אוניברסיטת תל אביב הפקולטה למדעי החיים ע"ש ג'ורג' ס. וייז המדרשה לתארים מתקדמים דיפרנציאציה כמוטיפית באוכלוסיות של שומר פשוט (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare, Apiaceae) בישראל חיבור לשם קבלת התואר "דוקטור לפילוסופיה" מאת מיכל גרוס הוגש לסנאט של אוניברסיטת תל-אביב יוני 2006 עבודה זו נעשתה בהנחיית פרופ' יעקב פרידמן ד"ר אפרים לוינסון II לזכרם של הורי היקרים חיה ורפאל כהן ז"ל III תודות לפרופ' יקי פרידמן על ההשקעה וההנחיה המסורה והמקצועית. לד"ר אפרים לוינסון על היחס החם, ההנחיה והתמיכה המקצועית. לפרופ' אמוץ דפני על הנכונות והייעוץ בנושא הביולוגיה של ההאבקה. לפרופ' עידו יצחקי על הנכונות והייעוץ הסטטיסטי. לפרופ' דני יואל על הייעוץ והעזרה בעבודה המיקרוסקופית. לד"ר נתיב דודאי , דויא סעדי ודוד בחשיאן על הסיוע בעבודת השדה והתמיכה החברית. לעינת בר ואולגה לרקוב על עזרתן ב- GC-MS. ליעל כהן על התמיכה והערות המועילות בכתיבה. לפרופ' עוזי רביד ולכל יתר חברי המחלקה לתבלינים על התמיכה המקצועית והחברתית. לד"ר מוסה אוקזן עבור איסוף יחידות תפוצה של שומר פשוט ממרסין, טורקיה. לשמוליק אישי היקר ולבנותי האהובות. שחוו איתי את הרגעים השמחים והקשים, תמכו, עזרו ועודדו לאורך כל הדרך. לכולכם תודה רבה. IV תוכן העניינים עמוד תקציר ------------------------------------------------------------------------------------------ VIII-XI פרק א. מבוא ------------------------------------------------------------------------------------ 1-6 א.1 תיאור הצמח -------------------------------------------------------------------------- 1 א.2 שימושים של שומר פשוט ------------------------------------------------------------- 1 א.3 אברי הפרשת השמן האתרי בשומר פשוט ---------------------------------------------- 2 א.4 מרכיבי השמן האתרי בשומר פשוט ---------------------------------------------------- 2-4 א.5 טקסונומיה, תפוצת המין בעולם ובארץ ------------------------------------------------ 5 א.6 מטרות המחקר ------------------------------------------------------------------------ 6 פרק ב. חומרים ושיטות - כללי ----------------------------------------------------------------- 7-9 ב.1 אוכלוסיות המחקר -------------------------------------------------------------------- 7 ב.2 זיהוי תרכובות נדיפות ------------------------------------------------------------------ 8-9 מיצוי תרכובות המצויות באברי צמח שונים ----------------------------------------- 8 הפקת שמן אתרי על ידי זיקוק מים ------------------------------------------------- 8 איסוף תרכובות נדיפות הנפלטות לאוויר החופשי ---------------------------------- 8 אנליזת הנדיפים באמצעות GC-MS ---------------------------------------------- 9 ב.3 ניתוח סטטיסטי ---------------------------------------------------------------------- 9 פרק ג. הרכב ותכולת האולאורזין באברי צמח במהלך האונטוגנזה ------------------------------ 10-51 ג.1 חומרים ושיטות ---------------------------------------------------------------------- 12-16 ג.2 תוצאות ------------------------------------------------------------------------------ 17-41 ג.1.2. אפיון מרכיבי האולאורזין של אוכלוסיות המחקר ------------------------------- 17-18 ג.2.2. הרכב ותכולת האולאורזין במהלך האונטוגנזה השוואה - בין שני הכמוטיפים ---- 18-22 ג.1.2.2. הרכב ותכולה בצמח הצעיר (נבטים) -------------------------------- 18-22 ג.2.2.2. הרכב ותכולה בצמח הבוגר ---------------------------------------- 23-30 ג.3.2 מבנה ביבי השמן במהלך התפתחות הפרי ---------------------------------------- 31-34 ג.4.2. ההרכב הכימי ושיעור הפליטה של נדיפים מאברי צמח שלמים ------------------ 34-36 ג.5.2. הפוטנציאל הפיטוטוקסי והאוטוטוקסי של השמן האתרי המופק משני כמוטיפים--- 37-41 ג.3 דיון ומסקנות ------------------------------------------------------------------------ 41-51 ג.1.3. השוואת ההרכב הכימי בין אברי הצמח השונים במהלך האונטוגנזה -------------- 41-46 V ג.2.3. ההרכב הכימי ושיעור הפליטה של נדיפים מאברי צמח שלמים ------------------ 47-48 ג.3.3. הפוטנציאל הפיטוטוקסי והאוטוטוקסי של השמן האתרי המופק משני כמוטיפים - 49-51 פרק ד. ביוסינתזה של t-anethole ו-estragole ----------------------------------------------- 52-80 ד. 1 חומרים ושיטות --------------------------------------------------------------------- 54-58 ד.1.1. מתילטרנספראז ---------------------------------------------------------------- 54-57 א. הכנת מיצוי חלבוני אל-תאי ------------------------------------------------- 54 ב. בדיקת פעילות אנזימטית למתילטרנספראז ---------------------------------- 54-55 ג. זיהוי תוצרי פעילות OMT's ----------------------------------------------- 55 ד. קביעת ריכוז החלבון ------------------------------------------------------- 55 ה. ניקוי חלקי של האנזים – gel permeation ------------------------------- 56 ו. קביעת המשקל המולקולרי -------------------------------------------------- 56 ז. בדיקת תכונות הפעילות האנזימטית ----------------------------------------- 56-57 ד.2.1. איזומראז --------------------------------------------------------------------- 57-58 א. הכנת מיצויים חלבוניים אל-תאיים ------------------------------------------ 57 ב. בדיקת פעילות אנזימטית לאיזומראז ---------------------------------------- 57-58 ד.2 תוצאות ------------------------------------------------------------------------------ 58-74 ד.1.2. מתילטרנספראז --------------------------------------------------------------- 58-72 א. פעילות של O-methyltransferases המותנת ב-Chavicol או ב- Anol בפירות הכמוטיפים -------------------------------------------------------- 58-60 ב. השוואת פעילות של O-methyltransferases באוכלוסיות שונות של שומר ---- 60 ג. הקשר בין פעילות O-methyltransferases ותכולת estragole ו- t-anethole באברי צמח שונים במהלך התפתחותם ------------------------ 60-65 ד. פעילות של O-methyltransferases כלפי נגזרות פנוליות שונות -------- 66-67 ה. מאפייני הפעילות האנזימטית של O-methyltransferases בשני הכמוטיפים- 68-72 ד.2.2. איזומראז --------------------------------------------------------------------- 73-74 ד.3 דיון ומסקנות ------------------------------------------------------------------------ 75-80 ד.1.3 מתילטרנספראז ---------------------------------------------------------------- 75-79 א. מתילציה של Anol ו-Chavicol במיצוי אל-תאי של שומר פשוט ----------- 75 ב. תכונות ה-O-methyltransferases שהופקו מפירות שני הכמוטיפים ------- 75-77 ג. הקשר בין פעילות O-methyltransferases והשינויים בתכולת estragole ו- t- anethole במהלך ההתפתחות של אברי צמח שונים בשומר פשוט --------- 77-79 ד. פעילות של O-methyltransferases באוכלוסיות שונות של שומר ------ 79 VI ד.2.3. פעילות של anethole / methyl chavicol isomerase --------------------- 79-80 פרק ה. דרך ההורשה של התכונה לצבירת estragole ו/או t-anethole ---------------------- 81-91 ה.1 חומרים ושיטות ------------------------------------------------------------------- 82-84 ה.2 תוצאות --------------------------------------------------------------------------- 84-89 ה.3 דיון ומסקנות ---------------------------------------------------------------------- 89-91 פרק ו. מהלך הפריחה ושיעור החנטה -------------------------------------------------------- 92-116 ו.1 חומרים ושיטות -------------------------------------------------------------------- 93-96 ו.2 תוצאות ---------------------------------------------------------------------------- 96-104 ו.1.2. התפתחות הפרח ------------------------------------------------------------- 96-98 ו.2.2. מועד ומשך הזמן של רצפטיביות הצלקת ------------------------------------- 99 ו.3.2. הכנית כאתר לנביטת אבקה -------------------------------------------------- 99-100 ו.4.2. מועדי הפריחה האוכלוסיות השונות ------------------------------------------ 101-102 ו.5.2. שיעור החנטה כתוצאה מהאבקה בין ובתוך נציגי אוכלוסיות טבעיות ---------- 102-104 ו.3 דיון ומסקנות ---------------------------------------------------------------------- 105-109 ו.1.3. ביולוגיה של הפריחה בנציגי אוכלוסיות טבעיות שגודלו בתנאים דומים ------- 105-107 ו.2.3. שיעור החנטה כתוצאה מהכלאות מכוונות בין ובתוך נציגי אוכלוסיות טבעיות - 107-109 פרק ז. דיון כללי ----------------------------------------------------------------------------- 110-116 ז.1 תכולה והרכב האולאורזין בשני הכמוטיפים של שומר פשוט ומשמעותם האקולוגית--- 110-113 ז.2 הבסיס הגנטי והביוכימי לשונות בהרכב הכימי של הכמוטיפים. ---------------------- 113-115 ז.3 המנגנון לשימור ההבדלים ביו הכמוטיפים------------------------------------------- 115-116 רשימת ספרות -------------------------------------------------------------------- 117-131 נספחים --------------------------------------------------------------------------------------- 132-136 תקציר באנגלית -------------------------------------------------------------------- D -A VII תקציר שומר פשוט (Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare), סוככיים (Apiaceae), הינו המיקריפטופיט, נפוץ באגן הים התיכון עם חדירה אירנוטורנית, המקובל מקדמת דנא כצמח רפואה ותבלין. המרכיבים העיקריים בשמן האתרי של פירות השומר המשפיעים על טעמו המיוחד הם: הפנילפרופנואידים – t-anethole ו-methylchavicol) estragole) והמונוטרפנואידים: fenchone ו- limonene. בישראל, נפוץ המין במגוון רחב של בתי גידול. באוכלוסיות הבר בארץ זוהו שני כמוטיפים הנבדלים בתכולה היחסית של t-anethole ו-estragole בפירות. בעבודה זו הוגדרו המטרות הבאות: 1. השוואת ההרכב ותכולת המרכיבים הנדיפים באברי צמח שונים במהלך האונטוגנזה בשני כמוטיפים שונים שגודלו בתנאים דומים, ובחינת הקשר בין תכולת השמן האתרי הנצברת, לבין הרכב הנדיפים המשתחררים לאוויר בסביבת הצמח ופוטנציאל השפעתו הפיטוטוקסית של השמן האתרי. 2. איתור השלב(ים) במסלול הביוסינתטי לייצור t-anethole ו-estragole הגורם להבדל בין הכמוטיפים השונים ובחינת פוטנציאל הייצור שלהם באברים השונים של הצמח במהלך האונטוגנזה. 3. תיאור מערכת הרבייה והשוואת פוטנציאל ההפריה כתוצאה מהכלאות בין ובתוך אוכלוסיות שומר. 4. קביעת הבסיס הגנטי האחראי לשונות בהרכב הכימי בין הכמוטיפים. לצורך המחקר נבחרו אוכלוסיות בר של שומר פשוט בעלות הרכב שונה של t-anethole ו- estragole בשמן האתרי שלהן. ארבע אוכלוסיות ממקומות שונים בישראל, ולהשוואה גם שתי אוכלוסיות הממוקמות מחוץ לישראל: אוכלוסיה דרומית מג'בל קתרינה (סיני, מצרים) ואוכלוסיה