1 Banco Base De Semillas Instituto De Investigaciones

BANCO BASE DE SEMILLAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS

PRIMER INFORME TÉCNICO DE AVANCE DEL ESTUDIO:

PROPAGACION DE ESPECIES ARBUSTIVAS Y CACTACEAS QUE FORMAN EL DESIERTO FLORIDO EN LA REGIÓN DE ATACAMA.

SOLICITANTE: INGENIERÍA Y CONSTRUCCIÓN SIGDO KOPPERS S.A

OFERENTE: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS, CENTRO REGIONAL DE INVESTIGACIÓN INTIHUASI

Camino a Peralillo s/n Teléfono [56] (51) 223290 Fax [56] (51) 226070 Casilla 36-B Vicuña, CHILE

SEPTIEMBRE 2016

RESPONSABLES DEL PROYECTO

Dr. Pedro León Lobos, Biólogo, Director de Proyecto. Dr. José Hernández Cartes, Ingeniero Forestal, Propagación y nutrición de plantas Coordinador de Proyecto.

EQUIPO DE TERRENO Marcos Acosta, Asistentes recolectores de semillas. José Hernández Cartes, Profesional a cargo de salida a terreno.

LABORATORIO DE GERMINACIÓN Karina Martínez Tilleria, Ingeniero Agrónomo, Dra. Biología y Ecología Aplicada. Johana Navarro, Ingeniero Agrónomo.

INDICE 1. ANTECEDENTES ...... 4 2. INTRODUCCIÓN ...... 6 3. OBJETIVO GENERAL ...... 9 4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 9 5. METODOLOGÍA ...... 10 a) Propagación sexual de especies arbustivas y cactáceas ...... 10 b) Propagación asexual de Cumulupuntia sphaerica ...... 12 c) Propagación (sexual y asexual) y rescate de plantas adultas de Tillandsia landbeckiii en terreno (VER ANEXO II)...... 14 6. RESULTADOS PRELIMINARES ...... 14 7. DISCUSIÓN PRELIMINAR ...... 16 8. CONCLUSIONES PRELIMINARES ...... 17 9. LITERATURA CONSULTADA ...... 17 ANEXO I: PROGRAMA OFICIAL DE TRABAJO ...... 19 ANEXO II. BIOLOGÍA REPRODUCTIVA Y RESPUESTA AL TRASPLANTE DE INDIVIDUOS ADULTOS DE Tillandsia landbeckii Phil ...... 20

1. ANTECEDENTES

Transmisora Eléctrica del Norte S.A. asociada a Ingeniería y Construcción Sigdo Koppers S.A. (en adelante ICSK), se encuentran dando cumplimiento a los compromisos ambientales adquiridos ante la Autoridad. Estos compromisos corresponden a medidas de mitigación frente a los impactos ambientales provocados por el desarrollo del proyecto “Línea de Transmisión de 500 kV Mejillones – Cardones”. El Proyecto, calificado ambientalmente favorable según RCAˊs 504/2012, 1044/2015 y 114/2015, tienen como objetivo transmitir la energía proveniente de una S/E elevadora ubicada en la zona de Mejillones hasta las regiones de Atacama y Coquimbo.

Las variantes del Proyecto se localizan en las comunas de Mejillones, Antofagasta, Taltal en la Región de Antofagasta, y las comunas de Diego de Almagro y Copiapó en la Región de Atacama. La superficie total del Proyecto corresponde a 688,5 ha, la que corresponde a la modificación de trazado de 500 kV y 220 kV y traslado y ampliación de la S/E Compensación e Instalación de Faena.

Dentro de los compromisos ambientales adquiridos con la autoridad, se encuentra la viverización de las especies objetivos a intervenir durante la etapa de construcción del Proyecto “Sistema de Transmisión de 500 KV Mejillones – Cardones” a realizar por Ingeniería y Construcción Sigdo Koppers (ICSK) de acuerdo al contrato firmado con la empresa titular “Transmisión Eléctrica del Norte”. Buscando mitigar el impacto de las actividades del Proyecto sobre las especies en categoría de conservación, mediante la relocalización y propagación de las especies vegetales afectadas en el proyecto. Entre las actividades consideradas son: a) Viverización de especies arbustivas y cactáceas. b) Enriquecimiento para la especie Copiapoa megarhiza. c) Estudio de Tillandsia landbeckiii. d) Selección de sectores de establecimiento.

4 e) Programa de revegetación. f) Plan de seguimiento.

Las especies consideradas para este plan son: 1) Atriplex clivicola, 2) Atriplex desertícola, 3) Copiapoa megarhiza, 4) Cumulupuntia sphaerica, 5) Ephedra breana, 6) Eulychnia acida, 7) Heliotropium chenopodiaceum, 8) Nolana albescens, 9) Encelia canescens, 10) Tetragonia angustifolia, 11) Tillandsia landbeckii, 12) Phyrrocactus confinis y 13) Aphylocladus denticulatus.

Con el fin de dar cumplimiento al compromiso ambiental, específicamente lo relativo a la viverización de plantas objetivo, Sigdo Koppers solicitó a INIA una propuesta técnica y económica. Dicha propuesta que fue aprobada, forma parte de un segundo Contrato de Servicios de Investigación, firmado el 14 de Julio de 2016.

Dado el escaso a nulo conocimiento sobre la biología y ecología de las especies comprometidas en el plan de manejo y en general de la mayoría de la Flora del Desierto de Atacama, la propuesta técnica elaborada por el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA), como parte de un Plan de Manejo Biológico, considera un fuerte componente de investigación aplicada, dirigida a establecer las condiciones óptimas para propagar estas especies vía semillas y en algunos casos usar métodos de propagación vegetativa.

2. INTRODUCCIÓN

La propagación es el proceso por el cual las plantas producen nuevos organismos a partir de semillas, tallos, hojas y raíces. Este proceso debe desarrollarse como una alternativa más para la conservación de la biodiversidad. Conocer más sobre los métodos de propagación ayuda a enriquecer el conocimiento acerca de las especies y también permite conocer su biología reproductiva, importante para su conservación ex-situ y/o reforestación.

Para conservar la diversidad genética tanto in-situ como ex-situ, la propagación sexual es la mejor alternativa. Esto se debe a que durante la reproducción se unen las células de dos progenitores, que dan lugar a descendencia con una nueva combinación cromosómica. Esta nueva combinación genética, favorece que los nuevos individuos tengan mayores posibilidades de adaptación a los cambios climáticos y ambientales.

La reproducción o propagación asexual, también conocida como propagación vegetativa, es la reproducción de una planta a partir de una célula, tejido u órgano (ramas, tallos, hojas o raíces). Esto es posible de realizar porque cada célula vegetal contiene las características genéticas necesarias para generar una nueva planta. La propagación vegetativa mediante la recolección de brotes, es uno de los métodos más utilizados y consiste en la multiplicación de individuos sin la intervención de la fecundación sexual, en el cual no se forman gametos, zigotos, meiosis y fecundación. Acontece con la multiplicación de células somáticas que generan nuevas células mediantes divisiones mitóticas. Al no existir fusión de gametos ni recombinación, los descendientes son clones al material parental. El fenómeno se basa en el concepto biológico de la totipotencia celular, donde toda célula vegetal contiene la información genética necesaria para formar una nueva planta. Por ello, la propagación vegetativa a través de estacas, ha sido utilizada en programas de restauración y reforestación en diversos programas de EEUU, Japón, Europa, Nueva Zelanda, Australia, Canadá y Chile.

Estacas recolectadas en terreno es una alternativa viable desde el punto de vista práctico, ya que es un método que contribuye a solucionar problemas asociados a la producción de semillas tales como su viabilidad, germinación y recolección de las mismas.

El beneficio de la propagación asexual radica en la obtención de plantas idénticas con características deseables, como la sanidad o tolerancia al estrés biótico o abiótico y como tal, juega un papel muy importante en la permanencia de una característica ideal de una generación a otra. Aunque en éste caso, la variabilidad genética disminuye, permite obtener individuos de especies con dificultosa germinación por semillas, de forma rápida y eficiente, principalmente cuando se requieren muchos individuos como es el caso de la reforestación o restauración de áreas degradadas.

La conservación ex situ de semillas, es valiosa para realizar estudios sobre distintos aspectos de la biología o conducta de las especies, el desarrollo de técnicas de reproducción, el resguardo de la diversidad genética y ayuda a evitar la extinción de especies. Varios de los relevantes puntos antes mencionados, son desarrollados en el proyecto: Recolección y conservación de semillas, dirigido por Ingeniería y Construcción Sigdo Koppers S.A (ICSK)

ICSK encomendó al Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA), la propagación sexual de especies arbustivas y cactáceas que forman el desierto florido en la región de atacama de 13 especies objetivo: Atriplex clivicola, Atriplex desertícola, Copiapoa megarhiza, Cumulupuntia sphaerica, Ephedra breana, Eulychnia acida, Heliotropium chenopodiaceum, Nolana albescens, Encelia canescens, Tetragonia angustifolia, Tillandsia landbeckii, Phyrrocactus confinis y Aphyllocladus denticulatus.

De las especie objetivo, cuatro son nativas, cuatro son endémicas de Chile y tres son endémicas de la Región de Atacama, demostrándose la importancia de su

7 resguardo y propagación con fines de reforestación. Además, dos de estas especies se encuentran casi amenazadas, dos son vulnerables y dos no han sido evaluadas aún por el comité de clasificación de especies, perteneciente al Ministerio de Medio Ambiente (MMA).

Mediante diversas pruebas, se ha podido comprobar que algunas de las especies objetivo tienen una difícil propagación mediante semilla, por lo cual su propagación vegetativa es de relevancia para los programas de reforestación o restauración de áreas. Sin embargo, la recolección de semillas es de suma importancia para el resguardo de su diversidad genética.

Estas especies son parte de la formación vegetacional “Desierto Florido interior”, sector desde donde se realizaron las colectas, específicamente en el sector entre Diego de Almagro y sur de Copiapó, Región de Atacama.

El presente informe da cuenta de los principales resultados obtenidos hasta ahora respecto de los puntos comprometidos entre ICSK e INIA para la viverización de las 13 especies objetivo, especies arbustivas y cactáceas.

3. OBJETIVO GENERAL

Generar conocimiento sobre la biología de las especies incluidas en el Plan de Manejo Biológico con el fin de desarrollar metodologías para la propagación y su posterior establecimiento en terreno con el fin de desarrollar exitosamente el programa de revegetación establecidas en las RCA´s.

4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Propagar vía reproducción sexual las especies arbustivas y cactáceas comprometidas. b) Generar conocimiento sobre la biología reproductiva, desarrollo y transplante de Tillandsia landbeckii. c) Seleccionar los sectores a proponer para el establecimiento de las especies comprometidas. d) Elaborar una propuesta de Programa de revegetación de las especies arbustivas y cactáceas comprometidas.

5. METODOLOGÍA a) Propagación sexual de especies arbustivas y cactáceas

Una vez obtenidos resultados positivos en el proceso de germinación, las semillas serán establecidas en pequeños maceteros en un medio de crecimiento de turba y vermiculita (1:1) e instaladas en cámaras de crecimiento Binder (KBWF-240), con un fotoperíodo de 12:12 Luz/Oscuridad y 75 % de humedad relativa (Figura 1).

Figura 1 A-B). Siembra de semillas de Eulychnia acida en macetero.

Para evaluar la influencia de la temperatura de incubación en el crecimiento inicial de las plantas, se estableció un ensayo, considerando el factor temperatura como variable a estudiar. Se utilizaron tres tratamientos de temperatura 15, 20 y 25 °C. La unidad muestral estará constituida por un macetero con 5 plantas (Figura 2).

Figura 2. Instalación de ensayo de crecimiento de cactáceas a diferentes temperaturas.

Una vez conocido los resultados preliminares del efecto de la temperatura en el crecimiento de las especies, se continuará con una segunda etapa en sombreadero, donde se evaluará el efecto del medio de crecimiento en el desarrollo de las plantas. Para ello, las semillas serán sembradas en placas petri sobre un medio de agar- agar al 1% y establecidas en una cámara de crecimiento Binder (KBWF-240), una vez germinadas serán trasplantadas en contenedores en un medio de crecimiento de tierra de hoja. La unidad experimental estará conformada por la planta. Cada 60 días, durante un año serán realizadas mediciones de crecimiento en elongación (± 0,1 cm) y diámetro (± 0,1 mm). Al final de la temporada de crecimiento, tres plantas serán colectadas y secados a 65º C hasta llegar a peso constante para análisis de biomasa.

Al final del período de crecimiento en incubadora se efectuara un análisis de varianza (ANDEVA) para evaluar el efecto de las temperaturas en el crecimiento en altura y biomasa aérea y radicular. La homogeneidad de varianza será evaluada mediante la prueba de Levene (P < 0,05). El supuesto de normalidad de los residuos se evaluara mediante la prueba de Shapiro-Wilks (P < 0,05). Para detectar diferencias significativas entre los tratamientos, se realizara la prueba de comparación múltiple Tukey, con un 95 % de confianza.

b) Propagación asexual de Cumulupuntia sphaerica

En agosto 2016 se realizó una expedición a la localidad de Copiapó, en la región de Atacama donde se identificaron individuos adultos de la especie a la cual se les recolectaron artejos (Figura 3).

FIGURA 3. Individuos adultos de C. sphaerica localizados en la Región de Copiapó.

Los artejos recolectados fueron almacenadas en cajas refrigeradas a 15 °C y trasladadas al laboratorio del Banco Base de Semillas – INIA Intihuasi Vicuña (30°2’S-70°41’O, 628 msnm, 60 km al este de la ciudad de La Serena) para su procesamiento. Los artejos fueron limpiados y dimensionados, dejando solo un cuerpo. A los artejos de C.sphaerica se les realizaron un corte basal con la finalidad de adicionar diferentes concentraciones de ácido indol butirico (AIB) y posteriormente instalados en maceteros de 200 cc en un sombreadero. Se utilizaron tres diferentes medios de crecimiento (turba, suelo del lugar y una mezcla 1:1 de suelo del lugar/ turba). Las concentraciones de ácido indol butirico (AIB) utilizadas fueron de 500, 1000, 3000, 5000 y 10000 mgL-1 más un tratamiento control sin hormona. Dichas concentraciones se lograron con la adición a 140 ml de alcohol etílico al 96% de 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 1,0 y 2,0 g de AIB respectivamente. Una vez preparada la solución, esta fue mezclada en forma homogénea con 200 g de talco inerte que sirvió como testigo (Mitchell & Livingston, 1973). Para evaluar la influencia del

12 medio de crecimiento y las concentraciones hormonales en el enraizamiento de los artejos se estableció un diseño experimental factorial que correspondió a bloques completos al azar con tres repeticiones, considerando siete concentraciones hormonales (0, 500,1000, 2000, 3000, 5000 y 10000 ppm) y tres medios de crecimiento (turba, suelo del lugar y una mezcla 1:1 de suelo del lugar/ turba). La unidad muestral estará constituida por el macetero con un artejo Figura 4.

FIGURA 4. Instalación de ensayo de propagación vegetativa de C.sphaerica. A) Selección y corte de artejos de plantas adultas de C.sphaerica. B) Instalación de artejo en el medio de crecimiento. C) Artejos instalados en el macetero individual. D) Instalación de ensayo de propagación vegetativa de C. sphaerica.

Al final del período de estudio, se evaluará el porcentaje de artejo enraizados por medio de un análisis de varianza (ANOVA) y test de Tukey para establecer diferencias entre promedios de efectos significativos, utilizando el software Infostat.

c) Propagación (sexual y asexual) y rescate de plantas adultas de Tillandsia landbeckiii en terreno (VER ANEXO II).

6. RESULTADOS PRELIMINARES

Para Atriplex deserticola se observó que la temperatura presenta un efecto claro en la elongación, aumentando el crecimiento en un 290 % para la temperatura 20ºC en contraste con la temperatura de 15ºC. No existiendo un claro efecto de la extracción de las brácteas y siembra directa de las semillas en macetero a la variable estudiada, transcurrido 96 días (16 de junio – 30 de septiembre 2016) de establecido el ensayo.

Figura 5. Ensayo de temperatura en Atriplex desertícola. A) Evaluación del efecto de la temperatura en el crecimiento en elongación. B) Efecto de la siembra directa y temperatura en la elongación. C-D) Efecto de la extracción de las brácteas y temperatura en la elongación.

Para Eulychnia acida se observó que las temperaturas presentan un efecto claro en la elongación, aumentando el crecimiento en un 26 % en la temperatura 20ºC en contraste con la temperatura de 25ºC y un 6% en contraste con la temperatura alternante 25/5ºC. A medida que la temperatura aumenta sobre los 25ºC existe una disminución significa en el crecimiento Figura 6.

0,5 A B

0,4

0,3

0,2 Elongación (cm)

0,1

0,0 20ºC 25ºC 25/5ºC Temperaturas Figura 6. Efecto de la temperatura en la elongación de plántulas de de E.acida.

Para Copiapoa megarhiza se observó que las temperaturas presentan un efecto claro en la elongación, aumentando el crecimiento en un 38 % en la temperatura de 15ºC, en contraste con la temperatura de 25ºC. El aumento de la temperatura sobre los 25ºC provoca una disminución significa en el crecimiento de la especie.

1,2 A B 1,0

0,8

0,6

Elongación (cm) 0,4 25ºC 25/5ºC 15ºC 0,2

0,0 15ºC 25ºC 25/5ºC Temperaturas Figura 7. Efecto de la temperatura en la elongación de C.megarhiza.

7. DISCUSIÓN PRELIMINAR

La temperatura es el principal factor que determina la adaptación de las especies a diferentes localidades dado que altera diversas funciones vitales. A medida que la temperatura aumenta también lo hace la velocidad del crecimiento vegetal hasta alcanzar un valor óptimo, por encima del cuál un aumento de temperatura provoca una disminución de ella. Las bajas temperaturas afectan los procesos fisiológicos disminuyendo la velocidad de las reacciones enzimáticas. La temperatura afecta sobre las reacciones enzimáticas, a medida aumenta se incrementa la energía cinética de las moléculas aumentando la velocidad de las reacciones. Sin embargo, si la temperatura aumenta mucho se alteran los procesos fisiológicos al producirse una desnaturalización de las enzimas y desorganización de algunas estructuras celulares.

Atriplex desertícola es una especie nativa concentrándose principalmente en las zonas áridas del norte de Chile. Esta especie es característica del desierto de atacama y es especialmente abundante en los valles de los ríos de Copiapó y Huasco, en las quebradas, desde los 400 msnm hasta la pre-cordillera a los 3000 msnm. Es una especie que no presenta antecedentes bibliográficos de su proceso de germinación, por ello no existen información referentes al efecto de las condiciones ambientales en la tasa de crecimiento de las plantas producidas en vivero. Con los resultados preliminares obtenidos, podemos discutir que existe una relación directa entre la temperatura de propagación y la elongación u crecimiento en altura de las plantas de A.deserticola, mostrando una alta sensibilidad a los cambios de temperatura. Las plantas instaladas a 20ºC han presentado un crecimiento constante de 2,5 cm/ mes, contrariamente a lo acontecido con la temperatura de 15ºC. Para las cactáceas estudiadas, la elongación muestra una relación directa con la temperatura, reflejando la alta sensibilidad a los cambios de temperatura. Esto sugiere una deficiencia en elongación y desarrollo, al no utilizar la temperatura adecuada para su propagación. Dicho comportamiento fue similar al observado en otras especies de cactáceas, donde las condiciones ambientales (temperatura, 16 humedad ambiental, radiación y humedad del suelo) son de importancia para su crecimiento y desarrollo.

8. CONCLUSIONES PRELIMINARES

A medida que aumenta la temperatura sobre los 25ºC la elongación u crecimiento en altura de las cactáceas estudiadas disminuye.

Para el caso del Atriplex desertícola, a medida que aumenta la temperatura el crecimiento en altura aumenta.

9. LITERATURA CONSULTADA

BENOIT, I. 1989. Libro rojo de la flora terrestre de Chile. Corporación Nacional Forestal. Impresora Creces Ltd., Santiago, Chile. 157p.

GAJARDO R .1994. La vegetación natural de Chile. Clasificación y Distribución geográfica. Ed. Universitaria. Santiago. 165 pp.

GAJARDO R, MT SERRA & I GREZ .1987. Fichas técnicas de lugares específicos con presencia de especies leñosas amenazadas de Extinción. En: BENOIT I ( 1989) Libro Rojo de la Flora Terrestre de Chile. Corporación Nacional Forestal.157 pp.

IGLESIAS G., L. PRIETO R., J.A. ALARCÓN B., M. 1996. La propagación vegetativa de plantas forestales. Ciencia Forestal, INIFAP. Vol. 21(79): 15-41.

MOLINA-MONTENEGRO MA, R OSES, C ATALA, C TORRES-DÍAZ, G BOLADOS, P LEÓN-LOBOS (2016). Nurse effect and soil microorganisms are key to improve the establishment of native plants in a semiarid community. Journal of Arid Environments 126 (2016) 54-61.

RIEDEMANN, P., G. ALDUNATE y S. TEILLIER. 2006. Flora Nativa de Valor Ornamental; Identificación y Propagación. Chile Zona Norte. Edición 1, Chile. 405p.

RUIZ, H. y J. PAVÓN. 1798. Flora Peruviana et Chilensis Tomus I. C. Bermejo, Madrid, España. 193p.

SANTELICES, R., BOBADILLA, C. 1997. Arraigamiento de estacas de Quillaja saponaria Mol. y Peumus boldus Mol. En: Bosque, Vol. 18, N 2, pág. 77-85. Disponible en: http://mingaonline.uach.cl/pdf/bosque/v18n2/art08.pdf.

TEILLIER, S., H. ZEPEDA y P. GARCÍA. 1998. Flores del Desierto de Chile. Marisa Cuneo, Valdivia. 111p.

ANEXO I: PROGRAMA OFICIAL DE TRABAJO Nombre del Estudio: VIVERIZACIÓN Y PROPAGACIÓN DE ESPECIES XERÓFITICAS Y CACTACEAS Institución Ejecutoria: Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA - Intihuasi

Año 2016 Año 2017 Resultado Actividad Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo comprometido

Elaboración de Entrega Plan de Planificación Plan de trabajo.- Carta GANTT actualizada trabajo: 15 detallada Actividades 15 septiembre a Mayo 2017 septiembre 2016 2016 Instalación Resultados preliminares Propagación sexual Inicio actividad. Compra de insumos. ensayo Monitoreo de Monitoreo de Monitoreo de Monitoreo de Monitoreo de en la propagación de de especies Propagación x Habilitación espacios nutrientes / Monitoreo de ensayos ensayos ensayos ensayos ensayos ensayos especies arbustivas en arbustivas especie vivero medio de estudio. crecimiento*

Instalación ensayos Instalación Resultados preliminares Inicio actividad. Propagación de de temperaturas en ensayo medio Monitoreo de Monitoreo de Monitoreo de Monitoreo de Monitoreo de en la propagación de Propagación x Monitoreo de ensayos especies cactáceas** ambiente controlado de crecimiento ensayos ensayos ensayos ensayos ensayos especies de cactáceas en especie *. /hormonas ** estudio

Instalación ensayos Instalación Enriquecimiento para Inicio actividad. Resultados preliminares de temperaturas en Monitoreo de Monitoreo de ensayo medio Monitoreo de Monitoreo de Monitoreo de la especie Copiapoa Propagación x Monitoreo de ensayos en la propagación de ambiente controlado ensayos ensayos de crecimiento ensayos ensayos ensayos megarhiza especie Copiapoa megarhiza *. /nutrición

Instalación ensayos Instalación Entrega de Instalación Resultados preliminares Estudio de Tillandsia de germinación de Monitoreo de Monitoreo de Monitoreo de ensayos de Monitoreo de Propuesta de ensayos de Monitoreo de ensayos en la germinación y landbeckii semillas ***/ ensayos ensayos ensayos macro- ensayos Estudio fenología trasplante trasplante propagación

Selección de los Selección de los sectores mediante sectores mediante descripción descripción Sectores de trasplantes Selección de los vegetacional vegetacional de plantas viverizadas, sectores de trasplante (distribución, (distribución, descritas. espaciamiento, espaciamiento, caracterización del caracterización del sitio, densidad) sitio, densidad) -Plan de trabajo 31 de Mayo.- actualizado a Informe Final.- 31 de Marzo.- Mayo del 2017. Resultados de Informe trimestral - 15 de 28 de Febrero.- todas las 15 de III.- Resultado Septiembre.- Propuesta actividades Noviembre.- preliminar de la Metodología de metodológica detalladas en Propuesta propagación por Informes trabajo para Estudio de informes de metodológica 30 de Diciembre.- semillas para C. Tillandsia Enriquecimiento Avance y los Programa de Informe trimestral II.- megarhiza y landbeckii. Copiapoa resultados al año Revegetación Resultados del - 30 de megarhiza. 1 de la Estudio Septiembre.- propagación por Vegetacional. Informe trimestral semillas de las I especies * En especies con protocolo superior a un 50 % de germinación. ** Para el caso de la especie Cumulopuntia sphaerica, se realizara un ensayos de propagación vegetativa dado antecedente de baja germinación. ***Logrando un 50% de germinación se iniciaran los ensayos de propagación de T.landbeckii

ANEXO II. BIOLOGÍA REPRODUCTIVA Y RESPUESTA AL TRASPLANTE DE INDIVIDUOS ADULTOS DE Tillandsia landbeckii Phil

BANCO BASE DE SEMILLAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS

ESTUDIO: BIOLOGÍA REPRODUCTIVA Y RESPUESTA AL TRASPLANTE DE INDIVIDUOS ADULTOS DE Tillandsia landbeckii Phil.,

SOLICITANTE: INGENIERÍA Y CONSTRUCCIÓN SIGDO KOPPERS S.A (SK)

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS, CENTRO REGIONAL DE INVESTIGACIÓN INTIHUASI

Camino a Peralillo s/n Teléfono [56] (51) 223290 Fax [56] (51) 226070 Casilla 36-B Vicuña, CHILE SEPTIEMBRE 2016

RESPONSABLES DEL PROYECTO

Dr. Pedro León Lobos, Biólogo, Director de Proyecto.

Dr. José Hernández Cartes, Ingeniero Forestal, Propagación y nutrición de plantas Coordinador de Proyecto.

EQUIPO DE TERRENO

Marcos Acosta, Asistente recolector de semillas.

José Hernández Cartes, Profesional a cargo de salida a terreno.

LABORATORIO DE GERMINACIÓN

Karina Martínez Tilleria, Ingeniero Agrónomo, Dra. Biología y Ecología Aplicada

Johana Navarro, Ingeniero Agrónomo.

AREA DE PROPAGACIÓN

María José Espejo, Ingeniero en Ejecución Agrícola

1. ANTECEDENTES

Transmisora Eléctrica del Norte S.A. a través de Ingeniería y Construcción Sigdo Koppers S.A. (en adelante ICSK), se encuentran dando cumplimiento a los compromisos ambientales adquiridos ante la Autoridad. Estos compromisos corresponden a medidas de mitigación frente a los impactos ambientales provocados por el desarrollo del proyecto “Línea de Transmisión de 500 kV Mejillones – Cardones”. El Proyecto, calificado ambientalmente favorable según RCAˊs 504/2012, 1044/2015 y 114/2015, tienen como objetivo transmitir la energía proveniente de una S/E elevadora ubicada en la zona de Mejillones hasta las regiones de Atacama y Coquimbo.

Las variantes del Proyecto se localizan en las comunas de Mejillones, Antofagasta, Taltal en la Región de Antofagasta, y las comunas de Diego de Almagro y Copiapó en la Región de Atacama. La superficie total del Proyecto corresponde a 688,5 ha, la que corresponde a la modificación de trazado de 500 kV y 200 kV y traslado y ampliación de la S/E Compensación e Instalación de Faena 03.

Dentro de los compromisos voluntarios ambientales adquiridos por Transmisora Eléctrica del Norte con la autoridad, se encuentra la realización de un estudio de la especie Tillandsia landbeckii, especie herbácea de la familia Bromeliaceae, catalogada como “Vulnerable (VU)”, de conformidad con el Libro Rojo de la Flora Terrestre de Chile (Benoit, 1989). Dicho estudio incluye la germinación de semillas y/o propagación vegetativa, y su viverización. En conjunto con esto se debe realizará una prueba de trasplante de un grupo de individuos que serán afectados por el proyecto a un sector aledaño, de preferencia en el área de la instalación de faena,

Dentro de los compromisos ambientales adquiridos, se busca mitigar el impacto de las actividades del Proyecto sobre las especies en categoría de conservación,

Dado el escaso a nulo conocimiento sobre la biología y ecología de las especies comprometidas en el plan de manejo y en general de la mayoría de la Flora del Desierto de Atacama, la propuesta técnica elaborada por INIA, como parte de un Plan de Manejo Biológico, considera un fuerte componente de conservación e investigación aplicada, dirigida a establecer las condiciones óptimas para propagar estas especies vía semillas y, definir las condiciones ecológicas más adecuadas para el repoblamiento de estas especies.

2. Introducción A nivel mundial la familia Bromeliaceae, a la cual pertenece Tillandsia landbeckii, incluye unos 56 géneros y 3.086 especies (Luther, 2006). Su distribución está restringida a los trópicos, subtrópicos y zonas templadas o secas de América, excepto por una especie que crece al oeste de África (Smith y Downs, 1974). La diversidad de bromeliáceas declina hacia el sur de América (Rundel y Dillon, 1998), encontrando por ejemplo 14 géneros y 424 especies en Perú (Brako y Zarucchi, 1993), y en Chile solo 6 géneros y 22 especies (Pinto, 2005).

Dentro de la familia Bromeliaceae, el género Tillandsia es el más numeroso comprendiendo unas 600 especies en seis subgéneros (Ramírez et al., 2004). En términos generales, las especies de éste género corresponden a plantas aéreas, herbáceas, hermafroditas, epífitas que crecen sobre árboles, arbustos, cactus, rocas, incluso directamente sobre la arena (Pinto, 2005), y se disponen en una roseta basal o en fascículos, de color verde a verde grisáceas (Elizalde 2014). Estas especies poseen distintos mecanismos adaptativos que les permiten vivir en ambientes extremos, muy húmedos o áridos (Pinto, 2005).

En Chile, el género Tillandsia comprende 6 especies: T. capillaris (var. T. virescens), T. gessei, T. landbeckii, T. marconae, T. tragophoba y T. usneoides (Zizka & Muñoz-Schick, 1993; Zizka et al. 2009). Las primeras cinco se encuentran en el norte del país, y solo T. capillaris var. virescens está presente en la zona andina. Todas las otras especies solo están presentes en la cordillera de la costa, siendo T. marconae y T. landbeckii las únicas que forman tillandsiales (Pinto, 2005).

Los “tillandsiales”, son ecosistemas dominados por plantas del género Tillandsia presentes en la costa peruana y chilena (Aponte y Flores, 2013). En Chile su distribución se ha reportado desde la Región de Arica y Parinacota hasta la Región de Valparaiso (I; II, IV y V Región).

Las lomas de Tillandsia presentes en la costa del norte de Chile, son comunidades que se desarrollan en suelos arenosos desérticos (Pinto 2005) y subsisten gracias a la presencia de neblina costera, la cual entrega agua y nutrientes, particularmente importantes en los meses de invierno y primavera (Cereceda et al. 1999). En consecuencia, las especies de Tillandsia presentes en el país tienen distribuciones restringidas, son altamente endémicas y están asociadas a la presencia de corredores de neblina a lo largo del área costera.

El incremento histórico de la aridez y el cambio climático representan un seria amenaza para la estabilidad y supervivencia futura de los Tillandsiales del desierto costero del norte de Chile, debido a la disminución del agua aportada por la neblina costera (Schulz et al., 2011), por lo que su estudio es necesario para generar conocimientos que permitan implementar programas de conservación tanto in situ como ex situ, con el fin de salvaguardar este patrimonio biológico.

Las Tillandsias poseen adaptaciones morfológicas, fisiológicas y ecológicas que le permiten sobrevivir en el desierto, entre las que se cuenta la capacidad de ciertas especies para utilizar variablemente la vía fotosíntética C3 o el Metabolismo Ácido Crassuláceo (CAM) (Rundel y Dillon, 1998). Este mecanismo fotosintético alternativo le permite capturar CO2 en el día, cuando la humedad relativa es alta (C3), o bien en periodos más secos realizar la captura de carbono durante la noche (CAM), a modo de evitar la pérdida de humedad desde sus hojas. Además, las Tillandsias presentan pelos compuestos en sus hojas (Benzing, 2000), una modificación adaptativa que les permite disminuir la velocidad de transpiración y atrapar la capa de agua en sus bordes (Campbell y Reece, 2007). Debido a éstas adaptaciones, las plantas de Tillandsia crecen lentamente y son muy tolerantes al estrés ambiental (Pinto, 2005).

Tillandsia landbeckii, también conocida como clavel de aire, es una especie presente en las zonas costeras de Perú y el norte de Chile formando amplios campos sobre la arena. Según la literatura, ésta especie se encontraría desde las Islas San Gallan (13° 50'S) en el centro de Perú (Smith y Downs, 1977) a la Región de Coquimbo (31°50’S), en la Provincia de Illapel

(Pinto, 2005). Sin embargo, actualmente la ocurrencia de esta especie en Chile se encuentra centrada principalmente en la Cordillera de la Costa al oeste de Iquique, por lo que hacia el sur su presencia se hace cada vez más escasa y disgregada (Rundel et al. 1997).

T. landbeckii es una planta epífita que crece principalmente sobre arena entre los 300 y 1500 m de altitud en la cordillera de la costa. Posee una altura promedio de 30 cm, incluyendo la vara floral, con delgados tallos que se agrupan en cojines, ramificados, los que pueden llegar a los 20 cm de largo. Solamente en etapas tempranas posee raíz, las cuales pierde durante su desarrollo (Pinto, 2005). Esta especie ha desarrollado un complejo mecanismo para captar las gotas de neblina costera, mediante hojas escamosas especializadas, y utiliza el metabolismo CAM, el que le permite sobrevivir a las hostiles condiciones climáticas del desierto de Atacama (Rundel et al., 1997).

La relación altamente específica entre el hábitat de Tillandsia landbeckii y su dependencia del agua aportada por la neblina costera, sugiere que estas comunidades pueden servir como indicadores biológicos del cambio climático en el norte de Chile (Rundel et al. 1997). Además, las características y adaptaciones ecológicas que poseen estas formaciones vegetales las vuelve únicas en el mundo (León et al., 1997; León y Sagástegui, 2008), por lo que el estudio de su biología y ecología es de suma importancia para su valorización y conservación.

3. Justificación del estudio

A pesar de que T. landbeckii aún no ha sido evaluada por el Comité de Clasificación de Especies del MMA, ha sido clasificada como vulnerable en el Libro Rojo de la Flora Terrestre de Chile (Benoit, 1989) y otros estudios indican un alto grado de vulnerabilidad por su restringido rango de distribución en Chile, el cambio climático, el cual puede ser un problema dada su extrema especialización y dependencia de la humedad de niebla, y la presencia de deportes motorizados en dunas y arenas donde subsiste la especie (Pinto, 2005; Zizka et al., 2009; Schulz et al., 2011). Sin embargo, los estudios realizados a la fecha, se han centrado principalmente en la identificación de adaptaciones morfológicas a ambientes áridos (Rundel y Dillon, 1998), la identificación de poblaciones, su distribución,

25 forma de crecimiento (Rundel et al., 1997; Pinto, 2006) y fenología (Pinto, 2005). No obstante, a pesar de los esfuerzos realizados en el pasado, esta especie aún no es bien conocida y aspectos tan relevantes como su reproducción, propagación, dinámica de transplante y establecimiento in situ aún no han sido investigados.

En este trabajo, se propone realizar estudios sobre: a) Fisiología de germinación de semillas. La germinación de T. landbeckii en la naturaleza es desconocida, por lo que es necesario investigar los factores que permiten que la germinación suceda. La información obtenida en este estudio contribuirá en el desarrollo de metodologías para la propagación de la especie mediante semillas. b) Propagación vegetativa. No existen ensayos anteriores para T. landbeckii, que describan su comportamiento bajo propagación a través de sus hojas, lo que contribuiría a obtener individuos de la especie rápidamente. La micro-propagación también es una alternativa al momento de obtener individuos de forma más rápida que mediante semillas. Además éste método asegura la sanidad vegetal de los individuos que se obtengan. c) Desarrollo de plantas a partir de semillas y propagación vegetativa. El seguimiento del crecimiento y desarrollo en vivero de plantas obtenidas desde semilla y por métodos de macro y micro-propagación vegetativa, permitirá conocer la evolución, desenvolvimiento y requerimientos de individuos de T. landbeckii obtenidos bajo distintos métodos de propagación. d) Ensayo de transplante de Tillandsias. Esta investigación permitirá conocer el comportamiento de T. landbeckii frente a la recuperación de ejemplares y su transplante, dos procesos cruciales para la supervivencia de la especie y que nunca antes han sido estudiados, frente a la remoción de plantas desde sus sitios de origen.

La finalidad del estudio es producir protocolos de germinación, propagación vegetativa y transplante de T. landbekii, para la conservación in-situ y ex-situ de la especie.

4. Antecedentes Bibliográficos

Clasificación taxonómica Reino: Plantae, Phylum: Magnoliophyta, Clase: Liliopsida, Orden: Poales, Familia: Bromeliaceae, Género: Tillandsia, Especie: Tillandsia landbeckii Phil, Nombre común: clavel del aire, calachunca.

Características morfológicas de Tillandsia landbeckii Tillandsia landbeckii presenta una inflorescencia aromática con 1 o 2 flores subsésiles, raramente 3, bisexuales, de diversos colores, naranjo, púrpura, marfil, café, siendo el amarillo el más frecuente; sépalos asimétricos, parcialmente escamosos de 1 cm de largo. Estambres junto a los pétalos, de 6 mm de largo, que sobrepasan levemente el pistilo; Ovario súpero, tan largo como el pistilo. El fruto es una cápsula cilíndrica de aprox. 2 cm de largo; Las semillas de 1-4 mm poseen apéndices plumosos de 1 cm de largo (Smith & Downs, 1977; Pinto, 2002; Castañeda, 2003).

Características de las semillas En el género Tillandsia la fertilización del óvulo da origen a la semilla. El endosperma ocupa gran parte del interior de la semilla y contiene carbohidratos de reserva, proteínas, vitaminas y minerales. El embrión crece lentamente, alimentado por el endosperma y ocupa sólo una porción pequeña de la semilla, por lo general un tercio del volumen total (Fig. 1). En la madurez, un embrión de Tillandsia se compone de un cotiledón carnoso, situado al abrigo del endospermo, un ápice embrionario pequeño con varias hojas parcialmente desarrolladas y una raíz primaria parcialmente desarrollada (Benzing, 1980).

En T. landbeckii cada flor polinizada produce una cápsula con tres cámaras, y cada cápsula contiene de 18 a 54 semillas por fruto, el cual demora 3 meses en madurar (Pinto, 2005). El fruto se seca gradualmente, hasta que las paredes de las cámaras se contraen y separan. La pared de cada cámara se dobla hacia atrás y provee de una abertura para la dispersión de las semillas, que ocurre generalmente por viento (Molina, 1999). Los pelos exteriores se sueltan de la semilla para tomar forma de quitasol, lo que les permite ser transportadas por el viento (Pinto, 2005).

Figura 1. Anatomía de la semilla del género Tillandsia (Benzing, 1980)

Requerimientos para la germinación en semillas de Tillandsia La dormancia (latencia) es un mecanismo de base genética que poseen algunas semillas, que puede ser de naturaleza física o fisiológica, y que previenen la germinación de la semilla cuando condiciones ambientales le son adversas. La dormancia permite que la germinación se sincronice con el ambiente, a la espera de que existan condiciones óptimas para la supervivencia de las plántulas (Hartmann et al., 2002).

Las semillas de bromeliaceas epífitas son consideradas quiescentes, es decir, que no pasan por un periodo de dormancia y pueden germinar inmediatamente después de ser dispersadas, cuando se encuentran en un medio apropiado de humedad y temperatura (Benzing, 2000). Se esperaría entonces, que las semillas de Tillandsia landbeckii sometidas a medios controlados de temperatura, humedad y luz germinen rápidamente. Sin embargo, la germinación también dependerá de la calidad y viabilidad de las semillas colectadas, atributos que pueden variar según el año, las condiciones climáticas en las cuales se desarrollaron y otros factores ambientales y genéticos de las poblaciones.

Tratamientos para incrementar la germinación de semillas Frecuentemente en los ensayos de germinación se encuentran semillas que no germinan, aun cuando han absorbido agua, oxígeno y se encuentran en condiciones óptimas de temperatura, luz y humedad (Besnier, 1989; Hartmann et al., 1990; ISTA, 1996). En estos casos, las semillas pueden ser sometidas a tratamientos pregerminativos aplicando compuestos u hormonas para promover e incrementar la germinación. Entre los tratamientos que promueven la germinación de semillas se encuentra el ácido giberélico (GA₃) (Ramos y Zavaleta, 1993).

El ácido giberélico es una hormona vegetal, relacionada con el desarrollo del embrión, y ha sido ampliamente utilizado para acelerar la germinación y uniformidad de ésta en diferentes especies. Se ha reportado que al ser aplicado exógenamente en las semillas de diversas especies, es efectivo en el control y promoción de la germinación por que interrumpe estados de latencia y reemplaza ciertos estímulos ambientales como luz o temperatura. Por lo tanto, su aplicación resultaría en un mayor porcentaje de germinación y la disminución del tiempo de germinación (Bhattacharya y Khuspe, 2001).

Se han realizado algunos trabajos para comprobar la efectividad de GA3 en semillas de especies de Tillandsias (Meoño, 2013; Vásquez, 2014), resultando en mayores porcentajes y velocidad de germinación, motivo por el cual se realizarán ensayos para evaluar el efecto de ésta fitohormona en la germinación de semillas de T. landbeckii.

Propagación de Tillandsia La propagación es una de las etapas claves de un programa de conservación de especies vegetales. Disponer de propágulos de alta calidad genética y fisiológica es esencial para aumentar la probabilidad de reintroducción de especies amenazadas. Sin embargo, en especies amenazadas generalmente la producción de semillas y propagación de plantas son etapas restrictivas. Por ello, se hace imperativo conocer sus mecanismos de propagación en vivero tanto sexual como asexual.

La propagación vegetativa es un método que puede mitigar y resolver problemas en especies que presentan dificultades para germinar, y consiste en la multiplicación de individuos basada en la totipotencialidad celular (Hartmann y Kester, 2001; Rojas et al., 2004). La propagación vegetativa se produce por la estimulación de los tejidos para entrar en división celular y producir primordios radiculares, mediante la acumulación natural de auxinas y de carbohidratos en las áreas expuestas (Baldini, 1992; Hartmann y Kester, 2001). De esta manera, los tejidos se estimulan para que produzcan etileno, auxinas y citoquininas, los cuales promueven la formación de raíces adventicias (Hartmann y Kester, 2001; Salisbury y Ross, 1992; Wilson, 1994; Zacarías y Lafuente, 2000).

Davidson y Donnan (1977) lograron propagar in vitro bromeliaceas del género Cryptanthus utilizando medio MS conteniendo 1 mg/L de la auxina ácido naftalenacético (ANA). Así mismo, Droste et. al. (2005) demostraron que estas bromelias desarrollaron raíces en medio basal Murashige y Skoog (MS) al 50% de su concentración conteniendo 0.2 mg/L de ANA. Por otra parte, Huertas et al 1995, utilizo embriones inmaduros de Tillandsia spp., logrando propagar cultivares de éste modo. Otros estudios realizados con éxito en la propagación in vitro de especies de Tillandsia, fueron el de Mansilla (2007), quien uso el medio de cultivo MS al 50% y Orozco (2011), utilizando también medio de cultivo MS al 25% de su concentración original.

Distribución de las poblaciones de Tillandsia landbeckii Phil en Chile El conocimiento acerca de las especies de Tillandsia en Chile es limitado y fragmentado (Rauh, 1985b; Zizka y Muñoz-Schick, 1993). Los estudios acerca de las lomas de Tillandsia en Chile, revelan que éstas son raras en el país y se localizan principalmente al Oeste de Iquique (Rauh, 1985ª; Rundel et al., 1997), pero dichos estudios entre otros (Cereceda et al., 1999) han sido espacialmente restringidos.

T. landbeckii ha sido reportada en Chile desde la Región de Arica y Parinacota, hasta la Región de Coquimbo, específicamente Illapel (31°50’’S). No obstante, a pesar de que su distribución se ha reportado para 5 regiones, es fragmentada y restringida. Hacia el sur es cada vez más escasa su presencia y mayor el grado de vulnerabilidad de la especie, porque las poblaciones son más pequeñas, reportándose un retroceso de todas ellas a causa de la disminución de la humedad que ha ocurrido durante los últimos milenios, como efecto del cambio climático (Pinto, 2005).

Respecto a las comunidades de Tillandsia, su tamaño, ubicación y estado, solo se tienen reportes más completos de aquellas cercanas a Iquique, existiendo un gran desconocimiento de las poblaciones del límite sur y los intermedios.

Las interrogantes centrales que dieron origen a éste estudio fueron: ¿Cuál es la mejor forma de propagar ésta especie?, ¿Cómo se desarrolla la especie luego de la germinación? y ¿Cuál es su comportamiento frente al transplante de individuos adultos en terreno?. En base a estas preguntas de investigación surge el siguiente Objetivo general:

Generar conocimiento sobre la biología reproductiva, desarrollo y transplante de Tillandsia landbekii, con el fin de aportar a futuros programas de conservación in situ y ex situ de esta especie.

Para avanzar en el desarrollo de éste objetivo central, se plantean los siguientes objetivos específicos:

a) Evaluar el efecto de la temperatura y aplicación de ácido giberélico en el porcentaje y velocidad de germinación de las semillas de Tillandsia landbekii.

b) Determinar el efecto de diferentes concentraciones hormonales y época de recolección de hojas en el enraizamiento de brotes de Tillandsia landbekii mediante la macro y micro propagación.

c) Realizar un seguimiento de las plantas germinadas y propagadas vegetativamente, para conocer la velocidad de crecimiento, sus requerimientos y descubrir en qué momento del desarrollo pierde la raíz.

d) Evaluar el efecto de la protección y riego en la sobrevivencia de plantas adultas trasplantadas.

Parte importante del planteamiento del desarrollo de éste proyecto corresponde a investigación exploratoria y descriptiva, con un fin aplicado, que no requiere el planteamiento de hipótesis específicas (Hernández-Sampieri et al. 2006).

5. METODOLOGÍA En una primera etapa, a partir del año 2016 hasta mediados del 2018 se realizarán expediciones mensuales y semestrales a la Región de Atacama, específicamente los sectores donde crece la especie Tillandsia landbeckii. Se prospectará específicamente los sectores donde se desarrolla el proyecto “Línea de Transmisión de 500 kv Mejillones – Cardones”, identificando plantas adultas de la especie en estudio, a las cuales se les registrará fenología, y recolectaran vástagos (primavera, verano, otoño e invierno) y semillas. Los vástagos y frutos colectados serán almacenados en cajas refrigeradas a 15 °C y trasladadas al laboratorio del Banco Base de Semillas – INIA Intihuasi Vicuña (30°2’S- 70°41’O, 628 msnm, 60 km al este de la ciudad de La Serena) para ser utilizados en ensayos de germinación y propagación, así como para su procesamiento, limpieza y almacenamiento con fines de conservación.

OBJETIVO 1:

Germinación Las semillas de T. landbeckii presentan unos finos pelos blanquecinos unidos en un extremo, los que requieren de una minuciosa limpieza manual por su pequeño tamaño. Por ello, los frutos recolectados serán tamizados y presionados manualmente para eliminar impurezas y se finalizara con una limpieza utilizando una lupa estereoscópica. Una vez que las semillas estén limpias, se estimará el número total de semillas para cada muestra mediante el peso de 100 semillas, de acuerdo a la siguiente fórmula:

= 100 ∗ 100 Dónde S = Número total semillas, PT = Peso total semillas y P100 = Peso de 100 semillas.

Las semillas serán sembradas en cápsulas petri (10 cm de diámetro) en un medio de crecimiento con agar-agar e incubadas en cámaras de crecimiento Binder (KBWF-240), con un 80 % de humedad relativa.

Temperatura Para evaluar la influencia de la temperatura de incubación en la germinación de las semillas, se establecerá un ensayo considerando el factor temperatura como variable a estudiar. Se utilizaran cuatro tratamientos de temperatura (15, 20, 25 y 25/5 °C). En todos los casos se utilizara un fotoperíodo de 14 h luz/8h oscuridad, excepto en la temperatura alternante 25/5°C, que tendrá un fotoperiodo de 16h luz/8h oscuridad durante un periodo de 100 días. La unidad muestral estará constituida por una cápsula petri con 20 semillas distribuidas en 3 réplicas.

Adición de hormonas Adicionalmente, se instalara un ensayo para evaluar la influencia del ácido giberélico y temperatura en la germinación. El diseño experimental será completamente al azar, considerando un diseño factorial de tres temperaturas (15, 20 y 25/5 ºC) y dos tratamientos

(Sin ácido giberélico y 250 ppm de GA3 por 24 h). En todos los casos se utilizara un fotoperiodo de 12h luz/12h oscuridad, excepto en la temperatura alternante 25/5°C, que tendrá un fotoperiodo de 16h luz/8h oscuridad durante un periodo de 100 días.

Se considerará como semilla germinada a aquella que su radícula supere los 2 mm. Las condiciones de germinación dependerán de los ensayos a realizar.

La evaluación del número de semillas germinadas será efectuada diariamente los valores serán expresados en porcentaje de germinación y determinados mediante la expresión [1] y la velocidad de germinación se determinará en base a la expresión [2].

[1] %= ∗ 100 Dónde: G (%): Germinación (%), ni: es el número de semillas germinadas el i-esimo día,

Ni: es el número de semillas totales,

La velocidad de germinación fue determinada usando la relación de Maguire (1962).

ú [2] = ∑ í

Dónde: v: índice de velocidad de germinación (número de semillas germinadas día-1), ni: es el número de semillas germinadas el i-esimo día, ti: tiempo transcurrido en días desde la incubación, k: es el número de días que dura la evaluación.

Al final del período de estudio, las pruebas de germinación serán evaluadas mediante estadística descriptiva utilizando el software Infostat. Además se evaluará el porcentaje de germinación y velocidad de germinación, mediante un análisis de varianza (ANOVA) y test de Tukey para establecer diferencias significativas entre tratamientos, utilizando el software Infostat.

OBJETIVO 2:

Propagación vegetativa Macro propagación Se utilizaran hojas basales de plantas seleccionadas, las que serán desinfectadas mediante su inmersión en una solución con fungicida Captan en concentración de 10 g L–1 durante 15 minutos previo al tratamiento auxínico. El medio de enraizamiento a utilizar consistirá en una mezcla de turba con vermiculita en una proporción volumétrica de 1:1. Se utilizaran

35 cajas plásticas de 30 x 19 x 15 cm, a las cuales se les realizaran perforaciones basales para facilitar el drenaje de agua gravitacional post riego. Las cajas serán instaladas en una cámara de crecimiento Binder (KBWF-240) manteniendo una temperatura de 20ºC y fotoperiodo de 12 horas de luz intercalado con una temperatura de 18ºC y 12 horas de oscuridad y una humedad relativa del aire del 95 %. Las concentraciones de ácido indol butirico (AIB) utilizadas serán de 500, 1000, 3000, 5000 y 10000 mgL-1 más un tratamiento control sin hormona. Dichas concentraciones se lograran con la adición a 140 ml de alcohol etílico al 96% de 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 1,0 y 2,0 g de AIB respectivamente. Una vez preparada la solución, esta será mezclada en forma homogénea con 200 g de talco inerte que sirvirá como testigo (Mitchell y Livingston, 1973). Para evaluar la influencia de las concentraciones hormonales y la época de recolección en el enraizamiento se establecerá un diseño experimental factorial de bloques completos al azar con tres repeticiones, considerando seis concentraciones hormonales (500,1000, 3000, 5000 y 10000 ppm), además de un tratamiento control (sin hormona) y cuatro épocas de recolección de brotes (primavera verano, otoño e invierno). La unidad muestral estará constituida por 10 estacas.

Micro propagación El material vegetal se obtendrá de semillas obtenidas desde el lugar de estudio, las cuales serán sumergidas en agua durante 48 h. Posteriormente se realizara una asepsia superficial con una solución de etanol al 70% (v/v) durante 3 min y un enjuague en agua destilada estéril, seguido de un lavado en una solución de hipoclorito de sodio por 20 min. Luego se realizaran tres enjuagues sucesivos en agua destilada estéril (Uribe et al., 2012). Los embriones serán establecidos en medio MS (Murashige y Skoog 1962). Tras el establecimiento de cadenas proliferativas vía organogénesis directa, se seleccionarán microtallos provenientes del cultivo. Los microtallos serán establecidos en medio base MS durante un periodo de 30 días, con los macronutrientes diluidos a un 25%, en presencia de auxinas (ANA e IBA). El estudio (proliferación e inducción rizogénica) se realizara en una cámara de crecimiento controlado a una temperatura de 25 ± 2 °C, con una humedad relativa del 80%, fotoperiodo de 16 h luz y densidad de flujo fotónico de 30 μmol m-2 s-1. Para evaluar la influencia de las concentraciones hormonales (ANA e IBA) en el enraizamiento de los micro-tallos, longitud de raíces y número de raíces, se establecerá un

36 diseño experimental de un factor completo al azar con 10 repeticiones, considerando cuatro concentraciones hormonales de ANA (0,1, 0,5, 1 y 2 mg/L) y cuatro concentraciones de IBA (0,05, 0,1, 0,5 y 1,0 mg/L), además de un tratamiento control (sin hormona). La unidad experimental corresponderá a cuatro hojas dispuestos individualmente en recipientes de vidrio con 25 ml de medio de cultivo.

Al final del período de estudio, se evaluará el porcentaje de estacas enraizadas, longitud de raíces y número de raíces por medio de un análisis de varianza (ANOVA) y test de Tukey para establecer diferencias significativas, utilizando el software Infostat.

OBJETIVO 3:

Seguimiento de las plantas germinadas y propagadas vegetativamente Se realizará un seguimiento de las plantas germinadas, para conocer la velocidad de crecimiento y en qué momento del desarrollo pierde la raíz, proceso no descrito aún para T. landbeckii. Con éste propósito, se realizarán observaciones semanales en las que se medirá altura de planta, número de hojas y presencia de raíces.

Las plantas germinadas a partir de semillas y propagadas vegetativamente, serán trasplantadas a contenedores plásticos y llevadas a sombreadero, lugar se realizarán las mediciones y evaluación de su desarrollo.

OBJETIVO 4:

Transplante de plantas adultas Se realizara una prospección para identificar los individuos de T. landbeckii que potencialmente pueden ser afectados por el proyecto. Estos ejemplares serán georreferenciados y marcados en terreno, para ser considerados en el ensayo de trasplante de plantas adultas. Los individuos serán removidos desde el suelo mediante el uso de pala, provocando que los individuos de forma natural inicien un acondicionamiento. Las plantas serán extraídas cuidadosamente sin provocar daño, perdida de la estructura y depositadas en

37 sacos de arpilleras de 50x50 cm y trasladadas al sector de plantación. El lugar de plantación será de similar condiciones que el lugar de extracción de los individuos. La preparación del suelo considera una mezcla de suelo del lugar y materia orgánica en una proporción 70:30 (tierra local: tierra orgánica).

Para determinar el método de transplante, se evaluara la influencia de la instalación de la malla de protección solar y frecuencia de adición de humedad. Se establecerá un diseño experimental factorial que corresponderá a bloques completos al azar con tres repeticiones, considerando protección solar (con malla de protección solar y sin malla de protección solar), y cuatro frecuencias de adición de humedad (sin la adición de humedad, una, tres y cinco). La unidad muestral y número de tratamientos dependerá del número de individuos a ser trasplantados.

El área destinada para el ensayo será delimitada en su perímetro con un cerco simple compuesto por una malla de protección tipo ovejera, Ursus de 7 hebras, cubierta en su totalidad con una malla raschel oscura, para ser visualizada por las personas y la fauna nativa que habita y transita por dicha área. El riego será aplicado en la parte aérea en forma de nebulización, con un volumen de 1,2 litros por planta al año, iniciándose durante junio del 2017.

Para conocer la influencia de la instalación de la malla de protección solar y frecuencia de riego en la sobrevivencia de las plantas de T.landebeckii, se evaluara cada dos meses la sobrevivencia de las plantas por medio de un análisis de varianza (ANOVA) y test de Tukey para establecer diferencias significativas entre promedios, utilizando el software Infostat.

6. RESULTADOS ESPERADOS

Luego de efectuar cada uno de los puntos planteados en este estudio, se espera obtener: 1. Un protocolo de germinación para semillas de T. landbeckii, que permita su propagación sexual.

2. Información acerca de la propagación vegetativa. De aquí se obtendrán dos productos, si se obtienen resultados favorables: a) un protocolo de macro-propagación, generado a partir de hojas de T. landbeckii, y b) un protocolo de micro-propagación, generado a partir de material seminal o vegetativo.

3. Información acerca del desarrollo y crecimiento de T. landbeckii en plantas obtenidas desde semillas y macro y micropropagación. Además, se obtendrá información acerca de los requerimientos de la especie para su mantención en vivero.

4. Finalmente, se espera generar un protocolo de trasplante para T. landbeckii. Este protocolo incluirá información relevante para su remoción, transplante y cuidados post- transplante.

7. Carta Gantt

Año 2016 Año 2017 Año 2018 Año 2019 Actividad septiembre / diciembre enero/abril mayo/agosto septiembre/diciembre enero/abril mayo/agosto septiembre/diciembre enero/abril mayo/agosto

Ensayo preliminar de Instalación ensayo de Ensayos de germinación de semillas monitoreo monitoreo monitoreo monitoreo monitoreo evaluación Análisis de resultados temperatura hormona

Recolección de hojas de Recolección de hojas Recolección de hojas de Recolección de Ensayo de macro-propagación monitoreo monitoreo evaluación Análisis de resultados otoño de invierno primavera hojas de verano

Instalacion de ensayo Ensayo de micro-propagación monitoreo monitoreo monitoreo monitoreo evaluación Análisis de resultados de hormonas

Aplicación de los Rescate e instalación de Aplicación de los Aplicación de los Trasplante de planta adultas tratamientos de monitoreo monitoreo monitoreo evaluación Análisis de resultados ensayo de trasplante tratamientos de humedad tratamientos de humedad humedad

Informe I Informe II Informe III Informe Final Informes (Diciembre 2016) (diciembre 2017) (diciembre 2018) (agosto 2019)

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