Tese De Doutorado

UFG UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS IQ INSTITUTO DE QUÍMICA

P E R E I R A INFLUÊNCIA DE FATORES EDÁFICOS NA COMPOSIÇÃO

QUÍMICA DE CASCAS E SEMENTES DE JABUTICABA D I (Myrciaria cauliflora) A S

L U C I A N E LUCIANE DIAS PEREIRA

ORIENTADOR: PROF. DRA. SUZANA DA COSTA SANTOS

TESE DE DOUTORADO

2016 GOIÂNIA- 2016

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), regulamentada pela Resolução CEPEC nº 832/2007, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [x] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação

Nome completo do autor: Luciane Dias Pereira

Título do trabalho: Influência de fatores edáficos na composição química de cascas e sementes de jabuticaba (Myrciaria cauliflora).

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Data: 26 / 08 / 16 Assinatura do (a) autor (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE DOUTORADO EM QUÍMICA

INFLUÊNCIA DE FATORES EDÁFICOS NA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE CASCAS E SEMENTES DE JABUTICABA (Myrciaria cauliflora)

LUCIANE DIAS PEREIRA

Tese apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás como exigência parcial, para obtenção do título de Doutora em Química. Área de concentração: Química de Produtos Naturais.

Orientadora: Dra. Suzana da Costa Santos Co-orientador: Dr. Diego Palmiro Ramirez Ascheri

Goiânia 2016 i

iii

Aos meus pais pela educação que me deram. Ao meu marido pelo apoio e compreensão. As minhas irmãs e minha filha.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramento a Deus, pela minha vida e por ter me dado a oportunidade de realizar e concretizar esta conquista.

Aos meus pais Joaquim (in memorium) e Neli, minhas irmãs Viviane e Rejane, e meus sobrinhos pelo amor e apoio em todos os momentos da minha vida. Ao meu esposo Cristiano, pelo companheirismo, amizade e incentivo aos meus estudos e por estar sempre ao meu lado e acreditar em mim.

Agradeço de maneira especial, à minha orientadora, Profa. Dra. Suzana, pela oportunidade de realizar este trabalho, pelos ensinamentos, pelo apoio, incentivo e dedicação.

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Diego, da Universidade Estadual de Goiás pelos ensinamentos durante realização das análises.

Agradeço ao Prof. Dr. Pedro Henrique pelas contribuições dadas no trabalho.

Aos meus amigos da pós-graduação, Gilmara, Ruver e Deomar que me acompanharam e me ajudaram durante estes anos de estudo.

À Fazenda Jabuticabal pela gentileza em oferecer as amostras para realização das análises.

Ao Instituto Federal de Goiás, Câmpus Anápolis, pela licença concedida para finalização deste trabalho. À Fapeg e ao CNPq pelo incentivo financeiro.

SUMÁRIO

Página LISTA DE FIGURAS viii LISTA DE TABELAS xi LISTA DE ABREVIATURAS xiii RESUMO xv ABSTRACT xivi

INTRODUÇÃO 1 1. Generalidades sobre a Jabuticaba 1 2. Composição nutricional 2 3. Compostos fenólicos 3 3.1. Flavonoides 4 3.2. Taninos 5 4. Aplicações medicinais 5 5. Relação entre solo e constituintes químicos do metabolismo secundário 7 6. Otimização da extração de constituintes bioativos 8 OBJETIVOS 10

CAPÍTULO 1 Isolamento e identificação de compostos fenólicos de 11 cascas e sementes da jabuticaba (Myrciaria cauliflora) 1. OBJETIVOS 11 2. MATERIAIS E MÉTODOS 11 2.1. Material vegetal 11 2.2. Preparação dos extratos brutos 11 2.3. Fracionamento por partição entre solventes 11 2.4. Fracionamento e isolamento dos compostos por cromatografia em coluna 12 2.4.1. Fração solúvel em metanol das sementes 12 2.4.2. Fração acetato de etila das sementes 13 2.4.3. Fração solúvel em metanol das cascas 13 2.4.4. Fração acetato de etila das cascas 13 2.5. Análise espectroscópica das substâncias puras e misturas 16 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 16 3.1. Extração e fracionamento da sub-frações das cascas e sementes 16 3.2. Caracterização espectroscópica dos compostos isolados e identificados 17 vi

3.2.1. Caracterização do composto Mc1: pedunculagina 17 3.2.2. Caracterização do composto Mc2: alnusiina 18 3.2.3. Caracterização do composto Mc3: cauliflorina 22 3.2.4. Caracterização da mistura Mc4: 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glucose e 25 alnusiina 3.2.5. Caracterização da mistura Mc5: estrictinina e outros compostos 27 3.2.6. Caracterização da mistura Mc6: casuarictina e outros compostos 29 3.2.7. Caracterização da mistura Mc7: castalagina e vescalagina 30 3.2.8. Caracterização do composto Mc8: quercitrina 32 3.2.9. Caracterização da mistura Mc9: miricitrina, ácido elágico e ácido gálico 34 3.2.10. Caracterização da mistura Mc10: ácido protocatecúico e ácido cítrico 36 3.2.11. Caracterização da mistura Mc11: ácido 2-O-(3,4-dihidróxibenzoil) 37 -2,4,6-triidróxifenil-acético e ácido gálico. 4. CONCLUSÕES 39

CAPÍTULO 2 Otimização das condições de extração de compostos 40 fenólicos das cascas e sementes de jabuticaba (Myrciaria cauliflora) 1. OBJETIVOS 40 2. MATERIAIS E MÉTODOS 40 2.1. Amostras 40 2.2. Planejamento experimental 41 2.2.1. Obtenção dos extratos das cascas 41 2.2.2. Obtenção dos extratos das sementes 43 2.3. Quantificação dos compostos fenólicos dos extratos das cascas e sementes 43 2.3.1. Fenóis totais 43 2.3.2. Taninos 44 2.3.3. Antocianinas totais monoméricas 44 2.3.4. Índice de cor e tonalidade 45 2.3.5. Flavonoides 45 2.4. Análise estatística 46 2.4.1. Extratos das cascas 46 2.4.2. Extratos das sementes 46 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 46 3.1. Constituintes fenólicos dos extratos das cascas 46 3.2. Constituintes fenólicos dos extratos das sementes 52 4. CONCLUSÕES 55

vii

CAPÍTULO 3 Influência de fatores edáficos na composição físico-química 56 e de componentes fenólicos das cascas e sementes de jabuticaba (Myrciaria cauliflora) 1. OBJETIVOS 56 2. MATERIAIS E MÉTODOS 56 2.1. Obtenção das amostras 56 2.2. Composição química das cascas e sementes 56 2.3. Determinação do teor de nutrientes nas sementes e cascas dos cinco 57 pomares 2.3.1. Digestão das amostras 57 2.3.2. Análise dos nutrientes 57 2.4. Análise química do solo 57 2.5. Análise estatística 58 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 59 4. CONCLUSÕES 69

REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS 70

APÊNDICES 81

A1. Espectros do composto Mc1: pedunculagina 81 A2. Espectros do composto Mc2: alnusiina 82 A3. Espectros do composto Mc3: cauliflorina 85 A4. Espectros da mistura Mc4: 1,2,3,4,6-penta-o-galoil -β-D-glucose e alnusiina 87 A5. Espectros da mistura Mc5: estrictinina e outros compostos 89 A6. Espectros da mistura Mc6: casuarictina e outros compostos 90 A7. Espectros da mistura Mc7: castalagina e vescalagina 91 A8. Espectros do composto Mc8: quercitrina 93 A9. Espectros da mistura Mc9: miricitrina, ácido elágico e ácido gálico 94 A10. Espectros da mistura Mc10: ácido protocatecuico e ácido cítrico 95 A11. Espectros da mistura Mc10: ácido 2-O-(3,4-dihidróxibenzoil)- 96 2,4,6-trihidróxifenilacético e ácido gálico

viii

LISTA DE FIGURAS

Página Figura 1. Jabuticabeira com frutos e pomar da Fazenda Jabuticabal, Hidrolândia-GO. 1 Figura 2. Estrutura dos ácidos presentes no fruto de jabuticaba. 2 Figura 3. Estrutura dos principais tipos de flavonoides. 4 Figura 4. Exemplos de estruturas de taninos: condensado (a) e hidrolisável (b). 5 Figura 5. Rota do ácido chiquímico na síntese de compostos fenólicos. 8 Figura 6. Obtenção do extrato aquoso das cascas e das sementes de jabuticaba. 11 Figura 7. Partição entre solventes dos extratos aquosos das sementes e cascas. 12 Figura 8. Fracionamento da fração solúvel em metanol das sementes. 13 Figura 9. Fracionamento da fração acetato de etila das sementes. 14 Figura 10. Fracionamento da fração solúvel em metanol das cascas. 15 Figura 11. Fracionamento da fração acetato de etila das cascas. 15 1 Figura 12. Espectro de RMN de H do composto Mc1 (acetona-d6, 500 Mz). 18 1 Figura 13. Espectro de RMN de H do composto Mc2 (acetona-d6, 500 Mz). 20 Figura 14. Praecoxina D (a), alnusiina: 1ª estrutura proposta (b) e 2ª estrutura 22 proposta (c). 1 Figura 15. Espectro de RMN de H do composto Mc3 (acetona-d6, 500 Mz). 23 1 Figura 16. Espectro de RMN de H da mistura Mc4 (acetona-d6, 500 Mz). 26 1 Figura 17. Espectro de RMN de H da mistura Mc5 (metanol-d4, 500 Mz). 28 1 Figura 18. Espectro de RMN de H da mistura Mc6 (acetona-d6, 500 Mz). 29 1 Figura 19. Espectro de RMN de H da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 Mz). 31 1 Figura 20. Espectro de RMN de H do composto Mc8 (metanol-d4, 500 Mz). 33 1 Figura 21. Espectro de RMN de H da mistura Mc9 (metanol-d4, 500 Mz). 35 1 Figura 22. Espectro de RMN de H da mistura Mc10 (metanol-d4, 500 Mz). 37 1 Figura 23. Espectro de RMN de H da mistura Mc11 (metanol-d4, 500 Mz). 38 Figura 24. Sítios de amostragem da Fazenda Jabuticabal, Hidrolândia-GO. 40 Figura 25. Planejamento composto central para dois fatores. 42 Figura 26. Superfícies de resposta para as variáveis dependentes: (a) fenóis totais, 48 (b) taninos e (c) antocianinas. Figura 27. Superfícies de resposta para as variáveis dependentes: (a) Índice de cor 50 e (b) Tonalidade. Figura 28. Otimização do teor de compostos fenólicos e propriedades de cor em 51 função do tempo de ultassom e do volume de solvente EtOH/HCl. Figura 29. Ordenação dos dois primeiros eixos da RDA mostrando as amostras 65 ix em triplicatas de cascas (C) e sementes (S) dos frutos de M. cauliflora nos solos de amostragem (S1, S2, S3, S4, S5). Figura 30. Dendrograma de similaridade das amostras das partes dos frutos de 65 M. cauliflora cultivados em diferentes solos com base nos escores canônicos da RDA. Figura 31. Diagrama de Venn ilustrando a contribuição dos preditores das 68 partes do fruto (semente), do solo de cultivo (Mn2+) e dos nutrientes (Mn2+ e Cu2+) no particionamento da variação dos constituintes centesimais e teores fenólicos de M. cauliflora de acordo com a Tabela 28. As frações conjuntas não se encontram em escala. Figura A1. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 81

COSY do composto Mc1 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A2. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 81

HSQC do composto Mc1 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A3. Espectro de massas do composto Mc1. 82 13 Figura A4. Espectro de RMN de C do composto Mc2 (acetona-d6, 500 Mz). 82 Figura A5. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 83

HSQC do composto Mc2 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A6. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 83

COSY do composto Mc2 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A7. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento 84 de HMBC do composto Mc2 (acetona-d6, 500 MHz). 84 Figura A8. Espectro de massas do composto Mc2. 13 Figura A9. Espectro de RMN de C do composto Mc3 (acetona-d6, 500 Mz). 85 Figura A10. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 85

HSQC do composto Mc3 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A11. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 86

COSY do composto Mc3 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A12. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento 86 de HMBC do composto Mc3 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A13. Espectro de massas do composto Mc3. 87 Figura A14. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 87

HSQC da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A15. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 88

COSY da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A16. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento 88 de HMBC da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A17. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 89

HSQC da mistura Mc5 (metanol-d4, 500 MHz). x

Figura A18. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 89

COSY da mistura Mc5 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A19. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento 90 de HMBC da mistura Mc5 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A20. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 90

HSQC da mistura Mc6 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A21. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 91

COSY da mistura Mc6 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A22. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 91

HSQC da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A23. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 92

COSY da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A24. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento 92 de HMBC da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz). Figura A25. Espectro de massas do composto Mc7. 93 Figura A26. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 93

HSQC do composto Mc8 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A27. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 94

COSY do composto Mc8 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A28. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 94

HSQC da mistura Mc9 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A29. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 95

COSY da mistura Mc9 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A30. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 95

HSQC da mistura Mc10 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A31. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 96

COSY da mistura Mc10 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A32. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de 96

HSQC da mistura Mc11 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A33. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de 97

COSY da mistura Mc11 (metanol-d4, 500 MHz). Figura A34. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento 97 de HMBC da mistura Mc11 (metanol-d4, 500 MHz).

LISTA DE TABELAS

Página Tabela 1. Composição nutricional por 100 g de jabuticabas. 3 Tabela 2. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc1. 18 Tabela 3. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc2. 20 Tabela 4. Dados de correlação a longa distância 1H-13C do composto Mc2. 21 Tabela 5. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc3. 24 Tabela 6. Dados de correlação a longa distância 1H-13C do composto Mc3. 25 Tabela 7. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc4. 27 Tabela 8. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc5a. 28 Tabela 9. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc6a. 30 Tabela 10. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc7. 32 Tabela 11. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc8. 34 Tabela 12. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc9. 35 Tabela 13. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc10. 37 Tabela 14. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc11. 39 Tabela 15. Resumo das principais características dos solos dos sítios de 41 amostragem de M. cauliflora. Tabela 16. Planejamento composto central para dois fatores com valores reais e 43 codificados das variáveis: volume de solvente (V) e tempo de ultrassom () e níveis utilizados no preparo de extratos de cascas de jabuticaba. Tabela 17. Respostas* obtidas para compostos fenólicos: fenóis totais (FT), 47 taninos (T) e antocianinas totais monoméricas (ATM). Tabela 18. Respostas* obtidas para compostos fenólicos: índice de cor (IC), 49 tonalidade (Ton) e densidades ópticas a 420, 520 e 620 nm. Tabela 19. Otimização da função Desejabilidade dos teores de FT, T, ATM, IC 52 e Ton obtidos em função do tempo de ultrassom () e volume (V) de solvente para os extratos das cascas de jabuticaba. Tabela 20. Respostas* obtidas de máxima Desejabilidade para compostos 52 fenólicos: FT, T, ATM e propriedades de cor: IC e Ton para os extratos da casca de jabuticaba. Tabela 21. Respostas* obtidas para compostos fenólicos: fenóis totais (FT), 53 taninos (T) e antocianinas totais monoméricas (ATM) para os extratos das sementes de jabuticaba. Tabela 22. Análise de variância para as médias de teores de FT, T e FLA 54 xii em função do tipo de solo e solvente de extração para os extratos das sementes de jabuticaba. Tabela 23. Sítios de amostragem das plantas de M. cauliflora. 56 Tabela 24. Composição centesimal, em g 100 g-1 de matéria seca, das cascas e 60 sementes de jabuticaba em função dos cinco tipos de solos. Tabela 25. Concentrações de macro e micronutrientes em cascas e sementes 62 de M. cauliflora. Tabela 26. Características químicas dos solos de amostragem de M. cauliflora. 63 Tabela 27. Composição centesimal, teor fenólico e parâmetros de coloração 66 de cascas e sementes dos frutos de jabuticaba nas diferentes classes. Tabela 28. Sumário do particionamento da variação dos constituintes químicos 67 das cascas e sementes de jabuticaba por meio de RDA parciais.

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

ADP – Adenosina Difosfato ABTS – 2,2’- azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico ANOVA – Análise de Variância AOAC – Association of Official Analytical Chemists ATM – Antocianinas Totais Monoméricas CJL – Cascas de Jabuticaba Liofilizada CSBC – Compostos Secundários Baseados em Carbono CTC – Capacidade de Troca Catiônica d – Dupleto dd – Duplo dupleto DCA – Análise de Correspondência Destendenciada DIC – Delineamento Inteiramente Casualizado DPPH – 2,2-Difenil-1-picrilhidrazila ECJ – Extratos de Cascas de Jabuticaba FRAP – Redução dos íons de ferro FT – Fenóis Totais H+Al – Potencial de Acidez HCA – Hierarchical Cluster Analysis HDL – Lipoproteínas de Alta Densidade HHDF – Hexahidroxidifenoíla

HPCDEA – Extração Assistida por Alta Pressão de CO2 IAA – Auxina Ácido Indolilacético IC – Índice de Cor J – constante de acoplamento LDL – Lipoproteína de Baixa Densidade LC-MS – Cromatografia Líquida Acoplada à Espectroscopia de Massas LDL – Lipoproteína de Baixa Densidade M.O – Matéria Orgânica m/z – razão massa/Carga NADPH – Nicotinamida Adenina denucleotídeo fosfato nm – Nanômetro (1x10-9) PCA – Principal Component Analysis ORAC – Capacidade de absorção do radical oxigênio pH – Potencial Hidrogeniônico pRDAs – Análise de Redundância Canônica Parcial ppm – Partes por Milhão

Raj – Coeficiente de Determinação Ajustado RDA – Análise de Redundância Canônica RMN – Ressonância magnética nuclear s – simpleto SAS – Statistical Analysis Systems DP – Desvio Padrão SDS – Sodium Dodecyl Sulfate SE – Solvente de Extração SJL – Semente de Jabuticaba Liofilizada xiv

T – Taninos TEAC – Atividade antioxidante equivalente ao Trolox Ton – Tonalidade TS – Tipo de Solo u.a. – Unidade de Absorbância UV/Vis – Ultravioleta/visível V – Volume VIF – Fator de Inflação da Variância v/v – Volume/Volume  – Tempo de Agitação assistido por Ultrassom

RESUMO

Sementes e cascas de jabuticaba (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg) coletadas na Vinícola Jabuticabal, foram extraídas separadamente com acetona:água 50%. Após partição entre solventes, as frações acetato de etila e metanólica foram submetidas a repetidas cromatografias em coluna utilizando-se Diaion HP-20 e Sephadex LH-20 como adsorventes. Substâncias puras e frações foram analisadas por RMN de 1H e 13C, uni e bidimensional e espectroscopia de massas ESI-TOF. Neste trabalho foram isolados e identificados quinze compostos sendo sete elagitaninos, um deles inédito, um éster galoílico, três ácidos fenólicos, dois flavonoides glucosilados, um depsídeo e um ácido orgânico. Para otimização da extração dos compostos fenólicos utilizou-se um delineamento experimental ao acaso, empregando-se a técnica de planejamento Box-Wilson composto central para dois fatores, com ponto central e quatro axiais. Os fatores foram compostos pelo tempo de agitação () e volume de solvente (V) constituído por etanol/ácido clorídrico (9:1). Foram realizados três experimentos independentes em duplicata, além de ensaios para quantificação dos compostos fenólicos antocianinas totais monoméricas (ATM), taninos (T) e fenóis totais (FT), padrões de coloração índice de cor (IC) e tonalidade (Ton). De acordo com os resultados, quando o volume permaneceu constante e variou o tempo de agitação observou-se que todos os teores de fenóis e padrões de cor aumentaram. O tempo total de 75 min de ultrassom e volume de solvente de 64 mL apresentou maior poder de extração, obtendo-se teores de FT, T e ATM de 33,5; 7,91 e 5,57 mg g-1, com IC e Ton de 0,893 u.a. e 0,833, respectivamente. Na extração de compostos fenólicos nas sementes foram testados os solventes: água, etanol aquoso (50%) e metanol aquoso (50%), sendo que esta última mistura forneceu os maiores teores de FT, T e flavonoides: 15,71; 12,65 e 64,14 mg g-1, respectivamente. No estudo da influência do solo nas variações químicas de cascas e sementes de jabuticaba, os dados obtidos da análise de composição centesimal, compostos fenólicos, padrões de coloração e nutrientes minerais de amostras de cinco pomares foram analisados por redundância canônica (RDA) e de agrupamento hierárquico (HCA). Essas análises ordenaram as amostras em quatro grupos: as cascas do grupo I e II foram relacionadas aos altos níveis de fenóis totais e fibras, respectivamente, enquanto que os taninos e flavonoides foram os principais compostos presentes nas sementes do grupo III e o teor de umidade foi maior em sementes do grupo IV. A separação de cascas (grupos I e II) de sementes (grupos III e IV) em grupos distintos foi influenciada pelos teores dos nutrientes Mn2+ e Cu2+ dos frutos, enquanto Mn2+ do solo distinguiu amostras das classes I e III das outras, II e IV, caracterizando assim uma forte influência de alguns nutrientes dos solos e dos frutos na composição química das sementes e cascas de jabuticaba.

xvi

ABSTRACT

Seeds and peels of jabuticaba (Myrciaria cauliflora (Mart) O. Berg) collected in the Jabuticabal Winery were separately extracted with aqueous acetone (50%). After partitioning between solvents, the fractions ethyl acetate and methanol were subjected to repeated column chromatography using Diaion HP-20 and Sephadex LH-20 as adsorbents. Pure substances and fractions were analyzed by 1H NMR and 13C, one and two dimensional, and ESI-TOF mass spectroscopy. In this work, fifteen compounds were isolated and identified: seven ellagitannins, one of them is novel, one galloyl ester, three phenolic acids, two glycosylated flavonoids, one depside and one organic acid. To optimize the extraction of phenolic compounds, a randomized experimental design was applied, using Box-Wilson central composite design for two factors, with center point and four axial. The independent variables were stirring time () and solvent volume (V), which consisted of ethanol/hydrochloric acid (9:1). Three independent experiments in duplicate were performed, as well as assays for quantitation of phenolic compounds total monomeric anthocyanins (TMA), tannins (T), total phenols (TP), and color parameters color index (CI) and tonality (Ton). According to the results, when the volume remained constant and the stirring time increased, all phenolic contents and color patterns intensified. The best conditions for greater extraction were total ultrasonic time of 75 min and solvent volume of 64 ml, yielding the concentrations of TP, T and TMA of 33.5; 7.9 and 5.57 mg g-1, and CI and Ton, 0.893 a.u. and 0.833, respectively. In the extraction of phenolic compounds from seeds, the following solvents were tested water, aqueous ethanol (50%), aqueous methanol (50%), and the latter mixture provided the highest levels of TP, T and flavonoids: 15.71; 12.65 and 64.14 mg g-1, respectively. The influence of soil on jabuticaba seed and peel chemical contents was evaluated. Data obtained from the analysis of centesimal composition, phenolic contents, color parameters and mineral nutrients of samples collected in five orchards were analyzed by canonical redundancy (RDA) and hierarchical clustering (HCA). These analyzes ordered samples in four groups: the peels in groups I and II were related to high levels of phenolics and fibers, respectively, while the tannins and flavonoids were main compounds present in the seeds of group III, the moisture content was higher in seeds of group IV. The separation of peels (Groups I and II) and seeds (Groups III and IV) in different groups was influenced by the levels of fruits nutrients, Mn2+ and Cu2+, whereas Mn2+ from soil distinguished samples of the clusters I and III from the others, II and IV, characterizing a strong influence of some soil and fruits nutrients on the chemical composition of the jabuticaba seeds and peels.

INTRODUÇÃO

1. Generalidades sobre a Jabuticaba A Jabuticabeira (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg) (Figura 1) pertence à família Myrtaceae. Seus frutos ficam suportados diretamente nos troncos e ramos da árvore, apresentam 3-4 cm de diâmetro quando maduros e a cor das cascas varia de vermelho ao roxo-escuro e preto. A polpa é branca, contendo 1-4 sementes e têm um sabor doce e ácido (REYNERTSON et al., 2008; FLORES et al., 2012), característico da sua composição, a qual apresenta açúcares, ácidos orgânicos e terpenos (PLAGEMANN et al., 2012). A importância econômica dessa planta está diretamente ligada aos seus frutos, que podem ser consumidos in natura ou na forma de sucos, geleias, vinhos e licores (ABE et al., 2012; WU et al., 2012).

Figura 1. Jabuticabeira com frutos e pomar da Fazenda Jabuticabal, Hidrolândia-GO. Fonte: Fazenda Jabuticabal.

A jabuticaba, embora seja um fruto popular em todo o País, não chega a ter valor comercial, por ser muito perecível, apresentando um curto período de aproveitamento após a colheita (BRUNINI et al., 2004). Apesar de ser grande a produção em um único pé, essa rápida deterioração do fruto prejudica a sua comercialização (SATO; CUNHA, 2009; LIMA et al., 2008). A jabuticaba pode desempenhar um papel importante para a indústria no futuro próximo, podendo ser consumido como suplemento nutricional (COSTA et al., 2013). Frutos comestíveis têm uma ampla variedade de nutrientes, os quais estão presentes em baixas concentrações em um determinado fruto, mas apresentam um grande benefício para a saúde humana (WU et al., 2013a). A Fazenda Jabuticabal (Figura 1), localizada em Nova-Fátima no município de Hidrolândia-Goiás, possui mais de 30 mil pés de jabuticaba e processa cerca de 20 toneladas de fruto, produzindo 8 toneladas de resíduos, chamado de bagaço de jabuticaba. O mesmo é constituído de casca (95,0%) e sementes (5,0%) e é normalmente descartado, não sendo usado para outros fins produtivos a não ser, em parte, destinado à alimentação animal (VINÍCOLA JABUTICABAL, 2014). 2

2. Composição nutricional Alguns alimentos são consumidos não só por suas propriedades sensoriais e preferência pessoal, mas sim como fonte de nutrientes e compostos bioativos (ROOSEN et al., 2007). Além dos nutrientes essenciais, a maioria das frutas contém micronutrientes, tais como sais minerais, aminoácidos, ácidos orgânicos e vitaminas. De acordo com estudos anteriores da composição nutricional da jabuticaba (Tabela 1), pode-se observar que a mesma é rica em cálcio, fósforo e potássio, além de possuir grande quantidade de ácido ascórbico (Figura 2) e compostos fenólicos (RUFINO et al., 2010; RUFINO et al., 2011; DE ASSIS et al., 2009). Quanto aos ácidos orgânicos, os mais abundantes são os ácidos cítrico e succínico (JHAM et al., 2007); os ácidos málico, oxálico e acético (Figura 2) foram detectados, porém em menor quantidade (LIMA et al., 2011a).

OH O OH O HO O OH O OH OH HO O OH HO OH OH O Ácido ascórbico Ácido cítrico Ácido succínico

OH O O HO OH O OH HO H C OH O OH O 3 Ácido málico Ácido oxálico Ácido acético

Figura 2. Estrutura dos ácidos presentes no fruto de jabuticaba.

Tabela 1. Composição nutricional por 100 g de jabuticabas. Composição nutricional Teores encontrados Proteína 0,11-0,32 g Carboidratos 12,58 g Cálcio 6,3-7,6 g Fósforo 9,2-34,6 Ferro 0,49-0,87 g Potássio 13,2 mg Fibra 0,08 mg Triptofano 1,0 mg Lisina 7,0 mg Ácido ascórbico 17,7-238 mg Vitamina B1 0,04 mg Vitamina B2 0,09 mg Antocianinas Totais 58,1-315 mg Fenólicos totais 460,9 mg Carotenóides totais 0,32 mg Fonte: Rufino et al. (2011). 3

A umidade é o principal componente na maioria dos alimentos. Esse fator influencia diretamente no processamento, armazenamento, conservação da qualidade, composição química e desenvolvimento de microrganismos. Além disso, este fator pode afetar as propriedades sensoriais do alimento (GURAK et al., 2014). Lima et al. (2011a) identificaram os ácidos graxos linoleico, oleico e palmítico nos óleos das sementes de jabuticaba das variedades Paulista e Sabará. A proporção desses ácidos no óleo das sementes se assemelha com a obtida para as sementes de uva, muito usado nas indústrias de cosméticos. Entretanto, o componente majoritário para ambas as variedades, 24 e 29% respectivamente, foi um fitoesterol (C29H50O) não identificado. Segundo Wang e Zheng (2003) o teor de cinzas pode ser considerado como uma medida geral de qualidade nos alimentos, uma vez que maiores teores de cinzas retratam também maiores teores de cálcio, magnésio, ferro, fósforo, sódio e outros componentes minerais. O consumo de fibras traz efeitos positivos sobre a hipercolesterolemia, principalmente através da redução da lipoproteína de baixa densidade (LDL). Em diabéticos, as fibras da jabuticaba podem estimular a produção de ácidos graxos de cadeia curta, o que aumenta a oxidação da glucose, reduzindo a liberação de ácidos graxos livres e melhorando a sensibilidade à insulina (ALEZANDRO et al., 2013b). Fibras alimentares podem ser ingeridas a partir de frutas e vegetais como ingredientes funcionais, pois fornecem inúmeros benefícios à saúde, tais como capacidade de diminuir os níveis de colesterol ruim, melhorar a tolerância à glucose e a resposta da insulina, reduzir a hiperlipidemia e hipertensão, contribuir para a saúde gastrointestinal e prevenir certos tipos de câncer (VIUDA-MARTOS et al., 2012). A American Dietetic Association (2008) recomenda uma ingestão de 20 a 30 g diárias de fibras para adultos quando em uma dieta rica em carboidratos e pobre em gorduras. De acordo com Lima et al. (2008) as cascas de jabuticaba são constituídas por proteínas e fibras alimentares, o que possibilita o seu aproveitamento para fabricação de geleias, podendo ser uma alternativa viável para a utilização dos resíduos que muitas vezes são descartados e não apresentam valor comercial.

3. Compostos fenólicos A jabuticaba é uma fruta rica em compostos fenólicos. O teor máximo encontrado de antocianinas (Tabela 1) é de 315 mg por 100 g do fruto e o total fenólico 460,9 mg (TERCI, 2004). O mirtilo, importante fonte de polifenóis nos países de clima temperado, contém teor de antocianinas totais variando na faixa de 200-350 mg e fenólicos totais entre 350-490 mg por 100 g do fruto (YUAN et al., 2011). As fontes alimentares ricas em compostos fenólicos incluem frutas, chá, café e cacau, além dos alimentos processados derivados destas fontes, tais como o vinho. Em níveis 4 elevados, os fenóis transmitem adstringência, amargor e cor aos alimentos (GENOVESE et al., 2008). Até o momento foram isolados e identificados no fruto de jabuticaba seis ácidos fenólicos (ácidos gálico, elágico, protocatecúico, metil protocatecúico, cinâmico e o-cumárico), seis flavonoides [quercetina, quercitrina, isoquercitrina, quercimeritrina, rutina e miricitrina], dois depsídeos (ácido 2-O-(3,4-dihidroxibenzoil)-2,4,6-trihidroxifenilacético e jaboticabina) e três antocianinas (cianidina-3-O-glucosídeo, delfinidina-3-O-glicosídeo e piranocianina B) (REYNERTSON et. al., 2006). Além desses, dois elagitaninos foram isolados recentemente, oenoteina C e iso-oenoteina C (WU et al., 2013b). Outros compostos fenólicos foram identificados no extrato bruto por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS), sendo que sete elagitaninos (casuarina, casuarinina, telimagrandina I, telimagrandina II, 1-O-galoil-4,6-O-HHDF--D-glucose, casuarictina e pedunculagina) tiveram suas estruturas sugeridas (WU et al., 2012).

3.1. Flavonoides Os flavonoides são metabólitos secundários amplamente distribuídos no reino vegetal

(CORCORAN et al., 2012). Eles são caracterizados por um esqueleto C6-C3-C6 com diferentes substituições nos anéis. Atualmente, mais de 8000 flavonoides já são conhecidos e de acordo com suas estruturas químicas eles são classificados em: flavanonas, flavonas, isoflavonas, flavonóis e antocianinas (Figura 3).

OH OH OH

HO O HO O HO O OH OH OH

OH O OH O OH O

flavanona flavona flavonol OH HO O

+ HO O OH

OH O açucares OH OH

antocianina isoflavona

Figura 3. Estrutura dos principais tipos de flavonoides.

As antocianinas são uma classe dos flavonoides com atividade antioxidante potente e que estão dispersas por todo o reino vegetal, sendo encontradas principalmente nas frutas de cor escura, e em alguns tecidos de flores onde são responsáveis pela cor vermelha, roxa ou azul (CROZIER et al., 2009). 5

Uma das principais funções das antocianinas em flores e frutas é o poder de atrair agentes polinizadores e dispersores de sementes, além de proteger diversos tecidos da planta de processos oxidativos durante etapas de seu ciclo de vida, principalmente em fases iniciais do crescimento (EIBOND et al., 2004). A deficiência natural de elétrons das antocianinas faz com que esses compostos sejam particularmente reativos, apresentando também uma grande sensibilidade às mudanças de pH e temperatura (VOLP et al., 2008).

3.2. Taninos Os taninos se dividem em duas classes: condensados, que são formados pela condensação de unidades flavan-3-ol; e hidrolisáveis, formados pela esterificação do ácido gálico com as hidroxilas da glucose (Figura 4). Duas unidades vizinhas de ácido gálico podem sofrer acoplamento oxidativo gerando o ácido hexaidroxidifenoil, característico dos elagitaninos (Figura 4b). Esses compostos possuem a propriedade de precipitar proteínas e conferem adstringência aos frutos de determinadas plantas (QUIDEAU, 2009). Os níveis de taninos hidrolisáveis presentes nos frutos de jabuticaba são significativamente maiores do que em outros frutos da família Myrtaceae, tais como cambuci, goiaba, camu-camu, pitanga e grumixama (ABE et al., 2012). Assim, a jabuticaba é uma fonte promissora de derivados do ácido elágico na dieta humana (WU et al., 2013a; ALEZANDRO et al., 2013a). Portanto a capacidade antioxidante da jabuticaba pode ser devida à presença de ácido elágico e elagitaninos que estão presentes no fruto em quantidades consideráveis (WU et al., 2012).

HO O OH OH HO O OH OH O OH HO O O HO O OH HO O OH O O OH OH HO O OH O OH HO O OH HO OH

OH HO OH HO OH OH

(a) (b)

Figura 4. Exemplos de estruturas de taninos: condensado (a) e hidrolisável (b).

4. Aplicações medicinais A jabuticaba já tem sido usada por muito tempo na medicina popular. O decocto da casca seca é empregado tradicionalmente no tratamento de hemoptise, tosse, bronquite, asma, 6 inflamação das amígdalas, diarreia e disenteria (REYNERTSON et al., 2006). Já as cascas e folhas da jabuticabeira são usadas contra diarreia devido à sua alta adstringência (SOUZA- MOREIRA et al., 2011; ALBUQUERQUE et al., 2007). Até o momento, cerca de vinte estudos relataram atividade antioxidante da jabuticaba, seja do fruto inteiro, maduro ou verde, ou da casca e das sementes separadas. Produtos industrializados também foram testados, tais como a geleia, o suco e os vinhos (tinto, rose e branco). Na maioria dos estudos, foi utilizado o teste de capacidade antioxidante frente ao radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), e com menor frequência os ensaios de capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC), 2,2’- azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico (ABTS), atividade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC), redução dos íons de ferro (FRAP), sistema ácido linoléico-β-caroteno e voltametria cíclica também foram empregados. Todos os resultados mostraram que a jabuticaba apresenta capacidade antioxidante, independente da parte do fruto, ou do estágio de amadurecimento do fruto, ou do produto industrial, ou mesmo do tipo de ensaio antioxidante empregado (WU et al., 2013a; MARTINS DE SÁ et al., 2014; SILVA et al., 2014). Outras atividades biológicas também foram comprovadas para essa espécie. Os extratos etanólico dos frutos mostraram efeito inibitório contra Klebsiella pneumoniae (HAMINIUK et al., 2011); enquanto que os extratos aquosos de cascas e sementes, após secagem por spray-drying, inibiram o crescimento de três bactérias Gram-negativas, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Escherichia coli (SILVA et al., 2014). O extrato das folhas também foi eficaz contra Staphylococcus aureus, além de inibir seis bactérias orais, formadoras do biofilme dental, e duas espécies de Candida (C. tropicalis e C. Albicans) (OLIVEIRA et al., 2011; MACEDO-COSTA et al., 2009; SOUZA-MOREIRA et al., 2010). A atividade antidiarreica foi testada através de ensaios de inibição de crescimento das bactérias Enterocococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella spp. e Shigella spp. e mobilidade gastro-intestinal. Nesses ensaios os extratos do fruto e das folhas mostraram atividade bactericida, porém não houve efeito significativo na mobilidade gastro-intestinal (SOUZA-MOREIRA et al., 2011). A adição de cascas liofilizadas de jabuticaba em dietas ricas em gordura de ratos obesos aumentou os níveis de colesterol bom (HDL) e diminuiu os níveis de insulina sérica, o que demonstra um potencial benefício na prevenção de doenças cardiovasculares e do diabetes do tipo 2 em obesos (LENQUISTE et al., 2012; DRAGANO et al., 2013). Além disso, a jabuticaba e seus isolados, oenoteina C e iso-oenoteina C apresentaram efeito inibitório das enzimas -amilase e -glucosidase, demonstrando importante ação antidiabetes (WU et al., 2013a). Os vinhos de jabuticaba (tinto, rose e branco) também podem contribuir para proteção cardiovascular, pois induziram vasodilatação da artéria aorta em ratos. O efeito vasorelaxante 7 foi dependente da concentração de vinho e se mostrou mais acentuado com o vinho tinto, que possui concentrações mais altas de polifenóis (MARTINS DE SÁ et al., 2014). Os compostos isolados dos frutos, depsídios e antocianinas, diminuíram a produção de interleucina IL-8 em células epiteliais do pulmão, antes e após o tratamento com fumaça de cigarro (REYNERTSON et al., 2006). Essa atividade sugere uma ação anti-inflamatória importante desses compostos, inclusive para doenças como bronquite, enfisema e doença pulmonar crônica obstrutiva (WU et al., 2013a). Essas mesmas substâncias apresentaram atividade citotóxica quando submetidas a testes in vitro com diferentes linhagens de células cancerosas do intestino (REYNERTSON et al., 2006). Inclusive, extratos de cascas de jabuticaba se mostraram promissores em testes de inibição de proliferação de diferentes células cancerígenas, como leucemia e câncer de próstata (LEITE-LEGATTI et al., 2012).

5. Relação entre solo e constituintes químicos do metabolismo secundário Os metabólitos secundários são constituintes químicos produzidos pelas plantas e pelos microrganismos vivos com funções adaptativas ao meio ambiente e que ajudam na reprodução e sobrevivência das espécies vegetais. A biossíntese de vários metabólitos secundários pode ser influenciada pela variação na concentração de nutrientes minerais, tais como K, Ca, Mn, Mg, Cu, Zn e Co pode influenciar etapas importantes na biossíntese de vários metabólitos secundários (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; TREUTTER, 2010). Alguns desses nutrientes atuam como cofatores de enzimas que regulam etapas fundamentais na biossíntese de compostos fenólicos (Figura 5). Os principais fatores que podem influenciar as rotas de biossíntese de metabólitos secundários são: 1) fatores genéticos, intrínsecos à própria espécie, 2) fatores abióticos, tais como temperatura, radiação UV, disponibilidade de água e nutrientes e 3) fatores bióticos, interações positivas e/ou negativas com animais e microrganismos (IASON et al., 2012). Esses fatores influenciam o conteúdo de praticamente todas as classes de metabólitos secundários. Estudos com folhas de Eugenia uniflora e Myrciaria cauliflora revelaram que as concentrações de flavonoides, fenóis totais e taninos hidrolisáveis se correlacionam fortemente com níveis de cobre e manganês (SANTOS et al., 2011; DUARTE et al., 2010). Esses dois metais são co-fatores de peroxidases e polifenol oxidases, enzimas que participam da biossíntese de ligninas (LIN, et al., 2005). O equilíbrio entre lignificação e produção de compostos fenólicos, flavonoides e taninos, depende do suprimento desses dois metais nas folhas. Nos frutos da jabuticaba essa tendência já não foi tão evidente; observou-se apenas que solos mais pobres em nutrientes apresentaram teores mais altos de todos os compostos fenólicos (DUARTE et al., 2012).

Glucose-1-P G-fosfogliconato Rota Glicólise fosfato e Pentose Fosfoenol piruvato Eritrose-4-fosfato Mn Co

Rota do ácido chiquímico

ácido corismático

ácido antranílico ácido prefênico

fenilalanina tirosina triptofano Mn Zn ácido cinâmico Glucosídeos IAA cianogênicos

ácido-p-cumárico

ácido Cu caféico Quinona s

ácido B? ferúlico B?

álcool álcool álcool p-cumaril coniferil sinapil

monocotiledôneas gimnospermas dicotiledonêas Mn Fe

+ H2O2 Lignina

Parede celular Si

Figura 5. Rota do ácido chiquímico na síntese de compostos fenólicos. Fonte: Modificada de Yamada, 2004.

6. Otimização da extração de constituintes bioativos O processo de otimização da extração é importante para a minimização do tempo e volume de solvente usado na obtenção dos constituintes bioativos. Diferentes grupos de pesquisa têm feito um esforço para desenvolver um procedimento de extração de compostos fenólicos das cascas da jabuticaba que seja eficiente. Já foram testadas metodologias como a extração por fluído supercrítico e extração assistida por alta pressão de CO2 (HPCDEA),sendo 9 que em ambas foram avaliados os parâmetros de temperatura e pressão (CAVALCANTI et al., 2011; SANTOS; MEIRELES, 2011). Também foram comparadas quatro técnicas de extração por solventes utilizando-se: ultrassom, agitação, extração contínua com aparelho de Soxhlet e combinação de ultrassom e agitação, todos realizados com etanol (SANTOS et al., 2010). O método que utiliza ultrassom para extração de compostos antioxidantes facilita a liberação de compostos extraíveis por meio do aumento de transporte de massa de solvente, a partir da fase contínua, para dentro das células vegetais onde estão os compostos bioativos (LEE; ROW, 2006), principalmente nos minutos iniciais da extração (ZHANG et al., 2009). Além disso, esse método encurta o tempo de extração, diminui o consumo de solvente, aumenta a produtividade e melhora a qualidade dos extratos (WANG; WELLER, 2006). Otimizações empregando diferentes solventes acidificados ou neutros, tais como etanol, metanol, acetona e água, também foram realizadas em estudos visando a extração de compostos fenólicos da casca da jabuticaba (MONTES et al., 2005; LIMA et al., 2011b; ARAÚJO et al., 2013). Observou-se que além do tipo de solvente, o ácido utilizado e a proporção solvente/água desempenham um papel fundamental na coloração do extrato, sendo que o etanol acidificado com ácido clorídrico (pH > 2) foi o solvente que apresentou os melhores parâmetros de cor: menor luminosidade (L*) e maiores valores de tonalidade (hab) e croma (C*ab) (MONTES et al., 2005). Uma extração eficiente de compostos fenólicos deve maximizar a obtenção de compostos bioativos com degradação mínima de antocianinas e resultar em um extrato com alta atividade antioxidante usando tecnologias limpas com mínimo impacto ambiental e matérias-primas menos tóxicas e de baixo custo (SANTOS et al., 2010). A parceria de pesquisa com a Vinícola Jabuticabal iniciou-se em 2008 com o projeto “Análise dos compostos fenólicos, voláteis e ácidos orgânicos do fruto e dos vinhos da jabuticabeira (Myrciaria cauliflora)” financiado pelo CNPq (Edital MCT/CNPq 14/2008 - Universal - Faixa A). Durante a execução deste projeto foi possível identificar os constituintes voláteis e quantificar compostos fenólicos (fenóis totais, taninos e antocianinas) de folhas e frutos da jabuticabeira coletados em seis pomares diferentes. Através da análise multivariada destes dados verificou-se que a produção dos compostos voláteis e fenólicos é fortemente influenciada pelo solo de cultivo (DUARTE et al., 2010). Entretanto não foi feita uma análise individual dos compostos fenólicos, pois naquele estudo eles foram quantificados em grupos e não como substâncias isoladas. Além do controle da matéria-prima, o conhecimento das melhores condições de cultivo permitiria a produção de frutos mais adequados para a produção do vinho tinto. Entretanto mesmo com um maior controle e adequação do cultivo, ainda se faz necessário identificar as estruturas químicas dos compostos envolvidos na formação da cor, para que seja possível determinar as melhores condições de maceração e acondicionamento da bebida. 10

Existe uma extensa literatura sobre coloração de vinhos de uvas viníferas e americanas, porém estas espécies possuem apenas taninos condensados, enquanto a jabuticaba possui uma mistura de taninos condensados e hidrolisáveis. Ao contrário dos taninos condensados, pouco se tem estudado a cerca de interações entre elagitaninos e antocianinas, os poucos trabalhos envolvem elagitaninos extraídos dos barris de carvalho e as antocianinas dos frutos (CHASSAING et al., 2010; JORDAO et al., 2008). Com isso este projeto visa elucidar não só as estruturas químicas presentes nas cascas e sementes de jabuticaba, mas também quantificar e conhecer as melhores condições edáficas para produção dos compostos fenólicos (fenóis totais, taninos e antocianinas).

OBJETIVOS O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a influência dos fatores edáficos na composição química de frutos de jabuticaba oriundos de cinco diferentes solos.

Os objetivos específicos foram:  Isolar e identificar os principais compostos fenólicos presentes nas cascas e sementes da jabuticaba (Myrciaria cauliflora).  Determinar a composição centesimal das cascas e sementes da jabuticaba obtida de cinco diferentes solos.  Empregar a técnica de planejamento experimental para otimização da extração de compostos fenólicos das cascas e sementes da jabuticaba.  Quantificar os compostos fenólicos por ensaios colorimétricos.  Quantificar os macro e micronutrientes das cascas e sementes da jabuticaba.  Avaliar a influência do solo na composição química das cascas e sementes de frutos obtidos de cinco pomares diferentes por análise estatística multivariada.

CAPÍTULO 1 – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE CASCAS E SEMENTES DA JABUTICABA (Myrciaria Cauliflora)

1. OBJETIVOS Isolar e identificar os principais compostos fenólicos presentes nas cascas e sementes da jabuticaba (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg).

2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Material vegetal Os frutos foram coletados na Fazenda Jabuticabal, localizada no município de Hidrolândia, Goiás (S 1649’53’’, W 4914’45’’) na safra de 2011. Cerca de 8 kg de frutos foram lavados com água corrente e as sementes foram separadas manualmente das cascas.

2.2. Preparação dos extratos brutos As sementes (1,8 kg) e cascas (4,2 kg) foram trituradas individualmente em liquidificador utilizou solução de acetona/água (50%), depois foram transferidas para béqueres de 5 L e a extração exaustiva continuou com a mesma mistura de solventes, utilizou agitação mecânica ao abrigo da luz (YOSHIDA et al., 1996). Os extratos foram concentrados em rotaevaporador a 35 C e depois foram filtrados à pressão reduzida obteve o extrato aquoso e o precipitado (Figura 6).

Sementes Cascas 1,8 kg 4,2 kg

1) Trituração 2) Extração com acetona/água (50%)

Extrato Bruto Extrato Bruto

1) Evaporação 2) Filtração

Extrato aquoso Precipitado Extrato aquoso Precipitado 700 mL 3,75 L

Figura 6. Obtenção do extrato aquoso das cascas e das sementes de jabuticaba.

2.3. Fracionamento por partição entre solventes O extrato aquoso (700 mL) das sementes foi fracionado por partição líquido-líquido com éter etílico (2 x 100 mL), utilizou funil de separação. A fração etérea foi evaporada obteve-se 0,04 g. A fração aquosa foi separada em dois funis de separação (350 mL em cada) e foi 12 particionada com acetato de etila (14 x 50 mL), obteve-se após a evaporação do solvente e liofilização a fração acetato de etila (0,63 g) e a fração aquosa (57,09 g). Parte da fração aquosa (5 g) foi reservada para ensaios posteriores, enquanto 52,09 g foram solubilizados em metanol (2,0 L), e em seguida submetidos à filtração a vácuo, obteve-se após evaporação e liofilização duas frações: solúvel (21,45 g) e insolúvel em metanol (7,06 g). O extrato aquoso (3,75 L) das cascas foi fracionado por partição líquido-líquido com acetato de etila (5,8 L), obteve-se após evaporação e liofilização a fração acetato de etila (4,34 g) e a fração aquosa (79 g). Parte da fração aquosa (5 g) foi reservada para ensaios posteriores enquanto 74 g foram solubilizados em metanol (2,0 L), obteve-se após evaporação e liofilização duas frações: solúvel (56,56 g) e insolúvel em metanol (4,07 g) (Figura 7).

Extrato aquoso das Extrato aquoso das sementes (700 mL) cascas (3,75 L)

1) Éter Etílico 1) Acetato de Etila

Fra ção etérea Fração aquosa Fração acetato Fração aquosa 0,04 g 4,34 g 74g 2) Acetato de etila 2) MeOH

Fração acetato Fração aquosa Fração Solúvel 0,63 g 57,09 g Fração Insolúvel 56,56 g 4,07 g

3) MeOH

Fração Solúvel Fração Insolúvel 21,45 g 7,06 g

Figura 7. Partição entre solventes dos extratos aquosos das sementes e cascas.

2.4. Fracionamento e isolamento dos compostos por cromatografia em coluna 2.4.1. Fração solúvel em metanol das sementes A fração solúvel em metanol das sementes foi dividida em duas porções (11,74 g e 9,71 g) e cada uma foi submetida à cromatografia em coluna com Diaion HP-20 como adsorvente (27 x 4 cm, 200 g). Foi utilizado gradiente de água, água/metanol (20, 40, 60 e 80% metanol), metanol puro e acetona (Figura 8). Foram coletadas 104 frações na primeira coluna e 81 frações na segunda coluna. As frações das duas colunas foram reunidas em 8 frações principais após análise por cromatografia em camada delgada (CCD), tendo sílica-gel como adsorvente e ácido fórmico, formiato de etila e tolueno (1:7:1) como eluente e revelação com solução de FeCl3/HCl. 13

Somente três subfrações foram refracionadas: SJM2 (587 mg), SJM4 (1,05 g) e SJM7 (533 mg), utilizou-se cromatografia em coluna com Sephadex LH-20 (27 x 1,8 cm, 100g). O gradiente seguiu um gradiente de polaridade: clorofórmio/etanol (30, 40, 50, 70 e 90% etanol), etanol, etanol/metanol (20, 40, 60, e 80% metanol), metanol, metanol/acetona (1:1), acetona, acetona/água (1:1). De SJM2 foram coletadas 70 frações que foram reunidas em 12 frações principais, mas nenhuma substância pôde ser identificada. De SJM4 coletaram-se 78 frações que foram reunidas em 11 frações principais, após CCD. As substâncias pedunculagina e a mistura de castalagina e vescalagina foram isoladas e identificadas. De SJM7 foram reunidas 17 frações principais a partir de 127 frações e cauliflorina foi isolada pura e identificada (Figura 8).

Fração solúvel em MeOH sementes (21,45 g)

Diaion HP-20

8 frações SJM 1-8

SJM 2 SJM 4 SJM 7 587 mg 1,05 g 533 mg

Sephadex LH-20 Sephadex LH-20

12 frações 11 frações 17 frações

cauliflorina pedunculagina castalagina 39,8 mg 320,7 mg vescalagina 271,2 mg

Figura 8. Fracionamento da fração solúvel em metanol das sementes.

2.4.2. Fração acetato de etila das sementes A fração acetato de etila das sementes (634 mg) foi submetida à cromatografia em coluna utilizou Sephadex LH-20 como adsorvente (27 x 4 cm, 200 g). Para tanto, utilizou-se como fase móvel um gradiente de clorofórmio/etanol (30, 40, 50, 70, 90% etanol), etanol, etanol/metanol (20, 40, 60, e 80% metanol), metanol, metanol/acetona/água (4:4:2). Durante o fracionamento foram coletadas 161 frações, as quais foram reunidas em 23 frações principais (SJAE1-23) após análise por CCD nas mesmas condições anteriores. Nessas frações foram identificadas duas substâncias puras: ácido gálico (SJAE6) e alnusiina (SJAE19). Na mistura SJAE17 foi identificada estrictinina (Figura 9).

Fração acetato de etila

sementes (634 mg)

Sephadex LH-20

23 frações SJAE1-23

ácido gálico estrictinina alnusiina 30,5 mg 35,5 mg 72,9 mg

Figura 9. Fracionamento da fração acetato de etila das sementes.

2.4.3. Fração solúvel em metanol das cascas A fração solúvel em metanol (56,56 g) das cascas foi dividida em duas porções e cada uma foi submetida separadamente à cromatografia em coluna com Diaion HP-20 como adsorvente (27 x 4 cm, 200 g). Foi utilizado gradiente de água, água/metanol (30, 60% metanol), metanol puro e água. Foram coletadas 25 frações em cada coluna, que foram reunidas em 5 frações principais (CJM1-5) após análise por CCD, CJM1 (976,3 g), CJM2 (8,01 g), CJM3 (2,02 g), CJM4 (108 mg) e CJM5 (18,8 mg). A fração CJM2 foi dissolvida em água destilada (100 mL) e submetida à partição líquido-líquido com acetato de etila (900 mL), gerando a fração 0,6 g após evaporação. O material evaporado foi fracionado em Sephadex LH-20 com gradiente de clorofórmio/etanol (30, 40, 50, 70, 90% etanol), etanol, etanol/metanol (20, 40, 60, e 80% metanol), metanol. Nesse fracionamento foram coletadas 115 frações que após CCD foram reunidas em 25 frações (CJM16-40). Três substâncias foram identificadas (Figura 10): ácido protocatecúico (CJM20), o depsídeo ácido 2-O-(3,4-dihidróxibenzoil)-2,4,6- trihidróxifenilacético (CJM24) e casuarictina (CJM40).

2.4.4. Fração acetato de etila das cascas A fração acetato de etila das cascas (4,34 g) foi submetida à cromatografia em coluna utilizou Sephadex LH-20 como adsorvente (coluna 28 x 4 cm, 200 g). Para tanto se utilizou-se como fase móvel um gradiente de diclorometano/etanol 30, 40, 50, 70, 90% etanol), etanol, etanol/metanol (20, 40, 60, e 80% metanol), metanol, metanol/acetona 50% e metanol/acetona/água (4:4:2). Durante o fracionamento foram coletadas 150 frações, que foram reunidas em 21 frações principais (CJAE1-21) após análise por CCD. Várias substâncias foram identificadas: quercitrina, miricitrina, ácido gálico, ácido elágico, pentagaloil-glucose e alnusiina (Figura 11). A fração CJAE4 (741 mg) foi refracionada utilizou-se Sephadex LH-20 (27 x 1,8 cm, 100g) e eluindo-se com o gradiente: diclorometano, diclorometano/etanol (10, 20, 30, 40, 50% 15 etanol), metanol/acetona (1:1) e foram reunidas 12 frações, após análise por CCD. Na fração CJAE29 foram identificados em mistura: ácido protocatecúico e ácido cítrico (Figura 11).

Fração solúvel em metanol cascas (56,56 g)

Diaion HP-20

5 frações CJM1-5

CJM2 (8,0 g)

Partição c/ acetato de etila CJM2 (0,6 g) Sephadex LH-20

25 frações CJM16-40

ácido protocatecúico ácido 2-O-(3,4-dihidróxibenzoil)- casuarictina 8,0 mg 2,4,6-trihidroxifenilacético e 8,9 mg ácido gálico 14 mg

Figura 10. Fracionamento da fração solúvel em metanol das cascas.

Fração acetato de etila cascas (4,34 g)

Sephadex LH-20

21 frações CJAE1-21

CJAE4 quercitrina miricitrina, penta-galoil-glucose 741 mg 124 mg ácido elágico e e alnusiina ácido gálico 46 mg 319 mg Sephadex LH-20

12 frações ácido protocatecúico e ácido cítrico 88 mg

Figura 11. Fracionamento da fração acetato de etila das cascas.

2.5. Análise espectroscópica das substâncias puras e misturas As substâncias puras e algumas misturas foram analisadas por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C, uni e bidimensional, em equipamento BRUKER AVANCE III – 500

MHz, utilizou sonda TBI (Triple Broad Band Inverse detection), solubilizadas em acetona-D6, acetona-D6 + D2O e metanol-D4 no Laboratório de Ressonância Nuclear Magnética do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás (IQ/UFG). Os dados de RMN foram processados utilizou o programa ACD/NMR Processos Academic Edition (versão 12.01, 2010). Espectros de massa foram obtidos em aparelho Bruker microTOF (ESI-TOF MS) do Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Extração e fracionamento da sub-frações das cascas e sementes Na preparação do extrato bruto foi utilizada uma mistura de acetona/água (50%), conforme descrito por Mello e Santos (2003) por ser a condição mais adequada para a obtenção de taninos hidrolisáveis. A extração líquido-líquido foi utilizada inicialmente nos extratos brutos para obtenção de frações com polaridades distintas (Figura 6, página 11). Sendo assim as frações acetato de etila de cascas e sementes são compostas por substâncias de média polaridade (flavonoides, ácidos fenólicos e monômeros de taninos hidrolisáveis). A fase aquosa foi liofilizada e depois dissolvida parcialmente em metanol para evitar o uso de n- butanol. Nas frações solúveis em metanol são encontrados, geralmente, os taninos hidrolisáveis (monômeros e dímeros), enquanto os açúcares e os polímeros permanecem na fração insolúvel em metanol. No caso das cascas da jabuticaba, mesmo a fração solúvel em metanol estava impregnada de açúcares e polissacarídeos, o que tornou improdutivo o isolamento de substâncias fenólicas. O gel vinílico polimérico Diaion HP-20 foi utilizado como adsorvente nas separações preliminares, principalmente nas frações solúveis em metanol, por ele ser o mais adequado para eliminação de açúcares e outras substâncias muito polares (OKUDA et al., 1989). Nos demais fracionamentos o gel dextrano hidroxipropilado, Sephadex LH-20, apresentou separações eficientes com o gradiente: clorofórmio/etanol, etanol e metanol, ou seja com aumento progressivo de polaridade. Nesse caso, o mecanismo de separação é principalmente por adsorção de substâncias ao invés da filtração em gel (OKUDA et al., 1989). Neste trabalho foram identificados quinze compostos das sementes e das cascas da jabuticaba, sendo sete elagitaninos, um éster galoílico, três ácidos fenólicos, dois flavonoides glicosilados, um depsídeo e um ácido orgânico. O composto cauliflorina não foi isolado anteriormente e é inédito na literatura.

3.2. Caracterização espectroscópica dos compostos isolados e identificados 3.2.1. Caracterização do composto Mc1: pedunculagina

HO 6' O

HO O O 6 4 HO O O 2 1 O OH HO 6' 3 O O OH O 6' 6'

HO OH

HO OHHO OH

O composto Mc1 foi isolado da fração solúvel em metanol das sementes (frações SJM58-61, 304,6 mg) como um sólido amorfo branco e foi identificado como sendo 2,3-4,6-Di-

O-(s)-hexahidroxidifenoil-D-glucose, conhecido como pedunculagina. Sua estrutura foi determinada po meio de seus espectros de RMN de 1H, COSY e HSQC e espectrometria de massas, além da comparação com dados da literatura (HATANO et al., 1988). Nesse elagitanino a hidroxila ligada ao C-1 não está esterificada, por isso ele é um hemiacetal e existe como uma mistura de anômeros α e β. Portanto, devido à conformação todos os sinais aparecem duplicados nos seus espectros de RMN (Figura 12). Os sinais dos hidrogênios anoméricos se encontram blindados em δH 5,46 d (J = 4 Hz) para o anômero α e δH 5,06 d (J = 8 Hz) para o β (Tabela 2). Por meio do mapa de correlação homonuclear 1H-1H (COSY) foi possível identificar os outros hidrogênios da glucose a partir dos hidrogênios anoméricos (Figura A1). Utilizando o mapa de correlação heteronuclear 1H-13C (HSQC) foram assinalados os carbonos ligados aos hidrogênios (Figura A2). Na região dos aromáticos foram observados quatro simpletos duplicados entre δH 6,35 e 6,63 o que confirma a presença de dois grupos hexahidroxidifenoíla (HHDF). No espectro de massa (Figura A3) o pico de íon molecular [M-H]¯ foi observado a m/z

783,0686, que corresponde à fórmula molecular C34H24O22, o que confirma a estrutura do composto Mc1 como sendo o elagitanino pedunculagina. Essa substância apresenta potente atividade inibitória da anidrase carbônica, e pode ser útil no tratamento do glaucoma e diurese (SATOMI et al., 1993). Pedunculagina também possui alta atividade antitumoral in vivo contra sarcoma S180 e in vitro contra vários tipos de células cancerosas (CHANG et al., 1995), além da inibição in vivo da enzima DNA topoisomerase II (KHANBABAEE et al., 2003), levando à morte de células tumorais. Também se mostrou muito promissora no tratamento de dermatite atópica (LEE et al., 2010).

HO 6' O

HO O O 6 4 HO O O 2 1 O OH HO 6' 3 O O OH O 6' 6'

HO OH

HO OHHO OH

1 Figura 12. Espectro de RMN de H do composto Mc1 (acetona-d6, 500 Mz).

Tabela 2. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc1.

δH (ppm), multip., J (Hz) δC (ppm) C/H α anômero  anômero α anômero  anômero 1 5,46 d (4,0) 5,06 d (8,0) 91,8 95,4 2 5,07 dd (10,0; 4,0) 4,86 dd (9,0; 8,0) 75,6 78,5 3 5,47 t (10,0) 5,24 dd (10,0; 9,0) 75,9 77,7 4 5,08 t (10,0) 5,08 t (10,0) 69,9 69,7 5 4,61 ddd (10,0; 7,0; 2,0) 4,22 ddd (10,0; 6,0; 1,0) 67,5 72,6 6a 5,26 dd (13,0; 7,0) 5,30 dd (13,0; 6,0) 63,6 63,6 6b 3,79 dd (13,0; 2,0) 3,85 dd (13,0; 1,0) - - HHDF 6’ 6,34 s; 6,57 s 6,33 s; 6,52 s 107,3; 107,4; 107,6; 107,7 6,61 s; 6,66 s 6,60 s; 6,67 s 107,8; 107,9; 108,4; 108,5 a b Espectro realizado em acetona-d6. 6 : axial, 6 : equatorial.

3.2.2. Caracterização do composto Mc2: alnusiina

OH HO OH C OH 5' 6' O 1' 6' O B O 3' 1' O O O 6 4 HO 1' O 2 A O 1 O OH Tergaloila HO 6' 3 O O OH O 6' 1' 1' 6' HO OH HHDF HO OHHO OH 19

O composto Mc2 foi isolado a partir das sementes, na fração acetato de etila (SJAE19, 72,9 mg). Nos espectros de RMN de 1H e de 13C (Figuras 13 e A4) desta substância todos os sinais aparecem duplicados, entretanto por meio do experimento de HSQC (Figura A5) foi possível identificar os dois hidrogênios anoméricos δH 5,47 d (H-1α, J = 3,8 Hz) e δH 5,07 d (H-

1β, J = 8,0 Hz), correlacionados com os respectivos carbonos δC 91,8 e 95,5. Utilizando-se os experimentos de correlação de 1H-1H (COSY) e de 1H-13C (HSQC) foi possível assinalar todos os outros hidrogênios e carbonos das glucoses α e β (Figuras A5, A6 e Tabela 3). Comparando-se os deslocamentos dos hidrogênios e carbonos da estrutura Mc2 com a estrutura do composto anterior, a pedunculagina, observou-se uma grande semelhança para todos os sinais das glucoses  e β, inclusive a diferença de deslocamento químico entre os hidrogênios ligados ao C-6 (δ > 1,3 ppm). O que indica que parte da estrutura de Mc2 se assemelha à estrutura da pedunculagina. Porém quatro simpletos referentes aos hidrogênios aromáticos apareceram desblindados, δH 6,95; 6,96; 6,99 e 7,01, inclusive dois destes hidrogênios estão ligados a carbonos com deslocamentos químicos mais altos (δC 113,0), o que não é comum para o grupo HHDF. A presença de dez simpletos aromáticos e a diferença no deslocamento químico de quatro deles indicou que um dos grupos HHDF estava ligado a mais um anel aromático. Após uma detalhada avaliação do mapa de correlação a longa distância 1H-13C (HMBC)

(Figura A7 e Tabela 4) observou-se que os simpletos δH 6,99 e 7,01 se correlacionavam com os carbonos δC 120,8; 148,4; 143,0 e com a carbonila a δC 167,5; esta também se correlacionou com os hidrogênios ligados aos C-6 das glucoses. Devido à grande diferença nos deslocamentos químicos tanto dos hidrogênios (duplicados) quanto dos carbonos aromáticos, comparado a um grupo HHDF comum, concluiu-se que o quinto anel aromático deveria estar ligado a algum dos oxigênios desta unidade. As correlações a longa distância entre os hidrogênios δH 6,95 e 6,96 e os carbonos δC 112,3; 140,5; 143,6; 144,0 e 163,4 indicaram que o quinto anel possui uma função lactona, isto devido ao baixo deslocamento químico da carbonila, que está de acordo com o composto praecoxina D (Figura 14a), em que a carbonila se encontra a 163,4 ppm (HATANO et al., 1988).

OH HO OH C OH 5' 6' O 1' 6' O B O 3' 1' O O O 6 4 HO 1' O 2 A O 1 O OH Tergaloila HO 6' 3 O O OH O 6' 1' 1' 6' HO OH HHDF HO OHHO OH

1 Figura 13. Espectro de RMN de H do composto Mc2 (acetona-d6, 500 Mz).

Tabela 3. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc2.

δH (ppm), multip., J (Hz) δC (ppm) C/H α anômero  anômero α anômero  anômero 1 5,47 d (3,8) 5,07 d (8,0) 91,8 95,5 2 5,09 dd (9,8; 3,8) 4,88 dd (9,0; 8,0) 75,9 78,5 3 5,50 t (9,8) 5,27 dd (10,0; 9,0) 75,9 77,6 4 5,16 t (9,8) 5,16 t (10,0) 70,0 69,6 5 4,63 ddd (9,8; 7,0; 2,0) 4,26 ddd (10,0; 6,0; 1,0) 67,4 72,4 6a 5,21 dd (13,0; 7,0) 5,24 dd (13,0; 6,0) 64,5 64,5 6b 3,87 dd (13,0; 2,0) 3,94 dd (13,0; 1,0) - - HHDF 1’ - 2’ 114,4; 114,8 3’ - 4’ 136,1; 136,3 5’ 145,1; 145,1 6’ 6,40 s; 6,65 s 6,41 s; 6,64 s 107,6; 107,5 7’ 168,7; 169,7 Tergaloila A 1’ - 2’ 113,9; 114,7 3’ - 4’ 136,3 5’ 145,1; 145,7 6’ 6,60 s; 6,64 s 107,6 7’ 168,3; 168,7 Tergaloila B 1’ - 2’ 120,8 3’ - 21

Tabela 3. Dados de RMN de 1H-13C do composto Mc2 (continuação). δH (ppm), multip., J (Hz) δC (ppm) C/H α anômero  anômero α anômero  anômero Tergaloila B 4’ 143,0 5’ 148,4 6’ 6,99 s; 7,01 s 113,0 7’ 167,5 Tergaloila C 1’ 112,3 2’ 140,5 3’ - 4’ 143,6 5’ 144,0 6’ 6,95 s; 6,96 s 110,0 7’ 163,4 a b Espectro realizado em acetona-d6. 6 : axial, 6 : equatorial.

Tabela 4. Dados de correlação a longa distância 1H-13C do composto Mc2.

1 13 δH (ppm) correlações a longa distância H- C α anômero 1 5,47 C-2, C-3, C-5

2 5,09 C-1, C-3, C-7’ HHDF 3 5,50 C-2, C-4, C-7’ HHDF 4 5,16 C-2, C-3, C-5, C-7’A 5 4,63 C-4

6 5,21; 3,87 C-5, C-7’B  anômero 1 5,07 C-5β 2 4,88 C-1β, C-3β, C-7’ HHDF 3 5,27 C-1β, C-2β, C-4β, C-7’ HHDF 4 5,16 C-3β, C-5β, C-7’A 5 4,26 C-1β, C-4β 6 5,24; 3,94 C-5β, C-7’B HHDF 6’ 6,40; 6,65 C-2’HHDF, C-4’ HHDF, C-5’ HHDF, C-7’ HHDF 6,41; 6,64 Tergaloil A 6’ 6,60; 6,64 C-2’A, C-4’A, C-5’A, C-7’A Tergaloil B 6’ 6,99; 7,01 C-2’B, C-4’B, C-5’B, C-7’B Tergaloil C 6’ 6,95; 6,96 C-1’C, C-2’C, C-4’C, C-5’C, C-7’C

O elagitanino alnusiina foi isolado pela primeira vez do fruto de Alnus sieboldiana, Betulaceae (YOSHIDA et al., 1981), quando foi feita uma primeira proposta de estrutura (Figura 14b). Em 1987, a mesma substância foi isolada dos frutos de Rosa roxburghii, Rosaceae (YOSHIDA et al., 1987), e foi mantida a mesma estrutura inicialmente proposta, porém em 1989 houve uma revisão e propuseram uma segunda estrutura para alnusiina (Figura 14c) (YOSHIDA et al., 1989a e YOSHIDA et al., 1989b). Somente em 1992 chegou-se à estrutura correta, devido principalmente ao fato que após hidrólise parcial da alnusiina há formação de 22 pedunculagina e por isso as duas estruturas propostas inicialmente não poderiam estar corretas (YOSHIDA et al., 1992). Talvez a dificuldade de identificar a estrutura correta se deve ao fato que o grupo tergaloila ser muito mais raro em elagitaninos do que o grupo valoneoíla, onde o terceiro anel está ligado ao oxigênio da posição 5’ do grupo HHDF, como na maioria dos elagitaninos (QUIDEAU, 2009).

HO OH OH O HO OH OH O OH OH O O HO OH O O O O HO O O OH HO O HO O O O O O O O O O HO HO O O O OH O OH O O OH HO O HO O HO O O O OH O OH O O O O

HO OH HO OH HO OH

HO OHHO OH HO OHHO OH HO OHHO OH

(a) (b) (c)

Figura 14. Praecoxina D (a), alnusiina: 1ª estrutura proposta (b) e 2ª estrutura proposta (c).

Testes biológicos com alnusiina demonstraram que este composto possui atividade antitumoral in vivo contra sarcoma S180 (MIYAMOTO et al., 1987) e inibiu em 88% a peroxidação de lipídeos, induzida por NADPH e ADP, em microssomas de fígado de ratos (OKUDA et al., 1983a). Alnusiina afetou o metabolismo lipídico de duas formas, enquanto a lipólise induzida por adrenalina em células adiposas foi inibida em 84% (KIMURA et al., 1983a), o efeito oposto foi observado (35% de aumento) quando o hormônio adrenocorticoide fez a indução da lipólise (KIMURA et al., 1983b). Este elagitanino também apresentou efeito anti- hepatotóxico em lesões induzidas por CCl4 (HIKINO et al., 1985).

3.2.3. Caracterização do composto Mc3: cauliflorina

OH HO OH C OH 6' O 4' 1' 6' O B O 1' O O 3' O 6 4 HO 1' O 2 A O 1 HO OH Tergaloila HO 6' 3 OH OH

O composto Mc3 foi obtido a partir da fração solúvel em metanol das sementes (SJM35, 39,8 mg). Este composto também apresentou os sinais de 1H e 13C duplicados (Figuras 15 e A9), demonstrando que a hidroxila ligada ao carbono anomérico não está esterificada, portanto é um hemiacetal como os obtidos anteriormente. Utilizando-se o mapa de correlação de 1H-13C

(HSQC) (Figura A9) foram identificados os hidrogênios e carbonos anoméricos como sendo: δH

5,19 d (H-1α, J = 3,7 Hz), δH 4,60 d (H-1β, J = 7,8 Hz), δC 94,0 (C-1α) e δC 99,0 (C-1β). O fato dos sinais dos hidrogênios anoméricos estarem mais blindados, comparado com pedunculagina e alnusiina, e a grande diferença entre os deslocamentos dos carbonos anoméricos (δ- = 5,0) já indicam que a hidroxila da posição 2 também não está esterificada (YOSHIDA et al., 1984; HATANO et al., 1988). Os outros hidrogênios e carbonos das glucoses  e  foram assinalados pelos experimentos bidimensionais de HSQC e COSY (Figuras A10 e A11) e se encontram na Tabela 5. Por meio desses dados concluiu-se que a hidroxila da posição 3 também não está esterificada, por isso os hidrogênios ligados aos carbonos 1, 2 e 3 estão mais blindados. Já os hidrogênios das posições 4 e 6 aparecem em deslocamentos químicos mais altos, o que se assemelha com o elagitanino 4,6-O-(s)-hexahidroxi-difenoil-β-D-glucose (HILLIS; YAZAKI,

1973). Entretanto, os simpletos desblindados a δH 6,91, 6,92 e 6,93 na região dos aromáticos já demonstra que Mc3 não possui um grupo HHDF e sim um grupo tergaloíla.

OH HO OH C OH 6' O 4' 1' 6' O B O 1' O O 3' O 6 4 HO 1' O 2 A O 1 HO OH Tergaloila HO 6' 3 OH OH

1 Figura 15. Espectro de RMN de H do composto Mc3 (acetona-d6, 500 Mz).

A identificação do grupo tergaloíla foi possível por meio das correlações à longa distância 1H-13C do experimento de HMBC (Figura A12 e Tabela 6), onde a correlação entre o hidrogênio δH 6,91 e a carbonila em 163,2 ppm indicou a presença de um anel lactônico. Os hidrogênios em 6,92 e 6,93 ppm se correlacionaram com C-6 e  o que comprova que o anel B do grupo tergaloíla está ligado na posição 6 das glucoses. Existe grande semelhança entre os deslocamentos químicos dos carbonos dos anéis do grupo tergaloíla do composto Mc3 e do elagitanino alnusiina (Mc2), comprovando que as duas substâncias possuem este mesmo substituinte ligado nas posições 4 e 6 das glucoses. O espectro de massas (Figura A13) apresentou o pico de íon molecular [M-H]¯ a m/z

631,0585 (calculado para C27H19O18, m/z 631,0577) o que confirma à fórmula molecular

C27H20O18. Desta forma a estrutura do composto Mc3 foi estabelecida como sendo o tanino 4,6- O-tergaloil-glucose, que foi nomeado como cauliflorina, inédito na literatura até o momento.

Tabela 5. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc3.

δH (ppm), multip., J (Hz) δC (ppm) C/H α anômero  anômero α anômero  anômero 1 5,19 d (3,7) 4,60 d (7,8) 94,0 99,0 2 3,57 dd (9,5; 3,7) 3,34 dd (9,3; 7,8) 74,2 77,1 3 3,89 t (9,5) 3,68 t (9,3) 73,3 75,5 4 4,81 t (9,5) 4,86 t (9,3) 73,5 73,8 5 4,42 ddd (9,5; 6,4; 1,0) 3,91 m 67,5 72,0 6a 5,05 dd (13,0; 6,4) 5,07 dd (13,0; 6,4) 65,0 65,0 6b 3,76 dd (13,0; 1,0) 3,82 d (13,0) - - Tergaloila A 1’ - - 2’ - 114,3 3’ - - 4’ - 136,3 5’ - 145,8 6’ 6,73 s; 6,74 s 107,5 7’ - 168,2 Tergaloila B 1’ - - 2’ - 121,3 3’ - - 4’ - 142,6 5’ - 148,1 6’ 6,92 s; 6,93 s 112,1 7’ - 167,8 Tergaloila C 1’ - 113,0 2’ - 140,5 3’ - - 4’ - 143,7 5’ - 144,3 6’ 6,91 s 110,0 7’ - 163,2 a b Espectro realizado em acetona-d6 (Constantes de acoplamento em Hz). 6 : axial, 6 : equatorial.

Tabela 6. Dados de correlação a longa distância 1H-13C do composto Mc3.

1 13 δH (ppm) correlações a longa distância H- C α anômero 1 5,19 C-3, C-5 2 3,57 C-3 3 3,89 C-2, C-4

4 4,81 C-3, C-5, C-6, C-7’A 5 4,42 C-1, C-4

6 3,76; 5,05 C-4, C-5, C-7’B  anômero 1 4,60 C-5β 2 3,34 C-1β, C-3β 3 3,68 C-2β, C-4β 4 4,86 C-3β, C-5β, C-6β, C-7’A 5 3,91 C-1β, C-4β 6 3,82; 5,07 C-5β, C-7’B Tergaloil A 6’ 6,73; 6,74 C-2’A, C-4’A, C-5’A, C-7’A Tergaloil B 6’ 6,92; 6,93 C-2’B, C-4’B, C-5’B, C-7’B Tergaloil C 6,91 C-1’C, C-2’C, C-4’C, C-5’C, C-7’C

3.2.4. Caracterização da mistura Mc4: 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glucose e alnusiina

OH HO OH OH C OH HO OH 6' O 5' 1' 3' O OH B O HO O O 6' O O O 6 O 6 OH 1' 4 O HO O 4 O 2 O O A O 1 HO 1 OH O OH O 3' 3 O 3 2 Tergaloila HO O O O O HO OH OH 6' 1' 1' 6' OH O OH OH HO OH HHDF HO OH Galoíla HO OHHO OH

1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glucose (Mc4a) alnusiina (Mc4b)

A partir do fracionamento da fração acetato de etila das cascas da jabuticaba obteve-se a mistura Mc4 (CJAE17, 46 mg), composta de 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glucose, o espectro de RMN de 1H (Figura 16) mostrou-se muito complexo, porém alguns sinais desblindados se destacaram, tais como o dupleto em δH 6,34 (J = 8,0 Hz), o tripleto em δH 6,02 (J = 10 Hz) e os quatro simpletos acima de 7,0 ppm. Estes sinais já indicaram a presença de um grupo galoíla esterificado no carbono anomérico. Os hidrogênios e carbonos, metilênico e metínicos, do composto Mc4a (Tabela 7) foram assinalados por meio da análise dos mapas de correlação de 26

1H-13C HSQC (Figura A14) e de 1H-1H COSY (Figura A15). Este composto foi então identificado como sendo o éster galoílico 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glucose a partir dos dados de 1H e 13C e também por comparação com a literatura (BERETTA et al., 2011). Os sinais de hidrogênios e carbonos das glucoses  e  do segundo composto, Mc4b, foram identificados partindo-se dos carbonos anoméricos δC 91,2 (C-1) e 95,0 (C-1) e utilizando-se os experimentos de HSQC e COSY. Os sinais dos hidrogênios aromáticos foram assinalados por meio das correlações a longa distância 1H-13C do experimento de HMBC (Figura A16) entre hidrogênios glucosídicos e as respectivas carbonilas e estas com os hidrogênios aromáticos. Desta forma, foi possível reconhecer a presença do grupo tergaloíla, principalmente pela correlação dos sinais em δH 6,94 e 6,95 com uma carbonila em δC 163 ppm; além disso esta carbonila não se correlaciona com nenhum dos hidrogênio das glucoses. Comparando-se estes dados com o do composto Mc2, isolado das sementes, concluiu-se que ambos possuem a mesma estrutura, sendo assim Mc4b é o elagitanino alnusiina.

A = alnusiina P = penta-galoil-glucose

1 Figura 16. Espectro de RMN de H da mistura Mc4 (acetona-d6, 500 Mz).

O penta-O-galoil-β-D-glucose está presente em várias outras espécies que contém taninos hidrolisáveis, incluindo muitas plantas medicinais (OKUDA et al., 1993). Ele apresenta um amplo efeito de atividades biológicas, tais como, atividade antioxidante, anticâncer, antidiabético, efeitos gastro e cardioprotetor (BERETTA et al., 2011), atividade antiparasitária 27 contra o Tripanossoma cruzi (SANTOS et al., 2012) e atividade inibitória da lipase pancreática, que está relacionada à obesidade (KWON et al., 2013).

Tabela 7. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc4. 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glucose

C/H δH (ppm), multip., J (Hz) δ C (ppm) 1 6,34 d (8,0) 93,1 2 5,63 dd (10,0; 8,0) 71,4 3 6,02 t (10,0) 73,1 4 5,67 t (10,0) 69,2 5 4,56 m 73,5 6a 4,40 dd (12,0; 2,0) 62,2 6b 4,20 dd (12,0; 6,0) Galoilas 2’ e 6’ 6,98 s; 7,02 s; 7,07 s; 7,12 s; 7,18 s 110,0

Alnusiina δH (ppm), multip., J (Hz) δ C (ppm) C/H α anômero  anômero α anômero  anômero 1 5,50 d (4,0) 5,09 d (8,0) 91,2 95,0 2 5,09 dd (10,0; 4,0) 4,88 dd (10,0; 8,0) 75,2 78,0 3 5,51 t (10,0) 5,29 t (10,0) 75,1 77,5 4 5,20 m 5,15 m 69,2 69,2 5 4,66 m 4,27 m 67,0 71,7 6a 5,25 d (13,0) 5,28 d (13,0) 64,0 64,0 6b 3,85 dd (13,0; 2,0) 3,90 dd (13,0; 2,0) - - HHDF 6’ 6,38 s; 6,61 s 6,39 s; 6,60 s 106,1; 106,9 Tergaloila A 3’ 6,59 s; 6,63 s 106,9; 107,3 Tergaloila B 3’ 6,98 s; 7,00 s 113,0; 113,3 Tergaloila C 6’ 6,94 s; 6,95 s 110,0

3.2.5. Caracterização da mistura Mc5: estrictinina e outros compostos

OH OH HO O OH O HO O O HO O OH O O HO HO OH OH

estrictinina (Mc5a)

A mistura Mc5 foi obtida por meio do fracionamento da fração acetato de etila das sementes de jabuticaba (SJAE 17, 35,5 mg). Apesar da complexidade do espectro de RMN de 1 H (Figura 17) foi possível detectar um dupleto a δH 5,72 (J = 8,0 Hz), que correspondeu ao 28 hidrogênio anomérico de uma glucose em conformação β esterificada em C-1. Os outros hidrogênios e carbonos deste composto foram identificados por meio dos mapas de correlação HSQC e COSY (Figuras A17 e A18) e os dados se encontram na Tabela 8. O mapa de correlações a longa distância 1H-13C do experimento de HMBC (Figura A19) confirmou a presença de um grupo galoíla em C-1 e um grupo HHDF ligado aos carbonos 4 e 6. Portanto, a estrutura deste composto foi confirmada como sendo o elagitanino 1-O-galoil-4,6-O-(s)- hexahidroxidifenoil-β-D-glucose, conhecido como estrictinina, que foi isolado pela primeira vez de folhas de Casuarina stricta Ait. (Casuarinaceae) (OKUDA et al., 1982 e 1983b; YOSHIDA et al., 1984).

1 Figura 17. Espectro de RMN de H da mistura Mc5 (metanol-d4, 500 Mz).

Tabela 8. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc5a.

C/H δH (ppm), multip., J (Hz) δC (ppm) 1 5,72 d (8,0) 94,8 2 3,72 dd (9,0; 8,0) 73,3 3 3,74 m 73,3 4 4,94 t (10,0) 72,0 5 4,18 m 72,0 6a 5,26 dd (13,0; 6,0) 63,6 6b 3,85 d (13,0) - Galoila 2’ e 6’ 7,21 s 109,4 HHDF 6’ 6,52 s; 6,68 s 106,0; 107,2 a b Espectro realizado em metanol-d4. 6 : axial, 6 : equatorial.

3.2.6. Caracterização da mistura Mc6: casuarictina e outros compostos

HO 6' O HO OH HO O O 6 2' 4 HO O OH 2 O 1 O 6' O 3 O HO 6' O O OH O 6' 6'

HO OH

HO OHHO OH

casuarict ina (Mc6a)

O elagitanino casuarictina (1-O-galoil-2,3:4,6-di-O-(s)-hexahidroxidifenoil-β-D-glucose) foi identificado na fração CJM40 (8,9 mg) oriunda da fração solúvel em metanol das cascas.

1 Figura 18. Espectro de RMN de H da mistura Mc6 (acetona-d6, 500 Mz).

O espectro de RMN de 1H (Figura 18) apresentou na região dos hidrogênios aromáticos um simpleto a δH 7,20 (2H) referente a um grupo galoíla e quatro simpletos (1H cada) entre

6,41 e 6,69 ppm característicos de dois grupos HHDF. O dupleto em δH 6,22 (J = 8,8 Hz) e seu respectivo carbono a δC 91,4 revelaram a presença de esterificação da hidroxila na posição C-1 30 da β-glucose. Os deslocamentos químicos dos outros hidrogênios e carbonos glucosídicos foram assinalados por meio dos experimentos bidimensionais de HSQC e COSY (Figuras A20 e A21) e são mostrados na Tabela 9. Este elagitanino foi isolado inicialmente das folhas de duas espécies: Casuarina stricta Ait. (Casuarinaceae) e Stachyurus praecox Sieb. et Zucc. (Stachyuraceae) (OKUDA et al.,1983b; YOSHIDA et al.,1984).

Tabela 9. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc6a.

C/H δH (ppm), multip., J (Hz) δC (ppm) 1 6,22 d (8,8) 91,4 2 5,20 t (8,8) 75,1 3 5,44 dd (10,0; 8,8) 76,4 4 5,15 t (10,0) 68,6 5 4,50 dd (10,0; 6,4) 72,5 6 5,34 dd (13,0; 6,4) 62,7 6 3,90 dd (13,0) - Galoíla 2’ e 6’ 7,20 s 109,3 HHDF 6’ 6,41 s; 6,49 s; 6,60 s; 6,69 s 106,1; 106,2; 106,6; 106,8 Espectro realizado em acetona-d6.

3.2.7. Caracterização da mistura Mc7: castalagina e vescalagina

OH HO OH

OH A 6' HHDF HO 1' B O 1' O HO 6' O O R2 Flavogaloila R1 6 5 3 1 O O O O 1' HO OH 1' O C O 2' A HO 1' 3' 2' 3' OH OH B HO HO OH OH

castalagina (Mc7a) R1 = H; R2 = OH vescalagina (Mc7b) R1 = OH; R2 = H

A mistura Mc7 obtida a partir da fração solúvel em metanol das sementes de jabuticaba (SJM62, 271,2 mg) apresentou um espectro de RMN de 1H (Figura 19) menos complexo que os anteriores, apesar da presença de duas substâncias na proporção de 1:0,3. Na região dos açúcares, não foi encontrado nenhum sinal com constantes de acoplamento que fossem compatíveis com as de hidrogênios anoméricos de  e  glucoses (4 e 8 Hz, respectivamente). No experimento de HSQC (Figura A22) também não foram observados os sinais característicos 31

4 dos carbonos anoméricos de glucopiranoses na conformação C1, que ocorrem na região entre 90 e 99 ppm. Os dois experimentos mostraram sinais de carbonos entre 64,5 e 77,0 ppm e hidrogênios anoméricos com constantes de acoplamento de 4,7 e 2,3 Hz (δH 5,74 e 4,92, respectivamente), estes dados são característicos de elagitaninos C-glucosídicos, em que a glucose está na forma de cadeia aberta. O assinalamento dos outros hidrogênios e carbonos foi possível por meio dos experimentos bidimensionais de HSQC, COSY e HMBC (Figuras A22, A23 e A24). Os dados se encontram na Tabela 10. O espectro de massas da mistura (Figura

A25) apresentou o pico de íon molecular [M-H]¯ a m/z 933,0631 (calculado para C41H25O26, m/z

933,0640) que corresponde à fórmula molecular C41H26O26.

1 Figura 19. Espectro de RMN de H da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 Mz).

A comparação dos dados da mistura Mc7 com elagitaninos C-glucosídicos já conhecidos na literatura permitiu a identificação de Mc7a como castalagina e Mc7b como vescalagina, que são epímeros na posição C-1 da glucose (HERVE DU PENHOAT et al., 1991; VIVAS et al., 1995). Nessas substâncias, três hidroxilas das glucoses estão esterificadas com um grupo trifenoila, conhecido como flavogalonila, e o carbono anomérico se liga diretamente ao anel A deste grupo. Essas substâncias ocorrem com frequência em plantas das famílias Myrtaceae, Fagaceae, Betulaceae e Lythraceae entre outras (NONAKA et al., 1990) e contribuem para as propriedades sensoriais de vinhos envelhecidos em barris de carvalho, sendo que as espécies 32

Quercus petraea e Q. robur contêm cerca de 40 a 60% desses taninos por peso em suas madeiras (QUIDEAU, 2009).

Tabela 10. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc7.

δH (ppm), multip., J (Hz) δC (ppm) C/H castalagina vescalagina castalagina vescalagina 1 5,74 d (4,7) 4,92 d (2,3) 66,7 64,6 2 5,04 dd (4,7; 1,4) 5,24 dd (2,3; 1,5) 73,3 77,0 3 5,03 dd (7,0; 1,4) 4,58 t (7,0; 1,5) 65,6 67,7 4 5,24 dd (7,4; 7,0) 5,22 dd (7,4; 7,0) 68,6 68,6 5 5,62 ddd (7,4; 2,6; 1,0) 5,65 ddd (7,4; 2,6; 1,0) 70,4 70,4 6a 5,10 dd (13,0; 2,6) 5,10 dd (13,0; 2,6) 64,5 64,5 6b 4,01 d (13,0) 4,01 d (13,0) - - 1’ - - - - 2’ - - 113,3; 114,2 114,9; 114,9 3’ - - - - 4’ - - 135,5; 135,5 136,6; 136,6 5’ - - 144,4; 144,4 144,4; 144,4 6’ 6,79 s; 6,91 s 6,79 s; 6,79 s 107,7; 108,0 108,0; 108,0 7’ - - 165,5; 165,5 165,5; 165,5 HHDF B 1’ - - - - 2’ - - 114,0 114,0 3’ - - - - 4’ - - 135,0 135,0 5’ - - 144,4 144,4 6’ 6,64 s 6,63 s 106,8 106,8 7’ - - 167,7 167,7 Flavogalonila A 1’ - - 121,8 124,2 2’ - - - 118,9 3’ - - 145,9 - 4’ - - 136,6 - 5’ - - 142,6 143,5 6’ - - 114,8 116,5 7’ - - 162,6 163,2 Flavogalonila B 7’ - - 164,4 164,4 a b Espectro realizado em acetona-d6 + D2O. 6 : axial, 6 : equatorial.

3.2.8. Caracterização do composto Mc8: quercitrina

2' OH 8 HO O 5' 6' 3 6 O OH O 1'' O HO 2'' HO OH 33

O composto Mc8 foi isolado da fração acetato de etila das cascas da jabuticaba (CJAE7, 124mg). Sua estrutura foi identificada como sendo o flavonoide quercetina-3-O-α-L- ramnopiranosídeo ou quercitrina, por meio de seus espectros de RMN de 1H, COSY e HSQC e comparação com dados da literatura (CERUKS et al., 2007). 1 No espectro de RMN de H (Figura 20) observaram-se dois dupletos em δH 6,20 e 6,37 (J = 2,0 Hz, H-6 e H-8), típico do anel A tetrassubstituído de flavonoides, em que os hidrogênios se acoplam em meta. O conjunto de três sinais em δH 7,34 d (J = 2,1 Hz, H-2’); 7,30 dd (J = 2,1; 8,3 Hz, H-6’) e 6,91 d (J = 8,3 Hz, H-5’) é típico do anel aromático B trissubstituído de quercetina, com acoplamentos orto e meta.

1 Figura 20. Espectro de RMN de H do composto Mc8 (metanol-d4, 500 Mz).

O ramnosídeo foi identificado pela presença do dupleto em 5,35 ppm (J = 1,7 Hz, H-1”), referente ao hidrogênio anomérico com oxigênio em posição α e o dupleto em 0,95 ppm, com integração para três hidrogênios, correspondendo ao sinal do grupo metila. Os outros hidrogênios do açúcar e seus respectivos carbonos foram assinalados utilizando-se os experimentos bidimensionais de HSQC (Figura A26) e COSY (Figura A27) e se encontram na Tabela 11. A ligação da ramnose com o oxigênio na posição C-3 do flavonoide foi deduzida em função dos deslocamentos químicos dos hidrogênios e carbonos aromáticos e por comparação com dados da literatura (CERUKS et al., 2007). Este flavonoide já foi isolado e identificado nos frutos de M. cauliflora (REYNERTSON et. al., 2006) além de muitas outras espécies. É um flavonoide fundamental na dieta humana, 34 destacando-se o potencial antioxidante, anticarcinogênico e seus efeitos protetores aos sistemas renal, cardiovascular e hepático (BEHLING et al., 2004).

Tabela 11. Dados de RMN de 1H e 13C do composto Mc8.

C/H δH (ppm), multip., J (Hz) δ C (ppm) 6 6,20 d (2,0) 98,2 8 6,37 d (2,0) 93,0 2’ 7,34 d (2,1) 115,3 5’ 6,91 d (8,3) 115,2 6’ 7,30 dd (8,3; 2,1) 121,4 1’’ 5,35 d (1,7) 101,8 2’’ 4,22 dd (3,5; 1,7) 70,3 3’’ 3,75 dd (9,6; 3,5) 70,7 4’’ 3,34 t (9,6) 71,5 5’’ 3,42 m 70,5 CH3 0,95 d (6,1) 16,3 Espectro realizado em metanol-d4.

3.2.9. Caracterização da mistura Mc9: miricitrina, ácido elágico e ácido gálico

OH OH 2' OH O OH 2 8 O HO COOH HO O OH 6' 5 5' 6 3 HO 6 O OH OH O HO O O 1'' O OH HO 2'' HO ácido elágico (Mc9b) ácido gálico (Mc9c) OH

miricitrina (Mc9a)

Os compostos miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo, também conhecida como miricitrina (Mc9a), ácido elágico (Mc9b) e ácido gálico (Mc9c) foram obtidos em mistura na fração acetato de etila das cascas da jabuticaba (CJAE8, 319 mg). As suas estruturas foram identificadas por meio de seus espectros de RMN de 1H, COSY e HSQC e por comparação com dados da literatura (MAHMOUD et al., 2001, MOURA et al., 2011). 1 Observou-se no espectro de RMN de H (Figura 21) a presença de dois dupletos em δH 6,19 e 6,36 (J = 2,2 Hz, H-6 e H-8) referentes aos hidrogênios do anel A, quando este se encontra dihidroxilado na posição meta. A presença de apenas um simpleto em δH 7,06 (2 H) é característico de anel trihidroxilado da miricitrina.

O dupleto em δH 5,30 (J = 1,6 Hz, H-1”) referente ao hidrogênio anomérico em posição equatorial e o dupleto em δH 0,96 (J = 6,3 Hz; 3 H) relativo ao grupo metila identificam a hexose como ramnose, que está ligada à estrutura da miricitrina. Os demais hidrogênios da ramnose e 35 seus carbonos foram assinalados por meio dos experimentos de HSQC (Figura A28), COSY (Figura A29), os dados se encontram na Tabela 12.

O simpleto em δH 6,92 (H-2 e H-6) e seu respectivo carbono δC 108,3 referem-se ao ácido gálico (Moura et al, 2011), também isolado da semente da jabuticaba (SJAE6, 30,5 mg).

O outro simpleto em δH 7,52 (δC 111,8) é característico do ácido elágico (LI et al., 1999).

1 Figura 21. Espectro de RMN de H da mistura Mc9 (metanol-d4, 500 Mz).

Tabela 12. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc9.

C/H δH (ppm), multip., J (Hz) δ C (ppm) Miricitrina 6 6,19 d (2,2) 98,3 8 6,36 d (2,2) 93,2 2’ e 6’ 7,06 s 108,1 1’’ 5,30 d (1,6) 101,9 2’’ 4,24 dd (3,4; 1,6) 70,35 3’’ 3,81 dd (9,3; 3,4) 70,55 4’’ 3,35 t (9,7) 71,74 5’’ 3,50 m 70,55 CH3 0,96 d (6,3) 16,2 Ácido elágico 5 e 5’ 7,52 s 111,8 Ácido gálico 2 e 6 6,92 s 108,3 Espectro realizado em metanol-d4.

O flavonoide miricitrina e os ácidos gálico e elágico já foram isolados dos frutos de M. cauliflora (REYNERTSON et al., 2006). Miricitrina também foi encontrada em frutas do gênero 36

Pouteria (Sapotaceae) (MA et al., 2004) e Manilkara zapota (Sapodilla) (MA et al., 2003), no látex de Crotondraco (Euphorbiaceae) (TSACHEVA et al., 2004) e recentemente foi isolada do extrato aquoso de Rhuscoriaria L. (Anacardiaceae) (REGAZZONNI et al., 2013). Este flavonoide é capaz de inibir a proliferação de tumores devido à ativação da resposta imune do hospedeiro (YASUKAWA et al., 1990); possui efeito antimutagênico, atribuído à sua capacidade de captura de radicais livres (EDENHARDER; GRUNHAGE, 2003) e sua ingestão está associada ao aumento dos níveis de HDL na corrente sanguínea (KIMIRA et al., 1998). Os ácidos gálico e elágico apresentam atividades sequestradoras de radicais livres por terem hidroxilas fenólicas capazes de formar radicais mais estáveis (MOURA et al., 2011).

3.2.10. Caracterização da mistura Mc10: ácido protocatecúico e ácido cítrico

OH O 2 HO COOH HO 4 O OH O 2 6 HO 5 OH

ácido protocatecúico (Mc10a) ácido cítrico (Mc10b)

O ácido protocatecúico (Mc10a) e o ácido cítrico (Mc10b) foram obtidos das cascas da jabuticaba na fração acetato de etila (CJAE29, 40 mg). As estruturas foram identificadas por meio de seus espectros de RMN 1H, COSY, HSQC e comparação com os dados da literatura (MOURA et al., 2011). 1 No espectro de RMN de H (Figura 22) observaram-se dois dupletos em δH 7,44 ppm (J

= 2,0 Hz, H-2) e δH 7,42 ppm (J = 7,9 Hz, H-5) e um duplo dupleto δH 6,81 ppm (J = 7,9; 2,0 Hz, H-6) referente ao ácido protocatecúico. Em deslocamento químico mais baixo foram identificados dois dupletos em δH 2,80 (J = 15,6 Hz) e δH 2,92 (J = 15,6 Hz) característicos do ácido cítrico. A confirmação dos sinais dos dois ácidos foi realizada por meio dos experimentos bidimensionais de HSQC e COSY (Figuras A30 e A31), dados na Tabela 13. O ácido protocatecuico também foi obtido na fração CJM20 (8,0 mg), ele já foi isolado anteriormente dos frutos da jabuticaba (REYNERTSON et al., 2006). O ácido cítrico tem sido identificado tanto nos frutos como nos vinhos de jabuticaba (JHAM et al., 2007; FORTES et al., 2012). O ácido protocatecúico, como outros ácidos fenólicos, tem capacidade de sequestrar radicais livres e tem o potencial de proteger o organismo de reações oxidativas que podem desencadear uma série de doenças degenerativas (LI et al., 2008). O ácido cítrico é um antioxidante secundário que age por vários mecanismos de ação como ligação com metais, remoção de oxigênio, conversão de hidroperóxidos em espécies não radicalares e absorvendo radiação UV (GORDON, 2001). 37

1 Figura 22. Espectro de RMN de H da mistura Mc10 (metanol-d4, 500 Mz).

Tabela 13. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc10.

C/H δH (ppm), multip., J (Hz) δ C (ppm) Ácido protocatecúico 2 7,44 d (2,0) 116,2 5 7,42 d (7,9) 114,4 6 6,81 dd (7,9; 2,0) 122,7 Ácido cítrico 2a e 4b 2,80 dab (15,6) 42,4 2A e 4B 2,92 dAB (15,6) 42,4 Espectro realizado em metanol-d4.

3.2.11. Caracterização da mistura Mc11: ácido 2-O-(3,4-dihidróxibenzoil)-2,4,6- trihidróxifenilacético e ácido gálico.

5' OH 6'

3 HO O 7' OH 2' O 5 1 7 OH O OH

A mistura Mc11, obtida da fração metanólica das cascas (CJM24, 14 mg), apresentou um espectro de RMN de 1H (Figura 23) relativamente simples. Observaram-se sinais típicos de anel tetrassubstituído com hidrogênios em meta, δH 6,20 e δH 6,30 (simpletos largos), e anel trissubstituído com hidrogênios acoplando em orto e meta, sinais em δH 6,95; 7,58 e 7,60 ppm. Os acoplamentos foram confirmados no experimento de COSY (Figura A33). A primeira vista pareceu ser um espectro característico do flavonoide quercetina, entretanto os deslocamentos químicos dos carbonos C-3 e C-5 (δC 100,7 e 99,8 ppm), assinalados pelo experimento de HSQC (Figura A32), diferiam completamente de um flavonoide. No experimento bidimensional de HMBC (Figura A34) foram observadas correlações a longa distância entre o simpleto em δH

3,45 e os carbonos a δC 106,6, δC 150,6 e δC 156,8 do anel tetrassubstituído. Após o assinalamento de todos os carbonos (Tabela 14) e comparação com dados da literatura (HILLDEBRAND et al., 2004; LI et al., 2012) foi possível identificar o depsídeo: ácido 2-O-(3,4- dihidróxibenzoil)-2,4,6-trihidróxifenilacético. Este composto já foi isolado do fruto da jabuticaba (REYNERTSON et al., 2006) e apresentou atividade antioxidante frente aos radicais DPPH, ânion superóxido, hidroxil e ABTS•+; inibição da enzima -glicosidase, indução da enzima quinona redutase, redução da produção de interleucinas IL-8 e inibição da expressão da metaloproteinase MMP-1 (REYNERTSON et al., 2006; WANG et al., 2013; LI et al., 2012; DASTMALCHI et al., 2012). Nesta mesma fração também foi identificado o ácido gálico.

5' OH 6'

3 HO O 7' OH 2' O 5 1 7 OH O OH

1 Figura 23. Espectro de RMN de H da mistura Mc11 (metanol-d4, 500 Mz).

Tabela 14. Dados de RMN de 1H e 13C da mistura Mc11.

C/H δH(ppm), multip., J (Hz) δC (ppm) Depsídeo 1 - 106,6 2 - 150,6 3 6,20 sl* 100,7 4 - 156,8 5 6,30 sl* 99,8 6 - 156,8 7 3,45 sl* 29,0 8 - 174,8 1’ - 120,0 2’ 7,58 sl* 116,4 3’ - 144,7 4’ - 150,6 5’ 6,95 d (8,0) 114,8 6’ 7,60 d (8,0) 123,1 7’ - 165,3 Ácido gálico 2 e 6 7,09 s 109,1 Espectro realizado em metanol-d4. * simpleto largo.

4. CONCLUSÕES O estudo químico das sementes e cascas da jabuticaba permitiu o isolamento e a elucidação estrutural de quinze compostos, sendo que oito substâncias foram isoladas e identificadas pela primeira vez nessa espécie: 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glucose, pedunculagina, alnusiina, estrictinina, casuarictina, castalagina, vescalagina e o novo elagitanino cauliflorina. Em estudo anterior com frutos dessa espécie os elagitaninos pedunculagina, estrictinina e casuarictina tiveram suas estruturas sugeridas por meio de análise por cromatografia líquida acoplada com detector de massas (WU et al., 2012). No mesmo trabalho outros quatro elagitaninos também foram sugeridos, porém não foram identificados no presente estudo.

CAPÍTULO 2 – OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DAS CASCAS E SEMENTES DE JABUTICABA (Myrciaria Cauliflora)

1. OBJETIVOS O presente trabalho teve por objetivo otimizar a elaboração de extratos de casca de jabuticaba em função do tempo e volume de solvente etanol/ácido clorídrico (EtOH/HCl) e quantificação de seus compostos fenólicos (fenóis totais, taninos e antocianinas totais monoméricas) e as propriedades de cor (índice de cor e tonalidade), aplicando Metodologia de Superfície de Resposta e função Desejabilidade. Além disso, esse trabalho otimizou as condições de extração de compostos fenólicos nas sementes de jabuticaba em função do tipo de solvente (água pura, água/etanol 50% e água/metanol 50%) e quantificação de fenóis totais, taninos e flavonoides.

2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Amostras Os frutos de jabuticaba (Myrciaria cauliflora) foram coletados na Fazenda Jabuticabal (Hidrolândia, Goiás) em outubro/2013. A coleta foi realizada em cinco pomares escolhidos por conter solos de diferentes características (Figura 24 e Tabela 15). Em cada pomar escolheu-se, ao acaso, seis pés de jabuticaba dos quais foram colhidos 2 kg de frutos de cada pé, perfazendo um total de 12 kg de cada pomar.

Figura 24. Sítios de amostragem da Fazenda jabuticabal, Hidrolândia-GO. Fonte: Google. 41

Tabela 15. Resumo das principais características dos solos dos sítios de amostragem de M. cauliflora. Solo Características predominantes S1 Arenoso/argiloso (areia branca). S2 Arenoso (saibro), baixo equilíbrio de nutrientes. S3 Argiloso (com adubação orgânica), maior equilíbrio de nutrientes. S4 Arenoso/argiloso (cascalho). S5 Arenoso/argiloso, baixo equilíbrio de nutrientes.

Os frutos colhidos foram condicionados em caixas plásticas e conduzidos aos Laboratórios de Química do Câmpus Anápolis de Ciências Exatas e Tecnológicas - Henrique Santillo da Universidade Estadual de Goiás (UEG). Esses frutos foram lavados, esmagados e despolpados manualmente e se realizou a separação das cascas, polpas e sementes. Amostras das cascas obtidas de cada pomar foram selecionadas ao acaso para posteriormente serem misturadas, aproximadamente 150 g de cascas foram acondicionadas em sacos plásticos e congeladas em freezer a -20 °C. Após 24 h de congelamento, as cascas foram misturadas com 50 mL de água destilada, homogeneizadas com auxílio de um blender portátil (Black & Decker, Mixer Vertical SB50) e liofilizadas para sua desidratação. A liofilização foi realizada em liofilizador (Thermo, Heto PowerDry LL3000). Após liofilização, a amostra desidratada (cascas de jabuticaba liofilizada, CJL) foram acondicionadas em frascos com tampas herméticas e refrigeradas em geladeira a 6 ± 2 °C até elaboração dos extratos de cascas de jabuticaba. Amostras de sementes de cada pomar foram selecionadas ao acaso para posteriormente serem misturadas, aproximadamente 150 g de sementes foram acondicionadas em sacos plásticos e congeladas em freezer a -20 °C. Após 24 h de congelamento as sementes foram trituradas em moinhos de facas e liofilizadas para sua desidratação. Após liofilização, o produto desidratado (sementes de jabuticaba liofilizada, SJL) foi acondicionado em frascos com tampas herméticas sob refrigeração em geladeira a 6 ± 2 °C até elaboração dos extratos de sementes de jabuticaba.

2.2. Planejamento experimental 2.2.1. Obtenção dos extratos das cascas Com o intuito de minimizar o tempo de preparo dos extratos das cascas e o volume de solvente, em delineamento experimental ao acaso, empregou-se a técnica de planejamento composto central para dois fatores, com ponto central e quatro axiais (nove tratamentos com três repetições cada) (Figura 25). Os fatores foram o tempo de ultrassom () e volume de solvente (V) da mistura EtOH/HCl (9:1, v/v) (MONTES et al., 2005) com a finalidade de extrair a maior quantidade de compostos fenólicos (fenóis totais, taninos e antocianinas totais 42 monoméricas) e obter os melhores parâmetros de cor (índice de cor e tonalidade).

Figura 25. Planejamento composto central para dois fatores.

A escolha das variáveis  e V e seus respectivos níveis foi baseada em trabalhos realizados por Duarte et al. (2012) e Fortes et al. (2011). A Tabela 16 apresenta os níveis reais e codificados assumidos para cada uma das variáveis analisadas. Os extratos da CJL foram preparados por agitação assistida por ultrassom (Maxiclean, Merse 750) segundo Escarpa e González (2001). A variável  aplicada para cada tratamento foi complementada por mais três tempos de ultrassom, sendo cada um deles a metade do tempo estabelecido no planejamento. O volume também foi complementado de mais três volumes iguais de extração de acordo com o planejamento da Tabela 16. A extração foi realizada em tubos de ensaio adicionou-se 1,0 g de CJL e solução EtOH/HCl (9:1) em seguida foram agitados no tempo determinado no planejamento. Após a agitação, os extratos foram centrifugados e decantados para um balão de fundo redondo. Os extratos dos ensaios 1, 3 e 7 foram transferidos para balão volumétrico de 25 mL e o volume foi completado com o mesmo solvente. Os extratos dos ensaios 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10 e 11 foram concentrados em evaporador rotativo e transferidos para balão volumétrico de 25 mL. Dos ensaios do planejamento obteve- se os extratos de cascas de jabuticaba (ECJ) que foram analisados quanto aos teores de fenóis totais (FT), taninos (T), antocianinas totais monoméricas (ATM), índice de cor (IC) e tonalidade (Ton). Após a otimização realizou-se a elaboração dos extratos das cascas de cada pomar, separadamente, por agitação assistida por ultrassom (Maxiclean, Merse 750) de acordo com a metodologia descrita por Escarpa e González (2001) no tempo de ultrassom 38,4 min e volume de solvente de 10,0 mL obtidos através do algoritmo de otimização (Figura 28, página 51). 43

Tabela 16. Planejamento composto central para dois fatores com valores reais e codificados das variáveis: volume de solvente (V) e tempo de ultrassom () e níveis utilizados no preparo de extratos de casca de jabuticaba. Níveis Variáveis - -1 0 +1   (min) 9 15 30 45 51 V (mL) 4 6 10 14 16 Níveis codificados Níveis reais Ensaios x1 x2  (min) V (mL) 1 -1,0 -1,0 15 6 2 -1,0 1,0 15 14 3 1,0 -1,0 45 6 4 1,0 1,0 45 14 5 - 0,0 9 10 6  0,0 51 10 7 0,0 - 30 4 8 0,0  30 16 9 (C) 0,0 0,0 30 10 = valor dos níveis axiais do planejamento composto central para dois fatores, igual a 1,414.

2.2.2. Obtenção dos extratos das sementes Para o estudo dos parâmetros de extração das sementes de jabuticaba os fatores foram compostos pelo tipo de solo (TS) e solvente de extração (SE) constituído por água, água/etanol 50%, água/metanol 50% com a finalidade de extrair a maior quantidade de compostos fenólicos. Os extratos da SJL foram preparados aplicando agitação assistida por ultrassom (ESCARPA; GONZÁLEZ, 2001). Pesou-se 1,0 g de SJL em tubo de ensaio, adicionou-se 10 mL do solvente e agitou em banho de ultrassom (Maxiclean, Merse 750) por 30 min, à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugou-se 15 min (4000 rpm), e decantou-se o extrato para um balão volumétrico de fundo chato de 25 mL. Adicionou-se ao tubo de ensaio mais 10 mL de solvente e agitou em banho de ultrassom por 15 min, centrifugou-se e decantou-se o extrato para o mesmo balão. Essa operação foi realizada mais uma vez utilizou-se ao todo 25 mL de solvente. Os extratos foram analisados quanto aos teores de fenóis totais, taninos e flavonoides.

2.3. Quantificação dos compostos fenólicos dos extratos das cascas e sementes 2.3.1. Fenóis totais A quantificação de fenóis totais nos extratos das cascas e sementes foi determinada segundo método de Folin-Ciocalteu, descrito por Escarpa e González (2001). O extrato foi diluído em água destilada na proporção de 1:4. Em balão volumétrico de 25 mL foi adicionado 0,3 mL da amostra diluída e 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich). Após 1 min 44 acrescentou-se 4,0 mL de solução de carbonato de sódio 20% e completou-se o volume com água destilada. Após 30 min realizou-se a leitura da absorvância a 750 nm em espectrômetro (Perkin Elmer, Lambda 35 UV/Vis). Para quantificação dos fenóis totais nos extratos das cascas construiu-se a curva de calibração com ácido tânico como padrão (0,4 a 1,4 mg g-1; y = - 0,0593 + 0,3803x; r2 = 0,9896) e os resultados foram apresentados como concentração de ácido tânico equivalente, em mg g-1 de casca liofilizada. Os ensaios foram realizados em duplicatas. Para quantificação dos fenóis totais nos extratos das sementes construiu-se a curva de calibração com ácido tânico como padrão (0,2 a 1,0 mg g-1; y = - 0,0423 + 0,9982x; r2 = 0,9937) e os resultados foram apresentados como concentração de ácido tânico equivalente, em mg g-1 de semente liofilizada. Os ensaios foram realizados em duplicatas.

2.3.2. Taninos A quantificação de taninos nos extratos das cascas e sementes foi realizada segundo Waterman e Mole (1994). Amostras de extratos (1,0 mL) foram evaporadas até a metade do volume e, em seguida, diluídas com 0,5 mL de água destilada. Foram adicionados 2,0 mL da solução de albumina bovina sérica (1,0 mg mL-1) e a mistura foi agitada e deixada em repouso por 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, essa mistura foi centrifugada (Centribio, 80- 2B) por 15 min a 4000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado dissolvido em 4,0 mL de solução de SDS-trietanolamina-isopropanol e em 1,0 mL do reagente cloreto férrico 20%. Após 15 min as absorbâncias foram medidas a 510 nm em espectrômetro (Perkin Elmer, Lambda 35 UV/Vis). O branco foi preparado com solução de SDS-trietanolamina-isopropanol e solução de cloreto férrico 20%. Para quantificação dos taninos nos extratos das cascas construiu-se uma curva de calibração com ácido tânico como padrão (0,2 a 0,9 mg g-1; y = 0,0015 + 0,978x; r2 = 0,9934) e os resultados foram apresentados como concentração de ácido tânico equivalente em mg g-1 de casca liofilizada. Os ensaios foram realizados em duplicatas. Para quantificação dos taninos nos extratos das sementes construiu-se uma curva de calibração com ácido tânico como padrão (0,2 a 1,0 mg g-1; y = - 0,0116 + 1,0079x; r2 = 0,9992) e os resultados foram apresentados como concentração de ácido tânico equivalente em mg g-1 de semente liofilizada. Os ensaios foram realizados em duplicatas.

2.3.3. Antocianinas totais monoméricas A quantificação de antocianinas totais monoméricas nos extratos das cascas foi realizada segundo o método do pH diferencial descrito por Reynertson et al. (2008). O extrato (0,5 mL) foi transferido para dois balões volumétricos de 25 mL e os volumes dos balões foram completados um com solução tampão pH 1,0 e outro com solução tampão pH 4,5. As misturas foram deixadas em repouso por 15 min ao abrigo da luz e as leituras das absorbâncias foram 45 realizadas a 520 e 700 nm em espectrômetro (Perkin Elmer, Lambda 35 UV/Vis) para ambas as soluções. As concentrações de antocianinas foram expressas como cianidina-3-glucose em mg g-1 e calculadas de acordo com a Equação 1:

Concentração de antocianinas (mg g-1) = A x MM x FD (1) ε x b

A = (A520nm - A700nm) pH 1,0 - (A520nm - A700nm) pH 4,5 (absorvância) MM = 449 g mol-1 (massa molar da cianidina-3-glucose) FD = fator de diluição (50) ε = 26.900 L mol-1 cm-1 (coeficiente de extinção da cianidina-3-glucose,  = 520 nm) b = 1 (caminho ótico da cubeta em cm).

2.3.4. Índice de cor e tonalidade Para determinação do índice de cor e tonalidade nos extratos das cascas foi utilizada a metodologia descrita por Somers e Evans (1977). Uma alíquota de 0,5 mL de amostra foi adicionada a um balão volumétrico de 10 mL, completou-se seu volume com água destilada. Depois de homogeneizadas, as soluções foram deixadas em repouso por 15 min e ao abrigo da luz. Em seguida fez-se a leitura das absorvâncias em espectrofotômetro (Perkin Elmer, Lambda 35 UV/Vis) nos comprimentos de onda de 420, 520 e 620 nm. Para minimizar o efeito de interferentes foi feita uma calibração do equipamento com uma prova em branco, preparada utilizando-se água destilada em substituição à amostra. As análises foram feitas em duplicatas. O índice de cor (IC) e a tonalidade (Ton) foram calculados através das Equações 2 e 3:

IC = A420 + A520 + A620 (2)

Ton = A420/A520 (3)

2.3.5. Flavonoides A quantificação de flavonoides nos extratos das sementes foi realizada segundo método descrito na Pharmacopeia Helvetica (1990). A técnica baseia-se na propriedade dos flavonoides em absorver radiação no comprimento de onda da luz ultravioleta de forma proporcional a sua concentração. Amostras de extratos das sementes (5,0 mL) foram transferidas para balão volumétrico de 10 mL, acrescentou-se 1,0 mL de solução etanólica de cloreto de alumínio a 12% e o volume foi completado com solução etanólica de ácido acético glacial a 5%. Após 30 min, efetuou-se a leitura de absorvância a 422 nm. Para quantificação dos flavonoides construiu-se uma curva de calibração com rutina como padrão (0,03 a 0,2 mg g-1; y = 0,0397 + 0,065x; r2 = 0,9983) e os resultados foram apresentados como concentração de rutina equivalente em mg g-1 de semente liofilizada.

2.4. Análise estatística 2.4.1. Extratos das cascas As respostas analisadas dos extratos das cascas foram teor de fenóis totais, taninos, antocianinas totais monoméricas, índice de cor e tonalidade. Essas respostas foram expressas em valores médios ± desvio padrão (Tabelas 17 e 18). Os gráficos de superfície de resposta foram desenhados através do modelo matemático proposto nos níveis reais das variáveis manteve-se a resposta em função do eixo Z, com eixos X e Y as variáveis independentes. Uma vez obtido um modelo polinomial ajustado à resposta, as melhores condições do processo de extração dos compostos fenólicos foram definidas por meio do algoritmo de otimização proposto por Derringer e Suich (1980). Esse algoritmo se baseia na definição de uma função de Desejabilidade (D) restrita no intervalo de [0,1], para a qual se adotou como limites inferior, médio e superior os valores de 0, 0,5 e 1,0, respectivamente. Se a resposta for aquela que se deseja, D = 1 e se a resposta estiver fora da região aceitável, D = 0. Assim, as variáveis independentes são escolhidas de modo a maximizar a Desejabilidade global. A análise estatística e os gráficos de superfície de resposta foram obtidos por meio do programa Statistica for Windows versão 8.0 da StatSoft (2007).

2.4.2. Extratos das sementes As respostas analisadas para os extratos das sementes foram teor de fenóis totais, taninos e flavonoides. Essas respostas foram expressas em valores médios ± desvio padrão (LUNET et al., 2006). Com o intuito de verificar os efeitos que causam as variáveis tipos de solo e solventes de extração, um delineamento experimental inteiramente casualizado (DIC) foi aplicado com três repetições, contendo os fatores compostos fenólicos e solvente de extração. Os dados foram submetidos à análise de variância e quando significativa a nível de 5% de probabilidade, aplicou-se o teste de Tukey (GOMES, 2000). As análises estatísticas foram feitas usando o programa Statistica for Windows versão 8.0 da StatSoft (2007).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Constituintes fenólicos dos extratos das cascas O conteúdo fenólico pode ser usado como um indicador da capacidade antioxidante para qualquer produto que se destina a ser utilizado como fonte natural de antioxidantes em alimentos funcionais (VIUDA-MARTOS et al., 2012). Em função disso foi realizada uma otimização da extração de compostos fenólicos das cascas de jabuticaba segundo um planejamento experimental (Tabela 16, página 43). Os experimentos foram conduzidos aleatoriamente em planejamento composto central para dois fatores. Os níveis dos fatores utilizados, bem como as respostas obtidas correspondentes aos fenóis totais, taninos e antocianinas totais monoméricas para o processo de extração baseada em agitação assistida por ultrassom, estão especificados na Tabela 17. 47

Tabela 17. Respostas* obtidas para compostos fenólicos: fenóis totais (FT), taninos (T) e antocianinas totais monoméricas (ATM) para os extratos das cascas de jabuticaba.

Ensaio  (min) Tempo V (mL) Volume FT (mg g-1) T (mg g-1) ATM (mg g-1) total total (min) (mL) 1 15 37,5 6 24 17,1 ± 0,18 4,32 ± 0,03 3,15 ± 0,03 2 15 37,5 14 56 20,3 ± 0,18 4,67 ± 0,05 3,45 ± 0,09 3 45 112,5 6 24 31,4 ± 0,13 6,06 ± 0,04 5,15 ± 0,03 4 45 112,5 14 56 29,6 ± 0,18 5,26 ± 0,18 4,69 ± 0,03 5 9 22,5 10 40 15,9 ± 0,14 3,42 ± 0,02 2,33 ± 0,03 6 51 127,5 10 40 27,5 ± 0,18 4,96 ± 0,04 4,10 ± 0,41 7 30 75,0 4 16 24,3 ± 0,14 5,33 ± 0,01 4,25 ± 0,15 8 30 75,0 16 64 33,5 ± 0,05 7,91 ± 0,08 5,57 ± 0,03 9 (C) 30 75,0 10 40 27,2 ± 0,28 6,64 ± 0,09 5,13 ± 0,06 * Médias ± desvio padrão obtidos de duplicatas.

A jabuticaba pode ser considerada como um fruto rico em compostos fenólicos, quando comparado com outros frutos tradicionais como uva (AROZARENA et al., 2002; ORTEGA- MEDER et al., 1994). As concentrações de FT, T e ATM variaram de 15,9 a 33,5 mg g-1, 3,42 a 7,91 mg g-1 e 2,33 a 5,57 mg g-1, respectivamente (Tabela 17). Na Figura 26 pode-se observar que as superfícies de respostas para as variáveis dependentes (FT, T e ATM) foram ascendentes, indicando que a alteração do tempo de ultrassom e o volume do solvente EtOH/HCl aumentou o teor de compostos fenólicos, chegando até um limite máximo de extração experimental de 33,5; 7,91 e 5,57 mg g-1 para FT, T e ATM, respectivamente, valores referentes ao ensaio 8 (Tabela 17). Após, observou-se a ocorrência de diminuição nos teores de compostos fenólicos, principalmente para taninos e antocianinas, conforme altera o volume de solvente e aumenta o tempo de extração em que as cascas ficam expostas ao ultrassom (Figura 26). Esse fato pode ocorrer devido à ação das enzimas óxido-redutases que degradam os compostos fenólicos (CARRERA et al., 2012, DERKYI et al., 2011) e também pela polimerização das antocianinas monoméricas, o que provoca a diminuição de suas concentrações (MALACRIDA; MOTTA, 2005). Por isso, o tempo de ultrassom deve ser otimizado para evitar processos de oxidação, degradação e polimerização destes compostos causados por prolongados períodos de extração. 48

Figura 26. Superfícies de resposta para as variáveis dependentes: (a) fenóis totais, (b) taninos e (c) antocianinas totais monoméricas.

As concentrações de FT e ATM do ensaio 8 estão acima daquelas obtidas por Santos et al. (2010) que obtiveram 26 mg g-1 FT e 4,7 mg g-1 ATM, para cascas de jabuticaba, utilizando etanol e banho de ultrassom por 2 h. Por outro lado, Fortes et al. (2011) extraíram 12,5 mg g-1 de ATM de cascas de frutos maduros empregando 40 mL de solvente e 75 min de extração em banho de ultrassom, porém eles utilizaram metanol/ácido fórmico (9:1) como solvente. No mesmo estudo, as concentrações de FT e T, 32,9 e 7,21 mg g-1 respectivamente, ficaram abaixo do obtido no ensaio 8. Já foi reportado que metanol é mais eficiente para extração de antocianinas (KAPASAKALIDIS et al., 2006), de fato, metanol pode ser 20% mais efetivo do que etanol em extrair antocianinas do bagaço de uva (METIVIER et al., 1980), apesar das indústrias de alimentos preferirem o etanol devido à maior toxicidade do metanol. As propriedades de cor de extratos vegetais estão intimamente ligadas às concentrações de seus compostos fenólicos e suas interações. Os níveis dos fatores utilizados bem como as respostas obtidas correspondentes o índice de cor e à tonalidade para o 49 processo de extração baseada em agitação assistida por ultrassom, estão especificados na Tabela 18. O indíce de cor variou de 0,257 a 1,125 u.a. e a tonalidade de 0,760 a 1,133, sendo que os valores mínimos ocorreram no ensaio 5, porém os máximos foram obtidos em ensaios diferentes para cada variável dependente (Tabela 18).

Tabela 18. Respostas* obtidas para as propriedades de cor: índice de cor (IC), tonalidade (Ton) e densidades ópticas a 420, 520 e 620 nm para os extratos das cascas de jabuticaba.

Ensaio  (min) V (mL) IC Ton A420 A520 A620 1 15 6 0,411 ± 0,004 0,808 ± 0,011 0,167 0,206 0,038 2 15 14 0,461 ± 0,008 0,833 ± 0,007 0,205 0,246 0,010 3 45 6 0,920 ± 0,012 1,133 ± 0,011 0,477 0,421 0,022 4 45 14 0,999 ± 0,003 0,901 ± 0,004 0,462 0,513 0,024 5 9 10 0,257 ± 0,011 0,760 ± 0,022 0,105 0,139 0,013 6 51 10 1,125 ± 0,002 0,982 ± 0,005 0,536 0,546 0,043 7 30 4 0,633 ± 0,003 0,961 ± 0,011 0,294 0,306 0,033 8 30 16 0,893 ± 0,008 0,833 ± 0,011 0,389 0,467 0,037 9(C) 30 10 0,879 ± 0,007 1,035 ± 0,019 0,436 0,421 0,022 * Médias ± desvio padrão obtidos de duplicatas.

Na Figura 27 nota-se que o tempo de extração exerceu maior efeito no índice de cor dos extratos do que o volume de solvente empregado. O aumento do índice de cor foi proporcional ao tempo de ultrassom utilizado, chegando ao máximo de 1,125 u.a. no ensaio 6 (Tabela 18 e Figura 27a). Este valor máximo de IC coincide com o máximo de absorção nos três comprimentos de onda medidos, 420, 520 e 620 nm (Tabela 18). Já para a tonalidade não ocorreu a mesma tendência em todos os volumes de solvente utilizados. Observa-se na Figura 27b que a curva é ascendente em volumes menores de solvente, porém conforme o volume aumenta ocorre um máximo e depois os valores decrescem. Os máximos de tonalidade, 1,133 e 1,035, coincidem com os ensaios 3 e 9 onde a absorção em 420 nm foi maior que em 520 nm (Tabela 18). Glories (1984) define índice de cor como a soma das densidades ópticas, medidas nos comprimentos de onda de 420, 520 e 620 nm. O comprimento de onda de 420 nm (cor alaranjada) indica a maior quantidade de taninos, a polimerização dos taninos e a combinação dos taninos com as antocianinas. O comprimento de onda de 520 nm indica a tendência da cor vermelha e maiores quantidades de ATM; o comprimento de onda de 620 nm indica à tendência à cor violeta-azul, produto das condensações entre catequinas e antocianinas.

(a) (b)

Figura 27. Superfícies de resposta para as variáveis dependentes: (a) Índice de cor e (b) Tonalidade para os extratos de cascas de jabuticaba.

Um maior índice de cor está relacionado à contribuição dos comprimentos de ondas em 420, 520 e 620 nm. No ensaio 6 (Tabela 18) o comprimento de onda em 520 nm indica um maior conteúdo de antocianinas monoméricas ou antocianinas complexadas com co- pigmentos, que podem ser flavonoides, ácidos fenólicos ou outras antocianinas (CASTANEDA- OVANDO et al., 2009). Quando ocorre a copigmentação, a intensidade da absorção aumenta (efeito hipercrômico) e há um pequeno deslocamento batocrômico para maiores comprimentos de ondas (525 nm), sendo que a estabilidade da cor aumenta através dessa interação da antocianina com o copigmento (BORDIGNON-LUIZ et al., 2007; SARI et al., 2012).

Já, os fatores que podem aumentar a tonalidade (A420/A520) são a polimerização dos taninos e a combinação dos mesmos com as antocianinas, fenômenos esses que aumentam o valor A420. A polimerização das antocianinas também promove a mudança da coloração vermelha para o amarronzado, ou seja, aumento da absorção em 420 nm e diminuição em 520 nm (PACHECO-PALENCIA; TALCOTT, 2010). Comparando-se os resultados obtidos para FT, T e ATM (Tabela 17) com os parâmetros de cor (Tabela 18) constatou-se que, apesar da diminuição do conteúdo de todos os fenóis nas extrações mais prolongadas, houve um aumento do índice de cor. Esse fato pode ser explicado por um conjunto de interações e reações que possivelmente ocorreram durante os maiores tempos de extração, Ou seja, a polimerização das antocianinas e/ou taninos ou a combinação dos mesmos, aumenta a absorvância no comprimento de onda 420 nm, enquanto que a copigmentação de antocianinas com flavonoides e outros fenóis aumentou o comprimento de onda 520 nm, e as condensações com catequinas podem ter aumentado o valor de comprimento de onda de 620 nm. 51

Os maiores valores da tonalidade, ensaios 3 e 9, podem ser decorrentes de uma maior polimerização das taninos, o que faria A420 ser maior que A520, tornando o extrato mais alaranjado. Os melhores ensaios são aqueles onde os valores dos índices de cor são maiores que os das tonalidades, como nos ensaios 4, 6 e 8, pois nesses casos a coloração é mais intensa e com tons mais avermelhados. A Figura 28 mostra os resultados do algoritmo de otimização. As linhas tracejadas verticais sinalizam as condições de máxima Desejabilidade global, que neste caso chegou a 0,796, tempo de ultrassom e volume de solvente EtOH/HCl igual a 38,4 min e 10,0 mL, respectivamente.

Figura 28. Otimização do teor de compostos fenólicos e propriedades de cor em função do tempo de ultrassom e do volume de solvente EtOH/HCl.

Nessas condições, o extrato experimental apresentou 29,1; 6,50 e 5,24 mg g-1 de fenóis totais, taninos e antocianinas, enquanto que as variáveis de cor obtido foi 1,00 u.a. e 1,06 para índice de cor e tonalidade, respectivamente (Figura 28). Um aspecto importante no preparo de extratos vegetais é de obter o máximo de concentração de seus constituintes com menor degradação. Nesse sentido foi aplicada a função Desejabilidade visando estabelecer as melhores condições de tempo de ultrassom e volume de solvente EtOH/HCl para a obtenção de extratos de CJL com maior quantidade de fenóis totais, taninos e antocianinas, e como consequência, maior índice de cor e tonalidade. 52

A Tabela 19 mostra as condições da função Desejabilidade para cada variável dependente, os resultados da Desejabilidade global e dos preditos.

Tabela 19. Otimização da função Desejabilidade dos teores de FT, T, ATM, IC e Ton obtidos em função do tempo de ultrassom () e volume (V) de solvente para os extratos das cascas de jabuticaba.

Desejabilidade FT (mg g-1) T (mg g-1) ATM (mg g-1) IC Ton

di=0,0 15,8 3,40 2,32 0,25 0,74

dm= 0,5 24,6 5,68 3,95 0,69 0,94

ds= 1,0 33,5 7,95 5,54 1,13 1,14 D= 0,796 29,1 6,50 5,24 1,00 1,06 * Dados experimentais.

Para a elaboração dos extratos das cascas de jabuticabas obtidas de cada pomar, aplicou-se o tempo de ultrassom de 38,4 min e volume de solvente de 10,0 mL obtidos na máxima Desejabilidade da Figura 28. Os resultados dos teores de FT, T, ATM, IC e Ton estão na Tabela 20. Os extratos obtidos das cascas de jabuticaba dos solos S2 e S5 apresentaram os maiores teores de FT, T, ATM e IC e os menores teores de Ton, enquanto o solo S3 apresentou os menores teores desses compostos fenólicos. Na Tabela 20 se observa que houve diferenças significativas entre os tipos de solo e os teores dos compostos fenólicos (FT, T, ATM, IC e Ton) de acordo com o teste Tukey aplicado.

Tabela 20. Respostas* obtidas de máxima Desejabilidade para compostos fenólicos: FT, T, ATM e propriedades de cor: IC e Ton para os extratos das cascas de jabuticaba.

Solo FT (mg g-1) T (mg g-1) ATM (mg g-1) IC Ton S1 26,28 ± 0,15 d 5,33 ± 0,03 d 4,25 ± 0,02 c 0,81 ± 0,07 d 0,93 ± 0,09 b S2 28,49 ± 0,20 b 6,63 ± 0,08 b 5,13 ± 0,03 b 0,95 ± 0,15 b 0,55 ± 0,12 d S3 24,28 ± 0,17 e 4,27 ± 0,06 e 3,84 ± 0,03 d 0,63 ± 0,09 e 1,07 ± 0,06 a S4 27,34 ± 0,06 c 5,75 ± 0,06 c 4,28 ± 0,02 c 0,91 ± 0,22 c 0,75 ± 0,03 c S5 29,81 ± 0,05 a 7,17 ± 0,08 a 5,57 ± 0,01 a 1,20 ± 0,01 a 0,33 ± 0,02 e * Médias ± desvio padrão obtidos de duplicatas. Médias seguidas por letras diferentes nas colunas diferem significativamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

3.2. Constituintes fenólicos dos extratos das sementes Pela Tabela 21 observa que os teores de compostos fenólicos são influenciados pelos tipos de solo e solvente de extração. O melhor solvente de extração é a água/metanol (50%), seguida do água/etanol (50%) e água pura em todos os tipos de solo de cultivo das plantas. Montes et al. (2005) mostraram que a utilização de metanol ou etanol como solventes de extração não apresentou um efeito significativo no rendimento final, mas a eficiência do processo foi afetada pela concentração do solvente. Metivier et al. (1980) relataram que o 53 metanol foi 20% mais eficaz que o etanol e 73% mais eficaz do que a água na recuperação de compostos fenólicos nos extratos de uvas.

Tabela 21. Teores de fenóis totais, taninos e flavonoides contidos nos extratos obtidos das sementes de jabuticaba.

Tipo de Solo Solvente Água pura Água/ etanol (50%) Água/ metanol (50%) Fenóis totais (mg g-1) S1 5,65 ± 0,12 dC 7,25 ± 0,20 dB 7,63 ± 0,06 dA S2 6,13 ± 0,08 cC 8,40 ± 0,24 cB 9,15 ± 0,05 cA S3 4,64 ± 0,11 eC 4,85 ± 0,09 eB 6,68 ± 0,07 eA S4 9,40 ± 0,10 aC 11,92 ± 0,05 aB 15,71 ± 0,04 aA S5 7,13 ± 0,02 bC 9,78 ± 0,14 bB 14,20 ± 0,10 bA Taninos (mg g-1) S1 4,87 ± 0,06 dC 6,85 ± 0,03 dB 7,72 ± 0,07 dA S2 5,15 ± 0,02 cC 8,55 ± 0,02 cB 9,57 ± 0,04 cA S3 3,71 ± 0,00 eC 4,96 ± 0,03 eB 6,62 ± 0,01 eA S4 8,96 ± 0,02 aC 11,80 ± 0,07 aB 12,65 ± 0,02 aA S5 6,67 ± 0,03 bC 9,98 ± 0,02 bB 10,57 ± 0,02 bA Flavonoides (mg g-1) S1 32,41 ± 0,17 dC 41,43 ± 0,27 dB 44,26 ± 0,02 dA S2 35,45 ± 0,31 cC 46,46 ± 0,23 cB 48,41 ± 0,29 cA S3 20,51 ± 0,28 eC 32,71± 0,17 eB 40,23 ± 0,03 eA S4 53,62 ± 0,32 aC 60,33 ± 0,07 aB 64,14 ± 0,38 aA S5 46,43 ± 0,36 bC 55,87 ± 0,07 bB 56,54 ± 0,36 bA Médias ± desvio padrão obtidos de duplicatas. Médias seguidas por letra minúscula diferente na coluna e maiúscula na linha diferem significativamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

A análise revelou que S4, solo arenoso/argiloso (cascalho) com pouca quantidade de nutrientes, apresentou significativo conteúdo de compostos fenólicos em todos os solventes de extração. De acordo com Close et al. (2005), esse fato pode estar associado ao poder antioxidante desses compostos, que atuam na proteção dos frutos contra estresses abióticos. Os extratos obtidos das sementes de jabuticaba provenientes do S4 apresentaram os maiores teores de fenóis totais, taninos e antocianinas totais monoméricas nos solventes água/metanol, seguido do S5, S2, S1 e S3, respectivamente. De acordo como o teste Tukey ao nível de 5% de significância houve diferenças entre as médias dos teores dos compostos fenólicos para os resultados que comparam tipo de solo e solvente de extração (Tabela 21). Os teores dos compostos fenólicos aumentaram para o solvente água/metanol 50% em todos os extratos obtidos das sementes, indicando que o processo foi efetivo para extrair os compostos 54 fenólicos. A proporção de 50% dos solventes etanol e metanol adicionada à água foi utilizada para que não houvesse interferência na complexação dos taninos com as proteínas. De acordo com Montes et al. (2005), o tipo de solvente e sua concentração são fatores significativos (p < 0,001) que influenciam os parâmetros de cor. A luminosidade está relacionada com a transmissão de luz, valores baixos são desejáveis, uma vez que estão relacionados com a extração de antocianinas mais eficientes. Os resultados da análise de variância apresentados na Tabela 22 mostram os efeitos estimados para os diferentes fatores estudados. Como pode ser observado, houve interação entre os fatores tipo de solo e solvente de extração (p < 0,01) indicando que a extração dos compostos fenólicos ocorreu devido ao efeito sinérgico causado por essas variáveis independentes.

Tabela 22. Análise de variância para as médias de teores de FT, T e FLA obtidos em função do tipo de solo e solvente de extração para os extratos das sementes de jabuticaba.

Fenóis totais (FT) Taninos (T) Flavonoides (FLA)

Fonte da variação g. l. MQ Fc MQ Fc MQ Fc Tipo de Solo (TS) 4 93,16 6562,73** 72,33 4360,42** 1467,55 1730,34** Solvente: S1 2 4,43 312,34** 4,375 263,71** 169,79 200,19** Solvente: S2 2 9,86 694,98** 12,808 772,07** 196,19 231,32** Solvente: S3 2 5,03 354,59** 5,612 338,29** 417,19 491,89** Solvente: S4 2 40,29 2838,63** 83,614 5040,22** 134,21 158,25** Solvente: S5 2 51,03 3594,85** 47,423 2858,61** 140,05 165,13** Solvente de Extração (SE) 2 83,60 5889,74** 112,62 6788,49** 977,21 1152,20** Tipo de Solo: Água 4 13,12 924,61** 3,29 198,293** 621,47 732,75** Tipo de Solo: Água/etanol (50%) 4 28,23 1988,61** 31,30 1886,489** 537,16 633,35** Tipo de Solo: Água/metanol (50%) 4 65,33 4602,34** 58,36 3517,843** 349,02 411,52** TS x SE 8 6,76 476,41** 10,30 621,10** 20,05 23,64** Erro 45 0,01 -- 0,01 -- 0,85 -- Total 59 ------(FT) CV (%) = 1,390 ------(T) CV (%) = 1,701 ------(FLA) CV (%) = 2,029 ------g. l. = Graus de liberdade; MQ = quadrado médio; Fc = Teste F calculado; valor-p = Probabilidade; Ft = Teste F tabelado. ** altamente significativo ao nível de 5 e 1 % de probabilidade.

O teor de compostos fenólicos em tecidos vegetais tem sido relacionado com a disponilibilidade de luz e nutrientes (KRAUS et al., 2004). Alguns estudos mostram que a produção de compostos fenólicos diminui com uma alta disponibilidade de nitrogênio e aumenta com a deficiência de nitrogênio (LOPONEN et al., 1998; HAUKIOJA et al.1998). Enquanto outros estudos mostram uma correlação positiva entre compostos fenólicos e 55 disponibilidade de luz (INGERSOLL et al., 2010; HAGEN et al., 2007). Essa tendência foi observada na semente do S3 que apresentou baixos teores de compostos fenólicos no solo adubado com baixa luminosidade solar, enquanto que os solos com baixo equilíbrio de nutrientes apresentaram os maiores teores de compostos fenólicos. Esses resultados corroboram com os encontrados por Duarte et al. (2010) no estudo com o fruto de jabuticaba proveniente da mesma espécie. Devido ao elevado teor de compostos fenólicos encontrados na casca e sementes de jabuticaba, sugere-se que elas sejam empregadas como fonte potencial de pigmentos naturais a serem aproveitados pelas indústrias alimentícias, farmacêuticas e químicas. Portanto, deve- se buscar alternativas para a utilização desse fruto a fim de se fazer uso das suas propriedades antioxidantes, bem como aumentar a vida útil do fruto.

4. CONCLUSÕES A partir da combinação dos fatores, tempo de ultrassom e volume de solvente EtOH/HCl conseguiu-se elaborar extratos de casca de jabuticaba com maiores quantidades de compostos fenólicos. Nas condições experimentais com o tempo total de 75 min de ultrassom e volume total de solvente EtOH/HCl de 64 mL foram obtidas as maiores quantidades de fenóis totais (33,5 mg g-1), taninos (7,9 mg g-1) e antocianinas totais monoméricas (5,57 mg g-1), com índice de cor e tonalidade de 0,893 u.a. e 0,833, respectivamente. De acordo com a Metodologia de Superfície de Resposta aplicada aos dados experimentais para os fatores tempo de agitação assistido por ultrassom e volume de solvente, o tempo de ultrassom exerceu maior efeito na extração dos compostos fenólicos da casca de jabuticaba. De acordo com a função Desejabilidade, a melhor condição do processo de elaboração de extratos de casca de jabuticaba seria uma combinação de tempo de ultrassom de 38,4 min e volume de solvente EtOH/HCl de 10,0 mL. Na quantificação de compostos fenólicos das semente, os extratos provenientes do S4 apresentaram os maiores teores em água pura, água/etanol 50% e água/metanol 50%, sendo que a extração no solvente água/metanol 50%, obteve-se 15,71 mg g-1 de fenóis totais, 12,65 mg g-1 de taninos e 64,14 mg g-1 de flavonoides. Isso indica que o sistema de solventes água/metanol 50% pode ser considerado o mais adequado para a extração de compostos fenólicos (MONTES, 2005).

CAPÍTULO 3 – INFLUÊNCIA DE FATORES EDÁFICOS NA COMPOSIÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E DE COMPOSTOS FENÓLICOS DAS CASCAS E SEMENTES DE JABUTICABA (Myrciaria Cauliflora)

1. OBJETIVOS Neste trabalho objetivou-se determinar a influência de fatores edáficos e de nutrientes dos frutos na composição físico-química e de compostos fenólicos das cascas e sementes da jabuticaba, cultivadas em cinco tipos de solo. Estudar as correlações entre os dados da composição química das cascas e sementes com os nutrientes dos solos e dos frutos através de técnicas de análise estatística multivariada.

2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Obtenção das amostras Os frutos foram coletados na Fazenda Jabuticabal, localizada no município de Hidrolândia, Goiás na safra de 2013. Foram coletadas amostras de frutos de 25 plantas em cinco tipos de solo com idades das plantas variando de 10 a 35 anos (Figura 24, Tabela 15, página 40 e 41, respectivamente e Tabela 23). Os frutos foram lavados com água corrente e as sementes separadas das cascas manualmente. Para determinação da composição química da jabuticaba, as cascas e as sementes foram secas em estufa de circulação forçada a 45 ± 5 ºC por 48 h. Em seguida foram moídas no moinho de facas Perten Laboratory Mill 3100, identificadas e armazenadas em frascos hermeticamente fechados até a realização das análises.

Tabela 23. Sítios de amostragem das plantas de M. cauliflora. Solos Número de amostras Latitude (S) Longitude (W) Idade das plantas (anos) S1 5 16° 55' 25,5" 49° 21' 53,5" 10 S2 5 16° 55' 26,9" 49° 21' 51,8" 20 S3 5 16° 55' 28,8" 49° 21' 42,0" 35 S4 5 16° 55' 30,1" 49° 21' 49,7" 15 S5 5 16° 54' 41,4" 49° 21' 35,8" 20

2.2. Composição química das cascas e sementes As análises de composição química e de carboidratos totais foram realizadas no laboratório de Enzimologia da Universidade Estadual de Goiás (UEG) – Câmpus Anápolis de Ciências Exatas e Tecnológicas - Henrique Santillo. 57

As cascas e as sementes foram analisadas utilizando-se os métodos da Association of Official Analytical Chemists (2006) com os seguintes parâmetros: a umidade foi determinada por secagem a 105 C; o teor de lipídeos foi calculado pela perda de peso após extração com hexano em aparelho Soxhlet; o teor de cinzas foi determinado por aquecimento em mufla a 600 C durante 6 h; a quantidade de proteínas foi obtida de acordo com o método de Kjeldahl e os níveis de fibras alimentares (solúvel e insolúvel) foram determinados de acordo com o método gravimétrico enzimático. Todas as análises foram realizadas em triplicatas. Os carboidratos totais, ou fração nifext (fração livre de nitrogênio), foram determinados por diferença de acordo com a fórmula: Carboidratos = 100 - % de (água + lipídeos + cinzas + proteínas + fibra bruta)

2.3. Determinação do teor de nutrientes nas cascas e sementes dos cinco pomares 2.3.1. Digestão das amostras Pesou-se 0,5 g de cascas e sementes em tubo para digestão de amostras, acrescentou- se 6 mL de solução nitro-perclórica – HNO3:HClO4 (2:1). Em seguida, os tubos foram colocados em bloco digestor. Iniciou-se o aquecimento à temperatura de 50 oC e foi aumentando gradativamente (50 em 50 oC) até atingir a temperatura de 210 oC, durante um período de tempo de 30 min. A digestão completa foi observada quando obteve-se uma solução incolor. Após atingir a temperatura ambiente, a solução foi transferida para tubo do tipo falcon e o volume foi completado para 50 mL, com água deionizada.

2.3.2. Análise dos nutrientes As análises dos nutrientes das cascas e sementes foram realizadas por espectrofotometria de absorção atômica, espectrometria de chama de emissão e colorimetria. Os seguintes nutrientes foram quantificados: Cu, Fe, Mn, Zn, P, K, Ca e Mg. As análises foram realizadas no Laboratório de Análise de Solos da Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás (UFG).

2.4. Análise química do solo Amostras de solo foram coletadas em uma profundidade de 0-10 cm em cinco pomares localizados na Fazenda Jabuticabal. As amostras foram secas ao ar, misturadas e peneiradas (2 mm). A porção mais fina (< 2 mm) foi mantida para a análise físico-química. A textura (argila, silte e areia) do solo, matéria orgânica (M.O.), capacidade de troca catiônica (CTC), potencial de acidez (H+Al) foram determinadas por meio da aplicação dos métodos habituais (SILVA, 1999). O pH foi determinado em um volume de água-solo na razão 1:1. Os elementos Ca, Mg e Al foram extraídos com KCl 1 mol L-1; P, K, Cu, Fe, Mn e Zn foram extraídos com solução Mehlich. As análises foram realizadas no Laboratório de Análise de Solos da Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás (UFG). 58

2.5. Análise estatística A análise estatística multivariada foi conduzida no programa Canoco (Canonical Community Ordination) versão 5.0 (Biometrics, The Netherlands, 2012). Os constituintes químicos foram ordenados em uma matriz resposta, com as linhas representando as amostras e as colunas as variáveis químicas. Os parâmetros físico-químicos do solo e dos nutrientes minerais de cascas e sementes dos frutos foram ordenados em outra matriz de dados explicativos (matriz ambiental) com as linhas representando as amostras e as colunas contendo as variáveis. Para a escolha do método de ordenação utilizou-se o comprimento do gradiente das variáveis explicativas (ambiental) em unidades de desvio padrão (DP), obtido por meio da análise de correspondência destendenciada (DCA). Essa análise avalia a magnitude da dispersão na matriz de resposta em relação à matriz explicativa ao longo do primeiro eixo de ordenação. Nesse estudo, foram obtidos valores de gradientes menores do que 2,0 unidades de desvio padrão, sendo considerados uniformes (lineares). Dessa forma, utilizou-se a análise de redundância canônica (RDA), a qual se assemelha a uma PCA condicionada, em que a matriz de dados explicativa condiciona o posicionamento dos pesos das variáveis na matriz resposta (LEPŠ; ŠMILAUER, 2007). O teste de permutação de Monte Carlo irrestrito (999 permutações) foi utilizado para avaliar a significância dos autovalores canônicos. Na RDA, o fator de inflação da variância (VIF) juntamente com a técnica de Bonferroni sequencial foi utilizado para guiar a seleção das variáveis explicativas, evitando a multicolinearidade nas regressões multivariadas. Valores de VIF > 20 são considerados fortemente multicolineares (LEPŠ; ŠMILAUER, 2007). A análise de agrupamento hierárquico (HCA) foi utilizada a fim de detectar os agrupamentos naturais provenientes da ordenação pelas RDAs e suas relações intra e intergrupos. A análise de HCA utilizou a distância Euclidiana com a minimização da variância pela a técnica de Ward (1963). Em adição às técnicas anteriores, o particionamento da variação total da matriz resposta foi obtido por meio de RDA parciais (pRDAs), utilizando a matriz explicativa reordenada em dois ou três grupos de variáveis (BORCARD et. al., 1992; LEGENDRE; LEGENDRE, 2003). Os termos significativos em cada grupo de variáveis foram selecionados pelo procedimento de seleção progressiva de variáveis disponível no Canoco, com o nível de significância ajustado pela correção de Bonferroni e utilizando o VIF da variável como critérios para avaliar a multicolinearidade nas regressões múltiplas e diminuir erro tipo I (TER BRAAK; ŠMILAUER, 2012; LEPŠ; ŠMILAUER, 2007). O particionamento da variação total dos dados da matriz resposta resultou em diferentes frações de variação dos dados sem ou com a sobreposição entre diferentes grupos de variáveis explicativas. 59

Antes da análise multivariada, os dados foram pré-processados: a matriz resposta foi transformada para log (x+1), centrada e, na maioria das análises, autoescalonada, enquanto que a matriz explicativa foi centrada e autoescalonada. Os valores das médias foram comparados utilizando-se a análise de variância (ANOVA) pelo procedimento SAS GLM (STATISTICAL ANALYSIS SYSTEMS, SAS, 1997). A homocedasticidade das variâncias foi verificada com o uso do teste de Hartley. Nos casos em que se revelaram desvios significativos da hipótese nula as variáveis foram submetidas à transformação pela ordem dos mesmos (rank). Aplicou-se o teste de Tukey para a comparação das média e as diferenças entre as médias foram estabelecidas. Os resultados são apresentados como valores médios e pelo desvio padrão das medições independentes em alguns casos. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da composição centesimal das cascas e sementes de jabuticaba em função dos cinco tipos de solo se encontram na Tabela 24. As cascas e as sementes desse fruto são ricas em fibras e carboidratos, segundo os dados. De acordo com a análise de variância das médias observou-se diferenças significativas entre as médias segundo o teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. A umidade das cascas e das sementes nos cinco tipos de solos tiveram seus valores compreendidos entre 15,24-20,48% e 14,52-31,01%, respectivamente (Tabela 24). Entretanto, não foi observada a mesma tendência na variação da umidade entre diferentes solos para cascas e sementes. Enquanto as cascas provenientes do solo S2 apresentaram a maior umidade (20,48), nas sementes obteve-se o maior teor de umidade (31,01) no solo S3. Leite-Legatti et al. (2012) estudaram a composição química das cascas de jabuticaba e encontraram teor de umidade de 15,33%. Enquanto que Gurak et al. (2014) so comparar os frutos inteiros, cascas e bagaços de jabuticaba encontraram teores de umidade de 18,1; 15,2 e 11,5%, respectivamente. Os teores de lipídeos de cascas e sementes variaram na faixa de 0,45-0,49% (Tabela 24) e ocorreram diferenças significativas entre os diferentes solos, sendo que os S1 e S2 apresentaram maiores quantidades de lipídeos tanto nas cascas quanto nas sementes. Os teores médios de lipídeos encontrados por Alezandro et al. (2013a) nos frutos inteiros das variedades Paulista e Sabará foram 0,55% e 0,40%, enquanto que Gurak et al. (2014) encontraram para os frutos inteiros e cascas de jabuticaba teores de 0,53 e 0,83%, respectivamente. As quantidades de cinzas presentes nas cascas e nas sementes de jabuticaba variaram nas seguintes faixas 4,71-4,86 e 0,98-0,99%, respectivamente (Tabela 24), mostrando que o teor de cinzas nas cascas foi mais de quatro vezes maior que nas sementes. Lima et al. (2008) também encontraram um teor de cinzas nas cascas de jabuticaba da variedade Sabará 60

(4,40%) maior do que nas sementes (2,68%). Teores menores de cinzas nas cascas de jabuticaba foram observados em outros estudos, como 3,52% (LEITE-LEGATTI et al., 2012) e 3,15% (GURAK et al., 2014). Alezandro et al. (2013a) e Alezandro et al. (2013b) relataram valores de cinzas de 2,30-5,20% para os frutos maduros e inteiros, em duas espécies de jabuticabas produzidas no Brasil.

Tabela 24. Composição centesimal, em g 100 g-1 de matéria seca, das cascas e sementes de jabuticaba em função dos cinco tipos de solos.

Fatores Solos S1 S2 S3 S4 S5 Casca Umidade 18,35 ± 0,13 b 20,48 ± 0,11 a 15,63 ± 0,28 d 15,24 ± 0,36 d 16,88 ± 0,36 c Lipídeos 0,48 ± 0,01 a 0,49 ± 0,01 a 0,46 ± 0,01 b 0,46 ± 0,03 b 0,48 ± 0,01 a Cinzas 4,74 ± 0,13 b 4,78 ± 0,06 ab 4,80 ± 0,04 ab 4,86 ± 0,04 a 4,71 ± 0,04 b Fibra Sol. 5,45 ± 0,01 d 5,48 ± 0,01 a 5,47 ± 0,01 b 5,46 ± 0,01 c 5,46 ± 0,01 c Fibra Ins. 23,12 ± 0,01 c 23,05 ± 0,01 d 23,10 ± 0,01 b 23,02 ± 0,01 e 23,19 ± 0,01 a Proteínas 5,64 ± 0,31 b 6,26 ± 0,44 ab 5,76 ± 0,31 b 6,23 ± 0,06 a 5,15 ± 0,45 b Carboidratos 55,88 ± 0,07 c 53,03 ± 0,46 d 58,69 ± 0,57 a 57,23 ± 0,75 bc 57,82 ± 0,49 ab Semente Umidade 24,74 ± 0,61 c 27,96 ± 0,21 b 31,01 ± 0,22a 27,13 ± 0,25 b 14,52 ± 0,01 d Lipídeos 0,47 ± 0,01 a 0,47 ± 0,01 a 0,45 ± 0,01 b 0,45 ± 0,01 b 0,45 ± 0,01 b Cinzas 0,98 ± 0,01 b 0,98 ± 0,01 b 0,99 ± 0,01 a 0,99 ± 0,01 a 0,98 ± 0,01 b Fibra Sol. 0,50 ± 0,01 a 0,48 ± 0,08 c 0,49 ± 0,01 b 0,49 ± 0,01 bc 0,49 ± 0,01 b Fibra Ins. 22,89 ± 0,01 c 22,93 ± 0,03 b 22,87 ± 0,04 d 22,90 ± 0,03 a 22,84 ± 0,01 e Proteínas 2,00 ± 0,05 c 4,71 ± 0,05 a 3,36 ± 0,04 b 3,52 ± 0,06 b 2,88 ± 0,07 bc Carboidratos 57,03 ± 0,04 b 50,84 ± 0,08 d 49,18 ± 0,35 e 52,90 ± 0,11 c 66,14 ± 0,07 a * Médias ± desvio padrão de três repetições quantificadas em porcentagem em base seca. Médias seguidas por letras iguais nas linhas não diferem ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

Os teores de fibras alimentares (solúvel + insolúvel) provenientes das cascas e das sementes variaram nas faixas de 28,48-28,65% e 23,33-23,42%, respectivamente (Tabela 24). As cascas apresentaram cerca de dez vezes mais fibras solúveis, constituídas por pectinas, gomas, mucilagens e algumas hemiceluloses, do que as sementes. Resultado semelhante foi obtido por Lima et al. (2008) para jabuticabas da variedade Paulista com 6,77% e 0,57% de fibras solúveis para cascas e sementes, respectivamente. Leite-Legatti et al. (2012) encontraram para a casca de jabuticaba liofilizada teores de fibra alimentar insolúvel e solúvel de 20,0% e 5,0%, respectivamente. Esses valores estão próximos aos obtidos no presente estudo (Tabela 24). Na determinação da presença de proteína observou-se o desprendimento de gases amoniacais indicando que a casca e a semente possuem proteínas na sua constituição. Os 61 níveis de proteínas presentes nas cascas e sementes variaram nas faixas de 5,15-6,26% e 2,00-4,71%, respectivamente (Tabela 24). Na maioria dos solos analisados neste trabalho os teores de proteínas foram maiores nas cascas do que nas sementes. Essa tendência difere de outros trabalhos (LIMA et al., 2008), onde não houve diferença significativa entre cascas e sementes provenientes das duas variedades de jabuticaba estudadas. Os teores de proteínas encontrados para as cascas da jabuticaba em outros trabalhos foram mais baixos, 0,97% (GURAK et al., 2014) e 1,10-1,16% (LIMA et al., 2008), porém Leite-Legatti et al. (2012) reportaram um teor médio de 4,89% para cascas liofilizadas. Os carboidratos são os componentes majoritários tanto nas cascas como nas sementes, cujos teores encontram-se nas faixas de 53,03-58,69 e 49,18-66,14%, respectivamente (Tabela 24). Esses valores estão próximos dos obtidos por Ascheri et al. (2006) e Ferreira et al. (2012) que foram de 56,06 e 58,70%, respectivamente. Entretanto, estão abaixo de 79,85% encontrado por Gurak et al. (2014). Os altos teores de carboidratos da jabuticaba possibilitam a incorporação de cascas e sementes deste fruto no enriquecimento de pães, biscoitos e outros produtos alimentícios. Diferenças significativas ocorreram nos níveis de carboidratos entre os solos estudados. As cascas dos frutos do solo S3 e as sementes do solo S5 apresentaram os maiores teores de carboidratos totais. Estudo anterior com frutos colhidos na Fazenda Jabuticabal demonstrou diferenças na concentração de açúcares redutores em relação ao solo de origem, podendo esse fato estar correlacionado tanto com nutrientes do solo quanto com a quantidade de luz solar que as jabuticabeiras recebem (DUARTE et al., 2012). Os resultados encontrados para as sementes do S3 estão de acordo com a hipótese do balanço entre carbono/nitrogênio. De acordo com Bryant et al. (1983), condições de baixa luminosidade solar, devido ao fato das árvores possuírem copas altas e largas, combinado com uma fonte de nutrientes elevada podem produzir plantas com baixas concentrações de compostos que atuam na defesa da planta. Os carboidratos que são produzidos na fotossíntese são usados para crescimento da planta, ficando indisponíveis para a biossíntese de metabólitos secundários baseados em carbono. A Tabela 25 apresenta as concentrações de macro e micronutrientes em cascas e sementes de M. cauliflora. Os resultados indicaram poucas variações das concentrações de nutrientes que estão presentes nas cascas e sementes em função dos solos, sendo o manganês o responsável pela maior diferença. Nas amostras de cascas as concentrações de cobre, fósforo e magnésio foram menores do que as encontradas nas sementes. Enquanto as concentrações de ferro, manganês, zinco, potássio e cálcio foram maiores nas cascas do que nas sementes. Esses resultados mostram que, de um modo geral, as cascas do fruto de jabuticaba apresentam maiores concentrações de nutrientes do que as sementes, podendo ser utilizadas como alternativa para produção de suplementos benéficos à saúde.

Tabela 25. Concentrações de macro e micronutrientes em cascas e sementes de M. cauliflora. Nutrientes Solos S1 S2 S3 S4 S5 Casca Cu (mg dm-3) 2,33 ± 0,58 b 4,00 ± 0,00 ab 4,33 ± 0,58 a 5,67 ± 0,58 a 5,00 ± 1,00 a Fe (mg dm-3) 55,67 ± 3,06 ab 61,67 ± 2,89 a 60,70 ± 0,58 ab 62,67 ± 1,15 a 52,70 ± 2,41 b Mn (mg dm-3) 49,00 ± 2,65 b 57,33 ± 0,58 a 45,00 ± 1,73 b 55,00 ± 1,00 a 55,33 ± 2,06 a Zn (mg dm-3) 16,00 ± 1,40 ab 20,77 ± 2,90 a 17,17 ± 1,25 ab 15,53 ± 1,46 b 15,03 ± 1,78 b P (mg dm-3) 1,70 ± 0,18 a 1,94 ± 0,18 a 1,74 ± 0,31 a 1,43 ± 0,38 a 1,86 ± 0,21 a K (mg dm-3) 1,41 ± 0,08 a 1,21 ± 0,04 ab 1,26 ± 0,14 a 0,70 ± 0,09 c 0,85 ± 0,24 bc Ca (cmolc dm-3) 0,13 ± 0,01 a 0,13 ± 0,01 a 0,12 ± 0,01 ab 0,10 ± 0,01 ab 0,11 ± 0,01 b Mg (cmolc dm-3) 0,06 ± 0,01 a 0,07 ± 0,00 a 0,07 ± 0,01 ab 0,05 ± 0,00 b 0,05 ± 0,01 b Semente Cu (mg dm-3) 7,00 ± 1,00 b 10,00 ± 0,00 a 10,00 ± 0,00 a 7,00 ± 0,00 b 8,00 ± 0,00 b Fe (mg dm-3) 51,33 ± 2,21 b 61,00 ± 2,65 a 60,33 ± 2,08 a 54,67 ± 2,31 ab 53,33 ± 1,53 b Mn (mg dm-3) 17,33 ± 1,53 d 25,00 ± 0,00 b 22,00 ± 1,00 c 30,70 ± 0,58 a 8,00 ± 1,00 e Zn (mg dm-3) 15,60 ± 1,21 ab 16,90 ± 0,92 a 17,80 ± 1,30 a 13,77 ± 1,03 b 16,10 ± 0,85 ab P (mg dm-3) 2,57 ± 0,20 a 2,75 ± 0,61 a 2,07 ± 0,28 a 1,86 ± 0,41 a 1,91 ± 0,50 a K (mg dm-3) 0,64 ± 0,02 ab 0,67 ± 0,05 a 0,43 ± 0,09 c 0,51 ± 0,03 bc 0,71 ± 0,04 a Ca (cmolc dm-3) 0,11 ± 0,02 a 0,11 ± 0,01 a 0,11 ± 0,01 a 0,10 ± 0,00 a 0,10 ± 0,00 a Mg (cmolc dm-3) 0,10 ± 0,01 a 0,10 ± 0,00 a 0,10 ± 0,00 a 0,10 ± 0,00 a 0,10 ± 0,00 a * Médias ± desvio padrão de três repetições. Médias seguidas pela mesma letra nas linhas não diferem ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

Os resultados das características químicas dos cincos tipos de solos estudados estão na Tabela 26. Observou-se que os sítios de amostragem diferem consideravelmente em relação à textura e ao teor de nutrientes minerais. A textura de cada solo depende da proporção de argila, silte e areia, sendo observadas variações no conteúdo de argila (29-46%), silte (15-19%) e areia (38-56%), o que pode influenciar diretamente na quantidade de nutrientes químicos presentes em cada solo. Todos os solos apresentaram baixos teores de Zn e altos níveis de Fe, propriedades que são características dos solos do Cerrado. O solo S2, caracterizado por terra arenosa com baixo equilíbrio de nutrientes apresentou o maior teor de ferro (235,7%). O solo S3, que só recebe adubo orgânico, apresenta maior equilíbrio de nutrientes, com altos teores de fósforo, cálcio, magnésio, cobre e manganês, e não apresenta alumínio na sua composição (Tabela 26). Segundo Bryant et al. (1983), o acúmulo de nutrientes no solo provoca um aumento da capacidade de fotossíntese e do crescimento da planta, devido à presença dos metais que são necessários às atividades enzimáticas. Esse fato leva a uma deficiência de carboidratos que iriam atuar na produção de compostos fenólicos. No presente trabalho, os solos com deficiências nutricionais apresentaram os maiores teores de compostos fenólicos, enquanto o 63 solo com maior equilíbrio de nutrientes (S3), caracterizou-se com menores teores de compostos fenólicos.

Tabela 26. Características químicasa dos solos de amostragem de M. cauliflora. Constituinte Sítios de amostragem S1 S2 S3 S4 S5 Argila (%) 39,0 29,0 35,0 46,0 41,0 Silte (%) 19,0 15,0 19,0 16,0 17,0 Areia (%) 42,0 56,0 46,0 38,0 42,0 Mat. Orgânica (%) 0,9 0,7 1,5 1,6 0,7 pH 4,0 4,2 4,7 4,2 4,0 P (mg dm-3) 1,4 2,9 6,2 0,8 2,6 K (mg dm-3) 36,0 29,0 29,0 34,0 36,0 Ca (mg dm-3) 0,6 0,7 2,7 0,8 0,2 Mg (cmolc dm-3) 0,3 0,3 0,5 0,2 0,1 Al (cmolc dm-3) 0,7 0,3 0,0 0,4 0,3 H + Al (cmolc dm-3) 6,6 8,1 4,8 7,3 3,9 CTC (cmolc dm-3) 7,6 9,2 8,1 8,4 4,3 Cu (mg dm-3) 1,3 1,1 2,2 1,3 1,9 Fe (mg dm-3) 111,3 235,7 195,0 67,3 71,2 Mn (mg dm-3) 20,2 27,2 46,8 3,8 27,0 Zn (mg dm-3) 0,4 1,1 1,6 1,3 0,3 aBaseado nos dados originais.

O solo S4 apresentou maior quantidade de matéria orgânica, porém baixos teores de fósforo, cálcio e manganês. Enquanto os solos S1, S2 e S5 apresentaram os menores teores de matéria orgânica. De acordo com Resende (2003) os solos pobres em matéria orgânica e arenosos são mais propensos às deficiências de nutrientes, pois além de não contarem com uma importante fonte de micronutrientes que é a matéria orgânica, a lixiviação é facilitada pela falta de cargas elétricas que permitiriam a retenção dos micronutrientes adicionados a adubação. Entretanto, teores elevados de matéria orgânica também podem levar à deficiência de cátions metálicos, principalmente o Cu devido à formação de complexos orgânicos que permanecem retidos. Os valores de pHs dos solos foram considerados baixos e fortemente ácidos (4,0-4,7), consistente com as características predominante dos solos do Cerrado (VERA et al., 2005; FRANCO; HARIDASON, 2008; ZARDO; HENRIQUES, 2011). Valores de pH acima de 6,0 e saturação por bases maior que 50% provocam redução na disponibilidade dos micronutrientes Cu, Fe, Mn e Zn (SOUZA, 1998). Na Tabela 26 os resultados mostraram que os solos apresentaram baixos teores de P, Zn e Cu, resultados esses que são satisfatórios para o balanço nutricional de micronutrientes, 64 pois devido as interações antagônicas entre os nutrientes, altas concentrações de P podem induzir a carência de Zn, comprometendo o crescimento da planta, e níveis elevados de Cu inibem fortemente a absorção de Zn e vice-versa (DECHEN et al., 1991). Em suma, os solos dos pomares onde as jabuticabeiras são cultivadas apresentaram baixos níveis dos nutrientes; os teores de P (0,8-6,2 mg dm-3), K (29-36 mg dm-3), Ca (0,2-2,7 mg dm-3) e Mg (0,1-0,5 cmolc dm-3) estão abaixo do necessário para o pleno desenvolvimento das plantas, com isso essas plantas precisam de mecanismos para se adaptar à deficiência desses nutrientes. Os dados de composição centesimal, compostos fenólicos de cascas e sementes e parâmetros de coloração foram submetidos à análise estatística multivariada em que foram elaboradas duas matrizes: matriz de resposta (30 amostras x 13 variáveis químicas e parâmetros de cor) e matriz explicativa [(30 amostras x 23 variáveis ambientais (textura do solo, nutrientes do solo e nutrientes do fruto)]. Essas duas matrizes foram analisadas em conjunto através da análise de redundância canônica, a fim de elucidar os padrões de variação dos constituintes químicos nas amostras em função das variáveis ambientais. Os resultados da análise de ordenação pela RDA (Figura 29) indicaram que as correlações entre os conjuntos de dados de resposta e ambiental (matriz explicativa) foram maiores nos dois primeiros eixos canônicos (0,999 e 0,623) e com fatores de inflação da variável considerados baixos (VIF < 9,4), isso sugere ausência de multicolinearidade entre as variáveis (LEPŠ; ŠMILAUER, 2007). Os testes de permutação de Monte Carlo (999 permutações) apresentaram resultados altamente significativos para os dois primeiros eixos canônicos (RDA1: F-Fischer = 1072,6; p < 0,001; RDA2: F = 7,3; p < 0,002), sinalizando que os padrões de variação nas matrizes originais não surgem ao acaso. A soma dos autovalores canônicos também foi altamente significativa (traço da matriz resposta = 0,946; F = 66,9, p < 0,001) (TER BRAAK; ŠMILAUER, 2012; LEGENDRE; LEGENDRE, 2003; LEPŠ; ŠMILAUER, 2007). Esses resultados sugerem uma forte e significativa associação entre os constituintes químicos e parâmetros de cor das cascas e sementes com os nutrientes do solo de cultivo e das partes dos frutos de jabuticaba (fatores ambientais explicativos). De acordo com a Figura 29, o eixo RDA1 apresenta principalmente a correlação entre os nutrientes Cu2+ e Mn2+ das amostras à distribuição seletiva dos constituintes químicos na semente e casca dos frutos, respectivamente. Enquanto a RDA2 descreve majoritariamente a influência de fatores nutricionais do solo de origem das amostras. Um aumento no eixo RDA2 está associado a um aumento no teor de Mn2+ (fósforo e Fe3+, não mostrados) nos solos S2 e S3, cujas amostras de cascas e sementes dos frutos apresentam valores mais elevados de fibras solúveis e umidade, respectivamente. Por sua vez, partes dos frutos provenientes de solos com menores teores de Fe3+ e altos teores de K+ (não mostrados no diagrama) como S1, S4 e S5 estão associados aos teores de taninos e flavonoides das amostras. 65

Cascas

Figura 29. Ordenação dos dois primeiros eixos da RDA mostrando as amostras em triplicatas de cascas (C) e sementes (S) dos frutos de M. cauliflora nos solos de amostragem (S1, S2, S3, S4 e S5). Parâmetros nutricionais do solo e das partes do fruto foram tratados como variáveis ambientais e estão representados por setas vermelhas a partir da origem. Os constituintes químicos das cascas e sementes são representados por setas azuis no diagrama. Os baricentros das amostras estão representados por triângulos vermelhos e as elipses indicam as classes de amostras similares.

CS11 CS12 CS13 Classe I CS41 CS43 CS53 CS42 Cascas CS21 CS22 CS51 CS23 Classe II CS52 CS31 CS32 CS33 SS11 SS52

Amostras SS51 SS12 SS53 Classe III SS13 SS41 SS43 Sementes SS42 SS21 SS22 Classe IV SS23 SS31 SS32 SS33

0 5 10 15 20 Distância Euclideana

Figura 30. Dendrograma de similaridade das amostras das partes dos frutos de M. cauliflora cultivados em diferentes solos com base nos escores canônicos da RDA.

Assim, enquanto a RDA2 mostra as alterações na fertilidade do solo, a RDA1 descreve um diferencial na distribuição de metabólitos em diferentes partes do fruto. Dessa forma, foram obtidas quatro classes de amostras (Figura 29), pela análise de agrupamento hierárquico (HCA), utilizando os escores dos eixos canônicos provenientes da RDA (Figura 30). Os valores dos constituintes químicos e parâmetros de cor para cada classe se encontram na Tabela 27.

Tabela 27. Composição centesimal, teor fenólico e parâmetros de coloração de cascas e sementes dos frutos de jabuticaba nas diferentes classesa.

Constituintes I II III IV Carboidratosb 56,66 ± 0,92 a 56,39 ± 2,83 a 12,80 ± 0,72 b 14,04 ± 0,84 b Lipídeos 0,48 ± 0,01 ab 0,48 ± 0,01 a 0,46 ± 0,01 b 0,46 ± 0,01 b Proteínasb 5,82 ± 0,46 a 5,80 ± 0,59 a 0,49 ± 0,01 b 0,48 ± 0,01 b Fibras solúveis 5,46 ± 0,01 b 5,48 ± 0,01 a 0,50 ± 0,01 c 0,49 ± 0,01 c Fibras insolúveis 23,09 ± 0,07 a 23,11 ± 0,06 a 22,88 ± 0,03 b 22,91 ± 0,03 b Umidadeb 16,86 ± 1,58 b 17,72 ± 2,33 b 22,13 ± 5,81 b 29,49 ± 1,68 a Cinzasb 4,79 ± 0,08 a 4,78 ± 0,05 a 0,98 ± 0,00 b 0,98 ± 0,01 b Fenóis totaisb 27,23 ± 1,27 a 27,20 ± 2,52 a 12,53 ± 3,73 b 7,91 ± 1,35 b Flavonoides   55,10 ± 8,79 a 44,34 ± 4,49 b Taninos 5,79 ± 0,68 b 5,88 ± 1,35 b 10,31 ± 2,15 a 8,10 ± 1,61 ab Antocianinas 4,45 ± 0,50 a 4,76 ± 0,77 a   Índice de cor 0,90 ± 0,13 a 0,90 ± 0,25 a   Tonalidade 0,77 ± 0,22 a 0,69 ± 0,33 a   aBaseado nos dados originais. bTransformado pela ordem dos mesmos (rank) na ANOVA. Médias seguidas pela mesma letra nas linhas não diferem ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

Dessa forma, a análise de RDAs sequenciais utilizando alguns grupos de variáveis explicativas e outros grupos, como covariáveis, permitiu particionar a variação total explicada em subconjuntos com ou sem sobreposição de informação entre grupos de variáveis. Esse tipo de covariação pode ser abordado por métodos de ordenação condicionados, considerando a influência de cada grupo de variável sobre os indivíduos (amostras), como uma variável sobre a qual análises estatísticas multivariadas são executadas a fim de se avaliar a importância relativa dos conjuntos de dados explicativos. Nesse estudo, o particionamento da variação foi realizado utilizando-se dois ou três conjuntos de variáveis explicativas (Tabela 28). A visualização do particionamento da variação total dos conjuntos de resposta foi obtida pela Figura 31, página 68, representada pelo diagrama de Venn, o qual sumariza as diversas frações da variabilidade total. Os resultados do particionamento da variação na Tabela 28 e Figura 31 mostraram que a maior contribuição na variação total explicada foi devido à parte dos frutos (97,7%; fração [a+d+f+g]) seguido pelos seus minerais (83,8%; [c+e+f+g]). A contribuição total dos nutrientes do solo (0,5%; [b+d+e+g]) não foi significativa (p = 0,771). Quando se analisa a contribuição 67 isolada dos grupos de variáveis, independentemente de qualquer sobreposição, observa-se que o maior porcentual se deve ainda às partes dos frutos (11,0%; [a]), seguido por uma pequena, porém, significativa (p = 0,001) contribuição dos nutrientes do solo de origem das amostras (0,4% [b]) e por uma também significativa contribuição dos nutrientes minerais das partes dos frutos (0,3% [c]). Porém, a maior contribuição entre as frações da variação foi devido à sobreposição entre as partes do fruto e os seus nutrientes minerais (86,7% [f]). Observa-se, ainda, uma contribuição negativa para a fração da variação devida aos três grupos de variáveis (3,3%; [g]). Esse fato é devido aos efeitos conjuntos serem obtidos por diferença e não por meio de parâmetros estimados nos modelos de regressão, sendo o seu significado atribuído a uma maior importância dos fatores isolados do que no efeito conjunto (LEGENDRE; LEGENDRE, 2003).

Tabela 28. Sumário do particionamento da variação dos constituintes químicos das cascas e sementes de jabuticaba por meio de RDA parciais. Variação explicada Efeitos e variáveis Covariáveis Fração da variação F Pa (%) Efeito total Partes,Solo, Minerais [a+b+c+d+e+f+g] 98,5 402 0,001 Efeitos parciais Partes Solo, Minerais [a] 11,0 179 0,001 Solo, Minerais Partes [b+c+e] 0,8 6,3 0,001 Solo, Minerais [b+c+d+e+f+g] 87,5 60,7 0,001 Partes [a+d+f+g] 97,7 1189 0,001 Solo Partes, Minerais [b] 0,4 7,3 0,002 Minerais, Partes [a+c+d+e+f+g] 98,1 430 0,001 Solo [b+d+e+g] 0,5 0,1 0,771 Minerais Partes, Solo [c] 0,3 2,4 0,046 Partes, Solo [a+b+d+e+f+g] 98,2 729 0,001 Partes, Solo Minerais [a+b+d] 14,7 4,4 0,001 Minerais [c+e+f+g] 83,8 69,7 0,001 Efeitos conjuntos Partes e Solo [d] 3,3 Minerais e Solo [e] < 0,1 Partes e Minerais [f] 86,7 Partes, Solo e Minerais [g] -3,3 Resíduos [h] 1,5 aBaseado sobre o teste de Monte Carlo (999 permutações). Preditor Partes = casca e semente; preditor Solo = Mn2+; preditores minerais = Cu2+ e Mn2+ da casca ou semente. Soma de todos os autovalores divididos pela variância total.

Assim, quase toda a variação explicada no conjunto de dados pode ser modelada por variáveis nutricionais de diferentes partes do fruto quimicamente estruturadas. Isto é, as 68 variações nos fenóis totais, taninos, antocianinas, flavonoides entre outros constituintes e parâmetros de cor são ambientalmente determinadas ea variabilidade química é pouco determinada por fatores genéticos, ao qual é atribuído ao pequeno resíduo (1,5%; [h]).

Figura 31. Diagrama de Venn ilustrando a contribuição dos preditores das partes do fruto (semente e casca), do solo de cultivo (Mn2+) e dos nutrientes (Mn2+ e Cu2+) no particionamento da variação dos constituintes centesimais e teores fenólicos de M. cauliflora de acordo com a Tabela 28. As frações conjuntas não se encontram em escala.

Esses resultados reforçam os obtidos em estudo anterior com jabuticabas (Duarte et al., 2012), em que fatores edáficos e espaciais explicaram 47,4% da variação química relacionada aos compostos fenólicos, açúcares redutores e acidez, enquanto os mesmos fatores explicaram apenas 1,3% da variação dos componentes químicos nos óleos essenciais. No presente estudo, observou-se que a separação nas partes dos frutos, cascas e sementes, aumentou bastante o nível de variação explicada quando comparado ao estudo anterior com os frutos inteiros. A importância dos fatores ambientais na produção de constituintes químicos pelos frutos da Jabuticabeira sugere que os fabricantes de produtos derivados desses frutos devem concentrar seus esforços em condições ambientais locais, as quais podem ser mais bem estruturadas por meio de grupos de variáveis explicativas, como a parte do fruto, as características físico-químicas do solo de cultivo das amostras e dos nutrientes minerais das diferentes partes do fruto.

4. CONCLUSÕES Compostos fenólicos, principalmente taninos, flavonoides e antocianinas, bem como os carboidratos, têm papel fundamental durante a elaboração de vinhos de jabuticaba e irão contribuir com características organolépticas decisivas ao produto final. O equilíbrio dessas substâncias na matéria-prima pode ser conseguido pela escolha do melhor solo de cultivo e uso racional de fertilizantes. O particionamento da variação total mostrou que 97,7% da variação é explicada pela combinação: partes do fruto (cascas e sementes) com minerais do fruto (Mn2+ e Cu2+) e nutrientes do solo (Mn2+). Assim, quase toda a variação explicada no conjunto de dados pode ser modelada por variáveis nutricionais de diferentes partes do fruto quimicamente estruturadas, isto é, as variações químicas são determinadas principalmente por fatores ambientais e muito pouco por diferenças genéticas.

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APÊNDICES

A1. ESPECTROS DO COMPOSTO MC1: PEDUNCULAGINA

Figura A1. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY do composto Mc1 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A2. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC do composto Mc1 (acetona-d6, 500 MHz). 82

Figura A3. Espectro de massas do composto Mc1.

A2. ESPECTROS DO COMPOSTO MC2: ALNUSIINA

13 Figura A4. Espectro de RMN de C do composto Mc2 (acetona-d6, 500 Mz). 83

Figura A5. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC do composto Mc2 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A6. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY do composto Mc2 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A7. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento de HMBC do composto Mc2 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A8. Espectro de massas do composto Mc2.

A3. ESPECTROS DO COMPOSTO MC3: CAULIFLORINA

13 Figura A9. Espectro de RMN de C do composto Mc3 (acetona-d6, 500 Mz).

Figura A10. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC do composto Mc3 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A11. Expansão do mapa de homonuclear 1H-1H do experimento de COSY do composto Mc3 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A12. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento de HMBC do composto Mc3 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A13. Espectro de massas do composto Mc3.

A4. ESPECTROS DA MISTURA MC4: 1,2,3,4,6-PENTA-O-GALOIL-Β-D-GLUCOSE E ALNUSIINA

Figura A14. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz). 88

Figura A15. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A16. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento de HMBC da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz).

A5. ESPECTROS DA MISTURA MC5: ESTRICTININA E OUTROS COMPOSTOS

Figura A17. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC da mistura Mc5 (metanol-d4, 500 MHz).

Figura A18. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY da mistura Mc5 (metanol-d4, 500 MHz).

Figura A19. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento de HMBC da mistura Mc5 (metanol-d4, 500 MHz).

A6. ESPECTROS DA MISTURA MC6: CASUARICTINA E OUTROS COMPOSTOS

Figura A20. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC da mistura Mc6 (acetona-d6, 500 MHz). 91

Figura A21. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY da mistura Mc6 (acetona-d6, 500 MHz).

A7. ESPECTROS DA MISTURA MC7: CASTALAGINA E VESCALAGINA

Figura A22. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz). 92

Figura A23. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A24. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento de HMBC da mistura Mc7 (acetona-d6, 500 MHz).

Figura A25. Espectro de massas do composto Mc7.

A8. ESPECTROS DO COMPOSTO MC8: QUERCITRINA

Figura A26. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC do composto Mc8 (metanol-d4, 500 MHz). 94

Figura A27. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY do composto Mc8 (metanol-d4, 500 MHz).

A9. ESPECTROS DA MISTURA MC9: MIRICITRINA, ÁCIDO ELÁGICO E ÁCIDO GÁLICO

Figura A28. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC da mistura Mc9 (metanol-d4, 500 MHz). 95

Figura A29. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY da mistura Mc9 (metanol-d4, 500 MHz).

A10. ESPECTROS DA MISTURA MC10: ÁCIDO PROTOCATECUICO E ÁCIDO CÍTRICO

Figura A30. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC da mistura Mc10 (metanol-d4, 500 MHz).

Figura A31. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY da mistura Mc10 (metanol-d4, 500 MHz).

A11. ESPECTROS DA MISTURA MC10: ÁCIDO 2-O-(3,4-DIHIDRÓXIBENZOIL)-2,4,6- TRIHIDRÓXIFENILACÉTICO E ÁCIDO GÁLICO.

Figura A32. Expansão do mapa de correlação heteronuclear 1H-13C do experimento de HSQC da mistura Mc11 (metanol-d4, 500 MHz). 97

Figura A33. Expansão do mapa de correlação homonuclear 1H-1H do experimento de COSY da mistura Mc11 (metanol-d4, 500 MHz).

Figura A34. Expansão do mapa de correlação a longa distância 1H-13C do experimento de HMBC da mistura Mc11 (metanol-d4, 500 MHz).