Universidade Federal Fluminense Instituto De Saúde De Nova Friburgo Curso De Gradução Em Biomedicina

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE SAÚDE DE NOVA FRIBURGO CURSO DE GRADUÇÃO EM BIOMEDICINA

BIANCA ARAUJO CARVALHO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE TRICHOMONADÍDEOS PRESENTES NO MICROBIOMA INTESTINAL DE PRIMATAS NÃO HUMANOS

NOVA FRIBURGO 2019

BIANCA ARAUJO CARVALHO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE TRICHOMONADÍDEOS PRESENTES NO MICROBIOMA INTESTINAL DE PRIMATAS NÃO HUMANOS

Monografia apresentada à Universidade Federal Fluminense/Instituto de Saúde de Nova Friburgo, como Trabalho de Conclusão do Curso de graduação em Biomedicina.

ORIENTADORA: HELENA LUCIA CARNEIRO SANTOS CO-ORIENTADORA: KARINA MASTROPASQUA REBELLO

NOVA FRIBURGO 2019

BIANCA ARAUJO CARVALHO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE TRICHOMONADÍDEOS PRESENTES NO MICROBIOMA INTESTINAL DE PRIMATAS NÃO HUMANOS

Monografia apresentada à Universidade Federal Fluminense/ Instituto de Saúde de Nova Friburgo, como Trabalho de Conclusão do Curso de graduação em Biomedicina.

Apresentada em: 26 de novembro de 2019

Banca examinadora ______Dra Karina Mastropasqua Rebello-IOC/ FIOCRUZ ______Profa Dra Aline Cardoso Caseca-Universidade Federal Fluminense ______Dra Thabata Lopes Alberto Duque- IOC/ FIOCRUZ ______Prof. Dr Helvécio Cardoso Póvoa- Universidade Federal Fluminense

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DEDICATÓRIA

Este trabalho eu dedico à minha família, aos meus amigos, e a todos que fizeram parte da minha jornada até aqui.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Dr.a Helena Lucia Carneiro Santos por toda paciência e dedicação ao transmitir-me não só conhecimento, mas também a paixão pela pesquisa científica brasileira. Agradeço por cada crítica construtiva que levaram a refletir e a desenvolver um melhor raciocínio crítico e ampliando meus pontos de vista sobre cada situação. Agradeço também pelos elogios que me incentivaram e me passaram confiança. Mostrou-me que temos profissionais extremamente dedicados e competentes que fazem toda a diferença no cenário nacional e internacional.

À minha co-orientadora Dr.a Karina Mastropasqua Rebello por ser um verdadeiro modelo de profissional com sua postura sempre ética, competência, didática, dedicação à pesquisa e ao estudo contínuo e sensibilidade ao próximo. Agradeço pela Raquel e Rutinha que existem nela, por todas as críticas e conselhos que me inspiram a querer ser cada vez melhor, tanto na minha vida profissional quanto na pessoal. Agradeço por me mostrar que não é fácil ir sempre além, mas que vale a pena.

À minha tutora e querida Prof.a Dr.a Aline Cadoso Caseca por todo incentivo, competência e confiança. Agradeço por me inspirar a sempre pensar fora da caixinha e me passar confiança para alcançar meus objetivos. Obrigada pelos inúmeros conselhos que com toda certeza foram essenciais para chegar até aqui e que vou levar para toda vida. Obrigada por ser exemplo de mulher, mãe, cientista e professora.

Aos meus pais Domigas e José, aos meus irmãos Jacson, Jacqueline e Jaqueilson, meus sobrinhos Gabriel, Vinícius, Luíza, Viktor, Beatriz e a toda minha grande família que são meus maiores apoiadores e incentivadores. Agradeço pela compreensão quando eu me ausentava para estudar e por todas as noites de pizza e churrasco que me faziam sair do quarto. Obrigada por ser esse meu grande suporte, por toda união, proteção e transmissão de valores. Obrigada por todo amor incondicional.

Aos meus professores do Instituto de saúde Nova Friburgo por me inspirarem a querer ser uma profissional tão competente quanto eles. Em especial aos vi professores Dr. Leonardo, Dr.a Caroline e Dra Fabiana que buscaram ampliar nossa visão e capacidade de raciocínio, não somente durante as aulas, mas também abrindo as portas para estudos em laboratório e projetos de extensão.

Aos meus colegas do Laboratório em Estudos Integrados em Protozoologia (LEIP) da Fundação Oswaldo Cruz, que me acolheram tão bem nesse processo. Obrigada por toda ajuda, pelo clima leve, conselhos e inúmeras risadas (obrigada Rhagner Bonono). Agradeço por ter conhecido profissionais tão incríveis e competentes que me fizeram sentir parte desta grande família científica. Todos foram essenciais para minha caminhada até aqui: Andreia, Amanda, Rhagner, Vítor, Sheylinha, Claudia, Júlia, Igor, Carol e Clezia.

Aos meus colegas de turma, em especial a Gabriela, Jéssica, Giovana, Rodrigo e às minhas amigas de turma e de laboratório Monique e Thaís, pela amizade, diversão, ajuda e companheirismo. Obrigada por tornarem essa caminhada mais leve e por mostrarem que na ciência e na vida chegamos mais longe quando verdadeiramente buscamos cumprir nossos objetivos apoiando e torcendo uns pelos outros.

À minha família do Movimento dos Focolares que esteve comigo durante toda essa jornada, sempre apoiando e caminhando junto comigo. Agradeço por toda confiança e por toda comunhão que tivemos durante os espinhos e as rosas. Obrigada por me incentivarem a buscar um mundo mais unido e mais fraterno, por meio de atitudes concretas e diárias em todos os setores da minha vida. Agradeço especialmente às focolarinas Maysa, Fátima, Vau e Lui. Aos meus queridos amigos Luana, Maria Clara, Luíz (Ribeira), Thaís, Suelen, Luan e Marcelo. Às minhas queridas irmãs de unidade: Gabriela, Carla, Rayane, Ana, Carol, Natália e Stefany.

Às irmãs que ganhei em Friburgo, que construíram nosso Forninho e que me deram um apoio incondicional durante toda essa jornada: Karol, Marcela, Mariana, Luciana, Isabella e Yasmin.

Aos meus amigos de infância que estão em diferentes partes do mundo, mas que são a extensão da minha família, em especial ao Francisco e toda equipe de natação dos tempos de GCC e a minha melhor amiga da vida Isabella.

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EPÍGRAFE

Quem poderá descrever as infinitas belezas e descobertas, os horizontes sem limites que contempla uma alma abandonada à aventura da vontade divina?

Chiara Lubich

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RESUMO Trichomonadídeos são protozoários flagelados que pertencem a superclasse Parabasália e pertencem as ordens Trichomonadida e Tritrichomonadida . São microrganismos que apresentam um ciclo de vida simples e não possuem mitocôndria. São descritos em uma vasta variedade de hospedeiros, e são encontrados no trato gastrointestinal e nas vias geniturinárias. Os primatas não humanos (PNHs) são ótimos biomodelos para pesquisas biomédicas, pois são similares em termos fisiológicos, anatômicos, assim como neurológicos. Apesar de serem ocasionalmente relatados, ainda são escassas as informações sobre estes flagelados em PNHs. O intuito deste estudo é identificar e isolar trichomonadídeos em fezes de PNHs. Para tanto, 19 amostras fecais de PNHs da colônia do Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB/ Fiocruz) e da Fundação RioZoo foram analisadas por exame direto das fezes e coprocultura. Além disso, as culturas viáveis foram axenizadas e depositadas na coleção de protozoários da FIOCRUZ. Também foi feita a caracterização molecular destes isolados, utilizando oligonucleotídeos para amplificação dos alvos 18S e regiões ITS. Foram identificadas oito amostras de Pentatrichomonas hominis, duas de Tritrichomonas foetus, duas de Tritrichomitus batrachorum. Outras duas amostras apresentaram picos duplos no eletroferograma não sendo possível identificá-las, e uma amostra ainda não apresentou percentual de similaridade relevante com nenhuma sequência depositada no GenBank. Cinco amostras não apresentaram uma sequência de boa qualidade. O presente trabalho descreve o primeiro relato de T. batrachorum e T. foetus em fezes de PNHs, e fornece dados importantes para melhor compreensão dos trichomonadídeos em PNHs.

Palavras-chave: Trichomonadídeos; Primatas Não Humanos; Tritrichomonas foetus; Pentatrichomonas hominis; Trichomitus batrachorum; ITS; 18S.

ABSTRACT Trichomonads are flagellated protozoan that belong to the superclass Parabasalia, and belong to the orders Trichomonadida and Tritrichomonadida. The life cycle of these microorganisms are simple, and they lack mitochondria. It is a known parasite of many different animals and they are found in the urogenital tract and gastrointestinal tract. Moreover, a few studies have described the presence of those flagellates in their hosts, but there isn’t much informations about these protozoans in NHP. The purpose of this study is to identify and isolate trichomonads in NHP feces. Indead, 19 samples of NHPs from the Colony of the Instituto de Ciência e Tecnologia em biomodelos (ICTB / Fiocruz) and the Fundação RioZoo were analyzed by direct examination of the samples and by coproculture. In addition, viable cultures went to the axenization process and then deposited in the FIOCRUZ protozoan collection. Molecular characterization, was made by oligonucleotides for the targets to the 18S and ITS regions. Eight samples of Pentatrichomonas hominis, two of Tritrichomonas fetus, and two of Tritrichomitus batrachorum were identified. Two other samples showed double peaks in the electropherogram, and one had no relevant similarity percentages with any sequence deposited in GenBank. Also five samples did not display a good quality of sequence. This study describes the first report of T. batrachorum and T. fetus in NHPs and gives important datas that can help to understand trichomonadids in NHPs.

Keywords: Trichomonads, Non-human primates, Tritrichomonas foetus; Pentatrichomonas hominis; Trichomitus batrachorum; ITS; 18S.

Sumário RESUMO...... IX ABSTRACT ...... X LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………………....XIII LISTA DE TABELAS……………………………………………………………………...XIV LISTA DE ABREVIATURAS...... XV 1. Introdução ...... 1 1.1 Os protozoários ...... 1 1.2 Taxonomia ...... 2 1.3 Morfologia ...... 3 1.4 Caracterização molecular ...... 6 1.5 Ciclos biológicos de trichomonadídeos ...... 7 1.6. Trichomonadídeos presentes no trato gastrointestinal...... 8 1.7 Principais trichomonadídeos descritos em diferentes hospedeiros...... 10 1.7.1 Hospedeiros humanos...... 10 1.7.2 Hospedeiros Primatas não-humanos...... 11 1.8 PNHs como modelos biológicos...... 12 1.9Trichomonadídeos intestinais isolados de PNHs ...... 15 1.10 Doença/ Patogenia...... 16 1.11 Diagnóstico e Tratamento...... 16 2.Justificativa...... 18 3. Objetivos...... 19 3.1 Objetivo geral...... 19 3.2 Objetivos específicos...... 19 4. Material e Métodos...... 20 4.1 Origem das amostras...... 20 4.2 Axenização dos isolados de amostras fecais de PHNs ...... 21 4.3 Criopreservação isolados de trichomonadídeos ...... 21 xi

4.4 Microscopia óptica...... 21 4.5 Procedimento de extração de DNA ...... 22 4.6 Ensaios de Reação da Cadeia da Polimerase (PCR) ...... 22

4.7 Purificação dos produtos de PCR ...... 23

4.8 Reação de sequenciamento, alinhamento e identificação ...... 23 5.Resultados ...... 24 5.1 Axenização dos isolados ...... 24 5.2 Observação dos isolados por microscopia óptica ...... 24 5.3 Padronização da temperatura de anelamento do PCR...... 25 5.4 Análise dos produtos amplificados e purificados...... 26 5.5 Identificação molecular dos trichomonadídeos achados nas fezes de PNHs.. 27 6 Discussão ...... 29 7. Conclusões ...... 34 8. Referências bibliográficas...... 35

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LISTA DE FIGURAS Figura 1: Imagem ilustrativa de trofozoíta de T. vaginalis 5 Figura 2: Imagem da forma trofozoíta de P. hominis 5 Figura 3: Ilustração da mitose do tipo criptopleuromitótica 6 Figura 4: Ciclo biológico de P. hominis 8 Figura 5: Provável ciclo biológico de D. fragilis 9 Figura 6: Fotografia de Saimiri sp e ustus 13 Figura 7: Fotografia de Macaca mulatta 14 Figura 8: Fotografia de macacos Cynomolgus 15 Figura 9: Isolados de trichomonadídeos corados com Giemsa 25 Figura 10: Gel de agarose 1,5% do produto amplificado utilizando os alvos ITS 26 e18S Figura 11: Gel de agarose 1,5% dos produtos amplificados por ITS e 18S 27

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LISTA DE TABELAS Tabela 1: Lista das amostras e seus respectivos hospedeiros 20 Tabela 2: Identificação das amostras utilizando os alvos moleculares ITS e 27 18S

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LISTA DE ABREVIATURAS

°C-graus Celcius µl -microlitros µm - micromolar AIDS- Acquired Immune Deficiency Syndrome- sídrome da imunodeficiência adquerida ATP- Adenosine triphosphate- Trifosfato de adenosina

BSA - Bovine serum albumin- soro de albumina bovino DMSO - dimethyl sulfoxide - dimetil sulfóxido DNA - deoxyribonucleic acid -ácido desoxirribonucleico dNTPs- desoxirribonucleotídeos fosfatados EDTA- Ethylenediamine tetraacetic acid -ácido etilenodiamino tetra-acético GAPDH- gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase g-gravidade HCl – ácido clorídrico h-horas HIV- Human Immunodeficiency Virus- vírus da imonodeficiência humana ICTB- Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos ISTs- infecções sexualmente transmissíveis ITS- Internal transcribed spacer- espaçador interno transcrito kg- quilo L- litro M- molar

MgCl2 – cloreto de magnésio min-minutos mM- milimolar

N2 - nitrogênio OMS – Organização Mundial da Saúde p/p – relação peso por peso pb- pares de base PBS - phosphate buffered saline -solução salina tamponada composta por 10mM tampão fosfato e 0,15M NaCl pH 7,2)

PCR - Polymerase Chain Reaction -Reação em cadeia da polimerase PDTIS- Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Insumos para Saúde pH- potencial hidrogeniônico PM- padrão de peso molecular pmol-picomol PNH- primata não humano rRNA- Ribosomal ribonucleic acid- ácido ribonucleico ribossomal SCPrim- Serviço de Criação de Primatas não humanos SDS – sódio dodecil sulfato SFB – soro fetal bovino s-segundos SSU-RNA subunidade menor do RNA ribossomal TBE – Tris-Ácido Bórico-EDTA

TYM- trypticase–yeast extract–maltose UV- ultravioleta V – volts v/v – relação volume por volume

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1. INTRODUÇÃO

1.1 Os protozoários

Trichomonadídeos são um grupo de protozoários flagelados encontrados nos tratos geniturinário e gastrointestinal de diferentes hospedeiros. Todavia, poucas espécies são consideradas de importância médico-veterinária, tais como: Trichomonas vaginalis que infecta a trato urogenital de humanos (KISSINGER, 2015), Tritrichomonas foetus que parasita o trato urogenital de bovinos (YULE et al., 1989) e o trato gastrointestinal de cães e gatos; Trichomonas tenax que é encontrada na cavidade bucal de primatas (HERSH, 1985); Dientamoeba fragilis e Pentatrichomonas hominis que podem ser encontradas no trato intestinal de vários hospedeiros como: porcos, equinos, aves, cachorros, gatos e primatas (BAKER, 2006; BARRATT et al., 2011) e Tritrichomonas mobilensis descrita no trato intestinal de primatas não humanos (PNHs) (SCIMECA et al., 1989). Apesar da diversidade de espécies de trichomonadídeos, os estudos se concentram em T. vaginalis e T. foetus, devido a sua importância na saúde humana e animal (COBO et al., 2009; KULDA, 1990; PATTON et al., 2006). Existem poucos relatos na literatura que descrevem a presença de trichomonadídeos em PNHs (LILLY et al., 2002; SMEJKALOVA et al., 2011; WENRICH, 1944), entretanto, há mais de um século, estes flagelados foram identificados em PNHs de cativeiros (CUNHA e MUNIZ, 1929; PINDAK et al., 1985). Em 1908, foi descrito o primeiro relato de trichomonadídeos em Macaca fasciculares (NOC, 1908). Posteriormente outros trichomonadídeos foram descritos em PNHs, como: P. hominis, D. fragilis e T. mobilensis (BARRATT et al., 2011; INOUE et al., 2015; SCIMECA et al., 1989). Ao longo dos anos, o maior interesse sobre esses microrganismos foi devido à grande semelhança com os protozoários encontrados em humanos (CUNHA e MUNIZ, 1929). Inicialmente, acreditava-se na especificidade destes parasitos, que seriam capazes de infectar apenas um único hospedeiro (DOBELL, 1934). Entretanto, posteriormente, vários estudos mostraram que parasitos da ordem Trichomonadida podem parasitar diferentes hospedeiros (INOUE et al., 2015; KAMARUDDIN et al., 2014; LI et al., 2015; MELONI et al., 2011; SMEJKALOVA et al., 2011).

1.2 Taxonomia

A taxonomia dos trichomonadídeos foi inicialmente baseada apenas na morfologia do parasito. Este grupo de parasitos fora inicialmente alocado no filo Parabasália (Honigberg, 1973), classe Trichomonadea (Kirby, 1947), ordem Trichomonadida (Kirby, 1947), família Trichomonadidae (Wenyon, 1926) e gênero (Ditrichomonas, Tritrichomonas, Trichomonas e Pentatrichomonas). Os gêneros foram basicamente descritos de acordo com o número de flagelos. Nos últimos anos, tanto as características morfológicas quanto as moleculares estão sendo utilizadas na classificação, e algumas propostas de classificação vêm sendo descritas. (CEPICKA et al., 2010). Apesar de serem seres simples e primitivos, os trichomonadídeos são um grupo que pode ser considerado como bem-sucedido do reino Protista devido à sua capacidade de sobreviver/infectar diferentes hospedeiros (BARRATT et al., 2016). Pertencem ao infra-reino Excavata e filo Metamonada (ADL et al., 2012). Este grupo está inserido na superclasse Parabasália, que engloba os organismos eucariotos unicelulares flagelados que podem parasitar hospedeiros vertebrados ou invertebrados, além de microrganismos de vida livre (MALIK et al., 2011). Parabasália dá origem a seis classes monofiléticas, são elas: Trichomonadea, Tritrichomonadea, Trichonymphea, Hipotrichonymphea, Spirotrichonymphea e Cristamonadea (ADL et al., 2012). A classe Trichomonadea divide-se em Trichomonadida e Honigbergiellida. Na ordem Trichomonadida estão alocadas espécies como T. vaginalis e T. tenax (BENCHIMOL, 2013). A classe Tritrichomonadea possui apenas a ordem Tritrichomonadida, e inclui os gêneros Tritrichomonas e Dientamoeba (ADL et al., 2012; BENCHIMOL, 2013). Acreditava-se que D. fragilis pertencia ao grupo das amebas, porém, através das técnicas de microscopia eletrônica e de caracterização molecular, esses organismos foram realocados para a Classe Tritrichomonadidae (CAMP et al., 1974; CEPICKA et al., 2010; JEPPS e DOBELL, 1918; MALIK et al., 2011). Outra proposta de classificação é descrita por Cavalier-Smith (2013), que aloca o gênero Trichomonas como pertencente ao filo Loukozoa, ao subfilo Metamonada, superclasse Parabasália, classe Trichomonadea, ordem Trichomonadida e família Trichomonadidae (CAVALIER-SMITH, 2003).

1.3 Morfologia

Os trichomonadídeos são protozoários que exibem comumente o formato piriforme. Geralmente, apresentam um corpo celular formado pela presença de múltiplos flagelos na sua porção anterior, e um flagelo recorrente que se estende por todo corpo celular formado a membrana ondulante. Os flagelos, juntamente com a membrana ondulante, formam o sistema mastigonte. Esses flagelados não possuem mitocôndria, mas possuem uma organela com funções semelhantes chamada hidrogenossomo, que se localiza próximo ao retículo endoplasmático (BENCHIMOL, 2013). Essa organela possui uma enzima chamada piruvato ferredoxina oxirredutase, que é responsável pela oxidação do piruvato em acetato com a consequente liberação de energia na forma de ATP. Apresentam retículo endoplasmático liso e o rugoso, e esse último envolve a membrana nuclear externa. O núcleo se localiza na porção anterior do corpo celular. O complexo de Golgi e corpo parabasal são anexados à parede do núcleo juntamente com o filamento parabasal. Os microtúbulos formam duas estruturas de sustentação: a pelta e o axóstilo. A pelta fica localizada próximo aos flagelos, e o axóstilo fica na porção posterior ao núcleo, prolongando-se até a extremidade do protozoário, e juntos formam o complexo pelta-axostilar. Outra estrutura com a função ainda não totalmente elucidada é a costa, que se origina nos corpúsculos basais e pode agir tanto na sustentação quanto na redução de tensões durante o movimento dos flagelados. Pode existir ou não uma estrutura penteada na sua base. Padrões de estriação podem auxiliar na diferenciação interespecífica, sendo a costa tipo A com conformação de bandas paralelas e costa tipo B com formato de espinha de peixe (BENCHIMOL, 2013). O número de flagelos e a disposição destes são características utilizadas na diferenciação dos trichomonadídeos. Podem ser observados de três a cinco flagelos na sua porção anterior. Além disso, a disposição do flagelo recorrente, que fica parcialmente aderido ao corpo celular e tem uma porção livre de tamanho variado, é uma característica utilizada para auxiliar na diferenciação de T. vaginalis e T. foetus (BENCHIMOL, 2013). A família Trichomonadidae é única entre os membros do Parabasália que possuem a costa tipo B que está sempre por baixo da membrana ondulante (CEPICKA et al., 2010). 3

Descrições morfológicas características de trichomonadídeos foram importantes durante as pesquisas de Dobell em 1940 em achados de primatas, e os protozoários foram diferenciados segundo a quantidade de flagelos anteriores: Tritrichomonas -quando apresentam três flagelos; Trichomonas ou Tetratrichomonas – quando apresentam quatro flagelos; Pentatrichomonas – que apresenta cinco flagelos (DOBELL, 1940). T. vaginalis foi descrito como um protozoário que possui cinco flagelos sendo quatro anteriores. O quinto flagelo é incorporado junto a membrana ondulante do parasita que é suportado por uma costa delgada não contrátil, e a suas características morfológicas são semelhantes a maioria dos outros trichomonadídeos (PETRIN et al., 1998) (Figura 1). Inoue (2015) durante um estudo com achados de trichomonadídeos em PNHs, descreveu a forma trofozoíta de P. hominis com as seguintes características: são piriformes, apresentam múltiplos flagelos e uma membrana ondulante. Em amostras coradas com Giemsa, os trofozoítos apresentam núcleo, axóstilo, quatro ou cinco flagelos e um flagelo posterior que se alinha ao longo da membrana ondulante e segue solto ao longo do corpo do protozoário (Figura 2). O tamanho desses tricomonadídeos é de aproximadamente de 10 a 15 μm de comprimento e 7 a 12 μm de largura (INOUE et al., 2015). T. foetus é um protozoário com a morfologia característica dos tricomonadídeos, e possui três flagelos anteriores e um posterior, e uma parte livre com a membrana ondulante (WENRICH e EMMERSON, 1933). D. fragilis é um trichomonadídeo que apresenta morfologia semelhante aos demais flagelados. Na forma trofozoíta, não apresenta pelta e flagelos e a locomoção ocorre através de pseudópodes ficando com aspecto ameboide. Todavia, estruturas de pelta e de flagelos são observados na forma cística. O seu corpo celular varia de 3 a 5 µm. As demais organelas, tais como axóstilo, costa, hidrogenossomos, corpos basal e parabasal estão presentes no trofozoíto (BANIK et al., 2012; CAMP et al., 1974; MUNASINGHE et al., 2013). T. mobilensis é um trichomonadídeo que apresenta um corpo mais alongado, uma costa mais delgada, três flagelos anteriores e um flagelo que funciona como membrana ondulante (CULBERTSON et al., 1986).

Figura 1: Imagem ilustrativa de trofozoíta de T. vaginalis. (a) flagelos anteriores (b)membrana ondulante, (c) pelta, (d) costa, (e) hidrogenossomos, (f) axóstilo (Fonte: Bouchemal et al, 2017).

Flagelos

Flagelos Membrana ondulante

Membrana ondulante

Núcleo Costa Núcleo

Axóstilo Axóstilo

Flagelo

Figura 2: Imagem da forma trofozoíta de P. hominis (Fonte: adaptado CDC).

Os trichomonadídeos apresentam uma característica peculiar em relação a mitose, sendo essa exonuclear (CAVALIER-SMITH, 2003). Estes protozoários apresentam um tipo especial de mitose do tipo criptopleuromitótica. Neste tipo de mitose o envelope nuclear persiste, e o fuso mitótico é extranuclear, ocorrendo a paradesmose (Figura 3). O início da divisão é marcado pelo aparecimento do cinestossomo suplementar que aumenta o flagelo ventral. Os microtúbulos cromossomiais vão em direção ao núcleo, prendendo-se nos centrômeros que estão inseridos no envelope nuclear (BRUGEROLLE, 1975). Com o alongamento do fuso extranuclear, o sistema mastigonte da célula filha é separado e migra para um polo oposto. No final, dois núcleos filhos são formados na telófase. Em 5 cada célula filha, os flagelos são formados através do desenvolvimento do cinestossomo (HONIGBERG e BRUGEROLLE, 1990).

Figura 3: Ilustração da mitose do tipo criptopleuromitótica (Fonte: adaptado Honingberg e Brugerolle, 1990).

1.4 Caracterização Molecular

Inicialmente, as relações filogenéticas dos organismos pertencentes a superclasse Parabasália eram classificadas a partir de características morfológicas, e os mapas de evolução eram delineados a partir de um restrito número de características majoritariamente ligadas às estruturas do citoesqueleto (GERBOD et al., 2002). A utilização de métodos moleculares na taxonomia mostrou que alguns protozoários pertencentes a ordem Trichomonadida foram classificados erroneamente, principalmente aqueles cuja classificação foi baseada na espécie de seus hospedeiros. Um exemplo é P. hominis, que apresenta uma grande variedade de hospedeiros, bem como, T. foetus que pode ser encontrado tanto em bovinos quanto em felinos (Dos Santos et al., 2017). Marcadores genéticos são importantes ferramentas na identificação de parasitos e de outros microrganismos, a partir de amostras biológicas ou ambientais (MALIK et al., 2011). Atualmente, os estudos de relações filogenéticas são baseados principalmente na análise da sequência da subunidade menor do RNA ribossomal (SSU-rRNA) (GERBOD et al., 2002). Análise conjunta dos genes gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e SSU-rRNA mostrou ser uma boa ferramenta no esclarecimento do grau de parentesco entre os organismos presentes na superclasse Parabasália (GERBOD et al., 2004). A utilização do SSU-rRNA ribossomal é uma importante ferramenta para as confirmações taxonômicas ao complementar os dados baseados na morfologia

(DIMASUASUAY e RIVERA, 2013; MARITZ et al., 2017). Contudo, existem discordâncias entre os dados baseados nas características morfológicas com os dados obtidos por meio de análise do marcador SSU-rRNA (KEELING et al., 1998). Os marcadores moleculares ITS (espaçador interno transcrito) também são alvos utilizados em estudos de taxonomia. Eles codificam as regiões localizadas entre os genes 18S, 5.8S e 28S. Essa região varia muito entre espécies diferentes, mas é bem conservada em organismos de uma mesma espécie (KLEINA et al., 2004) 2004). Sendo assim, é considerada uma região adequada para a identificação de diferentes espécies de organismos próximos filogeneticamente (HILLIS e DIXON, 1991). O marcador SSU-rRNA tem mostrado um grande potencial para identificação de organismos pertencentes a ordem Trichomonadida, podendo identificar e classificar os microrganismos até o nível taxonômico de família (KLEINA et al., 2004). Dimasuay e Riveira (2003) utilizaram a combinação de dois pares de oligonucleotídeos para amplificação específica do gene 18S rRNA de tricomonadídeos. O primeiro par T18SRi e T18SF amplifica a primeira metade do gene correspondente a 900 pares de base, e o outro par T18SR e T18SFi amplifica em torno de 800pb (DIMASUASUAY e RIVERA, 2013).

1.5 Ciclos biológicos de Tricomonadídeos

O ciclo biológico da maioria dos protozoários da ordem Trichomonadida é simples e com único estágio evolutivo trofozoíta (HONIGBERG, 1963). Todavia, alguns trichomonadídeos tem a capacidade de formar cistos ou pseudocistos em situação de estresse, por exemplo, com a oscilação de temperatura. Os pseudocistos são formas arredondadas com flagelos internalizados muito semelhantes aos cistos, porém não apresentam a parede cística. Essa estrutura é formada por uma camada celular claramente definida que confere resistência ao protozoário (PEREIRA-NEVES et al., 2003).

T. vaginalis, T. mobiliensis, T. foetus, e T. tenax formam pseudocistos (GRANGER et al., 2000; MIDLEJ et al., 2011; PEREIRA-NEVES et al., 2003; RIBEIRO et al., 2015), enquanto que D. fragilis formam cistos (MUNASINGHE et al., 2013). Ainda não existem relatos da formação de cisto ou pseudocisto em P. 7 hominis, somente a forma trofozoíta é descrita ao longo do seu ciclo biológico (BROOKE e MELVIN, 1984). 1.6 Trichomonadídeos presente no trato gastrointestinal

Acredita-se que a via fecal-oral seja a principal forma de transmissão. Tem sido proposto que o ciclo se inicia por meio da ingestão de alimentos e água contaminados. Uma vez ingeridos, os parasitos atingem o intestino grosso, onde os trofozoítos se multiplicam por divisão e posteriormente são eliminados junto às fezes, podendo contaminar alimentos e/ou água. P. hominis apresenta um ciclo biológico relativamente simples, onde apenas a forma trofozoíta é descrita. Isso é um indicativo de que a transmissão desse protozoário ocorre diretamente de um hospedeiro para o outro, uma vez que essa forma flagelada não resiste muito tempo no meio ambiente (BARRATT et al., 2011; BROOKE e MELVIN, 1984; SANTOS, 2016) (Figura 4).

Figura 4: Ciclo biológico de P. hominis (Fonte: elaborado pelo autor)

O ciclo de T. mobilenses ainda não é totalmente conhecido. Sabe-se que esse protozoário pode ser encontrado na forma trofozoíta nas fezes e na porção inferior do intestino de PNHs, principalmente do gênero Saimiri (SCIMECA et al., 1989). Em condições desfavoráveis ocorre a internalização dos flagelos seguido da formação de pseudocistos (MIDLEJ et al., 2011).

Em um estudo com camundongos infectados com D. fragilis foi observado que em condições desfavoráveis, como variação de temperatura, o protozoário é capaz de formar cistos (MUNASINGHE et al, 2013). Nesse mesmo trabalho, os autores sugerem ainda que D. fragilis pode apresentar a forma cística em seu ciclo evolutivo em diferentes hospedeiros (MUNASINGHE et al, 2013) (Figura 5).

Figura 5: Provável ciclo biológico de D. fragilis. Formas trofozoítas que são encontradas nas fezes entram em contato com algum alimento contaminando-o. Desenvolvem a forma cística quando não encontram um ambiente favorável no ambiente, e quando os cistos são ingeridos pelo hospedeiro, e ocorre o desencistamento ao passar pelo estômago. No intestino ocorre a multiplicação das formas trofozoítas, que serão eliminadas juntos às fezes, reiniciando o ciclo (Fonte adaptada: elaborado pelo autor).

1.7 Principais trichomonadídeos descritos em diferentes hospedeiros

Os trichomonadídeos mais estudados são os que infectam o homem e aqueles que causam prejuízos financeiros ou infectam animais domésticos. Gookin e colaboradores identificaram P. hominis e T. foetus em fezes de cães com diarreia (GOOKIN et al., 2005). P. hominis também já foi descrito infectando cachorros (KIM et al., 2010; LI et al., 2015), felinos e suínos (LI et al., 2014). T. foetus é um protozoário de importância medico-veterinária que pode infectar a região urogenital de bovinos, e pode causar abortamento (HONIGBERG, 1963). Também é considerado um agente causador da tricomoníase em felinos em todo mundo (BASTOS et al., 2019; YAO e KOSTER, 2015). Esse protozoário foi descrito em gatos sintomáticos, com diarreia crônica (YAO e KOSTER, 2015) e assintomáticos (SANTOS et al., 2015). Além disso, existe um relato na literatura que descreve um caso de co-infecção com T. foetus e P. hominis em gatos assintomáticos (SANTOS et al., 2015). T. foetus também já foi descrito no cólon e, ocasionalmente no intestino delgado de porcos (LUN et al., 2005). Esse protozoário é considerado como comensal e não patogênico intestinal (TACHEZY et al., 2002), entretanto, um estudo mais recente mostrou que ele pode ser considerado como um patógeno facultativo em suínos (MOSTEGL et al., 2011). Essa mesma espécie de tricomonadídeo também já foi encontrada parasitando touros (LOVE et al., 2017; YAO, 2013).

1.7.1 Hospedeiros humanos

T. vaginalis é o agente causador da tricomoníase humana (SCHWEBKE e BURGESS, 2004). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) a tricomoníase é umas das infecções sexualmente transmissíveis (ISTs) não virais mais prevalentes do mundo com a estimativa de 156 milhões de casos novos por ano (WHO, 2018). Nas últimas décadas têm ocorrido um aumento das taxas de prevalência e a incidência da tricomoníase (POOLE e MCCLELLAND, 2013).

T. tenax é uma espécie encontrada na cavidade oral e região traqueobronquial do homem. Inicialmente foi descrita como um protozoário comensal (HERSH, 1985). Entretanto, esse tricomonadídeo apresenta um potencial patogênico (HONIGBERG, 2012), pois é capaz de causar danos a diferentes linhagens de células de mamíferos em experimentos in vitro (RIBEIRO et al., 2015). P. hominis é um flagelado encontrado no intestino que é considerado não patogênico para o homem, todavia, algumas evidências têm associado o parasito com episódios de diarreia em crianças (MELONI et al., 2011). A presença desse protozoário no trato respiratório humano foi revelada por técnicas moleculares em um relato de caso de enfisema pulmonar (JONGWUTIWES et al., 2000). Além disso, recentemente, um estudo revelou uma alta prevalência de infecção causada por P. hominis em pacientes com câncer intestinal (ZHANG et al., 2019). D. fragilis pode ser encontrado no intestino humano causando doenças gastrointestinais (BARRATT et al., 2011). Existem relatos clínicos que mostram que esse flagelado foi mais prevalente do que Giardia, que é considerado o principal agente causador de diarreia (STARK et al., 2010). Apesar disso, ainda é descrito como um protozoário negligenciado (STARK et al., 2016). A infecção causada por D. fragilis apresenta sintomatologia inespecífica, tais como: dor epigástrica diarreia, vômitos e náuseas (JOHNSON et al., 2004).

1.7.2 Hospedeiros primatas não-humanos (PNHs)

O primeiro relato de tricomonadídeo em PNHs foi em 1908 (NOC, 1908). Desde então, alguns trabalhos vêm sendo descritos na literatura, entretanto, pouquíssimas informações são encontradas. Apesar da grande variedade de parasitos pertencentes a ordem Trichomonadida, ainda pouco se sabe acerca da sua diversidade em PNHs (SMEJKALOVA et al., 2011). Informações mais precisas sobre as espécies encontradas nos primatas são difíceis de serem encontradas na literatura (BRADY et al., 1988). D. fragilis é um protozoário encontrado em fezes de gorilas, babuínos e outros PNHs (HEGNER e CHU, 1930; LANKESTER et al., 2010; STARK et al., 2008). Por sua vez, P. hominis é comumente encontrado no trato intestinal de diversas espécies de saguis (INOUE et al., 2015; PINDAK et al., 1985; SCIMECA

11 et al., 1989; SMEJKALOVA et al., 2011), chimpanzés (SMEJKALOVA et al., 2011) e outros PNHs (CUNHA e MUNIZ, 1929; HEGNER e CHU, 1930). T. mobilensis é um parasito descrito no cécum de primatas não humanos e possui a capacidade de invadir o epitélio intestinal, podendo causar ulceração e necrose da mucosa (SCIMECA et al., 1989). É considerado um protozoário comumente encontrado em colônias de PNHs, principalmente infectando macacos da espécie Saimiri (CULBERTSON et al., 1986; PINDAK et al., 1985). Os relatos de T. vaginalis em primatas são apenas de estudos nos quais esses mamíferos são utilizados como modelos experimentais (PATTON et al., 2006). Naturalmente, essa espécie de trichomonadídeo é encontrada apenas infectando o homem (PRIMON-BARROS et al., 2015).

1.8 PNHs como modelos biológicos

PNHs são os nossos ancestrais mais próximos, e apresentam uma grande variedade de espécies dentro da classe Mammalia. Algumas espécies estão sob perigo de extinção e exigem uma atenção especial para sua preservação (SMEJKALOVA et al., 2011). A proximidade da relação filogenética entre humanos e PNHs assim como similaridade em termos fisiológicos e anatômicos, podem resultar em um alto potencial para o intercâmbio de patógenos (ZHANG et al, 2014). Os primatas são considerados ótimos modelos experimentais para estudos nos campos das ciências básica e aplicada (PHILIPS et al., 2014). Os principais estudos que utilizam PNHs são relacionados com doenças infecciosas, como HIV/ AIDS; febre amarela e dengue (GALLER et al., 2005; MARTININELLI et al., 2015), estudos de neurociências (MITCHELL et al., 2018; MITCHELL e LEOPOLD, 2015) e farmacologia (BRENNAN et al., 2018). Os PNHs são modelos experimentais especiais por apresentarem uma grande semelhança de respostas imunológicas a agentes infecciosos (GIBBS et al., 2007), além de compartilhar doenças e infecções observadas em humanos. As espécies mais comumente utilizadas em pesquisas biomédicas são: Macaca fascicularis (Cynomolgus), Macaca nemestrina e Macaca mulatta (macacos rhesus) (GARDNER e LUCIW, 2008), sendo essa última a mais empregada por ter uma maior distribuição geográfica (XUE et al., 2016). M.

12 mulata teve seu genoma sequenciado em 2007, agregando ainda mais conhecimento sobre a genética desses primatas (GIBBS et al., 2007). O Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB/ Fiocruz) é responsável pela criação e fornecimento de biomodelos para pesquisa biomédica. Além disso, o ICTB também oferece o serviço de controle de qualidade desses modelos experimentais e contribui para o ensino e pesquisa nos laboratórios da Fiocruz e de outras instituições do país (https://www.ictb.fiocruz.br). O Serviço de Criação de Primatas Não Humanos (SCPrim) que pertence ao ICTB/ Fiocruz possui primatas do Novo mundo e Velho mundo. As espécies representativas do Novo Mundo são: Saimiri sciureus e S. ustus, e as do Velho Mundo são: M. mulatta (Macaco rhesus) e M. fascicularis (Cynomolgus). O gênero Saimiri sp. (Figura 6) abriga primatas não humanos neotropicais encontrados principalmente em países como Bolívia e Peru. Este gênero pode ser dividido em 2 grupos por diferenças fenotípicas encontradas na região dos olhos: S. sciureus que apresentam ‘’ arcos góticos’’ e o S. boliviensis que apresentam ‘’arcos romanos’’ (ABEE, 2000). Esses macacos pesam em torno de 3 a 4 kg e se alimentam de frutas, vegetais e insetos (BONSKI et al, 2002). Saimiri sp. apresenta hábitos diurnos e as fêmeas atingem sua idade reprodutiva por volta dos 3 anos de idade, e sua gestação pode durar de 24 a 26 semanas (TAUB, 1980; HOPF, 1967). O principal relato de achados de trichomonídeos intestinais no gênero Saimiri está relacionado à T. mobilenses (CULBERTSON et al., 1986; PINDAK et al., 1985; SCIMECA et al., 1989).

Figura 6: Fotografia de Saimiri sp e S. ustus (Fonte: ICTB/FIOCRUZ)

M. mulatta (macaco rhesus) é uma espécie de primatas de pequeno porte de origem asiática (Figura 7). Em cativeiro observa-se que esses PNHs são menores e mais pesados quando comparados aos encontrados PNHs que vivem na natureza. A dieta desses animais consiste em vegetais, frutas e ocasionalmente pequenos vertebrados. As fêmeas possuem um ciclo menstrual com duração de 26 a 30 dias, e sua gestação dura de 165 a 175 dias (ANDRADE et al., 2010). Os principais achados de trichomonadídeos intestinais em M. mulatta são de P. hominis (CUNHA e MUNIZ, 1929; WENRICH, 1935).

Figura 7: Fotografia de Macaca mulatta (Fonte: ICTB/FIOCRUZ)

M. fascicularis (Cynomolgus) são primatas de origem asiática (Figura 8). O primeiro registro de trichomonídeos intestinais nessa espécie foi feito por Noc em 1908 (NOC, 1908). São macacos de pequeno porte sendo que em cativeiro se apresentam menores e mais pesados do que os exemplares encontrados na natureza. Sua dieta consiste basicamente em frutas e vegetais, podendo também se alimentar de pequenos vertebrados. Sua idade reprodutiva acontece em torno dos três anos. O ciclo menstrual das fêmeas dura de 28 a 32 dias, e sua gestação dura de 155 a 165 dias. Essa espécie tem apenas um filhote a cada gestação (ANDRADE et al., 2010).

Figura 8: Fotografia de macacos Cynomolgus (Fonte: ICTB/FIOCRUZ)

1.9 Tricomonadídeos intestinais isolados de PNHs

Cunha e Muniz (1929), ao investigarem a causa de frequentes desinteria na colônia de macacos da Fiocruz, notaram a presença de P. hominis, a mesma espécie encontrada em humanos, chamando atenção de outros pesquisadores para compreender melhor a relação desses flagelados com PNHs (CUNHA e MUNIZ, 1929). Nos Estados Unidos, 30 PNHs foram analisados, e mais de 80 % dos macacos estavam infectados por trichomonadídeos intestinais, sendo que em 30 % dos casos foi observado degradação da mucosa intestinal dos primatas infectados (SCIMECA et al., 1989). Em um estudo sobre a diversidade de trichomonadídeos intestinais em PNHs realizado na República Checa, foram descritas 9 novas espécies de parasitos intestinais de PNHs (SMEJKALOVA et al., 2011). Nas Filipinas, amostras de PNHs selvagens foram analisadas, e na maioria foi observada a presença de trichomonadídeos, sendo P. hominis a espécie mais frequente presente no intestino. Nesse estudo foi descrito pela primeira vez D. fragilis em PNHs (HEGNER e CHU, 1930). Na República Centro-Africana, Lilly e colaboradores descreveram uma alta prevalência de P. hominis em PNHs (LILLY et al., 2002). Por sua vez, no parque nacional em Uganda (Kibale National Park) foram analisadas seis espécies de

15 primatas. Os pesquisadores identificaram dez protozoários diferentes, incluindo trichomonadídeos sendo D. fragilis a mais prevalente (CHAPMAN et al., 2012). Uma colônia de macacos rhesus infectados pelo vírus da imunodeficiência símia (SIV) na Alemanha foi estudada e nela foram detectadas espécies de Trichomonadídeos nas amostras coletadas (KUHN et al., 1997).

1.10 Doença/ Patogenia A maioria dos trichomonadídeos intestinais encontrados em PNHs não é considerada patogênica (INOUE et al., 2015). O potencial patogênico de D. fragilis está relacionado a alguns casos de diarreias crônicas, mas ainda não existe um consenso entre os estudiosos. (JOHNSON et al., 2004; MUNASINGHE et al., 2013). Autores sugerem que a superfície do lúmen intestinal dos macacos pode influenciar, facilitando a adesão dos tricomonadídeos (SCIMECA et al., 1989). Um estudo com PNHs do gênero Saimiri mostrou um acúmulo de T. mobiliensis no ceco desses primatas. Os autores sugeriram que este acúmulo pode estar relacionado com a pouca movimentação intestinal dessa região quando comparada com as demais seções do intestino. Neste mesmo estudo ainda foi observado que a maioria dos casos de infecção com T. mobiliensis foi invasiva, mas sem uma resposta inflamatória adjacente (SCIMECA et al., 1989). Isso se mostra como um aspecto um tanto singular quando se tenta compreender essa relação hospedeiro-parasita.

1.11 Diagnóstico e Tratamento O diagnóstico de trichomonadídeos em PNHs deve ser feito através do exame parasitológico, que consiste na avaliação direta das fezes em microscópio óptico, seguido pela análise molecular para identificação correta da(s) espécime(s) presentes na amostra fecal (SANTOS, 2016). Em primatas, o tratamento contra os trichomonadídeos intestinais é realizado através do emprego do metronidazol. O metronidazol libera metabólitos tóxicos de vida curta que danificam estruturas do hidrogenossomo, fazendo com que o metabolismo celular só ocorra no citosol (KULDA et al., 1993). Dessa forma, o metronidazol não tem uma função citotóxica imediata necessitando de

16 em média 5 dias para a completa eliminação do protozoário do organismo. A dose diária administrada depende do tipo de hospedeiro, sendo em média em torno de 30mg/kg (BARRATT et al., 2011; BRADY et al., 1988; MELONI et al., 2011). Apesar dos poucos estudos sobre trichomonadídeos em hospedeiros animais, os dados têm mostrado uma grande diversidade de trichomonadídeos. Desta forma, faz-se necessário mais estudos para mapear e dimensionar os casos, empregando o isolamento, análise molecular e ultra-estrutural.

2. JUSTIFICATIVA Os trichomonadídeos são encontrados no trato gastrointestinal de uma variedade hospedeiros. São considerados, em sua grande maioria, parasitos comensais. Nos últimos anos, alguns estudos têm reportado que P. hominis é responsável por quadros de diarreia em felinos e por infecção respiratória em humanos. T. mobilensis é descrito como responsável por quadros de diarreia em primatas não humanos. Por sua vez, T. foetus é considerado um patógeno do trato reprodutivo de bovinos, e mais recentemente foi reportado como agente causador de um quadro de diarreia muco sanguinolenta crônica em felinos. Interessantemente, T. foetus também foi isolado do trato biliar de um indivíduo imunocomprometido. Poucos são os estudos sobre os parasitos das classes Trichomonadidae e Tritrichomonadidae que transitam nos microbiomas intestinais de uma gama de hospedeiros. Os trichomonadídeos podem ser considerados um universo pouco conhecido e inexplorado em relação a sua biologia, biodiversidade e identificação taxonômica. Assim, mapear e dimensionar a presença trichomonadídeos em PNHs de cativeiro é um ponto de partida para estudos dos padrões de infecção, riquezas de espécies assim como, para estudo sobre zoonoses. Diante do exposto acima, percebemos a importância de isolar e identificar trichomonadídeos presentes no microbioma de PNHs. Estudar a diversidade de espécies que colonizam o trato gastrointestinal é um passo fundamental para estudos que visam avaliar o potencial patogênico destes protozoários tanto para saúde animal quanto para a saúde humana.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Identificação e caracterização molecular de trichomonadídeos encontrados no trato-gastrintestinal de PNHs mantidos em cativeiros.

3.2 Objetivos específicos - Realizar a axenização de cepas de trichomonadídeos isoladas de PNHs mantidas em meio poliaxenico; - Manter os tricomonadídeos isolados em meio de cultura TYM; - Padronizar a etapa de criopreservação de amostras axenizadas; - Amplificar o DNA de trichmonadídeos por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para os alvos 18S e ITS1-ITS2; - Realizar o sequenciamento dos produtos amplificados pela PCR e comparar as sequencias obtidas com as disponíveis nos bancos de DNA público (GenBank).

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Origem das amostras

Neste estudo foram utilizadas 19 amostras positivas para trichomonadídeos obtidas de PNHs do Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB) - antigo Centro de Criação de Animais de Laboratório (Cecal) da FIOCRUZ e da Fundação RioZoo, (Zoológico da cidade do Rio de Janeiro). Dessas, 15 amostras já estavam criopreservadas em meio poliaxênico e as quatro restantes foram obtidas a partir de amostras de fezes frescas oriundas do ICTB. Todas as amostras de fezes foram coletadas exclusivamente pelos médicos-veterinários dos respectivos cativeiros, durante o exame clínico realizado periodicamente. A amostra Ph/ S é uma amostra de P. hominis isolada de um paciente, e está depositada na Coleção de Protozoários da FIOCRUZ (COLPROT 899). Essa amostra foi utilizada nas etapas de padronização e como controle positivo dos experimentos (Tabela 1). Esse estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa animal CEUA FIOCRUZ L-W5/16.

Tabela 1: Lista das amostras e seus respectivos hospedeiros

Hospedeiro Identificação Local Armazenamento 1 Humano Ph/S Controle + - 196 ⁰C 2 M. mulatta AN27 ICTB - 196 ⁰C 3 M. mulatta 8117 ICTB - 196 ⁰C 4 Chimpanzé Kioko RioZoo - 196 ⁰C 5 Chimpanzé Paulinho RioZoo - 196 ⁰C 6 S. sciureus 222 ICTB - 196 ⁰C 7 S. sciureus 236 ICTB - 196 ⁰C 8 M. mulatta L38 ICTB - 196 ⁰C 9 S. ustus Q15 ICTB - 196 ⁰C 10 S. ustus Q63 ICTB - 196 ⁰C 11 M. mulatta AM41 ICTB - 20 ⁰C 12 S. sciureus 48PNH ICTB - 196 ⁰C 13 S. sciureus 66 ICTB - 196 ⁰C 14 S. sciureus 224 ICTB - 196 ⁰C 15 M. mulatta AB8 ICTB - 196 ⁰C 16 M. mulatta AC53 ICTB - 196 ⁰C 17 M. mulatta AC24 ICTB - 20 ⁰C 18 M. fascicularis U77B ICTB - 20 ⁰C 19 M. mulatta AB47 ICTB - 196 ⁰C 20 M. mulatta AM59 ICTB - 20 ⁰C

4.2 Axenização dos isolados de amostras fecais de PNHs

Para o processo de axenização de amostras, 1 mL dos isolados criopreservados (cultura poliaxênica) foram adicionados ao meio Pavlova suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) e 2 % (v/v) de penicilina e estreptomicina penicilina (10,000 U/mL)/ estreptamicina (10,000 µg/mL). Inicialmente, as amostras foram mantidas em meio Pavlova por uma semana, em seguida foram inoculadas em meio Trypticase-yeast extract-maltose (TYM) nos pHs 6,3 e 7,0 acrescidos de 2 % (v/v) dos seguintes antibióticos: meropenem, ampicilina, amicacina e piperacilina. Periodicamente os tubos foram observados em microscopia de luz para evidenciar o crescimento e ausência de bactérias. As culturas foram mantidas em estufa a 37 °C, com repiques a cada dois dias. Após a eliminação da flora bacteriana, o isolado foi novamente criopreservado em solução contendo meio TYM suplementado com 10 % de SFB, 2 % de antibiótico e de 10% de solução criopreservante (DMSO ou glicerol).

4.3 Criopreservação de isolados de tricomonadídeos

Os isolados foram criopreservados em solução crioprotetora contendo meio de cultura TYM (pHs 6,3 e 7) suplementado com 10 % (v/v) de SFB e 4 % (v/v) de DMSO ou glicerol. Em seguida, os isolados foram colocados em um aparato comercial de criopreservação (NalgeneTM cryo 1º C - “Mr Frosty”, Sigma, USA) contendo álcool isopropílico absoluto para uma diminuição gradual de temperatura por 24 h. Posteriormente, as amostras foram armazenadas a – 196 o C (N2 líquido). A viabilidade das amostras criopreservadas foi posteriormente avaliada por meio do cultivo em meio TYM pH 6,3.

4.4 Microscopia óptica

Para a observação da morfologia de dois isolados, foram feitos esfregaços em lâminas, essas foram coradas com Giemsa na diluição 1:10. O esfregaço foi fixado em metanol absoluto por 4 min, seguido de 4 min HCl (5 N) e 14 min de

Giemsa, conforme protocolo da Coleção de Protozoários da FIOCRUZ. As lâminas coradas foram então observadas em microscópio óptico.

4.5 Procedimento de extração de DNA

As culturas foram centrifugadas (2500 x g por 10 min), e o sedimento foi então coletado e congelado a – 20 oC para posterior extração de DNA. A extração de DNA dos isolados foi realizada com o kit comercial QIAmp DNA Stool (Qiagen), segundo as instruções do fabricante comercial.

4.6 Ensaios de Reação em cadeia da polimerase (PCR)

As amplificações por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), foram realizadas utilizando um par de oligonucleotídeos iniciadores. Estes iniciadores flanqueiam parte das regiões do espaçador interno transcrito (ITS-1 e ITS-2) e do gene 5.8S rRNA (Integrated DNA Technologies – IDT) e região 18S da família Trichomonadida e Tritrichomonadida. Os iniciadores utilizados foram ITSF (5´-TTC AGT TCA GCT GGT CTT CC-3`) e ITSR (5´- GTA GGT GAA CCT GCC GTT GG-3`) (KLEINA et al., 2004) e T18SR (5´- CCTTCCGTCAATTCCTTCAA-3´) e T18SF (5´-GGAAGCACACTTCGGTCATAG- 3´) (DIMASUASUAY e RIVERA, 2013). As reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 50 μl, contendo os seguintes reagentes: 10 pmol de cada iniciador, 1,5mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP, 20mM Tris-HCl pH 8,4, 1U de Taq DNA polimerase (DNA Platinum polimerase, Invitrogen Life Technologies, USA), 0,04 % de albumina de soro bovino (BSA-Sigma Chem. Co., USA) e 3 uL do DNA extraído. As condições térmicas da amplificação foram as seguintes: uma etapa de desnaturação inicial (95 °C/5 min), seguido de 40 ciclos composto por uma etapa de desnaturação inicial (95 °C/ 30 s), anelamento (54,7 °C/ 30 s) e uma etapa de extensão (72 °C/ 1 min). Após os 40 ciclos, a reação foi submetida a uma etapa de extensão final (72 °C/ 7 min). Para cada PCR foi utilizado controle de reação (branco) e um controle positivo Ph/S. Os produtos da PCR foram posteriormente visualizados em gel de agarose a 1,5 % (70 V por 45 min) em tampão TBE 1X (Tris 1,1 M; Ácido Bórico 0,9 M; EDTA 25 mM, pH 8,3). O gel foi

22 visualizado no trans- iluminador (UV transluminador, Major Science) e fotodocumentados com câmera digital. Uma etapa de padronização do gradiente de temperatura de anelamento foi realizada, onde foram testadas as seguintes temperaturas: 66 ⁰C, 64,9 ⁰C, 63,2 ⁰C, 60,5 ⁰C, 57,3 ⁰C, 54,7 ⁰C, 53 ⁰C e 52 ⁰C. O alvo ITS é descrito como eficaz na identificação a nível de espécie. Na falta de resolução deste alvo, realizaremos a PCR com o alvo 18S.

4.7 Purificação dos produtos de PCR

As amostras oriundas da PCR foram purificadas com o kit Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega), segundo as informações do fabricante. A qualidade do produto purificado foi avaliada através de eletroforese em gel de agarose 1,5 % (p/v) em tampão TBE 1X (Tris 1,1 M; Ácido Bórico 0,9 M; EDTA 25 mM, pH 8,3). Utilizamos 5 uL do produto purificado acrescido de 4 uL do tampão de amostra contendo 2 µL de Gel Red (1:500) e 2 µL de tampão 6X DNA Loading Dye. O padrão de massa molecular (3 uL) utilizado foi o DNA ladder de 100 pb (Ludwig). A corrida eletroforética foi feita à 70 V por 1 h, e em seguida o gel foi visualizado no trans- iluminador (UV transluminador, Major Science) e fotodocumentado com câmera digital.

4.8 Reação de sequenciamento, alinhamento e identificação

Os produtos purificados foram submetidos a reações de sequenciamento utilizando o kit Big Dye TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems), seguindo as instruções do fabricante, e posteriormente a reação foi enviada para a plataforma de sequenciamento PDTIS (Plataforma de Desenvolvimento Tecnológico em Insumos para Saúde)/ FIOCRUZ. Os cromatogramas obtidos foram analisados e editados no programa SeqMan inserido no pacote LaserGene (DNASTAR, Inc. Madison, WI, USA). As sequencias consensos obtidas foram comparadas com as sequencias disponíveis no banco de DNA (GenBank), utilizando a ferramenta BLAST do servidor do NCBI (http://ncbi.nlm.gov/BLAST)

5. RESULTADOS

5.1 Axenização de isolados Os antibióticos meropenem, ampicilina e amicacina não foram eficazes na eliminação bacteriana das amostras em cultura de uma maneira geral. A microbiota bacteriana das amostras foi completamente eliminada apenas na presença de 2 % piperacilina. As amostras axenizadas foram a AC53, AB47, 48PNH, Q15 e 224. As amostras oriundas de culturas poliaxênicas foram inicialmente cultivadas em TYM em dois pHs (pH 6,3 e pH 7,0). O protocolo padronizado para axenização consistiu na utilização de meio TYM suplementado com 10 % SBF, 2 % de piperacilina, nos pH 6,3 e 7,0 e 10% de DMSO. A única exceção foi o isolado 224, que foi criopreservado em solução composta por meio TYM contendo 10 % SBF, 2 % de piperacilina, no pH 6,3 e glicerol a 10 %. A amostra AB47 inicialmente foi inoculada em meio TYM pH 6,3, mas quando foi colocada no mesmo meio de cultura em pH mais básico (pH 7,0), foi observado um crescimento mais expressivo dos parasitos. AB47 foi cultivada em pH 7,0 por 10 dias e em seguida, foi criopreservada. A amostra Ph/ S também cresceu melhor em pH 7,0 e foi criopreservada nessas condições.

5.2 Observação dos isolados por microscopia óptica

Os isolados 224 e Ph/S foram submetidos a técnica de coloração por Giemsa. Em ambos os isolados observamos a presença de flagelos, membrana ondulante, núcleo e axóstilo. Na amostra Ph/S, o axóstilo se afunilava gradualmente até a sua parte mais posterior (Figura 9A). No isolado 224 observamos células com formas arredondadas multinucleadas flageladas (Figura 9B).

A B

Figura 9: Isolados de tricomonadídeos corados com Giemsa. (A) amostra Ph/ S barra Ph/S: 5µM; (B) amostra 224. Barra = 10µM.

5.3 Padronização da temperatura de anelamento do PCR

A etapa de padronização de temperatura de anelamento foi realizada utilizando a amostra Ph/S. As temperaturas de 66 ⁰C, 64,9 ⁰C, 63,2 ⁰C, 60,5 ⁰C, 57,3 ⁰C, 54,7 ⁰C, 53 ⁰C e 52 ⁰C foram testadas, utilizando oligonucleotídeos que amplificam os alvos ITS e 18S. Não observamos amplificação do DNA apenas na temperatura de 52 °C quando utilizamos o ITS. Nas demais temperaturas testadas foi observado um produto amplificado do tamanho aproximado de 300 pares de bases (Figura 10). Para o alvo 18S, na temperatura de anelamento de 52 °C também não houve a amplificação do DNA. Nas demais temperaturas o DNA foi amplificado, entretanto, nas temperaturas de 66 °C, 64,9 °C e 63,2 °C observamos que as bandas no gel apresentaram uma qualidade inferior quando comparada com as demais (Figura 10). Resolvemos então adotar como temperatura padrão a temperatura 54,7 °C para os dois alvos moleculares testados.

ITS 18S

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

900 pb

300 pb

18S

PM 15 16 17 18 19 20

900 pb

Figura 10: Gel de agarose 1,5 % do produto amplificados utilizando os alvos ITS e 18S. (1) controle positivo; (2) nada; (3) 66 ⁰C; (4) 64,9 ⁰C; (5) 63,2 ⁰C; (6) 60,5 ⁰C; (7) 25

57,3 ⁰C; (8) 54,7 ⁰C; (9) 53 ⁰C; (10) 52 ⁰C; (11) nada; (12) nada; (13) 66 ⁰C; (14) 64,9 ⁰C; (15) 63,2 ⁰C; (16) 60,5 ⁰C; (17) 57,3 ⁰C; (18) 54,7 ⁰C; (19) 53 ⁰C; (20) 52 ⁰C. PM: padrão de peso molecular em pares de base (bp).

5.4 Análise dos produtos amplificados e purificados

Das 20 amostras estudadas, 10 foram amplificadas apenas pelo ITS: AN27, 8117, 222, 236, L38, Q63, Kioko, Paulinho e Ph/ S. Utilizando o alvo 18S, apenas 5 amostras amplificaram: AC53, AC24, AM59, U77B e AB47. Os isolados AM41, 48PNH, 66, 224 e AB8 amplificaram tanto no ITS quanto no 18S. Escolhemos aleatoriamente alguns isolados para visualizar o fragmento amplificado em gel. Os isolados 222, L38 e Ph/ S amplificados pelo com alvo ITS apresentaram, como esperado, uma banda de 300 pb. As amostras 48PNH, 66, 224 e AB8 amplificados pelo 18S apresentaram uma única banda de 900 pb (Figura 11).

ITS 18S PM 1 2 3 4 5 6 7

3000pb

1000pb

900pb 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb

Figura 11: Gel de agarose 1,5 % dos produtos amplificados por ITS e 18S. (1) isolado 222; (2) L38; (3) Ph/ S; (4) 48PNH; (5) 66; (6) 224; (7) AB8.

5.5. Identificação molecular dos trichomonadídeos achados nas fezes de PNHs

Das 20 amostras estudadas, nove foram identificadas como P. hominis, duas como T.foetus e duas como Trichomitus batrachorum. Sete amostras não foram identificadas (Tabela 2). Tabela 2: Identificação das amostras utilizando os alvos moleculares ITS e 18S. HOSPEDEIRO ID ALVO ESPÉCIE IDENT E- AMOSTR VALUE A Humanos Ph/S ITS P. hominis 98,76 % 1e-161 M. mulatta AN27 ITS P. hominis 99,70 % 1e-170 M. mulatta 8117 ITS P. hominis 99,70 % 5e-170 Chimpanzé kioko ITS não identificado ------Chimpanzé Paulinho ITS não identificado ------S. sciureus 222 ITS P. hominis 100 % 1e-51 S. sciureus 236 ITS P. hominis 99 % 5e-134 M. mulatta L38 ITS P. hominis 99 % 5e-172 S. ustus Q15 ITS não identificado ------S. ustus Q63 ITS P. hominis 99,10 % 3e-167 ITS M. mulatta AM41* não identificado ------18S ITS T. foetus 98,37 % 0 S. sciureus 48PNH 18S T. foetus 98,57 % 0 ITS P. hominis 99 % 0 S. sciureus 66 18S P. hominis 100 % 0 ITS T. foetus 98,88 % 2e-178 S. sciureus 224 18S T. foetus 99,25 % 0 ITS Monocercomonas columbrum 90,48% 1e-53 M. mulatta AB8 18S Monocercomonas sp. 89% 1e-53 M. mulatta AC53 18S Trichomitus batrachorum 99,83 % 0 M. mulatta AC24* 18S não identificado ------M. fascicularIs U77B* 18S P. hominis 100 % 0 M. mulatta AB47 18S Trichomitus batrachorum 99,76 % 3e-167 M. mulatta AM59* 18S não identificado ------*Material extraído diretamente das fezes

Os isolados AN27, 8117, 222, 236, L38, Q63 e o isolado 66 foram amplificados para o alvo ITS, e identificados como P. hominis. O isolado 66 foi confirmado como P. hominis nos dois alvos utilizados. As amostras 48PNH e 224 foram identificadas como T. foetus. Por sua vez, os isolados U77B, AC53 e AB47 foram sequenciados apenas quando o alvo foi o 18S. U77B foi identificado como

P. hominis. AC53 e AB47 foram identificados como Trichomitus batrachorum (Tabela 2). Os isolados Paulinho e Kioto não foram identificados, uma vez que as sequências obtidas apresentaram picos duplos no eletroferograma, o que é sugestivo de uma infecção mista. O isolado AB8, teve seu DNA amplificado pelo alvo ITS, e a sequência obtida apresentou um baixo percentual de identidade (90,48%) com a sequencias de Monocermonas columbrum depositadas no GenBank. O mesmo resultado foi observado para o alvo 18S, Monocercomonas sp com o percentual de identidade de 89%. Os isolados AM41, Q15, AC24 e AM59 não apresentaram uma boa qualidade de sequência para nenhum dos alvos utilizados, não sendo possível identificá-los.

6. DISCUSSÃO Os trichomonadídeos são descritos parasitando diversas espécies de animais como porcos, cachorros, gatos e PNHs (KIM et al., 2010; LI et al., 2015; LI et al., 2014). Esses protozoários são adaptáveis, não só a diferentes hospedeiros, mas também conseguem parasitar diferentes sítios anatômicos nesses hospedeiros. Podem ser encontrados na cavidade oral, como T. tenax, e no intestino humano, como P. hominis, e ambas as espécies podem ser encontradas no pulmão de indivíduos imunossuprimidos. Essa plasticidade nos mostra como esses protozoários possuem uma grande versatilidade e amplo potencial de adaptação a diferentes ambientes (JONGWUTIWES et al., 2000; MALLAT et al., 2004). Neste estudo foi realizado a axenização de isolados de tricomonadídeos oriundos de fezes de primatas. Amostra fecal por si só é um ambiente onde é encontrada uma ampla variedade de microrganismos, e existe uma dificuldade na eliminação da carga bacteriana desse tipo de amostra, e em conseguir uma cultura axênica. É sugestivo que bactérias tenham uma relação de mutualismo com os flagelados (JULIANO, CAPPUCCINELLI e MATTANA, 1991; JOHANSSON, MORGAN e WINKLER JR, 1947), onde é observado um

28 crescimento mais expressivo dos parasitos quando a flora bacteriana está presente. À medida que a carga bacteriana diminuía com o uso de antibióticos, também observamos a redução da quantidade de parasitos na cultura. Tal fato pode ser tanto explicado pela atividade tóxica do antibiótico, mas como também pela diminuição de uma possível fonte de nutrientes oferecidos pelas bactérias (JOHANSSON, MORGAN e WINKLER JR, 1947; SENECA e IDES, 1953). No primeiro momento após a eliminação das bactérias observamos uma diminuição da quantidade de flagelados, que foi estabilizado ao longo do tempo em cultura. No presente estudo, P. hominis foi a espécie mais identificada e observada em diferentes espécies de PNHs. Quando comparamos as oito amostras de P. hominis obtidas com as sequências depositadas no Genbank, observamos um elavado percentual de identidade com P. hominis encontradas em diferentes hospedeiros e encontradas em locais diferentes do microbiomas (CEPLECHA et al, 2013; DIMASUAY et al, 2013). Os isolados 66, AN27 e Q63 apresentaram um percentual de identidade de 98% com uma sequência de P. hominis obtida de pacientes tailandeses com o quadro de enfisema pulmonar (JONGWUTIWES et al, 2000). P. hominis vem sendo descrito como um frequente colonizador do intestino de PNHs de cativeiro (PINDAK et al, 1985; SMEJKALOVÁ et al, 2011, INOUE et al, 2015). O ciclo de vida desse protozoário tem como único estágio a sua forma trofozoita e sua provável forma de contágio é através da via fecal-oral. Geralmente o primata infectado não apresenta nenhuma sintomatologia (INOUE et al, 2015), entretanto, existem relatos de casos de diarreia onde o único suspeito de causar a infecção foi P. hominis (TOLBERT et al, 2012; MELONI et al, 2011, GOOKIN et al, 2005). P. hominis foi relatado causando diarreia em humanos (MELONI et al, 2011) e de acordo com alguns estudos, esse flagelado é o mesmo encontrado em PNHs (HEGNER e CHU, 1930; WENRICH,1944; SMEJKALOVÁ et al, 2011). Quando a diferenciação dos trichomonadídeos era baseada somente através da microscopia óptica, acreditava-se que os flagelados eram hospedeiro específico. Com a popularização do sequenciamento de DNA, verificou-se que este grupo de protozoários circula em diferentes hospedeiros tanto humano quanto em animais (INOUE et al., 2015; SMEJKALOVA et al., 2011). Não se sabe

29 ao certo se esses animais antes já eram parasitados por tais flagelados, ou se esses flagelados estão passando a se adaptar a novos hospedeiros (INOUE et al., 2015; LEVY et al., 2003; LI et al., 2015). Além disso, a maneira como esses organismos estão se comportando também é um motivo de questionamentos. Anteriormente, a maioria desses protozoários era vista como comensal, mas estudos mais recentes mostraram que muitos deles estão envolvidos com alguma resposta inflamatória e com algumas patologias (JONGWUTIWES et al., 2000; SCIMECA et al., 1989). Os ciclos biológicos de trichomonadídeos ainda não estão completamente elucidados. Muito pouco se sabe acerca das etapas que ocorrem ao longo do ciclo de vida destes protozoários, principalmente sobre o encistamento que ocorre apenas em algumas espécies. Anteriormente, as formas arredondadas e compactas encontradas eram questionadas e podiam ser consideradas formas celulares em estado degenerativo ou apenas contaminação (HONIGBERG e BRUGEROLLE,1990). Atualmente, algumas pesquisas tentaram mostrar que na verdade essas formas podiam ser um mecanismo de resistência desses protozoários ao meio ambiente (PEREIRA NEVES, RIBEIRO, BENCHIMOL, 2003). A forma de resistência pode ajudar a explicar algumas etapas que ainda não estão claras do ciclo desses flagelados, assim como as vias de transmissão. São descritos pseudocistos em T. mobilensis e T. foetus (MIDLEJ et al., 2011) e cistos em D. fragilis (STARK et al., 2014), e esses estágios evolutivos aumentam a chance de infecção de novos hospedeiros (PEREIRA- NEVES, RIBEIRO, BENCHIMOL, 2003). Ainda não existem relatos de formação de pseudocistos em P. hominis, e mais estudos são necessários. P. hominis passa de um hospedeiro para o outro de forma direta já que sua forma trofozoíta não fica viável por muito tempo no meio (BARRATT et al., 2011). A caracterização molecular é um importante recurso para a identificação de organismos muito próximos que não são facilmente diferenciados pela morfologia. Nesse estudo foram utilizados dois pares de iniciadores. O ITS que tem como alvo regiões entre genes 18S, 5.8S e 28S (KLEINA et al, 2004) e o iniciador que tem como alvo o gene 18S. O gene 18S tem uma sequência com 1700 pb e possui um grau maior de conservação. No estudo de Dimasuay foram utilizados dois pares de iniciadores para o alvo 18S. Uma parte de 900pb foi

30 sequenciada pelos iniciadores T18SRi e T18SF e outra parte de 800 pb foi sequenciada com os iniciadores T18SR e T18SFi. Neste estudo foi utilizado somente os iniciadores T18SRi e T8SF (DIMASUASUAY e RIVERA, 2013). O iniciador ITS sequencia entre as regiões ITS-1 e ITS-2 que são genes menos conservados, essa característica é importante para um bom marcador, que pode fazer a identificação até o nível de espécie. Neste estudo, foram seguidos os protocolos utilizados por Kleina e Dimasuay no PCR, porém quando tentávamos as temperaturas de anelamento descritas por esses autores, não obtivemos bons resultados. Assim, optamos por padronizar uma nova temperatura de anelamento. Partindo do princípio de que baixas temperaturas propiciam uma menor estringência entre as moléculas de nucleotídeos (HECKER e ROUX,1996). Dentre as temperaturas que não apresentaram bandas inespecíficas, foi escolhida a temperatura 54,7 ⁰C, pois foi a menor temperatura onde observamos amplificação para ambos alvos utilizados. As amostras AM41, AC24, AM49 e AM59 não apresentaram boa qualidade após o sequenciamento. Os DNAs desses isolados foram extraídos diretamente de fezes congeladas. Elas apresentaram uma reação com baixa eficiência, mas ainda foi possível visualizar bandas no gel de agarose a 1,5 %. Todavia o produto do sequenciamento não foi de boa qualidade impedindo a identificação dos microrganismos. Uma possível explicação para esse ocorrido é a grande quantidade de interferentes como, por exemplo, polissacarídeos, pode funcionar como inibidores na etapa de PCR (MONTEIRO et al, 1997). As amostras 48PNH e 224, ambas coletadas de S. sciureus, foram identificadas como T. foetus. Esta é a primeira vez que se relata esse microrganismo no intestino de PNH. Em decorrência disso, estas amostras foram sequenciadas para os alvos ITS e 18S. As sequências obtidas apresentaram mais de 98% de similaridade com sequências depositadas no Genbank para T. foetus, provenientes de achados em felinos e bovinos (LEVY et al., 2003; RAE e CREWS, 2006). T. foetus é um flagelado de importância veterinária por ser capaz de parasitar o sistema genito-urinário de bovinos. A infecção está relacionada a infertilidade e com isso causa prejuízos financeiros na criação de bovinos (RAE e CREWS, 2006; SANTOS, 2016). Este flagelado também infecta o intestino de gatos e cachorros causando diarreia (GOOKIN et al., 2005; GOOKIN et al., 2001).

T. mobilensis é frequentemente encontrado em PNHs do gênero Saimiri e é capaz de causar diarreia crônica ao agredir a mucosa do seu hospedeiro (SCIMECA et al., 1989). T. foetus e T. mobilensis são relatados como parasitos muito semelhantes pertencentes a família Trichomonadida, e existia a desconfiança de que sejam a mesma espécie. Foi feito um estudo comparativo entre esses dois flagelados, onde foram analisadas características morfológicas, moleculares e metabólicas. Apesar de muitas semelhanças, apresentaram diferenças que ainda os caracterizam como duas espécies diferentes (MIDJE et al, 2011). Um outro achado foi T. batrachorum, que identificado nos isolados AB47 e AC53 coletados de M. mulatta. No cultivo em meio TYM se adaptaram melhor em pH mais próximo a 7,0 tendo um crescimento mais lento em pH 6,3, e nessa faixa de pH não se mantinham estáveis por mais de duas semanas. T. batrachorum é um trichomonadídeo pouco estudado que habita répteis, como cobras lagartos e sapos (DIMASUAY e RIVERA, 2013; VAN̂ ÁĈOVÁ et al, 1997), e já foi encontrado em porcos (DIMASUAY, LAVILLA e RIVERA, 2013). Não há relatos deste flagelado em macacos. Uma possível forma de transmissão desse protozoário pode envolver a participação de pequenos répteis infectados que vivem próximos aos PNHs em cativeiro (SMEJKALOVÁ et al, 2011). As amostras oriundas de chimpanzés do Riozoo apresentaram duplos picos no resultado do eletroferograma. Isso é um indicativo de infecção mista nesses animais. O procedimento ideal para a identificação desses isolados seria a técnica de diluição seriada seguida de clonagem.

7. CONCLUSÕES

- O processo de axenização de trichomonadídeos não é uma tarefa fácil, visto que não existem protocolos descritos na literatura. Talvez se a identificação dos isolados tivesse sido a priori, o processo de axenização poderia ter sido mais rápido;

- A caracterização molecular não foi bem-sucedida quando o DNA foi extraído diretamente das fezes, mesmo quando utilizamos o kit de extração para fezes;

- Algumas amostras não foram identificadas com os alvos moleculares utilizados no presente estudo, pois existe uma limitação do GenBank, em relação ao número de sequencias depositadas que não contemplam todas as espécies de trichomonadídeos;

- Observamos uma grande de diversidade de trichomonadídeos nas amostras de PNHs de cativeiro;

- Pela primeira vez, T foetus e T. batrachorum foram identificados e descritos em PNHs.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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