UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto De Biologia
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Biologia SANDERSON TARCISO PEREIRA DE SOUSA INVESTIGAÇÃO DE GENES ENVOLVIDOS NA BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS A PARTIR DO METAGENOMA DE MANGUEZAL IMPACTADO COM PETRÓLEO INVESTIGATION OF GENES INVOLVED IN THE BIODEGRADATION OF AROMATIC HYDROCARBONS FROM THE OIL-IMPACTED MANGROVE METAGENOME Campinas 2018 SANDERSON TARCISO PEREIRA DE SOUSA INVESTIGAÇÃO DE GENES ENVOLVIDOS NA BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS A PARTIR DO METAGENOMA DE MANGUEZAL IMPACTADO COM PETRÓLEO INVESTIGATION OF GENES INVOLVED IN THE BIODEGRADATION OF AROMATIC HYDROCARBONS FROM THE OIL-IMPACTED MANGROVE METAGENOME Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Genética e Biologia Molecular na Área de Genética de Micro-organismos. Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas as partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology in the area of Genetics of Microorganisms. ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO SANDERSON TARCISO PEREIRA DE SOUSA E ORIENTADO PELA DRA. VALÉRIA MAIA MERZEL. Orientador (a): DRA. VALÉRIA MAIA MERZEL Campinas 2018 Campinas, 20/04/2018. COMISSÃO EXAMINADORA Prof.(a) Dr.(a). Valéria Maia Merzel (Presidente) Prof.(a). Dr.(a) Cynthia Canedo da Silva Prof.(a) Dr(a). Tiago Palladino Delforno Prof.(a) Dr(a). Fabiana Fantinatti Garboggini Prof.(a) Dr(a). Geizecler Tomazetto Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno. DEDICATÓRIA... Dedico essa tese a minha querida avó Antonina do Carmo Ribeiro, que hoje, infelizmente, já não está entre nós, mas tenho certeza que continua olhando e orando por mim de onde ela estiver. Dedico também a minha noiva Jussimara Teles e a todos os meus familiares que me apoiaram de todas as formas para a realização desse trabalho, pois, se não fosse por eles, acho que não conseguiria estar aqui. AGRADECIMENTOS... À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), em especial ao CPQBA, pela oportunidade e infraestrutura disponibilizada para execução deste trabalho; À orientadora Profa. Dra. Valéria Maia Merzel, pelo incentivo, confiança, aprendizado e amizade em todos os momentos do Doutorado; Aos membros da Banca, Profa. Dra. Cynthia Canêdo Da Silva, Dr. Tiago Palladino Delforno, Profa. Dra. Fabianna Fantinatti Garboggini e Profa. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte, pela disponibilidade e valiosas correções e sugestões realizadas nesta Tese; Aos professores, técnicos e demais funcionários de todas as divisões do CPQBA e CBMEG/UNICAMP pelos ensinamentos e amizade; A todos os amigos e colegas do Doutorado pela amizade, conversas e colaboração nos trabalhos; À secretaria da pós-graduação em genética e biologia molecular pelas instruções, paciência e colaboração; À minha noiva JUSSIMARA TELES PEREIRA, pelo amor e paciência; À toda minha família, em especial a ANTONINA DO CARMO†, ABEL MARTINS, DALVA DE SOUSA, JUSSIARA SILVA, LUÍZ LÁZARO, MARCO AURÉLIO E GIOVANI RIBEIRO, por tudo; À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da bolsa de estudo e apoio financeiro ao projeto “Investigação de genes envolvidos na biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos a partir do metagenoma de mangue impactado com petróleo”. Processo nº 2013/22555-4. Resumo O manguezal é um dos biomas mais importantes para a manutenção da vida nos mares e o equilíbrio da biosfera. O sedimento do mangue é uma grande fonte de novos recursos genéticos para pesquisa. Estes ambientes têm sofrido impacto antropogênico por muito tempo, principalmente a poluição causada por derramamento de petróleo. Diversos estudos estão sendo conduzidos para explorar o potencial genético destas comunidades com a finalidade de desenvolver novos processos biotecnológicos para o tratamento de ambientes contaminados. Dentro deste contexto, este trabalho visou identificar e caracterizar genes que codificam dioxigenases, proteínas envolvidas na degradação de hidrocarbonetos aromáticos, a partir de clones fosmidiais de uma biblioteca metagenômica construída de sedimento de mangue impactado por petróleo do município de Bertioga-SP. A coleta e processamento das amostras ambientais, juntamente com a construção da biblioteca metagenômica fosmidial, foi realizada previamente no âmbito do projeto FAPESP “Prospecção de metagenoma microbiano de sedimentos de manguezais na busca por novos compostos bioativos” (Processo no. 2011/50809-5). O DNA metagenômico das amostras de sedimento, coletadas em triplicata, foi extraído e usado em reações de PCR para a construção de bibliotecas dos genes de dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos (ARHDs) e análise de seus padrões de distribuição biogeográfico. O DNA total da biblioteca fosmidial foi isolado e sequenciado em plataforma Illumina para prospecção in silico de genes envolvidos no metabolismo de compostos aromáticos. Ainda, os clones fosmidiais foram submetidos a uma triagem preliminar por colorimetria, baseada no uso do composto MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2 H- tetrazolium bromide] (Merck) e, posteriormente, ensaios de degradação de hidrocarbonetos por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) para confirmar e quantificar a atividade de degradação de hidrocarbonetos aromáticos (fenol, naftaleno, fenantreno, pireno e benzopireno) dos clones. O DNA fosmidial dos clones com melhor potencial de degradação foi sequenciado e processado para montagem de grandes fragmentos metagenômicos. Caracterização estrutural e funcional dos insertos metagenômicos foram feitos nas plataformas RAST e IMG, para elucidação de clusters gênicos envolvidos na degradação de hidrocarbonetos aromáticos. Alvos gênicos foram isolados, ligados em vetor de expressão pET28a(+) e transformados em cepas de E. coli BL21(DE3) e Rosetta. A análise da diversidade dos genes α-ARHD revelou que Pseudomonas, Streptomyces, Variovorax, Bordetella e Rhodococcus foram os cinco gêneros mais abundantes entre os 15 sítios analisados. A análise de distribuição biogeográfica revelou forte endemismo de algumas Operational Protein Families (OPF) de α-ARHD em cada região geográfica e uma considerável proximidade evolutiva entre OPFs encontradas em sítios da Antártica e da América do Sul. O sequenciamento da biblioteca fosmidial permitiu identificar um total de 71.729 sequências metagenômicas parciais na categoria SEED para metabolismo de compostos aromáticos (1% do total). Estas foram classificadas nas subcategorias Anaerobic degradation of aromatic compounds (20,34%), Metabolism of central aromatic intermediates (35,40%), e Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds (22,56%). Além disso, foi evidenciado o predomínio das dioxigenases de Catecol, Protocatecuato e Homogentisato, envolvidas no metabolismo central, e das dioxigenases de Fenilpropionato, Lignostilbeno, Bifenil e Benzoato envolvidas nas vias periféricas de degradação de aromáticos. As análises de bioinformática dos dados de sequenciamento dos clones fosmidiais potencialmente degradadores revelaram uma interessante diversidade de genes envolvidos direta e indiretamente no metabolismo de compostos aromáticos. Os ensaios de cromatografia mostraram a eficiência de 3 clones na degradação de fenol (98%), pireno (75%) e naftaleno (71%). Os clones contendo os genes alvos para dioxigenases apresentaram sinais positivos nos testes de expressão. Os resultados deste trabalho permitiram elucidar a riqueza, distribuição e relação genética entre os genes ARHD de diferentes sítios ao redor do mundo. Além disso, a avaliação da biblioteca metagenômica pelas diferentes técnicas empregadas, revelou seu extenso potencial genético para o metabolismo de compostos aromáticos. Abstract Mangrove is one of the most important biomes for the maintenance of life in the seas and the balance of the biosphere. Mangrove sediment is a major source of new genetic resources for research. These environments have long been suffering anthropogenic impacts, especially pollution caused by oil spills. Many microbial species are able to degrade petroleum compounds, and several studies are being conducted to explore the genetic potential of these communities with the purpose of developing new biotechnological processes for the treatment of contaminated environments. In this context, this work aimed to identify and characterize genes encoding dioxygenases, proteins involved in the degradation of aromatic hydrocarbons, from fosmid clones of a metagenomic library constructed from oil-impacted mangrove sediments located in the city of Bertioga-SP. Sampling and further processing of environmental samples, together with the metagenomic fosmid library construction, were performed previously under the project “Bioprospecting microbial metagenome from mangrove sediments in the search for novel bioactive compounds” (FAPESP Process no. 2011/50809-5). Metagenomic DNA from sediment samples, collected in triplicate, was extracted and used in PCR reactions for the assembly of Aromatic Ring-Hydroxylating Dioxygenases (ARHDs) gene library and analysis of their biogeographic distribution patterns. Total fosmid DNA was isolated and sequenced on the Illumina platform for in silico prospecting of genes involved in the metabolism of aromatic compounds. Further, fosmid clones were subjected to a preliminary colorimetric screening, based on the use