UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CLONES DE Paullinia cupana (Mart.) Ducke E AVALIAÇÃO DE SEUS TRAÇOS FUNCIONAIS E POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO Fabio de Azevedo Silva Mestrado em Química, Área de Concentração Produtos Naturais CUIABÁ MATO GROSSO – BRASIL 2016 FABIO DE AZEVEDO SILVA DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CLONES DE Paullinia cupana (Mart.) Ducke E AVALIAÇÃO DE SEUS TRAÇOS FUNCIONAIS E POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Química, para obtenção do título de Mestre em Química, Área de Concentração Produtos Naturais CUIABÁ MATO GROSSO – BRASIL 2016 ii iii FABIO DE AZEVEDO SILVA DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CLONES DE Paullinia cupana (Mart.) Ducke E AVALIAÇÃO DE SEUS TRAÇOS FUNCIONAIS E POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, para obtenção do título de Magister Scientiae. iv AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Marcos Antonio Soares, pela orientação, ensinamentos, sugestões e paciência. A Profa. Dra Olivia Moreira Sampaio pela co-orientação, ensinamentos e disposição. A Profa. Dra Ana Helena e ao Prof. Dr. Lucas Campos pela disposição em participar da banca avaliadora. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Química e à cordenação do curso pela contribuição em minha formação. A minha família pelo carinho e compreensão incondicionais. Ao Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos Naturais (CALPQPN) onde pude realizar parte do meu trabalho. A Profa. Dra Ana Helena e ao Prof. Vinicius Palaretti pelas contribuições com análises de RMN. A Leticia Ceron, pela amizade e pelas muitas ocasiões em que fui ajudado. A Luana Donadel pela colaboração com experimentos de citotoxicidade. Ao pesquisador Gilvan Ferreira pela colaboração com sequenciamento Aos amigos que tive oportunidade de conhecer neste curso, especialmente Michele, Francine, Damiana e Washington, que me ajudaram em diversas ocasiões. Aos meus colegas Ivani, Ana, Rhavena e William, que contribuíram com muitas informações e conselhos. Aos demais membros do Laboratório de Biotecnologia e Ecologia Microbiana (LABEM) por ajudarem de diversas formas, especialmente a Esther, Cailla, Katia, Jaqueline e Bruna, que me acompanham por mais tempo. A Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária (Embrapa) A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa. Aos todos os demais que de alguma forma colaboraram com o desenvolvimento do trabalho. v RESUMO SILVA, Fabio de Azevedo. Universidade Federal de Mato Grosso, Abril de 2016. Diversidade de fungos endofíticos de clones de Paullinia cupana (Mart.) Ducke e avaliação de seus traços funcionais e potencial biotecnológico. Orientador: Marcos Antônio Soares. Endofíticos são microrganismos que habitam tecidos internos de seus hospedeiros, podendo desempenhar diversas relações ecológicas sem demonstrar sintomas visíveis de infecção. Produzem compostos com diferentes aplicações biotecnológicas e que podem beneficiar o hospedeiro. Este trabalho teve o objetivo de determinar a composição da comunidade de fungos endofiticos de clones de Paullinia cupana (Mart.) Ducke tolerantes e suscetíveis a antracnose e determinar seus papéis funcionais e seu potencial biotecnológico. Raízes e sementes foram desinfestadas e inoculadas em placas com meio de cultura BDA e TSA. O sequenciamento parcial da região ITS do gene rDNA foi realizado para identificação das linhagens de fungos endofíticos. A produção de enzimas hidrolíticas, ácido indolacético (AIA) e antifúngicos, a capacidade endofitíca dos fungos isolados e a associação com fungos dark septate (DSE) foram avaliados Extratos AcOEt foram preparados para avaliação do potencial antimicrobiano, antioxidante, citotóxico e teor fenólico. Extratos AcOEt foram purificados por CLAE e CC e sua estrutura foi determinada por análise de espectros de RMN 1D e 2D e espectrometria de massas. Trinta e três espécies distribuídas em 256 linhagens foram isoladas. Xylogone ganodermophthora apresentou maior frequência relativa (30%). As comunidades endofíticas de clones suscetíveis, da localidade Manaus e das raízes apresentaram maior diversidade de espécies e maior taxa de colonização. A atividade antimicrobiana, antioxidante e citotóxica foi observada no extrato AcOEt de diferentes espécies. A inibição de fungos fitopatogênicos, secreção de enzimas hidrolíticas e produção de AIA foi observada em diversas espécies. Paullinia cupana se associa com DSE e FMA e fungos das espécies P. asparagi (22TSA) e P. vi pinodella (28S) produzem estruturas de DSE. O ácido 3-hidroxipropiônico e a substância 070 foram identificados no fungo D. phaseolorum (8S) e inibem o crescimento de P. aeruginosa em concentrações de 0,23 μg/mL. Portanto, as comunidades de fungos endofíticos são diferentes em cada clone, localidade e órgão vegetal. Os isolados apresentam potencial biotecnológico e produzem traços funcionais in vitro que podem beneficiar clones suscetíveis e tolerantes. Palavras-chave: Paullinia cupana, fungos endofíticos, metabílitos secundários. vii ABSTRACT SILVA, Fabio de Azevedo. Federal University of Mato Grosso, April 2016. Diversity of endophytic fungi from Paullinia cupana (Mart.) Ducke clones and evaluation of their functional traits and biotechnological potential. Adviser: Marcos Antonio Soares. Endophytes are microorganisms that inhabit internal tissues of their hosts and can perform various ecological relationships without showing visible symptoms of infection. They produce compounds with different biotechnological applications and can benefit the host. This study aimed to characterize the endophytic fungi community of resistant and susceptible clones of Paullinia cupana (Mart.) Ducke and determine their role in promoting host resistance and biotechnological potential. Roots and seeds were sterilized and inoculated into plates with BDA and TSA culture media. The identification was carried out by partial sequencing of the ITS rDNA region. EtOAc extracts were prepared for evaluating potential antimicrobial, antioxidant, cytotoxic and phenolic content. EtOAc extracts were purified through CC and HPLC and compounds were elucidated by analysis of 1D and 2D NMR spectra and mass spectrometry. It was evaluated the production of hydrolytic enzymes, indole acetic acid (IAA) and fungicides, the endophytic ability and the association with mycorrhizal fungi (AMF) and dark septate (DSE). We isolated 256 strains of 33 species. Xylogone ganodermophthora showed higher relative frequency (30%). There was greater species diversity and higher colonization rate in the endophytic community of susceptible clones, Manaus environment, roots and PDA culture medium. Seventeen species with antimicrobial activity were found. The DPPH radical inhibition ranged from 0.14 to 85.37% and the phenolic content ranged between 0.022 and 0.861 mg GAE/mL. Five species reduced viability of tumor cells in more than 90%. Several species inhibited pathogenic fungi and produce hydrolytic enzymes and IAA. P. cupana is associated with DSE and FMA and the species P. asparagi (22TSA) and P. pinodella (28S) produce DSE structures. 3- hydroxypropionic acid was identified viii in D. phaseolorum. Therefore, communities are different in each clone, location and plant organ. Isolates have biotechnological potential and produce functional traits in vitro trat could benefit both susceptible and tolerant clones. Keywords: Paullinia cupana, endophytic fungi, secondary metabolites. ix SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ...................................................... xiii LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... xv 1 – INTRODUÇÃO GERAL .......................................................................... 16 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................... 17 2.1 – Paullinia cupana (Mart.) Ducke ...................................................... 17 2.1.1 – Caracterização ...................................................................................... 17 2.1.2 - Constituintes químicos e propriedades terapêuticas ............................. 20 2.1.3 - Produção e Comercialização ................................................................. 23 2.1.4 - Doenças da cultura ................................................................................ 28 2.2 - Microrganismos Endofíticos ............................................................ 30 2.2.1 – Introdução ............................................................................................. 30 2.2.2 - Relação entre endofítico e hospedeiro .................................................. 31 2.2.3 - Diversidade de microrganismos endofíticos .......................................... 34 2.2.4 - Microrganismos associados a P. cupana .............................................. 35 2.2.5 - Aplicações de microrganismos endofíticos ............................................ 36 2.2.5.1- Antibióticos .......................................................................................... 37 2.2.5.2 – Agentes anticâncer ............................................................................ 38 2.2.5.3 - Antioxidantes ...................................................................................... 39 2.2.5.4 – Benefícios ao Hospedeiro .................................................................