Universidade Federal De Mato Grosso Diversidade

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CLONES DE Paullinia cupana (Mart.) Ducke E AVALIAÇÃO DE SEUS TRAÇOS FUNCIONAIS E POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO

Fabio de Azevedo Silva Mestrado em Química, Área de Concentração Produtos Naturais

CUIABÁ MATO GROSSO – BRASIL 2016 FABIO DE AZEVEDO SILVA

DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CLONES DE Paullinia cupana (Mart.) Ducke E AVALIAÇÃO DE SEUS TRAÇOS FUNCIONAIS E POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Química, para obtenção do título de Mestre em Química, Área de Concentração Produtos Naturais

CUIABÁ MATO GROSSO – BRASIL 2016 ii

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FABIO DE AZEVEDO SILVA

DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CLONES DE Paullinia cupana (Mart.) Ducke E AVALIAÇÃO DE SEUS TRAÇOS FUNCIONAIS E POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, para obtenção do título de Magister Scientiae.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Marcos Antonio Soares, pela orientação, ensinamentos, sugestões e paciência. A Profa. Dra Olivia Moreira Sampaio pela co-orientação, ensinamentos e disposição. A Profa. Dra Ana Helena e ao Prof. Dr. Lucas Campos pela disposição em participar da banca avaliadora. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Química e à cordenação do curso pela contribuição em minha formação. A minha família pelo carinho e compreensão incondicionais. Ao Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos Naturais (CALPQPN) onde pude realizar parte do meu trabalho. A Profa. Dra Ana Helena e ao Prof. Vinicius Palaretti pelas contribuições com análises de RMN. A Leticia Ceron, pela amizade e pelas muitas ocasiões em que fui ajudado. A Luana Donadel pela colaboração com experimentos de citotoxicidade. Ao pesquisador Gilvan Ferreira pela colaboração com sequenciamento Aos amigos que tive oportunidade de conhecer neste curso, especialmente Michele, Francine, Damiana e Washington, que me ajudaram em diversas ocasiões. Aos meus colegas Ivani, Ana, Rhavena e William, que contribuíram com muitas informações e conselhos. Aos demais membros do Laboratório de Biotecnologia e Ecologia Microbiana (LABEM) por ajudarem de diversas formas, especialmente a Esther, Cailla, Katia, Jaqueline e Bruna, que me acompanham por mais tempo. A Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária (Embrapa) A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa. Aos todos os demais que de alguma forma colaboraram com o desenvolvimento do trabalho. v

RESUMO

SILVA, Fabio de Azevedo. Universidade Federal de Mato Grosso, Abril de 2016. Diversidade de fungos endofíticos de clones de Paullinia cupana (Mart.) Ducke e avaliação de seus traços funcionais e potencial biotecnológico. Orientador: Marcos Antônio Soares.

Endofíticos são microrganismos que habitam tecidos internos de seus hospedeiros, podendo desempenhar diversas relações ecológicas sem demonstrar sintomas visíveis de infecção. Produzem compostos com diferentes aplicações biotecnológicas e que podem beneficiar o hospedeiro. Este trabalho teve o objetivo de determinar a composição da comunidade de fungos endofiticos de clones de Paullinia cupana (Mart.) Ducke tolerantes e suscetíveis a antracnose e determinar seus papéis funcionais e seu potencial biotecnológico. Raízes e sementes foram desinfestadas e inoculadas em placas com meio de cultura BDA e TSA. O sequenciamento parcial da região ITS do gene rDNA foi realizado para identificação das linhagens de fungos endofíticos. A produção de enzimas hidrolíticas, ácido indolacético (AIA) e antifúngicos, a capacidade endofitíca dos fungos isolados e a associação com fungos dark septate (DSE) foram avaliados Extratos AcOEt foram preparados para avaliação do potencial antimicrobiano, antioxidante, citotóxico e teor fenólico. Extratos AcOEt foram purificados por CLAE e CC e sua estrutura foi determinada por análise de espectros de RMN 1D e 2D e espectrometria de massas. Trinta e três espécies distribuídas em 256 linhagens foram isoladas. Xylogone ganodermophthora apresentou maior frequência relativa (30%). As comunidades endofíticas de clones suscetíveis, da localidade Manaus e das raízes apresentaram maior diversidade de espécies e maior taxa de colonização. A atividade antimicrobiana, antioxidante e citotóxica foi observada no extrato AcOEt de diferentes espécies. A inibição de fungos fitopatogênicos, secreção de enzimas hidrolíticas e produção de AIA foi observada em diversas espécies. Paullinia cupana se associa com DSE e FMA e fungos das espécies P. asparagi (22TSA) e P. vi pinodella (28S) produzem estruturas de DSE. O ácido 3-hidroxipropiônico e a substância 070 foram identificados no fungo D. phaseolorum (8S) e inibem o crescimento de P. aeruginosa em concentrações de 0,23 μg/mL. Portanto, as comunidades de fungos endofíticos são diferentes em cada clone, localidade e órgão vegetal. Os isolados apresentam potencial biotecnológico e produzem traços funcionais in vitro que podem beneficiar clones suscetíveis e tolerantes. Palavras-chave: Paullinia cupana, fungos endofíticos, metabílitos secundários.

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ABSTRACT

SILVA, Fabio de Azevedo. Federal University of Mato Grosso, April 2016. Diversity of endophytic fungi from Paullinia cupana (Mart.) Ducke clones and evaluation of their functional traits and biotechnological potential. Adviser: Marcos Antonio Soares.

Endophytes are microorganisms that inhabit internal tissues of their hosts and can perform various ecological relationships without showing visible symptoms of infection. They produce compounds with different biotechnological applications and can benefit the host. This study aimed to characterize the endophytic fungi community of resistant and susceptible clones of Paullinia cupana (Mart.) Ducke and determine their role in promoting host resistance and biotechnological potential. Roots and seeds were sterilized and inoculated into plates with BDA and TSA culture media. The identification was carried out by partial sequencing of the ITS rDNA region. EtOAc extracts were prepared for evaluating potential antimicrobial, antioxidant, cytotoxic and phenolic content. EtOAc extracts were purified through CC and HPLC and compounds were elucidated by analysis of 1D and 2D NMR spectra and mass spectrometry. It was evaluated the production of hydrolytic enzymes, indole acetic acid (IAA) and fungicides, the endophytic ability and the association with mycorrhizal fungi (AMF) and dark septate (DSE). We isolated 256 strains of 33 species. Xylogone ganodermophthora showed higher relative frequency (30%). There was greater species diversity and higher colonization rate in the endophytic community of susceptible clones, Manaus environment, roots and PDA culture medium. Seventeen species with antimicrobial activity were found. The DPPH radical inhibition ranged from 0.14 to 85.37% and the phenolic content ranged between 0.022 and 0.861 mg GAE/mL. Five species reduced viability of tumor cells in more than 90%. Several species inhibited pathogenic fungi and produce hydrolytic enzymes and IAA. P. cupana is associated with DSE and FMA and the species P. asparagi (22TSA) and P. pinodella (28S) produce DSE structures. 3- hydroxypropionic acid was identified viii in D. phaseolorum. Therefore, communities are different in each clone, location and plant organ. Isolates have biotechnological potential and produce functional traits in vitro trat could benefit both susceptible and tolerant clones.

Keywords: Paullinia cupana, endophytic fungi, secondary metabolites.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ...... xiii LISTA DE FIGURAS ...... xv 1 – INTRODUÇÃO GERAL ...... 16 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 17 2.1 – Paullinia cupana (Mart.) Ducke ...... 17 2.1.1 – Caracterização ...... 17 2.1.2 - Constituintes químicos e propriedades terapêuticas ...... 20 2.1.3 - Produção e Comercialização ...... 23 2.1.4 - Doenças da cultura ...... 28 2.2 - Microrganismos Endofíticos ...... 30 2.2.1 – Introdução ...... 30 2.2.2 - Relação entre endofítico e hospedeiro ...... 31 2.2.3 - Diversidade de microrganismos endofíticos ...... 34 2.2.4 - Microrganismos associados a P. cupana ...... 35 2.2.5 - Aplicações de microrganismos endofíticos ...... 36 2.2.5.1- Antibióticos ...... 37 2.2.5.2 – Agentes anticâncer ...... 38 2.2.5.3 - Antioxidantes ...... 39 2.2.5.4 – Benefícios ao Hospedeiro ...... 42 3 - JUSTIFICATIVA ...... 44 4 - OBJETIVOS ...... 46 4.1 - Objetivo Geral ...... 46 4.2 - Objetivos Específicos ...... 46 5.0 - ARTIGOS ...... 47 ARTIGO 1 - DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CLONES E ÓRGÃOS DE Paullinia cupana (Mart.) Ducke EM DIFERENTES LOCALIDADES E AVALIAÇÃO DE TRAÇOS FUNCIONAIS ...... 47 INTRODUÇÃO ...... 48 METODOS ...... 49 x

Isolamento de fungos endofíticos de P. cupana: ...... 49 Identificação Molecular: ...... 50 Análises de estrutura das comunidades ...... 50 Diafanização e análise qualitativa das estruturas de infecção ...... 51 Avaliação da capacidade endofítica in vitro ...... 51 Análise de traços funcionais ...... 52 Teste de antibiograma contra fungos fitopatogênicos ...... 52 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 52 Diversidade de fungos endofíticos de P. cupana ...... 52 Diafanização de raízes de P. cupana e capacidade endofítica dos isolados .... 65 Avaliação de traços funcionais ...... 68 CONCLUSÃO ...... 72 REFERÊNCIAS ...... 73 ARTIGO 2 - POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE EXTRATOS E COMPOSTOS OBTIDOS DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE Paullinia cupana (MART.) DUCKE ...... 94 INTRODUÇÃO ...... 95 METODOLOGIA...... 97 Microrganismos Utilizados ...... 97 Obtenção de extratos para ensaios biológicos ...... 98 Determinação da atividade antioxidante e do teor de compostos fenólicos dos extratos ...... 99 Atividade antimicrobiana qualitativa e teste de concentração mínima inibitória 99 Determinação da atividade citotóxica ...... 100 Purificação e determinação estrutural ...... 101 RESULTADOS ...... 102 Determinação da atividade antioxidante e do teor de compostos fenólicos ... 102 Determinação da atividade antimicrobiana e citotóxica ...... 104 Purificação e determinação estrutural ...... 108 Atividade antimicrobiana de substâncias purificadas ...... 112 CONCLUSÃO ...... 113 Material Suplementar ...... 114 xi

REFERÊNCIAS ...... 114 MATERIAL SUPLEMENTAR ...... 127 6.0 – CONCLUSÕES GERAIS ...... 150 7.0 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 151 8.0 ANEXOS ...... 193 ANEXO 1 – Esquemas da purificação de extratos AcOEt de fungos endofíticos de P. cupana ...... 194 ANEXO 2 – Instruções de Formatação – Revista Fungal Ecology ...... 198 ANEXO 3 - Instruções de Formatação – Revista Current Microbiology 221

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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AcOEt Acetato de Etila ATCC American Type Culture Collection AIA Ácido indolacético BDA Batata, Dextrose e Ágar BHI Brain Heart Infusion CC Cromatografia em Coluna CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CMM Concentração mínima de morte CMI Concentração mínima inibitória C18 Sílica gel de fase reversa tipo octadecil silano d Dubleto dd Duplo dubleto ddd Duplo duplo dubleto dl Dubleto largo DAD Detector de Arranjo de Diodos D.O. Densidade Óptica DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazil DSE Dark septate endophyte EAG Equivalente de Ácido Gálico ERO Espécies reativas de oxigênio FAA Solução de ácido acético, água, álcool e formol FT Fenóis Totais FMA Fungos micorrízicos arbusculares ha Hectare Hz Hertz ITS Espaçador interno transcrito

IC50 Concentração efetiva média xiii

J Índice de Similaridade de Jaccard J Constante de Acoplamento min Minutos MM Meio mínimo mineral NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Reação em cadeia da polimerase ppm Partes por Milhão PVLG Polivinil lacto-glicerol q.s.p. Quantidade suficiente para ql Quadrupleto largo r Teste de correlação de Spearman RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono - 13 RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio rpm Rotações por minuto s Singleto sl Singleto largo t Tripleto tl Tripleto largo TSA Ágar triptona de soja UFMT Universidade Federal de Mato Grosso δ Deslocamento Químico Ø Diâmetro

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estruturas químicas de substâncias encontradas em sementes de P. cupana...... 16 Figura 2. Diversidade estrutural de metabólitos isolados de fungos endofíticos...... 29 Figura 3. Reação de oxirredução do radical DPPH...... 31 Figura 4. Moléculas que compõem o reagente de Folin- Ciocalteu...... 32 Figura 5. Visão geral das diferentes vias para síntese de AIA em microrganismos...... 33

1 – INTRODUÇÃO GERAL

Paullinia cupana (Mart.) Ducke, conhecida no Brasil como ‘guaraná’, é uma das espécies mais conhecidas da Amazônia (LIM, 2013). Apresenta efeito estimulante e diversas aplicações terapêuticas, como antioxidante, antimicrobiano e anti-inflamatório (VAN WYK & WINK, 2015; BASILE et al. 2013; WATSON & PREEDY, 2014). O Brasil é o único produtor de guaraná em escala comercial e grande parte é destinada para fabricação de refrigerantes (SCHIMPL et al. 2013). A produção de guaraná está em crescimento e registrou alta de 3% em 2015 (CONAB, 2015). A produção é afetada por doenças causadas por fungos, bactérias e nematódeos, com destaque para a antracnose (MAHESHWARI et al. 2013). Tais doenças podem ser combatidas de diferentes formas, como controle químico ou o uso de clones resistentes a patógenos (DEAN et al. 2012). Plantas podem apresentar maiores chances de sobrevivência ao ataque de patógenos quando são colonizadas por determinadas espécies de microrganismos endofíticos (SCHULZ & BOYLE, 2005). Endofíticos são microrganismos que habitam o interior dos tecidos de seus hospedeiros, pelo menos durante uma fase do seu próprio ciclo de vida, podendo desempenhar diversas relações ecológicas sem demonstrar sintomas visíveis da infecção (SCHULZ & BOYLE, 2005). Estes microrganismos podem tornar o hospedeiro resistente a estresses bióticos e abióticos devido a síntese de enzimas e compostos com atividade antioxidante, antimicrobiana, entre outros (SCHULZ & BOYLE, 2005). Apresentam utilidade para a saúde humana, pois podem produzir compostos com atividade antibiótica (ARIVUDAINAMBI et al. 2011), anticâncer (PANDI et al. 2013), anti- inflamatória (ZHANG et al. 2014), antioxidante (XIAO et al. 2014), antidiabética (AKSHATHA et al. 2014), imunossupressora (ZHANG et al. 2013), tripanocidas (INAHASHI et al. 2011), entre outras. Muitas espécies de fungos endofíticos foram descritas, porém é escasso o conhecimento relativo ao seu potencial químico e sua diversidade em regiões tropicais.

Neste trabalho foram isolados fungos endofíticos de raízes e sementes de clones tolerantes e suscetíveis de P. cupana. Os objetivos foram avaliar os fatores que podem afetar a composição das comunidades, determinar seu papel em promover resistência ao hospedeiro, avaliar seu potencial biotecnológico e realizar a determinação estrutural de metabolitos produzidos pelas espécies selecionadas.

2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 – Paullinia cupana (Mart.) Ducke

2.1.1 – Caracterização

Paullinia cupana, conhecida popularmente no Brasil como guaraná, guaranaína, guaranauva, uarana ou narana, é uma das espécies mais conhecidas da região amazônica. Em países de língua espanhola como Peru, Espanha e Venezuela, é conhecida como ‘Cupana’. Está presente na cultura dos índios Tupi, Sateré-Maué, e Guarani Paraguaios, principalmente na religião, nas superstições e nos conhecimentos terapêuticos (LIM, 2013). O nome ‘guaraná’ é originado da língua Tupi que pode ser traduzida como 'cipó rastejador' ou 'planta que escala'. Alguns autores atribuem o nome aos índios Guarani, que consumiam a semente desde tempos pré-colombianos (SMALL, 2011). O primeiro documento que menciona o guaraná data de 1669, escrito pelo jesuíta João Felipe Bettendorff, onde relata que apenas os Sateré-Maué cultivavam o guaraná. Esta tribo pertencente ao grupo linguístico dos Tupis, e vivia ao longo do rio Maués e de seus afluentes (SMITH & ATROCH, 2010). Segundo Bettendorff, os indígenas valorizavam o guaraná tanto quanto os europeus valorizavam ouro, porque podiam caçar por um longo tempo sem ter fome. Na tradição dos Sateré-Maué o extrato era

17 consumido por diluição em água pelo menos uma vez por dia. Todas as etapas de produção eram realizadas por mulheres (SMITH & ATROCH, 2010). De acordo com a mitologia dos Sateré-Maué, o guaraná se originou devido a rivalidade entre dois irmãos e sua irmã chamada Onhiamiaçabê (CLEMENT et al. 2010). Segundo a lenda, os irmãos não queriam que ela se casasse, porque conhecia todas as plantas, inclusive as que eram boas para curar. Um dia, Onhiamiaçabê foi atraída e encantada por uma pequena serpente e ficou grávida. Quando seu filho havia crescido, os irmãos de Onhiamiaçabê o assassinaram. Sua mãe removeu e plantou seu olho esquerdo, que deu origem a um guaraná de má qualidade, chamado de guaraná-falso. Então ela fez o mesmo com o olho direito, que deu origem ao guaraná-verdadeiro, de alta qualidade. No lugar onde enterrou o corpo do filho, nasceu o primeiro nativo Sateré-maué. Este mito evidencia a diferença entre a variedade 'sorbilis' e as outras espécies do gênero Paullinia, chamadas de 'guaraná-falso'. Estas produzem frutos menores e com menos aplicações do que a variedade 'sorbilis' (CLEMENT et al. 2010). O nome 'Paullinia' tem origem incerta. Alguns autores atribuem o nome ao médico e botânico alemão C.F. Paullini ou a Simon Paulli (1603- 1680) e seu filho Christian Frances (1643-1742). O nome 'cupana' vem do latim 'cupa' que significa 'contêiner', em referência ao formato do fruto (SMALL, 2011). A espécie foi registrada pela primeira vez como "Paullinia cupana H.B.K. typica" por Karl Sigismund Kunth, em 1821, que utilizou amostras coletadas na Venezuela. Anos mais tarde, o botânico Von Martius coletou na região de Maués, uma planta que nomeou 'Paullinia sorbilis'. Em 1937, Ducke analisou as plantas identificadas por Kunth e Martius e concluiu que eram a mesma espécie. Ele as separou em duas variedades diferentes: P. cupana variedade typica e P. cupana variedade sorbilis (MIRANDA & METZNER, 2010). Atualmente, P. cupana apresenta a seguinte classificação botânica: Reino Viridiplantae; Filo Streptophyta; Subclasse Rosidae; Ordem Sapindales; Família Sapindaceae; Gênero Paullinia (NCBI, 2015). P. cupana tem a maior importância econômica do gênero e seu habitat natural é a região

18 dos rios Amazonas, Negro, Maués e Paraná do Ramos. Maués, no Amazonas, foi considerado o centro de origem da variedade sorbilis, pois foi neste local onde foi domesticada (DUARTE & PAULL, 2015). O gênero Paullinia é encontrado predominantemente na região neotropical, nativo da Amazônia brasileira. O gênero abrange 180 espécies, todas nativas da Amazônia, sendo que 40 delas são utilizadas por diferentes grupos indígenas (DUARTE & PAULL, 2015). Na classificação de Koppen, o clima da região de origem é do tipo Am (Clima tropical monçônico), com temperatura média de 22ºC e pluviosidade média de 2,200 mm. O gênero é encontrado no Brasil, Colômbia, Venezuela e Uruguai (WACD, 2015). Paullinia cupana é encontrada na selva em forma de trepadeira, mas quando cultivada em campo aberto, assume a forma de arbusto lenhoso (BURLANDO et al. 2010). Vive em média 35 anos, começa a produzir frutos a partir do terceiro ano e atinge seu auge aos 5 anos de idade (FARMACOPEIA, 2010). A folha é composta por cinco folíolos alternados e podem ou não apresentar gavinhas. Apresenta pecíolos com 7–15 cm, com um canal no seu lado superior, uma bainha e uma bráctea decídua em cada lado (DUARTE & PAULL, 2015). A espécie é monóica, isto é, apresenta flores masculinas e femininas (KHAN & ABOURASHED, 2011). A flor feminina possui anteras indeiscentes, um ovário com 3 carpelos e 3 lóculos com um óvulo cada. A flor masculina possui 8 estames, 3 de tamanhos diferentes, um ovário rudimentar, um estilete e estigma. O cálice das flores tem 2 sépalas externas e 3 sépalas internas e longas pétalas (5 cm) (DUARTE & PAULL, 2015). Apresenta alogamia, isto é, fertilização cruzada, e a polinização é realizada predominantemente por abelhas dos gêneros Melipona e Apis (KRUG; GARCIA; GOMES, 2015). A principal diferença entre as variedades typica e sorbilis é que sorbilis apresenta flores e frutos maiores e não possui gavinhas (LIM, 2013). A floração está relacionada com o período de seca, entre junho e setembro, como ocorre com outras espécies na Amazônia (DUARTE & PAULL, 2015).

O fruto é piriforme, de coloração vermelho-alaranjado e amadurecem entre janeiro e fevereiro. É dividido em 3 partes com 3 cápsulas deiscentes de 2,5cm, parcialmente abertas quando maduras. Apresenta de 1 a 3 sementes negras ou esverdeadas, cuja base é revestida por um arilo branco (TFAED, 2015). Medem entre 1,2-2,0 cm, pesam cerca de 1 g, correspondendo a 84% da massa do fruto (DUARTE & PAULL, 2015). Folhas e ramos de espécies de Sapindaceae são usadas pelos indígenas durante a pesca para intoxicar peixes (ACEVEDO-RODRÍGUEZ et al. 2011).

2.1.2 - Constituintes químicos e propriedades terapêuticas

A semente de guaraná apresenta alcaloides como adenina, guanina, xantina, hipoxantina, tetrametilxantina, teobromina e teofilina (DPED, 2015). Contém até 7% de cafeína, teobrominas e teofilinas (6,733 mg/g), catequinas e epicatequinas (4,336 mg/g), procianidinas B1-B4 e C1 e polissacarídeos (SOUZA et al. 2010). A cafeína da semente é seu principal composto bioativo (WEBB, 2011). Os constituintes majoritários da semente seca são taninos (12%), amido (5-6%), gorduras (3%), resina (7%) e cafeína (2,6 - 7%) (KHAN & ABOURASHED, 2011). Polissacarídeos presentes no extrato da semente são compostos principalmente por amido e fibras, inclusive hemiceluloses e polissacarídeos pécticos, como homogalaturonanos (DALONSO & DE OLIVEIRA PETKOWICZ, 2012). O óleo fixo da semente apresenta cianolipídeos e acilgliceróis. No óleo essencial da semente são encontrados estragol, anetol, carvacrol, cariofileno, limoneno, α-copeno, e 4- (dimetilpropil)-fenol (KHAN & ABOURASHED, 2011) (Figura 1). A atividade psicoestimulante da semente é atribuída à cafeína, teobromina e teofilina, comumente encontrados em chás e café (ANTONELLI-USHIROBIRA et al. 2010). Estes alcaloides são estimulantes do sistema nervoso (VAN WYK & WINK, 2015). O extrato da semente possui efeito anti-inflamatório (WATSON & PREEDY, 2014) e reduz a falta de apetite, a fadiga e a sonolência em

20 pacientes com câncer (PALMA et al. 2015; DE OLIVEIRA CAMPOS et al. 2011; MARTINS; ARRUDA; DEL GIGLIO, 2015). O extrato apresenta efeito antiproliferativo (FUKUMASU; LATORRE; ZAIDAN-DAGLI, 2011) e promove a apoptose (ZEIDÁN-CHULIÁ et al. 2013). Possui propriedades neuroprotetoras atribuída a cafeína (NOBRE et al. 2010; ASTORINO & ALKADHI, 2012) e pode ser útil para tratar doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson (DE OLIVEIRA et al., 2010; BITTENCOURT et al. 2014).

Figura 1 – Estruturas químicas de substâncias encontradas em sementes de P. cupana (KHAN & ABOURASHED, 2011; SOUZA et al. 2010).

O extrato apresenta atividade ansiolítica, porém não são conhecidos os mecanismos de ação que promovem esta atividade (RONCON et al. 2011). Desordens metabólicas como obesidade, hipertensão e diabetes podem ser prevenidas pelo consumo diário do extrato (COSTA KREWER et al. 2011). A promoção de perda de peso está relacionada com sua capacidade de suprimir o apetite e acelerar a oxidação de lipídeos (ASTORINO & ALKADHI, 2012). O extrato apresenta efeito cardioprotetor, assim como outros alimentos ricos em cafeína, devido a capacidade de inibir agregação de plaquetas (DE LIMA PORTELLA et al. 2013). O extrato apresenta atividade antioxidante (DALONSO & DE OLIVEIRA PETKOWICZ, 2012; ZEIDÁN-CHULIÁ et al. 2013; BITTENCOURT et al. 2013; BULKU et al. 2010) atribuída a catequinas, epicatequinas, proantocianidinas, compostos fenólicos e catecóis (KHAN & ABOURASHED, 2011; CECHINEL-FILHO, 2012). A fração de acetona do extrato da semente de guaraná apresenta atividade antimicrobiana contra diversas linhagens patogênicas resistentes e suscetíveis (BASILE et al. 2013; MARTINS et al. 2014). A atividade antimicrobiana pode estar relacionada com o ácido catechu-tânico (JOSHI et al. 2012). O extrato pode ser utilizado para combater os sintomas da menopausa (WATSON & PREEDY, 2014) e disfunção erétil (FERRINI et al. 2015) e estimula a espermatogênese (LEITE et al. 2011). Pode promover maior rigidez da pele, contribuindo para reduz a intensidade de olheiras (PAPAGEORGIOU et al. 2009) e celulites (BURLANDO et al. 2010). Existem formulações farmacêuticas com patente registrada que possuem guaraná em sua composição. Alguns exemplos são emagrecedores (HALFORD & JARMAN, 2013; JARMAN & HESSEL, 2014; SHIRAZI et al. 2011; WENNIGER, 2011); suplementos (CHEYENE, 2014, VON NIESSEN, 2010); antienvelhecimento (GIAMPAPA, 2015), antioxidantes (PALMER, 2013); antidepressivos (GAZLEY, 2013); inibidores enzimáticos (NORIMOTO & MORIMOTO, 2011); inibidores de disfunção erétil (RAJFER, 2011); promotores de crescimento capilar (DASCALU, 2013); energéticos (PIANOWSKI; CALIXTO; DEL GIGLIO, 2012; YA et al. 2013) e anti-lesões

(WALTER JOE, 2014). O extrato é utilizado como estimulante não-nicotínico para substituição do tabaco (JENSEN, 2014; MAY, 2011). O guaraná não é recomendado para gestantes, lactantes, crianças e para pessoas que sofrem de doenças cardíacas, psicológicas e insônia (SIMONS, 2013; KUHN & WINSTON, 2012; PENDLETON et al. 2012). Gestantes devem reduzir o consumo de alimentos ricos em cafeína, pois ela restringe o crescimento do feto e reduz sua massa corporal (HECKMAN et al. 2010). O consumo excessivo de guaraná, assim como o consumo excessivo de café, causa nervosismo, insônia, palpitações e aumento da pressão sanguínea (WEBB, 2011). Pode causar diurese, diarreia, dores de cabeça e de estômago, irritabilidade, náusea, vômitos, convulsões e arritmias (KUHN & WINSTON, 2012; BURLANDO et al. 2010).

2.1.3 - Produção e Comercialização

O manejo da cultura de guaraná é similar ao manejo do café em diversos aspectos (ECOCROP, 2010). O cultivo tradicional de guaraná é realizado sob alta luminosidade, em solos profundos, de textura média ou elevada, bem drenados (DUARTE & PAULL, 2015). O solo deve ser poroso, de acidez moderada e apresentar alto teor de matéria orgânica e alumínio (pH 3,5-5,0) (DUARTE & PAULL, 2015). A fonte primária de matéria orgânica do solo é de origem vegetal, composta principalmente por carboidratos (celulose), gorduras (glicerídeos), ligninas, proteínas e carvão vegetal (PAUL, 2014). Na Amazônia, os pomares são feitos em solos de floresta recém- desmatada, sem utilizar sistema de irrigação, devido ao regime de chuvas bem distribuído. Cada planta ocupa um espaço de 4m x 5m, resultando em 500 plantas por hectare (DUARTE & PAULL, 2015). O plantio e a fertilização são realizados no auge do período chuvoso, entre janeiro e fevereiro. Métodos tradicionais de plantio são amplamente utilizados, porém formas modernas de propagação estão sendo adotadas,

23 como câmaras de nebulização e cultura de tecidos (ECOCROP, 2010). Plântulas devem ser cultivadas sob sombra parcial nos 6 primeiros meses e o cultivo deve ocorrer em áreas com clima similar a sua região de origem. O plantio não deve empregar maquinário pesado, pois a cultura não tolera solo compactado (DUARTE & PAULL, 2015). A propagação da cultura pode ser realizada de forma sexuada ou assexuada. A forma assexuada é utilizada para clonagem de plantas com características superiores. É caracterizada pela remoção de tecidos de uma planta adulta, que são submetidos a um tratamento para promover o crescimento de raízes (DUARTE & PAULL, 2015). Na forma sexuada, a semente é colhida e plantada o mais rápido possível, pois perdem a capacidade de germinação em até 3 dias (DUARTE & PAULL, 2015). A semente é plantada em um substrato úmido e fechada em saco plástico para manter a umidade até a germinação (ECOCROP, 2010). A poda é realizada no fim da colheita e são removidos ramos longos, caídos, danificados ou doentes (DUARTE & PAULL, 2015). A colheita em escala comercial pode ser iniciada quando as plantas atingem entre 3 e 4 anos. Ela deve ser feita manualmente na estação de seca, quando metade dos frutos do cacho estiverem abertos (ECOCROP, 2010). Os cachos são inteiramente cortados e ficam na sombra por 3 dias, em seguida as sementes são removidas manual ou mecanicamente (DUARTE & PAULL, 2015). Tais procedimentos auxiliam a impedir o surgimento de patógenos. O método tradicional e o método industrial de produção do extrato da semente são similares. O método industrializado emprega os mesmos equipamentos utilizados na produção de café em pó (SMITH & ATROCH, 2010). A casca avermelhada do fruto pode ser removida manualmente, por submersão em água ou por desidratação (DUARTE & PAULL, 2015). As sementes são lavadas, secas e torradas em forno industrial por até 5h. Alternativamente, a secagem pode ser realizada sob o sol, onde as sementes são cobertas por um filme transparente por até 5 dias (DUARTE & PAULL, 2015). Sementes torradas são chamadas guaraná ‘em rama’ e são trituradas até resultar em um pó, de coloração castanho clara a castanho avermelhada

(SMITH & ATROCH, 2010). Ele pode ser consumido desta maneira ou pode ser moldado para formar bastões, que apresentam maior durabilidade. Para isso basta misturar o pó com água, molda-los em forma de cilindros e deixar secando em sol. Uma alternativa é deixar o bastão ser defumado por várias semanas, o que lhe confere um sabor diferenciado (SMITH & ATROCH, 2010). O crescimento do mercado do guaraná está relacionado com investimentos em pesquisas realizadas por instituições privadas e públicas. Dentre estas instituições destacam-se a empresa brasileira de pesquisa agropecuária (Embrapa) e a companhia de bebidas das Américas (AmBev) (FILOCHE & PINTON, 2014). Ambas as instituições desenvolvem variedades de guaraná melhoradas geneticamente e disponibilizam algumas delas comercialmente para produtores. Em 1976, a Embrapa iniciou em Manaus o Programa de Melhoramento do Guaranazeiro. Seu objetivo era selecionar linhagens mais produtivas e resistentes a doenças e estresses, a fim de aumentar a produção para 400 kg/ha (FILOCHE & PINTON, 2014). O rendimento pode variar de forma significativa entre um indivíduo e outro e entre um ano e outro, devido a variações no regime de chuvas (DUARTE & PAULL, 2015). A produção média para plantas não-melhoradas varia entre 0,1 kg e 4 kg anualmente, por planta. Plantas melhoradas desenvolvidas pela Embrapa produzem entre 4 kg e 6 kg anualmente, por planta (DUARTE & PAULL, 2015). O processo de melhoramento de plantas consiste em realizar cruzamentos entre linhagens consideradas 'superiores' e submete-las a tratamentos com hormônios vegetais (SOUZA et al. 2012). Durante a década de 70, um novo modelo de produção agrícola foi implementado, no qual novas técnicas desenvolvidas pela Embrapa foram fornecidas aos pequenos agricultores. O objetivo era melhorar a produtividade da cultura do guaraná e transformar os pequenos produtores em fornecedores de matéria prima para uso industrial (FILOCHE & PINTON, 2014). Este plano tinha como alvo principal os caboclos, conhecidos como 'agricultores familiares'. Estas medidas contribuíram para o crescimento da

25 produção de guaraná e redução do êxodo rural. Coibir o êxodo rural ainda é necessário no Brasil, especialmente na região amazônica, pois o fluxo de mão de obra não qualificada para as grandes cidades contribui para o aumento da miséria e da criminalidade (FILOCHE & PINTON, 2014). Em 1999, a Embrapa disponibilizou no mercado 12 clones de alta produtividade e resistentes a pragas. Porém, a maioria dos produtores agrícolas apresentou resistência em descartar os cultivares velhos de guaraná e aceitar a transferência de tecnologia (FILOCHE & PINTON, 2014). Em 2005 foram disponibilizadas no mercado novas linhagens com produtividade de 4 kg a 6 kg anuais por planta (DUARTE & PAULL, 2015). A comercialização do guaraná não é recente, pois teve início no período colonial, quando se tornou uma importante mercadoria na região amazônica. Neste período, era vendido como fortificante, tônico, estimulante, antídoto para febre e para tratar enxaqueca e problemas intestinais (SMITH & ATROCH, 2010). Foi comercializado para regiões distantes, como Mato Grosso e Bolívia (FILOCHE & PINTON, 2014). Não se sabe ao certo se havia exportação para a Europa, mas existem registros de seu consumo na região em 1775 (HECKMAN et al. 2010). Desde este período até o século XX, a região de Maués foi o maior centro produtor de guaraná do Brasil. De fato, até o início dos anos 1990, a maioria das plantações comerciais estava localizada em Maués e ao longo do rio Amazonas (DUARTE & PAULL, 2015). A produção de guaraná não apresentou crescimento significativo até a década de 1920, quando surgiram os refrigerantes. O guaraná foi comercializado pela primeira vez como refrigerante em 1921 (HECKMAN et al. 2010). As sementes eram trazidas de Maués e processadas em São Paulo pela empresa Antártica. As vendas nos primeiros anos se restringiram a região sudeste do Brasil (HECKMAN et al. 2010). A popularização do refrigerante não se deve apenas às grandes empresas, mas aos fabricantes independentes, que surgiram em todo o país (SMITH & ATROCH, 2010). Alguns anos depois, o guaraná ganhou reputação nacional e internacional e passou a ser considerado uma tendência no mercado global de refrigerantes e energéticos (FILOCHE & PINTON, 2014). Houve aumento na demanda,

26 mas inicialmente não foi significativo, pois os fabricantes eram cautelosos quanto a quantidade de guaraná colocada em seus produtos (LIM, 2013). Atualmente, estima-se que 70% da produção brasileira de guaraná seja transformada em xarope e destinada para fabricação de refrigerantes. Os demais 30% são comercializados em forma de extrato em pó, cápsulas e barras (SCHIMPL et al. 2013). O Brasil é o terceiro maior fabricante de refrigerantes do mundo e o guaraná é o sabor mais popular (HECKMAN et al. 2010). O maior estado produtor é a Bahia, onde a produção se desenvolve de forma integrada com grandes empresas do setor de bebidas (DA COSTA, 2012). O Amazonas deixou sua posição histórica de maior produtor de guaraná, porém a cultura ainda tem grande importância econômica para o Estado. O guaraná corresponde a 12% das exportações anuais realizadas pelo Polo Industrial de Manaus (PIM), o que corresponde a aproximadamente US$ 131 milhões (DA COSTA, 2012). No Brasil, a produção anual média de guaraná em grãos foi de 3,67 mil toneladas entre 2012 e 2015 (CONAB, 2015). A produção de guaraná em grãos em 2015 cresceu 3% atingindo 3,660 toneladas. A área de colheita em 2015 atingiu 11,767 hectares, um crescimento de 3,7% em relação a 2014 (CONAB, 2015). No comercio brasileiro, o extrato da semente é facilmente encontrado em farmácias na forma de bastão, pó, cápsulas ou tabletes (KUHN & WINSTON, 2012). O extrato foi reconhecido como seguro para consumo pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e FDA (Food and Drug Administration) (DUCHAN; PATEL; FEUCHT, 2010). O guaraná pode ser encontrado como componente de energéticos, sucos, barras de cereal, sorvetes, liquores e balas (LIM, 2013). Na região amazônica é comumente consumido em cafeterias e restaurantes, na forma de shakes (SMITH & ATROCH, 2010). O guaraná é exportado principalmente para Europa e Estados Unidos (AZEVEDO, 2014). No exterior, é mais conhecido como ‘Guarana’, Brazilian cocoa ou Guarana bread (SMALL, 2011), encontrado principalmente em lojas especializadas em alimentos brasileiros ou latinos. É consumido principalmente na forma de bebidas energéticas, que

27 contém outros componentes como erva Mate, Gingko biloba e Ginseng (LIM, 2013). Existe atualmente um debate quanto à forma como o guaraná é explorado comercialmente. Pela medida provisória nº 2186-16 de 2001, o acesso aos recursos genéticos deve receber autorização do Estado, das comunidades e dos proprietários da terra. Os benefícios devem ser compartilhados com os fornecedores do recurso ou do conhecimento tradicional (FILOCHE & PINTON, 2014). A lei não exige nenhuma autorização legal para exploração comercial de extratos ou óleos essenciais, seja por companhias nacionais ou estrangeiras. Portanto, a lei é eficiente apenas em proteger o patrimônio genético de qualquer apropriação intelectual. Os índios Sateré-Maue se consideram responsáveis pela diversidade genética da cultura e pela domesticação das linhagens selvagens. Por isso reivindicam retornos financeiros por parte do governo ou das empresas que exploram a cultura (FILOCHE & PINTON, 2014).

2.1.4 - Doenças da cultura

São conhecidas diversas doenças causadas por fungos, bactérias e nematódeos na cultura de guaraná. Os nematódeos Xiphinema americanum, Meloidogyne arenaria e Meloidogyne thamesi causam enrugamentos e lesões em plântulas de guaraná e são frequentemente encontrados em viveiros (TFAED, 2015). A crosta negra, causada pelo fungo Septoria paullinae, é caracterizada por pontuações negras, salientes e globosas nas folhas (DUARTE & PAULL, 2015). O 'superbrotamento', causado Fusarium decemcellulare, é caracterizado pela proliferação de novos ramos ou massas similares a tumores, causando danos severos principalmente em viveiros (SOUZA et al. 2012). A doença é possivelmente transmitida pelo inseto Lotarips adisi. O fungo Ganoderma philippii causa a podridão vermelha radicular, caracterizada pelo amarelamento das folhas, seguido por enfraquecimento gradual e morte da planta (AGUSTINI et al. 2014). O

28 apodrecimento de raízes pode ser causado por outras espécies de fungo, como Phytophthora cactorum e Cylindrocladium clavatum (HORST, 2013). A bactéria Xanthomonas campestris causa a mancha foliar, doença que pode ser controlada por bactericidas a base de cobre (RYAN et al. 2011). A doença mais severa da cultura é a antracnose, que causa forte necrose nas folhas, podendo levar a uma desidratação completa (BOGAS et al. 2015). A doença é um fator limitante para a expansão da cultura e causa redução da área de plantio de guaraná no Brasil (MAHESHWARI; SARAF; AERON, 2013). Em cultivares antigos, formados por plantas propagadas sexualmente, a produção anual pode ser reduzida em até 88% (DE FREITAS SIA et al. 2013). Não existe uma forma eficiente de controlar a antracnose na cultura do guaraná. Porém, existem medidas de prevenção e redução de perdas, como o uso de clones tolerantes, o manejo adequado da cultura e o controle químico (BOGAS et al. 2015). A antracnose pode afetar a planta em todos os estágios de desenvolvimento. É causada principalmente por espécies de fungo do gênero Colletotrichum, considerado o mais comum e mais importante gênero de fungo fitopatogênico (DEAN et al. 2012). Na cultura do guaraná, a doença é causada principalmente por Colletotrichum guaranicola, que leva a planta à morte quando atacada sucessivamente (PEREIRA, 2005). Albuquerque (1960) foi o primeiro a pesquisar a antracnose no guaraná e propôs medidas de controle utilizadas até hoje por produtores e pesquisadores. Algumas delas são: incineração de plantas e órgãos excessivamente atacados, uso de fungicidas e inseticidas, podas regulares e propagação de variedades tolerantes. O uso de clones tolerantes é uma forma viável de controlar doenças, do ponto de vista socioeconômico e ambiental. Porém substituir plantios é um processo demorado e complexo. Por isso, o controle químico é uma alternativa a curto prazo que, apesar de ser onerosa, é eficiente. Não encontramos estudos recentes sobre controle químico da antracnose na cultura do guaraná e são escassos os estudos realizados dentro deste assunto. A Embrapa recomenda os fungicidas azoxistrobin, difenoconazol,

29 tiofanato metílico, tebuconazol e flutriafol, com 3 aplicações em intervalos de 14 dias (PEREIRA, 2005).

2.2 - Microrganismos Endofíticos

2.2.1 – Introdução

Endofíticos foram descobertos em 1904 na Alemanha (TAN & ZOU, 2001) e desde então o termo passou por diferentes definições. São definidos como microrganismos que habitam o interior dos tecidos de seus hospedeiros, pelo menos durante uma fase do seu próprio ciclo de vida, podendo desempenhar diversas relações ecológicas sem demonstrar sintomas visíveis da infecção (SCHULZ & BOYLE, 2005). Os hospedeiros podem ser algas, briófitas, pteridófitas, gimnospermas e angiospermas (HYDE & SOYTONG 2008). Bactérias e fungos endofíticos foram isolados de raízes de quase todos os hospedeiros estudados (PETRINI,1991) e são os microrganismos mais encontrados como endofíticos (SCHULZ, 2005). Não existem evidencias de outros microrganismos como micoplasmas e arqueobactérias em associação endofítica, mas é provável que existam (STROBEL & DAISY, 2003; HAGGAG, 2010). Microrganismos que habitam um tecido vegetal assintomático não são necessariamente endofíticos, pois existem microrganismos desempenhando outras estratégias de vida dentro da planta (SCHULZ & BOYLE, 2005). Ele pode ser um patógeno latente; um patógeno colonizando uma planta que não é seu hospedeiro; um saprófito; um oportunista ou um endofítico (BACON & WHITE, 2000). Fungos balansiaceos são ascomicetos da família Balansiaceae que pertencem aos gêneros Epichloe e Balansia e apresentam requisitos e adaptações distintas (BACON, et al. 1994). Este grupo de endofíticos é amplamente estudado devido a sua importância ecológica e econômica. No

30 interior do hospedeiro, crescem sistemicamente e intercelularmente, resultando em transmissão vertical pelas sementes. Devido a esta transmissão vertical, o hospedeiro pode transferir os endofíticos de geração em geração (ARNOLD, 2007). O hospedeiro é beneficiado principalmente pelo ganho nutricional e pela proteção a estresses abióticos. O grupo é conhecido por produzir uma ampla diversidade de metabólitos secundários, inclusive alcaloides que podem intoxicar mamíferos pastadores (BACON, 1993). É amplamente aceito que o relacionamento entre balansiaceos e hospedeiro seja mutualístico. Porém, existem balansiaceos não contribuem de nenhuma forma para o bom desempenho de seu hospedeiro (ARNOLD et al. 2003) Em comparação com fungos balansiaceos, os fungos não- balansiaceos são mais diversos tanto filogeneticamente, quanto em relação a suas estratégias de sobrevivência. A maioria deles pertence ao filo Ascomycota e foram isolados de todos os órgãos de quase todas as plantas analisadas (SCHULZ et al. 1993). Sua colonização pode ser inter ou intracelular, localizada ou sistêmica. Neste grupo de microrganismos, o termo 'endofítico' se refere a fungos e bactérias que ocupam temporariamente e de forma críptica o tecido vegetal (WHITE et al. 2011). .

2.2.2 - Relação entre endofítico e hospedeiro

Dentro do hospedeiro, o microrganismo endofítico pode crescer intercelularmente ou intracelularmente e pode apresentar especificidade a um órgão ou tecido. Pode colonizar apenas tecidos aéreos ou radiculares e pode ser especializado em ocupar cada nicho interno do hospedeiro (SCHULZ & BOYLE, 2005). Pode crescer apenas como endofítico ou como epifítico e pode apresentar ubiquidade ou especificidade a certos hospedeiros (BACON & WHITE, 2000). Pode cessar seu crescimento por um longo período, voltando a crescer após mudanças físicas ou maturacionais no hospedeiro (WHITE; JEFFREY; STONE, 2011). Fungos podem colonizar a planta de

31 forma intra ou intercelular, porém bactérias iniciam a colonização de forma intercelular (STROBEL & DAISY, 2003). A interação entre endofítico e hospedeiro é um processo multifatorial e envolve principalmente a predisposição genética do hospedeiro, seu status metabólico e fatores ambientais (ARNOLD & LUTZONI, 2007). Diversas espécies endofíticas se originam de outros substratos, como solo (WHITE; MARTIN; CABRAL, 1996). Endofíticos dos gêneros Fusarium, Phomopsis e Phoma são comuns em regiões temperadas, por outro lado, Xylariaceae, Colletotrichum, Guignardia, Phyllosticta e Pestalotiopsis predominam nos trópicos (SCHULZ & BOYLE, 2005). Os filos Zygomycetes e Basidiomycetes têm baixa ocorrência como endofíticos (FISHER; PETRINI; PETRINI, 1991). As espécies mais comuns de fungos endofíticos são as primeiras a colonizar os tecidos vegetais (WHITE & BACON, 2012). Quando o órgão se torna senescente, estes fungos crescem e esporulam rapidamente. Quando a decomposição do órgão avança, a comunidade endofítica é gradualmente substituída por espécies saprofíticas, tipicamente encontradas em serapilheira (BACON & WHITE, 2000). Comunidades de microrganismos saprofíticos rizosféricos, patogênicos e endofíticos se sobrepõem consideravelmente, porém alguns táxons são preferencialmente encontrados como endofíticos (WHITE; JEFFREY; STONE, 2011). É comum que espécies epifíticas e rizosfericas sejam isoladas como endofíticas, porém elas tendem a não ser dominantes na comunidade endofítica. Espécies de fungos de solo são raramente encontrados nas folhas, mas são comuns na parte interna de raízes e caules (ARNOLD & LUTZONI, 2007). A forma de colonização e a composição da comunidade endofítica entre parte aérea e radicular apresentam diferenças. Em assembleias foliares são escassas as espécies dominantes (ARNOLD, 2007) e a colonização é predominantemente intercelular localizada ou intracelular confinada em células individuais (LAU; ARNOLD; JOHNSON, 2013). A colonização nas raízes é extensiva e pode ser inter ou intracelular. Estruturas especializadas

32 em aprimorar a troca de metabólitos são observadas em ambos, parte aérea e raízes (ARNOLD, 2007). Existem diversas hipóteses que buscam explicar como o endofítico consegue colonizar o hospedeiro sem provocar sintomas macroscópicos de doenças. Fungos endofíticos produzem maior proporção de substâncias com atividade herbicida do que em fungos patogênicos. É plausível que as mesmas substâncias sejam sintetizadas in vivo em algum momento do ciclo de vida do endofítico (SCHULZ et al. 1999). Tais substâncias são tóxicas ao hospedeiro, porém não provocam sintomas visíveis de doenças. O hospedeiro responde a infecção com os mesmos mecanismos de defesa que emprega contra patógenos (ARNOLD, et al. 2003). Patógenos podem superar os mecanismos de defesa da planta de diversas formas, como por exemplo, reduzindo as concentrações de compostos fenólicos de defesa (SCHULZ et al. 1999). Enquanto o patógeno suprime os mecanismos de defesa da planta, o endofítico aparentemente pode tolerá-los. Existem diversos argumentos que buscam explicar de que maneira os endofíticos conseguem se associar com o hospedeiro de forma assintomática. É possível que isso ocorra devido a adaptações ao longo de sua co-evolução com o hospedeiro (WHITE; JEFFREY; STONE, 2011). Pode ocorrer um antagonismo balanceado entre endofítico e hospedeiro, o que explicaria a ausência de sintomas de doenças (WHITE & BACON, 2012). A virulência do fungo endofítico pode se equilibrar com os mecanismos de defesa da planta, tornando a interação assintomática. Caso este equilíbrio seja desfeito, o fungo endofítico será morto ou a planta desenvolverá uma doença. São necessários mais estudos para determinar se isso se aplica a bactérias endofíticas (WHITE & TORRES, 2010). O equilíbrio entre endofítico e hospedeiro pode ser perturbado quando o hospedeiro é estressado por condições ambientais. Assim, o endofítico pode deixar de atuar de forma mutualística e passar a atuar como um patógeno (BACON, 1993). Plantas estressadas apresentaram sintomas de doenças ou redução de crescimento quando inoculadas com fungos endofíticos. Isso demonstra que o endofítico pode de fato se tornar

33 patogênico quando o hospedeiro é estressado ou quando esta senescente (SCHULZ et al. 1998). As interações fisiológicas entre os dois simbiontes podem resultar em diversas vantagens para ambos (WHITE; MARTIN; CABRAL, 1996). Alguns endofíticos produzem fitoquímicos originalmente característicos de seus hospedeiros (STONE; BACON; WHITE, 2000). Acredita-se que este fenômeno seja resultado de uma recombinação genética entre endofítico e hospedeiro, que teria ocorrido ao longo do processo evolutivo (TAN & ZOU, 2001). Se endofíticos podem produzir os mesmos compostos que seus hospedeiros produzem, isso poderia evitar a devastação de florestas, contribuindo para a preservação da biodiversidade (STROBEL & DAISY, 2003). A fabricação de um produto a partir de microrganismos pode ser mais fácil e menos onerosa, o que reduziria seu preço de mercado (BACON et al. 1994).

2.2.3 - Diversidade de microrganismos endofíticos

A composição da comunidade endofítica e sua frequência de colonização variam com o hospedeiro, distribuição geográfica, características do campo, tipo e idade do tecido (HOFFMAN & ARNOLD, 2008). Em plantas lenhosas, o estágio de crescimento e a posição da copa podem influenciar (SCHOLTYSIK et al. 2013). Existem diferentes padrões de distribuição espacial e temporal, por exemplo, a composição de espécies pode ser diferente entre a lamina foliar e o pecíolo (VAZ et al. 2014). A frequência de colonização pode aumentar ou diminuir periodicamente com a estação do ano (WU et al. 2014). Diferenças na pluviosidade, temperatura ou altitude podem promover a colonização de determinadas espécies endofíticas (VAZ et al. 2014). A microbiota endofítica de uma espécie vegetal permanece relativamente constante, independentemente da distância geográfica e da diferença de idade (WHITE; JEFFREY; STONE, 2011). Porém, é possível

34 obter maior diversidade de endofíticos de uma espécie vegetal se forem amostradas plantas de zonas ecológicas diferentes, com diferentes associações ecológica (WHITE & BACON, 2012). Utilizar meios de cultura diferentes pode levar a uma maior variedade de grupos de fungos isolados de um único hospedeiro (BACON & WHITE, 1994). Os métodos utilizados para estudar a diversidade de endofíticos são os mesmos empregados para o estudo de microrganismos fitopatogênicos. Porém é dado ênfase na autoecologia, sinecologia e biodiversidade dos fungos em seu ambiente natural. A técnica selecionada para o estudo da comunidade endofítica pode influenciar a diversidade de endófitos que será isolada. Alguns exemplos são, o tipo de desinfestação superficial, o tamanho do fragmento vegetal, o meio de cultura utilizado, entre outros (WHITE; JEFFREY; STONE, 2011). Trabalhos que utilizam órgão vegetais de maior idade e fragmentos de menor tamanho apresentam maior aquisição de espécies e maior diversidade (ARNOLD & LUTZONI, 2007)

2.2.4 - Microrganismos associados a P. cupana

Estudos prévios descrevem o isolamento de fungos endofíticos nas folhas de P. cupana, os quais pertencem aos gêneros Aspergillus, Bionectria, Botrysphaeria, Cladosporium, Cochliobolus, Colletotrichum, Coniosporium, Daldinnia, Diaporthe, Phomopsis, Guignardia, Nigrospora, Pestalotiopsis, Phanerochaete, Pleosporales, Sordariomycetes e Xylaria (DE FREITAS SIA et al. 2013). Apesar de Colletotrichum ser patogênico, foi isolado de folhas saudáveis e sem sintomas de antracnose. Alguns destes gêneros não eram conhecidos como endofíticos, como Coniosporium, encontrado apenas como epifítico, saprofítico e sobre monumentos antigos, e Phanerochaete (DE FREITAS SIA et al. 2013). A filosfera de P. cupana apresenta bactérias dos filos Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes e Acidobacteria, com predominância de Firmicutes nos tecidos assintomáticos (BOGAS et al.

2015). Os isolados pertencem aos gêneros Bacillus, Microbacterium, Brevibacillus, Sphingomonas, Ochrobactrum, Stenotrophomonas, Curtobacterium, Methylobacterium, Paenibacillus, Rhizobium e Nocardioides. Os gêneros Cohnella, Brevundimonas, Pseudomonas, Paracoccus, Williamsia e Mucilaginibacter representam apenas 1,2% do total de gêneros observados (BOGAS et al. 2015). No solo rizosferico foram encontradas bactérias dos gêneros Ralstonia, Burkholderia, Cupriavidus, Pantoea, Dyella, Bacillus, Corynebacterium, Lysobacter, Paenibacillus, Curtobacterium, Chryseobacterium, Actinomycetales e Delfitia (BATISTA, 2012). Foram encontrados actinomicetos dos gêneros Streptomyces, Nocardiopsis, Actinomadurae e Planobispora (SILVA, 2012). Nos frutos foram isoladas bactérias dos gêneros Stenotrophomonas, Paenibacillus e Ochrobactrum, e as espécies Rhizobium leguminosarum, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis e Microbacterium murale (SILVA, 2015). Foram encontradas 2 espécies de fungos, a saber, Lasiodiplodia theobromae e Fusarium decemcellulare (SILVA, 2015). A comunidade endofítica foliar apresenta maior diversidade e inclui gêneros não encontrados na rizosfera e nas sementes, como Pseudomonas, Erwinia, Entereobacter, Serratia, Acinetobacter, Microbacterium, Cronobacter, Comamonas, Klebsiella e Staphylococcus (BONATELLI, 2012).

2.2.5 - Aplicações de microrganismos endofíticos

A busca por produtos naturais de origem microbiana começou quando Pasteur descobriu que a fermentação é causada por células (STROBEL & DAISY, 2003). Posteriormente, Fleming descobriu a penicilina, produzida por Penicillium notatum e desde então foram encontradas diferentes espécies de microrganismos produtoras de compostos com diversas aplicações. Mesmo nos dias de hoje, a busca por novas substâncias que promovam assistência e alívio para o ser humano em diversos aspectos é crescente (WHITE & BACON, 2012). Microrganismos endofíticos são

36 considerados fontes promissoras de novos produtos naturais, que podem ter diversas aplicações na saúde, agricultura e indústria (BACON et al. 1994). Novas drogas são necessárias para combater novas doenças; tratar doenças causadas por microrganismos resistentes a antibióticos; tratar doenças negligenciadas, entre outros (STROBEL, 2012). Tais medicamentos devem ser altamente efetivos, apresentar baixa toxicidade e baixo impacto ambiental. Sabe-se que 31% dos metabólitos isolados de fungos de solo e 51% dos metabólitos isolados de fungos endofíticos eram inéditos (WHITE, 1994). Estes dados demonstram que fungos apresentam um grande potencial para desenvolvimento de novos fármacos, especialmente endofíticos. Endofíticos produzem esteroides, xantonas, fenóis, cumarinas, perileno, quinonas, furandionas, terpenoides, depsipeptideos, citocalasinas e compostos de novos grupos estruturais como palmarumicinas (SCHULZ et al. 2002) (Figura 2). Abaixo serão apresentados exemplos que demonstram o potencial destes microrganismos na produção de antibióticos, anticânceres, antioxidantes entre outros.

2.2.5.1- Antibióticos

Antibióticos são moléculas de baixo peso molecular, ativas em baixas concentrações contra outros microrganismos (DEMAIN, 1981). Endofíticos produzem antibióticos que podem inibir ou matar microrganismos patogênicos de plantas e animais. A atividade antimicrobiana de endofíticos é frequentemente relatada na literatura. Diversos compostos com atividade antimicrobiana foram isolados de microrganismos endofíticos, como os antifúngicos massarigenina D, espiromassaritona e paecilospirona (SUN et al. 2011), a maklamicina, com forte atividade contra bactérias Gram positivas (IGARASHI et al. 2011), os tripanocidas espoxazomicinas A, B e C (INAHASHI et al. 2011) e os antivirais emerimidinas, emerifenolininas, perilenoquinonas e versicolactonas (ZHANG et al. 2011; WELLENSIEK et al. 2013; ZHOU et al. 2015).

Figura 2 - Diversidade estrutural de metabólitos isolados de fungos endofíticos (SCHULZ et al. 2002).

2.2.5.2 – Agentes anticâncer

Endofíticos produzem compostos com atividade anticâncer. O taxol era obtido apenas de teixos do gênero Taxus, posteriormente foi isolado do fungo endofítico Taxomyces andreanae (STROBEL et al. 2004). Atualmente são conhecidas diferentes espécies de fungos produtoras de taxol, como Lasiodiplodia theobromae (PANDI et al. 2013), Stemphylium sedicola (MIRJALILI et al. 2012), Phoma betae (KUMARAN et al. 2014), Fusarium oxysporum (ELAVARASI; RATHNA; KALAISELVAM, 2012), Colletotrichum

38 gloeosporioides (RAJ et al. 2014), Fusarium redolens (GARYALI & REDDY, 2013), entre outros. Assim como o taxol, a camptotecina é considerada um dos agentes anticâncer mais eficientes disponíveis no mercado. Diversos endofíticos produzem camptotecina e seus análogos, como Fomitopsis sp., Alternaria alternata, Phomposis sp. (SHWETA et al. 2013), Neurospora (REHMAN et al. 2008), Fusarium solani (VENUGOPALAN & SRIVASTAVA, 2015), Trichoderma atroviride (PU et al. 2013), Paenibacillus polymyxa (PU et al. 2015) entre outros. O fungo Aspergillus niger produziu o lapachol, que inibe fortemente o crescimento de células tumorais (GOVINDAPPA, 2014). O fungo Hypocrea lixii produziu o cajanol, com forte atividade citotóxica in vitro contra linhagens celulares de carcinoma pulmonar humano (ZHAO et al. 2013). A bactéria Bacillus amyloliquefaciens apresentou exopolisacarídeos com atividade antitumoral contra células de carcinoma gástrico (CHEN, 2013). As bactérias Serratia marcescens e Bacillus methylotrophicus produzem grande quantidade de L-asparaginase, enzima utilizada no tratamento de leucemia e tumores (NONGKHLAW & JOSHI, 2015).

2.2.5.3 - Antioxidantes

Diversos compostos isolados de endofíticos apresentam atividade antioxidante in vitro em ensaios de sequestro do radical 2,2-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) e são encontrados vários exemplos na literatura. A altenusina e djalonensona, isoladas de Botryosphaeria dothidea (XIAO et al. 2014). O ácido 4-hidroxil-3-metoxibenzóico, isolado de Streptomyces sp. (YANG et al. 2015). O dibutil ftalato, alternariol metil éter e alternariol, isolados de Alternaria sp. (YAN-YUN & LI, 2012); entre outros. Alguns casos de maior destaque são de fungos do gênero Nigrospora com IC50 de 9,28 µg/mL contra o DPPH (PAWLE et al. 2014). As espécies Aspergillus awamori e Corynespora cassiicola apresentam atividade antioxidante comparável ao ácido ascórbico (HIPOL et al. 2014).

Observa-se nos trabalhos mencionados que a atividade antioxidante e o teor de fenóis totais são frequentemente avaliados por técnicas colorimétricas. A colorimetría é empregada para determinar a concentração de compostos de cor em uma solução. O objetivo é mensurar a concentração de moléculas que absorvem um comprimento de onda específico (OLIVEIRA et al. 2014). O comprimento de onda transmitido pelo colorímetro ou espectrofotômetro deve ser o mesmo que é absorvido pelo composto que será mensurado (CAROCHO & FERREIRA, 2013). O ABTS (2,2-azinobis (3- etilbenzotiazolina-acidosulfónico)) e o DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) são exemplos de radicais cromogênicos que podem ser utilizados para determinar a atividade antioxidante por colorimetría.

O radical DPPH apresenta a fórmula C18H12N5O6, com o elétron desemparelhado localizado em um dos átomos de nitrogênio (BLOIS, 1958). Em temperatura ambiente, apresenta cor violeta, característica gerada pelo elétron deslocalizado (MOLYNEUX, 2004). Devido a sua alta reatividade, radicais livres apresentam um curto tempo de vida, porém o DPPH é uma exceção, sendo considerado um radical estável. Sua estabilidade está relacionada com os anéis benzênicos e as duplas ligações presentes na estrutura da molécula, que propiciam efeito de ressonância, eficaz em estabilizar a carga eletrônica, que se dispersa por toda a molécula (SHARMA & BHAT, 2009). Na reação de captura do DPPH ocorre uma reação de oxirredução, na qual o elétron desemparelhado do nitrogênio se emparelha com o elétron cedido por um radical hidrogênio de um antioxidante (Figura 3).

Figura 3 - Reação de oxirredução do radical DPPH.

O método de Folin-Ciocalteu é um dos métodos colorimétricos mais usados para quantificar fenóis totais de amostras biológicas (WATERHOUSE, 2002). O reagente de Folin-Ciocalteu é uma combinação de fosfomolibdato de sódio e ácido fosfotungstico (ZAIA et al. 1998) (Figura 4). Durante a reação ocorre a transferência de elétrons de compostos fenólicos para o reagente, que passa a apresentar coloração azul, com forte absorção no comprimento de 765 nm (ZAIA et al. 1998).

Figura 4 – Moléculas que compõem o reagente de Folin- Ciocalteu

A cor azul é proporcional ao teor de fenóis. A maior desvantagem deste método é sua falta de especificidade a fenóis, pois o reagente de Folin- Ciocalteu pode reagir com qualquer substância redutora da amostra, como hidroxilaminas, guanidinas, tiois, vitaminas, trioses gliceraldeidos, diidroxiacetonas e alguns íons inorgânicos (PETERSON, 1979; IKAWA et al. 2003). Apesar das limitações, o método ainda é amplamente empregado.

2.2.5.4 – Benefícios ao Hospedeiro

Os benefícios que o endofítico pode promover ao hospedeiro apresentam grande utilidade na agricultura. Aprimorar a resistência de cultivares sem empregar pesticidas é um dos maiores objetivos da agricultura atual. Novos compostos são necessários para desenvolver agrotóxicos de baixo impacto ambiental, combater novas doenças agrícolas e promover alternativas de controle de pragas e patógenos (STROBEL & DAISY, 2003). Endofíticos e fungos microrrízicos podem promover o crescimento vegetal por uma série de fatores, como síntese de fitormônios, maior acesso a minerais e nutrientes e fixação de nitrogênio atmosférico (BACON & WHITE, 2000; SINGH et al. 2011). Fungos de diferentes gêneros podem promover o crescimento vegetal, como Neotyphodium, Curvularia, Colletotrichum, Fusarium, Alternaria (KIM et al. 2012) e bactérias como Streptomyces e Burkholderia (VERMA et al. 2011). Uma forma de promover o crescimento vegetal é pela síntese do fitormônio ácido indolacético (AIA). Em microrganismos, existem diferentes vias metabólicas que levam a produção do AIA usando triptofano como precursor, como foi demonstrado por Spaeden et al. (2007) (Figura 5).

Figura 5 - Visão geral das diferentes vias para síntese de AIA em microrganismos (SPAEDEN et al. 2007).

A colonização endofítica pode resultar em proteção contra herbivoría (ARNOLD et al. 2003). Esta relação foi observada em endofíticos de Pezicula sp. que produzem metabólitos tóxicos para larvas de diversos insetos (SCHULZ et al., 1995). A síntese de inseticidas foi observada em bactérias endofíticas como Bacillus amyloliquefaciens, que tornam o hospedeiro menos atrativo para larvas (LI et al. 2015a). Afídeos e ácaros apresentaram aumento na taxa de mortalidade e redução no tempo de sobrevivência quando alimentados com plantas colonizadas por Neotyphodium gansuense (ZHANG et al. 2012). Endofíticos podem promover a resistência sistêmica do hospedeiro, como foi observado em Piriformospora indica (HARRACH et al. 2013), Fusarium oxysporum e Rhizobium etli (MARTINUZ et al. 2012). Quando inoculado na raiz, P. indica aumentou a atividade das enzimas antioxidantes deidroascorbato redutase e monodeidroascorbato redutase, que liberam ácido ascórbico, com grande atividade antioxidante. Dessa forma o fungo consegue prevenir a necrose e a retardação do crescimento da planta, relacionados com a doença (HARRACH et al. 2013). A promoção de resistência ao hospedeiro pode ocorrer em casos de estresse por desidratação, temperatura, salinidade, entre outros (BAGHERI et al. 2013; KHAN et al. 2013b). A desidratação leva a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) em nível celular, comprometendo o desenvolvimento de diferentes culturas agrícolas. O fungo endofítico Penicillium resedanum reduziu a geração de ERO pela redução dos teores de glutationa, catalase, peroxidade e polifenol oxidase. O endofítico promoveu alongamento do caule e do conteúdo de clorofila e aumentou a taxa fotossintética (KHAN et al. 2013a).

3 - JUSTIFICATIVA

Devido à grande diversidade de plantas e a abundância de inoculos no ar, a região tropical apresenta grande diversidade de fungos endofíticos (ARNOLD, 2003). Nesta região, as folhas, ramos e raízes de plantas foram os órgãos onde a diversidade endofítica foi mais estudada (DUI AL BANERJEE, 2011). Nestes estudos foi constatado que as comunidades endofíticas apresentam um grande número de espécies raras (MAY, 1991; ARNOLD & LUTZONI, 2007). A diversidade de endofíticos pode variar entre hospedeiros espacialmente distantes (POLISHOOK et al. 1996; ARNOLD, 2000), entre órgãos vegetais (WEARN et al. 2012) e devido a características climáticas de cada ambiente (HIGGINS et al. 2014). Os estudos realizados nas regiões tropicais ainda são insuficientes para responder diversas questões de relevância ecológica, como os papéis ecológicos que endofíticos desempenham. Devido à falta de informações, a diversidade de endofíticos é conhecida de forma escassa nesta região. São necessários mais estudos que avaliem a diversidade de fungos endofíticos, os fatores que podem influencia- la, entre outros aspectos. Desta forma, neste trabalho pretende avaliar a diversidade de fungos endofíticos de clones de Paullinia cupana (Mart.) Ducke. A investigação da interação de endofíticos com o hospedeiro é realizada para determinar de que maneiras o hospedeiro pode ser beneficiado. Fungos endofíticos podem impedir a colonização da planta por fungos patogênicos e reduzir os danos causados por eles (KIRK & DEACON, 1987; NEWSHAM, 1999). A presença de determinadas espécies de fungos endofíticos em sementes pode resultar em redução na severidade de doenças em diversos órgãos (VILICH; DOLFEN; SIKORA, 1998). Plantas suscetíveis a fungos, nematoides, larvas ou traças patogênicas podem adquirir resistência quando colonizadas por determinadas espécies de fungos endofíticos (DUGASSA-GOBENA; RAPS; VIDAL, 1998; DABABAT et al. 2008; MOLL & VIDAL 1995; DAVIS, 1967; MATTA, 1989). Diversas espécies de fungos endofíticos podem promover ganho de biomassa e crescimento

44 vegetal (VILICH; DOLFEN; SIKORA, 1998; MANDYAM; LOUGHIN; JUMPPONEN, 2010). Raízes podem ser colonizadas por fungos dark septate, que promovem ganho de biomassa, protegem contra doenças, aumentam a produção de sementes, entre outros benefícios (MANDYAM; LOUGHIN; JUMPPONEN, 2010; WU et al. 2010; NARISAWA; USUKI; HASHIBA, 2004; ACHATZ et al. 2010). Os benefícios que endofíticos conferem ao hospedeiro estão relacionados com a grande diversidade de compostos bioativos que produzem (KUSARI; SINGH; JAYABASKARAN, 2014). Estes compostos podem ser utilizados pelo homem na agricultura e no desenvolvimento de novas drogas (RADIC & STRUKELJ, 2012; CARTER, 2011). Fungos endofíticos produzem antibióticos capazes de inibir microrganismos multirresistentes (ARIVUDAINANBI et al. 2011; RADIC & STRUKELJ, 2012; BIN et al. 2014) e compostos com atividade anticâncer, antioxidante, antifúngica, entre outros (HAMILTON & BAUERLE, 2012; PURI et al., 2005; KIM et al. 2015). O desenvolvimento de novos medicamentos é necessário para introduzir no mercado alternativas de tratamentos e combater novas doenças (WHO, 2014). Portanto, a investigação dos endofíticos obtidos neste trabalho pode contribuir para o desenvolvimento de novas drogas e agentes para o controle de patógenos. Este trabalho pretende investigar a diversidade de fungos endofíticos de P. cupana em cada ambiente, órgão vegetal e clone e analisar seus traços funcionais e atividades biológicas. Esta investigação abre possibilidades para novas descobertas de relevância ecológica e biotecnológica.

4 - OBJETIVOS

4.1 - Objetivo Geral

Caracterizar a comunidade de fungos endofíticos de clones suscetíveis e tolerantes de Paullinia cupana (Mart.) Ducke, avaliar se as comunidades endofíticas de cada clone, órgãos e localidade são diferentes e analisar seus traços funcionais e potencial biotecnológico.

4.2 - Objetivos Específicos

- Avaliar a associação de fungos com raízes de P. cupana

- Avaliar a riqueza e diversidade de espécies de fungos endofíticos de clones suscetíveis e resistentes de P. cupana

- Obter extratos AcOEt dos morfotipos obtidos.

- Avaliar a atividade antimicrobiana, antioxidante, antitumoral e teor de fenóis totais dos extratos AcOEt.

- Determinar os traços funcionais importantes na promoção de crescimento vegetal.

- Isolar metabólitos especiais produzidos pelos fungos selecionados empregando métodos cromatográficos.

- Determinar a estrutura molecular dos compostos purificados por técnicas de RMN 1D e 2D e espectrometria de massas.

- Avaliar a atividade antimicrobiana, antioxidante e antitumoral dos metabólitos especiais purificados.

5.0 - ARTIGOS ARTIGO 1 - DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CLONES E ÓRGÃOS DE Paullinia cupana (Mart.) Ducke EM DIFERENTES LOCALIDADES E AVALIAÇÃO DE TRAÇOS FUNCIONAIS Fungal Ecology (ISSN: 1754-5048)

RESUMO Endofíticos são microrganismos que habitam o interior dos tecidos de seus hospedeiros sem demonstrar sintomas visíveis de infecção e produzem compostos que podem beneficia-lo. Neste trabalho foram isolados fungos endofíticos de clones de Paullinia cupana suscetíveis e tolerantes a antracnose, doença causada por Colletotrichum sp. A diversidade e composição das comunidades endofíticas e seus papéis funcionais foram analisados. Raízes e sementes foram desinfestadas e inoculadas em placas com meio de cultura BDA e TSA. O sequenciamento parcial da região ITS do gene rDNA foi realizado para identificação das linhagens. A produção de enzimas hidrolíticas, ácido indolacético (AIA) e antifúngicos e a capacidade endofitíca dos fungos isolados foram avaliadas. A associação de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e dark septate (DSE) com raízes de P. cupana foi investigada. Trinta e três espécies distribuídas em 256 linhagens foram isoladas. A maior riqueza, maior taxa de colonização e o maior índice de Shannon ocorreram nas comunidades endofíticas da localidade Manaus, de clones suscetíveis e das raízes. A maior dominância ocorreu nas comunidades endofíticas da localidade Maués, de clones tolerantes e das sementes. A inibição de fungos fitopatogênicos, secreção de enzimas hidrolíticas e produção de AIA foi observada em diversas espécies. Ocorre associação de raízes de P. cupana com fungos DSE e FMA. P. asparagi (22TSA) e P. pinodella (28S) foram caracterizadas como DSE’s pelas estruturas típicas de DSE. A estrutura da comunidade de fungos endofíticos em P. cupana é influenciada pelo clone, localidade e órgão vegetal. A presença de DSE e de fungos produtores de enzimas, antifúngicos e AIA em

47 clones suscetíveis e tolerantes de P. cupana sugere que ambos podem ser beneficiados pela associação.

INTRODUÇÃO

Paullinia cupana, conhecida popularmente como guaraná, é nativa da Amazônia brasileira. É conhecida pelo seu efeito estimulante, causado pela alta concentração de cafeína. Inicialmente cultivada apenas por nativos, seu cultivo cresceu impulsionado pela indústria de bebidas e representando uma tendência no mercado global de refrigerantes e energéticos (Filoche & Pinton, 2014). O Brasil enfrenta dificuldades para aumentar sua produção devido a doenças que limitam a expansão da cultura. A antracnose (agente casual Colletotrichum guaranicola) e o superbrotamento (agente casual Fusarium decemcellulare) prejudicam seriamente as plantações (Dean et al., 2012, Pereira, 2005, Souza et al., 2012). O desenvolvimento de clones tolerantes a doenças promoveu aumento da produção nas últimas décadas, apesar dos prejuízos causados pelas doenças permanecerem significativos (Companhia Nacional de Abastecimento, 2015, Da Costa, 2012). O controle de doenças agrícolas e o aumento da produção podem ser obtidos através de microrganismos endofíticos (Soares et al., 2015; Kumar & Kaushik, 2013, Johnson et al., 2014). Por definição, endofíticos são microrganismos que habitam o interior dos tecidos de seus hospedeiros, pelo menos durante uma fase do seu próprio ciclo de vida, podendo desempenhar diversas relações ecológicas sem demonstrar sintomas visíveis da infecção no hospedeiro (White, 1987). Endofíticos podem promover a resistência sistêmica do hospedeiro ao ataque de patógenos (Harrach et al., 2013) e inibir o ataque e colonização de microrganismos patogênicos (Kirk & Deacon, 1987, Newsham, 1999). A diversidade endófitos e os processos que interferem na sua distribuição permanecem pouco compreendidos na região tropical (Vincent et al., 2016). Hospedeiros de regiões tropicais abrigam maior diversidade de fungos endofíticos do que plantas de regiões temperadas

(Arnold, 2003). Esta diversidade relaciona-se com a alta diversidade de habitats e a intensa especialização das espécies na utilização destes habitats (Higgins et al., 2014). A composição das comunidades endofíticas é influenciada por diversos fatores, como clima (Higgins et al., 2014), distância geográfica (Polishook et al., 1996, Arnold et al., 2000), tipo de tecido vegetal (Wearn et al., 2012), sistema de cultivo (Saucedo-Garcia et al., 2014) bem como tipo de cultivar. Cultivares tolerantes a um determinado fitopatógeno podem abrigar uma comunidade endofítica diferente de cultivares não-tolerantes (Feng et al. 2013; Manter et al., 2010). Existem espécies endofíticas que apresentam traços funcionais benéficos ao hospedeiro, mas que estão presentes apenas em cultivares tolerantes ou apresentam maior abundância nestes cultivares (Feng et al. 2013). Hospedeiros podem ser beneficiados pela associação com uma classe de fungos endofíticos radiculares denominados dark septate (Rodriguez et al. 2009), que promovem o crescimento vegetal e tolerância a estresses abióticos (Mandyam & Jumpponen, 2013, Ling et al., 2013). Não há informações sobre os fatores que afetam a composição de comunidades endofíticas em P. cupana, sobre os papéis funcionais que desempenham ou sobre sua associação com fungos DSE. Nossos objetivos foram detectar a associação de P. cupana com fungos DSE, bem como determinar a influência da localidade, tipo de clone e órgão vegetal na estrutura da comunidade de fungos endofíticos. Traços funcionais envolvidos com o crescimento vegetal e tolerância a fitopatógenos foram determinados nas comunidades de fungos.

METODOS

Isolamento de fungos endofíticos de P. cupana:

Sementes e raízes de 5 indivíduos adultos de P. cupana foram coletados nos municípios de Manaus (2º 53' 29.14''S e 59º 58' 39.90''W, 99 m de altitude) e Maués (3º 22' 54'' S e 57º 42' 55'' W, 18 m de altitude),

49 localizados no estado do Amazonas (Brasil). O clone CMU 871 é tolerante ao superbrotamento, doença causada por Fusarium decemcellulare, por outro lado, o clone CMU 300 é suscetível a este patógeno (Nascimento Filho et al., 1999). Ambos os clones são resistentes a antracnose, uma das principais doenças da cultura, cujo agente casual é C. guaranicola (Bentes & Barreto 2004). A desinfestação do material e isolamento dos endofíticos foram feitos segundo Petrini (1991). Sementes e fragmentos de raiz desinfestados foram inoculados em meio de cultura BDA (ágar batata dextrose) e TSA (ágar triptona de soja) suplementados com estreptomicina, cloranfenicol e tetraciclina (200 mg/L). A incubação foi realizada por 15 dias e as linhagens foram agrupadas morfologicamente (Lacap et al., 2003). O DNA genômico foi extraído de cada grupo morfológico para identificação molecular.

Identificação Molecular:

A região internal transcribed spacer regions (ITS) foi amplificada de acordo com Rosa et al. (2009) utilizando primers ITS1 e ITS4 (White et al., 1990). Sequências foram analisadas pelo software BioEdit (versão 7.2.5) e comparadas com as sequências do banco de dados NCBI GenBank (Nacional Center for Biotechnology Information) pela ferramenta BLAST. Sequências obtidas foram depositadas no GenBank.

Análises de estrutura das comunidades

Foram avaliados a taxa de colonização de endofíticos (Petrini 1991) e a frequência relativa das espécies isoladas (Arnold et al., 2007). A diversidade e riqueza de espécies foram estimadas pelos índices de Shannon - Weaver (1948) e Chao 1 (Chao, 1987), respectivamente. A riqueza e equitabilidade foram analisadas pela série de Hill. A dominância de espécies foi medida pelo índice de Simpson (1949). A similaridade entre as diferentes comunidades e

50 a análise de cluster por UPGMA foram avaliadas pelo índice de Jaccard (1908). As análises foram realizadas no software Past (Hammer et al., 2001).

Diafanização e análise qualitativa das estruturas de infecção

Parte das raízes coletadas de P. cupana foi descolorida para visualização da associação com fungos endofíticos. A diafanização das raízes de P. cupana foi realizada segundo Phillips & Hayman (1970). Lâminas de microscopia foram montadas com 15 fragmentos de raízes por indivíduo e analisadas nos aumentos de 10 e 40 vezes. A presença de estruturas de fungos endomicorrízicos (FMA) e fungos dark septate (DSE) foi avaliada em microscópio Nikon® Eclipse E200 acoplado com câmera (Bel Photonics®).

Avaliação da capacidade endofítica in vitro

Fungos com micélio escuro e hifas septadas foram selecionados para avaliar sua capacidade infectiva e diferenciação de estruturas típicas de dark septate. Sementes de P. cupana não foram utilizadas devido à dificuldade em promover sua germinação (Duarte & Paull, 2015). De forma alternativa, foram utilizadas sementes de sorgo (Sorghum sp.) cultivar BRS 373. Sementes foram desinfestadas (Piernas & Guiraud, 1997) e incubadas em meio mínimo mineral (MM) (Davis & de Serres, 1970) à temperatura ambiente (aproximadamente 27°C) e sob luz natural. Após 5 dias, as radículas das plântulas foram inoculadas com fragmentos de micélio ativados previamente em meio BDA. Plântulas controle não foram inoculadas. As raízes foram diafanizadas, coradas e analisadas após 15 dias de interação (Phillips & Hayman, 1970). Raízes coradas foram preservadas em polivinil lacto-glicerol (PVLG) e observadas com auxílio de microscópio (Koske & Tessier, 1983).

Análise de traços funcionais

A produção das enzimas celulase (Hagerman, Blau & Mcclure, 1985), esterase (Sierra, 1957), amilase, fosfatase e protease (Hankin & Anagnostakis,1975) in vitro foi avaliada. A produção de sideróforos foi determinada em meio cromoazurol S (Schwyn & Neilands, 1987). Em todos os testes, micélio ativado em BDA foi utilizado como inóculo e a formação de halos foi determinada após 24 h de incubação. A produção de ácido indolacético foi determinada pelo método colorimétrico, utilizando como controle negativo caldo BD suplementado com triptofano (0,1275g de triptofano para cada 850ml de caldo BD) (Gordon & Weber, 1951). A concentração de AIA foi determinada utilizando-se a equação da curva padrão de AIA.

Teste de antibiograma contra fungos fitopatogênicos

Extratos brutos AcOEt dos fungos endofíticos foram obtidos de acordo com Rosa et al. (2012) e conservados à -20ºC até o momento de sua utilização. A avaliação da capacidade dos extratos AcOEt em inibir fitopatógenos foi realizada pelo teste de difusão em disco de papel (Bauer et al., 1966), nos quais foram aplicados 10 μL de extrato AcOEt (20 mg/mL). Foram selecionados Colletotrichum sp. (linhagem 2353) e Fusarium sp. (linhagem F386) patógenos de guaraná, Colletotrichum sp. (linhagem PF02) patógeno de pimentão (Capsicum sp.) e Colletotrichum sublineola patógeno de sorgo (Sorghum sp.). A taxa de inibição (TI) foi calculada (Lai et al., 2009).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Diversidade de fungos endofíticos de P. cupana

O isolamento de fungos endofíticos de raízes e sementes de P. cupana resultou em 256 linhagens distribuídas em 33 espécies (Tabela 1). O filo e classe com maior riqueza e frequência relativa foram Ascomycota e Sordariomycetes. Estes são táxons frequentemente descritos em comunidades de plantas tropicais (Arnold & Lutzoni, 2007) (Tabela 2). A ordem Diaporthales apresentou maior frequência relativa incluindo gêneros abundantes em plantas tropicais, como Diaporthe e Phomopsis (Rossman et al., 2007) (Tabela 2). O gênero Xylogone, bem como a espécie X. ganodermophthora, apresentaram maior frequência relativa nas comunidades endofíticas radiculares e apresentaram maior frequência relativa total (Tabela 1). Xylogone é um táxon raro relatado como endofítico em Taxus chinensis e como fungo edáfico (Wu et al., 2013; Kim et al., 2015). Encontramos relatos da espécie X. ganodermophthora apenas como micopatógeno (Kang et al., 2011). P. asparagi apresentou a segunda maior frequência relativa total (Tabela 1). P. asparagi ocorre como endofítica (Murali et al., 2006) e frequentemente relatada como fitopatogênico, especialmente em culturas de aspargo (Yin et al., 2012). O gênero Phomopsis é prevalentemente encontrado como endofítico em muitas espécies tropicais (Udayanga et al., 2011). Nas comunidades endofíticas de sementes, apenas a espécie D. phaseolorum está presente em todas as comunidades (Tabela 1) sendo comum em hospedeiros tropicais (Sebastianes et al., 2012; Casella et al., 2013). As demais espécies apresentaram frequência relativa total inferior a 10%. Os gêneros Peyronellaea, Paraphaeosphaeria, Sydowiella, Mariannaea, Pochonia, Arxiella, Mycena e Nectria são relatados em regiões tropicais (Arevalo et al. 2009; Schroth et al. 2000; Cai et al. 2010; Chia et al. 2014; Hyde et al. 2005; Kövics et al. 2014), porém, não encontramos relatos de sua ocorrência em comunidades endofíticas tropicais. Este fato demonstra o quanto é limitado o conhecimento da diversidade endofítica de regiões tropicais.

O tipo clonal de P. cupana influenciou nas comunidades endofíticas do hospedeiro. Comunidades endofíticas de sementes de clones suscetíveis de Manaus e Maués apresentaram maior riqueza, maior índice de Shannon e maior equitabilidade (Tabela 3). Por outro lado, comunidades endofíticas de sementes de clones tolerantes de Manaus e Maués apresentaram maior dominância. Em comunidades endofíticas radiculares de clones tolerantes de Manaus ocorreu maior riqueza e maior dominância, enquanto que comunidades endofíticas radiculares de clone suscetível de Manaus apresentam maior índice de Shannon, maior equitabilidade e maior taxa de colonização (Tabela 3).

Fig 1 - Diagramas de Venn representando a distribuição das espécies de fungos endofíticos de P. cupana nas comunidades analisadas. (A) Distribuição de espécies em comunidades endofíticas de clones suscetíveis e tolerantes da localidade Manaus (B) Distribuição de espécies em comunidades endofíticas de clones suscetíveis e tolerantes da localidade Maués (C) Distribuição de espécies em comunidades endofíticas de raízes e sementes de clones suscetíveis (D) Distribuição de espécies em comunidades endofíticas de raízes e sementes de clones tolerantes. Mus = Localidade Manaus; Mes = Localidade Maués; Sus= Clone Suscetível; Tol= Clone Tolerante; Fru = Semente; Rot = Raíz

Em comunidades endofíticas radiculares de clones suscetíveis de Maués ocorreu maior riqueza, maior índice de Shannon e dominância. Por 57 outro lado, comunidades endofíticas radiculares de clone tolerante de Maués apresentam maior equitabilidade e maior taxa de colonização (Tabela 3). Portanto, comunidades endofíticas isoladas de raízes e sementes de clones suscetíveis apresentam maior riqueza e maior índice de Shannon do que as comunidades endofíticas de clones tolerantes (Tabela 3). Clones tolerantes apresentaram maior riqueza apenas na comunidade endofítica radicular de Manaus. As comunidades radiculares de clones tolerantes e suscetíveis de Manaus compartilham 11 espécies (Fig 1 A) e ocorre maior frequência relativa na comunidade radicular de clone suscetível (Tabela 1). A comunidade endofítica radicular de clone suscetível de Manaus apresenta o maior número de espécies exclusivas dentre todas as comunidades de clones suscetíveis (Fig 1 C). Em relação aos clones tolerantes, a comunidade endofítica radicular de clone tolerante de Manaus apresenta maior número de espécies exclusivas (Fig 1 D). Assim como em cultivares de tabaco, tomate, batata e algodão (Bottomly et al., 2004, Feng et al. 2013; Manter et al., 2010; Wang et al., 1997) foi observado que clones suscetiveis e tolerantes de P. cupana apresentam comunidades endofíticas diferentes, com maior diversidade de espécies em clones suscetíveis. Os fatores responsáveis por modelar a composição e riqueza das comunidades endofíticas são pouco conhecidos. Clones suscetíveis apresentaram maior diversidade de espécies endofíticas. Cultivares suscetíveis podem ser mais vulneráveis a infecções microbianas, que podem colonizar o tecido de forma mais rápida do que em cultivares tolerantes (Loughman & Deverall, 1986; Kang & Buchenauer, 2000). Raízes podem produzir exsudados que promovem a colonização de determinados grupos de microrganismos (Bais et al. 2006; Rudrappa & Bais, 2007). Exsudados produzidos por diferentes clones influenciam a comunidade microbiana da rizosfera e consequentemente afetam a composição e riqueza da comunidade endofítica (Broeckling et al., 2008). São necessários estudos

58 para determinar se há diferenças entre a composição dos exsudados dos clones suscetíveis e tolerantes de P. cupana. A localidade onde P. cupana foi cultivada influenciou nas comunidades endofíticas do hospedeiro. Em comunidades endofíticas de sementes de clones tolerantes de Manaus ocorre maior riqueza, maior dominância e maior taxa de colonização (Tabela 3). As comunidades endofíticas de clone tolerante de Maués apresentam maior equitabilidade e maior índice de Shannon. Em comunidades endofíticas radiculares de clones tolerantes de Manaus ocorre maior riqueza, maior índice de Shannon e maior dominância (Tabela 3). Comunidades endofíticas de sementes de clones suscetíveis de Maués apresentam maior riqueza, maior índice de Shannon, maior equitabilidade e maior taxa de colonização. Comunidades endofíticas radiculares de clones suscetíveis de Manaus apresentam maior riqueza, maior índice de Shannon, maior equitabilidade e maior taxa de colonização (Tabela 3). Portanto, foi possível determinar que a localidade influencia a diversidade de fungos endofíticos em P. cupana. A localidade Manaus é onde ocorreu a maior riqueza de espécies de fungos endofíticos, especificamente nas comunidades de sementes e raízes de clones tolerantes e nas comunidades radiculares de clone suscetível. As comunidades radiculares de clone tolerante de Manaus e Maués compartilham 9 espécies (Fig 1 D) e ocorre maior frequência relativa na comunidade radicular de clone tolerante de Manaus (Tabela 1). Em Manaus, a comunidade endofítica radicular de clone tolerante apresenta o maior número de espécies exclusivas (Fig 1 A), enquanto que em Maués, a comunidade radicular de clone suscetível apresenta mais espécies exclusivas (Fig 1 B). A riqueza estimada pelo índice de Chao nas comunidades endofíticas que ocorrem em Maués foi próxima ao que foi observado. Porém, em grande parte das comunidades endofíticas que ocorrem em Manaus foi estimada uma riqueza maior do que o observado (Tabela 3).

A diversidade de espécies endofíticas entre hospedeiros cultivados em monoculturas e policulturas pode ser diferente (Saucedo-Garcia et al., 2014). Neste estudo, os clones de Manaus foram cultivados em uma policultura, enquanto que os clones de Maués cresceram em uma monocultura. É possível que a proximidade dos clones de Manaus com diferentes espécies de plantas hospedeiras tenha contribuído para gerar maior riqueza nas comunidades endofíticas desta localidade. Outros fatores como temperatura, pluviosidade e composição do solo podem influenciar a diversidade de espécies endofíticas (Hoffman & Arnold, 2008, U’ren et al., 2012, Carroll, 1995). A composição do solo, a pluviosidade e a temperatura das localidades avaliadas são diferentes (IBGE, 2016, INMET, 2016) e podem ter influenciado na diversidade endofítica de cada comunidade. Os órgãos vegetais de P. cupana influenciaram na composição das comunidades endofíticas. Nas comunidades endofíticas radiculares dos clones tolerantes de Manaus e de Maués ocorre maior riqueza, maior índice de Shannon, maior equitabilidade e maior taxa de colonização (Tabela 3). Comunidades endofíticas de sementes de clones tolerantes de Manaus e Maués apresentam maior dominância (Tabela 3). Em comunidades endofíticas radiculares dos clones suscetíveis de Manaus e Maués ocorre maior riqueza, maior índice de Shannon e maior taxa de colonização (Tabela 3). As comunidades endofíticas de sementes de clones suscetíveis de Manaus e Maués apresentam maior dominância. As comunidades de sementes e raízes de clones tolerantes e suscetíveis de cada localidade não compartilham espécies (Fig 1A; B). Portanto, a raiz é o órgão que concentra a maior riqueza de espécies em todas as comunidades analisadas. A riqueza de espécies nas respectivas comunidades é apresentada na figura 2. Os dados demonstram que o órgão vegetal é um importante fator na determinação da composição da comunidade de fungos endofíticos de P. cupana, pois nas raízes são encontradas comunidades com maior riqueza e diversidade.

Sementes podem permanecer isoladas do ambiente externo por um longo período, o que contribui para que a riqueza de espécies endofíticas seja menor (Vega et al., 2010). Sementes de guaraná são envoltas por um espesso epicarpo e parcialmente envolvidas por uma membrana delgada que corresponde ao mesocarpo (Duarte & Paull, 2015). Por outro lado, raízes possuem contato constante com o solo e podem ser infectadas por uma grande diversidade de microrganismos que habitam este ambiente. Os gêneros Diaporthe, Phomopsis e Pestalotiopsis encontrados em raízes e sementes de P. cupana foram encontrados na comunidade endofítica da filosfera de P. cupana por De Freitas Sia et al. (2013). Espécies de Phomopsis, Diaporthe, Fusarium e Glomerella ocorreram em comunidades endofíticas de raízes e de sementes (Fig 2). As demais espécies ocorreram apenas um dos órgãos vegetais analisados (Fig 2). Isso demonstra que espécies de fungos endofíticos de P. cupana podem apresentar especificidade ao órgão colonizado, como foi observado em outros hospedeiros tropicais (Bhilabutra et al., 2010, Photita et al., 2001). Nas comunidades endofíticas de raízes foi observado a dominância de X. ganodermophthora, enquanto que em comunidades endofíticas de sementes, D. phaseolorum e P. asparagi foram as espécies dominantes (Fig 2). D. phaseolorum e P. asparagi, bem como os gêneros Fusarium e Glomerella, ocorrem como endofíticos em hospedeiros tropicais (Sebastianes et al., 2012; Murali et al., 2006; Vieira et al. 2011; Costa et al. 2012).

Fig 2 – Distribuição de espécies de fungos endofíticos de P. cupana dentro das comunidades avaliadas. Mus = Localidade Manaus; Mes = Localidade Maués; Sus= Clone Suscetível; Tol= Clone Tolerante; Fru = Semente; Rot = Raíz.

A fim de analisar a riqueza e equitabilidade das comunidades endofíticas foi elaborado o gráfico da série de Hill (Fig 3).

Fig 3 - Série de Hill demonstrando a riqueza e equitabilidade das comunidades endofíticas das localidades Manaus (A) e Maués (B). Mus = Localidade Manaus; Mes = Localidade Maués; Sus= Clone Suscetível; Tol= Clone Tolerante; Fru = Semente; Rot = Raíz.

Na localidade Manaus ocorre maior riqueza na comunidade radicular de clone tolerante, maior equitabilidade na comunidade de sementes de clone suscetivel e maior dominância na comunidade endofítica de sementes de clone tolerante (Fig 3A). Na localidade Maués ocorre maior riqueza comunidade endofítica radicular de clone suscetível, maior dominância na comunidade endofítica de sementes de clone tolerante (Fig 3B). As comunidades de sementes de clones suscetíveis e tolerantes apresentaram maior equitabilidade em relação as demais comunidades endofíticas de Maués (Fig 3B). A similaridade entre as 8 comunidades de fungos endofíticos de P. cupana foi avaliada pelo índice de Jaccard (Fig 4). Inicialmente, as comunidades oriundas de raízes de sementes possuem os menores índices de similaridade. Em seguida, o tipo clonal foi determinante para a diferenciação das comunidades dentro de cada grupo previamente separado por órgão. E por fim, a localidade determinou os maiores índices de similaridade entre as comunidades. A similaridade entre comunidades endofíticas pode diminuir na medida em que a distância geográfica entre hospedeiros da mesma espécie aumenta (Arnold & Herre, 2003, Arnold & Lutzoni, 2007, Hoffman & Arnold, 2008, U’ren et al., 2012, Polishook et al., 1996, Arnold et al., 2000).

Fig 4 - Análise da similaridade entre as comunidades endofíticas dos clones e Localidades. Mus = Localidade Manaus; Mes = Localidade Maués; Sus= Clone Suscetível; Tol= Clone Tolerante; Fru = Semente; Rot = Raíz.

Diafanização de raízes de P. cupana e capacidade endofítica dos isolados

A presença de microsclerócios nas raízes de todos os indivíduos analisados confirma que P. cupana se associa com fungos dark septate (Fig 5). Esta associação pode resultar em aumento na absorção de nutrientes e promoção do crescimento vegetal (Jumpponen et al., 2001). Associações com fungos DSE podem se tornar patogênicas, contudo em grande parte dos trabalhos revisados por Newsham (2011), a inoculação de fungos DSE aumentou a biomassa vegetal em diferentes órgãos. Devido à forte coloração escura das raízes de P. cupana, não foi possível calcular a porcentagem de colonização (Mcgonigle et al., 1990). Quinonas, xantonas e produtos de 65 oxidação de flavonoides são comuns em plantas lenhosas e contribuem para sua intensa coloração marrom e são possivelmente responsáveis pela coloração observada em raízes de P. cupana (Damodaran, Parkin & Fennema, 2010).

Fig 5 - Estruturas de fungos micorrízicos e dark septate observadas no interior de raízes de P. cupana. Microesclerócio (M), arbúsculo (AR), hifa cenocítica azul (HA), vesícula (V), hifa coil (HC), hifa marrom septada (HS). Imagens obtidas em microscópio óptico no aumento de 40x.

O estabelecimento de relação simbiótica entre raízes de P. cupana e fungos foi avaliada por observação microscópica. As linhagens Phomopsis asparagi (22TSA), Peyronellaea pinodella (28S), Sydowiella fenestrans (104BDA) e Colletotrichum gloeosporioides (6TSA) foram selecionadas para a avaliação da capacidade endofítica pois apresentam micélio escuro e hifas septadas. A espécie Phomopsis asparagi (22TSA) colonizou intensamente o tecido radicular de sorgo. Esta espécie é frequentemente relatada como fitopatogênica, especialmente de culturas de aspargo (Yin et al., 2012). Provoca descoloração da haste ou tronco e lesões ovais, além de manchas

66 marrons nas raízes (Persley et al., 2010). Apesar de ser uma linhagem endofítica em P. cupana, P. asparagi (22TSA) provocou os mesmos sintomas nas plântulas de sorgo avaliadas. Os sintomas podem ter ocorrido devido ao amplo tempo de cultivo utilizado. P. asparagi (22TSA) produziu microsclerócios (Fig 6A), apesar de ter causado os sintomas observados. Microsclerócios foram observados em raízes colonizadas por P. pinodella (28S) (Fig 6B), porém esta espécie não causou sintomas de doenças no hospedeiro. Dentre as espécies de fungos endofíticos isoladas de sementes, apenas P. pinodella (28S) apresentou micélio escuro e hifas septadas. Os demais fungos avaliados colonizaram a radícula da plântula sem causar sintomas de doenças, permanecendo saudáveis como os controles. Porém não desenvolveram estruturas de dark septate.

Fig 6 - Microsclerócios encontrados em raízes de sorgo colonizadas por (A) Phomopsis asparagi (22TSA) (B) P. pinodella (28S).

Não foram encontradas na literatura informações sobre produção de estruturas de dark septate pelas espécies de fungos endofíticos avaliadas. Contudo, existem espécies de dark septate no gênero Phomopsis (Vaz et al., 2012) e nas ordens Diaporthales (Herrera et al., 2013) e Pleosporales (Porras-Alfaro et al., 2011, Loro et al., 2012). Fungos DSE apresentam ampla distribuição, sendo relatados em diferentes ambientes, como regiões subantarticas, florestas temperadas e tropicais, regiões semi-áridas, entre outras (Jumpponen & Trappe, 1998). Contudo, as informações atualmente disponíveis sobre dark septate foram

67 obtidas principalmente de estudos conduzidos em regiões árticas e temperadas (Mandyam & Jumpponen, 2005). Diversas famílias de plantas tropicais estabelecem associações com dark septate (Jumpponen & Trappe, 1998). Há poucos relatos de dark septate associados com espécies da famíliaSapindaceae (Stevens et al., 2010; Zhang et al., 2011) e com outras espécies da região amazônica (Fernandes Junior et al., 2013; Posada et al., 2012). Não foram encontradas na literatura informações sobre associação de P. cupana com fungos DSE, indicando que este é o primeiro relato desta associação. Paralelamente, estruturas típicas de fungos micorrízicos foram detectadas nas raízes observadas. Arbúsculos apresentaram morfologia do tipo arum e estão presentes em raízes de clones suscetíveis coletados em Manaus. Hifas coil e hifas septadas marrons foram observadas apenas em indivíduos tolerantes. Vesículas foram observadas somente nos clones oriundos de Maués. É relatada na literatura a associação de P. cupana com fungos micorrízicos (Oliveira & Oliveira, 2010, Ferraz, 1979, Oliveira & Oliveira, 2004). Em P. cupana, a colonização de fungos micorrízicos e sua esporulação são eventos sazonais, fortemente influenciados pelo aumento da pluviosidade (Oliveira & Oliveira, 2010). A colonização de micorrízas em P. cupana é favorecida pelo aumento da acidez e do teor de manganês do solo, mas é inibida pelo teor de ferro (Oliveira & Oliveira, 2004). Acaulospora é o gênero de fungo micorrízico que predomina em P. cupana e a taxa de infecção radicular pode atingir 89% (Ferraz, 1979). Acaulospora desenvolve microsclerócios do tipo Arum (Breuninger et al., 2000, Yamato 2004) o que indica que pode ser responsável pelas estruturas observadas nas raízes de P. cupana.

Avaliação de traços funcionais

Foram encontradas 8 espécies produtoras de amilase (Tabela 4), algumas das quais são conhecidas pela atividade amilolítica, como P. 68 microspora (Joel et al., 2012), T. harzianum (Mohamed et al., 2014), F. solani (Kumar et al., 2013), P. janthinellum (Sindhu, Suprabha, Shashidhar, 2011), F. oxysporum e F. meliae (Katoch, Salgotra, Singh, 2014). Quinze espécies apresentaram atividade proteolítica, dentre as quais: F. solani, P. janthinellum, G. zeae, F. oxysporum, F. meliae e T. harzianum são conhecidas pela síntese de protease (Lan & Li-Ming, 2015, Lowe et al., 2015, Choudhuri et al., 2012, Katoch et al., 2014). É conhecido que a produção de protease por F. oxysporum contribui significativamente para que a espécie possa infectar diversas culturas de forma patogênica (Pietro et al., 2003). Não foram encontradas informações na literatura sobre a produção de proteases nas demais espécies e da produção de amilase nas espécies M. robusta, D. melonis e M. terrestres. A atividade celulolítica foi observada em 13 espécies (Tabela 4). F. oxysporum, F. meliae, G. acutata, F. solani e T. harzianum são relatadas na literatura como produtoras de celulase (Katoch, Salgotra, Singh, 2014, Shearer, 2010, Dwivedi, 2015, Maeda et al., 2011). T. harzianum pode degradar celuloses e hemiceluloses devido a um complexo enzimático, o que é comum em bactérias, mas pouco comum em fungos (Silva et al., 2012). Não foram encontradas ocorrências de produção de celulase na literatura pelas demais espécies. Não houve produção de esterase, fosfatase e sideróforos nas condições avaliadas. Ao todo, 13 espécies não apresentaram atividade enzimática apesar de haver relatos da secreção de enzimas por outros autores, como C. gloeosporioides e P. macrospinosa produtores de amilase e celulase (Katoch, Salgotra, Singh, 2014, Mandyam, Loughin, Jumpponen, 2010). M. camptospora secretando protease e amilase (Peterson et al., 2009, Peterson et al., 2011) e T. asperellum sintetizando protease, celulase e amilase (Kathiresan et al., 2011).

Foram encontradas 12 espécies capazes de inibir fungos fitopatogênicos no teste do antibiograma (Tabela 4). A taxa de inibição variou entre 64,3% e 83,8%. O fungo patogênico de sorgo foi inibido pelo maior número de espécies. Foram encontradas 8 espécies com atividade fungicida nos clones tolerantes e o mesmo número nos clones suscetíveis. As espécies H. fuscoatra, G. zeae e F. polyphialidicum inibiram o maior número de fungos patogênicos. Estas foram as únicas espécies que inibiram o fitopatógeno de guaraná. A espécie G. zeae ocorre apenas em clones tolerantes e apresentou a maior taxa de inibição contra os fitopatógenos de guaraná e sorgo. Não houve inibição de Fusarium sp. nas condições avaliadas. A atividade antifúngica de X. ganodermophtora, H. fuscoatra, F. polyphialidicum e F. oxysporum foi investigada em outros trabalhos. X. 70 ganodermophtora inibe o crescimento dos fitopatógenos Phytophthora capsici, F. oxysporum e Sclerotium rolfsii (Kang et al., 2014). H. fuscoatra produz diversos compostos com atividade antifúngica como monordeno e monocilina (Wicklow et al., 1998), fuscoatrosida (Joshi, Gloer, Wicklow, 2002) e fuscoatrol A (Poyser et al., 1986). A espécie F. polyphialidicum inibem o crescimento de Trichoderma longibrachiatum e Mortierella elongata in vitro (Galgóczs et al., 2006). F. oxysporum produz nanoparticulas que controlam o crescimento de Cryptococcus neoformans e Candida albicans (Ishida et al., 2014). M. camptospora apresenta fraca atividade antibacteriana contra Micrococcus luteus (Fukuda et al., 2011), mas não foram encontradas informações sobre seu potencial fungicida. Não foram encontrados trabalhos que tenham investigado o potencial antifúngico das demais espécies que apresentaram atividade neste trabalho. Contudo, alguns destes gêneros são relatados com atividade antifúngica, como Paraphaeosphaeria (Shao et al., 2016), Mycoleptodiscus (Gong et al., 2015), Diaporthe (Zhang et al., 2012), Glomerella (Kishore et al., 2007), Pochonia (Zeng et al., 2011) e Gibberella (Borrow et al., 1955). Portanto, clones suscetíveis e tolerantes de P. cupana são colonizados por fungos endofíticos capazes de inibir o crescimento de linhagens patogênicas de Colletotrichum. A produção de tais enzimas e antifúngicos promovem a resistência do hospedeiro. Estes compostos auxiliam a suprimir o crescimento de patógenos, impedindo que desenvolvam a doença (Bashan & De Bashan, 2005). Apenas as espécies M. terrestris, F. oxysporum e T. harzianum apresentaram atividade proteolítica, celulolítica e amilolítica. Estas espécies foram encontradas em clones tolerantes e suscetíveis de P. cupana. Ambos os clones são colonizados por espécies endofíticas produtoras de protease, celulase e amilase. Apesar de clones suscetíveis serem colonizados por espécies produtoras de tais enzimas, isso não lhes confere resistência ao fitopatógeno F. decemcellulare. Isso sugere que a produção destas enzimas

71 não esteja fortemente relacionada com promoção de resistência em P. cupana. Foram encontradas 17 espécies produtoras de AIA (Tabela 4). As espécies F. oxysporum, F. solani, T. harzianum e T. asperellum são conhecidas pela síntese de AIA em testes in vitro (Hoyos-Carvajal et al., 2009, Tsavkelova et al., 2012, Gunasekaran & Weber, 1972). Não foram encontrados relatos de produção de AIA para demais espécies analisadas. Contudo, diversas espécies dos gêneros Mycena, Gibberella, Glomerella e Pestalotiopsis produzem AIA in vitro e promovem o crescimento vegetal (Furukawa et al., 1996, Madhukar & Reddy, 1991, Dan et al., 2012, Zhang et al., 1999). Não foram encontrados estudos sobre a promoção de crescimento vegetal em P. cupana. Contudo, a promoção de crescimento vegetal promovido por AIA secretado por endofiticos é relatada em diferentes culturas agrícolas, como feijão (Stajković et al. 2011), eucalipto (Paz et al. 2012), arroz, cana de açúcar (Nutaratat et al. 2014), café (Silva et al. 2012) entre outros. Em Sapindaceae foi relatado que o AIA pode estar envolvido na germinação de sementes de Litchi chinensis (Yang et al. 2012). Em nosso estudo, os clones tolerantes de P. cupana são colonizados por 15 espécies produtoras de AIA, enquanto que clones suscetíveis são colonizados por 13 espécies. Portanto, ambos os clones são colonizados por várias espécies endofíticas que poderiam beneficia-los pela síntese de AIA.

CONCLUSÃO

A espécie amazônica P. cupana abriga uma comunidade de fungos endofíticos cuja estrutura é influenciada pelo órgão, tipo clonal e localidade do hospedeiro. As raízes de clones suscetíveis e tolerantes são colonizadas por fungos DSE e FMA. Neste trabalho, 33 espécies de fungos endofíticos foram obtidas de raízes e sementes de P. cupana. As comunidades endofíticas de cada localidade, clone e órgão vegetal analisados são 72 diferentes em composição de espécies, sobretudo em relação aos órgãos. Diversas espécies endofíticas são produtoras de enzimas hidrolíticas, AIA e antifúngicos in vitro. O papel desta comunidade em P. cupana precisa ser avaliado, pois é possível que estes fungos beneficiem os clones in vivo, protegendo-os de fitopatógenos como Colletotrichum e promovendo o crescimento vegetal.

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ARTIGO 2 - POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE EXTRATOS E COMPOSTOS OBTIDOS DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE Paullinia cupana (MART.) DUCKE Current Microbiology (ISSN: 1432-0991)

RESUMO Endofíticos habitam tecidos internos de seus hospedeiros, podendo desempenhar diversas relações ecológicas sem demonstrar sintomas visíveis da infecção. Endofíticos de hospedeiros tropicais apresentam grande potencial para desenvolvimento de novos fármacos. Neste trabalho foi realizada a avaliação do potencial biotecnológico de fungos endofíticos isolados de Paullinia cupana (Mart.) Ducke e o isolamento de moléculas bioativas. Extratos AcOEt de 33 espécies de fungos endofíticos foram submetidos a diferentes bioensaios. A atividade antimicrobiana foi avaliada por difusão em ágar e por microdiluição em placas de 96 poços. A atividade citotóxica foi avaliada por citometria de fluxo. A atividade antioxidante foi determinada pelo do teste de captura do radical DPPH e o teor fenólico foi quantificado pelo método de Folin-Ciocalteu. A purificação de extratos AcOEt foi realizada por técnicas cromatográficas. A estrutura química das substâncias foi determinada pela análise de espectros de RMN 1D e 2D e espectrometria de massas. Dezessete espécies apresentaram atividade antibacteriana, sendo que D. phaseolorum (8S) e T. harzianum (43BDA) apresentaram os melhores valores de concentração mínima inibitória. A inibição do radical DPPH variou entre 0,14 e 85,37% e o teor fenólico variou entre 0,022 e 0,861 mg de EAG/mL. Cinco espécies reduziram a viabilidade

94 de células tumorais em mais de 90%. Foram isoladas 2 substâncias do extrato

AcOEt de D. phaseolorum (8S) que inibem P. aeruginosa. Este estudo demonstrou que fungos endofíticos de P. cupana apresentam potencial antibiótico, antioxidante e citotóxico e a linhagem D. phaseolorum (8S) isolada de sementes de P. cupana produz substâncias com atividade antimicrobiana in vitro.

Palavras Chave: Endofíticos; Amazônia; Antimicrobiano; Antitumoral.

INTRODUÇÃO

Paullinia cupana (Mart.) Ducke (Sapindaceae) conhecida no Brasil como ‘guaraná’, é uma das espécies mais conhecidas da Amazônia [44]. O extrato da semente é consumido por nativos desde o período pré-colombiano devido ao seu efeito estimulante e suas aplicações terapêuticas [65]. O guaraná é uma importante cultura agrícola no Brasil, sobretudo nas regiões norte e nordeste [21]. Devido a relevância na agricultura e suas aplicações terapêuticas, diversas investigações foram conduzidas com diferentes finalidades. Foram estudadas as substâncias presentes na semente e sua toxicidade. Os constituintes majoritários da semente seca são taninos, amido, gorduras, resinas e cafeína [37] e a cafeína é seu principal composto bioativo

[75]. O consumo do extrato de guaraná em excesso causa efeitos colaterais similares aos observados pelo consumo excessivo de café [75]. O extrato apresenta atividade anti-inflamatória, antiproliferativa, neuroprotetora, ansiolítica e antioxidante [74, 28, 11, 60, 12]. Paullinia cupana se associa com 95 endomicorrizas [53]. A comunidade de microrganismos endofíticos da filosfera de P. cupana foi caracterizada [13, 22]. Porém, sua atividade biológica não foi avaliada.

Microrganismos endofíticos habitam o interior do tecido vegetal, podendo desempenhar diversas relações ecológicas sem demonstrar sintomas de doenças [77]. Representam uma importante fonte de novas moléculas bioativas, com diferentes aplicações para a saúde humana [76, 8].

O desenvolvimento de novos antibióticos é uma demanda constante pois seu uso extensivo seleciona naturalmente espécies resistentes [67].

Apesar da ampla diversidade de antibióticos disponiveis comercialmente, as infecções microbianas permanecem sendo importantes causadoras de morbidade e mortalidade [67]. Infecções causadas por patógenos resistentes resultam em prolongamento da doença, maiores gastos com o tratamento e maior risco de morte [14]. As informações disponíveis na literatura sobre o potencial antibacteriano, antifúngico, tripanocida e antiviral de fungos endofíticos são exemplos que evidenciam seu grande potencial para o desenvolvimento de novos antibióticos [73, 2, 18,

82].

O maior causador de mortalidades, contudo, é o câncer, considerado uma doença emergente e que produzirá 21 milhões de novos casos até 2030

[78]. Os alcaloides paclitaxel, vincristina e captotecina, a lignana podofilotoxina e o isoflavonóide cajanol estão entre as substâncias isoladas de fungos endofíticos que apresentaram maior suscesso no tratamento de câncer [19]. Porém, poucas substâncias são efetivamente comercializadas 96 como drogas, devido aos processos de extração, purificação e seu baixo rendimento, o que demonstra a necessidade de mais pesquisas em busca de endofíticos com produtores de comopostos anticâncer.

A região tropical apresenta uma grande diversidade de espécies vegetais, que por sua vez abrigam uma grande diversidade de fungos endofíticos [4]. Endofíticos isolados de espécies nativas da região amazônica produzem substâncias com diferentes aplicações, como antimicrobianos [10,

26, 9], antioxidantes [5], antimaláricos [25], entre outros. Os trabalhos demonstram que endofíticos desta região apresentam potencial para o desenvolvimento de novos fármacos, porém o conhecimento acerca de sua atividade biológica ainda é escasso.

Neste trabalho, extratos de endofíticos associados a raízes e sementes de P. cupana foram produzidos e substâncias foram isoladas e purificadas para avaliação de sua atividade biológica. As moléculas isoladas foram caracterizadas por técnicas de RMN para sua determinação estrutural.

METODOLOGIA

Microrganismos Utilizados

As espécies de fungos endofíticos de P. cupana utilizados para produção de extratos AcOEt estão especificados na tabela 1.

Tabela 1 Fungos endofíticos utilizados para a produção de extratos AcOEt Nº de Acesso Espécie - Linhagem Origem GenBank Fusarium solani - 41BDA Raiz KU512702 Paecilomyces parvisporus - 9BDA Raiz KU512703 Sydowiella fenestrans - 104BDA Raiz KU512692 Mycoleptodiscus terrestris - 65TSA Raiz KU512714 Diaporthe hongkongensis - 11BDA Raiz KU512691 Trichoderma asperellum - 1BDA Raiz KU512700 Glomerella acutata - 15S Semente KU512706 Nectria rigidiuscula - 29S Semente KU512689 Diaporthe terebinthifolii - 24S Semente KU512670 Xylogone ganodermophthora - 1TSA Raiz KU512708 Nigrograna mackinnonii - 101BDA Raiz KU512680 Phomopsis asparagi - 19BDA Raiz KU512713 Arxiella dolichandrae - 90BDA Raiz KU512704 Diaporthe phaseolorum - 8S Semente KU512679 Periconia macrospinosa - 66BDA Raiz KU512687 Pestalotiopsis microspora - 14S Semente KU512681 Colletotrichum gloeosporioides - 6TSA Raiz KU512696 Penicillium janthinellum - 17BDA Raiz KU512715 Mariannaea camptospora - 14TSA Raiz KU512716 Humicola fuscoatra - 124BDA Raiz KU512712 Mycena robusta - 95BDA Raiz KU512710 Fomitopsis meliae - 32S Semente KU512693 Gibberella zeae - 3S Semente KU512707 Fusarium polyphialidicum - 5S Semente KU512705 Pochonia boninensis - 49BDA Raiz KU512701 Fusarium oxysporum - 13TSA Raiz KU512685 Diaporthe melonis - 29TSA Raiz KU512682 Peyronellaea pinodella - 28S Semente KU512671 Phomopsis lagerstroemiae – 43TSA Raiz KU512690 Trichoderma harzianum - 43BDA Raiz KU512711 Parapleurotheciopsis inaequiseptata - 62TSA Raiz KU512695 Paraphaeosphaeria arecacearum - 45TSA Raiz KU512678 Sem similaridade – 12TSA Raiz - (-) = Amostra não submetida ao banco de dados Genbank.

Obtenção de extratos para ensaios biológicos

Extratos AcOEt brutos foram obtidos de acordo com Rosa et al. [61] e conservados à -20ºC até o momento de sua utilização.

Determinação da atividade antioxidante e do teor de compostos fenólicos dos extratos

A atividade antioxidante foi avaliada pelo do teste de captura do radical DPPH, [46]. Extratos AcOEt foram avaliados nas concentrações de

0,04, 0,08, 0,16 e 1,6 mg/mL. O teor de compostos fenólicos totais (FT) nos extratos AcOEt foi avaliado pelo método espectrofotométrico de Folin-

Ciocalteu [15] empregando extratos na concentração de 20 mg/mL. Valores de IC50 foram utilizados para denotar a concentração de extrato em mg/mL necessária para sequestrar 50% dos radicais DPPH. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas por Scott-Knott.

Diferenças de 5% (P<0,05) entre as médias foram consideradas significativas. As correlações entre atividade antioxidante e teor fenólico foram avaliadas pelo teste de Spearman (r).

Atividade antimicrobiana qualitativa e teste de concentração mínima inibitória

A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo teste de difusão em ágar

[33] e pelo teste de microdiluição em placas de 96 poços [54]. A atividade antimicrobiana de amostras purificadas por cromatografia foi avaliada apenas pelo teste de microdiluição em placas de 96 poços. Foram utilizadas linhagens suscetíveis de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Escherichia

99 coli (ATCC 25922) e linhagens multirresistentes de S. aureus (3A), E. coli

(1A), Pseudomonas aeruginosa (2A) e Cryptococcus neoformans (12F). No teste de microdiluíção em placas, os extratos AcOEt foram utilizados na concentração de 20 mg/mL. Foram utilizados como controle positivo tetraciclina (0,05 mg/mL) e anfotericina (0,05 mg/mL). Foi utilizado como controle negativo meio LB com metanol. Na avaliação da concentração mínima inibitória foi empregada a mesma metodologia. Extratos AcOEt selecionados foram diluídos em série, partindo da concentração de 5000

µg/mL até 39 µg/mL. Amostras purificadas por cromatografia foram avaliadas a partir da concentração de 30 µg/mL até 0,2 µg/mL. A concentração mínima de morte (CMM) foi determinada segundo Elek & Hilson [24] utilizando meio

ágar Mueller-Hinton (MH).

Determinação da atividade citotóxica

A atividade citotóxica foi avaliada por citometria de fluxo. Foram utilizadas as linhagens tumorais K-562 (ATCC CCL-243), KASUMI-1 (ATCC

CRL-2724), ARH-77 (ATCC CRL-1621) e JURKAT (ATCC TIB-152). Células foram testadas na concentração de 105 células/mL e extratos AcOEt foram testados em 100 µg/mL. A incubação foi realizada em estufa de CO2 (5%) por

24h. Foi adicionado calceína (2x105 mg/mL) e iodeto de propídeo (5 µg/mL).

A viabilidade celular foi verificada em citômetro de fluxo e os dados adquiridos foram analisados pelos softwares Prism 5 e FlowJo vX0.7. A determinação

100 da concentração inibitória média empregou a mesma metodologia, utilizando células mononucleares humanas de sangue periférico. Os testes foram realizados em duplicata, utilizando estaurosporina (5x105 mg/mL) como controle.

Purificação e determinação estrutural

Os extratos brutos de D. phaseolorum – 8S (235 mg) e T. asperellum

- 1BDA (240 mg) foram purificados por cromatografia de coluna em fase reversa empregando sílica gel C-18 (Merck) e utilizando os sistemas CH3OH-

H2O (3:7; 7:3 v/v) e CH3OH 100%. A fração CH3OH 100% do extrato de T. asperellum - 1BDA foi submetida a cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) semi-preparativa, nas condições CH3OH/H2O/HCO2H (7:2,9:0,1) modo isocrático.

Frações obtidas de D. phaseolorum – 8S foram submetidas a cromatografia em coluna com sílica 60 (40-63 mm, Merck), utilizando 21,7 mg da fração CH3OH-H2O 7:3 e 48,2 mg da fração CH3OH-H2O 3:7. Foram utilizados os sistemas AcOEt/CH3OH (1:1 v/v), hexano e CH3OH na purificação da fração 7:3 e CHCl3 na purificação da fração 3:7.

Espectros de RMN foram obtidos utilizando um espectrômetro Bruker

Ascend 500 operando a 500 MHz para o núcleo de 1H e 125 MHz para o núcleo do 13C. Deslocamentos químicos foram expressos em parte por milhão

(ppm), referenciados pelo pico do solvente residual. Espectroscopia

101 dimensional (COSY, HSQC e HMBC) foram utilizadas para sua determinação estrutural. Análises feitas por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) foram realizadas em um cromatógrafo

Shimadzu modelo GC17A acoplado com um detector modelo GCMS-

QP5050A.

RESULTADOS

Determinação da atividade antioxidante e do teor de compostos fenólicos

Os resultados do teste antioxidante e teste fenólico estão apresentados na tabela 2. Para a maioria das espécies, a porcentagem de inibição variou entre 10% e 40% na concentração mais alta. A inibição do radical DPPH foi constatada em todas as concentrações analisadas. A linhagem 12TSA registrou o melhor resultado (85,37%) na concentração mais alta (1,6 mg/mL). F. solani (41BDA) apresentou o melhor resultado nas concentrações de 0,16 mg/mL, 0,08 mg/mL e 0,04 mg/mL (44,32%, 43,69% e 43,88% respectivamente).

Todos os extratos apresentaram teores de fenóis totais, que variaram entre 0,861 mg de EAG/mL para a espécie H. fuscoatra (124BDA) e 0,022 mg de EAG/mL para a espécie P. asparagi (19BDA). Foi observada uma relação proporcional entre teor fenólico e atividade antioxidante, porém estas variáveis não se correlacionaram em todas as concentrações avaliadas.

102

Tabela 2 Atividade antioxidante e teor fenólico de extratos AcOEt de fungos endofíticos de P. cupana

Atividade Antioxidante 5 Espécie - Linhagem Teor Fenólico IC50 0,04 mg/mL1 0,08 mg/mL 0,16 mg/mL 1,6 mg/mL Sem similaridade - 12TSA 27,52 ± 0,0183b 31,3±0,009b4 35,4 ± 0,019d 85,3 ± 0,01e 0,622 ± 0,088b 0.55 Fusarium solani - 41BDA 43,8 ± 0,025b 43,6 ± 0,019c 44,3 ± 0,013d 47,3 ± 0,002d 0,216 ± 0,003e 1.6 Paecilomyces parvisporus - 9BDA 36,2 ± 0,007b 37,5 ± 0,052c 38,5 ± 0,029d 51,3 ± 0,029d 0,465 ± 0,032c 0.7 Sydowiella fenestrans - 104BDA 23,9 ± 0,019b 38,7 ± 0,027c 41,9 ± 0,2d 48,9 ± 0,006d 0,226 ± 0,022e 0,52 Mycoleptodiscus terrestris - 65TSA 36,2 ± 0,014b 36,9 ± 0,02c 37,5 ± 0,01d 42,4 ± 0,027d 0,141 ± 0,02f 0.53 Diaporthe hongkongensis - 11BDA 30,4 ± 0,018b 35,6 ± 0,052c 38 ± 0,08d 44,4 ± 0,038d 0,218 ± 0,017e 0.47 Trichoderma asperellum - 1BDA 30,4 ± 0,01b 30,3 ± 0,008b 32,8 ± 0,005c 42 ± 0,009d 0,157 ± 0,018f 0.55 Glomerella acutata - 15S 27,4 ± 0,019b 31,3 ± 0,036b 32,1 ± 0,117c 36,8 ± 0,008c 0,385 ± 0,036c 0.83 Nectria rigidiuscula - 29S 24,6 ± 0,014b 30,8 ± 0,056b 31,8 ± 0,033c 35 ± 0,018c 0,134 ± 0,009f 0.56 Diaporthe terebinthifolii - 24S 16 ± 0,115a 29,4 ± 0,019b 34,8 ± 0,022d 37,7 ± 0,018c 0,318 ± 0,006d 0.59 Xylogone ganodermophthora - 1TSA 23,9 ± 0,004b 24,2 ± 0,014b 27,8 ± 0,008c 41 ± 0,005d 0,333 ± 0,038d 0.58 Nigrograna mackinnonii - 101BDA 24,3 ± 0,008b 25,1 ± 0,013b 27,7 ± 0,018c 38,2 ± 0,092c 0,265 ± 0,003e 0.51 Phomopsis asparagi - 19BDA 27,1 ± 0,011b 29,0 ± 0,004b 29,3 ± 0,004c 29,8 ± 0,016c 0,022 ± 0,009g 0.58 Arxiella dolichandrae - 90BDA 17,5 ± 0,094a 18 ± 0,166a 27,5 ± 0,082c 35 ± 0,114c 0,121 ± 0,051f 0.13 Diaporthe phaseolorum - 8S 23,6 ± 0,035b 23,9 ± 0,027b 24,2 ± 0,009c 26,1 ± 0,013b 0,062 ± 0,006g 0.26 Periconia macrospinosa - 66BDA 14,2 ± 0,005a 24,4 ± 0,008b 26,6 ± 0,007c 31,1 ± 0,099c 0,365 ± 0,004d 0.9 Pestalotiopsis microspora - 14S 17,9 ± 0,01a 22,1 ± 0,005b 23,0 ± 0,029c 24 ± 0,046b 0,302 ± 0,006d 0.53 Colletotrichum gloeosporioides - 6TSA 11,5 ± 0,056a 20,2 ± 0,048b 25,9 ± 0,021c 28,7 ± 0,204c 0,171 ± 0,01f 0.55 Penicillium janthinellum - 17BDA 12,9 ± 0,012a 13,6 ± 0,008a 14 ± 0,001b 40,9 ± 0,002d 0,662 ± 0,017b 0.55 Mariannaea camptospora - 14TSA 7,6 ± 0,049a 12,4 ± 0,01a 13,6 ± 0,002b 41,4 ± 0,009d 0,294 ± 0,015d 0.98 Humicola fuscoatra - 124BDA 7,1 ± 0,031a 7,4 ± 0,02a 14,2 ± 0,011b 40,4 ± 0,023d 0,861 ± 0,043a 0.68 Mycena robusta - 95BDA 10,2 ± 0,005a 12,4 ± 0,063a 15,9 ± 0,021b 20,3 ± 0,011b 0,419 ± 0,04c 0.75 Fomitopsis meliae - 32S 8,2 ± 0,058a 11,7 ± 0,007a 16,7 ± 0,006b 19,9 ± 0,005b 0,078 ± 0,001g 0.836 Gibberella zeae - 3S 6,6 ± 0,246a 9,5 ± 0,127a 15,5 ± 0,091b 24,7 ± 0,072b 0,133 ± 0,006f 0.28 Fusarium polyphialidicum - 5S 7,3 ± 0,014a 7,9 ± 0,01a 8,6 ± 0,013a 15 ± 0,01b 0,076 ± 0,048g 0.55 Pochonia boninensis - 49BDA 5,3 ± 0,007a 8,0 ± 0,003a 9,5 ± 0,058a 10,5 ± 0,035a 0,278 ± 0,025d 1.6 Fusarium oxysporum - 13TSA 4,5 ± 0,03a 3,2 ± 0,028a 8,7 ± 0,025a 14,4 ± 0,084b 0,454 ± 0,035c 0.7 Diaporthe melonis - 29TSA 0,1 ± 0,037a 4,6 ± 0,014a 4,9 ± 0,036a 16,7 ± 0,021b 0,337 ± 0,029d 0,52 Peyronellaea pinodella - 28S 0,8 ± 0,007a 5,1 ± 0,023a 6,6 ± 0,038a 7,3 ± 0,023a 0,459 ± 0,135c 0.53 Phomopsis lagerstroemiae – 43TSA 1,1 ± 0,027a 2,1 ± 0,052a 3,7 ± 0,024a 6,1 ± 0,007a 0,15 ± 0,009f 0.47 Trichoderma harzianum - 43BDA 0,8 ± 0,006a 1,9 ± 0,006a 3,4 ± 0,011a 5,9 ± 0,037a 0,163 ± 0,009f 0.55 Parapleurotheciopsis inaequiseptata - 62TSA 2,6 ± 0,019a 2,6 ± 0,018a 3,1 ± 0,011a 3,3 ± 0,029a 0,302 ± 0,007d 0.83 Paraphaeosphaeria arecacearum - 45TSA 0,4 ± 0,006a 0,9 ± 0,007a 1,1 ± 0,003a 7,1 ± 0,053a 0,23 ± 0,005e 0.56 Concentração do extrato dos fungos endofíticos 2Média da porcentagem de inibição do radical DPPH obtida de 3 repetições 3Desvio Padrão 4Teste estatístico Scott-Knott (p < 0.05) - Valores marcados com a mesma letra minúscula em cada coluna não diferem estatisticamente entre si quanto a atividade antioxidante e teor de fenóis totais.5Teor fenólico medido em EAG = Equivalente de ácido gálico.

103

Foi registrada alta correlação entre atividade antioxidante e teor fenólico nas concentrações 0,08 mg/mL (r = 0,81) e 0,16 mg/mL (r = 0,72) e baixa correlação nas concentrações 0,04 mg/mL (r = 0,58) e 1,6 mg/mL (r = 0,33).

A espécie H. fuscoatra (124BDA) apresentou o maior teor de compostos fenólicos, mas apesar disso não apresentou a maior porcentagem de atividade antioxidante. Sabe-se que o teste de Folin-Ciocalteu mede o teor de compostos fenólicos e de compostos não fenólicos, os quais podem não apresentar atividade antioxidante [52].

Algumas espécies avaliadas são conhecidas por sua atividade antioxidante. Linhagens de T. harzianum apresentaram taxas de inibição do radical DPPH de até 54,6% [40]. As espécies D. phaseolorum, F. solanie F. oxysporum inibem o radical DPPH com concentração efetiva média (IC50) de

659 µg/mL 578 µg/mL e 44,9 µg/mL respectivamente [5, 47, 42]. P. microspora produz pestacina [30] que sequestra superóxidos e hidroxilas. O extrato etanólico de C. gloeosporioides apresentou taxa de inibição de 52,7% contra o DPPH [49]. P. janthinellum produz o 2,2-Metilenobis(5-metil-6-tert- butil-fenol), que apresenta atividade antioxidante contra peróxidos [29].

Não encontramos estudos de atividade antioxidante e teor fenólico com as demais espécies avaliadas.

Determinação da atividade antimicrobiana e citotóxica

O extrato AcOEt de 17 espécies apresentaram atividade antimicrobiana (Tabela 3). Os extratos de Trichoderma harzianum (43BDA), 104

Diaporthe melonis (29TSA), Diaporthe phaseolorum (8S) e Diaporthe terebinthifolii (24S) inibiram 3 ou mais patógenos. Estes extratos foram selecionados para a determinação da concentração mínima inibitória (CMI).

As linhagens multirresistentes P. aeruginosa e C. neoformans foram inibidas apenas pelos extratos de T. harzianum (43BDA) e D. phaseolorum (8S).

As espécies que apresentaram atividade antibacteriana são em sua maioria relatadas na literatura com tal atividade. Dentre elas estão T. harzianum [48], D. melonis [51], C. gloeosporioides [3], F. oxysporum [69], F. solani [71], M. camptospora [27], G. acutata [72], G. zeae [45], D. phaseolorum [64], P. microspora [43], H. fuscoatra [66] e T. asperellum [22].

A espécie X. ganodermophthora foi relatada com atividade antifúngica [35].

Não encontramos informações sobre atividade antibacteriana das espécies

M. terrestris, P. asparagi, D. terebinthifolii e N. rigidiuscula.

O extrato de T. harzianum (43BDA) inibiu o maior número de linhagens patogênicas no teste de concentração mínima inibitória (Tabela 3). T. harzianum é frequentemente relatado na literatura pela sua atividade antimicrobiana [79, 41]. Produz a 6-n-Pentil-α-pirona, que inibe diversas espécies de bactérias e fungos [70]. D. melonis produz a flavomanina-6,6-di-

O-metil éter, que inibe S. pneumoniae e uma linhagem multirresistente de S. aureus com concentração mínima inibitória de 2 µg/mL e 32 µg/mL respectivamente [51]. D. phaseolorum produz o ácido 3-hidroxipropionico, que apresenta concentração mínima inibitória de 64 µg/mL contra S. aureus e S. typhi [64]. Não encontramos informações sobre o potencial antibacteriano da espécie D. terebinthifolii. 105

Na avaliação da concentração mínima de morte, houve crescimento microbiano em todas as concentrações testadas, indicando que os extratos testados apresentam concentração mínima de morte superior a 5.000 µl. Este resultado demonstrou que os extratos apresentaram atividade bacteriostática. Substâncias com esta propriedade são encontradas no gênero Trichoderma [80, 62].

Extratos AcOEt de 5 espécies reduziram a viabilidade das células tumorais em mais de 90% no teste citotóxico (Tabela 3). Estas linhagens foram selecionadas para a determinação da concentração efetiva média. A espécie

P. asparagi (22TSA) apresentou o melhor resultado, com IC50 de 98,3 µg/mL.

As espécies P. asparagi, M. camptospora e T. asperellum são conhecidas por sua atividade citotóxica. T. asperellum e M. camptospora reduziram a viabilidade de células de câncer cervical (HeLa) e câncer de mama (MCF-7)

[55, 27]. Quetoglobosinas produzidas por P. asparagi apresentaram citotoxidade contra linhagens celulares de leucemia e de colón murino [20].

Não encontramos informações sobre a atividade citotóxica de X. ganodermophthora e P. lagerstroemiae, contudo, o potencial citotóxico do gênero Phomopsis é reconhecido [81, 48, 31].

106

Tabela 3 Atividade antimicrobiana e antitumoral de extratos AcOEt de fungos endofíticos de P. cupana

Atividade Antimicrobiana Atividade Antitumoral Espécie - Linhagem 1 S.A (S) E.C (S) E.C (M) S.A (M) C.N (M) ARH-77 JURKAT K-562 KASUMI-1 IC50 (µg/mL)

Mycoleptodiscus terrestris - 65TSA + + + + ------Trichoderma harzianum - 43BDA 5.000 > 5.000 78.13 2.500 5.000 - - - - - Diaporthe melonis - 29TSA 5.000 39.06 312.5 > 5.000 > 5.000 - - - - - Phomopsis asparagi - 34TSA + + - - - - - + + 52,17 Colletotrichum gloeosporioides - 6TSA - + ------Xylogone ganodermophthora - 11TSA + ------Mycoleptodiscus terrestris - 30TSA + ------Phomopsis asparagi - 38TSA + ------Fusarium oxysporum - 13TSA + ------Fusarium solani - 41BDA + ------Mariannaea camptospora - 123BDA* + - - + - + + + + 72,88 Glomerella acutata - 15S + ------Glomerella acutata - 18TSA + - + ------Gibberella zeae - 3S + ------Diaporthe phaseolorum - 8S 1.250 > 5.000 39.06 1.250 > 5.000 - - - - - Pestalotiopsis microspora - 14S + ------Humicola fuscoatra - 124BDA + ------Diaporthe terebinthifolii - 24S 625 2.500 78.13 > 5.000 > 5.000 - - - - - Trichoderma asperellum - 1BDA + - - - - + + + + - Nectria rigidiuscula - 29S + ------Phomopsis asparagi – 22TSA - - - - - + + + + 98,34 Xylogone ganodermophthora – 130BDA* + - - + - - - - + 94,95 Xylogone ganodermophthora – 64BDA ------+ 71 Phomopsis lagerstroemiae – 43TSA ------+ - F. oxysporum - 20S* + ------P. boninensis - 49BDA* + - - + ------X. ganodermophthora - 1TSA* + - - + ------P. janthinellum - 17BDA* + - - + ------S.A = S. aureus; E.C = E. coli; C.N = C. neoformans; (S) = Suscetível; (M) = Multiresistente; (+) = Com Inibição; (-) = Sem Inibição. A mínima concentração inibitória das linhagens 43BDA, 1 29TSA, 24S e 8S é apresentada em µg/mL. Não houve inibição de linhagens de P. aeruginosa. *Linhagem apresentou atividade antimicrobiana apenas no teste de difusão em ágar. IC50 foi avaliado com células mononucleares humanas de sangue periférico.

107

Purificação e determinação estrutural

A partir da CC de frações MeOH-H2O 3:7 e MeOH-H2O 7:3 do extrato

AcOEt de D. phaseolorum – 8S foram obtidas 5 amostras de aspecto sólido e incolor (Tabela 4).

Tabela 4 Extratos AcOEt purificados por CC obtidos de D. phaseolorum (8S)

Espécie e Fração 1º CC 2º CC

CH3CH2OH/MeOH D. phaseolorum - 8S AcOEt/MeOH (1:1) → (1:1) Amostra 11 CH3OH-H2O (3:7) Amostra 11B

CH3CH2OH/ CH3OH (9,5:0,5) D. phaseolorum - 8S CH3CH2OH→ Amostra Amostra 12 CH3OH-H2O (7:3) 12A

Hexano/C3H6O (6:4) D. phaseolorum - 8S Amostra 15 CHCl3 → Amostra 15 CH3OH-H2O (3:7)

D. phaseolorum - 8S CH3CH2OH / CH3OH (9,5:0,5) CH3OH – Amostra 13B CH3OH-H2O (7:3) Amostra 13

D. phaseolorum - 8S CH3OH → Amostra 7B CH3OH 100% → Amostra 7 CH3OH-H2O (3:7) CC = Cromatografia de coluna em sílica gel.

A amostra 15 (Tabela 4) apresentou dados espectrais iguais aos dados previamente apresentados por Schwarz et al [63] e Sebastianes et al [64]

(Tabela 5). Portanto, a amostra 15 foi identificada como ácido 3- hidroxipropiônico (3-HPA).

108

Tabela 5 Dados de RMN 1H e RMN 13C de subtâncias isoladas de fungos endofíticos de P. cupana e comparação com a literatura

1-Hidroxi-8-Metoxiantraquinona Ácido 3-Hidroxipropiônico Ftalato de di-(2-etilhexila) Hidrogênio Amostra 17A 1,3 Ayer et al. (1989)4,5 Hidrogênio Amostra 151,2 Schwarz et al. (2004)1,2 Hidrogênio Amostra 070 1,2 Amade et al. (1994)4,6 OH - 12.96 (1H, s) H-1 3.07 (2H, t, J= 6.02 Hz) 2.95 (2H, t, J= 6.02 Hz) 1 0.90 (6H, t, J = 6.5 Hz) 0.82 (t, J = 5.3 Hz) H-5 7.95 (1H, d, J= 7.5) 7.96 (1H, dd, J = 1.3, 7.8 Hz) H-2 4.68 (2H, t, J= 6.05 Hz) 4.61 (2H, t, J= 6.02 Hz) 2-4 1.28 – 1.33 (8H, m) 1.15 – 1.30 (m) H-1 7.86 (1H, t, J= 7.9) - Carbono 5 - 1.59 (m) H-4 7.77 (1H, d, J= 7.2) 7.77 (1H, dd, J = 1.3, 7.8 Hz) C-1 174.51 171.7 6 4.20 (2H, qd, J= 5.65; 8.4 Hz) 4.13 (m) H-6 7.72 (1H, t, J= 7.7) 7.74 (1H, t, J = 7.8 Hz) C-3 69.29 69.8 8 1.41 (2H, q, J = 6.9 Hz) 1.31 (dq, J = 4.3 Hz) H-3 7.60 (1H, d, J= 8.1) 7.60 (1H, t, J = 7.8 Hz) C-2 30.74 30.8 9 0.88 (3H, t, J = 6.4 Hz) 0.79 (t, J = 4.3 Hz) H-7 7.33 (1H, d, J= 8.5) 7.35 (1H, dd, J = 1.3, 7.8 Hz) 11 7.70 (1H, dd, J= 3.35; 5.80 Hz) 7.60 (dd, J = 6.3; 2.2 Hz) H-2 - 7.29 (1H, dd, J = 1.3, 7.8 Hz) 12 7.52 (1H, dd, J= 3.35; 5.80 Hz) 7.40 (dd, J = 6.3; 2.2 Hz)

OCH3 4.06 (3H, s) 4.04 (3H, s) Carbono Carbono 1 10.95 9.91 C-9 - 188.7 2 22.98 21.94 C-10 - 183.0 3 23.74 22.79 C-1 - 162.6 4 28.92 27.92 C-8 161.95 161.0 5 38.73 37.78 C-10a 135.95 135.9 6 68.16 67.02 C-3 135.72 135.8 7 167.76 166.58 C-6 135.49 135.8 8 29.69 29.39 C-4a 132.79 132.8 9 14.05 12.96 C-4 124.06 124.7 10 132.46 131.51 C-8a 119.36 120.9 11 130.88 129.79 C-5 - 120.2 12 128.80 127.75 C-2 118.62 118.8 C-7 118.22 118.2 C-9a - 117.1 OCH3 55.66 56.7

1 1 2 13 3 13 4 1 Deslocamentos em ppm. RMN H 500 MHz, CDCl3; RMN C 125 MHz, CDCl3; RMN C 125 MHz, CD3OD; RMN H 400 MHz, CDCl3; 5 13 6 13 RMN C 400 MHz, CDCl3; RMN C 100 MHz; CDCl3; (-) = Sinal não detectado no respectivo espectro de RMN.

109

As amostras 11B, 12A e 13B isoladas de D. phaseolorum (Tabela 4) apresentaram deslocamentos químicos similares aos da amostra 15 e foram igualmente identificadas como ácido 3-hidroxipropiônico.

O ácido 3-hidroxipropiônico é um ácido carboxílico de amplo uso industrial e disponível comercialmente [34]. Pode ser sintetizado por diferentes vias metabólicas, a partir de diferentes precursores e sua síntese foi relatada tanto procariotos quanto eucariotos [39]. O desenvolvimento de novas metodologias para sua síntese visa reduzir os custos de produção e aumentar o rendimento da reação, a fim de aumentar sua disponibilidade comercial [16].

A partir da CC da fração MeOH-H2O 3:7 do extrato AcOEt de D. phaseolorum (8S) foi obtida a amostra 070, de aspecto sólido e cor amarelo escuro (Tabela 4). A amostra foi submetida a análises de RMN de 13C e 1H e os dados obtidos estão apresentados na tabela 5. Através do mapa de correlação do HSQC foi possível correlacionar os sinais H de 7.52; 7.70;

4.20; 1.41; 1.28-1.33; 1.25; 0.88; e 0.90 com os sinais de C em 130.8; 128.8;

68.16; 23.74; 38.7-28.9-22.9; 29.69; 14.05 e 10.96 respectivamente. O espectro de COSY mostrou correlação de δ 7.70 com δ 7.52.

Observando os dados do HMBC, as correlações fundamentais observadas foram: H 7.70 com C 130.8 e 167.7, de H 7.52 com C 128.8, de H 4.20 com C 68 e de H 1.33-1.28 com C 22.9 e 23.74. Nas análises de espectrometria de massas verificamos o íon molecular através do pico m/z

110

= 390. Com base nestas informações, sugerimos que a amostra 070 corresponde ao ftalato de di-(2-etilhexila).

O ftalato de di-(2-etilhexila) foi identificado em diferentes espécies de fungos e bactérias isolados de diferentes ambientes, inclusive endofíticos [32;

1; 50; 59; 36; 68]. Apresenta atividade nematicida [50], antimicrobiana [36], leishmanicida [6] e indutora de apoptose [58]. Com base em nossas pesquisas, consideramos que este é o primeiro relato da produção do ftalato de di-(2-etilhexila) no gênero Diaporthe.

A fração CH3OH 100% obtida do extrato AcOEt de T. asperellum

(1BDA) foi submetida a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), por onde foi obtida a amostra 17A, de aspecto sólido e coloração amarela clara.

A amostra 17A foi submetida a análises de RMN de 13C e 1H e os dados obtidos estão apresentados na tabela 5.

Através do mapa de correlação do HSQC foi possível correlacionar os sinais H de 7.95; 7.86; 7.72; 7.60; 7.33 e 4.06 com os sinais de C em

118.62; 135.72; 135.49; 118.22; 124.06 e 55.67 respectivamente. O espectro de COSY mostrou correlação de 7.95 com δ 7.60 e de δ 7.77 com δ 7.33. No espectro de HMBC, as correlações fundamentais observadas foram: H 7.95 com C 118.22 e 119.36, de H 7.77 com C 124.06, de H 7.72 com C

132.79, de H 7.60 com C 118.62 e 119.36 e de H 4.06 com C 161.95.

Com base nestas informações, foi sugerido que a amostra 17A corresponde ao 1-hidroxi-8-metoxiantraquinona. Com base nas análises de espectrometria de massas, foi possível verificar o íon molecular através do pico m/z = 254.

111

1-hidroxi-8-metoxiantraquinona foi isolada como produto natural pela primeira vez a partir do fungo fitopatogênico Leptographium wageneri [7]. O fungo foi cultivado em centeio e a substância foi obtida da fração hexano/EtOAc (4:1). A substância foi produzida sintéticamente em diferentes trabalhos [17; 38; 57]. Não encontramos informações na literatura sobre sua atividade biológica.

Atividade antimicrobiana de substâncias purificadas

O ftalato de di-(2-etilhexila) e o ácido 3-hidroxipropiônico foram submetidos a avaliação de atividade antimicrobiana. O ácido 3- hidroxipropiônico apresentou atividade antimicrobiana contra a linhagem suscetível e multirresistente de P. aeruginosa em todas as concentrações avaliadas (Tabela 6). O ácido 3-hidroxipropiônico não impediu o crescimento da linhagem multirresistente de E. coli, porém apresentou melhor desenpenho que o controle na concentração de 30 µg/mL. O ácido 3- hidroxipropiônico foi relatado com atividade antibacteriana contra

Staphylococcus aureus e Salmonella typhi [64] e atividade nematicida contra

Meloidogyne incógnita [63].

O ftalato de di-(2-etilhexila) apresentou atividade antimicrobiana contra a linhagem suscetível e multirresistente de P. aeruginosa em todas as concentrações avaliadas (Tabela 6). O ftalato de di-(2-etilhexila) não impediu o crescimento das linhagens suscetíveis de S. aureus e E. coli. Porém, na

112 concentração de 30 µg/mL apresentou desenpenho semelhante ao do controle.

Tabela 6 Atividade antimicrobiana de substâncias purificadas

Amostra S.A (M) E.C (M) P.A (M) S.A (S) E.C (S) P.A (S)

Ácido 3-hidroxipropiônico >30 >30 0,23 >30 >30 0,23

070 >30 >30 0,23 >30 >30 0,23

5.000 5.000 5.000 Tetraciclina 5.000 5.000 5.000

Valores em µg/mL. S.A = S. aureus; E.C = E. coli; P.A = P. aeruginosa; (S) = Suscetível; (M) = Multiresistente

Houve crescimento de colônias no teste de concentração mínima de morte, indicando que as amostras avaliadas apresentam atividade bacteriostática.

CONCLUSÃO

Extratos AcOEt obtidos de diferentes espécies de fungos endofíticos isolados de P. cupana apresentam moléculas com atividade antibiótica, antioxidante e citotóxica. A linhagem endofítica Trichoderma asperellum

(1BDA) isolada de raízes produz uma substância com a fórmula C15H10O4. A linhagem endofítica Diaporthe phaseolorum (8S) isolada das sementes produz o ácido 3-hidroxipropiônico (3-HPA) e o ftalato de di-(2-etilhexila), os quais apresentam atividade antimicrobiana contra linhagens de P. aeruginosa

113

suscetíveis e multirresistentes a antibióticos, com concentração mínima de

morte de 0,23 µg/mL em ambos os casos.

Material Suplementar

Espectros de 1H-RMN e 13C-RMN uni e bidimensionais e os espectros

de massas obtidos foram disponibilizados em anexo.

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MATERIAL SUPLEMENTAR

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ÁCIDO 3-HIDROXIPROPIÔNICO

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AMOSTRA 17A

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AMOSTRA 070

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6.0 – CONCLUSÕES GERAIS

Paullinia cupana abriga espécies de fungos endofíticos comumente encontrados em hospedeiros tropicais e espécies raramente relatadas como endofíticas. As comunidades endofíticas de cada localidade, clone e órgão vegetal analisados são diferentes em composição, sobretudo em relação aos órgãos. Comunidades endofíticas de Manaus apresentam maior taxa de colonização, maior riqueza e índice de Shannon, porém as comunidades endofíticas de Maués apresentam maior frequência relativa e dominância. Comunidades endofíticas de clones suscetíveis apresentam maior taxa de colonização, equitabilidade e índice de Shannon, enquanto que comunidades endofíticas de clones tolerantes apresentam maior dominância. Em relação aos órgãos vegetais, as comunidades endofíticas de raízes apresentam maior riqueza, equitabilidade e índice de Shannon, enquanto que comunidades endofiticas de semente apresentam maior dominância. Tanto clones suscetíveis quanto clones tolerantes são colonizados por fungos DSE, FMA e por diversas espécies endofíticas produtoras de enzimas, AIA e antifúngicos in vitro. É possível que estes fungos beneficiem os clones in vivo, protegendo-os de fitopatógenos como Colletotrichum e promovendo o crescimento vegetal. Os testes biológicos realizados demonstraram que espécies de fungos endofíticos de P. cupana produzem moléculas com propriedades antibióticas, antioxidantes e citotóxicas. A partir do extrato AcOEt de T. asperellum (1BDA) isolado de raízes, foi obtida o 1-hidroxi-8- metoxiantraquinona. O ácido 3-hidroxipropiônico e o ftalato de di-(2-etilhexila) foram isoladas do extrato AcOEt de D. phaseolorum (8S) e apresentam atividade antimicrobiana contra linhagens de P. aeruginosa suscetíveis e multirresistentes a antibióticos.

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7.0 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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192

8.0 ANEXOS

193

ANEXO 1 – Esquemas da purificação de extratos AcOEt de fungos endofíticos de P. cupana

194

Fluxograma 1 - Purificação do extrato AcOEt do fungo endofítico Diaporthe phaseolorum (8S)

195

Fluxograma 2 - Purificação do extrato AcOEt do fungo endofítico Trichoderma asperellum (1BDA)

Fluxograma 3- Purificação do extrato AcOEt do fungo endofítico Phomopsis asparagi (22TSA)

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Fluxograma 4 - Purificação do extrato AcOEt do fungo endofítico Mariannaea camptospora (123BDA)

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ANEXO 2 – Instruções de Formatação – Revista Fungal Ecology

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Fungal Ecology Editorial-Production Elsevier Ltd Bampfylde Street Exeter, EX1 2AH UK

Guide for Authors

Fungal Ecology publishes investigations into all aspects of fungal ecology, including the following (not exclusive) population dynamics; adaptation; evolution; role in ecosystem functioning, nutrient cycling, decomposition, carbon allocation; ecophysiology; intra- and inter-specific mycelial interactions, fungus-plant (pathogens, mycorrhizas, lichens, endophytes), fungus-invertebrate and fungus-microbe interaction; genomics and (evolutionary) genetics; conservation and biodiversity; remote sensing; bioremediation and biodegradation; quantitative and computational aspects - modelling, indicators, complexity, informatics. The usual prerequisites for publication will be originality, clarity, and significance as relevant to a better understanding of the ecology of fungi.

Submission of Manuscripts:

There are no submission fees or page charges. Submission to this journal proceeds totally online. Use the following guidelines to prepare your article. Via the homepage of this journal http://www.elsevier.com/journals you will be guided stepwise through the creation and uploading of the various files. The system automatically converts source files to a single Adobe Acrobat PDF version of the article, which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files are converted to PDF at submission for the review process, these source files are needed for further processing

211 after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's decision and requests for revision, takes place by e-mail and via the author's homepage, removing the need for a hard-copy paper trail.

It is a condition of publication that all manuscripts must be written in clear and grammatical English and be submitted to the Fungal Ecology Web site athttp://ees.elsevier.com/funeco. Text and tables should be submitted as Word documents, and figures should be submitted as TIFF or EPS files (300 dpi). The accompanying cover letter, outlining the basic findings of the paper and their significance, should be addressed to the Editorial Office. Authors are asked to submit the names, addresses, telephone numbers, and e-mail addresses of three to five potential reviewers within their cover letter.

Manuscripts are accepted for review with the understanding that no substantial portion of the study has been published or is under consideration for publication elsewhere and that its submission for publication has been approved by all of the authors and by the institution where the work was carried out. This should be stated in the covering letter. Manuscripts that do not meet the criteria or standards for publication in Fungal Ecology will be immediately returned to the authors, without detailed review.

Upon acceptance of an article, authors will be asked to sign a 'Journal Publishing Agreement' (for more information on this and copyright seehttp://www.elsevier.com/copyright. Acceptance of the agreement will ensure the widest possible dissemination of information. An e-mail (or letter) will be sent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal Publishing Agreement' form or a link to the online version of this agreement.

If material from other copyrighted works is included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases:

212 contact Elsevier Global Rights Department, P.O. Box 800, Oxford OX5 1DX, UK; phone: (+44) 1865 843830, fax: (+44) 1865 853333, e- mail: [email protected]

Mini Reviews and Commentaries:

Fungal Ecology review articles (about 3500 words) and commentaries are usually solicited by the Senior Editor or Editorial Board members. However, suggestions and proposals will be considered. There is no rigid format for reviews, but they should include an Abstract, an Introduction setting the background to the article, and should finish with a Conclusion section, which mentions future directions.

Short Communications:

These are short papers (less than 1500 words) without the limitations of subdivisions into introduction, Methods, Results etc. They are not interim reports nor reports of new species or species lists. An abstract should be included. One table or figure is allowed; references should be kept to a minimum.

Methodological Advances:

This section of Fungal Ecology publishes articles that describe the development of tools for studying fungal ecology. Manuscripts submitted to this section will be reviewed as rigorously as our Regular Research Articles. These papers are not "Research Notes" or "Short Communications", but full articles that describe the development and evaluation of tools for analysis of fungi. Such tools include microscopy, molecular, genetic and computational/modeling methods.

Preparation of Manuscript:

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Authorities for species are not necessary. It is important to differentiate between genes and proteins. Therefore, all gene names and loci should be typed in italics. Most recommendations of the Council of Biology Editors should be followed; consult the CBE Style Manual, 6th ed. (Council of Biology Editors, 9650 Rockville Pike, Bethesda, MD 20814). Nonstandard abbreviations should be defined at their initial appearance.

Manuscripts should be double-spaced throughout. Do not include line numbering in the manuscript. Pages should be organized as follows:

The title page (p. 1) should contain the article title, authors' names and complete affiliations, footnotes to the title, and the address for manuscript correspondence (including telephone and fax numbers and an e-mail address). Authors' home page addresses (URL) may also be provided at the authors' discretion.

The abstract (p. 2) must be a single paragraph that summarizes the main findings of the paper in less than 150 words. After the abstract a list of up to 10 index descriptors that will be useful for indexing or searching should be included.

The Introduction should be as concise as possible, without subheadings. Materials and methods should be sufficiently detailed to enable the experiments to be reproduced. Results and Discussions may be combined and may be organized into subheadings. Acknowledgments should be brief and should precede the references.

Linking Services Requirements

Discoverability of research and high quality peer review are ensured by online links to the sources cited. In order to allow us to create links within

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ScienceDirect and to abstracting and indexing services, such as Scopus, CrossRef or PubMed, please ensure that data provided in the references are correct. Please note that incorrect surnames, journal/book titles, publication year and pagination may prevent the link creation. When copying references, please be careful as they may already contain an error.

Reference Style

There are no strict requirements on reference formatting at submission. References can be in any style or format as long as the style is consistent. Author(s) name(s), journal title/book title, chapter title/article title, year of publication, volume and issue/book chapter and the pagination must be present. The reference style used by the journal will be applied to the accepted article by Elsevier at the proof stage. Note that incorrect or missing data will be highlighted at proof stage for the author to correct. If you do wish to format the references yourself they should be arranged according to Harvard ref. style:

Text: All citations in the text should refer to: 1. Single author: the author's name (without initials, unless there is ambiguity) and the year of publication; 2. Two authors: both authors' names and the year of publication; 3. Three or more authors: first author's name followed by 'et al.' and the year of publication. Citations may be made directly (or parenthetically). Groups of references should be listed first alphabetically, then chronologically. Examples: 'as demonstrated (Allan, 2000a, 2000b, 1999; Allan and Jones, 1999). Kramer et al. (2010) have recently shown ....' List: References should be arranged first alphabetically and then further sorted chronologically if necessary. More than one reference from the same author(s) in the same year must be identified by the letters 'a', 'b', 'c', etc., placed after the year of publication.

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Examples: Reference to a journal publication: Van der Geer, J., Hanraads, J.A.J., Lupton, R.A., 2010. The art of writing a scientific article. J. Sci. Commun. 163, 51–59. Reference to a book: Strunk Jr., W., White, E.B., 2000. The Elements of Style, fourth ed. Longman, New York. Reference to a chapter in an edited book: Mettam, G.R., Adams, L.B., 2009. How to prepare an electronic version of your article, in: Jones, B.S., Smith , R.Z. (Eds.), Introduction to the Electronic Age. E-Publishing Inc., New York, pp. 281–304.

Figures:

Number figures consecutively with Arabic numerals, in order of appearance in the text. Please visit our Web site at http://www.elsevier.com/artworkinstructions for detailed instructions on preparing electronic artwork.Color Figures:

One color plate will be published free of charge in each article, provided that color is deemed scientifically necessary by the reviewers and the Editorial Board. Additional color figures will be charged to the author. However, if together with your accepted article, you submit usable color figures, then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these figures will appear in color on the Web (e.g., ScienceDirect and other sites) regardless of whether these illustrations are reproduced in color in the printed version. [Please note: Because of technical complications that can arise in converting color figures to "gray scale" (for the printed version should you not opt for color in print), please submit in addition usable black-and-white files corresponding to all the color illustrations.]

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Color figures for exclusive use as cover illustrations may be submitted by authors who are also submitting a manuscript for consideration. These figures do not need to relate to the manuscript being submitted but should relate to the larger scope and focus of Fungal Ecology. Tables:

Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Type each table on a separate page with a short descriptive title typed directly above. Place footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase letters. Avoid vertical rules. Ensure that the data presented in tables do not duplicate results described elsewhere in the article.

DNA Sequences and GenBank Accession Numbers. Authors wishing to enable other scientists to use the accession numbers cited in their papers via links to these sources should type this information in the following manner:

For each and every accession number cited in an article, authors should type the accession number in bold, underlined text. Letters in the accession number should always be capitalized. (See example below.) This combination of letters and format will enable the typesetter to recognize the relevant texts as accession numbers and add the required links to GenBank sequences. Example: "GenBank accession nos.AI631510, AI631511, AI632198, and BF223228, a B-cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no. AA361117)."

Authors are encouraged to check accession numbers used very carefully. An error in a letter or number can result in a dead link. In the final version of the printed article, the accession number will not appear bold or underlined. In the final version of the electronic copy, the accession number text will be linked to the appropriate source in the NCBI databases, enabling readers to go directly to that source from the article.

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One set of page proofs in PDF format will be sent by e-mail to the corresponding author (if we do not have an e-mail address then paper proofs will be sent by post). Elsevier now sends PDF proofs that can be annotated; for this you will need to download Adobe Reader version 7 or newer available free fromhttp://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html. Instructions on how to annotate PDF files will accompany the proofs. The exact system requirements are given at the Adobe site:http://www.adobe.com/products/acrobat/acrrsystemreqs.html#70win.If you do not wish to use the PDF annotations function, you may list the corrections (including replies to the Query Form) and return to Elsevier in an e-mail. Please list your corrections quoting line number. If, for any reason, this is not possible, then mark the corrections and any other comments (including replies to the Query Form) on a printout of your proof and return by fax, or scan the pages and e-mail, or by post.

Please use this proof only for checking the typesetting, editing, completeness and correctness of the text, tables and figures. Significant changes to the article as accepted for publication will only be considered at this stage with permission from the Editor. We will do everything possible to publish your article quickly and accurately. Therefore, it is important to ensure that all of your corrections are sent back to us in one communication: please check carefully before replying, as inclusion of any subsequent corrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely your responsibility. Note that Elsevier may proceed with the publication of your article if no response is received.

AudioSlides

The journal encourages authors to create an AudioSlides presentation with their published article. AudioSlides are brief, webinar-style presentations that are shown next to the online article on ScienceDirect. This gives authors the opportunity to summarize their research in their own words and to help readers understand what the paper is about. More information and examples

218 are available at 10http://www.elsevier.com/audioslides. Authors of this journal will automatically receive an invitation e-mail to create an AudioSlides presentation after acceptance of their paper.

Research highlights

Research highlights are a short collection of bullet points that convey the core findings of the article. Research highlights are mandatory and should be submitted in a separate file in the online submission system. Please use 'Research highlights' in the file name and include 3 to 5 bullet points (maximum 85 characters per bullet point including spaces). See http://www.elsevier.com/researchhighlights for examples. Distribution of Material:

Authors who publish a research article in Fungal Ecology should be prepared freely to distribute to academic researchers for their own use any strains, cell products, or DNA clones described in the article. Nucleic acid and protein sequences must be deposited in the appropriate databases.

Author Inquiries :

Register for free to receive email updates from the article tracking service athttp://www.elsevier.com/trackarticle. The article tracking service also provides the facility to set up e-mail alerts to inform you of when an article's status has changed, as well as detailed artwork guidelines, copyright information, frequently asked questions, and more. Contact details for questions arising after acceptance of an article, especially those relating to proofs, are provided after registration of an article for publication.

OFFPRINTS:

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The corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of the article via e-mail. The PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use.

220

ANEXO 3 - Instruções de Formatação – Revista Current Microbiology

Current Microbiology Editor-in-Chief: Erko Stackebrandt ISSN: 0343-8651 (printversion) ISSN: 1432-0991 (electronic version) Journal no. 284

Instructions for Authors TYPES OF PAPERS Original Papers, Review Papers, Letters, etc EDITORIAL PROCEDURE Double-blind peer review This journal follows a double-blind reviewing procedure. Authors are therefore requested to submit two documents at the time of their submission: ► A title page only, which includes: • A concise and informative title • The name(s) of the author(s) • The affiliation(s) and address(es) of the author(s) • The e-mail address and fax number of the corresponding author ► A blinded manuscript without any author names and affiliations. Authors should avoid language that could identify themselves as the authors. Authors should properly cite and reference their own work, but should not use phrases such as “In our previous work (Smith, 2011), we presented…” which identifies the author. Such work should be referred to in the third person, e.g., “Previously Smith (Smith, 2011) presented…”. The blinded manuscript should contain: • A concise and informative title • Abstract: Please provide an abstract of 150 to 250 words. The abstract should not contain any undefined abbreviations or unspecified references. • Keywords: Please provide 4 to 6 keywords which can be used for indexing purposes.

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MANUSCRIPT SUBMISSION Manuscript Submission Submission of a manuscript implies: that the work described has not been published before; that it is not under consideration for publication anywhere else; that its publication has been approved by all co-authors, if any, as well as by the responsible authorities – tacitly or explicitly – at the institute where the work has been carried out. The publisher will not be held legally responsible should there be any claims for compensation. Permissions Authors wishing to include figures, tables, or text passages that have already been published elsewhere are required to obtain permission from the copyright owner(s) for both the print and online format and to include evidence that such permission has been granted when submitting their papers. Any material received without such evidence will be assumed to originate from the authors. Online Submission Please follow the hyperlink “Submit online” on the right and upload all of your manuscript files following the instructions given on the screen. TITLE PAGE Title Page The title page should include:  The name(s) of the author(s)  A concise and informative title  The affiliation(s) and address(es) of the author(s)  The e-mail address, telephone and fax numbers of the corresponding author Abstract Please provide an abstract of 150 to 250 words. The abstract should not contain any undefined abbreviations or unspecified references. TEXT Text Formatting

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Manuscripts should be submitted in Word.  The text of a research paper should be divided into Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements, Conflict of Interest, and References.  Materials and Methods must include statement of Human and Animal Rights.  Use a normal, plain font (e.g., 10-point Times Roman) for text.  Use italics for emphasis.  Use the automatic page numbering function to number the pages.  Do not use field functions.  Use tab stops or other commands for indents, not the space bar.  Use the table function, not spreadsheets, to make tables.  Use the equation editor or MathType for equations.  Save your file in docx format (Word 2007 or higher) or doc format (older Word versions). Manuscripts with mathematical content can also be submitted in LaTeX.  LaTeX macro package (zip, 182 kB) Headings Please use no more than three levels of displayed headings. Abbreviations Abbreviations should be defined at first mention and used consistently thereafter. Footnotes Footnotes can be used to give additional information, which may include the citation of a reference included in the reference list. They should not consist solely of a reference citation, and they should never include the bibliographic details of a reference. They should also not contain any figures or tables. Footnotes to the text are numbered consecutively; those to tables should be indicated by superscript lower-case letters (or asterisks for significance values and other statistical data). Footnotes to the title or the authors of the article are not given reference symbols.

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Always use footnotes instead of endnotes. Acknowledgments and Funding Information Acknowledgments of people, grants, funds, etc. should be placed in a separate section on the title page. The names of funding organizations should be written in full. In addition, please provide the funding information in a separate step of the submission process in the peer review system. Funder names should preferably be selected from the standardized list you will see during submission. If the funding institution you need is not listed, it can be entered as free text. Funding information will be published as searchable metadata for the accepted article, whereas acknowledgements are published within the paper. SCIENTIFIC STYLE  Please always use internationally accepted signs and symbols for units (SI units).  Nomenclature: Insofar as possible, authors should use systematic names similar to those used by Chemical Abstract Service or IUPAC.  Genus and species names should be in italics.  Generic names of drugs and pesticides are preferred; if trade names are used, the generic name should be given at first mention.  Please use the standard mathematical notation for formulae, symbols, etc.: Italic for single letters that denote mathematical constants, variables, and unknown quantities Roman/upright for numerals, operators, and punctuation, and commonly defined functions or abbreviations, e.g., cos, det, e or exp, lim, log, max, min, sin, tan, d (for derivative) Bold for vectors, tensors, and matrices. MANUSCRIPT LENGTH 1.The manuscript should not be longer than 12 pages, double spaced, including Figures and Tables .The 12-page limit does not include references.

224

2. The references should be listed alphabetically, then numbered. REFERENCES Citation Reference citations in the text should be identified by numbers in square brackets. Some examples: 1. Negotiation research spans many disciplines [3]. 2. This result was later contradicted by Becker and Seligman [5]. 3. This effect has been widely studied [1-3, 7]. Reference list The list of references should only include works that are cited in the text and that have been published or accepted for publication. Personal communications and unpublished works should only be mentioned in the text. Do not use footnotes or endnotes as a substitute for a reference list. The entries in the list should be numbered consecutively.  Journal article Gamelin FX, Baquet G, Berthoin S, Thevenet D, Nourry C, Nottin S, Bosquet L (2009) Effect of high intensity intermittent training on heart rate variability in prepubescent children. Eur J Appl Physiol 105:731-738. doi: 10.1007/s00421- 008-0955-8 Ideally, the names of all authors should be provided, but the usage of “et al” in long author lists will also be accepted: Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance. N Engl J Med 965:325–329  Article by DOI Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production. J Mol Med. doi:10.1007/s001090000086  Book South J, Blass B (2001) The future of modern genomics. Blackwell, London  Book chapter Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (ed) The rise of modern genomics, 3rd edn. Wiley, New York, pp 230-257

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 Online document Cartwright J (2007) Big stars have weather too. IOP Publishing PhysicsWeb. http://physicsweb.org/articles/news/11/6/16/1. Accessed 26 June 2007  Dissertation Trent JW (1975) Experimental acute renal failure. Dissertation, University of California Always use the standard abbreviation of a journal’s name according to the ISSN List of Title Word Abbreviations, see  ISSN.org LTWA If you are unsure, please use the full journal title. For authors using EndNote, Springer provides an output style that supports the formatting of in-text citations and reference list.  EndNote style (zip, 2 kB) Authors preparing their manuscript in LaTeX can use the bibtex file spbasic.bst which is included in Springer’s LaTeX macro package. TABLES  All tables are to be numbered using Arabic numerals.  Tables should always be cited in text in consecutive numerical order.  For each table, please supply a table caption (title) explaining the components of the table.  Identify any previously published material by giving the original source in the form of a reference at the end of the table caption.  Footnotes to tables should be indicated by superscript lower-case letters (or asterisks for significance values and other statistical data) and included beneath the table body. ARTWORK AND ILLUSTRATIONS GUIDELINES Electronic Figure Submission  Supply all figures electronically.  Indicate what graphics program was used to create the artwork.  For vector graphics, the preferred format is EPS; for halftones, please use TIFF format. MSOffice files are also acceptable. 226

 Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files.  Name your figure files with "Fig" and the figure number, e.g., Fig1.eps. Line Art

 Definition: Black and white graphic with no shading.  Do not use faint lines and/or lettering and check that all lines and lettering within the figures are legible at final size.  All lines should be at least 0.1 mm (0.3 pt) wide.  Scanned line drawings and line drawings in bitmap format should have a minimum resolution of 1200 dpi.  Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files.

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Halftone Art

 Definition: Photographs, drawings, or paintings with fine shading, etc.  If any magnification is used in the photographs, indicate this by using scale bars within the figures themselves.  Halftones should have a minimum resolution of 300 dpi. Combination Art

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 Definition: a combination of halftone and line art, e.g., halftones containing line drawing, extensive lettering, color diagrams, etc.  Combination artwork should have a minimum resolution of 600 dpi. Color Art  Color art is free of charge for online publication.  If black and white will be shown in the print version, make sure that the main information will still be visible. Many colors are not distinguishable from one another when converted to black and white. A simple way to check this is to make a xerographic copy to see if the necessary distinctions between the different colors are still apparent.  If the figures will be printed in black and white, do not refer to color in the captions.  Color illustrations should be submitted as RGB (8 bits per channel).

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Figure Lettering  To add lettering, it is best to use Helvetica or Arial (sans serif fonts).  Keep lettering consistently sized throughout your final-sized artwork, usually about 2–3 mm (8–12 pt).  Variance of type size within an illustration should be minimal, e.g., do not use 8-pt type on an axis and 20-pt type for the axis label.  Avoid effects such as shading, outline letters, etc.  Do not include titles or captions within your illustrations. Figure Numbering  All figures are to be numbered using Arabic numerals.  Figures should always be cited in text in consecutive numerical order.  Figure parts should be denoted by lowercase letters (a, b, c, etc.).  If an appendix appears in your article and it contains one or more figures, continue the consecutive numbering of the main text. Do not number the appendix figures, "A1, A2, A3, etc." Figures in online appendices (Electronic Supplementary Material) should, however, be numbered separately. Figure Captions  Each figure should have a concise caption describing accurately what the figure depicts. Include the captions in the text file of the manuscript, not in the figure file.  Figure captions begin with the term Fig. in bold type, followed by the figure number, also in bold type.  No punctuation is to be included after the number, nor is any punctuation to be placed at the end of the caption.  Identify all elements found in the figure in the figure caption; and use boxes, circles, etc., as coordinate points in graphs.  Identify previously published material by giving the original source in the form of a reference citation at the end of the figure caption.

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Figure Placement and Size  Figures should be submitted separately from the text, if possible.  When preparing your figures, size figures to fit in the column width.  For most journals the figures should be 39 mm, 84 mm, 129 mm, or 174 mm wide and not higher than 234 mm.  For books and book-sized journals, the figures should be 80 mm or 122 mm wide and not higher than 198 mm. Permissions If you include figures that have already been published elsewhere, you must obtain permission from the copyright owner(s) for both the print and online format. Please be aware that some publishers do not grant electronic rights for free and that Springer will not be able to refund any costs that may have occurred to receive these permissions. In such cases, material from other sources should be used. Accessibility In order to give people of all abilities and disabilities access to the content of your figures, please make sure that  All figures have descriptive captions (blind users could then use a text-to-speech software or a text-to-Braille hardware)  Patterns are used instead of or in addition to colors for conveying information (colorblind users would then be able to distinguish the visual elements)  Any figure lettering has a contrast ratio of at least 4.5:1 ELECTRONIC SUPPLEMENTARY MATERIAL Springer accepts electronic multimedia files (animations, movies, audio, etc.) and other supplementary files to be published online along with an article or a book chapter. This feature can add dimension to the author's article, as certain information cannot be printed or is more convenient in electronic form. Submission  Supply all supplementary material in standard file formats.

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 Please include in each file the following information: article title, journal name, author names; affiliation and e-mail address of the corresponding author.  To accommodate user downloads, please keep in mind that larger- sized files may require very long download times and that some users may experience other problems during downloading. Audio, Video, and Animations  Aspect ratio: 16:9 or 4:3  Maximum file size: 25 GB  Minimum video duration: 1 sec  Supported file formats: avi, wmv, mp4, mov, m2p, mp2, mpg, mpeg, flv, mxf, mts, m4v, 3gp Text and Presentations  Submit your material in PDF format; .doc or .ppt files are not suitable for long-term viability.  A collection of figures may also be combined in a PDF file. Spreadsheets  Spreadsheets should be converted to PDF if no interaction with the data is intended.  If the readers should be encouraged to make their own calculations, spreadsheets should be submitted as .xls files (MS Excel). Specialized Formats  Specialized format such as .pdb (chemical), .wrl (VRML), .nb (Mathematica notebook), and .tex can also be supplied. Collecting Multiple Files  It is possible to collect multiple files in a .zip or .gz file. Numbering  If supplying any supplementary material, the text must make specific mention of the material as a citation, similar to that of figures and tables.

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 Refer to the supplementary files as “Online Resource”, e.g., "... as shown in the animation (Online Resource 3)", “... additional data are given in Online Resource 4”.  Name the files consecutively, e.g. “ESM_3.mpg”, “ESM_4.pdf”. Captions  For each supplementary material, please supply a concise caption describing the content of the file. Processing of supplementary files  Electronic supplementary material will be published as received from the author without any conversion, editing, or reformatting. Accessibility In order to give people of all abilities and disabilities access to the content of your supplementary files, please make sure that  The manuscript contains a descriptive caption for each supplementary material  Video files do not contain anything that flashes more than three times per second (so that users prone to seizures caused by such effects are not put at risk) DOES SPRINGER PROVIDE ENGLISH LANGUAGE SUPPORT? Manuscripts that are accepted for publication will be checked by our copyeditors for spelling and formal style. This may not be sufficient if English is not your native language and substantial editing would be required. In that case, you may want to have your manuscript edited by a native speaker prior to submission. A clear and concise language will help editors and reviewers concentrate on the scientific content of your paper and thus smooth the peer review process. The following editing service provides language editing for scientific articles in all areas Springer publishes in:  Edanz English editing for scientists

233

Use of an editing service is neither a requirement nor a guarantee of acceptance for publication. Please contact the editing service directly to make arrangements for editing and payment. For Authors from China 文章在投稿前进行专业的语言润色将对作者的投稿进程有所帮助。作者可自愿

选择使用Springer推荐的编辑服务，使用与否并不作为判断文章是否被录用的依据。提高文章的语言质量将有助于审稿人理解文章的内容，通过对学术内容的判断来决定文章的取舍，而不会因为语言问题导致直接退稿。作者需自行联

系Springer推荐的编辑服务公司，协商编辑事宜。

 理文编辑 For Authors from Japan ジャーナルに論文を投稿する前に、ネイティブ・スピーカーによる英文校閲

を希望されている方には、Edanz社をご紹介しています。サービス内容、料金および申込方法など、日本語による詳しい説明はエダンズグループジャパ

ン株式会社の下記サイトをご覧ください。

 エダンズグループジャパン For Authors from Korea

영어 논문 투고에 앞서 원어민에게 영문 교정을 받고자 하시는 분들께 Edanz

회사를 소개해 드립니다. 서비스 내용, 가격 및

신청 방법 등에 대한 자세한 사항은 저희 Edanz Editing Global 웹사이트를

참조해 주시면 감사하겠습니다.

 Edanz Editing Global ETHICAL RESPONSIBILITIES OF AUTHORS This journal is committed to upholding the integrity of the scientific record. As a member of the Committee on Publication Ethics (COPE) the journal will follow the COPE guidelines on how to deal with potential acts of misconduct.

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Authors should refrain from misrepresenting research results which could damage the trust in the journal, the professionalism of scientific authorship, and ultimately the entire scientific endeavour. Maintaining integrity of the research and its presentation can be achieved by following the rules of good scientific practice, which include:  The manuscript has not been submitted to more than one journal for simultaneous consideration.  The manuscript has not been published previously (partly or in full), unless the new work concerns an expansion of previous work (please provide transparency on the re-use of material to avoid the hint of text-recycling (“self-plagiarism”)).  A single study is not split up into several parts to increase the quantity of submissions and submitted to various journals or to one journal over time (e.g. “salami-publishing”).  No data have been fabricated or manipulated (including images) to support your conclusions  No data, text, or theories by others are presented as if they were the author’s own (“plagiarism”). Proper acknowledgements to other works must be given (this includes material that is closely copied (near verbatim), summarized and/or paraphrased), quotation marks are used for verbatim copying of material, and permissions are secured for material that is copyrighted. Important note: the journal may use software to screen for plagiarism.  Consent to submit has been received explicitly from all co-authors, as well as from the responsible authorities - tacitly or explicitly - at the institute/organization where the work has been carried out, before the work is submitted.  Authors whose names appear on the submission have contributed sufficiently to the scientific work and therefore share collective responsibility and accountability for the results. In addition:

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 Changes of authorship or in the order of authors are not accepted after acceptance of a manuscript.  Requesting to add or delete authors at revision stage, proof stage, or after publication is a serious matter and may be considered when justifiably warranted. Justification for changes in authorship must be compelling and may be considered only after receipt of written approval from all authors and a convincing, detailed explanation about the role/deletion of the new/deleted author. In case of changes at revision stage, a letter must accompany the revised manuscript. In case of changes after acceptance or publication, the request and documentation must be sent via the Publisher to the Editor-in-Chief. In all cases, further documentation may be required to support your request. The decision on accepting the change rests with the Editor- in-Chief of the journal and may be turned down. Therefore authors are strongly advised to ensure the correct author group, corresponding author, and order of authors at submission.  Upon request authors should be prepared to send relevant documentation or data in order to verify the validity of the results. This could be in the form of raw data, samples, records, etc. If there is a suspicion of misconduct, the journal will carry out an investigation following the COPE guidelines. If, after investigation, the allegation seems to raise valid concerns, the accused author will be contacted and given an opportunity to address the issue. If misconduct has been established beyond reasonable doubt, this may result in the Editor-in-Chief’s implementation of the following measures, including, but not limited to:  If the article is still under consideration, it may be rejected and returned to the author.  If the article has already been published online, depending on the nature and severity of the infraction, either an erratum will be placed with the article or in severe cases complete retraction of the article

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will occur. The reason must be given in the published erratum or retraction note.  The author’s institution may be informed. COMPLIANCE WITH ETHICAL STANDARDS To ensure objectivity and transparency in research and to ensure that accepted principles of ethical and professional conduct have been followed, authors should include information regarding sources of funding, potential conflicts of interest (financial or non-financial), informed consent if the research involved human participants, and a statement on welfare of animals if the research involved animals. Authors should include the following statements (if applicable) in a separate section entitled “Compliance with Ethical Standards” when submitting a paper:  Disclosure of potential conflicts of interest  Research involving Human Participants and/or Animals  Informed consent Please note that standards could vary slightly per journal dependent on their peer review policies (i.e. single or double blind peer review) as well as per journal subject discipline. Before submitting your article check the instructions following this section carefully. The corresponding author should be prepared to collect documentation of compliance with ethical standards and send if requested during peer review or after publication. The Editors reserve the right to reject manuscripts that do not comply with the above-mentioned guidelines. The author will be held responsible for false statements or failure to fulfill the above-mentioned guidelines. DISCLOSURE OF POTENTIAL CONFLICTS OF INTEREST Authors must disclose all relationships or interests that could have direct or potential influence or impart bias on the work. Although an author may not feel there is any conflict, disclosure of relationships and interests provides a more complete and transparent process, leading to an accurate and objective assessment of the work. Awareness of a real or perceived conflicts of interest

237 is a perspective to which the readers are entitled. This is not meant to imply that a financial relationship with an organization that sponsored the research or compensation received for consultancy work is inappropriate. Examples of potential conflicts of interests that are directly or indirectly related to the research may include but are not limited to the following:  Research grants from funding agencies (please give the research funder and the grant number)  Honoraria for speaking at symposia  Financial support for attending symposia  Financial support for educational programs  Employment or consultation  Support from a project sponsor  Position on advisory board or board of directors or other type of management relationships  Multiple affiliations  Financial relationships, for example equity ownership or investment interest  Intellectual property rights (e.g. patents, copyrights and royalties from such rights)  Holdings of spouse and/or children that may have financial interest in the work In addition, interests that go beyond financial interests and compensation (non-financial interests) that may be important to readers should be disclosed. These may include but are not limited to personal relationships or competing interests directly or indirectly tied to this research, or professional interests or personal beliefs that may influence your research. The corresponding author collects the conflict of interest disclosure forms from all authors. In author collaborations where formal agreements for representation allow it, it is sufficient for the corresponding author to sign the disclosure form on behalf of all authors. Examples of forms can be found  here: 238

The corresponding author will include a summary statement in the text of the manuscript in a separate section before the reference list, that reflects what is recorded in the potential conflict of interest disclosure form(s). See below examples of disclosures: Funding: This study was funded by X (grant number X). Conflict of Interest: Author A has received research grants from Company A. Author B has received a speaker honorarium from Company X and owns stock in Company Y. Author C is a member of committee Z. If no conflict exists, the authors should state: Conflict of Interest: The authors declare that they have no conflict of interest. RESEARCH INVOLVING HUMAN PARTICIPANTS AND/OR ANIMALS 1) Statement of human rights When reporting studies that involve human participants, authors should include a statement that the studies have been approved by the appropriate institutional and/or national research ethics committee and have been performed in accordance with the ethical standards as laid down in the 1964 Declaration of Helsinki and its later amendments or comparable ethical standards. If doubt exists whether the research was conducted in accordance with the 1964 Helsinki Declaration or comparable standards, the authors must explain the reasons for their approach, and demonstrate that the independent ethics committee or institutional review board explicitly approved the doubtful aspects of the study. The following statements should be included in the text before the References section: Ethical approval: “All procedures performed in studies involving human participants were in accordance with the ethical standards of the institutional and/or national research committee and with the 1964 Helsinki declaration and its later amendments or comparable ethical standards.” For retrospective studies, please add the following sentence: “For this type of study formal consent is not required.” 2) Statement on the welfare of animals

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The welfare of animals used for research must be respected. When reporting experiments on animals, authors should indicate whether the international, national, and/or institutional guidelines for the care and use of animals have been followed, and that the studies have been approved by a research ethics committee at the institution or practice at which the studies were conducted (where such a committee exists). For studies with animals, the following statement should be included in the text before the References section: Ethical approval: “All applicable international, national, and/or institutional guidelines for the care and use of animals were followed.” If applicable (where such a committee exists): “All procedures performed in studies involving animals were in accordance with the ethical standards of the institution or practice at which the studies were conducted.” If articles do not contain studies with human participants or animals by any of the authors, please select one of the following statements: “This article does not contain any studies with human participants performed by any of the authors.” “This article does not contain any studies with animals performed by any of the authors.” “This article does not contain any studies with human participants or animals performed by any of the authors.” INFORMED CONSENT All individuals have individual rights that are not to be infringed. Individual participants in studies have, for example, the right to decide what happens to the (identifiable) personal data gathered, to what they have said during a study or an interview, as well as to any photograph that was taken. Hence it is important that all participants gave their informed consent in writing prior to inclusion in the study. Identifying details (names, dates of birth, identity numbers and other information) of the participants that were studied should not be published in written descriptions, photographs, and genetic profiles unless the information is essential for scientific purposes and the participant (or parent or guardian if the participant is incapable) gave written informed

240 consent for publication. Complete anonymity is difficult to achieve in some cases, and informed consent should be obtained if there is any doubt. For example, masking the eye region in photographs of participants is inadequate protection of anonymity. If identifying characteristics are altered to protect anonymity, such as in genetic profiles, authors should provide assurance that alterations do not distort scientific meaning. The following statement should be included: Informed consent: “Informed consent was obtained from all individual participants included in the study.” If identifying information about participants is available in the article, the following statement should be included: “Additional informed consent was obtained from all individual participants for whom identifying information is included in this article.” AFTER ACCEPTANCE Upon acceptance of your article you will receive a link to the special Author Query Application at Springer’s web page where you can sign the Copyright Transfer Statement online and indicate whether you wish to order OpenChoice, offprints, or printing of figures in color. Once the Author Query Application has been completed, your article will be processed and you will receive the proofs. Open Choice In addition to the normal publication process (whereby an article is submitted to the journal and access to that article is granted to customers who have purchased a subscription), Springer provides an alternative publishing option: Springer Open Choice. A Springer Open Choice article receives all the benefits of a regular subscription-based article, but in addition is made available publicly through Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.  Springer Open Choice Copyright transfer Authors will be asked to transfer copyright of the article to the Publisher (or grant the Publisher exclusive publication and dissemination rights). This will

241 ensure the widest possible protection and dissemination of information under copyright laws. Open Choice articles do not require transfer of copyright as the copyright remains with the author. In opting for open access, the author(s) agree to publish the article under the Creative Commons Attribution License.  Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License Offprints Offprints can be ordered by the corresponding author. Color illustrations Online publication of color illustrations is free of charge. For color in the print version, authors will be expected to make a contribution towards the extra costs. Proof reading The purpose of the proof is to check for typesetting or conversion errors and the completeness and accuracy of the text, tables and figures. Substantial changes in content, e.g., new results, corrected values, title and authorship, are not allowed without the approval of the Editor. After online publication, further changes can only be made in the form of an Erratum, which will be hyperlinked to the article. Online First The article will be published online after receipt of the corrected proofs. This is the official first publication citable with the DOI. After release of the printed version, the paper can also be cited by issue and page numbers.

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