Plagiat Merupakan Tindakan Tidak Terpuji

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE DPPH

DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL

ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh :

Aldo Kristian

NIM : 098114038

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN PERSEMBAHAN

Skripsi ini kupersembahkan untuk :

Tuhanku Yesus Kristus atas segala berkat dan penyertaan-Nya

Bapak, Ibu dan Kakak-kakakku atas kasih sayang

dan segala hal yang diberikan

Sahabat-sahabatku dan almamaterku

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis kepada Tuhan atas segala rahmat, berkat, anugrah dan penyertaan-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN

METODE DPPH DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL

FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP

(Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.)” ini dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

(S.Farm) pada Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Penulis ingin berterima kasih kepada segala pihak yang telah memberikan bantuan baik dukungan, bimbingan, sarana, materil maupun moril dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada:

1. Ipang Djunarko,M.Sc.,Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

2. Prof.Dr.C.J. Soegihardjo,Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan perhatian, bimbingan dan arahan dari awal pengusulan skripsi

sampai penulisan skripsi ini selesai.

3. Lucia Wiwid Wijayanti,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya

untuk menguji dan juga memberikan masukan dan saran dalam skripsi ini.

4. Yohanes Dwiatmaka,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya untuk

menguji dan juga memberikan masukan dan saran dalam skripsi ini.

vii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Rini Dwiastuti S.Far.,Apt, M.Sc., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang

telah membimbing dan memberi nasihat kepada penulis.

6. Sahabat seperjuangan skripsi DPPH, Anthony Felix, Mikhael Gustandy,

Willigis Danu Patria yang selalu membantu dan bekerjasama dengan luar biasa.

7. Teman-teman FSM dan FST A 2009, atas kerjasama, dukungan dan bantuan

yang diberikan.

8. Segenap laboran Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium.

9. Pemerintah Kabupaten Bengkayang, Kal-Bar, atas bantuan dana yang

diberikan.

10. Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat

disebut satu per satu.

Penulis menyadari bahwa masih terdapat ketidaksempurnaan dalam penulisan skripsi ini. Dengan segala kerendahan hati penulis akan menerima segala kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan banyak pihak.

Yogyakarta, 10 Maret 2013

Penulis

viii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL……………………………………………………. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………... ii

HALAMAN PENGESAHAN………………………………………….. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN………………………………………… iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..………………………………. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA…. vi

KATA PENGANTAR.…………………………………………………. vii

DAFTAR ISI…………………………………………………………….. ix

DAFTAR TABEL……………………………………………………….. xiii

DAFTAR GAMBAR…………………………………………………….. xv

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………... xvi

INTISARI………………………………………………………………... xvii

ABSTRACT……………………………………………………………... xviii

BAB I PENGANTAR……………………………………………………. 1

A. Latar Belakang…………………………………………………... 1

B. Permasalahan…………………………………………………….. 3

C. Keaslian Penelitian……………………………………………..… 3

D. Manfaat penelitian……………………………………………...... 4

E. Tujuan Penelitian…………………………………………………... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA……………………………………..... 6

A. Dadap Serep………………...... 6

1. Keterangan botani………………………………………………… 6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Nama tumbuhan…………………………………………………. 6

3. Klasifikasi dadap serep…..……………………………………… 6

4. Gambaran umum………………………………………………… 7

5. Kandungan kimia dadap serep…………………………………… 7

B. Senyawa Fenolik……………………………………………………. 8

C. Radikal Bebas…………………………………………………… 9

D. Antioksidan……………………………………………………… 11

E. Penyarian………………………………………………………… 13

F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu…………………………….... 14

G. Validasi Metode……………………………………………...…… 16

H. Landasan Teori……………………………………………………. 18

I. Hipotesis………………………………………………………….. 19

BAB III METODOLOGI PENELITIAN………………………………… 20

A. Jenis dan Rancangan Penelitian………………………………….. 20

B. Variabel…………………………………………………………… 20

C. Definisi Operasional…………………..……………………….… 20

D. Bahan dan Alat Penelitian………………………………………… 21

1. Bahan penelitian……………………………………………….. 21

2. Alat penelitian…………………………………………….…… 21

E. Tatacara Penelitian………………………………………………… 22

1. Determinasi tumbuhan………………………………………… 22

2. Pengumpulan bahan……………………………………….…… 22

3. Preparasi sampel…………………………………………….… 22

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji…………………….… 23

5. Uji pendahuluan……………………………………………..… 24

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan………………..…… 25

7. Uji aktivitas antioksidan………………………………….…… 26

8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total…………. 27

9. Penetapan kandungan fenolik total……………………………. 27

F. Analisis Hasil……………………………………………………… 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………….… 31

A. Determinasi……………………………………………………….. 31

B. Hasil Pengumpulan Bahan………………………………………… 31

C. Hasil Preparasi Sampel……………………………………….…… 34

1. Ekstraksi sampel……………………………………………..… 34

2. Fraksinasi ekstrak…………………………………………….… 35

D. Hasil Uji Pendahuluan……………………………………………...... 37

1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan……………………….… 37

2. Uji pendahuluan senyawa fenolik……………………………… 39

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan……………………. 40

1. Penentuan panjang gelombang maksimun (λ maks)…………… 40

2. Penentuan Operating Time (OT)………………………………... 41

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan………………………. 43

1. Presisi metode uji aktivitas antioksidan ………………………… 45

2. Linearitas metode uji antioksidan……………………………….. 46

3. Spesifisitas metode uji antioksidan………………………………… 47

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH……………… 48

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total……….. 55

1. Penentuan operating time (OT)……………………………………….. 55

2. Penentuan panjang gelombang maksimum…………………………… 56

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total………… 57

1. Presisi metode penetapan kadar kandungan fenolik total…………….. 57

2. Linieritas metode penetapan kandungan fenolik total………………… 58

3. Spesifisitas metode penetapan kandungan fenolik total………………. 59

J. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total……………………………. 59

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN…………………………………. 62

A. Kesimpulan……………………………………………………….……. 62

B. Saran………………………………………………………………...... 62

DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………….. 63

LAMPIRAN…………………………………………………………….… 66

BIOGRAFI PENULIS…………………………………………………….. 95

xii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan

antioksidan sebagai penetral……………………………. 13

Tabel II. Kisaran recovery hasil analisis yang diterima………….. 17

Tabel III. Kriteria nilai presisi yang masih dapat diterima………... 17

Tabel IV. Hasil Scanning panjang gelombang maksimum DPPH… 40

Tabel V. Hasil pengukuran absorbansi seri baku kuersetin

yang direaksikan dengan radikal DPPH………………… 43

Tabel VI. Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat

ekstrak etanol daun dadap serep yang direaksikan

dengan DPPH…………………………………………… 44

Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar kuersetin……. 45

Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat……… 45

Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode

DPPH……………………………………………………. 51

Tabel X. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak

etanol daun dadap serep dengan metode DPPH…………. 52

Tabel XI. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan Fraksi etil asetat

ekstrak etanol daun dadap serep…………………………. 53

Tabel XII. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin

dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep…… 54

xiii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Tabel XIII. Hasil scanning panjang gelombang maksimum………….. 57

Tabel XIV. Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter……… 58

Tabel XV. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang

direaksikan dengan Folin-Ciocalteu…………………… 58

Tabel XVI. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat

ekstrak etanol daun dadap serep……………………… 60

xiv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Beberapa struktur senyawa isoflavonoid………………… 8

Gambar 2. Klasifikasi flavonoid produk alam………………………. 9

Gambar 3. Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH……….. 12

Gambar 4. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan.. 15

Gambar 5. Skema jalannya penelitian……………………………….. 30

Gambar 6. Blanko DPPH , Fraksi etil asetat, Kuersetin…………..…. 38

Gambar 7. Blanko reagen Folin-ciocalteau , Fraksi+reagen

Folin-ciocalteau, Asam galat+ragen Folin-ciocalteatu…… 39

Gambar 8. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)…………….. 42

Gambar 9. Grafik Penetuan OT Fraksi Etil Asetat (Replikasi 1)……... 42

Gambar 10. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa…………….. 48

Gambar 11. Struktur senyawa kuersetin……………………………….. 49

Gambar 12. Usulan mekanisme reaksi kuersetin dan radikal DPPH…… 49

Gambar 13. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin………………………………………………….. 51

Gambar 14. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat…………………………………………… 52

Gambar 15. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)…………… 56

Gambar 16. Reaksi pembentukan kompleks molybdenum-blue……….. 60

Gambar 17. Kurva kalibrasi asam galat………………………………... 60

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat determinasi tanaman dadap serep………………. 66

Lampiran 2. Gambar tanaman dadap serep………………………… 67

Lampiran 3. Perhitungan rendemen……………………………... … 68

Lampiran 4. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan……………………………….. ... 69

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi pengujian aktivitas antioksidan…………………………………. 70

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi………………………………... 72

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan……………. 73

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH.. 74

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi air ekstrak metanol daun dadap serep……………………... 84

Lampiran 10. Penimbangan bahan pengujian kandungan fenolik total... 85

Lampiran 11. Perhitungan konsentrasi pengujian fenolik total………… 85

Lampiran 12. Scanning kontrol asam galat……………………………. 88

Lampiran 13. Optimasi penentuan kandungan fenolik total…………… 88

Lampiran 14. Perhitungan kandungan fenolik total…………………… 93

Lampiran 15. Hasil pengujian statistik dengan software R 2.14.1…….. 94

xvi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

INTISARI

Dalam pengobatan tradisional di Indonesia, daun dari tanaman dadap serep berkhasiat untuk mengobati sakit kepala, batuk serta untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan. Senyawa fenolik merupakan salah satu kandungan bioaktif dari daun dadap serep. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep secara in vitro yang didasarkan pada efek peredaman radikal bebas larutan 1,1-difenil- pikrilhidrazil (DPPH) yang dinyatakan dengan inhibition concentration 50 (IC50). Kandungan fenolik total juga ditentukan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu dengan baku standar asam galat yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat. Prinsip metode ini adalah senyawa fenolik teroksidasi dalam suasana basa dan pereaksi Folin-Ciocalteu tereduksi menjadi larutan berwarna biru yang dapat diukur dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 245,15 ± 4,26 µg/mL dan kandungan fenolik total sebesar 8,51 ± 0,18 ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep dan metode yang digunakan belum tervalidasi.

Kata kunci: daun dadap serep (Erythrina subumbrans Hassk), fraksi etil asetat, antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total

xvii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRACT

In Indonesian traditional medicine, the leaves of dadaps (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.) are efficacious to cure headaches, cough and can also be used as a drink for women after childbirth. Phenolic compound is one of the bioactive contents in dadaps leaves. This research was conducted to determine the antioxidant activities of ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves in vitro based on the reducing effect of free radical of 1,1-diphenyl-pikrilhidrazil

(DPPH) solution expressed by inhibition concentration 50 (IC50). The total phenolic contents was also determined by using the Folin-Ciocalteu reagent with gallic acid standard expressed by the mass of gallic acid equivalents. The principle of this method is oxidized phenolic compounds in alkaline medium and Folin- Ciocalteu reagent is reduced to a blue solution that can be measured by the visible spectrophotometer at a wavelength of 750 nm. The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves had antioxidant activities with

IC50 valued in the amount of 245.15 ± 4.26 µg/mL and the total phenolic content of 8.51 ± 0.18 gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves and the method has not been validated.

Keywords : dadaps leaves (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.), ethyl acetate fraction, antioxidant, DPPH, total phenolic content

xviii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang

Paparan sistem biologis dari xenobiotik, polusi, radiasi pengion atau cahaya UV dan perkembangan kondisi patologis tertentu menyebabkan tekanan oksidatif, akibatnya meningkatkan produksi oksigen radikal. (Sapakal et al.,

2008). Pembentukan radikal bebas dan reaksi oksidasi pada biomolekul akan berlangsung sepanjang hidup. Inilah penyebab utama dari proses penuaan dan berbagai penyakit degeneratif (Silalahi, 2006). Radikal oksigen terus dibentuk pada semua organisme hidup, dengan efek merusak yang menyebabkan cedera dan kematian sel (Sapakal et al., 2008). Jenis Reaktif Oksigen Spesies (ROS) termasuk radikal hidroksil, radikal anion superoksida, hidrogen peroksida, radikal nitrat oksida, radikal hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida mampu bereaksi dengan membran lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya, yang mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al., 2008).

Antioksidan adalah zat yang berperan penting dalam menunda atau mencegah penyakit degeneratif oleh kerusakan oksidatif dari komponen sel hidup yang disebabkan oleh radikal bebas. Didalam tubuh secara alami telah mengandung enzim-enzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti enzim glutation reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), glutation peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif dengan menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen reaktif dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Namun karena

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

tekanan oksidatif berlebih didalam tubuh, menyebabkan produksi radikal bebas menjadi meningkat didalam tubuh yang berakibat dibutuhkannya tambahan antioksidan yang cukup untuk menanggulangi tekanan oksidatif yang tinggi tersebut sehingga dapat mengurangi dampak kerusakan sel sebagai akibat dari reaksi radikal bebas.

Antioksidan sintetik seperti butylated hidroksitoluen (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), tert-butylhydroquinone (TBHQ) dan propil gallate (PG) telah digunakan selama bertahun-tahun, namun senyawa tersebut sedang diperiksa untuk kemungkinannya dalam menimbulkan toksisitas. Oleh karena itu, sekarang ini dilakukan penelitian intensif tentang antioksidan polifenol alami yang berasal dari tumbuhan untuk menggantikan antioksidan sintetis (Qader et al., 2011).

Dadap serep (Erythrina subumbrans) adalah salah satu tanaman yang secara tradisional digunakan untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan untuk mengobati sakit kepala. Rebusan daunnya juga digunakan untuk mengobati batuk (Anonim, 2007). Dalam tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Senyawa fenolik tersebut memiliki peranan penting dalam kaitan penggunaan tanaman terhadap manfaatnya bagi kesehatan. Salah satu manfaat dari kandungan senyawa fenolik pada tanaman dadap serep telah dibuktikan dalam penelitian

Rukachaisirikul et al.,(2007) yang menunjukan tanaman dadap serep (Erythrina subumbrans) mengandung senyawa fenolik yang beraktivitas antibakteri lebih kuat dibanding standar antibiotik vancomycin dan oxacillin terhadap beberapa strain bakteri streptococcus dan staphylococcus.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3

Senyawa fenolik merupakan senyawa bioaktif dari tumbuhan yang merupakan sumber antioksidan alami yang aman. Untuk melihat potensi antioksidan dari tanaman dadap serep, dalam penelitian ini dilakukan pemeriksaan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang dilakukan dengan metode 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) secara spektrofotometri. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Aktivitas diukur dengan menghitung jumlah pengurangan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan pengurangan konsentrasi larutan DPPH. Peredaman tersebut dihasilkan oleh bereaksinya molekul Difenil Pikril Hidrazil dengan atom hidrogen yang dilepaskan satu molekul komponen sampel sehingga terbentuk senyawa Difenil

Pikril Hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke kuning (Zuhra, Tarigan dan Sihotang, 2008). Penentuan kandungan fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dilakukan menggunakan metode Folin-Ciocalteu dimana merupakan salah satu metode yang cepat dan sederhana dalam menentukan kandungan fenolik total (Fu et al., 2011).

B. Permasalahan

1. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun

dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50

2. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap

serep yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat ?

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 4

C. Keaslian Penelitian

Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji aktivitas antioksidan daun dadap pernah dilakukan oleh :

Estrada, E.I., 2010, dengan judul “Actividad Antioxidante De Alcaloides De

Erythrina Americana Miller”. Penelitian ini menggunakan daun dadap spesies

Erythrina Americana Miller yang diperoleh di universitas nacional autonoma

de Mexico (Mexico) dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (2,2-

diphenyl-1-picrylhydrazyl).

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah bahwa dalam penelitian ini daun dadap serep spesies Erythrina subumbrans

(Hassk.) Merr. yang digunakan dipanen dari dari kebun tanaman obat Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

2. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas antioksidan daun dadap serep sehingga bisa dimanfaatkan sebagai alternatif untuk pemeliharaan kesehatan manusia.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5

E. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH fraksi etil asetat

ekstrak etanolik daun dadap serep.

2. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun

dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50

dan mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik

daun dadap serep yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Dadap Serep

1. Keterangan botani

Dadap serep termasuk tanaman legum pohon, berasal dari Asia Tenggara dan tersebar di seluruh kepulauan nusantara. Varietas tanaman ini dibedakan berdasarkan ada tidaknya duri pada kulitnya (Purwanto, 2007).

2. Nama tumbuhan

Nama latin : Erythrina subumbrans Hassk. (Anonim, 2007).

Nama sinonim : Erythrina hypaphorus Boerl., Erythrina lithosperma

Miquel (Anonim, 2007).

Nama daerah : dadap minyak, dadap limit (sunda); dadap lengan,

dadap lisah (jawa); dadap lenga, thetheuk oleng

(Madura) (Purwanto, 2007).

3. Klasifikasi dadap serep menurut USDA (2011)

Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Superdivisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub Kelas : Rosidae Ordo : Fabales Famili : Fabaceae Genus : Erythrina Spesies : Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7

4. Gambaran umum

Dadap serep merupakan tanaman legum pohon, tumbuh tinggi agak bengkok, ketinggian mencapai 15-22 m dengan diameter batang 40-100 cm, sistem perakaran dalam. Kulit batang berwarna hijau, batang yang tua bercampur garis-garis kecoklatan, cabang tumbuh lurus ke atas membentuk sudut 45o.

Daunnya beranak tiga helai, berbentuk delta atau gemuk bundar ujung agak meruncing, bagian bawah daun membundar, bila diremas terasa lunak ditangan.

Ukuran panjang tangkai daun 10-20,5 cm; panjang daun 9-19 cm; dan lebar daun

6-17 cm. Daun atas berukuran lebih besar daripada kedua daun penumpu.

Bunganya tumbuh diantara ketiak daun, daun mahkota bunyanya berwarna merah kekuningan, berbentuk terompet. Polongnya berukuran kecil, berbentuk sabit, berisi 4-8 biji per polong (Purwanto, 2007).

Dalam penggunaannya, bagian kulit kayu dan daun dadap serep secara empiris digunakan untuk pengobatan tradisional sebagai campuran dengan tanaman obat lainnya. Di Indonesia ditemukan daun mudanya digunakan untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan untuk mengobati sakit kepala.

Rebusan daunnya digunakan untuk mengobati batuk (Anonim, 2007).

5. Kandungan kimia dadap serep

Tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Flavonoid dan isoflavonoid yang terkandung dalam tanaman dadap merupakan senyawa bioaktif yang menarik perhatian para peneliti karena selain memiliki struktur senyawa yang

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 8

baru, senyawa bioktif tersebut juga menunjukan potensi sebagai senyawa antimikroba (Rasooli, 2011).

O O O

O O Isoflavan Isoflavone Isoflavanone

O O O O

Isoflavan-3-ene Isoflavanol 3-arylcoumarin

Gambar 1. Beberapa struktur senyawa isoflavonoid (Samanta, Das, dan Das, 2011)

B. Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder dari alam dengan jumlah senyawa yang besar (lebih dari 8.000) yang tersebar luas diseluruh kingdom tanaman dan dikarakterisasi dengan setidaknya memiliki satu cincin aromatis dengan satu atau lebih terikat dengan gugus hidroksil. Senyawa fenolik dapat diklasifikasikan berdasarkan susunan dari atom karbon dalam flavonoid (flavonol, flavon, flavan-3-ol, antosianidin, flavanon, isoflavon dan lainnya) dan non- flavonoid (asam fenolat, hidroksinamat, stilben dan lainnya) dan senyawa- senyawa tersebut umumnya berada terkonjugasi dengan gula dan asam organik

(Cartea, Francisco, Soengas, dan Velasco, 2010).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 9

Flavonoid merupakan salah satu kelompok metabolit sekunder terbesar sebagai senyawa fenolik. Flavonoid melindungi tanaman terhadap berbagai ancaman biotik dan abiotik yang menunjukkan spektrum dengan beragam fungsi biologis dan memainkan peran penting dalam interaksi antara tanaman dan lingkungannya (Samanta et al., 2011). Senyawa fenolik mayoritas yang ada di alam berada sebagai glikosida. Adanya gula dan gugus hidroksil membuat senyawa fenolik larut dalam air sedangkan adanya gugus metil dan unit isopentil membuat flavonoid menjadi lipofilik (Samanta et al., 2011).

Sebagian besar koleksi metabolit dari produk alam disebut dengan istilah flavonoid yang mencakup senyawa dengan karbon berstruktur C6-C3-C6.

Tergantung pada posisi keterkaitan dari cincin aromatik ke bagian benzopiren, kelompok produk alam ini dibagi menjadi tiga kelas: Flavonoid (2 - fenilbenzopiren), isoflavonoid (3-benzopiren) dan Neoflavonoid (Samata et al.,

2011).

Flavonoids O Isoflavonoids (3-benzopyrans)

Neoflavonoids

Gambar 2. Klasifikasi flavonoid produk alam (Samata et al., 2011)

C. Radikal Bebas

Reaktif oksigen spesies (ROS) adalah istilah yang meliputi semua molekul yang sangat reaktif yang mengandung atom oksigen yang merupakan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10

golongan radikal bebas. Jenis ROS termasuk radikal hidroksil, radikal anion superoksida, hidrogen peroksida, singlet oksigen, radikal nitrat oksida, radikal hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida. Semua mampu bereaksi dengan membran lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya, yang mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al, 2008).

Banyak bukti yang telah dikumpulkan untuk melihat kerusakan seluler yang timbul akibat dari spesies oksigen reaktif (ROS), setidaknya sebagian, dalam etiologi dan patofisiologi penyakit manusia seperti gangguan neurodegeneratif

(misalnya penyakit alzheimer, penyakit parkinson, multipel sklerosis, syndrom down), peradangan, infeksi virus, autoimun patologi, dan gangguan sistem pencernaan seperti peradangan pencernaan dan ulkus. Dalam sistem metabolisme tubuh, radikal bebas dihasilkan sebagai bagian dari proses normal metabolisme tubuh, dan reaksi berantai radikal bebas biasanya diproduksi di rantai pernapasan mitokondria, campuran oksidase fungsi hati, dengan leukosit bakteri, melalui aktivitas xantin oksidase, polusi atmosfer, dan dari transisi logam katalis, obat dan xenobiotik. Selain itu, mobilisasi kimia dari cadangan lemak di bawah berbagai kondisi seperti menyusui, olahraga, demam, infeksi dan bahkan puasa, dapat menghasilkan peningkatan aktivitas radikal dan meningkatkan kerusakan, khususnya yang berhubungan dengan kekebalan tubuh dan sistem saraf. Hormon stres (adrenalin dan noradrenalin) yang disekresikan oleh kelenjar adrenal di bawah kondisi stres emosional yang berkelanjutan dan berlebihan, yang kemudian dimetabolisme menjadi lebih sederhana seperti molekul radikal bebas, juga dapat meningkatkan produksi senyawa radikal dalam tubuh (Atawodi, 2005).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 11

D. Antioksidan

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang mampu menunda, memperlambat atau menghambat reaksi oksidasi didalam tubuh. Antioksidan mampu menstabilkan, atau menonaktifkan radikal bebas sebelum menyerang sel dalam tubuh. Antioksidan merupakan senyawa yang penting untuk menjaga kesehatan seluler dan kesehatan sistemik tubuh (Sapakal et al., 2008).

Senyawa antioksidan dapat dibedakan berdasarkan komposisi, sifat fisik dan kimia, mekanisme dan tempat aksi dari senyawa antioksidan tersebut. Enzim- enzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti enzim glutation reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), glutation peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif dengan menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen reaktif dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Senyawa dengan bobot molekul tinggi seperti protein : albumin, ceruplasmin, transferin, haptoglobin mengikat logam aktif redoks dan membatasi produksi radikal bebas katalis logam.

Senyawa dengan berat molekul rendah dibagi menjadi antioksidan larut lemak

(tokoferol, karotenoid, kina dan beberapa polifenol) dan antioksidan yang larut air

(asam askorbat, asam urat dan beberapa polifenol). Senyawa antioksidan jenis mineral: selenium, mangan, tembaga, dan seng diakui sebagai antioksidan yang serbaguna. Senyawa antioksidan jenis vitamin: vitamin A, C, dan E ternyata memiliki peran penting dalam mencegah atau meminimalkan kerusakan peroksidasi dalam sistem biologis. Tanaman kaya antioksidan merupakan sumber antioksidan alami yang dapat ditemukan dalam sayuran, kacang kedelai, kulit

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 12

jeruk, biji sesame, daun teh hijau, biji kakao, anggur, tomat, jeruk, apel, biji- bijian, zaitun, wortel (Sapakal et al.,2008).

Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun antioksidan alami. Tetapi saat ini penggunaan antioksidan sintetik mulai dibatasi karena ternyata dari hasil penelitian yang telah dilakukan bahwa antioksidan sintetik seperti BHT (Butylated Hydroxy Toluena) ternyata dapat meracuni binatang percobaan dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu industri makanan dan obat-obatan beralih mengembangkan antioksidan alami dan mencari sumber- sumber antioksidan alami baru (Zuhra et al., 2008).

Gambar 3. Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH ((a) donasi kedua atom hidrogen, (b) dimerisasi, (c) kompleksasi) (Bondet, Brand- Williams, dan Berset, 1997)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 13

Tabel I. Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan antioksidan sebagai penetral (Sapakal et al., 2008)

Reactive Oxygen Species Senyawa antioksidan (ROS)

Radikal hidroksil vitamin C, glutation, flavonoid, asam lipoid

Radikal superoksida vitamin C, glutation, flavonoid, SOD

vitamin C, glutation, betakaroten, Hidrogen peroksida vitamin E, CoQ10, flavonoid, asam lipoid

Lipid peroksida beta karoten, vitamin E, ubiquinon, flavonoid, glutation peroksidase

E. Penyarian

Penyarian adalah kegiatan penarikan zat atau metabolit aktif yang semula berada didalam sel yang kemudian ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif tersebut larut dalam cairan penyari (Harborne, 1987). Secara umum, penyarian dapat dibedakan menjadi infudasi, maserasi, perkolasi dan penyarian berkesinambungan. Sebagai cairan penyari digunakan air, eter, atau campuran etanol air (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).

Maserasi merupakan metode yang melibatkan perendaman dan penggojogan bahan tanaman didalam pelarut tertentu yang kemudian pelarutnya diuapkan (Raaman, 2006). Remaserasi merupakan modifikasi cara penyarian maserasi. Pada proses remaserasi cairan penyari dibagi menjadi dua bagian.

Seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 14

diendap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua (Depkes, 1986). Alkohol didalam banyak penelitian merupakan pelarut yang cocok untuk berbagai tujuan ekstraksi sebagai pelarut awal yang digunakan dalam tahapan ekstraksi (Harborne, 1998).

Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakukan sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin menganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Ekstraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang menyatakan “pada konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak campur”. Perbandingan konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut dengan koefisien distribusi atau koefisien partisi (Kd) dan digambarkan dengan rumus :

푆 표푟푔 Kd = 푆 푎푞

Dimana [S]org dan [S]aq masing-masing merupakan konsentrasi analit dalam fase organik dan dalam fase air; Kd merupakan koefisien partisi. Efiseiensi proses ekstraksi tergantung pada nilai distribusinya dan juga tergantung pada volume relative kedua fase. Adanya ekstaksi berulang (bertingkat) akan meningkatkan efisiensi ekstraksi (Gandjar dan Rohman, 2007).

F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu

Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan. Metode ini bertujuan untuk mengetahui parameter konsentrasi yang ekivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 15

ini dapat dicapai dengan cara mengintepretasikan data eksperimental dari metode tersebut (Molyneux, 2004).

Uji kuantitatif daya antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1- difenil-2-pikrilhidrazil) secara spektrofotometri sinar tampak. Metode ini didasarkan pada perubahan warna radikal DPPH. Perubahan warna tersebut disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH dengan satu atom hidrogen yang dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan uji untuk membentuk senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning. Pada metode ini absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang tidak bereaksi dengan senyawa antioksidan (Josephy, 1997).

O2N NO2

H N N NO2 + AH O2N N N + A

O2N NO2

DPPH Reduced Form DPPH Free Radical Phenolic Compounds

Gambar 4. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan (Irshad, Zafaryab, Singh, dan Rizvi, 2012)

Dalam metode DPPH, dengan adanya elektron bebas yang tidak berpasangan pada senyawa radikal DPPH, senyawa tersebut memberikan serapan maksimum yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dan memberikan warna ungu. Warnanya berubah dari ungu menjadi kuning sebagai bentuk berkurangnya

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 16

absorptivitas molar radikal DPPH pada 517 nm dari 9660 ke 1640 ketika elektron bebas radikal DPPH dipasangkan dengan hidrogen dari senyawa antioksidan radikal bebas untuk membentuk senyawa DPPH-H. Dengan demikian hasil dekolorisasi yang terjadi memberikan nilai stoikiometri sehubungan dengan jumlah elektron yang ditangkap (Prakash, 2001).

Metode Folin-Ciocalteu (F-C) merupakan metode kolorimetri yang sering digunakan yang berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan sodium karbonat, yang akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk mereduksi warna kuning F-C menjadi berwarna biru, yang dapat diukur secara spektrofotometri ( Cicco dan Lattanzio, 2011).

G. Validasi Metode

Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis dapat memberikan hasil seperti yang diharapakan dengan akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2007).

Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya atau nilai rujukan. Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH (International Conference on

Harmanization) merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi). Data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali (recovery)

(Gandjar dan Rohman, 2007). Rata-rata persen recovery yang dihasilkan seharusnya berada dalam kisaran sebagai berikut :

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 17

Tabel II. Kisaran recovery hasil analisis yang diterima (APMVA, 2004)

% Senyawa

impuritis/aktif Rata-rata recovery yang diterima

≥ 10 98-102 %

≥ 1 90-110 %

0,1-1 80-120 %

< 1 75-125 %

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Tabel III. Kriteria nilai presisi yang masih dapat diterima (APVMA, 2004)

Kadar zat aktif Nilai KV yang masih dapat diterima (%) (%) ≥ 10 ≤ 2

1-10 ≤ 5

0,1-1 ≤ 10

<0,1 ≤ 20

Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks (Gandjar dan

Rohman, 2007). Jika respon yang dihasilkan dari suatu metode dapat membedakan senyawa yang dituju dengan respon yang lainnya, maka metode

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 18

tersebut dapat dikatakan selektif. Selektifitas suatu metode analisis dapat ditunjukan dengan menampilkan data yang menggambarkan tidak adanya interferensi dari hasil produk degradasi dan senyawa yang dapat menyebabkan interferensi lainnya dalam matriks (APVMA, 2004).

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x)

(Gandjar dan Rohman, 2007).

H. Landasan Teori

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil dan sangat reaktif yang merupakan salah satu faktor penyebab kerusakan sel dalam tubuh.

Untuk mengurangi dampak kerusakan yang diakibatkan dari radikal bebas, dibutuhkan senyawa antioksidan yang merupakan suatu senyawa yang mampu menunda, memperlambat atau menghambat reaksi oksidasi didalam tubuh yang dapat berasal dari radikal bebas. Antioksidan mampu menstabilkan atau menonaktifkan radikal bebas sebelum menyerang sel dalam tubuh. Sumber- sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun antioksidan alami yang berasal dari tanaman.

Secara empiris tanaman dadap serep digunakan sebagai bahan obat tradisional yang digunakan untuk mengobati batuk, sakit kepala, demam dan minuman bagi wanita sehabis melahirkan. Tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 19

lektin. Adanya berbagai kandungan senyawa fenolik disamping saponin dan lektin dalam tanaman dadap serep tersebut memberikan kemungkinan besar bahwa tanaman ini memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

Pengujian aktivitas antioksidan dari suatu sampel uji dapat dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Metode ini didasarkan pada perubahan warna radikal DPPH yang disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH dengan senyawa antioksidan yang menyumbangkan satu atom hidrogen yang dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan uji untuk membentuk senyawa

1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning, sisa DPPH yang tidak bereaksi diukur secara spektrofotometri sinar tampak.

Kandungan senyawa fenolik dari suatu sampel dapat diukur dengan metode Folin-Ciocalteu (F-C). Metode ini berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan sodium karbonat, yang akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk mereduksi warna kuning F-C menjadi berwarna biru, yang dapat diukur secara spektrofotometri.

I. Hipotesis

Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep mempunyai aktivitas antioksidan yang dapat diukur dengan metode DPPH yang dinyatakan dengan

IC50. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dapat diukur dengan metode Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena subjek uji diberi perlakuan.

B. Variabel

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap

serep.

2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total

fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu

pemanenan dan cara panen.

4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari, cuaca, kelembaban,

curah hujan.

C. Definisi Operasional

1. Daun dadap serep adalah daun (folium) segar dari tanaman dadap serep yang

dipanen dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma (Yogyakarta) dengan bentuk daun belah ketupat, dengan lebar ± 10-17

cm, berwarna hijau.

2. Ekstrak etanolik daun dadap serep adalah sari hasil proses maserasi daun dadap

serep dengan penyari etanol.

3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanolik daun dadap serep

dengan menggunakan pelarut etil asetat.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 21

4. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan

kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep untuk

menangkap radikal DPPH.

5. Nilai inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil

asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang menghasilkan penangkapan 50%

radikal DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: daun dadap serep yang diambil dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta, akuades (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma); bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu: metanol, bahan kualitas p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen

Folin-Ciocalteu, asam galat, dan kuersetin kualitas Sigma Chem. Co., USA; bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat; bahan kualitas teknis CV. General Labora, yaitu: metanol; dan aluminium foil.

2. Alat penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scaltec

SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath

(labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Perkin

Elmer Lamda 20), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000μL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 22

E. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tumbuhan

Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimian, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Tanaman dadap serep diperoleh dari kebun tanaman obat Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma di Yogyakarta. Pengumpulan pada musim kemarau bulan Agustus tahun 2012. Pemanenan dilakukan pada tanaman saat pagi hari.

3. Preparasi sampel

Daun dadap serep segar dicuci dengan air mengalir, dikering-anginkan, dan ditimbang sebanyak 1 kg, kemudian dihaluskan dengan grinder. Ketika dihaluskan, daun tersebut ditambahkan sedikit cairan penyari (etanol 76%).

Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang 100 g dan dituang kedalam bejana maserasi, ditambah etanol 76% sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol 76% secukupnya selama dua hari. Kemudian filtratnya dicampurkan dengan filtrat terdahulu. Campuran filtrat kemudian disaring. Lalu hasil penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak etanol daun dadap serep.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 23

Ekstrak etanol daun dadap serep ditambah 300 mL air hangat dan diekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna.

Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada bagian atas.

Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator. Hasil fraksi tersebut kemudian ditutup dengan plastik serta aluminium foil lalu disimpan dalam desikator. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan untuk dianalisis lebih lanjut.

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji

a. Pembuatan larutan DPPH

Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

b. Pembuatan larutan stok kuersetin Sebanyak 2,5 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL.

c. Pembuatan larutan pembanding

Diambil sebanyak 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL larutan stok kuersetin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 μg/mL.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 24

d. Pembuatan larutan uji

1. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Sebanyak 12,5 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu di add metanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 75; 150; 225; 300; 375 μg/mL.

2. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total

Sebanyak 5,0 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan metanol p.a sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 500,0 µg/mL.

e. Pembuatan larutan asam galat

Dibuat larutan asam galat dengan konsetrasi 500 µg/mL dalam akuades : methanol p.a (1:1). Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai

10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50;

75; 100; 125; dan 150 µg/mL.

5. Uji pendahuluan

a. Uji fenolik

Sejumlah 0,5 mL larutan uji 500,0 µg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 µg/mL dimasukan ke dalam 3 tabung reaksi. Lalu ditambahkan 5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi. Diamkan selama 10 menit.

Tambahkan 4 mL larutan natrium karbonat 1 M. Kemudian amati warna larutan tersebut.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 25

b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 μg/mL , dan larutan uji 200,0 μg/mL.

Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut.

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.

b. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing 3 labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan pembanding kuersetin 5; 10 dan 15 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 75; 225; 375 μg/mL.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 26

7. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode spoktrofotometri sesuai dengan penelitian Rollando (2012).

a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH.

Ditambahan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.

b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup kemudian ditambah dengan 1 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.

c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b, divalidasi presisi (%CV), spesifisitas

(spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).

% CV = 푆푡푎푛푑푎푟 퐷푒푣푖푎푠푖 푆퐷 푘표푛푠푒푡푟푎푠푖 푡푒푟푢푘푢푟 x 100% 푟푎푡푎 −푟푎푡푎 푘표푛푠푒푛 푡푟푎푠푖 푡푒푟푢푘푢푟

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 27

d. Estimasi aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri.

a. Penentuan OT

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat

1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit.

b. Penentuan panjang gelombang maksimum

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1

M. Diamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.

9. Penetapan kandungan fenolik total

a. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air

(1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 28

Setelah OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1 M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.

b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total

Hasil dari prosedur 9 a , divalidasi presisi (%CV), spesifisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).

% CV = 푆푡푎푛푑푎푟 퐷푒푣푖푎푠푖 푆퐷 푘표푛푠 푒푡푟푎푠푖 푡푒푟푢푘푢푟 x 100% 푟푎푡푎 −푟푎푡푎 푘표푛푠푒푛푡푟푎푠푖 푡푒푟푢푘푢푟

c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 500 μg/mL, lalu masing-masing dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat).

Lakukan 3 kali replikasi.

F. Analisis Hasil

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus :

Absorbansi (larutan kontrol) – Absorbansi sampel (larutan pembanding/uji) X 100%

Absorbansi larutan control

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 mengunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding, sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalisis secara statistik

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 29

untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC50 larutan pembanding dan larutan uji.

Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat dalam per g fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku secara intrapolasi.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 30

Determinasi tanaman

Pengumpulan dan preparasi bahan

Pembuatan ekstrak etanol daun dadap serep

Ekstraksi cair-cair dengan wasbensin dan air

Fraksi wasbensin Fraksi air

Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat

Fraksi air II Fraksi etil asetat

Uji Pendahuluan

Optimasi metode Optimasi uji antioksidan penetapan kandungan fenolik total

Validasi metode uji Validasi metode aktivitas antioksidan penetapan kandungan fenolik total

Estimasi aktivitas Estimasi kandungan antioksidan fenolik total

Analisis statistik

Gambar 5. Skema jalannya penelitian

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi

Dalam penelitian ini langkah pertama yang dilakukan adalah determinasi tanaman yang akan digunakan sebagai sampel uji. Tujuan dilakukannya determinasi adalah untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang digunakan serta untuk menghindari kesalahan dalam penggunaan tanaman saat dilakukan penelitian. Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma dengan acuan buku Flora of Java (Backer and Bakhuizen van den Brink,

1965). Dari hasil determinasi (lampiran 1) yang dilakukan terbukti bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah dadap serep (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.).

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Daun dadap serep yang digunakan diperoleh dari kebun tanaman obat

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Daun dipanen tanggal

21 september 2012. Daun dadap serep dipilih yang tidak layu, tidak terdapat bekas luka daun, masih berwarna hijau dan masih segar. Adanya luka daun pada tanaman dapat menyebabkan timbulnya respon enzimatik terhadap luka pada daun tanaman tersebut. Polifenol oksidase merupakan suatu enzim ekstraseluler yang akan mengoksidasi senyawa fenolik menjadi bentuk radikal dan membentuk polimer yang digunakan untuk menutup luka pada daun. Menurut Harborne

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 32

(1987), senyawa fenol pada tanaman sangat peka terhadap adanya proses oksidasi enzim yang mungkin dapat berakibat hilangnya senyawa fenol. Berkurangnya senyawa fenolik pada daun maka dapat mengakibatkan pada berkurangnya aktivitas antioksidan. Seleksi ini dilakukan untuk menjaga kualitas daun yang akan digunakan sehingga kemungkinan terjadinya pengurangan mutu sampel daun akibat sudah terjadinya perubahan kandungan kimia daun dari proses perubahan metabolisme tumbuhan dapat dihindari. Daun kemudian dicuci, dibersihkan dengan air bersih yang mengalir untuk menghilangkan sisa-sisa partikel debu, pengotor lain serta kontaminan yang masih tertinggal di daun.

Proses pemanenan dan preparasi simplisia merupakan proses yang dapat menentukan mutu simplisia daun dadap serep yang akan digunakan sebagai sampel uji, oleh karena itu diperlukan prosedur baku dalam proses tersebut.

Waktu terbaik untuk pemanenan daun (kualitas pada puncak musim atau waktu pada hari pemanenan) harus ditentukan sesuai dengan kualitas dan kuantitas konstituen aktif biologis dari hasil vegetatif total bagian tanaman obat yang ditargetkan. Dalam pemanenan daun dadap serep dipilih pada saat pagi hari untuk mendapatkan hasil metabolit sekunder dari tanaman secara maksimal dan tidak dalam kondisi basah (hujan atau embun) atau dalam kondisi kelembaban tinggi untuk mengurangi kemungkinan terjadinya kontaminasi oleh mikroba pada tanaman. Kontaminasi mikroba pada tanaman dapat mengakibatkan berubahnya metabolisme dari tanaman tersebut. Hal ini dikarenakan adanya senyawa fitotoksin yang dihasilkan oleh mikroba yang merupakan hasil sintesis mikroba pada tanaman saat mikroba tersebut menyerang tanaman. Fitotoksin dapat

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 33

menginduksi tanaman untuk memproduksi senyawa fitoaleksin yang merupakan senyawa hasil metabolisme tanaman sebagai pertahanan atas serangan mikroba.

Menurut Harborne (1987), senyawa fitoaleksin pada tanaman dapat berupa seskuiterpenoid, isoflavonoid, asetilena, atau senyawa fenol. Apabila senyawa fitoaleksin diproduksi berlebih pada tanaman sebagai tanggapan atas serangan mikroba, maka jumlah senyawa fenol yang dibutuhkan sebagai sumber fitoaleksin akan bertambah. Hal ini dapat menimbulkan kandungan senyawa fenol yang merupakan metabolit sekunder tanaman yang dapat berfungsi sebagai senyawa antioksidan akan berkurang akibat digunakannya senyawa fenol sebagai sumber fitoaleksin.

Daun dadap yang telah diperoleh dan dicuci kemudian dikeringkan sebelum ekstraksi. Menurut World Health Organization (2003), dalam proses pengeringan, kelembapan udara pada tempat pengeringan diperhatikan dan dijaga untuk menghindari kelembapan udara berlebih yang dapat menimbulkan tumbuhnya kontaminan jamur pada daun. Pengeringan dilakukan dalam keadaan terawasi untuk mencegah terjadinya perubahan kimia yang mungkin terjadi. Daun dadap serep yang diperoleh dikeringkan segera tanpa menggunakan suhu tinggi dan dalam aliran udara yang baik. Setelah daun dadap serep benar-benar kering, daun tersebut disimpan diwadah yang kering dan bersih.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 34

C. Hasil Preparasi Sampel

1. Ekstraksi sampel

Serbuk simplisia yang digunakan kemudian diekstraksi dengan cairan penyari etanol 76%. Menurut Harborne (1998), etanol didalam banyak penelitian merupakan pelarut yang cocok untuk berbagai tujuan ekstraksi sebagai pelarut awal yang digunakan dalam tahapan ekstraksi. Metode penyarian yang digunakan adalah dengan maserasi. Pemilihan metode ini karena dengan metode ini sampel yang digunakan tidak mengalami perlakuan pemanasan sehingga senyawa yang tidak cocok dengan pemanasan terjaga stabilitasnya. Maserasi dilakukan selama dua hari dan dilanjutkan remaserasi selama dua hari. Selama proses maserasi dilakukan, digunakan juga shaker sebagai alat untuk membantu penggojogan.

Penggojogan dilakukan untuk meningkatkan kontak antara cairan penyari yang digunakan dengan sampel, sehingga proses ekstraksi metabolit yang terkandung dalam sampel dapat berjalan lebih efektif dan mendapatkan hasil penyarian yang maksimal. Remaserasi dalam penelitian ini dilakukan untuk memaksimalkan hasil perolehan penyarian dari senyawa yang belum tersari akibat sudah jenuhnya cairan penyari yang digunakan.

Hasil dari proses maserasi dan remaserasi dikumpulkan yang kemudian disaring dengan corong Buchner yang dilapisi kertas saring dan diintegrasikan dengan pompa vacuum sehingga proses penyaringan lebih cepat. Filtrat hasil penyaringan tersebut kemudian diuapkan pelarutnya menggunakan alat vacuum rotary evaporator. Alat tersebut dapat menguapkan pelarut yang digunakan dengan titik didih yang lebih rendah dari titik didih pelarut dengan adanya pompa

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 35

vakum, sehingga dapat memperkecil kemungkinan rusaknya senyawa yang terkandung didalamnya. Perolehan bobot ekstrak daun dadap serep adalah sebesar

14,235 g.

2. Fraksinasi ekstrak

Struktur senyawa aktif dalam tanaman sangat bervariasi. Perbedaaan ini dipengaruhi golongan dan substituen dari senyawa tersebut. Hal ini dapat menyebabkan perbedaan polaritas dari tiap-tiap senyawa tersebut sehingga untuk mengekstraksi senyawa aktifnya diperlukan pelarut dengan polaritas yang bertingkat. Menurut Snyder (1997), proses fraksinasi akan memisahkan komponen aktif dari ekstrak daun kedalam fraksi polar, semi polar dan fraksi non polar. Etanol merupakan salah satu pelarut universal yang dapat menyari banyak senyawa kimia seperti klorofil, minyak, vitamin dan mineral. Oleh sebab itu dalam penelitian ini dilakukan fraksinasi yang bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa didalam ekstrak sehingga yang didapat adalah senyawa- senyawa yang dituju yaitu senyawa fenolik. Dalam melakukan fraksinasi dalam penelitian ini menggunakan prinsip ektraksi cair-cair dimana merupakan teknik ekstraksi yang menggunakan dua pelarut yang tidak tercampurkan yang menimbulkan perpindahan senyawa terlarut dari satu pelarut ke pelarut kedua.

Ekstrak yang didapat kemudian dilarutkan dengan air hangat agar lebih mudah untuk melarutkan ekstrak kental. Fraksinasi dilakukan dengan wasbensin yang merupakan pelarut non polar. Penggunaan wasbensin yang merupakan senyawa non polar dimaksudkan untuk mengekstraksi senyawa-senyawa non polar seperi minyak, lemak, klorofil dan vitamin. Fraksinasi dilakukan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 36

menggunakan corong pisah. Dalam corong pisah, fraksi air akan berada dibagian bawah sedangkan fraksi wasbensin ada di bagian atas. Hal ini dikarenakan adanya perbedaan bobot jenis antara wasbensin dan air. Fraksi air yang mengandung senyawa polar seperti fenolik disimpan, sedangkan fraksi wasbensin yang mengandung klorofil, minyak, lemak dan vitamin tidak digunakan dalam penelitian ini.

Tahap selanjutnya melakukan fraksinasi kembali dari fraksi air yang diperoleh menggunakan pelarut etil asetat. Menurut Robinson (1995), pengekstraksian kembali fraksi air dengan pelarut organik yang tidak bercampur dengan air tetapi agak polar sering kali bermanfaat untuk memisahkan golongan fenolik seperti senyawa-senyawa flavonoid dari senyawa yang lebih polar seperti karbohidrat. Etil asetat merupakan pelarut yang baik untuk ini. Fraksi air akan berada dibagian bawah dan fraksi etil asetat yang berbobot jenis lebih kecil dari bobot jenis air akan berada diatas. Fraksi etil asetat akan mengkestraksi senyawa fenolik aglikon sedangkan senyawa seperti antosianin, glikosida flavonoid akan berada dalam fraksi air.

Dalam melakukan fraksinasi, dilakukan dengan perbandingan yang sama antara pelarut etil asetat, wasbensin dan air dengan masing-masing menggunakan

100 mL fraksi. Menurut Gandjar dan Rohman (2007), fraksinasi juga dilakukan secara berulang sebanyak tiga kali karena ekstraksi berulang dengan volume yang sama akan lebih efektif dibanding melakukan ekstraksi tunggal dengan volume yang besar. Bentuk glikosida senyawa fenolik bersifat polar, sedangkan bentuk

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 37

aglikonnya bersifat cenderung non polar, sehingga tidak menutup kemungkinan adanya senyawa tersebut larut dalam air maupun etil asetat.

Setelah didapat fraksi etil asetat, fraksi kemudian diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator untuk meminimalkan pemaparan pemanasan supaya stabilitas senyawa fenolik tetap terjaga. Sisa fraksi etil asetat kemudian dimasukkan kedalam oven dengan suhu 40 oC untuk menguapakan sisa pelarut sehingga didapatkan ekstrak kental. Fraksi kental etil asetat dalam cawan petri kemudian dibungkus dengan plastik dan ditutup dengan alumunium foil supaya tidak terkena udara dan tidak terpapar sinar UV yang dapat mendegradasi senyawa fenolik yang ada didalam fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat yang sudah dibungkus dimasukan didalam desikator agar tidak terpapar lembab dan ditumbuhi jamur atau mikroba. Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 0,424 g dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 0,424 %.

D. Hasil Uji Pendahuluan

1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Tujuan uji pendahuluan aktivitas antioksidan adalah untuk mengetahui secara kualitatif adanya senyawa yang berpotensi memiliki aktivitas antioksidan di dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep. Uji ini menggunakan radikal DPPH dengan kuersetin sebagai pembanding dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik sebagai sampel uji. Uji ini perlu dilakukan sebelum uji kuantitatif dimana dapat menentukan langkah perlu dilakukannya uji kuantitatif aktivitas antioksidan atau tidak.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 38

Uji ini dilakukan menggunakan tabung reaksi dengan menambahkan sejumlah larutan kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep ke larutan DPPH. Keberadaan senyawa antioksidan dapat menyebabkan terjadinya peluruhan warna larutan dari ungu ke kuning.

Gambar 6. Blanko DPPH (B), Fraksi etil asetat (A), Kuersetin (C)

Dalam uji ini digunakan kontrol positif berupa larutan DPPH yang ditambah kuersetin untuk menunjukan warna larutan jika hasilnya positif (Gambar

5). Kontrol negatif dalam penelitian ini menggunakan larutan DPPH untuk menunjukan warna larutan apabila hasil uji negatif (Gambar 5). Dari hasil uji yang dilakukan terlihat adanya penurunan intensitas warna larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanolik dari warna ungu menjadi kuning (Gambar 5). Ini menunjukan bahwa hasil pengujian positif dan didalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep mengandung senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 39

1. Uji pendahuluan senyawa fenolik

Uji ini bertujuan untuk mengetahui adanya kandungan senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep. Pengujian dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteau yang didasarkan pada reaksi oksidasi-reduksi dalam suasana basa. Pengujian dilakukan dengan mencampurkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan pereaksi Folin-Ciocalteau. Menurut

Cicco dan Lattanzio (2011), reaksi yang terjadi yaitu adanya oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa, yang pada umumnya menggunakan sodium karbonat, yang mana biasanya akan menghasilkan ion fenolik yang cukup banyak. Ion fenolat yang terbentuk akan mereduksi warna kuning dari reagen Folin-ciocalteau.

Reaksi positif dari metode ini membentuk kompleks warna biru. Semakin tinggi kadar fenol pada sampel, semakin banyak produk molekul berwarna biru, akibatnya intensitas warna biru semakin tinggi.

Gambar 7. Blanko reagen Folin-ciocalteau (A), Fraksi+reagen Folin- ciocalteau (B), Asam galat+ragen Folin-ciocalteatu (C)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 40

Uji ini menggunakan kontrol negatif, yaitu pereaksi Folin-Ciocalteu untuk menunjukan warna larutan jika hasilnya negatif (Gambar 6). Kontrol positif dalam uji ini menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu yang ditambah asam galat untuk menunjukan warna larutan jika hasilnya positif (Gambar 6). Dari hasil penelitian yang dilakukan, fraksi etil asetat yang diberi reagen Folin-Ciocalteu menunjukan warna biru. Dapat disimpulkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep mengandung senyawa fenolik.

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)

Tujuan penentuan panjang gelombang maksimum adalah untuk menentukan panjang gelombang dimana larutan DPPH yang digunakan memberikan absorbansi yang paling optimum. Menurut Gandjar dan Rohman

(2007), pada panjang gelombang maksimum, perubahan yang sedikit dari konsentrasi akan memberikan perubahan yang paling besar pada absorbansi yang dihasilkan. Dengan demikian diperoleh sensitivitas yang maksimum.

Panjang gelombang maksimum dilakukan dengan scanning tiga konsentrasi larutan DPPH. Scanning panjang gelombang dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm.

Tabel IV. Hasil Scanning panjang gelombang maksimum DPPH

Konsentrasi larutan DPPH λ maks hasil scanning λ maks rata-rata λ maks teoritis 0,02 mM 515,5 nm 0,04 mM 515,5 nm 515,5 nm 515-520 nm 0,08 mM 515,5 nm

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 41

Menurut Molyneux (2004), panjang gelombang teoritis untuk pengukuran

DPPH berkisar antara 515 nm-520 nm. Hasil scanning tiga konsentrasi larutan

DPPH didapatkan hasil panjang gelomabang maksimum rata-rata adalah 515,5 nm

(Tabel IV). Panjang gelombang ini masih masuk dalam kisaran panjang gelombang teoritis DPPH, yaitu 515-520 nm.

2. Penentuan Operating Time (OT)

Operating time merupakan waktu dimana reaksi yang terjadi sudah optimal. Menurut Mustariche (2012), pada rentang waktu tersebut senyawa uji dan larutan pembanding berada dalam keadaan reaksi sempurna dengan DPPH yang ditunjukan dengan diperolehnya absorbansi DPPH yang stabil. Pengukuran pada waktu OT bertujuan untuk meminimalkan kesalahan dalam memperoleh hasil pengukuran. Penetuan OT dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan

DPPH yang sudah direaksikan dengan larutan pembanding, yaitu kuersetin serta larutan uji, yaitu fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep. Pengukurun dilakukan pada konsentrasi rendah, tengah dan tinggi. Absorbansi diukur tiap 5 menit selama 60 menit.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 42

Operating time kuersetin 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

0.3 Absorbansi 0.2 0.1 0 0 20 40 60 80 Waktu (menit)

Gambar 8. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)

Penentuan OT Fraksi Etil Asetat 0.8 0.7 0.6 0.5 75 µg/mL 0.4 225 µg/mL 0.3

375 µg/mL Absorbansi 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Waktu (menit)

Gambar 9. Grafik Penetuan OT Fraksi Etil Asetat (Replikasi 1)

Dari hasil pengukuran OT yang terlihat pada gambar 7 dan gambar 8 menunjukan bahwa absorbansi stabil pada menit ke-30 hingga menit ke-60.

Dengan demikian, secara teoritis dapat disimpulkan bahwa pada menit ke-30

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 43

seluruh senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan pada larutan pembanding dan larutan uji sudah bereaksi dengan radikal DPPH, sehingga OT yang akan digunakan untuk reaksi radikal DPPH dengan larutan pembanding dan larutan uji adalah 30 menit.

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Validasi metode merupakan serangkaian prosedur yang digunakan untuk menjamin bahwa metode analisis dapat memberikan hasil seperti yang diharapakan dengan akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Hasil dari suatu analisis dengan metode yang valid akan memberikan hasil yang dapat dipertanggung jawabkan. Parameter metode analisis yang dinilai dalam pengujian ini yaitu presisi, linearitas dan spesifisitas.

Tabel V. Hasil pengukuran absorbansi seri baku kuersetin yang direaksikan dengan radikal DPPH

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi Kuersetin Absorbansi Kuersetin Absorbansi Kuersetin Absorbansi (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) 5,2 0,653 5 0,663 5 0,656 7,8 0,563 7,5 0,572 7,5 0,559 10,4 0,475 10 0,473 10 0,480 13 0,377 12,5 0,385 12,5 0,395 15,8 0,288 15 0,292 15 0,311 Persamaan regresi linear Persamaan regresi linear Persamaan regresi linear y = -0,035x + 0,833 y = -0,037x + 0,849 y = -0,028x + 0,82 r = -0,9997 r = -0,9998 r = -0,9995

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 44

Dari tiga replikasi yang dilakukan memberikan persamaan regresi linear yang berbeda tiap replikasinya. Berdasarkan nilai persamaan regresi linear seri baku kuersetin yang dihasilkan, dipilih persamaan dari hasil replikasi dua yaitu y

= -0,037x + 0,849 yang akan digunakan untuk menghitung nilai presisi

(Coefficient of variation) dari kuersetin. Persamaan tersebut dipilih karena nilai r dari replikasi dua menghasilkan nilai yang paling mendekati 1 atau -1, yaitu r = -

0,9998.

Tabel VI. Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang direaksikan dengan DPPH

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi Fraksi Absorbansi Fraksi Absorbansi Fraksi Absorbansi (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) 75,6 0,612 75 0,603 75 0,617 151,2 0,506 150 0,531 150 0,514 226,8 0,442 225 0,449 225 0,435 302,4 0,334 300 0,367 300 0,345 378 0,255 375 0,27 375 0,263 Persamaan regresi linear Persamaan regresi linear Persamaan regresi linear y = -0,088x + 0,695 y = -0,001x + 0,693 y = -0,001x + 0,697 r = -0,9975 r = -0,9986 r = -0,9991

Berdasarkan hasil (pada tabel VI) dari tiga replikasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang dilakukan dipilih persamaan replikasi tiga yaitu y = -0,001x + 0,697 dengan nilai r = 0,9991 sebagai persamaan yang akan digunakan untuk menghitung coefficient of variation (CV) untuk fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 45

1. Presisi metode uji aktivitas antioksidan

Presisi merupakan keterulangan dan ketertiruan dari perolehan hasil analisis beberapa kali terhadap sampel yang dianalisis dengan metode yang digunakan. Presisi dari metode analisis dinyatakan dalam Coeffisien of Variant

(CV). Menurut Kingstone (2004), CV yang baik adalah CV ≤ 20% untuk konsentrasi analit <0,1%b/v.

Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar kuersetin

Rerata Rerata Konsentrasi konsentrasi %IC SD % CV Rendah 5,067 23,654 0,0051 0,781 Tengah 10,133 44,716 0,0037 0,757 Tinggi 15,267 65,506 0,0122 4,137

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukan pada tabel VII, didapat nilai % CV 0,0781 %, 0,757 %, 4,137 % untuk tiga konsentrasi standar kuersetin yang digunakan. Nilai ini masih masuk dalam persyaratan % CV menurut

Kingstone (2004), dimana CV yang baik adalah CV ≤ 20% dengan konsentrasi analit <0,1%b/v.

Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat

Rerata Rerata Konsentrasi konsentrasi %IC SD % CV Rendah 86 26,475 0,0070 1,162 Tengah 255 46,792 0,0070 1,584 Tinggi 434,4 68,380 0,0075 2,857

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukan pada tabel VIII, didapat

% CV fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dari tiga konsentrasi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 46

yaitu 1,162 %, 1,584 %, 2,857 %. Nilai ini juga masih masuk dalam persyaratan

% CV menurut Kingstone (2004), dimana CV yang baik adalah CV ≤ 20% dengan konsentrasi analit <0,1%b/v, sehingga dari hasil yang diperoleh dapat disimpulkan metode analisis yang digunakan memiliki presisi yang baik.

2. Lineritas metode uji antioksidan

Linearitas merupakan suatu gambaran mengenai kemampuan suatu prosedur analisis untuk menghasilkan hubungan yang proporsional antara konsentrasi analit dalam sampel dengan hasil yang diberikan, baik secara langsung atau dengan transformasi dari perhitungan matematik yang baik.

Linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r). Dalam penentuan kurva kalibrasi yang baik, konsentrasi minimal terdiri dari lima konsentrasi dengan jarak antara 50-150%. Sedangkan menurut Chan et al., (2004), untuk koefisien korelasi adalah 0,995 ataupun diharapkan lebih dari nilai tersebut.

Berdasarkan hasil tiga repikasi yang ditunjukan pada tabel V untuk validasi metode analisis kuersetin, didapatkan persamaan regresi linear untuk replikasi satu, replikasi dua dan replikasi tiga berturut-turut adalah 0,9997, 0,9998, dan 0,9995. Dari tiga hasil tersebut nilai r yang dihasilkan masih memenuhi persyaratan linearitas menurut Chan et al (2005), dimana minimal koefisien korelasi linearitas yang baik minimal r = 0,995. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan dalam analisis kuersetin mempunyai linearitas yang baik.

Dari persamaan regresi linier fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang ditunjukan pada tabel VI, hasil dari tiga replikasi yang dilakukan didapatkan nilai koefisien korelasi berturut-turut adalah replikasi satu r

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 47

= 0,9975, r = 0,9986, dan r = 0,9991. Tiga hasil ini masih diatas nilai koefisien korelasi linearitas minimal menurut Chan et al (2005), yaitu r = 0,995. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan metode ini memiliki linieritas yang baik untuk menganalisis fraksi etil asetat ekstrak daun dadap serep.

3. Spesifisitas metode uji antioksidan

Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode analisis dalam mengukur dengan akurat respon analit dalam suatu matriks diantara komponen potensial lainnya didalam sampel. Dalam metode analisis ini yang menggunakan spektrofotometri visibel pada pengukuran kuersetin dan fraksi etil asetat sampel uji, spesifikasi metode dapat dilihat dengan tidak adanya serapan dari sampel sebelum ditambah DPPH pada panjang gelombang pengukuran yang digunakan yaitu 515,5 nm.

Berdasarkan hasil scanning pada larutan pembanding kuersetin

(Lampiran 6c ) dan larutan uji fraksi etil asetat (Lampiran 6e ) pada panjang gelombang 515,5 nm tidak terdapat serapan, sehingga ketika kuersetin maupun larutan uji fraksi etil asetat direaksikan dengan radikal DPPH maka yang terbaca hanya absorbansi DPPH hasil reaksi. Dari hasil tersebut maka dapat disimpulkan metode uji aktivitas antioksidan untuk kuersetin dan fraksi etil asetat memiliki spesifitas yang baik.

Dari hasil validasi metode analisis yang dilakukan menunjukkan bahwa metode penangkapan radikal bebas DPPH oleh kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep sebagai antioksidan terbukti sudah baik dalam linearitas, presisi dan spesifisitas sehingga hasil yang diperoleh dapat dipercaya.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 48

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Radikal DPPH

Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan. Aktivitas diukur secara spektrofotometri dengan menghitung jumlah pengurangan intensitas warna ungu larutan DPPH yang sebanding dengan jumlah DPPH yang beraksi dengan senyawa antioksidan.

Menurut Zuhra et al., (2008), peredaman tersebut dihasilkan oleh bereaksinya molekul Difenil Pikril Hidrazil dengan atom hidrogen yang dilepaskan satu molekul komponen sampel sehingga terbentuk senyawa Difenil Pikril Hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke kuning.

Dengan adanya penangkapan radikal DPPH menyebabkan terjadinya penurunan nilai absorbansi DPPH. Reaksi radikal DPPH terhadap senyawa fenolik adalah sebagai berikut :

O2N NO2

H N N NO2 + AH O2N N N + A

O2N NO2

DPPH Reduced Form DPPH Free Radical Phenolic Compounds

Gambar 10. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan (Irshad et al., 2012) Mengenai pelarut yang digunakan, dalam penelitian ini menggunakan perlarut metanol karena menurut Molyneux (2004), telah diketahui metanol tidak memberikan interferensi pada reaksi yang terjadi. Pada penelitian ini digunakan kuersetin sebagai pembanding dalam uji aktivitas antioksidan. Digunakan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 49

kuersetin sebagai pembanding karena kuersetin termasuk flavonoid yang telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan.

Gambar 11. Struktur senyawa kuersetin (Cartea, 2010)

OH OH OH OH HO O

HO O DPPHH O OH O O H DPPH- OH O OH OH OH OH HO O

HO O O OH O O Kuersetin- OH O DPPH-

OH O OH OH OH O OH DPPH HO O O OH HO O HO OH O O OH OH OH O OH O HO O

O OH O

OH OH OH OH

HO O HO O

O O OH O OH O

Gambar 12. Usulan mekanisme reaksi antara kuersetin dan radikal DPPH

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 50

Pada gambar 12 menunjukan reaksi kuersetin dalam peredaman radikal

DPPH yang dihasilkan oleh bereaksinya molekul DPPH dengan atom hidrogen yang dilepaskan molekul kuersetin sebagai standar sehingga terbentuk senyawa

Difenil Pikril Hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke kuning. Pengurangan radikal DPPH juga disebabkan reaksi terminasi antara radikal DPPH dengan radikal kuersetin yang terbentuk.

Metode DPPH dalam analisis ini bertujuan untuk mengetahui parameter konsentrasi yang ekivalen memberikan 50 % efek aktivitas antioksidan (IC50).

IC50 didefinisikan sebagai konsentrasi efektif larutan uji yang dapat menurunkan

50% intensitas serapan blanko dan dapat dihitung dari persamaan regresi linear pada kurva konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak daun dadap serep terhadap persen peredaman. Semakin kecil harga IC50 yang dihasilkan menunjukan kemampuan menangkap radikal bebas yang semakin kuat. Persamaan regresi linier dan hasil perhitungan % IC untuk standar kuersetin ditunjukan pada tabel IX dan gambar 13 persamaan regresi linier dan hasil perhitungan % IC untuk fraksi etil asetat ditunjukkan pada tabel X dan gambar 14, sedangkan hasil IC50 untuk kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep di tunjukan pada tabel XI.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 51

Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH

Konsentrasi Replikasi (µg/mL) % IC Persamaan regresi linier 5,2 24,246 7,8 34,687 I 10,4 44,896 y = 4,024x + 3,323 13 56,265 r=0,9997 15,8 66,589 5 22,817 7,5 33,411 II 10 44,936 y = 4,326x + 1,210 12,5 55,180 r=0,9999 15 66,007 5 23,898 7,5 35,151 III 10 44,315 y = 3,949x + 4,994 12,5 54,176 r=0,9995 15 63,921

Kurva konsentrasi kuersetin vs %IC Kuersetin 80 70 60 50 y = 4.326x + 1.210 40 R² = 0.9999 30

%IC Kuersetin %IC 20 10 0 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 Konsentrasi kuersetin (µg/mL)

Gambar 13. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 52

Tabel X. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan metode DPPH Replikasi Konsentrasi (µg/mL) % IC Persamaan regresi linier 75,6 26,176 151,2 38,963 I 226,8 46,683 y = 0,141x + 16,09 302,4 59,710 r = 0,9975 378 69,240 75 28,129 150 36,710 y = 0,131x + 17,40 II 225 46,484 r = 0,9986 300 56,257 375 67,819 75 25,121 150 37,621 y = 0,141x + 15,30 III 225 47,209 r = 0,9991 300 58,131 375 68,083

Kurva konsentrasi fraksi etil asetat vs %IC fraksi etil asetat 80 70 60 y = 0.141x + 15.30 50 r = 0.9991 40 30 20

%IC fraksi etil asetat etil fraksi %IC 10 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Konsentrasi fraksi etil asetat (µg/mL)

Gambar 14. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 53

Tabel XI. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep

IC50 (µg/mL) Replikasi Replikasi Replikasi Rata-rata Bahan Uji 1 2 3 (µg/mL) SD % CV Kuersetin 11,593 11,278 11,443 11,438 0,157 1,377 Fraksi etil asetat 240,496 248,855 246,099 245,150 4,425 1,736

Dari tabel XI, nilai % CV yang dihasilkan untuk sampel kuersetin dan fraksi etil asetat berturut-turut sebesar 1,377 % dan 1,736 %. Dari hasil tersebut dapat dikatakan bahwa CV yang dihasilkan menurut Kingstone (2004) memenuhi persyaratan analisis, yaitu ≤ 20%, hal ini berarti bahwa uji aktivitas antioksidan yang dilakukan mempunyai presisi yang baik.

Berdasarkan hasil perhitungan yang ditunjukan pada tabel XI, rata-rata

IC50 kuersetin adalah 11,438 ± 0,157 µg/mL dan rata-rata IC50 fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep adalah 245,150 ± 4,425 µg/mL. Dari hasil nilai

IC50 tersebut diketahui bahwa kuersetin memiliki aktivitas antioksidan lebih besar dibandingkan dengan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

Berdasarkan tingkat kekuatan aktivitas antioksidan menurut Aryanto (2006), kuersetin berada pada tingkat antioksidan sangat kuat (< 50 µg/mL), sedangkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep pada tingkat lemah (> 150

µg/mL).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 54

Tabel XII. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep (Aryanto, 2006)

Intensitas Nilai IC50 Kuersetin Fraksi etil asetat ekstrak etanolik Sangat kuat <50 µg/mL √ Kuat 50-100 µg/mL - - Sedang 101-150 µg/mL - - Lemah >150 µg/mL - √

Data hasil IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat kemudian dianalisa secara statistik untuk melihat signifikansi data dari kuersetin dan fraksi etil asetat. Dalam penelitian ini analisa data secara statistik menggunakan software R 2.14.1. Hal pertama yang dilakukan adalah melakukan pengujian distribusi normal data IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat . Hal ini dilakukan untuk mengetahui langkah selanjutnya apakah akan menggunakan uji parametrik atau non-parametrik.

Pengujian distribusi normal data dilakukan menggunakan uji normalitas Shapiro- wilk. Pemilihan uji normalitas Shapiro-Wilk karena menurut Dahlan (2012), jika data yang digunakan berjumlah kurang dari lima puluh maka uji normalitas data menggunakan uji normalitas Shapiro-wilk. Hipotesis null (Hnull) adalah data IC50 terdistribusi normal sedangkan hipotesis alternatif adalah data IC50 terdistribusi tidak normal. Berdasarkan hasil yang diperoleh nilai P untuk IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat berturut-turut sebesar 0,9488 dan 0,6291. Nilai signifikansi yang diperoleh untuk kuersetin dan fraksi etil asetat lebih besar dari nilai signifikansi

0,05 (taraf kepercayaan 95%), oleh karena itu Hnull diterima. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan data IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat terdistribusi normal.

Dari hasil analisis data yang secara statistik diketahui terdistribusi normal, maka langkah selanjutnya melakukan uji parametrik, yaitu uji T tidak

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 55

berpasangan. Hipotesis null (Hnull) adalah nilai IC50 kuersetin tidak lebih kecil daripada fraksi etil asetat dan hipotesis alternatif yang digunakan adalah nilai IC50 kuersetin lebih kecil daripada fraksi etil asetat. Hasil pengujian statistik diperoleh nilai signifikansi sebesar 0,000 antara kuersetin dan fraksi etil asetat. Dari hasil yang diperoleh jika dibandingkan dengan nilai signifikansi yang ditentukan, yaitu

0,05 maka Hnull ditolak karena nilai signifikansi yang dihasilkan lebih kecil daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Dari hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 kuersetin lebih kecil daripada fraksi etil asetat.

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total

1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan operating time (OT) dilakukan dengan mengukur absorbansi tiap 5 menit dalam rentang waktu 30 menit. OT merupakan waktu dimana reaksi yang terjadi antara asam galat dan reagen Folin-Ciocalteu sudah optimal yang ditunjukkan dengan absorbansi yang stabil.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 56

Operating Time Asam Galat

0.9 0.8 0.7 0.6 50 ppm 0.5 100 ppm 0.4 150 ppm

Absorbansi 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 Waktu (menit)

Gambar 15. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukkan pada grafik penentuan OT asam galat menunjukan dari menit ke-10 sampai ke-30 absorbansi senyawa hasil reaksi asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu terbentuk secara stabil. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa OT penetapan kandungan fenolik total adalah 10 menit.

2. Penentuan panjang gelombang maksimum

Panjang gelombang maksimum ditentukan untuk mendapatkan serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu.

Menurut Gansch, Weber, dan Lee (2009), panjang gelombang maksimum untuk hasil reaksi Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenolik adalah 750-765. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan melakukan scanning pada panjang gelombang 600-800 nm pada tiga konsentrasi larutan asam galat

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 57

Tabel XIII. Hasil scanning panjang gelombang maksimum

Konsentrasi larutan λ maks λ maks λ maks Asam galat hasil scanning rata-rata teoritis

150 µg/mL 754 100 µg/mL 744 750,3 750 50 µg/mL 753

Hasil Scanning tiga konsentrasi asam galat yang sudah direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu didapatkan hasil panjang gelombang maksimum rata-rata adalah 750 nm. Oleh karena itu dalam menentukan kandungan fenolik total menggunakan panjang gelombang 750 nm.

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total

Validasi metode penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan analisis presisi, linearitas dan spesifisitas dari tiga replikasi larutan baku asam galat yang digunakan.

1. Presisi metode penetapan kadar kandungan fenolik total

Presisi metode analisis dinyatakan dengan koefisien variasi atau CV.

Menurut Harmita (2004), kadar analir sekitar 100 ppm CV kurang dari 5 % dapat dikatakan metode tersebut memberikan presisi yang baik. Dari ketiga tingkat konsentrasi yang dibuat, nilai % CV yang dibuat masuk dalam % CV yang dipersyaratkan sehingga metode ini dapat dikatakan memilki presisi yang baik.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 58

Tabel XIV. Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter

rata-rata Sampel SD %CV absorbansi Seri 1 0,328 0,01 2,940 Seri 2 0,446 0,006 1,400 Seri 3 0,554 0,01 1,854 Seri 4 0,660 0,013 1,97 Seri 5 0,773 0,015 1,992

2. Linieritas metode penetapan kandungan fenolik total

Linieritas merupakan kemampuan dari suatu metode untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang ditentukan. Pada persamaan regresi linear yang didapat dari tiga replikasi asam galat adalah replikasi satu sebesar 0,9993, replikasi dua sebesar 0,9995 dan replikasi tiga sebesar 0,9999. Menurut Harmita (2004), persyaratan linearitas yang baik jika nilai r lebih besar atau mendekati 0,999, maka dapat dikatakan bahwa kurva baku memenuhi persyaratan linearitas.

Tabel XV. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu

Asam galat Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) terukur (µg/mL) terukur (µg/mL) terukur 50 0,321 49,8 0,324 51 0,339 75 0,444 74,7 0,453 76,5 0,441 100 0,545 99,6 0,565 102 0,551 125 0,652 124,5 0,675 127,5 0,653 150 0,777 149,4 0,786 153 0,756 y = 0,004x + 0,0998 y = 0,004x + 0,1022 y = 0,004x + 0,1296 r= -0,9993 r = 0,9995 r = 0,9999

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 59

3. Spesifisitas metode penetapan kandungan fenolik total

Berdasarkan hasil scanning pada larutan asam galat (Lampiran 12) dan fraksi etil asetat pada panjang gelombang 750 nm tidak terdapat serapan. Hal ini berarti bahwa hanya hasil reaksi asam galat atau fraksi etil asetat dengan pereaksi

Folin-Ciocalteau saja yang terbaca pada panjang gelombang 750 nm tanpa adanya respon pembacaan absorbansi dari senyawa lain. Oleh karena itu, metode penetapan kandungan fenolik total untuk asam galat dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep memiliki spesifisitas yang baik.

J. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total

Penetapan kandungan fenolik total dalam penelitian ini dilakukan secara spektrofotometri dengan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu menggunakan asam galat sebagai pembanding. Menurut Cicco dan Lattanzio (2011), metode

Folin-Ciocalteu (F-C) merupakan metode kolorimetri yang sering digunakan yang berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan natrium karbonat, yang akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk mereduksi kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat warna kuning F-C menjadi berwarna kompleks berwarna biru, yang dapat diukur secara spektrofotometri. Semakin besar konsentrasi senyawa fenol maka semakin banyak ion fenolat yang akan mereduksi kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 60

O H (PMo O ) OH 2 12 12

+ atau + H2O H3PO4(MoO3)12 +

H7(PMo12O10) O reagen Folin-Ciocalteu Senyawa fenol kuinon Kompleks molybdenum-blue

Gambar 16. Reaksi pembentukan kompleks molybdenum-blue (Singleton dan Rossi, 1965)

Kurva persamaan regresi linear 0.8 0.7 0.6 y = 0.004x + 0.129 0.5 r = 0.9999 0.4 regresi linear asam 0.3 galat

Absorbansi 0.2 Linear (regresi linear asam galat) 0.1 0 0 50 100 150 200 Konsentrasi asam galat (µg/mL)

Gambar 17. Kurva kalibrasi asam galat dalam penetapan fenolik total

Tabel XVI. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep

Kandungan fenolik Sampel rata-rata SD CV total Replikasi 1 8,30 Replikasi 2 8,57 8,507 0,183 2,156 Replikasi 3 8,65

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 61

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukan pada gambar 17, didapat persamaan regresi linear replikasi tiga yaitu y = 0,004x + 0,129 dengan r =

0,9999. Persamaan ini dipilih karena merupakaan persamaan regresi linear yang memiliki nilai r paling mendekati 1. Dari hasil perhitungan didapatkan hasil kandungan fenolik total rata-rata pada sampel sebesar 8,507 ± 0,183 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep

dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan sebagai IC50 rata-rata

sebesar 245,15 ± 4,425 µg/mL dan metode yang digunakan belum tervalidasi.

2. Kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap

serep yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat rata-rata sebesar

8,51 ± 0,18 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanolik

daun dadap serep dan metode yang digunakan belum tervalidasi.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian aktivitas antioksidan dari fraksi air ekstrak etanolik

daun dadap serep untuk melihat potensi aktivitas antioksidan dari fraksi air

tersebut.

2. Perlu dilakukan penelitian untuk melihat potensi aktivitas lainnya (seperti

aktivitas antibakteri) dari daun tanaman dadap serep.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 63

Daftar Pustaka

Anonim, 2007, PROSEA Plant Resources of South-East Asia 11 Auxiliary plants, LIPI Press, Jakarta, pp.127-130 APVMA, 2004, Guidelines for The Validation of Analytical Methods for Active Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products , Kingston Ariyanto,R., 2006, Uji Aktivitas antioksidan, Penentuan Kandungan Fenolik dan Flavonoid Total Fraksi Kloroform dan Fraksi Air Ekstrak Metanolik Pegagan (Centella asiatica L. Urban), Skripsi, Universitas Gadjah Mada Atawodi, S.E., 2005, Antioxidant potential of African medicinal plants, Afr. J. Biotechnol, Vol. 4 (2), 128 Backer CA, dan Bakhuizen van den Brink RC, 1965. Flora of Java, Vol. 2. Noordhoff, Groningen, The Netherland, pp. 626–628 Bondet, V., Brand-Williams, W. and Berset, C., 1996, Kinetics and Mechanisms of Antioxidant Activity using the DPPH• Free Radical Method, Lebensm.- Wiss. U.-Technol., vol. 30, 609–615 Cartea, M.E., Francisco, M., Soengas, P., and Velasco, P., 2010, Phenolic Compounds in Brassica Vegetables, Molecules, 16, 251-280 Chan, Chung Chow, Lam, Herman, Lee, and Y.C., Zhang, Xue-Ming, 2004, Analtytical Method Validation and Instrument Performance Verification, Jhon Wiley and Sons, Inc., New Jersey Cicco, N., and Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial Carbonate Concentration on the Folin-Ciocalteu Micro-Method for the Determination of Phenolics with Low Concentration in the Presence of Methanol: A Comparative Study of Real-Time Monitored Reactions, American Journal of Analytical Chemistry,840-844 Dahlan, M.S., 2012, Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika, Jakarta, pp. 37, 42-49 Depkes RI, 1986, Sediaan Galenik, Departemen kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 2, 10-13 Desmiaty, Y., Julia, R., Ika, R., 2008, Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas Daun Cerme (Phyllanthus acidus (L.) Skeels), Jurnal Farmasi Indonesia, 70 – 74 Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986, Sediaan Galenik, Jilid 2, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 11-12 Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 1036, 1061 Estrada, E.I., 2010, Actividad Antioxidante De Alcaloides De Erythrina Americana Miller, Tesis, Campus Montecillo, Mexico

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 64

Fu, L., Xu, B.T., Gan, R.Y., Zhang, Y., Xu, X.R., Xia, E.Q., and Li, H.B., 2011, Total Phenolic Contents and Antioxidant Capacities of Herbal and Tea Infusions, Int. J. Mol. Sci., 12, 2112-2124 Gandjar, I. G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, PP: 46-48, 465-472 Gansch, H., Weber, C.A., and Lee, C.Y., 2009, Antioxidant Capacity and Phenolic Phytochemicals in Black Raspberries, New York Fruit Quarterly, 17(1), 19-21 Harborne, J.B., 1998, Phytochemical Methods : a guide to modern techniques of plant analysis, Third edition, Chapman & Hall, London, pp 4-6 Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Ed. 2, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung, 47- 109 Harmita, 2004, Majalah Ilmu Kefarmasian Vol.I, No.3: Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara, Departemen Farmasi FMIPA UI, Jakarta, pp. 117-135 Irshad, Md., Zafaryab, Md., Singh, M., and Rizvi, M.M.A., 2012, Comparative Analysis of the Antioxidant Activity of Cassia fistula Extracts, Int.J.Med.Chem., Volume 2012, 1-6 Josephy, P.D., 1997, Molecular Toxicology, Oxford University Press, New York, pp. 44-103 Kingston, 2004, Guidelines for The Validation of Analytical methods for Active Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products, Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci.Technol., 26(2), 211-219 Mustarichie, R., Moektiwardoyo, M., Levita, J., Supriyatna, Muhtadi, A., Subarnas, A., and Udin, L.Z., 2012, The Research Evidence of Antioxidant and Anti-Cancer Activity of Genistein Content In The Indonesia Traditional Food (Oncom) Ethanol Extract, Int. Res J Pharm. App Sci., 2(5), 65-73 Prakash, Aruna Ph. D., 2001, Antioxidant Activity, takes you into the Heart of a Giant Resource Volume 19 Number 2, 1,2 Purwanto, I., 2007, Mengenal Lebih Dekat Leguminosae, Kanisius, Yogyakarta, pp. 77-78

Qader, S.W., Abdulla M.A., Chua L.S., Najim N., Zain M.M., and Hamdan S., 2011, Antioxidant, Total Phenolic Content and Cytotoxicity Evaluation of Selected Malaysian Plants, Molecules, 3434

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 65

Raaman, N., 2006, Phytochemical Techniques, New India Publishing Agency, New Delhi, pp. 10-11 Rasooli, I., 2011, Bioactive Compounds in Phytomedicine, InTech, Croatia, pp. 163-179 Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, edisi keenam, penerbit ITB, Bandung, pp. 191-209 Rollando, 2012, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2- Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Air Ekstrak Metanol Daun Sirih (Piper Betle L.), Skripsi, 27-34, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Rukachaisirikul, T., Innok, P., Aroonrerk, N., Boonamnuaylap, W., Limrangsun, S., Boonanyon, C., Woonjina, U., Suksamrarn, A., 2007, Antibacterial Pterocarpans From Erythrina subumbrans, J.Ethnopharmacol., 110, 171- 175 Samanta, A., Das, G., Das, S.K., 2011, Roles of Flavonoids in Plants, Int J Pharm Sci Tech, Vol-6, 12-28 Sapakal V. D., Shikalgar T. S., Ghadge R. V., Adnaik R.S., Naikwade N. S., Magdum C. S. 2008, In Vivo Screening of Antioxidant Profile : a review, Journal of Herbal Medicine and Toxicology, 1-2 Silalahi, J., 2006, Makanan Fungsional, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, p. 41 Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolic with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147 Snyder L.R., and Kirkland J.J,1997, Practical HPLC Method Development, 2nd Ed, John Wiley and sons United States Department of Agriculture (USDA), 2011, Natural Resources Conservation Service,http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=ERSU15, diakses tanggal 3 Februari 2013 Wangcharoen, W. dan Morasuk, W., 2007a, Antioxidant Capacity and Phenolic content of Some Thai Culinary Plants, Mj. Int. J.Sci.Tech., 01(02), 100- 106 World Health Organization, 2003, WHO guidelines on good agricultural and collection practices (GACP) for medicinal plants, World Health Organization, Geneva, pp. 13-16, 55-60 Zuhra, C.F., Tarigan, J., dan Sihotang, H., 2008, Aktivitas Antioksidan Senyawa Flavonoid dari Daun Katuk (Sauropus androgunus (L) Merr.), Jurnal Biologi Sumatera, pp. 7 – 10

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 66

LAMPIRAN Lampiran 1.Surat determinasi tanaman dadap serep

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 67

Lampiran 2. Gambar tanaman dadap serep dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 68

Lampiran 3. Perhitungan rendemen

Cawan1 Cawan 2 Cawan 3 (g) (g) (g)

Bobot cawan 59,1322 59,4312 59,2913

Bobot 64,3125 63,7355 64,0414 cawan+ekstrak Bobot ekstrak 5,1803 4,3043 4,7501

Total bobot ekstrak 14,2347

Bobot serbuk daun dadap yang digunakan = 100 g Bobot total ekstrak etanol = 14,2347 g

Rendemen ekstrak etanol = 퐵표푏표푡 푒푘푠푡푟푎푘 푒푡푎푛표푙 x 100% 퐵표푏표푡 푠푒푟푏푢푘 푑푎푢푛 푦푎푛푔 푑푖푔푢푛푎푘푎푛 = 14,2347 푔 x 100% 100 푔 = 14,2347 %

Bobot fraksi etil asetat = 0,4238 g

Rendemen fraksi etil asetat = 퐵표푏표푡 푓푟푎푘푠푖 x 100% 퐵표푏표푡 푠푒푟푏푢푘 푑푎푢푛 푦푎푛푔 푑푖푔푢푛푎푘푎푛 = 0,4238 x 100% 100 = 0,4238 %

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 69

Lampiran 4. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan a. Penimbangan DPPH Replikasi 1 (g) Repilkasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Bobot kertas 0,2123 0,2129 0,2130 Bobot kertas + DPPH 0,2279 0,2286 0,2289 Bobot kertas + sisa 0,2123 0,2129 0,2130 Bobot DPPH 0,0156 0,0157 0,0159 b. Penimbangan Kuersetin Replikasi 1 Repilkasi 2 Replikasi 3 (g) (g) (g) Bobot kertas 0,2347 0,2326 0,2439 Bobot kertas + kuersetin 0,2373 0,2352 0,2465 Bobot kertas + sisa 0,2348 0,2327 0,2439 Bobot zat 0,0025 0,0025 0,0026 c. Penimbangan sampel uji Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Bobot cawan 14,5897 14,114 14,1086 Bobot cawan + fraksi 14,6025 14,1266 14,1211 Bobot cawan + sisa 14,5899 14,1141 14,1086 Bobot zat 0,0126 0,0125 0,0125

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 70

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi pengujian aktivitas antioksidan a. Konsentrasi DPPH Replikasi 1

BM = 394,33

Mol = massa = 15,6 mg = 0,0395 mmol BM 394,33 M = mol = 0,0395 mmol = 0,395 mM volume 0,1 L

Replikasi 2

BM = 394,33

Mol = massa = 15,7 mg = 0,0398 mmol BM 394,33 M = mol = 0,0398 mmol = 0,398 mM volume 0,1 L

Replikasi 3

BM = 394,33

Mol = massa = 15,9 mg = 0,0403 mmol BM 394,33 M = mol = 0,0403 mmol = 0,403 mM volume 0,1 L b. Konsentrasi Kuersetin Kosentrasi larutan induk Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

2,5 mg = 250 µg/mL 2,5 mg = 250 µg/mL 2,6 mg = 260 µg/mL 10 mL 10 mL 10 mL

Konsentrasi seri larutan pembanding kuersetin

Konsentrasi larutan pembanding Seri larutan pembanding Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Seri 1 5 µg/ml 5 µg/ml 5,2 µg/ml Seri 2 7,5 µg/ml 7,5 µg/ml 7,8 µg/ml Seri 3 10 µg/ml 10 µg/ml 10,4 µg/ml Seri 4 12,5 µg/ml 12,5 µg/ml 13 µg/ml Seri 5 15 µg/ml 15 µg/ml 15,6 µg/ml

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 71

Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding (Replikasi 1) Larutan induk = 250 µg/mL Konsentrasi larutan pembanding (seri 1) =

C1 x V1 = C2 x V2

250 µg/mL x 0,2 mL = C2 x 10 mL

C2 = 5 µg/mL b. Konsentrasi sampel uji fraksi etil asetat Konsentrasi larutan induk Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 12,6 mg = 504 µg/mL 12,5 mg = 500 µg/mL 12,5 mg = 500 µg/mL 25 mL 25 mL 25 mL

Konsentrasi seri larutan uji fraksti etil asetat Konsentrasi larutan sampel (µg/mL) Seri larutan uji Replikasi Replikasi 2 Replikasi 3 1 Seri 1 75,6 75 75 Seri 2 151,2 150 150 Seri 3 226,8 225 225 Seri 4 302,4 300 300 Seri 5 378 375 375

Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding (Replikasi 2) Larutan induk = 500 µg/mL Konsentrasi larutan sampel uji (seri 1) =

C1 x V1 = C2 x V2

500 µg/mL x 1,5 mL = C2 x 10 mL

C2 = 75 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 72

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi a. Scanning metanol

b. Scanning metanol : air (1:1 v/v)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 73

c. Scanning Kuersetin

d. Scanning asam galat

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 74

e. Scanning fraksi etil asetat (400-600 nm)

f. Scanning fraksi etil asetat (600-800 nm)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 75

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan Operating Time 1. Penetuan OT kuersetin

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 517 nm 5 µg/mL 10 µg/mL 15 µg/mL 5 0,665 0,551 0,371 10 0,653 0,536 0,35 15 0,645 0,523 0,333 20 0,638 O,51 0,317 25 0,634 0,499 0,308 30 0,633 0,494 0,303 35 0,632 0,494 0,303 40 0,632 0,494 0,303 45 0,632 0,494 0,303 50 0,631 0,494 0,302 55 0,631 0,494 0,302 60 0,631 0,494 0,302 OT yang didapat 30 menit

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 517 nm 5 µg/mL 10 µg/mL 15 µg/mL 5 0,623 0,492 0,306 10 0,612 0,476 0,284 15 0,602 0,465 0,272 20 0,597 0,455 0,26 25 0,594 0,448 0,251 30 0,592 0,441 0,243 35 0,592 0,441 0,243 40 0,592 0,441 0,243 45 0,592 0,441 0,243

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 76

50 0,592 0,440 0,243 55 0,592 0,440 0,242 60 0,592 0,440 0,242 OT yang didapat 30 menit

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 517 nm 5 µg/mL 10 µg/mL 15 µg/mL

5 0,650 0,483 0,335 10 0,629 0,462 0,312 15 0,621 0,446 0,291 20 0,616 0,435 0,274 25 0,613 0,426 0,261 30 0,61 0,42 0,252 35 0,61 0,42 0,252 40 0,61 0,42 0,252 45 0,61 0,42 0,251 50 0,61 0,419 0,251 55 0,609 0,419 0,251 60 0,609 0,419 0,251

2. Penetuan OT fraksi etil asetat daun dadap serep

Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 517,0 nm Waktu (menit) 75 µg/mL 225 µg/mL 375 µg/mL 5 0,662 0,380 0,264 10 0,645 0,361 0,248 15 0,627 0,354 0,234 20 0,618 0,348 0,225 25 0,613 0,343 0,219 30 0,609 0,338 0,215 35 0,609 0,338 0,215 40 0,609 0,338 0,215 45 0,609 0,338 0,215 50 0,609 0,338 0,215 55 0,609 0,338 0,214 60 0,609 0,338 0,214 OT yang didapat 30 menit

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 77

Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 517 nm Waktu (menit) 75 µg/mL 225 µg/mL 375 µg/mL 5 0,616 0,398 0,335 10 0,604 0,370 0,311 15 0,595 0,352 0,293 20 0,588 0,341 0,279 25 0,585 0,333 0,272 30 0,582 0,327 0,267 35 0,582 0,327 0,267 40 0,582 0,327 0,267 45 0,582 0,327 0,267 50 0,582 0,327 0,266 55 0,582 0,327 0,266 60 0,582 0,326 0,266 OT yang didapat 30 menit

Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 517 nm Waktu (menit) 75 µg/mL 225 µg/mL 375 µg/mL 5 0,659 0,455 0,330 10 0,637 0,438 0,301 15 0,626 0,424 0,277 20 0,619 0,413 0,258 25 0,615 0,409 0,247 30 0,613 0,406 0,243 35 0,613 0,406 0,243 40 0,613 0,406 0,243 45 0,613 0,406 0,243 50 0,613 0,406 0,242 55 0,613 0,405 0,242 60 0,613 0,405 0,242 OT yang didapat 30 menit

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 78

b. Penentuan λ maksimum 1. Scanning DPPH 0,020 mM

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 79

2. Spektra DPPH 0,04 mM

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 80

3. Spektra DPPH 0,08 mM

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 81

4. Plot scanning λ maksimum

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH

% IC = Absorbansi (larutan kontrol) – Absorbansi sampel (larutan pembanding/uji) X 100%

Absorbansi larutan control a. Kuersetin Absorbansi Konsentrasi Absorbansi larutan Persamaan regresi Replikasi (µg/mL) kontrol pembanding % IC linier 5,2 0,653 24,2459 7,8 0,563 34,6868 I 10,4 0,862 0,475 44,8956 y = 4,024x + 3,323 13 0,377 56,2645 r=0,9997 15,8 0,288 66,5893

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 82

Konsentrasi 5 ,2 µg/mL

% IC = 0,862 −0.653 푥 100 % = 24,2459% 0,862 Konsentrasi 7,8 µg/mL

% IC = 0,862−0.563 푥 100 % = 34,6868% 0,862 Konsentrasi 10,4 µg/mL

% IC = 0,862 −0.475 푥 100 % = 44,8956% 0,862 Konsentrasi 13µg/mL

% IC = 0,862 −0.377 푥 100 % = 56,2645% 0,862 Konsentrasi 15,8 µg/mL % IC = 0,862 −0.288 푥 100 % = 66,5893% 0,862

Absorbansi Konsentrasi Absorbansi larutan Persamaan regresi Replikasi (µg/mL) kontrol pembanding % IC linier 5 0,663 22,8172 7,5 0,859 0,572 33,4109 II 10 0,473 44,9360 y = 4,326x + 1,210 12,5 0,385 55,1804 r=0,9999 15 0,292 66,0070 Absorbansi Konsentrasi Absorbansi larutan Persamaan regresi Replikasi (µg/mL) kontrol pembanding % IC linier 5 0,656 23,8979 7,5 0,862 0,559 35,1508 III 10 0,480 44,3155 y = 3,962x + 4,663 12,5 0,395 54,1763 r=0,9995 15 0,311 63,9211

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 83

b. fraksi etil asetat daun dadap serep Replikasi Konsentrasi Absorbansi Absorbansi % IC Persamaan (µg/mL) kontrol larutan sampel regresi linier uji 75,6 0,612 26,1761 151,2 0,506 38,9626 y = 0,141x + I 226,8 0,829 0,442 46,6828 16,09 302,4 0,334 59,7105 r = 0,9975 378 0,255 69,24

Konsentrasi 75,6 µg/mL % IC = 0,829−0.612 푥 100 % = 26,1761 % 0,829 Konsentrasi 151,2 µg/mL

% IC = 0,829−0.506 푥 100 % = 38,9626 % 0,829 Konsentrasi 226,8 µg/mL % IC = 0,829−0.442 푥 100 % = 46,6828 % 0,829 Konsentrasi 302,4 µg/mL

% IC = 0,829−0.334 푥 100 % = 59,7105 % 0,829 Konsentrasi 378 µg/mL

% IC = 0,829−0.255 푥 100 % = 69,24 % 0,829

Replikasi Konsentrasi Absorbansi Absorbansi % IC Persamaan (µg/mL) kontrol larutan regresi linier sampel uji 75 0,603 28,1287 150 0,531 36,7104 y = 0,131x + II 225 0,839 0,449 46,4839 17,40 300 0,367 56,2574 r = 0,9986

375 0,27 67,8188

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 84

Replikasi Konsentrasi Absorbansi Absorbansi % IC Persamaan (µg/mL) kontrol larutan regresi linier sampel uji 75 0,617 25,1214

150 0,514 37,6214 y = 0,141x + III 225 0,824 0,435 47,2087 15,30 300 0,345 58,1311 r = 0,9991

375 0,263 68,0825

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi air ekstrak metanol daun dadap serep a. Kuersetin Replikasi I Persamaan regresi linier : y = 4,024x + 3,323 ( y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL)

IC50 adalah nilai x saat y = 50 50 = 4,024x + 3,323

x = 50−3,323 = 11,5929µg/mL 4,024

Replikasi Persamaan IC50 (µg/mL) II y = 4,326x + 1,210 11,2783 III y = 3,949x + 4,994 11,4429 b. Fraksi etil asetat daun dadap serep Replikasi I Persamaan regresi linier : y = 0,141x + 16,09 ( y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL)

IC50 adalah nilai x saat y = 50 50 = 0,141x + 16,09 x = 50−16,09 = 240,4965 µg/mL 0,141

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 85

IC50 Replikasi Persamaan (µg/mL) II y = 0,131x + 17,40 248,855 III y = 0,141x + 15,30 246,0993

Lampiran 10. Penimbangan bahan pengujian kandungan fenolik total a. Data penimbangan asam galat Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Bobot Kertas 0,2246 0,2268 0,2431 Bobot Kertas + zat 0,2496 0,2519 0,2689 Bobot sisa 0,2246 0,227 0,2434 Bobot zat 0,0250 0,0249 0,0255 b. Data penimbangan fraksi etil asetat Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Bobot cawan 14,5925 14,1172 14,2864 Bobot cawan + fraksi 14,5975 14,1224 14,2915 Bobot cawan + sisa 14,5925 14,1174 14,2865 Bobot zat 0,005 0,005 0,005

Lampiran 11. Perhitungan konsentrasi pengujian fenolik total a. Konsentrasi asam galat Kosentrasi larutan induk Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 25,2 mg = 2500 µg/mL 24,9 mg = 2490 µg/mL 25,5 mg = 2550 µg/mL 10 mL 10 mL 10 mL

Kosentrasi larutan intermediet Replikasi 1 Replikasi 2

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

2500 µg/mL x 5 mL = C2 x 25 ml 2490 µg/mL x 5 mL = C2 x 25 mL

C2 = 500 µg/mL C2 = 498 µg/mL Replikasi 3

C1.V1 = C2.V2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 86

2550 µg/mL x 5 mL = C2 x 25 mL

C2 = 510 µg/mL

Konsentrasi seri larutan asam galat Replikasi 1 (500 µg/mL) Seri 1 Seri 2 Seri 3

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

500 µg/mL.1 = C2. 10 500 µg/mL.1,5 = C2. 10 500 µg/mL.2 = C2. 10

C2 = 50 µg/mL C2 = 75 µg/mL C2 =100 µg/mL

Seri 4 Seri 5

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

500 µg/mL.2,5 = C2. 10 500 µg/mL.3 = C2. 10

C2 =125 µg/mL C2 =150 µg/mL

Replikasi 2 (498 µg/mL) Seri 1 Seri 2 Seri 3

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

498 µg/mL.1 = C2. 10 498 µg/mL.1,5 = C2. 10 498 µg/mL.2 = C2. 10

C2 = 49,8 µg/mL C2 = 74,7 µg/mL C2 = 99,6 µg/mL

Seri 4 Seri 5

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

498 µg/mL.2,5 = C2. 10 498 µg/mL.3 = C2. 10

C2 = 124,5 µg/mL C2 = 149,4 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 87

Replikasi 3 (510 µg/mL)

Seri 1 Seri 2 Seri 3

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

510 µg/mL.1 = C2. 10 510 µg/mL.1,5 = C2. 10 510 µg/mL.2 = C2. 10

C2 = 51 µg/mL C2 = 76,5 µg/mL C2 = 102 µg/mL

Seri 4 Seri 5

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

510 µg/mL.2,5 = C2. 10 510 µg/mL.3 = C2. 10

C2 = 127,5 µg/mL C2 = 153 µg/mL

Konsentrasi Larutan Asam Galat (µg/mL) Absorbansi Seri larutan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 R1 R2 R3 Seri 1 50 49,8 51 0,321 0,324 0,339 Seri 2 75 74,7 76,5 0,444 0,453 0,441 Seri 3 100 99,6 102 0,545 0,565 0,551 Seri 4 125 124,5 127,5 0,652 0,675 0,653 Seri 5 150 149,4 153 0,777 0,786 0,756

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 88

Lampiran 12. Scanning kontrol asam galat

Lampiran 13. Optimasi penentuan kandungan fenolik total a. Penentuan Operating Time Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 750,0 nm Waktu (menit) 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,314 0,504 0,764 10 0,325 0,524 0,796 15 0,325 0,525 0,796 20 0,325 0,525 0,796 25 0,325 0,525 0,796 30 0,325 0,526 0,797 OT yang didapat 10 menit

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 89

Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 750,0 nm Waktu (menit) 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,296 0,522 0,727 10 0,303 0,548 0,758 15 0,306 0,548 0,759 20 0,306 0,548 0,759 25 0,306 0,548 0,76 30 0,306 0,548 0,76 OT yang didapat 10 menit

Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 750,0 nm Waktu (menit) 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,309 0,547 0,759 10 0,327 0,584 0,791 15 0,328 0,584 0,791 20 0,328 0,584 0,792 25 0,328 0,584 0,792 30 0,328 0,584 0,792 OT yang didapat 10 menit

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 90

b. Penentuan λ maksimum 1. Spektra asam galat 50 μg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 91

2. Spektra asam galat 100 μg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 92

3. Spektra asam galat 150 μg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 93

Lampiran 14. Perhitungan kandungan fenolik total

Sampel replikasi 1

Absorbansi sampel = 0,461

y = 0,004x + 0,129

0,461 = 0,004x + 0,129

0,461− 0,129 x = = 83 µg/mL 0,004

v 0,5 mL Kandungan fenolik total = x . = 0,083 mg/mL. m 0,005 g

= 8,3 mg ekivalensi asam galat per g fraksi

Sampel replikasi 2

Absorbansi sampel = 0,472

y = 0,004x + 0,129

0,472 = 0,004x + 0,129

0,472− 0,129 x = = 85,75 µg/mL 0,004

v 0,5 mL Kandungan fenolik total = x . = 0,0857 mg/mL. m 0,005 g

= 8,57 mg ekivalensi asam galat per g fraksi

Sampel replikasi 3

Absorbansi sampel = 0,475

y = 0.004x + 0.129

0,475 = 0.004x + 0.129

x = 0,475− 0,129 = 86,5 µg/mL 0,004

v 0,5 mL Kandungan fenolik total = x . = 0,0865 mg/mL. m 0,005 g

= 8,65 mg ekivalensi asam galat per g fraksi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 94

Lampiran 15. Hasil pengujian statistik dengan software R 2.14.1 a. Uji normalitas

b. Uji T tidak berpasangan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 95

BIOGRAFI PENULIS

Aldo Kristian, penulis skripsi dengan judul UJI

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN

METODE DPPH DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL

ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP

SEREP (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.), dilahirkan di kota Pontianak 20 Desember 1991 dari pasangan Bapak Yosep Puna S,Pd dan Ibu Magdalena. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di SD N 17 Pontianak pada tahun 1997 hingga 2003 lalu melanjutkan pendidikan menengah di SMP Santo Fransiskus Asisi Pontianak pada tahun 2003 hingga 2006. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan di SMA N 5 Pontianak pada tahun 2006 hingga 2009 dan melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2009 hingga 2013. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis aktif mengikuti berbagai kepanitian acara seperti acara Pharmacy Performance and Event Cup (2010) dan Temu alumni akbar (2012). Selain kegiatan dalam lingkungan kampus, penulis juga pernah menjadi relawan dalam pendataan demografis wilayah rawan bencana merapi yang diselenggarakan oleh United Nations Development Programme (UNDP) pada tahun 2012.