Tesis De Diploma

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Composición y abundancia de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos de la Ensenada Guajimico, región Centro-Sur de Cuba

TESIS DE DIPLOMA

Autora: Rosely Peraza Escarrá Tutor: M.Sc. Ángel R. Moreira González

2012

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas

TESIS DE DIPLOMA

Composición y abundancia de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos de la Ensenada Guajimico, región Centro‐Sur de Cuba

Autora: Rosely Peraza Escarrá Tutor: M.Sc. Ángel R. Moreira González

Centro de Estudios Ambientales de Cienfuegos (CEAC) Calle 17 esq. Ave 46 s/n. Reparto Reina, Cienfuegos 55100, Cuba.

[email protected]

2012

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UxÜÇ j|ÄÄ|tÅá

A mi madre, mi padre, mi hermano, tía mima, y mami Ana

AGRADECIMIENTOS

Este documento simboliza el final de un período universitario maravilloso, lleno de enseñanzas y aventuras inolvidables. Quiero agradecer a todos lo que aportaron su granito de arena en el proceso de tránsito, pues me han ayudado a crecer.

¨Sentir gratitud y no expresarla, es como envolver un regalo y no entregarlo¨

En primer lugar, quiero agradecer a los profesores en los que me apoyé para la confección del documento:

A mi tutor Ángel R. Moreira, por poner a mi disposición sus conocimientos, mantenerse pendiente de mí a pesar de sus muchas tareas, por las sugerencias, y las carreras para lograr un trabajo con calidad. Además agradezco las gestiones que realizó en vistas a mi futuro laboral.

Al Dr. Augusto Comas, quien dedicó parte de su valioso tiempo a la revisión del documento, y en todo momento fue un libro abierto a mis inquietudes. Gracias por sus consejos, y especialmente, gracias por aceptarme como su pupila.

A Dariel Cabrera, que asistió a todos mis llamados de ayuda. Gracias por guiarme y servirme como tutor, así como por dejarme conocimientos que me servirán en el futuro cercano.

A mi profe Alan Rivero, por ayudarme con la estadística, brindarme buenos consejos, y sobre todo por su paciencia.

A Mabel Seisdedo, Laura Castellanos, Alexis Veliz, Yeny Labaut, y el resto de los trabajadores del Centro de Estudios Ambientales de Cienfuegos, que colaboraron de diversas maneras.

Quiero agradecer a Arnaldo Quintana y Juan Carlos, los amigos de mi papi que hicieron el enorme favor de prestarme sus computadoras, y se mantuvieron al tanto de las cosas que me hicieran falta.

A Ana Laura ¨Laurita¨, por hacerme tiempo de máquina en su laptop, y por las divertidas experiencias compartidas.

Un agradecimiento especial va a un grupo de personas a continuación, porque cada una se ha robado un espacio en mi corazón:

A mi Rafe (verás que tu lugar está aquí), por la entrega y el querer infinito, por participar de momentos decisivos de mi vida, por ser en muchas ocasiones el lugar donde me refugio. Agradezco a tu familia por contarme como otro miembro, por el cuidado y todo el cariño. También agradezco las horas interminables en tu máquina superpoderosa, y el ánimo que me diste en momentos de desespero.

A Yane, mi hermana de la vida, por defenderme y quererme tanto, por tener siempre un consejo valioso para darme. Por creer en mí. Porque cuando no quedaba nadie, quedaste tú, mi mejor amiga.

A Ana María ¨Anita¨, agradezco el tenerte a mi lado en estos tiempos, poder contar contigo, con tu amistad que aprecio tanto. Gracias por malcriarme de vez en cuando, y por la confianza que has depositado en mí. Gracias por ser todo un ejemplo.

AGRADECIMIENTOS

A ¨May¨, que me has aceptado tal y cual soy, que me has hecho reír tantas veces, y también llorar. Agradezco tu amistad, tus detalles que resultan únicos, tus momentos de lucidez y de locura. Significas muchas cosas buenas para mí, cuando sea grande quiero ser como tú.

A Rinier, mi amigo y consejero, porque cada uno de los minutos contigo ha sido un suceso importante.

A Odle, en quien he encontrado tolerancia, cariño, y sobre todo, oídos incansables.

A Dayanita, que eres una de las personas más sinceras que he conocido. Te agradezco tus opiniones, y el dejarme conocerte un poco mejor.

A Lucre, por mantenerte al tanto de mis pasos, y no dejarme fuera de los tuyos. Muchas gracias por la alegría que me dejan tus correos, y sobre todo, por mantener nuestra amistad a pesar de la distancia.

A Tati, porque en ti he descubierto una persona generosa, divertida, dispuesta a ayudarme.

A Alexis, agradezco un mar de conocimientos útiles para la vida, y el deseo de querer superarme. Agradezco que alguna vez hayas sido mi amigo.

Siento un agradecimiento enorme hacia Magdalena, en quien siempre he encontrado soluciones y disposición. Tus consejos son oro. Gracias por estar cuando te he necesitado.

A mis tíos de Cienfuegos, mi familia de Santa Clara, y de La Habana, porque he estado presente para ustedes, que me hacen sentir importante.

A mis compañeros de aula y pasillos, quienes han crecido junto a mí; y a los profesores que he tenido, especialmente a: Katia Ojito, Oristela, Rolando Cárdenas, Zenaida, María Magdalena, Daimí Carrasana, los profes Iturria y De la Torre, que marcaron páginas de mi historia.

Finalmente, el agradecimiento mayor va para mis tesoros, los motores impulsores de mis obras, las estrellas que me iluminan:

Gracias a mi ¨pito¨, el mejor papi del mundo, la persona por la que me guío tantas veces, la mano que siempre ha hecho mis sueños realidad, el héroe de tantas batallas.

Gracias a mi mami preciosa, mi musa y apoyo en toda circunstancia. La que me cuida eternamente, la mujer más laboriosa del universo.

A mi hermano, por ser el odioso que más quiero, a quien tengo para aprender sobre paciencia y sentido del perdón.

A mi ¨titingui¨, mi cultivadora de sueños, mi baúl de sorpresas, mi flor. Gracias por tanto amor, por vivir conmigo cada uno de mis momentos aunque no estemos en el mismo lugar, por ser inspiración para mí.

A mi mami Ana, mi superabuela, fuente de sabiduría, amor, dedicación, y ternura. Gracias por quererme. Muchas gracias a todos

Resumen

La mayoría de las comunidades de dinoflagelados epibentónicos asociadas con macroalgas, sedimentos, corales y fanerógamas, son productoras de toxinas que causan síndromes de intoxicación en regiones tropicales y subtropicales. En Cuba, y especialmente en Cienfuegos, los estudios acerca de estas microalgas han sido escasos. Este trabajo estuvo dirigido a determinar la composición y abundancia de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos en la Ensenada Guajimico, Cienfuegos, y su relación con algunos factores ambientales. Las muestras se tomaron desde mayo del 2011 hasta marzo del 2012, con una frecuencia mensual. Se midió la temperatura, la salinidad, y el pH del agua; así - - + -3 como de manera semestral algunos nutrientes (N-NO2 , N-NO3 , N-NH4 , P-PO4 ), y clorofila a. Seis especies fueron identificadas: Gambierdiscus caribaeus, Ostreopsis lenticularis, Prorocentrum belizeanum, P. concavum, P. lima, y P. rhathymum. G. caribaeus constituye un nuevo hallazgo para las aguas cubanas. O. lenticularis, G. caribaeus y P. belizeanum fueron las especies de mayor frecuencia de aparición. La abundancia relativa total varió desde 1,15 x 104 hasta 5,89 x 105 cél./g de macroalga húmeda, en los meses de octubre y febrero, respectivamente. O. lenticularis fue la especie de mayor densidad durante todo el período, y definió la abundancia relativa total de especies. Se confirmó la presencia de palitoxina en el área. El análisis estadístico mostró que los factores temperatura y salinidad, no influyeron en las fluctuaciones de la abundancia de las especies.

Palabras clave: Abundancia, Cienfuegos, dinoflagelados epibentónicos, factores ambientales, toxicidad.

Abstract

The majority communities of epibenthic dinoflagellates associated with macroalgae, sediments, corals and seagrasses, are toxins producers that cause poisoning syndromes in tropical and subtropical regions. In Cuba, especially in Cienfuegos, studies on these microalgae have been scarce. This work was aimed to determine the composition and abundance of epibenthic thecate dinoflagellates producing toxins in Guajimico cove, Cienfuegos, and their relationship with some environmental factors. Samples were taken from May 2011 to March 2012, with a monthly frequency. Temperature, salinity, and pH of the water were measured; some - - + -3 nutrients (N-NO2 , N-NO3 , N-NH4 , P-PO4 ), and chlorophyll a, with a semester frequency were also determined. Six species were identified: Gambierdiscus caribaeus, Ostreopsis lenticularis, Prorocentrum belizeanum, P. concavum, P. lima, and P. rhathymum. G. caribaeus is a new report from Cuban waters. O. lenticularis, G. caribaeus and P. belizeanum were the most frequent species. The total relative abundance ranged from 1,15 x 104 to 5,89 x 105 cells./g seaweed wet weight, in October and February, respectively. O. lenticularis was the higher density species over the entire period and defined the total relative abundance of species. The presence of palytoxin was confirmed in the area. Statistical analysis showed that temperature and salinity did not affect the abundance and composition of the species.

Key words: Abundance, Cienfuegos, environmental factors, epibenthic dinoflagellates, toxicity.

Índice

1 Introducción 1

2 Revisión bibliográfica 4

2.1 Floraciones Algales Nocivas 4

2.2 Síndromes y toxinas asociados a dinoflagelados bentónicos tecados 5

2.2.1 Ciguatera y ciguatoxinas 6

2.2.2 Clupeotoxismo y otras afectaciones causadas por palitoxinas 8

2.2.3 Intoxicación diarreica por mariscos y DSP toxinas 10

Generalidades taxonómicas y ecológicas de los dinoflagelados 2.3 11 epibentónicos tecados potencialmente tóxicos

2.3.1 Aspectos generales de los dinoflagelados 11

2.3.2 Género Gambierdiscus 12

2.3.3 Género Ostreopsis 14

2.3.4 Género Prorocentrum 14

3 Materiales y métodos 16

3.1 Análisis de parámetros físico-químicos del agua 17

Análisis de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente 3.2 18 tóxicos en las muestras

3.2.1 Identificación de los dinoflagelados 19

3.2.2 Conteo y estimación de la densidad de dinoflagelados 19

3.2.3 Análisis de toxinas de la especie más abundante 20

4 Resultados 21

4.1 Análisis de parámetros físico-químicos del agua 21

Índice

Análisis de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente 4.2 23 tóxicos en las muestras

4.2.1 Identificación de los dinoflagelados 23

Conteo y estimación de la densidad de dinoflagelados. Relación de la 4.2.2 28 abundancia de las especies con la temperatura y la salinidad del agua

4.2.3 Análisis de toxinas de la especie más abundante 37

5 Discusión 38

5.1 Análisis de parámetros físico-químicos del agua 38

Análisis de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente 5.2 39 tóxicos en las muestras

5.2.1 Identificación de los dinoflagelados 39

Conteo y estimación de la densidad de dinoflagelados. Relación de la 5.2.2 42 abundancia de las especies con la temperatura y la salinidad del agua

5.2.3 Análisis de toxinas de la especie más abundante 46

6 Conclusiones 48

7 Recomendaciones 49

Introducción

1 Introducción El océano mundial hace que la tierra se diferencie del resto de los planetas por el aspecto que le brinda, y por la enorme variedad de organismos estrechamente relacionados a él. El intercambio de gases y calor entre el agua y la atmósfera, amortigua las oscilaciones estacionales de la temperatura, determina el régimen de lluvias, y atenúa el efecto invernadero, por lo que interviene en la regulación del clima (Duarte et al., 2006). Se ha sugerido que la evolución de nuestra especie se asocia al uso del hábitat costero y al consumo de alimentos de origen marino (Morgan, 1997). El océano es la cuna de diversas culturas, y brinda un conjunto muy variado de servicios a la sociedad. Entre estos servicios se encuentran: hacer posible la comunicación y la transportación, el reciclado de contaminantes, la obtención de recursos como petróleo, gas, y minerales de alto valor. La flora y fauna marina son recursos renovables, utilizados en la dieta humana y de otros animales, así como en la industria biotecnológica. Los ciclones tropicales, tsunamis y en algunos casos la erosión, son eventos naturales que afectan los hábitats costeros. Sin embargo, lamentablemente existen disturbios antropogénicos, como el derrame de hidrocarburos, construcción de barreras para el transporte de sedimentos, salinización o eutrofización, que también afectan estos hábitats, y pueden promover o fortalecer los eventos de origen natural. Estos sucesos en conjunto, a menudo favorecen la introducción de especies invasoras en el ecosistema, o la proliferación de organismos que encuentran las condiciones ideales para su desarrollo (Duarte et al., 2006). La expresión “floraciones algales” se aplica en general al crecimiento masivo de microalgas, cuando el número de estos organismos sobrepasa los niveles normales, mientras ¨mareas rojas¨, en particular, se refiere al incremento de las concentraciones de dinoflagelados, independientemente que la coloración del agua sea rojiza o no. En los casos que estos eventos resulten dañinos para el hombre, por los efectos adversos en la salud humana, en las explotaciones de acuicultura y turísticas, y para las poblaciones naturales de organismos marinos, se les denomina Floraciones Algales Nocivas (FANs). En un principio, el término se utilizó para dinoflagelados planctónicos, pero en la actualidad se aplica a cualquier población microalgal, ya sea planctónica o bentónica, siempre que la aparición conlleve a un efecto nocivo (Sar et al., 2002).

Introducción

Existe una tendencia global al incremento de la frecuencia, intensidad, y distribución geográfica de florecimientos de microalgas tóxicas asociadas a una creciente presión antropogénica sobre los ecosistemas costeros (Hallegraeff et al., 2004). Algunas microalgas producen toxinas tan potentes, que pueden resultar dañinas aunque no alcancen concentraciones celulares elevadas que cambien la coloración del agua (Sar et al., 2002). Las comunidades de dinoflagelados epibentónicos se encuentran comúnmente asociadas con macroalgas, sedimentos, corales y fanerógamas. La mayoría de estos dinoflagelados son potenciales productoras de toxinas (Nakajima et al., 1981), responsables de síndromes de intoxicación en las cadenas alimenticias, entre los que se encuentran la ciguatera, el clupeotoxismo (Riobó, 2008), y la intoxicación diarreica por mariscos (FAO, 2004). La ciguatera, principal síndrome asociado a dinoflagelados epibentónicos, es causada por especies del género Gambierdiscus Adachi et Fukuyo (Van Dolah, 2000a; Riobó, 2008). Las ciguatotoxinas se acumulan en el cuerpo de peces de arrecifes coralinos. El clupeotoxismo y la intoxicación diarreica por mariscos son ocasionados por otras toxinas que son producto del metabolismo de especies de los géneros Ostreopsis Schmidt y Prorocentrum Ehrenberg, respectivamente (Riobó, 2008). Los estudios acerca de dinoflagelados epibentónicos tóxicos en Cuba se han realizado principalmente en la costa norte, concentrados cerca de la capital del país. Popowski et al. (2001) realizaron estudios en el litoral norte habanero sobre la distribución y abundancia de Gambierdiscus toxicus (Adachi et Fukuyo) Chinain, Faust, Holmes, Litaker et Tester. Otras especies de los géneros Prorocentrum y Ostreopsis han sido observadas en este litoral (Delgado et al., 2002; Delgado et al., 2005; Delgado et al., 2006). La provincia de Cienfuegos, al igual que otras regiones del país, es afectada anualmente por casos de ciguatera. En esta provincia, los estudios sobre dinoflagelados epibentónicos potencialmente tóxicos han sido escasos (Moreira, 2009a; 2010; Pombo, 2000), y se han desarrollado fundamentalmente en la bahía de Cienfuegos, donde estos organismos son poco abundantes. En prospecciones realizadas en el litoral abierto de la provincia de Cienfuegos, específicamente en la Ensenada de Guajimico, se ha evidenciado la presencia de

Introducción

abundantes poblaciones de dinoflagelados epibentónicos tóxicos que no han sido identificados. Debido a la importancia que implica la presencia de estos microorganismos en esta zona, se hace necesario emprender un particular estudio taxonómico-ecológico. La siguiente investigación forma parte del proyecto de cooperación técnica del Organismo Internacional de Energía Atómica ¨Diseño e implementación de sistemas de alerta temprana y evaluación de la toxicidad de los florecimientos de algas nocivas (FANs) en la región del Caribe aplicando técnicas nucleares¨ RLA/7/014. Para iniciar una investigación basada en estos antecedentes se plantea la siguiente hipótesis: La composición y abundancia de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos es variable en el tiempo.

Para corroborar esta hipótesis se trazaron los siguientes objetivos: - General:  Determinar la composición y abundancia de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos en la Ensenada de Guajimico, y su relación con algunos factores ambientales. - Específicos:  Identificar las especies de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos asociados a macroalgas.  Evaluar la variación temporal de la composición y abundancia de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos.  Determinar la relación entre la abundancia de los dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos y algunos factores ambientales.

Revisión bibliográfica

2 Revisión bibliográfica 2.1 Floraciones Algales Nocivas El crecimiento explosivo del fitoplancton, conocido también como floraciones, es un fenómeno natural con beneficios para las redes tróficas marinas. Mediante la fotosíntesis, el fitoplancton sintetiza materia orgánica a partir de energía solar, macronutrientes, y oligoelementos; mientras liberan O2 al ambiente. El crecimiento de estos organismos actúa como una ¨bomba biológica de carbono¨ que ayuda a mitigar el efecto invernadero; además de que excretan a la atmósfera el gas dimetil- sulfuro, y este favorece la formación de núcleos de condensación de agua que dan lugar a las nubes, con lo que ayudan a contrarrestar el exceso de radiación solar. Las Floraciones Algales Nocivas (FANs) (en inglés ¨Harmful Algal Blooms¨, o su acrónimo HAB), es una denominación adoptada por la Comisión Oceanográfica Intergubernamental (COI) de la UNESCO, y aceptada internacionalmente para designar a cualquier proliferación de microalgas percibida como un daño por su impacto negativo en la salud pública, la acuicultura, el medio ambiente y las actividades recreativas (Reguera et al., 2011). Entre los efectos que estas floraciones pueden provocar, se encuentra la alteración de las condiciones físico-químicas de medio, ya sea por causar anoxia, descender el pH del agua por la emisión de abundante anhídrido carbónico, o cambiar la viscosidad. Si las microalgas que proliferan son productoras de toxinas, pueden ocurrir trastornos al ser ingeridas por diferentes organismos de la cadena trófica, que actúan como bioacumuladores de las toxinas, y como vectores que las transfieren a niveles superiores de la cadena. Las intoxicaciones o síndromes se clasifican de acuerdo con los efectos biológicos en los organismos en: Intoxicación Paralizante por Marisco (PSP, del inglés Paralytic Shellfish Poisoning), Intoxicación Diarréica por Marisco (DSP, del inglés Diarrhetic Shellfish Poisoning), Intoxicación Amnésica por Marisco (ASP, del inglés Amnesic Shellfish Poisoning), Intoxicación Neurotóxica por Marisco (NSP, del inglés Neurotoxic Shellfish Poisoning), Intoxicación por Azaspirácidos (AZP, del inglés Azaspiracid Poisoning), y la Intoxicación Ciguatérica de Pescado o Ciguatera (CFP, del inglés Ciguatera Fish Poisoning) (Sar et al., 2002). Si bien la mayoría de los episodios de intoxicaciones microalgales son producidos por microalgas planctónicas, existen FANs de microalgas bentónicas, que viven

Revisión bibliográfica

adheridas a macroalgas (epífitas) o a otro tipo de substratos. Las microalgas epibentónicas más conocidas son las causantes del envenenamiento por consumo de peces, llamado Ciguatera. Existen 6 grupos de toxinas de origen microalgal (Reguera et al., 2011), causantes de los síndromes mencionados: – Toxinas de tipo paralizante (PST, del inglés Paralytic Shellfish Toxins), producidas por dinoflagelados planctónicos de los géneros Alexandrium Halim, Gymnodinium Stein y Pyrodinium Plate. – Toxinas lipofílicas (DST, del inglés Diarrhetic Shellfish Toxins, pectenotoxinas y yesotoxinas). Las toxinas diarreicas (ácido okadaico y dinophysistoxinas) son producidas por dinoflagelados del género planctónico Dinophysis Ehrenberg y especies bentónicas del género Prorocentrum; las pectenotoxinas por Dinophysis spp., y las yesotoxinas por dinoflagelados planctónicos como Gonyaulax spinifera Claparède et Lachmann, Lingulodinium polyedrum (Stein) Dodge y Protoceratium reticulatum (Claparède et Lachmann) Bütschli. – Toxinas de tipo amnésico (AST, del inglés Amnesic Shellfish Toxins), producidas por diatomeas planctónicas del género Pseudo-nitzschia Peragallo. – Toxinas neurotóxicas (NST, del inglés Neurotoxic Shellfish Toxins), producidas por especies planctónicas del género Karenia Hansen et Moestrup, tales como Karenia brevis (Davis) Hansen et Moestrup, en el Golfo de México. – Ciguatoxinas (CTX, del inglés Ciguatoxins), producidas por dinoflagelados bentónicos del género Gambierdiscus. – Cianotoxinas producidas por cianobacterias.

2.2 Síndromes y toxinas asociados a dinoflagelados bentónicos tecados La ciguatera es un síndrome endémico de regiones tropicales y subtropicales, causado por toxinas producidas por especies de género Gambierdiscus, que viven asociadas a los arrecifes de coral. Otro ejemplo de FANs bentónicas son las floraciones de Ostreopsis spp., cuyas toxinas, liberadas al agua de mar, pasan al aerosol marino y causan irritaciones de la vías respiratorias y la piel de los bañistas (Reguera et al., 2011). Algunas especies del género Prorocentrum producen toxinas diarreicas que provocan desórdenes gastrointestinales en habitantes de aguas tropicales y templadas (Sar et al., 2002).

Revisión bibliográfica

Las biotoxinas son responsables de los síndromes de intoxicación desde las latitudes tropicales a las polares (Hallegraeff, 1993). Debido a su heterogeneidad estructural, afectan directamente a gran variedad de receptores y procesos metabólicos (Hu et al., 2001). Estos compuestos son metabolitos secundarios que no tienen ninguna función en la economía interna del organismo que las produce, pero si cumplen actividades específicas en mamíferos (FAO, 2004). Aunque no se sabe con exactitud por qué algunas especies de microalgas producen toxinas, se puede plantear la posibilidad de que los organismos que las sintetizan lo hagan para competir por espacio, luchar contra la depredación, o como mecanismo de defensa ante el sobrecrecimiento de otros organismos Actualmente, las toxinas producidas por microorganismos marinos son de interés global por los daños que ocasionan en animales, especialmente en humanos, que se afectan tanto en la salud, como en la economía.

2.2.1 Ciguatera y ciguatoxinas La ciguatera es un caso particular de envenenamiento, causado por la ingestión de peces de arrecifes coralinos que contienen en sus cuerpos potentes neurotoxinas, nombradas ciguatoxinas (CTX), acumuladas a lo largo de la cadena alimenticia (Van Dolah, 2000a). Esta enfermedad se informó por primera vez en 1511, por Peter Martyr de Anghera. Luego en 1601, Harmansen la informó para las islas del Océano Índico, y posteriormente en 1606, De Quiros la detectó en varios archipiélagos del Océano Pacífico (FAO, 2004). El nombre de ciguatera fue dado en 1866, por el ictiologista cubano Don Felipe Poey, que observó sus síntomas en pobladores consumidores de un pequeño molusco (Livona pica Linnaeus), conocido localmente como cigua (Laurent et al., 2005). Limitada originalmente a los trópicos y subtrópicos, en un cinturón entre las latitudes 35º L.N y 35º L.S (Pottier et al., 2001), la ciguatera se ha expandido a otras regiones, debido al desarrollo de la transportación marítima, el turismo, y la importación de pescado desde los trópicos (Van Dolah, 2000b). Es una enfermedad que afecta a más de 50 mil personas cada año, pero esta es una cifra conservadora dado a los numerosos casos que son mal diagnosticados o quedan sin registrar (Campora et al., 2008).

Revisión bibliográfica

Los síntomas de la intoxicación por ciguatoxinas se manifiestan poco después de ser ingeridas. Estos síntomas pueden ser muy diversos y se clasifican en: gastrointestinales, neurológicos o cardíacos, entre los que se encuentran diarrea, vómitos, dolor abdominal, sudoraciones, alteraciones en el olfato, reducción de la presión sanguínea, parálisis, parestesias en labios y extremidades, inversión de la temperatura (los objetos fríos dan sensación de estar calientes y los calientes se perciben como fríos), ritmo cardíaco irregular, entre otros (Van Dolah, 2000b; Friedman et al., 2008). Las especies del género Gambierdiscus generalmente se encuentran asociadas a macroalgas que son consumidas por pequeños peces herbívoros, y estos a la vez sirven de alimento a peces carnívoros (Reguera et al., 2011), que luego son consumidos por el hombre. Otros dinoflagelados asociados a la intoxicación son Amphidinium carterae Hulburt, Amphidinium klebsii Kofoid et Swezy, Coolia monotis Meunier, Prorocentrum lima (Ehrenberg) Stein, Prorocentrum concavum Fukuyo, Prorocentrum rhathymum Loeblich III, Sherley et Schmidt, Ostreopsis siamensis Schmidt, Ostreopsis lenticularis Fukuyo y Ostreopsis ovata Fukuyo (Bentur y Spanier, 2007). Las CTXs fueron aisladas por primera vez en 1977, en una investigación de G. toxicus (Nicholson y Richard, 2006). A pesar de que G. toxicus se encuentra presente en las zonas donde son frecuentes los casos de ciguatera, otras especies del género son productoras de ciguatoxinas (Litaker et al., 2009). Entre las toxinas producidas por Gambierdiscus se encuentran: gambiertoxinas, maitotoxina (MTX), gambierol y compuestos antifúngicos (Caillaud et al., 2010). Las gambiertoxinas son moléculas poco polares, que se transforman por metabolismo oxidativo en el hígado de los peces en CTXs más polares y potentes (Nicholson y Richard, 2006). Estas formas más oxidadas pueden ser hasta 10 veces más tóxicas que las CTXs a partir de las que surgieron, por lo que se pueden plantear la ocurrencia de una biomagnificación de los efectos tóxicos de estos compuestos (Lewis, 2001). Pueden localizarse en cualquier tejido del pez, pero en órganos internos como el hígado, cerebro, huesos y gónadas, se encuentran en una proporción 100 veces mayor (Riobó, 2008). Existen alrededor de 400 especies de peces que pueden potencialmente causar ciguatera (Tester et al., 2010).

Revisión bibliográfica

Las CTXs aisladas de tejidos de peces son compuestos altamente oxigenados, polietéreos, liposolubles, incoloros, inodoros, no detectables al gusto, y estables al calor (Murata et al., 1990). Estas toxinas actúan a nivel de canales de sodio de las membranas celulares, abundantes en células nerviosas, musculares y cardíacas (Lewis et al., 1992). Alteran la permeabilidad de estos canales, y provocan un creciente influjo de este ion, y consecuentemente se afecta la excitabilidad de las células. En combinación con este efecto, pueden bloquear canales de potasio dependientes de voltaje, así como aumentar la concentración de calcio intracelular (Nicholson y Richard, 2006). Se han identificado y caracterizado tres familias de ciguatoxinas: ciguatoxinas del Pacífico (P-CTX), ciguatoxinas del Caribe (C-CTX), y ciguatoxinas del Océano Índico (I-CTX) (Hamilton et al., 2010). P-CTX-1 es la más abundante y ciguatérica (Lehane y Lewis, 2000). La MTX se obtuvo por primera vez a partir de Ctenochaetus strigosus Bennett, vulgarmente llamado “maito” o pez cirujano. Es una molécula hidrosoluble que incrementa el influjo de calcio en las células, y esto provoca despolarización de las membranas celulares (Estacion, 2000). Como toxina es más potente que las CTXs, pero se acumula pobremente en los tejidos de peces, y es poco probable su relación con síntomas de ciguatera (Lewis, 2006).

2.2.2 Clupeotoxismo y otras afectaciones causadas por palitoxinas El clupeotoxismo es un tipo de envenenamiento causado por el consumo de peces de la familia Clupeidae, entre los que se encuentran sardinas y arenques, o anchoas (familia Engraulidae). Es un síndrome poco frecuente que se ha distribuido ampliamente en los trópicos y subtrópicos. El primer caso de clupeotoxismo se informó en 1770, por pobladores dominicanos que consumieron una especie de arenque. La primera descripción de los síntomas se realizó en 1978, donde se indica el sabor ácido y metálico que se advierte inmediatamente tras la ingesta del pescado, y que va seguido de náuseas, sequedad en la boca, vómitos, malestar, dolor abdominal y diarrea. La alteración gastrointestinal producida por esta intoxicación puede ir acompañada de pulso débil, taquicardia, escalofrios, sudor frío, vértigo, descenso en la presión sanguínea, cianosis y otras evidencias de colapso vascular. También surgen síntomas

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neurológicos como nerviosismo, pupilas dilatadas, fuerte dolor de cabeza, adormecimiento, hormigueo, hipersalivación, calambres musculares, dificultad respiratoria, progresiva parálisis muscular, convulsiones, coma, y finalmente puede causar la muerte del individuo (Aligizaki et al., 2011). El clupeotoxismo se distingue de la ciguatera u otros tipos de envenenamientos a partir de pescados, por la gravedad de los síntomas, que le atribuyen una elevada tasa de mortalidad en humanos. Los peces de la familia Clupeidae son capturados frecuentemente en áreas turbias y salobres, en contraste a las aguas transparentes de los hábitats de arrecifes de coral, típicos de la ciguatera. Además, los clupeidos son los primeros en adquirir la toxina, mientras que los peces que producen ciguatera en su forma más grave, son las grandes especies carnívoras que se encuentran al final de la cadena alimenticia. También, resulta relevante la estacionalidad de los episodios, en el caso del clupeotoxismo suceden en los meses cálidos del año, mientras que la ciguatera está presente en cualquier estación (Riobó, 2008). Onuma et al. (1999) concluyeron que el dinoflagelado bentónico O. siamensis era el causante de este envenenamiento, luego de investigar la muerte de una mujer que consumió sardina intoxicada. El análisis de los restos de sardina (agallas y esófago) reveló gran cantidad de sedimentos del fondo marino, y con posteriores ensayos se identificó a la palitoxina (PLTX) como agente causal de la enfermedad. Teniendo en consideración el hecho de que las especies de Ostreopsis tapizan el fondo de mares tropicales, y que algunas son productoras de PLTX y/o análogos, resultan las candidatas más probables para explicar la causa del clupeotoxismo. La PLTX fue inicialmente aislada y purificada a partir de un coral del género Palythoa Lamouroux, y posteriormente se ha identificado en otros organismos marinos, entre los que se incluyen varias especies de Ostreopsis (Riobó et al., 2006). Se ha podido aislar un análogo de la PLTX, la ostreocina-D, a partir de O. siamensis (Usami et al., 1995). Estas toxinas se trasladan por la cadena alimenticia, y han sido encontradas en peces, cangrejos, moluscos y equinodermos (Aligizaki et al., 2011). Las palitoxinas son poliéteres de un elevado peso molecular, que poseen áreas lipofílicas e hidrofílicas, y constituyen unas de las toxinas marinas conocidas más potentes (Riobó, 2008). Su mecanismo de acción no está totalmente dilucidado, aunque algunas investigaciones sugieren su especificidad para las bombas Na+/K+,

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transformándolas en canales iónicos. Por estos canales fluyen rápidamente los iones, a favor de su gradiente de concentración (Hilgemann, 2003). Esta situación provoca despolarización de las membranas celulares, que afecta fundamentalmente a la musculatura cardíaca lisa y esquelética, y a los nervios mielinizados (Tosteson, 2000).

2.3.3 Intoxicación diarreica por mariscos y DSP toxinas Los organismos productores de toxinas diarreicas (DST) son dinoflagelados pertenecientes a los géneros Dinophysis y Prorocentrum, los cuales son filtrados por moluscos (Van Dolah, 2000a; FAO, 2004). El síndrome DSP es causado por la ingestión de moluscos que acumulan estas toxinas en sus tejidos, entre los que se encuentran mejillones, ostras, almejas y vieiras. Algunos peces pueden acumular DST que adquieren en su alimentación (FAO, 2004). Los síntomas de la intoxicación son diarreas, vómitos y dolor abdominal, que aparecen aproximadamente 30 minutos después de la ingestión de la especie contaminada. No se ha registrado ningún caso de intoxicación mortal (Riobó, 2008). La DSP fue documentada por primer vez en 1976, en Japón, donde causó grandes problemas en la pesca de vieiras. Entre 1976 y 1982, se informaron 1300 casos para este país, mientras en 1981, más de 5000 casos en España, y en 1983, alrededor de 3300 casos en Francia. En 1984 provocó el cierre de la industria de mejillones en Suecia por casi un año. La incidencia de esta enfermedad está en incremento debido a la identificación en nuevas áreas de las microalgas y moluscos que intervienen en la intoxicación (FAO, 2004). Existen 3 grupos de DSP toxinas, en dependencia de la estructura química. El primer grupo es el de las toxinas acídicas, donde se encuentran el Ácido Okadaico (OA) y sus derivados, nombrados dinophysistoxinas (DTX-1, DTX-2 y DTX-3) (FAO, 2004). Estos son poliéteres lipofílicos, de elevado peso molecular, que se acumulan en tejidos grasos de los moluscos (Riobó, 2008). Su efecto consiste en inhibir proteínas fosfatasas que se encuentran en las células del epitelio intestinal en humanos, lo que provoca inflamación del tejido y diarrea. Para el OA y DTX-1 se ha comprobado actividad promotora de tumores. En el segundo grupo se ubican las toxinas neutrales, que son lactonas polietéreas pertenecientes a la pectenotoxinas (PTXs). En el tercer grupo se incluyen compuestos sulfatados nombrados

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yessotoxinas (YTXs), y derivados de estos, como el 45- hidroxiyessotoxina, poliéteres del tipo de las brevetoxinas. Las YTXs no causan diarrea (FAO, 2004).

2.3 Generalidades taxonómicas y ecológicas de los dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos 2.3.1 Aspectos generales de los dinoflagelados Los dinoflagelados son organismos unicelulares eucariotas con un par de flagelos, que utilizan para su movimiento. Existen especies marinas y dulceacuícolas, así como planctónicas y bentónicas; aproximadamente el 50% realiza fotosíntesis. Las especies pertenecientes a los órdenes Prorocentrales, Dinophysiales y Gonyaulacales presentan teca (pared celular celulósica de múltiples placas), mientras que los géneros Gymnodiniales y Noctilucales, son atecados o desnudos (Taylor, 1987). Los dinoflagelados son el grupo de microalgas con mayor número de especies dañinas (Taylor, 1985; 1993). Para la descripción de los dinoflagelados se utilizan varios criterios, entre los que se encuentran: tamaño y forma celular, ornamentación de la superficie (poros, espinas, hendiduras, etc.), presencia o ausencia de teca, lugar de donde parten los flagelos (dinoconta, cuando un flagelo distintivo parte del lado ventral; desmoconta, cuando ambos flagelos parten del terminal anterior), posición del cíngulo o surco transversal (su desplazamiento en relación a los polos del organismo) (Hallegraeff et al., 2004). En las especies tecadas, la teca está formada por una serie de placas separables ante la acción de hipoclorito de sodio. Prorocentroidea y Dinophysoidea, tienen estructura bivalvar lateral, o sea, sus placas principales se disponen simétricamente a ambos lados del plano sagital, formando una valva izquierda y una derecha. En Prorocentroidea cada valva está formada por una sola gran placa. Para la clasificación se tiene en cuenta el patrón de las placas, las cuales se tabulan. El sistema artificial introducido por Kofoid y modificado por Balech, es el aplicado fundamentalmente para la identificación de Gonyaulacoides y Peridinioides (Taylor et al., 2004). Este sistema reconoce una serie de placas sobre la base de su posición en la célula. La tabulación se refiere al número de placas en cada serie específica.

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La terminología orientacional es utilizada para la descripción. Se denomina polo apical a la región que queda delante, indicando el rumbo del movimiento del organismo; el polo antapical es la región opuesta. En las especies desmocontas, los flagelos parten de una zona de pequeñas placas, asimétricamente excavada de la placa lateral más grande, la valva derecha; la otra placa lateral es la valva izquierda. Para las especies dinocontas, la región de donde parte el flagelo se denomina ventral, y el lado opuesto es el dorsal. Estos términos también se utilizan para designar el lado desde el cual se está observando la célula. La vista ventral es usualmente la más característica, excepto en especies altamente aplanadas. La longitud de la célula es la distancia que existe desde el polo apical hasta el antapical, mientras que el ancho se mide de izquierda a derecha en vista dorso- ventral (Hallegraeff et al., 2004). Los principales géneros tecados epibentónicos productores de toxinas son Gambierdiscus, Ostreopsis y Prorocentrum (Taylor et al., 2004).

2.3.2 Género Gambierdiscus Las especies son aplanadas anteroposteriormente, de forma lenticular (Fraga et al., 2011), con una tabulación similar a Pyrodinium y Alexandrium, aunque lucen morfológicamente diferentes. El poro apical es pequeño y en forma de gancho (Taylor et al., 2004). Inicialmente fue descrita una especie, G. toxicus, y luego se fueron añadiendo otras especies: Gambierdiscus australes Faust et Chinain; Gambierdiscus belizeanus Faust; Gambierdiscus caribaeus Vandersea, Litaker, Faust, Kibler, Holland et Tester; Gambierdiscus carolinianus Litaker, Vandersea, Faust, Kibler, Holland et Tester; Gambierdiscus carpenteri Kibler, Litaker, Faust, Holland, Vandersea et Tester; Gambierdiscus pacificus Chinain et Faust; Gambierdiscus polynesiensis Chinain et Faust; Gambierdiscus ruetzleri Faust, Litaker, Vandersea, Kibler, Holland et Tester; Gambierdiscus yasumotoi Holmes (Litaker et al., 2009); y la última especie descrita recientemente fue Gambierdiscus excentricus Fraga (Fraga et al., 2011). Se ha comprobado la toxicidad para las especies: G. australes, G. pacificus, G. polynesiensis, G. toxicus, G. yasumotoi (Moestrup et al., 2011), y G. caribaeus (Lartigue et al., 2009).

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Gambierdiscus es un género exclusivamente marino. Las especies G. belizeanus, G. carolinianus, y G. ruetzleri se distribuyen en el Océano Atlántico; mientras que G. australes, G. pacificus, G. polynesiensis, G. toxicus, y G. yasumotoi, se encuentran solo en el Pacífico. G. caribaeus y G. carpenteri se hallan dispersos en ambos océanos (Litaker et al., 2010), y G. excentricus, es una especie descrita recientemente para el Atlántico (Fraga et al., 2011). Teniendo en consideración la distribución global de la mayoría de los microorganismos (Fenchel et al., 1997), es probable encontrarse en futuras investigaciones, que especies antes designadas como endémicas de una región, sean luego descubiertas en otras regiones (Litaker et al., 2010). Las especies de este género habitan en aguas poco profundas (<50 m), con temperatura media anual entre 21 y 31° C (Chateau-Degat et al., 2005; Tester et al., 2010), abundantes macrófitas (donde las células puedan adjuntarse) (Villareal et al., 2007), grado de turbulencia bajo o moderado (Delgado et al., 2006), salinidad alta y estable (Taylor, 1985; Morton et al., 1992; Delgado et al., 2006), luz con niveles de incidencia <10% (Taylor, 1985). Además son favorecidas por concentraciones de nutrientes elevadas, que pueden ser directamente obtenidos de las macrófitas sustrato (Carlson, 1984; Carlson y Tindall, 1985). Varios estudios demuestran que el incremento de los registros de ciguatera se corresponden con un aumento de la abundancia de Gambierdiscus spp., pero no siempre altas concentraciones de estas células conllevan a la enfermedad (Gillespie et al., 1985a). Esto sugiere que el factor abundancia celular es un requisito, pero no una condición suficiente. Algunos factores naturales y/o antropogénicos alteran la estructura de las comunidades bentónicas, y permiten el desarrollo de macroalgas donde las especies de Gambierdiscus crecen en número (Gillespie et al., 1985b; Briggs y Leff, 2009). Si el disturbio favorece el incremento de suficientes células tóxicas, existe mayor probabilidad de un brote de ciguatera. En muchas ocasiones los cambios en el hábitat coinciden con períodos de altas temperaturas del agua o disponibilidad de nutrientes, que pueden interactuar sinérgicamente en el incremento de estas microalgas (Carlson, 1984). La magnitud de la población resultante depende de la intensidad, tiempo de duración y escala de disturbio (Briggs y Leff, 2009).

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La densidad celular con la cual se comienzan a depositar niveles de toxinas significantes en la cadena alimenticia, depende de factores en interacción poco estudiados. Entre estos factores se incluyen: la toxicidad innata de las especies o de los clones, la regulación de la toxicidad por condiciones ambientales, la estructura de la comunidad de macroalgas sustrato, y lo apetecibles que estas sean (Litaker et al., 2010). 2.3.3 Género Ostreopsis El género Ostreopsis está conformado por especies de tamaño grande, muy aplanadas, con una tabulación similar a Gambierdiscus, pero con un alto grado de distorsión debido a su alongación dorso-ventral. El poro apical es estrecho y desplazado dorsolateralmente hacia la izquierda. Las células son elípticas y punteadas hacia el surco (Taylor et al., 2004). Estas poseen aspecto de pera en vista apical; y lo que parece ser la longitud de la célula es el ancho dorso-ventral (Faust et al., 1996). Actualmente se distinguen 10 morfoespecies: O. siamensis; O. lenticularis; O. ovata; Ostreopsis heptagona Norris; Ostreopsis mascarenensis Quod; Ostreopsis labens Faust et Morton; Ostreopsis marinus Faust; Ostreopsis belizeanus Faust; Ostreopsis caribbeanus Faust; y Ostreopsis tholus Morton (Riobó, 2008). Según Rhodes (2011), han sido demostradas como tóxicas: O. lenticularis, O. mascarenensis, O. ovata, O. siamensis, O. heptagona, y O. labens. Estos microorganismos son exclusivamente marinos; y se registran más florecimientos y nuevas localizaciones cada año. Son un componente común de la microflora epibentónica en áreas donde se han informado casos de ciguatera, particularmente en ambientes de arrecife de coral (Faust et al., 1996). El área de distribución geográfica de Ostreopsis se relaciona estrechamente con la del género Gambierdiscus, en aguas tropicales y subtropicales (Tindall y Morton, 1998), aunque algunas especies se han localizado en aguas templadas (Rhodes, 2011). Generalmente Ostreopsis spp. se encuentran como epífitas de macroalgas, fanerógamas, escombros de coral, o en la arena, pero se pueden encontrar en la columna de agua. El clima no parece tener particular impacto en la ocurrencia de florecimientos o en la producción de toxinas de estas especies, pues los eventos tóxicos han sido informados tanto en regiones templadas como tropicales (Rhodes, 2011).

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2.3.4 Género Prorocentrum Las células del género Prorocentrum están comprimidas lateralmente, y constituidas por dos grandes placas o valvas, con numerosas placas más pequeñas en la región flagelar (Graham y Wilcox, 2000). La valva izquierda es más o menos aplanada en la parte anterior, mientras que la derecha presenta una excavación en la que están encajadas varias plaquitas que conforman el poro flagelar. Algunas especies poseen una o varias espinas apicales. Todas las especies conocidas de Prorocentrum tienen dos cloroplastos (Taylor et al., 2004). Se han descrito aproximadamente 70 especies de este género, pero solo se conoce la toxicidad de algunas: Prorocentrum arabianum Morton et Faust; Prorocentrum arenarium Faust; Prorocentrum belizeanum Faust; Prorocentrum borbonicum Ten- Hage, Turquet, Quod, Puiseux-Dao et Couté; Prorocentrum cassubicum (Woloszynska) Dodge; P. concavum; Prorocentrum emarginatum Fukuyo; Prorocentrum faustiae Morton; Prorocentrum hoffmannianum Faust; P. lima; Prorocentrum maculosum Faust; Prorocentrum minimum (Pavillard) Schiller; y P. rhathymum (Moestrup et al., 2011). Las especies de este género son exclusivamente marinas, existen formas planctónicas y bentónicas (Faust et al., 1999). La mayoría de las especies bentónicas (P. belizeanum, P. concavum, P. lima, y P. rhathymum) han sido descritas para aguas tropicales y subtropicales del Caribe, y los océanos Pacífico e Índico (Aligizaki et al., 2009).

Materiales y Métodos

3 Materiales y Métodos

Descripción de área de estudio El estudio se realizó en la Ensenada de Guajimico (21 º 55´ L.N y 80 º 18´ L.O), ubicada en el Litoral Este de la provincia de Cienfuegos (Fig. 1). Esta pequeña ensenada presenta un área superficial de 0,2 km2 y una profundidad media de 3 m. El sustrato que predomina en la mayor parte del área es arenoso-fangoso, donde se encuentran extensos placeres de la angiosperma marina Thalassia testudinum Koenig. En la zona más somera aparecen pequeñas colonias del coral pétreo Porites porites Pallas, y abundantes piedras cubiertas por macroalgas, dominando las especies del género Dictyota Lamouroux (CEAC, 2007). Las características físico-químicas del agua de este área evidencian buena calidad, típico de regiones costeras oligotróficas con alta renovación e intercambio de sus aguas (Seisdedo, 2008).

Figura 1. Ubicación del área de estudio (Ensenada de Guajimico).

Materiales y Métodos

Muestreo El muestreo se desarrolló durante el período de mayo de 2011 a marzo de 2012, con una frecuencia mensual. El mes de agosto no pudo ser muestreado. Los meses de mayo a octubre corresponden al período lluvioso, mientras que los meses de noviembre a marzo, al período seco. Se seleccionó el área más abundante en macroalgas (aproximadamente 10 m de longitud del sector costero) para realizar la colecta. Las muestras fueron colectadas a través de un equipo ligero de buceo (snorkelling) entre 0.5 y 1 m de profundidad. Las macroalgas pardas Dictyota spp. fueron el sustrato escogido para determinar la abundancia de los dinoflagelados tóxicos. Se tomó una muestra de macroalgas, colectando al azar especímenes del género Dictyota a lo largo de un transecto horizontal, de aproximadamente 10 m de longitud, hasta alcanzar una biomasa de alrededor de 50 g. Las macroalgas se depositaron en una bolsa de nylon con agua de mar circundante. Este paso se realizó de forma rápida y sin movimientos bruscos para evitar el desprendimiento de los dinoflagelados. Posteriormente, se selló la bolsa conteniendo la muestra y se mantuvo en un lugar oscuro a temperatura ambiente hasta su traslado al laboratorio.

Análisis Estadístico Se realizó un análisis ANOVA por rangos de Kruskal-Wallis (p<0,01) para determinar diferencias en la riqueza de especies, y en los valores de abundancia de estos microorganismos durante los meses muestreados. Cuando se detectaron diferencias, se empleó el test de la U de Mann-Whitney (p<0,05), y una comparación múltiple de medias no paramétrica (p<0,01), respectivamente. Con el propósito de analizar la posible relación entre la abundancia de los dinoflagelados con la temperatura, y salinidad del agua, se desarrolló un análisis de correlación por rangos de Spearman (p<0.05). Los datos fueron procesados a través del paquete estadístico STATISTICA 8.0 (StatSoft Inc., 2007).

3.1 Análisis de parámetros físico-químicos del agua La temperatura, salinidad, y pH fueron medidos a través de una sonda digital modelo YSI-30, con una frecuencia mensual.

Materiales y Métodos

Con el propósito de evaluar el estado del agua, se midieron nutrientes y clorofila a, con una frecuencia semestral, para lo cual se tomó una muestra de agua en un mes distintivo de la época lluviosa (septiembre), y otra en un mes distintivo de la época seca (enero). Los ensayos analíticos se realizaron en el laboratorio del Centro de Estudios Ambientales de Cienfuegos, según los métodos descritos en el manual de procedimientos de esta instalación (Tabla I).

Tabla I. Métodos de determinación de nutrientes

Ensayo Método

- Nitrógeno de Nitritos (N-NO2 ) Espectrofotométrico. Diazotación con Sulfanilamida

- Nitrógeno de Nitratos (N-NO3 ) Espectrofotométrico. Reducción con Hidracina.

+ Nitrógeno Amoniacal (N-NH4 ) Espectrofotométrico. Indofenol azul.

-3 Fósforo de ortofosfato ( P-PO4 ) Espectrofotométrico. Reducción con ácido ascórbico

Para determinar la clorofila a se tomó una muestra de un litro de agua, que luego se pasó por filtros Whatman GF/C. Se maceraron los filtros con acetona al 90%, y se dejaron reposar por 24 horas en refrigeración y a la oscuridad, de acuerdo con la metodología descrita por APHA (1998). Los extractos se centrifugaron, y se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro a 640 nm (UNEP, 1991). Se anotó como dato adicional el aspecto del agua (posible presencia de natas, espumas, acumulaciones de algales en la orilla).

3.2 Análisis de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos en las muestras

Desprendimiento de los dinoflagelados del sustrato y su conservación La bolsa de nylon se agitó vigorosamente (2 min) para permitir el desprendimiento de los dinoflagelados asociados a las macroalgas. Posteriormente se retiraron las macroalgas, y se filtró la suspensión de agua de mar contenida en la bolsa a través de tres tamices superpuestos de 250 μm, 150 μm y 20 μm.

Materiales y Métodos

El residuo contenido en el último tamiz (fracción de 150–20 μm) se lavó con agua de mar filtrada con ayuda de un frasco lavador, se vertió en una probeta y se anotó su volumen final. Se agregó Lugol ácido para la fijación de la muestra. Las macroalgas sustrato se pesaron utilizando una balanza digital Sartorius GP4102, ± 0,01 g.

3.2.1 Identificación de los dinoflagelados La identificación de los organismos se realizó a través de varias descripciones de dinoflagelados epibentónicos tóxicos (Faust et al., 1996; Hansen et al., 2001; Hallegraeff et al., 2004; Litaker et al., 2009). Se empleó un microscopio de luz (Laborlux Leica Leitz, aumento 400 X), equipado con contraste de fase. Para el estudio de las placas de los dinoflagelados se utilizó una solución de hipoclorito de sodio (0,1%). Los detalles característicos de algunas especies, como la superficie de la teca, fueron observados en un Microscopio Electrónico de Barrido, en el Centro de Investigaciones en Estructuras Microscópicas, de la Universidad de Costa Rica.

3.2.2 Conteo y estimación de la densidad de dinoflagelados Para el recuento celular se usaron cámaras de sedimentación según el método de Utermöhl modificado por Edler y Elbrachter (2010). El material fijado fue sedimentado en cámaras de 25 mL en el tiempo apropiado, de acuerdo con la altura de la cámara. Se realizó el conteo de tres muestras tomadas de la muestra mensual total utilizando un microscopio invertido (Carl Zeiss 426126, aumento 400 X). La abundancia de los dinoflagelados se expresó en forma de densidad celular (células/g de macroalga húmeda), utilizando la siguiente transformación (Reguera et al., 2011):

D = N x (S/s) x (Vm/Vs) x (1/Pm) donde: D: densidad celular en cél/g N: Número de células contadas de una especie determinada S: Área total de la cámara de conteo (mm2) s: Área de la placa de sedimentación barrida (mm2) Vm: Volumen de la muestra (mL)

Materiales y Métodos

Vs: Volumen sedimentado en la cámara de conteo (mL) Pm: Peso húmedo de la macroalga (g)

3.2.3 Análisis de toxinas de la especie más abundante Para determinar la presencia de toxinas en la especie de dinoflagelado epibentónico más abundante, se realizó un análisis en el Centro Oceanográfico de Vigo (España). Se utilizó la muestra microalgal colectada en mayo de 2011 (1,98 x 104 células de O. lenticularis en 47,5 g de Dyctiota spp./peso húmedo, suspendido en 650 ml de agua de mar), la cual fue filtrada a través de un filtro GF/C. La extracción de la toxina del filtro se desarrolló en metanol al 100%. Con el extracto obtenido se realizó el análisis de actividad hemolítica en eritrocitos humanos, bioensayos en ratones, y cromatografía líquida con detección de fluorescencia, según la metodología descrita por Riobó y Franco (2011).

Resultados

4 Resultados 4.1 Análisis de parámetros físico-químicos del agua El máximo de temperatura se registró en el mes de septiembre (30,7ºC), mientras que el mínimo fue en enero (25,2ºC). En el período lluvioso los valores de temperatura resultaron ser superiores que los registrados para el período seco (Fig. 2).

29 C) o

27 Temperatura (

May-2011May Jun JunJul JulSept SeptOct OctNov NovDic Dic Ene-2012Ene Feb FebMar Mar 2011 2012 Meses Figura 2. Variación temporal en la temperatura del agua.

Los valores de salinidad no variaron de forma notable durante el período de estudio. En la época lluviosa estos valores oscilaron entre 35,3 y 35,7 ups, con un valor medio de 35,52 ups; en cambio, en la seca se registraron entre 35,4 y 35,7 ups, con un valor medio de 35, 56 ups (Fig. 3).

Resultados

38,0

37,5

37,0

36,5

Salinidad (ups) 36,0

35,5

35,0 MayM-11Jun JJul JlSept SOct ONov NDic DEne E-12Feb FMar M 2011 2012 Meses

Figura 3. Variación temporal en la salinidad del agua.

Los valores de pH presentaron poca variación. El valor mínimo registrado (8,06) fue para los meses de junio y julio, mientras el valor máximo (8,11) se detectó en el mes de enero. En la temporada lluviosa los valores oscilaron entre 8,06 y 8,08 unidades; y en la seca estuvieron entre 8,08 y 8,11 unidades (Tabla II).

Tabla II. Variación de los valores de pH.

Mes May. Jun. Jul. Sept. Oct. Nov. Dic. Ene. Feb. Mar.

2011 2012

pH 8,07 8,06 8,06 8,08 8,07 8,09 8,08 8,11 8,10 8,09

- - + -3 Los nutrientes determinados fueron N-NO2 , N-NO3 , N-NH4 , y P-PO4 disueltos. El - valor de N-NO2 obtenido para el período seco estuvo por debajo del límite de cuantificación (0,014 µmol/L), mientras que para el período lluvioso fue de 0,35 - µmol/L. El N-NO3 arrojó en ambas épocas un valor de por debajo del límite de + cuantificación (0,114 µmol/L). El valor de N-NH4 determinado para el período seco 22

Resultados

estuvo por debajo del límite de cuantificación (0,614 µmol/L), en cambio, para el período lluvioso fue de 1,428 µmol/L. Tanto para el período seco como para el lluvioso, el valor de P-PO4-3 se mantuvo por debajo del límite de cuantificación (0,142 µmol/L). Respecto a la clorofila a, el menor valor (0,11 μg/L) se obtuvo en el período seco, y para el período lluvioso el valor fue de 0,16 µg/L (Tabla III).

Tabla III. Resultados de indicadores hidrológicos por período climático.

- - + -3 Temporada N-NO2 N-NO3 N-NH4 P-PO4 Clorofila a µmol/L µmol/L µmol/L µmol/L ug/L

Seca < 0,014 < 0,114 < 0,614 < 0,142 0,11

Lluvia 0,35 < 0,114 1,428 < 0,142 0,16

El aspecto del agua se mantuvo invariable durante todo el período estudiado. No se detectó la presencia de natas, espumas o acumulaciones algales en la orilla.

4.2 Análisis de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos en las muestras 4.2.1 Identificación de los dinoflagelados Se identificaron tres géneros y seis especies de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos: G. caribaeus, O. lenticularis, P. belizeanum, P. concavum, P. lima, y P. rhathymum (Fig. 4). G. caribaeus se informa por primera vez para Cuba. El resto de las especies habían sido halladas en la provincia de Cienfuegos.

Resultados

Figura 4. Esquema de ubicación taxonómica de las especies.

Descripción de las especies  Gambierdiscus caribaeus Vandersea, Litaker, Faust, Kibler, Holland et Tester, 2009 Células fotosintéticas, comprimidas anteroposteriormente, con una longitud entre 69- 97 µm, y ancho entre 68-97 µm. Tienen forma lenticular, redondeadas en vista apical, con un radio promedio longitud/ancho de 1. La superficie celular es lisa, con numerosos poros de redondeados a ovales. El cíngulum es estrecho, profundamente excavado. Se distinguen por presentar la placa 1p grande, ancha, pentagonal; la placa 2´´ grande, rectangular, simétrica; y la placa 4´´ cuadrangular, simétrica y grande (Fig. 5 a y b).

Figura 5. Gambierdiscus caribaeus: (a) Vista apical de la teca. (b) Esquema de las vistas apical y antapical (Litaker et al., 2009, modificado).

Resultados

 Ostreopsis lenticularis Fukuyo, 1981 Células fotosintéticas, con muchos cromoplastidios de color carmelita-dorado. Son células muy comprimidas anteroposteriormente y agudas ventralmente, por lo que son observadas mayormente en vista apical o antapical. Poseen una longitud entre 60-85 μm, y un ancho entre 50-67 μm. Las características distintivas de la especie son su forma celular lenticulada a ovalada, la falta de ondulación en vista lateral, y la presencia de poros grandes redondeados esparcidos aleatoriamente en la superficie valvar (Fig. 6 a, b y c). a bc

Figura 6. Ostreopsis lenticularis: (a) Organismo vivo. (b) Vista apical de la teca. (c) Vista antapical de la teca.

 Prorocentrum belizeanum Faust, 1993 Células fotosintéticas, redondeadas o ligeramente ovales, con una longitud entre 50- 60 μm, y un ancho entre 52-55 μm. Poseen un pirenoide localizado en el centro de la célula. Las valvas son cóncavas en el centro. La superficie valvar presenta abundantes areolas redondeadas u ovaladas, característica distintiva de esta especie. Las areolas marginales aparentan la presencia de una banda intercalar transversalmente estriada. El área periflagelar tiene forma de triángulo (V) y está localizada en la región apical de la valva derecha (Fig. 7 a y b).

Resultados

Figura 7. Prorocentrum belizeanum: (a) Vista valvar con protoplasma. (b) Superficie de la teca (Micrografía electrónica).

 Prorocentrum concavum Fukuyo, 1981 Células fotosintéticas, con una longitud entre 45-55 μm, y ancho entre 38-45 µm. El pirenoide se encuentra en el centro, y el núcleo, posteriormente. Las células son marcadamente aovadas en vista valvar, más anchas detrás del medio. En vista lateral tienen forma de lenticular a elipsoidal, con área central achatada. La valva izquierda es recta, mientras que la derecha es profundamente cóncava. La superficie valvar está cubierta con muchos poros someros. Las areolas se distribuyen por toda la superficie, excepto en el área central, y se encuentran más densas cerca del margen (Fig. 8 a y b).

a b

Figura 8. Prorocentrum concavum: (a) Organismo vivo en vista valvar. (b) Superficie de la teca (Micrografía en contraste de fases).

Resultados

 Prorocentrum lima (Ehrenberg) Dodge, 1975 Células fotosintéticas, con una longitud entre 30-48 µm, y ancho entre 26-30 µm. Poseen un pirenoide localizado en la región central. Tienen forma ovada-oblonga, más amplias en la mitad posterior, y estrechas hacia la región anterior. En vista lateral son lenticuladas a elipsoidales, con un área central achatada en la vista valvar. La superficie valvar es prácticamente lisa, con escasos poros pequeños, marginales, redondeados, lo cual es característica distintiva de esta especie. El centro de la valva no presenta poros (Fig. 9).

Figura 9. Vista valvar de Prorocentrum lima con protoplasma.

 Prorocentrum rhathymum Loeblich III, Sherley et Schmidt, 1979 Células fotosintéticas, con una longitud entre 30-40 µm, y ancho entre 22-25 µm. Las células son ovaladas a oblongas, con los lados rectos en vista valvar, mientras que en vista lateral son de forma lenticular o elipsoidal. La superficie valvar presenta escasos poros grandes dispuestos de forma radial en estrechas depresiones, además aparecen escasos poros marginales. El centro de la valva no presenta poros. El área periflagelar está localizada apicalmente y desplazada hacia la valva derecha. Es un área relativamente pequeña, y aloja a un prominente collar periflagelar, semejante a una espina apical, característica distintiva en la especie (Fig. 10).

Resultados

Figura 10. Vista valvar de Prorocentrum rhathymum con protoplasma.

4.2.2 Conteo y estimación de la densidad de dinoflagelados. Relación de la abundancia de las especies con la temperatura y salinidad del agua El número de especies detectadas mensualmente varió desde 2, en el mes de octubre, hasta 5, en los meses de junio, julio, noviembre, diciembre y enero (Fig. 11). G. caribaeus, O. lenticularis, y P. belizeanum fueron las especies de mayor frecuencia de aparición. G. caribaeus, y O. lenticularis fueron las únicas especies observadas todos los meses. P. belizeanum no fue hallada en el mes de octubre. P. lima y P. rhathymum solo se detectaron en cinco meses (junio, julio, noviembre, diciembre y enero), y cuatro meses (mayo, junio, noviembre y enero), respectivamente. P. concavum fue la especie de menor frecuencia de aparición, solo se observó en los meses de julio y diciembre (Tabla IV). El análisis ANOVA por rangos de Kruskal-Wallis encontró diferencias significativas entre meses en la riqueza de especies durante el período muestreado, en el intervalo de confianza del 99%. El test de la U de Mann-Whitney detectó diferencias entre el mes de octubre y los meses de junio, julio, noviembre, diciembre, y enero (p<0,05).

Resultados

7 Riqueza de especies

Número de especies 2

0 MayMayJun JunJul JulSep SepOct OctNov NovDic DicEne EneFeb FebMar Mar 2011 2012 Meses

Figura 11. Número de especies detectadas en los meses muestreados.

Tabla IV. Frecuencia de aparición de las especies de dinoflagelados.

Especie May. Jun. Jul. Sept Oct. Nov. Dic. Ene. Feb. Mar. . 2011 2012

G. caribaeus x x x x x x x x x x

O. lenticularis x x x x x x x x x x

P. belizeanum x x x x x x x x x

P. concavum x x

P. lima x x x x x

P. rhathymum x x x x

Resultados

La concentración total de dinoflagelados varió desde 1,15 x 104 hasta 5,89 x 105 cél./g de macroalga húmeda, en los meses de octubre y febrero, respectivamente. Las especies predominantes, en orden de importancia, fueron O. lenticularis, P. belizeanum, y G. caribaeus. O. lenticularis fue tan abundante que definió la abundancia relativa total de especies (Fig. 12); sus valores de abundancia relativa siempre fueron superiores al 85%. P. concavum, P. lima, y P. rhathymum presentaron bajos valores de abundancia relativa, que no superaron el 1% (Fig. 13). El análisis estadístico para los valores de abundancia entre meses (KW, p<0,01), indicó que existen diferencias significativas para todas la especies. El análisis de correlación por rangos de Spearman (p<0.05) no mostró relación entre la abundancia de las especies y el factor temperatura, mientras si lo hizo para la salinidad, aunque fueron correlaciones débiles. Las especies con correlación entre su abundancia y la salinidad fueron O. lenticularis (r=0,53), P. belizeanum (r=0,62), y P. rhathymum (r=0,47).

6.0x105

G. caribaeus 5 5.5x10 O. lenticularis P. belizeanum 5 P. concavum 5.0x10 P. lima P. rhathymum 4.5x105 Abundancia relativa total

1.2x105 1.0x105 8.0x104 6.0x104 4.0x104 2.0x104 Abundancia (Cél./gde macroalga húmeda) 0.0 -2.0x104 M-11May JJun JlJul SSept OOct NNov DDic E-12Ene FFeb MMar 2011 2012 Meses

Figura 12. Relación de los valores de abundancia relativa total y por especie, con respecto al tiempo.

Resultados

100%100

80%80

de la concentración la de 60%60

O. lenticularis 40%40 G. caribaeus P. belizeanum

20%20 P. concavum P. lima Valores porcentuales porcentuales Valores P. rhathymum

00 Mayo Junio Julio Sept Oct Nov Dic Ener Feb Mar May Jun Jul Sept Oct Nov Dic Ene Feb Mar 2011 2012 Meses

Figura 13. Valores porcentuales de abundancia de los dinoflagelados tóxicos durante los meses de colecta. El menor valor de abundancia de G. caribaeus se detectó en el mes de marzo (1,36 x 102 cél./g de macroalga húmeda), y el máximo en febrero (2,18 x 103 cél./g de macroalga húmeda) (Fig. 14). Otros picos de alta abundancia fueron encontrados en los meses de septiembre y mayo (1,6 x 103 cél./g de macroalga húmeda). El test de comparación múltiple de medias no paramétrico mostró diferencias significativas entre los meses febrero y marzo (p<0,01).

Resultados

3,50E+03

3,00E+03

2,50E+03 húmeda)

2,00E+03 macroalga 1,50E+03 de

l./g é

(c 1,00E+03

5,00E+02 Abundancia

0,00E-01

-5,00E+02 Mean mayoMay Junjulio Jul Sept octubreOct Novdiciembre Dic Ene febreroFeb Mar Mean±SD 2011 junio septiembre noviembre 2012enero marzo Mean±1,96*SD Meses Figura 14. Abundancia relativa de G. caribaeus en el período de estudio.

El mínimo de abundancia de O. lenticularis se encontró en el mes de octubre (1,1 x 104 cél./g de macroalga húmeda), y el máximo en el mes de febrero (5,31 x 105 cél./g de macroalga húmeda) (Fig. 15). Otros picos de alta abundancia se observaron en los meses de junio (7,02 x 104 cél./g de macroalga húmeda), y marzo (1,1 x 105 cél./g de macroalga húmeda). El test de comparación múltiple de medias no paramétrica mostró diferencias significativas en los meses de mayo y octubre con el mes de febrero, y entre octubre y marzo (p<0,01).

Resultados

7,00E+05

6,00E+05

5,00E+05 húmeda)

4,00E+05 macroalga 3,00E+05 de

l./g é

(c 2,00E+05

1,00E+05 Abundancia

0,00E-01

-1,00E+05 Mean mayoMay Jun julioJul Sept octubreOct Novdiciembre Dic Ene febreroFeb Mar Mean±SD 2011 junio septiembre noviembre 2012enero marzo Mean±1,96*SD Meses Figura 15. Abundancia relativa de O. lenticularis en el período de estudio.

La menor concentración de P. belizeanum se observó en el mes de septiembre (35 cél./g de macroalga húmeda), y la mayor en el mes de febrero (5,53 x 104 cél./g de macroalga húmeda) Un segundo pico de alta abundancia se encontró en el mes de marzo (2,01 x 104 cél./g de macroalga húmeda) (Fig. 16). La comparación múltiple de medias no paramétrica detectó diferencias significativas entre los meses septiembre y octubre con el mes de febrero, y entre octubre y marzo (p<0,01).

Resultados

7,00E+04

6,00E+04

5,00E+04 húmeda)

4,00E+04 macroalga 3,00E+04 de

l./g é

(c 2,00E+04

1,00E+04 Abundancia

0,00E-01

-1,00E+04 Mean mayoMay Jun julioJul Sept octubreOct Nov diciembreDic Ene febreroFeb Mar Mean±SD 2011 junio septiembre noviembre 2012enero marzo Mean±1,96*SD Meses Figura 16. Abundancia relativa de P. belizeanum en el período de estudio.

La especie P. concavum solo se observó en los meses de julio y diciembre, en concentraciones de 1 x 102 y 57 cél./g de macroalga húmeda, respectivamente (Fig. 17). El test de comparación múltiple de medias no paramétrica no detectó diferencias significativas para los valores de abundancia entre meses.

Resultados

2,20E+02 2,00E+02 1,80E+02 1,60E+02 1,40E+02 húmeda) 1,20E+02 1,00E+02

macroalga 8,00E+01

de 6,00E+01 l./g

é 4,00E+01 (c

2,00E+01 0,00E-01 -2,00E+01 Abundancia -4,00E+01 -6,00E+01

-8,00E+01 Mean mayoMay Jun julioJul Septoctubre Oct Novdiciembre Dic Ene febreroFeb Mar Mean±SD 2011 junio septiembre noviembre 2012enero marzo Mean±1,96*SD Meses Figura 17. Abundancia relativa de P. concavum en el período de estudio.

La concentración mínima de P. lima se encontró en diciembre (40 cél./g de macroalga húmeda), mientras que la máxima se observó en enero (2,62 x 102 cél./g de macroalga húmeda) (Fig. 18). La comparación múltiple de medias no paramétrica no mostró diferencias significativas en la abundancia de esta especie durante los meses de colecta.

Resultados

6,00E+02

5,00E+02

4,00E+02 húmeda)

3,00E+02 macroalga

l./g 2,00E+02 é (c

1,00E+02 Abundancia 0,00E-01

-1,00E+02 Mean mayoMay Junjulio Jul Sept octubreOct Nov diciembreDic Ene febreroFeb Mar Mean±SD 2011 junio septiembre noviembre 2012enero marzo Mean±1,96*SD Meses Figura 18. Abundancia relativa de P. lima en el período de estudio.

La menor abundancia de P. rhathymum se registró en noviembre (35 cél./g de macroalga húmeda), y la mayor en enero (2,14 x 102 cél./g de macroalga húmeda) (Fig. 19). El análisis de comparación múltiple de medias no paramétrica no detectó diferencias significativas entre meses en la abundancia de esta especie en el período muestreado.

Resultados

5,00E+02

4,00E+02 húmeda) 3,00E+02 macroalga 2,00E+02 de

l./g é (c

1,00E+02

Abundancia 0,00E-01

-1,00E+02 Mean mayoMay Junjulio Jul Sept octubreOct Nov diciembreDic Ene febreroFeb Mar Mean±SD 2011 junio septiembre noviembre 2012enero marzo Mean±1,96*SD Meses Figura 19. Abundancia relativa de P. rhathymum en el período de estudio.

4.2.3 Análisis de toxinas de la especie más abundante El extracto microalgal de O. lenticularis fue tóxico, debido a que mostró actividad hemolítica por la presencia de PLTX. Los ratones inyectados con el extracto de esta especie, murieron entre 4 y 24 horas después de la inyección, manifestando los síntomas típicos relacionados a la toxina. El contenido de toxina en las células se estimó en 0,12 pg/célula, mediante el método cromatrográfico y biológico.

Discusión

5 Discusión 5.1 Análisis de parámetros físico-químicos del agua La variabilidad de los valores de temperatura del agua puede ser relacionada con la temperatura atmosférica presente en los meses comprendidos en cada época del año. En la etapa lluviosa se encuentran los meses más calurosos, y en la seca, los de menor temperatura (Seisdedo, 2006). Los valores de salinidad mostraron poca variación en ambas épocas, lo que se corresponde con las características del área de estudio. La Ensenada de Guajimico se localiza en una zona de montañas, donde las lluvias más fuertes ocurren en la zona norte del sistema montañoso, debido al predominio de los vientos alisios húmedos del noreste, y por esta razón, se considera como un área poco lluviosa (CEAC, 2007). Según el criterio normado para la salinidad en la N.C. 25 (1999), en cuanto a los acuatorios marinos de uso pesquero, los valores estuvieron dentro del rango de calidad buena. Para este indicador, la N.C. 22 (1999), establece que sus valores no deben ser inferiores de 36 ups, pero es válido tener en consideración que el área posee un pequeño aporte fluvial del arroyo La Jutía, que pudiera guardar relación con que los valores se mantuvieran alrededor de 35 ups. El pH se mantuvo en valores aceptables para el baño (N.C. 22, 1999), que es uno de los usos importantes de la zona; en cambio, para acuatorios marinos de uso pesquero, entran en la clasificación de calidad dudosa (N.C. 25, 1999). - - + -3 Para los nutrientes N-NO2 , N-NO3 , N-NH4 , y P-PO4 , los valores estuvieron por debajo del límite de cuantificación, o fueron pequeños. Según los rangos establecidos en la N.C. 25 (1999), para estos compuestos, el área presenta aguas de buena calidad, lo que demuestra el poco impacto antropogénico sobre la misma. Los valores obtenidos de clorofila a resultaron bajos. A partir de la escala de clasificación expuesta por Contreras et al. (1994), la cual se basa en la concentración de clorofila a para evaluar estado trófico, se confirma el estado oligotrófico del agua planteado en los resultados de Seisdedo (2008). Otro indicador de la buena calidad del agua en la zona fue la apariencia transparente de la misma, y el hecho de no desarrollarse macroalgas filamentosas que según Littler y Littler (1984), son indicadoras de ambientes inestables. Al contrario, en estudios realizados en la bahía de Cienfuegos (Moreira et al., 2010), se detectó el

Discusión

desarrollo de macroalgas filamentosas epífitas, asociadas a las zonas de descargas de residuales de la ciudad.

5.2 Análisis de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos en las muestras 5.2.1 Identificación de los dinoflagelados En el género Gambierdiscus las diferencias morfológicas entre especies son muy sutiles, lo que significa que la identificación de estos organismos utilizando como único método la microscopía de luz, no es suficiente; se necesitan otros métodos más avanzados, entre ellos la microscopía electrónica, y el análisis filogenético de ácidos nucleicos. Litaker et al. (2009) observaron que la descripción original de la especie tipo G. toxicus, incorporaba más de una especie. Estos autores realizaron una revisión del género, y describieron cuatro nuevas especies. En el presente trabajo se informa por primera vez para Cuba la especie G. caribaeus, una de las especies recientemente descritas por Litaker et al. (2009), y este resultado fue corroborado por análisis filogenético de ácidos nucleicos en el Centro Oceanográfico de Vigo (España). La talla y la morfología de las placas de los organismos de la Ensenada de Guajimico, identificados como G. caribaeus, está comprendida dentro del rango de la especie. Aunque se requieren estudios taxonómicos futuros, es muy probable que muchos de los hallazgos en Cuba de G. toxicus (Popowski et al., 2001; Delgado et al., 2006; Moreira, 2009a; 2009b) correspondan a G. caribaeus, debido a que esta última es una especie de amplia distribución en el Caribe (Litaker et al., 2009; Litaker et al., 2010). Además, se ha demostrado que G. caribaeus es un dinoflagelado tóxico (Lartigue et al., 2009), por lo que podría ser el agente causante del síndrome de la ciguatera en la provincia de Cienfuegos, y en otras regiones del país. Según Lartigue et al. (2009), la toxicidad de G. caribaeus en cultivo fue mucho menor que la de otras cepas de Gambierdiscus. Sin embargo, en el medio natural aún no se conoce con exactitud el papel que juegan las condiciones ambientales en modular la toxicidad de una especie de Gambierdiscus (Chinain et al., 1999). La morfología descrita para la especie O. lenticularis, se ajustó a la descripción taxonómica ofrecida por Fukuyo (1981) y Faust et al. (1996). La identificación de

Discusión

Ostreopsis spp. basada en las características morfológicas es difícil, debido a que el patrón de las placas, el tamaño celular, y la superficie de la teca, es bastante similar en varias especies. Los análisis de biología molecular en Ostreopsis han sido muy valiosos en la identificación de las especies y en los estudios de distribución geográfica (Penna et al., 2010). Basado en la combinación de los resultados morfológicos y genéticos se sugiere la presencia de O. lenticularis en nuestra zona de estudio. Faust et al. (1996), plantearon que O. lenticularis es la especie más frecuente del género. Esta especie ha sido encontrada en áreas someras tropicales asociadas a arrecifes (Rhodes, 2011), fundamentalmente en aguas del Océano Atlántico y el Caribe (Tosteson et al., 1986; Carballeira et al., 1998; Ashton et al., 2003; Peréz- Guzmán et al., 2008). Delgado et al. (2006) la registraron por primera vez para Cuba, mientras que Moreira (2009a), la detectó en el litoral de Cienfuegos. Las dimensiones de P. belizeanum coinciden con la descripción original para la especie ofrecida por Faust (1993). También se corresponden con las dimensiones que brinda Delgado et al. (2002) cuando la describe para aguas cubanas. P. belizenum se localiza comúnmente en aguas tropicales (Steidinger y Tangen, 1996). Las células son móviles, generalmente asociadas a sedimentos, y partículas de detrito en zonas arrecifales del Caribe (Faust, 1993), así como a macroalgas (Turquet et al., 1997), lo que se corresponde con su presencia en la ensenada de estudio. En costas cubanas la han identificado tanto en el litoral de La Habana (Delgado et al., 2002; Delgado et al., 2006), como en el de Cienfuegos (Moreira, 2009a). Esta especie es productora de Ácido Okadaico (OA), y pequeñas cantidades de Dinophysistoxina-1 (DTX-1) (Morton et al., 1998), por lo que debe tenerse en cuenta la presencia y el comportamiento de sus poblaciones. Faust (1998), la describe como una especie tóxica asociada a diferentes tipos de substratos macroalgales, en el sedimento y en el detrito. Las dimensiones de P. concavum fueron ligeramente superiores en comparación con la descripción original dada por Fukuyo (1981), mientras que se corresponden con el rango ofrecido por Faust y Gulledge (2002), Delgado et al. (2002), y el de la especie encontrada en Malasia por Mohammad-Noor et al. (2007). Fukuyo (1981) la describió por primera vez para Polinesia Francesa, Nueva Caledonia, e Islas Ryukyu. Es una especie tropical y nerítica (Steidinger y Tangen, 1996), lo que indica

Discusión

la naturalidad de encontrarla en la zona de estudio. Varios autores también la relacionaron con macroalgas en Sainte-Marie (Madagascar), Islas Réunion y Zanzibar (Hansen et al., 2001), y en costas cubanas (Delgado et al., 2002; Delgado et al., 2006; Moreira, 2009a); aunque Faust (1990) la encontró asociada a detrito flotante de manglar en el Lago Hidden. Debido a que P. concavum es productora de una toxina de acción rápida (Tindall et al., l984), toxinas diarreicas, y tres diol ésteres del OA (Hu et al., 1993), es de interés el estudio de sus poblaciones. P. lima presentó una talla comprendida dentro del rango dado por Dodge (1975), Delgado et al. (2000), y Mohammad-Noor et al. (2007). Esta especie es de amplia distribución mundial, nerítica, de ambientes estuarinos (Steidinger y Tangen, 1996), lo que coincide con su presencia en el área. Además, se ha encontrado asociada a la arena, a la superficie de macroalgas rojas y pardas (Fukuyo, 1981; Carlson, 1984), arrecifes coralinos (Fukuyo, 1981; Bomber et al., 1985; Carlson y Tindall, 1985), y a detrito flotante en manglares (Faust, 1991). Delgado et al. (2000), Delgado et al. (2006), y Moreira (2009a), la detectaron con anterioridad en nuestro país. Respecto a la toxicidad de la especie, se conoce que produce DTX-1 (Delgado et al., 2005), y además, puede producir OA (Mohammad-Noor et al., 2007). Las dimensiones de P. rhathymum se corresponden a las ofrecidas por Fukuyo (1981), y son un poco superiores a las dadas por Mohammad-Noor et al. (2007). Varios autores (Faust et al., 1999; Hansen et al., 2001; Faust y Gulledge, 2002) consideraron a P. rhathymum como sinónimo de P. mexicanum Tafall; sin embargo, recientemente Cortés-Altamirano y Sierra-Beltrán (2003), se basaron en la forma celular, la ornamentación de la superficie valvar, el hábitat, y la biogeografía, para demostrar que estas son especies diferentes. Teniendo en consideración que P. mexicanum es una especie planctónica (Cortés-Altamirano y Sierra-Beltrán, 2003), se puede plantear que los informes de este dinoflagelado para aguas cubanas como epífito sobre macroalgas (Delgado et al., 2002; Delgado et al., 2006; Moreira, 2009a), se corresponden realmente con la especie epibentónica P. rhathymum. Es posible asumir que P. rhathymum es cosmopolita, debido a que se ha encontrado en ambos hemisferios (34 ºN - 17 ºS) en el Océano Pacífico, y el Caribe (Cortés- Altamirano y Sierra-Beltrán, 2003). Produce toxinas hemolíticas (Nakajima et al., 1981), y un precipitado soluble en agua, tóxico para ratones (Carlson y Tindall, 1985), por lo que resultan interesantes los conocimientos sobre la especie.

Discusión

5.2.2 Conteo y estimación de la densidad de dinoflagelados. Relación de la abundancia de las especies con la temperatura y salinidad del agua La composición específica de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos en la ensenada de estudio, es típica de ambientes tropicales saludables, donde varios autores (Fukuyo, 1981; Faust, 1995; Mohammad-Noor et al., 2007), han encontrado coexistiendo a especies de los géneros Gambierdiscus, Ostreopsis, Prorocentrum, Coolia Meunier, y Amphidinium Claperède et Lachmann. La riqueza total de especies fue superior a la detectada por Pombo (2000) en la bahía de Cienfuegos, quien observó el predominio de P. lima, una especie tolerante a cambios bruscos de las condiciones ecológicas. Resultados diferentes fueron observados por Delgado et al. (2006) en el litoral habanero, pues encontraron siete especies de dinoflagelados tóxicos, con el predominio de P. lima y G. toxicus. En los meses de septiembre y octubre, se observó una disminución de la abundancia relativa de macroalgas y un incremento de la abundancia relativa de cianobacterias oportunistas (Oscillatoria margaritifera Gomont), a lo que puede asociarse que en estos meses se detectaran los menores valores de riqueza de especies de dinoflagelados. Moreira et al. (2003), también observaron menor abundancia relativa de macroalgas en el mes de octubre en la bahía de Cienfuegos. Los meses de septiembre y octubre están asociados a la ocurrencia de tormentas, huracanes, y al aumento de las escorrentías fluviales que contribuyen a la disminución de la biodiversidad y abundancia del macrofitobentos en Cuba (Suárez, 2005). Los valores de densidad obtenidos para G. caribaeus se encuentran en el rango estimado por Litaker et al. (2010) para el género, en los Océanos Atlántico y Pacífico. Estos autores detectaron que más del 85 % de los valores de densidad media se encontraron por debajo de 103 cél./g de macroalga húmeda. Antes de la revisión del género, son varias las investigaciones que abordaron la abundancia de G. toxicus en el Caribe. Por ejemplo, Ballantine et al. (1985) observaron en aguas puertorriqueñas, que las concentraciones de G. toxicus eran muy fluctuantes y no mostraban estacionalidad, lo que se corresponde con los resultados observados en la ensenada de estudio; ellos además detectaron una abundancia mayor de la especie (7,78 x 103 cél./g de macroalga húmeda). Sin embargo, Lobel et al. (1988)

Discusión

hallaron bajas concentraciones de G. toxicus (24 ± 14 cél./g de macroalga húmeda) en comparación con el presente trabajo. En Cuba, Popowski et al. (2001) encontraron valores de concentración media de G. toxicus inferiores (4,55 x 102 cél./g de macroalga en la bahía artificial del litoral habanero, y 1,14 x 102 cél./g de macroalga en el arrecife) a los encontrados en la ensenada (8,46 x 102 cél./g de macroalga). Según Delgado et al. (2006), G. toxicus fue la segunda especie con mayor abundancia (8-33%) en su estudio, y el descenso de sus concentraciones lo relacionaron a la ocurrencia de fuertes lluvias, y frentes de frío que afectaron al país. Se conoce que G. caribaeus crece bien en condiciones de laboratorio a 22-33 ºC, y óptimamente a 29-33 ºC (Litaker et al., 2009), y a pesar de que el análisis estadístico no mostró correlación con entre la abundancia y el factor temperatura, la temperatura del agua pudo favorecer la constancia de sus concentraciones durante el período de estudio. Según Chateau-Degat et al. (2005), la densidad de Gambierdiscus spp. está fuertemente relacionada con la temperatura del agua. Similar al presente estudio, Delgado et al. (2006) encontraron una correlación negativa entre la salinidad y la abundancia de las especies G. toxicus y P. lima. A partir de la amplia distribución de G. caribaeus en aguas oceánicas, se puede plantear que los valores de salinidad en la ensenada facilitan el desarrollo de esta especie. Se ha sugerido que además de la temperatura del agua y la salinidad, otros factores determinan el desarrollo de Gambierdiscus spp., entre los que se encuentran la concentración de nutrientes, la competencia con otros microorganismos, y factores de crecimiento endógenos (Chateau-Degat et al., 2005), lo cual es aplicable a todas las especies encontradas en el presente estudio. Dado a que la ecología del género Gambierdiscus es relativamente bien conocida (Litaker et al., 2010), se puede predecir que muchas especies responderán favorablemente al cambio climático global (Tester, 1994). Litaker et al. (2010), establecieron una correlación entre la distribución y abundancia de Gambierdiscus spp. con la ciguatera, y plantearon la posibilidad de que concentraciones celulares por debajo de 103 cél./g de macroalga húmeda, representen poco riesgo o ninguno de quedar intoxicado. Es necesario tener en consideración que los disturbios naturales o antrópicos, promueven el desarrollo de macroalgas sustrato en los arrecifes coralinos donde estos dinoflagelados tóxicos proliferan. Morrison et al.

Discusión

(2008) encontraron que en La Habana, las zonas más afectadas por la ciguatera coincidían con áreas de arrecifes deteriorados, en las que predominaban especies de macroalgas. Se puede decir que las macroalgas desempeñan el papel de vectores en la transmisión de la ciguatera. Los valores de abundancia de O. lenticularis en el presente estudio fueron altos y muy superiores al resto de los dinoflagelados durante todos los meses de colecta. Resultados similares han sido obtenidos en investigaciones para otras islas del Caribe, como Puerto Rico e Islas Vírgenes, en las que se evidenció que esta es la especie dominante de la microflora epifítica sobre macroalgas, en áreas someras y resguardadas asociadas a los ecosistemas de arrecifes coralinos (Ballantine et al., 1985; Carlson y Tindall, 1985). Sin embargo, las densidades de O. lenticularis en la Ensenada de Guajimico, fueron más estables y superiores a las detectadas por Ballantine et al. (1985) para el sur de Puerto Rico, donde se encontró una gran variabilidad en la densidad de esta especie, y máxima abundancia de 4,3 x 104 cél./g de macroalga húmeda sobre la feofícea Dictyota sp. El máximo valor de abundancia de O. lenticularis en el mes de febrero estuvo cercano al máximo encontrado para Ostreopsis spp. (5,9 x 105 cél./g de macroalga húmeda) en el Mediterráneo, que es uno de los valores más altos registrados para especies de dinoflagelados bentónicos (Vila et al., 2001). Es la primera vez que en Cuba se detectan poblaciones distintivas de este género. En los estudios realizados en la región noroccidental de la isla, O. lenticularis se observó como una especie rara, con muy bajos valores de abundancia (Delgado et al., 2006). Similar a los resultados en otras islas del Caribe (Carlson y Tindall, 1985; Ballantine et al., 1988), no se observó una correlación entre la abundancia de O. lenticularis y el factor temperatura. Pudiera ser que la temperatura para el crecimiento óptimo de esta especie se encuentre cercana a los 26 oC, lo que explicaría los mayores picos de abundancia en los meses de febrero y marzo. En comparación con otros años, estos meses se caracterizaron por ser muy calurosos, con valores de temperatura atmosférica superiores a la media histórica (INSMET, 2012a, b y c). Según investigaciones de Tindall y Morton (1998) en zonas tropicales, algunas cepas de este género presentan crecimiento óptimo a temperaturas relativamente altas (21-31 ºC).

Discusión

El análisis estadístico mostró una débil correlación entre la abundancia de la especie y la salinidad, pero se puede plantear que los valores de salinidad detectados favorecen el desarrollo de este dinoflagelado, que ha sido varias veces detectado en aguas con condiciones oceánicas. Se debe brindar especial énfasis en el futuro al estudio de micronutrientes presentes en el entorno de las macroalgas, debido a que el incremento de la disponibilidad de nutrientes como el fósforo podría estar relacionado con la proliferación de O. lenticularis. A pesar de que la abundancia de P. belizeanum no fue la predominante en la zona de estudio, Faust y Gulledge (2002) plantearon que esta especie puede ser el mayor componente de los asentamientos bentónicos en las aguas tropicales del Caribe. P. belizeanum no se detectó en el mes de octubre, lo que podría estar relacionado a que en los meses de septiembre y noviembre se observaron los valores de abundancia más bajos. Es interesante señalar que Delgado et al. (2002) hallaron este dinoflagelado en las costas cienfuegueras solo en el mes de febrero, que coincide con el mes de mayor abundancia de la especie según los resultados de este trabajo. Teniendo en consideración la distribución de P. belizeanum en aguas tropicales, se puede plantear que en el área de estudio los valores de temperatura y salinidad favorecieron su presencia durante casi todo el período. Pudiera ser que el mismo factor que afectó la abundancia de O. lenticularis en el mes de febrero tuviera influencia sobre la densidad de P. belizeanum. En cuanto a la especie P. concavum, los resultados obtenidos en esta investigación no son suficientes para ser discutidos a profundidad y compararlos con los obtenidos por otros autores. Sin embargo, es válido destacar que en 2002, Delgado et al. detectaron solo en el mes de mayo a P. concavum como epífita de macroalgas en costas cienfuegueras, con una concentración de 6,51 x 102 cél./g de macroalga húmeda. Aligizaki et al. (2009), observaron que P. lima era la especie más común del género en costas griegas, donde se encontró en elevada densidad (hasta 1,33 x 105 cél./g de macroalga). En aguas cubanas Delgado et al. (2000), registraron densidades de este dinoflagelado entre 20-32 cél./g de macroalga húmeda, que resultan menores en comparación con las concentraciones detectadas en la ensenada (de 40 a 2,62 x 102 cél./g de macroalga); mientras que en otras investigaciones (Pombo, 2000;

Discusión

Delgado et al., 2006) señalaron a P. lima como la especie predominante. Moreira (2009a) observó que P. lima era abundante en la época lluviosa (93 cél./g de macroalga), y muy poco abundante en la seca (9 cél./g de macroalga), lo cual no se corresponde con el presente resultado. Bomber et al. (1985), realizaron un estudio durante un año en los cayos de la Florida, y pudieron determinar que la especie presentaba mayor densidad en el período de noviembre a mayo, y esto pudiera estar en relación con su presencia en los meses de noviembre, diciembre, y enero en el presente estudio. Según Morton et al. (1992), el crecimiento óptimo de P. lima se desarrolla a temperaturas entre 26-28 ºC, y con una salinidad por debajo de 35 ups. P. rhathymum se observó en bajas concentraciones a pesar de que Morton et al. (1992), indicaron que esta especie (citada como P. mexicanum) mostraba un crecimiento óptimo a temperaturas entre 26-28°C, y a salinidades oceánicas típicas (~36 ups). Delgado et al. (2006), encontraron a la especie (citada como P. mexicanum) en densidades inferiores a 103 cél./g de macroalga húmeda, lo cual se corresponde con los resultados obtenidos. Por el contrario, Moreira (2009a) detectó un florecimiento de 3,1 x 103 cél./g de macroalga, en la bahía de Cienfuegos. En comparación con Delgado et al. (2002) que hallaron a P. rhathymum (citada como P. mexicanum) solo en el mes de mayo (52 cél./g de macroalga), en esta investigación se detectó presente en cuatro de los meses muestreados, incluyendo el mes de mayo, en el cual el número de células superó al detectado anteriornente.

5.2.3 Análisis de toxinas de la especie más abundante El análisis de toxinas desarrollado en este estudio demostró la presencia de palitoxina (0,12 pg/célula) en el extracto de O. lenticularis. Aligizaki et al. (2008) encontraron mayores valores (0,3-0,7 pg/célula) de concentración de toxina en muestras naturales de Ostreopsis spp. en las costas de Grecia, mientras que Lenoir et al. (2004), detectaron menores valores (0,04 pg/célula) en muestras naturales de O. mascarensis de la Isla Rodríguez, Océano Índico. La palitoxina muestra actividad biológica incluso a bajas concentraciones (Moore y Scheuer, 1971). Wiles et al. (1974), plantearon que la dosis letal de esta toxina administrada por vía intravenosa en ratas, cerdos, conejos, perros, y monos, se encontraba en el rango de 0,03-0,45 mg/kg. Por extrapolación, la dosis tóxica en humanos está entre 2,3-31,5 mg/kg (Uemura, 1991).

Discusión

En el Caribe (Puerto Rico e Islas Vírgenes), investigaciones con cultivos de O. lenticularis han demostrado la toxicidad de esta especie solo a través de bioensayos (Tindall et al., 1990; Ashton et al., 2003). De acuerdo con nuestra información, el presente estudio podría ser el primer informe de palitoxina en esta especie determinada tanto por métodos biológicos y químicos. La presencia de abundantes poblaciones de O. lenticularis en la zona de estudio, señala una potencial amenaza a la salud pública. La palitoxina producida por un florecimiento de Ostreopsis spp. ha sido asociada a intoxicaciones por diferentes rutas de exposición, como por ejemplo, la ingestión de mariscos contaminados, la inhalación, o la exposición cutánea a aguas marinas que contengan aerosol de esta toxina (Tubaro et al., 2011). Varios autores plantean la posible implicación de Ostreopsis spp. en el síndrome de ciguatera (Vila et al., 2001; Ashton et al., 2003; Riobó, 2008).

Conclusiones

6 Conclusiones

1. Se identificaron tres géneros y seis especies de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos: G. caribaeus, O. lenticularis, P. belizeanum, P. concavum, P. lima, y P. rhathymum. G. caribaeus constituye un nuevo registro para las aguas cubanas.

2. La especies O. lenticularis, G. caribaeus, y P. belizeanum fueron las de mayor frecuencia de aparición y predominantes por su abundancia. O. lenticularis fue la especie predominante en todos los meses de colecta, sus valores porcentuales de abundancia relativa fueron muy superiores al resto de las especies, siempre por encima del 85%. 3. En cuanto a los factores ambientales que puedan relacionarse con la abundancia de los dinoflagelados estudiados, se puede plantear que la temperatura y la salinidad no influyeron en la densidad de las especies. Es posible que la densidad de especies esté influenciada por otros factores.

Recomendaciones

7 Recomendaciones

 Incrementar las series temporales de datos de composición-abundancia de los dinoflagelados, y parámetros ambientales que permitan un mejor análisis estadístico y entendimiento del comportamiento ecológico de las especies.  Determinar con periodicidad mensual la concentración de nutrientes en el entorno de las macroalgas con el objetivo de realizar correlaciones de este factor con la abundancia de los dinoflagelados epibentónicos.  Cultivar las especies de dinoflagelados epibentónicos tecados potencialmente tóxicos predominantes por su abundancia para estudios ecológicos- toxicológicos más especializados.

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