Sesquiterpenlactone: Neuronale Netze Als QSAR-Modell Sowie Pharmakokinetische Untersuchungen Am Beispiel Von

Sesquiterpenlactone: Neuronale Netze als QSAR-Modell sowie pharmakokinetische Untersuchungen am Beispiel von

Arnica montana

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

vorgelegt von Steffen Wagner aus Schweina

Mai 2006

Dekan: Prof. Dr. A. Bechthold Leiterin der Arbeit: Prof. Dr. I. Merfort Referentin: Prof. Dr. I. Merfort Koreferent: Prof. Dr. R. Schubert Dritter Prüfer: Prof. Dr. M. Jung

Tag der Verkündigung des Prüfungsergebnisses: 06. Juli 2006

Teile dieser Arbeit wurden in folgenden Publikationen, Kurzvorträgen und Posterpräsentionen veröffentlicht:

Publikationen

Wagner, S., Kratz, F. und Merfort, I. (2004): In vitro behaviour of sesquiterpene lactones and sesquiterpene lactone containing plant preparations in human blood, plasma and human serum albumin solutions; Planta Medica 70 227-233

Wagner, S., Suter, A. und Merfort, I. (2004): Skin penetration studies of Arnica preparations and of their sesquiterpene lactones; Planta Medica 70 897-903

Wagner, S., Hofmann, A., Siedle, B., Terfloth, L., Merfort, I. und Gasteiger, J. (2006): Development of a structural model for NF-kappaB inhibition of sesquiterpene lactones using self-organizing neural networks; Journal of Medicinal Chemistry 49 2241-2252

Wagner, S., Merfort, I. (2006): Skin penetration behaviour of sesquiterpene lactones from different Arnica preparations using a validated GC-MSD method; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (eingereicht)

Wagner,S., Reich,E., Merfort,I. (2006): HPTLC – a useful tool for the quality control of plant extracts of Hedera helix and Capsicum frutescens; (in Vorbereitung)

Kurzvorträge

Wagner, S., Merfort I. (August 2003): Possibilities of modern HPTLC for the analysis of herbals; als Beitrag im Workshop: International harmonization of TLC- procedures for Herbal Drugs, Herbal Drug Preparation and HMB: Trends and concepts; Annual Congress of the Society for Medicinal Plant Research, Kiel, Deutschland

Wagner, S., Suter, A., Merfort, I. (August 2003): Skin penetration studies of Arnica preparations and of their sesquiterpene lactone; Annual Congress of the Society for Medicinal Plant Research, Kiel, Deutschland

Wagner, S., Suter, A., Merfort, I. (März 2004): Skin penetration studies of Arnica preparations and of their sesquiterpene lactones; Doktorandentagung der DPhG, Freudenstadt-Lauterbach, Deutschland

Merfort, I., Martin, S., Lass, C., Wagner, S., Schempp, C. (April 2005): The allergenic sesquiterpene lactones and the transcription factor NF-κB; 19th Meeting of the ERGECD, Flörsheim, Deutschland

Wagner, S., Hofmann, A., Siedle, B., Merfort, I. und Gasteiger, J. (Mai 2005): Neural Networks for the prediction of the NF-κB inhibitory activity of sesquiterpene lactones; BioPerspectives 2005, Wiesbaden, Deutschland

Wagner, S., Hofmann, A., Siedle, B., Merfort, I. und Gasteiger, J. (August 2005): Neural networks: Tools for the NF-κB inhibiting sesquiterpene lactones; Annual Congress of the Society for Medicinal Plant Research, Firenze, Italien

Posterpräsentationen

Wagner, S., Reich, E., Merfort, I. (November 2004): Use of modern HPTLC for the qualitiy control of plant extracts; Statusseminar Phytoextrakte – Produkte und Prozesse, Frankfurt, Deutschland

Wagner, S., Hofmann, A., Siedle, B., Terfloth, L., Merfort, I. und Gasteiger, J. (Februar 2006): Development of a structural model for NF-kB inhibition of sesquiterpene lactones using self-organizing neural networks; 18. Irseer Naturstofftage der DECHEMA e.V., Irsee, Deutschland

Für Constance und meine Eltern

Wir sind Zwerge, die auf den Schultern von Riesen sitzen. Wir können mehr und weiter sehen, nicht, weil wir einen schärferen Blick oder eine stattlichere Gestalt, sondern weil deren Größe bewirkt, dass wir gehoben und getragen werden.

Bernhard von Chartres (gest. um 1130)

INHALTSVERZEICHNIS I

INHALTSVERZEICHNIS

I. Einleitung ______1

I.1. Sesquiterpenlactone – eine besondere Gruppe von pflanzlichen Sekundärstoffen ______1

I.2. Sesquiterpenlactone - Leitstrukturen für antiphlogistische Arzneistoffe? ______4

I.3. Arnica montana L. - Pharmakokinetische Untersuchungen über eine traditionelle Arzneipflanze______6

I.4. Validierte analytische Methoden ______8

II. Ergebnisse ______1

II.1. Einblicke in die Struktur-Wirkungsbeziehungen von SLs und ihrer Hemmaktivität gegenüber von NF-κB ______13 II.1.1. Der Datensatz______13 II.1.2. Überlagerungen von 3D-optimierten Strukturen der Sesquiterpenlactone ______16 II.1.3. Betrachtung intramolekularer Abstände mittels RDF-transformierter 3D-Strukturen ______18 II.1.4. Künstliche Neuronale Netze______22 II.1.5. Betrachtung von Atomeigenschaften und Oberflächenpotentialen im Kohonen Netz ______31 II.1.6. Die Suche nach dem besten Modell ______35

II.1.7. Bewertung des besten Modells „χπ + HBP + χπ(L-RDF)“ ______41

II.2. Bindung von Sesquiterpenlactonen an Blutbestandteile______47 II.2.1. Kurzer Überblick über den Aufbau des Blutes______47 II.2.2. Die Bindung von Parthenolid an HSA steigt bei längeren Inkubationszeiten und zunehmenden HSA-Konzentrationen______50 II.2.3. Die Sesquiterpenlactone SL1 bis SL4 und die Arnikatinkturen T1 bis T3 binden in unterschiedlichem Ausmaß an HSA ______52 II INHALTSVERZEICHNIS

II.2.4. Bindungsverhalten der Sesquiterpenlactone SL1 bis SL4 und der Arnikatinkturen T1 bis T3 gegenüber Plasma ______55 II.2.5. Bindungsverhalten der Sesquiterpenlactone SL1 bis SL4 und der Arnikatinkturen T1 bis T3 gegenüber Blut ______56 II.2.6. Bindungsverhalten von 11β-Glutathionyl-parthenolid (SL5) an HSA56 II.2.7. Betrachtung der Reaktionskinetik von Parthenolid gegenüber HSA 58 II.2.8. Effekt der Sesquiterpenlactone SL1, SL2 und SL4 auf die Thiol-Gruppen des HSA______62 II.2.9. Bestimmung des ungebundenen Anteils an Parthenolid nach Inkubation mit HSA mittels Ausschluß-HPLC______63

II.3. Penetrationsverhalten von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana L. 65 II.3.1. Überblick über den Aufbau der humanen Haut und Grundlagen der Penetration ______65 II.3.2. Sesquiterpenlactone penetrieren in und permeieren durch die Hornhaut ______68 II.3.3. Sesquiterpenlactone in Tinkturen penetrieren besser als isolierte SLs ______71 II.3.4. Ein Thymol-Derivat zeigt nur eine geringe Enhancer-Wirkung ____ 72 II.3.5. Sesquiterpenlactone in Arnikazubereitungen zeigen eine ausreichende Penetration und Permeation ______73 II.3.6. Eine Erhöhung der SL-Konzentration führt zu einer im gleichen Maßen erhöhten Menge an penetrierten SL ______75 II.3.7. Längere Inkubationszeiten verschlechtern die Penetration von SLs in dem Gel-Präparat Z4______77 II.3.8. Bei Verwendung der Salben-Zubereitung Z6 bleibt die Penetration der SLs über 4h konstant ______78 II.3.9. Untersuchung der Penetration nach wiederholter Applikation von SLs in dem Gel-Präparat Z4______80

II.4. Entwicklung und Validierung von quantitativen Analysenmethoden ______81

INHALTSVERZEICHNIS III

II.4.1. GC-MS-Analytik zur Quantifizierung von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana L.______81 II.4.2. HPTLC-Analytik zur Quantifizierung von 11β-Glutathionyl- parthenolid ______88 II.4.3. HPTLC-Analytik zur Quantifizierung von Capsaicin in Capsicum frutescens L. ______91 II.4.4. HPTLC-Analytik zur Quantifizierung von α-Hederin und Hederacosid C in Hedera helix L. ______95

III. Zusammenfassung der Ergebnisse ______103

III.1. Untersuchungen zu Struktur-Wirkungsbeziehungen von SLs und ihrer Hemmaktivität gegenüber NF-κB ______103

III.2. Bindung von Sesquiterpenlactonen an Blutbestandteile______104

III.3. Penetrationsverhalten von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana L. 105

III.4. Entwicklung und Validierung von quantitativen Analysenmethoden ______106

IV. Diskussion ______107

IV.1. Untersuchungen zu Struktur-Wirkungsbeziehungen von SLs und ihrer Hemmaktivität gegenüber von NF-κB ______107 IV.1.1. Counterpropagation Neuronale Netze als QSAR-Modell ______107 IV.1.2. Strukturelle Informationen des Modells für die NF-κB Hemmaktivität ______109 IV.1.3. Verwendung des QSAR-Modells zur Aktivitätsvorhersage und zur Leitstruktursuche ______115

IV.2. Bindung von Sesquiterpenlactonen an Blutbestandteile______116 IV.2.1. Verhalten der SLs und Tinkturen gegenüber HSA und Plasma ___ 117 IV.2.2. Bindungstellen von Sesquiterpenlactonen im HSA-Molekül _____ 120 IV.2.3. Das Verhalten von SLs und Tinkturen gegenüber Blut sowie die Auswirkung auf ihre biologische Aktivität______121

IV INHALTSVERZEICHNIS

IV.3. Penetrationsverhalten von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana L. 123 IV.3.1. Die isolierten Sesquiterpenlactone zeigen ein unterschiedliches Penetrationsverhalten______123 IV.3.2. Sesquiterpenlactone in Tinkturen zeigen eine verbesserte Penetration ______124 IV.3.3. Das Penetrationsverhalten der Sesquiterpenlactone in verschiedenen Zubereitungen ______126 IV.3.4. Das Penetrationsverhalten von SLs in der mit SLs angereicherten Zubereitung Z7 ______127 IV.3.5. Einfluß längerer Inkubationszeiten auf die Penetration von SLs in Gel- und Salben-Zubereitungen ______127

IV.4. Entwicklung und Validierung von quantitativen Analysenmethoden ______128

V. Material und Methoden ______131

V.1. Material und Methoden für die Berechnung der Neuronalen Netzwerke 131 V.1.1. Datensatz ______131 V.1.2. Generation der 3D-Struktur______135 V.1.3. Überlagerung von 3D-Strukturen______135 V.1.4. verwendete Atomeigenschaften______137 V.1.5. Verwendete Oberflächenpotentiale ______142 V.1.6. Berechnung der 3D-Strukturdeskriptoren______143 V.1.7. Reduktion der Deskriptorenanzahl und Normalisierung______145 V.1.8. Generierung von selbst-organisierenden Neuronalen Netzwerken 145 V.1.9. Suche nach gut clusternden Eigenschaften ______146 V.1.10. Validierung______148

V.2. Charakterisierung der experimentell verwendeten Sesquiterpenlactone, Tinkturen und Zubereitungen ______149

INHALTSVERZEICHNIS V

V.3. Bestimmung des Sesquiterpenlacton-Gehaltes in den Tinkturen und Zubereitungen ______154 V.3.1. Tinktur und Zubereitung Z1 (verdünnte Tinktur)______154 V.3.2. Gel (Z5)______154 V.3.3. Salben (Z6 und Z7) ______154

V.4. Studien zur Bindung an Blutbestandteile______155 V.4.1. Gewinnung von Blut und Plasma______155 V.4.2. Humanes Serumalbumin (HSA) ______155 V.4.3. Untersuchung des Bindungsverhaltens der Sesquiterpenlactone in HSA-Lösungen, Plasma und Blut mittels Proteinfällung ______156 V.4.4. Bindungsverhalten von 11β-Glutathionyl-parthenolid (SL5) mit humanem Serumalbumin ______156 V.4.5. Bindungsverhalten von Parthenolid (SL4) mit humanem Serumalbumin mittels Ausschluss-HPLC-Analytik ______157 V.4.6. Photometrische Bestimmung von freien Thiol-Gruppen ______158

V.5. Studien zur Hautpenetration ______159 V.5.1. Untersuchungslösungen und –zubereitungen ______159 V.5.2. Monoterpen aus Arnikatinktur ______160 V.5.3. Haut-Penetrations-Studien ______160 V.5.4. Datenanalyse ______162

V.6. Chromatographische Methoden ______164 V.6.1. GC-MS Methode zur Bestimmung von Sesquiterpenlactonen_____ 164 V.6.2. HPLC-Methode zur Bestimmung von Parthenolid (SL4) in HSA- Matrix ______165 V.6.3. HPTLC-System ______165

VI. Literatur ______167

VII. Anhang ______188

VII.1. Chemikalien ______189

VII.2. Verbrauchsmaterialien ______190

VII.3. Geräte ______190

VI INHALTSVERZEICHNIS

VII.4. Software ______191

VII.5. Standardmischungen______191 VII.5.1. Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz ______191 VII.5.2. Vanillin-Schwefelsäure-Reagenz ______192 VII.5.3. Vanillin-Phosphorsäure-Reagenz ______192 VII.5.4. Thymol-Schwefelsäure-Reagenz______192 VII.5.5. Schwefelsäure-Reagenz ______192

VII.6. Abkürzungen ______192

EINLEITUNG 1

I. EINLEITUNG

I.1. Sesquiterpenlactone – eine besondere Gruppe von pflanzlichen Sekundärstoffen

Als Sekundärstoffe oder sekundäre Metabolite bezeichnet man Substanzen, die nicht essentiell wichtig für das Wachstum und die Entwicklung eines Organismus sind. Besonders Pflanzen sind durch ihre Vielfalt an Sekundärstoffen gekennzeichnet und grenzen sich damit z.B. von tierischen Organismen ab. So wurden bisher mehr als 7000 verschiedene Alkaloide aus Pflanzen, aber nur 50 aus Tieren identifiziert. Der biologische Sinn dieser Sekundärstoffe ist nicht immer sofort erkennbar. Daher sah man früher diese Stoffe als unnütze oder toxische End- oder Nebenprodukte des Stoffwechsels an, die in einer Art innerer Exkretion in der Pflanze (end-)gelagert wurden. Heute glaubt man, dass sich pflanzliche Sekundärstoffe als Folge einer intensiven Interaktion zwischen Pflanzen und ihrer Umwelt – insbesondere Fressfeinden, Parasiten etc. – entwickelt haben und dass diese Stoffe somit wichtige ökologische Funktionen wahrnehmen. Ein lebhafter Sekundär-Metabolismus fällt besonders bei den Angiospermae auf, wobei das Auftreten bestimmter Stoffgruppen in einer Pflanze abhängig von der phylogenetischen Stellung dieser Pflanze ist. So zeigt sich, dass die bei ursprünglichen Angiospermen vorherrschenden Derivate des Shikimisäureweges zunehmend durch solche des Mevalonsäure-Acetatweges ersetzt werden (Abbildung I-1). In Übereinstimmung damit fehlen bei den am weitesten entwickelten Ordnungen der Araliales, Campanulales und Asterales weitgehend Gerbstoffe. An ihre Stelle sind spezifisch wirksamere Verbindungen wie Polyacetylenverbindungen und Sesquiterpenlactone getreten.

2 EINLEITUNG

Abbildung I-1. Verteilung wichtiger biogenetischer Gruppen von sekundären Pflanzenstoffen von ursprünglichen (links) zu abgeleiteten (rechts) Angiospermen. Das Schema zeigt, dass Derivate des Shikimisäureweges (punktiert) zunehmend von solchen des Mevalonsäure- Acetatweges (gestreift) ersetzt werden. (Frohne und Jensen 1998) entnommen.

Geht man davon aus, dass diese spezifischen Gift- und Abwehrstoffe durch eine intensive evolutionäre Interaktion zwischen Pflanzen und Tieren entstanden, wird das weite Spektrum an biologischen und pharmakologischen Wirkungen erklärbar. So zeigen Sesquiterpenlactone (SLs) neben ihrer allgemeinen fraßhemmenden Wirkung infolge ihres bitteren Geschmacks insbesondere cytotoxische, antitumorale, antibakterielle, antifungale, parasitizide, anthelmintische, molluscizide, antiphlogistische, antihyperlipidämische, atemanaleptische, migränehemmende und kardiotonische Eigenschaften (Fischer 1991; Schmidt 1999b; Willuhn 1987). Besonders die antiinflammatorische Aktivität der SLs konnte bereits in vielen in-vivo, in-vitro- und ex-vivo Studien nachgewiesen werden. So konnte schon früh gezeigt werden, dass verschiedene SLs antiphlogistische und antiarthritische Effekte im Carageenan- Rattenpfotenödem-Test und Adjuvans-Arthritis-Test besitzen (Hall et al. 1979). Um die antiphlogistische Aktivität auf molekularer Ebene zu verstehen, wurden zahlreiche Studien durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass SLs die Transkriptionsfaktoren NF-κB, NF-AT und AP-1 in mikromolaren Konzentrationen

EINLEITUNG 3 hemmen (Bork et al. 1997; Garcia-Pineres et al. 2001; Hehner et al. 1999; Klaas et al. 2002; Lyss et al. 1997; Mazor et al. 2000; Ruengeler et al. 1999; Wong und Menendez 1999). Im Arbeitskreis Merfort erfolgte der Nachweis, dass die Hemmung von NF-κB durch eine selektive Alkylierung von Cystein-38 in der DNA bindenden Domäne der p65- Untereinheit erfolgt (Garcia-Pineres et al. 2001; Lyss et al. 1998; Lyss et al. 1997). NF-κB reguliert als ein zentraler Mediator im Entzündungsgeschehen eine Vielzahl von proinflammatorischen und inflammatorischen Genen (Pahl 1999) und spielt somit eine zentrale Rolle bei der beobachteten entzündungshemmenden Eigenschaft von vielen Sesquiterpenlactonen (Abbildung I-2).

P Nemo P IκB IκB IKIKKaK-a IKK-ß p50 p65 IκB-Kinase p50 p65 inaktives Komplex Sesquiterpenlacton Heterodimer Ub-Konjugation IκB Abspaltung P P IκB Ub p50 p65 Ub Ub p50 p65 aktives IκB Heterodimer

p50 p65 Transcription von Cytoplasma Target genen GGGGACTTTCC z.B. Cytokine (IL-1, IL-2, IL-6, TNF-a), Nucleus Zelladhesionsmoleküle, Cyclooxygenase-II, iNO-Synthase

Abbildung I-2. Vereinfachte Darstellung der NF-κB-Kaskade und der Eingriff von Sesquiterpenlactonen in selbige.Ub=Ubiquinon. (Merfort 2003) entnommen.

Für die Alkylierung der p65-Untereinheit sind α,β-ungesättigte Carbonylstrukturen verantwortlich, wie sie als α-Methylen-γ-Lactongruppen oder α,β-ungesättigte Ketone vielfach in Sesquiterpenenlactonen auftreten (Abbildung I-3). Diese nach Art einer Michael-Addition ablaufende Alkylierung findet auch mit anderen biologischen Sulfhydrylgruppen, wie z.B. mit denjenigen im Glutathion, statt.

4 EINLEITUNG

δ+ H p65 -SH O

O δ− p65 O HS - p65 δ− OH S δ+ H H O O O O O OH O OH p65 S

Abbildung I-3. Molekularer Mechanismus der NF-κB-Hemmung durch Helenalin, einem Sesquiterpenlacton aus Arnica montana. Es erfolgt die Alkylierung der SH-Gruppe von Cystein- 38 in der p65 Untereinheit nach Art einer Michael-Addition. Beide α,β-ungesättigten Strukturen scheinen an dieser Alkylierung beteiligt zu sein, wenn auch die Exomethylengruppe des Lactons aktiver ist.

I.2. Sesquiterpenlactone - Leitstrukturen für antiphlogistische Arzneistoffe?

Sekundäre Naturstoffe bilden nach wie vor eine reiche, erfolgsversprechende und auch profitable Quelle bei der Arzneimittelentwicklung (Brewer 2000; Newman et al. 2003). So besitzen 61 % aller zwischen 1981 und 2001 in die Therapie neu eingeführten „kleinen“ Moleküle (d.h. unter Ausschluß von Proteinen/Peptiden) als Vorbild einen Naturstoff, seien sie auch selber partial- oder vollsynthetisch hergestellt (Newman et al. 2003). Die Vorteile, die sich bei der Nutzung von Naturstoffen zur Leitstruktursuche ergeben, liegen zum einen in ihrer hohen Diversität im chemischen Raum. Zum anderen sind sie im Laufe der Evolution für Interaktionen mit Rezeptoren - wie oben dargelegt - entwickelt und optimiert worden. So konnte die Effizienz einer computergestützten Suche nach COX- Inhibitoren auf der Basis einer 3D-Datenbank mit über 40,000 Naturstoffen gezeigt werden (Rollinger et al. 2004). Eine Kombination von Ethnopharmakologie und Bioinformatik führte auch bei der Leitstruktursuche von Phospholipase A2 Inhibitoren zum Erfolg (Bernard et al. 2001). Sesquiterpenlactone bilden mit über 4000 bekannten Strukturen eine der größten Gruppen an Sekundärstoffen (Schmidt 1999b). Dieser Reichtum an strukturellen

EINLEITUNG 5

Variationen (Abbildung I-4) und ihr bekannter molekularer Mechanismus zur NF-κB Hemmung machen diese Gruppe zu einem vielversprechenden Ausgangspunkt für die Suche und Entwicklung von antiphlogistischen Arzneimitteln.

OO O O O O O O O abcd

O O O O O O efg

Abbildung I-4. Auswahl an Grundstrukturen der Sesquiterpenlactone. Gezeigt sind die Grundkörper der Germacranolide (a), Heliangolide (b), Guaianolide (c und d), Pseudoguaianolide (e), Hypocretenolide (f) und Eudesmanolide (g). Diese Grundstrukturen werden vielfältig variiert durch den Einbau von funktionellen Gruppen. Zu berücksichtigen ist auch, dass der Ringschluss zum Lactonring zu unterschiedlichen C-Atomen erfolgen kann, wie es bei den Guaianolid-Grundstrukturen (c und d) gezeigt ist.

Grundlage jedweder Leitstruktursuche sind Quantitative Struktur-Aktivitäts- Untersuchungen. Anhand kleiner Datensätze konnte schon recht früh die Bedeutung der α-Methylen-γ-lacton-Gruppierung für die biologische Aktivität der Sesquiterpene gezeigt werden (Hall et al. 1979; Hladon et al. 1978; Kupchan et al. 1971; Ruengeler et al. 1999; Schmidt 1999a). Auch die Bedeutung zusätzlicher α,β-ungesättigter Carbonylgruppen sowie von Epoxygruppen etc. konnte in früheren Arbeiten demonstriert werden (Hladon et al. 1978; Ruengeler et al. 1999). Bei all diesen Arbeiten fanden jedoch nur kleine Datensätze Verwendung bzw. es wurden nur bestimmte Gruppen von Sesquiterpenlactonen in die Untersuchungen mitaufgenommen. Im Laufe der Jahre konnte im Arbeitskreis Merfort ein Datensatz von 103 Sesquiterpenlactonen mit den dazugehörigen NF-κB Hemmaktivitäten zusammengestellt werden. Siedle et al. führte mit diesem ausreichend großen Datensatz erstmals klassische QSAR-Untersuchungen durch. Sie konnte die oben erwähnten Beobachtungen bestätigen und weitere wichtige Deskriptoren ausmachen (Siedle et al. 2004). Dies waren vor allem das ganze Molekül beschreibende Eigenschaften wie die Elektronenaffinität und topologische Deskriptoren. Um eine ausreichende gute Korrelation der Struktur-Aktivitäts-Beziehung zu erreichen, war allerdings eine Unterteilung des Datensatzes in einzelne Grundstrukturen notwendig

6 EINLEITUNG

(Siedle et al. 2004). Dies könnte auf die Verwendung von Deskriptoren zurückzuführen sein, die das ganze Molekül beschreiben, nicht aber die 3- dimensionale Struktur dieser Moleküle im einzelnen. Ziel dieser Arbeit soll es nun sein, weitere Einblicke in die Struktur-Aktivitäts- Beziehung zu gewinnen. Unter Verwendung von Deskriptoren, die die 3- dimensionale Struktur beschreiben und unter Zuhilfenahme von neuronalen Netzen soll ein Modell erstellt werden, das zur Aktivitätsvorhersage neuer Sesquiterpenlactone sowie zur Entwicklung und Optimierung von Leitstrukturen für zukünftige antiphlogistische Wirkstoffe dienen soll.

I.3. Arnica montana L. - Pharmakokinetische Untersuchungen über eine traditionelle Arzneipflanze

Ein Großteil der über 4,000 bekannten Sesquiterpenlactone wurde aus Pflanzen der Familie der Asteraceae isoliert. Eine ganze Reihe von Spezies dieser Familie wird in der traditionellen Medizin bei (im weitesten Sinne) entzündlichen Erkrankungen eingesetzt. Hierzu zählen z.B. die in Europa verbreitete Arnica montana L., wie auch die in Mittel- und Südamerika beheimatete Mikania micrantha H.B.K sowie Saussurea lappa Clarke, eine in Asien beheimatete Pflanze. Zubereitungen aus Arnica montana sind darüber hinaus von der Kommission E und der ESCOP (European Scientific Cooperative on Phytotherapy) für Anwendungsgebiete wie Behandlung von Verletzungs- und Unfallfolgen (Hämatomen, Quetschungen, Prellungen) als auch von rheumatischen Muskel- und Gelenkbeschwerden positiv bewertet worden (German Commision E 2004). Erste Klinische Prüfungen bestätigten die Zweckmäßigkeit der Anwendung von Arnikazubereitungen bei entzündlichen Erkrankungen (Knuesel et al. 2002). Lyss et al. konnten nicht nur die NF-κB Hemmaktivität der in Arnica montana vorkommenden Sesquiterpenlactone (Lyss et al. 1998; Lyss et al. 1997), sondern auch eine Wirkung der in den Zubereitungen verwendeten Arnikatinkturen zeigen (Klaas et al. 2002; Lyss et al. 1999). Dabei spielte für die Aktivität die Herkunft der Arnikablüten eine entscheidende Rolle. Von Arnica montana existieren verschiedene

EINLEITUNG 7

Chemotypen, die sich in ihrem Sesquiterpenspektrum unterscheiden (Willuhn et al. 1994; Willuhn und Leven 1991a). So ist ein in Spanien vorkommender Chemotyp durch das Vorkommen von 11α,13-Dihydrohelenalinestern gekennzeichnet, wohingegen in dem in Mitteleuropa vorkommenden Chemotyp Helenalinester dominieren (Abbildung I-5). Dabei zeigte sich in Zellversuchen, dass die 11α,13- Dihydrohelenalinester, die nur eine α,β-ungesättigte Carbonylfunktion besitzen, eine geringere Hemmaktivität gegen NF-κB besitzen als die mit zwei α,β-ungesättigten Carbonylfunktionen ausgestatteten Helenalinester. Diese Aktivitätsverhältnisse zeigten sich in einem ähnlichen Ausmaß auch für die entsprechenden Tinkturen.

H H O O O O OH O OH O

Helenalin 11α,13-Dihydrohelenalin

Abbildung I-5. Die beiden Grundkörper der in verschiedenen Arnica-Chemotypen dominierenden Sesquiterpenlactone. Die genuin in der Pflanze vorkommenden Derivate sind an der OH-Gruppe mit verschiedenen kurzkettigen Säuren (Essigsäure, Methacrylsäure, Isobuttersäure u.a.) verestert.

In einer Arbeit von Humar et al. (Humar et al. 2003) wurden verschiedene Sesquiterpenlactone – unter anderem auch 11α,13-Dihydrohelenalinester – auf die Beeinflussung der CD69- und IL-2-Bildung im Vollblut untersucht. Hierbei zeigte sich ein Verhalten, welches im Widerspruch zu den Aktivitäten gegen NF-κB steht. Die monofunktionellen 11α,13-Dihydrohelenalinester zeigten eine höhere Aktivität als bifunktionelle Sesquiterpenlactone wie Parthenolid. Somit scheint die relative Aktivität von mono- und bifunktionellen Sesquiterpenlactonen sehr stark von den eingesetzten Matrices (Zellsuspension vs. Vollblut) abzuhängen. Um diesen Widerspruch aufzuklären, sind Bindungsstudien an Vollblut, Plasma und Humanem Serum Albumin notwendig. Diese Untersuchungen können Hinweise liefern, ob bei der üblichen lokalen Applikation eine für die Wirkung notwendige Konzentration an Sesquiterpenlactonen am Entzündungsherd erreichbar ist - oder ob die notwendige Konzentration durch Reaktion der Sesquiterpenlactone mit Bestandteilen des Blutes verhindert wird.

8 EINLEITUNG

Zubereitungen aus Arnikablüten werden, wie erwähnt, nur äußerlich zur lokalen Applikation angewendet. Eine innere Anwendung verbietet sich hinsichtlich ihrer carditonischen und atemanaleptischen (Neben-)Wirkungen (Merfort 2003). Obwohl die antiphlogistische Wirkung von Arnikazubereitungen sowohl auf molekularer Ebene, in Zellmodellen als auch in klinischen Studien gut belegt ist, fehlen Untersuchungen zur Hautpenetration der wirksamkeitsbestimmenden Sequiterpenlactone. Diese Untersuchungen sind wichtig, da neben der Verwendung unterschiedlicher Chemotypen auch unterschiedliche Extrakte verarbeitet werden, wie wässrig-ethanolische Extrakte als auch ölige Auszüge. Zur vergleichenden Penetrationsuntersuchung verschiedener Zubereitungen kann ein Stripping-Test mit Schweinehaut als Modell für die menschliche Haut verwendet werden. Obwohl eine ganze Reihe an beträchtlichen Unterschieden zwischen der Haut von Mensch und Hausschwein bestehen (Montagna und Yun 1964), existieren Ähnlichkeiten in der epidermalen Dicke und im Aufbau (Meyer et al. 1978; Montagna und Yun 1964), in der Hautstruktur (Marcarian und Calhoun 1966), im Lipidgehalt (Gray und Yardley 1975; Nicolaides et al. 1968) und der allgemeinen Morphologie (Meyer et al. 1978). Diese sind zurückzuführen auf strukturelle und funktionelle Veränderungen der Haut während der Domestikation des Schweines, was z. B. zur fehlenden bzw. geringen Behaarung geführt hat (Meyer et al. 1978). Vor allem hinsichtlich des Aufbaues des permeationsbestimmenden Stratum corneums bestehen Ähnlichkeiten. So ist der Prozeß der Erneuerung der Epidermis und somit auch des Stratum corneums vergleichbar. Auch die Keratin-Proteine besitzen eine vergleichbare Struktur (Meyer et al. 1978). Zusammenfassend zeigt sich, dass die Hautpermeabilität des Menschen der des Hausschweines weitaus ähnlicher ist als die anderer Species. Dies gilt besonders für lipophile Stoffe (Dick und Scott 1992), zu denen auch Sesquiterpenlactone zu zählen sind.

I.4. Validierte analytische Methoden

Für die quantitative Analytik von Sesquiterpenlactonen wurden eine ganze Reihe von HPLC- und GC-Methoden entwickelt (Merfort 2002). Auch zur Bestimmung der

EINLEITUNG 9

Helenalin- und 11α,13-Dihydrohelenalinderivate in Arnica montana sind sowohl HPLC-Methoden mit UV-Detektion als auch GC-Methoden mit FI-Detektion gebräuchlich (Willuhn und Leven 1991a). Vor allem die GC-Methode hat sich sehr bewährt, da hier eine wesentlich bessere Auftrennung der sehr ähnlichen Derivate möglich ist. Diese Methoden wurden zur Bestimmung der Helenalin- und 11α,13- Dihydrohelenalinderivate in Arnikatinkturen entwickelt, in denen Konzentrationen dieser Sesquiterpenlactone zwischen 0.03 bis 0.2 % (m/V) vorliegen. Bei den hier verwendeten Zubereitungen sind weitaus geringere Mengen (bis unter 0.005 %) zu erwarten. Weiterhin sind diese Zubereitungen durch eine sehr komplizierte Matrix ausgezeichnet, die trotz der bestehenden Aufarbeitungsvorschriften zu Problemen hinsichtlich der Spezifität führt. Um die notwendigen Gehaltsbestimmungen für die einzelnen Zubereitungen durchführen zu können, ist daher die Entwicklung und Validierung einer empfindlicheren und spezifischeren Methode notwendig. Ähnliches gilt für die Bestimmung von Sesquiterpenlactonen in den Hornhaut- Stripps bei den Penetrationsuntersuchungen. Hier ist – besonders beim Testen der Arnikazubereitungen - mit äußerst geringen Konzentrationen zu rechnen. Daher sollte eine aufwändige Aufarbeitung der Proben vermieden und die Vermessung von Proben mit Anteilen der komplexen Matrix möglich sein. Dieses hätte zusätzlich den Vorteil eines geringeren zeitlichen Aufwands. Aus diesen Gründen sollte eine gaschromatographische Auftrennung mit einer massenspektrometrischen Detektion entwickelt und validiert werden.

Sesquiterpenlactone können auch als Glutathionaddukte vorliegen. Diese Derivate besitzen keine verwendbare UV-Absorption und sind auch nicht verdampfbar. Beides macht die Anwendung sowohl einer HPLC-UV- als auch einer GC-Analyse unmöglich. Es könnte aber eine Dünnschichtchromatographische Methode entwickelt werden.

Entgegen gängigen Vorstellungen ist eine quantitative Dünnschichtchromatographie mit einer ausreichenden Genauigkeit durchaus möglich. Hierbei ist neben einer automatischen Auftragung und einer densitometrischen Vermessung vor allem die Verwendung spezieller Platten notwendig, die sich durch kleinere und

10 EINLEITUNG gleichmäßiger verteilte Partikel der stationären Phase auszeichnen. Die sich daraus ergebende moderne, hochleistungsfähige Dünnschichtchromatographie wird in Analogie zur HPLC als high performance thin layer chromatography (HPTLC) bezeichnet. Die Unterschiede der TLC- zu den HPTLC-Platten und die sich daraus ergebenden Vorteile sind in Tabelle I.4-1aufgeführt.

Tabelle I.4-1. Unterschiede zwischen TLC und HPTLC-Platten am Beispiel von Kieselgel als stationäre Phase.

Parameter TLC HPTLC Partikelgröße 10-15 µm 5-7 µm Schichtdicke 250 µm 50-200 µm Entwicklungsdistanz 10-15 cm 3-5 cm Entwicklungszeit 30-200 min 3-20 min Breite der Zonen - am Start 3-6 mm 1-1.5 mm - nach der Entwicklung 6-15 mm 2-5 mm Lösungsmittelverbrauch 50 mL 5-8 mL Bestimmungsgrenze - Absorption 100-1000 ng 10-100 ng - Fluoreszens 1-100 ng 0.1-10 ng Anzahl zu trennender max. 12 max. 32 Substanzen

Die Verwendbarkeit von HPTLC für Quantifizierungs-Fragestellungen konnte schon vielfach bewiesen werden, z.B. auch für das Sesquiterpenlacton Parthenolid in Zubereitungen aus Tanacetum procumbens (Abourashed 2004). HPTLC-Methoden eignen sich auch für die Routineuntersuchung in der Qualitätskontrolle von pflanzlichen Arzneimitteln. Dabei bietet sie gegenüber der HPLC bei vergleichbarer Genauigkeit eine Reihe von Vorteilen, wie z.B. einen geringeren Lösungsmittelverbrauch und einen wesentlich geringeren Zeitaufwand. Daher ist die Entwicklung von HPTLC-Methoden zur raschen und kostengünstigen Quantifizierung von Naturstoffen wünschenswert.

Im Speziellen ergeben sich aus den obigen Ausführungen folgende Punkte, die Gegenstand der Arbeit sein sollen: 1. Vergleich von Sesquiterpenlactonen durch Überlagerung ihrer 3D-Strukturen und durch Transformation ihrer 3D-Strukturen in 2-dimensionale Graphen,

EINLEITUNG 11

unter Berücksichtigung von Atomparametern, und Ermittlung wichtiger Strukturparameter für die Hemmung der NF-κB-DNA-Bindung. 2. Erstellung eines QSAR-Modells auf der Basis von Sesquiterpenlactonen mit Hilfe von Neuronalen Netzen zur Leitstruktursuche und –optimierung sowie zur Vorhersage der NF-κB Hemmaktivität von neuen Sesquiterpenlactonen. 3. Untersuchung des Bindungsverhaltens von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana sowie von Parthenolid und seinem Glutathionaddukt zu Humanem Serum Albumin, Serum und Vollblut. Vergleich isolierter mit in verschiedenen Arnikatinkturen vorliegenden Sesquiterpenlactonen. 4. Untersuchungen zur Hautpenetration von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana-Blüten, unter Einbeziehung von isolierten Sesquiterpenlactonen sowie von in Tinkturen verschiedener Chemotypen und in Lotionen, Gelen und Salben vorliegenden Sesquiterpenlactonen. 5. Entwicklung und Validierung einer sensitiven GC-MS Methode zur Quantifizierung von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana. Einsatz dieser Methode sowohl zur Gehaltsbestimmung in Arnikazubereitungen als auch bei den Penetrationsuntersuchungen. 6. Entwicklung und Validierung einer HPTLC-Methode zur Quantifizierung von Parthenolid-11β-glutathionyl in komplexen Matrices, wie Humanem Serum Albumin und Blutserum. 7. Entwicklung und Validierung einer HPTLC-Methode zur Quantifizierung der Wirkstoffe in Früchten von Capsicum frutescens L. und in Blättern von Hedera helix L. als gleichwertiger Ersatz für die bestehenden HPLC-Methoden.

ERGEBNISSE 13

II. ERGEBNISSE

II.1. Einblicke in die Struktur-Wirkungsbeziehungen von SLs und ihrer Hemmaktivität gegenüber von NF-κB

II.1.1. Der Datensatz

Grundlage der folgenden Untersuchungen ist ein Datensatz von 103 SLs aus 6 verschiedenen Strukturklassen mit ihren NF-κB Hemmaktivitäten. Name, Herkunft sowie die Publikation, in der die Aktivität gegenüber NF-κB veröffentlicht wurde, finden sich in Tabelle V-2. Die Strukturen dieser Verbindungen sind im folgendem abgebildet.

HO O OH CH3 HO O HO H O O HO O OH H O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O 1 (2) 2 (2) 3 (2) 4 (5) 5 (2) 6 (3)

CH3 CH3 H O H O H O O O OH H O OH H O OH O O O O O O OH O OH O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O 7 (3) 8 (2) 9 (1) 10 (2) 11 (1) 12 (1)

O O O O O H O H O H O H O H O H O OH H CO O O O 3 O O O E Z Z E Z O

O O O O O O O O O O O O O OH OH OH O OH O OH 13 (2) 14 (1) 15 (2) 16 (2) 17 (1) 18 (1)

O O O H O H O H O O OCH3 O O OH OH O O O O O O O O O O O

O O O O OH O OH O OH O OH OH 19 (4) 20 (2) 21 (1) 22 (6) 23 (4) 24 (4)

O OH OH OH HO O O O O O O O O O O

O O O O OH O O O O O O O O OH O O OH 25 (3) 26 (4) 27 (4) 28 (4) 29 (4) 30 (4)

14 ERGEBNISSE

OH OH OH HO

O O O O O O O H O O

O O O O O O O O O O O HO OH HO O 31 (4) 32 (5) 33 (4) 34 (3) 35 (6) 36 (4)

OH O O H3CO O O O O OH O O O O O O O OH O O O O HO HO O O O O O O O O O O O O 37 (4) 38 (2) 39 (2) 40 (2) 41 (2) 42 (2)

O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O HO H3CO HO O O OH 43 (6) 44 (2) 45 (4) 46 (6) 47 (6) 48 (1)

O O OH O O O O OH O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O OH OH Cl OH O 49 (3) 50 (2) 51 (1) 52 (5) 53 (1) 54 (1)

O H CO H CO O O O O 3 3 O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O H3CO HO OH O O 55 (1) 56 (6) 57 (2) 58 (1) 59 (2) 60 (2)

OH OH O O O H O H Cl O OH O O H H H H H O O O O O O O O O O O O 61 (3) 62 (5) 63 (4) 64 (3) 65 (1) 66 (3)

O H O O O O O O O O O O O O O O O H H O 67 (3) 68 (3) 69 (4) 70 (3) 71 (1) 72 (2)

ERGEBNISSE 15

O O O OH O O OH O O O O H H O O O O O O H H H H O O O O O O O H O O O O O 73 (4) 74 (3) 75 (2) 76 (3) 77 (4) 78 (3)

OH O H O H O H

HO O O H H O O H HO H H H O O O O O O O O O O O OH O OH 79 (6) 80 (4) 81 (5) 82 (6) 83 (2) 84 (6)

H H O O H O O O O O H H H O O O O O O O O O O O O O O O HO O O OH O 85 (6) 86 (4) 87 (3) 88 (3) 89 (6) 90 (5)

O H OH O O OH OH OH O O O

O O O O H H O H O O O O O O O O O 91 (5) 92 (4) 93 (5) 94 (6) 95 (5) 96 (6)

O OH OH OH O O O O O OH OH O O O O H HO H HO H HO H O HO H HO H O O O O O O O O O O O 97 (6) 98 (5) 99 (6) 100 (6) 101 (5) 102 (4)

O O O O O

103 (5)

Abbildung II.1-1. Strukturen der untersuchten Sesquiterpenlactone. In Klammern ist die entsprechende Aktivitätsklasse angegeben.

16 ERGEBNISSE

II.1.2. Überlagerungen von 3D-optimierten Strukturen der Sesquiterpenlactone

In einer Arbeit von Siedle (Siedle 2003) wurde eine Auswahl von 22 SLs aus dem auch in dieser Arbeit untersuchten Datensatz einer Überlagerungsuntersuchung unterzogen. Diese Untersuchung wurde auf alle 103 SLs ausgeweitet. Ziel ist es, die Lage von Struktureinheiten zueinander im 3-dimensionalen Raum zu vergleichen. Da der ungesättigte γ-Lactonring den reaktiven Teil der aktiven Sesquiterpenlactone darstellt, erscheint vor allem die Lage anderer Strukturelemente zu diesem interessant. Die 3D-Optimierung der Strukturen erfolgte mit dem Programm CORINA. Die so energieminimierten SLs wurden mit Hilfe des Programmes GAMMA übereinandergelegt, ohne dass Molekülflexibilitäten berücksichtigt wurden. Es erfolgte jeweils die Überlagerung von 3-5 Molekülen. Da wie oben dargelegt, der γ-Lactonring das zentrale Element ist, dessen Umgebung betrachtet werden soll, wurde das C-Atome 11 der verschiedenen Moleküle immer übereinandergelegt. Dabei erfolgte die Betrachtung der Überlagerungen sowohl innerhalb derselben Aktivitätsklassen als auch innerhalb derselben Strukturklassen. Um Lagebeschreibungen wie „oben“, „unten“, „rechts“ und „links“ bei der Beschreibung der Ergebnisse verwenden zu können, wurden alle Moleküle so angeordnet, dass der γ-Lactonring auf der rechten Seite mit dem Ring-Sauerstoff nach oben zum Liegen kommt (siehe zum Beispiel Abbildung II.1-2). Es zeigte sich, dass bei den Verbindungen der Aktivitätsklassen 1 und 2 (stark aktiv mit IC100 von 5 bzw. 10 oder 12.5 µM) meistens eine Estergruppierung auf der Rückseite des Moleküls in der Nähe der Exomethylen-Gruppe vorhanden ist (Abbildung II.1-2). Außer einer Estergruppierung kommen auch freie Hydroxy- Gruppen vor.

ERGEBNISSE 17

12, 14, 17 21, 48,51 16, 18, 45 41, 42, 59

oben hinten links rechts vorne

unten

oben links vorne hinten rechts

unten

Abbildung II.1-2. Übereinandergelegte SLs (fette Nummern) der Aktivitätsklasse 1 (erste und zweite Spalte) und 2 (dritte und vierte Spalte). In der oberen Reihe sind die SLs so angeordnet, dass der γ-Lactonring rechts mit der Sauerstoffunktion nach oben zu liegen kommt. In der unteren Reihe sind die SLs um 90° nach rechts gedreht. Hier sind die Lactonringe rot, die typischen polaren Gruppierungen grün umschrieben.

Bei den Aktivitätsklassen 4 bis 6 (IC100 von 50, 100, 200 oder 300 µM) waren solche polaren Gruppierungen fast nie vorhanden. Hier lagen entsprechende Gruppen entweder in der Nähe der Sauerstoffunktionen oder in einer Ebene mit dem γ-Lactonring (Abbildung II.1-3).

31, 36, 102 32, 101, 103 79, 89, 100

oben hinten links rechts vorne

unten

oben links

vorne hinten rechts

unten

Abbildung II.1-3. Übereinandergelegte SLs (fette Nummern) der Aktivitätsklasse 4 (erste Spalte) 5 (zweite Spalte) und 6 (dritte Spalte). In der oberen Reihe sind die SLs so angeordnet, dass der γ-Lactonring rechts mit der Sauerstoffunktion nach oben zu liegen kommt. In der unteren Reihe sind die SLs um 90° nach rechts gedreht. Hier sind die Lactonringe rot umschrieben, die für die aktiven SLs typischen polaren Gruppen sind nicht vorhanden.

Bei der Aktivitätsklasse 3 (IC100 von 20 µM) ergibt sich ein uneinheitliches Bild. Diese Ergebnisse bestätigen die von Siedle anhand einer kleinen Auswahl gemachten

18 ERGEBNISSE

Beobachtungen (Siedle et al. 2004). Eine Aufstellung über das Vorhandensein oder das Fehlen einer polaren Gruppierung in der genannten Umgebung der Exomethylengruppe (Abbildung II.1-4) zeigt eindeutig die Präferenz dieser Gruppierung bei den aktiven SLs (Aktivitätsklasse 1 und 2) an. Weitere eindeutige Beziehungen konnten aus den Überlagerungen der Strukturen nicht festgestellt werden.

100

60 ohne polare Gruppierung mit polarer Gruppierung 40 prozentualer Anteil 20

0 123456 Aktivitätsklasse

Abbildung II.1-4. Prozentuale Anteile der SLs mit und ohne polare Gruppierung im Bereich der Exomethylengruppe des γ-Lactons, aufgeschlüsselt nach Aktivitätsklassen. Es ist eine eindeutige Konzentrierung der SLs mit polarer Gruppierung in den Aktivitätsklassen 1 und 2 und ein Fehlen derselben in den Aktivitätsklassen 4 bis 6 festzustellen.

Dieses Ergebnis zeigt, dass für eine starke NF-κB inhibierende Aktivität eine polare Gruppierung eine bestimmte räumliche Anordnung zur Exomethylengruppierung aufweisen muss.

II.1.3. Betrachtung intramolekularer Abstände mittels RDF- transformierter 3D-Strukturen

Die Radiale Verteilungsfunktion (RDF) Um eine allgemeingültige und besser vergleichbare Beschreibung der 3D-Struktur, und damit weitergehende Untersuchungen zu ermöglichen, wurde die 3D-Struktur in eine im 2-dimensionalen Raum graphisch darstellbare Funktion unter Verwendung von verschiedenen Atomeigenschaften transformiert. Steinhauser und Gasteiger entwickelten diese Transformation auf der Basis eines RDF-Codes (radial distribution function), der auf dem Gebiet der Röntgen-

ERGEBNISSE 19 strahlenbeugung weit verbreitet ist. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm RCODE (Computer-Chemie-Centrum Universität Erlangen-Nuremberg 2005c). Der RDF- Code kann als eine Wahrscheinlichkeitsverteilung der zwischenatomaren Abstände rij interpretiert werden, bei der die Atomparameter pi und pj der Atome i und j berücksichtigt werden (Hemmer et al. 1999; Hemmer und Gasteiger 2000b).

N −1 N 2 −B(r −rij ) g(r) = ∑∑pi pje Formel II.1-1 i=>11j

N ist die Anzahl der Atome im Molekül, B ist ein Glättungsfaktor (Gasteiger und Engel 2003). Die erste Summe beschreibt die Entfernung aller Atome j zum „Zentralatom“ i, wobei das Produkt der Atomparameter p von i und j einfließt. Danach wird jedes andere Atom als „Zentralatom“ gewählt, was durch die zweite Summe beschrieben wird. Zur besseren Vorstellung über die Interpretationsmöglichkeiten von g(r) siehe Abbildung II.1-5.

Abbildung II.1-5. g(r) für Helenalin (84) unter Verwendung der π-Atompartialladung qπ. Da dieser Atomparameter nur bei Atomen mit π-Elektronen ungleich null ist, ergibt sich ein sehr übersichtliches Bild mit nur geringen Überlappungen. Wie gezeigt, lassen sich die einzelnen Peaks der Funktion bestimmten Abständen im Molekül zuordnen. g(r) enthält somit die Information über die dreidimensionale Verteilung der Atome im Molekül und ihre Lage zueinander unter Berücksichtigung von qπ .

Die Verteilung der π-Atompartialladung (qπ) im Molekül als wichtiges Kriterium zur Unterscheidung aktiver und weniger aktiver SLs Mit der gleichen Auswahl von 22 SLs konnte Siedle zeigen, dass ein Doppelpeak bei

3.5 Å im RDF-Code unter Verwendung von qπ ein für aktive Substanzen charakteristisches Element darstellt (Siedle 2003). Dieses Ergebnis wurde für alle

20 ERGEBNISSE anderen SLs des Datensatzes überprüft. Weiterhin wurde auf weitere typische Elemente im RDF-Code dieses Atomparameters geachtet. Ein charakteristischer Ausschnitt des RDF-Codes ist in Abbildung II.1-6 gezeigt. Es konnten fünf sehr typische Peaks verschiedenen intramolekularen Abständen von funktionellen Gruppen zugeordnet werden.

O O H O 3.6 Å O O 0.01E O 3.5 Å

O 0.00 O O 2.9 Å O OH O

O -0.01

O RDF-Code g(r) -0.02 2.75 Å O O -0.03 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 2.25 Å Atomabstände r (Å)

Abbildung II.1-6. RDF-Code g(r) unter Berücksichtigung der Atomeigenschaft qπ des SLs 17. Gezeigt sind fünf Peaks und ihre Zuordnung zu bestimmten intramolekularen Abständen.

Der negative Ausschlag bei 2.25 Å tritt bei allen SLs auf. Es existieren hier nur geringe quantitative Unterschiede. Bei einem Atomabstand von 2.9 Å hingegen ist nur dann ein Signal zu erkennen, wenn eine Exomethylengruppe vorhanden ist. Ist diese gesättigt (SLs 35, 84, 89, 90 und 91), dann ist aufgrund eines qπ von 0 am C- Atom kein Ausschlag vorhanden. Da bekanntermaßen nur SLs mit einem α,β- ungesättigten Lacton eine gute Aktivität aufweisen (Siedle et al. 2004), kann das Fehlen dieses „Peaks“ ein Hinweis auf eine fehlende Aktivität geben. Auch bei den Atomabständen 2.75 Å, 3.5 Å und 3.6 Å sind Abhängigkeiten zwischen g(r) und der Aktivität festzustellen. So ist beim Atomabstand von r=2.75 Å eine Konzentrierung von hohen g(2.75 Å)-Werten bzw. von solchen größer null bei den hochaktiven Substanzen festzustellen (Abbildung II.1-7).

ERGEBNISSE 21

3.50

3.00 29 % 23 % 6 % 6 % 2.50

2.00

1.50 g(2.75 Å) 57 % 42 % 41 % 6% 25 % 25 % 1.00

0.50 14 % 35 % 53 % 89 % 75 % 75 % 0.00 123456 Aktivitätsklasse

Abbildung II.1-7. Absolutwerte des RDF-Codes g bei einem Abstand von r=2.75 Å von allen 103 SLs in Abhängigkeit von der Aktivitätsklasse. Wie zu erkennen, nimmt der Anteil der Werte mit |g(2.75 Å)|>0 mit steigender Aktivitätsklasse ab. Besonders hohe Werte von |g(2.75 Å)| sind vor allem bei den Aktivitätsklassen 1 und 2 zu finden.

Die Signale bei den Atomabständen r=3.5 Å und 3.6 Å bilden häufig ein Doppelpeak (Abbildung II.1-6). Wie bereits erwähnt, konnte an einer SLs-Auswahl gezeigt werden, dass das Vorhandensein dieses Doppelpeaks mit einer hohen Hemmaktivität gegenüber von NF-κB korreliert (Siedle 2003). Bei Verwendung des ganzen Datensatzes konnte diese Beobachtung bestätigt werden (Abbildung II.1-8).

12 93 % 69 % 10

4 76 %

|g(3.5 Å)|·|g(3.6 Å)| 44 % 2 42 % 7% 31 % 24 % 56 % 58 % 100 % 0 123456 Aktivitäsklasse

Abbildung II.1-8. Vorhandensein eines Doppelpeaks bei r=3.5 bzw. 3.6 Å bei allen 103 SLs in Abhängigkeit von der Aktivitätsklasse. Das Vorhandensein eines Doppelpeaks wurde durch das Produkt der Absolutwerte des RDF-Codes g bei beiden Abständen beschrieben. Wie zu erkennen, nimmt der Anteil der Werte mit|g(3.5)|·|g(3.6)|>0 mit steigender Aktivitätsklasse ab. Besonders hohe Werte von |g(3.5)|·|g(3.6)| sind vor allem bei den Aktivitätsklassen 1 und 2 zu finden.

22 ERGEBNISSE

Bei allen Vergleichen ist jedoch erkennbar, dass immer nur ein Trend festzustellen ist, dass aber niemals eine vollständige Trennung der Aktivitätsklassen anhand eines RDF-Werts möglich ist. Daher ist es sinnvoll, eine Methode zum Vergleich der RDF- Kurven auszuwählen, die es ermöglicht, Unterschiede nicht nur einzelner Atomabstände sondern der ganzen meist sehr komplexen Kurven herauszuarbeiten. Diese Möglichkeiten eröffnen uns Neuronale Netze, die hochdimensionale Eingabemuster in einen 2-dimensionalen Raum abzubilden vermögen. Da sie als Werkzeuge zur Aufstellung Quantitativer Struktur-Wirkungs-Beziehungen (QSAR) geeignet sind, können mit Hilfe Neuronaler Netze auch RDF-Kurven als Deskriptoren in QSAR-Untersuchungen verwendet werden.

II.1.4. Künstliche Neuronale Netze

Künstliche neuronale Netzte (ANN, artificial neural network) sind informationsverarbeitende Systeme, die aus einer großen Anzahl an Einheiten, den Neuronen, bestehen, die untereinander verbunden sind. Dieses System soll die Informationsverarbeitung im biologischen System „Gehirn“ nachahmen, indem wesentliche Charakteristika der biologischen Nervenzelle auf abstrakte mathematische Modelle übertragen werden. Im biologischen Neuron, der datenverarbeitenden Grundeinheit des Gehirns, werden Signale über die Dendriten empfangen und zum Zellkörper (Soma) geleitet. Dort summieren sich die elektrischen Potentiale auf und führen bei Überschreiten eines Schwellenwertes zur Bildung eines elektrischen Signals, des Ausgabesignals, das über das Axon abgeleitet wird (Abbildung II.1-9). Vergleicht man diesen Ablauf mit denjenigen in künstlichen

Neuronen, wird die Ähnlichkeit beider Systeme deutlich. Die Eingabesignale inpi werden unter Berücksichtigung von Gewichtungsfaktoren wi zur Größe netj aufsummiert.

net j = ∑ wiinpi Formel II.1-2

Die durch diese Propagierungsfunktion (Formel II.1-2) erhaltene Größe netj wird durch eine Transferfunktion in die Größe outj transformiert.

out j = f (net j ) Formel II.1-3

ERGEBNISSE 23

Die Gewichtungsfaktoren wi sind zum Beispiel vergleichbar mit der synaptischen Bahnung im biologischen System und spielen ebenso wie diese eine zentrale Rolle im Lernvorgang.

inpj

w w w w Propagierungs- funktion Transfer- funktion

outj Abbildung II.1-9. Schematischer Aufbau eines Neurons (links; nach http://starklab.slu.edu/PhysioLab/NKPhysioNervesAnswerKey.htm) und das Modell eines künstlichen Neurons (rechts; Abkürzungen siehe Text). Die Pfeile zeigen den Informationsfluss an.

Es existieren viele verschiedene Typen von Neuronalen Netzwerken (zum Beispiel Kohonen-, Hopfield-, Backpropagation- und Counterpropagation-Netzwerke), die sich in ihrer Architektur (d.h. der Verknüpfung und Gestalt der Neuronen) und ihrem Lernverfahren unterscheiden. Allen gemein ist, dass sie nicht für bestimmte Problemstellungen programmiert werden, sondern sich durch Lernbeispiele selbstständig einer gestellten Aufgabe anpassen. Grundsätzlich lassen sich zwei Lernverfahren unterscheiden: das überwachte Lernen (supervised learning) und das nicht-überwachte Lernen (unsupervised learning). Beim überwachten Lernen sind sowohl die Eingabewerte als auch die optimalen Ausgabewerte bekannt. Nach jeder Präsentation der Werte erfolgt die Berechnung der Ausgabewerte. Je nach Abweichung dieser Ausgabewerte vom bekannten Optimum werden alle möglichen Variablen des Netzes korrigiert. Durch wiederholtes Präsentieren erhält das Netz die Fähigkeit zur Generalisierung und kann für neue Eingabewerte Vorhersagen für die Ausgabewerte machen. Bekanntestes Beispiel hierfür sind Backpropagation-Netze (Rumelhart et al. 1986). Im Gegensatz dazu werden beim nicht-überwachten Lernen dem Neuronalen Netz nur Eingabemuster präsentiert. Ziel ist es anhand dieser Muster die Trainingsdaten in Klassen zu unterteilen bzw. Ähnlichkeiten zwischen

24 ERGEBNISSE den Trainingsdaten zu erkennen. Der bekannteste Vertreter dieser Gruppe sind Kohonens selbstorganisierende Karten. Die darauf aufbauenden Counterpropagation-Netze bedienen sich demgegenüber des überwachten Lernens. Beide werden in dieser Arbeit verwendet und daher im folgenden Kapitel kurz dargestellt. Neuronale Netze sind sehr vielseitig einsetzbar. Im Bereich Pharmazie/Chemie finden neben der Aufstellung quantitativer Struktur-Wirkungsbeziehungen (Bayram et al. 2004; Hasegawa et al. 2002; Novic et al. 1997; Polley et al. 2004) Neuronale Netze Verwendung zur Simulierung von Spektren (Gasteiger et al. 1997; Hemmer et al. 1999; Hemmer und Gasteiger 2000a), zur Projektion von Moleküloberflächen und deren Eigenschaften auf 2D-Flächen (Gasteiger et al. 1994; Polanski et al. 1998), zum Design neuer Wirkstoffe (Anzali et al. 1998; Gasteiger et al. 2003; Greaves und Gasteiger 2001; Terfloth und Gasteiger 2001), zur Klassifizierung biologischer und toxikologischer Aktivität (Bucinski et al. 2000; Spycher et al. 2005) sowie zur taxonomischen Klassifizierung (Da Costa et al. 2005).

Kohonen Netzwerk Teuvo Kohonen enwickelte in den 1980er Jahren das Konzept der selbst- organisierenden Karten (SOM, self-organizing map), (Kohonen 1982a; Kohonen 1982b). Diese werden durch nicht-überwachtes Lernen trainiert. Ihre besondere Eigenschaft ist, dass ein mehrdimensionaler Funktionsraum in eine zweidimensionale Karte unter Erhalt der Topologie abgebildet wird. Sie werden daher vor allem zur Visualisierung mehrdimensionaler Räume und zur Klassifizierung verwendet.

Architektur Diese als „Kohonen Netze“ bezeichneten Neuronalen Netze bestehen aus nur einer Schicht Neuronen, die in der Regel in der Form eines rechtwinkligen Gitters angeordnet sind. So ist in der Abbildung II.1-10 das Kohonen Netzwerk aus 8×6 Neuronen aufgebaut. In y-Richtung besteht jedes Neuron wiederum aus i Gewichten w, wobei i der Länge des Eingaberaumes, d.h. der einzelnen Eingabevektoren, entsprechen muß. Jeder dieser Eingabevektoren enthält Informationen über je ein Objekt aus dem zu untersuchenden Datensatz.

ERGEBNISSE 25

z y

1 wj1

2 wj2 ...... i wji

Abbildung II.1-10. Architektur eines Kohonen-Netzwerkes (rechts). Die Neuronen bilden in xz- Ebene ein einschichtiges Gitter, wobei jedes Neuron in y-Richtung aus i Gewichten w besteht. Der Eingabevektor (links) stimmt in seiner Länge mit der Anzahl der Gewichte überein.

Die einzelnen Neuronen stehen über ein sogenanntes Nachbarschaftsgitter miteinander in Verbindung: jedes Neuron besitzt dadurch eine gewisse Anzahl an benachbarten Neuronen. Die Anzahl ist durch das verwendete rechtwinklige Gitter bestimmt (Abbildung II.1-11): Jedes Neuron besitzt 8 direkte Nachbarn (Nachbarn ersten Grades), 16 Nachbarn zweiten Grades, 24 Nachbarn dritten Grades usw. Möglich wären auch andere Gitter, zum Beispiel hexagonale.

Zentrales Neuron Benachbartes Neuron ersten Grades Benachbartes Neuron zweiten Grades Benachbartes Neuron dritten Grades

Abbildung II.1-11. Die Nachbarschaftsbeziehung in einem Kohonen-Netz mit rechtwinkligem Gitter.

Die Anzahl der Nachbarn würde sich jedoch an den Rändern des rechtwinkligen Gitters reduzieren. Um dies zu verhindern und um ein gleichmäßiges Gitter zu erhalten, kann dieses zusätzlich die Gestalt eines dreidimensionalen Torus haben (Abbildung II.1-12). Dadurch besitzt das Gitter keinerlei Ränder und Ecken. In speziellen Fällen wäre auch eine einfache rectangulare Topologie mit Rändern denkbar.

26 ERGEBNISSE

Abbildung II.1-12. Durch Aufschneiden eines Torus (links oben) entsteht das Gitter des Kohonen Netzwerkes. Neuronen am gegenüberliegenden „Rand“ sind benachbart. Dadurch besitzt dieses Gitter weder Anfang noch Ende. Vorlage aus (Da Costa et al. 2005) entnommen.

Das Trainieren des Kohonen Netzes Da Kohonen Netze nicht-überwacht trainiert werden, stehen dem Netz nur Informationen über die Eingabedaten zur Verfügung. Vor dem Training werden die Gewichtsvektoren w zufällig initialisiert, d.h. jedem von ihnen wird eine Zufallszahl zugewiesen. Im folgendem sei nun ein Trainingsprozeß beschrieben: 1) Ein Eingabevektor wird zufällig ausgewählt. Dieser wird allen Neuronen präsentiert und dieses Neuron ausgewählt, das dem Eingabevektor am ähnlichsten ist. Der Vergleich der Ähnlichkeit kann in jeder beliebigen Metrik erfolgen. Hier wurde die euklidische Distanz verwendet (Formel II.1-4).

k 2 d = x − w = X − W Formel II.1-4 sj ∑i=1 si ji s j

XS ist hierbei ein Eingabevektor aus der Menge aller Eingabevektoren X, Wj die

Gesamtheit der Gewichte des Neurons j und dsj die entsprechende euklidische

Distanz. xsi ist die i-te Komponente des Eingabevektors XS, wji das entsprechende i-te Gewicht des Neurons j. k ist die Länge des Eingabevektors bzw. die Anzahl der Gewichte in einem Neuron.

Das Neuron mit der geringsten euklidischen Distanz dsj zum Eingabevektor wird ausgewählt und als zentrales (oder Gewinner-) Neuron c bezeichnet:

ERGEBNISSE 27

c ← min Xs − Wj Formel II.1-5

2) Die Neuronen des Netzwerkes werden in Abhängigkeit ihrer Lage zum Gewinnerneuron c dem Eingabevektor angepasst. Hierbei nimmt der Grad der Anpassung mit zunehmender Entfernung zum Gewinnerneuron ab (Formel II.1-6). Dadurch wird eine Organisation des Netzes erreicht, die in späteren Zyklen zu einer Erregung benachbarter Neuronen durch ähnliche Eingabevektoren führt.

neu alt alt wji = wji +η(t)ϕ j (t,z)⋅(xsi − wji ) Formel II.1-6

ϕ(t,z) ist eine von der Zeit t und dem Abstand z zum Gewinnerneuron abhängige Nachbarschaftsfunktion, die Werte zwischen 1 und 0 besitzt. Sie sorgt dafür, dass benachbarte Neuronen unterschiedlichen Grades zu einem unterschiedlichen Ausmaß angepasst werden können (Abbildung II.1-13).

ϕ(t,z) ϕ(t,z)

1 1

z z

Abbildung II.1-13. Abhängigkeit zweier möglicher Nachbarschaftsfunktionen ϕ(t,z) vom Abstand z zum Gewinnerneuron. Durch die im linken Diagramm veranschaulichte Nachbarschaftsfunktion erfolgt eine starke Anpassung der nächsten Nachbarschaft (ϕ(t,z)=1), alle anderen Neuronen werden nicht angepasst (ϕ(t,z)=0). Bei der im rechten Diagramm dargestellten Funktion nimmt die Gewichtungsmodifizierung mit zunehmender Entfernung vom Gewinnerneuron linear ab. Letztere Nachbarschaftsfunktion findet in dem von uns benutzten Programm SONNIA Verwendung.

η(t) ist eine mit der Zeit t veränderbare Lernrate und nimmt ebenfalls Werte zwischen 1 und 0 an. Sie sorgt ebenso wie die zeitveränderliche Nachbarschaftsfunktion ϕ(t,z) dafür, dass bei jedem neuen Trainingszyklus das Ausmaß der Anpassung abnimmt. Dadurch bildet sich zu Beginn eine Fernordnung der Eingabevektoren aus, während im weiteren Verlauf mehr Wert auf die Nahordnung gelegt wird (Abbildung II.1-14).

28 ERGEBNISSE

η(t) φ(t,z) 1 1

t=1

t=11

z 0 t 0 0 20 40 60 80 100 -6 -4 -2 0 2 4 6

Abbildung II.1-14. Zeitabhängigkeit der Lernrate η(t) und der Nachbarschaftsfunktion ϕ(t,z). Die Zeit t kann als Anzahl der Trainingszyklen interpretiert werden.

3) Mit den Schritten 1 und 2 ist ein Zyklus abgeschlossen. Die Schritte 1 und 2 werden für die restlichen Eingabevektoren des Datensatzes wiederholt. 4) Mit den Schritten 1 bis 3 ist eine Epoche beendet. Die Schritte 1 bis 3 werden ebenfalls wiederholt. So wurden in dieser Arbeit standardmäßig immer 50 Epochen durchgeführt.

Ausgabekarten Während des Trainings erfolgt die Abbildung des Eingaberaumes in den Gewichten des neuronalen Netzes. Um zu ermitteln, wie sich die einzelnen Eingabevektoren im Netz verteilen, muß nach Beendigung des Trainingsprozesses der gesamte Trainingsdatensatz noch einmal dem Netz präsentiert werden. Die sich daraus ergebende Verteilung aller Eingabevektoren kann visualisiert werden. Da im allgemeinen eine Eigenschaft der Eingabevektoren von Interesse ist – wie in diesem Fall die NF-κB Hemmaktivität – kann die Verteilung dieser Eigenschaft im Netz farbcodiert als 2-dimensionale Karte ausgegeben werden (Abbildung II.1-15). Die Eigenschaft kann, wie in dieser Arbeit, in Klassen eingeteilt sein, aber auch kontinuierliche Werte besitzen.

ERGEBNISSE 29

O H O O

O O OH O 20 H O

OCH3 O

O OH O 19

Abbildung II.1-15. Beispiel einer farbcodierten Ausgabekarte (links). Wegen der besseren Übersichtlichkeit sind jeweils zwei Aktivitätsklassen zu einer Farbe zusammengefasst: 1 und 2 sind rot, 3 und 4 orange sowie 5 und 6 gelb dargestellt. Das Programm SONNIA bietet die Möglichkeit, sich die Strukturen der Verbindungen, die sich in den einzelnen Neuronen verbergen, anzusehen. Wie dargestellt, können sich in einem Neuron auch zwei oder mehr Verbindungen befinden. In diesem Fall gibt das Netz die Farbe des Mittelwerts der Aktivitätsklassen aus. Da eine toroidale Topologie verwendet wurde, verdeutlicht erst das Aneinanderreihen mehrerer Ausgabekarten (rechts) die Clusterung der Aktivitäten.

Counterpropagation Netze Kohonens Konzept der selbstorganisierten Karten kann auch auf Problemstellungen angewendet werden, wo nach quantitativen Beziehungen zwischen unabhängigen Variablen (den Eingabedaten) und abhängigen Variablen (den Ausgabedaten) gesucht wird – wie zum Beispiel auf QSAR-Fragestellungen und somit auf Vorhersage von Eigenschaften. Hierzu wird eine zusätzliche Schicht an Neuronen benötigt – die Ausgabeschicht. Hierbei hat jedes Neuron in der oberen Schicht (Kohonen- oder Eingabeschicht) ein korrespondierendes Neuron in der unteren Schicht (Ausgabeschicht). Die Neuronen der Ausgabeschicht sind wiederum ein- oder mehrdimensionale Vektoren. Auch die Eingabevektoren erhalten einen zusätzlichen zweiten Teil. Während der erste Teil, wie bei Verwendung von Kohonen Netzen, Informationen enthält, die die Objekte beschreiben, enthält der zweite Teil die zu untersuchenden und vorherzusagenden Eigenschaften der Objekte (Abbildung II.1-16).

30 ERGEBNISSE

x Abbildung II.1-16. Architektur eines z y Counterpropagation Netzes (rechts). Die Neuronen bilden in xz-Ebene ein

1 wj1 einschichtiges Gitter, wobei jedes

2 wj2 Neuron in y-Richtung aus i Gewichten . . w der Eingabeschicht und aus k . . Gewichten c der Ausgabeschicht . . besteht. Das Eingabemuster (links) . . Eingabeschicht stimmt in seiner Länge mit der Anzahl . . der Gewichte überein. Der obere Teil . . des Eingabemusters enthält die . . Deskriptoren des Objektes, der untere w i ji Teil die zu untersuchenden Eigenschaften.

1 cj1 b

2 c g

j2 s

. . u

A . . . .

k cjk

Der Trainingsprozeß läuft prinzipiell wie bei den Kohonen Netzen ab. Auch bei den CPGNN entscheidet der erste Teil des Eingabevektors über das Gewinnerneuron. Aber im Gegensatz zu den Kohonen Netzen erfolgt auch eine Angleichung der Gewichte in der Ausgabeschicht. Dadurch ergibt sich erst die Möglichkeit mit Hilfe eines Neuronalen Netzes Vorhersagen über Eigenschaften von Objekten zu treffen. Die Angleichung der Gewichte in der Ausgabeschicht (Formel II.1-7) erfolgt in analoger Weise wie bei der Angleichung in der Kohonen-Schicht (Formel II.1-6).

neu alt alt c jk = c jk +η(t)ϕ j (t,z)⋅(ysk − c jk ) Formel II.1-7

In Analogie zu den obigen Gleichungen kennzeichnet cjk das k-te Gewicht des

Neurons j aus der Ausgabeschicht und ysk die k-te Komponente des zweiten Teils des Eingabevektors s. Da beim Training eines CPGNN eine Anpassung der Ausgabewerte erfolgt, kann diese Methode als überwachtes Lernverfahren interpretiert werden. Zur Visualisierung des trainierten Netzes stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung. Zum einen können Ausgabekarten erstellt werden wie bei den Kohonen

ERGEBNISSE 31

Netzen beschrieben. Weiterhin lässt sich die Ausgabeschicht direkt durch Betrachtung der Gewichte visualisieren.

II.1.5. Betrachtung von Atomeigenschaften und Oberflächenpotentialen im Kohonen Netz

Suche nach der optimalen Netzdimension Die zu wählende Dimension des Kohonen Netzes in xz-Richtung (Abbildung II.1-1) ist abhängig von der Anzahl der Eingabevektoren. Zum einen muß die Anzahl der Neuronen im Netz so groß sein, dass eine ausreichende Trennung der Eingabevektoren möglich ist. Andererseits darf sie nicht zu groß sein, da dann viele Neuronen nach dem Training unbesetzt wären. Erfahrungsgemäß sollte die Anzahl der Eingabevektoren zu der Anzahl der Neuronen im Verhältnis 1:1 bis 1:0.7 stehen (Teckentrup 2000). Da der Datensatz 103 SLs enthält, müsste das Netz somit zwischen 70 und 100 Neuronen besitzen. Da das Kohonen Netz dafür angelegt ist, höherdimensionale Objekte in einer zweidimensionalen Karte topologieerhaltend abzubilden, kommt auch der Form des Netzes eine Bedeutung zu. Es sind sowohl quadratische (zum Beispiel 10×10, 9×9 usw.) als auch verschiedene rectangulare (zum Beispiel 12×8, 13×6 usw.) Formen denkbar. Die systematische Untersuchung der verschiedenen Netzgrößen und –formen ergab die besten Ergebnisse (eine gute Clusterung mit wenigen leeren Neuronen und Konflikten) bei einer langgestreckten Form von 15×6 Neuronen. Diese Netzdimension in der xz-Ebene wurde bei allen nachfolgenden Untersuchungen verwendet.

Kohonen Netze von RDF-codierten Atomeigenschaften Da bei der Berechnung der RDF-Codes nicht nur die 3D-Struktur der Moleküle, sondern auch Atomeigenschaften mitberücksichtigt werden können, wurden 15 verschiedene von PETRA berechnete Atomeigenschaften untersucht (siehe Tabelle V-4). Für jede der 15 Atomeigenschaften wurde ein Datensatz aus 103 Eingabevektoren (= 103 Moleküle) erstellt. Jeder Vektor enthält den RDF-Code

32 ERGEBNISSE zwischen 0 und 12.8 Å für das entsprechende Molekül. Da Datenpunkte im Abstand von 0.1 Å zu Vektoren zusammengefasst wurden, ergibt sich eine Vektorlänge von 128. Die Ausgabekarten für die RDF-Codes der 15 verschiedenen Atomeigenschaften sind in Abbildung II.1-17 dargestellt, die Bewertung dieser Ausgabekarten ist in Tabelle II.1-1 zusammengefasst.

qformal nel aperipher αd

nringsize χLP χπ χσ

nfree-el aLPStab nneighbor nnon-H-neighbor

qπ qσ qtot Abbildung II.1-17. Beipielhafte Ausgabekarten von Kohonen Netzen, die sich bei Präsentation der mit der entsprechenden Atomeigenschaft berechneten RDF-Codes ergeben. Bei Verwendung der fett geschriebenen Atomeigenschaften ist eine leichte Clusterung erkennbar. Wegen der besseren Übersichtlichkeit sind jeweils zwei Aktivitätsklassen zu einer Farbe zusammengefasst: 1 und 2 sind rot, 3 und 4 orange sowie 5 und 6 gelb dargestellt. Der toroidalen Topologie wegen wurden vier Einzelkarten aneinandergelegt.

Bei keiner Ausgabekarte ist eine sehr gute Clusterung der Hemmaktivitäten erkennbar. Anhand der Ausgabekarten und der Bewertung entsprechend der einzelnen Kriterien lassen sich jedoch einige Atomeigenschaften herausfiltern, die zu einer teilweisen Clusterung führen. Dies sind die physikalischen Eigenschaften

Atompolarizierbarkeit, αd, π- und σ-Elektronegativität, χπ und χσ, σ-Ladung, qσ, und

Anzahl der Elektronen, nel, sowie die topologischen Eigenschaften über die Lage an der Peripherie, aperipher, und über die Anzahl der Nachbaratome unter (nneighbor) oder ohne Einbeziehung (nnon-H-neighbor) der Wasserstoffatome.

ERGEBNISSE 33

Tabelle II.1-1. Bewertung der in der Abbildung II.1-17 abgebildeten Ausgabekarten anhand verschiedener Kriterien. Die Atomeigenschaften, die zu den besten Ergebnissen führen, sind fett hervorgehoben.

Clusterung Belegungsrate Atomeigenschaften Konflikte korrekt falsch unentschieden (%) qformal 59 31 13 63 53 nel 65 18 20 78 14 aperipher 64 26 13 83 11 αd 66 24 13 78 13 nringsize 70 25 8 58 26 χLP 61 30 12 73 17

χπ 71 23 9 76 9 χσ 58 26 19 79 12 nfree-el 66 24 13 76 15 aLPstab 58 23 22 63 36 nneighbour 64 24 15 80 13 nnon-H-neighbour 69 26 8 80 20 qπ 66 27 10 64 35

qσ 65 25 13 79 12 qtot 67 27 9 76 13

Kohonen Netze von AC-codierten Oberflächenpotentialen Ähnlich wie die Transformation einer 3D Struktur unter Berücksichtigung einer Atomeigenschaft in einem eindimensionalen Graphen mittels RDF möglich ist, ist auch eine Transformation der Moleküloberfläche unter Berücksichtigung eines Oberflächenpotentials möglich. Da hierbei jedoch feststehende Punkte der Oberfläche und nicht schwingungsfähige Atome betrachtet werden, erfolgt die Transformation mittels Autocorrelation (AC; siehe Abschnitt V.1.6). Aussehen und Interpretation der erhaltenen Kurven sind jedoch mit den RDF-Kurven identisch.

Tabelle II.1-2 Ausgabekarten von Kohonen Netzen, die sich bei Präsentation der mit dem entsprechenden Potential berechneten AC-Codes der Oberfläche ergibt. Wegen der besseren Übersichtlichkeit sind jeweils zwei Aktivitätsklassen zu einer Farbe zusammengefasst: 1 und 2 sind rot, 3 und 4 orange sowie 5 und 6 gelb dargestellt. Die Bewertung der Karten erfolgte anhand verschiedener Kriterien. HBP führt zu einer ausreichenden Clusterung und ist daher fett hervorgehoben.

Oberflächen- Clusterung Belegungs- Ausgabekarten Konflikte potential korrekt falsch unentschieden rate (%)

MEP 54 30 19 81 15

HBP 59 25 19 83 15

34 ERGEBNISSE

Es wurden zwei Oberflächenpotentiale berücksichtigt – das Molekulare Elektrostatische Potential (MEP) und das Wasserstoffbrückenpotential (HBP, hydrogen binding potential). Die Eingabevektoren der beiden Datensätze bestanden wiederum aus 128 Werten der AC-Kurve im Bereich zwischen 0 und 128 Å. Nur bei Verwendung des HBP als Oberflächenpotential ergab sich eine erkennbare Clusterung mit akzeptablen Werten für die einzelnen Kriterien (Tabelle II.1-2).

QSAR mit Neuronalen Netzen Wie oben dargelegt, führt die Präsentation einiger RDF-codierter Atomeigenschaften sowie des AC-codierten HBP zu einer gewissen Clusterung der Hemmaktivitäten. Die verwendeten Deskriptoren müssen somit Informationen über die Hemmaktivität der SLs enthalten. Daher ist es naheliegend auf der Grundlage dieser Deskriptoren QSAR-Modelle zu erstellten. Neuronale Netze wurden schon vielfach bei der Aufstellung quantitativer Struktur-Wirkungs-Beziehungen (QSAR) herangezogen (Bucinski et al. 2000; Novic et al. 1997; Polley et al. 2004; Vracko und Gasteiger 1997). Hierbei fanden jedoch klassische Moleküldeskriptoren (Molekülmasse, HOMO, LUMO, totales Dipolmoment etc.), (Bucinski et al. 2000; Novic et al. 1997) oder Deskriptoren der 3D-Struktur (Vracko und Gasteiger 1997) Verwendung. Wenn Deskriptoren verwendet wurden, die auf Atomeigenschaften beruhten, fehlte diesen die Information über die räumliche Beziehung (Polley et al. 2004). Diese Information bleibt hingegen bei der Anwendung von RDF- bzw. AC-Codes erhalten. Ein auf der Basis solcher Deskriptoren erstelltes Vorhersagemodell würde somit detailliertere Informationen über den Einfluß der Struktur auf die biologische Aktivität enthalten als ein klassisches QSAR-Modell (Siedle et al. 2004). Dass dieser Ansatz erfolgsversprechend ist, zeigen Untersuchungen zur Klassifizierung der Toxizität von Substanzen mittels CPGNN, bei denen AC-codierte Atomdeskriptoren verwendet wurden (Spycher et al. 2005). Daher wurde im folgenden ein QSAR-Modell mithilfe von CPGNN aufgebaut, wobei die RDF-codierten Atomeigenschaften und die AC-codierten Oberflächenpotentiale als Deskriptoren verwendet werden. Allerdings besitzt – wie oben gezeigt - keine der verwendeten Eigenschaften das Potential, die Aktivität alleine vorhersagen zu können. Es bietet sich daher an, Deskriptoren verschiedener Atomeigenschaften bzw. Oberflächenpotentiale

ERGEBNISSE 35 systematisch zu kombinieren, um damit ein QSAR-Modell auf der Basis einer 3D- Strukturrepräsentation zu erhalten.

II.1.6. Die Suche nach dem besten Modell

Strategie zur Suche des besten Modells

2D-Struktur CORINA 3D-Struktur PETRA Eigenschaften SURFACE RCODE AC-Deskriptoren der Oberfläche RDF-Deskriptoren der Atomeigenschaften 1. SONNIA 2. Auswahl der gut clusternden Datensätze beste Datensätze Reduzierung der Deskriptorenanzahl reduzierte, beste Datensätze Kombination von bis zu 4 Datensätzen Kombinationen der besten Datensätze 1. SONNIA 2. Auswahl der gut clusternden Datensätze bester Datensatz Validierung mittels 10fold-CV und externem Datensatzes validierter bester Datensatz

Abbildung II.1-18. Strategie zur Erstellung des besten CPGNN zur Vorhersage der NF-κB Hemmaktivitäten von SLs.

Die Strategie, die bei der Suche des besten Modells verfolgt wurde, ist in Abbildung II.1-18 dargestellt. Ausgehend von den 3D-optimierten Molekülstrukturen und den berechneten Atomeigenschaften erfolgte die Berechnung der AC-codierten Oberflächenpotentiale und der RDF-codierten Atomeigenschaften. Diese AC- bzw. RDF-Werte wurden in vorangegangenen Untersuchungen (siehe Seite 31ff) als Deskriptoren einem Kohonen Netz präsentiert und die 9 am besten clusternden herausgefiltert (Tabelle II.1-3). Diese wurden nun systematisch miteinander kombiniert. Die Kombination mit den besten Bewertungskriterien wurde schließlich zur Erstellung des QSAR-Modells ausgewählt und verschiedenen Validierungen unterzogen. Bevor dies möglich ist, war jedoch noch zweierlei zu berücksichtigen. (1) Zum einen würde sich bei dieser Kombination eine sehr große Anzahl an Deskriptoren ergeben. Zwar sind Kohonen- und CPGNN nicht so empfindlich

36 ERGEBNISSE gegenüber hohen Deskriptorenmengen wie zum Beispiel Regressionsanalysen, aber auch hier ist eine möglichst geringe Anzahl an Deskriptoren anzustreben. Daher erfolgte eine Reduktion der Deskriptoren innerhalb jedes der 9 Datensätze auf der Basis eines t-Testes wie im Abschnitt V.1.7 beschrieben. Die Datensätze enthalten danach nur noch zwischen 7 und 12 Deskriptoren (Tabelle II.1-3). (2) Weiterhin ist es notwendig, jeden einzelnen Deskriptor zwischen 0 und 1 zu normalisieren, um eine gleiche Gewichtung der einzelnen Deskriptoren beim Training des Neuronalen Netzes zu erreichen. Ansonsten würden die bei unterschiedlichen Atomeigenschaften auftretenden unterschiedlichen Größenordnungen der RDF-Werte zur Dominanz bestimmter Deskriptoren führen, da das Gewinnerneuron auf der Basis euklidischer Distanzen ausgewählt wird.

Tabelle II.1-3. Die 9 besten Datensätze und die Anzahl ihrer Deskriptoren nach der Reduktion.

Atomeigenschaft bzw. nel aperipher αd χ χ nneighbor nnon-H-neighbor qσ HBP Oberflächenpotential π σ Anzahl der Deskriptoren 10 12 10 8 9 7 7 10 9 nach der Reduzierung

Kombination der verschiedenen RDF-codierten Atomparameter und des AC- codierten Oberflächenpotentials HBP Die 9 besten Datensätze mit reduzierten und normierten Deskriptoren (8 RDF- codierte Atomeigenschaften und ein AC-codiertes Oberflächenpotential) konnten nun untereinander kombiniert werden. Hierfür wurden in einem ersten Schritt je zwei der 8 RDF-codierten Atomeigenschaften (nel, aperipher, αd, χπ, χσ, nneighbor, nnon-H-neighbor, qσ) miteinander kombiniert und einem Kohonen Netz präsentiert. Die Kombinationen zeigten Vektorlängen zwischen 14 und 22. Wie in Tabelle II.1-4 und Tabelle II.1-5 zu erkennen, verbesserte sich die Clusterung der Hemmaktivitäten auf der Grundlage mancher Kombinationen sehr. Besonders die Kombinationen nel+χπ (k3), aperipher+nnon-H-neighbor (k12), αd+χπ (k14), χπ+χσ (k19),

χπ+nneighbor (k20), χπ+nnon-H-neighbor (k21) zeigten eine gute Clusterung mit guten Bewertungen durch die einzelnen Kriterien. Auffällig war vor allem die Dominanz der π-Elektronegativität, χπ, die bei 5 der 6 gut clusternden Kombinationen vertreten war.

ERGEBNISSE 37

Tabelle II.1-4. Bewertung der Kombinationen jeweils 2er Atomeigenschaften anhand verschiedener Kriterien. Die Kombinationen, die zu den besten Ergebnissen führen, sind fett hervorgehoben. Da die Netzwerkberechnung von der Initialisierung zu Beginn des Trainings abhängt, wurden zur Berechnung der Kriterien 4 verschiedene, zufällig initialisierte Netzwerke herangezogen.

kombinierte Clusterung Belegungsrate Nr. Konflikte Atomeigenschaften korrekt falsch unentschieden (%) k1 nel+aperipher 67 22 14 84 9 k2 nel+αd 67 25 12 81 11

k3 nel+χπ 75 16 12 79 6 k4 nel+χσ 68 23 13 80 10 k5 nel+nneighbour 66 21 16 82 10 k6 nel+nnon-H-neighbour 65 24 15 81 20 k7 nel+qσ 65 24 15 83 10 k8 aperipher+αd 64 25 14 82 9 k9 aperipher+χπ 71 15 17 79 10 k10 aperipher+χσ 67 25 11 85 14 k11 aperipher+nneighbour 66 25 12 85 11 k12 aperipher+nnon-H-neighbour 70 23 11 83 8 k13 aperipher+qσ 69 22 13 85 11

k14 αd+χπ 72 19 12 79 7 k15 αd+χσ 64 27 13 80 9 k16 αd+nneighbour 67 25 12 84 8 k17 αd+nnon-H-neighbour 68 22 13 83 9 k18 αd+qσ 67 28 10 83 10

k19 χπ+χσ 70 21 10 81 8 k20 χπ+nneighbour 73 21 9 80 7 k21 χπ+nnon-H-neighbour 76 18 10 76 7 k22 χπ+qσ 65 25 13 83 7 k23 χσ+nneighbour 70 23 10 80 9 k24 χσ+nnon-H-neighbour 68 26 10 78 11 k25 χσ+qσ 66 26 11 82 10 k26 nneighbour+nnon-H-neighbour 68 22 13 80 8 k27 nneighbour+qσ 63 26 14 84 9 k28 nnon-H-neighbour+qσ 66 26 12 84 7

In einen zweiten Schritt wurden nun die 8 am besten clusternden Atomeigenschaften sowie die 6 gut clusternden Atomeigenschaften mit dem AC-codierten Oberflächenpotential HBP kombiniert. Dies führte zu Datensätzen mit Vektorlängen zwischen 24 und 27, die nun ebenfalls einem Kohonen-Netz präsentiert wurden. Durch das Einbeziehen des Oberflächenpotentials (HBP) in die entsprechenden Datensätze, konnte bei manchen Kombinationen eine weitere Verbesserung der Clusterung erreicht werden (Tabelle II.1-6). Vier Kombinationen zeigten eine gute

Bewertung durch die einzelnen Kriterien: χπ+HBP (k32), nel+χπ+HBP (k37),

χπ+nneighbour+HBP (k41) und χπ+nnon-H-neighbour+HBP (k42).

38 ERGEBNISSE

Tabelle II.1-5: Beipielhafte Ausgabekarten von Kohonen Netzen, die sich bei der Präsentation von Kombinationen der RDF-Codes verschiedener Atomparameter ergeben. Im linken-unteren Teil ist die Nummer der Kombination (1-28) angegeben. Die fett hervorgehobenen Kombinationen zeigen eine gute Clusterung. Wegen der besseren Übersichtlichkeit sind jeweils zwei Aktivitätsklassen zu einer Farbe zusammengefasst: 1 und 2 sind rot, 3 und 4 orange sowie 5 und 6 gelb dargestellt. Der toroidalen Topologie wegen wurden vier Einzelkarten aneinandergelegt.

el π σ neighbour non-H-

peripher σ n a n n q α χ χ neighbour

nel

aperipher k1

αd k2 k8

χπ k3 k9 k14

χσ k4 k10 k15 k19

nneighbour k5 k11 k16 k20 k23

nnon-H- k6 k12 k17 k21 k24 k26 neighbour

qσ k7 k13 k18 k22 k25 k27 k28

ERGEBNISSE 39

Tabelle II.1-6 Bewertung von Kombinationen von RDF-codierten Atomeigenschaften und des AC-codierten HB-Potentials anhand verschiedener Kriterien. Die Kombinationen, die zu den besten Ergebnissen führen, sind fett hervorgehoben. Da die Netzwerkberechnung von der Initialisierung zu Beginn des Trainings abhängt, wurden zur Berechnung der Kriterien je 4 verschiedene, zufällig initialisierte Netzwerke herangezogen.

k29 k30 k31 k32 k33 k34 k35 k36 k37 k38 k39 k40 k41 k42 Nr.

P + r

+ r

+ o o

r r + B + B b b

o P P h h b b

H P

H P g g h h

B i i g P g e P e B B i i + + + HBP n n + HBP H + HBP e

H e

- B - B

+ HBP +

π π n H + HBP

σ n π H

H + HBP + + - χ - HBP χ H + HBP n

+ HBP χ H n + HBP

χ +

n +

n d el

π σ

π π

o o non-H-neighbor + + + π q π +

χ χ + α χ n + n

l non-H-neighbor

l peripher neighbor n d

π χ χ e π e π n n n peripher a Kombination Kombination n

α χ χ χ n n a

Ausgabekarte Ausgabekarte

66 66 67 76 66 68 68 68 71 66 70 61 73 75 korrekt korrekt

23 25 23 20 25 22 20 19 21 22 21 23 18 19 falsch falsch Clusterung 14 13 13 7 12 13 16 14 11 16 12 19 12 10 unentschieden unentschieden

86 85 83 82 83 84 83 85 83 84 79 83 84 80 rate (%) Belegungs-

8 11 10 6 10 9 8 9 6 9 9 6 5 5 Konflikte

Unter Heranziehung der Tabelle II.1-4 und der Tabelle II.1-6 ließen sich aus allen Kombinationen 4 herausfiltern, die sich durch eine besonders geringe Konfliktanzahl (≤6), eine hohe Anzahl an korrekt geclusterten (≤73) und einer geringen Anzahl an falsch geclusterten Neuronen (≥20) auszeichneten. Es handelte sich um die

Kombinationen nel+χπ (k3), χπ+HBP (k32), χπ+nneighbour+HBP (k41) und

χπ+nnon-H-neighbour+HBP (k42).

40 ERGEBNISSE

Der lokale RDF-Code – eine Möglichkeit zur Generierung weiterer Deskriptoren In RDF-Kurven kann es infolge der Summierung über alle Atome - besonders bei komplexen Molekülen - zur Überlagerung verschiedener Abstände kommen. Dies kann zu einer Fehlinterpretation bzw. -sortierung durch Neuronale Netze führen. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu umgehen, ist die Verwendung von lokalen RDF-Kurven (L-RDF, siehe Abschnitt V.1.6). Hierbei wird nur von einem zentralen Atom ausgegangen. Da bei Sesquiterpenlactonen das exocyclische C-Atom des Lactonringes eine zentrale Rolle für die Reaktion mit der p65-Untereinheit von NF-κB spielt (Garcia-Pineres et al. 2001), wurde dieses Atom als Zentrum festgelegt. Für alle 15 Atomparameter, die auch bei Erstellung der RDF-Kurven Verwendung fanden, wurden L-RDF-Kurven erstellt. Hierbei erfolgte die Berechnung der L-RDF- Kurven im Bereich von 0 bis 12.8 Å. Von jeder der Kurven wurden 128 Werte in einem Abstand von 0.1 Å zu einem Datensatz zusammengefasst und einem Neuronalen Netz präsentiert. Dabei führte leider keiner der präsentierten Datensätze zu einer ausreichenden Clusterung der NF-κB Hemmaktivität. Bei genauer Betrachtung der einzelnen Deskriptoren zeigten jedoch zwei die Fähigkeit, zwischen den einzelnen Aktivitäten gut zu unterscheiden. Hierzu wurde ein t-Test, wie er auch zur Reduktion der RDF- und AC-codierten Datensätzen angewendet wurde (siehe Abschnitt V.1.7), eingesetzt. Dabei handelte es sich um die Deskriptoren beim Abstand von 1.5 Å und 4.5 Å in der L-RDF-Kurve des

Atomparameters χπ, im folgendem als χπ(L-RDF) bezeichnet. Diese beiden Deskriptoren wurden mit den 4 besten weiter oben erhaltenen

Kombinationen (nel+χπ, χπ+HBP, χπ+nneighbour+HBP, χπ+nnon-H-neighbour+HBP) zu 4 neuen Datensätzen vereinigt und einem Kohonen Netz präsentiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle II.1-7 zusammengefasst.

Die Einbeziehung von χπ(L-RDF) führte bei den Kombinationen nel+χπ (k3) und

χπ+nnon-H-neighbour+HBP (k42) zu keiner wesentlichen Verbesserung. Bei den

Kombinationen χπ+HBP (k32) und χπ+nneighbour+HBP (k41) wurde dagegen eine bessere Clusterung und eine geringere Anzahl an Konflikten erhalten. Die beiden

Kombinationen χπ+HBP+χπ(L-RDF) (k44) und χπ+nneighbour+HBP+χπ(L-RDF) (k45) waren somit hinsichtlich der Bewertungskriterien allen bis hierher untersuchten

Datensätzen überlegen. Dabei zeigte χπ+HBP+χπ(L-RDF) (k44) eine etwas bessere

ERGEBNISSE 41

Belegungsrate als χπ+nneighbour+HBP+χπ(L-RDF) (k45), so dass χπ+HBP+χπ(L-RDF) (k44) als beste Kombination ausgewählt wurde.

Tabelle II.1-7. Bewertung von Kombinationen unter Einbeziehung von χπ(L-RDF) anhand verschiedener Kriterien. Die Kombinationen, die zu den besten Ergebnissen führen, sind fett hervorgehoben. Da die Netzwerkberechnung von der Initialisierung zu Beginn des Trainings abhängt, wurden zur Berechnung der Kriterien je 4 verschiedene, zufällig initialisierte Netzwerke herangezogen.

Clusterung Belegungs- Nr. Kombination Ausgabekarten Konflikte korrekt falsch unentschieden rate (%) n + χ + k43 el π 75.75 17.75 9.50 78.1 6.13 χ π(L-RDF)

χπ + HBP + k44 77.25 16.25 9.00 82.7 5.00 χ π(L-RDF) χ + n + k45 π neighbour 77.50 16.25 9.25 80.2 4.75 HBP + χπ(L-RDF) χ + n + k46 π non-H-neighbour 74.75 15.25 12.00 79.4 5.75 χ HBP + π(L-RDF)

II.1.7. Bewertung des besten Modells „χπ + HBP + χπ(L-RDF)“

Durch systematisches Kombinieren verschiedener Deskriptoren konnte ein Modell entwickelt werden, das in den verschiedenen Bewertungskriterien die besten Werte ergab. Dieses enthält Deskriptoren der RDF- und L-RDF-codierten

π-Elektronegativität (χπ) und des auf die Oberfläche projizierten, AC-codierten Wasserstoffbindungspotentials (HBP). Die genaue Zusammensetzung ist in Tabelle II.1-8 gegeben.

Tabelle II.1-8. Deskriptoren des als bestes Modell ausgewählten Datensatzes.

Eigenschaft codiert durch Deskriptorenanzahl Atomabstände [Å]

χπ RDF 8 1.4; 1.6; 2.6; 3.5; 4.6; 5.1; 5.9; 6.6 HBP AC 9 4.4; 6.9; 7.1; 7.3; 7.7; 8.2; 8.6; 8.9; 10.3

χπ L-RDF 2 1.5; 4.5

Validierung Die interne Validierung mittels 10-facher Kreuzvalidierung (CV; cross validation) führte zu einer korrekten Vorhersage von 80.6 % (Tabelle II.1-9). Das bedeutet, dass 20 SLs falsch vorhergesagt wurden (Tabelle II.1-10).

42 ERGEBNISSE

Tabelle II.1-9. Die auf der 10-fachen CV basierende „Verwechslungsmatrix“ des besten Modells χπ+HBP+χπ(L-RDF). Der von den beiden Diagonalen umgrenzte Bereich kennzeichnet den als „richtig vorhergesagt“ definierten Bereich. nfalsch bezeichnet die Anzahl der falsch vorhergesagten SLs.

Aktivitätsklasse, experimentell nfalsch innerhalb der Aktivitätsklasse, vorhergesagten vorhergesagt Aktivitätsklassen 1 2 3 4 5 6 1 5 8 1 0 1 0 2

2 7 9 7 2 0 0 2

3 1 2 4 4 1 3 5

4 0 2 5 12 1 4 6

5 2 0 0 1 3 4 2

6 0 1 0 2 6 5 3 n innerhalb der experi- falsch 3 3 1 4 2 7 20 mentellen Aktivtätsklasse

Eine zu positive Bewertung ist ein Risiko bei dieser Art von Validierung – besonders wenn eine hohe Anzahl an Deskriptoren mit einer geringen Anzahl an Molekülen assoziiert wird. Neuronale Netze sind allerdings nicht so empfindlich gegenüber einer hohen Anzahl an Deskriptoren wie zum Beispiel Regressionsanalysen. Das Verhältnis ist in unserem Modell ausreichend (19 Deskriptoren bei 103 SLs). Trotzdem muß man berücksichtigen, dass diese 19 aus einer großen Anzahl von möglichen Deskriptoren ausgewählt wurden. Deswegen wurde noch eine Validierung mit einem externen Datensatz vorgenommen. Die hierbei verwendeten 14 SLs (Abbildung II.1-19, siehe auch Tabelle V-3) fanden während der Generierung des Modells keinerlei Berücksichtigung. Die Validierung erbrachte eine korrekte Vorhersage von 78.6 %, d.h. 11 der 14 SLs wurden richtig vorhergesagt (Tabelle II.1-10). Weiterhin wurde eine 10fache CV mit allen 117 SLs durchgeführt (103 SLs des Originaldatensatzes und 14 SLs des externen Datensatzes), wobei 77.8 % der SLs (d.h. 91 SLs) korrekt vorhergesagt wurden. Diese ähnlichen Raten für eine korrekte Vorhersage bei allen drei Datensätzen spricht dafür, dass dieses Modell kein Artefakt darstellt und einen großen Bereich unterschiedlicher Strukturen abdeckt.

ERGEBNISSE 43

H O H O O O H O O O O O O HO O O O O O O O O O O O O O O HO O O HOHO OH N1 (4) N2 (2) N3 (1) N4 (3) N5 (4)

O O O O H O H O O O O O O O OHO H OH O O O O O O O HO H O HO H O O O OH OH O O O N6 (3) N7 (2) N8 (2) N9 (6) N10 (4)

H O O O O O H O O O O O O H OH

H O O O O O O O O N11 (4) N12 (3) N13 (5) N14 (5)

Abbildung II.1-19. Strukturen der SLs des externen Datensatzes. Es sind 6 verschiedene Strukturklassen vertreten: Die Pseudoguaianolide N1-N3, die Furanoheliangolide N4-N7, das Eudesmanolid N8, das Montahibisciolid N9, die Germacranolide N10-N13 und das Elemanolid N14.

Das Modell soll insbesondere für die Suche und Entwicklung von Leitstrukturen Verwendung finden. Hierbei ist es von besonderem Interesse, dass hohe Hemmaktivitäten für die NF-κB DNA Bindung (Aktivitätsklasse 1 und 2) genau vorhergesagt werden. Während der 10fach CV traf dieses für 31 der 37 SLs dieser beiden Aktivitätsklassen (84 %) zu. Nur 4 der restlichen 66 SLs (6 %) wurden irrtümlicherweise der Aktivitätsklasse 1 und 2 zugeordnet. Dieses zeigt, dass dieses Modell bei der Suche nach Leitstrukturen mit potenter NF-κB Hemmaktivität sehr gut einsetzbar ist. Bei 12 der 20 während der 10fach CV falsch vorhergesagten SLs handelt es sich um 6 SLs-Paare die sich trotz unterschiedlicher Aktivität gegenseitig vorhersagen (Tabelle II.1-10). Bei den Paaren 19/20, 45/46 und 49/58 ist eine Unterscheidung anhand der ausgewählten Deskriptoren nicht möglich, ja selbst die RDF-codierte

Atomeigenschaft χπ und das AC-codierte Oberflächenpotential HBP in ihrer Gesamtheit erlauben keine klare Unterscheidung (Abbildung II.1-20).

44 ERGEBNISSE

SLs χπ HBP

0.020 400 19 20 0.015 19 300 20

0.010 ) 200 r g(r)

19(4)/20(2) A( 0.005

100 0.000

0 -0.005

02468 024681012 Atomabstand r (Å) Abständer der Oberflächenpunkte r (Å)

140 0.030 0.025 23 120 79 23 0.020 79 0.015 100 0.010 80 0.005 0.000 g(r) 23(4)/79(6) 60 A(r) -0.005 -0.010 40 -0.015 20 -0.020 -0.025 0 -0.030

02468 024681012 Atomabstand r (Å) Abstände der Oberflächenpunkte r (Å)

400 0.025 350 0.020 49 49 58 300 58 0.015 250

200 0.010 g(r) g(r) A(r) 49(3)/58(1) 150 0.005 100 0.000 50 -0.005 0

-50 -0.010 02468 024681012 Atomabstand r (Å) Abstände der Oberflächenpunkte r (Å)

0.020 260 240 220 65 65 0.015 103 200 103 180 160 140 0.010 120 g(r) A(r) 65(1)/103(5) 100 80 0.005 60 40 20 0.000 0 -20 02468 024681012 Atomabstand r (Å) Abstände der Oberflächenpunkte r (Å)

Abbildung II.1-20. Die im besten Modell verwendeten RDF- bzw. AC-Codes für vier SL-Paare, die sich trotz unterschiedlicher Aktivität während der 10fach-CV gegenseitig vorhersagen (Aktivitätsklasse in Klammern). Die im besten Modell verwendeten Deskriptoren sind durch graue Punkte gekennzeichnet.

Die Paare 23/79 bzw. 65/103 sind dadurch gekennzeichnet, dass sich trotz einer jeweilig unterschiedlichen Grundstruktur die Deskriptoren und die zugrundeliegenden Kurven sehr stark ähneln. Hierbei stimmen bei beiden Paaren die Deskriptoren des AC-codierten Potentials sehr gut überein, während bei denen der RDF-codierten χπ kleine Unterschiede vorhanden sind (Abbildung II.1-20).

ERGEBNISSE 45

Tabelle II.1-10. Durch 10fach CV falsch vorhergesagte SLs (Spalte 3) sowie Ausreißer der Qualitätskriterien „Konflikte“ (Spalte 4) und „Clusterung“ (Spalte 5) unter Berücksichtigung von 4 verschiedenen CPGNN. Diejenigen SLs wurden zusammengruppiert, die im selben Neuron zu liegen kamen bzw. sich gegenseitig vorhergesagt haben. Mit einem „*“ markierte SLs sind Konflikt-Ausreißer, solche mit „#“ sind Ausreißer bezogen auf die Clusterung. Ein Bindestrich in den Spalten bedeutet, dass das entsprechende SL nicht falsch vorhergesagt wurde bzw. keinen Ausreißer darstellt.

Validierung: Konflikte Clusterung falsch vorhergesagte SLs SL class experimentell experimentell Aktivitätsklasse, Rate falscher Rate 4 CPGNN [%] SLs beteiligt in in SLs beteiligt predicted by SLpredicted Clusterung unter Verwednung von predicted activity predicted Konfliktneuronen 5# 2 6 82 82 50 82* 6 - - 5 - 92 4 6 82 - - 19* 4 2 20 20 - 20 2 4 19 19 - 23 4 6 79 79 - 79 6 4 23 23 - 25*# 3 - - 85/100 25 85 6 3 25 25 - 36 4 2 38 38 - 38* 2 4 36 36/100 - 100 6 4 36 25/38/102 - 102* 4 - - 100 - 33# 4 - - - 25 34# 3 - - - 25 37 4 - - 65 - 65*# 1 5 103 37 25 103# 5 1 65 - 50 39# 3 - - - 25 43 6 4 37 - - 45# 4 6 46 46 25 46# 6 4 45 45 25 47# 6 3 88 - 50 48 1 - - 49/58 - 49* 3 1 58 48/58 - 58 1 3 49 49 - 53 1 5 91 - - 71# 1 - - - 50 72# 2 - - - 50 83# 2 - - - 75 87# 3 - - - 50 93 5 3 76 - - N2 1 3 88 N4 3 6 47 N8 2 6 43

Ausreißer Unter Berücksichtigung der Qualitätskriterien „Konflikte“ und „Clusterung“ zeigte das generierte beste Modell Ausreißer (Abbildung II.1-21). Ausreißer der Clusterung sind SLs, die Inseln anderer Aktivität in einem Aktivitäts- Cluster bilden. Da die Ausgabekarte von der Initialisierung des Netzwerkes zu Beginn abhängt, wurden vier verschiedene zufällig initialisierte CPGNN betrachtet. Interessanterweise war kein SL in allen Netzwerken isoliert. Nur ein SL (83) war in 3

46 ERGEBNISSE der 4 CPGNN isoliert, alle anderen waren nur in 2 (6 SLs) oder einen (7 SLs) von 4 CPGNN isoliert (Tabelle II.1-9). Somit erlaubt das Modell eine gute Clusterung ohne ein SL auszuschließen. Eine Isolation führte nur bei 6 SLs zu einer falschen Vorhersage während der Kreuzvalidierung.

isoliertes Neuron

Konflikt- Neuron

Abbildung II.1-21. Ausgabekarte des besten Modells zur Demonstration der beiden Arten von Ausreißern. Hohe Hemmaktivität (Aktivitätsklasse 1 und 2) ist in dunkelgrau, Aktivitätsklasse 3 und 4 in grau und Aktivitätsklasse 5 und 6 in hellgrau angegeben. Die weißen Neuronen sind unbesetzt. Das isolierte Neuron ist umgeben von anderen Aktivitäten. Das SL, welches im Zusammenhang zu diesem Neuron steht, stellt einen Ausreißer der Clusterung dar. Dem als Konflikt-Neuron bezeichneten Neuron sind zwei SLs zugeordnet: 19 (Aktivitätsklasse 4) und 20 (Aktivitätsklasse 2). Da die umgebenden Neuronen von den Aktivitätsklassen 1 und 2 (dunkelgrau) dominiert werden, ist SL 19 als Ausreißer anzusehen.

Wie schon weiter oben dargelegt, treten Konflikte auf, wenn SLs mit unterschiedlicher Aktivität in ein und demselben Neuron zu liegen kommen. Als Ausreißer im Hinblick auf diese Konflikte ist dasjenige SL im Konfliktneuron definiert, dessen Aktivität sich von den benachbarten am stärksten unterscheidet (Abbildung II.1-21), (Spycher et al. 2005). Unter Berücksichtigung dieser Definition können 7 SLs als Ausreißer angesehen werden. Diese Ausreißer könnten SLs sein, deren strukturelle Eigenschaften nicht vollständig erfasst wurden oder die eine anderen molekularen Wirkmechanismus besitzen. Eine 10fache CV unter Ausschluß dieser Ausreißer (Mazzatorta et al. 2003; Vracko und Gasteiger 1997) führte zu einem Anstieg des Anteils an korrekt vorhergesagten SLs auf 88.5 % (85 von 96 SLs). Trotzdem wurde der ursprüngliche Datensatz von 103 SLs beibehalten, um einen möglichst weiten Bereich an unterschiedlichen SL- Strukturen abzudecken – auch solchen, die nicht korrekt vorhergesagt wurden. Unbekannte SLs, deren Aktivität durch einen Ausreißer vorhergesagt würde, könnten als nicht bestimmbar definiert werden. Dadurch kann das Risiko einer falsch vorhergesagten Aktivität verringert werden.

ERGEBNISSE 47

II.2. Bindung von Sesquiterpenlactonen an Blutbestandteile

Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme von Erythrozyten auf ihrem Weg durch eine Arteriole (http://www.medsana.ch/images/med/1115320342haemoglobin.jpg).

II.2.1. Kurzer Überblick über den Aufbau des Blutes

Aufbau und Zusammensetzung des Blutes Blut stellt in funktioneller Hinsicht ein flüssiges Gewebe dar und setzt sich aus dem flüssigen Blutplasma und den geformten Blutbestandteilen zusammen. Letztere machen ca. 40 bis 45 % des Gesamtblutes aus und bestehen wiederum aus Erythrozyten (4 bis 5×106 µL-1), Leukozyten (5 bis 10×103 µL-1) und Thrombozyten (1.5 bis 3.5×105 µL-1). Das Blutplasma besteht zu über 90 % aus Wasser, in dem unter anderem Proteine und anorganische Elektrolyte gelöst sind. Die Plasmaproteine machen ca. 7-8 % des Plasmas aus und bestehen wiederum aus Albumin (60 bis 80 %), Globulinen (20 bis 40 %) und Fibrinogen (4 %). Plasma ohne Fibrinogen und einigen anderen Gerinnungsfaktoren bezeichnet man als Blutserum. Der normale Blut-pH-Wert liegt bei 7.4. Weiterhin finden sich im Blut noch eine Reihe weiterer organischer Bestandteile wie Nahrungsstoffe (Kohlenhydrate, Fette), Stoffwechselprodukte, Hormone und Enzyme.

48 ERGEBNISSE

Struktur und Funktion des Humanen Serum Albumins Humanes Serumalbumin (HSA) ist das häufigste Protein im Blut, wo es in Konzentrationen um 25 mg/ml vorliegt (Sugio et al. 1999). Es trägt zu 80 % zum kolloid-osmotischen Druck bei (Carter und Ho 1994) und ist der wichtigste Puffer zum Erhalt des Blut-pH-Wertes (Figge et al. 1991). HSA besitzt ein Molekulargewicht von 66462 g⋅mol-1 und besteht aus 858 Aminosäuren (PDB-Protein Data Bank 2005). Es ist charakterisiert durch einen niedrigen Gehalt an L-Tryptophan und L-Methionin, einen hohen Gehalt an L-Cystein und an geladenen Aminosäuren (L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, L-Lysin, L- Arginin). Die Ladungen sind in der Primärstruktur ungleich verteilt. Dieses Ungleichgewicht ist jedoch in der Tertiärstruktur nicht mehr erkennbar (Abbildung II.2-1).

Abbildung II.2-1. HSA-Molekül. Basische Reste sind blau, saure rot und neutrale gelb eingefärbt. (Friedli 1996) entnommen.

Es sind 3 homologe Domänen erkennbar (Brown 1976). Jede Domäne besteht aus jeweils 2 Subdomänen (a und b). Subdomäne a wird gebildet von 4 α-Helices (a-h1 bis a-h4), die von 2 kurzen α-Helices (a-h5 und a-h6) flankiert werden. Subdomäne b besteht aus 4 α-Helices (b-h1 bis b-h4), (Sugio et al. 1999), (Abbildung II.2-2). An der Fixierung der Struktur sind 17 Disulfidbrücken beteiligt. Ungewöhnlich unter extrazellulären Molekülen ist das Auftreten einer freien Thiol-Gruppe, hier an der Position 34. Der Hauptteil der Disulfidbrücken liegt gut geschützt und ist anderen Molekülen nicht ohne weiteres zugänglich. Ein Blockieren der einzigen freien SH-

ERGEBNISSE 49

Gruppe verhindert das Auftreten von gemischten Disulfiden in älterem Albumin sowie die Bildung von Albumindimeren (Peters, Jr. 1985). Abbildung II.2-2. Tertiärstruktur von HSA. Jede Substruktur ist verschieden gefärbt Ia(gelb), Ib (grün), IIa(rot), IIb(violett), IIIa(blau) und IIIb(cyan). (Sugio et al. 1999) entnommen.

Cys 34

Die freie Thiol-Gruppe an Cystein 34 befindet sich im Loop zwischen Ia-h2 und Ia-h3 (Sugio et al. 1999), (Abbildung II.2-2). Obwohl Cystein 34 an der Oberfläche des Moleküls liegt, ist in der Kristallstruktur das γS-Atom zum Inneren hin gerichtet und von Seitenketten der Aminosäuren Prolin 35, Histidin 39, Valin 77 und Tyrosin 84 umgeben. Diese verhindern, dass die SH-Gruppe mit anderen Substanzen reagieren kann. Wenn sich HSA in Lösung befindet, kann jedoch die phenolische Seitenkette wegdrehen und ein Angriff von Reaktionspartnern an Cystein 34 ist möglich. Weiterhin wäre eine Änderung des Protein-Rückgrates in Lösung möglich, wobei die SH-Gruppe nach außen schwingt (Sugio et al. 1999). Für eine freiere Zugänglichkeit der SH-Gruppe in Lösung im Vergleich zur Kristallstruktur spricht unter anderem, dass im zirkulierenden Plasma ungefähr 30 % des Cystein 34 von L-Cystein oder L- Glutathion (GSH) oxidiert ist (Peters, Jr. 1985) und dass eine Absättigung der freien SH-Gruppe mit Maleinimid möglich ist (siehe Kapitel II.2.8). Herausragendste Eigenschaft von Albumin ist die Fähigkeit, reversibel mit einer großen Anzahl von Liganden zu binden. So erfüllt es zum Beispiel

50 ERGEBNISSE

Transportaufgaben für Fettsäuren. Weiterhin ist es für die Inaktivierung toxischer lipophiler Metabolite, wie zum Beispiel Bilirubin (Emerson, Jr. 1989) wichtig. Auch besitzt HSA eine breite Affinität zu negativ geladenen aromatischen Substanzen. Neben reversiblen Bindungen kommt es auch zur Bildung covalenter Addukte mit

Pyridoxalphosphat, L-Cystein, L-Glutathion sowie verschiedenen Metallen (Cu2+, Ni2+, Hg2+, Ag+ und Au+) (Friedli 1996). Da die Reaktion von Helenalin und

Parthenolid mit L-Cystein und L-Glutathion bekannt und gut untersucht ist (Knight 1995; Schmidt 1997), ist auch eine Reaktion mit Cystein 34 des Albumins wahrscheinlich. Diese Reaktion hätte einen enormen Einfluss auf die Verteilung der Sesquiterpenlactone (SLs) im Körper und somit auf die Toxizität, die Allergenität etc. Vor diesem Hintergrund wurde das Bindungsverhalten von Parthenolid (SL4) sowie von drei in Arnikablüten vorkommenenden Pseudoguaianoliden (SL1: Dihydrohelenalinacetat, SL2: Dihydrohelenalinmethacrylat, SL3: Helenalinisobutyrat) an Blutbestandteile untersucht. Zusätzlich wurden Untersuchungen durchgeführt, inwieweit sich das Bindungsverhalten ändert, wenn Sesquiterpenlactone in Arnikatinktur, einem alkoholischen Extrakt, vorliegen. Hierzu fanden drei verschiedene Tinkturen Verwendung. Hierbei fand eine Tinktur aus Arnikablüten des spanischen Chemotyps Verwendung (T1), die durch eine Dominanz von Dihydrohelenalinderivaten gekennzeichnet ist. Zwei weitere Tinkturen (T2 und T3) sind aus Arnikablüten mitteleuropäischer Provenienz hergestellt, so dass bei diesen Helenalinderivate dominieren. Bei Tinktur T3 wurden frische Arnikablüten bei der Herstellung verwendet, während bei T1 und T2 - wie üblich - getrocknete Blüten eingesetzt wurden.

II.2.2. Die Bindung von Parthenolid an HSA steigt bei längeren Inkubationszeiten und zunehmenden HSA-Konzentrationen

Am Anfang erfolgte eine Überprüfung, ob Sesquiterpenlactone konzentrations- und zeitabhängig mit HSA reagieren. Als Modellsubstanz wurde Parthenolid (SL4) ausgewählt. Hierzu wurde SL4 mit einer Endkonzentration von 200 µM mit einer HSA-Lösung (40 mg/mL) für unterschiedliche Zeiten (0, 5, 15, 60, 180, 240 und 960 min) inkubiert

ERGEBNISSE 51 und nach Abschnitt V.4.3 aufgearbeitet. Es ergab sich eine Abnahme der Parthenolid- Konzentration über die Zeit, die in Abbildung II.2-3 dargestellt ist.

240

200

160

120 [µM] 80

Konzentration an Parthenolid 0 0.0 200.0 400.0 600.0 800.0 1000.0 1200.0 Inkubationszeit [min]

Abbildung II.2-3. Abnahme der Konzentration an freiem Parthenolid über die Zeit während der Inkubation von Parthenolid (200 µM) in HSA (40 mg/mL) bei 37 °C.

Wurde SL4 (200 µM) mit unterschiedlichen Konzentrationen von HSA (5, 10, 20, 30, 40 und 50 mg/mL) inkubiert (60 min, 37 °C), ergab sich ein funktioneller Zusammen- hang zwischen gebundenem Parthenolid und HSA-Konzentration (Abbildung II.2-4).

200.0

160.0

120.0 R2 = 0.9981 80.0

Parthenolid [µM] 40.0 Konzentration an freiem

0.0 1 10 100 HSA-Konzentration [mg/mL]

Abbildung II.2-4. Abhängigkeit der HSA-Bindung von Parthenolid (200 µM) von der HSA- Konzentration bei 37 °C nach einer Inkubationszeit von einer Stunde. Gezeigt ist die Abnahme an freiem Parthenolid.

52 ERGEBNISSE

Obwohl die Reaktion wie oben gezeigt nach einer Stunde nicht abgeschlossen war, wurde diese Inkubationszeit von 60 min bei den nachfolgenden Untersuchungen benutzt, weil in früheren Arbeiten gezeigt werden konnte, dass nach einer Inkubationszeit von einer Stunde nur noch 5.4 % von Dihydrohelenalin im Plasma nach i.v. Applikation gefunden werden konnte (Grippo et al. 1991).

II.2.3. Die Sesquiterpenlactone SL1 bis SL4 und die Arnikatinkturen T1 bis T3 binden in unterschiedlichem Ausmaß an HSA

Die Bindungseigenschaften von SL1 bis SL4 (Endkonzentration 200 µM) gegenüber HSA wurden unter Verwendung von 2 verschiedenen HSA-Lösungen (40 und 50 mg/mL) und einer Inkubationszeit von 1 Stunde verglichen (Abbildung II.2-5). Die beiden verwendeten HSA Konzentrationen lagen im Bereich der HSA-Konzentration des in späteren Versuchen verwendeten Plasmas (44.7 mg/mL).

Dihydrohelenalinmethacrylat (SL2) Dihydrohelenalinacetat (SL1) Helenalinisobutyrat (SL3) Tinktur T1 Tinktur T2 Tinktur T3 Parthenolid (SL4)

80.00 70.00 60.00 d,h 50.00 gh c c,d,g 40.00 30.00 a,f b,f a,e a eb 20.00 10.00 gebundenes SL [%] 0.00 HSA (40 mg/mL) HSA (50 mg/mL)

Abbildung II.2-5. Reaktion von SL1 bis SL4 (200 µM) und der SLs in den Arnikatinkturen T1 bis T3 (200 µM Gesamt-SL) mit HSA bei zwei unterschiedlichen Konzentrationen nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde und einer Temperatur von 37 °C. Die gebundenen SLs sind als prozentualer Anteil an den eingesetzten SL-Mengen angegeben. Signifikanzberechnungen wurden durchgeführt zwischen SLs und SLs in Tinkturen innerhalb derselben Matrix sowie zwischen den einzelnen SLs und Tinkturen in den verschiedenen Matrices. Gleiche Buchstaben kennzeichnen Werte, die keine statistische Signifikanz (p>0.05) untereinander aufweisen.

ERGEBNISSE 53

Die gebundenen Anteile von SL1, SL3 und SL4 stiegen signifikant an, wenn 50 mg/mL HSA anstelle von 40 mg/mL HSA verwendet wurden. Bei SL2 ist ein ähnlicher, jedoch nicht signifikanter Trend zu beobachten. Diese Ergebnisse unterstreichen die Beobachtungen, die bei Inkubation von SL4 mit unterschiedlichen HSA-Konzentrationen gemacht wurden (Abbildung II.2-4). Die monofunktionellen SLs (SL1 und SL2) zeigen eine geringere Bindung als das bifunktionelle SL3. Parthenolid (SL4) – obwohl eigentlich auch monofunktionell – bindet im größten Ausmaß an HSA.

Die SLs in den Arnikatinkturen zeigen ein vergleichbares Verhalten wie ihre entsprechenden Hauptkomponenten. Es existieren aber einige Unterschiede. Zum einen ist beim Übergang von 40 mg/mL HSA zu 50 mg/mL kein signifikantes Ansteigen der gebundenen SL-Menge, sondern nur ein Trend in diese Richtung zu verzeichnen (Abbildung II.2-5). Dies ist jedoch größtenteils auf die größere Varianz der Messwerte zurückzuführen, deren Ursache wiederum im fehleranfälligen Aufsummieren der vielen SL-Peakflächen in den Tinkturen zu suchen ist. Weiterhin fällt eine etwas - meist auch signifikant - höhere Menge an gebundenem Gesamt-SL in den Tinkturen im Vergleich zum entsprechend dominierenden SL auf: Tinktur T1 zeigt bei beiden HSA-Konzentrationen einen größeren gebundenen SL-Anteil als dies bei dem in dieser Tinktur dominierenden Dihydrohelenalinmethacrylat (SL1) zu beobachten ist. Ähnlich verhält es sich bei den Tinkturen T2 und T3 im Vergleich zu deren dominierendem SL Helenalinisobutyrat (SL3) (Abbildung II.2-5).

Um Einblicke in das kinetische Verhalten zu bekommen, wurden Experimente mit unterschiedlichen SL-Konzentrationen (jeweils 100 µM, 200 µM und 500 µM) in einer Lösung mit 40 mg/mL HSA durchgeführt (Abbildung II.2-6). Im Gegensatz zu SL1 bis SL3, zeigte Parthenolid (SL4) einen gleichbleibenden Prozentsatz an gebundenem SL (Abbildung II.2-6, links). Dies ist ein Hinweis darauf, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt durch SL4 selbst bestimmt wird. Dieses Verhalten könnte durch die hypothetische Bildung eines kationischen Intermediates (siehe Abbildung IV.2-1) von SL4 sowie durch seine im Vergleich zum bifunktionellen Helenalinisobutyrat (SL3) hohe Proteinbindung bedingt sein. Im

54 ERGEBNISSE

Gegensatz zu SL4 wurden bei SL2 die gleichen absoluten Mengen bei allen eingesetzten Konzentrationen gebunden (Abbildung II.2-6, rechts). Hier wäre eine überwiegende Beeinflussung der Reaktionsgeschwindigkeit durch das HSA eine mögliche Erklärung. Ein Verhalten, wie es für eine Reaktion zweiter Ordnung zu erwarten ist, zeigten SL1 und SL3: Bei ihnen stieg mit zunehmender Konzentration die absolute Menge an gebundenen SLs, während der prozentuale Anteil der gebundenen SLs abnimmt (Abbildung II.2-6, links und rechts).

Dihydrohelenalinacetat (SL1) Dihydrohelenalinmethacrylat (SL2)

Helenalinisobutyrat (SL3) Parthenolid (SL4) 100 250

80 200

60 150

40 100

20 50 gebundenes SL [%] SL [%]

0 SL [nmol] gebundenes 0 0 100 200 300 400 500 600 0 100 200 300 400 500 600 SL-Konzentration [µM] SL-Konzentration [µM]

Abbildung II.2-6. Menge von an HSA gebundenen SLs SL1 bis SL4 nach einstündiger Inkubationszeit bei 37 °C und einer HSA-Konzentration von 40 mg/mL (602 µM). links: prozentuale Angabe, rechts: absolute Angabe des gebundenen SLs.

Tinktur T1 Tinktur T2 Tinktur T3 100 250

80 200

60 150

40 100

20 50 gebundenes SL [%]

0 gebundenes SL [nmol] 0 0 100 200 300 400 500 600 0 100 200 300 400 500 600 SL-Konzentration [µM] SL-Konzentration [µM]

Abbildung II.2-7. Menge von an HSA gebundenes Gesamt-SL in den Tinkturen T1 bis T3 nach einstündiger Inkubationszeit bei 37 °C und einer HSA-Konzentration von 40 mg/mL (602 µM). links: prozentuale Angabe, rechts: absolute Angabe des gebundenen SLs.

Die Gesamt-SLs in den Tinkturen zeigten ein im wesentlichen identisches Verhalten wie die entsprechenden Hauptkomponenten: Tinktur T1 wies die gleiche Charakteristik wie SL2 auf; Die Tinkturen T2 und T3 entsprachen in ihren Bindungsverhalten SL3 (Abbildung II.2-7).

ERGEBNISSE 55

II.2.4. Bindungsverhalten der Sesquiterpenlactone SL1 bis SL4 und der Arnikatinkturen T1 bis T3 gegenüber Plasma

Der Gehalt von HSA in Plasma wurde zu 44.7 mg/mL bestimmt. Die Bindungsraten der SL1 bis SL4 zeigten bei Verwendung von Plasma dieselbe Reihenfolge wie bei der Verwendung von HSA: der Dihydrohelenalinester SL2 zeigte die geringste, Parthenolid (SL4) die höchste Bindungsrate (Abbildung II.2-8). Verglichen mit den Bindungsstudien unter Verwendung der HSA-Lösungen fiel eine wesentliche Erhöhung des gebundenen Anteils auf, trotz eines vergleichbaren HSA-Anteils. Die Bindungsrate ist bei SL1 bis SL3 um den Faktor 2, bei SL4 um den Faktor 1.5 höher (Tabelle II.2-1).

Dihydrohelenalinmethacrylat (SL2) Dihydrohelenalinacetat (SL1) Helenalinisobutyrat (SL3) Tinktur T1 Tinktur T2 Tinktur T3 Parthenolid (SL4)

100.00 c c dd 80.00 d 60.00 a,b a,b b a,b 40.00

20.00 gebundenes SL [%] 0.00 Plasma Blut

Abbildung II.2-8. Reaktion von SL1 bis SL4 (200 µM) und der SLs in den Arnikatinkturen T1 bis T3 (200 µM Gesamt-SL) mit Plasma und Blut nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde und einer Temperatur von 37 °C. Die gebundenen SLs sind als prozentualer Anteil an den eingesetzten SL-Mengen angegeben. Gleiche Buchstaben kennzeichnen Werte, die keine statistische Signifikanz (p>0.05) untereinander aufweisen.

Im Gegensatz zu den isolierten Substanzen zeigten die SLs in den Tinkturen ein komplett anderes Verhalten. Bei ihnen war kein Anstieg der Bindungsrate bei Verwendung von Plasma festzustellen, sondern ein fast identisches Bindungsverhalten beim Vergleich von HSA-Lösungen und Plasma (Tabelle II.2-1, Abbildung II.2-5 und Abbildung II.2-8).

56 ERGEBNISSE

Tabelle II.2-1. Faktor, um den sich der gebundene Anteil am entsprechenden SL bzw. an den SLs in den Tinkturen ändert, wenn man von einer HSA-Lösung (40 mg/mL und 50 mg/mL HSA) zu Plasma (44.7 mg/mL) übergeht.

Sesquiterpenlactone Tinkturen

SL1 SL2 SL3 SL4 T1 T2 T3 40 mg/mL HSA 2.5 2.6 1.8 1.5 1.3 1.2 1.1 50 mg/mL HSA 1.8 2.0 1.7 1.4 1.0 1.1 1.0

II.2.5. Bindungsverhalten der Sesquiterpenlactone SL1 bis SL4 und der Arnikatinkturen T1 bis T3 gegenüber Blut

Bei der Verwendung von Blut als Matrix wurde eine allgemeine Zunahme des gebundenen Anteils aller SLs festgestellt – diesmal auch eine Zunahme des gebundenen Anteils der SLs in den Tinkturen (Abbildung II.2-8). In diesem Versuch war kein signifikanter Unterschied zwischen der Bindung von SL1 und SL2 zu beobachten. SL4 ist nahezu komplett an Blut gebunden und nur noch in Spuren zu detektieren.

Auch bei den SLs in den Tinkturen war eine Zunahme des gebundenen Anteils im Vergleich zur Verwendung von Plasma zu erkennen. Jedoch war der gebundene Anteil immer noch geringer als bei Verwendung der isolierten SLs (Abbildung II.2-8).

II.2.6. Bindungsverhalten von 11β-Glutathionyl-parthenolid (SL5) an HSA

Die Wahrscheinlichkeit einer Bildung von Glutathion-SL-Addukten im Blut ist sehr hoch. Eine Reaktion von verschiedenen SLs wie Helenalin und Parthenolid mit

L-Glutathion (GSH) wurde nachgewiesen, ebenso die Reversibilität dieser Michael-

Addition. Weiterhin findet man in den Erythrozyten eine hohe Konzentration an L- Glutathion (Adamowicz et al. 2002). SLs können sehr gut Zellmembranen penetrieren, was die zahlreichen Zellversuche zu ihrer antiphlogistischen Aktivität beweisen (siehe Literatur in (Siedle et al. 2004)). Aber auch extrazellulär kommt GSH in geringeren Mengen vor. SL-Glutathion-Addukte zeigen eine vergleichbare antiphlogistische Aktivität in Enzymassays wie die entsprechenden SLs (Schmidt 2000; Schmidt et al. 1999; Schmidt 1997).

ERGEBNISSE 57

Es stellt sich die Frage, ob diese Addukte ebenso mit HSA oder Bestandteilen des Plasmas reagieren wie die einzelnen SLs oder nicht. Hieraus würden sich Hinweise über die Reversibilität einer Bindung zwischen HSA und SL ergeben. Vor diesem Hintergrund wurden unterschiedliche Konzentrationen an HSA und Plasma mit einer Lösung von 11β-Glutathionyl-parthenolid (SL5) versetzt und nach verschiedenen Inkubationszeiten mittels HPTLC die Menge an SL5 bestimmt.

40 mg/mL HSA 50 mg/mL HSA Plasma Puffer

100

40 freies Addukt [%] 20

0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Inkubationszeit [min]

Abbildung II.2-9. Reaktion von 11-β-Glutathionyl-Parthenolid mit zwei verschiedenen Konzentrationen an HSA und mit Plasma. Als Vergleich wurde weiterhin eine Zeitkurve für SL5 in 0.01 M Phosphat-Puffer (pH 7.4) aufgenommen.

Wie aus der Abbildung II.2-9 zu erkennen ist, besteht wiederum eine Abhängigkeit von der Konzentration an HSA: Bei Verwendung von 40 mg/mL HSA ist bei allen Zeitpunkten ein statistisch signifikant höherer Anteil an freiem SL5 detektierbar als beim Einsatz von 50 mg/mL HSA. Nach 5 Stunden ist bei beiden HSA- Konzentrationen ein Wert an freiem SL5 erreicht, der auch über die nächsten 16 Stunden nur unmerklich abnimmt. Ähnliches ist bei der Verwendung von Plasma zu beobachten. Allerdings nimmt im Plasma die Menge an SL5 auch nach 5 stündiger Inkubationszeit weiter ab. Nach 1200 min sinkt der Wert auf 20 %. Auch bei Verwendung von reinem Puffer ist eine Abnahme feststellbar: Aus messtechnischen Gründen ist der erste Wert erst nach einer halben Stunde detektierbar und wurde auf 100 % gesetzt. Nach zwei Stunden hat die Konzentration an freiem SL5 auf 90 % abgenommen und bleibt daraufhin unverändert. Dies spricht für eine Gleichgewichtseinstellung zwischen Addukt und Parthenolid nach ungefähr zwei

58 ERGEBNISSE

Stunden. Die nach 20 Stunden festgestellte, ungefähr um den Faktor 2 geringere Menge an Addukt SL5 im Plasma im Vergleich zu den HSA-Matrices, liegt ungefähr in derselben Größenordnung wie der Unterschied der Bindung von Parthenolid zu HSA bzw. Plasma.

II.2.7. Betrachtung der Reaktionskinetik von Parthenolid gegenüber HSA

Zur Bestimmung der Reaktionskinetik wurde untersucht, ob eine Reaktion nullter, erster oder zweiter Ordnung vorliegt, um Hinweise zu erhalten, wie viele Reaktionspartner beteiligt sind und nach welchem Schema die beobachteten Bindungsreaktionen ablaufen. Hierfür wurden die Daten für die zeitabhängige Reaktion von SL4 mit HSA (40 mg/mL) verwendet (s. Abschnitt II.2.2). Eine Reaktion nullter (bzw. pseudonullter) Ordnung kann rein visuell bei Betrachtung der Abbildung II.2-3 ausgeschlossen werden. Sie wäre auch schwierig zu erklären, da beide Reaktionspartner in einem vergleichbaren molaren Konzentrationsbereich vorliegen. Eine Reaktion erster Ordnung wäre gegeben, wenn die Reaktion nur von der Konzentration an Parthenolid abhängig wäre, z.B. durch eine vorausgehende notwendige Aktivierung von Parthenolid. Diese Reaktionsordnung würde folgende Gesetzmäßigkeit aufweisen:

−k∗t CSL4 (t) = C0;SL4 ∗ e (Formel II.2-1)

Somit ergäbe sich ein linearer Abfall an der Konzentration von Parthenolid cSL4, wenn ln cSL4 gegen die Zeit t aufgetragen würde. Wie in Abbildung II.2-10 zu sehen, ergibt sich keine lineare Beziehung und somit gehorcht diese Reaktion nicht einer Kinetik erster Ordnung.

ERGEBNISSE 59

5 R2 = 0.9717 4

SL4 3 ln c 2

0 0.0 200.0 400.0 600.0 800.0 1000.0 1200.0 Inkubationszeit [min]

Abbildung II.2-10. Auftragung von ln cSL4 gegen die Zeit t. Es ist kein linearer Abfall zu beobachten.

Am wahrscheinlichsten für die untersuchte Reaktion wäre eine Kinetik zweiter Ordnung mit folgendem Reaktionsschema: SL4 + HSA → Addukt Für diese Reaktionskinetik lässt sich folgende Gleichung aufstellen:

y = −k *t (Formel II.2-2) mit

1 c * c y = ∗ ln 0;HSA t;SL4 (Formel II.2-3) c0;HSA − c0;SL4 ct ;HSA * c0;SL4

Die entsprechende Auftragung des Terms y gegen die Zeit t ist in Abbildung II.2-11 dargestellt. Zwar ist hier eine wesentlich bessere lineare Korrelation festzustellen, aber die Abweichungen sind trotzdem noch zu groß.

60 ERGEBNISSE

-1000

-2000 R2 = 0.9907 -3000

-4000 y [l/mol]

-5000

-6000

-7000 0 200 400 600 800 1000 1200 Inkubationszeit [min]

Abbildung II.2-11. Auftragung von y gegen die Zeit t. Als cHSA;0 wurde die Gesamtkonzentration an HSA in die Gleichung eingesetzt.

Bei der letzten Berechnung wurde davon ausgegangen, dass die gesamte Menge an eingesetztem HSA für die Reaktion zur Verfügung steht. Da, wie oben dargelegt, eine Reaktion von Cys 34 mit SL4 am wahrscheinlichsten ist, müßte für die Berechnung der Reaktionskinetik zweiter Ordnung nur die Konzentration an HSA mit freier Thiol-Gruppe an Cystein 34 verwendet werden. Wie im Abschnitt II.2.8 gezeigt, besitzen aber nur 34.5 % des eingesetzten HSA ein freies Cystein 34.

0 -5000 -10000 -15000 R2 = 0.9972 -20000 -25000 y [l/mol] -30000 -35000 -40000 -45000 0 200 400 600 800 1000 1200 Inkubationszeit [min]

Abbildung II.2-12. Auftragung von y gegen die Zeit t. Als c0;HSA wurde die Konzentration an HSA mit freier Thiol-Gruppe am Cystein 34 (34.5 % der Gesamtkonzentration) verwendet.

ERGEBNISSE 61

Unter Berücksichtigung der sich ergebenden Konzentrationen wurde Abbildung II.2-12 erstellt. Hier ist eine gute lineare Korrelation erkennbar, die sich durch eine Betrachtung der Residuen bestätigt (Abbildung II.2-13). Es ergibt sich eine Geschwindigkeitskonstante k von 44 Lmol-1min-1.

Abbildung II.2-13. Residual-Plot von Abbildung II.2-12. Es ist eine relativ gleichmäßige Verteilung der Messpunkte erkennbar.

Um dieses Ergebnis zu verifizieren, wurden die Daten verwendet, die bei der Betrachtung der Konzentrationsabhängigkeit der Bindung von SL4 mit HSA erhalten wurden. Unter Benutzung dieser Daten und der Formel II.2-2 und II.2-3 für die Reaktion zweiter Ordnung kann die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante k für jede einzelne HSA-Konzentration berechnet werden. Diese Konstanten weichen sowohl untereinander als auch von der Geschwindigkeitskonstante k=44 Lmol-1min-1, die im Zeitversuch ermittelt wurde, ab (Tabelle II.2-2). Dies spricht trotz der guten Korrelation beim Zeitversuch (Abbildung II.2-12) gegen das Vorhandensein einer Reaktion zweiter Ordnung.

Tabelle II.2-2. Geschwindigkeitskonstanten k unter Annahme einer Reaktion zweiter Ordnung für die einzelnen HSA-Konzentrationen.

HSA-Gesamtkonzentration [mg/mL] 5 10 20 30 40 50 Geschwindigkeitskonstante k [Lmol-1min-1] 111 174 110 68 65 60

Somit ergibt sich ein sehr uneinheitliches Bild der Reaktion zwischen HSA und Parthenolid. Eine einfache Reaktion zwischen 1 mol HSA und 1 mol Parthenolid kann ausgeschlossen werden.

62 ERGEBNISSE

II.2.8. Effekt der Sesquiterpenlactone SL1, SL2 und SL4 auf die Thiol-Gruppen des HSA

Die Betrachtung der Reaktionskinetik hat gezeigt, dass nicht von einer einfachen Reaktion von Cystein 34 mit den SLs ausgegangen werden kann, wie es Untersuchungen über Reaktionen von SLs mit Thiolen, wie Glutathion oder Cystein, nahelegen. Um zu untersuchen, welchen Anteil die Reaktion mit Cystein 34 an der Gesamtbindung hat, wurde die Konzentration an freiem Thiol in HSA in Gegenwart von SL1, SL3 und SL4 über die Zeit bestimmt. Auf eine Untersuchung von SL2 wurde verzichtet, da die vorhergehenden Untersuchungen eine ähnliche Bindungsrate zu HSA und Plasma zeigten wie SL1. Die Versuche wurden in 40 mg/mL (602 µM) HSA durchgeführt. Die Konzentration der SLs betrug wiederum 200 µM. Das Prinzip der Bestimmung ist eine Reaktion von 5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoat) mit Thiolgruppen, wobei gelb gefärbte, UV- photometrisch vermessbare 5-Thio-2-nitrobenzoesäure gebildet wird. Der Gehalt an freiem Cystein 34 in der HSA-Lösung wurde zu 208±2 µM bestimmt. Dies entspricht einem Anteil von 34.5 % an HSA mit freiem Cystein 34 in den verwendeten HSA- Lösungen und stimmt mit früheren Literaturwerten überein (Kratz et al. 2000; Warnecke et al. 2004). Als Kontrolle wurden folgende zwei Experimente durchgeführt: SL4 (200 µM) wurde für eine Stunde mit L-Glutathion-Lösung (200 µM) inkubiert. Die Menge an freiem Thiol reduzierte sich hierbei auf 21.8±2.0 %. Dies zeigt, dass die Abnahme an Thiol detektierbar ist und Parthenolid die Farb-Reaktion nicht stört. Weiterhin wurde N- Ethylmaleinimid (200 µM) mit HSA (40 mg/mL) versetzt und eine Stunde inkubiert. Hierbei reduzierte sich die Menge an freiem Thiol (d.h. die Menge an freiem Cystein 34) auf 14.6±0.3 %. Dies ist wiederum ein Beweis für die Erreichbarkeit von Cystein 34 sowohl für das farbgebende 5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoat) als auch für N-Ethylmaleinimid. SL3 reduzierte den Anteil an freien Thiol-Gruppen auf 196±2 µM (Reduktion um 5.8 %) nach einer Inkubationszeit von 60 min und auf 185±2 µM (Reduktion um 11.1 %) nach 20stündiger Inkubationszeit. Im Gegensatz dazu zeigen SL1 und SL4

ERGEBNISSE 63 erst nach 20 Stunden eine nennenswerte Reduktion auf 199±4 µM (Reduktion um 4.3 %) bzw. auf 192±1 µM (Reduktion um 7.7 %), (Abbildung II.2-14).

225 Dihydrohelenalinacetat (SL1) 220 Helenalinisobutyrat (SL3) 215 Parthenolid (SL4) 210 HSA-Kontrolle für SL1 205 HSA-Kontrolle für SL3

[µM] 200 * * HSA-Kontrolle für SL4 195 * 190 * 185 * 180 Konzentration an freien Thiol freien an Konzentration 0 204060801001060 1080 1100 Inkubationszeit[min]

Abbildung II.2-14. Effekt der SLs SL1, SL3 und SL4 auf die freien Thiol-Gruppen in HSA (40 mg/mL) bei 37 °C. Die mit „*“ gekennzeichneten Werte unterscheiden sich statistisch signifikant von den entsprechenden Negativkontrollen (p<0.05).

Interessant ist weiterhin das Ausmaß der Bindung für die einzelnen SLs. Während bei den Versuchen, die auf einer Proteinfällung beruhen, Parthenolid (SL4) am meisten an HSA gebunden wurde, gefolgt von Helenalinisobutyrat (SL3) und Dihydrohelenalinacetat (SL1) (Abbildung II.2-5), änderte sich die Reihenfolge bei der Cystein 34 Bindung: SL3 wurde am meisten gebunden, gefolgt von SL4 und schließlich SL1. Dabei wurde das bifunktionelle SL3 doppelt so stark wie das monofunktionelle SL1 gebunden.

II.2.9. Bestimmung des ungebundenen Anteils an Parthenolid nach Inkubation mit HSA mittels Ausschluß-HPLC

Bei den obigen Untersuchungen zeigte sich, dass nur ein kleiner Teil des gebundenen SL-Anteils auf eine Reaktion mit Cystein 34 zurückführen ist. Es ergibt sich nun die Frage, ob der überwiegende Teil der gebundenen SLs sich in einer kovalenten Bindung zu anderen Aminosäuren des HSA befindet oder aber sich nicht-kovalent an die Oberfläche des HSA anlagert und bei der Proteinfällung durch Acetonzugabe einfach mitausgefällt wird. Eine Möglichkeit, dies zu bestimmen, ist die Auftrennung der Inkubationslösung ohne vorherige Aufarbeitung durch eine Ausschluß-HPLC. Durch die große Anzahl an theoretischen Böden in einer HPLC-Säule können die nicht-kovalenten Bindungen infolge ihrer schnelleren Gleichgewichtseinstellung

64 ERGEBNISSE getrennt und Parthenolid als isolierter Peak erhalten werden. Weiterhin kann in einem zweiten Versuch Cystein 34 mittels N-Ethylmaleinimid (NEM) blockiert werden und somit der Anteil an kovalenter, aber nicht durch Cystein 34 bedingter Bindung bestimmt werden. Als Modellsubstanz für diesen Versuch wurde Parthenolid (SL4) verwendet.

100 Parthenolid und HSA Parthenolid, HSA und NEM

freies Parthenolid (%) 20

0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Inkubationszeit (min)

Abbildung II.2-15. Reaktion von SL4 (200 µM) mit HSA (40 mg/mL) nach 1, 2, 3 und 26 stündigen Inkubationszeit und einer Temperatur von 37 °C. Hierbei wurde einmal N- Ethylmaleinimid zugesetzt, um freies Cystein 34 zu blockieren. Das freie, wiedergefundene SL4 ist als prozentualer Anteil an der eingesetzten SL-Menge angegeben. Im Gegensatz zu den obigen Bindungsstudien erfolgte hier die Bestimmung des freien Parthenolids nicht mittels Eiweißfällung und GC-Untersuchung, sondern mittels Ausschluß-HPLC unter direktem Einspritzen der Inkubationslösung.

Wie in Abbildung II.2-15 zu erkennen, zeigte Parthenolid nach einstündiger Inkubationszeit eine im Vergleich zum Fällungsversuch wesentlich geringere Bindung (19.8±0.4 % vs. 52.3±2.3 %). Dies gilt auch für längere Inkubationszeiten: Während bei den Fällungsversuchen nach 16h weniger als 5 % des Parthenolids noch detektierbar waren, waren hier noch nach 26 Stunden um die 15 % des Parthenolids auffindbar. Der Anteil an Thiol gebundenem Parthenolid ergibt sich aus der Differenz zwischen dem Bindungsanteil von Parthenolid bei der Inkubation in HSA und dem bei der Inkubation mit HSA+NEM. Dieser Anteil ist nach einstündiger Inkubation gering und liegt mit ca. 2.8±0.8 % in einer ähnlichen Größenordnung wie die Werte, die sich bei der Bestimmung nach Ellmann ergaben (Abschnitt II.2.9). Der thiol-gebundene Anteil erhöht sich nach 26 h nur geringfügig auf ca. 4 %.

ERGEBNISSE 65

II.3. Penetrationsverhalten von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana L.

II.3.1. Überblick über den Aufbau der humanen Haut und Grundlagen der Penetration

Die Haut ist mit einer Fläche von bis zu 2 m² und einer durchschnittlichen Masse von 11 kg nach der Skelettmuskulatur das größte Organ des Menschen. Anatomisch besteht sie aus der Epidermis, dem bindegewebsreichen Corium und der Subcutis. Epidermis und Corium werden zur Cutis zusammengefasst (Abbildung II.3-1).

Abbildung II.3-1. Aufbau der menschlichen Haut (oben links) unter besonderer Berücksichtigung der Epidermis (oben rechts) und des Stratum corneums (unten). Die Bilder wurden (Kühnel 2002) und (Landmann 1991) entnommen.

Die Epidermis stellt ein mehrschichtiges, verhorntes Plattenepithel aus 10-20 bis zu mehreren 100 Zellschichten dar. Histologisch unterteilt sie sich von innen nach außen in das Stratum basale, das Stratum spinosum, das Stratum granulosum, das Stratum lucidum (nur in der Leistenhaut) und das Stratum corneum (Abbildung II.3-1). Die

66 ERGEBNISSE zentrale Aufgabe der Epidermis ist die Bildung des Stratum corneums, das ständig in Form kleiner Schüppchen abgeschilfert wird. Neue Zellen werden im Stratum basale gebildet. Die Zellen werden nach außen geschoben und machen dabei einen Prozeß der Zelldifferenzierung durch. Die histologisch erkennbaren Schichten der Epidermis basieren auf den biochemischen und morphologischen Änderungen der Zellen während dieser Differenzierung (Thews et al. 1991).

Das Stratum corneum (Hornhaut) Die äußerste Schicht der Epidermis gilt als die größte Barriere für eine freie transdermale Diffusion (Schaefer et al. 1978; Scheuplein und Blank 1971) und steht somit im Zentrum von Untersuchungen zur Wirkstoffpermeation durch die Haut. Diese Barrierefunktion ist Vorraussetzung für die Existenz vieler höherer Lebensformen auf dem Festland (Gray und White 1978; Gray und Yardley 1975; Long et al. 1985; Yardley und Summerly 1981). Das Stratum corneum besteht aus ca. 20 Schichten abgeplatteter, vollständig verhornter, kernloser, abgestorbener Zellen. Vereinfacht zeigt die Hornhaut eine mauerartige Organisation: die proteinreichen Hornzellen sind vollständig von einer lamellaren Lipidphase umgeben (Abbildung II.3-1) (Elias 1983; Landmann 1991). Während die diskontinuierliche und volumenmäßig größere Proteinphase für physikalische und chemische Stabilität sorgt, führt die kontinuierliche Lipidphase zur Impermeabilität des Stratum corneum. Die Hornhautzellen bestehen überwiegend aus Keratin, welches sich aus den filamentbildenden Keratinen mit 40-70 kDa und den aggregat-bildenden Keratohyalinen zusammensetzt. Umgeben sind die Hornhautzellen von Involukrin, einem glutaminreichen Protein, das ein sehr widerstandsfähiges Netz um die Zellen bildet und diese schützt (Landmann 1991). Die Bildung der Lipide für die extrazellulären Lipidlamellen im Stratum corneum erfolgt in den Lamellengranula während der Zelldifferenzierung der Epidermisschichten. Die Menge an Lamellengranula nimmt nach außen hin zu. An der Grenze zur Hornhaut verschmelzen die Granula mit der Zellmembran und bilden somit die lamellenartige Struktur zwischen den Hornhautzellen aus.

ERGEBNISSE 67

Zusammensetzung der Lipidphase Vergleicht man das Lipidmuster des Stratum corneums mit dem anderer Gewebe, fällt die Dominanz an Ceramiden (40 %) , Cholesterol (einschließlich der Ester, 38 %) und freien Fettsäuren (9 %) auf (Raith 1999). Diese drei Komponenten sind es, die die Barrierefunktion aufrechterhalten. Polare Phospho- und Glykolipide fehlen fast ganz. Die Ceramide sind Amide von Fettsäuren mit langkettigen hydroxylierten Aminbasen, den Sphingoiden (Abbildung II.3-2).

O O O HN Ceramid 1 OH OH

HN Ceramid 2 OH OH Abbildung II.3-2. Struktur von zwei Ceramiden des Stratum corneum nach (Raith 1999).

Der funktionelle Aufbau der Ceramide ähnelt denjenigen von Phospholipiden. An einem hydrophilen Kopf befinden sich zwei hydrophobe Schwänze, so dass es zur Ausbildung von Doppelschichten kommt. Durch die geringere Polarität und die fehlende Ladung des „Ceramidkopfes“ im Vergleich zu den Phospholipiden können sich mehrere Doppelmembranen zusammenlagern. Diese Lamellenstruktur wird über Ceramide mit sehr langer lipophiler Kette zusammengehalten, die bis in die benachbarte Doppelschicht hineinreichen. Bei diesen „Nieten“ handelt es sich um Ceramide mit einer zusätzlichen Fettsäure an der ω-Hydroxygruppe (Abbildung II.3-2, Ceramid 1). Der Aufbau aus Lipidlamellen ist für die Bildung einer Permeationsbarriere sehr geeignet, da sie 10² bis 104 mal effektiver ist als eine reine Lipidphase (Landmann 1991).

Grundlagen der Penetration

68 ERGEBNISSE

interzellulär transzellulär

Abbildung II.3-3. Wege der Permeation für Wirkstoffe. (Barry 1987) entnommen.

Die bevorzugten Permeationswege für Wirkstoffe sind die interzelluläre oder die transzelluläre Permeation (Bauer et al. 1999). Welcher Weg bevorzugt wird, hängt unter anderem von den physikalischen Eigenschaften des Stoffes, wie Verteilungskoeffizient, Molekülgröße und Löslichkeit, ab (Kanikkannan et al. 2000). Stark lipophile Wirkstoffe werden im Normalfall über den interzellulären Weg aufgenommen, bei zunehmender Polarität spielt auch immer mehr der transzelluläre Weg eine Rolle (Barry 1987; Bauer et al. 1999). Bei beiden Wegen haben die Stratum corneum Lipide einen großen Anteil an der Barrierefunktion. Stoffe penetrieren am besten bei einem Verteilungskoeffizient um oder etwas über 1 (Williams und Barry 1992), was auf die Doppelmembranstruktur der Lipidphase zurückzuführen ist.

II.3.2. Sesquiterpenlactone penetrieren in und permeieren durch die Hornhaut

Für die Penetrationsuntersuchungen wurden zwei Sesquiterpenlactone aus Arnica montana L. ausgewählt: 11α,13-Dihydrohelenalinacetat (SL1), das dominierende SL im spanischen Chemotyp und Helenalinisobutyrat (SL3), welches in Arnikablüten mitteleuropäischer Provenienz eines der hauptsächlich vorkommenden SLs ist (Willuhn et al. 1994). Hierbei wurde die prozentuale Menge an SLs, die mindestens die angegebene Hornhauttiefe d erreicht hat (siehe V.5.4), als Penetration [%] gegen die Hornhauttiefe d aufgetragen. Unter Verwendung eines semi-logarithmischen Maßstabes konnten diese Penetrationsprofile in zwei Abschnitte unterteilt werden: Einen ersten Bereich bis zu einer Tiefe von ca. 7-10 µm, welcher das Stratum corneum

ERGEBNISSE 69 repräsentiert und einen zweiten, stärker abfallenden Bereich, welcher dem darunterliegenden Stratum granulosum zuzuordnen ist (Abbildung II.3-4). Der erste Teil der Kurve lässt sich durch eine exponentielle Gleichung beschreiben.

∗ P = ab d Formel II.3-1

Hierbei ist P die Penetration in [%] und d die Hauttiefe in [µm]. Daraus ergibt sich eine lineare Kurve im semi-logarithmischen Maßstab. Dies impliziert, dass in diesem Bereich jede Hornhautschicht denselben Widerstand gegen eine Penetration besitzt (Schaefer et al. 1978). Unter der Annahme, dass die Hornhautschicht die Hauptbarriere der Haut darstellt und das Haupthindernis für eine transdermale Diffusion ist (Schaefer et al. 1978), kann der Parameter b zur Charakterisierung der Penetrationsfähigkeit herangezogen werden: je näher der Koeffizient b an null ist (d.h. je flacher die Kurve), desto besser ist die Penetration in die Hornschicht.

Dihydrohelenalinacetat (SL1) 100

-0.3847x 2 Versuch 1 y = 32.923e ; R = 0.9646 0.1 -0.483x 2 Versuch 2 y = 44.952e ; R = 0.9801 Penetration [%] -0.3684x 2 Versuch 3 y = 36.64e ; R = 0.9479 0.01 0246810121416 Hauttiefe [µm]

Helenalinisobutyrat (SL3) 100

-0.6995x 2 Versuch 1 y = 38.988e ; R = 0.9847 10 -1.9837x Versuch 2 y = 410.22e ; R2 = 0.9937 1 -0.7721x 2 Versuch 3 y = 13.226e ; R = 0.9944 0.1 Penetration [%] 0.01 0246810121416 Hauttiefe [µm] Abbildung II.3-4. Penetrationsprofil von SL1 (oben) und SL3 (unten) von jeweils drei Versuchen nach einstündiger Inkubationszeit. Jeder Punkt repräsentiert den Prozentsatz an aufgetragenem SL, welcher mindestens bis zu dieser Tiefe penetrierte.

70 ERGEBNISSE

Während SL1 eine Penetration in und eine Permeation durch die Hornhaut zeigte, konnte SL3 nur bis zu einer Tiefe von 7 µm detektiert werden. Da jedoch die Penetrationskurven und somit auch der Koeffizient b bei SL3 starke Schwankungen zeigten, ergab sich kein signifikanter Unterschied zu den Koeffizienten b bei den Penetrationsprofilen von SL1 (Abbildung II.3-4 und Abbildung II.3-5). Die Gründe für dieses im Endeffekt unterschiedliche Verhalten der beiden sehr ähnlichen Sesquiterpenlactone könnte in der stärkeren Reaktivität von SL3 gegenüber SH- Gruppen liegen (Schmidt 1997), die zum Beispiel in Hautproteinen zu finden sind. So befinden sich vor allem in den unteren zwei Dritteln des Stratum corneums freie SH- Gruppen (Montagna und Yun 1964). Solche Alkylierungen mittels Michael-Addition gehören zu den allgemein in der Haut ablaufenden Metabolisierungen (Dimitrov et al. 2005). Dadurch würde ein Teil von SL3 in der Haut nicht mehr detektiert werden und eine geringere Penetration vortäuschen. Dagegen spricht, dass keine Reaktion zwischen dem hoch reaktiven Sesquiterpenlacton Parthenolid und gepulvertem Stratum corneum festgestellt werden konnte. Hierzu wurden 200 µl einer 2.5 mM Parthenolid-Lösung mit gepulverter Hornhaut für 1 h bei 37 °C inkubiert, getrocknet und anschließend mit Aceton unter Zugabe eines internen Standards (Santonin) extrahiert und im GC-MS vermessen.

T1 T2 SL1 SL3 0 b -0.4 a b a,b -0.8

-1.2

-1.6 Exponentialkoeffizient -2

Abbildung II.3-5. Mittelwerte der Exponentialkoeffizienten aus den Penetrationskurven von 11α,13-Dihydohelenalinacetat (SL1), Helenalinisobutyrat (SL3) sowie von den Arnikatinkturen T1 und T2 von je drei Experimenten. Ein gleicher Buchstabe kennzeichnet einen statistisch signifikanten Unterschied der jeweiligen Werte (p>0.05).

ERGEBNISSE 71

II.3.3. Sesquiterpenlactone in Tinkturen penetrieren besser als isolierte SLs

Beide untersuchte Arnikatinkturen zeigten nahezu dasgleiche Penetrationsverhalten (Abbildung II.3-6) und wiesen demzufolge auch einen identischen Exponentialkoeffizienten b auf (Abbildung II.3-5). Interessanterweise zeigten SLs, wenn sie Bestandteil von Arnikatinkturen waren, eine Zunahme der Penetration, verglichen mit den isolierten SLs in Ethanol-Wasser, obwohl Sesquiterpenlactone und Ethanol in derselben Konzentration vorlagen. Zum Beispiel waren nur 1 % der applizierten Menge an SL1 bis zu einer Tiefe von 8 µm penetriert, während 8-10 % der Sesquiterpene in Arnikatinkturen bis zu dieser Tiefe penetrierten. Hierbei ist ein statistisch signifikanter Unterschied nur zwischen den Koeffizienten b der Tinkturen und SL1 festzustellen. Ein entsprechender Unterschied zu den Koeffizienten von SL3 ist jedoch - wiederum wegen der großen Standardabweichung – nicht gegeben.

Arnica Tinktur aus Blüten des Typs "Arbo" 100

Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 0.1 -0.2322x -0.2926x -0.2647x

Penetration [%] y = 46.928e y = 50.185e y = 41.206e 2 R = 0.9927 R2 = 0.9975 R2 = 0.9943 0.01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Hauttiefe [µm]

Arnica Tinktur aus Blüten des spanischen Chemotyps 100

1 Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3

0.1 -0.3086x -0.2708x -0.2553x

Penetration [%] y = 41.992e y = 100.36e y = 56.973e R2 = 0.9796 R2 = 0.9958 R2 = 0.9961 0.01 0246810121416 Hauttiefe [µm]

Abbildung II.3-6. Penetrationsprofil der Tinkturen T1 (unten) und T2 (oben) von jeweils drei Versuchen nach einstündiger Inkubationszeit. Jeder Punkt repräsentiert den Prozentsatz an aufgetragenem SL, welcher mindestens bis zu dieser Tiefe penetrierte.

72 ERGEBNISSE

II.3.4. Ein Thymol-Derivat zeigt nur eine geringe Enhancer-Wirkung

Die verbesserte Penetration bei der Verwendung von Tinkturen könnte durch Enhancer hervorgerufen werden, wie zum Beispiel durch Fettsäuren, langkettige Alkohole, n-Alkane und Monoterpene, welche Komponenten im ätherischen Öl von Arnikablüten darstellen (Merfort 1990) und somit auch in Arnikatinkturen zu finden sind. Vor allem Monoterpene wurden in einer Vielzahl von Arbeiten auf ihre Enhancer-Aktivität überprüft und als positiv bewertet (Almirall et al. 1996; Moghimi et al. 1998; Williams und Barry 1992). Auch die in Arnikatinkturen zu findenden Monoterpene (Kos 2005; Merfort 1990) könnten an einer verbesserten Penetration beteiligt sein. Um eine Enhancer-Aktivität dieser pflanzlichen Sekundärstoffe zu überprüfen, wurde eine Lösung von SL1 (2.5 mM; Ethanol/Wasser = 7:3) mit 10-Acetoxy-8,9- epoxythymolisobutyrat (Endkonzentration: 1.13 mM) versetzt und die Penetration von SL1 bei Verwendung dieser Lösung untersucht. Zur Kontrolle erfolgte die Penetrationsmessung einer 2.5 mM SL1-Lösung ohne Zugabe eines Thymolderivates. Als Anhaltspunkt für die eingesetzte Menge des Thymolderivates dienten GC-MS- Analysen in unterschiedlichen Tinkturen, durch die eine maximale Konzentration an Thymolderivaten von ungefähr 0.1 % (1.13 mM berechnet als 10-Acetoxy-8,9- epoxythymolisobutyrat) abgeschätzt wurde. Um den Einfluß von interindividuellen Unterschieden im Hautzustand zu unterbinden, erfolgte die Vermessung je einer Probe und einer Kontrolle auf demselben Ohr. Die Versuche wurden doppelt durchgeführt (Abbildung II.3-7). Die Koeffizienten b als Maß für die Penetration unterschieden sich je nachdem, ob das Thymolderivat verwendet wurde oder nicht (Abbildung II.3-7). Somit konnte bei Gegenwart von 10-Acetoxy-8,9-epoxythymolisobutyrat eine geringe Zunahme der Penetration nachgewiesen werden. Diese Verbesserung der Penetration ist jedoch wesentlich geringer als beim Vergleich von reinem SL und der entsprechenden Tinktur. Hier ergibt sich ein um den Faktor 0.67 kleinerer Koeffizient b, während sich beim Vergleich zur Kombination SL und Thymolderivat nur ein entsprechender Faktor von 0.93 errechnen läßt.

ERGEBNISSE 73

-0.3278x -0.305x SL1 (1) y = 7.7293e SL1 + Thymolderivat (1) y = 28.237e R2 = 0.9621 R2 = 0.9664 -0.3286 -0.3077 SL1 (2) y = 5.6151e x SL1 + Thymolderivat (2) y = 5.9786e x R2 = 0.9845 R2 = 0.9736 100 0

10 -0.1 SL2 1 -0.2 + Thymolderivat

0.1 -0.3 SL2 Koeffizient b Penetration [%] 0.01 -0.4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Hornhauttiefe [µm]

Abbildung II.3-7. links: Penetrationsprofil von SL1-Lösung in Gegenwart von 10-Acetoxy-8,9- epoxythymolisobutyrat (graue Symbole) und ohne weiteren Zusatz (weiße Symbole) bei zwei Versuchen nach einstündiger Inkubationszeit. Jeder Punkt repräsentiert den Prozentsatz an aufgetragenem SL, welcher mindestens bis zu dieser Tiefe penetrierte. rechts: Mittelwerte der Exponentialkoeffizienten b von je zwei Experimenten. Die beiden Mittelwerte unterscheiden sich statistisch signifikant (p>0.05).

II.3.5. Sesquiterpenlactone in Arnikazubereitungen zeigen eine ausreichende Penetration und Permeation

Da Arnikatinkturen nur verdünnt oder aber als halbfeste Zubereitung Anwendung finden, sollten verschiedene Zubereitungen (Z1 bis Z6) untersucht werden. Die Zubereitungen Z1 bis Z4 bestanden zu 50 % aus einer Tinktur, die aus Arnikablüten des Types „Arbo“ hergestellt wurden. Der Gehalt an Gesamt-SLs betrug bei allen vier Zubereitungen 0.50 mM. Bei Z1 handelte es sich um eine verdünnte Tinktur, während Z2 10 % und Z3 2.5 % eines Lipides enthielten. Z4 war eine Gel-Formulierung mit Hydroxypropylcellulose und Glycerol. Auch bei Z5 handelte es sich um ein Gel, das allerdings 25 % Arnikatinktur des spanischen Chemotyps enthielt und ein Gesamt-SL-Gehalt von 0.25 mM aufwies. Z6 war eine Salbe, die 25% eines öligen Auszuges von Arnikablüten des spanischen Chemotyps enthielt mit einem Gesamt-SL-Gehalt von 0.35 mM. Alle getesteten Zubereitungen zeigten eine Penetration in und eine Permeation durch die Hornhaut (Abbildung II.3-8). Dabei traten starke Unterschiede auf, die sich bei

74 ERGEBNISSE

Zugrundelegen der Koeffizienten b auch teilweise als statistisch signifikant erwiesen (Abbildung II.3-9). Z3 bis Z6 zeigten eine bessere Penetration als Z1 und Z2. Der Koeffizient b von der verdünnten Arnikatinktur Z1 war identisch mit demjenigen der getesteten Arnikatinkturen T1 und T2 (Abbildung II.3-5 und Abbildung II.3-6). Wie man beim Vergleich der beiden Gelzubereitungen Z4 (mit mitteleuropäischer Arnikatinktur) und Z5 (mit Tinktur aus spanischem Chemotyp) erkennt, war die Penetration von SLs in Zubereitungen - genauso wenig wie in den Tinkturen - von der Herkunft der Arnikablüten abhängig.

100 100 Z1 (Versuch 1) Z1 (Versuch 1) Z1 (Versuch 1) Z2 (Versuch 1) Z2 (Versuch 2) Z2 (Versuch 3) -0.2971x -0.1913x -0.3153x y = 13.729e y = 38.809e y = 16.104e y = 4.7805e-0.4228x y = 11.02e-0.3999x y = 7.3896e-0.2873x 2 2 2 R = 0.9249 R = 0.9845 R = 0.9922 R2 = 0.9887 R2 = 0.9969 R2 = 0.9751 10 10

1 1 Penetration [%] Penetration Penetration [%]

0.1 0.1 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 Hauttiefe [µm] Hauttiefe [µm] 100 100 Z3 (Versuch 1) Z3 (Versuch 2) Z3 (Versuch 3) Z4 (Versuch 1) Z4 (Versuch 2) Z4 (Versuch 3) -0.134x -0.1222x y = 3.7544e-0.1252x y = 8.9261e-0.1657x y = 11.065e-0.1487x y = 4.6071e y = 5.3693e y = 1.5795e-0.136x 2 2 R2 = 0.9838 R2 = 0.9842 R2 = 0.9908 R = 0.9626 R = 0.9706 R2 = 0.8798 10 10

1 1 Penetration [%] Penetration Penetration [%]

0.1 0.1 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 Hauttiefe [µm] Hauttiefe [µm] 100 100 Z5 (Versuch 1) Z5 (Versuch 2) Z5 (Versuch 3) Z6 (Versuch 1) Z6 (Versuch 2) Z6 (Versuch 3) y = 5.1841e-0.1358x y = 6.8062e-0.2565x y = 5.6357e-0.1384x y = 5.2576e-0.1608x y = 4.592e-0.246x y = 6.5543e-0.1416x R2 = 0.917 R2 = 0.9955 R2 = 0.9904 R2 = 0.9994 R2 = 0.9555 R2 = 0.9717 10 10

1 1 Penetration [%] Penetration Penetration [%]

0.1 0.1 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 Hauttiefe [µm] Hauttiefe [µm]

Abbildung II.3-8. Penetrationsprofil der Zubereitungen Z1 bis Z6 von jeweils drei Versuchen nach einstündiger Inkubationszeit. Jeder Punkt repräsentiert den Prozentsatz an aufgetragenem SL, welcher mindestens bis zu dieser Tiefe penetrierte.

Wie oben aufgeführt, zeigten SLs in Tinkturen eine bessere Penetration als isolierte SLs. Sehr häufig werden in kommerziellen Produkten – wie zum Beispiel in Z6 – statt Arnikatinktur Arnika-Öl-Extrakte verarbeitet. Wie man in Abbildung II.3-8 und Abbildung II.3-9 erkennt, zeigte Z6 ein ähnliches Penetrationsverhalten wie Z3, Z4

ERGEBNISSE 75 und Z5. Dies läßt vermuten, dass das Enhancement-Prinzip der Tinkturen auch in den Öl-Extrakten zu finden ist.

Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 0

-0.1

b,d -0.2 a,c e f -0.3

a,b -0.4 Exponentialkoeffizient b c,d,e,f -0.5

Abbildung II.3-9. Mittelwert der Exponentialkoeffizienten b der Penetrationskurven aus je drei Experimenten von den Zubereitungen Z1 bis Z6. Ein gleicher Buchstabe kennzeichnet einen statistisch signifikanten Unterschied der jeweiligen Werte (p>0.05).

II.3.6. Eine Erhöhung der SL-Konzentration führt zu einer im gleichen Maßen erhöhten Menge an penetrierten SL

Ein Hauptproblem bei der Arzneimitteltherapie ist das Erreichen einer ausreichenden Konzentration des Arzneistoffs am Wirkort. Bei der lokalen Therapie spielen neben der pharmazeutischen Formulierung oder Enhancern die Konzentration des Arzneistoffs die entscheidende Rolle. Daher wurde das Penetrationsverhalten von SLs in der Zubereitung Z7 untersucht, welche eine 10fach höhere Konzentration an 11α,13-Dihydrohelenalinderivaten bei ansonsten gleicher Zusammensetzung besitzt als Z6. Weiterhin unterscheiden sich die SL-Anteile nicht nur zwischen den Chemotypen. Auch innerhalb der Chemotypen liegen die einzelnen Derivate, abhängig vom Habitat und von der Herkunft, in unterschiedlichen prozentualen Anteilen vor (Willuhn et al. 1994). Deswegen ist es von Interesse zu wissen, ob verschiedene SL- Derivate Unterschiede in ihrem Penetrationsverhalten zeigen. Hieraus läßt sich

76 ERGEBNISSE schließen, ob es gerechtfertigt ist, die Gesamt-SLs-Penetration von Tinkturen und Zubereitungen von der entsprechenden Haupt-SL-Penetration abzuleiten. Für diese Untersuchungen wurde ebenfalls Z7 verwendet. Die Verwendung einer mit SLs angereicherten Zubereitung war notwendig, um auch Derivate zu berücksichtigen, die nur in geringen Konzentrationen vorkommen.

100.0 DH acetat DH isobutyrat DH methacrylat DH isovalerianat DH tiglinat 10.0

1.0 Penetration [%]

0.1 0 5 10 15 20 Hauttiefe [µm]

Abbildung II.3-10. Penetrationsprofil der fünf dominierenden 11α,13-Dihydrohelenalin- Derivate von Z7 nach einer Inkubationszeit von einer Stunde. Jeder Punkt repräsentiert den Prozentsatz an aufgetragenem SL, welcher mindestens bis zu dieser Tiefe penetrierte.

DH- DH- DH- DH-acetat isobutyrat methacrylat isovalerianat DH-tiglinat Z7 GesamtSL Z6 GesamtSL 0

-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

Exponentialkoeffizient -0.5

Abbildung II.3-11. Mittelwerte der Exponentialkoeffizienten von je drei Penetrationsprofilen von fünf 11α,13-Dihydrohelenalinderivaten (DH) in Zubereitung Z7, sowie von den Gesamt- SLs in den Zubereitungen Z6 und Z7. Die Mittelwerte zeigen keinen statistisch signifikanten Unterschied (p<0.05) zueinander.

ERGEBNISSE 77

In Abbildung II.3-10 sind die Penetrationsprofile von den 5 häufigsten 11α,13- Dihydrohelenalinderivaten der Zubereitung Z7 aufgeführt, in Abbildung II.3-11 die Mittelwerte der entsprechenden Exponentialkoeffizienten. Die Koeffizienten der einzelnen SLs sowie der Gesamt-SLs von Z7 waren nur wenig negativer als derjenige von Z6. Trotz der 10fachen Konzentration an SL unterschieden sich somit das Penetrationsverhalten von Z6 und Z7 kaum. Zwischen den einzelnen SLs waren keinerlei statistisch signifikante Unterschiede festzustellen.

II.3.7. Längere Inkubationszeiten verschlechtern die Penetration von SLs in dem Gel-Präparat Z4

100 100 1 h Inkubation 2 h Inkubation 4 h Inkubation 1 h Inkubation 2 h Inkubation 4 h Inkubation -0.2335x -0.3978x -0.1943x y = 2.7517e-0.1984x y = 6.3818e y = 8.2504e y = 1.341e y = 1.6868e-0.3341x y = 7.0891e-0.558x 10 2 2 10 2 R2 = 0.7831 R = 0.8978 R = 0.9672 R = 0.8563 R2 = 0.918 R2 = 0.9502

1 1 Penetration [%] Penetration 0.1 [%] Penetration 0.1

0.01 0.01 0246810120 2 4 6 8 10 12 Hauttiefe [µm] Hauttiefe [µm]

100 Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 1 h Inkubation 2 h Inkubation 4 h Inkubation 0 -0.2895x y = 2.0846e-0.2862x y = 3.7253e y = 4.3674e-0.5326x

10 2 R2 = 0.9569 R = 0.9381 R2 = 0.9331 -0.1

1 -0.2

-0.3

Penetration [%] 0.1 -0.4 1 h Inkubation

0.01 Exponentialkoeffizient -0.5 2 h Inkubation 024681012 4 h Inkubation Hauttiefe [µm] -0.6 Abbildung II.3-12. oben und unten links: Penetrationsprofil von Z4 nach ein, zwei und vierstündiger Inkubation bei drei Versuchen. Jeder Punkt repräsentiert den Prozentsatz an aufgetragenem SL, welcher mindestens bis zu dieser Tiefe penetrierte. unten rechts: die entsprechenden Exponentialkoeffizienten nach ein-, zwei- und vierstündiger Inkubation drei drei Versuchen.

Um zu untersuchen, inwieweit die Penetration der SLs zeitabhängig ist, wurde Z4 für unterschiedliche Zeiten (1 h, 2 h und 4 h) inkubiert. Auch hier konnte wiederum eine Penetration in und eine Permeation durch das Stratum corneum beobachtet werden. Die Koeffizienten b für eine Stunde waren vergleichbar mit denen aus den früheren Untersuchungen von Z4. Innerhalb der einzelnen Versuche wurden die Koeffizienten bei längeren Inkubationszeiten aber zunehmend negativer (Abbildung

78 ERGEBNISSE

II.3-12). Dies sprach dafür, dass SLs in tiefere Hautschichten penetrieren, ohne dass eine weitere Penetration von SLs in das Stratum corneum stattfindet. Dies könnte durch eine Eintrocknung des Gels im Laufe der Zeit herrühren, wodurch die SLs schlechter aus dem Gel in die Hornhaut penetrieren können.

II.3.8. Bei Verwendung der Salben-Zubereitung Z6 bleibt die Penetration der SLs über 4h konstant

100 1 h Inkubation y = 5.1841e- 0.1358x y = 6.8062e- 0.2565x y = 5.6357 e- 0.1384x r 2 = 0.917 r 2 = 0.9955 r 2 = 0.9904 4 h Inkubation 10 y =8.5334e- 0.5669x y = 5.8009e- 0.5684x y = 6.4467 e- 0.6592x r 2 = 0.9548 r 2 = 0.9689 r 2 = 0.9101

1 Penetration [%]

0.1 0 5 10 15 20 Hauttiefe [µm] 100 1 h Inkubation y = 5.257e−0.1608x y = 4.592e−0.246x y = 6.5543e−0.1416x r 2 = 0.9994 r 2 = 0.9555 r 2 = 0.9717 10 4 h Inkubation y = 7.136e−0.1943x y =19.875e−0.3299x y = 9.9761e−0.3091x r 2 = 0.9085 r 2 = 0.9806 r 2 = 0.9634

1 Penetration [%]

0.1 0 5 10 15 20 Hauttiefe [µm]

Abbildung II.3-13. Penetrationsprofil der Arnikazubereitungen Z5 (oben) und Z6 (unten) nach einstündiger (graue Symbole) und vierstündiger (weiße Symbole) Inkubation in drei verschiedenen Experimenten. Jeder Punkt repräsentiert den Prozentsatz an aufgetragenem SL, welcher mindestens bis zu dieser Tiefe penetrierte.

Um das in I.1.7 beobachtete Verhalten weiter zu verifizieren wurden ähnliche Versuche mit der Zubereitung Z6 durchgeführt. Bei dieser Zubereitung handelte es sich um eine Salbe, bei der nicht von einer Eintrocknung auszugehen ist. Da Z6 ein

ERGEBNISSE 79 anderes SL-Spektrum als Z4 aufwies, wurden gleichzeitig Versuche mit der Gel- Zubereitung Z5 durchgeführt. Es wurden Inkubationszeiten von einer und vier Stunden für die Zubereitungen Z5 und Z6 eingehalten. Während bei Z5 ähnlich wie bei Z4 eine Reduktion der Penetration nach vier Stunden im Vergleich zu einer Stunde zu beobachten war, zeigte Z6 eine fast konstante Penetration bei beiden Inkubationszeiten (Abbildung II.3-13). Beim Vergleich der Exponentialkoeffizienten fiel der statistisch signifikante Unterschied bei der Penetration von Z6 nach 4stündiger Inkubation zu den anderen Zubereitungen auf (Abbildung II.3-14). Die Unterschiede könnten für die Therapie wichtig sein: Bei Verwendung von Z6 penetrierten 2.3 ± 0.9 % (1 Stunde Inkubationszeit) bzw. 2.8 ± 0.8 % (4 Stunden Inkubationszeit) der wiedergefundenen SLs bis zu einer Tiefe von 5 µm. Bei Verwendung von Z5 hingegen sank der penetrierte Anteil von 2.4 ± 0.5 % nach einstündiger Inkubation auf 0.3 ± 0.1% nach einer Inkubationszeit von 4 Stunden. Dies entspricht einer Abnahme auf ein Siebtel.

Z5 Z6 0

-0.1

-0.2

-0.3 ab

-0.4 c 1 h Inkubation -0.5 4 h Inkubation Exponentialkoeffizient -0.6

-0.7 a,b,c

Abbildung II.3-14. Exponentialkoeffizienten b (Mittelwert von drei Versuchen) der Penetrationskurven von Z5 und Z6 bei zwei unterschiedlichen Inkubationszeiten. Diesselben Buchstaben kennzeichnen einen statistisch signifikanten Unterschied (p>0.05) der jeweiligen Werte.

80 ERGEBNISSE

II.3.9. Untersuchung der Penetration nach wiederholter Applikation von SLs in dem Gel-Präparat Z4

Um eine in der Praxis oft auftretende wiederholte Applikation eines Gels zu simulieren, wurden 200 µL des Gels Z4 nach 0, 3 und 6 Stunden auf dieselbe Fläche aufgetragen, ohne das Gelreste von vorherigen Applikationen entfernt wurden. Nach einer abschließenden Inkubation von einer weiteren Stunde – also nach insgesamt 7 Stunden – erfolgte das Strippen. SLs waren nach dieser wiederholten Applikation nicht im gesamten Stratum corneum detektierbar. Ab einer Tiefe von 3 bis 6 µm befanden sich die SL-Mengen unterhalb des Detektionslimits der GC-MS-Methode. Entsprechend war der Exponentialkoeffizient bei der kumulativen Applikation (-0.568 ± 0.104) viel negativer als bei einer einstündigen Inkubationszeit (-0.131 ± 0.007).

100 kumuliert (1) y = 0.5594e-0.5529x R2 = 0.9261 10 kumuliert (2) y = 0.8942e-0.6789x R2 = 0.9689 1 kumuliert (3) y = 0.5145e-0.4723x R2 = 0.8418 0.1 1 h Inkubation (1) y = 2.8163e-0.1220x Penetration [%] 2 0.01 R = 0.9535 1 h Inkubation (2) y = 3.3456e-0.1157x 2 0.001 R = 0.9647 -0.2135x 0246810121 h Inkubation (3) y = 19.448e Hauttiefe [µm] R2 = 0.9937

Abbildung II.3-15. Penetrationsprofil von Z4 nach kumulativer Applikation (0, 3 und 6 Stunden Inkubation) bei drei Versuchen. Als Vergleich wurde das Penetrationsprofil von Z4 nach einfacher Applikation und einstündiger Inkubation abgebildet. Jeder Punkt repräsentiert den Prozentsatz an aufgetragenem SL, welcher mindestens bis zu dieser Tiefe penetrierte.

ERGEBNISSE 81

II.4. Entwicklung und Validierung von quantitativen Analysenmethoden

II.4.1. GC-MS-Analytik zur Quantifizierung von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana L.

Allgemeines Die bisherige GC-FID Methode (Willuhn und Leven 1991a) ist für eine quantitative Bestimmung von Helenalin- und 11α,13-Dihydrohelenalinderivaten aus Arnica montana L. in Zubereitungen, wie z.B. Salben, nicht selektiv und sensitiv genug. Da neben einer hohen Sensitivität auch eine hohe Selektivität notwendig ist, um geringe Mengen an SLs in einer so komplexen Matrix wie die einer Salbe zu bestimmen, wurde eine GC-MS Methode, in der eine spezielle, spezifische Masse detektiert wird, entwickelt. Als spezifische Masse wurde für die 11α,13-Dihydrohelenalinderivate 246 amu, für die Helenalinderivate 244 amu ausgewählt. Der Anteil dieser Masse an der Gesamtmasse im MS-Spektrum ist für die einzelnen SLs, die im SL-Spektrum von Arnica zu finden sind, ungefähr gleich (Tabelle II.4-1 und Tabelle II.4-2).

Tabelle II.4-1. Anteil der Masse 246 an der Gesamtmasse im MS-Spektrum (PSL;246) in Prozent (Spalte 2) sowie bezogen auf den Anteil von DH-methacrylat PDH-methacrylat; 246 (Spalte 3).

Anteil PSL;246 von amu 246 an der Gesamtmasse 11α,13-Dihydrohelenalin (DH) [%] bezogen auf Derivate [%] PDH-methacrylat; 246 DH-methacrylat 5.5 100 DH-isovalerianat 5.7 104 DH-tiglinat 6.2 112 DH-acetat 5.5 100 DH-isobutyrat 5.3 96 DH 5.6 102

Nur der Anteil der Masse 244 an der Gesamtmasse weicht bei Helenalin stark von diesem Anteil, bezogen auf Helenalinisobutyrat, ab. Da jedoch dieses Derivat nur in geringen Mengen in Arnikablüten zu finden ist (Willuhn et al. 1994), ist dieser Fehler zu vernachlässigen. Dieses ermöglicht eine rationale Quantifizierung von 11α,13- Dihydrohelenalinderivaten als 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat und von Helenalinderivaten als Helenalinisobutyrat. Die entwickelte Methode soll im Bereich

82 ERGEBNISSE der Hautpenetration und im Bereich der Gehaltsbestimmung in Arnikazubereitungen verwendet werden.

Tabelle II.4-2. Anteil der Masse 244 an der Gesamtmasse im MS-Spektrum (PSL;244) in Prozent (Spalte 2) sowie bezogen auf den Anteil von H-isobutyrat PH-isobutyrat; 244 (Spalte 3).

Anteil PSL;244 von amu 244 an der Gesamtmasse Helenalin (H) Derivate [%] bezogen auf [%] PH-isobutyrat; 244 H-isobutyrat 5.7 100 H-isovalerianat 5.3 93 H-methacrylat 5.7 100 H-tiglinat 4.7 82 H-acetat 5.5 96 H 3.3 58

Wegen der zum Teil komplexen Aufarbeitung sowie der Injektionsungenauigkeit bei der GC-Analytik wurde, wie bei Willuhn und Leven (Willuhn und Leven 1991a), Santonin als interner Standard verwendet (Abbildung II.4-1). Santonin stellt selbst ein Sesquiterpenlacton dar und ist somit im chemischen Verhalten und Eigenschaften den Arnika-SLs sehr ähnlich. Weiterhin ist Santonin im GC- Chromatogramm gut von Arnika-SLs abgetrennt und käuflich zu erwerben.

Abbildung II.4-1. Santonin, ein Sesquiterpenlacton aus Artemisia cina BERG & SCHMIDT (Flores Cinae), wurde als innerer Standard verwendet.

Validierung Die Validierung umfasste Tests auf Spezifität, Linearität, Präzision, Genauigkeit und Stabilität. Grundlage der Validierung und der Beurteilung waren Leitlinien der FDA (U.S.Department of Health and Human Services 1996; U.S.Department of Health and Human Services 2001). Zwei Matrices fanden Verwendung: eine Matrix, die durch Behandlung einer Placebo-Salbe nach Abschnitt V.3.3 erhalten wurde (Salben- Matrix) und eine Matrix, die aus mit Hornhaut beladenen Tesa-Stripps nach

ERGEBNISSE 83 entsprechender Aufarbeitung (Abschnitt V.5.3) hergestellt wurde (Hornhaut-Matrix). Die Placebo Salbe besitzt die gleiche Zusammensetzung wie die Arnikazubereitung Z6 (siehe Tabelle V-10), jedoch wurde zu ihrer Herstellung reines Pflanzenöl anstelle des Arnika-Öl-Extraktes verwendet.

Selektivität (Selectivity) Chromatogramme von unterschiedlichen Blindproben wurden mit Chromatogrammen von Blindproben, die mit 8 µM (2×LOQ) 11α,13- Dihydrohelenalinmethacrylat, 0.9 µM (2×LOQ) Helenalinisobutyrat oder 800 µM Santonin versetzt wurden, auf Signalüberlagerung verglichen. Zusätzlich wurden Arnikatinkturen aus Blüten vom Typ „Arbo“ und vom spanischen Chemotyp als Blindproben verwendet, um die Selektivität des internen Standards Santonins bezüglich der in Arnika vorkommenden Sesquiterpenlactone zu überprüfen. Es konnten keinerlei Signalüberlagerungen eines Matrix-Signals mit einem SL-Signal oder eines SL-Signals mit dem Santonin-Signal beobachtet werden.

Bestimmungsgrenze (Limit of quantification; LOQ) Für 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat konnte eine Konzentration von 4.4 µM (1.5 ng Säulenaufgabe) in Hornhaut- und Salben-Matrix als LOQ bestimmt werden. Bei der Bestimmung der Präzision (n=9 an drei verschiedenen Tagen) zeigte sich eine relative Standardabweichung (RSD) von 5.3 % (Hornhaut-Matrix) und von 3.8 % (Salben-Matrix). Die Genauigkeit zeigte eine Abweichung vom wahren Wert von -11.9 % bis +5.9 % (Salben-Matrix) sowie von –4.2 % bis +4.3 % (Hornhaut-Matrix). Das gleiche wurde für Helenalinisobutyrat durchgeführt und ein LOQ von 0.46 µM (0.16 ng Säulenaufgabe) bestimmt. Die Präzision lag bei 8.1 % RSD (Hornhaut- Matrix) und bei 4.2 % RSD (Salben-Matrix), die Genauigkeit zeigte Abweichungen von –14.1 % bis –8.0 % (Salben-Matrix) und von –17.2 % bis –2.7 % (Hornhaut- Matrix). Die LOQs beider SLs erfüllten die Anforderungen an Präzision und Genauigkeit, wie sie generell im bioanalytischen Bereich gefordert werden (U.S.Department of Health and Human Services 2001).

84 ERGEBNISSE

Nachweisgrenze (Limit of detection, LOD) Die Bestimmung des LOD basiert auf dem Signal-Rausch-Verhältnis, wobei ein Verhältnis von 3:1 als akzeptabel zur Abschätzung des LOD gilt (U.S.Department of Health and Human Services 1996). 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat zeigte ein LOD von 0.44 µM (0.15 ng Säulenaufgabe) mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3.4:1, Helenalinisobutyrat ein LOD von 0.09 µM (0.03 ng Säulenaufgabe) mit einen Signal-Rausch-Verhältnis von 4:1.

Linearität – Kalibrierungskurve Die Konzentrationen zwischen Haupt- und Nebenkomponenten im SL-Spektrum von Arnikatinkturen sowie die SL-Konzentrationen zwischen den ersten und letzten Hornhautstripps unterscheiden sich sehr stark. Daher ist eine Kalibrierungsfunktion notwendig, die einen großen Bereich unterschiedlicher Konzentrationen abdeckt.

Wegen der Verwendung eines internen Standards mit der Peakfläche AIST und einer

Konzentration von cIST, wurde die Peakfläche ASL des zu bestimmenden SL korrigiert.

ASL ASL,corr = cIST Formel II.4-1 AIST

Eine Linearität zwischen ASL,corr und der Konzentration an SL cSL wurde gezeigt. Hierbei fanden jeweils 8 Konzentrationen Verwendung. Die Experimente wurden dreimal durchgeführt. Für 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat wurde eine Linearität zwischen 549 µM und 4.39 µM unter Verwendung von Konzentrationen von 549 µM, 329 µM, 220 µM, 165 µM, 110 µM, 43.9 µM und 4.39 µM. Hierbei wurde folgende Kalibrierungsfunktion erhalten:

2 cSL1[]μM = 0.680∗ ASL1,corr []μM ; R = 0.999 Formel II.4-2

ERGEBNISSE 85

800

600 SL,corr 400

200

Fläche A Fläche 0

0 100 200 300 400 500 600 Konzentration an Dihydrohelenalinmethacrylat c (μM) SL 20 10 0 -10 0 100 200 300 400 500 600

Abbildung II.4-2. Regressionsgerade und Residuenplot für 11α,13-Dihydrohelenalin- methacrylat

Für Helenalinisobutyrat konnte eine Linearität zwischen 581 µM und 0.46 µM gezeigt werden. Hierbei wurden Konzentrationen von 581 µM, 384 µM, 232 µM, 174 µM, 116 µM, 46 µM 4.6 µM und 0.46 µM eingesetzt und folgende Kalibrierungsfunktion berechnet:

2 cSL2 []μM = 0.521∗ ASL2,corr []μM ; R = 0.999 Formel II.4-3

1200 1000 800

SL,corr 600 400 200

Fläche A 0 -200 0 100 200 300 400 500 600 Konzentration an Helenalinisobutyrat c (μM) 40 SL 20 0 -20 0 100 200 300 400 500 600 Abbildung II.4-3. Regressionsgerade und Residuenplot für Helenalinisobutyrat

86 ERGEBNISSE

Präzision (precision) Die Daten wurden unterteilt in Wiederholungspräzision (Wiederholbarkeit) und Intermediäre Präzision (Reproduzierbarkeit). Die Wiederholpräzision wurde bestimmt durch Injektion von drei Proben an einem Tag. Dieses wurde an drei Tagen durchgeführt. Für die Berechnung der Intermediären Präzision wurden die Daten aller drei Tage verwendet. Die Präzision für 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat wurde durch Vermessung dieses SLs in Hornhaut- und Salben-Matrix bei Konzentrationen von 549 µM, 220 µM und 4.39 µM (LOQ) bestimmt, wodurch der Bereich der Kalibriergerade abgedeckt wurde. In analoger Weise wurden bei Helenalinisobutyrat Konzentrationen von 581 µM, 232 µM und 0.46 µM (LOQ) verwendet. Die Daten sind in Tabelle II.4-3 und Tabelle II.4-4 aufgeführt und erfüllen die Anforderungen, wie sie in den Leitlinien der FDA aufgeführt sind (U.S.Department of Health and Human Services 2001).

Genauigkeit (Accuracy) Die Mittelwerte der Wiederholpräzision bei den drei Konzentrationen wurden als „aktuelle Werte“ definiert gemäß der FDA (U.S.Department of Health and Human Services 2001). Die „wahren Werte“ wurden berechnet durch Einsetzen der SL- Konzentrationen in die Kalibrierfunktion. Die Genauigkeit wird berechnet als die prozentuale Abweichung der „aktuellen Werte“ von den „wahren Werten“ (Tabelle II.4-3 und Tabelle II.4-4). Die ermittelten Abweichungen erfüllen die Anforderungen.

Tabelle II.4-3. Validierungsdaten von Präzision und Genauigkeit für 11α,13- Dihydrohelenalinmethacrylat.

RSD der Wiederholpräzision RSD der Intermediären Präzision Genauigkeit: [%] [%] Abweichung vom wahren Wert [%]

[µM] Hornhaut- Hornhaut- Salben-Matrix Salben-Matrix Salben-Matrix Hornhaut-Matrix Matrix Matrix Konzentration Konzentration

549 1.9-3.4 0.8-2.0 2.3 2.0 -5.2 bis –3.3 -2.4 bis +0.6 220 0.4-2.7 2.8-3.7 2.0 4.0 -6.8 bis -4.8 -6.3 bis –0.5 4.4 2.0-3.2 1.8-7.6 3.8 5.3 -11.9 bis –5.9 -4.2 bis +4.3

ERGEBNISSE 87

Tabelle II.4-4. Validierungsdaten von Präzision und Genauigkeit für Helenalinisobutyrat.

RSD der Wiederholpräzision RSD der Intermediären Präzision Genauigkeit: [%] [%] Abweichung vom wahren Wert [%]

[µM] Hornhaut- Hornhaut- Hornhaut- Salben-Matrix Salben-Matrix Salben-Matrix Matrix Matrix Matrix Konzentration Konzentration

581 0.9-4.4 0.6-2.3 3.0 2.2 +8.0 bis +3.8 -0.4 bis +3.4 232 0.8-4.3 1.3-3.8 2.9 3.7 -4.0 bis –1.5 -3.2 bis +1.1 0.46 0.7-5.0 1.2-4.8 4.2 8.1 -14.1 bis –8.0 -17.3 bis –2.7

Stabilität (stability) Die Autosamplerstabilität (20 °C) wurde unter Verwendung von Salben-Matrix und Hornhaut-Matrix für 24 h und für 48 h überprüft. Die Werte wurden durch dreifache Injektion bestimmt.

Tabelle II.4-5. Wiederfindungsrate [%] von 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat bei einer Konzentration von 220 µM und von Helenalinisobutyrat bei einer Konzentration von 232 µM in zwei unterschiedlichen Matrices nach 24 und 48 Stunden bei 20 °C.

Wiederfindugsrate von 11α,13 Wiederfindungsrate von Inkubationszeit Dihydrohelenalinmethacrylat [%] Helenalinisobutyrat [%] [h] Hornschicht- Hornschicht- Salben-Matrix Salben-Matrix Matrix Matrix

24 100.2 105.2 102.4 100.2 48 98.1 106.2 99.7 104.4

Beide SLs waren bei einer Konzentration von 220 µM (11α,13- Dihydrohelenalinmethacrylat) bzw. von 232 µM (Helenalinisobutyrat) bis zu 48 h stabil (Tabelle II.4-5).

Beurteilung Anhand der Validierung konnte die Verwendbarkeit der Methode bei der Bestimmung auch kleiner Mengen an 11α,13-Dihydrohelenalin- und Helenalinderivaten in komplexen Matrices gezeigt werden. Als Matrices wurden eine Hornhaut-Matrix und eine Salben-Matrix verwendet. Somit ist diese Methode zur Vermessung von Stripp-Proben aus den Penetrationsversuchen sowie zur Gehaltsbestimmung der Salben Z5 und Z6 validiert. Bei Verwendung anderer

88 ERGEBNISSE

Matrices, d.h. anderer Zubereitungen, ist eine entsprechende Überprüfung vor allem der Selektivität notwendig. Zur Verwendung bei der Gehaltsbestimmung von Arnikablüten und Tinkturen ist eine entsprechende Überprüfung nicht notwendig, da entsprechende Untersuchungen schon vorliegen (Leven und Willuhn 1987).

II.4.2. HPTLC-Analytik zur Quantifizierung von 11β-Glutathionyl- parthenolid

Methodenentwicklung Mit Hilfe der hier entwickelten HPTLC-Methode kann das Verhalten von 11β- Glutathionyl-parthenolid (SL5; Abbildung II.4-4) gegenüber HSA und Plasma untersucht werden. SL5 lag als wässrige Lösung beziehungsweise gelöst in HSA- Lösung (40 und 50 mg HSA/ml) oder Plasma vor.

HOOC H H N COO- H N H

S + O NH3

O O

O Abbildung II.4-4. Struktur des zu bestimmenden 11β-Glutathionyl-parthenolids (SL5).

Zur Anwendung kam das HPTLC-System (siehe Abschnitt V.6.3). Die Folien wurden in einer gesättigten Doppeltrogkammer (20×10 cm) mit einer Mischung aus Ethylacetat, Methanol, Wasser und Ameisensäure (50:40:10:0.4) über eine Laufstrecke von 5 cm entwickelt. Die Derivatisierung erfolgte durch Tauchen der lösungsmittelfreien Platte in Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz (s. Abschnitt VII.5). Anschließend wurde die Platte im Trockenschrank bei 120 °C für 20 min erhitzt.

Das Addukt SL5 ist durch einen Rf-Wert von 0.48 gekennzeichnet (Abbildung II.4-5).

ERGEBNISSE 89

Abbildung II.4-5. Beispielchromatogramm des Adduktes SL5 nach Besprühen mit Anisaldehyd-Schwefelsäure.

Um die optimale Absorptionswellenlänge des mit Anisaldehyd-Schwefelsäure angefärbtem SL5 zu ermitteln, wurde ein Spektrum im Bereich von 200 bis 700 nm aufgenommen (Abbildung II.4-6). Hierbei wurde ein Maximum bei 588 nm bestimmt, bei dem alle folgenden Bestimmungen durchgeführt wurden.

Abbildung II.4-6. Spektrum des mit Anisaldehyd-Schwefelsäure angefärbten Parthenolid- Addukts SL5 mit den beiden Maxima bei 366 nm und 588 nm.

Zur Quantifizierung wurden die Folien densitometrisch mit dem TLC Scanner 3 ausgewertet.

Validierung Im Folgenden wurde eine kurze Validierung der obigen Methode durchgeführt, wobei auf Stabilität des Adduktes im Fließmittel und auf den Nachweis des linearen

90 ERGEBNISSE

Zusammenhanges zwischen aufgetragener Menge und Absorption besonderen Wert gelegt wurde. Da nur Proben auf einer Folie relativ zueinander ausgewertet werden, war die Untersuchung der Genauigkeit und der Wiederholpräzision nicht notwendig.

Stabilität Um die Stabilität des Adduktes SL5 im Fließmittel zu kontrollieren, wurde eine 2-dimensionale DC entsprechend der obigen Bedingungen durchgeführt (Frey und Zieloff 1992). Dabei traten keine Flecken außerhalb der Diagonale auf. Bei einen Zerfall müssten Flecken ober- oder unterhalb dieser Linie zu erkennen sein (Frey und Zieloff 1992).

Linearität

Die lineare Korrelation zwischen aufgetragener Menge an SL5 mSL5 und Peakfläche

FSL5 konnte unter Verwendung von 5 verschiedenen Auftragsmengen gezeigt werden. Aufgetragen wurden 55.5 ng, 111.0 ng, 166.5 ng, 222.0 ng und 277.5 ng. Die Auftragung erfolgte doppelt. Die folgende Kalibrierfunktion konnte berechnet werden:

mSL5 = 10.311∗FSL5 + 424.59 Formel II.4-4

Das entsprechende Diagramm ist in Abbildung II.4-7 dargestellt.

4000 y = 10.311x + 424.59 R2 = 0.9881 3000

2000 Fläche

1000

0 0 50 100 150 200 250 300 Masse A1 [ng]

Abbildung II.4-7. Regressionsgerade der Methode zur Bestimmung des Adduktes SL5.

ERGEBNISSE 91

II.4.3. HPTLC-Analytik zur Quantifizierung von Capsaicin in Capsicum frutescens L.

Allgemeines In den Früchten von Capsicum frutscens L. (Capsici fructus acer) sind Säureamide in Konzentrationen von bis zu 1.0 % enthalten. Neben dem Hauptsäureamid Capsaicin (bis zu 50 %) sind vor allem Nordihydrocapsaicin (ca. 7 %) und Dihydrocapsaicin (ca. 35 %) vorhanden (Hänsel et al. 1999), Abbildung II.4-8.

O N H Capsaicin OH

O N

H Nordi hydroc apsai c i n OH

O N

H OH Dihydrocapsaicin

Abbildung II.4-8 . Struktur der drei in Capsicum frutescens dominierenden Säureamide.

Da alle Säureamide zur Wirkung von Capsici Fructus beitragen, ist eine Bestimmung des Gesamt-Säureamidgehaltes notwendig. Zur Zeit werden Methoden verwendet, bei denen die Bestimmung der einzelnen Säureamide mittels RP-HPLC und UV-Detektion bei 280 nm erfolgt (Cooper et al. 1991; European Pharmacopeia 1997). Der Gesamt-Gehalt wird dann durch Aufsummieren der einzelnen Säureamidgehalte berechnet. Bei Verwendung von Kieselgel, wie in der DC üblich, tritt keine Auftrennung in die einzelnen Säureamide auf. Dies ist darauf zurückzuführen, dass bei den vorherrschenden Adsorbtionseffekten nur die bei allen Säureamiden identischen Phenol- und Säureamidteilstrukturen an der Wechselwirkung mit der stationären Phase beteiligt sind. Die lipohilen, bei den einzelnen Capsaicinen unterschiedlichen C8- oder C9

92 ERGEBNISSE

Ketten nehmen an der Wechselwirkung kaum teil und führen somit auch nicht zu einer Auftrennung.

Methode Es fand das HPTLC-System Verwendung. Nach dem Auftragen wurden die Folien in einer gesättigten Doppeltrogkammer (20×10 cm) mit einer Mischung aus Diethylether und Hexan (50:50) über eine Laufstrecke von 5 cm entwickelt.

Die Capsaicine sind durch einen Rf-Wert von 0.3 charakterisiert (Abbildung II.4-9).

Fließmittelfront 162 ng 162 ng 269 ng 538 ng 807 53.8 ng 53.8 1077 ng 1077 ng 1346

Capsaicin: Rf=0.30

Start

Abbildung II.4-9. Beispielchromatogramm mit steigender Konzentration an Capsaicin- Standard. Die Platte wurde mit Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz derivatisiert und im sichtbaren Licht abfotografiert.

Die Capsaicinmengen wurden mittels densitometrischer Detektion bestimmt. Hierbei wurde wie in bekannten HPLC/UV-Methoden (Cooper et al. 1991) eine Wellenlänge von 280 nm verwendet.

Validierung Die Validierung beinhaltet Tests auf Spezifität, Stabilität, Präzision und Genauigkeit sowie die Erstellung einer Regressionsgerade.

Spezifität Neben einem Capsaicin-Standard wurden zwei Extrakte aus Früchten von Capsicum frutescens L. (Extrakt 2 und 3) und ein Extrakt aus Früchten von Capsicum annuum L. (Extrakt 1) vermessen. Der Capsaicin-Peak ist bei den Extrakten 2 und 3 gut von anderen Peaks abgetrennt. Bei dem Capsaicin-freien Capsicum annuum-Extrakt 1 sind im Bereich des Capsaicins keine weiteren störenden Substanzen erkennbar.

ERGEBNISSE 93

Abbildung II.4-10. 3-Dimensionale Darstellung der Chromatogramme (densitometrisch, 280 nm) von einer Capsaicin-Lösung, zwei Extrakten aus Früchten von Capsicum frutescens L. (Extrakt 2 und Extrakt 3) und einem Extrakt aus Früchten von Capsicum annuum L. (Extrakt 1).

Stabilität Die Stabilität von Capsaicin im Chromatographie-System wurde mittels einer 2-dimensionale DC getestet. Es konnten keine Flecken detektiert werden, die auf eine Instabilität von Capsaicin hindeuten (siehe auch Seite 89).

Bestimmungsgrenze (LOQ) Für Capsaicin konnte ein LOQ von 53.8 ng pro Bande bestimmt werden. Dabei zeigte sich eine Präzision (n=8) von 8.4 % und eine Genauigkeit von –6.6 %.

Regressionsgerade

Eine Korrelation zwischen aufgetragener Masse an Capsaicin mCaps und Peakfläche

ACaps konnte unter Verwendung von 7 verschiedenen Auftragsmengen (53.8 ng, 162 ng, 269 ng, 538 ng, 807 ng, 1077 ng, 1346 ng) gezeigt werden. Bedingt durch die densitometrische Detektion wurde eine polynomische Regressionskurve erstellt:

94 ERGEBNISSE

2 2 ACaps = −0.00048mCaps + 2.15mCaps − 8.75 ; r = 0.9999 Formel II.4-5

Eine graphische Darstellung ist in Abbildung II.4-11 gegeben.

2000

1500

1000

500 Peakfläche

0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Masse an Capsaicin (ng) 10 0 -10 0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Abbildung II.4-11. Regressionskurve und Residuenplot für Capsaicin.

Präzision Es wurde die Reproduzierbarkeit berechnet, indem an drei verschiedenen Tagen die Peakfläche bei 269 ng, 538 ng und 1076 ng doppelt bestimmt wurde. Die prozentualen Abweichungen sind in Tabelle II.4-6 angegeben.

Genauigkeit Die Mittelwerte der Reproduzierbarkeit bei den drei Konzentrationen wurden als „aktuelle Werte“ definiert. Die „wahren Werte“ wurden berechnet durch Einsetzen der Massen in die Regressionsgerade (Tabelle II.4-6).

Tabelle II.4-6. Validierungsdaten von Reproduzierbarkeit und Genauigkeit für Capsaicin.

Genauigkeit: RSD der Reproduzierbarkeit [%]

[ng] Abweichung vom wahren Wert [%] Masse

269 4.2 -4.7 538 3.5 -4.9 1076 1.4 -1.9

ERGEBNISSE 95

II.4.4. HPTLC-Analytik zur Quantifizierung von α-Hederin und Hederacosid C in Hedera helix L.

Allgemeines Hedera helix L. (Araliaceae) ist durch das Vorkommen von Triterpensaponinen vom Oleanan-Typ charakterisiert. Genuin dominiert das bisdesmosidische Hederacosid C (bis 14 %, Abbildung II.4-12), (Demirci et al. 2004). Bedingt durch die Glykosidesterbindung an C-28 findet vor allem bei Einwirkung von Wasser ein Abbau in Monodesmoside statt. So bildet sich aus dem genuinen Hederacosid C das monodesmosidische α-Hederin (Abbildung II.4-12). Dieser Abbau ist von großer Bedeutung, da sich die beiden Stoffe sehr stark in ihrer biologischen Wirkung unterscheiden. Zwar ist α-Hederin wesentlich toxischer und hämolytisch wirksamer als Hederacosid C, allerdings scheint es auch für die sekretolytische Wirkung von Efeu-Zubereitungen verantwortlich zu sein (Schlenger 2003), die bei der Anwendung bei Katarrhen der oberen Atemwege von Bedeutung ist (German Commision E 1988). Bei der Analytik der Saponine finden überwiegend HPLC-Methoden Anwendung. Das Problem der schlechten UV-Detektierbarkeit wird durch Verwendung einer sehr unspezifischen Wellenlänge von 200 nm bzw. 205 nm (Demirci et al. 2004) oder durch Verwendung eines Light-Scattering-Detectors umgangen (Crespin et al. 1994). Auch eine massenspektrometrische Detektion wurde beschrieben (Gaillard et al. 2003).

O R H 2

R1 O H CH2OH

Hederacosid C α-Hederin R1 α-L-Rha(1→2)-α-L-Ara (1→) α-L-Rha(1→2)-α-L-Ara (1→) R2 α-L-Rha(1→4) - β-D-Glc(1→6) - β-D-Glc(1→) H

Abbildung II.4-12. Struktur der beiden relevanten Saponine in Blättern von Hedera helix.

96 ERGEBNISSE

Hier soll eine HPTLC-Methode zur Quantifizierung von Hederacosid C und α- Hederin entwickelt werden. Da infolge fehlender UV-absorbierender Funktionen eine direkte densitometrische Auswertung nicht möglich ist, soll diese erst nach vorangegangener Derivatisierung erfolgen.

Methodenentwicklung Es fand das HPTLC-System wie im Abschnitt V.6.3 beschrieben Verwendung.

Fließmittel Als Fließmittel wurde eine Mischung von Ethylacetat, Aceton, Methanol und Wasser entwickelt. Um sinnvolle Rf Werte für Hederacosid C und α-Hederin zu erreichen waren zwei unterschiedliche Mischungen notwendig: für Hederacosid 30:20:20:4, für α-Hederin 50:20:10:4. Die Folien wurden in einer gesättigten Doppeltrogkammer (20×10 cm) über eine Laufstrecke von 5 cm entwickelt. Es ergab sich bei Verwendung der entsprechenden

Fließmittel für Hederacosid C ein Rf-Wert von 0.28, für α-Hederin einer von 0.40 (Abbildung II.4-13).

Abbildung II.4-13. 3-Dimensionale Darstellung von Beispielchromatogrammen für α-Hederin und Hederacosid C.

ERGEBNISSE 97

Derivatisierungsreagenzien Anhand von Literaturangaben wurden 5 Derivatisierungsreagenzien ausgewählt: Vanillin-Phosphorsäure-Reagenz, Thymol-Schwefelsäure-Reagenz, Vanillin- Schwefelsäure-Reagenz, Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz und Schwefelsäure- Reagenz (s. Abschnitt VII.5), (Jork et al. 1989; Merck 1970). Derivatisiert wurde mit Hilfe eines Tauchgerätes (Chromatogram immersion device III), anschließend wurden die Platten für 10 min bei 120 °C im Trockenschrank erhitzt. Vanillin- Phosphorsäure führte zum Abplatzen der Kieselgelschicht, bei Verwendung von Schwefelsäure-Reagenz war keine Färbung der beiden Saponine festzustellen. Alle anderen Reagenzien ergaben eine deutliche Färbung. Für eine reproduzierbare Analytik ist eine gewisse Stabilität der Färbung notwendig. Zuerst wurden UV/VIS- Spektren im Bereich von 200 bis 700 nm für Hederacosid C und α-Hederin nach Derivatisierung mit den entsprechenden Reagenzien aufgenommen, um die optimalen Adsorptionswellenlänge herauszufinden. Dabei waren die Maxima bei Hederacosid C und α-Hederin jeweils identisch. Mit Vanillin-Schwefelsäure gab es zwei Maxima bei 475 und bei 615 nm (Abbildung II.4-15), mit Thymol-Schwefelsäure ein Maximum bei 500 nm, mit Anisaldehyd-Schwefelsäure bei 620 nm. Dann wurden die Platten 5, 20 und 40 min nach beendeter Derivatisierung densitometrisch bei den ermittelten Maxima vermessen. Mit Vanillin-Schwefelsäure-Reagenz und einer Wellenlänge von 475 nm zeigte sich nur eine anfänglich geringe Abnahme der Farbintensität Abbildung II.4-14), die dann für mindestens 2 Stunden stabil blieb. Daher wurde in allen folgenden Versuchen dieses Reagenz und eine Absorptionswellenlänge von 475 nm ausgewählt sowie eine Wartezeit von mindestens 10 min nach Herausnahme aus dem Trockenschrank eingehalten.

98 ERGEBNISSE

100

85 Anisaldehyd-Schwefelsäure (620 nm) Thymol-Schwefelsäure (500 nm) 5 Vanillin-Schwefelsäure (475 nm) Vanillin-Schwefelsäure (625 nm) 0

Abnahme der inFarbintensität % 0 10203040

Wartezeit nach Derivatisierung (min)

Abbildung II.4-14. Stabilität der Färbung von drei verschiedenen Derivatisierungreagenzien am Beispiel von Hederacosid C.

100 475 nm 625 nm

50 Hederacosid C α-Hederin Signalstärke

0 200 300400 500 600 700 Wellenlänge λ [nm]

Abbildung II.4-15. UV/VIS-Spektren für Hederacosid C und α-Hederin.

Validierung Die Validierung beinhaltete Tests auf Spezifität, Stabilität, Präzision und Genauigkeit sowie die Erstellung einer Regressionsgerade. Die Stabilität der Derivatisierung wurde im vorangegangenen Abschnitt schon gezeigt.

Spezifität Zur Demonstration der Spezifität konnte das Fehlen des α-Hederins in der genuinen Droge und die vollständige Hydrolyse des Hederacosid C in α-Hederin

ERGEBNISSE 99 herangezogen werden. So zeigten sich bei einem vollständig hydrolysierten Extrakt keine Peaks im Bereich des Hederacosids. Umgekehrt konnte in einem nicht- hydrolysierten Extrakt im Bereich des α-Hederins kein Peak detektiert werden.

Stabilität Die Stabilität von Hederacosid C und α-Hederin in den verwendeten Chromatographie-Systemen wurde mittels 2D-DCs getestet. Es konnten keine Flecken detektiert werden, die auf eine Instabilität dieser beiden Saponine hindeuten (siehe auch Seite 89).

Regressionsgerade

Eine Linearität zwischen aufgetragener Masse an Saponin mHederacosid bzw. mHederin und der entsprechenden Peakfläche AHederacosid bzw. AHederin konnte unter Verwendung von mindestens 7 verschiedenen Auftragemengen gezeigt werden. Bei Hederacosid C wurden 23.6 ng, 47.6 ng, 70.8 ng, 94.4 ng, 118 ng, 141.6 ng und 165.2 ng aufgetragen. Es ergab sich folgende Beziehung:

2 AHederacosid = 7.2673mHederacosid + 45.564 ; r = 0.9969 Formel II.4-6

Bei α-Hederin fanden Massen von 36.2 ng, 72.4 ng, 108.6 ng, 144.8 ng, 181 ng, 217.2 ng, 253.4 ng, 289.6 ng, 325.8 ng und 362 ng Verwendung. Es konnte folgende Regressionsgerade erstellt werden:

2 AHederin = 6.477mHederin + 121.4 ; r = 0.9945 Formel II.4-7

Eine graphische Darstellung der beiden Regressionsgeraden ist in Abbildung II.4-16 gegeben.

100 ERGEBNISSE

1400 3000 1200 2500 1000

2000 800 1500 600 Fläche 1000 Fläche 400 200 500 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Masse an Hederacosid C (ng) Masse an α−Hederin (ng) 80 20 40 0 0 -20 -40 -80 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 50 100 150 200 250 300 350 400

Abbildung II.4-16. Regressionskurve und Residueenplot für Hederacosid C und α-Hederin.

Präzision Es wurden 3 verschiedene Mengen (ca. 20, 80 und 140 ng) an α-Hederin und Hederacosid C aufgetragen, entwickelt, derivatisiert und detektiert. Dies wurde 3 mal täglich an 3 verschiedenen Tagen durchgeführt, wobei die Standards jeden Tag von einer anderen Person hergestellt wurden. Für die Wiederholpräzision wurde die Standardabweichungen innerhalb eines Tages berechnet. Die intermediäre Präzision ist hingegen die Standardabweichungen der gesamten 9 Werte. Die prozentualen Standardabweichungen wurden in Tabelle II.4-7 zusammengestellt.

Tabelle II.4-7. Validierungsdaten der Präzision und die Genauigkeit für Hederacosid und α- Hederin.

RSD der Tagespräzision [%] RSD der Reproduzierbarkeit [%] Genauigkeit [%]

[ng] Hederacosid C α-Hederin Hederacosid C α-Hederin Hederacosid C α-Hederin Masse

20 0.2-3.9 3.1-6.8 +8 bis -27 -32 bis -63 11.2 1.1 80 1.0-3.4 4.3-10.7 +2 bis +8 -4 bis -16 3.2 7.2 140 1.3-2.3 2.6-5.8 +6 bis -2 -3 bis -10 4.4 4.2

Genauigkeit Zum einen erfolgte ein Vergleich der Flächenwerte, die anhand der Regressionsgerade berechnet wurden und denen, die während der Präzisionsbestimmung gemessen wurden. Dabei wurden die Mittelwerte der Intermediären Präzision bei den drei Konzentrationen als „aktuelle Werte“ definiert.

ERGEBNISSE 101

Die „wahren Werte“ wurden, wie in (U.S.Department of Health and Human Services 1996) angegeben, berechnet. Die sich ergebenden Abweichungen sind in Tabelle II.4-7 aufgeführt Zum anderen wurde ein Extrakt mit schon bestimmten Saponingehalt mit einer bekannten Menge an Hederacosid C versetzt. Auch hier konnte eine theoretisch sich ergebene Fläche berechnet und mit der tatsächlich gemessenen verglichen werden. Dabei betrug der gemessene Wert 103.6 % vom theoretisch berechneten Wert.

102

ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE 103

III. ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE

III.1. Untersuchungen zu Struktur-Wirkungsbeziehungen von SLs und ihrer Hemmaktivität gegenüber NF-κB

Vor dem Hintergrund, SLs als Leitstrukturen für die gezielte Entwicklung von NF- κB-Inhibitoren einzusetzen, wurden Untersuchungen zu Struktur- Wirkungbeziehungen durchgeführt und die folgenden Ergebnisse erhalten:

1. Durch Überlagerungsstudien von 3D-Strukturen konnte die Bedeutung von Ester- und Hydroxygruppen in der Nähe der Exomethylen-Gruppe des γ-Lactonringes für eine hohe NF-κB-Hemmaktivität bestätigt werden. 2. Unter Verwendung von 103 strukturell sehr verschiedenen Sesquiterpenlactonen konnte ein QSAR-Modell auf der Basis von Counterpropagation Neuronalen Netzen entwickelt werden. Bei diesem Modell wurden 19 Deskriptoren von RDF- und L-RDF codierter π-Elektronegativität sowie AC-codiertem Wasserstoffbindungspotential eingesetzt. Zusätzlich sind die effektive Atompolarisierbarkeit, die σ-Ladung sowie verschiedene topologische Atomeigenschaften (Anzahl benachbarter Atome u.a.) als Deskriptoren von Bedeutung. 2.1. Durch Vergleich von RDF-Codes konnte das Vorhandensein eines α-Methylen-γ-lactons als wichtigster Parameter für eine Hemmaktivität gegenüber NF-κB sowie die Steigerung dieser Hemmaktivität bei Vorliegen weiterer α,β-ungesättigter Ketone bestätigt werden. 2.2. Mit einer korrekten Vorhersage von 80.6 % bei einer 10fachen Kreuzvalidierung und 78.6 % bei Verwendung eines externen Datensatzes ist das entwickelte Modell zur Vorhersage der NF-κB-Hemmaktivität von neuen SLs geeignet. 2.3. Unter Verwendung des Modells ergaben sich bei der Suche nach hoch

aktiven SLs (IC100 < 20 µM) nur 16 % falsch negative und 6 % falsch positive

104 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE

Zuordnungen. Dies macht das Modell zur Suche und Optimierung von Leitstrukturen mit starker Hemmaktivität gegenüber NF-κB geeignet.

III.2. Bindung von Sesquiterpenlactonen an Blutbestandteile

Zur besseren Abschätzung der Bioverfügbarkeit von SLs in in-vitro und in in-vivo- Studien wurde die Interaktion von isolierten mono- und bifunktionellen SLs und SLs in Arnikazubereitungen mit Blutbestandteilen untersucht und die folgenden Beobachtungen gemacht:

1. Sesquiterpenlactone binden in unterschiedlichem Ausmaß an die verschiedenen Blutbestandteile. Monofunktionelle SLs, wie Dihydrohelenalinacetat und – methacrylat, weisen dabei ein geringeres Bindungsverhalten auf als bifunktionelle SLs, wie Helenalinisobutyrat und Parthenolid. Bei Vergleich der verwendeten Matrices ergibt sich folgende Reihenfolge hinsichtlich des gebundenen SL-Anteils: HSA (40 mg/mL) < HSA (50 mg/mL) < Plasma < Blut. 2. Sesquiterpenlactone in den Tinkturen binden bei Verwendung von HSA-Lösung als Matrix in einem vergleichbaren Ausmaß wie isolierte SLs. In Plasma und Blut ist die Bindung von SLs in Tinkturen jedoch wesentlich geringer als die von isolierten SLs. 3. SLs binden nur zu einem geringen Ausmaß an Cystein 34 des HSA. Als Bindungspartner kommen eher andere Aminosäurereste, wie Lysin, in Frage. Auch spielen nicht-kovalente Bindungen eine große Rolle. 4. Die Bindung ist reversibel, was beispielhaft für die Reaktion zwischen Parthenolid als Modellsubstanz und HSA gezeigt wurde. 5. Durch diese Untersuchungen zum Bindungsverhalten an Blut und deren Bestandteile konnte die unterschiedliche biologische Aktivität von mono- und bifunktionellen SLs bei Verwendung von Blut und Zellinien erklärt werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE 105

III.3. Penetrationsverhalten von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana L.

Für die Wirksamkeitsabschätzung von Arzneimitteln sind pharmakokinetische Untersuchungen unerläßlich. Daher wurde für einige äusserlich anzuwendenden Arnikazubereitungen das Penetrationsverhalten mit Hilfe des Stripping-Tests und Schweinehaut als Modell für die menschliche Haut untersucht und folgende Ergebnisse erhalten:

1. Sesquiterpenlactone aus Arnica montana L. penetrieren in die Hornhaut. Dabei zeigt das monofunktionelle 11α,13-Dihydrohelenalinacetat eine wesentlich bessere Penetration als das bifunktionelle Helenalinisobutyrat und auch Permeation durch das Stratum corneum. 2. Sesquiterpenlactone in Tinkturen und in Öl-Extrakten penetrieren und permeieren wesentlich besser als die isolierten Sesquiterpenlactone. Hierbei ist die Penetration unabhängig von der Herkunft der Arnikablüten und somit davon, ob 11α,13-Dihydrohelenalinderivate oder Helenalinderivate dominieren. Auch die Säurereste zeigen keinen messbaren Einfluß auf die Penetration. 3. Sesquiterpenlactone in Zubereitungen zeigen eine für die Wirkung ausreichende Penetration und Permeation. Diese sind bei Salben und Gelen besser als bei alkoholischen Tinkturen. 4. Bei den in den Zubereitungen üblichen Konzentrationen treten noch keine Sättigungseffekte bei der Penetration auf. Auch bei einer 10fach höheren Konzentration ist ein fast identisches Penetrationsverhalten festzustellen. 5. Gel-Zubereitungen zeigen nach längeren Inkubationszeiten eine Abnahme der Penetration, wohingegen die Penetration beim Einsatz von Salben auch über vier Stunden stabil bleibt.

106 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE

III.4. Entwicklung und Validierung von quantitativen Analysenmethoden

Zur erforderlichen quantitativen Analyse im Bereich der Bindungsstudien und der Penetrationsuntersuchungen war die Entwicklung und Validierung von Analysenmethoden notwendig. Weiterhin konnten die Verwendung der HPTLC bei quantitativen Analysen an beispielhaften, relevanten Drogen gezeigt werden.

1. Eine GC-MS Methode zur Quantifizierung von Helenalin- und 11α,13- Dihydrohelenalinderivaten unter Verwendung spezifischer Atommassen (244 und 246 amu) wurde entwickelt und validiert. Diese Methode ist auch bei Vorliegen komplexer Matrices wie Salben geeignet und erlaubt mit LOQ-Werten von 0.16 ng (Helenalinderivate) bzw. 1.5 ng (11α,13-Dihydrohelenalinderivate) die Quantifizierung geringer Mengen. 2. Zur quantitativen Bestimmung von 11β-Glutathionyl-parthenolid in Albuminlösung und in Plasma wurde eine HPTLC-Methode entwickelt und im Bereich von 55.5 bis 277.5 ng aufgetragenem Addukt validiert. Dabei wurde das Addukt mit Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz derivatisiert und densitometrisch vermessen. 3. Für die Bestimmung des Gesamtcapsaicin-Gehaltes von Capsicum frutescens L. wurde eine HPTLC-Methode entwickelt und validiert. Diese ist im Bereich von 53 ng bis 1400 ng an aufgetragenem Capsaicin einsetzbar. 4. Das genuine Saponin Hederacosid C aus Hedera helix L. sowie sein Abbauprodukt α-Hederin lassen sich mit der hier entwickelten und validierten Methode im Bereich von 24 ng – 170 ng bzw. von 40 ng – 370 ng an aufgetragener Menge quantifizieren. Zur notwendigen Derivatisierung wurde Vanillin-Schwefelsäure ausgewählt, das zu einer für 2 Stunden stabilen Färbung führt.

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 107

IV. DISKUSSION

IV.1. Untersuchungen zu Struktur-Wirkungsbeziehungen von SLs und ihrer Hemmaktivität gegenüber von NF-κB

An der antiphlogistischen Wirkung vieler Sesquiterpenlactone ist die Hemmung von NF-κB durch eine selektive Alkylierung des Cystein-38 der p65-Untereinheit maßgeblich beteiligt (Garcia-Pineres et al. 2001; Lyss et al. 1998; Lyss et al. 1997). Diese nachgewiesene NF-κB-Inhibition und ihre strukturelle Vielfalt machen diese Naturstoffe interessant, als potentielle Leitstrukturen für die Entwicklung von antiphlogistischen Arzneimitteln herangezogen zu werden. Grundlage einer Leitstrukturentwicklung ist hierbei die Kenntnis über Zusammenhänge zwischen der chemischen Struktur, der Reaktivität und den pharmakologischen Effekten. In der jüngsten Vergangenheit wurden bereits Untersuchungen zu quantitativen Struktur- Wirkungsbeziehungen mit Sesquiterpenlactonen durchgeführt, mit dem Ziel Leitstrukturen für effektive NF-κB-Inhibitoren aufzustellen (Ruengeler et al. 1999; Siedle et al. 2004). Zum einen wurde aber ein relativ kleiner Datensatz von 28 SLs verwendet, zum anderen führte die Verwendung der klassischen QSAR-Analyse bei einem Datensatz von 103 SLs nur zu befriedigenden Ergebnissen, wenn Korrelationen für einzelne Untergruppen, nicht aber für den ganzen Datensatz von 103 Sls aufgestellt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde der gleiche Datensatz verwendet und für alle 103 SLs ein strukturelles Modell für die NF-κB-Inhibition auf der Basis von Counterpropagation Neuronalen Netzen entwickelt.

IV.1.1. Counterpropagation Neuronale Netze als QSAR-Modell

Häufig beschreiben Deskriptoren, die üblicherweise bei QSAR-Untersuchungen eingesetzt werden, das ganze Molekül oder einzelne Moleküleigenschaften. In der vorliegenden Untersuchung wurde auf Deskriptoren zurückgegriffen, die Atomeigenschaften und die Lage von Atomen zueinander berücksichtigen – also

108 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN

Deskriptoren, die Informationen über die 3D-Struktur der Substanzen enthalten. Diese wurden durch Transformation der 3D-Struktur (unter Berücksichtigung einer Atomeigenschaft) mittels RDF und der Moleküloberfläche (unter Berücksichtigung eines Potentials) mittels AC erstellt. Die dabei anfallende große Anzahl an Deskriptoren ist nicht für die Erstellung einer klassischen QSAR-Gleichung geeignet, wohl aber für die Aufstellung von Neuronalen Netzen bzw. von Selbstorganisierenden Karten. Das beste entwickelte Modell stellt eine Kombination von Deskriptoren der RDF- und L-RDF codierten π-Elektronegativität und der AC-codierten HBP- Moleküloberfläche dar. Dieses Modell erlaubt bei einer internen und einer externen Validierung jeweils eine korrekte Vorhersage von ca. 80%. Diese ist vergleichbar mit den früheren klassischen QSAR-Untersuchungen mit demselben Datensatz (Siedle et al. 2004), wobei hier jedoch eine Unterteilung in fünf Untergruppen entsprechend der Grundstrukturen notwendig war. Da das hier entwickelte CPGNN mit seinen verwendeten Deskriptoren, die auf der Grundlage der 3D-Struktur ermittelt wurden, den ganzen Datensatz beschreibt, ist es der klassischen QSAR-Untersuchung von Siedle et al. überlegen. Zwar weisen auch andere QSAR-Untersuchungen mit Naturstoffen unter Verwendung von neuronalen Netzen mit „klassischen“ Moleküldeskriptoren eine ähnliche Vorhersagekraft auf (Nikolovska-Coleska et al. 1998; Novic et al. 1997; Oblak et al. 2000), aber hier wurden nur Variationen der Grundstruktur, hier die des „Flavonol“, betrachtet. In diesem Fall war die Verwendung von die 3D-Struktur beschreibenden Deskriptoren nicht notwendig. Die Vorhersagekraft des erstellten Modells ist zwar durch das Vorhandensein von Ausreißern begrenzt, es konnte aber gezeigt werden, dass kein SL bei jedem, sondern immer nur bei einem Teil der trainierten CPGNNs als Ausreißer auftritt. Bei diesen Ausreißern könnten die für die Aktivität wichtigen strukturellen Eigenschaften entweder nicht vollständig erfasst worden sein oder aber ein anderer

Wirkungsmechanismus vorliegen. Interessant ist hierbei das Paar 36 (IC100=50µM) und 38 (IC100=10µM), welches sich trotz unterschiedlicher Hemmaktivität gegenseitig vorhersagt. Dieses Paar unterscheidet sich nur durch eine Hydroxygruppe an der ungewöhnlichen Position C-7 bei 38. Da diese Hydroxylierung nur bei diesem einen

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 109

Molekül im Datensatz auftritt, konnte keine ausreichende Berücksichtigung dieser interessanten, aktivitätserhöhenden Derivatisierung bei der Modellentwicklung erfolgen. Es wird bei SL 38 auch ein anderer molekularer Angriff diskutiert (Siedle et al. 2004).

IV.1.2. Strukturelle Informationen des Modells für die NF-κB Hemmaktivität

Das beste Model stellt eine Kombination von χπ+HBP+χπ(L-RDF) dar. Damit konnte die Bedeutung der π-Elektronegativität χπ für die NF-κB Hemmaktivität aufgezeigt werden. In vorhergehenden QSAR Analysen fand hingegen nur die Elektronenaffinität des Gesamtmoleküls Berücksichtigung (Siedle et al. 2004). Diese trifft zwar auch Aussagen über die Reaktivität des Moleküls, jedoch nicht in so differenzierter Form wie bei Verwendung von χπ als Atomeigenschaft.

H H C+ H H + S H O O O O–

H H H S O O Abbildung IV.1-1. Reaktionsmechanismus für die Michael-Addition der Sulfhydryl-Gruppe von Cystein mit der α-Methylen-γ-lacton-Gruppe eines SLs.

Dieser Atomparameter wurden sowohl mittels RDF- als auch mittels L-RDF transformiert. Nur Atome mit π-Elektronen – wie Atome in Doppelbindungen oder Atome mit freien Elektronenpaaren in Konjugation mit Doppelbindungen - besitzen

χπ-Werte ungleich null und werden somit bei der RDF-Transformation berücksichtigt. Diese Atome repräsentieren α,β-ungesättigte Carbonylstrukturen - wie zum Beispiel α-Methylen-γ-lacton-Gruppierungen - die hauptsächlich an der postulierten Reaktion mit Cystein 38 der p65-Untereinheit beteiligt sind (Abbildung IV.1-1). Aus diesem Grund wurde das exocyclische C-Atom auch als das zentrale

110 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN

Atom bei der L-RDF-Codierung definiert. Aber nicht alle Atomabstände der RDF- und L-RDF-Kurven zeigten eine Bedeutung hinsichtlich der Hemmaktivität. Es wurden nur einige wenige mithilfe eines statistischen t-Tests ausgewählt. Beim Betrachten der selektionierten Deskriptoren fällt auf, dass hohe Deskriptorwerte mit einer hohen Hemmaktivität der SLs korrelieren (Abbildung IV.1-2). Die ermittelten Atomabstände konnten mit wichtigen strukturellen Eigenschaften in Beziehung gebracht werden.

1.0 r=1.4Å1.0 r=4.6Å 0.9 0.9 0.8 0.8 0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 g(r), normalisiert

g(r), normalisiert 0.2 0.2 0.1 0.1 0.0 0.0 123456 123456 Aktivitätsklassen Aktivitätsklassen

1.0 0.7 0.9 r=5.9Å0.6 r=6.6Å 0.8 0.7 0.5 0.6 0.4 0.5 0.4 0.3 0.3 0.2 g(r), normalisiert

0.2 g(r), normalisiert normalisiert 0.1 0.1 0.0 123456 0.0 123456 Aktivitätsklassen Aktivitätsklassen

Abbildung IV.1-2. Verteilung der normalisierten RDF-Werte g(r) für 4 im Modell verwendete Atomabstände bei den einzelnen Aktivitätsklassen. Die Balken geben den Bereich an, in dem sich 95 % der Werte bei den einzelnen Aktivitätsklassen befinden. Bei den Atomabständen r=1.4 Å, r=4.6 Å und r=5.9 Å ist eine Abnahme der durchschnittlichen g(r)-Werte mit zunehmender Aktivitätsklasse festzustellen. Bei r=6.6 Å ist die Verteilung komplexer.

Der Atomabstand von r=1.5 Å der L-RDF codierten Eigenschaft χπ korreliert exakt mit der Atomdistanz zwischen dem exocyclischen C-Atom und dem benachbarten C-Atom im Lactonring. Dies verdeutlicht die Bedeutung der α-Methylen- γ-lactonstruktur für die Reaktion mit Cystein. Die Verwendung ähnlicher Distanzen

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 111

(r=1.4 Å und 1.6 Å) der RDF-codierten Eigenschaft χπ offenbart, dass andere α,β- ungesättigte Carbonyl-Strukturen ebenfalls für eine hohe Hemmaktivität notwendig sind. In analoger Weise kann dies für einen Atomabstand von r=2.6 Å diskutiert werden, da auch dieser zumeist innerhalb von α,β-ungesättigten Carbonylstrukturen auftritt (Abbildung IV.1-3). Somit korreliert der Wert dieses Deskriptors mit der Anzahl an α,β-ungesättigten Carbonylstrukturen: Je mehr dieser Strukturelemente im Molekül auftreten, umso größer ist die Aktivität. Mithilfe dieses einen Deskriptors ist eine fast komplette Unterscheidung der Aktivitätsklassen 1 und 2 von den Aktivitätsklassen 3 bis 6 möglich (Abbildung IV.1-4). Die Wichtigkeit dieser Strukturelemente konnte schon des öfteren gezeigt werden (Schmidt 1997; Siedle et al. 2004).

Abbildung IV.1-3. Verschiedene

Atomabstände mit χπ-Werten größer als null am Beispiel der SLs 50 (Aktivitätsklasse 2; links) und 83 (Aktivitätsklasse 2; rechts). Reihe a zeigt RDF-codierte Atomabstände von r=2.6 Å, Reihe b von r=3.5 Å. Bei Reihe c sind die L-RDF codierten Abstände von r=4.6 Å mit dem exocyclischen C-Atom des Lactonringes als Zentralatom aufgezeigt. Reihe d zeigt die RDF-codierten Abstände von r=5.9 Å. Zur besseren Verdeutlichung ist die 3D-Struktur der beiden Moleküle in Reihe e angegeben.

Der Atomabstand von r=3.5Å ist vor allem innerhalb des α-Methylen-γ-lactons und innerhalb von α,β-ungesättigten Carbonylstrukturen, die Teil eines Ring-Systems

112 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN sind, zu finden (Abbildung IV.1-3). Dadurch kommt die Bedeutung dieser Elemente innerhalb von Ringsystemen im Vergleich zu solchen in Seitenketten, wie zum Beispiel in Methacrylat-Resten, zum Ausdruck und wird erneut bestätigt (Ruengeler et al. 1999). Die mittleren Abstände von r=4.6Å (RDF-codiert) und r=4.5Å (L-RDF codiert) enthalten Informationen über die Nachbarschaft von α,β-ungesättigten

Carbonylstrukturen. So gibt uns die L-RDF codierte χπ bei einem Abstand von r=4.5Å Informationen über das Vorhandensein von Hydroxy-, Carboxy- und Ester- Gruppen in direkter Nachbarschaft zu der Exomethylen-Gruppe des Lactonringes. Die Existenz dieser Gruppen führt zu einer vermehrten Hemmaktivität, was auch schon durch die Überlagerung aller 3D Strukturen gezeigt werden konnte. Diese Beobachtungen stimmen mit früheren QSAR-Untersuchungen überein (Schmidt 1997; Siedle et al. 2004).

1.0

0.8

0.6

0.4 für r=2.6 Å, normalisiert

π χ 0.2

RDF von von RDF 0123456 Hemmaktivitätsklasse

Abbildung IV.1-4. Verteilung der normalisierten RDF-codierten Atomeigenschaft χπ bei einem Atomabstand von r=2.6Å zu den Aktivitätsklassen 1 bis 6. Jeder Rhombus symbolisiert ein SL. Basierend auf einem RDF-Wert von 0.65 ist eine fast vollständige Trennung von SLs der Aktivitätsklassen 1+2 von 3-6 möglich. Dadurch richtig zugeordnete SLs sind durch eine durchgezogene Linie, falsch zugeordnete durch eine gepunktete Linie umrahmt. Nur 9 von 37 SLs (24%) der Aktivitätsklassen 1+2 sowie 3 von 66 SLs (5%) der Aktivitätsklassen 3-6 würden bei Benutzung nur dieses einen Deskriptors falsch klassifiziert.

Die großen Atomabstände von 5.1Å, 5.9Å und 6.6Å beschreiben die Position von verschiedenen α,β-ungesättigten Carbonylstrukturen zueinander (Abbildung IV.1-3).

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 113

Neun Abstände zwischen 4.4Å und 10.3Å von dem AC-codierten Wasserstoffbindungspotential (HBP) sind in dem besten Modell mitberücksichtigt. Schmidt et al. konnten zeigen, dass die Anzahl von Wasserstoffbindungsakzeptoren bzw. die zugängliche Oberflächenpartialladung für die Cytotoxizität von SLs bedeutsam ist (Schmidt 1999b; Schmidt und Heilmann 2002). Dies ist jedoch das erste mal, dass ein Oberflächenpotential in Struktur-Wirkungs-Beziehungen von SLs aufgeführt wird. Bei der Berechnung des Wasserstoffbindungspotentials werden funktionelle Gruppen in Protonendonoren und -akzeptoren unterteilt und auf eine Oberfläche projiziert. Daher ist ein direkter Vergleich zwischen den Atomabständen der Eigenschaft χπ und den Abständen der Oberflächenpunkte des HBP nicht möglich. Im Gegensatz zu den Deskriptoren, die sich aus χπ ergeben, korrelieren hohe Werte der HBP-Deskriptoren nicht unbedingt mit hohen Hemmaktivitäten (Abbildung IV.1-5).

0.9 1.0 0.8 0.9 0.8 0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 A(r), normalisiert

0.2 normalisiert normalisiert A(r), 0.1 r=4.4Å0.1 r=7.7Å 0.0 0.0 123456 123456 Aktivitätsklassen Aktivitätsklassen

1.0 0.9 0.9 0.8 0.8 0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 A(r), normalisiert 0.2 0.1 normalisiert A(r), r=8.2Å 0.1 0.0 r=8.6Å 123456 0.0 123456 Aktivitätsklassen Aktivitätsklassen

Abbildung IV.1-5. Verteilung der normalisierten AC-Werte A(r) für 4 im Modell verwendete Abstände von HBP- Oberflächenpunkten bei den einzelnen Aktivitätsklassen. Die Balken geben den Bereich an, in dem sich 95 % der Werte bei den einzelnen Aktivitätsklassen befinden.

114 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN

Da die Werte des Wasserstoffbindungspotentials positive und negative Werte annehmen können, sind die AC-codierten Werte ebenfalls positiv (Abstände zwischen zwei Donoren bzw. zwei Akzeptoren) und negativ (Abstände zwischen Akzeptor und Donor), (siehe auch Formel V.1-17). Durch die Normalisierung kommen im allgemeinen negative Werte im Bereich von 0 bis 0.5 und positive im Bereich von 0.5 bis 1 zum Liegen. Interessant ist nun, dass nur bei geringer Hemmaktivität (Klassen 4 bis 6) Werte kleiner 0.5 auftreten, d.h. keine Abstände zwischen Donoren bzw. Akzeptoren auf der Oberfläche berücksichtigt werden können. In den verwendeten Sesquiterpenlactonstrukturen kommen als Wasserstoffbindungsdonoren nur Hydroxygruppen, als Akzeptoren Oxo- und Estergruppen in Frage. Da hierbei jedes SL durch mindestens eine Oxo-Gruppe im Lactonring charakterisiert wird, führt das Fehlen weiterer Oxo- oder Estergruppen und das Vorhandensein von Hydroxygruppen zu negativen Potentialwerten und somit zu den beobachteten niedrigen Werten bei den Aktivitätsklassen 4 bis 6. Umgekehrt bedeutet dies, dass weitere Oxogruppen und die daraus resultierenden hohen AC-Werte für eine hohe Aktivität Vorraussetzung sind. Allerdings sind diese

Beziehungen komplexer als bei der RDF- bzw. L-RDF-codierten χπ, wie man bei einem Vergleich der Abbildung IV.1-4 mit der Abbildung IV.1-5 erkennt. Somit werden durch das Wasserstoffbrückenbindungspotential wahrscheinlich weitere Eigenschaften - wie die Möglichkeit, an die p65-Untereinheit von NF-κB zu binden - beschrieben. Vor allem das elektrostatische Oberflächenpotential (MEP) findet bei vielen QSAR-Untersuchungen Berücksichtigung, da es oft die Möglichkeit einer die Anlagerung des Moleküls an das Target beschreibt ((Anzali et al. 1998) und darin zitierte Literatur). Interessant in dieser Hinsicht ist die Beobachtung, dass SLs der Aktivitätsklasse 5 und 6 normalisierte AC-Werte um 0.5 bei einen Abstand der Oberflächenpunkte bei r=10.3 Å zeigen, während SLs der Aktivitätsklasse 1 durch Werte zwischen 0.6 und 0.75 charakterisiert sind. Dies bedeutet, dass bei den aktiven SLs Oberflächenbereiche mit einen Wasserstoffbindungspotential an unterschiedlichen Seiten des Moleküles vorhanden sein müssen, damit dieser Abstand von 10.3 Å erreicht werden kann.

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 115

IV.1.3. Verwendung des QSAR-Modells zur Aktivitätsvorhersage und zur Leitstruktursuche

Das entwickelte Modell soll nicht nur zur Vorhersage der Hemmaktivität neuer SLs, sondern auch zur Suche und Entwicklung von Leitstrukturen dienen. Dass dieses Modell zur Aktivitätsvorhersage geeignet ist, konnte durch die Validierung mit einem externen Datensatz bereits gezeigt werden. Dass es auch zur Leitstruktursuche und –entwicklung geeignet ist, bedarf noch eines experimentellen Nachweises. Bei der Leitstruktursuche sind zwei verschiedene Strategien vorstellbar. Zum einen können Strukturdatenbanken nach Substanzen durchsucht werden, die als aktiv vorhergesagt werden. Zum anderen wäre auf der Grundlage der bekannten Struktur-Wirkungs-Beziehungen und unter Beachtung chemisch-synthetischer Gesichtspunkte die de novo Konstruktion von Leitstrukturen möglich, die mit Hilfe des Modells überprüft und optimiert werden könnten. Bei beiden Vorgehensweisen ist darauf zu achten, dass sich die Substanzen innerhalb des „chemischen Raumes“ befinden, der von dem verwendeten Datensatz mit 103 SLs gebildet wird. So sollten sich die entsprechend normalisierten Deskriptorwerte der neuen Substanzen im selben Bereich bewegen, wie bei den 103 SLs, d.h. zwischen 0 und 1. Weiterhin sollten diese Substanzen auch in grundlegenden Eigenschaften den 103 SLs ähneln, z.B. hinsichtlich des Molekulargewichtes, der enthaltenen chemischen Elemente und Gruppen. Dies ist notwendig, da eine Aktivitätsvorhersage für Substanzen, die sich außerhalb des „chemischen Raumes“ befinden, einer Extrapolierung entspräche.

N O O

O O O O

O O N

Abbildung IV.1-6. Ein als aktiv vorhergesagtes Lacton aus der CSD (Sirim 2005).

116 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN

In einem ersten Versuch wurde die öffentlich zugängliche Cambridge Structural Database (CSD) nach interessanten Strukturen durchsucht (Sirim 2005). Hierzu wurden alle Strukturen mit γ-Lactonringen herausgefiltert und diese virtuell – wenn möglich – mit einer α-Methylengruppe versehen. Man erhielt einen Datensatz von über 900 Strukturen, die nun dem CPGNN-Modell präsentiert werden konnten. Ein Beispiel für eine als aktiv vorhergesagte Substanz ist in Abbildung IV.1-6 aufgeführt. Für diese und andere Substanzen sind Synthesen und eine Überprüfung der Aktivitäten im Zellversuch geplant.

IV.2. Bindung von Sesquiterpenlactonen an Blutbestandteile

In einer Arbeit von Humar et al. (Humar et al. 2003) zeigten verschiedene SLs ein Verhalten, das im Widerspruch zu den Reaktivitäten in bisherigen Experimenten stand: 11α,13-Dihydrohelenalinester hemmten die Bildung von CD69 und IL-2 in T-Zellen bei Verwendung von Vollblut 2-5 mal so stark wie das quasi bifunktionelle Parthenolid. Bei Verwendung von Zellkulturen und z.B. NF-κB als Target war dagegen Parthenolid (SL4; siehe auch Abbildung IV.2-1) ca. 5fach aktiver als die monofunktionellen 11α,13-Dihydrohelenalinester (Klaas et al. 2002; Ruengeler et al. 1999). Ein möglicher Grund für dieses Verhalten könnte die Bindung der reaktiveren SLs an spezifische Blutbestandteile sein, wodurch die weniger reaktiven Dihydrohelenalinester in höheren Konzentrationen vorliegen würden. Die relative Aktivität von monofunktionellen und bifunktionellen SLs scheint somit sehr stark von den eingesetzten Matrices abzuhängen Da SLs durch reaktive Michael-Systeme charakterisiert sind, ist eine Reaktion dieser Strukturen sehr wahrscheinlich. Entsprechend sind Reaktionen mit Sulfhydrylgruppen (SH), wie z.B. des Cysteins und Glutathions, beschrieben worden (Jodynis-Liebert et al. 1999; Schmidt et al. 1999; Schmidt 1997). Als SH-Donoren im Blut kommen neben intrazellulärem Glutathion vor allem das Cystein-34 des Albumins in Frage. So konnte in verschiedenen Arbeiten gezeigt werden, dass dieses Cystein für die Bildung von Albumin-gebundenen Prodrugs geeignet ist, da eine

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 117 schnelle und selektive Bindung möglich ist (Kratz et al. 2002; Oblak et al. 2004; Warnecke und Kratz 2003). Um den Einfluß der eingesetzten Matrices auf die SLs zu untersuchen und damit die oben genannten Diskrepanzen zu klären, wurde die Bindung verschiedener SLs (SL1 bis SL4) sowie von Tinkturen (T1 bis T3) an Albumin (HSA), Plasma- und Blutbestandteile untersucht.

IV.2.1. Verhalten der SLs und Tinkturen gegenüber HSA und Plasma

Die monofunktionellen SLs (SL1 und SL2) zeigen bei Verwendung von HSA, Plasma und Blut jeweils eine geringere Bindung als das bifunktionelle SL3. Dies steht in Übereinstimmung mit ihrer bekannten unterschiedlichen Reaktivität und damit bedingten Aktivität (Schmidt et al. 1999; Schmidt 1999b). Das eigentlich monofunktionelle Parthenolid (SL4) bindet am meisten an Matrices-Bestandteile. Parthenolid kann als quasi bifunktionell angesehen werden, da durch Bildung eines kationischen Intermediates ein zweites Reaktionszentrum entstehen könnte (Abbildung IV.2-1), (Fischer et al. 1998).

HS R R

S + C -H+

O O HO O HO O H H H O O O H+

Abbildung IV.2-1. Hypothetische Ausbildung eines kationischen Parthenolid-Intermediates, welches neben dem α,β-ungesättigten Lacton einen weiteren Angriffspunkt für nucleophile Agenzien, wie zum Beispiel Thiol-Gruppen, bietet. Nach (Fischer et al. 1998).

α,β-Ungesättigte Gruppen in Säureresten haben keinen Einfluß auf das Bindungsverhalten, wie das nahezu identische Verhalten von 11α,13- Dihydrohelenalinacetat (SL1) und 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat (SL2) gegenüber den verschiedenen Matrices zeigt. Konjugierte Esterstrukturen dürften daher keine Rolle als reaktives Strukurelement in einer Michael-Addition spielen, wie von Haufen und Vieluf diskutiert wird (Hausen und Vieluf 1997). Diese Autoren

118 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN vertreten die Meinung, dass 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat aufgrund dieses Strukturelementes als Hapten fungiert und mit Hautproteinen zum Vollantigen reagiert und somit ein Kontaktallergen darstellt. Dieses ist aufgrund der vorliegenden Untersuchungen sehr unwahrscheinlich. Auch bei der NF-κB- Hemmung von SLs zeigte das Vorliegen ungesättigter Seitenketten keine Zunahme der Hemmaktivität (Ruengeler et al. 1999) Beim Übergang von HSA-Lösung zu Plasma als Matrix war eine Zunahme der Bindungsrate um den Faktor 2 bei SL1 bis SL3 festzustellen. Ein vergleichbarer Anstieg (um den Faktor 2.7) wurde schon in früheren Untersuchungen beobachtet, als die Bindung von radioaktiv markiertem 11α,13-Dihydrohelenalin in bovinem Serumalbumin und Serum verglichen wurde (Grippo et al. 1991). Dieser Anstieg der Bindungsrate war nicht festzustellen, wenn SLs als Bestandteil von Tinkturen eingesetzt wurden. Diese Ergebnisse werfen Fragen auf, wie: Was führt zu der gesteigerten Bindung der isolierten SLs in Plasma beim Vergleich zu HSA und warum ist dieser Anstieg bei Verwendung von Tinkturen nicht zu beobachten? Ein Grund könnte sein, dass im Plasma wesentlich mehr freie Thiolgruppen zu finden sind als in HSA. Es konnte aber gezeigt werden, dass im Plasma vorkommende Globuline keinerlei freie SH- Gruppen besitzen (Haeberli 1995) und alle weiteren Proteine nur in geringen Mengen vorkommen. Der Gehalt an L-Glutathion ist mit einer Konzentration von 8 µM (Benard und Balasubramanian 1993) ebenfalls für diese Effekte vernachlässigbar. Trotzdem ist der Gehalt von Thiolen im Plasma wesentlich höher als in der verwendeten HSA-Lösung, da im Plasma das Cystein 34 des HSA zu 70 %, in den verwendeten HSA-Lösungen dagegen nur zu 34.5 % frei vorliegt (Peters, Jr. 1985), (siehe Abschnitt II.2.8). Die Verdopplung an freien Thiolgruppen stimmt überraschend gut mit der festgestellten Erhöhung des gebunden Anteils an SLs um den Faktor 2.0 überein. Dieses erklärt aber nicht das Bindeverhalten von SLs, die in Tinkturen vorliegen. Zwar kann die beobachtete identische Bindungsrate bei den SLs in den Tinkturen relativ einfach durch ein Abfangen der zusätzlichen reaktiven Gruppen im Plasma durch Substanzen in den Tinkturen, wie Flavonoide und Kaffesäurederivate, erklärt werden. So konnte für das Flavonolglykosid Quercetin eine starke Bindung im Bereich der IIA-Subdomaine festgestellt werden (Boulton et al.

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 119

1998). Wenn aber die Thiolgruppen die einzigen Reaktionspartner darstellen, stellt sich die Frage, warum diese Substanzen nicht auch schon die Reaktion mit Cystein 34 in den HSA-Lösungen verhindern. Hier zeigen SLs und SLs in den Tinkturen ein vergleichbares Bindungsverhalten. Aufgrund dieses Widerspruchs kommen für die zusätzliche Bindung der SLs im Plasma nur Reaktionen an anderen Stellen des HSA, an andere Substanzen oder aber nicht-kovalente Bindungen in Frage. Auch bei den Versuchen mit HSA-Lösungen ist eine alleinige Reaktion mit der Thiolgruppe an Cystein 34 auszuschließen, da dies zu ähnlichen Widersprüchen führen würde. Dass nicht nur eine einfache Reaktion zwischen Cystein 34 und Parthenolid vorliegt, zeigten auch schon die Ergebnisse der Reaktionskinetik. Um zu klären, welches Ausmaß diese Bindung besitzt, wurde die Abnahme der Thiolgruppen über die Zeit beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass von dem gebundenen Anteil nur ein kleiner Teil auf eine Bindung mit Cystein 34 zurückzuführen ist. Somit sind Reaktionen mit anderen Aminosäuren des HSA sowie nicht-kovalente Bindungen mit HSA notwendig, um die beobachtete Bindung zu erklären. Für α-Methylen-γ-butyrolacton als Modellsubstanz für SLs wurde eine bevorzugte Reaktion an Lysinresten im HSA-Molekül nachgewiesen (Franot et al. 1993). Reaktionen mit Cysteinresten erfolgten hingegen nur unter reduzierenden Bedingungen (Franot et al. 1993). Allerdings wurde für diese Untersuchungen HSA in Pulverform verwendet, bei dessen Herstellung die Gefahr besteht, dass die freien Cysteingruppen zu einen großen Teil oxidiert werden und so von vornherein von einem sehr geringen Anteil an HSA mit freiem Cystein 34 ausgegangen werden muß. Ähnliches gilt für Untersuchungen von Pickert et al., die das Verhalten von α- Methylen-γ-butyrolacton mit BSA untersuchten und ebenfalls eine Lysinbindung der Modellsubstanz nachwiesen (Pickert et al. 2003). Dieses stimmt mit anderen Berichten überein, die zeigen, dass eine ganze Reihe von Lysinen des Albumins (Lys-199, 220, 345, 412, 525) an der Bindung von Liganden beteiligt sind (Sugio et al. 1999). Für Lys- 199 konnte auch eine Acetylierung durch Acetylsalicylsäure gezeigt werden (Peters, Jr. 1985). Bei der beobachteten geringen Bindung an Cystein 34 sind beide α,β-ungesättigten Carbonylstrukturen zu einem gleichen Anteil beteiligt. Dieses steht im Widerspruch zu Reaktionen mit L-Cystein und L-Glutathion, bei denen jeweils eine der beiden

120 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN

Carbonylstrukturen in der Reaktion mit der entsprechenden Thiolgruppe überwog (Schmidt 1997). SL4 mit seinem postulierten zweiten Reaktionszentrum (Abbildung IV.2-1) zeigt in der Bindung zu Cystein 34 eine Zwischenstellung zwischen mono- und bifunktionellen SLs, obwohl die Gesamtbindung bei SL4 am höchsten ist.

IV.2.2. Bindungstellen von Sesquiterpenlactonen im HSA-Molekül

Neben kovalenten werden auch nicht-kovalente Bindungen bei der Proteinfällung mitberücksichtigt. Eine einfache Mitfällung von freien SLs kann aufgrund der beobachteten Zeit- und Konzentrationsabhänigkeit ausgeschlossen werden. Ein Vergleich der einzelnen Experimente ergibt Hinweise darauf, an welche Strukturen des HSA und auf welche Weise Parthenolid (SL4) bindet. Wie in Tabelle IV.2-1 gezeigt, nimmt der gebundene Anteil mit der Zeit zu. Der Abfall der Bindungsanteile bei den nicht-kovalenten Bindungen ist auf die fast vollständige Gesamt-Bindung nach 1000 min zurückzuführen. Die HSA-Bindung von Parthenolid ist überwiegend auf nicht-kovalente Bindungen zurückzuführen. Die auf zwei unterschiedlichen Wegen bestimmte Cystein 34 Bindung macht dabei nur einen kleinen Teil der kovalenten Bindungen aus. Es scheint die Bindung an andere Aminosäuren zu überwiegen. Für die anderen SLs kann von einem ähnlichen Verhältnis der einzelnen Bindungsraten ausgegangen werden. Insbesondere die Bindung an Cystein 34 findet bei allen SLs nur zu einem geringen Ausmaß statt.

Tabelle IV.2-1. Zusammenstellung der Bindungseigenschaften für Parthenolid, die sich aus den einzelnen Experimenten ergeben. Gezeigt sind die Werte nach einer Inkubationszeit von 60 min und nach 1000 min.

Bindung nach Experiment Bedeutung 60 min > 1000 min (%) (%) 1 Ausfällen Gesamt-Bindung 54.0±4.1 97.9±3.6 2 Ausschluß-HPLC (in HSA) kovalente Bindung inklusive Cys 34 19.8±0.4 84.5±0.2 3 Ausschluß-HPLC (in HSA+NEM) kovalente Bindung ohne Cys 34 17.2±0.6 80.7±0.3 4 Ellmann-Bestimmung Bindung an Cys 34 0.9±2.0 5.8±2.0 5 Differenz von 1 und 2 nichtkovalente Bindungen 34.2±4.4 13.4±3.8 6 Differenz von 2 und 3 Bindung an Cys 34 2.6±1.0 3.9±0.5

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 121

IV.2.3. Das Verhalten von SLs und Tinkturen gegenüber Blut sowie die Auswirkung auf ihre biologische Aktivität

Die allgemeine Zunahme an gebundenem SL, die beim Übergang von Plasma zum Vollblut zu beobachten ist, überrascht nicht: entsteht doch durch Einschluß der zellulären Bestandteile eine sehr komplexe Matrix. Zu berücksichtigen ist jedoch, dass die Konzentration an HSA im Blut nur halb so groß ist wie im Plasma. Die starke Bindung kann zurückgeführt werden auf die Bindung an Proteine oder an L- Glutathion, welche an oder in Blutzellen vorkommen. Auch eine An- und Einlagerung an Membranen ist möglich. Besonders die dominierenden Erythrocyten sind durch einen hohen Gehalt an L-Glutathion (GSH) – bis zu 2.5 mM – charakterisiert (Adamowicz et al. 2002), der den Gehalt an eingesetztem SL um ein Vielfaches übertrifft. Weiterhin erscheint eine Reaktion von SLs mit SH-Gruppen in Blutplättchen sehr wahrscheinlich (Heptinstall et al. 1987). Allerdings zeigten andere Untersuchungen, dass SH-Gruppen von Blutbestandteilen nicht das primäre Target des monofunktionellen Hymenoxons (Abbildung IV.2-2) zu sein scheinen (Hill et al. 1980).

H HO

O O

O OH

Abbildung IV.2-2. Hymenoxon, ein monofunktionelles SL aus Hymenoxys odorata DC.

In Blut binden die Dihydrohelenalinester zu einem weit niedrigeren Anteil als Parthenolid (84.7±3.2 % and 85.5±3.5 % verglichen mit 98.6±1.0 %), wodurch die Untersuchungen von Humar et al. eine Erklärung finden (Humar et al. 2003): Danach hängt die relative Aktivität von monofunktionellen und bifunktionellen SLs sehr stark von den eingesetzten Matrices ab (s. Seite 116). Die sich daraus ergebende Diskrepanz (Faktor 10 bis 25) lässt sich mit der festgestellten 10fach höheren Konzentration an freien Dihydrohelenalinester (SL1 und SL2) im Blut im Vergleich zum Parthenolid (SL4) gut erklären. Es scheint so, als ob weniger reaktive SLs nicht so stark von Matrix-Bestandteilen abgefangen werden und somit zu einem größeren

122 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN

Ausmaß für eine Reaktion mit dem eigentlichen Target zur Verfügung stehen. In derselben Untersuchung konnte weiterhin bei der Verwendung hoher Konzentrationen an SLs eine überraschend geringe Cytotoxizität festgestellt werden (Humar et al. 2003). Auch dies ist durch den durchweg geringen Anteil an freien SLs in Blut erklärbar. Falls diese Bindung reversibel verläuft, wäre eine Depotbildung denkbar, die eine Hemmung des entsprechenden Targets möglich macht, ohne dass die für toxische Effekte notwendigen Konzentrationen erreicht würden. Die Reversibilität von GSH-Addukten von Helenalin konnte bereits in verschiedenen Untersuchungen gezeigt werden (Schmidt et al. 1999; Schmidt 1999b). Auch die hier durchgführten Untersuchungen zur Bindung von 11β-Glutathionyl-parthenolid an HSA erbrachten erste Hinweise für die Reversibilität der Parthenolid-HSA Bindung. Falls die Bindung zu HSA irreversibel wäre, hätten nach 20 Stunden nur noch geringe Mengen an 11β-Glutathionyl-parthenolid detektierbar sein müssen, da Parthenolid immer wieder aus dem Parthenolid-Glutathion-Gleichgewicht entfernt werden würde. Es lagen aber nach 16 h Inkubation von Parthenolid in HSA nur noch ca. 5 % des Parthenolids ungebunden vor, während bei Verwendung von 11β-Glutathionyl-parthenolid nach 20 h noch über 40 % frei vorlagen. Auch spricht die schon nach fünf Stunden zu beobachtende Einstellung eines Gleichgewichtes für eine Reversibilität der Bindung von Parthenolid an HSA. Interessant in diesem Zusammenhang ist auch, dass 11β-Glutathionyl-parthenolid im Vergleich zu Parthenolid erst bei höheren Konzentrationen und längeren Inkubationszeiten eine NF-κB-Hemmung zeigt, während cytotoxische Effekte sogar weitgehend fehlen (Garcia Pineres 2003). Dies kann auf eine langsame Freisetzung von Parthenolid aus der GSH-Bindung zurückgeführt werden. Entsprechende Addukte mit HSA sollten zu ähnlichen Effekten führen. Insgesamt sind diese Untersuchungen zum Bindungsverhalten der SLs an Blutbestandteile sehr wichtig, um Aussagen zur Bioverfügbarkeit und - damit verbunden - zur Aktivität machen zu können. Dieses gilt insbesondere für die systemische Anwendung, wie die von Parthenolid zur Behandlung der Migräne (Palevitch et al. 1997). Zwar spricht die festgestellte starke Bindung an Blutbestandteile für eine schlechte Verfügbarkeit, aber die Hinweise auf eine teilweise Reversibilität machen eine systemische Verwendung dieses SLs plausibel.

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 123

Aber auch nach externer Applikation spielt die Bioverfügbarkeit eine wichtige Rolle. Nach einer vorausgesetzten erfolgreichen Permeation durch die Hornhaut (siehe Abschnitt II.3) können die extern angewendeten Arnica Inhaltsstoffe SL1 bis SL3 im Bereich ihres Wirkortes auch mit Blut in Berührung kommen. Die beobachtete nicht vollständige Bindung der Arnica Inhaltsstoffe machen es wahrscheinlich, dass sie nach externer Applikation bioverfügbar sind. Ob die geringere Bindung bei der Verwendung von Tinkturen, die in vitro bei der Verwendung von Blut als Matrix zu beobachten ist, auch eine Erhöhung der Bioverfügbarkeit sowie der biologischen Aktivität zur Folge hat, muß in weiteren Studien geklärt werden.

IV.3. Penetrationsverhalten von Sesquiterpenlactonen aus Arnica montana L.

Zubereitungen aus Blüten von Arnica montana L. werden äußerlich bei entzündlichen Erkrankungen angewendet. Obwohl schon klinische Studien zur Wirksamkeit vorliegen (Knuesel et al. 2002), existierten bisher keine Untersuchungen zum Penetrationsverhalten ihrer wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe, den Sesquiterpenlactonen. Aus diesem Grund wurden Penetrationsuntersuchungen mit Schweinehaut als Modell durchgeführt. Untersucht wurde die Penetration von 11α,13-Dihydrohelenalinacetat (SL1) und Helenalinisobutyrat (SL3), Tinkturen (T1 und T2) sowie verschiedenen Zubereitungen (Z1 bis Z6) in die Hornhaut untersucht. Bei den Zubereitungen wurden verdünnte Tinkturen (Z1), Lotionen (Z2 und Z3), Gele (Z4 und Z5) und Salben (Z6 und Z7) verwendet.

IV.3.1. Die isolierten Sesquiterpenlactone zeigen ein unterschiedliches Penetrationsverhalten

Das monofunktionelle Sesquiterpenlacton SL1 zeigt eine wesentlich bessere Penetration als das bifunktionelle Sesquiterpenlacton SL3. Das unterschiedliche Verhalten dürfte maßgeblich auf den unterschiedlichen Octanol-Wasser- Koeffizienten log P der beiden Substanzen zurückzuführen sein. Dieser Koeffizient

124 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN stellt in einer Arbeit von Kanikkannan et al. neben dem Molekulargewicht einen der wichtigsten Faktoren für die Vorhersage der Hautpermeabilität dar (Kanikkannan et al. 2000). Mit Hilfe des des Programmes CAChe® wurden log P-Werte für SL1 (log P=1.48) und SL3 (log P=2.50) berechnet. Der geringere Wert für SL1 kann damit als Erklärung für die bessere Penetration herangezogen werden, da in einem Multilayer-System mit alternierenden lipophilen und hydrophilen Schichten, wie das der Hornhaut, eine Substanz umso besser penetriert je näher ihr log P-Wert an 0.0 liegt (Williams und Barry 1992). Weiterhin dürfte die unterschiedliche Aktivität dieser beiden SLs gegenüber SH-Gruppen von Hautproteinen das Penetrationsverhalten mit beeinflussen. Bindungsstudien mit Hautpulver und der sehr reaktiven Modellsubstanz Parthenolid (SL4) zeigten zwar keine Reaktion. Zu berücksichtigen ist hierbei aber, dass das verwendete Hautpulver mit CrO3 behandelt wurde, wodurch eine Oxidation der freien SH-Gruppen erfolgt sein kann.

IV.3.2. Sesquiterpenlactone in Tinkturen zeigen eine verbesserte Penetration

Beim Übergang von isolierten SLs zu Tinkturen ist eine starke Verbesserung der Penetration festzustellen, wobei hier kein Unterschied mehr zwischen 11α,13- Dihydrohelenalin- und Helenalinderivaten zu beobachten ist. Diese Effekte treten trotz eines gleichen SL-Gehaltes und eines gleichen Ethanol-Gehaltes auf. Dies ist ein Hinweis, dass für die Penetrationserhöhung nur weitere Inhaltsstoffe der Arnikatinkturen in Frage kommen dürften. Nach Barry lassen sich solche Enhancer- Effekte eines Stoffes auf einen oder mehreren von drei Mechanismen zurückführen: zu nennen sind hier, eine Störung der streng geordneten Lipidstruktur zwischen den Hornhautzellen, eine Interaktion mit intrazellulären Proteinen, die zu einer verbesserten Permeation der Hornhautzellen führt und eine Mitnahme des Wirkstoffes in die Haut (Barry 1989). Enhancer-Effekte sind für eine Vielzahl von Stoffen beschrieben worden, wie für DMSO, Propylenglycol und Natriumlaurylsufat (Barry 1987), aber auch für in der Pflanzenwelt weit verbreitete Stoffe, wie Terpene, Fettsäuren und langkettige Alkohole (Kanikkannan et al. 2000). Interessanterweise zeigen auch Sesquiterpene einen Enhancer-Effekt, Sesquiterpenlactone jedoch nicht (Cornwell und Barry 1994; Kadir und Barry 1991). Besonders oft werden Monoterpene

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 125 eingesetzt, um die Penetration chemisch definierter Substanzen zu erhöhen (Almirall et al. 1996; El Kattan et al. 2001; Gao und Singh 1998; Godwin und Michniak 1999; Kunta et al. 1997; Levison et al. 1994; Moghimi et al. 1998; Vaddi et al. 2002; Williams und Barry 1991; Yamane et al. 1995). Sie wirken durch eine Störung der Lipidstruktur (Williams und Barry 1991). In Arnikatinkturen treten Derivate des Monoterpens Thymol auf (Merfort 1990), so dass eventuell diese Begleitstoffe eine Penetrationserhöhung induzieren. Bei Verwendung von aus Arnikatinkturen gewonnenem 10-Acetoxy-8,9- epoxythymolisobutyrat (Kos 2005) konnte zwar nur ein geringer Enhancer-Effekt beobachtet werden, was aber durch die geringe, hier verwendete Konzentration von 0.1 % (m/V) bedingt sein könnte. Diese Konzentration entspricht jedoch der Gesamtkonzentration an Monoterpenen in Arnikatinkturen. Thymol und andere Monoterpene werden üblicherweise in größeren Konzentrationen von 2 bis 5 % (m/V) eingesetzt, um einen Enhancer-Effekt zu erreichen (El Kattan et al. 2001). Somit leisten die Thymolderivate nur einen kleinen Beitrag zur verbesserten Penetration der Tinkturen. Weitere Substanzen müssen daher zum Enhancer-Effekt beitragen. Allen voran seien hier die Fettsäuren genannt, die im ätherischen Öl und somit auch in den Tinkturen zu finden sind (Merfort 1990). Sie werden oft als Enhancer in Konzentrationen zwischen 2.5 % und 10 % verwendet (Murakami et al. 1998; Vaddi et al. 2002; Williams und Barry 1992) und erhöhen die Permeation vor allen von unpolaren Stoffen (Cooper 1984). Die Konzentration in den Tinkturen ist jedoch mit 0.1 % auch hier wesentlich geringer als die üblicherweise zur Penetrationserhöhung verwendete. Zur besseren Penetration müssen demzufolge verschiedene Inhaltsstoffe der Arnikatinkturen beitragen. Obwohl in Pflanzen weitverbreitete Substanzen, wie Monoterpene und Fettsäuren, vielfach als Enhancer eingesetzt werden, wurde hier unseres Wissens erstmals wissenschaftlich belegt, dass ein pflanzlicher Wirkstoff im komplexen Gemisch eines Extraktes besser penetriert als in isolierter Form. Da sehr viele Heilpflanzen topisch eingesetzt werden (Brown und Dattner 1998), ist eine Beurteilung der Begleitstoffe in den Extrakten hinsichtlich ihres Einflusses auf die Penetration des Wirkstoffes von großer Bedeutung. Damit ließe sich wesentlich besser abschätzen, wann und inwieweit der Einsatz von Pflanzenextrakten gegenüber von Reinstoffen von Vorteil ist.

126 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN

Das Enhancement-Prinzip der Tinkturen scheint auch in den Öl-Extrakten vorhanden zu sein. Allerdings muss berücksichtigt werden, dass der Öl-Extrakt nur in Form der Salbenzubereitung Z6 untersucht wurde, bei der selbst Substanzen verarbeitet wurden, die einen Einfluss auf die Penetration haben. Zu nennen sind hier Fettsäuren als Komponenten des Extraktionsmittels und vor allem als Bestandteil der Salbenrezeptur. So beträgt die Konzentration an Fettsäuren in der Zubereitung Z6 mehr als 4.5 %. Außerdem tritt bei der Anwendung von Salben eine Okklusion auf, die zu einer Wassereinlagerung in die Hornhaut führt. Durch diese Einlagerung – Hornhaut kann die drei- bis fünffache Menge an Wasser aufnehmen – erhöht sich die Durchlässigkeit für Wirkstoffe (Bauer et al. 1999; Zhai und Maibach 2002). Dabei kommt es zur Hydratation der polaren Kopf-Gruppen der Lipide und in Folge davon zu lockerer gepackten lipophilen Kohlenwasserstoffketten (Barry 1987).

IV.3.3. Das Penetrationsverhalten der Sesquiterpenlactone in verschiedenen Zubereitungen

Sesquiterpenlactone in den Gel-Zubereitungen Z4 und Z5 weisen im Vergleich zu den Tinkturen T1 und T2 sowie zu der verdünnten Arnikatinktur Z1 ein besseres Penetrationsverhalten auf. Dieses läßt sich durch das das langsamere Eintrocknen dieser Gele im Vergleich zu den wässrig-ethanolischen Tinkturen erklären. Die schwache Penetration bei der Lotion Z2 könnte mit der relativ hohen Konzentration an Lipiden in dieser Zubereitung zusammenhängen. Diese Lipide könnten eine Art Depot für die lipophilen SLs an der Oberfläche der Haut bilden und somit eine Penetration vermindern. Interessanterweise zeigt die Lotion Z3, trotz der enthaltenen Lipide, eine signifikant bessere Penetration der SLs. Möglicherweise überwiegt bei der geringeren Lipidkonzentration die Enhancer Funktion der Lipide gegenüber dem Depoteffekt. Auch tritt bei beiden Formulierungen kein Eintrocknen wie bei dem Gel Z1 auf. Dieses trifft auch für die Salbe Z6 zu. Obwohl diese Zubereitung eine vergleichbar hohe Lipidkonzentation wie Z2 besitzt, ist eine bessere Penetration zu beobachten, was auf den möglichen Einfluß der in hohen Konzentration vorkommenden Fettsäuren zurückzuführen sein könnte.

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 127

IV.3.4. Das Penetrationsverhalten von SLs in der mit SLs angereicherten Zubereitung Z7

Mit der Zubereitung Z7 wurde eine Zubereitung getestet, die eine 10fach höhere Konzentration an SLs besitzt als die ansonsten identische Zubereitung Z6. Bei Verwendung von Z7 konnte eine entsprechend höhere Menge an penetrierten SLs detektiert werden. Es ist somit ohne weiteres möglich, größere Mengen an SLs lokal zu applizieren, um entsprechend höhere Konzentrationen am Wirkort zu erreichen. Mit der Testung der Salbe Z7 sollte weiterhin überprüft werden, ob sich die einzelnen SLs innerhalb der Zubereitung in ihrer Penetration unterscheiden. Dieses war nicht der Fall. Obwohl hier nur 11α,13-Dihydrohelenalinderivate untersucht wurden, ist ein ähnliches Verhalten auch für die Helenalinderivate anzunehmen. Untersuchungen mit der Tinktur haben jedenfalls gezeigt, dass beide Gruppen keinen Unterschied hinsichtlich des Penetrationsverhaltens aufweisen. Somit scheint die Zusammensetzung hinsichtlich der SL-Derivate und somit die Herkunft der Arnikablüten keinen Einfluß auf die Penetration zu haben.

IV.3.5. Einfluß längerer Inkubationszeiten auf die Penetration von SLs in Gel- und Salben-Zubereitungen

Die Untersuchungen der Gel-Zubereitungen Z4 und Z5 zeigen eine Abnahme der Penetration der SLs nach längeren Inkubationszeiten, was auf die Eintrocknung der Gele und damit auf einen erschwerten Übergang der SLs aus dem Gel in das Stratum corneum zurückgeführt werden kann. Auch das schlechte Penetrationsprofil nach kumulativem Auftragen und insgesamt siebenstündiger Inkubation kann durch eine solche Eintrocknung bedingt sein. Diese Annahme wird bestärkt durch die gleichbleibende Penetration von Salbenzubereitungen auch bei längerer Exposition. Es findet hier keine Eintrocknung statt sondern es tritt sogar ein Okklusionseffektes auf. Die Übertragung der Ergebnisse zu Inkubationszeiten und wiederholter Applikation auf die Praxis sind aber nur bedingt möglich. Zu berücksichtigen ist, dass infolge einer gewissen, stets vorkommenden Schweißproduktion die Oberfläche des Stratum corneums stets zu einem geringen Umfang feucht ist, so dass das Eintrocknen von Gelen und Tinkturen verzögert, beziehungsweise ein Stoffübergang

128 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN von der Zubereitung in die Haut erleichtert wird. Dass ausreichende Wirkstoffmengen bei Verwendung von Gelzubereitungen erreicht werden, zeigt eine klinische Studie zur Effektivität eines Arnika-Gels bei Osteoarthritis (Knuesel et al. 2002). Trotzdem sollte bei der Anwendung berücksichtigt werden, dass Applikationsabstände von mehr als zwei Stunden und wiederholtes Auftragen ohne Entfernung der Gelreste von vorherigen Applikationen aufgrund der hier erhaltenen Untersuchungsergebnisse nicht optimal sind.

IV.4. Entwicklung und Validierung von quantitativen Analysenmethoden

Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier Analysenmethoden entwickelt und validiert. So weit bekannt, ist die entwickelte GC-MS-Methode die erste Methode zur Bestimmung von Sesquiterpenlactonen, bei der eine GC-MS Kopplung verwendet wird. Sie verknüpft somit die Sensitivität der MS mit der Selektivität der GC, wobei durch Messung spezifischer Massen die Selektivität noch weiter erhöht werden konnte. Dadurch erlaubt sie auch die Quantifizierung von geringen Mengen an Sesquiterpenlactonen in sehr komplexen Matrices. Die Daten der Validierung liegen innerhalb der Akzeptanzgrenzen, die von der FDA für die Analyse von Substanzen in biologischen Matrizen gefordert sind (U.S.Department of Health and Human Services 2001). Bei den anderen drei entwickelten Methoden wurde als Analysenverfahren die HPTLC verwendet. Hierbei konnten einige Vorteile der HPTLC gegenüber den anderen, mit einem höheren apparativen Aufwand verbundenen Chromatographiemethoden GC und HPLC aufgezeigt werden. So ist ohne jede weitere Aufarbeitung eine Probenauftragung möglich, da bei jeder neuen Analyse eine neue stationäre Phase (d.h. eine neue HPTLC-Folie) verwendet wird. Dadurch müssen keine Substanzen aus der Probe entfernt werden, die mit der stationären Phase reagieren könnten. Zeitraubende Spül- und Äquilibrierungsschritte entfallen. Postchromatographische Derivatisierungen sind ohne großen apparativen Aufwand möglich, so dass auch schwer UV-detektierbare Substanzen, wie z.B. 11β-

DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 129

Glutathionyl-parthenolid oder die Saponine α-Hederin und Hederacosid C, einer Detektion mittels UV/VIS-Absorption zugänglich werden. Aber auch die pro Analyse benötigte Zeit spricht für die HPTLC als Analysenmethode. Während z.B. bei den publizierten HPLC-Methoden zur Bestimmung von Hederacosid und α- Hederin Analysenzeiten zwischen 25 und 35 Minuten pro Analyse anfallen (Crespin et al. 1994; Demirci et al. 2004), werden bei der entwickelten HPTLC-Methode pro Platte circa 1.5 Stunden benötigt. Da pro Platte allerdings bis zu 20 Proben vermessen werden können, ergibt sich hieraus nur eine Analysenzeit von unter 5 Minuten pro Probe. Dieses bedeutet, dass vor allem dort, wo viele Proben in relativ kurzer Zeit anfallen, wie z.B. in der Qualitätskontrolle, HPTLC-Methoden eine Alternative zur weitverbreiteten HPLC darstellen können. Obwohl das offene System „HPTLC“ Vorteile bietet, liegen darin aber auch einige Nachteile. Vor allem der Einfluß von Umweltfaktoren – wie Licht, Feuchtigkeit und Luft – ist durch das offene System sehr groß, so dass eine sehr genaue Standardisierung der Methode notwendig ist, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Daher ist die Reproduzierbarkeit bei den entwickelten HPTLC Methoden etwas schlechter als bei den HPLC-Methoden. Die Validierungsdaten entsprechen aber dennnoch den von der FDA geforderten Akzeptanzgrenzen (U.S.Department of Health and Human Services 2001). Nur bei der Genauigkeit von α-Hederin und Hederacosid C treten im untersten Auftragebereich starke Abweichungen auf. Dies dürfte auf einen zu gering gewählten LOQ zurückzuführen sein, da sich bei den höheren Auftragemengen die Validierungsdaten im geforderten Bereich befinden.

130

MATERIAL UND METHODEN 131

V. MATERIAL UND METHODEN

Eine Zusammenstellung der verwendeten Chemikalien, Verbrauchsmaterialien, Geräte und Software befindet sich im Anhang.

V.1. Material und Methoden für die Berechnung der Neuronalen Netzwerke

V.1.1. Datensatz

Die verwendeten 103 SLs sind in Tabelle V-2 zusammengefasst, die Strukturen sind in Abbildung II.1-1 aufgezeigt. Die biologische Aktivität ist dargestellt als die Konzentration [µM], bei der eine totale Hemmung der DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors NF-κB im EMSA (electrophoretic mobility shift assay) zu beobachten ist und wird als IC100 Wert bezeichnet. Experimentelle Informationen zu der genauen Vorgehensweise finden sich in (Siedle et al. 2004). Aufgrund des semiquantitativen Vorgehens sind nur IC100-Werte von 5, 10, 12.5, 20, 25, 50, 100, 200 und 300 µM vertreten. Zum Training der Neuronalen Netze sowie zur Vorhersage der Aktivität erfolgte eine Verschlüsselung der IC100-Werte in Aktivitätsklassen von 1 bis 6 (Tabelle V-1).

Tabelle V-1. Zuordnung von IC100-Werten zu den Aktivitätsklassen.

IC100[µM] 5 10 12.5 20 25 50 100 200 300 Aktivitätsklasse 1 2 2 3 3 4 5 6 6

132 Material und Methoden

Tabelle V-2. Sesquiterpenlactone des verwendeten Datensatzens mit Angabe der Pflanze, aus der die Substanz isoliert wurde, sowie die Publikation, in der die Aktivität gegenüber NF-κB veröffentlicht wurde.

IC100 Nr. Name Herkunft Publikation [µM] I Germacranolide ohne Furanoheliangolide 1 2α-Acetoxy-15-isovaleroyl-miguanin + 12.5 Mikania guaco (Ruengeler 2000) 2α-Acetoxy-15-(2-methylbutyryl)-miguanin 2 15-Isobutyryl-miguanin 12.5 M. guaco (Ruengeler 2000) 3 15-Isovaleroyl-miguanin + 12.5 M. guaco (Ruengeler 2000) 15-(2-Methylbutyryl)-miguanin 4 9α,14-Dihydroxy-15-isobutyryloxy-costunolid 100 M. guaco (Ruengeler 2000) 5 14-Hydroxy-15-isovaleroyloxy-9-oxo-melampolid + 12.5 M. guaco (Ruengeler 2000) 14-Hydroxy-15-(2-methylbutyryloxy)-9-oxo-melampolid 6 1α-Methoxy-15-isobutyryloxy-9-oxo-germacra- 25 M. guaco (Ruengeler 2000) 4E,10(14),11(13)-trien-12,6α-olid 7 1β-Methoxy-15-isobutyryloxy-9-oxo-germacra- 25 M. guaco (Ruengeler 2000) 4E,10(14),11(13)-trien-12,6α-olid 8 1β-Methoxy-15-isovaleroyloxy-9-oxo-germacra- 4E,10(14),11(13)-trien-12,6α-olid + 12.5 M. guaco (Ruengeler 2000) 1β-Methoxy-15-(2-methylbutyryloxy)-9-oxo-germacra- 4E,10(14),11(13)-trien-12,6α-olid 9 8β-Hydroxy-9α-methacryloyloxy-14-oxo-acanthospermolid 5 Milleria quinqueflora L. (Castro et al. 2000b) 10 9α-Hydroxy-8β-methacryloyloxy-14-oxo-acanthospermolid 10 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 11 15-Acetoxy-9α-methacryloyloxy-8β-hydroxy-14-oxo- 5 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) acanthospermolid 12 15-Acetoxy-9α-hydroxy-8β-methacryloyloxy-14-oxo- 5 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) acanthospermolid 13 9α-Hydroxy-8β-methacryloyloxy-14-oxo-acanthospermolid- 10 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 4α,5β-epoxid 14 Miller-9E-enolid 5 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 15 Miller-9Z-enolid 10 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 16 1β-Methoxy-miller-9Z-enolid 10 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 17 4β,15-Epoxy-miller-9E-enolid 5 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 18 4β,15-Epoxy-miller-9Z-enolid 5 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 19 9α-Methoxy-miller-1(10)Z-enolid 50 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 20 9α-Acetoxy-miller-1(10)Z-enolid 10 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 21 9α-Acetoxy-4β,15-epoxy-miller-1(10)Z-enolid 5 M. quinqueflora (Castro et al. 2000b) 22 Tatridin A 200 Tanacetum prateritum (Goren et al. 1996) 23 1-Epitatridin B 50 T. prateritum (Goren et al. 1996) 24 Tamirin (Goren und Tahtasakal 50 Tanacetum chiliophyllum 1993) 25 Parthenolid 20 (Garcia Pineres 2003) 26 15-(2´,3´-Epoxy)-isobutyryloxy-micrantholid 50 Mikania cordifolia (Klaas 2001) 27 15-Isobutyryloxy-micrantholid 50 M. cordifolia (Klaas 2001) 28 15-(2´-Methyl-3´-hydroxy)-butyryloxy-micantholid 50 M. cordifolia (Klaas 2001) 29 15-(2´-Hydroxy)-isobutyryloxy-micantholid 50 M. cordifolia (Klaas 2001) 30 14-Acetoxy-15-(3´-hydroxy)-methacryloyloxy-micantholid 50 M. cordifolia (Klaas 2001) 31 15-(2´-Methyl)-butyryloxy-micantholid 50 M. cordifolia (Klaas 2001) 32 15-(3´-Hydroxy)-isobutyryloxy-micantholid 100 M. cordifolia (Klaas 2001) 33 15-Methacryloyloxy-micantholid 50 M. cordifolia (Klaas 2001) 34 15-(4-Hydroxy)-methacryloyloxy-micantholid 20 M. cordifolia (Klaas 2001) 35 11ß,13-Dihydro-14-oxo-15-hydroxy-germacra-1(10)E,4Z- 300 M. cordifolia (Klaas 2001) dien-12,8α-olid 36 Costunolid 50 Podachaenium eminens (Castro et al. 2000a) 37 3-Acetoxy-costunolid 50 P. eminens (Castro et al. 2000a) 38 7-Hydroxy-costunolid 10 P. eminens (Castro et al. 2000a) 39 Eupatoriopikrin 20 Eupatorium cannabinum (1) 40 Enhydrin 10 Viguiera gardneri (Schorr et al. 2002)

MATERIAL UND METHODEN 133

IC100 Nr. Name Herkunft Publikation [µM]

41 Molephantin 10 Elephantopus mollis (Banerjee et al. 1986) 42 Molephantinin 10 E. mollis (Banerjee et al. 1986) 43 9β-Acetoxycostunolid 200 (2) 44 Scandenolid 10 Mikania micrantha (Siedle 2003) II Furanoheliangolide 45 Diversifolin 50 Tithonia diversifolia (Rüngeler et al. 1998) 46 Diversifolin-methylether 200 T. diversifolia (Rüngeler et al. 1998) 47 Tirotundin 200 T. diversifolia (Rüngeler et al. 1998) 48 Centratherin 5 Proteopsis furnensis (Vichnewski et al. 1990) 49 Goiazensolid Eremanthus 20 (Lunardello et al. 1995) mattogrossensis 50 Isogoiazensolid 10 E. mattogrossensis (Lunardello et al. 1995) 51 1-Oxo-5-chlor-3,10-epoxy-8-methacryloyloxy-germacra- Artefakt aus E. 5 (Lunardello et al. 1995) 2,4(15),11(13)-trien-12,6β-olid mattogrossensis 52 15-Hydroxy-eremantholid B 100 Eremanthus arboreus (Vichnewski et al. 1999) 53 15-Acetoxy-eremantholid B 5 E. arboreus (Vichnewski et al. 1999) 54 15-Deoxybudlein A 5 Calea lantanoides (Vichnewski et al. 1982) 55 Atripliciolidtiglat 5 Viguiera robusta (Da Costa et al. 1996) 56 3,10-Hydroxy-2-methoxy-8-(2-methylpropanoyloxy)- 200 T. diversifolia (Pereira et al. 1997) germacra-4,11(13)-dien-12,6β-olid 57 15-Deoxygoiazensolid Vanillomopsis 10 (Vichnewski et al. 1976) erythropappa 58 Budlein A 5 V. gardneri (3) 59 2β-Methoxy-2-deethoxy-phantomolin 10 Eremanthus mollis (Banerjee et al. 1986) 60 2β-Methoxy-2-deethoxy-8-O-deacylphantomolin-8-O- 10 E. mollis (Banerjee et al. 1986) tiglinat III Guaianolide 61 Cumambrin A 20 Tanacetum densum (Goren et al. 1992) 62 Cumambrin B 100 T. densum (Goren et al. 1992) 63 Dehydro-leucodin 50 P. eminens (Castro et al. 2000a) 64 3-Chloro-dehydroleucodin 20 P. eminens (Castro et al. 2000a) 65 3,4-Epoxy-dehydroleucodin 5 P. eminens (Castro et al. 2000a) 66 2-Oxo-guaia-1(5),11(13)-dien-12,8β-olid 20 Decachaeta thieleana (4) 67 2-Oxo-guaia-1(5),11(13)-dien-12,8α-olid 20 D. thieleana (4) 68 Thieleanin 20 D. thieleana (Castro et al. 1983) 69 3-Oxo-guaia-4,11(13)-dien-12,8β-olid 50 D. thieleana (4) 70 2-Oxo-guaia-1(5),11(13)-dien-12,6β-olid 20 D. thieleana (4) 71 2-Oxo-guaia-1,4(15), 11(13)-trien-12,8β-olid 5 D. thieleana (4) 72 2-Oxo-guaia-1,4,11(13)-trien-12,8α-olid) 10 D. thieleana (4) 73 3-Oxo-guaia-1(2),11(13)-dien-12,8α-olid 50 D. thieleana (4) 74 2-Oxo-guaia-1(5),11(13)-dien-12,6α-olid 20 D. thieleana (4) 75 2-Oxo-8β-methacryloyloxy-guaia-1(10),3,11(13)-trien-12,6α- 10 V. gardneri (Schorr et al. 2002) olid 76 2-Oxo-8β-epoxyangelicoyloxy-guaia-1(10),3,11(13)-trien- 20 V. gardneri (3) 12,6α-olid 77 2-Oxo-8β-methacryloyloxy-10β-hydroxy-guaia-3,11 (13)- 50 V. gardneri (Schorr et al. 2002) dien-12,6α-olid 78 2-Oxo-8β-methacryloyloxy-10α-hydroxy-guaia-3,11 (13)- 20 V. gardneri (Schorr et al. 2002) dien-12,6α-olid 79 3β,10β-Dihydoxy-guaia-4(15),11(13)-dien-12,6α-olid 200 (2) 80 2-Oxo-15-hydroxy-guaia-1(10),3,11(13)-trien-12,6α-olid (Kisiel und Zielinska 50 Cichorium intybus L. 2001) 81 3β-Acetoxy-guaia-4(15),10(14),11(13)-trien-12,6α-olid 100 (2) 82 3β-Senecioyloxy-guaia-4(15),10(14),11(13)-trien-12,6α-olid 200 (2) IV Pseudoguaianolide 83 Helenalin Arnica chamissonis ssp. 10 (Willuhn et al. 1990) foliosa 84 11α,13-Dihydrohelenalin 200 A. chamissonis ssp. foliosa (Willuhn et al. 1990) 85 Chamissonolid 200 A. chamissonis ssp. foliosa (Willuhn et al. 1990)

134 Material und Methoden

IC100 Nr. Name Herkunft Publikation [µM]

86 2,3-Dihydroaromaticin (Merfort und Wendisch 50 Arnica cordifolia. 1993) 87 Mexicanin I 20 Arnica acaulis (Leven 1988) 88 Helenalinisobutyrat 20 A. chamissonis ssp. foliosa (Willuhn et al. 1990) 89 11α,13-Dihydrohelenalinacetat 200 A. chamissonis ssp. foliosa (Klaas et al. 2002) 90 11α,13-Dihydrohelenalintiglinat 100 A. chamissonis ssp. foliosa (Klaas et al. 2002) 91 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat 100 A. chamissonis ssp. foliosa (Klaas 2001) V Hypocretenolide 92 14-Hydroxy-cretenolid 50 Leontodon hispidus L. (Zidorn et al. 1999) 93 14-Acetoxy-cretenolid 100 (2) VI Eudesmanolide 94 Douglanin 300 T. praeteritum (Goren 1995) 95 Santamarin 100 T. praeteritum (Goren 1995) 96 Ludovicin A 200 T. praeteritum (Goren 1995) 97 3α-Hydroxyreynosin 200 T. praeteritum (Goren 1995) 98 Ludovicin B 100 T. praeteritum (Goren 1995) 99 1β-Hydroxy-4α-hydroxy-15-isobutyryloxy-eudesma-11(13)- 200 M. cordifolia (Klaas 2001) en-12,8β-olid 100 1β-Hydroxy-4β-hydroxy-15-isobutyryloxy-eudesma-11(13)- 200 M. cordifolia (Klaas 2001) en-12,8β-olid 101 1β-Acetoxy-4α-hydroxy-15-isobutyryloxy-eudesma-11(13)- 100 M. cordifolia (Klaas 2001) en-12,8β-olid 102 1β-Hydroxy-15-isobutyryloxy-eudesma-3,11(13)-dien-12,8β- 50 M. cordifolia (Klaas 2001) olid 103 2-Oxo-3-acetoxy-eudesma-3,11(13)-dien-12,8β-olid 100 D. thieleana (4)

(1) Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof.Becker, Universität Saarbrücken (2) Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Kisiel; Polnische Akademie der Wissenschaften, Krakau (3) Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. F. da Costa, Universidad de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasilien (4) Murillo et al. unveröffentlichte Ergebnisse

Ein weiterer Datensatz von 14 SLs wurde für die Validierung des besten Modells verwendet. Dieser wurde während aller anderen Betrachtungen nicht berücksichtigt. Namen, Herkunft und Aktivität sind in Tabelle V-3 aufgelistet, die Strukturen sind in Abbildung II.1-19 abgebildet.

Tabelle V-3 Sesquiterpenlactone des Test-Datensatzes mit Angabe der Pflanze, aus der die Substanz isoliert wurde sowie der Publikation, in der die Aktivität gegenüber NF-κB beschrieben wurde.

IC100 Publikation Nr Name Herkunft [µM]

N1 2β-Ethoxy-2,3-dihydrohelenalin-6-O-acetat 50 Arnica montana (Kos et al. 2005) N2 Helenalin-2-methylbutyrat 10 A. montana (Kos et al. 2005) N3 Helenalinmethacrylat 5 A. montana (Kos et al. 2005) N4 Niveusin A 20 Viguiera sylvatica (Lindenmeyer 2004) N5 2β-Hydroxy-1-desoxy-niveusin A 50 V. sylvatica (Lindenmeyer 2004) N6 Niveusin B 20 V. sylvatica (Lindenmeyer 2004) N7 4,5-Isobudlein A 10 V. sylvatica (Lindenmeyer 2004) N8 8α-(2’R,3’R-Epoxy-2’-methylbutyryloxy)-4α-hydroxy-9-oxo- 10 Montanoa hibiscifolia (Müller et al. 2004) 5βH-eudesm-1Z,11(13),dien-6β,12-olid N9 8α-(2’R,3’R-Epoxy-2’-methylbutyryloxy)-9α-hydroxy- 200 M. hibiscifolia (Müller et al. 2004)

MATERIAL UND METHODEN 135

IC100 Publikation Nr Name Herkunft [µM]

montahibisciolid N10 9β-(2’S,3’S-Epoxy-2’-methylbutyryloxy)-8α-hydroxy-germacra- 50 M. hibiscifolia (Müller et al. 2004) 4E,1(10)E-dien-6β,12-olid N11 8α-(2’S,3’S-Epoxy-2’-methylbutyryloxy)-9-oxo-germacra- 50 M. hibiscifolia (Müller et al. 2004) 4E,1(10)E-dien-6β,12-olid N12 8α-(2’S,3’S-Epoxy-2’-methylbutyryloxy)-1α-methoxy-9-oxo- 20 M. hibiscifolia (Müller et al. 2004) 10αH-germacra-4E-en-6β,12-olid N13 8α-Hydroxy-9β-tigloyloxy-germacra-4E,1(10)E-dien-6β,12-olide 100 M. hibiscifolia (Müller et al. 2004) N14 Dehydrosaussurealacton 100 Saussurea lappa (Müller 2004)

V.1.2. Generation der 3D-Struktur

Zur Berechnung der 3D-Struktur wurde das Programm CORINA (COoRdInAtes) (Computer-Chemie-Centrum Universität Erlangen-Nuremberg 2004; Molecular Networks GmbH Erlangen 2005; Sadowski und Gasteiger 1993b) verwendet. Es wurde für jedes Molekül jeweils eine energiearme Konformation generiert. Dies wurde als ausreichend erachtet, da SLs erfahrungsgemäß nur wenige, sehr ähnliche energiearme Konformation besitzen sowie das wichtigste Strukturelement – der Lactonring – besonders rigide ist. CORINA arbeitet als ein „automatischer 3D- Modellbaukasten“. Hierbei werden monozentrische Fragmente mit standardisierten Bindungslängen und –winkeln kombiniert. Für Ringgrößen bis 9 Atome existieren Konformationstabellen, auf die bei Bedarf zurückgegriffen wird. Bei größeren sowie bei überbrückten Ringen wird eine Backtracking-Prozedur angewendet unter Berücksichtigung einiger geometrischer und energetischer Beschränkungen (Computer-Chemie-Centrum Universität Erlangen-Nuremberg 2004). Eine genaue Beschreibung dieser Prozedur findet sich in (Sadowski und Gasteiger 1993a).

V.1.3. Überlagerung von 3D-Strukturen

Das Programm GAMMA (Genetic Algorithm for Multiple Molecule Alignment), ermöglicht die Überlagerung von dreidimensionalen Strukturen von Molekülen (Handschuh et al. 1998; Handschuh et al. 2000). Entwickelt wurde das Programm zur Bestimmung von Pharmakophoren in einer Gruppe analoger Wirkstoffe. Das Prinzip des Programms basiert auf genetischen Algorithmen. Dies sind Optimierungsverfahren auf der Grundlage von natürlicher Mutation und Selektion.

136 Material und Methoden

Es wird von einer Population von Parametersätzen, also von verschiedenen Startpunkten, ausgegangen. Die einzelnen Parametersätze werden nach dem Vorbild der Evolution als Individuen bezeichnet. Diese Individuen werden entsprechend ihrer Anpassung an ein Problem selektiert. Die selektierten Individuen unterliegen dann verschiedenen Modifizierungen, die in Analogie zur Evolution als Mutation und Crossover/Rekombination bezeichnet werden. Es existieren jedoch auch Modifizierungen, die keine Entsprechungen in der Natur haben. Mit den so modifizierten Individuen erfolgt dann eine neue Selektion usw. Übertragen auf das Problem der Molekülüberlagerung stellt ein Individuum eine zufällig generierte Überlagerung von 2 oder mehreren Molekülen dar. Die Information wird in Matchlisten zusammengestellt, die die Zuordnung der Atome der einzelnen Moleküle untereinander enthält (Abbildung V.1-1).

Abbildung V.1-1. Beispiel einer Atomzuordnungstabelle von 3 Molekülen nach einer Optimierung. Atome verschiedener Moleküle, werden zufällig „übereinandergelegt“ und zu Atomtubeln zusammengefasst. Die Atomtubel in der Abbildung sind schon optimiert, d.h. die „übereinandergelegten“ Atome sind u.a. räumlich benachbart. Nach einer Vorlage von (Handschuh et al. 1998).

Als Selektionskriterium für die einzelnen Individuen wird die Größe der übereinandergelegten Einheiten zweier Moleküle I und II (Anzahl der überlagerten Atome in einer Substruktur, siehe Abbildung V.1-1) und die Güte der Überlagerung (Distanz D der einzelnen Atome zueinander, siehe Formel V.1-1) berücksichtigt.

(N −1)! 2 D = ∑(dI (i, j) − dII (i, j)) Formel V.1-1 1 mit dI(i,j) und dII(i,j) als Atomdistanzen in den Molekülen I und II zwischen den entsprechenden Atomen im Atomtubel i und j in einer Substruktur mit N Tubeln. Weiterhin können von PETRA berechnete Atomeigenschaften (Atompartialladungen, Elektronegativität oder Polarisierbarkeit) berücksichtigt werden (siehe Abschnitt V.1.4). Dabei sollten sich die überlagernden Atome

MATERIAL UND METHODEN 137 hinsichtlich der ausgewählten Atomeigenschaften innerhalb gewisser Grenzen ähneln. Entsprechend der Kriterien werden die einzelnen Individuen mit in die nächste Generation übernommen oder nicht. Die Individuen der Nachfolgegeneration werden dann durch Operatoren verändert. Zum einen findet eine Mutation der Zuordnungstabellen statt, bei der alle Atome außer denen des Referenzmoleküls verändert werden können (Abbildung V.1-2).

Abbildung V.1-2. Der Operator Mutation wechselt eine einzelne Atomzuordnung aus. Ein Paar wird zufällig ausgewählt (links, in der Tabelle schraffiert umrandet) und ersetzt durch ein anderes (rechts, in der Tabelle schraffiert umrandet).

Beim Operator Rekombination (= Crossover) werden zufällig ausgewählte Bereiche zwischen 2 verschiedenen Individuen ausgetauscht. Die sich neu ergebene Population aus selektierten und veränderten Individuen wird einem neuen Selektionsschritt unterzogen und der ganze Prozess beginnt von Neuem.

V.1.4. verwendete Atomeigenschaften

Den Atomen der 3D-optimierten Moleküle wurden verschiedene Atomeigenschaften zugeordnet. Die entsprechenden Atomeigenschaften wurden unter Zuhilfenahme des Programms PETRA (Parameter Estimation for the Treatment of Reactivity Applications) berechnet (Tabelle V-4), (Computer-Chemie-Centrum Universität Erlangen-Nuremberg 2005a; Molecular Networks GmbH Erlangen 2005). Es ermöglicht

138 Material und Methoden die Berechnung einer ganzen Palette an Eigenschaften der Atome, der Bindungen und des Gesamtmoleküls unter Verwendung verschiedener empirischer Methoden.

Tabelle V-4. Liste der verwendeten, von PETRA berechneten Atomeigenschaften.

Abkürzung Symbol Beschreibung laut PETRA nel NEL Anzahl an Elektronen aperipher PERIPH beschreibt, ob Atom peripher (aperipher=1) ist oder nicht (aperipher=0) αd POLARIZ effektive Atompolarizierbarkeit nringsize RINGSIZ Größe des kleinsten Ringes, zu dem das Atom gehört χLP ENLP Elektronegativität der freien Elektronenpaare

χπ ENPI π-Elektronegativität χσ ENSIG σ-Elektronegativität nfree-el FREEEL Anzahl an freien Elektronen aLPstab LPSTAB Mesomeriestabilisierung durch freie Elektronenpaare nneighbour NEIGHBOR Anzahl an benachbarten (gebundenen) Atomen nnon-H-neighbour NONHNEIG Anzahl an benachbarten Atomen ohne Wasserstoffatome qformal FORMCH formale Ladung der Atome qπ QPI π-Ladung qσ QSIG σ-Ladung qtot QTOT Gesamtladung

Unter den physikochemischen Parametern fanden vor allem die folgenden

Verwendung: σ-Ladung (qσ), π-Ladung (qπ), π-Elektronegativität (χπ), effektive

Atompolarisierbarkeit (αd). Die Grundlage ihrer Berechnung soll im folgendem kurz erläutert werden. σ-Ladungsverteilung Als Grundlage der Berechnung verwendet PETRA das PEOE-Konzept (Partial Equalization of Orbital Electronegativities), (Gasteiger und Marsili 1980). Grundlage ist die theoretische Überlegung, dass die Elektronegativität χ als Mittelwert des Ionisationspotential I und der Elektronenaffinität E anzusehen ist (Mulliken 1934).

1 χ = (I + E) Formel V.1-2 2

Die verschiedenen Orbitale eines Atoms werden separat berechnet: jedes Orbital hat seine eigene Elektronegativität, χi. Die initialen Orbital-Elektronegativitäten sind von Hinze und Jaffe bestimmt worden (Hinze et al. 1963; Hinze und Jaffe 1963; Hinze und Jaffe 1962).

MATERIAL UND METHODEN 139

Jedoch ist die Elektronegativität nicht nur abhängig von der Art des Orbitals, sondern auch von deren Besetzungsnummer (n=0,1,2). Werte der Elektronegativität können aus den berechneten Werten von Hinze und Jaffe (siehe oben) für den neutralen Status (n=1) sowie für den mit einer positiven (n=0) oder negativen (n=2) Ladung erhalten werden. Die Besetzung muss jedoch analog zu den kontinuierlichen Werten für die Ladung q als kontinuierliche Variable angesehen werden. Mit drei fixierten Werten für die Abhängigkeit der Elektronegativität χi von der Ladung q (n=0,1,2 entsprechend q=+1,0,-1) kann ein Polynom zweiten Grades aufgestellt werden.

2 χi = ai + biq + ciq Formel V.1-3

+ 0 - Die drei Koeffizienten ai, bi und ci können mithilfe der Werte von χi , χi und χi bestimmt werden und sind abhängig vom Hybrid-Status der Orbitale. Bei der Ausbildung von Bindungen werden die Elektronenwolken vom Atom A mit der geringeren Elektronegativität zum Atom B mit der höheren Elektronegativität verschoben. Dies führt zu einer positiven Ladung des Atoms A und einer Zunahme seiner Elektronegativität. Bei Atom B tritt der entgegengesetzte Prozeß auf. Somit gleichen sich die Elektronegativitäten von zwei miteinander verbundenen Atomen an. Die Angleichung ist jedoch nicht vollständig, da eine Elektronenverschiebung zu einem elektrostatischen Potential führt, das gegen eine weitere Verschiebung gerichtet ist. Die oben dargelegten Ideen sind die Grundlagen der PEOE-Methode, die als ein iterativer Prozess durchgeführt wird. Diese Iteration sei im folgenden Schema unter Zuhilfenahme der Abbildung V.1-3erklärt:

C D' B B' A

B'' C'' C'

Abbildung V.1-3. Schematisches Molekül zur Verdeutlichung des iterativen Prozesses der PEOE-Methode.

140 Material und Methoden

Schritt 1: für jedes Atom A und Orbital i

2 χ A,i = ai + biqA + ciqA Formel V.1-4

Schritt 2: für jede Bindung A-B

〈n〉 + −1 n Δ′qAB = (χ A,i ) (χ A,i − χB,i )α Formel V.1-5

〈n〉 ΔqAB = ΔqAB + Δ′qAB Formel V.1-6

Schritt 3: für alle Bindungen zum Atom A

〈n〉 〈n〉 qA = ∑ΔqAB Formel V.1-7

〈n〉 qA = qA + qA Formel V.1-8

Diese Schritte werden wiederholt, bis die Anzahl der Iterationen n=10 ist. Der Dämpfungsfaktor α ist auf 0.5 gesetzt. Am Ende des Iterationsprozessen erhält man für jedes Atom A des Moleküls den Wert für die σ-Ladung qA,σ. π-Ladungsverteilung Ähnlich wie bei der Bestimmung der σ-Ladungsverteilung wird auch hier ein Konzept verwendet, dessen Grundlage die oben eingeführte Beziehung (siehe Formel V.1-2) von Mulliken ist (Mulliken 1934). Dieses Konzept wird analog als PEPE (Partial Equalization of π-electronegativity) bezeichnet (Marsili und Gasteiger 1980). Ausgehend von der Struktur werden die möglichen Resonanzstrukturen erstellt, die entsprechend der Ladungen in den Valenzbindungen und der formalen Ladung der Atome an den beiden Enden einer Resonanzstruktur topologisch gewichtet werden.

Dieser topologische Gewichtungsfaktor Wt setzt sich aus drei Teilen zusammen:

Wt = fQ fB f A Formel V.1-9

fQ - Faktor für die Ladungstrennung

fB – Faktor, falls die Anzahl von kovalenten Bindungen abnimmt

fA – Faktor, falls ein aromatisches System zerstört wurde Weiterhin erfolgt auch eine Gewichtung der Resonanzstrukturen entsprechend ihrer elektronischen Natur durch den Gewichtungsfaktor We.

We = Δχπ + feΔqN Formel V.1-10

MATERIAL UND METHODEN 141

Δχπ Differenz der π-Elektronegativitäten derjenigen Atome, bei denen eine Änderung der formalen Ladung erfolgt

feΔqN Term, der die Elektronen-Abstoßung der benachbarten Atome beschreibt Die π-Elektronegativitäten sind abhängig von Atom-Typ, Hybridisierung und σ- Ladung. Die Berechnung erfolgt analog Formel V.1.-3.

2 χπ ,i = aπ ,i + bπ ,iqσ + cπ ,iqσ Formel V.1-11

+ Die drei Koeffizienten aπ,i, bπ,i und cπ,i können wiederum mithilfe der Werte von χπ,i ,

0 - χπ,i und χπ,i bestimmt werden. Das Produkt der beiden Gewichtungsfaktoren wird zur Berechnung des Effektes der einzelnen Resonanzstrukturen am Ladungsausgleich herangezogen. Die berechnete Ladung wird entlang des π-Systems zu den Atomen der Resonanzstruktur bewegt, wobei die Elektronegativitäten der Atome angepasst werden. Der Prozess der Gewichtung der Strukturen und der Bewegung der Ladung wird in mehreren Cyclen wiederholt, wobei die bewegte Ladung immer weiter reduziert wird. Am Ende erhält man für jedes Atom, welches an einem π-System beteiligt ist, die

π-Ladung qπ und die π-Elektronegativität χπ. Effektive Polarisierbarkeit

Die mittlere Molekülpolarisierbarkeit (MMP) αmol kann berechnet werden aus der

Summe der entsprechenden Atomanteile αi . Diese Atominkremente sind u.a. vom Hybridisierungsgrad abhängig (Gasteiger und Hutchings 1984).

Atome αmol = ∑αi Formel V.1-12 1

Der Beitrag zur Stabilisierung einer Ladung infolge einer Polarisierung nimmt mit der Distanz zum Ladungszentrum rasch ab. Diese Abnahme kann durch einen einfachen Dämpfungsterm beschrieben werden, wobei die Anzahl an Bindungen nij zwischen dem Atom i und dem Ladungszentrum j als Wert für den Abstand der beiden Atome verwendet wird (Abbildung V.1-4).

Atome nij α d, j = ∑0.5 αi Formel V.1-13 1

142 Material und Methoden

Der Wert der effektiven Polarisierbarkeit αd ist somit ein Maß für die Stabilisierung einer Ladung, die sich aus einem Polarisierungseffekt ergibt.

H H 0.52•α i H C α H 0.5• i H C H C H N H H

Abbildung V.1-4. Graphische Darstellung des Vorganges zur Berechnung der effektiven Polarisierbarkeit des Stickstoffs in 2-Aminopropan.

V.1.5. Verwendete Oberflächenpotentiale

Ausgehend von den 3D-Strukturen wurden mit Hilfe des Programms SURFACE Moleküloberflächen berechnet, wobei den Oberflächenpunkten Potential-Werte zugeordnet wurden (Computer-Chemie-Centrum 2005). In dieser Arbeit fanden das Elektrostatische Potential und das Wasserstoffbrückenpotential Verwendung. Das Molekulare Elektrostatische Potential (MEP) Das MEP hat sich als eine der wichtigsten Eigenschaften bei der Interaktion von Molekülen herausgestellt. Zur Berechnung erhält der zu betrachtende Punkt j eine

Probeladung von +e. Die Berechnung von MEPj erfolgt nach dem Coulomb-Gesetz

(Formel V.1-14), wobei die Partialladungen qσ,i aller Atome i unter Berücksichtigung des Abstandes rij aufsummiert werden. Die Berechnung von qσ,i erfolgt nach dem PEOE-Verfahren (siehe oben).

1 q MEP = i Formel V.1-14 j ∑i 4πε0 rij

Das Wasserstoffbrückenpotential (HBP, hydrogen bonding potential) Zur Bestimmung des HBP wird ein Modell-Wasserstoffbrückendonor bzw. -akzeptor auf der Moleküloberfläche abgerollt und dabei die Bindungsenergie für die

MATERIAL UND METHODEN 143

Oberflächenpunkte berechnet. Die Bestimmung erfolgt unter Zuhilfenahme eines empirischen Kraftfeldes (Vedani und Dunit 1985; Vedani und Huhta 1990).

⎛ A C ⎞ HBP = ⎜ − ⎟cos2 (θ )cosn(ω ) Formel V.1-15 j ∑H −Bind ⎜ 12 10 ⎟ Don−H...Acc H...Acc−LP ⎝ rDon...Acc rDon...Acc ⎠

θDon−H...Acc ist der Winkel zwischen dem Wasserstoffbrückendonor, dem Wasserstoffatom und dem Wasserstoffbrückenakzeptor, der idealerweise 180 ° beträgt. ωH...Acc−LP beschreibt den Winkel zwischen dem Wasserstoffatom, dem Wasserstoffbrückenakzeptor und seinem freien Elektronenpaar LP (lone pair) mit einem Idealwert von 0 °. Der erste Term der Formel V.1-15 geht auf das Lennard-Jones-Potential zurück und ist grundsätzlich negativ. Die Koeffizienten A und C hängen von verschiedenen Faktoren ab, wie dem Donor- bzw. Akzeptor-Atomtyp. Die Potenzierung des dritten

Terms ist notwendig, um den positiven Effekt, die eine Annäherung von ωH...Acc−LP an 0 ° hat, zu verstärken. n ist hierbei ein empirischer Wert, der vom Akzeptoratom abhängt.

V.1.6. Berechnung der 3D-Strukturdeskriptoren

Um Atomeigenschaften oder Oberflächenpotentiale zur Molekülcharakterisierung in einem Künstlichen Neuronalen Netz zu verwenden, ist eine vektorielle Darstellung notwendig. Diese Darstellung muss unabhängig von der Molekülgröße (resp. der Atomanzahl) und der Lage des Moleküls im Raum sein. Mathematische Transformationen, die hierfür Verwendung fanden, waren die Radiale Verteilungsfunktion, eine lokale Radiale Verteilungsfunktion sowie die 3D Autokorrelation. Radiale Verteilungsfunktion (RDF, radial distribution function) Die Berechnung erfolgte mit dem Programm RCODE (Computer-Chemie-Centrum Universität Erlangen-Nuremberg 2005c). Diese Funktion wurde zur Transformation der verschiedenen Atomeigenschaften verwendet. Weiterhin fand es Verwendung bei der Betrachtung intramolekularer Abstände von funktionellen Gruppen. In diesem

144 Material und Methoden

Ergebnissteil erfolgt auch eine Beschreibung und Interpretation dieser Funktion (siehe Abschnitt II.1.3)

Lokale Radiale Verteilungsfunktion (L-RDF, local radial distribution function) Diese Transformation wurde unter Zuhilfenahme des Programms ARDF (Computer- Chemie-Centrum Universität Erlangen-Nuremberg 2005b) ebenfalls auf alle Atomeigenschaften angewandt. Ähnlich wie beim RDF-Code kann L-RDF als eine Wahrscheinlichkeitsverteilung von interatomaren Abständen interpretiert werden, wobei jedoch immer von ein- und demselben Zentralatom c ausgegangen wird.

N 2 −B(r −ric ) f (r) = pc ∑ pie Formel V.1-16 i=1;i≠c

Als Zentralatom c wurde das exocyclische Kohlenstoff-Atom des Lactonringes ausgewählt, da dieses eine zentrale Rolle bei der Alkylierung von p65/NF-κB mittels einer Michael-Addition spielt. Somit erfolgt durch die L-RDF-Codierung eine Beschreibung der Umgebung dieses reaktiven Zentrums. Der Vorteil dieser Transformation gegenüber einer RDF-Codierung liegt in der geringeren Komplexität des erhaltenen Diagramms. Dadurch ist die Gefahr geringer, dass für die Aktivität wichtige Atomabstände durch andere überlagert werden.

3D Autocorrelation (AC) Zur Transformation der Oberflächenpotentiale wurde die 3D Autocorrelation verwendet (Gasteiger und Engel 2003). Die Berechnung erfolgte genau wie die Generierung der Oberflächen durch das Programm SURFACE (Computer-Chemie- Centrum 2005).

N N A(du ,do ) = ∑∑δ (dij ,du ,do )pj pi i==11j

⎧1∀du < dij ≤ do δ (d ,d ,d ) = Formel V.1-17 ij u o ⎨ ∀ ≤ ∨ > ⎩0 dij du dij do

Zur Berechnung der AC wird das Produkt der Atomeigenschaften p für die

Oberflächenpunkte i und j, die eine Euklidische Distanz von dij besitzen, summiert.

MATERIAL UND METHODEN 145

Dabei werden nur Abstände zwischen einer unteren Grenze du und einer oberen

Grenze do berücksichtigt.

g(r), f(r), und A(du,do) wird üblicherweise für eine Anzahl diskreter Abstände r innerhalb definierter Intervalle berechnet. In dieser Arbeit erfolgte – wenn nicht anders angegeben - die Berechung von 128 Werten im Bereich von r=0 bis r=12.8 Å.

V.1.7. Reduktion der Deskriptorenanzahl und Normalisierung

Von jeder Atomeigenschaft wurden zwei Datensätze (ein RDF-codierter und ein L- RDF-codierter), von jedem Oberflächenpotential ein Datensatz (AC-codiert) erhalten. Von jedem Datensatz wurden diejenigen Deskriptoren ausgewählt, durch welche die einzelnen Klassen der NF-κB Hemmaktivitäten unterschieden werden konnten. Hierzu wurden die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Deskriptorenwerte für jede Aktivitätsklasse berechnet und mit Hilfe eines statistischen t-Tests verglichen. Die ausgewählten Deskriptoren wurden zu neuen Datensätzen zusammengefasst. Damit war eine Reduktion von 128 Deskriptoren zu 7 bis 12 Deskriptoren je Atomeigenschaft möglich. Alle Deskriptoren der reduzierten Datensätze wurden zwischen 0 und 1 normalisiert (Formel V.1-18), (Mazzatorta et al. 2003). min(x) beschreibt den kleinsten Wert, max(x) entsprechend den größten Wert innerhalb eines Datensatzes.

x − min(x) x′ = i Formel V.1-18 i max(x) − min(x)

V.1.8. Generierung von selbst-organisierenden Neuronalen Netzwerken

Zur Generierung der Kohonen Netzwerke (KNN, Kohonen Neural Network) und der Counterpropagation Netzwerke (CPGNN, Counterpropagation Neural Network) wurde das Programm SONNIA (Self-Organizing Neural Network for Information Analysis) verwendet. Eine Einführung zu Neuronalen Netzen findet sich im Kapitel II.1.4.

146 Material und Methoden

Beide Neuronalen Netzwerke (NN) bestehen aus einer n-dimensionalen Eingabeschicht, wobei n die Anzahl der Deskriptoren aus der reduzierten RDF-, L-RDF- oder AC-Codierung ist. Die zusätzlich bei den CPGNN auftretende Ausgabeschicht enthält die Information über die NF-κB Hemmaktivität, ausgedrückt als Aktivitätsklassen 1 bis 6. Hierbei wurden diese Aktivitätsklassen entweder als natürliche Zahl zwischen 1 und 6 oder aber binär (0=nicht zur Klasse gehörend; 1=zur Klasse gehörend) verschlüsselt, wobei bei letzterem für jede Aktivitätsklasse eine extra Schicht notwendig ist.

Kohonen Netzwerk Counterpropagation Netzwerk

mit 1-dimensionaler mit 6-dimensionaler x Ausgabeschicht Ausgabeschicht y

t z

EEingabeschicht

Abbildung V.1-5. Architektur der verwendeten Neuronalen Netzwerke und der entsprechenden Vektoren. Während Kohonen Netzwerke nur eine Eingabeschicht besitzen, haben CPGNN zusätzlich eine Ausgabeschicht, die Informationen über die Hemmaktivität enthält. Dabei kann diese Information entweder in einer Schicht als natürliche Zahl zwischen 1 und 6 dargestellt werden oder aber binär (0=nicht zur Klasse gehörend; 1=zur Klasse gehörend), wobei je Klasse eine extra Schicht notwendig ist.

Es wurden unterschiedliche Größen von Netzwerken getestet. Es zeigte sich, dass bei den verwendeten Datensätzen eine Größe von 6×15×n die besten Ergebnisse lieferte, wobei n die Dimension des Vektors, d.h. des reduzierten Datensatzes ist. Wenn nicht anders angegeben, wurde diese Netzdimension in den Versuchen verwendet. Die verwendete Netztopologie war toroidal. Um einen direkten Vergleich zu gewährleisten, wurden alle Trainingsparameter konstant gehalten (cycles: 5150, interval: 515, span x: 3.0, span y: 7.5, step x: 0.3, step y: 0.75, rate: 0.9 and rate factor: 0.87). Zur Bedeutung dieser Parameter siehe Kapitel II.1.4.

V.1.9. Suche nach gut clusternden Eigenschaften

KNN wurde mit jedem Datensatz trainiert. Anhand der sich ergebenden Ausgabekarte erfolgte eine Beurteilung der Clusterbildung durch die einzelnen

MATERIAL UND METHODEN 147

Datensätze. Zuerst erfolgte eine visuelle Beurteilung der Karten. Als nächstes erfolgte die Berechnung der Clusterung für die einzelnen Aktivitätsklassen: ein Neuron wurde als „korrekt“ geclustert definiert, wenn die benachbarten Neuronen überwiegend dieselbe Aktivitätsklasse besitzen. Wenn andere Aktivitäten in der Nachbarschaft dominieren, ist dieses Neuron isoliert und als „falsch“ geclustert anzusehen. Wenn weder dieselbe noch die anderen Aktivitäten überwiegen, war das entsprechende Neuron „unentschieden“ geclustert (Abbildung V.1-6).

Clusterung falsch unentschieden richtig Belegungsgrad 0.84 (76 von 90 Neuronen belegt) Konflikt O H O H O O OCH3 O O O O O O OH O OH O 19 20 (AK 2) (AK 4) Die unterschiedlich aktiven SLs 20 (AK 4) und 19 (AK 2) finden sich im selben Neuron

Abbildung V.1-6. Verdeutlichung der Beurteilungskriterien für die Clusterung anhand einer Ausgabekarte (6×15 Neuronen). Zur besseren Übersichtlichkeit sind die Aktivitätsklassen (AK) 1 und 2 rot, 3 und 4 orange sowie 5 und 6 gelb dargestellt.

Weitere Qualitätskriterien waren die Belegungsrate B sowie die Konfliktanzahl K. Die Belegungsrate gibt an, welcher Anteil der Neuronen mit einem Vektor besetzt ist. Viele leere Neuronen (erkenntlich durch eine geringe Belegungsrate) sind ein Zeichen für fehlende Daten und für eine schlechte Trennleistung. Konflikte treten auf, wenn Moleküle (d.h. Vektoren) mit unterschiedlicher Aktivitätsklasse innerhalb desselben Neurons zu liegen kommen (Abbildung V.1-6). Hierbei muss berücksichtigt werden, dass das Auftreten von zwei Molekülen benachbarter Aktivitätsklassen im selben Neuron nicht als Konflikt gewertet wird. Wenn man bedenkt, dass alle SLs mit 10 µM < IC100 ≤ 25 µM zur Aktivitätsklasse „3“ und SLs mit 5 µM < IC100 ≤ 10 µM zur Aktivitätsklasse „2“ gehören, wird deutlich, dass SLs mit benachbarter Aktivitätsklasse in ihrer Aktivität ähnlicher sein können als zwei SLs innerhalb derselben Aktivitätsklasse. Dies wurde auch berücksichtigt, wenn

148 Material und Methoden während der Validierung entschieden werden musste, ob ein SL korrekt oder falsch vorhergesagt wurde.

V.1.10. Validierung

Das beste durch Bewertung, Auswahl und Kombination verschiedener Deskriptoren erhaltene Modell wurde durch die Verwendung zweier unterschiedlicher Validierungsprozesse validiert. Für beide Prozesse wurden CPGNN mit 6- dimensionaler Ausgabeschicht verwendet. Für die interne Validierung wurde eine 10-fache Kreuzvalidierung (CV, cross- validation) verwendet: es erfolgte eine randomisierte Aufspaltung des Datensatzes in 10 Teilmengen. Unter Verwendung von 9 Teilmengen erfolgte die Generierung des CPGNN. Die verbleibende Teilmenge wurde als Test-Set verwendet und die Aktivität der darin befindlichen SLs bestimmt. Um zufällige Initialisierungseffekte auszuschließen, wurde dieser Vorgang 19mal durchgeführt. Der Prozess wurde daraufhin wiederholt, bis jede Teilmenge als Test-Set verwendet wurde. Danach erfolgte eine neue randomisierte Aufspaltung und eine Wiederholung des ganzen Prozesses. Insgesamt wurden 19 randomisierte Auftrennungen durchgeführt. Dies lieferte insgesamt 3610 (19×10×19) erstellte CPGNN für eine einzige 10fache CV. Bei einer zweiten Validierung wurde ein externer Datensatz herangezogen (N1 bis N14), der während der Bewertung und Auswahl der Deskriptoren nicht verwendet wurde. Hierbei erfolgte die Vorhersage der Aktivitätsklassen für die einzelnen SLs im externen Datensatz durch Verwendung von 19 CPGNN. Diese wurden unter zufälliger Initialisierung mit dem Datensatz der 103 SLs trainiert.

MATERIAL UND METHODEN 149

V.2. Charakterisierung der experimentell verwendeten Sesquiterpenlactone, Tinkturen und Zubereitungen

Bei den Studien zur Bindung an Blutbestandteile wurden 5 Sesquiterpenlactone (SL1 bis SL5) sowie 3 verschiedene Arnikatinkturen (T1 bis T3) eingesetzt. Während der Penetrationsuntersuchungen fanden 2 Sesquiterpenlactone (SL1 und SL3), 2 Arnikatinkturen (T1 und T2) und 7 Arnikazubereitungen (Z1 bis Z7) Verwendung (Abbildung V.2-1).

H H H

O O O

O O O O O O

O O O

11α,13-Dihydrohelenalinacetat 11α,13-Dihydrohelenalinmethacrylat Helenalinisobutyrat (SL1) (SL2) (SL3) O

HOOC H H N COO- H N H

S + O NH3

O O O O

O O

Parthenolid Parthenolid-11β-glutathionyl (SL4) (SL5)

Abbildung V.2-1. Strukturen der bei den Bindungsstudien und den Penetrationsuntersuchungen eingesetzten Sesquiterpenlactone.

Drei der insgesamt fünf verwendeten Sesquiterpenlactone stammen aus Arnica montana L.: 11α,13-Dihydrohelenalinacetat (SL1) und –methacrylat (SL2) sowie

Helenalinisobutyrat (SL3). Parthenolid (SL4) stammt aus Tanacetum parthenium (L.)

SCHULTZ. SL5 stellt ein Addukt von Parthenolid mit Glutathion dar. Die beiden 11α,13-Dihydrohelenalinderivate wurden im Arbeitskreis Merfort nach Vorgehensweisen isoliert, wie sie in der Literatur beschrieben sind (Willuhn und Leven 1991a). Helenalinisobutyrat wurde von S. Hildebrand (Firma Hermal, Hamburg, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die Identifizierung aller drei

150 Material und Methoden

Sesquiterpenlactone erfolgte durch NMR und MS Analysen, die Reinheit wurde durch GC- und DC-Analysen sichergestellt. 11β-Glutathionyl-parthenolid (SL5; Abbildung V.2-1) wurde von Dr. F. Kratz bereitgestellt und mit Hilfe von NMR-Analysen identifiziert (unveröffentliche Ergebnisse).

Arnikatinktur T1 (Registrierungsnummer 0006511) wurde von der Firma Kneipp (Würzburg, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die Herstellung erfolgte aus Blüten des spanischen Chemotyps, der durch die Dominanz von 11α,13- Dihydrohelenalinestern im Sesquiterpenlactonspektrum charakterisiert ist (Willuhn et al. 1994). Die Gesamt-SL-Konzentration wurde zu 1.150 mg/mL bestimmt. Eine genaue Zusammenstellung des Gehaltes befindet sich in Tabelle V-5.

Tabelle V-5. SLsGehalt der Arnikatinktur T1.

Derivat Gehalt [mM] [mg/ml] [% - m/V]

Dihydrohelenalin 0.047 0.016 0.002 Dihydrohelenalin-acetat 0.245 0.081 0.008 Dihydrohelenalin-isobutyrat 0.125 0.042 0.004 Dihydrohelenalin-methacrylat 1.717 0.571 0.057 Dihydrohelenalin-isovalerianat 0.730 0.243 0.024 Dihydrohelenalin-tiglinat 0.562 0.187 0.019 Helenalin-methacrylat 0.033 0.011 0.001

Gesamt-Sesquiterpenlactone 3.459 1.150 0.115

Arnikatinktur T2 wurde aus getrockneten Blüten von Arnica montana L. durch Perkolation hergestellt. Hierbei erfolgte die Herstellung entsprechend den Angaben des Europäischen Arzneibuches (DEV 1:10). Als Rückstellmuster Nr. 020 befindet sich eine Probe im Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie. Die verwendete Droge hatte eine mitteleuropäische Provenienz, was sich in der Zusammensetzung des Sesquiterpenlactonspektrums zeigt: es überwiegen Helenalinester (Willuhn et al. 1994); 11α,13-Dihydrohelenalinester kommen in geringeren Mengen vor. Die Gesamt-SL-Konzentration betrug 0.64 mg/mL (Tabelle V-6).

MATERIAL UND METHODEN 151

Tabelle V-6. SL-Gehalt der Arnika Tinktur T2.

Derivat Gehalt [mM] [mg/ml] [% - m/V]

Dihydrohelenalin-acetat 0.108 0.036 0.004 Dihydrohelenalin-isobutyrat 0.174 0.057 0.006 Dihydrohelenalin-methacrylat 0.130 0.043 0.004 Dihydrohelenalin-isovalerianat 0.099 0.033 0.003 Dihydrohelenalin-2-methylbutyrat 0.064 0.021 0.002 Dihydrohelenalin-tiglinat 0.095 0.032 0.003 Helenalin-acetat 0.146 0.048 0.005 Helenalin-isobutyrat 0.357 0.119 0.012 Helenalin-methacrylat 0.221 0.074 0.007 Helenalin-isovalerianat 0.356 0.118 0.012 Helenalin-2-methylbutyrat 0.080 0.027 0.003 Helenalin-tiglinat 0.102 0.034 0.003

Gesamt-Sesquiterpenlactone 1.933 0.642 0.064

Tabelle V-7. SL-Gehalt der Arnikatinktur T3.

Derivat Gehalt [mM] [mg/ml] [% - m/V]

Dihydrohelenalin-acetat 0.050 0.017 0.002 Dihydrohelenalin-isobutyrat 0.067 0.022 0.002 Dihydrohelenalin-methacrylat 0.065 0.022 0.002 Dihydrohelenalin-isovalerianat 0.021 0.007 0.001 Dihydrohelenalin-2-methylbutyrat 0.040 0.013 0.001 Dihydrohelenalin-tiglinat 0.043 0.014 0.001 Helenalin-acetat 0.067 0.022 0.002 Helenalin-isobutyrat 0.155 0.052 0.005 Helenalin-methacrylat 0.117 0.039 0.004 Helenalin-isovalerianat 0.155 0.051 0.005 Helenalin-2-methylbutyrat 0.050 0.017 0.002 Helenalin-tiglinat 0.038 0.013 0.001

Gesamt-Sesquiterpenlactone 0.867 0.288 0.029

Eine weitere Tinktur – Arnikatinktur T3 (Chargennummer 006169) – wurde von der Firma Bioforce (Roggwil, Schweiz) zur Verfügung gestellt. Die Zusammensetzung ähnelt sehr der von Arnikatinktur T2, jedoch lag hier der Extraktion ein DEV von 1:20 zugrunde und es wurden frische Arnikablüten verwendet. Die Gesamt-SL- Konzentration war demnach mit 0.288 mg/mL relativ niedrig (Tabelle V-7).

152 Material und Methoden

Die getesteten Arnikazubereitungen Z1 bis Z4 wurden uns von der Firma Bioforce (Roggwil, Schweiz) zur Verfügung gestellt. Zur Herstellung dieser Zubereitungen wurde eine Arnikatinktur von frischen Arnica montana L. Blüten vom Typ „Arbo“ verwendet. Bei Z1 handelt es sich um eine verdünnte Tinktur, bei den Lotiones Z2 und Z3 wurden unterschiedliche Mengen an mittelkettigen Triglyceriden verarbeitet. Bei Zubereitung Z4 wurde die Arnikatinktur in einem Gel verarbeitet. Z1 bis Z3 sind nicht kommerziell erhältlich, Z4 ist als „A. Vogel Rheuma Gel“ (Chargennummer 009 862) im Handel erhältlich. Informationen über die Zusammensetzung dieser Zubereitungen ist in Tabelle V-8 gegeben.

Tabelle V-8. Zusammensetzung der Arnikazubereitungen Z1 bis Z4. Angegeben sind die prozentualen Massenanteile (% m/m).

Z1 Z2 Z3 Z4 Arnikatinktur 50 50 50 50 Ethanol (94 % m/m) 26.6 - - 26.6 Wasser, demineralisiert 23.4 30 37.5 15.9 Methylhydroxypropylcellulose - - - 2.5 Glycerin (85 % m/m) - 5 5 5 Mittelkettige Triglyceride - 10 2.5 - Polyethylenglykol 40 - 5 5 - End-Ethanolgehalt 50 25 25 50

Tabelle V-9. SLs-Gehalt der Arnikazubereitung Z1. Dieselbe Zusammensetzung besitzen die Zubereitungen Z2 bis Z4.

Derivat Gehalt [mM] [mg/ml] [%]

Dihydrohelenalin-acetat 0.039 0.013 0.001 Dihydrohelenalin-isobutyrat 0.058 0.019 0.002 Dihydrohelenalin-methacrylat 0.052 0.017 0.002 Dihydrohelenalin-isovalerianat 0.022 0.007 0.001 Dihydrohelenalin-2-methylbutyrat 0.034 0.011 0.001 Dihydrohelenalin-tiglinat 0.031 0.010 0.001 Helenalin-acetat 0.033 0.011 0.001 Helenalin-isobutyrat 0.076 0.025 0.003 Helenalin-methacrylat 0.055 0.018 0.002 Helenalin-isovalerianat 0.077 0.026 0.003 Helenalin-tiglinat 0.022 0.007 0.001

Gesamt-Sesquiterpenlactone 0.499 0.165 0.017

Da für die Herstellung aller 4 Zubereitungen dieselbe Arnikatinktur in derselben Konzentration verwendet wurde, war die Bestimmung des SLs-Gehaltes in Zubereitung Z1 ausreichend. Es wurde ein Gesamt-Sesquiterpenlacton-Gehalt von

MATERIAL UND METHODEN 153

0.165 mg/mL ermittelt (Tabelle V-9). Mit einen Anteil von 53 % überwiegen die Helenalinderivate leicht gegenüber den 11α,13-Dihydrohelenalinderivaten.

Drei weitere Zubereitungen, die Arnika-Öl-Extrakt enthielten, wurden uns von der Firma Kneipp (Würzburg, Deutschland) zur Verfügung gestellt: Die Gel-Zubereitung „Arnika KühlGel®“ (Z5, Chargennummer 0119656), die Salbe „Arnica-Kneipp Venensalbe®“ (Z6, Chargennummer 0305895) sowie eine mit Sesquiterpenlactonen angereicherte Salbe (Z7, Chargennummer ASS37). Die Zusammensetzung der Zubereitungen Z5 und Z6 ist in Tabelle V-10 aufgeführt. Die Zusammensetzung von Z7 entspricht derjenigen von Z6, jedoch wurde eine entsprechende Menge eines

Arnika-CO2-Extraktes (13.56 % Gesamt-SL-Gehalt) zum Arnika-Öl-Extrakt hinzugegeben, so dass der Gehalt an SLs in Z7 ungefähr 10fach höher als in Z6 ist.

Tabelle V-10. Zusammensetzung der Arnikazubereitungen Z5 und Z6. Angegeben sind die prozentualen Massenanteile (% m/m).

Zubereitung Z6 Zubereitung Z5 Arnica-Kneipp Venensalbe® Arnika KühlGel® Wasser, demineralisiert 68.00 Wasser, demineralisiert 50.32 Arnika-Öl-Extrakt (DEV 1 :3.5-4.5) 10.00 Arnikatinktur 25.00 Glycerol 85 % Ethanol 96 % (V/V) 22.30 Stearinpalmitinsäure Polyacrylsäure (Carbopol 980 NF) Sojalecithin Tris amino ultra pure emulgierender Cetylstearylalkohol Parfümöl Tucan (Lanette N®) (Robertet, Paris, Frankreich) Cetylalkohol (Lanette 16) Campher Glycerolmonooleat (Monomuls 90-O 18) Benzylalkohol 1.00

Sowohl der Arnika-Öl-Extrakt als auch die Arnikatinktur, die zur Herstellung der Zubereitungen Z5 bis Z7 verwendet wurden, sind durch eine Dominanz an 11α,13- Dihydrohelenalinestern (>96 % des Gesamt-SL-Gehalt) gekennzeichnet und entstammen daher Blüten des Spanischen Arnica montana-Chemotyps (Tabelle V-11).

154 Material und Methoden

Tabelle V-11. SLs-Gehalt der Arnikazubereitungen Z5, Z6 und Z7 (n.d. = nicht detektierbar).

Derivat Gehalt Z5 Gehalt Z6 Gehalt Z7

[mM] [mM] [mM] [mg/g] [mg/g] [mg/g] [mg/g]

Dihydrohelenalin 0.004 0.001 n.d. n.d. Dihydrohelenalin-acetat 0.021 0.007 0.021 0.008 0.271 0.090 Dihydrohelenalin-isobutyrat 0.010 0.003 0.014 0.004 0.127 0.042 Dihydrohelenalin-methacrylat 0.121 0.040 0.172 0.057 1.706 0.566 Dihydrohelenalin-isovalerianat 0.053 0.018 0.081 0.027 0.782 0.260 Dihydrohelenalin-tiglinat 0.035 0.012 0.046 0.015 0.448 0.149 Helenalin-methacrylat 0.002 0.001 0.011 0.004 0.105 0.035 Helenalin-isovalerianat 0.001 0.000 n.d. n.d. Helenalin-tiglinat 0.001 0.000 0.001 0.000 0.021 0.007

Gesamt-Sesquiterpenlactone 0.247 0.082 0.350 0.116 3.461 1.149

V.3. Bestimmung des Sesquiterpenlacton-Gehaltes in den Tinkturen und Zubereitungen

V.3.1. Tinktur und Zubereitung Z1 (verdünnte Tinktur)

Die Aufarbeitung erfolgte entsprechend der von Willuhn et al. entwickelten Methode (Willuhn und Leven 1991a).

V.3.2. Gel (Z5)

0.20 mg Santonin (interner Standard) in ethanolischer Lösung wird zu 10.0 g Gel gegeben. Nach Entfernen des Ethanols unter Vakuum und Zugabe von 10 ml Wasser erfolgt die weitere Aufarbeitung nach Willuhn et al. (Willuhn und Leven 1991a).

V.3.3. Salben (Z6 und Z7)

5.0 g Salbe und 0.20 mg Santonin (interner Standard) wurden in 25 mL Aceton gelöst, 10 g Natriumsulfat, wasserfrei, hinzugegeben und 5 Minuten extrahiert. Nach einer Standzeit von 5 Minuten wurde die Lösung filtriert. Der Rückstand wurde noch vier weitere Male mit 15 mL Aceton extrahiert und filtriert. Die vereinigten Lösungen wurden auf ein Volumen von ca. 20 mL reduziert. Dann wurden wiederum 10 g Natriumsulfat hinzugegeben, für 5 Minuten gerührt und anschließend filtriert. Gefäß

MATERIAL UND METHODEN 155 und Filter wurden mit Aceton nachgespült. Die vereinigten Lösungen wurden abgedampft. Der klare, gelbe und ölige Rückstand wurde in 10 mL Petrolether (Siedepunktbereich 40-60 °C) aufgenommen und 4 mal gegen 15 mL Ethanol 65 %(V/V) ausgeschüttelt. Eine Ruhezeit von je 10 Minuten wurde nach jedem Ausschütteln eingehalten, um eine vollständige Phasentrennung zu gewährleisten. Die vereinigte und abgedampfte Ethanol-Lösung wurde in 4 mL Aceton aufgenommen und über eine mit 2 mL Aceton konditionierte Festphasensäule (Chromabond®) gegeben. Sie wurde mit 1 mL Aceton und 1 mL Ethylacetat eluiert. Das Eluat wird zur Trockene eingedampft und in 1 mL Aceton wiederaufgenommen.

Alle nach der obigen Vorschrift erhaltenen Lösungen wurde dann im GC-MS vermessen (siehe Kapitel V.6.1).

V.4. Studien zur Bindung an Blutbestandteile

V.4.1. Gewinnung von Blut und Plasma

Das Blut wurde von gesunden Freiwilligen (5 Männer, 2 Frauen) per Venenpunktion in der Armbeuge entnommen und in 10 mL Blutröhrchen gesammelt. Die Gerinnung wurde durch EDTA-Zugabe verhindert. Der Gehalt an humanem Serumalbumin (HSA) wurde auf 25 mg/mL (376 µM) geschätzt, ausgehend vom HSA-Gehalt im Plasma (s. unten) und einem Hämatokrit von ca. 43 %. Plasma wurde durch Zentrifugation des Blutes bei 1118 × g für 10 min gewonnen. Das Plasma aller Freiwilligen wurde gepoolt. Der Gehalt an humanem Serumalbumin (HSA) wurde zu 44,7 mg/mL (673 µM) bestimmt unter Verwendung eines Elektrophorese-Systems „Elphoscan-Mini“ wie bei (Thomas 1998) beschrieben.

V.4.2. Humanes Serumalbumin (HSA)

Verwendung fand „human albumin 200 ‚Dessau’“, welches HSA gelöst in einer Konzentration von 200 mg/mL enthält. Die Herstellung dieser Lösung erfolgte auf so schonende Weise, dass die natürliche Struktur des HSA – vor allem der Anteil an freien SH-Gruppen – bewahrt bleibt. Die Verdünnung zu den in den Versuchen

156 Material und Methoden verwendeten Konzentrationen erfolgte durch Zugabe von 0.01 M Phosphat-Puffer (pH 7.4).

V.4.3. Untersuchung des Bindungsverhaltens der Sesquiterpenlactone in HSA-Lösungen, Plasma und Blut mittels Proteinfällung

Verwendet wurden Blut, Plasma sowie zwei Konzentrationen von HSA-Lösungen: 40 mg/mL (602 µM) und 50 mg/mL (754 µM). Je 0.7 mL dieser Lösungen wurden mit 50 µL einer Sesquiterpenlacton-Lösung oder einer Tinktur für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Sesquiterpenlacton-Lösungen von SL1, SL2, SL3 und SL4 wurden in drei verschiedenen Konzentrationen verwendet: 7.5 mM, 3 mM und 1.5 mM. Auch die Tinkturen wurden durch Aufkonzentrierung oder Verdünnung auf einen Gesamtsesquiterpenlacton-Gehalt von 7.5 mM, 3 mM und 1.5 mM eingestellt. Als Lösungsmittel fand immer Ethanol-Wasser = 1:9 (V/V) Verwendung. Die Endkonzentration im Versuch betrug somit immer 500 µM, 200 µM und 100 µM. Nach einer einstündigen Inkubation erfolgte die Zugabe von 50 µL internen Standards (3 mM Santoninlösung in Ethanol-Wasser = 1:9 (V/V)). Dann wurde das Protein durch die tropfenweise Zugabe von 1.2 mL Aceton unter mehrmaligem Schütteln ausgefällt. Die einzelnen Proben wurden zur Abtrennung der Proteine zentrifugiert (15000 × g für 10 min). Der Überstand wurde mit Hilfe einer Vakuumzentrifuge getrocknet und bei –20 °C gelagert. Zur Vermessung im GC-FID erfolgte die Auflösung der Probe in 200 µL Aceton. Die Ergebnisse repräsentieren somit den nicht-proteingebundenen Anteil und werden in Prozent von der eingesetzten Sesquiterpenlacton-Menge angegeben.

V.4.4. Bindungsverhalten von 11β-Glutathionyl-parthenolid (SL5) mit humanem Serumalbumin

Verwendet wurden HSA-Lösungen in zwei Konzentrationen: 40 mg/mL (602 µM) und 50 mg/mL (754 µM). Je 0.7 mL dieser Lösungen wurden mit 50 µL einer 3 mM Lösung von SL5 in Ethanol-Wasser = 1:9 (V/V) für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Endkonzentration von SL5 im Versuch betrug somit 200 µM.

MATERIAL UND METHODEN 157

Die Vermessung der Proben erfolgte durch eine eigens entwickelte und validierte HPTLC-Methode (siehe Abschnitt II.4.2).

V.4.5. Bindungsverhalten von Parthenolid (SL4) mit humanem Serumalbumin mittels Ausschluss-HPLC-Analytik

Ziel war es zu untersuchen, inwieweit die Bindung von Parthenolid an HSA durch eine Reaktion mit Cystein 34 und anderen Aminosäuren erfolgt, und somit kovalente von nicht kovalenten Bindungen zu unterscheiden. Verwendet wurden HSA-Lösungen bei einer Konzentration von 40 mg/mL (602 µM). Je 0.7 mL dieser Lösungen wurden mit 50 µL einer 3 mM Lösung von SL4 in Ethanol-Wasser = 1:9 (V/V) bei 37 °C inkubiert. Die Endkonzentration von SL4 im Versuch betrug somit 200 µM. In einem zweiten Versuch wurde HSA-Lösung vor dem Versuch mit 2 µL N-Ethyl- maleinimid (NEM; 3 % (m/m) in Methanol) versetzt. NEM reagiert mit den freien Thiolgruppen des HSA (Schneider und Wenck 1969):

O O

S R R SH + N N

O O

Albumin N-Ethyl-Maleinimid (HSA) (NEM)

Abbildung V.4-1. Reaktion von N-Ethyl-Maleinimid mit Thiolgruppen wie z.Bsp. der SH Gruppe an Cystein 34 in HSA.

Anschließend wurde der Versuch wie oben durchgeführt. Es wurden Inkubationszeiten von 0 h, 1 h, 2 h, 3 h und 24 h untersucht. Die fertigen Proben wurden mittels einer HPLC-Methode zur Bestimmung des Parthenolids vermessen (siehe Abschnitt V.6.2).

158 Material und Methoden

V.4.6. Photometrische Bestimmung von freien Thiol-Gruppen

Die quantitative Bestimmung der freien Thiol-Gruppen basiert auf einer Reaktion von Thiolen mit 5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoat) (DTNB, Ellmanns-Reagenz) in 0.1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 8.0. Hierbei entsteht aus DTNB das gelbe Dianion 5-Thio-2-nitrobenzoesäure (TNB) (Ellman 1958), (Abbildung V.4-2). Bei pH 8.0 liegt über 99 % des gebildeten TNB ionisiert vor und das Absorptionsmaximum des Dianions bei 412 nm kann zur Konzentrationsbestimmung herangezogen werden. DTNB zeigt hingegen bei einer Wellenlänge von 412 nm keinerlei Absorption. Die Sesquiterpenlactone SL1, SL3 und SL4 wurden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Konzentration an freien Thiol Gruppen von HSA bei einer Endkonzentration von 200 µM untersucht. Hierzu wurden 0.7 mL einer HSA-Lösung (40 mg/mL) mit 50 µL der entprechenden SL-Lösung (3 mM; Ethanol-Wasser=1:9 (V/V)) bei 37 °C für 0, 1, 1½ und 20 Stunden inkubiert. Als Negativkontrolle diente eine Probe, die durch Zugabe von 50 µL einer Ethanol-Wasser-Mischung (1:9 (V/V)) zur entsprechenden HSA-Lösung hergestellt wurde.

NO 2 NO2 - OOC -OOC

pH 8.0 - RS + S S + S S S-

- COO COO- NO 2 NO2 Abbildung V.4-2. Reaktion von DTNB mit einem Thiol zu TNB und dem entsprechenden Disulfid.

200 µL der inkubierten Lösung wurden mit 20 µL von DTNB (0.01 M in Puffer) und 580 µL Puffer in einer Küvette versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 15 min wurde das gebildete TNB durch Messung der Absorption bei 412 nm bestimmt. Die Messung erfolgte über das Zweistrahl-Photometer U 2000 mit Hilfe einer Referenzküvette, die mit 780 µL Puffer und 20 µL DTNB-Lösung (0.01 M in Puffer) gefüllt war. Die Absorption A wurde mit Hilfe eines molaren

MATERIAL UND METHODEN 159

Absorptionskoeffizienten ε=13600 M-1cm-1 von TNB bei 412 nm und einer Schichtdicke von d=1cm in die entsprechende Konzentration c umgerechnet (Ellman 1958). A c[M ] = Formel V.4-1 ε[M −1cm−1 ]× d[cm] Da 1 mol TNB durch eine Reaktion von 1 mol DTNB mit 1 mol Thiol gebildet wird, kann die Konzentration an TNB cTNB in direkten Zusammenhang zur Konzentration an Thiol-Gruppen cThiol gesetzt werden:

cThiol [M ] = cTNB [M ] Formel V.4-2

Unter Beachtung, dass HSA nur eine freie Thiol-Gruppe besitzt – am Cystein 34 – kann die Konzentration an Thiol-Gruppen wiederum mit der Konzentration an

Albumin mit freier Thiol-Gruppe cHSA-SH gleichgesetzt werden:

cTNB [M ] = cHSA−SH [M ] Formel V.4-3

Es ist zu beachten, dass nur ca. 70% des HSA im Plasma eine freie SH-Gruppe am Cystein 34 besitzen, bei der verwendeten HSA-Lösung waren es sogar nur 35% (Kratz et al. 2000; Warnecke et al. 2004). Auch eigene Untersuchungen bestätigten diesen Wert (34.5 %; siehe Abschnitt II.2.8). Das restliche HSA ist durch L-Glutathion

(GSH) oder L-Cystein oxidiert.

V.5. Studien zur Hautpenetration

V.5.1. Untersuchungslösungen und –zubereitungen

Die Sesquiterpenlactone SL1 und SL3 wurden in Ethanol-Wasser (7:3 V/V) zu einer Endkonzentration von 2.5 mM gelöst. Um die Ergebnisse der Tinkturen mit denen der isolierten SLs vergleichen zu können, wurden die Tinkturen T1 und T2 auf 2.5 mM Gesamt-SL-Gehalt eingestellt. Alle Zubereitungen (Z1 bis Z7) wurden unverändert eingesetzt. Der jeweilige Gehalt ist bei der Diskussion der Ergebnisse zu berücksichtigen.

160 Material und Methoden

V.5.2. Monoterpen aus Arnikatinktur

Das in Arnikatinkturen vorkommende 10-Acetoxy-8,9-epoxythymolisobutyrat (Abbildung V.5-1) wurde aus einem Frischpflanzenextrakt von Arnica montana L.- Blüten von Dr. Olha Kos isoliert (Kos 2005).

Abbildung V.5-1. Struktur des aus Arnica montana L. - Frischpflanzenextrakt isolierten Thymolabkömmlings 11-Acetoxy-8,9-epoxythymolisobutyrat.

Die Identifizierung erfolgte durch NMR- und MS-Analysen, die Reinheit wurde durch GC- und DC-Analysen sichergestellt.

V.5.3. Haut-Penetrations-Studien

Die Methode, die bei den Penetrationsversuchen Verwendung fand, basierte auf Arbeiten von Wohlrab (Lasch und Wohlrab 1986; Wohlrab 1984; Wohlrab und Hassler 1981) und Schaefer (Schaefer et al. 1978). Diese wurde von verschiedenen Doktoranden am Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg angewendet und verbessert (Fröhlich 2000; Joos 1994; Peschka 1994; Reineck 1998). Für die Penetrationsversuche fanden ungebrühte Schweineohren von frisch geschlachteten Schweinen Verwendung. Die Ohren wurden vom Schlachthof bezogen und innerhalb von 7 Stunden verwendet. Die Innenseiten der Ohren wurden mittels eines Elektrorasierers „Phillishave HS 955“ von Haaren befreit und mit Hilfe von Fäden Hautareale zu 50 mm × 20 mm (10 cm²) abgegrenzt (Abbildung V.5-2b). Je Ohr konnten bis zu 3 Felder verwendet werden. Dann wurde eine Hauttemperatur von 32 °C mit Hilfe eines Umlaufthermostaten eingestellt (Abbildung V.5-2a). 200 µL der zu untersuchenden Probe wurden auf das Hautareal aufgetragen und inkubiert.

MATERIAL UND METHODEN 161

Nach der Inkubationszeit wurde mit dem Strippen begonnen. Hierzu wurden die vorbereiteten und tarierten Klebestreifen „Tesa Office-Film transparent“ von 20 mm × 50 mm auf den entsprechenden Hautarealen aufgebracht und mit Hilfe einer ca. 600 g schweren Rolle angedrückt (Abbildung V.5-2c). Die Rolle wurde hierbei, ohne dass zusätzlicher Druck ausgeübt wurde, 10mal über den Klebestreifen hin- und hergerollt. Danach wurde der Klebestreifen durch kurzes, kräftiges Ziehen entfernt (Abbildung V.5-2d). Nach dem 16. bis 20. Stripp war die Hornschicht komplett entfernt. Dies war am Auftreten nass-glänzender Bereiche der nächsttieferen Hautschicht (Basalschicht) zu erkennen. Um sicherzugehen, dass die Hornhaut vollständig abgetragen war, wurde 23 mal gestrippt.

Abbildung V.5-2. Aufbau und Durchführung der Penetrationsversuche. a – Geräteaufbau zur Temperierung des Schweineohres. b – abgestecktes Hautareal. c – Andrücken der Tesastreifen mittels einer Rolle. d – Abziehen der Tesastreifen.

Schließlich wurde das Gewicht der Klebestreifen nach dem Strippen bestimmt und durch Subtraktion der Tara die Masse der Hautschicht bestimmt. Dies war

162 Material und Methoden notwendig, da die Anzahl der Stripps nicht notwendigerweise mit der Masse an abgestrippter Hornhaut und somit der Tiefe der Hornhaut korreliert (Berrutti et al. 2000; Marttin et al. 1996). Auch können so interindividuelle Unterschiede besser ausgeglichen werden. Aus der Masse an Haut mHaut, der Fläche des gestrippten

2 3 Bereiches AStripp (1000 mm ) und einer angenommenen Dichte von ρHaut=1 mg/mm (Anderson und Cassidy 1973; Kalia et al. 2001) konnte die Tiefe der Hautschicht d berechnet werden:

mHaut [mg] d[μm] = 2 −3 ×1000 Formel V.5-1 AStripp [mm ]ρHaut [mg×mm ]

Die Sesquiterpenlactone wurden mit Hilfe von Aceton vom Klebestreifen extrahiert und Santonin als interner Standard zugefügt (200 µL einer 50 µM Santonin-Lösung). Bei den Untersuchungen der Zubereitungen Z5 bis Z7 erfolgte ab dem dritten Tesafilmstreifen eine Vereinigung von je drei Tesafilmextrakten: 3 bis 5, 6 bis 8, 9 bis 11, 12 bis 14, 15 bis 17, 18 bis 20 und 21 bis 23. Die erhaltene Lösung wurde in der Vakuumzentrifuge bei 40 °C zur Trockene evakuiert und dann wieder in 200 µL Methanol aufgenommen und bei 15,000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Aufreinigung über eine Sephadex-Säule gegeben. Das Eluat wurde wiederum in der Vakuumzentrifuge eingedampft und in 80 µL einer 50 %igen wässrigen Ethanol- Mischung aufgenommen. Die somit erhaltene Lösung wurde vermessen: bei den Einzelsubstanzen und den Tinkturen erfolgte die Messung am GC-FID (Willuhn und Leven 1991b), bei allen Zubereitungen wegen der höheren Empfindlichkeit am GC- MS (siehe Abschnitt V.6.1).

V.5.4. Datenanalyse

Mit jedem Stripp wurde eine bestimmte Dicke an Hornhaut abgestrippt und somit eine bestimmte Hornhauttiefe erreicht. Stripp und Hornhauttiefe wurden folgendermaßen zugeordnet: Die Hornhauttiefe, die mit dem entsprechenden Stripp mindestens erreicht wurde, ergibt sich aus der Summe der darüberliegenden abgestrippten Hornhautdicken. Somit entspricht Stripp 1 immer einer Hornhauttiefe von 0 µm, Stripp 4 einer Hornhauttiefe, die der Summe der Hornhautdicken von Stripp1 bis 3 entspricht.

MATERIAL UND METHODEN 163

Die im gesamten Versuch in der Haut gefundene Masse an SL mges ergibt sich aus der

Summe der Massen in jedem einzelnen Stripp mstripp.

23 mges = ∑mStripp Formel V.5-2 Stripp=1

Die bis zu einer bestimmten Tiefe d (die ja einen bestimmten Stripp n zugeordnet ist) gefundene Masse an SL md berechnet sich aus der Summe der Massen bis zum Stripp n-1.

n−1 md = ∑mStripp Formel V.5-3 Stripp=1

Von Interesse ist aber die Masse mpen;d, die mindestens eine bestimmte Hornhauttiefe penetriert hat.

mpen;d = mges − md Formel V.5-4

Hieraus lässt sich dann unter Verwendung der eingesetzten Masse an SL meingesetzt der prozentuale Anteil an der SL-Masse Apen;d [%], der eine entsprechende Hornhauttiefe d (den entsprechenden Stripp n) mindestens erreicht hat, berechnen.

mpen;d Apen;d = 100% Formel V.5-5 meingesetzt

Zur Auswertung fanden bei den Lösungen von isolierten SLs die Flächen im GC-Chromatogramm Verwendung, bei den Arnikatinkturen und Arnikazubereitungen wurde nur die Fläche des dominierenden Sesquiterpenlactons berücksichtigt: bei Tinkturen und Zubereitungen, die aus Blüten des spanischen Chemotyp hergestellt wurde, wurde das dominierende 11α,13- Dihydrohelenalinmethacrylat, bei denen aus den Blüten vom Typ „Arbo“ das dominierende Helenalinisobutyrat. Es wird davon ausgegangen, dass die geringerkonzentrierten SLs ein identisches Penetrationsverhalten zeigen. Der penetrierte prozentuale Anteil am Gesamtsesquiterpenlacton Apen-ges;d wird gleich dem gemessenen prozentualen Anteil am dominierenden SL Apen-SL;d gesetzt.

Apen−ges;d = Apen−SL;d Formel V.5-6

164 Material und Methoden

Daher wird im Ergebnisteil immer von der prozentualen Penetration der

Gesamtsesquiterpenlactone Apen-ges;d gesprochen. Dass die obige Annahme gerechtfertigt ist, konnte im Abschnitt II.3.6 gezeigt werden.

Der Wert für Apen-ges;0 (Penetration der Gesamtsesquiterpenlactone Apen-ges;d bei einer Hornhauttiefe von d=0 µm) wird als Wiederfindungsrate definiert: Es handelt sich um die Gesamtmenge an wiedergefundenem SL bezogen auf die eingesetzte Menge an SL.

V.6. Chromatographische Methoden

V.6.1. GC-MS Methode zur Bestimmung von Sesquiterpenlactonen

Diese Methode wurde bei allen Gehaltsbestimmungen in den Tinkturen als auch zur Vermessung der Penetrationsproben bei den Zubereitungen verwendet.

GC-MS System und Parameter Die GC-Analyse wurde an einem HP6890 series GC-System durchgeführt, das mit einem Agilent 5973 Network Mass Selective Detector gekoppelt war. Als Trägergas fand Helium 5.0 Verwendung. Als Säule kam eine Kapillarsäule (25 m × 0.25 mm Innerer Durchmesser), die mit 0.25 µm Dimethylsiloxan beschichtet war, zum Einsatz (Optima 1). Die Flussrate betrug 1.0 mL/min. Das verwendete Temperaturprogramm startete bei 120 °C und heizte mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/min auf eine Endtemperatur von 270 °C auf. Diese wurde für 20 min konstant gehalten. Injektor- und Detektortemperatur wurden auf 290 °C eingestellt. Injektionsvolumina von 1 µL wurden ungesplittet verwendet. Der Massen-Detektor wurde bei einer Ionisierungsenergie von 70 eV verwendet. Zur Identifizierung der Sesquiterpenlactone wurde ein EI-Massenspektrum zwischen 40 und 400 amu aufgenommen. Für die Quantifizierung erfolgte die Aufnahme bei 246 amu (Santonin und 11α,13-Dihydrohelenalinderivate) und bei 244 amu (Helenalinderivate).

MATERIAL UND METHODEN 165

Die Validierung der Methode ist im Abschnitt II.4.1 beschrieben.

V.6.2. HPLC-Methode zur Bestimmung von Parthenolid (SL4) in HSA- Matrix

Ein HPLC- System bestehend aus HPLC Pump 422 und HPLC 535 Detektor (beides Biotek Kontron) wurde verwendet. Die Steuerung erfolgte über die Software Kroma System 2000. Die Chromatographie wurde an einer BioSil SEC 250 Säule (300×7.8 mm) mit einer BioSil 250guard Vorsäule (80×7.8 mm) durchgeführt. Injektionsvolumina von 50 µL wurden verwendet. Als mobile Phase wurde BioSil- Phase verwendet und isokratisch mit einer Flussgeschwindigkeit von 1 mL/min eluiert. Detektiert wurde bei 220 nm. Die Validierung der Methode erfolgte durch den Arbeitskreis von Dr. Felix Kratz, Tumorbiologie-Zentrum, Freiburg.

V.6.3. HPTLC-System

Die HPTLC – Analytik wurde mit Hilfe eines Systems der Firma CAMAG, bestehend aus dem Autosampler ATS4, dem Densitometer TLC Scanner 3, dem Dokumentationsgerät Reprostar 3 sowie dem Tauchgerät Chromatogram immersion device III durchgeführt. Die Auftragung der Proben erfolgte bandförmig (6 mm) durch den Autosampler ATS4 mit den in Tabelle V.6-1 angegebenen Parametern auf eine HPTLC-Folie 20×10 cm bzw. 10×10 cm. Die Parameter des TLC-Scanner 3 zur densitometrischen Vermessung sind in Tabelle V.6-2 aufgeführt.

Tabelle V.6-1. Tabelle V.6-2. verwendete Parameter des TLC- ATS4-Auftragungsparameter für ATS4 Scanner 3

Sprühgas N2 Scangeschwindigkeit 20 mm/s Befüllungsgeschwindigkeit 8 µL/s Datenauflösung 100 µm/Schritt Vorsprühvolumen 200 nL Lampe Deuterium Restvolumen 200nL Spaltgröße 6.00×0.45 mm; Mikro Dosierungsgeschwindigkeit 50 nL/s Mess-Modus Absorption Spülzyklen / Vakuumzeit 1 / 4.0 s Füllzyklen / Vakuumzeit 1 / 0.0 s Sprühgastemperatur unbeheizt

166

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188

ANHANG 189

VII. ANHANG

VII.1. Chemikalien

Chemikalien Hersteller α-Hederin Roth, Karlsruhe, Deutschland 10-Acetoxy-8,9- Arbeitskreis Merfort, Pharmazeutische epoxythymolisobutyrat Biologie, Universität Freiburg Arbeitskreis Merfort, Pharmazeutische 11α,13-Dihydrohelenalinacetat Biologie, Universität Freiburg Arbeitskreis Merfort, Pharmazeutische 11α,13-Dihydrohelenalinacetat Biologie, Universität Freiburg Arbeitskreis Kratz Tumorbiologie, 11β-Glutahionyl-parthenolid Universität Freiburg 5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoat) Roth, Karlsruhe, Deutschland (DTNB) Aceton Merck, Darmstadt, Deutschland Ameisensäure Roth, Karlsruhe, Deutschland Biotek Kontron, Montigny le. Bretonneau, BioSil-Phase Frankreich Capsaicin Roth, Karlsruhe, Deutschland Essigsäure Roth, Karlsruhe, Deutschland Ethanol Merck, Darmstadt, Deutschland Ethylacetat Merck, Darmstadt, Deutschland Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Roth, Karlsruhe, Deutschland Glutathione Sigma Chemicals, St. Louis, USA Hederacosid C Roth, Karlsruhe, Deutschland Arbeitskreis Merfort, Pharmazeutische Helenalinisobutyrat Biologie, Universität Freiburg Helium 5.0 Messer-Griesheim, Karlsruhe, Deutschland human albumin 200 „Dessau“ Pharma Dessau, Dessau, Deutschland Methanol Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumsulfat Merck, Darmstadt, Deutschland N-Etylmaleinimid Sigma Chemicals, St. Louis, USA p-Anisaldehyde Roth, Karlsruhe, Deutschland Parthenolid Sigma Chemicals, St. Louis, USA Petrolether Roth, Karlsruhe, Deutschland Santonin Sigma Chemicals, St. Louis, USA Schwefelsäure Roth, Karlsruhe, Deutschland Stickstoff 5.0 Messer-Griesheim, Karlsruhe, Deutschland Wasserstoff 5.0 Messer-Griesheim, Karlsruhe, Deutschland

190 ANHANG

VII.2. Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterial Hersteller BioSil 250guard (80×7.8 mm) BIO-RAD, Hercules, USA BioSil SEC 250 (300×7.8 mm) BIO-RAD, Hercules, USA ® Chromabond NH2 6 mL/500 mg Machery-Nagel, Düren, Deutschland HPTLC-Folie 20×10 cm Merck, Darmstadt, Deutschland Optima 1 Machery-Nagel, Düren, Deutschland Plastibrand®-Einmalküvetten Roth, Karlsruhe, Deutschland Reaktionsgefäße 1.5 und 2.0 mL Roth, Karlsruhe, Deutschland Tesa Office-Film transparent, Art-Nr. Beiersdorf, Hamburg, Deutschland 4204

VII.3. Geräte

Gerät Hersteller Analysenwaage AB184-A3 Mettler Toledo, Nänikon, Schweiz Analysenwaage OHAUS Analytical Mettler Toledo, Nänikon, Schweiz plus Analysenwaage Sartorius Sartorius AG, Göttingen, Deutschland Auftragegerät Autosampler ATS4 Camag, Muttenz, Schweiz Densitometer TLC Scanner 3 Camag, Muttenz, Schweiz Dokumentationsgerät Reprostar 3 Camag, Muttenz, Schweiz Hirschmann & Beilner, Ottobrunn, Elphoscan-Mini Deutschland Gaschromatograph HP6890 GC Hewlett Packard, Wilmington, USA system Heizbad HB4 Basic IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland Kontrollmodul für Vacuubrand, Wertheim, Deutschland Rotationsverdampfer CVC 2 Magnetrührer RCT basic IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland Massendetektor Agilent 5973 Hewlett Packard, Wilmington, USA Network Mass Selective Detector Membranvakuumpumpe MZ 2C Vacuubrand, Wertheim, Deutschland Biotek Kontron, Montigny le. Bretonneau, Pumpe HPLC Pump 422 Frankreich Rasierer Phillishave HS 955 Phillips, Hamburg, Deutschland Rotationsverdampfer RV 05-ST Vacuubrand, Wertheim, Deutschland Tauchgerät Chromatogram Camag, Muttenz, Schweiz immersion device III Trockenschrank T6060 Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland

ANHANG 191

Gerät Hersteller Umlaufthermostat EC Julabo, Seebach, Deutschland Biotek Kontron, Montigny le. Bretonneau, UV-Detektor HPLC 535 Detector Frankreich Vakuumzentrifuge vacuum Sauer, Reutlingen, Deutschland concentrator BH VC 300H Zentrifuge Heraeus Biofuge fresco Kendro, Osterode, Deutschland Zentrifuge Rotina 35 R Hettich, Tuttlingen, Deutschland Zweistrahlphotometer U2000 Hitachi, Japan

VII.4. Software

Software Hersteller Computer Chemie Centrum, Universität ARDF Erlangen CAChe Fujitsu, Sunnyvale, USA CORINA Molecular Networks GmbH, Nürnberg GAMMA Molecular Networks GmbH, Nürnberg Biotek Kontron, Montigny le. Bretonneau, Kroma System 2000 Frankreich PETRA Molecular Networks GmbH, Nürnberg RCODE Molecular Networks GmbH, Nürnberg SONNIA Molecular Networks GmbH, Nürnberg SURFACE Molecular Networks GmbH, Nürnberg

VII.5. Standardmischungen

VII.5.1. Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz

Folgende Lösungsmittel vorsichtig miteinander vermischen: Methanol 85.0 mL Essigsäure 10.0 mL Schwefelsäure 5.0 mL Nach dem Abkühlen der Lösung 0.5 mL Anisaldehyd hinzugeben. Die Lösung ist solange verwendbar, wie keine Rosafärbung auftritt.

192 ANHANG

VII.5.2. Vanillin-Schwefelsäure-Reagenz

Folgende Lösungsmittel vorsichtig miteinander vermischen: Methanol 85.0 mL Essigsäure 10.0 mL Schwefelsäure 5.0 mL Nach dem Abkühlen der Lösung 1.3 g Vanillin hinzugeben. Die Lösung ist solange verwendbar, wie keine Rosafärbung auftritt.

VII.5.3. Vanillin-Phosphorsäure-Reagenz

2 g Vanillin werden in 50 mL Ethanol gelöst und dann mit 50 mL Wasser und 70 mL o- Phosphorsäure versetzt.

VII.5.4. Thymol-Schwefelsäure-Reagenz

0.75 g Thymol werden in 142.5 mL Ethanol gelöst und 7.5 mL Schwefelsäure (conc.) hinzugegeben.

VII.5.5. Schwefelsäure-Reagenz

Zu 85 mL Wasser werden vorsichtig 15 mL Schwefelsäure (conc.) zugegeben und anschließend 7.5 mL Methanol hinzugefügt.

VII.6. Abkürzungen

In die Liste nicht aufgeführt sind Abkürzungen der SI-Einheiten (http://www.bipm.org/en/si) sowie Abkürzungen der chemischen Elemente nach IUPAC (http://www.iupac.com).

Abkürzung Beschreibung χ Elektronegativität -12 -1 2 -1 ε0 elektrische Feldkonstante: 8.854·10 J C m AC Autocorrelation amu Atommasseneinheit (atom mass unit; 1.66053886 × 10-27 kg) ANN Künstliches Neuronales Netz (artificail neural network) bzw. beziehungsweise ca. circa

ANHANG 193

Abkürzung Beschreibung CPGNN Counterpropagation Neuronales Netz CV Kreuzvalidierung (cross validation) Cys Cystein DC Dünnschicht-Chromatographie DEV Drogen-Extrakt-Verhältnis DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) DTNB 5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoat) e Einheitsladung/Elementarladung: 1.602·10-19 C E Elektronenaffinität EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. und andere (et alii) FID Flammenionisationsdetektor g Erdbeschleunigung; g=9.81 m/s² GC Gas-Chromatographie GSH Glutathion h Stunde HBP Wasserstoffbindungspotential (hydrogen binding potential) Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (High Pressure Liquid HPLC Chromatography) Hochleistungs-Dünnschicht-Chromatographie (High Performance HPTLC Thin Layer Chromatographic) HAS humanes Serumalbumin I Ionisationspotential Minimale Konzentration für eine maximale Hemmung (inhibitory IC100 concentration for 100% inhibition) kDA 1Kilodalton=10³ Dalton (1Da=1 u=1 amu=1.66053886 × 10-27 kg) KNN Kohonens Neuronales Netz L Liter LOD Detektionsgrenze (limit of detection) LOQ Bestimmungsgrenze (limit of quantification) lokale radiale Verteilungsfunktion (local radial distribution L-RDF function) M Mol MEP molekulares elektrostatisches Potential MS Massenspektroskopie; Massenspektrometer n.d. nicht detektierbar NEM N-Ethylmaleinimid NF-κB Nuclear Factor κ B NMR Kernspinresonanz (Nuclear Magnetic Resonance) NN Neuronales Netz q Ladung Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung (quantitative structure- QSAR activity relationship RDF radiale Verteilungsfunktion (radial distribution function)

194 ANHANG

Abkürzung Beschreibung

Rf Retentionsfaktor RP Umkehrphase (reversed phase) RSD Relative Standardabweichung (relative standard deviation) SC Hornhaut (stratum corneum) SL Sesquiterpenlacton SOM Selbstorganisierende Karten (self-organizing map) TLC Dünnschicht-Chromatographie (thin layer chromatography) TNB 5-Thio-nitrobenzoat TNF-α Tumornekrosefaktor alpha u.a. unter anderem usw. und so weiter UV ultraviolett z.B. zum Beispiel

DANKSAGUNG 195

DANKSAGUNG

Die vorliegende Arbeit wurde auf Anregung und unter Leitung von Frau Pof. Dr. I. Merfort am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie angefertigt. Meiner Doktormutter danke ich herzlich für ihre ausgezeichnete wissenschaftliche Betreuung meiner Arbeit, ihre stete Diskussionsbereitschaft, ihre wertvollen Ratschläge sowie ihre großzügige Förderung und Unterstützung zu jeder Zeit. Herrn Prof. Dr. R. Schubert (Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie) danke ich herzlich für die Übernahme des Koreferates sowie für die Einführung in die Penetrationsuntersuchungen und die Bereitstellung der für die Stripping-Untersuchungen notwendigen Gerätschaften. Herrn Dr. F. Kratz (Klinik für Tumorbiologie, Freiburg) möchte ich für die Bereitstellung der HSA-Lösung sowie für die Möglichkeit, in seinem Labor HPLC- und UV-Messungen zur HSA-Bindung von SLs durchführen zu können, danken. S. Hildebrandt sei für die Hilfe im Labor gedankt. Herrn Prof. Dr. J. Gasteiger (Computer Chemie Centrum, Universität Erlangen) möchte ich für zahlreiche Anregungen und Diskussionen, für das Bereitstellen der Programme im Bereich der Computerchemie (CACTUS, PETRA, CORINA, SONNIA, RCODE, SURFACE, ARDF, GAMMA) sowie für die Möglichkeit, in seinem Arbeitskreis die verschiedenen Programme kennenzulernen, danken. Vor allem Angelika Hofmann, Simon Spycher, Eric Pellegrini und Lothar Terfloth aus seinem Arbeitskreis sei für die nette Aufnahme und Arbeitsatmosphäre, die gute Betreuung und die zahlreichen, wertvollen Ideen gedankt. Bei Herrn Dr. Eike Reich von der Firma Camag (Muttenz, Schweiz) möchte ich mich ganz herzlich für die Möglichkeit bedanken, an einem Einführungskurs zur HPTLC- Analytik teilnehmen zu können. Auch für seine vielfältigen und wertvolle Tipps im Bereich der Dünnschichtchromatographie sei an dieser Stelle gedankt. Danke an Herrn Dr. Herschig und dem Schlachthof, Freiburg, für das Bereitstellen der Schweineohren.

196 DANKSAGUNG

Vielen Dank an die Bioforce AG (Roggwil, Schweiz) für die finanzielle Unterstützung und die Bereitstellung von Arnika-Tinkturen und Zubereitungen. Der Kneipp GmbH (Würzburg) sei an dieser Stelle für die finanzielle Unterstützung und die Bereitstellung von Arnika-Zubereitungen gedankt. Herrn Andreas Prestel danke ich für die engagierte und selbstständige Durchführung einiger Penetrationsversuche. Für die Blutstpende sei Olha Kos, Bettina und Gabriel Siedle, Anke Frerich, Prof. Dr. Irmgard Merfort und Constance gedankt. Herrn Dr. F. Merfort danke ich fürs sonntägliche Blutabnehmen. Mein Dank gilt allen jetzigen und ehemaligen Kolleginnen und Kollegen des Lehrstuhls für Pharmazeutische Biologie, die mich bei der Entstehung dieser Arbeit unterstützt haben. Vielen Dank an die AG Merfort: Alfonso Garcia Piñeres, Maja Lindenmeyer, Stefan Müller, Bettina Siedle, Barbara Schuler, Olha Kos, Claudia Kern, Karin Schorr, Anita Rott, Claudia Prahst, Andrea Hrenn, Cordula Markmann, Christoph Jäger, Christian Lass, Titus Sparna, Agnes Millet, Raul Arce Cordoba, Jose Miguel Escandell, Renato Murillo, Matilda Wallenberg sowie Maria Behrens für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die schöne gemeinsame Zeit. Auch allen anderen Kollegen des Lehrstuhls sei herzlich gedankt besonders Alfred Schandelmeier, Ursula von Mulert und Raija Boll. Andrea Hrenn und Bettina Siedle bin ich für die kritische Durchsicht des Manuskripts besonders dankbar. Schließlich möchte ich all meinen Freunden und meiner ganzen Familie danken, die durch ihre Unterstützung diese Arbeit erst ermöglicht haben. Mein größter Dank gilt Constance für ihre liebevolle Unterstützung und ihr großes Verständnis in all den Jahren.

LEBENSLAUF 197

Steffen Wagner Eichbergstrasse 22a 79117 Freiburg

LEBENSLAUF

Eltern Günter Wagner; Facharbeiter in der metallverarbeitenden Industrie Erika Gerda Wagner, geb. Spiekerkötter; Drogistin beide wohnhaft in Schweina / Thüringen

Geboren am 29. Oktober 1975 in Bad Salzungen / Thüringen.

Verheiratet mit Constance Huyke, Ärztin.

Ausbildung

1982 bis 1990 Besuch der Polytechnischen Oberschule „Friedrich Fröbel“, Schweina 1990 bis 1994 Besuch des Stattlichen Gymnasiums Bad Liebenstein 1994 Ablegen des Abiturs – Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife

1994 bis 1996 Zivildienstes im Landratsamt Wartburgkreis, Abteilung Umweltamt Freiwilliges Ökologisches Jahres (FÖJ) im Naturschutzzentrum „Alte Wart 1996 Gumpelstadt

1996 bis 2000 Pharmaziestudium an der Julius-Maximilians-Universität Würzburg August 1998 Ablegen des ersten Staatsexamens August 2000 Ablegen des zweiten Staatsexamens

November 2000 bis Pharmaziepraktikum am Zentralinstitut Arzneimittelforschung, Sinzig April 2001 Mai 2001 bis Pharmaziepraktikum in der Eulen-Apotheke, Würzburg Oktober 2001

November 2001 Ablegen des dritten Staatsexamens

Beginn der Promotion bei Prof. Dr. I. Merfort, Lehrstuhl für Pharmazeutisc März 2002 Biologie, Universität Freiburg