Identifikation und Charakterisierung pathogenetischer Zusammenhänge des Kurzrippen-Polydaktylie Syndroms

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von Kristin Keßler

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 28.08.2019 Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Georg Kreimer Gutachter: Prof. Dr. med. André Reis PD Dr. Dieter Engelkamp

Die Neigung der Menschen, kleine Dinge für wichtig zu halten, hat sehr viel Großes hervorgebracht.

Georg Christoph Lichtenberg (1742 - 1799)

© KK 08.11.2012

Quilling-Technik: Fibroblast mit primärem Cilium Grün: Cytoplasma, rot: primäres Cilium, blau: Zellkern

I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeic hnis

Ihn

Inhal tsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ...... II

1. Zusammenfassung ...... 1 2. Summary ...... 3 3. Einleitung ...... 5 3.1. Aufbau und Funktion von Cilien ...... 5 3.2. Ciliogenese und intraflagellarer Transport ...... 8 3.3. Ciliopathien ...... 10 3.4. Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome ...... 13 3.5. Zielsetzung dieser Arbeit ...... 16 4. Methoden ...... 17 4.1. Patientenkollektiv ...... 17 4.2. Isolierung von Nukleinsäuren ...... 19 4.2.1. Isolierung von genomischer DNA aus humanem Blut ...... 19 4.2.2. Isolierung von genomischer DNA aus Zellen ...... 19 4.2.3. Isolierung von RNA aus humanem Blut ...... 19 4.2.4. Isolierung von RNA aus Zellen ...... 19 4.2.5. Isolierung von Plasmid-DNA ...... 20 4.2.6. Qualitätskontrolle für isolierte Nukleinsäuren...... 20 4.3. Gelelektrophorese ...... 20 4.3.1. Gelextraktion aus Agarosegelen ...... 20 4.4. Amplifikation genomischer DNA (Whole Genome Amplification) ...... 20 4.5. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...... 21 4.5.1. Standard-PCR ...... 21 4.5.2. GC-rich-PCR ...... 22 4.5.3. Hefe-PCR ...... 23 4.6. Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) ...... 24 4.7. Quantitative real time PCR (qPCR) ...... 24 4.7.1. Durchführung der qPCR ...... 25 4.7.2. Auswertung qPCR ...... 25 4.8. Sequenzierung nach Sanger ...... 26 4.8.1. PCR Aufreinigung ...... 26 4.8.2. Sequenzierreaktion ...... 26 4.8.3. Sequenzieraufreinigung ...... 27

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4.8.4. Analyse der Sequenzen ...... 27 4.9. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) ...... 28 4.9.1. MLPA Sonden-Design ...... 28 4.9.2. Durchführung der MLPA ...... 29 4.9.3. MLPA Auswertung ...... 29 4.10. Klonierung von Plasmiden ...... 29 4.10.1. pCR8/GW/TOPO TA Klonierung ...... 29 4.10.2. LR Clonase Reaktion (Gateway System) ...... 30 4.10.3. Transformation von Plasmiden in chemisch kompetente Bakterien ...... 30 4.10.4. Selektion positiver Klone ...... 31 4.10.5. Herstellung von Bakterien-Kryostocks...... 31 4.11. Zellkultur ...... 31 4.11.1. Auftauen von Zelllinien ...... 31 4.11.2. Kultur von adhärent wachsenden Zellen ...... 31 4.11.3. Splitten von Zellkulturen ...... 32 4.11.4. Einfrieren von Zellkulturen ...... 32 4.11.5. Transfektion von adhärenten Zelllinien mit siRNA ...... 33 4.11.6. Transfektion von adhärenten Zelllinien mit Plasmiden ...... 33 4.12. Lichtmikroskopie ...... 34 4.12.1. Fixierung und indirekte Immunfluoreszenzmarkierung von Zellen ...... 34 4.12.2. Dreifachfärbung von Zellen mittels Zenon Labeling Technologie...... 35 4.12.3. Fluoreszenzmikroskopische Analyse...... 35 4.13. CRISPR/Cas9 ...... 36 4.13.1. CRISPR/Cas9 Vektordesign und Transfektion in HEK293T ...... 37 4.13.2. Fluorescence activated cell sorting (FACS) und Zellernte ...... 38 4.13.3. T7E1 Mismatch Assay...... 38 4.13.4. Identifizierung von Mutationen in CRISPR-Zellklonen...... 39 4.13.5. Überblick über den Ablauf zur Generierung von CRISPR-Zellklonen ...... 40 4.14. Ko-Immunopräzipitation ...... 40 4.15. Western Blot Analyse ...... 41 4.15.1. Herstellung Proteinlysat...... 41 4.15.2. Konzentrationsbestimmung von Proteinen ...... 42 4.15.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ...... 42 4.15.4. Western Blot Transfer und Analyse ...... 43

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4.16. Herstellung eines polyklonalen Antikörpers gegen NEK1 ...... 44 4.16.1. Auswahl des Epitopbereichs und Klonierung in pGEX-4T3 ...... 44 4.16.2. Expression rekombinantes Protein und Aufreinigung im GST-System ...... 45 4.16.3. Testung der Präimmunseren und Immunisierung von Kaninchen ...... 46 4.16.4. Testung der Seren und Aufreinigung des Antikörpers via Hi-Trap Säulen ..... 47 4.17. Zusammenstellung einer Ciliengenliste...... 48 4.18. Ranglistenerstellung von Kandidatengenen mit ENDEAVOUR ...... 49 4.19. Hefe-2-Hybrid-System (Y2H) ...... 50 4.19.1. Die Hefestämme AH109 und Y187 ...... 51 4.19.2. Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae ...... 52 4.19.3. Herstellung der Bait- und Prey-Konstrukte ...... 52 4.19.4. Transformation von Hefezellen ...... 53 4.19.5. Hefe-2-Hybrid-Screen ...... 54 4.19.6. Analyse der positiven Hefeklone ...... 55 4.19.7. Datenbankanalyse ...... 55 4.19.8. 1on1 Hefe-2-Hybrid Assay und α-Galaktosidase Test ...... 55 4.20. Next Generation Sequencing Technologien ...... 56 4.20.1. Exom-Sequenzierung ...... 57 4.20.2. Gen-Panel (TruSight One) Sequenzierung ...... 58 4.20.3. RNA-Sequenzierung ...... 58 5. Material ...... 60 6. Ergebnisse ...... 61 6.1. Mutationen in bereits beschriebenen Genen für SRPS/SRTD ...... 61 6.1.1. Identifizierung von Mutationen in NEK1 ...... 61 6.1.2. Identifizierung von Mutationen in DYNC2H1 ...... 66 6.1.3. Identifizierung von Mutationen in EVC ...... 71 6.2. Identifizierung eines neuen Kandidatengens für SRPS/SRTD ...... 73 6.2.1. Exom-Sequenzierung – DYNC2LI1 Mutationen ...... 73 6.2.2. DYNC2LI1 – ubiquitäre Expression und Lokalisation ...... 75 6.2.3. DYNC2LI1 knockdown – Analyse Cilienmorphologie ...... 78 6.2.4. DYNC2LI1 – weitere Patienten ...... 83 6.3. Herstellung eines polyklonalen Antikörpers gegen NEK1 ...... 86 6.4. Identifikation direkter Interaktionspartner von NEK1 mit dem Hefe-2- Hybrid-System ...... 91

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6.4.1. Analyse der NEK1 Bait Konstrukte hinsichtlich intrinsischer Autoaktivität ... 91 6.4.2. Hefe-2-Hybrid-Screen (Y2H) ...... 93 6.4.3. Identifikation der NEK1 Interaktionspartner mittels Datenbankanalyse...... 94 6.4.4. Analyse der identifizierten NEK1 Interaktionspartner ...... 95 6.4.4.1. Erstellung einer Ciliengenliste ...... 95 6.4.4.2. Erstellung einer Rangliste mit ENDEAVOUR ...... 95 6.4.4.3. Einteilung der NEK1 Interaktionspartner nach Cilien-Evidenz ...... 96 6.4.4.4. Ingenuity Pathway Analyse mit Interaktionspartnern von NEK1 ...... 98 6.4.5. Verifizierung der Interaktion zwischen NEK1 und DYNC2LI1 ...... 101 6.4.5.1. Hefe-2-Hybrid 1on1-Screen ...... 101 6.4.5.2. Kolokalisation ...... 103 6.4.5.3. Ko-Immunopräzipitation ...... 105 6.4.6. Identifizierung von NEK1 Interaktionen mit bekannten Ciliengenen im Großdurchsatz 1on1-Screen...... 106 6.5. Identifikation von ciliären Signaltransduktionswegen mittels CRISPR/Cas9 .. 107 6.5.1. Generierung von NEK1-CRISPR-Zelllinien ...... 108 6.5.2. NEK1 Expression in den CRISPR-Zelllinien auf RNA- und Proteinebene ... 111 6.5.3. Cilienmorphologie in NEK1-CRISPR-Zelllinien ...... 113 6.5.4. RNA-Sequenzierung der NEK1-CRISPR-Zelllinien ...... 117 6.5.4.1. Validierung der differentiell exprimierten Gene in NEK1-CRISPR- Zelllinien ...... 117 6.5.4.2. Analyse von Signalwegen mittels IPA bei NEK1-CRISPR-Zelllinien ...... 119 7. Diskussion ...... 127 7.1. Bekannte Gene für das Phänotypenspektrum der SRPS/SRTD ...... 127 7.1.1. Mutationen im NEK1 Gen ...... 127 7.1.1.1. Weiterführende Analysen der NEK1 Mutation von P1 p.(Arg127*) ...... 128 7.1.1.2. Weitere NEK1-Patienten dieser Dissertation ...... 129 7.1.1.3. NEK1-Mutationsspektrum ...... 131 7.1.2. Mutationen im DYNC2H1 Gen ...... 134 7.1.2.1. DYNC2H1-Patienten dieser Dissertation ...... 135 7.1.2.2. DYNC2H1-Mutationsspektrum ...... 137 7.1.3. Mutationen im EVC Gen ...... 138 7.2. DYNC2LI1 in der Pathogenese der SRTD 15 ...... 139 7.2.1. Identifikation von DYNC2LI1 Mutationen ...... 139

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7.2.2. DYNC2LI1 ist ubiquitär exprimiert ...... 140 7.2.3. Effekte der DYNC2LI1 Varianten auf die Proteinstruktur ...... 141 7.2.4. DYNC2LI1-Defekte beeinflussen die Cilienlänge und -morphologie ...... 142 7.2.5. DYNC2LI1 erweitert das phänotypische Spektrum von skelettalen Ciliopathien...... 143 7.3. Y2H-Screen - Analyse von NEK1 Interaktionspartnern ...... 145 7.3.1. Bekannte Cilien-assoziierte NEK1 Interaktionspartner ...... 145 7.3.2. Identifikation der Interaktion von NEK1 mit DYNC2LI1 ...... 147 7.3.3. NEK1 ist Teil des C21orf2-SPATA7 Komplexes ...... 148 7.4. CRISPR/Cas9 - Genomeditierung von NEK1 ...... 150 7.4.1. CRISPR Klone weisen typischen NEK1-Phänotyp auf ...... 150 7.4.2. NEK1-CRISPR-Klone zeigen Veränderungen in cilien-assoziierten Signalwegen ...... 152 7.5. Abschließende Diskussion der Ergebnisse und Ausblick ...... 155 8. Verzeichnisse ...... 157 8.1. Literaturverzeichnis ...... 157 8.2. Abkürzungsverzeichnis ...... 170 8.3. Abbildungsverzeichnis ...... 174 8.4. Tabellenverzeichnis ...... 177 9. Danksagung ...... 179 10. Veröffentlichungen und Kongressbeiträge ...... 180 11. Lebenslauf ...... 184 12. Eidestattliche Erklärung ...... 185 13. Anhang ...... 186 13.1. Ciliopathien und deren Charakterisierung nach unterschiedlicher Ausprägung der Phänotypen ...... 186 13.2. SRPS-Patienten - Variantenübersicht mit Vorhersageprogrammen ...... 187 13.3. Varianten im NEK1, DYNC2H1 und DYNC2LI1 Gen dieser Dissertation und anderer Publikationen ...... 189 13.4. Patientenbilder - P7 mit Mutationen im DYNC2LI1 Gen ...... 193 13.5. Patient P11 – komplette Sequenz des complex rearrangements ...... 194 13.6. qPCR Daten Patienten P26/27/28 – DYNC2LI1 Expression mittels verschiedener TaqMan-Sonden ...... 196 13.7. MLPA Analyse des DYNC2LI1 Gens in Patient P28 ...... 197

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13.8. Lokalisation von NEK1 in Kontroll- und Patienten-Fibroblasten (P1) mittels Immunfluoreszenz ...... 198 13.9. Absättigungstest des NEK1-H3T1 Antikörpers in Kontroll- und Patienten- Fibroblasten (P1) mittels Immunfluoreszenz ...... 200 13.10. Hauptnetzwerke der Ingenuity Pathway Analyse – NEK1 Y2H-Screen ...... 201 13.11. Cilienmorphologie NEK1-CRISPR-Zelllinien und Non Target Kontrollen ...... 206 13.12. Differentiell exprimierte Gene unter beiden Nährbedingungen in NEK1- CRISPR-Zelllinien (RNA-Seq Daten) ...... 214 13.13. Validierung der RNA-Seq Daten – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter beiden Nährbedingungen ...... 221 13.14. Hauptnetzwerke der Ingenuity Pathway Analyse – RNA-Seq Daten NEK1- CRISPR-Zelllinien unter beiden Nährbedingungen ...... 224 13.15. Genliste cilien-assoziierte Gene (Kurzversion) ...... 227 13.16. Hefe-2-Hybrid-Screen (Y2H) - NEK1 Interaktionspartner ...... 234 13.17. Großdurchsatz 1on1-Screen - NEK1 Interaktionen mit bekannten Ciliengenen ... 236 13.18. PFA-Fixierung von Zellen ...... 240 13.19. Coverage Daten Patienten P7, P23, P30 ...... 240 13.20. Vewendetes Material ...... 241 13.20.1. Verbrauchsmaterialien ...... 241 13.20.2. Enzyme, Standards, Chemikalien ...... 242 13.20.3. Puffer und Lösungen ...... 244 13.20.4. Medien und Medienzusätze ...... 249 13.20.5. Bakterienstämme, Zelllinien, Hefe ...... 251 13.20.6. Sonden (MLPA, TaqMan) ...... 252 13.20.7. Primer ...... 254 13.20.8. Antikörper ...... 259 13.20.9. Vektoren und Vektorkarten ...... 260 13.20.10 Kits ...... 263 13.20.11. Geräte ...... 263 13.20.12. Datenbanken und Software ...... 265

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Zusammenfassung

1. Zusammenfassung

Das Wachstum auf Ebene des Individuums sowie auf zellulärer Ebene unterliegt vielfältig regulierten Mechanismen. Hierzu gehören das primäre Cilium sowie der Basalkörper, welche bei fast allen Säugetierzellen vorhanden sind. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass eine wachsende Anzahl an humanen Erkrankungen mit Beteiligung des Skelettsystems mit einer Dysfunktion des primären Ciliums oder des dazugehörenden Basalkörpers assoziiert sind. Diese Gruppe von Erkrankungen - sog. Ciliopathien - umfassen beim Menschen ein breites phänotypisches Spektrum, welches neben skelettalen Auffälligkeiten auch Gehirn- fehlbildungen, Polydaktylie, Nierenerkrankungen und weitere Organauffälligkeiten aufweist. Die Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome (short-rib polydactyly syndromes [SRPS] bzw. short-rib thoracic dysplasias [SRTD]) stellen eine Gruppe meist letaler autosomal-rezessiv vererbter Osteochondrodysplasien dar, welche zu den skelettalen Ciliopathien zugeordnet werden. In dieser Arbeit konnte ich bei 16 von 32 Patienten mit der Verdachtsdiagnose SRPS/SRTD sichere oder wahrscheinlich pathogene Varianten in NEK1, DYNC2H1, DYNC2LI1 und EVC mittels Sanger-Sequenzierung bzw. der Next Generation Sequencing Technologie identifizieren, wodurch das Mutationsspektrum dieser Erkrankungsgruppe erweitert werden konnte. Bislang vorliegende Ergebnisse zeigen, dass Mutationen in den bekannten Ciliopathie-assoziierten Genen zu einem biallelen loss-of-function Effekt als pathogenetischer Mechanismus führen und somit die Methode der CRISPR/Cas9 vermittelten Genomeditierung hervorragend geeignet ist, um diesen Effekt nachzubilden. Ich etablierte daher mittels CRISPR/Cas9 drei Zelllinien mit frameshift Deletionen. Mit dem in dieser Arbeit selbst hergestellten polyklonalen NEK1-H3T1 Antikörper konnte in den NEK1-CRISPR- Klonen sowohl ein Verlust des full-length Proteins als auch eine veränderte Cilien-Morphologie mit fehlendem NEK1 Signal am Basalkörper von primären Cilien nachgewiesen werden, welches somit auch den beobachteten ciliären Phänotyp in NEK1-Patienten-Zellen widerspiegelte. Zur Identifikation der detaillierten Effekte von NEK1 Mutationen auf noch unbekannte Signaltransduktionswege führte ich eine RNA-Sequenzierung durch. Zur Erfassung der Änderung der Expressionsprofile wurden die NEK1-CRISPR-Zellen unter Normal- sowie Hungermedium untersucht, wobei eine signifikante Expressionsänderung von Genen der PDGF-, Wnt-, MAPK-, EGF- und Growth Hormone Signalwege identifiziert wurde. Diese Ergebnisse geben erstmals konkrete Hinweise auf die bei den ciliären NEK1- Chondrodysplasien beteiligten Reaktionswege. Die Funktion des NEK1 Proteins lässt sich auch über seine Interaktionspartner definieren, weshalb ich Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Analysen unter Verwendung einer murinen 1

Zusammenfassung retinalen cDNA-Bank durchführte, um gezielt nach ciliären und Basalkörper-assoziierten Interaktionspartnern zu suchen. Die in den Hefe-Screens gefundenen Interaktionen NEK1-C21orf2-SPATA7 und NEK1-DYNC2LI1 wurden mittels Galaktosidase Tests (1on1-Screens), Kolokalisationsanalysen und Ko-Immunopräzipitationsexperimenten validiert. Diese Interaktionspartner erweitern zum einen das ciliäre Proteininteraktionsnetzwerk und zum anderen stellen diese potentielle ursächliche Proteine für die verschiedenen skelettalen Ciliopathien des SRPS/SRTD-Spektrums dar. So konnte ich in dieser Arbeit mittels Next Generation Sequencing in einem Patienten compound heterozygote Mutationen in DYNC2LI1, welches ein Teil des cytoplasmatischen Dynein-2 Komplexes darstellt, identifizieren. Mittels siRNA knockdown in Fibroblasten konnte ich nachweisen, dass der Funktionsverlust von DYNC2LI1 zu morphologisch abnormen Cilien führt. Reduzierte Cilienlängen mit zusätzlicher Akkumulation von IFT-B Proteinen in den verdickten Cilienspitzen bestätigen DYNC2LI1 als ursächliches Ciliopathie-Gen und erweitern das klinische Spektrum von Ciliopathien, die durch Defekte des Dynein-2-Komplexes verursacht werden. Die stetig wachsende Anzahl von Cilien- bzw. Centrosomen-assoziierten Genen wurde von mir mit weiteren Informationen (Cilien-Evidenz, humanes Krankheitsbild, Maus-Modell, etc.) in einer Ciliengenliste zusammengefasst, welche für weiterführende Analysen z.B. als Filterkriterien von NGS-Daten, Netzwerk- oder Pathwayanalysen herangezogen werden kann. In dieser Dissertation konnten Mutationsanalysen in einer Patientenkohorte zusammen mit weiteren cilien-morphologischen Untersuchungen und Interaktionsstudien dazu beitragen, ciliäre Proteine und Phänotypen besser zu charakterisieren und unser Wissen über die Cilienfunktionen zu erweitern.

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Summary

2. Summary

Individual and cellular growth is maintained by a variety of regulated mechanisms. These include the primary cilium and the basal body, which are present in almost all mammalian cell lines. In recent years, it has been shown that an increasing number of human skeletal disorders are associated with dysfunction of the primary cilium or the associated basal body. This group of diseases - so-called ciliopathies - include a wide spectrum of human phenotypes with brain malformation, polydactyly, kidney disease and other organ abnormalities in addition to skeletal abnormalities. Short-rib polydactyly syndromes [SRPS] or short-rib thoracic dysplasias [SRTD] are a group of autosomal recessively inherited lethal osteochondrodysplasias, which are assigned to the skeletal ciliopathies. In this work, in 16 out of 32 patients with a suspected diagnosis of SRPS/SRTD, I identified pathogenic or likely pathogenic variants in NEK1, DYNC2H1, DYNC2LI1 and EVC using Sanger Sequencing and Next Generation Sequencing technology, thereby expanding the mutation spectrum of this disease group. Previous results showed that mutations in known ciliopathy-associated genes lead to a biallelic loss-of-function effect as a pathogenetic mechanism and thus the method of CRISPR/Cas9-mediated genome editing is excellently suited to mimic this effect. I therefore established three cell lines with frameshift deletions using CRISPR/Cas9. With my custom-made polyclonal NEK1-H3T1 antibody produced in this project, a loss of the full-length protein as well as an altered cilia morphology with missing NEK1 signal at the basal body of primary cilia could be detected in the NEK1- CRISPR clones, reflecting the observed ciliary phenotype in NEK1 patient cells. To identify the detailed effects of NEK1 mutations on yet unknown signal transduction pathways, I performed RNA sequencing. To determine expression profile changes, the NEK1-CRISPR cells were examined under normal and starvation media, whereby significant expression change of genes of the PDGF, Wnt, MAPK, EGF and growth hormone signaling pathways were identified. These results provide for the first time concrete indications of reaction pathways involved in ciliary NEK1 chondrodysplasias. The function of the NEK1 protein can also be defined through its interaction partners, which is why I performed yeast two-hybrid (Y2H) analyses using a murine retinal cDNA library for a targeted search for ciliary and basal body-associated interaction partners. The interactions NEK1-C21orf2-SPATA7 and NEK1-DYNC2LI1 found in the yeast screens were validated by galactosidase assays (1on1 screens), colocalization analyses and co-immunoprecipitation experiments. On the one hand, these interaction partners expand the ciliary protein interaction network and on the other hand, they represent potential causative proteins for the various 3

Summary skeletal ciliopathies of the SRPS/SRTD spectrum. By using the Next Generation Sequencing technology, I was also able to identify in one patient compound heterozygous mutations in DYNC2LI1, which is part of the cytoplasmic dynein-2 complex. I was able to show via siRNA knockdown experiments in fibroblasts that the loss of functional DYNC2LI1 leads to morphologically abnormal cilia. Reduced cilia lengths with additional accumulation of IFT-B proteins in the bulbous ciliary tips confirm DYNC2LI1 as a causative ciliopathy gene and expand the clinical spectrum of ciliopathies caused by defects in the dynein-2 complex. The ever-expanding number of cilia- or centrosome-associated genes were summarized by me with further information (cilia evidence, human disease, mouse model, etc.) in a cilia gene list, which can be used for further studies e.g. as filter criteria for NGS data, network or pathway analyses. In this dissertation, mutation analyses in a patient cohort, along with other ciliary-morphological examinations and interaction studies, helped to better characterize ciliary proteins and phenotypes, and to expand our understanding of ciliary functions.

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Einleitung

3. Einleitung

Cilien sind evolutionär gesehen sehr alte Strukturen, welche wahrscheinlich als Spezialisierung des Cytoskeletts bereits in Ur-Eukaryoten vorhanden waren. Heute können diese Organelle in den meisten Eukaryoten gefunden werden, wobei nur wenige Modellorganismen - wie z. B. die Pflanze A. thaliana oder die Bäckerhefe S. cerevisiae - keine Cilienbildung zeigen. Die Evolution führte zu einer Reihe von verschiedenen ciliären Funktionen, welche essentielle Bedeutung sowohl in der Entwicklung als auch in der Funktion von Zellen bzw. Organen haben. Dafür wird ein komplexes Proteinnetzwerk benötigt, welches sich aus mehr als 3000 ciliären und centrosomalen Proteinen zusammensetzt [1-5]. Das heutige Verständnis über den Cilienaufbau, die Funktion und auch über die Assoziation mit humanen Erbkrankheiten, den sogenannten Ciliopathien, wurde durch die Verwendung verschiedener Modellorganismen (z. B. C. reinhardtii, C. elegans und M. musculus) erlangt. Jedoch sind viele ciliäre Funktionen und die Beteiligung cilien- assoziierter Proteine an verschiedenen Signalwegen noch unverstanden, welches weitere Forschung erfordert, um ein tieferes Verständnis auch im Hinblick auf die sehr heterogenen Krankheitsbilder zu erlangen [6-9].

3.1. Aufbau und Funktion von Cilien

Cilien werden allgemein als fingerförmige Ausstülpungen der Plasmamembran bezeichnet, welche sich beweglich (motil) oder unbeweglich (immotil) von der Oberfläche von Zellen in die extrazelluläre Umgebung erstrecken und von einem Cytoskelett aus Mikrotubuli gestützt werden. Dieses ubiquitär vorkommende sensorische Organell in Vertebraten ist auch auf den meisten Zellen des menschlichen Körpers zu finden und erfüllt viele verschiedene Funktionen, indem es als eine Art „Antenne“ funktioniert, die bestimme Signale mittels Rezeptoren von außerhalb der Zelle aufnimmt und an der Fortleitung von mechanischen und chemischen Signalen in die Zelle beteiligt ist [2, 10-12]. Obgleich in der Historie der Cilienforschung das Interesse ausschließlich den motilen Cilien galt, wird in den letzten Jahren dem zunächst als rudimentär bezeichneten primären Cilium mehr Aufmerksamkeit zuteil und rückt aufgrund der Beteiligung an zahlreichen zellulären Prozessen und Signalwegen immer mehr in den Fokus der Forschung [6, 13]. Cilien sind in Hinblick auf ihre Struktur und Funktion sehr vielfältig, dennoch besitzen alle Cilien einen charakteristischen Grundaufbau und können in drei verschiedene Abschnitte unterteilt werden: Basalkörperkomplex, Übergangszone (transition zone) und Axonem (Abb. 1).

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Einleitung

Der Basalkörperkomplex besteht aus dem Basalkörper mit einer 9x3+0 Struktur (A-, B- und C- Tubuli) und der Centriole, welche in der pericentriolären Matrix (PCM) eingebettet sind, und das Cilium apikal unterhalb der Zellmembran verankern. An den Basalkörperkomplex schließt sich die Übergangszone (transition zone) an, welche eine 9x2+0 Mikrotubulistruktur aufweist. Diese spezialisierte Struktur funktioniert als Diffusionsbarriere (ciliary gate) und reguliert den Transport von ciliären Proteinen in bzw. aus dem Cilium [13-15]. Abschließend folgt das Axonem, welches aus neun radial um ein zentrales Mikrotubuli-Paar angeordneten Mikrotubuli-Dupletts besteht (9x2+2 bei motilen Cilien), die aus dem distalen Ende des Basalkörpers auswachsen (Abb. 1).

Abb. 1 Modell der Komponenten und Organisation von motilen und immotilien Cilien und des intraflagellaren Transports (IFT) Das ciliäre Axonem, bestehend aus Duplett-Mikrotubuli und in einigen Fällen Singulett-Mikrotubuli am distalen Ende, erstreckt sich von einer Übergangszone (transition zone) zu einer (gewöhnlich) Triplett-Mikrotubuli Struktur, welche als Basalkörper bezeichnet wird. Im Gegensatz zu motilen Cilien fehlt den immotilen Cilien das zentrale Mikrotubulipaar und dazugehörige Motilitätsstrukturen, einschließlich der inneren und äußeren Dynein- Arme (IDA: inner dynein arm, ODA: outer dynein arm) und der Radialspeichen (radial spokes). Querschnitte zeigen die Mikrotubuli-Architekturen in verschiedenen Regionen der beweglichen und nicht-beweglichen Cilien. Die Elongation des Axonems wird durch den intraflagellaren Transport (IFT) Mechanismus vermittelt. Der anterograde IFT von der Basis bis zur Cilienspitze hängt von IFT-B Proteinen und Untereinheiten der Motorprotein Kinesin II Familie ab. Von der Spitze zur Cilienbasis gerichteter retrograder IFT erfolgt durch IFT-A Proteine und cytoplasmatische Dyneine (verändert nach [3, 16]).

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Einleitung

Die Mikrotubuli-Dupletts setzen sich jeweils aus einem A- und B-Tubulus zusammen und unterscheiden sich insofern, dass der B-Tubulus aus einer geringeren Anzahl an Protofilamenten aufgebaut ist. Diese Mikrotubuli-Dupletts stehen durch innere und äußere Dynein-Arme, Nexine und Radialspeichen (radial spokes) miteinander in Kontakt und befähigen somit die Cilien zur Bewegung (motile Cilien) [17-19]. Motile Cilien sind in den respiratorischen Epithelzellen für die Atemwegsreinigung durch Abtransport von Bronchialsekret und eingedrungenen Fremdkörpern zuständig. Des Weiteren ist dieser Cilientyp in den Ependymalzellen im Gehirn für den Fluss der Cerebrospinalflüssigkeit verantwortlich. Bei der Fortpflanzung übernehmen die beweglichen Cilien eine wichtige Rolle, indem sie als bewegliches Flagellum von Spermien fungieren oder in den Epithelzellen des Eileiters durch Erzeugung eines Flüssigkeitsstroms den gerichteten Transport der Eizelle ermöglichen [2, 13, 17, 18, 20]. Cilien kommen ubiquitär auf nahezu allen Zellen von Vertebraten vor, wobei die meisten keine aktive Beweglichkeit - sogenannte primäre Cilien - besitzen. Unbewegliche primäre Cilien treten meist singulär auf und weißen eine 9x2+0 Struktur ohne zentrales Mikrotubuli-Paar auf (Abb. 1). Das primäre Cilium ist mechanisch empfindlich und dient somit z. B. als Flusssensor in Nierenepithelzellen. Das Biegen des Ciliums durch Strömungs- änderungen bewirkt eine vorrübergehende Zunahme des intrazellulären Calciums. Des Weiteren sind immotile Cilien auf Cholangiozyten im Gallengang, auf Osteozyten oder Chondrozyten in Knochen bzw. Knorpeln zu finden. Außerdem sind primäre Cilien in sensorischen Geweben vorhanden, z. B. im olfaktorischen Epithel oder als sogenanntes Verbindungscilium (connecting cilium) in der Retina, welches das apikale Innensegment mit dem distalen Außensegment verbindet [2, 20-23]. Die sensorischen Cilien in olfaktorischen Riechsinneszellen weisen eine Besonderheit auf, indem sie zwar eine 9x2+2 Struktur besitzen, jedoch mangels fehlender Dynein-Proteine keine aktiven Bewegungen initiieren können [18, 24, 25]. Eine weitere Ausnahme bilden die Cilien des embryonalen Primitivknotens. Diese erinnern zwar mit einer 9x2+0 Struktur an ein primäres Cilium, aber durch vorhandene Dynein- Arme können aktive Bewegungen ausgeführt werden. Nodale Cilien erzeugen einen gerichteten Strom von Signalmolekülen während der Gastrulation, welcher maßgeblich für die Ausbildung der asymmetrischen Rechts-Links-Körperachse verantwortlich ist [11, 18, 26]. Im Allgemeinen weisen Cilien ein breites Funktionsspektrum auf, indem sie als “Antenne” extrazelluläre Stimuli über ciliäre Membranrezeptoren detektieren und in der Zelle Signaltransduktionskaskaden verschiedener Signalwege initiieren. Diese umfassen den Hedgehog, Wnt, Planar Cell Polarity, FGF, Notch, mTor, PDGF und den Hippo Signalweg

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Einleitung

[27-34]. Primäre Cilien sind im Hedgehog (Hh) Signalweg, welcher für viele Entwicklungsprozesse benötigt wird, beteiligt. Mutationen in verschiedenen ciliären Komponenten führen z. B. zu Defekten bei der Bildung des Neuralrohrs oder der Extremitätenknospen. Eine normale Entwicklung dieser Gewebe hängt von einem präzise koordinierten Gradienten der Hh-Signaltransduktion ab [35, 36]. Der Wnt Signalweg ist für viele Entwicklungsschritte während der Embryogenese von Bedeutung und ist auch bei der Homöostase von adulten Geweben involviert. Wnt Signale haben pleiotrope Auswirkungen auf z. B. Zellschicksalspezifizierung und Differenzierung. Die Hedgehog- und Wnt-Signalwege werden außerdem benötigt, um die Osteoblasten- und Chondrozytendifferenzierung während der Knochenentwicklung zu koordinieren. So ist z. B. Indian hedgehog (Ihh), ein Mitglied der Hedgehog Proteinfamilie, essentiell für die Osteogenese in der endochondralen Knochenbildung während der Embryogenese [35, 37-39]. Der PDGF Signalweg spielt eine bedeutende Rolle in der Regulation von z. B. Proliferation, Migration und Apoptose während der embryonalen und postnatalen Entwicklung. Dieser Signalweg ist außerdem wichtig für das Wachstum von Bindegewebe, für die Wundheilung im Erwachsenenalter oder für die Wachstumskontrolle von Fibroblasten via PDGF Rezeptoren (platelet-derived growth factor receptor) [33, 40]. Zusammenfassend können Cilien als Mechano-, Chemo- und Osmosensoren dienen und spielen durch die vielfältige Beteiligung an verschiedenen Signalwegen eine wichtige Rolle in der Differenzierung, Migration, Proliferation und der Determination der Rechts-Links Asymmetrie. Somit sind sie sowohl für die embryonale und postnatale Entwicklung, als auch für die ordnungsgemäßen Organfunktionen im Erwachsenenalter verantwortlich [2, 36, 41-43].

3.2. Ciliogenese und intraflagellarer Transport

Die Ausbildung eines primären Ciliums erfolgt in der G1- bzw. G0-Phase des Zellzyklus. Im ersten Schritt der Ciliogenese wandert das Centrosom, welches aus einer Mutter- und einer Tochtercentriole besteht, zur Zellmembran. Die Muttercentriole, welche als Basalkörper das Grundgerüst für das wachsende Axonem bildet, wird zusammen mit der Tochtercentriole in der pericentriolären Matrix (PCM) eingebettet. Der Basalkörper bildet dabei zusammen mit der Centriole des Basalkörpers den Basalkörperkomplex. Sobald sich der Basalkörper an der Plasmamembran anheftet, wird die Assemblierung des axonemalen Mikrotubuli-Cytoskeletts initiiert. Dabei beginnt der Aufbau des Ciliums von der Spitze her beginnend, indem zur Verlängerung des Ciliums an dessen distalen Ende axonemale Untereinheiten angefügt werden [17, 41, 44, 45] (Abb. 2). 8

Einleitung

Abb. 2 Schema verschiedener Komponenten des intraflagellaren Transportsystems (IFT) Der IFT tritt in zwei Richtungen auf, der anterograde Transport ist von der Basis zur Cilienspitze gerichtet, der retrograde Transport erfolgt von der Cilienspitze zurück zur Basis. Der anterograde Transport wird vom Kinesin II Motor und IFT Komplex B vermittelt. Der IFT Komplex B besteht aus 16 IFT Proteinen, wobei IFT81 und IFT72/74 einen Tetramerkomplex bilden und mit IFT27/46/52/88 interagieren und so den Kern von IFT Komplex B bilden. Der retrograde Transport wird durch den Dynein-2 Motor und IFT Komplex A, welcher aus 6 IFT Proteinen besteht, reguliert. Das BBSome besteht aus 7 konservierten BBS Proteinen und BBIP10, assembliert mit IFT Komplex A und B, um den IFT-vermittelten Transport von Cargo-Proteinen zu erleichtern (verändert nach [20, 46, 47]).

Für die Assemblierung, Aufrechterhaltung und Abbau des Ciliums sind verschiedene Proteine erforderlich, welche über den intraflagellaren Transport (IFT) zum Ziel gebracht werden müssen. Dieser evolutionär hoch konservierte IFT-Mechanismus wurde zuerst in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii beschrieben und ist auch in anderen Spezies essentiell für das Wachstum und die Aufrechterhaltung ciliärer Strukturen [48]. Der IFT ist ein bidirektionales Transportsystem, bei dem man zwischen anterograden, zur Cilienspitze gerichteten Transport und retrograden, von der Spitze zur Basis gerichteten Transport unterscheidet. Für den anterograden Transport sind KIF3A und KIF3B/C (Untereinheiten der Motorprotein Kinesin II Familie), das KIF-assoziierte Protein 3 (KIFAP3) und der IFT Komplex B (16 verschiedene IFT Proteine) verantwortlich. Der retrograde Transport wird dahingegen durch den cytoplasmatischen Dynein-2 Komplex (DYNC2H1, DYNC2LI1, WDR34/60 und TCTEX1D2) und den IFT Komplex A (6 verschiedene IFT Proteine) gesteuert. Das sogenannte BBSome besteht aus sieben hochkonservierten BBS Proteinen (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8 and BBS9) und BBIP10, welche mit IFT-A bzw. IFT-B assemblieren, um eine funktionierende IFT-Maschinerie für den Transport von Cargo-Proteinen sicherzustellen [44-47, 49, 50] (Abb. 2).

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Einleitung

Der Zellzyklus ist eng mit der Ciliogenese verknüpft, d. h. das primäre Cilium wird in sich teilenden Zellen am Ende der S-Phase abgebaut, um eine ordnungsmäße Ausbildung des mitotischen Spindelapparates zu gewährleisten. In vielen Zellen erfolgt der Eintritt in den Zellzyklus nach einer vorausgegangenen Cilienresorption und erst nach der Mitosephase werden die Cilien in der G0/G1-Phase wieder neu assembliert. Der Zyklus der Ciliogenese (Auf- und Abbau des Ciliums) wird also durch die Progression durch den Zellzyklus koordiniert, es scheint also eine regulatorische Beziehung zwischen diesen beiden Zyklen zu geben [17, 45, 51]. Zellzyklusregulierungssignale, cytoplasmatische Vesikeltransportsysteme und Rekrutierung von allen benötigten IFT-Komponenten zur richtigen Zeit am richtigen Ort sind für den Mechanismus der Ciliogenese wichtig. Defekte von Genen, die für eine Vielzahl von Proteinen kodieren, die an der Ausbildung von Cilien, deren Aufrechterhaltung und Funktionsfähigkeit beteiligt sind, wie z. B. IFT Subkomponenten und Komponenten des ciliären Axonems, der Überganszone oder des Basalkörpers, führen zu einem breiten phänotypischen Spektrum [22, 41, 43, 52, 53]. Mit einem Funktionsverlust der Cilien einhergehende Krankheiten werden als Ciliopathien bezeichnet.

3.3. Ciliopathien

Diverse Krankheiten werden mit Defekten in Proteinen, welche in der Cilienbildung, -erhaltung und -funktion involviert sind, assoziiert [42, 52]. Da Cilien ubiquitär auf nahezu allen Zellen von Vertebraten zu finden und in vielen fundamentalen biologischen Prozessen involviert sind, verwundert es nicht, dass Mutationen in ciliären Genen in einer Vielzahl humaner Erkrankungen resultieren. Im Allgemeinen wird bei Ciliopathien beobachtet, dass bei Veränderungen in demselben Gen je nach Mutationslast eine unterschiedliche phänotypische Schwere vorliegt [41, 54]. Je nachdem ob die betroffenen Cilien motile oder nicht-motile Funktion ausüben bzw. der intraflagellare Transport (IFT), der Basalkörper oder das Centrosom betroffen ist, weisen Patienten unterschiedlichste Phänotypen wie z. B. Gehirnfehlbildungen, Polydaktylie, Nierenzysten, Retinadegeneration, Adipositas, mentale Entwicklungsstörungen oder Skelettanomalien auf [2, 53-55] (13.1, Tab. 10). Das Krankheitsbild der primären ciliären Dyskinesie (PCD) wird durch eine Dysfunktion der motilen Cilien verursacht. Dabei kommt es zu chronischer Bronchitis und Sinusitis aufgrund von ciliären Defekten in den respiratorischen Epithelien der Atemwege. Des Weiteren ist die Erkrankung durch einen Situs inversus (seitenverkehrte Anlage der inneren Organe) bedingt durch eine unzureichende Determinierung der Rechts-Links-Asymmetrie 10

Einleitung sowie durch Infertilität der Patienten charakterisiert [2, 13, 16, 56]. In der OMIM Datenbank werden zum jetzigen Zeitpunkt 36 verschiedene Gene als ursächlich für PCD (OMIM phenotypic series: PS244400) gelistet. Mutationen in 5 verschiedenen Genen (OMIM phenotypic series: PS173900) führen zur polyzystischen Nierenerkrankung (PKD). Auf den epithelialen Sammelrohr- und Tubuluszellen der Niere sind primäre Cilien zu finden, wobei diese an der Signalweiterleitung von der extrazellulären Umgebung in das Zellinnere verantwortlich sind. Dabei kommt es zu einer Aktivierung der Membranproteine Polycystin 1 und 2 und mittels einer Signalkaskade zu einer Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration. Dies wiederum reguliert Prozesse wie z. B. Genexpression, Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Fehlerhaft ausgebildete primäre Cilien durch Mutationen z. B. in PDK1/2 führen zur Ausbildung polyzystischer Nieren aufgrund einer defekten ciliären Signalübertragung [11, 13, 57, 58]. Das Alström Syndrom, Joubert Syndrom, Meckel-Gruber Syndrom (MKS), Oro-fazio- digitales Syndrom (OFD) und Senior-Løken Syndrom (SLSN) werden auch mit zu den humanen Ciliopathien gezählt (Abb. 3). Ciliopathien mit Beteiligung des Skelettsystems stellen insbesondere das Bardet-Biedl Syndrom (BBS) und das Ellis-van Creveld Syndrom (EVC) dar, sowie die Gruppe der Short-rib Polydaktylie Syndrome (SRPS), welche gemäß neuer Einteilung in OMIM zu den SRTDs (Short-rib thoracic dysplasias, OMIM phenotypic series PS208500) gezählt werden. Die SRTDs werden unter 3.4 genauer erläutert. Das phänotypische Spektrum dieser oben genannten Ciliopathien kann vielmehr als ein Kontinuum angesehen werden anstelle von eindeutigen Syndromen. Dies reicht von milden, nicht letalen Formen wie z. B. Bardet-Biedl und Senior-Løken Syndrom, über mittelschweren Phänotypen z. B. Joubert Syndrom, bis hin zu den schweren letalen Syndromen wie Meckel-Gruber oder die zu den skelettalen Ciliopathien gehörende SRPS [13, 16, 43, 53, 54, 56, 59] (Abb. 3).

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Einleitung

Abb. 3 Klinische und genetische Variabilität primärer Ciliopathien Das Venn-Diagramm zeigt zusammengefasst die genetischen Überlappungen (>80 Gene) unter verschiedenen primären Ciliopathien (Senior-Løken, Bardet-Biedl, Meckel-Gruber, Joubert, Oro-fazio-digitales Syndrom, Nephronophthise und Skelettdysplasien). *NPHP1 auch in einer Familie mit BBS identifiziert, **EVC2 wird als neues Kandidatengen für MKS postuliert, #C2CD3 auch in einer Familie mit Skelettdysplasie identifiziert, ##CEP120 auch in einem Fetus mit MKS identifiziert. Die unterstrichenen Gene (DYNC2H1, DYNC2LI1, EVC, IFT80, NEK1, TTC21B, WDR35) wurden in der in dieser Arbeit untersuchten Patientenkohorte mit Verdachtsdiagnose Kurzrippen-Polydaktylie Syndrom (SRPS/SRTD) sequenziert (verändert nach [43]).

Während in der klinischen Praxis eine Klassifizierung der Ciliopathien in verschiedene Subtypen erfolgt, ist dabei aber zu bedenken, dass es zahlreiche Überschneidungen der klinischen Merkmale gibt und diese Komplexität der Ciliopathien es schwierig macht eine bestimmte zuzuordnende Diagnose für einen Patienten zu erstellen. Die klinische Heterogenität der Ciliopathien spiegelt sich auch in deren genetischen Heterogenität wider. Funktionelle Studien haben interessante Korrelationen zwischen der Funktion und der Cilien-Domäne des mutierten Proteins und dem zugrunde liegenden klinischen Phänotyp offenbart. Dabei hat in den letzten Jahren die Technologie des Next Generation Sequencings die Identifizierung von neuen Ciliopathie-Genen maßgeblich beschleunigt [47, 60-63]. Zum jetzigen Zeitpunkt wurden über 80 Gene als ursächlich für primäre, nicht-motile Ciliopathien identifiziert (Abb. 3) [43]. Interessanterweise scheinen einige Gene sehr organ- spezifisch zu sein, so sind Mutationen in ARL13B nur in Joubert-Patienten mit rein neurologischen Manifestationen identifiziert worden, oder in isolierten SRPS-Phänotypen sind die Gene IFT80/DYNC2H1 mutiert [64-67]. Defekte in anderen Genen sind nicht so selektiv, zeigen aber immer noch eine bevorzugte Beteiligung von bestimmten Organen und Geweben. Einige Beispiele sind C5orf42, dessen Mutationen Oro-fazio-digitales Syndrom (OFD) sowie 12

Einleitung

Joubert Syndrom mit einer hohen Prävalenz von Polydaktylie verursachen und IFT140, welches in SRPS mit einer hohen Prävalenz von schweren Nierenerkrankungen mutiert ist [68-70]. Auf der anderen Seite sind Gene wie z. B. CEP290 extrem pleiotrop, d. h. sie sind in einem breiten Spektrum von Ciliopathien mit Defekten in der Netzhaut, Nieren, Leber und zentralem Nervensystem mutiert. Mutationen in KIAA0586 sind ursächlich für eine milde Form des Joubert Syndroms sowie für komplexere Ciliopathiephänotypen mit Merkmalen von Joubert, OFD und SRPS/SRTD [71-73]. Das Auftreten von mindestens einer hypomorphen Mutation ist in der Regel mit milderen Phänotypen (z. B. Bardet-Biedl) assoziiert, während biallelische loss- of-function Mutationen häufig zu schweren oder letalen Krankheiten (z. B. Meckel-Gruber) führen [43, 74-76]. In den letzten Jahren wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen über 20 Gene als ursächlich für ciliäre Skelettdysplasien beschrieben (Abb. 3, rote Umrandung). Im Folgenden (3.4) sollen die Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome (SRPS/SRTD), welche zu den letalen Osteochondrodysplasien gehören, näher erläutert werden.

3.4. Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome

Die Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome (Short-rib polydactyly syndromes, SRPS) gehören zur Gruppe der autosomal rezessiv vererbten Osteochondrodysplasien [77], wobei als ein wichtiges Merkmal die perinatale Letalität dieser Skelettdysplasien im Vordergrund steht. Diese werden derzeit klinisch eingeteilt in sechs verschiedene SRPS-Typen: Saldino-Noonan (Typ I, MIM 613091), Majewski (Typ II, MIM 263520), Verma-Naumoff (Typ III, MIM 613091), Beemer (Typ IV, MIM 269860), SRPS mit oder ohne Polydaktylie Typ V (MIM 614091) und Typ VI (MIM 615503), wobei nach der aktuellen Nosologie der Osteochondrodysplasien Typ I und III zusammengefasst werden [59, 78-80] (Tab. 1). Die Gruppe der SRPS umfasst ein breites phänotypisches Variabilitätsspektrum, wobei bei den Betroffenen sowohl extreme Verkürzungen der Extremitäten, ein enger Thorax mit kurzen Rippen als auch Polydaktylie und faziale Auffälligkeiten auftreten. Weitere Organfehlbildungen sind unter anderem Gehirn- und Herzfehlbildungen, polyzystische Nieren, sowie gastrointestinale oder urogenitale Atresien. Die Einteilung in die jeweiligen Gruppen erfolgt zum einen über die unterschiedlichen Fehlbildungen einzelner Organe als auch durch eine radiologische Charakterisierung. 1971 wurden die Short-rib Polydaktylie Syndrome von Majewski et al. mit einem Bericht über 4 perinatal verstorbene Neugeborene als erstes beschrieben, wobei die Betroffenen mediane Lippen-Kiefer-Gaumenspalten, exzessive Polysyndaktylie, verkürzte Rippen und Gliedmaßen, Genitalmissbildungen, Anomalien der Epiglottis und Fehlbildungen innerer 13

Einleitung

Organe aufwiesen [81]. Saldino und Noonan konnten im darauf folgenden Jahr einen weiteren Typ anhand von zwei Patienten nachweisen [82]. Im Jahr 1977 stellten Naumoff et al. die Vermutung auf, dass es einen dritten Typ der SRPS gibt. Dies stützten sie auf drei von ihnen untersuchte Individuen, bei denen sich die röntgenologischen Untersuchungen von den vorher schon beschriebenen SRPS Typen unterschieden [83]. Ein vierter Typ von SRPS wurde 1983 von Beemer und Langer diagnostiziert [84]. Eine neue SRPS Form (Typ V, MIM 614091) wurde 2007 bzw. 2011 beschrieben, wobei die untersuchten Feten zusätzlich zu den typischen SRPS Merkmalen eine acromesomelische Hypomineralisation und Campomelie aufwiesen [85, 86]. Somit wurde auch Typ V in die SRPS Übersichtlisten (Typen I-V) aufgenommen [87]. Ein weiterer SRPS Typ (Typ VI, MIM 615503) wurde 2013 von McInerney-Leo veröffentlicht [88].

Tab. 1 Übersicht der SRTDs und ähnlicher skelettaler Ciliopathien mit ursächlichen Genen

Phänotyp Phänotyp (OMIM) Gen (OMIM) PubMed CED 1 218330 IFT122 (606045) 20493458, 24689072 CED 3 614099 IFT43 (614068) 21378380 EVC, WAD 225500, 193530 EVC (604831) 23220543, 12468274 EVC, WAD 225500, 193530 EVC2 (614068) 23220543, 12468274 JATD, JBTS 21 615636 CSPP1 (611654) 24360808, 24360803 SRTD 1 [ATD 1] 208500 n.a. n.a. SRTD 2 [ATD 2] 611263 IFT80 (611177) 17468754, 19648123 SRTD 3 [SRPS I, SRPS III, ATD 3] 613091 DYNC2H1 (603297) 19442771, 1936161 SRTD 4 [ATD 4], NPHP 12/ JBTS 11 613819, 613820 TTC21B (612014) 21258341, 25492405 SRTD 5 [ATD 5], CED 4, NPHP 13, 614376, 614378, WDR19 (608151) 22019273, 23683095 SLSN8 614377, 616307 SRTD 6 [SRPS II] 263520 NEK1 (604588) 21211617 (*), 22499340 SRTD 7 [SRPS V], CED 2 614091, 613610 WDR35 (613602) 21473986, 21473986 SRTD 8 [SRPS VI] 615503 WDR60 (615462) 23910462, 25492405 SRTD 9 [MZSDS] 266920 IFT140 (614620) 22503633, 23418020 SRTD 10, RP 71 615630, 616394 IFT172 (607386) 24140113, 25168386 SRTD 11 615633 WDR34 (613363) 24183449, 24183451 SRTD 12 [SRPS IV] 269860 n.a. n.a. SRTD 13 [ATD] 616300 CEP120 (613446) 25361962 SRTD 14, JBTS 23 616546, 616490 KIAA0586 (610178) 26166481, 26026149 SRTD 15 617088 DYNC2LI1 26130459 (*), 26077881 SRTD 16 [SRPS] 617102 IFT52(617083) (617094) 27466190, 26880018 SRTD 17 [ATD] 617405 TCTEX1D2 26044572, 25830415 (*) als Teil dieser Doktorarbeit publiziert; SRPS I = Typ Saldino-Noonan; SRPS (617353)II = Typ Majewski; SRPS III = Typ Verma-Naumoff; SRPS IV = Typ Beemer-Langer; RP = Retinitis pigmentosa; WAD = Weyers Akrodental/facial Dysostose; EVC = Ellis-van Creveld Syndrom; CED = Cranio-ektodermale Dysplasie; SLSN = Senior-Løken Syndrom; JBTS = Joubert Syndrom; JATD = Jeune/ Asphyxierende Thoraxdysplasie; MZSDS = Mainzer-Saldino Syndrom; NPHP = Nephronophthise; n.a. = nicht angegeben; [ ]: frühere Bezeichnung bzw. Alias; DYNC2H1, DYNC2LI1, EVC, IFT80, NEK1, TTC21B und WDR35 wurden in der in dieser Arbeit untersuchten Patientenkohorte mit Verdachtsdiagnose Kurzrippen-Polydaktylie Syndrom (SRPS/SRTD) sequenziert [fett: Gene mit krankheitsverursachenden Mutationen identifiziert]. Datenstand: Januar 2018.

Die Nomenklatur der Short-rib Polydaktylie Syndrome (SRPS) hat sich über mehrere Jahre weiterentwickelt und wurde mehrfach geändert. So wurden die Short-rib Polydaktylie Syndrome von Sillence im Jahr 1980 in 4 Untergruppen unterteilt, 1990 erfolgte von Spranger und Maroteaux eine weitere Unterteilung in 7 Subtypen [89, 90]. Die Asphyxierende 14

Einleitung

Thoraxdysplasie (ATD, MIM 208500), die Ellis-van Crefeld Syndrome (EVC, MIM 225500) und das Mainzer-Saldino Syndrom (MZSDS/ SRTD 9, MIM 266920) zeigen phänotypische Ähnlichkeiten zu den SRPS, ebenso wie die Cranio-ektodermale Dysplasie (CED, Sensenbrenner Syndrom, MIM 218330), bei der auch Haar, Zahn und Retina Anomalien beobachtet werden. Somit werden all diese oben genannten Krankheitsbilder mit einem breiten überlappenden Phänotypenspektrum derzeit laut OMIM in SRTD 1-17 (Short-rib thoracic dysplasias, phenotypic series PS208500) eingeteilt (Tab. 1). Einige Formen von SRTD sind in der Neugeborenenperiode letal aufgrund einer respiratorischen Insuffizienz sekundär zu einem stark eingeschränkten Brustkorb, während andere (z. B. Ellis-van Crefeld, Jeune/ATD) mit dem Leben vereinbar sind [59, 87]. Als verursachender genetischer Defekt wurden zuerst bei einigen Patienten mit SRPS Typ I/III und ATD Mutationen in den ciliären Genen IFT80 und DYNC2H1 identifiziert [65, 66, 91]. Mutationen im IFT122- und WDR35-Gen konnten als Ursache für Cranio-ektodermale Dysplasie und SRPS Typ V nachgewiesen werden [86, 92]. Im Jahr 2011 konnte unsere Arbeitsgruppe Mutationen in NEK1 bei Patienten mit SRPS Typ Majweski (SRPS II bzw. SRTD 6) identifizieren und funktionell charakterisieren. Diese Studie zeigte zum ersten Mal, dass ein am Basalkörper lokalisiertes Protein im Zusammenhang mit dieser Erkrankungsgruppe steht. Ein Funktionsverlust von NEK1 konnte mit dem Auftreten von strukturell veränderten Cilien (stark reduzierte Länge und verminderte Zahl an cilientragenden Zellen) assoziiert werden. Darüber hinaus gab der Nachweis von zwei jeweils heterozygoten Mutationen im NEK1 und DYNC2H1 Gen den Verdacht auf einen digenen-diallelen Erbgang [12]. In der Zwischenzeit konnte in einer Vielzahl von Studien der Zusammenhang von Mutationen im NEK1 Gen und Krankheitsbildern aus dem Kurzrippen-Polydaktylie Spektrum bestätigt werden [61, 87, 93, 94]. Bis heute sind Mutationen in 20 verschiedenen Genen als Ursache für skelettale Ciliopathien identifiziert worden (Tab. 1), wobei alle Genprodukte hierbei am Dynein-Motor, am intraflagellaren Transport (IFT) des primären Ciliums oder dem Basalkörperkomplex involviert sind. Trotz der Identifizierung der zugrunde liegenden genetischen Ursachen der skelettalen Ciliopathien bleibt zum einen die Frage nach dem krankheitsspezifischen Pathomechanismus meist ungeklärt, zum anderen ist die Ursache der Variabilität der Symptomatik noch offen. Die bisher gezeigten Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass durch die Aufklärung der verschiedenen Funktionen ciliärer Gene ein wesentlicher Erkenntnisgewinn für die Entstehung der Ciliopathien und weiterer Cilien-assoziierter Krankheitsbilder erhalten werden kann.

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Einleitung

3.5. Zielsetzung dieser Arbeit

Trotz der großen Fortschritte in der Aufklärung genetischer Ursachen von skelettalen Ciliopathien, insbesondere des SRPS/SRTD Spektrums, bleiben die Ursachen bei einer Vielzahl von Patienten bisher unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher die Ursachen der Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome in 32 Patienten mittels Sanger-Sequenzierung oder der Next Generation Sequencing Technologie untersucht werden. Somit können neue Varianten in bekannten Genen identifiziert werden bzw. neue ciliäre Gene funktionell charakterisiert werden. Hierfür sollten Nachweise von morphologischen Defekten des primären Ciliums, die Identifikation zugrunde liegender ciliärer Signaltransduktionswege und Proteininteraktions- studien durchgeführt werden, um den individuellen und komplexen Pathomechanismus besser zu verstehen.

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Methoden

4. Methoden

4.1. Patientenkollektiv

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die genetischen Ursachen der Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome (SRPS, short-rib polydactyly syndrome) in 29 Familien mit einem oder mehreren Betroffenen untersucht (insg. 32 Patienten). Im Vorfeld wurden alle betroffenen Familienmitglieder durch verschiedene Ärzte untersucht und DNA- bzw. Blut-Proben für Studienzwecke an Herrn PD Dr. med. Christian Thiel geschickt. Anamnesen, Familienstamm- bäume und schriftliche Einverständnisse der Probanden bzw. deren gesetzlichen Vertretern lagen vor. Im Folgenden sind alle Patienten, deren Eltern und Geschwister (falls vorhanden) aufgelistet, die mit der Verdachtsdiagnose SRPS in die Studie mit aufgenommen wurden (Tab. 2) und sich deren klinischer Phänotyp mit schon in der Literatur beschriebenen SRPS Merkmalen überlappt. Im Anhang ist aufgelistet (13.2), welche der 6 Kandidatengene (NEK1, DYNC2H1, DYNC2LI1, IFT80, TTC21B, WDR35) bei den Patienten mittels Sanger (4.8) sequenziert wurden. Bei Patient P7 & P30 wurde eine Exom-Sequenzierung (4.20.1) durchgeführt, bei einer Familie (SRPS#22) wurde mit den DNAs der Eltern ein Gen-Panel (TruSight One, Illumina) sequenziert (4.20.2).

Tab. 2 Übersicht aller untersuchten SRPS Patienten

Familie Pat. ID. DNA Nr. Familienmitglied Status 30989 6280 Patient (P1) Betroffen 30740 6127 Schwester Normal SRPS#1 30908 6177 Bruder Normal 20455 6029 Mutter Normal 30674 6028 Vater Normal 55051 35869 Patient (P2) Betroffen SRPS#2 61873 50144 Vater Normal 55051 48645 Mutter Normal 61237 48956 Patient (P3) Betroffen SRPS#3 122346 189373 Mutter Normal 122347 189374 Vater Normal SRPS#4 31925 8767 Patient (P4) Betroffen SRPS#5 60631 47748 Patient (P5) Betroffen 63739 53409 Patient (P6) Betroffen SRPS#6 63739 53421 Mutter Normal 65584 56475 Patient (P7) Betroffen 65586 56479 Mutter Normal SRPS#7 65585 56477 Bruder Normal 65766 56918 Sohn Normal

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Methoden

Familie Pat. ID. DNA Nr. Familienmitglied Status

70432 65195 Patient (P8) Betroffen SRPS#8 70432 65193 Mutter Normal 70433 65194 Vater Normal 72454 69002 Patient (P9) Betroffen SRPS#9 76454 76677 Mutter Normal 76455 76678 Vater Normal 73006 71132 Patient (P10) Betroffen SRPS#10 73007 71135 Mutter Normal 73008 71133 Vater Normal SRPS#11 76152 76159 Patient (P11) Betroffen SRPS#12 76714 77147 Patient (P12) Betroffen SRPS#13 67872 103579 Patient (P13) Betroffen 81276 106022 Patient (P14) Betroffen 81276 114730 Patient (P18) Normal SRPS#14 85685 115007 Vater Normal 81276 114669 Mutter Normal 103779 150899 Bruder der Mutter Normal SRPS#15 81877 107179 Patient (P15) Betroffen 79309 102190 Patient (P16) Betroffen SRPS#16 79310 102149 Mutter Normal 79311 102150 Vater Normal SRPS#17 85104 113601 Patient (P17) Betroffen SRPS#18 87291 117930 Patient (P19) Betroffen SRPS#19 90793 124691 Patient (P20) Betroffen SRPS#20 94150 131168 Patient (P21) Betroffen SRPS#21 98740 140194 Patient (P22) Betroffen 98425 139565 Mutter Normal SRPS#22 98426 139566 Vater Normal Nicht vorh. Nicht vorh. Patient (P23) Betroffen SRPS#23 99621 142534/ 149044 Patient (P24) Betroffen SRPS#24 100300 143913 Patient (P25) Betroffen 69246 62940 Schwester (P26) Betroffen SRPS#25 69245 63045 Bruder (P27) Betroffen 64661 54914 Patient (P28) Betroffen SRPS#26 64697 54922 Mutter Normal 64662 54894 Vater Normal 22633 24320 Patient (P29) Betroffen SRPS#27 22652 24321 Mutter Normal 22653 24322 Vater Normal 102443 148967 Patient (P30) Betroffen 102443 148194 Mutter Normal SRPS#28 102444 148209 Vater Normal 102443 179987 Patient (P31) Normal 102443 179986 Mutter Normal SRPS#29 109700 163286 Patient (P32) Betroffen

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Methoden

4.2. Isolierung von Nukleinsäuren

4.2.1. Isolierung von genomischer DNA aus humanem Blut Genomische DNA wurde standardmäßig aus peripheren Blutlymphozyten von Patienten und gesunden Kontrollen durch Mitarbeiter des molekulargenetischen Diagnostiklabors des Humangenetischen Instituts Erlangen unter Leitung von Dr. rer. nat. Cornelia Kraus extrahiert, kontrolliert und bei 4 °C aufbewahrt. Bei eingeschickten DNA-Proben wurden die Konzentrationen und Reinheit mittels Infinite 200 NanoQuant (Tecan) bestimmt und auf einem Agarosegel eine mögliche Degradierung der DNA überprüft. Ein Teil der DNA-Proben wurde anschließend für die MLPA-Analysen mit dem QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers erneut aufgereinigt.

4.2.2. Isolierung von genomischer DNA aus Zellen Die Extraktion von DNA aus Zellen erfolgte mit Hilfe des DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen) gemäß Herstellerangaben. Dazu wurden die adhärent wachsenden Zelllinien zuerst mit 1x PBS gewaschen, anschließend wurden diese in 24- bzw. 6-well Platten für mind. 30 Min. bei -20 °C eingefroren. Für eine höhere DNA Ausbeute erfolgte die Elution in max. 50 µl AE Puffer, wobei dieser Elutionsschritt einmal wiederholt wurde.

4.2.3. Isolierung von RNA aus humanem Blut Die Blutentnahme zur RNA-Isolierung erfolgte mittels PAXgene Blood RNA tubes (Becton Dickinson), die der RNA-Stabilisierung dienten. Die Isolierung der RNA wurde routinemäßig durch Mitarbeiter des Humangenetischen Instituts Erlangen unter Nutzung des PAXgene Blood RNA Kits (Becton Dickinson) durchgeführt. Bei einem Teil der Proben wurde anschließend ein DNase Verdau mit dem RNase-free DNase Set (Qiagen) nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

4.2.4. Isolierung von RNA aus Zellen Zur Isolierung von RNA wurden adhärent wachsende Zelllinien zuerst mit 1x PBS gewaschen, anschließend mit 0,05 % Trypsin/EDTA abgelöst und in DMEM/Ham´s F-12 aufgenommen, bevor diese erneut mit 1x PBS gewaschen und bei 2000 rpm für 5 Min. pelletiert wurden. Danach wurde die RNA aus den pelletierten Zellen mithilfe des RNeasy Mini Kits (Qiagen) nach Herstelleranweisungen isoliert, wobei standardmäßig ein DNase Verdau (RNase-Free DNase Set, Qiagen) auf der Säule erfolgte. 19

Methoden

4.2.5. Isolierung von Plasmid-DNA Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse [95]. Hierzu wurden 3-5 ml LB Medium mit 50 μg/ml des entsprechenden Antibiotikums (je nach verwendetem Plasmid) versetzt und mit der gewünschten Bakterienkolonie direkt von einer LB-Platte oder einem Kryostock angeimpft. Nach der Kultivierung über Nacht bei 37 °C unter ständigem Schütteln wurde die Kultur für 10 Min. bei 13000 rpm pelletiert. Anschließend wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) nach Herstelleranweisung isoliert. Zur Isolierung größerer DNA Mengen wurde das Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben verwendet.

4.2.6. Qualitätskontrolle für isolierte Nukleinsäuren Die isolierten DNA- und RNA-Proben wurden hinsichtlich ihrer Qualität und Quantität mit Hilfe des Infinite 200 NanoQuants (Tecan) photometrisch vermessen.

4.3. Gelelektrophorese

DNA- und RNA-Fragmente wurden durch horizontale Gelelektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt. Je nach erwarteter Größe wurden 1-3 % Agarosegele verwendet, welche mit 0,1 μl/ml Ethidiumbromid versetzt wurden. Die Proben wurden vor dem Auftragen mit Ladepuffer 1:1 versetzt und anschließend bei einer Spannung von 90-130 V für 15-60 Min. in einem TBE-Puffersystem aufgetrennt. Zur Größenbestimmung wurden verschiedene DNA- Standards mitgeführt. Die Dokumentation erfolgte mit einem UV-Transilluminator (UV Star, Biometra) und der BioDocAnalyze software (Biometra).

4.3.1. Gelextraktion aus Agarosegelen Für eine Extraktion einzelner Banden aus dem Gel wurden diese verschiedenen großen Produkte mit einem Skalpell herausgetrennt und mittels QIAquick Gel Extraktion Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben isoliert.

4.4. Amplifikation genomischer DNA (Whole Genome Amplification)

Da die DNA-Menge der Patienten häufig limitiert war und bei einem letalen Phänotyp der SRPS nicht erneut DNA isoliert werden kann, wurde für Mutationsscreenings der SRPS Kandidatengene zuvor eine Whole Genome Amplification durchgeführt. Diese erfolgte mit dem

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Methoden

Illustra Genomiphi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare) nach Angaben des Herstellers. Da durch die Amplifikation mittels der isothermalen Phi29 Polymerase Artefakte entstehen können, wurden alle möglicherweise pathogenen Varianten nochmals an Original-DNA validiert.

4.5. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung einer hitzestabilen DNA- Polymerase aus Thermophilus aquaticus lassen sich gezielt DNA Abschnitte exponentiell amplifizieren [96]. Die für die PCR benötigten Primer wurden mit Hilfe des Programms Primer 3 [97] entworfen. Als Bedingungen wurde standardmäßig eine Länge von 19-27 Oligonukleotiden, eine Schmelztemperatur von 57-63 °C, ein GC-Gehalt von 20-80 % sowie möglichst ein G oder C am 3‘ Ende des Primers gewählt (CG Clamp). Anschließend wurden mit Hilfe der BLAT sowie der PCR Funktion des UCSC Genome Browsers die Spezifität der Primer geprüft und SNPs oder repetitive Sequenzen innerhalb der Primersequenz ausgeschlossen. Die Oligonukleotide wurden anschließend von Thermo Scientific synthetisiert und in lyophyllisierter Form verschickt. Die Sequenzen der hier verwendeten Primer sind im Anhang gelistet (13.20.7). In dieser Arbeit wurden verschiedene PCR Ansätze und Cyclerprogramme genutzt um DNA bzw. cDNA zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese (4.3) überprüft und anschließend mit Hilfe des Pipettierroboters Biomek NXP (Beckman Coulter) und des AMPure Kits (Agencourt) aufgereinigt (4.8.1).

4.5.1. Standard-PCR Die PCR wurde standardmäßig in 15 μl Ansätzen, mit der unten gezeigten Zusammensetzung, durchgeführt. Als Template wurden 20-100 ng DNA eingesetzt und als Standard-Enzyme wurde eine Mischung von Taq recombinant und Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen) verwendet. Es wurde hierfür ein Touchdown-PCR-Programm genutzt, bei dem mit einer hohen Annealing-Temperatur begonnen wird und im weiteren Verlauf die Annealing-Temperatur schrittweise um 1 °C pro Zyklus erniedrigt wurde, um eine spezifische und effiziente Ausbeute des gewünschten PCR-Produkts zu erhalten.

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Methoden

PCR-Ansatz (Einzelproben) PCR-Ansatz (Primerplatten)

dNTPs (10 pmol/µl) 1 µl dNTPs (10 pmol/µl) 105 µl PCR-Puffer Invitrogen (10x) 1,5 µl PCR-Puffer Invitrogen (10x) 157,5 µl DMSO 0,75 µl DMSO 78,75 µl Betain (50 mM) 3 µl Betain (50 mM) 315 µl MgCl2 (50 mM) 0,45 µl MgCl2 (50 mM) 47,25 µl H2O 6,5 µl H2O 832,5 µl F-Primer (10 pmol/µl) 0,5 µl Template (20-100 ng) 60 µl R-Primer (10 pmol/µl) 0,5 µl Taq recombinant 6,3 µl Template (20-100 ng) 1 µl Platinum Taq 6,3 µl Taq recombinant 0,06 µl Gesamt 1608,6 µl Platinum Taq 0,06 µl Gesamt 15 µl Je 15 μl des Mastermixes pro Well pipettieren

Cycler-Programm Touchdown-PCR

Temperatur Zeit Zyklenzahl 94 °C 3 Min. 1x 94 °C 20 s 65 °C -1 °C/ Zyklus 1 Min. 9x 68 °C 1 Min. 94 °C 20 s 55 °C 1 Min. 29x 68 °C 1 Min. 68 °C 10 Min. 1x 15 °C 5 Min. 1x

4.5.2. GC-rich-PCR Für besonders schwierige Templates z. B. Promotorbereiche, die sich meist durch einen hohen Gehalt an Guanin- und Cytosin-Basen (GC-rich) auszeichnen, wurde das GC-Rich System dNTPack von Roche verwendet.

Ansatz 1 Ansatz 2

dNTPs (10 pmol/µl) 1 µl H2O 2 µl H2O 10 µl Puffer gelb 5 µl F-Primer (10 pmol/µl) 1 µl Enzymmix 0,5 µl R-Primer (10 pmol/µl) 1 µl Puffer rot 2,5 µl DNA 2 µl Gesamt 17,5 µl Gesamt 7,5 µl

Ansätze auf Eis pipettieren, Mastermix 2 zu Mastermix 1 hinzufügen und anschließend Reaktion starten.

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Methoden

Cycler-Programm GC-rich-PCR

Temperatur Zeit Zyklenzahl 95 °C 3 Min. 1x 95 °C 30 s 60 °C 30 s 11x 68 °C 45 s 95 °C 30 s 60 °C 30 s (5 s länger/ Zyklus) 29x 68 °C 45 s (5 s länger/ Zyklus) 68 °C 10 Min. 1x 4 °C 1 Min. 1x

4.5.3. Hefe-PCR Nachdem die Hefeklone max. 1-2 Tage auf SD/-LTHA Platten gewachsen waren, wurden diese mit einer autoklavierten Pipettenspitze in 96-well Platten überführt, in welchen der Hefe-PCR- Mastermix vorgelegt worden war. Diese PCR sollte die in den Hefe-Plasmiden enthaltenen cDNAs mittels KAPA2G Robust DNA Polymerase (Peqlab) amplifizieren. Die Hefe-PCRs wurden in Kooperation mit der Tierphysiologie Erlangen von Nadja Gießl durchgeführt.

Hefe-PCR-Ansatz

5x KAPA2G Puffer B 20 µl 5x KAPA Enhancer 1 20 µl

MgCl2 2 µl dNTP-Mix 2 µl 7848 Forward (100 pmol/µl Stock) 2,5 µl P2Gal4AD Reverse (100 pmol/µl Stock) 2,5 µl KAPA2G Robust DNA-Polymerase 0,5 µl H2O 50,5 µl Gesamt 100 µl

Cycler-Programm Hefe-PCR

Temperatur Zeit Zyklenzahl 95 °C 13 Min. 1x 95 °C 30 s 60 °C 1 Min. 41x 72 °C 3:30 Min. 72 °C 5 Min. 1x 12 °C ∞

Der Erfolg der PCR wurde im Anschluss mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft (4.3). Waren keine Banden auf dem Gel zu erkennen, wurden die entsprechenden Proben aufgereinigt (4.8.1) und das Produkt der ersten PCR als Template für eine zweite PCR („Re-PCR“) verwendet. Für die Re-PCR wurde der Standard PCR-Ansatz folgendermaßen abgewandelt und das Touchdown-PCR-Programm (abgewandelt mit 4 Min. Elongationszeit) verwendet. 23

Methoden

Re-PCR-Ansatz

dNTPs (10 pmol/µl) 1 µl PCR-Puffer Invitrogen (10x) 1,5 µl DMSO 0,75 µl Betain (50 mM) 3 µl MgCl2 (50 mM) 0,45 µl T7 Promotor Forward (10 pmol/µl) 0,5 µl P2Gal4AD Reverse (10 pmol/µl) 0,5 µl Aufgereinigtes PCR-Produkt (1.Hefe PCR) 7,5 µl Taq recombinant 0,06 µl Platinum Taq 0,06 µl Gesamt 15 µl

4.6. Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR)

Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase kann RNA in cDNA (complementary DNA) umgeschrieben werden, die dann in einer PCR (4.5) oder quantitativer real time PCR (4.7) als Template eingesetzt werden kann. Die cDNA Synthese erfolgte mittels Super Script II Reverse Transcriptase (Life Technologies) und random Hexamer Primern (Life Technologies) gemäß Herstellerangaben. Für die Erststrangsynthese wurden 500-1000 ng RNA eingesetzt. Nach der cDNA Synthese wurde der 20 μl Ansatz auf 50-100 ng/µl mit HPLC-Wasser verdünnt und bei -20 °C gelagert.

4.7. Quantitative real time PCR (qPCR)

Ziel der quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR) ist es, aus der Menge an amplifiziertem Produkt auf die Menge an eingesetzter cDNA zu schließen. Dadurch kann die Transkriptmenge bestimmter Gene ermittelt werden. Eine zuverlässige Quantifizierung erreicht man durch Verfolgen der Amplifikatkonzentration über alle Zyklen der PCR. Dazu wird die PCR mit einem Prozess, der eine lineare Korrelation der Amplifikatkonzentration mit einer Fluoreszenzintensität erzeugt, gekoppelt. Man verwendet sequenzspezifische Sondenmoleküle, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Der spezifische Nachweis wird durch die Bindung der Sondenmoleküle an das definierte PCR-Produkt erreicht. Bei der in dieser Arbeit verwendeten TaqMan Methode enthalten die TaqMan-Sonden einen Reporter- Fluoreszenzfarbstoff am 5‘-Ende und einen nicht fluoreszierenden Quencher-Farbstoff am 3‘-Ende [98, 99]. Zunächst erhält man kein Fluoreszenzsignal, da der Quencher eine messbare Fluoreszenzemission des Reporters unterdrückt. Durch die 3‘-5‘-Exonukleaseaktivität der Taq Polymerase wird die Fluoreszenzsonde während der Strangsynthese hydrolytisch gespalten. Infolgedessen wird der Quencher vom Reporter getrennt und man erhält ein Fluoreszenzsignal,

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Methoden welches messtechnisch erfasst werden kann. Die im Verlauf der PCR gemessene Intensität der Fluoreszenz ist direkt proportional zur Anzahl der neu synthetisierten DNA-Stränge und damit proportional zur Menge an Ausgangs-DNA.

4.7.1. Durchführung der qPCR Für die Durchführung der qPCR wurde TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies) zusammen mit TaqMan Gene Expression Assays (Life Technologies) für die zu untersuchenden Gene sowie für 4-5 endogene Kontrollgene (Beta Actin [ACTB], Beta-2- Microglobulin [B2M], Large Ribosomal Protein [RPLPO], Phosphoglycerate Kinase 1 [PGK1] bzw. TATA-box binding Protein [TBP]) verwendet. Die verwendeten Sonden sind im Anhang (13.20.6) aufgelistet. qPCR-Ansatz 1x 4,5x TaqMan Gene Expression Master Mix 7,5 µl 33,8 µl TaqMan Gene Expression Assay (probe) 0,75 µl 3,4 µl

H2O 6,75 µl 30,4 µl Gesamt 15 µl 67,6 µl Zum Mastermix wurde 10 µl cDNA hinzugegeben, 40-mal durch Auf- und Abpipettieren gemischt und anschließend je 15 μl in 4 Wells der 384-well Platte (technische Replikate) pipettiert. Die Amplifikation und Detektion erfolgte im ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Life Technologies) oder im QuantStudio 12K Flex (Life Technologies) mit folgendem Programm:

Cycler-Programm qPCR

Temperatur Zeit Zyklenzahl 50 °C 2 Min. 1x 95 °C 10 Min. 95 °C 15 s 40-50x 60 °C 1 Min.

4.7.2. Auswertung qPCR Die qPCR-Daten wurden mit Hilfe von 2 verschiedenen Programmen ausgewertet. Liefen die qPCRs am ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Life Technologies) wurden die Daten mit der ABI PRISM 7900 HT SDS V2.1.1 Software (Life Technologies) analysiert, nach Detektion im QuantStudio 12K Flex (Life Technologies) wurde die Auswertung mit der QuantStudio12k Flex Software (Life Technologies) vorgenommen. Die mathematische Berechnung der relativen Genexpression erfolgte mittels ΔΔCT-Methode. Hierzu wurden die

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Methoden

Daten semilogarithmisch aufgetragen und innerhalb der linearen Phase ein Schwellenwert automatisch festgesetzt. Der PCR-Zyklus, bei dem die Amplifikationskurve diesen Schwellenwert überschreitet, wurde als CT-Wert (Threshold Cycle) ausgegeben. Die CT-Werte des zu untersuchenden Gens (Zielgen) wurden anschließend zu vier ubiquitär exprimierten Genen (endogene Kontrollen) ins Verhältnis gesetzt, um den ΔCT Wert zu berechnen.

ΔCT = CT Zielgen - CT Referenzgene

Danach wurde der ΔCT-Wert von einer Kontrolle zu den ΔCT-Werten der Proben in ein Verhältnis gesetzt, um den ΔΔCT-Wert zu erhalten.

ΔΔCT = ΔCT veränderte Zellen (patient/siRNA) - ΔCT normale Zellen (controls/scrambled)

Der finale Schritt ist die Berechnung des RQ-Wertes (Relative Quantification), die auf der Annahme beruht, dass jeder PCR-Zyklus zu einer Verdoppelung des PCR-Produktes führt, mit der Formel RQ = 2-(ΔΔCT) [100, 101]. Der Wilcoxon Two Sample Test bzw. Mann-Whitney- U Test wurden genutzt, um aus den technischen bzw. biologischen Replikaten die Signifikanz zu berechnen.

4.8. Sequenzierung nach Sanger

Die DNA-Sequenzierung erfolgte nach der Kettenabbruchmethode von Sanger et al. [102], welche durch den Einsatz von fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden modifiziert wurde [103].

4.8.1. PCR Aufreinigung Zur weiteren Benutzung für die Sanger-Sequenzierung wurden die PCR-Produkte mit Hilfe des Pipettierroboters Biomek NX (Beckman Coulter) über Magnetic Beads (AMPure Kit, Agencourt) nach Herstelleranweisung aufgereinigt. Alternativ wurden bei einem Teil der PCR- Produkte enzymatisch überschüssige Primer und dNTPs mit einem 1:2 Gemisch aus Exonuklease I und antarktischer Phosphatase für 15 Min. bei 37 °C und anschließender Hitzeinaktivierung beider Enzyme für 15 Min. bei 80 °C verdaut. Anschließend wurden die PCR-Produkte mit HPLC-Wasser nach Bedarf verdünnt.

4.8.2. Sequenzierreaktion Die Sequenzierreaktion wurde mit dem BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies) standardmäßig in 10 μl Ansätzen in folgender Zusammensetzung durchgeführt.

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Methoden

Sequenzier-Ansatz (Einzelproben) Sequenzier-Ansatz (Primerplatten)

Sequenzierpuffer (5x) 2 µl Sequenzierpuffer (5x) 210 µl Premix (BigDye v3.1) 0,25 µl Premix (BigDye v3.1) 26,25 µl Primer F bzw. R 0,25 µl H2O 288,75 µl

H2O 2,5 µl Gesamt 525 µl PCR-Produkt (aufgereinigt) 5 µl Gesamt 10 µl Je 5 μl des Mastermixes pro Well pipettieren und 5 µl PCR-Produkt (aufgereinigt) hinzufügen

Wenn Plasmide sequenziert wurden, wurde der Ansatz so abgewandelt, dass 1 µl Plasmid als

Template verwendet wurde und mit 6,5 µl H2O aufgefüllt wurde. Bei sehr schwachen Hefe PCR-Produkten wurden 7,5 µl aufgereinigtes Produkt in die Sequenzierreaktion eingesetzt.

Cycler-Programm Sequenzierung

Temperatur Zeit Zyklenzahl 96 °C 10 s 55 °C 10 s 25x 60 °C 2 Min. 15 °C 10 Min. 1x

Die Elongationszeit wurde bei Bedarf (Sequenzierung von Plasmiden bzw. Hefe PCR- Produkte) auf bis zu 4 Min. verlängert.

4.8.3. Sequenzieraufreinigung Die Sequenzierreaktionen wurden mit Hilfe des Pipettierroboters Biomek NX (Beckman Coulter) über Magnetic Beads mit dem Agencourt CleanSEQ Kit (Beckman Coulter) nach Herstelleranweisung aufgereinigt.

4.8.4. Analyse der Sequenzen Die Sequenzen wurden vom Sequenzierer ABI 3730 Genetic Analyzer (48 Kapillaren, Life Technologies) abgelesen und in Elektropherogramme übertragen. Die Rohdaten wurden mit dem Programm Sequencing Analysis 5.1 Software (Applied Biosystems) auf Qualität geprüft. Anschließend erfolgte die Sequenzauswertung mit den Programmen Chromas Version 2.23 (Technelysium), SeqManII 5.03 (DNA Star Inc.), SeqPilot 4.1.2. (JSI Medical Systems) oder Mutation Surveyor Version 4.0.8 (Softgenetics). Für einen Abgleich der erhaltenen Sequenzen mit der Genom-Annotation GRCh37/hg19 wurden die Online-Programme Human BLAT Search (UCSC Genome Bioinformatics) und BLAST (NCBI) verwendet.

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Methoden

4.9. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)

Um Kopienzahlvarianten für bis zu 50 Loci parallel in einem Ansatz analysieren zu können, wurde in dieser Arbeit die Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) Multiplex-PCR-Methode verwendet [104]. Hierzu werden zwei spezifische Oligonukleotide direkt nebeneinander an der komplementären Ziel-DNA hybridisiert und anschließend miteinander ligiert, um eine MLPA-Sonde zu bilden. Jede der designten Sonden (4.9.1) besitzt eine unterschiedliche Länge, was anschließend die Unterscheidung der Produkte der Multiplex- PCR ermöglicht. Neben der spezifischen Zielsequenz tragen die Oligonukleotide terminal Bindungsstellen für Universalprimer, mit deren Hilfe die Sonden in einer Multiplex-PCR amplifiziert werden. In dieser auf die Ligation folgenden Multiplex-PCR-Reaktion werden dann durch Verwendung von einem Fluoreszenz-markierten Universal-Primerpaar die MLPA- Sonden der unterschiedlichen Targets gemeinsam amplifiziert. Nicht ligierte Oligonukleotide können dabei nicht als Template für die PCR-Reaktion dienen und werden von der Amplifikation ausgeschlossen. Die Produkte werden anschließend kapillarelektrophoretisch aufgetrennt und eine Endpunktbestimmung der Sonden durchgeführt. Anhand der dabei für eine Sonde erhaltenen Signalhöhen (peaks), welche proportional zur vorhandenen Menge an Zielsequenz sind, kann dann nach Normalisierung gegen mitgeführte endogene Kontrollsonden die Target-Menge relativ quantifiziert werden.

4.9.1. MLPA Sonden-Design In den hier verwendeten MLPA-Ansätzen wurden 12 bzw. 14 Sonden in Kombination verwendet. Zur Größenunterscheidung der Produkte unterschieden sich diese in ihrer Länge um 4 Basen und deckten so den Größenbereich von 88-136 Basen Länge ab. Die Sonden wurden nach dem Manual Designing synthetic MLPA probes, Version 12 von MRC Holland und unter Verwendung des Programms Raw (MRC Holland) entworfen. Dabei wurde unter Verwendung von Human BLAT Search (UCSC Genome Bioinformatics) darauf geachtet, dass die Sonden nicht im Bereich von SNPs oder repetitiven Regionen lagen. Als Referenzsondenmix wurde der SALSA MLPA P200 Human DNA reference-1 (MRC-Holland) benutzt. Die Oligonukleotide wurden inklusive der Phosphorylierung des 5‘-Endes des rechten Oligonukleotides durch Thermo Scientific synthetisiert. Die Sequenzen der in dieser Arbeit verwendeten MLPA- Sonden für DYNC2LI1 sind im Anhang (13.20.6) aufgelistet.

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Methoden

4.9.2. Durchführung der MLPA Zu untersuchende DNAs wurden im Vorfeld mit dem QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. Maximal 250 ng der aufgereinigten DNA-Proben wurden verdünnt in 5 μl TE-Puffer eingesetzt. Für eine Kombination aus 12 bzw. 14 Sonden wurden 0,8 pmol aller 24 bzw. 28 Oligonukleotide mit TE zu einem 200 μl Gesamtvolumen umfassenden Probemix (Sondenmix A bzw. B für DYNC2LI1) aufgefüllt. Die anschließende MLPA-Reaktion wurde mittels SALSA MLPA EK5-Reagenzien (MRC Holland) nach Protokoll des Herstellers (General MLPA Protocol for DNA Detection & Quantification) durchgeführt. Die Fragment-Analyse fand an einem ABI 3100 Genetic Analyzer (Life Technologies) statt.

4.9.3. MLPA Auswertung Die Analyse der generierten Daten erfolgte mit der Software SeqPilot 4.1.2. (JSI Medical Systems). Mitgeführte Kontroll-Sonden dienten dabei der Normalisierung und ließen eine anschließende Berechnung der relativen Quantität der Proben im Vergleich zu Kontroll-Proben zu. Als Grenzwerte für das Vorliegen einer Deletion bzw. Duplikation wurden 75 % bzw. 125 % der Dosis im Vergleich zu den Kontrollen gewählt.

4.10. Klonierung von Plasmiden

4.10.1. pCR8/GW/TOPO TA Klonierung In Vorbereitung für verschiedene Experimente mussten ganze Gene oder nur bestimmte Genbereiche (Domänen) in ein bestimmtes Plasmid eingefügt werden. Dazu wurde das pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) verwendet. Die Klonierung wurde weitgehend nach Angaben des Herstellers durchgeführt, wobei abweichend statt 1 μl nur 0,5 μl des Eingangsvektors (Entry vector) eingesetzt wurden. Der Reaktionsansatz wurde 25 Min. bei Raumtemperatur inkubiert und abschließend vollständig in kompetente Bakterien transformiert (4.10.3). Nach der erfolgreichen Ligation des Inserts in den Eingangsvektor, wird das DNA- Fragment von zwei attL Rekombinationsstellen flankiert, durch die das DNA-Fragment zu einem späteren Zeitpunkt mittels Gateway Technologie in einen Expressionsvektor (destination vector) kloniert werden konnte (4.10.2). Die Vektorkarte des pCR8/GW/TOPO Vektors ist im Anhang aufgeführt (13.20.9).

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Methoden

4.10.2. LR Clonase Reaktion (Gateway System) Die Gateway Technologie der Firma Invitrogen stellt eine universelle Klonierungsmethode dar und gewährleistet eine schnelle und hocheffiziente Integration von DNA in multiple Vektorsysteme. Die Herstellung von Expressionsvektoren zur rekombinanten Protein- gewinnung erfolgte in dieser Arbeit mit Hilfe der sogenannten Gateway LR Clonase Reaktion. Hierfür wurde Gateway LR ClonaseII Enzyme Mix gemäß den Herstellerangaben verwendet. Vom pCR8/GW/TOPO bzw. pENTR223 (Eingangsvektor) wurden die Inserts (DNA- Fragmente) in verschiedene Expressionsvektoren kloniert (Abb. 4). Für Hefeexperimente (4.19.3) wurden das Insert vom pCR8/GW/TOPO in pBD-GAL4 Cam (BD-Vektor) und pAD-GAL4 2.1 (AD-Vektor) kloniert, für Ko-Immuopräzipitations- Experimente hingegen in pDEST/N-SF-TAP (TAP-Tag) und pDEST27GST (GST-Tag). Alle Vektorkarten sind im Anhang (13.20.9) gelistet.

Abb. 4 LR Clonase Reaktion – Gateway System Das Schema zeigt die vier verschieden Plasmidtypen und Enzymmixe, die in der Gateway Klonierung Verwendung finden. Der rote Pfeil markiert das Insert (DNA-Fragment des Zielgens). Die LR Clonase Reaktion zwischen den attL und attR Rekombinationsstellen führt zum Austausch des ccdB Gens durch ein DNA-Fragment, wodurch aus einem Eingangs- und einem Zielvektor ein rekombinantes Expressionsplasmid und ein Donor-Vektor als Nebenprodukt entstehen. Amp. = Ampicillin-Resistenz, Spec. = Spectinomycin-Resistenz (verändert nach [105]).

4.10.3. Transformation von Plasmiden in chemisch kompetente Bakterien Zur Transformation wurden 25 µl bzw. 50 μl chemisch kompetente E. coli Bakterien der Stämme DH5α, BL21, Sure oder One Shot Top10 mit der TOPO-Reaktion bzw. dem LR-Clonase Ansatz gemischt und für 30 Min. auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte der Hitzeschock bei 42 °C für 30-90 s zur Aufnahme des Vektors. Nach Zugabe von 125 μl bzw. 250 µl SOC-Medium (Invitrogen) wurden die Bakterien für 1 Stunde bei 37 °C horizontal geschüttelt. Der Transformationsansatz wurde anschließend auf antibiotikahaltigen Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Von den Platten wurden Klone für Übernachtkulturen gepickt, bei 37 °C über Nacht geschüttelt und am nächsten Tag eine Isolation von Plasmid-DNA (4.2.5) durchgeführt.

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Methoden

4.10.4. Selektion positiver Klone Zur Identifizierung von positiven Klonen, die den richtigen Vektor aufgenommen haben, wurden diese mit Primern, die die Vektor-Insert-Grenze überspannen, sequenziert. Dabei wurde darauf geachtet, dass das Insert in der richtigen Orientierung und im richtigen Leseraster eingefügt wurde und die Sequenz der annotierten Wildtypsequenz entspricht.

4.10.5. Herstellung von Bakterien-Kryostocks Nach der Identifikation eines positiven Klons wurden 700 µl der Bakterienkultur mit 700 µl sterilem Bakterien-Einfriermedium (13.20.4) gemischt und die Bakterienlösung bei -80 °C eingefroren.

4.11. Zellkultur

Die Kultivierung von eukaryotischen Zellen erforderte sterile Arbeitstechniken zur Vermeidung bakterieller oder sonstiger Kontaminationen. Deshalb wurden alle Arbeiten in Sterilwerkbänken durchgeführt und ausschließlich gammabestrahlte Zellkulturmaterialien verwendet.

4.11.1. Auftauen von Zelllinien Das Auftauen der bei -80 °C gelagerten Zellen erfolgte möglichst schnell durch Inkubation im Wasserbad bei 37 °C. Anschließend wurden die Zellen in ein 15 ml Falkon überführt und mit DMEM/Ham´s F-12 aufgefüllt. Es folgte eine Zentrifugation bei Raumtemperatur und 1000 rpm für 8 Min., der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in frisches Nährmedium aufgenommen. Die Zellsuspension wurde anschließend in eine 25 cm2

Kulturflasche überführt und in den Brutschrank (37 °C, 5 % CO2 und 95 % relative Luft- feuchtigkeit) gestellt.

4.11.2. Kultur von adhärent wachsenden Zellen Die Zelllinie HEK293 (Human Embryonic Kidney Cells) stammt von menschlichen Nierenzellen ab, welche mit Komponenten des menschlichen Adenovirus vom Typ 5 immortalisiert wurden [106]. Die in dieser Arbeit verwendeten HEK293T-Zellen sind eine Variante der ursprünglichen Zelllinie und exprimieren zusätzlich das SV40 large T-Antigen. Die verwendeten humanen Kontroll-Fibroblasten wurden von Mitarbeitern des

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Methoden

Zytogenetiklabors des Humangenetischen Instituts Erlangen unter Leitung von Dr. rer. nat. Udo Trautmann aus Hautbiopsien kultiviert und von mir in Folgeexperimenten weiter passagiert. Um eine möglichst schnelle Zellteilung zu erreichen, wurde anfangs das Medium DMEM/Ham´s F-12 mit 20 % hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (Fetal Bovine Serum, Biochrome AG), 2 % Ultroser G (PALL BIOSEPRA) und 1 % Antibiotikalösung (Penicillin/ Streptomycin/Glutamin von Gibco) verwendet. In weiteren Passagen der Zellkultur wurden 75 cm2 Zellkulturflaschen verwendet und dem Medium DMEM/Ham´s F-12 wurden nur 10 % fetales Kälberserum und 1 % Antibiotikalösung zugesetzt. Um bei Fibroblasten die Ausbildung eines primären Ciliums zu induzieren, wurden die Zellen fünf Tage lang unter Hungermedium (DMEM/Ham´s F-12 mit 0 % fetalem Kälberserum und 1 % Antibiotikalösung) gesetzt. Die Induzierung eines Ciliums bei HEK239T Zellen benötigte nur 3 Tage, wobei das Hungermedium zusätzlich 1:1 mit 1x PBS verdünnt wurde.

4.11.3. Splitten von Zellkulturen Sobald eine Konfluenz von ca. 80-100 % zu beobachten war, wurden die Zellen je nach Bedarf gesplittet. Dafür wurde das alte Medium abgezogen, die Zellen mit vorgewärmten 1x PBS gewaschen und 2 ml 0,05 % Trypsin/EDTA hinzugefügt. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei 37 °C im Brutschrank konnten die Zellen vom Flaschenboden abgeklopft werden. Die Zellen wurden in frisches Medium aufgenommen und das im Medium enthaltene fetale Kälberserum stoppte die Reaktion des Trypsins. Zum Splitten wurde ein Teil der Zellen (1:3 bis 1:10) in frisches Kulturmedium überführt.

4.11.4. Einfrieren von Zellkulturen Zur Aufbewahrung von Zellen wurden zu einer möglichst frühen Passage Kryostocks hergestellt. Dazu wurden die Zellen bis zu fast 100%iger Konfluenz kultiviert, dreimal mit je 10 ml HANKs Salt Solution gewaschen und anschließend das HANKs Medium vollständig abgenommen. Danach wurden die Zellen analog zu 4.11.3 mit Trypsin behandelt. Die abgelösten Zellen wurden in 10 ml Medium aufgenommen und in 15 ml Falkons überführt. Es schloss sich ein 8-minütiger Zentrifugationsschritt bei 1000 rpm und RT an. Das Medium wurde vollständig abgezogen und das Zellpellet in ca. 1 ml Zellkultur-Einfriermedium (13.20.4) resuspendiert. Zum Schluss erfolgten erst eine einstündige Inkubation bei 4 °C und eine weitere einstündige Inkubation bei -20 °C, bevor die Zellen bei -80 °C weggefroren wurden.

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Methoden

4.11.5. Transfektion von adhärenten Zelllinien mit siRNA Die Transfektion humaner Zelllinien mit sogenannter small interfering RNA (siRNA) diente der gezielten Expressionsreduktion (Silencing) von Gentranskripten vermittelt durch den RNA- Interferenz-Mechanismus (RNAi). Dieser beruht darauf, dass doppelsträngige RNA-Moleküle in der Zelle durch das Enzym Dicer in kurze Fragmente - sog. siRNAs - gespalten werden. Die entstandene siRNA wird anschließend in den sogenannten RNA-induced silencing complex (RISC) eingebaut, über welchen dann die Zerstörung siRNA-homologer mRNA und damit eine post-transkriptionelle Herunterregulation des Zielgens vermittelt wird [107]. Hierzu wurden Stealth RNAi siRNAs (Invitrogen) nach dem Hersteller-Protokoll in humane Fibroblasten eingebracht. Das Medium wurde ca. 24 Stunden vor Transfektion durch Antibiotika-freies DMEM-Medium ersetzt und die Zellen in 6-well Platten, in welche zusätzlich ein steriles Deckgläschen gelegt wurde, ausgesät. Zum Zeitpunkt der Transfektion sollte eine optimale Konfluenz von 70-90 % vorliegen. 7,5 µl Lipofecatamin 2000 (Invitrogen) wurde zu 242,5 µl Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Mix A) gegeben und 15 Min. bei RT inkubiert. Währenddessen wurde 18,75 µl der siRNA (Stealth RNAi siRNA negative control bzw. Zielgen RNAi siRNA je 20 μM Stocklösung) in 250 µl Opti-MEM verdünnt (Mix B). Dann wurde Mix A zu Mix B gegeben, vorsichtig gemischt und für weitere 15 Min. bei RT inkubiert (Mix C). Kurz vor der Transfektion wurde erneut 2 ml frisches DMEM in den 6-well Platten vorgelegt und vorsichtig 500 µl von Mix C aufgeträufelt. Das Transfektionsmedium wurde nach 4-6 Stunden durch frisches Normal- bzw. Hungermedium (4.11.2) ersetzt, bevor nach 5 Tagen die RNA Isolation aus Zellen (4.2.4), cDNA-Synthese mit anschließender qPCR (4.6, 4.7) erfolgte, bzw. Immunfluoreszenzanalysen (4.12.1) oder Western Blots (4.15) durchgeführt wurden.

4.11.6. Transfektion von adhärenten Zelllinien mit Plasmiden Eine Transfektion von Plasmiden in HEK293T Zellen, um eine Überexpression von Zielgenen für Ko-Immunopräzipitation bzw. CRISPR/Cas9 vermittelten Genomeditierung zu erreichen, erfolgte mittels Polyethylenimin (PEI). PEI ist ein kationisches Polymer, welches an DNA bindet und diese in kleine kationische Nanopartikel kondensiert, wodurch die Aufnahme der PEI-DNA-Komplexe in die Zellen erleichtert wird [108, 109]. Das Transfektions-Reagenz PEI (13.20.3) wurde von Nicole Schürmann im Rahmen ihrer Masterarbeit im Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen hergestellt, in Vorversuchen getestet und mir für weitere Experimente zur Verfügung gestellt.

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Methoden

Die Zellen wurden unter Antibiotika-freiem DMEM-Medium in 6-well Platten oder 10 cm Schalen ausgesät (inklusive steriler Deckgläschen) und nach 24 Stunden bei einer Konfluenz der Zellen von 70-90 % transfiziert. In Vorversuchen wurden verschiedene Plasmidmengen bei gleichbleibenden PEI Volumen eingesetzt, um bestmögliche Transfektionseffizienzen zu erhalten. Die Reagenzien wurden gemäß nachfolgendem Schema zusammenpipettiert, 15 s durch Vortexen gemischt, 15-20 Min. bei Raumtemperatur inkubiert und 200 µl (6-well Platte) bzw. 1200 µl (10 cm Schale) der PEI/Plasmid Mischung auf die Zellen geträufelt. Nach 4-6 Stunden wurde das Medium gewechselt und nach 1-3 Tagen die Zellen weiterverarbeitet (Immunfluoreszenz 4.12, Western Blot 4.15, Ko-Immunopräzipitation 4.14, Fluorescence- activated cell sorting FACS 4.13.2).

Pipettierschema PEI Transfektion

6-well Platte 10 cm Schale DMEM ohne AB 2 ml 10 ml Plasmid x µl (1-2 µg) in 100 µl Opti-MEM x µl (5-20 µg) in 600 µl Opti-MEM PEI 100 µl 600 µl PEI/Plasmid Mischung 200 µl 1200 µl

4.12. Lichtmikroskopie

4.12.1. Fixierung und indirekte Immunfluoreszenzmarkierung von Zellen Für verschiedene Versuchsansätze wurden die Zellen in 24-, 6-well oder 10 cm Schalen, in welche sterile Deckgläschen vorgelegt waren, in Normalmedium ausgesät. Je nach Fragestellung wurden die Zellen 1-5 Tage unter Normal- bzw. Hungermedium (4.11.2) gesetzt und dann folgendermaßen fixiert und fluoreszenzmarkiert. Von mir wurde standardmäßig die Methode der Methanolfixierung durchgeführt (Tab. 3). Für Testfärbungen der CRISPR/Cas9 Transfektionseffizienz wurde in Kooperation mit dem Lehrstuhl für Tierphysiologie von PD Dr. rer. nat habil. Andreas Gießl und Beata Schmidt PFA-Fixierungen nach deren Standardprotokoll durchgeführt (13.18). Die primären und sekundären Antikörper Verdünnungen sind antikörperspezifisch unter 13.20.8 aufgelistet.

Tab. 3 Versuchsprotokoll für Antikörperfärbung (Methanolfixierung)

Vorgehen Volumen Zeit Medium vom 24-/6-well Platte bzw. 1-10 ml - 10 cm Schale abziehen Deckgläschen für nächste Schritte in 24-well - - Platte überführen 1x Waschen 1x PBS (auf Eis) 500 µl 5 Min. Fixierung Methanol (+EGTA) bei -20 °C 250 µl 10 Min. Lufttrocknen (RT) - 20-30 Min. 34

Methoden

Vorgehen Volumen Zeit - Hier wäre Lagerungsschritt bei 4 °C Deckgläschen in feuchte Kammer legen (RT) möglich bei späterer Weiterverarbeitung 2x Waschen 1x PBS (RT) 150 µl 5 Min. Tween 20 (0,01 %) in 1x PBS (RT) 100 µl 10 Min. 2x Waschen 1x PBS (RT) 150 µl 5 Min. Blockieren in Blockierungslösung (RT) 150 µl 45-60 Min. Primärer Antikörper in Blockierungslösung 50-100 µl Über Nacht (4 °C) 3x Waschen 1x PBS (RT) 150 µl 5 Min. Sekundärer Antikörper in Blockierungs- 50-100 µl 1-2 Std. lösung mit DAPI 1:50000 (dunkel, RT) 3x Waschen 1x PBS (RT) 150 µl 5 Min. Spülen mit ddH2O 150 µl Eindecken mit Aqua-Polymount 1 Tropfen

4.12.2. Dreifachfärbung von Zellen mittels Zenon Labeling Technologie Durch die Zenon Labeling (Invitrogen) Technologie werden zunächst Primärantikörper und Fluoreszenz-markierte Zenon Fragmente nicht-kovalent miteinander verbunden und dann zur Inkubation auf das Präparat gegeben. Dadurch ist es möglich drei Primärantikörper zu verwenden, wobei zwei in der gleichen Spezies (hier: Maus) generiert werden können. Für die Dreifachfärbung wurde polyglutamyliertes Tubulin GT335 (AG-20B-0020-C100, Maus, AdipoGen), DYNC2LI1 (sc-376645, Maus, Santa Cruz) und NEK1-H3T1 (Kaninchen, selber hergestellt 4.16) verwendet. Das Vorgehen entspricht den unter 4.12.1 beschriebenen Schritten bis zur Sekundärantikörper Färbung. Danach wurden die Deckgläschen 5x mit PBST (PBS mit 0,3 % Triton-X 100) je 5 Min. gewaschen. Während dieser letzten beiden Waschschritte wurde pro Deckgläschen 92,5 µl PBST + 2,5 µl des 3.Primärantikörpers (welcher noch nicht wie die anderen beiden Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert wurde) mit 2,5 µl Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 (Invitrogen) gemischt und 5 Min. bei RT inkubiert. Danach wurde 2,5 µl Zenon blocking reagent (Invitrogen) hinzugefügt und weitere 5 Min. bei RT inkubiert. 100 µl dieser Lösung verblieben dann 1-1,5 Stunden bei RT auf den Deckgläschen, bevor wieder 5x 5 Min. mit PBST gewaschen wurde und dann mit ProLong Gold Antifade Mountant (Life Technologies) eingedeckt wurde.

4.12.3. Fluoreszenzmikroskopische Analyse Die Analyse der Präparate erfolgte mit dem Fluoreszenzmikroskop AxioImager Z2 mit Apotom- Funktion (Zeiss). Es wurden jeweils mehrere übereinanderliegende Ebenen, sogenannte Stacks, aufgenommen. Zur besseren Darstellung wurden mit dem Programm AxioVision Rel. 4.8

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Methoden

(Zeiss) mehrere aufeinander folgende Ebenen ausgewählt und in eine Ebene projiziert (erweiterte Tiefenschärfe). Kontrast und Helligkeit der digitalen Bilder wurden mit Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems) oder ImageJ 1.45 [110] optimiert und die Abbildungen in CorelDRAW X7 (Corel Corporation) arrangiert. Für die 3D-Darstellung der primären Cilien und die Lokalisation von Kandidatenproteinen wurden in Kooperation mit PD Dr. rer. nat. habil. Andreas Gießl (Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen) Bilder mit dem Laser Scanning Microscope 710 (Zeiss) und der ZEN 2010 Software aufgenommen und mit der Imaris 7.7 Software (Bitplane Scientific) weiterbearbeitet. Die Auszählung der Cilien und die Vermessung der Cilienlänge (in Triplikaten) erfolgte anhand von Fluoreszenzaufnahmen mit 63- bzw. 100-facher Objektiv- Vergrößerung mit Hilfe der Bildbearbeitungsprogramme ImageJ 1.45 und FIJI [111].

4.13. CRISPR/Cas9

Das CRISPR System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ist ein adaptives Immunsystem bei Prokaryoten, welches zum Schutz gegen fremde Nukleinsäuren - wie Viren und Plasmide - dient [112]. Die CRISPR Loci bestehen aus mehreren aufeinanderfolgenden kurzen Sequenzwiederholungen (Repeats), die durch exogene DNA Segmente (Spacer) unterbrochen werden. Die Spacer stammen von Viren und Plasmiden, die den betreffenden Prokaryoten infiziert haben. Ein weiteres wichtiges Element des CRISPR Locus ist eine AT-reiche Leader-Sequenz, welche upstream der Repeat-Spacer-Sequenzen liegt und als Promotor für die Transkription einer Vorläufer-CRISPR-RNA (prä-crRNA) dient. Diese prä-crRNA wird weiter prozessiert, um kleine crRNAs zu generieren, welche die Zielsequenz erkennen (Protospacer), und dann durch Cas-Proteine geschnitten werden. Essentiell für ein effektives Schneiden ist ein Sequenzmotiv downstream am 3’-Ende der Zielregion, die sogenannte PAM-Sequenz (Protospacer Adjacent Motif) [113]. Diesen prokaryotischen Abwehrmechanismus macht man sich seit wenigen Jahren in den Laboren als sogenannte Genomeditierung (genome editing) zu Nutze. Im Jahr 2013 wurde die Nutzung dieses präzisen und effektiven Systems erstmals an humanen und murinen Zellen veröffentlicht [114] und verdeutlichte den Nutzen dieses Systems für zukünftige Forschungsprojekte in vielen Fachbereichen. Das genome editing involviert die Nutzung von Nukleasen und small guide RNAs (sgRNA) in Verbindung mit endogenen Reparaturmechanismen, um DNA-Sequenzen zu inserieren, deletieren oder Mutationen an spezifische Stellen in der genomischen DNA einzubauen [115].

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Methoden

Hierbei induzieren die Nukleasen einen Doppelstrangbruch (DSB), welcher durch die Reparaturmechanismen NHEJ (Non Homologous End Joining) oder HDR (Homology Directed Repair) repariert wird [116]. Im fehleranfälligen NHEJ Signalweg werden die Enden des Doppelstrangbruchs durch einen DNA-Reparaturkomplex wieder verbunden, wodurch zufällige Indel-Mutationen in der kodierenen Region eines Genes entstehen können, die durch einen Frameshift zu einem vorzeitigen Stopcodon und damit zum Knockout des Gens führen (Abb. 5). Alternativ kann für die Reparatur ein Template in Form eines Plasmides oder ssODN (single-stranded Oligo Deoxy Nucleotides) hinzugefügt werden, um über den HDR Signalweg eine sehr genaue und präzise Editierung im Genom zu ermöglichen. Somit kann im Bereich der Humangenetik das CRISPR/Cas9 System angewendet werden, um z. B. pathogene Mutationen in Zellkultur zu untersuchen, wenn kein Zellmaterial von Patienten zur Verfügung steht.

Abb. 5 Mechanismus der CRISPR/Cas9 vermittelten Genomeditierung Zunächst wird durch den CRISPR-Komplex ein Doppelstrangbruch eingeführt, welcher zwei verschiedene Reparaturmechanismen aktiviert. Beim Non Homologous End Joining (NHEJ) Mechanismus kommt es zu zufälligen Indel-Mutationen beim Zusammenfügen des Doppelstrangbruches. Der Homology Directed Repair (HDR) Mechanismus kann durch eingeführte Templates (blau) beeinflusst werden, sodass die gewünschte Sequenz eingebracht wird (verändert nach [116]).

4.13.1. CRISPR/Cas9 Vektordesign und Transfektion in HEK293T Zur Untersuchung von loss of function Mutationen in NEK1 wurde ein CRISPR-Vektor (U6-gRNA/EF1a-puro-2A-Cas9-2A-GFP) von Sigma Aldrich bezogen, welcher Exon 24 (NM_012224.2) als Zielbereich von NEK1 abdeckt (GGTCAACTTGTGATTCCTCTGG). Von der Firma wurde bei der Generierung des Target-Bereichs darauf geachtet, dass alle fünf bis jetzt bekannten Isoformen abgedeckt sind und off-target Effekte möglichst minimiert werden. Der CRISPR Target-Bereich liegt C-terminal zum NEK1-H3T1 Antikörperepitop (Exon 20-24).

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Methoden

Die CRISPR-Plasmide wurden in Sure-Bakterien transformiert und Plasmid-DNA in ausreichender Menge mittels Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben isoliert (4.2.5). Zur Optimierung der effizientesten Plasmidmenge wurden HEK293T Zellen mittels PEI (Polyethylenimin) transfiziert (4.11.6) und nach PFA-Fixierung die Transfektionsrate über die Anzahl an GFP-positiven Zellen am Mikroskop (Axio Imager Z2, Zeiss) bestimmt. HEK293T Zellen wurden in 10 cm Schalen bei ca. 50-60 % Konfluenz mit 12 µg NEK1-CRISPR-Plasmid transfiziert, parallel wurde ein Ansatz mit 12 µg eines Non Target CRISPR-Vektors mitgeführt.

4.13.2. Fluorescence activated cell sorting (FACS) und Zellernte Nach 3 Tagen Inkubationszeit im Brutschrank wurden die GFP-positiven Zellen mittels FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) selektiert und in 96-well Platten vereinzelt (Heike Danzer, Lehrstuhl für Genetik Erlangen, BD FACS AriaIII, Software BD FACS Diva 6.0). Alle verbliebenen GFP-positiven Zellen wurden in ein 15 ml Falkon sortiert, abzentrifugiert und das Zellpellet für einen späteren T7E1 Mismatch Assay (4.13.3) bei -20 °C weggefroren. Nach der Sortierung wurden die 96-well Platten bei 37 °C im Brutschrank inkubiert, regelmäßig alle 2 bis 3 Tage unter dem Mikroskop durchgerastert und die Zellklone schrittweise auf 24-well und 6-well Platten überführt. Pro Zellklon wurden zwei 6-well Duplikate generiert, eines davon wurde für weitere Experimente und Kryostocks (4.11.4) in 10 cm Schalen überführt, vom zweiten wurde genomische DNA (4.2.2) isoliert.

4.13.3. T7E1 Mismatch Assay Um die Effizienz des CRISPR/Cas9 vermittelten genome editings zu überprüfen, wurden alle verbliebenen GFP-positiven Zellen mittels FACS sortiert (4.13.2) und aus dieser Zellmischung genomische DNA isoliert (4.2.2). Diese wurde als Template in eine PCR eingesetzt, bei der die Primer den CRISPR-Bereich flankieren. Die Primer für die Amplifikation durften nicht so gewählt werden, dass der CRISPR-Bereich genau in der Mitte des Fragments liegt. Denn dadurch würden beim T7E1 Mismatch Assay zwei gleich große Fragmente entstehen, die nur als eine Bande auf dem Gel sichtbar wären. Liegt die Mutation weit genug entfernt von der Mitte der amplifizierten Sequenz, so entstehen durch den Schnitt der T7 Endonuclease 1 (New England Biolabs) zusätzlich zur Wildtyp-Bande zwei verschieden große Fragmente, die anschließend im Gel auch detektierbar sind (Abb. 6).

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Methoden

Abb. 6 Schematische Darstellung des T7E1 Mismatch Assays Nach einer PCR vom CRISPR Target Bereich (rot) und anschließender Denaturierung können sich im Annealing Schritt zwei Wildtyp DNA-Stränge, zwei mutierte DNA-Stränge oder jeweils ein Wildtyp und ein mutierter Strang aneinanderlagern. Das Enzym T7E1 verdaut nur Heteroduplizes, welche als drei Banden im Gel sichtbar sind (verändert nach Anleitung des EnGen Mutation Detection Kits, New England Biolabs).

Die PCR-Produkte werden Hitze-denaturiert und langsam abgekühlt, sodass Wildtyp und mutierte Einzelstränge sog. Heteroduplizes ausbilden. Im anschließenden enzymatischen Verdau mit T7 Endonuclease 1 werden dabei ausschließlich Heteroduplizes geschnitten. Der Anteil geschnittener DNA ist somit proportional zur Effizienz des genome editings. Die PCR wurde mit Primern für NEK1 (Exon 23-24 überspannend) nach dem Standardprotokoll (4.5.1) angesetzt. 10 µl dieses Ansatzes wurden mit folgendem Programm denaturiert und langsam annealt. PCR-Programm mismatchT7

Temperatur Zeit Zyklenzahl 95 °C 10 Min. 1x 95-85 °C -2 °C/ Zyklus 1 s 5x 85-25 °C -0,1 °C/ Zyklus 1 s 600x 4 °C ∞ 1x

Anschließend wurden 10 µl dieses Produktes mit 1 µl 10x T7E1 Puffer und 0,5 µl T7 Endonuklease 1 versetzt und 20 Min. bei 37 °C inkubiert. Die Auftrennung der durch den Schnitt der Endonuklease entstandenen Fragmente erfolgte mittels Gelelektrophorese.

4.13.4. Identifizierung von Mutationen in CRISPR-Zellklonen Von den genomischen DNAs der verschiedenen CRISPR-Zellklone wurde eine PCR mit Primern für NEK1 Exon 23-24 überspannend nach Standardprotokoll durchgeführt und anschließend sequenziert. Eine Auswertung der Sequenzen erfolgte mit Mutation Surveyor Version 4.0.8 (Softgenetics), Chromas Version 2.23 (Technelysium) und SeqManII 5.03 (DNA Star Inc.). Die Zellklone, die aufgrund des CRISPR/Cas9 vermittelten genome editing eine Mutation aufwiesen, wurden in 10 cm Schalen weiter kultiviert. Ein Teil der Zellen wurde als

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Methoden

Kryostock weggefroren (4.11.4) und mit den verbliebenen Zellen weitere Experimente wie Immunfluoreszenz (4.12), Western Blot (4.15) und RNA-Sequenzierung (4.20.3) durchgeführt.

4.13.5. Überblick über den Ablauf zur Generierung von CRISPR-Zellklonen Zusammenfassend im Kurzüberblick benötigt es 5 Schritte, um mit der CRISPR/Cas9 Methode erfolgreich Mutationen im gewünschten Gen in einer Zelllinie einbringen zu können (Abb. 7): Transfektion mit CRISPR-Vektor (1), FACS Sortierung von GFP+ Zellen (2), Zellernte und DNA-Isolation (3), PCR, T7E1 Mismatch und Sequenzierung (4), Testung positiver CRISPR- Klone in z. B. Immunfluoreszenz und Western Blot (5).

Abb. 7 Schematischer Arbeitsablauf der CRISPR/Cas9 Methode

4.14. Ko-Immunopräzipitation

Die Immunopräzipitation wird genutzt, um eine Interaktion zweier bekannter Proteine in vitro nachzuweisen. Dazu wird ein Proteingemisch mit einem gegen das gesuchte Protein gerichteten spezifischen Antikörper inkubiert. Dieser Komplex wiederum bindet an mit Protein A bzw. G gekoppelte beads und kann so präzipitiert werden. Auf diese Weise können Interaktionspartner des Zielproteins ko-präzipitiert werden. Die Ko-Immunopräzipitation wurde von mir am Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen durchgeführt. Da der Nachweis einer Interaktion mit intrinsischen NEK1 bzw. DYNC2LI1 Protein nicht möglich war, wurden 15 µg NEK1-pDEST/N-SF-TAP und 10 µg DYNC2LI1- pDEST27GST Plasmide in vier 10 cm Schalen HEK293T ko-transfiziert (4.11.6) und 3 Tage unter Normalmedium inkubiert. Für eine Bestätigung der Überexpression mittels qPCR (4.7) wurde aus einem Teil der Zellen RNA isoliert (4.2.4) und aus dem anderen Teil der Zellen Proteinlysat (4.15.1) mit Lysepuffer Ko-IP (13.20.3) hergestellt. Zur Quantifizierung der Gesamt-Proteinmenge wurde ein BCA-Assay (4.15.2) durchgeführt und 1700 µg Gesamt- Protein für die Ko-Immunopräzipitation eingesetzt. Für jeden Ansatz wurden 20 μl der sich in einem Storage Buffer befindenden Protein A Mag Sepharose Beads (GE Healthcare) in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß gegeben, in das magnetische Rack gestellt und der Puffer abgenommen. 40

Methoden

Danach folgten drei Waschschritte mit 500 μl 1x TBS. Das Proteinlysat wurde mit gleichem Volumen 1x TBS verdünnt und ca. 10 µg des Antikörpers [6 µl NEK1-H3T1 (Kaninchen, selber hergestellt 4.16), 15 µl DYNC2LI1 (15949-1-AP, Kaninchen, Acris) bzw. als Negativkontrolle 0,5 µl IgG from rabbit serum (I8140, Sigma-Aldrich)] dazu gegeben und über Nacht bei 4 °C unter langsamen Drehen inkubiert. Am Nächsten Tag wurden die Überstände weggefroren und die Beads folgendermaßen gewaschen: 1x 10 Min. mit Lysepuffer Ko-IP leicht schütteln lassen, 2x mit je 1 ml 1x TBS leicht schütteln, Überstande jeweils verwerfen. Die Beads wurden zum Schluss in 75 µl 2x Lämmli aufgenommen, 20 Min. bei 70 °C geschüttelt, anschließend 5 Min. bei 95 °C inkubiert und 15 µl des Präzipitats auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen und ein Western Blot (4.15) durchgeführt.

4.15. Western Blot Analyse

Die Western Blot Analyse ist eine spezifische Methode zum Proteinnachweis. Es vereinigt die Spezifität der Antikörpererkennung mit der hohen Trennschärfe der SDS-Gelelektrophorese. Die in SDS-Gelen aufgetrennten Proteine werden im Western Blot elektrophoretisch auf eine Trägermembran transferiert [117]. Dabei bleibt die Anordnung der Proteine nach dem Molekulargewicht erhalten, d. h. die transferierten Proteine stellen ein exaktes Replikat des Gels dar [118]. Die Identität der Proteine kann dann mittels Immunodetektion nachgewiesen werden. Alle Western Blot Analysen wurden von mir am Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen durchgeführt.

4.15.1. Herstellung Proteinlysat Für die Herstellung von Proteinextrakten aus Zellen wurden die Zellen in 10 cm Schalen mit 1x PBS gewaschen, abgeschabt und anschließend pelletiert (2000 rpm, 5 Min., 4 °C). Das Pellet wurde je nach Größe in 100-500 μl Lysepuffer mit Proteinaseinhibitor (Extraktionslysepuffer oder Lysepuffer [Ko-IP / CRISPR] 13.20.3) aufgenommen und für ca. 30 Min. auf Eis inkubiert. Die Lyse der Zellen erfolgte mittels Ultraschall in zwei Durchgängen (5 s, 5 Zyklen, 50 % & 5 s, 5 Zyklen, 30 %). Unlösliche Zellbestandteile wurden durch Zentrifugation (15 Min., 13000 rpm, 4 °C) entfernt und der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Bei der Lysatherstellung für die Ko-Immunopräzipitation (4.14) bzw. bei Verwendung von NEK1-CRISPR-Zellen wurde der Ultraschall-Schritt weggelassen (stattdessen 5x mit Syringe-Nadel auf- und abziehen), um eine mögliche schwache Interaktion

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Methoden von Proteinen durch die starken Scherkräfte nicht zu zerstören bzw. um die Degradation der full-length Proteine zu verhindern. Die Konzentration der Proteinextrakte wurde photometrisch mittels BCA Assay (4.15.2) bestimmt. Alle Schritte wurden auf Eis durchgeführt, um den Abbau der Proteine zu verhindern. Die Aufbewahrung der Proteinextrakte erfolgte bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C bzw. bei NEK1-CRISPR-Zellen wurden die Proteinextrakte immer frisch verwendet.

4.15.2. Konzentrationsbestimmung von Proteinen Für die Quantifizierung von Proteinkonzentrationen wurde der Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific) verwendet und gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Das Nachweisreagenz wurde mit 50 Volumen Pierce BCA Protein Assay Reagent A und 1 Volumen Pierce BCA Protein Assay Reagent B frisch angesetzt. Anschließend wurden 2 μl der Probe mit 48 μl 0,05 M HEPES-Puffer (13.20.3) versetzt sowie eine definierte Protein-Standardreihe mit bovinem Serumalbumin (BSA) in aufsteigender Konzentration angesetzt (0, 2, 4, 8, 16, 32 und 50 μg in je 50 μl 0,05 M HEPES-Puffer). Nach Zugabe von 1 ml Nachweisreagenz wurden die Ansätze 30 Min. bei 55 °C im Wärmeschrank inkubiert, danach ca. 15 Min. auf RT abgekühlt und die Proben direkt im Anschluss photometrisch bei 562 nm vermessen. Mit Hilfe der linearen Regression konnte basierend auf den Absorptionswerten der BSA-Standardreihe rechnerisch die Konzentration der Proteinproben ermittelt werden.

4.15.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Die Proteinlysate wurden auf Eis aufgetaut bzw. frisch verwendet und mit 2x Lämmli versetzt. Nach einer 5-minütigen Denaturierung bei 95 °C und anschließender Zentrifugation (1 Min., 13000 rpm) konnten die gewünschten Probenmengen auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen werden. Die Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel der selbstgegossenen SDS-Polyacrylamid-Gele, welche für die Auftrennung bei kleinen Proteinen verwendet wurden, ist nachfolgend aufgeführt. Zusammensetzung der verwendeten Trenn- und Sammelgele

Trenngel 10 % Trenngel 12 % Sammelgel 6 %

H2O 1,9 ml 1,6 ml 2,7 ml 4x Trenngelpuffer 1,3 ml 1,3 ml - 4x Sammelgelpuffer - - 0,5 ml 30 % Acrylamid Mix 1,7 ml 2,0 ml 0,67 ml 10 % SDS 50 µl 50 µl 40 µl 10 % APS 50 µl 50 µl 40 µl TMED 2 µl 2 µl 4 µl Gesamtvolumen 5 ml 5 ml 4 ml 42

Methoden

Für die Analyse von großen Proteinen wurden 3-8%ige Gradientengele (NuPAGE Novex Tris- Acetat, Invitrogen) verwendet. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 110 V für das Sammelgel und 180 V für das Trenngel in einer Elektrophoresekammer mit Laufpuffer (je nach Experiment Laufpuffer für „große Proteine“ bzw. „kleine Proteine“ (13.20.3)) und wurde beendet, sobald die Lauffront aus dem Gel herausgelaufen war. Die im SDS-Gel aufgetrennten Proteine wurden anschließend entweder mittels Western Blot auf eine PVDF-Membran übertragen (4.15.4) oder mit Coomassie-Brilliant-Blau (Roth) visualisiert. Dafür wurden die Gele zunächst 15 Min. in Coomassie-Brilliant-Blau inkubiert, anschließend wurde die überschüssige Farbe mit Entfärber-Lösung (13.20.3) ausgewaschen, wodurch die Proteinbanden im Gel sichtbar wurden. Sobald der gewünschte Entfärbegrad erreicht war, wurde das Gel in 7,5 % Essigsäure überführt und die Banden im ChemiDoc Geldokumentationssystem (Bio-Rad) mit Hilfe des Computerprogramms Image Lab 4.0 (Bio- Rad) dokumentiert.

4.15.4. Western Blot Transfer und Analyse Zunächst wurde die PVDF-Membran (GE Healthcare) 15-20 s mit 100 % Methanol benetzt, um sie zu aktivieren. Anschließend wurden die Blotmembran und das SDS-Polyacrylamid-Gel 15 Min. auf einem Schüttler in Transferpuffer inkubiert. Der Proteintransfer wurde mit dem Tank-Blot-System (Bio-Rad) in Transferpuffer „große Proteine“ (13.20.3) im Kühlraum bei 200 mA für 3-4 Stunden durchgeführt. Der Transfer von kleinen Proteinen wurde mit Hilfe des Semidry-Blot-Systems von Bio-Rad (15 V, 60 Min.) und dem Transferpuffer „kleine Proteine“ (13.20.3) durchgeführt. Die Membran wurde direkt nach dem Transferprozess für 60 Min. in Blockierungslösung (13.20.3) überführt, um alle freien Bindestellen abzusättigen. Anschließend wurde die Membran mit einer Verdünnung aus primärem Antikörper und Blockierungslösung über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Membran dreimal mit 1x TBST gewaschen (einmal kurz, zweimal für 10 Min.). Danach wurde die Membran mit einer 1:10000 Verdünnung sekundärer, HRP-gekoppelter Antikörper für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur geschwenkt. Abschließend wurde die Membran mit 1x TBST zweimal gewaschen (einmal kurz, einmal 10 Min.) und mit 1x TBS zweimal für 5 Min. gewaschen. Die Membran wurde mit ca. 1 ml Luminata Forte Western HRP Substrate (Millipore) versetzt und nach 5 Min. die Chemilumineszenz mit dem ChemiDoc Geldokumentationssystem (Bio-Rad) detektiert. Die Aufnahmen wurden mit Photoshop CS5 (Adobe Systems) bezüglich Helligkeit und Kontrast bearbeitet und die Abbildungen in CorelDRAW X7 (Corel Corporation) arrangiert. 43

Methoden

4.16. Herstellung eines polyklonalen Antikörpers gegen NEK1

Die Spezifität eines Antikörpers ist für biochemische Methoden (Western Blot, Immunfluoreszenz, Ko-Immunopräzipitation) in der Wissenschaft von enormer Bedeutung. Da in Vorarbeiten der käuflich erwerbbare NEK1 Antikörper (AP15020PU-N, Kaninchen, Acris) keine spezifische Färbung in Immunfluoreszenzanalysen und keine spezifische Banden im Western Blot zeigte [119], wurde ein polyklonaler Antikörper gegen das humane NEK1 Protein selbst hergestellt. Dies erfolgte im Rahmen einer Kooperation mit dem Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen.

4.16.1. Auswahl des Epitopbereichs und Klonierung in pGEX-4T3 Der Epitopbereich, gegen den der polyklonale Antikörper gerichtet werden soll, bedarf einer sorgfältigen Prüfung. Es muss darauf geachtet werden, dass der Bereich ca. 400-600 bp bzw. 130-200 Aminosäuren umfasst und keine Schnittstellen für Thrombin (Leu Val Pro Arg | Gly Ser) aufweist. Für das gewünschte Protein werden die Ziel-Sequenz und dazugehörige Domänen (falls bekannt) mittels BLASTp compare protein sequence überprüft, sodass die Sequenz nur mit dem gewünschten Protein und dessen Isoformen übereinstimmt. Im Falle von NEK1 wurde eine 444 bp große Sequenz (1759–2202 bp NM_012224.2, kodierend für Aminosäuren 587-734 NP_036356.1 = H3 [humaner Epitopbereich 3]) ausgewählt, die in allen 5 bekannten NEK1 Isoformen vorhanden ist und nach der in verschiedenen Proteinen hochkonservierten Kinase-Domäne lokalisiert ist (Abb. 21). Diese Zielsequenz (H3) wurde mittels PCR aus dem hNEK1-pENTR221 Vektor (Invitrogen) amplifiziert, wobei der forward Primer eine Schnittstelle für BamHI und der reverse Primer eine Schnittstelle für XhoI und ein Stop-Triplett enthielt (Tab. 27). Das PCR-Produkt H3 wurde mittels QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt. Danach erfolgte ein Verdau des pGEX-4T3 Expressionsvektors (GE Healthcare) und des PCR-Produktes mit BamHI/XhoI über Nacht bei 37 °C mit folgendem Ansatz:

Ansatz Verdau mit BamHI/XhoI

PCR-Produkt H3 pGEX-4T3 (aufgereinigt) (1,2 µg/µl) Template 48 µl 4 µl 10x NEB 4 Puffer 7 µl 5 µl 10x BSA 7 µl 5 µl BamHI 1,5 µl 1,5 µl XhoI 1,5 µl 1,5 µl H2O 5 µl 33 µl Gesamt 70 µl 50 µl 44

Methoden

Nach dem Verdau wurden die Ansätze mittels Gelelektrophorese (4.3) aufgetrennt und die geschnittenen Banden mittels QIAquick Gel Extraktion Kit (Qiagen) (4.3.1) aus dem Gel extrahiert. Im Anschluss wurde das PCR-Produkt H3 in den pGEX-4T3 Vektor bei 14 °C über Nacht gemäß folgendem Ansatz ligiert.

Ligations-Ansatz Ansatz 1 Ansatz 2 pGEX-4T3 (BamHI/XhoI) 1 µl 1 µl PCR-Produkt H3 (BamHI/XhoI) 3 µl 6 µl

10x Ligationspuffer (Roche) 2 µl 2 µl T4 Ligase (Roche) 1 µl 1 µl H2O 13 µl 10 µl Gesamt 20 µl 20 µl

Der gesamte Ligationsansatz wurde in DH5α gemäß Standardprotokoll (4.10.3) transformiert und auf LB-Platten mit Ampicillin bei 37 °C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden Übernachtkulturen angeimpft, Plasmide (hNEK1-H3-pGEX-4T3) isoliert (4.2.5) und mittels Sanger-Sequenzierung (4.8) überprüft, ob das Insert in der richtigen Orientierung und im richtigen Leseraster im Vektor eingefügt wurde und die Wildtyp-Sequenz des gewünschten Epitopbereichs (H3) inseriert wurde. Von den positiven Bakterien-Klonen wurden Kryostocks (4.10.5) hergestellt und bei -80 °C gelagert.

4.16.2. Expression rekombinantes Protein und Aufreinigung im GST-System Für eine bessere Expression des rekombinanten Proteins wurde das Plasmid hNEK1-H3-pGEX-4T3 in BL21 Bakterien re-transformiert (4.10.3) und eine 5 ml Übernachtkultur in LB-Medium (+Amp.) angeimpft. Am nächsten Tag wurde diese Vorkultur in 4 Liter 2x YT-Medium (+Amp.) gegeben und bis zu einer OD600nm 0,6-0,8 bei 37 °C im Schüttler inkubiert. Danach wurde mit 20 ml IPTG (100 mM) induziert und die Bakterien weitere 5 Stunden wachsen gelassen. Anschließend wurde die Bakteriensuspension in 200 ml Gefäßen (15 Min., 4300 rpm, 4 °C) pelletiert. Die Pellets wurden über Nacht bei -80 °C eingefroren, um die Membranlyse zu erleichtern. Am nächsten Tag wurden die Pellets auf Eis aufgetaut, pro Pellet 5 ml Lysozym (10 mg/ml in 25 mM Tris-Puffer pH 8) hinzugefügt, durch mehrfaches Vortexen und auf- und abpipettieren gelöst und mit ca. 40 ml 1x PBS (PBS für GST-Systeme 13.20.3) auf ein Endvolumen von 50 ml aufgefüllt. Danach erfolgte eine 30-minütige Inkubation auf Eis auf einem Horizontalschüttler. Die Lyse der Zellen erfolgte mittels Ultraschall in mehreren Durchgängen (4x 5 s, 5 Zyklen, 40 % & 4x 5 s, 5 Zyklen, 70 %). Um eine zu starke Erwärmung

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Methoden des Lysats zu vermeiden, wurden die Proben nach jedem Zyklus auf Eis abgekühlt. Im Anschluss wurde das Lysat 20 Min. bei 14500 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in frische 50 ml Falkons überführt und auf Eis gestellt. Alle folgenden Schritte wurden im Kühlraum bei 4 °C durchgeführt. Die Aufreinigung der Überstände erfolgte an GST- Sepharose 4B Beads (GE Healthcare) über Kunststoff-Säulen mit Fritten (ca. 10-15 ml Volumen). Es wurden 10 ml 1x PBS in die Säule vorgelegt und 2,66 ml Sepharoselösung dazu pipettiert. Die Sepharose wurde mit 10 ml 1x PBS gewaschen und dann schrittweise das Lysat (ca. 180 ml klarer Überstand) auf die Säule gegeben, wobei der Durchlauf mit einer elektrischen Pumpe erleichtert wurde. Nach vollständiger Überführung des Lysats wurde mit 40 ml 1x PBS gewaschen (Waschschritte W1-6) und danach ein Thrombinverdau durchgeführt. Dazu wurden 100 µl Thrombinlösung (1U/µl) mit 1,9 ml 1x PBS verdünnt, auf die Säule gegeben und 3 Stunden bei 4 °C leicht geschüttelt. Das Eluat wurde in 2 ml Eppendorfgefäßen aufgefangen, die Sepharose mit 4-6 ml 1x PBS gewaschen und auch aufgefangen (Eluat E1-6). Mit den Eluaten wurde eine Proteinbestimmung (4.15.2) und SDS-Gelelektrophorese (4.15.3) durchgeführt. Bei erfolgreicher Expression des rekombinanten Proteins NEK-H3 wurde das Eluat für die Immunisierung von mehreren Kaninchen zum Pineda Antikörper-Service (Berlin) geschickt und die Seren von ausgewählten Kaninchen getestet (4.16.3 und 4.16.4).

4.16.3. Testung der Präimmunseren und Immunisierung von Kaninchen Der Erfolg der Immunantwort ist von Tier zu Tier unterschiedlich und somit müssen vor der Immunisierung mit dem rekombinanten NEK1-H3 Protein (4.16.2) Präimmunseren von 8 verschiedenen Kaninchen getestet werden. Diese Präimmunseren wurden von der Firma Pineda Antikörper-Service (Berlin) zugeschickt und von mir im Western Blot getestet. Dazu wurden ca. 40 µg Proteinlysate aus Zellen (4.15.1) und ca. 1 µg des rekombinanten NEK1 Proteins NEK1-H3 (ca. 17 kDa) mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend ein Western Blot gemäß Standardprotokoll (4.15) durchgeführt. Anstatt über Nacht die Primärantikörper in Blockierungslösung auf der Membran zu inkubieren, wurden die Präimmunseren 1:100 in Blockierungslösung verdünnt und bei 4 °C über Nacht geschwenkt. Die Visulisierung der Banden erfolgte im ChemiDoc Geldokumentationssystem (Bio-Rad). Die Tiere, mit deren Präimmunseren keine Banden auf der erwarteten NEK1 Größe (rekombinantes Protein 17 kDa, full-length NEK1 in Zelllysaten ca. 140 kDa) zu detektieren waren, wurden für die Immunisierung ausgewählt. Dazu wurde 1 ml rekombinantes Protein NEK1-H3 (2,5 mg/ ml) zur Firma Pineda Antikörper-Service (Berlin) geschickt, welche dann dieses Protein den Kaninchen (Tier 1 & 8) injizierten (1. Boost). 46

Methoden

4.16.4. Testung der Seren und Aufreinigung des Antikörpers via Hi-Trap Säulen Am 61. Tag der Immunisierung wurden die Seren von Kaninchen 1 & 8 erneut mittels Western Blot (4.15) getestet. Da die Immunantwort noch zu schwach war, wurde ein zweiter Boost mit rekombinanten NEK1-H3 Protein durchgeführt und nach insgesamt 90 Tagen der Immunisierung das Serum (ca. 75 ml) verschickt. Die Seren wurden aliquotiert und bei -80 °C gelagert. 5 ml Serum von NEK1-H3 Tier 1 wurden mittels HiTrap NHS-activated HP Columns (GE Healthcare) aufgereinigt. Zunächst musste das rekombinante NEK1-H3 Protein (5,5 µg/µl in 1x PBS) schrittweise in Kopplungspuffer aufgenommen werden. Dazu wurden 300 µl rekombinantes Protein mit 2 ml Kopplungspuffer gemischt, auf Amicon Ultra 10 K Säulen (Millipore) gegeben und bei 4 °C 7500 g für 6 Min. zentrifugiert. 400 µl des aufkonzentrierten Proteins wurden erneut mit 3 ml Kopplungspuffer gemischt und für 8 Min. unter obigen Bedingungen zentrifugiert. 400 µl des Konzentrats wurde dann wiederum mit 600 µl Kopplungspuffer gemischt, sodass ca. 1 mg Protein in 1 ml Kopplungspuffer (=Antigenlösung) vorliegen sollte, welches dann über die Hi-Trap Säulen aufgereinigt werden konnte. 1 ml 1 mM eiskalte HCl wurde auf die Hi-Trap Säule pipettiert, der Adapter aufgesetzt und die Säule mit 6 ml eiskalter 1 mM HCl gewaschen (2x 3 ml). Danach wurde 1 ml der Antigenlösung (NEK1-H3 in Kopplungspuffer) mit Spritze auf die Säule gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Säule 6x mit je 6 ml Puffer A bzw. Puffer B (abwechselnd, beginnend mit A) gewaschen, wobei die Laufgeschwindigkeit der Puffer ca. 1 Tropfen pro Sekunde betragen sollte. Im Anschluss wurde die Säule zuerst mit 6 ml 100 mM Glycin (pH 2,5), dann mit 6 ml 75 mM Tris HCl (pH 8) gewaschen, bevor 5 ml des Serums von Tier 1 (1:1 mit 150 mM Tris HCl pH 8 versetzt) auf die Säule gegeben wurde. Der Durchfluss wurde aufgefangen und nochmals auf die Säule gegeben. Anschließend erfolgten 10 Waschschritte der Säule mit je 1 ml 75 mM Tris HCl. Die Waschschritte wurden in Eppendorfgefäßen aufgefangen und die OD280nm (NanoDrop Protein IgG) vermessen. Es wurde so lange weitergewaschen bis der Wert unter 0,02 lag. Danach folgte die Elution gemäß folgenden Schritten: 10x 100 µl 1 M Tris HCl in Eppendorfgefäßen vorlegen, mehrmals 1 ml 100 mM Glycin (pH 2,5) durch die Säule lassen, in vorgelegtem Tris HCl auffangen und die OD280nm messen. Alle Eluate wurden direkt auf Eis gestellt, die Eluate mit einer OD über 0,1 vereinigt und in Aliquots bei -80 °C gelagert. Der mit dieser Methode aufgereinigte NEK1 Antikörper (NEK1-H3T1) konnte dann in Immunfluoreszenz (4.12.1), Western Blot (4.15) und Ko-Immunopräzipitation (4.14) verwendet werden.

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Methoden

4.17. Zusammenstellung einer Ciliengenliste

In den letzten Jahren ist die wissenschaftliche Untersuchung von primären Cilien immer mehr in den Fokus gerückt, weil dieses Organell eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Wirbeltieren und humanen genetischen Erkrankungen spielt. Eine wachsende Anzahl an Krankheitsbildern mit Beteiligung des Skelettsystems ist mit einer Dysfunktion des primären Ciliums oder des dazugehörenden Basalkörper-Komplexes assoziiert. Diese Gruppe von Erkrankungen, die Ciliopathien, wurden in vielen verschiedenen Studien untersucht und daraus erhaltene Daten haben verschiedene Cilien-assoziierte Gene identifiziert. Um schon bekannte Ciliengene und weitere neue ciliäre Kandidaten übersichtlich darzustellen, habe ich eine Ciliengenliste anhand verschiedener Datenbanken und Publikationen erstellt. Grundlage zur Erstellung waren folgende Cilien-spezifische Datenbanken:

1) Ciliome.com (http://www.sfu.ca/~leroux/ciliome_home.htm) 2) SYSCILIA (http://www.syscilia.org/goldstandard.shtml) 3) Cildb V3.0 (http://cildb.cgm.cnrs-gif.fr/)

Auf Ciliome.com kann nach verschiedenen Kriterien (z. B. Stichwörter, Studien, Spezies) gesucht werden, oder aber man bedient sich der auf der Homepage angegebenen Ciliengenliste, welche aber nur 147 Gene umfasst, da es sich dabei um eine der ersten Studien handelt [3], die eine übersichtliche Darstellung von Ciliengenen zeigen wollte. Das europäische Projekt „SYSCILIA“ hat sich zum Ziel gesetzt im systematischen biologischen Großansatz Cilienfunktionen näher zu charakterisieren und Defekte des Ciliums in humanen Erkrankungen aufzuzeigen. Im SYSCILIA Gold Standard SCGSv.1 [9] wurden nur Ciliengene mit humanen Orthologen aufgenommen, welcher eine Anzahl von 303 cilien- assoziierten Genen umfasst. Bei Cildb V3.0 wurden verschiedene Studien und Publikationen (aus verschiedenen Spezies) als Grundlage für die Vergebung eines Cilien-Evidenz Wertes herangezogen. Je höher dieser Wert ist, desto häufiger wurde in verschiedenen Organismen ein Nachweis für die ciliäre Beteiligung dieses Proteins angegeben. Man kann in dieser Datenbank nach einzelnen Genen suchen oder sich Listen erstellen lassen mit verschiedenen Filterkriterien (z. B. Stichwörter, Anzahl an Organismen mit Orthologen, Cilien-Evidenz). Von der Datenbank werden bei der Auswahl Homo sapiens Cilien-Evidenzen von 0 bis 27 angegeben. In meine Ciliengenliste habe ich die Ciliengene nach Cilien-Evidenz gefiltert, wobei beim Filterungschritt Cilien-Evidenz „10“, Ciliengene mit Evidenz 10 oder höher zusammengefasst werden, d. h. exemplarisch

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Methoden

DYNC2LI1 wird in meiner Liste mit Evidenz von ≥10 angegeben, wobei der eigentliche Evidenzwert 18 entspricht. Des Weiteren habe ich zur Erstellung der Ciliengenliste weitere 8 Übersichtsarbeiten [4, 5, 8, 54, 72, 120-122] herangezogen, wobei die Gene in meine Liste mitaufgenommen wurden, die in mindestens einer dieser Arbeiten gelistet waren. Außerdem erfolgten noch regelmäßig PubMed Recherchen (Suchbegriffe „ciliopathies“, „primary cilium“, „ciliary genes“), um die Genliste aufgrund neuer Cilien-spezifischer Publikationen zu aktualisieren, die folgende Kriterien erfüllen:

1) Neues humanes Krankheitsbild mit ciliärem Phänotypenspektrum und zugrunde liegender pathogener Mutation 2) Lokalisation am Cilium bzw. Basalkörperkomplex in verschiedenen Zelltypen 3) Mausphänotypen, die Überlappungen zum Ciliopathiespektrum im Menschen zeigen

Zum Schluss wurde noch ein Abgleich mit der HMGD Datenbank (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php) gemacht, um schon beschriebene Krankheitsbilder zu den jeweiligen Ciliengenen oder Kandidatengenen einzufügen. Diese Liste, die während des Projektzeitraumes 1032 cilien-assoziierte Gene enthielt (13.15, Tab. 20), konnte für verschieden Abfragen herangezogen werden, z. B. als Filterkriterien bei der Exom-Auswertung, als Kategorisierungshilfe von Y2H-Daten oder als Abgleich mit den bei der RNA-Sequenzierung erhaltenen differentiell exprimierten Genen.

4.18. Ranglistenerstellung von Kandidatengenen mit ENDEAVOUR

ENDEAVOUR ist eine Software für eine computergestützte Priorisierung von Kandidatengenen basierend auf vorgegebenen Training Genes. Zu einer Rangliste kommt man in drei Schritten: Zuerst werden Informationen zu den Training Genes von verschiedenen Datenbanken gesammelt, um Modelle zu generieren. Dies schließt funktionelle Annotationen, Protein- Protein-Interaktionen, regulatorische Informationen, Expressionsdaten, Daten aus der Literatur und weitere Kriterien mit ein. Im zweiten Schritt werden diese Modelle benutzt, um die Kandidatengene zu analysieren und diese anhand ihrer Scores in eine Rangliste einzuordnen. Zum Schluss werden die unterschiedlichen Rankings basierend auf den verschiedenen Modellen in eine globale Rangliste verrechnet. Vorgehen bei Y2H-Daten (NEK1 Teil 1-4 & full-length): Als erstes wurde in der ENDEAVOUR Software als Spezies mus musculus ausgewählt, da im Y2H-Screen eine murine retinale cDNA Library verwendet wurde. Als Training Genes wurden 49

Methoden die Gene aus der Ciliengenliste (13.15, Tab. 20) benutzt, da der Fokus des Screens auf ciliäre und Basalkörper-assoziierte Interaktionspartner von NEK1 gelegt wurde. Des Weiteren wurden alle von ENDEAVOUR zur Verfügung gestellten Datenquellen für die Berechnung von Modellen zur Erstellung einer Rangliste benutzt. Die im Y2H identifizierten Gene wurden als Kandidatengene eingefügt und die Priorisierung gestartet.

4.19. Hefe-2-Hybrid-System (Y2H)

Das Hefe-2-Hybrid-System (yeast two-hybrid system, Y2H) ist eine in vivo Methode zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen. Die Grundlage des ursprünglich für die Bäckerhefe S. cerevisiae entwickelten Systems basiert auf der Nutzung des Transkriptionsfaktors GAL4. Für die Transkription der für den Galaktose-Stoffwechsel benötigten Gene ist dieser GAL4 Transkriptionsfaktor verantwortlich und besteht aus zwei funktionell unabhängigen Domänen: einer transkriptionsaktivierenden Domäne (AD) und einer DNA Bindungsdomäne (DBD). Beide Domänen können physikalisch voneinander getrennt werden, ohne dass sie ihre jeweilige Funktion verlieren. Wenn diese in räumliche Nähe zueinander gebracht werden, können die einzelnen Domänen einen funktionsfähigen Transkriptionsfaktor bilden. Dies macht man sich im Hefe-2-Hybrid-Screen zu Nutze, um Protein-Protein-Interaktion nachzuweisen. Dafür werden zu untersuchende Proteine oder Teile davon - als Bait - mit der DBD des Transkriptionsfaktors fusioniert, wohingegen ein möglicher Interaktionspartner des Proteins - als Prey - in Form eines bekannten oder unbekannten Proteins aus einer cDNA-Bank in einen Expressionsvektor kloniert wird, der die AD-Domäne von GAL4 enthält. Die Bildung von Fusionsproteinen wird dadurch ermöglicht, dass die AD- bzw. BD-Vektoren anschließend parallel in Hefezellen transformiert werden. Interagiert nun ein Prey- mit einem Bait- Fusionsprotein, entsteht ein funktionsfähiger GAL4-Transkriptionsfaktor. Dieser kann mit der DBD-Domäne spezifisch an die vor dem Promotor liegende Upstream Activating Sequence (UAS) binden und mit Hilfe der AD-Domäne die RNA-Polymerase II rekrutieren (Abb. 8). Dies initiiert dann die Expression von Reportergenen und ermöglicht damit den Nachweis der Protein-Protein-Interaktion [123, 124]. Durch eine Deletion des GAL4-Gens in den verwendeten Hefestämmen ist eine endogene Transkriptionsaktivierung dabei ausgeschlossen. Alle im Folgenden beschriebenen Hefe-Experimente wurden in Zusammenarbeit mit Dr. rer. nat. Nathalie Falk (Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen) durchgeführt.

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Methoden

Abb. 8 Schematische Darstellung des Hefe-2-Hybrid-Systems Das zu untersuchende Protein X (Bait) wird mit der DNA Bindungsdomäne (DBD) des GAL4-Transkriptions- faktors fusioniert. Ein potentieller Interaktionspartner des Proteins Y (Prey) wird dagegen als Fusionsprotein mit der Aktivierungsdomäne (AD) des Transkriptionsfaktors exprimiert (A). Durch eine Interaktion der Proteine werden die Domänen in räumliche Nähe gebracht und bilden einen funktionsfähigen GAL4-Transkriptionsfaktor. DBD bindet an die Upstream Activating Sequence (UAS) und AD rekrutiert die RNA-Polymerase II, wodurch die Expression von Reportergenen initiiert (B) und der Nachweis der Protein-Protein-Interaktion ermöglicht wird (verändert nach [124]).

4.19.1. Die Hefestämme AH109 und Y187

Die Transkription spezifischer Hefe-Reportergene wird im Y2H-Screen dazu verwendet, positive Hefetransformanten zu selektionieren und die Interaktion zweier Proteine zu visualisieren. Die in dieser Arbeit verwendeten Hefestämme beinhalten dafür selektive Marker für Histidin (HIS3) sowie Adenin (ADE2), sodass eine Selektion auf entsprechenden Mangelmedien erfolgen kann. Die Visualisierung interagierender Proteine wird z. B. durch das MEL1-Reportergen ermöglicht, welches für das Enzym α-Galaktosidase kodiert. Dieses Enzym kann hydrolytisch X-α-Gal in einen blauen Farbstoff umwandeln und somit positive Hefeklone optisch sichtbar gemacht werden. Abb. 9 gibt einen Überblick über die in dieser Arbeit verwendeten Hefestämme AH109 und Y187 (Clontech). Die Bäckerhefe S. cerevisiae ist ein einzelliger Organismus, der sowohl in haploider als auch in diploider Form vorkommen kann. Diploide Zellen vermehren sich asexuell durch Abschnürung einer Tochterknospe (Sprossung). Haploide Zellen unterschiedlichen Paarungstyps können dagegen zu einer neuen diploiden Zelle verschmelzen - sog. Mating [125]. Bei S. cerevisiae unterscheidet man zwei verschiedene Paarungstypen (mating types), die als MAT a bzw. MAT α bezeichnet werden. In dieser Arbeit wurden die haploiden Hefestämme AH109 und Y187 mit den mating types MAT a sowie MAT α verwendet.

Abb. 9 Reportergenkonstrukte der Hefestämme AH109 und Y187 Die Hefestämme AH109 und Y187 enthalten Selektionsmarker für Histidin (HIS3) und Adenin (ADE2) sowie Gene für die Enzyme α-Galaktosidase (MEL1) und β-Galaktosidase (LacZ). Die Expression der Reportergene wird durch drei heterologe Promotoren reguliert, welche alle durch den Transkriptionsfaktor GAL4 erkannt werden (verändert nach MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries User Manual von Clontech). 51

Methoden

4.19.2. Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae Die Kultivierung der Hefestämme Y187 und AH109 erfolgte standardmäßig in YPDA- Medium. Eine Selektion der Hefen anhand ihrer Auxotrophien wurde durch SD-Medium, welches entsprechend den Selektionsbedingungen mit Dropout-Zusätzen (Clontech) supplementiert wurde, erreicht. Zur Herstellung von Flüssigkulturen wurde das Medium mit einer frischen Hefekolonie von einer Agarplatte bzw. direkt aus einer Hefe-Kryostock beimpft und in einem Kulturröhrchen oder Erlenmeyerkolben bei 180-200 rpm und 30 °C geschüttelt. Hefen auf festen Nährböden wurde das Wachstum für 2 bis 3 Tage in einem Wärmeschrank (30 °C) ermöglicht. Zur längerfristigen Aufbewahrung der Hefen wurden Kryostocks hergestellt, indem jeweils 500 μl frische Hefekultur, 300 µl Hefe-Einfriermedium (13.20.4) und 200 µl 25 % Glycerol gemischt wurde und bei -80 °C gelagert wurde.

4.19.3. Herstellung der Bait- und Prey-Konstrukte Für die in dieser Arbeit durchgeführten Hefe-Interaktionsstudien kamen unterschiedliche Bait- und Prey-Konstrukte zum Einsatz. Die Herstellung der Bait-Fusionsproteine erfolgte mit Hilfe des pBD-GAL4-Cam Vektors, welcher die DBD Domäne des GAL4-Transkriptionsfaktors sowie die kodierende Sequenz (full-length oder einzelne Teile) des zu untersuchenden Proteins beinhaltet. Zusätzlich verfügt der Vektor über einen Wachstumsselektionsmarker für die Aminosäure Tryptophan (TRP1) (Vektorkarte 13.20.9). Für die Herstellung der Prey- Fusionsproteine wurde der pAD-GAL4-2.1/DEST Vektor verwendet, welcher die AD-Domäne von GAL4 sowie die kodierende Sequenz (full-length oder einzelne Teile) eines potentiellen Interaktionspartners umfasst. Ferner besitzt der Vektor einen Wachstumsselektionsmarker für die Aminosäure Leucin (LEU2) (Vektorkarte 13.20.9). Nach erfolgreicher Transformation beider Vektoren in die Hefe können positive Klone aufgrund der unterschiedlichen Selektionsmarker auf Mangelmedium-Platten ohne Tryptophan (-Trp) und Leucin (-Leu) selektiert werden. Eine endogene Synthese der Aminosäuren ist ausgeschlossen, da die verwendeten Hefestämme AH109 und Y187 auxotroph für Tryptophan und Leucin sind. Im Rahmen eines Y2H-Screens sollten ciliäre Interaktionspartner des NEK1 Proteins identifiziert werden. Dafür wurden full-length NEK1 und spezifische Domänen (Teil 1-4) des NEK1-Proteins in den pBD-GAL4-Cam/DEST Expressionsvektor kloniert (4.10.2). Als Prey-Konstrukt diente eine selbst hergestellte cDNA-Bank aus der Retina der Maus (in pGADT7-Rec Vektor), welche Dr. rer. nat. Nathalie Falk in ihrer Masterarbeit am Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen mit dem Make Your Own “Mate & Plate” Library Kit (Clontech) hergestellt und schon erfolgreich publiziert hat [126, 127]. 52

Methoden

Zur Bestätigung einer durch den Y2H-Screen identifizierten Interaktion wurde ein 1on1 Hefe-2- Hybrid Assay durchgeführt. Dafür wurden full-length NEK1 und NEK1-Domänen (Teil 1-4) in den pAD-GAL4-2.1/DEST Vektor umkloniert, wohingegen der potentielle Interaktionspartner DYNC2LI1 full-length in den pBD-GAL4-Cam/DEST Vektor eingebracht wurde. Für die Herstellung der Hefe-Expressionsvektoren wurden die jeweiligen DNA-Fragmente mittels PCR amplifiziert (4.5.1), anschließend in einen Eingangsvektor ligiert (4.10.1) und zuletzt mittels LR-clonase Reaktion in die pAD- bzw. pBD-Zielvektoren kloniert (4.10.2).

4.19.4. Transformation von Hefezellen Bevor die Bait- und Prey-Konstrukte in die Hefezellen transformiert und in diesen exprimiert werden konnten, mussten die Zellen zunächst kompetent gemacht werden. Die Herstellung und Transformation kompetenter Hefen wurde mit Hilfe der Lithiumacetat (LiAc) Methode gemäß Herstellerangaben (Yeastmaker Yeast Transformation System 2 Kit, Clontech) durchgeführt. Zu Beginn wurden 100 ml YPDA-Medium mit 50 μl der zu transformierenden Hefe aus einem Kryostock angeimpft und die Kultur in einem 250 ml Erlenmeyerkolben über Nacht

(30 °C, 180 rpm) geschüttelt. Bei einer OD600nm von 0,15-0,3 wurde die Kultur für 5 Min. und 1500 g abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 100 ml YPDA-Medium aufgenommen. Anschließend wurde die Hefe erneut bis zu einer OD600nm von 0,4-0,5 auf dem Schüttler für 3 bis 5 Stunden unter obigen Bedingungen vermehrt. Sobald die Hefekultur einen entsprechenden OD-Wert erreicht hatte, wurde diese für 3 Min. bei 1500 g zentrifugiert, der Überstand daraufhin verworfen und die pelletierten Zellen mit 30 ml sterilem Wasser gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation (3 Min., 1500 g) wurden die Hefezellen in ein neues Reaktionsgefäß überführt, erneut zentrifugiert (1 Min., 1500 g) und in 1,5 ml 1x TE/LiAc- Puffer gelöst. Am Schluss wurden die kompetenten Hefen für 15 s bei 8000 g sedimentiert und in 600 μl 1x TE/LiAc-Puffer aufgenommen. Alle Reaktionsschritte erfolgten bei RT.

Vor der Transformation der kompetenten Ansatz Hefe Transformation Hefen wurde folgender Ansatz auf Eis Plasmid-DNA (pAD bzw. pBD) 1 µg Yeastmaker Carrier-DNA 5 µl pipettiert, wobei die Lachssperma Carrier- Kompetente Hefezellen (in TE/LiAc) 50 µl DNA (Yeastmaker) zuvor für 5 Min. bei PEG/LiAc-Puffer 500 µl Gesamt ca. 560 µl 98 °C denaturiert wurde.

Die Transformationsansätze wurden gut gemischt und 30 Min. bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurden pro Reaktion 20 μl DMSO hinzugefügt und nach einem Hitzeschock für 15 Min. bei 42 °C im Wasserbad wurde die Hefekultur 30 s bei 8000 g sedimentiert, der 53

Methoden

Überstand verworfen und das Hefepellet in 1 ml YPD Plus Medium resuspendiert. Nach 60- minütiger Inkubation (30 °C, 550 rpm) wurden die Zellen zentrifugiert (30 s, 1500 rpm) und in 1 ml 0,9 % NaCl aufgenommen. Die Hefen wurden daraufhin erneut durch Zentrifugation pelletiert (30 s, 1500 g), der Überstand größtenteils verworfen und die Hefezellen im verbleibenden Rest resuspendiert. Zum Schluss wurden die Ansätze vollständig auf SD/-Leu bzw. SD/-Trp Agarplatten ausplattiert und bis zu 3 Tage bei 30 °C im Wärmeschrank inkubiert.

4.19.5. Hefe-2-Hybrid-Screen Der Y2H-Screen zur Identifikation neuer Interaktionspartner des NEK1 Proteins wurde gemäß Herstellerangaben (Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manuals von Clontech) durchgeführt. Am Anfang wurden 50 ml SD/-Trp mit 160 μl des mit dem Plasmid pBD-GAL4-Cam transformierten Hefestammes AH109 (Insert: NEK1 full-length bzw. Teil 1-4) aus einem Kryostock angeimpft und die Hefekultur in einem 250 ml Erlenmeyer- kolben über Nacht (30 °C, 155 rpm) angezogen. Bei Erreichen einer OD600nm von 0,8-1,0 wurde die Hefekultur für 4 Min. bei 1500 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 5 ml SD/-Trp Medium aufgenommen. Danach wurde 1 ml der murinen Retina cDNA-Bank (Library von Dr. rer. nat. Nathalie Falk in Y187 Hefestamm [127]) bei RT aufgetaut und beide Hefestämme in 45 ml YPDA-Medium zusammenpipettiert. Das mating der Hefezellen erfolgte für 20-24 Stunden unter langsamen Schütteln (30 °C, 100 rpm). Nach Ablauf dieser Zeit sollten ausreichend Zygoten unter dem Mikroskop zu erkennen sein (sog. „Mickey Mouse“ Struktur) (Abb. 10). Am darauffolgenden Tag wurde die Hefesuspension zentrifugiert (8 Min., 1500 g), der Überstand verworfen und das Zellpellet in 20 ml YPDA-Medium resuspendiert.

Abb. 10 Schematische Darstellung eines Hefe-2-Hybrid-Screens mit NEK1 Die Bait Konstrukte NEK1 Teil 1-4 & full-length werden mit den Prey Konstrukten der murinen retinalen cDNA Bank vereint und durch mating der Hefen entstehen diploide Zellen (Mickey Mouse). Die diploiden Hefen sind aufgrund der Reportergenaktivierung infolge einer Interaktion von Bait und Prey in der Lage mittels Auxotrophie- Komplementierung auf SD/-LTHA Mangelmedium zu wachsen. Die in den Prey Konstrukten enthaltenen cDNAs werden mittels Hefe-PCR amplifiziert, sequenziert und abschließend positive Klone mit Datenbankrecherchen ermittelt. (Auxotrophie Komplementierung verändert nach [124]).

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Methoden

Abschließend wurden je 300 μl Hefezellen auf ca. 70-80 SD-Agarplatten ohne Leucin, Tryptophan, Histidin und Adenin (-LTHA) ausplattiert und bis zu 18 Tage bei 30 °C im Wärmeschrank inkubiert. Die einzelnen Hefekolonien wurden auf neue SD/-LTHA Platten im Raster ausgestrichen und weitere 1-2 Tage bei 30 °C inkubiert (Abb. 10). Zur dauerhaften Aufbewahrung wurden die Hefen zusätzlich in 2,5 ml SD/-LTHA Medium für 2-3 Tage vermehrt (30 °C, 180 rpm), um sie anschließend als Kryostocks (4.19.2) bei -80 °C zu lagern.

4.19.6. Analyse der positiven Hefeklone Zur Verifizierung der positiven Klone wurden diese vom Raster der SD/-LTHA Platten mit einer Pipettenspitze abgenommen und als Template in eine Hefe-PCR (4.5.3) eingesetzt. Dadurch konnten die in den Prey-Plasmiden enthaltenen cDNAs amplifiziert und die potentiellen Interaktionspartner durch Sequenzierung (4.8) sowie Datenbankrecherche (4.19.7) ermittelt werden.

4.19.7. Datenbankanalyse Zur Identifizierung der cDNA-Inserts, die in den Hefe-Plasmiden enthalten sind, wurden die Sequenzen sowohl auf Nukleinsäure- als auch auf Proteinebene mittels verschiedener Datenbanken analysiert. Für die Sequenzanalyse auf Nukleotid-Ebene wurden die Datenbanken Mouse BLAT Search und NCBI mus musculus BLASTn verwendet. Dabei muss darauf geachtet werden, dass der Sequenzabschnitt TGGCCATTATGG des Hefevektors vorhanden ist, somit sind beide TGG in-frame und die nachfolgende Sequenz entspricht dem cDNA Insert +1 im Leserahmen. Für den Proteinsequenzvergleich kamen die Datenbanken NCBI mus musculus BLASTp, NCBI mus musculus BLASTx und Uniprot zur Anwendung (13.20.12). Die Alignments erfolgten an Maus-Datenbanken, da die für den Hefe-2-Hybrid-Screen verwendete cDNA library aus muriner Retina hergestellt wurde. Zum Schluss wurden die so erhaltenen Maus Gene bzw. Proteine auf Homologie im Menschen abgeglichen (www.flyrnai.org/cgi- bin/DRSC_orthologs.pl).

4.19.8. 1on1 Hefe-2-Hybrid Assay und α-Galaktosidase Test Um die im Y2H-Screen ermittelte Interaktion zwischen humanen NEK1 (full-length + vier Teile) und murinen Dync2li1 auch an humanen DYNC2LI1 Protein bestätigen zu können, wurde zunächst full-length DYNC2LI1 aus selbst hergestellter cDNA (4.6) aus humanen Kontroll-Fibroblasten mittels PCR amplifiziert, gemäß 4.19.3 kloniert und in kompetente Hefe

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Methoden transformiert (4.19.4). Danach wurde ein 1on1 Hefe-2-Hybrid Assay mit anschließendem α-Galaktosidase Test durchgeführt. Beim α-Galaktosidase Test nutzt man das Enzym, welches vom MEL1-Reportergen kodiert wird und infolge einer Proteininteraktion durch Aktivierung des GAL4-Transkriptionsfaktors exprimiert wird [128]. Das chromogene Substrat X-α-Gal (5- Brom-4-chlor-3-indolyl-α-D-Galaktopyranosid) wird dabei zu Galaktose und 5-Brom-4-chlor- indoxyl umgesetzt. Durch die spontane Oxidation von 5-Brom-4-chlor-indoxyl entsteht eine tiefblaue Färbung der positiven Y2H-Klone. Um die α-Galaktosidaseaktivität zu testen, wurden 2,5 ml YPDA-Medium mit 40 μl AH109 bzw. Y187 Hefen beimpft und diese für 2 Tage bei 200 rpm und 30 °C vermehrt. 2,5 μl AH109 Hefekultur wurden daraufhin auf eine YPDA-Platte getropft und 48 Stunden bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurden 2,5 μl Y187 Hefe-Kultur direkt auf die gewachsenen AH109 Hefen pipettiert und das mating zu diploiden Hefezellen bei 30 °C in einem Wärmeschrank ermöglicht. Nach 3-tägiger Inkubation wurden die Hefen auf eine X-α-Gal-haltige SD/-LTHA Platte überführt und die Blaufärbung der Klone innerhalb von 24 Stunden verfolgt. Für die Herstellung der X-α-Gal-haltigen Selektionsplatten wurden 25 mg X-α-Gal in 1 ml N,N- Dimethylformamid gelöst und jeweils 110 μl X-α-Gal Lösung pro SD/-LTHA Platte mit einem sterilen Spatel ausplattiert. Der 1on1 Hefe-2-Hybrid Assay kann herangezogen werden, um einzelne Interaktionspartner, welche im Y2H-Screen identifiziert wurden, zu bestätigen. Dieser Assay kann aber auch im Großdurchsatzverfahren durchgeführt werden. Beim 1on1 Großdurchsatz sind in 96-well Platten Hefeklone vorgelegt, welche mit Vektoren transfiziert wurden, die für schon bekannte Ciliengene kodieren (13.17, Tab. 22). Dies wurde von mir in einem wissenschaftlichen Kurzaufenthalt am Department of Human Genetics (Radboud University Medical Center, Nijmegen, Netherlands) unter Leitung von Prof. Dr. Ronald Roepman und Senior Research Technician Stef Letteboer durchgeführt.

4.20. Next Generation Sequencing Technologien

In den letzten Jahren wurden neue Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung entwickelt, die unter dem Begriff Next Generation Sequencing (NGS) zusammengefasst werden. Durch massive Parallelisierung der Sequenzierung können große Mengen von DNA oder RNA relativ zeit- und kostengünstig analysiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Exom- Sequenzierungen (4.20.1), Gen-Panel Sequenzierungen (4.20.2), sowie Transkriptomanalysen mittels RNA-Sequenzierung (4.20.3) durchgeführt. Die praktische Durchführung und bioinformatische Analysen der Rohdaten wurden von der Core Unit Ultra-Deep Sequencing unter Leitung von Dr. rer. nat. Arif Ekici durchgeführt. 56

Methoden

4.20.1. Exom-Sequenzierung Die Exom-Sequenzierung der Patienten P7 (56475) und P30 (148967) erfolgte auf einer SOLiD- Plattform (Life Technologies) nach Anreicherung mit einem SureSelect Target Enrichment System (Agilent) gemäß dem SureSelect Target Enrichment System for ABI SOLiD Fragment Protocol. Der allgemeine Arbeitsablauf wird nachfolgend kurz erläutert. Im ersten Schritt wurde die genomische DNA zunächst mit dem Covaris Ultrasonicator (Life Technologies) in 150-180 bp lange DNA-Fragmente geschert. Die nachfolgende Präparation der Library erfolgte automatisiert mit Hilfe des SPRIworks System III (Beckman Coulter). Nach der Library-Amplifikation erfolgte eine Anreicherung des Exoms mit dem Agilent SureSelect Target Enrichment System und dem SureSelect Human All Exon Kit V3/V5. Hierzu mussten die Proben zunächst mit den Anreicherungssonden für 24 Stunden bei 65 °C hybridisiert werden, bevor sie anschließend durch einen Pulldown über Streptavidin-beads angereichert wurden. Um mehrere Proben in einer Spur zusammenzuführen (poolen) und somit gemeinsam sequenzieren zu können, wurden den Proben DNA-Barcodes angefügt und in einer Emulsions-PCR wurde die Library nochmals amplifiziert. Danach erfolgte die eigentliche Sequenzierung mit 75 bp langen Fragment-reads (single end reads) auf einem SOLiD 5500 XL System (Life Technologies). Die primäre Datenanalyse erfolgte standardisiert in der Next Generation Sequencing Pipeline des Humangentischen Instituts. Im Durchschnitt können mehr als 100 Millionen reads pro sequenziertem Individuum generiert werden. Mit der SOLiD LifeScope software v2.5 konnten ca. 160 Millionen reads auf das humane Referenzgenom (hg19) gemappt werden. Die durchschnittliche Abdeckung lag bei über 80x und über 70 % der Target-Sequenz waren mindestens zehnfach abgedeckt. Eine Tabelle mit den Coverage-Daten für die einzelnen Proben befindet sich im Anhang (13.19, Tab. 24). Das Erkennen der Varianten (calling) erfolgte mit hoher Stringenz mit GATK2 und SAMtools [129-131]. Variantenannotationen wurden mittels ANNOVAR [132] generiert. Zur weiteren Priorisierung der Varianten wurden bei Aminosäureaustauschen die Vorhersageprogramme SIFT, PolyPhen2 und MutationTaster verwendet [133-135]. Die öffentlichen Datenbanken dbSNP [136], 1000 Genomes [137], Exome Variant Server (NHLBI GO Exome Sequencing Project (ESP)), sowie die hausinterne Exom-Variantendatenbank wurden genutzt, um Polymorphismen aus den Daten herauszufiltern. Die Abfragen der oben genannten Datenbanken erfolgten mit dem hauseigenen Programm NGS Variant Analyzer (PD Dr. med. Christian Thiel) für P7 von Melanie Fröhlich im Rahmen ihrer von mir mitbetreuten Masterarbeit und für P30 von M.Sc. Nadine Hauer in

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Methoden

Kooperation. Die grafische Darstellung der Sequenzen erfolgte mit dem Integrative Genomics Viewer (IGV) [138, 139]. Varianten wurden basierend auf einer autosomal rezessiven Vererbung der SRPS, der Allel-Frequenz in der Bevölkerung, der Lokalisierung innerhalb der kodierenden Sequenz (Exon, splice-site) und den funktionalen Effekt auf Proteinebene ausgewählt, mittels Sanger-Sequenzierung (4.8) validiert und die Segregation in der Familie überprüft.

4.20.2. Gen-Panel (TruSight One) Sequenzierung Anstelle von Exom-Sequenzierungen kann auch ein Gen-Panel auf der MiSeq Platform (Illumina) sequenziert werden. Beim TruSight One Sequencing Panel Kit (Illumina) sind die exonischen Genbereiche für über 4800 Gene mit bekannten klinischen Phänotypen hinterlegt. Dabei wurde im Vorhinein überprüft, ob unter diesen Genen auch bekannte SRPS Gene aufgeführt sind. Eine Abdeckung der SRPS-Gene DYNC2H1, EVC, EVC2, IFT43, IFT80, IFT122, IFT140, NEK1, TTC21B, WDR19 und WDR35 war hierbei gewährleistet. Dieses Panel wurde, da vom Patienten P23 keine DNA vorhanden war, nur bei den Eltern der Familie SRPS#22 verwendet. Die Durchführung der Gen-Panel Sequenzierung erfolgte gemäß Herstellerangaben, mit Hilfe der SeqNext Software (JSI Medicals Systems) wurden die Daten von Dr. rer. nat. Cornelia Kraus ausgewertet. Die identifizierten Varianten wurden mittels Sanger-Sequenzierung (4.8) validiert.

4.20.3. RNA-Sequenzierung Für die Transkriptomanalysen wurden zunächst 1,7-4 µg RNA mit dem TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina) nach Herstellerangaben amplifiziert. Das RNA-Template wurde selektioniert und fragmentiert, bevor für die cDNA-Synthese der SuperScript II/First Strand Synthesis Act D Mix genutzt wurde und anschließend doppelsträngige cDNA (ds-cDNA) mit dem Second Strand Marking Master Mix hergestellt wurde. Die ds-cDNA wurde dann mit Hilfe von Ampure XP Beads aufgereinigt, die Proben mittels Barcodes gelabelt (TSP1 Target Sample Plate Barcode Label) und mit dem PCR Primer Cocktail (PPC) in einer PCR-Reaktion angereichert. Zum Schluss erfolgte eine quantitative und qualitative Kontrolle der Library Präparation per Messung am Qubit und Aiglent Bioanalyzer DNA 1000, bevor der RNA-Seq Lauf im NGS-Labor des Instituts auf dem auf einem HighSeq2500 System (Illumina) durchgeführt wurde. Die bioinformatischen Analyse der Rohdaten erfolgte durch Dr. Fulvia Ferrazzi. Dafür wurden zunächst rRNAs, tRNAs, snRNAs und verstreut liegende Sequenzwiederholungen 58

Methoden

(interspered repeats) herausgefiltert und gegen ein manuell korrigiertes Filter Referenzfile mittels des Programs bwa-mem v. 0.7.8-r455 (http://adsabs.harvard.edu/abs/2013arXiv1303.3997L) zugeordenet (Alignment). Anschließend wurden die Sequenzen (Reads) gegen das Referenzgenom (hg19) mit Hilfe von STAR aligner v. 2.4.0j [140] gemappt, die Read Anzahl pro Gen wurde mit featureCounts program v. 1.4.6- p2 [141] und dem Ensembl gtf annotation file (genebuild 2013-09) berechnet. Dabei wurden die Reads pro kb auf die jeweilige Genlänge normalisiert (normalized reads per kilobase, NPRK). Eine weitere Normalisierung erfolgte durch die Division des NPRK-Werts durch die durchschnittliche Anzahl der Reads pro Probe (in Millionen), um den RPKM-Wert (reads per kilobase per million mapped reads) zu erhalten. Nachfolgende Analysen zur Berechnung der differentiell exprimierten Gene wurden mit den Programmen R Version 3.2.1 (https://www.r- project.org/) und DESeq2 package v.1.8.1 [142] durchgeführt. Dabei wurden die Gene als differentiell exprimiert eingestuft, wenn der p-Wert unter 0,01 lag. Heatmaps von den regularized log-transformed Daten wurden mit dem R Packet gplots v. 2.17.0 erstellt und die Expressionswerte über die Proben standardisiert. Die so erhaltenen Daten der differentiell exprimierten Gene konnte ich dann mit meiner Ciliengenliste (4.17) abgleichen und mit Ingenuity Pathway Analysis IPA (Ingenuity Systems, Qiagen) die Anreicherung von diesen Genen in bestimmten Signalwegen visualisieren.

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Material

5. Material

Alle verwendeten Materialien sind im Anhang (13.20) aufgelistet.

5.1 Verbrauchsmaterialien (13.20.1) 5.2 Enzyme, Standards, Chemikalien (13.20.2) 5.3 Puffer und Lösungen (13.20.3) 5.4 Medien und Medienzusätze (13.20.4) 5.5 Bakterienstämme, Zelllinien, Hefe (13.20.5) 5.6 Sonden (MLPA, TaqMan) (13.20.6) 5.7 Primer (13.20.7) 5.8 Antikörper (13.20.8) 5.9 Vektoren und Vektorkarten (13.20.9) 5.10 Kits (13.20.10) 5.11 Geräte (13.20.11) 5.12 Datenbanken und Software (13.20.12)

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Ergebnisse

6. Ergebnisse

6.1. Mutationen in bereits beschriebenen Genen für SRPS/SRTD

Die Gruppe der Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome (Short-rib polydactyly syndromes, SRPS) umfasst die häufigeren autosomal-rezessiv vererbten, letalen Chondrodysplasien. Diese werden derzeit eingeteilt in SRPS I (Saldino-Noonan, MIM 613091), SRPS II (Majewski, MIM 263520), SRPS III (Verma-Naumoff, MIM 613091), SRPS IV (Beemer, MIM 269860), SRPS V (MIM 614091) und SRPS VI (MIM 615503). Dabei werden nach der aktuellen Nosologie der Osteochondrodysplasien SRPS Typ I und III zusammengefasst [59, 78, 87]. Pathognomonisch umfasst die Gruppe der SRPS die Kombination aus einer Wachstumsstörung auf Grundlage einer Skelettdysplasie mit Polydaktylien, engem Thorax und weiteren je nach Typ fakultativen Fehlbildungen verschiedener Organe. Die Jeune Asphyxierende Thoraxdysplasie (ATD, MIM 208500) und die Ellis-van Crefeld Syndrome (EVC, MIM 225500) zeigen phänotypische Ähnlichkeiten zu den SRPSs, ebenso wie die Cranio- ektodermale Dysplasie (CED, Sensenbrenner Syndrom, MIM 218330) und das Mainzer- Saldino Syndrom (MZSDS/ SRTD 9, MIM 266920). Als verursachende genetische Defekte wurden zuerst bei einigen Patienten mit SRPS Typ III und ATD Mutationen in den ciliären Genen IFT80 und DYNC2H1 identifiziert [66, 91], wohingegen in den darauffolgenden Jahren in insg. 20 Genen Mutationen beschrieben wurden, die als ursächlich für die laut OMIM neue Einteilung der SRTDs (Short-rib thoracic dysplasia, SRTD 1-17) angesehen werden (Tab. 1, S.14).

6.1.1. Identifizierung von Mutationen in NEK1 In Vorarbeiten identifizierte ich die genetische Ursache für SRPS Typ Majewski (SRPS II/ SRTD 6) [119], welcher sich durch disproportionierten Kleinwuchs, einen sehr engen Thorax mit verkürzten Rippen, prä- und postaxiale Polydaktylie, Lippen-Kiefer-Gaumenspalte und hypoplastische Lungen auszeichnet. Des Weiteren treten Herz-, Hirn- und Nierenfehlbildungen auf, sowie Fehlbildungen des Urogenitalsystems. Radiologische Befunde sind vor allem Rippenanomalien und Verkürzungen der Röhrenknochen, insbesondere die diagnoseweisende extreme Verkürzung der Tibia. Ich konnte in 3 verschiedenen Patienten (P1-P3, Tab. 4) Mutationen im NEK1 Gen identifizieren, welche in den Familien segregierten [12]. Dabei handelte es sich um eine homozygote nonsense Mutation [c.379C>T, p.(Arg127*)] in Patient P1, P2 wies eine homozygote splice-site Mutation auf [c.869-2A>G]. Die Mutationen lagen in hoch konservierten Bereichen und verschiedene computergestützte Vorhersagen des

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Ergebnisse

Mutationseffektes sagten einen pathogenen Effekt dieser Varianten voraus (13.2, Tab. 11). P3 wies eine heterozygote frameshift Mutation in NEK1 [c.1640dup; p.(Asn547Lysfs*2)] und eine weitere heterozygote Mutation im DYNC2H1 Gen [c.11747G>A, p.(Gly3916Asp), Tab. 5] auf. In beiden untersuchten Genen NEK1 und DYNC2H1 konnte keine zweite Mutation nachgewiesen werden. Jeder Elternteil war Anlageträger eines dieser Mutationen, die in 382 Kontrollchromosomen nicht detektiert wurden. Auf der Grundlage von Beschreibungen von möglichen digenen diallelen Vererbungen in anderen Ciliopathien - wie z. B. Bardet-Biedl Syndrom oder Nephronophthise [143, 144] - vermuten wir daher auch im Patienten P3 einen solchen Vererbungsmechanismus [12]. Die Identifizierung neuer Mutationen in NEK1 in weiteren 29 Patienten mit der Verdachtsdiagnose SRPS, welche Merkmalsüberlappungen zum oben genannten Phänotyp zeigten, war eines der Hauptziele dieser Arbeit. Hier konnten in 4 weiteren Patienten potentiell krankheitsverursachende Varianten in NEK1 bestätigt werden (Tab. 4, 13.2, Tab. 11).

Tab. 4 Identifizierte NEK1 Varianten in SRPS-Patienten

Patient cDNA Position Protein Position Zygotie Mutationstyp Vererbung P1(*) c.379C>T p.(Arg127*) hom. nonsense mat./pat. P2(*) c.869-2A>G p.? hom. splice-site mat./pat. P3(*,#) c.1640dup p.(Asn547Lysfs*2) het. frameshift mat. c.214+1G>A ($) p.? het. splice-site mat. P9 c.3023C>G p.(Ser1008*) het. nonsense pat. c.214+1G>A ($) p.? het. splice-site mat. P10 c.1900_1901delGA p.(Glu634Lysfs*11) het. frameshift pat. c.397-14_397-4con p.? het. splice-site ? (◘) NM_152788.4:c.2779- P11 23029_2779-22742 c.550A>G p.(Ser184Gly) het. missense ? (◘) P12 c.2774G>T p.(Ser925Ile) hom. missense mat./pat. (◘) (*) publiziert [12], (#) digene/diallele Vererbung [DYNC2H1 Gen], ($) dieselbe splice-site Mutation in 2 wahrscheinlich nicht verwandten Familien identifiziert. (◘) keine DNA der Eltern vorhanden, hom.=homozygot, het.=heterozygot, mat.=maternal, pat.=paternal. Ausführlichere Informationen (SIFT, PolyPhen2, MutationTaster, MutationAssesor, splice- site Vorhersagen, PhyloP, GERP++, CADD und ExAc) sind der Tab. 11 im Anhang (13.2) zu entnehmen.

Im Patienten P9 konnte compound heterozygot eine splice-site Mutation [c.214+1G>A] und eine nonsense Mutation [c.3023C>G, p.(Ser1008*)] im NEK1 Gen nachgewiesen werden, welche in der Familie segregierten. Die splice-site Mutation, welche maternal vererbt wurde, liegt in einem hoch konservierten Bereich und 3 verschiedene Splicing-Vorhersageprogramme sagten einen Verlust der Spleißstelle vorher. Das Vorhandensein von aberrant gespleißten Transkripten konnte aber aufgrund des Fehlens von Patienten-RNA nicht überprüft werden. Die paternal vererbte nonsense Mutation liegt auch in einem konservierten Bereich, wies einen sehr hohen CADD-Wert von 42 auf und verschiedene Vorhersage-Programme stuften diese Mutation als krankheitsverursachend ein (13.2, Tab. 11). Eine Abfrage beider Varianten in 62

Ergebnisse

1167 in-Haus Exomen ergab, dass an diesen Positionen alle Kontrollen das wildtyp Referenzallel aufwiesen. Anhand dieser Ergebnisse kann die klinische Diagnose SRPS Typ Majewski bei Patient P9 bestätigt werden. In einer weiteren Familie konnte im Patienten P10 auch compound heterozygote nonsense und splice-site Mutationen identifiziert werden. Durch eine paternal vererbte 2 bp Deletion [c.1900_1901delGA] kommt es in Exon 21 zu einer Verschiebung des Leserasters (frameshift) und nach 11 Aminosäuren zu einem vorzeitigen Stopcodon [p.(Glu634Lysfs*11)]. In ExAc (Exome Agregation Consortium) ist diese Variante mit einer sehr niedrigen Allelfrequenz von 8,174x10-6 annotiert (13.2, Tab. 11). Ob es zu einem nonsense mediated mRNA decay und damit zu einem Verlust des full-length Proteins kommt, konnte mittels Western Blot nicht überprüft werden, da keine primären Zellen des Patienten zur Verfügung standen. Die c.214+1G>A splice-site Mutation, welche mütterlicherseits vererbt wurde, konnte nicht auf Spleiß-Defekte überprüft werden, da keine RNA vom Patienten zur Verfügung stand. Beide Varianten konnten mittels NGS Variant Analyzer in 1167 in-Haus Exomen gesunder Kontrollindividuen nicht nachgewiesen werden. Auffällig ist, dass diese splice-site Mutation in unserem Patientenkollektiv sowohl in Patient P10 als auch P9 (Tab. 4) rekurrent nachgewiesen wurde. Eine Verwandtschaft dieser beiden Familien liegt aufgrund der Anamnese und der unterschiedlichen Wohnsitze wahrscheinlich nicht vor, kann aber nicht 100%ig ausgeschlossen werden. Ob es sich hierbei eventuell doch um eine Founder-Mutation handelt, konnte mangels Haplotypen-Daten nicht überprüft werden. Die klinische Diagnose Kurzrippen-Polydaktylie Syndrom wurde demnach bei Patient P10 gesichert, wobei beide Elternteile heterozygote Anlageträger sind. Die Sanger-Sequenzierung von NEK1 im Patienten P11 ergab eine heterozygote missense Mutation [c.550A>G, p.(Ser184Gly)], welche in einem hoch konservierten Bereich lokalisiert ist. Für diese Variante ist ein hoher CADD-Wert von 29,2 annotiert und Vorhersage- programme über den Mutationseffekt (SIFT/PolyPhen2/LRT) sagen einen schädlichen Effekt dieser Mutation voraus (13.2, Tab. 11). Bei der zweiten identifizierten heterozygoten Variante handelt es sich um ein complex rearrangement im Intron 5 des NEK1 Gens. Mittels PCR konnte in Kontroll-DNA ein Produkt mit einer Größe von 591 bp nachgewiesen werden, wohingegen beim Patienten eine zusätzliche Bande auf Höhe von 868 bp detektiert werden konnte (Abb. 11). Nach Gelextraktion, TOPO-Klonierung und anschließender Sequenzierung konnte beim kleinen Fragment die erwartete wildtypische Sequenz von Exon 6 mit flankierenden intronischen Bereichen nachgewiesen werden. Im großen Fragment wurden im Intron 5 11 Basenpaare (Position -14 bis -4; chr4:170510669-170510679) deletiert und stattdessen ein

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Ergebnisse

288 bp großes Stück inseriert (Abb. 11). Mittels der BLAST-Funktion von NCBI konnte zu diesem inserierten Fragment der intronische Bereich des ANKS1B Gens (NM_152788.4: Intron 17; vollständige Sequenz unter 13.5, Abb. 52) mit dem höchsten Score und p-Wert alignt werden, welches auf Chromosom 12 annotiert ist (chr12:99248656-99248943). Diese Mutation wird nach HGVS Nomenklatur c.397-14_397-4conNM_152788.4:c.2779-23029_2779-22742 benannt.

Abb. 11 Nachweis eines complex rearrangement im Patienten P11 im NEK1 Gen Eine PCR mit Primern für das Exon 6 und flankierenden intronischen Bereichen des NEK1 Gens ergab in einer Kontroll-DNA (K) eine wildtyp Bande mit einer erwarteten Größe von 591 bp. Beim Patienten (P11) konnte eine zusätzliche Bande bei 868 bp detektiert werden. Nach Gelextraktion und TOPO-Klonierung konnte im kleinen Fragment die erwartete Wildtyp-Sequenz nachgewiesen werden, im großen Fragment wurden 11 bp deletiert und ein 288 bp großes Fragment inseriert. Hierbei handelt es sich um den intronischen Bereich des ANKS1B Gens. Diese Mutation liegt heterozygot vor, die Vererbung kann aufgrund von fehlender Eltern-DNA nicht erbracht werden. ST = pUC Mix Marker 8; zur besseren Übersicht Sequenzstück von 260 bp (….) nicht im Elektro- pherogramm dargestellt.

Da diese Mutation im Bereich des Spleißakzeptors lokalisiert ist, wurden mittels Splice-site-Vorhersageprogrammen eine Änderung des wildtyp Akzeptors vorhergesagt, welches wahrscheinlich das Spleißen beeinflussen kann (13.2, Tab. 11). Das Vorhandensein von aberranten Spleiß-Transkripten konnte aufgrund von fehlender RNA nicht überprüft werden. Keine dieser Varianten konnte in 1167 in-Haus Exomen gesunder Kontrollindividuen identifiziert werden. Des Weiteren ist keine Aussage möglich, welche der Varianten von welchem Elternteil vererbt wurde, bzw. ob beide Varianten auf nur einem Allel vorhanden sind, da von den Eltern keine DNA-Proben zur Verfügung standen. Eine abschließende Klärung der klinischen Relevanz beider identifizierten Varianten auf das Krankheitsbild SRPS kann somit nicht eindeutig erbracht werden. Im Patienten P12 konnte ich eine homozygote missense Mutation [c.2774G>T, p.(Ser925Ile)] im Exon 27 des NEK1 Gens nachweisen. Diese Position ist schwach konserviert und verschiedene Vorhersageprogramme lassen eine benigne oder neutrale Variante vermuten

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Ergebnisse

(13.2, Tab. 11). Im Gegensatz dazu, wurde diese Variante weder im ExAc-Browser, im 1000 Genomes Project, in dbSNP138, noch im Exome Variant Server annotiert. Der CADD-Wert von 9,086 liegt unter dem Schwellenwert von 10, bei dem die Variante zu den 10 % der Varianten mit mittlerem Risiko gezählt werden kann. Eine Proteinmodellierung, ob der Austausch der Aminosäure Serin zu Isoleucin an der Position 925 zu sterischen Hinderungen führt und somit einen Effekt z. B. auf die korrekte Faltung des Proteins hat, wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Eine Abfrage dieser Variante an Position chr4:70354723-170354723 ergab, dass von 1167 Proben im NGS Variant Analyzer keines der Individuen diese Variante aufwies. Da die Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome autosomal rezessiv vererbt werden, kann trotz fehlender DNA der Eltern, davon ausgegangen werden, dass die Eltern heterozygote Anlageträger sind und somit im Patienten die Variante homozygot auftritt. Trotz typischer phänotypischer Erscheinung des Patienten (verkürzte Gliedmaße, verengten Thorax, Poly- und Syndaktylien, leicht verbreiterte Nasenwurzel) und blutsverwandten Eltern kann bis jetzt nicht eindeutig geklärt werden, ob diese Variante als krankheitsverursachend eingestuft werden kann und wird somit als VUS (variant of unknown significance) geführt. In summa konnte in dieser Arbeit von 29 weiteren untersuchten Patienten mit Verdachtsdiagnose SRPS in 4 Patienten 6 neue Varianten (nonsense, splice-site, missense) im NEK1 Gen identifiziert werden, welche über das gesamte Protein gleichmäßig verteilt sind. Insgesamt 3 Varianten [c.214+1G>A, p.(Ser1008*) und p.(Glu634Lysfs*11)] konnten aufgrund des Vererbungsmusters in der jeweiligen Familie und verschiedener Vorhersageprogramme als pathogen eingestuft werden. Zwei Varianten [c.397-14_397- 4conNM_152788.4:c.2779-23029_2779-22742 und p.(Ser184Gly)] sind laut der Proteinprediktion vermutlich krankheitsverursachend, wobei eine abschließende Aussage aufgrund der fehlenden Segregation in der Familie nicht möglich ist. Eine Variante [p.(Ser925Ile)] wird zum jetzigen Zeitpunkt als variant of unknown significance (VUS) eingestuft.

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Ergebnisse

6.1.2. Identifizierung von Mutationen in DYNC2H1 In den verbliebenen 25 Patienten mit Verdachtsdiagnose SRPS, bei denen keine krankheitsverursachende Mutation im NEK1 Gen identifiziert werden konnten, wurde anschließend eine Sanger-Sequenzierung des 90 Exons umfassenden DYNC2H1 Gens durchgeführt (Tab. 5), da dieses Gen schon als ursächlich für SRPS von verschiedenen Arbeitsgruppen beschrieben wurde [65, 66, 145]. In Patient P3 konnte ich schon im Rahmen meiner Masterarbeit [119] die Pathogenität einer heterozygoten missense Mutation [c.11747G>A, p.(Gly3916Asp)] im DYNC2H1 Gen nachweisen (Tab. 5) und eine weitere heterozygote Mutation in NEK1 [c.1640dup; p.(Asn547Lysfs*2), Tab. 4]. Vater und Mutter waren jeweils Anlageträger eines dieser Varianten, die in 191 gesunden Kontrollindividuen nicht detektiert werden konnten. Auf der Grundlage von digenen diallelen Vererbungsmechanismen in anderen Ciliopathien - wie z. B. Bardet-Biedl Syndrom oder Nephronophthise [143, 144], stellten wir daher auch in diesem Patienten die Hypothese einer solchen Vererbung auf [12]. Diese beschriebene paternal vererbte missense Variante liegt auch im ersten Nukleotid von Exon 82, demzufolge auch im Spleiß- Akzeptor. Drei Splice-site-Vorhersageprogramme sagten auch für diese Variante eine Erniedrigung der Splice-site Erkennung voraus, welches aber aufgrund von fehlender Patienten- RNA nicht validiert werden konnte. Die klinische Diagnose SRPS Typ Majewski konnte bei Patient P3 bestätigt werden.

Tab. 5 Identifizierte DYNC2H1 Varianten in SRPS-Patienten

Patient cDNA Position Protein Position Zygotie Mutationstyp Vererbung missense/ P3(*,#) c.11747G>A p.(Gly3916Asp) het. pat. splice-site P5 c.1151C>T p.(Ala384Val) het. missense ? (◘) P6 c.10711_10714delTTTA p.(Phe3571Argfs*5) het. frameshift mat. c.448C>T p.(Arg150*) het. nonsense mat. P8 c.10343T>C p.(Leu3448Pro) het. missense pat. c.2006A>G p.(Lys669Arg) het. missense pat. P14 c.6545G>A p.(Cys2182Tyr) het. missense pat. c.8627T>C p.(Leu2876Ser) het. missense mat. P19 c.7277G>A p.(Arg2426His) het. missense ? (◘) c.6809G>A p.(Arg2270Gln) het. missense ? (◘) P21 c.10163C>T p.(Pro3388Leu) het. missense ? (◘) c.988C>T p.(Arg330Cys) het. missense mat. P30(°) c.11333C>T p.(Ala3778Val) het. missense pat. (*) publiziert [12], (#) digene/diallele Vererbung [NEK1 Gen], (°) Exom-Sequenzierung durchgeführt, (◘) keine DNA der Eltern vorhanden, hom.=homozygot, het.=heterozygot, mat.=maternal, pat.=paternal. Ausführlichere Informationen (SIFT, PolyPhen2, MutationTaster, MutationAssesor, splice-site Vorhersagen, PhyloP, GERP++, CADD und ExAc) sind der Tab. 11 im Anhang (13.2) zu entnehmen.

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Ergebnisse

Patient P5 wies nur eine heterozygote missense Variante [c.1151C>T, p.(Ala384Val), rs369614706] mit einer MAF von 4,089 x 10-5 (ExAc) auf, alle anderen beobachteten Varianten in exonischen und flankierenden intronischen Bereichen waren als Polymorphismus bei dbSNP138 annotiert. Die in einem hochkonservierten Bereich lokalisierte Variante hatte einen CADD-Wert von 22,1, konnte in keinem der Exomdaten von 1167 Kontrollindividuen detektiert werden und verschiedene Vorhersageprogramme sagen einen schädlichen Effekt dieser Mutation voraus (13.2, Tab. 11). Von diesem Indexpatient konnte die Vererbung in der Familie nicht überprüft werden, da keine Eltern-DNA zur Verfügung stand. Aufgrund einer rezessiven Vererbung der Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome und der Hypothese einer digenen diallelen Vererbung wurden bei diesem Patienten auch die für schon SRPS beschriebenen Gene NEK1, IFT80, TTC21B und WDR35 sequenziert, wobei keine weiteren pathogenen Varianten identifiziert werden konnten. Des Weiteren wurde diese missense Variante c.1151C>T schon in Kombination mit einer nonsense Mutation [c.4351C>T, p.(Gln1451*)] in der Literatur beschrieben [146]. Die klinische Diagnose SRPS kann in Patient P5 aufgrund einer fehlenden zweiten krankheitsverursachenden Variante und fehlender Segregation in der Familie nicht abschließend geklärt werden. Die Sanger-Sequenzierung von DYNC2H1 im Patienten P6 ergab eine heterozygote Deletion von 4 bp in Exon 71, welche zu einem Frameshift und nach 5 Aminosäuren zu einem vorzeitigem Stopcodon führt [c.10711_10714delTTTA, p.(Phe3571Argfs*5)]. Diese Variante liegt in einem hoch konservierten Bereich und wird mütterlicherseits vererbt (13.2, Tab. 11). Ob es durch nonsense mediated mRNA decay zu einem Verlust des full-length Proteins kommt, konnte aufgrund fehlender Patienten-Zellen mittels Western Blot nicht überprüft werden. Eine zweite mögliche krankheitsverursachende Variante [c.12886G>C, p.(Gly4296Arg)] wurde bei Patientenrekrutierung 2010 aufgrund verschiedener Vorhersageprogramme als krankheits- verursachend eingestuft, dies musste aber aufgrund neuerer Erkenntnisse (MAF 0,013 und 27x in homozygoten Zustand bei über 60000 Exomen des ExAc Konsortiums) revidiert werden. Die erste Variante c.10711_10714delTTTA wurde keinmal in 1167 in-Haus Exomen gesunder Kontrollindividuen identifiziert, die zweite Variante c.12886G>C hingegen 26 mal heterozygot und stützt somit die Daten aus ExAc. Die klinische Diagnose Kurzrippen-Polydaktylie Syndrom kann demnach erst nach Identifikation eines zweiten mutanten Allels in cis als gesichert angesehen werden. In einer weiteren Familie konnte im Patienten P8 compound heterozygote nonsense und missense Mutationen identifiziert werden. Durch den maternal vererbten Nukleotidaustausch von C nach T an der hochkonservierten Position 448 wird die Aminosäure Arginin in ein

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Ergebnisse

Stopcodon geändert [c.448C>T, p.(Arg150*)], welches verschiedene computergestützte Vorhersagen des Mutationseffektes als krankheitsverursachende Variante einstufen. Auch die väterlicherseits vererbte Variante [c.10343T>C, p.(Leu3448Pro)] wird mit einem CADD-Wert von 20,7 und von PolyPhen2, LRT und MutationTaster als pathogen beurteilt (13.2, Tab. 11). Beide Varianten bestätigen aufgrund ihrer Konservierung und Effekt auf die Proteinfunktion die Diagnose SRPS, wobei beide Elternteile heterozygote Anlageträger sind und diese Varianten in keinem der 1167 in-Haus Exome beobachtet wurden. Die Direktsequenzierung der kodierenden Exons und der flankierenden intronischen Sequenz des DYNC2H1 Gens aus kultivierten Amnionzellen von P14 ergab neben als nicht krankheitsverursachend bekannten Polymorphismen die drei unbekannten missense Varianten [c.2006A>G, c.6545G>A und c.8627T>C] jeweils heterozygot. Diese Varianten sind in den Mutations- und Polymorphismus-Datenbanken (HGMD, dbSNP, Exome Variant Server) sowie in der Literatur und 1167 Kontroll-Exomen noch nicht beobachtet worden. PolyPhen2, SIFT und MutationTaster bewerten die beiden paternal vererbten Varianten [c.2006A>G und c.6545G>A] jeweils als wahrscheinlich nicht krankheitsverursachend. Die mütterlicherseits vererbte Variante [c.8627T>C] ist übereinstimmend als krankheitsverursachend bewertet (13.2, Tab. 11). Eine Gendeletion konnte durch den Nachweis heterozygoter Polymorphismen ausgeschlossen werden, Deletionen einzelner Exons oder intronische Varianten wurden mit dieser Analyse nicht erfasst. Die klinische Verdachtsdiagnose eines Short-rib Polydaktylie Syndroms Typ III auf der Grundlage von DYNC2H1 Mutation konnte in P14 somit nicht abschließend bestätigt werden. Eine Pränataldiagnostik des ungeborenen Geschwister P18 ergab dieselben Varianten [c.2006A>G und c.6545G>A], welche auch in der Blutprobe des Vaters nachgewiesen werden konnten. Die Variante [c.8627T>C], welche zusätzlich bei P14 identifiziert wurde, konnte bei P18 nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht ausgeschlossen werden, dass die Erkrankung bei dem ersten Feten P14 in der vorangegangenen Schwangerschaft durch Mutationen in anderen Ciliengenen verursacht wird. Die Diagnose SRPS bei dem ungeborenen Kind P18 kann weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. In der zugesandten DNA-Probe P19 aus Fruchtwasserzellen konnte keine pathogene Mutation im IFT80 und NEK1 Gen identifiziert werden. Die Sequenzierung der 90 kodierenden Exons des DYNC2H1 Gens ergab, neben als Polymorphismen bekannter Varianten, jedoch den Austausch eines Guanins durch ein Adenin an der Position 7277 [c.7277G>A, p.(Arg2426His)] heterozygot. Diese Veränderung ist bislang in der Literatur und in Datenbanken (HGMD, dbSNP, ESP) weder als Polymorphismus, noch als krankheitsverursachende Mutation

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Ergebnisse beschrieben worden. In unserem Patientenkollektiv wurde diese Variante ebenfalls noch nicht in Zusammenhang mit einem Kurzrippen-Polydaktylie Syndrom beobachtet. Auch in den 1167 in-Haus Exomen von Kontroll-Individuen konnte diese Variante nicht detektiert werden. Die Position ist jedoch hoch konserviert (PhyloP, GERP++) und in den Vorhersageprogrammen (PolyPhen2, SIFT, MutationTaster) wird dieser Variante ein Effekt auf die Funktion des Proteins zugeschrieben (13.2, Tab. 11). Eine zweite unklare Variante im DYNC2H1 Gen konnte in den kodierenden Abschnitten der DNA-Probe P19 nicht nachgewiesen werden. Die klinische Verdachtsdiagnose SRPS konnte molekulargenetisch bislang nicht bestätigt werden. In einer weiteren Familie konnten in P21 per Sanger-Sequenzierung compound heterozygote missense Mutationen nachgewiesen werden. Die Variante c.6809G>A führt zu einem Aminosäureaustausch von Arginin zu Glutamin an Position 2270 [p.(Arg2270Gln)]. Diese Variante wurde weder in der Literatur beschrieben, noch in unseren SRPS-Patienten beobachtet, noch in dbSNP oder ESP annotiert. Bei der zweiten Variante c.10163C>T wird Prolin zu Leucin ausgetauscht [p.(Pro3388Leu)]. Diese Variante ist auch nicht in dbSNP und ESP gelistet, aber wurde compound heterozygot mit einer zweiten Mutation in DYNC2H1 [c.12480_13556del, p.(Asn4160_Gln4314del)] in einer belgischen Familie mit Jeune Syndrom beschrieben [145]. Beide in P21 identifizierten Varianten sind hoch konserviert, werden basierend auf verschiedenen Vorhersageprogrammen als krankheitsverursachend eingestuft (13.2, Tab. 11) und wurden in keinem der Kontroll-Exome nachgewiesen. Die Verdachtsdiagnose SRPS kann als sehr wahrscheinlich angesehen werden, es kann aber aufgrund fehlender Analyse der Eltern nicht gezeigt werden, ob die beiden Mutationen auf verschiedenen Allelen lokalisiert sind. Eine Exom-Sequenzierung von P30 wurde mit Hilfe eines SureSelect V5 Kits (Agilent) auf einer HiSeq 2500 Plattform (Illumina) durchgeführt. Durch die Sequenzierung wurden 95,5 % der Zielregion >20-fach abgedeckt, bei einer mittleren Abdeckung von 173,2. Die detektierten Varianten wurden gegen 550 in-Haus Kontrollen, häufige Varianten (Allelfrequenz >0,1 %) und bei den Eltern vorliegende Varianten auf mögliche krankheits- verursachende compound heterozygote Varianten gefiltert. Es wurden nur nicht synonyme Varianten berücksichtigt, die in Exons und Splice-Regionen liegen und in Genen lokalisiert sind, wobei ein letzter Filterungsschritt gegen Gene aus meiner Ciliengenliste (Tab. 20) erfolgte. Im Exon 6 zeigte sich die heterozygote missense Variante c.988C>T, welche zum Austausch der Aminosäure Arginin durch Cystein an Position 330 führt [p.(Arg330Cys)] und in der Literatur bereits mit dem Krankheitsbild der Jeune Asphyxierenden Thoraxdysplasie beschrieben wurde [94, 145]. Diese Variante ist maternal vererbt. Im Exon 78 konnte die

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Ergebnisse heterozygote Variante c.11333C>T nachgewiesen werden, die zum Austausch der Aminosäure Alanin durch Valin an Position 3778 führt [p.(Ala3778Val)]. Diese Variante ist paternal vererbt, liegt an einer hoch konservierten Position, ist weder in unseren Kontrollkollektiv, noch im Exome Variant Server vorhanden und wird von 3 von 4 Mutationsvorhersageprogrammen (PolyPhen2, MutationTaster, LRT) als krankheitsverursachend vorhergesagt (13.2, Tab. 11). Beide Varianten wurden mittels Sequenzierung nach Sanger in DNA-Proben des betroffenen Patienten P30 und der Eltern bestätigt. Die Verdachtsdiagnose eines Kurzrippen-Polydaktylie Syndroms beim Feten konnte somit durch den Nachweis einer Compound-Heterozygotie für zwei Mutationen im DYNC2H1 Gen bestätigt werden. Eine Pränataldiagnostik in einer erneuten Schwangerschaft ergab beim werdenden Kind P31 heterozygot die bekannte paternale Mutation [c.11333C>T, p.(Ala3778Val)] im Exon 78 des DYNC2H1 Gens. Die maternale Mutation [c.988C>T, p.(Arg330Cys)] liegt nicht vor. Das Vorliegen eines SRPS aufgrund einer Compound-Heterozygotie für die beiden bekannten familiären Mutationen im DYNC2H1 Gen konnte somit beim werdenden Kind P31 ausgeschlossen werden. In summa konnte ich in dieser Arbeit in weiteren 7 Patienten mit Verdachtsdiagnose SRPS 12 neue Varianten im DYNC2H1 Gen identifizieren, welche gleichmäßig über das gesamte Protein verteilt sind. In 2 Patienten konnten nonsense Mutationen, in den Restlichen verschiedene missense Varianten nachgewiesen werden. In 4 Patienten lagen die Varianten compound heterozygot vor, in 3 Patienten konnte je nur eine heterozygote Variante identifiziert werden. Insgesamt 4 Varianten [c.448C>T, c.988C>T, c.10343T>C und c.11333C>T] konnten aufgrund des Vererbungsmusters in der jeweiligen Familie und verschiedener Vorhersageprogramme als pathogen eingestuft werden. 6 Varianten [c.1151C>T, c.6809G>A, c.7277G>A, c.8627T>C, c.10163C>T und c.10711_10714delTTTA] sind gemäß Prediktion als wahrscheinlich krankheitsverursachend bewertet, 2 werden eher als benigne eingestuft [c.2006A>G und c.6545G>A], wobei durch fehlende Segregationsanalysen in den Familien oder einer fehlenden zweiten Mutation keine eindeutig abschließende Aussage möglich ist. Im Gegensatz zum NEK1 Gen konnten keine neuen splice-site Mutationen, noch Mutationen im homozygoten Zustand nachgewiesen werden.

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Ergebnisse

6.1.3. Identifizierung von Mutationen in EVC Im Patient P23 (Familie SRPS#22) mit Verdacht auf Vorliegen eines Kurzrippen-Polydaktylie Syndromes (SRPS) konnten mittels Sanger-Sequenzierung keine Mutationen in NEK1 und DYNC2H1 identifiziert werden. Auch die Sequenzierung weiterer in der Literatur beschriebener Gene für SRPS (IFT80) konnte keine pathogenen Varianten identifizieren. Da das phänotypische Spektrum der skelettalen Ciliopathien breit gefächert ist und eine eindeutige Zuordnung zum bestimmten Krankheitsbild nicht immer möglich ist, wurde eine Gen-Panel Sequenzierung (TruSight One) an DNAs der Eltern des Patienten P23 durchgeführt. Im TruSight One Sequencing Panel Kit (Illumina) werden die exonischen Genbereiche für über 4800 Gene mit bekannten klinischen Phänotypen sequenziert, wobei auch eine Abdeckung der bekannten SRPS-Gene DYNC2H1, EVC, EVC2, IFT43, IFT80, IFT122, IFT140, NEK1, TTC21B, WDR19 und WDR35 gewährleistet war. Die Auswertung ergab in beiden Elternteilen eine heterozygote Mutation in der splice-site von Exon 3 im EVC Gen [c.384+5G>C, Abb. 12 A], welche in keinem der in-Haus Exome gesunder Kontrollindividuen detektiert werden konnte. Diese c.384+5G>C splice-site Mutation wurde in Kombination mit einer weiteren Spleißvariante c.1465-1G>A schon als krankheitsursächlich beschrieben [147]. Die Basensubstitution c.384+5G>C wurde in dieser Publikation mittels Minigen Expressionsassay, RT-PCR und Sequenzierung überprüft und der Nachweis einer neuen kryptische Akzeptorstelle innerhalb von Exon 4 erbracht. Da dieselbe Mutation im Patienten P23 im konservierten Bereich des Spleißdonors lokalisiert ist, wurden auch in diesem Fall mittels Splice-site-Vorhersageprogrammen eine Änderung des wildtyp Donors und damit ein Verlust der Spleißstelle vorhergesagt, welches wahrscheinlich das Splicing beeinflussen kann. Durch die anschließende Sequenzierung der mRNA nach reverser Transkription (Exon 2-11) konnte zwar kein aberrant gespleißtes Transkript nachgewiesen werden, jedoch ergab die Analyse eines auf genomischer DNA-Ebene nachgewiesenen heterozygoten Polymorphismus [c.249A>G; Abb. 12 B] den Verlust eines Allels [r.249G, LOH, Abb. 12 C] und bestätigte den Abbau des Transkriptes dieses Allels durch nonsense mediated mRNA decay.

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Ergebnisse

Abb. 12 Identifizierung einer splice-site Mutation im EVC Gen in Familie SRPS#22 mittels TruSight One Genpanel (A) Auswertung des TruSight One Genpanels mit dem SeqNext Modul der SeqPilot Software ergab eine heterozygote splice-site Mutation c.384+5G>C im EVC Gen in beiden Elternteilen der Familie SRPS#22. (B) Ein auf genomischer DNA nachgewiesener heterozygoter Polymorphismus c.249A>G (B) konnte nach reverser Transkription der mRNA im homozygoten Status nachgewiesen (C) werden, was den Verlust eines Allels (r.249G, loss of heterozygosity LOH) aufzeigt.

Das Ellis-van Crefeld Syndrom wird autosomal rezessiv vererbt und durch die heterozygote Anlageträgerschaft der Elternteile sollte die Mutation im betroffenen Kind homozygot vorliegen, welches aber aufgrund des Fehlens von DNA des Kindes nicht nachgewiesen werden konnte. Die Mutation c.384+5G>C ist aufgrund der guten Konservierung, eines CADD-Wertes von 10,25, vier verschiedener Splice-Site-Vorhersageprogramme und der oben beschriebenen Ergebnisse des Verlusts eines Alles als krankheitsverursachend anzusehen (13.2, Tab. 11) und erweitert somit das phänotypische Spektrum der Ellis-van Creveld Syndrome [147].

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Ergebnisse

6.2. Identifizierung eines neuen Kandidatengens für SRPS/SRTD

Aufgrund der vermuteten Anzahl von bislang über 1000 mit dem primären Cilium assoziierten Genen und den bislang bekannten Ciliopathien gehen wir davon aus, dass die Mehrzahl der Defekte noch unbekannt ist. Insbesondere die Überlappung der phänotypischen Charakteristika (Polydaktylie, Herzfehler, Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalte, enger Thorax) der skelettalen Ciliopathien lassen vermuten, dass diesen pleiotropen Entwicklungsdefekten Defekte im Aufbau und Erhalt der primären Cilien zugrunde liegen. Die Exom-Sequenzierung hat sich als sehr erfolgreiche Methode zur Identifizierung der zugrunde liegenden genetischen Ursachen der autosomal-rezessiv vererbten Entitäten herausgestellt [61, 145, 148] und sollte in dieser Arbeit bei Patienten mit noch nicht geklärter molekulargenetischer Ursache angewandt werden.

6.2.1. Exom-Sequenzierung – DYNC2LI1 Mutationen Eine Sequenzierung der 5 häufigsten Gene für SRPS/SRTD (NEK1, DYNC2H1, IFT80, TTC21B und WDR35) ergab beim Patienten P7 keine pathogenen Varianten, die als ursächlich für den Krankheitsphänotyp eingestuft werden konnten. Da der Patient einen Jeune Asphyxierenden Thoraxdysplasie ähnlichen Phänotyp aufwies (Patientenbilder 13.4, Abb. 51), welcher Überlappungen zum SRPS und EVC Spektrum zeigte, lag die Vermutung nahe, dass auch hier ein eventuell an der Ciliogenese beteiligtes Gen ursächlich sein könnte. Aufgrund der großen Anzahl in meiner Ciliengenliste annotierten und potentiellen Ciliengene wurde daraufhin eine Exom-Sequenzierung in diesem Patienten durchgeführt. Dies ergab 156,9 M single end reads, wobei 85,01 % dieser reads auf das humane Genom (hg19) gemappt werden konnten und 88,06 % in Zielsequenzen der Anreicherungsbereiche (on target) lagen. 81,5 % der angereicherten Targets waren mind. 5x gecovert mit einer durchschnittlichen 73,3-fachen Abdeckung. In summa wurden 52679 Varianten identifiziert, von denen 2076 als Indels (Insertion und Deletion Mutationen im Genom) und 50603 als SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) eingestuft wurden. Basierend auf der Vermutung einer sehr seltenen Häufigkeit dieses im Patienten beobachteten Phänotyps wurden alle häufigen Varianten mit über 0,01 % ausgeschlossen. Zusätzlich wurden die Varianten als nicht ursächlich beurteilt, wenn sie in mind. 1 der 666 im Hause gelaufenen Exomen vorkamen oder in dbSNP132, 1000 Genomes Project oder im Exome Variant Server gelistet waren. Aufgrund der Annahme eines autosomal rezessiven Vererbungsmusters und nach Ausschluss von intergenischen, intronischen und synonymen Varianten blieben 58 Varianten in 4 Genen (variants of unknown significance, VUS) übrig.

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Ergebnisse

Basierend auf dem Mutationseffekt dieser Varianten, ihrer Konservierung (PhyloP, GERP++) und Werte verschiedener Vorhersageprogramme (SIFT, PolyPhen2, MutationTaster, CADD) blieben im DYNC2LI1 Gen (NM_001193464) zwei potentiell ursächliche Varianten übrig [149]: eine nonsense Mutation [c.622C>T, p.(Arg208*)] in Exon 8 und eine missense Mutation [c.662C>T p.(Thr221Ile)] in Exon 9 (Abb. 13, 13.2, Tab. 11).

Abb. 13 Visualisierung der DYNC2LI1 Mutationen (A) Sanger-Sequenzierung der compound heterozygoten Mutationen in DYNC2LI1 in Patient P7: nonsense Mutation [c.622C>T p.(Arg208*)] in Exon 8 und missense Mutation [c.662C>T p.(Thr221Ile)] in Exon 9. (B) Protein Modell der Nukleosid-Triphosphat-Hydrolase Domäne von DYNC2LI1 im Wildtyp und der p.(Thr221Ile) Mutante. Thr221 ist in der Nähe der Nukleosid-Bindungsstelle lokalisiert, ein Austausch von Threonin zu Isoleucin in der Mutante führt zu sterischen Hinderungen und verringert die Größe der Nukleosid-Bindetasche, welches die Hydrolyase-Funktion des Proteins beeinträchtigt (verändert nach [149]).

Beide Varianten konnten mittels Sanger-Sequenzierung validiert werden und wurden weder in 858 Kontroll-Chromosomen von gesunden Individuen noch in den 61486 Exomen des Exome Agregation Consortium (ExAc) detektiert. Die betroffenen Positionen sind sowohl auf Nukleotid- als auch auf Aminosäureebene hoch konserviert. Ein Vergleich der Proteinsequenz mit bekannten Protein-Motiven sagt eine P-loop Domäne vorher, welche eine Nukleosid- Triphosphat-Hydrolase Domäne (AS 30-240) enthält und zusätzlich eine Dynein-light intermediate Domäne (AS 30-163). Eine Proteinmodellierung in Kooperation mit Prof. Dr. Heinrich Sticht (Institut für Biochemie der FAU Erlangen-Nürnberg) ergab, dass Thr221 in der Nähe der Nukleosid-Bindungsstelle lokalisiert ist (Abb. 13 B). Somit würde ein Austausch von Threonin zu Isoleucin in der Mutante zu sterischen Hinderungen führen und die Größe der Nukleosid-Bindetasche verringern, welches die Hydrolyase-Funktion des Proteins beeinträchtigt. Die gesunde Mutter, Bruder und Sohn der betroffenen Patientin waren heterozygote Anlageträger für die Mutation p.(Thr221Ile). Obwohl keine DNA des gesunden Vaters und der betroffenen 2 Geschwister vorhanden waren, kann trotzdem aufgrund der Familienanamnese davon ausgegangen werden, dass die nonsense Mutation p.(Arg208*) wahrscheinlich paternal vererbt wird. Daher werden die beiden identifizierten Varianten als pathogen eingestuft und im Folgenden das DYNC2LI1 Gen näher charakterisiert und der Effekt der Mutation in Folgeexperimenten überprüft. 74

Ergebnisse

6.2.2. DYNC2LI1 – ubiquitäre Expression und Lokalisation Die cytoplasmic dynein 2 light intermediate chain 1 (DYNC2LI1, alternativ D2LIC oder LIC3) besteht aus 13 Exons und kodiert für ein 351 Aminosäure langes Protein, wobei drei verschiedene Isoformen (Isoform 4=NM_001193464.1, Isoform 2=NM_015522.3, Isoform 1 =NM_016008.3, Stand Juli 2015) annotiert sind. Die Transkript Variante 4 besitzt eine alternative in-frame Spleißstelle im mittleren Abschnitt der kodierenden Region, welche im Vergleich zu Variante 1 zu einem 1 Aminosäure längeren Protein führt. Isoform 2 ist die kürzeste der drei Isoformen, welche sich in der 3‘ kodierenden Region und in der 3‘ UTR unterscheidet und einen anderen C-Terminus aufweist. Alle 3 Isoformen sind bis Exon 6 identisch, wobei Isoform 2 mit einem größeren Exon 6 und mit einem anderen Stopcodon endet. Grissom et al. konnten an verschiedenen Geweben von adulten Mäusen mittels Western Blot zeigen, dass Dync2li1 ubiquitär exprimiert ist mit hohem Expressionsniveau in Gehirn, Niere, Lunge und Hoden [150]. Da für die verschiedenen Isoformen grundsätzlich verschiedene entwicklungsspezifische sowie auch gewebespezifische Aufgaben denkbar sind, wurde die Expression der einzelnen Isoformen in verschiedenen fetalen und adulten Geweben unter Verwendung isoform-spezifischer TaqMan-Sonden analysiert. In menschlichen Geweben konnten wir die höchste mRNA Expression in Chondrozyten, Gehirn und Niere nachweisen, welche bis zu viermal stärker als im Vergleich zu Herz und Leber war. Des Weiteren konnten signifikante Unterschiede mit bis zu doppelten Expressionsniveaus in fetalen Geweben (Gehirn, Lunge und Niere) detektiert werden (Abb. 14 A). Die beiden längsten Isoformen 1 und 4 werden prädominant (Isoform 4 ca. 22-31 %, Isoform 1 ca. 53-67 %) im Vergleich zur kurzen Isoform 2 (ca. 6-22 %) in allen untersuchten Geweben exprimiert (Abb. 14 B).

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Ergebnisse

Abb. 14 Analyse des Expressionsmusters der 3 DYNC2LI1 Isoformen in fetalen und adulten humanen Geweben mittels TaqMan-basierter qPCR Als Template dienten die Gewebepanels Human Fetal Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel, Human Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel I, 2 Osteoblasten und 8 Chondrozyten cDNAs. Es wurden isoform-spezifische Sonden (hs01005273_Isoform 4 [NM_001193464.1], hs01011588_Isoform 1 [NM_016008.3], custom-AJKAK22_Isofo rm 2 [NM_015522.3]) verwendet, die Normalisierung erfolgte über 4 mitgeführte endogene Kontrollen. (A) Additive Darstellung der relativen Expression der einzelnen Isoformen in den verschiedenen fetalen und adulten Geweben mit höchster Expression in Chondrozyten, Gehirn und Niere (B) Addition der Expressionen der 3 Isoformen diente der Berechnung der Gesamtexpression von DYNC2LI1 (=100 %). Daraus ergab sich die prozentuale Darstellung der relativen Isoformenexpression zueinander, wobei die beiden längsten Isoformen prädominant exprimiert werden (verändert nach [149]).

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Ergebnisse

Das Genprodukt von DYNC2LI1 stellt die intermediär leichte Kette dar, welche zusammen mit DYNC2H1 und weiteren anderen Komponenten den cytoplasmatischen Dynein-2 Komplex bildet. Dieser Komplex ist wichtig für den retrograden Intraflagellartransport (IFT) des primären Ciliums [50]. Defekte von Komponenten des Dynein-2 Komplexes wurden mit dem klinischen Phänotyp SRPS III, Jeune/ Asphyxierende Thoraxdysplasie SRTD 3/8/11 [59, 87] assoziiert, welche auch in Immunfluoreszenzanalysen typische morphologische Änderungen der primären Cilien in Zellkultur aufwiesen. Da in früheren Studien eine Lokalisation von DYNC2LI1 am Golgi Apparat, an den Centrosomen und am Axonem von cilientragen Epithelialzellen berichtet wurde [150-152], sollten in dieser Arbeit weitere Analysen zur Lokalisation von DYNC2LI1 - mit Hauptaugenmerk auf primäre Cilien - durchgeführt werden. Mit Immunfluoreszenzaufnahmen sollte die Lokalisation von DYNC2LI1 in Kontroll- Fibroblasten gezeigt werden, welche nach 5 tägiger Inkubation unter Hungermedium zur Induktion von primären Cilien fixiert wurden. Die Kontroll-Fibroblasten zeigten eine Lokalisation von DYNC2LI1 sowohl im Cytoplasma als auch an der Basalkörperregion (Abb. 15 A) bzw. Transitionszone der primären Cilien (Abb. 15 B). Während der Mitose konnte auch ein Signal an den Centrosomen detektiert werden (Abb. 15 C). Da vom Patienten P7 keine Fibroblasten für weiterführende Experimente zur Verfügung standen, sollte die DYNC2LI1 Expression mittels siRNA knockdown herunterreguliert werden und der Effekt auf die Cilienlänge und -morphologie untersucht werden (6.2.3).

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Ergebnisse

Abb. 15 Lokalisation des DYNC2LI1 Proteins in Kontroll-Fibroblasten mittels Immunfluoreszenz (A) DYNC2LI1 ist in Kontroll-Fibroblasten im Cytoplasma und verstärkt am Basalkörper des primären Ciliums lokalisiert. Des Weiteren konnte eine Lokalisation von DYNC2LI1 an der Transitionszone (B) und an den Centrosomen (C) während der Zellteilung detektiert werden (Pfeile). Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium für Induktion des primären Ciliums. Grün = DYNC2LI1 (1:100), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm. (verändert nach [149]).

6.2.3. DYNC2LI1 knockdown – Analyse Cilienmorphologie Um einen möglichen loss-of-function Effekt von DYNC2LI1 in vivo weiter untersuchen zu können, wurde in Kontroll-Fibroblasten ein siRNA-vermittelter transienter knockdown von DYNC2LI1 durchgeführt. Es wurde auf die Methode des Gen knockdowns mittels siRNA zurückgegriffen, da zum damaligen Zeitpunkt die Methode der Genomeditierung mittels CRISPR/Cas9 noch nicht etabliert war. Für eine transiente Transfektion von Kontroll- Fibroblasten musste zuerst eine geeignete DYNC2LI1-siRNA gefunden werden, welche das Gen stark genug herunterreguliert. Hierfür wurden die Zellen mit 3 verschiedenen siRNAs 78

Ergebnisse transfiziert. Alle drei siRNAs regulieren jeweils alle drei bekannten DYNC2LI1 Isoformen herunter, da die siRNAs in Exon 1, 2 oder 6 binden und die 3 Isoformen sich in den ersten 6 Exons nicht unterscheiden. Die siRNA#3 (HSS147516) hat mit 13 % Restaktivität (nach 2-tägiger Inkubation) das Gen DYNC2LI1 am stärksten herunterreguliert und wurde deshalb in den folgenden knockdown Experimenten verwendet. Für die Ausbildung der primären Cilien konnte in Vorexperimenten gezeigt werden, dass in Kontroll-Fibroblasten eine Inkubation von 5 Tagen unter Hungermedium benötigt wird, um die Cilienausbildung zu induzieren. Da bei einem siRNA knockdown nur eine temporäre Abnahme der Genexpression erreicht wird, wurde nach 5-tägiger Inkubation unter Hungermedium erneut mittels qPCR die Expression gemessen, wobei durchschnittlich eine Restexpression von 39 % detektiert wurde. Anschließend wurden die behandelten Zellen und dazugehörige Kontrollen für Immunfluoreszenzanalysen fixiert und die Anzahl der Zellen mit bzw. ohne Cilien gezählt. Auf der Grundlage von beobachteten ciliären Defekten in skelettalen Ciliopathien, welche durch eine Dysfunktion von IFT- oder Basalkörper-Proteinen verursacht wird [59, 87], erwarteten wir, dass ein loss-of-function Effekt von DYNC2LI1 zu morphologisch abnormalen oder fehlenden primären Cilien führt. Eine Auszählung von ca. 300 Zellen ergab in den Kontrollzellen (nach Scrambled siRNA Transfektion) eine Anzahl von 85 % und in DYNC2LI1-depletierten Zellen 84 %, die ein primäres Cilium aufwiesen (Abb. 16 A, χ2-Test: p = 0,927). Anschließend wurde die Cilienlänge zwischen den knockdown Zellen und den Kontrollzellen analysiert. Zur Quantifizierung wurden 191 Cilien der DYNC2LI1-depletierten Zellen und 181 Cilien der Scrambled Kontrollen anhand der Fluoreszenzaufnahmen mit 100- facher Objektiv-Vergrößerung gemessen. Die Messung erfolgte in Triplikaten mit Hilfe des Bildbearbeitungsprogrammes FIJI. Der Median aller gemessenen Cilienlängen betrug bei den Scrambled Kontrollzellen 1,83 μm, wohingegen die Cilien in den DYNC2LI1-knockdown Zellen signifikant kürzer waren (Abb. 16 B) mit einer durchschnittlichen Länge von 1,42 μm (Mann-Whitney-U Test: p = 1,205 × 10−6). Die Beobachtung von verkürzten Cilien in den Knockdown Experimenten bestätigten somit auch schon die Resultate von kurzen Cilien im Zebrafisch Modell bzw. Dync2li1tm1Aar knockout Mäusen [153, 154].

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Ergebnisse

Abb. 16 Cilienanzahl und Cilienlänge in DYNC2LI1-depletierten Zellen im Vergleich zur Scrambled Kontrolle (A) Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Anzahl an cilientragenden Zellen beobachtet (85 % Scrambled Kontrolle [n=291] vs. 84 % DYNC2LI1-siRNA [n=305], χ2-Test: p = 0,927, Größenstandard: 20 µm). (B) Die mediane Cilienlänge betrug in der Scrambled Kontrolle 1,83 µm [n=181], im Gegensatz dazu waren die Cilien in DYNC2LI1 knockdown Zellen [n=191] signifikant kürzer mit einer Länge von 1,42 µm (Mann-Whitney-U Test: p = 1,205 × 10−6, Maßstabsbalken: 10 µm). Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium für Induktion des primären Ciliums. Grün = PCNT (1:500, Centrosomenmarker), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern) (verändert nach [149]).

Reduzierte Cilienlängen mit Verdickungen an der Cilienspitze wurden auch schon für andere Defekte in DYNC2H1 und WDR34 - weitere Komponenten des cytoplasmatischen Dynein-2 Komplexes - beobachtet [65, 155]. Das Vorhandensein von verdickten Cilienenden, welche einen retrograden IFT Defekt in diesen Zellen erklären könnte, sollte auch in den DYNC2LI1- depletierten Zellen analysiert werden. Die DYNC2LI1 knockdown Zellen zeigten zusätzlich zur reduzierten Cilienlänge weitere ciliäre morphologische Auffälligkeiten mit signifikant verdickten Cilienspitzen in 14 % der analysierten Zellen (Abb. 17). In Kontrollzellen (nach Scrambled siRNA Transfektion) hingegen konnte eine normale Cilienstruktur beobachtet werden mit nur 6 % malformierten Cilien (χ2-Test: p= 0,028).

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Ergebnisse

Abb. 17 DYNC2LI1 knockdown Zellen weisen eine veränderte Cilienmorphologie auf DYNC2LI1-depletierte Zellen [n=191] zeigen verkürzte Cilien mit Verdickungen der Cilienspitze in 14 % der untersuchten Zellen. Scrambled Kontrollen [n=181] weisen eine normale Cilienstruktur auf mit ciliären Veränderungen in nur 6 % der gemessenen Kontroll-Cilien (χ2-Test: p = 0,028). Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium für Induktion des primären Ciliums. Grün = PCNT (1:500, Centrosomenmarker), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 2,5 µm, 3-dimensionale Rekonstruktion des Ciliums mittels Imaris Software; verändert nach [149].

Des Weiteren wurde schon in der Literatur beschrieben, dass sich durch einen retrograden IFT- Defekt in den verdickten Cilienenden IFT-B Proteine akkumulieren können [88, 145]. Um dies in DYNC2LI1-depletierten Zellen überprüfen zu können, wurden in Immunfluoreszenzanalysen die beiden IFT-B Proteine IFT57/88 angefärbt. Eine Lokalisation von IFT57/88 konnte im Cytoplasma und am Basalkörper des primären Ciliums in Scrambled Kontrollen und knockdown Zellen beobachtet werden. Morphologisch veränderte Cilien in DYNC2LI1- depletierten Zellen zeigten zusätzlich eine Akkumulation von IFT57 (Abb. 18 A) und IFT88 (Abb. 18 B) in der verdickten Cilienspitze, welches die Vermutung eines retrograden IFT- Defekts in diesen Zellen bestätigte.

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Ergebnisse

Abb. 18 Akkumulation von IFT-B Proteinen in der Cilienspitze bestätigen retrograden IFT Defekt von DYNC2LI1 knockdown Zellen (A) Scrambled Kontrolle und knockdown Zellen zeigen eine Lokalisation von IFT57 an der Basalkörperregion der primären Cilien. Zusätzlich konnte in DYNC2LI1-depletierten Zellen eine Akkumulation von IFT57 - einer Komponente des IFT-B Komplexes - in den Verdickungen der Cilienspitzen (Pfeil) beobachtet werden. (B) IFT88 - ein weiterer Teil des IFT-B Komplexes - ist in beiden untersuchten Zelllinien auch am Basalkörper lokalisiert. IFT88 ist zusätzlich in der Cilienspitze von Scrambled Kontrollen lokalisiert, im Vergleich dazu mit einem sehr starken Akkumulationssignal von IFT88 in DYNC2LI1 knockdown Zellen (Pfeil). Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium für Induktion des primären Ciliums. Grün = IFT57 (1:100) / IFT88 (1:200), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 2,5 µm, 3-dimensionale Rekonstruktion des Ciliums mittels Imaris Software; verändert nach [149].

In summa konnte ich zeigen, dass eine Herunterregulation von DYNC2LI1 zu verkürzten Cilien mit Verdickungen der Cilienspitzen führt und eine Akkumulation von IFT-B Proteinen in den morphologisch auffälligen Cilien einen Defekt im retrograden Intraflagellartransport in diesen Zellen bestätigt.

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Ergebnisse

6.2.4. DYNC2LI1 – weitere Patienten Nach erfolgreicher Identifizierung von pathogenen Varianten im DYNC2LI1 Gen in Patient P7, sollte dieses Gen in 284 Patienten mit ideopathischen Kleinwuchs (Short-Net-Kohorte) sequenziert werden (Tab. 6), um eventuell weitere Patienten mit Mutationen in DYNC2LI1 identifizieren und somit das Mutationsspektrum erweitern zu können.

Tab. 6 Identifizierte DYNC2LI1 Varianten in Patienten mit SRPS bzw. Wachstumsverzögerung

Patient cDNA Position Protein Position Zygotie Mutationstyp Vererbung c.622C>T p.(Arg208*) het. nonsense wahrsch. pat. (◘) P7(*,°) c.662C>T p.(Thr221Ile) het. missense mat. P26/P27 c.2T>C p.(Met1?) het. Kein Startcodon (◘) P28 c.232-8T>G p.? het. splice-site pat. P29 c.162-2A>G p.? het. splice-site mat. (*) publiziert [149], (°) Exom-Sequenzierung durchgeführt, (◘) keine DNA der Eltern vorhanden. Ausführlichere Informationen (SIFT, PolyPhen2, MutationTaster, MutationAssesor, splice-site Vorhersagen, PhyloP, GERP++, CADD und ExAc) sind der Tab. 11 im Anhang (13.2) zu entnehmen.

Im Geschwisterpaar P26/27 konnte beim DYNC2LI1 Screening der Short-Net-Platten jeweils heterozygot die Variante c.2T>C nachgewiesen werden, welche das Startcodon dieses Gens betrifft. Diese Position ist hoch konserviert, weißt einen CADD-Wert von 12,41 auf, zwei Vorhersageprogramme (PolyPhen2 und MutationTaster) stufen diese Variante als wahrscheinlich krankheitsverursachend ein, wohingegen SIFT und LRT diese eher als neutral werten (13.2, Tab. 11). Diese Variante wurde keinmal in 1167 in-Haus Kontroll-Exomen beobachtet, weist laut ExAc Browser eine MAF von 7,319 x 10-5 auf und wurde einmal im 1000 Genomes Project (C=0.0002/1) gelistet. Eine Analyse der relativen Expression von DYNC2LI1 in P26/27 und 11 PaxGene-Kontrollen ergab mit zwei verschiedenen TaqMan-Sonden kein eindeutiges Ergebnis (1x herunterreguliert auf ca. 25 %, 1x unverändert, 1x leicht hochreguliert (13.6, Abb. 53). Um Kopienzahlvarianten in diesen beiden Patienten auszuschließen wurde eine MLPA-Analyse der 13 Exons des DYNC2LI1 Gens durchgeführt (Abb. 19). Da als Grenzwerte für das Vorliegen einer Deletion bzw. Duplikation 75 % bzw. 125 % der Dosis im Vergleich zu den Kontrollen gewählt wurde, konnten keine Abweichungen in der Kopienzahl nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte ich keine 2. Mutation (second hit) in einem der anderen in dieser Arbeit untersuchten Ciliengene (NEK1, DYNC2H1, IFT80, TTC21B, WDR35 (13.2, Tab. 11) identifizieren. Die klinische Diagnose ideopathischer Kleinwuchs aufgrund von DYNC2LI1 Mutationen kann molekulargenetisch bislang nicht bestätigt werden.

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Ergebnisse

Abb. 19 MLPA-Analyse von DYNC2LI1 in den Patienten P26 und P27 Eine MLPA-Analyse mit Sonden für alle 13 Exons von DYNC2LI1 (Sondenmix A+B) und mit dem Referenzsonden P200-Mix ergab bei beiden Geschwistern (P26=62940, P27=63045) keine Deletionen oder Duplikationen von einzelnen Exons im Vergleich zu mitgeführten Kontrollen. Grenzwerte zur Angabe von Deletionen oder Duplikationen werden mit dem Faktor 0,75 bzw. 1,25 definiert (rote Linien).

Im Patienten P28 konnte eine heterozygote Variante c.232-8T>G im Spleißakzeptor im Intron 4 identifiziert werden, welche paternal vererbt wurde. Diese Variante weißt einen niedrigen CADD-Wert von 2,199 und eine MAF von 2,44 x 10-5 (ExAc Browser) auf und wurde in keinem der 1167 in-Haus Exome nachgewiesen. Splice-site-Vorhersageprogramme ergaben kein konsistentes Ergebnis (kein Einfluss auf Spleißen, schwache oder starke Erniedrigung der Spleißstellenerkennung (13.2, Tab. 11)). Durch eine Sequenzierung der mRNA nach reverser Transkription (Exon 1-13) konnte kein aberrant gespleißtes Transkript nachgewiesen werden (Abb. 20). Da auf genomischer DNA-Ebene in keinem der Exons von DYNC2LI1 heterozygote Varianten detektiert wurden, kann demnach nicht überprüft werden ob es zu einem Verlust eines Allels kommt, welches sich durch Vorhandensein dieser SNPs im homozygoten Status (loss of heterozygosity LOH) darstellen würde.

Abb. 20 Sequenzierung des DYNC2LI1 Transkripts nach reverser Transkription in P28 Zur Überprüfung auf das Vorhandensein von alternativ gespleißten DYNC2LI1 Transkripten im Patient P28 mit der splice-site Variante c.232-8T>G wurde die mRNA in cDNA transkribiert und eine PCR mit RT-Primern (DYNC2LI1_RT_5UTR_F_a + DYNC2LI1_Iso4_Stop_Topo_R2) durchgeführt, um das full-length DYNC2LI1 zu erhalten. Anschließende Sequenzierung konnte kein aberrant gespleißtes Transkript nachweisen, alle Exons sind vollständig abgedeckt. Die Abdeckung aller 13 Exons der 3 bekannten DYNC2LI1 Isoformen (NM_016008.3, NM_015522.3, NM_001193464.1) wurde mit dem UCSC Genome Browser basierend auf GRCh37/hg19 dargestellt. 84

Ergebnisse

Eine quantitative real-time PCR ergab in Patient P28 vergleichbar zu P26/27 und 11 Kontrollen kein eindeutiges Ergebnis (13.6, Abb. 53). Auch eine durchgeführte MLPA-Analyse der 13 Exons von DYNC2LI1 ergab keine Deletion oder Duplikation einzelner Exons (13.7, Abb. 54). Eine weitere heterozygote Variante in eines der weiteren in dieser Arbeit untersuchten Ciliengene (NEK1, DYNC2H1, IFT80, TTC21B, WDR35) konnte nicht gefunden werden. Zum jetzigen Zeitpunkt bleibt die molekulargenetische Ursache in diesem Patienten ungeklärt. Bei Patient P29 wurde per Sanger-Sequenzierung heterozygot die splice-site Variante c.162-2A>G detektiert, welche mütterlicherseits vererbt wurde. Diese Variante liegt in einem hoch konservierten Bereich, weißt einen hohen CADD-Wert von 18,38 auf und bei vier Splice-site-Vorhersageprogrammen wird ein Verlust der Spleißstelle vorhergesagt, welcher sehr wahrscheinlich das Spleißen beeinflusst (13.2, Tab. 11). Das Vorhandensein von aberrant gespleißten Transkripten konnte aber aufgrund des Fehlens von Patienten-RNA nicht überprüft werden. Es konnten auch keine Deletionen oder Duplikationen einzelner Exons von DYNC2LI1 mittels MLPA im Patienten und dessen Eltern nachgewiesen werden. In den Ciliengenen NEK1, DYNC2H1, IFT80, TTC21B und WDR35 konnte auch keine weitere mögliche krankheits- verursachende Variante identifiziert werden (13.2, Tab. 11). Eine abschließende Klärung der klinischen Relevanz der Splice-Variante in DYNC2LI1 kann somit nicht eindeutig erbracht werden. In summa konnte ich in einem Patienten compound heterozygote nonsense und missense Mutationen [p.(Arg208*), p.(Thr221Ile)] im DYNC2LI1 Gen als ursächlich für einen Jeune Asphyxierenden Thoraxdysplasie ähnlichen Phänotyp nachweisen. Eine Sequenzierung dieses Gens in weiteren Patienten mit Wachstumsverzögerungen ergaben heterozygote splice-site Varianten [c.162-2A>G und c.232-8T>G] oder ein Fehlen des Startcodons [c.2T>C, p.(Met1?)]. Diese Varianten sind gemäß Prediktion nicht konsistent als wahrscheinlich krankheitsverursachend bewertet, wobei durch Ergebnisse der MLPA- bzw. qPCR-Analysen, durch fehlende Segregationsanalysen in den Familien oder einer fehlenden zweiten Mutation keine eindeutig abschließende Aussage zur Pathogenität dieser Varianten möglich ist.

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Ergebnisse

6.3. Herstellung eines polyklonalen Antikörpers gegen NEK1

Eine weitere funktionelle Charakterisierung der in dieser Arbeit identifizierten NEK1 Mutationen auf Proteinebene in Immunfluoreszenz- und Western Blot Analysen bedarf eines spezifischen NEK1 Antikörpers. Der käuflich erwerbbare NEK1 Antikörper (AP15020PU-N, Kaninchen, Acris) zeigte in Vorarbeiten keine spezifische Färbung in Immunfluoreszenz- analysen und keine spezifische Banden im Western Blot [119]. Deshalb wurde ein polyklonaler Antikörper gegen das humane NEK1 Protein im Rahmen einer Kooperation mit dem Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen hergestellt (4.16). Als Epitop-Bereich wurde eine 444 bp große Sequenz (1759–2202 bp NM_012224.2 Exon 20-24, kodierend für Aminosäuren 587-734 NP_036356.1) ausgewählt, die in allen 5 bis jetzt bekannten NEK1 Isoformen vorhanden ist und C-terminal zu der in verschiedenen Proteinen hochkonservierten Kinase-Domäne lokalisiert ist (Abb. 21).

Abb. 21 NEK1 Domänen-Struktur mit Lokalisation des Antikörper-Epitops NEK1-H3T1 Der Epitop-Bereich des NEK1 Antikörpers H3T1 liegt in der Coiled-coil Domäne (Exon 20-24 NM_012224.2, NP_036356.1 AS 587-734) und deckt alle 5 bis jetzt bekannten NEK1 Isoformen (NM_001199397.1, NM_012224.2, NM_001199398.1, NM_001199399.1, NM_001199400.1) ab. Die Epitop-Region wurde mit dem UCSC Genome Browser basierend auf GRCh37/hg19 dargestellt. Proteinschema verändert nach [12], NLS= nuclear localization signal; NES = nuclear export sequence.

Dieser Epitop-Bereich wurde mittels PCR aus dem Vektor hNEK1pENTR221 amplifiziert und in einen Expressionsvektor pGEX-4T3 kloniert (4.16.1). Die Expression des rekombinanten Proteins (NEK1-H3-GST ca. 44 kDa) erfolgte für 5 Stunden in BL21 E.coli und wurde über GST-Sepharosebeads Säulen aufgereinigt (NEK1-H3 ca. 17 kDa) (Abb. 22 A). Von der Firma Pineda Antikörper-Service (Berlin) wurden uns Präimmunseren von 8 Kaninchen zur Verfügung gestellt, welche im Western Blot (Abb. 22 B) gegen rekombinantes NEK1 Protein

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Ergebnisse bzw. Zelllysat aus Fibroblasten getestet wurden. Kaninchen 1 und 8 wurden für die Immunisierung mit rekombinatem NEK1-H3 Protein ausgewählt, da auf dem Western Blot bei diesen Tieren keine Banden auf der erwarteten NEK1 Höhe zu sehen waren (Abb. 22 B, Sterne). Bei den verbliebenen 6 Kaninchen konnten schon im Vorfeld viele Banden detektiert werden, was für das Vorhandensein von Antikörpern gegen NEK1 vor der Immunisierung in diesen Tieren spricht.

Abb. 22 Expression rekombinantes NEK1-H3 Protein und Test Präimmunseren (A) Expression von rekombinanten NEK1-H3-GST in BL21 E.coli: Starke Expression des 44 kDa NEK1-H3-GST in Vor- und Nachsäule, nach Thrombinverdau und Elution erhält man 17 kDa NEK1-H3 Protein (Eluat 1-6), ca. 25 µg Protein pro Spur aufgetragen, ST= PageRuler unstained (B) Test der Präimmunseren von 8 Kaninchen im Western Blot: 1 µg rekombinantes humanes NEK1-H3 (1), 40 µg Zelllysat humane Kontroll-Fibroblasten K4 (2), 1 µg rekombinantes murines Nek1-M4 (3), 40 µg Zelllysat Maus 3T3 Fibroblasten (4). Präimmunseren 1:100, ST= PageRuler prestained. Präimmunseren von Tier 1 und 8 zeigen keine Banden auf erwarteter NEK1 Größe und sind somit geeignet für Immunisierung (*).

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Ergebnisse

Nach einer Immunisierung von 90 Tagen wurden mir Seren der beiden Kaninchen 1 und 8 überlassen, um in Immunfluoreszenzanalysen und Western Blot die Immunantwort zu testen. Es zeigte sich, dass im Vergleich zum Präimmunserum nach 90 Tagen Immunisierung das rekombinante NEK1-H3 Protein bei ca. 17 kDa im Western Blot detektiert werden konnte (Abb. 23 A, Stern). In Immunfluoreszenzaufnahmen von Kontroll-Fibroblasten konnten am 90. Immunisierungstag sowohl im Cytoplasma als auch verstärkt an den Centrosomen ein NEK1 Signal detektiert werden (Abb. 23 B, weiße Kästen).

Abb. 23 Vergleich Präimmunserum zu 90. Tag Immunisierung im Western Blot und Immunfluoreszenz (A) Test des Präimmunserums von Tier 1 im Western Blot: 1 µg rekombinantes NEK1-H3 Protein (1), 40 µg Zelllysat humane Kontroll-Fibroblasten K4 (2), Präimmunseren 1:250, ST= PageRuler prestained. Präimmunserum von Tier 1 zeigt keine Banden auf erwarteter NEK1 Größe, nach 90 Tagen Immunisierung wird ein starkes Signal des rekombinanten NEK1-H3 Proteins (*) bei ca. 17 kDa detektiert. (B) Immunfluoreszenzaufnahmen an humanen Kontroll-Fibroblasten K4 1 Tag unter Normalmedium: Nach 90 Tagen Immunisierung deutliche Lokalisation von NEK1 sowohl im Cytoplasma als auch an den Centrosomen (weiße Kästen) erkennbar. Keine Färbung der Centrosomen und schwächere Färbung im Cytoplasma beim Ansatz mit Präimmunserum zu erkennen. Serum je 1:100, grün = NEK1-H3T1, rot = acetyliertes α Tubulin (1:800, Marker für Cytoskelett), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

Aufgrund einer guten Immunantwort von Tier 1 und einer spezifischen NEK1 Lokalisation an den Centrosomen wurde das Serum von Tier 1 über NHS-activated HiTrap Säulen aufgereinigt und die Spezifität des so erhaltenen polyklonalen Antikörpers gegen NEK1 in weiteren Experimenten getestet. Dafür wurde von Kontroll-Fibroblasten und Patienten-Fibroblasten [P1, p.(Arg127*)] nach 5 Tagen Inkubation unter Normal- und Hungermedium Zelllysat hergestellt und im Western Blot getestet. Bei Kontroll-Fibroblasten und HEK293T Zellen wurde die full-length NEK1 Bande unter beiden Nährbedingungen bei ca. 140 kDa detektiert, diese Bande fehlte bei den Patienten-Zellen (Abb. 24 A). Durch die nonsense Mutation [c.379C>T, p.(Arg127*)] kommt es zum nonsense mediated mRNA decay und es wird kein full-length NEK1 Protein gebildet. Zusätzlich erkennt man noch Banden auf Höhe von 100 und 50 kDa, welche entweder

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Ergebnisse ein unspezifisches Signal darstellen oder kleinere bis jetzt noch nicht bekannte Isoformen von NEK1. Mit dem NEK1-H3T1 Antikörper führte ich außerdem eine Immunopräzipitation durch und konnte eine Anreicherung des NEK1 full-length Proteins bei ca. 140 kDa im Western Blot nachweisen (Abb. 24 B), im Vergleich dazu zeigten eingesetzte Kontroll-IgG keine Bande auf der erwarteten Höhe.

Abb. 24 Test des NEK1-H3T1 Antikörpers im Western Blot und Immunopräzipitation (A) Western Blot: Kontroll-Fibroblasten (K) und HEK293T (H) zeigen sowohl unter Normal- (5) als auch Hungermedium (0) eine full-length NEK1 Bande bei ca. 140 kDa, diese fehlt bei Patienten-Fibroblasten [P: c.379C>T, p.(Arg127*)]. 30 µg Protein pro Spur, NEK1-H3T1 1:2000, β-Actin 1:3000, ST = peqGold Marker V (verändert nach [8]). (B) Western Blot: Immunopräzipitation an GST-Sepharose Beads mit 6 µl NEK1- H3T1 (N) ergab eine Anreicherung des full-length NEK1 Proteins bei ca. 140 kDa, keine Bandendetektion auf erwarteter Höhe bei Kontroll-Ansätzen mit 15 µl Kontroll-IgG (K) und 10 µl GFP-IgG (G). H = HEK293T Lysat (5 % Input), NEK1-H3T1 1:1000, ST = peqGold Marker V.

Verschiedene Studien konnten zeigen, dass murines Nek1 an den Centrosomen lokalisiert ist und aufgrund eines Cilienlokalisationsignales in der Coiled-coil Domäne von mNek1 eine Lokalisation am Basalkörper des primären Ciliums nachzuweisen ist [156-158]. Mit Immunfluoreszenzaufnahmen sollte die Lokalisation von humanen NEK1 mittels NEK1-H3T1 Antikörper am Basalkörper des primären Ciliums in Fibroblasten von Patient P1 und Kontrollen gezeigt werden. Nach 5 tägiger Inkubation der Zellen unter Hungermedium, um die Ausbildung von primären Cilien zu induzieren, wurden die Fibroblasten für Immunfluoreszenzaufnahmen fixiert (4.12.1) und zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Die Kontroll-Fibroblasten zeigten eine Lokalisation von NEK1 im Cytoplasma und in 82 % der ausgezählten Zellen eine Lokalisation am Basalkörper der primären Cilien bzw. an den Centrosomen (Abb. 25). In Patientenzellen konnte auch eine Lokalisation von NEK1 im Cytoplasma nachgewiesen werden, aber in 74 % der gezählten Zellen war kein oder nur ein schwaches und diffuses NEK1 Signal am Basalkörper bzw. Centrosomen zu erkennen (χ2-Test, p-Wert ˂ 0,001). Die Patientenzellen wiesen eine verringerte Cilienanzahl und Cilienlänge auf und zusätzlich eine stärkere Anfärbung des Cytoskeletts (Abb. 25). Jeweils 4 exemplarische Übersichtsbilder, anhand derer die

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Ergebnisse

Auszählungen von 68 (Patient P1) bzw. 66 (Kontrolle) Zellen vorgenommen wurden, sind im Anhang (13.8, Abb. 55 und Abb. 56) abgebildet.

Abb. 25 Lokalisation von NEK1 in Kontroll- und Patienten-Fibroblasten (P1) mittels Immunfluoreszenz NEK1 ist in Kontroll-Fibroblasten im Cytoplasma und verstärkt am Basalkörper des primären Ciliums lokalisiert (Pfeil). Bei den Patienten-Fibroblasten (P1) kann auch ein Signal im Cytoplasma detektiert werden, die Lokalisation am Basalkörper ist schwächer und diffus (Pfeil). Zusätzlich erkennt man in Patientenzellen eine stärkere Anfärbung des Cytoskeletts (posttranslationale Polyglutamylierung der Tubuline). Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium für Induktion des primären Ciliums. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

Um die Spezifität des NEK1-H3T1 Antikörpers zu testen, wurde für einen Absättigungstest der Antikörper zusammen mit 100 µg rekombinanten NEK1-H3 Protein in 100 µl Blockierungslösung verdünnt. Die Ansätze wurden für 60 Min. auf Eis inkubiert, wodurch sich Antigen-Antikörper-Komplexe ausbilden können und somit der Antikörper nicht mehr an das NEK1 Epitop binden kann. Immunfluoreszenzaufnahmen zeigten, dass durch die Absättigung mit NEK1-H3 Protein und Färbung mit NEK1-H3T1 Antikörper kein Signal mehr im Cytoplasma und am Basalkörper nachgewiesen werden konnte. Die Bilder des Absättigungstests sind im Anhang (13.9, Abb. 57) abgebildet. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass der selbst hergestellte polyklonale NEK1-H3T1 Antikörper eine hohe Spezifität für das NEK1 Antigen aufweist und in verschiedenen biochemischen Methoden wie Immunfluoreszenz, Western Blot und Immunopräzipitation eingesetzt werden kann.

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Ergebnisse

6.4. Identifikation direkter Interaktionspartner von NEK1 mit dem Hefe- 2-Hybrid-System

Für die gezielte Suche nach Interaktionspartnern von NEK1 wurde ein Hefe-2-Hybrid-Screen mit einer murinen Retina cDNA Library in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Gießl (Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen) durchgeführt. Das Hefe-2-Hybrid-System basiert auf der durch den Transkriptionsfaktor GAL4 vermittelten Aktivierung spezifischer Hefe- Reportergene (4.19). Eine Expression wird durch die Interaktion eines bekannten Proteins (Bait, NEK1) mit einem potentiellen Interaktionspartner (Prey), welche jeweils mit der transkriptionsaktivierenden Domäne (AD) bzw. der DNA Bindungsdomäne (DBD) des GAL4- Transkriptionsfaktors fusioniert sind, initiiert. Ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor wird gebildet, sobald die Domänen in räumliche Nähe zueinander gebracht werden. Dadurch wird der Nachweis der Protein-Protein-Interaktion durch die Expression von Reportergenen ermöglicht.

6.4.1. Analyse der NEK1 Bait Konstrukte hinsichtlich intrinsischer Autoaktivität

Für den Y2H-Screen wurden als Bait Konstrukte vier unterschiedlich große Fragmente des NEK1 Proteins (Teil 1-4) und das full-length NEK1 Protein verwendet (Abb. 26). Diese wurden in pBD-GAL4-Cam/DEST Vektoren kloniert und zusammen mit der DBD Domäne des Transkriptionsfaktors GAL4 im Hefestamm AH109 als Fusionsprotein exprimiert. Bevor die Bait Proteine im Hefe-2-Hybrid-Screen verwendet werden können, muss überprüft werden, ob diese eine intrinsische Autoaktivität aufweisen, wodurch ohne Anwesenheit eines Prey Proteins die Expression der Reportergene aktiviert werden würde. Dafür wurden die Hefen auf SD- Platten ohne Leucin (-L), Tryptophan (-T), Histidin (-H) und Adenin (-A) ausgestrichen.

Abb. 26 NEK1 Domänen-Struktur mit Lokalisation der Y2H Bait Abschnitte (Teil 1-4) Für die Analyse erfolgte sowohl die Klonierung des full-length Transkripts, als auch von insgesamt 4 Teilen, die zusammen das NEK1 Transkript abdecken, in den pBD-GAL4-Cam Vektor [Teil 1 = Kinase- und Basische Domäne; Teil 2 = Coiled-coil Domäne (CC1-4). Teil 3 und 4 = C-terminal vorhergesagte NES (nuclear export sequence) und Coiled-coil Bereich (CC5)]. Proteinschema verändert nach [12].

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Ergebnisse

Der Hefestamm AH109 ist auxotroph für Leucin, Tryptophan, Histidin und Adenin. Da der transformierte pBD-GAL4-Cam Vektor ein Gen für die Synthese von Tryptophan aufweist, können sich die Hefen nur auf SD/-T Platten vermehren. Auf Mediumplatten ohne Leucin, Histidin und Adenin können die Hefeklone nur wachsen, wenn aufgrund intrinsischer DNA Bindungseigenschaften des Bait Proteins die Transkription der Reportergene initiiert wird.

Abb. 27 Analyse der NEK1 Bait Konstrukte hinsichtlich intrinsischer Autoaktivität Die NEK1 Bait Konstrukte (Teil 1-4 & full-length) sowie das Kontrollprotein p53 wurden in AH109 Hefen transformiert und das Wachstum auf Mangelmediumplatten ohne Leucin (-L), Tryptophan (-T), Histidin (-H) und Adenin (-A) analysiert. Alle verwendeten Bait Konstrukte konnten nur auf SD/-T Platten wachsen, es liegt keine intrinsische Autoaktivität vor.

Bei den NEK1 Bait Konstrukten (Teil 1-4 und full-length) konnte eine intrinsische Autoaktivität ausgeschlossen werden, da diese analog zur Positivkontrolle p53 nur auf SD/-T Platten gewachsen sind und kein Wachstum auf SD-LT/LTH/LTHA Platten zeigten (Abb. 27). Aufgrund dieser Ergebnisse konnten alle Bait Konstrukte für die nachfolgenden Y2H-Screens verwendet werden.

92

Ergebnisse

6.4.2. Hefe-2-Hybrid-Screen (Y2H) Mit Hilfe eines Y2H-Screens sollte gezielt nach ciliären und Basalkörper-assoziierten Interaktionspartnern von NEK1 gesucht werden. Dafür wurde eine bereits im Vorfeld hergestellte murine retinale cDNA-Bank [126, 127] verwendet. Der pGADT7-Rec Vektor wurde für die Herstellung der Prey Konstrukte verwendet, der die potentiellen Interaktionspartner als Fusionsprotein mit der AD-Domäne von GAL4 exprimiert und zusätzlich die Synthese der Aminosäure Leucin ermöglicht. Um für den Y2H-Screen das Prinzip des matings (Verschmelzen haploider Hefezellen zu diploiden Zellen) anwenden zu können, wurden die Prey Konstrukte in Hefen des Stammes Y187 transformiert. Voraussetzung für das mating zweier Hefen ist dabei der jeweilige Paarungstyp (mating type) [125, 159]. Bei den in dieser Arbeit verwendeten S. cerevisiae Stämmen AH109 und Y187 werden zwei verschiedene mating types MAT a und MAT α miteinander fusioniert. Zu Beginn des Hefe-2- Hybrid-Screens wurden die Bait Konstrukte NEK1 Teile 1-4 und full-length NEK1 mit den Prey Konstrukten der murinen retinalen cDNA-Bank vereinigt und das mating der beiden Hefestämme ermöglicht. Als Bait Kontrolle wurde RPGRIP1 (retinitis pigmentosa GTPase regulator interacting protein 1) verwendet, welches freundlicherweise von Prof. Dr. Ronald Roepman (Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Netherlands) zur Verfügung gestellt wurde. Nach etwa 20-24 Stunden wurde das erfolgreiche mating unter dem Mikroskop überprüft, wobei eine typische Hefezygote eine dreiteilige Struktur aufweist, welche einem Mickey Mouse Kopf ähnelt. Diese erfolgreichen Paarungsansätze konnten danach auf SD/-LTHA Mangelmedium ausplattiert werden (Abb. 10). Die Hefestämme Y187 und AH109 zeigen Auxotrophie für Leucin, Tryptophan, Histidin und Adenin und können deshalb nicht auf SD/-LTHA Mangelmedium wachsen. Diploide Hefezellen enthalten sowohl ein Prey Konstrukt als auch das NEK1 Bait, wodurch sie den Mangel an Leucin und Tryptophan aufgrund der in den transformierten Vektoren enthaltenen Selektionsmarkern kompensieren können. Dabei wird die Expression der GAL4- gesteuerten Reportergene aktiviert, sobald es zu einer Interaktion zwischen den Proteinen kommt. Somit kann fehlendes Histidin und Adenin synthetisiert werden und das Wachstum der Hefen wird somit auf SD/-LTHA Mangelmedium ermöglicht. Die verschiedenen Ansätze wurden auf diesen SD/-LTHA Platten bis zu 18 Tage bei 30 °C inkubiert bis die Hefekolonien eine ausreichende Größe erreicht hatten. Zur weiteren Selektion wurden die Hefeklone auf neue SD/-LTHA Platten im Raster ausgestrichen und von diesen dann Klone für Hefe-PCRs gepickt (Abb. 10).

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Ergebnisse

Bei NEK1 Teil 1 sind 98 Kolonien auf den Selektionsplatten gewachsen, für Teil 2 wurden insgesamt 200 Klone gesammelt. 66 mögliche Interaktoren konnten bei NEK1 Teil 3 identifiziert werden, für Teil 4 konnten 48 Klone überführt werden. Beim Ansatz mit full-length NEK1 sind 159 Klone auf den Mangelmediumplatten gewachsen. Die Platten mit der Positiv- Kontrolle RPGRIP1 waren bereits nach kurzer Inkubationszeit mit einem dichten Rasen an Hefekolonien bewachsen, was für ein sehr effizientes mating der Hefestämme und eine erfolgreiche Durchführung der Y2H-Screens spricht. Daher wurden von diesem Prey Konstrukt repräsentativ 100 Klone ausgewählt. Die in den Prey Plasmiden enthaltenen cDNAs wurden mittels Hefe-PCR amplifiziert, sequenziert und durch Datenbankrecherche positive Y2H-Klone analysiert.

6.4.3. Identifikation der NEK1 Interaktionspartner mittels Datenbankanalyse Zur Identifizierung der in den Hefe Vektoren enthaltenen cDNA Targets wurden die mittels Hefe-PCR erhaltenen Fragmente sequenziert und sowohl auf Nukleotid- als auch auf Proteinebene mittels Datenbankvergleich ausgewertet. Dabei wurde überprüft, ob sich das cDNA-Fragment in-frame, d. h. im richtigen Leserahmen des Vektors (Sequenzabschnitt TGGCCATTATGG, beide TGG in-frame) und im translatierten Bereich der mRNA eines Zielgenes befand. Wurden diese Kriterien nicht erfüllt, wurde der Hefeklon verworfen. Des Weiteren wurden schon in anderen Publikationen als falsch positive annotierte Proteine, z. B. Proteine des Proteasoms, Zinkfinger- und Hitzeschockproteine, ribosomale Proteine sowie Untereinheiten der Cytochrom C Oxidase, in Folgeexperimenten nicht weiter untersucht [124]. Bei NEK1 Teil 1 wurden 98 Klone sequenziert, von denen 18 einem Gen zugeordnet werden konnten. Von den 200 Hefekolonien, die bei NEK1 Teil 2 auf den SD/-LTHA Platten gewachsen waren, wurden 49 potentielle Interaktionspartner identifiziert, 151 Klone lieferten kein eindeutiges Ergebnis. Bei NEK1 Teil 3 wurden 66 Hefekolonien sequenziert, 18 mit positivem, 48 mit negativem Ergebnis. Die 48 Hefeklone von NEK1 Teil 4 ergaben nur ein Interaktionsprotein, bei full-length NEK1 ergab die Analyse von 159 Hefekolonien 4 verschiedene potentielle Interaktionspartner. Es gab 6 Proteine, die in mehr als einem NEK1 Teil identifiziert wurden (ACADVL, ATP5A1, BAHCC1, COX2, PSMB1, UNC119), außerdem konnten manche Klone nur einmal bzw. bis zu 13 mal (YWHAG) nachgewiesen werden. In summa konnten 84 Interaktionspartner in allen NEK1 Teilen identifiziert werden, abzüglich der murinen Gene ohne humanes Ortholog und ohne falsch positive Klone, verblieben insgesamt 72 potentielle Interaktoren. Die für das jeweilige NEK1 Bait Konstrukt identifizierten potentiellen Interaktionspartner sind im Anhang (13.16, Tab. 21) aufgeführt. 94

Ergebnisse

6.4.4. Analyse der identifizierten NEK1 Interaktionspartner Für eine weitere Analyse der im Hefe-2-Hybrid-Screen identifizierten NEK1 Interaktionspartner wurde zunächst eine Ciliengenliste mit annotierten und potentiellen Ciliengenen erstellt, danach die Hefe Interaktionspartner mit Hilfe von ENDEAVOUR in eine Rangliste eingeteilt, mit der Ciliengenliste abgeglichen und mittels Ingenuity Pathway Analyse (IPA) die interessantesten mit NEK1 interagierenden Proteine näher eingegrenzt.

6.4.4.1. Erstellung einer Ciliengenliste Die Forschung an Cilien und Ciliopathien und die rasante Entwicklung der Next Generation Sequencing Technologie hat in den letzten Jahren viele neue Ciliengene hervorgebracht, deren Funktionsverlust zu Veränderungen in der Cilienmorphologie oder -anzahl bzw. zu Mislokalisation von Cilienproteinen führte und damit das Ciliopathiespektrum immer mehr erweiterte [63]. Für eine übersichtliche Darstellung von cilien-assoziierten Genen bzw. potentiellen Ciliengenen habe ich eine Ciliengenliste anhand verschiedener Datenbanken und Literaturrecherche erstellt (4.17). Die Gesamtanzahl der Ciliengene bzw. Kandidatengene belief sich während des Projektzeitraumes auf 1032 Gene (13.15, Tab. 20), für die Gennamen, cilien-spezifische Publikationen, Mausmodelle, Einträge in OMIM, MedGen und HGMD für schon bekannte annotierte Krankheiten aufgelistet wurden. Für mehr als 440 Gene konnte ich auch mittels PubMed Recherche cilien-spezifische Publikationen einfügen. Zusätzlich wurde mit der Cildb V3 Datenbank eine Einteilung in verschiedene Cilien-Evidenzen (Wert 1 bis ≥10, siehe 4.17) vorgenommen. 123 Gene weisen eine Cilien-Evidenz von ≥10 auf, 315 Gene sind mit einem Evidenzwert ≥5 annotiert. Des Weiteren sind 410 Gene mit Einträgen in HGMD gelistet, wobei über 150 eindeutig in die Kategorie Ciliopathien eingeteilt werden können (z. B. Kurzrippen-Polydaktylie Syndrom, Bardet-Biedl Syndrom, Joubert-Syndrom, Retinitis pigmentosa, primäre ciliäre Dyskinesie, Nephronophthise, etc.). Auch die 20 bis jetzt bekannten skelettalen Ciliopathie-Gene (3.4, Tab. 1) - auf die in dieser Arbeit der Fokus gelegt ist - sind in der Ciliengenliste annotiert. Diese Ciliengenliste konnte für den nächsten Schritt der Datenfilterung mittels ENDEAVOUR herangezogen werden. Die vollständige Ciliengenliste ist im Anhang (13.15, Tab. 20) aufgeführt.

6.4.4.2. Erstellung einer Rangliste mit ENDEAVOUR Die große Anzahl der im Y2H-Screen identifizierten NEK1 Interaktionspartner sollte mittels ENDEAVOUR Software in eine Rangliste eingeteilt werden (4.18). Dabei wurde der Fokus auf

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Ergebnisse ciliäre und Basalkörper-assoziierte Interaktionspartner von NEK1 gelegt und als Training Genes die Gene aus meiner Ciliengenliste (13.15, Tab. 20) verwendet. Die Werte des kompletten Global Rankings der ENDEAVOUR-Resultate befindet sich im Anhang (13.16, Tab. 21). Die Top 5 Gene sind KIF3A, ACTG1, UNC119, RAB11A und DYNC2LI1 (Tab. 7). Die Interaktion zwischen der Coiled-coil Domäne von NEK1 und KIF3A wurde schon in einem Y2H-Screen beschrieben [160]. In dem von mir durchgeführten Hefe-2-Hybrid-Screen erfolgte die Interaktion auch mit NEK1 Teil 2, welches der Coiled-coil Domäne (Abb. 26) entspricht, und bestätigt somit die von Surpili et al. gezeigte Interaktion.

Tab. 7 Globale Priorisierung der NEK1 Interaktionspartner mit ENDEAVOUR

Genname NEK1 Bait # Klone Rang Werte KIF3A (*) Teil 2 1 1 0,000156 ACTG1(*) Teil 1 1 2 0,0157 UNC119 (*) Teil 2+3 3 3 0,0296 RAB11A (*) Teil 2 2 4 0,0435 DYNC2LI1(*) Teil 1 2 5 0,0472 OSBPL1A Teil 2 1 6 0,0682 MYL6 Teil 2 1 7 0,0786 PIAS4 Teil 1 1 8 0,0794 KPNA4 Teil 2 2 9 0,0808 NEFL Teil 2 1 10 0,0878 (*) in Ciliengenliste inkl. PMID annotiert; je niedriger der Wert, desto höher das Ranking

ACTG1, UNC119 und RAB11A sind schon in der Literatur als bekannte Ciliengene gelistet [161-163], die Interaktion dieser Proteine mit NEK1 wurde bis jetzt noch nicht beschrieben. DYNC2LI1 wurde als interessantes Cilienprotein ausgewählt, da es im cytoplasmatischen Dynein-2 Komplex lokalisiert ist, bei dem schon andere Untereinheiten (DYNC2H1, TECTEX1D2, WDR34+60) mit skelettalen Ciliopathien assoziiert wurden [50]. Auffällig ist, dass in den Top 10 Genen, hauptsächlich die NEK1 Interaktionen mit Teil 1 und 2 gelistet sind (Tab. 7), welche der Kinase-, Basischen- und Coiled-coil Domäne entsprechen, was für eine hohe Wichtigkeit dieser Domänen für Interaktionen mit anderen Proteinen spricht.

6.4.4.3. Einteilung der NEK1 Interaktionspartner nach Cilien-Evidenz Als nächsten Schritt habe ich die Liste der Y2H NEK1 Interaktionspartner mit meiner Ciliengenliste abgeglichen und mittels Cildb V3 Cilien-Evidenzen zum jeweiligen Gen annotiert (13.16, Tab. 21). Insgesamt 12 Interaktionspartner waren schon als annotierte oder potentielle Ciliengene in der Ciliengenliste annotiert. 22 NEK1 Interaktionspartner hatten nach Abfrage in Cildb V3 einen Cilien-Evidenzwert von ≥ 3, d. h. je höher dieser Wert ist, desto öfter 96

Ergebnisse wurden in verschiedenen Spezies und in verschiedenen Studien diese Gene als cilien-assoziiert beschrieben. Niedrigere Evidenzwerte zwischen 0 und 2 zeigen nur an, dass noch zu wenige Daten in verschiedenen Studien erhalten wurden, um eine Beteiligung dieser Gene bei der Ciliogenese nachzuweisen (4.17). Aufgrund der annotierten Cilien-Evidenzen der Cildb V3, Literaturrecherche und Daten aus meiner Ciliengenliste habe ich die Y2H Interaktionspartner weiter in 2 Kategorien eingeteilt: 1) cilien-spezifisch publiziert

2) Cilien-Evidenz ≥ 3 und Mausphänotyp mit überlappenden Merkmalen zum SRPS Krankheitsbild, z. B. Letalität (Tab. 8).

Tab. 8 Einteilung der NEK1 Interaktionspartner nach Cilien-Evidenz

1) Cilien-spezifisch publiziert 2) Cilien-Evidenz ≥ 3 + Mausphänotyp NEK1 # Cilien- NEK1 # Cilien- Gen Bait Klone Evidenz Gen Bait Klone Evidenz ACTG1 (*) Teil 1 1 ≥10 ATP5A1 Teil 1+3 2 5 ARHGAP35 Teil 2 2 1 DYNC2LI1 (*) Teil 1 2 ≥10 CD63 Teil 2 1 1 MCRS1 (*) Teil 2 1 3 KIF3A (*) Teil 2 1 6 OSBPL1A Teil 2 1 5 NUP98 Teil 2 1 3 PDIA3 (*) Teil 2 2 6 RAB11A (*) Teil 2 2 3 SMG1 Teil 3 1 3 UNC119 (*) Teil 2+3 3 8 UBR4 (*) Teil 2 1 5 VCP Teil 2 1 8 (*) in Ciliengenliste inkl PMID annotiert (13.15, Tab. 20); 1) ARHGAP35 (26859289), CD63 (20634433), NUP98 (26493400) und VCP (26389662) waren zum Abfragezeitpunkt noch nicht in Ciliengenliste aufgeführt. 2) Mausphänotypen: MGI:88115, MGI:1913996, MGI:1858420, MGI:1927551, MGI:95834, MGI:1919742, MGI:1916366

8 NEK1 Interaktionspartner sind schon in verschiedenen Publikationen als Cilien-assoziierte Gene gelistet (Kategorie 1), da die Autoren entweder eine Lokalisation & Funktion am Cilium nachweisen oder das Phänotypenspektrum der Ciliopathien durch Mutationen in diesen Genen erweitern konnten. Bei ARHGAP35 und CD63 konnte trotz eines niedrigen Cilien- Evidenzwertes eine Beteiligung an der Ciliogenese nachgewiesen werden [164, 165]. 7 Gene wurden aufgrund von einer Cilien-Evidenz von ≥ 3 und einem Mausphänotyp (z. B. embryonal letal) als Kandidaten-Ciliengene ausgewählt (Kategorie 2). Der interessanteste Kandidat DYNC2LI1 hat von den in Kategorie 2 gelisteten Genen den höchsten Cilien- Evidenzwert von ≥10. Dync2li1 knockout Mäuse (Dync2li1tm1Aar) versterben embryonal vor Tag 11,5 und weisen Neuralrohrdefekte zusätzlich zu einer Vielzahl von weiteren Entwicklungsstörungen auf [153].

97

Ergebnisse

Aus den in den zwei Kategorien gelisteten 15 Genen, sind 6 Interaktionspartner (ACTG1, DYNC2LI1, KIF3A, OSBPL1A, RAB11A und UNC119) auch unter der Top 10 ENDEAVOUR Rangliste aufgeführt (Tab. 7). Die Kombination aus hohem Cilien-Evidenzwert und hohem Rang in der ENDEAVOUR Liste erleichtert die Kategorisierung der NEK1 Interaktionspartner und grenzt die interessantesten Kandidaten weiter ein.

6.4.4.4. Ingenuity Pathway Analyse mit Interaktionspartnern von NEK1 Eine weitere Möglichkeit die identifizierten Proteine, die mit NEK1 interagieren, näher zu charakterisieren ist die Nutzung der Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software, um eine Anreicherung der Y2H-Gene in verschiedenen Signalwegen graphisch darstellen zu können. Dazu wurden die Y2H Genliste in IPA hochgeladen und eine Core Analyse (mit direkten und indirekten Interaktionen, max. 35 Molekülen/Netzwerk, alle in IPA hinterlegten Datenquellen, mit hoher vorhergesagter Konfidenz bzw. experimentell bestätigt, Spezies Mensch und Maus, alle Mutationstypen) durchgeführt. Dies ergab eine Anreicherung der Y2H Interaktionspartner in 5 Hauptnetzwerken:

1) Tissue Morphology, Metabolic Disease, Molecular Transport 2) Auditory Disease, Neurological Disease, Hereditary Disorder 3) Cell Morphology, Cellular Assembly and Organization, Cellular Development 4) Embryonic Development, Organ Development, Organ Morphology 5) Cell Death and Survival, Cellular Function and Maintenance, Embryonic Development

Im Hauptnetzwerk 3 werden 16 Hefe Interaktionspartner gelistet (grau), und ihre Verbindungen zu einander, welche über 18 verschiedene Proteine (weiß) vernetzt sind. 4 von den in diesem Netzwerk aufgeführten Genen (NEK1, KIF3A, CTDSP1 und TM2D1) sind auch in meiner Ciliengenliste annotiert. Deutlich ersichtlich wird hier die schon bekannte Interaktion von NEK1 mit KIF3A, welches wiederum über 3 Knotenpunkte mit anderen Y2H Interaktionspartner verknüpft ist (Abb. 28). Die in diesen Netzwerken annotierten Gene sind wichtig für die zelluläre Entwicklung, Zellmorphologie, Embryonalentwicklung, Organentwicklung, Zelltod etc., welche gut in Einklang mit den Entwicklungsdefekten von Ciliopathien, insbesondere der SRPS, gebracht werden kann. Alle 5 Hauptnetzwerke sind im Anhang (13.10) aufgelistet.

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Ergebnisse

Abb. 28 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H Interaktionspartner Hauptnetzwerk 3 Darstellung von 16 Hefe-Interaktionspartnern von NEK1 (grau) in einem Netzwerk und verschiedenen Genen (weiß), über welche Verknüpfungen über verschiedene Knotenpunkte erstellt wurden. Die bekannte Interaktion von NEK1 und KIF3A und in Ciliengenliste aufgeführte Gene sind blau hinterlegt.

Die 5 Hauptnetzwerke geben einen guten Überblick über die Verbindungen der Y2H Interaktionspartner in verschiedenen Signalwegen. Für eine detailreichere Analyse dieser Netzwerke wurden die Daten zusätzlich nach drei Kategorien gefiltert:

1) Cell death, organismal death, death of embryo und apoptosis, da die in dieser Arbeit untersuchten SRPS zu den letalen Osteochondrodysplasien gezählt werden. 2) Transport of protein und import of protein, da für den Auf- und Abbau des primären Ciliums während der Ciliogenese verschiedene Proteine benötigt werden, welche zu ihrem Zielort transportiert werden müssen. 3) Formation of primary cilia, lack of embryonic cilia und quantity of cilia, da NEK1 zu den Ciliengenen gezählt wird und potentielle Interaktionspartner auch am Cilium lokalisiert sein könnten.

Von den im Hefe-2-Hybrid-Screen identifizierten Proteinen konnten mit diesen Filterungsschritten 47 Gene in einem Netzwerk dargestellt werden (Abb. 29), wobei 8 cilien- 99

Ergebnisse spezifisch publizierte Gene in orange und 6 Kandidatengene mit Cilien-Evidenz ≥3 (Tab. 8) in grün markiert sind. In dieses Netzwerk kann auch ARHGAP10 (Abb. 29) eingeordnet werden, welches in der RNA-Sequenzierung von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium differentiell exprimiert ist (6.5.4.1).

Abb. 29 Ingenuity Pathway Analyse – Filterung der Y2H Daten nach Kategorien Die erhaltenen Daten der im Y2H-Screen identifizierten NEK1 Interaktionspartner wurden mittels Ingenuity Pathway Analyse in 3 Kategorien (Zelltod, Proteintransport, Cilium) weiter gefiltert. Es konnnten insg. 47 NEK1 Interaktionspartner (grau) in einem Netzwerk zusammengefasst werden, wobei 8 bekannte cilien-spezifisch publizierte Gene in orange, 6 Kandidatengene (Cilien-Evidenz ≥3 + Mausphänotyp) in grün dargestellt sind. In der Kategorie Cilium verblieben 4 Gene (roter Kasten), unter anderem das interessanteste Kandidatengen DYNC2LI1. Auch der Interaktionspartner ARGHAP10 (pink), welches unter Normalmedium in NEK1-CRISPR- Zelllinien laut RNA-Seq Daten als differentiell exprimiert gelistet ist, wird in dieses Netzwerk eingeordnet.

In diesem Netzwerk werden insg. 4 Gene (NEK1, KIF3A, ACTG1 und DYNC2LI1) zu der Kategorie 3 (Formation of primary cilia, lack of embryonic cilia und quantity of cilia) eingeordnet, wobei 3 Gene schon bekannte Ciliengene sind und DYNC2LI1 ein ciliäres Kandidatengen (Abb. 29). DYNC2LI1 wurde für weitere Experimente als interessantester Interaktionspartner von NEK1 ausgewählt, da DYNC2LI1 in der ENDEAVOUR Liste Rang 5 belegt, eine hohe Cilien-Evidenz von ≥10 aufweist, in der Ingenuity Pathway Analyse zur Kategorie „Cilia“ eingeordnet wurde und im Y2H-Screen 2 Hefeklone mit DYNC2LI1 cDNA- Insert per Sanger-Sequenzierung identifiziert wurden. DYNC2LI1 Klon #94 deckt Exon 7-12 und Klon #95 einen größeren Bereich von Exon 7-13 ab (Abb. 31 B). Durch die Nutzung von den oben genannten Programmen konnte Schritt für Schritt die große Anzahl von 72 potentiellen NEK1 Interaktionspartnern auf wenige interessante Proteine eingegrenzt und 100

Ergebnisse

DYNC2LI1 aufgrund seiner Involvierung im cytoplasmatischen Dynein-2 Komplex und durch die Identifizierung von compound heterozygoten Mutationen in Patient P7 via Exom- Sequenzierung (6.2.1) als bester Kandidat für weitere Analysen herangezogen werden.

6.4.5. Verifizierung der Interaktion zwischen NEK1 und DYNC2LI1 Eine im Y2H-Screen identifizierte Interaktion zwischen zwei Proteinen muss in mehreren weiterführenden Experimenten bestätigt werden. Da im Hefe-Screen von zwei Klonen nur Exon 7-13 abgedeckt waren, wurde das full-length DYNC2LI1 in einen Entry Vector kloniert und mittels Gateway Technologie in pBD-GAL4-Cam/DEST und pDEST27-GST Vektoren umkloniert (4.10.2). Zur Bestätigung der im Y2H-Screen gewonnenen Ergebnisse wurde zunächst ein Hefe-2-Hybrid 1on1-Screen mit dem NEK1 Teil 1 und full-length als Bait und DYNC2LI1 full-length als Prey Protein durchgeführt. Zusätzlich sollte die Interaktion durch eine Kolokalisation (6.4.5.2) in Immunfluoreszenzaufnahmen und Ko-Immunopräzipitation (6.4.5.3) validiert werden.

6.4.5.1. Hefe-2-Hybrid 1on1-Screen Im Rahmen des Hefe-2-Hybrid 1on1-Screens wurde ein α-Galaktosidase Test zur Visualisierung von positiven Y2H-Klonen durchgeführt. Um auszuschließen, dass die Aktivierung der Reportergene auf eine Interaktion zwischen NEK1 - AD oder DYNC2LI1 - DBD zurückzuführen ist, wurden die DNA-Fragmente für den 1on1-Screen vice versa in den jeweils gegensätzlichen Vektor umkloniert. Dementsprechend wurde das 1059 bp große DYNC2LI1 Fragment mit der DBD Domäne und NEK1 Teil 1 + full-length mit der AD Domäne des GAL4-Transkriptionsfaktors fusioniert.

Analyse der 1on1-Konstrukte hinsichtlich intrinsischer Autoaktivität: Zunächst wurde auf SD-Mangelmediumplatten getestet, ob die neu hergestellten Bait- und Prey-Konstrukte (vice versa zum Y2H-Screen umkloniert) eine intrinsische Autoaktivität besitzen. Dies erfolgte analog zu dem in 6.4.1 beschriebenen Verfahren durch Ausplattieren auf SD-/L/-T/-LT/-LTH/-LTHA Platten. Hefezellen, welche mit dem pAD-GAL4-2.1 Vektor transformiert wurden, können nur auf SD/-L Mangelmedium wachsen, wohingegen Hefeklone mit dem pBD-GAL4-Cam Vektor nur in der Lage sind sich auf SD/-T Selektionsplatten zu vermehren (Abb. 30). Alle Konstrukte zeigen das erwartete Wachstumsverhalten, eine intrinsische Autoaktivierung konnte demnach ausgeschlossen werden.

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Ergebnisse

Abb. 30 Analyse der 1on1-Konstrukte hinsichtlich intrinsischer Autoaktivität Die mit der transkriptionsaktivierenden Domäne (AD) fusionierten NEK1 Teil 1 und full-length sowie das mit der DNA Bindungsdomäne (DBD) fusionierte DYNC2LI1 full-length wurden in die Hefestämme AH109 bzw. Y187 transformiert und das Wachstumsverhalten auf Mangelmedium ohne Leucin (-L), Tryptophan (-T), Histidin (-H) und Adenin (-A) analysiert. Als Kontrolle wurden das SV40 large T Antigen (AD) und das Mausprotein p53 (DBD) getestet Alle Hefeklone vermehren sich erwartungsgemäß nur auf SD/-L (AD) bzw. SD/-T (DBD) Selektionsplatten.

α-Galaktosidase Test: Zur Verifizierung der im Hefe-2-Hybrid-Screen identifizierten Interaktion zwischen NEK1 Teil 1 und DYNC2LI1 wurde die Aktivierung des MEL1 Reportergens in einem zweiten Selektionsverfahren überprüft. MEL1 kodiert für das Enzym α-Galaktosidase, welche durch Hydrolyse X-α-Gal in einen tiefblauen Farbstoff umsetzt, wodurch positive Y2H-Klone durch Blaufärbung visualisiert werden können. Für den α-Galaktosidase Test wurden die Konstrukte NEK1 Teil 1 (AD), NEK1 full- length (AD) und DYNC2LI1 full-length (DBD) in Flüssigkulturen angezogen und durch Auftropfen auf eine YPDA-Platte in entsprechender Kombination das mating ermöglicht. Die gewachsenen Hefeklone wurden dann auf Selektionsplatten mit zunehmender Stringenz überführt und zuletzt auf einer X-α-Gal-haltigen SD/-LTHA Platte ausgestrichen. Sowohl bei NEK1 Teil 1 als auch bei NEK1 full-length sind die Kolonien unter den stringenten Selektionsbedingungen gewachsen und zeigten eine Blaufärbung, welche bei NEK1 Teil 1 stärker ausgeprägt war (Abb. 31 A). Die Hefen sind also durch die Interaktion von NEK1 mit DYNC2LI1 in der Lage die GAL4-aktivierten Reportergene HIS, ADE2 und MEL1 zu exprimieren. Auffällig ist, dass der NEK1 Interaktionsbereich die Exons 7 bis 13 von 102

Ergebnisse

DYNC2LI1 abdeckt, und somit den Bereich mit einschließt, in welchen bei Patient P7 die compound heterozygoten Mutationen in DYNC2LI1 mittels Exom-Sequenzierung (6.2.1) identifiziert wurden (Abb. 31 B).

Abb. 31 α-Galaktosidase Test zur Visualisierung positiver Hefeklone (A) Zur Bestätigung der NEK1-DYNC2LI1-Interaktion wurde die Aktivierung des Hefereportergens MEL1 getestet. Die Konstrukte NEK1 Teil 1 (AD) und NEK1 full-length (AD) wurden in Kombination mit DYNC2LI1 (DBD) auf X-α-Gal-haltigen SD/-LTHA Platten ausgestrichen. Sowohl bei NEK1 Teil 1 als auch bei full-length NEK1 erkennt man eine Blaufärbung der Hefeklone, wobei die Färbung bei Teil 1 stärker ist. Die Hefeklone sind in der Lage aufgrund der NEK1-DYNC2LI1 vermittelten Aktivierung von GAL4 das MEL1 kodierte Enzym α-Galaktosidase zu exprimieren und das Substrat X-α-Gal in einen blauen Farbstoff umzusetzen. (B) Der NEK1 Interaktionsbereich (Y2H Klone 94+95) deckt Exons 7-13 von DYNC2LI1 ab, in welchem die compound heterozygoten Mutationen [c.622C>T; c.662C>T] in Patient P7 mittels Exom-Sequenzierung diagnostiziert wurden. Der Interaktionsbereich wurde mit dem UCSC Genome Browser basierend auf GRCm38/mm10 dargestellt [M.musculus: NM_172256.2; H.sapiens: NM_016008.3, NM_015522.3, NM_001193464.1].

Im Rahmen des Hefe-2-Hybrid 1on1-Screens konnte ich zeigen, dass bedingt durch eine Interaktion zwischen NEK1 Teil 1 bzw. full-length und DYNC2LI1 full-length alle Reportergene aktiviert und exprimiert wurden, wodurch das Resultat des Y2H-Screens eindeutig bestätigt werden konnte.

6.4.5.2. Kolokalisation In Immunfloureszenzanalysen kann durch die Beobachtung der räumlichen Überlappung zwischen zwei oder mehr verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen eine Kolokalisation von mehreren Zielproteinen nachgewiesen werden. So lassen sich Rückschlüsse ziehen, ob die zu untersuchenden Proteine sich im gleichen Zellkompartiment und in Nähe zueinander befinden

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Ergebnisse

[166]. Da es sich bei NEK1 um ein Cilienprotein [156-158] handelt und von DYNC2LI1 eine Lokalisation in der Basalkörperregion von primären Cilien schon beschrieben wurde [151, 152], sollte mittels Immunfluoreszenz eine Kolokalisation von NEK1 und DYNC2LI1 am Cilium nachgewiesen werden. Hierfür wurden Kontroll-Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium gesetzt, um die Ausbildung von primären Cilien zu induzieren. Danach wurden die Zellen fixiert und eine Dreifachfärbung (NEK1-H3T1, DYNC2LI1, polyglutamyliertes Tubulin) mittels Zenon Labeling Technologie durchgeführt (4.12.2). NEK1 ist im Cytoplasma lokalisiert und zeigt ein starkes Signal am Basalkörper des primären Ciliums. DYNC2LI1 zeigt auch eine Färbung des Cytoplasmas, des Zellkerns und des Basalkörpers (Abb. 32).

Abb. 32 Kolokalisation von NEK1 und DYNC2LI1 an der Basalkörperregion des primären Ciliums (A) Immunfluoreszenzaufnahmen an humanen Kontroll-Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium. Lokalisation von NEK1 sowohl im Cytoplasma als auch am Basalkörperbereich des primären Ciliums. DYNC2LI1 ist im Cytoplasma, Zellkern und am Basalkörper lokalisiert. Dreifachfärbung mittels Zenon Labeling zum Nachweis einer Kolokalisation von NEK1 und DYNC2LI1 am Basalkörper von primären Cilien (Pfeil). Grün = NEK1-H3T1 (1:250), pink = DYNC2LI1 (1:100), rot = Zenon Alexa Fluor 568 mouse IgG1 labeling reagent mit polyglutamylierten Tubulin (1:40, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 5 µm (B) Schematische Darstellung eines primären Ciliums mit Kolokalisation von NEK1 und DYNC2LI1 am Basalkörper (Cilienschema verändert nach [20]).

Mittels Zenon Labeling konnte spezifisch das Cilium angefärbt werden und gleichzeitig DYNC2LI1, obwohl beide Primärantikörper aus derselben Spezies (Maus) stammen. Durch eine Überlagerung der Emissionspektren wird eine Kolokalisation der beiden Proteine NEK1 und DYNC2LI1 in weißlich-gelb dargestellt. Eine Färbung mit Zenon ohne polyglutamyliertes Tubulin diente als Negativkontrolle, wodurch nachgewiesen wurde, dass das Zenonreagenz alleine nicht unspezifisch die primären Cilien anfärbt. Mit der Dreifachfärbung konnte ich zeigen, dass sowohl DYNC2LI1 als auch NEK1 am Basalkörper des primären Ciliums in Kontroll-Fibroblasten eine Kolokalisation zeigen (Abb. 32 A, Pfeil).

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Ergebnisse

6.4.5.3. Ko-Immunopräzipitation Um die Interaktion von NEK1 und DYNC2LI1 in einem weiteren Experiment in vitro nachzuweisen, wurde die Methode der Immunopräzipitation genutzt und von mir am Lehrstuhl für Tierphysiologie Erlangen durchgeführt. Dazu wurde NEK1-pDEST/N-SF-TAP und DYNC2LI1-pDEST27GST in HEK293T Zellen für 72 Stunden überexprimiert (qPCR: NEK1 150x, DYNC2LI1 400x) und das Proteingemisch mit gegen die gesuchten Proteine spezifischen Antikörpern NEK1-H3T1 und DYNC2LI1 inkubiert. Als Negativkontrolle dienten in einem Ansatz Kontroll-IgG aus Kaninchen. Der Proteinkomplex wiederum bindet an Protein A gekoppelte beads und kann so präzipitiert werden. Die Immunopräzipitation (IP) mit NEK1-H3T1 Antikörper zeigte im Western Blot mit NEK1-H3T1 Antikörper (Abb. 33) eine Anreicherung des full-length NEK1 (N-SF-TAP). Eine mit DYNC2LI1 Antikörper durchgeführte IP zeigte eine starke Bande auf Höhe des full-length DYNC2LI1 (GST), wobei im Vergleich zum Input von 7 % Lysat aus HEK293T eine starke Anreicherung festzustellen ist. Der mit NEK1-H3T1 präzipitierte Ansatz und mit anti-GST Antiköper entwickelte Western Blot zeigte eine Bande auf erwarteter DYNC2LI1 Größe von ca. 60 kDa (Abb. 33, Stern), im Vergleich dazu ist keine Bande in der Spur mit Kontroll-IgG zu detektieren. Somit konnte ich zeigen, dass der in obigen Experimenten bestätigte Interaktionspartner von NEK1 - DYNC2LI1 - ko-präzipitiert wurde und deshalb diese beiden Proteine Teil des gleichen Komplexes sind.

Abb. 33 Ko-Immunopräzipitation zur Bestätigung der Interaktion zwischen NEK1 und DYNC2LI1 Ko-Transfektion von NEK1-pDEST/N-SF-TAP und DYNC2LI1-pDEST27-GST in HEK293T Zellen für 72 Stunden (qPCR Überexpression: NEK1 150x, DYNC2LI1 400x). Ko-Immunopräzipitation wurde mit 6 µl NEK1-H3T1, 15 µl DYNC2LI1 und 0,5 µl Kontroll-IgG durchgeführt und im Western Blot (NEK1-H3T1 1:1000, Anti-GST 1:10000) eine Interaktion von NEK1 und DYNC2LI1 (Stern, ca. 60 kDa) nachgewiesen, keine Bande mit Kontroll-IgG. 15 µl der IP-Eluate pro Spur, 7 % des HEK293T Proteinlysats als Input, ST= Novex Sharp Prestained.

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Ergebnisse

6.4.6. Identifizierung von NEK1 Interaktionen mit bekannten Ciliengenen im Großdurchsatz 1on1-Screen Eine weitere Möglichkeit Interaktionen von NEK1 mit anderen Cilienproteinen nachzuweisen ist ein Hefe-2-Hybrid 1on1-Screen im Großdurchsatz auf 96-well Platten durchzuführen. Dies wurde von mir während eines wissenschaftlichen Kurzaufenthaltes am Department of Human Genetics (Radboud University Medical Center, Nijmegen, Netherlands) unter Leitung von Prof. Dr. Ronald Roepman und Senior Research Technician Stef Letteboer durchgeführt. In mehreren 96-well Platten sind Hefeklone vorgelegt, welche mit Vektoren transfiziert wurden, die für schon bekannte Ciliengene kodieren (13.17, Tab. 22). Mit diesen Hefen im 96-well Plattenformat wurde das mating mit NEK1 (sowohl pAD als auch pBD) ermöglicht, welche dann auf SD/-LTHA Platten mittels eines Stempels überführt wurden. Bei 14 bekannten Cilienproteinen konnte in diesem Screen ein Wachstum auf Mangelmediumplatten beobachtet werden (Abb. 34 A). Die Validierung erfolgte mit einem β-Galaktosidase Test, welcher gemäß Standardprotokoll von Mitarbeitern des Humangentischen Instituts Nijmegen durchgeführt und mir die Daten zur Verfügung gestellt wurden.

Abb. 34 β-Galaktosidase Test zur Visualisierung positiver Hefeklone und Pulldown Experiment (A) Wachstum von 14 verschiedenen Hefeklonen auf SD/-LTHA Mangelmediumplatten und Blaufärbung mittels β-Galaktosidase Test visualisiert die Interaktion von NEK1 mit bekannten Cilienproteinen. Stärkstes Signal bei Klon 163: SPATA7 (9: CDR2, 12: SPAG5 aa 774-1193, 15: SPAG5 aa 1115-1190, 30: IFT74, 32: IFT88, 52: SDCCAG8 fr.1, 55: SDCCAG8 short, 94: CEP290 cc456, 102: NLP isoB fl, 236: MNS1, 283: IFT122, 286: IFT74, 78: OFD1 369). (B) Oben: Coomassie Färbung von 10 % Input GST Negativ-Kontrolle (Spur 2) und GST- Fusionsproteine C21orf2 und SPATA7 (Spur 3-4). Unten: Western Blot mit NEK1-H3T1 auf Input Proteinextrakt aus Rinderretina (Spur 1) und Pulldown Material GST-C21orf2 und GST-SPATA7 (Spur 2-4). Nachweis der Interaktion durch Vorhandensein der full-length NEK1 Bande bei C21orf2 und SPATA7, keine Bande bei der GST Leerkontrolle (verändert nach [8]).

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Ergebnisse

Unter den gefundenen Cilienproteinen, die mit NEK1 interagieren, waren z. B. 3 verschiedene intraflagellare Transport Proteine (IFT 74/88/122) gelistet und zusätzlich stellte sich SPATA7 (Abb. 34 A, roter Kasten) als interessantester Kandidat heraus, da Minh Nguyen (Arbeitsgruppe Prof. Roepman) in einem von ihr durchgeführten Y2H-Screen mit SPATA7 vice versa NEK1 als Interaktionsprotein identifizieren konnte. Für die Bestätigung der Interaktion von NEK1 mit SPATA7 bzw. C21orf2 wurde ein Pulldown durchgeführt (Abb. 34 B) und anschließend mit NEK1-H3T1 Antikörper im Western Blot die Interaktionsbanden nachgewiesen [8]. Mit Y2H-Screens im Großdurchsatz ist es somit möglich in kurzer Zeit Interaktionen eines neuen Proteins mit schon bekannten ciliären Proteinen nachzuweisen und somit das Spektrum an der Ciliogenese beteiligten Proteine zu erweitern.

6.5. Identifikation von ciliären Signaltransduktionswegen mittels CRISPR/Cas9

Änderungen in den von primären Cilien abhängigen Reaktionswegen (Hedgehog, Wnt, Planar cell polarity und PDGFRα Signalweg) werden mit einem breiten phänotypischen Spektrum in Verbindung gebracht. Die Vermutung, dass dieses pleiotrope Bild verschiedener Ciliopathien durch den unterschiedlichen Einfluss der Mutationen in unterschiedlichen Cilienproteinen auf diese Signalwege zurück zu führen ist, sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Bislang vorliegende Ergebnisse zeigen, dass Mutationen in den bekannten Ciliopathie-assoziierten Genen zu einem biallelen loss-of-function Effekt als pathogenetischen Mechanismus führen und somit die Methode der CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9) vermittelten Genomeditierung hervorragend geeignet ist, um diesen Effekt nachzubilden. Im Gegensatz zum siRNA vermittelten knockdown kann eine insbesondere für die funktionellen Analysen des primären Ciliums notwendige langanhaltende und spezifische Herunterregulation erreicht werden. Außerdem bietet dieses Verfahren eine effiziente Möglichkeit, über eine Selektion transfizierter Zellen reinere Zellpopulationen für down-stream Untersuchungen zu erhalten. Aufgrund der identifizierten NEK1 Mutationen (überwiegend nonsense und splice-site) gehen wir von einem loss-of-function Effekt aus [12, 87, 94]. Daher habe ich mittels der CRISPR/Cas9-Methode 3 Zelllinien mit frameshift Mutationen etabliert. Der loss-of-function Effekt dieser eingebrachten Mutationen sollte mittels Western Blot und Immunfluoreszenz- Analysen bestätigt und ein möglicher Effekt auf ciliäre Signaltransduktionswege mittels RNA- Sequenzierung und anschließender Pathwayanalysen nachgewiesen werden.

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Ergebnisse

6.5.1. Generierung von NEK1-CRISPR-Zelllinien Um einen CRISPR knockout in HEK293T Zellen durchführen zu können, wurden mit Hilfe eines CRISPR-Tools von Sigma-Aldrich geeignete Vektoren für das Gen NEK1 gesucht. Bei der Auswahl der CRISPR Sequenzen wurde darauf geachtet, dass alle möglichen Splice-Varianten des NEK1 Proteins durch den CRISPR knockout betroffen sind. Außerdem sollten die Sequenzen wenige Homologien zu Sequenzen in anderen Genen zeigen, um off-target Effekte zu vermeiden. Die CRISPR Sequenz deckt Exon 24 (NM_012224.2) als Zielbereich von NEK1 ab und liegt C-terminal zum NEK1-H3T1 Antikörperepitop (Exon 20-24). Mit den ausgewählten Vektoren wurden Testtransfektionen mit 4 und 8 µg Vektor und Polyethylenimin (PEI) durchgeführt, um die für die beste Transfektionseffizienz geeignete Menge an Vektor zu etablieren. Die Verwendung von 12 µg Vektor und einer Inkubationszeit von 3 Tagen ergab eine Transfektionseffizienz von ca. 20 %, welche bei der Non Target Kontrolle etwas höher war (Abb. 35 A). Die Zellen, welche durch die Expression des auf dem CRISPR-Vektor befindlichen GFP-Reportergens grün fluoreszierten, wurden mittels Fluorescence activated cell sortigng (FACS) in 96-well Platten sortiert und mit den verbliebenen GFP-positiven Zellen wurde ein T7E1 Mismatch Assay durchgeführt. Beim Mismatch Assay werden Heteroduplices (Mischung aus wildtyp und mutierter DNA), welche einen sogenannten Loop ausbilden, von der Endonuklease geschnitten, wohingegen Homoduplices aus wildtyp DNA und Homoduplices aus mutierter DNA durch das Enzym nicht erkannt werden. Dies ergab im PCR-Ansatz (Exon 23-24 überspannend) mit genomischer DNA aus dem Non Target Ansatz eine Bande auf erwarteter Höhe von 589 bp, bei NEK1-CRISPR Exon 24 eine schwächere Wildtypbande von 589 bp und zwei zusätzliche Banden von 430 bp und 159 bp, welche durch den Schnitt der Endonuklease bei Heteroduplices zustande kommen (Abb. 35 B). Diese schwachen Banden spiegeln die niedrige Transfektions- effizienz wider, die auch schon in Immunfluoreszenzaufnahmen beobachtet wurde.

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Ergebnisse

Abb. 35 Bestimmung der CRISPR Transfektionseffizienz (A) Transfektion von 12 µg CRISPR-Vektor Non Target bzw. NEK1 Exon 24 ergaben aufgrund des im CRISPR- Vektor befindlichen GFP-Reportergens in Immunfluoreszenzaufnahmen eine Effizienz von ca. 20 % (Maßstabsbalken: 50 µm). Diese Zellen wurden mittels FACS in 96-well Platten sortiert und weiterkultiviert. (B) Durchführung eines T7E1 Mismatch Assays mit den verbliebenen GFP-positiven Zellen ergaben eine wildtyp Bande von 589 bp beim Non Target Ansatz, hingegen beim NEK1 Exon 24 Ansatz eine wildtyp Bande von 589 bp und zusätzlich 2 Banden bei 430 bp und 159 bp, welche durch den Schnitt der Endonuklease bei Entstehung von sog. Loops von Heteroduplices entstehen.

Von den genomischen DNAs der verschiedenen CRISPR-Zellklone wurde eine PCR mit Primern für NEK1 (Exon 23-24 überspannend) nach Standardprotokoll durchgeführt und anschließend sequenziert. Die identifizierten Mutationen wurden zunächst in heterozygote und in homozygote Mutationen und danach in Deletionen und Insertionen eingeteilt. Anschließend wurde beurteilt, ob es sich bei der Mutation um eine in-frame oder frameshift Mutation handelt. Von den 96-well Platten mit NEK1 Exon 24 CRISPR-Klonen sind insgesamt 13 Zellklone angewachsen, welche nach erfolgter Sequenzierung auf das Vorhandensein von Mutationen mit dem Programm Mutation Surveyor überprüft werden konnten. Insgesamt belief sich die Anzahl der Wildtyp-Klone auf 5, es wurden 8 Klone mit Mutationen identifiziert. Davon waren 4 Mutationen in ihrer Sequenz eindeutig zu bestimmen, bei 4 mutierten Zelllinien handelte es sich um Mischklone, welche für weiterführende Experimente verworfen wurden. Insgesamt wurden keine heterozygoten und 4 homozygote Mutationen beobachtet, wobei auffällig war, dass bei diesem CRISPR-Ansatz nur Deletionen, aber keine Insertions- Mutationen detektiert wurden (CR2: c.2299_2317delGTGATTCCTCTGGATGAGT, CR5: c.2306_2318delCTCTGGATGAGTT, CR8: c.2306delC, CR14: c.2306_2308delCTC). Außerdem verursachte eine der sequenzierten CRISPR-Klone eine in-frame Mutation (CR14), bei der das Leseraster der Basentripletts nicht verändert wurde und 3 verschiedene frameshift (CR2/5/8) Mutationen (Tab. 9), welche zu einem vorzeitigen Stopcodon und damit zum Gen knockout führen. Von der 96-well Platte des Non Target Ansatzes wurden 3 Zellklone (NT2/3/4) für das entsprechende Exon sequenziert und die wildtyp Sequenz nachgewiesen.

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Ergebnisse

Tab. 9 Zusammenfassung der erhaltenen CRISPR-Zellklone mit NEK1 Mutation

Klon Größe Zygotie cDNA Position Protein Position

CR2 19 bp hom. c.2299_2317delGTGATTCCTCTGGATGAGT p.(Val767*) CR5 13 bp hom. c.2306_2318delCTCTGGATGAGTT p.(Pro769Glnfs*3) CR8 1 bp hom. c.2306delC p.(Pro769Leufs*5)

NEK1-CRISPR-Ex24 AGGCAGGAGGTCAACTTGTGATTCCTCTGGATGAGTTAACACTAGATACA

NT2 AGGCAGGAGGTCAACTTGTGATTCCTCTGGATGAGTTAACACTAGATACA

NT3 AGGCAGGAGGTCAACTTGTGATTCCTCTGGATGAGTTAACACTAGATACA

NT4 AGGCAGGAGGTCAACTTGTGATTCCTCTGGATGAGTTAACACTAGATACA

CR2_19bpDel AGGCAGGAGGTCAACTT------TAACACTAGATACA

CR5_13bpDel AGGCAGGAGGTCAACTTGTGATTC------AACACTAGATACA

CR8_1bpDel AGGCAGGAGGTCAACTTGTGATTC-TCTGGATGAGTTAACACTAGATACA

CR6wt AGGCAGGAGGTCAACTTGTGATTCCTCTGGATGAGTTAACACTAGATACA

CR9wt AGGCAGGAGGTCAACTTGTGATTCCTCTGGATGAGTTAACACTAGATACA ***************** ************* Clustal Omega Alignment der verschiedenen NEK1-CRISPR-Klone; [*] Übereinstimmung der Nukleotide CRISPR-Bereich Exon 24, [-] Deletionen, hom.=homozygot. Mutationen in NEK1-CRISPR Klonen mittels Mutation Surveyor nachgewiesen. CR14 mit einer 3bp Deletion (c.2306_2308delCTC) wird hier nicht gezeigt.

Durch den CRISPR-verursachten Doppelstrangbruch und anschließendem Reparatur- mechanismus NHEJ konnten mittels Sequenzierung von genomischer DNA bei allen NEK1-CRISPR-Klonen Deletionen identifziert werden. Ob auf beiden Allelen die gleichen Deletionen zustande kamen und somit eindeutig von homozygoten Mutationen gesprochen werden kann, sollte in weiteren Schritten überprüft werden. Wenn z. B. bei einer größeren Deletion eines Allels die ausgewählten Primer dort nicht binden können, würde mittels PCR nur die Amplifikation von einem Allel, nicht aber von beiden Allelen, erfolgen. Das Vorliegen von compound heterozygoten Mutationen würde nicht detektierbar sein und somit den Anschein einer homozygoten Mutation erwecken. Heterozygote Polymorphismen konnte ich in den CRISPR-Bereich befindlichen Exons 23+24 und angrenzender Introns nicht nachweisen, da die annotierten SNPs (rs67794467, rs34099167) sowohl in den NEK1-CRISPR-Klonen, als auch in den Non Targets homozygot wildtyp vorlagen. Laut dbSNP144 sind auch in den angrenzenden Exons 22 bzw. 25 (+/- 100 bp in angrenzende Introns) keine häufigen SNPs gelistet, die auf Heterozygosität hin untersucht werden können. Eine Deletion einzelner Exons oder intronischer Varianten kann somit nicht ausgeschlossen werden, weshalb die Nomenklatur der CRISPR-Klone mit NEK1 Mutation nicht 100%ig geklärt ist. Als nächster Schritt muss bei CRISPR/Cas9 Experimenten zusätzlich zur Variantenidentifikation auf DNA-Ebene immer noch eine Verminderung der Expression und ein funktioneller Verlust auf Proteinebene (6.5.2 und 6.5.3) nachgewiesen werden.

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Ergebnisse

6.5.2. NEK1 Expression in den CRISPR-Zelllinien auf RNA- und Proteinebene Zunächst sollte das relative Expressionslevel von NEK1 in den 8 verschiedenen Zelllinien (3x NEK1 Mutation, 3x Non Target Kontrolle, 2x mit NEK1-CRISPR-Vektor behandelt, aber Wildtypsequenz) sowohl unter Normal- als auch unter Hungermedium mittels quantitativer real-time PCR bestimmt werden. Die verwendete NEK1-TaqMan-Sonde (Hs01591486_m1) liegt in Exon 3 und 4 - N-terminal zur CRISPR-Region in Exon 24 - und detektiert somit auch die verkürzten Transkripte, die mittels CRISPR/Cas9 generiert wurden. Die mathematische Berechnung der relativen Genexpression erfolgte mittels der ΔΔCT-Methode, der relative Expressionsunterschied (RQ, relative quantification) wurde mit der Formel 2-ΔΔCT berechnet. Die 5 verwendeten Kontrollen wurden gemittelt und als Bezugswert gleich 1 gesetzt. Alle zu untersuchenden Ansätze wurden auf den Mittelwert der Kontrollen unter Normalmedium bezogen (Abb. 36).

Abb. 36 Relatives Expressionslevel von NEK1 in CRISPR-Klonen im Vergleich zu Kontrollen Die Expression von NEK1 ist in den CRISPR-Klonen CR2 und CR5 sowohl unter Normal- als auch unter Hungermedium im Vergleich zu den Kontrollen signifikant auf ca. 11-31 % erniedrigt, im Gegensatz dazu zeigt Klon CR8 unter Hungermedium eine Expression von 88 % (nicht signifikant p = 0,4564). Von den 5 verwendeten Kontrollen wurde der Mittelwert berechnet und als Bezugswert gleich 1 gesetzt. Alle Ansätze wurden auf den Mittelwert der Kontrollen unter Normalmedium bezogen. N = Normalmedium, H = Hungermedium, MW-5K = Mittelwert von 5 Kontrollen. * p ≤ 0,001299, n.s. = nicht signifikant (Wilcoxon Two Sample Test). Kontrollen (Non Target NT2/3/4, CR6/9 mit wildtyp Sequenz), CR2 = CRISPR 19 bp Deletion, CR5 = CRISPR 13 bp Deletion, CR8 = CRISPR 1 bp Deletion.

Bei dem CRISPR-Klon CR2 (19 bp Deletion) wurde sowohl unter Hunger- (H) als auch unter Normalmedium (N) eine Restexpression von 21-30 % im Vergleich zu den 5 gemittelten Kontrollen gemessen. Beim Klon CR5 (13 bp Deletion) wurde eine etwas schwächere Restexpression mit RQ-Werten von 0,24 und 0,18 detektiert. Im Gegensatz dazu wurde bei CRISPR-Klon CR8 (1 bp Deletion) zwar unter Normalmedium eine Expression von 11 %

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Ergebnisse ermittelt, aber unter Hungermedium eine Erhöhung der Expression auf 88 % (Abb. 36). Die Signifikanzen dieser Ergebnisse wurden mit dem Wilcoxon Two Sample Test berechnet. Die p-Werte betrugen für CR_2N/H, CR5_N/H und CR8_N p ≤ 0,001299, für CR8_H war das Ergebnis nicht signifikant mit einem p-Wert von 0,4565. Der loss-of-function Effekt der eingebrachten Mutationen sollte im nächsten Schritt mittels Western Blot an 8 Zelllinien, welche jeweils 3 Tage unter Normal- bzw. Hungermedium inkubiert wurden, nachgewiesen werden. Da der NEK1-H3T1 Antiköper N-terminal zum CRISPR-Bereich in Exon 20-24 bindet, kann damit sowohl das full-length Protein nachgewiesen werden, als auch ein verkürztes Protein, welches aufgrund der eingebrachten Mutation gebildet wurde, detektiert werden. Die verkürzten Proteine von 767-773 AS hätten eine Größe von ca. 88 kDa, im Vergleich dazu das full-length NEK1 (NP_036356.1) mit 1258 AS mit 142 kDa. Sowohl bei den Non Target Kontrollen (NT2/3/4) als auch bei 2 CRISPR- Klonen mit Wildtypsequenz (CR6wt/CR9wt) kann mit dem NEK1-H3T1 Antikörper eine Bande auf Höhe des full-length NEK1 Proteins bei ca. 140 kDa unter beiden Nährbedingungen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu kann bei keinem der 3 NEK1-CRISPR-Klone mit verschiedenen frameshift Mutationen eine full-length NEK1 Bande detektiert werden (Abb. 37), was durch einen Abbau der verkürzten Proteine mittels nonsense mediated mRNA decay erklärt werden kann.

Abb. 37 Western Blot der NEK1-CRISPR-Klone im Vergleich zu Kontrollen Non Target Kontrollen und wildtyp NEK1-CRISPR-Klone 6+9 zeigen sowohl unter Normal- als auch Hungermedium eine full-length NEK1 Bande bei ca. 140 kDa, diese fehlt bei den CRISPR-Klonen CR2/5/8 mit NEK1 Mutationen. 30 µg Gesamtprotein pro Spur aufgetragen, NEK1-H3T1 1:1000, β-Actin 1:1000, ST = peqGold Marker V. Zellen 3 Tage unter N = Normalmedium bzw. H = Hungermedium. Kontrollen (Non Target NT2/3/4, CR6/9 mit wildtyp Sequenz), CR2 = CRISPR 19 bp Deletion, CR5 = CRISPR 13 bp Deletion, CR8 = CRISPR 1 bp Deletion.

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Ergebnisse

Sowohl bei Kontrollen als auch bei Klonen mit Mutationen kann bei ca. 90 kDa eine Bande mit dem NEK1-H3T1 Antikörper detektiert werden, wodurch keine Rückschlüsse auf das Vorhandensein verkürzter Proteine mit ca. 88 kDa gezogen werden können. Zusätzlich erkennt man schwache Proteinbanden in den CRISPR-Klonen auf Höhe von ca. 50, 120 und 130 kDa, diese werden auch bei den Kontrollen beobachtet und können nicht in Einklang mit der berechneten Größe der verkürzten Proteine bei ca. 88 kDa gebracht werden. Zusammenfassend konnte ich mit meinem selbst hergestellten NEK1-H3T1 Antikörper nachweisen, dass bei den CRISPR-Klonen aufgrund der eingebrachten frameshift Mutationen kein funktionelles full-length NEK1 Protein mehr gebildet werden kann (Abb. 37).

6.5.3. Cilienmorphologie in NEK1-CRISPR-Zelllinien Im nächsten Schritt sollte mittels Immunfluoreszenz-Analysen die Anzahl und Länge von primären Cilien in den jeweiligen CRISPR-Zelllinien gemessen, sowie die subzelluläre Lokalisation von NEK1 in den HEK293T Zellen für 3 Tage unter Hungermedium, um die Ciliogenese zu induzieren, nachgewiesen werden. Diese Versuche wurden sowohl in den modifizierten Zelllinien (CR2/5/8) als auch an Zelllinien ohne Mutation (NT2/3/4/CR6wt/CR9wt) durchgeführt. Auf der Grundlage von beobachteten ciliären Defekten in NEK1-defizienten Zellen (Abb. 25, S.90, Patient P1 Fibroblasten, [12]) erwarteten wir, dass ein loss-of-function Effekt von NEK1 mittels CRISPR/Cas9 vermittelten genome editing auch zu morphologisch abnormalen oder fehlenden primären Cilien führt. Eine Auszählung von 5 Kontroll-Zelllinien (NT2/3/4/CR6wt/CR9wt) ergab im Mittel eine Cilien-Anzahl von 57 % und in den 3 NEK1-depletierten Zelllinien (CR2/5/8) zwischen 27-30 % (Abb. 38 A). Ich konnte somit nachweisen, dass mittels CRISPR/Cas9 generierte NEK1 Mutationen in diesen Zelllinien die Anzahl cilientragender Zellen signifikant verändert wurde (χ2-Test: p < 0,001). Anschließend wurde die Cilienlänge zwischen den NEK1- depletierten Zellen und den Kontrollzellen analysiert. Zur Quantifizierung wurden die Cilien anhand der Fluoreszenzaufnahmen mit 63-facher Objektiv-Vergrößerung gemessen. Die Messung erfolgte in Triplikaten mit Hilfe des Bildbearbeitungsprogrammes FIJI. Der Median aller gemessenen Cilienlängen betrug bei den 5 Kontroll-Zelllinien (NT2/3/4/CR6wt/CR9wt) 1,33-1,60 μm, wohingegen die Cilien in den NEK1-CRISPR-Zellen (CR2/5/8) signifikant kürzer waren (Abb. 38 B) mit einer durchschnittlichen Länge von 1,20-1,27 μm (Wilcoxon Two Sample Test: p < 6,70 x 10-13).

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Ergebnisse

Abb. 38 Anzahl an cilientragenden Zellen und Vermessung der Cilienlängen von NEK1-CRISPR-Zelllinien im Vergleich zu Kontrollen (A) Es wurde ein signifikanter Unterschied in der Anzahl an cilientragenden Zellen beobachtet (44-78 % bei Kontrollen NT2/3/4/CR6wt/CR9wt [Ø 5 Kontr.: 57 %] vs. 27-30 % in den 3 verschiedenen NEK1-CRISPR- Zelllinien CR2/5/8, χ2-Test: p < 0,001. Es wurden n ≥ 400 Zellen pro Zelllinie ausgezählt (B) Die mediane Cilienlänge betrug bei den Kontrollen NT2/3/4/CR6wt/CR9wt 1,33-1,60 µm [Ø 5 Kontr.: 1,50 µm], im Gegensatz dazu waren die Cilien in NEK1-depletierten Zellen CR2/5/8 signifikant kürzer mit einer Länge von 1,20-1,27 µm (Wilcoxon Two Sample Test: p < 6,70 x 10-13). Es wurden n ≥ 180 Cilien pro Zelllinie mit FIJI vermessen. Die Zelllinien wurden für die Induktion von primären Cilien 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Kontrollen (Non Target NT2/3/4, CR6/9 mit wildtyp Sequenz), CR2 = CRISPR 19 bp Deletion, CR5 = CRISPR 13 bp Deletion, CR8 = CRISPR 1 bp Deletion.

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Ergebnisse

In Immunfluoreszenzaufnahmen von Kontroll-Zelllinien und NEK1-CRISPR-Zelllinien, welche 3 Tage unter Hungermedium inkubiert wurden, um die Cilienbildung zu induzieren, werden exemplarisch bei den mittels CRISPR/Cas9 genomeditierten Zelllinien diese ciliären morphologischen Auffälligkeiten (verminderte Cilienanzahl und -länge) bildlich dargestellt (Abb. 39). Weitere Bilder der Cilienmorphologie in allen 5 Kontroll-Zelllinien und 3 NEK1- depletierten Zelllinien sind im Anhang (13.11) abgebildet. Zusätzlich zur reduzierten Cilienanzahl und -länge konnte in den 3 CRISPR-Zelllinien mit verschiedenen NEK1 Mutationen eine vermehrte Anfärbung des Cytoskeletts (posttranslationale Polyglutamylierung der Tubuline) nachgewiesen werden (Abb. 39, Sterne). Diese vermehrten posttranslationalen Modifikationen der Tubuline wurden auch schon in den P1 [c.379C>T, p.(Arg127*)] Patienten- Fibroblasten (Abb. 25, S.90) beobachtet, welche aber in den CRISPR-Zellen nicht so deutlich ausgeprägt war. Des Weiteren sollte in den Kontroll- und CRISPR-Zelllinien die Lokalisation von NEK1 an der Basalkörperregion der primären Cilien überprüft werden. In allen Kontrollen konnte ich mit dem selbst hergestellten NEK1-H3T1 Antikörper (6.3.) eine Lokalisation von NEK1 sowohl im Cytoplasma als auch am Basalkörper der primären Cilien nachweisen (Abb. 39, NT4, Pfeile). Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder sowohl der Non Target Ansätze als auch der NEK1-CRISPR Ansätze mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Dabei ließ sich auch in den drei verschiedenen NEK1-depletierten Zelllinien (CR2/5/8) eine Lokalisation im Cytoplasma erkennen, wobei das Signal in den Regionen des Basalkörpers der primären Cilien entweder nicht vorhanden oder eher schwach und diffus war. Bei einer Ausbildung von kurzen Cilien in den CRISPR-Zellen konnte in einzelnen Fällen ein Signal am Basalkörper detektiert werden, welches aber im Vergleich zu Kontrollen schwächer war (Abb. 39, CR, Pfeile).

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Ergebnisse

Abb. 39 Analyse der Cilienmorphologie und Lokalisation des NEK1 Proteins in NEK1-CRISPR-Zelllinien im Vergleich zu Kontrollen Die Non Target Kontroll-Zelllinie (NT4) weist viele primäre Cilien mit normaler Morphologie und Cilienlänge auf, wobei ein starkes Lokalisationssignal von NEK1 an der Basalkörperregion der primären Cilien (Pfeile) und im Cytoplasma vorhanden ist. Im Vergleich dazu kann bei den CRISPR-Zelllinien mit NEK1 Mutationen (CR2/5/8) eine verminderte Anzahl von Cilien mit verkürzter Cilienlänge beobachtet werden. Zusätzlich erkennt man in den NEK1-depletierten Zellen eine stärkere Anfärbung des Cytoskeletts durch posttranslationale Polyglutamylierung der Tubuline (Sterne). In den NEK1-CRISPR-Zelllinien kann auch ein NEK1 Signal im Cytoplasma detektiert werden, die Lokalisation am Basalkörper ist oft nicht vorhanden, in seltenen Fällen schwach und diffus. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Alle Zelllinien wurden für die Induktion von primären Cilien 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Non Target Kontrolle (NT4), CR2 = CRISPR 19 bp Deletion, CR5 = CRISPR 13 bp Deletion, CR8 = CRISPR 1 bp Deletion. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

In summa konnte ich die schon in Patienten-Fibroblasten [P1, c.379C>T, p.(Arg127*), Abb. 25, S. 90, [12]] beobachteten morphologischen Cilienauffälligkeiten mittels der CRISPR/Cas9- Methode in 3 Zelllinien mit NEK1 frameshift Mutationen validieren, in welchen sowohl eine verminderte Anzahl cilientragender Zellen, verkürzte Cilienlängen, als auch eine verstärkte Cytoskelettanfärbung beobachtet wurde. 116

Ergebnisse

6.5.4. RNA-Sequenzierung der NEK1-CRISPR-Zelllinien Da in den oben genannten Vorexperimenten nachgewiesen werden konnte, dass mittels CRISPR/Cas9 generierte NEK1 Mutationen in Zelllinien die Anzahl cilientragender Zellen und die Cilienlänge signifikant verändert war, sollte in diesen Zelllinien ein möglicher Effekt auf ciliäre Signaltransduktionswege mittels RNA-Sequenzierung und anschließender Pathway- Analysen untersucht werden. Dazu wurde von 16 RNA-Proben (3x Non Target, 3x NEK1 Mutation, 2x mit NEK1-CRISPR-Vektor behandelt, aber Wildtypsequenz sowohl unter Normal- als auch unter Hungermedium) eine RNA-Sequenzierung in der Core Unit Ultra Deep Sequencing des Instituts durchgeführt. Für die bioinformatische Analyse der Daten wurden zunächst rRNAs, tRNAs, snRNAs und verstreut liegende Sequenzwiederholungen (interspersed repeats) herausgefiltert, anschließend wurden die Reads gegen das Referenzgenom (hg19) gemappt und die Read Anzahl pro Gen berechnet. Dabei wurden die Reads pro kb auf die jeweilige Genlänge normalisiert (Normalized Reads Per Kilobase, NPRK). Eine weitere Normalisierung erfolgte durch die Division des NPRK-Werts durch die durchschnittliche Anzahl der Reads pro Probe (in Millionen), um den RPKM-Wert (Reads Rer Kilobase Per Million Mapped Reads) zu ermitteln. Nachfolgend werden einzelne Gene mittels qPCR validiert und anschließend mittels IPA (Ingenuity Pathway Analysis) auf zugrunde liegende ciliäre Signalwege untersucht.

6.5.4.1. Validierung der differentiell exprimierten Gene in NEK1-CRISPR- Zelllinien Die aus der RNA-Sequenzierung erhaltenen Gene mit einem p-Wert unter 0,01 wurden als signifikant differentiell exprimiert eingestuft. Hierbei zeigten sich im Ansatz unter Hungermedium 257 signifikant differentiell exprimierte Gene (128 Gene mit erhöhter und 129 mit erniedrigter Expression bei den NEK1-CRISPR- Zelllinien, Abb. 40 B). Unter normalen Nährbedingungen zeigte sich bei 229 Genen eine differentielle Expression (87 Gene mit erhöhter und 142 mit erniedrigter Expression, Abb. 40 A). Insgesamt zeigte sich ein großer Überlappungsbereich von 70 differentiell exprimierten Genen sowohl unter Normal- als auch unter Hungermedium (29 Gene erhöht, 41 erniedrigt). Eine vollständige Liste der differentiell exprimierten Gene unter beiden Nährbedingungen ist im Anhang aufgelistet (13.12).

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Ergebnisse

Abb. 40 Heatmaps der signifikant differentiell exprimierten Gene von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normal- und Hungermedium Die Heatmaps zeigen 229 signifikant differentiell exprimierte Gene unter Normalmedium (A) und 257 Gene unter Hungermedium (B) mit einem p-Wert < 0,01. Eine Filterung ergab unter Normalmedium eine Überlappung mit 11 und unter Hungermedium mit 19 differentiell exprimierten Ciliengenen. Dargestellt sind zusätzlich die Kandidatengene ARHGAP10 (# NEK1 Interaktionspartner laut Y2H-Screen) und FZD1 ($ cilien-assoziierter Wnt- Signalweg). Erkennbar sind jeweils deutliche Cluster-Bildungen von den 3 CRISPR-Zelllinien mit NEK1 Mutationen (CR2/5/8) gegen die 5 Kontrollen (Non Target 2/3/4, CR6/9wt). Sowohl die verschiedenen Zelllinien (Spalten) als auch die einzelnen Gene (Zeilen) wurden nach ihrer Ähnlichkeit in der Expression angeordnet. Blau = erniedrigte Expression, rot = erhöhte Expression, grau = Expression nicht signifikant verändert (p > 0,01). (*) Auswahl der Gene für Validierung der RNA-Seq Daten mittels qPCR.

Die sowohl unter Normal- als auch unter Hungermedium erhaltenen differentiell exprimierten Gene wurden anschließend mit den 1032 Genen der Ciliengenliste abgeglichen. Dies ergab unter Normalmedium eine Überlappung von 11 Ciliengenen, unter Hungermedium wurden insg. 19 Ciliengene als differentiell exprimiert eingestuft (Abb. 40 A+B, 13.12). Des Weiteren konnte von den 72 möglichen im Y2H-Screen identifizierten NEK1 Interaktionspartnern ARHGAP10 auch in den NEK1-CRISPR-Zelllinien als differentiell exprimiert identifiziert werden, mit einem Foldchange von -1,62 (p=0,00250719) unter Normalmedium. Ein Abgleich mit Genen, welche in cilien-assoziierten Signalwegen beteiligt sind, ergab für FZD1 eine erhöhte Expression (Foldchange +1,46) unter beiden Nährbedingungen. Zur Qualitätskontrolle der Daten wurde die Genexpression der statistisch signifikant veränderten Gene mittels qPCR überprüft, wobei für die Bestätigung primär die Gene ausgesucht wurden, die auch in meiner Ciliengenliste (ABCE1, CEP41, DYNLT1, IFT52, NEK1) annotiert waren, im Y2H-Screen als NEK1 Interaktionspartner (ARHGAP10)

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Ergebnisse identifiziert wurden oder im cilien-assoziierten Wnt-Signalweg (FZD1) vertreten sind. Von den 7 untersuchten Genen mit differentieller Expression konnten mittels qPCR an CRISPR- Zelllinien mit NEK1 Mutation bzw. dazugehörigen Kontrollen unter Normalmedium alle 7 Gene validiert (13.13) werden. Unter Hungermedium hingegen konnte gezeigt werden, dass der Klon CR8 eine relative hohe NEK1-Expression (RQ = 0,82) aufwies, im Gegensatz zu den beiden anderen CRISPR-Klonen CR2/5 mit je 0,23 und 0,19 (Abb. 36, S.111). Bei der Berechnung der Mittelwerte der RQs aller drei CRISPR-Klone CR2/5/8 konnte demnach die Expressionsänderung von 3 Genen (CEP41, FZD1, NEK1) unter beiden Nährbedingungen validiert werden. Vernachlässigt man den CRISPR Klon 8 mit erhöhter NEK1-Expression unter Hungermedium konnten für CR2/5 die Expressionsänderung von 4 Genen (ABCE1, ARHGAP10, CEP41, NEK1) mit p-Wert unter 0,05 bestätigt werden. Für die Gene DYNLT1 und FZD1 war die Richtungsänderung der Expression in der qPCR vergleichbar mit den RNA- Seq Daten, aber nicht mehr statistisch signifikant (Wilcoxon Two Sample Test p > 0,05) (13.13). Eine Herunterregulation von IFT52 (RNA-Seq Foldchange: -1,35) unter Hungermedium ließ sich mittels qPCR nicht bestätigen, es wurde kein Expressionsunterschied zu den Kontrollen detektiert (qPCR RQ=1,07). Aufgrund der oben erhaltenen validierten Expressionsänderungen bei 6 von 7 untersuchten Genen kann somit angenommen werden, dass die Qualität der RNA- Sequenzierung ausreichend gut ist für eine weitere Auswertung.

6.5.4.2. Analyse von Signalwegen mittels IPA bei NEK1-CRISPR-Zelllinien NEK1 ist bei der Bildung von primären Cilien beteiligt [156] und die Ausbildung von Cilien ist wiederum an den Zellzyklus gekoppelt [167]. In vielen Zellen erfolgt der Eintritt in den Zellzyklus nach einer vorausgegangenen Cilienresorption und erst nach der Mitosephase werden die Cilien wieder neu assembliert [45]. Der Zyklus der Ciliogenese wird also durch die Progression durch den Zellzyklus koordiniert, es scheint also eine regulatorische Beziehung zwischen diesen beiden Zyklen zu geben [167]. Und da die NEK1-CRISPR-Zelllinien verkürzte Cilien und eine reduzierte Anzahl an cilientragenden Zellen aufwiesen, könnte die Koordination des Cilienzyklus mit dem Zellteilungszyklus negativ beeinflusst werden. Deshalb werden im Folgenden die Signalwege in NEK1-CRISPR-Zelllinien je nach Nährbedingung untersucht. Dazu wurden die RNA-Seq Daten in IPA importiert und eine Core-Analyse (mit direkten und indirekten Interaktionen, max. 35 Molekülen/Netzwerk, alle in IPA hinterlegten Datenquellen, mit hoher vorhergesagter Konfidenz bzw. experimentell bestätigt, Spezies Mensch, alle Mutationstypen) durchgeführt.

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Ergebnisse

Normalmedium Unter Normalmedium konnten die 229 differentiell exprimierten Gene in insgesamt 15 Netzwerke (13.14, Abb. 73) eingeordnet werden, wobei eine Anreicherung in folgenden 5 Hauptnetzwerken zu erkennen ist:

1) Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Cellular Assembly and Organization 2) Reproductive System Development and Function, Endocrine System Development and Function, Molecular Transport 3) Developmental Disorder, Hereditary Disorder, Metabolic Disease 4) Cellular Compromise, Carbohydrate Metabolism, Lipid Metabolism 5) Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Cellular Movement, Hematological System Development and Function

Aufgrund der beobachteten Wachstumsdefekte in SRPS Patienten wird hier Hauptnetzwerk 2 im Detail gezeigt, welches als eines der Hauptknotenpunkte eine signifikante Anreicherung für den Growth Hormone Signalweg zeigt (Abb. 41).

Abb. 41 Ingenuity Pathway Analyse – Hauptnetzwerk 2 von RNA-Seq Daten von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium Darstellung von 26 differentiell exprimierten Genen von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium, welche über verschiedene Knotenpunkte verknüpft sind. 15 Gene sind hochreguliert (rot) und 11 Gene herunterreguliert (grün), wobei eines der Hauptverknüpfungen der Growth Hormone Signalweg (blau hinterlegt) darstellt. Stärkste Expression mit höchstem Foldchange weist DIO2 auf, des Weiteren befindet sich FZD1, welches in cilien- assoziierten Signalwegen beteiligt ist, in diesem Hauptnetzwerk 2. 120

Ergebnisse

In dieses Netzwerk 2 werden 26 differentiell exprimierte Gene von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium eingeordnet, von denen 15 Gene hochreguliert (rot) und 11 Gene herunterreguliert (grün) sind. DIO2 weist die stärkste Expression mit höchstem Foldchange (FC: +13,39) auf, des Weiteren befindet sich das in cilien-assoziierten Signalwegen beteiligte FZD1 (FC: +1,46) Gen in diesem Hauptnetzwerk 2 (Abb. 41, Tab. 17). Mit dem Hauptaugenmerk auf die 11 Ciliengene, welche mit den RNA-Seq Daten überlappen (Tab. 18), ergibt sich nach Filterung in IPA nur noch ein Netzwerk (Infectious Diseases, Cellular Development, Connective Tissue Disorders). In diesem werden 10 Ciliengene (rot/grün) zusammen mit 24 weiteren Genen (weiß) über mehrere Knotenpunkte vernetzt (Abb. 42 A, Abb. 75). Bei einer noch stringenteren Filterung in der Kategorie Diseases and Function verbleiben nur noch die 2 Gene NEK1 und PLK4, welche laut RNA-Seq beide im Vergleich zu Kontrollen eine niedrigere Expression (Foldchange -5,47 und -1,50, Tab. 17, Tab. 18) aufweisen. Hier zeigt sich die funktionelle Beteiligung von NEK1 und PLK4 bei der Duplikation von Centrosomen, dem Centrosomenzyklus und der Ausbildung von Cilien (Abb. 42 B).

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Ergebnisse

Abb. 42 Netzwerkdarstellung der 11 differentiell exprimierten Ciliengene von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium (A) Darstellung von 34 Genen von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium in einem Netzwerk, welche über verschiedene Knotenpunkte verknüpft sind. 4 Gene sind hochreguliert (rot) und 6 herunterreguliert (grün), welche als Ciliengene (blau hinterlegt) annotiert sind. Das differentiell exprimierte Gen CYGB (Foldchange +2,44) wird in diesem Netzwerk nicht dargestellt. (B) Eine weitere Filterung nach NEK1 in der Kategorie Diseases and Function ergibt eine Beteiligung der Ciliengene NEK1 und PLK4 bei der Duplikation von Centrosomen, dem Centrosomenzyklus und der Ausbildung von Cilien (gestrichelte blaue Linien = Inhibierung).

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Ergebnisse

Hungermedium Unter Hungermedium konnten die 257 differentiell exprimierten Gene in insgesamt 18 Netzwerke (13.14, Abb. 74) eingeordnet werden, wobei dies die 5 Hauptnetzwerke sind:

1) Renal and Urological System Development and Function, Reproductive System Development and Function, Organ Morphology 2) Cellular Assembly and Organization, Developmental Disorder, Gastrointestinal Disease 3) Cancer, Endocrine System Disorders, Organismal Injury and Abnormalities 4) Immunological Disease, Cell Death and Survival, Cellular Assembly and Organization 5) Cellular Assembly and Organization, Cellular Compromise, Cellular Function and Maintenance

Des Weiteren zeigte IPA eine signifikante Anreicherung für die canonischen Pathways PDGF Signaling, MAPK Signaling, Thrombopoietin Signaling, EGF Signaling und – wie schon unter Normalmedium beschrieben - Growth Hormone Signaling (Hauptnetzwerk 1, Abb. 43). Im Hauptnetzwerk 1 unter Hungermedium sind 24 Gene über mehrere Knotenpunkte miteinander verknüpft, wobei 17 Gene hochreguliert (rot) und 7 herunterreguliert (grün) sind. Die zweithöchste Expression von allen differentiell exprimierten Genen mit einem p-Wert kleiner 0,01 zeigte DIO2, welches einen Foldchange von +11,99 aufweist. Auch das im cilien- assoziierten Wnt-Signalweg beteiligte FZD1 kann mit einem Foldchange von +1,46 zu diesem Netzwerk zugeordnet werden (Abb. 43, Tab. 16).

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Ergebnisse

Abb. 43 Ingenuity Pathway Analyse – Hauptnetzwerk 1 von RNA-Seq Daten der NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium Darstellung von 24 differentiell exprimierten Genen von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium, welche über verschiedene Knotenpunkte verbunden sind. 17 Gene sind hochreguliert (rot) und 7 Gene herunterreguliert (grün), wobei eines der Hauptverknüpfungen der Growth Hormone Signalweg (blau hinterlegt) darstellt. Stärkste Expression mit zweithöchstem Foldchange weist DIO2 auf, des Weiteren kann FZD1, welches in cilien- assoziierten Signalwegen beteiligt ist, in dieses Hauptnetzwerk 1 eingegliedert werden.

Filtert man bei der IPA Analyse nach den 19 Ciliengenen, welche laut RNA-Sequenzierung differentiell exprimiert sind, ergeben sich nur noch 4 Hauptnetzwerke (Tab. 18, Abb. 76), wobei im Netzwerk 2 auch die Gene KIF3A und PCBP4 annotiert sind (Abb. 44 A, Sterne), welche als NEK1 Interaktionspartner im Y2H-Screen (Tab. 7, Tab. 21) identifiziert wurden. Desweiteren werden 8 von 19 Ciliengenen (rot/grün), welche in der RNA-Seq als differentiell exprimiert eingestuft wurden, zusammen mit 25 weiteren Komponenten (weiß) im Netzwerk 2 eingebunden. Die beiden Gene HTR6 und DISC1 sind hochreguliert und 6 Ciliengene herunterreguliert (Abb. 44 A). Das differentiell exprimierte Gen DYNLT1, welches zusammen mit den schon für SRPS beschriebenen DYNC2H1 und DYNC2LI1 den cytoplasmatischen Dynein-2 Komplex bildet und als Regulator für die Cilienlänge fungiert [50, 168], kann mit einem Foldchange von -1,49 zusammen mit weiteren Molekülen ins Hauptnetzwerk 2 und 5 eingeordnet werden (Abb. 44 A).

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Ergebnisse

Abb. 44 Netzwerkdarstellung der 19 differentiell exprimierten Ciliengene von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium (A) Darstellung von 33 Genen (weiß) von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium im Netzwerk 2, welche über mehrere Knotenpunkte miteinander verbunden sind. 2 Gene sind hochreguliert (rot) und 6 herunterreguliert (grün), welche als Ciliengene (blau hinterlegt) annotiert sind. Die restlichen 11 differentiell exprimierten Ciliengene werden in diesem Netzwerk nicht dargestellt. Des Weiteren sind die im Y2H-Screen als mit NEK1 interagierenden Proteine KIF3A und PCBP4 (Sterne) vertreten. (B) Eine Filterung in IPA nach cilien-assoziierten Begriffen in der Kategorie Disease and Function ergibt eine Beteiligung von 8 Ciliengenen bei der Ausbildung von Axonemen, Protrusionen, Cilien und der Stabilisierung von Aktinfilamenten.

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Ergebnisse

Da unter Hungermedium die Ciliogenese in den Zellen induziert wird, erfolgten weitere Filterungsschritte in der Kategorie Diseases and Function nach verschiedenen cilien- assoziierten Begriffen. Somit konnten 4 herunterregulierte (NEK1, DYNLT1, IFT52, TSGA10) und 4 hochregulierte Ciliengene (HTR6, CEP41, DISC1, AK7) in einem Ciliennetzwerk dargestellt werden, wobei sich eine funktionelle Beteiligung dieser 8 differentiell exprimierten Gene bei der Stabilisierung von Aktinfilamenten und der Ausbildung von Axonemen, Protrusionen und Cilien zeigt (Abb. 44 B). In summa konnte in den NEK1-CRISPR-Zelllinien mittels der Ingenuity Pathway Analysis Software unter beiden Nährbedingungen eine Anreicherung der differentiell exprimierten Gene in Netzwerken gezeigt werden, welche mit dem Growth Hormone Signalweg assoziiert sind. Des Weiteren ließ sich unter Hungermedium eine Beteiligung dieser Gene im PDGF Signaling, MAPK Signaling, Thrombopoietin Signaling, EGF Signaling nachweisen. Filterungsschritte der differentiell exprimierten Gene (229 unter Normalmedium, 257 unter Hungermedium) nach Ciliengenen in meiner Ciliengenliste ergab außerdem eine Beteiligung einiger dieser Gene beim Zellzyklus und der Ciliogenese. Außerdem konnten auch im NEK1 Y2H-Screen identifizierte Interaktionspartner in die Hauptnetzwerke eingeordnet werden und erweitern somit das Proteinspektrum von ciliären Signaltransduktionswegen.

126

Diskussion

7. Diskussion

7.1. Bekannte Gene für das Phänotypenspektrum der SRPS/SRTD

Bei der Gruppe der in dieser Arbeit charakterisierten Erkrankungen, den Kurzrippen- Polydaktylie Syndromen (SRPS), handelt es sich um eine der häufigeren autosomal rezessiv vererbten Osteochondrodysplasien, welche in 6 Typen (SRPS I-VI) eingeteilt werden. Gemäß neuer OMIM Nomenklatur werden diese SRPSs mit weiteren ähnlichen Krankheitsbildern (JATD, EVC, MZSDS, CED, etc.) zu den SRTD 1-17 (short rib thoracic dysplasia) zusammengefasst. Phänotypisch weisen diese Patienten eine Skelettdysplasie mit Polydaktylien und engem Thorax auf. Des Weiteren können je nach Typ fakultative Fehlbildungen und Anomalien, wie urogenitale Fehlbildungen, insbesondere Nierenzysten, Herzfehler, Gehirnfehlbildungen, faziale Auffälligkeiten, wie Lippen-Kiefer-Gaumenspalten und Hydrops fetalis Bestandteil des Spektrums sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mittels Sanger- bzw. Exom-Sequenzierungen in mehreren Familien mit der Diagnose Kurzrippen-Polydaktylie Syndrom homozygote und compound heterozygote Mutationen in 3 der bereits bekannten 20 SRTD-Gene (Tab. 1, S. 14) identifiziert, die im Folgenden diskutiert werden.

7.1.1. Mutationen im NEK1 Gen Die Erstbeschreibung von NEK1 als ursächliches Gen für SRPS Typ Majewski (SRPS II/ SRTD 6) erfolgte 2010 im Rahmen meiner Masterarbeit. Ich konnte in 3 Familien (P1-P3) mit der Verdachtsdiagnose SRPS II nonsense bzw. splice-site Mutationen im NEK1 Gen identifizieren und die Vermutung einer digenen diallelen Vererbung aufstellen [12] (Abb. 45). NEK1 kodiert für eine NIMA-related Serin/Threonin Kinase mit Funktionen in der DNA- Doppelstrangbruchreparatur, in neuronalen Entwicklungsprozessen und der Koordination der Zellzyklus-assoziierten Ciliogenese [156, 157, 160]. NEK1 wird aus folgenden Gründen als Ciliengen in meiner Ciliengenliste aufgeführt:

 Erstbeschreibung von NEK1 Mutationen als ursächlich für SRPS II/ SRTD 6 [12] und Erweiterung des NEK1 Mutationsspektrums [61, 87, 93, 94]  Reduzierte Cilienanzahl und -länge in NEK1-Patienten-Fibroblasten mit stärkerer Anfärbung des Cytoskeletts (posttranslationale Modifikation der Tubuline) [12]  Mehrere Literaturangaben für Beteiligung von NEK1 an der Ciliogenese [156-158, 169]  Auflistung von NEK1 als Ciliengen des europäischen Projekts „SYSCILIA“ [9]  In Cildb V3 wird NEK1 mit einem Cilien-Evidenzwert von 2 gelistet [170] 127

Diskussion

 Zwei knockout Mausmodelle Nek1kat und Nek1kat-2J, welche eine Mutation im Nek1 Gen aufweisen und den Phänotyp der Patienten mit SRPS Typ Majewski (Kleinwuchs, Gesichtsdysmorphien und polyzystische Nieren) widerspiegeln [171-173]

7.1.1.1. Weiterführende Analysen der NEK1 Mutation von P1 p.(Arg127*) Die homozygote nonsense Mutation p.(Arg127*) von Patient P1 liegt in der hoch konservierten Kinase-Domäne, welche für die Centrosomen Integrität und Ciliogenese erforderlich ist. Vom murinen Nek1 ist auch bekannt, dass es an der Ausbildung des primären Ciliums involviert ist und die Coiled-coil Domäne von Nek1 ein Cilienlokalisationssignal enthält [156, 157]. Des Weiteren konnten diese Autoren zeigen, dass Fusionsproteine, die nur aus dem C-Terminus (AS258-1203) bestehen und dementsprechend keine funktionstüchtige Coiled-coil Domäne aufweisen, keine Lokalisation von murinen Nek1 am Cilium mehr zeigen. Der in dieser Dissertation hergestellte polyklonale NEK1-H3T1 Antikörper ist auch gegen die Coiled-coil Domäne (AS 587-734) der 5 bis jetzt bekannten humanen NEK1 Isoformen gerichtet und sollte somit sowohl für den Nachweis eines Lokalisationssignals von NEK1 am primären Cilium in Immunfluoreszenzanalysen als auch für die Detektion des full-length Proteins im Western Blot verwendet werden. Durch die Mutation c.379C>T im Patienten P1 entsteht ein vorzeitiges Stopcodon p.(Arg127*), dieses Stopsignal führt zu einer verfrühten Freisetzung der Polypeptidkette bei der Proteinbiosynthese und somit zu einem verkürzten (truncated ) Protein. Der nonsense-mediated mRNA decay (NMD) Signalweg ist ein mRNA Überwachungssystem, welches Transkripte mit einem vorzeitigen Terminationscodon degradiert, um die Translation von falschen Transkripten zu verhindern [174, 175]. Der aufgrund der nonsense Mutation p.(Arg127*) erwartete Verlust des full-length Proteins konnte in dieser Arbeit erstmals im Western Blot nachgewiesen werden, da im Vergleich zu Kontroll-Fibroblasten sich bei den NEK1-defizienten Zellen von Patient P1 keine Bande auf Höhe der erwarteten 140 kDa nachweisen ließ [8]. Die zusätzlich erkennbaren Banden auf Höhe von 100 und 50 kDa könnten entweder aufgrund der Herstellung eines polyklonalen Antikörpers unspezifische Signale oder kleinere bis jetzt noch nicht bekannte Isoformen von NEK1 darstellen. Die schon in der Masterarbeit durchgeführten morphologischen Studien an Fibroblasten des betroffenen Patienten P1 ergaben eine deutlich erniedrigte Anzahl von Zellen mit Cilien und eine signifikante Verkürzung der Cilienlänge bei ansonsten unauffälliger Mitose [12]. Bei weiteren Immunfluoreszenzanalysen in dieser Dissertation mit dem NEK1-H3T1 Antikörper konnte ich in Kontroll-Fibroblasten eine Lokalisation von NEK1 im Cytoplasma und am Basalkörper der primären Cilien bzw. an den Centrosomen erkennen, wohingegen sich in den 128

Diskussion

Patienten-Fibroblasten P1 neben der Lokalisation im Cytoplasma kein oder nur ein schwächeres diffuses NEK1 Signal an den Cilien bzw. Centrosomen beobachten ließ. Die Spezifität des NEK1-H3T1 Antikörpers wurde vorher durch die Absättigung des Antikörpers mit dem zugehörigen Peptid (rekombinantes NEK1-H3 Protein) in immunhistochemischen Färbungen überprüft. Da bei den Absättigungstests keine Fluoreszenzsignale mehr beobachtet werden konnten, kann von einer spezifischen Bindung des Antikörpers ausgegangen werden. Durch die im Patienten vorliegende nonsense Mutation p.(Arg127*) wird kein funktionstüchtiges Protein gebildet, bzw. Transkripte mit einem vorzeitigen Terminationscodon durch den NMD- Mechanismus degradiert [174, 175] und somit wird kein Signal in Immunfluoreszenzanalysen am primären Cilium erwartet. Dass aber ab und zu bei der Ausbildung von verkürzten Cilien in den Patientenzellen ein schwaches NEK1 Lokalisationssignal am Cilium beobachtet wurde, kann eventuell durch einen nicht vollständigen nonsense-mediated mRNA decay der c.379C>T nonsense Allele erklärt werden, welches sich auch in einer NEK1-Restexpression von 38 % in LCL-Zelllinien des Patienten im Vergleich zu Kontrollen abzeichnete [12, 119]. Fehler bei der Eliminierung von mRNAs mit vorzeitigem Stopcodon resultieren in der Synthese von anormalen Proteinen, welche toxisch für die Zellen des Organismus sein können [174, 175]. Die physiologische Rolle dieses Signalweges und die Aufklärung dieses grundlegenden Mechanismus sind wichtig für das Verständnis der Genotyp-Phänotyp-Korrelation in verschiedenen genetisch bedingten Krankheiten. Ohne das NEK1 Protein könnten dessen Aufgaben in der Ciliogenese [156, 157] nicht mehr ausgeübt werden und somit kann der schwere perinatal letale Phänotyp SRPS Typ Majewski (SRPS II/ SRTD 6) des Patienten P1 erklärt werden [12].

7.1.1.2. Weitere NEK1-Patienten dieser Dissertation Zusätzlich zu den 3 vorbeschriebenen SRPS Typ Majewski Patienten (P1: p.(Arg127*) [hom.], P2: c.869-2A>G [hom.], P3: p.(Asn547Lysfs*2) [het.]) [12] konnte ich in dieser Dissertation von 29 untersuchten Patienten mit klinischer Verdachtsdiagnose eines Short-Rib Polydaktylie Syndroms in 4 Patienten 6 neue Varianten (nonsense, splice-site, missense) im NEK1 Gen molekulargenetisch bestätigen. Mittels Splice-site-Prädiktion sollte die Dignität aller gefundenen Splicing-Mutationen in Patienten P2/P9/P10/P12 validiert werden, wobei ein vollständiger Verlust der Spleißstellen vorhergesagt wurde. Diese Mutationsvorhersageprogramme lassen vermuten, dass durch die vorliegenden Mutationen im Spleiß-Donor bzw. Spleiß-Akzeptor diese nicht mehr von den Untereinheiten des Spliceosoms erkannt werden können und somit kein erfolgreiches Spleißen 129

Diskussion der prä-mRNA mehr stattfindet [176]. Der Schweregrad einer Krankheit korreliert mit dem Level an korrekt gespleißter RNA im Verhältnis zu alternativ gespleißten Varianten. Veränderungen im Level von Spleißfaktoren modulieren das Spleißmuster von krankheitsassoziierten Genen. Folglich führt die Modulation des Spleißmusters zu einer Regulation der Proteinfunktion und zu einer Modifikation (gentic modifier) des Krankheits- schweregrades [177, 178]. Man könnte deshalb die Vermutung anstellen, dass durch die splice- site Mutationen die Level an korrekt gespleißter RNA in den Patienten zu niedrig sind und deshalb der schwere Phänotyp des perinatal letalen SRPS zur Ausprägung kommt. Eine Überprüfung, ob die besagten Exons vollständig herausgespleißt werden oder nicht, konnte nicht erfolgen, da keine RNA-Proben für weitere Analysen zur Verfügung standen. Hervorzuheben ist, dass die c.214+1G>A splice-site Mutation in unserem Patientenkollektiv sowohl in Patient P9 als auch P10 jeweils heterozygot nachgewiesen werden konnte (Tab. 4). Aufgrund der Anamnese und der unterschiedlicher Herkunft erscheint eine Verwandtschaft beider Familien unwahrscheinlich, dies kann aber nicht 100%ig ausgeschlossen werden. Founder-Mutationen haben einen gemeinsamen Ursprung (Founder), sind also dieselbe Mutation auf dem gleichen Haplotypen, wohingegen rekurrente Mutationen wiederholt (rekurrent) auf unterschiedlichem Background (Haplotyp) entstehen. Für verschiedene Ciliopathien - wie z.B. JATD, primäre ciliäre Dyskinesie und Joubert Syndrom - wurden schon Founder-Mutationen als ursächlich beschrieben [179-182]. Die beiden Patienten P9 [c.214+1G>A, c.3023C>G] und P10 [c.214+1G>A, c.1900_1901delGA] weisen zusätzlich zur selben splice-site Mutation weitere unterschiedliche heterozygote SNPs im NEK1 Gen auf (Tab. 13). Eine weiterführende Haplotypen-Analyse mittels Microarrays in den beiden betroffenen Familien könnte neue Erkenntnisse bringen, dies wurde aber nicht mehr durchgeführt. Zum jetzigen Zeitpunkt lässt sich nur vermuten, dass es sich nicht um eine Founder-Mutation, sondern um eine rekurrente Variante handelt, die zufällig unabhängig voneinander in zwei Familien entstanden ist. In den letzten Jahren konnten zusätzlich zu den Standardvorhersageprogrammen (SIFT, PolyPhen2, MutationTaster etc.) auch noch auf ExAC (61486 Exom-Daten des Exome Aggregation Consortiums [183]) und CADD-Werte (Combined Annotation Dependent Depletion [184]) als Einstufungshilfen für die Pathogenität gefundener Varianten zurückgegriffen werden. Basierend auf dem sehr seltenen Vorkommen des SRPS-Phänotyps wurden im ExAC-Browser alle häufigen Varianten über 0,01 % ausgeschlossen. Der CADD- Wert bezieht sich auf viele unterschiedliche Annotationen einer Variante, wobei nach Funktionalität, Pathogenität und Risiko priorisiert wird [184]. Der CADD-Score kann einen

130

Diskussion

Wert von 1 - 99 annehmen. Ist der CADD-Wert größer oder gleich 10, gehört die Variante zu den 10 % der Varianten mit mittleren Risiko. Ein Wert von 20 besagt, dass die Variante zu dem einem Prozent der Varianten mit hohem Risiko zählt. Alle bis jetzt identifizierten NEK1 Mutationen sind gleichmäßig über das gesamte Protein verteilt und liegen hauptsächlich in drei Domänen (Kinase, Basische, Coiled-coil Abb. 45), welche zum einen für die Funktion der Zellzykluskontrolle und zum anderen für die Regulation der Cilien wichtig sind [156, 157, 185, 186]. Die Varianten c.214+1G>A, p.(Ser1008*) und p.(Glu634Lysfs*11) werden aufgrund der Familiensegregation und Vorhersagen verschiedener Prädiktionsprogramme als krankheitsverursachend eingestuft. Das complex rearrangement und die Mutation p.(Ser184Gly) werden auch als pathogen gelistet, wobei aber aufgrund fehlender Eltern-DNA keine abschließende Aussage über die Vererbung der einzelnen Varianten gemacht werden kann. Die Variante p.(Ser925Ile) wird zum jetzigen Zeitpunkt noch als variant of unknown significance (VUS) eingestuft. Insgesamt hat sich die Anzahl von Patienten mit Varianten im NEK1 Gen auf insgesamt 7 erhöht, wobei alle identifizierten Varianten homozygot bzw. compound heterozygot vorliegen, welches die autosomal rezessive Vererbung von SRPS bestätigt [59, 78, 80]. In der DIDA-Datenbank (DIgenic diseases DAtabase [187]) werden seit 2016 detaillierte Informationen über Gene und assoziierte Varianten, die in digenen Erkrankungen involviert sind, aufgelistet. Zurzeit sind 213 digene Kombinationen aufgeführt, welche in 44 verschiedenen digenen Erkrankungen beteiligt sind. Diese Kombinationen setzen sich aus 364 verschiedenen Varianten zusammen, die über 136 verschiedene Gene verteilt sind. Die in Patient P3 beobachtete Kombination der heterozygoten Variante in NEK1 c.1640dup mit der zweiten heterozygoten Variante in DYNC2H1 c.11747G>A [12] wurde als digene diallele Vererbung für SRPS in DIDA vermerkt und ist als krankheitsverursachend beschrieben (Abb. 48).

7.1.1.3. NEK1-Mutationsspektrum In den letzten Jahren konnte in einer Vielzahl von Studien der Zusammenhang von Mutationen im NEK1 Gen und Krankheitsbildern aus dem Kurzrippen-Polydaktylie Spektrum bestätigt werden [61, 87, 93, 94]. El Hokayem et al. konnten in 5 Patienten jeweils homozygot 4 verschiedene Mutationen in NEK1 identifizieren [94] (Abb. 45). Hervorzuheben ist, dass es sich bei der in der Kinase- Domäne lokalisierten nonsense Mutation [c.379C>T, p.(Arg127*)] um dieselbe Mutation handelt, die wir in Patient P1 erstbeschrieben haben [12]. Obwohl die von El Hokayem 131

Diskussion beschriebene Familie aus Frankreich stammt und unser Patient P1 eine türkische Ethnizität aufweist, ist eine Verwandtschaft beider Familien eher unwahrscheinlich, kann aber nicht komplett ausgeschlossen werden. Um die homozygote c.379C>T Variante als Founder- Mutation bestätigen zu können, könnte man eine Haplotypen-Analyse beider Familien durchführen. Zum jetzigen Zeitpunkt wird diese Variante nur als rekurrente Mutation angesehen, welche unabhängig voneinander in zwei Familien entstanden ist. Die jeweils homozygoten missense Mutationen [c.433G>A, p.(Gly145Arg) und c.758T>C, p.(Leu253Ser)] sind auch in der Kinase-Domäne von NEK1 lokalisiert (Abb. 45). Das von den Autoren verwendete Vorhersageprogramm Alamut sagte einen pathogenen Effekt dieser missense Mutationen voraus, welche in 200 Kontrollchromosomen nicht beobachtet wurden [94]. Des Weiteren konnten sie eine Indel Mutation c.2846_2847insGG2847delT identifizieren, welche zu einem vorzeitigen Stopcodon führt [p.(Asp949Glufs*6)]. Die klinische Diagnose SRPS Typ Majewski (SRPS II/ SRTD 6) wurde anhand von Röntgenaufnahmen mit SRPS-typischen Merkmalen gestellt und molekulargenetisch mittels Sanger-Sequenzierung validiert. Die Autoren konnten keine Korrelation der Mutationsart oder der Lokalisation der Varianten mit dem Schweregrad des Phänotyps feststellen. Chen et al. konnten einen Patienten mit SRPS Typ Verma-Naumoff (SRPS III/ SRTD 3) publizieren, welcher in der Kinase-Domäne von NEK1 eine homozygote splice-site Mutation im Intron 4 (c.331-1A>G) aufwies [188]. In einer weiteren Publikation dieses Autors [93] wurde in einem Patienten mit SRPS Typ Majewski (SRPS II/ SRTD 6) eine heterozygote splice-site Mutation (c.465-1G>A) vorgestellt, wobei kein zweiter Hit im NEK1 Gen nachgewiesen werden konnte (Abb. 45). Auch die Sequenzierung der Gene WDR35, DYNC2H1, IFT80, EVC und EVC2 ergab keine weitere heterozygote Variante. Dies ist die erste Beschreibung eines SRPS Patienten, der den für dieses Krankheitsbild typischen Phänotyp zeigt, und nur eine paternal vererbte heterozygote NEK1 Variante besitzt. Auf der Beobachtung von digenen diallelen Vererbungen von Ciliopathien [12, 143, 144] könnte z. B. mit einer Exom-Sequenzierung gezielt nach Mutationen in weiteren Ciliengenen gesucht werden, um einen zweiten Hit zu identifizieren und somit die in der Literatur beschriebene autosomal rezessive Vererbung von SRPS zu stützen [78, 80]. McInerney-Leo et al. beschreiben in ihrer Publikation, dass die Whole-Exome- Sequenzierung eine effiziente und spezifische Methode darstellt, um die genetischen Ursachen für SRTDs aufzuklären [61]. Sie beschreiben den Fall der Patientin SKDP-126.3 als eine Ausnahme der vermuteten Phänotyp-Genotyp-Korrelation. Bei dieser Patientin konnte keine definitive klinische Diagnose gestellt werden, sie zeigte Überlappungen sowohl mit dem Jeune

132

Diskussion

Syndrom als auch mit Sensenbrenner Syndrom. Es konnte compound heterozygot eine splice- site Mutation [c.869-1G>T] und eine missense Mutation [c.514C>T; p.(Pro172Ser)] im NEK1 Gen identifiziert werden (Abb. 45). Mutationen im NEK1 Gen wurden zunächst nur mit SRPS Typ Majewski in Verbindung gebracht, wobei die Patienten pränatal oder bei der Geburt versterben [12, 81, 189]. SKDP-126.3 zeigt phänotypische Merkmale des SRPS Typs Majewski wie z. B. Kleinwuchs, verkürzte Tibia, engen Thorax, aber zum Zeitpunkt der Publikation war das Mädchen 3 Jahre alt, was nicht in Einklang mit der perinatalen Letalität von SRPS II gebracht werden kann. Anhand der Exomdaten konnte noch eine seltene Mutation (MAF < 0.001) in WDR60 (NM_018051: Exon 6: c.C891G, p.H297Q) identifiziert werden, welche noch nicht bei Individuen mit SRTD berichtet wurde [61]. Es ist somit nicht eindeutig, ob diese Variante oder andere Varianten im Genom den durch die compound heterozygoten NEK1 Mutationen vorliegenden Phänotyp modifizieren, welches die Vermutung stützt, dass Ciliopathien genetischen Modifikationen unterliegen [54].

Abb. 45 Schematische Darstellung der Domänenstruktur von NEK1 und Lokalisation identifizierter Varianten In 7 von 32 Patienten, welche mit Verdacht auf Short-rib Polydaktylie Syndrom (SRPS) in dieser Dissertation untersucht wurden, wurden homozygote, compound heterozygote oder heterozygote Mutationen bzw. VUS in NEK1 identifiziert. Sowohl in dieser Arbeit als auch von anderen Arbeitsgruppen wurden 16 verschiedene splice- site, missense und nonsense Mutationen in insg. 14 Patienten beschrieben, welche gleichmäßig über das NEK1 Protein verteilt sind und alle bekannten Domänen (Kinase, Basische, Coiled-coil) abdecken. (#) Erstbeschreibung; ($) digene diallele Vererbung DYNC2H1; (°) c.397-14_397-4conNM_152788.4:c.2779-23029_2779-22742; (§) Variant of unknown significance (VUS). Proteinschema verändert nach [12] und Darstellung aller Varianten im Anhang (Tab. 12). Die Varianten dieser Arbeit sind auf NM_012224.2, NP_036356.1 berechnet.

In summa konnte in den letzten Jahren von mir in dieser Arbeit und von anderen Arbeitsgruppen in insg. 14 Patienten mit der klinischen Diagnose SRPS 16 verschiedene Mutationen im NEK1 Gen (Abb. 45) identifiziert werden [12, 61, 93, 94, 188]. In 8 Patienten konnten homozygote, in 4 Patienten compound heterozygote NEK1 Mutationen identifiziert werden, was in Einklang mit einer autosomal rezessiven Vererbung der SRPS gebracht wird. Eine digene diallele

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Diskussion

Vererbung (NEK1 und DYNC2H1) wurde in einem der Patienten (P3) beobachtet [12], des Weiteren wurde ein Patient mit heterozygoter NEK1 Variante ohne zweiten Hit beschrieben [93]. Am häufigsten wurden splice-site Mutationen (6x) beobachtet, nonsense und missense Mutationen wurden je fünfmal beschrieben (13.3, Tab. 12). Bei den verschiedenen Mutationsarten trat am häufigsten (4x) die Kombination einer missense mit einer splice-site Mutation auf. Nonsense Mutationen wurden 3x mit splice-site und 2x mit missense Mutationen kombiniert. Die 16 verschiedenen Mutationspositionen sind über das gesamte NEK1 Gen gleichmäßig verteilt, wobei die stärkste Anhäufung der identifizierten Mutationen in der Kinase Domäne (9x) zu verzeichnen ist, in der Basischen und Coiled-coil Domäne sind jeweils zwei Mutationen lokalisiert und 3 Mutationen liegen in keiner funktionellen Domäne des NEK1 Proteins (Abb. 45). Die große Anzahl an Mutationen in der Kinase Domäne verdeutlicht die wichtige Funktion dieser Domäne für die Centrosomen Integrität und Ciliogenese [156, 157]. Somit tragen die Ergebnisse unserer Analysen und die Identifikation des NEK1 Gens zur Erweiterung der Kenntnisse über die vermutete Heterogenität der Erkrankungsgruppe der Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome bei und erweitern das NEK1 Mutationsspektrum. Im Zuge der in der Diagnostik immer mehr zum Einsatz kommenden Exom- Sequenzierung konnten im Jahr 2016/2017 auch Mutationen in NEK1 als ursächlich für die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Oro-fazio-digitales Syndrom Typ 2 (OFD II/ Mohr- Syndrom) und axiale Spondylometaphysäre Dysplasie (SMD) identifiziert werden [190-193]. Somit sind die Phänotypen, die mit NEK1 Mutationen assoziiert sind, sehr variabel und die Etablierung einer Genotyp-Phänotyp Korrelation gestaltet sich als schwierig.

7.1.2. Mutationen im DYNC2H1 Gen Das DYNC2H1 Gen kodiert für das cytoplasmatische Dynein-2 Protein der schweren Kette 1 (dynein cytoplasmic 2 heavy chain 1), welches als Komponente des Dynein-2 Komplexes eine Rolle beim retrograden Intraflagellartransport (IFT) des primären Ciliums spielt [50, 152]. So konnten im Jahr 2009 bei Patienten mit JATD und SRPS III (heute als SRTD 3 annotiert) durch den Nachweis von Mutationen im DYNC2H1 Gen ein vermuteter Zusammenhang zu den Ciliopathien bestätigt werden. Mutationen in diesem Gen verursachen ein heterogenes Phänotypen-Spektrum, die mit einer veränderten primären Cilienfunktion zusammenhängen, und beinhalten häufig Polydaktylie, abnormale Skelettogenese und polyzystische Nieren. Chondrozyten von betroffenen Individuen zeigten morphologisch abnorme, verkürzte Cilien mit einer anomalen Cytoskelett-Mikrotubuli-Architektur, was ein verändertes Mikrotubuli- Netzwerk als Teil des Krankheitsprozesses impliziert [65, 66]. 134

Diskussion

DYNC2H1 wird aus folgenden Gründen als Ciliengen in meiner Ciliengenliste aufgeführt:

 Erstbeschreibung von DYNC2H1 Mutationen als ursächlich für ATD/ SRPS III [65, 66] und Erweiterung des DYNC2H1 Mutationsspektrums [94, 145, 194]  Cilienabnormalitäten in Patienten-Chondrozyten aufgrund von Defekten im retrograden Transportprotein DYNC2H1 [65]  DYNC2H1 ist Teil des cytoplasmatischen Dynein-2 Komplexes mit wichtiger Rolle im retrograden IFT-Transport im Cilium [50, 195]  Lokalisation von DYNC2H1 am Golgi-Apparat und Beteiligung von DYNC2H1 an der Cilien/Flagellen-Assemblierung [196-198]  Auflistung von DYNC2H1 als Ciliengen des europäischen Projekts „SYSCILIA“ [9]  In Cildb V3 wird DYNC2H1 mit einem Cilien-Evidenzwert von ≥10 gelistet [170]  Dync2h1b2b414Clo Mausmodell für ATD3 mit z. B. kardiovaskulären Defekten, Nieren- agenesie und Polydaktylie, welches den Phänotyp der Patienten widerspiegelt [199, 200]

7.1.2.1. DYNC2H1-Patienten dieser Dissertation Aufgrund des breiten SRPS/SRTD Phänotypenspektrums sollte bei 25 Patienten dieser Dissertation, welche ohne Mutationsbefund im NEK1 Gen waren, das 90 Exons umfassende DYNC2H1 Gen per Sanger- oder mittels Exom-Sequenzierung bei Patient P30 untersucht werden. In 7 Patienten mit Verdachtsdiagnose SRPS konnte ich somit 12 neue Varianten im DYNC2H1 Gen identifizieren, welche gleichmäßig über das gesamte Protein verteilt sind. Diese lagen hauptsächlich in der Dynein heavy chain N-terminalen Region 1, der ATP-Binde und Hydrolase Domäne und in der Dynein heavy chain C-terminalen Region. Nonsense Mutationen konnten in 2 Patienten nachgewiesen werden, in den Restlichen wurden verschiedene missense Varianten identifiziert (Abb. 49). In 4 Patienten lagen die Varianten compound heterozygot vor, in 3 Patienten (P5/P6/P19) konnte je nur eine heterozygote Variante identifiziert werden. Insgesamt 4 Varianten wurden aufgrund der Segregation in den Familien und verschiedener Vorhersageprogramme als pathogen eingestuft. Somit werden insg. 6 Varianten als wahrscheinlich krankheitsverursachend eingestuft, 2 werden eher als benigne bewertet, wobei durch fehlende Vererbungsmuster in den jeweiligen Familien oder einer fehlenden zweiten Mutation keine eindeutig abschließende Aussage möglich ist. Im Gegensatz zum NEK1 Gen konnte ich im DYNC2H1 Gen keine neuen splice-site Mutationen, noch Mutationen im homozygoten Zustand nachweisen.

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Diskussion

Die im Patient P3 beobachtete Kombination einer heterozygoten Variante in DYNC2H1 c.11747G>A mit der zweiten heterozygoten Variante in NEK1 c.1640dup [12] wurde als digene diallele Vererbung für SRPS in DIDA vermerkt und ist als krankheitsverursachend beschrieben (Abb. 48). Dies untermauert die Beobachtungen von digenen diallelen Vererbungs- mechanismen in anderen Ciliopathien - wie z. B. Bardet-Biedl Syndrom oder Nephronophthise [143, 144]. Patient P5 wies nur eine heterozygote missense Variante [c.1151C>T, p.(Ala384Val), rs369614706]) mit einer MAF von 4,089 x 10-5 (ExAc) auf, die schon für SRPS beschriebenen Gene NEK1, IFT80, TTC21B und WDR35 waren ohne Befund. Diese missense Variante wurde schon in Kombination mit einer nonsense Mutation [c.4351C>T, p.(Gln1451*)] in der Literatur beschrieben [146]. Eine Exom-Sequenzierung dieses Patienten könnte eventuell einen 2.Hit in einem anderen mögliche Ciliengen aufdecken und somit die klinische Diagnose SRPS klären. Patient P21 zeigte compound heterozygote DYNC2H1 Mutationen [p.(Arg2270Gln), p.(Pro3388Leu)] welche gemäß Prädiktionen als krankheitsverursachend eingestuft werden, aber eine allelspezifische Diskriminierung konnte mangels fehlender Eltern-DNA nicht erfolgen. Interessanterweise wird diese p.(Pro3388Leu) Variante compound heterozygot mit einer zweiten Mutation in DYNC2H1 p.(Asn4160_Gln4314del) in einer belgischen Familie mit ATD/ Jeune Syndrom beschrieben [145]. Eine Exom-Sequenzierung in Patient P30 ergab die Varianten p.(Arg330Cys) und p.(Ala3778Val) compound heterozygot, welche in der Familie segregierten und gemäß verschiedener Vorhersageprogramme als krankheitsverursachend eingestuft wurden. Diese p.(Arg330Cys) Variante wurde schon mehrmals in der Literatur beschrieben, homozygot in Patient „JATD-14“ und compound heterozygot mit p.(Asn2845Ilefs*8) in Patient mit SRPS Typ II [94, 145]. Die Exom-Sequenzierung mit zusätzlicher Filterung gegen ciliäre Gene kann als sehr effiziente und spezifische Methode zur Identifizierung der zugrunde liegenden genetischen Ursachen von ciliären Chondrodysplasien, insbesondere der SRTDs, angesehen werden. Die Einführung von NGS hat die genetische Diagnostik, entweder in Form von spezifischen Gen-Panels oder Whole-Exome-Sequenzierung maßgeblich erleichtert [59, 61, 145].

136

Diskussion

7.1.2.2. DYNC2H1-Mutationsspektrum In den letzten Jahren konnte zusätzlich zu den Erstbeschreibungen von Merrill bzw. Dagoneau in einer Vielzahl von Studien der Zusammenhang von Mutationen im DYNC2H1 Gen und Krankheitsbildern aus dem SRPS/SRTD-Spektrum bestätigt werden [12, 61, 94, 145, 146, 194, 201-204]. In dieser Dissertation und 11 weiteren Publikationen konnten somit 100 verschiedene Mutationspositionen identifiziert werden, die gleichmäßig über das ganze Gen verteilt sind und auch alle bekannten Domänen in DYNC2H1 abdecken (Abb. 49). Dabei konnten 11x splice-site, 20x nonsense, 65x missense, 4x größere Deletionen detektiert werden, wobei 13 dieser Mutationspositionen in jeweils 2-3 Patienten gefunden wurden. Bei den verschiedenen Mutationsarten trat am häufigsten (43x) die Kombination einer missense mit einer missense Mutation auf. Dies stützt auch die Beobachtung von missense- missense Kombinationen in den Patienten P14/P21/P30 dieser Dissertation. Des Weiteren wurden laut verschiedener oben genannter Publikationen missense Mutationen 35x mit nonsense und 16x mit splice-site Mutationen kombiniert. Kombinationen splice-site mit splice-site bzw. nonsense mit splice-site kamen 6 mal vor. Compound heterozygote Mutationen wurden 48x, Varianten im homozygoten Zustand nur 8x gefunden. In 3 Patienten konnte die Kombination aus 3 verschiedenen heterozygote Varianten als wahrscheinlich ursächlich beschrieben werden (13.3, Tab. 14) [94, 145]. Auch in Patient P14 in dieser Dissertation konnten drei verschiedene heterozygote Varianten [p.(Leu2876Ser) mat., p.(Lys669Arg) pat. und p.(Cys2182Tyr) pat.] gezeigt werden, wobei die beiden paternal vererbten Varianten gemäß Prädiktion als wahrscheinlich nicht krankheitsverursachend gewertet werden. Die klinische Verdachtsdiagnose eines Short-Rib Polydactyly Syndroms Typ III auf der Grundlage von DYNC2H1 Mutation konnte in P14 somit nicht abschließend bestätigt werden. Von 8 Patienten dieser Arbeit, konnten bei Patienten P5/P6/P19 nur jeweils eine heterozygote Mutation in DYNC2H1 nachgewiesen werden. Heterozygote Varianten ohne 2. Hit wurden auch von einer anderen Arbeitsgruppe 5 mal beobachtet [194]. Eine zweite heterozygote Mutation, um den autosomal-rezessiven Vererbungsmechanismus der SRPS/SRTD zu stützen [78, 80], könnten partielle intragenetische Deletionen oder Mutationen im intronischen Bereich bzw. Promotorregionen sein, die nicht ausgeschlossen werden konnten. Insgesamt 3 Varianten [p.(Ala384Val), p.(Pro3388Leu) und p.(Arg330Cys)] in den in dieser Arbeit untersuchten Patienten konnten auch von anderen Arbeitsgruppen in Kombination mit weiteren DYNC2H1 Mutationen, nachgewiesen werden [94, 145, 146]. Die von uns beschriebene digene diallele Kombination von Mutationen in DYNC2H1 und NEK1 wurden in den anderen Publikationen mit DYNC2H1-Patienten zwar nicht beschrieben, wobei aber für

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Diskussion andere Ciliopathien (Bardet-Biedl Syndrom/ Nephronophthise) der Mechanismus einer digenen diallelen Vererbung schon berichtet wurde [143, 144]. In der Diagnostik wird die Exom- Sequenzierung immer mehr zum Einsatz kommen, wodurch in Zukunft weitere neue DYNC2H1 Mutationen identifiziert werden und somit die allelische Heterogenität von Ciliopathien, dass ein klinisch relevanter Phänotyp durch mehrere (oftmals viele) Mutationen innerhalb eines bestimmten Gens zustande kommen kann, bestätigt wird [145, 205, 206].

7.1.3. Mutationen im EVC Gen Anstelle von Exom-Sequenzierungen kann in der Diagnostik auch auf Gen-Panel- Sequenzierungen zurückgegriffen werden. Beim TruSight One Sequencing Panel Kit (Illumina) sind die exonischen Genbereiche für über 4800 Gene mit bekannten klinischen Phänotypen hinterlegt. Ein Abgleich dieser Gene mit den 20 bekannten Genen für SRPS/SRTD ergab, dass 11 Gene (DYNC2H1, EVC, EVC2, IFT43, IFT80, IFT122, IFT140, NEK1, TTC21B, WDR19 und WDR35) abgedeckt sind. Erst kürzlich als ursächlich für die Kurzrippen Thoraxdysplasien und überlappende ähnliche skelettale Ciliopathien ursächliche 9 Gene (CEP120, CSPP1, DYNC2LI1, IFT52, IFT172, KIAA0586, TCTEX1D2, WDR34 und WDR60, vgl. Tab. 1, S.14) werden bei diesem Gen-Panel leider nicht abgedeckt. Die Auswertung des Gen-Panels ergab in beiden Elternteilen eine heterozygote Mutation in der splice-site von Exon 3 im EVC Gen [c.384+5G>C], vom Patienten P23 wird aufgrund der autosomal-rezessiven Vererbung des Ellis-van Crefeld Syndroms davon ausgegangen, dass diese Variante beim nicht untersuchten Patienten homozygot vorliegen muss. Eine Sequenzierung der mRNA nach reverser Transkription von Exon 2-11 zeigte zwar kein aberrantes Spleißmuster, aber die Analyse eines auf genomischer DNA-Ebene nachgewiesenen heterozygoten Polymorphismus [c.249A>G] ergab den Verlust eines Allels [r.249G, LOH] und bestätigte den Abbau des Transkriptes dieses Allels durch nonsense mediated mRNA decay. Die in dieser Dissertation nachgewiesene c.384+5G>C splice-site Mutation wurde von Shi et al. in Kombination mit einer weiteren Spleißvariante c.1465-1G>A schon als krankheitsursächlich beschrieben [147]. Das Ellis-van Crefeld Syndrom (EVC) ist eine seltene autosomal rezessive Skelettdysplasie, die durch kurze Gliedmaßen, kurze Rippen, postaxiale Polydaktylie und dysplastische Nägel und Zähne gekennzeichnet ist [207, 208]. Dies passt zum beobachteten Phänotyp der in dieser Dissertation untersuchten Patientenkohorte, somit wird die Mutation c.384+5G>C als ursächlich angenommen und erweitert das Spektrum der Ellis-van Crefeld Syndrome. Die NGS Technologie in der genetischen Diagnostik, entweder in Form von 138

Diskussion spezifischen Gen-Panels oder Whole-Exome-Sequenzierung, erleichtert somit die Identifikation zugrunde liegender Mutationen in Patienten mit EVC [209]. In Zukunft könnte man evtl. auch ein Multi-Gen Panel spezifisch für SRTD-Gene erstellen, welches auch die neueren annotierten Gene umfasst, um die Routine-Diagnostik zu erleichtern.

7.2. DYNC2LI1 in der Pathogenese der SRTD 15

Trotz der aktuellen Erfolge in der Identifizierung der zugrunde liegenden genetischen Ursachen der SRPS/SRTD (z. B. NEK1, DYNC2H1, etc.) bleibt die Frage nach dem individuellen Pathomechanismus, ebenso wie die Ursache der Variabilität der Symptomatik der Ciliopathien bei vielen SRPS/SRTD Formen ungeklärt. Die Ergebnisse dieser Studien sollen deshalb das Spektrum der Ciliopathien durch den Nachweis von Varianten in neuen Genen und durch deren funktionelle Charakterisierung erweitern. Aufgrund der vermuteten Anzahl von bislang über 1000 mit dem primären Cilium assoziierten Genen gehen wir davon aus, dass die Exom- Sequenzierung als effizienteste und spezifischste Methode zur Identifizierung der zugrunde liegenden genetischen Ursachen der autosomal-rezessiv vererbten Entitäten beitragen kann [61, 145, 148].

7.2.1. Identifikation von DYNC2LI1 Mutationen Die Next Generation Sequencing Technologie sollte in dieser Arbeit bei SRPS/SRTD-Patienten mit noch nicht geklärter molekulargenetischer Ursache angewandt werden. Die gefundenen Varianten wurden zunächst anhand verschiedener Kriterien priorisiert. Dabei wurde sowohl der vorhergesagte Effekt auf die Proteinfunktion als auch die Funktion des Gens bei der Ciliogenese miteinbezogen. Insbesondere Kandidatengene der von mir erstellten Liste bekannter und vermuteter Ciliengene wurden als sehr relevant angesehen, da dies die These einer krankheitsursächlichen Veränderung in der Pathogenese von Ciliopathien stark unterstützt. Bei Patient P7, welcher einen Jeune Asphyxierenden Thoraxdysplasie ähnlichen Phänotyp aufwies und Überlappungen zum SRPS und EVC Spektrum zeigte, lag die Vermutung nahe, dass auch hier ein eventuell an der Ciliogenese beteiligtes Gen ursächlich sein könnte. Nach der Exom-Sequenzierung wurden in diesem Patienten basierend auf Mutationseffekten, Konservierung, Werte verschiedener Vorhersageprogramme und Abgleich mit der 1032 Gene umfassenden Ciliengenliste DYNC2LI1 als Kandidatengen mit zwei potentiell ursächlichen jeweils heterozygoten Varianten [c.622C>T, p.(Arg208*) und c.662C>T p.(Thr221Ile)] identifiziert, welche in der Familie segregierten [149]. Auch die

139

Diskussion phänotypische Analyse der Dync2li1tm1Aar Mäuse unterstützt die Vermutung von DYNC2LI1 als ursächliches Gen für SRPS/SRTD. Diese knockout Mäuse versterben vor Tag E11.5. Zusätzlich zu fehlenden Monocilien weisen sie Neuralrohr- und Herzfehler auf, und zeigen Defekte in der Rumpf- und Schwanzentwicklung [153]. Somit können die phänotypische Überlappungen mit dem beobachteten Phänotypenspektrum der SRPS-Entitäten (Letalität, Organfehlbildungen und insbesondere Thorax- und Knochendefekte, etc.) in Einklang gebracht werden [78-80]. Das DYNC2LI1 Gen kodiert für ein Protein, welches als Komponente des cytoplasmatischen Dynein-2 Komplexes eine Rolle beim retrograden Intraflagellartransport (IFT) des primären Ciliums spielt. Dieses Gen wird ubiquitär exprimiert und sein Protein, das am Axonem- und Golgi-Apparat lokalisiert ist, interagiert direkt mit dem cytoplasmatischen Dynein-2 Protein der schweren Kette 1 (DYNC2H1) [50, 150-152]. Defekte von Komponenten des Dynein-2 Komplexes wurden schon mit dem klinischen Phänotyp SRPS III, Jeune/ Asphyxierende Thoraxdysplasie (SRTD 3/8/11) [59, 87] assoziiert, welche auch in Immunfluoreszenzanalysen typische morphologische Änderungen der primären Cilien in Zellkultur aufwiesen. DYNC2LI1 wurde anhand mehrerer verschiedener Original- bzw. Übersichtsarbeiten, welche DYNC2LI1 als Ciliengen postulieren, in meine Ciliengenliste mit aufgenommen. Der Cilien-Evidenzwert, welcher für DYNC2LI1 laut Cildb V3 bei 18 angegeben wird, ist ein weiterer Priorisierungswert als Ciliengen-Kandidat [170, 210]. Je höher dieser Wert ist, desto häufiger wurde in verschiedenen Organismen ein Nachweis für die ciliäre Beteiligung dieses Proteins angegeben. Somit stützen diese Daten die These von DYNC2LI1 als neues Ciliengen für SRPS/SRTD, weshalb im Folgenden die durchgeführten Experimente kurz diskutiert werden.

7.2.2. DYNC2LI1 ist ubiquitär exprimiert Von DYNC2LI1 (D2LIC, LIC3) sind bis zum heutigen Zeitpunkt 3 Isoformen (NM_001193464; NM_016008; NM_015522) bekannt, wobei die längste aus 13 Exons besteht, die für ein 352 Aminosäuren langes Protein kodiert. DYNC2LI1 ist ubiquitär exprimiert mit hohen Expressionsspiegeln in Gehirn, Niere, Lunge und Hoden, welches in Western Blots von adulten Mäusen nachgewiesen wurde [150]. Der Effekt der DYNC2LI1 Mutationen auf die Expression konnte in dieser Arbeit nicht untersucht werden, da keine RNA von Patient P7 zur Verfügung stand. Wir analysierten die Expressionslevel von DYNC2LI1 in verschiedenen Geweben mit adulten und fetalen cDNA-Panels sowie in Osteoblasten und Chondrozyten. Wir konnten somit eine ubiquitäre Expression von DYNC2LI1 in allen untersuchten Geweben nachweisen, welches die Daten von Grissom et al. unterstützt. Wir bestätigten die höchsten mRNA Expressionslevel 140

Diskussion in Chondrozyten, Gehirn und Niere, wobei ein signifikanter Unterschied zu höheren Expressionsraten in fetalen Geweben (Gehirn, Lunge und Niere) beobachtet wurde [149]. Dies steht im Einklang mit Expressionsprofilen von Genen, die an der Struktur und Funktion des primären Ciliums in verschiedenen Spezies beteiligt sind [120, 121, 211]. Die zwei längsten Isoformen werden überwiegend in allen untersuchten Geweben, einschließlich Osteoblasten und Chondrozyten, exprimiert. Das Vorhandensein eines primären Ciliums auf Chondrozyten wurde erstmals vor über 50 Jahren beschrieben [212]. Primäre Cilien sind sowohl auf Osteozyten, als auch auf Chondrozyten vorhanden [2] und sind wichtig für die Knochen- bzw. Knorpelentwicklung. Da die identifizierten DYNC2LI1 Mutationen nur in den beiden längsten Isoformen lokalisiert sind, ziehen wir in Betracht, dass diese Isoformen eine pathogene Wirkung auf die Skelettentwicklung bei unseren Patienten haben und damit krankheitsverursachend sind. Die Hh- und Wnt-Pathways, welche auch bei der Signalperzeption von primären Cilien beteiligt sind, werden außerdem benötigt, um die Osteoblasten- und Chondrozytendifferenzierung während der Knochenentwicklung zu koordinieren [37]. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass Osteoblasten- oder Osteocyten-spezifische Deletionen von ciliären Proteinen zu verschiedenen Skelett- fehlbildungen führen, was die Vorstellung verstärkt, dass primäre Cilien für die Regulierung der Knochenentwicklung und -erhaltung unverzichtbar sind [213]. Dies spiegelt sich auch im skelettalen Phänotyp des Patienten (enger Thorax, kurze Rippen, postaxiale Hexadaktylie) wider. Im Artikel von Yuan et al. wird außerdem noch die Rolle von primären Cilien und IFT-Proteinen bei der Entwicklung von Knochen und Knorpel, sowie die Differenzierung und Mechanotransduktion von mesenchymalen Stammzellen, Osteoblasten, Osteozyten und Chondrozyten diskutiert [214]. Da DYNC2LI1 Teil des cytoplasmatischen Dynein-2 Komplexes ist [50, 195], welcher für den retrograden IFT verantwortlich ist, sollten die identifizierten Mutationen entscheidende Auswirkungen auf die Proteinfunktion haben und somit die Ciliogenese bzw. Defekte im IFT-Transportmechanismus in weiteren Experimenten untersucht werden.

7.2.3. Effekte der DYNC2LI1 Varianten auf die Proteinstruktur Die identifizierten Mutationen, welche in der Nukleosid-Triphosphat-Hydrolase-Domäne liegen, haben entscheidende Auswirkungen auf die Proteinfunktion. Eine molekulare Modellierung der Veränderungen ergab, dass Thr221 in der Nähe der Nukleosid-Bindungsstelle lokalisiert ist und der Austausch von Threonin zu Isoleucin in der Mutante zu sterischen Hinderungen führen und die Größe der Nukleosid-Bindetasche verringern, welches die 141

Diskussion

Hydrolyase-Funktion des Proteins beeinträchtigt. Durch das Stopsignal der p.(Arg208*) Variante wird kein funktionstüchtiges Protein gebildet bzw. durch den nonsense-mediated mRNA decay (NMD) Signalweg Transkripte mit einem vorzeitigen Terminationscodon degradiert [174, 175]. Da keine Patientenzellen vorhanden waren, konnte nicht überprüft werden, ob im Western Blot kein full-length DYNC2LI1 Protein bei ca. 40 kDa im Vergleich zu Kontrollen nachgewiesen werden kann. Auch eine Immunfluoreszenzanalyse zum Beweis einer veränderten Lokalisation von DYNC2LI1 in Patientenzellen kann somit nicht erbracht werden, wohingegen mittels siRNA knockdown Experimente der Effekt einer Herunterregulation von DYNC2LI1 auf die Cilienmorphologie überprüft werden kann.

7.2.4. DYNC2LI1-Defekte beeinflussen die Cilienlänge und -morphologie DYNC2LI1 wurde als Teil des cytoplasmatischen Dynein-2-Komplexes identifiziert, der am retrograden IFT-Transport beteiligt ist [50, 195]. Der Verlust von cytoplasmatischem Dynein-2 im dync2-li1 Morpholino-Zebrafischmodell führt zu kürzeren Cilien und geringerer Cilienanzahl mit einer Ansammlung von IFT88 nahe dem distalen Ende des Verbindungsciliums [154]. Frühere Studien lokalisierten DYNC2LI1 in Säugerzellen am Golgi-Apparat und in der Centrosomenregion, zusätzlich wurde eine Lokalisation am Axonem von cilientragen Epithelialzellen berichtet [150-152]. Von mir durchgeführte Immunfluoreszenzfärbungen mit einem Antikörper gegen DYNC2LI1 unterstützten die Lokalisation am Centrosom, im Axonem und auch im Bereich der Übergangszone (transition zone). Auf der Basis der beobachteten Ciliendefekte, die durch Dysfunktion von IFT- und Basalkörper-Proteinen verursacht werden, erwarteten wir, dass der Funktionsverlust von DYNC2LI1 beim Menschen zu morphologisch abnormen und fehlenden Cilien führt. Da keine DYNC2LI1-Patientenzellen zur Verfügung standen, führte ich Immunfluoreszenzanalysen an DYNC2LI1 siRNA knockdown Zellen durch. Dies ergab keinen Unterschied in der Anzahl von cilientragenden Zellen, aber die Cilienlänge war signifikant reduziert im Vergleich zu Kontrollen. Die Beobachtung von kürzeren Cilien bestätigten die Ergebnisse im dync2-li1- Morpholino-Zebrafischmodell und in Dync2li1tm1Aar knockout Mäusen [153, 154]. Reduzierte Cilienlängen mit verdickten Spitzen wurden schon für Defekte von DYNC2H1 und WDR34 - weitere Komponenten des cytoplasmatischen Dynein-2 Komplexes - beschrieben [65, 155]. Eine andere Publikation zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied im Verhältnis von cilientragenden Zellen und Cilienlänge in Wdr34-knockdown-ATDC5-Linien [215]. In einer weiteren Komponente des Dynein-2 Komplexes - WDR60 - wurde zwar eine reduzierte Cilienanzahl, aber eine normale Cilienlänge in Zelllinien von betroffenen Patienten beobachtet 142

Diskussion

[88]. Zusammengefasst zeigen diese Daten von verschiedenen Arbeitsgruppen, dass eine Reduktion der Cilienanzahl sowie der Cilienlänge ein häufiges Kennzeichen von Dynein-2 Defekten darstellt. Darüber hinaus zeigten wir in DYNC2LI1-depletierten Zellen eine höhere Inzidenz von Cilien mit verdickten Spitzen, was auf einen Defekt in der Mikrotubuli-Architektur hindeutet. Dies wurde auch in Dync2li1tm1Aar knockout Mäusen beobachtet, in denen stumpfartige nodale Cilien mit ungeordneten Mikrotubuli, IFT-Proteinen und Zelltrümmern vorlagen [153, 216]. Bekannte IFT-B Proteine, welche sich in Cilien mit retrogradem IFT-Transportdefekt akkumulieren, sind z. B. IFT57 und IFT88 [88, 145]. Morphologisch abnormale Cilien in den DYNC2LI1-knockdown Zellen zeigten auch eine signifikante Akkumulation von IFT57/88 an der Cilienspitze, was den IFT-Transportdefekt in DYNC2LI1-defizienten Zellen bestätigt [149].

7.2.5. DYNC2LI1 erweitert das phänotypische Spektrum von skelettalen Ciliopathien Zusammenfassend führen Mutationen in Mitgliedern des Dynein-2-Komplexes zu Jeune- Syndrom/ ATD und anderen Formen des SRTD-Spektrums. Unterschiedliche Defekte dieses Komplexes legen eine Korrelation zwischen der Anzahl an Cilien, der resultierenden Cilienlänge und den funktionellen IFT-Komponenten mit den phänotypisch überlappenden, aber variablen klinischen Merkmalen nahe. Daher erweitert die Identifizierung von Mutationen in DYNC2LI1 (Teil des cytoplasmatischen Dynein-2 Komplexes) bei unseren Patienten das phänotypische Spektrum von skelettalen Ciliopathien (Abb. 46). Weitere Analysen von DYNC2LI1 Sequenzierungsdaten von Patienten mit ideopathischen Kleinwuchs (Short-Net-Kohorte) ergaben heterozygote splice-site Varianten [c.162-2A>G und c.232-8T>G] oder ein Fehlen des Startcodons [c.2T>C, p.(Met1?)]. Durch fehlende Segregationsanalysen in den Familien oder fehlende zweite Mutationen und durch die nicht konsistenten Ergebnisse von MLPA- bzw. qPCR-Analysen ist keine eindeutige abschließende Aussage zur Pathogenität dieser Varianten möglich. Die Anzahl an ursächlichen DYNC2LI1 Varianten konnte in den Patienten, die in dieser Studie untersucht wurden, nicht erweitert werden. Aber fast zeitgleich zur Veröffentlichung der compound heterozygoten DYNC2LI1 Mutationen in Patient P7 [149], wurden von Taylor et al. 3 weitere Patienten mit compound heterozygoten Mutationen in DYNC2LI1 veröffentlicht [217]. Diese Patienten wiesen auch den für SRPS typischen Phänotyp mit kurzen Röhrenknochen, horizontalen Rippen, engem Thorax und Polydaktylie auf und waren perinatal letal. Die Varianten p.(Leu117Val) und p.(Trp124*) liegen auch wie die Mutationen von Patient P7 in der 143

Diskussion

Nukleosid-Triphosphat-Hydrolase-Domäne, wohingegen c.993+1G>A und p.(Glu334*) in der Coiled-coil-Domäne lokalisiert sind. Mit primären Patienten-Fibroblasten konnten Taylor et al. zeigen, dass DYNC2LI1 essentiell für die Stabilität des Dynein-2 Komplexes ist und dass Mutationen in DYNC2LI1 zu Cilien mit sehr variabler Länge, zu Beeinträchtigungen im Hedgehog-Pathway und zu ciliären IFT-Akkumulationen führen. Die Ergebnisse dieser Studie erweitern das Verständnis der SRPS-Locus Heterogenität und demonstrieren die Bedeutung von DYNC2LI1 in der Stabilität des Dynein-2 Komplexes, der ciliären Funktion, der Hedgehog-Regulation und Skelettogenese [217]. Durch die mehrfache Identifikation von DYNC2LI1 Varianten wird das klinische SRTD-Spektrum erweitert und dieser Phänotyp als „SRTD 15“ in der OMIM Phänotypenserie PS208500 annotiert (Abb. 46).

Abb. 46 Schema des primären Ciliums und bekannte Mutationen in skelettalen Ciliopathie-assoziierten Genen Identifikation von compound heterozygoten Mutationen in DYNC2LI1 in Patient P7 mit einem Jeune Asphyxierenden Thoraxdysplasie ähnlichen Phänotyp (Überlappungen zum SRPS und EVC Spektrum) erweitern das klinische Spektrum von Defekten im cytoplasmatischen Dynein-2 Komplex. Dieser Phänotyp wird laut OMIM als SRTD 15 gelistet und erweitert das SRTD-Spektrum, welches laut phenotypic series PS208500 SRTD 1-17 umfasst. Hefe-2-Hybrid-Screen (Y2H) bestätigte eine Interaktion vom SRTD 6 ursächlichen NEK1 Protein mit dem SRTD 15 ursächlichen DYNC2LI1 Protein (roter Pfeil). EVC/EVC2 = Ellis-van Crefeld Syndrom, CED = Cranio-ektodermale Dysplasie, SRTD = Kurzrippen Thoraxdysplasie (short-rib thoracic dysplasia), JATD = Jeune Asphyxierende Thoraxdysplasie. Weitere Geninformationen unter Tab. 1, Datenstand: Januar 2018 (verändert nach [149, 218]).

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Diskussion

7.3. Y2H-Screen - Analyse von NEK1 Interaktionspartnern

In den letzten Jahren wurden aufgrund der intensiven Forschung an Cilien und Ciliopathien viele neue Ciliengene identifiziert, deren Funktionsverlust zu Veränderungen in der Cilienmorphologie oder -anzahl bzw. zu Mislokalisation von Cilienproteinen führt und somit das Ciliopathiespektrum immer mehr erweitert wird [63, 219, 220]. Eine übersichtliche Darstellung von cilien-assoziierten Genen bzw. potentiellen Ciliengenen mit weiteren Informationen in Form von Ciliengenlisten wird als wichtig für weitere Analysen erachtet (Tab. 20). Zur Erweiterung der Anzahl an neuen ciliären Proteinen können z. B. Proteininteraktionsstudien durchgeführt werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden mehrere Y2H-Screens durchgeführt, um ciliäre Interaktionspartner des NEK1 Proteins zu identifizieren und in weiteren Schritten näher zu charakterisieren.

7.3.1. Bekannte Cilien-assoziierte NEK1 Interaktionspartner Von den insg. 72 interagierenden NEK1 Proteinen aus den Hefe-Screens (NEK1 Teil 1-4 & full-length) konnten mit Hinblick auf einer ciliären Beteiligung KIF3A, ACTG1, UNC119 und RAB11A als sehr interessant angesehen werden, da diese nach einem Abgleich gegen meine Ciliengenliste sowohl bezogen auf die Funktion Platz 1-4 (ENDEAVOUR ranking) belegen, als auch schon erfolgreich als cilien-assoziiert publiziert wurden. KIF3A bildet mit KIF3B/C die Untereinheiten der Motorprotein Kinesin II Familie und zusammen mit dem KIF-assoziierten Protein 3 (KIFAP3) und 16 weiteren Proteinen des IFT Komplex B sind sie für den anterograden IFT-Transport im Cilium zuständig [44, 46, 49, 221]. Eine Interaktion von KIF3A mit der Coiled-coil Domäne (NEK1 Teil 2) konnte in dieser Dissertation gezeigt werden und stützt somit die schon im Jahr 2003 von Surpili et al. beobachtete NEK1-KIF3A Interaktion via der Coiled-coil Region [160]. ACTG1 (Actin gamma 1) interagiert gemäß Hefe-Screen mit der Kinase-Domäne (NEK1 Teil 1), welche für die Centrosomen Integrität und Ciliogenese erforderlich ist [156, 157]. Actine sind hochkonservierte Proteine, die an verschiedenen Arten von Zellmotilität und an der Aufrechterhaltung des Cytoskeletts beteiligt sind. Das Gamma Actin 1 wird cytoplasmatisch in allen Zelltypen gefunden und Mutationen in diesem Gen sind z. B. mit DFNA20/26 (autosomal dominanter nicht-syndromaler sensorineuraler progressiver Hörverlust) assoziiert. [222, 223] In Actb bzw. Actg1 knockout Mausmodellen konnte gezeigt werden, dass β-Actin and γ-Actin zwar für die Entwicklung von Hörsinneszellen entbehrlich sind, aber für die Erhaltung der Sterocilien im Erwachsenenalter benötigt werden, welches sich

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Diskussion durch verschiedene Muster von progressivem Hörverlust und ausgeprägten pathogenen Veränderungen der Stereocilien-Morphologie in alternden Mäusen zeigte [161]. UNC119 wird spezifisch in Photorezeptoren der Retina exprimiert und ist an den Photorezeptor-Synapsen in der äußeren plexiformen Schicht der Netzhaut lokalisiert. Es wird vermutet, dass es eine Rolle beim Mechanismus der Freisetzung von Photorezeptor- Neurotransmittern durch den synaptischen Vesikelzyklus spielt [224, 225]. In Kooperation mit Dr. rer. nat. Andreas Gießl konnte das Protein Nek1 am Basalkörperkompex der sensorischen Neuronen in der Netzhaut, im Riechepithel und in den Hirnventrikeln der Maus lokalisiert werden (noch unveröffentlichte Daten). Die gefundene UNC119-NEK1 Interaktion ist durch die beschriebene Lokalisation der beiden Proteine in der Retina erklärbar und dass für den Hefe- Screen eine retinale cDNA-Library verwendet wurde [127]. Wie verschiedene Proteine selektiv in das primäre Cilium transportiert und dort organisiert werden, ist zwar noch nicht hinreichend geklärt, aber es ist bekannt, dass UNC119 mit verschieden IFT-Molekülen interagiert, um ciliäre Cargo-Proteine zu transportieren [162, 226]. RAB11A wurde schon mehrmals cilien-assoziiert publiziert, wobei das Protein an der Basis von primären Cilien angereichert ist und wenn die Funktion z. B. durch RNA-Interferenz gehemmt wird, damit auch die Ciliogenese blockiert wird [163]. Es ist außerdem bekannt, dass RABs und andere kleine GTPasen für den ciliären Transport von Bedeutung sind. Lim et al. konnten zeigen, dass Rab8a in Verbindung mit Rab11a via der Interaktion mit vielen Proteinen, die mit dem Basalkörper oder dem Axonem des primären Ciliums assoziiert sind, eine kritische Funktion für die Ciliogenese ausübt [227]. Rab11-FIP3 bindet z. B. auch DYNC1LI2 (dynein light intermediate chain 2), welches ein Teil des Dynein-1 Komplexes darstellt [228]. Die unterschiedlichen funktionellen Rollen der cytoplasmatischen Dyneine werden durch die Isoformen der intermediären Ketten definiert [229]. Die Dynein-1 und Dynein-2 Komplexe zeigen eine ähnliche Zusammensetzung, wobei bei Dynein-2 nur DYNC2LI1 als leichte intermediäre Kette auftaucht, in Dynein-1 sowohl DYNC1LI1 und DYNC1LI2 [50]. Da RAB11 mit DYNC1LI2 interagiert, und NEK1 laut den Hefe-Screens dieser Dissertation sowohl mit RAB11 als auch mit DYNC2LI1 interagiert, könnte man eventuell ein größeren Proteinkomplex RAB11-DYNC1LI2-DYNC2LI1-NEK1 über direkte oder auch indirekte Interaktionen vermuten, welches in weiterführenden Studien näher analysiert werden müsste. Zusätzlich ergab der in der Humangenetik Nijmegen durchgeführte Großdurchsatz- 1on1-Screen unter den gefundenen Cilienproteinen, die mit NEK1 interagieren, 3 verschiedene intraflagellare Transport Proteine (IFT 74/88/122). Von IFT122 ist bekannt, dass Mutationen in diesem Gen ursächlich für die Cranio-ektodermale Dysplasie 1 (CED 1, MIM 218330) sind

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Diskussion

[230]. Die CED 1-4 werden aufgrund ähnlicher phänotypischer Erscheinung mit zum überlappenden Spektrum der SRPS/SRTD gezählt (Tab. 1). Mutationen in IFT74 wurden schon für das Bardet-Biedl Syndrom 20 (BBS 20, MIM 617119) beschrieben, welches auch mit zum Ciliopathie-spektrum gezählt wird [231]. Für IFT88 ist zwar bis zum jetzigen Zeitpunkt noch kein humanes Erkrankungsbild annotiert, aber eine Bedeutung als ciliäres Protein wurde im Maus- oder Zebrafischmodell und auch in Chlamydomonas beschrieben [232, 233]. Alle oben beschriebenen Gene (KIF3A, ACTG1, UNC119, RAB11A, IFT74/88/122) sind sowohl auf Ciliome.com als auch in der Genliste des europäischen Großprojekts „SYSCILIA“ annotiert [3, 9] und weisen Cilien-Evidenzwerte von 3 bis ≥ 10 auf [170]. Mit Hinblick auf eine Erweiterung des Ciliopathie-Spektrums sollten im nächsten Schritt neue ciliäre Proteine, die in dieser Arbeit in Y2H Analysen identifiziert wurden, im Folgenden kurz diskutiert werden.

7.3.2. Identifikation der Interaktion von NEK1 mit DYNC2LI1 Für eine weiterführende Untersuchung der 72 im Hefe-Screen identifizierten NEK1 Interaktionspartner ist neben der Filterung gegen meine Ciliengenliste bzw. der Erstellung einer ENDEAVOUR Rangliste auch eine Analyse mittels der Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software möglich. Dies ergab für die Y2H NEK1-Interaktoren eine Anreicherung in verschiedenen Netzwerken, welche von enormer Bedeutung für verschiedene Entwicklungs- prozesse (embryonal, zellulär, Organe betreffend), für die Zellmorphologie und auch für den Zelltod sind. Dies kann gut in Einklang mit den beobachteten Entwicklungsdefekten der SRPS/SRTD bzw. der Ciliopathien im Allgemeinen gebracht werden [16, 22, 63]. Eine Filterung nach weiteren Kategorien (Zelltod, Proteintransport, primäre Cilien) ergab eine Anreicherung von 8 cilien-spezifisch publizierten Genen und 6 Kandidatengenen mit einer Cilien-Evidenz ≥3. Bei der Kategorie „primäre Cilien“ rückten NEK1, KIF3A, ACTG1 und DYNC2LI1 in den Fokus, wobei für alle eine Beteiligung an der Ciliogenese publiziert wurde [12, 151, 161, 234]. DYNC2LI1 wurde als neuer wahrscheinlicher Interaktionspartner von NEK1 ausgewählt, da DYNC2LI1 in der ENDEAVOUR Liste Rang 5 belegt, eine hohe Cilien- Evidenz von ≥10 annotiert ist und ein Mausmodell Dync2li1tm1Aar mit typischen phänotypischen Merkmalen von Ciliopathien existiert [153, 170]). DYNC2LI1 bildet zusammen mit anderen Komponenten den für den retrograden IFT-Transport wichtigen Dynein-2 Komplex, wobei Defekte dieses Komplexes schon mit dem klinischen Phänotyp der SRPS/SRTD assoziiert wurden [50, 59, 87]. Die im Hefe-Screen beobachtete NEK1-DYNC2LI1 Interaktion wurde mit verschiedenen Experimenten validiert, wobei der selbsthergestellte Antikörper NEK1-H3T1 147

Diskussion verwendet wurde. Beide ciliären Proteine zeigten eine Kolokalisation am Basalkörper des primären Ciliums und Ko-Immunopräzipitationsanalysen bewiesen, dass DYNC2LI1 und NEK1 Teil eines Komplexes darstellen. Die 2 Hefeklone mit DYNC2LI1-Inserts deckten Exon 7-13 ab, dementsprechend beinhaltet der Interaktionsbereich auch die Exons 8+9, in denen bei dem Patienten P7 per Exom-Sequenzierung compound heterozygot Mutationen identifiziert wurden, die als ursächlich für SRTD 15 (MIM 617088) angesehen werden. SiRNA-Experimente bestätigten zudem eine Reduktion der Cilienlänge und Akkumulationen von IFT-B Proteinen an den Cilienspitzen, ähnlich zu Beobachtungen in anderen Ciliopathien mit retrograden IFT- Defekten [61, 145, 149]. Taylor et al. konnten auch Veränderungen in der Cilienmorphologie in DYNC2LI1-Patientenzellen nachweisen, somit wird das klinische Spektrum von Dynein-2 Defekten erweitert [217]. Interessanterweise liegen 4 von 6 beobachteten Mutationspositionen, die als ursächlich für SRTD 15 beschrieben wurden, in den Exons 7-13, welches auch den im Y2H-Screen identifizierten Interaktionsbereich widerspiegelt (Abb. 50). Um die Bedeutung dieses Bereiches für die Interaktion von NEK1 mit DYNC2LI1 näher zu untersuchen, könnten mittels Ko-Immunopräzipitationsstudien bewiesen werden, ob durch das Vorhandensein dieser Mutationen die Interaktion der beiden Proteine verloren geht. Durch die Gesamtheit an erhobenen Daten - Lokalisation, Expression von 3 DYNC2LI1 Isoformen in cilientragenden Geweben, Cilienphänotyp, Patienten mit Mutationen, NEK1-DYNC2LI1 Interaktion, Cilien- Evidenz - kann DYNC2LI1 als bestätigtes Ciliengen angesehen werden. In aktuellen und zukünftigen groß angelegten Studien können durch Interaktionsanalysen die ciliäre Protein- Landschaft näher aufgedeckt und das komplexe Cilien-Interaktom analysiert werden [4, 5, 7, 235].

7.3.3. NEK1 ist Teil des C21orf2-SPATA7 Komplexes Der Nachweis von Interaktionen des NEK1 Proteins mit schon bekannten ciliären Proteinen ist auch im Großdurchsatz-Hefe-Screen möglich. Dabei macht man sich das Vorhandensein von 285 Hefeklonen im 96-well Format zu Nutze, um in kurzer Zeit Interaktionen per 1on1-Screen zu verifizieren. Dabei stellte sich als weiterer möglicher Kandidat SPATA7 heraus, da in Kooperation mit der Humangenetik Nijmegen zusätzlich auch vice versa eine Interaktion von NEK1-SPATA7 verifiziert werden konnte [8]. SPATA7 ist als ursächlich für die Lebersche Kongenitale Amaurose (LCA3, MIM 604232) und die juvenile Retinitis Pigmentosa (RP, MIM 604232) beschrieben [236] (Abb. 47). Im vom europäischen Projekt „SYSCILIA“ durchgeführten siRNA-basierten funktionellen Genomik-Screening, welches zur Identifikation von Regulatoren der Ciliogenese und Ciliopathie-Genen durchgeführt wurde, konnte gezeigt 148

Diskussion werden, dass C21orf2, SPATA7 und NEK1 interagieren. Tandem-Affinitätsreinigung (TAP), gefolgt von einer Massenspektrometrie(MS)-Analyse [Strep-Tag II/FLAG(SF-TAP)- markiertem C21orf2] identifizierte insgesamt 88 Proteine. Affinitäts-Proteomik und Ko- Immunopräzipitationstests mit meinem selbst hergestellten NEK1-H3T1 Antikörper zeigten, dass C21orf2, NEK1 und das retinale Ciliopathie-Protein SPATA7 Teil des gleichen Proteinkomplexes sind [8].

Abb. 47 Ciliopathie-Protein-Interaktionsnetzwerk Das Netzwerk veranschaulicht den hohen Grad der Konnektivität von Proteinen (rote Ellipsen), von denen bekannt ist, dass sie mit phänotypisch überlappenden menschlichen Ciliopathien (blaue Ellipsen), insbesondere der SRTD (grüne Ellipsen) assoziiert sind. Diese Protein-Protein-Interaktionsinformationen sind sehr hilfreich bei der Identifizierung von Funktionsmodulen zur Untersuchung der molekularen Maschinerie, die mit der Ciliogenese, ciliären Signalwegen oder spezifischen Funktionen wie IFT assoziiert sind. Hefe-2-Hybrid-Screen (Y2H) und Ko- Immunopräzipitation bestätigten eine Interaktion vom SRTD 6 ursächlichen NEK1 Protein mit dem SRTD 15 ursächlichen DYNC2LI1 Protein (lila Rechtecke). Affinitäts-Proteomik und Ko-Immunopräzipitationstests mit meinem selbst hergestellten NEK1-H3T1 Antikörper zeigten, dass C21orf2, NEK1 und das retinale Ciliopathie- Protein SPATA7 Teil des gleichen Proteinkomplexes sind (orange Rechtecke) [8]. Weitere Informationen für ursächliche Proteine für skelettale Ciliopathien in Tab. 1, Abbildung verändert nach [5].

Die Assoziation von C21orf2 mit NEK1 könnte eine Erklärung für den in C21orf2-mutierten Individuen beobachteten variablen skelettalen Phänotyp (Jeune) liefern [237], da Mutationen in NEK1 das Short-Rib-Polydaktylie-Syndrom Typ II (SRPS II; MIM 263520, [12]) verursachen, welches eine ciliäre mit JATD verwandte Chondrodysplasie darstellt. Darüber hinaus könnte die Assoziation von C21orf2 mit SPATA7 den retinalen Phänotyp erklären, da Mutationen in SPATA7 die retinalen Dystrophien LCA3 und RP verursachen [236] (Abb. 47).

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Diskussion

Durch eine Kolokalisation der 3 Proteine am Basalkörper von hTERT-RPE1 Zellen, durch die Identifikation des NEK1-SPATA7-C21orf2 Interaktionskomplexes in Pull-down Experimenten und durch das Vorhandensein humaner Phänotypen, kann somit das Ciliopathiespektrum erweitert werden und mittels Interaktionsnetzwerken neue Erkenntnisse der komplexen ciliären Protein-Landschaft gewonnen werden [4, 5, 7, 235]. Zusammenfassend erweitern die identifizierten Interaktionen NEK1-C21orf2-SPATA7 und NEK1-DYNC2LI1 das ciliäre Proteininteraktionsnetzwerk und die identifizierten ursächlichen Proteine für die verschiedenen skelettalen Ciliopathien (SRPS/SRTD-Spektrum) können in Zukunft durch weitere Interaktionsstudien mit bekannten oder neuen Ciliopathien verknüpft werden (Abb. 47).

7.4. CRISPR/Cas9 - Genomeditierung von NEK1

Mutationen in bekannten Ciliopathie-assoziierten Genen führen häufig zu einem biallelen loss- of-function Effekt als pathogenetischen Mechanismus [43, 53] und somit ist die Methode der CRISPR/Cas9 vermittelten Genomeditierung [238, 239] hervorragend geeignet, um diesen Effekt nachzubilden. Dabei kann im Gegensatz zum siRNA vermittelten knockdown eine spezifische und langanhaltende Herunterregulation erreicht werden, die insbesondere für funktionelle Analysen des primären Ciliums notwendig ist. In dieser Dissertation konnten 3 NEK1-CRISPR-Klone mit Mutationen in Exon 24 generiert werden, welche auf ciliäre Phänotypen und mögliche Veränderungen in cilien-assoziierten Signalwegen hin untersucht wurden.

7.4.1. CRISPR Klone weisen typischen NEK1-Phänotyp auf Drei NEK1-CRISPR-Klone wiesen Deletionen von 1bp, 13bp und 19bp auf. Eine Analyse auf Vorhandensein von heterozygoten SNPs in angrenzenden Exons bzw. Introns 22-25 ergab sowohl in den CRISPR-Klonen als auch in den Non Targets homozygot wildtyp. Eine Deletion einzelner bzw. mehrerer Exons und Introns auf einem Allel und somit das eventuelle Vorliegen einer Compound-Heterozygotie konnte somit nicht ausgeschlossen werden. Eine Sequenzierung des kompletten NEK1 Gens erfolgte in den CRISPR-Klonen nicht, es bleibt bei der Vermutung, dass es sich um homozygote Deletionen in Exon 24 handelt, welche aufgrund eines Frameshifts zu einem vorzeitigen Stopcodon und somit zum Gen-Knockout führen. Dies ließ sich durch das Fehlen des full-length NEK1 Proteins im Western Blot bestätigen. Da in diesem CRISPR-Ansatz nur Klone mit Deletionen vorhanden waren, stützt dies die Daten von

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Diskussion

Wang et al., welche Deletionen mit einer Häufigkeit von 91 % wesentlich öfter beobachteten als Insertionen oder Substitutionen mit Häufigkeiten von 6 % beziehungsweise 3 % [238]. NEKs (NIMA-related kinases) sind eine Familie von Serin/Threonin Kinasen, die bei der Cilienregulation und in der Zellzykluskontrolle involviert sind [185]. So spielt auch die Never-in-mitosis related kinase 1 (Nek1) eine wichtige Rolle bei der zellulären Antwort auf DNA-Schäden, beeinflusst die Centrosomenstabilität und ist bei der Checkpoint-Kontrolle im Zellzyklus involviert [157, 240, 241]. Nek1 reguliert unter anderem auch den Zelltod und die Mitochondrienmembranpermeabilität durch die Phosphorylierung von VDAC1 (voltage dependent anion channel 1), wobei Nek1-defiziente Zellen sich durch übersteigerte Mitochondrienmembranpermeabilität (MMP) und beschleunigten Zelltod auszeichnen [242]. Dies legt die Vermutung nahe, dass auch dieser Mechanismus in den NEK1-CRISPR-Zellen zum vorzeitigen Zelltod führt und deshalb nur wenige CRISPR-Klone mit NEK1 Mutationen (13 von 96, davon 3 mit homozoygoten Frameshift-Mutationen) überlebten. Alle drei CRISPR-Klone zeigten eine geringe NEK1-Restexpression (18-30 %) auf RNA-Ebene, vergleichbar mit der schon bei LCL-Zelllinien des Patienten P1 beobachteten Expression von 38 % [12, 119]. Mit dem selbsthergestellten NEK1-H3T1 Antikörper konnte erstmals das Fehlen des NEK1 full-length Proteins in den NEK1-CRISPR-Klonen (CR2/5/8) nachgewiesen werden, welches die Western Blot Daten von Fibroblasten des NEK1-Patienten P1 [p.(Arg127*)] widerspiegelt [8]. Auch der in den Patienten-Fibroblasten beobachtete ciliäre Phänotyp (niedrigere Cilienanzahl und verkürzte Cilienlängen [12]) konnte in den NEK1- CRISPR-Zelllinien nachgebildet werden, wobei in Immunfluoreszenzanalysen mit dem NEK1- H3T1 Antikörper auch das Fehlen des NEK1 Proteins am Basalkörper des primären Ciliums bestätigt werden konnte. Die mehrfache Beobachtung von ciliären Auffälligkeiten sowohl in Patienten-Fibroblasten als auch in den NEK1-CRISPR-Klonen untermauert damit die schon mehrfach beschriebene Funktion von NEK1 bei der Ciliogenese und bestätigen den Funktionsverlust der beobachteten Mutationen [156, 157]. Zusammenfassend konnte in verschiedenen Experimenten der biallele loss-of-function Effekt in CRISPR-Zellen bzw. Patientenzellen als pathogenetischer Mechanismus von NEK1-assoziierten Ciliopathien nachgewiesen werden.

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Diskussion

7.4.2. NEK1-CRISPR-Klone zeigen Veränderungen in cilien-assoziierten Signalwegen Da bei dem letalen Phänotyp des SRPS II selten Patientenzellen für weiterführende Analysen zur Verfügung stehen, kann das CRISPR-System genutzt werden, um mehrere Zelllinien mit NEK1 Mutationen zu generieren. Ein weiterer Vorteil gegenüber Patientenzellen ist, dass die CRISPR-Klone und die dazugehörenden Non Target Kontrollen alle denselben genetischen Hintergrund aufweisen, was somit vergleichende Expressionsanalysen erleichtert. Die RNA- Sequenzierung von drei NEK1-CRISPR-Klonen und entsprechender Kontrollen ergab unter unterschiedlichen Nährbedingungen (Normal- bzw. Hungermedium) 229 bzw. 257 differentiell exprimierte Gene, die in Signalwegen wie z. B. PDGF-, Wnt-, MAPK-, EGF- und GH- (Growth Hormone) Signalwegen angereichert waren. Die Einordnung in den Wachstumshormon- Signalweg ist aufgrund der beobachteten Wachstumsdefekte (Kleinwuchs, kurze Rippen, verkürzte Gliedmaße, etc.) in SRPS Patienten bemerkenswert. In diesem Growth Hormone Netzwerk wird auch das FZD1 Gen eingeordnet, welches bei den NEK1-CRISPR-Zellen gemäß RNA-Seq Daten leicht hochreguliert ist. FZD1 kodiert für den frizzled class receptor 1, ein Mitglied der "frizzled" Genfamilie mit 7-Transmembran-Domänen, die als Rezeptoren für Wnt- Signalproteine dienen. Das primäre Cilium weist zudem eine wichtige Rolle bei der Wnt-Signalübertragung auf, welche wiederum die Zellproliferation, die Bestimmung des Zellschicksals und die Migration reguliert [37, 243]. Die Koordination der Chondrozyten- und Osteoblastendifferenzierung während der Knochenentwicklung wird den cilien-assoziierten Hh- und Wnt-Pathways zugeschrieben [37]. Dass primäre Cilien für die Regulierung der Knochenentwicklung und -erhaltung unverzichtbar sind, wird durch Osteocyten- oder Osteoblasten-spezifische Deletionen ciliärer Proteine deutlich, die zu verschiedenen skelettalen Fehlbildungen führen können [213]. Da Cilien ubiquitär auf verschiedenen Zellarten und Geweben vorhanden sind [2], und NEK1- Patientenzellen bzw. NEK1-CRISPR-Zelllinien einen ciliären Phänotyp mit niedriger Cilienanzahl bzw. verkürzter Cilienlänge aufweisen, könnte man vermuten, dass auch die Cilien in Chondrozyten oder Osteoblasten eine morphologische Veränderungen zeigen. Dadurch würde die Signalperzeption über den Wnt-Signalweg in diesen Zellarten nicht mehr funktionieren und somit wäre der skelettale Phänotyp der SRPS-Patienten (enger Thorax, kurze Rippen, postaxiale Hexadaktylie) erklärbar. Die RNA-Seq Daten ergaben bei den CRISPR-Zellen, die für eine Cilieninduktion unter Hungermedium gesetzt wurden, zudem in der Ingenuity Pathway Analyse (IPA) eine Anreicherung von differentiell exprimierten Genen im PDGF-Signalweg, welcher wiederum

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Diskussion schon als cilien-assoziiert beschrieben wurde [33, 243]. Es ist bekannt, dass sich PDGFα Rezeptoren (platelet-derived growth factor receptor α, PDGFRA) in der Cytoplasmamembran von primären Cilien befinden und durch eine Liganden-abhängige Aktivierung der Rezeptoren die Wachstumskontrolle dieser Zellen erfolgt [2]. Durch die Ligandenbindung werden zelluläre Antworten durch Signalkaskaden induziert und somit werden auch die für die Proliferation benötigten Gene angeschaltet [18]. Die Expression von PDGF-A und PDGFRA ist außerdem für die menschliche Knochenentwicklung wichtig, wobei Wachstumsfaktoren über autokrine und parakrine Effekte die Osteogenese während der Skelettentwicklung regulieren [244]. Da sowohl in den Patientenzellen als auch in den NEK1-CRISPR-Zelllinien die Anzahl der cilientragenden Zellen erniedrigt war, könnten an den verkürzten primären Cilien weniger bzw. keine PDGFα Rezeptoren in die Cilienmembran integriert werden und somit die Wachstumskontrolle von diesen Zellen über den PDGFα Signalweg nicht mehr erfolgen. Ein verzögertes Zellwachstum müsste in zukünftigen Experimenten durch z. B. Zellproliferations- assays mittels Bromodesoxyuridin (BrdU) überprüft werden. Mit Hinblick auf die Veränderung ciliärer Signalwege aufgrund von NEK1-Defizienz ergab eine weitere Filterung der RNA-Seq Daten gegen meine Ciliengenliste eine Herunterregulation von z. B. DYNLT1, IFT52, TSGA10 und PLK4. Diese Gene sind wichtig für Ausbildung von Axonemen, Protrusionen, Cilien und der Stabilisierung von Aktinfilamenten. Hervorzuheben ist dabei das differentiell exprimierte Gen DYNLT1, welches zusammen mit den schon für SRPS beschriebenen DYNC2H1 und DYNC2LI1 den cytoplasmatischen Dynein-2 Komplex bildet und als Regulator für die Cilienlänge fungiert [50, 168]. IFT52 ist essentiell für die Integrität des IFT-B-Kernkomplexes und für die Biosynthese und Aufrechterhaltung von Cilien. Mutationen in diesem Gen sind schon mit einer skelettalen Ciliopathie assoziiert (SRTD 16, MIM 617102) [245, 246]. In NEK1-CRISPR-Zellen kann demnach eine reduzierte Expression der für die Ciliogenese verantwortlichen Gene NEK1, DYNLT1 und IFT52 mittels qPCR validiert werden, welches somit Einfluss auf die Cilienassemblierung haben könnte und damit die Beobachtung verkürzter Cilienlängen und erniedrigter Cilienanzahl in diesen Zelllinien bestätigt. Im Gegensatz dazu sind 4 ciliäre Gene (AK7, DISC1, CEP41, HTR6) leicht hochreguliert, welche schon mit anderen Ciliopathien z. B. Primäre Ciliäre Dyskinesie (PCD) oder Joubert Syndrom (JBTS) assoziiert wurden [247, 248]. Man könnte vermuten, dass in NEK1-CRISPR-Zellen durch eine kompensatorische Hochregulation anderer Ciliengene die Cilienlänge anderweitig moduliert wird, was das Vorhandensein von kurzen Cilien bzw. einer reduzierten Cilienanzahl von ca. 30 % erklären könnte. Kim et al. konnten zeigen, dass mutierte IFT88 Zellen (orpk/orpk) keine Cilien mit

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Diskussion normaler Länge ausbilden können. Aber mit einer Cytochalasin D Behandlung konnte dieser Cilienlängendefekt teilweise wieder aufgehoben werden, die Zellen zeigten nach 16 Stunden deutlich längere Cilien als im Vergleich zur Behandlung mit DMSO [249]. In zukünftigen Experimenten könnte man die NEK1-CRISPR-Zellen auch mit Cytochalasin D versetzen und in Immunfluoreszenzanalysen überprüfen, ob eine normale Cilienlänge wiederhergestellt werden kann. Wäre dies der Fall könnte man in weiteren Schritten untersuchen, welche Gene z.B. kompensatorisch hochreguliert werden und somit trotz NEK1-Defizienz die Cilienlänge moduliert werden kann. Somit könnte das schon von verschiedenen Arbeitsgruppen beobachtete Zusammenspiel verschiedener ciliärer Proteine zur Regulation der Cilienlängen erweitert werden [8, 249-251]. Eine vergleichende Analyse der NEK1-CRISPR RNA-Seq Daten mit den identifizierten NEK1 Interaktionspartnern des Y2H-Screens ergab außerdem eine Herunterregulation von ARHGAP10, welches mit NEK1 Teil 3 (AS 734-1052) interagiert. Ob die NEK1 Mutationen der CRISPR-Klone (AS 767-769) Einfluss auf die Interaktion mit ARHGAP10 haben, müsste z. B. in Ko-Immunopräzipitationsstudien untersucht werden. Das für die Zelldifferenzierung wichtige ARHGAP10 gehört zu den Rho GTPase aktivierenden Proteinen [252], wird gemäß Ingenuity Pathway Analyse der Kategorie „Cell Death and Survival, Cellular Function and Maintenance, Embryonic Development” zugeordnet und lässt sich somit sehr gut in Verbindung mit den beobachteten SRPS/SRTD Phänotypen bringen [80, 87]. Eine Sequenzierung dieses Gens in den noch 16 ungeklärten Patienten, welche keine Mutationen in den schon mit SRTD-assoziierten Genen aufwiesen, könnte eventuell neue Varianten identifizieren und das Spektrum der skelettalen Ciliopathien erweitern. Die RNA-Seq Daten der NEK1-CRISPR-Klone geben somit erste Hinweise, dass der Verlust von NEK1 und die dadurch gestörte Cilienbildung, verschiedene ciliäre Signaltransduktionswege (Hh, Wnt, PDGF, etc.) negativ beeinflussen kann und somit zu den pleiotropen klinischen Defekten im SRPS/SRTD-Spektrum führt. Die geringe Anzahl an in dieser Dissertation untersuchten Zelllinien müsste in weiterführenden Experimenten erweitert werden und z. B. Einzelzellsequenzierungen durchgeführt werden. Da die mRNA Konzentrationen nicht unbedingt mit der Menge an exprimierten Protein korrelieren, müssen in Zukunft die differentiell exprimierten Gene noch mit weiteren Experimenten wie Western Blot oder Immunfluoreszenz auf Veränderung der Proteinlevel bzw. Lokalisation hin überprüft werden.

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Diskussion

7.5. Abschließende Diskussion der Ergebnisse und Ausblick

In den letzten Jahren hat die Anzahl an publizierten Ciliopathien rasch zugenommen, mit einer entsprechend ansteigenden Anzahl an etablierten und potentiellen Ciliopathie-assoziierten Genen. Die Charakterisierung von ciliären Proteinen und Phänotypen hat unser Wissen über die Cilienfunktionen stetig vergrößert [16, 63]. Durch die Etablierung neuer Methoden, wie der Next Generation Sequencing Technologie, konnten große Fortschritte in der Aufklärung der Ciliopathien erzielt werden [62]. Dennoch bleiben die genetischen Ursachen in vielen Fällen immer noch ungeklärt. Dies liegt nicht zuletzt an der enormen genetischen Heterogenität, die sich auch in der klinischen Heterogenität des Ciliopathienspektrums widerspiegelt. Bisher wurden Veränderungen in ca. 190 Genen als ursächlich für Ciliopathien identifiziert [16]. Schätzungen zufolge geht man heute davon aus, dass über 1000 Gene an der Entstehung der Ciliopathien beteiligt sein könnten, und viele dieser einzelnen Gendefekte sehr selten sind [219, 220]. Im Rahmen meiner Arbeit sollten mit Hilfe des aktuellen und sich in den letzten wenigen Jahren enorm erweiterten Methodenspektrums sowohl unbekannte Krankheitsursachen bei Patienten mit Kurzrippen-Polydaktylie Syndromen identifiziert werden als auch Mutationen in bekannten skelettalen Ciliopathie-Genen näher charakterisiert werden. So konnte ich in mehreren Patienten Mutationen in den bekannten SRTD-Genen NEK1, DYNC2H1 und EVC identifizieren. Durch die Herstellung eines spezifischen Antikörpers gegen NEK1 waren in dieser Arbeit auch weitere funktionelle Analysen möglich, sodass ein Effekt der NEK1 Mutationen auf Proteinebene im Western Blot durch Fehlen des full-length Proteins nachgewiesen werden konnte. Auch typische morphologische Auffälligkeiten der primären Cilien und fehlende Lokalisation von NEK1 am Basalkörperkomplex des primären Ciliums untermauern die schon öfters beobachtete Beteiligung von NEK1 an der Ciliogenese [156, 157]. Die Identifizierung eines neuen Gens für SRTD - DYNC2LI1 - zeigt, dass die Exom- Sequenzierung mit zusätzlicher Filterung gegen bekannte und potentielle ciliäre Gene eine effiziente Methode zum Nachweis der genetischen Ursachen in diesen Patienten darstellt. Da es in der in dieser Arbeit untersuchten Patientengruppe nicht möglich war, weitere Patienten mit Mutationen im gleichen Gen zu identifizieren, werden weiterführende Analysen immer wichtiger, um so die Pathogenität gefundener Varianten besser einschätzen zu können. So konnte ich durch DYNC2LI1-knockdown Analysen einen Effekt auf die Cilienlänge mit Akkumulation von verschiedenen IFT-B Proteinen nachweisen [149]. Parallel dazu untermauern die Ergebnisse von Tylor et al. DYNC2LI1 als neues Ciliengen für SRTD 15 [217]. Umso wichtiger erscheint es durch Kooperationen mit anderen Arbeitsgruppen weitere 155

Diskussion

Patienten mit ähnlichen Phänotypen zu untersuchen, Mutationsdatenbanken zu generieren, als auch die stetig wachsende Anzahl an Ciliopathie-Genen in Ciliengenlisten übersichtlich darzustellen [9, 16, 120]. Um neue Erkenntnisse hinsichtlich der ciliären Funktion von NEK1 im Kontext von beteiligten Proteinnetzwerken zu erlangen, wurden im Rahmen dieser Dissertation mehrere Y2H-Screens durchgeführt. Die Nachweise der Interaktionen von NEK1-DYNC2LI1 und NEK1-C21orf2-SPATA7 zeigen, dass NEK1 als ciliärer Interaktionspartner eine wichtige Rolle zuteil wird [8]. Von weiteren identifizierten Interaktionspartnern, welche vorher noch nicht funktionell mit dem primären Cilium assoziiert waren, könnte mittels CRISPR/Cas9 Genomeditierung ciliäre Defekte generiert und somit eine Beteiligung an der Ciliogenese bewiesen werden. Die Anzahl an neuen ciliären Proteinen wird weiter erhöht und erweitert somit im Allgemeinen das Verständnis der ciliären Protein-Landschaft und der Ciliopathienetzwerke im Besonderen. Weitere Erkenntnisgewinne über die Beteiligung verschiedener Gene an cilien- assoziierten Signalwegen können mittels CRISPR/Cas9 genomeditierten Zelllinien in Kombination mit der RNA-Sequenzierungstechnologie erhalten werden. So ergaben sich in NEK1-CRISPR-Zelllinien durch die Analyse differentiell exprimierter Gene erste Hinweise auf eine Beteiligung in ciliären Signalwegen wie z. B. PDGF, Wnt und Hh. Die Identifizierung bekannter und neuer Kandidatengene, die Klärung der Pathogenese, die Einordnung in betroffene Signal- und Stoffwechselwege und die Analyse der funktionellen Netzwerke von Ciliopathien, wird eine der großen Herausforderungen der nächsten Jahre sein. Dabei wird nicht nur das Wissen um den Aufbau und die Funktion der Cilien erweitert, sondern auch durch den Nachweis von Varianten in neuen Ciliopathie-Genen und durch deren funktionelle Charakterisierung die Grundlage möglicher zukünftiger therapeutischer Strategien geschaffen.

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8.2. Abkürzungsverzeichnis

AbkürzungxxxxxxxxxxxxxxxxBedeutung Abb. Abbildung AD Aktivierungsdomäne von GAL4 ADE Adenin AK Antikörper Amp. Ampicillin AS Aminosäure APS Ammoniumperoxodisulfat Aqua bidest. Lateinisch: Aqua bidestillata BB Basal Body (Basalkörper) BLAST Basic Local Alignment Search Tool BLAT BLAST-like alignment tool bp Basenpaare BSA Bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise ca. circa

CaCl2 Calciumchlorid CC Coiled-coil cDNA complementary (komplementäre) DNA CED Cranio-ektodermale Dysplasie Chr. Chromosom CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CT Threshold Cycle C-Terminus Carboxy-Terminus DAPI 4, 6-Diamidino-2-Phenylindol DBD DNA Bindungsdomäne von GAL4 ddH2O Doppelt-destilliertes Wasser ddNTP Didesoxynukleosidtriphosphat d. h. das heißt DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Medium DMF N,N-Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DOC Natrium-Deoxycholat DSB Doppelstrangbruch DTT Dithiotreitol E. coli Escherichia coli (Bakterium) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglykoltetraessigsäure ESP NHLBI GO Exome Sequencing Project EtBr Ethidium-Bromid EtOH Ethanol EVC Ellis-van-Crefeld Syndrom FACS Fluorescence Activated Cell Sorting 170

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AbkürzungxxxxxxxxxxxxxxxxBedeutung FC Fold-Change (Faktor der Expressionsänderung) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) g Erdbeschleunigung GAL4 Galaktosidase-induzierter Transkriptionsfaktor GFP Green Fluorescent Protein GST Gluthation S-Transferase HCl Salzsäure HDR Homology Directed Repair HEK Human Embryonic Kidney HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure het. heterozygot hg19 Human Genome Issue HG-19, GRCh37 (2009) HIS Histidin hom. homozygot HRP Horseradish Peroxidase (Meerrettichperoxidase) IF Immunfluoreszenz IFT Intraflagellarer Transport IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-Galaktosid JATD Jeune asphyxierende Thoraxdysplasie Kan. Kanamycin kb Kilobasen KCl Kaliumchlorid kDa Kilodalton Ko-IP Ko-Immunopräzipitation L Liter LB Luria Broth LCL Lymphoblastoide Zelllinie LEU Leucin LOH Loss of Heterozygosity LSM Laser Scanning Mikroskop LTHA Leucin-Tryptophan-Histidin-Adenin M Molar MAF Minor allele frequency mat. maternal MAT Mating Type (Paarungstyp Hefe) MeOH Methanol mg Milligramm

MgCl2 Magnesiumchlorid Min. Minute ml Milliliter MLPA Multiplex Ligation-dependent probe amplification mM Millimol mRNA Messenger RNA MW Molekulargewicht MZSDS Mainzer-Saldino syndrome n Anzahl der Stichproben 171

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AbkürzungxxxxxxxxxxxxxxxxBedeutung n.a. nicht annotiert NaCl Natriumchlorid NaOH Natriumhydroxid NCBI National Center for Biotechnology Information NES Nuclear Export Sequence ng Nanogramm NGS Next Generation Sequencing NHEJ Non homologous end joining nm Nanometer NMD Nonsense-mediated mRNA Decay N-Terminus Amino-Terminus OD Optische Dichte OMIM Online Mendelian Inheritance in Men (NCBI) ORF Open Reading Frame (offener Leserahmen) p Signifikanzwert (p-Wert) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PAM Protospacer Adjacent Motif pat. paternal PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PCM pericentrioläre Matrix PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion) PEI Polyethylenimin PFA Paraformaldehyd pH Säuregrad (lateinisch: potentia hydrogenii) pmol Pikomol POI Protein of Interest PVDF Polyvinylidenfluorid rekomb. rekombinant RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease rpm rotations per minute (Umdrehungen pro Min.) RQ Relative Quantification (relative Quantifizierung) RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction s Sekunden S. Seite S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SD Standard Deviation (Standardabweichung) SDS Natriumdodecylsulfat sgRNA small guide RNA siRNA small interfering RNA SNP Single Nucleotide Polymorphism (Einzelnukleotidpolymorphismus) sog. sogenannt Spect. Spectionomycin SRPS Short-Rib Polydactyly Syndrome (Kurzrippen-Polydaktylie Syndrom) SRTD Short-Rib Thoracic Dysplasia (Kurzrippen Thoraxdysplasie) 172

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AbkürzungxxxxxxxxxxxxxxxxBedeutung SSC Standard Saline Citrate-Puffer ssODN single-stranded oligodeoxynucleotides Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer Taq Polymerase Thermophilus aquaticus Polymerase TBE TRIS Borat EDTA TBS trisgepufferte Salzlösung TBST trisgepufferte Salzlösung mit Tween-20 TEMED Tetramethylethylendiamin TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TRP Tryptophan U Units (Einheit Enzym) u. a. unter anderem UAS Upstream Activating Sequence UCSC University of California, Santa Cruz UTR Untranslated Region (nicht translatierte Region) UV Ultraviolett V Volt vgl. vergleiche v/v Volumen pro Volumen Vol. Volumen VUS Variant of Unknown Significance WAD Weyers akrodental/facial Dysostose WB Western Blot WT Wildtyp X-α-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-α-D-Galaktopyranosid Y2H Hefe-2-Hybrid z. B. zum Beispiel °C Grad Celsius α alpha β beta μg Mikrogramm μl Mikroliter μm Mikrometer % Prozent

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8.3. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Modell der Komponenten und Organisation von motilen und immotilien Cilien und des intraflagellaren Transports (IFT)...... 6 Abb. 2 Schema verschiedener Komponenten des intraflagellaren Transportsystems (IFT)9 Abb. 3 Klinische und genetische Variabilität primärer Ciliopathien ...... 12 Abb. 4 LR Clonase Reaktion – Gateway System ...... 30 Abb. 5 Mechanismus der CRISPR/Cas9 vermittelten Genomeditierung...... 37 Abb. 6 Schematische Darstellung des T7E1 Mismatch Assays ...... 39 Abb. 7 Schematischer Arbeitsablauf der CRISPR/Cas9 Methode ...... 40 Abb. 8 Schematische Darstellung des Hefe-2-Hybrid-Systems ...... 51 Abb. 9 Reportergenkonstrukte der Hefestämme AH109 und Y187 ...... 51 Abb. 10 Schematische Darstellung eines Hefe-2-Hybrid-Screens mit NEK1 ...... 54 Abb. 11 Nachweis eines complex rearrangement im Patienten P11 im NEK1 Gen ...... 64 Abb. 12 Identifizierung einer splice-site Mutation im EVC Gen in Familie SRPS#22 mittels TruSight One Genpanel ...... 72 Abb. 13 Visualisierung der DYNC2LI1 Mutationen ...... 74 Abb. 14 Analyse des Expressionsmusters der 3 DYNC2LI1 Isoformen in fetalen und adulten humanen Geweben mittels TaqMan-basierter qPCR ...... 76 Abb. 15 Lokalisation des DYNC2LI1 Proteins in Kontroll-Fibroblasten mittels Immunfluoreszenz ...... 78 Abb. 16 Cilienanzahl und Cilienlänge in DYNC2LI1-depletierten Zellen im Vergleich zur Scrambled Kontrolle ...... 80 Abb. 17 DYNC2LI1 knockdown Zellen weisen eine veränderte Cilienmorphologie auf .... 81 Abb. 18 Akkumulation von IFT-B Proteinen in der Cilienspitze bestätigen retrograden IFT Defekt von DYNC2LI1 knockdown Zellen ...... 82 Abb. 19 MLPA-Analyse von DYNC2LI1 in den Patienten P26 und P27 ...... 84 Abb. 20 Sequenzierung des DYNC2LI1 Transkripts nach reverser Transkription in P28 .. 84 Abb. 21 NEK1 Domänen-Struktur mit Lokalisation des Antikörper-Epitops NEK1-H3T1 ...... 86 Abb. 22 Expression rekombinantes NEK1-H3 Protein und Test Präimmunseren ...... 87 Abb. 23 Vergleich Präimmunserum zu 90. Tag Immunisierung im Western Blot und Immunfluoreszenz ...... 88 Abb. 24 Test des NEK1-H3T1 Antikörpers im Western Blot und Immunopräzipitation ... 89 Abb. 25 Lokalisation von NEK1 in Kontroll- und Patienten-Fibroblasten (P1) mittels Immunfluoreszenz ...... 90 Abb. 26 NEK1 Domänen-Struktur mit Lokalisation der Y2H Bait Abschnitte (Teil 1-4) . 91 Abb. 27 Analyse der NEK1 Bait Konstrukte hinsichtlich intrinsischer Autoaktivität ...... 92 Abb. 28 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H Interaktionspartner Hauptnetzwerk 3 ...... 99 174

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Abb. 29 Ingenuity Pathway Analyse – Filterung der Y2H Daten nach Kategorien ...... 100 Abb. 30 Analyse der 1on1-Konstrukte hinsichtlich intrinsischer Autoaktivität ...... 102 Abb. 31 α-Galaktosidase Test zur Visualisierung positiver Hefeklone ...... 103 Abb. 32 Kolokalisation von NEK1 und DYNC2LI1 an der Basalkörperregion des primären Ciliums ...... 104 Abb. 33 Ko-Immunopräzipitation zur Bestätigung der Interaktion zwischen NEK1 und DYNC2LI1 ...... 105 Abb. 34 β-Galaktosidase Test zur Visualisierung positiver Hefeklone und Pulldown Experiment ...... 106 Abb. 35 Bestimmung der CRISPR Transfektionseffizienz ...... 109 Abb. 36 Relatives Expressionslevel von NEK1 in CRISPR-Klonen im Vergleich zu Kontrollen ...... 111 Abb. 37 Western Blot der NEK1-CRISPR-Klone im Vergleich zu Kontrollen ...... 112 Abb. 38 Anzahl an cilientragenden Zellen und Vermessung der Cilienlängen von NEK1-CRISPR-Zelllinien im Vergleich zu Kontrollen ...... 114 Abb. 39 Analyse der Cilienmorphologie und Lokalisation des NEK1 Proteins in NEK1-CRISPR-Zelllinien im Vergleich zu Kontrollen ...... 116 Abb. 40 Heatmaps der signifikant differentiell exprimierten Gene von NEK1-CRISPR- Zelllinien unter Normal- und Hungermedium ...... 118 Abb. 41 Ingenuity Pathway Analyse – Hauptnetzwerk 2 von RNA-Seq Daten von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium ...... 120 Abb. 42 Netzwerkdarstellung der 11 differentiell exprimierten Ciliengene von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium ...... 122 Abb. 43 Ingenuity Pathway Analyse – Hauptnetzwerk 1 von RNA-Seq Daten der NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium ...... 124 Abb. 44 Netzwerkdarstellung der 19 differentiell exprimierten Ciliengene von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium ...... 125 Abb. 45 Schematische Darstellung der Domänenstruktur von NEK1 und Lokalisation identifizierter Varianten...... 133 Abb. 46 Schema des primären Ciliums und bekannte Mutationen in skelettalen Ciliopathie-assoziierten Genen ...... 144 Abb. 47 Ciliopathie-Protein-Interaktionsnetzwerk ...... 149 Abb. 48 DIDA Datenbank - digene diallele Vererbung für SRPS in NEK1 und DYNC2H1 ...... 189 Abb. 49 Schematische Darstellung der Domänenstruktur von DYNC2H1 und Lokalisation identifizierter Varianten...... 192 Abb. 50 Schematische Darstellung der Domänenstruktur von DYNC2LI1 und Lokalisation identifizierter Varianten...... 192 Abb. 51 Morphologische und radiographische Merkmale der Patienten mit DYNC2LI1 Mutationen ...... 193

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Verzeichnisse

Abb. 52 Patient P11 – Sequenz des 288bp inserierten Fragments des ANKS1B Gens im Spleißbereich des Introns 5 von NEK1 ...... 194 Abb. 53 DYNC2LI1 Expression in Patienten P26/27/28 – Analyse mittels qPCR und verschiedener DYNC2LI1-TaqMan-Sonden ...... 196 Abb. 54 MLPA-Analyse von DYNC2LI1 von Patient P28 und Eltern ...... 197 Abb. 55 Lokalisation von NEK1 in Kontroll-Fibroblasten mittels Immunfluoreszenz .... 198 Abb. 56 Lokalisation von NEK1 in Patienten-Fibroblasten (P1) mittels Immun- fluoreszenz ...... 199 Abb. 57 Absättigungstest des NEK1-H3T1 Antikörpers ...... 200 Abb. 58 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 1 ...... 201 Abb. 59 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 2 ...... 202 Abb. 60 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 3 ...... 203 Abb. 61 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 4 ...... 204 Abb. 62 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 5 ...... 205 Abb. 63 CRISPR Non Target Kontrolle NT2 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation ...... 206 Abb. 64 CRISPR Non Target Kontrolle NT3 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation ...... 207 Abb. 65 CRISPR Non Target Kontrolle NT4 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation ...... 208 Abb. 66 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR2 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation .... 209 Abb. 67 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR5 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation .... 210 Abb. 68 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR8 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation .... 211 Abb. 69 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR6wt - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation 212 Abb. 70 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR9wt - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation 213 Abb. 71 Expression von ABCE1, ARHGAP10, CEP41, DYNLT1 in NEK1-CRISPR- Zelllinien ...... 222 Abb. 72 Expression von FZD1, IFT52 und NEK1 in NEK1-CRISPR-Zelllinien ...... 223 Abb. 73 Ingenuity Pathway Analyse – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium 224 Abb. 74 Ingenuity Pathway Analyse – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium 225 Abb. 75 Ingenuity Pathway Analyse mit Filterung gegen Ciliengenliste – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium ...... 226 Abb. 76 Ingenuity Pathway Analyse mit Filterung gegen Ciliengenliste – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium ...... 226

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Verzeichnisse

8.4. Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Übersicht der SRTDs und ähnlicher skelettaler Ciliopathien mit ursächlichen Genen ...... 14 Tab. 2 Übersicht aller untersuchten SRPS Patienten ...... 17 Tab. 3 Versuchsprotokoll für Antikörperfärbung (Methanolfixierung) ...... 34 Tab. 4 Identifizierte NEK1 Varianten in SRPS-Patienten ...... 62 Tab. 5 Identifizierte DYNC2H1 Varianten in SRPS-Patienten ...... 66 Tab. 6 Identifizierte DYNC2LI1 Varianten in Patienten mit SRPS bzw. Wachstumsverzögerung ...... 83 Tab. 7 Globale Priorisierung der NEK1 Interaktionspartner mit ENDEAVOUR ...... 96 Tab. 8 Einteilung der NEK1 Interaktionspartner nach Cilien-Evidenz ...... 97 Tab. 9 Zusammenfassung der erhaltenen CRISPR-Zellklone mit NEK1 Mutation ...... 110 Tab. 10 Phänotypisches Spektrum häufiger Ciliopathien...... 186 Tab. 11 Patientenübersicht wahrscheinlich ursächlicher Varianten mit Vorhersageprogrammen ...... 187 Tab. 12 Übersicht NEK1 Varianten dieser Arbeit und anderer Publikationen ...... 189 Tab. 13 Vergleich der Identifizierten Varianten im NEK1 Gen in den Patienten P9 und P10 ...... 189 Tab. 14 Übersicht DYNC2H1 Varianten dieser Arbeit und anderer Publikationen ...... 190 Tab. 15 Übersicht DYNC2LI1 Varianten dieser Arbeit und anderer Publikationen ...... 192 Tab. 16 Differentiell exprimierte Gene unter Hungermedium in NEK1-CRISPR-Zelllinien ...... 214 Tab. 17 Differentiell exprimierte Gene unter Normalmedium in NEK1-CRISPR-Zelllinien ...... 217 Tab. 18 RNA-Seq Daten der NEK1-CRISPR-Zelllinien - Filterung nach Ciliengenen ... 220 Tab. 19 qPCR Ergebnisse – Validierung ausgewählter Gene der RNA-Seq Daten ...... 221 Tab. 20 Genliste bekannter und potentieller Ciliengene ...... 227 Tab. 21 Identifizierte NEK1 Interaktionspartner im Hefe-Screen mit full-length NEK1 und NEK1 Teile 1-4 ...... 234 Tab. 22 Belegungsschemata 1on1-Screen Platten und identifizierte NEK1 Interaktionspartner ...... 236 Tab. 23 Versuchsprotokoll für Antikörperfärbung (PFA-Fixierung) ...... 240 Tab. 24 Durchschnittliche Deckungstiefe (coverage) der Exom-Sequenzierungen von P7, P23, P30 ...... 240 Tab. 25 Primer für NEK1 (NM_012224.2) Sequenzierung ...... 254 Tab. 26 Primer für NEK1 (human: NM_012224.2, murin: NM_175089.4) Hefeteile ..... 254 Tab. 27 Primer für NEK1 (NM_012224.2) Antikörperregion ...... 254 Tab. 28 Primer für NEK1 (NM_012224.2) Plasmid Entry TOPO Sequenzierung ...... 255 177

Verzeichnisse

Tab. 29 Primer für Vektorsequenzierungen...... 255 Tab. 30 Primer für Hefe-PCR ...... 255 Tab. 31 Primer für IFT80 (NM_020800.2) Sequenzierung ...... 255 Tab. 32 Primer für DYNC2H1 (NM_001080463.1) Sequenzierung ...... 255 Tab. 33 Primer für Test-PCR cDNA-Synthese ...... 257 Tab. 34 Primer für TTC21B (NM_024753.4) Sequenzierung ...... 257 Tab. 35 Primer für WDR35 (NM_001006657.1) Sequenzierung ...... 258 Tab. 36 Primer für DYNC2LI1 (NM_001193464.1) Sequenzierung ...... 258 Tab. 37 Primer für DYNC2LI1 (NM_001193464.1) Klonierung ...... 258 Tab. 38 Primer für DYNC2LI1 (NM_001193464.1) Splicing RT-PCR ...... 258 Tab. 39 Primer für EVC (NM_153717.2) Sequenzierung und Splicing RT-PCR ...... 259

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Danksagung

9. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die mich bei der Anfertigung dieser Doktorarbeit unterstützt haben.

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. André Reis für die freundliche Aufnahme und Unterstützung am Humangenetischen Institut sowie für die Übernahme des Erstgutachtens.

Ein besonderer Dank geht an PD Dr. med. Christian Thiel für die Bereitstellung des Themas, die kompetente Betreuung, freundliche Unterstützung und Diskussionsbereitschaft, die wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Darüber hinaus möchte ich mich bei allen aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern der AG Thiel für die freundschaftliche und warmherzige Atmosphäre, die tatkräftige Unterstützung während der ganzen Laborarbeit und die unterhaltsamen Momente bedanken.

Für die Übernahme des Zweitgutachtens möchte ich PD. Dr. Dieter Engelkamp danken.

Bei allen Mitdoktoranden und Masteranden möchte ich mich für die Unterstützung und die schöne Zeit im und auch außerhalb des Labors bedanken. Ein Ausdruck unserer unermüdlichen Kreativität zeigt auch der gemeinsam gedrehte Film „Psychogenetics 2“, welcher den Labor“alltag“ in einem etwas anderen Licht darstellte.

Allen Mitarbeitern des Instituts für Humangenetik sei an dieser Stelle herzlich für das gute Arbeitsklima und die stete Hilfsbereitschaft gedankt.

Dem Lehrstuhl Tierphysiologie an der Universität Erlangen-Nürnberg möchte ich danken, dass ich in diesem Labor viele Methoden erlernen durfte. Ein besonderer Dank geht dabei an PD Dr. rer. nat. habil. Andreas Gießl, der mir als Mentor mit Rat und Tat zur Seite stand und meine gefühlt tausenden Fragen beantworten konnte. Ich danke auch Nathalie, Nadja und Beata, die für mich viele Vorarbeiten erledigt haben und durch viele Anregungen und Hilfestellungen so zum Gelingen der gemeinsamen Experimente beigetragen haben.

Weiterhin möchte ich mich bei allen Kooperationspartnern bedanken, insbesondere bei Prof. Dr. Ronald Roepman für die Möglichkeit verschiedene Hefe-Experimente während eines wissenschaftlichen Kurzaufenthaltes am Department of Human Genetics (Radboud University Nijmegen, Netherlands) durchzuführen.

Ein großes Dankeschön gilt meiner Familie und meinen Freunden für das Dasein in allen Lebenslagen, die Fähigkeit Kraft zu spenden und die immer offenen Ohren.

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Veröffentlichungen und Kongressbeiträge

10. Veröffentlichungen und Kongressbeiträge

Teile der vorliegenden Dissertation und von Kooperationsprojekten wurden auf nationalen sowie europäischen Kongressen vorgestellt und in folgenden Zeitschriften veröffentlicht.

Publikationen:

 Functional analyses of Pericentrin and Syne-2/Nesprin-2 interaction in ciliogenesis. Falk N, Kessler K, Schramm SF, Boldt K, Becirovic E, Michalakis S, Regus-Leidig H, Noegel AA, Ueffing M, Thiel CT, Roepman R, Brandstätter JH, Gießl A. J Cell Sci. 2018 Aug 17;131(16). pii: jcs218487. doi: 10.1242/jcs.218487; PMID:30054381  Analyse von CRISPR/Cas9 genomeditierten mIMCD3 Zellen, Y2H-Screens zur Identifikation neuer Interaktionspartner

 An siRNA-based functional genomics screen for the identification of regulators of ciliogenesis and ciliopathy genes. Wheway G, Schmidts M, Mans DA, Szymanska K, Nguyen TT, Racher H, Phelps IG, Toedt G, Kennedy J, Wunderlich KA, Sorusch N, Abdelhamed ZA, Natarajan S, Herridge W, van Reeuwijk J, Horn N, Boldt K, Parry DA, Letteboer SJF, Roosing S, Adams M, Bell SM, Bond J, Higgins J, Morrison EE, Tomlinson DC, Slaats GG, van Dam TJP, Huang L, Kessler K, Giessl A, Logan CV, Boyle EA, Shendure J, Anazi S, Aldahmesh M, Al Hazzaa S, Hegele RA, Ober C, Frosk P, Mhanni AA, Chodirker BN, Chudley AE, Lamont R, Bernier FP, Beaulieu CL, Gordon P, Pon RT, Donahue C, Barkovich AJ, Wolf L, Toomes C, Thiel CT, Boycott KM, McKibbin M, Inglehearn CF; UK10K Consortium; University of Washington Center for Mendelian Genomics, Stewart F, Omran H, Huynen MA, Sergouniotis PI, Alkuraya FS, Parboosingh JS, Innes AM, Willoughby CE, Giles RH, Webster AR, Ueffing M, Blacque O, Gleeson JG, Wolfrum U, Beales PL, Gibson T, Doherty D, Mitchison HM, Roepman R, Johnson CA. Nat Cell Biol. 2015 Aug;17(8):1074-1087. doi: 10.1038/ncb3201. Epub 2015 Jul 13; PMID:26167768  Veröffentlichung des selbst hergestellten polyklonalen Antikörpers NEK1-H3T1 im Rahmen des Europäischen Projekts „SYSCILIA“

 DYNC2LI1 mutations broaden the clinical spectrum of dynein-2 defects. Kessler K, Wunderlich I, Uebe S, Falk NS, Gießl A, Brandstätter JH, Popp B, Klinger P, Ekici AB, Sticht H, Dörr HG, Reis A, Roepman R, Seemanová E, Thiel CT. Sci Rep. 2015 Jul 1;5:11649. doi: 10.1038/srep11649; PMID:26130459  Exom-Sequenzierung bei Patienten mit skelettaler Ciliopathie (SRTD 15)

 MAP4-dependent regulation of microtubule formation affects centrosome, cilia, and Golgi architecture as a central mechanism in growth regulation. Zahnleiter D*, Hauer NN*, Kessler K*, Ube S, Sugano Y, Neuhauss SC, Giessl A, Ekici AB, Blessing H, Sticht H, Dörr HG, Reis A, Thiel CT.* These authors contributed equally to this manuscript. Hum Mutat. 2015 Jan;36(1):87-97. doi: 10.1002/humu.22711. Epub 2014 Nov 28; PMID:25323976  Exom-Sequenzierung bei Patienten mit autosomal-rezessiv vererbtem Kleinwuchs

 NEK1 mutations cause short-rib polydactyly syndrome type majewski. Thiel C, Kessler K, Giessl A, Dimmler A, Shalev SA, von der Haar S, Zenker M, Zahnleiter D, Stöss H, Beinder E, Abou Jamra R, Ekici AB, Schröder-Kress N, Aigner T, Kirchner T, Reis A, Brandstätter JH, Rauch A. Am J Hum Genet. 2011 Jan 7;88(1):106-14. doi: 10.1016/j.ajhg.2010.12.004; PMID:21211617  Erstbeschreibung von NEK1 Mutationen in Patienten mit Short-rib Polydaktylie Syndrom Typ Majewski (SPRS II / SRTD 6) 180

Veröffentlichungen und Kongressbeiträge

Kongressbeiträge

Vorträge:

 27. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik 2016, Lübeck Identification of the NEK1 protein network in skeletal ciliopathies Kristin Kessler, Nathalie S. Falk, Ina Wunderlich, Steffen Uebe, Bernt Popp, Arif B. Ekici, Heinrich Sticht, Eva Seemanová, Andreas Gießl, Christian T. Thiel

 22. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik 2011, Regensburg NEK1 mutations cause short rib-polydactyly syndrome type Majewski Kessler, K., Giessl, A., Dim mler, A., Shalev, S. A, von der Haar, S., Zenker, M., Zahnleiter, D., Stöss, H., Beinder, E., Abou Jamra, R., Ekici, A. B., Schröder-Kreß, N., Aigner, T., Kirchner, T., Reis, A., Brandstätter, J., Rauch, A., Thiel, C. T.

Poster:

 EMBO Conference - Centrosomes and Spindle Pole Bodies 2017, Heidelberg The centrosomal protein NIMA-related serine/threonine kinase -Nek 1- at cilia of sensory cells Kristin Kessler, Nathalie Falk, Johann Helmut Brandstätter, Christian Thiel, Andreas Gießl

Pericentrin, identified at the basal-body complex in mammalian photoreceptor cells, interacts with Nesprin protein Syne-2 in the retina Andreas Gießl*, Nathalie Falk, Kristin Kessler, Marlene Lösl, Johannes Glöckner, Karsten Boldt, Marius Ueffing, Ronald Roepmen, Christian Thiel, Johann Helmut Brandstätter * presenting author

 Cilia Conference 2016, Amsterdam Identification of the NEK1 protein network in skeletal ciliopathies Kristin Kessler, Nathalie S. Falk, Steffen Uebe, Bernt Popp, Arif B. Ekici, Heinrich Sticht, Ronald Roepman, Eva Seemanová, Andreas Gießl, Christian T. Thiel

Pericentrin and KASH protein Syne-2 mediate the attachment between the centrosome and nucleus required in mammalian retinal development Nathalie Falk*, Kristin Kessler, Johannes Glöckner, Karsten Boldt, Marius Ueffing, Ronald Roepmen, Angelika A. Noegel, Christian Thiel, Johann Helmut Brandstätter, Andreas Gießl * presenting author

Pericentrin, linked to a growing list of human disorders, identified at the basal-body complex in mammalian photoreceptor cells Andreas Gießl*, Kristin Kessler, Marlene Lösl, Johannes Glöckner, Karsten Boldt, Marius Ueffing, Ronald Roepmen, Christian Thiel, Johann Helmut Brandstätter, Nathalie Falk * presenting author

 6th International IZKF-Symposium 2016, Kloster Banz Bad Staffelstein Identification and characterization of DYNC2LI1 – an interaction partner of the short rib- polydactyly syndrome protein NEK1 Kristin Kessler, Nathalie S. Falk, Andreas Gießl, Ina Wunderlich, Steffen Uebe, Johann H. Brandstätter, Bernt Popp, Patricia Klinger, Arif B. Ekici, Heinrich Sticht, Helmuth-Günther Dörr, André Reis, Ronald Roepman, Eva Seemanová,Christian T. Thiel

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Veröffentlichungen und Kongressbeiträge

 5th International Caesar Conference 2015, Bonn Identification of mutations in DYNC2LI1, a member of the mammalian cytoplasmic dynein-2 complex, expands the clinical spectrum of Jeune/ATD ciliopathies Kristin Kessler, Nathalie S. Falk, Andreas Gießl, Ina Wunderlich, Steffen Uebe, Johann H. Brandstätter, Bernt Popp, Patricia Klinger, Arif B. Ekici, Heinrich Sticht, Helmuth-Günther Dörr, André Reis, Ronald Roepman, Eva Seemanová, Christian T. Thiel

 26. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik 2015, Graz DYNC2LI1 mutations broaden the clinical spectrum of dynein-2 defects Kessler, K., Wunderlich, I., Uebe, S., Falk, NS., Gießl, A., Brandstätter, JH., Popp, B., Ekici, AB., Sticht, H., Dörr, HG., Reis, A., Roepman, R., Seemanová, E., Thiel, CT.

 Cilia Conference 2014, Paris Identification of mutations in DYNC2LI1, a member of the mammalian cytoplasmic dynein 2 complex, expands the clinical spectrum of Jeune/ATD ciliopathies Kristin Kessler, Nadine N Hauer, Ina J Wunderlich, Melanie Froehlich, Andreas Giessl, Heinrich Sticht, Nathalie S Falk, Johann Helmut Brandstätter, Arif B Ekici, Steffen Uebe, Eva Seemanová, André Reis1, Christian T Thiel

Pericentrin interacts with KASH domain-containing protein Syne-2 Falk N*, Kessler K, Glöckner J, Boldt K, Ueffing M, Roepmen R, Thiel C, Brandstätter JH, Gießl A * presenting author

 European Human Genetics Conference 2014, Mailand Identification of mutations in DYNC2LI1, a member of the mammalian cytoplasmic dynein 2 complex, expands the clinical spectrum of Jeune/ATD ciliopathies Kristin Kessler, Nadine N Hauer, Ina Wunderlich, Melanie Froehlich, Andreas Giessl, Heinrich Sticht, Nathalie Falk, Johann Helmut Brandstätter, Arif B Ekici, Steffen Uebe, Eva Seemanová, André Reis, Christian T Thiel

 5th International IZKF-Symposium 2014, Kloster Banz Bad Staffelstein Identification and characterization of the pathogenesis of short rib-polydactyly syndromes Kessler K., Giessl A., Falk N. S., Brandstätter J.H., Reis A., Thiel C.T.

 25. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik 2014, Essen Spectrum of NEK1, DYNC2H1, and IFT80 mutations in short-rib polydactyly syndrome / asphyxiating thoracic dystrophy K. Kessler, A. Giessl, J. H. Brandstätter, A. Reis, A. Rauch, C. T. Thiel

 24. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik 2013, Dresden Altered ciliogenesis associated signal transduction in short rib-polydactyly syndrome type Majewski Kessler, K., Giessl, A., Brandstätter, J., Reis, A., Rauch, A., Thiel, C. T.

MAP4 defect underlines centrosomal organization as a central mechanism in growth regulation Zahnleiter D.*, Hauer N., Kessler K., Ekici A.B., Sticht H., Reis A., Dörr H.-G., Thiel C.T. * presenting author (talk)

 European Human Genetics Conference 2012, Nürnberg Ciliogenesis associated signal transduction is altered by NEK1 mutations in short rib- polydactyly syndrome type Majewski Kessler, K., Giessl, A., Brandstätter, J., Rauch, A., Thiel, C. T.

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Veröffentlichungen und Kongressbeiträge

Publizierte Abstracts ohne persönliche Kongressteilnahme:

 30. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik 2019, Weimar Identification of the expression pattern of DYNC2LI1 deficiency in short-rib-polydactyly syndrome Vogl C., Kessler K., Büttner C., Uebe S., Gießl A., Ekici AB., Sticht H., Seemanová E., Reis A., Thiel CT

 29. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik 2018, Münster Using CRISPR/Cas9 mediated genomic editing to obtain DYNC2LI1 deficient cell lines Carina Vogl, Kristin Kessler, Steffen Uebe, Andreas Gießl, Patricia Klinger, Arif B Ekici, Heinrich Sticht, Eva Seemanová, André Reis, Christian T Thiel

 11th Göttingen Meeting of the German Neuroscience Society 2015, Göttingen The protein Nek1 - an underlying cause of the human autosomal-recessive short-rib polydactyly syndrome type Majewski - at cilia of sensory cells Gießl A, Kessler K, Falk N, Thiel C, Brandstätter JH

Centrosomal protein Pericentrin interacts with Nesprin protein Syne-2 in the retina Falk N, Kessler K, Glöckner J, Boldt K, Ueffing M, Roepmen R, Thiel C, Brandstätter JH, Gießl A

 64th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics 2014, San Diego Deciphering the genetic basis of idiopathic short stature. C. T. Thiel, N. H. Hauer, K. Kessler, U. Uebe, A. B. Ekici, H. Sticht, H.-G. Doerr, A. Reis

 63rd Annual Meeting of the American Society of Human Genetics 2013, Boston MAP4 defect underlines centrosomal organization as a central mechanism in growth regulation. C. T. Thiel, D. Zahnleiter, N. Hauer, K. Kessler, Y. Sugano, S. Neuhaus, A. B. Ekici, H. Blessing, H. Sticht, H.-G. Doerr, A. Reis

 61st Annual Meeting of the American Society of Human Genetics 2011, Montreal Mutations of NEK1 cause short rib-polydactyly syndrome type Majewski with defective Ciliogenesis. C. T. Thiel, K. Kessler, A. Giessl, A. Dimmler, S. A. Shalev, S. von der Haar, M. Zenker, D. Zahnleiter, H. Stoess, E. Beinder, R. Abou Jamra, A. B. Ekici, N. Schroeder-Kress, T. Aigner, T. Kirchner, A. Reis, J. Brandstaetter, A. Rauch

 European Human Genetics Conference 2011, Amsterdam NEK1 mutations cause short rib-polydactyly syndrome type majewski C. T. Thiel, K. Kessler, A. Giessl, A. Dimmler, S. Shalev, S. von der Haar, D. Zahnleiter, H. Stoess, E. Beinder, R. Abou Jamra, A. B. Ekici, N. Schroeder-Kress, T. Aigner, T. Kirchner, A. Reis, J. Brandstaetter, A. Rauch

183

Lebenslauf

11. Lebenslauf

Aus Veröffentlichungsfassung entfernt.

184

Eidesstattliche Erklärung

12. Eidestattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, Kristin Keßler, dass ich diese Doktorarbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Ich habe keinen anderen Promotionsversuch unternommen.

Markt Erlbach, den 21.05.2019 Kristin Keßler

Ort, Datum Name

185

Anhang

13. Anhang

13.1. Ciliopathien und deren Charakterisierung nach unterschiedlicher Ausprägung der Phänotypen

Tab. 10 Phänotypisches Spektrum häufiger Ciliopathien

SRPS Alström BBS Joubert MKS NPHP OFD PCD PKD RP SLSN EVC Hirnfehlbildung + + + + + Polydaktylie + + + + + + Nierenfehlbildung + + + + + + + + + + Retinadegeneration + + + + + + Skelettauffälligkeiten + + + + + + + Mentale Retardierung + + + + + Herzfehler + + + + + + Leberauffälligkeiten + + + + + + Kleinwuchs + + + (+) + Adipositas + + + Schwerhörigkeit + + + Diabetes mellitus + + Infertilität + + + Situs inversus + + Infektneigung + (+) SRPS: Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome (short-rib polydayctyly syndrome), BBS: Bardet-Biedl Syndrom, MKS: Meckel-Gruber Syndrom, NPHP: Nephronophthise, OFD: Oro-fazio-digitales Syndrom, PCD: Primäre ciliäre Dyskinesie, PKD: Polyzystische Nierenerkrankung, RP: Retinitis pigmentosa, SLSN: Senior-Løken Syndrom, EVC: Ellis-van Creveld Syndrom. Übersichtsarbeiten über Ciliopathien mit Phänotypentabellen: PMID 22632799, 21898032, 19876933, 19876935

186

Anhang

13.2. SRPS-Patienten - Variantenübersicht mit Vorhersageprogrammen

Diese Tabelle enthält nur die wichtigsten Informationen zu den wahrscheinlich ursächlichen Varianten, alle weiteren ausführlichen Details sind in Tab. A auf CD zu finden.

Tab. 11 Patientenübersicht wahrscheinlich ursächlicher Varianten mit Vorhersageprogrammen

Patient Gen het/homo cDNA Pos. Protein Pos. Vererbung SIFT PolyPhen2 MutationTaster GERP++ PhyloP CADD exac02all HSF NNSPLICE SSSC NetGene2 mat./ P1 NEK1 homo c.379C>T p.(Arg127*) 1 A 4,23 1,228 42 0,000008187 pat. mat./ P2 NEK1 homo c.869-2A>G p.? (splicing) 5,32 2,02 11,81 AS KS KS KS pat. mat./ P2 NEK1 homo c.2680+5G>A p.? (splicing) 4,864 AS ES ES KS pat. P3 NEK1 het c.1640dup p.(Asn547Lysfs*2) mat. p.(Gly3916Asp) / P3 DYNC2H1 het c.11747G>A pat. P D 5,6 2,647 14,81 0,0001554 NE ES ES ES p.? (splicing) P5 DYNC2H1 het c.1151C>T p.(Ala384Val) ? 0 D D 5,07 2,515 22,1 0,00004089 P6 DYNC2H1 het c.10711_10714delTTTA p.(Phe3571Argfs*5) mat. P7 DYNC2LI1 het c.622C>T p.(Arg208*) pat.? 1 A 5,13 2,662 39 0,00004066 P7 DYNC2LI1 het c.662C>T p.(Thr221Ile) mat. 0,03 B 5,09 2,639 15,06 P8 DYNC2H1 het c.448C>T p.(Arg150*) mat. 1 A 5,8 2,735 37 P8 DYNC2H1 het c.10343T>C p.(Leu3448Pro) pat. 0 D D 5,55 2,238 20,7 0,00003584 P9 NEK1 het c.214+1G>A p.? (splicing) mat. 5,86 2,763 28 AS KS KS KA P9 NEK1 het c.3023C>G p.(Ser1008*) pat. 0 A 1,8 0,314 42 0,0001144 P10 NEK1 het c.214+1G>A p.? (splicing) mat. 5,86 2,763 28 AS KS KS KA P10 NEK1 het c.1900_1901delGA p.Glu634Lysfs*11 pat. 0,00000817

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Anhang

Patient Gen het/homo cDNA Pos. Protein Pos. Vererbung SIFT PolyPhen2 MutationTaster GERP++ PhyloP CADD exac02all HSF NNSPLICE SSSC NetGene2 c.397-14_397- P11 NEK1 het 4conNM_152788.4:c.2779 p.? (splicing) ? AS ES ES KS -23029_2779-22742 P11 NEK1 het c.550A>G p.(Ser184Gly) ? 0,01 D N 6,02 2,304 29,2 NE ES ES KA mat./ - P12 NEK1 homo c.2774G>T p.(Ser925Ile) 0,18 B N -0,26 9,086 pat. ? 1,22 P14 DYNC2H1 het c.2006A>G p.(Lys669Arg) pat. 0,09 B N 4,55 0,983 12,78 P14 DYNC2H1 het c.6545G>A p.(Cys2182Tyr) pat. 1 P N 3,88 2,41 14,06 0,000008172 P14 DYNC2H1 het c.8627T>C p.(Leu2876Ser) mat. 0 D D 5,76 2,195 23,9 P18 DYNC2H1 het c.2006A>G p.(Lys669Arg) pat. 0,09 B N 4,55 0,983 12,78 P18 DYNC2H1 het c.6545G>A p.(Cys2182Tyr) pat. 1 P N 3,88 2,41 14,06 0,000008172 P19 DYNC2H1 het c.7277G>A p.(Arg2426His) ? 0,21 D D 5,75 2,701 24,3 P21 DYNC2H1 het c.6809G>A p.(Arg2270Gln) ? 0,07 D D 5,7 2,679 26,7 P21 DYNC2H1 het c.10163C>T p.(Pro3388Leu) ? 0 D D 6,08 2,894 33 P23 EVC het c.384+5G>C p.? (splicing) mat. 10,25 AS KS ES KS P23 EVC het c.384+5G>C p.? (splicing) pat. 10,25 AS KS ES KS P26 DYNC2LI1 het c.2T>C p.(Met1?) ? 0,01 D A 4,72 1,99 12,41 0,00007319 P27 DYNC2LI1 het c.2T>C p.(Met1?) ? 0,01 D A 4,72 1,99 12,41 0,00007319 P28 DYNC2LI1 het c.232-8T>G p.? (splicing) pat. 2,199 0,0000244 NE ES ES ES P29 DYNC2LI1 het c.162-2A>G p.? (splicing) mat. 2,104 18,38 AS KS KS KS P30 DYNC2H1 het c.988C>T p.(Arg330Cys) mat. 0 D D 5,26 2,439 21,3 0,00004087 P30 DYNC2H1 het c.11333C>T p.(Ala3778Val) pat. 0,78 P D 5,37 2,687 24,5 0,00001634 P31 DYNC2H1 het c.11333C>T p.(Ala3778Val) pat. 0,78 P D 5,37 2,687 24,5 0,00001634 KS = Keine Spleißstelle; AS = Affecting splicing; ES = Erniedrigung splice-site Erkennung; NE = No effect on splicing; ? = keine Eltern-DNA; KA = keine Aussage möglich A= disease_causing_automatic; B= benign ; D= probably damaging/ disease_causing ; N= polymorphism_automatic ; P= possibly damaging Diese Tabelle enthält nur die wichtigsten Informationen zu den wahrscheinlich ursächlichen Varianten, alle weiteren ausführlichen Details sind in Tab. A auf CD zu finden.

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Anhang

13.3. Varianten im NEK1, DYNC2H1 und DYNC2LI1 Gen dieser Dissertation und anderer Publikationen

Tab. 12 Übersicht NEK1 Varianten dieser Arbeit und anderer Publikationen Patient cDNA Position; Protein Position Literatur (PMID) P9+P10 c.214+1G>A; p.? in dieser Arbeit 1 c.331-1A>G; p.? 22795106 P1 +2 c.379C>T; p.(Arg127*) 21211617 (#), 22499340 P11 c.397-14_397-4conNM_152788.4:c.2779-23029_2779-22742; p.? in dieser Arbeit (°) 3 c.433G>A; p.(Gly145Arg) 22499340 4 c.465-1G>A; p.? 22482978 5 c.514C>T; p.(Pro172Ser) 25492405 P11 c.550A>G; p.(Ser184Gly) in dieser Arbeit (°) 6 c.758T>C; p.(Leu253Ser) 22499340 7 c.869-1G>T; p.? 25492405 P2 c.869-2A>G; p.? 21211617 (#) P3 c.1640dup; p.(Asn547Lysfs*2) 21211617 (#), ($) P10 c.1900_1901delGA; p.(Glu634Lysfs*11) in dieser Arbeit P12 c.2774G>T; p.(Ser925Ile) in dieser Arbeit (§), (°) 8 c.2846_2847insGG2847delT; p.(Asp949Glufs*6) 22499340 P9 c.3023C>G; p.(Ser1008*) in dieser Arbeit Diese nach Position sortierten Varianten werden in Abb. 45 dargestellt; die Varianten dieser Arbeit sind auf NM_012224.2, NP_036356.1 berechnet. (#) = Erstbeschreibung, ($) = digene diallele Vererbung (DYNC2H1 Gen); (§) Variante als VUS eingestuft; (°) Vererbung nicht geklärt, da keine Eltern-DNA vorh.; weitere Informationen zur Zygotie, Mutationsart etc. in Tab. 11, Tab. B auf CD. Stand der Daten: Dezember 2015. NEK1 Varianten ursächlich für Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Oro-fazio-digitales Syndrom Typ 2 (OFD II/ Mohr- Syndrom) und axiale Spondylometaphysäre Dysplasie (SMD) werden hier nicht gelistet.

Tab. 13 Vergleich der Identifizierten Varianten im NEK1 Gen in den Patienten P9 und P10 Patient P9 Patient P10 dbSNP 138 c.214+1G>A (het.) c.214+1G>A (het.) 1. Variante, bei beiden Patienten gleich wt c.607-3T>C (het.) rs55679731 wt c.1900_1901delGA (het.) 2. Variante, unterschiedlich bei den Patienten wt c.2171A>G (het.) rs34099167 c.2681-20G>A (het.) c.2681-20G>A (het.) rs7680152 c.3023C>G (het.) wt 2. Variante, unterschiedlich bei den Patienten c.*165G>A (het.) c.*165G>A (het.) rs4692721 wt c.*495T>C (het.) rs1129694 wt c.*710A>G (het.) rs13212 Beide Patienten weisen im Bereich des NEK1 Gens keine homozygoten Varianten auf und es konnten unterschiedliche heterozygote SNPs identifiziert werden. Eine gemeinsame Abstammung der Familien kann somit als sehr wahrscheinlich ausgeschlossen werden. Demzufolge handelt es sich bei der in beiden Patienten P9 und P10 vorliegenden splice-site Mutation höchstwahrscheinlich nicht um eine Founder-Mutation, diese Variante ist zufällig, unabhängig voneinander mehrmals (rekurrent) in verschiedenen Patienten entstanden.

Abb. 48 DIDA Datenbank - digene diallele Vererbung für SRPS in NEK1 und DYNC2H1 Die Beschreibung der heterozygoten Variante in NEK1 (c.1640dup nach neuer HGVS Nomenklatur, früher c.1640insA) in Kombination mit der zweiten heterozygoten Variante in DYNC2H1 (c.11747G>A) wurde als digener dialleler Vererbungsmechanismus für die Short-rib Polydaktylie Syndrome [SRPS] in DIDA (DIgenic diseases DAtabase) annotiert; verändert nach http://dida.ibsquare.be/detail/?dc=dd010 .

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Anhang

Tab. 14 Übersicht DYNC2H1 Varianten dieser Arbeit und anderer Publikationen Patient cDNA Position; Protein Position Literatur (PMID) 1 c.195G>T; p.(T65T) (Splice Donor) 23456818 2 c.312_313delTA; p.(Pro104Profs*2) 23456818 P8 c.448C>T; p.(Arg150*) in dieser Arbeit 3 c.535T>G; p.(Trp179Gly) 23339108 4 c.624_625GT>AA; p.(Phe209Ile) 19361615 (#) c.654_655insTTTATAACTTGGACAGTCTATCCTTACTA; 5 (2x) 19442771 (#), 23339108 p.(Glu219Leufs*2) in dieser Arbeit, P30 + 6 (2x) c.988C>T; p.(Arg330Cys) 22499340, 23456818 7 c.1012A>G; p.(Arg338Gly) 22499340 P5 +8 c.1151C>T; p.(Ala384Val) in dieser Arbeit (*), 25982780 9 c.1288C>T; p.(Arg430Cys) 22499340 10 c.1306G>T; p.(Glu436*) 23456818 11 c.1421T>G; p.(Leu474Arg) 25492405 12 c.1483A>G; p.(Lys495Arg) 22499340 13 (2x) c.1759C>T; p.(Arg587Cys) 19361615 (#), 23339108 14 c.1953G>A; p.(Lys651Lys) (Splice Donor) 23456818 P14 c.2006A>G; p.(Lys669Arg) in dieser Arbeit (§) 15 c.2087A>C; p.(His696Pro) 23339108 16 c.2346-5T>G; p.? 23456818 17 c.2443G>C; p.(Gly815Arg) 25492405 18 c.2549T>A; p.(Leu850*) 23339108 19 c.2612T>C; p.(Leu871Pro) 23456818 20 c.2749_2750delCTinsG; p.(Thr917Argfs*1) 23339108 21 c.2819-14A>G; p.? 24961629 22 c.3459-1G>A; p.? 23456818 23 c.3682C>A; p.(Leu1228Ile) 23456818 24 c.3694G>A, p.(Asp1232Asn) 26874042 19442771 (#), 23339108, 25 (3x) c.3719T>C; p.(Ile1240Thr) 23456818 26 c.4135A>G; p.(Met1379Val) 23456818 27 c.4267C>T; p.(Arg1423Cys) 22499340 28 c.4325G>A; p.(Gly1442Asp) 23456818 29 c.4351C>T; p.(Gln1451*) 25982780 30 (2x) c.4610A>G; p.(Gln1537Arg) 19442771 (#), 23339108 31 c.IVS33+1G>T; p.? 19361615 (#) 32 c.5176C>T; p.(Arg1726*) 23339108 33 c.5220delT; p.(Phe1740Leufs*26) 23339108 34 c.5682_5683delAA; p.(Glu1894fs*10) 25410398 35 c.5959A>G; p.(Thr1987Ala) 19442771 (#) 36 c.5971A>T; p.(Met1991Leu) 19442771 (#) 37 c.5972T>A; p.(Met1991Lys) 23456818 38 c.6035C>T; p.(Ala2012Val) 23339108 39 c.6043C>T; p.(Arg2015*) 23339108 40 c.6047A>G; p.(Tyr2016Cys) 26826164 41 c.6161G>C; p.(Cys2054Ser) 23339108 42 c.6444T>A; p.(Leu2115His) 23339108 P14 c.6545G>A; p.(Cys2182Tyr) in dieser Arbeit (§) 43 c.6551A>T; p.(Asp2184Val) 26826164 44 c.6614G>A; p.(Arg2205His) 19361615 (#) 45 (2x) c.6679A>G; p.(Met2227Val) 23456818, 23339108 P21 c.6809G>A; p.(Arg2270Gln) in dieser Arbeit (°) 46 c.6910G>A; p.(Ala2304Thr) 23456818 47 c.7078G>T; p.(Asp2360Tyr) 23339108 48 c.7085A>G; p.(Asn2362Ser) 23456818 49 c.7148C>T; p.(Thr2383Met) 23339108 P19 c.7277G>A; p.(Arg2426His) in dieser Arbeit (*) 50 c.7382G>T; p.(Gly2461Val) 19442771 (#) 190

Anhang

Patient cDNA Position; Protein Position Literatur (PMID) 51 c.7437+3A>G; p.? 23456818 52 c.7442G>A; p.(Arg2481Gln) 23456818 53 c.7486C>T; p.(Pro2496Ser) 22499340 54 c.7539A>T; p.(Gly2513Gly) (Splice Donor) 23456818 55 c.7577T>G, p.(Ile2526Ser) 24961629 56 (2x) c.7594C>T; p.(Arg2532Trp) 23339108, 23456818 57 c.7663G>A; p.(Val2555Met) 23456818 58 c.7718A>G; p.(Tyr2573Cys) 23456818 59 c.7919T>C; p.(Ile2640Thr) 23456818 60 c.7981C>T; p.(Arg2661Cys) 23339108 61 c.7985G>A; p.(Arg2662Gln) 22499340 62 c.8283delT; p.(Phe2761Leufs*19) 23339108 c.8389_8397delCCAGCTTTG; 63 23456818 p.(Pro2797_Leu2799del) (3AS) 64 (2x) c.8457A>G; p.(Ile2819Met) 23339108, 23456818 65 c.8512C>T; p.(Arg2838*) 19361615 (#) 66 c.8534delA; p.(Asn2845Ilefs*8) 22499340 67 c.8617A>G; p.(Met2873Val) 23339108 P14 c.8627T>C; p.(Leu2876Ser) in dieser Arbeit 19442771 (#), 23339108, 68 (3x) c.9044A>G; p.(Asp3015Gly) 23456818 69 c.9070C>T; p.(Arg3004Cys) 25410398 70 c.9353+1G>A; p.? 23339108 71 c.9817C>T; p.(Gln3273*) 23456818 72 (2x) c.10063G>T; p.(Gly3355*) 19442771 (#), 23339108 73 c.10130delT; p.(Leu3377Cysfs*34) 19442771 (#) P21 +74 c.10163C>T; p.(Pro3388Leu) in dieser Arbeit (°), 23456818 P8 c.10343T>C; p.(Leu3448Pro) in dieser Arbeit 75 FISH Probe RP11-2I22 (Deletion Exon 71; 30 AS); p.? 23339108 76 c.10606C>T; p.(Arg3536*) 23339108 77 c.10669T>C; p.(Ser3557Pro) 23339108 P6 c.10711_10714delTTTA; p.(Phe3571Argfs*5) in dieser Arbeit (*) 78 c.10732T>A; p.(Phe3578Ile) 23339108 79 c.11221T>C; p.(Ser3741Pro) 23339108 80 (2x) c.11284A>G; p.(Met3762Val) 19442771 (#), 23339108 81 c.11312C>T; p.(Ala3771Val) 25492405 P30 c.11333C>T; p.(Ala3778Val) in dieser Arbeit 82 c.11417G>A; p.(Arg3806His) 25492405 83 c.11437C>T; p.(Arg3813Cys) 23456818 84 c.11560T>G; p.(Trp3854Gly) 23456818 14kb deletion (g.103191405-103204921); 85 23456818 p.(Gly3891_Gln4020del) (129 AS) P3 c.11747G>A; p.(Gly3916Asp) (Splice Akzeptor) 21211617 ($) 86 c.12400T>C; p.(Trp4134Arg) 23339108 87 c.12478-2A>G; p.? 22499340 c.12480_13556del (g.103325916-103350592); 88 23456818 p.(Asn4160_Gln4314del) (154 AS) 89 c.12538delC; p.(Leu4180Phefs*29) 23456818 90 c.12716T>G; p.(Leu4239Arg) 23456818 Diese nach Position sortierten Varianten werden in Abb. 49 dargestellt; die Varianten dieser Arbeit sind auf NM_001080463.1, NP_001073932.1 berechnet. (#) = Erstbeschreibung, ($) = digene diallele Vererbung (NEK1 Gen); (§) Variante als VUS eingestuft; (°) Vererbung nicht geklärt, da keine Eltern-DNA vorh., (*) kein 2.Hit; weitere Informationen zur Zygotie, Mutationsart etc. in Tab. 11, Tab. B auf CD. Stand der Daten: April 2016.

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Anhang

Abb. 49 Schematische Darstellung der Domänenstruktur von DYNC2H1 und Lokalisation identifizierter Varianten In dieser Dissertation und 11 weiteren Publikationen konnten 100 verschiedene Mutationspositionen identifiziert werden, die gleichmäßig über das ganze Gen verteilt sind und auch alle bekannten Domänen in DYNC2H1 abdecken. Dabei konnten 11x splice-site, 20x nonsense, 65x missense, 4x größere Deletionen detektiert werden. (#) Erstbeschreibung ($) digene diallele Vererbung NEK1; (§) Variante als VUS eingestuft; (°) Vererbung nicht geklärt, da keine Eltern-DNA vorh., (*) kein 2.Hit; Proteinschema verändert nach [194] und Darstellung aller Varianten in Tab. 14. Die Varianten dieser Arbeit sind auf NM_001080463.1, NP_001073932.1 berechnet.

Tab. 15 Übersicht DYNC2LI1 Varianten dieser Arbeit und anderer Publikationen Patient cDNA Position; Protein Position Literatur (PMID) P26 + P27 c.2T>C; p.(Met1?) in dieser Arbeit P29 c.162-2A>G; p.? in dieser Arbeit P28 c.232-8T>C ; p.? in dieser Arbeit 1 c.349C>G; p.(Leu117Val) 26077881 2 c.372G>A; p.(Trp124*) 26077881 P7 c.622C>T; p.(Arg208*) 26130459 (in dieser Arbeit) P7 c.662C>T; p.(Thr221Ile) 26130459 (in dieser Arbeit) 3 c.996+1G>A; p.? 26077881 4 c.1003G>T; p.(Glu335*) 26077881 Diese nach Position sortierten Varianten werden in Abb. 50 dargestellt (ohne P26-29, da für diese Varianten die Pathogenität nicht bewiesen werden konnte und jeweils kein 2. Hit vorhanden war); Die Varianten dieser Arbeit sind auf NM_001193464.1, NP_001180393.1 berechnet. Weitere Informationen zur Zygotie, Mutationsart etc. in Tab. 11, Tab. B auf CD. Stand der Daten: Juli 2015.

Abb. 50 Schematische Darstellung der Domänenstruktur von DYNC2LI1 und Lokalisation identifizierter Varianten In dieser Dissertation und einer weiteren Publikation [217] konnten 6 verschiedene Mutationspositionen identifiziert werden, die gleichmäßig über das ganze Gen verteilt sind und auch alle bekannten Domänen in DYNC2LI1 abdecken. C-Terminal wird der im NEK1-Y2H-Screen identifizierte Interaktionsbereich der beiden Hefeklone #94+95 dargestellt (lila Balken). Proteinschema verändert nach [149] und Darstellung aller Varianten in Tab. 15. Die Varianten dieser Arbeit sind auf NM_001193464.1, NP_001180393.1 berechnet.

192

Anhang

13.4. Patientenbilder - P7 mit Mutationen im DYNC2LI1 Gen

Abb. 51 Morphologische und radiographische Merkmale der Patienten mit DYNC2LI1 Mutationen (a) Stammbaum der Familie. (b-d) Faziales Erscheinungsbild des Patienten 1 (II.1), postaxiale Hexadaktylie und Dystrophie der Nägel. (e) Faziales Erscheinungsbild von Patient 2 (II.5 = P7 56475, Exom-Sequenzierung durchgeführt) mit breiter und prominenter Stirn, flachem Nasenrücken, breiter und schiefstehender Nasenspitze und tiefsitzenden Ohren. (f-g) Patient 2 mit engem Thorax und postaxialer Hexadaktylie. (h-j) Patient 3 (II.6) 19. Schwangerschaftswoche, mediale Lippenspalte, spitz zulaufendes Kinn, enger Thorax und postaxiale Hexadaktylie. (k,l) Radiographische Merkmale von Patient 3 mit langen Tibiae, metaphysealer Dysplasie und kurzen Rippen (verändert nach [149]).

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Anhang

13.5. Patient P11 – komplette Sequenz des complex rearrangements

288bp inseriertes Fragment des intronischen Bereiches des ANKS1B Gens (NM_152788.4: Intron 17; chr12:99248656-99248943) GGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCATGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTA ACAAGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGCGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCTAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCA GGAGAATGGCGTGAACCCGGGAAGCGGAGCTTGCAGTGAGCTGAGATTGCGCCACTGCAGTCCGCAGTCCGACCTGGGCGACAGAGCGAGACT CCGTCTC

Abb. 52 Patient P11 – Sequenz des 288bp inserierten Fragments des ANKS1B Gens im Spleißbereich des Introns 5 von NEK1 Nach Gelextraktion, TOPO-Klonierung und anschließender Sequenzierung konnte beim kleinen Fragment die erwartete wildtypische Sequenz von Exon 6 mit flankierenden intronischen Bereichen nachgewiesen werden. Im großen Fragment wurden im Intron 5 11 bp (Position -14 bis -4; chr4:170510669-170510679) deletiert und stattdessen ein 288 bp großes Stück inseriert. Mittels der BLAST-Funktion von NCBI konnte zu diesem inserierten Fragment der intronische Bereich des ANKS1B Gens (NM_152788.4: Intron 17) mit dem höchsten Score und p-Wert alignt werden, welches auf Chromosom 12 annotiert ist (chr12:99248656-99248943). Diese Mutation wird nach HGVS Nomenklatur c.397-14_397- 4conNM_152788.4:c.2779-23029_2779-22742 benannt.

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P11- NEK1 Exon 6 großes Fragment

GAATTCGCCCTTtggattgtctcttttcttgatggtgtcctttgatgcacaaaagtttttaattttgatagtccaatttatccttttaatttttttgcttgtgcttttgacgt catatctaagaaaccattccctagcccaatggcatgaagatttattcctatgtttttctctaggagttttgtattttagttttgatatttagatctagactccattttgaattaatttt tgtttatgatttgaggtaggggacttcatttattcttttgtatgtgaatatccagttactctagcacaatttttttaactggattttaaattttatgaaaaatgttgacttagaactg gactgtaacaatatttctagggtttttttttttgagacggagtctcgctctgtcgcccaggtcggactgcggactgcagtggcgcaatctcagctcactgcaagctccgc ttcccgggttcacgccattctcctgcctcagcctcccgagtagctaggactacaggcgcccgccaccgcgcccggctaattttttgtatttttagtagagacggggtttc accttgttagccaggatggtctcaatctcctgacctcatgatccacccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccaccgcgcccggcccagA ACATATTTTTAACTAAAGATGGAACAGTACAACTTGGAGATTTTGGAATTGCTAGAGTTCTTAATA Ggtaacatgaattttaaactttgttttgatataatgttttcagcgaaccttcaatccatgatgatgtatatgtgataatttatggtatctttaagtacattctttactgggatgttg ctttattgggccatgttctgagAAGGGCGAATTC

 PCRproduktgröße: 868bp  Inseriertes Stück: 288bp (intronischer Bereich des ANKS1B Gens)

P11 - NEK1 Exon 6 kleines Fragment

GAATTCGCCCTTtggattgtctcttttcttgatggtgtcctttgatgcacaaaagtttttaattttgatagtccaatttatccttttaatttttttgcttgtgcttttgacgt catatctaagaaaccattccctagcccaatggcatgaagatttattcctatgtttttctctaggagttttgtattttagttttgatatttagatctagactccattttgaattaatttt tgtttatgatttgaggtaggggacttcatttattcttttgtatgtgaatatccagttactctagcacaatttttttaactggattttaaattttatgaaaaatgttgacttagaactg gactgtaacaatatttctagggtttttttttttcctgtcttttacagAACATATTTTTAACTAAAGATGGAACAGTACAACTTGGAGAT TTTGGAATTGCTAGAGTTCTTAATAGgtaacatgaattttaaactttgttttgatataatgttttcagcgaaccttcaAtccatgatgatgtatatgt gataatttatggtatctttaagtacattctttactgggatgttgctttattgggccatgttctgagAAGGGCGAATTC

 PCRproduktgröße: 591bp  Bereich, der beim großen Fragment fehlt

Farbenbeschreibung: Vektor, Intron, Exon6, Bereich, der bei Patient 76159 inseriert ist

195

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13.6. qPCR Daten Patienten P26/27/28 – DYNC2LI1 Expression mittels verschiedener TaqMan-Sonden

Expression von DYNC2LI1 in Kontrollen und Patienten Expression von DYNC2LI1 in Kontrollen und Patienten Expression von DYNC2LI1 in Kontrollen und Patienten DYNC2LI1-Sonde Hs00602913_m1 (alt) DYNC2LI1-Sonde Hs00602913_m1 (alt) DYNC2LI1-Sonde Hs00602913_m1 (alt)

Expression von DYNC2LI1 in Kontrollen und Patienten Expression von DYNC2LI1 in Kontrollen und Patienten DYNC2LI1-Sonde Hs01005266_m1 (neu) DYNC2LI1-Sonde Hs01005266_m1 (neu)

qPCR-1 vom 15.8.2014 qPCR-2 vom 01.09.2014 qPCR-3 vom 09.09.2014 Abb. 53 DYNC2LI1 Expression in Patienten P26/27/28 – Analyse mittels qPCR und verschiedener DYNC2LI1-TaqMan-Sonden Eine Analyse der relativen Expression von DYNC2LI1 in P26/27/28 und 11 PaxGene-Kontrollen ergab mit zwei verschiedenen TaqMan-Sonden (Hs00602913_m1, Hs01005266_m1 ) kein eindeutiges Ergebnis (1x runterreguliert auf ca. 25 %, 1x unverändert, 1x leicht hochreguliert).

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13.7. MLPA Analyse des DYNC2LI1 Gens in Patient P28

Abb. 54 MLPA-Analyse von DYNC2LI1 von Patient P28 und Eltern Eine MLPA-Analyse mit Sonden für alle 13 Exons von DYNC2LI1 (Sondenmix A+B) und mit dem Referenzsonden P200-Mix ergaben beim Patienten (P28=54914) und dessen Eltern keine Deletionen oder Duplikationen von einzelnen Exons im Vergleich zu mitgeführten Kontrollen. Grenzwerte zur Angabe von Deletionen oder Duplikationen werden mit dem Faktor 0,75 bzw. 1,25 definiert (rote Linien).

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13.8. Lokalisation von NEK1 in Kontroll- und Patienten-Fibroblasten (P1) mittels Immunfluoreszenz

Abb. 55 Lokalisation von NEK1 in Kontroll-Fibroblasten mittels Immunfluoreszenz NEK1 ist in Kontroll-Fibroblasten im Cytoplasma und verstärkt am Basalkörper des primären Ciliums lokalisiert Dargestellt sind 4 expemplarische Übersichtsbilder anhand derer 66 Kontrollzellen ausgezählt wurden. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium für Induktion des primären Ciliums. Grün = NEK1- H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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Abb. 56 Lokalisation von NEK1 in Patienten-Fibroblasten (P1) mittels Immunfluoreszenz Bei den Patienten-Fibroblasten (P1) kann wie auch bei den Kontrollen ein NEK1 Signal im Cytoplasma detektiert werden, die Lokalisation am Basalkörper ist schwächer und diffus. Zusätzlich erkennt man in Patientenzellen eine stärkere Anfärbung des Cytoskeletts (posttranslationale Polyglutamylierung der Tubuline). Dargestellt sind 4 expemplarische Übersichtsbilder anhand derer 68 Patienten-Zellen ausgezählt wurden. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium für Induktion des primären Ciliums. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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13.9. Absättigungstest des NEK1-H3T1 Antikörpers in Kontroll- und Patienten-Fibroblasten (P1) mittels Immunfluoreszenz

Abb. 57 Absättigungstest des NEK1-H3T1 Antikörpers Um die Spezifität des NEK1-H3T1 Antikörpers zu testen, wurde für einen Absättigungstest der Antikörper zusammen mit 100 µg rekombinanten NEK1-H3 Protein in 100 µl Blockierungslösung verdünnt. Immunfluoreszenzaufnahmen zeigen, dass durch die Absättigung mit NEK1-H3 Protein und Färbung mit NEK1- H3T1 Antikörper sowohl in Patienten (P1) als auch in Kontroll-Fibroblasten kein Signal mehr im Cytoplasma und am Basalkörper nachgewiesen werden kann. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Fibroblasten 5 Tage unter Hungermedium für Induktion des primären Ciliums. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

200

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13.10. Hauptnetzwerke der Ingenuity Pathway Analyse – NEK1 Y2H- Screen

Abb. 58 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 1 Darstellung von Hefe-Interaktionspartnern von NEK1 (grau) in einem Netzwerk und verschiedenen Genen (weiß), über welche Verknüpfungen über verschiedene Knotenpunkte erstellt wurden. Dies ergab eine Anreicherung der Y2H Interaktionspartner in Hauptnetzwerk 1 der Kategorie „Tissue Morphology, Metabolic Disease, Molecular Transport“.

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Abb. 59 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 2 Darstellung von Hefe-Interaktionspartnern von NEK1 (grau) in einem Netzwerk und verschiedenen Genen (weiß), über welche Verknüpfungen über verschiedene Knotenpunkte erstellt wurden. Dies ergab eine Anreicherung der Y2H Interaktionspartner in Hauptnetzwerk 2 der Kategorie „Auditory Disease, Neurological Disease, Hereditary Disorder“.

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Abb. 60 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 3 Darstellung von Hefe-Interaktionspartnern von NEK1 (grau) in einem Netzwerk und verschiedenen Genen (weiß), über welche Verknüpfungen über verschiedene Knotenpunkte erstellt wurden. Dies ergab eine Anreicherung der Y2H Interaktionspartner in Hauptnetzwerk 3 der Kategorie „Cell Morphology, Cellular Assembly and Organization, Cellular Development“. In diesem Netzwerk wird auch die schon in der Literatur beschriebene Interaktion von NEK1 und KIF3A (orangener Stern) dargestellt [160].

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Abb. 61 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 4 Darstellung von Hefe-Interaktionspartnern von NEK1 (grau) in einem Netzwerk und verschiedenen Genen (weiß), über welche Verknüpfungen über verschiedene Knotenpunkte erstellt wurden. Dies ergab eine Anreicherung der Y2H Interaktionspartner in Hauptnetzwerk 4 der Kategorie „Embryonic Development, Organ Development, Organ Morphology“. In diesem Netzwerk wird auch DYNC2LI1 (orangener Stern) dargestellt, welches als Interaktion in dieser Dissertation mittels Kolokalisation, Ko-Immunopräzipitation und 1on1-Y2H-Screen bestätigt wurde. Desweiteren wurde mittels Exom-Sequenzierung in Patient P7 Mutationen im DYNC2LI1 Gen identifiziert [149].

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Abb. 62 Ingenuity Pathway Analyse – Y2H NEK1 Interaktionspartner Hauptnetzwerk 5 Darstellung von Hefe-Interaktionspartnern von NEK1 (grau) in einem Netzwerk und verschiedenen Genen (weiß), über welche Verknüpfungen über verschiedene Knotenpunkte erstellt wurden. Dies ergab eine Anreicherung der Y2H Interaktionspartner in Hauptnetzwerk 5 der Kategorie „Cell Death and Survival, Cellular Function and Maintenance, Embryonic Development“. In diesem Netzwerk wird auch ARHGAP10 (orangener Stern) dargestellt, welches als differentiell exprimiertes Gen in der RNA-Sequenzierung von NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium nachgewiesen und mittels qPCR bestätigt wurde.

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Anhang

13.11. Cilienmorphologie NEK1-CRISPR-Zelllinien und Non Target Kontrollen

Abb. 63 CRISPR Non Target Kontrolle NT2 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation Die Non Target Kontroll-Zelllinie (NT2) weist viele primäre Cilien mit normaler Morphologie und Cilienlänge auf, wobei ein starkes Lokalisationssignal von NEK1 an der Basalkörperregion der primären Cilien und im Cytoplasma vorhanden ist. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Für die Induktion von primären Cilien wurde die Zelllinie 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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Anhang

Abb. 64 CRISPR Non Target Kontrolle NT3 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation Die Non Target Kontroll-Zelllinie (NT3) weist viele primäre Cilien mit normaler Morphologie und Cilienlänge auf, wobei ein starkes Lokalisationssignal von NEK1 an der Basalkörperregion der primären Cilien und im Cytoplasma vorhanden ist. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Für die Induktion von primären Cilien wurde die Zelllinie 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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Anhang

Abb. 65 CRISPR Non Target Kontrolle NT4 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation Die Non Target Kontroll-Zelllinie (NT4) weist viele primäre Cilien mit normaler Morphologie und Cilienlänge auf, wobei ein starkes Lokalisationssignal von NEK1 an der Basalkörperregion der primären Cilien und im Cytoplasma vorhanden ist. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Für die Induktion von primären Cilien wurde die Zelllinie 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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Anhang

Abb. 66 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR2 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation Bei der CRISPR-Zelllinien mit NEK1 Mutationen (CR2, homozygote 19 bp Deletion) kann eine verminderte Anzahl von Cilien mit verkürzter Cilienlänge beobachtet werden. Zusätzlich erkennt man in den NEK1- depletierten Zellen eine stärkere Anfärbung des Cytoskeletts durch posttranslationale Polyglutamylierung der Tubuline. In den NEK1-CRISPR-Zelllinien kann auch ein Signal im Cytoplasma detektiert werden, die Lokalisation am Basalkörper ist schwächer und diffus bzw. bei Ausbildung von kurzen Cilien ist das Areal des NEK1-Signals flächenmäßig kleiner. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Für die Induktion von primären Cilien wurde die Zelllinie 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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Anhang

Abb. 67 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR5 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation Bei der CRISPR-Zelllinien mit NEK1 Mutationen (CR5, homozygote 13 bp Deletion) kann eine verminderte Anzahl von Cilien mit verkürzter Cilienlänge beobachtet werden. Zusätzlich erkennt man in den NEK1- depletierten Zellen eine stärkere Anfärbung des Cytoskeletts durch posttranslationale Polyglutamylierung der Tubuline. In den NEK1-CRISPR-Zelllinien kann auch ein Signal im Cytoplasma detektiert werden, die Lokalisation am Basalkörper ist schwächer und diffus bzw. bei Ausbildung von kurzen Cilien ist das Areal des NEK1-Signals flächenmäßig kleiner. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Für die Induktion von primären Cilien wurde die Zelllinie 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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Anhang

Abb. 68 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR8 - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation Bei der CRISPR-Zelllinien mit NEK1 Mutationen (CR8, homozygote 1 bp Deletion) kann eine verminderte Anzahl von Cilien mit verkürzter Cilienlänge beobachtet werden. Zusätzlich erkennt man in den NEK1-depletierten Zellen eine stärkere Anfärbung des Cytoskeletts durch posttranslationale Polyglutamylierung der Tubuline. In den NEK1- CRISPR-Zelllinien kann auch ein Signal im Cytoplasma detektiert werden, die Lokalisation am Basalkörper ist schwächer und diffus bzw. bei Ausbildung von kurzen Cilien ist das Areal des NEK1-Signals flächenmäßig kleiner. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Für die Induktion von primären Cilien wurde die Zelllinie 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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Anhang

Abb. 69 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR6wt - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation Die NEK1-CRISPR-Zelllinie (CR6wt: mit CRISPR/Cas9 behandelt, aber wildtyp NEK1 Sequenz) weist viele primäre Cilien mit normaler Morphologie und Cilienlänge auf, wobei ein starkes Lokalisationssignal von NEK1 an der Basalkörperregion der primären Cilien und im Cytoplasma vorhanden ist. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Für die Induktion von primären Cilien wurde die Zelllinie 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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Abb. 70 NEK1-CRISPR-Zelllinie CR9wt - Cilienmorphologie und NEK1 Lokalisation Die NEK1-CRISPR-Zelllinie (CR9wt: mit CRISPR/Cas9 behandelt, aber wildtyp NEK1 Sequenz) weist viele primäre Cilien mit normaler Morphologie und Cilienlänge auf, wobei ein starkes Lokalisationssignal von NEK1 an der Basalkörperregion der primären Cilien und im Cytoplasma vorhanden ist. Zur Vergleichbarkeit der Intensität des NEK1 Signals wurden die Bilder mit gleichen Belichtungszeiten aufgenommen. Für die Induktion von primären Cilien wurde die Zelllinie 3 Tage unter Hungermedium inkubiert. Grün = NEK1-H3T1 (1:250), rot = Polyglutamyliertes Tubulin (1:1000, Cilienmarker), blau = DAPI (1:50000, Zellkern), Maßstabsbalken: 10 µm.

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Anhang

13.12. Differentiell exprimierte Gene unter beiden Nährbedingungen in NEK1-CRISPR-Zelllinien (RNA-Seq Daten)

Tab. 16 Differentiell exprimierte Gene unter Hungermedium in NEK1-CRISPR-Zelllinien ensembl hgnc_symbol baseMean log2FoldChange FCIngen lfcSE stat pvalue padj ENSG00000264508 RN7SL473P 1,528986107 7,14930872 +141,96 2,235410057 3,19820907 0,00138284 NA ENSG00000211448 DIO2 (*) 67,20512326 3,584135955 +11,99 1,150356643 3,115673713 0,001835252 0,363322617 ENSG00000010282 HHATL 3,443474403 3,570993804 +11,88 1,218210645 2,931343457 0,003374994 NA ENSG00000145920 CPLX2 (*) 18,69432489 2,903526259 +7,48 0,883512806 3,286343151 0,001014973 0,259432771 ENSG00000152939 MARVELD2 (*) 19,78371677 2,898366997 +7,46 0,682988882 4,243651798 2,20E-05 0,024943461 ENSG00000178171 AMER3 4,51391833 2,677949716 +6,40 1,013187153 2,643094819 0,008215203 NA ENSG00000260903 XKR7 (*) 39,87381905 2,645712115 +6,26 0,734727509 3,600943322 0,000317065 0,134295336 ENSG00000188981 MSANTD1 6,241201159 2,530028303 +5,78 0,964841854 2,622220721 0,008735883 NA ENSG00000205922 ONECUT3 7,022468803 2,359790651 +5,13 0,811084408 2,909426722 0,003620923 NA ENSG00000143107 FNDC7 (*) 43,22932657 2,275286277 +4,84 0,854900379 2,661463642 0,007780174 0,623166336 ENSG00000135625 EGR4 5,777102018 2,168550474 +4,50 0,690146501 3,142159629 0,001677066 NA ENSG00000090382 LYZ 12,58441518 2,109121611 +4,31 0,781556992 2,698615241 0,006962863 0,602859406 ENSG00000120738 EGR1 1216,239928 2,109005395 +4,31 0,665962947 3,166850957 0,001540993 0,325185308 ENSG00000269404 SPIB 6,512254631 2,071337359 +4,20 0,708661112 2,92288842 0,003468008 NA ENSG00000213199 ASIC3 253,1072245 1,71033566 +3,27 0,626743228 2,728925632 0,006354103 0,594403424 ENSG00000179388 EGR3 66,51669724 1,694815959 +3,24 0,636593292 2,662321422 0,007760374 0,623166336 ENSG00000135346 CGA (*) 16,52459008 1,670859206 +3,18 0,633754363 2,636446078 0,008377951 0,631995868 ENSG00000179698 KIAA1875 63,35551633 1,595210829 +3,02 0,598460188 2,665525394 0,007686813 0,623166336 ENSG00000187678 SPRY4 6,781700455 1,57328153 +2,98 0,60296679 2,609234135 0,009074513 NA ENSG00000130545 CRB3 16,60956942 1,489795081 +2,81 0,55049823 2,706266795 0,006804436 0,602859406 ENSG00000112139 MDGA1 345,1048241 1,486944562 +2,80 0,560793695 2,651500145 0,008013508 0,631995868 ENSG00000158748 HTR6 69,11412956 1,445200566 +2,72 0,401443065 3,600013776 0,0003182 0,134295336 ENSG00000122877 EGR2 37,00741869 1,437706665 +2,71 0,341586315 4,208911779 2,57E-05 0,027393183 ENSG00000126562 WNK4 (*) 145,5674717 1,426407631 +2,69 0,493357563 2,891224819 0,003837435 0,521634135 ENSG00000080573 COL5A3 16,49750087 1,419692479 +2,68 0,541660453 2,621000798 0,008767206 0,631995868 ENSG00000006283 CACNA1G (*) 147,2733975 1,394671035 +2,63 0,434782097 3,207747157 0,001337791 0,307319278 ENSG00000134668 SPOCD1 (*) 121,8061886 1,384328189 +2,61 0,432567325 3,200260654 0,001373034 0,307627319 ENSG00000160471 COX6B2 19,15407118 1,375386542 +2,59 0,444902218 3,09143557 0,001991912 0,377836764 ENSG00000186056 MATN1-AS1 72,04196841 1,370109804 +2,58 0,357124273 3,836507087 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(*) 340,8105992 1,017009089 +2,02 0,2630866 3,865681827 0,000110779 0,074460088 ENSG00000162745 OLF ml2B 157,7604127 1,013333897 +2,02 0,336216755 3,013930395 0,00257887 0,438785198 ENSG00000186648 LRRC16B (*) 396,3699871 0,998339468 +2,00 0,301165176 3,314923326 0,000916683 0,241984156 ENSG00000095321 CRAT 947,7054903 0,989430616 +1,99 0,310374072 3,187864923 0,001433275 0,313386387 ENSG00000164398 ACSL6 482,4489989 0,981187995 +1,97 0,316413348 3,100969033 0,001928885 0,372397851 ENSG00000184347 SLIT3 416,2648811 0,972395504 +1,96 0,330440617 2,942723905 0,003253384 0,487320656 ENSG00000151090 THRB 695,411455 0,967754835 +1,96 0,351755694 2,751212987 0,005937502 0,579543061 ENSG00000153214 TMEM87B 946,2011868 0,964991172 +1,95 0,266785067 3,617110893 0,00029791 0,134295336 ENSG00000171956 FOXB1 137,6185009 0,964682696 +1,95 0,373691606 2,581494153 0,009837366 0,631995868 214

Anhang ensembl hgnc_symbol baseMean log2FoldChange FCIngen lfcSE stat pvalue padj ENSG00000163328 GPR155 518,6673149 0,956990055 +1,94 0,28636441 3,341861005 0,000832187 0,23669623 ENSG00000166833 NAV2 335,0560354 0,947033729 +1,93 0,286123679 3,309875408 0,000933375 0,241984156 ENSG00000144730 IL17RD (*) 949,6167478 0,945449127 +1,93 0,271738564 3,479260045 0,0005028 0,172166455 ENSG00000181856 SLC2A4 138,3690723 0,942589817 +1,92 0,36240303 2,60094353 0,009296776 0,631995868 ENSG00000166046 TCP11L2 223,5036527 0,922266014 +1,90 0,332719089 2,771905922 0,005572914 0,579543061 ENSG00000171608 PIK3CD 208,8239365 0,919628704 +1,89 0,303806551 3,027020653 0,002469771 0,431832502 ENSG00000267534 S1PR2 139,5322764 0,915763625 +1,89 0,33532565 2,730968016 0,00631486 0,594403424 ENSG00000112276 BVES 1140,040776 0,911297443 +1,88 0,321477239 2,834718391 0,00458661 0,569332519 ENSG00000196110 ZNF699 284,295919 0,909235807 +1,88 0,304128425 2,989644281 0,002793025 0,454928668 ENSG00000142197 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Anhang ensembl hgnc_symbol baseMean log2FoldChange FCIngen lfcSE stat pvalue padj ENSG00000120832 MTERFD3 1414,609495 -0,450646652 -1,37 0,168713519 -2,671076123 0,00756085 0,623166336 ENSG00000120699 EXOSC8 5049,478247 -0,452800807 -1,37 0,168272378 -2,690880182 0,007126378 0,602859406 ENSG00000173418 NAA20 3145,874471 -0,453914314 -1,37 0,17405789 -2,607835325 0,009111678 0,631995868 ENSG00000183527 PSMG1 3442,4619 -0,454933409 -1,37 0,161574338 -2,815629104 0,004868183 0,575291382 ENSG00000135469 COQ10A (*) 1576,407347 -0,460317025 -1,38 0,144222213 -3,191720721 0,00141428 0,313004327 ENSG00000164038 SLC9B2 (*) 1594,094396 -0,468942854 -1,38 0,181698415 -2,580885769 0,009854718 0,631995868 ENSG00000162961 DPY30 2491,364861 -0,481778955 -1,40 0,173037743 -2,784242024 0,005365298 0,579543061 ENSG00000060762 MPC1 2435,272305 -0,495061171 -1,41 0,156043047 -3,172593586 0,001510839 0,324982032 ENSG00000164022 AIMP1 (*) 4118,269007 -0,496886397 -1,41 0,142619095 -3,484010311 0,00049396 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0,410338322 ENSG00000125901 MRPS26 5406,646231 -0,751140658 -1,68 0,28525321 -2,633241736 0,008457413 0,631995868 ENSG00000184076 UQCR10 5202,371389 -0,753836398 -1,69 0,273613937 -2,75510965 0,005867247 0,579543061 ENSG00000165060 FXN 1826,962094 -0,756373416 -1,69 0,261714914 -2,89006616 0,003851608 0,521634135 ENSG00000145335 SNCA (*) 1186,696996 -0,758070089 -1,69 0,286469738 -2,646248406 0,008139002 0,631995868 ENSG00000173457 PPP1R14B 3548,40631 -0,766210032 -1,70 0,274860356 -2,787633848 0,005309452 0,579543061 ENSG00000109576 AADAT (*) 1378,314437 -0,77403363 -1,71 0,132992165 -5,820144588 5,88E-09 1,07E-05 ENSG00000163319 MRPS18C 1435,788824 -0,779359115 -1,72 0,208127024 -3,744632001 0,000180658 0,099351158 ENSG00000164096 C4orf3 3387,340558 -0,793874163 -1,73 0,21686074 -3,660755581 0,000251473 0,13422718 ENSG00000270419 CAHM 88,68063594 -0,807667138 -1,75 0,309041094 -2,613461945 0,008963006 0,631995868 216

Anhang ensembl hgnc_symbol baseMean log2FoldChange FCIngen lfcSE stat pvalue padj ENSG00000137038 TMEM261 3806,089771 -0,808334494 -1,75 0,288768121 -2,799251146 0,005122128 0,575291382 ENSG00000164978 NUDT2 1941,228083 -0,81512952 -1,76 0,29481252 -2,764908088 0,005693884 0,579543061 ENSG00000109534 GAR1 (*) 2366,951336 -0,820081454 -1,77 0,21548075 -3,805822345 0,000141334 0,085497531 ENSG00000145337 PYURF 5299,139954 -0,82035353 -1,77 0,226904309 -3,615416272 0,000299865 0,134295336 ENSG00000189046 ALKBH2 3933,034439 -0,83280467 -1,78 0,281049226 -2,963198592 0,003044601 0,468249269 ENSG00000232388 LINC00493 2207,153742 -0,843823334 -1,79 0,321005296 -2,628689758 0,008571452 0,631995868 ENSG00000123737 EXOSC9 (*) 5484,19777 -0,848507026 -1,80 0,178736446 -4,747252414 2,06E-06 0,002878532 ENSG00000135951 TSGA10 572,1603122 -0,850693445 -1,80 0,323104833 -2,632871309 0,008466642 0,631995868 ENSG00000179988 PSTK (*) 969,1934803 -0,915553463 -1,89 0,236050128 -3,878639971 0,000105042 0,073635478 ENSG00000109390 NDUFC1 (*) 2227,761871 -0,931844484 -1,91 0,237758108 -3,91929634 8,88E-05 0,067153549 ENSG00000169288 MRPL1 1973,409785 -0,9406553 -1,92 0,336244234 -2,797535856 0,005149405 0,575291382 ENSG00000164104 HMGB2 (*) 14083,35081 -0,941904137 -1,92 0,288793469 -3,261514677 0,001108187 0,271775363 ENSG00000109536 FRG1 959,5988174 -0,943714854 -1,92 0,327366312 -2,882748837 0,003942216 0,526053983 ENSG00000169976 SF3B5 4237,930905 -0,959254674 -1,94 0,299591792 -3,201872348 0,001365375 0,307627319 ENSG00000123576 ESX1 109,1132352 -0,964792895 -1,95 0,314489087 -3,067810405 0,002156334 0,403434494 ENSG00000226950 DANCR (*) 1757,297626 -0,971603912 -1,96 0,278699525 -3,486205836 0,000489924 0,172166455 ENSG00000069482 GAL (*) 1344,041345 -1,005943669 -2,01 0,261058791 -3,853322327 0,000116526 0,075525383 ENSG00000168556 ING2 (*) 1116,063864 -1,023825174 -2,03 0,313694289 -3,263767338 0,001099414 0,271775363 ENSG00000109775 UFSP2 (*) 1309,436723 -1,032120561 -2,05 0,256788763 -4,019336932 5,84E-05 0,053500775 ENSG00000164105 SAP30 790,1003755 -1,037501964 -2,05 0,306736921 -3,382383702 0,000718597 0,224846514 EPB41L4A-AS1 ENSG00000224032 (*) 3141,437974 -1,118239808 -2,17 0,394722136 -2,832979728 0,004611631 0,569332519 ENSG00000134363 FST (*) 44,87398841 -1,202924074 -2,30 0,397973375 -3,022624499 0,00250593 0,433120132 ENSG00000177410 ZFAS1 (*) 5696,095009 -1,225637321 -2,34 0,370087516 -3,31174997 0,000927144 0,241984156 ENSG00000164853 UNCX 29,73992971 -1,25964596 -2,39 0,414342447 -3,040108417 0,00236493 0,424938115 ENSG00000269893 SNHG8 (*) 1678,191625 -1,264552278 -2,40 0,336912746 -3,753352439 0,000174485 0,099351158 ENSG00000133962 CATSPERB 31,88053637 -1,390018056 -2,62 0,50423371 -2,756694027 0,005838896 0,579543061 ENSG00000168209 DDIT4 25182,60246 -1,42069516 -2,68 0,527395395 -2,693795156 0,007064357 0,602859406 ENSG00000124253 PCK1 (*) 24,79622232 -1,454015963 -2,74 0,401129385 -3,624805407 0,000289179 0,134295336 ENSG00000113657 DPYSL3 (*) 111,024223 -1,535963771 -2,90 0,529817084 -2,899045379 0,003743007 0,514606773 ENSG00000072201 LNX1 9,64804096 -1,6773864 -3,20 0,638628201 -2,626546083 0,008625631 0,631995868 ENSG00000164197 RNF180 (*) 14,93344679 -1,758776098 -3,38 0,680524895 -2,584440496 0,009753713 0,631995868 ENSG00000183780 SLC35F3 7,711662989 -1,867082477 -3,65 0,708160015 -2,636526261 0,008375972 NA ENSG00000214389 RPS3AP26 54,37281127 -1,944704597 -3,85 0,746856427 -2,603853333 0,00921822 0,631995868 ENSG00000231120 BTF3P10 7,339542051 -2,012941627 -4,04 0,739227307 -2,723034727 0,006468526 NA ENSG00000102287 GABRE (*) 48,74370892 -2,216550024 -4,65 0,804074955 -2,75664602 0,005839753 0,579543061 ENSG00000210154 MT-TD 22,75725002 -2,278014923 -4,85 0,863589831 -2,637843617 0,008343505 0,631995868 ENSG00000137601 NEK1 (*) 2489,171907 -2,33688419 -5,05 0,264313454 -8,841336498 9,46E-19 1,72E-14 ENSG00000128165 ADM2 (*) 117,901402 -5,808220142 -56,03 2,052983988 -2,829159981 0,004667036 0,572279557 (*) 70 überlappende Gene differentiell exprimiert mit p-Wert ˂ 0,01 sowohl unter Normal- als auch Hungermedium Gelb markiert: 19 Gene, die auch in Ciliengenliste aufgeführt sind. Weitere Informationen und Übersichten in Tab. C auf CD.

Tab. 17 Differentiell exprimierte Gene unter Normalmedium in NEK1-CRISPR-Zelllinien ensembl hgnc_symbol baseMean log2FoldChange FCIngen lfcSE stat pvalue padj ENSG00000211448 DIO2 (*) 67,20512326 3,742949203 +13,39 1,150816826 3,252428291 0,000536855 0,207294421 ENSG00000260903 XKR7 (*) 39,87381905 2,958416075 +7,77 0,737116054 4,013501073 1,94E-05 0,019863547 ENSG00000145920 CPLX2 (*) 18,69432489 2,940032979 +7,67 0,912759317 3,221038586 0,000607483 0,21616876 ENSG00000143107 FNDC7 (*) 43,22932657 2,881571802 +7,37 0,865322245 3,330056311 0,000393684 0,17010892 ENSG00000168348 INSM2 25,17089893 2,753773604 +6,74 0,712792862 3,863357434 3,92E-05 0,029674375 ENSG00000152939 MARVELD2 (*) 19,78371677 2,404226688 +5,29 0,67819844 3,545019489 0,000161248 0,09754455 ENSG00000161180 CCDC116 38,93438081 2,397892411 +5,27 0,819783533 2,925031198 0,001850698 0,339257166 ENSG00000196381 ZNF781 12,30121655 2,362694239 +5,14 0,605606797 3,901366778 3,29E-05 0,025966235 ENSG00000259954 IL21R-AS1 9,468984768 2,143764457 +4,42 0,771931544 2,777143225 0,003118597 0,405252546 ENSG00000189223 PAX8-AS1 9,565474425 2,034581696 +4,10 0,73066623 2,784556905 0,003039742 0,40329605 ENSG00000135346 CGA (*) 16,52459008 2,010907565 +4,03 0,639354697 3,145214348 0,000815296 0,250779423 ENSG00000116544 DLGAP3 136,2342392 1,913419779 +3,77 0,704748569 2,7150389 0,003856097 0,442272695 ENSG00000104112 SCG3 343,989176 1,902550056 +3,74 0,707162458 2,690400253 0,004190202 0,442272695 ENSG00000166183 ASPG 9,280892347 1,822287833 +3,54 0,623913918 2,920735986 0,001879571 0,341104542 ENSG00000155265 GOLGA7B 46,00078631 1,748758306 +3,36 0,613378323 2,851027235 0,002409854 0,383631891 ENSG00000237276 ANO7P1 10,65568115 1,746281106 +3,35 0,513963307 3,397676606 0,000298899 0,139087633 ENSG00000135407 AVIL 17,84666469 1,713922209 +3,28 0,609001451 2,814315474 0,002741183 0,401447831 ENSG00000179141 MTUS2-AS1 8,529948041 1,668515311 +3,18 0,627115577 2,660618509 0,004628988 0,464126368 ENSG00000159409 CELF3 69,68733182 1,567360839 +2,96 0,580574016 2,699674453 0,004061476 0,442272695 ENSG00000169429 IL8 12,26297792 1,562831308 +2,95 0,576099209 2,712781554 0,003885668 0,442272695 ENSG00000167244 IGF2 94,6937691 1,492297733 +2,81 0,514126667 2,902587688 0,002006193 0,346746603 ENSG00000188163 FAM166A 10,71884922 1,488822114 +2,81 0,489769296 3,039843712 0,001214725 0,291113859 ENSG00000171450 CDK5R2 30,57189439 1,412295231 +2,66 0,516008871 2,736959206 0,003579397 0,435965774 ENSG00000166866 MYO1A 12,06104842 1,39603582 +2,63 0,571759257 2,441649701 0,009357114 0,604316404 ENSG00000153531 ADPRHL1 (*) 129,2490234 1,370325398 +2,59 0,440244367 3,112647203 0,000923383 0,261836922 ENSG00000126562 WNK4 (*) 145,5674717 1,356574455 +2,56 0,484741185 2,79855415 0,0028958 0,40329605 ENSG00000182397 DNM1P46 32,24167353 1,346037811 +2,54 0,517606487 2,600504139 0,005643658 0,497764416 ENSG00000099365 STX1B 124,4719193 1,345866746 +2,54 0,412055117 3,26622991 0,000508289 0,204987378 ENSG00000246877 DNM1P35 (*) 37,66763561 1,340043372 +2,53 0,335101857 3,9989136 2,08E-05 0,019863547 ENSG00000108309 RUNDC3A 185,4069324 1,32100151 +2,50 0,521737223 2,53192882 0,007042873 0,542966054 217

Anhang ensembl hgnc_symbol baseMean log2FoldChange FCIngen lfcSE stat pvalue padj ENSG00000103723 AP3B2 (*) 331,1695275 1,319374437 +2,50 0,408438959 3,230285477 0,000585827 0,21616876 ENSG00000130477 UNC13A 845,3842527 1,304574069 +2,47 0,534111294 2,442513543 0,009332084 0,604316404 ENSG00000161544 CYGB 15,20175892 1,284466734 +2,44 0,488422141 2,629829047 0,005125979 0,474623816 ENSG00000128564 VGF 40,56467491 1,26829367 +2,41 0,411659139 3,080931651 0,001041273 0,284961727 ENSG00000144550 CPNE9 25,41355985 1,264560038 +2,40 0,51837797 2,439455592 0,009420958 0,606282081 ENSG00000140323 DISP2 260,9474931 1,260836931 +2,40 0,494113565 2,55171487 0,006610204 0,534510481 ENSG00000172780 RAB43 24,32184411 1,245246421 +2,37 0,480290788 2,592692702 0,005789288 0,49793362 ENSG00000174791 RIN1 15,32170572 1,227483079 +2,34 0,492515606 2,492272458 0,007987381 0,566230458 ENSG00000135127 CCDC64 235,0220533 1,224179228 +2,34 0,448112182 2,731858846 0,003642116 0,436964469 ENSG00000134668 SPOCD1 (*) 121,8061886 1,209830751 +2,31 0,428809772 2,82136936 0,00267446 0,401447831 ENSG00000049769 PPP1R3F 112,3414118 1,185241281 +2,27 0,401193552 2,954287965 0,001664618 0,330275557 ENSG00000028277 POU2F2 85,42546826 1,183699568 +2,27 0,386696455 3,061056166 0,001122096 0,290911288 ENSG00000102003 SYP 884,6573807 1,174173318 +2,26 0,434709589 2,70105226 0,004042661 0,442272695 ENSG00000185567 AHNAK2 (*) 612,7413002 1,118478515 +2,17 0,317719126 3,520337381 0,000179102 0,101573144 ENSG00000151322 NPAS3 93,59545856 1,086542618 +2,12 0,351277694 3,093115896 0,000994426 0,277643715 ENSG00000106688 SLC1A1 372,1920481 1,074092715 +2,11 0,406073976 2,645066612 0,00487429 0,469713591 ENSG00000182870 GALNT9 17,24112093 1,07120907 +2,10 0,442419263 2,421253232 0,009965769 0,623474883 ENSG00000006283 CACNA1G (*) 147,2733975 1,066809747 +2,09 0,42947367 2,483993368 0,008198325 0,571332947 ENSG00000205583 STAG3L1 53,91135818 1,047276663 +2,07 0,365313959 2,866785232 0,002279224 0,369383247 ENSG00000185010 F8 102,7340965 1,028358101 +2,04 0,379650721 2,708695241 0,003939722 0,442272695 ENSG00000169184 MN1 (*) 340,8105992 1,023846636 +2,03 0,261131795 3,920804197 3,01E-05 0,025966235 ENSG00000105641 SLC5A5 (*) 51,96944177 1,020596674 +2,03 0,392013295 2,603474647 0,005589152 0,497764416 ENSG00000183570 PCBP3 197,7635937 1,007487345 +2,01 0,405938258 2,481873351 0,008253136 0,571332947 ENSG00000197013 ZNF429 (*) 97,58574161 1,002543646 +2,00 0,380318666 2,636062165 0,005021636 0,472189884 ENSG00000145198 VWA5B2 (*) 84,97037428 0,992264225 +1,99 0,395856578 2,506625584 0,007633169 0,56311689 ENSG00000196972 LINC00087 145,5924111 0,98414623 +1,98 0,374184155 2,630111984 0,005121201 0,474623816 ENSG00000132718 SYT11 47,15968163 0,979437386 +1,97 0,348649959 2,809228455 0,002790242 0,401447831 ENSG00000197496 SLC2A10(*) 321,0325943 0,976405971 +1,97 0,323168143 3,021355885 0,001301165 0,295169348 ENSG00000162526 TSSK3 (*) 18,89887939 0,973844933 +1,96 0,368930479 2,639643482 0,004962557 0,472189884 ENSG00000198794 SCAMP5 1159,514834 0,961468639 +1,95 0,379935581 2,530609627 0,007072605 0,542966054 ENSG00000225449 RAB6C-AS1 98,30427208 0,937038673 +1,91 0,344403437 2,720758772 0,00378208 0,442272695 ENSG00000179399 GPC5 (*) 103,5752844 0,89046576 +1,85 0,329081785 2,705910202 0,003976953 0,442272695 ENSG00000149809 TM7SF2 610,6423888 0,810879517 +1,75 0,288771825 2,808028507 0,00280193 0,401447831 ENSG00000246339 EXTL3-AS1 46,3820286 0,791797287 +1,73 0,283645298 2,79150507 0,002967494 0,40329605 ENSG00000186648 LRRC16B (*) 396,3699871 0,762478341 +1,70 0,300390539 2,538290133 0,006901071 0,539830357 ENSG00000197380 DACT3 283,2206003 0,739383783 +1,67 0,259030362 2,854429019 0,002381088 0,382406886 ENSG00000136367 ZFHX2 300,1635709 0,724337149 +1,65 0,297711529 2,433016792 0,009610562 0,61629853 ENSG00000105939 ZC3HAV1 (*) 3342,834898 0,717619764 +1,64 0,235511784 3,047065205 0,001182426 0,291113859 ENSG00000144730 IL17RD (*) 949,6167478 0,705418546 +1,63 0,271397097 2,599211834 0,00566752 0,497764416 ENSG00000149591 TAGLN 241,4118526 0,697698754 +1,62 0,283572635 2,460388161 0,008827399 0,594335815 ENSG00000158286 RNF207 595,3465023 0,695648721 +1,62 0,282965386 2,458423386 0,008881656 0,594335815 ENSG00000099974 DDTL 123,1361146 0,69094096 +1,61 0,265635401 2,601087651 0,005632914 0,497764416 ENSG00000178764 ZHX2 1088,361146 0,673350697 +1,59 0,228750767 2,943599731 0,001730505 0,331701039 ENSG00000116985 BMP8B 698,3072341 0,673015759 +1,59 0,260169354 2,586837182 0,005900665 0,502747769 ENSG00000188176 SMTNL2 (*) 178,9657314 0,653748908 +1,57 0,214863627 3,042622513 0,001202201 0,291113859 ENSG00000085662 AKR1B1 12634,42263 0,64235272 +1,56 0,264958901 2,424348521 0,009871189 0,623474883 ENSG00000159842 ABR (*) 3022,962377 0,62165439 +1,54 0,250619102 2,480474893 0,008289472 0,571332947 ENSG00000271270 TMCC1-AS1 214,6594649 0,618790158 +1,54 0,249200569 2,4831009 0,008221359 0,571332947 ENSG00000160703 NLRX1 1104,066158 0,606661616 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Anhang ensembl hgnc_symbol baseMean log2FoldChange FCIngen lfcSE stat pvalue padj ENSG00000104231 ZFAND1 4497,099018 -0,545555371 -1,46 0,222780555 -2,448846447 0,009150405 0,599500201 ENSG00000213923 CSNK1E 27847,00355 -0,559464813 -1,47 0,21427981 -2,610907739 0,005454836 0,492670488 ENSG00000145348 TBCK 946,844704 -0,56116892 -1,48 0,190053331 -2,952691835 0,001674309 0,330275557 ENSG00000173705 SUSD5 3352,419805 -0,564518759 -1,48 0,157226896 -3,59047194 0,000132669 0,083023387 ENSG00000109466 KLHL2 (*) 854,0160582 -0,569230186 -1,48 0,19101044 -2,980099854 0,001514908 0,318124574 ENSG00000109332 UBE2D3 18092,03997 -0,571711018 -1,49 0,214252006 -2,668404506 0,004510427 0,454751232 ENSG00000109534 GAR1 (*) 2366,951336 -0,578454447 -1,49 0,215599992 -2,682998458 0,004295582 0,445464112 ENSG00000142731 PLK4 4255,382542 -0,584124849 -1,50 0,229857167 -2,541251401 0,00683594 0,539830357 ENSG00000164038 SLC9B2 (*) 1594,094396 -0,587929885 -1,50 0,181982323 -3,230697767 0,000584878 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(*) 1570,960754 -0,668602627 -1,59 0,211001071 -3,168716745 0,00074472 0,238135125 ENSG00000189007 ADAT2 4193,752237 -0,670060851 -1,59 0,250330173 -2,676708303 0,004387018 0,447278674 ENSG00000109445 ZNF330 2647,722877 -0,670074386 -1,59 0,232796082 -2,878374845 0,002187324 0,360868726 ENSG00000069482 GAL (*) 1344,041345 -0,683334025 -1,61 0,261705112 -2,611083976 0,005451687 0,492670488 ENSG00000145781 COMMD10 1075,144614 -0,690629123 -1,61 0,276764066 -2,49537136 0,007909683 0,565823254 ENSG00000071205 ARHGAP10 888,7877188 -0,694975483 -1,62 0,244728113 -2,83978605 0,002507191 0,391455096 ENSG00000109458 GAB1 1362,267822 -0,698498945 -1,62 0,220513727 -3,167598469 0,000747945 0,238135125 ENSG00000111727 HCFC2 904,1103816 -0,700686395 -1,63 0,253667785 -2,762220649 0,003283002 0,408081663 ENSG00000109576 AADAT (*) 1378,314437 -0,701847083 -1,63 0,132964816 -5,278442091 1,93E-08 3,90E-05 ENSG00000198856 OSTC (*) 6121,754142 -0,707396655 -1,63 0,252684357 -2,799526904 0,002886032 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(*) 1757,297626 -0,80484722 -1,75 0,279165164 -2,883050338 0,002151221 0,358168448 ENSG00000171517 LPAR3 1446,053832 -0,817662815 -1,76 0,295586172 -2,76624177 0,003237941 0,408081663 ENSG00000215712 TMEM242 (*) 2082,93513 -0,822643806 -1,77 0,214189019 -3,840737542 4,35E-05 0,031610441 ENSG00000172667 ZMAT3 2327,245394 -0,82688034 -1,77 0,306769628 -2,695443959 0,004119743 0,442272695 ENSG00000115289 PCGF1 1014,258063 -0,830403913 -1,78 0,323189755 -2,569400481 0,006243858 0,512730898 ENSG00000165929 TC2N 905,7727159 -0,83098769 -1,78 0,289872655 -2,866733638 0,002279641 0,369383247 ENSG00000123737 EXOSC9 (*) 5484,19777 -0,844402519 -1,80 0,178837522 -4,721618316 5,02E-07 0,000701458 ENSG00000272034 SNORD14A 199,5726988 -0,87614453 -1,84 0,34295991 -2,554655824 0,006547975 0,53288182 ENSG00000237149 ZNF503-AS2 1156,272583 -0,877199921 -1,84 0,360771693 -2,431454402 0,00965708 0,617101016 ENSG00000168556 ING2 (*) 1116,063864 -0,884689787 -1,85 0,313777196 -2,819484007 0,002692147 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Anhang ensembl hgnc_symbol baseMean log2FoldChange FCIngen lfcSE stat pvalue padj ENSG00000255717 SNHG1 15669,2354 -1,026237601 -2,04 0,387381264 -2,649166842 0,0048085 0,469164826 ENSG00000198467 TPM2 2415,876401 -1,03226888 -2,05 0,356717192 -2,893801881 0,002070264 0,354444736 ENSG00000239264 TXNDC5 90,13499339 -1,035419397 -2,05 0,410572394 -2,521892393 0,007271922 0,549878533 ENSG00000179988 PSTK (*) 969,1934803 -1,054764719 -2,08 0,237323322 -4,444420837 2,24E-06 0,002905624 ENSG00000180071 ANKRD18A 1117,884168 -1,058699773 -2,08 0,366780683 -2,886465458 0,002125197 0,357111726 ENSG00000134363 FST (*) 44,87398841 -1,086651234 -2,12 0,391405494 -2,776279973 0,003127899 0,405252546 ENSG00000204387 C6orf48 5054,423618 -1,088875576 -2,13 0,404168724 -2,694111425 0,004138253 0,442272695 ENSG00000249859 PVT1 975,5452149 -1,113653326 -2,16 0,410510462 -2,712850049 0,003884767 0,442272695 ENSG00000251022 THAP9-AS1 3703,65847 -1,118274114 -2,17 0,318926478 -3,50636962 0,000190012 0,104495336 ENSG00000177410 ZFAS1 (*) 5696,095009 -1,158531698 -2,23 0,37015336 -3,129869463 0,000864672 0,259582483 ENSG00000147606 SLC26A7 136,680586 -1,183215444 -2,27 0,433343556 -2,730432766 0,00365983 0,436964469 ENSG00000199753 SNORD104 110,4251248 -1,184130841 -2,27 0,456074147 -2,596355984 0,005720576 0,497764416 ENSG00000156218 ADAMTSL3 44,72569794 -1,197797837 -2,29 0,452483313 -2,647164665 0,004840525 0,469713591 ENSG00000154553 PDLIM3 604,7889417 -1,239493168 -2,36 0,363517398 -3,409721719 0,000284441 0,135843254 ENSG00000167513 CDT1 9160,017802 -1,264486058 -2,40 0,496191479 -2,548383256 0,006681341 0,536517604 ENSG00000233016 SNHG7 4502,482344 -1,280460684 -2,43 0,504197073 -2,539603565 0,006872115 0,539830357 ENSG00000212125 TAS2R15 16,942007 -1,305772379 -2,47 0,516154957 -2,529806914 0,007090751 0,542966054 ENSG00000269893 SNHG8 (*) 1678,191625 -1,31746326 -2,49 0,337160442 -3,9075262 3,20E-05 0,025966235 EPB41L4A-AS1 ENSG00000224032 (*) 3141,437974 -1,368504527 -2,58 0,394721088 -3,467016506 0,000224207 0,110125098 ENSG00000253537 PCDHGA7 61,74099496 -1,471038976 -2,77 0,587986429 -2,501824709 0,007750048 0,563434103 ENSG00000158711 ELK4 3928,884585 -1,523169793 -2,87 0,563719888 -2,701997618 0,004029798 0,442272695 ENSG00000132205 EMILIN2 142,0917575 -1,52972473 -2,89 0,551377685 -2,774368227 0,00314859 0,405252546 ENSG00000207031 SNORD59A 28,62039302 -1,658587437 -3,16 0,653206167 -2,539148466 0,006882136 0,539830357 ENSG00000125775 SDCBP2 132,8153723 -1,66015452 -3,16 0,61567616 -2,696473616 0,004105492 0,442272695 ENSG00000113657 DPYSL3 (*) 111,024223 -1,681951339 -3,21 0,557659934 -3,016087831 0,001326816 0,297272237 ENSG00000176928 GCNT4 13,30004501 -1,699791959 -3,25 0,689897727 -2,463831803 0,008733019 0,594335815 ENSG00000197181 PIWIL2 33,94314424 -1,711154192 -3,27 0,64718743 -2,643985516 0,004891771 0,469713591 ENSG00000140090 SLC24A4 122,5720777 -1,866896134 -3,65 0,670633168 -2,783781393 0,003047905 0,40329605 ENSG00000124253 PCK1 (*) 24,79622232 -1,892323553 -3,71 0,447338709 -4,230180656 6,72E-06 0,008132497 ENSG00000170324 FRMPD2 44,95752811 -2,01320853 -4,04 0,646698869 -3,113054044 0,000921955 0,261836922 ENSG00000205592 MUC19 109,0902598 -2,081176821 -4,23 0,685643027 -3,035364963 0,001235165 0,291113859 ENSG00000151224 MAT1A 109,7011138 -2,35275476 -5,11 0,80109735 -2,936914919 0,001772923 0,331701039 ENSG00000102287 GABRE (*) 48,74370892 -2,375287522 -5,19 0,803865009 -2,954833828 0,001661316 0,330275557 ENSG00000251164 HULC 14,91133272 -2,384124158 -5,22 0,971385173 -2,454355105 0,008994947 0,594335815 ENSG00000137601 NEK1 (*) 2489,171907 -2,451888353 -5,47 0,264142953 -9,282429548 2,22E-16 4,03E-12 ENSG00000146166 LGSN 38,01505208 -2,518017258 -5,73 0,978588768 -2,573110729 0,006169362 0,509262456 ENSG00000253953 PCDHGB4 14,37860468 -2,726079486 -6,62 1,008148178 -2,704046434 0,004002047 0,442272695 ENSG00000126752 SSX1 25,96245536 -2,74834143 -6,72 1,118668308 -2,456797434 0,00892678 0,594335815 ENSG00000164197 RNF180 (*) 14,93344679 -2,809167469 -7,01 0,803905019 -3,4944022 0,000199854 0,106675223 ENSG00000137440 FGFBP1 38,41781226 -2,874810767 -7,34 0,936301593 -3,070389698 0,001083445 0,284961727 ENSG00000122862 SRGN 33,99571166 -3,195588718 -9,16 0,778014807 -4,10736234 1,23E-05 0,013990218 ENSG00000100181 TPTEP1 104,2207571 -3,629771126 -12,38 1,44637853 -2,509558218 0,007562553 0,562480379 ENSG00000165584 SSX3 27,11998567 -3,633544657 -12,41 1,314932659 -2,763293338 0,003270926 0,408081663 ENSG00000001626 CFTR 25,85362649 -3,686962614 -12,88 1,094613763 -3,36827723 0,000337128 0,152954796 ENSG00000105929 ATP6V0A4 10,5801638 -4,444466791 -21,77 1,355021575 -3,279997066 0,000481212 0,19847802 ENSG00000235711 ANKRD34C 108,3827367 -5,339453683 -40,49 1,962042795 -2,721374731 0,003774187 0,442272695 ENSG00000128165 ADM2 (*) 117,901402 -6,146717171 -70,85 2,024215846 -3,036591767 0,001229535 0,291113859 (*) 70 überlappende Gene differentiell exprimiert mit p-Wert ˂ 0,01 sowohl unter Normal- als auch Hungermedium Gelb markiert: 11 Gene, die auch in Ciliengenliste aufgeführt sind. Weitere Informationen und Übersichten in Tab. C auf CD.

Tab. 18 RNA-Seq Daten der NEK1-CRISPR-Zelllinien - Filterung nach Ciliengenen Normalmedium Hungermedium HGNC FCIngen pvalue padj HGNC FCIngen pvalue padj CYGB +2,44 0,00513 0,47462 CRB3 +2,81 0,00680 0,60286 TSSK3 +1,96 0,00496 0,47219 HTR6 +2,72 0,00032 0,13430 IQCE +1,52 0,00500 0,47219 TSSK3 +2,53 0,00106 0,26704 UBE4A +1,36 0,00909 0,59740 AK7 +2,38 0,00915 0,63200 JADE1 -1,42 0,00568 0,49776 KIAA1107 +2,11 0,00169 0,34424 UBE2D3 -1,49 0,00451 0,45475 DISC1 +1,66 0,00983 0,63200 PLK4 -1,50 0,00684 0,53983 MAN2B2 +1,52 0,00008 0,06384 PRPF39 -1,51 0,00476 0,46670 CEP41 +1,47 0,00813 0,63200 PDE8A -1,52 0,00180 0,33414 CDC16 -1,25 0,00541 0,57954 ABCE1 -1,57 0,00045 0,18927 EIF2S2 -1,33 0,00085 0,23670 NEK1 -5,47 2,22E-16 4,03E-12 IFT52 -1,36 0,00118 0,27846 DPY30 -1,40 0,00537 0,57954 SMDT1 -1,46 0,00683 0,60286 DYNLT1 -1,49 0,00550 0,57954 PPID -1,56 0,00302 0,46766 TCEB2 -1,60 0,00624 0,59274 ABCE1 -1,64 0,00032 0,13430 TSGA10 -1,80 0,00847 0,63200 NEK1 -5,05 9,46E-19 1,72E-14 220

Anhang

13.13. Validierung der RNA-Seq Daten – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter beiden Nährbedingungen

Tab. 19 qPCR Ergebnisse – Validierung ausgewählter Gene der RNA-Seq Daten RNA-Seq qPCR (RQ-Werte) Genname Medium FCIngen CR2 CR5 CR8 MW CR2/5/8 MW CR2/5 H -1,6400 0,7505 0,4924 2,9630 1,0307 0,6079 p-Wert 0,0003 p-Wert 0,6674 0,0002 0,0013 0,5186 0,0209 Validierung nein ja nein nein ja ABCE1 N -1,5700 0,6214 0,6109 0,3834 0,5260 0,6161 p-Wert 0,0004 p-Wert 0,0002 0,0002 0,0002 0,0000 0,0001 Validierung ja ja ja ja ja H -1,4366 0,6281 0,6374 2,0138 0,9307 0,6327 p-Wert 0,0325 p-Wert 0,0317 0,0407 0,0003 0,5967 0,0071 Validierung ja ja nein nein ja ARHGAP10 N -1,6200 0,6821 0,6697 0,4116 0,5729 0,6759 p-Wert 0,0025 p-Wert 0,0002 0,0002 0,0011 0,0000 0,0001 Validierung ja ja ja ja ja H 1,4700 4,1333 1,0906 4,0886 2,6414 2,1231 p-Wert 0,0081 p-Wert 0,0002 0,5754 0,0011 0,0014 0,0137 Validierung ja nein ja ja ja CEP41 N 1,2987 1,3359 1,4156 0,8640 1,1778 1,3752 p-Wert 0,0560 p-Wert 0,0273 0,0061 0,0811 0,1283 0,0016 Validierung ja ja nein ja ja H -1,4900 0,6292 0,9178 4,8001 1,4048 0,7599 p-Wert 0,0055 p-Wert 0,0002 0,5842 0,0002 0,7407 0,1092 Validierung ja nein nein nein nein DYNLT1 N -1,1588 0,7769 0,9182 0,5530 0,7334 0,8446 p-Wert 0,2765 p-Wert 0,2733 0,6273 0,0002 0,0645 0,7029 Validierung ja ja nein ja ja H 1,4613 3,3757 0,9862 1,6559 1,7665 1,8246 p-Wert 0,0036 p-Wert 0,0060 0,8972 0,1200 0,0317 0,0665 Validierung ja nein nein ja nein FZD1 N 1,4622 1,3590 1,4284 1,1552 1,3089 1,3933 p-Wert 0,0019 p-Wert 0,0228 0,0177 0,2733 0,0042 0,0025 Validierung ja ja nein ja ja H -1,3557 1,3050 0,8879 1,7480 1,2652 1,0764 p-Wert 0,0012 p-Wert 0,5754 0,5754 0,0969 0,3811 0,9797 Validierung nein nein nein nein nein IFT52 N -1,1174 0,9515 1,0189 0,5444 0,8081 0,9846 p-Wert 0,2078 p-Wert 0,7369 0,7941 0,0002 0,0590 0,6655 Validierung ja ja nein ja ja H -5,0500 0,2346 0,1986 0,8194 0,3368 0,2159 p-Wert 0,0000 p-Wert 0,0002 0,0002 0,4565 0,0004 0,0001 Validierung ja ja nein ja ja NEK1 N -5,4700 0,2971 0,2420 0,1120 0,2004 0,2643 p-Wert 0,0000 p-Wert 0,0013 0,0002 0,0002 0,0000 0,0001 Validierung ja ja ja ja ja Die Validierung der RNA-Seq Daten erfolgte mittels qPCR, die genspezifischen TaqMan-Sonden sind unter 13.20.6 augfgelistet. Die entsprechenden graphische Auswertungen sind unter Abb. 71 und Abb. 72 zu finden. H=Hungermedium, N=Normalmedium, MW=Mittelwert CR2 = CRISPR 19 bp Deletion, CR5 = CRISPR 13 bp Deletion, CR8 = CRISPR 1 bp Deletion

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Abb. 71 Expression von ABCE1, ARHGAP10, CEP41, DYNLT1 in NEK1-CRISPR-Zelllinien Eine Analyse der relativen Expression von ABCE1, ARHGAP10, CEP41, DYNLT1 in NEK1-CRISPR-Zelllinien (CR2/5/8) und entsprechender Kontrollen (NT2/3/4, CR6wt, CR9wt) unter beiden Nährbedingungen erfolgte mittels TaqMan-Sonden in qPCR Experimenten zur Validierung der RNA-Seq Daten. Einzelne RQ-Werte sind unter Tab. 19 aufgeführt.

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Abb. 72 Expression von FZD1, IFT52 und NEK1 in NEK1-CRISPR-Zelllinien Eine Analyse der relativen Expression von FZD1, IFT52 und NEK1 in NEK1-CRISPR-Zelllinien (CR2/5/8) und entsprechender Kontrollen (NT2/3/4, CR6wt, CR9wt) unter beiden Nährbedingungen erfolgte mittels TaqMan- Sonden in qPCR Experimenten zur Validierung der RNA-Seq Daten. Einzelne RQ-Werte sind unter Tab. 19 aufgeführt.

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13.14. Hauptnetzwerke der Ingenuity Pathway Analyse – RNA-Seq Daten NEK1-CRISPR-Zelllinien unter beiden Nährbedingungen

Abb. 73 Ingenuity Pathway Analyse – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium RNA-Seq Daten mit p<0,01 ergeben 229 differentiell exprimierte Gene, die von Ingenuity Pathway Analsyis in 15 Hauptnetzwerke eingeordnet werden. Die graphischen Abbildungen der einzelnen Netzwerke sind in Abb. I-XV auf CD zu finden.

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Anhang

Abb. 74 Ingenuity Pathway Analyse – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium RNA-Seq Daten mit p<0,01 ergeben 257 differentiell exprimierte Gene, die von Ingenuity Pathway Analsyis in 18 Hauptnetzwerke eingeordnet werden. Die graphischen Abbildungen der einzelnen Netzwerke sind in Abb. XVI-XXXIII auf CD zu finden.

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Abb. 75 Ingenuity Pathway Analyse mit Filterung gegen Ciliengenliste – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Normalmedium RNA-Seq Daten mit p<0,01 ergeben 11 differentiell exprimierte Gene, die von Ingenuity Pathway Analsyis in 1 Hauptnetzwerk eingeordnet werden. Die graphische Abbildung dieses Netzwerkes ist in Abb. XXXIV auf CD zu finden.

Abb. 76 Ingenuity Pathway Analyse mit Filterung gegen Ciliengenliste – NEK1-CRISPR-Zelllinien unter Hungermedium RNA-Seq Daten mit p<0,01 ergeben 19 differentiell exprimierte Gene, die von Ingenuity Pathway Analsyis in 4 Hauptnetzwerke eingeordnet werden. Die graphischen Abbildungen der einzelnen Netzwerke sind in Abb. XXXV-XXXVIII auf CD zu finden.

226

Anhang

13.15. Genliste cilien-assoziierte Gene (Kurzversion) Tab. 20 Genliste bekannter und potentieller Ciliengene Cilien-Evidenz Cilien-Evidenz Genname HGNC ID OMIM ID Genname HGNC ID OMIM ID (Cildb V3) (Cildb V3) ABCB10 HGNC:41 2 605454 BBS1 HGNC:966 9 209901 ABCE1 HGNC:69 2 601213 BBS10 HGNC:26291 1 610148 ACACA HGNC:84 0 200350 BBS12 HGNC:26648 0 610683 ACSBG1 HGNC:29567 3 614362 BBS2 HGNC:967 7 606151 ACTG1 HGNC:144 10 102560 BBS4 HGNC:969 8 600374 ACYP1 HGNC:179 2 600875 BBS5 HGNC:970 10 603650 ADAM15 HGNC:193 0 605548 BBS7 HGNC:18758 10 607590 ADAMTS10 HGNC:13201 0 608990 BBS9 HGNC:30000 8 607968 ADAMTS8 HGNC:224 1 605175 BCO2 HGNC:18503 2 611740 ADCK5 HGNC:21738 0 BEST4 HGNC:17106 6 607336 ADCY3 HGNC:234 2 600291 BPHL HGNC:1094 3 603156 ADGB HGNC:21212 2 614630 BTF3 HGNC:1125 2 602542 ADGRA2 HGNC:17849 0 606823 C10orf107 HGNC:28678 5 ADGRV1 HGNC:17416 0 602851 C10orf88 HGNC:25822 0 ADH6 HGNC:255 2 103735 C11orf16 HGNC:1169 4 ADORA2A HGNC:263 0 102776 C11orf65 HGNC:28519 2 ADPGK HGNC:25250 1 611861 C11orf70 HGNC:28188 8 ADRB2 HGNC:286 1 109690 C11orf74 HGNC:25142 3 ADRBK1 HGNC:289 1 109635 C11orf88 HGNC:25061 4 AGBL2 HGNC:26296 4 C12orf65 HGNC:26784 0 613541 AGR3 HGNC:24167 4 609482 C14orf142 HGNC:20356 2 AHI1 HGNC:21575 1 608894 C14orf79 HGNC:20126 2 AIPL1 HGNC:359 3 604392 C16orf46 HGNC:26525 3 AK1 HGNC:361 6 103000 C16orf71 HGNC:25081 1 AK5 HGNC:365 3 608009 C19orf44 HGNC:26141 0 AK7 HGNC:20091 9 615364 C1orf158 HGNC:28567 5 AK8 HGNC:26526 10 615365 C1orf87 HGNC:28547 5 AKAP14 HGNC:24061 3 300462 C20orf85 HGNC:16216 3 ALDH18A1 HGNC:9722 3 138250 C21orf2 HGNC:1260 1 603191 ALDH1A3 HGNC:409 1 600463 C21orf58 HGNC:1300 4 ALDOA HGNC:414 4 103850 C21orf59 HGNC:1301 10 615494 ALMS1 HGNC:428 6 606844 C2CD3 HGNC:24564 3 615944 ANAPC4 HGNC:19990 0 606947 C2orf40 HGNC:24642 5 611752 ANAPC5 HGNC:15713 0 606948 C2orf42 HGNC:26056 1 ANKH HGNC:15492 1 605145 C2orf44 HGNC:26157 0 616234 ANKRD26 HGNC:29186 3 610855 C2orf71 HGNC:34383 0 613425 ANKRD42 HGNC:26752 1 C2orf73 HGNC:26861 3 ANKRD45 HGNC:24786 2 C4orf22 HGNC:28554 10 ANP32E HGNC:16673 4 609611 C5orf42 HGNC:25801 1 614571 AOC2 HGNC:549 0 602268 C5orf49 HGNC:27028 4 AP1M2 HGNC:558 0 607309 C6 HGNC:1339 1 217050 AP2B1 HGNC:563 5 601025 C6orf118 HGNC:21233 3 APOBEC4 HGNC:32152 3 609908 C7orf31 HGNC:21722 0 616071 ARF4 HGNC:655 5 601177 C7orf57 HGNC:22247 5 ARF6 HGNC:659 2 600464 C8orf37 HGNC:27232 4 614477 ARFGEF1 HGNC:15772 3 604141 C9orf116 HGNC:28435 5 614502 ARHGAP18 HGNC:21035 3 613351 C9orf135 HGNC:31422 6 ARHGAP5 HGNC:675 3 602680 C9orf24 HGNC:19919 4 ARL13B HGNC:25419 6 608922 C9orf9 HGNC:1367 4 ARL3 HGNC:694 10 604695 CA4 HGNC:1375 3 114760 ARL6 HGNC:13210 10 608845 CALM1 HGNC:1442 10 114180 ARMC2 HGNC:23045 2 CAL ml4 HGNC:18445 4 ARMC3 HGNC:30964 4 611226 CALU HGNC:1458 2 603420 ARMC4 HGNC:25583 7 615408 CAMK2D HGNC:1462 3 607708 ARPC3 HGNC:706 3 604225 CAPN2 HGNC:1479 9 114230 ARRB2 HGNC:712 0 107941 CAPS HGNC:1487 8 114212 ARVCF HGNC:728 3 602269 CAPSL HGNC:28375 10 ASAP1 HGNC:2720 1 605953 CASC1 HGNC:29599 8 ASB6 HGNC:17181 0 615051 CAT HGNC:1516 4 115500 ASNA1 HGNC:752 3 601913 CBX5 HGNC:1555 0 604478 ASXL2 HGNC:23805 0 612991 CBY1 HGNC:1307 1 607757 ATAT1 HGNC:21186 3 615556 CC2D2A HGNC:29253 10 612013 ATF3 HGNC:785 1 603148 CCDC103 HGNC:32700 1 614677 ATG101 HGNC:25679 1 615089 CCDC108 HGNC:25325 8 614270 ATMIN HGNC:29034 2 614693 CCDC113 HGNC:25002 10 616070 ATP12A HGNC:13816 3 182360 CCDC114 HGNC:26560 10 615038 ATP1A1 HGNC:799 6 182310 CCDC121 HGNC:25833 0 ATP2B2 HGNC:815 8 108733 CCDC146 HGNC:29296 10 ATP6V0D2 HGNC:18266 0 CCDC151 HGNC:28303 10 615956 ATP9B HGNC:13541 1 614446 CCDC17 HGNC:26574 4 ATXN10 HGNC:10549 2 611150 CCDC170 HGNC:21177 4 AZIN2 HGNC:29957 0 608353 CCDC173 HGNC:25064 7 B3GNT7 HGNC:18811 1 615313 CCDC180 HGNC:29303 3 B3GNT8 HGNC:24139 1 615357 CCDC181 HGNC:28051 4 B4GALT1 HGNC:924 0 137060 CCDC191 HGNC:29272 0 B9D1 HGNC:24123 10 614144 CCDC24 HGNC:28688 1 B9D2 HGNC:28636 10 611951 CCDC28B HGNC:28163 0 610162 BBOF1 HGNC:19855 9 CCDC39 HGNC:25244 10 613798 227

Anhang

Cilien-Evidenz Cilien-Evidenz Genname HGNC ID OMIM ID Genname HGNC ID OMIM ID (Cildb V3) (Cildb V3)

CCDC40 HGNC:26090 10 613799 CLRN1 HGNC:12605 0 606397 CCDC47 HGNC:24856 2 CLUAP1 HGNC:19009 10 CCDC60 HGNC:28610 4 CNGA2 HGNC:2149 2 300338 CCDC63 HGNC:26669 9 CNGA4 HGNC:2152 4 609472 CCDC65 HGNC:29937 10 611088 CNGB1 HGNC:2151 2 600724 CCDC74A HGNC:25197 0 CNN3 HGNC:2157 2 602374 CCDC74B HGNC:25267 3 CNP HGNC:2158 2 123830 CCDC78 HGNC:14153 5 614666 COG4 HGNC:18620 2 606976 CCDC81 HGNC:26281 4 COMT HGNC:2228 3 116790 CCDC96 HGNC:26900 4 COPB2 HGNC:2232 3 606990 CCNA1 HGNC:1577 4 604036 CRB1 HGNC:2343 0 604210 CCNO HGNC:18576 3 607752 CRB3 HGNC:20237 0 609737 CCP110 HGNC:24342 5 609544 CRHR2 HGNC:2358 0 602034 CCR1 HGNC:1602 0 601159 CROCC HGNC:21299 8 615776 CCT4 HGNC:1617 6 605142 CRX HGNC:2383 0 602225 CCT5 HGNC:1618 10 610150 CSE1L HGNC:2431 5 601342 CCT6A HGNC:1620 4 104613 CSNK1G1 HGNC:2454 2 606274 CCT6B HGNC:1621 2 610730 CSPP1 HGNC:26193 7 611654 CCT8 HGNC:1623 5 CSTF3 HGNC:2485 3 600367 CD160 HGNC:17013 0 604463 CTDSP1 HGNC:21614 1 605323 CD1D HGNC:1637 0 188410 CTNNB1 HGNC:2514 5 116806 CDC16 HGNC:1720 1 603461 CUL2 HGNC:2552 4 603135 CDC20 HGNC:1723 1 603618 CUL4A HGNC:2554 1 603137 CDC23 HGNC:1724 2 603462 CYB5D1 HGNC:26516 10 CDC27 HGNC:1728 1 116946 CYB5D2 HGNC:28471 2 CDC73 HGNC:16783 1 607393 CYGB HGNC:16505 1 608759 CDH23 HGNC:13733 2 605516 CYP17A1 HGNC:2593 0 609300 CDHR3 HGNC:26308 4 615610 CYS1 HGNC:18525 0 CDK1 HGNC:1722 8 116940 DAAM1 HGNC:18142 0 606626 CDS1 HGNC:1800 4 603548 DACH1 HGNC:2663 0 603803 CELSR2 HGNC:3231 3 604265 DAPK1 HGNC:2674 2 600831 CELSR3 HGNC:3230 3 604264 DAW1 HGNC:26383 4 CENPJ HGNC:17272 4 609279 DBF4B HGNC:17883 0 611661 CEP104 HGNC:24866 8 DCDC2 HGNC:18141 4 605755 CEP120 HGNC:26690 5 613446 DCTN2 HGNC:2712 5 607376 CEP126 HGNC:29264 0 614634 DDB1 HGNC:2717 4 600045 CEP131 HGNC:29511 6 613479 DFNB31 HGNC:16361 1 607928 CEP135 HGNC:29086 9 611423 DHX30 HGNC:16716 2 616423 CEP152 HGNC:29298 3 613529 DIAPH1 HGNC:2876 3 602121 CEP162 HGNC:21107 2 610201 DISC1 HGNC:2888 1 605210 CEP164 HGNC:29182 5 614848 DLEC1 HGNC:2899 3 604050 CEP19 HGNC:28209 4 615586 DMRT2 HGNC:2935 1 604935 CEP250 HGNC:1859 6 609689 DNAAF1 HGNC:30539 9 613190 CEP290 HGNC:29021 5 610142 DNAAF2 HGNC:20188 1 612517 CEP41 HGNC:12370 9 610523 DNAAF3 HGNC:30492 4 614566 CEP72 HGNC:25547 3 616475 DNAAF5 HGNC:26013 1 614864 CEP83 HGNC:17966 6 615847 DNAH1 HGNC:2940 10 603332 CEP89 HGNC:25907 4 615470 DNAH10 HGNC:2941 8 605884 CEP97 HGNC:26244 7 615864 DNAH11 HGNC:2942 10 603339 CETN2 HGNC:1867 10 300006 DNAH12 HGNC:2943 4 603340 CFAP100 HGNC:26842 10 DNAH2 HGNC:2948 10 603333 CFAP126 HGNC:32325 0 616119 DNAH3 HGNC:2949 10 603334 CFAP157 HGNC:27843 0 DNAH5 HGNC:2950 10 603335 CFAP161 HGNC:26782 0 DNAH6 HGNC:2951 8 603336 CFAP20 HGNC:29523 0 DNAH7 HGNC:18661 10 610061 CFAP206 HGNC:21405 9 DNAH9 HGNC:2953 10 603330 CFAP221 HGNC:33720 0 DNAI1 HGNC:2954 10 604366 CFAP36 HGNC:30540 7 DNAI2 HGNC:18744 10 605483 CFAP43 HGNC:26684 0 DNAJA2 HGNC:14884 6 611322 CFAP44 HGNC:25631 0 DNAJA4 HGNC:14885 9 CFAP45 HGNC:17229 10 605152 DNAJB13 HGNC:30718 10 610263 CFAP52 HGNC:16053 0 609804 DNAJC9 HGNC:19123 0 611206 CFAP53 HGNC:26530 9 614759 DNAL1 HGNC:23247 10 610062 CFAP58 HGNC:26676 10 DNAL4 HGNC:2955 7 610565 CFAP61 HGNC:15872 0 DNALI1 HGNC:14353 10 602135 CFAP69 HGNC:26107 0 DNM1L HGNC:2973 6 603850 CFAP70 HGNC:30726 10 DNM2 HGNC:2974 7 602378 CFAP74 HGNC:29368 0 DPCD HGNC:24542 2 616467 CFAP77 HGNC:33776 0 DPH1 HGNC:3003 0 603527 CHCHD6 HGNC:28184 3 615634 DPY30 HGNC:24590 5 612032 CHD4 HGNC:1919 2 603277 DPYSL2 HGNC:3014 1 602463 CHMP4B HGNC:16171 2 610897 DRC1 HGNC:24245 10 615288 CHP1 HGNC:17433 4 606988 DRC3 HGNC:25384 10 CHST11 HGNC:17422 0 610128 DRC7 HGNC:25289 10 CHST5 HGNC:1973 2 604817 DRD1 HGNC:3020 0 126449 CHST9 HGNC:19898 2 610191 DRD2 HGNC:3023 0 126450 CLDN2 HGNC:2041 1 300520 DRD4 HGNC:3025 0 126452 CLEC3B HGNC:11891 0 187520 DRD5 HGNC:3026 0 126453 CLGN HGNC:2060 4 601858 DRG1 HGNC:3029 3 603952 CLHC1 HGNC:26453 0 DRG2 HGNC:3030 1 602986 CLIC6 HGNC:2065 5 615321 DUSP14 HGNC:17007 0 606618

228

Anhang

Cilien-Evidenz Cilien-Evidenz Genname HGNC ID OMIM ID Genname HGNC ID OMIM ID (Cildb V3) (Cildb V3)

DUSP23 HGNC:21480 1 FOXJ1 HGNC:3816 5 602291 DVL1 HGNC:3084 2 601365 FSD1L HGNC:13753 4 609829 DYDC1 HGNC:23460 5 615154 FUZ HGNC:26219 0 610622 DYDC2 HGNC:23468 6 G2E3 HGNC:20338 1 611299 DYNC1H1 HGNC:2961 9 600112 G3BP1 HGNC:30292 4 608431 DYNC2H1 HGNC:2962 10 603297 GALNT6 HGNC:4128 0 605148 DYNC2LI1 HGNC:24595 10 GALR2 HGNC:4133 1 603691 DYNLL1 HGNC:15476 10 601562 GART HGNC:4163 3 138440 DYNLL2 HGNC:24596 10 608942 GAS8 HGNC:4166 10 605178 DYNLRB2 HGNC:15467 10 607168 GBF1 HGNC:4181 3 603698 DYNLT1 HGNC:11697 9 601554 GDF5 HGNC:4220 0 601146 DYX1C1 HGNC:21493 3 608706 GFPT1 HGNC:4241 0 138292 DZANK1 HGNC:15858 3 GK HGNC:4289 0 300474 DZIP1 HGNC:20908 1 608671 GLB1L HGNC:28129 4 DZIP1L HGNC:26551 4 GLB1L2 HGNC:25129 5 DZIP3 HGNC:30938 3 608672 GLG1 HGNC:4316 8 600753 EDC4 HGNC:17157 4 606030 GLI1 HGNC:4317 0 165220 EEF1D HGNC:3211 4 130592 GLI2 HGNC:4318 1 165230 EFCAB1 HGNC:25678 5 GLI3 HGNC:4319 0 165240 EFCAB12 HGNC:28061 4 GLIPR2 HGNC:18007 1 607141 EFCAB5 HGNC:24801 0 GLIS2 HGNC:29450 0 608539 EFCAB6 HGNC:24204 6 GLIS3 HGNC:28510 2 610192 EFCAB7 HGNC:29379 4 GMPPB HGNC:22932 3 615320 EFHB HGNC:26330 9 GMPR HGNC:4376 2 139265 EFHC1 HGNC:16406 10 608815 GNAS HGNC:4392 2 139320 EFHC2 HGNC:26233 10 300817 GNRHR HGNC:4421 1 138850 EID3 HGNC:32961 0 612986 GPAM HGNC:24865 3 602395 EIF2S2 HGNC:3266 2 603908 GPATCH2L HGNC:20210 0 EIF3B HGNC:3280 3 603917 GPBAR1 HGNC:19680 0 610147 EIF3L HGNC:18138 5 GPR119 HGNC:19060 0 300513 EIF4G1 HGNC:3296 4 600495 GPR161 HGNC:23694 0 612250 EIF4H HGNC:12741 2 603431 GPR173 HGNC:18186 0 300253 EIF5A HGNC:3300 6 600187 GPR20 HGNC:4475 0 601908 EIF5B HGNC:30793 2 606086 GPR63 HGNC:13302 0 606915 ELOVL4 HGNC:14415 0 605512 GPR84 HGNC:4535 0 606383 ELP4 HGNC:1171 0 606985 GPT2 HGNC:18062 1 138210 ENKD1 HGNC:25246 3 GSK3B HGNC:4617 3 605004 ENKUR HGNC:28388 10 611025 GSTA1 HGNC:4626 2 138359 EPB41L2 HGNC:3379 2 603237 GUCY1A2 HGNC:4684 1 601244 EPS15L1 HGNC:24634 1 GUCY2D HGNC:4689 1 600179 ERBB2IP HGNC:15842 2 606944 H1FOO HGNC:18463 0 ERICH3 HGNC:25346 5 HADH HGNC:4799 4 601609 ERICH5 HGNC:26823 0 HAP1 HGNC:4812 2 600947 ESRRG HGNC:3474 3 602969 HARS HGNC:4816 4 142810 ETFB HGNC:3482 3 130410 HAUS6 HGNC:25948 3 613433 EVC HGNC:3497 0 604831 HELQ HGNC:18536 2 606769 EVC2 HGNC:19747 1 607261 HERC3 HGNC:4876 1 605200 EXOC3 HGNC:30378 1 608186 HIST1H2BD HGNC:4747 8 602799 EXOC3L4 HGNC:20120 1 HIST1H4I HGNC:4793 0 602833 EXOC4 HGNC:30389 1 608185 HKDC1 HGNC:23302 2 EXOC5 HGNC:10696 1 604469 HNF1B HGNC:11630 0 189907 EXOC6 HGNC:23196 3 609672 HNRNPK HGNC:5044 2 600712 EXOC6B HGNC:17085 2 607880 HRASLS2 HGNC:17824 2 613866 EXTL2 HGNC:3516 2 602411 HSP90AA1 HGNC:5253 10 140571 EYA1 HGNC:3519 2 601653 HSPA1A HGNC:5232 10 140550 FAIM HGNC:18703 5 HSPA4 HGNC:5237 4 601113 FAM114A2 HGNC:1333 3 HSPA8 HGNC:5241 10 600816 FAM161A HGNC:25808 5 613596 HSPB1 HGNC:5246 2 602195 FAM179A HGNC:33715 3 HSPB11 HGNC:25019 9 FAM188B HGNC:21916 3 HSPH1 HGNC:16969 6 610703 FAM200A HGNC:25401 0 HTR1B HGNC:5287 1 182131 FAM216B HGNC:26883 6 HTR1D HGNC:5289 1 182133 FAM49B HGNC:25216 4 HTR6 HGNC:5301 0 601109 FAM81B HGNC:26335 3 HTT HGNC:4851 3 613004 FAM89B HGNC:16708 0 616128 HUWE1 HGNC:30892 2 300697 FANK1 HGNC:23527 5 611640 HYDIN HGNC:19368 10 610812 FBF1 HGNC:24674 1 HYLS1 HGNC:26558 2 610693 FBLN2 HGNC:3601 2 135821 ICA1L HGNC:14442 4 FBXL13 HGNC:21658 5 609080 IDE HGNC:5381 3 146680 FBXL2 HGNC:13598 4 605652 IDH1 HGNC:5382 3 147700 FBXO11 HGNC:13590 2 607871 IFIT1 HGNC:5407 2 147690 FBXO15 HGNC:13617 3 609093 IFIT3 HGNC:5411 2 604650 FBXO16 HGNC:13618 1 608519 IFT122 HGNC:13556 10 606045 FBXO34 HGNC:20201 0 609104 IFT140 HGNC:29077 10 614620 FBXO47 HGNC:31969 0 609498 IFT172 HGNC:30391 10 607386 FBXW7 HGNC:16712 1 606278 IFT20 HGNC:30989 10 614394 FHAD1 HGNC:29408 2 IFT22 HGNC:21895 10 FLII HGNC:3750 2 600362 IFT27 HGNC:18626 10 615870 FLNA HGNC:3754 1 300017 IFT43 HGNC:29669 4 614068 FOPNL HGNC:26435 8 IFT46 HGNC:26146 10 FOXC1 HGNC:3800 0 601090 IFT52 HGNC:15901 10

229

Anhang

Cilien-Evidenz Cilien-Evidenz Genname HGNC ID OMIM ID Genname HGNC ID OMIM ID (Cildb V3) (Cildb V3)

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230

Anhang

Cilien-Evidenz Cilien-Evidenz Genname HGNC ID OMIM ID Genname HGNC ID OMIM ID (Cildb V3) (Cildb V3)

OPN1MW HGNC:4206 1 300821 PTCH1 HGNC:9585 1 601309 OPN1SW HGNC:1012 1 613522 PTGES3 HGNC:16049 9 607061 OPRL1 HGNC:8155 0 602548 PTPDC1 HGNC:30184 1 OR2Z1 HGNC:15391 0 PTPN13 HGNC:9646 3 600267 OR51M1 HGNC:14847 0 PTPRQ HGNC:9679 0 603317 ORC1 HGNC:8487 0 601902 PTPRT HGNC:9682 2 608712 OSBPL3 HGNC:16370 4 606732 QSER1 HGNC:26154 0 OSCP1 HGNC:29971 10 608854 RAB10 HGNC:9759 6 612672 P2RY14 HGNC:16442 0 610116 RAB11A HGNC:9760 3 605570 PA2G4 HGNC:8550 4 602145 RAB11B HGNC:9761 6 604198 PACRG HGNC:19152 10 608427 RAB11FIP3 HGNC:17224 3 608738 PACRGL HGNC:28442 3 RAB17 HGNC:16523 1 602206 PAFAH1B1 HGNC:8574 7 601545 RAB23 HGNC:14263 7 606144 PAK2 HGNC:8591 4 605022 RAB36 HGNC:9775 4 605662 PARD3 HGNC:16051 0 606745 RAB3IL1 HGNC:9780 0 PARD6A HGNC:15943 2 607484 RAB3IP HGNC:16508 1 608686 PCDH15 HGNC:14674 1 605514 RAB8A HGNC:7007 4 165040 PCM1 HGNC:8727 5 600299 RABL2A HGNC:9799 6 605412 PCMTD2 HGNC:15882 1 RABL2B HGNC:9800 8 605413 PCNT HGNC:16068 5 605925 RABL6 HGNC:24703 2 610615 PDE6A HGNC:8785 3 180071 RAN HGNC:9846 10 601179 PDE6B HGNC:8786 4 180072 RANBP1 HGNC:9847 6 601180 PDE6D HGNC:8788 1 602676 RANGAP1 HGNC:9854 2 602362 PDE8A HGNC:8793 3 602972 RAPSN HGNC:9863 2 601592 PDGFRA HGNC:8803 1 173490 RASA3 HGNC:20331 0 605182 PDIA3 HGNC:4606 6 602046 RBAK HGNC:17680 0 608191 PDZD7 HGNC:26257 0 612971 RBKS HGNC:30325 4 611132 PECR HGNC:18281 1 605843 RBX1 HGNC:9928 1 603814 PFN2 HGNC:8882 4 176590 RCAN3 HGNC:3042 3 605860 PHB HGNC:8912 8 176705 RDH12 HGNC:19977 1 608830 PHC1 HGNC:3182 1 602978 RFX2 HGNC:9983 10 142765 PIAS1 HGNC:2752 0 603566 RFX3 HGNC:9984 9 601337 PIBF1 HGNC:23352 4 607532 RGS22 HGNC:24499 3 615650 PIFO HGNC:27009 6 614234 RIBC1 HGNC:26537 10 PIH1D2 HGNC:25210 4 RIBC2 HGNC:13241 10 PIH1D3 HGNC:28570 7 300933 RILPL1 HGNC:26814 0 614092 PIN1 HGNC:8988 4 601052 RILPL2 HGNC:28787 1 614093 PKD1 HGNC:9008 0 601313 RMDN3 HGNC:25550 2 611873 PKD1L1 HGNC:18053 0 609721 ROPN1L HGNC:24060 10 611756 PKD1L3 HGNC:21716 0 607895 RP1 HGNC:10263 2 603937 PKD2 HGNC:9009 1 173910 RP2 HGNC:10274 4 300757 PKD2L1 HGNC:9011 1 604532 RPE65 HGNC:10294 1 180069 PKHD1 HGNC:9016 0 606702 RPGR HGNC:10295 6 312610 PLCH1 HGNC:29185 4 612835 RPGRIP1 HGNC:13436 2 605446 PLEKHA8 HGNC:30037 0 608639 RPGRIP1L HGNC:29168 4 610937 PLEKHB1 HGNC:19079 5 607651 RPL12 HGNC:10302 7 180475 PLK1 HGNC:9077 5 602098 RPL18 HGNC:10310 5 604179 PLK4 HGNC:11397 6 605031 RPL21 HGNC:10313 4 603636 PMP2 HGNC:9117 2 170715 RPL22 HGNC:10315 1 180474 PNPO HGNC:30260 1 603287 RPL4 HGNC:10353 7 180479 POC1A HGNC:24488 9 614783 RPL7 HGNC:10363 7 604166 POC1B HGNC:30836 7 614784 RPL9 HGNC:10369 6 603686 POMK HGNC:26267 0 615247 RPLP2 HGNC:10377 3 180530 PPID HGNC:9257 2 601753 RPS12 HGNC:10385 1 603660 PPIL6 HGNC:21557 5 RPS14 HGNC:10387 6 130620 PPP1CC HGNC:9283 8 176914 RPSA HGNC:6502 8 150370 PPP1R16A HGNC:14941 3 609172 RSPH1 HGNC:12371 8 609314 PPP1R32 HGNC:28869 4 RSPH14 HGNC:13437 0 605663 PPP1R36 HGNC:20097 3 RSPH3 HGNC:21054 10 615876 PPP2CA HGNC:9299 7 176915 RSPH4A HGNC:21558 10 612647 PPP2R1A HGNC:9302 7 605983 RSPH9 HGNC:21057 10 612648 PPP2R1B HGNC:9303 4 603113 RSRC2 HGNC:30559 0 PRDX3 HGNC:9354 8 604769 RTTN HGNC:18654 3 610436 PRDX4 HGNC:17169 8 300927 RUVBL1 HGNC:10474 5 603449 PRDX5 HGNC:9355 3 606583 RUVBL2 HGNC:10475 8 604788 PRMT5 HGNC:10894 2 604045 SARS HGNC:10537 5 607529 PROM1 HGNC:9454 8 604365 SASS6 HGNC:25403 6 609321 PRPF19 HGNC:17896 2 608330 SAXO2 HGNC:33727 4 PRPF3 HGNC:17348 1 607301 SCGB2A1 HGNC:7051 2 604398 PRPF31 HGNC:15446 0 606419 SCLT1 HGNC:26406 2 611399 PRPF38A HGNC:25930 0 SDCCAG8 HGNC:10671 5 613524 PRPF39 HGNC:20314 3 614907 SEC23A HGNC:10701 3 610511 PRPF4B HGNC:17346 1 602338 SEC23B HGNC:10702 3 610512 PRPF6 HGNC:15860 1 613979 SEC24B HGNC:10704 3 607184 PRPF8 HGNC:17340 4 607300 SEPT2 HGNC:7729 6 601506 PRUNE2 HGNC:25209 2 610691 SEPT7 HGNC:1717 5 603151 PSCA HGNC:9500 2 602470 SEPT9 HGNC:7323 4 604061 PSMB5 HGNC:9542 3 600306 SERBP1 HGNC:17860 2 607378 PSMC1 HGNC:9547 2 602706 SERPINI2 HGNC:8945 4 605587 PSMD5 HGNC:9563 2 604452 SFI1 HGNC:29064 3 612765 PSPH HGNC:9577 4 172480 SFXN1 HGNC:16085 0 615569

231

Anhang

Cilien-Evidenz Cilien-Evidenz Genname HGNC ID OMIM ID Genname HGNC ID OMIM ID (Cildb V3) (Cildb V3)

SHH HGNC:10848 0 600725 TGFBI HGNC:11771 2 601692 SIMC1 HGNC:24779 0 TH HGNC:11782 3 191290 SLC12A5 HGNC:13818 2 606726 TLR5 HGNC:11851 1 603031 SLC17A8 HGNC:20151 2 607557 TM2D1 HGNC:24142 0 610080 SLC22A4 HGNC:10968 3 604190 TMEM107 HGNC:28128 2 616183 SLC23A1 HGNC:10974 4 603790 TMEM138 HGNC:26944 2 614459 SLC27A2 HGNC:10996 5 603247 TMEM17 HGNC:26623 2 614950 138140|1430 SLC2A1 HGNC:11005 2 90 TMEM190 HGNC:29632 3 SLC2A2 HGNC:11006 0 138160 TMEM2 HGNC:11869 2 605835 SLC30A1 HGNC:11012 3 609521 TMEM216 HGNC:25018 2 613277 SLC47A2 HGNC:26439 0 609833 TMEM231 HGNC:37234 9 614949 SLC4A8 HGNC:11034 4 605024 TMEM237 HGNC:14432 1 614423 SLF1 HGNC:25408 0 TMEM254 HGNC:25804 2 SLFN13 HGNC:26481 2 614957 TMEM33 HGNC:25541 3 SMDT1 HGNC:25055 1 615588 TMEM47 HGNC:18515 3 300698 SMO HGNC:11119 0 601500 TMEM67 HGNC:28396 9 609884 SMYD2 HGNC:20982 3 610663 TNFAIP8L1 HGNC:28279 5 615869 SNAP25 HGNC:11132 2 600322 TNPO1 HGNC:6401 1 602901 SNTB2 HGNC:11169 2 600027 TNRC6B HGNC:29190 2 610740 SNX10 HGNC:14974 0 614780 TOPORS HGNC:21653 0 609507 SPA17 HGNC:11210 7 608621 TPD52 HGNC:12005 1 604068 SPAG1 HGNC:11212 4 603395 TPI1 HGNC:12009 6 190450 SPAG16 HGNC:23225 8 612173 TPPP2 HGNC:19293 4 SPAG17 HGNC:26620 5 616554 TPPP3 HGNC:24162 9 SPAG6 HGNC:11215 10 605730 TRAF3IP1 HGNC:17861 10 607380 SPAG8 HGNC:14105 3 605731 TRAPPC10 HGNC:11868 1 602103 SPATA17 HGNC:25184 6 611032 TRAPPC3 HGNC:19942 2 610955 SPATA18 HGNC:29579 5 612814 TRAPPC9 HGNC:30832 1 611966 SPATA33 HGNC:26463 2 615409 TRIM32 HGNC:16380 1 602290 SPATA4 HGNC:17333 4 609879 TRIM34 HGNC:10063 0 605684 SPATA6 HGNC:18309 3 613947 TRIP11 HGNC:12305 1 604505 SPATA7 HGNC:20423 2 609868 TSC22D4 HGNC:21696 1 611914 SPEF1 HGNC:15874 10 610674 TSGA10 HGNC:14927 7 607166 SPEF2 HGNC:26293 10 610172 TSNAXIP1 HGNC:18586 6 607720 SRD5A2 HGNC:11285 0 607306 TSSK3 HGNC:15473 0 607660 SRGAP3 HGNC:19744 3 606525 TTBK2 HGNC:19141 2 611695 SRI HGNC:11292 3 182520 TTC12 HGNC:23700 2 610732 SRRT HGNC:24101 2 614469 TTC21A HGNC:30761 10 611430 SSNA1 HGNC:11321 10 610882 TTC21B HGNC:25660 10 612014 SSTR3 HGNC:11332 0 182453 TTC25 HGNC:25280 0 ST18 HGNC:18695 0 TTC26 HGNC:21882 10 STAM2 HGNC:11358 0 606244 TTC29 HGNC:29936 9 STAT6 HGNC:11368 1 601512 TTC30A HGNC:25853 10 STIL HGNC:10879 2 181590 TTC30B HGNC:26425 10 STK10 HGNC:11388 3 603919 TTC5 HGNC:19274 2 STK33 HGNC:14568 3 607670 TTC8 HGNC:20087 10 608132 STK36 HGNC:17209 1 607652 TTK HGNC:12401 2 604092 STK38L HGNC:17848 0 615836 TTLL10 HGNC:26693 2 STO ml2 HGNC:14559 4 608292 TTLL3 HGNC:24483 3 STO ml3 HGNC:19420 6 608327 TTLL5 HGNC:19963 2 612268 STOX1 HGNC:23508 3 609397 TTLL6 HGNC:26664 5 610849 STPG1 HGNC:28070 1 615826 TTLL9 HGNC:16118 8 STX3 HGNC:11438 1 600876 TUBA1A HGNC:20766 10 602529 SUFU HGNC:16466 1 607035 TUBA1B HGNC:18809 10 602530 SUMF2 HGNC:20415 0 607940 TUBA1C HGNC:20768 10 SUPT3H HGNC:11466 1 602947 TUBA4A HGNC:12407 10 191110 SURF4 HGNC:11476 1 185660 TUBB HGNC:20778 10 191130 SWT1 HGNC:16785 1 TUBB2A HGNC:12412 10 615101 SYNCRIP HGNC:16918 3 TUBB2B HGNC:30829 10 612850 SYNE2 HGNC:17084 2 608442 TUBB3 HGNC:20772 10 602661 SYVN1 HGNC:20738 1 608046 TUBB4B HGNC:20771 10 602660 TAAR8 HGNC:14964 0 606927 TUBB6 HGNC:20776 9 615103 TBC1D19 HGNC:25624 2 TUBE1 HGNC:20775 5 607345 TBC1D30 HGNC:29164 1 615077 TUBGCP2 HGNC:18599 6 TBC1D32 HGNC:21485 1 615867 TUBGCP3 HGNC:18598 7 TBC1D7 HGNC:21066 0 612655 TUBGCP4 HGNC:16691 4 609610 TCEB2 HGNC:11619 1 600787 TUBGCP5 HGNC:18600 0 608147 TCTE1 HGNC:11693 7 186975 TUBGCP6 HGNC:18127 3 610053 TCTEX1D1 HGNC:26882 4 TULP1 HGNC:12423 4 602280 TCTEX1D2 HGNC:28482 10 TULP3 HGNC:12425 4 604730 TCTN1 HGNC:26113 8 609863 TUSC3 HGNC:30242 4 601385 TCTN2 HGNC:25774 2 613846 UBA1 HGNC:12469 6 314370 TCTN3 HGNC:24519 6 613847 UBA7 HGNC:12471 1 191325 TECPR1 HGNC:22214 1 614781 UBE2D3 HGNC:12476 1 602963 TEKT1 HGNC:15534 10 609002 UBE2E2 HGNC:12478 1 602163 TEKT2 HGNC:11725 10 608953 UBE2E3 HGNC:12479 1 604151 TEKT3 HGNC:14293 10 612683 UBE2I HGNC:12485 1 601661 TEKT4 HGNC:31012 10 UBE2R2 HGNC:19907 1 612506 TEKT5 HGNC:26554 8 UBE4A HGNC:12499 1 603753 TEX26 HGNC:28622 5 UBE4B HGNC:12500 0 613565 TEX9 HGNC:29585 7 UBQLN1 HGNC:12508 2 605046

232

Anhang

Cilien-Evidenz Cilien-Evidenz Genname HGNC ID OMIM ID Genname HGNC ID OMIM ID (Cildb V3) (Cildb V3)

UBR4 HGNC:30313 5 609890 WDR60 HGNC:21862 7 615462 UBR5 HGNC:16806 0 608413 WDR63 HGNC:30711 10 UBXN10 HGNC:26354 3 WDR66 HGNC:28506 10 ULK4 HGNC:15784 1 WDR7 HGNC:13490 3 613473 UMOD HGNC:12559 0 191845 WDR78 HGNC:26252 10 UNC119 HGNC:12565 8 604011 XBP1 HGNC:12801 2 194355 UNC119B HGNC:16488 9 XPNPEP3 HGNC:28052 0 613553 USH1C HGNC:12597 0 605242 XPO5 HGNC:17675 2 607845 USH1G HGNC:16356 0 607696 XPO7 HGNC:14108 3 606140 USH2A HGNC:12601 1 608400 ZBBX HGNC:26245 4 USP12 HGNC:20485 2 ZBTB26 HGNC:23383 1 USP14 HGNC:12612 3 607274 ZMYM1 HGNC:26253 0 USP15 HGNC:12613 1 604731 ZMYND10 HGNC:19412 6 607070 USP18 HGNC:12616 1 607057 ZMYND12 HGNC:21192 10 USP29 HGNC:18563 0 609546 ZNF140 HGNC:12925 2 604082 USP35 HGNC:20061 1 ZNF175 HGNC:12964 0 601139 USP39 HGNC:20071 1 611594 ZNF184 HGNC:12975 1 602277 USP4 HGNC:12627 1 603486 ZNF20 HGNC:12992 2 194557 USP5 HGNC:12628 3 601447 ZNF222 HGNC:13015 1 USPL1 HGNC:20294 0 ZNF24 HGNC:13032 0 194534 VANGL1 HGNC:15512 0 610132 ZNF420 HGNC:20649 2 VDAC3 HGNC:12674 4 610029 ZNF423 HGNC:16762 1 604557 VHL HGNC:12687 0 608537 ZNF451 HGNC:21091 1 615708 VWA3B HGNC:28385 4 ZNF461 HGNC:21629 1 608640 WBP2NL HGNC:28389 0 610981 ZNF473 HGNC:23239 0 WDPCP HGNC:28027 1 613580 ZNF474 HGNC:23245 4 WDR11 HGNC:13831 3 606417 ZNF510 HGNC:29161 0 WDR19 HGNC:18340 10 608151 ZNF567 HGNC:28696 0 WDR31 HGNC:21421 4 ZNF569 HGNC:24737 1 613904 WDR34 HGNC:28296 5 613363 ZNF570 HGNC:26416 2 WDR35 HGNC:29250 10 613602 ZNF599 HGNC:26408 0 WDR49 HGNC:26587 2 ZNF76 HGNC:13149 0 194549 WDR54 HGNC:25770 7 ZNF846 HGNC:27260 1 Cilien-Evidenz mit Wert „10“ bedeutet, dass dieses Gen eine Evidenz von 10 oder höher laut Cildb V3.0 (http://cildb.cgm.cnrs-gif.fr/) aufweist.

Eine vollständige Ciliengenliste mit weiteren Informationen zu den Genen ist in Tab. D auf CD beigefügt.

233

Anhang

13.16. Hefe-2-Hybrid-Screen (Y2H) - NEK1 Interaktionspartner

Tab. 21 Identifizierte NEK1 Interaktionspartner im Hefe-Screen mit full-length NEK1 und NEK1 Teile 1-4 Name des Gens ENDEAVOUR Cildb V3 murine cDNA-Bank humanes Ortholog NEK1 Bait Klon Anzahl Rang Wert Cilien-Evidenz 2210016F16Rik C9orf64 Teil 3 1 52 0.808 1 Acadvl ACADVL Teil 1+2 2 65 0.957 0 Actg1 (*) ACTG1 (*) Teil 1 1 2 0.0157 ≥10 Akap11 AKAP11 Teil 1 1 64 0.932 1 Ap2m1 AP2M1 Teil 1 1 34 0.530 2 Arhgap10 ARHGAP10 Teil 3 2 66 0.970 0 Atf5 ATF5 Teil 2 1 67 0.977 0 Atp13a1 ATP13A1 Teil 2 1 13 0.135 1 Atp5a1 ATP5A1 Teil 1+3 2 12 0.134 5 Bahcc1 BAHCC1 Teil 2+3 3 41 0.678 0 Cd63 CD63 Teil 2 1 48 0.755 1 Cope COPE FL 1 14 0.162 2 Cops6 COPS6 Teil 2 1 36 0.573 1 Cox11 COX11 Teil 2 2 30 0.452 1 Cox2 MT-CO2 Teil 1 + FL 5 n.a. n.a. 1 Ctdsp1 (*) CTDSP1 (*) Teil 3 2 24 0.408 1 Ctxn1 CTXN1 Teil 3 1 69 0.990 3 Cuedc1 CUEDC1 FL 1 55 0.833 0 Cwc22 CWC22 Teil 1 1 n.a. n.a. 1 Dmd DMD Teil 3 4 15 0.164 2 Dnmt3a DNMT3A Teil 3 13 49 0.781 0 Dync2li1 (*) DYNC2LI1 (*) Teil 1 2 5 0.0472 ≥10 Eid1 EID1 Teil 1 1 n.a. n.a. 0 Eif3f EIF3F Teil 2 1 n.a. n.a. 3 Fbxl5 FBXL5 Teil 2 1 25 0.408 0 Fus FUS Teil 3 1 68 0.982 2 Gls2 GLS2 Teil 2 1 45 0.736 1 Grlf1 ARHGAP35 Teil 2 2 11 0.0916 1 Heatr6 HEATR6 Teil 1 1 n.a. n.a. 0 Hps5 HPS5 Teil 2 1 62 0.917 0 Idh3g IDH3G Teil 1 1 17 0.237 3 Ing3 ING3 Teil 2 1 22 0.364 1 Kif3a (*) KIF3A (*) Teil 2 1 1 0.000156 6 Kpna4 KPNA4 Teil 2 2 9 0.0808 1 Lyst LYST Teil 2 4 27 0.444 1 Mcoln1 MCOLN1 Teil 1 1 44 0.730 0 Mcrs1(*) MCRS1(*) Teil 2 1 42 0.684 3 Mgarp MGARP Teil 2 1 n.a. n.a. 2 Mrpl2 MRPL2 Teil 2 1 53 0.825 0 Mrps9 MRPS9 Teil 2 1 51 0.806 1 Myef2 MYEF2 Teil 2 1 16 0.185 4 Myl6 MYL6 Teil 2 1 7 0.0786 2 Ndufa3 NDUFA3 Teil 2 1 56 0.862 0 Nefl NEFL Teil 2 1 10 0.0878 0 Nr2e3 NR2E3 Teil 2 1 59 0.895 0 Nup98 NUP98 Teil 2 1 23 0.398 3 Osbpl1a OSBPL1A Teil 2 1 6 0.0682 5 Pcbp4 PCBP4 Teil 2 8 28 0.445 0 Pcca PCCA Teil 2 1 32 0.464 1

234

Anhang

Name des Gens ENDEAVOUR Cildb V3 murine cDNA-Bank humanes Ortholog NEK1 Bait Klon Anzahl Rang Wert Cilien-Evidenz Pdia3(*) PDIA3(*) Teil 2 2 33 0.484 6 Pfdn1 PFDN1 FL 1 43 0.714 0 Pfkl PFKL Teil 2 1 40 0.633 2 Pias4 PIAS4 Teil 1 1 8 0.0794 0 Pigm PIGM Teil 2 1 58 0.875 0 Pim2 PIM2 Teil 2 1 31 0.457 1 Psmb1 PSMB1 Teil 1+3 2 26 0.426 1 Psmb5 (*) PSMB5 (*) Teil 2 1 63 0.921 3 R3hd ml R3HD ml Teil 2 1 n.a. n.a. 1 Rab11a (*) RAB11A (*) Teil 2 2 4 0.0435 3 Rabggtb RABGGTB Teil 2 1 39 0.624 2 Rnaset2a RNASET2 Teil 3 1 n.a. n.a. 0 Rnaset2b RNASET2 Teil 3 1 n.a. n.a. 0 Rpl9 (*) RPL9 (*) Teil 2 1 61 0.911 6 S100a1 S100A1 Teil 1 1 29 0.447 0 Scmh1 SCMH1 Teil 3 1 21 0.315 0 Sfxn5 SFXN5 Teil 3 1 37 0.578 0 Sh3bp5 SH3BP5 Teil 3 1 54 0.832 1 Slc12a5 (*) SLC12A5 (*) Teil 2 10 46 0.736 2 Slc25a4 SLC25A4 Teil 1 1 35 0.548 3 Smg1 SMG1 Teil 3 1 n.a. n.a. 3 Stard3nl STARD3NL Teil 2 1 50 0.800 0 Stx7 STX7 Teil 2 1 19 0.293 2 Tada2a TADA2A Teil 3 1 n.a. n.a. 0 Tax1bp1 TAX1BP1 Teil 2 1 20 0.306 0 Tecr TECR Teil 2 1 n.a. n.a. 3 Thoc2 THOC2 Teil 2 1 47 0.742 1 Tmem74b TMEM74B Teil 4 1 n.a. n.a. 0 Ubr3 UBR3 Teil 2 1 n.a. n.a. 1 Ubr4 (*) UBR4 (*) Teil 2 1 n.a. n.a. 5 Unc119 (*) UNC119 (*) Teil 2+3 3 3 0.0296 8 Usp47 USP47 Teil 1 1 57 0.867 0 Vcp VCP Teil 2 1 38 0.612 8 Ywhag YWHAG Teil 2 13 18 0.270 4 Zfp386 n.a. Teil 1 1 60 0.905 0 FL = full-length; n.a. = nicht annotiert; falsch positive (Proteine des Proteasoms, Zinkfinger- und Hitzeschockproteine, ribosomale Proteine sowie Untereinheiten der Cytochrom C Oxidase) sind grau hinterlegt. Der mittels Kolokalisation und Ko-Immunopräzipitation verifizierte NEK1 Interaktionspartner DYNC2LI1 ist gelb hinterlegt (in diesem Gen Mutationen in Patient P7 mittels Exom-Sequenzierung identifiziert, siehe 6.2.1, Abb. 13) (*) in Ciliengenliste inkl. PMID annotiert (siehe 13.15, Tab. 20).

235

Anhang

13.17. Großdurchsatz 1on1-Screen - NEK1 Interaktionen mit bekannten Ciliengenen

Tab. 22 Belegungsschemata 1on1-Screen Platten und identifizierte NEK1 Interaktionspartner

NCdb_entry NCdb_entry # pBD Researcher # pAD Researcher clone_id clone_id 1 MAEA 71 Dorus / Emine 1 MAEA 71 Dorus / Emine 2 C20orf11 9 Dorus / Emine 2 C20orf11 9 Dorus / Emine 3 YPEL5 173 Dorus / Emine 3 YPEL5 173 Dorus / Emine 4 MKLN1 75 Dorus / Emine 4 MKLN1 75 Dorus / Emine 5 SMU1 147 Dorus / Emine 5 SMU1 147 Dorus / Emine 6 RANBP10 111 Dorus / Emine 6 RANBP10 111 Dorus / Emine 7 RMND5B 113 Dorus / Emine 7 RMND5B 113 Dorus / Emine 8 RMND5A 112 Dorus / Emine 8 RMND5A 112 Dorus / Emine 9 CDR2 (*, $) 21 Dorus / Emine 9 CDR2 (*,$) 21 Dorus / Emine 10 MAPRE1 74 Dorus / Emine 10 MAPRE1 74 Dorus / Emine 11 SPAG5 aa 774-862 x Ferry 11 SPAG5 aa 774-862 x Ferry 12 SPAG5 aa 774-1193 (*,$) x Ferry 12 SPAG5 aa 774-1193 (*,$) x Ferry 13 SPAG5 aa 973-1034 x Ferry 13 SPAG5 aa 973-1034 x Ferry 14 SPAG5 aa 1115-1190 x Ferry 14 SPAG5 aa 973-1193 x Ferry 15 SPAG5 aa 973-1193 (*) x Ferry 15 SPAG5 aa 1115-1190 (*) x Ferry 16 hEPS8 aa 551-end x Ferry 16 hEPS8 aa 551-end x Ferry 17 hEPS8 aa 551-616 x Ferry 17 hEPS8 aa 551-616 x Ferry 18 hEPS8 aa 182-533 x Ferry 18 hEPS8 aa 182-533 x Ferry 19 hEPS8 aa 182-248 x Ferry 19 20 hEPS8 aa 1-211 x Ferry 20 hEPS8 aa 1-211 x Ferry 21 hEPS8 L329P x Ferry 21 hEPS8 L329P x Ferry 22 hEPS8 fl x Ferry 22 hEPS8 fl x Ferry 23 Espin fl x Ferry 23 Espin fl x Ferry 24 Cacna1D x Ferry 24 Cacna1D x Ferry 25 IFT20 57 Jeroen / Stef 25 IFT20 57 Jeroen / Stef 26 IFT27 58 Jeroen / Stef 26 IFT27 58 Jeroen / Stef 27 IFT52 60 Jeroen / Stef 27 IFT52 60 Jeroen / Stef 28 IFT54 155 Jeroen / Stef 28 IFT54 155 Jeroen / Stef 29 IFT57 62 Jeroen / Stef 29 IFT57 62 Jeroen / Stef 30 IFT74 (*) 61 Jeroen / Stef 30 IFT74 (*) 61 Jeroen / Stef 31 IFT81 63 Jeroen / Stef 31 IFT81 63 Jeroen / Stef 32 IFT88 (*) 66 Jeroen / Stef 32 IFT88 (*) 66 Jeroen / Stef 33 TTC30A 158 Jeroen / Stef 33 TTC30A 158 Jeroen / Stef 34 IFT140 54 Jeroen / Stef 34 IFT140 54 Jeroen / Stef 35 IFT144 163 Jeroen / Stef 35 IFT144 163 Jeroen / Stef 36 IFT43 x Machteld 36 IFT43 x Machteld 37 NPHP4 7850-7851 96 Stef 37 NPHP4 7850-7851 96 Stef 38 NPHP4 7850-7853 97 Stef 38 NPHP4 7850-7853 97 Stef 39 NPHP4 7852-7851 98 Stef 39 NPHP4 7852-7851 98 Stef 40 NPHP4 7852-7853 99 Stef 40 NPHP4 7852-7853 99 Stef 41 NPHP4 12041-12042 91 Stef 41 NPHP4 12041-12042 91 Stef 42 NPHP4 12041-12043 92 Stef 42 NPHP4 12041-12043 92 Stef 43 NPHP4 12044-12045 93 Stef 43 NPHP4 12044-12045 93 Stef 44 NPHP4 12038-12039 89 Stef 44 NPHP4 12038-12039 89 Stef 45 NPHP4 12038-12040 90 Stef 45 NPHP4 12038-12040 90 Stef 46 NPHP4 fl 101 Heleen 46 NPHP4 fl 101 Heleen 47 BBS5 front 3 Stef 47 BBS5 front 3 Stef 48 BBS5 middle 4 Stef 48 BBS5 middle 4 Stef 49 BBS5 back 5 Stef 49 BBS5 back 5 Stef 50 BBS5 PH-B2 6 Stef 50 BBS5 PH-B2 6 Stef 51 SDCCAG8 fl 147 Stef 51 SDCCAG8 fl 147 Stef 52 SDCCAG8 fr.1 (*) 143 Stef 52 SDCCAG8 fr.1 (*) 143 Stef 53 SDCCAG8 fr.2 144 Stef 53 SDCCAG8 fr.2 144 Stef 54 SDCCAG8 fr.3 145 Stef 54 SDCCAG8 fr.3 145 Stef 55 SDCCAG8 short (*) Stef Stef 55 SDCCAG8 short (*) Stef Stef 56 C8orf37 fl 11 Stef 56 C8orf37 fl 11 Stef 57 RPGRIP1 C2short 137 Stef 57 RPGRIP1 C2short 137 Stef 58 RPGRIP1 C2long 136 Stef 58 RPGRIP1 C2long 136 Stef 59 RPGRIP1 C2N 138 Stef 59 RPGRIP1 C2N 138 Stef 60 bRPGRIP1 "fl" + coiled coil 139 Heleen 60 bRPGRIP1 "fl" incl coil 139 Heleen 61 KIAA1005 C2short Heleen / Syl Stef 61 KIAA1005 C2short Heleen / Syl Stef 62 KIAA1005 C2C + C2N Heleen / Syl Stef 62 KIAA1005 C2C + C2N Heleen / Syl Stef 63 KIAA1005 C2N Heleen / Syl Stef 63 KIAA1005 C2N Heleen / Syl Stef 64 KIAA1005 RID Heleen / Syl Stef 64 KIAA1005 RID Heleen / Syl Stef 65 KIAA1345 16 Heleen 65 KIAA1345 16 Heleen 66 hKIAA1345 coiled coil Heleen / Syl Heleen 66 hKIAA1345 coiled coil Heleen / Syl Heleen 67 hKIAA1345 naC2-end Heleen / Syl Heleen 67 hKIAA1345 naC2-end Heleen / Syl Heleen 68 hKIAA1345 Cterm Heleen / Syl Heleen 68 hKIAA1345 Cterm Heleen / Syl Heleen 69 hKIAA1345 C2 fragment Heleen / Syl Heleen 69 hKIAA1345 C2 fragment Heleen / Syl Heleen

236

Anhang

NCdb_entry NCdb_entry # pBD Researcher # pAD Researcher clone_id clone_id

70 hKIAA1345 Nterm Heleen / Syl Heleen 70 hKIAA1345 Nterm Heleen / Syl Heleen 71 hKIAA1345 C2-end Heleen / Syl Heleen 71 hKIAA1345 C2-end Heleen / Syl Heleen 72 hCRB1-icd 28 Ilse 72 hCRB1-icd 28 Ilse 73 bCRB1-icd 29 Ilse 73 bCRB1-icd 29 Ilse 74 hCRB2-icd 30 Ilse 74 IFT88 (N-term) 64 Jeroen / Stef 75 Cep164 fl 23 Stef 75 IFT88 (C-term) 65 Jeroen / Stef 76 Cep164 1-550 24 Stef 76 WDR35 169 Machteld 77 Cep164 551-1100 25 Stef 77 OFD1 328 171 Karlien 78 Cep164 1101-end 26 Stef 78 OFD1 369 (*) 172 Karlien 79 DCTN1 iso2 (p135) 32 Stef 79 OFD1 cc2+3 x Karlien 80 DCTN2 (p50) 34 Stef 80 OFD1 cc4+5 x Karlien 81 LCA5-like Fr1 197 Karlien 81 LCA5-like Fr1 197 Karlien 82 LCA5-like Fr2 198 Karlien 82 LCA5-like Fr2 198 Karlien 83 LCA5-like FL 195 Karlien 83 LCA5-like FL 195 Karlien 84 BBS1 fl x Erwin 84 RPGRIP C2-end 134 Stef 85 BBS2 fl x Erwin 85 RPGRIPL C2-end Heleen / Syl Stef 86 BBS3 fl x Erwin 86 RPGR fl 142 Stef 87 BBS4 fl x Erwin 87 RPGR Nterm 125 Stef 88 BBS5 fl 2 Stef 88 RPGR Cterm 114 Stef 89 BBS6 fl x Erwin 89 BBS5 fl 2 Stef 90 BBS7 fl x Erwin 90 Nek4 Fr1 190 Karlien 91 BBS8 fl x Erwin 91 Nek4 Fr2 191 Karlien 92 BBS9 fl x Erwin 92 Nek4 Fr3 192 Karlien 93 BBS10 fl x Erwin 93 Nek4 FL 188 Karlien 94 BBS11 fl x Erwin 94 CEP290 cc456 (*) 187 Karlien 95 BBS12 fl x Erwin 95 NEK8 FL 200 Karlien 96 96 97 97 USH2a-icd x Erwin 98 98 VLGR1-icd x Erwin 99 99 Whirlin fl x Erwin 100 100 Harmonin fl ($) x Erwin 101 101 NLP isoA fl x Erwin 102 102 NLP isoB fl ($) x Erwin 103 103 CF152 (Lebc) fl x Karlien 104 104 CF152 (Lebc) fr1 x Karlien 105 105 CF152 (Lebc) fr2 x Karlien 106 106 CF152 (Lebc) fr3 x Karlien 107 107 CF152 (Lebc) fr4 x Karlien 108 108 CF152 (Lebc) fr5 x Karlien 109 109 CF152 (Lebc) fr6 x Karlien 110 110 Sans fl x Erwin 111 111 KIAA0373 (CEP290) x Heleen 112- 112- 120 120 121 121 BBS1 x Erwin 122 122 BBS2 x Erwin 123 123 BBS3 x Erwin 124 124 BBS4 x Erwin 125 125 BBS5 2 Erwin 126 126 BBS6 x Erwin 127 127 BBS7 x Erwin 128 128 BBS8 x Erwin 129 129 BBS9 x Erwin 130 130 BBS10 x Erwin 131 131 BBS11 x Erwin 132 132 BBS12 x Erwin 133 133 Cep164 fl 23 Stef 134 134 Cep164 1-550aa 24 Stef 135 135 Cep164 550-1100 aa 25 Stef 136 136 Cep164 1100-end 26 Stef 137- 137- 144 144 145 AHI1 1 Katsanis 145 AHI1 1 Katsanis 146 C14orf179 7 Katsanis 146 C14orf179 7 Katsanis 147 CLUAP1 31 Katsanis 147 CLUAP1 31 Katsanis 148 DNAI2 35 Katsanis 148 DNAI2 35 Katsanis 149 DYNC2LI1 7 Katsanis 149 DYNC2LI1 7 Katsanis 150 DYNLL2 51 Katsanis 150 DYNLL2 51 Katsanis 151 HSPB11 52 Katsanis 151 HSPB11 52 Katsanis 152 IFT46 59 Katsanis 152 IFT46 59 Katsanis 153 INPP5E 67 Katsanis 153 INPP5E 67 Katsanis 154 INVS 68 Katsanis 154 INVS 68 Katsanis 155 IQCB1 69 Katsanis 155 IQCB1 69 Katsanis 156 KIF3A 70 Katsanis 156 KIF3A 70 Katsanis 157 KIF3B 72 Katsanis 157 KIF3B 72 Katsanis 158 MAPRE2 108 Katsanis 158 MAPRE2 108 Katsanis 159 RAB3IP 115 Katsanis 159 RAB3IP 115 Katsanis

237

Anhang

NCdb_entry NCdb_entry # pBD Researcher # pAD Researcher clone_id clone_id

160 RAB8A 140 Katsanis 160 RAB8A 140 Katsanis 161 RABL5 141 Katsanis 161 RABL5 141 Katsanis 162 RSPH9 148 Katsanis 162 RSPH9 148 Katsanis 163 SPATA7 (*, #) 153 Katsanis 163 SPATA7 (*, #) 153 Katsanis 164 TMEM216 154 Katsanis 164 TMEM216 154 Katsanis 165 TRAF3IP1 156 Katsanis 165 TRAF3IP1 156 Katsanis 166 TRIM32 157 Katsanis 166 TRIM32 157 Katsanis 167 TTC30B 159 Katsanis 167 TTC30B 159 Katsanis 168 TULP1 164 Katsanis 168 TULP1 164 Katsanis 169 TXNDC3 165 Katsanis 169 TXNDC3 165 Katsanis 170 VHL 166 Katsanis 170 VHL 166 Katsanis 171 WDR34 167 Katsanis 171 WDR34 167 Katsanis 172 XPNPEP3 170 Katsanis 172 XPNPEP3 170 Katsanis 173- 173- 193 193 194 ARL3 264 Katsanis 194 ARL3 264 Katsanis 195 195 196 B9D2 265 Katsanis 196 B9D2 265 Katsanis 197 C15orf26 266 Katsanis 197 C15orf26 266 Katsanis 198 C16orf80 267 Katsanis 198 C16orf80 267 Katsanis 199 199 200 C20orf26 268 Katsanis 200 C20orf26 268 Katsanis 201 C3orf15 269 Katsanis 201 C3orf15 269 Katsanis 202 CALM2 270 Katsanis 202 CALM2 270 Katsanis 203 CAMK2A 271 Katsanis 203 CAMK2A 271 Katsanis 204 CBY1 272 Katsanis 204 CBY1 272 Katsanis 205 CCDC147 273 Katsanis 205 CCDC147 273 Katsanis 206 CCDC65 274 Katsanis 206 CCDC65 274 Katsanis 207 CETN2 276 Katsanis 207 CETN2 276 Katsanis 208 CETN3 277 Katsanis 208 CETN3 277 Katsanis 209- 209- 210 210 211 CYB5D1 278 Katsanis 211 CYB5D1 278 Katsanis 212 DNAI1 279 Katsanis 212 DNAI1 279 Katsanis 213 DNALI1 280 Katsanis 213 DNALI1 280 Katsanis 214 DPP3 281 Katsanis 214 DPP3 281 Katsanis 215 DPY30 282 Katsanis 215 DPY30 282 Katsanis 216 DYNLRB2 283 Katsanis 216 DYNLRB2 283 Katsanis 217 DYNLT1 284 Katsanis 217 DYNLT1 284 Katsanis 218 DZIP1 285 Katsanis 218 DZIP1 285 Katsanis 219 E2F4 286 Katsanis 219 E2F4 286 Katsanis 220 EFHC1 287 Katsanis 220 EFHC1 287 Katsanis 221 EFHC2 288 Katsanis 221 EFHC2 288 Katsanis 222 FOXJ1 289 Katsanis 222 FOXJ1 289 Katsanis 223 FUZ 290 Katsanis 223 FUZ 290 Katsanis 224 224 225 GSTP1 291 Katsanis 225 GSTP1 291 Katsanis 226 HSF1 292 Katsanis 226 HSF1 292 Katsanis 227 HSPA1L 293 Katsanis 227 HSPA1L 293 Katsanis 228 HSPA5 294 Katsanis 228 HSPA5 294 Katsanis 229 INTU 295 Katsanis 229 INTU 295 Katsanis 230 IQCA1 296 Katsanis 230 IQCA1 296 Katsanis 231 231 232 KIAA0562 275 Katsanis 232 KIAA0562 275 Katsanis 233 LRRC6 297 Katsanis 233 LRRC6 297 Katsanis 234 234 235 MKKS x Katsanis 235 MKKS x Katsanis 236 MNS1 (*) 298 Katsanis 236 MNS1 (*) 298 Katsanis 237 237 238 NEK7 299 Katsanis 238 NEK7 299 Katsanis 239 NME7 300 Katsanis 239 NME7 300 Katsanis 240 PACRG 301 Katsanis 240 PACRG 301 Katsanis 241 PAFAH1B1 302 Katsanis 241 PAFAH1B1 302 Katsanis 242 242 243 POLL 303 Katsanis 243 POLL 303 Katsanis 244 PPP1CA 304 Katsanis 244 PPP1CA 304 Katsanis 245 PPP1CB 305 Katsanis 245 PPP1CB 305 Katsanis 246 PPP1R7 306 Katsanis 246 PPP1R7 306 Katsanis 247 PPP2R1A 307 Katsanis 247 PPP2R1A 307 Katsanis 248 PRDX2 308 Katsanis 248 PRDX2 308 Katsanis 249 PTPDC1 309 Katsanis 249 PTPDC1 309 Katsanis 250 250 RFX3 310 251 RIBC1 311 Katsanis 251 RIBC1 311 Katsanis 252 RP2 312 Katsanis 252 RP2 312 Katsanis 253 SPAG16 313 Katsanis 253 SPAG16 313 Katsanis 254 SPAG6 314 Katsanis 254 SPAG6 314 Katsanis 255 SPATA4 315 Katsanis 255 SPATA4 315 Katsanis 256 SPEF1 316 Katsanis 256 SPEF1 316 Katsanis 238

Anhang

NCdb_entry NCdb_entry # pBD Researcher # pAD Researcher clone_id clone_id

257 SSNA1 317 Katsanis 257 SSNA1 317 Katsanis 258 STEAP3 318 Katsanis 258 STEAP3 318 Katsanis 259 STK36 319 Katsanis 259 STK36 319 Katsanis 260 STOM 320 Katsanis 260 STOM 320 Katsanis 261- 261- 264 264 265 TUBB2C 323 Katsanis 265 TUBB2C 323 Katsanis 266 TULP3 324 Katsanis 266 TULP3 324 Katsanis 267 UBE2K 325 Katsanis 267 UBE2K 325 Katsanis 268 UBE2N 326 Katsanis 268 UBE2N 326 Katsanis 269 UNC119 327 Katsanis 269 UNC119 327 Katsanis 270 VANGL2 328 Katsanis 270 VANGL2 328 Katsanis 271 VIM 329 Katsanis 271 272 WDR16 330 Katsanis 272 WDR16 330 Katsanis 273 WDR60 331 Katsanis 273 WDR60 331 Katsanis 274 WDR66 332 Katsanis 274 WDR66 332 Katsanis 275 275 276 YWHAE 333 Katsanis 276 YWHAE 333 Katsanis 277 ZMYND12 334 Katsanis 277 ZMYND12 334 Katsanis 278 278 279 WDR26 262 Dorus 279 WDR26 262 Dorus 280 WDR47 260 Dorus 280 WDR47 260 Dorus 281 ARMC8 208 Dorus 281 ARMC8 208 Dorus 282 ARL13B 207 Erwin 282 ARL13B 207 Erwin 283 IFT122 (*) 53 Dorus 283 IFT122 (*) 53 Dorus 284 TTC21A 253 Dorus 284 TTC21A 253 Dorus 285 WDR35 352 Dorus 285 WDR35 352 Dorus Im 1on1-Screen identifizierte humane (*) NEK1 Interaktionspartner und murine ($) Nek1 Interaktionspartner (#) verifizierter NEK1 Interaktionspartner; Hefe-Versuche in Kooperation mit Department of Human Genetics (Radboud University Nijmegen, Niederlande) veröffentlicht in [8].

239

Anhang

13.18. PFA-Fixierung von Zellen

Tab. 23 Versuchsprotokoll für Antikörperfärbung (PFA-Fixierung) Vorgehen Volumen Zeit Medium vom Well abziehen 1x Waschen mit 1x PBS (auf Eis) 500 µl 5 Min. Fixierung 4 % PFA (in PBS) bei 4 °C 250 µl 10 Min. Deckgläschen in feuchte Kammer legen (RT) 2x Waschen 1x PBS (RT) 150 µl 5 Min. Tween 20 (0,01 %) in 1x PBS (RT) 100 µl 10 Min. PBS NH4Cl (RT) 150 µl 10 Min. Blockieren in Blockierungslösung (RT) 150 µl 45-60 Min. Primärer Antikörper in Blockierungslösung (4 °C) 50-100 µl Über Nacht 3x Waschen 1x PBS (RT) 150 µl 5 Min. Sekundärer Antikörper in Blockierungslösung 50-100 µl 1-2 Std. mit DAPI 1:50000 (dunkel, RT) 3x Waschen 1x PBS (RT) 150 µl 10 Min. Spülen mit ddH2O 150 µl Eindecken mit Aqua-Polymount 1 Tropfen

13.19. Coverage Daten Patienten P7, P23, P30

Tab. 24 Durchschnittliche Deckungstiefe (coverage) der Exom-Sequenzierungen von P7, P23, P30 Average % 1x % 5x % 10x % 20x DNA Nr. Familie Coverage Coverage Coverage Coverage Coverage 56475 (P7) SRPS#7 73.34 0.8806 0.8153 0.7725 0.7047 139565 (P23) 217.52 0.9784 0.974 0.9707 0.9635 SRPS#22 139566 (P23) 188.53 0.9791 0.9746 0.9701 0.9603 148194 153.19 0.9706 0.9634 0.9584 0.9494 148209 SRPS#28 155.47 0.9741 0.9673 0.9625 0.9536 148967 (P30) 173.2 0.9734 0.9667 0.9622 0.9548

240

Anhang

13.20. Vewendetes Material

13.20.1. Verbrauchsmaterialien

Material Bezugsquelle Alufolie Paclan Amicon Ultra 10 K Säulen Millipore Autoklavierbeutel Roth Deckgläschen rund (Ø 10 mm) * Sterilisation: Ende dieser Tabelle Thermo Scientific Desinfektionsmittel Apesin Tana-Chemie GmbH Einwegskalpell Feather Einbettmedium Aqua Polymount Polysciences Einbettmedium ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies Extra Thick Blot Paper Bio-Rad Falkons 15 ml, 50 ml Greiner Frischhaltefolie Saran Glutathionsepharose 4B Beads GE Healthcare Gummischaber TTP Handschuhe Sempercare Latex Powder Free Sempermed Handschuhe Sempercare Nitrile Sempermed Hefekulturplatten Ø 10 bzw. 15 cm Sarstedt, Greiner Hefekulturröhrchen 13 ml mit Belüftungsstopfen Sarstedt HiTrap NHS-activated HP Säule GE Healthcare Immersol Zeiss Kanüle Microlance BD Biosciences Klebefolien Sealing Tape / Microseal B Film Costar / Bio-Rad Luminata Forte Western HRP Substrate Millipore Microspin-Säulen GE Healthcare Objektträger 76x26 mm Roth Optical Adhesive Covers Life Technologies Parafilm Pechiney Plastic Packaging Pasteurpipetten Volac PAXgene Blood RNA tubes Becton Dickinson PVDF-Membran Hybond-P GE Healthcare Petrischalen Sarstedt Pipettenspitzen 10 μl Biozym Pipettenspitzen 200 μl, 1000 μl Sarstedt Pipettenspitzen Combitips plus 0,1 ml, 0,5 ml Eppendorf Pipettenspitzen Dispensorpipette 5 ml, 10 ml, 25 ml TTP Pipettenspitzen mit Filter 10 μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl Biozym Platten: 384-well Optical Reaction Plate (qPCR) Life Technologies Platten: 96-well DeepWell Platten (2 ml) Wagner & Munz Platten: 96-well PCR-Platten Corning Platten: 96-well Sequenzier-Platten Greiner Platten: 96-well Tissue Culture Plate Sarstedt Protein A Mag Sepharosebeads GE Healthcare QIAshredder Qiagen Reaktionsgefäß 0,2 ml Peqlab, nerbeplus 241

Anhang

Material Bezugsquelle Reaktionsgefäß 1,5 ml mit/ohne Deckel Eppendorf Reaktionsgefäß 2 ml Eppendorf Spritzen 1 ml, 10 ml Braun, BD Biosciences Sterilfilter VWR Thermowell Sealing Matten Corning Whatmanpapier 3MM Chr GE Healthcare Zellkulturflaschen 25 cm2, 75 cm2 TPP Zellkulturtestplatten 6-well, 24-well TPP Zellkulturschale 10 cm TPP

* Sterilisation von Deckgläschen - Ca. 50 Deckgläschen in 10 cm Schale legen und mit 70%igen Ethanol (ca. 10-15 ml) bedecken - Für 4 Stunden auf Schüttler inkubieren, anschließend 3 x mit 1x PBS (autoklaviert, ca. 10-15 ml) waschen - Petrischale anschließend mit sterilem 1x PBS auffüllen und über Nacht unter UV-Licht (Sterilwerkbank) inkubieren, Lagerung 4 °C

13.20.2. Enzyme, Standards, Chemikalien

Material Bezugsquelle Adeninhemisulfat Sigma-Aldrich Agar-Agar Roth Agarose Biozym, Roth Ampicillin Roth Antarktische Phosphatase I (5 U/μl) New England Biolabs Applichem Blocking Reagenz CA AppliChem APS Ammoniumpersulfat Sigma-Aldrich BamHI New England Biolabs Betain (5 M) Sigma-Aldrich Bicin Roth Bisacrylamid-Stammlösung Rotiphorese Gel 30 Roth BIS-TRIS Roth Borsäure Roth Bromphenolblau Sigma-Aldrich BSA (Bovines Serumalbumin) Sigma-Aldrich Chloramphenicol Roth Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Coomassie-Brilliant-Blau Roth D-(+)-Glucose Roth DAPI Serva Desoxynucleotid-Triphosphate (dNTPs) Life Technologies dHCl Merck Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x 2 H20) Merck Dithiotreitol (DTT) Roth, Life Technologies DMF (N,N-Dimethylformamid) Roth DNase I, RNase-Free (10 U/μl) Qiagen DOC (Natrium-Deoxycholat) VWR

242

Anhang

Material Bezugsquelle Dropout Supplements (–Leu –Trp –His –Ade ) Clontech EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Roth EGTA Ethylenglykoltetraessigsäure Roth Essigsäure Roth Ethanol Roth Ethanolamin Sigma-Aldrich Ethidiumbromid (10 mg/ ml) Roth Exonuclease I (20 U/μl) New England Biolabs Fischgelatine Sigma-Aldrich Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Invitrogen Glycin Roth Glycerin Roth Hefeextrakt Roth HEPES Sigma-Aldrich HPLC-Wasser Merck IPTG Roth Isopropanol Roth Kaliumchlorid (KCl) Roth

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck Kanamycin Roth KAPA2G Robust DNA Polymerase Peqlab LiAc Sigma-Aldrich Ligationspuffer Roche Lipofectamine 2000 Invitrogen Luminata Forte Western HRP substrate Millipore Lysozym aus Hühnereiweiß Sigma-Aldrich

Magnesiumchlorid (MgCl2) Invitrogen

Magnesiumsulfat (MgSO4) Roth Methanol Roth Natriumacetat Roth Natriumchlorid (NaCl) Roth Natriumcitrat Roth

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Roth Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) Merck NEB 4 Puffer New England Biolabs

PCR Puffer ohne MgCl2 (10x) Invitrogen PEG 3350 (Polyethylenglykol) Sigma-Aldrich PEI (Polyethylenimin) Polysciences Pepton Merck PFA (Paraformaldehyd) Roth Pierce BCA Protein Assay Reagent A Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Reagent B Thermo Scientific Platinum Taq Polymerase Invitrogen Ponceau S Solution Sigma-Aldrich Random Hexamer Primer Life Technologies RNaseOUT Ribonuclease Inhibitor (40 U/μl) Life Technologies

243

Anhang

Material Bezugsquelle Salzsäure (HCl) Roth SD-Base Clontech Sequenzierpuffer (5x) Life Technologies Sodiumdodecylsulfat (SDS) Merck Standard 1 kb DNA Ladder New England Biolabs Standard 100 bp DNA Ladder New England Biolabs Standard pUC-Mix Marker 8 Fermentas Standard Novex Sharp Pre-stained Proteinstandard Invitrogen Standard peqGOLD Protein-Marker V Peqlab Standard PageRuler Unstained Protein Ladder Fermentas Spectinomycin Sigma-Aldrich SuperScript II Reverse Transkriptase Life Technologies T4 Ligase Roche T7 Endonuclease 1 New England Biolab T7E1 Puffer New England Biolab Taq recombinant Polymerase Invitrogen Tetramethylethylendiamin (TEMED) GE Healthcare Thrombin GE Healthcare Tricin Roth Trihydroxymethylaminomethan (TRIS) Roth Trihydroxymethylaminomethan Hydrochlorid (TRIS-HCl) Roth Triton-X 100 Pharmacia Biotech Trypton Roth Tween 20 Sigma-Aldrich X-α-Gal Roth XhoI New England Biolabs Xylencyanol Merck YPD Roth

13.20.3. Puffer und Lösungen

Ammoniumperoxodisulfat APS (10 %) 1 g APS 10 ml Aqua bidest. Lagerung bei -20 °C

Blockierungslösung (Immunfluoreszenz) 0,5 ml 10 % BSA 0,25 ml Fischgelatine in 50 ml 1x PBS (sterilfiltriert) lösen, aliquotieren, Lagerung -20 °C

Blockierungslösung (Western Blot) 2,0 g Applichem Blocking Reagenz 1,21 g Tris 8,76 g NaCl

mit 900 ml H2Omilli auffüllen, zum Lösen des Blocking Reagenz auf 95 °C erhitzen, abkühlen lassen und den pH auf 7,4 einstellen, Lagerung 4 °C

244

Anhang

DAPI 1 ml 4x SSC/0,2 % Tween 1 μl DAPI mit Aqua bidest. auf 4 ml auffüllen

DNA-Ladepuffer (6x) 50 % Glycerin 0,01 % Bromphenolblau 0,01 % Xylencyanol

Entfärbelösung 10 % (v/v) Essigsäure 25 % (v/v) Methanol

in H2O

Extraktionslysepuffer (Western Blot) 5 ml 1M Tris-HCl (pH 7,5) 0,88 g NaCl 1 ml Triton X-100 0,5 g DOC (Natrium-Deoxycholat) auf 100 µl Extraktionslysepuffer 10 µl Protease Inhibitor (10x) zugeben

HEPES (0,05 M) 1,19 g HEPES in 100 ml Aqua bidest. lösen, pH 7,3-7,4

Kopplungspuffer

0,84 g NaHCO3 1,461 g NaCl mit Aqua bidest. auf 50 ml auffüllen und auf pH 8,3 einstellen, sterilfiltrieren

Lämmli-Probenpuffer (2x) 6,25 ml 1 M Tris/HCl pH 7,5 20,0 ml 10%ige SDS 10,0 ml Glycerin 0,2 ml 0,5 M EDTA (pH 7,5) 0,02 g Bromphenolblau auf 45 ml Aqua bidest. auffüllen, pH 6,8 einstellen 0,77 g DTT zugeben und auf 50 ml mit Aqua bidest. auffüllen, Aliquots Lagerung -20 °C

Laufpuffer „große Proteine“ (20x) 121 g TrisBase 179 g Tricine 20 g SDS

mit H2O auf 1L auffüllen, kein pH einstellen nötig

Gebrauchslösung: 1:20 Verdünnung der Stammlösung mit H2O

245

Anhang

Laufpuffer „kleine Proteine“ (10x) 30 g 250 mM Tris pH 8,4 144 g 1,92 M Glycin 10 g SDS

mit H2O auf 1L auffüllen, kein pH einstellen nötig

Gebrauchslösung: 1:10 Verdünnung der Stammlösung mit H2O

Lysepuffer (Ko-IP bzw. CRISPR) 500 µl 1M Tris-HCl (pH 8,0) 750 µl 1M NaCl 10 µl 0,5M EDTA 50 µl TritonX-100 auf 5 ml mit Aqua bidest. auffüllen, Puffer vor Benutzung immer frisch ansetzen.

Methanol + EGTA (Ímmunfluoreszenz) in 50 ml Methanol Spatelspitze EGTA zugeben, mischen, überschüssiges EGTA absetzen lassen, sterilfiltrieren, Lagerung -20 °C

Paraformaldehyd PFA (4 %) 4 g PFA 80 ml Aqua bidest. 5 Tropfen 1 M NaOH im Wasserbad auf 54 °C erwärmen und für 10 Min. unter ständigem Rühren lösen 4 Tropfen 1 M HCl 10 ml 0,1 M PBS filtrieren

PBS (10x) 80 g NaCl 2 g KCl

11,5 g Na2HPO4

2 g KH2PO4 auf 1 L mit Aqua bidest. auffüllen, pH 7,0 einstellen 1:10 Verdünnung herstellen und autoklavieren

PBS GST-Systeme (5x) 40,91 g NaCl 1,01 g KCl

8,9 g Na2HPO4

1,23 g KH2PO4 in 1 L Aqua bidest. lösen, pH 7,3

PBST 1x PBS mit 0,3 % Triton-X 100

PEG/LiAc-Puffer (1x) 8 ml 50 % PEG 3350 1 ml 10x TE-Puffer 1 ml 10x LiAc

246

Anhang

PEI Polyethylenimin Transfektionsreagenz (0,1 mg/ ml)

8,77 g NaCl in 900 ml H2O lösen, pH 5,5 einstellen, auf 1000 ml auffüllen (NaCl-Lösung) 100 mg PEI in 900 ml NaCl-Lösung lösen, dazu aufheizen bis maximal 80 °C, mit NaCl auf 1000 ml auffüllen, unter Rühren abkühlen lassen auf Raumtemperatur, dann mit Hilfe von Eis auf ca. 4 °C, pH 7,8 einstellen, sterilfiltrieren, Lagerung bei 4 °C für ca. 9 Monate

Protease Inhibitor Lösung (10x) 1 Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets 1 ml Aqua bidest. lösen und Aliquots bei -20 °C lagern

Puffer A 1,497 ml Ethanolamin 1,461 g NaCl mit Aqua bidest. auf 50 ml auffüllen und auf pH 8,3 einstellen, sterilfiltrieren

Puffer B 0,4 g Na-Acetat 1,461 g NaCl mit Aqua bidest. auf 50 ml auffüllen und auf pH 4 einstellen, sterilfiltrieren

Sammelgelpuffer (4x) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) 0,4 % (w/v) SDS in Aqua bidest.

SDS-Lösung (10 %) 10 g SDS

in 80 ml H2Omilli lösen, mit Wasser auf 100 ml auffüllen, Lagerung bei RT

SSC (20x) 525,9 g NaCl 264,6 g NaCitrat auf 3 L mit Aqua bidest. auffüllen, pH 7,0 einstellen und autoklavieren

4x SSC/ 0,2 % Tween 100 ml 20x SSC 400 ml Aqua bidest. 1 ml Tween 20

TBE Tris-Borat-EDTA (10x) 1,0 M Tris 0,83 M Borsäure 0,01 M EDTA mit Aqua bidest. auffüllen und pH 8,3 einstellen

247

Anhang

TBS (10x) 12,1 g Tris Base 175,3 g NaCl

in 800 ml H2Omilli lösen, pH 7,5 einstellen, auf 1000 ml mit H2Omilli auffüllen

Gebrauchslösung: 1:10 Verdünnung der Stammlösung mit H2O

TBST 1 L TBS 1 ml Tween 20

TE/LiAc-Puffer (1x) 1,1 ml 10x TE-Puffer 1,1 ml 10x LiAc (1 M) 7,8 ml Aqua bidest.

TE-Puffer 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA

Transferpuffer „große Proteine“ 16,4 g Bicine 21 g BisTris 4 ml 10%ige (0,01 %) SDS 8 ml 0,5 M EDTA pH 7,5

mit H2Omilli auf 3,8 L auffüllen, vor Gebrauch 5 % Methanol (=200 ml) zugeben, Lagerung 4 °C

Transferpuffer „kleine Proteine“ 6 g 25 mM Tris 30 g 200 mM Glycin 2 ml 10 % SDS

mit H2Omilli auf 1,6 L auffüllen, vor Gebrauch 20 % Methanol (=400 ml) zugeben, Lagerung 4 °C

Trenngelpuffer (4x) 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 0,4 % (w/v) SDS in Aqua bidest.

Tween 20 Lösung 0,01 % (Immunfluoreszenz) 5 µl Tween 20 in 50 ml 1x PBS (sterilfiltriert) lösen, Aliquots Lagerung -20 °C

248

Anhang

13.20.4. Medien und Medienzusätze

Material Bezugsquelle

Ampicillin (50 mg/ml) Roth 0,5 g Ampicillin 10 ml Aqua bidest. steril filtrieren und Lagerung bei -20 °C

Antibiotikalösung Penicillin/Streptomycin/Glutamin Gibco

Chloramphenicol (34 mg/ml) Roth 0,34 g Chloramphenicol 10 ml 100 % Ethanol steril filtrieren und Lagerung bei -20 °C

DMEM/Ham´s F-12 Biochrom

Dropout Supplements (für SD/-LTHA) Clontech –Leu (L) –Trp (T) –Leu/–Trp (LT) –Leu/–Trp/–His (LTH) –Leu/–Trp/–His/–Ade (LTHA)

Opti-MEM Invitrogen

Einfriermedium (Bakterien) Einzelkomponenten unter

2,46 g MgSO4 13.20.2 0,39 g Tris-HCl in 25 ml Aqua bidest. lösen, auf 35 ml auffüllen,

65 ml Glycerin hinzugeben, gut mischen, autoklavieren, Lagerung 4 °C

Einfriermedium (Hefe) Einzelkomponenten unter 738,75 ml YPD 13.20.2 11,25 ml 0,2%ige Adeninhemisulfat-Lösung (sterilfiltriert) 250 ml 25 % Glycerin

Einfriermedium (Zellkultur) Einzelkomponenten unter 4 ml Glycerin (autoklaviert) 13.20.2 16 ml DMEM/Ham´s F12 20 ml Fetales Kälberserum mischen, sterilfiltrieren, Lagerung -20 °C

249

Anhang

Material Bezugsquelle

Fetales Kälberserum (Fetal Bovine Serum) Biochrom 500 ml 30 Min. 60 °C im Wasserbad hitzeinaktivieren, aliquotieren, Lagerung -20 °C

Glucoselösung (50 %) Sigma-Aldrich 250 g D-(+)-Glucose 500 ml Aqua bidest. Aqua bidest. erhitzen, unter ständigem Rühren langsam 250 g Glucose dazugeben, Lösung sterilfiltrieren

HANKs Salt Solution Biochrom

IPTG-Lösung (100 mM) Roth 478 mg IPTG 20 ml Aqua bidest. lösen, für Induktion zu Bakteriensuspension geben

Kanamycin (50 mg/ml) Roth 0,5 g Kanamycin 10 ml Aqua bidest. steril filtrieren und Lagerung bei -20 °C

LB-Medium Einzelkomponenten unter 10 g Pepton 13.20.2 5 g Hefeextrakt 10 g NaCl 0,2 g NaOH-Plätzchen auf 1 L mit Aqua bidest. auffüllen, pH 7,5 einstellen und autoklavieren

LB‐Selektionsplatten Einzelkomponenten unter 500 ml LB-Medium 13.20.2 7,5 g Agar-Agar autoklavieren, auf 50 °C abkühlen lassen, Antibiotikum zugeben, Platten gießen, Lagerung bei 4 °C

SD-Medium Clontech 26,7 g SD-Base 960 ml Aqua bidest. pH 5,8 17 g Agar (für Festmedium) je nach Bedarf beim Ansatz Dropout Supplement gemäß Herstellerangaben hinzufügen autoklavieren, 40 ml 50 % Glucsoselösung (sterilfiltriert) hinzugeben

250

Anhang

Material Bezugsquelle SOC‐Medium Invitrogen

Spectinomycin (30 mg/ml) Sigma-Aldrich 0,3 g Spectinomycin 10 ml Aqua bidest. steril filtrieren und Lagerung bei -20 °C

Trypsin/EDTA (0,05 %) Invitrogen

Ultroser G PALL BIOSEPRA

X-α-Gal Roth 25 mg X-α-Gal 1 ml N,N-Dimethylformamid lösen und jeweils 110 μl X-α-Gal Lösung pro SD/- LTHA Platte mit einem sterilen Spatel ausplattieren YPDA-Medium Einzelkomponenten unter 50 g YPD 13.20.2 15 g Agar (für Festmedium) 985 ml Aqua bidest. 15 ml 0,2%ige Adeninhemisulfat-Lösung (sterilfiltriert) autoklavieren und 40 ml 50 % Glucoselösung (sterilfiltriert) hinzufügen

YPD Plus Medium Zymo Research

YT-Medium 2x Einzelkomponenten unter 32 g Trypton 13.20.2 20 g Hefeextrakt 10 g NaCl in 2 L Aqua bidest. lösen, pH 7,0, autoklavieren

13.20.5. Bakterienstämme, Zelllinien, Hefe

Verwendete Bakterienstämme: Bakterienstamm Verwendungszweck Bezugsquelle E.coli BL21 Proteinexpression Arbeitsgruppe Gießl (Tierphysiologie Erlangen) E.coli DH5α Transformation zur Plasmid- Arbeitsgruppe Gießl Amplifikation (Tierphysiologie Erlangen) E.coli SURE Transformation zur Plasmid- Arbeitsgruppe Gießl Amplifikation (Tierphysiologie Erlangen) E.coli One Shot TOP10 Transformation zur Plasmid- Invitrogen Amplifikation

251

Anhang

Verwendete Zelllinien: Zelllinie Verwendungszweck Bezugsquelle HEK293T Transfektion Arbeitsgruppe Gießl (Tierphysiologie Erlangen) Proteinexpression DNA/RNA Isolation IF, WB, Ko-IP Fibroblasten Transfektion Zytogenetisches Labor (Humangenetik Erlangen) Proteinexpression DNA/RNA Isolation IF, WB WB = Western Blot, IF = Immunfluoreszenz, Ko-IP = Ko-Immunopräzipitation

Verwendete Hefestämme: Hefen Genotyp Mating type Reportergene Referenz Saccharomyces MATa, trp1-901, leu2-3, 112, MAT a HIS3 [253] cerevisiae ura3-52, ADE2 Stamm AH109 his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LacZ (Clontech) LYS2 : : MEL1 GAL1UAS-GAL1TATA- HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA- ADE2, URA3 : : MEL1UAS-MEL1TATA- lacZ, MEL1 Saccharomyces MATα, ura3-52, his3-200, MAT α LacZ [254] cerevisiae ade2-101, trp1-901, leu2-3, MEL1 Stamm Y187 112, gal4Δ, met-, gal80Δ, (Clontech) URA3 : : GAL1UASGAL1TATA- lacZ, MEL1

13.20.6. Sonden (MLPA, TaqMan) MLPA: MLPA-Sonden Design für DYNC2LI1 Exon Sequenz 5‘-3‘ Mix DYNC2LI1-E1_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGATGCTATCACTACTCCGAGCCTGTGACGT B DYNC2LI1-E1_RPO TTGCGGCAGCCAGGCCGTCGACGTGATTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC B DYNC2LI1-E2_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCTCTCATGTAGTGAAACTCTCTGGGAAAT A DYNC2LI1-E2_RPO TGCAAAAGCTGAAGTGGAAAAAAGGGGAATTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC A DYNC2LI1-E3_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGATTGACATTAACGCAGTGTTCCTTCTTTTTTAATTTCCAGG B DYNC2LI1-E3_RPO GAAAGACTACTATTATTCTAAGGTGTCTTGACAGGTAAGTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC B DYNC2LI1-E4_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGAACCACCAAAACCAACCTTAGCTTTGGAATA A DYNC2LI1-E4_RPO TACATATGGAAGAAGAGCAAAAGGGCACAACATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC A DYNC2LI1-E5_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGGTGGAGGAACCTCTTTATTGGACTTAATCAGC B DYNC2LI1-E5_RPO ATACCCATCACAGGTGACACCTTACGGTAAGTGATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC B DYNC2LI1-E6_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGAAAAGTGTTTTTATTTCTTTAGGACGTTTTCTCTTGTTC A DYNC2LI1-E6_RPO TCGTTCTGGATCTTTCAAAACCTAATGATCTCTGGCCCACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC A

252

Anhang

Exon Sequenz 5‘-3‘ Mix

DYNC2LI1-E7_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGACAGGATCATGAATTAATTGACCCATTTCCGGTACCT B DYNC2LI1-E7_RPO CTGGTCATAATTGGAAGTAAATATGATGTTTTTCAGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC B DYNC2LI1-E8_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGATCTGAGAAGAGAAAGGTAATATGCAAGACACTTCGATT A DYNC2LI1-E8_RPO TGTTGCACATTATTATGGAGCATCATTAATGGTTTGTATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC A DYNC2LI1-E9_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGATGTACGTGGAGTTATCAACCAGTTGGCATT B DYNC2LI1-E9_RPO TGGCATTGACAAAAGGTACTGCTAAGATCGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC B DYNC2LI1-E10_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGATAATCAATATGTGTGGATCAGAATAAACCGCT B DYNC2LI1-E10_RPO GTTTATCACAGCAGGATTGGATTCTTTCTACTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC B DYNC2LI1-E11_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTCCTCCTGTTCCTGAAAATGACATTGGAAAGCT A DYNC2LI1-E11_RPO TCATGCCCACTCACCTATGGAGTTGTGGAAAAAATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC A DYNC2LI1-E12_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGACAAGGACCCTGCGAGAGATCCTCAGTATGCTGAAAA A DYNC2LI1-E12_RPO TGAAGTCGATGAGATGAGAATTCAGAAGGATCTGGTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC A DYNC2LI1-E13_LPO GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGTTTTAGGAACTGGAACAGTACAAAAGAAGTTCTTCCA B DYNC2LI1-E13_RPO AGTCTTGGAAACAAATCGAGCTTGATTCTTGAACCTATTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC B

TaqMan Sonden (pre-designed):

Gen Dye Bestellnummer Firma ABCE1 (NM_001040876.1, NM_002940.2) FAM Hs00759267_s1 Life Technologies ACTB (endogene Kontrolle) FAM 4352935E Life Technologies ARHGAP10 (NM_024605.3) FAM Hs00226305_m1 Life Technologies B2M (endogene Kontrolle) VIC 4326319E Life Technologies CEP41 (4 Isoformen*) FAM Hs01026295_m1 Life Technologies DYNC2LI1 (3 Isoformen) FAM Hs00602913_m1 Life Technologies DYNC2LI1 (NM_001193464.1) FAM Hs01005273_m1 Life Technologies DYNC2LI1 (NM_016008.3) FAM Hs01011588_m1 Life Technologies DYNC2LI1 (NM_015522.3#) FAM DYNC2LI1_AJKAK22 Life Technologies DYNLT1 (NM_006519.2) FAM Hs00831821_s1 Life Technologies FZD1 (NM_003505.1) FAM Hs00268943_s1 Life Technologies IFT52 (NM_016004.2) FAM Hs00211198_m1 Life Technologies NEK1 (5 Isoformen**) FAM Hs01591486_m1 Life Technologies PGK1 (endogene Kontrolle) VIC 4326318E Life Technologies RPLPO (endogene Kontrolle) VIC 4326314E Life Technologies TBP (endogene Kontrolle) VIC 4326322E Life Technologies # custom-made, spezifisch für kurze DYNC2LI1 Isoform (AATAGAGTTTTAAAGTAGTGGTTTG) * NM_001257158.1, NM_001257159.1, NM_001257160.1, NM_018718.2 ** NM_001199397.1, NM_001199398.1, NM_001199399.1, NM_001199400.1, NM_012224.2

253

Anhang

13.20.7. Primer

Tab. 25 Primer für NEK1 (NM_012224.2) Sequenzierung Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ NEK1_Prom1_f1_F (*) agactgctgtacatttccaaacc NEK1_Prom1_f1_R (*) agtgaggctgggctagaacc NEK1_Prom1_f2_F (*) agtccctttctcggtgtagtagc NEK1_Prom1_f2_R (*) cgttaccgcctctccaactt NEK1_Prom2-3_F tggaaaagccattcttgttaaatc NEK1_Prom2-3_R ctctcgcataatttatctgaccttc NEK1e1F cccataactcggaatctagagc NEK1e1R caggatgatttttaccattttgc NEK1e2F catgtaagtttgcctttctctcc NEK1e2R ggagtcttttgctttaggttatcg NEK1e3F cgataacctaaagcaaaagactcc NEK1e3R gcgtatgtttttaagcaaaaatgg NEK1e4F tgccctaattcttttgagtatgg NEK1e4R gatgggcaactgaacaaagg NEK1e5F cccagtaacatctcttacattttgg NEK1e5R gcaagcaggagatctaatacagg NEK1e6F tggattgtctcttttcttgatgg NEK1e6R ctcagaacatgtcccaataaagc NEK1e7F tgctctacagtgtatgtcagtcacc NEK1e7R caattcccctcaccatatattagc NEK1e8F gggacagctacttttgtcatttg NEK1e8R ctgggtgttttgaaagaattcac NEK1e9F tttggccctaattttgctacc NEK1e9R agatgtgttctcctcaacactgg NEK1e10F ggcagcataattactactgaaaaagg NEK1e10R cgttctcaaaatatcagctaggc NEK1e11F tcaatgattatgaaaattaaacagtgc NEK1e11R tagaggactggtaaaacacagaagg NEK1e12F1 aatgtaatttggaagagagttatggaa NEK1e12R1 attcgtttgaaagaaataaggaaag NEK1e12F2 ttggaagagagttatggaagtattga NEK1e12R2 aaaagaagttataggtattcgtttgaaag NEK1e13_14F tgccattggtgtactaactttcc NEK1e13_14R cctggccctatttattctttcc NEK1e15F acaaatgaaaaggcaagaaaagg NEK1e15R catatcagatacatgcaggaaagc NEK1e16_17F gcattgaaatttactttttcttttgag NEK1e16_17R atggagaaaacatccacaaagtg NEK1e18F tcattacagagatagtgtttcatcagc NEK1e18R ccacccctggtataaaagatagc NEK1e19F tacatttccattaaccggatttc NEK1e19R cagaatttctctggaacaaatgg NEK1e20F tgttccagagaaattctgagagg NEK1e20R ggagaaagatgaaagaaaaattaaagg NEK1-T203e20F (#) tcatcaataaatggtcagtatttgc NEK1-T203e20R (#) aagttctgaaatccggttaatgg NEK1e21F1 gcccttctttctggtaactcatt NEK1e21R1 tgcgagagagacagagagactg NEK1e21F2 ttttattctaagaccacatgcaca NEK1e21R2 ctgatgtactacccaggaagagc NEK1e22F caatgaaagcgggttatttagg NEK1e22R aaaaacctgaaagggacattagg NEK1e23_24F ggaacaaattaatgaaaaccaaaaag NEK1e23_24R tcagcttctctcaattcttctaagtg NEK1e25F tgccattattcatcattctttcc NEK1e25R caagactaccatttggacaatcc NEK1e26F gcagtaatgcagctttttgaact NEK1e26R gggtgacttgttaggcagtcata NEK1e27F ttgaagagaaaattttacataatggtg NEK1e27R gggacctgggttttaaaatgtc NEK1e28F tatttggtgaggatttgaacagg NEK1e28R aactgaccaaaaactttcactgc NEK1e29F tgctagaatttgtgttacatactgtgc NEK1e29R agaagatggaggtttttgttgg NEK1e30F aagtcacctttggatcctctagc NEK1e30R gaagacataaaagcagaggttaatgag NEK1e31F ttaccggtgaaaaacaatgtagg NEK1e31R taaagttggaaatggttcacagc NEK1e32F acatctctaggagtgttttgattcc NEK1e32R tcatcttcatcttcatgaatagcc NEK1e33F agaggaactgagacttcatctgg NEK1e33R cccaagtagatttcacaaaatgg NEK1e34f1F tcctttagcatgaacaagaatgg NEK1e34f1R tttgctgaaactcaaagttaccc NEK1e34f2F cagatttaagatggactttcttattgc NEK1e34f2R actgtttctacagcctgtgtgc NEK1e34f3F ggtttttcaatggagtctttaagc NEK1e34f3R acttggcatattgtgattgaagc NEK1e34f4F tttctctttaaggaccagaaccag NEK1e34f4R tcaacatactgatagtgctgcaag NEK1e34f5F acacagcttcaatcacaatatgc NEK1e34f5R aatcatgcccatctttcagg NEK1-T203e36F ($) tattttgggaaatgaacatcagc NEK1-T203e36R ($) gctggaatcacaagcataaacc (*) PCR nur mit GC-Rich Kit möglich, (#) für Exon 19 bzw. 20 der Isoformen NM_001199398.1 bzw. NM_001199397.1, ($) für Exon 36 von ENST00000379072 (liegt im Intron 33 von NM_012224.2), aber dieses Ensembl Transkript ist nicht mehr in der Datenbank annotiert (Stand: August 2016).

Tab. 26 Primer für NEK1 (human: NM_012224.2, murin: NM_175089.4) Hefeteile Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ 123_Primer hNek1 Anf For atggagaagtatgttagactacag 181_Primer hNek1 Teil1 Ende Rev mSt ttattctttttcaataaattccag 182_Primer hNek1 Teil2 For gaaaggaggaaaatatctgag 183_Primer hNek1 Teil2 Ende Rev mSt ttaggatgtatctagtgttaactc 184_Primer hNek1 Teil3 For acttttgagataaatgttcat 185_Primer hNek1 Teil3 Ende Rev mSt ttatgaacatgtccttaacatctt 186_Primer hNek1 Teil4 For gaagaatcctttgcatttcga 187_Primer hNek1 Teil4 Ende Rev mSt ctattcatcattatcttcttggtaggc 95_Nek1mm_Entry_For 143_Nek1mm_Entry_Rev mSt atggagaagtatgtgagactgcag ttattctttctcaataaattccaa (Teil 1) (Teil 1) 144_Nek1mm_Entry_For_1060 145_Nek1mm_Entry_Rev_2190 mSt gaaaggaagaaaatgtctgag ttaggatgtatccagtgtcactgc (Teil 2) (Teil 2) 146_Nek1mm_Entry_For_2059 147_Nek1mm_Entry_Rev_2991 mSt tcttgtgagaccgttggtcac ttatgagcaggtcctcagcatctt (Teil 3) (Teil 3) 148_Nek1mm_Entry_For_2883 96_Nek1mm_Entry_Rev mSt gaagaaccaattccaattcga ttattcatcattatcttcctgataggc (Teil 4) (Teil 4) Für hNEK1 full-length Primer 123 & 187, für mNek1 full-length Primer 95 und 96 kombinieren

Tab. 27 Primer für NEK1 (NM_012224.2) Antikörperregion Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ 91_Nek1h_AKR2_pGex_For gatcggatccaatcattctgaaggacaagaa 92_Nek1h_AKR2_pGex_Rev tcgactcgagtcaatcagagagattctgctttcc BamH1 mSt XhoI 10pGex5_FP (pGEX-4T3) aacgtattgaagctatccc 09pGex3_RP (pGEX-4T3) tcaagaattatacactccg

254

Anhang

Tab. 28 Primer für NEK1 (NM_012224.2) Plasmid Entry TOPO Sequenzierung Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ hNEK1-pENTR221_F1 ctggcagttccctactctcg hNEK1-pENTR221_R3 cccctccctcacagtaatcc hNEK1-pENTR221_F2 cgctagcatggatgttttcc hNEK1-pENTR221_R13 ctgatagtgacctgttcgttgc hNEK1-pENTR221_F4 agcgaataaatgctcagaaagg hNEK1-pENTR221_R14 gtaacatcagagattttgagacacg hNEK1-pENTR221_F5 cctatgatctccgcagtttgg hNEK1-pENTR221_F6 aggaagcagcaagaaagagaag hNEK1-pENTR221_F7 gcaggtcatcaccattttcc hNEK1-pENTR221_F8 gaacaactagaacgaaagagaaagg hNEK1-pENTR221_F9 ggtcaacttgtgattcctctgg hNEK1-pENTR221_F10 tggaacaaacaaagatgagagc hNEK1-pENTR221_F11 tcagaacccttatggatgttcc hNEK1-pENTR221_F12 agaggaactgagacttcatctgg

Tab. 29 Primer für Vektorsequenzierungen Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ 10pGex5_FP (pGEX-4T3) aacgtattgaagctatccc 09pGex3_RP (pGEX-4T3) tcaagaattatacactccg GW1 F (Entry TOPO) gttgcaacaaattgatgagcaatgc GW2 R (Entry TOPO) gttgcaacaaattgatgagcaatta M13F (Entry TOPO) gtaaaacgacggccag M13R (Entry TOPO) caggaaacagctatgac T7 Promotor F taatacgactcactataggg P2Gal4AD_R(neu) cacgatgcacagttgaagtg 01_Primer For agtagtaacaaaggtcaaagacag pBD GAL4/Dest 02_Primer For atttcaagctataccaagcataca pAD GAL4/Dest 11(80)pAD-GAL4 2.1 DEST tattcgatgatgaagataccccaccaa (1964-1990)F 12(81)pBD-GAL4 CAM agtaacaaaggtcaaagacagttgact DEST (843-869)F TapTaqNTerm_17Fneu gattataaagatgatgatgataa

Tab. 30 Primer für Hefe-PCR Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ 7848 For ctatctattcgatgatgaag P2Gal4AD_R(neu) cacgatgcacagttgaagtg T7 Promotor taatacgactcactataggg

Tab. 31 Primer für IFT80 (NM_020800.2) Sequenzierung Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ IFT80e1F ggcgcctaaaatacaaactcg IFT80e1R cgaagcacacagcttcaaaac IFT80e2F1 cttgatgtcagaaggactgaagg IFT80e2R1 ttatagcaaacggttcactttgg IFT80e2F2 tggaaattctttacctgaccaga IFT80e2R2 acagccactaaaggaatgaaaaa IFT80e3F tcatgtggtcagatcttttctcc IFT80e3R aaaaatatgcagatccacaaatacc IFT80e4F atttgcctttatgcctttagtgc IFT80e4R ggattggaaacagacagaatgg IFT80e5F1 gagactgcagtgacaaaggaaac IFT80e5R1 aagtcagtctcaaccaccgtattag IFT80e6F1 ttgctcacagtagattttcaaagg IFT80e6R1 tgttctgtaataaaggctgattaaacc IFT80e7F1 acaaatgaaacaagcaaatgagg IFT80e7R1 tttatgaagtccatgctttaaaatacc IFT80e8F1 tcttttagtttttgcaaacttctcc IFT80e8R1 tacttcatccttcacaatcatgc IFT80e9F1 attcttttaaaaatgatcttattacgttg IFT80e9R1 tgggcattcaggttctatatctg IFT80e10F tttttgtgtttcaaaatcttgct IFT80e10R aactgttgatgtacaaacctcgtt IFT80e11F1 tgctttttagttggggatacaga IFT80e11R1 ttctaaaatgtaaaatagaaacagattgg IFT80e12F1 aaaacaaaccaaaacaaccaatg IFT80e12R1 tttttcctgattactgatctttgatg IFT80e13F1 ccacattaataaattaaaattggatgc IFT80e13R1 tcctatcacaaactttaccagtgc IFT80e14F1 agtgcagcttttgaacgattaac IFT80e14R1 gatcaaaacattaaaacatttccaga IFT80e15F attgtttggtatgtgtttttcacc IFT80e15R tcacactgagaaaactacctgagc IFT80e16F1 gagactccgtgtgtatttcacg IFT80e16R1 gcaacatgtattcctctgtattgc IFT80e17F1 tgcttattttaaggcagttcagtc IFT80e17R1 cagattttggaactgatggaaag IFT80e18F1 tttactttaggagcaaaccatgtg IFT80e18R1 gtagatggaaaaatacattaaggtcaa IFT80e19F gtggaataaacagagggaagagc IFT80e19R atcaaatagcacccaaccttagc IFT80e20f1F tctatctgtttactcttagttactttggag IFT80e20f1R cttttggaggcattttacaattt IFT80e20f2F catgcagaaagatgaaacacaaa IFT80e20f2R gtttctgtgaacttgcctatgct IFT80e20f3F agcagcattactggaatagcaaa IFT80e20f3R atcaaacaagtttgtcacccaag IFT80e20f4F ttctgtttgggatgaacaaattc IFT80e20f4R tccaatattccggaaaagaaaag IFT80e20f5F tgaatttgtgaaaatttccttgg IFT80e20f5R tgtgggatctgtttctaattctagg

Tab. 32 Primer für DYNC2H1 (NM_001080463.1) Sequenzierung Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ DYNC2H1_Prom_F aacgatgttgggaaatgcag DYNC2H1_Prom_R gaagggaagagaggagctttg DYNC2H1e1F gatagcctccgcgagctt DYNC2H1e1R catctaagccaataatgcaggag DYNC2H1e2F ttcttaaggaaagaagagataaattgg DYNC2H1e2R atgttgagttgatgtggattgc DYNC2H1e3F taaaatgcaatccacatcaactc DYNC2H1e3R cctatgctcagagaaattccaaa 255

Anhang

Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ DYNC2H1e4F agtgtcacctatttgacctcagc DYNC2H1e4R gttttggatttctcaattcattttac DYNC2H1e5F tagagttgtggcagttgaaaagg DYNC2H1e5R gacacatatgatttataccacccaac DYNC2H1e6F atgcatgtggtatttcatagatcc DYNC2H1e6R actaatttccagcagatgtatagtgc DYNC2H1e7_8F tctggactagagtttcagttttattgg DYNC2H1e7_8R atcccaacggatcaactcag DYNC2H1e9F atgtagcccttgtggaaagc DYNC2H1e9R tttaatcctaaatggtatgcaacg DYNC2H1e10F gatacatttttctgacattttcatgc DYNC2H1e10R aaaattagacagacatgccaagg DYNC2H1e11F ttctgaatcacagatcagagaagg DYNC2H1e11R ggaacagacaagagaaacaagagg DYNC2H1e12F3 atggaattggattctaatgatgg DYNC2H1e12R3 ctggcagtgctattctatgagc DYNC2H1e12F4 tttggatattgcagtttgtttcc DYNC2H1e12R4 tgtttaagaataattgcttgcttgc DYNC2H1e13F gccctattggagatgaaaaacc DYNC2H1e13R gtgggaaaggtctaaggaagc DYNC2H1e14F tgccagactgccttatcatttat DYNC2H1e14R aaatgggaattgtgatttctctg DYNC2H1e15F cccttctcagtacattggtcaag DYNC2H1e15R ggcattccataagacactacagg DYNC2H1e16F ttatacggagagtaacaaggatgtacc DYNC2H1e16R ccactcccttaaactgatttgg DYNC2H1e17F cttagaagcacttaatgagaatttgc DYNC2H1e17R attttaatgttatgccacacaagg DYNC2H1e18F ttctgtttattctttaggctgtgc DYNC2H1e18R atctggaggaggcaagaagc DYNC2H1e19F gtgcttaaagatcaccatattactgc DYNC2H1e19R cctaatgattgaatatggacttttcc DYNC2H1e20F cgtgaaacaactaaactttcatgg DYNC2H1e20R taagccagactattgtggacctc DYNC2H1e21F ttttctgccaaatcagaatatatagg DYNC2H1e21R agggaggtcaatttcaacagc DYNC2H1e22F cctttgaaaagttgacattggtc DYNC2H1e22R gcctttcttgaaatttgctttc DYNC2H1e23_24F cacacatacaaggattgcagttaag DYNC2H1e23_24R ttttcttcatcaaacggaataattt DYNC2H1e25F3 aaatatgtgagaggggagcatc DYNC2H1e25R3 gccagaatgcaacactaaaagtc DYNC2H1e25F4 caaagggtaatttgtgtgtgtcc DYNC2H1e25R4 atactttaaggtcggcagctttg DYNC2H1e26F gccttatggtgaaaagccaga DYNC2H1e26R tgcctgtattaagcacttcacaa DYNC2H1e27F acctttagttcattttaagcaggtaa DYNC2H1e27R gaatcactgatgggttggtagac DYNC2H1e28F tgatcagcttcaaagatgtcaga DYNC2H1e28R caatcaccagaattgtcacactg DYNC2H1e29F cacaaatttcaccagtgaatcc DYNC2H1e29R catttttaagatatgagctgagtttcc DYNC2H1e30F ccccgtcttgaaataacagtatagag DYNC2H1e30R tggaaccaggaagctattagatg DYNC2H1e31F tgagttctgtgaagtaggcttgg DYNC2H1e31R cctcgagtaatcaccaacacag DYNC2H1e32F ccatttaaattcatggagaaatcac DYNC2H1e32R ttcttatgtgacacctttctaattctg DYNC2H1e33F tcttgaaaaataagtttgatttcagc DYNC2H1e33R ggactatactacgtacaacctctgtcc DYNC2H1e34F ggaaaaatcttctgttcatttcaga DYNC2H1e34R attttaattctttaaattcccaacat DYNC2H1e34F2 (*) tgtaaaatggacagaggttgtacg DYNC2H1e34R2 (*) agattagaaacacggatgtcagg DYNC2H1e34F3 (*) tggcaaagaaataattttaaatacaga DYNC2H1e34R3 (*) gaaacacggatgtcaggagaa DYNC2H1e34F4 (*) tgcattattttgtttatcccttga DYNC2H1e34R4 (*) aagggtaagaaacctcagaaacg DYNC2H1e35F ataaactctgcaaagcagtgtagg DYNC2H1e35R catcagaataaaaatcatgcaatagg DYNC2H1e36F gctttatcctacccttgagaacc DYNC2H1e36R gtcaggtaaaaactggagaaaacc DYNC2H1e37F agtcttggtaccctgtgatctga DYNC2H1e37R tcaactaggaaaagggatcaatct DYNC2H1e38F tctattacattttaggcaataccttcc DYNC2H1e38R actgaaaatgatagcatgtcttgg DYNC2H1e39F ggaataaaaatacctaagccttgc DYNC2H1e39R aaagaagttaatcataaatgggaaaaa DYNC2H1e40F aaagtaactaaagccaccttttgtatg DYNC2H1e40R gtagcagtgacaaaatccacctc DYNC2H1e41F tggttcttgaaaaggtatgtgaa DYNC2H1e41R caaacatcataaaataactcaaaggag DYNC2H1e42F ttggaactaagatgatttacttttgg DYNC2H1e42R tcttctcagattgctgtctttcc DYNC2H1e43F cagtcctcacaatgccttaaaac DYNC2H1e43R tagataaaactggccccaaatg DYNC2H1e44F gcatttagaaataattgaaacttaggc DYNC2H1e44R tgcctatattttgagaagggtagg DYNC2H1e45F gaatttggttgaaatgagaatgg DYNC2H1e45R tttgagctgacagcagaataacc DYNC2H1e46F acaggtagaaattggtattcctctg DYNC2H1e46R ttcccaaaaggaagttttaatagtg DYNC2H1e47F cctttcttccatttatctgatgc DYNC2H1e47R caatgtaaaacagtatggcctgaac DYNC2H1e48F ccttctggagatgatcttatttgg DYNC2H1e48R tctatgtaagtacaggcacatctcg DYNC2H1e49F tgagtgtgagatgatatgtagtcacttt DYNC2H1e49R aaaaatgtaattttctaataatcatgga DYNC2H1e50F cttaggggttggatttactttcc DYNC2H1e50R agcatgtttaacaccatgtctcc DYNC2H1e51F tggaggaagatggaaaaataacc DYNC2H1e51R ctttgcaatctaatgacaaaataagg DYNC2H1e52F gaaacaactcctactatttcatttgag DYNC2H1e52R tttggtgccataattaaggtgat DYNC2H1e53F tgtgtgtcaaaatgttgtcttgg DYNC2H1e53R tgggttctaggttaaatgacatacc DYNC2H1e54F tagttgtctaggaatgcctgtgc DYNC2H1e54R gaaagtgagactgttttccaagg DYNC2H1e55F ttgtttttctttaaaacctctgtgg DYNC2H1e55R aaagagtttacataagttgcacatgg DYNC2H1e56F tgaaacctttctgatagaaaatatgg DYNC2H1e56R ccattaatttatacttttcctggaagg DYNC2H1e57F caaattaggttattgcagttgtgg DYNC2H1e57R cacccatgtatttagatgaagtgc DYNC2H1e58F tgcatacaccattttgttaaactga DYNC2H1e58R aagcataccaggacagttgaaag DYNC2H1e59F tttatttgggtcaagttaataagtgc DYNC2H1e59R aaaggaacttttacctagccttcc DYNC2H1e60F ccatttttatccagaaatttacacg DYNC2H1e60R tatagactactgggtcccacagc DYNC2H1e61F gaaagacagatgggatgtttagg DYNC2H1e61R gcaaattaatggatctttctctcc DYNC2H1e62F gtgattgggatgaaaattctgc DYNC2H1e62R ttcagcaaatctaaagtagctaggg DYNC2H1e63F ggaagaatgggtttcaagtaagg DYNC2H1e63R atattttgccatcaaaagaatgc DYNC2H1e64F aaatgaaagctcaacatttttgg DYNC2H1e64R gcacaatgatgtggttagtaaatagc DYNC2H1e65F tcatggttgtatatttgtgttctcc DYNC2H1e65R ctccaagctaacttaaaagctcctac DYNC2H1e66F ccattcaatgtgtgattctgaac DYNC2H1e66R agtaagcccatcatgtgtgactc DYNC2H1e67F cgtcttagactctgtcgaaaagc DYNC2H1e67R tgacattagcatcaaatgtacagg DYNC2H1e68F atttgtaatagtctgtcaaacacaagg DYNC2H1e68R cattgctcattaagatcttgtattcc DYNC2H1e69F tgccataaacatcaaatgaatgac DYNC2H1e69R aacactccttatcctcagtgtgc DYNC2H1e70F catcatcttcatttgttttatgtgc DYNC2H1e70R aaagtgttacatgtggtcttttgg 256

Anhang

Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ DYNC2H1e71F tgattgtaattttcatttcttgaaagc DYNC2H1e71R ccagttaaatgttctggaaaaatacc DYNC2H1e72F ttttgtgtgccaaattttaacg DYNC2H1e72R ttgccctaagtaagtgaacttgg DYNC2H1e73F ttattagcaacaaatagcctgtgg DYNC2H1e73R gaacacctctgaagcaaattatacc DYNC2H1e74F caacattttcctaaatggttctcag DYNC2H1e74R ttttactgggggaacttacatcc DYNC2H1e75F ttcacaaggtggagatagctagg DYNC2H1e75R ggcgtgatttaattgtcaataagg DYNC2H1e76F ttttgatgataggcttgaggaag DYNC2H1e76R agccgagaattatttttctaaaacag DYNC2H1e77F tcagtcttctcttgcattgtgg DYNC2H1e77R gcaatagcaaaaacaaaaacagc DYNC2H1e78F aaagccagttaggaaggtttagg DYNC2H1e78R aaatgtcttggcttctcttatatgc DYNC2H1e78F1 gtcaaggtcaagctgatttagca DYNC2H1e78R1 ctaagcttccctgtcaatcttca DYNC2H1e78F2 tggcaggaaggttaaactattca DYNC2H1e78R2 cagaactggcagccaagatac DYNC2H1e79F aaggctggtagtttaggcatagc DYNC2H1e79R gagtactgctttcatacaactggtg DYNC2H1e80F aatttaactcaaacccggtaagc DYNC2H1e80R catgcccagctaattttgtattt DYNC2H1e81F acttttcatgctatggccagtta DYNC2H1e81R ccagaaagaagaatccatgtaaaaa DYNC2H1e82F tccctatcccttaggaaggtttc DYNC2H1e82R aactgtgaataattacttgtgcatttg DYNC2H1e83F tccctttgtatgtgggagttatg DYNC2H1e83R tggaatgtgttgtgaaaataaaatg DYNC2H1e84F ccaaataacaacaacaaatgaagc DYNC2H1e84R tgtatgactcaggcagaaatgg DYNC2H1e85F accgctttaaatgttgaggaac DYNC2H1e85R tgatggaggagtcacttataacaatg DYNC2H1e86F ttcaggaacttgtactttccttcc DYNC2H1e86R tgatgattcagtgtcagttaccg DYNC2H1e87F gcaaggaatcgtatttaagatgg DYNC2H1e87R acaatcaagggcagtgtaatagg DYNC2H1e88F ttgaaaatttagtgtgaactctgaca DYNC2H1e88R atccccaagattcttatgtttgc DYNC2H1e89F tgaacacaatggaaagcatagc DYNC2H1e89R caaggttttcaaatgtcttgtgc DYNC2H1e90f1F tccttggttatctaataatctgtttcc DYNC2H1e90f1R ttttgagccactggaaaagtg DYNC2H1e90f2F aaagggaacattgattctttaagc DYNC2H1e90f2R gaatttatcctccattattatgtcacc DYNC2H1e90f3F tggctcaaaaatttgttttaggt DYNC2H1e90f3R tatcctgtagtcccagctacgag (*) Alternativprimer zur vollständigen Abdeckung der Exon/Intron Grenze (nur Patienten-DNA 149044, 142534)

Tab. 33 Primer für Test-PCR cDNA-Synthese Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ GAPDH F gtggagtccactggcgtcttc GAPDH R ctccgacgcctgcttcaccac PPIH_RT_F tcacctgctctaagtgcgat PPIH_RT_R actacatctccccacactgc

Tab. 34 Primer für TTC21B (NM_024753.4) Sequenzierung Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ TTC21Be1F (*) cttttccagctgcactctcc TTC21Be1R (*) acaaaagtaaacacaaccaacagc TTC21Be2F tgcctgaattttacattattctagatg TTC21Be2R tgggcatatatcagtgcaagtag TTC21Be3F ccagtcttcaggttttatcatgc TTC21Be3R cctgatgaatttacacccttgtc TTC21Be4F ttgccttgttaattatctgacctatt TTC21Be4R gggatctttgaagactcagtagc TTC21Be5F tgtagtatagttcccaagacactaggc TTC21Be5R tgagctacttggttttgtcagg TTC21Be6F aaaagtgataactgctcctcacag TTC21Be6R attcacagatgtcgctttttctc TTC21Be7F acagtggaatagtgaggcaagc TTC21Be7R ctacacaggagtttcatacagaaagc TTC21Be8F atggaatattatgggtgtcttcg TTC21Be8R ctccatcaggttcttacagttgg TTC21Be9F tcagtagaaatgttagactttgaaatc TTC21Be9R gagtgtgggcagtagagaac TTC21Be10F gaagaacacatggattttgtgg TTC21Be10R gttttgaatggaggtaaataaatgc TTC21Be11F ttgaacaaataattgcatatcagtagc TTC21Be11R ttaaaagcgatttcaactaacatagg TTC21Be12F agagccattatttgcattgtctg TTC21Be12R cgcttaagccacacaagtttatag TTC21Be13F tttattggcctctcagtaacacc TTC21Be13R tgcaactgttagcaaaatactacagg TTC21Be14F tttcctgaatccgatttaatgtg TTC21Be14R tgggcagcttttcattttctac TTC21Be15F atgtactagcatttattcattctgc TTC21Be15R atgtatcaaaatataatgggttaagac TTC21Be16F tgcatttcagaaaatggaaagat TTC21Be16R ccttttaataggaagttgtactcatca TTC21Be17F atccttcagccctctataactgg TTC21Be17R aagaaggcctttaacacaaatcc TTC21Be18F taattgacaggcaggtgtatgc TTC21Be18R acgcatgtatttatataaccaaccac TTC21Be19F attcttcaggcaactgattgag TTC21Be19R gagattgctttcctcttatacatgg TTC21Be20F tctaggctcgagaattacaagc TTC21Be20R tgcaccctgcctacatcttc TTC21Be20F3 attatgctgtgtgtgagttacgg TTC21Be20R3 (Seq) tctgaggaaattagaagacatctgg TTC21Be21F ttattgcaatgacttttggtcaac TTC21Be21R aagggcatgtaaaagcctgac TTC21Be22F aaatacaattttgcaagcagagc TTC21Be22R cagtaggattaccaggtttgtgc TTC21Be23F tgtgcaattaaatcggtattcct TTC21Be23R gatttaccaaagatacagtcctttaca TTC21Be23F3 (Seq) atggtgcccatatctgaagtatt TTC21Be23R3 tctgtctggtaaataaaactgttgaa TTC21Be24F ttcaacagttttatttaccagacaga TTC21Be24R caaataactcaccccaggtctc TTC21Be24F2 (Seq) cactggagaaccaaatgatgc TTC21Be25F agagtataaaagagtgcccagagc TTC21Be25R caacacaacaaaacagtaacatcg TTC21Be26F caattatcttgaccacacagtgc TTC21Be26R atgcttgtttcctgattgtgg TTC21Be27F aaatgggttgatatgattgacctc TTC21Be27R tgtgaaaaatctaggtgattgcca TTC21Be28F tagtttggttgttcattcaccag TTC21Be28R cactgataatctccctaaacatactga TTC21Be29f1F caccattaaaaagtgttatagctgttg TTC21Be29f1R caaaaacactttaaaagagaacaatgc TTC21Be29f2F tcctaatggagttgaatgagagc TTC21Be29f2R ttccaatttttgaaacaacacag TTC21Be29f3F gcattgttctcttttaaagtgtttttg TTC21Be29f3R accaccacccattaacattacag (*) PCR nur mit GC-Rich Kit möglich, (Seq): PCR-Produkt nur in eine Richtung sequenzierbar

257

Anhang

Tab. 35 Primer für WDR35 (NM_001006657.1) Sequenzierung Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ WDR35e1F aacaggactagcccagctacc WDR35e1R agactgaggctctgggaacc WDR35e2F gccgttcgtttttcttcttg WDR35e2R ccgatgtttacattcaacattctc WDR35e3F tatgctcttttgatcccttgtaa WDR35e3R aatgttgacatttctgcattaagta WDR35e4F tgtctttactgggatgaaataggg WDR35e4R tgaaaagtaggcagcaataaatcc WDR35e5F ctcaggttgtagaaaactttgcag WDR35e5R aacagatggttaaaatcaaagaacg WDR35e6F atgaatgctgtgaagaatttgtg WDR35e6R aagactttaattacacaaaccgcc WDR35e7F tggggaaaatggacatttagg WDR35e7R tttaaacagaaaaattccttactttgg WDR35e8F gctacgtattttcccacagtgac WDR35e8R tttcctctaccttactcactgcac WDR35e9F cttttcacaaaataatgttcataccac WDR35e9R tttctgctagctcctaaaacaagac WDR35e10F ggttgaatctgtcttctatttctgaag WDR35e10R acccaatgttttgatgtacttgc WDR35e11F ttaaaacaatgtgatgtaaaatgtgc WDR35e11R ttctgaagtcccctcatattgc WDR35e12F tttcatcagttatttcccagttagc WDR35e12R tggtactggatctgacaaagtagg WDR35e13F ttctgatttcagagactgtgtatgg WDR35e13R gtaagtgaggacagccatttcc WDR35e14F atgtttttggtacagctttcagg WDR35e14R ggagaggaggagttatgttttcc WDR35e15F tgctgtctgtttctcttttaggc WDR35e15R tctcagtctggtctccatttcc WDR35e16F gaatttgtgtattgccaaagtgc WDR35e16R agttcataatagacacgcccatc WDR35e17F tgataatctgattttgaagaagaatgg WDR35e17R tttttaaaatccacagaaatgttcc WDR35e18F cagccaagaagttaaaggaagc WDR35e18R ctgggtccacactgctaacc WDR35e19F tttacttttaggatccagaacatcc WDR35e19R catcttaaaaagaagagcaagaatgg WDR35e19F3 tttctcttccttattttgctcaca WDR35e19R3 (Seq) ggtgtggattgtcctctatgaac WDR35e20F cccctactatcctcctgatgg WDR35e20R gaactgatagagtactcagggatgc WDR35e21F aggctaagttcctaaagtgtttgg WDR35e21R gctcatctcacaacttcacagg WDR35e22F ttctgaagctgaagataatgaacag WDR35e22R aagcatcattccatgtctaagaaac WDR35e23F tcgttaaaaatcagatccacagc WDR35e23R cctcatggtagcactttaagagg WDR35e24F tgcttataggacttatgttgctgtg WDR35e24R cagaagcaataaaaccagagtgg WDR35e25F gggaatcaaatttgttagttttgg WDR35e25R caatgatgtaatgttatttaacgtgct WDR35e26F tgactgttgttatttgggagttg WDR35e26R tgttattgaaggccacataaagg WDR35e27F tttcataggatgagctgttagcc WDR35e27R cttcaaaattcagtgctttaattcc WDR35e28F tttaagtgtattaaataaagttagact WDR35e28R acaaaactcacagaaataaacctt (Seq): PCR-Produkt nur in eine Richtung sequenzierbar

Tab. 36 Primer für DYNC2LI1 (NM_001193464.1) Sequenzierung Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ DYNC2LI1_E1F cccttggcatatagttgacacc DYNC2LI1_E1R tttatgctcaaggctgattcc DYNC2LI1_E2F gaatgactaatcctcagatgttttacc DYNC2LI1_E2R tcatgctaaaccagattggtca DYNC2LI1_E3F cactgtgatggaaagttgacagtt DYNC2LI1_E3R tttctccctcaaatagggaaatc DYNC2LI1_E4F atccactaagacggtgttttgc DYNC2LI1_E4R tgttttcacagtttgggttgg DYNC2LI1_E5F attttgagggatgggataaagg DYNC2LI1_E5R ttctttgaaagcattacaggttagg DYNC2LI1_E6F ggagtcttagaataatgctacggttt DYNC2LI1_E6R ggccaggatggtcttgat DYNC2LI1e6_F1 agataaatttcagtacattaggatttcaa DYNC2LI1e6_R1 acagagtgatggtgaaggctatt DYNC2LI1e6_F2 ttgctgtttgggattattactgg DYNC2LI1e6_R2 tgaagaacttgtgttaccatcatagc DYNC2LI1e6_F3 agatgaacctgttcactggaaaa DYNC2LI1e6_R3 ctgctacactttcttataaactctgga DYNC2LI1_E7F agggaattgccatttctagtttt DYNC2LI1_E7R tctgtcccaactatgtcttttcc DYNC2LI1_E8F ggtaatggaatcctattcctgaaa DYNC2LI1_E8R agaccatctagcagtgcatgttc DYNC2LI1_E9F tttgaagaacgagttaaagttaccaa DYNC2LI1_E9R tgaaattatcccctttatgttgagt DYNC2LI1_E10F gctccctgatttcttttacttcc DYNC2LI1_E10R cacaaacatgtcaatgtgatgc DYNC2LI1_E11F agtactagaatctgtcccagtgacc DYNC2LI1_E11R ttgaaagtggagcaggaacc DYNC2LI1_E12F agagacaactgaaaggggacct DYNC2LI1_E12R tggaaaatcaaaaaggtttatgtg DYNC2LI1_E13F ctgcttagccacacagaaactct DYNC2LI1_E13R tctcctatttcaggtgcttcttg Exon 6 F1/2/3 & R1/2/3: Abdeckung des in der kürzesten Isoform 2 (NM_015522.3) verlängerten Exon 6 mit alternativer 3‘UTR

Tab. 37 Primer für DYNC2LI1 (NM_001193464.1) Klonierung Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ DYNC2LI1_Iso4_Start_TOPO_F1 atgcccagtgaaactctctgg DYNC2LI1_Iso4_Stop_Topo_R1 tcaagaatcaagctcgatttgtttc DYNC2LI1_Iso4_Start_TOPO_F2 atgcccagtgaaactctctggga DYNC2LI1_Iso4_Stop_Topo_R2 tcaagaatcaagctcgatttgtttccaa DYNCL2I1_Iso4_Intern_Seq_F gctaaagcagtttctgaaatgaga DYNC2LI1_Iso4_Intern_Seq_R atgatccttcggcatattattcc

Tab. 38 Primer für DYNC2LI1 (NM_001193464.1) Splicing RT-PCR Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ DYNC2LI1_RT_5UTR_F_a gattctaggctggtcactactcc DYNC2LI1_Iso4_Stop_Topo_R2 tcaagaatcaagctcgatttgtttccaa DYNC2LI1_RT_Ex8_F cttcgatttgttgcacattattatgg DYNC2LI1_RT_Ex2_R atttttctgcaatttcagctccatca DYNC2LI1_RT_Ex10_F atcaatatgtgtggatcagaataaac DYNC2LI1_RT_Ex4_R tgtgcccttttgctcttcttc DYNC2LI1_RT_Ex12_F ctgaaagatatcaaggaccctg DYNC2LI1_RT_Ex6_R catggtgggccagagatcat DYNC2LI1_Iso4_Intern_Seq_F gctaaagcagtttctgaaatgaga DYNC2LI1_Iso4_Intern_Seq_R atgatccttcggcatattattcc

258

Anhang

Tab. 39 Primer für EVC (NM_153717.2) Sequenzierung und Splicing RT-PCR Primer forward Sequenz 5’→3’ Primer reverse Sequenz 5’→3’ 8161_EVCe3F tggcattttggaaaaacttg 8162_EVCe3R agtccagggctctgtgaatg 8163_EVC_RTe1/2F cGACACCAGaaagacgacac 8164_EVC_RTe6R AAGAAGGTCAAGGAGGCACA 8179_EVC_RTe7F ggctgatgtggaaaagaagg 8180_EVC_RTe11R tccaggacctcatgaaaagc

13.20.8. Antikörper

Primär-Antikörper Herkunft Methode Verdünnung Bezugsquelle Acetyliertes Maus IF 1:800 Abcam (ab24610) alpha Tubulin Beta-Actin Kaninchen WB 1:1000-1:3000 Abcam (ab8227) DYNC2LI1 Maus IF 1:100 Santa Cruz (sc-376645) WB 1:500 DYNC2LI1 Kaninchen IF 1:100 Acris (15949-1-AP) WB 1:500 Ko-IP 15 µl GST Ziege WB 1:10000 GE Healthcare (27-4577-01) IFT 57 Kaninchen IF 1:100 Proteintech (11083-1-AP) IFT 88 Kaninchen IF 1:200 Proteintech (13967-1-AP) IgG from rabbit serum Kaninchen Ko-IP 0,5 µl Sigma-Aldrich (I8140) NEK1-H3T1 Kaninchen IF 1:250 In dieser Arbeit hergestellt WB 1:1000-1:2000 (4.16); publiziert in [8] Ko-IP 6 µl PCNT (MmPeriC1) Kaninchen IF 1:500 PD Dr. rer. nat. habil. Andreas Gießl

(Tierphysiologie Erlangen) [255] Polyglutamyliertes Maus IF 1:1000 AdipoGen Tubulin (GT335) (AG-20B-0020-C100) WB = Western Blot, IF = Immunfluoreszenz, Ko-IP = Ko-Immunopräzipitation

259

Anhang

Sekundär-Antikörper Markierung Methode Verdünnung Bezugsquelle Ziege anti-Maus Alexa Fluor 594 IF 1:500 Molecular Probes Ziege anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 IF 1:500 Molecular Probes Ziege anti-Maus Alexa Fluor 488 IF 1:500 Molecular Probes Ziege anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 IF 1:500 Molecular Probes Ziege anti-Maus Cy5 IF 1:100 Dianova Ziege anti-Maus HRP-gekoppelt WB 1:10000 Sigma-Aldrich Ziege anti-Kaninchen HRP-gekoppelt WB 1:10000 Sigma-Aldrich Zenon IgG1anti-Maus Alexa Fluor 568 IF 2,50 µl (= 1:40) Invitrogen DAPI IF 1:50000 Serva WB = Western Blot, IF = Immunfluoreszenz, HRP = Horseradish Peroxidase

13.20.9. Vektoren und Vektorkarten

Vektor Bezugsquelle NEK1-pENTR221 (Insert hNEK1 NM_012224.2) Invitrogen Nek1-pENTR223 (Insert mNek1 BC-167181) Imagenes-Bio NEK1-CRISPR-Vektor (Lentivirales Plasmid) Sigma-Aldrich U6-gRNA/EF1a-puro-2A-Cas9-2A-GFP pCR8/GW/TOPO Invitrogen pDEST27 (GST) Invitrogen pDEST/N-SF-TAP PD Dr. rer. nat. habil. Andreas Gießl pAD-GAL4-2.1/DEST Dr. Elöd Körtvely, München pBD-GAL4-Cam/DEST Dr. Elöd Körtvely, München pGADT7-T (Hefe Positivkontrolle AD) Clontech pGBKT7-53 (Hefe Positivkontrolle BD) Clontech pGEX-4T3 GE Healthcare pENTR221 (gekauft mit humanen NEK1) pENTR223 (gekauft mit murinen Nek1)

TOPO-Entry Vektoren mit hNEK1 bzw. mNek1 Insert für anschließende LR Clonase Reaktionen im Gateway System oder als Template für Amplifikation der Epitopregion für Antikörperherstellung. 260

Anhang pDEST27 pDEST/N-SF-TAP

GST-Vektor und TAP-Tag Vektor für Überexpression und anschließende Ko-Immunopräzipitation. pAD-GAL4-2.1/DEST pBD-GAL4-Cam/DEST

Hefevektoren (pAD und pBD) von Dr. Elöd Körtvely aus München zur Verfügung gestellt zur Klonierung eines Inserts (Gene of Interest) und anschließenden Hefe-Screen [Originalvektoren aus HybriZAP-2.1 two-hybrid vector system wurden umgebaut, dass sie für das Gateway-System verwendbar sind]. pGADT7-T

AD-Hefekontrollvektor (Clontech) als Positivkontrolle (Insert: SV40 large T-Antigen) für Autoaktivierungstests. 261

Anhang pGBKT7-53

BD-Hefekontrollvektor (Clontech) als Positivkontrolle (Insert: murines p53) für Autoaktivierungstests. pGEX-4T3 pCR8/GW/TOPO

pGEX Expressionsvektor zur Expression von TOPO-Entry Vektor als Eingangsvektor für rekombinaten Protein für anschließende verschiedene Inserts und anschließende LR Antikörperherstellung Clonase Reaktionen im Gateway System

U6-gRNA/EF1a-puro-2A-Cas9-2A-GFP

Vektor zur Generierung von CRISPR knockout Zelllinien (human) mit Target Region in Exon 24 (GGTCAACTTGTGATTCCTCTGG) von NEK1 [NM_012224.2].

262

Anhang

13.20.10. Kits Kit Bezugsquelle Agencourt CleanSEQ Kit Beckman Coulter Agencourt AMPure Kit Beckman Coulter BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Life Technologies DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen DYNC2LI1 Human 1 3er Set Stealth RNA siRNA Invitrogen (HSS147514, HSS147516, HSS182153) Endofree Plasmid Maxi Kit Qiagen Gateway LR ClonaseII Enzyme Mix Invitrogen GC-Rich System dNTPack Roche Human Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel 1 Clontech Human Fetal Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel Clontech Illustra Genomiphi V2 DNA Amplification Kit GE Healthcare Lipofecatamin 2000 Invitrogen Make Your Own “Mate & Plate” Library Kit Clontech pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit Invitrogen Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific QIAamp DNA Micro Kit Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kits Qiagen QIAquick Gel Extraktion Kit Qiagen QIAquick PCR Purification Kit Qiagen RNase-free DNase Set Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen SALSA MLPA EK5-Reagenzien MRC-Holland SALSA MLPA P200 Human DNA reference-1 MRC-Holland Stealth RNAi siRNA Negative Controls Lo/Med/Hi GC Invitrogen TaqMan Gene Expression Master Mix Life Technologies TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit Illumina TruSight One Sequencing Panel Kit Illumina Yeastmaker Yeast Transformation System 2 Kit Clontech Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit Invitrogen

13.20.11. Geräte Gerät Firma ABI 3100 Genetic Analyzer Life Technologies ABI 3730 Genetic Analyzer Life Technologies ABI PRISM 7900 HT Detection System Life Technologies Absaugpumpe HLC Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies Autoklaven Webeco, HMC Bunsenbrenner Fireboy Tecnomara ChemiDoc Geldokumentationssystem Bio-Rad Einschweißgerät Typ HM 2300 CD Hulme Martin Eismaschine Ziegra Elektrophoresekammer MWG Biotech, Bio-Rad

263

Anhang

Gerät Firma FACS Aria III BD Biosciences Feinwaage CP225D Sartorius Fluoreszenzmikroskop Zeiss Axio Imager Z2 mit Apotom Zeiss Geldokumentationsanlage BioDocAnalyzer 2.0 Biometra Heizblock Eppendorf Heizplatte Rommelsbacher Horizontalschüttler Unimax 1010 Heidolph Inkubator Bakterienkultur B 6060 Heraeus Inkubator Schüttelinkubator Innova 4300 New Brunswick Scientific Inkubator Zellkultur BBD 6220 Thermo Scientific Kamera DC300 Leica Kühl- und Gefrierschränke (4 °C, -20 °C, -80 °C) Siemens, Liebherr, Revco Laborwaage MC1 Sartorius Laser Scanning Mikroskop LSM 710 Zeiss Lichtmikroskop Labovert (Zellkultur) Leitz Magnetrührer IKAMAG RH und KMO2 Janke&Kunkel Mikrowelle Panasonic, Siemens Multipette pro Eppendorf Nanoquant Infinite 200 Tecan Neubauerzählkammer: Neubauer Improved Brand pH-Meter: Digital pH-Meter HI 2211 Hanna instruments Pinzetten Dumont Fine Science Tools Pipette 8-Kanal 5-50 μl Capp, Dunn Pipette HandyStep S Brand Pipette Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson Pipettierhilfe Easypet Eppendorf Pipettierroboter Biomek NX Beckman Coulter Pipettierroboter Hydra Matrix Technologies Pipettierroboter Genesis RSP 100 Tecan Tecan Pumpe Typ E25 Serva-Technik QIAcube Qiagen QuantStudio 12K Flex Life Technologies Rolleninkubator RM5 Assistent Rotationsmischer Heidolph Schüttel-Inkubator Heraeus Schüttler DOS-20-S LTF Labortechnik Spannungsgerät Microcomputer Electro. Power Supply Consort Spannungsgerät Power pac 300 Bio-Rad Spektralphotometer Nanodrop 1000 Peqlab Spektralphotometer Ultrospec 2100 pro GE Healthcare Sterilbank Gelaire BSB6A Flow Laboratories Sterilbank Lamin Air Heraeus Tank-Blot-System Bio-Rad Tecan GENios Microplate Reader Tecan Thermocycler Mastercycler pro Eppendorf Thermomixer compact Eppendorf

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Anhang

Gerät Firma Trans-Blot Cell Bio-Rad Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad Überkopfschüttler GFL Ultraschallhomogenisator Sonoplus HD 2200 Bandelin Electronic UV-Transilluminator „UV-Star“ Biometra Vortexer VF 2 Janke&Kunkel Wasseraufbereitungsanlage Purelab plus USF-Elga Wasserbäder Memmert, Julabo, Lauda ecoline Zentrifuge Biofuge 22 R Heraeus Zentrifuge Biofuge pico Heraeus Zentrifuge Centrifuge 5415 Eppendorf Zentrifuge Centrifuge 5804 Eppendorf Zentrifuge Centrifuge 5810 Eppendorf Zentrifuge miniSpin Eppendorf Zentrifuge Omnifuge 2.ORS Heraeus, Sepatech Zentrifuge Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed Du Pont Instruments

13.20.12. Datenbanken und Software Datenbank/ Software Internetseite/ Firma 1000 Genomes http://www.1000genomes.org/ ABI PRISM R 7900 HT SDS V2.1.1 Life Technologies Adobe Photoshop CS5 Adobe Systems ANNOVAR http://www.openbioinformatics.org/annovar Axio Vision Software Version 4.8 Zeiss BioDocAnalyze 2.0 Biometra BLAT http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat BLASTn, BLASTp, BLASTx http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Cildb V3.0 http://cildb.cgm.cnrs-gif.fr/ Ciliome.com http://www.sfu.ca/~leroux/ciliome_home.htm Chromas Version 2.23 Technelysium ClinVar https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ Clustal Omega http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ Coils Server coiled coil prediction http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html Combined Annotation Dependent Depletion http://cadd.gs.washington.edu/ CorelDRAW X7 Corel Corporation Database of Genomic Variants http://projects.tcag.ca/variation/ dbSNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ DIgenic diseases DAtabase http://dida.ibsquare.be DIOPT (DRSC Integrative Ortholog Prediction Tool) https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl http://homes.esat.kuleuven.be/~bioiuser/endeavour/tool/en ENDEAVOUR deavourweb.php Ensembl http://www.ensembl.org/index.html ExAC Browser http://exac.broadinstitute.org/ Exome Variant Server http://evs.gs.washington.edu/EVS/ ExPASy Translate Tool http://www.expasy.org/tools/dna.html ExpressionSuite Software v1.0.3 Life Technologies 265

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Datenbank/ Software Internetseite/ Firma Gemini Tecan http://research- Gepis tissue (Genehub-GEPIS) public.gene.com/Research/genentech/genehub-gepis/ FACS Diva 6.0 Software BD Biosciences FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads Human Gene Mutation Database http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php Hugo Gene Nomenclature Committee http://www.genenames.org/ Human Genome Variation Society http://www.hgvs.org/ Human Splicing finder (HSF) http://www.umd.be/HSF3/HSF.html IGV Genome Browser www.broadinstitute.org/igv/ Imaris 7.7 Software Bitplane Scientific ImageJ 1.45 Wayne Rasband Image Lab 4.0 Bio-Rad Ingenuity Pathway Analysis IPA Ingenuity Systems (Qiagen) In silico PCR http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr LUMC Mutalyzer https://mutalyzer.nl/ Marcoil coiled coil prediction http://bcf.isb-sib.ch/webmarcoil/webmarcoilC1.html Microsoft Office 2013 Microsoft Mouse Genome Informatics MGI http://www.informatics.jax.org/ Mutation Surveyor Version 4.0.8 Softgenetics Mutation Taster http://www.mutationtaster.org/ NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NEBcutter V2.0 http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ NetGene2 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/ NGS Variant Analyzer PD Dr. med. Christian Thiel NNSplice 0.9 http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html Oligo Calc http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html OMIM http://www.omim.org/ ORF open reading frame finder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/ Polyphen 2 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/ Primer 3 http://frodo.wi.mit.edu/ QuantStudio 12K Flex Software Life Technologies Raw MRC Holland SeqManII 5.03 DNA Star Inc. SeqNext Software JSI Medicals Systems SeqPilot 4.1.2. JSI Medical Systems Sequencing Analysis 5.1 Software Applied Biosystems SIFT http://sift.jcvi.org/ Splice Site Score Calculation (SSSC) http://rulai.cshl.edu/new_alt_exon_db2/HTML/score.html STRING http://string.embl.de/ SYSCILIA http://www.syscilia.org/goldstandard.shtml UCSC Genome Browser http://genome.ucsc.edu/ Uniprot http://www.uniprot.org/ http://www.fon.hum.uva.nl/Service/Statistics/Wilcoxon_T Wilcoxon Two Sample Test est.html ZEN 2010 Software Zeiss

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