur les 87 en avaient besoin. Étant donné que le recours à ce type de thérapie est relativement rare (Scott,

2004) et qu’une grande proportion des participants portant l’allèle mutant en recevait, il est probable que les individus portant le polymorphisme à nucléotide unique G1463A représentent une sous-catégorie de patients dépressifs dont les symptômes sont sévères et réfractaires à la plupart des traitements. Cependant, comme des critères diagnostiques précis n’existent pas actuellement pour ce sous-type de dépression et que les données sur ce trouble demeurent à l’heure actuelle très controversées, il serait préférable de se tourner vers les effets comportementaux directs d’une baisse de sérotonine entraînée par une mutation du gène Tph2.

Tel que mentionné précédemment, diverses mutations de Tph2 ont été associées à l’autisme, au trouble déficitaire de l’attention, au trouble bipolaire, à l’anxiété et à la dépression. Cependant, une expérience (Szily & Keri, 2012) a montré que des individus sains, atteints d’une mutation à Tph2, seraient déficitaires par rapport à des contrôles non porteurs, dans l’évaluation d’émotions négatives telles que l’anxiété et la tristesse. Aucune différence n’a été observée pour les émotions positives comme la joie. Ces chercheurs

39 associent les difficultés observées chez les porteurs de la mutation au développement du trouble obsessionnel compulsif et du trouble panique, deux troubles anxieux, ainsi qu’au trouble déficitaire de l’attention, une condition associée avec divers déficits de performance cognitive (Gualtieri & Johnson, 2008; Rutledge, van den Bos, McClure, & Schweitzer,

2012). De plus, il y a un lien entre une mutation de Tph2 et des traits de personnalité associés à l’anxiété, comme l’évitement des dommages (harm avoidance), ainsi que des troubles de personnalité des ensembles B et C, fréquemment comorbides aux troubles anxieux et de l’humeur, de même que la consommation abusive d’alcool (Gutknecht et al.,

2007; Reuter, Kuepper, et al., 2007). Des mutations de Tph2 ont également été associées à des troubles cognitifs, comme des déficits mnésiques et exécutifs (Reuter et al., 2008;

Reuter, Ott, Vaitl, & Hennig, 2007). Une mutation de Tph2 pourrait donc induire une vulnérabilité à la fois au niveau de l’anxiété, de la performance cognitive et de l’éthylisme.

1.4.2 Tph2 chez la souris Une méthode efficace d’observer les comportements induits par la mutation d’un gène est de synthétiser ce gène chez des animaux. Ainsi, Beaulieu et al. (2008) ont développé des souris portant une mutation équivalente au polymorphisme à nucléotide unique humain G1463A. Ces souris mutantes, dites knockin, portent, à l’instar des humains, une mutation du nucléotide guanine pour un nucléotide adénine, cependant, sur la

1449ème position de la séquence d’acides nucléiques. Cette mutation substitue l’acide aminé arginine par un acide aminé histidine, mais sur la 439ème base de l’enzyme Tph2.

Du point de vue moléculaire, les souris knockin souffrent d’une réduction importante de 5-

HT. Chez les knockins homozygotes (HO), le taux de synthèse de la 5-HT dans le cortex frontal, le striatum et l’hippocampe est réduit de ≈ 80% par rapport aux souris de même

lignée sans mutation (dites wildtype [WT], pour souris de type sauvage) alors que chez les hétérozygotes (HET), il est réduit de 40%, mais uniquement dans le cortex frontal. De plus, chez les souris HO, la 5-HIAA, un produit de la dégradation de la 5-HT, est réduite à des niveaux quasiment indétectables dans les trois régions mentionnées précédemment. Chez les HET, les niveaux de 5-HIAA ne sont pas significativement différents de ceux des WT.

Sur le plan comportemental, ces souris ont été testées dans des tâches d’activité locomotrice, de suspension par la queue, d’émergence noirceur-lumière et d’interactions sociales (Beaulieu et al., 2008). Aucune différence n’a été observée entre les groupes quant

à la locomotion de base (distance totale voyagée) lors d’une séance d’exploration libre de

30 minutes dans une chambre d’activité. Ce résultat indique que les autres effets comportementaux observés ne sont pas dus à une réduction de l’activité générale des sujets mutants.

Dans un test de suspension par la queue (tail suspension test) de 6 min, les souris

HET et HO demeurent immobiles significativement plus longtemps que les souris WT. Ce test est un bon indicateur du « comportement apparenté à la dépression » chez l’animal

(Steru, Chermat, Thierry, & Simon, 1985) et il est très sensible à l’effet des ISRS. Plus un rongeur se débat longtemps pour se libérer de l’appareil, moins on le considère comme résigné, ce qui fait du test un modèle animal populaire de la dépression (un temps d’immobilité élevé est considéré comme un « comportement apparenté à la dépression »).

L’utilisation de certaines drogues psychotropes (antidépresseurs, atropine et psychostimulants) réduit le temps d’immobilité des souris, alors que le diazépam l’augmente.

Le test d’émergence noirceur-lumière est composé d’un appareil divisé en deux compartiments, l’un fermé et sombre et l’autre ouvert et illuminé (voir Figure 1.4). Les

41 souris sont d’abord placées dans le compartiment sombre et laissées dans l’appareil pendant

5 min. L’expérimentateur enregistre le temps initial passé dans le compartiment sombre avant que le rongeur n’entre dans le compartiment éclairé, ainsi que le nombre d’entrées, le temps passé et l’activité locomotrice dans chaque compartiment. Ce test est souvent utilisé pour modéliser l’anxiété chez les rongeurs et il est sensible à l’effet des benzodiazépines

(Crawley & Goodwin, 1980) qui réduisent la latence d’entrée dans le compartiment lumineux, puis augmentent la distance parcourue et le temps passé dans ce compartiment.

Figure 1.4 Appareil d’émergence noirceur-lumière.

Les souris HET et HO prennent significativement plus de temps à entrer dans le compartiment lumineux et sont moins actives dans ce compartiment que les souris WT. De plus, les souris HO, mais pas les souris HET, traversent plus souvent la ligne séparant les deux compartiments pendant les 5 min de cette tâche (Beaulieu, et al., 2008). Ce test indique donc que les souris ayant un taux réduit de 5-HT présentent des comportements plus anxieux.

Quand elles sont soumises à un test d’interactions sociales dyadiques (Rodriguiz,

Chu, Caron, & Wetsel, 2004), les interactions sociales normales, comme renifler ou suivre l’autre souris, ne diffèrent pas chez les souris des trois génotypes. Par contre, les comportements agressifs varient selon le génotype : les souris HET passent significativement plus de temps à adopter des postures menaçantes à l’égard des autres que les souris WT, ce qui n’est pas le cas des souris HO. Par ailleurs, les souris HO passent significativement plus de temps à attaquer directement les autres souris que les souris WT et les souris HET, alors qu’il n’y a pas de différence significative entre ces deux groupes au niveau des attaques (Beaulieu, et al., 2008). Il y aurait donc des variations de l’agressivité chez les souris knockin, selon leur génotype.

D’autres chercheurs ont testé ces souris knockin dans différentes tâches (Jacobsen,

Medvedev, & Caron, 2012; Jacobsen, Siesser, et al., 2012). Les niveaux extracellulaires de

5-HT dans le cortex frontal et l’hippocampe sont réduits de 60 à 70% chez les souris HO.

De plus, aucun mécanisme compensatoire pour le transporteur de 5-HT ou la Monoamine

Oxydase (MAO) n’est apparent chez les mutantes; chez ces dernières, les taux de ces enzymes sont similaires à ceux des souris WT. De même, la proportion de récepteurs 5-

HT1A dans l’hippocampe des mutantes ne diffère pas. Cependant, les souris mutantes présentent un nombre anormalement élevé de récepteurs 5-HT2A dans le cortex frontal et leur réponse hypothermique accrue à la clonidine suggère de possibles changements dans le système noradrénergique. Malgré tout, la mutation ne semble pas être affectée significativement par des mécanismes homéostatiques compensatoires (Jacobsen, Siesser, et al., 2012).

Les souris mutantes démontrent également des signes d’anxiété dans un test d’enfouissement de billes, considéré comme un modèle animal de comportements

compulsifs (Broekkamp, Rijk, Joly-Gelouin, & Lloyd, 1986; Joel, 2006). Elles appuient moins sur un levier que les souris WT pour obtenir une récompense de lait condensé à des niveaux de dilution plus concentrés, notamment 25%, 50% et non dilué. Cependant, des tests de préférence au sucrose n’ont pas révélé de différence entre les souris WT et HO, peu importe la concentration utilisée. Les auteurs postulent donc un phénotype d’anhédonie limité à un paradigme particulier, possiblement modulé par l’effort à fournir pour obtenir un renforçateur (Jacobsen, Medvedev, et al., 2012).

Du point de vue électrophysiologique, une expérience récente (Dzirasa, Kumar,

Sachs, Caron, & Nicolelis, 2013) a montré que les oscillations des décharges neuronales, de type beta et delta, entre l’amygdale et le cortex préfrontal médian des souris knockin Tph2

étaient plus synchronisées que celles des souris WT. De plus, les oscillations intrastructurales de l’amygdale et du cortex préfrontal médian avaient également un niveau de synchronisation plus élevé. Un traitement chronique à la fluoxétine a contribué, chez les mutantes, à réduire, sans abolir, cette différence. Cette observation pourrait s’expliquer par un déficit du contrôle du cortex préfrontal sur la structure limbique qu’est l’amygdale. La déficience en 5-HT serait principalement responsable de ce dérèglement neuronal chez les mutantes, ce qui mènerait aux anomalies affectives détectables dans le comportement.

Des expériences effectuées dans notre laboratoire (Del’Guidice, et al., 2013) ont démontré, à l’aide d’un nouveau test comportemental appelé le labyrinthe en H, que les souris mutantes G1449A-R439H souffrent de déficits de performance dans une tâche de nature exécutive. Après l’apprentissage d’une tâche d’alternance dans un labyrinthe, qui requiert d’émettre deux réponses précises, les souris éprouvent des déficits importants dans l’apprentissage d’une nouvelle tâche de non alternance dans laquelle la répétition des réponses précédentes ne mène qu’à un taux de renforcement de 50%. Enfin, elles présentent

également un déficit dans une troisième tâche, une tâche d’inversion, dans laquelle un renforcement ne peut être obtenu qu’en inversant complètement son schème de réponses.

Les souris mutantes présentent également un phénotype de persévération : elles continuent

à émettre plusieurs réponses successives sans obtenir de renforcement. Dans cette expérience, l’injection de drogues sérotoninergiques, telles que 5-HTP, précurseur de la 5-

HT, et des agonistes des récepteurs sérotoninergique améliorent significativement les performances des souris mutantes, alors que l’injection d’une drogue dopaminergique, le méthylphénidate, empire les résultats de toutes les souris. Il en ressort qu’une partie des déficits observés dans la tâche serait causée par la déficience en 5-HT entraînée par la mutation.

Cependant, toutes les drogues sérotoninergiques n’ont pas un effet positif sur ces souris mutantes. L’administration chronique d’ISRS, notamment, la paroxétine ou la fluoxétine, mène à une réduction de la 5-HT tissulaire dans le cerveau des mêmes souris mutantes Tph2. En effet, les souris porteuses de la mutation et traitées aux ISRS pendant trois semaines présentent des taux de 5-HT équivalents à 1-3% de ceux des souris WT, une réduction dramatique (Siesser et al., 2013). Ces données permettent d’expliquer en grande partie pourquoi les sujets humains porteurs de la mutation s’avéraient réfractaires aux traitements par ISRS dans l’étude de Zhang et ses collaborateurs (Zhang, et al., 2005a).

Elles revêtent également une importance clinique majeure pour le traitement pharmacologique de patients potentiellement porteurs ou pour tout individu chez lequel la synthèse de 5-HTP par Tph2 est fortement réduite. En effet, chez ces individus, le fait de bloquer le transporteur de la 5-HT semble avoir des effets délétères ; les auteurs suggèrent plutôt d’opter pour un traitement au 5-HTP, dont la production découle de l’action de l’enzyme Tph2 sur le tryptophane et qui, par conséquent, contourne cette action.

Une récente série d’expériences s’est penchée sur les effets d’un stress chronique précoce sur l’anxiété, l’inhibition comportementale, le conditionnement de peur et la sécrétion de corticostérone chez les souris porteuses de la mutation G1449A (Sachs et al.,

2013). Dans le cas de ces expériences, les résultats des souris HO et HET ont été fusionnés, de sorte que les auteurs ont comparé les mutantes (KI) aux souris de type sauvage (WT). Le stress chronique auquel les souris étaient soumises lors des 14 premiers jours de leur vie

était un protocole de séparation maternelle d’une durée de 3 h par jour. Les tests ont été administrés lorsque les souris ont atteint l’âge de deux mois.

Les KI contrôles et les WT stressées couvrent moins de distance au centre d’un champ ouvert, ce qui est interprété comme une réponse anxieuse. Le stress précoce n’affecte pas les KI. Dans le labyrinthe en zéro surélevé, un couloir circulaire dans lequel deux sections sont couvertes et deux autres ouvertes, les expérimentateurs observent le temps passé dans les sections fermées (anxiété), comparé au temps passé dans les sections ouvertes. Des interactions sont observées au niveau du temps passé dans les sections ouvertes du labyrinthe, du nombre d’entrées dans ces sections et du nombre de positions d’étirement (stretch attend postures) vers ces sections. Dans les trois cas, chez les souris non stressées, les KI présentent des tendances à passer moins de temps, à entrer moins souvent et à s’étirer moins de fois vers les sections ouvertes, comportements indicatifs d’anxiété, alors que l’inverse est apparent chez les souris soumises au stress. Cependant, les effets inter-groupes ne ressortent pas statistiquement. Les auteurs concluent que le stress de séparation précoce a un effet modeste sur les comportements anxieux et que la mutation

étudiée peut modifier cette réponse (Sachs, et al., 2013).

Pour ce qui est de l’impulsivité, les KI stressées sautent plus souvent d’une plateforme élevée que les autres souris dans le test de l’évitement de falaise (cliff avoidance

47 test), qui consiste à placer les souris sur une plateforme de verre transparent de 12 cm de diamètre et élevée à 20 cm du plancher pendant 100 s. Dans le test d’évitement passif inhibiteur de descente (step-down inhibitory passive avoidance test), les KI ont une latence plus courte que celle des WT à descendre de la plateforme lors du rappel. Ce test consiste à placer les souris sur une plateforme d’acrylique élevée quelques cm au-dessus d’un plancher électrifié. Pendant l’entraînement, au moment de leur descente de la plateforme, elles reçoivent un choc électrique aux pattes, puis elles sont testées au rappel 1.5 h plus tard et leur latence à descendre est enregistrée (Prado, et al., 2006). Les auteurs concluent que la déficience sérotoninergique cérébrale mène à de la désinhibition comportementale (Sachs, et al., 2013). Dans un test de néophobie alimentaire avec privation alimentaire de 24 h, nourriture familière et environnement nouveau (champ ouvert), les souris KI stressées initient le comportement alimentaire plus rapidement que les KI contrôles et les WT stressées, ce qui est également interprété comme une forme de désinhibition comportementale causée par la déficience sérotoninergique et le stress précoce combinés.

La mutation n’a aucun effet sur le conditionnement contextuel de peur, alors que les souris soumises au stress de séparation maternel précoce passent moins de temps figées.

Le test de conditionnement consiste dans ce cas à placer les souris dans une cage de conditionnement et à présenter une fois un son avec un choc électrique, puis à les remettre dans la même cage 24 h plus tard et à évaluer le temps pendant lequel elles émettent une réponse de figement. Le stress chronique précoce affecte donc négativement l’apprentissage et la mémoire de peur contextuelle, sans égard au déficit sérotoninergique

(Sachs, et al., 2013).

Les niveaux de corticostérone plasmatique ont également été mesurés chez les souris. Aucune différence n’est détectée dans la condition de base. Cependant, tout de suite

après un stress de contention aigu de 15 min, les niveaux de corticostérone sont plus élevés chez les souris qui ont subi le stress chronique de séparation, sans égard au génotype. Ceci indique que ces souris présentent une réponse plus prononcée au stress aigu lorsqu’elles ont

été soumises à un stress chronique précoce. Les niveaux de cellules hippocampiques marquées à la bromodéoxyuridine (BrdU) après des injections effectuées 24, 16 et 4 h avant euthanasie, un indice de prolifération cellulaire, ne diffèrent pas entre les génotypes, alors que le stress de séparation précoce les réduit chez toutes les souris. Enfin, les niveaux de 5-

HT et 5-HIAA sont réduits de 65 à 70% dans l’amygdale des souris KI, en comparaison avec les souris WT (Sachs, et al., 2013).

Une autre mutation de Tph2, C1473G, mène à une réduction de 40% de la synthèse de 5-HT comparativement à des souris non porteuses (Zhang, et al., 2004). Cette mutation apparaît chez plusieurs souches de souris couramment utilisées en laboratoire, dont les

BALB/c et les DBA/2, par opposition aux souris C57Bl/6 et les 129X1/SvJ, qui ne sont pas porteuses. Chez des souris porteuses, les mutantes présentent une activité de l’enzyme

Tph2 significativement plus faible que les non porteuses. De plus, les mutantes présentent deux fois moins d’agressions entre les mâles et sont immobiles significativement moins longtemps dans le test de nage forcée (Forced Swimming Test), un analogue du test de suspension par la queue (TST) dans lequel les souris sont observées alors qu’elles nagent activement ou se laissent passivement flotter dans un bocal rempli d’eau. Cependant, elles ne présentent pas de différences en activité locomotrice, ni en thigmotaxie (Osipova, et al.,

2009). Ces résultats suggèrent que la mutation de Tph2 mènerait à un phénotype antidépressif, très similaire à ce qui est observé dans le test de nage forcée suite à l’administration d’ISRS. L’absence de différence obtenue en thigmotaxie suggère

également que ces mutantes ne présentent pas de phénotype anxieux, ce qui entrerait en

49 contradiction avec des données chez l’humain et chez l’animal, faisant appel à d’autres méthodes de réduction ou d’augmentation de la 5-HT, de même que certains modèles théoriques (Cools, et al., 2008; Fernandez & Gaspar, 2012; Homberg, 2012; Maron, Nutt,

& Shlik, 2012).

Une autre série d’expériences s’est penchée sur les effets comportementaux de la mutation C1473G, généralement associée aux souris de souches DBA/2 et BALB/c, introduite cette fois chez des souris C57Bl/6 (Berger, et al., 2012). Les résultats indiquent un phénotype d’anxiété dans le labyrinthe en croix surélevé, le labyrinthe en zéro, le test d’émergence noirceur-lumière et le test de néophobie alimentaire. Le labyrinthe en croix surélevé est un test très similaire au labyrinthe en zéro surélevé, mais dans lequel l’appareil est en forme de croix, avec deux couloirs opposés étant dotés de murs et les deux autres couloirs étant ouverts (voir Figure 1.5). Le temps passé dans les couloirs fermés est interprété comme un indice d’anxiété. Le test de néophobie alimentaire consistait dans cette expérience à placer une souris affamée dans un environnement nouveau, comme un champ ouvert ou une cage inconnue, puis à placer au centre de l’environnement un contenant rempli de nourriture familière. L’anxiété induit, chez les rongeurs, une latence plus élevée à initier le comportement d’alimentation et peut également conduire une souris à consommer moins de nourriture. D’autres variantes du même test introduisent un aliment nouveau dans un environnement connu, ou un aliment nouveau dans un environnement nouveau, pour induire la néophobie alimentaire.

Figure 1.5 Labyrinthe en croix surélevé (Source de l’image originale : site web de

l’Institut national sur l’abus de drogues (NIDA), http://www.drugabuse.gov/news-

events/nida-notes/2012/11/stress-receptor-mediates-lifelong-consequences-early-trauma).

Les résultats de Berger et al. (2012) dans le labyrinthe en croix surélevé indiquent que les souris mutantes entrent moins souvent dans les couloirs ouverts, passent plus de temps dans les couloirs fermés et parcourent moins de distance. Dans le labyrinthe en zéro, elles passent plus de temps dans les sections fermées. Dans le test d’émergence noirceur- lumière, elles prennent plus de temps à traverser une première fois vers le compartiment illuminé, y traversent moins souvent et y passent moins de temps. Dans le test de néophobie

51 alimentaire, elles prennent plus de temps à commencer à se nourrir. Les comportements généralement associés à un phénotype dépressif, comme l’immobilité dans le test de nage forcée et le test de suspension par la queue, ne sont pas affectés chez les souris mutantes.

Ces souris ne présentent pas d’anhédonie, telle que mesurée par un test de préférence au sucrose avec deux bouteilles (Berger et al., 2012).

La résignation apprise réfère à l’état dans lequel un animal a été préalablement exposé à une situation où il n’y a pas de contingence entre un comportement et une conséquence, i.e. que cette conséquence a 50% des chances d’apparaître à la suite du comportement et 50% en dehors de l’émission du comportement. Quand, plus tard, il y a une contingence entre le comportement et la conséquence, l’animal se comporte comme s’il

était encore dans une situation où il n’y a pas de lien et est dit « résigné ». Certains chercheurs associent la résignation apprise à des symptômes de dépression majeure dans des modèles animaux avec rongeurs (Sherman, Sacquitne, & Petty, 1982). Dans l’expérience de Berger et al. (2012), les souris ont été soumises au test de résignation apprise suivant, dans une cage d’évitement à deux compartiments : lors de la phase d’apprentissage, des chocs sont transmis dans le plancher des deux compartiments à intervalles imprévisibles; lors de la phase de test, la seconde journée, le plancher d’un seul compartiment est électrifié et ce stimulus aversif est annoncé par un voyant lumineux. La souris qui ne tente pas de changer de compartiment à la deuxième journée est résignée, ne percevant aucune contingence entre son comportement et la conséquence. Les souris mutantes ne présentent pas de différences avec les souris WT lors du test classique de résignation apprise dans une cage d’évitement à deux compartiments.

D’autres souris sont soumises à un stress chronique imprévisible de six semaines, pendant lequel elles sont exposées, d’une journée à une autre, à une privation d’eau, une

période de contention, de la litière mouillée, une absence de litière, une cage tournée à angle de 45°, à un prédateur (rat) au travers d’une grille ou à un cycle circadien inversé. Les souris des deux génotypes perdent du poids lors de ces procédures, la perte étant plus prononcée chez les souris mutantes. Les souris des deux groupes sont également plus immobiles dans le test de suspension par la queue et le test de nage forcée. Aucune différence n’apparaît au test de préférence au sucrose à deux bouteilles, ni dans les quatre tests d’anxiété (Berger, et al., 2012).

Suite à un traitement chronique de six semaines à l’ISRS escitalopram, visant à augmenter les taux de 5-HT cérébrale, la différence de latence à manger entre les souris mutantes et normales s’est estompée dans le test de néophobie alimentaire, le seul test qui

évaluait chez ces souris l’efficacité des ISRS dans le cadre de cette série d’expériences. La mutation C1473G peut donc être associée à un phénotype d’anxiété, apparent dans quatre tests comportementaux, sans que les mutantes ne démontrent pour autant de phénotype d’anhédonie ou de résignation apprise, plus souvent associés à la dépression. De plus, les souris mutantes sont plus vulnérables au stress chronique, tel que démontré par leur perte de poids, bien que cette vulnérabilité ne se soit pas traduite dans les tests comportementaux subséquents. Enfin, le comportement des souris mutantes s’améliore après un traitement chronique aux ISRS, ce qui n’était pas le cas avec la majorité des humains portant la mutation G1463A, ni des souris portant la mutation analogue.

Bien que leur objectif n’était pas d’étudier les différences dues au polymorphisme

C1473G de Tph2, des chercheurs ont comparé les réactions à un stress chronique chez des souris BALB/c, porteuses de la mutation, à celles de souris C57BL/6, non porteuses, dans divers tests comportementaux (Tannenbaum & Anisman, 2003). Les stresseurs chroniques

étaient variés (p. ex., contention de 15 min, cage avec odeur de chat pendant 1 h, privation

53 alimentaire pendant 12 h, injections intrapéritonéales de saline) et présentés sur une période de 60 j. Chez les souris BALB/c, la latence à sortir du compartiment sombre en émergence noirceur-lumière, le temps de nage active dans le test de nage forcée et le temps passé à manger dans un test de néophobie alimentaire (environnement nouveau) sont augmentés par le stress chronique, alors que les effets inverses ou une absence d’effet sont observés chez les souris C57BL/6. Les auteurs attribuent les trois modifications de comportement observées chez les BALB/c comme étant des indices d’anxiété (la nage active dans le test de nage forcée traduirait un niveau d’activation comportementale élevé par l’anxiété, alors que le temps à manger serait une forme de déplacement d’activité sous forme alimentaire).

Les auteurs concluent qu’en plus d’être naturellement plus anxieuses, les souris BALB/c sont également plus susceptibles au stress chronique (Tannenbaum & Anisman, 2003) ; il est donc possible qu’une mutation de Tph2 soit associée à une susceptibilité accrue au stress chronique.

D’autres chercheurs (Liu et al., 2011; Savelieva et al., 2008) ont créé des lignées de souris pour lesquelles l’isoforme Tph2 est complètement retiré (knockout ; KO). L’enzyme tryptophane hydroxylase 2 cesse de fonctionner chez ces souris, ce qui mène à une réduction encore plus importante du niveau de 5-HT dans le système nerveux central.

L’analyse des neurones sérotoninergiques de ces souris KO démontre que l’absence de l’enzyme tryptophane hydroxylase 2 ne produit pas d’altérations de la morphologie ou de la distribution des fibres sérotoninergiques et ne nuit pas à l’expression du transporteur de la

5-HT. Chez ces mêmes mutantes, la 5-HT est indétectable dans les neurones du noyau du raphé alors qu’elle est présente dans la glande pinéale, à l’intérieur de laquelle la 5-HT est synthétisée par Tph1 (Gutknecht et al., 2008).

Des souris KO de Tph2, KO de Tph1 et KO double (DKO ; Tph1 et Tph2) ont

également été générées et testées (Savelieva, et al., 2008). Aucune différence de comportement n’est rapportée entre les souris KO-Tph1 et les souris WT. Chez les mâles, les souris KO-Tph2 et les souris DKO sont plus légères et plus petites ; les femelles DKO ont un pourcentage de graisse corporelle moins élevé que les femelles WT. Les souris KO-

Tph2 et les souris DKO enterrent plus de billes dans un test d’enfouissage. Les mâles KO-

Tph2 sont immobiles moins longtemps dans le test de nage forcée. L’immobilité dans ce test est souvent inhibée par l’administration d’antidépresseurs, ce qui rend ce résultat surprenant. Les mâles et femelles DKO sont aussi immobiles moins longtemps et se débattent plus longtemps dans le test de nage forcée que les souris WT. Dans le test de suspension par la queue, considéré comme analogue, les souris KO-Tph2 présentent le même phénotype que les souris WT. Quant aux souris DKO, elles sont immobiles plus longtemps dans ce dernier test, ce qui entre en contradiction avec les résultats du test de nage forcée et démontre ici un effet de la mutation plus apparenté au phénotype dépressif.

Le KO de Tph2 affecte les comportements sexuels des souris mâles. Ces souris n’ont pas de préférence sexuelle pour les souris femelles, pour leur odeur génitale ou pour l’odeur de la litière dans laquelle elles ont passé 4 j, même si ces mâles sont capables de discriminer des odeurs sans valence sexuelle et présentent un intérêt similaire à celui des souris contrôles pour la copulation. Cependant, 35 min après une injection de 5-HTP, les knockouts mâles recommencent à présenter une préférence pour les femelles, leur odeur génitale et leur litière (Liu, et al., 2011). Il semblerait donc que l’absence de l’isoforme

Tph2 chez les souris mâles mène à une réduction importante de l’incitation motivationnelle pour les souris femelles, sans pour autant affecter la tendance motivationnelle à rechercher les contacts de nature sexuelle. L’injection d’un précurseur de la 5-HT vient rétablir la

55 motivation des souris, ce qui suggère un rôle pour ce neurotransmetteur dans la motivation sexuelle. Il serait donc possible de renverser des déficits comportementaux très divers, engendrés par une mutation de Tph2, à l’aide d’injections de 5-HTP.

Diverses mutations de Tph2 ont été étudiées et, selon la mutation ainsi que les méthodes utilisées, plusieurs phénotypes comportementaux, parfois contradictoires, ont été découverts. En raison de l’attrait particulier que peut avoir une mutation retrouvée chez une population humaine et ce, malgré sa rareté, l’équivalent murin de la mutation G1463A fera l’objet des expériences effectuées dans cette thèse. En effet, la possibilité de transposer ce modèle animal chez l’être humain paraît plus prometteuse, du fait des liens entre la mutation étudiée et la psychopathologie (Jacobsen, Medvedev, et al., 2012). De plus, le knockout de Tph2 est d’une grande utilité pour étudier la fonction du gène, mais une telle situation d’absence totale du gène dans un organisme est plutôt improbable chez l’humain et risque peu d’aider à comprendre davantage la psychopathologie chez ce dernier. Enfin, bien que la mutation C1473G ait originalement été découverte chez des souris communément utilisées en laboratoire (Zhang et al., 2004) et qu’elle ait une utilité certaine pour aider à la compréhension des fonctions de Tph2, aucune donnée publiée ne fait état de la découverte de patients psychiatriques humains portant cette mutation. Pour un résumé des données exposées dans la présente section, voir le tableau 1.2.

Tableau 1.2 Résumé des résultats chez les souris mutantes Tph2. Auteurs et années de Mutation Tests administrés Conclusions tirées chez les mutantes publication des articles étudiée Beaulieu et al., 2008 G1449A Activité locomotrice, Réduction de production de 5-HT de TST, émergence ≈ 40-80% ; comportements apparentés à noirceur-lumière, la dépression et l’anxiété, agressivité. interactions sociales. Aucun effet sur la locomotion. Jacobsen, Medvedev, G1449A Enfouissement de billes, Comportements apparentés à l’anxiété et al., 2012 ; Jacobsen, renforcement appétitif (compulsions) et phénotype d’anhédonie Siesser, et al., 2012 par appui sur levier. modulé par l’effort.

Dzirasa et al., 2013 G1449A Article principalement Dérèglement des oscillations des en électrophysiologie. décharges neuronales beta et delta entre amygdale et cortex préfrontal médian, dérèglement des oscillations intrastructurales propres à chacune de ces structures. Amélioration suite à un traitement chronique à la fluoxétine.

Del’Guidice et al., 2013 G1449A Labyrinthe en H. Déficits de flexibilité cognitive et persévérations. Amélioration suite à un traitement aigu aux médicaments sérotoninergiques. Détérioration suite à un traitement au méthylphénidate.

Siesser et al., 2013 G1449A Article principalement Réduction drastique de la 5-HT en pharmacologie. extracellulaire suite à l’administration chronique de paroxétine ou de fluoxétine.

Sachs et al., 2013 G1449A Stress chronique Effet modeste du stress chronique précoce, champ ouvert, précoce sur l’anxiété - la mutation peut labyrinthe en zéro moduler cette réponse. La déficience en surélevé, évitement de 5-HT cérébrale mène à de la désinhibition la falaise, évitement comportementale et le stress chronique passif inhibiteur de l’amplifie. Le stress chronique affecte descente, néophobie négativement l’apprentissage de peur alimentaire, contextuel, sans égard au génotype. Le conditionnement stress chronique, mais pas le génotype, contextuel de peur. fait augmenter le taux de corticostérone plasmatique et diminuer la prolifération cellulaire.

Osipova et al., 2009 C1473G Interactions sociales, Phénotype antidépressif, moins nage forcée, champ d’agressivité inter-mâles, anxiété ouvert, activité normale, aucun effet sur la locomotion. locomotrice. Enzyme Tph2 moins active.

Tableau 1.2 Résumé des résultats chez les souris mutantes Tph2 (suite). Auteurs et années de Mutation Tests administrés Conclusions tirées chez les mutantes publication des articles étudiée Berger et al., 2012 C1473G Labyrinthe en croix Comportements apparentés à l’anxiété, surélevé, labyrinthe en absence d’anhédonie ou de résignation zéro surélevé, apprise. Suite au stress chronique, perte émergence noirceur- de poids importante en l’absence de lumière, néophobie phénotype dépressif ou anxieux, alimentaire, préférence comparativement à contrôles. au sucrose, cage Amélioration du phénotype anxieux suite d’évitement à deux à l’administration chronique compartiments, stress d’escitalopram. chronique suivi de TST et nage forcée.

Tannenbaum & C1473G Stress chronique suivi Anxiété naturellement plus élevée et Anisman, 2003 d’émergence noirceur- susceptibilité au stress chronique accrue. lumière, nage forcée et néophobie alimentaire.

Gutknecht et al., 2008 KO Tph2 Article principalement Absence de fonctionnement de Tph2. en physiologie et en Aucune altération des fibres biologie moléculaire. sérotoninergiques ou de l’expression du transporteur de 5-HT. 5-HT indétectable dans les neurones du raphé, mais détectable dans la glande pinéale.

Savelieva et al., 2008 KO Tph2 Enfouissage de billes, Mâles plus petits, comportements nage forcée, TST. apparentés à l’anxiété (compulsions), phénotype antidépressif en nage forcée – absence de phénotype en TST. et

DKO (Tph1+ Idem. Mâles et femelles plus petits, comportements apparentés à l’anxiété Tph2) (compulsions), phénotype antidépressif en nage forcée et dépressif en TST.

Liu et al., 2011 KO Tph2 Préférences sexuelles, Absence de préférences en présence des odeurs génitales et d’une aptitude à discriminer des odeurs des litières de mâles et neutres et d’un intérêt normal pour la de femelles chez les copulation. Les préférences pour les mâles. femelles, leurs odeurs et leurs litières apparaissent suite à l’administration aigue de 5-HTP.

1.5 Problématique et hypothèses Étant donné le large éventail de troubles liés à de faibles niveaux de 5-HT, tels que la dépression, l’anxiété, l’autisme et plusieurs déficits cognitifs, les souris porteuses du polymorphisme à nucléotide unique G1449A du gène Tph2 constituent un modèle animal très intéressant pour des conditions similaires chez l’humain. Qui plus est, l’introduction de polymorphismes naturels présente certains avantages sur l’approche par knockout (qui retire complètement des gènes) car une certaine fonctionnalité des enzymes est conservée, comme pour les gènes mutants chez l’humain. Ceci augmente le pouvoir comparatif du modèle avec les troubles liés aux déficits sérotoninergiques chez l’humain (Jacobsen,

Medvedev, et al., 2012).

Cependant, seuls quelques tests comportementaux effectués avec ces souris ont fait l’objet d’articles scientifiques. De plus, bien qu’un article ait récemment exposé les effets d’un stress chronique sur les souris porteuses de cette mutation précise de Tph2 (Sachs, et al., 2013), il s’agissait d’un stress de séparation maternel précoce, pour lequel les tests comportementaux administrés étaient différés de plusieurs semaines. Aucune publication ne présente les résultats des effets d’un stress chronique plus récent sur les comportements des souris, afin d’en déterminer leur niveau de vulnérabilité. En outre, peu de ces expériences ont permis d’évaluer, avec plusieurs mesures, le phénotype anxieux des souris afin de comparer l’effet de celui-ci sur leurs performances cognitives. En effet, sachant que des organismes à 5-HT réduite ont tendance à souffrir d’anxiété, il est fort possible que leurs déficits dans des tâches de nature cognitive soient, en partie ou en totalité, dus à des

émotions négatives. Enfin, bien que des expériences aient évalué la motivation de ces souris à consommer du sucrose, leur niveau de préférence pour l’alcool et leur motivation à en consommer n’ont pas fait l’objet de travaux publiés.

Pour avoir un portrait plus clair du phénotype anxieux, i.e. pour analyser les effets d’un polymorphisme à nucléotide unique G1449A sur les comportements apparentés à l’anxiété, sur les performances cognitives, sur la motivation et les comportements

éthyliques, il est nécessaire d’explorer davantage les différences observables entre les souris porteuses et celles n’exprimant pas cette mutation.

Pour ce faire, des tests d’anxiété, motivationnels, de préférence à l’alcool et cognitifs sont administrés aux souris porteuses du gène mutant Tph2 homozygote ou non porteuses. Considérant les résultats des expériences précédemment décrites sur la réduction de 5-HT chez l’humain et chez l’animal, ainsi que les plus récentes théories décrivant le rôle de ce neurotransmetteur dans le comportement, il est possible de formuler les prédictions suivantes :

- Les souris HO présenteront des comportements d’anxiété dans les tests mesurant

ce paramètre. Suite à l’exposition à un stress chronique récent, les souris WT

présenteront également des comportements anxieux. Cependant, l’anxiété des

souris HO devrait dépasser celle de tous les autres groupes lorsqu’elles seront

soumises à un stress chronique récent.

- Des travaux dans notre laboratoire (Del’Guidice, et al., 2013) révèlent des

déficits de performance cognitive chez les souris HO. Les résultats devraient

être reproduits ici, avec l’observation supplémentaire des effets d’un stress

chronique sur la performance, afin de déterminer l’apport de l’anxiété dans cette

dernière.

o Suite à l’administration d’un stress chronique, les souris WT devraient

présenter des performances inférieures à celles observées dans la condition

sans stress ; la performance des souris HO devraient également être

davantage affectée que celle des souris WT, les rongeurs prédisposés à

l’anxiété étant habituellement plus sensibles aux effets du stress chronique

sur la performance cognitive (Bellani, Luecken, & Conrad, 2006).

- Enfin, les souris HO présenteront une plus forte préférence à l’alcool que les souris

WT et cette préférence se maintiendra en condition aversive, i.e. quand l’alcool est

mélangé à de la quinine.

Les deux chapitres suivants présentent les expériences effectuées afin de fournir des

éclaircissements aux questions précédentes. Ces deux articles de nature empirique, rédigés en anglais, contiennent les détails méthodologiques relatifs à ces expériences, ainsi que les résultats obtenus. Un chapitre de discussion fait suite à ceux-ci, intégrant les résultats empiriques avec la littérature couverte dans le présent chapitre.

CHAPITRE 2

Anxiety and cognitive performance after chronic stress in mice with human tryptophan hydroxylase 2 loss of function mutation

Francis Lemay, B.A. 1,2, François Y. Doré, Ph.D. 2, and Jean-Martin Beaulieu, Ph.D. 1,3

1 Institut universitaire en santé mentale de Québec, 2601, chemin de la Canardière, Québec, Québec, Canada 2 École de psychologie, Université Laval. Pavillon Félix-Antoine-Savard, 2325, rue des Bibliothèques, Québec, Québec, Canada 3 Département de psychiatrie et de neurosciences, Faculté de médecine, Université Laval. Pavillon Ferdinand-Vandry, 1050, avenue de la Médecine, Québec, Québec, Canada.

2.1 Résumé

Les niveaux d’anxiété et les performances cognitives des souris knockin Tph2 G1449A-

R439H de type sauvage (WT-C) et homozygotes (HO-C) sont évalués, alors que certaines d’entre elles (WT-S et HO-S) sont préalablement soumises à un stress chronique de contention. Les tests d’émergence noirceur-lumière et de labyrinthe en croix surélevé sont administrés pour évaluer l’anxiété, alors que le test de labyrinthe en H sert à évaluer leurs performances cognitives. Les souris HO-C et WT-S présentent un phénotype anxieux dans les deux premiers tests, comparativement aux souris WT-C ; elles ont également des taux de complétion plus bas et font plus d’erreurs de persévération dans le labyrinthe en H. Dans les tests administrés, le stress chronique n’affecte pas les comportements des souris HO.

Les implications de ce résultat sont discutées. L’anxiété semble être un facteur clé entre la réduction de sérotonine cérébrale et les déficits subséquemment observés dans les tâches cognitives chez les rongeurs.

2.2 Abstract Background: The serotonergic system is involved in both anxiety and cognitive performance.

Tph2 G1449A-R439H knockin mice are considered an interesting model of serotonin depletion such as it can be found in humans. Data show that they present heightened anxiety and deficits in cognitive tasks. Consequently, we proposed to assess and compare their anxiety levels and their cognitive performances, as well as their susceptibility to chronic stress in both kinds of tasks. Method: Wildtype (WT-C) and homozygote (HO-C) Tph2 G1449A-R439H knockin mice were used, and some (WT-S and HO-S) were administered a 2 h per d, 4 consecutive d chronic restraint stress protocol to verify their susceptibility to stress. The anxiety levels of mice were then assessed on the elevated plus maze and light-dark emergence tests. Their cognitive performances were also assessed using the H-Maze, an automated apparatus measuring spatial learning, cognitive flexibility and response inhibition. This task consists in successively learning three spatial rules for obtaining reinforcement in an odor-guided environment. Results: In the anxiety tests, HO-C and WT-S showed more anxiety-like behavior than WT-C. In the H-Maze test, HO-C and WT-S presented lower completion rates and did more perseveration errors than WT-C mice. After chronic stress, the behaviors of HO and WT mice were similar to those of unstressed HO mice. Conclusion: HO-C mice present an anxiety-like phenotype, as do WT-S mice. HO mice seem to possess some resiliency to stress or adapted to chronic stress faster than other mice, in that chronic stress did not affect their behavior. Anxiety appears to be a key mediating factor between serotonin depletion and subsequent deficits observed in cognitive tasks in rodents.

2.3 Acknowledgements

The authors wish to thank Carolyne Jean, Jean Levasseur-Moreau, and Thomas Del’Guidice for their help with behavioral testing, as well as Nathalie Bouchard and Kathye Aubé for the management of the mouse colony throughout the experiments. Funding for this article was provided by grants from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to J.-M.B. and the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) to F.Y.D. F.L. was financially supported by a doctoral scholarship from NSERC.

2.4 Introduction Individuals afflicted with affective disorders, such as anxiety and mood disorders, tend to present deficits of memory, attention, and/or executive functioning (Butters et al.,

2011; Castaneda, Tuulio-Henriksson, Marttunen, Suvisaari, & Lonnqvist, 2008; Gualtieri &

Morgan, 2008; Koso & Hansen, 2006; Lyche, Jonassen, Stiles, Ulleberg, & Landro, 2010;

O'Toole & Pedersen, 2011). Numerous environmental factors, including daily stressors and traumatizing life events, can trigger episodes of heightened anxiety and depression

(Goenjian et al., 2000; McWilliams, Cox, & Enns, 2003). Such stressors may also affect the performance of individuals without affective disorders in tasks measuring memory or executive functions (Dresler, Meriau, Heekeren, & van der Meer, 2009; Gass & Curiel,

2011).

It is assumed that serotonin is involved in various affective disorders (Baldwin &

Rudge, 1995) and the serotonergic system is a prime target in pharmacological treatments for anxiety and depression (Gerard, Liard, Crochard, Goni, & Millet, 2012; Hollingworth,

Burgess, & Whiteford, 2010; Ressler & Nemeroff, 2000). However, most medications targeting the serotonergic system also affect other neurotransmitter systems (Hyttel, 1994;

Lucki & O'Leary, 2004). Consequently, the role of serotonin in human anxiety and mood is still debated (Heninger, Delgado, & Charney, 1996; Lacasse & Leo, 2005). Serotonin is also involved in executive functioning as shown by experiments using acute tryptophan depletion in individuals with no apparent psychological illness (Riedel, Sobczak, &

Schmitt, 2003; Roiser et al., 2006; Roiser et al., 2008; Roiser, Muller, Clark, & Sahakian,

2007). Yet, results on the effects of acute tryptophan depletion on cognition and mood in humans have been inconsistent (Clark et al., 2005; Heninger, et al., 1996; Moore et al.,

2000). Biological mechanisms not directly related to serotonin may be partially responsible

67 for the observable effects of acute tryptophan depletion such as a decrease in the activity of the enzyme nitric oxide synthase or reduced rates of kynurenine metabolites (van

Donkelaar et al., 2011).

One possible approach to clarifying the role of serotonin in behavior and improving experimental control is to use knockin and knockout mouse models of genetically induced serotonin depletion (Homberg, 2012). One such animal model is the Tph2 G1449A-R439H knockin mouse, which was engineered after the discovery of the single nucleotide polymorphism G1463A among a cohort of patients with major depression, many of whom also presented anxiety symptoms (Zhang et al., 2005).

This single nucleotide polymorphism is known to reduce brain serotonin synthesis by affecting tryptophan hydroxylase, the rate-limiting enzyme in serotonin synthesis. In knockin homozygous mutant mice carrying the homologous mutation G1449A, brain serotonin synthesis is reduced by ≈ 80% (Beaulieu et al., 2008). At the behavioral level, homozygote Tph2 G1449A-R439H knockin mice showed signs of an anxious-like phenotype. Compared to wildtype controls, they exhibited longer immobility in the tail suspension test, longer latency to cross to the illuminated compartment in the light-dark emergence test, a higher level of inter-male aggression (Beaulieu, et al., 2008), lower rates of lever-pressing for a high quality reward, and more marble burying (Jacobsen et al.,

2012).

In recent experiments (Sachs et al., 2013), the signs of anxiety in these mice were replicated in the open field test and the results demonstrated that a mild early life stress, like maternal separation, increased the frequency of anxiety-like behavior in controls, but did not further affect it in mutants. In the same series of experiments, results obtained in neophobia and cliff avoidance tests suggest that early maternal separation impaired

behavioral inhibition in knockin mice. Observations made in our laboratory also show that knockin mice are impaired on a spatial learning task requiring cognitive flexibility and response inhibition. Heterozygote and homozygote knockins present important deficits, including perseverative behavior, and these deficits are partially reversed by the administration of serotonergic agents. However, it is known that anxiety and chronic stress may negatively affect performance on cognitive tasks in humans (Castaneda, et al., 2008;

Gass & Curiel, 2011) and rodents (Conrad, Galea, Kuroda, & McEwen, 1996), and given the anxiolytic effects of serotonergic drugs (Bandelow et al., 2012; de Angelis, 1996;

Mirza, Nielsen, & Troelsen, 2007; Witkin, 2008), it is hard to tell whether the deficits of

Tph2 G1449A-R439H knockin mice in cognitive tasks are a direct result of serotonin depletion or if they are mediated by anxiety.

The relationship between serotonin, anxiety, and cognition has yet to be studied in

Tph2 G1449A-R439H knockin mice. In Sachs et al.’s experiments (Sachs, et al., 2013), mice’s behavior was assessed after an early chronic stress but with the exception of fear conditioning, no other cognitive tasks were administered. A recent, acute restraint stress was used prior to assessing levels of plasma corticosterone but not before behavioral tests.

In the present experiment, we use a relatively mild, recent chronic restraint stress to assess its effects on Tph2 G1449A-R439H knockin mice in various tests measuring anxiety-like behavior, as well as in a recently developed cognitive test, the H-Maze.

The protocol used for chronic stress in the present experiment consists in physically restraining mice for 2 h per day, on four consecutive days. This protocol, which involves a relatively mild stress compared to what is generally used (Buynitsky & Mostofsky, 2009;

Najafi et al., 2013; Tian et al., 2013; Zeeni et al., 2013), was selected because we expected high susceptibility to recent chronic stress in homozygote mutants. Indeed, some mouse

69 strains, such as BALB, which carry a different polymorphism of Tph2 (Zhang, Beaulieu,

Sotnikova, Gainetdinov, & Caron, 2004), do present a strong behavioral response following chronic stress (Tannenbaum & Anisman, 2003). The chosen protocol has been shown to induce a higher level of anxiety than the unstressed control condition (Cancela, Rossi, &

Molina, 1991; Gameiro et al., 2006; Stone & Platt, 1982). Anxiety is assessed by two tests: the light-dark emergence and elevated plus-maze tests. The H-Maze test is used to assess learning and working memory, but mostly cognitive flexibility and inhibition of a learned response.

2.5 Materials and Methods

2.5.1 Animals Engineering of G1449A-R439H Tph2 knockin mice has previously been described

(Beaulieu et al., 2008). All mice were individually housed in an air-conditioned, humidity- controlled room in which temperature was kept between 22 and 23°C. They were maintained on a 12h-12h light-dark cycle (lights on at 7AM). Wildtype (WT) littermates were used as controls for mutant homozygote mice (HO) in which the rate of brain serotonin synthesis is reduced by ≈ 80%. All mice were naïve and aged 3 to 4 months at the beginning of the experiment. Food and water were available ad libitum, except for mice undergoing the H-Maze task, which were water-deprived (see H-Maze section). All procedures were conducted in accordance with the Comité de protection des animaux de laboratoire de l’Université Laval, which is responsible for the application and enforcement of the regulations of the Canadian Council on Animal Care in Science.

2.5.2 Chronic Stress Protocol In order to elicit anxiety in mice, a 4 d chronic restraint stress protocol was used.

For 2 h/day, mice were restrained into a closed translucent Plexiglas tube (11.5 cm long,

2.8 cm in diameter) with 20 holes drilled on its contour to facilitate breathing. The shape of the tube was deliberately selected to resemble the H-Maze, which is mainly made up of larger cylinders (see H-Maze section). During the 2-h restraint, the tube was placed in the home cage. The beginning of this procedure varied randomly between 10 AM and 2 PM in order to maintain an unpredictable stress throughout the 4 d period. Unstressed control and mutant mice were identified as WT-C and HO-C respectively, whereas chronically restrained control and mutant mice were part of groups WT-S and HO-S, respectively.

2.5.3 Anxiety Tests All WT-C and HO-C mice used in the anxiety tests were experimentally naïve and came from independent cohorts, one for each anxiety test administered. However, due to a shortage in the colony, the same 14 WT-S (n =5 males, 9 females) and 12 HO-S (n = 4 males, 8 females) mice were used in both anxiety tests: to avoid learning effects, they were randomly assigned to begin on either test. These took place on the day following the last exposure to chronic stress.

Light-dark Emergence Test. Fifteen WT-C mice (n = 7 males, 8 females) and 16

HO-C mice (n = 8 males, 8 females) were used in this test. Mice were placed in a square- shaped open field (28.5 cm x 28.5 cm x 20.5 cm) that was divided into two compartments, one covered with opaque black acrylic, the other open (Med Associates, Inc., St. Albans,

VT). The apparatus rested on a table 90.5 cm above the floor. A light source (60W, 130V) illuminated the open compartment. Lighting was kept at 600 ± 10 lux during the test, after preliminary (unpublished) observations indicating that most WT mice did not come out of

71 the covered compartment under higher illumination. Mice were initially placed in the dark compartment (13.5 cm x 28.5 cm x 20.5 cm) and were free to roam for 5 min as beam breaks were recorded. Time spent in the open, illuminated compartment and distance covered in both compartments was recorded. In order to mask olfactory cues, all surfaces of the apparatus were thoroughly cleaned with a 30% alcohol solution after each mouse.

Elevated Plus Maze Test. Twenty-five WT-C (n = 12 males and 13 females) and 20

HO-C (n = 9 males, 11 females) mice were used in this test. Mice were placed on a white, opaque acrylic cross-shaped maze with four arms (each 30 cm length, 5 cm width). Two opposite arms had 14 cm tall walls (closed arms), while the other two did not (open arms).

The maze rested on a table, 125 cm above the floor. A webcam (LifeCam Cinema,

Microsoft, Redmond, WA) was fixed 82 cm above the maze and mice were filmed for 5 min. At the beginning of the test, the mouse was placed in the middle of the maze, its head pointing toward a closed arm. In order to calculate the time spent in open arms and time spent in motion, an experimenter blind to the genotypes of the mice analyzed the videos with the software ANY-Maze (Stoelting Co., Wood Dale, IL). The floor and walls of the elevated plus-maze were thoroughly cleaned with a 30% alcohol solution before a new mouse was introduced.

2.5.4 H-Maze Test Mice were first submitted to the chronic stress protocol before being tested in the H-

Maze: 8 WT-C (n = 5 males, 3 females), 8 HO-C (n = 5 males, 3 females), 8 WT-S (n = 6 males, 2 females) and 8 HO-S (n = 3 males, 5 females) mice were used. The chronic stress protocol began 1 d before familiarization to the H-maze. The H-maze is an H-shaped apparatus with two cylindrical chambers (C1 and C2) connected by a plastic tube (23 cm

long, 5 cm in diameter). Each testing chamber is made of two plastic tubes 5 cm in diameter, connected to an empty plastic cube. Cube sides are 6 cm. All tubes are made up of two halves (top and bottom) which can be separated. The top halves can be removed to clean the maze. On top of the cubes, inverted fans ejected neutral or scented air from the outside extremities of the tubes connected to the cubes. At each lateral extremity of the testing chambers, a water port was located above the air and odor ports. The activity of a mouse was detected by photoelectric cells located 5 cm away from each tube extremity and

5 cm away from both extremities of the connecting straight tube.

In the experiment, odor may be ejected through all lateral extremities of the testing chambers at a flow rate of 5 L/min by forcing clean air (0.7 bar) through two Erlenmeyer flasks that contained 200 ml water mixed with 5 g/L isoamyl acetate (Sigma-Aldrich).

Neutral air (1000 ml Erlenmeyer flask containing 200 ml of water) was ejected at the same flow rate on both sides of the testing chambers. The H-maze was set on a square table, 160 cm above the floor. Inside the maze, mice moved freely and all procedures and recordings were controlled by a computer, via a program developed using Lab View software

(National Instruments, Nanterre, France). Mouse behavior was observed directly in the testing room.

Familiarization. Testing in the H-Maze was preceded by three days of familiarization. The day before familiarization, water bottles were removed from all mice’ home cages. From this moment on, water was only available to mice for 5 min in the AM, immediately after the end of familiarization trials, and then for 5 min beginning at 4:30 PM

± 15 min. Mice were weighed in the morning of each day.

On each daily familiarization session, mice were individually placed in the H-maze for 10 min by lifting the top half of the connecting tube. On the first day, mice ran freely

73 throughout the maze with water and odor delivered ad libitum. The odor was an olfactory cue that kept the olfactory environment constant between sessions, with the aim of reducing the anxiogenic effect of novelty. At the end of the session, the mouse was returned to its home cage, had access to water for 5 min, and was subsequently water deprived. On the second day of familiarization, the odor was ejected from each extremity of one of the two testing chambers, which was randomly chosen. When the mouse crossed one of the photocells, 10 µl of water were delivered. The same odor was ejected inside the second testing chamber until the mouse crossed one of the two photocells to get the same reward.

This automated odor ejection was maintained for 10 min. On the third day of familiarization, the same odor was ejected from only one end of a testing chamber

(randomly chosen). When the mouse reached the end of that tube, 10 µl of water were delivered. When the mouse went to the next randomly chosen extremity with the odor, 10

µl of water were distributed again, and so forth for 10 min. After 3 d of familiarization, it was assumed that most control mice would have learned the odor-reward association.

Test session. Before the test session, mice were weighed again to verify that they had reached 85% ± 5% of their initial weight. At the beginning of the test session, the mouse was introduced into the apparatus by lifting the top half of the connecting tube.

When the mouse was in the middle of the tube, the same odor was ejected from both extremities of one randomly chosen chamber. During the whole training session, scented air guided the mouse to the chamber where the reward was delivered without indicating which side to choose. The response was given by crossing one of the two photocells at the extremities of the chamber. The reward (10 µl) was only delivered when the mouse chose the correct side. When the mouse crossed the photocell located at the end of the connecting tube toward the next chamber, the odor was ejected at both extremities of the chamber.

Once again, the mouse had to go to one extremity to try and obtain the reward. Between trials, neutral air was ejected in both chambers. The test was administered without interruption until a criterion of four consecutive successful trials was attained at each phase, or a total time limit of 60 min was reached, whichever came first. The criterion was chosen on the basis of results from published experiments (Belhaoues, Soumireu-Mourat, Caverni,

& Roman, 2005; Del'Guidice, et al., 2009).

INSERT FIGURE 2.1.

Three different rules had to be discovered (Figure 2.1): an alternation rule

(alternation phase [ALT]), a non-alternation rule (non-alternation phase [N-ALT]) and a reversal rule (reversal phase [REV]). All three phases were performed in succession. The rule switched automatically once the criterion or the time limit was reached. At the end of the session, the mouse was returned to its home cage with water available ad libitum.

In the first phase (ALT), mice had to learn to alternate between both chambers of the H-maze (alternating between turning left in C1 and turning right in C2). In the second phase (N-ALT), mice had to inhibit the response learned in the first phase. The appropriate response in the N-ALT phase was to always turn to the same side when entering a chamber.

Maintenance of the ALT strategy under N-ALT conditions would result in a 50% reward rate. Once the criterion or the time limit was reached, the third phase (REV) started. The mouse had to perform the opposite strategy to the one learned in the N-ALT phase: it had to always turn to the same side, except it was the opposite side to that assigned in the N-ALT phase. Maintenance of the N-ALT strategy would result in a 0% reward rate.

Analyses were made on the number of mice having completed each phase of the test and on the overall (regardless of phase) frequency of perseveration errors, that is, consecutive unreinforced trials in series of six or more.

2.5.5 Statistical analyses Analyses used SPSS version 17.0 (IBM, Armonk, New York). The number of mice having completed each phase was analyzed with Mann Whitney U tests. Other data were analyzed using Two-Way ANOVAs with Genotype X Stress (2 X 2) as factors. For these, outliers were withdrawn from analyses, on a test by test basis. A result that was 1.5 interquartile ranges below the first quartile or above the third one for variables related to a specific test was considered an outlier (Tukey, 1977; Frigge, Hoaglin, & Iglewicz, 1989).

Significance levels were set at .05 and when the interaction was significant, one-tailed post- hoc t-tests with the Holm-Bonferroni correction (Holm, 1979) were performed. In those cases, comparisons between WT-C and WT-S, between HO-C and HO-S, between WT-S and HO-S, between WT-C and HO-C, then between HO-C and WT-S, were analyzed.

Therefore, for post-hoc tests, the alpha levels were set at .01, .0125, .017, .025, and .05. In cases of unequal variances between groups, t-tests with degrees of freedom modified accordingly were done; their t values are reported with a t′ in the Results section.

2.6 Results

2.6.1 Light-dark Emergence Test INSERT FIGURES 2.2 AND 2.3

One WT-C female, one HO-C female, one WT-S female and two HO-S males were withdrawn from analyses on this test because their scores were considered statistical outliers. There was no significant effect of Genotype, F(1, 48) = 2.307, of Stress, F(1, 48) =

.464, or a Genotype X Stress interaction, F(1, 48) = 2.157 in total distance covered.

Locomotor activity did not differ between mice of the two genotypes and was not affected by chronic stress (Figure 2.2A). As for time spent in the illuminated area (Figure 2.2B), the effect of Stress, F(1, 48) = 8.674, p < .01, was significant, just like the Genotype X Stress

Interaction F(1, 48) = 10.266, p < .01 (Figure 2.3), but the effect of Genotype, F(1, 48) =

1.376, was not. Post-hoc tests showed that the time spent in the illuminated compartment was significantly lower in WT-S than in WT-C, t′(17.869) = 4.016, p < .001, but there was no significant difference between HO-C and HO-S mice, t(23) = -.219. No difference was apparent between stressed mice of both genotypes, t(21) = -2.068. HO-C mice spent significantly less time in the illuminated compartment than WT-C mice, t(27) = 2.738, p <

.017, but they did not differ from WT-S mice in that regard, t(26) = -1.672. The avoidance of the illuminated compartment, indicative of anxiety, was higher in unstressed HO mice than in unstressed WT mice, while it was increased by chronic stress in WT mice, but not in HO mice. Stressed WT mice presented an equal level of anxiety-like behavior to that of unstressed, as well as stressed, HO mice.

2.6.2 Elevated Plus Maze Test INSERT FIGURES 2.4 AND 2.5

Two WT-C males, two HO-C males, two WT-S males and one HO-S female mice were withdrawn from analyses on the elevated plus-maze due to their scores being outliers.

No effect of Genotype, F(1, 60) = 1.521, Stress, F(1, 60) = .007, nor Genotype X Stress interaction, F(1, 60) = .444, was found for total time spent in motion inside the maze

(Figure 2.4A). Locomotor activity did not differ between mice of the two genotypes and was not affected by chronic stress. As for time spent in open arms (Figure 2.4B), the

Genotype X Stress interaction was significant, F(1, 60) = 6.325, p < .05 (Figure 2.5), but not the effect of Genotype, F(1, 60) = .388, or of Stress, F(1, 60) = 1.548. Post-hoc tests showed that WT-C spent significantly more time than WT-S mice, t′(23.299) = 3.059, p <

.0125, in the open arms whereas HO-C and HO-S mice did not differ t(27) = -1.510. WT-S

77 and HO-S mice did not differ on this variable, t′(11.177) = -2.126. WT-C also spent more time than HO-C mice, t′(26.601) = 2.462, p < .017, while HO-C mice did not differ from

WT-S, t′(24.813) = -1.381. Avoidance of open arms, which is indicative of anxiety, was increased by chronic stress in WT mice, but not in HO mice. It also was higher in unstressed HO mice, as compared to unstressed WT. The level of anxiety-like behavior of

HO-C mice was equal to that of WT-S and HO-S mice. WT-S and HO-S mice showed the same levels of anxiety-like behavior.

INSERT FIGURE 2.6

2.6.3. H-Maze Test The number of mice having completed the task in each group was first analyzed

(Figure 2.6). Only in group WT-C, did all mice complete the task and reach the criterion on each of the three phases. Half of HO-C mice learned the first rule, compared to 75% of stressed mice from both genotypes. In the second phase, all HO-C mice and 83% of HO-S mice that had succeeded in the first phase were able to reach the criterion, whereas only

33% of WT-S having learned the ALT rule could learn N-ALT. Finally, 25% of HO-C mice and 40% of remaining HO-S mice having reached the N-ALT phase could complete the REV phase, whereas one out of the remaining two WT-S mice did. Thus, completion rates for the entire H-Maze test were 100% for WT-C, 12.5% for HO-C and WT-S, and

25% for HO-S mice. Non-parametric Mann-Whitney U tests revealed that more WT-C mice than HO-C mice reached the criterion in all three phases, ALT, U = 16, p < .02, N-

ALT, U = 16, p < .02, and REV, U = 4, p < .001. There was no difference between WT-C and WT-S mice on the ALT phase, U = 24, p > .05, but fewer WT-S mice than WT-C mice reached the criterion on the N-ALT, U = 8, p < .01, and REV phases, U = 4, p = .001. The

number of mice reaching criterion did not differ in groups HO-C and HO-S whether it was on the ALT, U = 24, p > .05, the N-ALT, U = 28, p > .05, or the REV, U = 28, p > .05, phases. HO-C mice thus demonstrated a deficit in learning the first rule and three of the four mice from the same group which succeeded in the ALT phase failed in the REV phase.

Chronic stress induced performance deficits in WT-S mice, compared with WT-C mice, as early as on the N-ALT phase. Chronic stress did not further impede HO mice in reaching the criterion at any phase.

INSERT FIGURES 2.7, 2.8 AND 2.9

The response patterns in each group (Figure 2.7) suggest that some groups tended to make more perseveration errors, which generally indicates a flexibility deficit.

Perseveration errors, defined as the number of consecutive unreinforced trials in series of six or more, were analyzed. Due to the unequal success rates of our various groups and the low n in the latter phases of the test, perseveration errors of all mice were analyzed overall

(Figure 2.8). There was no effect of Genotype, F(1, 28) = 2.729, while the effect of Stress,

F(1, 28) = 5.773, p < .05, and the interaction Genotype X Stress, F(1, 28) = 14.095, p =

.001 (Figure 2.9), were significant. The Holm-Bonferroni corrected post-hoc test showed that WT-S mice made more perseverative errors than WT-C mice, t′(7.287) = -3.846, p <

.017, whereas HO-C and HO-S mice did not significantly differ on this measure, t(14) =

1.127. HO-C mice also made significantly more perseverative errors than WT-C mice, t(14)

= -7.291, p < .001, but they did not differ from WT-S mice on that measure, t(14) = .433.

WT-S and HO-S mice made similar numbers of perseveration errors, t′(11.177) = -2.126.

Unstressed WT mice made less perseveration errors than unstressed HO mice, which suggests a deficit of cognitive flexibility in HO mice. Furthermore, chronic stress reduced cognitive flexibility in WT mice but not in HO, and unstressed HO mice had a similar level

79 of impairment to that of stressed WT mice. Chronically stressed mice of both genotypes did not differ in terms of perseveration errors.

2.7 Discussion

2.7.1 Anxiety Results from the anxiety tests demonstrate that unstressed, serotonin-depleted HO mice exhibited more anxiety-like behavior than unstressed WT mice. In the light-dark emergence and elevated plus maze tests, chronic stress increased anxiety-like behavior in

WT mice, but not in HO mice; stressed WT and HO mice, as well as unstressed HO mice, all had levels of anxiety-like behavior that were similar.

One constant observed in both tests of anxiety-like behavior is that recent chronic restraint stress was insufficient for modifying the behavior of HO mice. In none of the anxiety tests administered did stressed HO mice differ from unstressed ones. Furthermore, the level of anxiety-like behavior of stressed mice of both genotypes was similar to that of unstressed, serotonin-depleted HO mice. Thus, all groups, but unstressed WT, showed significant anxiety-like behavior of a similar magnitude. The recent chronic restraint stress protocol used here was efficient in inducing anxiety-like behavior in WT mice, similar to that of expectedly anxious unstressed HO mice (Beaulieu, et al., 2008). However, the fact that it did not elevate the level of anxiety-like behavior of HO mice is an unexpected result.

Indeed, BALB mice, which carry the C1473G single nucleotide polymorphism of Tph2, also associated with lower brain serotonin synthesis (Zhang, et al., 2004), showed higher behavioral vulnerability to chronic stress than did C57BL mice (Tannenbaum & Anisman,

2003). We thus assumed that brain serotonin depletion would be associated with a higher susceptibility to chronic stress with Tph2 G1449A-R439H mice. Future experiments would

be needed in order to determine if our results were caused by an unexpected phenotype of resiliency to recent chronic stress in our mutant mice (Elliott, Ezra-Nevo, Regev, Neufeld-

Cohen, & Chen, 2010; Feder, Nestler, & Charney, 2009). Although not significant, results show a very marginal trend toward anxiety reduction and a lower perseveration count in stressed HO mice as compared to their unstressed counterparts.

Another hypothesis would be that HO mice adapt to chronic stress faster than WT mice due to potential differences in the functioning of their hypothalamic-pituitary-adrenal axis (Dallman, 2007). Although corticosterone levels were not found to differ between WT and HO mice after exposure to acute stress or a combination of early chronic and recent acute stresses (Sachs, et al., 2013), it is possible that some physiological responses associated with the noradrenergic system are affected in Tph2 G1449A-R439H mutants, which may explain different latencies of acclimatation between genotypes. Indeed, these mice demonstrated enhanced hypothermic response to clonidine (Jacobsen, et al., 2012), an adrenergic agonist which inhibits noradrenalin release: the hypothermic response to that drug is attributed to decreased plasma noradrenalin in humans and animals (Mizobe,

Nakajima, Sunaguchi, Ueno, & Sessler, 2005; Myers, Beleslin, & Rezvani, 1987; Rudy &

Wolf, 1971; Tsoucaris-Kupfer & Schmitt, 1972). Running chronic stress protocols of shorter and longer durations on these mice would be necessary in order to verify the faster adaptation hypothesis.

A third possibility would be that unstressed mutant mice already are at a peak level of anxiety. Indeed, no significant differences in terms of anxiety-like behavior were found between unstressed HO mice and stressed mice, or between stressed mice of both genotypes. This suggests that even though the chronic stress protocol has some efficacy, the anxiety that unstressed HO mice present cannot be further elevated.

A fourth hypothesis would be that our chronic stress protocol was insufficient for inducing anxiety-like behavior in the already anxious HO mice. Indeed, various durations, intensities, and frequencies of physical restraint have yielded very broad physiological and behavioral responses in rodents, some not having any obvious effect on certain strains

(Buynitsky & Mostofsky, 2009). However, that possibility remains unlikely, as stressed

WT mice present a significant increase in their anxiety scores and these appear to be somewhat higher than those of HO mice (although not significantly so). We therefore posit that the role of the G1449A-R439H mutation of Tph2 in anxiety requires further study, especially given that its presence was previously found in human major depression patients who frequently presented anxiety symptoms.

Results obtained replicate and expand on those of Beaulieu et al. (2008), Jacobsen et al. (2012), and Sachs et al. (2013) in that they demonstrate that unstressed G1449A-R439H

Tph2 knockin HO mice have a higher level of anxiety-like behavior than their WT littermates. This observation is consistent with the potential role of serotonin in anxiety and other affective disorders (Baldwin & Rudge, 1995; Paul & Lowry, 2013): lower levels of brain serotonin are associated with higher anxiety and the beneficial effects of selective serotonin reuptake inhibitors are partly caused by elevated serotonin. Our results also expand on the findings of Sachs et al. (2013) in that they demonstrate that HO mice did not present a higher level of anxiety-like behavior following a recent exposure to chronic restraint stress.

2.7.2 Cognitive performance In the H-Maze task, unstressed HO mice presented deficits of cognitive performance, compared to unstressed WT mice. Chronic stress negatively affected WT mice, but had no effect on the performances of HO mice.

The success rate of unstressed HO mice was lower than that of WT mice as early as the first phase of the task, which suggests a deficit of basic rule learning. This contrasts with previous observations made in our laboratory, which indicated that HO mice began to exhibit a deficit of cognitive flexibility in the second phase of the task. Housing may be a factor in the differences observed between past observations and ours. We used to house our mice 3-4 per cage, whereas in the present experiment, all mice were housed individually due to infighting among HO. It is known that individual housing may affect the levels of anxiety and cognitive performance in rodents (Pham, Soderstrom, Winblad, &

Mohammed, 1999; Voikar, Polus, Vasar, & Rauvala, 2005; Von Frijtag et al., 2000).

Regardless, in the present experiment, a number of unstressed HO mice, which were able to complete the first two phases of the task, did not succeed in learning the final rule.

Completion rates thus ended up being similar to those of our previous observations, a result that is consistent with various reports on the effects of serotonin depletion or augmentation on cognition in rodents (Brigman et al., 2010; Hohmann, Walker, Boylan, & Blue, 2007;

Lieben, Steinbusch, & Blokland, 2006; Lieben, van Oorsouw, Deutz, & Blokland, 2004;

Sirvio, Riekkinen, Jakala, & Riekkinen, 1994).

After chronic restraint stress, numerous WT mice were unable to learn the second rule. Chronically stressed WT mice had the same overall success rate as unstressed HO mice. It seems that anxiety had a negative effect on performance in the H-Maze task: stress impaired the performance of WT mice on it, and HO mice, which had elevated anxiety,

83 performed poorly on the task. Others also reported that chronic stress negatively affects performance on cognitive tasks in rodents (Lapiz-Bluhm, Soto-Pina, Hensler, & Morilak,

2009; Li et al., 2008; Nagata, Nakashima-Kamimura, Mikami, Ohsawa, & Ohta, 2009). As in the anxiety tests, the performance of HO mice, however, was not affected by exposure to chronic stress, as their final completion rates were similar to those of unstressed HO and stressed WT mice.

Regarding perseveration errors, which are indicative of cognitive inflexibility and are frequently associated with both prefrontal dysfunction and depleted brain serotonin

(Clarke, Dalley, Crofts, Robbins, & Roberts, 2004; Clarke et al., 2005; Homberg, 2012;

Walker, Mikheenko, Argyle, Robbins, & Roberts, 2006), WT-C mice made overall fewer of these than HO-C and WT-S mice. As was the case for anxiety-like behavior and H-Maze completion rates, chronic stress did not increase the frequency of perseveration errors in

HO mice. The scores of stressed mice of both genotypes on the present variable were equivalent and also similar to those of unstressed HO mice, a result that reflects what was observed with anxiety in the light-dark emergence and elevated plus maze tests. Chronic stress thus elevated the amount of perseveration errors made by WT mice to a level similar to that of anxious, serotonin-depleted HO mice, while it did not significantly affect the performances of the latter.

2.7.3 Effects of anxiety on cognitive performance Considering unstressed HO mice presented a level of anxiety that was higher than that of unstressed WT mice, as well as results in the H-Maze showing that they presented cognitive deficits, anxiety may represent a mediating factor between serotonin depletion and subsequent deficits observed in cognitive tasks in rodents. In the present experiment,

WT mice exposed to chronic stress generally showed higher levels of anxiety-like behaviors, as well as deteriorated cognitive performance, whereas unstressed HO mice, for which brain serotonin synthesis is reduced by ≈ 80%, generally had higher anxiety and demonstrated lower cognitive performance than unstressed WT mice. Chronic stress did not affect HO mice in terms of their anxiety-like behaviors or cognitive performance. The group differences in terms of perseverative errors were very similar to those observed on anxiety tasks. Precisely, WT-C mice showed little avoidance behavior on anxiety tasks and emitted few perseveration errors in the H-Maze, whereas HO-C mice presented higher avoidance and did more perseveration errors. Chronic stress generally elevated WT mice’s anxiety-like behaviors and perseveration errors, whereas it had no effect on levels of behavioral avoidance and numbers of perseveration errors of HO mice. Furthermore, the anxiety-like behaviors and perseveration errors of stressed mice of both genotypes were similar in magnitude to those of unstressed HO mice.

Higher levels of anxiety have been associated with perseverative behaviors in a number of cognitive tasks in rodents (Andersen, Greene-Colozzi, & Sonntag, 2010; Gill,

Perry, McGuire, Perez-Gomez, & Tasker, 2012; Jiao, Pang, Beck, Minor, & Servatius,

2011; Servatius, Jiao, Beck, Pang, & Minor, 2008). Considering that stressed WT mice, as well as stressed and unstressed HO mice, presented considerable and similar avoidance behaviors, made numerous perseveration errors and had a low completion rate on the H-

Maze task, it seems legitimate to assume that anxiety is a major factor in their perseverative behavior, which in turn negatively affected their cognitive performances.

In rats, the coupling of chronic stress with pharmacological inhibition of

Tryptophan hydroxylase by p-CPA administration caused more pronounced deficits in a spatial learning task, as well as more avoidance behavior in the elevated plus-maze and

85 open field tests, than p-CPA administration alone (Zhou et al., 2008). In the present experiment, chronic stress did not exacerbate the behavioral phenotype of mice carrying a serotonin depleting single nucleotide polymorphism of Tph2. Moreover, the effects of the mutation and chronic restraint stress were not cumulative here, in that serotonin-depleted mice exposed to chronic stress did not present more severe anxiety-like behavior or cognitive performance deficits than unstressed ones. It appears, therefore, that anxiety-like behavior and cognitive performances are negatively correlated, in that normal, unstressed mice show little anxiety and perform cognitive tasks efficiently, whereas similar mice that are submitted to stress show higher anxiety and impaired cognitive performance, just like unstressed and stressed serotonin-depleted mice. One conclusion which may be drawn from these observations is that cognitive performance deficits observed in serotonin depleted mice are in large part mediated by anxiety.

Considering the fact that the effects of chronic stress on mice carrying the Tph2

G1449A-R439H single nucleotide polymorphism did not reflect the effects of chronic stress applied to pharmacologically-induced serotonin depletion, the study of behavior associated with this mutation remains highly relevant for the understanding of serotonin- related psychopathology. Indeed, given that the mutation studied here is found in humans, albeit rarely so, data obtained from these experiments may have major implications for the understanding of individuals afflicted with that specific polymorphism and other similar ones. Furthermore, data obtained using Tph2 G1449A-R439H knockin mice also have implications for various other serotonin-related mental conditions, as well as for the clinical practice of those whose aim is to better understand and treat those conditions.

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2.9 Figures Figure 2.1

Figure 2.2

Figure 2.3

100 90 80

70 60 50 WT 40

Time Time sec in 30 HO 20 10 0 Control Stress Condition

Figure 2.4

100

Figure 2.5

15 WT

Time Time sec in HO 10

Control Stress Condition

101

Figure 2.6

102

Figure 2.7

103

Figure 2.8

104

Figure 2.9

10 WT 8 HO 6

Perseveration errorsPerseveration 4

0 Control Stress Condition

105

2.10 Figure captions

Figure 2.1 Rules to be learned on each phase of the H-Maze task.

Figure 2.2 Results from the light-dark emergence test. A. Total distance covered. B. Time spent in the illuminated compartment. Data are means ± standard error of the mean (S.E.M.). * or # = p < .05 compared with WT-C.

Figure 2.3 Illustration of the Genotype X Stress interaction for time spent in the illuminated compartment on the light-dark emergence test.

Figure 2.4 Results from the elevated plus maze test. A. Time in motion. B. Time spent in open arms of the maze. Data are means ± S.E.M. * or # = p < .05 compared with WT-C.

Figure 2.5 Illustration of the Genotype X Stress interaction for time spent in the open arms during the elevated plus maze test.

Figure 2.6 Numbers of mice per group having completed each phase of the H-Maze test. * or # = p < .05 compared with WT-C.

Figure 2.7 Response patterns on the H-Maze test for one representative mouse per group. Bars above zero represent reinforced trials, whereas bars underneath zero represent unreinforced trials. Numbers of trials required to complete a phase are indicated above the abbreviation for each phase completed.

Figure 2.8 Perseveration errors in the H-Maze, across the three phases. Data are means ± S.E.M. * or # = p < .05 compared with WT-C.

Figure 2.9 Illustration of the Genotype X Stress interaction for perseveration errors in the H-Maze.

106

CHAPITRE 3

Mice with human tryptophan hydroxylase 2 loss of function mutation present higher motivation for alcohol under aversive conditions

Francis Lemay, B.A. 1,2, François Y. Doré, Ph.D. 2, and Jean-Martin Beaulieu, Ph.D. 2,3

1 Institut universitaire en santé mentale de Québec, 2601, chemin de la Canardière, Québec, Québec, Canada 2 École de psychologie, Faculté des sciences sociales, Université Laval. Pavillon Félix-Antoine- Savard, 2325, rue des Bibliothèques, Québec, Québec, Canada 3 Département de psychiatrie et de neurosciences, Faculté de médecine, Université Laval. Pavillon Ferdinand-Vandry, 1050, avenue de la Médecine, Québec, Québec, Canada.

107

3.1 Résumé

Des tests de préférence à deux bouteilles de 48 h sont administrés pour évaluer les niveaux de préférence pour le sucrose ou la quinine des souris Tph2 G1449A-R439H de type sauvage (WT) et homozygotes (HO). Une série de tests à deux bouteilles évalue ensuite leur préférence ou leur motivation pour l’alcool. Les souris WT et HO ne présentent pas de différences de préférence pour le sucrose, la quinine ou l’alcool. Après avoir été familiarisées à une solution d’alcool et de quinine, puis soumises à une période de sevrage de quatre jours, les souris HO présentent un niveau d’aversion plus faible que celui des WT pour la solution d’alcool mélangé à la quinine. Cette différence se maintient pendant deux blocs de quatre jours. Ces résultats suggèrent une association entre un faible niveau de sérotonine cérébrale et une motivation accrue pour l’alcool et permettent de considérer les souris Tph2 G1449A-R439H comme un modèle animal de vulnérabilité à l’éthylisme.

108

3.2 Abstract Background: The relationship between anxiety, depression, and pathological alcohol consumption may be partially modulated by serotonin. Tph2 G1449A-R439H knockin mice are considered an interesting model of serotonin depletion such as it can be found in humans.

These mice show various psychopathology-related behavioral phenotypes. This, along with the recognized involvement of serotonin in alcohol-related behaviors, makes Tph2 G1449A-

R439H mice a promising animal model to study alcohol preference and motivation for its consumption. Method: 48 h, two-bottle preference tests were used to assess wildtype (WT) and homozygote (HO) Tph2 G1449A-R439H knockin mice’s preference levels and motivation for sucrose and quinine consumption. A series of two-bottle choice tests served to evaluate their preference for alcohol and alcohol mixed with quinine. In the first two tasks, they were familiarized with increasing concentrations of alcohol (3%, 6% and 10%), for four blocks of four days each, followed by a four day withdrawal period, then either 10% alcohol or 10% alcohol with .025% quinine. In the following two tasks, they were familiarized with the same concentrations of alcohol, mixed with quinine. Following the withdrawal period, they were faced with either 10% alcohol and quinine, or quinine alone. The task with alcohol and quinine at all blocks except withdrawal was replicated with a longer post-withdrawal exposure period.

Results: WT and HO mice do not present differences in preference levels for sucrose, quinine, or alcohol. However, after being familiarized with alcohol and quinine, then denied access to the solution for four days, HO mice show lower aversion levels than WT mice for alcohol mixed with quinine. This result is maintained for two blocks of four days. Conclusion: HO mice used in these experiments presented a higher level of motivation for alcohol. Implications of this result for considering Tph2 knockin G1449A-R439H mice an animal model of vulnerability to alcohol-related psychopathology are discussed.

109

3.3 Acknowledgements

The authors wish to thank Jean Levasseur-Moreau and Carolyne Jean for their help with behavioral testing, as well as Nathalie Bouchard and Kathye Aubé for the management of the mouse colony throughout the experiments. Funding for this article was provided by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) to F.Y.D. and J.- M.B.F.L. was financially supported by a doctoral scholarship from NSERC.

110

3.4 Introduction Treatments which target the serotonergic system improve symptoms of depression, anxiety, and alcohol dependence (Gerard, Liard, Crochard, Goni, & Millet, 2012;

Hollingworth, Burgess, & Whiteford, 2010; Lovinger, 1999; Sari, Johnson, & Weedman,

2011; Tollefson, Lancaster, & Montague-Clouse, 1991). In clinical trials, drugs that affect the serotonergic system have shown a beneficial effect on the treatment of patients with comorbid alcohol dependence and major depression (Cornelius et al., 2005; Cornelius et al., 2012; Nunes & Levin, 2004). Similarly, a rapid tryptophan depletion protocol, which drastically lowers the plasma levels of the serotonin precursor, induces an increase of depressive symptoms and stimulates the urge to drink in depressive and alcoholic patients

(Pierucci-Lagha et al., 2004). Hence, the serotonergic system is an important common denominator in alcohol-related behaviors, modulating susceptibility to pathological drinking, and affective disorders such as major depression and anxiety disorders (Kranzler

& Anton, 1994; LeMarquand, Pihl, & Benkelfat, 1994a, 1994b; Tollefson, 1989, 1991).

On the other hand, the clinical effects observed after acute tryptophan depletion are inconsistent (Moore et al., 2000), possibly because they may result not only from serotonin depletion but also from other mechanisms such as a decrease in the activity of the enzyme nitric oxide synthase or reduced rates of kynurenine metabolites (van Donkelaar et al.,

2011). Another approach, which allows a better control of environmental variables in experimental conditions, is to model in knockout and knockin mice the deficits observed in humans suffering from the effects of low brain serotonin levels (Homberg, 2012). One such animal model is the Tph2 G1449A-R439H knockin mouse which was engineered after the discovery of the single nucleotide polymorphism G1463A among a cohort of human major depression patients (Zhang et al., 2005).

111

A majority of patients who carry this single nucleotide polymorphism have a family history of mental illness which often includes drug and alcohol abuse. Many of them also show signs of comorbid anxiety disorders. The mutation is known to reduce, almost exclusively, serotonin synthesis in the brain by affecting tryptophan hydroxylase, the rate- limiting enzyme in serotonin synthesis. In mice, the analog mutation, G1449A, is associated with a ≈ 80% reduction of brain serotonin synthesis in homozygous mutants

(Beaulieu et al., 2008).

At the behavioral level, Tph2 G1449A-R439H knockin mice exhibit a higher level of inter-male aggression, longer immobility in the tail suspension test, as well as a longer latency to cross to the open compartment in the light-dark emergence test (Beaulieu, et al.,

2008) and more marble burying (Jacobsen, et al., 2012) than wildtype mice. These last three phenotypes are generally interpreted as signs of depressive- and anxiety-like behaviors in rodents. Relationships have been established between serotonin depletion and compulsive behavior, such as those observed in some anxiety disorders, as well as impulsive behaviors (including deficits in cognitive flexibility and response inhibition) and dependencies (Fineberg, et al., 2010).

Given the significant level of brain serotonin depletion and the known behavioral phenotype of Tph2 G1449A-R439H knockin mice, a susceptibility to alcohol preference should be expected in mutants. A method that is frequently used to assess rodents’ preference for alcohol is the two-bottle preference test (Cai et al., 2006; Crabbe, Spence,

Brown, & Metten, 2011; Karatayev, Baylan, & Leibowitz, 2009; Kim, Kim, Baek, Lee, &

Han, 2011; Ramachandra, Phuc, Franco, & Gonzales, 2007; Yang, Wang, Rice, Munro, &

Wand, 2008). It revealed, after only a few days of exposure, differences in alcohol preference among various mouse genotypes (Belknap, Crabbe, & Young, 1993). Other

112

models of alcohol exposure may be better suited to assess dependence per se (Goldstein &

Judson, 1971; O'Neill & Rahwan, 1977), but the two bottle preference test assesses natural preferences in mice and thus, susceptibility to abusive consumption. Since the test is administered in the home cages, stress induced by handling is minimized and mice freely choose between drinking or avoiding alcohol for a prolonged period. Furthermore, some modified versions of the classic two-bottle test aim to model characteristics of alcohol abuse in humans (Correia, Ribeiro, Brunialti Godard, & Boerngen-Lacerda, 2009; Hopf,

Chang, Sparta, Bowers, & Bonci, 2010; Robbins, 1989). Abusive alcohol consumption in humans is often maintained regardless of aversive consequences attached to it, such as financial losses and social isolation (Devlin, Scuffham, & Bunt, 1997; Perkins, 1992) and animal protocols for drug abuse have used consumption in spite of aversive consequences as a way to model such behavior (Deroche-Gamonet, Belin, & Piazza, 2004; Robinson,

2004; Vanderschuren & Everitt, 2004; Vendruscolo et al., 2012). Therefore, in some versions of the two-bottle task we administer, we modify an original protocol (Yoneyama,

Crabbe, Ford, Murillo, & Finn, 2008) and mix quinine with alcohol. By adding this well- known, highly aversive stimulus to alcohol, we aim at assessing the motivation of mice to surmount negative consequences in order to obtain a preferred substance.

Here, we discover that mice carrying the Tph2 G1449A-R439H mutation have lower aversion for the quinine-alcohol solution than their wildtype littermates, which suggests higher motivation for alcohol.

113

3.5 Materials and Methods

3.5.1 Animals The generation of G1449A-R439H Tph2 knockin mice has previously been described (Beaulieu et al., 2008). All mice were individually housed in an air-conditioned, humidity-controlled room in which temperature was kept between 22 and 23°C. They were maintained on a 12h-12h light-dark cycle (lights on at 7AM). Wildtype (WT) littermates were used as controls for mutant homozygote mice (HO), for which brain serotonin synthesis rate is reduced by ≈ 80% (Beaulieu, et al., 2008). Mice used in the behavioral tests were naïve and aged 3 to 5 months. Food and water were always available ad libitum.

All procedures were conducted in accordance with the Comité de protection des animaux de l’Université Laval, which is responsible for the application and enforcement of the regulations of the Canadian Council on Animal Care in science.

3.5.2 Sucrose preference and quinine aversion tests Alcohol preference has been reported to be positively correlated with sucrose preference (Blednov et al., 2008; Blizard & McClearn, 2000). Some animal models of serotonin dysregulation have also shown lower appetitive motivation for sucrose (Tang,

Lei, Sun, Liu, & Zhao, 2013). Therefore, before testing Tph2 G1449A-R439H knockin mice in alcohol preference tests with or without quinine, we verified whether they differ from wildtype mice on their capacity to detect sucrose and on their level of preference for this substance. We also verified whether the motivation of knockin mice for aversive

(quinine) as well as appetitive substances differ from the one in wildtype mice. Sucrose preference and quinine aversion tests lasted 48 h since most experiments (Brenes Saenz,

Villagra, & Fornaguera Trias, 2006; Martinez-Hernandez, Lanuza, & Martinez-Garcia,

2006; Sakic et al., 1997; Towell, Muscat, & Willner, 1987) use this duration. Finally,

114

because an experiment using a lever-pressing protocol (Jacobsen, Medvedev, & Caron,

2012) revealed that appetitive motivation in Tph2 knockin mice was low with high concentrations of sweet milk, a multi-concentration sucrose preference test was administered to find out whether the effects would be replicated in a free-drinking paradigm.

Seventeen WT mice (n = 12 males, 5 females) and 16 HO mice (n = 10 males, 6 females) were used for these tests. The tests were run continuously for 96 h. Each home cage was equipped with two bottles. Every 24 h, the bottles were weighed and their left- right positions were switched to avoid a spatial preference. An empty cage with two bottles served to record the quantities of liquid lost by evaporation or bottle leakage. Mice were weighed every 2 d.

On the first two days, one bottle was filled with distilled water and the other bottle was filled with either a 1% (weight/volume) sucrose solution or a .025% (w/v) quinine solution. Fifteen mice were randomly selected to begin testing with sucrose and 18 with quinine. After 48 h, the bottle containing sucrose or quinine was cleaned and filled with the other solution, whereas the bottle containing distilled water was cleaned and refilled.

Therefore, each mouse was exposed to sucrose for 48 h and to quinine for 48 h in a counterbalanced design. Preference ratios for each substance were expressed as differences in bottle weights after 48 h, corrected for evaporation or leakage, by comparing the initial weights of the bottles (example: [weight of quinine bottle – weight of water bottle] /

[weight of quinine bottle + weight of water bottle] * 100) .

115

3.5.3 Test of sucrose preference with different concentrations Seven female WT and seven female HO mice were used in this test. The general procedure was similar to the one in the previous test. The tests were run continuously for 18 days. Each home cage was equipped with two bottles. Every 24 h, the bottles were weighed and their left-right positions were switched to avoid a spatial preference. An empty cage with two bottles served to record the quantities of liquid lost by evaporation or bottle leakage. Mice were weighed every 4 d.

In each home cage, one bottle was filled with distilled water and the other bottle contained a sucrose solution. One of nine concentrations of sucrose (0025%, .01%, .10%,

.25%, .50%, 10%, 25%, 50%, 75%; w/v) was randomly assigned to each mouse and tested for 48 h. Each mouse was exposed to the nine sucrose concentrations. Preference ratios were calculated as in the sucrose preference and quinine aversion tests.

3.5.4 Alcohol preference tests The alcohol preference tests were a series of two-bottle preference tests in which one bottle contained water, whereas the other contained alcohol or alcohol and quinine.

These tests are based on a short-term protocol which allowed to detect different levels of alcohol preference among various mouse strains (Yoneyama, et al., 2008). Relatively short tests are well-suited to assess alcohol preference in mice because mice tend to avoid unpalatable solutions and to choose palatable ones within minutes of first exposure

(Belknap, Belknap, Berg, & Coleman, 1977). In addition, 4-day tests were shown to be sufficient to detect differences between genotypes (Tordoff & Bachmanov, 2002). As previously mentioned, in some versions of the task, mice are presented with the bittering agent quinine, mixed with alcohol, in order to assess the motivation of mice to consume

116

alcohol. Elevated or maintained alcohol consumption in spite of aversive consequences is thought to model some characteristics of alcohol abuse in humans.

In all the alcohol preference tests, the solutions were the neutral grain spirit Global

94% (Alcool Global, Société des Alcools du Québec, Québec, Canada) diluted into distilled water.

INSERT FIGURE 3.1

As in the two previous tests, the positions of the bottles were switched every 24 h.

Bottles were weighed daily at around 16 h ± 30 min and new liquids replaced the old ones every 4 d in order for solutions to remain fresh. The first part of each version of the alcohol preference test was a 12 d familiarization phase, in which the alcohol content of the bottle was gradually raised at each 4 d block. Then, a 4 d withdrawal period was introduced during which two bottles containing only water were available. Following the withdrawal period, depending on the task, a solution of alcohol, quinine, or alcohol and quinine was presented for one or more 4 d blocks. Different cohorts of mice were used for each version of the test (Figure 3.1).

Preference ratios for each substance (see previous section “Sucrose preference and quinine aversion tests” for calculations) corrected for liquid evaporation or leakage were calculated.

Basic alcohol preference test

In the first version of the alcohol preference test, basic preference for alcohol was assessed. Nineteen WT mice (n = 10 males, 9 females) and 19 HO mice (n = 9 males, 10 females) were exposed successively to a 3%, a 6% and a 10% alcohol solution. Following the withdrawal period, they were exposed to the 10% alcohol solution for one 4 d block.

Post-withdrawal quinine test

117

For this test, the effects of the introduction of quinine in the alcohol solution were assessed. Twenty WT mice (n = 10 males, 10 females) and 21 HO mice (n = 10 males, 11 females) were used. The procedure was the same as in the Basic alcohol preference test except that after the withdrawal period, mice were exposed to a solution of 10% alcohol mixed with .025% quinine, for one 4 d block.

Alcohol-quinine test

For this test, prolonged exposure to an alcohol-quinine solution was used in order to assess mice’s motivation for alcohol. Sixteen WT mice (n = 5 males, 11 females) and 10

HO mice (n = 3 males, 7 females) were familiarized with a 3% alcohol mixed with .025% quinine solution, followed by a 6% alcohol mixed with .025% quinine solution, and then, a

10% alcohol mixed with .025% quinine solution. Following the withdrawal period, mice were exposed to the 10% alcohol mixed with .025% quinine solution for one 4 d block.

Alcohol-quinine and post-withdrawal test with quinine only

In order to assess whether a difference in preference levels on the previous test was due to quinine only, an aversive test was administered. Fourteen WT mice (n = 6 males, 8 females) and 14 HO mice (n = 3 males, 10 females) were used. The same familiarization phase as in the Alcohol-quinine test was used but was followed, after the withdrawal period, by a 4-d block with an alcohol-free, .025% quinine solution.

Long-term alcohol-quinine test

Twelve WT mice (n = 6 males, 6 females) and 13 HO mice (n = 7 males, 6 females) were used in this test. This version was the same as the alcohol-quinine test and was aimed at verifying whether a difference between groups in aversion levels was maintained throughout time. The same familiarization phase was administered except that three blocks of 4 d each instead of one followed the withdrawal period.

118

3.6 Results

3.6.1 Sucrose preference and quinine aversion tests INSERT FIGURE 3.2

These tests had the objective of showing whether the level of appetitive motivation were apparent between genotypes, as well as if differences could be detected in taste detection thresholds for sweet and bitter flavors. T-tests on preference ratios (Figure 3.2) show that both groups were able to detect the two tastes and exhibited a clear preference for sucrose, t(31) = -.586, and aversion for quinine, t(31) = 1.661, without significant differences between genotypes.

3.6.2 Test of sucrose preference with different concentrations INSERT FIGURE 3.3

Given the correlation between sucrose and alcohol preferences, and the fact that multiple alcohol concentrations would be accessible to mice during the preference tests, a test of sucrose preference with different concentrations was administered. Analyses revealed that no difference in preference was found between genotypes and that some sucrose concentrations were preferred by mice (Figure 3.3). A mixed ANOVA with

Genotype X Concentrations (2 X 2) as factors was used on the preference ratios. Mauchly’s test revealed that the criterion of sphericity of variances was not met (p = .005). Therefore, a Greenhouse-Geisser correction was applied to intra-subject analyses. The ANOVA revealed a significant effect of Concentrations, F(2.918, 35.016) = 24.281, p < .001, no effect of Genotype, F(1, 12) = .576, and no interaction , F(2.918, 35.016) = 1.346. Paired comparisons showed that mice prefer the 10% concentration to the lower five concentrations (all p < .001), as well as the higher 50% (p = .001) and 75% (p < .001) concentrations. The 25% concentration was preferred to the .0025% (p < .001), .01% (p =

119

.01), .10% (p = .001), .25% (p = .001), .50% (p < .001), and 75% (p < .001) concentrations.

Finally, the 50% concentration was preferred to the .0025% (p = .003), .10% (p = .009), and 75% (p = .028) concentrations. In both groups, mice had a marked preference for the

10% and the 25% concentrations. In mutant mice as in wildtype mice, preference levels for sucrose followed the same inverted U shape.

3.6.3 Alcohol preference tasks Basic alcohol preference test and post-withdrawal quinine test

INSERT FIGURE 3.4

The first two alcohol preference tasks aimed at assessing whether differences in preference for alcohol existed between genotypes before or after a withdrawal period, as well as whether alcohol mixed with quinine would yield different levels of aversion.

Results from both the Basic alcohol preference test and the Post-withdrawal quinine test were analyzed together, since the pre-withdrawal familiarization phase was identical in both cases. Preference for alcohol did not differ in WT and HO mice and both groups had an aversion for quinine mixed in alcohol after exposure to alcohol (Figure 3.4). Precisely, a mixed ANOVA with Genotype X Condition X Block (2 X 2 X 4) as factors was used to analyze the preference ratios. Mauchly’s test revealed that the criterion of sphericity of variances was not met (p = .002) and thus, Greenhouse-Geisser’s correction was applied to intra-subject analyses. Significant effects of Block, F(2.653, 198.941) = 17.310, p < .001, as well as of Condition, F(1, 75) = 6.664, p < .05, were detected, but there was no effect of the factor Genotype, F(1, 75) = .237, while Block X Condition, F(2.653, 198.941) =

18,043, p < .001, was the only significant interaction . The analysis of simple main effects

120

showed a difference between conditions at Block 4 in WT mice, F(1, 208.14) = 17.918, p <

.001, and in HO mice, F(1, 208.14) = 26.517, p < .001.

INSERT FIGURE 3.5

Alcohol-quinine test and post-withdrawal test with only quinine

Considering the aversion of mice of both genotypes for quinine, as well as their aversion to alcohol mixed with quinine without any prior familiarization, we tested whether the level of motivation for alcohol would differ between genotypes after familiarization with quinine and alcohol with the alcohol-quinine test. We also verified whether any effect observed could be due to quinine itself with the post-withdrawal test with only quinine.

Results from both the Alcohol-quinine test and the Alcohol-quinine and post-withdrawal test with only quinine were analyzed together, since the pre-withdrawal familiarization phase was identical in both cases. Results obtained suggest that HO mice have a tendency to continue consuming alcohol, in spite of the aversive taste of quinine. However, that behavior probably is not due to quinine itself, given that the aversion levels of HO mice do not differ from those of WT at Block 4 of the post-withdrawal with only quinine test, when they are presented with the opportunity to consume quinine without alcohol (Figure 3.5). A mixed ANOVA with Genotype X Condition X Block (2 X 2 X 4) as factors was used on preference ratios. Mauchly’s test on the sphericity of variances revealed that this criterion was met (p = .099). There was a significant effect of Block, F(3, 150) = 5.884, p = .001, but no significant effect of Genotype, F(1, 50) = .031, or of Condition F(1, 50) = 2.600. The interactions Block X Condition F(3, 150) = 4.356, p < .01, and Block X Genotype X

Condition F(3, 150) = 3.012, p < .05, but not the interaction Genotype X Condition, F(1,

50) = 3.711, were significant. In order to decompose the triple interaction, Block X

Genotype mixed ANOVAs were done for each test condition. For the Alcohol-quinine

121 condition, Mauchly’s sphericity of variances test revealed that the criterion was met (p =

.545), and a Block X Genotype interaction was detected, F(3, 72) = 5.175, p < .01 ; for the

Alcohol-quinine test and post-withdrawal test with only quinine condition, Mauchly’s test revealed that sphericity of variances was also respected (p = .273), but a Block X Genotype interaction was not detected, F(3, 78) = .052. Therefore, simple main effects analyses were done on Blocks 1 through 4 for the Alcohol-quinine test condition. These reveal a significant difference on Block 4 only, F(1, 189.48) = 9.415, p < .01. Thus, the motivation level of HO mice for alcohol is superior to that of WT mice.

INSERT FIGURE 3.6

Long-term alcohol-quinine test

In order to determine the duration of the higher motivation level of HO mice for alcohol, the alcohol-quinine test was repeated, with a longer post-withdrawal exposure period. A mixed ANOVA with Genotype X Block (2 X 6) as factors was used on preference ratios. Mauchly’s test revealed that the criterion of sphericity of variances was met (p = .196). The effect of Block, F(5, 115) = 5.121, p < .001, but not the effect of

Genotype, F(1, 23) = 2.699, or the interaction, F(5, 115) = 2.092, was significant. At Block

5, the preference ratio was higher than at Block 4 (p = .004) and 6 (p = .005). Although the interaction was not significant, considering the differences in means and the S.E.M. at

Blocks 4 (WT = -56.3 ± 1.8, HO = -47.9 ± 2.5) and 5 (WT = -49.5 ± 2.6, HO = -40.4 ±

2.5), a main effects analysis was run on these blocks. It revealed differences at Block 4,

F(1, 70.317) = 6.140, p < .02, and Block 5, F(1, 70.317) = 7.145, p < .01. Consumption of alcohol and quinine, compared with water, remained higher in HO mice as compared to

WT mice for two blocks of 4 d; then it returned to levels similar to those of WT mice. Also, mice of both genotypes showed a slight augmentation of preference for alcohol and quinine

122

in the second block of 4 d following withdrawal; that augmentation disappeared at the following block (Figure 3.6).

3.7 Discussion The tests on sucrose preference and quinine aversion showed that gustatory preference and aversion did not differ in WT and HO mice. These results are interesting for two reasons. First, HO mice did not exhibit any gustatory deficits. HO and WT mice preferred sucrose to water, detected it at the same concentrations, and also avoided the bitter taste of quinine. Second, the positive motivation of HO mice for an appetitive substance and their negative motivation for an aversive substance did not differ from that of controls. Thus, the results observed in alcohol and in alcohol and quinine tests cannot be explained by gustatory or motivational deficits, or by a higher tendency for caloric intake

(McMillen & Williams, 1998).

No effect of Genotype was detected in the familiarization phase of the Basic alcohol preference task. The alcohol preference ratio was near zero, even after the 4-day withdrawal period. As expected, the addition of quinine to alcohol, following withdrawal, resulted in aversion in both WT and HO mice. However, when mice were first familiarized with alcohol and quinine for 12 d, and then denied access to it for 4 d, the aversion level of

HO mice was lower than that of WT mice for the 10% alcohol and .025% quinine solutions. The long-term version of that test indicated that this difference was maintained for over a week. The return of HO’s preference level to values similar to those of WT mice was to be expected, as the alcohol deprivation effect (Sinclair & Senter, 1968; Sparta et al.,

2009), which is often observed in rodents following an imposed alcohol withdrawal period following initial familiarization, is known to be time-limited (Spanagel & Holter, 1999). It

123 has previously been found to last approximately one week, or less (Rodd-Henricks,

McKinzie, Murphy, et al., 2000; Rodd-Henricks, McKinzie, Shaikh, et al., 2000). In order to make sure that the observed difference was due to the combination of alcohol and quinine, and not solely an effect of familiarization to bitterness in HO mice (Birch, 1999;

Capaldi & Privitera, 2008), mice were exposed to the original quinine and alcohol protocol, followed by a post-withdrawal exposure to quinine and water only. No difference between

WT and HO mice appeared on the aversion test with a quinine solution, even when they were previously familiarized with alcohol.

The phenotype observed in the present tests is reminiscent of some characteristics of alcohol abuse or dependence in humans. HO mice consumed more alcohol mixed with quinine than WT mice. This difference did not seem to be the result of some mice developing a preference to quinine over time. Indeed, on the alcohol-quinine test and alcohol-quinine and post-withdrawal test with only quinine, no differences were observed between genotypes. It was only on the test in which alcohol was also present after the withdrawal period that a difference in aversion levels was found. The taste or the effects of alcohol (10%) thus seem to be the cause for the difference between HO mice and WT mice in terms of their aversion levels in the alcohol-quinine test. Consequently, the reduction of cerebral serotonin levels by the G1449A single nucleotide polymorphism of Tph2 is associated with a higher level of motivation for alcohol consumption. This particular phenotype presents similarities with the clinical presentation observed in humans suffering alcohol dependence or abuse. Mice engaging in unreinforced behavior or one leading to aversive consequences (consuming quinine in an alcohol-quinine solution) might be construed (Correia, et al., 2009) as a model for human consumption habits that turn out to be harmful and costly, both economically and socially (Devlin, et al., 1997; Perkins, 1992).

124

These results have clinical implications. G1449A-R439H Tph2 knockin mice have been shown to present anxious, aggressive, and depressive-like behaviors (Beaulieu, et al.,

2008; Jacobsen, Medvedev, et al., 2012; Jacobsen, Siesser, et al., 2012), which turn out to be frequently associated with abusive alcohol consumption or dependence in humans

(Bolton, Cox, Clara, & Sareen, 2006; Bolton, Surkan, Gray, & Desmousseaux, 2012;

Merikangas et al., 1998). Furthermore, some of the first individuals that were identified as carrying the G1463A single nucleotide polymorphism had subclinical anxiety symptoms, whereas a majority of them had family histories of drug or alcohol abuse (Zhang, et al.,

2005). The present results are consistent with the hypothesis that subjects carrying that mutation present an increased susceptibility to consuming more alcohol, regardless of the fact that consumption may be associated with harmful consequences. They further add to the suggestion that G1449A-R439H Tph2 knockin mutant mice are a valuable animal model of serotonin depletion.

125

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133

3.9 Figures Figure 3.1

134

Figure 3.2

135

Figure 3.3

136

Figure 3.4

137

Figure 3.5

138

Figure 3.6

139

3.10 Figure captions

Figure 3.1 Schema of the first four versions of the alcohol preference tests. From top left to bottom right: Basic alcohol preference test; Post-withdrawal quinine test; Alcohol-quinine test; Alcohol-quinine and post-withdrawal test with only quinine. EtOH = alcohol, Q = quinine.

Figure 3.2 Results from the Sucrose preference and quinine aversion tests (means ± S.E.M.)

Figure 3.3 Preference ratios in the test of Sucrose preference with different concentrations (means ± S.E.M.). Not shown are the preference ratios for .0025% and .01% concentrations, which did not differ from those of .10%, .25%, and .5% concentrations.

Figure 3.4 Mice’s drinking preferences on the Basic alcohol preference test and the Post- withdrawal with quinine test (means ± S.E.M.). Legend: WT-A: WT mice in Basic alcohol preference test, HO-A: HO mice in Basic alcohol preference test, WT-A-AQ: WT mice in Post-withdrawal with quinine test, HO-A-AQ: HO mice in Post-withdrawal with quinine test. + = p < .05 between WT of both conditions, $ = p < .05 between HO of both test conditions.

Figure 3.5 Mice’s drinking preferences on the Alcohol-quinine test and the Alcohol- quinine and post-withdrawal test with only quinine (means ± S.E.M.). Legend : WT-AQ: WT mice in the Alcohol-quinine test, HO-AQ: HO mice in the Alcohol-quinine test, WT- AQ-Q: WT mice in the Alcohol-quinine and post-withdrawal test with only quinine, HO- AQ-Q: HO mice in the Alcohol-quinine and post-withdrawal test with only quinine. * p < .05 between WT and HO of the Alcohol-quinine test condition.

Figure 3.6 Mice’s drinking preferences on the Long-term alcohol-quinine test (means ± S.E.M.). * p < .05 between WT and HO.

140

CHAPITRE 4

Conclusion

141

4.1 Synthèse générale des résultats Cette thèse vise à établir les effets de la mutation G1449A de Tph2 chez la souris, similaire à la mutation humaine G1463A chez l’humain, sur divers comportements couramment associés à l’anxiété pathologique, notamment la réaction au stress, la performance cognitive, la motivation et la consommation d’alcool. L’étude de cette mutation s’avère intéressante pour diverses raisons. D’abord, elle a été retrouvée chez des individus souffrant de dépression majeure et chez lesquels les traitements classiques ont démontré une faible efficacité (Zhang, et al., 2005a, 2005b). Également, cette mutation est associée à une réduction majeure de la production de 5-HT dans plusieurs régions du cerveau, étant donné les dysfonctions de l’enzyme Tryptophane hydroxylase 2 qu’elle engendre (Beaulieu, et al., 2008; Jacobsen, Siesser, et al., 2012; Sachs, et al., 2013). Les souris utilisées pour étudier cette mutation dans le cadre de la présente thèse sont considérées comme un modèle animal approprié pour effectuer des comparaisons avec les fonctions de la 5-HT chez l’humain. En effet, la réduction de production de ce neurotransmetteur est importante (jusqu’à ≈ 80%, selon le génotype et la région du cerveau) et, contrairement à certaines méthodes utilisées chez l’humain, comme la réduction de tryptophane, cette méthode n’est pas associée à des baisses d’activité de l’enzyme oxyde nitrique synthase ou à des taux réduits de métabolites de kynurénine (Jacobsen, Medvedev, et al., 2012), qui sont aussi associés à des phénotypes dépressifs ou anxieux (van

Donkelaar, et al., 2011).

Le chapitre 2 présente une expérience étudiant l’effet d’un stress chronique de contention sur les comportements anxieux et la performance cognitive. Cette expérience suggère que les souris mutantes sont plus anxieuses que les souris contrôles. Étant donné le lien entre l’anxiété et l’éthylisme établi dans le chapitre d’introduction de cette thèse, le

142

chapitre 3 présente une expérience examinant la consommation d’alcool chez les souris mutantes et la motivation à en consommer. La vérification préalable que les souris mutantes ne diffèrent pas des souris contrôles quant à leurs préférences gustatives et leur motivation sur le plan appétitif et aversif est également faite dans ce chapitre.

Dans le chapitre 2, les tâches d’anxiété administrées sont le test d’émergence noirceur-lumière et le test de labyrinthe en croix surélevé. Dans ces tests, les résultats indiquent que les souris WT sont plus anxieuses après un stress chronique de contention que sans stress chronique. Au contraire, les souris HO, qui sont plus anxieuses que les souris WT quand elles n’ont pas été préalablement stressées, ne sont pas plus anxieuses après un stress chronique. En somme, les souris HO n’ayant pas subi de stress étaient davantage anxieuses que les souris WT non stressées et contrairement aux souris WT, le stress chronique n’a pas affecté le niveau d’anxiété des souris HO dans deux tests d’anxiété.

Quatre hypothèses pourraient expliquer l’absence d’effet du stress chronique chez les souris HO : 1) un potentiel phénotype de résilience au stress; 2) la possibilité que la mutation G1449A affecte chez elles le système noradrénergique et que cette dysfonction soit associée à un fonctionnement altéré de l’axe hypothalamo-pituitaire-adrénal (HPA), 3) un effet de plafond de l’anxiété exprimée par les souris mutantes non-stressées et 4) une insuffisance d’intensité du protocole de stress chronique utilisé.

La première hypothèse est posée en raison de l’existence de mutations qui confèrent, chez certaines souches de souris, une plus grande résistance aux effets du stress chronique sur les comportements d’anxiété ou la cognition (Elliott, Ezra-Nevo, Regev,

Neufeld-Cohen, & Chen, 2010; Feder, Nestler, & Charney, 2009), ainsi que la tendance non-significative des résultats suggérant une réduction de l’anxiété et des erreurs de

143 persévération chez les mutantes, suite au stress chronique. En ce qui concerne la seconde hypothèse, des résultats obtenus avec les souris mutantes G1449A laissent entrevoir la possibilité d’un dérèglement du système noradrénergique chez ces souris (Jacobsen,

Siesser, et al., 2012). Ce type de dérèglement pourrait être associé à un dysfonctionnement de l’axe HPA et contribuer à une forme d’adaptation accélérée des souris au protocole de stress chronique de contention (Dallman, 2007). Pour ce qui est de la troisième hypothèse, elle réfère à une forme d’effet plafond de l’anxiété chez les souris HO, qui ont un niveau d’anxiété si élevé, en l’absence d’un stress chronique, que ce dernier ne détériore pas davantage leur comportement. Ce type d’effet plafond est parfois rapporté lors de l’utilisation de tests d’anxiété chez l’humain, surtout avec les cas de troubles sévères

(Bobes, Garcia-Calvo, Prieto, Garcia-Garcia, & Rico-Villademoros, 2006 ; Page, Hooke, &

Morrison, 2007 ; McLean & Hope, 2010). Cette hypothèse est plausible chez l’animal, d’autant plus que les souris HO non stressées, HO stressées et WT stressées ont des comportements d’évitement similaires dans les deux tests d’anxiété, suggérant qu’il y aurait un niveau maximal d’anxiété au-delà duquel il est difficile d’augmenter les comportements d’évitement chez les souris des deux génotypes. Une autre explication probable pour expliquer cet effet plafond observé chez les HO non stressées est la possibilité que celles-ci aient été soumises à une forme de stress chronique précoce dès les premières semaines de leur vie. Cette explication est exposée en plus de détails vers la fin de la section 4.3,

Modèle animal et observations chez l’humain.

La dernière hypothèse réfère à une insuffisance du protocole de stress chronique à générer une réponse anxieuse chez les souris. Sa validité est improbable. En effet, les souris

WT soumises au stress chronique ont des augmentations significatives de leurs comportements d’évitement, indicatifs de l’anxiété, ce qui atteste de l’efficacité du

144

protocole. Par conséquent, il est apparent que l’hypothèse d’une résilience biologique face au stress, du dérèglement de l’axe HPA et de l’effet plafond de l’anxiété atteint chez les souris HO sont celles qui ont le meilleur potentiel de générer des expériences supplémentaires.

Le labyrinthe en H utilisé dans le chapitre 2 est une tâche cognitive qui évalue l’apprentissage de trois règles, soit l’alternance, la non alternance et l’inversion. Il permet d’évaluer l’apprentissage et la flexibilité cognitive dans une tâche spatiale (Del'Guidice et al., 2009). Les souris HO y sont déficitaires dès le départ : elles commettent plusieurs erreurs de persévération et sont pour la plupart incapables d’apprendre correctement les trois règles. Suite au même stress chronique que celui utilisé avant les tâches d’anxiété, les souris WT démontrent également des déficits importants et font plusieurs erreurs de persévération; les souris HO, elles, font sensiblement autant d’erreurs de persévération et ne semblent pas être affectées par le stress. Ces résultats concordent avec d’autres expériences qui rapportent des déficits cognitifs suite à une réduction de la 5-HT ou des améliorations de performance suite à une augmentation du même neurotransmetteur (Brigman, et al.,

2010; Hohmann, Walker, Boylan, & Blue, 2007; Lieben, Steinbusch, & Blokland, 2006;

Lieben, van Oorsouw, Deutz, & Blokland, 2004; Sirvio, Riekkinen, Jakala, & Riekkinen,

1994), de même que des expériences qui démontrent que le stress chronique, chez des rongeurs normaux, cause des déficits cognitifs importants (Lapiz-Bluhm, et al., 2009; Li et al., 2008; Nagata, Nakashima-Kamimura, Mikami, Ohsawa, & Ohta, 2009).

L’ensemble de ces résultats obtenus dans le chapitre 2, suggère que l’anxiété est un facteur important dans les erreurs de persévération qui, elles, nuisent aux performances cognitives. Les déficits cognitifs observés chez les souris à 5-HT réduite seraient donc en grande partie modulés par l’anxiété.

145

Compte tenu que les souris mutantes HO sont plus anxieuses que les souris WT, et en raison du lien fréquemment observé entre l’anxiété et la consommation d’alcool

(Kushner et al., 2012), le chapitre 3 vise à déterminer le niveau de préférence pour l’alcool des souris mutantes et leur motivation à consommer cette substance. Des tests préliminaires vérifient les préférences gustatives et la motivation appétitive et aversive des souris. Ces tests ne révèlent aucune différence entre les souris des deux génotypes quant à leur capacité

à discriminer une solution appétitive (sucrose) ou une solution aversive (quinine) et quant à leur motivation à rechercher la première et à éviter la seconde. Après l’exposition à une solution d’alcool dont la concentration augmente progressivement (3%, 6% et 10%) et un sevrage, les souris mutantes et les souris contrôles ne diffèrent pas dans leur préférence pour l’alcool. De même, l’introduction de quinine dans l’alcool après le sevrage indique que les deux groupes de souris ont une aversion comparable pour l’alcool additionné de quinine. Quand la quinine est ajoutée à de l’alcool avant et après le sevrage, les souris HO démontrent un niveau d’aversion pour la solution alcoolisée et amère inférieur à celui des souris WT. Cette aversion moindre des souris HO se maintient dans une version prolongée de la même tâche. Quand la quinine est ajoutée à l’alcool avant le sevrage et à de l’eau non alcoolisée après le sevrage, l’aversion des souris HO ne diffère pas de celle des souris WT.

Ces résultats indiquent que les souris mutantes Tph2, qui ont un déficit important de production de la 5-HT cérébrale et qui présentent un niveau d’anxiété élevé, ont une motivation accrue pour la consommation d’alcool. En effet, le fait de consommer une substance malgré des conséquences aversives directement associées à la consommation est considéré comme un phénotype important des modèles animaux d’abus d’alcool ou de dépendance aux drogues (Correia, Ribeiro, Brunialti Godard, & Boerngen-Lacerda, 2009;

Deroche-Gamonet, et al., 2004; Robinson, 2004; Vendruscolo et al., 2012). Ces modèles

146

peuvent refléter les caractéristiques d’individus consommant abusivement de l’alcool, malgré les conséquences néfastes de leur consommation, telles que les pertes financières et l’isolement social (Devlin, Scuffham, & Bunt, 1997; Perkins, 1992; Robbins, 1989).

Parmi les résultats obtenus au chapitre 3, il peut sembler à première vue difficile d’accorder l’absence de différence de préférence pour l’alcool entre les souris mutantes et les souris contrôles avec l’aversion moins prononcée des mutantes pour l’alcool en présence de quinine. Il serait logique de s’attendre à ce que des souris susceptibles à la dépendance ou l’abus d’alcool présentent à tout le moins une préférence pour cette substance. Cependant, les indices de préférence à l’alcool des souris des deux génotypes s’approchent de zéro, soit l’absence de préférence par rapport à l’eau, à tous les temps de mesure.

À ce sujet, il est important de mentionner que dans la majorité des cas, chez l’humain, la préférence à l’alcool est fortement corrélée à la préférence au sucre, qui est retrouvé en grandes quantités dans la majorité des boissons alcoolisées ; plusieurs gènes associés à la dépendance à l’alcool chez l’humain seraient également associés à la consommation excessive de sucre (Kampov-Polevoy, Garbutt, & Janowski, 1999 ; Fortuna,

2012). De plus, au Québec et au Canada, les ventes de vin ou de bière, en termes de litre d’alcool absolu, sont plus élevées que celles de spiritueux (Institut national de santé publique du Québec, 2003), les premiers contenant généralement des glucides ou sucres ajoutés, contrairement aux derniers (United States Department of Agriculture, 2011). Il est donc possible que le développement de la préférence pour l’alcool débute chez certains avec un attrait pour les goûts sucrés, puis se maintienne grâce à l’interaction entre le goût de la substance et ses effets. Dans les expériences effectuées au chapitre 3, la boisson alcoolique utilisée est un spitirueux sans additif sucré, mélangé à de l’eau distillée. Par

147 conséquent, la partie de l’attrait pour l’alcool qui peut être attribuée à son goût sucré plutôt qu’à ses effets psychotropes chez l’humain n’est probablement pas présente dans les expériences effectuées. Le développement d’une préférence à l’alcool chez les souris aurait possiblement bénéficié d’un stade d’exposition à une substance alcoolisée mélangée à un

édulcorant, afin de la rendre sucrée. Ceci étant dit, le fait que les niveaux de préférence pour la solution d’alcool et de quinine diffèrent entre les souris des deux génotypes et que cette différence se maintient dans deux protocoles, dont un allongé, suggère une motivation accrue des mutantes pour la consommation d’alcool, possiblement davantage en lien avec ses effets psychotropes que son goût. Bien que les souris mutantes ne présentent pas une préférence pour l’alcool plus marquée que les souris contrôles, elles persévèrent tout de même dans leur consommation de la substance lorsque celle-ci est rendue aversive par l’ajout de quinine, ce qui laisse entrevoir qu’elles seraient prédisposées à l’éthylisme.

Par ailleurs, le phénotype comportemental des souris mutantes Tph2 n’inclut pas l’anhédonie, un symptôme généralement associé à la dépression majeure (Kalueff,

Gallagher, & Murphy, 2006), puisque la motivation des souris HO à consommer des produits appétitifs, comme le sucrose, ne diffère pas de celle des souris contrôles. Ces résultats confirment qu’une réduction de la 5-HT cérébrale est effectivement associée à une prédisposition à consommer davantage d’alcool, du moins en présence d’un phénotype anxieux (Higley, Hasert, Suomi, & Linnoila, 1998; LeMarquand, Pihl, & Benkelfat, 1994a,

1994b; Naranjo & Knoke, 2001; Tollefson, 1989, 1991).

4.2 Intégration des résultats Les souris mutantes, porteuses de la mutation G1449A de Tph2, analogue à la mutation G1463A chez l’humain, présentent des comportements généralement associés à

148

l’anxiété chez les rongeurs. Soumettre des souris non porteuses de cette mutation à un stress chronique induit chez elles des comportements d’anxiété, alors qu’aucun effet anxiogène supplémentaire n’est induit par le stress chez les mutantes. De même, les souris porteuses de la mutation ne démontrent pas de déficits gustatifs ni de différences de préférence à l’alcool. Cependant, lorsque l’alcool leur est offert dans une condition aversive, c’est-à-dire avec de la quinine, une substance amère, les souris mutantes ont une motivation plus élevée à la consommation d’alcool que les souris contrôles. Ce phénotype n’est pas sans rappeler les conduites associées à l’abus ou à la dépendance à l’alcool chez l’humain (American Psychiatric Association, 2002) : il est fréquent qu’un individu persiste

à consommer de l’alcool alors que ce comportement est associé à des conséquences désagréables. En outre, la consommation abusive d’alcool est associée à l’anxiété (Bolton, et al., 2006; Bolton, et al., 2009) et un mécanisme de réduction de la tension a été proposé pour expliquer cette relation entre les deux comportements (Cappell, et al., 1981; Conger,

1956; Hinson & Siegel, 1980; Koob, 2013; Poulos, et al., 1981; Siegel, 1979, 1983;

Stockwell, et al., 1982). Il est donc possible que le niveau d’anxiété des souris mutantes soit en lien avec leur motivation plus élevée pour la consommation d’alcool. L’aversion plus faible des souris mutantes Tph2 à consommer l’alcool mélangée à de la quinine après une familiarisation et un sevrage démontre une motivation accrue pour l’alcool. Celle-ci suggère une certaine vulnérabilité à la dépendance à l’alcool, qui mettrait partiellement en cause la mutation du gène Tph2 (Beaulieu et al., 2008).

Un modèle motivationnel de l’alcoolisme chez l’humain (Cooper, et al., 1995; Cox

& Klinger, 1988) fait état de deux types de motivation pour expliquer le maintien du comportement de consommation abusive d’alcool : la motivation à réduire la tension et la motivation à augmenter les émotions positives. Selon l’analyse factorielle qui a validé ce

149 modèle (Ooteman, et al., 2006), la corrélation entre l’anxiété auto-rapportée des sujets alcooliques et la motivation à augmenter les émotions positives est très faible, alors que la corrélation entre l’anxiété auto-rapportée et la motivation à réduire la tension est plus forte.

Ces données s’accordent bien avec les hypothèses sur la réduction de la tension et le renforcement négatif (Conger, 1956; Siegel, 1979, 1983). Les deux modèles semblent bien s’appliquer aux souris mutantes Tph2 : celles-ci présentent un phénotype anxieux important de même qu’une motivation accrue pour la consommation d’alcool, bien que leur consommation de base ne diffère pas de celle des souris contrôles. Les souris mutantes chercheraient davantage à réduire une tension (anxiété) qui n’est pas présente chez les souris WT. De plus, leur niveau de consommation est relativement bas ; à l’exception de la condition alcool sans quinine, l’eau est toujours préférée à l’alcool – il est donc peu probable que les souris soient à la recherche d’une augmentation des émotions positives, car elles consommeraient alors davantage, afin de tirer un maximum d’effet de l’alcool disponible.

Les données obtenues vont dans le sens de l’hypothèse selon laquelle la relation entre l’anxiété et la consommation d’alcool aurait comme dénominateur commun des faibles taux de 5-HT (Tollefson, 1989, 1991). Les résultats de nos expériences appuient ces suggestions, en y ajoutant comme précision supplémentaire qu’une réduction de la 5-HT limitée au système nerveux central est suffisante pour être associée à ces comportements.

Les déficits cognitifs observés dans les tâches de réduction expérimentale de 5-HT ou résultant d’élévation auto-rapportée de l’anxiété (déficits de flexibilité cognitive et d’inhibition de la réponse), sont associés aux conduites impulsives et compulsives dont font partie à la fois certains troubles anxieux et les dépendances et l’abus d’alcool (Fineberg, et al., 2010). Les performances déficitaires des souris HO dans le labyrinthe en H, plus

150

précisément leur nombre élevé d’erreurs de persévération, sont apparentées à ces conduites.

Les résultats obtenus ici soutiennent les nombreuses associations faites entre le neurotransmetteur 5-HT, l’anxiété, les déficits cognitifs associés à ceux-ci, ainsi que la consommation abusive d’alcool.

Les souris mutantes ont présenté des déficits d’apprentissage et de flexibilité cognitive, accompagnés d’erreurs fréquentes de persévération, dans une tâche d’apprentissage spatial évaluant le fonctionnement cognitif, le labyrinthe en H. Lorsque soumises à un stress chronique, les souris WT ont présenté un profil de réponse similaire à celui des souris HO, alors que le taux de succès final de ces dernières, lorsque soumises à un stress chronique, est demeuré relativement inchangé. Les souris stressées des deux génotypes ont des performances similaires. Les mêmes variations de comportement associé

à l’anxiété sont observées : les souris HO sont plus anxieuses que les souris WT et ces dernières deviennent plus anxieuses suite à l’exposition à un stress chronique, ce qui n’est pas le cas des souris HO. Les souris stressées des deux génotypes émettent autant de comportements d’évitement. Les résultats obtenus ici, en lien avec la performance cognitive et l’anxiété, vont dans le sens de la théorie du contrôle attentionnel (Eysenck &

Calvo, 1992; Eysenck, et al., 2007), ainsi que de celles de la régulation des processus

émotionnels et comportementaux par la 5-HT (Cools, et al., 2008) et de la modulation de la prise de décision par la 5-HT (Homberg, 2012).

Plus précisément, Eysenck et ses collaborateurs (Eysenck & Calvo, 1992; Eysenck, et al., 2007) postulent que lorsqu’un individu ressent de l’anxiété, son attention centrée sur les stimuli prend le pas sur son attention dirigée vers un but. Ceci affecte négativement sa performance cognitive, du fait de la faible flexibilité de l’attention centrée sur les stimuli.

Les auteurs mentionnent, parmi d’autres fonctions affectées par l’anxiété, la mémoire de

151 travail, l’inhibition de la réponse et la flexibilité cognitive. Il s’avère que le labyrinthe en H demande le bon fonctionnement de ces fonctions afin d’en arriver à compléter les trois phases (Del'Guidice, et al., 2009) et que les souris qui démontrent de l’anxiété éprouvent des difficultés importantes à le faire. La théorie de l’efficacité du traitement cognitif et la théorie du contrôle attentionnel ont originalement été élaborées pour expliquer des déficits de performance cognitive chez des sujets humains anxieux. Cependant, certains de leurs postulats s’appliquent aux animaux porteurs d’une mutation similaire à celle retrouvée chez des humains dépressifs majeurs. De plus, le système sérotoninergique pourrait représenter un substrat biologique important pour appuyer les postulats proposés par Eysenck et ses collaborateurs. En effet, ceux-ci se limitent à discuter du rôle de certaines aires frontales dans le fonctionnement exécutif. Cependant, les données obtenues dans la présente thèse suggèrent que les fibres sérotoninergiques ont un rôle important, à la fois dans l’anxiété et dans un fonctionnement exécutif optimal.

En ce qui concerne les modèles théoriques du rôle de la 5-HT dans l’anxiété, la cognition et la consommation d’alcool, les données obtenues sont surtout en accord avec ceux de la modulation de la prise de décision (Homberg, 2012), de la régulation des processus émotionnels et comportementaux (Cools, et al., 2008) et de l’évaluation des récompenses futures (Schweighofer, et al., 2007). En effet, tel que prévu par ces modèles, les souris à faible production de 5-HT cérébrale démontrent un niveau élevé d’anxiété, ainsi que des déficits cognitifs, plus particulièrement de flexibilité cognitive et d’inhibition de réponses précédemment apprises. En parallèle avec cette inflexibilité, souvent associée à de l’impulsivité (Fineberg, et al., 2010; Poulos, et al., 1996), les souris mutantes étudiées dans la présente thèse ont un niveau plus élevé de motivation pour l’alcool en conditions aversives. Bien que ceci ne se soit pas traduit en une consommation abusive ou en

152

dépendance à l’alcool, les résultats obtenus vont sensiblement dans le même sens que ce que les modèles théoriques prédisent en lien avec une réduction des taux de 5-HT. Les résultats présentés au chapitre 3 suggèrent que la motivation à l’alcool associée à une réduction de la 5-HT cérébrale prédispose à l’éthylisme chez les souris.

Les données présentées dans les chapitres 2 et 3 s’accordent relativement bien avec la théorie de la régulation des processus émotionnels et comportementaux (Cools, et al.,

2008). Les postulats de la théorie, au niveau biologique, sont concordants avec les résultats empiriques de Dzirasa et ses collaborateurs (2013), qui rapportent un dérèglement des décharges neuronales entre le cortex frontal et l’amygdale. La théorie de Cools et ses collaborateurs prédit que des taux réduits de 5-HT sont responsables de déficits des fonctions exécutives, de l’apprentissage et et de la mémoire, ce qui concorde avec les données obtenues dans le labyrinthe en H au chapitre 2 de la présente thèse. L’impulsivité et des déficits d’inhibition comportementale font partie des prédictions les plus importantes d’une réduction de la 5-HT selon le modèle de Cools ; les déficits d’inhibition de la réponse et les multiples erreurs de persévération des souris mutantes homozygotes dans le labyrinthe en H concordent avec ces prédictions. La théorie postule que le niveau d’inhibition réduit du cortex frontal sur l’amygdale cause, chez les organismes à 5-HT réduite, des troubles au niveau affectif, comme de l’anxiété. Ce phénotype est observé dans les tâches d’émergence noirceur-lumière et de labyrinthe en croix surélevé au chapitre 2.

Cependant, le mécanisme postulé comme responsable de ces déficits en cas de 5-HT réduite avant la révision de la théorie, soit une attente exagérément élevée de l’impact prédit des punitions, ne s’applique pas aux données obtenues dans le labyrinthe en H, cette tâche n’impliquant pas de punitions. De plus, la théorie de la régulation des processus

émotionnels et comportementaux prévoit que les organismes à 5-HT réduite seront

153 davantage vulnérables aux stresseurs. Cette prédiction ne s’avère pas applicable au cas des souris mutantes G1449A, chez lesquelles les homozygotes subissent une réduction de ≈

80% de la production de 5-HT cérébrale (Beaulieu., et al., 2008).

Les postulats de la théorie de la modulation de la fuite de Tops et al. (2009) ont généralement été contredits par les données obtenues ici. En effet, une réduction de la 5-HT cérébrale chez les souris mutantes est plutôt associée à une anxiété accrue. De plus, tel que mentionné précédemment, la théorie de la modulation de la fuite permet difficilement d’expliquer les déficits cognitifs observés chez les souris. Cette théorie permet par ailleurs d’expliquer plusieurs comportements associés à l’alimentation, la 5-HT étant associée à l’état de satiété. En s’y fiant, il serait donc possible d’affirmer que le niveau de satiété pour l’alcool en condition aversive, chez les souris mutantes, est déréglé, ce qui expliquerait leur motivation accrue pour la substance. Cependant, les postulats de ce modèle en lien avec l’anxiété excluent la possibilité de lier le phénotype anxieux des souris à leur motivation accrue pour l’alcool. Enfin, bien que ces données n’aient pas été l’objet des expériences effectuées dans le cadre de cette thèse, des résultats obtenus en lien avec l’agressivité

(Beaulieu, et al., 2008) sont en accord avec les postulats de Tops et ses collaborateurs

(2009) sur le rôle de la 5-HT.

En ce qui concerne la théorie de l’évaluation des récompenses futures

(Schweighofer, et al., 2007), bien qu’il ait été mentionné que son cadre soit relativement limité et ne permette pas de couvrir une grande proportion des fonctions de la 5-HT, elle permet tout de même de faire certaines prédictions qui s’accordent avec les résultats obtenus dans les chapitres 2 et 3. En effet, ce modèle prédit qu’une réduction des taux de 5-

HT mène à une impulsivité accrue qui, elle, peut être associée à l’alcoolisme et au maintien de troubles affectifs, tels que la dépression majeure. L’impulsivité comportementale des

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souris mutantes est démontrée par leurs erreurs de persévération. Celles-ci présentent

également un niveau de motivation accru pour l’alcool, qui peut représenter un indice de susceptibilité à l’éthylisme. Enfin, les prédictions du modèle quant aux troubles affectifs sont en quelque sorte confirmées par les données de Beaulieu et ses collaborateurs (2008) dans le test de suspension par la queue, ainsi que par de nombreux résultats obtenus dans divers tests d’anxiété (Beaulieu et al., 2008 ; Siesser et al., 2013 ; chapitre 2).

Enfin, le modèle théorique du modulateur de la prise de décision (Homberg, 2012), est celui qui s’accorde probablement le mieux avec les données obtenues aux chapitres 2 et

3. Notamment, l’auteure postule que le rôle de 5-HT est d’intégrer des informations sensorielles et émotionnelles utiles d’un point de vue motivationnel, menant ainsi à un état de vigilance très similaire à l’attention centrée sur le but dans la théorie du contrôle attentionnel (par opposition à l’attention centrée sur le stimulus, voir Eysenck & Calvo,

1992; Eysenck, et al., 2007). Ainsi, selon cette théorie, il faudrait s’attendre à ce qu’un organisme à 5-HT réduite ait des déficits de flexibilité cognitive et d’inversion des apprentissages, ce qui s’est produit dans les expériences effectuées. Des comportements impulsifs et compulsifs, tels que des conduites anxieuses, ainsi que de la consommation excessive d’alcool sont également prédits. Bien que les souris mutantes utilisées dans les expériences des chapitres précédents n’aient pas consommé excessivement d’alcool, leur phénotype suggère une susceptibilité à une consommation abusive malgré la présence de stimuli aversifs dans l’environnement. À la différence du modèle de Cools et ses collaborateurs (2008), celui d’Homberg (2012), par ailleurs très similaire, ne prédit pas une plus grande vulnérabilité au stress chez les organismes à 5-HT réduite. Les données obtenues dans la présente thèse sont donc davantage concordantes avec la théorie du neurotransmetteur 5-HT comme modulateur de la prise de décision.

155

4.3 Modèle animal et observations chez l’humain Les données recueillies dans la présente thèse appuient l’idée que les souris knockin

Tph2 porteuses de la mutation G1449A constituent un modèle animal d’une validité intéressante (Arguello & Gogos, 2006; Doré & Goulet, 2002) lorsque comparé aux effets des déficits sérotoninergiques observés chez l’être humain. En effet, le modèle présente une validité symptomatologique et biochimique, en accord avec ce qui est connu de la présentation clinique de la dépression majeure et de l’anxiété (American Psychiatric

Association, 2002; An, et al., 2008; Baldwin & Rudge, 1995; Coppen, 1967; Illi, et al.,

2009; Jacobsen, Medvedev, et al., 2012; McWilliams, et al., 2003; Rawana, 2013; Reuter,

Kuepper, et al., 2007; Sachs, et al., 2013). Cependant, la validité du modèle n’est pas parfaite ; sa validité étiologique pourrait être améliorée, alors que la réponse au traitement des souris n’est pas celle qui serait attendue d’humains anxieux ou dépressifs.

Effectivement, alors qu’on considère le stress chronique comme une cause possible d’élévation de l’anxiété ou de la dépression chez les êtres humains, le présent modèle n’arrive pas à générer une telle réponse symptomatique chez les souris mutantes, bien qu’il le fasse chez les WT. En ce qui concerne la réponse au traitement pharmacologique, elle est l’inverse de ce qui serait attendu de patients dépressifs ou anxieux (Siesser, et al., 2013).

Bien que le traitement aux ISRS n’ait pas été efficace chez les souris mutantes

(Siesser, et al., 2013), des expériences sur ces dernières fournissent des pistes de réflexion quant au développement de traitements potentiels pour les humains porteurs de la mutation et réfractaires aux effets des ISRS. L’agoniste des récepteurs 5-HT2C, CP809.101, ainsi que le 5-HTP, ont démontré une efficacité significative pour améliorer les déficits cognitifs des

156

souris (Del’Guidice et al., 2013). Enfin, le modèle animal a tout de même permis de déterminer pourquoi le traitement aux ISRS en était un à éviter pour les porteurs de la mutation, étant à l’origine d’une réduction drastique des taux de sérotonine cérébrale lorsqu’administrés de façon chronique (Siesser, et al., 2013).

Les humains porteurs de la mutation sont plus sévèrement atteints que la moyenne des patients dépressifs, ce qui pourrait les placer dans une catégorie autre que les dépressifs majeurs ou les anxieux faisant généralement l’objet d’études empiriques (Zhang, et al.,

2005b). Des chercheurs ont déjà proposé un modèle allant au-delà des catégories diagnostiques du DSM-IV, à l’aide d’analyses factorielles faites sur des données

épidémiologiques (Eaton, et al., 2011; Krueger, 1999; Krueger & Markon, 2006). Le phénotype comportemental des souris mutantes Tph2 pourrait représenter un modèle animal intéressant des troubles d’internalisation (plus précisément la rubrique détresse) du modèle de Krueger. La dépression majeure et l’anxiété généralisée figurent dans cette catégorie du modèle, alors que les humains porteurs de la mutation sont majoritairement diagnostiqués avec un trouble dépressif majeur, ainsi que des symptômes d’anxiété généralisée comorbides. Les souris mutantes Tph2 ont à la fois comme phénotype des comportements apparentés à la dépression (outre l’anhédonie) et à l’anxiété. De plus, des données récentes suggèrent que la consommation d’alcool, chez l’humain, est fortement corrélée avec les troubles internalisés du modèle de Krueger (Kushner, et al., 2012). Les données comportementales recueillies sur les souris mutantes Tph2 sont donc en accord avec les données épidémiologiques chez l’humain. La réduction cérébrale de 5-HT pourrait ainsi être considérée comme un facteur de risque majeur pour le développement des troubles internalisés.

157

Une inconsistance possible entre l’effet plafond observé chez le modèle animal et les observations chez l’humain est due à la probable influence de l’environnement. Parmi les porteurs de la mutation de l’étude de Zhang et al. (2005a), certains n’ont pas été diagnostiqués comme dépressifs ou présentant des symptômes anxieux. Il est fort probable que chez ceux-ci, des influences environnementales aient eu un effet protecteur (Nugent,

Tyrka, Carpenter, & Price, 2011). En effet, il est reconnu que chez l’humain, une interaction importante entre le profil génétique d’un individu et les stresseurs dans son environnement peut être à l’origine de la génèse d’un trouble psychiatrique ou, au contraire, représenter un facteur de protection (Caspi, Hariri, Holmes, Uher, & Moffitt, 2010; Caspi et al., 2002; Caspi et al., 2003). L’environnement peut donc représenter un facteur protecteur, ou à l’inverse, un facteur précipitant, dans le développement de psychopathologies chez les humains porteurs de la mutation. Par conséquent, il serait logique de croire que les protocoles de stress chronique utilisés dans le chapitre 2 et dans l’article de Sachs et ses collaborateurs (2013) auraient dû induire davantage de conduites apparentées et corrélées à l’anxiété chez les souris mutantes que ce qui est observé, le stress chronique étant une façon de modéliser un facteur de risque environnemental (Post et al., 2011; Schmidt, Sterlemann,

& Muller, 2008). Ceci étant dit, sans avoir pu tester les effets d’un stress chronique sur les humains porteurs de la mutation, il est difficile de se prononcer sur l’existence ou non d’un effet plafond des conduites anxieuses ou dépressives chez ceux-ci. Il serait aussi tentant de conclure qu’une fois que des souris ont subi une réduction cérébrale de la 5-HT, il n’est plus possible pour leur phénotype anxieux ou cognitif de se détériorer ; elles seraient alors moins vulnérables aux influences de l’environnement que les humains. Cependant, une possibilité intéressante, mentionnée à la section 4.1, Synthèse générale des résultats, est que les souris mutantes subissent presque toutes un stress chronique précoce en bas âge.

158

Chez les souris knockout de Tph2, lorsque les mères donnent naissance à une portée, des phénomènes importants de négligence maternelle sont observés. Le taux de survie des souriceaux nés de mères mutantes est très faible ; la majorité d’entre eux se fait cannibaliser par la mère. Chez des souris ayant adopté des portées de mères d’autres génotypes, la moitié des souriceaux se fait cannibaliser par les mères knockout, pour moins de 6% pour les mères WT. La majorité des mères mutantes n’arrive pas à retrouver ses souriceaux, à reconstruire un nid et à les y placer en moins de 30 min, alors qu’en moyenne, les mères WT accomplissent ces tâches en moins de 4 min (Alenina et al., 2009).

Les auteurs de l’article démontrent ensuite que ce comportement n’est pas causé par un déficit des fonctions olfactives, les souris des deux génotypes prenant le même temps à retrouver un biscuit enfoui dans de la litière fraîche.

Bien qu’une expérience équivalente n’ait pas été effectuée sur les souris portant la mutation G1449A de Tph2, il est probable que le même phénomène soit observé dans leurs portées. Ainsi, il est possible que la majorité des mutantes soit inévitablement soumise à un stress de nature environnemental en début de vie, ce qui expliquerait le faible effet du stress chronique récent. En effet, les souris ayant subi un stress chronique très précoce ne sont possiblement plus affectées aussi fortement par un stress chronique récent à l’âge de 3 mois

(hypothèse de l’effet plafond), ou se sont possiblement acclimatées, de sorte que le stress utilisé dans les expériences n’était pas efficace chez elles (hypothèse de l’adaptation). Ceci pourrait également expliquer pourquoi certains porteurs de la mutation chez l’humain ne développent pas de trouble psychiatrique clair. En effet, chez ces derniers, plusieurs facteurs entrent en jeu (la mère n’est peut-être pas porteuse de la mutation, un des parents peut fournir un facteur de protection, l’enfant peut en outre vivre une enfance sans

159 traumatismes majeurs, etc.), alors que le tableau est plus homogène chez les souris élevées en laboratoire.

4.4 Recherches futures et implications cliniques En lien avec les effets respectifs du bagage génétique et de l’environnement sur les comportements, il pourrait être intéressant de départager l’apport de chaque facteur dans le phénotype des souris mutantes G1449A. En effet, étant donné la possibilité qu’une partie du phénotype des souris mutantes Tph2 soit le résultat des soins maternels dysfonctionnels, il serait intéressant de vérifier si des souris mutantes élevées par des mères WT présentent des variations similaires au niveau des déficits cognitifs, de la motivation pour l’alcool, de l’anxiété et de la réaction au stress. Les données ainsi obtenues permettraient d’éclaircir l’apport de la mutation et de l’environnement dans le phénotype des souris mutantes, et peut-être de dériver des hypothèses quant à l’étiologie du phénotype des humains porteurs.

Une question qui demeure en suspens est celle de la potentielle résilience des souris mutantes face au stress. Elle est intimement liée à l’apport de l’environnement ou des gènes sur le phénotype d’un organisme. Les comportements anxieux et les déficits cognitifs des souris porteuses de la mutation G1449A ne se sont pas significativement détériorés suite à l’administration du stress de contention dans le chapitre 2. Il est possible que cette mutation soit associée à une résilience accrue au stress, d’autres chercheurs ayant rapporté que des mutations peuvent augmenter la résilience à l’anxiété chez les souris (Elliott, et al., 2010;

Feder, et al., 2009). De plus, certains des résultats obtenus au chapitre 2, bien que non significatifs, montrent une tendance très marginale vers la réduction d’anxiété et moins d’erreurs de persévération chez les souris mutantes stressées, comparées aux mutantes contrôles.

160

Bien qu’apporter quelques éclaircissements au sujet de l’interaction gènes et environnement dans leur phénotype puisse répondre en partie à la question, tenter de déterminer le seuil minimal de stress chronique requis pour affecter les comportements des souris mutantes revêt tout de même un intérêt certain. Il est généralement reconnu que varier l’intensité, la durée et la fréquence d’un stress de contention peut mener à des résultats très divers (Buynitsky & Mostofsky, 2009). D’autres méthodes d’induction du stress chronique, telles que la défaite sociale répétée (Albonetti & Farabollini, 1994;

Golden, Covington, Berton, & Russo, 2011), l’isolement social (Pham, Soderstrom,

Winblad, & Mohammed, 1999; Voikar, Polus, Vasar, & Rauvala, 2005; Von Frijtag et al.,

2000) et les chocs électriques inévitables à répétition, pourraient être évaluées afin de déterminer leurs effets sur divers comportements. Ces expériences permettraient d’estimer ensuite le niveau de résilience des patients porteurs de la mutation aux tracas quotidiens et aux traumatismes. En outre, elles pourraient également informer les cliniciens et les aider à

établir des pronostics plus justes, ainsi qu’à évaluer les risques de rechute en cours de traitement. Dans la totalité des expériences effectuées dans le cadre de cette thèse, les souris

étudiées étaient hébergées en solitaire – il pourrait être intéressant de comparer les mêmes comportements, chez des souris hébergées en groupe, afin de tester l’effet de l’isolement social sur les phénotypes observés.

Dans le même ordre d’idées, il serait important de se pencher sur les possibles déterminants biologiques et environnementaux de la motivation des souris mutantes Tph2.

Sachant que cette mutation peut affecter le niveau de motivation des souris pour une substance, soit l’alcool, il demeure possible que d’autres types de motivation soient affectés, ce qui peut avoir une incidence sur une forte proportion des comportements observés. De plus, certaines facettes de la motivation pour l’alcool n’ont pas été étudiées

161 dans la présente thèse. Une première étape serait d’étudier la réaction des souris mutantes face à l’exposition à une substance alcoolique sucrée, afin de vérifier si leur préférence à cette substance est supérieure à celle des souris contrôles. Afin d’en connaître davantage sur ce qui module la motivation des souris mutantes porteuses de la mutation G1449A pour l’alcool, il serait intéressant de les soumettre à divers stress chroniques et aigus afin de voir si elles en consomment davantage ou moins, suite à l’exposition à certains stress.

L’injection de 5-HTP, ou de toute autre substance sérotoninergique qui contourne l’effet de la mutation, serait également une bonne manière de s’assurer que ce sont bien les taux de 5-

HT réduite qui conduisent à une motivation accrue pour l’alcool chez les mutantes, et pas un mécanisme non identifié. La quantification des taux de divers neurotransmetteurs, dont la 5-HT, avant et après exposition à l’alcool serait également d’un intérêt marqué pour mieux comprendre la fonction de ceux-ci dans les comportements d’éthylisme. Dans le cas où les taux de 5-HT cérébrale augmenteraient suite à la consommation d’alcool, une partie des déterminants biologiques du modèle de réduction de la tension et de renforcement négatif (Conger, 1956; Siegel, 1979, 1983) serait élucidée, ce qui renforcerait davantage la fonction de la 5-HT dans ce modèle.

Dans une optique d’amélioration des conditions pour les humains porteurs de cette mutation ou d’autres mutations entraînant une réduction massive de 5-HT cérébrale, il serait profitable de tenter d’établir des protocoles de traitement mettant en jeu 5-HTP, afin de vérifier si le phénotype anxieux et cognitif des souris s’améliore suite à son administration. Étant donné que le traitement au 5-HTP peut induire des effets secondaires tels que des nausées, des vomissements, des maux de tête et de la somnolence (Gijsman et al., 2002), il serait idéal de tester également les effets d’autres substances sérotoninergiques, telles que CP809.101, un agoniste des récepteurs 5-HT2C. Cette

162

substance a démontré une certaine efficacité pour améliorer le profil cognitif des souris mutantes Tph2 (Del’Guidice et al., 2013). D’autres agonistes sérotoninergiques pourraient

également représenter des avenues de traitement prometteuses. La validation de l’efficacité de diverses substances sérotoninergiques pour les souris porteuses du polymorphisme

G1449A de Tph2 pourrait représenter une première étape pour l’établissement de traitements pharmacologiques efficaces pour le traitement des humains porteurs de la mutation. Ainsi, il serait intéressant de se pencher sur l’efficacité de ces drogues, chez les patients qui, même s’ils ne sont pas porteurs de la mutation, ne répondent pas aux traitements classiques pour la dépression ou l’anxiété, comme les ISRS. Les découvertes faites sur l’efficacité de ces substances pour réduire chez les souris mutantes la motivation à l’alcool (Zabik, Sprague, & Binkerd, 1994) pourraient même inspirer des travaux en vue de valider de nouveaux traitements pour les cas de comorbidités éthylisme – trouble affectif chez l’humain (Beaulieu, et al., 2012; Labbate, Sonne, Randal, Anton, & Brady, 2004;

Powell, et al., 1995).

4.5 Conclusion Cette thèse confirme que les souris mutantes homozygotes porteuses de la mutation

G1449A sont plus anxieuses que les souris non porteuses et présentent des performances cognitives déficitaires dans une tâche d’apprentissage spatial. Elle permet également d’affirmer que ces souris mutantes ne sont pas affectées par un stress chronique récent de contention, que ce soit au niveau des comportements anxieux ou de la performance cognitive, alors que le même stress affecte les souris de type sauvage. Ces observations suggèrent que l’anxiété a un rôle important à jouer dans les déficits cognitifs observés chez les souris à 5-HT cérébrale réduite. De plus, les résultats obtenus dans les expériences

163 présentées démontrent que les souris mutantes n’ont pas de déficits gustatifs pour le sucrose ou la quinine et que leur motivation appétitive et aversive pour ces produits est égale à celle des souris de type sauvage équivalentes. Les niveaux de préférence à l’alcool sont égaux chez les deux types de souris. Cependant, la motivation des souris mutantes à consommer de l’alcool, après avoir été familiarisées à une substance alcoolique rendue amère par de la quinine, est supérieure.

Les résultats obtenus sur l’effet du stress chronique et de la motivation à l’alcool sont relativement inattendus. Ils permettent néanmoins d’apporter des connaissances nouvelles sur les effets de cette mutation qui existe sous la forme G1463A chez des humains souffrant de dépression majeure. Ils permettent en outre de comprendre davantage les phénotypes comportementaux observés chez les animaux souffrant de 5-HT cérébrale réduite, ainsi que de dériver des explications probables pour les situations équivalentes chez les humains.

Tel que discuté dans les dernières sections, les résultats des expériences effectuées dans le cadre de cette thèse ont permis d’émettre de nouvelles hypothèses. Celles-ci devraient pouvoir générer d’autres expériences, qui permettront d’en comprendre davantage sur le rôle de la 5-HT cérébrale dans le comportement. De telles expériences permettraient

également d’éclaircir les effets de la mutation étudiée et son rôle dans les comportements apparentés à la psychopathologie. De plus, l’utilisation de modèles animaux portant des mutations qui réduisent sélectivement la production de certains neurotransmetteurs a des retombées sur la compréhension du rôle de chacun des neurotransmetteurs dans les troubles mentaux. Il est probable que les résultats obtenus suite à des expériences utilisant les souris mutantes G1449A aient des retombées dans le monde clinique. Les humains qui ont été identifiés avec la mutation étaient majoritairement atteints de trouble dépressif majeur et de

164

symptômes d’anxiété, puis présentaient des antécédents familiaux d’abus de substances.

Les connaissances acquises à l’aide de ces souris pourraient donc éventuellement inspirer les protocoles de recherche clinique sur les humains souffrant de troubles similaires.

165

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