DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

TESIS DOCTORAL

EFECTO MODULADOR DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL EN LA CINÉTICA DE ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS DEL SISTEMA OXPHOS EN UN MODELO CELULAR DE ENFERMEDAD MITOCONDRIAL

Rosa María Pello Gutiérrez

MADRID, 11 DE MAYO DE 2013

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID

EFECTO MODULADOR DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL EN LA CINÉTICA DE ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS DEL SISTEMA OXPHOS EN UN MODELO CELULAR DE ENFERMEDAD MITOCONDRIAL

Memoria que presenta la Licenciada en Ciencias Biológicas Rosa María Pello Gutiérrez Para optar al grado de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid

Directora de Tesis: Dra. Cristina Ugalde Bilbao Co-director de Tesis: Dr. Miguel Ángel Martín Casanueva

Instituto de Investigación Hospital Universitario 12 de Octubre

Hospital Universitario 12 de Octubre Instituto de Investigación

Doña Cristina Ugalde Bilbao, Doctora en Ciencias, como Directora de Tesis y Don Miguel Ángel Martín Casanueva, Doctor en Ciencias, como co-Director de Tesis.

CERTIFICAN: Que Doña Rosa María Pello Gutiérrez, licenciada en Ciencias Biológicas, ha realizado bajo nuestra dirección en el Instituto de Investigación del Hospital Universitario 12 de Octubre (i+12) de Madrid, el trabajo titulado:

EFECTO MODULADOR DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL EN LA CINÉTICA DE ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS DEL SISTEMA OXPHOS EN UN MODELO CELULAR DE ENFERMEDAD MITOCONDRIAL.

Una vez supervisado el trabajo, consideramos que reúne todos los requisitos necesarios en cuanto a originalidad y calidad para ser presentado como Tesis Doctoral con el objeto de optar al título de Doctor en Ciencias Biológicas por la Universidad Autónoma de Madrid.

Madrid, a 30 de Abril de 2013

Dr. Miguel Ángel Dra. Cristina Ugalde Dr. Miguel Ángel Martín Fernández Moreno Bilbao Casanueva (Tutor) (Directora de Tesis) (co-Director de Tesis) Departamento de Instituto de Investigación Instituto de Investigación Bioquímica. Hospital Universitario 12 Hospital Universitario 12 Facultad de Medicina. de Octubre. de Octubre. Universidad Autónoma de Avenida de Córdoba s/n Avenida de Córdoba s/n Madrid. 28041 Madrid. 28041 Madrid.

Esta tesis doctoral ha sido realizada gracias a la concesión de un Contrato Post- Formación Sanitaria Especializada (expediente número CM-050088) por parte del Ministerio de Sanidad y Consumo / Fondo de Investigaciones Sanitarias / Instituto de Salud Carlos III, asignado a Doña Rosa Pello Gutiérrez. El presente trabajo ha sido financiado por un proyecto de investigación del Instituto de Salud Carlos III (número PI05-0647), concedido a la Dra. Cristina Ugalde Bilbao, así como por un proyecto de la Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña (número 2005-069), concedido al Dr. Miguel Ángel Martín Casanueva.

Agradecimientos______

En 1997 una estudiante de biología de la universidad de Oviedo se acercó al departamento de fisiología de la facultad de medicina, pues le picaba aquello de estar en el laboratorio, la investigación….. y es allí donde se empezó a picar por eso de hacer la “TESIS”, por ello he de agradecer a aquellos que me hicieron comenzar esta larga andadura …… para mí los tres mosqueteros (Tino, Paterson y Fini) y al pequeño D´Artacan (Natalia) por esos primeros y estupendos años donde pude presentar mi suficiencia investigadora, y hacer mis primeros pinitos en este mundillo, conocer el mundo de las ratas, y de la diabetes.

Como todos sabemos la vida del investigador es dura y más si lo haces por amor al arte como fue mi caso. Una se va haciendo mayor e intenta ganarse el pan, por lo que acabe en el Hospital Universitario 12 de Octubre en Madrid, donde pase buenos años de residente. Sin embargo no fue hasta el 2006 donde conocí a una investigadora nata, que regresaba a su país (España) tras varios años en el extranjero, me imagino que para conseguir una estabilidad familiar, e intentaba hacerse un hueco en este voraz mundo de investigadores. Aunque se que sus comienzos fueron duros, ahora no le falta trabajo, ideas, ilusión, ni proyectos remunerados (que sabemos que en este mundo es bastante importante). Y esa ilusión por su trabajo hizo posible que yo escribiera ésta Tesis. “Muchas gracias Cristina, por hacer realidad uno de mis sueños”, a parte de enseñarme el apasionante mundo de las proteínas y los blue-native y el juego que dan los cíbridos. Te debo una comida.

Seguro que la fecha del 1997 os ha sorprendido, más aun cuando estamos en el 2013…efectivamente 18 años para escribir una tesis. Y al final con prisas…

Por lo que en este camino he de agradecer a mucha gente que hiciera realidad este proyecto. Empezaremos por mi compañera de búfferes, MC, “que de cuantos” litros tenemos a nuestras espalda eh??….los chicos del laboratorio de al lado, Pi, un crac en el análisis de la cadena respiratoria, Sara, la chica de los Southern, el McGiver del laboratorio, Henry, la peque, Laura, María una madraza investigadora, y Aitor por ayudarme con la estadística, además de a Miguel Ángel , mi codirector, que me enseño la parte más bonita de ser analista, que existía algo más que “control F6” y por supuesto no me puedo olvidar de quien hoy es mi amigo y compañero de fatigas, Albert, un crac

de las PCRs y mi bibliotecario particular, entre otras muchas cosas, sin él, esto hubiera sido imposible. Y por supuesto no me puedo olvidar de la loca de Ines, de JC, el chico McArdle, ni de los que ya no están por el labo; la gallega Laurita, Yolanda, Rebe y Elena con las que compartí cafés, comidas y muchas horas. No me puedo olvidar de Miluchi, la más vital y moderna del labo, de Alberto y su punto de vista, de Paco y sus ideas, de Paz y de Joaquín Arenas, un ejemplo a seguir tanto a nivel científico como humano, quien construyó y sigue velando por este grupo.

Sin embargo estos últimos años también he de agradecer este proyecto a mi compañera de curro y amiga Bea, así como a mis técnicos favoritos Bea, Virgi, Marisa, David y Jose, por su insistencia en que la terminara. Jose puedo decirte que por fin me voy a comer el conejo de chocolate. Y a las chicas Padel “Toñi y Olga”, por esos partidillos entre corrección y corrección.

Mai, Nuri, parece increíble pero ahora ya no tengo escusa para no quedar….. Por fin he terminado.

Finalmente dar las gracias a mis Padres, por inculcarme el lema “todo lo que se empieza se termina”. Puedo deciros que lo he terminado.

Y a mi princesita, que ha conseguido que me pusiera fecha de entrega.

Un beso para todos, todos ocupáis un trocito de mi corazón, de todos me llevo algo bueno y de nuevo “Muchas gracias por acompañarme en este periodo de mi vida y hacerlo posible”.

Resumen______

La Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber (LHON) es la enfermedad mitocondrial más frecuente. Se trata de una atrofia óptica de herencia materna, que produce la degradación específica de las células ganglionares de la retina (CGR). Esta enfermedad está producida casi en su totalidad por tres mutaciones en el ADN mitocondrial (ADNmt) que afectan a subunidades esenciales para la función del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial: m.3460G>A en el gen ND1, m.11778G>A en el gen ND4 y m.14484T>C en el gen ND6. Un número cada vez mayor de evidencias clínicas sugiere el efecto modulador del fondo genético o haplogrupo mitocondrial en la expresión clínica de LHON. Sin embargo, hasta la fecha no se han aportado evidencias experimentales suficientemente claras que demuestren dicho papel modulador. El objetivo principal del presente trabajo constituyó el análisis del efecto del fondo genético mitocondrial en la biogénesis de los complejos del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS), utilizando cíbridos transmitocondriales control y portadores de las tres mutaciones LHON más prevalentes bajo distintos haplogrupos mitocondriales. En ensayos de electroforesis nativa en estado estacionario, se observó que tanto los niveles como las actividades enzimáticas de los complejos de la cadena respiratoria fueron comparables entre cíbridos control y mutantes. Sin embargo, la acumulación de intermediarios del complejo I sugería defectos en el ensamblaje o en la estabilidad de dicho complejo. Esta hipótesis se confirmó mediante experimentos de inhibición reversible de la traducción de proteínas mitocondriales con doxiciclina, que demostraron un retraso en la cinética de ensamblaje del complejo I en todas las líneas mutantes. Dicho retraso fue acompañado de retardos diferenciales en las cinéticas de ensamblaje de los complejos III y IV, el cual cuantitativamente dependía del fondo genético en el que se encontraba cada mutación. Estos datos sugieren que polimorfismos específicos en el ADNmt pueden modificar el potencial patogénico de las mutaciones LHON, afectando al ensamblaje global de los complejos del sistema OXPHOS.

Summary______

Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) constitutes the most frequent mitochondrial disorder. It is mostly due to three mitochondrial DNA (mtDNA) mutations in respiratory chain complex I subunit genes: m.3460G>A in the ND1 gene, m.11778G>A in the ND4 gene and m.14484T>C in the ND6 gene. Despite considerable clinical evidences, a genetic modifying role for the mtDNA haplogroup background in the clinical expression of LHON remains experimentally unproven. The aim of the current work was to investigate the effect of mtDNA haplogroups on the assembly of OXPHOS complexes in transmitochondrial hybrids (cybrids) harboring the three common LHON mutations. The steady-state levels of respiratory chain complexes appeared normal in mutant cybrids. However, an accumulation of low molecular weight subcomplexes suggested a complex I assembly/stability defect, which was further demonstrated by reversibly inhibiting mitochondrial protein translation with doxycycline. Our results showed differentially-delayed assembly rates of respiratory chain complexes I, III2, and IV amongst mutants belonging to different mtDNA haplogroups, revealing that specific mtDNA polymorphisms may modify the pathogenic potential of LHON mutations by affecting the overall assembly kinetics of OXPHOS complexes.

INDICE______ABREVIATURAS…….………………………………………..……………….….…14 INTRODUCCIÓN…………………………………………………....………..……...17 1. LA MITOCONDRIA………………………………………………………..……..17 1.1. CARACTERÍSTICAS DE LA HERENCIA DEL ADN MITOCONDRIAL...18 2. EL SISTEMA OXPHOS……………………………….……………....…………..19 3. EL COMPLEJO I…………………………………………………...... ……….....19 3.1. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN……………………..…...... 19 3.2. RUTA DE LOS ELECTRONES………………………...... …………….....22 3.3. ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO I EN HUMANOS…………………...…23 3.4. FACTORES DE ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO I…………………...... 25 3.4.1. NDUFAF1/CIA30…………………………..……………………25 3.4.2. Ecsit………………………………………………………..……..26 3.4.3. ACAD9…………………………………………….……………..26 3.4.4 TMEM126B……………………………………..……...………....26 3.4.5. NDUFAF2/NDUFA12L/B17.2L………….……….…..…………26 3.4.6. NDUFAF3/C3orf60 y NDUFAF4/C6orf66…………………..….26 3.4.7. NDUFAF5/C20orf7y NDUFAF6/C8orf38…………..……….….26 3.4.8. NUBPL/HuInd1/C14orf127………………………….…………..27 3.4.9. MidA/C2orf56 ………………………………...……..…………..27 3.4.10. Perfil filogenético del complejo I…………………..…...….…...27 4. SUPERCOMPLEJOS…………………………..………………………...….……..27 5. EL COMPLEJO I Y LA ENFERMEDAD MITOCONDRIAL……………..……..29 6. NEUROPATÍA ÓPTICA DE LEBER………………………….……………….…30 6.1. FACTORES GENÉTICOS………………………....….……………..…….32 6.1.1. Haplogrupos mitocondriales…………….……………………….32 6.1.2. Influencia de los genes ligados al cromosoma X……….…..……33 6.1.3. Influencia de los estrógenos y el papel de la NSE……...…....…..33 6.1.4 OPA1, PARL, MAPT……………………………………..……….34 6.2. FACTORES AMBIENTALES……………………..………………………..34 6.3. CONSECUENCIAS FISIOPATOLÓGICAS CELULARES DE LAS MUTACIONES ASOCIADAS A LHON.……………………….………..…..….35 6.4. MODELOS ANIMALES DE LHON………………………………………..36

HIPÓTESIS ………………..……………………………………….………………....38 MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………….…………………41 1. MATERIALES……………………………………………………………….……46 1.1. MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE LOS PACIENTES PORTADORES DE LAS MUTACIONES LHON………………….……...………………..…….…..41 1.1.1 Clínica de los pacientes con la mutación m.3460A>G en MT-ND1………41 1.1.1.1 Paciente con haplogrupo mitocondrial H12……….…...41 1.1.1.1 Paciente con haplogrupo mitocondrial H*……………..41 1.1.2 Clínica de los pacientes con la mutación m.1778A>G en MT-ND4……..41 1.1.2.1 Paciente con haplogrupo mitocondrial U5a……..…...... 41 1.1.2.2 Paciente con haplogrupo mitocondrial J1c…………….41 1.1.3 Clínica de los pacientes con la mutación m.14484T>C en MT-ND6….…41 1.1.3.1 Pacientes con haplogrupo mitocondrial J1b….………..41 1.1.3.2 Pacientes con haplogrupo mitocondrial J1c….………...41 1.2 CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS DE LAS LÍNEAS DE CÍBRIDOS TRANSMITOCONDRIALES EN ESTUDIO……..…………………..…………42 1.3 REACTIVOS, SOLUCIONES Y TAMPONES……..……………….……….44 1.4 OLIGONUCLEÓTIDOS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO DE LAS MUTACIONES PRIMARIAS DE LHON……...………………….………...….44 1.5 ANTICUERPOS……………………………………………………………45 1.5.1 Para el complejo I…………….………………………..……...... …....45 1.5.2 Para el complejo II ………………………………...…………....……….45

1.5.3 Para el complejo III .……..………………….………...…………..…….....45 1.5.4 Para el complejo IV ..…………………………….………………………45 1.5.5 Anticuerpos secundarios …………………..……...…….………….…….45 2. MÉTODOS……………………………………………………………….……..…46 2.1 GENERACIÓN DE CÍBRIDOS TRANSMITOCONDRIALES LHON…..…46 2.2 CULTIVOS CELULARES…....……………………………….…..………...47 2.3 INHIBICIÓN DE LA TRADUCCIÓN MITOCONDRIAL MEDIANTE TRATAMIENTO CON DOXICICLINA …………………..……………………...….48 2.4 DETECCIÓN MEDIANTE ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN DE LAS MUTACIONES LHON EN CÍBRIDOS TRANSMITOCONDRIALES……..…..49 2.4.1 Aislamiento de ADN total de cíbridos transmitocondriales ...... ………..49 2.4.2 Amplificación de los ácidos nucleicos y condiciones de PCR………...... 49

2.4.3 Purificación de fragmentos de ADN en geles de agarosa….…….…....…50 2.4.4 Detección de las mutaciones primarias de LHON mediante digestión de los fragmentos de ADN amplificados por PCR y purificados del gel ………….....50 2.4.4.1 Detección de la mutación m.3460A>G en MT-ND1…..…….…50 2.4.4.2 Detección de la mutación m.11778A>G en MT-ND4………….51 2.4.4.3 Detección de la mutación m.14484T>C en MT-ND6……...…...51 2.5 CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DE ADNmt ……..……51 2.6 ELECTROFORESIS AZUL NATIVA EN GELES DE POLIACRILAMIDA (BN-PAGE)…………...………………………………….………….………….52 2.6.1 Purificación de mitocondrias a partir de cíbridos transmitocondriales mediante tratamiento con digitonina ………………………...……..………….52 2.6.2 Preparación de muestras para ensayos de electroforesis azul nativa (BN- PAGE) ….……………………………………...…………...……….....………53 2.6.3 Electroforesis bidimensional azul nativa (BN-PAGE)…..….……………53 2.6.3.1 Preparación de geles de poliacrilamida para la electroforesis nativa en primera dimensión (1D-BN-PAGE) ……...…………….…....53 2.6.3.2 Electroforesis nativa en primera dimensión (1D-BN-PAGE) .....54 2.6.3.3 Electroforesis en segunda dimensión en condiciones desnaturalizantes (2D-BN/SDS-PAGE) …………..………...…...….….54 2.7 TRASFERENCIA E INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS UNIDAS A MEMBRANA (WESTERN BLOT)……………………………………..…..……56 2.8 ENSAYOS DE ACTIVIDAD EN GEL (IGAs) ……….……….…………….56 2.9 ESTADÍSTICA ……………………….…………………………….………56

RESULTADOS………………….……………….……………………………………57 1. CONFIRMACIÓN DE LOS NIVELES DE HOMOPLASMIA DE LAS MUTACIONES LHON EN CÍBRIDOS TRANSMITOCONDRIALES…...... …58 2. NIVELES ESTACIONARIOS DE LOS COMPLEJOS DE LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL EN CIBRIDOS LHON…..………….….….…60 2.1 ANÁLISIS DE LOS CIBRIDOS CON LA MUTACIÓN m.3460G>A EN MT- ND1………………………………………………….……………….…………63 2.2 ANÁLISIS DE LOS CÍBRIDOS CON LA MUTACIÓN m.11778G>A EN MT- ND4……………………………………………………..………………………63

2.3 ANÁLISIS DE LOS CÍBRIDOS CON LA MUTACIÓN M.14484T>C EN MT- ND6………………………………………………..……………………………63 2.4 ANÁLISIS DE LAS LINEAS CON HAPLOGRUPO MITOCONDRIAL J1……..……………………………………………………………………..…..63 2.5 POSIBLE INFUENCIA DE VARIACIONES EN LA MASA MITOCONDRIAL ……………………………………………………………………………….…64 3. ACUMULACIÓN DE INTERMEDIARIOS DEL COMPLEJO I EN CÍBRIDOS CON MUTACIONES LHON…………………………………………….……..……….....65 3.1 ANÁLISIS DE LAS LÍNEAS DE CÍBRIDOS LHON 3460/ND1 EN HAPLOGRUPOS H………………………………..………...…………..…..…65 3.2 ANÁLISIS DE LA LÍNEAS DE CÍBRIDOS LHON 11778/ND4 EN HAPLOGRUPOS U5 Y J1 …...……………………………..……………….….65 3.3 ANÁLISIS DE LAS LÍNEAS DE CÍBRIDOS LHON 14484/ND6 EN HAPLOGRUPO J1……………………………………………………………..66 4. CINÉTICA DE ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS DE LA CADENA RESPIRATORIA EN CIBRIDOS CONTROL……………………...... ……...…67 4.1 CINÉTICAS DE RECUPERACIÓN DE LA ACTIVIDAD Y ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO I……………………………………………..…………..…..68 4.2 CINÉTICAS DE ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO III ……………...…….69 4.3 CINÉTICAS DE ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO IV Y DEL

SUPERCOMPLEJO III2+IV………………………...………………………….69 5. INFLUENCIA DEL FONDO GÉNETICO MITOCONDRILA EN LAS CINÉTICAS DE ENSAMBLAJE Y ACTIVACIÓN DEL COMPLEJO I EN CIBRIDOS CON MUTACIONES PRIMARIAS DE LHON……………….………..70 5.1 ANÁLISIS DE LOS CÍBRIDOS CON LA MUTACIÓN m.3460A>G EN MT- ND1...... …71 5.1.1 Cinéticas de recuperación de la actividad en gel del complejo I ………….……71 5.1.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo I ………………………………...………72 5.2 ANÁLISIS DE LOS CÍBRIDOS CON LA MUTACIÓN m.11778G>A EN MT- ND4…..…………………………………………………………………………73 5.2.1 Cinéticas de recuperación de la actividad en gel del complejo I …………..…73 5.2.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo I ………………………………………73 5.3 COMPARATIVA DE LOS CÍBRIDOS CON LAS MUTACIONES en m.11778G>A y m.14484T>C HAPLOGRUPO J1 …...…………………….…74

5.3.1 Cinéticas de recuperación de la actividad en gel del complejo I ………………..74 5.3.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo I ………………..…………………..……75 6. INFLUENCIA DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL EN LAS CINÉTICAS DE ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS III y IV EN CÍBRIDOS CON MUTACIONES PRIMARIAS DE LHON…………………….…………..…..76 6.1 ANÁLISIS DE LOS CÍBRIDOS CON LA MUTACIÓN m.3460A>G EN ND1…………………………………………………..………..………..………76 6.1.1 Cinéticas de ensamblaje del complejo III …………..……………….….….…….…..76 6.1.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo IV …………………………….….………..….77

6.1.3 Cinéticas de ensamblaje del supercomplejo III2+IV ……………...…….………….78 6.2 ANÁLISIS DE LOS CÍBRIDOS CON LA MUTACIÓN m.11778G>AEN MT- ND4………………………………………………………….…...…………..…79 6.2.1 Cinéticas de ensamblaje del complejo III…………………………...…….……79 6.2.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo IV …………………………….………..…..…80

6.2.3 Cinéticas de ensamblaje del supercomplejo III2+IV…………………………………81 6.3 COMPARATIVA DE LOS CÍBRIDOS CON LAS MUTACIONES m.11778G>A y m.14484 T>C EN HAPLOGRUPO J1……………………..….82 6.3.1 Cinéticas de ensamblaje del complejo III …..…………....………………………82 6.3.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo IV …………………….…..……….…..…83

6.3.3 Cinéticas de ensamblaje del supercomplejo III2+IV…………...…….………….83

DISCUSIÓN………………………..……………………………….………………....85 1. INFLUENCIA DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL SOBRE LA BIOGÉNESIS DE LOS COMPLEJOS DE CADENA RESPIRATORIA EN CÍBRIDOS CONTROL.…………………………… ……….………………....….…87 2.INFLUENCIA DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL SOBRE LA BIOGÉNESIS DEL COMPLEJO I EN CÍBRIDOS PORTADORES DE MUTACIONES LHON………………………………………………...…………….89 3.INFLUENCIA DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL SOBRE LA BIOGÉNESIS DE LOS COMPLEJOS III Y IV EN CÍBRIDOS PORTADORES DE MUTACIONES LHON…………….……….….………………………….…………91 CONCLUSIONES…………………………………………………..……….………..99 BIBLIOGRAFÍA……...…………………………..…………...... 101

ANEXOS………...……………………………………………………………………115 ARTICULOS PUBLICADOS DURANTE EL DESARROLLO DE LATESIS 1. FORMA PARTE DE LA TESIS: Mitochondrial DNA background modulates the assembly kinetics of OXPHOS complexes in a cellular model of mitochondrial disease. Pello R, Martín MA, Carelli V, Nijtmans LG, Achilli A, Pala M, Torroni A, Gómez-Durán A, Ruiz-Pesini E, Martinuzzi A, Smeitink JA, Arenas J, Ugalde C. m Mol Genet. 2008 Dec 15;17(24):4001-11. 2. PUBLICADO DURANTE ESTE PERIODO: Impact of the mitochondrial genetic background in complex III deficiency.Gil Borlado MC, Moreno Lastres D, González Hoyuela M, Moran M, Blázquez A, Pello R, Marín Buera L, Gabaldon T, García Peñas JJ, Martín MA, Arenas J, Ugalde C. PLoS One. 2010 Sep 17;5(9).

Abreviaturas______

2D-BN/SDS-PAGE Segunda dimensión en condiciones desnaturalizantes de la electroforesis azul nativa. 1D-BN-PAGE Primera dimensión en condiciones nativas de la electroforesis azul nativa. ADN Ácido dexosirribonucleico. ADNmt ADN mitocondrial. ADNn ADN nuclear. ARN Ácido ribonucleico. ARNm ARN mensajero. ARNr ARN ribosómico. ARNt ARN de transferencia. ARNi ARN de interferencia. ATP Adenosín trifosfato. BN-PAGE Electroforesis azul nativa o blue native. CGR Células ganglionares de la retina. CI Complejo I, NADH ubiquinona deshidrogenasa. CII Complejo II, Succinato coenzima Q reductasa. CIII Complejo III, Ubiquinol citocromo c oxidoreductasa. CIV Complejo IV, Citocromo c oxidasa o COX.

CoQ Coenzima Q10 ó ubiquinona. CTE Cadena de transporte electrónico. CYTB Citocromo b.

CV Complejo V, Complejo ATP sintasa, FoF1-ATP sintasa. DOA Oftalmoplegia autosómica dominante. DMEM Medio Eagle modificado de Dulbecco. DMSO Dimetil sulfóxido. FADH Flavin adenosin deshidrogenasa. FBS Suero bovino fetal. FMN Flavín mononucleótido. GFP Proteína verde fluorescente. IGA Ensayo de actividad en gel.

LHON Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber. FILA Acidosis láctica neonatal. LS Síndrome de Leigh. MELAS Acrónimo de los síntomas: Miopatía, Encefalopatía, Acidosis Láctica y accidentes Cerebrovasculares. MTRNR1 Gen mitocondrial que codifica la subunidad 12S del ARNr mitocondrial. NADH Nicotín adenosín deshidrogenasa. NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato. NTB Azul de nitrotetrazolium. NT2 Línea celular de teratoma. OCT Tomografía de coherencia óptica. OXPHOS Fosforilación oxidativa. Pb Pares de bases. PCR Reacción en cadena de la polimerasa. PIRA Análisis de restricción mediante el uso de un primer modificado. PTP Poro permeable de transición de la membrana mitocondrial. RFLP Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción. ROS Especies reactivas del oxígeno.

INTRODUCCIÓN______

INTRODUCCIÓN______

1. LA MITOCONDRIA______

Las mitocondrias son orgánulos celulares cuya principal función es generar energía celular en forma de adenosín trifosfato (ATP), molécula utilizada como fuente de energía química, a partir de un proceso conocido como fosforilación oxidativa (OXPHOS). Están formadas por una doble membrana lipídica que separa dos espacios: 1) el espacio intermembrana situado entre las membranas externa e interna, donde se encuentra embebido el sistema que lleva a cabo la fosforilación oxidativa o sistema OXPHOS y 2) la matriz mitocondrial, donde se encuentran entre 2 y 10 copias de ADN mitocondrial (ADNmt) y las proteínas necesarias tanto para la replicación, transcripción y traducción del ADNmt como para la detoxificación de las especies reactivas de oxigeno (ROS), la regulación de la apoptosis, el metabolismo del hierro, la biosíntesis de aminoácidos, la oxidación de los ácidos grasos y el ciclo de Krebs, procesos esenciales para el correcto funcionamiento celular. El número de mitocondrias por célula oscila entre 102 y 105, dependiendo de las necesidades energéticas de cada tipo celular. En mamíferos, los tejidos más activos son el sistema nervioso central (incluyendo el ojo y el nervio óptico), el corazón, el músculo esquelético, el páncreas endocrino, los riñones y el hígado, siendo tambiénlos más susceptibles cuando existen problemas en el aporte energético.

Figura 1: Genoma mitocondrial humano. En amarillo se indican los genes codificantes de proteínas y en rojo los ARNr 16S y 12S. Con puntos morados, se señalan los 22 ARNt junto a la letra correspondiente del aminoácido que transportan. El origen de replicación y la

dirección de síntesis vienen marcados por OH

para la hebra pesada (línea interior) y por OL la hebra ligera (línea exterior) (Yu-Wai-Man et al., 2011).

El ADNmt humano (Figura 1) es una molécula circular de doble cadena, sin intrones, con un tamaño de 16.569 pares de bases (pb) e información para dos ARNs ribosómicos (ARNr 12S y 16S), 22 ARNs de trasferencia (ARNt) y 13 subunidades proteicas que forman parte de cuatro de los cinco complejos multiméricos que componen el sistema OXPHOS (Figura 2): siete de las 44 del complejo I 17

(CI) o NADH-ubiquinona oxidoreductasa (ND1-6 y ND4L); una de las 11 que forman el complejo III (CIII) o ubiquinol-citocromo c oxidoreductasa (citocromo b); tres de las 14 del complejo IV (CIV) o citocromo c oxidasa (CO1, CO2 y CO3); y dos de las 16 del complejo V (CV) o ATP sintasa (ATP6 y ATP8) (Balsa et al., 2012) (Figura 2). 1.1. Características de la herencia del ADN mitocondrial Las enfermedades mitocondriales son el resultado de alteraciones mitocondriales producidas por mutaciones en genes nucleares, que siguen la clásica herencia mendeliana, o en genes mitocondriales, que siguen normas diferentes a las mendelianas. Varios son los aspectos que caracterizan este tipo de herencia: Herencia materna: Sólo las mitocondrias del gameto femenino son transmitidas a la descendencia. Por lo tanto, el ADNmt se trasmite de madres a hijos/as y a su vez, sólo las hijas lo trasmitirán a su descendencia. En un paciente miopático con una mutación de novo en el gen ND2 del ADNmt se observó que algunas mitocondrias se transmitieron por vía paterna (Schwartz and Vissing, 2002), hecho que no ocurría en otras miopatías esporádicas. Heteroplasmia: Las células eucariotas tienen un número variable de mitocondrias, cada una de las cuales contiene a su vez de 2 a 10 moléculas de ADNmt (poliplasmia), las cuales, si son idénticas, se habla de homoplasmia, mientras que si coexiste una mezcla de ADNmt se denomina heteroplasmia. Efecto umbral: Es la cantidad mínima de ADNmt mutado necesario para que el fenotipo clínico se manifieste, depende de cada mutación y del tejido afectado, pero generalmente se halla entre un 60-90% de heteroplasmia (Rossignol et al., 2003). Existen excepciones, como la mutación dominante (m.5545C>T), con un umbral menor al 25% (Sacconi et al., 2008). Segregación mitótica: La división de las mitocondrias y la replicación del ADNmt son procesos independientes del ciclo celular. Durante la división celular las mitocondrias se distribuyen al azar entre las células hijas. En un paciente con una mutación heteroplásmica, la proporción de moléculas mutadas puede variar en cada tejido, y a lo largo del tiempo. Efecto del cuello de botella mitocondrial: Surge como explicación al rápido cambio de las variantes en el ADNmt entre generaciones. Se estableció que en las etapas tempranas de la embriogénesis el número de moléculas de ADNmt en oocitos disminuía drásticamente para posteriormente ser amplificado, facilitando la eliminación de mutaciones deletéreas (Jansen and de Boer, 1998; Krakauer and Mira, 1999). Recientemente, en ratón se ha demostrado que ocurre durante la foliculogénesis postnatal (Cao et al., 2009; Wai et al., 2008).

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2. EL SISTEMA OXPHOS______

El sistema OXPHOS produce ATP a través del proceso de fosforilación oxidativa, y está formado por los cuatro complejos (complejos I-IV) de la cadena de transporte electrónico (CTE), el complejo V y dos transportadores móviles de electrones: la ubiquinona (CoQ) y el citocromo c. La fosforilación oxidativa engloba una serie de reacciones de óxido-reducción, donde los electrones entran en forma de NADH a través del CI o en forma de FADH2 vía complejo II (CII) para reducir el CoQ a ubiquinol. Los electrones son transferidos por el ubiquinol al complejo III y de éste al complejo IV a través del citocromo c, que finalmente se lo trasmite a un átomo de oxígeno (Figura 2). El gradiente electroquímico generado por las reacciones de óxido-reducción acopladas a la translocación de protones producida en los complejos de la CTE es aprovechado por el complejo V para fosforilar el ADP y formar ATP.

Figura 2: Representación del sistema OXPHOS. El sistema OXPHOS reside en la membrana interna mitocondrial y está compuesto por 5 complejos: CI (naranja), CII (morado), CIII (azul), CIV (amarillo) y CV (marrón). A excepción del complejo II, todos los complejos están formados por subunidades codificadas por genes mitocondriales y nucleares, representadas en el cuadrante superior (Lazarou et al., 2009). En recuadro naranja las subunidades del CI al excluir la subunidad NDUFA4, y en recuadro amarillo las subunidades del CIV al incluir la subunidad NDUFA4 propuesta de (Balsa et al., 2012).

Todas las subunidades del CII, así como las subunidades no codificadas por el ADNmt del resto de los complejos del sistema OXPHOS, están codificadas por alrededor de 80 genes nucleares, que se importan desde el citoplasma a la mitocondria por procesos altamente regulados que requieren la sincronización de ambos genomas (Garesse and Vallejo, 2001).

3. EL COMPLEJO I______

3.1 Estructura y función El CI o NADH: ubiquinona oxidorreductasa (E.C. 1.6.5.3) es el más grande de los complejos de la CTE, con un peso molecular de 980 kDa. Está formado por 37 proteínas 19

estructurales codificadas por el genoma nuclear (Balsa et al., 2012; Carroll et al., 2006; Janssen et al., 2006; Murray et al., 2003) y 7 subunidades codificadas por el ADNmt (ND1-6 y ND4L), componentes no proteicos como el flavín mononucleótido (FMN), varios núcleos de hierro azufre de naturaleza no hemínica, y fosfolípidos como la cardiolipina, que participa en la estabilidad estructural, o la fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, implicadas en la correcta actividad catalítica del CI (Sharpley et al., 2006). 7 subunidades nucleares (NDUFV1, NDUFV2, NDUFS1, NDUFS2, NDUFS3, NDUFS7 y NDUFS8) y las 7 codificadas por ADNmt son esenciales para su función catalítica y evolutivamente se corresponden con el core o estructura funcional mínima de la NADH-1 de E. coli (Brandt, 2006; Leif et al., 1993; Weidner et al., 1993). La reacción redox y de traslocación protónica del CI es la siguiente:

+ + + + NADH + H + Co-Q + 4H matriz → NAD + Co-QH2 + 4H

El CI posee forma de “L” o “bota” según imágenes tridimensionales vistas por microscopia electrónica de baja resolución en Neurospora crassa (Guenebaut et al., 1997), Yarrowia lipolytica (Radermacher et al., 2006), E. coli (Friedrich and Bottcher, 2004) y Bos Taurus (Grigorieff, 1998). Estructuralmente, consta de dos brazos (Figura 3): 1) el brazo hidrofílico o brazo periférico, con función catalítica, está localizado en la matriz mitocondrial. Dicho brazo está constituido por un módulo flavoproteico o módulo N, donde se produce la entrada de electrones y un módulo de proteínas hierro-azufre o módulo Q, implicado en la trasferencia de electrones a la ubiquinona, 2) el brazo hidrofóbico, brazo de membrana o módulo P es perpendicular al brazo hidrofílico y está implicado en la trasferencia de electrones a la ubiquinona y en el bombeo de protones (Brandt, 2006).

Figura 3: Esquema estructural del CI. En rojo se indican las subunidades identificadas por homología con el CI humano y que evolutivamente se corresponden con el core o estructura funcional mínima de la NADH-1 de E. coli (Leif et al., 1993; Weidner et al., 1993). En negro se indica la localización de las subunidades según el modelo de ensamblaje del CI en mamíferos (Mimaki et al., 2011). 20

El tratamiento con detergentes caotrópicos suaves permitió determinar que el CI bovino está formado por 4 subcomplejos estructurales (Carroll et al., 2003; Carroll et al., 2002; Sazanov et al., 2000) (Figura 4): 1) el subcomplejo Iα, formado por el brazo periférico y la parte del brazo de membrana que contiene la subunidad ND6. Mediante cromatografía de exclusión este subcomplejo se disoció en subunidades sueltas y en el subcomplejo Iλ, constituido por 15 subunidades nucleares que incluyen las 7 subunidades catalíticas del core, (NDUFV1, NDUFV2, NDUFS1, NDUFS2, NDUFS3, NDUFS7 y NDUFS8), los cofactores redox (FMN y centros Fe-S) y la subunidad NADUFA13/Grim19, del brazo de membrana; 2) el subcomplejo Iβ, que forma la parte principal del brazo de membrana, donde se localizan 14 subunidades nucleares y las subunidades ND4 y ND5 (Sazanov et al., 2000; Sazanov and Walker, 2000); y 3) el subcomplejo Iγ, formado por las subunidades NDUFC1, ND1, ND2, ND3 y ND4L. ND1 y ND2 conectan el brazo periférico y el de membrana (Grigorieff, 1999). Se piensa que las subunidades ND1, ND4 y ND5 están implicadas en la transferencia de electrones a la ubiquinona (Fisher and Rich, 2000). ND2, ND4 y ND5 parecen participar en la función de bombeo de protones, por similitud a los antiporter de iones K+/H+ o Na+/H+ (Friedrich, 2001).

Figura 4: Estructura y subunidades del CI. El CI estructuralmente lo forman 4 subcomplejos; Iα, Iβ, Iλ y Iγ; entre los que se reparten las 44 subunidades que lo componen (Balsa

et al., 2012; Carroll et al., 2006; Janssen et al., 2006; Murray et al., 2003).

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El resto de las subunidades que no conforman el -core- , se conocen como subunidades “supernumerarias o accesorias”. La subunidad MWFE/NDUFA1 parece tener un papel activo en el ensamblaje o estabilidad del CI (Au et al., 1999; Yadava et al., 2002) participando en el ensamblaje entre el brazo periférico y el de membrana, el anclaje del complejo I a la membrana interna (Scheffler et al., 2004), y requiere de ND4 y ND6 para su inserción y estabilización en el CI (Yadava et al., 2004). B16.6/NDUFA13/Grim-19, participa en el ensamblaje, función del CI (Huang et al., 2004), y en la iniciación de la apoptosis (Fearnley et al., 2001; Huang et al., 2007), función también atribuida a la subunidad de 75kDa/NDUFS1 (Ricci et al., 2004). B14.7/NDUFA11 es homóloga a las translocasas de la membrana interna mitocondrial y parece participar en la incorporación de las subunidades mitocondriales (Berger et al., 2008). NDUFA2 y NDUFA10 poseen homología con proteínas ribosomales mitocondriales y con la timidina kinasa 2 mitocondrial, respectivamente (Gabaldon et al., 2005), lo que sugiere su implicación en la síntesis de proteínas mitocondriales. ESSS/NDUFB11 es fosforilada por una proteín kinasa dependiente de AMPc, por lo que regularía la actividad del CI (Chen et al., 2004) y es necesaria para estabilizar la NDUFA1 (Scheffler et al., 2004). Análisis de coevolución predijeron la interacción de la subunidad B15/NDUFC2 con ND4, y de NDUFA1 con ND1 y ND4 (Gershoni et al., 2010). NDUFS5, NDUFB7 y NDUFA8 contienen residuos de cisteína conservados, y se ha comprobado que NDUFB7 y NDUFA8 participan en la estabilización del CI (Szklarczyk et al., 2011). La nitración de NDUFB8 disocia los supercomplejos, afectando a la actividad del CI (Davis et al., 2010). NDUFA9 une NADPH en Y. lypolitica, hecho esencial para el ensamblaje del CI (Abdrakhmanova et al., 2006). 3.2 Ruta de los electrones La estructura atómica del brazo periférico de Thermus thermophilus fue resuelta por cristalografía de rayos X (Baranova et al., 2007; Efremov et al., 2010; Sazanov and Hinchliffe, 2006), lo que ayudó a describir la ruta de los electrones y la posición de algunas de las subunidades del brazo periférico del CI (Koopman et al., 2010; Sazanov, 2007).

Figura 5: Esquema hipotético de la ruta electrónica del CI. Se muestra la ruta de los electrones que tiene lugar en el CI de Thermus thermophilus sobre la estructura del CI bovino. Adaptación de (Koopman et al., 2010). 22

El CI tiene dos sitios de unión a nucleótidos, uno para el NADPH en la subunidad NDUFA9 (Abdrakhmanova et al., 2006) y otro para el NADH que se encuentra en la subunidad NDUFV1 (Patel et al., 1991). Estos electrones se transfieren al FMN y de éste al centro N3, y luego pasarían de los centros N4 y N5 de la subunidad NDUFS1, a los centros N6a y N6b de la subunidad NDUFS8 y de allí al centro N2 de la subunidad NDUFS7 (Figura 5) (Sazanov, 2007; Sazanov and Hinchliffe, 2006). La fosforilación reversible de algunas subunidades parece intervenir en la regulación enzimática del CI, en la transferencia electrónica y en la producción de superóxidos (Schilling et al., 2005). La transferencia de electrones al CoQ se produce en las subunidades NDUFS2 y NDUFS7 (centro N2), junto a la participación de ND1, lo que probablemente esté unido a la translocación de protones mediado por la subunidad ND2. En Y. lipolytica se ha demostrado que el brazo de membrana contiene dos módulos que participarían independientemente en la translocación (Drose et al., 2011), y cuya activación se produciría a través de cambios conformacionales del brazo de membrana, que está asociado directamente con la reducción de la ubiquinona (Efremov and Sazanov, 2011; Ohnishi and Salerno, 2005). 3.3 Ensamblaje del complejo I en humanos El ensamblaje del CI humano es un proceso dinámico multidireccional que necesita de factores de ensamblaje para su completa formación. Los conocimientos actuales de la ruta de ensamblaje del CI humano se han elaborado gracias al uso de la técnica de electroforesis bidimensional en condiciones nativas (Blue Native Gel Electrophoresis o BN-PAGE) en mitocondrias purificadas. Dicha técnica se ha aplicado al estudio del ensamblaje del CI: 1) en fibroblastos de pacientes con déficit enzimático aislado del CI asociado a mutaciones en subunidades nucleares (Ugalde et al., 2004a), mitocondriales (Antonicka et al., 2003) o en factores de ensamblaje (Dunning et al., 2007); 2) en cíbridos control, analizando la incorporación de subunidades del CI sintetizadas de novo tras inhibición de la traducción mitocondrial con doxiciclina (Ugalde et al., 2004b); 3) en células HEK 293 en las que se indujo la expresión transitoria de subunidades nucleares del CI asociadas a GFP, como NDUFS3 (Vogel et al., 2007a); 4) en mitocondrias de fibroblastos o linfoblastos de pacientes con déficit aislado del CI, en las que se importaron in vitro subunidades nucleares marcadas radioactivamente (Lazarou et al., 2007) y 5) en estudios realizados en células in vivo, siguiendo la incorporación al CI de subunidades marcadas con fluorescencia (Dieteren et al., 2012; Dieteren et al., 2008).

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Los primeros estudios de ensamblaje del CI en humanos propusieron un modelo semi- secuencial conservado evolutivamente, donde el brazo periférico y el de membrana se formarían independientemente mediante la asociación de distintos módulos funcionales, uniéndose ambos brazos en las etapas finales para formar el CI totalmente ensamblado (Antonicka et al., 2003; Ugalde et al., 2004a; Ugalde et al., 2004b). Actualmente, existen pequeñas diferencias en la incorporación de unidades específicas entre los distintos modelos de ensamblaje descritos (Antonicka et al., 2003; Lazarou et al., 2009; Ugalde et al., 2004b; Vogel et al., 2007a). Sin embargo, se acepta por consenso una ruta semi-secuencial de ensamblaje del CI, cuyo primer paso sería el anclaje a la membrana interna de un intermediario del módulo Q, que estaría mediado por la subunidad ND1. Secuencialmente, se produciría la inserción de otras subunidades localizadas en el brazo hidrofóbico. Tras la expansión del brazo de membrana y del módulo Q, se incorporaría el módulo N catalítico en una etapa final del ensamblaje, lo que conllevaría la activación enzimática del CI. La mayoría de los modelos sugieren una ruta de ensamblaje progresiva, pero se ha propuesto que este proceso es dinámico, en el cual las subunidades e intermediarios de ensamblaje podrían ser intercambiados por otros pre-existentes (Lazarou et al., 2007). El modelo de ensamblaje del CI consta de 7 etapas (Figura 6) (McKenzie and Ryan, 2010; Mimaki et al., 2012). En primer lugar, las subunidades NDUFS2 y NDUFS3 se unirían para formar un intermediario del módulo Q, al que se unen las subunidades NDUFS7 y NDUFS8 dando lugar a un segundo intermediario, al que se incorporarían NDUFA9 y otras subunidades (Antonicka et al., 2003; Lazarou et al., 2007; Ugalde et al., 2004b; Vogel et al., 2007a; Vogel et al., 2007c). Este tercer intermediario, que se encuentra asociado con los factores de ensamblaje NDUFAF3 y NDUFAF4, se ancla a la membrana interna mediante su asociación a un subcomplejo del brazo hidrofóbico que contiene la subunidad ND1 (Saada et al., 2009; Vogel et al., 2004). Todo este grupo formaría un cuarto intermediario cuyo peso molecular aproximado es de 400 kDa que serviría como anclaje y estabilización en la membrana interna de la subunidad ND1 recién sintetizada, lo que orquestaría todo el ensamblaje posterior del holo-enzima o CI funcional (Zurita and Shoubridge, 2012). Este intermediario de 400 kDa se uniría a otro de 460 kDa, previamente formado en la membrana interna, que a su vez contaría con los factores de ensamblaje NDUFAF1 y Ecsit asociados a las subunidades mitocondriales ND2, ND3, ND4L y ND6 (Dunning et al., 2007; Vogel et al., 2007b). Estas asociaciones forman el quinto intermediario de ensamblaje, al que se unen ND5

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y posteriormente ND4 para dar lugar al sexto intermediario de 830 kDa (Perales-Clemente et al., 2010).

Figura 6: Ruta de ensamblaje del complejo I. Adaptación del modelo descrito en (McKenzie and Ryan, 2010). Las subunidades estructurales se indican en negro, los factores de ensamblaje en color. Los pesos moleculares de los intermediarios de ensamblaje, enumerados del 1 al 6, se expresan en kDa. Las letras “a, b, c y d” señalan intermediarios de ensamblaje que contienen la subunidad NDUFS3, descritos en (Vogel et al., 2007a; Weidner et al., 1993). En recuadros rojos se indican los puntos de incorporación de las subunidades ND, descritos en (Perales-Clemente et al., 2010). En recuadro amarillo el factor de ensamblaje ACAD9, descrito por (Nouws et al., 2012).

La subunidad ND4 se incorpora antes que las subunidades NDUFB6 y NDUFB8, pues células con mutaciones en ND4 no son capaces de incorporar estas dos subunidades (Perales- Clemente et al., 2010). A este último intermediario se uniría la subunidad NDUFA13 y el factor de ensamblaje NDUFAF2 (Ogilvie et al., 2005). El brazo de membrana se iría completando con las subunidades NDUFA1, NDUFA2, NDUFA6 y NDUFA10. En el paso final se incorporaría la subunidad NDUFS5 y el módulo N, formado por las subunidades NDUFV1, NDUFV2, NDUFV3, NDUFS1, NDUFS4, NDUFS6 y NDUFA12. Una vez realizada su función, los factores de ensamblaje se separarían del CI. 3.4 Factores de Ensamblaje del complejo I Hasta la fecha se han caracterizado 14 factores de ensamblaje del CI (Fassone and Rahman, 2012; Mimaki et al., 2012; Nouws et al., 2012; Pagniez-Mammeri et al., 2012b). A continuación se describen sus principales características y funciones: 3.4.1 NDUFAF1/CIA30 Homólogo de cia30 de Neurospora crassa implicado en el ensamblaje del brazo de membrana del CI (Kuffner et al., 1998). Co-inmunoprecipita con ND1, ND2, ND3, ND6, NDUFA6, NDUFA9, NDUFB6, NDUFS3 y NDUFS7 y participa en la unión de los intermediarios de 400 y 460 kDa para la formación o estabilización del intermediario de 830 25

kDa (Dunning et al., 2007). Mutaciones en NDUFAF1 se han asociado con cardioencefalomiopatía (Dunning et al., 2007). 3.4.2 Ecsi. Es una proteína que interacciona con NDUFAF1 en el proceso de formación y estabilización de los intermediarios de 460 y 830 kDa (Vogel et al., 2007b). 3.4.3 ACAD9. Es una acil-CoA dehidrogenasa de la beta-oxidación de ácidos grasos (He et al., 2007; Zhang et al., 2002a). Mutaciones en este gen dan lugar a un déficit aislado de CI en pacientes con cardiomiopatía y encefalopatía. ACAD9 co-purifica con Ecsit y NDUFAF1, colaborando en las mismas etapas de ensamblaje (Gerards et al., 2011; Haack et al., 2010; Nouws et al., 2010). 3.4.4 TMEM126B Identificado por espectrometría de masas (Heide et al., 2012), comigra con NDUFAF1, Ecsit y ACAD9 en un mismo complejo, denominado complejo mitocondrial para el ensamblaje del complejo I. 3.4.5 NDUFAF2/NDUFA12L/B17.2L Las mutaciones en NDUFAF2 se asocian con síndrome de Leigh, (Herzer et al., 2010; Ogilvie et al., 2005). En células de pacientes con mutaciones en NDUFAF2, se observó la acumulación de intermediarios de ensamblaje que contenían NDUFS3 y NDUFS2 (Hoefs et al., 2009). En pacientes con mutaciones en NDUFV1 y NDUFS4 se acumulaba NDUFAF2 en el subcomplejo de 830 kDa y estaba ausente en el holo-enzima del CI (Vogel et al., 2005) lo que sugería su participación en estadios tardíos del ensamblaje. 3.4.6 NDUFAF3/C3orf60 y NDUFAF4/C6orf66 Se han encontrado mutaciones en NDUFAF3 en pacientes con acusado déficit enzimático del CI, en células de estos pacientes se observó una reducción en la síntesis y estabilidad de la subunidad ND1 (Saada et al., 2009). NDUFAF3 co-inmunoprecipita con NDUFAF4 en el intermediario de 400 kDa que estabiliza ND1, sugiriendo que participan en etapas tempranas del ensamblaje del CI (Zurita Rendon and Shoubridge, 2012). 3.4.7 NDUFAF5/C20orf7 y NDUFAF6/C8orf38. Mutaciones en NDUFAF5 y NDUFAF6 se han visto en pacientes con síndrome de Leigh asociado a déficits aislados del CI o combinados de los complejos I y IV (Gerards et al., 2010; McKenzie et al., 2011; Saada et al., 2012; Sugiana et al., 2008). Ambos participan en la

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formación del intermediario de 400 kDa que contiene a la subunidad ND1 (Zurita Rendon and Shoubridge, 2012). 3.4.8 NUBPL/HuInd1/C14orf12. En Yarrowia lipolytica, la proteína Fe-S requerida para la actividad NADH deshidrogenasa, Ind1, está implicada en la incorporación de los centros de Fe-S en las subunidades del CI (Bych et al., 2008). Mutaciones en HuInd1 (gen Ind1 humano) dan lugar a encefalomiopatía (Calvo et al., 2010). Células deficientes en HuInd1 acumularon el intermediario de 460 kDa del brazo de membrana, disminuyendo los niveles de NDUFS1, NDUFV1, NDUFS3, NDUFA13 del brazo periférico (Sheftel et al., 2009). 3.4.9 MidA/C2orf56 La inhibición de la expresión de la proteína MidA reveló niveles reducidos del CI tanto en células humanas como en Dictyostelium (Carilla-Latorre et al., 2010; Torija et al., 2006). Mediante análisis de doble híbrido en levaduras, se demostró que esta proteína interaccionaba con la subunidad NDUFS2 (Carilla-Latorre et al., 2010). 3.4.10 Perfil filogenético del complejo I. La comparación del perfil filogenético de 43 especies que contenían o carecían del CI, identificó 19 proteínas que co-evolucionaban con las subunidades estructurales (Pagliarini et al., 2008), como FOXRED1, LYRM5 y LACTB, cuya inhibición mediante ARNi provocó una reducción de la actividad del CI (Pagliarini et al., 2008). Mutaciones en FOXRED1 se han asociado a déficit aislado del CI, lo que sugiere su participación en el ensamblaje del complejo I (Calvo et al., 2010; Fassone et al., 2010).

4. SUPERCOMPLEJOS______

La organización estructural y funcional de la CTE ha estado en debate durante más de 50 años. Se han propuestos dos modelos: el “modelo fluido”, donde los complejos del sistema OXPHOS difunden libremente en la membrana interna mitocondrial y el transporte de

Figura 7: Estructura del respirasoma mitocondrial bovino y propuesta del transporte de electrones a través de la CTE. El respirasoma estaría formado por un monómero del CI (amarillo), el dímero del CIII (rojo) y de 1-6 copias del CIV (verde) (Vonck and Schafer, 2009).

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electrones ocurre mediante colisiones al azar (Hackenbrock et al., 1986) y el “modelo sólido”, que propone que los complejos del sistema OXPHOS están organizados en estructuras rígidas (Chance and Williams, 1955), a las que posteriormente se denominó supercomplejos o respirasomas (Schagger and Pfeiffer, 2000). Actualmente se acepta que estos dos modelos coexisten en un “modelo dinámico”, en el que los complejos cambiarían de un estado de movimiento libre a fijarse en estructuras rígidas y viceversa, adaptándose a los cambios metabólicos celulares (Acin-Perez et al., 2008; Hochman et al., 1985; Koopman et al., 2010; Lenaz and Genova, 2010). Mediante técnicas de microscopía electrónica y electroforesis nativa, se han caracterizado tres estructuras de supercomplejos en mamíferos (Schafer et al.,

2007): la asociación de los complejos I y III (supercomplejo I+III2), la unión de los complejos

III y IV (supercomplejo III2+IV) y la asociación de los complejos I, III y IV en el respirasoma

(o supercomplejo I+III2+IV). En el respirasoma de mamíferos (Figura 7), el dímero del complejo III (CIII2) ocuparía el área central del brazo de membrana del CI, donde sólo uno de los monómeros del CIII estaría en contacto directo con el CI; el CIV se situaría en el extremo del brazo de membrana, compartiendo una pequeña área con el CIII (Vonck and Schafer, 2009). Estas estructuras co-existen junto con los complejos III y IV libres, pero la mayor parte del CI está asociado en los distintos supercomplejos (Moreno-Lastres et al., 2012). Los respirasomas aportan beneficios funcionales y estructurales al sistema OXPHOS, pues al disminuir la distancia de difusión de la ubiquinona y citocromo c, aumentaría la eficiencia del flujo de los electrones entre los complejos, y al canalizar los sustratos entre los complejos asociados, aumentaría la eficacia catalítica (Heinemeyer et al., 2007; Schagger, 2001). Además se ha sugerido que podrían tener un papel importante en la disminución de la Figura 8: Asociación propuesta del formación de radicales libres (Lenaz and Genova, CIII y CIV al intermediario de 830 kDa 2009). La presencia de los supercomplejos o del CI (Lazarou et al., 2009). respirasomas es esencial para mantener la estabilidad de los complejos de la CTE, particularmente del CI. El CI se estabilizaría mediante su asociación con el dímero del CIII, ya que defectos genéticos en subunidades que afectan al ensamblaje del CIII pero no a su actividad, afectarían secundariamente a la estabilidad y actividad del CI (Acin-Perez et al., 2004; Blakely et al., 2005; Schagger et al., 2004). Así mismo, la ausencia del CIV y del transportador citocromo c en células de mamíferos, provoca

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una pérdida de estabilidad del CI (Blakely et al., 2005; D'Aurelio et al., 2006; Diaz et al.,

2006). De acuerdo con estas observaciones, en células con mutaciones en las subunidades del módulo N catalítico del CI se observó la acumulación de supercomplejos parcialmente ensamblados que contenían el intermediario de 830 kDa del CI junto con los complejos III y IV, lo que sugiere que la formación del CI totalmente ensamblado dependería de la asociación de este intermediario con los complejos III y IV (Figura 8) (Lazarou et al., 2009). Recientemente, nuestro grupo ha propuesto una ruta de ensamblaje de los supercomplejos, en la que el intermediario de 830 kDa del CI constituiría la estructura base sobre la que se insertarían subunidades libres e intermediarios de ensamblaje de los complejos III y IV en etapas sucesivas, culminando con la incorporación del módulo N catalítico del CI y la activación del respirasoma (Moreno-Lastres et al., 2012).

5. EL COMPLEJO I Y LA ENFERMEDAD MITOCONDRIAL______

El déficit enzimático aislado del CI constituye la causa más común de los trastornos de la CTE. Un tercio de los casos con déficits en el sistema OXPHOS están provocados por mutaciones tanto en las subunidades estructurales como en proteínas de ensamblaje del CI. Hasta la fecha, se han descrito mutaciones en las 7 subunidades codificadas por el ADNmt (ND1-ND6, ND4L), en 17 de las 37 subunidades estructurales codificadas por el genoma nuclear (NDUFS1, NDUFS2, NDUFS3, NDUFS4, NDUFS6, NDUFS7, NDUFS8, NDUFV1, NDUFV2, NDUFA1, NDUFA2, NDUFA9, NDUFA10, NDUFA11, NDUFA12, NDUFB3, NDUFB9), así como en 9 factores de ensamblaje NDUFAF1, NDUFAF2, NDUFAF3, NDUFAF4, NDUFAF5, NDUFAF6, ACAD9, NUBPL y FOXRED1 (Fassone et al., 2012; Haack et al., 2012a; Haack et al., 2012b; Lazarou et al., 2009; Mimaki et al., 2012; Nouws et al., 2012; Pagniez-Mammeri et al., 2012a; Pagniez-Mammeri et al., 2012b). Las manifestaciones clínicas de los déficits aislados del CI son muy variadas (DiMauro and Schon, 2008; Fassone and Rahman, 2012; Zeviani and Carelli, 2007). En buena medida, dependen de la edad de inicio de la enfermedad, y pueden estar afectados desde un único órgano o tejido hasta expresarse de manera multisistémica. Algunas de ellas son: intolerancia al ejercicio (músculo); cardiomiopatía hipertrófica (corazón); atrofia óptica hereditaria o LHON (ojo), que produce ceguera y suele comenzar en la edad adulta; el síndrome de MELAS, encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica y accidentes cerebrovasculares, que

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presenta una clínica muy heterogénea; el síndrome de Leigh, se presenta con anomalías respiratorias, nistagmus, ataxia, distonía e hipotonía; leucoencefalomiopatía infantil/juvenil, una enfermedad infantil fatal caracterizada por neurodegeneración temprana y progresiva con unas características neuropatológicas bien definidas como la presencia de lesiones focales y bilaterales en una o más áreas del sistema nervioso; y acidosis láctica neonatal (FILA) que se presenta en el periodo neonatal o infancia temprana de rápida progresión (Fassone and Rahman, 2012).

6. LA NEUROPATÍA ÓPTICA DE LEBER______

La neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) o atrofia óptica de herencia materna, es una de las neuropatías ópticas hereditarias más comunes. Su prevalencia estimada en Europa es 1:45.000 (Mascialino et al., 2012). Fue descrita por primera vez en 1871 por el oftalmólogo alemán Theodor Leber. Históricamente, constituye la primera enfermedad asociada a una mutación en el genoma mitocondrial. Los primeros síntomas son visión borrosa, con inicio unilateral o bilateral, que con el tiempo afecta y/o empeora en ambos ojos, con pérdida de la agudeza visual y de la visión de los colores. La pérdida de la visión es indolora y está provocada por la degeneración del nervio óptico, específicamente de las células ganglionares de la retina (CGRs), que son neuronas implicadas en el envío de información desde el ojo al cerebro (Figura 9). Existe un cuadro clínico denominado LHON-plus en el que, además de la pérdida de visión, se producen alteraciones motoras y en la conducción eléctrica que controla el latido cardiaco. Otros signos clínicos extra oculares como fallo en la conducción cardiaca (síndrome de Wolf-Parkinson- White y Lown-Ganon Levine) son ocasionalmente evidentes, junto con pequeños problemas neurológicos.

Figura 9: Esquema de las partes implicadas en LHON. Abajo a la derecha una mitocondria, donde se produce el fallo que daña a las CGRs. La CGR abajo a la derecha. Arriba a la izquierda esquema de un ojo, órgano afectado y las capas de la retina donde se localizan las CGRs, arriba a la derecha.

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Se han descrito numerosas mutaciones en el ADNmt asociadas a LHON, mayoritariamente en genes que codifican subunidades estructurales del CI, sin embargo tres de ellas están presentes en el 90% de los casos descritos: la mutación m.3460G>A, que afecta al gen MT-ND1 (Howell et al., 1991; Huoponen et al., 1991), la mutación m.11778G>A, localizada en el gen MT-ND4 (Wallace et al., 1988), y la mutación m. 14484T>C, en el gen MT-ND6 (Johns et al., 1992). A estas tres mutaciones se las conoce como “mutaciones primarias de LHON”, por conferir riesgo genético para la expresión individual de la enfermedad (Tabla 1). El 10% restante de las mutaciones LHON están localizadas mayoritariamente en los genes que codifican las subunidades ND1 y ND6, cuyos genes representan regiones de elevada frecuencia mutacional. (Chinnery et al., 2001; Maresca et al., 2012; Valentino et al., 2004).

Tabla 1: Mutaciones primarias de LHON. Gen Mutación Cambio aminoacídico Preva- Referencias lencia (Howell et al., 1991; MT-ND1 m.3460G>A A52T/(Ala52Thr) 13% Huoponen et al., 1991) MT-ND4 m.11778G>A K340H/(Arg340His) 69% (Wallace et al., 1988) MT-ND6 m.14484T>C M64V/(Met64Val) 14% (Johns et al., 1992)

En la población caucásica la mutación más prevalente es la m.11778G>A en MT-ND4, con una frecuencia del 69%. Las mutaciones m.14484T>C y m.3460G>A presentan frecuencias más bajas, de un 14% y 13% respectivamente (Mackey et al., 1996). Sin embargo, esta distribución es diferente en función del origen étnico. En este sentido, en la población asiática la prevalencia de la mutación m.11778G>A es muy elevada (90%) (Mashima et al., 1998), mientras que en la población canadiense de origen francés la mutación más abundante es la m.14484T>C en MT-ND6 con una prevalencia del 87%, como resultado de un efecto fundador (Macmillan et al., 1998). La expresión clínica de la enfermedad se manifiesta preferentemente en hombres jóvenes, con una edad de comienzo entre los 15 y los 35 años. En la mayoría de los casos, la pérdida de la visión es repentina y permanente, aunque existe una fracción minoritaria de pacientes en los que se ha observado una recuperación espontánea de la visión, generalmente

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de forma bilateral, que suele ocurrir entre 6 y 12 meses después del inicio de la pérdida visual. La mutación m.14484T>C se asocia a una edad temprana de inicio de los síntomas, generalmente por debajo de los 20 años, que es un signo de buen pronóstico, dado que aumenta la posibilidad de recuperación espontánea de la visión (Barboni et al., 2006). El peor pronóstico de recuperación visual se asocia con la mutación m.11778G>A (Yu-Wai-Man et al., 2009), aunque el peor fenotipo clínico se produce con la mutación m.3460G>A (Carelli et al., 2004). Las mutaciones asociadas a esta patología se encuentran generalmente en homoplasmia, y únicamente el 10-15% de las familias diagnosticadas de LHON presentan mutaciones heteroplásmicas. Sin embargo, la penetrancia de la mutación es incompleta, por lo que se ha especulado con la implicación de otros factores, bien genéticos o ambientales, en el desarrollo de la enfermedad. Actualmente no existe tratamiento eficaz, aunque se han descrito casos aislados de recuperación visual tras el tratamiento con idebenona (análogo de coenzima Q). En este sentido, recientemente, se ha publicado un estudio multicentrico a doble ciego en el que se describe la recuperación visual de pacientes tratados con análogos del coenzima Q (idebenona) (Klopstock et al., 2011; Mashima et al., 2000; Sabet-Peyman et al., 2012). 6.1 Factores genéticos 6.1.1 Haplogrupos mitocondriales Entre los posibles factores genéticos asociados a la expresión de LHON, se ha descrito la influencia de los haplogrupos mitocondriales (Carelli et al., 2006; Hudson et al., 2007c; Sadun et al., 2003), definidos por la existencia de un número estable de sitios polimórficos en regiones codificantes del ADNmt, que se detectaron tras estudios de cortes con enzimas de restricción (o RFLP) del ADNmt en un amplio rango de población humana. El conjunto de dichos polimorfismos forma patrones o combinaciones específicas, que se han mantenido

Figura 10: Distribución geográfica de los haplogrupos mitocondriales. Los distintos haplogrupos parten de un ancestro común y se han ido extendiendo de forma radial desde África hacia los distintos continentes durante 150.000 años de evolución (Wallace, 1995). constantes en los últimos 150.000 años. Por ello, los haplogrupos mitocondriales se han usado para estudiar el origen, dispersión y evolución de las poblaciones humanas (Wallace et al., 1999) (Figura10). Los 9 haplogrupos de población europea son H, I, J, K, U, V, W, X y T 32

(Torroni et al., 1994; Wallace et al., 1999). Los más abundantes son el H (40%) (Wallace et al., 1999), el U (20%) (Herrnstadt et al., 2002), el T (10,6%) y el J (7,6%) (Richards et al., 1998) y el menos representado es el superhaplogrupo o clado IWX (Richards et al., 1998). El haplogrupo J parece contribuir a la expresión clínica de LHON en presencia de las mutaciones m.11778G>A (subclase J1c) y m.14484T>C (subclase J2b) (Hudson et al., 2007b; Torroni et al., 1997). El haplogrupo J está definido por polimorfismos que alteran la secuencia de aminoácidos del citocromo b, lo que podría afectar a la estructura del complejo y a la estabilización o eficiencia del transporte electrónico de los supercomplejos (Hudson et al., 2007b). El haplogrupo H parece ejercer un efecto protector en los pacientes portadores de las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C, al evitar el efecto de los polimorfismos en citocromo b propios del haplogrupo J (Howell et al., 2003; Hudson et al., 2007b). El haplogrupo K parece favorecer la penetrancia de la mutación m.3460G>A (Hudson et al., 2007b). 6.1.2 Influencia de los genes ligados al cromosoma X La atrofia óptica se manifiesta en el 50% de los hombres frente al 10-15% de las mujeres (Kirches, 2011). Varios trabajos han analizado la posible implicación en la expresión de LHON de regiones genómicas específicas del cromosoma X. La región Xp21 se ha definido como haplotipo de alto riesgo al asociarse con un incremento de la pérdida de la visión en pacientes con mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C (Hudson et al., 2007a). La región Xq27.1 se ha asociado con pacientes LHON con la mutación m.11778G>A en homoplasmia y haplogrupo J (Shankar et al., 2008). 6.1.3 Influencia de los estrógenos y el papel de la NSE Giordano y colaboradores (Giordano et al., 2011), basándose en el papel protector que ejercen los estrógenos en las mujeres y su demostrada acción directa sobre la CTE, el estrés oxidativo y la biogénesis mitocondrial (Carelli et al., 2007; Carelli et al., 2004; Chen et al., 2009; Simpkins and Dykens, 2008), estudiaron el efecto del 17-β-estradiol en cíbridos transmitocondriales con las mutaciones primarias de LHON, demostrando un incremento en la síntesis de ATP, una disminución de ROS y una baja tasa de apoptosis. Por otro lado Yee y colaboradores han descrito la utilidad de los niveles séricos de NSE (enolasa especifica de neuronas), un marcador de estres neuronal, al encontrar niveles mas altos en portadores asintomáticos de LHON frente a sintomáticos y controles, pudiendo ser utilizado como un marcador de riesgo de paceder la enfermedad (Yee et al., 2012).

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6.1.4 OPA1, PARL, MAPT Ciertos polimorfismos localizados el gen OPA1 (proteína relacionada con la atrofia óptica autosómica dominante, DOA) no parecen contribuir a la penetrancia de LHON. Los estudios de asociación con polimorfismos en el gen PARL (presenilina) presentan resultados discordantes (Hudson et al., 2010; Phasukkijwatana et al., 2010; Zhang et al., 2010). La asociación de variantes en el gen MAPT previamente asociadas con enfermedades neurodegenerativas ha sido descartada en relación con la penetrancia de LHON (Hudson et al., 2011). 6.2 Factores ambientales Se han descrito cinco parejas de gemelos monocigotos en las que, a excepción de dos de ellas, sólo uno de los hermanos manifestó la enfermedad, (Biousse et al., 1997; Harding et al., 1995; Johns et al., 1993; Lam, 1998; Newman et al., 1991; Nikoskelainen et al., 1987). La influencia de enfermedades sistémicas, el estrés, la exposición a toxinas químicas, las drogas anti-retrovirales y los agentes anti-tuberculosis se han relacionado con la expresión de LHON pero basándose en descripciones clínicas que no proporcionan una clara conclusión o confirmación epidemiológica (Luzhansky et al., 2001; Riordan-Eva et al., 1995; Sadun et al., 2003). Se ha demostrado el efecto tóxico de la 2,5-hexanediona, un marcador biológico de exposición laboral al n-hexano (un solvente utilizado en ciertas industrias) en cíbridos transmitocondriales con las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C (Ghelli et al., 2009). Las deficiencias nutricionales parecen descartarse como factor implicado en la expresión de LHON, ya que durante el periodo de malnutrición sufrido en Cuba a principios de 1990, no se produjeron cambios en la penetrancia de LHON en una gran familia portadora de la mutación m.11778G>A (Newman et al., 1994). Se han publicado estudios contradictorios sobre la influencia del tabaco y la ingesta de alcohol en la expresión de LHON (Cullom et al., 1993; Charlmers and Harding, 1996; Kerrison et al., 2000; Riordan-Eva et al., 1995; Sadun et al., 2003; Tsao et al., 1999). Un trabajo basado en una encuesta telefónica a 402 pacientes con LHON, mostró una penetrancia del 93% en los pacientes varones fumadores, frente a una penetrancia del 66% en pacientes no fumadores; por otro lado, encontraron un incremento del fallo visual en los pacientes con una ingesta muy alta de alcohol (Kirkman et al., 2009). Este trabajo corroboró estudios previos realizados en una familia brasileña con la mutación homoplásmica m.11778G>A en el haplogrupo J (97 afectados, de 332 miembros), en la que se demostró una mayor tasa de expresión de la enfermedad en el grupo con elevado consumo de alcohol y tabaco (Sadun et al., 2002; Sadun et al., 2003).

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6.3 Consecuencias fisiopatológicas celulares de las mutaciones asociadas a LHON Los cíbridos transmitocondriales se han convertido en el modelo celular más utilizado para estudiar los efectos bioquímicos y mecanismos patogénicos producidos por las mutaciones LHON (King and Attardi, 1989). Estudios realizados tanto en muestras de pacientes como en cíbridos, demostraron que la mutación m.3460G>A, que se asocia con el fenotipo clínico más grave, produce una fuerte disminución de la actividad del CI, mientras que las mutaciones "menos graves", m.11778G>A y m.14484T>C, presentan una actividad del CI normal o ligeramente disminuida (Brown et al., 2000; Cock et al., 1998; Hofhaus et al., 1996; Vergani et al., 1995). Ensayos celulares de respiración mitocondrial usando sustratos del CI (malato y piruvato, o malato y glutamato), mostraron una disminución variable del consumo de oxígeno dependiente de cada mutación (Hofhaus et al., 1996; Vergani et al., 1995; Baracca et al., 2005; Brown et al., 2000), la cual fue acompañada de una importante disminución en la síntesis de ATP dependiente del CI (Baracca et al., 2005). Otros factores relacionados con la fisiopatología de LHON son el aumento de ROS y la disminución de las defensas antioxidantes, los cuales son particularmente evidentes en las mutaciones m.3460G>A y m.11778G>A (Floreani et al., 2005), resultados que coinciden con la disminución de los niveles basales de glutatión, y de las defensas antioxidantes (Schoeler et al., 2007) observados en cíbridos resultantes de la fusión de linfoblastos de pacientes con las mutaciones m.3460G>A y m.11778G>A con la línea de teratocarcinoma humano (NT2), que al ser tratadas con ácido retinoico se diferencian a células neuronales, con el objeto de aumentar su similitud con las células ganglionares de la retina (CGRs) (Wong et al., 2002). Además, la incubación de los cíbridos LHON en medio con galactosa disminuía el crecimiento celular, causando una apoptosis masiva en las células portadoras de las mutaciones m.3460G>A y m.14484T>C, que a su vez, fueron más sensibles al estrés metabólico que la mutación m.11778G>A (Ghelli et al., 2003). Esto mismo se observó en la línea de células inmortalizadas de CGRs, línea RGC-5 (Li et al., 2009). Por otro lado, se ha descrito un descenso en la actividad del trasportador de aminoácidos excitatorios (EAAT1) en cíbridos transmitocondriales con las mutaciones LHON (Beretta et al., 2004). EAAT1 es el principal trasportador de glutamato en las células de la retina, por lo que su funcionamiento anómalo podría producir un acúmulo del glutamato extracelular, exponiendo a las CGRs a exotoxicidad mediada por glutamato, un mecanismo que podría contribuir a su degeneración (Beretta et al., 2004; Beretta et al., 2006; Sala et al., 2008). Otro de los factores a considerar es la relación existente entre la alteración de la homeostasis de calcio, el incremento de ROS, la

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apoptosis y la apertura del poro permeable de transición de la membrana mitocondrial (PTP) que sucede en los cíbridos LHON. En este sentido, cíbridos LHON (m.14484T>C y otra mutación secundaria de LHON) tratados con rotenona (inhibidor del CI), oligomicina (inhibidor del CV) o crecidos en medio con galactosa, sufrieron despolarización de la membrana mitocondrial, la cual se restablecía con ciclosporina A (inhibidor de la apertura del PTP) y con la sobreexpresión de Bcl2 (factor anti-apoptótico) (Porcelli et al., 2009). Wong y Cortopassi observaron una mejora de la supervivencia de cíbridos-NT2 mitocondriales con mutaciones LHON sensibilizados con peróxido de hidrogeno al ser tratados con ciclosporina A (Wong and Cortopassi, 1997). Una protección similar se observó con el uso de ciclosporina A y minocycline (con posible efecto neuroprotector) en los cibridos-NT2 LHON en los que se indujo una alteración en la homeostasis del calcio citosólico al ser previamente tratados con tapsigargina, un inhibidor la captación de calcio por el retículo endoplásmico (Haroon et al., 2007). 6.4 Modelos animales de LHON Aunque los estudios genéticos de LHON comenzaron hace más de dos décadas, apenas se entienden los mecanismos patogénicos que producen la degeneración específica de las CGRs y que podrían permitir una estrategia terapéutica efectiva. Esto es debido en gran parte a la carencia de un buen modelo animal de LHON. El primer modelo animal de LHON se realizó administrando rotenona, un inhibidor del CI, directamente en el ojo de ratones control. El análisis histológico mostró una disminución del 43% del tamaño de la capa de las CGRs un día después de la inyección de rotenona (Zhang et al., 2002b). En otro experimento, se inyectó una ribozima diseñada mediante ingeniería genética, encargada de la degradación específica del ARNm de la subunidad nuclear NDUFA1 del CI. Esta aproximación dio lugar a una neuropatía óptica en el ratón, con reducción de la actividad superóxido dismutasa y con una histología similar a la observada en pacientes LHON (Qi et al., 2003). Otro de los modelos animales se realizó inyectando microesferas que contenían rotenona en la capa superior del colliculus del ojo de ratas control (Marella et al., 2010). Estos animales presentaron los signos más comunes de LHON: pérdida visual a las dos semanas de la inyección, sin daño histológico aparente de las CGRs y donde la muerte de las CGRs ocurrió en estadios posteriores. La inyección de la NADH deshidrogenasa alternativa de levaduras (NDi1) mediante la misma estrategia, permitió la restauración normal de la visión, lo que abre una ventana de posibilidades a la terapia génica (Marella et al., 2010). El último de los modelos es la construcción de un ratón con una mutación equivalente a la m.14600G>A en MT-ND6 en

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humanos (asociada a distonía y síndrome de Leigh cuando está en homoplasmia y atrofia óptica cuando está en heteroplasmia). Esta mutación produce atrofia óptica en el ratón, observándose en los sinaptosomas un aumento de la producción de ROS, y un mantenimiento de los niveles de ATP incluso cuando aumentaba la demanda energética (Lin et al., 2012).

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HIPÓTESIS______

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Hipótesis______

1. Las mutaciones más frecuentes del ADNmt asociadas con neuropatía óptica hereditaria de Leber, m.3460G>A en MT/ND1, m.11778G>A en MT/ND4 y m.14484T>C en MT/ND6, podrían alterar el ensamblaje o estabilidad del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial.

2. El fondo genético mitocondrial o haplogrupo en presencia de las mutaciones del ADNmt más frecuentemente asociadas con neuropatía óptica hereditaria de Leber, m.3460G>A en MT/ND1, m.11778G>A en MT/ND4 y m.14484T>C en MT/ND6 podría influir en el ensamblaje o estabilidad del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial.

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MATERIALES Y MÉTODOS______

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1. MATERIALES______

1.1 Manifestaciones clínicas de los pacientes portadores de las mutaciones LHON

En este estudio se utilizaron fibroblastos procedentes de 6 pacientes con neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), para la obtención de cíbridos mitocondriales, cuyas características clínicas se describen a continuación:

1.1.1 Clínica de los pacientes con la mutación m.3460G>A en MT-ND.

1.1.1.1 Paciente con haplogrupo mitocondrial H12:

Este paciente cursó con una clínica de LHON muy grave. Como antecedentes familiares conocidos, tenía una tía por vía materna fallecida con enfermedad de Parkinson y demencia.

1.1.1.2 Paciente con haplogrupo mitocondrial H*:

Las manifestaciones clínicas de LHON aparecieron de manera tardía, asociadas a una atrofia óptica, desmielinización del sistema nervioso central, neuropatía periférica (el paciente se trasladaba en silla de ruedas), defecto en la conducción cardiaca (uso de marcapasos) y parálisis del diafragma.

1.1.2 Clínica de los pacientes con la mutación m.11778G>A en MT-ND4

1.1.2.1 Paciente con haplogrupo mitocondrial U5a:

Esta paciente cursó con clínica de LHON acompañada de esclerosis múltiple.

1.1.2.2 Paciente con haplogrupo mitocondrial J1c:

Esta paciente presentó clínica grave de LHON, acompañada de síndrome de Wolff- Parkinson-White, una anomalía de la conducción eléctrica del corazón.

1.1.3 Clínica de los pacientes con la mutación m.14484T>C en MT-ND6

1.1.3.1 Paciente con haplogrupo J1b:

Los datos disponibles únicamente indicaban una clínica de LHON.

1.1.3.2 Paciente con haplogrupo mitocondrial J1c:

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Los datos disponibles únicamente indicaban una clínica de LHON.

1.2 Características genéticas de las líneas de cíbridos transmitocondriales en estudio

En el presente trabajo se utilizaron diez líneas celulares correspondientes a cíbridos transmitocondriales control y portadores de las tres mutaciones primarias de LHON. Se realizó la secuenciación del genoma mitocondrial de todas las líneas de cíbridos en estudio y se comparó con la secuencia de referencia revisada de Cambridge (rCRS) (Andrews et al., 1999). Las variantes polimórficas no sinónimas detectadas se detallan en las Tablas 3 y 4.

Tabla 3: Haplogrupos mitocondriales y variantes no sinónimas detectadas en el ADNmt de los cíbridos control utilizados en este estudio.

Controles Identificación Haplogrupo Polimorfismos Cambio de en Genbank no sinónimos aminoácido (según rCRSª) CON/T2 FJ178379 T2 T4216C (MT-ND1) Tyr > His A4917G (MT-ND2) Asn > Asp A10398G (MT-ND3) Thr > Ala C14766T (MT-CYB) Thr > Ile C15452A (MT-CYB) Leu > Ile CON/J1 FJ178380 J1b T4216C (MT-ND1) Tyr > His A4917G (MT-ND2) Asn > Asp G5460A (MT-ND2) Ala > Thr G8557A (MT-ATP6) Ala > Thr A10398G (MT-ND3) Thr > Ala G13708A (MT-ND5) Thr > Ala T13879C (MT-ND5) Ser > Pro C14766T (MT-CYB) Thr > Ile C15452A (MT-CYB) Leu > Ile CON/K1 EU915473 K1a2 A4024T (MT-ND1) Thr > Ser G9055A (MT-ATP6) Ala > Thr A10398G (MT-ND3) Thr > Ala T11025C (MT-ND4) Leu > Pro C14766T (MT-CYB) Thr > Ile C15452A (MT-CYB) Phe > Leu CON/H5 EU915473 H5 A7245G (MT-CO1) Thr > Ala a rCRS: Secuencia revisada de Cambridge (Andrews et al., 1999), la cual pertenece al haplogrupo H2a. Todas las secuencias de ADNmt se diferencian de la rCRS en las variantes polimórficas A8860G (MT-ATP6) y A15326G (MT-CYB). CON/T2, CON/J1, CON/K1 y CON/H5: Hacen referencia a los cíbridos control con haplogrupos T2, J1, K1 y H5, respectivamente.

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Tabla 4: Haplogrupos mitocondriales y variantes no sinónimas detectadas en el ADNmt de los cíbridos portadores de mutaciones LHON utilizados en este estudio.

Cíbrido Mutación Número de Haplogrupo Polimorfismos Cambio de LHON LHON Genbank no sinónimos aminoácido (según rCRSª) ND1/H* m.3460G>A EU915472 H* - - (G3460A) ND1/H12 m.3460G>A EU915475 H12 A14552G (MT-ND6) Val > Ala (G3460A) ND4/J1 m.11778G>A EU915476 J1c T4216C (MT-ND1) Tyr > His (G11778A) A10398G (MT-ND3) Thr > Ala T12083 G (MT-ND4) Ser > Ala G13708A (MT-ND5) Ala > Thr C14766T (MT-CYB) Thr > Ile T14798C (MT-CYB) Phe > Leu A15452C (MT-CYB) Leu > Ile ND4/U5 m.11778G>A EU915477 U5a1 G9477A (MT-CO3) Val > Ile (G11778A) A9667G (MT-CO3) Asn > Ser C14766T (MT-CYB) Thr > Ile A14793G (MT-CYB) His > Arg ND6/J1 m.14484T>C EU915478 J1b A15326G (MT-CYB) Tyr > His (T14484C) G546OA (MT-ND2) Ala > Thr G8557A (MT-ATP6) Ala > Thr A10398G (MT-ND3) Ser > Pro G13708A (MT-ND5) Thr > Ile C14766T ( MT-CYB) Leu > Ile C1542A ( MT-CYB) Leu > Ile ND6/J1´ m.14484T>C EU915479 J1c T4216C (MT-ND1) Tyr > His (T14484C) T7042C (MT-CO1) Val > Ala A10398G (MT-ND3) Thr > Ala G13708A (MT-ND5) Ala > Thr G14279A (MT-ND6) Ser > Leu C14766T (MT-CYB) Thr > Ile T14798C (MT-CYB) Phe > Leu C15452A (MT-CYB) Leu > Ile a rCRS: Secuencia revisada de Cambridge (Andrews et al., 1999), la cual pertenece al haplogrupo H2a. Todas las secuencias de ADNmt se diferencian de la rCRS en las variantes polimórficas A8860G (MT- ATP6) y A15326G (MT-CYB). ND1/H* y ND1/H12 hacen referencia a los cíbridos portadores de la mutación m.3460A>G en MT- ND1, con haplogrupos mitocondriales H* y H12, respectivamente. ND4/J1 y ND4/U5 hacen referencia a los cíbridos portadores de la mutación m.11778A>G en MT- ND4, con haplogrupos mitocondriales J1 y U5, respectivamente. ND6/J1 y ND6/J1´ hacen referencia a los cíbridos portadores de la mutación m.14484C>T en MT- ND6, ambas líneas con haplogrupo mitocondrial J1.

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Las dos líneas celulares control con haplogrupos mitocondriales K1 y H5, así como las seis líneas de cíbridos portadores de mutaciones LHON, fueron cedidas por el Dr. Valerio Carelli (Universitá di Bologna, Italia) y el Dr. Andrea Martinuzzi (E. Medea Scientific Institute, Conegliano Research Centre, Italia). Los cíbridos transmitocondriales control con haplogrupos mitocondriales T y J fueron cedidos por el Dr. Eduardo Ruiz Pesini (Universidad de Zaragoza).

1.3 Reactivos, soluciones y tampones

Todos los reactivos utilizados en este trabajo fueron de grado analítico o apto para biología molecular y bioquímica. La preparación de las soluciones y tampones empleados más comúnmente, se realizó de acuerdo con el libro de Sambrook y Russel, 2001. De forma alternativa, la composición de medios específicos utilizados en los distintos experimentos se detalla en la descripción de los métodos o, en su defecto, en la bibliografía correspondiente. 1.4 Oligonucleótidos para el análisis genético de las mutaciones primarias de LHON

Los oligonucleótidos utilizados en este trabajo como cebadores fueron sintetizados por Roche Diagnostics S.L e Invitrogen. En la Tabla 5 se especifica la denominación de cada oligonucleótido, su secuencia de bases en dirección 5´→3´, la aplicación para la que se diseñaron y su temperatura de anillamiento o meelting (Tm). Los oligonucleótidos sentido se indican con la letra “F” y los oligonucleótidos anti-sentido se indican con la letra “R”.

Tabla 5: Oligonucleótidos para el análisis genético de las mutaciones primarias de LHON.

Nombre Secuencia de ADN Aplicación Tm 3108 F 5´-TTCAAATTCCTCCCTGTACG -3´ PCR-RFLP 57ºC 3717 R 5´-GGCTACTGCTCGCAGTG -3´ 11684 F 5´- TTCACCGGCGCAGTCATTCTCATAA -3´ PCR-RFLP 57ºC 12001 R 5´- TGTTGTGGTAAATATGTAGAG -3´ 14450 F 5´-ATAGCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGA PCR-PIRA 57ºC CAACGA -3´ 14686 R 5´-CCGTGCGAGAATAATGATGTATGC -3´ PCR-PIRA: análisis de restricción mediante el uso de un primer modificado. La base subrayada en el primer 14450 F, introduce artificialmente un sitio de restricción/corte en ausencia de la mutación m.14484C>T.

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1.5 Anticuerpos

A continuación se describen los anticuerpos primarios monoclonales que reconocen subunidades de los complejos del sistema OXPHOS mitocondrial humano, así como los anticuerpos secundarios utilizados en los análisis de Western-blot (apartado 2.7.), y su dilución de trabajo.

1.5.1 Para el complejo I: Anti- NDUFA9 (39 kDa, Molecular Probes). Obtenido en ratón. Dilución 1:1000. 1.5.2 Para el complejo II: Anti- SDHA (70 kDa, Molecular Probes). Obtenido en ratón. Dilución 1:40000. 1.5.3 Para el complejo III: Anti- CORE2 (48.5 kDa, Molecular Probes). Obtenido en ratón. Dilución 1:10000. 1.5.4 Para l complejo IV: Anti- COX5A (16.8 kDa, Molecular Probes). Obtenido en ratón. Dilución 1:4000. 1.5.5 Anticuerpos secundarios: GAMPO (Molecular Probes). Anticuerpo anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa. Dilución 1:1500.

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2. MÉTODOS______

2.1 Generación de cíbridos transmitocondriales LHON

Las líneas celulares con las que se ha realizado este estudio son cíbridos transmitocondriales, células caracterizadas por poseer todas ellas el mismo fondo genético nuclear, pero diferente carga genética mitocondrial (Chalmers et al., 1996; King and Attardi, 1996). Los cíbridos transmitocondriales constituyen el modelo celular más útil para estudiar los mecanismos patogénicos asociados a mutaciones en el ADNmt (Taylor and Turnbull, 2005), ya que permiten expresar un ADNmt pre-seleccionado en células con un fondo nuclear conocido. Este modelo celular ha permitido analizar las consecuencias bioquímicas y fisiológicas del ADNmt (Pallotti et al., 2004; Vives-Bauza et al., 2006), estudiar el efecto del fondo genético nuclear sobre la segregación de las mutaciones patogénicas (Dunbar et al., 1995), o demostrar la presencia de la recombinación heteróloga del ADNmt en células humanas (D'Aurelio et al., 2004). Además, es el modelo más utilizado para estudiar las alteraciones celulares asociadas a mutaciones LHON.

Los cíbridos transmitocondriales control y portadores de las mutaciones LHON se construyeron según métodos descritos previamente (King and Attardi, 1989). La técnica (Figura 11) consiste en deplecionar o eliminar el ADNmt de una línea celular mediante tratamiento con bromuro de etidio (célula rho0). Estas células pueden ser posteriormente repobladas con mitocondrias de células de pacientes con mutaciones patogénicas en el ADNmt. Para ello, se lleva a cabo la fusión de estas células rho0 bien con células enucleadas que mantienen su ADNmt, o bien directamente con plaquetas (que carecen del ADN nuclear, ADNn) derivadas de dichos pacientes. A las células resultantes de la fusión se les conoce como cíbridos transmitocondriales. Las células rho0 no poseen cadena respiratoria funcional, por lo que dependen de uridina y piruvato exógeno para crecer. Ello permite seleccionar fácilmente los cíbridos que contienen el ADNmt del paciente (King and Attardi, 1989). Una vez repobladas las células rho0 con nuevas mitocondrias, se puede analizar el efecto que producen diferentes moléculas de ADNmt sobre un mismo fondo genético nuclear.

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Figura11: Ejemplo de generación de cíbridos transmitocondriales. Los cíbridos se obtienen mediante fusión de citoplastos (o células a las que previamente se les ha eliminado el ADNn) con 0 células rho (o células nucleadas a las que previamente se les ha eliminado el ADNmt). Los cíbridos transmitocondriales se aíslan tras un proceso de selección en un medio de cultivo restrictivo.

Los cíbridos transmitocondriales control con haplogrupos mitocondriales K1 (CON/K1 y H5 (CON/H5) se obtuvieron a partir de fibroblastos enucleados de dos individuos sanos. Los cíbridos transmitocondriales con mutaciones LHON se obtuvieron a partir de fibroblastos enucleados de seis pacientes que portaban en su ADNmt una de las tres mutaciones primarias de LHON. Estas ocho líneas celulares han sido ampliamente estudiadas y caracterizadas en la literatura desde la década de los 90 (Baracca et al., 2005; Beretta et al., 2004; Floreani et al., 2005; Ghelli et al., 2003; Vergani et al., 1995). Los cíbridos transmitocondriales control con haplogrupos mitocondriales T (CON/T) y J (CON/J) se obtuvieron a partir de plaquetas de dos individuos sanos.

2.2 Cultivos celulares

Los cíbridos transmitocondriales se cultivaron en medio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) con 4,5 g/l de glucosa (Invitrogen), complementado con suero fetal bovino (FBS) al 5%, 50 µg/mL de uridina y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (Lonza Rockland,

Inc) a una temperatura de 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%, 95% de aire y 99% de humedad.

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La descongelación de las diferentes líneas se realizó mediante inmersión de los criotubos (Nunc, Thermo Fisher) en un baño a 37ºC y su posterior cultivo. Para el subcultivo de las distintas líneas celulares, éstas se despegaron de la placa mediante un tratamiento con tripsina-EDTA (0,5 mg/ml tripsina, 0,22 mg/ml EDTA) (Lonza Rockland, Inc) a 37ºC. Posteriormente se sembraron en una botella de cultivo T-75 o T-175 (Nunc, Thermo Fisher) en función del número de células necesarias para el experimento. Los cíbridos se pasaron cuando alcanzaron el 70-80% de confluencia, mediante dilución 1/10 en controles y 1/5 en células mutadas. Para la congelación de estas células se utilizó un medio de congelación consistente en una solución al 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich) en medio de cultivo DMEM. Una vez despegadas las células según se ha descrito, recogidas en medio DMEN y centrifugadas en un falcon de 15 ml a 2500 rpm durante 5 minutos, el pellet se resuspendió en 1 ml del medio de congelar y se introdujeron en criotubos. Estos criotubos se colocaron en contenedores con 2-propanol (Sigma-Aldrich), se guardaron en congeladores de -80ºC durante varios días antes de ser conservados en nitrógeno líquido.

2.3 Inhibición de la traducción mitocondrial mediante tratamiento con doxiciclina

Para analizar las cinéticas de ensamblaje de los complejos del sistema OXPHOS en los cíbridos transmitocondriales, se bloqueó la formación de los complejos que contienen subunidades codificadas por el ADNmt mediante tratamiento con doxiciclina, que a bajas concentraciones provoca la inhibición específica y reversible de la traducción de proteínas mitocondriales. La retirada de la doxiciclina del medio de cultivo posibilita la reanudación de la síntesis de novo de las proteínas mitocondriales, lo que permite analizar la incorporación individual de las proteínas recién sintetizadas en los diferentes complejos OXPHOS (Figura 12). Esta estrategia fue utilizada previamente para estudiar la ruta de ensamblaje del complejo I en la línea celular 143B-206 TK- (Ugalde et al., 2004b).

Para bloquear la traducción mitocondrial, las células se cultivaron en un medio con 15 g/ml de doxiciclina durante un periodo máximo de 6 días, al cabo de los cuales se retiró la droga mediante sustitución por el medio de cultivo normal. El tratamiento con doxiciclina se realizó durante dicho periodo debido a que tratamientos más prolongados alteraban la viabilidad celular. Tras la retirada del antibiótico, las células se crecieron en condiciones exponenciales y se recolectaron a los distintos tiempos especificados en cada experimento.

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Inhibición Reversible con Doxiciclina

6º Día 1- Se retira doxiciclina

Durante 6 días Tras 72 horas *T72h Tras 48 horas *T48h Los cíbridos se crecieron en presencia de ¤doxiciclina Tras 24 horas *T24h

Tras 15 horas ¤ Doxiciclina: antibiótico que inhibe *T Tras 6 horas 15h de manera reversible la traducción de las proteínas codificadas por el *T6h ADNmt *T0h 2-Se Añadió el medio normal *Se recoge pellet celular Figura 12: Procedimiento experimental para la inhibición reversible de la traducción mitocondrial mediante tratamiento con doxiciclina. Las células se cultivaron en un medio con doxiciclina durante 6 días, al cabo de los cuales se retiró la droga mediante sustitución por el medio de cultivo normal. Las células se crecieron en condiciones exponenciales y se recogieron a los distintos tiempos (T0, T6, T15,

T24, T48, T72 y T96, en horas) tras la retirada de la droga.

2.4 Detección mediante análisis de restricción de las mutaciones LHON en cíbridos transmitocondriales

La presencia en homoplasmia de las mutaciones primarias de LHON en los cíbridos transmitocondriales se verificó mediante análisis de PCR-RFLP o PCR-PIRA.

2.4.1 Aislamiento de ADN total de cíbridos transmitocondriales

Para el aislamiento de ADN total a partir de las líneas de cíbridos transmitocondriales en cultivo se utilizó el kit Nucleon BACC3 for Blood & Cell Cultures (Amersham Biosciences) siguiendo las indicaciones del fabricante. La concentración de los ADN obtenidos se cuantificó espectrofotométricamente a 260 nm mediante el uso del nanodrop (NanodropSpectrophotometer ND-1000, versión 3.3.0). El ADN se almacenó a -20 °C hasta su uso.

2.4.2 Amplificación de ADN y condiciones de PCR

Para llevar a cabo la amplificación, se preparó una mezcla de reacción que contenía los siguientes reactivos a las concentraciones finales indicadas: 1X NH4 Reaction Buffer

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(Bioline), 1,5 mM MgCl2 (Bioline), 0,025 U/L BioTaq DNA polymerase (Bioline), 0,2 mM de cada uno de los 2’-Deoxinucleótidos 5’-Trifosfato (timidina, citosina, guanina y adenina), 0,2 M de cada oligonucleótido (sentido o F y antisentido o R) y 50-100 ng del ácido nucleico a amplificar.

Las condiciones de las reacciones de PCR fueron las mismas para todos los ADNs obtenidos de las distintas líneas celulares y consistieron en los siguientes pasos : 1 ciclo de 5 minutos a 95 ºC, 30 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 1 minuto a 57 ºC y 1 minuto a 72ºC, 1 ciclo de 10 minutos a 72ºC y una etapa final a 4ºC.

2.4.3 Purificación de fragmentos de ADN en geles de agarosa

Con el fin de evitar contaminaciones con amplificaciones de ADN inespecíficas, se procedió a la purificación de las bandas correspondientes de ADN a partir de geles de agarosa (Lonza Rockland, Inc). La purificación se realizó con el kit GFX PCR ADN and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences), siguiendo las indicaciones del fabricante.

2.4.4 Detección de las mutaciones primarias de LHON mediante digestión de los fragmentos de ADN amplificados por PCR y purificados del gel.

Las condiciones generales de digestión con enzimas de restricción de los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR se realizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las reacciones de digestión se llevaron a cabo durante 2 horas a 37ºC, seguidas de una incubación de 20 minutos a 80ºC para la inactivación de las enzimas.

2.4.4.1 Detección de la mutación m.3460G>A en MT- ND1

Para la amplificación de este fragmento de ADN se usaron los oligonucleótidos 3108F y 3717R (Tabla 5). Esta mutación produce un cambio G por A en la posición 3460 del ADNmt, el cual elimina un punto de Figura 13: Patrón de bandas de la digestión con HinlI, para la corte para la enzima de restricción Hin1I (BsaHI) detección de la mutación (Fermentas GmbH). El patrón de bandas resultante de la m.3460G>A en MT-ND1.

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digestión se muestra en la Figura 13, que representa las bandas de RFLP para los casos de una muestra control (C) con el cambio nucleotídico en homoplasmia normal, de una muestra con el cambio en homoplasmia mutante (M) y una muestra heteroplásmica (H).

2.4.4.2 Detección de la mutación m.11778G>A en MT-ND4

Para la amplificación de este fragmento de ADN se usaron los oligonucleótidos 11684F y 12001R (Tabla 5). Esta mutación produce un cambio G por A en la posición 11778 del ADNmt, el cual elimina un punto de corte para la enzima LweI (SfaNI) (Fermentas GmbH). El patrón de bandas resultante de la digestión se muestra en la Figura 14, que representa el RFLP para los casos de Figura 14: Patrón de bandas de una muestra control (C), de una muestra con el la digestión con LweI, para la cambio nucleotídico en homoplasmia mutante (M) y detección de la mutación m.11778G>A en MT-ND4. una muestra heteroplásmica (H).

2.4.4.3 Detección de las mutación m.14484T>C en MT-ND6

Para la amplificación de este fragmento de ADN se usaron los oligonucleótidos 14417F y 14710R (Tabla 5). Esta mutación produce un cambio T por C en la posición 14484 del ADNmt, que elimina un punto de corte para la enzima MboI (Sau 3AI) (Takara Bio, Inc). El patrón de bandas resultante de la digestión se muestra en la Figura 15, que representa el producto del RFLP para los casos de una muestra normal (C), de una muestra homoplásmica mutante (M) y una Figura 15: Patrón de bandas de la digestión con MboI, para la detección muestra heteroplásmica (H). de la mutación m.14484T>C en MT- ND6 2. 5 Cuantificación del número de copias de ADNmt

La cuantificación relativa del ADNmt frente al nuclear (ADNn) se realizó mediante PCR a tiempo real en un sistema HT7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) (Andreu et al., 2009). En primer lugar, se extrajo el ADN total de las diez líneas de cíbridos transmitocondriales (cuatro controles y seis líneas portadoras de mutaciones LHON), de las

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células de osteosarcoma 143B-206-TK- y de la línea de células 143B rho0 como control negativo, utilizando para ello el kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH). Se cuantificó el ADNmt y ADNn de cada una de las muestras en el mismo pocillo de reacción. Para la cuantificación del ADNmt se usó una pareja de cebadores (oligonucleótido sentido: 5'-CCA CGG GAA ACA GCA GTG AT-3'; oligonucleótido anti-sentido: 5'-CTA TTG ACT TGG GTT AAT CGT GTG A-3') que amplifica un fragmento del gen 12S mitocondrial y una sonda Taqman marcada en 5´ con el fluorocromo 6FAM (5'-FAM-TGC CAG CCA CCG CG-MGB-3') para su detección. Para la cuantificación del ADNn se usó el Kit Human RNAasaP (Applied Biosystems), que incluye una pareja de cebadores que amplifica un fragmento del gen nuclear RNAasa P y una sonda TaqMan marcada en 5´con el fluorocromo VIC para su detección. Cada pocillo de reacción contenía un volumen final de 20 microlitros, que incluía una mezcla 1X de Taqman universal PCR mastermix (Applied Biosystems), 1µl del kit RNAasa P, 112 nM de cada cebador del ADNmt, 125 nM de la sonda mitocondrial marcada con 6FAM y 2 ó 10 ng del ADN total. Las condiciones del termociclador fueron las siguientes: 1 ciclo a 50°C de 2 minutos, 1 ciclo a 95°C de 10 minutos, y 40 ciclos de desnaturalizacióna 95°C de 15 segundos y de extensión a 60°C de 1 minuto. La cuantificación de las muestras se realizó por duplicado y con dos concentraciones de ADN distintas (2 y 10 ng de ADN total). La cuantificación absoluta del ADNmt y ADNn se calculó usando una curva de calibración realizada por dilución de una solución stock, consistente en una mezcla de un número conocido de copias de dos plásmidos, uno con el fragmento del gen 12S del ADNmt y otro con el fragmento del gen RNAasa P nuclear. El número de copias del ADNmt de este calibrador se determinó dividiendo su concentración por el peso molecular de cada plásmido. 2.6 Electroforesis azul nativa en geles de poliacrilamida (BN-PAGE)

2.6.1 Purificación de mitocondrias a partir de cíbridos transmitocondriales mediante tratamiento con digitonina Las mitocondrias se aislaron de los cultivos celulares como se ha descrito previamente (Nijtmans et al., 2002), a excepción de pequeñas modificaciones en el protocolo. Los cíbridos se cultivaron hasta que las células alcanzaron un 70-80% de confluencia. Las células se recogieron con tripsina, se lavaron dos veces con tampón fosfato (PBS) y se resuspendieron en 100 μl de PBS y 100 μl de solución de digitonina (4 mg/ml). Las muestras se mantuvieron en

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hielo durante 10 minutos para disolver las membranas. Se les añadió 1 ml de PBS frío y se centrifugaron durante 10 minutos a 10000 rpm a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y el pellet se lavó una vez más con 1 ml de PBS frío. 2.6.2 Preparación de muestras para ensayos de electroforesis azul nativa (BN-PAGE) Para la separación de los complejos mitocondriales en condiciones nativas, los pellets mitocondriales obtenidos en el apartado anterior se solubilizaron en 100 μl de tampón 1,5 M ácido 6-amino hexanoico (Sigma Aldrich), 50 mM Bis-Tris (Sigma Aldrich) a pH 7,0. Se determinó la concentración de proteína utilizando el kit Micro BCA Protein Assay (Pierce). Tras conocer la concentración de proteínas de cada una de los pellets celulares solubilizados, se les añadió una solución de n-dodecyl b-D-maltósido (DDM, Sigma) al 2% (p/v) y se incubaron en hielo durante 10 minutos. Después de centrifugar durante 30 minutos a 13000 rpm a 4ºC se recogió el sobrenadante, al cual se añadieron 10 μl de tampón de carga: 750 mM ácido 6-amino hexanoico, 50 mM Bis-Trisa pH: 7, 0,5 mM EDTA y 5% Serva Blue G-250 (Serva). 2.6.3 Electroforesis bidimensional azul nativa (BN/PAGE) La electroforesis azul nativa (BN-PAGE) es una técnica que permite separar, en una primera dimensión llevada a cabo en condiciones no desnaturalizantes (1D-BN-PAGE), los complejos de la cadena respiratoria con su conformación nativa y por tanto, funcionalmente activos. Posteriormente, las subunidades que componen dichos complejos se pueden separar en una segunda dimensión llevada a cabo en condiciones desnaturalizantes (2D-BN/SDS- PAGE). 2.6.3.1 Preparación de geles de poliacrilamida para la electroforesis nativa en primera dimensión (1D-BN-PAGE) La separación de los complejos mitocondriales se realizó en geles separadores no desnaturalizantes con un gradiente del 5-15% de acrilamida/bisacrilamida (29:1, Biorad), utilizando separadores de 1,5 mm. Dichos geles se prepararon a temperatura ambiente en el sistema de formación de geles múltiples en gradiente Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber (Bio-Rad), a partir de la mezcla de dos soluciones con concentraciones del 5% y 15% de acrilamida/bisacrilamida, para conseguir un gradiente del 5-15% (Figura 16). Una vez preparados, los geles se mantuvieron a 4ºC durante 24 horas antes de ser usados. El gel concentrante se preparó posteriormente, a una concentración del 4% de acrilamida/bisacrilamida (29:1, Bio-Rad).

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Figura 16: Sistema para la preparación manual de geles en gradiente. A la izquierda se presenta el sistema para preparación de geles múltiples (Mini-PROTEAN 3 Multi-casting chamber) y a la derecha, el sistema de formación de gradientes (Bio-Rad) utilizados en este trabajo.

2.6.3.2 Electroforesis nativa en primera dimensión (1D-BN-PAGE) Para la primera dimensión (1D-BN-PAGE), se utilizaron los geles con un gradiente del 4-15% de acrilamida/bisacrilamida descritos en el apartado anterior. Se cargaron 40 μg de proteína mitocondrial por pocillo, se utilizó como ánodo el tampón A (50 mM Bis-Tris pH 7,0) y como cátodo el tampón C1 (15 mM Bis-Tris, 50 mM tricina pH 7,0 y 0,02% Serva Blue G-250). Las proteínas se separaron inicialmente a 30 V durante 30 minutos. Posteriormente se aplicó un voltaje de 80 V. Cuando el frente de electroforesis estuvo aproximadamente en la mitad del gel, se cambió el tampón C1 por el tampón C2 (15 mM Bis-Tris, 50 mM tricina pH 7,0) para lavar el exceso de azul de los geles, continuando su separación a 80 V hasta que el frente de azul de coomassie comenzadaba a salir del gel. Los ensayos 1D-BNE-PAGE se realizaron por triplicado para cada línea celular (Figura 17). Uno de los geles fue procesado para una segunda dimensión (2D) en un gel al 10% SDS- PAGE, siguiendo los métodos descritos a continuación en el apartado 2.6.3.3 (Figura 17). Otro gel se utilizó para transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa (apartado 2.7) y poder analizar el ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria en su conformación nativa. El tercer gel se utilizó para realizar el ensayo de actividad en gel (IGA) del complejo I mitocondrial descrito en el apartado 2.8. 2.6.3.3 Electroforesis en segunda dimensión en condiciones desnaturalizantes (2D- BN/SDS-PAGE) En la electroforesis en segunda dimensión (2D-BN/SDS-PAGE), se separaron las distintas subunidades de los complejos de la cadena respiratoria en función de su peso molecular. Para ello se cortó con un bisturí cada carril del gel de 1D-BN-PAGE y se rotó 90º 54

en un cristal (Figura 17). La banda cortada se incubó durante una hora en una solución desnaturalizante (1% SDS, 1% β-mercaptoetanol). El exceso de solución desnaturalizante se eliminó utilizando papel de filtro. Este paso es esencial pues el β-mercaptoetanol inhibe la polimerización de la acrilamida del gel separador de la 2D-BN/SDS-PAGE. Posteriormente se montó el sistema de electroforesis, utilizando cristales con separadores de 0,75 mm. El gel separador se preparó al 10% acrilamida/ bisacrilamida y 0,1% SDS. El gel concentrante se preparó al 4% acrilamida/ bisacrilamida con 0,1% SDS y se añadió alrededor de la banda de 1D-BNE-PAGE. Como ánodo se utilizó el tampón A-SDS (0,2 M Tris HCl pH 8,9) y como cátodo el tampón C-SDS (0,1 M Bis-Tris, 0,1 M tricina pH 8,2 y 0,1% SDS). Las proteínas se separaron a 30 V durante 30 minutos y posteriormente a 80 V durante 2-4 horas.

Figura 17. Electroforesis bidimensional azul nativa. (1) Los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial se separan en su conformación nativa mediante una primera dimensión de la electroforesis azul nativa (1D-BN-PAGE). (2 y 3) Preparación de geles y separación de proteínas en una segunda dimensión realizada en condiciones desnaturalizantes (2D-BN/SDS-PAGE). Para ello se corta cada carril del gel de 1D, se rota 90º y se inserta en un gel al 10% de acrilamida/ bisacrilamida. Las proteínas se separan en el gel separador en función de su peso molecular. Las fotos en azul muestran el patrón de subcomplejos proteicos que se pueden observar en geles 2D- BN/SDS-PAGE utilizando la tinción con azúl de coomassie modificado de (Calvaruso et al., 2008; Fassone and Rahman, 2012).

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2.7 Trasferencia e inmunodetección de proteínas unidas a membrana (WESTERN BLOT)

Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa PROTAN® (Schleider & Schuell) a 25 V y temperatura ambiente durante toda la noche en un sistema de trasferencia de Biorad en buffer de trasferencia. Posteriormente, las membranas se preincubaron durante 14-16 horas en solución de bloqueo (0,1% Tween-20 y 5% leche desnatada en polvo en PBS) en agitación y se incubaron durante 2 horas con el anticuerpo primario correspondiente en las condiciones de dilución pre- establecidas para cada uno de ellos (apartado 1.5). Las membranas se lavaron tres veces con 0,1% Tween-20 en PBS y se incubaron utilizando una dilución 1:1500 del anticuerpo secundario correspondiente, durante 1 hora a temperatura ambiente en solución de bloqueo. Cada membrana se lavó tres veces con 0,1% Tween-20 en PBS. Como reactivo de revelado se utilizó el kit ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham). La cuantificación de la señal se realizó mediante el programa de análisis de imágenes Image J 1.36 (http://rsb.info.nih.gov/ij). 2.8 Ensayos de actividad en gel (IGAs) Para el ensayo de actividad en gel (IGA) del complejo I, los geles se incubaron 2 horas a temperatura ambiente con la siguiente solución: 2 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL NADH y 2,5 mg/mL NTB (azul de nitrotetrazolium, Sigma). Después de la incubación, los geles se lavaron y escanearon inmediatamente. 2.9 Estadística Los datos de este estudio fueron analizados con ayuda del programa informático SPSS (versión 15.0). Para valorar que las muestras seguían un patrón de distribución normal se utilizó el test de Kolmogorov Smirnof (p<0,05). El estudio de las diferentes grupos se realizó mediante el test t-student para datos independientes, estableciendo diferencias significativas cuando la p<0,05.

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RESULTADOS______

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RESULTADOS______

1. CONFIRMACIÓN DE LOS NIVELES DE HOMOPLASMIA DE LAS MUTACIONES LHON EN CÍBRIDOS TRANSMITOCONDRIALES______

Para los estudios descritos en el presente trabajo se utilizaron diez líneas celulares: cuatro líneas de cíbridos control (CON) con haplogrupos mitocondriales T2, J1, K1 y H5 (CON/T2, CON/J1, CON/K1 y CON/H5, respectivamente), así como seis líneas de cíbridos portadores de una de las tres mutaciones primarias que están implicadas en la neuropatía óptica hereditaria de Leber (o mutaciones LHON). Dos líneas celulares tenían la mutación m.3460G>A, que afecta a la subunidad ND1 del complejo I, con los haplogrupos mitocondriales H* (ND1/H*) y H12 (ND1/H12); dos líneas con la mutación m.11774G>A, que afecta a la subunidad ND4 del mismo complejo, con los haplogrupos mitocondriales J1 (ND4/J1) y U5 (ND4/U5); y dos líneas celulares con la mutación m.14484T>C, que afecta a la subunidad ND6, con haplogrupo mitocondrial J1 (ND6/J1). Para confirmar la presencia en homoplasmia de las tres mutaciones primarias de LHON en los cíbridos transmitocondriales de estudio, se realizó un análisis de PCR-RFLP o PCR-PIRA específica para cada una de las mutaciones, utilizando para ello los oligonucleótidos, enzimas de restricción y condiciones experimentales descritas en los apartados 1.4 y 2.4 de Materiales y Métodos. En primer lugar, se analizaron los niveles de la mutación m.3460G>A en el gen MT- ND1 en las líneas celulares con dicha mutación y haplogrupos mitocondriales H* y H12 (ND1/H* y ND1/H12) (Figura 18). Para ello, a partir de ADN celular total se amplificó un fragmento de 610 pares de bases (pb) mediante PCR. En cíbridos control, después de la digestión con la enzima de restricción Hin1 I (BsaHI) aparecieron dos únicos productos de 358 y 252 pb. La presencia de la mutación elimina dicho sitio de restricción, por lo que la aparición de un único fragmento de 610 pb en los cíbridos mutantes confirmaba el estado homplásmico de la mutación.

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Figura18: Análisis por PCR-RFLP de la mutación m.3460G>A. Digestión enzimática con Hin1I (BsaHI) de la PCR realizada para detectar la mutación m.3460G>A. CON/H5 y CON/K1: Líneas celulares control con haplogrupos H5 y K1. ND1/H* y ND1/H12: Líneas celulares portadoras de la mutación m.3460G>A en haplogrupos H* y H12.

En segundo lugar, se analizó la mutación m.11778G>A en las líneas celulares con esta mutación, con haplogrupos mitocondriales U5 y J1 (ND4/U5 y ND4/J1) (Figura 19). Para ello, a partir de ADN celular total se amplificó un fragmento de 318 pb mediante PCR. En cíbridos control, después de la digestión con la enzima de restricción LweI (SfaNI) aparecieron dos productos de 219 y 99 pb. La presencia de la mutación elimina el sitio de corte, apareciendo un único fragmento de 318 pb en los cíbridos mutantes lo que confirmaba el estado homoplásmico de la mutación.

Figura 19: Análisis por PCR-RFLP de la mutación m.11778G>A. Digestión enzimática con LweI (SfaNI) de la PCR realizada para detectar la presencia de la mutación m.11778G>A. CON/H5 y CON/K1: Líneas celulares control con haplogrupos H5 y K1. ND4/J1 y ND4/U5: Líneas con la mutación m.11778G>A en haplogrupos J1 y U5.

Por último, se analizaron los niveles de heteroplasmia de la mutación m.14484T>C en las líneas celulares portadoras de dicha mutación y haplogrupo mitocondrial J1 (ND6/J1 y ND6/J1’) (Figura 20). Para ello, a partir de ADN celular total se amplificó un fragmento de 237 pb mediante PCR. En cíbridos control, después de la digestión con la enzima de restricción MboI (Sau3AI) aparecieron dos productos de 205 y 32 pb. La presencia de la mutación elimina dicho sitio de restricción, apareciendo un único fragmento de 237 pb en los cíbridos mutantes, lo que indicaba un estado de homoplasmia de la mutación.

Figura 20: Análisis por PCR-PIRA de la mutación m.14484T>C. Digestión enzimática con MboI (Sau 3AI) de la PCR realizada para detectar la mutación m.14484T>C. CON/H5 y CON/K1: Líneas celulares control con haplogrupos H5 y K1. ND6/J1 y ND6/J1´: Líneas con de la mutación m.14484T>C con haplogrupo J1.

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2. NIVELES ESTACIONARIOS DE LOS COMPLEJOS DE LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL EN CÍBRIDOS LHON______

Con objeto de analizar los niveles estacionarios de los complejos individuales de la cadena respiratoria mitocondrial en los cíbridos LHON, se purificaron sus fracciones mitocondriales y se sometieron a electroforesis azul nativa (BN-PAGE) en dos geles independientes.

En una de los geles, se realizó un ensayo de actividad en gel (IGA) para el complejo I (Figura 21, primer panel). Dicho ensayo reveló que la actividad del CI bien era normal, o bien se encontraba ligeramente aumentada en todas las líneas con alguna de las tres mutaciones primarias de LHON, aunque sin observarse diferencias significativas respecto a las líneas control.

En el gel que se procesó en paralelo, se llevó a cabo un ensayo de western-blot. En este ensayo, las membranas se incubaron con anticuerpos que reconocen específicamente subunidades de los complejos del sistema OXPHOS: la subunidad NDUFA9 del complejo I, la proteína SDHA del complejo II, la subunidad CORE2 del complejo III y la subunidad COX5A del complejo IV. Tal como se puede observar en la Figura 21, los niveles estacionarios del complejo I, al igual que en los complejos III y IV, fueron normales en todas las líneas de cíbridos que portaban las mutaciones LHON, no observándose diferencias significativas respecto a los cíbridos control. Sin embargo, el complejo II presentaba niveles más bajos en las líneas de cíbridos que contenían la mutación m.11778G>A (11778/ND4) (Figura 21, panel inferior). Esta disminución podría reflejar un descenso de la masa mitocondrial, tal como se ha sugerido en estudios previos que mostraban una reducción de la actividad enzimática de la citrato sintasa en las líneas de cíbridos 11778/ND4 frente a los controles (Baracca et al., 2005). El resto de las líneas de cíbridos con mutaciones en las subunidad ND1 (3460/ND1) o ND6 (14484/ND6) mostraron unos niveles de complejo II comparables a los de los cíbridos control, lo que concuerda con la actividad normal de la citrato sintasa previamente descrita en estos cíbridos mutados (Baracca et al., 2005).

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Figura 21: BN-PAGE de los complejos del sistema OXPHOS en las líneas de cíbridos control y portadoras de mutaciones LHON. Para separar los complejos de la cadena respiratoria, se procesaron 40 µgr de proteína mitocondrial en geles BN-PAGE con un gradiente del 4-15%. Primer panel: Ensayo de actividad en gel para el complejo I (CI-IGA). Un segundo gel se procesó en paralelo y se analizó por western-blot usando anticuerpos contra las siguientes subunidades: del complejo I, NDUFA9 (segundo panel); del complejo III, CORE2 (tercer panel); del complejo IV, COX5A (cuarto panel), y del complejo II, SDHA (quinto panel). CI: Complejo I. CIII2: Complejo III dimérico. III2+IV: Supercomplejo III2+IV. CIV: Complejo IV. CII: Complejo II. En la parte superior de la figura se indica el nombre de las líneas celulares, en la parte inferior los haplogrupos mitocondriales a los que pertenece cada línea. A la derecha de la figura se indica el anticuerpo utilizado y a la izquierda, el peso molecular aproximado del complejo marcado.

Para excluir la posibilidad de que las diferencias observadas en los niveles de los complejos de la cadena respiratoria entre las distintas líneas fueran debidas a variaciones en su masa mitocondrial, se utilizaron las señales obtenidas del complejo II para normalizar dichos complejos. Para ello, se densitometraron las señales obtenidas para cada uno de los complejos

de la cadena respiratoria (complejos I, III, IV y el supercomplejo III2+IV) y se dividieron por la medida densitométrica de los niveles del complejo II. En este análisis no se observaron diferencias significativas en los niveles de los complejos de la cadena respiratoria entre los distintos controles con diferentes haplogrupos (Figura 22).

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Figura 22: Niveles estacionarios de los complejos I, III, IV de la cadena respiratoria y del supercomplejo III2+IV, así como de la actividad en gel del complejo I (IGA-CI) en cíbridos control. Cada valor corresponde a la media de las señales obtenidas en cinco experimentos de BN-PAGE independientes, normalizados por la medida del complejo II. No se observaron diferencias significati vas entre las distintas lineas control. u.a.d: Unidades arbitrarias de densitometrado. Posteriormente, se calculó la media de las señales obtenidas de la actividad en gel del

complejo I y de los complejos I, III, IV y del supercomplejo III2+IV de las cuatro líneas de cíbridos control y se compararon con las medidas de las señales de las seis líneas de cíbridos mutantes (3460/ND1, 11778/ND4 y 14484/ND6) (Figura 23).

Figura 23 : Análisis comparativo de los niveles estacionarios de los complejos I, III, IV de la cadena respiratoria y del supercomplejo III +IV, así como de la actividad en gel del complejo I (IGA-CI) 2 entre cíbridos control y cíbridos portadores de mutaciones LHON. Cada valor corresponde a la media de las señales obtenidas en cinco experimentos independientes de BN-PAGE, normalizados por la medida del complejo II. Las diferencias significativas (t-student, p<0,05) se han señalado con un asterisco (*). u.a.d: Unidades arbitrarias de densitometrado.

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2.1 Análisis de los cíbridos con la mutación m.3460G>A en MT-ND1 Tras normalizar las señales obtenidas de los diferentes complejos respecto al complejo II, no se encontraron diferencias significativas al comparar los niveles estacionarios de los complejos I, III, IV o la actividad en gel del complejo I entre las líneas con la mutación m.3460G>A respecto a los controles, independientemente del fondo genético mitocondrial en el que se encontraba dicha mutación (haplogrupos mitocondriales H* y H12). Sin embargo, se observó una caída significativa en los niveles del supercomplejo

III2+IV en la línea celular ND1/H12, que curiosamente no se correlacionó con una disminución en los niveles del complejo III ni del complejo IV (Figura 23). 2.2 Análisis de los cíbridos con la mutación m.11778G>A en MT-ND4 Al analizar los niveles de los complejos de la cadena respiratoria en las líneas portadoras de la mutación m.11778G>A, se observó un aumento significativo tanto en la actividad en gel del complejo I como en los niveles de los complejos I, III y IV en la línea de cíbridos con haplogrupo mitocondrial J1 (ND4/J1) en comparación con las líneas de cíbridos control, así como con la línea que portaba la misma mutación pero con haplogrupo mitocondrial U5 (ND4/U5). Al comparar los valores obtenidos para la línea de cíbridos ND4/U5 respecto a los controles, no se detectaron diferencias significativas en los niveles estacionarios de ningún complejo de la cadena respiratoria (Figura 23). 2.3 Análisis de los cíbridos con la mutación m.14484T>C en MT-ND6 Aunque las dos líneas portadoras de la mutación m.14484T>C manifestaron una mayor señal tanto de la actividad en gel del complejo I, como de los niveles estacionarios de los diferentes complejos analizados, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas al compararlas con los valores obtenidos de los controles. Tampoco se encontraron diferencias significativas entre ambas líneas (Figura 23). 2.4 Análisis de las líneas con haplogrupo mitocondrial J1 Curiosamente, las tres líneas portadoras de mutaciones LHON con haplogrupo mitocondrial J1 mostraron niveles elevados en sus actividades en gel del complejo I, así como en los niveles de los complejos I, III y IV respecto a los controles. Sin embargo, dicho aumento sólo fue estadísticamente significativo (p<0.05) para la línea 11778/ND4. En el supercomplejo III2+IV no se encontraron diferencias significativas en ninguna de las líneas al compararlo con los controles.

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2.5 Posible influencia de las variaciones en la masa mitocondrial Para excluir que las diferencias observadas en los niveles de los complejos de la cadena respiratoria se debían a variaciones en el número de copias del ADNmt en las diferentes líneas celulares, se calculó el ratio de copias de ADNmt respecto al ADN nuclear (ADNn) en cada una de las líneas (Tabla 6). Los resultados mostraron que no existían diferencias significativas en el cociente ADNmt/ADNn entre los controles y la línea mutada ND1/H* (Tabla 6). Sin embargo, el resto de las líneas portadoras de mutaciones LHON presentaron un incremento o un descenso en el contenido de ADNmt.

Línea celular Ratio ADNmt / ADNn Tabla 6: Número de copias de ADNmt de las 143B-206-TK- 381±20 líneas de cíbridos, expresadas como el ratio ADNmt/ADNn. Controles (n=4) 345±44 ND1/H* 395±36 Los números indican el valor medio de cuatro ND1/H12 517±62 medidas independientes ± desviación estándar ND4/U5 553±32 (X±SD). ND4/J1 639±35 ND6/J1 243±26

ND6/J1´ 239±20 143B rho0 No detectables

En primer lugar las líneas ND4/U5 y ND4/J1 mostraron un ratio elevado de ADNmt/ADNn respecto a los controles. Estas líneas también presentaron una disminución de los niveles del complejo II y una reducción relativa de la actividad citrato sintasa (Baracca et al., 2005) lo que podría sugerir que el mayor contenido de ADNmt pudiera manifestarse como un mecanismo para compensar una disminución en la masa mitocondrial. Por el contrario, la línea ND1/H12 mostró un ratio elevado y las dos líneas 14484/ND6 un ratio disminuido de ADNmt/ADNn, pero ambas líneas con niveles normales de complejo II y de citrato sintasa (Baracca et al., 2005). Estas diferencias relativas en el contenido del ADNmt de los cíbridos con mutaciones LHON no se vieron reflejadas en los niveles estacionarios de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial, excepto en la línea ND4/J1 que presentó niveles significativamente elevados de los diferentes complejos.

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3. ACUMULACIÓN DE INTERMEDIARIOS DEL COMPLEJO I EN CÍBRIDOS CON MUTACIONES LHON______Para valorar si las mutaciones primarias LHON realmente afectaban al ensamblaje o estabilidad del complejo I, se realizó un ensayo de blue native en dos dimensiones (BN- PAGE), ya que esta técnica permite determinar en detalle la posible acumulación de intermediarios del ensamblaje o de productos de degradación de los complejos de la cadena respiratoria. Una vez procesadas las muestras, los distintos geles se incubaron con un anticuerpo que reconoce específicamente la subunidad NDUFA9 del complejo I. Cada una de las líneas de cíbridos con mutaciones LHON se comparó con el control correspondiente a su mismo haplogrupo mitocondrial. 3.1 Análisis de las líneas de cíbridos LHON 3460/ND1 en haplogrupo H Tal como se observa en la Figura 24, los cíbridos portadores de la mutación m.3460G>A con haplogrupo mitocondrial H* (ND1/H*) mostraron un ensamblaje correcto del complejo I, así como un patrón normal de subcomplejos de bajo peso molecular. Sin embargo, los cíbridos con la mutación m.3460G>A con haplogrupo mitocondrial H12 (ND1/H12), mostraron en comparación con los controles una clara acumulación de la subunidad NDUFA9 en subcomplejos de bajo peso molecular, lo que sugiere fallos en el ensamblaje o en la estabilidad del complejo I.

Figura 24: Análisis comparativo mediante 2D– BN/SDS-PAGE del estado estacionario del complejo I en la línea control con haplogrupo H5 (CON/H5) y en los cíbridos 3460/ND1, con haplogrupos H (ND1/H ) y H12 (ND1/H12). El complejo I ( 980kDa) se marcó con un anticuerpo primario que reconoce la subunidad NDUFA9 (39 kDa). CI, indica la posición relativa del complejo I totalmente ensamblado. Las direcciones de la primera (1D) y segunda dimensión (2D) se indican mediante flechas.

3.2 Análisis de las líneas de cíbridos LHON 11778/ND4 en haplogrupos U5 y J1 Al igual que ocurría con los cíbridos ND1/H12, los cíbridos con la mutación m.11778G>A bajo el haplogrupo mitocondrial U5 (ND4/U5) también mostraron una acumulación de subcomplejos que contenían la subunidad NDUFA9 respecto al control con haplogrupo K1 (K es una subclase del haplogrupo U) (Figura 25). Sin embargo, la línea con la misma mutación bajo el haplogrupo mitocondrial J1 (ND4/J1) mostró un ensamblaje normal 65

del complejo I, sin la acumulación de subcomplejos del mismo, al compararla con su control correspondiente con haplogrupo mitocondrial J1 (CON/J1) (Figura 25).

Figura 25: Análisis comparativo mediante 2D– BN/SDS-PAGE del estado estacionario del complejo I en las líneas control con haplogrupo K1 (subclase del haplogrupo U) (CON/K1) y J (CON/J1), así como en los cíbridos 11778/ND4 con haplogrupos U5 (ND4/U5) y J1 (ND4/J1). El complejo I ( 980kDa) se marcó con un anticuerpo primario que reconoce la subunidad NDUFA9 (39 kDa). CI, indica la posición relativa del complejo I totalmente ensamblado. Las direcciones de la primera (1D) y segunda dimensión (2D) se indican mediante flechas.

3.3 Análisis de las líneas de cíbridos LHON 14484/ND6 en haplogrupo J1 Las dos líneas de cíbridos portadoras de la mutación m.14484T>C, ambas con haplogrupo mitocondrial J1 (ND6/J1 y ND6/J1´), mostraron un patrón de ensamblaje del complejo I similar al control con su mismo haplogrupo mitocondrial (Figura 26).

Figura 26: Análisis comparativo mediante 2D– BN/SDS-PAGE del estado estacionario del complejo I en la línea control con haplogrupo mitocondrial J1 (CON/J1) y en los cíbridos 14484/ND6, también con haplogrupo J1 (ND6/J1 y ND6/J1´). El complejo I ( 980kDa) se marcó con un anticuerpo primario que reconoce la subunidad NDUFA9 (39 kDa). CI, indica la posición relativa del complejo I totalmente ensamblado. Las direcciones de la primera (1D) y segunda dimensión (2D) se indican mediante flechas.

Estos resultados sugieren que el grado de alteración en el ensamblaje o estabilidad del complejo I mitocondrial potencialmente provocado por las mutaciones LHON, podría depender del fondo genético o haplogrupo mitocondrial al que van asociadas dichas mutaciones. Ello implicaría un papel modulador del fondo genético mitocondrial en la biosíntesis del complejo I y posiblemente, de otros complejos de la cadena respiratoria.

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4- CINÉTICAS DE ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS DE LA CADENA RESPIRATORIA EN CÍBRIDOS CONTROL______

Para estudiar si el fondo genético del ADNmt “per se” podía ejercer un papel modulador en la formación de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial, en primer lugar se analizaron las posibles diferencias en la cinética de ensamblaje de dichos complejos en las cuatro líneas de cíbridos control con diferentes haplogrupos mitocondriales (Figura 27).

Para diferenciar si las alteraciones en los niveles de los complejos de la cadena de transporte electrónico se debían a fallos en el proceso de ensamblaje o bien a la desestabilización estructural de los complejos previamente formados, se desarrolló en nuestro laboratorio un protocolo de inhibición reversible de la traducción de las proteínas mitocondriales mediante tratamiento con el antibiótico doxiciclina (apartado 2.3 de Materiales y Métodos).

Como se observa en la Figura 27, tras la retirada del inhibidor del medio de cultivo, las líneas de cíbridos control con distintos haplogrupos mitocondriales no presentaron diferencias significativas ni en la recuperación de la actividad en gel del CI, ni en la cinética de formación de novo de los complejos de la cadena respiratoria. Estos datos concuerdan con estudios previos en los cuales tampoco se observaron diferencias en la bioenergética de varias líneas de cíbridos control con distintos haplogrupos europeos (Amo et al., 2008; Carelli et al., 2002).

Con el fin de representar gráficamente las cinéticas de recuperación de los complejos de la cadena respiratoria en cíbridos control, se cuantificaron las señales obtenidas tanto de los ensayos de actividad en gel del complejo I como de los ensayos de western-blot de las cuatro líneas control en dos experimentos independientes para cada línea celular, se calculó la media de dichos valores y se normalizaron por la señal obtenida del complejo II (Figura 27). Los datos se expresaron como porcentaje del valor en estado estacionario de las células no tratadas con doxiciclina (punto SS).

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Figura 27: BN -PAGE de los complejos de la cadena respiratoria en cíbridos control con haplogrupos mitocondriales T2, J1, K1 y H5. Las células se crecieron en un medio de cultivo suplementado con 15µg/ml de doxiciclina durante 6 días. Tras restaurar la traducción mitocondrial y el crecimiento celular mediante la sustitución del medio por un medio de cultivo normal, se recogieron las células a las 0, 6, 15, 24, 72 y 96 horas de retirar el antibiótico (T0, T6, T15, T24, T72 y T96). Las fracciones mitocondriales se procesaron en dos geles de BN-PAGE con un gradiente del 4-15% de acrilamida/ bisacrilamida. En el primer gel se realizó un ensayo de actividad en gel para el complejo I (CI-IGA, primer panel). El segundo gel se utilizó para un análisis de western-blot, usando anticuerpos que reconocían: la subunidad NDUFA9 del complejo I (segundo panel), la proteína CORE2 del complejo III (tercer panel), la subunidad COX5A del complejo IV (cuarto panel), y la subunidad SDHA del complejo II (quinto panel). CI: Complejo I. CIII2: Complejo III dimérico. III2+IV: Supercomplejo que contiene los complejos III y IV. CIV: Complejo IV. CII: Complejo II. SS: niveles en estado estacionario de los complejos de la cadena de transporte electrónico.

4.1 Cinéticas de recuperación de la actividad en gel y del ensamblaje del complejo I Después de un tratamiento de 6 días en presencia de doxiciclina (Figura 28A, punto T0), tanto la actividad en gel como los niveles del complejo I se redujeron en un 80% respecto a las muestras no tratadas en estado estacionario (Figura 28A, punto SS). El complejo I comenzó a detectarse entre las 24-48 horas tras la retirada de la doxiciclina del medio de cultivo, habiendo recuperado a las 96 horas unos niveles similares a los del control en estado estacionario. Sin embargo, la actividad del complejo I comenzó a detectarse a las 48-72 horas de la retirada del antibiótico, observándose niveles normales de su actividad a las 72-96 horas.

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Estos datos sugieren que la activación del complejo I ocurre con retraso respecto a la formación del complejo I totalmente ensamblado.

A B

Figura 28: Cinéticas de ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria y actividad del CI en cibridos control. Las células se trataron durante 6 días con doxiciclina y se recogieron a las 0, 6, 15, 24, 48, 72, 96 horas tras retirar la droga del medio. Se analizaron 40 µgr de proteínas mitocondriales por blue-native en combinacion con ensayos de actividad en gel del complejo I (IGA-CI) o de western-blot mediante transferencia a membranas de nitrocelulosa e incubación con anticuerpos contra subunidades específicas del sistema OXPHOS. Las señales obtenidas del IGA-CI y de los western- blot incubados con diferentes anticuerpos se cuantificaron, se normalizaron por la señal del complejo II y se expresaron como porcentaje respecto a los niveles de los complejos en células no tratadas en estado estacionario (SS). A) Cinéticas de recuperación de la actividad del complejo I frente a su cinética de ensamblaje. B) Cinéticas de recuperación de los complejos I, III, IV y del supercomplejo III2+IV. u.a.d: Unidades arbitrarias de densitometrado.

4.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo III La cinética de recuperación del ensamblaje del complejo III fue comparable a la del complejo I. El complejo III también comenzó a detectarse entre las 24-48 horas tras la retirada de la doxiciclina del medio de cultivo, recuperando a las 72 horas unos niveles similares a los del control en estado estacionario (Figura 28B). Estos datos sugieren que el ensamblaje de los complejos I y III parece tener lugar en paralelo.

4.3 Cinéticas de ensamblaje del complejo IV y del supercomplejo III2+IV El complejo IV comenzó a detectarse en paralelo a la aparición del supercomplejo

III2+IV, a las 48-72 horas tras la retirada de la doxiciclina del medio de cultivo. Ambas estructuras recuperaron unos niveles similares a los del control en estado estacionario a las 96 horas después del tratamiento (Figura 28B). Estos datos sugieren que la biosíntesis del complejo IV y del supercomplejo III2+IV ocurriría con posterioridad respecto a la formación de los complejos I y III, pero parece tener lugar en paralelo a la recuperación de la actividad en gel del complejo I (Figura 28A).

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5. INFLUENCIA DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL EN LAS CINÉTICAS DE ENSAMBLAJE Y ACTIVIDAD DEL COMPLEJO I EN CÍBRIDOS CON MUTACIONES PRIMARIAS LHON______Estudios previos realizados en pacientes, han sugerido un efecto funcional del fondo genético mitocondrial sobre la manifestación clínica de la enfermedad de LHON (Carelli et al., 2006; Hudson et al., 2007b; Sadun et al., 2003; Torroni et al., 1997). Para comprobar si la cinética de ensamblaje del complejo I de la cadena de transporte electrónico estaba afectada diferencialmente por las mutaciones LHON en distintos fondos genéticos mitocondriales, se procedió de la misma manera que con los cíbridos control, utilizando una estrategia de inhibición reversible de la traducción mitocondrial mediante tratamiento con doxiciclina en las líneas celulares mutadas (Figura 29).

Figura 29 : BN-PAGE de los complejos de la cadena respiratoria en una línea control representativa y en los cíbridos con mutaciones primarias de LHON. Las células se crecieron en un medio de cultivo suplementado con 15 µg/ml de doxiciclina durante 6 días. Tras restaurar la traducción mitocondrial y el crecimiento celular mediante sustitución por un medio de cultivo normal, se recogieron las células a las 0, 6, 15, 24, 72 y 96 horas de retirar el antibiótico (T0, T6, T15, T24, T72 y T96). Las fracciones mitocondriales se procesaron en dos geles de BN-PAGE con un gradiente del 4-15% de acrilamida/ bisacrilamida. En el primer gel se realizó un ensayo de actividad en gel para el complejo I (CI-IGA, primer panel). El segundo gel se utilizó para un análisis de western-blot, usando anticuerpos que reconocían: la subunidad NDUFA9 del complejo I (segundo panel), la proteína CORE2 del complejo III (tercer panel), la subunidad COX5A del complejo IV (cuarto panel), y la subunidad SDHA del complejo II (quinto panel). CI: Complejo I. CIII : Complejo III dimérico. III +IV: Supercomplejo que 2 2 contiene los complejos III y IV. CIV: Complejo IV. CII: Complejo II. SS: niveles de los complejos de la cadena de transporte electrónico en estado estacionario.

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Tras la retirada del inhibidor del medio de cultivo, los cíbridos con la misma mutación LHON en distintos haplogrupos mitocondriales presentaron diferencias significativas tanto en la recuperación de la actividad en gel del complejo I, como en la cinética de formación de novo de dicho complejo respecto a los cíbridos control (Figura 29). Para representar gráficamente las cinéticas de recuperación de los complejos de la cadena respiratoria en los cíbridos mutados respecto a los controles, se cuantificaron las señales obtenidas de la recuperación de la actividad y ensamblaje del complejo I de las seis líneas mutadas en dos experimentos independientes para cada línea celular, se calculó la media de dichos valores y se normalizaron por la señal obtenida del complejo II. Los datos se expresaron como porcentaje del valor en estado estacionario de las células no tratadas con doxiciclina (Figuras 30-41). Para mostrar los resultados con mayor claridad, las líneas celulares se agruparon en base a la mutación primaria LHON que portaban y se compararon con los valores medios de los cíbridos control. 5.1 Análisis de los cíbridos con la mutación m.3460G>A en MT-ND1 5.1.1 Cinéticas de recuperación de la actividad en gel del complejo I Tras cultivar los cíbridos portadores de la mutación m.3460G>A en MT-ND1 durante 6 días con doxiciclina, se observó una inhibición total de la actividad en gel del complejo I respecto a las células no tratadas (Figura 30A, punto T0 y SS). Estos datos contrastan con la inhibición parcial de la actividad del complejo I obtenida tras el tratamiento con la droga en cíbridos control, lo que sugiere que la mutación m.3460G>A podría estar afectando a la estabilidad del complejo I. Tras la retirada del inhibidor del medio de cultivo, no se observaron diferencias significativas en la recuperación de la actividad del complejo I entre los cíbridos con la mutación m.3460G>A en haplogrupos mitocondriales H* y H12 (ND1/H* y ND1/H12, respectivamente). Sin embargo, sí se observaron diferencias entre las cinéticas de recuperación de la actividad del complejo I en los cíbridos mutados respecto a los cíbridos control. En los cíbridos mutados ND1/H* y ND1/H12, la actividad del complejo I comenzó a detectarse hacia las 72-96 horas tras la retirada de la doxiciclina del medio de cultivo, sin llegar a recuperarse los niveles del estado estacionario a las 96 horas. Por tanto, las líneas celulares con mutaciones en el gen MT-ND1, mostraron un retraso de aproximadamente 24 horas respecto a la cinética de recuperación de la actividad del complejo I en cíbridos control, independientemente del haplogrupo mitocondrial de dichas líneas celulares (H* o H12). 71

5.1.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo I Se obtuvieron resultados similares al analizar la cinética de ensamblaje del complejo I en los cíbridos mutados ND1/H* y ND1/H12. Tras el tratamiento con doxiciclina (Figura 30B, punto T0), se observó una reducción de aproximadamente el 80-95% en los niveles del complejo I totalmente ensamblado respecto a las células no tratadas en estado estacionario (Figura 30B, punto SS). En los cíbridos control dicha reducción fue menos drástica, del 80%, por lo que estos datos corroborarían el posible efecto de la mutación m.3460G>A sobre la estabilidad del complejo I.

A B

Figura 30: Reaparición del complejo I de la cadena respiratoria en cíbridos con de la mutación m.3460G>A en MT-ND1. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de actividad en gel del complejo I (IGA-CI) y de western-blot tras incubar las membranas con el anticuerpo que reconoce la subunidad NDUFA9 del complejo I (Figura 29). Los valores se normalizaron por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles en las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND1/H*: Línea celular con la mutación m.3460G>A en haplogrupo H*. ND1/H12: Línea celular con la mutación m.3460G>A en haplogrupo H12.

H12. Tras la retirada del inhibidor del medio de cultivo, se observaron diferencias leves en

la recuperación de los niveles del complejo I entre los cíbridos mutados ND1/H* y ND1/H12. Además, se observaron diferencias significativas entre las cinéticas de recuperación de dicho complejo en los cíbridos mutados respecto a los cíbridos control. En los cíbridos mutados ND1/H* y ND1/H12, el complejo I comenzó a detectarse hacia las 48-72 horas tras la retirada de la doxiciclina del medio de cultivo, con un leve retraso respecto a los cíbridos control. Sin embargo, a partir de las 48 horas la cinética de ensamblaje parecía acelerarse en los cíbridos mutados. De esta manera, la línea celular con la mutación m.3460G>A en haplogrupo H12 (ND1/H12) recuperó aproximadamente el 90% de los niveles máximos del complejo I a las 96 horas, mientras que la línea en haplogrupo H* (ND1/H*)

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consiguió alcanzar en ese punto unos niveles del complejo I que superaban los obtenidos por los cíbridos control. Estos datos muestran que aunque se produce un retraso inicial en la biosíntesis del complejo I en las células portadoras de la mutación en ND1, los niveles de dicho complejo se restauran a valores similares a los controles independientemente del haplogrupo mitocondrial asociado a la mutación. Además, el retraso en la cinética de recuperación de la actividad del complejo I respecto a la aparición del complejo I totalmente ensamblado, de nuevo sugeriría la existencia de una distancia temporal entre la formación del complejo I y la activación del mismo. 5.2 Análisis de los cíbridos con la mutación en m.11778G>A en MT-ND4 5.2.1 Cinéticas de recuperación de la actividad en gel del complejo I Tras cultivar los cíbridos portadores de la mutación m.11778G>A en MT-ND4 durante 6 días con doxiciclina (Figura 31A, punto T0), se observó una inhibición total de la actividad en gel del complejo I respecto a las células no tratadas (Figura 31A, punto SS). Estos datos de nuevo contrastan con los resultados obtenidos en cíbridos control, lo que sugiere que la mutación m.11778G>A también afectaría a la estabilidad del complejo I. Tras la retirada del inhibidor del medio de cultivo, se observaron importantes diferencias en la recuperación de la actividad del complejo I entre los dos cíbridos con la mutación m.11778G>A en haplogrupos mitocondriales U5 y J1 (ND4/U5 y ND4/J1, respectivamente), así como entre las cinéticas obtenidas en los cíbridos mutados respecto a los controles. Aunque ambas líneas celulares mostraron una mínima actividad del complejo I a las 48 horas de retirar la doxiciclina del medio, la línea ND4/J1 recuperaba aproximadamente el 50% de dicha actividad a las 96 horas, mientras que la línea ND4/U5 apenas consiguió recuperar en ese mismo tiempo un 20% de la actividad máxima del complejo I. Por tanto, las líneas celulares con la mutación m.11778G>A mostraron un importante retraso en la cinética de recuperación de la actividad del complejo I respecto a los cíbridos control, estando más afectada la línea con haplogrupo mitocondrial U5. 5.2.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo I Se observaron resultados similares cuando se analizaron las cinéticas de ensamblaje del complejo I en los cíbridos mutados ND4/U5 y ND4/J1 (Figura 31B). De nuevo, ambas líneas mostraron una mínima recuperación del ensamblaje del complejo I a las 48 horas del tratamiento con doxiciclina. A las 96 horas post-tratamiento, la línea ND4/J1 había recuperado aproximadamente el 75% de los niveles estacionarios del complejo I, mientras que la línea ND4/U5 apenas recuperó un 20% de dichos niveles en el mismo tiempo. 73

Estos resultados indican que la mutación m.11778G>A provoca un claro retraso en la restauración de los niveles y activación del complejo I respeto a los controles, de forma más grave cuando la mutación está presente en un entorno genético definido por el haplogrupo mitocondrial U5, en comparación con otro entorno genético como el haplogrupo J1. A B

Figura 31: Reaparición del complejo I de la cadena respiratoria en cíbridos portadores de la mutación m.11778G>A en MT-ND4. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de actividad en gel del complejo I (IGA-CI) y de western-blot tras incubar las membranas con el anticuerpo que reconoce la subunidad NDUFA9 del complejo I (Figura 29). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles en las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND4/U5: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo U5. ND4/J1: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo J1. 5.3 Comparativa de los cíbridos con las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C en haplogrupo J1 Al no observar diferencias en los niveles estacionarios de los complejos de la cadena respiratoria entre las dos líneas de cíbridos con la mutación m.14484T>C en el gen MT-ND6, ambas en haplogrupo J1, sólo se realizó el experimento de inhibición con doxiciclina con una de las líneas (ND6/J1). Dicha línea se comparó con los cíbridos que portaban la mutación m.11778G>A en el gen MT-ND4 en el mismo haplogrupo mitocondrial (ND4/J1). 5.3.1 Cinéticas de recuperación de la actividad en gel del complejo I Las líneas ND4/J1 y ND6/J1 tienen diferentes mutaciones primarias de LHON con el mismo fondo genético mitocondrial. Tras cultivar los cíbridos ND6/J1 durante 6 días con doxiciclina (Figura 32A, punto T0), se observó una mayor inhibición de la actividad en gel del complejo I respecto a las células no tratadas (Figura 32A, punto SS), que fue similar a la obtenida en las células ND4/J1 (Figura 32A, punto T0). Estos datos sugieren que la mutación m.14484T>C también parece afectar a la estabilidad del complejo I. Tras la retirada del inhibidor del medio de cultivo, ambas líneas mostraron un retraso similar en la restauración de la actividad en gel del complejo I respecto a los controles, apenas 74

recuperando un 50% de la actividad total del complejo I a las 96 horas de la retirada del antibiótico (Figura 32A).

A B

Figura 32: Reaparición del complejo I de la cadena respiratoria en cíbridos con las mutaciones en MT- ND4 y MT-ND6 en haplogrupo mitocondrial J1. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de actividad en gel del complejo I (IGA-CI) y de western-blot tras incubar las membranas con el anticuerpo que reconoce la subunidad NDUFA9 del complejo I (Figura 29). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles en las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND4/J1: Línea celular con la mutación m.11778G>A en el gen MT-ND4 en haplogrupo J1. ND6/J1: Línea celular con la mutación m.14484T>C en MT-ND6 en haplogrupo J1.

5.3.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo I Las líneas mutadas ND4/J1 y ND6/J1 también mostraron un comportamiento similar en la recuperación de los niveles de complejo I totalmente ensamblado (Figura 32B). Ambas líneas presentaron un retraso acusado en las cinéticas de ensamblaje del complejo I respecto a los cíbridos control, con una recuperación de los niveles de complejo I de aproximadamente el 20% de los niveles estacionarios a las 48 horas, y apenas del 75% a las 96 horas de la retirada del antibiótico. Estos datos muestran que las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C afectarían al ensamblaje del complejo I de forma similar cuando se encuentran en un mismo entorno genético mitocondrial. En resumen, nuestros resultados demuestran defectos tanto en el ensamblaje como en la estabilidad del complejo I en cíbridos portadores de las tres mutaciones primarias de LHON, independientemente de su haplogrupo mitocondrial, respecto a células control. Además, nuestros datos sugieren que la gravedad de dichas alteraciones podría depender del haplogrupo mitocondrial en el que se encuentra la mutación patogénica analizada.

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6. INFLUENCIA DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL EN LAS CINÉTICAS DE ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS III Y IV EN CÍBRIDOS CON MUTACIONES PRIMARIAS LHON______El conjunto de variantes polimórficas que definen el fondo genético mitocondrial de determinadas subclases de los haplogrupos J y H incluyen la presencia de polimorfismos específicos en el gen MT-CYB, que provocan cambios en la secuencia de aminoácidos de la subunidad citocromo b (CYTB) del complejo III mitocondrial. Estos polimorfismos podrían añadir un efecto negativo sobre la función del complejo I, ya que la estabilidad del mismo depende del correcto ensamblaje de los complejos III y IV. Concretamente, se ha sugerido que polimorfismos en la subunidad CYTB podrían interaccionar sinérgicamente con las mutaciones primarias LHON, lo que afectaría a la interacción física entre los complejos I y III y por tanto, al ensamblaje o estabilidad de los supercomplejos mitocondriales (Carelli et al., 2006). Por esta razón, se analizaron las cinéticas de ensamblaje de los complejos III y IV en los cíbridos portadores de las mutaciones primarias de LHON con distintos fondos genéticos mitocondriales. 6.1 Análisis de los cíbridos con la mutación m.3460G>A en MT-ND1 En primer lugar, se analizaron los cíbridos portadores de la mutación m.3460G>A con haplogrupos mitocondriales H* y H12 (ND1/H* y ND1/H12, respectivamente). Como se puede observar en las Figuras 33-35, tras la retirada de la doxiciclina del medio de cultivo no se observaron diferencias significativas en las cinéticas de recuperación de los complejos III,

IV, ni del supercomplejo III2+IV entre la línea celular ND1/H* y los cíbridos control. Sin embargo, la línea ND1/H12 mostró un retraso en la recuperación de los complejos III, IV y del supercomplejo III2+IV respecto a los controles y a la línea con la misma mutación pero distinto haplogrupo. 6.1.1 Cinéticas de ensamblaje del complejo III Al cultivar los cíbridos portadores de la mutación m.3460G>A en MT-ND1 durante 6 días con doxiciclina (Figura 33, punto T0), se observó una drástica reducción en los niveles del complejo III en la línea celular ND1/H12 en comparación con los cíbridos control. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en dichos niveles entre la línea celular ND1/H* y los controles. Estos datos sugieren que la mutación m.3460G>A, en un entorno genético determinado por el haplogrupo H12, podría afectar a la estabilidad del complejo III. Concretamente, tanto la línea ND1/H* como los controles alcanzaron el 50% de los niveles estacionarios del complejo III a las 24 horas tras finalizar el tratamiento, recuperando 76

los niveles estacionarios a las 72 horas. Sin embargo, la línea ND1/H12 presentó una mínima recuperación de los niveles del complejo III a las 72 horas de retirar la droga del medio, apenas alcanzando el 50% de los niveles máximos de dicho complejo a las 96 horas (Figura 33).

Figura 33: Recuperación del complejo III de la cadena respiratoria en cíbridos portadores de la mutación m.3460G>A en MT-ND1. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de western- blot tras incubar las membranas con el anticuerpo que reconoce la subunidad CORE2 del complejo III (Figura 29). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles de las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND1/H*: Línea celular con la mutación m.3460G>A en haplogrupo H*. ND1/H12: Línea celular portadora de la mutación m.3460G>A en haplogrupo H12.

6.1.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo IV Al cultivar los cíbridos portadores de la mutación m.3460G>A en MT-ND1 durante 6 días con doxiciclina (Figura 34, punto T0), se observó una drástica reducción en los niveles del complejo IV en la línea celular ND1/H12 en comparación con los cíbridos control. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en dichos niveles entre la línea celular ND1/H* y los controles. Estos datos sugieren que la mutación m.3460G>A, en un entorno genético determinado por el haplogrupo H12, podría afectar a la estabilidad del complejo IV. La línea celular ND1/H* recuperó el 50% de los niveles estacionarios del complejo IV entre las 24-48 horas tras retirar la doxiciclina del medio de cultivo, consiguiendo superar los niveles máximos de dicho complejo en los cíbridos control a las 96 horas. Sin embargo, la línea ND1/H12 presentó una mínima recuperación de los niveles del complejo IV, apenas alcanzando el 40% de los niveles máximos de dicho complejo a las 96 horas tras el tratamiento (Figura 34).

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Figura 34: Restauración del complejo IV de la cadena respiratoria en cíbridos con la mutación m.3460G>A en MT-ND1. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de western-blot tras incubar las membranas con el anticuerpo que reconoce la subunidad COX5A del complejo IV (Figura 29). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles de las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND1/H*: Línea celular con la mutación m.3460G>A en haplogrupo H*. ND1/H12: Línea celular con la mutación m.3460G>A en haplogrupo H12.

6.1.3 Cinéticas de ensamblaje del supercomplejo III2+IV Tanto la línea ND1/H* como los controles alcanzaron el 50% de los niveles estacionarios del supercomplejo III2+IV a las 48-72 horas tras la retirada de la doxiciclina, alcanzando los niveles estacionarios a las 96 horas. Sin embargo, en el mismo periodo de tiempo no se llegó a detectar la presencia del supercomplejo III2+IV en la línea ND1/H12 (Figura 35).

Figura 35: Recuperación del supercomplejo III2+IV mitocondrial en cíbridos portadores de la mutación m.3460G>A en MT-ND1. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de western- blot tras incubar las membranas con el anticuerpo que reconoce la subunidad CORE2 del complejo III (Figura 29). ). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles de las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND1/H*: Línea celular con la mutación m.3460G>A en haplogrupo H*. ND1/H12: Línea celular con la mutación m.3460G>A en haplogrupo H12.

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Estos resultados sugieren que la mutación m.3460G>A no afectaría a la biosíntesis ni a la estabilidad de los complejos III y IV de la cadena respiratoria cuando se localiza en un entorno genético definido por el haplogrupo mitocondrial H*. Sin embargo, cuando dicha mutación se localiza en un entorno genético definido por el haplogrupo mitocondrial H12, provocaría graves fallos tanto en el ensamblaje como en la estabilidad de los complejos III y

IV, lo que a su vez se traduciría en alteraciones en la formación del supercomplejo III2+IV.

A 6.2 Análisis de los cíbridos con la mutación m.11778G>A en MT-ND4

B En segundo lugar, se analizaron los cíbridos con la mutación m.11778G>A con haplogrupos mitocondriales U5 y J1 (ND4/U5 y ND1/J1, respectivamente). Como se puede observar en la Figura 36, tras la retirada de la doxiciclina del medio de cultivo, se observaron diferencias significativas en las cinéticas de recuperación del complejo III entre ambas líneas y los cíbridos control. Además, la línea ND4/U5 mostró un retraso en la recuperación del

complejo IV y del supercomplejo III2+IV respecto a los controles y a la línea con la misma mutación pero distinto haplogrupo (Figuras 37 y 38). Por el contrario, no se observaron diferencias significativas en las cinéticas de recuperación del complejo IV y del

supercomplejo III2+IV entre la línea celular ND4/J1 y los cíbridos control (Figuras 37 y 38).

6.2.1 Cinéticas de ensamblaje del complejo III Al cultivar los cíbridos portadores de la mutación m.11778G>A en MT-ND4 durante 6 días con doxiciclina (Figura 36, punto T0), se observó una leve reducción en los niveles del complejo III en la línea celular ND4/J1 en comparación con los cíbridos control. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en dichos niveles entre la línea celular ND4/U5 y los controles. Estos datos sugieren que la mutación m.11778G>A, en un entorno genético determinado por el haplogrupo J1, podría afectar a la estabilidad del complejo III Tras retirar la droga del medio de cultivo, las líneas de cíbridos con la mutación m.11778G>A en MT- ND4 mostraron un retraso en las cinéticas de ensamblaje del complejo III respecto a los controles, independientemente de su fondo genético mitocondrial (Figura 36). Los controles recuperaron el 50% de los niveles estacionarios del complejo III a las 24 horas del tratamiento con doxiciclina, alcanzando los niveles estacionarios a las 72 horas. Sin embargo, las líneas con la mutación m.11778G>A apenas recuperaron los niveles estacionarios del complejo III a las 96 horas del tratamiento con doxiciclina, mostrando un retraso de al menos 24 horas respecto a los cíbridos control.

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Figura 36: Recuperación del complejo III de la cadena respiratoria en cíbridos portadores de la mutación m.11778G>A en MT-ND4. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de western- blot tras incubar las membranas con el anticuerpo que reconoce la subunidad CORE2 del complejo III (Figura 29). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles de las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND4/J1: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo J1. ND4/ U5: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo U5.

6.2.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo IV Tras cultivar los cíbridos con la mutación m.11778G>A en MT-ND4 durante 6 días con doxiciclina (Figura 37, punto T0), se observó una mayor reducción en los niveles del complejo IV en las dos líneas celulares mutadas que en los cíbridos control. Estos datos sugieren que la mutación en m.11778G>A podría afectar a la estabilidad del complejo IV.

Figura 37: Recuperación del complejo IV de la cadena respiratoria con la mutación m.11778G>A en MT-ND4. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de western-blot tras incubar las membranas con el anticuerpo que reconoce la subunidad COX5A del complejo IV (Figura 29). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles de las células no tratadas (punto SS) CON: Valores medios de las células control. ND4/J1: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo J1. ND4/U5: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo U5. Tras la retirada de la doxiciclina del medio de cultivo, se observó un retraso en la cinética de recuperación del complejo IV de la línea ND4/U5 respecto a los controles y a la 80

línea ND4/J1. Concretamente, la línea celular ND4/J1 recuperó el 50% de los niveles estacionarios del complejo IV entre las 48 y 72 horas tras la retirada del inhibidor, alcanzando los niveles máximos de dicho complejo a las 96 horas, de forma similar a los cíbridos control. Sin embargo, la línea ND4/U5 apenas consiguió recuperar el 50% de los niveles estacionarios del complejo IV a las 96 horas de retirar el antibiótico (Figura 37).

6.2.3 Cinéticas de ensamblaje del supercomplejo III2+IV

La recuperación de los niveles del supercomplejo III2+IV ocurrió de forma paralela entre los cíbridos control y la línea ND4/ J1, alcanzando un 90% de los niveles estacionarios del mismo a las 96 horas de retirar la doxiciclina del medio de cultivo. Sin embargo, la línea ND4/U5 sólo consiguió recuperar un 40% de los niveles estacionarios del supercomplejo

III2+IV durante el mismo periodo (Figura 38).

Figura 38: Recuperación del supercomplejo III2+IV en cíbridos con la mutación m.11778G>A en MT-ND4. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de western-blot tras incubar las membranas con un anticuerpo que reconoce la subunidad CORE2 del complejo III (Figura 29). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles de las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND4/J1: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo J1. ND4/U5: Línea celular con la mutación m.11778A>G en haplogrupo U5.

Estos resultados sugieren que la mutación m.11778G>A afectaría levemente a la estabilidad de los complejos III y IV de la cadena respiratoria cuando se localiza en un entorno genético definido por el haplogrupo mitocondrial J1. Sin embargo, la rápida restauración de los niveles estacionarios de los complejos III y IV sugiere que dicha situación no afectaría dramáticamente al proceso de ensamblaje de dichos complejos ni a la formación de los supercomplejos. Por el contrario, cuando dicha mutación se localiza en un entorno genético definido por el haplogrupo mitocondrial U5, provocaría graves fallos en la estabilidad del complejo IV

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y en el ensamblaje de los complejos III y IV, lo que a su vez se traduciría en alteraciones en la formación del supercomplejo III2+IV. 6.3 Comparativa de los cíbridos con las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C en haplogrupo J1 Por último, a fin de analizar la influencia del fondo genético mitocondrial definido por el haplogrupo J1, se compararon las cinéticas de ensamblaje de los complejos III y IV, así como del supercomplejo III2+IV, entre las dos líneas de cíbridos portadoras de las mutaciones m.11778G>A en MT-ND4 y m.14484T>C en MT-ND6, ambas en haplogrupo J1 (ND4/J1 y ND6/J1, respectivamente). Como se puede observar en las Figuras 39- 41, tras la retirada de la doxiciclina del medio de cultivo, no se observaron diferencias significativas en las cinéticas de recuperación de los complejos III, IV, ni del supercomplejo III2+IV entre ambas líneas celulares. Tan sólo se observó un ligero retraso en la recuperación del complejo III en las dos líneas mutadas al compararla con los cíbridos control, mostrando un comportamiento similar a los controles en las cinéticas de ensamblaje del complejo IV y del supercomplejo III2+CIV.

6.3.1 Cinéticas de ensamblaje del complejo III Al cultivar las células durante 6 días con doxiciclina (Figura 39, punto T0), se observó una reducción similar en los niveles del CIII entre las líneas ND4/J1y ND6/J1 en comparación con los cíbridos control. Estos datos sugieren que las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C, en un entorno genético determinado por el haplogrupo J1, podrían afectar a la estabilidad del CIII.

Figura 39: Restauración del complejo III en cíbridos con las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C en haplogrupo J1. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de western-blot tras incubar las membranas con un anticuerpo que reconoce la subunidad CORE2 del complejo III (Figura 29). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles de las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND4/J1: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo J1. ND6/J1: Línea celular con la mutación m.14484T>C en haplogrupo J1 82

Tras retirar la droga del medio de cultivo, la línea mutada ND6/J1 mostró un leve retraso en la cinética de recuperación del complejo III, similar a la de la línea ND4/J1 (Figura 39). Los controles recuperaron los niveles estacionarios del complejo III a las 72 horas del tratamiento con doxiciclina, mientras que las líneas ND4/J1 y ND6/J1 recuperaron dichos niveles a las 96 post-tratamiento, mostrando un retraso de 24 horas respecto a los cíbridos control. 6.3.2 Cinéticas de ensamblaje del complejo IV Al cultivar los cíbridos durante 6 días con doxiciclina (Figura 40, punto T0), se observó una reducción drástica en los niveles del complejo IV en la línea celular ND4/J1 en comparación con los cíbridos control. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en dichos niveles entre la línea celular ND6/J1 y los controles.

Figura 40: Reaparición del complejo IV en cíbridos con las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C en haplogrupo mitocondrial J1. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de western-blot tras incubar las membranas con un anticuerpo que reconoce la subunidad COX5A del complejo IV (Figura 29). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles de las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND4/J1: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo J1. ND6/J1: Línea celular con la mutación m.14484T>C en haplogrupo J1

Estos datos sugieren que, a diferencia de la mutación m.11778G>A en MT-ND4, la mutación m.14484T>C en MT-ND6 no parece afectar a la estabilidad del complejo IV en un entorno genético determinado por el haplogrupo J1. Tras retirar la droga del medio de cultivo, las líneas celulares ND4/J1 y ND6/J1 mostraron cinéticas de recuperación de los niveles del complejo IV similares a los cíbridos control.

6.3.3 Cinéticas de ensamblaje del supercomplejo III2+IV

La recuperación de los niveles del supercomplejo III2+IV ocurrió de forma paralela entre los cíbridos control y las líneas ND4/J1 y ND6/J1, alcanzando alrededor de un 80-90%

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de los niveles estacionarios de dicho supercomplejo a las 96 horas tras retirar la doxiciclina del medio de cultivo (Figura 41). Estos resultados sugieren que la mutación m.14484T>C afectaría levemente a la estabilidad del supercomplejo III2+IV, al menos cuando se localiza en un entorno genético definido por el haplogrupo mitocondrial J1. Sin embargo, la rápida restauración de los niveles estacionarios de dicho complejo sugiere que el proceso de ensamblaje del supercomplejo

III2+IV no estaría afectado.

Figura 41: Recuperación del supercomplejo III2+IV en cíbridos con las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C en haplogrupo mitocondrial J1. Se cuantificaron las señales obtenidas de los ensayos de western-blot tras incubar las membranas con un anticuerpo que reconoce la subunidad CORE2 del complejo III (Figura 29). ). Los valores fueron normalizados por la señal correspondiente del complejo II (CII) y se expresaron como porcentaje de los niveles de las células no tratadas (punto SS). CON: Valores medios de las células control. ND4/J1: Línea celular con la mutación m.11778G>A en haplogrupo J1. ND6/J1:Línea celular con la mutación m.14484T>C en haplogrupo J1.

En resumen, nuestros datos muestran que cíbridos portadores de dos mutaciones patogénicas distintas localizadas en un mismo entorno genético o haplogrupo mitocondrial (ND4/J1 versus ND6/J1), pueden mostrar un comportamiento más parecido a nivel de las cinéticas de restauración de los complejos de la cadena respiratoria que líneas celulares portadoras de la misma mutación en el ADNmt pero diferente haplogrupo mitocondrial (ND4/J1 versus ND4/U5). Por tanto, nuestros datos apoyarían la implicación funcional del fondo genético mitocondrial sobre el ensamblaje de los complejos del sistema OXPHOS.

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DISCUSIÓN______

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DISCUSIÓN______

Los cíbridos utilizados en este trabajo han sido ampliamente analizados como modelos de estudio para investigar las posibles causas fisiopatológicas de la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), generando resultados sobre 1) las consecuencias bioquímicas y moleculares asociadas al defectos enzimáticos del complejo I de la cadena respiratoria, como pueden ser la disminución en la síntesis de ATP y el consumo de oxígeno, el aumento de la producción de radicales libres del oxígeno a través del complejo I, o 2) el efecto neurotóxico del glutamato, el aumento de apoptosis, alteraciones en la homeostasis del calcio, la despolarización de la membrana mitocondrial y la desregulación de la apertura de los poros permeables de transición de membrana (Baracca et al., 2005; Beretta et al., 2004; Floreani et al., 2005; Ghelli et al., 2003; Porcelli et al., 2009; Vergani et al., 1995).

Además de los estudios realizados hasta el momento, en el presente trabajo se han analizado las alteraciones en el ensamblaje o estabilidad de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en cíbridos transmitocondriales portadores de las tres mutaciones primarias de LHON más prevalentes, y el posible efecto modulador del fondo genético mitocondrial sobre dichos procesos. Para diferenciar si las mutaciones LHON conducían a alteraciones en el proceso de ensamblaje o bien a la desestabilización estructural de los complejos de la cadena respiratoria, las células se cultivaron en presencia del antibiótico doxiciclina, qué a baja concentración actúa específicamente como un inhibidor reversible de la traducción de las proteínas mitocondriales sin afectar a la traducción de las proteínas citosólicas (Moreno-Lastres et al., 2012). Este tratamiento permite la degradación de los complejos del sistema OXPHOS que contienen subunidades codificadas por el ADNmt (complejos I, III, IV y V), cuya síntesis se reinicia de forma sincronizada al eliminar la doxiciclina del medio de cultivo, permitiendo analizar en el tiempo de forma dinámica la biogénesis de los complejos mitocondriales mediante métodos de electroforesis azul nativa (BN-PAGE). En las condiciones experimentales establecidas en este estudio, las células se trataron con doxiciclina durante seis días porque tratamientos a tiempos más largos condujeron a la muerte celular. Esta estrategia experimental ha sido utilizada para estudiar la ruta biosintética del ensamblaje del CI y del respirasoma mitocondrial en células 143B-206 TK- (Moreno-Lastres et al., 2012; Ugalde et al., 2004b) ), y ha ayudado en la interpretación de los mecanismos fisiopatológicos asociados al déficit enzimático de los complejos I y III (Gil Borlado et al., 2010; Pello et al., 2008). 86

Los resultados obtenidos reflejan tres hallazgos importantes:

En primer lugar, las mutaciones más prevalentes de LHON no afectan a los niveles estacionarios del CI en cíbridos transmitocondriales, dado que éstos se encontraron a niveles comparables entre las células control y mutadas. Sin embargo, las diferencias en el perfil de ensamblaje de la cadena respiratoria entre las células tratadas durante 6 días con doxiciclina y posteriormente analizadas mediante ensayos de electroforesis azul nativa, sugieren que en todos los cíbridos mutados se producían fallos en el ensamblaje acompañados de una pérdida de la estabilidad del complejo I.

En segundo lugar, aunque los niveles estacionarios de otros complejos del sistema OXPHOS no se encontraron disminuidos en los cíbridos con mutaciones LHON, las diferencias en el perfil de ensamblaje de los complejos III y IV analizadas mediante los mismos ensayos sugieren que, en todos los cíbridos mutados, se producen fallos tanto en el ensamblaje como en la estabilidad de los complejos III, IV y del supercomplejo III2+IV.

Y en tercer lugar, las alteraciones observadas en la biogénesis y estabilidad de los complejos I, III y IV de la cadena respiratoria parecen estar moduladas por el haplogrupo mitocondrial específico en el que se encuentran las mutaciones LHON.

1. INFLUENCIA DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL SOBRE LA BIOGÉNESIS DE LOS COMPLEJOS DE CADENA RESPIRATORIA EN CÍBRIDOS CONTROL______

Al analizar cuatro líneas de cíbridos control cuyo ADNmt pertenecía a cuatro haplogrupos mitocondriales europeos diferentes (T2, J, K1, H5), no se detectaron diferencias apreciables ni en los niveles o actividades enzimáticas del complejo I, ni en las cinéticas de recuperación de ensamblaje de los complejos III, IV ni del supercomplejo III2+IV. Estos hallazgos correlacionan con estudios previos en los cuales tampoco se observaron diferencias entre varias líneas de cíbridos control pertenecientes a los haplogrupos europeos H, T y J cuando se analizaron distintos parámetros bioenergéticos, como el consumo de oxígeno, la sensibilidad a la inhibición por rotenona, la proliferación celular en glucosa y en galactosa, o las actividades enzimáticas de cadena respiratoria (Amo et al., 2008; Carelli et al., 2002). Sin embargo, otros estudios han puesto de manifiesto diferencias en varios parámetros de la función mitocondrial atribuibles a la variabilidad genética de los haplogrupos mitocondriales, en los que se observaron diferencias significativas en los niveles de ADNmt, la expresión de 87

los ARNm mitocondriales, la síntesis de proteínas mitocondriales, la actividad y niveles de la citocromo oxidasa o complejo IV, el consumo de oxígeno y el potencial de membrana al comparar líneas de cíbridos control con haplogrupo H con líneas de cíbridos control con haplogrupos UK y J (Gomez-Duran et al., 2010; Gomez-Duran et al., 2012).

Respecto al efecto del tratamiento con doxiciclina sobre la estabilidad de los complejos de la cadena respiratoria en cíbridos control, en esta tesis se observó una reducción de aproximadamente el 80% tanto de la actividad del complejo I, como de los niveles de los complejos I, III y IV en los controles tratados con el antibiótico respecto a las muestras no tratadas, datos que coinciden con los publicados previamente (Ugalde et al., 2004b). Estos datos indican que, a pesar de la larga duración del tratamiento, no se consigue alcanzar una inhibición total de la síntesis de proteínas mitocondriales en cíbridos control. Este hecho ha sido posteriormente demostrado mediante el análisis de la traducción mitocondrial mediante marcaje metabólico en células 143B-206 TK- tratadas con doxiciclina durante 6 días (Moreno- Lastres et al., 2012).

Respecto a las cinéticas de recuperación de los complejos totalmente ensamblados de la cadena respiratoria tras el tratamiento de los cíbridos control con doxiciclina, en primer lugar se observó la aparición del complejo I a las 24-48 horas post-tratamiento, el cual recuperó unos niveles similares a los del estado estacionario a las 96 horas, lo que es similar a lo observado por Lazarou y colaboradores mediante estudios de marcaje metabólico en fibroblastos humanos en los que analizaron la biogénesis del CI tras la inhibición de la síntesis de proteínas citosólicas con cicloheximida. En ese estudio se observó la aparición del complejo I totalmente ensamblado a las 24 horas tras la retirada de la droga (Lazarou et al., 2007). Sin embargo, la recuperación de la actividad del CI presentó un retraso de 24 horas respecto al ensamblaje del CI, observándose niveles normales de su actividad a las 72-96 horas. Estos resultados son consistentes con otros previamente publicados, en los que se llevó a cabo un tratamiento similar en otras líneas celulares, como las células de osteosarcoma humano 143B-206 TK- o la línea CCL16-B2 de fibroblastos de hámster (Yadava et al., 2004).

Además, en los cíbridos control tratados con doxiciclina, se observaron cinéticas solapantes de recuperación de los complejos I y III, lo que sugiere que ambos complejos se estarían sintetizando en paralelo. La biogénesis del complejo IV se produce posteriormente a la de los complejos I y III, y en paralelo a la activación del complejo I y la formación del

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supercomplejo III2+IV, lo que sugiere que el complejo IV podría ser un factor limitante en la formación del respirasoma mitocondrial, una hipótesis que concuerda con el modelo de ensamblaje de los supercomplejos mitocondriales recientemente propuesto por nuestro grupo (Moreno-Lastres et al., 2012).

2. INFLUENCIA DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL SOBRE LA BIOGÉNESIS DEL COMPLEJO I EN CÍBRIDOS PORTADORES DE MUTACIONES LHON______

En el estado estacionario, los niveles del complejo I totalmente ensamblado fueron comparables entre cíbridos control y mutados. Sin embargo, la acumulación diferencial de subcomplejos o de intermediarios de ensamblaje del CI en las líneas celulares portadoras de mutaciones LHON era sugerente de defectos en el ensamblaje o en la estabilidad de dicho complejo. Estas anomalías fueron más evidentes en las líneas ND1/H12 y ND4/U5, mientras que las líneas celulares con las mismas mutaciones en un fondo genético mitocondrial distinto ND1/H* y ND4/J1, respectivamente, presentaron unos niveles del CI completamente ensamblado y un patrón de intermediarios de ensamblaje similares a los cíbridos control. Estos resultados sugieren que el grado de afectación en el ensamblaje o en la estabilidad del CI en los cíbridos portadores de mutaciones LHON, podría depender de la asociación de una mutación LHON determinada con un fondo genético mitocondrial específico.

Estas hipótesis se confirmaron al analizar las cinéticas de ensamblaje del complejo I en los cíbridos mutados mediante tratamiento con doxiciclina.

Al analizar el efecto del tratamiento sobre la estabilidad del complejo I en los cíbridos mutados, se observó una reducción prácticamente total de la actividad del mismo, así como un fuerte descenso del complejo I totalmente ensamblado respecto a los cíbridos control. Estos hallazgos sugieren una pérdida de la estabilidad del complejo I en las líneas celulares con mutaciones LHON respecto a las líneas control.

Además, se observaron diferencias en las cinéticas de recuperación del complejo I entre las distintas líneas de cíbridos mutados. Es de destacar que las diferencias observadas en las cinéticas de ensamblaje del complejo I se basan en la utilización del anticuerpo que reconoce la subunidad NDUFA9, que es una de las primeras subunidades en incorporarse en la ruta del ensamblaje del complejo I, posteriormente a la subunidad ND1 pero cuando aún las

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subunidades ND6 y ND4 no se han incorporado (Dunning et al., 2007; Perales-Clemente et al., 2010; Saada et al., 2009; Vogel et al., 2004; Vogel et al., 2005; Vogel et al., 2007b). Para valorar de una manera más exhaustiva si las mutaciones LHON alteran el ensamblaje del complejo I, quizá habría sido interesante utilizar un anticuerpo adicional que reconociese alguna de las subunidades del módulo que confieren actividad NADH deshidrogenasa al complejo I (o módulo N), tales como la subunidad NDUFV1 o la NDUFS1, dado que la incorporación del módulo N en el complejo I constituye el último paso en el ensamblaje y activación del mismo (Moreno-Lastres et al., 2012). En este sentido, las dos líneas de cíbridos con la mutación m.3460G>A en MT-ND1 (ND1/H* y ND1/H12) mostraron un defecto más leve que las líneas con las mutaciones en MT-ND4 y MT-ND6, que presentaron defectos más acusados de recuperación de las cinéticas de ensamblaje del complejo I. La recuperación del ensamblaje del complejo I en las líneas ND1/H* y ND1/H12 presentó un marcado retraso inicial, pero se produjo una aceleración a partir de las 48 horas, de tal modo que ambas líneas celulares recuperaron o incluso aumentaron el nivel del CI alcanzado en el estado estacionario a las 96 horas post-tratamiento. Este efecto podría ocurrir como un mecanismo compensatorio ante la inhibición de la síntesis de proteínas mitocondriales, que se vería reflejado en un incremento general de la masa mitocondrial a las 96 horas post-tratamiento. Esta hipótesis se vería apoyada por la observación de un aumento paralelo de los niveles del complejo II a las 96 horas en la línea ND1/H*. Sin embargo, las líneas mutadas en MT-ND4 y MT-ND6 presentaron un retraso global en la biogénesis del complejo I, consiguiendo recuperar a las 96 horas alrededor de únicamente un 80% de los niveles estacionarios del complejo I. Estas diferencias podrían explicarse porque la entrada de la subunidad ND1 en el complejo I ocurre en los primeros pasos de la formación del mismo (Saada et al., 2009; Vogel et al., 2004), por lo que las mutaciones en MT-ND1 afectarían al ensamblaje del complejo en una fase temprana. Sin embargo, una vez que está insertada la subunidad ND1 en la membrana interna mitocondrial, el proceso se aceleraría. Como las subunidades ND4 y ND6 se incorporan en pasos intermedios del ensamblaje del complejo I (Perales-Clemente et al., 2010), sería de esperar que las mutaciones en estas subunidades condujeran a un retraso en el proceso de ensamblaje en fases posteriores.

Por tanto, en todas las líneas portadoras de mutaciones LHON se produce tanto una pérdida de la estabilidad del complejo I como alteraciones en el ensamblaje del mismo, las

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cuales podrían estar moduladas por el fondo genético mitocondrial en el que se encuentran dichas mutaciones.

3. INFLUENCIA DEL FONDO GENÉTICO MITOCONDRIAL SOBRE LA BIOGÉNESIS DE LOS COMPLEJOS III y IV EN CÍBRIDOS PORTADORES DE MUTACIONES LHON______

De igual manera, todos los cíbridos portadores de mutaciones LHON presentaron niveles estacionarios normales de los complejos III y IV de la cadena respiratoria mitocondrial, así como del supercomplejo III2+IV. Dado que, a diferencia del complejo I, no se analizó la acumulación de intermediarios de ensamblaje de estos complejos mediante ensayos de 2D-BN/SDS-PAGE, inicialmente no se pudo determinar si las mutaciones LHON podrían producir alteraciones en el ensamblaje o estabilidad de estos complejos.

Sin embargo, las dos líneas celulares portadoras de la mutación m.11778G>A en el gen MT-ND4 (ND4/U5 y ND4/J1) presentaron una disminución en los niveles estacionarios del complejo II. Esta disminución podría reflejar un descenso de la masa mitocondrial específico de estos cíbridos, tal como se ha sugerido en estudios previos que demostraron una reducción de la actividad enzimática de citrato sintasa en dichas líneas, frente a los cíbridos control y las líneas portadoras de mutaciones en MT-ND1 y MT-ND6 (Baracca et al., 2005). Además, las líneas celulares ND4/U5 y ND4/J1 mostraron una ratio elevada de ADNmt/ADNn respecto a los controles, lo que sugiere que el mayor contenido de ADNmt podría manifestarse como un mecanismo para compensar una disminución en la masa mitocondrial. De hecho, la línea que contenía la mutación m.11778G>A en haplogrupo J1 (ND4/J1), presentó niveles significativamente elevados de los diferentes complejos. Otras líneas celulares también mostraron alteraciones en la ratio de ADNmt/ADNn respecto a los controles, pero con niveles normales tanto del complejo II como de la citrato sintasa (Baracca et al., 2005). Por ejemplo, la línea ND1/H12 mostró un aumento en la ratio de ADNmt/ADNn, pero las dos líneas portadoras de la mutación m.14484T>C en MT-ND6 (ND6/J1 y ND6/J1’) mostraron una ratio disminuida de ADNmt/ADNn. Por tanto, las diferencias relativas en el contenido del ADNmt de los cíbridos portadores de mutaciones LHON en general no correlacionaron con los niveles estacionarios de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial, salvo en la línea ND4/J1. Las diferencias observadas en los niveles estacionarios de los complejos mitocondriales entre las distintas líneas podrían deberse a la presencia de

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polimorfismos específicos en el D-loop localizados en la región control o en las regiones no codificantes del ADNmt, como los ARN ribosómicos 12S y 16S y los ARN de trasferencia (ARNt). Las variaciones polimórficas en estas regiones podrían afectar a la eficiencia de la transcripción y traducción de las proteínas mitocondriales, modificando de forma diferencial la eficiencia de síntesis de los complejos de la cadena respiratoria entre las distintas líneas celulares analizadas.

Sin embargo, al analizar las cinéticas de recuperación de los complejos III y IV en los cíbridos portadores de mutaciones LHON, se observaron claras diferencias tanto en la estabilidad como en el ensamblaje de los complejos III, IV y del supercomplejo III2+IV. Estos resultados indican la existencia de alteraciones en la formación del respirasoma mitocondrial en los cíbridos con mutaciones LHON, que podrían producirse como consecuencia de anomalías tanto en el proceso de ensamblaje del pre-complejo I de 830 kDa como de su posterior asociación a intermediarios del ensamblaje de los complejos III y IV (Moreno- Lastres et al., 2012). En este sentido, sería relevante analizar si las mutaciones LHON, o bien la combinación de cada mutación con un haplogrupo mitocondrial específico, pudieran afectar a la biogénesis y funcionalidad del respirasoma mitocondrial.

Las diferencias observadas en las cinéticas de recuperación de los complejos III y IV en los cíbridos portadores de mutaciones LHON parecerían estar influidas por el fondo genético mitocondrial. La línea celular más afectada fue la portadora de la mutación m.3460G>A en MT-ND1 en haplogrupo mitocondrial H12 (ND1/H12), la cual mostró los retrasos más grandes en las cinéticas de ensamblaje de los complejos III y IV respecto a los controles, así como la ausencia del supercomplejo III2+ IV. En contraste, la línea celular portadora de la misma mutación en el haplogrupo mitocondrial H* (ND1/H*) mostró un patrón de ensamblaje de los complejos III, IV y del supercomplejo III2+IV similar a los controles. Estas diferencias podrían ser atribuidas a la presencia en la línea celular ND1/H12 de la variante polimórfica no sinónima específica m.14552A>G que afecta a la subunidad ND6 (Tabla 4). Esta variante genética, en combinación con otros polimorfismos presentes en regiones no codificantes del ADNmt y en presencia de la mutación m.3460G>A en MT-ND1, podría disminuir la estabilidad de los complejos o supercomplejos de la cadena respiratoria mitocondrial, pero para confirmar esta hipótesis es necesario la realización de más experimentos. La línea celular portadora de la mutación m.11778G>A en MT-ND4 en haplogrupo mitocondrial U5 (ND4/U5), también presentó un destacado defecto del 92

ensamblaje de los complejos III, IV y del supercomplejo III2+IV. Sin embargo, la línea celular portadora de la misma mutación en el haplogrupo mitocondrial J1 (ND4/J1) mostró un patrón normal de ensamblaje de los complejos III, IV y del supercomplejo III2+IV. En esta línea tan sólo se detectó un ligero retraso en la formación del complejo III, que pronto recuperó los niveles estacionarios de las células control. De nuevo, estas diferencias podrían explicarse por la presencia en la línea celular ND4/U5 de dos variantes polimórficas del ADNmt en el gen MT-CO3, que codifica la subunidad CO3 del complejo IV mitocondrial. Estos cambios (m.9477G>A y m.9667A>G, Tabla 4), en combinación con otros polimorfismos específicos del haplogrupo mitocondrial U5, podrían añadir un efecto deletéreo a la mutación m.11778G>A en MT-ND4. Curiosamente, las dos líneas celulares con haplogrupo mitocondrial J1 (ND4/J1 y ND6/J1) mostraron cinéticas de recuperación de los complejos III,

IV y del supercomplejo III2+IV similares a los controles. Este resultado fue inesperado, debido que se considera que la mutación m.14484T>C en MT-ND6 lleva asociada una variante polimórfica no-sinónima en la subunidad ND6, (m.14279G>A), la cual ha sido propuesta como mutación primaria de LHON en una familia de origen ruso (Zhadanov et al., 2005). En ese caso, los pacientes presentaron la mutación m.14279G>A en el haplogrupo mitocondrial U4.

Estos resultados sugieren, en contraste con lo propuesto anteriormente (Carelli et al., 2006; Hudson et al., 2007b), que la acumulación de variantes genéticas no sinónimas en las subunidades ND del complejo I y citocromo b del complejo III asociadas a determinadas subclases del haplogrupo mitocondrial J, podría ejercer un efecto protector sobre la estabilidad de los complejos y supercomplejos del sistema OXPHOS. Esta hipótesis es consistente con estudios previos que establecieron una relación entre la presencia del haplogrupo J y una mayor y mejor longevidad (De Benedictis et al., 1999; Dominguez-Garrido et al., 2009), y una menor incidencia de padecer la enfermedad de Parkinson (van der Walt et al., 2003). Sin embargo, esta hipótesis no explica que el haplogrupo J persista asociado a las mutaciones LHON en la población, ya que son frecuentes las grandes familias con las mutaciones m.11778G>A y m.14484T>C en homoplasmia y haplogrupo J, donde los casos esporádicos son escasos. Por otro lado, tampoco explica la baja penetrancia descrita para la mutación m.14484T>C en mujeres, ya que dicha mutación afecta a 7-8 varones por cada mujer (Harding et al., 1995; Mashima et al., 1998). Por tanto, se precisa la realización de estudios genéticos y

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poblacionales adicionales que confirmen el posible papel protector del haplogrupo mitocondrial J.

En función de los resultados obtenidos se podrían establecer dos tipos de correlaciones genotipo-fenotipo:

1) Atendiendo tan solo a los resultados sobre los anomalías en la cinética de ensamblaje del complejo I, la mayor gravedad fenotípica correspondería a las líneas portadoras de la mutación en MT-ND4 (11778/ND4), que presentaron el retraso más acusado en la recuperación de los niveles del complejo I activo. Los cíbridos portadores de la mutación en MT-ND6 (14484/ND6) ocuparían un lugar intermedio y por último, los cíbridos portadores de la mutación en MT-ND1 (3460/ND1) serían los menos afectados, ya que presentaron las cinéticas de ensamblaje y activación del complejo I más parecidas a los controles. Estos resultados apoyarían estudios previos en los que se observó una correlación directa entre los fallos en la producción de ATP dependiente del complejo I, que fueron más pronunciados en los cíbridos con mutaciones en MT-ND4 y la expresión clínica más marcada de las mutaciones LHON (Baracca et al., 2005).

2) Atendiendo a la cinética global de recuperación de todos los complejos del sistema OXPHOS analizados, el fenotipo más acusado correspondería a las líneas portadoras de la mutación en MT-ND1, seguidas de los cíbridos con la mutación en MT-ND4 (11778/ND4) y por último, las líneas portadoras de la mutación en MT-ND6 (14484/ND6), siendo éstas las menos afectadas ya que presentaron cinéticas de formación de todos los complejos de cadena respiratoria similares a las observadas en cíbridos control. Estos resultados son consistentes con los resultaos obtenidos por mediciones polarográficas de la actividad enzimática del complejo I (Carelli et al., 2004), con la mayor producción de radicales libres detectada en cíbridos con la mutación m.3460G>A en MT-ND1 (Floreani et al., 2005) y con la disminución de la salida de glutamato en esos mismos cíbridos tras la incubación con rotenona o H2O2 (Beretta et al., 2004). Así mismo, correlacionarían con los criterios clínicos utilizados para establecer el potencial patogénico de las mutaciones LHON (Carelli et al., 2004). Los criterios propuestos son la alteración del transporte electrónico del complejo I, penetrancia cuando la mutación se encuentra en homoplasmia, afectación clínica diferencial según el género, modificación fenotípica dependiente de haplogrupo mitocondrial, y tasa de recuperación visual. Siguiendo estos criterios se estableció que las mutaciones m.3460G>A en MT-ND1 y

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m.11778G>A en MT-ND4 presentan los fenotipos clínicos más agresivos. De acuerdo con estos criterios, en el modelo celular estudiado en esta tesis los cíbridos con la mutación m.14484G>A en MT-ND6 con haplogrupo J1 (ND6/J1) mostraron la mejor cinética de recuperación global del ensamblaje de la cadena respiratoria. Este hallazgo concuerda clínicamente con la mayor frecuencia de recuperación espontánea de la visión de los pacientes portadores de esta mutación, que normalmente está asociada al haplogrupo J1.

Por tanto, los resultados de este trabajo sugieren que las diferencias en la capacidad de ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria entre los distintos cíbridos con mutaciones LHON, podrían contribuir a las diferencias fenotípicas de la enfermedad observadas en los pacientes.

Este estudio proporciona un nuevo escenario para entender mejor la fisiopatología del LHON. En condiciones fisiológicas, es probable que la biogénesis de la cadena respiratoria mitocondrial alcance un equilibrio entre la síntesis y activación de nuevos complejos, y la degradación de viejos complejos no funcionales, que permita cubrir las demandas energéticas celulares. Sin embargo existe la posibilidad de que, en determinadas condiciones de estrés en las que se produce un aumento repentino de la demanda energética, las células necesiten incrementar rápidamente su capacidad de producción de energía en forma de ATP mediante un aumento en la expresión y activación de las enzimas del sistema OXPHOS. En estos casos de necesidad inmediata de ATP, es posible que las células de los pacientes con mutaciones primarias de LHON no sean capaces de conseguir sintetizar eficientemente nuevos complejos OXPHOS para cubrir las necesidades energéticas celulares. Además, el fondo genético mitocondrial en el que se encuentran las mutaciones patogénicas influiría no sólo en la cinética de ensamblaje del complejo I, sino también en la formación de los complejos III y IV, por lo que afectaría directamente a la capacidad de formación de respirasomas funcionales. A su vez, las mutaciones y su entorno genético influirían sobre la estabilidad de los distintos complejos, agravando la pérdida de estabilidad y actividad del complejo I en el respirasoma, que es dependiente de la correcta formación y estabilidad de los complejos III y IV (Acin- Perez et al., 2004; Diaz et al., 2006; Moreno-Lastres et al., 2012; Schagger et al., 2004). Ello podría explicar la disminución de la síntesis de ATP dependiente del complejo I (Baracca et al., 2005), el aumento de radicales libres del oxígeno y el aumento de la muerte celular observadas en los cíbridos con mutaciones primarias LHON (Beretta et al., 2004; Ghelli et al., 2003; Wong et al., 2002). Consecuentemente, al recuperarse las condiciones fisiológicas

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de normalidad, el restablecimiento de los niveles basales de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial permitiría una recuperación de las actividades enzimáticas OXPHOS y de la síntesis basal de ATP. Esta hipótesis podría explicar en parte la recuperación visual que ocurre espontáneamente en algunos de los pacientes que desarrollan la enfermedad de LHON, en los cuales la degeneración de las células ganglionares de la retina (CGRs) producida por un sistema OXPHOS dañado, que desencadena una serie de mecanismos que llevarían a un aumento de los niveles de ROS y de la muerte celular, podría revertir si el fallo energético no ha alcanzado un umbral crítico para poder recuperar la funcionalidad del sistema OXPHOS y por lo tanto, de las CGRs (Carelli et al., 2004). De acuerdo con esta hipótesis, la expresión alotópica en cíbridos de la subunidad ND4 re-codificada en el núcleo e importada a la mitocondria mediante el uso de vectores adenovirales, permitió la recuperación parcial del déficit enzimático del complejo I causado por la mutación m.11778G>A (Guy et al., 2002).

Las mutaciones mitocondriales que producen LHON son generalmente homoplásmicas en todas las células del organismo, pero por qué su tejido diana son únicamente las células ganglionares de la retina? Las células de la retina presentan una alta demanda energética ya que la porción inicial de sus axones, es decir, desde la cabeza del nervio óptico hasta la lámina cribosa, se encuentra desmielinizada y por ello es particularmente rica en mitocondrias que proveen la cantidad necesaria de ATP, imprescindible para la transmisión de las señales visuales. A partir de la lámina cribosa, los axones, recubiertos de mielina tienen una menor demanda energética gracias a los nodos de Ranvier que facilitan la transmisión de las señales (despolarización), por lo que se requieren menos mitocondrias en estas regiones. Esta alta demanda energética, puede ser lo que haga que esta porción del nervio óptico sea vulnerable a la disfunción mitocondrial. Por otro lado, la pérdida de la función de las CGR es más compleja que una crisis bioenergética, donde otros mecanismos de la función mitocondrial parecen estar involucrados como el mantenimiento del ADNmt, de la red mitocondrial, y del gradiente diferencial de mitocondrias a lo largo de la lámina cribosa, así como el transporte axonal. La vulnerabilidad de las CGRs en el LHON, no deriva sólo de su anatomía específica, sino también puede venir determinada por factores genéticos tejido-específicos y factores exógenos como el tabaco. Es posible que el defecto del complejo I sea leve o inapreciable en el resto de los tejidos, pero que sin embargo en las células ganglionares de la retina este defecto se vea acentuando con el tiempo, bien por un incremento continuado de radicales

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libres que lentamente van dañando la estructura de la membrana o produciendo algún otro cambio a nivel de ADN nuclear o mitocondrial que las haga más sensibles.

Por otro lado es interesante el hecho de que otras células con características energéticas y funcionales similares, como las células ciliadas de la cóclea, células con una alta demanda energética y que no se dividen como las CGRs no se vean afectadas cuando un paciente manifiesta pérdida visual producida por alguna de las tres mutaciones primarias de LHON, o al revés, qué la mutación m.1555G>A en el gen MT-RNR1 del ARNr 12S, generalmente homoplásmica y vinculada a la sordera neurosensorial no sindrómica, sólo afecta al sistema auditivo, más concretamente a las células ciliadas externas del órgano de Corti y no observamos lesión a nivel de las células ganglionares de la retina, cuando los estudios realizados en ambas las relacionan con los mismos mecanismos fisiopatológicos (Berrettini et al., 2008; Lu et al., 2010; Torroni et al., 1999).

Desde que en 2004 comenzó a usarse la Tomografía de Coherencia Óptica (OCT), técnica no invasiva de exploración neuro-oftalmológica, para el estudio de la retina y del nervio óptico, se ha asociado un patrón típico de pérdida de la función axonal de LHON con la DOA (también asociado con un defecto del complejo I) y la enfermedad de Parkinson, sin embargo todavía no ha sido suficiente para aclarar el mecanismo fisiopatológico del LHON (Carelli et al., 2004).

Aunque los resultados aquí generados aportan nuevas ideas en el estudio de los posibles mecanismos fisiopatológicos, no tenemos que olvidarnos de las limitaciones de este trabajo: 1) al haberse realizado utilizando el modelo celular de cíbridos, hemos de tener en cuenta que la célula rho0 usada para la fusión celular deriva de una línea celular tumoral (células de osteosarcoma), con una población genéticamente heterogénea donde los juegos cromosómicos no son totalmente idénticos y contienen múltiples desequilibrios cromosómicos; 2) el número de clones disponibles, pues la generación de cíbridos implica una selección clonal de una línea celular tumoral, donde cada clon contendrá una carga genética nuclear característica y 3) se han realizado in vitro en condiciones de cultivo que no suponen un estrés metabólico tan importante como el existente en las CGRs, células con una fuerte dependencia del sistema OXPHOS, mientras las células tumorales son altamente glucolíticas (Kirches, 2011). Hubiera sido interesante haber podido realizar el estudio en cíbridos derivados de la línea celular de teratoma (NT2), una línea con unas características más

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parecidas a las de las CGRs, y/o con los cíbridos derivados de las células de osteosarcoma en condiciones de estrés metabólico en medio libre de glucosa enriquecido con galactosa, para ver si las diferencia son mayores, o con más clones con el mismo haplogrupo derivados de la misma o diferente célula rho0 para ver si estos resultados se repiten.

Aunque previamente se ha sugerido que los haplogrupos podrían contribuir a la predisposición a las enfermedades mitocondriales (D'Aurelio et al., 2010; Lu et al., 2010), posiblemente a través de la regulación de los niveles de ROS, de forma similar a la observada en modelos cíbridos de ratón (Li et al., 2010; Moreno-Loshuertos et al., 2006), los resultados de esta tesis constituyen la primera evidencia experimental de que el fondo genético mitocondrial, en combinación con las mutaciones patogénicas de LHON, podría modular la gravedad de las manifestaciones fenotípicas de la enfermedad como consecuencia de promover alteraciones en las cinéticas de ensamblaje de los complejos del sistema OXPHOS (Pello et al., 2008). Estudios realizados con posterioridad han confirmado la importancia funcional del fondo genético mitocondrial sobre el posible desarrollo de otras enfermedades mitocondriales. Tal es el caso de las diferencias fenotípicas vistas en pacientes con mutaciones en ATP6 y citocromo b (D'Aurelio et al., 2010; Gil Borlado et al., 2010). Sin embargo, el fondo genético mitocondrial no alcanza a explicar cuestiones claves de la enfermedad de LHON, tales como la penetrancia incompleta de las mutaciones primarias de LHON, la mayor prevalencia de la enfermedad en el género masculino, la especificidad por las células ganglionares de la retina, la bioenergética y la dinámica de las mitocondrias en los tejidos principalmente afectados. Por lo tanto, es necesario seguir profundizando sobre la posible influencia de otros factores genéticos nucleares y epigenéticos o medioambientales que puedan contribuir al desarrollo de esta patología.

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CONCLUSIONES______

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CONCLUSIONES______

1. Las líneas de cíbridos control bajo la influencia de diferentes fondos genéticos, haplogrupos T2, J1, K1, H5 no presentan diferencias ni en la estabilidad del complejo I, ni en la cinética de ensamblaje de los diferentes complejos de la cadena respiratoria

2. Las tres líneas de cíbridos con mutaciones LHON, independientemente de su haplogrupo, sufren un retraso en la recuperación de la actividad en gel del CI y de la cinética de ensamblaje del CI de más a menos afectadas ND4=ND6

3. El ensamblaje y estabilidad del CIII y CIV de las líneas de cíbridos LHON parece estar influenciado por el haplogrupo donde:

a. Se produce un retraso de la recuperación del CIII en los cíbridos con la mutación en el gen ND1 con haplogrupo H12.

b. Se produce un retraso de la cinética de recuperación del CIV y del

supercomplejo III2+IV en las líneas de cíbridos con mutaciones en ND1 y haplogrupo H12, y ND4 con haplogrupo U5.

c. Las líneas de cíbridos con mutaciones en ND1/H* y las líneas con haplogrupo J; ND4/J y ND6/J no presentan un retraso de la cinética de ensamblaje de los complejos

III, IV y del supercomplejo III2+IV.

4. La línea de cíbridos con la mutación en ND1/H12 tiene un retraso de la cinética de ensamblaje de todos los complejos.

5. Las líneas de cíbridos con las mutaciones en ND1/H*, y las líneas con haplogrupo J: ND4/J y ND6/J, parecen comportarse de manera similar, presentando un retraso de la cinética y actividad en gel del CI, pero no presentan un retraso de la cinética de ensamblaje de los complejos III, IV, y del supercomplejo III2+IV.

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BIBLIOGRAFÍA______

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114

ANEXOS ______

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Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24 4001–4011 doi:10.1093/hmg/ddn303 Advance Access published on September 19, 2008 Mitochondrial DNA background modulates the assembly kinetics of OXPHOS complexes in a cellular model of mitochondrial disease

Rosa Pello1,2, Miguel A. Martı´n1,2, Valerio Carelli3, Leo G. Nijtmans4, Alessandro Achilli5,6, Maria Pala5, Antonio Torroni5, Aurora Go´ mez-Dura´n7,8, Eduardo Ruiz-Pesini7,8, Andrea Martinuzzi9, Jan A. Smeitink4, Joaquı´n Arenas1,2 and Cristina Ugalde1,2,

1CIBERER-U723 and 2Centro de Investigacio´n, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid 28041, Spain, 3Dipartimento di Scienze Neurologiche, Universita` di Bologna, Bologna 40123, Italy, 4Nijmegen Centre for Mitochondrial Disorders, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen 6500 HB, The Netherlands, 5Dipartimento di Genetica e Microbiologia, Universita` di Pavia, Pavia 27100, Italy, 6Dipartimento di Biologia Cellulare e Downloaded from Ambientale, Universita` di Perugia, Perugia 06123, Italy, 7CIBERER-U727 and 8Departamento de Bioquı´mica, Biologı´a Molecular y Celular, Universidad de Zaragoza, Zaragoza 50013, Spain and 9E. Medea Scientific Institute, Conegliano Research Centre, Conegliano 21015, Italy

Received August 7, 2008; Revised and Accepted September 16, 2008 http://hmg.oxfordjournals.org/

Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON), the most frequent mitochondrial disorder, is mostly due to three mitochondrial DNA (mtDNA) mutations in respiratory chain complex I subunit genes: 3460/ND1, 11778/ND4 and 14484/ND6. Despite considerable clinical evidences, a genetic modifying role of the mtDNA haplogroup background in the clinical expression of LHON remains experimentally unproven. We investigated the effect of mtDNA haplogroups on the assembly of oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes in transmito- chondrial hybrids (cybrids) harboring the three common LHON mutations. The steady-state levels of respi- ratory chain complexes appeared normal in mutant cybrids. However, an accumulation of low molecular by guest on April 26, 2013 weight subcomplexes suggested a complex I assembly/stability defect, which was further demonstrated by reversibly inhibiting mitochondrial protein translation with doxycycline. Our results showed differentially delayed assembly rates of respiratory chain complexes I, III and IV amongst mutants belonging to different mtDNA haplogroups, revealing that specific mtDNA polymorphisms may modify the pathogenic potential of LHON mutations by affecting the overall assembly kinetics of OXPHOS complexes.

INTRODUCTION m.3460G . AinND1 (3460/ND1), m.11778G . AinND4 Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON, MIM#535000) is (11778/ND4), and m.14484T . CinND6 (14484/ND6) (2). a maternally inherited blinding disease characterized by sub- Although the genetic basis are known since 1988 (3), the patho- acute degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) leading genesis of LHON via complex I dysfunction remains poorly to optic nerve atrophy and bilateral loss of central vision, understood. Most LHON families carry the mtDNA pathogenic prevalently in young males (1). In 95% of cases worldwide, mutation in homoplasmic condition, but not all maternally LHON is caused by three point mutations in mitochondrial related individuals develop visual loss, suggesting addi- DNA (mtDNA) respiratory chain complex I subunit genes: tional genetic or epigenetic determinants for the phenotypic

To whom correspondence should be addressed at: Centro de Investigacio´n, Hospital Universitario 12 de Octubre, Avda. de Co´rdoba s/n, Madrid 28041, Spain. Tel: þ34 913908763; Fax: þ34 913908544; Email: [email protected] New Genbank accession numbers: EU915472, EU915473, EU915474, EU915475, EU915476, EU915477, EU915478, EU915479, FJ178379, FJ178380

# The Author 2008. Published by Oxford University Press. All rights reserved. For Permissions, please email: [email protected] 4002 Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24 expression of LHON. To date, the most compelling evidence RESULTS for a genetic modifying role comes from the mtDNA hap- Cybrid clones and complete sequence analysis of mtDNA logroup hosting the primary LHON mutations. Independent studies revealed that the Eurasian haplogroup J is preferen- In the present study we have used six homoplasmic mutant LHON tially associated with the 11778/ND4 and 14484/ND6 LHON cybrid cell lines (two for each common mutation), previously pathogenic mutations (4–6). Recently, this association was investigated and extensively characterized (11,15,17–19) narrowed to haplogroup J1 for the 14484 mutation, and to sub- and four control cybrid cell lines. In all cases the complete clades J1c and J2b for the 11778 mutation, suggesting that sequence of the cybrid-repopulating mtDNAs was determined. specific mutational motifs, which included non-synonymous All non-synonymous polymorphic variants found in the variants in complex I and III subunit genes, could increase mtDNA coding regions relative to the revised Cambridge the penetrance and risk of LHON expression by structural reference sequence (20) are listed in Table 1. alterations in the mitochondrial respiratory chain complexes or supercomplexes (7,8). Due to the lack of animal models to study mitochondrial Steady-state levels of individual respiratory chain disorders caused by mtDNA gene defects, transmitochondrial complexes in LHON cybrids cytoplasmic hybrids (cybrids) have become a major cellular To analyze the respiratory chain content in the four control model to analyze the pathophysiological consequences of and six mutant cybrids harboring different mtDNA back- LHON mutations. Cybrids are generated by fusing mtDNA- grounds (Table 1), we performed BN–PAGE combined with depleted human cells (rho zero cells) with enucleated cells complex I in-gel activity (IGA) assay and western blot analy- Downloaded from (cytoplasts) from LHON patients. The resulting cybrid sis with antibodies raised against specific OXPHOS subunits clones contain a uniform nuclear DNA (nDNA) and an (Fig. 1A). Normal complex I activities were found in all exogenous mtDNA harboring the LHON mutation of interest, cybrids, and no significant differences were observed in the allowing direct comparisons of biochemical phenotypes due steady-state levels of fully assembled complexes I, III and solely to different mtDNA species (9). Bioenergetics studies IV between controls and mutants. For complex II, a relative http://hmg.oxfordjournals.org/ demonstrated that the 3460/ND1 mutation, associated with lower signal was found in the 11778/ND4 mutant clones the most severe clinical phenotype (10), consistently led to a (Fig. 1A, lowest panel), which might reflect a decreased complex I activity decrease, while the 11778/ND4 and amount of mitochondria as suggested by the previously 14484/ND6 mutations presented normal or slightly reduced reported decreased citrate synthase activity of these clones activities in both patients and cybrids (11–14). Complex compared with controls (15). The rest of cybrid clones I-dependent (pyruvate or glutamate-malate) respiration showed comparable complex II expression levels, which studies showed a variable reduction in the oxygen consump- correlated with their normal citrate synthase activities (15). tion rates depending on the mutation (11,12,14,15), which In order to exclude expression differences among the clones was accompanied by a severe impairment of complex due to variations in their mitochondrial mass, the signal by guest on April 26, 2013 I-driven ATP synthesis (15). A prevalent role of increased obtained from the complex II antibody was used to normalize reactive oxygen species (ROS) production in LHON pathogen- for the expression levels of mitochondrial respiratory chain esis was proposed (16,17), as well as a decrease in antioxidant complexes (Fig. 1B). No significant differences were observed defenses that was particularly evident for the 3460/ND1 and among control cybrids belonging to different haplogroups. 11778/ND4 mutations (18). Moreover, incubation of LHON A general tendency for higher complex I activity or expression cybrids in galactose medium impaired cell growth and levels of mitochondrial complexes I, III and IV, and for the caused massive apoptotic cell death, being the 3460/ND1 supercomplex CIII2þ CIV (but not complex II) was observed and 14484/ND6 mutations more susceptible to apoptosis in the haplogroup J1 mutant cells. This increase was not stat- than the 11778/ND4 mutation (12,18,19). istically significant for the clones characterized by the 14484/ In the present study, we have investigated control ND6 mutation on haplogroup J1 (ND6/J1 and ND6/J10). and LHON cybrids in which the mtDNA genome was com- However, the clone carrying the 11778/ND4 mutation on hap- pletely sequenced. By using blue native gel electrophoresis logroup J1 (ND4/J1) showed significantly higher steady-state (BN–PAGE) in combination with immunodetection, we levels (P , 0.05) of all respiratory chain complexes when aimed to elucidate the effect that common primary LHON compared with the controls or to its counterpart ND4/U5, mutations on different mtDNA haplogroups might exert which harbored the same mutation on a haplogroup U5a on the assembly of complex I and other mitochondrial mtDNA. Clone ND4/U5 on the contrary did not show signifi- respiratory chain complexes. To address the dynamics of cant differences when compared with controls. Similarly, no assembly, we partially depleted control and LHON cybrids significant differences were found in the expression levels of of oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes by respiratory chain complexes I, III, and IV between controls doxycycline treatment, which reversibly inhibits mitochon- and the clones harboring the 3460/ND1 mutation on different drial translation. Our results showed altered kinetics of subclades (H and H12) of haplogroup H. A 4-fold decrease complex I assembly and defective recovery of complex I (P , 0.05) in the expression levels of supercomplex CIII2þ activity in all LHON cybrids, and differential alterations in CIV was observed in clone ND1/H12, but this result did not the assembly kinetics of respiratory chain complexes III correlate with a decreased expression of individual complexes and IV that can be attributed to specific genetic variations III or IV (Fig. 1B). amongst the mtDNA backgrounds hosting the primary The mtDNA copy number was calculated for each clone in LHON mutations. order to exclude that the differences in the steady-state Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24 4003

Table 1. Haplogroup affiliation and non-synonymous nucleotide changes of haplogroups (Table 2). Although no differences were found mtDNAs from the cybrid clones used in this study between controls and clone ND1/H, the rest of LHON mutant cybrids showed either increased or reduced mtDNA Cybrid Genbank LHON Haplogroup Non-synonymous Amino content. Clones ND1/H12, ND4/U5 and ND4/J1 exhibited cell lines ID mutation polymorphisms acid the highest mtDNA/nDNA rates. These cells consistently relative to rCRSa change showed the lowest relative levels of complex II or citrate CON/T2 FJ178379 Control T2 T4216C (ND1) Tyr.Hi synthase activities (15), suggesting that the high mtDNA A4917G (ND2) Asn.Asp b content might represent a compensatory mechanism for the A10398G (ND3) Thr.Ala reduced mitochondrial mass. On the contrary, the 14484/ C14766T (CYTB) Thr.Ile C15452A (CYTB) Leu.Ile ND6 mutant clones exhibited the lowest mtDNA/nDNA CON/J1c FJ178380 Control J1b T4216C (ND1) Tyr.His rates but showed normal levels of complex II or citrate A4917G (ND2)c Asn.Asp synthase activities. These relative differences in the mtDNA G5460A (ND2) Ala.Thr content did not seem to influence the steady-state levels of res- G8557A (ATP6) Ala.Thr A10398G (ND3) Thr.Ala piratory chain complexes in any clone except ND4/J1, which G13708A (ND5) Ala.Thr showed a significant increase in the expression levels of T13879C (ND5) Ser.Pro OXPHOS complexes. These expression differences might be C14766T (CYTB) Thr.Ile due to the presence in each individual clone of specific poly- C15452A (CYTB) Leu.Ile morphisms in the D-loop control region or within the non-

CON/K1 EU915473 Control K1a2 A4024T (ND1) Thr.Ser Downloaded from G9055A (ATP6) Ala.Thr protein coding regions of mtDNA, such as the 12S and 16S A10398G (ND3) Thr.Ala rRNAs and the mitochondrial tRNAs. Polymorphic variations T11025C (ND4) Leu.Pro within these regions might affect the translation efficiency C14766T (CYTB) Thr.Ile of mitochondrial proteins, which could account for the T14798C (CYTB) Phe.Leu CON/H5 EU915472 Control H5 A7245G (COI) Thr.Ala differences observed in the steady-state levels of the native

ND1/H EU915474 G3460A H ––OXPHOS complexes. http://hmg.oxfordjournals.org/ ND1/H12 EU915475 G3460A H12 A14552G (ND6) Val.Ala ND4/J1 EU915476 G11778A J1c T4216C (ND1) Tyr . His A10398G (ND3) Thr . Ala T12083G (ND4) Ser . Ala Differential accumulation of low molecular weight complex G13708A (ND5) Ala . Thr I subcomplexes in mutated LHON cybrids C14766T (CYTB) Thr . Ile T14798C (CYTB) Phe . Leu In order to study whether the primary LHON mutations in the C15452A (CYTB) Leu . Ile mitochondrial ND1, ND4 and ND6 genes could affect complex ND4/U5 EU915477 G11778A U5a G9477A (COIII) Val . Ile A9667G (COIII) Asn . Ser I assembly or stability, and to investigate the possible presence C14766T (CYTB) Thr . Ile of complex I assembly intermediates or breakdown products, by guest on April 26, 2013 A14793G (CYTB) His . Arg two-dimensional (2D) BN/SDS–PAGE electrophoresis was ND6/J1 EU915478 T14484C J1b T4216C (ND1) Tyr . His performed. Gels were blotted and incubated with an antibody G5460A (ND2) Ala . Thr against the complex I NDUFA9 subunit (Fig. 2). Each mutant G8557A (ATP6) Ala . Thr A10398G (ND3) Thr . Ala cell line was compared with a control belonging to the closest G13708A (ND5) Ala . Thr evolutionarily related mtDNA haplogroup. Cybrids harboring T13879C (ND5) Ser . Pro the 3460/ND1 mutation on haplogroup H12 mtDNA (ND1/ C14766T (CYTB) Thr . Ile H12) showed a smeary pattern of accumulated NDUFA9 C15452A (CYTB) Leu . Ile 0 subunit-containing subcomplexes, suggestive of a complex I ND6/J1 EU915479 T14484C J1c T4216C (ND1) Tyr . His T7042C (COI) Val . Ala assembly or stability defect, while the haplogroup H clone A10398G (ND3) Thr . Ala (ND1/H) showed normal amounts of fully assembled G13708A (ND5) Ala . Thr complex I and a regular pattern of low molecular weight sub- G14279A (ND6) Ser . Leu complexes. The same observation was made for the 11778/ C14766T (CYTB) Thr . Ile T14798C (CYTB) Phe . Leu ND4 mutation clones: the haplogroup U5a cybrid (ND4/ C15452A (CYTB) Leu . Ile U5a), showed an accumulation of NDUFA9-containing sub- complexes compared with its K1a control (K is a subclade arCRS refers to the revised Cambridge reference sequence (20). In of haplogroup U), while the haplogroup J1 clone (ND4/J1) addition, all mtDNAs differed from rCRS, which belongs to haplogroup showed normal amounts of fully assembled complex I and H2a, for A8860G (ATP6) and A15326G (CYTB). b no accumulation of low molecular weight subcomplexes rela- The 10398 polymorphism in CON/T2, and tive to the J1 control. A normal complex I assembly pattern cthe 4917 polymorphism in CON/J1, have been confirmed by RFLP analysis and sequencing. Both 10398 and 10463 (tRNAArg) polymorphisms, and both was also observed for the 14484/ND6 LHON mutation 4917 and 5460 polymorphisms, were present in the same electropherogram clones characterized by a J1 mtDNA. Our results suggest without double peaks. that the assembly and/or stability of mitochondrial respiratory chain complex I would be more severely affected by the expression levels of respiratory chain complexes were primary LHON mutations when associated with certain influenced by variations in the mtDNA content among indi- mtDNA backgrounds, such as H12 or U5a, while the same vidual clones. No significant differences were found in the mutation on a different haplogroup would cause a less mtDNA/nDNA ratio between controls belonging to different severe disturbance on complex I. 4004 Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24 Downloaded from http://hmg.oxfordjournals.org/

Figure 1. (A) BN–PAGE analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in control and LHON cybrids. Mitochondrial particles were isolated as described in Materials and Methods and 40 mg protein was analyzed on a 5–15% BN–PAGE for the separation of multisubunit complexes. First panel, by guest on April 26, 2013 complex I IGA assay. A second gel was run in duplicate and western blot analysis was performed using antibodies against complex I NDUFA9 subunit (second panel), complex III core2 protein (third panel), complex IV COX5A subunit (fourth panel), or complex II-70 kDa subunit (fifth panel). CI, fully assembled complex I; CIII2, complex III dimer; CIV, complex IV; CIII2 þ CIV indicates the presence of a supercomplex containing complexes III and IV, frequently observed on BN–PAGE. (B) To calculate the steady-state levels of complex I activity and fully assembled complexes I, III, IV and supercomplex CIII2 þ CIV, five independent blue native blots were quantified, and the average numerical values normalized to those obtained from complex II. Significant differences (t-student, P , 0.05) are highlighted with an asterisk.

Table 2. MtDNA copy number in cybrid cell lines expressed as mtDNA/ with different mtDNA backgrounds, we depleted the cells nDNA ratio of complex I and other OXPHOS complexes containing mitochondrial-encoded subunits, by reversibly blocking mito- Cybrid cell lines mtDNA/nDNA chondrial protein translation with doxycycline. This strategy

2 was successfully used to follow the assembly kinetics of 143B TK 206 381 + 20 2 Controls (n ¼ 4) 355 + 44 respiratory chain complex I in the parental 143B TK 206 ND1/H 395 + 36 cell line (21), and helped the interpretation of assembly ND1/H12 517 + 62 defects in complex I-deficient patients with mutations in struc- ND4/J1 639 + 35 tural genes (22). Because further treatment with doxycycline ND4/U5 553 + 32 ND6/J1 243 + 26 affected cell viability in our culture conditions, cells were ND6/J10 239 + 20 cultured for 6 days in the presence of the inhibitor. After the 143B rho zero n.d. release of drug inhibition, cells grown in exponential con- ditions started translating mitochondrial proteins, and the Numbers indicate the mean values of four independent measurements per assembly of newly synthesized respiratory chain complexes sample + standard deviation; n.d., not-detectable. was investigated. To follow the reappearance of mitochondrial complexes after the reversible block of assembly, samples were collected at different time points (0, 6, 15, 24, 48, 72 Assembly kinetics of respiratory chain complexes and 96 h) after doxycycline removal, run on BN–PAGE and in control cybrids assayed for complex I IGA, or alternatively, blotted on nitro- In order to analyze possible differences in the assembly cellulose and incubated with antibodies raised against specific kinetics of respiratory chain complexes in control cybrids OXPHOS subunits. Results showed no significant differences Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24 4005 Downloaded from

Figure 2. 2D-BN/SDS–PAGE analysis of mitochondrial respiratory complex

I in LHON mutants. For the separation of individual subunits a 10% tricine http://hmg.oxfordjournals.org/ SDS-gel was run in the second dimension. Gels were blotted. For the position- ing of complex I (980 kDa) a primary antibody against complex I subunit NDUFA9 (39 kDa) was used in control and mutant cybrids. CI indicates the relative position of fully assembled complex I. The directions of the first (1D) and second (2D) dimension are shown. in the recovery kinetics of respiratory chain complexes among control cybrids belonging to different haplogroups (data not shown). For this reason, we quantified the signals obtained from the IGA assays and western blots in the four independent by guest on April 26, 2013 control cell lines, normalized them for the expression levels of mitochondrial complex II, expressed them as a percentage of the untreated cells (which correspond to the steady-state expression levels), and calculated the average numerical Figure 3. Assembly kinetics of respiratory chain complexes in control cybrids. values for the complex I activity restoration curve and the The four controls used in this study were treated for 6 days with doxycycline assembly rates of respiratory chain complexes I, III, IV and (an inhibitor of mitochondrial translation), the medium was replaced by supercomplex CIII þ CIV (Fig. 3). doxycycline-free medium and cells were grown for the indicated time (in 2 hours). Forty microgram of crude mitochondrial pellets was analyzed by Consistent with previous observations, after 6 days of doxy- BN–PAGE in combination with complex I-IGA assay. Duplicate gels were cycline treatment (Fig. 3, T0 point), we observed 70–90% blotted and incubated with antibodies against the NDUFA9 complex I reduction of complex I activity or fully assembled respiratory subunit, complex III core2 protein, complex IV COX5A subunit and chain complexes in control cybrids compared with untreated complex II-70 kDa subunit (data not shown). The signals were quantified, expressed as percentage of the untreated cells (indicated as SS), normalized cells (Fig. 3, SS point) (21). As shown in Figure 3A, controls with the complex II-70 kDa subunit and plotted. (A) Complex I activity recov- mainly acquired fully assembled complex I between 24 and ery kinetics versus complex I assembly rates. (B) Complex I versus complex III 48 h after doxycycline removal, and gained complex I activity assembly rates. (C) Complex III versus complex IV and supercomplex CIII2 þ 48 h after removing the drug. Restoration to normal complex CIV assembly kinetics. I steady-state levels occurred at time 72–96 h, and normal complex I activity levels were reached at 96 h. The observed complex CIII2þ CIV steady-state levels occurred 96 h after time course for complex I assembly and activity was com- removing the drug. These results match other studies in which parable with previous findings (21,23,24). Fully assembled no bioenergetic differences were observed in control cybrid complex III was restored in a similar time course as complex cell lines carrying European mtDNA haplogroups (25,26). I (Fig. 3B). Fully assembled complex IV, however, was acquired 24 h later than complexes I and III (Fig. 3C). Similarly, the formation of the mitochondrial supercomplex Delayed assembly kinetics of respiratory chain complex CIII2þ CIV paralleled the complex IV assembly kinetics, suggesting that a minimum pool of individual complexes I in cybrids harboring LHON primary mutations III and IV is necessary in order to form supercomplex CIII2þ To check whether the assembly kinetics of respiratory chain CIV (Fig. 3C). Restoration to normal complex IV and super- complex I was affected by the LHON mutations, we used 4006 Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24 Downloaded from http://hmg.oxfordjournals.org/

Figure 4. Re-appearance of respiratory chain complex I in LHON cybrids. The signals corresponding to complex I-IGA assays and western blots incubated with

the NDUFA9 antibody (Supplementary Material, Figure S1) were quantified, expressed as percentage of the untreated cells (indicated as SS), normalized with by guest on April 26, 2013 the complex II-70 kDa subunit, plotted, and compared with the average assembly kinetics of the controls. (A) Clones ND1/H and ND1/H12, harboring the 3460/ND1 mutation on subclades H and H12, respectively. (B) Clones ND4/J1 and ND4/U5, harboring the 11778/ND4 mutation on haplogroups J1 and U5a, respectively. (C) Clones ND4/J1 and ND6/J1, harboring the 11778/ND4 and 14484/ND6 mutations on haplogroup J1 mtDNAs. the same doxycycline inhibition strategy in our mutant cybrids 75–85% of total complex I activity. Similar results were (Supplementary Material, Figure S1). The complex I signals obtained for the recovery of fully assembled complex I from blue native experiments were quantified, and normalized (Fig. 4A, right). Controls gained 50% of total holocomplex as previously mentioned. Cell lines were grouped according to I at time 24 h, and the 3460/ND1 clones between 48 and 72 h. the LHON mutation they harbored and compared with the From time 48 h on complex I assembly kinetics seemed to ‘average’ control numerical values. After 6 days of doxycy- speed up in the mutants, since at time 96 h clone ND1/H12 cline treatment (Fig. 4, T0 points), we observed a practically recovered 90% of total holocomplex I, and the ND1/H total reduction of complex I activity and 85–100% clone presented more fully assembled complex I than the reduction of fully assembled respiratory chain complex I controls. This effect might represent a compensatory in the mutant cybrids compared with the untreated cells mechanism as a response to the inhibition of mitochondrial (Fig. 4, SS points). These values contrast with those obtained protein synthesis. This might involve a general increase in for the controls during the inhibition process, suggesting that mitochondrial mass because complex II, which only contains LHON mutations probably affect complex I stability. nuclear encoded subunits, also shows such an increase at Differences were found in the assembly kinetics of respirat- 96 h in the ND1/H cells (Supplementary Material, Figure S1). ory chain complex I between controls and LHON mutants. Differences in the complex I assembly rates were detected Clones characterized by the 3460/ND1 mutation on hap- between clones characterized by the 11778/ND4 mutation on logroups H12 and H (ND1/H12 and ND1/H, respectively) J1 and U5a haplogroups (Fig. 4B). Both the ND4/J1 and showed a similar 24 h delay in the recovery of complex I ND4/U5 cell lines showed a minimum of 48 h delay in the activity compared with controls (Fig. 4A, left). Controls recovery of complex I activity and fully assembled complex gained 50% of total complex I activity 48 h after doxycy- I compared with controls. Clone ND4/J1 gained 50% of cline removal, and the 3460/ND1 clones between 72 and total complex I activity and fully assembled complex I 96 h. At time 96 h, controls showed 100% of complex I between 72 and 96 h after the drug removal, but clone ND4/ activity, while clones ND1/H12 and ND1/H recovered U5a could not even reach these levels at 96 h. Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24 4007 Downloaded from http://hmg.oxfordjournals.org/

Figure 5. Assembly kinetics of respiratory chain complexes III and IV in LHON cybrids. The signals corresponding to western blots incubated with antibodies against the complex III core2 protein and complex IV COX5A subunit (Supplementary Material, Figure S1) were quantified, expressed as the percentage of untreated cells (indicated as SS), normalized with the complex II-70 kDa subunit, plotted, and compared with the control average assembly kinetics. (A) Signals corresponding to cybrid clones ND1/H and ND1/H12, which harbor the 3460/ND1 mutation. (B) Signals corresponding to cell lines ND4/J1 and ND4/U5 that harbor the 11778/ND4 mutation. (C) Signals from cells harboring the 11778/ND4 and 14484/ND6 mutations on a haplogroup J1 mtDNA, which correspond to cell lines ND4/J1 and ND6/J1. Top graphs represent the complex III assembly curves. Middle graphs represent the complex IV assembly rates. Bottom graphs represent the supercomplex CIII2 þ CIV assembly kinetics. by guest on April 26, 2013 No differences were found in the complex I assembly kin- clone ND1/H and controls, the ND1/H12 cell line showed a etics of clones harboring the 14484/ND6 mutation on a J1 minimum of 72 h delay in the recovery of fully assembled mtDNA (data not shown). We next compared the 11778/ complex III (Fig. 5A, top). Controls gained 50% of fully ND4 and 14484/ND6 clones characterized by the same hap- assembled complex III at time 24 h, whereas clone ND1/ logroup J1 background (ND4/J1 and ND6/J1, respectively). H12 reached these levels 96 h after doxycycline removal. Curiously, both clones showed similar delayed assembly Similarly, controls gained 50% of total holocomplex IV kinetics of respiratory chain complex I (Fig. 4C). Our results between 24 and 48 h after doxycycline removal, whereas demonstrate hampered kinetics of complex I assembly and clone ND1/H12 could not reach these levels before 96 h activity recovery in all LHON cybrids. (Fig. 5A, middle). In accordance with these results, clone ND1/H12 barely showed any expression of the mitochondrial supercomplex CIII2 þ CIV (Fig. 5A, bottom). MtDNA background influences the assembly kinetics of Conversely both 11778/ND4 clones only presented a slight respiratory chain complexes III and IV in LHON cybrids delay in the complex III assembly kinetics relative to controls It has been suggested that the mitochondrial background, (Fig. 5B, top). At 96 h after doxycycline removal, clone ND4/ in particular subclades of haplogroups J or H that harbour J1 had recovered 97% of total holocomplex III, and clone specific polymorphisms in the CYTB gene, could interact ND4/U5 85%. The main differences between these clones synergistically with the primary LHON mutations, either alter- were found in the assembly kinetics of respiratory chain ing the physical interaction between complexes I and III, or complex IV (Fig. 5B, middle). Mutant clone ND4/J1 presented stabilizing the supercomplex CI þ CIII2 (7). Some alterations no differences in the recovery kinetics of holocomplex IV, or could add a negative effect on complex I function, since it has supercomplex CIII2 þ CIV, with controls. However, the ND4/ been reported that fully assembled complex III and lately, U5 cell line showed 48 h delay in the recovery of fully complex IV, are essential for the stability of mitochondrial assembled complex IV compared with ND4/J1 and controls. complex I (27–29). For these reasons, we decided to test the Controls gained 50% of fully assembled complex IV assembly kinetics of respiratory chain complexes III and IV between 48 and 72 h after doxycycline removal, whereas in our LHON cybrids (Fig. 5). Main differences were observed clone ND4/U5 almost reached these levels at 96 h. Similarly, between the 3460/ND1 mutant clones (Fig. 5A). Although no the formation of the mitochondrial supercomplex CIII2 þ CIV real differences were found in the recovery rates between in the ND4/U5 clone paralleled the complex IV assembly time 4008 Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24 course (Fig. 5B, bottom), with 38% of the total amount of that complex I is more unstable in the LHON mutants. the supercomplex at time 96 h. Moreover, LHON cybrids characterized by different primary We next compared the ND4/J1 and ND6/J1 mutants mutations displayed clear differences in complex I recovery (Fig. 5C). No differences were found in the assembly kinetics kinetics. The 3460/ND1 mutation exerted the mildest defect, of any respiratory chain complex. whereas the 11778/ND4 and 14484/ND6 mutations hindered complex I assembly more severely. In addition to differences in complex I stability and assembly kinetics, clear differences were observed for the assembly and stability of complexes III DISCUSSION and IV among LHON mutants characterized by different The cybrids used in this study have been extensively analyzed mtDNA backgrounds. In particular, the clone harboring the as a model to investigate LHON pathophysiology, providing 11778/ND4 mutation on a haplogroup U5a background substantial evidence of complex I-dependent defects in showed, besides a strong complex I assembly defect, a respiration, ATP synthesis, and increased ROS production severe impairment of complex IV and supercomplex CIII2 þ (11,15,17–19). In the present investigation we have further CIV assembly rates. This effect can only be explained by analyzed the effect of the most common LHON mutations the presence of two mtDNA polymorphic variants affecting on the assembly or stability of native mitochondrial respiratory the COIII gene, G9477A and A9667G, (Table 1) which chain complexes, and checked whether different mitochon- could add a deleterious effect to that of the 11778/ND4 drial genetic backgrounds could affect this process. mutation. Unambiguously, the most affected clone was Our results are two-fold. First, we show that steady-state characterized by the 3460/ND1 mutation on haplogroup H12 Downloaded from levels of fully assembled complex I and other respiratory (ND1/H12), which showed a severe delay in the recovery chain complexes are not decreased in LHON mutant cybrids, rate of complexes III and IV, and consequently almost no but complex I assembly kinetics is delayed and complex I expression of mitochondrial supercomplex CIII2 þ CIV. In stability is reduced by the LHON mutations. This is illustrated contrast, the 3460/ND1 clone with a haplogroup H mtDNA by differences in the complex I assembly profile in 2D-BN/ (ND1/H ) showed normal assembly rates for complexes III http://hmg.oxfordjournals.org/ SDS gels, increased complex I turnover in the LHON and IV. These differences can be attributed to the presence mutant cells after a 6 days incubation with doxycycline, and in clone ND1/H12 of one specific non-synonymous variant differences in the recovery kinetics of respiratory chain (A14552G) affecting the complex I ND6 gene (Table 1). complex I among LHON clones. Secondly, this defect in This genetic variant, together with the 3460/ND1 LHON complex I assembly/stability is further modified by the mutation, might decrease the stability of mitochondrial respir- mtDNA haplogroup, and may be mediated by the assembly atory chain complexes and/or supercomplexes, but additional rates and stability of respiratory chain complexes III and IV. experiments are required to fully confirm this hypothesis. Thus, the present results provide the first experimental Finally, no differences in the recovery rates of respiratory evidence that certain mtDNA haplogroups, in combination chain complexes III and IV were detected between controls by guest on April 26, 2013 with the LHON pathogenic mutations, may contribute to the and clones harboring LHON mutations on haplogroup J1, severity of this disease by shifting the assembly kinetics of despite a mild delay in the formation of complex III that respiratory chain complexes. soon reached normal levels. This is a remarkable and unex- Our study also describes a useful mechanism to unveil pected result, especially when considering that one 14484/ assembly defects in patients with apparently normal respirat- ND6 clone carries an additional non-synonymous mutation ory chain enzyme activities. At first glance, the normal in ND6 (14279/ND6), which has been proposed as a primary steady-state levels of fully assembled complex I in LHON LHON mutation in a family of Russian ancestry (30). In that mutant cybrids looked as if there is no effect of LHON case, the 14279/ND6 mutation was found on a U4 mtDNA primary mutations on the formation of this complex. haplogroup. These results suggest, in contrast to what has However, a differential accumulation of complex I subassem- been previously proposed (7,8), that the combined accumu- blies in several mutants was suggestive of a complex I lation of ND and CYTB non-synonymous variants on specific assembly or stability defect. This defect was more evident in haplogroup J clades may exert a protective effect on the stab- cybrids harboring the 3460/ND1 and 11778/ND4 mutations ility of respiratory chain complexes and supercomplexes. This on H12 and U5a haplogroups, while clones harboring the may support the association of haplogroup J with successful same mutations on a different mtDNA background showed ageing (31), or reduced risk of Parkinson disease (32). normal amounts of fully assembled complex I, and a normal However, this result does not explain the increased LHON pattern of low molecular weight subcomplexes. These results penetrance of the 11778/ND4 and 14484/ND6 mutations on suggest that, in LHON cybrids, the severity of the complex certain haplogroup J backgrounds and further studies are I assembly and/or stability defect might depend on the associ- needed to properly elucidate this issue. ation of the primary LHON mutations with specific mtDNA Based on the present results on defective complex I assem- backgrounds. bly kinetics, the phenotypic severity of LHON mutations The analysis of respiratory chain complexes after a transient would increase from 3460/ND1,14484/ND6,11778/ND4. depletion of OXPHOS complexes with doxycycline further Our data agree with those obtained by others (15), who supported a decreased assembly or stability of complex I in observed a direct correlation between defects of complex the LHON mutants. Remarkably, after 6 days in the presence I-driven ATP synthesis and the clinical severity of LHON of the inhibitor all mutant cybrids presented a stronger mutations. However, considering the global recovery kinetics decrease of complex I compared with the controls, indicating of all respiratory chain complexes, the severity of the Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24 4009

LHON mutations would increase from 14484/ND6,11778/ information about the nature of mitochondrial respiratory ND4,3460/ND1. These results match the data obtained chain deficiencies, and will enhance our understanding of from the polarographic assessment of complex I activity OXPHOS disease mechanisms. defects, as well as the clinical criteria for ranking the patho- genic potential of each LHON mutation (10). In our cellular model, the 14484/ND6 cybrids presented the best global res- MATERIALS AND METHODS piratory chain assembly recovery. Accordingly, the highest Cell lines and culture conditions frequency of spontaneous visual recovery is found in LHON Cybrid cell lines were constructed using the osteosarcoma patients carrying the 14484/ND6 mutation, commonly associ- 2 ated with haplogroup J1. Thus, our results suggest that the 143B TK 206 cell line as an acceptor rho zero cell line, differences found in the assembly kinetics of respiratory and either enucleated fibroblasts from two healthy controls chain complexes III and IV amongst the mutant clones (CON/K and CON/H) and six LHON probands carrying the can be a contributing factor to the differences of disease 3460/ND1, 11778/ND4 and 14484/ND6 LHON primary expression. mutations, or platelets from two healthy controls (CON/T2 This study may also provide a further scenario for under- and CON/J1) as mitochondria donors (9). Cells were cultured standing the pathogenesis of LHON. Under regular physio- in high-glucose DMEM (Life Technologies) supplemented logical conditions, it is likely that the synthesis of with 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium respiratory chain complexes reaches a balance between pyruvate and antibiotics. To block mitochondrial translation, newly synthesized and degraded respiratory chain complexes 15 mg/ml doxycycline were added to the culture medium. Downloaded from to cope with the tissue energy demand. A possibility is that Cells were grown in exponential conditions and harvested at under certain stress conditions in which the respiratory the indicated time points. demand increases, a rapid energy supply is achieved through an increased rate of synthesis and enzyme activation of MtDNA sequencing and quantification of mtDNA respiratory chain complexes. On certain mtDNA genetic back- copy number http://hmg.oxfordjournals.org/ grounds, the primary LHON mutations may not only alter the assembly rate of respiratory chain complex I, but also affect The entire mtDNA sequences of LHON and control cybrid cell the formation of complexes III and IV. It is very likely that lines were determined and analyzed as previously reported this defective assembly adds a negative effect on complex I (7,35,36). Relative quantification of mtDNA versus nDNA stability (27–29), worsening the complex I activity defect. was performed by real-time PCR in a HT 7500 Real Time This in turn would decrease complex I-driven ATP synthesis PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) (15), and increase ROS production and apoptosis, as demon- as previously described with minor modifications (37). strated in cybrids (16–19). Conversely, when normal con- Briefly, total DNA was extracted from cultured cells with ditions are recovered, restoration of respiratory chain the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, by guest on April 26, 2013 complexes would lead to normal respiratory chain activities Germany). For each sample, mtDNA and nDNA were quanti- and ATP synthesis. Our data plead in favor of a spontaneous fied in the same reaction tube. MtDNA detection was per- visual recovery in those LHON patients in whom the RGCs formed by one set of primers (forward primer: 50-CCA CGG degeneration prompted by a lack of energy has not yet GAA ACA GCA GTG ATT-30, reverse primer: 50-CTA reached a critical threshold (10). In agreement, allotopic TTG ACT TGG GTT AAT CGT GTG A-30) and FAM-labeled expression of nuclear-re-coded ND4 using a recombinant TaqMan probe (50-FAM-TGC CAG CCA CCG CG-MGB-30) adenovirus-based vector led to a partial rescue of the mito- targeted to 12S ribosomal gene of mtDNA. For nDNA detec- chondrial OXPHOS deficiency caused by the G11778A tion, a kit including a TaqMan VIC-labeled probe for the mutation in the cybrid model (33). RNAse P nuclear gene was used (Human RNAse P PDAR; Although mtDNA haplogroups have been previously Applied Biosystems). Thermal cycler conditions were as suggested to contribute in disease predisposition, possibly by follows: 508C for 2 min, 958C for 10 min, and 40 cycles of modulating ROS production as recently shown in mouse 958C for 15 s and 608C for 1 min. All samples were tested cells (34), our current study demonstrates that biochemical in duplicate at two levels of DNA concentration. The relative differences in OXPHOS assembly kinetics could be an quantification of mtDNA versus nDNA was calculated by additional contributing factor. Still key features of LHON using a calibration curve consisting of serial dilutions of a such as the incomplete penetrance of LHON mutations, male stock solution made up of plasmids constructs with mtDNA prevalence, tissue specificity to RGCs, and the mitochondrial 12S and RNAse fragments inserts. The mtDNA copy bioenergetics and dynamics in neurons cannot be fully number was determined by division of the total DNA concen- explained by the mtDNA genetic background. Thus, the puta- tration by the weight of each plasmid molecule. tive role of nuclear modifying genes or epigenetic/environ- mental factors in the pathogenesis of LHON requires further investigation. In this regard, the influence that different Mitochondria preparation nuclear genetic backgrounds may exert on further modulating Mitochondrial membranes were isolated from cell cultures, as the assembly kinetics of the respiratory chain complexes in previously described with minor modifications (38). Briefly, LHON cybrids with the same mtDNA background will cybrid clones were cultured until cells were 70% confluent. aid future studies. The upcoming results on the assembly Cells were harvested with trypsin, washed twice with kinetics of respiratory chain complexes will provide essential phosphate-buffered saline (PBS), and re-suspended in 100 ml 4010 Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 24

PBS plus 100 ml of digitonin solution (4 mg/ml). The cell sol- Investigacio´n Me´dica Mutua Madrilen˜a to M.A.M. ution was kept on ice for 10 min to dissolve the membranes. (2005-069). One milliliter of cold PBS was added to the cells, which were spun for 10 min at 10 000 r.p.m. at 48C. The supernatant was removed, the pellet washed one more time in 1 ml cold ACKNOWLEDGEMENTS PBS, and the protein concentration was determined using the We thank Dr A. Garcı´a-Redondo, A. Bla´zquez and A. Delmiro MicroBCA protein assay kit (Pierce). For the preparation of for useful discussions and technical support. native mitochondrial complexes, pellets were solubilized in 100 ml buffer containing 1.5 M aminocaproic acid, 50 mM Conflict of Interest statement. None of the coauthors of the Bis–Tris, pH 7.0. Next, 2% (w/v) n-dodecyl b-D-maltoside present manuscript have any financial interests or connections, was added and the cells were incubated on ice for 10 min. direct or indirect, or other situations that might raise the ques- After centrifugation for 30 min at 13 000 r.p.m. at 48C, the tion of bias in the work reported or the conclusions, impli- supernatant was combined with 10 ml of sample buffer cations, or opinions stated – including pertinent commercial (750 mM aminocaproic acid, 50 mM Bis–Tris, 0.5 mM or other sources of funding for the individual author(s) or EDTA, 5% Serva Blue G-250) prior to loading. for the associated department(s) or organization(s), personal relationships, or direct academic competition. Blue native electrophoresis and IGA assays Downloaded from Blue native 5–15% gradient gels were loaded with 40 mgof REFERENCES mitochondrial protein using 50 mM Bis–Tris as an anode 1. Riordan-Eva, P., Sanders, M.D., Govan, G.G., Sweeney, M.G., Da Costa, J. buffer and 15 mM Bis–Tris/50 mM tricine containing 0.02% and Harding, A.E. (1995) The clinical features of Leber’s hereditary optic Serva Blue G-250 as a cathode buffer. After electrophoresis, neuropathy defined by the presence of a pathogenic mitochondrial DNA w proteins were transferred to a PROTAN nitrocellulose mem- mutation. Brain, 118, 319–337. brane (Schleicher & Schuell) at 25 V, overnight, and probed 2. Harding, A.E., Sweeney, M.G., Govan, G.G. and Riordan-Eva, P. (1995) http://hmg.oxfordjournals.org/ with specific antibodies. Duplicate gels were further processed Pedigree analysis in Leber hereditary optic neuropathy families with a pathogenic mtDNA mutation. Am. J. Hum. Genet., 57, 77–86. for second dimension 10% SDS–PAGE following previously 3. Wallace, D.C., Singh, G., Lott, M.T., Hodge, J.A., Schurr, T.G., Lezza, A.M., described methods. (38). Elsas, L.J. and Nikoskelainen, E.K. (1988) Mitochondrial DNA mutation For complex I IGA assay, gels were incubated for 2 h at associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science, 242,1427– room temperature with the following solutions: 2 mM Tris– 1430. HCl, pH 7.4, 0.1 mg/ml NADH, and 2.5 mg/ml NTB (nitrote- 4. Brown, M.D., Sun, F. and Wallace, D.C. (1997) Clustering of Caucasian Leber hereditary optic neuropathy patients containing the 11778 or 14484 trazolium blue). Gels were washed in distilled water, scanned mutations on an mtDNA lineage. Am. J. Hum. Genet., 60, 381–387. and photographed immediately. 5. Hofmann, S., Jaksch, M., Bezold, R., Mertens, S., Aholt, S., Paprotta, A.

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Mari Carmen Gil Borlado1., David Moreno Lastres1,2., Maritza Gonzalez Hoyuela1., Maria Moran1,2, Alberto Blazquez1,2, Rosa Pello1, Lorena Marin Buera1,2, Toni Gabaldon3, Juan Jose Garcia Pen˜ as4, Miguel A. Martı´n1,2, Joaquin Arenas1,2, Cristina Ugalde1,2* 1 Centro de Investigacio´n, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid, Spain, 2 Centro de Investigacio´n Biome´dica en Red de Enfermedades Raras-CIBERER, U723, Madrid, Spain, 3 Centre for Genomic Regulation-CRG, Barcelona, Spain, 4 Servicio de Neurologı´a, Hospital Universitario Nin˜o Jesu´s, Madrid, Spain

Abstract

Background: In recent years clinical evidence has emphasized the importance of the mtDNA genetic background that hosts a primary pathogenic mutation in the clinical expression of mitochondrial disorders, but little experimental confirmation has been provided. We have analyzed the pathogenic role of a novel homoplasmic mutation (m.15533 A.G) in the cytochrome b (MT-CYB) gene in a patient presenting with lactic acidosis, seizures, mild mental delay, and behaviour abnormalities.

Methodology: Spectrophotometric analyses of the respiratory chain enzyme activities were performed in different tissues, the whole muscle mitochondrial DNA of the patient was sequenced, and the novel mutation was confirmed by PCR-RFLP. Transmitochondrial cybrids were constructed to confirm the pathogenicity of the mutation, and assembly/stability studies were carried out in fibroblasts and cybrids by means of mitochondrial translation inhibition in combination with blue native gel electrophoresis.

Principal Findings: Biochemical analyses revealed a decrease in respiratory chain complex III activity in patient’s skeletal muscle, and a combined enzyme defect of complexes III and IV in fibroblasts. Mutant transmitochondrial cybrids restored normal enzyme activities and steady-state protein levels, the mutation was mildly conserved along evolution, and the proband’s mother and maternal aunt, both clinically unaffected, also harboured the homoplasmic mutation. These data suggested a nuclear genetic origin of the disease. However, by forcing the de novo functioning of the OXPHOS system, a severe delay in the biogenesis of the respiratory chain complexes was observed in the mutants, which demonstrated a direct functional effect of the mitochondrial genetic background.

Conclusions: Our results point to possible pitfalls in the detection of pathogenic mitochondrial mutations, and highlight the role of the genetic mtDNA background in the development of mitochondrial disorders.

Citation: Gil Borlado MC, Moreno Lastres D, Gonzalez Hoyuela M, Moran M, Blazquez A, et al. (2010) Impact of the Mitochondrial Genetic Background in Complex III Deficiency. PLoS ONE 5(9): e12801. doi:10.1371/journal.pone.0012801 Editor: Alejandro Lucia, Universidad Europea de Madrid, Spain Received May 19, 2010; Accepted August 20, 2010; Published September 17, 2010 Copyright: ß 2010 Gil Borlado et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: This study was partially supported by Fundacion de Investigacion Biomedica del Hospital Universitario 12 de Octubre/Agencia Pedro Lain Entralgo, and Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) to C.U. (grant numbers PI05-0379 and PI08-0021), and to M.A.M. (PI09-01359). T.G. was supported by grants from the ISCIII (PI06- 0213) and the Spanish Ministry of Science (MICINN) (BFU2009-09168). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * E-mail: [email protected] . These authors contributed equally to this work.

Introduction tute a major cause of complex III deficiency, and underlie a wide range of neuromuscular disorders [4]. These include mitochon- Mitochondrial complex III (CIII, ubiquinol-cytochrome c drial encephalomyopathy [5], hypertrophic or histiocytoid cardio- reductase or cytochrome bc1 complex, E.C.1.10.2.2) is a multi- myopathy [6,7], or sporadic mitochondrial myopathy, where protein enzyme complex that catalyzes the transfer of electrons exercise intolerance is the predominant symptom [8]. Additional from reduced coenzyme Q to cytochrome c, with a concomitant features include blood acidosis, muscle weakness or myoglobin- translocation of protons across the inner mitochondrial membrane uria. Defects in MT-CYB are also documented in patients with [1]. The purified bovine complex is a symmetric homodimer with multisystem disorders in cases of exercise intolerance accompanied a combined molecular mass of ,450 kDa [2,3]. Each monomer is by deafness, mental retardation, retinitis pigmentosa, cataract, composed of 11 subunits, of which ten are encoded in the nucleus growth retardation, and epilepsy [9,10]. Mutations in MT-CYB and one (cytochrome b) in the mitochondrial genome. Respiratory have also been associated with Leber hereditary optic neuropathy chain complex III deficiency [MIM 124000] is a relatively rare (LHON) [MIM: 535000], a maternally inherited disease resulting cause of mitochondrial dysfunction. Mitochondrial DNA in acute or subacute loss of central vision due to optic nerve (mtDNA) mutations in the cytochrome b (MT-CYB) gene consti- degeneration [11].

PLoS ONE | www.plosone.org 1 September 2010 | Volume 5 | Issue 9 | e12801 Pathogenic Role of mtDNA

When a new mutation is detected in the mtDNA of a patient of the peripheral area of atrium as a consequence of myelination with a mitochondrial defect, a strict association between the delay. At the age of six he presented with developmental delay mutation and the cellular dysfunction must be established before affecting his speech skills, which started to be treated by language assuming pathogenicity. Although many mutations in mitochon- therapy. He also developed behaviour disturbances and a drial tRNA genes and coding regions have been shown to cause functional clubfoot. Brain MRI and MR spectroscopy were diseases, the high rate of evolution of mtDNA creates many new normal. At present, at age nine years, he has a mild mental and polymorphic sites. For this reason, a number of useful criteria have developmental delay, functional clubfoot, cognitive abnormalities, been proposed in order to avoid the mistake of incorrect attention difficulties and hyperactivity, initiating treatment with assignment of pathogenicity to a mutation [12]. These criteria methylphenidate. His parents and a maternal aunt were all generally include the following aspects: i) the mutation should be asymptomatic. His mother suffered a previous miscarriage at two preferably found in heteroplasmic state; ii) there should be a strong months of gestation. A maternal aunt was referred to die at two association between heteroplasmic levels, clinical symptoms, months of age from an unknown disease. biochemical data, and family history; iii) the mutation should be highly conserved among species; and iv) transmitochondrial Cell Cultures cybrids should not restore the cellular and biochemical defects in Fibroblasts were obtained from skin biopsies and cultured in mitochondrial function found in the original tissue; when a DMEM medium (Life Technologies) supplemented with 10% defective mitochondrial function is maintained in cybrid cells foetal calf serum (FCS) and 100 IU/ml penicillin and 100 IU/ml bearing mutated mtDNA, it is generally assumed that the streptomycin. Transmitochondrial cybrids were obtained by fusion mutation is likely to be a pathogenic cause of disease. Additionally, of 143B206 TK- rho zero cells with control or patient-derived in recent years a number of studies emphasize the importance of enucleated fibroblasts or platelets as previously described [14]. To the mtDNA genetic background that hosts a primary pathogenic block mitochondrial translation, 15 mg/ml doxycycline were mutation in the clinical expression of mitochondrial disorders. The added to the culture medium. Cells were grown in exponential clearest example is the preferential association of the Eurasian conditions and harvested at the indicated time points. haplogroup J with the 11778/ND4 and 14484/ND6 LHON pathogenic mutations [13]. Enzyme activities of mitochondrial respiratory chain In this work we report a complex III-deficient patient with early- complexes onset metabolic acidosis and seizures, who harboured a novel m.15533 A.G homoplasmic mutation in the MT-CYB gene. Mitochondrial respiratory chain enzyme activities were mea- Although this genetic variant did not easily fulfil the pathogenicity sured in muscle (quadriceps muscle biopsy), skin fibroblasts, and criteria for mtDNA mutations, by forcing the de novo functioning of cybrids as described before [15], and expressed relative to the the OXPHOS system in mutant transmitochondrial cybrids we have citrate synthase activity in muscle, and as their specific activities in demonstrated a direct functional effect of the mtDNA genetic fibroblasts and cybrids (Table 1). background on the biogenesis of the mitochondrial respiratory chain. Genetic analyses Materials and Methods Total DNA was extracted from blood, muscle, fibroblasts and cybrids by standard methods. The whole mitochondrial DNA Ethics Statement (mtDNA) from patient’s muscle was sequenced by SECUGEN S.L. This study was approved by the institutional ethics committee (Madrid, Spain). The complete mtDNA was amplified from total (Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid, Spain), and was in DNA in 24 overlapping 800–1,000 bp-long polymerase chain accordance with the Declaration of Helsinki for Human Research. reaction (PCR) fragments. The PCR fragments were sequenced in The patient’s mother has given written informed consent (as both strands in an ABI 3730 sequencer using a BigDye v3.1 outlined in the PLoS consent form) to publication of the case sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), and were details. compared with the revised Cambridge reference sequence, CRS [16] (Table 2). Discrepancies were analyzed in the human mitochondrial Case Report genome databases MITOMAP (www.mitomap.org), mtDB (www. The proband was a male born to non-consanguineous parents, genpat.uu.se/mtDB/), and GiiB-JST mtSNP (http://mtsnp.tmig.or. delivered at full term by caesarean after an uneventful pregnancy. jp/mtsnp/index_e.shtml). To quantify the heteroplasmy levels of the At age 23 days he presented with abnormal movements of his m.15533 A.G mutation, PCR-restriction fragment length polymor- arms, and generalized hypertonia. He also showed central cyanosis phism (RFLP) analysis was performed in the proband’s family using with episodes of apnea that required intubation and mechanical the following primers: 59-CACTATTCTCACCAGACCTC-39, ventilation for twelve days, and a convulsive status with tonic- (forward) and 59-ACGCCTCCTAGTTTGTTAGG-39 (reverse), clonic seizures, which were recurrent during the following two and digestion with the restriction enzyme DdeI (New England Biolabs). days. After treatment with antiepileptic drugs, the paroxysmal Two hundred healthy control subjects of Spanish background movements finally remitted. Brain computerized tomography obtained from the Blood Bank of our Institution were screened to scans and brain ultrasonography revealed no abnormalities. rule out the presence of mutations in the healthy population. Laboratory examinations revealed persistent metabolic acidosis Additionally, sequencing ruled out mutations in the coding that was treated with bicarbonate, elevated anion gap, and regions of the following complex III nuclear genes: CYC1, moderate increase of resting plasma lactate (3.4 mmol/L; normal UQCRFS1, UQCRQ, UQCRH, UCRC, and BCS1L. ,2). At age two years a muscle biopsy was taken, which showed a single mitochondrial respiratory chain complex III defect. Other Bioinformatic analyses studies discarded pyruvate decarboxylase deficiency and organic Cytochrome b protein sequences from diverse vertebrate species acidemia. At three years of age brain magnetic resonance imaging were downloaded from Uniprot (The Uniprot Consortium, (MRI) displayed small abnormal signals in both thalami, and 2010)[17][17], and aligned with MUSCLE v3.2 [18]. The diffuse hypersignals in T2-weighted sequence in the white matter potential effect of the N263D and N260D mutations was evaluated

PLoS ONE | www.plosone.org 2 September 2010 | Volume 5 | Issue 9 | e12801 Pathogenic Role of mtDNA

Table 1. Residual enzyme activities of mitochondrial respiratory chain complexes in different tissues from the index patient.

Muscle* Fibroblasts** Cybrids**

Control Range Control Range Mutants Mean Control Range Patient (n = 100) Patient (n = 9) (n = 6) (n = 5)

CI 17,1 10–30 35,1 26–50 10 4–17 CII 16,3 4,5–17,4 10 10–17 12 11–27 CI+CIII 14,5 8.5–26 122 223–750 37 32–96 CII+CIII nd - 2,7 4,4–18,5 2,8 2,6–7,3 CIII 14,6 28–98 15,1 29–87 74 13–71 CIV 22,7 16–80 15,2 49–128 39 20–36 CS 194 78–250 61 60–160 142 108–175

Enzyme activities are expressed as *cU/U citrate synthase (CS) and **nmol.min21.mg prot21. CS activity is expressed as mU/mg protein. Abnormal values are indicated in bold. nd, not determined. Complex I, CI; Complex II, CII; Complex III, CIII; Complex IV, CIV. doi:10.1371/journal.pone.0012801.t001 by homology modelling of the mutated sequences using the 3D the lowest control value), and a combined deficiency of complexes structure of bovine complex III stored in PDB (1NTM) as a III and IV in fibroblasts (52% and 31% of the lowest control template. Modelling was performed at the Swiss model server [19]. values respectively) (Table 1). Sequencing of the entire mitochon- 3D models were visualized using Chimera [20]. drial genome in patient’s muscle enabled easy identification of haplogroup-specific polymorphisms and novel private substitutions Quantification of the mtDNA copy number (Table 2), and confirmed that the patient belonged to the Relative quantification of mtDNA versus nuclear DNA (nDNA) European haplogroup H2 (GenBank sequence accession number was performed by real-time PCR in a HT 7500 Real Time PCR HM046248). Comparison of the sequence with the revised System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) as previously Cambridge reference sequence (rCRS) revealed 12 synonymous described [21], except that the forward primer used for mtDNA substitutions, 5 non-synonymous substitutions, and 19 substitutions amplification was: 59-CCA CGG GAA ACA GCA GTG AT-39. either in mitochondrial rRNAs, tRNAs or in the mtDNA D-loop Results were presented as mean 6SD values. region. One missense mutation in MT-CYB (m.15533A.G) was not previously reported in the mtDNA sequence databases, and it Mitochondrial Protein Isolation and Blue Native Analysis was not detected in 200 ethnically-matched controls (Figure 1A). Blue native methods were performed as previously described The relative mutant load for this new nucleotide variant was [21]. Primary antibodies (Molecular Probes) were raised against measured by PCR-RFLP analysis in blood (not shown), muscle the complex I NDUFS3 and NDUFA9 subunits, complex III and fibroblasts of the patient (Figure 1B), and showed homo- core2 protein, complex IV COX2 and COX5A subunits, and plasmic levels of the mutation in all tissues. DdeI-RFLP analysis complex II SDHA subunit. Peroxidase-conjugated anti-mouse IgG also showed that the MT-CYB mutation was homoplasmic in was used as secondary antibody (Molecular Probes). The signal blood from the proband’s mother and maternal aunt, both was detected with ECLH plus (Amersham Biosciences). clinically unaffected (not shown). To discriminate between a nuclear or mitochondrial origin of Results the disease, transmitochondrial cybrids were constructed by transferring mitochondria from patient’s fibroblasts into Genetic and biochemical analyses of the MT-CYB 143B206 TK- rho zero (ru) cells, which lack mtDNA. Ten m.15533A.G mutation independent cybrid clones retained homoplasmic loads of the Mitochondrial respiratory chain enzyme activities showed a m.15533A.G mutation (Figure 1B). The enzyme activities of all single complex III defect in the patient’s skeletal muscle (52% of respiratory chain complexes were normal in six independent

Table 2. Haplogroup affiliation and non-synonymous nucleotide changes of the mtDNA sequence from the index patient.

Non-synonymous polymorphisms Genbank ID HAPLOGROUP relative to rCRSa Amino acid Change

HM046248 H2 A8860G (ATP6)Thr.Ala G9477A (CO3)Val.Ile C14766T (CYB)Thr.Ile A15326G (CYB)Thr.Ala A15533G (CYB)Asn.Asp

arCRS refers to the revised Cambridge reference sequence [16], which belongs to haplogroup H2a. doi:10.1371/journal.pone.0012801.t002

PLoS ONE | www.plosone.org 3 September 2010 | Volume 5 | Issue 9 | e12801 Pathogenic Role of mtDNA

Figure 1. Genetic and structural analysis of the m.15533A.G mutation. (A) Electropherogram showing the nucleotide change in patient’s muscle DNA, indicated by arrowheads. (B) PCR-RFLP analysis of the MT-CYB mutation. Uncut (wild-type) DNA consists of a 150 bp PCR product. The mutated sequence contains one DdeI restriction site that results in two products of 90 and 60 bp after digestion. The control sequence contains one MseI restriction site that results in the same two products after digestion. C, wild-type control; F, proband’s fibroblasts DNA; M, proband’s muscle DNA; Cy, control cybrid; 1, 2 and 3 refer to three independent mutant cybrid clones. (C) Alignment of cytochrome b amino acid sequences from selected species. Asparagine at amino acid position 263 is indicated with an arrow. (D) Partial 3D-images of the cytochrome b protein. The left panel shows the interaction site between the asparagine 263 (indicated in red) of cytochrome b and the aspartate 2 of the cytochrome c1 subunit (coloured in green). This is the closest negatively charged side-chain of cytochrome c1, which is facing the same aqueous pocket at a distance of 11.25 Armstrongs. Asparagine at position 260 of cytochrome b is indicated in blue. The central panel shows the 3D-structure of the asparagine 263 (in blue) in controls. The right panel shows the predicted structural effect of the N263D substitution (in red) in the patient. The images were obtained using the Chimera software [20]. doi:10.1371/journal.pone.0012801.g001

PLoS ONE | www.plosone.org 4 September 2010 | Volume 5 | Issue 9 | e12801 Pathogenic Role of mtDNA mutant clones (Table 1), which would in principle indicate that the main genetic defect should be located in the nuclear genome.

Features of the MT-CYB m.15533A.G mutation The m.15533A.G transition changes an asparagine into aspartate at amino acid residue 263, within an amino acid stretch relatively conserved amongst mammals, but not further on in evolution (Figure 1C). Based on its crystal structure [2,3], the cytochrome b subunit consists of eight intramembrane spanning domains (helixes A–H). Asn 263 is located between the E–F transmembrane helixes, within the second half of loop ef of cytochrome b, in close contact with functional domains of the RISP and cytochrome c1 subunits. The N263D amino acid substitution would exchange a positive for a negative charge within this region, possibly affecting the interaction between cytochrome Figure 2. BN-PAGE analysis of mitochondrial respiratory chain b and the RISP and cytochrome c1 subunits (Figure 1D). These complexes in control and mutant fibroblasts and cybrids. findings suggested that the N263D mutation could have an effect Mitochondrial particles were isolated as described in Methods and on the structural integrity of mitochondrial respiratory chain 40 mg of protein were analyzed on a 5–15% BN-polyacrylamide gel for complex III. However, a structural analysis of the N263D the separation of multisubunit complexes. Western-blot analysis was substitution only predicted a mild effect on the interaction performed using antibodies against the indicated OXPHOS subunits. CI, fully-assembled complex I. CIII , complex III dimer. CIV, complex IV. between complex III subunits. As shown in Figure 1D, residue 2 CIII2+IV indicates the presence of the supercomplex containing 263 (shown as red or yellow residues on the pink-coloured chain) is complexes III and IV. C1 and C2, control fibroblasts. P, patient’s facing an aqueous pocket, and the distances to the closest residues fibroblasts. C, control cybrid. Two independent mutant cybrids are of cytochrome c1 (coloured in green) are larger than 7 Armstrongs. indicated as #1 and #2. Several other charged residues, an arginine and three aspartates, doi:10.1371/journal.pone.0012801.g002 are present at close distances, suggesting that the relative charge introduced by the mutation is not large. A similar asparagine to untreated cells (which correspond to the steady-state expression aspartate substitution at amino acid position 260 of cytochrome b levels), and calculated the average numerical values for the (shown in blue in the figure) was previously reported as a restoration curves of the respiratory complexes in control and polymorphism [22]. The side chain of this residue is facing the mutant cybrids (Figure 3C). A significant delay in the recovery same aqueous pocket in a very close position to that of 263. kinetics of respiratory chain complexes I, III and IV was observed Altogether, these data do not plead in favour to consider the in the two independent mutant cybrids relative to two controls of N263D as a true pathogenic mutation. the same haplogroup (Figure 3C). The mtDNA copy number was calculated for control and Normal steady-state levels of respiratory chain mutant cybrids in order to exclude the possibility that the complexes in MT-CYB mutant cells differences observed in the assembly kinetics of respiratory chain To analyze the respiratory chain content in digitonin-extracted complexes could be due to variations in the mtDNA content. No mitochondria from patient’s fibroblasts and cybrids, 1D-BN- significant differences were found in the mtDNA/nDNA ratio PAGE analysis was combined with complex I in-gel activity assay between the controls (292635) and the mutants (289638) and western blot with antibodies raised against specific OXPHOS belonging to haplogroup H. Taken as a whole, our results subunits (Figure 2). In patient’s fibroblasts low steady-state levels of demonstrate a functional effect of the mtDNA genetic background respiratory chain complexes III and IV were observed, suggesting of the mutant clones in the assembly kinetics of respiratory chain an impaired assembly/stability defect. Consequently, decreased complexes. enzyme activities of these complexes were found in this tissue (Table 1). As expected from their restored enzyme activities, the Discussion mutant cybrids displayed normal steady-state levels of respiratory In this work we have shown the pathogenic role of the novel chain complexes relative to the controls. m.15533A.G genetic variant in the MT-CYB gene in a patient with metabolic acidosis and hyperlactacidemia, seizures, mild Delayed assembly kinetics of respiratory chain complexes mental delay, behaviour disturbances and a single enzyme defect in mutant cybrids of mitochondrial respiratory chain complex III. Based on the Next, we reversibly blocked for 6 days mitochondrial protein current standard pathogenicity criteria for mtDNA mutations, the translation with doxycycline, thus depleting the cells of OXPHOS mutation would have been easily excluded as potentially complexes that contained mitochondrial-encoded subunits [23]. deleterious. Our patient harboured the mutation in homoplasmic After the release of drug inhibition, mitochondrial translation state, as did his clinically unaffected mother and maternal aunt. resumed and the assembly of newly-synthesized mitochondrial The mutation was not highly conserved along evolution and the complexes was investigated by collecting cells at different time predicted structural data did not plead in favour of a deleterious points (0, 6, 15, 24, 48, 72, and 96 hours). Digitonin-isolated effect of the N263D substitution on the structure of cytochrome b. mitochondria were analyzed by BN-PAGE electrophoresis in Although he showed defective respiratory chain enzyme activities combination with in-gel activity assays (Figure 3A) or Western-blot and protein levels in muscle and cultured fibroblasts grown in using antibodies against subunits from different OXPHOS exponential conditions, these respiratory chain enzyme activities complexes (Figure 3B). The signals obtained from the Western- and assembly defects were restored to normal in transmitochon- blots were quantified, normalized for the expression levels of drial cybrids harbouring the homoplasmic m.15533A.G muta- mitochondrial complex II, expressed as a percentage of the tion, when these cells were grown in a favourable glucose-

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Figure 3. Assembly kinetics of respiratory chain complexes in control and mutant cybrids. Two different control cybrids belonging to haplogroup H, and two independent MT-CYB mutant clones were treated for 6 days with doxycycline (an inhibitor of mitochondrial translation), the

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medium was replaced by doxycycline-free medium and cells were collected at 0, 6, 15, 24, 48, 72, and 96 hours (indicated as t0–t16). SS indicates the steady-state expression levels of the respiratory chain complexes (A) Example of one control and one mutant clone. 40 mg of crude mitochondrial pellets were analyzed by BN-PAGE in combination with complex I and complex IV-IGA assays. (B) Duplicate gels were blotted and incubated with antibodies against the NDUFA9 complex I subunit, complex III core2 protein, complex IV COX5A subunit and complex II SDHA subunit. (C) The signals from the blots were quantified, expressed as percentage of the untreated cells (SS), normalized with the complex II SDHA subunit and plotted. The restoration curves constitute the mean values 6 SD obtained from the two controls and the two independent mutant cybrids. Upper left panel, complex I assembly rates. Upper right panel, complex III assembly rates. Lower left panel, complex IV assembly rates. Lower right panel, supercomplex CIII2+IV assembly kinetics. doi:10.1371/journal.pone.0012801.g003 containing medium under no stress conditions. Only when the [29,30], it suggests the requirement of additional contributors to mutant cybrids were forced to the de novo building up and the clinical manifestations of the disease. For instance, most functioning of the OXPHOS system by treating the cells with patients with LHON disease carry homoplasmic mtDNA doxycycline, we were able to observe a drastic functional effect of mutations. Although all offspring inherit the mutation, often only the mtDNA genetic background on the assembly kinetics of the some family members will develop the disease [30], which respiratory chain complexes. emphasizes the importance of nuclear genetic, epigenetic or Similar observations were previously made by our group in environmental factors as phenotypical modulators of mitochon- cybrid cell lines bearing the three classical homoplasmic LHON drial disorders. mutations [21]. These cells neither showed respiratory chain In general, the mutations that have the most deleterious effect enzyme defects nor decreased steady-state levels of OXPHOS on mitochondrial function will cause obvious clinical phenotypes. complexes, but displayed differentially-delayed assembly rates of The m.3243A.G mutation, for example, usually causes a respiratory chain complexes I, III, and IV amongst mutants devastating multisystem disease and fulfils all the criteria for belonging to different mtDNA haplogroups. Likewise, the mtDNA pathogenicity [31]. The problems may arise when a mutation genetic background was recently shown to play an important role causes disease only in the presence of an additional factor, or when in modulating the bioenergetics and biochemical defects in cybrids it only causes a mild clinical phenotype as it occurs in our patient. bearing the ATP6 NARP/MILS mutation [24]. This is in In these cases the ‘conventional’ criteria might not be applicable, agreement with the proposed effect on protein function of single and deeper functional tests should be performed in cybrid cell lines nucleotide polymorphisms (SNPs) that are located in the coding that harbour the mutation of interest, including i.e. oxygen region, which could affect protein stability, ligand binding, consumption and mitochondrial protein synthesis analyses, or de catalysis, allosteric regulation and post-translational modifications novo restoration of enzyme activities and assembly of the various [25]. Basal differences in OXPHOS capacities such as mitochon- components of the oxidative phosphorylation system. In this sense drial transcription and replication, protein synthesis, and bioen- our study describes a useful mechanism to unveil potentially ergetics have recently been demonstrated in control cybrids from deleterious mutations in patients with signs of mitochondrial different mtDNA haplogroups [26,27]. These results reveal that disease but apparently normal respiratory chain enzyme activities. specific mtDNA polymorphisms may modify the pathogenic Besides, our results point to possible pitfalls in the detection of potential of mtDNA mutations by affecting the overall biogenesis pathogenic mitochondrial mutations, and highlight the potentially and function of the OXPHOS complexes. important effects of the genetic mtDNA background in the In our MT-CYB mutant cybrids, the m.15533A.G mutation development of mitochondrial disorders, which should be taken most likely hampers the proper assembly of respiratory chain complex III, which would further affect the formation of complex I into account when defining the pathogenicity criteria for mtDNA [28]. In addition, the mutant clones showed, besides strong mutations. complex I and complex III assembly defects, a severe impairment Acknowledgments of complex IV and supercomplex CIII2+CIV assembly rates. This effect could be explained by the presence of two mtDNA Authors want to acknowledge Dr. Eduardo Ruiz Pesini for his kind gift of polymorphisms in the MT-CO3 and MT-ATP6 genes, G9477A the control cybrid clones, and Pilar del Hoyo for her excellent technical and A8860G respectively, plus two additional mtDNA polymor- support. phic variants in the MT-CYB gene, C14766T and A15326G, (Table 2) which could add a deleterious effect to that caused by the Author Contributions m.15533A.G mutation. Our results, however, do not explain the differences in the clinical expression of the m.15533A.G Conceived and designed the experiments: TG CU. Performed the experiments: MCGB DML MGH MM AB RP LMB. Analyzed the data: mutation among members of the proband’s family. Although MM TG JJGP MM JA CU. Contributed reagents/materials/analysis tools: reduced penetrance is a relatively common feature of homo- MM JA CU. Wrote the paper: CU. plasmic mtDNA mutations leading to mitochondrial disorders

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