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Characterization of Novel Granulovirus Strains from Costa Rica Against Phthorimaea Operculella and Tecia Solanivora

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Characterization of Novel Granulovirus Strains from Costa Rica Against Phthorimaea Operculella and Tecia Solanivora TESIS DOCTORAL Characterization of novel granulovirus strains from Costa Rica against Phthorimaea operculella and Tecia solanivora YANNERY GÓMEZ-BONILLA Pamplona, 2011 Memoria presentada por YANNERY GÓMEZ-BONILLA Para optar el grado de Doctora por la Universidad Pública de Navarra Characterization of novel granulovirus strains from Costa Rica against Phthorimaea operculella and Tecia solanivora Directores: Dra. Delia Muñoz Profesora Titular de Universidad Departamento de Producción Agraria Universidad Pública de Navarra España Dr. Miguel López-Ferber Directeur du centre LGEI École des Mines d´Alès Francia Universidad Pública de Navarra E. T. S. Ingenieros Agrónomos Pamplona, 2011 Miembros del Tribunal Presidente Dr. Pedro del Estal Padillo Dpto. Producción Vegetal: Botánica y Protección Vegetal Universidad Politécnica de Madrid Secretario Dr. Rosa Murillo Pérez Dpto. Producción Agraria Universidad Pública de Navarra Vocal Dr. Enrique Vargas Osuna Dpto. Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales Universidad de Córdoba Suplentes Dr. Oihane Simón de Goñi Instituto de Agrobiotecnología Centro Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Pública de Navarra Dr. Elisa Viñuela Sandoval Dpto. Producción Vegetal: Botánica y Protección Vegetal Universidad Politécnica de Madrid D. Mª DELIA MUÑOZ LABIANO, Profesora Titular del área de Producción Vegetal del Departamento de Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra, en España, y Dr. MIGUEL LÓPEZ-FERBER, Professeur des Ecoles des Mines, Directeur du centre LGEI, École des Mines d´Alès, Francia, INFORMAN: que la presente memoria de Tesis Doctoral titulada “Characterization of novel granulovirus strains from Costa Rica against Phthorimaea operculella and Tecia solanivora” elaborada por DÑA. YANNERY GÓMEZ BONILLA ha sido realizada bajo nuestra dirección y que cumple las condiciones exigidas por la legislación vigente para optar al grado de Doctor. Y para que así conste, firman la presente en Pamplona a 30 de junio de 2011. Fdo. Dra. Mª Delia Muñoz Labiano Fdo. Dr. Miguel López-Ferber Colaboradores Dr. Primitivo Caballero Universidad Pública de Navarra, Pamplona, Spain Dr. Xabier Léry Universtité Paris Sud, Orsay, Francia Dr. Trevor Williams Instituto de Ecología AC (INECOL), Xalapa, México AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer el apoyo que he recibido de todas aquellas instituciones que me ayudaron a la realización de la tesis doctoral. Al Departamento de Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra y al Centre de Pharmacologie et Biotetechnologie pour la Santé d` Centre Nacional de la Recherche Scientifique (CNRS), St Chrystol Les Ales, Francia. Mi más sincero agradecimiento al INTA por haberme dado la oportunidad de poder realizar este doctorado que fue de mucho enriquecimiento científico. Al personal de la Estación Carlos Durán por su colaboración en este trabajo y compañeros del Laboratorio de Fitoprotección por su gran apoyo moral. INIA-España quienes dieron el dinero para que pudiera realizar los estudios. MICIT-CONICIT, por toda la ayuda económica complementaria, porque sin esta no hubiera sido posible terminar los estudios. A mi directora de Tesis Delia Muñoz por su gran ayuda en la corrección escrita de esta tesis, por su amistad, siempre me dio mucho animo y esperanza, gracias Delia. Al Dr. Primitivo Caballero, por darme la oportunidad de entrar a su grupo de investigación en el mundo de los Baculovirus. Al Dr. Xavier Léry, por toda su enseñanza, paciencia y sobre todo el auxilio prestado en el desarrollo de las investigaciones. A los amigos y compañeros de la Universidad Pública de Navarra (Sonia, Emi, Amaia, Gabriel, Mariangeles, Iñigo, Sarhay, Rosa, Oihane, Rodrigo, Laura, Carlos, Pili, Noelia, Oihana, Maite, Alex por su apoyo y lo más valioso su amistad. Y a todas aquellas personas que tuve la dicha de conocer, no solo en Pamplona, sino también en St Chrystol Les Ales, Francia, ha sido la experiencia más enriquecedora de toda mi vida, porque en un poco tiempo conocí gente de muchos países de Europa y Latinoamérica que me brindaron cariño, amistad y ayuda. A todo mi familia y en particular a mis hermanos por su apoyo incondicional, porque siempre me dieron la fuerza y su admiración para seguir adelante a pesar de todas la dificultades. Dedico esta tesis a mis hijas Diana, Cathy, Silvia y mi nieto Aidan que me dan la alegría de todos los días, su energía positiva, su admiración y su gran amor. A mi querida madre Vilma, quien siempre me tiene en su corazón, en sus oraciones, quien me brinda todo su amor, comprensión, amistad y ayuda, si no hubiera sido por ella, no gozara de todos los éxitos que he tenido. Un largo camino he recorrido para terminar este trabajo, tuve en este largo caminar muchos altibajos, momentos críticos y difíciles, momentos de mucha soledad, sobre todo cuando estuve trabajando a lo que yo llame el “monasterio” en Francia, pero al mismo tiempo esto te ayuda a valorar, lo importante de la familia y las amistades. Entre como investigadora en un nuevo mundo con los Baculovirus y la biología molecular, y entre más avanzaba más ignorante me sentía. Termino tomando las palabras de un gran científico e investigador Dr. Louis Pasteur que dijo “UN POCO DE CIENCIA NOS APARTA DE DIOS. MUCHA, NOS APROXIMA”. MUCHAS GRACIAS A TODOS Y TODAS Y QUE ESTEN SIEMPRE PURA VIDA TABLE OF CONTENTS RESUMEN ........................................................................................................................3 SUMMARY ........................................................................................................................5 CHAPTER I. Introduction.........................................................................................................7 CHAPTER II. Characterization of a Costa Rican granulovirus strain highly pathogenic against its indigenous hosts, Phthorimaea operculella and Tecia solanivora ............47 CHAPTER III. Potato crops in Costa Rica are efficiently protected from Phthorimaea operculella and Tecia solanivora by an indigenous granulovirus strain ........63 CHAPTER IV. Stored potatoes in Costa Rica are efficiently protected from Phthorimaea operculella and Tecia solanivora with an indigenous granulovirus strain......69 CHAPTER V. Costa Rican soils contain highly insecticidal granulovirus strains against Phthorimaea operculella and Tecia solanivora .............................................75 CHAPTER VI. Resultados y Discusión General ....................................................................89 LIST OF PUBLICATIONS ......................................................................................................99 RESUMEN En la búsqueda de alternativas a los insecticidas químicos utilizados contra el complejo de especies de la polilla de la papa, formado por los lepidópteros Phthorimaea operculella y Tecia solanivora , destaca un granulovirus (GV) con prometedoras propiedades como agente de control. El virus, originalmente aislado de larvas de P. operculella y designado por ello granulovirus de P. operculella (PhopGV), es capaz de infectar también a T. solanivora . Se han aislado cepas de PhopGV en la mayoría de los países donde se encuentra P. operculella . Ensayos de laboratorio y campo han demostrado la eficacia de algunos de estos aislados geográficos como biopesticidas de P. operculella, aunque su actividad bioinsecticida es menor para T. solanivora . Hasta hace poco, todas las cepas de PhopGV se habían obtenido de larvas de P. operculella . Sin embargo, varias cepas colombianas de PhopGV aisladas recientemente de T. solanivora muestran mejores propiedades insecticidas contra este hospedador. A pesar de que son varias las formulaciones de PhopGV que ya han demostrado su eficacia en la protección de los tubérculos de patata en condiciones de almacén y en infestaciones de campo en Asia, Norteamérica y Sudamérica, todavía no ha sido posible realizar ensayos en Centroamérica por falta de aislados autóctonos. El primer objetivo de esta tesis fue por tanto recolectar cepas autóctonas de PhopGV de Costa Rica, donde las dos especies de polilla de la papa constituyen las principales plagas en campo y almacén. En un primer intento se aisló un granulovirus de larvas enfermas de P. operculella recogidas en Alvarado (Cartago, Costa Rica). El análisis molecular lo identificó como una nueva cepa de PhopGV, que recibió el nombre de PhopGV-CR1, y reveló su heterogénea composición genotípica. Biológicamente, esta cepa demostró una alta patogenicidad no sólo para una colonia costarricense de P. operculella sino también para una colonia criada en Francia. Sin embargo, la patogenicidad de PhopGV-CR1 contra T. solanivora fue cuatro veces menor. En un intento por mejorar la patogenicidad de PhopGV-CR1 contra su hospedador alternativo, se realizó un pase seriado del virus en tres generaciones de T. solanivora , incrementándose por cinco su patogenicidad. Este resultado indicó que la adaptación de esta cepa a su hospedador alternativo está en marcha. El elevado potencial insecticida demostrado por PhopGV-CR1 en condiciones de laboratorio justificó el siguiente objetivo de la tesis: la evaluación de la eficiencia de control en campo y almacén. En campo, el virus redujo el daño entre 50 y 80% comparado con los testigos sin tratamiento en los ensayos de invierno y verano. Además, esta reducción no fue 3 Resumen significativamente diferente de la producida por un insecticida químico o por una combinación del virus con un insecticida químico. En almacén, el virus redujo el daño en más de un 70% comparado con
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