אוניברסיטת תל אביב הפקולטה למדעי החיים ע"ש ג'ורג' ס. וייז המדרשה לתארים מתקדמים

דיפרנציאציה כמוטיפית באוכלוסיות של שומר פשוט

(Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare, Apiaceae) בישראל

חיבור לשם קבלת התואר "דוקטור לפילוסופיה"

מאת

מיכל גרוס

הוגש לסנאט של אוניברסיטת תל-אביב

יוני 2006

עבודה זו נעשתה בהנחיית

פרופ' יעקב פרידמן

ד"ר אפרים לוינסון

II לזכרם של הורי היקרים חיה ורפאל כהן ז"ל

III תודות לפרופ' יקי פרידמן על ההשקעה וההנחיה המסורה והמקצועית. לד"ר אפרים לוינסון על היחס החם, ההנחיה והתמיכה המקצועית. לפרופ' אמוץ דפני על הנכונות והייעוץ בנושא הביולוגיה של ההאבקה. לפרופ' עידו יצחקי על הנכונות והייעוץ הסטטיסטי. לפרופ' דני יואל על הייעוץ והעזרה בעבודה המיקרוסקופית. לד"ר נתיב דודאי , דויא סעדי ודוד בחשיאן על הסיוע בעבודת השדה והתמיכה החברית. לעינת בר ואולגה לרקוב על עזרתן ב- GC-MS. ליעל כהן על התמיכה והערות המועילות בכתיבה. לפרופ' עוזי רביד ולכל יתר חברי המחלקה לתבלינים על התמיכה המקצועית והחברתית. לד"ר מוסה אוקזן עבור איסוף יחידות תפוצה של שומר פשוט ממרסין, טורקיה. לשמוליק אישי היקר ולבנותי האהובות. שחוו איתי את הרגעים השמחים והקשים, תמכו, עזרו ועודדו לאורך כל הדרך.

לכולכם תודה רבה.

IV תוכן העניינים

עמוד

תקציר ------VIII-XI

פרק א. מבוא ------1-6 א.1 תיאור הצמח ------1 א.2 שימושים של שומר פשוט ------1 א.3 אברי הפרשת השמן האתרי בשומר פשוט ------2 א.4 מרכיבי השמן האתרי בשומר פשוט ------2-4 א.5 טקסונומיה, תפוצת המין בעולם ובארץ ------5 א.6 מטרות המחקר ------6

פרק ב. חומרים ושיטות - כללי ------7-9 ב.1 אוכלוסיות המחקר ------7 ב.2 זיהוי תרכובות נדיפות ------8-9 מיצוי תרכובות המצויות באברי צמח שונים ------8 הפקת שמן אתרי על ידי זיקוק מים ------8 איסוף תרכובות נדיפות הנפלטות לאוויר החופשי ------8 אנליזת הנדיפים באמצעות GC-MS ------9 ב.3 ניתוח סטטיסטי ------9

פרק ג. הרכב ותכולת האולאורזין באברי צמח במהלך האונטוגנזה ------10-51

ג.1 חומרים ושיטות ------12-16 ג.2 תוצאות ------17-41 ג.1.2. אפיון מרכיבי האולאורזין של אוכלוסיות המחקר ------17-18 ג.2.2. הרכב ותכולת האולאורזין במהלך האונטוגנזה השוואה - בין שני הכמוטיפים ---- 18-22 ג.1.2.2. הרכב ותכולה בצמח הצעיר (נבטים) ------18-22 ג.2.2.2. הרכב ותכולה בצמח הבוגר ------23-30 ג.3.2 מבנה ביבי השמן במהלך התפתחות הפרי ------31-34 ג.4.2. ההרכב הכימי ושיעור הפליטה של נדיפים מאברי צמח שלמים ------34-36 ג.5.2. הפוטנציאל הפיטוטוקסי והאוטוטוקסי של השמן האתרי המופק משני כמוטיפים--- 37-41 ג.3 דיון ומסקנות ------41-51 ג.1.3. השוואת ההרכב הכימי בין אברי הצמח השונים במהלך האונטוגנזה ------41-46

V ג.2.3. ההרכב הכימי ושיעור הפליטה של נדיפים מאברי צמח שלמים ------47-48 ג.3.3. הפוטנציאל הפיטוטוקסי והאוטוטוקסי של השמן האתרי המופק משני כמוטיפים - 49-51

פרק ד. ביוסינתזה של t-anethole ו-estragole ------52-80

ד. 1 חומרים ושיטות ------54-58 ד.1.1. מתילטרנספראז ------54-57 א. הכנת מיצוי חלבוני אל-תאי ------54 ב. בדיקת פעילות אנזימטית למתילטרנספראז ------54-55 ג. זיהוי תוצרי פעילות OMT's ------55 ד. קביעת ריכוז החלבון ------55 ה. ניקוי חלקי של האנזים – gel permeation ------56 ו. קביעת המשקל המולקולרי ------56 ז. בדיקת תכונות הפעילות האנזימטית ------56-57 ד.2.1. איזומראז ------57-58 א. הכנת מיצויים חלבוניים אל-תאיים ------57 ב. בדיקת פעילות אנזימטית לאיזומראז ------57-58 ד.2 תוצאות ------58-74 ד.1.2. מתילטרנספראז ------58-72 א. פעילות של O-methyltransferases המותנת ב-Chavicol או ב- Anol בפירות הכמוטיפים ------58-60 ב. השוואת פעילות של O-methyltransferases באוכלוסיות שונות של שומר ---- 60 ג. הקשר בין פעילות O-methyltransferases ותכולת estragole ו- t-anethole באברי צמח שונים במהלך התפתחותם ------60-65 ד. פעילות של O-methyltransferases כלפי נגזרות פנוליות שונות ------66-67 ה. מאפייני הפעילות האנזימטית של O-methyltransferases בשני הכמוטיפים- 68-72 ד.2.2. איזומראז ------73-74 ד.3 דיון ומסקנות ------75-80 ד.1.3 מתילטרנספראז ------75-79 א. מתילציה של Anol ו-Chavicol במיצוי אל-תאי של שומר פשוט ------75 ב. תכונות ה-O-methyltransferases שהופקו מפירות שני הכמוטיפים ------75-77 ג. הקשר בין פעילות O-methyltransferases והשינויים בתכולת estragole ו- t- anethole במהלך ההתפתחות של אברי צמח שונים בשומר פשוט ------77-79 ד. פעילות של O-methyltransferases באוכלוסיות שונות של שומר ------79

VI ד.2.3. פעילות של anethole / methyl chavicol isomerase ------79-80

פרק ה. דרך ההורשה של התכונה לצבירת estragole ו/או t-anethole ------81-91

ה.1 חומרים ושיטות ------82-84 ה.2 תוצאות ------84-89 ה.3 דיון ומסקנות ------89-91

פרק ו. מהלך הפריחה ושיעור החנטה ------92-116

ו.1 חומרים ושיטות ------93-96 ו.2 תוצאות ------96-104 ו.1.2. התפתחות הפרח ------96-98 ו.2.2. מועד ומשך הזמן של רצפטיביות הצלקת ------99 ו.3.2. הכנית כאתר לנביטת אבקה ------99-100 ו.4.2. מועדי הפריחה האוכלוסיות השונות ------101-102 ו.5.2. שיעור החנטה כתוצאה מהאבקה בין ובתוך נציגי אוכלוסיות טבעיות ------102-104 ו.3 דיון ומסקנות ------105-109 ו.1.3. ביולוגיה של הפריחה בנציגי אוכלוסיות טבעיות שגודלו בתנאים דומים ------105-107 ו.2.3. שיעור החנטה כתוצאה מהכלאות מכוונות בין ובתוך נציגי אוכלוסיות טבעיות - 107-109

פרק ז. דיון כללי ------110-116

ז.1 תכולה והרכב האולאורזין בשני הכמוטיפים של שומר פשוט ומשמעותם האקולוגית--- 110-113 ז.2 הבסיס הגנטי והביוכימי לשונות בהרכב הכימי של הכמוטיפים. ------113-115 ז.3 המנגנון לשימור ההבדלים ביו הכמוטיפים------115-116

רשימת ספרות ------117-131

נספחים ------132-136

תקציר באנגלית ------D -A

VII תקציר שומר פשוט (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare), סוככיים (Apiaceae), הינו המיקריפטופיט,

נפוץ באגן הים התיכון עם חדירה אירנוטורנית, המקובל מקדמת דנא כצמח רפואה ותבלין. המרכיבים העיקריים

בשמן האתרי של פירות השומר המשפיעים על טעמו המיוחד הם: הפנילפרופנואידים – t-anethole

ו-methylchavicol) estragole) והמונוטרפנואידים: fenchone ו- limonene. בישראל, נפוץ המין במגוון

רחב של בתי גידול. באוכלוסיות הבר בארץ זוהו שני כמוטיפים הנבדלים בתכולה היחסית של t-anethole

ו-estragole בפירות. בעבודה זו הוגדרו המטרות הבאות:

1. השוואת ההרכב ותכולת המרכיבים הנדיפים באברי צמח שונים במהלך האונטוגנזה בשני כמוטיפים שונים

שגודלו בתנאים דומים, ובחינת הקשר בין תכולת השמן האתרי הנצברת, לבין הרכב הנדיפים

המשתחררים לאוויר בסביבת הצמח ופוטנציאל השפעתו הפיטוטוקסית של השמן האתרי.

2. איתור השלב(ים) במסלול הביוסינתטי לייצור t-anethole ו-estragole הגורם להבדל בין הכמוטיפים

השונים ובחינת פוטנציאל הייצור שלהם באברים השונים של הצמח במהלך האונטוגנזה.

3. תיאור מערכת הרבייה והשוואת פוטנציאל ההפריה כתוצאה מהכלאות בין ובתוך אוכלוסיות שומר.

4. קביעת הבסיס הגנטי האחראי לשונות בהרכב הכימי בין הכמוטיפים.

לצורך המחקר נבחרו אוכלוסיות בר של שומר פשוט בעלות הרכב שונה של t-anethole ו- estragole בשמן

האתרי שלהן. ארבע אוכלוסיות ממקומות שונים בישראל, ולהשוואה גם שתי אוכלוסיות הממוקמות מחוץ

לישראל: אוכלוסיה דרומית מג'בל קתרינה (סיני, מצרים) ואוכלוסיה צפונית מאזור מרסין (טורקיה). שתיים

מהאוכלוסיות הישראליות: אוכלוסיית הר דוב (MD), שפירותיה עשירים ב-estragole, ואוכלוסיית באר חיל

(BH) העשירה ב-t-anethole הוגדרו בעבר ככמוטיפים, לאחר שנמצא כי נציגים מאוכלוסיות אלה שומרים על

הרכב המונוטרפנים והפנילפרופנואידים שבפירותיהם גם כשגודלו בתנאים אחידים מחוץ לבתי גידולם

הטבעיים. פירות שנאספו מנציגי אוכלוסיות הבר שנבדקו, גודלו בתנאי תרבות במרכז המחקר החקלאי בנווה

יער. ההרכב הכימי באברי הצמח השונים נקבע בשתי דרכים: א. לאחר שהאולאורזינים מוצו בהקסאן. ב. לאחר

לכידת המרכיבים המשתחררים לאוויר החופשי בסביבת אברי הצמח, בשיטת headspace. הפרדה וזיהוי

המרכיבים הכימיים נעשתה באמצעות GC-MS.

VIII נמצא כי השוני בהרכב הכימי בין הכמוטיפים נשמר באברי הצמח השונים ובמהלך התפתחותם. ההבדל בין

הכמוטיפים בהרכב האולאורזין ניכר בעיקר בהרכב הפנילפרופנואידים, המהווים 60-85% מהאולאורזין באברי

הצמח השונים. באיברים העל אדמתיים ההבדל קשור בתכולה שונה של t-anethole ו-estragole ואילו

בשורש הבוגר בתכולה של -dillapiole ו-apiole. הכמוטיפ האנתולי (באר חיל) מכיל פי 2 יותר apiole ופי

3.5 פחות dillapiole בהשוואה לכמוטיפ האסטרגולי (הר דוב). ייחודיות בין שני הכמוטיפים קיימת גם בהרכב

המונוטרפנואידים. כמוטיפ באר חיל עשיר יותר ב- limonene ועני יותר ב- fenchone בהשוואה לכמוטיפ הר

דוב שבנוסף לכך מתאפיין גם ב-α-phellandrene. הבדלים אלו מתבטאים בכל אברי הנצר ובמיוחד בפירות.

בדיקת נוכחות מונוטרפנואידים ופנילפרופנואידים שמשתחררים מהצמח השלם מלמדת כי בכל האיברים,

ובפירות בפרט, רמת ההתנדפות הכללית של השמן האתרי ביממה (אחוז מהתכולה הכללית בצמח) נמוכה

(0.1-0.4 בפירות), ומושפעת כנראה, מלחץ אדים נמוך של הפנילפרופנואידים מחד, ומהתעבות דפנות התאים

המקיפים את ביב השמן מאידך. לא נמצא הבדל משמעותי בין הכמוטיפים במבנה האנטומי של ביבי השמן או

באופי הפלורוצנטי המוקרן מהחתכים בפירות. מאידך, קיים הבדל משמעותי בכמות היחסית של המרכיבים

הנדיפים המשתחררים לאוויר, בהשוואה לכמותם היחסית באולאורזין. שיעור הנידוף של הפנילפרופנואידים

נמוך יחסית והמרכיב העיקרי המשתחרר משני הכמוטיפים בכל אברי הצמח הוא α-pinene. כתוצאה, ההבדל

בין הכמוטיפים בהרכב האוויר בסביבת הצמח קטן.

לפאזה הגזית של השמן האתרי המופק משומר יש פוטנציאל פיטוטוקסי ואוטוטוקסי שעשוי לעכב נביטה

ובמיוחד לפגוע בהתארכות השורשונים של נבטי חיטה ונבטי שומר. לכן קיימת האפשרות כי התייבשות שושנת

העלים ונשירתה לקראת הפריחה מהווה יתרון בצמצום הנביטה של יחידות התפוצה של השומר, שנושרים

בקרבת צמח האם ונביטת זרעים של מתחרים אחרים. ההשפעה הפיטוטוקסית של estragole על התארכות

השורשונים גדולה (פי 2 בריכוז של 200nl/ml) בהשוואה ל- t-anethole. עם זאת, שמן אתרי המופק מפירות

של כל אחד מהכמוטיפים, פיטוטוקסי יותר מהמרכיב הפנילפרופנואידי העיקרי שלו, וניתן להסיק כי הפעילות

הפיטוטוקסית קשורה גם במרכיבי השמן האתרי האחרים.

ההבדלים בכמות האולאורזין הכללית וההרכב השונה בין אברי הצמח, עשויים לרמז על תפקוד שונה של

מרכיבי האולאורזין באברים השונים. כמו כן ייצור גבוה של פנילפרופנואידים לעומת שחרורם בשיעור נמוך,

גורם לכך שחומרים אלה נאגרים בצמח בכמויות גדולות. עובדה זו עשויה לרמז כי תפקידם הביולוגי של

IX הפנילפרופנואדים בשומר, קשור דווקא בהצטברותם באברי הצמח, כנראה לצורך הגנה, ולא בשחרורם לצורך

משיכת חרקים למטרות האבקה או להפצת יחידות התפוצה. לכן, ניתן להניח כי לכמוטיפ העשיר ב-t-anethole

יהיה יתרון בשמירה על הפנילפרופנואידים באזורי גידול בעלי טמפרטורה גבוהה, שכן שיעור הנידוף שלו נמוך

פי חמש בהשוואה לזה של estragole.

פיתוח המערכת לבדיקת פעילות של OMT) anol / chavicol O-methyltransferase) אפשרה בחינת

הקשר בין צבירת הפנילפרופנואידים לבין פוטנציאל הייצור שלהם. התוצאות מצביעות על זיקה בין רמת

הפעילות של האנזים לבין צבירת estragole או t-anethole. לדוגמה: בעלים צעירים, בהם תכולת

הפנילפרופנואידים גבוהה, גם פעילות O-methyltransferases גבוהה יותר בהשוואה לעלים בוגרים. במהלך

הבשלת הפרי, הפעילות של O-methyltransferases עולה עד לשלב של פרי שעוותי, בדומה לעלייה

בתכולת הפנילפרופנואידים, ומשלב זה הפעילות יורדת בחדות. כמו כן, נמצא קשר בין תכולת השמן האתרי

בפרי לבין הנפח הכללי של ביבי השמן האתרי, העולה ברציפות משלב של ניצן (0.01mm3) עד לשלב של פרי

שעוותי (mm3 0.33). מכאן ניתן להסיק כי תכולת t-anethole ו- estragole בפירות תלויה בנפח ביבי השמן

וברמת הפעילות האנזימתית הקשורה בייצורם מחד, ומאידך בשיעור פליטתם.

נמצא כי למרות ההבדל בהרכב הפנילפרופנואידים כל האוכלוסיות והכמוטיפים של השומר, שנבדקו בעבודה זו,

מראים פעילות דומה של O-methyltransferase כלפי anol וגם כלפי chavicol, ללא קשר לכמוטיפ

הנבדק. לכן ניתן להסיק כי הגורם להבדל בין הכמוטיפים בייצור estragole או t-anethole אינו מצוי בשלב

הסופי (שלב המתילציה) של המסלול הביוסינתטי. כמו כן, לא נמצאה פעילות משמעותית של איזומראזות

העשויה להצביע על השלב במסלול הביוסינתטי בו נקבע ההבדל בין הכמוטיפים. ניתן אפוא להניח כי הגורם

להבדל בין הכמוטיפים ברמה הביוכימית מצוי בשלב מוקדם יותר במסלול הביוסינתטי לייצור t-anethole

ו-estragole.

על סמך הכלאות בין הכמוטיפים בדור F2 , F1 וההכלאות החוזרות עם כל אחד משני ההורים ניתן להסיק כי

התכונה לייצור t-anethole ו- estragole בשומר מקודדת על ידי גן עיקרי אחד בעל שני אללים (אנתולי

ואסטרגולי) בעלי אפקט תוספתי ואפקט דומיננטי של האלל האסטרגולי. מכאן ניתן להסיק כי תכולת

הפנילפרופנואידים בנצר קשורה בגורמים גנטיים ואינה נובעת מתנאים אקו-פיזיקלים כמו: משקעים שנתיים

X וטמפרטורה שנתית ממוצעת. כמו כן, ניתן להניח כי באוכלוסיות מעורבות עם שני הכמוטיפים יהיו יותר פרטים

בעלי תכולת estragole הגבוהה מזו של t-anethole.

השוואת פוטנציאל ההפריה כתוצאה מהכלאות בין ובתוך האוכלוסיות, מראות כי זרימת גנים אפשרית בקרב כל

האוכלוסיות כולל בין האוכלוסיות הישראליות והאוכלוסיות הזרות. עם זאת, לצמחי שומר מכל ששת

האוכלוסיות שנבדקו, פוטנציאל גבוה להאבקה עצמית, הנובע מסבילות עצמית ברמה גבוהה, ומפריחה בו זמנית

של פרחים בשלב זכרי ונקבי באותו צמח המאפשרת האבקת שכנים. סבירות גבוהה להאבקה עצמית מאפשרת

לשומר יכולת תפוצה רחבה, תוך חדירה והתבססות במגוון בתי גידול מחד, ומאידך עשויה להסביר את קיומן

ושימורן של אוכלוסיות בעלות הרכב כימי שונה, גם אם הן מצויות במרחק קטן זו מזו.

לסיכום: הממצאים בעבודה זו תורמים להבנת הגורמים להבדלים בין הכמוטיפים שונים, להבנת המכניזם של

מעבר הגנים בין ובתוך אוכלוסיות שומר והאופן בו נוצרים ונשמרים הכמוטיפים השונים וכן עשויים לתרום

לשיפור הרכב החומרים בטיפוח זני שומר תרבותיים.

XI

פרק א': מבוא

א.1 תיאור הצמח

שומר1 פשוט (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare) השייך למשפחת הסוככיים – Apiaceae

(Umbelliferae), הינו עשב רב שנתי, המיקריפטופיט, המעוצה בבסיסו וגובהו 0.7-3.0 מטר. בדומה לרב

שנתיים אחרים בסוככיים, ההתפתחות הראשונית של נבט השומר איטית. בשלב הראשון נוצרת שושנת עלים

ומאוחר יותר מופיעים עמודים נושאי תפרחות (Hornok, 1992 ;בר-דרומא, 1998). העלים גזורים מנוצים

2-4 פעמים לאונות נימיות. שושנת העלים המתפתחת בחורף מתייבשת במהלך הקיץ.

עמוד התפרחות המרכזי הנושא את הסוכך הראשון, יוצר את הפרחים הראשונים וחונט את הפירות הראשונים

(Hornok, 1992 ;בר-דרומא, 1998). כל עמודי התפרחות מסתעפים לענפים צדדיים נושאי סוככים שמספרם

אינו קבוע ותלוי בצפיפות הצמחים, בתנאי הגידול ובכמות המים העומדת לרשות הצמח (בר דרומא, 1998).

משך המחזור הוגטטיבי בשומר פשוט נמשך 30-35 שבועות בשנה ראשונה ו- -25 20 שבועות בשנים הבאות

(Desmarest, 1978 ). פריחת השומר נמשכת ממאי עד נובמבר ותלויה בגורמים גנטיים ובתנאי בית הגידול

(דימינשטיין, Zohary, 1972; 2000). המאביקים העיקריים של שומר פשוט הם דבורים, אולם הצוף הגלוי

מושך גם חרקים אחרים בעלי לשון קצרה (Crane and Walker, 1984). פרי השומר הינו דו זרעון

(diachene), המתפרק בעת ההבשלה לשתי פרודות (mericarp), כל אחת בעלת זרע אחד, והן מהוות את

יחידת התפוצה של הצמח. הדו זרעון הבשל צבעו חום וצורתו אליפטית, אורכו 4-6 מילימטר. הפרודות בנות

חמש צלעות בולטות (Zohary, 1972).

א.2 שימושים של שומר פשוט

שומר פשוט ידוע כבר בתקופות קדומות כצמח רפואה ותבלין וכל חלקי הנצר נאכלים. הפירות משמשים להכנת

תה, העלים הצעירים, ובזן F. vulgare var azoricum גם צוואר השורש, משמשים כירק למאכל ואילו גרגרי

האבקה משמשת כתבלין יקר מאוד הנקרא: spice of the angel.

1 שֻמָר – בכתב מלא - שומר

1 פירות השומר והשמן האתרי המופק מהם משמשים כתרופה נגד הפרעות בעיכול כמו גזים, נפיחות וכאבי בטן

בתינוקות, והפרעות בדרכי הנשימה הנגרמות על ידי נזלת, שיעול או ברונכיט (Morton, 1962

.( Boulos, 1983; Duke and Ayensu, 1985; Wichtl, 1994; Albuquerque et al., 1995

השומר נחשב כצמח בעל פעילות אסטרוגנית ומאמינים שלחליטה של פירות שומר תכונות לעורר הפרשת חלב

והשפעה מקלה על בעיות הקשורות למחזור הנשי (Albert-Puleo, 1980) .

השמן האתרי של השומר משמש גם בתעשיית הקוסמטיקה בייצור בשמים וסבונים, ובתעשיית המזון בייצור

משקאות אלכוהולים כמו משקה היווני Ouzo, ליקרים ודברי מאפה ומתיקה (Tanira et al., 1996 ). t-anethole המופק משומר, משמש בארה"ב כתבלין, וכתוסף מזון בנפח שנתי של 17100 קילו

.(Newberne et al., 1999)

א.3. אברי הפרשת השמן האתרי בשומר פשוט

השומר עשיר בשמן אתרי, המצטבר בכל אברי הצמח בתוך ביבי שמן, אך ריכוזו הגדול ביותר מצוי בפירות

בשלים טריים (Guillen and Manzanos, 1996; Gupta et al., 1995) (2-6% dw). ביבי השמן ( oil ducts) הינם מבנים צינוריים מאורכים המכילים חומרים ליפופיליים והם מצויים במשפחות כמו: אורניים,

אלוניים, פרעיים, אלתיים, מורכבים וסוככיים. הביבים יכולים להופיע כמופע בודד כמו באיקליפטוס או שהם

מחוברים ברשת כמו בסוככיים רבים (Fahn, 1979; Svoboda et al., 2000). במחקר על תכולת השמן

האתרי ומיקום ביבי השמן בשומר פשוט, פטרוזיליה מסולסלת ושבת ריחני, נמצאו בכל האיברים ביבים ממוצא

סכיזוגני (Robeva et al., 1988). גם ברוש עקוד (Conium maculatum) (סוככיים) נמצאו ביבי השמן

בכל אברי הצמח, והם מהווים את מקום האגירה ו/או הייצור של האלקלואידים והשמן האתרי בצמח

(Corsi and Biasci, 1998). בפטרוזיליה מסולסלת (Petroselinum crispum) נמצא כי ביבי השמן מכילים

פורנוקומרינים בריכוז גבוה המסונתזים, ככל הנראה, בתאי האפיתל של הביב (Hahlbrock, 1992

Reinold and Hahlbrock, 1997 ). על בסיס תצפיות במבנה ביבי השמן בכרפס ריחני ( Apium graveolens) טוען (Bosabalidis (1996 כי השמן האתרי מסונתז בלויקופלסטים של תאי האפיתל ומועבר

דרך הרשת האנדופלסמטית לדפנות המצפים את החלל ומשם לחלל הביב.

בשורשים של צמחים ממשפחת הסוככיים תוארו שני סוגים של ביבי שמן אתרי ממוצא סכיזוגני: א. ביבים

ראשוניים בעלי צורה משולשת הממוקמים בין תאי הפריציקל של שורשי השתילים. ב. ביבים שניוניים

2 המתפתחים על יד הקמביום במהלך ההתעבות המשנית, כשקוטר השורשים גדל והביבים הראשוניים נדחקים

(Stahl-Biskup and Wichtmann, 1991). ביחידות התפוצה של הסוככיים נקראים ביבי השמן: vittae

(וביחיד vitta). בכל פרודה (mericarp) ישנם שישה ביבי שמן הממוקמים בקליפת הפרי (Fahn, 1979).

זהו גם האתר לסינתזה ואגירה של חומרים שניוניים בעלי פעילות ביולוגית כמו פלבנואידים וקומרינים

.(Corsi and Biasci, 1998)

באמצעות שימוש בהדמיית תהודה מגנטית (MRI) הצליחו לאתר את מיקום צבירת השמן האתרי בפירות של

קימל ( Carum copticum) (סוככיים). נמצא שהמונוטרפן thymol המהווה את המרכיב העיקרי בשמן

הקימל, מצוי בביבים שבדופן הפרי (Gersbach and Reddy, 2002). בשומר מתוק נעשה שימוש באותה

שיטה לאיתור t-anethole בפירות, ונמצא כי הוא מרוכז בביבי השמן (Sarafis et al., 1990).

א.4 מרכיבי השמן האתרי בשומר פשוט

המרכיבים הנדיפים העיקריים של השמן האתרי של שומר פשוט, האחראים לארומה ולטעם הייחודי, הינם

הפנילפרופאנואידים methyl-chavicol) estragole) ו- t-anethole, האחראים לטעם המתקתק. המונוטרפן limonene, והמונוטרפן קטון fenchone האחראי לגוון המריר בארומה ומונוטרפים נלווים נוספים (איור א.1)

(Karlsen et al., 1969). הפירות מכילים גם 28% - 9 של שמנים לא נדיפים המורכבים בעיקר מ-

oleic acid ,linoleic acid , ו- Gupta et al., 1995) petrosenilic acid). כמו כן מצויים בפירות גם

סוכרים, חלבונים, פלבנואידים, ויטמינים ומינרלים (Leung and Foster, 1996). לעומת זאת, המרכיב

העיקרי בשורשי שומר פשוט הינו הפנילפרופנואיד - dillapiole (90%) (איור א.Keller, 1992 ) (1

.(Muckenstrum et al., 1997

3 Phenylpropanoids

CH2 CH3

H C H C 3 O 3 O estragole t - anethole

CH O 3 O CH2 O CH2 O CH2 O O O O O O CH O 3 CH3 CH3 CH3 myristicin apiole dillapiole

CH3

O CH2

H C 3 O O H3C elemicin

Terpens and Terpenoids

CH3 CH3 CH3 CH CH3 3 O

CH H3C 3 CH H3C 3 H3C CH3 H3C CH2 H3C CH3

α-pinene fenchone α- terpinolene limonene α-phellandrene

איור א.1: המרכיבים העיקריים של השמן האתרי של שומר פשוט

4

א.5 טקסונומיה, תפוצת המין בעולם ובארץ

השם Foeniculum נגזר מהשם הלטיני ‘foenum ' = שחת/מספוא וקשור כנראה לשימוש שעשו בו הרומאים

כמזון לבהמות (Kraus and Hammerschmidt, 1980). על פי התכונות המורפולוגיות של הצמח והרכב

השמן האתרי בפירות, סווג (Hegi (1931 את המין שומר פשוט לשני תת- מינים:

F. vulgare Mill ssp. piperitum (דל קרנות) אינו מתורבת, וגדל בר באזור הים תיכוני. בעל עלים מנוצים

קצרים ונוקשים סוככים צרים נושאי פירות קטנים נטולי ניחוח אניס (Hunault and Manoir, 1992). תת

מין זה אינו מכיל t-anethole או estragole וגם לא fenchone והמרכיבים העיקריים של השמן האתרי המופק

מפירותיו הם המונוטרפנים limonene ו – piperitenone-oxide=) rotundifolone) המקנה לו את טעמו

המריר. (Badoc et al., 1994; Muckenstrum et al., 1997; Krüger and Hammer, 1999). על פי

(Zohary (1972 זיהוי תת מין זה בארץ מקורו בטעות.

F. vulgare Mill ssp. capillaceum המאופיין על ידי עלים מנוצים לאונות ארוכות ורכות, הסוככים רחבים

ופירות בעלי ניחוח של אניס, בעל שלושה וריאנטים:

F. vulgare var. azoricum (Miller) Thell. (Italian fennel) .1 הינו צמח חד שנתי המגודל באירופה

ובארצות הברית ובו התעבות צבר העלים התחתונים יוצרת בולבוס המשמש כירק (בר דרומא, 1998).

F. vulgare var. dulce (Miller) Thell. (sweet fennel) .2 צמח חד שנתי המגודל בעיקר בצרפת,

איטליה ובספרד בעבור פריו ולצורך הפקת Hunault and Manoir, 1992) .t-anethole).

F. vulgare var. vulgare (Miller) Thell. .3 הגדל בבר, מוצאו מאזור הים התיכון ומדרום אירופה עם

חדירה אירנו-טוראנית (Zohary, 1972). זן זה גדל בתרבות בארצות מזרח אסיה (הודו, סין יפן) ובמרכז

ודרום אירופה (Wichtl, 1994; Leung and Foster, 1996).

בישראל F. vulgare var. vulgare אינו מגודל כצמח חקלאי אך גדל בבר במגוון רחב של בתי גידול, מהר

הנגב המרכזי (100 מ"מ גשם לשנה) עד לאזורים צפוניים של הר מירון והר דוב (1200 מ"מ גשם). מחוף הים

התיכון במערב ועד ים המלח במזרח. נפוץ בערוצים, בתי גידול לחים, בתות שדות בור ואזורים מופרעים בצידי

דרכים. (Barazani et al., 1999, פינברון-דותן ודנין, 1991).

במחקרים שבוצעו במדינות שונות, הן בצמחי בר של שומר פשוט בצרפת ובספרד

5 (Guillen and Manzanos, 1994; Muckenstrum et al., 1997) והן בצמחים שגודלו בתרבות

,( Ravid et al., 1983; Marotti et al., 1994; Bernath et al., 1996; Pank et al., 2003 )

אובחנה וריאביליות בריכוז היחסי של מרכיבי השמן האתרי שהופק מאיברים וגטטיביים ומפירות שומר.

לאחרונה, נבדקה השונות הכימית והמורפולוגית ב- 11 אוכלוסיות שומר הגדלות בר באזורים שונים בישראל,

לאורך מפל משקעים מכ- 1000 מ"מ גשם בצפון הארץ, ועד ל- 125 מ"מ גשם בדרום

(Barazani et al., 1999). השוואה שנערכה בין ההרכב הכימי של האולאורזין באוכלוסיות בר להרכב הכימי

של נציגיהן שגודלו בתנאים אחידים בנווה יער, מצביעה על קיום אוכלוסיות השומרות על הרכבן הכימי גם

בתנאי תרבות. בהתאם לכך הוגדרו שני כמוטיפים שונים הנבדלים בעיקר ביחס estragole/t-anethole:

כמוטיפ אנתולי המאפיין את אוכלוסיית צפון הנגב (באר חיל) וחוף הים (לוחמי הגטאות) וכמוטיפ אסטרגולי

המאפיין את אוכלוסיית הר דוב. לעומת זאת, באוכלוסיות בר אחרות (מעלות תרשיחה, הר מירון, רמת השרון),

חל שינוי בהרכב הכימי כתוצאה מגידולם בתנאי תרבות (Barazani et al., 1999, 2002).

השוני בהרכב הכימי בין הכמוטיפים נבדק באמצעות מצוי יחידות התפוצה הבשלות ולא היה ידוע אם וכיצד הוא

מתבטא גם באברי הצמח הוגטטיביים. היות ולכל אברי הצמח ריח ייחודי נבדק גם הקשר בין תכולת התרכובות

הארומטיות לבין פליטתן מאברי צמח שלמים.

לפיכך כללו מטרות העבודה:

1. השוואת ההרכב ותכולת המרכיבים הנדיפים בחלקי צמח שונים במהלך האונטוגנזה בשני הכמוטיפים

השונים, שגודלו בתנאים דומים, ובחינת הקשר בין תכולת השמן האתרי הנצברת, לבין התפתחות ביבי

השמן (vittae), הרכב הנדיפים באוויר בסביבת הצמח ופוטנציאל השפעתו הפיטוטוקסית של השמן האתרי.

2. איתור השלב(ים) במסלול הביוסינתטי לייצור t-anethole ו-estragole הגורם להבדל בין הכמוטיפים

השונים ובחינת פוטנציאל הייצור שלהם באברים השונים של הצמח במהלך האונטוגנזה.

3. תיאור מערכת הרבייה ומדידת שעור הפוריות כפונקציה של האבקה בין ובתוך אוכלוסיות שומר והשוואה

לאוכלוסיות המרוחקות גיאוגרפית מחוץ לישראל.

4. קביעת הבסיס הגנטי להבדל הכימי בין הכמוטיפים.

6

פרק ב': חומרים ושיטות - כללי

ב.1. אוכלוסיית המחקר

לצורך המחקר נבחרו אוכלוסיות של Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare בעלות הרכב שונה של -

estragole/anethole בשמן האתרי שלהם. ארבע אוכלוסיות ממקומות שונים בישראל ולצורך השוואה גם

שתי אוכלוסיות הממוקמות צפונית ודרומית מחוץ לישראל: אוכלוסיה מהר קתרינה, סיני (מצרים) ואוכלוסיה

ממרסין (טורקיה) (טבלה ב.Barazani et al., 1999; Gross et al., 2002) (1). שתיים מהאוכלוסיות

הישראליות: אוכלוסיית הר דוב (MD) שפירותיה עשירים ב-estragole ואוכלוסיית באר חיל (BH) העשירה

ב-t-anethole (טבלה ב.1) הוגדרו ככמוטיפים, לאחר שנמצא כי נציגיהן שומרים על הרכב המונוטרפנים

והפנילפרופנואידים שבפירותיהם גם בתנאי תרבות (Barazani et al., 2002).

פירות שנאספו מ10- צמחים מכל אחת מששת אוכלוסיות הבר הללו, נזרעו במגשי "חישתיל" בדצמבר 2000

בתערובת של ורמיקוליט וכבול ביחס 1:1 והונבטו בבית רשת. עם הצצת הפסיגים, כעבור 2-3 שבועות,

הועברו לעציצים קטנים בקוטר 10 ס"מ , וכעבור חודש נשתלו 20 שתילים מכל אוכלוסיה בשדה, במרכז

המחקר החקלאי בנווה יער, בערוגות במרווחים של 0.8 מטר. במהלך החודש הראשון השתילים הושקו

פעמיים בשבוע ובהמשך אחת לשבוע.

טבלה ב.1: אוכלוסיות שנבחרו לצורך המחקר, מקורן הגיאוגרפי והפנילפרופנואיד הדומיננטי המצוי בשמן האתרי של פירותיהם

Populations Country Locality 0N 0E Altitude dominant originating (m) phenylpropanoids Mount Dov (MD) Hermon - Northern 33019' 35043' 1200 estragole1 Mount Meron (MM) Northern Galilee 33000' 35025' 1000 estragole1 Ma’alot-Tarshiha Israel Western Galilee 33005' 35017' 550 estragole & t-anethole1 (MT) Beer Hail (BH) Negev desert 30059' 34045' 440 t-anethole1 Mercin (T) Turkey South-Eastern Taurus Mts. 36030' 34020' 50 estragole2 G’abel Katharina Egypt High mountains of Sinai 28035' 34001' 1600 t-anethole2 (S)

בהתאם לממצאים בעבודה זו ו- Barazani, et al., 1999 1 בהתאם לממצאים בעבודה זו 2

7 ב.2. זיהוי תרכובות נדיפות

בעבודה זו נעשה שימוש בשלוש שיטות לאיסוף התרכובות הנדיפות:

א. מיצוי תרכובות המצויות באברי צמח שונים : החומר הצמחי מוצה בממס אורגני – הקסאן ביחס של 10

מ"ל לגר' חומר טרי. הרקמות שנבדקו נשקלו, נכתשו ומוצו בהקסאן למשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר.

המיצוי עבר סינון בשכבת דקה של צמר זכוכית ו- sodium sulfate, להרחקת עודפי מים. לכל דגימה של

עלים הוכנסו 1 מ"ל סטנדרט (ethylmyristate) מתוך ריכוז של ug/ml 10 ואילו לשורשים והפסיגים

הוכנסו 0.5 מ"ל סטנדארט. המיצוי עבר נידוף בחנקן עד ל- 1 מ"ל והוזרק ללא מיהול ל-GC-MS. בפירות

ובפרחים נעשתה הבדיקה לאחר מיהול של Barazani et al., 1999) 1:5).

ב. הפקת שמן אתרי על ידי זיקוק מים : באמצעות מתקן "קליוונג'ר (Clevenger apparatus)

(Ravid et al., 1997). הפירות הוכנסו לגולת זכוכית עם מים, ביחס 7-13 גר' חומר טרי ל300- מ"ל

מים. הגולה הונחה על פלטת חימום וחוברה למעבה דרך מלכודת שאפשרה איסוף שמן אתרי. לאחר זיקוק

במשך שעה וחצי, נרשם נפח השמן ונאסף במבחנות זכוכית מסומנות שנשמרו בטמפ' של C˚4 בקופסאות

אטומות לאור. חישוב תכולת השמן האתרי נעשה לגרם חומר טרי ולפרודה אחת מהדו-זירעון.

הפקת שמן אתרי מעלים של שושנת העלים נעשתה ביחס של 200 גרם חומר טרי ל- 600 מ"ל מים וחישוב

תכולת השמן נעשתה לגרם חומר טרי.

ג. איסוף תרכובות נדיפות הנפלטות לאוויר החופשי : ההרכב הכימי של האוויר בסביבת הצמח החי, נבדק

בשיטת Raguso and Pichersky, 1995) dynamic headspace analysis), בחלקים וגטטיביים

ובפירות. אברי הצמח שנבדקו בכל כמוטיפ בנפרד, הוכנסו לארלנמאייר זכוכית בנפח של 1 ליטר בעל פתח

לצינור יניקה (איור ב.1). פתח הארלנמאייר נחסם והנדיפים שהשתחררו מאברי הצמח שבתוכו, נאספו

בעזרת משאבת ואקום השואבת את האוויר במשך 24 שעות, דרך קולונה המכילה 0.2 גרם חומר סופח:

Waters, Milford, MA) Porapak Q 80/100 polydivinylbenzene filter) . נפח האוויר העובר

דרך הקולונה באמצעות המשאבה הינו 2480 ליטר ליממה. מיצוי הנדיפים שנקלטו בקולונה נעשה על ידי

10 מ"ל הקסאן. ריכוז המיצויים נעשה על ידי נידוף בחנקן במכשיר הנידוף: (VAP II (Zymark, USA

עד ל- 0.5 מ”ל. זיהוי הנדיפים נעשה על ידי הזרקת 1µl מהמיצוי המרוכז למכשיר ה- GC- MS.

8

A Porapak Q B filters

צמח

משאבת Porapak Q filters איור ב.1. דגימת חומרים נידיפים בשיטת dynamic headspace A. ציור סכמטי החיצים מראים את כיוון זרימת האוויר. B צילום יישום השיטה בשתילי שומר מכמוטיפים בבאר חיל והר דוב

אנליזת הנדיפים: נעשתה במכשיר HP-GCD. גז כרומטוגרף ספקטרומטר מסה ממוחשב מסוג GCD plus

דגם G-1800B המצויד בגלאי מטיפוס Electron Ionization של חברת Hewlett Packard.עם אנרגיית

אלקטרונים של eV 70 . נפח של 1µl ממיצוי ההקסאן הוזרק לקולונת סיליקה קפילרית HP-5 בקוטר פנימי

של 0.25 מ"מ ובאורך של 30 מ'. הליום ששימש כגז נשא הוזרם בקצב של 1ml/min. טמפרטורת ההזרקה-

2500C בהזרקת splitless. העמודה חוממה ל– 700C והועלתה ל- 2000C בקצב של – C 40 בדקה.

טמפרטורת הגלאי הייתה - 2800C. רישום המסות נעשה בטווח של m/z 45-450. זמן יציאת הממס 3.5 דקות.

זיהוי הנדיפים העיקריים נעשה על ידי השוואת ספקטרום המסות וזמן יציאה מהקולונה (retention time)

לאלו של דוגמאות ידועות ודוגמאות מספריית Wiley של מכשיר GC-MS ומספרות (Adams, 1995).

האנליזה הכמותית נעשתה על ידי שימוש בסטנדארט פנימי µg) ethylmyristate 10-100), על ידי השוואת

השטח מתחת לשיא (pick) בכרומטוגרמה עבור חומר נתון, לשטח מתחת לשיא של הסטנרדארט שבדגימה.

הרכב השמן האתרי נקבע באותה דרך, לאחר מיהול של 20µl מהשמן אתרי שהופק, ב-petroleum 1ml

.ether

ב.3. ניתוח סטטיסטי

עיבוד הנתונים נעשה בעזרת תוכנת SPSS, Inc., Chicago, IL) SPSS) ברמת מובהקות של α = 0.05.

כדי לבדוק שוני של גורם אחד על סמך חזרות בקבוצות שונות, בוצע מבחן שונות חד כיווני ומבחן

Bonferroni כדי להגדיר קבוצות ייחודיות. השוואת שונויות וממוצעים של שני פרמטרים כמשתנים בלתי

תלויים על משתנה אחד נעשה על ידי מבחן ANOVA דו כיווני.

9 פרק ג': הרכב ותכולת האולאורזין באברי הצמח במהלך האונטוגנזה

מגוון עבודות רחב שנעשו באוכלוסיות שומר מאזורים גיאוגרפיים שונים, ושנסרקו על ידי

(Pank et al., (2003, מראות כי תכולת המרכיבים העיקריים בפירות משתנה בטווח רחב ונעה בין 0-89%

fenchone 0.4-32% ,t-anethole וestragole 2-86%-. בכל העבודות הללו לא נמצאה אוכלוסיה החסרה

.(Pank et al., 2003) estragole

באוכלוסיות של F. vulgare var vulgare ממקורות שונים שגודלו בתרבות בהונגריה במשך שתי עונות,

נמצא כי צמחים בשנתם הראשונה היו נמוכים יותר ותכולת השמן שלהם הייתה פחותה מזו של צמחים בני

שנתיים. יחד עם זאת התכולה של המרכיבים העיקריים (estragole ,t-anethole ו-limonene) נשארה יציבה

.(Bernath et al., 1996)

השמן האתרי מצטבר בכל חלקי הצמח, אך תכולתו הגדולה ביותר מצויה בפירות בשלים טריים (dw 2-6%)

(Guillen and Manzanos, 1996; Gupta et al., 1995). לעומתם, בדיקת הרכב השמן האתרי בחלקים

שונים בשומר פשוט שנאסף במקומות שונים באיטליה, מראה כי תכולת השמן האתרי הגבוהה ביותר, מצויה

בניצני הפרחים לקראת הפריחה (Bellomaria et al., 1999).

עבודות שונות שנעשו בוריאנטים שונים בשומר פשוט הראו על הבדלים בתכולה ובהרכב השמן האתרי בשלבי

התפתחות הפרי, אך גם בנושא זה לא קיימת אחידות בממצאים (Betts, 1968; Karlsen et al.,1969

. (Ravid et al., 1983; Cavaleiro et al., 1993; Marotti et al.,1993,1994; Bernath, et al., 1999

התוצאות המנוגדות נובעות כנראה מתנאי בתי גידול שונים. אומנם, דווח כי להשקיה של שומר פשוט אין

השפעה משמעותית על תכולת ה- t-anethole בשמן האתרי (Buntain and Chung, 1994), אבל הוספת

חנקן ופוספאט גרמה לעליה בתכולת השמן האתרי ולשינויים ביחס הכמותי של fenchone ו- t-anethole

בשמן האתרי בשומר הגדל בתרבות. (בתכולת ה- t-anethole הייתה ירידה מ- 81% ל- 57% ותכולת

ה- fenchone עלתה מ11- ל- % Khan et al., 1992) 34).

השינויים בתכולת ובהרכב השמן האתרי במהלך האונטוגנזה נחקרו גם בצמחי שומר שהורבו באמצעות עוברים

סומטיים, שפותחו מתרבית רקמה. בתרבית הרקמה ובעוברים הסומטיים לא נמצא שמן אתרי, אך מעקב אחר

התפתחות העוברים מלמד, שהמונוטרפנים נוצרים כבר בתחילת האונטוגנזה, לפני הווצרות הפנילפרופנואידים,

ושתכולת הפנילפרופנואידים עולה עם ההתפתחות והם מצטברים בעיקר בפרי (Miura et al.,1986).

10 בכל העבודות שהוזכרו נבדק הרכב החומרים הנדיפים בשמן האתרי או באולאורזין המופק מרקמות שונות.

אולם לא נבדקה השאלה מי מאותם החומרים אכן משתחררים לאטמוספרה כשהרקמות הן שלמות. נדיפים

המשתחררים לאטמוספרה עשויים להיות מאובחנים ממרחק על ידי אורגניזמים אחרים ויכולים לגרום

למשיכתם או דחיתם על ידי הצמח. זיהוי וכימות יחסי של נדיפים אלה עשוי לספק לחרק הקולט אותו, מידע

ספציפי על הזהות והמצב הפיזיולוגי של הצמח המשחרר (Kevan and Baker, 1983; Syed et al., 2003).

נידוף תרכובות מצמחים, או שטיפתן משאריות צמחים בקרקע על ידי גשם, או פירוקן על ידי מיקרואורגניזמים,

עשויים לגרום להצטברות חומרים פיטוטוקסים ולשמש אמצעי למניעת תחרות עם צמחים אחרים

.(Muller et al., 1964; Friedman et al., 1977; Friedman and Waller, 1983; Kohli et al., 2001)

חומרים אללוכימיים יכולים להשפיע ישירות על הצמחים או בעקיפין, על ידי השפעתם על אוכלוסיית המזיקים או

המיקרואורגניזמים (בעלי חשיבות למחזור חומרים או הפתוגנים לצמחים), או דרך השפעתם על הרכב הקרקע

דרך עליה בקישור יוני או הפרעה בקליטת נוטריאנטים ( Inderjit, 1998; Inderjit and Weiner, 2000

.(Vokou et al., .2002

המידע לגבי השפעת שמן אתרי של שומר על צמחים מועט. (Tworkoski (2002 בדק את השפעתם של 25

סוגי שמנים על דסקיות מעלים של שינן רפואי (Taraxacum officinale) והראה כי, גם בריכוז של v/v 2%

לשמן אתרי שהופק משומר לא הייתה פעילות הרביצידית. עם זאת, תרכובות פנוליות ידועות כבעלות תכונות

פיטוטוקסיות הגורמות לעיכוב נביטה של צמחים (Gershenzon, 1984; Inderjit, 1996). שימוש בעלים

מרוסקים ובשמן אתרי נקי של בת קורנית פשוטה (Thymus vulgaris) לבדיקת עיכוב נביטה עצמי ושל זרעי

עוקצר (Brachypodium phoenicoides) (דגניים) הראה כי, כמוטיפים בעלי תרכובות פנוליות, מעכבים

נביטה יותר מכמוטיפים ללא פנולים (Tarayre et al., 1995). תנאים של מחסור בנוטריאנטים כמו: בחנקן,

פוספאט,אשלגן וגופרית, גורמת לעליה בריכוז של תרכובות פנוליות. לצבירה של פנולים בכמות גדולה בתנאי

מחסור יש יתרון אדפטיבי מאחר ותרכובות אלה רעילות להרביבורים ומזיקים מחד, וגורמים לעיכוב גדילה

ונביטה של צמחים אחרים ונבטים עצמיים מאידך (Gershenzon, 1984).

צימוח שושנת העלים בחורף והתייבשותה לקראת קיץ ופיזור כמות גבוהה מאוד של יחידות תפוצה בקרבת

הצמח, המכילים כמות גבוהה של שמן אתרי, העלתה את ההנחה כי לצמח הבוגר היכולת להשפיע על צפיפות

אוכלוסיית הנבטים בקרבתו, ושיעורה עשוי להיות שונה בכמוטיפים השונים בהרכבם הכימי.

11 מטרות פרק זה כללו

1. השוואת הרכב ותכולה האולאורזין במהלך האונטוגנזה מנבט לצמח בוגר בין שני הכמוטיפים.

2. בדיקת השפעת ההרכב הכימי הפנימי של הצמח על תרכובות המתנדפות מאברי צמח שלמים.

3. בחינת הפוטנציאל הפיטוטוקסי והאוטוטוקסי של הפאזה הגזית של שמן האתרי המופק משני הכמוטיפים.

ג.1. שיטות וחומרים

ג.1.1. אפיון מרכיבי האולאורזין של אוכלוסיות המחקר

אפיון הרכב ותכולת האולאורזין בנציגי ששת אוכלוסיות המחקר, נעשה במיצוי אולאורזין, שהופק מפירות

בשלב שעוותי (עמוד 8). הפירות נאספו מהסוכך הראשוני של 10-15 פרטים מכל אוכלוסיה. כדי לבחון

ולהשוות את השינויים הכמותיים בהרכב הנדיפים, המתרחשים במהלך האונטוגנזה בתוך אברי הצמח ובסביבתו

נבחרו מתוך אוכלוסיות אלה שתי אוכלוסיות ישראליות שהוגדרו ככמוטיפים (Barazani et al., 2002):

אוכלוסיית הר דוב (MD) שפירותיה עשירים ב-estragole ואוכלוסיית באר חיל (BH) העשירה ב- t-anethole (טבלה ב.1). בנבטים ובצמחים בוגרים משני הכמוטיפים אשר גודלו בתנאים דומים, נבדקו אברי

צמח שונים ובמהלך האונטוגנזה.

ג.2.1. ההרכב והתכולה של האולאורזין במהלך האונטוגנזה בשני הכמוטיפים

ג.1.2.1. הרכב ותכולה בצמח הצעיר (נבטים):

פירות שנאספו מכל כמוטיפ בבית גידולו הטבעי מ- 10 צמחים שונים, שמשו להכנת תערובת זרעים (כפית

זרעים מכל צמח) לכל אחד משני הכמוטיפים. 100 זרעים מכל תערובת, נזרעו בתבניות "חישתיל" (2.5X2.5

ס"מ, בעומק של 0.5 ס"מ) על מצע המכיל כבול וורמיקוליט ביחס של 1:1, וגודלו בחממה. 13 יום לאחר

הזריעה, העתקו הנבטים בעלי זוג פסיגים לעציצים בנפח של 250 מ"ל. העציצים גודלו בחממה ללא דישון,

בתנאי לחות של 60-80% ובטמפ' של 18-250C. הצמחים הושקו ארבע פעמים במשך היום במשך 4-6

דקות. בנבטים אלה נבדק הרכב ותכולת האולאורזין בהתייחס ל:

12 א. בחלקי הנבט הצעיר (22 יום מזריעה או 13 יום מהצצת הפסיגים), נבדקו אברים שונים (איור ג.3,

עמ' 20). הבדיקה נעשתה על דגימות של: 15 צמחים מבאר חיל ו- 23 צמחים מהר דוב. מאחר וכמות

הרקמה בשלב זה נמוכה, בכל כמוטיפ אוחדו למיצוי אחד כל הפרטים שנדגמו באותו איבר.

ב. עם התפתחות העלה בשושנת העלים הראשונית, כחודש מהשתילה, נבדק בכל שתיל הרכב

ותכולת האולאורזין בחמישה עלים בגילאים שונים (בהפרשים של כשישה ימים אחד מהשני).

ג. במהלך התפתחות השורשים. בכמוטיפ הר דוב נבדקו שורשי צמחים בגיל: 22, 47, 132 ימים

מזריעה או 13, 35, 120 מהצצת הפסיגים. בכמוטיפ באר חיל נבדקו שורשי צמחים בגיל: 22,

42 , 132 מזריעה. או 13, 30, 120 ימים מהצצת הפסיגים.

הבדיקות בסעיפים ב ו- ג נערכו בשלוש חזרות כשכל חזרה נלקחה מ4- צמחים שונים מאותו כמוטיפ

שאוחדו למיצוי אחד, סך הכל נבדקו 12 צמחים בכל כמוטיפ.

ג.2.2.1. הרכב ותכולה בצמח הבוגר :

בשני הכמוטיפים נדגמו אברי הצמח בשלבי התפתחות שונים:

א. עלים צעירים ממרכז שושנת העלים - נדגמו בצמחים בני שנה אשר גודלו בשדה ושעדיין לא התפתחו

בהם עמודי תפרחות (ינואר-פברואר).

ב. עלים לאורך עמודי התפרחות – הבדיקה נערכה לפני שלב הפריחה. העלים נקטפו בו זמנית מ- 3 גבהים

לאורך עמוד התפרחת (10-15 ס"מ, 50-60 ס"מ, 100-120 ס"מ) המייצגים שלושה גילאים שונים

(טבלה ג.1).

ג. מקטעי גבעול – נדגמו מקטעים באורך 10 ס"מ באותם עמודי תפרחות ובאותם גבהים.

ד. איברים רפרודוקטיביים - נדגמו פרחים פתוחים ופירות מארבע דרגות התפתחות שונות (איור ג.1).

מכל חלקי הצמח נלקחו דגימות של 1 גר' חומר טרי מאותם צמחים. המדגמים נכתשו, עברו מיצוי בהקסאן

ואנליזה ב- MS-GC לצורך קביעת תכולה והרכב אולאורזין (ראה עמוד 8). הבדיקות נערכו בשלוש

חזרות בכל כמוטיפ, כשבכל חזרה נדגמו 3-4 צמחים שונים (סך הכול נבדקו 9 צמחים מאוכלוסיית באר

חיל ו- 12 צמחים מאוכלוסיית הר דב).

13

טבלה ג.1: תאור העלים שנדגמו בגבהים השונים מצמחים בני שנה משני הכמוטיפים

כמוטיפ הר דוב באר חיל גובה העלה (ס"מ) 11.9±2.1 58.3±6.0 113.3±8.8 15.1±2.9 49.7±6.1 98.3±13.2 אורך העלה (ס"מ) 40.7±5.3 12.7±1.5 6.7±0.9 40.1±5.8 29.3±5.2 2.9 15.2± מבנה העלה מנוצים 3- מנוצים מנוצים פעם אחת מנוצים 3-4 מנוצים שלוש מנוצים פעם 4 פעמים פעמיים עם 3-5 עלעלים. פעמים. פעמים עד פעמיים.

איור ג.1 שלבים בהתפתחות פרי של שומר פשוט. 0.5 פרי צעיר=1, פרי שעוותי = 2, פרי חצי בשל = 3, פרי בשל יבש = 4

שלבי התפתחות 4 3 2 1

גיל (ימים מחנטה) 0-7 8-23 24-40 41>

ג.3.1 מבנה ביבי השמן במהלך התפתחות הפרי

לצורך הכרת מערכת ביבי השמן האתרי בשני הכמוטיפים ובחינת הקשר בין תכולת השמן האתרי הנאגרת בפרי

במהלך התפתחותו לבין נפח ביבי השמן בפרי, נבדקו במיקרוסקופ אור המבנה האנטומי של פרחים ופירות ב4-

שלבי התפתחות: משלב של ניצן צהוב עד להבשלה מלאה של הפירות (במשך 42 יום).

הבדיקה האנטומית נערכה על 4 סוככים מ4- צמחים שונים בכל אחד משני הכמוטיפים. בכל שלב נעשו חתכי

רוחב ידניים בשליש העליון של הפרי. מדידת שטחי החתך הכללי ושטח חתך הביבים נעשתה באמצעות התוכנה

Analysis Image Processing במיקרוסקופ Olympus BX61.

נפח ביב אחד (Voil duct) חושב, על בסיס ההנחה כי לביב צורה הקרובה לשני חרוטים בעלי בסיס משותף, לפי

הנוסחה הבאה:

2 π (1 a) ∗ h ∗ 2 2 = V a 3 oil duct כאשר: h 2 שטח חתך הביב = π 1 a ( 2 ) a= קוטר הביב h = גובה הפרודה (mericarp)

14

אחוז שטח החתך של כלל הביבים בפרודה חושב יחסית לשטח קליפת הפרי של פרודה אחת מהדו-זרעון (איור

ג.B-9). הפקת השמן נעשתה באותם צמחים באמצעות זיקוק במים ב-Clevenger (עמוד 8). הזיקוק בוצע

ביחס של כ- 10 גר' חומר טרי ל- 300 מ"ל מים במשך שעתיים. חישוב תכולת השמן האתרי נעשה ליחידה

אחת מהדו-זרעון.

ג.4.1. ההרכב הכימי ושיעור הפליטה של נדיפים מאברי צמח שלמים

על מנת להעריך את תרומתן של התרכובות הנדיפות מצמח השומר להרכב האוויר בסביבתו, ולבחינת

הפוטנציאל לתפקודם כגורמי משיכה או דחייה של בעלי חיים, נבדק בשני הכמוטיפים, הרכב ושיעור השחרור

של חומרים נדיפים מאברי צמח שלמים לאוויר החופשי בהשוואה לתכולתם במקטע הנדיף של האולאורזין.

אנליזת נדיפים הינה בעייתית, מאחר ומחקרים שונים הוכיחו כי שיטות שונות, המאומצות כיום לזיהוי וכימות

הנדיפים, עשויות להניב תוצאות שונות בהתאם לסוג הנדיפים והבדלי כושר הספיחה של הנדיפים במצעים

השונים (Agelopoulos and Pickett, 1998, Van-Beek, 1999). בשיטת ה-headspace נמדדות

התרכובות הנפלטות מהצמח לסביבתו, ואילו בשיטת המיצוי בממס אורגני נמדדים נדיפים המיוצרים ונצברים

בצמח ואינם בהכרח נפלטים. כמו כן בשיטת המיצוי נכתשים אברי הצמח וחלק מהחומרים מתנדף ובשיטת

ה-headspace נבדקים המרכיבים הכימיים המשתחררים מאיבר שלם. מיצוי הצמח או חלקים ממנו מאפשר

זיהוי ודיגום מהיר ונוח אך אינו מבחין בהרכב הנדיפים המשתחררים מהצמח השלם (Flament et al., 1993).

ההרכב הכימי של האוויר החופשי בסביבת הצמח נבדק בשיטת dynamic headspace analysis (עמוד 8).

אברי צמח על קרקעיים שנבדקו משני הכמוטיפים (באר חיל והר דוב): א. עלים - עלים בלתי מנותקים נבדקו

בצמחי שומר צעירים שגודלו בעציצים במשך 4 חודשים. מכל כמוטיפ נבדקו 3 צמחים שונים המכילים 5-7

עלים כל אחד. ב. פרחים ופירות בשלב ירוק שעוותי - נבדקו 4 צמחים מכל כמוטיפ. בכל בדיקה הוכנסו

לארנמאייר 7-10 ענפים נושאי סוכך אחד הנושא פרחים או פירות. מכל איבר שנבדק, נלקחה גם דגימה של 1

ג' רקמה שעברה מיצוי בהקסאן למשך שעתיים וחצי לשם השוואה בין הרכב הנדיפים באוויר שבסביבת הצמח

לבין תכולתם בצמח.

15

ג.5.1. הפוטנציאל הפיטוטוקסי והאוטוטוקסי של השמן האתרי המופק משני

הכמוטיפים

כדי להעריך את ההשפעה הפיטוטוקסית של הפאזה הגזית המשתחררת משמן אתרי המופק משני הכמוטיפים של

השומר, נבדקה השפעת השמן האתרי על הנביטה והתפתחות השורשונים הן של זרעי חיטה תרבותית והן של

פירות שומר פשוט משני הכמוטיפים. עשרים זרעי חיטה תרבותית (זן "גליל") הונחו בתחתית בקבוק

סינטילציה בנפח 25 מ"ל על גבי 3 שכבות של נייר סינון " ווטמן" 1 בקוטר 2.5 ס"מ ובתוספת של 1.5 מ"ל

מים. נייר סינון שהודבק בצד הפנימי של מכסה הבקבוק, הוספג בשמן אתרי שהופק מפירות שומר משני

הכמוטיפים בריכוזים שונים (nl/ml 400 ,200 ,80 ,40 ,20 ,0) כך שמרכיבי השמן האתרי מתנדפים מנייר

הסינון לתוך חלל הבקבוק. הזרעים נחשפו לפאזה הגזית של השמנים השונים למשך 48 שעות בטמפרטורה של

C˚28 בחושך. בכל טיפול נערכו 4 חזרות.

כדי לבחון אם ההשפעה הפיטוטוקסית נובעת משני המרכיבים העיקריים בשמן האתרי של הכמוטיפים, נבדקה

באותה דרך גם ההשפעה על הנביטה של תרכובות מבודדות של t-anethole או Sigma) estragole).

לשם השוואה נחשפו זרעי החיטה בדרך דומה גם לשמן אתרי שהופק מעשב לימון (Cymbopogon citratus),

המכיל citral 80% , הידוע כחומר אללוכימי בעל השפעה חזקה על זרעי חיטה. לאחר האינקובציה נבדק אחוז

הנביטה (פריצת שורשון).

השפעת השמן האתרי על צימוח השורשון של זרעי חיטה או שומר, נבדקה בבקבוק פלסטיק מאורך בנפח של

50 מ"ל. מסביב לדופן הבקבוק הוכנסו שתי שכבות של נייר סינון "ווטמן" 1 ו- 5.5 מ"ל מים מזוקקים. לאחר

ספיגת המים בנייר הונחו 10 זרעי חיטה בין שכבת הנייר לדופן הבקבוק. נייר סינון שהודבק בצד הפנימי של

מכסה הבקבוק הוספג בשמן אתרי בריכוזים שונים (nl/ml 400 ,200 ,40 ,0) שהופק מפירות שומר משני

הכמוטיפים. לאחר הדגרה במשך 48 שעות בחושך, בטמפרטורה של C˚28 נמדד אורך שורשוני הנבטים.

בדרך דומה הונבטו 20 זרעי שומר משני הכמוטיפים שעברו חיטוי על ידי השריה ב- 30% אקנומיקה ביתית

וטיפת סבון במשך 20 דקות ונשטפו היטב במים מזוקקים, כדי למנוע התפתחות פטריות בזמן הנביטה. מאחר

וקצב הנביטה נמוך יותר בשומר בהשוואה לחיטה, נמדדו אחוז הנביטה ואורך השורשון שישה ימים לאחר

ההרטבה. כל טיפול נערך ב- 3 חזרות.

16 ג.2. תוצאות

ג.1.2. אפיון מרכיבי האולאורזין של אוכלוסיות המחקר

המרכיבים העיקריים המאפיינים את האולאורזין המופק מפירות של נציגי אוכלוסיות המחקר נתונים בטבלה

ג.2. אוכלוסיות באר חיל וסנטה קטרינה העשירות ב-t-anethole (80%) דומות מאוד בהרכב

הפנילפרופנואידים, אך נבדלות ביחסי המלווים האחרים. אוכלוסיית באר חיל עשירה יותר ב-α-pinene וב- fenchone ואילו אוכלוסיית סנטה קטרינה עשירה יותר ב-limonene וב-γ-terpinene . לעומתן אוכלוסיות

הר מירון, הר דוב ומרסין (טורקיה) העשירות ב-estragole (56-61%), מאופיינות גם בתכולה גבוהה יחסית

של fenchone (16-26%) לעומת 2-7% באוכלוסיות האנתוליות. אוכלוסיית מרסין נבדלת מהאוכלוסיות

האחרות ברמה נמוכה יחסית של limonene (1.2%) לעומת 2.5-6% באחרות וברמה גבוהה יחסית של

γ-terpinene (15.6%) לעומת 1-4% באוכלוסיות האחרות.

איור ג.2 מצביע על זיקה בין חלק ממרכיבי האולאורזין העיקריים: אסוציאציה שלילית חזקה קיימת בין

התכולה היחסית (%) של estragole לזו של r = -0.92, p<0.001, n=63) t-anethole) (איור ג.2A). וכן

בין התכולה היחסית של סך כל הפנילפרופנואידים לבין המונוטרפן r = -0.91, p<0.001, n=63) fenchone)

(איור ג.2C). לעומת זאת לא נמצאה זיקה עם בין תכולת limonene ותכולת הפנילפרופנואידים

(r = -0.25, p=0.048, n=63) (איור ג.2D).

טבלה ג.2. מרכיבי האולאורזין העיקריים (w/w%) , תכולת האולאורזין הכללית (mg/g fw) ואחוז ה- estragole מכלל הפנילפרופנואידים בפירות שעוותים באוכלוסיות השומר שנבדקו . ניתנים ממוצע ± n SE=10-14 מכל אוכלוסיה

סנטה קתרינה מרסין, טורקיה באר חיל מעלות תרשיחה הר מירון הר דוב Component (MD) (MM) (MT) (BH) (T) (S) α-pinene 2.0 ± 0.4 2.7 ± 0.5 1.6 ± 0.3 1.3 ± 0 1.8 ± 0.5 0.6 ± 0.2 limonene 4.8 ± 1.1 4.7 ± 1.0 5.1 ± 0.8 2.5 ± 0 1.2 ± 0.5 5.9 ± 1.4 γ-terpinene 1.4 ± 0.1 2.5 ± 0.3 1.9 ± 0.3 0.9 ± 0 15.6 ± 1.4 4.4 ± 1.0 fenchone 21.9 ± 1.4 26.4 ± 4.1 20.4 ± 2.3 7.3 ± 2 16.6 ± 2.7 1.8 ± 0.9

estragole 61.0 ± 3.8 56.8 ± 4.5 51.3 ± 5.3 3.7 ± 0 60.6 ± 3.2 3.3 ± 0.1 t -anethole 3.3 ± 2.0 1.2 ± 1.0 14.1 ± 3.7 81.3 ± 2 0.2 ± 0.1 80.1 ± 1.1

other 5.6 ± 0.5 5.7 ± 1.0 5.5 ± 0.5 3.0 ± 0 4.1 ± 0.5 3.9 ± 0.8 Total oleoresin 8.4 ± 0.7 7.7 ± 1.0 8.1 ± 0.6 17.2 ± 2 7.9 ± 0.7 8.2 ± 0.9 (mg/g fw) % estragole/ 97.6 ± 2.0 98.0 ± 1.7 77.4 ± 5.4 4.4 ± 0 99.7 ± 0.1 4.0 ± 0.1 phenylpropanoids Chemical type EE EAAE A A="anetholic " E="estragolic" EA= "estragole anetholic"

17 מקדם המתאם בין תכולה יחסית (%) של estragole עם תכולת (mg/g fw) האולאורזין הכללית מצביע על

אסוציאציה שלילית (r = -0.51), וניתן לומר כי תכולה האולאורזין גבוהה יותר באוכלוסיות בהן תכולה ה - estragole נמוכה (או לחליפין בעלי תכולה t-anethole גבוהה) (איור ג.2B).

100 50 A C r = - 0.92, P<0.001, n=63 r = - 0.91, P<0.001, n=63 40

) 80

60 30

40 20 -anethole ( % w/w -anethole fenchone (% w/w) fenchone t 20 10

0 0 0 102030405060708090 0 20406080100 estragole ( % w/w) phenylpropanoids(%w/w)

30 B 15 D r = - 0.51, P<0.001, n=63 r = - 0.25, P=0.048, n=63 25

20 10

15

10 5 limonene (% w/w) (% limonene

oleoresin ( mg/gfw) fw ( mg/gfw) oleoresin 5

0 0 0 102030405060708090 0 20406080100 estragole ( % w/w) phenylpropanoids (% w/w) איור ג. 2. מקדם המתאם של פירסון בין תכולת מרכיבי האולאורזין העיקריים (w/w % מתוך כלל מרכיבי האולאורזין), בנציגי 6 אוכלוסיות שומר: A. בין ה-estragole לבין ה- B t-anethole. בין ה-estragole לבין תכולת האולאורזין הכללית (mg/g fw) C. בין הפנילפרופנואידים לבין ה-D fenchone. בין הפנילפרופנואידים לבין ה- limonene

ג.2.2. הרכב ותכולת האולאורזין במהלך האונטוגנזה- השוואה בין שני הכמוטיפים

השוואת השינויים המתרחשים בהרכב הנדיפים במהלך האונטוגנזה של הצמח הצעיר נערכה בעלים ובשורשים

של נבטים בני 7-120 יום מהצצת הפסיגים, ובאברים שונים של צמחים בוגרים משני הכמוטיפים, המייצגים

שלבים בהתפתחות הצמח הבוגר: שושנת העלים, עלים שלאורך עמודי התפרחות, פרחים ופירות.

ג.1.2.2 תכולה והרכב האולאורזין בצמח הצעיר (נבטים):

א. תכולה והרכב האולאורזין בחלקי הנבט הצעיר

השוואה בין מרכיבי האולאורזין המופק מעלי נבטים צעירים (טבלה ג.3) מראה כי בכמוטיפ הר דוב (MD)

המרכיבים העיקרים הם: limonene ,α-phellandrene ,estragole ו-fenchone, ואילו בכמוטיפ באר חיל

18 (t-anethole :(BH ו- limonene. תכולת ה-fenchone בעלים נמוכה מאוד בכמוטיפ באר חיל. נוכחות של

α- phellandrene בעלי הנבטים היא ייחודית לכמוטיפ הר דוב. לעומת העלים, המרכיבים העיקריים בשורשי

הנבטים הם: dillapiole ,apiole שתכולתם בשורשים הצעירים דומה בשני הכמוטיפים (טבלה ג.4), ו- myristicin שתכולתו גבוהה יותר בכמוטיפ מהר דוב. estragole ו- t-anethole נמצאים בשורשים הצעירים

בהתאם לכמוטיפ, אך בריכוז נמוך פי 2-3 בהשוואה לעלים. כמו כן נמצא כי תכולת האולאורזין הכללית בשני

הכמוטיפים קטנה בפסיגים ובשורשים פי 2-4 בהשוואה לעלים (טבלה ג.3).

טבלה ג.3: תכולת האולאורזין (mg/gfw) ותכולה יחסית (%w/w) של מרכיבי האולאורזין באברים שונים של נבטי שומר פשוט, בנציגים מכמוטיפים באר חיל (BH) והר דוב (MD) בני 22 יום מזריעה (או 13 יום לאחר הצצת הפסיגים)

הר דוב (MD) באר חיל (BH) Component L YL C H R L YL C H R α-pinene 0.2 t 0.7 0.0 0.0 0.2 0.0 0.0 0.0 0.0 *α-phellandrene 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.3 21.6 4.1 8.9 3.5 *p-cymene 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.4 0.7 0.3 0.0 limonene 16.3 30.7 24.9 9.2 5.4 7.6 8.3 13.3 1.4 1.7 γ-terpinene 2.1 2.3 3.9 3.0 1.4 3.3 3.4 4.9 3.9 1.4 fenchone 2.4 1.2 0.0 0.7 1.3 7.0 4.5 0.8 1.5 2.9 α-terpinolene 1.7 1.6 0.9 t t 2.5 3.2 0.8 2.0 0.0 allo-ocimene 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.6 0.3 0.0 0.0 0.0 endo- fenchyl acetate 0.1 0.0 0.2 0.0 0.0 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 exo- fenchyl acetate 1.4 1.7 1.1 2.3 1.7 1.4 2.5 0.7 3.0 1.5 Total terpenes 24.2 37.5 31.7 15.2 9.8 34.2 44.5 25.6 21.3 11.2 estragole 2.4 1.1 1.0 0.8 0.5 53.8 46.2 42.9 46.4 18.0 t-anethole 70.1 53.8 41.8 58.7 31.6 5.4 0.0 0.4 1.3 0.2 myristicin 0.1 0.0 0.0 1.6 3.6 1.1 0.7 0.6 6.3 8.8 elemicin 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 dillapiole 0.5 1.2 6.3 4.6 12.8 2.5 3.8 14.4 9.3 17.7 apiole 1.9 2.3 17.5 16.7 40.1 2.5 3.5 15.2 13.8 43.0 Total phenylpropanoids 75.0 58.4 66.6 82.4 88.8 65.3 54.2 73.5 77.1 87.9 % phenylpropanoids 75 58 67 82 89 65 54 74 77 88 % est / phenylpropanoids 3 2 1 1 1 83 85 58 60 21 % ane / phenylpropanoids 93 92 63 71 36 8 0 0 2 0 other 0.7 4.2 1.7 2.5 1.4 0.5 1.2 1 1.6 0.9 Total oleoresin (mg/gfw) 1.5 0.9 0.3 0.5 0.4 0.8 0.7 0.2 0.6 0.3 עלים (הטרף גדול מס"מ הפטוטרת גדולה מ2- ס"מ =L עלים צעירים (הטרף קטן מס"מ הפטוטרת קטנה מ1.5- ס"מ) = YL שורשים = R תת פסיג = H פסיגים =C t=trace, <0.1% est = estragole; ane = anethole; מרכיב המצוי רק באוכלוסיית הר דוב*

19 ב. תכולה והרכב האולאורזין במהלך התפתחות העלה בשושנת עלים הראשונית

בשני הכמוטיפים, בצמחים צעירים בני 7-35 יום מהצצת הפסיגים, חלה ירידה בתכולת האולאורזין עם

התפתחות העלים, מ- mg/gfw 0.9 עד mg/gfw 0.1 בכמוטיפ הר דוב, ובכמוטיפ באר חיל מ-mg/gfw 1.5

עד mg/gfw 0.2 (איור ג.3A). מגמה זו קיימת גם כאשר מחשבים את תכולת האולאורזין לעלה (איור ג.3B),

אם כי במקרה זה חלה עליה בתכולת האולאורזין בין עלה בגיל שבוע לעלה בגיל שבועיים, אך בעלים הבוגרים

יותר חלה ירידה. הירידה בתכולת האולאורזין נובעת בעיקר מהירידה הדרסטית בתכולת ה-estragole וה- t-anethole בהתאם לכמוטיפ (איור ג.4). בכמוטיפ באר חיל גם תכולת ה- limonene, וה-fenchone בעלה,

עולים מעט במהלך השבועיים הראשונים, אך יורדים לאחר מכן (איור ג.B1- 4), יחד עם זאת, עם התפתחות

העלים, השינוי התכולה היחסית של ה– limonene אינו מובהק בכמוטיפ באר חיל אך עולה בכ –-8% 7

בכמוטיפ הר דוב. לעומת זאת התכולה היחסית של ה- fenchone יורדת בכמוטיפ באר חיל עם ההתפתחות ב -

3% (איור ג. 4A2) אך בכמוטיפ הר דוב השינוי אינו מובהק (נספח 1). כמוטיפ הר דוב מכיל בנוסף גם

α- phellandrene, שתכולתו היחסית עולה עם התפתחות העלים בכ- 5% (איור ג. 4A1).

בשני הכמוטיפים השינוי בתכולת α- pinene עם ההתפתחות, אינו מובהק.

2.0 A 0.6 B MD BH 0.5 1.6

F4,10=43.57, P,<0.001 F4,10=23.84, P,<0.001 0.4 תכולת F =60.10, P,<0.001 F =47.70, P,<0.001 1.2 4,10 4,10 0.3 (mg/g fw) (mg/ fresh leaf) (mg/ fresh

0.8

0.2 האולאורזין

0.4 0.1

0.0 0.0 0 102030400 10203040 גיל העלה (ימים מהצצת הפסיגים)

איור ג.3. שינויים בתכולת האולאורזין בעלים במהלך התפתחות נבטים בני 7-35 יום מהצצת הפסיגים, בשני כמוטיפים של שומר (BH- באר חיל ו- MD- הר דוב) mg/ fresh leaf .B mg/gfw .A (ניתנים: ממוצע ו- n=3 (SE בכל חזרה נדגמו 4 צמחים (פירוט של הניתוח הסטטיסטי ראה נספח 1).

20

% µg / leaf limonene 100 400 A1 B1 alpha-α-phellandrene phellandrene fenchone 80 300 alpha-pineneα-pinene

60 anetholet-anethole 200 estragole 40

100 20 מרכיבי

0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35 400 100 B2

A2 האולאורזין

80 300

60 200

40

100 20

0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35

גיל העלה (ימים מהצצת הפסיגים)

איור ג. 4. השינוי בתכולת המרכיבים העיקריים באולאורזין עם התפתחות העלה בנבטים בני 7-35 יום מהצצת הפסיגים משני הכמוטיפים: -1 מאוכלוסיית הר דוב (MD) 2. מאוכלוסיית באר חיל (BH) A. תכולה יחסית (%) B תכולה לעלה (µg/leaf) (ניתנים: ממוצע ו- n=3 (SE בכל חזרה נדגמו 4 צמחים (פירוט הניתוח הסטטיסטי ראה נספח 1)

ג. תכולה והרכב האולאורזין בשורשי נבטים בגילאים שונים

נמצא כי ההבדל בין הכמוטיפים בהרכב הכימי של השורש הבוגר (120 יום מהופעת הפסיגים) מתבטא בעיקר

בתכולה היחסית של הפנילפרופנואידים ופחות במרכיבים הכימיים (טבלה ג.4). כמוטיפ הר דוב (MD) עשיר

יותר ב-256.6µg/gfw) dillapiole) ופחות ב- 72.0µg/gfw) apiole) ואילו הכמוטיפ באר חיל (BH)

עשיר יותר ב-147.5µg/gfw) apiole) ופחות 71.6µg/gfw) dillapiole). כמו כן α-phellandrene מהווה

מרכיב ייחודי לשורש של הכמוטיפ MD ונעדר מהכמוטיפ BH. בשני הכמוטיפים ניתן למצוא בשורש גם myristicin ו- fenchone .

21

טבלה ג.4: השינוי בתכולת (µg/gfw) המרכיבים העיקריים באולאורזין של השורש במהלך התפתחותו, בצמחים בני 13,35,120 יום מהצצת הפסיגים, בשני הכמוטיפים של שומר פשוט הר דוב: (MD) ו- באר חיל (BH) (ממוצע ו - n =3 (SE בכל חזרה נדגמו 4 צמחים

MD BH Component 13days 35 days 120 days 13days35 days 120 days α- phellandrene 9.8 ± 1.0a 3.7 ± 3.0a 11.2±5.5a 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 limonene 4.9 ± 0.1a 1.9 ± 0.3b 3.4±0.8ab 20.1 ± 2.0a 2.1 ± 0.4b 1.0 ±0.2b γ- terpinene 4.0 ± 0.1a 1.4 ± 0.5a 7.4±4.5a 5.2 ± 0.0a 1.5 ± 0.6b 0.5 ±0.2b fenchone 8.3 ± 1.2b 33.8 ± 8.7a 29.1±3.8a 4.9 ± 1.0b 8.0 ± 0.6b 17.4 ±4.5a exo - fenchyl acetate 4.1 ± 0.2a 0.5 ± 0.0a 0.0±0.0a 6.2 ± 0.0a 1.8 ± 0.2a 0.0 ±0.0a estragole 51.0 ± 3.1a 2.1 ± 1.5b 0.0±0.0b 1.7 ± 0.0a 0.0 ± 0.0b 0.2 ±0.2b t- anethole 0.5 ± 0.1a 0.3 ± 0.3a 0.3±0.3a 117.7 ± 5.0a 9.9 ± 2.9b 0.4 ±0.3b myristicin 24.8 ± 2.2b 73.7 ± 1.7a 9.3±3.3c 13.5 ± 2.0a 12.3 ± 2.8a 34.8 ± 31.4a elemicin 0.6 ± 0.2a 0.0 ± 0.0a 0.0±0.0a 0.6 ± 0.2a 0.8 ± 0.3a 2.1 ±1.4a cis -asarone 0.0 ± 0.0a 0.6 ± 0.1a 0.8±0.5a 0.0 ± 0.0a 0.5 ± 0.3a 0.3 ±0.3a dillapiole 50.1 ± 3.2b 92.2 ± 1.5b 256.6±44.9a 47.7 ± 3.4a 22.0 ± 8.5a 71.6 ± 64.5a apiole 121.6 ± 5.1a 148.3 ± 17.4a 72.0±8.9b 149.4 ± 6.1a 122.0 ± 14.2a 147.5 ± 33.2a other 3.1 ± 0.1 1.7 ± 0.24.8 ± 1.2 5.3 ± 1.0 7.1 ± 2.1 11.7 ± 3.0 Total oleoresin 282.9 ± 21a 360.3 ± 29.6a 394.9± 50.2a 372.3 ± 51.0a 187.9 ± 24.7b 287.3 ± 43.6a sum phenylpropanoids 248.7 ± 22.3a 317.2 ± 30.2a 339.0±48a 330.6 ± 50.1a 167.5 ± 25.8b 256.8 ± 48.6b % phenylpropane derivatives 87.9 ± 2.5a 88.0 ± 2.5a 85.8± 2.8a 88.8 ± 2.9a 89.1 ± 3.2a 89.4 ± 3.1a a,b,c,d - אותיות שונות מציינות הבדלים מובהקים בתכולת המרכיב בגילים השונים של השורש. (Bonferroni multiple comparison p< 0.05)

בשני הכמוטיפים, התכולה (µg/gfw) וגם התכולה היחסית (%) של ה-fenchone ובכמוטיפ הר דוב גם dillapiole, עולים במהלך שלושת חודשי ההתפתחות הראשונים של השורש (טבלה ג.4 ואיור ג.5). לעומתם,

התכולה והתכולה היחסית של ה-limonen בשני הכמוטיפים, וכן גם apiole ו-myristicin בכמוטיפ הר דוב,

ו- γ-terpinene בכמוטיפ באר חיל, יורדים באופן משמעותי עם התפתחות השורש. ה-estragole

וה-t-anethole המהווים בכמוטיפ הר דוב ובכמוטיפ באר חיל (בהתאמה) את המרכיב העיקרי של חלקי הצמח

העליונים, מופיעים בשורש בשלב הראשוני של התפתחותו אך עם התבגרות השורש הם נעלמים (איור ג.5).

22 estragole % alpha α-phellandrene phellandrene

% my risticin limonene limonene dillapiole γ -γ terpinene-terpinene 80 apiole 12 fenchone A1 B1 fenchone 10 60 8

40 6

4 20 2 מרכיבי

0 0 0 50 100 150 0 50 100 150 80 t-anethole 12 B2 A2 my risticin dillapiole

10 האולאורזי apiole ן

) 60 8

% w/w 6 ( 40

4 20 2

0 0 0 50 100 150 0 50 100 150

גיל השורש (ימים מהצצת הפסיגים)

איור ג.5: שינויים בתכולה היחסית של מרכיבי האולאורזין (w/w %) במהלך התפתחות השורש בנבטים של שומר משני הכמוטיפים: -1 מאוכלוסיית הר דוב (MD); 2. מאוכלוסיית באר חיל (BH). גיל השורש – ימים מהצצת הפסיגים A. phenylpropanoids. B. monoterpenoids ניתנים: ממוצע ו– n=3 ,SE נדגמו 12 צמחים (פירוט סטטיסטי ראה נספח 2).

ג.2.2.2 תכולה והרכב האולאורזין בצמח הבוגר

כדי להבחין בהבדלים ובשינויים הכמותיים והיחסיים החלים בהרכב האולאורזין של שני הכמוטיפים

במהלך האונטוגנזה של הצמח הבוגר, נבדקו בשני הכמוטיפים העלים בשושנת העלים, לפני התפתחות

עמודי התפרחות, והושוו לעלים שלאורך עמוד התפרחות בגבהים שונים. כמו כן נבדקו קטעים מעמוד

התפרחות המיצגים גילאים שונים, פרחים ופירות בארבעה שלבי התפתחות.

23 א. בעלים של שושנת העלים

תכולת האולאורזין המצויה בשושנת העלים של הצמח הבוגר דומה בשני הכמוטיפים (כ- mg/g fw 1.8)

(טבלה ג.5). האולאורזין שמוצה משושנת העלים בכמוטיפ באר חיל מורכב בעיקר מ- t-anethole (כ80%-).

מרכיבים נוספים הם: fenchone , estragole ו-limonene המהווים כ5%- כל אחד.

בכמוטיפ הר דוב, המרכיב העיקרי בעלים הוא estragole (70%) והתכולה היחסית של t-anethole גבוהה

יחסית לחלקי צמח האחרים (8.7%), וקרובה לתכולה היחסית של ה-fenchone (8.5%). בשני הכמוטיפים

אחוז ה-limonene בשושנת העלים נמוך יחסית לזה המצוי בעלי הנבטים (טבלה ג.3).

טבלה ג.5. הרכב ותכולת האולאורזין ( µg/gfw ו- % w/w) בשושנת העלים בצמח הבוגר בנציגים משני כמוטיפים של שומר פשוט: הר דוב (MD) ו- באר חיל (BH). (ממוצע ו - n =3 (SE נדגמו 9 צמחים

µg/g fw % Component BH MD BH MD α - pinene 34.7 ± 23.2 59.9 ± 21.3 1.6 ± 1.0 2.9 ± 0.9 β - pinene 0.0 ± 0.0 1.6 ± 1.0 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 myrcene 0.0 ± 0.0 6.0 ± 3.3 0.0 ± 0.0 0.3 ± 0.2 α - phellandrene 25.9 ± 25.9 63.7 ± 36.5 1.5 ± 1.5 4.0 ± 2.8 limonene 81.9 ± 13.2 63.8 ± 18.7 4.9 ± 0.3 3.2 ± 0.5 terpinolene 6.0 ± 3.9 0.0 ± 0.0 0.4 ± 0.2 0.0 ± 0.0 fenchone 94.9 ± 15.6 167.1 ± 43.4 5.9 ± 1.1 8.5 ± 1.1 allo-ocimene 3.3 ± 3.3 5.9 ± 3.6 0.2 ± 0.2 0.3 ± 0.2 estragole 78.5 ± 20.5 1356.3 ± 265.4 4.5 ± 0.3 70.1 ± 5.3 endo- fenchyl acetate 0.0 ± 0.0 0.8 ± 0.8 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 exo- fenchyl acetate 14.5 ± 3.2 33.7 ± 17.9 1.0 ± 0.4 1.6 ± 0.6 cis -anethole 5.8 ± 3.0 0.0 ± 0.0 0.4 ± 0.3 0.0 ± 0.0 t- anethole 1361.2 ± 284.8 171.9 ± 166.3 79.5 ± 2.0 8.7 ± 8.4 germacrene-D 1.4 ± 1.4 3.8 ± 2.0 0.1 ± 0.1 0.2 ± 0.1 Total oleoresin 1707.8 ± 336.6 1934.5 ± 328.2 100.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 % est/phnylpropanoids 5.3 ± 0.3 89.8 ± 9.8

ב. בעלים לאורך עמוד התפרחות

נמצא כי בשני הכמוטיפים תכולת האולאורזין בעלה צעיר כפולה בהשוואה לזו שבעלה בוגר (טבלאות ג.6 ו-

ג.7). בכמוטיפ הר דוב השינוי שחל בתכולה היחסית של המרכיבים בעלה, חד יותר מזה של כמוטיפ באר חיל.

בכמוטיפ הר דוב ה-estragole המהווה את המרכיב העיקרי בעלה צעיר (56%) יורד בעלה בוגר ל- 11%.

ירידה חדה זו נובעת מירידה משמעותית בתכולת ה-estragole עם התבגרות העלה מ- mg/gfw 1.7 ל- 0.2 mg/gfw (טבלה ג.6). במרכיבים אחרים ובעיקר fenchyl acetate ,limonene, α-phellandrene וה -

α -pinene עולה התכולה (µg/g fw) עם ההתבגרות אך לא באופן מובהק. כמו כן קיימת מגמת עליה

24 בתכולתם היחסית עקב הירידה החדה והמובהקת בתכולת ה-estragole. גם בכמוטיפ באר חיל יורד באופן

מובהק אחוז ה-t-anethole – המרכיב העיקרי, עם ההתבגרות מ- 2.5mg/gfw ל- mg/gfw 1.2. בכמוטיפ זה

ישנה עליה מובהקת בתכולת ה- α -pinene המתבטאת גם בעליה בתכולתו היחסית.

ג. במקטעים לאורך עמוד התפרחות

תכולה והרכב האולאורזין נבדקו לאורך עמוד התפרחות בשלושה קטעים. קצה עמוד התפרחות מייצג את הגיל

הצעיר ביותר ואילו בסיס עמוד התפרחות מהווה את האזור הבוגר ביותר של עמוד התפרחות. נמצא כי תכולת

האולאורזין באזור צעיר של עמוד התפרחות גבוהה יותר מזו של אזור בוגר. פי 10 בכמוטיפ MD (טבלה ג.6)

ופי 5 בכמוטיפ BH (טבלה ג.7).

המרכיבים העיקריים במקטע הצעיר של עמוד התפרחות באוכלוסיית הר דוב הם: fenchone ,estragole, limonene ,t-anethole ו- fenchyl acetate. לעומת זאת במקטע הבוגר נוספים למרכיבים אלה גם:

α-phellandrene ו- α -pinene. התכולה היחסית של ה-estragole המהווה את המרכיב העיקרי (כ- 70%)

באולאורזין של אוכלוסיית זו, קבועה במהלך הגידול, אך תכולתו הכללית יורדת מאוד עם ההתבגרות. גם

התכולה היחסית של ה-t-anethole נשארת קבועה (כ- 7% בממוצע מכלל האולאורזין) למרות הירידה

בתכולתו. הירידה המשמעותית בתכולה ה-estragole גורמת לעליה בתכולה היחסית של מרכיבים נלווים כמו

fenchyl acetate ובמידה מועטה גם limonene, למרות העובדה שגם תכולתם הכללית של מרכיבים אלה

יורדת עם ההתפתחות (טבלה ג.6).

המרכיבים העיקריים במקטע הצעיר של עמוד התפרחות באוכלוסיית באר חיל הם: limonene ,t-anethole, fenchone ,α-pinene ,estragole ו-α-phellandrene. לעומת זאת הרכב המקטע הבוגר: t-anethole, fenchyl acetate ,estragole ו-α- pinene. גם בכמוטיפ זה אחוז ה-t-anethole המהווה את המרכיב

המרכזי (כ- 80%) אינו משתנה במידה ניכרת לאורך עמוד התפרחות, למרות שתכולתו יורדת מאוד עם

התבגרותו. בכל אחד מהכמוטיפים ישנם גם מרכיבים דיפרנציאלים, המופיעים בעיקר בעלים, אך יש לציין

שתכולתם נמוכה מאוד וקיימת שונות גדולה בנוכחותם בפרטים השונים. המרכיבים הדפרנציאלים הבולטים

בכמוטיפ הר דוב הם: cis-ocimene ,myrcene ואילו בכמוטיפ באר חיל cis- anethole מהווה מרכיב ייחודי

(טבלה ג.7) כנראה בגלל תכולת ה-t-anethole הגבוהה, המגדילה את הסיכוי למודיפיקציה של t-anethole

ל-Kraus and Hammerschmidt, 1980) cis- anethole).

25

טבלה ג.6: הרכב ותכולת האולאורזין ( µg/gfw ו- w/w%) בעלים ובעמודי התפרחות בגבהים שונים מהקרקע ( ,10-15 80-100 ,50-60 ס"מ ) בשומר פשוט : כמוטיפ אסטרגולי (הר דוב) n = 3 (נדגמו 12 צמחים) (ניתנים ממוצע ו -SE)

Leaves Stalk of infloresenecs Component bottom middle top bottom middle top %% α - pinene 9.6 ± 4.0 12.7 ± 4.4 5.3 ± 2.7 3.3 ± 1.8 3.3 ± 1.5 3.3 ± 1.3 camphene 0.0 ± 0.0 0.7 ± 0.3 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 sabinene 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 β - pinene 0.7 ± 0.4 1.0 ± 0.4 0.3 ± 0.3 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.3 ± 0.3 myrcene 2.7 ± 0.3 2.2 ± 0.1 1.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 α -phellandrene 25.1 ± 8.3 13.7 ± 5.0 10.3 ± 3.8 3.8 ± 3.3 1.0 ± 0.6 1.5 ± 0.8 p -cymene 0.4 ± 0.4 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 limonene 23.6 ± 7.5 16.4 ± 5.8 8.6 ± 2.7 5.2 ± 2.7 2.2 ± 1.1 3.9 ± 1.6 cis -ocimene 4.7 ± 0.7 2.4 ± 0.9 2.3 ± 0.4 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 γ - terpinen 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.6 ± 0.3 0.4 ± 0.4 0.0 ± 0.0 terpinolene 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.2 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 fenchone 12.8 ± 2.1 14.4 ± 2.3 9.1 ± 1.1 0.2 ± 0.1b 8.7 ± 1.9a 8.8 ± 2.8a allo -ocimene 1.0 ± 0.2 0.5 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.2 ± 0.1 0.2 ± 0.2 0.4 ± 0.1 camphor 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.1 ± 0.1 estragole 11.1 ± 1.1c 29.4 ± 1.2b 56.5 ± 2.5a 65.3 ± 4.5 69.4 ± 3.3 71.2 ± 3.9 endo -fenchyl acetate 3.3 ± 0.7a 1.1 ± 0.2a 0.4 ± 0.1b 0.0 ± 0.0 0.2 ± 0.1 0.0 ± 0.0 exo -fenchyl acetate 2.7 ± 1.7 0.8 ± 0.1 1.3 ± 0.3 12.7 ± 1.6 7.6 ± 1.9 3.1 ± 0.6 t - anethole 1.2 ± 0.8 3.8 ± 2.1 4.3 ± 2.7 7.5 ± 7.5 6.5 ± 6.4 6.8 ± 6.8 germacrene-D 0.8 ± 0.3 0.4 ± 0.0 0.4 ± 0.0 0.3 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.5 ± 0.3 other 0.5 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.7 ± 0.5 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 µg/ g fw µg/ g fw α - pinene 180.0 ± 80.3 338.9 ± 107.4 135.9 ± 55.1 6.7 ± 3.35b 30.7 ± 8.55ab 65.0 ± 8.85a camphene 0.0 ± 0.0 22.5 ± 9.7 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 sabinene 0.0 ± 0.0 1.7 ± 1.7 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 1.9 ± 1.9 β - pinene 13.7 ± 7.9 27.4 ± 10.8 5.7 ± 5.7 0.0 ± 0.0 1.1 ± 1.1 5.3 ± 5.3 myrcene 46.7 ± 6.3 63.4 ± 4.7 33.8 ± 6.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 α-phellandrene 410.8 ± 123.3 430.0 ± 167.6 366.1 ± 181.6 11.8 ± 10.1 12.8 ± 7.5 36.5 ± 18.6 p -cymene 5.7 ± 5.7 0.0 ± 0.0 6.4 ± 6.4 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 limonene 413.8 ± 147.0 429.8 ± 98.5 237.9 ± 47.1 14.0 ± 9.0 22.2 ± 11.6 80.4 ± 23.0 cis -ocimene 78.8 ± 9.6 77.7 ± 28.4 67.9 ± 2.8 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 γ - terpinen 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 1.5 ± 1.0 4.5 ± 4.5 0.0 ± 0.0 terpinolene 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.3 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 fenchone 210.7 ± 20.6 431.8 ± 98.6 289.1 ± 62.6 0.5 ± 0.2 102 ± 35.8 215 ± 104 allo -ocimene 16.1 ± 2.2 16.5 ± 6.5 0.0 ± 0.0 0.6 ± 0.45b 2.4 ± 2.36b 8.5 ± 1.74a camphor 0.0 ± 0.0 2.0 ± 2.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 1.0 ± 1.0 2.1 ± 2.1 estragole 190.4 ± 26.2b 854.3 ± 103.3b 1735.3 ± 237.9a 159.8 ±21.56b 762 ± 128.7b 1607 ± 7.59a endo -fenchyl acetate 54.0 ± 9.2a 31.4 ± 6.4a 11.6 ± 1.9b 0.0 ± 0.0 2.8 ± 1.4 0.0 ± 0.0 exo -fenchyl acetate 50.3 ± 34.6 23.4 ± 4.2 37.3 ± 7.1 32.0 ± 8.2 78.6 ± 13.5 66.9 ± 11.8 t - anethole 21.8 ± 15.3 114.1 ± 63.5 137.4 ± 79.1 21.3 ± 21.3 76.5 ± 75.5 129 ± 130 germacrene-D 12.7 ± 4.0 12.3 ± 2.1 11.9 ± 1.7 0.9 ± 0.5 3.9 ± 0.5 9.6 ± 5.3 other 7.9 ± 0.7 6.1 ± 2.5 0.0 ± 0.0 1.4 ± 0.7 1.1 ± 1.1 0.0 ± 0.0 Total oleoresin 1713 ± 458 2883 ± 608 3076 ± 456 251 ± 51b 1102 ± 153b 2228 ± 302a % estragole/ phenylpropanoids 92.25 ± 4.755 90.11 ± 5.362 93.297 ± 4.1 90.00 ± 9.1 90.4 ± 7.8 95.9 ± 8.0

אין שינוי מובהק עולה עם התבגרות האיבר יורד עם התבגרות האיבר

האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים כאשר : Bonferroni multiple comparison p< 0.05) a>b>c)

26 טבלה ג.7: הרכב ותכולת האולאורזין ( µg/gfw ו- w/w%) בעלים ובעמודי התפרחות בגבהים שונים מהקרקע ( 80-100 ,50-60 ,10-15ס"מ ) בשומר פשוט : כמוטיפ אנתולי (באר חיל) n = 3 (נדגמו 9 צמחים) (ניתנים ממוצע ו -SE) Leaves Stalk of infloresenecs Component bottommiddle top bottom middle top %% α - pinene 18.1 ± 1.0a 11.3 ± 2.5b 4.1 ± 0.6c 2.5 ± 0.5 4.1 ± 0.0 3.3 ± 0.4 β - pinene 3.6 ± 0.8a 1.9 ± 0.1b 0.9 ± 0.4b 0.8 ± 0.8 0.7 ± 0.4 0.8 ± 0.8 α - phellandrene 1.1 ± 1.1 1.0 ± 1.0 1.3 ± 1.3 0.6 ± 0.6 0.4 ± 0.4 2.5 ± 2.5 limonene 5.3 ± 3.4 3.0 ± 2.1 2.8 ± 1.2 1.2 ± 0.2 1.6 ± 0.8 5.6 ± 3.0 γ- terpinen 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.4 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 terpinolene 0.1 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.1 ± 0.0 0.0 ± 0.0 fenchone 0.2 ± 0.3b 0.8 ± 0.8b 5.4 ± 2.2a 0.0 ± 0.0b 1.8 ± 1.3ab 2.8 ± 0.0a allo -ocimene 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 estragole 3.0 ± 0.01c 3.4 ± 0.1b 4.0 ± 0.2a 3.4 ± 0.3 3.7 ± 0.0 3.4 ± 0.1 endo -fenchyl acetate 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 exo -fenchyl acetate 2.0 ± 1.0 1.6 ± 0.0 0.9 ± 0.3 3.1 ± 0.3 4.0 ± 1.2 2.0 ± 0.4 cis- anethole 0.3 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.2 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 t- anethole 65.3 ± 2.1b 75.2 ± 5.2a 78.9 ± 1.0a 86.2 ± 1.2a 80.9 ± 3.1b 77.9 ± 0.4b β -farnesene 0.1 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 germacrene-D 0.4 ± 0.2 0.4 ± 0.1 0.4 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.6 ± 0.1 1.1 ± 0.5 other 0.0 ± 0.0 0.9 ± 0.9 0.9 ± 0.3 1.5 ± 0.6 1.3 ± 0.1 0.4 ± 0.1 µg/ g fw µg/ g fw α - pinene 323.7 ± 42.7a 265.9 ± 54.5a 127.8 ± 7.6b 8.6 ± 3.1b 40.2 ± 3.0a 52.0 ± 8.5a β - pinene 61.7 ± 2.5a 44.4 ± 4.2b 26.9 ± 9.2c 3.1 ± 3.1 6.7 ± 3.3 12.3 ± 12.3 α - phellandrene 16.7 ± 16.7 24.8 ± 24.9 37.8 ± 37.9 2.2 ± 2.2 3.5 ± 3.5 40.4 ± 40.6 limonene 106.5 ± 78.2 69.0 ± 48.3 90.9 ± 43.8 3.8 ± 0.1b 16.5 ± 8.6b 86.9 ± 44.1a γ - terpinen 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 1.3 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 terpinolene 1.5 ± 1.5 2.0 ± 2.0 1.2 ± 1.2 0.4 ± 0.4 0.9 ± 0.0 0.0 ± 0.0 fenchone 5.3 ± 5.3b 18.9 ± 19.0b 175.9 ± 84.4a 0.0 ± 0.0b 18.5 ± 13.6b 43.6 ± 1.9a allo -ocimene 1.1 ± 1.1 0.0 ± 0.0 3.2 ± 3.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 estragole 54.8 ± 10.3b 81.0 ± 4.2b 124.5 ± 16.5a 11.4 ± 3.1c 35.7 ± 2.3b 52.9 ± 2.5a endo -fenchyl acetate 2.2 ± 2.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 exo -fenchyl acetate 40.2 ± 24.7 37.6 ± 1.6 28.1 ± 6.4 10.1 ± 1.0b 39.4 ± 14.6a 31.4 ± 4.9a cis- anethole 4.7 ± 0.2 2.9 ± 3.0 1.5 ± 1.5 0.7 ± 0.1 0.5 ± 0.5 0.0 ± 0.0 t- anethole 1171.4 ± 178.9c 1774.2 ± 158.4b 2466.6 ± 172.4a 284.8 ± 46.8c 781.9 ± 23.6b 1223.3 ± 43.1a β -farnesene 2.6 ± 2.6 2.1 ± 2.1 1.4 ± 1.4 0.0 ± 0.0 0.7 ± 0.7 0.0 ± 0.0 germacrene-D 8.1 ± 4.2 10.1 ± 1.8 11.6 ± 2.3 0.0 ± 0.0c 5.6 ± 1.7b 16.7 ± 6.6a other 0.0 ± 0.0 21.3 ± 21.4 26.7 ± 7.2 4.7 ± 1.2 12.9 ± 0.3 4.4 ± 0.0 b b a c b a Total oleoresin 1800.5 ± 329.7 2354.3 ± 51.2 3124.0 ± 253.0 331.0 ± 58.9 962.9 ± 60.3 1563.9 ± 53.2 % estragole/ phenylpropanoids 4.5 ± 0.1 4.4 ± 0.1 4.8 ± 0.2 3.8 ± 0.2 4.4 ± 0.1 4.1 ± 0.0 אין שינוי מובהק עולה עם התבגרות האיבר יורד עם התבגרות האיבר האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים כאשר : Bonferroni multiple comparison p< 0.05) a>b>c)

ד. במהלך התפתחות הפרחים והפירות

בשני הכמוטיפים, תכולת האולאורזין (µg/fruit) עולה עם התפתחות הפרי (איור ג.6) ונמשכת עד הבשלתו.

עם הבשלת הפרי, תכולת האולאורזין הכללית של כמוטיפ באר חיל (µg/fruit 200) גבוהה מזו של כמוטיפ

הר דוב (90µg/fruit ). בשני הכמוטיפים העלייה באה לביטוי בעיקר במרכיב העיקרי (ה-t-anethole בכמוטיפ

BH וה-estragole בכמוטיפ MD), אך קיימת עליה גם בתכולת ה-limonene, ה-fenchone, וה-α-pinene.

לגבי כל המרכיבים הללו העלייה בתכולה מתבטאת בעיקר במעבר מפרי בשלב 1 לפרי בשלב 3 (איור ג.6). עם

זאת, ההרכב היחסי, כלומר אחוז המרכיבים באולאורזין נשאר קבוע במידה מסוימת במהלך התפתחות הפרי.

27

1. כמוטיפ הר דוב (MD)

A B 200 µg/fruit 100 %

80 150 תכולת

60

100 מרכיבי

40

50 האולאורזין

20

0 0

2. כמוטיפ באר חיל (BH)

200 100 % µg/fruit

80 150 תכולת

60 מרכיבי

100

40

50 האולאורזין

20

0 0 flow ers fru 1 fru 2 fru 3 fru 4 flow ers fru 1 fru 2 fru 3 fru 4

שלבי התפתחות estragole t-anethole limonene

fenchone α-pinene γ-terpinene

איור ג .6. שינויים בהרכב ובתכולת מרכיבי האולאורזין העיקריים במהלך התפתחות הפרי בשומר פשוט משני הכמוטיפים . 1-כמוטיפ הר דוב (MD) .2 כמוטיפ באר חיל .(BH) כאשר: A- תכולה לפרי (B (µg/fruit. תכולה יחסית (%) ניתנים ממוצעים של שלוש חזרות, בכל חזרה נדגמו 4 צמחים (פירוט סטטיסטי ראה נספח 3).

fru1 =פרי צעיר, fru2 = פרי שעוותי, fru3 = פרי חצי, בשל fru4 =פרי בשל יבש 28

100

80

אחוז 96 96 95 95 95

60 מכלל

98 97 99 94 90

40

20 הפנילפרופנואידים

0 פרי בשל פרי בשל פרי שעוותי פרי צעיר פרחים למחצה

t- anethole בכמוטיפ באר חיל estragole בכמוטיפ הר דוב

איור ג.7 אחוז ה- estragole או ה- t- anethole מכלל הפנילפרופנואידים במהלך התפתחות הפרי בשני כמוטיפים של שומר פשוט (ניתנים ממוצע ו- n =3 (SE בכל חזרה נדגמו 3-4 צמחים

בכמוטיפ באר חיל BH התכולה היחסית של ה-limonene גבוהה יותר בפרחים (11.8%) בהשוואה לפירות

(2-4%) ואילו בכמוטיפ הר דוב תכולתו בפרחים דומה לתכולתו בפירות הבשלים (איור ג.6). לעומת זאת,

בשני הכמוטיפים, התכולה היחסית של ה- fenchone גבוהה יותר בפרי בהשוואה לפרחים. חשוב לציין

שלמרות ההבדלים בתכולת המרכיבים במהלך האונטוגנזה, התכולה היחסית של ה- t-anethole או ה- estragole מכלל הפנילפרופנואידים נשארת קבועה במהלך התפתחות הפרחים והפירות (איור ג.7).

ההרכב והתכולה (µg/gfw) של המרכיבים העיקריים בחלקים העל קרקעיים בצמח הבוגר בשני הכמוטיפים

מוצגים באיור ג.8. השוואה בין הכמוטיפים מראה כי הרכב החומרים בחלקים השונים דומה אך ביחסים שונים.

בכמוטיפ הר דוב α-pinene ו- α-phellandrene מצויים בחלקים הוגטטיביים, ובעיקר בעלים, בכמות גדולה

יחסית לחלקים הרפרודוקטיביים. לעומת זאת γ-terpinene מצוי יותר באיברים הרפרודוקטיביים (פרחים

ופירות). מגמה דומה קיימת גם בכמוטיפ באר חיל, אך יש לציין שבכמוטיפ זה תכולת ה- α-phellandrene

נמוכה יחסית לזו של הר דוב. בשני הכמוטיפים הפירות מאופיינים ברמה גבוהה יחסית של fenchone

29 בהשוואה לחלקים האחרים. בכמוטיפ באר חיל ה- limonene מהווה מרכיב משמעותי יותר בפרחים ואילו

בכמוטיפ הר דוב הוא מצוי בריכוז גבוה יותר בעלים בוגרים.

איור ג.8. דף כפול

30 ג.3.2. מבנה ביבי השמן במהלך התפתחות הפרי

נמצא כי מבנה והתפתחות הביבים דומה בשני הכמוטיפים שנבדקו. בכל פרודה (mericarp) ממוקמים ארבעה

ביבי השמן (vittae) בחריצים שבין הרכסים בצד הקמור של הפרודה ושני ביבים נוספים, גדולים יותר,

ממוקמים בחלק הפנימי השטוח יותר (איור ג.9). ביבי השמן המצויים כבר בניצני הפרחים, נראים בחתך אורך

כחלל המחולק על ידי מחיצות לרוחב הביב, עם מרווחים של 100-200µm (איור ג.10). בשלבי ההתפתחות

הראשוניים – בפרחים ובפרי הצעיר, לחתך רוחב של ביבי השמן האתרי צורה מעגלית יותר (איור ג.9A ו-

ג.9FL). אך בהמשך ההתפתחות, משלב של פרי שעוותי, הם נעשים אליפסיים (איורים ג.9B ו- ג.9C). ניתן

לראות זאת בבירור בפירות בהם רק פרודה אחת מופרית (איור ג.9E).

FL A

B C

עובר קליפת הפרי ביב שמן

E D

איור ג .9: חתכי רוחב (ח.ר) (ללא צביעה) בפרי שומר (schizocarp) בשלבי התפתחות שונים FL = ח.ר בפרח לא מופרה, A= ח.ר בפרי צעיר B= ח.ר בפרי שעוותי C= ח.ר בפרי חצי בשל D= ח.ר בפרודה אחת של פרי בשל יבש (E (mericarp= ח.ר בפרי צעיר בו רק פרודה אחת

31 1 2

מחיצות

לרוחב

הביב

איור ג. 10: חתכי אורך בפרי שעוותי של שומר פשוט 1. ללא צביעה 2. בפלואורסנציה באורך גל: nm 360-370

חלל הביב מוקף בתאי אפיתל הנראים היטב בשלבים הראשוניים (איור ג.9A), אך במהלך ההבשלה דפנות תאי

האפיתל ודפנות התאים הסמוכים, מתרפדים בחומר הנראה חום אדמדם במיקרוסקופ אור (איורים ג.D9 ו-

ג.113) ובעל פלואורסנציה אדומה-סגולה באורך גל של 360 ננומטר (איור ג . 112). רוב הפוליפנולים

צבעוניים או זוהרים חזק באור על סגול (300 ננומטר) הודות לקשרים כפולים מצומדים במולקולה.

פלואורסנציה טבעית, חזקה וטיפוסית לתאים מלוגננים, המאירים באור ירוק-צהוב, מצביעה על ליגניפיקציה

של דפנות התאים הללו (איור ג . 114). במקרה זה צביעה עם פלורוגלוצינול לנוכחות ליגנין נמצאה כבלתי

יעילה מאחר והדפנות בעלות צבע חום אדמדם באופן טבעי. כמו כן לא נמצא כל הבדל משמעותי באופי

הפלואורסנטי המוקרן מהחתכים של שני הכמוטיפים.

1 2

3 4

איור ג.11: ביבי שמן בחתכי רוחב (ח.ר) בפירות של שומר פשוט. בפרי שעוותי (למעלה) ובפרי בשל (למטה) 1. בצביעה עם Cl-Zn-I 2. בפלואורסנציה באורך גל: nm 360-370 3. ללא צביעה 4. בפלואורסנציה באורך גל: 440 - 420 nm 32 בחתך רוחב, השטח היחסי של הביבים משטח קליפת הפרי (pericarp) גדל מאוד במעבר משלב של ניצן לפרח

פתוח (איור ג.12A) ונבדל ממנו באופן מובהק (P=0.001). בשלב של פרי שעוותי, שטח הביבים הוא מקסימלי

(7.6% משטח הקליפה). השטח היחסי של ביבי השמן האתרי ביחס לשטח קליפת הפרי בחתך רוחב אינו נבדל

באופן מובהק בין השלב של פרח פתוח ועד לפרי בשל. לעומת זאת, הנפח הכללי של ביבי השמן האתרי עולה

ברציפות משלב של ניצן (0.01mm3) עד לשלב של פרי שעוותי (mm3 0.33) הודות להתארכות הפרי. עם

זאת, הנפח הכללי בניצן אינו נבדל במובהק מזה שבפרח הפתוח ולא מנפח הביבים שבפרי צעיר, אך נבדל

במובהק מנפח הביבים בפרי שעוותי עד לפרי בשל (P=0.005). משלב של פרי שעוותי ואילך נפח הביבים

לפרי אינו משתנה באופן מובהק (איור ג.A 12).

ducts volume / fruit duct area/pericarp area(%) 1.0 10 fruit b A fruit a fruit c 8 0.8

) flower (f) fruit d 6 fruit

/ F =8.91, P<0.0001, n=4 3 0.5 5,18 4 mm ( bud 0.3 2 Oil ducts' area (%)

Calculated oil ducts volume Calculated oil ducts volume F5,18=7.28, P=0.001, n=4 0.0 0

0.08 10 µl oil/fruit B ) fruit weight 8 0.06

6 l /fruit µ ( 0.04 4

0.02 2 Oil content

Fruit weight (mg/dry fruit) 0 0

0 2 15 28 35 42

0 2 15 28 35 42 זמן (ימים מניצן צהוב) איור ג.12: השינוי בגודל ובתכולת ביבי השמן במהלך התפתחות הפרי בשומר פשוט A. שטח הביבים היחסי משטח חתך הרוחב בפריקרפ ונפח הביבים היחסי לפרי B. השינוי בתכולת השמן אתרי (µl/fruit) לפרי a = פרי צעיר b = פרי שעוותי c = פרי חצי בשל d = פרי בשל (ניתן ממוצע ו- SE)

33 תכולת השמן האתרי לפרי המושפעת באופן מובהק משלבי ההתפתחות (F5,18=7.28, P=0.001, n=4),

עולה ברציפות משלב של ניצן (µl/fruit 0.009) עד לשלב של פרי בשל למחצה שבו התכולה הגבוהה ביותר

(0.05µ l/fruit) ויורדת עם הבשלת הפרי (µl/fruit 0.027) (איור ג. 12B).

ג.4.2. ההרכב הכימי ושיעור הפליטה של נדיפים מאברי צמח שלמים

כדי לבחון אם התרכובות הנדיפות המיוצרות על ידי שני הכמוטיפים, משתחררות גם לאוויר שבסביבתם, נבדק

הרכב הנדיפים שנפלטו לאוויר החופשי מאברי צמח שלמים בשיטת headspace, בהשוואה לתכולתם בתוך

אברי הצמח (פרק ב' עמוד 8-9).

נמצא כי בכל האברים שנבדקו (עלים פרחים ופירות), הרכב החומרים הנדיפים המשתחררים לאוויר דומה

להרכב החומרים הנדיפים שנמדדו במיצוי אולאורזין על ידי הקסאן (איור ג.13). מאידך, נמצא הבדל משמעותי

בתכולה היחסית של המרכיבים שבתוך אברי הצמח העל-קרקעיים (עלים, פרחים ופירות), לבין אלה

המתנדפים באופן חופשי לאוויר. במיצוי אברי הצמח בהקסאן, מהווים הפנילפרופנואידים (estragole או t-anethole, בהתאם לכמוטיפ) את המרכיב העיקרי ותכולתם היחסית באויר נמוכה באופן משמעותי. בשני

הכמוטיפים, המרכיב העיקרי המשתחרר לאוויר מאברי הצמח הוא α-pinene (איור א.1). התכולה היחסית של

α-pinene בשכבת האוויר הסמוכה לאיבר הנבדק, גבוהה במיוחד (20-50%), פי 4-10 מתכולתו היחסית

במיצוי (3-5%) (איור ג.13). לעומת זאת תכולתם היחסית של limonene ו- fenchone (איור א.1) אינה

משתנה באופן משמעותי במיצוי ובאוויר החופשי (איור ג.13).

השוואת הנתונים שהתקבלו בשתי השיטות לאיסוף הנדיפים שימשה להערכת מידת פליטת הנדיפים במשך

יממה, מעלים בלתי מנותקים מצמחים צעירים בני 4 חודשים בהשוואה לענפים נושאי פרחים או פירות שנותקו

מצמח האם. לצורך זה חושב היחס בין תכולת (µg/gfw) התרכובות הנפלטות לאוויר באופן טבעי, במשך

יממה, לבין תכולתן (µg/gfw) באולאורזין המתקבל במיצוי בהקסאן של אותם האיברים. היחסים הללו (ב-%)

המוצגים בטבלה ג.8 עשויים לשמש כמדד לשיעור איבוד המרכיב הנדיף מתוך גרם חומר טרי ליממה.

נמצא כי היחס בין כלל התרכובות הנפלטות במשך יממה לאוויר החופשי באופן טבעי (µg/gfw) , לבין

התכולה המצויה בתוך אברי הצמח השונים (טבלה ג.8), מראה על נידוף בשיעור נמוך.

מטבלה זו ניתן לראות גם כי תכולת הנדיפים הכללית שנפלטה מעלים לאחר יממה גבוהה יותר (7-10%) מזו

שנפלטה מפרחים ובפירות (כ- 0.3%) אך הבדל זה אינו מובהק.

34

כמוטיפ הר דוב כמוטיפ באר חיל

הר דוב (Leaves (MD באר-חיל (BH) 100 100 n=3 n=3 NS 80 ** 80 60 ** 60 NS NS

40 NS 40 NS * NS 20 NS 20

0 0

Flowers 100 100 n=5 n=4 תכולת 80 *** 80 *** ** 60 60 הנדיפים %) 40 40 *** מכלל NS NS ה 20 20 NS NS NS NS נדיפים ( 0 0

Fruits 100 100 n=3 n=4 80 80 *** * 60 * 60 ** 40 40 NS NS NS NS * 20 20 NS

0 0 α-pinene limonene fenchone estragole t-anethole α.-pinene limonene fenchone estragole t-anethole

הנדיפים באולורזין הנדיפים בסביבת הצמח

איור ג.13: תכולה יחסית (% מכלל הנדיפים) של הנדיפים העיקריים שזוהו באויר החופשי שבסביבת הצמח בהשוואה לתכולתם היחסית באולאורזין, באברי צמח שונים, בשני כמוטיפים (באר חיל והר דוב) של שומר פשוט. נתונים ממוצע ו- SE . הכוכביות מעל העמודות מצביעות על הבדל מובהק לפי מבחן -T להשוואת שני ממוצעים. *=0.05>P>0.01; **=0.01>P>0.001; ***=P<0.00; N.S= not significant

35

מבחן ANOVA דו כיווני מראה כי רמת הנידוף מושפעת מסוג האיבר רק לגבי שני מרכיבים: α-pinene,

( F2,17=5.78, P<0.015) ו- F2,17=4.79, P<0.02 ) limonene). בשני המרכיבים הללו וכן בכל יתר

המרכיבים, רמת הנידוף אינה משפעת מסוג הכמוטיפ ( P>0.05).

טבלה ג.8. היחס (%) בין תכולת (µg/gfw) התרכובות הנפלטות לאוויר באופן טבעי, במשך יממה, מאברי צמח שונים לבין תכולתם (µg/gfw) בתוך אותם האיברים (ניתנים ממוצע ו - n=3-4 (SE

כמוטיפ באר חיל (BH) כמוטיפ הר דוב (MD) פירות פרחים עלים פירות פרחים עלים Component

α -pinene* 34.5 ± 16.3a 3.0 ± 1.7b 4.1 ± 2.0b 16.0 ± 10.6a 0.2 ± 0.0b 0.6 ± 0.1b α - phellandrene 22.2 ± 15.7 1.2 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 limonene* 29.7 ± 19.7a 0.6 ± 0.2b 0.6 ± 0.1b 21.3 ± 19.6a 0.0 ± 0.0b 0.1 ± 0.0b γ- terpinene 13.7 ± 11.2 0.9 ± 0.5 1.4 ± 1.0 10.8 ± 10.8 0.9 ± 0.1 0.0 ± 0.0 fenchone 3.4 ± 1.4 0.8 ± 0.5 0.3 ± 0.1 2.1 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.2 ± 0.0 estragole 3.3 ± 2.4 0.1 ± 0.0 0.1 ± 0.0 1.4 ± 1.4 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 exo -fenchyl acetate 10.5 ± 8.7 2.2 ± 1.1 0.0 ± 0.0 7.2 ± 7.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 t -anethole 0.2 ± 0.1 0.0 ± 0.0 1.0 ± 0.7 0.8 ± 0.8 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 germacrene D 1.1 ± 1.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.3 ± 0.3 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 Total volatiles 7.4 ± 5.0 0.3 ± 0.0 0.4 ± 0.1 9.9 ± 8.7 0.4 ± 0.1 0.1 ± 0.0

הבדיקה נעשתה על עלים בלתי מנותקים בצמח צעיר בין 4 חודשים וענפים מנותקים נושאי פרחים ופירות של הצמח הבוגר, משני הכמוטיפים (הר דוב ובאר חיל). האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים כאשר : a>b .(Bonferroni multiple comparison) * מרכיבים בהם נמצא הבדל מובהק בין האיברים.

בדיקת התלות בין תכולת החומר בעלים לבין מידת פליטתו מהצמח (איור ג.14A) מראה כי האסוסיאציה

השלילית (r = -0.49) בין תכולת החומרים למידת הנידוף אינה מובהקת (estragole .(P>0.05 ו-t-anethole

שתכולתם בכמוטיפים גבוהה, מתנדפים הרבה פחות בהשוואה לפליטת תרכובות כמו limonene ,α-pinene,

α- phellandrene ו- fenchyl acetate. גם האסוסיאציה השלילית (r = -0.42) בין המשקל המולקולרי של

החומר לבין מידת פליטתו (איור ג.14B) אינה מובהקת (P>0.05). הטרפנים שמשקלם המולקולרי נע בין

134-136 נדיפים יותר מהפנילפרופנואידים שמשקלם המולקולרי 148.2. עם זאת, למרות משקלם

המולקולרי הזהה, פליטת estragole (1.4-3.3%) גבוהה יותר מפליטת t-anethole (כ0.2-0.8%-), ופליטת fenchyl acetate שמשקלו המולקולרי 196.3 גבוהה (7-10%) מזה של הפנילפרופנואידים (טבלה ג.8).

36

B A 40 r = - 0.42 40 r = - 0.49 1. α-pinene P = 0.29 P=0.22 2. limonene 35 35 1 1 n=8 n= 8 3. γ- terpinene 30 30 2

α- phellandrene .4 2 ה אחוז 25 25 5. estragole ה 4 חומר 6. t-anethole 20 4 20 7. fenchone

15 15 המצוי

exo -fenchyl acetate .8 3 התנדפות 3 8 10 10 8 בצמח מכלל

5 5 5 7 6 5 6 7 0 0 100 120 140 160 180 200 0 10203040506070 תכולה (% מכלל האולאורזין) משקל מולקולרי איור ג.14 : מקדם המתאם של פירסון בין תכולת הנדיפים העיקריים המצויים באולאורזין של עלי שומר פשוט (A) ומשקלם המולקולרי (B) לבין אחוז פליטתם ביממה

ג.5.1 . הפוטנציאל הפיטוטוקסי והאוטוטוקסי של השמן האתרי המופק משני הכמוטיפים

נמצא כי כבר בריכוז של nl/ml 20 יש לשמן האתרי שהופק מפירות שומר פשוט, מכל אחד משני הכמוטיפים,

השפעה פיטוטוקסית על נביטת זרעי חיטה תרבותית, שנחשפו לפאזה הגזית של השמן האתרי במשך 48 שעות

(טבלה ג.9). עיכוב נביטה של זרעי חיטה בשיעור של 50% על ידי estragole מתרחש בריכוז נמוך יותר

I50 = 56 nl/ml בהשוואה לזה של I50 = 94 nl/ml t-anethole. לעומת זאת, עיכוב נביטה של 50% בשמן

האתרי שהופק משני הכמוטיפים זהה ומתרחש בריכוז נמוך יותר מזה של estragole ו- t-anethole

(I50 = 42 nl/ml) אך גבוה בהשוואה לשמן האתרי שהופק מעשב הלימון (Cymbopogon citratus)

(דגניים) I50= 18 nl/ml. בשמן האתרי המופק מכמוטיפ הר דוב בריכוז של nl/ml 400 לא נמדדה כל נביטה

ואילו בשמן אתרי שהופק מהכמוטיפ באר חיל יש בריכוז זה נביטה של 45% בהשוואה לביקורת.

טבלה ג.9: שיעור הנביטה (% מביקורת) של זרעי חיטה תרבותית שנחשפו לריכוזים שונים של שמן אתרי ממקורות שונים בהשוואה לחשיפה לריכוזים שונים (nl/ml) של t-anethole או estragole, 48 שעות לאחר הרטבה. נתונים ממוצע ± SE של 4 חזרות כשבכל אחת 20 זרעים

מקור השמן האתרי ריכוז השמן עשב לימון שומר באר חיל שומר הר דוב nl/ml) estragole anethole) 0 100.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 20 90.8 ± 7.6 69.7 ± 5.0 69.7 ± 4.5 73.7 ±12.0 47.4 ± 7.7 40 73.7 ± 11.4 75.0 ± 5.0 52.6 ± 4.8 51.3 ± 7.2 42.1 ± 9.8 80 32.5 ± 10.1 52.6 ± 9.8 19.7 ± 6.9 43.4 ± 7.2 28.9 ± 7.9 200 25.7 ± 8.9 36.8 ± 5.7 18.4 ± 6.3 44.7 ± 6.6 0.0 ± 0.0 400 36.8 ± 13.6 43.4 ± 5.0 0.0 ± 0.0 34.2 ± 8.2 0.0 ± 0.0 (nl/ml) I50 56 94 42 42 18

37

מבחן ANOVA דו כיווני לבחינת השפעת מקור וריכוז השמן האתרי על אחוז הנביטה בזרעי חיטה מראה כי,

קיים הבדל מובהק בין סוגי השמן האתרי ובין הריכוזים השונים (F 25, 94 = 27.06, P<0.0001).

למרות העובדה שלריכוז השמן האתרי השפעה מובהקת, אוחדו תוצאות הריכוזים השונים למבחן ANOVA חד

כיווני, כדי לבחון את ההבדל בהשפעת סוג השמן האתרי על הנביטה. נמצא כי כל השמנים שנבדקו נבדלים

בהשפעתם על הנביטה במובהק מהביקורת. estragole, t-anethole ושמן אתרי מכמוטיפ באר חיל העשיר ב- t-anethole אינם נבדלים זה מזה בהשפעתם על הנביטה באופן מובהק (איור ג.15). שמן אתרי מכמוטיפ הר

דוב העשיר ב- estragole אינו נבדל בהשפעתו המעכבת על נביטת החיטה, מזה של estragole ומזה שהופק

מכמוטיפ באר חיל אך נבדל מ- t-anethole. לעומת זאת שמן אתרי שהופק מעשב לימון בעל פיטוטוקסיות

כפולה בהשוואה לשמן אתרי שהופק מכמוטיפ באר חיל ונבדל ממנו במובהק אך אינו נבדל במובהק מזה של

כמוטיפ הר דוב העשיר ב- estragole (איור ג.15).

120 100

שיעור F 25, 94 = 27.06, P<0.0001 80

a 60 הנביטה

%) 40 b bc bc 20 cd מביקורת

( d

0 עשב לימון שומר הר שומר באר t- anethole estragole ביקורת דוב חיל

איור ג.15: סיכום שיעורי הנביטה (% מביקורת) של זרעי חיטה תרבותית שנחשפו לריכוזים שונים של שמן אתרי ממקורות שונים, 48 שעות לאחר הרטבה נתונים ממוצע ± SE. a,b,c,d אותיות המייצגות הבדלים מובהקים (Bonferroni multiple comparison).

ההשפעה הפיטוטוקסית של ריכוזים שונים של שמן אתר, שהופק מפירות שומר מכל אחד משני הכמוטיפים,

נבדקה גם על התארכות השורשון בזרעי חיטה תרבותית (איורים ג.16 ו-ג.17). נמצא כי בריכוז של nl/ml

200, כל הטיפולים נבדלים באופן מובהק מהביקורת לאחר יומיים, שלושה ושישה ימים מהרטבה. אך עם זאת

כבר בריכוז של nl/ml 40 חל עיכוב בהתארכות השורשון, בעיקר בטיפול ב-estragole ובשמן משומר העשיר

ב- estragole מכמוטיפ הר דוב (איור ג.16). בריכוז של nl/ml 400 התארכות השורשונים נעצרת כמעט

38 לחלוטין, בעיקר בשמן אתרי המופק משני הכמוטיפים וב-estragole. השוואה בין השמנים האתרים מהמקורות

השונים בריכוז של nl/ml 200 (איור ג.17) מראה כי חשיפה ל-estragole גורמת לעיכוב גבוה יותר מזו של

שמן אתרי שהופק מכמוטיפ באר חיל בתחילת הניסוי, אך כעבור 6 ימים אין הבדל ביניהם ברמת העיכוב על

התארכות השורש.

estragole 100 anethole MD BH 80 * F 8,1 8= 37.41,P<0.0001

F1 = 19.11, P<0.0001 oil 60 F2 = 56.34, P<0.0001 concentration

40 F3 = 6.62, P<0.003 oil* concentration

20

0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 ריכוז השמן (nl/ml)

איור ג.16 : אורך שורשון (% מביקורת) של זרעי חיטה תרבותית שנחשפו לפאזה הגזית של סוגי שמן אתרי שונים בריכוזים שונים, 3 ימים לאחר ההרטבה. אורך ממוצע בביקורת היה 29.1 מ"מ. נתונים ממוצע ± n = 3 SE * ANOVA דו כיוונית לבחינת ההשפעה של סוג השמן והריכוז על אורך השורשון.

estragole anethole 100 MD BH 80

60

40

20

0 123456 ימים מהרטבה

איור ג.17: התארכות השורשון ( % מביקורת) של נבטי חיטה שנחשפו לפאזה הגזית של שמן אתרי משני הכמוטיפים בריכוז של 200nl/ml לאחר 48 שעות. אורך ממוצע בביקורת נע בין 20 מ"מ לאחר יומים מהרטבה ועד 41 מ"מ לאחר 6 ימים מהרטבה. נתונים ממוצע ± SE של שלוש חזרות

39 בדיקת ההשפעה האוטוטוקסית של השמן האתרי המופק משני הכמוטיפים על נביטה של יחידות תפוצה של

שומר מכמוטיפ באר חיל, העשיר ב-t-anethole (איור ג.18), מראה כי השפעה אוטוטוקסית קיימת כבר

בריכוז של nl/ml 40. עיכוב נביטה של I50) 50%) על ידי שמן אתרי שהופק משני הכמוטיפים של השומר

הינו זהה, ומתקיים בריכוז של I50 = 35 nl/ml. אורך השורשונים בריכוז זה נע בין 73-98% מביקורת.

חשיפה לפאזה הגזית של שמן אתרי בריכוז של nl/ml 200 שהופק מכמוטיפ העשיר ב- estragole, גורמת

לעצירה כמעט מוחלטת בנביטה, לעומת שיעור נביטה של 23% מביקורת בכמוטיפ העשיר ב- t-anethole. עם

זאת ANOVA חד כיוונית ומבחן Post Hoc-Bonferroni מראים כי שני הכמוטיפים, הנבדלים באופן מובהק

מהביקורת, אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק בהשפעתם על אחוז הנביטה והתפתחות השורשון, כנראה בגלל

השונות הגבוהה בתגובת יחידות התפוצה לשמן האתרי.

ביחידות תפוצה של כמוטיפ MD שיעור הנביטה היה נמוך יחסית גם בביקורת (24% לעומת 59.2% בכמוטיפ

BH), מאחר ונביטת זרעים בכמוטיפ זה מאוחרת יותר. תנאי הניסוי המתקיימים במבחנות סגורות המונעות

כניסה ויציאת אוויר, אינם מאפשרים בדיקת נביטה במועד מאוחר יותר.

שמן מכמוטיפ MD 100 A שמן מכמוטיפ באר חיל שיעור

80

* F 6,26 = 15.40, P<0.0001 60 הנביטה

%) %) F1 = 0.82, P = 0.37 oil 40 F2 = 56.34, P = 0.004 concentration

מבקורת

( 20 F3 = 0.85, P = 0.44 oil* concentration 0

100 B ** F 6,26 = 12.42, P<0.0001 אורך 80 F1 = 0.70, P = 0.41 oil 60

F2 = 20.36, P = 0.004 concentration השורשון 40 F3 = 4.3, P = 0.024 oil* concentration %) %) 20 מבקורת

( 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400

ריכוז השמן (nl/ml)

איור ג.18: ההשפעה האוטוטוקסית של שמן אתרי שהופק מפירות של כל אחד משני הכמוטיפים על נביטת יחידות תפוצה של שומר מהכמוטיפ העשיר ב-BH ) t-anethole) שנחשפו לריכוזים שונים של השמן, שישה ימים לאחר הרטבה. A. שיעור הנביטה (% מביקורת). שיעור הנביטה הממוצע בביקורת היה 59.2% ± 7.9 B. אורך השורשון ( % מביקורת). אורך שורשון ממוצע בביקורת היה 14.9 ± 4.3 מ"מ נתונים ממוצע ± SE של 3 חזרות בנות 20 זרעים כל אחת * ANOVA דו כיוונית לבחינת ההשפעה של סוג השמן והריכוז על % הנביטה. ** ANOVA דו כיוונית לבחינת ההשפעה של סוג השמן והריכוז על אורך השורשון.

40 ביחידות התפוצה של הכמוטיפ MD, הרגישות לשמן האתרי המופק מאותו כמוטיפ היתה גבוהה ולא חלה נביטה

גם בריכוז של nl/ml 40. לעומת זאת בחשיפה לשמן המופק מהכמוטיפ העשיר ב-t-anethole נבטו הזרעים

בריכוז של nl/ml 40 בשיעור של 33.3% מביקורת ואורך השורשון בזרעים שנבטו הגיע ל- 62.0%

מביקורת. בריכוזים גבוהים יותר לא התרחשה נביטה.

ג.3 דיון ומסקנות

השוואה שנערכה בהרכב ובתכולת האולאורזין בין שני כמוטיפים של שומר פשוט הגדלים בישראל מלמדת כי

שוני בהרכב הכימי בין הכמוטיפים קיים באברי הצמח השונים ובמהלך האונטוגנזה, ונשמר גם בהרכב האוויר

אשר בסביבת הצמח.

ג.1.3. השוואת ההרכב הכימי בין אברי הצמח השונים במהלך האונטוגנזה

בהשוואה בין אברי הצמח השונים נמצא כי בשני הכמוטיפים קיים הבדל גדול מאוד בהרכב האולאורזין בין

השורש לבין חלקי הנצר העל אדמתיים (עלים פרחים ופירות). עם זאת, הפנילפרופנואידים מהווים את המרכיב

העיקרי באולאורזין, הן בשורשים (88%) והן בחלקי הנצר השונים וביחידות התפוצה (65-89%). בשורש

המרכיבים העיקריים הם הפנילפרופנואידים: dillapiole ,apiol ו- myristicin (איור א.1) (המצוי באחוז

גבוה יותר בכמוטיפ הר דוב), ובשורש הבוגר גם המונוטרפן α -terpinolene (טבלה ג.4). בשורש הבוגר

הכמוטיפ האנתולי מכיל יותר (פי apiole (2 ואילו הכמוטיפ האסטרגולי מכיל יותר (פי dillapiole (3.5.

(Stahl-Biskup and Wichtmann (1991 מזכירים במחקרם על הרכב השמן האתרי בשורשי שומר

מהוריאנט F. vulgare var. azoricum, הרכב דומה לזה של כמוטיפ באר חיל, אך ביחסים שונים במקצת.

במחקרם נמצא כי המרכיבים העיקריים בשורש הבוגר היו: myristicin ,(36.0%) α-terpinolene apiol (22.9%), (24.7%) ומעט dillapiole (5.3%). לעומתם מציינים (Keller (1992 ו-

(Muckenstrum et al. (1997 כי הרכב השמן האתרי בשורשי שומר פשוט, דומה בזנים השונים, והמרכיב

העיקרי הינו הפנילפרופנואיד - dillapiole (90%). גם (Lamarti et al. (1993 מדווח על dillapiole

כמרכיב העיקרי (56%) בנבטים של שומר פשוט המלווה ב: t-anethole ,(13.6%) α-phellandrene

(apiole ,(11.5% (2%), ו- myristicin (1.6%) ותכולת נמוכה של estragole (0.9%). יתכן וההבדלים

נובעים מתנאי גידול שונים וגם מהבדלים בגילאי השורשים בזמן הבדיקה.

41 בהשוואה לשורשים, המרכיבים העיקריים באברי הצמח העל-קרקעיים (עלים, עמודי תפרחות, פרחים ופירות)

הם הפנילפרופנואידים: estragole או t-anethole בהתאם לכמוטיפ, והטרפנים: limonene ו-fenchone

ובכמוטיפ MD מצוי גם α-phellandrene המצוי ברמה נמוכה מאוד בכמוטיפ BH. הכמוטיפ BH עשיר יותר

ב- limonene ועני יותר ב- fenchone בהשוואה לכמוטיפ MD. בשני הכמוטיפים מצויים באברי הצמח העל-

קרקעיים גם מעט α-pinene ו- γ-terpinene (איור ג.8).

גם בכמנון האניס (Pimpinella anisum) (סוככיים) נמצא כי הפנילפרופנואידים מהווים את המרכיב העיקרי

הן בשורש והן בפירות, אך קיים הבדל בתכולתם: 76.9% בשורשים ו- 94.8% בפירות. כמו כן קיים הבדל

בסוג התרכובות. בפירות t-anethole מהווה את המרכיב העיקרי (92.5%) והוא מלווה גם ב-estragole

(2.2%). לעומת זאת, בשורשים המרכיב העיקרי t-epoxypseudoisoeugenol 2-methylbutyrate

(70.2%) והוא מלווה ב- t- pseudoisoeugenol 2-methylbutyrate (4.7%) ו- t-anethole (2%)

. (Santos et al., 1998)

בשני הכמוטיפים, ההבדלים בתכולה בין אברי הצמח הוגטטיביים והרפרודוקטיביים מתבטאים בתכולת הכללית

של האולאורזין ובתכולה היחסית שבין המרכיבים ופחות בסוג החומרים (איור ג.8). בפירות ובפרחים תכולת

האולאורזין גבוהה, בהשוואה לחלקים אחרים. ה- estragole או ה-t-anethole מהווים בכמוטיפים השונים את

המרכיב העיקרי בכל אברי הצמח העל-קרקעיים. בנוסף לכך, בפירות מרכיבים נוספים הבולטים בתכולתם

בשני הכמוטיפים הם fenchone ו- limonene. בפרחים, בכמוטיפ מבאר חיל אחוז ה- limonene וה- -γ terpinene גבוה יחסית לפירות, ואילו ה- fenchone נמצא בשיעור נמוך מאוד בהשוואה לכמוטיפ MD.

בעלים של שני הכמוטיפים שהרכבם דומה לפירות ניתן למצוא אחוז גבוה יותר של α-pinene יחסית לפירות

(איור ג.8). דמיון בין המרכיבים וביחס כמותי שונה, בין החלקים הוגטטיביים והפירות, נמצא גם במחקרים על

זני שומר שונים (Akgul and Bayrak, 1992; Hornok, 1992; Marotti et al., 1994

(Bernath et al., 1996

בנבטים של שני הכמוטיפים, הפסיג והתת פסיג (טבלה ג.3) מכילים בעיקר מרכיבים האופייניים לשורש כמו apiole, ו-dillapiole, אך גם מרכיבים האופייניים לעלה כמו: t-anethole ,limonene או estragole בהתאם

לכמוטיפ. מקור החומרים בפסיגים ובתת פסיג עשוי להיות מייצור מקומי או שהם מועברים לשם מהשורש

ומהנצר המתפתח. כמו כן, יתכן שמקורם מקליפת הפרי של הדו זרעון הנובט, כלומר מתוצרי הייצור בצמח האם

42 ולא בייצור מקומי של הנצר הצעיר.

תכולת האולאורזין הכללית, הקטנה יותר בפסיגים ובשורשים, בהשוואה לאברי הצמח העל-קרקעיים, וההרכב

השונה, עשויים לרמז על תפקוד שונה של מרכיבי האולאורזין באברי הצמח העל-קרקעיים לעומת האברים

התת-קרקעיים החשופים לתנאי סביבה שונים ולהתקפה של בעלי חיים שונים. myristicin (איור א.1), המהווה מרכיב המצוי גם בשמן אתרי של אגוז מוסקט ( Myristica fragrans),

פטרוזיליה ושבת ריחני, ידוע כחומר נוגד חרקים. תכולה של 10mg/kg לא נמצאה טוקסית לעכברים, אך ריכוז

של mg/kg 6-7 מספיקה כדי לגרום הזיות באדם (Shulgin, 1967; Hallstrom and Thuvander, 1997).

לעומתו, dillapiole מראה פעילות חזקה המאריכה שינה בעכברים (Honda et al., 1988). כמו כן הוכחה

גם פעילות סינרגיסטית של dillapiole עם נוגדי חרקים (Dhingra and Sarup, 1979). שמן אתרי שהופק

מפירות ומעלים של פטרוזיליה המכיל בין היתר גם dillapiole ,apiole ו-myristicin נמצא בעל פעילות

אנטי-בקטריאלית ואנטי-פיטריתית למגוון אורגניזמים (Minija and Thoppil, 2002). כמו כן, dillapiole, apiole ו-myristicin משמשים כמקור לסינתזה של אמפיטמינים מסויימים (Shulgin, 1967).

בשומר, שורשים צעירים מאוד מכילים גם estragole או-t-anethole בהתאם לכמוטיפ, הר דוב או באר חיל.

אולם בהמשך ההתפתחות, ה-estragole או ה-t-anethole נעלמים (איור ג.5). עובדה זו תומכת בהנחה שהם

אינם מסונתזים בשורש ויתכן שמקורם מקליפת הפרי.

בשורשים של שני הכמוטיפים, במעבר משלב של שורש צעיר (בן חודש) לשלב של שורש בוגר (3 חודשים),

השינויים מתבטאים בעיקר בעליה בתכולה יחסית (%) של dillapiole ו- α-terpinolene, ובירידה בתכולת

ה- apiole, ובכמוטיפ הר דוב גם ירידה ב-myristicin (איור ג.5). למרות כל השינויים הללו, התכולה היחסית

של הפנילפרופנואידים (%) במהלך התפתחות השורשים נשארת קבועה (86-89%) (טבלה ג.4). תוצאה זו

מחזקת את ההנחה שיש קשר בין הפנילפרופנואידים השונים במסלול הביוסינתטי ויתכן כי העלייה בצבירת ה - dillapiole קשורה לירידה בתכולת ה-apiole.

המונוטרפנים: limonene ו- γ-terpinene המצויים בכמות גבוהה יותר בנצר, קיימים גם בשורש הצעיר אך

תכולתם היחסית יורדת עם התפתחות השורש. יתכן והם מהווים חומר מוצא ל- α-terpinolene ההולך

ומצטבר עם התפתחות השורש. ממצאים אלה תואמים בחלקם לממצאים של Stahl-Biskup and

(Wichtmann (1991 בשומר מהוריאנט F. vulgare var. azoricum, המצביעים על ירידה בתכולה יחסית

43 (%) ה- limonene ,apiol, dillapiole וה- t-anethole לעומת עליה ניכרת באחוז ה-α- terpinolene וה - myristicin עם התפתחות השורש.

עם התפתחות העלים בשושנת העלים של הצמח הצעיר (איור ג.3) ולאורך עמוד התפרחות (טבלאות ג.6, ג.7)

בצמח הבוגר, חלה ירידה חדה בתכולת האולאורזין (mg/gfw 0.1 1.6-) הנובעת מירידה בתכולת כל

המרכיבים ובעיקר של ה-estragole בכמוטיפ הר דוב ו-t-anethole בכמוטיפ באר חיל. רמות נמוכות של

מרכיבי השמן האתרי בעלים הבוגרים בהשוואה לעלים הצעירים תואמות לממצאים במינים אחרים, כמו ב:

ריחן מצוי (Werker et al., 1993) (Ocimum basilicum), ונענה (Mentha pulegium) (שפתניים)

(Stengele and Stahl-Biskup,1993), וברוש עקוד (Conium maculatum) (סוככיים)

(Corsi and Biasci, 1998). יתכן כי ירידה זו נובעת מירידה בכמות וצפיפות ביבי השמן

(Sangwan et al., 2001), ו/או ירידה בפעילות אנזימטית ( ;Lewinsohn et al., 2000

Gershenzon et al., 2000). מעקב אחר מהלך התפתחות העלים בצמחים הצעירים מראה כי עלים בני 4

שבועות נמצאים בתהליך כמישה, והצמח מצמיח עלים חדשים. סביר להניח שיש לצמח יתרון בהפסקת תהליכי

ייצור מרכיבי השמן האתרי בשלב ההתייבשות או כבר בשלב הקודם לו. בצמח הבוגר, התייבשות עלים קיימת

גם בשושנת העלים וגם בעלים התחתונים שבעמוד התפרחות. ההתייבשות חלה לקראת שלב הפריחה, ויתכן כי

קיימת העדפה של חלוקת משאבים לטובת הפריחה. קיימת האפשרות כי הירידה בתכולת השמן האתרי בעלים

המתייבשים נובעת מקליטה של חומרים מהעלים אל האיברים הרפרודוקטיביים דרך ביבי השמן

(Dudai et al., 1992). מונוטרפנים נחשבים כחומרים העוברים מחזור מהיר בצמחים, אבל העדויות לכך

באות ממחקרים שבוצעו על איברים מנותקים. לעומת זאת, מחקרים שבוצעו בעלים שלמים של צמחים שונים,

אינם תומכים בהנחה זו (Gershenzon et al.,1993 Mihaliak et al., 1991 ). לכן ניתן להניח, כי הירידה

בתכולה קשורה בהפסקת תהליכי ייצור בשילוב עם שחרור חומרים שנוצרו בשלבים מוקדמים לאוויר החיצוני.

בדומה לעלים, גם לאורך עמוד התפרחות נמצא כי תכולת האולאורזין באזור צעיר של עמוד התפרחות גבוהה

פי 5-10 מזו של איזור בוגר. בכמוטיפ הר דוב תכולת האולאורזין באזור צעיר הינה mg/g fw 2.2 לעומת mg/g fw 0.25 באזור בוגר (טבלה ג.6), ואילו בכמוטיפ באר חיל תכולת האולאורזין באזור צעיר mg/g fw 1.56, לעומת mg/g fw 0.33 באזור בוגר (טבלה ג.7).

44 בניגוד לאיברים הוגטטביים, עם התפתחות הפרי, קיימת עליה בתכולת האולאורזין (µg/fruit) בשני

הכמוטיפים, הנובעת בעיקר מעליה בתכולת הפנילפרופנואידים, וכן מעליית תכולת המונוטרפנים: limonene

ו- fenchone (איור ג.6). העלייה בתכולת האולאורזין מתבטאת בעיקר במעבר מפרי צעיר (שלב 1) ועד לפרי

חצי בשל (שלב 3). בהנחה שכל השמן האתרי מתרכז בביבים, צפויה להיות התאמה בין נפח הביבים לבין

תכולת השמן האתרי. אולם השוואה בין השינוי בתכולת השמן האתרי במהלך הבשלת הפרי לבין השינוי בנפח

ביבי השמן בקליפת הפרי (איור ג.12A) מלמדת כי, הנפח הכללי של הביבים לפרי עולה משלב של ניצן ועד

לפרי שעוותי (שלב 2), ואינו משתנה באופן משמעותי עם ההבשלה. לכן ניתן להניח כי תכולת השמן איננה

תלויה רק בנפח הביבים אלא גם ברמת הייצור של מרכיבי השמן האתרי השונים. בשלבי ההתפתחות הצעירים,

בעיקר במעבר מניצן לפרח פתוח, שטח חתך הרוחב של ביבי השמן עולה ואילו רקמת האנדוספרם של העובר

עדיין לא התפתחה (איור ג.9). אך עם התפתחות הפרי ולמרות העלייה בנפחו, שטח הביבים אינו גדל באופן

משמעותי, כנראה בגלל גדילת העובר והתפתחות האנדוספרם בזרע, היוצרת לחץ על הביבים כלפי דופן קליפת

הפרי (pericarp) וכנראה, גורמת להם לשנות את צורתם מצורה מעגלית לאליפטית (איור ג.9). שינוי בצורת

הביבים עם התפתחות הביב דווחה גם במחקר על אוכלוסיות שומר בהונגריה (Bernath et al., 1999) וגם

ברוש עקוד (Conium maculatum) (סוככיים) (Corsi and Biasci, 1998).

הירידה בתכולת השמן האתרי (איור ג.12B) במעבר מפרי חצי בשל (שלב 3) לפרי בשל (שלב 4) גבוהה מאוד

בהשוואה לתכולת האולאורזין בשלבים אלה (איור ג.6). הסיבה לכך קשורה כנראה בשיטת ההפקה. מיצוי

האולאורזין בהקסאן, נעשה לאחר כתישת הפירות ומיצוי האולאורזין מכסימלי. לעומת זאת זיקוק השמן במים

נעשה ללא כתישת הפרי. התעבות דפנות תאי האפיתל המקיפים את הביב ודפנות התאים הסמוכים לביבי השמן

בפרי הבשל (איור ג.9D) מונעת כנראה את יציאת השמן בזמן הזיקוק, וכנראה שבפרי הבשל (שלב 4) לא היה

מיצוי מכסימלי של השמן.

הרכב דפנות תאי האפיתל ודפנות התאים הסמוכים לביבי השמן לא נבדק בשומר. כידוע, לתאים מלוגננים

פלואורסנציה טבעית לכן, דפנות התאים המאירים באור ירוק-צהוב מעידים על ליגניפיקציה שלהם (ג. 4-11).

במקרה שלנו צביעה עם פלורוגלוצינול לנוכחות ליגנין אינה יעילה מאחר והדפנות בעלות צבע חום אדמדם

באופן טבעי (איור ג9D). דפנות מלוגננים נמצאו גם בתאים בודדים אוגרי שמן אתרי, המצויים בצד האבאקסילי

של מזופיל העלה בעשב לימון (Lewinsohn et al., 1998) (Cymbopogon citratus).

45

לסיכום ניתן להסיק כי:

• ההבדל העיקרי בין הכמוטיפים מתבטא בעיקר בהרכב הפנילפרופנואידים. בכל חלקי הנצר (פרחים, פירות

עמוד תפרחות ועלים) ההבדל בא לידי ביטוי בהבדלים בין ה- estragole המצוי בעיקר בכמוטיפ הר דוב

ו- t-anethole המצוי בעיקר בכמוטיפ באר חיל. בשורש הבוגר ההבדל בין הכמוטיפים מתבטא בהבדלים

בתכולת dillapiole המצוי בעיקר בכמוטיפ הר דוב לעומת apiole המצוי בעיקר בכמוטיפ באר חיל.

ƒ בשני הכמוטיפים קיימת ייחודיות גם במונוטרפנואידים: כמוטיפ הר דוב מתאפיין ב- -α phellandrene המצוי בכל אברי הצמח. בכמוטיפ באר חיל הוא מצוי, אך ברמות נמוכות יחסית

בעלים ועמודי תפרחות בלבד. כמוטיפ באר חיל עשיר יותר ב- limonene ועני יותר ב- fenchone

בהשוואה לכמוטיפ MD. הבדלים אלו מתבטאים בכל אברי הצמח ובעיקר בפרי.

ƒ למרות השינויים שחלים במהלך האונטוגנזה בתכולת הפנילפרופנואידים באיברים השונים, התכולה

היחסית (%) של estragole או t-anethole מכלל הפנילפרופנואידים, קבועה באיברים העל אדמתיים.

ואילו בשורשים, אחוז הפנילפרופנואידים מכלל האולאורזין נשאר בדרך כלל קבוע.

ג.2.3. ההרכב הכימי ושיעור הפליטה של נדיפים מאברי צמח שלמים

התעבות דפנות התאים המקיפים את ביבי השמן האתרי כפי שנצפתה עם התפתחות הפרי עשויה להסביר את

הנידוף הנמוך מאברי הצמח השונים. ההבדל ברמת הנידוף בין פירות שלמים (0.1-0.4% מכלל האולאורזין)

לבין ההתנדפות מהעלים (7-10%) (טבלה ג.8) אינה מובהקת ונובעת כנראה גם מההבדל הגדול בכמות

ובשטח הפנים של איברים אלה. זאת, למרות העובדה שהעלים לא נותקו מהצמח בעוד שהענפים נושאי הפרחים

והפירות נותקו מצמח האם ולכן צפוי שהאזורים המנותקים יגבירו את עוצמת הנידוף. תוצאה זו עשויה להסביר

את הירידה בתכולת האולאורזין עם התפתחות העלים (טבלות ג.6, ג.7). העלייה בשטח פני העלה עם

התפתחותו, מגדילה את כושר הנידוף ממנו ותורמת לירידה בתכולת הנדיפים.

גורמים נוספים כמו: כמות ביבי שמן ליחידת שטח, או עובי שכבת הקוטיקולה או רמות ייצור שונות עשויות גם

הן לתרום להבדל (Gershenzon et al., 2000).

46 נמצא כי הרכב הנדיפים המשתחררים בקרבת הצמח שונה מאוד מהרכבם בצמח, ומתבטא בעיקר ביחסים

הכמותיים שבין α-pinene והפנילפרופנואידים. בשני הכמוטיפים, תכולת הפנילפרופנואידים בשכבת האוויר

הסמוכה לאיבר הנבדק נמוכה פי 3-10 מתכולתם בתוכו. לעומת זאת התכולה היחסית של α-pinene,

(20-50%), גבוהה פי 4-10 בקרבת הצמח מתכולתו היחסית במיצוי (3-5%) (איור ג.13). עם זאת, בשני

הכמוטיפים, הרכב האוויר בסביבת העלים דומה לזה שבסביבת הפרחים והפירות. ממצאים אלה שונים מנתונים

שהתקבלו במחקר שנעשה בצמח Chrysanthemum coronarium (מורכבים), המצביעים על הבדל ניכר

בהרכב הנדיפים המשוחררים מפרחים לשוניים וצינוריים בקרקפת לעומת העלים, ובעיקר בין האבקנים

לחלקים האחרים (Flamini et al., 2003).

למרות שהפנילפרופנואידים הינם המרכיבים הדומיננטים באולאורזין, הנדיפות שלהם לאוויר מכל אברי הצמח,

היא נמוכה ביותר בהשוואה לתרכובות כמו fenchyl acetate ,α- phellandrene ,α-pinene ו- limonene

(טבלה ג.8). ההבדל המשמעותי בתכולה היחסית בין מרכיבי הנדיפים המשתחררים לאוויר, להרכב הנדיפים

המצויים במיצוי האולאורזין באברי הצמח שנבדקו (איור ג.9) נובע מהבדלים בלחץ האדים בין הנדיפים

השונים ובמאגר החומר המצוי ברקמה (Dement et al., 1975). לחץ אדים גבוה מאוד של α-pinene

בטמפרטורה של Pa = 25 0C 550 לעומת Pa 8.45 של anethole, או של estragole (אין הבחנה בין

האיזומרים) (http://www.epa.gov), עשוי להסביר את תכולתו הגבוהה באוויר שבסביבת הצמח, למרות

תכולתו הנמוכה במיצוי.

למרות משקלם המולקולרי הזהה, קיים ההבדל בשיעור ההתנדפות בין t-anethole ל-estragole . אובדן ה - estragole ביממה לגרם רקמה (1.4-3.3%) גבוה מאובדן ה-t-anethole (כ0.2-0.8%-) (טבלה ג.8).

ההבדל נובע כנראה מלחץ האדים הכפול של ה - estragole בהשוואה לזה של ה-t-anethole . (ב- 0C 20

לחץ אדים של mm Hg (6.67 Pa) = anethole 0.05 ושל ה- mm Hg (12.0 Pa) = estragole 0.09

.(http://www.epa.gov)

חישוב רמת הנידוף יכול לשמש גם כמדד כללי להערכת יכולת הייצור של המרכיבים הנדיפים השונים. תרכובת

שרמת התנדפותה גבוהה, מחייבת ייצור בשיעור גבוה והמחיר הנדרש לכך מהצמח עולה בהתאם. מבין מינים

שונים של צמחים ים תיכוניים בהם נמדדה פליטה של טרפנים נמצא כי, באורן ירושלים (Pinus halepensis)

נפלטו טרפנים בשיעור הגבוה ביותר (µg/g dw.·h-1 86) ובלוטם (Cistus monspeliensis) נמדד השיעור

47 הנמוך ביותר (Llusià and Peñuelas, 1998 ) (4 µg/g dw.·h-1). בהשוואה לנתונים אלה, שיעור פליטת

כלל הטרפנים מעלים של שומר משני הכמוטיפים, היה דומה לערכים שנמדדו בלוטם: µg/g dw.·h-1 3.07

בכמוטיפ הר דוב ו- µg/g dw.·h-1 3.75 בכמוטיפ באר חיל. בהשוואה לטרפנים, שיעור פליטת

הפנילפרופנואידים מהעלים היה נמוך ובשיעור גבוה יותר בכמוטיפ הר דוב המכיל µg/g dw.·h-1) estragole

1.4) בהשוואה לכמוטיפ באר חיל המכיל בעיקר µg/g dw.·h-1) t-anethole 0.2).

התוצאות שהתקבלו בעבודה זו, מלמדות על האפשרות שחרקים מאביקים או כאלה הניזונים מהפירות עשויים

להבחין בשומר גם ממרחק. ניחוח הצמחים מתקבל הודות למולקולות אורגניות נדיפות בעלות משקל מולקולרי

נמוך (פחות מ- 400 דלתון). על האופן בו מגיבים חרקים למרכיבי הריח של פרחים ידוע מעט מאוד אך ברור

שהמאביקים מסוגלים להבחין בין תערובות ריח שונות, נפחים וריכוזים שונים של ריח, ולכך חשיבות בהצלחת

הרבייה בצמחים ( Pellmyr, 1986; Shafir et al ,1999; Pichersky and Gang, 2000; Pichersky and

.(Gershenzon, 2002; Dudareva and Pichersky, 2000; Schiestl and Ayasse, 2002

α-pinene ידוע כחומר המושך סוגים שונים של חיפושיות קליפה ( Schroeder and Lindelöw, 1989

Göran, 1990). מחקרים שונים מעידים על משיכה של מגוון חרקים ל-t-anethole כמו: חיפושיות בוגרות

ולרוות ( ;Metcalf and Lampman, 1989; Lehman, 1932; Cherry et al.,1996; Imai et al., 1998

Tóth et al., 2004), דבורים (Ladd and Tew, 1983) וזבובים (Cherry, 1998). לפי הממצאים של

(t-anethole Cherry et al., (1996 מושך זכרים ונקבות של חיפושית באותה מידה, ולכן פועל כנראה

כפיתיון מזוני ולא כפיתיון מיני. בעבודות אלה השתמשו במלכודות המכילות 10 מ"ל t-anethole או תערובת

של t-anethole עם חומרים אחרים, במשך 24 שעות, כדי ללכוד חרקים טורדניים. כמות זו גבוהה מאוד.

בכמוטיפ באר חיל תכולת ה- t-anethole בפרי בשל למחצה היא µg/fruit 164.9 (איור ג.6) תכולת החומר

במלכודת שוות ערך לשיח שומר מכמוטיפ זה המכיל בו זמנית כ- 6000 פירות בשלים למחצה. מאידך, שחרור t-anethole לאוויר מוגבל ביותר.

המשיכה ל-estragole ידועה פחות ומוזכרת כמרכיב המצוי בצמחי דקל השמן Elaeis guinensis במלאזיה,

הגורם למשיכת ספציפית של בוגרי החידקונית - Hussein et al., 1991) Elaeidobius kamerunicus).

48

לסיכום ניתן להסיק כי:

ƒ קיים הבדל משמעותי ביחסים הכמותיים שבין המרכיבים השונים בין הנדיפים המשתחררים מאברי הצמח

לאוויר לבין הנדיפים המצויים במיצוי אולאורזין של אותם אברים.

• למרות המשקל המולקולרי הזהה, רמת ההתנדפות של t-anethole (0.5%) נמוכה מזו של estragole

.(2.3%)

ג.3.3. הפוטנציאל הפיטוטוקסי והאוטוטוקסי של השמן האתרי המופק משני כמוטיפים

נמצא כי חשיפה של זרעי חיטה תרבותית לפאזה הגזית של השמן האתרי המופק משני הכמוטיפים גורמת

לעיכוב משמעותי בנביטה ובהתפתחות השורשונים החל מחשיפה לריכוזים נמוכים (nl/ml 20). ההשפעה באה

לידי ביטוי בעיקר בפגיעה בהתארכות השורשים (איור ג.16). נמצא כי ההשפעה הפיטוטוקסית של שמן אתרי

של השומר קיימת גם על יחידות התפוצה של השומר משני הכמוטיפים, החל מחשיפה לריכוז של nl/ml 40

(איור ג.18).

רעילות עצמית של שומר (F. vulgare var. azoricum) מוזכרת על ידי (Kohli et al., (2001 יחד עם

גידולים חקלאיים נוספים המראים אוטוטוקסיות כמו: אורז, חיטה, תירס, אספסת, חמניות, גזר, חצילים,

עגבניות, מלפפון ואפונה. אוטוטוקסיות בצמחים הוכחה גם במחקרים רבים נוספים ( Friedman, 1982

Friedman et al., 1977; Gopal and Stowe 1979; Friedman, and Waller, 1983a; 1983b;

.(Goel, 1993; Tarayre et al., 1995; Inderjit, 1998; Ervin and Wetzel, 2000

לרעילות עצמית עשוי להיות יתרון בויסות האוכלוסייה, בהכוונת הנביטה לעיתוי מתאים ולהגנה מפני פתוגנים

(Friedman and Waller, 1983a). אך עם זאת, יתרון להפרשת אללוכמיקלים כמנגנון המגביר כשירות

בתחרות עם מינים אחרים, יתכן רק במידה וקיים מנגנון המונע מגע עצמי עם החומר הרעיל. לצמח האם עצמו

נשקפת סכנה נמוכה לפגיעה עצמית, מאחר ושחרור החומרים האללופתיים נעשה בשכבת הקרקע העליונה

ואילו שורשי הצמח עמוקים, אך יש סכנה של פגיעה בנביטה של יחידות התפוצה.

בפירות של אמיתה גדולה (Ammi majus) (סוככיים), לדוגמא, נמצאו ריכוזים (0.1%~) של פסורלן

וקסנתוטוקסין המעכבים נביטה של צמחים שונים. פורנוקומרינים אלה מצויים בקליפה החיצונית של הפרי ולא

49 בסביבת העובר (Friedman and Waller, 1983a). יתכן שגם בפירות השומר קיימת הפרדה בין מרכיבי

השמן האתרי לבין העובר על ידי דפנות התאים המקיפים את ביבי השמן האתרי בקליפת הפרי (איור ג.9),

המתעבים עם התבגרות העובר. עם זאת, פיזור גבוה של יחידות התפוצה בסביבות צמח האם והשרת העלים של

שושנת העלים, כפי שנצפה בשדה, עשוי לגרום לעיכוב עצמי של הנביטה. מכאן ניתן להניח שלנמלים אוספות

זרעים כמו נמלת הקציר, יש חשיבות בהרחקת יחידות התפוצה מההשפעה המעכבת בסביבת צמח האם, בנוסף

להפצתם. ואומנם נמלות קציר (.Messor Sp) נצפו אוספות יחידות תפוצה של שומר באופן אינטנסיבי

(תצפיות שלנו בשדה שלא פורסמו).

נמצא כי בהשוואה ל- t-anethole, ל-estragole פוטנציאל פיטוטוקסי גבוה. לדוגמה: בריכוז של nl/ml 200

ההשפעה הפיטוטוקסית של estragole על התארכות השורשונים של חיטה, כפולה בהשוואה ל- t-anethole

(איור ג.16). כתוצאה, שמן אתרי המופק מכמוטיפ הר דוב העשיר ב-estragole יותר פיטוטוקסי משמן אתרי

המופק מכמוטיפ באר חיל העשיר ב-t-anethole (טבלה ג.9 ואיורים ג.-16ג.18).

בשני הכמוטיפים נמצא כי ההשפעה הפיטוטוקסית של השמן האתרי על כל מרכיביו, גבוהה מההשפעה של

המרכיב העיקרי בו. לדוגמה: בריכוז של nl/ml 200 לשמן אתרי המופק מכמוטיפ הר דוב השפעה פיטוטוקסית

הגדולה פי עשר על ההתארכות של שורשוני החיטה, בהשוואה לזו של estragole (איור ג.16). לכן אפשרי כי

הפנילפרופנואידים estragole ו-t-anethole מהווים אומנם גורם חשוב הקובע את התכונות הפיטוטוקסיות של

השומר, אך כנראה יש חשיבות גם למרכיבים נוספים כמו limonene ו-fenchone, הידועים כבעלי השפעה

רעילה על צמחים ומיקרואורגניזמים ( ,.Abrahim et al., 2000 Vokou et al., 2002; Kim et al

2002). כמוטיפ הר דוב עשיר יותר ב-fenchone ולעומתו כמוטיפ BH עשיר יותר ב-limonene .

יש לציין שהבדיקה שלנו התרחשה בתנאי מעבדה, והחשיפה הייתה לשמן אתרי שזוקק מצמחי השומר. בגלל

המסיסות הנמוכה של estragole ו-t-anethole במים (g/L in 250C 0.18) והנידוף המועט שלהם (טבלה

ג.8) יש להניח כי בתנאי שדה, הנתונים לשטיפה של גשמים, דרושות כמויות גדולות יותר של חומר צמחי

ליצירת השפעות דומות. בנוסף, בדיקת פיטוטוקסיות במעבדה אינה בהכרח מלמדת על המצב בשדה, מאחר ויש

להתחשב בגורמים סביבתיים נוספים (Inderjit and Weston, 2000; Stowe, 1979). סקירה מקיפה של

עבודות על האפקט האללופתי במערכות טבעיות שנערכה על ידי (Inderjit and Weiner (2001 הראתה

שההשפעה המשמעותית של האללופתיה אינה נעשית דרך השפעה ישירה על הצמח אלא באופן עקיף, למשל

50 דרך השפעתה על מיקרואורגניזמים בקרקע. ואכן, במיצוי מפירות שומר הוכחה פעילות אנטימיקרוביאלית נגד

חיידקים ופטריות ( Marotti et al., 1994; Tanira et al., 1996; Scora and Scora, 1998

Ruberto et al., 2000; Mimica-Duki, 2003) ופעילות נגד חרקים ( Sathiyamoorthy et al., 1997

.(Kim and Ahn, 2001; Bazzoni et al., 1997; Regnault and Hamraoui, 1995; Ho et al., 1997

לסיכום ניתן להסיק כי:

• לשמן אתרי שהופק מפירות של שומר פשוט יש השפעה פיטוטוקסית על זרעי חיטה (I50 =42 nl/ml)

והשפעה אוטוטוקסית על זרעי שומר (I50 =35 nl/ml), הבאה לידי ביטוי בעיכוב נביטה ובעיקר

בפגיעה בהתארכות השורשונים.

• ההשפעה הפיטוטוקסית של estragole על התארכות השורשים גדולה מזו של t-anethole (כפולה

בריכוז של nl/ml 200).

• שמן אתרי המופק מפירות הכמוטיפים של השומר, פיטוטוקסי יותר מהמרכיב הפנילפרופנואידי העיקרי

שלו.

בחינת השאלה אם אכן קיימת אללופתיה בשומר במערכות הטבעיות צריכה להיעשות על ידי מחקרים נוספים,

שייקחו בחשבון את השפעתם של t-anethole ו-estragole על אקולוגית הקרקע מחד ואת השפעתם של תנאי

הסביבה כמו משאבי המזון, אור, זמינות המים על הפעילות האללופתית מאידך.

51 פרק ד': ביוסינתזה של t-anethole ו- estragole מרכיבי השמן העיקריים, ה-t-anethole וה-estragole, המאפיינים את הכמוטיפים השונים בשומר הינם

פנילפרופנואידים המצויים גם בצמחים אחרים ממשפחות שונות. לדוגמה, estragole מצוי גם בלענה דרקונית

(Artemisia dracunculus) (מורכבים) וריחן מצוי (Ocimum basilicum) (שפתניים). t-anethole מצוי

גם בכמנון האניס (Pimpinella anisum) (סוככיים), ב- Ravensara anisata (עריים) ובאניס כוכבי

.(Croteau et al., 2000; Harborne and Baxter, 1995) (Illiciaceae) (Illicium verum)

למרות החשיבות הרפואית והכלכלית של ה-t-anethole וה-estragole, ידוע מעט מאוד על הגורמים

הביוכימיים המשפיעים על ייצור נגזרות הפנילפרופנואידים בשומר. ידועים כיום שני מסלולים בסיסיים ליצירת

פנולים בצמחים: מסלול החומצה השיקמית דרכה נוצרים רוב הפנולים בצמח ומסלול החומצה המולונית,

שלמרות היותה מקור חשוב לתוצרים שניונים של פנולים בפטריות וחיידקים, היא פחות חשובה בצמחים

עילאיים. במסלול החומצה השיקמית מומרות פחמימות פשוטות, מהגליקוליזה וממסלול הפנטוזות לחומצות

אמינו ארומטיות (phenylalanine ו-tyrosine). הפנילפרופנואידים שחלקם הגדול אחראי לארומה ולריח

המיוחדים של הצמחים המייצרים אותם, כדוגמת t-anethole ו- estragole, הינם נגזרות של החומצה האמינית

-phenylalanine , ומסלול הביוסנתזה שלהם קשור במסלול לייצור ליגנין (Croteau et al., 2000).

השלבים הראשונים בביוסנתזה של הפנילפרופנואידים אינם ידועים בשומר, אך ידועים בצמחים אחרים והם

קשורים בפעילות האנזימטית של האנזימים הבאים (איור ד.1):

‰ (phenylalanine-ammonia lyase (PAL, המסלק את הקבוצה האמינית של הפנילאלנין ויוצר את

חומר הביניים החשוב - t-cinnamic acid.

‰ האנזים- (cinnamate 4-hydroxylase (C4H, המוסיף את הקבוצה ההידרוקסילית לחומצה

הצינמית לקבלת .p-coumaric acid.

חומצות אלה משמשות כחומרי מוצא ליצירת מטבוליטים ריחניים רבים (Croteau et al., 2000).

בעזרת מיצויים חלבוניים חופשיים מתאים (cell-free extracts) שהופקו מגבעולים ועלים של שומר פשוט -

וריאנט מתוק, ועל ידי סימון רדיואקטיבי של החומרים הבאים: ,phenylalanine, phenylpyruvic cinnamic, p-hydroxycinnamic acids הוכיח (Kaneko ( 1960a, b שחומרים אלה עשויים להיות חומרי

מוצא ל- Kemmerer and Reichling (1996) .t-anethole הראו שבכמנון האניס (Pimpinella anisum)

52 (סוככיים), במסלול הביוסינתטי לייצור epoxypseudoisoeugenol -2 - methylbutyrate (פנילפרופנואיד

נדיר), t-anol עובר מתילציה ל-t-anethole על ידי האנזים: AOMT) O-methyltransferase באיור ד.1)

התלוי ב- SAM) S-adenosyl-L-methionine) כתורם הקבוצה המתילית. תהליך דומה מתרחש בריחן מצוי

(Ocimum basilicum), בו chavicol עובר מתילציה ל-estragole על ידי האנזים O-methyltransferase

(CVOMT באיור ד.Lewinsohn et al., 2000; Gang et al., 2001, 2002) (1). בדרך דומה נמצא כי

במיצוי אל-תאי מ- isoeugenol ,(Onagraceae) Clarkia breweri , נגזרת של t-anol , עובר מתילציה

ל- Wang and Pichersky 1998) methyl isoeugenol).

הגורם להבדל בין הכמוטיפים עשוי לנבוע גם מפעילות של איזומראזות, אנזימים המקטלזים שינויים מרחביים

או מבניים במולקולה. פעילות של איזומראז המשנה מיקום של קשר כפול C=C במולקולה, עשויה להפוך

anol ל-chavicol, (או ההפך), או להפוך t-anethole ל-estragole (או ההפך) (איור ד.1).

AOMT

CVOMT

איור ד . 1: הצעה למסלול ביוסנתטי לייצור estragole ו-t-anethole המבוססת על מחקרים קודמים בשומר ובצמחים אחרים. cinnamate 4-hydroxylase - C4H , phenylalanine-ammonia lyase - PAL, קיימים במגוון צמחים אך לא הוכחה פעילותם בשומר chavicol O-methyltransferase - CVOMT anol O-methyltransferase - AOMT שפעילותם בשומר הוכחה בעבודה זו. anethole / methyl chavicol isomerase - AMI ,anol /chavicol isomerase – ACI, עד כה לא הוכיחו קיומם בצמחים אחרים והממצאים בעבודה זו לא הוכיחו פעילות משמעותית בשומר, ויתכן שכלל אינם קיימים. יתכן שהרכב הפנילפרופנואידים נקבע על ידי שלבים לא ידועים המסומנים כחיצים עוקבים

מטרת הפרק: בדיקת האפשרות לקיום פעילות אנזימטית של מתילטרנספראזות ואיזומראזות בהקשר לסינתזה של פנילפרופנואידים, בכמוטיפים של שומר פשוט, ובחינת האפשרות כי פעילות כזו תורמת לקביעת ההבדל בהרכב הכימי של השמן האתרי שלהם.

53 ד.1. שיטות וחומרים

כדי לבדוק פעילות של מתילטרנספרזות ואיזומרזות בשומר ובחינת השפעתם על צבירת t-anethole ו- estragole בשני הכמוטיפים [הר דוב (MD) ובאר חיל(BH)], נבדקו בשני הכמוטיפים עלים וקטעי גבעול

בשלושה גבהים לאורך עמודי תפרחות, פרחים ופירות בארבעה שלבי התפתחות שונים. מכל כמוטיפ נדגמו 10

צמחים שונים כבני שנה. כמו כן נלקחו דגימות משורשון, פסיגים ועלה ראשוני בנבטים בגיל 22 יום מזריעה

(או 13 יום מהצצת הפסיגים). בכל אברי הצמח הללו נבדקו גם הרכב ותכולת האולאורזין (ראה סעיף ג.1).

ד.1.1. מתילטרנספראז:

א. הכנת מיצוי חלבוני אל-תאי

דגימות טריות מאברי הצמח השונים (1-2 גרם) נשקלו, נחתכו לחתיכות, והוקפאו בחנקן נוזלי בתוך מכתש

חרסינה המכיל 0.5 ג' חול ו- 0.1 ג' PVPP) polyvinylpolypyrolidone) המשמש לספיחת חומרים

פנולים הגורמים לחימצון החלבונים בעת המיצוי. הדגימות נכתשו עד לקבלת מרקם אחיד עם בופר מיצוי

(1:10w/v) המכיל: (mM bis-Tris pH 7, 10% [v/v] glycerol, 6.6 mM dithiothretiol (DTT 50

mM Na2S2O5 5 ו- PVP-10) polyvinylpyrrolidone (w/v) 1%). התמצית סורכזה במהירות של - g 20,000 במשך 10 דקות ב- 4oC. התרחיף הופרד מהמשקע ועבר ניקוי חלקי.

ב. בדיקת פעילות אנזימטית למתילטרנספראז

µl 2 מיצוי אל-תאי (המכיל כ- μg 1.2 חלבון) הודגר עם μM 10 סובסטראט: chavicol או t-anol (מתמיסה

המכילה (µM ,(1 mM 1% (v/v 18 תורם הקבוצה המתילית (SAM) (איור ד.2) המסומן באופן רדיואטיבי

ב- Amersham) (6 Ci/mol) S-[methyl-3H] adenosyl-L –methionine) בנפח סופי של µl 100 בופר

בדיקה המכיל: (mM bis-Tris pH 7, 10 % [v/v] glycerol, 6.6 mM dithiothretiol (DTT 50

o ו- mM) Na2S2O5 5). התערובת הודגרה למשך שעה ב- C 30. הריאקציה הופסקה על ידי הכנסת 1 מ"ל

הקסאן. המבחנות עברו ערבול בוורטקס וסורכזו למשך דקה ב- g 20,000 לצורך הפרדת הפאזות. פאזת

ההקסאן העליונה, המכילה את ה-t-anethole ו/או ה-estragole החדש שנוצר, המסומן רדיואקטיבית, הועברה

למבחנה המכילה 3 מ"ל נוזל סינטילציה המכיל: ,(g/L 2,5-diphenyloxazol (PPO 4

(g/L 2,2’-p-Phenylen-bis 5-phenyloxazol (POPOP 0.05 , ו- v/v Triton in toluene 10%.

רמת הרדיואקטיביות נמדדה באמצעות מונה סינטלציה (Kontron model 810, Switzerland).

54 הפעילות האנזימטית חושבה ביחידות של katal= 1 mol/sec of substrate) picokatal ) על סמך פעילות

ספציפית של הסובסטרארט ובהתחשב בפקטור התיקון של מונה הסינטלציה.

SAM + AOMT + SAH

OH OCH3

t-anol t-anethole

SAM + CVOMT + SAH

OH OCH3 chavicol estragole

איור ד.2. פעילות של O-Methyltransferase בשומר פשוט. מוצגים המתילציה של t-anol ל- t-anethole על ידי: (SAM: anol O-methyltransferase (AOMT והמתילציה של chavicol ל- estragole על ידי: SAM: chavicol O-methyltransferase (CVOMT)

ג. זיהוי תוצרי פעילות OMT's

נעשה על ידי ביצוע ריאקציה בתנאים דומים, עם תורם הקבוצה המתילית SAM שאינו מסומן

רדיואקטיבי, בנפח סופי של 1 מ"ל ולמשך 12 שעות. הריאקציה בוצעה במבחנות זכוכית סגורות בנפח של

10 מ"ל. להפסקת התהליך הוספו 2 מ"ל הקסאן. במקרה זה פאזת ההקסאן העליונה יובשה על קולונת

סודיום סולפאט ורוכזה לנפח סופי של µl 400 על ידי אידוי בחנקן באמצעות מכשיר Turbo Vap II

(Zymark, USA). למכשיר GC-MS הוזרק µl 1 מהחומר לזיהוי תוצרי הריאקציה.

ד. קביעת ריכוז החלבון

נעשתה על ידי שימוש בשיטת ברדפורד (Bradford, 1976) בראגנט (Bio-Rad, Munich). ריכוז

החלבון נקבע על ידי בדיקת בליעת האור באורך גל nm 595 בספקטרופוטומטר (Uvikon 810). כיול

המערכת נעשה באמצעות חלבון (Sigma) Bovine serum albumin (BSA).

55 ה. ניקוי חלקי של האנזים – gel permeation

כדי לסלק חומרים בעלי משקל מולקולרי נמוך העשויים להכיל מעכבים וסובסטראטים אנדוגניים, עבר המיצוי

האל- תאי (ml) (crude 2) ניקוי חלקי על קולונת Bio-Rad P-6 DG. גובה הקולונה (10 ס"מ) ביחס של

1:3 כלומר כל מ"ל מיצוי מוטען על 3 מ"ל קולונה. שטיפת הקולונה נעשתה בבופר המכיל :

50 mM bis-Tris pH 7, 10% [v/v] glycerol, 6.6 mM dithiothretiol (DTT) ,5 mM Na2S2O5

נבדקו מקטעים של 1 מ"ל לפעילות אנזימטית. מקטעים בהם הייתה פעילות אנזימטית הגבוהה ביותר אוחדו

ושימשו לאיפיון תכונות הפעילות האנזימטית ולקביעת המשקל המולקולרי.

ו. קביעת המשקל המולקולרי

המשקל המולקולרי של האנזים נקבע על פי גודל (size exclusion chromatography).

מיצוי חלבוני המנוקה באופן חלקי עבר סינון דרך ממברנת ca 462200) (0.2 µm) cellulose acetate)

(Schleicher and Schuell). המיצויים הוטענו על קולונת HiLoad 16/60 Superdex 75

(FPLC Amershan Pharmacia Biotech) בקצב של ml/min 1, בבופר המכיל:

25 mM Bis-Tris pH-6.9,150 mM KCl, 5% [v/v] glycerol, 6.6 mM dithiothretiol

ו- mM) Na2S2O5 5). מקטעים בנפח של 1 מ"ל נאספו במהלך ההרצה ונבדקו לפעילות אנזימטית. המשקל

המולקולרי במקטע הפעיל נקבע על בסיס השוואה לחלבונים בעלי גודל ידוע שהורצו בקולונה באותם תנאים:

alcohol dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae (MW ~150 KDa), phosphorylase b from rabbit muscle (MW ~97KDa), bovine serum albumin (MW~66 KDa), Carbonic

anhydrase from bovine erythrocytes (MW~29 KDa), cytochrome C from horse heart

(MW ~12 KDa), aprotinin from bovine lung (MW ~6 KDa) כולם מ- Sigma .

ז. בדיקת תכונות הפעילות האנזימטית

כדי לקבוע את התנאים האופטימליים לבדיקת הפעילות האנזימטית, וכדי לבחון אם קיים הבדל בתנאי

הריאקציה בין הכמוטיפים, הופקו מיצויים חלבונים אל-תאים (Crude) מפירות בשלב שעוותי משני

הכמוטיפים, בהם נמצאה רמת הפעילות הגבוהה ביותר. לאחר ניקוי חלקי ב- P-6 שימשו מיצויים אלה לצורך

השוואה במאפייני הפעילות של O-methyltransferase על שני הסובסטרטים chavicol ו- anol.

56 נבדקו מספר מאפיינים ביוכימיים ופיזיקליים כמו: טמפרטורה, ריכוז החלבון (אנזים), זמן אינקובציה, ריכוזי

הסובסטראטים: chavicol ,anol ו- SAM וקביעת קבועי מיכאליס-מנטן (Km) לפי שיטת Eadie-Hofstee.

כמו כן נבדקה הפעילות בבופרים ב- pH שונים. שינויים ב-pH הושגו על ידי החלפת בופר ההרצה בבופרים

הבאים: citric acid ל- pH 4, 5 ,6, בופר Bis Tris לpH 6,7- ואילו בופר Bis-Tris propane ל- pH 6.5, 7 ,7.5 ,8, 9 (ריכוזי הבופרים היו זהים 50mM).

בכל הבדיקות הללו נבדקה פעילות האנזים כמתואר בעמוד 54 (למעט הפרמטר הנבדק) במשך שעה,

בטמפרטורה של 30oC ובריכוז סובסטראט mM 0.1.

כדי לבחון את ספציפיות האנזים נבדקה האפשרות לביצוע מתילציה לתרכובות פנוליות אחרות בדומה למתואר

בסעיף בדיקת הפעילות (עמוד 54). מאחר וחלק מהסובסרטים הינם חומצות פנוליות נעשתה הפסקת הריאקציה

והפרדה בין התוצר האנזימטי המסומן רדיואקטיבי ליתר המרכיבים, על ידי הוספה של HCl + ethylacetate

כדי לנטרל את היונים הקרבוקסילים.

ד.2.1. איזומראז

א. הכנת מיצויים חלבוניים אל-תאיים

הכנת המיצוי התבססה על פרוצדורה שנוסתה בהצלחה במיצוי איזומראז בנענה חריפה ( Mentha

Kjonaas et al., 1985) (piperita). דגימות טריות מעלים ופירות (1-2 גרם) של שומר נשקלו, נחתכו

לחתיכות, הוקפאו בחנקן נוזלי בתוך מכתש חרסינה ונכתשו עד לקבלת מרקם אחיד עם בופר מיצוי

(w/v 1:5) המכיל :

100 mM sodium phosphate buffer, pH 6.6, 20% sorbitol, 50mM sodium ascorbate,

.(50 mM) Na2S2O5, 1 mM dithiothretiol, 1% (w/v) polyvinylpyrrolidone

התמצית סורכזה במהירות של - g 27,000 במשך 20 דקות ב- 4oC. התרחיף הופרד מהמשקע ושימש

לבדיקת הפעילות האנזימטית לאיזומראז.

ב. בדיקת פעילות אנזימטית לאיזומראז

הריאקציה בוצעה במבחנות זכוכית סגורות בנפח של 10 מ"ל על מיצוי גס (crude) ועל מיצוי שעבר

ניקוי חלקי בml .P-6- 0.3-1.0 מיצוי אל-תאי הודגרו עם mM -2 0.5 סובסטראט ( chavicol ,t-anol,

t-anethole ו- estragole), בנפח סופי של ml 2 ולמשך 1.5-12 שעות עם בופר המכיל:

57

Glycine- 50 mM, (pH 8.0), 5% sorbitol (w/v), 1 mM dithiothretiol. לצורך בקרה הודגרה

גם מבחנה עם מיצוי ללא כל סוסבטראט באותם תנאים. על מנת לחשב את תכולת התוצרים שהתקבלה,

הודגרו בתנאים דומים 4 מבחנות, המכילות בנפרד כל אחד מארבעת הסובסטרטים בריכוז ידוע וללא

מיצוי. להפסקת התהליך הוספו 2 מ"ל הקסאן. פאזת ההקסאן העליונה המכילה את הפנילפרופנואידים

יובשה על קולונת סודיום סולפאט ורוכזה לנפח סופי של µl 400 בדומה למתואר לעיל. למכשיר

GC-MS הוזרק µl 1 מהחומר לזיהוי תוצרי הראקציה.

ד.2. תוצאות

ההנחה לקיום פעילות מתילטרנספראזות ואיזומראזות נבדקה בשני הכמוטיפים הר דוב (MD) ובאר חיל

(BH), במטרה לבחון את השפעתם על צבירת t-anethole ו-estragole, וכדי לבחון הבדלים אפשריים בין

שני הכמוטיפים במסלול הביוסינתטי.

ד.1.2. מתילטרנספראז:

א. פעילות של O-methyltransferases המותנת ב- Chavicol וב- Anol בפירות הכמוטיפים

כדי לבחון את האפשרות של מעורבות OMT בייצור estragole בשומר פשוט, הוכן מיצוי אל תאי מפירות של

שומר מנציגי הכמוטיפ העשיר ב-estragole שמקורו בהר דוב (MD). המיצוי הודגר עם chavicol ועם תורם

קבוצה מתילית SAM המסומן רדיואקטיבית עם 3H, ונבדקה הווצרות של estragole) methylchavicol)

רדיואקטיבי (איור ד.2). הווצרותו של תוצר רדיואקטיבי במיצוי, לעומת העדרותו במיצוי שעבר הרתחה במשך

כ- 5 דקות, מהווה סימן לפעילות אנזימטית של מתילטרנספראז, המזרזת העברה של קבוצה מתילית מ-SAM

לסובסטראט chavicol. כדי לאשר את זהות התוצרים נערכה ריאקציה קרה בתנאים דומים, ונמצא כי methylchavicol נוצר רק לאחר הוספה של chavicol לתערובת הריאקציה המכילה SAM ומיצוי חלבוני

(איור ד.3A). לעומת זאת, אין יצירת estragole כאשר מצויים בתערובת הבדיקה רק SAM ו- chavicol ללא

מיצוי (איור ד3B ). כמו כן יש לציין שאין הווצרות estragole בהעדר chavicol או SAM או כשהמיצוי האל

תאי עובר הרתחה מוקדמת (תוצאות לא מוצגות).

58

148 A chavicol (s) 121 77 91 105 5163 133 43

m/z estragole (p)

B

t-anol (s) C

t-anethole (p)

RelativeAbundance = 115 m/z cis-anethole (p) cis-anol (s)

D 148

117 105 133 51 77 121 63 91

m/z 10 11 12 13 14 15 16 Retention Time (min)

איור ד.3: הפרדה וזיהוי תוצרי הפעילות האנזימטית של OMT במכשיר GC-MS A. מיצוי אל-תאי מפירות שומר מכמוטיפ הר דוב שהודגרו עם SAM ו- chavicol (כמתואר בשיטות) יוצרים estragole B. ללא מיצוי חלבוני בנוכחות בלעדית של SAM או chavico אין היווצרות estragole t-anethole .C ו- cis-anethole נוצרים רק לאחר הוספת t-anol ו- cis-anol לתערובת הראקציה המכילה מיצוי חלבוני ו-SAM. D. ללא מיצוי חלבוני ובנוכחות בלעדית של trans או cis-anethole אין היווצרות של s = substrate ; p= product) t-anethole) ספקטרום המסות של estragole מוצג ב- A ספקטרום המסות של t-anethole (הזהה לזה של cis-anethole) מוצג ב- D

59

תכולת הפנילפרופנואידים הנדיפים בפירות של כמוטיפ MD בפירות (איור ד.4) מראה כי המרכיב העיקרי

הינו estragole (91-99%), אך כמוטיפ זה מייצר גם t-anethole בכמות מועטה (1-9%). לכן נבדקה גם

האפשרות לפעילות של anol OMT ביצירת t-anethole.

נמצא כי מיצוי חלבוני אל-תאי מהכמוטיפ העשיר באסטרגול (MD) שהודגר עם anol ו- SAM המסומן

רדיואקטיבית עם 3H בדרך שתוארה לעיל, יוצר t-anethole רדיואקטיבי (איור ד.4CD).

נוכחות של cis-anethole בנוסף ל- t-anethole בתוצאות נובעת כנראה משימוש בסובסטראט המכיל

תערובת של 90%~ של t-anol ו10%-~של t-anethole . cis-anol ו- cis-anethole נוצרו רק בנוכחות

של מיצוי חלבוני, SAM וסובסטראט (t-anol ו- cis-anol (איור ד.3C). בהעדר מיצוי לא הייתה היווצרות

של t-anethole (איור ד.3D).

תוצאות זהות התקבלו בהפעלת מיצוי חלבוני אל תאי שהופק מהכמוטיפ העשיר ב-BH) t-anethole).

ב. השוואת פעילות של O-methyltransferases באוכלוסיות שונות של שומר

נבחנה האפשרות שהזמינות היחסית והפעילות הספציפית לסובסטרט של המתילטרנספראזות AOMT ו-

CVOMT עשויה להסביר באופן חלקי את השונות בהרכב הפנילפרופנואידים באוכלוסיות אלה. הנתונים

(איור ד.4) מראים כי למרות העובדה שהאוכלוסיות נבדלות מאוד בתכולת הפנילפרופנואידים שלהן, בכל

האוכלוסיות קיימת רמת פעילות דומה לשני המתילטרנספראזות ובשניהם קיים הפוטנציאל ליצור t-anethole

ו- estragole במידה וניתן הסובסטראט המתאים. מבחן ANOVA חד כיווני מראה כי אין הבדל משמעותי בין

האוכלוסיות ברמת הפעילות של F5,15=2.4 P>0.05 ) CVOMT). ואילו ברמת הפעילות של AOMT רק

אוכלוסיית MD נבדלת באופן מובהק מאוכלוסיות S ו- MT ואילו יתר האוכלוסיות אינן נבדלות במובהק זו

מזו.

60

20 A estragoleestragole content t- anethole content

15 t-anethole content

10 (mg/g fw) (mg/g fw) (mg/g 5

0

Volatile phenylpropanoids volatile phenyl propanecontent B 70 * F5,15 = 2.41 , P = 0.085

w **F5,15 = 6.00 , P = 0.006 60 a ab CVOMT activity

50 ab AOMT activity 40 ab

30 b b 20

OMT(pkat/g activity f 10

OMT activity (pkat/g fw) (pkat/g OMT activity

0 MD MM MT BH T S

איור ד.4: תכולת נגזרות הפנילפרופנואידים באולאורזין (A) ופעילות B) O -methyltransferases) בפירות בשלב שעוותי מאוכלוסיות שונות של שומר פשוט: אוכלוסיית הר דוב (MD), הר מירון (MM), מעלות תרשיחה (MT), באר חיל (BH), מרסין, טורקיה (T) וג' בל קטרינה (S). ניתנים ממוצע ו-n =3 . SE * ANOVA חד כיוונית לבחינת ההשפעה של סוג האוכלוסיה על פעילות CVOMT ** ANOVA חד כיוונית לבחינת ההשפעה של סוג האוכלוסיה על פעילות AOMT. האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים בין האוכלוסיות (Bonferroni multiple comparison p< 0.05).

ג. הקשר בין פעילות O-methyltransferases והשינויים בתכולת estragole ו- t-anethole

באברי צמח שונים של שומר במהלך התפתחותם

במטרה לזהות את האתרים הפוטנציאלים בייצור estragole ו- t-anethole, נערכה השוואה בין תכולת

החומרים האלה בחלקי צמח שונים לבין רמת הפעילות של in vitro OMT’s. בדיקה זו נערכה בשני

הכמוטיפים בנבטים (איור ד.5) ובצמח הבוגר (איור ד.6). נמצא כי בנבטי הכמוטיפים, תכולת ה-estragole

או ה- t-anethole (בהתאם לכמוטיפ) גבוהה בעלה הראשוני (µg/g fw 520 ו- 1200 בהתאמה) ובהתאם לכך

גם רמת הפעילות של pkat/g fw) O-methyltransferases 4-10). לעומת זאת בפסיגים תכולת

הפנילפרופנואידים נמוכה ( µg/g fw 64 ו- 132 בהתאמה) ורמת הפעילות אפסית (pkat/g fw 0-1).

בשורשון מצויים עקבות של estragole ו- µg/g fw ) t-anethole 2-10) ואין כמעט פעילות של

המתילטרנספראזות (pkat/g fw 0-0.1).

61

A1 first leaf A2

anethole content Cotyledons AOMT activity CVOMT activity estragole content roots

1500 1000 500 0 0 5 10 15 20

B1 B2 first leaf

Cotyledons

roots

1500 1000 500 0 0 5 10 15 20 Phenylpropane content (µg/gfw) Phenylpropanoids content (µg/g fw) OMTOMT activity activity (pkat/gfw) (pkat/gfw)

איור ד.5: תכולת estragole ו- A1,B1) (µg/g fw) t-anethole) ופעילות A2 ,B2) (pkat/g fw) O-methyltransferase) בשורשון, בפסיגים ובעלה הראשוני בנבטים בני 22 יום מזריעה, מהכמוטיפ באר חיל העשיר ב-A) t-anethole) ומהכמוטיפ הר דוב העשיר ב-B) estragole) ניתנים ממוצע ו- n =4 SE

AOMT = Anol O-methyltransferase activity. CVOMT= Chavicol O-methyltransferase activity. בצמח הבוגר, בשני הכמוטיפים (איור ד.6), תכולת estragole ו- t-anethole הגבוהה ביותר מצויה בפרחים

ובפירות צעירים (mg/g fw 5-10), ואילו בעמודי התפרחות התכולה הקטנה ביותר (mg/g fw 0.3-0.8).

פוטנציאל הייצור תואם את הממצאים הללו, והוא גבוה מאוד בפרחים ובפירות (pkat/g fw 26-54) ונמוך

ביותר בעמודי התפרחות (pkat/g fw 2-4).

במטרה לבחון את השינויים בפעילות OMT’s במהלך ההתפתחות, נבדקו מנבטים של שני הכמוטיפים, חמשת

העלים הראשונים (איור ד.7) ובצמח הבוגר נלקחו עלים לאורך עמוד התפרחות המייצגים שלושה גילאים

שונים (איור ד.8) וכן פרחים ופירות מארבעה שלבי התפתחות שונים (איור ד.9) נבדקה תכולת ה- estragole

וה-t-anethole שלהם, ומאותם האברים נעשה גם מיצוי חלבוני אל-תאי לבדיקת פעילות של:

(chavicol O-methyltransferase (CVOMT ו- (anol O-methyltransferase (AOMT.

62 estragole content t- anethole content CVOMT activity AOMT activity 14 80

12 1 70

60

10 A AB B 50 8 40 6 c (mg/g fw) AB 30 4 20 A

content 2 b 10 a a 0 0

14 80 B 12 70 OMT activity (pkat/gfw) OMT activity

2 60 Phenylpropanoids 10 B

B 50 8 40 6 30 4 A 20 b b 2 A 10 a a 0 0 stem leaves flowers fruits

איור ד.6: תכולת estragole ו- mg/g fw) t-anethole) ופעילות pkat/g fw) O-methyltransferases)) באברי הצמח הבוגר בכמוטיפ באר חיל (BH) העשיר ב-t-anethole (1) ובכמוטיפ הר דוב (MD) העשיר ב-estragole ( 2 ) AOMT = Anol O-methyltransferase activity. CVOMT= Chavicol O-methyltransferase activity. ניתנים ממוצע ו- n =4 SE. a,b,c אותיות שונות מייצגות הבדלים מובהקים בתכולת הפנילפרופנואיד העיקרי בכל כמוטיפ. A,B,C אותיות שונות מייצגות הבדלים מובהקים ברמת הפעילות של AOMT ו- CVOMT . (Bonferroni multiple comparison P<0.05)

עם התפתחות העלים בנבטים של הכמוטיפ באר חיל, חלה ירידה בתכולת t-anethole מתכולה של mg/gfw 1.2-0.9 בשני העלים הצעירים, לתכולה של mg/gfw 0.052 בעלה הבוגר ביותר. ובהתאם לכך גם

ירידה חדה בפעילות של המתילטרנספראזות (איור ד.7A), מגמה דומה חלה גם בכמוטיפ הר דוב. בכמוטיפ זה

חלה ירידה בתכולת ה- estragole מ- mg/gfw 0.5 בשני העלים הצעירים, ל-mg/gfw 0.054 בעלה הבוגר,

ובהתאם ירידה בפעילות המתילטרנספראזות מ- 4.6 ל- pkat/gfw 0.2 (איור ד.7B ). תוצאות דומות מתקבלות

גם בהשוואת עלים לאורך עמודי התפרחות בכמוטיפ הר דוב (איור ד.8).

63 estragole content t-anethole content CVOMT activity AOMT activity 1.5 25

) A 20 1.0 15

10 0.5 5

0.0 0 1.5 71418233125

20 B OMT activity (pkat/gfw) 1.0 15

Phenylpropenoids content (mg/gfw content Phenylpropenoids 10 0.5 5

0.0 0 7 14212835 Leaf age (days)

איור ד.7: תכולת estragole ו- mg/g fw) t-anethole) ופעילות pkat/g fw) O-methyltransferase) בעלי נבטים בגילאים שונים (ימים מהצצת הפסיגים) בכמוטיפ באר חיל העשיר ב-A) t-anethole) ובכמוטיפ הר דוב העשיר ב-B) estragole) AOMT = Anol O-methyltransferase activity. CVOMT= Chavicol O-methyltransferase activity. ניתנים ממוצע ו- n =4 SE. פירוט סטטיסטי ראה נספח 4.

2.0 20 A A 1.5 15 ) AAB fw

g 1.0 10 / g m (

a B 0.5 5 b B Phenylpropenoids content OMT activity (pkat/g fw) 0.0 b 0 young middle old

estragole content t- anethole content CVOMT activity AOMT activity

איור ד.8: תכולת estragole ו- mg/g fw) t-anethole) ופעילות pkat/g fw) O-methyltransferase) בעלים בגבהים שונים לאורך עמוד התפרחות בכמוטיפ העשיר באסטרגול שמקורו באוכלוסיית הר דוב (MD) AOMT = Anol O-methyltransferase activity. CVOMT= Chavicol O-methyltransferase activity. ניתנים ממוצע ו- n =3 SE a,b,c אותיות שונות מייצגות הבדלים מובהקים בתכולת הפנילפרופנואידים. A,B,C אותיות שונות מייצגות הבדלים מובהקים ברמת הפעילות של AOMT ו- CVOMT . (Bonferroni multiple comparison P<0.05)

64 בעלים צעירים של הצמח הבוגר תכולת ה- estragole היא הגבוהה ביותר (mg/ fw 1.7) ורמת הפעילות של

מתילטרנספראזות pkat/gfw 11-15 הן הגבוהות ביותר. לעומת זאת, בעלים הבוגרים בתחתית עמודי

התפרחות תכולת ה- mg/gfw estragole 0.2 והפעילות של pkat/g fw OMT 3.7 (איור ד.8).

הפעילות של AOMT ו- CVOMT בפירות עולה במובהק במהלך התפתחותם, בשני הכמוטיפים, משלב

הפריחה ועד לשלב של פרי שעוותי (שלב 2) בו הרמה מכסימלית (pkat/fruit 0.3-0.4) ואז חלה ירידה חדה

ברמת הפעילות (איור ד.9) לעומת זאת תכולת הפנילפרופנואידים עולה עד לשלב של פרי חצי בשל (שלב 3)

ונשארת יציבה במהלך ההבשלה (נספח 5).

70 0.6

60 0.5 50 0.4 40 0.3 30 0.2 20 0.1 10 0 0.0

200 B 0.6 0.5 150

0.4 OMT activity (pkat/fruit)

100 0.3 0.2

Phenylpropenoids contant (µg / fruit) 50 0.1 0 0.0 flowers 1 2 3 4

DeveloDevelopmentalpmental sta stagge

estragole content t-anethole content CVOMT activity AOMT activity

איור ד.9: תכולת estragole ו- µg/fruit) t-anethole) ופעילות (O-methyltransferase (pkat/fruit בפרחים ובפירות בשלבי התפתחות שונים, בשני כמוטיפים של שומר פשוט. 1 עד 4 מבטאים שלבים בהתפתחות הפרי: (1= פרי צעיר, ירוק בהיר 2= פרי בשלב שעוותי, ירוק כהה 3= פרי חצי בשל, ירוק חום 4= פרי בשל, חום ויבש. A. הכמוטיפ הר דוב (MD) העשיר ב- estragole B. הכמוטיפ באר חיל (BH) העשיר ב-t-anethole AOMT = Anol O-methyltransferase activity. CVOMT= Chavicol O-methyltransferase activity. ניתנים ממוצע ו- n =3 SE פירוט סטטיסטי ראה נספח 5.

65 טבלה ד.1: פעילות יחסית (%) של מתילטרנספראזות על סובסטרטים פנולים שונים בהשוואה לפעילותם על anol (100%) בכמוטיפים: באר חיל ( BH) והר דוב (n=3 (MD ניתנים ממוצע ±SE

Substrate Chemical composition MD BH

COH3

eugenol H2C CH 150.7 ± 3.4 137.8 ± 2.7 OH

COH3 t-isoeugenol H3C 133.0 ±20.1 115.3 ± 6.9 OH

H3C CH t-anol OH 100.0 ± 4.7 100.0 ±10.8

OH caffeic acid HOOC 96.6 ±17.8 69.6±20.5 OH

H C CH chavicol 2 83.1 ± 7.1 77.6 ± 5.5 OH

H C 4-ethylphenol 3 67.8 ±11.6 83.0 ± 3.7 OH

H3C CH2 4-propylphenol 65.9 ± 8.5 60.8 ± 5.8 OH

phenol 47.4 ± 7.1 28.1 ± 3.7 OH

p-cresol 33.8 ± 0.0 43.0 ± 3.6 H3C OH

OH catechol 18.7± 0.0 21.3 ± 0.4 OH

HOOC t-coumaric acid 13.0 ±13.6 20.4 ±10.9 OH

HO COH3 coniferyl alcohol CH2 13.1 ± 0.4 19.6 ± 4.2 OH

t-cinnamic acid HOOC 12.1 ± 2.6 4.7± 1.1

COH3 t-ferulic acid HOOC 19.5 ±14.4 4.8 ± 5.5 OH

66 ד. פעילות של O-methyltransferases כלפי נגזרות פנוליות שונות

כדי לבחון את ספציפיות האנזים לסובסטרטים שונים, נבדקה האפשרות לביצוע מתילציה לתרכובות פנוליות

אחרות. הנתונים הניתנים בטבלה ד.1 מראים כי הפעילות הגבוהה ביותר חלה על פנילפרופנואידים כמו t-anol isoeugenol ,eugenol, ו- caffeic acid. לעומת זאת בשני הכמוטיפים הפעילות על פנילפרופילים

כמו propylphenol ,chavicol 4- ו- 4-ethylphenol מעט נמוכה יותר. הפעילות הנמוכה ביותר נצפתה

בתרכובות פנוליות בהן השייר הפחמני גדול מ- 3 פחמנים או קטן מ- 2 פחמנים, וגם בתרכובות בעלות שייר

המסתיים בקבוצה קרבוקסילית, למעט caffeic acid . הנתונים מצביעים על דמיון בין הכמוטיפים בכל

התרכובות שנבדקו.

ה. מאפייני הפעילות האנזימטית של O-methyltransferases מכמוטיפים של שומר פשוט

כדי לקבוע את התנאים האופטימליים לפעילות האנזימטית, וכדי לבחון אם קיים הבדל בתנאי הריאקציה בין

הכמוטיפים, נערכה השוואה במאפייני הפעילות של O-methyltransferase על שני הסובסטרטים chavicol

ו- anol. בבדיקת הקשר בין זמן ההדגרה לרמת הפעילות, נמצא כי רמת הפעילות האנזימטית של OMT משני

הכמוטיפים עולה באופן לינארי עם העלייה בזמן ההדגרה, כצפוי לאנזימים, וזמן האינקובציה האופטימלי הוא

60 דקות (איור ד.10). מעבר ל60- דקות אינקובציה אין עלייה משמעותית ברמת הפעילות.

קביעת טמפרטורה ו- pH אופטימליים

הטמפרטורה האופטימלית לפעילות האנזימים AOMT ו- CVOMT בשני הכמוטיפים (בזמן דגירה במשך

שעה) הייתה 37oC (איור ו.11). בטמפרטורה של oC 45 ישנה ירידה חדה בפעילות כנראה בגלל דנטורציה

של החלבון.

בחינת ה- pH האופטימלי (איור ד.12) לפעילות האנזימים שהופקו משני הכמוטיפים מצביעה על הבדל קטן

ביניהם: הפעילות האופטימלית של שני האנזימים: AOMT ו- CVOMT שהופקו מהכמוטיפ העשיר ב-

t-anethole מאוכלוסיית באר חיל, הייתה ב- pH 8 (איור ד.12). ב- pH 8.5 חלה ירידה של % 70

מהפעילות ובpH 9.5- לא נמצאה כל פעילות. לעומת זאת ה- pH האופטימלי של האנזימים שהופקו מהכמוטיפ

העשיר ב- estragole מאוכלוסיית הר דוב, היה בטווח שבין 8-9 וב- pH 9.5 הייתה עדיין פעילות של 33%

מה- pH האופטימלי.

67

1.6 CVOMT activity AOMT activity

1.2 A

0.8

) 0.4 lE µ 0.0 fkat/

( 1.6 0 20406080100120140160

y Time (min.) B

1.2 Activit

0.8

0.4

0.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Time (min.)

איור ד.10: השפעת זמן האינקובציה על פעילות האנזימים (AOMT) anol-dependant OMT : (E) ו-CVOMT) chavicol-dependant OMT) בשני כמוטיפים של שומר פשוט: A. הכמוטיפ העשיר ב--t-anethole שמקורו באוכלוסיית באר חיל (BH) B. הכמוטיפ העשיר ב- estragole שמקורו באוכלוסיית הר דוב (MD) ניתנים ממוצע ± S.E של שתי חזרות

1.8 AOMT CV OMT 1.6 1.4 A B 1.2

1.0

0.8 0.6

Activity (fkat/µlE) 0.4

0.2

0.0 02040600204060

Temperature (oC) איור ד.11 : קביעת הטמפרטורה האופטימלית לפעילות האנזימים(AOMT) anol-dependant OMT : (E) ו-CVOMT) chavicol-dependant OMT) בשני כמוטיפים של שומר פשוט: A. הכמוטיפ העשיר ב--t-anethole שמקורו באוכלוסיית באר חיל (BH) B. הכמוטיפ העשיר ב- estragole שמקורו באוכלוסיית הר דוב (MD) ניתנים ממוצע ± S.E של שתי חזרות 68 citric acide 12 Bis Tris BisTris propane

10 A- AOMT A- CVOMT anol BH chavicol BH 8

6 4

2

0 12

fkat /µlE 10

anolB- MD AOMT chavicol B - CVOMT MD 8

6

4

2 0 246810246810

pH

איור ד . 12: השפעת ה- pH ובופרים שונים על פעילות האנזימים (AOMT) anol-dependant OMT :(E) ו-CHOMT) chavicol-dependant OMT) בשני כמוטיפים של שומר פשוט: A. הכמוטיפ העשיר ב--t-anethole שמקורו באוכלוסיית באר חיל (BH) B . הכמוטיפ העשיר ב- estragole שמקורו באוכלוסיית הר דוב (MD) ניתנים ממוצע ± S.E של שתי חזרות

פעילות O-methyltransferases כתלות בריכוז האנזים

על מנת לקבוע את ריכוז האנזים בו מצויה הריאקציה האנזימטית בשלב הלינארי, נערכה בדיקה רדיואקטיבית

כמתואר בפרק השיטות, ממיצוי המנוקה חלקית, בריכוזים משתנים בתחום שבין 0-10µl אנזים בתמיסה בנפח

סופי של 100µl. הנתונים המוצגים באיור ד.13 מראים כי בשני הכמוטיפים הפעילות הלינארית של AOMT

הינה בתחום שבין 1-10µl ואילו זו של ה- CVOMT בתחום שבין 1-5µl. לאור תוצאות אלה נלקחה לכל

הניסויים כמות של 2µl מהמיצוי החלבוני.

69 14 14 A B 12 12

) 10 10

8 8

6 6

4 4 Activity (fkat/µlE

anol

2 2 chavicol

0 0 0 5 10 15 0 5 10 15

Enzyme ( µl/100µl solution)

איור ד.13: פעילות האנזימים OMT's על הסובסטראטים anol ו- chavicol כפונקציה של ריכוז האנזים בשני כמוטיפים של שומר פשוט: A. הכמוטיפ העשיר ב--t-anethole שמקורו באוכלוסיית באר חיל (BH) B. הכמוטיפ העשיר ב- estragole שמקורו באוכלוסיית הר דוב (MD) ניתנים ממוצע ± S.E של שתי חזרות

קינטיקה האנזימטית

קבועי מיכאליס-מנטן (Km) של OMT נקבעו בשני הכמוטיפים עבור הסובסטרט, תורם הקבוצה המתילית -

SAM ועבור שני הסובסטרטים anol ו- chavicol . פעילות האנזים על SAM נבדקה כמתואר בפרק השיטות

עם הסובסטרט anol בריכוזים משתנים של SAM בין µM 0-180 (איור ו.14) ובריכוז משתנה בין 0-µM

500 לגבי הסובסטרטים anol ו- chavicol (איור ו.15). התוצאות מלמדות כי האנזימים משני הכמוטיפים

מנצלים SAM כתורם הקבוצה המתילית ובעלי ערך Km כמעט זהה של µM 3.95 לגבי הכמוטיפ BH ו-

4µM לגבי הכמוטיפ Km .MD עבור t-anol הינו 34.6µM בשני הכמוטיפים ולגבי Km chavicol הינו בין

.22-24 µM

30 BH MD 25 ליניארי (BH) ליניארי (MD) ( lE 20 איור ד.14 : חישוב ערך Km של OMT דרך µ טרנספורמציה לינארית של משוואת -Michaelis

fkat/ 15 ( Menten על פי עקום Eadie-Hofstee, עבור הסובסטרט SAM בשני הכמוטיפים: BH ו -y MD פעילות האנזים נבדקה כמתואר בפרק השיטות 10 Activit

בריכוזי סובסטראט בטווח של µM 0-180 5 ניתנים ממוצע ± S.E של שתי חזרות 0 01234567 Activity/ [substrate] (fkat/µlE)/µM 70 MD anol MD chavicol 50 60

50 40

40 30 30 20 20

10 10

0 0 0.00.51.01.50.0 0.5 1.0 1.5 2.0

BH anol BH chavicol 100 100

80 80

60 60

OMT activity (nkat/µg protein) OMT activity 40

40

20 20

0 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 1.0 2.0 3.0

Activity/ [substrate] nkat/µg protein/µM

איור ד. 15: חישוב ערכי Km של האנזימים OMT's דרך טרנספורמציה לינארית של משוואת Michaelis-Menten על פי עקום Eadie-Hofstee, עבור הסובסטרטים anol ו- chavicol בשני הכמוטיפים: BH ו -MD פעילות האנזים נבדקה כמתואר בפרק השיטות בריכוזי סובסטראט בטווח של µM 0-500. ניתנים ממוצע ± S.E של שתי חזרות

קביעת המשקל המולקולרי

המסה המולקולרית נקבעה, כמתואר בפרק השיטות, בעזרת כרומטוגרפיה על קולונת הפרדה לפי גודל ( size exclusion chromatography). הגודל המולקולרי של האנזימים נקבע לאחר השוואה עם חלבונים בעלי גודל

ידוע. פעילות מכסימלית של chavicol dependant OMT התקבלה באלואנט בנפח 56-57 מ"ל המתאים

לחלבון במשקל מולקולרי של kDa 72-77. פעילות מכסימלית של anol dependant OMT התקבלה

באלואנט בנפח 55-57 מ"ל המתאים לחלבון במשקל מולקולרי של kDa 77-82 (איור ד.16).

השוואה בין פעילות OMT (טבלה ד.2) על שני הסובסטרטים מצביעה על הבדלים דקים מאוד בפרמטרים כמו pH אופטימלי, Km, בריכוז האנזים בתחום הלינארי ובמשקל המולקולרי הבדלים אלו בולטים בעיקר בכמוטיפ

באר חיל.

71

0.8 A AOMT 5.2 CVOMT 0.7 log MW 5 ליניארי (log MW) 0.6

0.5 4.8 0.4

4.6 0.3

0.2 4.4 ) 0.1 µlE

/ 0.0 4.2 0.8 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 5.2 fkat ( B 0.7 Log MW 5 0.6

0.5 Activity 4.8 0.4

0.3 4.6

0.2 4.4 0.1

0.0 4.2 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Fraction (ml)

איור ד.16: קביעת המסה המולקולרית של האנזימים: (anol-dependant OMT (AOMT ו-(chavicol-dependant (CVOMT OMT בשני כמוטיפים של שומר פשוט: A. הכמוטיפ העשיר ב-t-anethole שמקורו באוכלוסיית באר חיל (B .(BH. הכמוטיפ העשיר ב- estragole שמקורו באוכלוסיית הר דוב (MD) ניתנים ממוצע ± S.E של שתי חזרות

טבלה ד.2: סיכום איפיון תכונות פעילות OMT על הסובסטרטים t-anol ו- chavicol ממיצוי חלבוני אל תאי שהופק משני כמוטיפים של שומר פשוט

כמוטיפ הר דוב כמוטיפ באר חיל תכונות הפעילות האנזימטית (BH) (MD) של המיצוי החלבוני chavicol t-anol chavicol t-anol 0C) 37 37 37 37) טמפרטורה אופטימלית min) 60 60 60 60) זמן אינקובציה אופטימלי pH אופטימלי בבופר 8.0±0.4 8.7 ± 0.7 8.6±0.5 8.9 ± 0.7 bis tris propane

Km (Eadie-Hofstee) 21.7 μM 34.6 μM 24.2μM 34.6 μM

Km (Eadie-Hofstee) SAM 3.95μM 4.0μM MW (kDa) 77 -72 82 77 77 1-5μl 1-10μl 1-5μl 1-10μl ריכוז אנזים (תחום הלינארי) ,caffeic acid, 4-ethylphenol, caffeic acid, 4-ethylphenol אפיניות גבוהה לסובסטרטים Isoeugenol, eugenol Isoeugenol, eugenol פנולים נוספים

72 ד.2.2. איזומראז

מאחר ופעילות של מתילטרנספראזות אינן מסבירות את ההבדל בין הכמוטיפים היה עניין לבחון אם הגורם

הביוכימי האחראי להבדל בין הכמוטיפ העשיר ב-t-anethole או ב-estragole קשור בפעילות של איזומראזות

(איור ד.1), בהנחה כי הן הופכות anol ל-chavicol (או להפך) או הופכות t-anethole ל-estragole (או

להפך).

לבדיקה זו נבחרה אוכלוסיית מעלות תרשיחה המכילה t-anethole ו-estragole, מתוך הנחה שאם קיים

איזומראז קיים סיכוי טוב למצוא אותו באוכלוסייה המכילה את שני הפנילפרופנואידים בכמות גבוהה. כמות של

500µl בנפח סופי של 2 מ"ל ממיצוי חלבוני מנוקה חלקית, שהופק מעלים של אוכלוסייה זו, הודגר במשך

שעה וחצי עם, בבופר sodium phosphate pH 6.6 בתוספת של sodium ascorbate ועם mM 0.5 מכל

אחד מארבעת הסובסטרטים: estragole , t-anethole ,chavicol , anol. נמצא כי קיימת רמה נמוכה מאוד

(pkat/ml extract 0.2-1.2) של פעילות איזומראזות ההופכות t-anethole ל-estragole ו-estragole ל- t-anethole . לעומת זאת, לא נמצאה כלל פעילות איזומראזות ההופכות anol ל-chavicol או ההיפך (טבלה

ד.3). תוצאות דומות התקבלו עם בופר ללא sodium ascorbate.

במבחנות הביקורת המכילות מיצוי חלבוני ללא אנזים או מיצוי לאחר הרתחה נמצאה רמה נמוכה של estragole או t-anethole שמקורם בחומרים המצויים באופן טבעי בצמח ונותרו גם לאחר הניקוי. לכן ערכי

התוצרים הנתונים בטבלאות חושבו לאחר הפחתת הביקורת.

טבלה ד.3 : בדיקת פעילות איזומראזות במיצוי עלים מאוכלוסיית מעלות תרשיחה (MT) ניתנים ממוצע ± SE של שתי חזרות substrate product pkat/ml extract

estragole t- anethole 0.2 ± 0.05 chavicol anol 0.0 ± 0.00 t- anethole estragole 1.16 ± 0.43 anol chavicol 0.0 ± 0.00

כדי להגדיל את רמת הפעילות של האיזומראז, במידה והוא קיים, הופק מיצוי אנזימטי מפירות בשלב שעוותי,

בהם כמות הפנילפרופנואידים גבוהה יותר. כמו כן כדי למצוא תנאים משופרים לריאקציה, הודגר המיצוי עם

הסובסטראט estragole בריכוזי סובסטראט ואנזים שונים. נמצא כי העלאת ריכוז ה-estragole לא גרמה

לעליה בכמות ה-t-anethole בדומה למבחנת הביקורת ללא סוסבטראט (טבלה ד.4). לעומת זאת הודגרה

73 בכמויות שונות של מיצוי עם estragole בריכוז של 1mM מראה כי בכמות של 500µl ישנה פעילות חלשה

של איזומראז pkat/ml extract 0.5 בהשוואה לחוסר פעילות עם 200µl מיצוי מפירות בשלב שעוותי.

תוצאות ההדגרה בזמנים שונים מראות כי זמן ממושך של הדגרה אינו יעיל, ויש כנראה התפרקות או התנדפות

של ה-t-anethole. לכן בכל יתר הניסויים משך זמן ההדגרה היה שעתיים.

טבלה ד.4: בדיקת פעילות איזומראזות במיצוי פירות מאוכלוסיית MT ניתנים ממוצע ± SE של שתי חזרות הראקציה הודגרה במשך שעתיים, עם כמות משתנה של אסטרגול (0-2mM) עם כמות של 200µl מיצוי שעבר ניקוי חלקי בנפח סופי של 2 מ"ל , בבופר: sodium phosphate pH 6.6

ריכוז הסובסטרט (mM) pkat/ml extract 0.0 0.00 ± 0.0 0.5 0.04 ± 0.01 1.0 0.00 ± 0.0 2.0 0.00 ± 0.0

במיצויים שהופקו מפירות בשלב שעוותי של נציגי שני הכמוטיפים: הר דוב העשיר ב- estragole, ובאר חיל

העשיר ב- t-anethole נמצאה פעילות חלשה מאוד (pkat/ml extract 0.3) של איזומראז ההופך t-anethole

ל-estragole רק בכמוטיפ הר דוב (בטבלה ד.5).

בבדיקות נוספות שנערכו כמו: תוספת של קופקטורים כמו: Fe3+ ,Mn2+, ו-NADPH, הדרושים לעיתים

לפעילות אנזימטית (Wallace and Laskowski, 1998) , תוספת של gum arabic 1%, ריכוז האנזים על

ידי דיאליזה בסוכר למשך 11 שעות, המסת הסובסטראט בהקסאן במקום באתנול, לא נמצאה פעילות

משמעותית של איזומראזות.

טבלה ד.5 : בדיקת פעילות איזומראזות במיצוי פרי שעוותי מהכמוטיפים באר חיל (BH) והר דוב (MD) ניתנים ממוצע ± SE של שתי חזרות

substrate product pkat/ml extract באר חיל (BH) הר דוב (MD) estragole t- anethole 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 chavicol anol 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.9 t- anethole estragole 0.3 ± 0.3 0.0 ± 0.0 anol chavicol 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

74 ד.3. דיון ומסקנות

ד.1.3 מתילטרנספראז

א. מתילציה של אנול וכביקול במיצוי אל-תאי של שומר פשוט

כדי לבדוק נוכחות של אנזימים הקשורים ביצירה של t-anethole ו- estragole פותחה מערכת לזיהוי

פעילות אנזימטית של (chavicol O-methyltransferase (CVOMT ושל anol O- methyltransferase

(AOMT) (איור ד.1). הדגרה של מיצוי חלבוני שהופק מפירות שומר עם תורם הקבוצה המתילית :

SAM) S-[methyl-3H] adenosyl-L –methionine) ועם הסובסטרטים chavicol או anol, יוצרת תוצר

רדיואקטיבי אשר זוהה על ידי GC- MS כ-estragole או t-anethole בהתאמה (איור ד.2). תוצאות אלה

מעידות על קיום OMT במיצוי אל-תאי מפירות השומר היכולות in vitro לבצע מתילציה של chavicol ו- anol וליצור estragole ו- t-anethole על ידי שימוש ב- SAM כתורם הקבוצה המתילית (איור ד.3).

תוצאות אלה תואמות לאלה שהתקבלו בכמנון האניס (Pimpinella anisum) בו הוכיחו לראשונה פעילות של

Kemmerer and Reichling, 1996) AOMT) ובריחן מצוי (Ocimum basilicum), בו הוכחה פעילות

של Lewinsohn et al., 2000; Gang et al., 2001) CVOMT).

חשוב לציין שבשמן האתרי של השומר לא נמצאו עקבות לנוכחות של anol או chavicol. כמו כן בבדיקה בה

הוכנס מיצוי חלבוני ו-SAM, ללא סובסטראט, לא התקבל תוצר רדיואקטיבי. העדר חומרים אלה במיצוי,

עשוי להיות קשור בפעילות גבוהה של OMT’s או אנזימים אחרים הפועלים עליהם או הגורמים לפירוקם.

נמצא כי בתאי תרבית של כמנון האניס (Pimpinella anisum) ה- anol עובר פולימריזציה כמעט מלאה תוך

שעה על ידי peroxidases גם בנוכחות כמות מועטה של Kemmerer and Reichling, 1996) H2O2).

כדי להוכיח שהמסלול הביוסינתטי in vivo של t-anethole ו- estragole עובר דרך anol או chavicol

דרוש מחקר נוסף.

ב. תכונות ה-methyltransferases שהופקו מפירות שני הכמוטיפים

מיצויים חלבונים אל-תאיים שהופקו מפירות בשלב שעוותי משני הכמוטיפים שימשו לצורך השוואת מאפייני

הפעילות של O-methyltransferases על שני הסובסטרטים chavicol ו-anol.

רמת הפעילות עולה באופן לינארי עד כ60- דקות, אחר-כך אין עליה בפעילות, כנראה בגלל העלמות

הסובסטראט (אנול, כביקול או SAM), או חוסר יציבות של האנזים. תכונות הפעילות האנזימטית של OMT

75 בשני הכמוטיפים המסוכמות בטבלה ד.2, מראות כי קיים דמיון רב ברוב הפרמטרים שנמדדו בין שני

הכמוטיפים. התנאים האופטימלים לפעילות האנזימטית דומים בשני הכמוטיפים וכוללים טמפרטורה אופטימלית

ב-pH ,370 C =8 בבופר bis Tris propane וזמן אינקובציה של שעה. התוצאות מלמדות כי האנזימים משני

הכמוטיפים מנצלים SAM כתורם הקבוצה המתילית ובעלי ערך Km כמעט זהה של µM 3.95 לגבי הכמוטיפ

באר חיל (BH) ו- 4µM לגבי הכמוטיפ הר דוב (MD). לשני הכמוטיפים ערך זהה של 34.6µM) Km) עבור t-anol ו-µM 24.2 עבור chavicol. ערכים אלה תואמים את הממצאים שהתקבלו גם בצמחים אחרים

.(Kermmerer and Reichling, 1996; Wang and Pichersky, 1998)

המשקל המולקולרי אשר שנקבע על ידי gel-permeation chromatography הינו kDa 80~ עבור

chavicol and anol dependant OMT, שמוצה מכל אחד משני הכמוטיפים. ערך זה דומה לרוב OMT’s

בצמחים המורכבים משתי תת יחידות זהות שלכל אחת מהן משקל מולקולרי של kDa 38-43

.(Wang and Pichersky, 1998; Bugos et al., 1992; Ibrahim and Muzac, 2000)

השוואה בין פעילות OMT על שני הסובסטרטים מצביעה על הבדלים דקים מאוד בפרמטרים כמו pH

אופטימלי, Km, בריכוז האנזים בתחום הלינארי ובמשקל המולקולרי (טבלה ד.2). הבדלים אלו בולטים בעיקר

בכמוטיפ באר חיל. הבדלים אלה עשויים לרמז שמדובר ביותר מאנזים אחד. הדמיון הרב בין ה- OMT’s

המצויים בשני הכמוטיפים עורר את הצורך לבדיקת הספציפיות שלהם לתרכובות אחרות. מיצוי חלבוני אל-תאי

שנלקח משני הכמוטיפים, נבדק עם מספר תרכובות פנוליות המהוות סובסטרטים בריכוז סופי של 0.1mM

(טבלה ד.1). נמצא כי הדמיון בין האנזימים מתבטא גם בספציפיות שלהם לסובסטרטים שונים. שני האנזימים

משני הכמוטיפים פועלים באופן יעיל (pkat/gfw 50≤) רק על פנילפרופנואידים כמו eugenol, chavicol ,t-anol ,iseougenol ו- 4-propylphenol, או תרכובות דומות כמו 4-ethylphenol . יתכן

שאורך השייר הפחמני משפיע על יעילות פעילות האנזים. הפעילות אינה מושפעת ככל הנראה מהעמדה או

מהעדר הקשר הכפול של השייר הפרופילי (allyl-phenol בהשוואה ל- propenyl phenol) או מהוספה של

קבוצה מטוקסית בעמדה מטה ( m-methoxy).

תוצאות אלה דומות לספציפיות של anol-dependant OMT שנמצאה ב- Pimpinella anisum

(Kermmerer and Reichling, 1996). לעומת זאת, הפעילות של chavicol-dependant OMT שנמצאה

בכמוטיפ העשיר ב- estragole בריחן מצוי (Ocimum basilicum) הושפעה מאוד מנוכחות הקבוצה

76 m-methoxy ולא הייתה פעילות עם eugenol (השונה מ-chavicol בתוספת של קבוצה (m-methoxy)

(טבלה ד.Lewinsohn et al., 2000) (1). הוספה של חמצן, לפחמן האחרון של השייר הפחמני, גורמת

לירידה חזקה בפעילות של pkat/gfw) OMT’s 20>). תוצאות דומות דווחו גם בכמנון האניס

( Kermmerer and Reichling, 1996) (Pimpinella anisum), למעט הפעילות הגבוהה שהתקבלה

בתוצאות שלנו עם הסובסטראט pkat/gfw) caffeic acid 70-97). ההבדל בפעילות בין התרכובות השונות

שנבדקו כסובסטרטים עשוי לנבוע מהבדלים במבנה המולקולות העשויות לגרום להפרעה בפעילות האנזים, או

שיתכן ובמיצוי המופק מפירות השומר קיים יותר מאנזים אחד של OMT’s, שכל אחד בעל תפקיד אחר

במסלול הביוסינתטי. רמז לכך ניתן לראות בקביעת המשקל המולקולרי ובעיקר במיצוי שהופק מהכמוטיפ באר

חיל (איור ד.16). בכמוטיפ זה, התקבלה פעילות מכסימלית של OMT בשני שיאים נפרדים המתאימים לחלבון

במשקל מולקולרי של kDa -72 77 ו- kDa 82. ניקוי טוב יותר של האנזים משני הכמוטיפים, בידודו ובחינת

המבנה המולקולרי של הגן הקשור אליו עשויים לתת תשובה לשאלה האם המתילציה של שני הסובסטראטים

(t-anol ו-chavicol) מזורזת על ידי אנזים אחד בעל ספציפיות לשני הסובסטראטים (או יותר), או, על ידי שני

אנזימים דומים. כמה מאנזימי OMT’s הינם בעלי ספציפיות גבוהה לסובסבטראט מסוים או לעמדה מסוימת

של הקבוצה המתילית, בעוד שאחרים הינם בעלי ספציפיות לטווח רחב של סובסטראטים ( Wang and

Pichersky, 1999; Ibrahim and Muzac, 2000). ב- Clarkia breweri, שינוי ב- 7 חומצות אמיניות

גורם לשינוי משמעותי בספציפיות Ibrahim and Muzac 2000) O-methyltransferases). בריחן מצוי

(Ocimum basilicum) שינוי בחומצה אמינית אחת באתר הפעיל אחראי לשינוי בספציפיות האנזים בין eugenol OMT ו-Gang et al., 2002) chavicol OMT).

ג. הקשר בין פעילות O-methyltransferase והשינויים בתכולת t-anethole ו- estragole במהלך

ההתפתחות של אברי צמח שונים בשומר פשוט

השוואה בין תכולת estragole ו- t-anethole לבין רמת הפעילות של in vitro OMT’s ברקמות שונות

בצמח הצעיר והבוגר במהלך התפתחותם בשני הכמוטיפים, מראה כי קיים קשר הדוק בין תכולת

הפנילפרופנואידים הללו באברי הצמח השונים לבין רמת הפעילות של OMT המשקפת לכן את פוטנציאל

הייצור שלהם.

בעלה הצעיר של נבטים בני 22 יום מזריעה, המכילים עלה ראשוני, (איור ד. 5) קיימת פעילות גבוהה של

77 O-methyltransferases, בהשוואה לפעילות נמוכה מאוד בפסיגים ואפסית בשורשונים. תוצאה זו תומכת

באפשרות שמקור ה- t-anethole וה-estragole המצויים בכמות מועטה בשורש צעיר אינם בייצור מקומי.

בצמח הבוגר בשני הכמוטיפים (איור ד.6), כפי שנמצא במחקר זה ובמחקרים אחרים (Gupta et al., 1995

Akgul and Bayrak, 1992;; Miura et al., 1996; Bernath et al., 1999), תכולת ה- estragole ו –

t-anethole הגבוהה ביותר מצויה בפרחים ובפירות צעירים (mg/g fw 5-10) ואילו התכולה הקטנה ביותר

בעמודי התפרחות (mg/g fw 0.3-0.8). ובהתאם, פוטנציאל הייצור גבוה ביותר מצוי בפרחים ובפירות

(pkat/g fw 26-54) ונמוך ביותר בעמודי התפרחות (pkat/g fw 2-4).

בדיקת רמת הפעילות של OMT עם התפתחות העלים בצמח הצעיר (איור ד.7) ובצמח הבוגר (איור ד.8)

מלמדת כי ייצור t-anethole ו- estragole מתחיל בשלב מוקדם מאוד בהתפתחות העלה ויורד באופן משמעותי

עם התפתחותו. גם בריחן מצוי (Ocimum basilicum) (שפתניים) נמצאה ירידה בתכולת methylchavicol

במהלך התפתחות העלה, הנמצאת בקורלציה עם ירידה ברמת הפעילות האנזימטית של chavicol-OMT ו-

.eugenol- OMT

עם התפתחות הפרי (איור ד.9) חלה עליה ברמת הפעילות של OMT's ובהתאם גם בצבירת t-anethole ו- estragole, עד שלב של פרי שעוותי (שלב 2). עם ההבשלה חלה הפסקה בפעילות OMT's. עליית בצבירת

הפנילפרופנואידים עד שלב של פרי חצי בשל, נובעת כנראה מצבירת תוצרי הייצור של שלבים המוקדמים מחד

ואידך פליטה נמוכה מאוד לסביבה (איור ג.8 ). הפסקה בייצור מרכיבי השמן האתרי לפני הבשלת הפרי דווחה

גם בכרויה תרבותית (Carum carvi) (סוככיים). נמצא כי צבירת carvone ו-limonene נפסקת מספר

שבועות לפני הבשלת הפרי, ועומדת בקורלציה עם ירידה בפעילות של שלושת האנזימים הקשורים בביוסינתזה

שלהם (Bouwmeester et al., 1998). חוקרים אלה סבורים, כי ירידה בצבירת המונוטרפנים קשורה

בתחרות עם מסלולים ביוסינתטים אחרים.

בכל הרקמות שבדקנו קיים פוטנציאל לפעילות בו זמנית in vitro של anol OMT ו- chavicol OMT.

למרות העובדה שאברי הצמח שנבדקו הכילו בעיקר estragole או t-anethole בהתאם לכמוטיפ. הנתונים

מראים כי ברוב הרקמות שנבדקו, רמת הפעילות של anol OMT גבוהה יותר מזו של chavicol OMT

תוצאה זו תואמת לממצאים בכמנון האניס Kemmerer and Reichling, 1996) Pimpinella anisum).

78 ד. פעילות של O-methyltransferases באוכלוסיות שונות של שומר

כדי לבחון את ההנחה כי פעילות שונה של המתילטרנספראזות AOMT ו- CVOMT עשויה להסביר באופן

חלקי את השונות בהרכב הפנילפרופנואידים באוכלוסיות של שומר (איור ד.1), נבדקה הפעילות עם מיצוי

חלבוני אל תאי שהופק מפירות שנקטפו מאוכלוסיות שומר הנבדלות בתכולת ה-t-anethole וה- estragole

שלהן. התוצאות (איור ד.4) מראות כי למרות ההבדל בתכולת הפנילפרופנואידים שלהן, בכל האוכלוסיות

קיימת רמת פעילות דומה לשני המתילטרנספראזות ובשניהם קיים הפוטנציאל ליצור t-anethole ו- estragole במידה וניתן הסובסטראט המתאים. רמת הפעילות הנמוכה יחסית ב- אוכלוסיית מעלות תרשיחה

(MT) וג'בל קתרינה, סיני (S) בהשוואה לזו של האוכלוסיות האחרות אינה קשורה רק בייצור נמוך יותר של

פנילפרופנואידים ועשויה לנבוע גם מסיבות אחרות כמו: קיום מעכבים, הבדלים זעירים במבנה האנזימים או

ברמות שונות של סובסטרט. יחד עם זאת, מבחן ANOVA חד כיווני הראה כי אין הבדל משמעותי בין

האוכלוסיות ברמת הפעילות של F3,20=2.4 P>0.05 ) CVOMT). ואילו ברמת הפעילות של AOMT רק

אוכלוסיית MD נבדלת באופן מובהק מאוכלוסיות S ו- MT ואילו יתר האוכלוסיות אינן נבדלות במובהק זו

מזו. תוצאות אלה מראות כי תהליך המתילציה של קבוצת ההידרוכסיל בעמדה para, השלב האחרון במסלול

הביוסינטטי של הפנילפרופנואידים בשומר(איור ד.1), אינו יכול להסביר את ההבדל בתכולת

הפנילפרופנואידים estragole ו-t-anethole בכמוטיפים של שומר. יתכן שההבדל בתכולת הפנילפרופנואים

קשור בזמינות הסובסטראטים כלומר, מהעדר אספקה של אחד מהאזומרים ואספקה סדירה מהשני, או בשלבים

מוקדמים יותר המעורבים במסלול הביוסינתטי של פנילפרופנואידים (איור ד.1).

ד.2.3. פעילות של anethole / methyl chavicol isomerase

במטרה לבחון אם הגורם הביוכימי האחראי להבדל בין הכמוטיפ העשיר ב- t-anethole או ב- estragole

קשור בפעילות של איזומראזות (איור ד.1) שאולי הופכות anol ל-chavicol, (או ההפך), או ההופכות t-anethole ל-estragole (או ההפך), נבדקה האפשרות לקיום פעילותן במיצויים אל-תאיים של פירות מנציגי

שני הכמוטיפים: הר דוב העשיר ב- estragole ובאר חיל העשיר ב- t-anethole, ובנציגי אוכלוסיית מעלות

תרשיחה המכילים estragole ו- t-anethole. הבדיקות נערכו בריכוזי סובסטראט ואנזים שונים, נבחנו שני

בופרים בהרכב שונה ובתוספת של קופקטורים כמו Fe3+ ,Mn2+, ו- NADPH. כמו כן נחשפו הריאקציות

לזמני אינקובציה שונים. בבדיקות אלה, נמצאה בחלק מהניסויים פעילות נמוכה מאוד של איזומראזות. פעילות

79 זו אינה משמעותית דיה כדי להסביר את ההבדל בין הכמוטיפים. יתכן והשיטות בהן השתמשנו לא מתאימות

לניטור איזומראזות, או שיתכן ונקודת הפיצול במסלול הביוסינתטי בין הכמוטיפים נמצאת בשלב מוקדם

במסלול הביוסינתטי (איור ד.1). מחקר בכמנון האניס (Pimpinella anisum) (סוככיים) ובריחן מצוי

(שפתניים) (Ocimum basilicum) הראה כי ההסתעפות במסלול ליצירת האיזומרים Allyl כמו estragole

ו-propenyl - כמו t-anethole חלים כנראה בשלב החומצה הצינמית (Manitto et al., 1974) (איור ד.1).

המשך החיפוש אחר הגורם הביוכימי להבדל בין הכמוטיפים בשלב אחר של המסלול הביוסינתטי יכול להעשות

על ידי בדיקות ביוכימיות נוספות כמו Pulse chase experiments ו- Isotopic dilution experiments או

באמצעות הנדסה גנטית.

לסיכום ניתן להסיק כי:

• פעילות דומה של OMT) anol /chavicol O-methyltransferase) קיימת בשני הכמוטיפים וביתר

אוכלוסיות השומר שנבדקו, למרות ההבדל בתכולת הפנילפרופנואידים שלהן. לכן הגורם להבדל ברמה

הביוכימית בין הכמוטיפים אינו מצוי בשלב הסופי (שלב המתילציה) של המסלול הביוסינתטי.

• התנאים האופטימלים לפעילות האנזימטית והספציפיות שלהם לסובסטרטים שונים הדומים בשני

הכמוטיפים שנבדקו, מרמזים על דמיון באנזימים הפועלים בשני הכמוטיפים.

• הבדלים דקים בפעילות OMT על שני הסובסטרטים, הבולטים בעיקר בכמוטיפ באר חיל, מרמזים על

פעילות של יותר מאנזים אחד.

• קיים קשר הדוק בין תכולת estragole או t-anethole באברי הצמח השונים לבין רמת הפעילות של

OMT המשקפת לכן את פוטנציאל הייצור שלהם. בפרחים ובפירות בשלב של פרי שעוותי פוטנציאל

הייצור גבוהה ביותר, בפסיגים ובתת פסיג רמת הפעילות נמוכה מאוד ובשורש אין ייצור מקומי של estragole ו- t-anethole .

• לא נמצאה פעילות משמעותית של איזומראזות העשויה להסביר את ההבדל בין הכמוטיפים, וכנראה,

הגורם להבדל ברמה הביוכימית בין הכמוטיפים מצוי בשלב מוקדם יותר במסלול הביוסינתטי לייצור

t-anethole ו- estragole .

80

פרק ה': דרך ההורשה של התכונה לצבירת estragole ו/או t-anethole

במחקרים קודמים שנערכו באוכלוסיות שומר פשוט בישראל נמצא כי, קיימת אסוציאציה חזקה בין תפוצת

הכמוטיפים לבין תנאי סביבה כמו גובה וטמפרטורה (Barazani et al., 1999). כמו כן נמצא כי קיים ההבדל

ברמת התורשתיות/פלסטיות בשמירה על תכולת הפנילפרופנואידים, בין אוכלוסיות בר לבין נציגיהן שגדלו

בתנאי תרבות (Barazani et al., 2002). ממצאים אלה, והנתונים שהתקבלו בעבודה זו, המראים כי ההבדל

בתכולת פנילפרופנואידים בין הכמוטיפים קיים בכל אברי הנצר, עוררו את הצורך לבחון את הבסיס הגנטי

והתורשתיות של התכונה לצבירת t-anethole ו- estragole.

2 תורשתיות במובן הרחב (h b) מצביעה על ההשפעה היחסית של גורמים סביבתיים וגנטיים על התכונה. ומוגדת

כשונות גנטית / שונות פנוטיפית. מרכיבי השונות הגנטית (VG) כוללים: שונות תוספתית (VA), שונות

דומיננטית (VG) ושונות אינטראקטיבית (אפסטטיות) (VI). תורשתיות גבוהה מעידה על השפעה שולית של

הגורמים הסביבתיים (Mather & Jinks, 1977).

2 תורשתיות במובנה הצר (hn ) מוגדרת כשונות תוספתית / שונות פנוטיפית. ככל שיש יותר השפעות

תוספתיות, הדמיון בין ההורים והצאצאים גדל. לכן, ערך התורשתיות במובן הצר, תורם מידע לבחינת יעילות

הסלקציה לאותה התכונה ובעל חשיבות בחיזוי תכונות הצאצאים ובחיזוי התגובה לסלקציה. תורשתיות גבוהה

מעידה שסלקציית ההורים לתכונה מסוימת תניב צאצאים דומים (Strickberger, 1985).

הערך התוספתי תלוי לא רק באללים המצויים בפרט, אלא תלויים גם בתדירות האללים באוכלוסיה. לכן

אוכלוסיות שונות עשויות להיות בעלות ערך שונה של תורשתיות לגבי אותה תכונה.

מאחר והצמח בעל חשיבות חקלאית בארצות שונות, המחקרים הגנטיים שבוצעו בו, קשורים בצורך לשפר את

תכונותיו האגרונומיות והכימיות כמו: הבשלה מוקדמת, זרעים גדולים, הגבלת גובה, הגדלת תכולת השמן

והיבול (,.Karlsen et al., 1969; Reichardt and Pank, 1993; Pank et al., 2003; Dashora et al estragole .(2003 נחשב כגורם סיכון לבריאות עקב היותו חשוד כחומר מסרטן (Miller et al., 1983

;Phillips et al., 1984; CEFS, 2003), לכן חשוב לפתח זנים בעלי הרכב חומרים הרצוי על פי תקנות

European pharmacopoeia: פירות עם תכולת שמן אתרי של לפחות t-anethole ,4% בתכולה של לפחות fenchone ,60% ברמה של 15% ו-estragole ברמה שאינה עולה על Pank et al., 2003) 5%). לצורך זה

81

נערכו ניסויי סלקציה לפרטים בעלי תכולה והרכב שמן אתרי הרצוי על ידי הכלאות בין ובתוך זני השומר

השונים ( Karlsen et al., 1969; Reichardt and Pank, 1993; Dashora et al., 2003 ). אולם, למרות

החשיבות בהרכב הארומה של השומר, לא נחקר אופן ההורשה של הכושר לייצור t-anethole ו- estragole,

וחלק גדול מהמחקרים הקשורים בהורשה של פנילפרופנואידים, ובעיקר של estragole, נעשו בצמחים

ממשפחת השפתניים ( Pushpangadan et al., 1975; Khosla et al., 1989; Gupta and Sobti 1990

.( Gupta et al., 1990; Fuentes-Granados et al., 2000

הכרת הבסיס הגנטי של התכונה לצבירת estragole ו- t-anethole בשומר פשוט עשויה לתרום להבנת

המנגנון הגנטי, הקובע את הרכבן של אוכלוסיות שונות הגדלות בבר ולהבנת ההבדל ברמת

התורשתיות/פלסטיות בשמירה על תכולת estragole ו- t-anethole, בין אוכלוסיות בר לבין נציגיהן שגדלו

בתנאי תרבות.

מטרת הפרק:

זיהוי דגם ההורשה של התכונה לצבירת estragole ו- t-anethole בכמוטיפים של שומר פשוט והערכת

התורשתיות שלה.

ה.1 שיטות וחומרים

השונות הפנוטיפית בתכולת ה -estragole וה-t-anethole נבחנה בפירות של נציגי האוכלוסיות השונות (דור

ההורים =P) (כמתואר בעמוד 12). מאחר והשמן האתרי מסונתז ונשמר בקליפת הפרי (pericarp), רקמה

שמקורה בצמח האם, הרכב ותכולת השמן הנמדדת הינה תכונה גנטית של צמח האם עם השפעות סביבתיות

.(Theobald, 1971)

קביעת הפנוטיפים השונים נעשתה על פי הנתונים שהתקבלו מהרכב האולאורזין בנציגי האוכלוסיות שנחקרו,

(טבלה ג.2) לפי המפתח הבא:

צמחים בעלי estragole 90-100% מכלל הפנילפרופנואידים הוגדרו כבעלי פנוטיפ "אסטרגולי" (E).

צמחים בעלי estragole 0-10% מכלל הפנילפרופנואידים הוגדרו כבעלי פנוטיפ "אנתולי" (A).

צמחים בעלי estragole 50-80% מכלל הפנילפרופנואידים הוגדרו כבעלי פנוטיפ "אסטרגולי/אנתולי" (EA).

82

במהלך עונות הפריחה, בשנים 2001-2004, בוצעו הכלאות רציפרוקליות בין פרטים מאוכלוסיות בעלות

תכולת estragole גבוהה (99-100% מכלל הפנילפרופנואידים) לבין פרטים מאוכלוסיות בעלות תכולת

t-anethole גבוהה (94-96% מכלל הפנילפרופנואידים) לקבלת דור F1. הפירות שהתקבלו בהכלאות

המכוונות נזרעו, ובנבטים שהתפתחו נבדק הרכב האולאורזין בעלים, מאחר ונמצא בעבודה זו כי היחס בין

תכולת ה -estragole וה- t-anethole נשמר בפירות, בעלים ובעמודי התפרחות (עמוד 46 ).

לאחר כחודש הועברו הצמחים הצעירים להמשך גידול בחלקה הסמוכה לחלקת ההורים בשדה. בעונת הפריחה

בוצעו בין הפרטים של דור F1 הכלאות עצמיות לקבלת דור F2 והכלאות חוזרות (BC) עם כל אחד משני

ההורים.

הערכת התורשתיות (heritability)

2 אומדן התורשתיות במובן הרחב -h b) Broad-sense heritability) של התכונה לתכולה יחסית (%) של estragole מתוך כלל הפנילפרופנואידים הנדיפים נעשתה לפי (Mather and Jinks (1977, על ידי אנליזה

של שונות הפנוטיפ (VP) לגבי תכולת ה- estragole בדור ההורים P1 וP2- ובדורות הצאצאים F1 ו- F2.

2 h b = VG/ VP

השונות הגנטית (VG) חושבה לפי: VG = VP - VE.

VP (שונות הפנוטיפית) - הוערכה כשונות שנמצאה בדור VP2) F2).

VE (השונות הסביבתית) - חושבה כממוצע של השונות הגנטית של דור ההורים P2 ,P1 ושל השונות הגנטית

של דור הצאצאים הראשון F1.

2 הערכת התורשתיות במובן הצר (h n) לתכולת ה-estragole נעשתה לפי Strickberger (1985).

2 h n =VA / VP כאשר השונות הפנוטיפית (VP) חושבה כסכום השונות התוספתית, הדומיננטית והסביבתית

( VP=VA+VD+VE). במצבים בהם אפקט הדומיננטיות לא קיים, הערך בין שני סוגי התורשתיות זהה.

התפלגות תכולת ה-estragole (% ה- estragole מתוך כלל הפנילפרופנואידים הנדיפים) בצאצאים נבחנה

במבחן Chi-square בהנחה של מודל הורשה של גן אחד בעל שני אללים עם דומיננטיות חלקית.

83

ה.2 תוצאות

איפיון הפנוטיפ על פי תכולת ה -estragole מתוך כלל הפנילפרופנואידים הנדיפים בפירות של נציגי דור

ההורים מששת אוכלוסיות המחקר נתון בטבלה ג.2.

תוצאות ההכלאות בדור F1 מראות כי כל ההכלאות בין הורים "אסטרגוליים", בעלי אולאורזין העשיר ב - estragole, הניבו בדור F1 צאצאים "אסטרגוליים". וכל ההכלאות בין הורים "אנתוליים" הניבו בדור F1

צאצאים "אנתוליים" (טבלה ה.1).

בדיקה של 20 נבטים שנבטו מיחידות תפוצה שהתקבלו על ידי האבקה חופשית בצמחים מכל אחת

מהאוכלוסיות השונות שגדלו בשכנות ונדגמו באקראי, מלמדת כי רובם (92%) בעלי הרכב פנילפרופנואידים

הדומה להוריהם, ואילו הנותרים (8%) הינם כנראה תוצרי הכלאה בין צמח "אנתולי" וצמח "אסטרגולי"

(טבלה ה.1).

טבלה ה.1 התפלגות הפנוטיפים בצאצאי דור F1 שהתקבלו בהאבקה חופשית ובהכלאות מכוונות בקרב הורים מהאוכלוסיות העשירות ב-E) estragole) ובקרב הורים מהאוכלוסיות העשירות ב- n (A) t-anethole = מספר הצאצאים שנבדקו

treatment population (phenotype) F1 phenotype EEAAn MD x T (E x E) 9 0 0 9 T x MM (E x E) 2 0 0 2 T x T (E x E) 11 0 0 11 cross MD x MD (E x E) 20 0 0 20 P1xP1 MM x MD (E x E) 14 0 0 14 S x S (A x A) 0 0 12 12 BH x BH (A x A) 0 0 14 14 S x BH (A x A) 0 0 18 18 MD (E) 20 0 0 20 free MM (E) 20 0 0 20 polination T (E) 18 2 0 20 P1 S (A) 0 6 14 20 BH (A) 0 0 20 20

"estragolic" phenotype =E, "anetholic" phenotype=A, "estragolic- anetholic" phenotype= EA MD-Mount Dov , MM- Mount Meron, MT- Ma’alot-Tarshiha, BH- Beer Hail, T- Mercin, S- G’abel Katharina

על פי תוצאות ההכלאות בין אוכלוסיות עשירות ב-estragole לבין האוכלוסיות העשירות ב- t-anethole

(טבלה ה.2 ו איורים ה.-1ה.3), כל הצאצאים בדור F1 מכילים estragole ו-t-anethole ביחס שבין 50-80% estragole. בדור F2 המתקבל בהכלאה עצמית של דור F1 מתקבלים שלושת הפנוטיפים:

84

הפנוטיפ "האסטרגולי" (E) המכיל estragole 90-100% מכלל הפנילפרופנואידים, הפנוטיפ "האנתולי"

(A) המכיל estragole 3-5% מכלל הפנילפרופנואידים והפנוטיפ המעורב "אסטרגולי-אנתולי" (EA) המכיל estragole 50-80% מכלל הפנילפרופנואידים. היחס בין הפנוטיפים השונים הוא 1:2:1 (טבלה ה.2).

בהכלאות החוזרות עם כל אחד מההורים (טבלה ה.2) מתקבלים שני פנוטיפים: הפנוטיפ המעורב ופנוטיפ של

ההורה איתו בוצעה ההכלאה החוזרת כשהיחס בין הפנוטיפים הינו 1:1. תוצאות מבחן Chi-square שנערכו

לכל אחת מההכלאות, בהנחה לגן אחד בעל שני אללים, נתונות בטבלה ה.2. בעשר הכלאות מתוך 12 סוגי

ההכלאות השונות שבוצעו, ערכי P של מבחן Chi square מראים כי α = 0.05) P>α). בשני ההכלאות

הנותרות α = 0.01) P>α). כדי להקטין את הסיכוי לקבלת תוצאה מובהקת באקראי במקרה של מספר ניסויים

החוזרים על אותו מבחן סטטיסיטי, ניתן להקטין את α בהתבסס על sequential Bonferroni correction

(Rice, 1989) (P<0.05/N). מאחר ומספר הניסויים במקרה שלנו הינו α =0.004 , 12. מכאן, בכל

ההכלאות התקבלה ההשערה כי דגם ההורשה הסביר הוא של גן אחד בעל שני אללים.

טבלה ה.2. התפלגות הפנילפרופנואידים ( estragole ו- t-anethole) בצאצאי דור F2 בהכלאות חוזרות ועצמיות של דור F1 שהתקבלו בהכלאות בין אוכלוסיות שונות של שומר

Segregation ratio in F2 progenies F1 Observed cross P1xP1 phenotype cross F1x ratio n Exp. ratio P* population (phenotype) (phenotype) E EA A T x BH (E x A) EA Self (EA xEA) 8 19 6 33 1 : 2 : 1 0.61 BCP1 (EA x A) 0 38 25 63 1 : 1 0.10 BCP2 (EA x E) 25 18 0 43 1 : 1 0.29 BHx T (A x E) EA Self (EA xEA) 13 18 5 36 1 : 2 : 1 0.17 BCP1 (EA x A) 0 8 4 12 1 : 1 0.25 BCP2 (EA x E) 10 2 0 12 1 : 1 0.02* SxT (A x E) EA Self (EA xEA) 2 17 4 23 1 : 2 : 1 0.06 BCP1 (EA x A) 0 12 11 23 1 : 1 0.83 BCP2 (EA x E) 7 9 0 16 1 : 1 0.62 MDx BH (E x A) EA Self (EA xEA) 9 13 0 22 1 : 2 : 1 0.02* BCP1 (EA x A) 0 9 7 16 1 : 1 0.62 BCP2 (EA x E) 4 8 0 12 1 : 1 0.25

* (α= 0.01) P* = value of χ2 test BCP1= backcross F1x P1 BCP2= back cross F1x P2 E= "estragolic" phenotype, A= "anetholic" phenotype, EA= "estragolic- anetholic" phenotype MD-Mount Dov , MM- Mount Meron, MT- Ma’alot-Tarshiha, BH- Beer Hail, T- Mercin, S- G’abel Katharina

85

מרסין, טורקיה באר חיל P1 = BH P2 = T

100 N=10 N=13 80

60

40

20

0 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 F1 = P1 x P2 80 N=12 60

40

20

0 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

) F2 = F1 x F1 80 N=69 60

40

20 Offsprings (%

0 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 BC1 = P1 x F1 80 N=75 60

40

20

0 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 BC2 =P2 x F1 80 N=55 60

40

20

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 estragole / phenylpropanoids (%)

איור ה.1: התפלגות תכולת ה -estragole בהכלאה בין האוכלוסייה "האנתולית " (BH=P1) והאוכלוסייה "האסטרגולית" (T=P2) , דור F1 ו -דור F2 וההכלאות החוזרות (BC) עם כל אחד מההורים: מרסין, טורקיה -T , באר חיל – BH

86

מרסין, טורקיה ג'בל קתרינה, סיני

P1 = S P2 = T

100 n = 9 n =13 80

60 40

20

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100 80 F1 = P1 x P2 60 n = 13 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ) 100

80 F2 = F1 x F1 60 n = 23 40

20 Offsprings (%

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100 BC1 = P1 x F1 80 n = 23 60 40 20 0

100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

80 BC2 =P2 x F1 60 n = 16 40

20

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Estragole / phenylpropanoids (%)

איור ה.2: התפלגות תכולת ה -estragole בהכלאה בין האוכלוסייה "האנתולית " (S=P1) והאוכלוסייה "האסטרגולית" (T=P2) , דור F1 ו -דור F2 וההכלאות החוזרות (BC) עם כל אחד מההורים: מרסין, טורקיה --T , ג'בל קתרינה -S

87

הר דוב באר חיל P1 = BH P2 = MD

100 n =10 n =10 80

60 40

20

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

100 F1 = P1 x P2 80 n = 9 60 40 20 0 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ) F2 = F1 x F1 80 n = 22 60

40

20

Offsprings (% 0

100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

80 BC1 = P1 x F1 60 n = 16

40

20

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100

80 BC2 =P2 x F1 60 n = 12 40

20

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Estragole / phenylpropanoids (%)

איור ה.3 : התפלגות תכולת ה- estragole בהכלאה בין הכמוטיפ "האנתולי" (BH=P1) והכמוטיפ "האסטרגולי" (MD=P2) , דור F1 ו -דור F2 וההכלאות החוזרות (BC) עם כל אחד מההורים : הר דוב - MD , באר חיל - BH

88

הערכת התורשתיות

2 ערך התורשתיות במובן הרחב (h b ) הינו גבוה ודומה בכל שלושת "המשפחות" (0.94-0.99). ערך גבוה זה

מעיד כי לגורמים גנטיים יש השפעה חזקה יותר בהשוואה לגורמים סביבתיים בביטוי של התכונה הזו. כצפוי

2 ערך התורשתיות במובן הצר (h n) נמוך יותר בהכלאות השונות (0.66-0.73).

ה.3 דיון ומסקנות

תוצאות ההכלאות שבוצעו כדי לבחון את אופן ההורשה של התכונה לייצור t-anethole או estragole

ומבחני Chi square שלהם, תומכים באפשרות כי התכונה לייצור ה- t-anethole וה- estragole בשומר

מקודדת על ידי גן עיקרי אחד בעל שני אללים עם דומיננטיות חלקית לאלל האסטרגולי. יחד עם זאת קבלת

שלושה צאצאים בודדים עם הרכב חריג ביחס ה- estragole וה- t-anethole בהכלאה: BH x T (איור ה.1)

מצביעה על אפשרות לקיום אללים או גנים נוספים.

אומדן התורשתיות במובן הרחב גבוה מאומדן השונות במובן הצר, כי בראשון יש ביטוי לשונות הגנטית על כל

מרכיביה (שונות תוספתית, דומיננטית ואפיסטטית), ואילו בשני בא לידי ביטוי בדרך חישובו רק המרכיב של

השונות התוספתית, התלויה לא רק באללים המצויים בפרט אלא גם בתדירות שלהם באוכלוסיה.

2 ערך התורשתיות במובן הרחב (h b ) הינו גבוה ודומה בכל ההכלאות (0.94-0.99). תוצאה זו מעידה על כך

שבתנאי הניסוי הנוכחי, לגורמים הגנטיים הייתה השפעה חזקה יותר מאשר לגורמים הסביבתיים בביטוי של

התכונה הזו. לעומת זאת, ערכי התורשתיות במובן הצר בהכלאות השונות נמוך יותר (0.66-0.73), ומעיד על

קיומו של אפקט דומיננטי לתכונה. ערכי התורשתיות במובן הצר מלמדים כי 66-73% מהשונות הנצפית

בתכונה לייצור t-anethole או estragole נגרמת על ידי שונות באפקט התוספתי של הפרטים באוכלוסיה. לכן

ניתן לאמץ מודל תוספתי-דומיננטי פשוט לביטוי התכונה לתכולת ה-estragole מכלל הפנילפרופנואידים.

בהתאם לממצאים שלנו ניתן להניח אחת משלושת האפשרויות (איור ה.4):

1. ל-t-anethole ול-estragole חומר מוצא משותף וכל אלל מקודד לסינתזה של חומר אחר: A1 מקודד

לסינתזה של A2 ,estragole לסינתזה של t-anethole. בהתאם לכך הגנוטיפ A1A1 מיצג את הכמוטיפ

האסטרגולי, ו- A2A2 את הכמוטיפ האנתולי ו- A1A2 את הכמוטיפ האסטרגולי-אנתולי (איור ה.-4 1).

89

2. הגן לייצור estragole מצוי בכל צמחי השומר. גן אחר שתוצרו הופך את אחד מחומרי הביניים שעל

המסלול ליצירת estragole ל-t-anethole, או גן הגורם להפיכת ה-estragole ל-t-anethole הוא הגן

הקובע את הכמוטיפים השונים. לגן זה שני אללים: האלל A הדומיננטי המייצר את האנזים הנ"ל ו- a הוא

האלל הרצסיבי שאינו מקודד לאנזים. בהתאם לכך: הגנוטיפ AA יהיה הגנוטיפ האנתולי, aa יהיה

הגנוטיפ האסטרגולי ואילו Aa יהיה הגנוטיפ המעורב (איור ה.-4 2).

3. ההשערה האלטרנטיבית: t-anethole הוא התוצר העיקרי ו-estragole נוצר בעקבות פעילות של גן נוסף

E על מסלולו או גן ההופך t-anethole ל-estragole. בהתאם לכך EE יהיה הגנוטיפ האסטרגולי, ee יהיה

הגנוטיפ האנתולי ואילו Ee יהיה הגנוטיפ המעורב (איור ה.4– 3).

estragole A1 חומר מוצא

A2 t-anethole 1

t-anethole חומר מוצא estragole חומר מוצא

A E

t-anethole estragole

2 3

איור ה.4. דגמים אפשריים לדרך ההורשה של התכונה לייצור t-anethole ו-estragole האותיות מייצגות את האללים הקובעים את התכונה והחיצים מתארים שלבים אפשריים במסלול הביוסינטטי : שלב הקיים בכל הכמוטיפים של השומר שלב במסלול הביוסינטטי השונה בכמוטיפים השונים.

בכל המחקרים שנערכו בשומר פשוט, לא נמצאו עד היום אוכלוסיות, או אפילו פרטים, בהם תכולת ה- estragole נמוכה מ- 1.6% או אוכלוסיות שאינן מכילות estragole בכלל (Bernáth et al., 1996

Muckensturm et al.,1997; Miraldi,1999; krüger,1999; Barazani et al.,1999; Pank et al., )

2003). עדות זו תומכת באפשרות השנייה שהוצגה. ביטוי חלקי של האלל A, או פעילות חלקית של האנזים

שאותו הוא מקודד עשויה ליצור מצב שבו לא כל ה-estragole הופך ל-t-anethole , כך שפרטים המכילים

90

אותו יהיו אנתולים אך יכילו גם רמה מסוימת של estragole, כפי שהדבר בא לידי ביטוי בכל האוכלוסיות

האנתוליות שנבדקו (Pank et al., 2003).

בדומה לשומר, גם בצמח Clausena anisum-olens (פיגמיים) קיימים שלושה וריאנטים כימיים: וריאנט

אנתולי, וריאנט אסטרגולי ווריאנט המכיל t-anethole 90% ו- estragole 10%. מחקר על השמן האתרי

שמוצה מעלי הצמח מרמז גם הוא על מנגנון הורשה של גן אחד בעל שני אללים עם דומיננטיות חלקית

(Molino, 2000). להבדיל ממצאי עבודתנו, האלל בעל האפקט הדומיננטי בצמח זה הינו האלל האנתולי .

לעומת זאת, במחקר שנעשה על ייצור t-anethole בכמנון האניס (Pimpinella anisum) (סוככיים), אבחנו

שבמסלול הביוסנתטי לייצור estragole ו- t-anethole מעורבים יותר מגן אחד (Manitto et al., 1974 ).

דגם ההורשה שמצאנו יכול להסביר את הפלסטיות שנמצאה באוכלוסיות מסוימות שנבדקו בישראל

(Barazani et al., 2002). אוכלוסיות שהרכב השמן שלהן בטבע הוא אנתולי/אסטרגולי כמו אוכלוסיות

מעלות תרשיחה, הר מירון, הר טייסים ורמת השרון (Barazani et al., 2002), עשויות להכיל בזרעיהם

עוברים בעלי הרכב גנטי אנתולי (25%) או אסטרגולי (25%) או אנתולי/אסטרגולי (50%). לכן, הרכב

הנבטים שיצמחו בתרבות מזרעים אלה , צפוי שיהיה תלוי בהרכב מקרי של זרעים שנלקחו מאוכלוסיות האם

בטבע. צמחים אלה יגלו רמה גבוהה של פלסטיות.

לסיכום ניתן להסיק כי:

• ההורשה של התכונה לייצור estragole ו- t-anethole בכמוטיפים של שומר מצביעה על דגם הורשה של

גן עיקרי יחיד עם שני אללים בעלי אפקט תוספתי + אפקט דומיננטי של האלל האסטרגולי.

• אוכלוסיות אנתוליות (אוכלוסיית באר חיל או ג'בל קתרינה) או אוכלוסיות אסטרגוליות (הר דוב ומרסין

טורקיה) ישמרו על הרכבן בתרבות ואילו אוכלוסיות אנתוליות /אסטרגוליות כמו אוכלוסיית מעלות

תרשיחה יגלו פלסטיות בתרבות.

91

פרק ו': מהלך הפריחה ושיעור החנטה

הכרות עם מערכת הרבייה של שומר פשוט הכרחית לצורך הבנת המכניזם של זרימת הגנים בין ובתוך

אוכלוסיות, הבנת תפוצת הכמוטיפים ושימורם, ואמצעי לימוד מנגנוני הורשה וסלקציה של תכונות בצמחים

מתורבתים.

בדומה לנציגים נוספים במשפחת הסוככיים, התפרחת בשומר הינה סוכך מורכב (איור ו.1) בעל 6-25 קרנות

בלתי שוות. הסוככים והסוככונים חסרי מעטפת ומעטפית. הפרחים הינם קטנים, נכונים ודו מיניים, כותרתם

צהובה וללא גביע. השחלה תחתית בת 2 מגורות חד זרעיות. בראש השחלה מצויה הכנית (stylopodium)

המחולקת לשניים, ממנה עולים שני עמודי עלי קצרים המסתיימים בצלקת (איור ו.Bell, 1971) (2). בבסיס

הכנית מצויים שני צופנים (Langenberger and Davis, 2002).

ברוב מיני הסוככיים האבקנים מבשילים לפני הצלקות (protandrous) אך נמצאו גם כמה מינים בהם הצלקת

מקדימה להבשיל (Bell, 1971; Webb, 1981; Schlessman and Barrie, 2004) (protogynous).

במינים שונים של סוככיים שנבדקו, כמעט ואינה קיימת אוטוגמיה, ואילו geitonogamy (האבקת שכנים)

והאבקה הדדית הן האסטרטגיות השולטות (Bell, 1971; Nemeth and Szekely, 2000).

על פי (Reichardt and Pank (1993, בשומר פשוט מתורבת בגרמניה קיימת הפרדה מוחלטת בין השלב

הזכרי לנקבי באותו הפרח. רק לאחר ש - 5 האבקנים נפתחים והאבקה מתפזרת הופכות הצלקות לרצפטיביות,

והרצפטיביות נמשכת יומיים. עם זאת החוקרים ממליצים על סירוס לפני ביצוע הכלאות בשומר ובכך מרמזים

על אפשרות להאבקה עצמית. ערך גבוה של ייצור פירות (מעל 61%) שנמדד על ידי (Nemeth et al. (1999

בסוככים מבודדים של זני שומר מתורבתים בהונגריה, אכן מעיד על סיכוי גבוה להאבקה עצמית.

עד כה לא נבדק הנושא בשומר פשוט הגדל בר בישראל, ולא נבחנה השפעתו על ההרכב הכימי של האולאורזין

באוכלוסיות השונות הגדלות, לעיתים, בסמוך אחת לשנייה.

מטרת הפרק: תיאור מערכת הרבייה והשוואת פוטנציאל ההפריה בין ובתוך נציגי אוכלוסיות בר של שומר

פשוט שגודלו בתרבות.

92 ו.1 שיטות וחומרים

לימוד הביולוגיה של הפריחה וההפריה נערך בכל ששת האוכלוסיות הטבעיות שגודלו בתרבות.

ו.1.1 התפתחות הפרח

לצורך הכרת שלבי ההתפתחות של הפרח הבודד ושל סדר הפריחה בדורי הסוככון והסוכך (איור ו.1), נערך

מעקב יומי אחר 3-4 תפרחות החל ממצב של ניצן ירוק עד צהוב, (איור ו.2AB) ועד לשלב החנטה, בארבעה

פרטים שונים, בכל אוכלוסייה. נבדקו פרמטרים כמו: External umbellule פתיחת אבקנים ועלי כותרת, התארכות הצלקות, Internal umbellule צבע הכנית והפרשת צוף.

איור ו.1: סוכך מורכב של שומר פשוט Foeniculum vulgare var vulgare

עם שלושה דורי פרחים בסוככונים whorl III החיצוניים והפנימיים whorl II

whorl I

ו.2.1. קביעת מועד ומשך זמן הרצפטיביות של הצלקת

קביעת מועד ומשך זמן בשלות הצלקות, דרושה לצורך קביעת הגיל האופטימלי של הפרח לביצוע הכלאות. וכן

לצורך קביעת משך הזמן הדרוש להגנת הפרחים המואבקים באופן מלאכותי מפני האבקה חופשית. רצפטיביות

הצלקת נקבעה על פי שינויים מורפולוגיים בצלקת כמו גודל, צבע ונוכחות צוף החל מיום פתיחת הפרח. אימות

הממצאים in vivo , נעשה באמצעות האבקה ידנית בשלבים שונים של הפריחה וקביעת שיעור הפוריות על פי

שיעור חנטת הפירות. במקביל נבחנה רצפטיביות הצלקת גם באמצעות הערכת פעילות של דהידרוגנאזות על

ידי שימוש ב- (3-4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5- diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT

(Sigma M-2128) - אינדיקטור, אשר בנוכחות דהידרוגנזות משנה צבעו לחום-סגול, המעיד על חיזור MTT

ל-.Rodriguez-Riaño and Dafni, 2000; Dafni et a.l, 2005) formazan). בדיקות אלה נעשו במהלך

ההתפתחות של פרחים בודדים של נציגים משלוש אוכלוסיות : באר חיל (BH), הר דוב (MD) ומעלות

תרשיחה (MT). בכל אוכלוסיה נערכו 3 חזרות לכל אחד משלבי הפריחה. בכל חזרה נבדקו 20-25 פרחים.

93 ו.3.1. הכנית (stylopodium) כאתר נביטת אבקה בנוסף לצלקות

פריחת השומר בישראל, נמשכת גם בעונה יבשה יחסית (יוני-אוגוסט) (Diminshtein, 2000) כשהפריחה

בטבע נמוכה. ליווי הפריחה בהפרשת צוף בכמות גבוהה עשויה למשוך חרקים רבים, וניתן להניח שגרגירי

אבקה מאותו הפרח יגיעו גם לכנית. גודלה של הכנית ושטח הפנים הדביק שלה בשלב הזכרי, הנובע מהפרשת

הצוף, עוררה את השאלה האם הכנית עשויה לשמש גם כ"מאגר אבקה", בנוסף להיותה מקור הצוף

(Bell, 1971). כמו כן קיימת האפשרות שהכנית מתפקדת גם כמשטח נביטה לגרגרי האבקה בנוסף לשתי

הצלקות. במטרה לבחון אפשרות זו, סומנו מספר כולל של 36 סוככים בשישה צמחים שונים משלושת

האוכלוסיות BH ,MD ו- MT. כל הפרחים בסוכך שהיו בשלב ניצן צהוב, סורסו ויתר הפרחים בסוכך סולקו.

כעבור 6 ימים, עם הבשלת הצלקות, הושארו הפרחים (40-60) בשלושה סוככים מכל צמח ובכל אוכלוסייה,

חשופים להאבקה חופשית לאחר שעברו את הטיפולים הבאים:

א. בסוכך אחד הצלקות כוסו בלק שקוף (Paco 20) . ב. בסוכך שני הצלקות הוסרו באמצעות פינצטה עדינה.

ג. בסוכך שלישי הצלקות לא עברו כל טיפול ושימשו כבקורת.

בשלושה סוככים נוספים מאותם צמחים הואבקו הפרחים (40-50) באופן ידני ולאחר האבקה הידנית כוסו

בשקית בד למניעת האבקה ספונטנית נוספת:

1. בסוכך א' הואבקו הצלקות בלבד. 2. בסוכך ב' הואבקה הכנית בלבד. 3. בסוכך ג' הואבקו הפרחים הן

בצלקות והן בכנית. מספר הפרחים הכללי בכל טיפול נע בין 282 ל360- פרחים. שבועיים לאחר האבקה נקבע

מספר הפירות שחנטו.

ו.4.1. קביעת מועדי הפריחה בנציגי האוכלוסיות השונות

הנחנו כי הגדרת ההבדלים במועדי הפריחה בין נציגי האוכלוסיות השונות שגודלו בנוה יער, עשויה לסייע

בתכנן ההכלאות ביניהם. במהלך השנים -2001 2004, נערך מעקב אחר מועדי הפריחה ב- 10-15 פרטים מכל

אחת מששת האוכלוסיות שגודלו בתנאי שדה. לצורך מעקב אחר מועד הפריחה, נספרו הצמחים הפורחים

במועדים שונים לאורך עונת הצמיחה ועוצמת הפריחה נקבעה על פי המפתח הבא:

• תחילת פריחה (הופעת סוככים ראשונים, עדיין ירוקים וסגורים בנדן) =0.5 • שיא פריחה של הצמח (נוכחות של סוככים עם פרחים פתוחים) =1 • סוף הפריחה (מצב שבו אין יותר סוככים חדשים) =0.5. • העדר פריחה = 0

94

ו.5.1. השפעת מקור האבקה על שיעור החנטה בין ובתוך נציגי אוכלוסיות טבעיות

כדי להשוות את פוטנציאל הפוריות בין ובתוך אוכלוסיות, בוצעה סדרת הכלאות בין פרטים מאוכלוסיות שונות

ומאותה אוכלוסיה ונקבע ערך ההאבקה העצמית לכל אוכלוסייה.

בכל אוכלוסייה נבחרו סוככים בשלבי התפתחות ראשוניים. פרחים בשלב ניצן- צהוב סורסו כדי למנוע האבקה

עצמית, על ידי הסרת עלי הכותרת עם האבקנים, ואילו יתר הפרחים בסוכך הוסרו. הסוככים בודדו ממאביקים

בעזרת שקית רשת צפופה המונעת כניסת חרקים (X 0.3 0.3 מ"מ). עם הבשלת הצלקות (ראה ו.1.2), 6-8

ימים לאחר הסירוס, בוצעה האבקה עם אבקה מהמקורות הבאים: 1. מאותו הצמח, לבדיקת ערך האבקה עצמית

(האבקת שכנים). 2. מצמחים אחרים מאותה האוכלוסייה. 3. מצמחים מכל אחת מהאוכלוסיות הזרות. איסוף

האבקה נעשה ביום ההאבקה מסוככים בשלב הזכרי שכוסו יום- יומיים קודם לכן בשקית נייר, כדי למנוע את

העלמות האבקה על ידי חרקים. לאחר ההאבקה המכוונת כוסו הסוככים מחדש כדי למנוע האבקה נוספת בלתי

מבוקרת. שבוע לאחר ההאבקה נפתחו השקיות מחדש, כדי למנוע התפתחות פטריות. בשלב זה פרחים שלא

הואבקו מתייבשים ואין חשש להאבקה בלתי מבוקרת משום שכל הצלקות כבר אינן רצפטיביות. לצורך בקרה

הושאר סוככים ללא כיסוי להאבקה חופשית.

האבקה עצמית ספונטנית נבדקה בארבעה סוככים מכל אוכלוסיה, שלא עברו סירוס, שבודדו על ידי שקית

רשת צפופה. כדי לבדוק את השפעת הסירוס על ייצור הפירות, שני סוככים מכל אוכלוסיה שעברו סירוס

הושארו ללא כיסוי להאבקה חופשית. עם הבשלת הפירות, כוסו הסוככים מחדש במטרה למנוע הפצת הזרעים.

ספירת הפירות שחנטו נערכה 14 יום לאחר ההאבקה. בשלב זה ניתן לראות כבר התפתחות ברורה של פרי

בפרחים בהם חלה הפריה. בשלב מאוחר יותר חלק מהפירות אינו מתפתח מסיבות שונות שאינן תלויות דווקא

בהפריה (כמו: התייבשות ענף, מזיקים, פטריות וכדומה).

חישוב ערך האי התאם עצמי (Index of self - incompatibility = ISI) נעשה על פי Zapata and

. (1978) Arroyo מספר הפירות שחנטו כתוצאה מהאבקה עצמית

ISI = ------מספר הפירות שחנטו כתוצאה מהאבקה זרה

ערכי ISI מתייחסים לאפשרויות הבאות: בעל התאם עצמי = 1 < אי התאם עצמי עיקרי = 0.2 > אי התאם עצמי חלקי = 1 > 0.2 < אי התאם עצמי מוחלט = 0

95

ו. 2. תוצאות

ו.1.2. התפתחות הפרח

במעקב אחר מהלך ההתפתחות של פרח בודד, אובחנה בכל האוכלוסיות תבנית דומה המצביעה על שבעה שלבי

התפתחות (איור ו.2). הכנית עוברת שינויי צבע (מירוק לצהוב) ושינויים ברמת הפרשת הצוף המתחילה בשלב

הזכרי (איור ו.2C) ונמשכת בתקופת בשלות הצלקת (איור ו.2E). במעבר בין השלב הזכרי לשלב הנקבי (איור

ו.2D) הפרשת הצוף נחלשת ולעיתים נפסקת. בשלב הנקבי הבשל (איור ו.2E) עמודי העלי מתארכים

ומתבלטים.

צלקות כנית

AB C DEFG

1 mm

איור ו.2: שלבים בהתפתחות הפרח בשומר פשוט עד לחנטה

A. ניצן ירוק – עלי הכותרת סגורים, כל חלקי הפרח ירוקים B. ניצן צהוב - עלי הכותרת סגורים וצהובים, הכנית ירוקה

C. הזכרי - עלי הכותרת פתוחים, אבקנים זקופים, המאבקים סגורים או פתוחים, הכנית צהבהבה ומבריקה בהתאם להפרשת הצוף D. הקדם- נקבי - עלי כותרת והאבקנים נשרו. עמודי העלי אינם בולטים, הכנית צהובה והפרשת הצוף מינימלית E. הנקבי הבשל - שני עמודי העלי מאורכים ונראים בצורת V. הצלקת רצפטיבית. הכנית צהובה ומבריקה בעקבות הפרשה מוגברת של צוף F. האחר- נקבי- הכנית צהובה ואיננה מבריקה. הפרשת הצוף נפסקה G. חנטה - הכנית יבשה וצבעה הצהוב פוחת

96 דוגמה למהלך ההתפתחות המינית בפרחים של סוכך אחד, מראה כי פרחי השומר הינם פרוטואנדריים

(protandrus). לראשונה מבשילים האבקנים ורק לאחר מכן העליים (איור ו.3). השוואת זמני הפריחה של

פרחים בדורים שונים של הסוככון, מראה כי משך הזמן של כל שלב פריחה בפרח תלוי בעמדת הסוככון בתוך

הסוכך ובמיקומו בדורי הסוככון. הדור הראשון של הסוככונים החיצוניים מקדימים לפרוח ביום-יומיים לעומת

הדורים הראשונים של הסוככונים הפנימיים. בתוך הסוככון, יש מרווח של 2-4 ימים בין הפריחה של הדור

הראשון לדור הבא אחריו (איור ו.3).

A1 - ♂ 1 - ♀ 0.5 0 1 A2

0.5 0 A3 1

0.5 0

1 B1

0.5

0

1 B2 Presence and maturation stage of flowers flowers of stage maturation and Presence 0.5 0

1 B3 0.5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 days

flowFlow ers ers in in male male stage stage Flowflow ers in female stage

איור ו.3: מהלך התפתחות הפרחים בדורי הסוככונים בסוכך יחיד הדוגמה נלקחה מפרט אחד מאוכלוסיית הר דוב (MD). תוצאות דומות נצפו בכל נציגי האוכלוסיות הנבדקות. המעקב נעשה ב- 12 סוככים מכל אוכלוסיה. השלב הזכרי: 1= נוכחות של פרחים זכריים. 0= העדר פרחים זכריים. השלב הנקבי: 1= נוכחות פרחים בשלב נקבי בשל. 0.5 = נוכחות פרחים בשלב "קדם נקבי" 0= העדר פרחים נקביים. A1-A3 מיצגים את הדורים 1-3 בסוככונים החיצוניים. B1-B3 מיצגים את הדורים 1-3 בסוככונים הפנימיים (איור ו.1)

97

המרווח בין תחילת השלב הזכרי למועד הבשלת הצלקת, קצר יותר בדורים הפנימיים (3-5 ימים) בהשוואה

לדורים החיצוניים (7-9 ימים) (איור ו.3). כתוצאה מכך, למרות שהפרחים אינם נפתחים בו זמנית, לאחר 9-10

ימים מתחילת השלב הזכרי בדור הראשון, רוב הפרחים בסוכך מצויים בשלב נקבי דומה, עם צלקת בשלה

וכנית צהובה ומבריקה בעקבות הפרשת הצוף. לאחר 14-16 יום משלב של ניצן צהוב בדור החיצוני של

הסוככון החיצוני, מסתיימת הפריחה, ויש חנטה של פרי בכל הפרחים בסוכך שהופרו. דגם זה מתקיים בכל

האוכלוסיות שנבדקו.

משך הזמן של השלב הזכרי מושפע באופן מובהק ממיקום הדור בסוכך (F 5, 150 = 20.8, P< 0.01) (איור

ו.4). בדורים החיצוניים של הסוכך משך הפריחה ארוך יותר (3-4 ימים) בהשוואה לדורים הפנימיים (1-2

ימים). מאידך, משך הפריחה אינו מושפע באופן מובהק מסוג האוכלוסייה (F 4, 150 = 0.38, P= 0.66) (איור

ו.5). לעומת זאת משך הזמן של השלב הנקבי מושפע במובהק מסוג האוכלוסייה (F 4, 150 = 28.7, P< 0.01)

(איור ו.5), אך אינו מושפע באופן מובהק ממיקום הדור בסוכך (F 5, 150 = 1.16, P=0.33) . באוכלוסיות הר

דוב (MD) ומרסין, טורקיה (T) אורך השלב הנקבי היה ארוך יותר (4-6 ימים) בהשוואה לאוכלוסיות באר

חיל (BH) וג'בל קתרינה (S) (2-4 ימים).

4

3 משך

2 השלב a a bc a ab הזכר

c י 1

0 III דור II whorlIII דור I whorlII דורIII whorl I דורII III whorl דור I II whorl דורwhorl I

סוככונים פנימיים סוככונים חיצוניים

איור ו.4: משך הזמן (ימים ממוצע ± SE) של השלב הזכרי בדורים של אותו הסוכך

n = 30 דורים (בשישה סוככים מכל אוכלוסיה) האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים (a>b>c>d)(Bonferroni multiple comparison p< 0.05 ).

98

s male stage 6 female stage

משך 5 הזמן

4 של

3 b a השלבים 2 bc d cd

1 המיניים

) 0 Duration of sexual stages (day Mercin, Mount Dov Ma’alot- Beer-Hail G’abel ימים (

Turkey Tarsiha Katharina

population איור ו.5 : משך הזמן (ימים ממוצע ± SE) של השלבים המיניים באוכלוסיות השונות. n = 36 דורים (בשישה סוככים מכל אוכלוסיה). האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים במשך הזמן של השלב הנקבי (a>b>c>d) (Bonferroni multiple comparison p< 0.05).

ו.2.2. מועד ומשך הזמן של רצפטיביות הצלקת

בחינת בשלות הצלקת in vivo על פי שיעור החנטה לאחר האבקה ידנית מכוונת במועדים שונים, מראה כי

האבקה בתקופה שבין 6-8 ימים מסיום השלב של ניצן צהוב (מועד הסירוס), היא היעילה ביותר ואחוז חנטת

הפירות בה הוא הגבוה ביותר (20-40%), תוצאה דומה נצפתה בכל האוכלוסיות שנבדקו (איור ו.6). כמו כן

נמצא כי קיימת אסוציאציה חזקה (r2=0.93) בין מבחן MTT - פעילות דהידרוגנאז, לבין בשלות הצלקות כפי

שנצפתה בבדיקה in vivo (איור ו.6). כשהצלקות היו בשלות, הכנית והצלקות נצבעו בכל שטחם בצבע חום -

ארגמן (איור ו.7). צביעת הכנית בדומה לצלקות עוררה את החשד לפעילותה כאתר נביטה לגרגרי האבקה.

ו.3.2. הכנית כאתר לנביטת אבקה

נמצא כי שיעור החנטה אינו נבדל באופן מובהק בין תפרחות שבהן הואבקו רק הצלקות לבין תפרחות בהן

הואבקו הצלקות והכנית (20-30% מכלל הפרחים שהואבקו) (טבלה ו.1). לעומת זאת, בכל התפרחות בהן

הואבקה הכנית בלבד בהאבקה ידנית, או בהאבקה חופשית לאחר הסרת הצלקות, או לאחר כיסוי הצלקות בלקה

שקופה, אחוז החנטה היה הנמוך ביותר (-0 9%). בתפרחות שהושארו להאבקה חופשית ללא טיפול (בקרה),

שיעור החנטה היה הגבוה ביותר (45-65%) (טבלה ו.1).

99 מבחן MTT חנטת פרי (%)

40 100 מבחן

80

30 MTT ) אחוז

60 חנטת פר

20 י הצלקות 40 (%) בעלות

10 20 תגובה

חיובית

0 0 (

0 2 4 6 810 12 14 ימים after emasculation מסירוסdays

איור ו.6: השוואה בין מבחן MTT לפעילות דהידרוגנאז לבין בדיקת רצפטיביות in vivo שנבחנה על ידי האבקה מכוונת בשלבים שונים במהלך התפתחות הפרח. ניתנים ממוצע ± n) SE = 9 סוככים)

A B

איור ו.7: מבחן MTT לפעילות דהידרוגנאז לבחינת בשלות הצלקת (כל משבצת 1X1 מ"מ) A. פרחים בשלב "קדם נקבי" בו הצלקת עדיין לא בשלה (4 ימים מניצן צהוב). B. פרחים בשלב "נקבי בשל" בו הצלקות בשלות (8 ימים מניצן צהוב). בשלב זה נצבעות הצלקות והכנית בצבע חום-ארגמן

טבלה ו.1: חנטת פרי (אחוז מתוך כלל הפרחים שהואבקו) בעקבות האבקה לאחר טיפולים שונים. ניתנים ממוצע ± SE . חנטת פרי (% ) n טיפול

1.2 ± 4.0 351 ללא צלקות 2.1 ± 3.6 306 כיסוי צלקות בלקה האבקה חופשית 4.7 ± 54.0 377 ללא טיפול (בקרה) 2.6 ± 25.4 384 צלקות + כנית 6.2 ± 24.5 282 צלקות בלבד האבקה ידנית 1.7 ± 6.9 314 כנית בלבד n = מספר הפרחים שהואבקו בכל טיפול

100 ו.4.2. מועדי הפריחה האוכלוסיות השונות

מועדי הפריחה ועוצמתה בנציגי האוכלוסיות השונות במשך 3 שנות מעקב (2003-2001) (איור ו.8) מראים,

כי בשנת הפריחה הראשונה התחילה הפריחה בסוף יוני – שבעה חודשים לאחר הזריעה (תחילת דצמבר).

בצמחים בני שנתיים החלה הפריחה במרץ ובשנתם השלישית, בסוף אפריל. התברר כי צמחים מאוכלוסיית

מעלות תרשיחה (MT) הקדימו לפרוח (מרץ-אפריל), אחריהם צמחים מאוכלוסיות באר חיל (BH), ג'בל

קתרינה (S) (אפריל-מאי), הר מירון (MM), הר דוב (MD) (יוני), ואוכלוסיית מרסין, דרום מזרח טורקיה

(T) המאחרת בפריחה (יולי). צמחים מאוכלוסיות BH ,MT, ו-S מקדימים לפרוח אך גם מקדימים לסיים את

A B 120 year I 100 2001 80

ע I

60 וצמת MT 40 BH

S הפריחה 20 MM 0 MD T 120 1234567 89 101112 ע

year II ו

100 צ

מ

2002

80 ת ע II ה

MT 60 וצמת

פ

BH ר

40 י S הפריחה ח 20 MM ה MD 0 T 1234567 89 101112 120 year III 100 2003 80 III ע MT 60 וצמת BH 40 S

MM הפריחה 20 MD T 0 1234567 89 101112 1/2 15/3 1/5 1/6 1/7 25/7 15/8 1/9 1/10 20/11 חודשי השנה BH MD T S MM MT

באיור ו.8 : מועדי הפריחה ועוצמתה באוכלוסיות השונות שגודלו בתנאים דומים במהלך 3 שנים. A. עוצמת הפריחה (% הפרחים הפורחים בהתאם למפתח בעמוד 100) B. הפריחה במהלך חודשי השנה. (תאים אפורים מייצגים פריחה עד 50%. תאים כהים מיצגים פריחה מעל 50%)

באר חיל (BH) הר דוב (הר דוב) מרסין,טורקיה (T) ג'בל קתרינה, סיני (S) הר מירון (MM) מעלות תרשיחה MT

101 עונת הפריחה. ההבדל במועדי הפריחה בין האוכלוסיות השונות נשמר לאורך כל שלוש שנות התצפית. במהלך

יולי- אוגוסט, כל נציגי האוכלוסיות השונות שגודלו בתרבות פרחו בעוצמה גבוהה (איור ו.8).

ו.5.2. שיעור החנטה כתוצאה מהאבקה בין ובתוך נציגי אוכלוסיות טבעיות

נמצא כי חנטת הפרי בסוככים החשופים להאבקה חופשית היא גבוהה (85-61%) ונבדלת באופן מובהק

משיעור החנטה בהאבקה מכוונת, עם אבקה שנלקחה מאותו הצמח, מצמחים בני אותה אוכלוסייה או

מאוכלוסיות זרות (-15% 57%) (טבלה ו.2). תוצאה זו התקבלה במרבית האוכלוסיות למעט אוכלוסיית באר

חיל, שבה לא נמצא הבדל בין שיעור חנטת פרי בהאבקה חופשית (71%) לבין שיעור החנטה בהאבקה מכוונת,

עם אבקה שנלקחה מאותו הצמח (74%).

טבלה ו.2: שיעור חנטת הפירות (%) בתגובה להאבקה באבקה ממקורות שונים בקרב אוכלוסיות שונות של שומר פשוט

אוכלוסיות מחוץ לישראל אוכלוסיות ישראליות Mount Dov Mount Meron Ma’alot-Trshiha Beer Hail Mercin, Turkey G’abel Katharina סוג הטיפול (MD) (MM) (MT) (BH) (T) (S) mean ± SE nmean± SE nmean± SE n mean ± SE nmean± SE nmean± SE n mean ± SE האבקה ידנית באבקה שמקורה : 6.1 ± 44.6 46 13.4 ± 57.3 82 5.0 ± 31.0 147 2.1 ± 74 74 8.8 ± 37.0 79 ±13.6 17.5 72 4.7 ± 16.4 באותו צמח בצמחים אחרים 5.1 ± 29.0 83 7.9 ± 17.2 230 7.6 ± 44.0 97 4.5 ± 44 194 5.4 ± 22.7 101 ±10.5 22.5 147 2.2 ± 15.1 מאותה אוכלוסיה בצמחים מאוכלוסיות 2.2 ± 28.2 486 7.9 ± 29.1 525 6.3 ± 26.0 732 3.9 ± 33 589 7.5 ± 25.0 438 6.1 ± 27.2 853 3.4 ± 25.6 אחרות * האבקה חופשית 3.8 ± 71.4 237 2.9 ± 85.2 150 20.8 ± 61.0 387 5.3 ± 71 1410 8.3 ± 62.0 597 6.5 ± 81.6 508 4.1 ± 64.7 ללא טיפול ( בקורת ) 4.6 ± 70.9 240 5.1 ± 75.8 94 5.6 ± 56.0 180 3.5 ± 70 181 0.2 ± 78.0 76 7.4 ± 85.9 690 0.9 ± 60.1 פרחים שעברו סירוס 1.1 ± 1.5 360 1.4 ± 0.8 55 0.0 ± 0.0 156 1.5 ± 7.0 1490 0.2 ± 0.2 450 0.5 ± 0.5 686 0.6 ± 0.6 סוככים מבודדים n = מספר הפרחים שהואבקו בכל טיפול *ממוצע של כלל ההאבקות שנעשו עם חמשת האוכלוסיות האחרות

כמו כן נמצא כי שיעור חנטת הפרי בסוככים שעברו סירוס בשלב של ניצן צהוב והושארו חשופים להאבקה

חופשית, אינו שונה באופן מובהק משיעור חנטת פרי בסוככים שלא עברו סירוס (טבלה ו.2).

השוואה בין שני הכמוטיפים מראה כי בכמוטיפ באר חיל (BH) שיעור החנטה הגבוה ביותר בהאבקה עצמית

ובהאבקה עם האוכלוסיות האחרות. בניגוד אליו, כמוטיפ הר דוב (MD) הוא בעל שיעור החנטה הנמוך ביותר

בכל סוגי הטיפולים (טבלה ו.2).

ההבדלים בשיעור חנטת הפרי מושפעים הן מסוג האוכלוסייה והן מסוג הטיפול, כלומר מהמקור ממנו נלקחה

האבקה (עצמי, אותה אוכלוסייה או אוכלוסייה זרה) על פי מבחן ANOVA דו כיוונית על נתוני חנטת הפרי

102 לאחר האבקה בין ובתוך האוכלוסיות (F23, 102 = 4.46, P<0.001). מאחר וההשפעה על שיעור חנטת הפרי

של האוכלוסייה ממנה נלקחה האבקה, הייתה נמוכה יחסית (F5=2.48, P=0.036) בהשוואה לסוג הטיפול

(F3=20.1, P<0.001), והאינטראקציה בין סוג הטיפול וסוג האוכלוסייה אינה מובהקת, נבדקה המובהקות בין

הטיפולים באמצעות מבחן post hoc במסגרת ANOVA חד כיוונית (איור ו.9). נמצא כי שיעור החנטה

בהאבקה עצמית גבוה יחסית ונבדל באופן מובהק משיעור חנטת פרי לאחר האבקה בין צמחים מאוכלוסיות

זרות, ואינו נבדל באופן מובהק משעור החנטה לאחר האבקה בין צמחים בתוך אותה אוכלוסייה (איור ו.9).

איור ו.9: שיעור חנטת הפירות בהאבקה חופשית בהשוואה להאבקה ידנית עם אבקה ממקורות שונים , באוכלוסיות שונות של Foeniculum vulgare var vulgare. ניתנים ממוצע ± SE אותיות שונות מצביעות אל הבדל מובהק . (Bonferroni multiple comparison P<0.05)

בכל האוכלוסיות, למעט אוכלוסיות הר דוב (MD), הערך הממוצע של מדד האי-התאם עצמי (ISI) גבוה מ1-

(טבלה ו.3), ולכן הן נחשבות כבעלות פוטנציאל להאבקה עצמית. לעומתן באוכלוסיית הר דוב הערך הממוצע

של ISI נמוך יותר (±0.2 0.67) והיא נחשבת כבעלת פוטנציאל להאבקה עצמית חלקית מאחר ו- ISI<1>

0.2. האפשרות להאבקה עצמית קיימת בשומר בכל האוכלוסיות שנבדקו, אולם האבקה עצמית ספונטנית ללא

מאביקים, נמוכה מאוד, (7%) באוכלוסיית באר חיל וביתר האוכלוסיות פחות מ- 1% (טבלה ו.2).

טבלה ו.3 : מדד האי-התאם עצמי (ISI) עבור אוכלוסיות שונות של שומר פשוט (30 פרחים בממוצע x 2-3 חזרות לכל סוג האבקה)

ISI SE ± ממוצע Population

Mount Dov (MD) 0.7 ± 0.1 Israel Mount Meron (MM) 1.0 ± 0.3 Ma’alot-Tarshiha (MT) 1.1 ± 0.3 Beer Hail (BH) 2.2 ± 0.2 Turkey Mercin, (T) 1.6 ± 0.5 Egypt G’abel Katharina (S) 3.7 ± 1.1 Index of self-incompatibility) ISI), נקבע לפי (Zapata and Arroyo (1978

103 לא נמצא דגם מסוים בשיעור חנטת הפירות בהאבקה המכוונת בין כל אחת מנציגי האוכלוסיות השונות לבין

שאר האוכלוסיות. לדוגמה, בין אוכלוסיית באר חיל לאוכלוסיית הר מירון שיעור החנטה גבוה (כ- 50%)

בהשוואה לשיעור החנטה כתוצאה מהכלאה בין אוכלוסיית מעלות תרשיחה ואוכלוסיית הר מירון (2-8%)

(טבלה ו.4). גם ההשוואה בין ההכלאות הרציפרוקליות (טבלה ו.4) שבוצעו בקרב האוכלוסיות אינה מצביעה

על דגם אחיד. לדוגמא, בכמוטיפ באר חיל אין הבדל משמעותי בין ההכלאות הרציפרוקליות עם נציגי כל

האוכלוסיות האחרות ושיעור חנטת הפירות דומה, בין אם מדובר בתורם אבקה או בתורם ביצית. לעומת זאת,

בכמוטיפ הר דוב חלק מההכלאות הרציפרוקליות עם האוכלוסיות האחרות נבדלות באופן משמעותי זו מזו, אך

עם זאת, אין מגמה אחידה בשיעור חנטת הפירות בין תורם האבקה או הביצית. לדוגמא: הכלאה בין אוכלוסיית

הר דוב לאוכלוסיית מעלות תרשיחה, כשהכמוטיפ הר דוב הוא תורם האבקה, שיעור החנטה גבוה (% 50)

לעומת 17.4% כשכמוטיפ הר דוב תורם הביצית. ואילו בהכלאה של כמוטיפ הר דוב עם אוכלוסיית הר מירון,

שיעור החנטה גבוה יותר כשכמוטיפ הר דוב תורם ביצית 33% לעומת 17.0% כשהוא תורם האבקה. בכל יתר

האוכלוסיות יש הכלאות בהן קיים דמיון בין ההכלאות הרציפרוקליות, כמו בהכלאות בין שתי האוכלוסיות

הזרות (מרסין וג'בל קתרינה), ויש הכלאות בהן קיים הבדל משמעותי, כמו בין אוכלוסיית מעלות תרשיחה

ואוכלוסיות הר דוב וג'בל קתרינה. למרות כל ההבדלים שהוזכרו, מבחן ANOVA חד כיווני על שיעור חנטת

הפרי הכולל, שהתקבל בכל אוכלוסיה לאחר האבקתה באבקה זרה (טבלה ו.2), מראה כי האוכלוסיות השונות

אינן נבדלות זו מזו באופן מובהק (F 5, 72 = 0.314, P>0.05) בשיעור החנטה הכולל המתקבל לאחר האבקה

זרה. גם השוואת שיעור החנטה הממוצעת בין כלל האוכלוסיות הישראליות (±12.6 28.4%) ובין אוכלוסיות

טורקיה (±6.3 26%) וסיני (±7.9 29%), אינה מצביעה על הבדל מובהק ביניהן (F 2, 75 =0.056, P>0.05).

טבלה ו.4. שיעור חנטת הפירות (%) (ממוצע ± SE) כתוצאה מהאבקה רציפרוקלית בין אוכלוסיות שונות של שומר פשוט. n = 30 פרחים בממוצע x 2-3 חזרות לכל סוג האבקה

♂ / ♀ parent Ma’alot- Mercin, Population Mount Dov Mount Meron Trshiha Beer - Hail Turkey Mount Meron 17.0 ± 1.0 Ma’alot-Trshiha 50.6 ± 7.0 1.9 ± 1.9 Beer-Hail 30.8 ± 5.9 47.0 ± 11.9 31.5 ± 12.3

parent Mercin, Turkey 10.3 ± 1.4 22.0 ± 0.3 13.8 ± 5.0 38.9 ± 12.3

♀ G’abel Katharina 13.2 ± 2.8 8.3 ± 1.7 11.8 ± 4.5 43.2 ± 0.3 68.4 ± 4.3

Mount Meron 33.0 ± 7.4 Ma’alot-Trshiha 17.4 ± 4.9 8.1 ± 2.6 Beer-Hail 20.8 ± 2.2 53.3 ± 11.3 24.8 ± 4.8

parent Mercin, Turkey 25.3 ± 3.0 19.3 ± 12.7 3.0 ± 1.7 34.3 ± 22.9

♂ G’abel Katharina 35.6 ± 18.7 38.0 ± 2.7 71.8 ± 6.6 31.2 ± 11.6 58.9 ± 7.7

104 ו. 3. דיון ומסקנות

לצורך הבנת מנגנון זרימת הגנים בין ובתוך אוכלוסיות שומר וקביעת היחס בין שיעור האבקה העצמית והאבקה

ההדדית, נערך מעקב אחר שלבי ההתפתחות של הפרח הבודד ושל כלל הפרחים בסוככון ובסוכך תוך התמקדות

באיתור שלב בשלות הצלקת. נבדק ריתמוס הפריחה בנציגי האוכלוסיות השונות, ובוצעו הכלאות מכוונות בתוך

ובין אוכלוסיות.

ו.1.3. ביולוגיה של הפריחה בנציגי אוכלוסיות טבעיות שגודלו בתנאים דומים.

מהלך התפתחות הפרח הבודד וכלל הפרחים בסוככים של צמחי שומר פשוט מאוכלוסיות שונות (איור ו.3),

מצביע על protandry מלאה הן בפרח הבודד והן ברמת הסוכך, בכל נציגי האוכלוסיות שנבדקו. ממצאים אלה

תואמים לממצאים שהתקבלו בצמחי שומר פשוט שגודלו בתרבות בהודו (Koul et al., 1996), אך עומדים

בסתירה למחקר על שומר פשוט בהונגריה (Nemeth et al., 1999), בו נמצא כי קיימים בסוכך בו זמנית,

פרחים בשלב זכרי ופרחים בשלב נקבי, ושיעור האבקה עצמית ספונטנית בסוככים מבודדים, ללא נוכחות

מאביקים היה גבוה (25-61%). על פי הממצאים בעבודה שלנו, ההפרדה בזמן בין השלבים המיניים מוחלטת.

גם האפקטיביות של נביטת גרגרי האבקה על הכנית נמוכה מאוד (פי 4-14) בהשוואה להאבקה דרך הצלקת

(טבלה ו.1). לכן הסיכוי לאוטוגמיה נמוך מאוד. ואומנם, בכל האוכלוסיות שנבדקו נמצא, כי שיעור האבקה

עצמית בסוככים מבודדים, ללא נוכחות מאביקים, אפסית כמעט (1.5% בממוצע) (טבלה ו.2).

בדיקת סוככים לאורך עמודי תפרחות על אותו הצמח מראה כי, סוכך חדש מתחיל לפרוח (פרחים בשלב זכרי)

רק לאחר שהפרחים בסוכך הסמוך סיימו את פריחתם (פרחים בשלב אחר נקבי או בחנטה) ולכן קיימת הפרדה

מוחלטת בין פרחים בשלב הזכרי לפרחים בשלב נקבי גם ברמת הענפים של אותו צמח. תופעה זו דווחה גם על

ידי (Nemeth et al. (1999 בשומר מתורבת. עם זאת, האבקת שכנים אפשרית בשומר, מאחר ובסוככים

שונים המתפתחים על עמודי תפרחות שונים של אותו הצמח קיימים, בו זמנית, פרחים זכריים בשלים ופרחים

בשלב נקבי בשל, בדומה למינים אחרים ממשפחת הסוככיים כמו כרוויה תרבותית (Carum carvi) וגד השדה

Bell, 1971; Nemeth and Szekely, 2000 Davila and Wardle, ) (Coriandrum sativum)

2002). ההבדל בקצב התפתחות הפרחים בין דורי הסוככונים בסוכך (איור ו.3) גורם לכך שבסופו של דבר כל

הפרחים בסוכך מצויים בשלב נקבי בשל, כאשר בכולם הכנית צהובה ומבריקה מצוף והצלקות רצפטיביות.

לסוכך במופע כזה עשוי להיות יתרון גדול בהגדלת כוח המשיכה והסיכוי לביקורי מאביקים, והגדלת פוטנציאל

105 האבקה בעיקר בשל העובדה שבשלב זה הפרחים חסרים את עלי הכותרת הצהובים והבולטים, ואת האבקה

המשמשת כגמול למאביקים. דגם התפתחות כזה מאפשר זמן פריחה ארוך יותר לכל סוכך, שבמהלכו ניתן גמול

רציף למאביקים של אבקה וצוף. נמצא כי הפרשת הצוף מהכנית מתחילה בשלב הזכרי וממשיכה בשלב הנקבי

(איור ו.2). לעיתים פני הכנית מתייבשים בין השלבים המיניים. תוצאות אלה תואמות למחקר שנעשה על

הפרשת הצוף בכרוויה תרבותית (.Carum carvi L) (סוככיים). במחקר זה נמצא כי הפרשת הצוף מהכנית

בשלב הנקבי גדולה פי 1.5 בהשוואה לזו המתקיימת בשלב הזכרי, והחוקרים מצביעים על האפשרות שבסיום

השלב הזכרי מתרחשת ספיגה חוזרת של צוף שלא נאסף (Langenberger and Davis, 2002). בשומר דרוש

לימוד נוסף על ההבדלים בהרכב ובכמות הפרשת הצוף במהלך התפתחות הפרח ובכמוטיפים השונים.

השוואת דגם ההתפתחות של הפרחים בסוככים של נציגי האוכלוסיות השונות מצביעה על אחידות בפרק הזמן

(כ3- ימים בממוצע) בו מצויים הדורים בשלב הזכרי (איור ו.5). לעומת זאת קיים הבדל מובהק בין האוכלוסיות

השונות בפרק הזמן של השלב הנקבי: באוכלוסיות צפוניות, ממזרח טורקיה (T) ומהר דוב (MD), השלב

הנקבי ארוך יותר (4-6 ימים) בהשוואה לאוכלוסיות דרומיות מבאר חיל וג'בל קתרינה (2-4 ימים) (איור ח.5).

ככל הנראה כאדפטציה לתנאי סביבה בהם פעילות המאביקים מוגבלת מחמת טמפרטורות נמוכות.

בחינת בשלות הצלקת in vivo, על פי שיעור חנטת הפירות לאחר האבקה ידנית מכוונת בשלבי פריחה שונים,

ובמקביל למבחן MTT (איור ו.6), מראה כי בכל האוכלוסיות שנבדקו, הצלקת רצפטיבית במשך כשבוע ימים,

אך שיא הבשלות נמצא בין 8-6 ימים לאחר הופעת ניצן צהוב. תוצאות אילו חורגות במעט מאלה שדווחו על

ידי (Reichardt and Pank (1993 בעבודתם על זני שומר פשוט המיועדים לגידול חקלאי בגרמניה. הם ציינו

שבשלות הצלקת מתרחשת במשך יומיים, בין היום הרביעי ליום ה6- מניצן צהוב. בכל מקרה בעת ביצוע

הכלאות מכוונות, יש לקחת בחשבון את מיקום הפרחים על הסוכך מאחר ומשך הזמן של השלב הזכרי מושפע

באופן מובהק מהדור בו הוא נמצא (איור ו.4). לכן המרווח בין שלב הניצן הצהוב לפרח בשלב נקבי בשל,

ארוך יותר בדור הראשון של הסוככונים החיצוניים והפנימיים בהשוואה לזה שבדורים הפנימיים.

נתוני מועדי הפריחה של אוכלוסיות השומר השונות שנמצאו במחקרנו תואמים לתנאי הסביבה שבאזורי

המוצא שלהן למרות שבעבודה זו גודלו נציגי האוכלוסיות בתנאים דומים. האוכלוסיות הדרומיות מקדימות

לפרוח בהשוואה לאוכלוסיות הצפוניות ההרריות. ממצאים אלה תואמים לממצאים שהתקבלו במחקר קודם על

106 חלק מאוכלוסיות אלה שגודלו בנווה יער (דמינשטיין, 2000). עם זאת, במהלך יולי אוגוסט כל הצמחים בשיא

פריחה וקיימת אפשרות של האבקה בין אוכלוסיות ממוצא שונה בתנאי תרבות.

ההבדל שנצפה בין נציגי האוכלוסיות בתחילת מועד הפריחה, עשוי להסביר באופן חלקי את הבידוד בין

האוכלוסיות.

לסיכום ניתן להסיק כי:

ƒ מהלך התפתחות הפרח הבודד וכלל הפרחים בסוככים של צמחי שומר פשוט דומה מאוד באוכלוסיות שונות

שנבדקו, ומצביע על protandry והפרדה מלאה בין השלב הזכרי לנקבי, הן בפרח הבודד והן ברמת הסוכך

אך לא ברמת הצמח, ולכן קיימת אפשרות להאבקת שכנים.

ƒ הצלקת רצפטיבית במשך כשבוע ושיא הבשלות בין 6-8 ימים משלב של ניצן צהוב.

ƒ הכנית, מעבר לתפקידה כמפרישת צוף, יכולה לשמש באופן חלקי מאוד גם כמקום לנביטת גרגרי האבקה

המאפשרת הפריה. וחלוקת התפקידים בין הצלקת והכנית נשמרת

ƒ מועדי תחילת הפריחה של אוכלוסיות השומר השונות תואמים למוצאן, למרות גידולם בתנאים דומים. אך

עם זאת קיימת אפשרות להפריה בין האוכלוסיות, עקב חפיפה חלקית במועדי הפריחה שלהן שהולכת

וגדלה עם מהלך הפריחה בחודשי הקיץ.

ו.2.3. שיעור החנטה כתוצאה מהכלאות מכוונות בין ובתוך נציגי אוכלוסיות טבעיות

שיעור החנטה הגבוה (70%) המתקבל בהאבקה חופשית בהשוואה ל- 30-45% בהאבקה ידנית (איור ו.9)

אינו נובע מתהליך הסירוס, מאחר ושיעור חנטת הפרי בסוככים שעברו סירוס והושארו חשופים להאבקה

חופשית, אינו שונה באופן מובהק משיעור חנטת הפרי בסוככים שלא עברו סירוס והואבקו באופן ידני

(טבלה ו.2). ההבדל בשיעור החנטה בין האבקה חופשית להאבקה ידנית נובע לכן ממספר גורמים אפשריים:

1. בהאבקה חופשית יש יותר הזדמנויות למפגש בין אבקה ממקורות שונים לבין הצלקת, מחמת משך הזמן

הממושך בו הצלקת רצפטיבית (כ7- ימים), וכמות גבוהה של מאביקים שנראו בשטח. לעומת זאת, בהאבקה

ידנית האבקת הצלקת בוצעה פעם אחת, ומקור האבקה המגיע בהאבקה הידנית, רק מפרט אחד, מגדיל את

האפשרות שהיה שימוש באבקה לא חיונית. ואומנם, (Paschke et al. (2002 מצאו במחקרם על

Cochlearia bavarica (מצליבים), כי בהשוואה לתורם אחד, האבקה ממספר תורמי אבקה, מעלה את ייצור

הזרעים. במחקר זה הקפידו החוקרים להשתמש במספר דומה של גרגרי האבקה בכל טיפול, ולטענתם, הסיבה

107 לעלייה בפוריות הנקבה ובכשירות הצאצאים, נובעת מהעלייה במגוון הגנטי של גרגרי האבקה. 2. יתכן כי

בהאבקה ידנית היה שימוש בכמות מועטה מידי, או להיפך, סתימת הצלקת בכמות גדולה מידי של אבקה

העלולים להפחית את סיכויי ההפריה (Young and Young, 1992; Stone et al., 1995). לעומתם טוענים

(Waites and Aagren (2004 כי בשנית גדולה (Lythrum salicaria) (כפריים), אין כל הוכחה שעודף

גרגרי אבקה לא חיוניים על הצלקת גורמים לסתימתה או מפריעים להפריה.

3. כיסוי הסוככים בשקיות עלול לגרום להפחתה בחנטת הפרי בהאבקה ידנית. התצפיות שלנו תואמות לאלה

של (Gaudeul and Till-Bottraud (2003 שדווחו כי בחרחבינה אלפינית (Eryngium alpinum)

(סוככיים) בידוד הפרחים לאחר האבקה באמצעות שקיות, גורם לעלייה בלחות, ומעודד התפתחות פטריות

וחרקים פרזיטים הפוגמים ביעילות האבקה.

ייצור זרעים גבוה (מעל 80%) מעיד בדרך כלל על התאם עצמי והאבקה עצמית (Dafni, 1992). בנוסף,

שומר פשוט מאופיין בכמות פרחים רבה בצמח הבודד במהלך עונת הפריחה. מחקרים בצמחים אחרים מראים

על מתאם חיובי בין מספר הפרחים הפתוחים בו זמנית והאבקה עצמית ( Harder and Barrett, 1995;

De Jong et al., 1999; Gaudeul and Till-Bottraud, 2003). ואכן, ערכי ISI של כל האוכלוסיות

הנבדקות (טבלה ו.3) מעידים על אפשרות גבוהה להאבקה עצמית. לאוכלוסיות באר חיל וג'בל קתרינה ערכי

ISI גבוהים יחסית (2.2 ו- 3.7 בהתאמה) לעומתן, אוכלוסיית הר דוב (ISI=0.7 ) יש כנראה התחלה של

התפתחות מנגנון המעלה את האי התאם עצמי.

להאבקה עצמית בצמחים עלולות להיות השלכות שליליות. ישנן עדויות המצביעות על ירידה בשונות הגנטית

בתוך האוכלוסייה, באוכלוסיות בהן קיימת האבקה עצמית ברמה גבוהה בהשוואה לאוכלוסיות בהן מתקיימת

האבקה זרה (Charlesworth and Charlesworth, 1995; Paschke et. al., 2002). לכן, בטווח הרחוק,

הפוטנציאל האדפטיבי באוכלוסיות בעלות האבקה עצמית עלול להיות נמוך מזה שבאוכלוסיות בעלות האבקה

זרה (Gaudeul and Till-Bottraud, 2003). עם זאת, להאבקה עצמית יש יתרון בתנאים בהם יש ירידה

בסיכוי להאבקה זרה, כמו בתנאי מזג אויר קשים, מחסור במאביקים מתאימים, פריחה מוקדמת או בתנאים בהם

קיימת תחרות על מאביקים ( Baker, 1955; Schemske et al., 1978; Lloyd, 1992; Motten, 1982;

Herrera et al., 2001) . לצמחים בעלי התאם עצמי יתרון גם בהתבססות על ידי פרט בודד בבתי גידול

חדשים, גם במקומות בהם חסרים המאביקים המתאימים (Baker, 1955).

108 במערכת הרבייה של שומר פשוט מתקיימות בו זמנית שתי אסטרטגיות רבייה: האחת כוללת האבקה עצמית

בהיקף רחב ופרחים בלתי ספציפיים המתאימים למאביקים שונים, המאפשרים תפוצה גיאוגרפית רחבה

והתבססות בבתי גידול שונים כפי שאופייני למיני סוככים רבים (Bell, 1971; Baker, 1955). אסטרטגיה

שנייה, הכוללת אפשרות להאבקה הזרה, באמצעותה יכול המין לשמור על שונות גנטית.

שני הכמוטיפים, הר דוב ובאר חיל, נבדלים מאוד זה מזה בשיעור חנטת הפרי בעקבות הכלאות מכוונות.

כמוטיפ באר חיל בעל פוטנציאל ההפריה הגבוה ביותר מבין כל האוכלוסיות, הן בהכלאות עצמיות והן בין

האוכלוסיות, לעומתו כמוטיפ הר דוב הוא בעל הפוטנציאל הנמוך ביותר (טבלה ו.4). כמו כן, בכמוטיפ באר

חיל אין הבדל משמעותי בין ההכלאות הרציפרוקליות, וחנטת הפרי גבוהה יחסית בין אם מדובר בתורם אבקה

או בתורם ביצית. לעומת זאת בכמוטיפ הר דוב ההכלאות הרציפרוקליות עם האוכלוסיות האחרות נבדלות

באופן משמעותי, אך יחד עם זאת אין מגמה אחידה בין תורם האבקה או הביצית. הבדלים אלה מצביעים כנראה

על מגמה של התפתחות אבולוציונית שונה בכמוטיפים שאוכלוסיותיהם מרוחקות זו מזו.

למרות ההבדלים בשיעור חנטת הפירות בהאבקה המכוונת בין כל אחת מנציגי האוכלוסיות השונות לבין שאר

האוכלוסיות (טבלה ו.4 ), מקור האבקה (האוכלוסייה) אינו הגורם המשפיע באופן מובהק על השונות בשיעור

החנטה. הסיבה לכך נובעת כנראה מהשונות בגורמים הסביבתיים. תהליך האבקה לא בוצע בו זמנית, וקיום

גורמים כמו: טמפרטורות שונות, רוחות, חיוניות אבקה, התפתחות פטריות או בקיעת כנימות בסוככים

המבודדים לאחר האבקה, עשויים להשפיע גם הם על שיעור חנטת הפרי ולגרום לשונות הגבוהה שהתקבלה

בתוצאות. לסיכום ניתן להסיק כי:

ƒ בשומר פשוט קיים פוטנציאל גבוה להאבקה עצמית מאחר ובכל הכמוטיפים קיימת סבילות עצמית ברמה

גבוהה ובכולן קיימת אפשרות להאבקת שכנים. מסקנה זו עשויה להסביר את קיומם ושימורן של

אוכלוסיות בעלות הרכב כימי שונה גם אם הן מצויות במרחק קטן זו מזו.

ƒ האבקה זרה (xenogamy) בין האוכלוסיות איננה שונה באופן מובהק בין האוכלוסיות הישראליות

והאוכלוסיות הזרות. לכן, באופן תיאורטי, זרימת גנים אפשרית בקרב כל האוכלוסיות.

ƒ כמוטיפ באר חיל בעל פוטנציאל פוריות הגבוה ביותר מבין כל האוכלוסיות שנבדקו, לעומתו, כמוטיפ הר

דוב בעל פוטנציאל פוריות הנמוך ביותר.

ƒ האבקה עצמית ספונטנית ללא מאביקים נמוכה מאוד ומגיעה לשיעור חנטה של 1.5% בממוצע.

109 פרק ז. דיון כללי

בעבודה זו נבדקו הגורמים המשפיעים על היווצרות ושימור של כמוטיפים בשומר פשוט. בדיון אתייחס תחילה

להבדל בין שני הכמוטיפים בתכולה ובהרכב האולאורזין ולמשמעותו האקולוגית האפשרית. אתאר את הבסיס

הגנטי והביוכימי לשוני בהרכב הכימי שבין שני הכמוטיפים. ולבסוף אדון במנגנון לשימור ההבדלים ביניהם.

ז.1. המשמעות האקולוגית של ההבדל בהרכב האולאורזין של שני הכמוטיפים

להרכב ולתכולת החומרים בשמן האתרי, הקובעים את ריחו וטעמו של הצמח, יכולה להיות חשיבות רבה בהגנה

על הצמח בדחיית הרביבורים או במשיכת בעלי חיים לצורכי האבקה או לצורך הפצת זרעים, ולכן הם עשויים

להשפיע גם על תפוצתו והתבססותו בבתי גידול שונים. הבחנה בשינויים החלים בהרכב ובכמות החומרים בשמן

האתרי עשויה לרמז על מנגנוני הייצור ולתרום להבנת תפקוד החומרים המשניים באברים השונים של הצמח

.(Kainulainen et al., 1998; Tavish et al., 2000)

בעבודה זו נערכה לראשונה השוואה מפורטת של ההרכב הכימי בין שני כמוטיפים של שומר פשוט אשר גודלו

בתנאים דומים, הכוללת השוואה בין אברי צמח (וגטטיביים ורפרודוקטיביים) ובשלבים שונים של האונטוגנזה.

בנוסף לכך נבדק גם הרכב הנדיפים המשתחררים מאברי צמח שונים לסביבתם החיצונית. פיתוח המערכת

לבדיקת פעילות של OMT שנעשתה במחקר זה, אפשרה בחינת הקשר בין צבירת הפנילפרופנואידים לבין

פוטנציאל הייצור שלהם, ושיעור שחרורם מהצמח, בניגוד לעבודות קודמות (Gupta et al., 1995

(Marotti et al.,1993,1994;Cavaleiro et al., 1993; Bernath et al.,1996; Barazani et al., 1999

בהן נבחנה רק רמת צבירתם.

נמצא כי בנוסף להבדל בהרכב הכימי הייחודי המאפיין את האולאורזין הנמצא בפירות של כל כמוטיפ, נשמר

ההבדל הכימי גם באברי הצמח הוגטטיביים (עלים ועמודי תפרחות) (איור ג.8), במהלך האונטוגנזה ואף

בתרכובות הנדיפות המשתחררות מאברי צמח שלמים (איור ג.13). ההבדל בין הכמוטיפים בהרכב האולאורזין

ניכר בעיקר בהרכב הפנילפרופנואידים, המהווים 60-85% מהאולאורזין. באיברים העל אדמתיים מתבטא

ההבדל בתכולה שונה של t-anethole ו- estragole ואילו בשורש ההבדל מתבטא בתכולה של -dillapiole

ו-apiole (איור א.1). כמו כן, נמצא קשר ברור בין תכולת t-anethole ו-estragole באברי הנצר ובמהלך

האונטוגנזה לבין פוטנציאל הייצור שלהם, המתבטא ברמת הפעילות של OMT.

110 ההרכב היחסי של הנדיפים, המשתחררים מהצמח החי, שונה מתכולתם היחסית באולאורזין המצוי בתוך אברי

הנצר. בשני הכמוטיפים נמצא כי למרות שהמרכיבים הדומיננטיים באולולארזין הם הפנילפרופנואידים,

המרכיב העיקרי המשתחרר לאוויר שבסביבת הצמח הוא α-pinene (איור א.1) שתכולתו באולאורזין נמוכה

(2-18%). כתוצאה מכך, ההבדל בין הכמוטיפים בהרכב הנדיפים בסביבת הצמח קטן.

α-pinene ידוע כחומר המושך סוגים שונים של חיפושיות קליפה (Schroeder and Lindelöw, 1989).

גם t-anethole מהווה גורם משיכה לחרקים ממשפחות שונות ( Lehman, 1932; Ladd and Tew, 1983

(Metcalf and Lampman,1989; Cherry et al.,1996, 1998; Imai et al., 1998; Tóth et al., 2004

וכן גם Hussein et al., 1991) estragole). חרקים אלה עשויים לשמש כמאביקים. אולם, ייצור גבוה של

פנילפרופנואידים, לעומת שחרורם בשיעור נמוך (איור ג.13), גורם לאגירתם ושמירתם בצמח בכמויות גדולות

ובמיוחד ביחידות התפוצה. עובדה זו עשויה לרמז כי מנגנון הפעולה ותפקידם הביולוגי של הפנילפרופנואידים

בשומר, קשור דווקא בהישארותם באברי הצמח, כנראה לצורך הגנה על העובר וחומרי התשמורת מפני

הרביבורים, ולא כסיגנלים כימיים המשתחררים מהצמח לצורך משיכת חרקים למטרות האבקה או לצורך הפצה

של יחידות תפוצה. ואכן, במיצוי מפירות שומר פשוט הוכחה פעילות אנטימיקרוביאלית של t-anethole ו - estragole נגד חיידקים ופטריות ( Marotti et al., 1994; Tanira et al., 1996; Scora and Scora, 1998

Ruberto et al., 2000; Mimica-Duki, 2003) וגם נגד חרקים הרביבורים (Bazzoni et al., 1997

Regnault and Hamraoui, 1995; Ho et al., 1997; Sathiyamoorthy et al., 1997; Kim and Ahn,

.(2001

תפוצת הכמוטיפים עשויה לנבוע מגורמים פיזיקליים הקשורים ברמות התנדפות שונות. לדוגמה: בבדיקת

ההתנדפות של מונוטרפנים ממחטים של אורן (Pinus elliottii) נמצא, כי טמפרטורת הסביבה משפיעה באופן

ישיר על רמת הנידוף (Tingey in: Tavish et al., 2000). לכן, ניתן להניח כי לכמוטיפ העשיר ב- t-anethole יתרון בשמירה על הפנילפרופנואידים באזורים בעלי טמפרטורה גבוהה, שכן שיעור הנידוף של t-anethole נמוך יותר (פי 5) בהשוואה ל- estragole. חיזוק להנחה זו נמצא במחקרם של

(Barazani et al. (1999, המצביע על זיקה חיובית בין הטמפרטורה באוגוסט לבין תכולת ה- t-anethole

באוכלוסיות של שומר בישראל הגדלות לאורך גרדיאנט אקלימי. כמו כן, בבדיקה שנערכה על ידי פרידמן

111 (מידע אישי) באוכלוסיות בר של שומר פשוט באי איקריה ביוון, נמצא כי בגובה 900 מטר מעל פני הים,

המרכיב העיקרי באולאורזין שהופק מפירות של שומר פשוט הינו estragole, ואילו בקרבת הים, t-anethole

מהווה את המרכיב העיקרי.

גם בכמוטיפים בני משפחות צמחים אחרות דווח על זיקה בין תפוצת הכמוטיפים לבין הטמפרטורה בבית

גידולם. במין Minthostachys andina (שפתניים) הגדל בבוליביה, נמצא כי אוכלוסיות העשירות

ב-menthone גדלות באזורים נמוכים, המאופיינים בשינויי אקלים קיצוניים, ואילו באזורים הגבוהים עלתה

שכיחות צמחים עשירים ב-Collazos et al., 1993) pulegone). בבת-קורנית פשוטה (Thymus vulgaris)

הגדלה בצרפת, כמוטיפים בעלי נדיפים לא פנולים בשמן האתרי (α-terpinol ו- geraniol) מראים עמידות

טובה יותר באזורים הקופאים בתחילת החורף (−10°בדצמבר) בהשוואה לכמוטיפים בעלי נדיפים פנוליים

(thymol ו-carvacrol), שבתי גידולם הטבעי באזורים שאינם קופאים. לכמוטיפים בעלי תרכובות פנוליות

יתרונות נוספים, מאחר והם עמידים יותר גם לתקופות יובש, מוגנים יותר מפני אכילת חלזונות ובעלי פוטנציאל

אללופטי גבוה יותר, המהווה יתרון בתחרות עם עשבוניים אחרים (Amiot et al., 2005).

ההבדלים בכמות האולאורזין הכללית בין אברי הצמח וההרכב השונה בשורשים ובנצר, מרמזים על תפקוד

שונה של מרכיבי האולאורזין באברים השונים, החשופים לתנאי סביבה שונים ולהתקפה של הרביבורים שונים. apiole ,dillapiole ו-myristicin (איור א.1) פנילפרופנואידים המאפיינים את השורשים של שני הכמוטיפים

שנבדקו, נמצאו בעלי השפעה טוקסית על חרקים, בעלי השפעה על מערכת העצבים ביונקים ובעלי פעילות

אנטי-בקטריאלית ואנטי-פיטריתית למגוון אורגניזמים ( Shulgin, 1967; Dhingra and Sarup, 1979

.(Honda et al., 1988; Hallstrom and Thuvander, 1997; Minija and Thoppil, 2002

בעבודה זו מצאנו כי, בתנאי מעבדה, לשמן האתרי המופק משומר יש פוטנציאל פיטוטוקסי ואוטוטוקסי המשפיע

על עיכוב חלקי בנביטה ובעיקר על עיכוב התארכות השורשונים של זרעי חיטה ושומר. היות וריכוז האולאורזין

בפירות גבוה פי 4-5 בהשוואה לאברי הצמח הוגטטיביים, השפעת הפנילפרופנואידים על העובר עשויה להיות

משמעותית על עיכוב נביטתו. איסוף יחידות התפוצה על ידי פועלות שלנמלת קציר שנצפו בשדה, יכול להוות

יתרון לא רק בהפצתם אלא גם באכילת הקליפה המכילה את ביבי השמן האתרי. בנוסף, ניתן לשער כי

התייבשות העלים של שושנת העלים ונשירתם בקרבת הצמח, יכולה להוות יתרון במניעת נביטה והתפתחות של

יחידות תפוצה של השומר עצמם ויתכן גם של זרעי מתחרים אחרים. בחלקות הניסוי סולקו העלים היבשים

112 והשטח רוסס, לכן לא ניתן היה לעקוב אחר התופעה בשדה. מאידך נתקלנו בצורך לנכש את נבטי השומר

שנבטו בקרבת צמחי האם כדי למנוע חדירה של גנוטיפים לא ידועים. בעתיד כדאי לבחון הנחה זו בבתי הגידול

הטבעיים.

בתנאי מעבדה הכמוטיפ האסטרגולי מהר דוב נמצא כבעל פוטנציאל פיטוטוקסי גבוה בהשוואה לכמוטיפ

האנתולי, עם זאת תכולת האולאורזין הכללית בפירות של כמוטיפ באר חיל גדולה יותר, בהשוואה לזו של הר

דוב. מאחר וכמוטיפ באר חיל גדל בבית גידול יבש יותר מהכמוטיפ של הר דוב, תוצאות אלה תואמות להנחה

כי צמחי מדבר עשירים יותר בשמן אתרי. (Bezic et al. (2003 משערים כי לקוטיקולה עבה ולשמן אתרי

תפקיד דומה בהתאמה לבתי גידול יובשניים. הפרשת השמן האתרי מגנה על הצמח מפני איבוד מים על ידי

הפחתת הדיות ועל ידי שבירת קרני האור. על פי (Friedman et al. (1977 באזורים צחיחים עשויה להיות

לאללופתיה משמעות לא מבוטלת בתחרות שבין מיני צמחים. הפיטוטוקסינים הנדיפים נספחים לקרקע של

האזור היבש יותר מאשר באזורים לחים, מודחים פחות לעומק על ידי מי הגשם ומתפרקים פחות על ידי

המיקרופלורה של הקרקע. ראיה לכך היא היעילות היחסית של האללופתיה בלענת המדבר Artemisia)

(herba-alba שנמצאה גבוהה יותר באזורים מדבריים לעומת אזורים בעלי משק מים טוב יותר.

השאלה אם אכן קיימת אללופתיה בשומר במערכת הטבעית ומידת השפעתה על מתחרים פוטנציאלים

בכמוטיפים השונים, נשארה בשלב זה פתוחה.

ז.2 הבסיס הגנטי והביוכימי לשונות בהרכב הכימי של הכמוטיפים

בעבודה זו מצאנו כי ההורשה של התכונה לייצור estragole ו- t-anethole בכמוטיפים של שומר מצביעה על

דגם הורשה של גן יחיד עיקרי עם שני אללים (אנתולי ואסטרגולי ) בעלי אפקט תוספתי ואפקט דומיננטי של

האלל האסטרגולי. מכאן ניתן להסיק כי באוכלוסיות מעורבות עם שני הכמוטיפים יהיו פרטים בעלי תכולת estragole גבוהה מזו של t-anethole. ממצא זה והדמיון בין הרכב הפנילפרופנואידים בפירות לבין הרכבם

בנצר, מצביעים על אפשרות כי תכולתם קשורה בגורמים גנטיים ואינה נובעת מתנאים אקו- פיזיקלים כגון:

משקעים שנתיים וטמפרטורה שנתית ממוצעת, כפי שהוצע על ידי (Barazani et al. (1999.

ניתוח האסוציאציה בין תכולת ה-estragole ו- t-anethole בפירות בשלב שעוותי, בכל נציגי ששת

האוכלוסיות שנבדקו, מצביע על זיקה שלילית ביניהם (איור ג.2). אוכלוסיות עם תכולת estragole גבוהה, הן

בעלות תכולת t-anethole נמוכה ולהיפך. תוצאות אלה תואמות את הממצאים ממחקרים אחרים בהם נבדק

113 ההרכב הכימי של הפירות (Krüger and Barazani et al., 1999; Pank et al., 2003; Miraldi, 1999

Hammer, 1999). יחד עם זאת חשוב לציין שבתוך אוכלוסיות בעלות תכולת estragole הנמוכה מ5%-

קיימת זיקה חיובית חזקה בין estragole ו-r = 0.98) t-anethole) (איור ג.2). ירידה בתכולת ה-estragole

מלווה בירידה גם בתכולת ה-t-anethole. ממצא זה תואם לממצאים שהתקבלו בסקירה רחבה של מחקרים

באוכלוסיות שומר שונות (Pank et al., 2003 ) ועשוי להוות בעיה בניסיון לפתח זנים בעלי תכולת estragole נמוכה. ניסויים כאלה מבוצעים בזנים המכילים רמות נמוכות של estragole, אולם ברירה

מתמשכת והורדה נוספת של ריכוז ה-estragole תגרור גם להפחתת כמות ה- t-anethole. התלות ההדדית

הגדולה בין שני המרכיבים הללו מרמזת על מסלול מטבולי משותף לשניהם.

כדי להסביר את השונות בהרכב הפנילפרופנואידים בכמוטיפים של השומר נבדקה האפשרות לאתר את מיקומו

של הגן במסלול הביוסינתטי. מצאנו כי הגורם להבדל בין הכמוטיפים בייצור estragole ו- t-anethole אינו

מצוי בשלב הסופי (שלב המתילציה) של המסלול הביוסינתטי. כמו כן לא נמצאה פעילות משמעותית של

איזומראזות העשויה להסביר את ההבדל בין הכמוטיפים. מכאן אנו מניחים כי הגורם להבדל ברמה הביוכימית

בין הכמוטיפים מצוי בשלב מוקדם יותר במסלול הביוסינתטי לייצור estragole ו- t-anethole (איור ד.1).

מעניין לציין כי בכל נציגי ששת האוכלוסיות שנבדקו, קיימת זיקה שלילית בין תכולת הפנילפרופנואידים וה- r = - 0.91) fenchone) (איור ג.C2), כאשר באוכלוסיות בעלות תכולה גבוהה של פנילפרופנואידים, תכולת

ה- fenchone נמוכה יותר. קשה להסביר את הסיבה לתלות בין מרכיבים אלה, מאחר ומקובל כי המונוטרפנים

נוצרים במסלול הדיאוקסיקסילולוז פוספאט (Eisenrich et al., 1998) (DXP) ואילו הפנילפרופנואידים הם

נגזרות של החומצה האמינית-פנילאלנין, והם נוצרים במסלול החומצה השיקמית (Croteau et al., 2000).

לעומת זאת (Tabata (2000 שעבד על כמוטיפים של Perilla frutescens (שפתניים), מצביע על קיום

אפשרי של גן דומיננטי- G הנוכח בכמוטיפים המייצרים מונוטרפנים וקשור בבקרת הסינתזה של geranyl

GPP) diphosphate), חומר המוצא המרכזי לכל המונוטרפנים. בהעדר הגן G צמחי פרילה צוברים בשמן

האתרי שלהם פנילפרופנואידים כמו myristicin ו-elemicin (איור א.1) במקום מונוטרפנים. כנראה שהגן

G מבקר שלב מוקדם מאוד במסלול הביוסינתטי, וקשור בפעילות על glyceraldehyde 3-phosphate.

מרכיב זה מצוי בצומת שבין המסלול לייצור טרפנים דרך DXP ומסלול החומצה השיקמית לייצור

פנילפרופנואידים. הזיקה השלילית שהתקבלה בין תכולת הפנילפרופנואידים וה- fenchone יוצרת גם היא

114 מגבלה בפיתוח זנים בעלי הרכב התואם את דרישות ה-European pharmacopoeia, משום שהורדת כמות ה- estragole קשורה בהורדת תכולת ה- fenchone מתחת לתכולה הנדרשת (% Pank et al., 2003) (15).

מקדם האסוציאציה בין תכולת ה -estragole ותכולת האולאורזין הכללית (r = -0.51) באוכלוסיות השונות

שנבדקו, מראה כי תכולת האולאורזין גבוהה יותר באוכלוסיות בהן תכולת ה-estragole נמוכה איור ג.2).

תוצאות אלה תואמות את הממצאים שדווחו על ידי (Pank et al. (2003. עם זאת, הבקרה הגנטית לתכולת

השמן האתרי הכללית לא נחקרה בשומר, ויש להניח כי היא קשורה בפעילות של גנים רבים נוספים, כאלה

המשפיעים על הביוסינתזה במסלוליים הביוכימים של החומרים השונים וכאלה הקשורים במבנה ובצפיפות ביבי

השמן.

ז.3 המנגנון לשימור ההבדלים ביו הכמוטיפים

התמיינות לכמוטיפים עשויה להיות שלב ראשוני בספציאציה תוך מינית. לדוגמה: בכלך מצוי ( Ferula communis) (סוככיים), בסרדיניה, נבדקה השונות הגנטית בין 5 אוכלוסיות, ביניהן כמוטיפים רעילים ולא

רעילים באמצעות אנליזה אלקטרופורזית של 14 אתרים אנזימטים ידועים. נמצא כי השונות בין הכמוטיפים

הרעילים והלא רעילים הייתה גדולה יותר מאשר בקרב כל אחד מהם בנפרד וללא תלות במרחק הגיאוגרפי.

ממצא המעיד על ירידה בזרימת גנים בין שני הכמוטיפים (Marchi et al., 2003) .

התצפיות שלנו מראות, כי הפוריות כתוצאה מהאבקה זרה (xenogamy) בין האוכלוסיות הישראליות של

שומר פשוט לבין האוכלוסיות הזרות דומה באופן מובהק (טבלה ו.4). לכן, ניתן להניח כי זרימת גנים אפשרית

בקרב כל האוכלוסיות ללא קשר למרחק הגיאוגרפי. לעומת זאת, מצאנו גם כי לצמחי שומר פשוט מששת

האוכלוסיות שנבדקו, פוטנציאל גבוה של האבקה עצמית, שמקורה בתבנית פריחה המאפשרת האבקת שכנים

(geitonogamy) בנוסף לסבילות עצמית. עם זאת, קיימים הבדלים בין אוכלוסיות שונות ברמת ההאבקה

העצמית, ובאוכלוסיית הר דוב יש כנראה התחלה של התפתחות מנגנון המגביר את האי התאם עצמי (טבלה

ו.3). מערכת הרבייה המתוארת כאן מסבירה את יכולת התפוצה הרחבה של השומר ואת התבססותו במגוון בתי

גידול מחד, ומאידך עשויה להסביר את קיומן ושימורן של אוכלוסיות בעלות הרכב כימי שונה גם אם הן מצויות

במרחק קטן זו מזו.

לשימור השונות הכימית יש יתרון אבולוציוני במיוחד בסביבה משתנה או בצמחים המשמשים מקור מזון למספר

הרביבורים ( Pellmyr, 1986; Pichersky and Gang, 2000; Pichersky and Gershenzon, 2002

115 Dudareva and Pichersky, 2000). בצמח בעל תפוצה רחבה כמו השומר, יש חשיבות בקיום פולימורפיזם

כימי המאפשר התמודדות עם תנאים אביוטים שונים ושימוש באסטרטגיות ההגנה שונות בפני פרזיטים

והרביבורים ממינים שונים ובעלי העדפות שונות. לדוגמא: בשש אוכלוסיות של אקליפטוס ( Eucalyptus terpenoids), בעלות הרכב טרפנים שונה, דווח כי ככל שעולה תכולת ה- cineole בעלים, יש הפחתה

משמעותית בשיעור הפגיעה על ידי החיפושית .Penelope et al., 1993) Anoplognathus spp).

באוכלוסיות בר של בת-קורנית פשוטה (Thymus vulgaris) בדרום צרפת נמצאו שישה טיפוסים כימיים

המאופיינים בהרכב שונה של מונוטרפנים. נמצא כי חלזונות (Helix aspersa) הניזונים מצמח זה, נדחים

מהטיפוסים המכילים פנוליים רעילים ( carvacrol ו- thymol ) ומעדיפים את הטיפוס הכימי המכיל linalool

כמרכיב עיקרי. עם זאת, linalool לא אטרקטיבי לכל ההרביוורים (Linhart and Thompson, 1995).

דוגמה מורכבת יותר המראה כי פולימורפיזם בייצור ציאנוגנים מושפע מגורמים ביוטים ואביוטיים, ניתן לראות

באוכלוסיות של תלתן זוחל ( Trifolium repens). נמצא כי עלי הצמחים הציאנוגנים נפגעים בטמפרטורות

נמוכות או בתנאי יובש, יותר מעלים של צמחים שאינם ציאנוגנים והם גם נתקפים יותר על ידי חילדון

(Uromyces trifolii). לעומת זאת צמחים שאינם ציאנוגנים נתקפים יותר על ידי החלזון (Helix aspersa)

הידוע כהרביבור ראשי של התלתן (Dirzo and Harper, 1982). נמצא כי ייצור הציאנוגנים אינם מושרה

בעקבות אכילת החלזונות, אך מושפע משינויים בטמפרטורה (Hayden and Parker, 2002).

השפעתם של גורמים אקולוגיים כמו מאביקים, מפיצי זרעים או הרביבורים על הרכב השמן האתרי לא נבדקה

עדיין בשומר פשוט. מחקר עתידי הבוחן את מידת הרעילות או המשיכה של מרכיבי השמן האתרי בכמוטיפים

השונים, לאורגנזמים הרביבוריים או למאביקים ומפיצי יחידות תפוצה המצויים בבתי הגידול השונים, עשוי

לתרום ליתר הבנה של השוני בהרכב השמן האתרי בין הכמוטיפים ובין אברי הצמח השונים לאורך מחזור

החיים.

116 רשימת ספרות Abrahim D., Braguini W.L., Kelmer-Bracht AM. and Ishii EL. 2000. Effects of four monoterpenes on germination, primary root growth, and mitochondrial respiration of maize. Journal of Chemical Ecology 26: 611 – 624. Adams R. 1995. Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography /Mass Spectroscopy. Allured Publ., Carol Stream, USA. Agelopoulos M.G. and Pickett J.A. 1998. Headspace analysis in chemical ecology: effects of different sampling methods on ratios of volatile compounds present in headspace samples. Journal of Chemical Ecology 24: 1161-1172. Akgul A. and Bayrak A. 1992. Comparative volatile oil composition of various parts from Turkish bitter fennel (Foeniculum vulgare var. vulgare). Progress in Essential Oils 17: 14. Albert-Puleo M. 1980. Fennel and anise as estrogenic agents. Journal of Ethnopharmacology 2: 337-344. Albuquerque A.A.C., Sorenson A.L. and Leal-Cardoso J.H. 1995. Effects of essential oil of Croton zehntneri, and of anethole and estragole on skeletal muscles. Journal of Ethnopharmacology 49: 41- 49. Amiot J. Salmon Y., Collin C. and Thompson J.D. 2005. Differential resistance to freezing and spatial distribution in a chemically polymorphic plant Thymus vulgaris. Ecology Letters 8: 370-378. Badoc A., Deffieux G., Lamarti A., Bourgeois G. and Carde J.P. 1994. Essential oil of Foeniculum voulgar Mill. (fennel) subsp. Piperitum (Ucria) Cout. Fruit. Essential Oil Research 6: 333-336. Baker H.G. 1955. Self-compatibility and establishment after 'long-distance’ dispersal. Evolution. 9: 347-349 Barazani O., Fait A., Cohen Y., Diminshtein S., Ravid U., Putievsky E., Lewinsohn E. and Friedman J. 1999. Chemical variation among indigenous populations of Foeniculum vulgare var. vulgare in Israel. Planta Medica 65: 486-489. Barazani O., Cohen Y., Fait A., Diminshtein S., Ravid U., Putievsky E. and Friedman J. 2002. Chemotypic differentiation in indigenous populations of Foeniculum vulgare var. vulgare in Israel. Biochemical Systematics and Ecology 30: 721-731.

117 Bazzoni E., Passino G.S., Moretti M.D.L., and Prota R. 1997. Toxicity of anethole and its effects on egg production of Ceratitis capitata Wied. (Dipt., Tephritidae). Annals of Applied Biology 131: 369-374. Bell C.R. 1971. Breeding systems and floral biology of the Umbelliferae. In: Heywood, V.H. (ed). "The Biology and Chemistry of the Umbelliferae". Academic Press, New York. pp. 93-107 Bellomaria B., Valentini G. and Arnold N. 1999. The essential oil of Foeniculum vulgare Mill. ssp. vulgare. Rivista Italiana EPPOS 27: 43-48. Bernath J., Nemeth E., Kattaa A. and Hethelyi E. 1996. Morphological and chemical evaluation of Fennel (Foeniculum vulgare Mill.) populations of different origin. Journal of Essential Oil Research 8: 247-253. Bernath J., Nemeth E., Petheo F., Mihalik E., Kalman K. and Franke R. 1999. Regularities of the essential oil accumulation in developing fruits of fennel (Foeniculum vulgare Mill.) and its histological background. Journal of Essential Oil Research 11: 431-438. Betts T.J. 1968. Anethole and fenchone in the developing fruits of Foeniculum vulgare

Mill. Journal of pharmacy and Pharmacology 20: 469-472. Bezic N., Dunkic V. and Radonic A. 2003. Anatomical and chemical adaptation of Spartium junceum L. in arid habitat. Acta Biologica Cracoviensla Series Botanica 2: 43– 47. Bosabalidis A.M 1996. Ontogenesis, ultrastructure and morphometry of the petiole oil ducts of celery (Apium graveolens L.). Flavour and Fragrance Journal 11: 269-274. Boulos L. 1983. Medicinal Plants of North Africa. Reference Publications Inc., Algonac, Michigan, USA. Bouwmeester H.J., Gershenzon J., Konings M.C. and Croteau R. 1998. Biosynthesis of the monoterpenes limonene and carvone in the fruit of caraway. I. Demonstration of enzyme activities and their changes with development. Plant Physiology 117: 901-912. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein – dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. Bugos R.C, Chiang V.L. and Campbell W.H. 1992. Characterization of bispecific caffeic acid/5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase from aspen. Phytochemistry 31:1495- 1498.

118 Buntain M. and Chung B.1994. Effects of irrigation and nitrogen on the yield components

of fennel (Foeniculum vulgare Mill.). Australian Journal of Experimental Agriculture 34: 845-849. Cavaleiro C.M.F, Rogue O.L. and da Cunha A.P. 1993. Contribution for the characterization of Portuguese fennel chemotypes. Journal of Essential Oil Research 5: 223-225. CEFS. committee of experts on flavouring substances. record of the 51 st. session. Strasbourg, 08 -10 April 2003. RD 51 REC, CD-P-SP (2003) 12. Available from: http://www.coe.int/T/E/social_cohesion/SOC-SP/Public Health/Flavouring substances/ REC%2051%20E%20FLAVOURS%20APRIL%202003.asp#TopOfPage (Accessed 3/7/05). Charlesworth D. and Charlesworth B. 1995. Quantitative genetics in plants: the effect of the breeding system on genetic variability. Evolution 49: 911-920. Cherry R., Klein M. and Leal W. 1996. Attraction of adult Anomala marginata (Coleoptera: Scarabaeidae) to anethole. Journal of agricultural entomology 13: 359-364. Cherry R.1998. Attraction of the lovebus Plecia nearctica (Diptera: Bibionidae) to anethole. Florida Entomologist 81:559-562. Corsi G. and Biasci D. 1998. Secretory structures and localization of alkaloids in Conium maculatum L.(Apiaceae) Annals of Botany 81: 157-162. Collazos S., Soriano-Ferrufino J. and Collin G.J. 1993. Variability in the composition of the essential oils of Mintostachys andina in central Bolivia. Phytochemistry 33: 123-127. Croteau R., Kutchan T. and Lewis G.N. 2000. Natural Products (Secondary Metabolites). Chapter 24 in: "Biochemistry & Molecular Biology of Plants". Buchanan B., Cruissem, R. J. (eds). American Society of Plant Physiologists pp. 1286-1316. Dafni A., 1992. Pollination Ecology: a practical approach. Oxford University Press. Oxford, UK Dafni A Pacini E. and Nepi M. 2005. Pollen and stigma biology. In: Dafni A. Kevan P.G. and Husband BC (eds). "Practical Pollination Biology". Cambridge University Press Cambridge, UK. pp 83-147. Dashora A., Sastry E.V.D., Singh D. and Nagda A.K. 2003. Combining ability analysis in varietal crosses of fennel (Foeniculum vulgare Mill.). Indian Journal of. Genetic 63: 89- 90. Davila D.Y. and Wardle G.M. 2002. Reproductive ecology of the Australian herb Trachymene incise subsp. Incise (Apiaceae). Australian Journal of Botany 50: 619-626.

119 de Jong T.J, Klinkhamer P.G.L. and Rademaker M.C.J. 1999. How geitonogamous selfing affects sex allocation in hermaphrodite plants. Journal of Evolutionary Biology 12: 166- 176. Dement W.A, Tyson B.J. and Mooney H.A. 1975. Mechanism of mono-terpene volatilisation in Salvia mellifera. Phytochemistry 14: 2555-2557. Desmarest P. 1978. New aspects of fennel cultivation in France. Acta Horticulturae 73: 289-295. Dhingra S. and Sarup P. 1979. Evaluating of same non-toxic chemicals as synergists for different insecticides in mixed formulations against Cylas formicarius Fabricius. Journal of Entomological Research 3: 131-141. Dirzo R. and Harper J.L. 1982. Experimental studies on slug-plant interactions: IV. The performance of cyanogenic and acyanogenic morphs of Trifolium Repens in the field. Journal of Ecology 70: 119-138 Dudai N., Putievsky E., Ravid U., Palevitch D. and Halevy A.H. 1992. Monoterpene content in Origanum syriacum as affected by environmental conditions and flowering. Physiologia Plantarum 84: 453-458. Dudareva N. and Pichersky E. 2000. Biochemical and molecular genetic aspects of floral scents. Plant Physiology 122: 627-633. Duke J.A. and Ayensu E.S. 1985. Medicinal Plants in China, vol.1. Reference publications Inc., Algonac, Michigan, USA. Eisenreich W., Schwarz M., Cartayrade A., Arigoni D., Zenk M.H. and Bacher A. 1998. The deoxyxylulose phosphate pathway of terpenoid biosynthetsis in plants and microorganisms. Chemistry Biology 5: 221-233. Ervin G. N. and Wetzel R. G. 2000. Allelochemical autotoxicity in the emergent wetland macrophyte Juncus effusus (Juncaceae) American Journal of Botany 87: 853-860. Fahn A. 1979. Secretory Tissues in Plants. Academic Press, London. pp: 185-195. Flament I., Debonneville C., Furrer A. 1993. Volatile Constituents of Roses. In: R. Teranishi, R.G Buttery, H. Sugisawa, Eds., Bioactive Volatile Compounds from Plants. American Chemical Society, Washington DC. pp. 269-281. Flamini G., Cioni P.L. and Morelli I. 2003. Volaties from leaves, fruits and virgin oil from Olea europaea Cv. Olivastra Seggianese from Italy. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 1382-1386. Flamini G., Cioni P.L.and Morelli I. 2003. Difference in the fragrances of pollen, leaves, and floral parts of Garland (Chrysanthemum coronarium) and composition of the

120 essential oil from flowerheads and leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 2267-2271. Friedman J., Orshan G.and Ziger-Cfir Y. 1977. Suppression of annuals by artemisia herba- alba in the negev desert of Israel. Journal Ecology 65: 413-426. Friedman J. 1982. Allelopathy and autotoxicity in arid regions. Proceedings of the seminar on allelochemicals and phermones. 97: 1-6. Friedman J. and Waller G.R. 1983a. Caffeine hazards and their preventing in germination seeds of coffee (Coffea Arabica L.). Journal of Chemical Ecology 9: 1099-1106. Friedman J. and Waller G.R. 1983b. Seeds as allelopathic agents. Journal of Chemical Ecology 9: 1107- 1117. Fuentes-Granados R.G., Widrlechner M.P. and Wilson L.A. 2000. Inheritance studies of aromatic compounds in Agastache foeniculum (Pursh) Kuntze. Journal of Essential Oil Research 12: 581-594. Gang D.R., Wang J., Dudareva N., Nam K.H., Simon J.E., Lewinsohn E. and Pichersky E. 2001. An investigation of the storge and biosynthesis of phenylpropenees in sweet basil. Plant Physiology 125: 539-555. Gang D.R. Lavid N. Zubieta C. Chen F. Beuerle T. Lewinsohn E. Noel J.P. and Pichersky E. 2002. O–Methyltransferases from sweet basil: facile change of substrate specificity and convergent evolution within a plant O-methyltransferase family. Plant Cell 14: 505– 519. Gaudeul M. and Till-Bottraud I. 2003. Low selfing in a mass-flowering, endangered perennial, Eryngium alpinum L. (Apiaceae) American Journal of Botany 90: 716-723. Gersbach P.V. and Reddy N. 2002. Non –invasive localization of thymole accumulation in Carum copticum (Apiaceae). Fruits by chemical shift selective magnetic resonance imaging. Annals of Botany 90: 253-257. Gershenzon J. 1984. Changes in the levels of plant secondary metabolites under water and nutrient stress. In: B.N. Timmerman, C. Steelnik, and F.A. Loewus (eds.). "Phytochemical Adaptations to Stress". Recent advances in phytochemistry vol. 18. Plenum Press, New York. pp: 273-321. Gershenzon J. Murtagh G. J. and Croteau R.1993. Absence of rapid terpene turnover in several diverse species of terpene-accumulating plants Oecologia 96: 583 – 592. Gershenzon J. McConkey M.E. and Croteau R.B. 2000. Regulation of monoterpene accumulation in leaves of peppermint Plant Physiology 122: 205-214

121 Gopal B. and Goel. U. 1993. Competition and allelopathy in aquatic plant communities. Botanical Reviews 59: 155–210. Göran N. 1990. Limonene inhibits attraction to α-pinene in the pine weevils Hylobius abietis and H. pinastri. Journal of Chemical Ecology 16: 1307 – 1320. Gross M., Friedman J., Dudai N., Larkov O., Cohen Y., Bar E., Ravid U. and Putievsky, E., Lewinsohn E. 2002. Biosynthesis of estragole and t-anethole in bitter fennel (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare) chemotypes. Changes in SAM: phenylpropene O-methyltransferase activities during development. Plant Science 163: 1047- 1053. Guillen M.D and Manzanos M.J. 1994. A contribution to study Spanish wild growing fennel as a source of flavour compounds. Chem. Microbial. Technol. Lebensm. 16:141- 145. Guillen M.D. and Manzanon M.J. 1996. A study of several parts of the plant Foeniculum vulgare as a source of compounds with industrial interest. Food Research International 29: 85-88. Gupta S.C.and Sobti S.N. 1990. Inheritance pattern of methyl chavicol and citral in Ocimum americanum. Indian Perfum 34: 253-259. Gupta K., Thakral K., Gupta V., and Arora S. 1995. Metabolic changes of biochemical constituents in developing fennel seeds. Journal of Science and Food Agriculture 68: 73-76. Hahlbrock. K.1992. In situ localization of phenylpropanoid related gene expression in different tissues of light and dark grown parsley seedlings. Zeitschrift fur Naturforschung Section C, Biosciences 47: 591-600. Harborne J.B. and Baxter H. (Eds). 1995. Phytochemical Dictionary. A Handbook of Bioactive Compounds from Plants. Taylor & Francic. Hallstrom H. and Thuvander A. 1997. Toxicological evaluation of myristicin. Nat Toxins 5:186-92. Harder L.D. and Barrett S.C.H. 1995. Mating cost of large floral displays in hermaphrodite plants. Nature 373: 512-515. Hayden K. J and Parker M. I. 2002. Plasticity in cyanogenesis of Trifolium repens L.: inducibility, fitness costs and variable expression. Evolutionary Ecology Research. 4:155–168 Hegi G. 1931. Illustrierte flora von Mitteleuropa. Munich: J.F., Lehmanns- verlag, vol 5. Herrera C.M., Sánchez-Lafuente A.M., Medrano M., Guitián J., Cerdá X. and Rey P. 2001. Geographical variation in autonomous self-pollination levels unrelated to

122 pollinator service in Helleborus foetidus (Ranunculaceae) American Journal of Botany 88: 1025-1032. Ho S.H., Ma Y. and Huang Y. 1997. Anethole, a potential insecticide from Illicium verum Hook F., against two stored product insects. International Pest Control 32: 50-51. http://www.epa.gov/chemrtk/estragole/c14022rs.pdf Honda G., Koezuka Y. and Tabata M. 1988. Isolation of dillapiole from a chemotype of Perilla frutescens, as an active principle for promoting hexobarbital-induced sleep. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 36: 3153- 3155. Hornok L. 1992. Cultivation and Processing of Medical Plants. Chichester, John Wiley & sons . New York. pp. 162-166. Hunault G. and Manoir J.D. 1992. Micropropagation of fennel (Foeniculum vulgare Miller). Biotechnology in Agriculture and Forestry 19: 198-217. Hussein M.Y., Lajis N.H. and Ali J.H. 1991. Biological and chemical factors associated with the successful introduction of Elaeidobius kamerunicus faust, the oil palm pollinator in Malayaia. Acta Horticulturae 288 6th pollination Symposium. Ibrahim R. K. and Muzac, I. 2000. The methyltransferase gene superfamily: a tree with multiple branches. In Evolution of metabolic pathways; Romeo, J. T., Ibrahim, R., Varin, L., Eds.; Recent Advances in Phytochemistry 34; Elsevier Science: Amsterdam, The Netherlands, pp 349-384. Imai T., Maekawa M., Tsuchiya S. and Fujimori T. 1998. Field Attraction of Hoplia communis to 2-phenylethanol, a major volatile component from host flowers, Rosa spp. Journal of Chemical Ecology 24: 1491 – 1497. Inderjit 1996. Plant phenolics in allelopathy. Botanical Review 62: 186-202. Inderjit 1998. Influence of Pluchea lanceolata (Asteraceae) on selected soil properties. American Journal of Botany 85: 64–69. Inderjit and Weston L.A.. 2000. Are laboratory bioassays for allelopathy suitable for prediction of field responses? Journal of Chemical Ecology 26: 2111-2118. Inderjit and Weiner J. 2000. Plant allelochemical interference or soil chemical ecology? Perspectives in Plant Ecology. Evolution and Systematics 4: 3-12. Kainulainen P., Tarhanen J., Tiilikkala K. and Holopainen J. K. 1998. Foliar and emission composition of essential oil in two carrot varieties. Journal of Agricultural and food Chemistry 46 : 3780 –3784. Kaneko K. 1960a. Biogenetic studies of natural products. IV. Biosynthesis of anethole by Foeniculum vulgare. Chemical Pharmacology Bulletin (Japan) 8: 611-614.

123 Kaneko K. 1960b. Biogenetic studies of natural products. V. Biosynthesis of anethole by Foeniculuni vulgare. Chemical Pharmacology Bulletin (Japan) 8: 875 –879. Karlsen J., Baerheim A., Chingova B. and Zolotovitch G. 1969. Studies on the fruits of Foeniculum species and their essential oil. Planta Medica 12: 281-293. Keller K. 1992. Foeniculum vulgare in: De Smet P.A.G. M., Keller K., Hansel R., Chandler R.F. (Eds) Adverse Effects of Herbal Drugs. Springer- Verlag. pp.135-142. Kemmerer B. and Reichling J. 1996. S-Adenosyl-L-methionine: anol O- methyltransferase in organ cultures of Pimpinella anisum. Phytochemistry 42: 397-403. Kevan P. G. and Baker H. G. 1983. Insects as flower visitors and pollinators. Annual

Review of Entomology 28: 407-453. Khan M.M.A., Samiuullah S.H. and Afridi M.M.R.K. 1992. Yield and quality of fennel in relation to basal and foliar application of nitrogen and phosphorus. Journal of Plant

Nutrition 15: 2505-2515. Khosla M.K, Bradu B.L and Thapa R.K. 1989. Biogenetic studies on the inheritance of different essential oil constituents of Ocimum species, their F1 hybrids and synthesized allopolyploids. Herba-Hungarica 28:1-2, 13-19. Kim D.H and Ahn Y.J 2001. Contact and fumigant activities of constituents of Foeniculum vulgare fruit against three coleopteran stored-product insects. Pest Management Science 57: 301 – 306. Kim D.H., Kim K.I., Chang K.S. and Ahn Y.J. 2002. Repellent activity of consitituents identified in Foeniculum vulgare fruit against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Agricultural and Food Chemistry 50: 6993-6996. Kjonaas R.B., Venkatachalam K.V. and Croteau R. 1985. Metabolism of monoterpenes: oxidation of isopiperitenol to isopiperitenone, and subsequent isomerization to piperitenone by soluble enzyme preparations from peppermint (Mentha piperita) leaves.

Archives of Biochemistry and Biophysics 238: 49-60. Koezuka Y., Honda G. and Tabata M. 1986. Genetic control of phenylpropanoids in Perilla frutescens. Phytochemistry 25: 2085-2087. Kohli R.K., Singh H.P. and Batish D.R. 2001. Allelopathy in Agroecosystems HaworthPress pp. 10-15. Koul P., Sharma N. and Koul A.K. 1996. Reproductive biology of wild and cultivated

fennel. Proceedings of the Indian Academy of Sciences: Plant Sciences 62: 125-134. Kraus A. and Hammerschmidt F.J 1980. An investigation of fennel oils. Dragoco report. Dragoco Gerberding and GmbH, Germany 27: 31-40.

124 Krüger H. and Hammer K. 1999. Chemotypes of fennel (F. vulgare Mill). Journal of Essential Oil Research 11:79-82. Ladd T.L. and Tew J.E. 1983. Attraction of honey bees (Hymenoptera: Apidae) to traps

baited with lures for Japanese beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Economic Entomology 76: 769-770. Lamarti A., Badoc A. and Carde J.P. 1993. Chromatographic study on the essential oil of bitter Fennel seedlings (Foeniculum vulgare Mill.); spectral characteristics (UV, IR, MS) of its constituents. Bulletin de la Societe de Pharmacie de Bordeaux 132: 73-89. Langenberger M.W and Davis A.R. 2002. Temporal changes in floral nectar production, reabsorption, and composition associated with dichogamy in annual caraway (Carum carvi; Apiaceae). American Journal of Botany 89: 1588-1598. Lehman R.S. 1932. Experiments to determine the attractiveness of various aromatic compounds to adults of the wireworms. Journal of Economic Entomology 25: 949-958. Leung A.Y. and Foster S. 1996. Encyclopedia of common natural ingredients used in food, drugs and cosmetics, 2nd edition. John Wiley & Sons inc. ed., New York. pp. 240-243. Lewinsohn E. Dudai N., Tadmor Y., Katzir I., Ravid U., Putievsky E. and Joel D.M. 1998. Histochemical localization of citral accumulation in Lemongrass leaves (cymbopogon citratus DC.) Stapf., Poaceae). Annals of Botany 81:35-39. Lewinsohn E., Ziv-Raz I., Dudai N., Tadmor Y., Lastochkin E., Larkov O., Chaimovitsh D., Ravid U., Putievsky E., Pichersky E and Shoham Y. 2000. Biosynthesis of estragole and methyl-eugenol in sweet basil (Ocimum basilicum L.). Developmental and chemotypic association of allylphenol O-methyltransferase activities. Plant Science 160: 27-35. Linhart Y.B. and Thompson J.D. 1995. Terpene-based selective hebivory by Helix aspersa (Mollusca) on Thymus vulgaris (Labiatae). Oecologia – Berlin 102: 126-132. Lloyd D.G. 1992. Self- and cross-fertilization in plants. II. The selection of self- fertilization. International Journal of Plant Science 153: 370-380. Llusià J. and Peñuelas J. 1998. Changes in terpene content and emission in potted Mediterranean woody plants under severe drought. Canadian Journal of

Botany 76: 1366–1373. Manitto P., Monty D. and Gramatica P. 1974. Biosynthesis of anethole in Pimpinella anisum L. Tetrahedron Letters 17: 1567-1568. Marotti M., Dellacecca V., Piccaglia R. and Giovanelli E. 1993. Agronomic and chemical evaluation of three varieties of F. vulgare Mill. Acta Horticulturae 331: 63-69.

125 Marotti M., Piccaglia R., Giovanelli E., Deans S.G. and Eaglesham E. 1994. Effects of variety and ontogenic stage on the essential oil composition and biological activity of fennel (Foeniculum vulgare Mill.). Journal of Essential Oil Research 6: 57-62. Marchi A., Appendino G., Pirisi I., Ballero M. and Loi M.C. 2003. Genetic differentiation of two distinct chemotypes of Ferula communis (Apiaceae) in Sardinia (Italy) Biochemical Systematics and Ecology 31: 1397-1408. Mather K. and Jinks J.l. 1977. Introduction to Biometrical Genetics. Chapman and Hall, London. 231 pp. 195-205. Metcalf R.L. and Lampman R.L. 1989. Estragole analogues as attractants for corn rootworms (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology 82: 123-129. Mihaliak C. A., Gershenzon J. and Croteau R. 1991. Lack of rapid monoterpene turnover in rooted plants: implications for theories of plant chemical defense. Ecologia 87: 373 - 376 Miller E. C., Swanson A. B., Phillips D. H., Fletcher T. L., Liem A. and Miller J. A. 1983. Structure-activity studies of the carcinogenicities in the mouse and rat of some naturally occurring and synthetic alkenylbenzene derivatives related to safrole and estragole. Cancer Research 43: 1124 -1134. Mimica-Duki N., Kujundzic S., Sokovic M. and Couladis M. 2003. Essential oil composition and antifungal activity of Foeniculum vulgare Mill. Obtained by different distillation conditions. Phytotherapy research 17: 368-371. Minija J. and Thoppil J.E. 2002. Studies on essential oil composition and microbicidal activities of two South Indian spices of the Apiaceae. International Journal of Aromatherapy 12: 213-215. Miraldi E. 1999. Comparison of the essential oils from ten Foeniculum vulgare Mill.

samples of fruits of different origin. Flavour and Fragrance Journal 14: 379-382. Miura Y., Ogawa K., Fukui H. and Tabata M. 1986. Changes in essential oil components during the development of fennel plants from somatic embryoids. Planta Medica 53: 95 – 96. Molino J.F. 2000. The inheritance of leaf oil composition in Clausena anisum-olens (Blanco) Merr. Journal of Essential Oil Research 12: 135-139. Morton J.F. 1962. Atlas of Medicinal Plants of Middle America, Bahamas to Yucatan. Springfield Illinous, Charles Thomas Publisher, USA. pp. 648-649. Motten A.F. 1982. Autogamy and competition for pollinators in Hepatica americana (Ranunculaceae). American Journal of Botany 69: 1296-1296.

126 Muckenstrum B., Foeclitorlen D., Reduron J.P., Danton P. and Hilderibtand M. 1997. Phytochemical and chemotaxonoinic studies of Foenicu!um vulgare. Biocheimical Systematics and Ecology 25: 353-358. Muller C.H., Muller W.H. and Hames B.L. 1964. Volatile growth inhibitors produced by aromatic shrubs. Science, N. Y. 143: 471-473. Nemeth E., Bernath J.and Petheo F. 1999. Study on flowering dynamic and fertilization properties of caraway and fennel. Acta-Horticulturae 502: 77-84. Nemeth E. and Szekely G. 2000. Floral biology of medicinal plants. I. Apiaceae species. International Journal of Horticultural Science 6: 133-136. Newberne P., Smith RL., Doull J., Goodman JI., Munro IC., Portoghese PS. Wagner BM., Weil CS., Wood LA., Adams TB., Lucas CD. and Ford RA. 1999. The FEMA GRAS assessment of trans-anethole used as a flavoring substance. Food and Chemical Toxicology 37: 789-811. Pank F. and Kruger H. 2003. Annual Report of the Federal Center for Breeding Research on Cultivated Plants. pp. 213-216. Pank F., Schneider E. and Kruger H. 2003. Possibilities and limitations of estragole content reduction of fennel (Foenicu!um vulgare Mill.) and its preparations. Arznei & Gewurzplanzen Journal of Medicinal & Spice plants. 4: 164-172. Paschke M., Abs C. and Schmid B. 2002. Effects of population size and pollen diversity on reproductive success and offspring size in the narrow endemic Cochlearia bavarica (Brassicaceae) American Journal of Botany 89: 1250-1259. Pellmyr O. 1986. Three pollination morphs in Cimicifuga simplex: incipient speciation due to inferiority in competition. Oecologia 78: 304-307. Penelope B., Edwards., Wanjura W.J. and Brown W.V. 1993. Selective herbivory by Christmas beetles in response to intraspecific variation in Eucalyptus terpenoids. Oecologia 95: 551-557. Phillips D. H., Reddy M. V. and Randerath K. 1984. Super P32-post-labelling analysis of DNA adducts formed in the livers of animals treated with safrole, estragole and other naturally-occurring alkenylbenzenes. Carcinogenesis 5: 1623-1628. Pichersky E. and Gang D.R. 2000. Genetics and biochemistry of secondary metabolites in plants: an evolutionary perspective. Trends in Plant Science 5: 439-445. Pichersky E. and Gershenzon J. 2002. The formation and function of plant volatiles:

perfumes for pollinator attraction and defense. Current Opinion in Plant Biology 5: 237- 243.

127 Pushpangadan P., Sobti S.N. and Khan R. 1975. Inheritance of major essential oil constituents in Ocimum basillicum var. glahratum Benth. (French basil). Indian Journal of experimental Biology 13: 520-521 Raguso R.A. and Pichersky E. 1995. Floral volatiles from Clarkia breweri and C. concinna (Onagraceae): recent evolution of floral scent and moth pollination. Plant Systematics and Evolution 194: 55-67. Ravid U., Putievsky E. and Snir N. 1983. The volatile components of oleoresins and the essential oils of Foeniculum vulgare in Israel. Journal of Natural Products 46: 848-851. Ravid U., Putievsky E., Lewinsohn E., and Dudai N. 1997. Identification of verbenone in essential oils of Rosmarinus officinalis L. Flavour and Fragrance Journal 12: 1-3. Regnault R.C. and Hamraoui A. 1995. Fumigant Toxic Activity and Reproductive Inhibition Induced by Monoterpenes on Acanthoscelides obtectus (Say) (Coleoptera), a Bruchid of Kidney Bean (Phaseolus vulgaris L.). Journal of Stored Products Research 31:291-299. Reichardt I. and Pank F. 1993. Methods and results of breeding a fennel variety (Foeniculum vulgare Mill.) for annual cultivation. In: Bernath J., Craker L.E., Lev A. (eds) Acta Horticulturae 330: 185-189. Reinold S. and Hahlbrock K. 1997. In situ localization of phenylpropanoid biosynthetic mRNAs and proteins in parsley (Petroselinum crispum). Acta-Botanica 110: 431-443. Rice W.R. 1989. Analyzing tables of statistical tests. Evolution 43: 223–225. Robeva P., Peneva P. and Genov K. 1988. Localization of the essential oil ducts in various organs of three species of the Umbelliferae in relation to essential oil content. Rasteniev"dni-Nauki 25: 6, 26-34 (in Bulgarian) . Rodriguez-Riano T. and Dafni A. 2000. A new procedure to asses pollen viability. Sexual Plant Reproduction 12: 241–244. Ruberto G., Baratta M.T., Deans S.G. and Dorman D.H.J. 2000. Antioxidant and antimicrobial activity of Foeniculum vulgare and Crithmum maritimum essential oils. Planta Medica 66: 687-693. Sangwan N.S., Farooqi A.H.A., Shabih F. and Sangwan R.S. 2001. Regulation of essential oil production in plants. Plant Growth Regulation 34: 3 - 21 Sarafis V., Rumpel H., Pope J. and Kuhen W. 1990. Non-invasive histochemistry of plant magnetic resonance microscopy. Protoplasma 159: 70-73 Sathiyamoorthy P., Lugasi-Evgi H., Van-Damme P., Abu-Rabia A., Gopas J. and Golan-Goldhirsh A. 1997. Larvicidal activity in desert plant of the Negev and

128 Bedouin market plant products. International Journal of pharmacognosy 35: 265- 273. Schemske D.W., Willson M.F., Melampy M.N., Miller L.J., Verner L., Schemske K.M. and Best L.B. 1978. Flowering ecology of some spring woodland herbs. Ecology 59: 351-351. Schiestl F.P. and Ayasse M. 2002. Do changes in floral odor cause speciation in sexually deceptive orchids? Plant Systematics and Evolution 234: 111-119 Schlessman M.A. and Barrie F.R. 2004. Protogyny in Apiaceae, subfamily Apioideae: systematic and geographic distributions, association traits, and evolutionary hypotheses. South African Journal of Botany 70: 475-487. Schroeder L. M. and Lindelöw Å. 1989. Attraction of scolytids and associated beetles by different absolute amounts and proportions of α-pinene and ethanol. Journal of Chemical Ecology 15: 807 - 817 Scora K.M. and Scora R.W. 1998. Effect of volatiles on mycelium growth of Penicillum digitatus, P. italicum, and P. ulaiense. Journal of Basic Microbiology 38: 405-413. Shafir S., Wiegmann D., Smith B.H. and Real L.A. 1999. Risk-sensitive foraging: choice behaviour of honeybees in response to variability in volume of reward. Animal Behaviour 57: 1055–1061 Shulgin A. T. and Sargent T. 1967. Psychotrophic phenylisopropylamines derived from apiole and dillapiole. Nature 215: 1494-1495 Stahl-Biskup E., and Wichtmann E.M. 1991. Composition of the essential oils from roots of some Apiaceae in relation to the development of their oil duct systems. Flavour and Fragrance Journal 6: 249-255. Stengele M. and Stahl-Biskup E. 1993. Seasonal variation of the essential oil of the European pennyroyal (Mentha pulegium L.). Acta Horticulturae 344: 41-51. Stone J.L., Thomson J.D., Dent-Acosta S.J. and Sara J. 1995. Assessment of pollen viability in hand-pollination experiments: a review. American Journal of Botany 82: 1186-1197. Stowe L.G. 1979. Allelopathy and its influence on the distribution of plants in an Illinois old-field. Journal of Ecology 67: 1065-1085. Strickberger M.W 1985. Genetics. The Macmillan company. New York. pp. 291-302. Svoboda K.P. Syred P.M. and Svoboda T.G. 2000. Secretory structures of aromatic and medicinal plants. A review and atlas of micrographs. Knighton: Microscopix Academic Press. pp. 1-25.

129 Syed Z., Guerin P.M. and Baltensweiler W. 2003. Antennal Responses of the Two Host Races of the Larch Bud Moth, Zeiraphera diniana, to Larch and Cembran Pine Volatiles Journal of Chemical Ecology 29: 1691 - 1708 Tabata M. 2000 Genetics of monoterpene biossynthesis in Perllla plants. Plant Biotechnology 17: 273- 280. Tanira M.O.M., Shah A.H., Mohsin A., Ageel A.M. and Quresehi S. 1996. Pharmacological and toxicological investigations on Foeniculum vulgare dried fruit extract in experimental animals. Phytotherapy Research 10: 33-36. Tarayre M., Thompson J.D., Escarre J. and Linhart Y.B. 1995. Intra-specific variation in the inhibitory effects of Thymus vulgaris (Labiatae) monoterpenes on seed germination. Oecologia 101: 110 - 118 Tavish H., Mc Davies N.W. and Menary R.C., 2000. Emission of volatiles from brown boronia flowers: some comparative observations. Annals of Botany 86: 347-354 Theobald W.L 1971. Comperative anatomical and developmental studies in the Umbelliferae. In: Heywood, V.H. (ed). "The Biology and Chemistry of the Umbelliferae". New York: Academic Press. pp. 177-196. Tóth M., Schmera D., and lrnrei Z. 2004. Optimization of a chemicaI attractant for Epicometis (Tropinota) birta poda. Z. Naturforsch 59: 288-292. Tworkoski T. 2002. Herbicide effects of essential oils. Weed Science 50: 425-431 Van Beek T.A. 1999. Modern methods of secondary product isolation and analysis. In: "Chemicals from Plants". Perspectives on plant secondary products. Walton N.J and Brown DE. (Eds.). Imperial College Press, London, pp. 91-186. Vokou D., Chalkos D., Karamanlidou G. and Yiangou M. 2002. Activation of soil respiration and shift of the microbial population balance in soil as a response to Lavandula stoechas essential oil. Journal of Chemical Ecology 28: 755 – 768. Waites A.R. and Aagren J. 2004. Pollinator visitation, stigmatic pollen loads and among- population variation in seed set in Lythrum salicaria. Journal of Ecology 92: 512-514. Wang J. and Pichersky E. 1998. Characterization of S-adenosyl- L-methionine: (iso) eugenol O-methyltransferase involved in scent production in Clarkia breweri. Arch. Biochem. Biophys 349: 153–160. Webb C.J. 1981. Andromonoecism protandry and sexual selection in Umbelliferae. New Zealand Journal of Botany 19: 335-338. Werker E., Putievsky E., Ravid U. and Dudai N. 1993. Glandular hairs and essential oil in developing leaves of Ocimum basilicum L. (Lamiaceae). Annals of Botany 71: 43-50.

130 Wichtl M. (ed). 1994. Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals. A handbook for practice on a scientific basis. English ed, edited and translated by Bisset N.G. Boca Raton: CRC press. pp. 200-202. Young H.J and Young T.P. 1992. Alternative outcomes of natural and experimental high pollen loads. Ecology 73: 639-647. Zapata T.R and Arroyo M.T.K. 1978. Plant reproduction ecology of a secondary deciduous tropical forest in Venezuela. Biotropica 10: 221-230. Zohary M. 1972. Flora Palestina Part II. Jerusalem: The Israel Academy of Sciences and Humanities. pp. 432-434. בר-דרומא מנחם. 1998. צמחי תבלין מרפא ובושם. משרד החקלאות, שרות ההדרכה והמקצוע: עמ' 24-26. דימינשטיין ס. 2000. ביות שומר פשוט (Foeniculum vulgare var. vulgare) בישראל (עבודת גמר לקראת תואר מ. א. באוניברסיטת תל אביב, תל אביב, 2000). פינבורן-דותן נ. ודנין א. 1991. המגדיר לצמחי בר בארץ ישראל. כנה: ירושלים. עמ': 34487.

131 נספח 1

ANOVA חד כיוונית בין גיל העלה לתכולת מרכיבי האולאורזין העיקריים שבו, במהלך ההתפתחות של הנבטים, בשני כמוטיפים של שומר פשוט.

גיל העלה ( ימים מהצצת הפסיגים)

population content component 7 13 18 24 30 F 4,10 N.S % α -pinene aaaaa 2.45 µg/leaf a a b ab a 4.88* N.S % limonene aaaaa 1.4 µg/leaf ab b ab a a 6.81** % fenchone c b ac a a 33.01*** ***µg/leaf b b a a a 28.43 באר חיל % estragole b b b ab a 13.25** µg/leaf b c b a a 39.73*** % t- anethole b b b ab a 7.23** µg/leaf b c b a a 39.15*** mg/gfw Total oleoresin b b a a a 43.57*** mg/fresh leaf Total oleoresin b c b a a 47.76*** N.S % α -pinene aaaaa 4.69 N.S µg/leaf a a a a a 3.72 N.S % α -phellandrene aaaaa 3.0 µg/leaf b b b ab a 8.31** % limonene bc c bc b a 36.41*** µg/leaf b b b ab a 10.80** N.S fenchone aaaaa 6.67 % הר דוב µg/leaf c b ac a a 15.03*** % estragole b b b b a 12.80** µg/leaf c d b ac a 37.99*** N.S % t- anethole aaaaa 0.05 µg/leaf a a a a a 0.83N.S mg/gfw Total oleoresin d c b ab a 60.10*** mg/fresh leaf Total oleoresin b c b ab a 23.84***

האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים כאשר : Bonferroni multiple comparison) aP>0.01; **=0.01>P>0.001; ***=P<0.00; N.S= not significant

132 נספח 2

ANOVA חד כיוונית בין גיל השורשים לתכולה היחסית (w/w%) של מרכיבי האולאורזין העיקריים, במהלך התפתחותם של נבטי שומר פשוט, בשני הכמוטיפים.

גיל השורש ( ימים מהצצת הפסיגים)

population component 13 35 120 F 2,6

limonene a b c 103.04*** N.S γ-terpinene aaa 4.76 N.S fenchone aaa 3.8 estragole a b b 91.261*** באר חיל t- anethole a b b 780.99*** N.S myristicin aaa 0.53 N.S dillapiole aaa 0.21 apiole aaa 0.53N.S N.S α -phellandrene aaa 1.77 limonene a b b 15.30** N.S γ-terpinene aaa 1.11 N.S fenchone aaa 4.19 ***estragole a b b 358.60 הר דוב N.S t- anethole aaa 1.57 myristicin b a c 163.10*** dillapiole b b a 59.02*** apiole a a b 17.09**

האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים כאשר : Bonferroni multiple comparison) a>b>c) *=0.05>P>0.01; **=0.01>P>0.001; ***=P<0.00; N.S= not significant

133 נספח 3

ANOVA חד כיוונית בין שלבי ההתפתחות של האברים הפרודוקטיביים לתכולת מרכיבי האולאורזין העיקריים, בשני הכמוטיפים של שומר פשוט.

שלבי התפתחות df F פרי בשל פרי חצי בשל פרי שעוותי פרי צעיר פרחים population content component N.S % α -pinene aa a a a4,10 1.49 µg/fruit " a a ab bc c 4,10 10.10** % limonene b a a a a 4,10 8.64** µg/fruit " a a ab b b 4,10 11.17*** N.S % γ-terpinene aa a a a4,10 4.20 N.S µg/fruit " aa a a a4,10 1.89 % fenchone a ab ab b b 4,10 9.54** µg/fruit " a a ac b bc 4,10 16.80*** באר חיל % estragole a ab b ab b 4,10 9.36** µg/fruit " a a b b b 4,10 39.43*** N.S % t- anethole aa a a a4,10 3.10 µg/fruit " a a b b b 4,10 35.69*** mg/gfw Total oleoresin a ab ab ab b 4,10 6.82** µg/fresh fruit Total oleoresin a ac b b b 4,10 36.86*** %estragole / phenylpropanoids a ab ab ab b 4,10 4.19* % α -pinene a a a a b 4,16 11.06*** µg/fruit " a a ab b c 4,16 20.05*** % α -phellandrene a b b b b 4,16 8.12** µg/fruit " a b b b ab 4,16 5.30** N.S % limonene aa a a a4,16 1.65 µg/fruit " a a ab ab b 4,16 4.52** % γ-terpinene b a a a a 4,16 36.97*** N.S µg/fruit " aa a a a4,16 1.97 % a b b b b 4,16 13.88*** fenchone הר דוב µg/fruit " a ab abc bc c 4,16 7.11** N.S % estragole aa a a a4,16 3.33 µg/fruit " a ab b c bc 4,16 9.07** N.S % t- anethole aa a a a4,16 0.27 µg/fruit " a ab ab ab b 4,16 7.18** mg/gfw Total oleoresin ab ab ab a ab 4,16 5.33**

µg/fresh fruit Total oleoresin a a b b b 4,16 15.86** %estragole / N.S phenylpropanoids aa a a a4,16 0.51

האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים כאשר : Bonferroni multiple comparison) aP>0.01; **=0.01>P>0.001; ***=P<0.00; N.S= not significant

134 נספח 4.

ANOVA חד כיוונית בין גיל העלה לתכולת הפנילפרופנואידים ופעילות OMT'S, במהלך ההתפתחות של נבטים בשני כמוטיפים של שומר פשוט.

גיל העלה (ימים מהצצת הפסיגים)

populationcomponent 7 13 18 24 30 df F estragole c c b a a 4,10 78.42*** content (µg/g fw) t- anethole d c b a a 4,10 99.88*** N.S באר חיל AOMT aaaaa4,10 2.53 activity (pkat/g fw) CVOMT b bc abc ab c 4,10 7.74** estragole c c b ab a 4,10 67.47*** content (µg/g fw) N.S t- anethole aaaaa4,10 0.89 הר דוב AOMT c b a a 4,10 111.87*** activity (pkat/g fw) CVOMT c c b b a 4,10 52.35***

האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים כאשר : Bonferroni multiple comparison) aP>0.01; **=0.01>P>0.001; ***=P<0.00; N.S= not significant

נספח 5.

ANOVA חד כיוונית בין שלבי ההתפתחות של האברים הפרודוקטיביים, לתכולת הפנילפרופנואידים ופעילות OMT'S, בשני כמוטיפים של שומר פשוט.

שלבי התפתחות df F פרי בשל פרי חצי בשל פרי שעוותי פרי צעיר פרחים population component µg/fruit estragole a a b b b 4,10 39.43*** µg/fruit t- anethole a a b b b 4,10 35.69*** באר חיל AOMT a a b a a 4,10 13.62*** activity (pkat/fruit) CVOMT ab ab a ab b 4,10 8.49** µg/fruit estragole a ab b c bc 4,16 9.07** µg/fruit t- anethole a ab ab ab b 4,16 7.18** הר דוב AOMT ab ab a b b 4,14 4.53* activity (pkat/fruit) CVOMT a a b a a 4,14 16.56***

האותיות השונות מייצגות הבדלים מובהקים כאשר : Bonferroni multiple comparison) aP>0.01; **=0.01>P>0.001; ***=P<0.00; N.S= not significant

135

נספח 6: רשימת הפרסומים שפורסמו (ובהכנה) בעקבות עבודה זו

1. מאמרים שראו אור:

1. Gross M., Friedman J., Dudai N., Larkov O., Cohen Y., Bar E., Ravid U. and Putievsky, E., Lewinsohn E. 2002. Biosynthesis of estragole and t-anethole in bitter fennel (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare) chemotypes. Changes in SAM: phenylpropene O-methyltransferase activities during development. Plant Science 163: 1047- 1053.

2. מאמרים בהכנה:

1. Gross M., Lewinsohn E., Dafni A., Dudai N., Cohen Y., and Friedman J. Flowering dynamics, receptive site and crossability in chemotypes of bitter fennel (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare). Ann.of Bot. In manuscript. 2. Gross M., Lewinsohn E., Dudai N., Cohen Y., and Friedman J. The inheritance of t- anethole and estragole in bitter fennel (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare).

3. כנסים בינלאומיים

Lewinsohn, E., Dudai, N., Larkov, O., Ziv-Raz, I., Gross, M., Tadmor, Y., Bar, E., Friedman, J., Shoham, Y., Ravid, U., Pichersky, E. and Putievsky, E. (2002). O-Methyltransferases involved in the formation of t-anethole, estragole, and methyl eugenol in wild and cultivated aromatic plants. Proceedings of the International Workshop on Agricultural and Quality Aspects of Medicinal and Aromatic Plants, Adana, Turkey, May 29-June 1, 2001, Ozguven M, Ed., pp. 39-54.

Gross, M., Friedman, J., Dudai, N., Larkov, O., Cohen, Y., Ravid, U., Putievsky, E. and Lewinsohn, E. (2001). Involvement of O-methyltransferases in the production of t-anethole and estragole in wild bitter fennel (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare) chemotypes in Israel World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Budapest, Hungary. (poster)

136 Tel Aviv University George S. Wise Faculty of Life Sciences Graduate School

Chemotypic differentiation among populations of

Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare, Apiaceae

In Israel

Thesis submitted for the degree "Doctor of Philosophy"

by

Michal Gross

Submitted to the Senate of Tel-Aviv University

June 2006

A

This work was carried out under the supervision of

Prof. Jacob Friedman

Dr. Efraim Lewinsohn

B

Abstract Bitter fennel (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare. Apiaceae) is a perennial hemicryptophyte, common along the Mediterranean basin with Irano turanian extension, and known since antiquity as a medicinal and aromatic herb. The major components of bitter fennel essential oils are the phenylpropanoid derivatives: methyl chavicol (estragole) and t-anethole and the cyclic monoterpenes fenchone and limonene. Bitter fennel grows naturally in different habitats in Israel and two chemotypes have been identified, differing in the proportions of t-anethole and estragole in their fruits' essential oils. In this study, the following goals were defined: 1. Comparison of the composition and the content of the volatiles in different plant's organs during ontogenesis of the two chemotypes grown under similar conditions, and analysis of the association between the accumulation of essential oil and headspace. In addition the phytotoxic potential of the fruit essential oils was evaluated. 2. To identify the stage in the biosynthetic pathway that is responsible for estragole and t-anethole production and analyze the potential for their production in different plant's organs during ontogenesis. 3. Understanding the reproduction system and the crossability potential between and among populations. 4. Determination of the genetic basis for the chemical differences between the chemotypes. Wild populations of F. vulgare Mill. var. vulgare from four localities in Israel, and two abroad: from Mt. Gabel Katerina in the Sinai Desert (Egypt) and Mercin (Turkey), were selected for this study, due to their t-anethole and estragole composition. Two of the Israeli populations (BH and MD) were identified as distinctive chemotypes dominated by either t- anethole or estragole. Fruits collected from representatives of the tested populations, were field grown at the Newe Ya’ar Research Center in Israel. Headspace and hexane extracts from different plant's organs were analyzed by GC-MS for their volatile composition. It was found that the chemical differences between the chemotypes are displayed in all the plant's organs and during their ontogenesis. It was found that the main difference between the chemotypes, were the phenylpropanoid derivatives, that constitute the main fraction (60-85%) of the oleoresin in all different plant's organs: t-anethole and estragole in the above ground parts, whereas in the roots

C dillapiole and apiole. The "anetholic" chemotype (Beer-Hail) contains two fold more apiole, and less dillapiole (x3.5) than the "estragolic" chemotype (Mount Dov). In addition, the Beer-Hail chemotype is rich in limonene and poor in fenchone as compared to the Mount Dov chemotype that is characterized by α-phellandrene content. Headspace analyses indicated emission level of total volatiles during a 24h test from all plant organs was low, when related to their content within the plant (e.g. 0.1-0.4% of total content of oleoresin in fruits). These low levels of emission are probably a result of the low vapor pressure of the phenylpropanoids and thick cell walls of the cells surrounding the oil duct. We did not find any significant difference in the anatomic structure or the fluorescence of the oil ducts between the chemotypes, but, it was found that there is a difference between headspace and oleoresin volatiles composition. The emission of phenylpropanoids is much lower than the monoterprnes, thus, the main compound that is released in both chemotypes, is α-pinene. As a result, the difference between chemotypes' headspace is decreased. It was found that the gaseous phase of fennel essential oil has a phytotoxic and autotoxic impact, which inhibited germination and mainly roots elongation of either wheat or fennel seedling. Therefore, the leaves' drying up of the rosette, and their shedding towards the flowering stage, may be an advantage in germination prevention of seeds from fennel or other competitor plants. The phytotoxic influence of estragole on roots elongation inhibition is higher than t-anethole (x2 in concentration of 200nl/ml). Still the essential oil from the chemotypes' fruits has a phytotoxic activity higher than its phenylpropanoids compoment. Therefore, it is suggested that phytotoxic activity is also associated with other components in the essential oil other than estragole or t-anethole. The differences in total oleoresin content and the different composition between plant's organs suggest different functions of the oleoresin components in the different organs. In addition, the high production of phenylpropanoids compared to their low emission, allows significant accumulation in the plant, suggesting that the essential oil functions as a defence material against herbivores rather than an attractant for pollinators or seeds' distributors. It is assumed that the rich t-anethole chemotype has an advantage in hot areas, due to its' lower emission value five-fold that of estragole. An association between accumulation of the phenylpropanoids and anol/chavicol O-methyltransferase activity during development was found. Young leaves displayed higher levels of O-methyltransferase activity as compared to old leaves. In developing

D fruits, O-methyltransferases activity levels increased until the waxy stage was reached and then dramatically decreased. In the fruits there was also a marked association between essential oil content and the total volume of the oil ducts that continuously increased from the bud stage (0.01mm3 ) to the waxy stage (0.33 mm3). The results of anol/chavicol O-methyltransferase activities indicated, that although the populations and chemotypes differed greatly in their phenylpropanoids composition, all of them displayed similar t-anol and chavicol dependent O-methyltransferase activities, forming t-anethole and estragole respectively. We also did not found a significant activity of isomerases. Thus, the differences between the chemotypes are not directly linked to the O-methyltransferases activity levels nor to activity of isomerases but are probably due to either differential substrate availability or, to another, yet unknown steps in the biosynthetic pathway to phenylpropanoids. In order to investigate the genetic basis of the chemical variation in these two chemotypes, the chemotypes were crossed reciprocally to obtain F1 and F2 generation and also back crosses of F1 to either of the parental types. Genetic analysis has shown that a biallelic gene with additive and dominant gene effects of estragole, controls the levels of these two phenylpropanoids in fennel. Suggesting that in mixed chemotypes populations, there will be more plants with high estragole content than t-anethole. Crossability tests between and among populations indicate that there is a marked potential of gene flow within and among various populations of bitter fennel, including between Israeli and foreign populations. Yet all the six populations examined, display a high potential for self pollination, since in all of them geitonogamy is possible and the index of self-compatibility (ISI) was high (0.7-3.7). High likelihoods of self-pollination may enable the establishment of new populations from a single or a few individuals and may enable the restrictions of gene flow exchange that partially explain the geographic proximity of the different chemotypes of F. vulgare found in Israel. In conclusion, the findings in this work contribute to better understanding of the factors that affect chemotype differentiation, potential and the gene flow among and between fennel populations, as well as explain the existence and preservation of chemical polymorphism in bitter fennel.

E 136 830 227 A 298 87 663 231 163 B 68 270 481 213 כמוטיפ באר חיל (BH) 5287 10787

alpha - pinene limonene alpha - pinene limonene gama terpinene fenchone gama terpinene fenchone estragole trans anethole estragole trans anethole other other

12.3 40.4 21.2 52.0 86.9 C1 90.9 43.6 26.9 37.8 52.9 127.8 175.9 31.4 45.5 124.5 1223.3

2466.6 28.1

D1

24.8 18.5 44.4 40.2 6.7 3.5 16.5 265.9 69.0 35.7 C2 38.5 18.9 20.6 39.4 81.0 1774.2 781.9 37.6

D2 2.2 3.8 8.6 3.1 0.0 11.4 7.1 C3 10.1 16.7 61.7 20.3 323.7 284.8 106.5 1171.4 5.3

D3 alpha - pinene beta - pinene 54.8 40.2 alpha - phellandrene limonene fenchone estragole alpha - pinene beta - pinene fenchyl acetate exo trans anethole alpha - phellandrene limonene other fenchone estragole fenchyl acetateα-pinene exo trans anethole other β pinene α-phellandrene limonene γ-terpinene fenchone 34.7 25.9 81.9 94.9 78.5 estragole E 16.4 fenchyl acetate 14.5 t-anethole other 1361.2

איור ג.8. הרכב ותכולת (µg/gfw) האולאורזין באברי צמח לאורך עמוד התפרחות של שומר פשוט מנציגי הכמוטיפים הר דוב (MD) ובאר חיל (BH) שגודלו בנווה יער. A= פרחים B= פרי שעוותי C= עלים (בשלושה גבהים) D = עמוד התפרחת (בשלושה גבהים) E= שושנת עלים

30 70 458 680 335 341 152 A 111 B 321 77 67 2037 520 כמוטיפ הר דוב (MD) 5725 5469

alpha - pinene limonene gama terpinene fenchone alpha - pinene limonene estragole trans anethole gama terpinene fenchone other estragole trans anethole other

135.9 5.7 C1 137.4 157.1 366.1 237.9 D1 65.05.3 36.5 11.6 129.4 89.0 80.4 0.0 214.8

1735.3 289.1

1607.4

C2

338.9 D2 114.1 31.4 225.7 27.4 30.7 12.8 2.8 76.5 1.1 22.2 91.4 101.8 430.0 854.3 431.8 429.8 762.4

C3 21.8 218.2 180.0 13.7 D3 54.0

21.3 6.7 11.8 190.4 410.8 0.0 14.0 36.7 210.7 0.5 413.8 0.0

159.8 α - pinene β - pinene α-phellandrene limonene fenchoneα-pinene estragole fenchyl acetate endo t- anethole other β- pinene α - pinene β - pinene α-phellandrene α-phellandrene limonene fenchone estragole limonene fenchyl acetate endo t- anethole γ-terpinene other 59.9 63.7 fenchone 171.9 63.8 33.7 18.2 estragole 167.1 fenchyl acetate t-anethole other E 1356.3

30