Aus dem Institut für Virologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Interspezies-Übertragung fledertierassoziierter RNS-Viren

HABILITATIONSSCHRIFT

Zur Erlangung der Venia legendi An der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Nadine Krüger, PhD

Hannover 2019

Tag der nichtöffentlichen wissenschaftlichen Aussprache: 12.07.2019

Die Anfertigung dieser Arbeit wurde durch Sachbeihilfen der Deutschen Forschungsgemeinschaft (KR 4762/2-1, HE 1168/16-1) gefördert.

Inhaltsverzeichnis

Liste der verwendeten Publikationen I Abkürzungsverzeichnis III 1.1. Fledertiere als Reservoir zoonotischer Viren ...... - 1 - 1.2. Paramyxoviren ...... - 3 - 1.2.1. Henipaviren - 3 - 1.2.2. Mumpsviren - 5 - 1.3. Orthomyxoviren ...... - 7 - 1.3.1. Fledertierassoziierte Influenzaviren - 7 - 1.4. Filoviren ...... - 9 - 1.4.1. Ebolaviren - 9 - 1.5. Interspezies-Übertragung und die Speziesbarriere ...... - 12 - 1.6. Der virale Replikationszyklus und seine Barrieren während der Interspezies- Übertragung ...... - 17 - 1.6.1. Der Eintrittsprozess - Rezeptorbindung und Fusion - 18 - 1.6.2. Replikation und Proteinsynthese - 23 - 1.6.3. Antiviral wirksame Wirtsfaktoren - 26 - 2. Konzept und Ziele der Arbeit - 31 - 3. Ergebnisse - 33 - 3.1. Spezies-abhängige Fusionsaktivität der KuV Hüllproteine ...... - 33 - 3.2. Identifizierung zellulärer Faktoren für den Eintrittsprozess fledertierassoziierter Influenzaviren ...... - 35 - 3.3. Spezies-übergreifende Replikation, immunmodulatorische Eigenschaften und Neurovirulenz des fledertierassoziierten MuV ...... - 37 - 3.4. Expression und antivirale Wirkung von Flughund-Tetherin ...... - 43 - 4. Übergreifende Diskussion - 45 - 4.1. Molekular-virologische Methoden zur Untersuchung neuer Viren ...... - 45 - 4.2. Zelluläre Barrieren als Restriktionsfaktoren ...... - 48 - 4.3. Neuartige Viren und das Risiko zoonotischer Infektionen ...... - 52 - 5. Zusammenfassung - 54 - 6. Summary - 56 - 7. Literaturverzeichnis - 58 - 8. Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Publikationen - 83 - 9. Publikationen - 85 -

I Publikationen

LISTE DER VERWENDETEN PUBLIKATIONEN

Die Publikationen sind in chronologischer Reihenfolge nach dem Datum ihrer Veröffentlichung aufgelistet. Die Erklärung über den eigenen Anteil an den jeweiligen Publikationen ist in Kapitel 8 angegeben.

Publikation 1: Krüger N, Hoffmann M, Drexler JF, Müller MA, Corman VM, Drosten C, Herrler G (2014). Attachment protein G of an African bat henipavirus is differentially restricted in chiropteran and nonchiropteran cells. J Virol. 2014 Oct;88(20):11973-80. doi: 10.1128/JVI.01561-14. http://jvi.asm.org/content/88/20/11973.long

Publikation 2: Krüger N, Hoffmann M, Drexler JF, Müller MA, Corman VM, Sauder C, Rubin S, He B, Örvell C, Drosten C, Herrler G (2015). Functional properties and genetic relatedness of the fusion and hemagglutinin-neuraminidase proteins of a mumps virus-like bat virus. J Virol. 2015 Apr;89(8):4539-48. doi: 10.1128/JVI.03693-14. http://jvi.asm.org/content/89/8/4539.long

Publikation 3: Hoffmann M, Krüger N, Zmora P, Wrensch F, Herrler G, Pöhlmann S (2016). The hemagglutinin of bat-associated influenza viruses is activated by TMPRSS2 for pH-dependent entry into bat but not human cells. PLoS One 2016 Mar 30;11(3):e0152134. doi: 10.1371/journal.pone.0152134. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4814062/

Publikation 4: Krüger N, Sauder C, Hoffmann M, Örvell C, Drexler JF, Rubin S, Herrler G (2016). Recombinant mumps viruses expressing the batMuV fusion glycoprotein are highly fusion active and neurovirulent. J Gen Virol 2016 Nov; 97(11):2837-2848. doi: 10.1099/jgv.0.000596. http://jgv.microbiologyresearch.org/content/journal/jgv/10.1099/jgv.0.000596#tab2

Publikationen II

Publikation 5: Krüger N, Sauder C, Hüttl S, Papies JP, Voigt K, Herrler G, Hardes K, Steinmetzer T, Örvell C, Drexler JF, Drosten C, Rubin S, Müller MA, Hoffmann M (2018). Entry, replication, immune evasion and neurotoxicity of synthetically-engineered bat-borne mumps virus. Cell Rep. 2018 Oct 9;25(2):312-320.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2018.09.018. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.09.018

Publikation 6: Hoffmann M, Nehlmeier I, Brinkmann C, Krähling V, Behner L, Moldenhauer AS, Krüger N, Nehls J, Schindler M, Maisner A, Becker S, Pöhlmann S (2018). Tetherin inhibits replication of Ebola virus and Nipah virus in fruit bat cells. J Virol. 2018 93:e01821-18. doi: 10.1128/JVI.01821-18. https://doi.org/10.1128/JVI.01821-18.

III Abkürzungen

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

ACE2 Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 (angiotensin converting enzyme) batMuV Fledertierassoziiertes Mumpsvirus (BatPV/Epo_spe/AR1/DCR/2009) BDBV Bundibugyo-Virus BOMV Bombali-Virus BST2 Bone marrow stromal antigen 2 (= Tetherin) CDC Centers for Disease Control and Prevention CedV Cedar-Virus CPE Zytopathischer Effekt (cytopathic effect) CpKd Carollia perspicillata Nierenzellen EBOV Ebola-Virus EidLu Eidolon helvum Lungenzellen EidNi Eidolon helvum Nierenzellen EpoNi Epomops buettikoferi Nierenzellen ER Endoplasmatisches Retikulum F Fusionsprotein FLUAV Influenza A Virus G Glykoprotein (Paramyxoviren) GFP Grün fluoreszierendes Protein GP Glykoprotein (Ebolaviren) H/ HA Hämagglutinin HeV Hendra-Virus HIV Humanes Immundefizienz-Virus HL HA-ähnlich (HA-like) hMuV Humanes Mumpsvirus HN Hämagglutinin-Neuraminidase HPAI Hoch pathogene (highly pathogenic) aviäre Influenzaviren HypLu Hypsignathus monstrosus Lungenzellen HypNi Hypsignathus monstrosus Nierenzellen IFN Interferon IRF-3 IFN-regulierender Faktor 3

Abkürzungen IV

ISG(s) IFN-stimuliertes Gen/ -stimulierte Gene KuV Kumasi-Virus (Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009) L Large protein, RNS-abhängige RNS Polymerase LPAI Niedrig pathogene (low-pathogenic) aviäre Influenzaviren M Matrixprotein mRNS Boten-RNS (messenger RNA) MuV Mumpsvirus N Nukleoprotein N/ NA Neuraminidase NF-κB Nuklearfaktor kappa in B-Zellen NHP Nicht-humane Primaten NiV Nipah-Virus NL NA-ähnlich (NA-like) P Phosphoprotein PAMPs Pathogen-assoziierte molekulare Muster PCR Polymerase-Kettenreaktion PipNi Pipistrellus spec. Nierenzellen RdRp RNS-abhängige RNS-Polymerase (RNA-dependent RNA polymerase) RESTV Reston-Virus RNP Ribonukleoprotein RNS Ribonukleinsäure RoNi Rousettus aegyptiacus Nierenzellen RT-PCR Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion SARS Schwer akutes Atemwegssyndrom (severe acute respiratory syndrome) SARS-CoV SARS-assoziiertes Coronavirus SARSr-CoV SARS-ähnliches CoV (SARS-related CoV) SeV Sendai-Virus SH Kleines hydrophobes Protein (small hydrophobic protein) siRNS Small interfering RNS STAT Signaltransduktor und Aktivator der Transkription SUDV Sudan-Virus

V Abkürzungen

TAFV Tai Forest-Virus TLR Toll-ähnlicher Rezeptor (toll-like receptor) TNF-α Tumornekrosefaktor alpha TSSPs Typ II Transmembran-Serinproteasen VLPs Virus-ähnliche Partikel (virus-like particles) VP40 Virusprotein 40 VSV Virus der Stomatitis vesicularis (vesicular stomatitis virus) VSVpp VSV-basierte Pseudotypen WHO World Health Organization ZNS Zentralnervensystem

- 1 - Einleitung

1. EINLEITUNG 1.1. Fledertiere als Reservoir zoonotischer Viren Fledertiere werden innerhalb der Klasse der Säugetiere (Mammalia) der Ordnung Chiroptera zugeordnet. Ursprünglich wurden die insgesamt über 1200 verschiedenen Fledertierarten aufgrund morphologischer Ähnlichkeiten und ihren Lebensweisen in die zwei Unterordnungen Megachiroptera (Flughunde) und Microchiroptera (Fledermäuse) unterteilt. Basierend auf tiefergreifenden phylogenetischen Analysen, die Informationen über die evolutionäre Verwandtschaft verschiedener Fledertierarten lieferten, wird mittlerweile eine Unterteilung in die zwei Unterordnungen Yangochiroptera und Yinpterochroptera vorgeschlagen (Teeling et al., 2005, Hutcheon 2006, Lei and Dong 2016). Zu den Yinpterochiroptera, häufig auch als Pteropodiformes bezeichnet, werden demnach alle Flughunde (Familie Pteropodidae), sowie fünf Familien der Fledermäuse (Craseonycteridae, Hipposideridae, Rhinopomatidae, Rhinolophidae, Megadermatidae) gezählt. Die Unterordnung Yangochiroptera oder Vespertilioniformes umfasst alle Fledermäuse, die nicht den Yinpterochiroptera zugeordnet sind.

Bedingt durch ihre große Anzahl hoch diverser Arten, ein nahezu weltweites Vorkommen, eine vergleichsweise lange Lebensspanne und die Befähigung zum aktiven Fliegen, stellen Fledertiere ein ideales Reservoir für diverse pathogene Erreger dar. Bisher wurden bereits mehr als 60 verschiedene Virusspezies in Fledertieren detektiert (Calisher et al., 2006, Hayman 2016). Für einige dieser Viren konnte bereits nachgewiesen werden, dass sie ein zoonotisches Potential besitzen. Als der bekannteste fledertierassoziierte Zoonoseerreger ist das Tollwutvirus zu nennen. Tollwutviren (Genus Lyssavirus) wurden in einer Vielzahl verschiedener Fledertierarten, hauptsächlich in hämatophagen Arten, nachgewiesen und führen nach einer Übertragung durch Bisse von infizierten Tieren zu einer in der Regel letal verlaufenden Erkrankung, die sich durch neurologische Symptome wie Lähmungen und Krämpfe manifestiert (Carneiro 1954, Malaga Alba 1954, Sulkin and Greve 1954, Lennette et al., 1960).

Der Begriff Zoonose bezeichnet Erkrankungen, die zwischen Tieren und Menschen übertragen werden können (Palmer et al., 2011). Während der Reservoirwirt in der Regel keine klinischen Symptome zeigt, kann die Übertragung auf andere Wirte in diesen zu schweren, teilweise

Einleitung - 2 - sogar letal verlaufenden Infektionen führen (Taylor et al., 2001, Woolhouse and Gowtage- Sequeria 2005). Neben Bakterien stellen Viren den Großteil zoonotischer Erreger dar, gefolgt von Protozoen, Pilzen und Helminthen (Jones et al., 2008). Bei der Mehrheit (94 %) der zoonotischen Viren handelt es sich um RNS-Viren, wahrscheinlich bedingt durch ihre hohe Mutationsrate und der daraus resultierenden Variabilität (Drake and Holland 1999, Woolhouse 2002, Denison et al., 2011).

In den letzten Jahren wurden zahlreiche neuartige RNS-Viren in Fledertieren detektiert. Unter diesen neuartigen Viren befinden sich unter anderem diverse Paramyxoviren (Drexler et al., 2009, Lau et al., 2010, Baker et al., 2012, Drexler et al., 2012, Kurth et al., 2012, Wilkinson et al., 2012, Baker et al., 2013), Coronaviren (Lau et al., 2005, Li et al., 2005b, Drexler et al., 2010, Ge et al., 2013, Yang et al., 2015), sowie zwei Orthomyxoviren, welche eine phylogenetische Ähnlichkeit zu Influenza A Viren aufweisen (Tong et al., 2012, Tong et al., 2013). Für einen Großteil dieser Viren gelang es bislang jedoch nicht, infektiöses Virus zu isolieren, oder die Isolierung wurde erst gar nicht versucht. Daher beschränken sich die verfügbaren Informationen hauptsächlich auf die genetischen Informationen des viralen Genoms, wobei hier auch häufig nur Fragmente einzelner Genabschnitte sequenziert und zur Analyse herangezogen wurden. Durch das Fehlen eines infektiösen Isolats und/oder der vollständigen RNS-Sequenz wird es erschwert, verlässliche Aussagen über das zoonotische Potential oder die Virulenz dieser neuartigen Viren zu treffen.

- 3 - Einleitung

1.2. Paramyxoviren Paramyxoviren gehören zur Ordnung Mononegavirales und werden innerhalb der Familie Paramyxoviridae in sieben Genera unterteilt: Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Morbillivirus, Respirovirus und Rubulavirus. Innerhalb der Paramyxoviren gibt es eine große Bandbreite hochdiverser Viren, welche sich sowohl in ihrem Wirts- und Organtropismus als auch in ihrer Virulenz unterscheiden. Während einige Viren wie das Fer-de-Lance-Virus (Clark et al., 1979) und das Lachs-Aquaparamyxovirus (Mitchell and Rodger 2011) ein strikt begrenztes Wirtsspektrum besitzen und ausschließlich Reptilien bzw. Fische infizieren, weisen andere Viren wie das Nipah-Virus eine beachtliche Bandbreite an Wirtsspezies, inklusive des Menschen, auf. Klinische Symptomatik und Schweregrad von Paramyxovirusinfektionen variieren in Abhängigkeit der Virusspezies und umfassen sowohl milde respiratorische Erkrankungen als auch systemische Infektionen und schwerwiegende bis letal verlaufende Infektionen des Zentralnervensystems (ZNS).

1.2.1. Henipaviren Das Genus Henipavirus umfasst bislang fünf Virusspezies, von denen vier ihr Reservoir in Flughunden der Familie Pteropodidae haben: Hendra- (HeV), Nipah- (NiV), Cedar- (CedV) und Kumasi-Virus (KuV).

HeV und NiV sind die zuerst entdeckten und am besten untersuchten Vertreter dieses Genus. Beide Viren haben gemeinsam, dass sie ihr Reservoir in Flughunden der Gattung Pteropus haben (Field et al., 2001, Yob et al., 2001, Field et al., 2007), nachweislich auf den Menschen übertragen werden und zu schweren, teilweise letal verlaufenden Pneumonien und Enzephalitiden führen können (O'Sullivan et al., 1997, Paterson et al., 1998, Chua et al., 1999). HeV führte erstmals im Jahr 1994 zu einem Ausbruch in Queensland in Australien (Murray et al., 1995a, Murray et al., 1995b, Selvey et al., 1995, Playford et al., 2010). Das Virus wurde von Pferden, welche sich wahrscheinlich über den Kontakt mit virushaltigem Urin von Flughunden infiziert hatten, auf den Menschen übertragen; direkte Übertragungen von Flughunden auf den Menschen sowie Mensch-zu-Mensch-Übertragungen sind für HeV bisher nicht bekannt (O'Sullivan et al., 1997, Hanna et al., 2006, Playford et al., 2010). Insgesamt wurden 94 Fälle in Pferden und sieben HeV-Infektionen in Menschen nachgewiesen (Field 2016). Der erste NiV-Ausbruch wurde im Jahr 1999 in Malaysia beobachtet (Chua et al., 1999). Während dieses

Einleitung - 4 -

Ausbruchs wurde NiV von infizierten Schweinen auf den Menschen übertragen (Chua et al., 2000, Epstein et al., 2006). In den folgenden Jahren kam es immer wieder zu NiV-Ausbrüchen in Bangladesch und der Siliguri Provinz Indiens. Im Gegensatz zu dem Ausbruch in Malaysia wurde hier das Virus ohne Zwischenwirt auf den Menschen übertragen und es kam zu nachfolgenden Mensch-zu-Mensch-Übertragungen. Zudem verliefen die Erkrankungen häufig schwerwiegender als beim Ausbruch in Malaysia (Chadha et al., 2006, Gurley et al., 2007, Luby et al., 2009a, Luby et al., 2009b). Durch Sequenzanalysen konnte gezeigt werden, dass zwei verschiedene NiV Genotypen existieren und für die unterschiedlichen Ausbrüche verantwortlich waren: NiV-M in Malaysia sowie NiV-B in Bangladesch und Indien (Harcourt et al., 2005, Wild 2009). Unterschiede in den Aminosäuresequenzen der beiden Genotypen können die verschiedenen Übertragungswege und die Virulenz dieser Viren erklären. Neben Schweinen und den Menschen sind eine Anzahl weiterer Säugetierspezies für NiV-Infektionen empfänglich und es wurden bereits natürliche Infektionen in Pferden, Hunden, Katzen und Wiederkäuern beobachtet (Hooper and Williamson 2000, Field et al., 2001, Mills et al., 2009).

Einige Jahre später wurde das CedV, als dritter Vertreter der Henipaviren, aus gepoolten Urinproben von australischen Flughunden der Spezies Pteropus alecto isoliert (Marsh et al., 2012). Obwohl CedV sowohl genetisch als auch funktionell dem HeV und NiV stark ähnelt, scheint dieses Henipavirus kein oder kaum pathogenes Potential zu besitzen. So wurden zum einen bisher noch keine Henipavirusausbrüche mit CedV assoziiert und es konnte zudem in Tierversuchen gezeigt werden, dass Frettchen und Meerschweinchen, welche hoch empfänglich gegenüber NiV- und HeV-Infektionen sind, keine klinischen Symptome nach einer experimentellen CedV-Infektion entwickeln (Marsh et al., 2012). Die fehlende Pathogenität von CedV wurde später dadurch erklärt, dass dieses Virus im Gegensatz zu HeV und NiV aufgrund der fehlenden Expression antagonisierender Proteine die Aktivierung des Interferonsystems in infizierten Zellen nicht effektiv hemmen kann (Lieu et al., 2015).

Bisher wurde angenommen, dass sich das Vorkommen von Henipaviren auf Australien und Südost-Asien beschränkt. In serologischen Feldstudien konnte allerdings gezeigt werden, dass afrikanische Flughunde der Gattungen Pteropus und Eidolon kreuzneutralisierende Antikörper gegen NiV und HeV besitzen (Olson et al., 2002, Iehle et al., 2007, Drexler et al., 2009, Hayman et al., 2011, Drexler et al., 2012). Ebenfalls wurden virale RNS von bisher unbekannten Viren,

- 5 - Einleitung die eine phylogenetische Verwandtschaft zu den bekannten Henipaviren aufweisen, in afrikanischen Flughunden detektiert (Drexler et al., 2009, Muleya et al., 2014). Mittels serologischer Studien konnte zudem gezeigt werden, dass Serumproben von Dorfbewohnern in Kamerun und domestizierten Schweinen in Uganda Antikörper gegen Oberflächenproteine von verschiedenen Henipaviren besitzen, was darauf schließen lässt, dass in Afrika zoonotische und Interspezies-Übertragungen von Henipaviren bereits stattgefunden haben (Pernet et al., 2014b, Atherstone et al., 2018). Das bekannteste und bislang am besten studierte afrikanische Henipaviren ist das KuV, welches in Ghana in einem Flughund der Spezies Eidolon helvum nachgewiesen wurde (Drexler et al., 2012). Für dieses Virus ist die komplette genetische Information bekannt, allerdings gibt es kein infektiöses Virusisolat. Unter den Henipaviren weist KuV die größte phylogenetische Verwandtschaft zu NiV und HeV auf. Die Aminosäurehomologie zwischen KuV und NiV/HeV variiert je nach Gen: N, M, F und L weisen eine Homologie zwischen 70,4 und 77,8 % auf, während P und G mit 33,4 % und 42,4 % weniger stark konserviert sind. In ersten Studien konnte bereits gezeigt werden, dass das KuV zwar mit dem konservierten Henipavirus-Rezeptor EphrinB2 interagieren kann, allerdings scheint die Fähigkeit Membranfusionen zu vermitteln im Falle des KuV auf Fledertierzellen beschränkt zu sein (Kruger et al., 2013, Kruger et al., 2014, Lawrence et al., 2014, Weis et al., 2014, Lee et al., 2015).

1.2.2. Mumpsviren Das Mumpsvirus (MuV) wird innerhalb der Familie Paramyxoviridae dem Genus Rubulavirus zugeordnet. Humane Mumpsviren (hMuV) werden basierend auf der phylogenetischen Verwandtschaft ihrer SH-Proteine in 12 Genotypen unterteilt, welche wiederum verschiedene MuV Stämme und teilweise Varianten von Stämmen beherbergen (WHO 2012). MuV Infektionen führen zu der hochansteckenden Erkrankung Mumps. In der Regel verläuft Mumps als eine milde Erkrankung charakterisiert durch eine ein- oder beidseitige Parotitis begleitet von unspezifischen grippe-ähnlichen Symptomen (CDC 2012). In einigen Fällen führt Mumps zu schwerwiegenderen Verläufen und es werden Komplikationen wie Pankreatitis, Orchitis oder Myokarditis beobachtet (Beard et al., 1977, Falk et al., 1989, Ozkutlu et al., 1989). Zudem besitzen verschiedene wildtyp hMuV Isolate ein unterschiedlich stark ausgeprägtes neurovirulentes Potential. Das ZNS ist in etwa 50 % aller Mumpsfälle involviert,

Einleitung - 6 - in selteneren Fällen kommt es zu potentiell letal verlaufenden aseptischen Meningitiden, Enzephalitiden und Hydrozephalusbildung (Russell and Donald 1958, Rubin et al., 2015). Berichte über die ersten epidemischen MuV-Ausbrüche reichen bis ins 18. Jahrhundert zurück (Hirsch 1886). Stark besuchte Orte wie Schulen, Gefängnisse und militärische Einrichtungen berichteten von einer Inzidenz von bis zu 6 % (Gordon and Kilham 1949, Levitt et al., 1970, Galazka et al., 1999). Mit der Einführung der Impfung gegen Mumps in dem Jahr 1967 reduzierte sich die Anzahl der Mumpsfälle drastisch (Koskiniemi and Vaheri 1989, Hviid et al., 2008), allerdings kommt es aktuell wieder vermehrt zu Mumpsausbrüchen in geimpften Populationen (Golwalkar et al., 2018). Die Ursache hierfür ist bisher noch nicht klar, es wird jedoch vermutet, dass die durch die Impfung erreichte Immunität mit der Zeit an Effizienz abnimmt (Lewnard and Grad 2018, Principi and Esposito 2018).

Menschen galten lange Zeit als das einzige Reservoir für MuV bis im Rahmen einer Surveillancestudie in der Demokratischen Republik Kongo in der Milz eines Flughundes der Gattung Epomops das genetische Material eines bislang unbekannten MuV (BatPV/Epo_spe/AR1/DCR/2009, batMuV) detektiert wurde, welche eine sehr hohe phylogenetische Verwandtschaft zu hMuV Isolaten aufweist (Drexler et al., 2012). Zudem zeigten Seren von verschiedenen afrikanischen Flughunden und insektivoren Fledermäusen eine Kreuzreaktivität gegenüber hMuVs (Drexler et al., 2012), sodass anzunehmen ist, dass (i) das Wirtsspektrum von MuV breiter ist als bisher angenommen und (ii) die fledertierassoziierten MuVs nicht nur phylogenetisch, sondern auch serologisch mit den humanen Viren verwandt sind. Im Falle des batMuV, dessen vollständige genetische Information bekannt ist, ist die Homologie der einzelnen Virusproteine im Vergleich zu hMuVs mit 81-94 % Aminosäureidentität sehr hoch konserviert. Eine Ausnahme stellt hier lediglich das SH-Protein dar, ein Protein welches auch innerhalb der hMuVs sehr variabel ist und daher zur Genotypisierung verwendet wird. Das SH-Protein des batMuV ist nur zu 39 % identisch mit einer Konsensussequenz für hMuV SH-Proteine, weshalb sich das batMuV keinem der bisher bekannten Genotypen zuordnen lässt.

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1.3. Orthomyxoviren Die Familie Orthomyxoviridae umfasst umhüllte Viren mit einem segmentierten, einzelsträngigen RNS-Genom mit negativer Polarität (Cheung and Poon 2007). Zu den epidemiologisch bedeutendsten Orthomyxoviren gehören die Influenza A Viren (FLUAV), welche ihr natürliches Reservoir in Wassergeflügel haben (Wright et al., 1992). FLUAV werden basierend auf Sequenzhomologien ihrer zwei Oberflächenproteine, dem Hämagglutinin (HA) und der Neuraminidase (NA), verschiedenen Subtypen zugeordnet. Bisweilen umfassen die konventionellen FLUAV 16 HA- (H1-16) und neun NA-Subtypen (N1-9) (Laver et al., 1984, Cheung and Poon 2007), von denen bisher nur die Subtypen H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7 und H9N2 aus Menschen isoliert wurden (Claas et al., 1998, Subbarao et al., 1998, Yuen et al., 1998, Guan et al., 1999, Lamb and Krug 2001, Guan et al., 2003a, Nicholson et al., 2003, Fouchier et al., 2004).

1.3.1. Fledertierassoziierte Influenzaviren Neben den klassischen FLUAV-Subtypen wurden in den Jahren 2012 und 2013 mittels RT-PCR zwei weitere Subtypen in Fledertieren entdeckt, welche provisorisch als H17N10 und H18N11 bezeichnet wurden. H17N10 wurde in einer Gelbschulterfledermaus der Spezies Sturnira lilium in Guatemala entdeckt, während das virale Genom von H18N11 in einer peruanischen Fruchtfledermaus der Spezies Artibeus planirostris detektiert wurde (Tong et al., 2012, Tong et al., 2013). Zusätzlich wurden mittels serologischer Studien spezifische Antikörper, welche gegen das H17 oder H18 gerichtet sind, in verschiedene südamerikanischen Fledermausspezies nachgewiesen, sodass eine weitreichendere Verbreitung fledertierassoziierter FLUAV anzunehmen ist (Tong et al., 2013).

Der molekulare Aufbau von H17N10 und H18N11 entspricht in seiner Struktur dem Aufbau konventioneller FLUAV-Subtypen. Die internen Proteine beider fledertierassoziierten FLUAV weisen eine im Vergleich zu den 16 klassischen FLUAV-Subtypen stark konservierte Aminosäuresequenz auf, während die Oberflächenproteine sich in ihrer Sequenz deutlich von den anderen FLUAV-Subtypen unterscheiden: H17 und H18 weisen eine durchschnittlich 45 %-ige Aminosäureidentität im Vergleich zu den 16 H-Subtypen auf, während die Konservierung zwischen N11 und N12 und den 10 konventionellen N-Subtypen bei nur ca. 29 % liegt (Tong et al., 2013). Aufgrund der Tatsache, dass sich H17/18 und N10/11

Einleitung - 8 - phylogenetisch nicht den klassischen FLUAV-Subtypen zuordnen lassen, sondern individuelle Cluster bilden, ist anzunehmen, dass H17N10 und H18N11 eine besondere Stellung unter den FLUAV-Subtypen einnehmen (Tong et al., 2012, Tong et al., 2013). Diese Annahme wurde weiter bestärkt, indem gezeigt wurde, dass H17 und H18 nicht an die klassischen FLUAV- Rezeptoren - α2,3- oder α2,6-verknüpfte Sialinsäuren - binden (Sun et al., 2013, Zhu et al., 2013, Wu et al., 2014, Hoffmann et al., 2016, Maruyama et al., 2016) und dass N10 und N11 die für FLUAV charakteristische Neuraminidaseaktivität fehlt (Li et al., 2012, Zhu et al., 2012, Wu et al., 2014). Aufgrund dieser gravierenden funktionellen Unterschiede ist eine Umbenennung der Fledertier-FLUAV Hüllproteine in HA-ähnliche (HA-like, HL) und NA- ähnliche (NA-like, NL) Proteine und dementsprechend eine neue Bezeichnung der Viren als HL17NL10 und HL18NL11 vorgeschlagen worden (Ma et al., 2015).

In weiterführenden Studien konnte des Weiteren gezeigt werden, dass zwar der Austausch einzelner interner Proteine in rekombinant hergestellten Chimären aus konventionellen und fledertierassoziierten FLUAV möglich ist, jedoch eine zufällige Reassortierung - der Austausch einzelner RNS-Segmente im Zuge einer Co-Infektion - höchstwahrscheinlich aufgrund unterschiedlicher Verpackungssignale ausgeschlossen zu sein scheint (Juozapaitis et al., 2014, Poole et al., 2014, Zhou et al., 2014). Basierend auf diesen Studien ist davon auszugehen, dass sich der virale Eintrittsprozess von HL17NL10 und HL18NL11 gegenüber den konventionellen FLUAV unterscheidet.

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1.4. Filoviren Filoviren gehören zur Ordnung Mononegavirales und werden innerhalb der Familie Filoviridae in die drei Genera Cueva-, Ebola- und Marburgvirus unterteilt. Sie sind umhüllte Viren mit filamentöser Morphologie und besitzen ein einzelsträngiges, unsegmentiertes RNS-Genom mit negativer Polarität.

1.4.1. Ebolaviren Dem Genus Ebolavirus werden aktuell fünf verschiedene Virusspezies zugeordnet: Zaire ebolavirus (Vertreter: Ebola-Virus, EBOV), Sudan ebolavirus (Vertreter: Sudan-Virus, SUDV), Bundibugyo ebolavirus (Vertreter: Bundibugyo-Virus, BDBV), Tai Forest ebolavirus (Vertreter: Tai Forest-Virus, TAFV) und Reston ebolavirus (Vertreter: Reston-Virus, RESTV). Darüber hinaus wurde kürzlich ein neues Ebolavirus entdeckt und als sechste Spezies vorgeschlagen - Bombali ebolavirus (Vertreter: Bombali-Virus, BOMV) (Goldstein et al., 2018). Für vier der Ebolavirusspezies - EBOV, SUDV, TAFV und BDBV - ist bekannt, dass sie zu einer klinischen Infektion des Menschen führen können. Für RESTV, welches als einziges Ebolavirus seinen Ursprung nicht in Afrika sondern Asien (Philippinen, China) hat (Hayes et al., 1992, Ikegami et al., 2002, Pan et al., 2014), ist hingegen gezeigt worden, dass dieses Virus zwar pathogen für nicht-humane Primaten (NHP) und Schweine, aber nicht für Menschen ist (Jahrling et al., 1996, Barrette et al., 2009, Normile 2009, Miranda and Miranda 2011, Weingartl et al., 2012). Über das kürzlich in Sierra Leone entdeckte BOMV liegen bislang keine Informationen über Virulenz, Pathogenität und Wirtsspektrum vor (Goldstein et al., 2018). Eine aktuelle Veröffentlichung beschreibt die Entdeckung und Charakterisierung des Měnglà-Virus, welches in China in Flughunden der Gattung Rousettus detektiert wurde (Yang et al., 2019). Aufgrund der vergleichsweise geringen phylogenetischen Verwandtschaft zu den drei Genera der Familie Filoviridae, wurde daher die Erschaffung eines neuen Genus für dieses Virus vorgeschlagen.

Gestützt durch den Nachweis viraler RNS-Sequenzen und Ebolavirus-spezifischen Antikörpern (Leroy et al., 2005, Pourrut et al., 2009, Taniguchi et al., 2011, Yuan et al., 2012, Olival et al., 2013, Goldstein et al., 2018), sowie durch die Tatsache, dass experimentell infizierte Fledertiere trotz erfolgreicher Virusreplikation keine klinischen Symptome zeigten (Swanepoel et al., 1996), wird angenommen, dass verschiedene fruktivore (Hypsignathus monstrosus, Epomops franqueti, Myonycteris torquata, Rousettus amplexicaudatus,

Einleitung - 10 -

Rousettus leschenautii) und insektivore (Chaerephon pumilus, Mops condylurus) Fledertierspezies das Reservoir für Ebolaviren darstellen; allerdings fehlt für den endgültigen Beweis dieser Hypothese die Isolation der entsprechenden Viren aus Fledertieren, welche auf natürlichem Weg infiziert wurden. Das Wirtsspektrum der humanpathogenen Viren EBOV, SUDV, TAFV und BDBV umfasst neben dem Menschen, Menschenaffen (Gorillas, Schimpansen), diverse Affenspezies und andere Säugetierspezies wie beispielsweise den Waldducker, eine kleine, waldbewohnende Antilopenart. Eine Infektion dieser Tierspezies kann durch direkten oder indirekten Kontakt mit infizierten Fledertieren stattfinden (Formenty et al., 1999, Leroy et al., 2004). Nach der initialen zoonotischen Übertragung des Virus durch direkten Kontakt des Menschen mit infizierten Fledertieren oder Primaten beispielsweise während der Jagd oder der Zubereitung von Fleisch (bush meat), wird der Erreger durch Mensch-zu-Mensch-Übertragungen innerhalb der Population weitergegeben. Die virale Eintrittspforte stellen dabei in der Regel Mikroläsionen in der Haut dar und die Ausbreitung von Ebolaviren in menschlichen Populationen geschieht hauptsächlich durch direkten Kontakt zu Blut oder anderen Körperflüssigkeiten infizierter Patienten, wohingegen für eine aerogene Übertragung bislang keine Hinweise bestehen (Dowell et al., 1999, Colebunders and Borchert 2000, Bausch et al., 2007). Infektionen des Menschen mit EBOV, SUDV oder BDBV sind in der Regel mit einer hohen Mortalität verbunden und können ein schwerwiegendes Krankheitsbild auslösen, welches zu Multiorganversagen und einem septischen Schock führen kann, während die früher als charakteristisch beschriebenen Hämorrhagien nur bei einem kleinen Teil der Erkrankten auftreten (Hartman et al., 2010, Feldmann and Geisbert 2011).

Die Geschichte der Ebolavirus-bedingten Ausbrüche beginnt im Jahr 1976, als es fast zeitgleich zu zwei Ausbrüchen im Ost-Sudan und Ost-Zaire und damit zu der Entdeckung von SUDV und EBOV, kam (Pourrut et al., 2005). In den folgenden Jahren wurden weitere durch SUDV oder EBOV ausgelöste Ausbrüche in der Demokratischen Republik Kongo und dem Sudan beschrieben. Für TAFV ist bislang nur ein einziger nicht letal verlaufender Fall eines Tierarztes, welcher eine Nekropsie an einem Schimpansen durchführte, aus dem Jahr 1994 bekannt (Le Guenno et al., 1995). BDBV wurde erstmals im Zusammenhang mit einem Ausbruch in West- Uganda im Jahr 2007 detektiert (Towner et al., 2008). Während die früher beobachteten Ausbrüche durch eine vergleichsweise geringe Fallzahl, eine regionale Begrenzung und ein

- 11 - Einleitung rasches Abklingen charakterisiert waren, führte EBOV von 2013 bis 2016 zu der bislang größten Epidemie der Ebola-Virus Krankheit, welche im Dezember 2013 im westafrikanischen Guinea begann und sich anschließend auf die Nachbarländer Sierra Leone und Liberia ausbreitete (Cenciarelli et al., 2015, Kaner and Schaack 2016). Bis die WHO die EBOV-Epidemie im Juni 2016 für beendet erklärte, wurden insgesamt 28.652 Fälle verzeichnet, von denen 11.325 letal verliefen (CDC 2014, WHO 2016). In den folgenden Jahren führte EBOV zu weiteren Fällen in der Demokratischen Republik Kongo: Im Jahr 2017 wurden 8 Fälle nachgewiesen und im November 2018 wurden insgesamt über 300 Fälle für das laufende Jahr gemeldet (WHO 2018).

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1.5. Interspezies-Übertragung und die Speziesbarriere Damit ein zoonotisches Virus von seinem tierischen Reservoir auf den Menschen übertragen werden und eine erfolgreichen Infektion in dieser neuen Wirtsspezies etablieren kann, muss es die Speziesbarriere überwinden. Die Speziesbarriere stellt eine hierarchische Abfolge mehrerer Barrieren dar, von denen jede einzelne von dem Virus überwunden werden muss. Die Wahrscheinlichkeit, ob ein Virus es schafft, diese Barrieren zu überwinden, hängt von vielfältigen Faktoren ab, zu denen neben erreger- und wirtsspezifischen Eigenschaften auch ökologische, epidemiologische und soziologische Faktoren zählen. Das Überwinden der Speziesbarriere lässt sich in vier chronologisch ablaufende Phasen einteilen: 1. Exposition der neuen Spezies zum Erreger, 2. Infektion der neuen Wirtsspezies, 3. Übertragung des Erregers innerhalb der neuen Spezies und 4. epidemische Ausbreitung (Abb. 1) (Wolfe et al., 2007, Woolhouse et al., 2012).

Ob es zu einer Exposition des Menschen mit einem zoonotischen Erreger kommt, hängt zunächst von der Erregerlast innerhalb des natürlichen Reservoirs ab. Die Erregerlast bezeichnet die Anzahl an Erregern, die zu einem bestimmten Zeitpunkt und an einem bestimmten Ort, theoretisch mit dem Menschen in Kontakt kommen kann. Bestimmt wird die Erregerlast durch (i) die Prävalenz des Erregers in der Reservoirspezies, (ii) die geographische Verbreitung und Ökologie des Reservoirs, (iii) die Infektiösität und (iv) Tenazität des Erregers, (v) Ausscheidungsweg und -menge, sowie (vi) Art und Weise der weiteren Verbreitung des Erregers (Plowright et al., 2017). Die Art der Erregerausscheidung und die Tenazität bestimmen maßgeblich den Übertragungsweg. So erfordert beispielsweise die Übertragung von Viren wie respiratorisch übertragenen Influenzaviren, welche nur eine geringe Tenazität aufweisen und außerhalb ihrer Wirte sehr instabil sind, in der Regel einen engen Kontakt zwischen Reservoir und Empfänger (Koopmans et al., 2004, Weber and Stilianakis 2008). Im Gegensatz dazu bleiben Viren mit einer hohen Tenazität - wie das Virus der Afrikanischen Schweinepest - über einen längeren Zeitraum in der Umwelt infektiös und können somit auch mittels Vektoren, in diesem Fall über Fleischprodukte oder sonstige tierische Erzeugnisse, übertragen und/oder über weitere Strecken transportiert werden (Farez and Morley 1997).

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Abbildung 1: Phasen der Interspezies-Übertragung zoonotischer Erreger. Die Erregerlast bestimmt maßgeblich, ob es zu einer Interspezies-Übertragung kommen kann. Die anschließende Interspezies- Übertragung läuft in vier Phasen ab und beginnt mit der Exposition des neuen Wirtes, gefolgt von Infektion und Übertragung innerhalb der neuen Spezies, welche letztendlich zu einer epidemischen Ausbreitung des Erregers führen kann. Die Erfolgschance jeder einzelnen Phase hängt von diversen Faktoren ab, welche verschiedene zu überwindende Barrieren definieren. Nur das Überwinden aller Barrieren kann zu der letzten Stufe der Interspezies-Übertragung, der Epidemie, führen.

Die Exposition des Menschen mit dem zoonotischen Erreger kann entweder über direkten Kontakt mit dem infizierten Reservoirwirt und/oder seinen Ausscheidungen oder indirekt über belebte (z.B. Arthropoden oder Zwischenwirte) und unbelebte Vektoren (z.B. kontaminierte Lebensmittel) geschehen. Zu einer direkten Übertragung kann es wie im Fall des Tollwutvirus durch Bisse infizierter Fledermäuse kommen (Sulkin and Greve 1954, Lennette et al., 1960,

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Lopez et al., 1992) oder aber auch wie für Ebolaviren angenommen durch die Jagd und den Verzehr von Fledertieren als alternative Nahrungsquelle, sogenanntes bush meat (Leroy et al., 2004, Mickleburgh et al., 2009, Kamins et al., 2011, Weiss et al., 2012). Die Wahrscheinlichkeit einer Exposition des Menschen durch direkten Kontakt wird neben der Verbreitung und Ökologie des Reservoirs zu einem großen Teil durch menschliches Verhalten und Handeln bestimmt (Parrish et al., 2008, Woolhouse et al., 2012). Neben dem gezielten Aufsuchen potentieller Erregerträger durch den Menschen, kann es durch Einschränkungen des Lebensraums der Reservoirspezies beispielsweise durch das Abholzen von Wäldern oder den Anbau von Lebensmitteln und/oder Rohstoffen in den Fledertier-Habitaten dazu führen, dass diese sich vermehrt in der Nähe von menschlichen Dörfern und Behausungen aufhalten und somit das Risiko eines direkten Kontakts zwischen Mensch und Fledertier deutlich erhöht ist (Walsh et al., 1993, Morse 2004, Patz et al., 2004, Weiss and McMichael 2004, Macpherson 2005, Wolfe et al., 2005, Karesh et al., 2012). Eine indirekte Übertragung wurde beispielsweise für NiV beobachtet: Während dem Ausbruch in Malaysia fungierten Schweine als Zwischenwirte, welche sich durch die Aufnahme von kontaminiertem Obst infizierten und anschließend das Virus auf den Menschen übertrugen (Chua et al., 2000, Epstein et al., 2006, Luby et al., 2009a); in Bangladesch fand eine Übertragung auf den Menschen durch den Verzehr von mit Flughundurin kontaminiertem Palmensaft statt (Luby et al., 2006, Luby et al., 2009a, Rahman et al., 2012). Für den Erreger des schwer akuten Atemwegssyndroms (SARS), dem SARS-assoziierten Coronavirus (SARS-CoV), wird ebenfalls angenommen, dass ein tierischer Zwischenwirt in die Interspezies- Übertragung involviert war. Vermutlich fand bedingt durch den engen Kontakt verschiedener Tierspezies auf asiatischen Tiermärkten die Übertragung von SARS-ähnlichen CoVs (SARSr- CoV) von Fledermäusen auf Zibetkatzen (Paguma larvata) statt, in denen das Virus sich durch Mutationen so weit veränderte, dass eine effiziente Übertragung auf und eine Infektion von Menschen mit anschließender pandemischer Ausbreitung ermöglicht wurde (Guan et al., 2003b, Zeng et al., 2004, Lau et al., 2005, Wang et al., 2006, Wang and Eaton 2007).

Etwa ein Drittel der Viren, welche Nutz- und Haustiere infizieren können, sind vermutlich auch in der Lage Infektionen im Menschen hervorzurufen; insgesamt umfasst die Anzahl an zoonotischen Viren schätzungsweise über 200 verschiedene Spezies (Cleaveland et al., 2001, Taylor et al., 2001, Woolhouse and Gowtage-Sequeria 2005, Woolhouse et al., 2012).

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Allerdings führt nicht jede Exposition mit einem potentiell zoonotischen Erreger auch zwangsläufig zu einer Infektion des Menschen. Nach der Exposition müssen die Viren zunächst einige physikalische Barrieren überwinden, bevor sie zu ihren Zielzellen, in denen die anschließende Replikation stattfindet, gelangen können. Solche Barrieren stellen beispielsweise die Haut, Schleimhäute, die Mukusschicht der Lunge oder die Magensäure dar (Kuiken et al., 2006, Plowright et al., 2017). Nachdem diese Barrieren überwunden wurden, findet die Infektion von Zielzellen mit nachfolgender Replikation und weiterer Virusausbreitung im Wirt statt. Der Erfolg dieses Schrittes hängt sowohl von zellulären Faktoren, wie beispielsweise dem Vorhandensein geeigneter Rezeptoren, als auch von viralen Faktoren wie z.B. der Mutationsrate ab. Da diese Arbeit sich mit den erreger- und wirtszell- spezifischen Eigenschaften befasst, welche eine wichtige Rolle bei der Interspezies- Übertragung spielen, wird in dem folgenden Unterkapitel 1.6 näher auf die Interaktionen, die im Rahmen des viralen Replikationszyklus zwischen Erreger und Wirt stattfinden, eingegangen. Neben den erreger- und wirtsspezifischen Faktoren spielen auch individuelle Faktoren, wie der Immunstatus (z.B. Immunsuppression, Co-Infektionen), genetische Faktoren oder der physiologische Status (z.B. Schwangerschaft, Mangelernährung) eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer klinischen Erkrankung, da durch diese Faktoren die Empfänglichkeit des Menschen gegenüber Infektionen erhöht sein kann (Kau et al., 2011, Woolhouse et al., 2012).

Es wird angenommen, dass von den Viren, die zu einer erfolgreichen Infektion des Menschen geführt haben, etwa die Hälfte innerhalb dieser neuen Spezies übertragen werden können und dass von diesem Anteil wiederum die Hälfte das Potential einer epidemischen Ausbreitung besitzt (Taylor et al., 2001). Ob ein Virus innerhalb der Spezies Mensch übertragen wird, hängt wie bereits bei der initialen Übertragung vom Reservoirwirt auf den Menschen von der Tenazität und Infektiösität des Erregers ab. Des Weiteren spielt der Gewebetropismus des Erregers eine entscheidende Rolle und bestimmt die Art der Erregerausscheidung und -übertragung. Replizieren Viren im Respirationstrakt wie beispielsweise Influenzaviren so können sie aerogen übertragen werden, während die Übertragung von lymphotropen Viren wie dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) den Kontakt mit erregerhaltigen Körperflüssigkeiten voraussetzt.

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Können die Viren erfolgreich ohne weitere Zwischenwirte innerhalb der Spezies Mensch übertragen werden, so kann es zu einer anschließenden epi- oder pandemischen Ausbreitung kommen. Beispielhaft sei an dieser Stelle die SARS-Epidemie im Jahr 2003 zu nennen, welche zu insgesamt 8098 Fällen in über 30 Ländern führte, von denen 774 letal verliefen (Cheng et al., 2007). Die initiale Infektion eines Menschen fand höchstwahrscheinlich im November 2002 in der Guangdong Provinz in China statt (Enserink 2013). Zu einer weiteren Ausbreitung kam es dadurch, dass ein infizierter Arzt, welcher Patienten mit der bis dahin unbekannten Pneumonie behandelt hatte, nach Hongkong reiste und dort den Erreger in einem Hotel auf zwölf weitere Hotelgäste übertrug (Demmler and Ligon 2003, Anderson et al., 2004, Skowronski et al., 2005). Die Tatsache, dass der Flughafen in Hongkong zu den größten Verkehrs- und Frachtflughäfen der Welt zählt, begünstigte die folgende globale Ausbreitung des SARS-CoV. Infizierte Menschen reisten während der Inkubationszeit, also vor dem Auftreten klinischer Symptome, in weitere Länder, in denen sie dann nach dem Auftreten der Symptome einer atypischen Pneumonie stationär in Krankenhäusern behandelt werden mussten und hier den Erreger auf weitere Kontaktperson wie beispielsweise medizinisches Personal übertrugen (Lee et al., 2003, Cherry and Krogstad 2004, Winter 2005). Im Mai 2004 wurde die SARS-Pandemie von der WHO für beendet erklärt (WHO 2004).

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1.6. Der virale Replikationszyklus und seine Barrieren während der Interspezies-Übertragung Nachdem die ersten epidemiologischen und ökologischen Barrieren der Interspezies- Übertragung erfolgreich überwunden worden sind, hängt das Auftreten oder Ausbleiben einer erfolgreichen Infektion des Menschen davon ab, ob das Virus in der Lage ist in humane Zellen einzudringen sowie sich in diesen Zellen zu vermehren und somit eine weitere Ausbreitung des Erregers zu gewährleisten. Die Tatsache, dass Viren als obligate intrazelluläre Parasiten keinen eigenen Stoffwechsel besitzen und somit für ihre Vermehrung, welche durch die Replikation der viralen Nukleinsäure und die Synthese viraler Proteine erfolgt, auf lebende Zellen angewiesen sind, verdeutlicht, welche zentrale Rolle das Vorhandensein geeigneter Zielzellen innerhalb des neuen Wirtsorganismus für eine erfolgreiche Interspezies- Übertragung hat.

Der virale Replikationszyklus lässt sich in verschiedene Phasen unterteilen: Die erste Phase umfasst den Eintrittsprozess in die Zielzelle und beinhaltet die Adsorption an die Zielzelle, das Überwinden zellulärer Membranen und die Freisetzung der viralen Nukleinsäure, das sogenannte Uncoating. Anschließend finden innerhalb der Zielzelle die Genomreplikation, mRNS-Synthese und Translation statt, welche der Vermehrung des viralen Genoms und der Synthese viraler Proteine dienen. Im letzten Schritt des Replikationszyklus werden alle Virusbestandteile in einem Vorgang, der als Assembly bezeichnet wird, an der Plasmamembran versammelt und anschließend werden durch Knospung bzw. Budding die neu synthetisierten Viruspartikel abgeschnürt und aus der infizierten Zelle freigesetzt, damit sie sich weiter im Organismus verbreiten oder ausgeschieden werden können. Damit die virale Replikation erfolgreich ablaufen kann, ist es zudem notwendig, dass die Viren über Mechanismen verfügen mit denen sie die Immunantwort des Wirtes umgehen können, wobei diese Strategien oftmals exklusiv auf die angeborene Immunantwort - insbesondere die Interferonantwort - abzielen.

Da der virale Replikationszyklus ein komplexer und je nach Virus unterschiedlich ablaufender Vorgang ist, beschränken sich die folgenden Unterkapitel in Anlehnung an die in dieser Arbeit verwendeten Viren auf den Replikationszyklus von umhüllten Viren mit einem negativ- strängigen RNS-Genom.

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1.6.1. Der Eintrittsprozess - Rezeptorbindung und Fusion Der virale Eintrittsprozess beginnt mit der Adsorption, der Erkennung spezifischer oder unspezifischer zellulärer Oberflächenstrukturen und der anschließenden Anheftung der Viruspartikel an diese. Während die Mehrheit der RNS-Viren mit Strukturen, die an der Oberfläche der Wirtszelle lokalisiert sind (z.B. Proteine, Glykolipide oder Sialinsäuren), interagieren und diese gleichzeitig als Eintrittsrezeptoren verwenden, wurde für einige Viren wie z.B. EBOV gezeigt, dass diese Viren zunächst unspezifisch mit Oberflächenstrukturen wie C-Typ Lektine oder Rezeptor-Tyrosinkinasen interagieren, dann durch Endo- oder Makropinozytose internalisiert werden und schließlich intrazellulär in den Endosomen an ihre virusspezifischen Eintrittsrezeptoren binden (Alvarez et al., 2002, Takada et al., 2004, Jae and Brummelkamp 2015, Wang et al., 2016). Bei umhüllten RNS-Viren wird der Vorgang der Rezeptorerkennung und -bindung durch virale Hüllproteine, welche in die Virushülle eingebaut werden und somit an der Oberfläche der Viren lokalisiert sind, initiiert. Aufgrund der Vielfältigkeit der RNS-Viren weisen auch die zellulären Bestandteile, welche als Rezeptor fungieren können, eine große Diversität auf.

Die Rezeptorspezifität eines Virus bestimmt maßgeblich das Wirtsspektrum und den Gewebetropismus des Erregers. Binden Viren an Rezeptoren, die innerhalb verschiedener Spezies eine hohe Konservierung aufweisen, so ist ihre Wahrscheinlichkeit, die Speziesbarriere ohne genetische Modifikationen zu überwinden, größer als für Viren, die an spezies-spezifische Rezeptoren binden (Woolhouse 2002). Zu den erst genannten Viren zählen beispielsweise die Henipaviren NiV und HeV. Beide Viren besitzen ein breites Wirtsspektrum und interagieren mit den zellulären Rezeptoren Ephrin B2 und B3 (Bonaparte et al., 2005, Negrete et al., 2005, Negrete et al., 2006, Bishop et al., 2007, Lee 2007, Xu et al., 2012). Der hohe Konservierungsgrad (96-98 %) dieser beiden Rezeptoren innerhalb verschiedener Säugetier-, Fisch- und Amphibienspezies, wird durch das Spektrum empfänglicher Wirte (Fledertiere, Menschen, Pferde, Schweine, Hunde, Katzen, Wiederkäuer, Meerschweinchen) reflektiert (Bossart et al., 2008). Durch Sequenzanalysen konnte zudem gezeigt werden, dass die Proteinsequenzen von NiV, welches während des Ausbruchs in Malaysia aus Flughunden, Menschen und Schweinen isoliert wurde, zu über 99 % identisch waren. Somit konnte es ausgeschlossen werden, dass für die erfolgreiche Interspezies-

- 19 - Einleitung

Übertragung eine Adaptation an den neuen Wirt notwendig war (Chua et al., 2002, Chua 2003, AbuBakar et al., 2004).

Während NiV und HeV hoch konservierte Rezeptoren für den Viruseintritt nutzen und somit ohne adaptive Mutationen eine entscheidende Barriere der Interspezies-Übertragung überwinden können, waren im Falle des SARS-CoV Mutationen in der rezeptor-bindenden Domäne des Spikeproteins notwendig. Die Tatsache, dass Fledermäuse nicht empfänglich für Infektionen mit dem humanen SARS-CoV sind und fledertierassoziierte SARSr-CoVs weder humane noch Zibetkatzenzellen infizieren können, ließ schnell die Vermutung aufkommen, dass sich der Erreger im Zuge der Interspezies-Übertragung an seinen neuen Wirt, die Zibetkatze bzw. den Menschen, angepasst haben muss (Ren et al., 2008). Da die phylogenetische Verwandtschaft zwischen SARS-CoV-Isolaten aus Menschen und Zibetkatzen größer ist, als die Verwandtschaft zu fledertierassoziierten SARSr-CoVs wird vermutet, dass sich das Virus zunächst an die Zibetkatze angepasst hat und anschließend in diesem Zwischenwirt genetische Adaptationen stattgefunden haben, welche eine nachfolgende Infektion des Menschen ermöglichten (Lau et al., 2005, Li et al., 2005b). Durch mehrfache Übertragungen des Erregers zwischen Zibetkatzen und Menschen hat sich wahrscheinlich der pandemische SARS-CoV Stamm entwickelt (Li et al., 2005b, Sheahan et al., 2008). Tatsächlich konnte in weiterführenden Studien gezeigt werden, dass SARSr-CoVs nicht effizient an humanes Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 (ACE2) - den zellulären Rezeptor für SARS-CoV - binden und dass SARS-CoVs nicht mit Fledertier-ACE2 interagieren. Wurde allerdings die rezeptor-bindenden Domäne des SARS-CoV Spikeproteins in das Spikeprotein eines SARSr-CoV eingebaut, so konnte dieses später ACE2 als Rezeptor verwenden (Becker et al., 2008, Ren et al., 2008). In anderen Studien wurde allerdings gezeigt, dass ACE2-Moleküle einiger Fledertierspezies durchaus als zellulärer Rezeptor für den Eintritt von SARS-CoV genutzt werden können (Hou et al., 2010, Hoffmann et al., 2013). Zusätzlich wurden in SARS- CoV Isolaten aus Zibetkatzen etliche Mutationen innerhalb der Rezeptor-bindenden Domäne entdeckt, von denen insbesondere die Aminosäuren in den Positionen 479 und 487 eine entscheidende Rolle für das Überwinden der Speziesbarriere gespielt haben, indem sie eine effizientere Bindung an humanes ACE2 erlaubten und so die Mensch-zu-Mensch-Übertragung ermöglicht haben (Li et al., 2005c, Qu et al., 2005, Li 2008).

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Nachdem die Viren die erste Hürde - das Binden an einen geeigneten zellulären Rezeptor - erfolgreich überwunden haben, müssen sie die Membran der Zielzelle überwinden, um das virale Genom in die Zelle einzuschleusen. Bei umhüllten Viren muss hierzu eine Fusion zwischen viraler und zellulärer Membran stattfinden. Um diesen Fusionsprozess durchführen zu können, exprimieren einige Viren an ihrer Oberfläche neben den rezeptor-bindenden Glykoproteinen ein zweites virales Protein, das sogenannte Fusionsprotein (z.B. Henipaviren, MuV), während bei anderen Viren die Fusion durch das selbe virale Protein, welches bereits für die Rezeptorbindung verantwortlich ist, vermittelt wird (z.B. EBOV, SARS-CoV) (Belouzard et al., 2012, Luo 2012, Miller and Chandran 2012, Bossart et al., 2013). Die Fusionsproteine verfügen über ein hydrophobes Fusionspeptid, welches in die zelluläre Membran der Zielzelle inseriert wird und infolge einer Konformationsänderung des Fusionsproteins zur Ausbildung einer Fusionspore führt, durch die das virale Genom in die Wirtszelle geschleust werden kann (Plemper 2011).

Virale Fusionsproteine werden zunächst in einer inaktiven Form synthetisiert und müssen zwei Aktivierungsschritte durchlaufen, damit sie in ihrer fusogenen Form vorliegen. Zum einen findet ein vorbereitender Priming Schritt statt, der oftmals durch die proteolytische Spaltung an einer charakteristischen Spaltstelle innerhalb des Fusionsproteins durch zelluläre Proteasen durchgeführt wird. Diese Spaltung ist notwendig, da sich das hydrophobe Fusionspeptid zunächst inmitten des Fusionsproteins verbirgt und dadurch nicht in der Lage ist, in die Membran der Zielzelle zu inserieren. Durch die proteolytische Aktivierung wird das Fusionsprotein in zwei Untereinheiten gespalten, sodass innerhalb des Fusionsproteins ein neuer N-Terminus entsteht, an dessen Ende sich das nun freie Fusionspeptid befindet (White et al., 1982, Baker et al., 1999). Diese Spaltung kann entweder direkt nach der Proteinsynthese in der infizierten Wirtszelle geschehen (z.B. Henipaviren, MuV) oder sie findet während des Eintritts in die nächste Zelle statt (z.B. SARS-CoV) (Diederich et al., 2005, Simmons et al., 2011). Welche entscheidende Rolle die proteolytische Aktivierung des fusions-vermittelnden Proteins in Bezug auf die Pathogenität eines Erregers einnimmt, lässt sich am Beispiel der FLUAV-Subtypen H5 und H7 verdeutlichen. Aviäre FLUAV werden aufgrund ihrer Virulenz in niedrig pathogene (low-pathogenic avian influenza viruses, LPAI) und hoch pathogene (highly pathogenic avian influenza viruses, HPAI) Viren unterteilt. Bislang sind hoch pathogene Viren nur für die Subtypen H5 und H7 bekannt, welche durch spontane Mutationen im Bereich der

- 21 - Einleitung proteolytischen Spaltstelle des HA-Proteins aus den niedrig pathogenen H5/H7 Subtypen entstehen können. Während die Infektion mit HPAI zu einer innerhalb weniger Stunden bis Tagen letal verlaufenden, systemischen Infektion in Nutzgeflügel führt, sind Morbidität und Mortalität im Falle einer LPAI Infektion wesentlich geringer (Wright et al., 1992). Neben der Virulenz unterscheiden sich auch die Replikationsorte und damit die Ausscheidungs- und Übertragungswege der Viren: LPAI Viren replizieren hauptsächlich im Darm und Respirationstrakt, wo sie zu einer lokal begrenzten Infektion führen, und werden von infiziertem Geflügel über den Kot ausgeschieden. Im Gegensatz hierzu können HPAI Viren zusätzlich in vaskulären Epithelzellen und perivaskulären Parenchymzellen replizieren, wodurch die virale Ausbreitung innerhalb des Organismus und die Entstehung einer systemischen Infektion begünstigt werden. Neben der fäkalen Ausscheidung werden HPAI Viren auch nasal und oral durch direkten Kontakt oder über kontaminierte Vektoren übertragen (Horimoto and Kawaoka 2005). In zahlreichen Studien wurde gezeigt, dass die Unterschiede in der Virulenz auf das HA-Protein, insbesondere auf das proteolytische Spaltmotiv zurückzuführen sind (Webster and Rott 1987, Horimoto and Kawaoka 1994). Während LPAI Viren ein einzelnes Arginin an der Spaltstelle aufweisen und durch Trypsin- ähnliche Proteasen, welche lokal begrenzt im Darm und Respirationstrakt exprimiert werden, gespalten werden, besitzen HPAI Viren ein multibasisches Spaltmotiv, das eine proteolytische Aktivierung durch ubiquitär vorkommende Proteasen wie Furin oder Proprotein-Konvertase 6 ermöglicht (Stieneke-Grober et al., 1992, Horimoto et al., 1994).

Der zweite Aktivierungsschritt der Fusions-vermittelnden Proteine umfasst Konformationsänderungen, welche entweder durch einen niedrigen pH-Wert oder durch Protein-Protein-Interaktionen mit dem rezeptor-bindenden Protein und/ oder dem zellulären Rezeptor initiiert werden. Diese Konformationsänderungen sind notwendig, da sich das Fusionspeptid zunächst inmitten der zwei Untereinheiten der Fusionsproteine, welche sich in Form von Multimeren (hauptsächlich Trimeren) zusammenlagern, befindet. Durch eine Umfaltung der Proteine entsteht eine helikal gewundene Struktur, an deren Spitze sich schließlich das Fusionspeptid befindet (Chang and Dutch 2012). Eine pH-abhängige Aktivierung ist beispielsweise für FLUAV beschrieben worden. Nachdem die Viren an den zellulären Rezeptor gebunden haben, findet eine Clathrin-abhängige Endozytose oder eine Makropinozytose der Viruspartikel statt (Roy et al., 2000, Sieczkarski and Whittaker 2002,

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Chen and Zhuang 2008). Sobald in den späten Endosomen ein pH-Wert von 5.0 erreicht ist, finden die Konformationsänderungen des HA-Proteins statt, welches nun die Fusion zwischen viraler und endosomaler Membran einleitet (Huang et al., 1980, Skehel et al., 1982, White et al., 1982). Im Gegensatz dazu wird bei Paramyxoviren (Henipaviren, MuV) die Konformationsänderung des Fusionsproteins durch Protein-Protein-Interaktionen ausgelöst, sodass diese Viren bei neutralem pH-Wert und damit direkt an der Plasmamembran fusionieren und ihr Genom in das Zytoplasma freisetzen können (Chang and Dutch 2012).

- 23 - Einleitung

1.6.2. Replikation und Proteinsynthese Nachdem die Fusion zwischen viraler und zellulärer Membran stattgefunden hat, werden die Ribonukleoproteinkomplexe (RNP) - bestehend aus dem von Nukleoproteinen (N) umhüllten viralen RNS-Genom - in das Zytoplasma der Zielzelle freigesetzt (Finch and Gibbs 1970, Longhi 2009). Anschließend werden sowohl Kopien des kompletten Genoms, welche die genetischen Informationen der neu synthetisierten Viruspartikel tragen, als auch Boten-RNS (mRNS) für die Translation der einzelnen viralen Proteine synthetisiert. Da in der Zelle keine vergleichbaren Transkriptions- oder Replikationsschritte mit einer negativ-strängigen RNS als Ausgangsmaterial stattfinden, werden diese Schritte durch den viralen Polymerasekomplex katalysiert. Die Komponenten dieses Komplexes unterscheiden sich je nach Virusfamilie, so besteht er bei Paramyxoviren aus der RNS-abhängigen RNS-Polymerase (RdRp, L-Protein) und dem Phosphoprotein (P) (Dochow et al., 2012), während sich der Polymerasekomplex im Falle der FLUAV aus den drei Proteinen PB1, PB2 und PA zusammensetzt (Murti et al., 1988, Klumpp et al., 1997). Mit Ausnahme von FLUAV, bei denen Transkription und Replikation im Zellkern stattfinden, laufen diese beiden Prozesse bei negativ-strängigen RNS-Viren im Zytoplasma ab (Dou et al., 2018). Unabhängig von der Lokalisation innerhalb der Zielzelle, erfüllt die RdRp zwei Aufgaben: Im Rahmen der Transkription synthetisiert der Polymerasekomplex virale mRNS, welche anschließend durch zelluläre Faktoren in die entsprechenden Proteine translatiert werden. Im Replikationsmodus synthetisiert die RdRp zunächst einen positiv orientierten Komplementärstrang des gesamten negativ-strängigen RNS-Genoms, welcher anschließend als Vorlage für die Synthese neuer viraler Genome dient (Assadullaeff et al., 1975, Huang et al., 1990, Perales and Ortin 1997, Mikulasova et al., 2000, Lamb and Kolakofsky 2001, Honda et al., 2002). Für Paramyxoviren wird angenommen, dass der Wechsel der RdRp zwischen Transkriptions- und Replikationsaktivität durch die Menge an neu synthetisierten N-Proteinen in der infizierten Zelle reguliert wird (Baker and Moyer 1988, Horikami et al., 1992). Nach ihrer Synthese werden die viralen Hüllproteine über den sekretorischen Transportweg zur Plasmamembran transportiert. Auf diesem Weg können im endoplasmatischen Retikulum (ER) und dem Golgi-Apparat post-translationale Modifikationen wie beispielsweise N- Glykosylierungen stattfinden (Gallagher et al., 1988, Hogue and Nayak 1992, Moll et al., 2004, Aguilar et al., 2006, Bowden et al., 2008, Biering et al., 2012). Neu synthetisierte N-Proteine lagern sich mit den replizierten RNS-Genomen zusammen und bilden so neue RNPs, ebenso

Einleitung - 24 - lagern sich die entsprechenden Proteine des Polymerasekomplexes zusammen. Nach der erfolgreichen Synthese aller viraler Komponenten und deren Ansammlung an der Plasmamembran vermittelt das Matrixprotein (M) die Knospung neuer Viruspartikel, indem es das Assembly - das Zusammenlagern von viralen Proteinen und RNPs - und das Budding, das Abschnüren neuer Viruspartikel von der Plasmamembran, einleitet (Sanderson et al., 1994, Lamb and Kolakofsky 2001, Ciancanelli and Basler 2006, Patch et al., 2007, Patch et al., 2008, Wang et al., 2010).

Für die Interspezies-Übertragung spielt eine genetische Variabilität eine große Rolle, da die Viren häufig nur schlecht in ihren neuen Wirten replizieren und nur wenig effizient übertragen werden, sodass eine Anpassung an den neuen Wirt unausweichlich ist. Literaturrecherchen haben ergeben, dass bis auf einige Ausnahmen fast alle Viren, denen das Überwinden der Speziesbarriere erfolgreich gelungen ist, ein einzelsträngiges RNS-Genom besitzen (Cleaveland et al., 2001, Elena and Sanjuan 2005, Woolhouse et al., 2005). Diese Tatsache lässt sich dadurch erklären, dass RNS-Viren im Vergleich zu DNS-Viren in der Regel ein breiteres Wirtsspektrum besitzen und dass ihre durchschnittliche Mutationsrate etwa 100-fach höher ist als bei Viren mit einem DNS-Genom, sodass sowohl die initiale Infektion eines neuen Wirtes als auch die anschließende Anpassung an diesen begünstigt werden (Woolhouse et al., 2001). Im Gegensatz zu den meisten DNS-Viren, besitzt die virale Polymerase der meisten RNS-Viren keine Fehlerkorrekturaktivität (Proof-reading-Aktivität), sodass die Produkte aus Replikation und Transkription anfälliger für Mutationen sind, was zu der Entstehung von neuen Virusvarianten führen kann, welche eine neue Wirtsspezies besser infizieren bzw. besser in ihr replizieren können (Steinhauer et al., 1992, Domingo and Holland 1997, Moya et al., 2004). Eine Ausnahme stellen hier die Coronaviren dar, da ihre Polymerase über einen Proof-reading- Aktivität verfügt (Denison et al., 2011, Smith and Denison 2013, Smith et al., 2014). Allerdings existieren auch einige DNS-Viren, welche vergleichsweise hohe Mutationsraten aufweisen (Shackelton et al., 2005, Shackelton and Holmes 2006, Michaud et al., 2013), sodass es bisher nicht endgültig geklärt ist, warum dennoch hauptsächlich RNS-Viren die Interspezies-Barriere überschreiten. Neben der Fehleranfälligkeit der Polymerase scheinen außerdem die Länge des Genoms, der Replikationsmechanismus, der Ort der Replikation innerhalb der Zielzelle und die Komplexität des Genoms eine wichtige Rolle in Hinblick auf die Mutationsrate zu spielen (Elena and Sanjuan 2005, Pulliam 2008, Sanjuan and Domingo-Calap 2016). Die Bedeutung

- 25 - Einleitung adaptiver Mutationen wird durch zahlreiche Studien belegt, welche zeigen, dass Punktmutationen in den Rezeptor-bindenden Proteinen die Bindung an einen neuen zellulären Rezeptor und somit die Interspezies-Übertragung ermöglicht haben (Subbarao et al., 1993, Hueffer et al., 2003, Li et al., 2005a).

Neben den adaptiven Mutationen kann durch Reassortierung oder Rekombination auch eine Vermischung der genetischen Information zwischen zwei oder mehreren nahverwandten Viren auftreten. Zu einer Reassortierung kommt es, wenn in einem Organismus Zellen zeitgleich von mehreren verwandten Viren mit einem segmentierten RNS Genom, z.B. zwei verschiedenen FLUAV-Subtypen, infiziert sind und sich die neu synthetisierten RNS-Segmente während des Assembly- und Buddingprozesses untereinander durchmischen, sodass neue Viren entstehen, die Bestandteile beider parentaler Viren beherbergen (Nelson et al., 2008, Greenbaum et al., 2012, McDonald et al., 2016). So ist beispielsweise der im Jahr 2009 in den USA und in Mexiko aufgetretene humane Erregers des Subtyps H1N1 entstanden, welcher RNS-Segmente von porcinen, humanen und aviären FLUAV Subtypen trug (Fraser et al., 2009, Perez-Padilla et al., 2009, Trifonov et al., 2009). Zu einer Rekombination, also dem Austausch von Genomabschnitten, kann es beispielsweise bei den Coronaviren kommen. Wenn zwei oder mehr Coronaviren in einem Wirt die gleiche Zelle infizieren und replizieren kann die Polymerase, welche manchmal bei der Synthese des Komplementärgenoms abfällt, auf einem homologen Genomabschnitt eines anderen Coronavirus wieder ansetzen und so chimäre Genome erzeugen, die neue Coronaviren hervorbringen können. Vor diesem Hintergrund haben Studien darauf hingewiesen, dass das SARS-CoV wahrscheinlich durch die Rekombination verschiedener SARSr-CoVs in Fledermäusen entstanden ist (Lau et al., 2015, Hu et al., 2017). Durch den Austausch von genomischen Abschnitten können die neu entstandenen Viren Eigenschaften erlangen, die ihnen die Infektion von oder die Replikation in neuen Wirtsspezies und/oder Organen erlauben bzw. erleichtern. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, dass durch die Expression eines neuen oder veränderten rezeptor-bindenden Proteins nun speziesübergreifend konservierte Rezeptoren oder Rezeptoren mit einem auf Organebene weitverbreiteten Expressionsprofil für die Interaktion mit Zielzellen verwendet werden können.

Einleitung - 26 -

1.6.3. Antiviral wirksame Wirtsfaktoren Das angeborene Immunsystem verfügt über verschiedene antivirale Mechanismen, welche die Infektion und Replikation von verschiedenen Erregern in Zielzellen verhindern oder zumindest erschweren. Reicht die angeborene Immunantwort nicht aus um Viren oder andere Erreger zu eliminieren, so kommt es zur Aktivierung des adaptiven Immunsystems, welches die Erreger über hochspezifische B- und T-Zellrezeptoren erkennt und gezielt bekämpft. Das Immunsystem mit seinen Signalkaskaden ist ein vielschichtiges und sehr komplexes System, daher befasst sich dieses Unterkapitel im Folgenden mit den antiviralen Mechanismen, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden: (i) Die Typ I Interferon- (IFN) initiierte Immunantwort, (ii) das antivirale wirksame Bone marrow stromal antigen 2 (BST2, Tetherin) und (iii) die Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) induzierte Nuklearfaktor-kappa B (NF-κB) Aktivierung.

Säugetierzellen reagieren auf die Anwesenheit von Mikroorganismen mit der Produktion von Typ I Interferonen (IFN-α, IFN-β). Die Zellen erkennen über verschiedene Rezeptoren, hauptsächlich Toll- (toll-like receptor, TLR) und retinoic acid inducible gene I (RIG-I) ähnliche Rezeptoren, sogenannte pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) wie einzel- oder doppelsträngige virale RNS (Akira et al., 2006, Medzhitov 2007, Takeuchi and Akira 2009). Nach der Erkennung der PAMPs über die zellulären Rezeptoren läuft eine Signalkaskade ab, welche eine Phosphorylierung des IFN-regulierenden Faktors 3 (IRF-3) katalysiert. Bedingt durch diese Phosphorylierung findet eine Translokation von IRF-3 in den Zellkern statt, um dort die Transkription der Typ I-Interferone zu initiieren (Kawai and Akira 2007, Takeuchi and Akira 2007, Takeuchi and Akira 2009, Baum and Garcia-Sastre 2010). Das sezernierte IFN stimuliert sowohl die initial infizierte Zelle, als auch nicht-infizierte Nachbarzellen, indem es an IFN-spezifische Rezeptoren bindet, wodurch die rezeptor-assoziierten Januskinasen aktiviert werden und nachfolgend eine Phosphorylierung des Signaltransduktors und Aktivators der Transkription 1 (STAT1) bzw. 2 (STAT2) erfolgt (Darnell et al., 1994). Die phosphorylierten STAT-Proteine dimerisieren, translozieren in den Zellkern und aktivieren dort die Transkription zahlreicher IFN-stimulierter Gene (ISGs) (Darnell 1997). Die Proteinprodukte der ISGs greifen auf unterschiedliche Weise in die verschiedenen Phasen des viralen Replikationszyklus ein. So hemmt beispielsweise Proteinkinase R die Translation viraler mRNS und RNase L baut einzelsträngige RNS ab (Hovanessian 2007), während andere ISGs wie

- 27 - Einleitung z.B. IFN-induzierte Transmembranproteine (IFITMs), TRIM5α, Myxovirus-Resistenz (Mx) Proteine oder BST-2/ Tetherin den Viruseintritt, das Uncoating, den RNP Transport oder die Freisetzung neuer Viruspartikel unterbinden (Haller et al., 1998, Ohtomo et al., 1999, Rentel et al., 2004, Stremlau et al., 2006, Brass et al., 2009, Sauter et al., 2010, Huang et al., 2011, Swiecki et al., 2013, Londrigan et al., 2015). Die antivirale Wirkung von Tetherin besteht darin, dass es das Budding neu synthetisierter Viruspartikel von der Plasmamembran infizierter Zellen verhindert und beschränkt sich daher auf behüllte Viren (Sauter et al., 2010, Swiecki et al., 2013). Die Besonderheit dieses Proteins ist es, dass Tetherin über zwei membraninserierende Domänen (eine N-terminale Transmembrandomäne und einen C-terminalen Glykosylphosphatidylinositol- (GPI) Anker) verfügt, von denen jeweils einer in die Plasmamembran der Zelle und die Virusmembran inseriert werden, sodass die Viruspartikel festgehalten und an der Freisetzung gehindert werden (Perez-Caballero et al., 2009, Fitzpatrick et al., 2010). Viele Viren kodieren für Proteine, die in der Lage sind Tetherin zu antagonisieren, indem sie entweder die Glykosylierung von Tetherin an der Zelloberfläche verhindern (z.B. SARS-CoV) oder dessen proteosomale Degradation einleiten (z.B. HIV, Sendai- Virus) (Douglas et al., 2009, Bampi et al., 2013, Taylor et al., 2015).

Neben Mechanismen, die gezielt gegen die Produkte einzelner ISGs gerichtet sind, haben Viren diverse Strategien entwickelt, um eine generelle Aktivierung der Typ I IFN-initiierten Immunantwort zu verhindern (Gale and Sen 2009). Paramyxoviren - insbesondere MuV, NiV und HeV - zählen zu den am besten untersuchten Viren in Bezug auf ihren IFN-Antagonismus. Aufgrund der Diversität innerhalb dieser Virusfamilie sind auch die Mechanismen des IFN- Antagonismus sehr vielfältig, sodass je nach Virusspezies verschiedene zelluläre Moleküle und aktivierende Schritte, welche im Rahmen der Signalkaskade ablaufen, als Angriffspunkt dienen. Während einige virale Proteine an die Rezeptoren zur Erkennung der PAMPs binden und diese damit blockieren, verhindern andere Proteine die Phosphorylierung und Translokation der STAT Proteine (Ramachandran and Horvath 2010, Audsley and Moseley 2013). Alle Paramyxoviren - mit Ausnahme des CedV - teilen jedoch die Gemeinsamkeit, dass sie für akzessorische Proteine, welche als IFN-Antagonisten fungieren, kodieren (Lamb and Kolakofsky 2001). Insgesamt gibt es fünf verschiedene akzessorische Proteine (V, W, C, D, I), die von den P-Genen der verschiedenen Paramyxoviren kodiert werden. Um mehrere Proteine aus einem einzigen Gen zu synthetisieren, existieren verschiedene Mechanismen. Am

Einleitung - 28 - weitesten verbreitet ist hierbei das sogenannte RNS-Editing. Zum Editing kommt es dadurch, dass die RdRp an einer purin-reichen Stelle innerhalb des P-Gens zusätzliche nicht-kodierte Guanosinbasen einbaut, sodass es zu einer Verschiebung des Leserahmens um ein oder zwei Nukleotide kommt. Als Konsequenz der Leserahmenverschiebung besitzen die verschiedenen Genprodukte zwar die gleiche N-terminale Sequenz, die C-terminalen Sequenzen variieren jedoch (Vidal et al., 1990, Jacques et al., 1994, Lo et al., 2009). Neben dem RNS-Editing benutzen Henipa-, Morbilli- und Respiroviren ein internes Startkodon innerhalb des P-Gens, während die C-Proteine des Sendai-Virus (SeV) durch das Ablesen alternativer Leserahmen synthetisiert werden (Curran et al., 1991, Wang et al., 1998). Eine Ausnahme stellt hier das CedV dar, da dieses Virus nicht wie die Henipaviren NiV und HeV für IFN-Antagonisten kodiert (Marsh et al., 2012, Audsley and Moseley 2013). Während die NiV und HeV V- und W-Proteine die Phosphorylierung von STAT1 und STAT2 und somit auch die nachfolgende Aktivierung von IFN-α verhindern (Rodriguez et al., 2002, Park et al., 2003, Shaw et al., 2004, Ciancanelli et al., 2009), ist CedV aufgrund des Fehlens antagonisierender Proteine nicht in der Lage, mit STAT1 oder STAT2 zu interagieren und so die ablaufende Signalkaskade zu unterbrechen. Dies ist höchstwahrscheinlich auch die Ursache für die fehlende Pathogenität von CedV im Tiermodell (Lieu et al., 2015).

Neben der IFN-vermittelten Immunantwort spielt auch die Aktivierung des Transkriptions- faktors NF-κB eine wichtige Rolle in der Abwehr von Viren. Die Aktivierung des NF-κB Signalwegs kann durch das Erkennen von PAMPs durch TLRs oder die Bindung von TNF-α oder Interleukin-1β an den TNF- oder Interleukin-1 Rezeptor 1 initiiert werden (Doyle and O'Neill 2006, Verstrepen et al., 2008). Durch die Rezeptorbindung werden Adaptorproteine rekrutiert, um das im Zytoplasma lokalisierte und inaktive NF-κB zu aktivieren. NF-κB liegt im inaktiven Zustand als Heterodimer, bestehend aus den zwei Proteinuntereinheiten p50 und p65, vor und ist zusätzlich mit dem κB-inhibierenden Protein (IκBα) assoziiert (Verstrepen et al., 2008). Die Adaptorproteine aktivieren den Kinasekomplex IKKα/β, der durch Phosphorylierung des IκBα die proteosomale Degradation von IκBα katalysiert (Gilmore 2006). Dadurch wird das nukleäre Lokalisationssignal der NF-κB p65 Untereinheit freigelegt, sodass diese in den Zellkern transportiert und dort die Transkription von NF-κB abhängigen Genen einleiten kann (Karin and Ben-Neriah 2000, Gilmore 2006). Ähnlich wie im Fall der IFN- vermittelten Immunantwort, exprimieren zahlreiche Viren Proteine, die eine

- 29 - Einleitung antagonisierende Wirkung gegenüber der NF-κB-vermittelten Immunantwort haben. So kodieren z.B. Paramyxoviren für das kleine hydrophobe Protein (small hydrophobic protein, SH). Für das SH-Protein von MuV und Simian-Virus 5 wird vermutet, dass es mit TLRs, TNF- und Interleukin-Rezeptoren interagiert und dadurch die nachfolgende Signalkaskade verhindert (Wilson et al., 2006, Franz et al., 2017).

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- 31 - Konzept und Ziele

2. KONZEPT UND ZIELE DER ARBEIT

Fledertiere sind das natürliche Reservoir für eine Vielzahl zoonotischer RNS-Viren, welche nach der Übertragung auf den Menschen zu schwerwiegenden bis letal verlaufenden Infektionen führen können. Insbesondere in den letzten Jahren wurden zahlreiche Studien veröffentlicht, die die Detektion bisher unbekannter RNS-Viren in Fledertieren beschreiben. Allerdings beschränkt sich in vielen dieser Studien die Virusdetektion auf den Nachweis viraler Antikörper oder RNS-Sequenzen, bei denen es sich teilweise sogar nur um Fragmente einzelner Gene handelt. Dadurch, dass häufig ein infektiöses Isolat oder die vollständige genetische Information dieser Viren fehlt, ist es kaum möglich zuverlässige Aussagen über ihre Virulenz und Pathogenesemechanismen, das Wirtsspektrum oder ein mögliches zoonotisches Potential zu treffen. Auch sind Studien, die sich mit der Funktionalität viraler Proteine befassen, bisweilen unterrepräsentiert, sodass viele Aspekte hinsichtlich einer möglichen Interspezies-Übertragung bislang unerforscht geblieben sind. Neben epidemiologischen Aspekten ist es für die Einschätzung des zoonotischen Potentials eines Virus unabdingbar, virale Faktoren, die eine Interspezies-Übertragung begünstigen, zu kennen und zu verstehen.

Für einige der erst kürzlich entdeckten fledertierassoziierten Viren konnte durch phylogenetische Analysen gezeigt werden, dass sie eine ausgeprägte Verwandtschaft zu bereits bekannten humanpathogenen Erregern aufweisen. Zu diesen Viren gehören (i) das fledertierassoziierte Mumpsvirus, ein möglicher Verwandter humaner Mumpsviren, (ii) das Afrikanische Kumasi-Virus, welches eine phylogenetische Verwandtschaft zu den zoonotischen Henipaviren NiV und HeV besitzt und (iii) die Influenzaviren HL17NL10 und HL18NL11, welche Ähnlichkeiten zu konventionellen FLUAV aufweisen. Das Ziel der näheren Untersuchung dieser Viren war es, Aussagen treffen zu können über (i) die Mechanismen beim Viruseintritt in die Zielzelle, (ii) ihre Replikationskompetenz in Zellen von verschiedenen Säugetierspezies, (iii) ihre immunmodulatorischen Eigenschaften und (iv) eventuell vorliegende spezies-spezifische Adaptationen zu analysieren.

Neben diesen vier neuartigen Viren befasst sich diese Arbeit zusätzlich mit dem antiviralen Faktor Tetherin um Erkenntnisse darüber zu gewinnen, ob Tetherin-Orthologe aus Fledertierzellen eine ähnliche Funktionsweise und Wirkungsspektrum wie das humane

Konzept und Ziele - 32 -

Tetherin besitzen und zur Kontrolle von fledertierassoziierten Viren (NiV, EBOV) in der Reservoirspezies beitragen.

Um die zuvor dargestellten Aspekte untersuchen zu können, wurde ein breites Spektrum an molekular-biologischen und virologischen Methoden angewendet, angefangen von der Überexpression einzelner viraler Hüllproteine in Zellkultursystemen, der Verwendung von Pseudoviren oder Virus-ähnlichen Partikeln, bis hin zur Erzeugung rekombinanter Viren bzw. Viruschimären. Um spezies-spezifische Unterschiede oder mögliche Anpassungen der Viren zu untersuchen, wurde für die entsprechenden Versuche neben humanen Zellen auch eine breite Auswahl verschiedener Fledertierzelllinien verwendet. Im Fall des fledertierassoziierten Mumpsvirus wurden die zuvor erwähnten in vitro Studien durch in vivo Infektionsversuche ergänzt, um zusätzliche Informationen über Neurovirulenz und -tropismus dieses Virus zu erhalten.

Die gewonnenen Ergebnisse sollen dazu beitragen, grundlegende Mechanismen des viralen Infektionszyklus und der Interspezies-Übertragung fledertierassoziierter RNS-Viren besser zu verstehen und dadurch das zoonotische Potential der untersuchten Viren besser einschätzen zu können. Die neugewonnenen Erkenntnisse legen wichtige Grundsteine für anschließende Studien, welche sich beispielsweise mit der Entwicklung neuer diagnostischer Tests, antivirale Strategien (Impfstoffe, Therapeutika) sowie Präventionsmassnahmen befassen.

- 33 - Ergebnisse

3. ERGEBNISSE 3.1. Spezies-abhängige Fusionsaktivität der KuV Hüllproteine Vorarbeiten Bisher ist es nicht gelungen ein infektiöses KuV zu isolieren oder - obwohl die vollständige RNS- Sequenz bekannt ist - rekombinantes KuV in Zellkultur zu erzeugen. Um dennoch erste Aussagen über das Risiko einer mögliches Interspezies-Übertragung treffen zu können, befassten sich vorangegangene Arbeiten mit der funktionellen Charakterisierung des KuV Fusions- (F) und rezeptor-bindenden Glykoproteins (G), da diese Proteine den viralen Eintrittsprozess - die erste zu überwindende Barriere für eine erfolgreiche Replikation in der Wirtszelle einer neuen Spezies - vermitteln. Es konnte gezeigt werden, dass KuV G in der Lage ist, mit dem hochkonservierten Rezeptor Ephrin B2 zu interagieren und dass die proteolytische Aktivierung des F-Proteins Ähnlichkeiten zu der proteolytischen Spaltung des phylogenetisch verwandten NiV zeigt, allerdings beschränkte sich die für Henipaviren typische Zellfusion, die zur Ausbildung mehrkerniger Riesenzellen (Synzytien) führt, auf eine Flughundzelllinie (HypNi/1.1, Lungenzellen von Hypsignathus monstrosus), während keine Fusion in Hamster- (BHK-21, Nierenzellen von Mesocricetus auratus) oder NHP-Zellen (Vero76, Nierenzellen von Cercopithecus aethiops) beobachtet wurde (Kruger et al., 2013). Zudem waren die beobachteten Synzytien in Flughundzellen auch weniger häufig und wesentlich kleiner im Vergleich zu NiV F und G induzierten Synzytien. Eine anschließende Studie zeigte, dass KuV F und G auch in humanen (A549, Lungenkarzinomzellen von Homo sapiens), Hunde- (MDCK, Nierenzellen von Canis lupus familiaris) und Schweinezelllinien (PAEC-EB2, Endothelzellen aus der Aorta von Sus scrofa), welche empfänglich für Henipavirus-Infektionen sind, keine Zellfusion induzieren konnte (Weis et al., 2014).

Krüger N, Hoffmann M, Drexler JF, Müller MA, Corman VM, Drosten C, Herrler G (2014). Attachment protein G of an African bat henipavirus is differentially restricted in chiropteran and nonchiropteran cells. J Virol. 2014 Oct;88(20):11973-80.

Für die Aktivierung der fusogenen Form des F-Proteins, muss neben der proteolytischen Spaltung eine Interaktion mit dem rezeptor-bindenden G-Protein stattfinden (Smith et al., 2009). Da in den vorangegangenen Veröffentlichungen bereits gezeigt wurde, dass KuV F an der Zelloberfläche exprimiert und proteolytisch aktiviert wird, befasst sich diese Studie mit der Expression des KuV G-Proteins. Zunächst wurde gezeigt, dass sich die Fusionsaktivität

Ergebnisse - 34 - nicht auf die zuvor beschriebene Flughund-Zelllinie beschränkt, sondern dass auch in Lungenzellen derselben Spezies (HypLu/2) sowie in Nierenzellen der verwandten Flughundspezies Eidolon helvum (EidNi/41), dem wahrscheinlichen Reservoirwirt von KuV, Zellfusionen beobachtet werden können, sodass hier eher von einem generellen Effekt in Fledertierzellen als von einem spezifischen Effekt einer einzigen Spezies auszugehen ist.

Mittels Immunfärbung und anschließender fluoreszenzmikroskopischer Analyse wurde die intrazelluläre Expression von KuV G untersucht. Während für NiV G eine deutliche Expression an der Zelloberfläche beobachtet wurde, zeigte KuV hauptsächlich eine Verteilung in perinukleären Regionen. Durch die Co-Expression von Fluorophor-gekoppelten Markern für die zellulären Kompartimente wurde gezeigt, dass das KuV G-Protein hauptsächlich im ER akkumuliert. Der Hinweis auf eine mögliche Retention während des sekretorischen Signalwegs konnte durch den Verdau mit Endoglykosidasen gestützt werden, da für KuV G im Gegensatz zu NiV G keine komplexen N-Glykosolierungen nachgewiesen werden konnten, welche während des Transports durch den Golgi-Apparat an Mannose-reiche N-Glykane geknüpft werden. Da sich zunächst keine Unterschiede zwischen Fledertier- und anderen Säugetierzellen ergaben, wurde die absolute Proteinmenge und die Menge des an der Zelloberfläche exprimierten KuV G in Fledertier- (HypNi/1.1), Hamster- (BHK-21) und NHP- Zellen (Vero76) mittels Immunblotting verglichen. Während die gesamte Proteinmenge für alle untersuchten Zelllinien annähernd identisch war, zeigten die Fledertierzellen eine deutlich höhere Menge von KuV G an der Zelloberfläche. Mittels Durchflusszytometrie wurde abschließend gezeigt, dass die Oberflächenexpression von KuV G in Fledertierzellen signifikant höher war als in den Zellen, in denen keine Zellfusion beobachtet wurde.

Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass KuV G zum Großteil im ER akkumuliert und grundsätzliche eine sehr geringe Expressionsrate an der Zelloberfläche besitzt. Da die Oberflächenexpression in Fledertierzellen allerdings deutlich höher ist als in anderen Säugetierzellen, liegt die Vermutung nahe, dass die auf Fledertierzellen begrenzte und im Vergleich zu NiV schwache Fusionsaktivität auf einen ineffizienten Transport des KuV G- Proteins an die Zelloberfläche zurück zu führen ist, wodurch wahrscheinlich keine ausreichende Interaktion zwischen F und G und somit auch keine effiziente Aktivierung der fusogenen Form des F-Proteins zustande kommen kann.

- 35 - Ergebnisse

3.2. Identifizierung zellulärer Faktoren für den Eintrittsprozess fledertierassoziierter Influenzaviren Hoffmann M, Krüger N, Zmora P, Wrensch F, Herrler G, Pöhlmann S (2016). The hemagglutinin of bat-associated influenza viruses is activated by TMPRSS2 for pH- dependent entry into bat but not human cells. PLoS One 11(3):e0152134.

In dieser Veröffentlichung wurden zelluläre Faktoren, welche für den Eintrittsprozess der fledertierassoziierten FLUAV vom Subtyp HL17NL10 und HL18NL11 notwendig sind, identifiziert. Da zu diesem Zeitpunkt weder ein infektiöses Feldisolat, noch rekombinante Viren verfügbar waren, wurden die Fragestellungen mithilfe von rhabdoviralen Pseudotypen untersucht. Das Prinzip der Pseudotypisierung beruht auf dem transienten Einbau der zu untersuchenden Proteine in virale Vektoren. Als viraler Vektor fungierte in diesem Fall ein genetisch modifiziertes Virus der Stomatitis vesicularis (VSV), in dessen Genom der Leserahmen für das rezeptorbindende und fusionsvermittelnde Glykoprotein G deletiert und dafür Leserahmen für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) und eine Leuchtkäfer-Luciferase inseriert wurden (Berger Rentsch and Zimmer 2011). Aufgrund des fehlenden G-Proteins wird der Eintrittsprozess der VSV Pseudotypen (VSVpp) durch die transient eingebauten Hüllproteine - in diesem Fall HL und NL - vermittelt. Der Erfolg des HL/NL-vermittelten Zelleintritts wird anschließend in den transduzierten Zellen über die Messung der Luciferase- Aktivität oder fluoreszenzmikroskopisch über den Nachweis von GFP ausgewertet.

Nachdem der Einbau der Hüllproteine der fledertierassoziierten FLUAV in die Pseudotypen sichergestellt wurde, wurden verschiedene Säugetierzelllinien mit den HL- und NL-tragenden VSVpp transduziert. Weder HL17 noch HL18 waren in der Lage, den Eintritt in humane (HEK- 293T, Huh7), NHP- (Vero76) oder Hundezellen (MDCK) zu vermitteln, obwohl alle dieser Zelllinien permissiv waren für den Eintritt von VSVpp, welche die Hüllproteine konventioneller FLUAV trugen. Im Gegensatz dazu waren verschiedene Flughundzelllinien empfänglich gegenüber dem Eintritt von HL17- und/oder HL18-tragenden VSVpp (Nierenzellen von Eidolon helvum (EidNi/41), Hypsignathus monstrosus (HypNi/1.1) und Epomops buettikoferi (EpoNi/22.1)). Zusätzlich wurde festgestellt, dass das NL der fledertierassoziierten FLUAV im Gegensatz zum NA-Protein der konventionellen FLUAV keinen Einfluss auf die Menge an freigesetzten VSVpp während der Produktion hat, sodass anzunehmen ist, dass sich die Funktionsweise von NL- und NA-Proteinen unterscheiden.

Ergebnisse - 36 -

Konventionelle FLUAV HA-Proteine benutzen zelluläre Sialinsäuren als Rezeptoren (Klenk et al., 1975, Carroll et al., 1981), weshalb eine enzymatische Entfernung der Sialinsäuren von der Zelloberfläche der zu transduzierenden Zellen mittels Sialidasen zu einer nahezu vollständigen Reduktion des VSVpp-vermittelten Eintritts führte. Im Gegensatz dazu war die Transduktionseffzienz von HL17- und HL18-tragenden VSVpp in Sialidase-behandelten Zellen signifikant höher als in unbehandelten Zellen. Daraus ist zu schließen, dass Sialinsäuren nicht als Rezeptoren für die untersuchten fledertierassoziierten FLUAV dienen. Der Anstieg der Transduktionseffizienz lässt sich wahrscheinlich dadurch erklären, dass durch die Entfernung der weit verzweigten Sialinsäuren ein besserer Zugang der HL-Proteine zu ihren zellulären Rezeptoren ermöglicht wird.

Weitere Untersuchungen zur Aktivierung (Priming) der fusogenen Form von HL17 und HL18 zeigten, dass beide Proteine in dieser Eigenschaft große Ähnlichkeiten zu den HA-Proteinen konventioneller FLUAV aufweisen, welche durch zelluläre Proteasen wie Trypsin gespalten werden (Bertram et al., 2010). Beide HL-Proteine konnten durch die Zugabe von exogenem Trypsin proteolytisch gespalten und aktiviert werden; des Weiteren wurde durch die Überexpression verschiedener humaner Proteasen gezeigt, dass HL17 und HL18 ähnlich wie konventionelles FLUAV HA ebenfalls durch Typ II Transmembran-Serinproteasen (TSSPs) proteolytisch gespalten werden können. Außerdem ist ein saurer endosomaler pH-Wert für die Konformationsänderungen im HL für dessen vollständige Aktivierung essentiell und damit identisch zum HA konventioneller FLUAV.

Zusammenfassend zeigt diese Veröffentlichung, dass die Hüllproteine von fledertierassoziierten FLUAV nicht in der Lage sind, den Eintritt in humane Zellen zu vermitteln. Aufgrund dessen, dass jedoch beide HL-Proteine in humanen Zellen proteolytisch aktiviert werden können, ist davon auszugehen, dass das Fehlen des bisher unbekannten zellulären Rezeptors ein unüberwindbares Hindernis für diese Viren darstellt.

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3.3. Spezies-übergreifende Replikation, immunmodulatorische Eigenschaften und Neurovirulenz des fledertierassoziierten MuV Krüger N, Hoffmann M, Drexler JF, Müller MA, Corman VM, Sauder C, Rubin S, He B, Örvell C, Drosten C, Herrler G (2015). Functional properties and genetic relatedness of the fusion and hemagglutinin-neuraminidase proteins of a mumps virus-like bat virus. J Virol. 2015 Apr 15;89(8):4539-48.

In der ersten Studie zum fledertierassoziierten MuV wurden das batMuV Fusionsprotein (F) und die Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) hinsichtlich ihrer Funktionalität untersucht und mit den entsprechenden Proteinen eines klinischen hMuV Isolats verglichen. Durch die Bindung von Erythrozyten an batMuV HN exprimierende Zellen und die Spaltung von Acetylneuraminsäure durch dieses Protein konnte gezeigt werden, dass batMuV HN sowohl hämadsorbierende als auch Neuraminidaseaktivität besitzt und somit hinsichtlich seiner Funktionalität dem hMuV HN-Protein ähnelt. Die Co-Expression von batMuV F und HN führte zur Ausbildung von Synzytien in verschiedensten Säugetierzelllinien, einschließlich humaner Zellen. Zudem führte auch die heterotypische Co-Expression von hMuV F und batMuV HN und vice versa zur Zellfusion. Da die Interaktion zwischen F und HN, welche notwendig ist um die Konformationsänderungen im F-Protein auszulösen, nur zwischen nahverwandten Viren effizient funktioniert, bestärkt die heterotypische Fusionsaktivität nochmals die phylogenetische und funktionelle Verwandtschaft zwischen den hMuV und batMuV Hüllproteinen. Die Fusionsaktivität von hMuV und batMuV unterschied sich insofern, dass die Expression des humanen F-Proteins zur Ausbildung wesentlich größerer Synzytien führte. Durch die Synthese chimärer F-Proteine, in denen einzelne Untereinheit ausgetauscht wurden, konnte gezeigt werden, dass das humane Signalpeptid die Expression an der Oberfläche begünstigt, sodass vermutlich bedingt durch die größere Anzahl oberflächlich exprimierter F-Proteine eine stärkere Zellfusion induziert werden kann. Unterschiede in der Fusionsaktivität sind allerdings auch für verschiedene hMuV Stämme beschrieben worden, sodass hier nicht von einem spezies-spezifischen Effekt auszugehen ist.

Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen, dass batMuV F und HN neben der phylogenetischen auch eine funktionelle Ähnlichkeit zu den entsprechenden hMuV Hüllproteinen aufweisen und dadurch wahrscheinlich auch den Eintritt in humane Zellen vermitteln können.

Ergebnisse - 38 -

Krüger N, Sauder C, Hoffmann M, Örvell C, Drexler JF, Rubin S, Herrler G (2016). Recombinant mumps viruses expressing the batMuV fusion glycoprotein are highly fusion active and neurovirulent. J Gen Virol 2016, 97, 1-12.

Als Weiterführung der vorherigen Studie wurde in dieser Arbeit die Funktionalität der batMuV Hüllproteine im Viruskontext untersucht. Dazu wurden mittels reverser Genetik chimäre MuVs erzeugt, indem die Leserahmen für das F- und/ oder HN-Gen eines hoch neurovirulenten hMuV Stammes (88-1961) durch die entsprechenden Leserahmen des batMuV ersetzt wurden. Zunächst wurde mittels fluoreszenzmikroskopischer Detektion von batMuV F und HN in infizierten Zellen, sowie durch den Nachweis dieser Proteine in aufgereinigten Viruspartikeln durch Immunoblotting nachgewiesen, dass (i) beide Proteine erfolgreich in die chimären Viruspartikel eingebaut werden, (ii) das batMuV F-Protein vollständig proteolytisch aktiviert wird und (iii) das batMuV HN in Form von Multimeren vorliegt und ein ähnliches Glykosylierungsmuster wie HN-Protein von hMuV aufweist. Alle chimären Viren waren in der Lage in Vero76 Zellen - einer Zelllinie, die standardmäßig für in vitro Studien mit MuV verwendet wird - zu replizieren. Die Replikationskinetiken der Viren, welche entweder beide batMuV Hüllproteine oder nur das batMuV HN trugen, waren vergleichbar zu dem authentischen hMuV, während die chimären Viren, die das batMuV F zusammen mit dem hMuV HN exprimierten, geringere Peaktiter erreichten und eine Verzögerung der viralen Replikation um einen Tag zeigten. Wahrscheinlich ist die Interaktion zwischen batMuV F und hMuV HN weniger effizient als die Interaktion zwischen hMuV F und batMuV HN oder den beiden batMuV Hüllproteinen, sodass es hierdurch zu einer weniger effizienten Fusionsaktivität der chimären Viren kommt. Unabhängig vom Ursprung des HN-Proteins, führten solche Viren, welche für das batMuV F kodierten zu einem starken zytopathischen Effekt (CPE), welcher durch die Ausbildung riesiger Synzytien, Ablösung infizierter Zellen und Vakuolisierung gekennzeichnet war. Für den hMuV Stamm wurden hingegen nur vereinzelte, kleinere Synzytien beobachtet und der CPE war insgesamt nicht so stark ausgeprägt.

Alle humanen MuV Stämme gehören zu einer einzigen Serogruppe, das heißt, dass neutralisierende Antikörper, die gegen einen bestimmten Stamm gerichtet sind, auch andere MuV Stämme neutralisieren können (Server et al., 1982, Kovamees et al., 1990, Orvell et al., 1997). Da das MuV HN-Protein das Hauptziel der neutralisierenden Antikörper ist (Server et

- 39 - Ergebnisse al., 1982, Kovamees et al., 1990, Orvell et al., 1997), wurde untersucht, ob die Inkubation von chimären MuV mit neutralisierenden Antikörpern, die gegen verschiedene hMuV Stämme gerichtet sind, eine anschließende Infektion von Vero76 Zellen verhindern kann. Alle Antiseren waren in der Lage die Infektion von Viren, welche das batMuV HN tragen, zu verhindern. Neben den neutralisierenden Antikörpern, welche die Viren am Eintritt hindern, werden im Rahmen einer MuV-Infektion auch Antikörper gebildet, die die Neuraminidaseaktivität des HN-Proteins blockieren und somit das Abschnüren neu synthetisierter Viruspartikel erschweren (Orvell 1984). In der vorangegangenen Studie wurde bereits gezeigt, dass das batMuV HN-Protein Neuraminidaseaktivität besitzt. Diese Aktivität konnte durch die Inkubation von chimären Viren mit spezifischen Antiköpern drastisch reduziert werden.

Um eine Aussage über die Neurovirulenz der MuVs treffen zu können, wurde ein in vivo Modell verwendet, welches in der Lage ist zwischen neurovirulenten und attenuierten hMuV Stämmen zu unterscheiden (Rubin et al., 2000). Dazu wurden neugeborene Ratten intrakranial mit den jeweiligen Viren inokuliert und nach einem Monat wurde die Hydrozephalusbildung, eine Erweiterung der mit Liquor gefüllten Flüssigkeitsräume im Gehirn, evaluiert. Der Neurovirulenzscore ergibt sich aus dem Verhältnis zwischen den Flächen des kompakten Gehirngewebes und den nach Fixierung und Trocknung luftgefüllten Ventrikeln im Sagittalschnitt des Gehirns. Alle chimären Viren erreichten einen Neurovirulenzscore, der vergleichbar mit dem Score des hoch neurovirulenten hMuV Stammes 88-1961 war.

In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die batMuV Hüllproteine auch im Viruskontext funktionell sind. Die Replikationskinetiken und die Neurovirulenz der chimären Viren, welche ein oder beide batMuV Hüllproteine exprimieren, sind vergleichbar mit den Ergebnissen, die für den hier verwendeten hMuV Stamm erzielt wurden. Neben der funktionellen Ähnlichkeit besteht auch eine antigenetische Verwandtschaft zwischen hMuV und batMuV, welche dadurch demonstriert wurde, dass MuV-spezifische Antikörper sowohl den Eintritt von batMuV blockieren als auch die für den Austritt wichtige Aktivität es batMuV HN inhibieren können.

Ergebnisse - 40 -

Krüger N, Sauder C, Hüttl S, Papies JP, Voigt K, Herrler G, Hardes K, Steinmetzer T, Örvell C, Drexler JF, Drosten C, Rubin S, Müller MA, Hoffmann M (2018). Entry, replication, immune evasion and neurotoxicity of synthetically-engineered bat-borne mumps virus. Cell Reports 25, 1-9, October 9, 2018.

Als Fortführung der zuvor beschriebenen Studien wurde in dieser Arbeit - basierend auf der veröffentlichten Nukleotidsequenz - authentisches, rekombinantes batMuV synthetisiert und anschließend charakterisiert. Die Ergebnisse der vorherigen Studien deuteten bereits darauf hin, dass hMuVs und batMuV nicht nur phylogenetisch, sondern auch funktionell und antigenetisch miteinander verwandt sind. Allerdings beschränkten sich diese Studien ausschließlich auf die Charakterisierung der Hüllproteine F und HN, während die übrigen viralen Proteine, welche ebenfalls eine wichtige Rolle hinsichtlich Replikation, Virulenz und Tropismus spielen, unberücksichtigt blieben. Zudem wurden die zuvor gewonnenen Erkenntnisse durch die Überexpression einzelner viraler Proteine oder durch die Charakterisierung chimärer Viren gewonnen. Diese Ergebnisse liefern zwar bereits eine sehr gute Tendenz über ein mögliches zoonotisches Potential und die Virulenz von batMuV, allerdings ist hierbei zu berücksichtigen, dass z.B. das Verhältnis zwischen F und HN in authentischen Viruspartikeln anders sein kann als in transfizierten Zellen und dass im Falle der chimären Viren die hMuV Proteine, welche das Grundgerüst dieser Viren bilden, auch einen gewissen Einfluss auf das in vitro Verhalten der chimären MuVs haben können. Durch die Herstellung des authentischen batMuV sollten daher die zuvor gewonnenen Erkenntnisse bestätigt und durch zusätzliche Untersuchungen weiterführende Einblicke in den Wirtstropismus und die Umgehung der antiviralen Immunantwort geliefert werden.

Um den Wirtstropismus von batMuV näher zu untersuchen, wurden Zelllinien von Flughunden (Nierenzellen von Epomops buettikoferi (EpoNi/22.1), Hypsignathus monstrosus (HypNi/1.1), Eidolon helvum (EidNi/41), Rousettus aegyptiacus (RoNi/7), Lungenzellen von Hypsignathus monstrosus (HypLu/2), Eidolon helvum (EidLu/43)), Fledermäusen (Nierenzellen von Pipistrellus spec, PipNi/3) und NHP (Vero76), sowie humane Zelllinien (Lungenkarzinom- (A549), Leberkarzinom- (Hep G2), Lungen- (BEAS-2B), Kolonkarzinom- (Caco-2) Zellen) mit rekombinantem batMuV und zu Vergleichszwecken mit dem neurovirulenten hMuV Stamm 88-1961 infiziert. BatMuV zeigte in allen Zelllinien, mit Ausnahme von Vero76, eine effizientere Replikation im Vergleich zum hMuV 88-1961 Stamm. Insbesondere in den

- 41 - Ergebnisse

Flughundzelllinien war die Replikation von hMuV durch wesentlich niedrigere und teilweise bis zu vier Tagen verzögert auftretende Peaktiter gekennzeichnet. Obwohl batMuV effizient in allen untersuchten Zelllinien replizierte, variierte die Fusogenität in Abhängigkeit der Zelllinien: Der stärkste CPE wurde in den Zellen der Spezies Epomops buettikoferi beobachtet, welche eine nahe Verwandtschaft zu der Reservoirspezies von batMuV (Epomophorus spec.) aufweist, gefolgt von den beiden Hypsignathus monstrosus Zelllinien, welche ebenso wie Epomops buettikoferi und Epomophorus spec. innerhalb der Familie der Flughunde (Pteropodidae) zur Unterfamilie der Epomophorinae gehört.

Die zuvor in Bezug auf die Hüllproteine F und HN dargestellten Ergebnisse wurden dadurch bestätigt, dass auch der Viruseintritt von authentischem batMuV die Expression von Sialinsäuren an der Oberfläche der Zielzellen erforderte und dass eine proteolytische Aktivierung des F-Proteins durch die zelluläre Protease Furin notwendig ist. Auch die vorangegangenen Ergebnisse des Neurovirulenztests und der Neutralisation durch MuV-spezifische Antikörper wurden für das authentische batMuV bestätigt.

Da neben dem Eintritt und der Replikation in Zielzellen auch das Umgehen der angeborenen Immunantwort eine wichtige Rolle zum Überwinden der Speziesbarriere spielt, wurde der Antagonismus der batMuV V- und I-Proteine mit der Typ I IFN-induzierten Immunantwort in humanen und Fledertierzellen untersucht. Die Stimulation der Zielzellen mit IFN-α, welches zum Auslösen der Signalkaskade und zur Transkription von ISGs und weiterem IFN führt, beeinträchtige weder die Replikation von batMuV noch von hMuV. In diesem Zusammenhang konnte in einem Reporterassay zudem gezeigt werden, dass die Expression von batMuV V und I die Aktivierung des humanen IFN-β Promotors effizient inhibiert. Neben dem IFN-Antagonismus wurde auch die Wirkung des batMuV SH-Proteins auf die NF-κB-vermittelte Immunantwort untersucht. Auch hier konnte das entsprechende batMuV Protein in einem Reporterassay die Aktivierung des humanen NF-κB Promotors nahezu vollständig verhindern. Es konnte zudem gezeigt werde, dass die fehlende Aktivierung des NF- κB Promotors wahrscheinlich auf der unterdrückten Translokation von NF-κB aus dem Zytoplasma in den Zellkern beruht, da sowohl das humane als auch das batMuV SH-Protein die durch TNF-α Stimulation ausgelöste NF-κB Translokation in humanen sowie Fledertierzellen unterbanden.

Ergebnisse - 42 -

Die in dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse bestärken die Annahme, dass batMuV in der Lage ist, die Speziesbarriere zu überwinden und zu Infektionen im Menschen zu führen. Für diese Annahme sprechen die Tatsachen, dass (i) batMuV effizient in humanen Zellen repliziert, (ii) alle für den Viruseintritt notwendigen Faktoren in diesen Zellen vorliegen und (iii) die akzessorischen Proteine von batMuV die IFN- und NF-κB-induzierte Immunantwort in humanen Zellen antagonisieren können. Im Vergleich zum batMuV scheint für den hMuV Stamm 88-1961 ein hoher Anpassungsgrad an humane Zellen vorzuliegen. Dieses Virus ist zwar in der Lage das Auslösen der Immunantwort in Fledertierzellen zu verhindern und in diesen zu replizieren, allerdings ist die Replikationseffizienz deutlich schwächer im Vergleich zu batMuV.

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3.4. Expression und antivirale Wirkung von Flughund-Tetherin Hoffmann M, Nehlmeier I, Brinkmann C, Krähling V, Behner L, Moldenhauer AS, Krüger N, Nehls J, Schindler M, Maisner A, Becker S, Pöhlmann S (2018). Tetherin inhibits replication of Ebola virus and Nipah virus in fruit bat cells. J Virol. 2018 93:e01821-18. doi: 10.1128/JVI.01821-18.

Während sich diverse Studien mit der antiviralen Wirkung von humanem Tetherin befasst haben, lagen bislang keine Informationen über die Funktionalität von Flughund-Tetherin oder die Interaktion dieses antiviralen Faktors mit fledertierassoziierten Viren vor. In dieser Arbeit wurde zunächst Tetherin aus Zelllinien der Flughunde Epomops buettikoferi und Hypsignathus monstrosus - zwei Spezies, die als mögliches Reservoir für Ebolaviren diskutiert werden - kloniert und anschließend die antivirale Wirkung gegenüber die fledertierassoziierten Viren EBOV und NiV untersucht.

Obwohl die Sequenz zwischen humanem und Flughund-Tetherin nur zu etwa 46 % konserviert ist, weisen beide Flughund-Proteine eine ähnliche Domänenorganisation, ein vergleichbares intrazelluläres Verteilungsmuster und eine ähnlich hohe Oberflächenexpression wie das humane Tetherin auf. Einzig der Grad der N-Glykosylierung scheint sich zwischen dem humanen und Flughund-Tetherin zu unterscheiden, da die Tetherin-Orthologe der Flughunde kaum komplexe Glykosylierungen aufweisen.

Um die antivirale Wirkung zu untersuchen, wurde die Freisetzung von virus-ähnlichen Partikeln (virus-like particles, VLPs) aus tetherin-exprimierenden Zellen mittels Immunoblotanalyse untersucht. Unter VLPs versteht man nicht infektiöse und replikationsinkompetente Partikel, die nach Zusammenlagerung viraler Strukturproteine an der Plasmamembran entstehen. Solch eine Zusammenlagerung wird z.B. durch das HIV Gag- Protein oder das EBOV Virusprotein 40 (VP40) initiiert. Exprimieren diese Zellen nun zusätzlich Tetherin, so wird die Freisetzung der VLPs verhindert. Werden aber zusätzlich zu Tetherin auch Tetherin-Antagonisten wie das HIV Vpu oder das EBOV Glykoprotein (GP) exprimiert, so wird die antivirale Funktion des Tetherins aufgehoben und es können wieder VLPs freigesetzt werden (Kuhl et al., 2011). Zunächst wurde gezeigt, dass HIV Vpu und EBOV GP in der Lage sind, Tetherin von verschiedenen NHPs, der Maus und des Menschen zu antagonisieren. Während das Vpu-Protein keines der beiden Tetherin-Orthologe der Flughunde

Ergebnisse - 44 - antagonisieren konnte, wurde durch die Expression von EBOV GP die antivirale Funktion beider Proteine aufgehoben, wenn auch mit unterschiedlicher Effektivität.

Da die bisher erzielten Ergebnisse durch die Überexpression von Tetherin gewonnen wurden, wurde anschließend die antivirale Wirkung von endogenem Tetherin untersucht. Mittels quantitativer PCR wurde gezeigt, dass die mRNS Level von Tetherin in Flughund- und humanen Zellen durch die Stimulation mit IFN-α ansteigen kann, wie es für ein ISG zu erwarten ist. Um den Anteil der antiviralen Wirkung von Tetherin an der IFN-induzierten Immunantwort zu bestimmen, wurden humane und Flughundzellen mit IFN-sensitivem VSV infiziert. Wie erwartet wurde die Infektion nach IFN-Stimulation der Zielzellen nahezu vollständig inhibiert. Durch die Transfektion von sogenannten small interfering RNS (siRNS), welche die Expression einzelner Gene gezielt unterdrücken, wurden die mRNS Level und somit die Expression von endogenem Tetherin inhibiert. Während die unterdrückte Expression von Tetherin in humanen Zellen kaum einen Effekt auf die Infektiösität der Viren hatte, konnte durch das Ausschalten von Tetherin in IFN-stimulierten Flughundzellen die Infektiösität von VSV deutlich gesteigert werden. Daraus lässt sich vermuten, dass in den Flughundzellen Tetherin eine bedeutende Rolle unter den ISGs einnimmt, während in humanen Zellen weitere ISGs an der antiviralen Wirkung beteiligt sind. Neben VSV wurde der gleiche Versuch mit NiV und EBOV, zwei flughund-assoziierten Viren, durchgeführt. Im Falle von NiV konnte die IFN-stimulierte Reduktion der Infektiösität durch die Unterdrückung der Tetherinexpression nahezu vollständig aufgehoben werden, während die Infektiösität von EBOV nur marginal gesteigert werden konnte. In diesem Versuch besaß das Flughund-Tetherin somit eine antivirale Wirkung gegenüber NiV, nicht jedoch gegenüber EBOV.

Zusammenfassend wurde in dieser Veröffentlichung gezeigt, dass die Expression von Flughund-Tetherin durch die Anwesenheit von IFN-α stimuliert wird und dass dieses Protein antiviral wirksam ist gegenüber HIV-basierten VLPs sowie authentischem VSV und NiV, während keine antivirale Wirkung gegenüber authentischem EBOV festgestellt wurde. Diese Befunde weisen darauf hin, dass Flughund-Tetherin eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der NiV- aber nicht der EBOV-Last in der Reservoirspezies spielt.

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4. ÜBERGREIFENDE DISKUSSION

Das Ziel dieser Arbeit war es, neuartige RNS-Viren, die in Fledertieren entdeckt wurden, hinsichtlich ihres Risikos die Speziesbarriere zu überschreiten zu untersuchen. In den letzten Jahren befassten sich immer mehr Studien mit der Detektion neuer Viren, jedoch wurde in der Mehrheit dieser Studien kein infektiöses Virus isoliert, zudem fehlen auch häufig Informationen über die Prävalenz dieser Erreger sowie Hinweise auf mögliche Ausbrüche. Da die vorhandenen Informationen über diese Viren oft sehr limitiert sind, ist es nicht möglich, zuverlässige Aussagen über das Risiko einer Interspezies-Übertragung zu machen. Zusätzlich fehlen meistens spezifische diagnostische Nachweisverfahren, sodass kaum Informationen über die Verbreitung dieser Erreger und ihre Beteiligung am aktuellen Infektionsgeschehen vorliegen.

4.1. Molekular-virologische Methoden zur Untersuchung neuer Viren Um trotz eines fehlenden Virusisolats eine weiterführende Charakterisierung dieser Erreger zu ermöglichen, steht eine große Anzahl an verschiedenen molekular-biologischen und virologischen Methoden zur Verfügung. Die Überexpression einzelner viraler Proteine in etablierten Zellkultursystemen ermöglicht es, die Funktionalität dieser Proteine zu untersuchen. Häufig wird diese Methode angewendet, um durch die Charakterisierung viraler Hüllproteine Rückschlüsse auf den viralen Eintrittsprozess zu ziehen. So können beispielsweise die Interaktion zwischen Virusproteinen und zellulären Rezeptoren, die proteolytische Spaltung der Fusionsproteine oder die Fusionsaktivität in vitro näher untersucht werden. Während einige dieser Ergebnisse sich relativ zuverlässig auf den Viruskontext übertragen lassen, sind andere Ergebnisse vorsichtiger zu interpretieren. Insbesondere die Ausbildung mehrkerniger Synzytien stellt für einige Viren ein in vitro Artefakt dar, welches in vivo kaum beobachtet wird. Zudem kann sich das Verhältnis der entsprechenden viralen Proteine in transfizierten Zellen von dem tatsächlichen Mengenverhältnis in Viruspartikeln unterscheiden und somit die Fusionsaktivität beeinflussen. Dennoch stellen Fusionsassays eine gute Möglichkeit dar, um die grundsätzliche Funktionalität viraler Hüllproteine zu untersuchen.

Eine weitere Möglichkeit, den viralen Eintrittsprozess ohne die Verwendung eines infektiösen Virusisolats zu untersuchen, stellen virale Pseudotypen dar (Schnitzer et al., 1977, Steffen et al., 2013, Rogalin and Heldwein 2016, Sakata et al., 2017). Pseudotypen sind

Diskussion - 46 - replikationsinkompetente Viren, welche anstelle des viruseigenen Hüllproteins die Hüllproteine der zu untersuchenden Viren transient exprimieren (Whitt 2010). Dadurch wird der Eintritt der Pseudotypen durch die Eigenschaften der fremden Hüllproteine vermittelt. Häufig tragen virale Pseudotypen zusätzlich Reportergene, z.B. ein grün fluoreszierendes Protein und/oder eine Luciferase, sodass auch eine quantitative Auswertung der Transduktion möglich ist. Die Methode der Pseudotypisierung ist weit verbreitet und es wurde in unabhängigen Studien gezeigt, dass der Eintrittsprozess viraler Pseudotypen vergleichbar mit dem Eintritt authentischer Viren ist, sodass die Ergebnisse, welche mithilfe dieser Methode gewonnen werden, sehr gut auf den Viruskontext übertragbar sind (Fukushi et al., 2005, Kobinger et al., 2007, Suda et al., 2016, Sakata et al., 2017). Zudem findet die Methode der Pseudotypisierung auch häufig Verwendung bei der Untersuchung von Viren der biologischen Sicherheitsstufen 3 und 4, da die verschärften Sicherheitsmaßnahmen den Umgang mit diesen Viren erschweren (Khetawat and Broder 2010, Kaku et al., 2012, Maruyama et al., 2014). Neben der Untersuchung des viralen Eintrittsprozesses werden Pseudotypen auch für immunologische Studien eingesetzt, welche sich mit der Quantifizierung virus-spezifischer Antikörper befassen (Fukushi et al., 2008, Logan et al., 2016a, Logan et al., 2016b, Moeschler et al., 2016).

Virus-ähnliche Partikel (VLPs) sind nicht-infektiöse Nanostrukturen, welche durch die Zusammenlagerung viraler Strukturproteine an der Zellmembran entstehen und kein genetisches Material enthalten. Die Freisetzung von VLPs wird durch ähnliche Mechanismen wie das Assembly und Budding von Viruspartikeln initiiert, beispielsweise vom HIV Gag-Protein (Wills and Craven 1991, Weldon and Wills 1993, Sakuragi et al., 2002) oder dem EBOV VP40 (Jasenosky et al., 2001, Timmins et al., 2001, Kallstrom et al., 2005). Durch die Co-Transfektion weiterer viraler Strukturproteine, können diese nach Expression an der Plasmamembran in die freigesetzten VLPs eingebaut und in weiterführenden Versuchen näher untersucht werden. Die größte Anwendung finden VLPs allerdings in der Entwicklung neuer Impfstoffe, da sie sowohl die angeborene als auch die erworbene Immunantwort aktivieren können und aufgrund der fehlenden Virusreplikation einen höheren Sicherheitsstandard als Lebendimpfstoffe bieten (Roldao et al., 2010, Jeong and Seong 2017, Mohsen et al., 2017, Mohsen et al., 2018).

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Die bisher genannten Methoden können bereits wertvolle Hinweise über den viralen Eintrittsprozess und mögliche Barrieren während dieses ersten Schrittes des Replikationszyklus liefern, allerdings beschränken sie sich auf die Charakterisierung einzelner viraler Proteine; auch bleibt die genaue Funktionalität dieser Proteine im Viruskontext bislang unberücksichtigt. Zudem können viele Fragestellungen wie etwa die Replikationsfähigkeit oder Virulenz nur mit vermehrungsfähigen authentischen Viren beantwortet werden. Die reverse Genetik revolutionierte die Erforschung der negativ-strängigen RNS-Viren, da mit Hilfe dieser Technologie aus DNS-Plasmiden infektiöse Viren hergestellt und beliebig verändert werden können, ohne dass ein infektiöses Ausgangsisolat notwendig ist (Neumann et al., 1999, Pekosz et al., 1999, Walpita and Flick 2005). Insbesondere in der Influenzaforschung spielt die Methode der reversen Genetik eine große Rolle (Neumann et al., 2005, Neumann et al., 2012, Perez et al., 2017), gefolgt von der Forschung an verschiedensten Paramyxoviren (z.B. Sendai-, Masern-, Mumps-, Nipah-, Hendra-, Parainfluenza-, Newcastle-, Respiratorisches Synzytialvirus) (Collins et al., 1995, Garcin et al., 1995, Radecke et al., 1995, Hoffman and Banerjee 1997, Yoneda et al., 2006, Marsh et al., 2013, Beaty et al., 2017b). Erst durch die Herstellung authentischer, infektiöser Viruspartikel können sämtliche Aspekte des Replikationszyklus untersucht und zuverlässige Aussagen über Infektiösität, Virulenz und Tropismus gemacht werden. Allerdings hängt die erfolgreiche Virenherstellung von mehreren Faktoren ab: Zum einen wird eine geeignete Zelllinie benötigt, welche die Replikation der rekombinanten Viren ermöglicht, zum anderen müssen die an der Replikation beteiligten viralen Proteine in ihren Mengenverhältnissen aufeinander abgestimmt sein, was diese Technik zu einer höchst herausfordernden Aufgabe macht. So ist beispielsweise bislang noch kein rekombinantes KuV verfügbar und auch zwischen der Entdeckung der fledertierassoziierten Influenzaviren und der Herstellung der entsprechenden rekombinanten Viren lagen mehrere Jahre.

Diskussion - 48 -

4.2. Zelluläre Barrieren als Restriktionsfaktoren Für den Replikationsprozess sind Viren auf eine geeignete Wirtszelle angewiesen. Während des gesamten Replikationsprozesses können zahlreiche zelluläre Barrieren auftreten, welche eine erfolgreiche Infektion und Vermehrung erschweren oder verhindern können. Insbesondere das Fehlen geeigneter zellulärer Rezeptoren stellt für viele Viren ein Hindernis dar und ist somit die Hauptursache für einen begrenzten Wirts- oder Gewebetropismus. Ein ausgeprägter Speziestropismus ist insbesondere für Coronaviren bekannt, da diese Erreger an hochspezifische Rezeptoren binden. Wie bereits zuvor für das SARS-CoV beschrieben, musste zunächst eine Adaptation des Spikeproteins an den humanen Rezeptor ACE2 stattfinden, bevor dieses Virus die Speziesbarriere überwinden konnte (Li et al., 2005c, Qu et al., 2005, Li 2008). Ähnliche Beobachtungen wurden für das Middle East respiratory syndrom (MERS) Coronavirus gemacht: Die Empfänglichkeit verschiedener Säugetierspezies hängt maßgeblich von der Proteinsequenz des Rezeptors Dipeptidyl-Peptidase 4 ab, insbesondere an den Positionen 291 und 336 (van Doremalen et al., 2014). Eine drastische Änderung des Wirtstropismus wurde für das feline Parvovirus beobachtet: Durch zwei Mutationen innerhalb des rezeptor-bindenden Proteins veränderte sich die Rezeptorspezifität so stark, dass das Virus nur noch mit Hunde-Transferrin, nicht jedoch mit seinem ursprünglichen Rezeptor in Katzenzellen interagieren kann und folglich als canines Parvovirus bezeichnet wurde (Govindasamy et al., 2003, Hueffer et al., 2003).

In Bezug auf die fledertierassoziierten Influenzaviren der Subtypen HL17NL10 und HL18NL11 wurde gezeigt, dass nur eine begrenzte Anzahl an Fledertierzelllinien empfänglich für den HL-vermittelten Eintritt viraler Pseudotypen war (Hoffmann et al., 2016). Ähnliche Beobachtungen wurden in einer anderen Veröffentlichung, in der ebenfalls die Empfänglichkeit verschiedener Säugetierzellen gegenüber HL- und NL-tragenden Pseudotypen untersucht wurde, beschrieben: Auch hier waren nur einige Fledertierzelllinien und die Hundezelllinie MDCK empfänglich, während die Hüllproteine keinen Eintritt in humane und Schweinezellen vermitteln konnten (Maruyama et al., 2016). In Infektionsversuchen mit rekombinantem HL17NL10 und HL18NL11 wurde eine effiziente Ausbreitung der Infektion nur in zwei Hundezelllinien - der Nierenzelllinie MDCK II und einer Zelllinie unbekannten Ursprungs - beobachtet (Moreira et al., 2016). Die Feststellung, dass die fledertierassoziierten Influenzaviren im Gegensatz zu den konventionellen Influenzaviren den

- 49 - Diskussion

Eintritt in polarisierte Epithelzellen hauptsächlich von der basolateralen Seite aus vermitteln, lässt vermuten, dass der zelluläre Rezeptor dieser Viren vorwiegend in der basolateralen Plasmamembran lokalisiert ist (Moreira et al., 2016). Obwohl der zelluläre Rezeptor für die fledertierassoziierten Influenzaviren bislang nicht bekannt ist, ist anzunehmen, dass die beobachtete Restriktion auf die fehlende bzw. begrenzte Expression des Rezeptors auf der Zelloberfläche zurückzuführen ist. Im Falle der polarisierten Epithelzellen gilt die fehlende Expression des Rezeptors dann entsprechend nur für die apikale Seite. Solange dieser Rezeptor jedoch unbekannt ist, ist es nicht möglich zu unterscheiden, ob es sich hierbei um einen begrenzten Spezies- oder Zelltropismus handelt.

Die Fusionsaktivität des Kumasi-Virus ist auf Zelllinien verschiedener Fledertierspezies beschränkt. Anders als im Fall der fledertierassoziierten Influenzaviren, liegt dieser Restriktion höchstwahrscheinlich keine spezies-spezifische Rezeptorpräferenz zugrunde, da bereits in unabhängigen Studien gezeigt wurde, dass das KuV G-Protein mit dem stark konservierten Rezeptor Ephrin B2 interagieren kann (Kruger et al., 2013, Lawrence et al., 2014, Pernet et al., 2014a, Weis et al., 2014, Lee et al., 2015). Stattdessen ist der Transport des G-Proteins zur Zelloberfläche nur sehr ineffizient und ein Großteil des Proteins wird im ER zurückgehalten (Kruger et al., 2014). Bedingt durch diese Retention weist das KuV G-Protein keine komplexen N-Glykosylierungen auf. Das Auftreten der Zellfusionen in Fledertierzellen korreliert mit der im Vergleich zu anderen Säugetierzelllinien erhöhten Oberflächenexpression des KuV G- Proteins. Da eine Interaktion zwischen dem Fusionsprotein und dem rezeptor-bindenden Protein stattfinden muss um die Konformationsänderungen auszulösen, ist anzunehmen, dass durch die geringe Oberflächenexpression des KuV G-Proteins das Fusionsprotein nur unzureichend aktiviert wird. In diesem Zusammenhang wurde für einige Paramyxoviren wie NiV, HeV und SeV beschrieben, dass eine fehlende N-Glykosylierung den Transport der viralen Hüllproteine zur Zelloberfläche und die Fusogenität beeinträchtigt (Segawa et al., 2000, Moll et al., 2004, Carter et al., 2005, Biering et al., 2012). In einer weiteren Studie wurde die Oligomerisierung des KuV G-Proteins untersucht, da Defekte in der Oligomerisierung zu einer verstärkten ER-Retention und einem reduzierten Transport zur Zelloberfläche führen können (Parks and Lamb 1990, Sergel-Germano et al., 1994, West et al., 2005). Hier wurde zwar gezeigt, dass KuV G im Gegensatz zu den NiV und HeV G-Proteinen, welche in gleichen Verhältnissen als Dimere und Tetramere vorliegen,

Diskussion - 50 - hauptsächlich Tetramere und höhergradige Oligomere bildet, allerdings beeinflussten alle Modifikationen des KuV G-Proteins, welche zu einer ähnlichen Oligomerisierung wie NiV und HeV G führten, die Fusionsaktivität negativ (Behner et al., 2018). Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Ausbildung von Oligomeren essentiell für die Funktionalität des KuV G-Proteins ist, jedoch nicht seine ER-Retention erklärt. Neben einer fehlerhaften Oligomerisierung kann auch das Vorhandensein spezifischer Transport-/Lokalisationssignale (Lys-Asp-Glu-Leu, Lys-Lys-X-X) die Ursache für die Retention von Proteinen im ER sein (Stornaiuolo et al., 2003). Der zytoplasmatische Abschnitt des KuV G-Proteins enthält zwei potentielle ER-Retentionssignale. In aktuellen Untersuchungen wurde allerdings gezeigt, dass verkürzte Versionen des KuV G-Proteins, welche kein Retentionssignal mehr enthalten, sich hinsichtlich ihrer zellulären Expression nicht von dem ursprünglichen Protein unterscheiden, sodass eine signalbedingte Retention sehr unwahrscheinlich ist (eigene Beobachtungen, Manuskript in preparation). Der zytoplasmatische Abschnitt viraler Hüllproteine spielt außerdem eine wichtige Rolle für den intrazellulären Transport, da die Proteine über diesen Bereich an zelluläre Faktoren binden können, welche sie über den richtigen Weg zur Zelloberfläche leiten und die Interaktion mit den negativ geladenen Lipiden der Plasmamembran erleichtern (El Najjar et al., 2014). Bislang ist es nicht bekannt, mit welchen zellulären Faktoren das KuV G-Proteine während ihres intrazellulären Transports interagieren. Eine weitere Erklärung für die Retention kann die fehlende Expression des KuV Matrixproteins sein. Dieses virale Strukturprotein ist für das Zusammenlagern aller viralen Komponenten an der Zellmembran verantwortlich und verleiht den Viruspartikeln ihre Form, indem es die Innenseite der Virushülle auskleidet, wo es mit den RNPs und den zytoplasmatischen Abschnitten der Hüllproteine interagiert (Dorfman et al., 1994, Coronel et al., 1999, Gomez- Puertas et al., 2000, Harrison et al., 2010). Weiterführende Untersuchungen zu diesem Virus werden allerdings dadurch erschwert, dass bislang kein infektiöses Virusisolat verfügbar ist. Zudem wird die Verwendung weiterer molekular-biologischer und virologischer Methoden, z.B. die Produktion viraler Pseudotypen, dadurch erschwert, dass für die erfolgreiche Synthese von Pseudotypen eine effiziente Oberflächenexpression beider viraler Hüllproteine vorausgesetzt wird.

- 51 - Diskussion

Neben dem Fehlen zellulärer Faktoren, welche für eine erfolgreiche Replikation notwendig sind, kann auch die antivirale Immunantwort verantwortlich für eine fehlgeschlagene Infektion und/oder anschließende Replikation sein. Eine wichtige Rolle bei der Abwehr viraler Erreger spielt die IFN-vermittelte Transkription von ISGs bzw. die Expression ihrer Genprodukte. Eines dieser Genprodukte ist das Transmembranprotein Tetherin, welches das Budding neu synthetisierter Viruspartikel verhindert, indem es gleichzeitig in die zelluläre und die virale Membran inseriert und so knospende Viruspartikel an der Plasmamembran festhält (Perez-Caballero et al., 2009, Fitzpatrick et al., 2010, Sauter et al., 2010, Swiecki et al., 2013). Während humanes Tetherin insbesondere in der HIV-Forschung ausgiebig untersucht wurde (Neil et al., 2008, Perez-Caballero et al., 2009, Venkatesh and Bieniasz 2013, Arias et al., 2016), lagen bislang keine Informationen vor, ob Tetherin auch eine Rolle bei der Immunabwehr in Fledertierzellen spielt. Hier wurde gezeigt, dass Tetherin-Orthologe aus Epomops buettikoferi und Hypsignathus monstrosus, zwei mögliche Reservoirspezies für Ebolaviren, strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten zu humanem Tetherin aufweisen und antiviral aktiv sind (Hoffmann et al., 2019). Während humanes Tetherin in VLP-Assays durch das Vpu-Protein von HIV und das GP-Protein von EBOV antagonisiert werden konnte, konnten die Tetherin- Orthologe aus Flughunden nur teilweise durch das EBOV GP antagonisiert werden. In Infektionsversuchen wurde gezeigt, dass VSV - ein Erreger, der neben Schweinen, Pferden und Rindern auch den Menschen infizieren kann - in seiner Ausbreitung deutlich stärker durch Flughund- als durch humanes Tetherin gehemmt wird. Ebenso wurde die Ausbreitung des zoonotischen NiV, welches sein Reservoir in Flughunden der Gattung Pteropus hat, in Zellkulturen durch die Tetherin-Orthologe der Flughunde drastisch reduziert. Einzig die infektiöse Ausbreitung von EBOV blieb durch die antivirale Wirkung des Flughund-Tetherins nahezu unbeeinflusst. Für EBOV ist bekannt, dass es in Flughunden der Spezies Epomops buettikoferi und Hypsignathus monstrosus vorkommt (Leroy et al., 2005). Dies lässt vermuten, dass EBOV eventuell aufgrund seiner Co-Evolution mit Flughunden der Gattungen Epomops und Hypsignathus die Eigenschaft erlangt hat, das Tetherin von Vertretern dieser Gattungen effizient zu antagonisieren. Ob NiV in der Lage ist Tetherin-Orthologe aus Flughunden der Gattung Pteropus zu antagonisieren, muss noch geklärt werden. Es bestünde allerdings auch die Möglichkeit, dass EBOV und NiV unterschiedliche Strategien entwickelt haben mit dem antiviralen Faktor Tetherin in ihrem natürlichen Reservoir umzugehen, wobei diese Strategie für EBOV auf einem direkten, durch sein GP-vermittelten, Antagonismus besteht.

Diskussion - 52 -

4.3. Neuartige Viren und das Risiko zoonotischer Infektionen Während für die bisher beschriebenen Viren verschiedene Restriktionen auf zellulärer Ebene festgestellt wurden, konnten im Falle des fledertierassoziierten Mumpsvirus keinerlei Restriktionsfaktoren beobachtet werden. Durch die Überexpression der batMuV Hüllproteine in Zellkultursystemen, sowie durch die Herstellung rekombinanter MuVs, in denen die Leserahmen für die beiden Hüllproteine eines hMuV Stammes durch die entsprechenden Leserahmen des batMuV ersetzt wurden, konnte bereits gezeigt werden, dass sich diese Proteine hinsichtlich ihrer Funktionalität sehr stark ähneln (Kruger et al., 2015, Katoh et al., 2016, Kruger et al., 2016, Beaty et al., 2017a). Mit der Herstellung von authentischem, rekombinantem batMuV wurde schließlich gezeigt, dass sich dieses Virus in diversen Säugetierzellen, einschließlich verschiedener humaner Zelllinien, vermehren kann und in der Lage ist, die IFN- und NF-κB-induzierte Immunantwort in humanen Zellen zu unterdrücken (Kruger et al., 2018). Zudem replizierte dieses Virus im Gehirn inokulierter Ratten und führte zu der für neurovirulente hMuV-Stämme typischen Hydrozephalusbildung (Kruger et al., 2018). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass batMuV sehr wahrscheinlich dazu in der Lage ist, auf den Menschen übertragen zu werden und zu einer klinischen Infektion zu führen. Allerdings ist davon auszugehen, dass das Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen hMuVs - entweder in Folge einer Impfung oder einer natürlichen Infektion - ebenso vor einer batMuV Infektion schützen kann, da mittels verschiedener in vitro Testverfahren gezeigt wurde, dass Antikörper, welche gegen hMuV Stämme gerichtet sind, eine Kreuzprotektivität gegenüber batMuV zeigen (Katoh et al., 2016, Kruger et al., 2016, Beaty et al., 2017a, Kruger et al., 2018).

Bedingt durch die enge antigenetische Verwandtschaft von batMuV und hMuVs ist es derzeit nicht möglich, mittels serologischer Untersuchungen zwischen diesen beiden Viren zu unterscheiden. Die Frage, ob bereits Infektionen des Menschen mit batMuV stattgefunden haben, lässt sich bedingt durch die Kreuzreaktivität derzeit nicht beantworten. Eine Möglichkeit zukünftig die Prävalenz von batMuV in der menschlichen Population zu untersuchen wäre die Amplifikation und anschließende Sequenzierung des SH-Proteins aus Probenmaterial, da dieses Protein auf Proteinebene die größte Divergenz zwischen batMuV und hMuV besitzt.

- 53 - Diskussion

Die geographische Verbreitung von batMuV ist bisher nicht bekannt. Durch die weite Verbreitung der afrikanischen Flughund-Gattung Epomophorus in Regionen südlich der Sahara (Fahr and Mildenstein 2016, Mildenstein 2016a, Mildenstein 2016b, Tanshi and Fahr 2016, Taylor 2016a, Taylor 2016b, Webala 2016) ist zu vermuten, dass batMuV ebenfalls in diesen Regionen vorkommt (Abb. 2A).

Abbildung 2: Geographische Verbreitung der Gattung Epomophorus und bestätigte Mumpsfälle in Afrika. A) Geographische Verbreitung der acht Flughundspezies der Gattung Epomophorus. Die Karte wurde basierend auf den Angaben der IUCN Red List (https://www.uicnredlist.org) erstellt. B) Bestätigte Mumpsfälle seit 1999 basierend auf Berichten der WHO.

In der Demokratischen Republik Kongo, dem Fundort von batMuV, werden keine routinemäßigen Impfungen gegen Mumps durchgeführt (WHO 2017a) und die Seroprävalenz von MuV in Säuglingen und Neugeborenen ist mit 22 % vergleichsweise hoch (Doshi et al., 2017). Zudem wurden in den letzten Jahren zahlreiche Fälle von Mumps in Afrika diagnostiziert (WHO 2017b, WHO 2017c) (Abb. 2B). Diese Punkte verdeutlichen, dass Mumps eine bedeutende Infektionskrankheit in Afrika darstellt, welche durch Impfung vermeidbar wäre. Es bestünde daher die Möglichkeit, dass batMuV bereits zu Infektionen in der lokalen Bevölkerung geführt hat, bzw. herrschen in vielen afrikanischen Regionen Bedingungen, die eine zoonotische Übertragung von batMuV ermöglichen würden.

Zusammenfassung - 54 -

5. ZUSAMMENFASSUNG

Untersuchungen zur Interspezies-Übertragung fledertierassoziierter RNS-Viren von Nadine Krüger

Die Interspezies-Übertragung von Mikroorganismen setzt voraus, dass die Erreger nicht nur in der Lage sind, die Zielzellen der neuen Wirtsspezies zu infizieren, sondern sich auch erfolgreich in diesen zu vermehren. Der erste Schritt des viralen Replikationszyklus beinhaltet den Eintrittsprozess und setzt bei behüllten Viren zum einen das Vorhandensein geeigneter zellulärer Rezeptoren auf Zielzellen voraus, zum anderen muss das fusions-vermittelnde Protein durch proteolytische Spaltung und Konformationsänderungen vollständig aktiviert werden, damit es die Fusion zwischen Virus- und Zellmembran bewirken kann. Im Anschluss finden Transkription und Replikation des viralen Genoms statt. Während diese beiden Schritte im Fall der RNS-Viren durch die viruseigene RNS-Polymerase bewerkstelligt werden, sind für die Ausführung der anschließenden Translation und der posttranslationalen Modifikationen zelluläre Faktoren verantwortlich. Zudem sind Mechanismen zum Umgehen der angeborenen Immunantwort für Viren von großer Bedeutung, da ansonsten die Erkennung von Mikroorganismen zum Ablauf von Signalkaskaden und damit zur Aktivierung der antiviralen Immunantwort führt. Jeder einzelne Schritt des viralen Replikationszyklus stellt eine Barriere dar, welche für eine erfolgreiche Interspezies-Übertragung überwunden werden muss. Während bei einigen Viren das Überwinden einzelner oder mehrerer Barrieren kein Hindernis darstellt, müssen bei anderen Viren zunächst Adaptationen an die neue Wirtsspezies stattfinden. Je weniger Adaptationen erforderlich sind, umso größer ist das Risiko, dass ein Virus auf eine neue Spezies übertragen wird und sich in dieser ausbreiten kann.

Untersuchungen zur Funktionalität des Fusions- (F) und des rezeptor-bindenden Glykoproteins (G) des KuV zeigten, dass die für Henipaviren typische Zellfusion in diesem Fall auf Zelllinien von Fledertieren beschränkt ist. Weitere Untersuchungen zeigten, dass das G Protein nur unzureichend zur Oberfläche transportiert und hauptsächlich im ER zurückgehalten wird. Obwohl in Fledertierzellen ebenfalls eine Retention im ER vorlag, war die absolute Oberflächenexpression des KuV G in diesen Zellen deutlich höher als in Säugetierzellen, in denen keine Zellfusion beobachtet wurde. Da bei Paramyxoviren eine Interaktion zwischen F und G für die Konformationsänderungen im F-Protein notwendig ist,

- 55 - Zusammenfassung ist davon auszugehen, dass die unzureichende Expression des G-Proteins an der Zelloberfläche für die spezies-spezifische Zellfusion verantwortlich ist. Für die fledertierassoziierten Influenzaviren wurde ebenfalls eine Speziesrestriktion in Bezug auf den Eintrittsprozess festgestellt. Mit Hilfe viraler Pseudotypen wurden die beiden Hüllproteine HL und NL näher untersucht. Diese konnten nur den Eintritt in Flughundzellen, nicht jedoch in andere Säugetierzellen vermitteln. Da des Weiteren gezeigt wurde, dass in allen Zelllinien die zellulären Faktoren vorliegen, welche zur Aktivierung des fusions-vermittelnden HL-Proteins notwendig sind, ist zu vermuten, dass die Restriktion auf das Fehlen geeigneter zellulärer Rezeptoren in diesen Zellen zurück zu führen ist.

Das fledertierassoziierte Mumpsvirus ähnelt den humanen Mumpsviren nicht nur phylogenetisch, sondern auch funktionell und antigenetisch. Da dieses Virus effizient in humanen Zellen repliziert, sich bezüglich des Eintrittsprozesses nahezu identisch zu humanen Mumpsviren verhält, sowohl die IFN- als auch die NF-κB-induzierte Immunantwort in humanen Zellen umgehen kann und in einem Tiermodel neurovirulente Eigenschaften zeigt, ist davon auszugehen, dass dieses Virus in der Lage ist, ohne weitere Adaptationen den Menschen zu infizieren und sich innerhalb dieser Spezies auszubreiten.

Zusätzlich wurde in dieser Arbeit die spezies-übergreifende Wirkung des antiviralen Faktors Tetherin untersucht. Durch die Erzeugung virus-ähnlicher Partikel wurde gezeigt, dass das humane Tetherin durch die antagonisierenden Proteine von HIV und EBOV in seiner Funktion gehemmt werden konnte. Im Gegensatz hierzu war das Flughund-Tetherin resistent gegenüber dem antagonisierenden HIV-Protein. In Infektionsstudien mit den fledertierassoziierten Viren EBOV und NiV und dem zoonotischen VSV wurde gezeigt, dass die Ausbreitung von VSV und NiV durch endogen exprimiertes Fledertier-Tetherin substantiell gehemmt wird, während so gut wie kein antiviraler Einfluss auf die Replikation von EBOV festgestellt wurde.

Summary - 56 -

6. SUMMARY

Investigations on the interspecies transmission of bat-derived RNA viruses by Nadine Krüger

The interspecies transmission of microorganisms requires the ability of a pathogen to enter target cells of a new host species and to efficiently replicate in these cells. The first step of the viral lifecycle comprises the entry process that requires the expression of suitable cellular receptors on the cell surface and - in the case of enveloped viruses - the activation of the fusion protein by proteolytic processing and conformational changes to be capable of mediating fusion between viral and cellular membranes. Whereas the replication and transcription of the viral genome of RNA viruses is mediated by the viral RNA polymerase, the subsequent translation and posttranslational modifications of newly synthesized viral proteins depend on the activity of cellular factors. Furthermore, mechanisms to evade innate immunity are important, because the recognition of microorganisms triggers signaling cascades that result in the activation of the antiviral immune response. Every single step of the viral lifecycle can represent a barrier that has to be overcome for successful interspecies transmission. Whereas some viruses can overcome one or several barriers without any adaptation process, other viruses need to adapt to the new host species first. The fewer adaptations are required, the greater the risk that a virus can be transmitted to and spread within a new host species population.

Investigations on the functionality of the fusion (F) and attachment glycoproteins (G) of KuV revealed that the cell-to-cell fusion, that is typical for henipavirus infections, was restricted to cell lines of bat origin. Further experiments showed that the cellular transport of KuV G to the cell surface is inefficient and that most of this protein is retained inside the ER. Although the majority of KuV G accumulates in the ER in bat cells as well, the total surface expression levels in these cells are significantly higher compared to cells that do not show any cell-to-cell fusion. Given that among paramyxoviruses a close interaction between F and G is required to induce the conformational changes in F, it is suggested, that the inefficient transport to the cell surface and thus low surface expression level of KuV G contribute to the restricted, species-specific fusogenicity.

- 57 - Summary

Also for bat-derived FLUAV a species restriction at the stage of the viral entry process has been determined. To investigate the surface glycoproteins HL and NL, a viral pseudotype system has been employed. Entry of viral pseudotypes was only achieved in cell lines of bat origin, but not in other mammalian cell lines. Further investigations showed, that the cellular factors that are required for the activation of the fusion-mediating HL protein are available in all cell lines analyzed, suggesting that the restriction most likely relies on the absence of suitable cellular receptors.

The bat-derived mumps virus is not only phylogenetically related to hMuVs but also displays a functional and antigenetic relatedness. Given that this virus efficiently replicates in human cells, utilizes identical molecular mechanisms for the viral entry process as hMuVs, can circumvent the IFN- as well as the NF-κB-induced immune response in human cells and exhibits neuropathogenic properties in an animal model, it is very likely that this virus might be transmitted to humans and spread within this species without any further adaptations.

In addition, this thesis investigated the interspecies functionality of the antiviral factor tetherin. By the generation of virus-like particles it has been shown, that human tetherin can be inhibited by the antagonistic proteins of HIV and EBOV. Contrarily, tetherin orthologous derived from two fruit bat species were resistant against antagonism by HIV Vpu. Infection studies using the bat-associated viruses EBOV and NiV as well as the zoonotic pathogen VSV revealed that endogenous fruit bat tetherin could efficiently inhibit viral spread of VSV and NiV, whereas almost no inhibitory effect against EBOV was obtained.

Literaturverzeichnis - 58 -

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- 83 - Publikationen

8. DARSTELLUNG DES EIGENEN ANTEILS AN DEN WISSENSCHAFTLICHEN

PUBLIKATIONEN

Krüger N, Hoffmann M, Drexler JF, Müller MA, Corman VM, Drosten C, Herrler G (2014). Attachment protein G of an African bat henipavirus is differentially restricted in chiropteran and nonchiropteran cells. J Virol. 2014 Oct;88(20):11973-80.

Konzept, Versuchsplanung: Krüger, Hoffmann, Herrler Experimentelle Durchführung: Krüger, Hoffmann Auswertung, Datenanalyse: Krüger, Hoffmann Ressourcen, Diskussion, Beratung: Drexler, Müller, Corman, Drosten, Herrler Manuskript: Krüger, Herrler Korrespondenz: Herrler

Krüger N, Hoffmann M, Drexler JF, Müller MA, Corman VM, Sauder C, Rubin S, He B, Örvell C, Drosten C, Herrler G (2015). Functional properties and genetic relatedness of the fusion and hemagglutinin-neuraminidase proteins of a mumps virus-like bat virus. J Virol. 2015 Apr 15;89(8):4539-48.

Konzept, Versuchsplanung: Krüger, Hoffmann Experimentelle Durchführung: Krüger Auswertung, Datenanalyse: Krüger, Hoffmann Ressourcen, Diskussion, Beratung: Drexler, Müller, Corman, Sauder, Rubin, He, Örvell, Drosten, Herrler Manuskript: Krüger Korrespondenz: Herrler

Hoffmann M, Krüger N, Zmora P, Wrensch F, Herrler G, Pöhlmann S (2016). The hemagglutinin of bat-associated influenza viruses is activated by TMPRSS2 for pH-dependent entry into bat but not human cells. PLoS One 11(3):e0152134.

Konzept, Versuchsplanung: Hoffmann, Krüger, Pöhlmann Experimentelle Durchführung: Hoffmann, Krüger, Zmora, Wrensch Auswertung, Datenanalyse: Hoffmann, Pöhlmann Ressourcen, Diskussion, Beratung: Herrler Manuskript: Hoffmann, Pöhlmann Korrespondenz: Hoffmann, Pöhlmann

Publikationen - 84 -

Krüger N, Sauder C, Hoffmann M, Örvell C, Drexler JF, Rubin S, Herrler G (2016). Recombinant mumps viruses expressing the batMuV fusion glycoprotein are highly fusion active and neurovirulent. J Gen Virol 2016, 97, 1-12.

Konzept, Versuchsplanung: Krüger Experimentelle Durchführung: Krüger, Sauder Auswertung, Datenanalyse: Krüger, Sauder, Hoffmann, Rubin Ressourcen, Diskussion, Beratung: Örvell, Drexler, Rubin, Herrler Manuskript: Krüger Korrespondenz: Krüger

Krüger N, Sauder C, Hüttl S, Papies JP, Voigt K, Herrler G, Hardes K, Steinmetzer T, Örvell C, Drexler JF, Drosten C, Rubin S, Müller MA, Hoffmann M (2018). Entry, replication, immune evasion and neurotoxicity of synthetically-engineered bat-borne mumps virus. Cell Reports 25, 1-9, October 9, 2018.

Konzept, Versuchsplanung: Krüger Experimentelle Durchführung: Krüger, Sauder, Hüttl, Papies, Voigt, Hoffmann Auswertung, Datenanalyse: Krüger, Sauder, Papies, Müller, Hoffmann Ressourcen, Diskussion, Beratung: Hardes, Steinmetzer, Örvell, Drexler, Drosten, Müller, Herrler, Rubin Manuskript: Krüger Korrespondenz: Krüger

Hoffmann M, Nehlmeier I, Brinkmann C, Krähling V, Behner L, Moldenhauer AS, Krüger N, Nehls J, Schindler M, Maisner A, Becker S, Pöhlmann S (2018). Tetherin inhibits replication of Ebola virus and Nipah virus in fruit bat cells. J Virol. 2018 93:e01821-18. doi: 10.1128/JVI.01821-18.

Konzept, Versuchsplanung: Hoffmann, Pöhlmann Experimentelle Durchführung: Hoffmann, Nehlmeier, Brinkmann, Krähling, Behner, Moldenhauer, Krüger, Nehls Auswertung, Datenanalyse: Hoffmann, Krüger, Schindler, Maisner, Becker, Pöhlmann Manuskript: Hoffmann, Pöhlmann Korrespondenz: Hoffmann, Pöhlmann

- 85 - Publikationen

9. PUBLIKATIONEN

Publikation 1: Krüger N, Hoffmann M, Drexler JF, Müller MA, Corman VM, Drosten C, Herrler G (2014). Attachment protein G of an African bat henipavirus is differentially restricted in chiropteran and nonchiropteran cells. J Virol. 2014 Oct;88(20):11973-80. doi: 10.1128/JVI.01561-14.

Abstract Henipaviruses are associated with pteropodid reservoir hosts. The glycoproteins G and F of an African henipavirus (strain M74) have been reported to induce syncytium formation in kidney cells derived from a Hypsignathus monstrosus bat (HypNi/1.1) but not in nonchiropteran BHK- 21 and Vero76 cells. Here, we show that syncytia are also induced in two other pteropodid cell lines from Hypsignathus monstrosus and Eidolon helvum bats upon coexpression of the M74 glycoproteins. The G protein was transported to the surface of transfected chiropteran cells, whereas surface expression in the nonchiropteran cells was detectable only in a fraction of cells. In contrast, the G protein of Nipah virus is transported efficiently to the surface of both chiropteran and nonchiropteran cells. Even in chiropteran cells, M74-G was predominantly expressed in the endoplasmic reticulum (ER), as indicated by colocalization with marker proteins. This result is consistent with the finding that all N-glycans of the M74- G proteins are of the mannose-rich type, as indicated by sensitivity to endo H treatment. These data indicate that the surface transport of M74-G is impaired in available cell culture systems, with larger amounts of viral glycoprotein present on chiropteran cells than on nonchiropteran cells. The restricted surface expression of M74-G explains the reduced fusion activity of the glycoproteins of the African henipavirus. Our results suggest strategies for the isolation of infectious viruses, which is necessary to assess the risk of zoonotic virus transmission.

Importance Henipaviruses are highly pathogenic zoonotic viruses associated with pteropodid bat hosts. Whether the recently described African bat henipaviruses have a zoonotic potential as high as that of their Asian and Australian relatives is unknown. We show that surface expression of the attachment protein G of an African henipavirus, M74, is restricted in comparison to the G protein expression of the highly pathogenic Nipah virus. Transport to the cell surface is more

Publikationen - 86 - restricted in nonchiropteran cells than it is in chiropteran cells, explaining the differential fusion activity of the M74 surface proteins in these cells. Our results imply that surface expression of viral glycoproteins may serve as a major marker to assess the zoonotic risk of emerging henipaviruses.

http://jvi.asm.org/content/88/20/11973.long

- 87 - Publikationen

Publikation 2: Krüger N, Hoffmann M, Drexler JF, Müller MA, Corman VM, Sauder C, Rubin S, He B, Örvell C, Drosten C, Herrler G (2015). Functional properties and genetic relatedness of the fusion and hemagglutinin-neuraminidase proteins of a mumps virus-like bat virus. J Virol. 2015 Apr;89(8):4539-48. doi: 10.1128/JVI.03693-14.

Abstract A bat virus with high phylogenetic relatedness to human mumps virus (MuV) was identified recently at the nucleic acid level. We analyzed the functional activities of the hemagglutinin- neuraminidase (HN) and the fusion (F) proteins of the bat virus (batMuV) and compared them to the respective proteins of a human isolate. Transfected cells expressing the F and HN proteins of batMuV were recognized by antibodies directed against these proteins of human MuV, indicating that both viruses are serologically related. Fusion, hemadsorption, and neuraminidase activities were demonstrated for batMuV, and either bat-derived protein could substitute for its human MuV counterpart in inducing syncytium formation when coexpressed in different mammalian cell lines, including chiropteran cells. Cells expressing batMuV glycoproteins were shown to have lower neuraminidase activity. The syncytia were smaller, and they were present in lower numbers than those observed after coexpression of the corresponding glycoproteins of a clinical isolate of MuV (hMuV). The phenotypic differences in the neuraminidase and fusion activity between the glycoproteins of batMuV and hMuV are explained by differences in the expression level of the HN and F proteins of the two viruses. In the case of the F protein, analysis of chimeric proteins revealed that the signal peptide of the bat MuV fusion protein is responsible for the lower surface expression. These results indicate that the surface glycoproteins of batMuV are serologically and functionally related to those of hMuV, raising the possibility of bats as a reservoir for interspecies transmission.

Importance The recently described MuV-like bat virus is unique among other recently identified human- like bat-associated viruses because of its high sequence homology (approximately 90% in most genes) to its human counterpart. Although it is not known if humans can be infected by batMuV, the antigenic relatedness between the bat and human forms of the virus suggests

Publikationen - 88 - that humans carrying neutralizing antibodies against MuV are protected from infection by batMuV. The close functional relationship between MuV and batMuV is demonstrated by cooperation of the respective HN and F proteins to induce syncytium formation in heterologous expression studies. An interesting feature of the glycoproteins of batMuV is the downregulation of the fusion activity by the signal peptide of F, which has not been reported for other paramyxoviruses. These results are important contributions for risk assessment and for a better understanding of the replication strategy of batMuV.

http://jvi.asm.org/content/89/8/4539.long

- 89 - Publikationen

Publikation 3: Hoffmann M, Krüger N, Zmora P, Wrensch F, Herrler G, Pöhlmann S (2016). The hemagglutinin of bat-associated influenza viruses is activated by TMPRSS2 for pH- dependent entry into bat but not human cells. PLoS One 2016 Mar 30;11(3):e0152134. doi: 10.1371/journal.pone.0152134.

Abstract New World bats have recently been discovered to harbor influenza A virus (FLUAV)-related viruses, termed bat-associated influenza A-like viruses (batFLUAV). The internal proteins of batFLUAV are functional in mammalian cells. In contrast, no biological functionality could be demonstrated for the surface proteins, hemagglutinin (HA)-like (HAL) and neuraminidase (NA)-like (NAL), and these proteins need to be replaced by their human counterparts to allow spread of batFLUAV in human cells. Here, we employed rhabdoviral vectors to study the role of HAL and NAL in viral entry. Vectors pseudotyped with batFLUAV-HAL and -NAL were able to enter bat cells but not cells from other mammalian species. Host cell entry was mediated by HAL and was dependent on prior proteolytic activation of HAL and endosomal low pH. In contrast, sialic acids were dispensable for HAL-driven entry. Finally, the type II transmembrane serine protease TMPRSS2 was able to activate HAL for cell entry indicating that batFLUAV can utilize human proteases for HAL activation. Collectively, these results identify viral and cellular factors governing host cell entry driven by batFLUAV surface proteins. They suggest that the absence of a functional receptor precludes entry of batFLUAV into human cells while other prerequisites for entry, HAL activation and protonation, are met in target cells of human origin.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4814062/

Publikationen - 90 -

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Publikation 4: Krüger N, Sauder C, Hoffmann M, Örvell C, Drexler JF, Rubin S, Herrler G (2016). Recombinant mumps viruses expressing the batMuV fusion glycoprotein are highly fusion active and neurovirulent. J Gen Virol 2016 Nov; 97(11):2837-2848. doi: 10.1099/jgv.0.000596.

Abstract A recent study reported the detection of a bat-derived virus (BatPV/Epo_spe/AR1/DCR/2009, batMuV) with phylogenetic relatedness to human mumps virus (hMuV). Since all efforts to isolate infectious batMuV have reportedly failed, we generated recombinant mumps viruses (rMuVs) in which the open reading frames (ORFs) of the fusion (F) and haemagglutinin- neuraminidase (HN) glycoproteins of an hMuV strain were replaced by the corresponding ORFs of batMuV. The batMuV F and HN proteins were successfully incorporated into viral particles and the resultant chimeric virus was able to mediate infection of Vero cells. Distinct differences were observed between the fusogenicity of rMuVs expressing one or both batMuV glycoproteins: viruses expressing batMuV F were highly fusogenic, regardless of the origin of HN. In contrast, rMuVs expressing human F and bat-derived HN proteins were less fusogenic compared to hMuV. The growth kinetics of chimeric MuVs expressing batMuV HN in combination with either hMuV or batMuV F were similar to that of the backbone virus, whereas a delay in virus replication was obtained for rMuVs harbouring batMuV F and hMuV HN. Replacement of the hMuV F and HN genes or the HN gene alone by the corresponding batMuV genes led to a slight reduction in neurovirulence of the highly neurovirulent backbone strain. Neutralizing antibodies inhibited infection mediated by all recombinant viruses generated. Furthermore, group IV anti-MuV antibodies inhibited the neuraminidase activity of bat-derived HN. Our study reports the successful generation of chimeric MuVs expressing the F and HN proteins of batMuV, providing a means for further examination of this novel batMuV. https://jgv.microbiologyresearch.org/content/journal/jgv/10.1099/jgv.0.000596#tab2

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Publikation 5: Krüger N, Sauder C, Hüttl S, Papies JP, Voigt K, Herrler G, Hardes K, Steinmetzer T, Örvell C, Drexler JF, Drosten C, Rubin S, Müller MA, Hoffmann M (2018). Entry, replication, immune evasion and neurotoxicity of synthetically-engineered bat-borne mumps virus. Cell Rep. 2018 Oct 9;25(2):312-320.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2018.09.018.

Abstract Bats harbor a plethora of viruses with an unknown zoonotic potential. In-depth functional characterization of such viruses is often hampered by a lack of virus isolates. The genome of a virus closely related to human mumps viruses (hMuV) was detected in African fruit bats, batMuV. Efforts to characterize batMuV were based on directed expression of the batMuV glycoproteins or use of recombinant chimeric hMuVs harboring batMuV glycoprotein. Although these studies provided initial insights into the functionality of batMuV glycoproteins, the host range, replication competence, immunomodulatory functions, virulence, and zoonotic potential of batMuV remained elusive. Here, we report the successful rescue of recombinant batMuV. BatMuV infects human cells, is largely resistant to the host interferon response, blocks interferon induction and TNF-a activation, and is neurotoxic in rats. Anti- hMuV antibodies efficiently neutralize batMuV. The striking similarities between hMuV and batMuV point at the putative zoonotic potential of batMuV.

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.09.018

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Publikation 6: Hoffmann M, Nehlmeier I, Brinkmann C, Krähling V, Behner L, Moldenhauer AS, Krüger N, Nehls J, Schindler M, Maisner A, Becker S, Pöhlmann S (2018). Tetherin inhibits replication of Ebola virus and Nipah virus in fruit bat cells. J Virol. 2018 93:e01821-18. doi: 10.1128/JVI.01821-18.

Abstract Ebola virus (EBOV) and Nipah virus (NiV) infection of humans can cause fatal disease and constitutes a public health threat. In contrast, EBOV and NiV infection of fruit bats, the putative (EBOV) or proven (NiV) natural reservoir, is not associated with disease, and it is currently unknown how these animals control the virus. The human interferon (IFN)- stimulated antiviral effector protein tetherin (CD317, BST-2) blocks release of EBOV- and NiV- like particles from cells and is counteracted by the EBOV glycoprotein (GP). In contrast, it is unknown whether fruit bat tetherin restricts virus infection and is susceptible to GP-driven antagonism. Here, we report the sequence of fruit bat tetherin and show that its expression is IFN stimulated and associated with strong antiviral activity. Moreover, we demonstrate that EBOV-GP antagonizes tetherin orthologues of diverse species but fails to efficiently counteract fruit bat tetherin in virus-like particle (VLP) release assays. However, unexpectedly, tetherin was dispensable for robust IFN-mediated inhibition of EBOV spread in fruit bat cells. Thus, the VLP-based model systems mimicking tetherin-mediated inhibition of EBOV release and its counteraction by GP seem not to adequately reflect all aspects of EBOV release from IFN- stimulated fruit bat cells, potentially due to differences in tetherin expression levels that could not be resolved by the present study. In contrast, tetherin expression was essential for IFN- dependent inhibition of NiV infection, demonstrating that IFN-induced fruit bat tetherin exerts antiviral activity and may critically contribute to control of NiV and potentially other highly virulent viruses in infected animals.

Importance Ebola virus and Nipah virus (EBOV and NiV) can cause fatal disease in humans. In contrast, infected fruit bats do not develop symptoms but can transmit the virus to humans. Why fruit bats but not humans control infection is largely unknown. Tetherin is an antiviral host cell protein and is counteracted by the EBOV glycoprotein in human cells. Here, employing model

Publikationen - 96 - systems, we show that tetherin of fruit bats displays higher antiviral activity than human tetherin and is largely resistant against counteraction by the Ebola virus glycoprotein. Moreover, we demonstrate that induction of tetherin expression is critical for interferon- mediated inhibition of NiV but, for at present unknown reasons, not EBOV spread in fruit bat cells. Collectively, our findings identify tetherin as an antiviral effector of innate immune responses in fruit bats, which might allow these animals to control infection

https://doi.org/10.1128/JVI.01821-18