Univerzita Karlova v Praze Přírodov ědecká fakulta Katedra parazitologie

Evoluce skupiny Retortamonadida (Eukaryota: Excavata: Fornicata)

Bc. Pavla Smejkalová

Diplomová práce Praha 2010

Vedoucí diplomové práce: RNDr. Ivan Čepi čka, Ph.D. Konzultant: Prof. RNDr. Jaroslav Kulda, CSc.

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatn ě a uvedla citace všech použitých pramen ů.

V Praze, 3. 5. 2010 Pavla Smejkalová

2

Na tomto místě bych cht ěla vyjád řit velké pod ěkování svému školiteli RNDr. Ivanu Čepi čkovi, Ph.D. za vedení b ěhem práce v laborato ři a za mnoho podn ětných p řipomínek při sepisování diplomové práce. D ěkuju Ivane, bez tvé pomoci bych tuto práci nikdy nedopsala. Také bych cht ěla pod ěkovat prof. RNDr. Jaroslavu Kuldovi, CSc. za poskytnuté výsledky ultrastrukturní studie a odborné rady. Děkuji všem lidem z našeho týmu za pomoc a za p říjemn ě strávený čas nejen v laborato ři, ale i mimo ni. V neposlední řad ě bych cht ěla poděkovat svým rodi čů m za podporu b ěhem studia.

3

1. ABSTRAKT ...... 6 2. ABSTRAKT ...... 7 3. CÍLE...... 8 4. LITERÁRNÍ P ŘEHLED ...... 9 4.1. Vývoj taxonomie od skupiny Metamonadida k Fornicata...... 9 4.1.1. Metamonadida a p ůvodní Metamonada...... 9 4.1.2. Teorie Archezoa...... 10 4.1.3. Exkavátní hypotéza...... 12 4.1.4. Moderní Metamonada...... 14 4.1.5. Fornicata ...... 14 4.2. Fornicata z hlediska morfologie...... 18 4.2.1. Řád Retortamonadida...... 18 4.2.2. Řád Diplomonadida ...... 25 4.2.3. Bazální Fornicata ...... 26

5. MATERIÁL A METODY...... 27 5.1. Kultivace a izolace nových izolát ů ...... 27 5.1.1. Složení a p říprava používaných médií...... 27 5.1.2. Získávání nových izolát ů ...... 29 5.1.3. Kultivace retortamonád...... 30 5.2. Příprava a zpracování trvalých preparát ů ...... 31 5.2.1. Barvení protargolem podle Bodiana...... 31 5.2.2. Mikroskopické pozorování a zpracovávání preparát ů ...... 33 5.3. Izolace DNA ...... 33 5.4. Amplifikace DNA a sekvenace...... 33 5.4.1. Amplifikace DNA pomocí specifických primer ů ...... 34 5.4.2. Elektroforéza amplifikované DNA...... 36 5.4.3. Přečišt ění PCR produktu...... 37 5.4.4. Klonování...... 37 5.4.5. Colony PCR...... 38 5.4.6. Izolace plasmid ů ...... 39 5.4.7. Sekvena ční reakce...... 39 5.5. Vyhodnocování sekvencí a fylogenetická analýza ...... 40 5.5.1. Tvorba a úprava alignmentu ...... 40 5.5.2. Tvorba fylogenetických strom ů ...... 41

6. VÝSLEDKY...... 42 6.1. Izoláty ...... 42 6.1.1. Vyšet ření hostitelé ...... 42 6.1.2. Kultury...... 43 6.2. Fylogenetická analýza...... 44 6.3. Porovnání délek a hypervariabilních oblastí u blízce p říbuzných druh ů retortamonád ...... 47 6.4. Morfologie ...... 48

4 7. DISKUZE ...... 52 7.1. Získávání nových izolát ů a sekvence:...... 52 7.2. Molekulárn ě-fylogenetická analýza...... 54 7.3. Rod Retortamonas...... 55 7.4. Rod Chilomastix ...... 56 7.5. Řád Retortamonadida...... 57

8. ZÁV ĚRE ČNÉ SHRNUTÍ ...... 59 9. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ...... 60 10. SEZNAM ZKRATEK ...... 72

5 1. ABSTRAKT

Řád Retortamonadida je malou skupinou heterotrofních bi číkovc ů, kte ří se d ělí do dvou rod ů (Chilomastix , Retortamonas ). Zástupci obou rod ů žijí zejména jako st řevní komenzálové obratlovc ů a bezobralých. V nedávné dob ě byl popsán také jeden voln ě žijící druh rodu Chilomastix . Poté, co molekulárn ě-fylogenetické studie prokázaly p říbuznost mezi řádem Retortamonadida, Diplomonadida a voln ě žijícím rodem Carpediemonas , byl vytvo řen taxon Fornicata. V sou časné dob ě tento taxon zahrnuje také voln ě žijící rody Dysnectes , Hicanonectes , Kipferlia a dva doposud nepopsané rody voln ě žijících bi číkovc ů. Řád Retortamonadida byl dlouhou dobu považován za monofyletický taxon. První molekulárn ě-fylogenetická studie, která zahrnovala sekven ční data obou rod ů, ale ukázala, že retortamonády vytvá ří parafyletický taxon, jehož vnit řní skupinou jsou diplomonády. I přesto retortamonády z ůstaly velmi málo prostudovaným taxonem a dodnes mnoho nevíme o příbuzenských vztazích uvnit ř řádu Retortamonadida. Hlavním cílem naší práce bylo získat co nejvíce nových sekven čních dat rodu Retortamonas i Chilomastix . Poda řilo se nám získat nové sekvence 14 kmen ů řádu Retortamonadida (4 kme- ny rodu Chilomastix , 10 kmen ů rodu Retortamonas ) a jednoho doposud nepopsaného rodu enteromonád. Rod Retortamonas vytvo řil v naší analýze, s vysokou statistickou podporou, sesterskou linii řádu Diplomonadida a rozpadl se na t ři samostatné skupiny A, B a C. Pozice rodu Chilomastix z ůstala nejasná, ale díky nov ě získaným sekvencím se v ětev rodu Chilomastix rozpadla na p ět samostatných linií. Naše studie odhalila u rodu Chilomastix obrovskou mezidruhovou i vnitrodruhovou variabilitu sekvencí genu pro SSU rRNA.

Klí čová slova: Fornicata, fylogeneze, Chilomastix, Retortamonas , Retortamonadida, SSU rDNA

6 2. ABSTRAKT

Retortamonads (Retortamonadida; genera Chilomastix and Retortamonas ) are a small group of protists comprising intestinal commensals of both vertebrates and invertebrates and one free-living species of the genus Chilomastix . Molecular phylogenetic studies showed that retortamonads are closely related to diplomonads, Carpediemonas , Dysnectes , Hicanonectes , Kipferlia and two undescribed lineages of free-living Carpediemonas -like organisms, together forming the monophyletic excavate group Fornicata. For a long time Retortamonadida have been assumed to be a monophyletic group. However, first molecular phylogenetic study including sequence data from both Retortamonas and Chilomastix suggested that Retortamonadida are paraphyletic and that diplomonads branch within Retortamonadida. Retortamonads still remain poorly studied protist group and their phylogeny is unclear. We sequenced and analysed SSU rDNA of ten Retortamonas and four Chilomastix SSU rDNA sequences. In addition, we sequenced SSU rDNA of an undescribed enteromonad lineage. The phylogenetic tree of Fornicata was largely unresolved and the phylogenetic position of the genus Chilomastix remained unclear. On the other hand, the genus Retortamonas and diplomonads formed a robust clade. Retortamonas sequences split into three host-specific lineages. The genus Chilomastix was monophyletic and split into five lineages. We identified an enormous interspecific and intraspecific variability within the genus Chilomastix .

Keywords: Fornicata, phylogeny, Chilomastix, Retortamonas , Retortamonadida, SSU rDNA

7 3. CÍLE

1. Osekvenovat a analyzovat sekvence genu pro SSU rDNA u kmen ů rodu Retortamonas a Chilomastix p ěstovaných na P řF UK.

2. Kultivovat a získat sekvenci SSU rDNA zástupce rodu Retortamonas z hmyzího hostitele.

3. Získat a analyzovat sekvence genu pro hsp90 rodu Chilomastix .

4. Zpracovat morfologii p ěstovaných kmen ů rodu Retortamonas a Chilomastix .

8 4. LITERÁRNÍ P ŘEHLED

Fornicata je relativn ě nedávno vytvo řený taxon (Simpson, 2003), který pat ří do eukaryotické říše Excavata (Cavalier-Smith, 2002; Simpson, 2003). Tento taxon zahrnuje velmi r ůznorodé skupiny jednobun ěč ných heterotrofních bi číkovc ů. Voln ě žijící rody Carpediemonas (Simpson & Patterson, 1999), Dysnectes (Yubuki et al., 2007), Hicanonectes (Park et al., 2009) a Kipferlia (Kolisko et al., 2010) jsou příbuzné parazitickým i voln ě žijícím retortamonádám (řád Retortamonadida; Grassé, 1952; Honigberg et al., 1964) a diplomonádám (řád Diplomonadida; Brugerolle et al., 1975b). Fornicata jsou z hlediska morfologie zna čně diverzifikovanou skupinou. Simpson (2003) sice na základ ě rozsáhlé srovnávací morfologické studie stanovil, že denzní v ějí řovitá fibrila, která se ohýbá nad vrcholem cytostomu, je synapomorfním znakem fornikát, ale u zna čně odvozených diplomonád byla tato struktura sekundárn ě redukována. Název taxonu je odvozen práv ě od této fibrily (lat. fornix = klenba). I p řes všechny strukturální odlišnosti je možné Fornicata definovat jako monofyletický taxon. Nikoli však na základ ě morfologie, ale výhradn ě na základ ě molekulárn ě- fylogenetických studií (Silberman et al., 2002; Simpson et al., 2002a; Kolisko et al., 2005, 2008, 2010; Yubuki et al., 2007; Cepicka et al., 2008; Park et al., 2009). Ješt ě p řed vznikem taxonu Fornicata byly řády Retortamonadida a Diplomonadida spjaty s existencí n ěkolika dalších taxon ů a teorií.

4.1. Vývoj taxonomie od skupiny Metamonadida k Fornicata

4.1.1. Metamonadida a p ůvodní Metamonada

Skupina Metamonadina (Grassé, 1952) byla charakterizována p řítomností axostylu a čty ř či více bi čík ů. Obsahovala tedy trichomonády, oxymonády, ale také retortamonády, o kterých se dnes ví, že žádný axostyl nemají. Do tohoto taxonu nebyly zahrnuty diplomonády, a to prá- vě na základ ě nep řítomnosti axostylu. Až do rozvoje elektronové mikroskopie byly Metamonadina respektovaným taxonem (Honigberg et al., 1964). Cavalier-Smith (1981) vylou čil z taxonu Metamonadida trichomonády, a to na základ ě jejich unikátních ultrastrukturních znak ů: uzav řená mitóza s extracelulárním d ělicím vřeténkem, výrazn ě vyvinutý Golgiho aparát p řipojený parabasálními fibrilami k mastigontu,

9 hydrogenosomy a charakteristická struktura kosty a axostylu. Zárove ň s vylou čením trichomonád vytvo řil nový taxon Metamonada, do kterého krom ě bývalých zástupců skupiny Metamonadina zahrnul i diplomonády, kv ůli jejich hypotetické blízké p říbuznosti s retortamonádami (Brugerolle, 1975b, 1977). Další vývoj pojetí metamonád byl úzce spjat s nov ě vzniklou teorií Archezoa.

4.1.2. Teorie Archezoa

Teorie Archezoa (Cavalier-Smith, 1983) p řepokládala, že k endosymbióze a vzniku mitochondrie došlo v evoluci eukaryotických organism ů pom ěrn ě pozd ě a že existují takové primitivní skupiny prvok ů, které se od ostatních eukaryot odšt ěpily ješt ě p řed touto událostí. Do nov ě vzniklé říše Archezoa (Cavalier-Smith, 1983) byly zahrnuty 4 skupiny (kmeny): Metamonada (Oxymonadida, Retortamonadida a Diplomonadida), Parabasalida, Archamoebae a Microsporidia. Archezoa se od ostatních eukaryot lišila organizací bu ňky. Na první pohled se jednalo o primitivní bu ňky s velmi slab ě vyvinutým endomembránovým systémem a nep řítomností n ěkterých klasických eukaryotických organel, zejména pak mitochondrie. Primitivnost t ěchto kmen ů byla dále podpo řena prvními molekulárn ě-fylogenetickými studiemi (Sogin, 1989), podle kterých se zástupci archezoí odv ětvovali parafyleticky na bázi eukaryotického stromu. Archezoa se stala st ředem zájmu řady autor ů a teorie byla testována hned dv ěma zp ůsoby. Byla ov ěř ována fylogenetická pozice amitochondriálních skupin řazených mezi Archezoa, ale zejména v nich byly hledány produkty mitochondriální endosymbiózy (Cavalier- Smith, 1993; Roger, 1999). Díky intenzivnímu výzkumu dostala tato teorie první trhliny. Postupn ě byly tém ěř u všech skupin nalezeny ur čité mitochondriální geny a Archezoa nejprve přestala být samostatnou říší (Cavalier-Smith, 1998), až postupn ě zanikla úpln ě (Roger, 1999).

4.1.2.1. Mitochondriální relikty u archezoí

První skupinou vylou čenou z archezoí byly trichomonády. Nalezené geny pro mito- chondriální proteiny hsp70 a cpn60 (Bui et al., 1996; Germot et al., 1996) potvrdily názor, že hydrogenosomy trichomonád sdílejí spole čného p ředka s mitochondrií (Lindmark & Müller, 1973; Müller, 1993; Dyall & Johnson, 2000).

10 Podobný osud potkal i v ětšinu ostatních archezoí. Bylo prokázáno, že mikro- sporidie nejsou primitivními eukaryoty, ale sekundárn ě zna čně modifikované houby. Keeling a Doolittle (1996) provedli fylogenetickou studii gen ů pro α- a β-tubulin a pro- kázali, že mikrosporidie jsou blízce p říbuzné houbám, a tedy spadají do říše Fungi. Germot et al. (1997) potvrdili p říbuznost mikrosporidií a hub porovnáním mitochondriálního genu pro protein teplotního šoku hsp70. Clark a Roger (1995) prokázali, že geny pro chaperon cpn60 a pro pyridin nukleotid transhydrogenázu (PNT) izolované z Entamoeba histolytica mají mitochondriální p ůvod. Pozd ěji byl chaperon cpn60 lokalizován v dříve nepopsané organele, mitosomu (Tovar et al., 1999; Mai et al., 1999), která má stejn ě jako hydrogenosom mitochondriálního předka. V okamžiku, kdy poslední archezoální skupinou z ůstaly metamonády (Cavalier- Smith, 1981), se již neuvažovalo o jejich samostatném postavení v rámci eukaryotického stomu. Cavalier-Smith (1998) vyjád řil nezbytnost zm ěny definice a popisu archezoí. Metamonády se sice stále v ětvily bazáln ě na eukaryotickém stromu, ale už nebyly považovány za primitivn ě amitochondriální. Oxymonády z ůstaly po dlouhou dobu velmi málo studovanou skupinou. Carpenter et al. (2008) popsali u druhu Saccinobaculus doroaxostylus p řítomnost denzní kulaté organely s dvojitou membránou. U rodu Monocercomonoides byla zjišt ěna p řítomnost gen ů pro [FeFe ] hydrogenázu a pyruvát-ferredoxin oxidoreduktázu (Hampl & Simpson, 2007), ale bun ěč ná lokalizace jejich produkt ů není doposud známá. Tyto výsledky bohužel nepodávají jasný d ůkaz o tom, že denzní organela oxymonád má mitochondriální p ůvod. Jasné d ůkazy o p řítomnosti organely takového p ůvodu byly však zjišt ěny u druhu Trimastix pyriformis (Hampl et al., 2008), který je blízce p říbuzný oxymonádám (Dacks et al., 2001). Nedávné výzkumy prokázaly, že i u diplomonád byla mitochondrie sekundárn ě redukována. Hodn ě studovaným organismem z řad diplomonád se stal druh Giardia intestinalis . Postupn ě u n ěj byla popsána řada gen ů kódujících mitochondriální proteiny: valyl-tRNA syntetázu (Hashimoto et al., 1998), chaperon cpn60 (Roger et al., 1998), cystein desulfurázu IscS (Tachezy et al., 2001) a protein teplotního šoku hsp70 (Arisue et al., 2002). Tovar et al. (2003) použili protilátky proti protein ům IscS a IscU (enzymy účastnící se biosyntézy Fe-S center mimo jiné v mitochondriích a jejich derivátech) k jejich lokalizaci v bu ňce giardie. Pomocí imunodetekce byly tyto proteiny lokalizovány v malých organelách s dvojitou membránou, v mitosomech. B ěhem genomového projektu byly u giardie nalezeny n ěkteré geny, které jsou homologické s geny mitochondriálními,

11 ale u žádného nebyla prokázána fylogenetická afinita k mitochondriální linii (Morrison et al., 2007). V poslední dob ě byly objeveny další dva proteiny mitochondriálního p ůvodu (Tom40, monothiol glutaredoxin) lokalizované v mitosomu Giardia intestinalis (Dagley et al., 2009; Rada et al., 2009). Další diplomonádou, u které byl detekován mitochodriální gen (chaperon cpn60) je Spironucleus barkhanus (Horner & Embley, 2001). Mimoto byla u druhu Spironucleus vortens pozorována denzní organela s dvojitou membránou a p řed- pokládá se, že by se mohlo jednat o pozůstatek mitochondrie (Sterud & Poynton, 2002). U řádu Retortamonadida doposud nebyla jasn ě prokázána p řítomnost mitochondriálních relikt ů. Hampl a Simpson (2007) zjistili p řítomnost denzní organely s dvojitou membránou na snímcích již publikované ultrastruktury druhu Chilomastix cuspidata (Weerakoon et al., 1999). U rodu Retortamonas zatím nebyla pozorována organela, o které by se dalo soudit, že má mitochondriálního p ředka. Díky p řítomnosti těchto organel u rodu Chilomatix a také díky prokázané blízké p říbuznosti retortamonád a diplomonád (Silberman et al., 2002; Kolisko et al., 2005, 2008; Cepicka et al., 2008; Park et al., 2009) je celý řád Retortamonadida považován za sekundárn ě amitochondriální. U voln ě žijících rod ů fornikát Carpediemonas, Dysnectes a Hicanonectes , které jsou blízce p říbuzné retortamonádám a diplomonádám (Park et al., 2009), byly také pozorovány organely, o nichž se soudí, že by mohly mít spole čného p ředka s klasickou mitochondrií (Simpson & Patterson, 1999; Yubuki et al., 2007; Park et al., 2009).

4.1.3. Exkavátní hypotéza

Postupné objevy řady mitochondriálních gen ů v původních archezoích pomohly sice p řekonat představu, že známe primárn ě amitochondriální eukaryotické organismy, ale nijak to ne- vysv ětlilo bazální postavení n ěkterých bývalých archezoí. Patterson et al. (1999) si povšimli morfologické podobnosti mezi organismy, u kterých nebyl v té dob ě nijak doložen poz ůstatek mitochondrie (retortamonády, Trimastix , Carpediemonas ), a jakobidy, kte ří mají klasickou mitochondrii. Na základ ě těchto pozorování byly hledány morfologické podobnosti mezi dalšími taxony a byla vytvo řena tzv. exkavátní hypotéza (Patterson et al., 1999; Simpson & Patterson 1999). Spojujícím znakem tzv. exkavátních taxon ů se stal výrazn ě vyvinutý cytostom s asociovaným zp ětným bi číkem a cytoskeletárními útvary. Dle této hypotézy cytostomy heteroloboseí, diplomonád, retortamonád, jakobid ů a rod ů Malawimonas , Trimastix a Carpediemonas jsou homologické a tyto taxony se vyvinuly ze spole čného exkavátního

12 předka. Simpson a Patterson (1999) ale nevylou čili možnost, že by uskupení exkavátních taxon ů mohlo být parafyletické, a že by typickým exkavát ů mohly být p říbuzné i další taxony. Pozd ější molekulárn ě-fylogenetické studie potvrdily p říbuznost n ěkterých exkavátních taxon ů s bi číkovci, kte ří nevykazují typicky exkavátní znaky. Na základ ě multigenové analýzy byla zjišt ěna p říbuznost skupiny Parabasalia a Fornicata (Baldauf et al., 2000; Arisue et al., 2005). Analýza genu pro SSU rRNA ukázala blízkou p říbuznost rodu Trimastix a oxymonád (Dacks et al., 2001) a pozd ěji byl na základ ě této p říbuznosti vytvo řen taxon Preaxostyla (Simpson, 2003). Poslední skupinou prvok ů, u které byla zjišt ěna p říbuznost s exkavátními taxony, byla Euglenozoa. Molekulárn ě-fylogenetické studie (Silberman et al., 2002; Cavalier- Smith, 2003) potvrdily p ředpokládanou p říbuznost mezi skupinou Euglenozoa a Heterolobosea. Cavalier-Smith již d říve (1998) vytvo řil taxon Discicristata, který sdružoval Heterolobosea a Euglenozoa na základ ě unikátního tvaru mitochondriálních krist. Morfologická podobnost exkavátních taxon ů a nov ě zjišt ěné d ůkazy o jejich příbuznosti s taxony Parabasalia, Oxymonadida a Euglenozoa vedly k vytvo ření nové skupiny Excavata (Cavalier-Smith, 2002). Cavalier-Smith se ale omezil pouze na popis taxonu a nijak se nezam ěř il na studium a porovnání exkavátních znak ů. Simpson (2003) proto provedl rozsáhlou kladistickou analýzu utrastrukturních znak ů. Navrhl osm apomorfních exkavátních znak ů, vyskytujících se v cytostomální oblasti, a sledoval jejich p řítomnost u všech taxon ů skupiny Excavata. Tato studie ale nep řinesla silný d ůkaz o monofylii exkavát a nebyl nalezen žádný synapomorfní morfologický znak této nov ě vytvo řené říše. Podobné výsledky p ři zjiš ťování monofylie exkavát m ěly i molekulárn ě-fylogenetické studie. Dlouhou dobu existovaly pouze dv ě, které se p řiklán ěly k tomu, že Excavata jsou monofyletická (Cavalier-Smith, 2003; Nikolaev et al., 2004). Ostatní auto ři (Dacks et al., 2001; Arisue et al., 2005) naopak usuzovali, že se jedná o polyfyletický taxon. I p řesto, že panovaly pochyby o monofylii skupiny Excavata, byly postupn ě nahromad ěny dobré důkazy o monofylii jejích vnit řních skupin (Simpson et al., 2002a, 2002b, 2006; Cavalier-Smith, 2003; Simpson & Roger, 2004; Hampl et al. 2005). Teprve nedávno se prokázalo, že artefakt p řitahování dlouhých v ětví nejspíše stojí za zdánlivou nep říbuzností exkavátních taxon ů. Dlouhé v ětve řady exkavát byly totiž ve fylogenetických analýzách přitahovány k jiným dlouhým v ětvím vyskytujících se uvnit ř jiných říší (Hampl et al., 2009). Hampl et al. (2009) provedli rozsáhlou fylogenomickou studii, při níž zohlednili problém p řitahování dlouhých v ětví a prokázali monofylii říše Excavata.

13 4.1.4. Moderní Metamonada

Při vytvo ření teorie Archezoa byly do skupiny Metamonada řazeny řády Retortamonadida, Diplomonadida a Oxymonadida. Jednalo se o t ři rozdílné linie, které byly spojovány na zá- klad ě n ěkolika shodných morfologických znak ů: podobné uspo řádání bazálních t ělísek a nep řítomnost klasické mitochondrie a Golgiho aparátu (viz Brugerolle, 1991). Do té doby ale nebyly jasn ě známy p říbuzenské vztahy mezi metamonádami. Cavalier-Smith (1993) vytvo řil taxon Eopharyngia obsahující diplomonády a retortamonády, a to na základ ě struktury mohutn ě vyvinutého cytofaryngu. Pozd ější vývoj taxonu Metamonada byl spjat s vývojem exkavátní teorie a s nov ě obje- venými vztahy mezi exkavátními taxony. Byla zjišt ěna p říbuznost mezi rodem Carpediemonas a diplomonádami (Simpson et al., 2002a) a byl vytvořen nový taxon Fornicata (Simpson, 2003). Na základ ě fylogenetických analýz byla potvrzena p říbuznost fornikát, trichomonád a oxymonád (Hampl et al., 2005). Moderní metamonády tedy op ět zahrnují d říve vylou čené trichomonády a od p ůvodního taxonu Metamonadida (Grassé, 1952) se liší pouze za členěním diplomonád a nov ě popsaných taxon ů pat řících mezi Fornicata. Metamonády jsou nyní člen ěny na dv ě hlavní skupiny: Trichozoa (Fornicata + Parabasalia) a Preaxostyla (Oxymonadida + Trimastix ) (Cavalier-Smith, 2003).

4.1.5. Fornicata

O p říbuznosti řád ů Retortamonadida a Diplomonadida se uvažovalo již na základ ě výsledk ů prvních ultrastrukturních studií (Brugerolle, 1975b). Cavalier-Smith (1993) pozd ěji vytvo řil taxon Eopharyngia. Na základ ě morfologických znak ů se p ředpokládalo, že retortamonády a diplomonády tvo ří monofyletické, sesterské taxony. Podle některých metod použitých v prvních molekulárn ě-fylogenetických studiích se ale retortamonády větvily uvnit ř taxonu Diplomonadida a tvo řily sesterskou skupinu k jeho podskupin ě Giardiinae. Toto v ětvení mělo nízkou statistickou podporu (Silberman et al., 2002) a sami auto ři byli k těmto výsledk ům pom ěrn ě skepti čtí. Pozd ější analýzy (Keeling & Brugerolle, 2006; Cepicka et al., 2008; Kolisko et al., 2008, 2010) sice ponechávaly diplomonády monofyletické, ale vždy pouze s nízkou statistickou podporou.

14 Od doby, kdy Brugerolle (1973a, 1977) provedl ultrastrukturní studie rod ů Chilomastix a Retortamonas , nikdo nepochyboval o monofylii řádu Retortamonadida. Když ale byly do molekulárn ě-fylogenetické analýzy zahrnuty nejenom sekvence rodu Retortamonas , ale i sekvence rodu Chilomastix (Cepicka et al., 2008), ukázalo se, že se z řejm ě jedná o para- fyletický taxon, jehož vnit řní skupinu tvo ří diplomonády. Ve výsledcích této analýzy rod Retortamonas tvo řil sesterskou skupinu k monofyletickému taxonu Diplomonadida a rod Chilomastix se v ětvil bazáln ěji. Cepicka et al. (2008) ale poukázali na fakt, který by mohl osv ětlit p říčinu protikladných výsledk ů morfologických a molekulárních fylogenetických analýz. V molekulárn ě-fylogenetických analýzách byly zahrnuty pouze sekvence zástupc ů rodu Retortamonas , kte ří byli izolováni z obratlov čích hostitel ů, ale ultrastruktura byla studována pouze na druhu Retortamonas agilis , který pochází ze st řeva hmyzího hostitele. Zatímco morfologické znaky druh ů Retortamonas agilis a Chilomastix aulastomi se shodují, doposud nepublikovaná studie ultrastruktury „obratlov čího“ druhu rodu Retortamonas (viz Cepicka et al., 2008; Kulda, unpubl.) vykazuje výrazné rozdíly, z nichž asi nej- významn ějším je nep řítomnost mikrotubulárního korzetu. Na základ ě rozdílné ultrastruktury lze říci, že „obratlov čí“ Retortamonas je novým rodem, odlišným od d říve popsaného rodu Retortamonas z hmyzu, ale bez sekvencí hmyzích retortamonád z ůstávají vnit řní vztahy skupiny Eopharyngia nejasné. Řád Diplomonadida zahrnuje unizoické enteromonády a diplozoické taxony Hexamitinae a Giardiinae, jejichž p říbuznost byla prokázána již na základ ě ultrastrukturních studií (Brugerolle, 1986, 1973b, 1974a, 1974b, 1975a, 1975b; Cheissin, 1965; Friend 1966; Ferguson, 1979; Desser et al., 1993; Sterud et al., 1997; Sterud, 1998; Sogayar & Gregório, 1998; Brugerolle & Regnault, 2001; Poynton & Sterud, 2002). Na základ ě morfologických znak ů Brugerolle (1975b) navrhl možné vývojové schéma diplozoických bun ěk diplomonád z unizoických enteromonád a Kulda a Nohýnková (1978) vytvo řili samostatnou čele ď Enteromonadidae, která byla považována za bazální linii diplomonád. Sidall et al. (1992) provedli fylogenetickou studii morfologických znak ů a její výsledky podpo řily bazální postavení enteromonád. Simpson (2003) poprvé vyjád řil pochybnosti o postavení enteromonád v rámci taxonu Diplomonadida. Na základ ě nepublikovaných molekulárních dat usuzoval, že enteromonády tvo ří n ěkolik r ůzných skupin uvnit ř diplomonád a že by tedy evoluce mohla probíhat nejen od unizoické bu ňky k diplozoické, ale i naopak. Teprve nedávno provedené molekulárn ě-fylogenetické analýzy prokázaly, že enteromonády nejsou sesterskou pop ř. bazál- ní parafyletickou skupinou diplozoických diplomonád, ale že se rozpadají na t ři r ůzné v ětve uvnit ř skupiny Hexamitinae (Kolisko et al., 2005, 2008). Kolisko et al. (2008) také potvrdili

15 výsledky d řív ějších studií (Cavalier-Smith & Chao, 1996; Silberman et al., 2002; Jørgensen & Sterud, 2007), které poukazovaly na to, že rod Spironucleus je parafyletický a rozpadá se na tři samostatné v ětve postupn ě se odv ětvující na bázi taxonu Hexamitinae. Simpson et al. (2002a) prokázali p říbuznost diplomonád (sekvence retortamonád nebyly v té dob ě k dispozici) a nov ě popsaného mo řského bi číkovce rodu Carpediemonas . Na základ ě výsledk ů srovnávací morfologické studie a molekulárn ě-fylogenetických analýz byl vytvo řen taxon Fornicata (Simpson, 2003). V posledních letech byli z mo řského sedimentu izolováni bi číkovci rodu Dysnectes (Yubuki et al., 2007) a Hicanonectes (Park et al., 2009), kte ří stejn ě jako zástupci rodu Carpediemonas tvo ří bazální linie fornikát. Kolisko et al. (2010) provedli molekulárn ě-fylogenetickou studii, do níž zahrnuli známé sekvence rodu Carpediemonas , Dysnectes a Hicanonectes a sekvence 18-ti nových, doposud nepopsaných, mo řských izolát ů (viz obr. 1). Tyto sekvence se rozd ělily do šesti samostatných linií (CL1 až CL6), bazálních k rodu Retortamonas a diplomonádám. Linie CL1 zahrnovala již popsaný rod Dysnectes , linie CL3 rod Hicanonectes a linie CL4 druh Carpediemonas membranifera . Linie CL6 byla tvo řená již popsaným druhem Carpediemonas bialata , který byl překlasifikován do nov ě popsaného rodu Kipferlia . Linie CL2 a CL5 zahrnují doposud nepopsané rody. Příbuzenské vztahy mezi všemi bazálními liniemi fornikát, tedy i rodem Chilomastix , jsou ale doposud neznámé.

16

Obr. 1: Fylogenetický strom genu pro SSU rRNA taxonu Fornicata. (zdroj: Kolisko et al., 2010)

17 4.2. Fornicata z hlediska morfologie

4.2.1. Řád Retortamonadida

Většina druh ů tohoto řádu byla popsána již na p řelomu 19. a 20. století (viz. Wenrich, 1932; Kulda & Nohýnková, 1978), ale i p řesto tento řád z ůstal jednou z nejmén ě studovaných eukaryotických skupin. Retortamonády se vyzna čují výrazn ě vyvinutým cytostomem a žijí zejména jako st řevní komenzálové či parazité bezobratlých a obratlovc ů včetn ě člov ěka (Kowalczyk, 1938; Kulda & Nohýnková, 1978). V relativn ě nedávné dob ě byl z mo řského sedimentu popsán jediný voln ě žijící druh retortamonád, Chilomasti x cuspidata (Bernard et al., 1997). Řád Retortamonadida zahrnuje i p řes řadu popsaných druh ů pouze dva rody, Retortamonas a Chilomastix . Na podobnost obou rod ů upozornili již auto ři v první polovin ě 20. století (Mackinnon, 1915; Alexeieff, 1917; Kowalczyk, 1938). Alexeieff (1917) vytvo řil čele ď Embadomonadidae, která zahrnovala rody Embadomonas (dnes Retortamonas ) a Chilomastix . Wenrich (1932) synonymizoval rod Embadomonas s rodem Retortamonas (Grassi, 1879) a čele ď Embadomonadidae p řejmenoval na Retortamonadidae. Příbuznost rod ů Chilomastix a Retortamonas byla potvrzena studiemi bun ěč né struktury druh ů Chilomastix aulastomi (Brugerolle, 1973a) a Retortamonas agilis (Brugerolle, 1977). Po dlouhou dobu to byly jediné studie zam ěř ující se na ultrastrukturu retortamonád. Pozd ěji byla publikována práce o ultrastruktu ře voln ě žijícího druhu Chilomastix cuspidata (Bernard et al., 1997). Tento druh byl p ůvodn ě popsán jako Percolomonas cuspidata (Larsen & Patterson, 1990), ale studie jeho ultrastruktury prokázala p řítomnost všech znak ů typických pro retortamonády. Bu ňka retortamonád má nej čast ěji hruškovitý tvar s oblým anteriorním a se zašpi čat ělým posteriorním koncem. U rodu Chilomastix je posteriorní konec bu ňky spíše protažen do delší špice, zatímco bu ňka zástupc ů rodu Retortamonas m ůže být u n ěkterých druh ů více oválná (viz Kulda & Nohýnková, 1978). Povrch bu ňky je vyztužen „korzetem“ vzájemn ě propojených mikrotubul ů (viz obr. 2) (Brugerolle 1973a, 1977).

18

Obr. 2: Vrstva subpelikulárních mikrotubul ů (Fsp) se nachází t ěsn ě pod cytoplazmatickou membránou (Mb). Šipka ozna čuje spoje mezi mikrotubuly. (zdroj: Brugerolle, 1973a).

Jádro retortamonád je vždy umíst ěno anteriorn ě a v jeho blízkosti se otvírá výrazn ě vyvinutý cytostom, který pokra čuje na ventrální stran ě asi do 1/2 délky bu ňky (Germain, 1932; Lair, 1956; Brugerolle 1973a, 1977). V apikální oblasti, napravo od jádra a nad horním okrajem cytostomu se nacházejí čty ři bazální t ělíska, která jsou organizována do dvou kolmých, od se- be vzdálených pár ů (viz obr. 3). U rodu Retortamonas z ůstávají dv ě bazální t ělíska holá a pouze dv ě nesou volný bi čík, zatímco u rodu Chilomastix všechna bazální t ělíska nesou volný bi čík (Brugerolle 1973a, 1977). U obou rod ů řádu Retortamonadida je jeden bi čík zp ětný a prochází cytostomem. Tento bi čík je po celé své délce volný (Collier & Boeck, 1926) a není vytvo řena undulující membrána, jak bylo chybn ě popisováno n ěkterými autory (da Fonseca, 1920; Boeck, 1921; Becker, 1926; Bishop, 1931; Zaman et al., 2000, viz Brugerolle, 2000). U rodu Chilomastix zp ětný bi čík nep řesahuje délku cytostomu (Leiva, 1921; Wenrich, 1932; Janakidevi, 1961), zatímco u rodu Retortamonas v ětšinou ano (Bishop, 1931; Hogue, 1933; Ludwig, 1946; Stabler, 1944; Nie, 1950). Zp ětný bi čík má v oblasti cytostomu lamelární výb ěžky. Po čet t ěchto výb ěžk ů odlišuje rody tohoto řádu. Zatímco u rodu Chilomastix byly pozorovány dva výb ěžky (Brugerolle, 1973a), u rodu Retortamonas dva až t ři (Brugerolle, 1977). S oblastí karyomastigontu jsou asociované mikrotubulární pásy a další denzní útvary. Hlavními mikrotubulárními pásy po čínajícími v oblasti mastigontu je pravá (Fd) a levá (Fg) fibrila, které podkládají cytostom, a pás supranukleárních mikrotubul ů (Brugerolle, 1973a, 1977). U druhu Chilomastix cuspidata nebyla popsána p řítomnost pásu supranukleárních mikrotubul ů, ale v apikální oblasti byla pozorována výrazná denzní fibrila (tzv. „lapel“) (obr. 4). Tato fibrila vytvá ří mohutný oblouk, který za číná u anteriorní části levé mikrotubulární fibrily (Fg) a kon čí ventráln ě u posteriorního páru bi čík ů. V nejvyšší části oblouku se “lapel“ dotýká po čátku subpelikulárních mikrotubul ů. Simpson a Patterson (1999) tuto strukturu zahrnuli mezi t ři synapomorfní znaky řádu Retortamonadida, i když Brugerolle

19 (1973a, 1977) se ani u druhu Retortamonas agilis ani u druhu Chilomastix aulastomi nezmi ňuje o p řítomnosti této výrazné denzní fibrily.

Obr. 3 Schéma karyomastigontu druhu Chilomastix aulastomi : 4 bazální t ělíska (1, 2, 3, R) jsou organizována do dvou pár ů a nachází se v těsné blízkosti jádra (N). S oblastí karyo- mastigontu jsou asocionány dv ě hlavní mikrotubulární fibrily (Fd, Fg) a denzní v ějí- řovitá fibrila (Fa). Pod cytoplasmatickou membránou se nachází souvislá vrstva mikrotubul ů (Fsp). (zdroj: Brugerolle, 1973a).

Obr. 4 Rekonstrukce flagelárního aparátu a asociova- ných fibril u druhu Chilomastix cuspidata . Čty ři bazální t ělíska (1, 2, 3, R) jsou asociována s pravým (Fd) a levým (Fg) mikrotubulárním ko řenem, denzní v ějí řovitou fibrilou (Fa) a mo- hutnou denzní fibrilou podkládající apikální část bu ňky (LAPEL). Oblastí cytostomu prochází zp ětný bi čík (RF). (zdroj: Bernard et al. 1997; upraveno).

20 Pravá cytostomální fibrila (Fd, viz obr. 3) je mohutn ější a delší než fibrila levá (Fg). V oblasti mastigontu se pravá fibrila (Fd) ohýbá o 360° a vytvá ří tzv. vlásenku (obr. 5). Prostor uvnit ř vlásenky se nazývá „gutter“ (obr. 5) a je to trubi čka, která prochází bu ňkou sm ěrem k jejímu posteriornímu konci a asi v polovin ě délky se spojuje s cytostomem a vytvá ří cytofarynx (Brugerolle 1973a, 1977; Bernard et al., 1997). T ěsn ě nad po čátkem cytostomu se nachází vějí řovitá fibrila (Fa), která je tvo řená denzním materiálem. Tato fibrila je p řiložena k anteriorním konc ům levé a pravé fibrily a svým obloukem „zast řešuje“ vrchol cytostomu (obr. 4).

Obr. 5 Příčný řez bu ňkou druhu Chilomastix aulastomi zachycuje pravý a levý mikrotubulární ko řen (Fd, Fg), “gutter“ (G), jádro (N), denzní vějí řovitou fibrilu (Fa) a zp ětný bi čík (R) procházející cytostomem. (zdroj: Brugerolle, 1973a).

V cytoplasmě se krom ě jádra vyskytují četné trávicí vakuoly s pohlcenými bakteriemi a drsné endoplazmatické retikulum, které je soust řed ěno v periferních oblastech bu ňky a také okolo jádra. Brugerolle (1973a, 1977) nepozoroval p řítomnost jiných organel, jako je mitochondrie či diktyosom. U druhu Chilomastix cuspidata byla zachycena denzní oválná organela (Weerakoon et al., 1999), ale teprve pozd ější zkoumání prokázalo, že tato organela má dv ě membrány a že by se mohlo jednat o poz ůstatek mitochondrie (Hampl & Simpson, 2007). U řady druh ů rodu Chilomastix i Retortamonas byla pozorována schopnost vytvá řet cysty. Brugerolle (1973a, 1977) popsal jejich ultrastrukturu. Chilomastix cuspidata je jedním z druh ů retortamonád, u kterých nebyla p řítomnost cyst zaznamenána (Bernard et al., 1997). Cysta retortamonád je oválná až hruškovitá, obklopená silnou st ěnou, která je tvo řená

21 vláknitým materiálem (obr. 6). Ve st ěně cysty není p řítomen ani pór ani operkulum. Ve zralé cyst ě jsou zachovány všechny struktury, které m ůžeme pozorovat u trofozoit ů, s výjimkou subpelikulárních mikrotubul ů, které jsou dezorganizovány už p řed encystací (Brugerolle, 1973a). Bu ňka trofozoita se p řed encystací zakulacuje, ztrácí subpelikulární mikrotubuly a bi číky či vnit řní mikrotubulární struktury se zeslabují a jsou h ůř e patrné.

Obr. 6: Podélný řez cystou druhu Chilomastix aulastomi : Na povrchu cysty je vrstva vláknitého materiálu (Pk) a uvnit ř nén ě zřeteln ě zachované jádro (N), bi čík (F) a cytostom (Cyt). (zdroj: Brugerolle, 1973a).

U retortamonád probíhá d ělení pouze u trofozoit ů, nikoli uvnit ř cyst (Kulda & Nohýnková, 1978). O samotném procesu d ělení se toho doposud moc neví. Jedná se o binární dělení, při kterém nedochází k rozpadu jaderné membrány. U rodu Retortamonas byla popsána přítomnost intranukleárního d ělícího v řeténka, které je pomocí fibril p řipevn ěno k jaderné membrán ě (Kulda & Nohýnková, 1978). U rodu Chilomastix z řejm ě proces jaderného d ělení probíhá jiným zp ůsobem. Brugerolle (1973a) pozoroval u druhu Chilomastix aulastomi d ělicí vřeténko, které vy čnívá z jádra a je upevn ěno na kinetosomy. Tento typ d ělení má n ěkteré podobné znaky s polouzav řenou mitózou diplomonád, zatímco d ělení rodu Retortanonas má blíže spíše k dělení popsanému u oxymonád (viz. Kulda & Nohýnková, 1978).

22 4.2.1.1. Přehled popsaných druh ů rodu Retortamonas a Chilomastix

Retortamonas Grassi, 1879 (syn.: Embadomonas Mackinnon, 1911)

Jednotlivé druhy rodu Retortamonas se mezi sebou liší zejména velikostí bu ňky a cytostomu a délkou a tlouš ťkou bi čík ů (Wenrich, 1932). Byly nalezeny u širokého spektra hostitel ů, mezi nimiž nalezneme řadu druh ů hmyzu, obojživelníky, plazi, savce i člov ěka.

Retortamonas gryllotalpae krtonožky ( Gryllotalpa gryllotalpa ) Retortamonas agilis larvy tiplic ( Tipula , Trichoptera). Retortamonas alexeieffi larvy tiplic ( Tipula , Trichoptera) Retortamonas belostomae mohutnatky ( Belostoma sp .) Retortamonas blattae šváb ( Blatta orientalis ) Retortamonas phyllophagae larvy brouk ů Phyllophaga sp. a Popillia japonica Retortamonas pericopti larvy brouk ů Pericoptus truncatus Retortamonas caudacus larvy vírník ů (Gyrinidae gen. sp.) Retortamonas wenrichi krtonožka ( Gryllotalpa hexadactyla ) Retortamonas hodotermitis termiti (Hodotermes mossambicus ) Retortamonas intestinalis člov ěk (Homo sapiens ) Retortamonas wenyoni vřeš ťan černý (Alouatta caraya ) Retortamonas cuniculi králík (Oryctolagus cuniculus ) Retortamonas bradypi lenochod hn ědokrký ( Bradypus variegatus ) Retortamonas caviae mor če ( Cavia porcellus ) Retortamonas ovis ovce a hov ězí dobytek Retortamonas dobelli řada obojživelník ů a plaz ů Retortamonas boae hroznýš královský ( Boa constrictor ) Retortamonas cheloni želva hv ězdnatá ( Geochelone elegans )

Podle: Mackinnon, 1911; da Foseca, 1920; Collier and Boeck, 1926; Hegner & Schumaker, 1928; Travis & Becker, 1931; Bishop, 1931, 1934; Geiman, 1932; Wenrich, 1932; Dobell, 1935; Kowalczyk, 1938; Stabler, 1944; Ludwig, 1946; Moskowitz, 1951; Laird, 1956; Kulda, 1959; Janakidevi, 1962; Martínez-Díaz et al., 2001; Brugerolle, 2005.

23
Chilomastix Alexeieff, 1912 (syn. Tetrachilomastix da Foseca 1920)

Druhy rodu Chilomastix lze od sebe odlišit velikostí bu ňky, velikostí a tvarem cytostomu, délkou p ředních bi čík ů a umíst ěním jádra v bu ňce (Kulda & Nohýnková, 1978). Zástupci rodu Chilomastix byly popsáni z dvou skupin bezobratlých (termiti a pijavky) a z v ětšiny t říd obratlovc ů.

Chilomastix mesnili člov ěka, opice a prasata. Chilomastix bettencourti laboratorní potkani a myši Chilomastix caprae kozy Chilomastix cuniculi domácí králíci Chilomastix intestinalis mor če ( Cavia porcellus ) Chilomastix wenrichi mor če ( Cavia porcellus ) Chilomastix equi kůň ( Equus caballus ) Chilomastix magna sysel ( Citellus tridecemlineatus ) Chilomastix megamorpha divoké mor če ( Cavia cutleri ) Chilomastix rosenbuchi čin čila ( Lagostomus maximus ) Chilomastix gallinarum řada domácích pták ů a bažant ů Chilomastix bursa plazi Chilomastix wenyoni lepoješt ěr ( Calotes nemoricola ) Chilomastix caulleryi řada druh ů obojživelník ů Chilomastix auslastomi pijavka ko ňská ( Haemopis sanguisuga )

Podle: Kutczynski, 1914; da Fonseca, 1916; Kofoid & Swezy, 1920; Boeck, 1921; Leiva, 1921; Hegner, 1924; Becker, 1926; Boeck & Tanabe, 1926; Nie, 1948, 1950; Moskowitz, 1951; Abraham, 1961a, 1961b; Janakidevi, 1961; Kulda & Nohýnková, 1978.

Přehled v ětšiny doposud popsaných druh ů řádu Retortamonadida je uveden na internetových stránkách „Tree of Web Life Project“ (http://www.tolweb.org/tree/phylogeny.html).

24 4.2.2. Řád Diplomonadida

Mezi zástupci tohoto řádu lze najít jak voln ě žijící druhy, tak parazity obratlovc ů a bez- obratlých (Kulda & Nohýnková, 1978). Na rozdíl od retortamonád postrádá bu ňka diplomonád typické znaky fornikát. Diplomonády nap říklad nemají typický exkavátní cytostom a nena- lezneme u nich ani mikrotubulární korzet, který je charakteristický pro retortamonády (Brugerolle 1973a, 1977). Karyomastigont je stejn ě jako u retortamonád umíst ěn na anteriorním konci bu ňky a bazální t ělíska jsou uspo řádány do dvou od sebe vzdálených, kolmých pár ů (Brugerolle, 1975b). Výjimkou je rod Caviomonas , který má pouze dv ě bazální t ělíska (Brugerolle & Regnaut, 2001). Z oblasti karyomastigontu diplomonád (výjimkou op ět rod Caviomonas ) vychází t ři hlavní mikrotubulární pásy: supranukleární, infranukleární a funis (Kulda & Nohýnková, 1978). Tyto t ři pásy mohou být u jednotlivých rod ů vyvinuty v různé mí ře. Asi nejvíce modifikované pásy mikrotubul ů lze najít u rodu Giardia . Supranukleární mikrotubuly jsou zde extrémn ě vyvinuté a tvo ří ventrální p řísavný disk (Brugerolle, 1975a). Diplomonády se d ělí dle po čtu karyomastigont ů v bu ňce na unizoické a diplozoické (Kulda & Nohýnková, 1978). Bu ňka enteromonád (rody Enteromonas , Caviomonas a Trimitus , a nepopsaný rod enteromonád, viz Kolisko et al., 2005) obsahuje pouze jeden karyomastigont a na ventrální stran ě bu ňky je mělký cytostom, který je asociovaný se zp ětným bi číkem. Výjimkou je op ět rod Caviomonas , který má pouze jediný, a to anteriorní bi čík, a jehož cytostom je redukovaný (Brugerolle & Regnaut, 2001). Ostatní diplomonády mají zdvojený karyomastigont i ostatní bun ěč né útvary a jejich bu ňka vykazuje axiální symetrii (Kulda & Nohýnková, 1978). Výjimkou je Giardia , u které je axiální symetrie porušena p řítomností nepárového ventrálního p řísavného disku. Diplozoické diplomonády se dále d ělí dle p řítomnosti či nep řítomnosti cytostom ů na dv ě skupiny: Hexamitinae a Giardiinae. Zástupci skupiny Hexamitinae (rod Hexamita , Spironucleus , Trepomonas , Gyromonas, Trigonomonas ) mají dva trubicovité cytostomy, které jsou otev řené na posteriorním konci a prochází jimi zp ětný bi čík (Brugerolle, 1973b, 1974a). K endocytóze u nich dochází v anteriorní části cytostomu, která není podložena mikrotubulárními fibrilami. Rod Trepomonas má na rozdíl od ostatních rod ů skupiny Hexamitinae dva posteriorn ě umíst ěné cytostomy, které jsou asociované se t řemi bi číky. Skupina Giardiinae má zcela redukované cytostomy (Brugerolle, 1974b, 1975a) a k příjmu potravy dochází pinocytózou na celém povrchu t ěla ( Octomitus ) či pouze na jeho dorzální stran ě ( Giardia )

25 (Kulda & Nohýnková, 1978). Zpětné bi číky procházejí u této skupiny celou bu ňkou jako holé axonemy.

4.2.3. Bazální Fornicata

Ultrastrukturní znaky rodu Carpediemonas (Simpson & Patterson, 1999), Dysnectes (Yubuki et al., 2007) a Hicanonectes (Park et al., 2009) prokázaly příbuznost k retortamonádám. Všechny tyto rody nesou v ětšinu exkavátních znak ů a od retortamonád se odliší pouze v několika z nich. Základním rozdílem je odlišný po čtem bazálních t ělísek a nep řítomnost zřetelného cytofaryngu. Karyomastigont rodu Carpediemonas má t ři bazální t ělíska, rod Dysnectes pouze dv ě a rod Hicanonectes má čty ři bazální t ělíska. Ultrastruktura rodu Kipferlia je dosud známa pouze útržkovit ě (Kolisko et al., 2010).

26 5. MATERIÁL A METODY

5.1. Kultivace a izolace nových izolát ů

5.1.1. Složení a p říprava používaných médií

Dvoufázové médium podle Dobell-Leidlaw (1926), modifikováno:

Toto médium se skládá z tekuté a pevné složky, p řičemž ob ě složky jsou p řipravovány odd ělen ě a kompletovány až t ěsn ě p řed použitím. Pevnou složku tvo ří 1,5 ml koagulovaného ko ňského séra. Sérum se nechává koagulovat v šikmo položených sklen ěných či plastových zkumavkách v horkovzdušném sterilizátoru p ři 80 °C po dobu jedné hodiny. Poté se zkumavky ponechají 24 hodin v pokojové teplot ě a cyklus sterilizace se op ět zopakuje. Druhá sterilizace se provádí proto, aby se zabránilo r ůstu kontaminujících mikroorganism ů, které první sterilizaci mohly p řežít ve form ě spor. Zkumavky jsou následn ě uchovávány v ledni čce. Tekutá složka média se p řipravuje z 500 ml Ringerova roztoku a 50 ml sterilně odebraného vaje čného bílku.

Tab č. 1: Složení Ringerova roztoku Roztok A NaCl 3,25 g

NaHCO 3 0,1 g KCl 0,07 g

NaH 2PO 4 H 2O 0,005 g destilovaná voda do 450 ml Roztok B CaCl2 2H2O 0,08 g destilovaná voda do 50 ml

Roztoky A a B jsou p řipravovány a autoklávovány odd ělen ě, aby se p ředešlo vysrážení fosfát ů v přítomnosti chloridu vápenatého. Po zchladnutí se oba roztoky smíchají a je do nich p řidáno 50 ml steriln ě odebraného vaje čného bílku. Takto p řipravená tekutá složka je uchovávána v ledni čce. P řed vlastní použitím je pevná složka p řevrstvena 3 ml tekuté složky.

27 Médium TYSGM-9 (Diamond, 1982), modifikováno:

Tab č. 2: Složení média TYSGM-9 trypton 1 g kvasni čný autolyzát 0,5 g

K2HPO 4 1,4 g

KH 2PO 4 0,2 g NaCl 3,75 g destilovaná voda do 485 ml hov ězí sérum (inaktivované) 15 ml

Všechny složky média, krom ě hov ězího séra byly rozpušt ěny ve vod ě a dopln ěny na pot řebný objem. Pomocí koncentrovaného roztoku HCl bylo upraveno pH na 7,2. Poté bylo sérum autoklávováno a po jeho zchladnutí bylo steriln ě p řidáno 15 ml hov ězího séra. Médium bylo rozpln ěno do plastových zkumavek a bylo skladováno v lednici.

Wenrichovo médium:

Tab č. 3: Složení Wenrichova média Loeffler´s Blood serum (Difco 270100) 2 g Riger ův roztok 1000 ml

Ringer ův roztok A i B byl p řipraven dle výše uvedeného p ředpisu (tab č. 1) v dvojnásobném objemu, vyklávován a po zchladnutí byly oba roztoky smíchány. Ringer ův roztok byl ve vodní lázni zah řán na 45 °C a poté v něm bylo resuspendováno Loefflerovo krevní sérum. Teplota byla udržována 30 minut na 45 °C. Následn ě byl roztok udržován 20 minut ve vroucí lázni a po zchladnutí byl uložen p řes noc do ledni čky. Druhý den byl roztok p řefiltrován p řes filtra ční papír, aby z něj byl odstran ěn hrubý precipitát. Přefiltrovaný roztok byl autoklávován 15 minut p ři 110 °C a po zchladnutí byl rozpln ěn do zkumavek a uchováván v ledni čce.

ATCC médium: 1525 Seawater 802 médium

Roztok A: 2 х konc. Artificial Seawater ………………………………………… 500ml

28 Tab č. 4: Složení média 2x konc. Artificial Seawater NaCl 24,72 g KCl 0,67 g

CaCl 2 2H 2O 1,36 g

MgCl 2 6H 2O 4,66 g MgSO4 7H2O 6,29 g

NaHCO 3 0,18 g destilovaná voda do 500 ml

Při p říprav ě je nutné dbát na to, aby byl hydrogenuhli čitan sodný (NaHCO 3) p řidán až nakonec, když jsou všechny ostatní sole rozpušt ěné. Poté byl roztok p řefiltrován p řes steriliza ční filtr do p řipraveného a sterilního roztoku B.

Roztok B: 2x konc. modifikované ATCC Medium 802 ……………………….. 500ml

Tab č. 5: Složení 2x konc. ATCC média 802 cerofyl 2,5g destilovaná voda do 500 ml

Při p říprav ě ATCC média 1525 byl použit dvakrát koncentrovaný modifikovaný roztok média 802. Cerofyl ( Cereal Grass Media, ScholAR Chemistry) byl nasypán do destilované vody, která byla uvedena do varu a poté va řena 5 minut. Po mírném zchladnutí byl roztok p řefiltrován přes filtra ční papír. Na rozdíl od ATCC média 802 nebyla do p řefiltrovaného roztoku p řidána sůl (Na 2HPO 4). Roztok byl sterilizován v autoklávu.

5.1.2. Získávání nových izolát ů

Materiál s retortamonádami byl získáván odb ěrem čerstvého trusu či pitvou st řeva u para- zitických druh ů a odběrem vodního sedimentu u voln ě žijících druh ů. Trus či obsah st řeva byl odebírán do zkumavky s médiem Dobell-Laidlaw. Obsah zkumavek byl v závislosti na hostiteli dán do termostatu do 37 °C, či byl ponechán v pokojové teplot ě. Druhý den byla provedena mikroskopická kontrola kultury a pokud byla zjišt ěna přítomnost bi číkovc ů, byla primokultura p řeo čkována. U kultur uložených v 37 °C došlo k přeo čkování druhý den a u kultur ponechaných v pokojové teplot ě po n ěkolika dnech.

29 Vzorky vodního sedimentu byly odebírány do zkumavek. P řibližn ě 1 ml vzorku byl poté nao čkován do média ATCC 1525. P řibližn ě po 6 až 7 dnech byla mikroskopicky zjiš ťována p řítomnost retortamonád.

5.1.3. Kultivace retortamonád

5.1.3.1. Kultivace st řevních retortamonád

St řevní retortamonády z obratlov čích hostitel ů byly vždy p ěstovány v polyxenických kulturách v médiu Dobell-Leidlaw či v jednom p řípad ě (kmen CHILO1) v médiu TYSGM. Teplota kultivace byla zvolena dle typu hostitele. Kmeny udržované p ři pokojové teplot ě byly p řeo čkovány jednou za 6 až 7 dní. Kmeny udržované ve 37 °C bylo nezbytné přeo čkovat jednou za 2 až 3 dny. Inokulum činilo p řibližn ě 0,25 ml s výjimkou kmene CHILO1 p ěstovaného v médiu TYSGM, kde inokulum bylo cca 1 ml.

5.1.3.2. Příprava a kultivace izolátu CAVIA2C

Kultura kmene CAVIA2 obsahovala 2 eukaryotické organismy: Blastocystis sp. a Chilomastix wenrichi . P ři p říprav ě monoeukaryotické kultury druhu Chilomastix wenrichi byl z po čátku z kultury kmene CAVIA2 opatrn ě odebrán asi 1 ml média ze sloupce, tak aby nedošlo k nasátí sedimentu s blastocystami, a tento objem byl nao čkován do čistého média Dobell-Leidlaw. Stejným zp ůsobem byla nová kultura CAVIA2C pasážována jednou za 3 až 4 dny. V okamžiku, kdy v sedimentu nebyly p řítomny blastocysty, ale pouze trofozoiti druhu Chilomastix wenrichi bylo, p ři pasážování odebíráno 0,25 ml sedimentu. Kultura byla tímto zp ůsobem p řeo čkována každé 2 až 3 dny.

5.1.3.3. Kultivace voln ě žijících retortamonád

Kmeny voln ě žijících retortamonád byly v obou p řípadech p ěstovány v médiu ATCC 1525 při pokojové teplot ě. Kultury byly o čkovány jednou za 6 až 7 dní a inokolum činilo p řibližn ě 1 ml.

30 5.2. Příprava a zpracování trvalých preparát ů

5.2.1. Barvení protargolem podle Bodiana

Při barvení protargolem se používá fixace za vlhka. Tento zp ůsob fixace zachovává prostorové uspo řádání bun ěk a je díky tomu možné pozorovat vzájemné uspo řádání organel v nafixovaných bu ňkách. Metoda barvení protargolem je základem pro srovnávací studie a druhové ur čení st řevních bi číkovc ů. Protargolem se obarví jádro, cytoplasma, bi číky a mikrotubulární útvary. P ři používání této metody barvení je výhodné barvit jeden vzorek na několika sklí čcích najednou.

Postup fixace: 1. Příprava Bouin-Hollandovy fixáže: Nejprve rozpustit 2,5 g octanu m ěď natého v destilované vod ě a poté p řidat 4 g kyseliny pikrové, 10 ml 40% formaldehydu a nakonec doplnit destilovanou vodu do 100 ml. P řed vlastním použitím p řidat ledovou kyselinu octovou tak, aby její finální koncentrace byla 5%.

2. Fixace za vlhka : Na odmašt ěném krycím sklí čku vytvo řit malou kapku materiálu, lehce jí rozet řít a okamžit ě vhodit sklí čko do Petriho misky s Bouin-Hollandovou fixáží nát ěrem dol ů tak, aby plavalo na hladin ě. Asi po 10 minutách sklí čko obrátit nát ěrem sm ěrem vzh ůru a pono řit sklí čko na dno misky s fixáží. Nechat fixovat 20 minut až 12 hodin. P řipravit si ty činky z polyethylenu a na říznout žiletkou jeden jejich konec asi 1 cm dlouhým podélným řezem. Na druhém konci ozna čit si zá řezem orientaci preparátu a číslem či zna čkou p říslušný preparát. Do 1 cm dlouhého řezu opatrn ě upevnit orientovan ě krycí sklí čka s preparáty. Takto upevn ěné, fixované preparáty opláchnout v 50% ethanolu a t řikrát v 70% ethanolu. Preparáty lze poté uchovávat v 70% ethanolu i delší dobu. Po celou dobu fixace je nutné dbát na to, aby rozt ěr nezaschl, a tím nedošlo k zdeformování fixovaných bun ěk.

Postup barvení: 1. preparáty fixované Bouin-Hollandovou fixáží a konzervované 70% ethanolem p řevést přes 50% ethanol do destilované vody.

2. 0,5% roztok KMnO 4…………………………………………………..…....………5 min 3. opláchnout v destilované vod ě …………………………….………..…...... 5x po 30 sec

31 4. 5% roztok kyseliny oxalové …………………………………………...…..….……5 min 5. opláchnout v destilované vod ě ……………………………….……………..5x po 30 sec 6. 1% roztok protargolu……………………………………………….…..…2 dny p ři 37°C

Roztok protargolu je nutné vždy p řipravit čerstvý p římo p řed použitím. Navážený protargol (Bayer, I. G. Farbenindustrie Actinengesellschaft) nasypat na hladinu destilované vody v kádince a nechat samovoln ě rozpustit. Na dno kádinky sto čit dob ře o čišt ěný m ěděný drát (p řibližn ě 5 g na 100 ml protargolu), nalít roztok protargolu, narovnat preparáty tak, aby byly ve vertikální poloze. Preparáty proložit jemnými m ěděnými drátky. Kádinku dob ře uzav řít a dát do termostatu na 48 hodin.

7. rychle opláchnout v destilované vod ě……………………………..……..…….2 x po 5 s

8. reduk ční roztok (roztok 1% hydrochinonu a 5% Na 2SO 3)…………….....…...……5 min

Reduk ční roztok p řipravit čerstvý p římo p řed použitím. Reduk ční roztok je nezbytné vym ěň ovat, pokud se barví více preparát ů.

9. opláchnout v destilované vod ě ……………………………………..……….5x po 30 sec

10. 0,5 či 1% roztok AuCl 3………………………...……………………...……………5 min 11. rychle opláchnout v destilované vod ě…………………………………..…… 2x po 5 sec 12. 2% roztok kyseliny oxalové ……………………………………………...... ………5 min 13. opláchnout v destilované vod ě ………………………………………..…….5x po 30 sec

14. 5% roztok Na 2S2O3….………………………………………..………...…………10 min 15. propírat proudící vodovodní vodou ……………………………………..…..15 – 20 min 16. převést alkoholovou řadou (50%, 70%, 80%, 96%, 100%) a karboxylolem do xylenu, montovat do DPX mountant for histology (Sigma).

Po celou dobu barvení je nutné dbát na to, aby preparáty nezaschly. Čerstv ě zamontované preparáty byly uchovávány v krabicích v horizontální poloze, aby nezatuhlé montovací médium nestékalo.

32 5.2.2. Mikroskopické pozorování a zpracovávání preparát ů

Barvené preparáty byly pozorovány mikroskopem OLYMPUS BX51 p ři zv ětšení 1000x a vyfoceny digitální kamerou OLYMPUS DP71 a pomocí programu QuickPHOTO MICRO 2.2 byly p řevedeny do po číta če a uloženy ve formátu tif. Fotografie byly dále upraveny v programu Corel PHOTO-PAINT. Jelikož p ři fixace za vlhka z ůstává zachována prostorová struktura bun ěk, byla v některých p řípadech po řízena série fotek r ůzných hladin jednoho objektu a z této série byla v programu Helicon Focus složena výsledná fotografie.

5.3. Izolace DNA

DNA z kultur byla izolována kitem ZR Genomic DNA II Kit TM (Zymo Research) dle protokolu „Cell suspension and proteinase K digested samples“. Tento protokol nevyžadoval žádnou speciální p řípravu vzork ů pro izolaci. Kultury byly p ředem pouze zahušt ěny centrifugací po dobu 8 minut p ři 500g a p řebyte čný supernatant byl odpipetován. DNA z trusu či ze st řevního obsahu pitvaných hostitel ů byla izolována pomocí kitu QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) dle protokolu „Isolation of DNA from stool for patho- gen detection“. Izolovaná DNA byla dlouhodob ě skladována v mrazáku p ři -20°C.

5.4. Amplifikace DNA a sekvenace

Amplifikovány a sekvenovány byly dva úseky DNA. Jedním úsekem byl gen pro RNA malé ribosomální podjednotky (SSU rRNA). Druhým úsekem byl gen pro protein teplotního šoku HSP90 (protein teplotního šoku). Příslušný gen byl nejprve amplifikován pomocí specifických primer ů. V případ ě, že se naamplifikoval pouze jeden fragment nebo m ěl požadovaný fragment p řevažující koncentraci, byl produkt amplifikace pouze p řečišt ěn a p římo sekvenován. V případ ě, že došlo k naamplifikování více fragment ů, byl fragment požadované délky vy říznut a DNA byla z gelu přečišt ěna. Ve v ětšin ě p řípad ů m ěly vy řezávané fragmenty tak nízkou koncentraci, že je nebylo možné přímo osekvenovat. Fragment byl proto ve v ětšin ě p řípad ů zaklonován do plasmidu a teprve poté sekvenován.

33 5.4.1. Amplifikace DNA pomocí specifických primer ů

5.4.1.1. SSU rRNA

Amplifikace DNA byla provád ěna pomocí t ří r ůzných polymeráz: rekombinantní Taq poly- meráza (5 U/µl; Fermentas), nativní Taq polymeráza bez BSA (5 U/µl; Fermentas) a LA poly- meráza (5 U/µl; Top-Bio). Následující tabulky shrnují složení reak čních sm ěsí p ři použití jednotlivých polymeráz (tab č. 7, 9, 10) a uvádí nastavení teplotního cyklu v termocykleru pro rekombinantní i nativní Taq polymerázu (tab č. 8) a pro LA polymerázu (tab č. 11). U většiny kmen ů se p ři nastavení doporu čené annealingové teploty primer ů (50 °C) nepoda řilo naamplifikovat DNA retortamonád a proto byl použit cyklus s teplotním gradientem k ur čení optimální annealingové teploty. Nejlepší výsledky amplifikace byly dosaženy p ři annealingové teplot ě 58 °C.

Tab č. 6: Použité primery primer sekvence Medlin A (Medlin et al., 1988) AYCTGGTTGATYYTGCCAG Medlin B (Medlin et al., 1988) TGATCCATCTGCAGGTTCACCT

Tab č. 7: Složení reak ční sm ěsi p ři použití rekombinantní Taq polymerázy PCR pufr (10x konc.) 5 µl

MgCl 2 (25 mM) 3,75 µl dNTP (2mM každý) 2,5 µl primer 1 12,5 pmol primer 2 12,5 pmol Taq polymeráza 0,5 µl DNA až 5 ng sterilní miliQ H 2O doplnit do 50µl

PCR reakce byla provád ěna v termocykléru p ři nastavení teplotního cyklu: Tab č. 8: Nastavení teplotního cyklu po čet cykl ů Teplota čas Část cyklu 1x 94 °C 4 min po čáte ční denaturace 94 °C 1 min denaturace 35x 50 °C 1 min nasednutí primer ů 68 °C 2 min 30 sec polymerace 1x 68 °C 10-30 min záv ěre čná polymerace

34 Tab č. 9: Složení reak ční sm ěsi p ři použití nativní Taq polymerázy bez BSA PCR pufr (10x konc.) 5 µl

MgCl 2 (25mM) 3,75 µl dNTP (2mM každý) 2,5 µl primer 1 12,5 pmol primer 2 12,5 pmol Taq polymeráza 0,5 µl DNA až 5 ng BSA 0,4 µl sterilní miliQ H 2O doplnit do 50µl

PCR reakce byla provád ěna v termocykléru se stejným nastavením teplotního cyklu jako předchozí reakce.

Tab č. 10: Složení reak ční sm ěsi p ři použití LA polymerázy

LA pufr (10x konc., + MgCl 2) 5 µl dNTP (10 mM každý) 1,5 µl DMSO 1 µl primer 1 12,5 pmol primer 2 12,5 pmol LA polymeráza 0,5 µl DNA až 5 ng sterilní miliQ H 2O doplnit do 50 µl

PCR reakce byla provád ěna v termocykléru p ři nastavení teplotního cyklu:

Tab č. 11: Nastavení teplotního cyklu p ři použití LA polymerázy po čet cykl ů teplota čas Část cyklu 1x 94 °C 4 min po čáte ční denaturace 94 °C 1 min denaturace 35x 50 °C 1 min nasednutí primer ů 68 °C 2 min 30 sec polymerace 1x 68 °C 10-30 min záv ěre čná polymerace

35 5.4.1.2. HSP90

K amplifikaci genu pro protein teplotního šoku HSP90 byla používána rekombinantní Taq polymeráza (5U/µl; Fermentas). Sekvence primer ů byly poskytnuty M. Kolískem (Dalhousie University, Halifax, Kanada).

Tab č. 12: Použité primery primer sekvence H90 910x1R TCGGGGTTGATYTCCATNGTYTT H90 100x CAGCTGATGTCCCTGATCATYAAYACNTTY H90 210UR TAGAAGCCGACGCCRAAYTGNCCRAT HSP 375F Ret1 TTYGGTGTYGGTTTCTAYTC

Tab č. 13: Složení reak ční sm ěsi PCR pufr (10x konc.) 5 µl

MgCl 2 (25 mM) 3,75 µl dNTP (2mM každý) 2,5 µl primer 1 25 pmol primer 2 25 pmol Taq polymeráza 0,5 µl DNA až 5 ng sterilní miliQ H 2O doplnit do 50µl

PCR reakce byla provád ěna v termocykléru p ři nastavení teplotního cyklu:

Tab č. 14: Nastavení teplotního cyklu po čet cykl ů teplota čas část cyklu 1x 94 °C 1 min po čáte ční denaturace 94 °C 15 sec denaturace 35x 50 °C 1 min nasednutí primer ů 68 °C 3 min polymerace 1x 68 °C 10 – 30 min záv ěre čná polymerace

5.4.2. Elektroforéza amplifikované DNA

Elektroforéza byla provedena na 1% horizontálním agarózovém gelu. Ješt ě b ěhem p řípravy byl do gelu p řidán ethidiumbromid (finální koncentrace 0.5 ug/ml) pro pozd ější zvýrazn ění

36 amplifikované DNA v procházejícím UV sv ětle. Obraz elektroforetického gelu byl vyfocen digitálním fotoaparátem a pomocí programu Alpha DigiDoc RT (Innovantion) byl p řeveden do po číta če.

5.4.3. Přečišt ění PCR produktu

Pokud byla na elekroforetickém záznamu zjišt ěna p řítomnost pouze jednoho na- amplifikovaného fragmentu, byl daný PCR produkt p řečišt ěn pomocí QIAquick PCR Purification Kitu (Qiagen) dle protokolu „QIAquick PCR Purification Kit Protocol, Using a microcentrifuge“. DNA byla eluována do 25 µl EB pufru a skladována v -20 °C. V případ ě, že bylo naapmlifikováno více fragment ů, byla část gelu s fragmentem požadované délky vy říznuta a fragment byl p řečišt ěn pomocí kitu Zymoclean™ Gel DNA

Recovery Kit (Zymo Research) a DNA byla eluována do 7 až 8 µl sterilní miliQ H 2O.

5.4.4. Klonování

Pomocí kitu pGEM-T Easy Vector System I (Promega) bylo provád ěno A/T klonování přečišt ěných fragment ů. Tento kit je založen na selekci transformovaných bun ěk pomocí rezistence k ampicilinu a na modro-bílé selekci buněk, které mají či nemají plasmid s vlo- ženým inzertem. Klonování bylo provád ěno dle p říslušného protokolu (množství vkládaného inzertu bylo p řibližn ě 45 až 50 ng na liga ční sm ěs) do kompeten čních bun ěk (JM109 High Efficiency Competent Cells, Promega) a následná selekce bun ěk se správn ě vloženým inzertem byla provád ěna na Petriho miskách s agarovým LB médiem s ampicilinem, X-gal a IPTG.

Tab č. 15: Složení média LB LB Broth (Sigma) 10 g destilovaná voda do 500 ml

LB médium bylo po namíchání vyklávováno a po zchladnutí bylo uchováváno v ledni čce. Při p říprav ě agarového LB média se krom ě LB Broth p řidalo do destilované vody ješt ě 5 až 7 g bakteriologického agaru. Takto p řipravené a vyklávované médium se po mírném zchladnutí rozlilo do sterilních Petriho misek. Po zatuhnutí média byly Petriho misky skladovány v ledni čce.

37 Tab č. 16: P říprava LB ploten pro výsev transformovaných bun ěk a pro následnou modro-bílou selekci IPTG (23.83 µg/ml) 100 µl X-gal (50 mg/ml) 20 µl AMP (100 µg/ml) 25 µl

Na p řipravené misky s IPTG, X-gal a ampicilinem bylo rozet řeno 100 – 150µl narostlé suspenze transformovaných bakterií. Zbytek suspenze byl sto čen (5 min na 10 000g), přebyte čný supernatant byl odpipetován a hustá suspenze buněk byla rozet řena na čistou připravenou misku. Nao čkované misky byly poté uloženy do termostatu na 37 °C p řes noc.

5.4.5. Colony PCR

Pomocí sterilní špi čky automatické pipety byla vždy odebrána část bílých kolonií. Bakterie z kolonií byly resuspendovány v 10 µl sterilní miliQ H 2O, která byla p ředem napipetována do sterilních mikrozkumavek. Bakterie byly zabity a jejich bu ňka degradována st řídáním teplot v termocykléru.

Tab č. 17: Nastavení likvida čního teplotního cyklu 96 °C 5 min 50 °C 1 min 50 sec 96 °C 1 min 50 sec 1x 45 °C 1 min 96 °C 1 min 40 °C 1 min

Tab č. 18: Složení reak ční sm ěsi PCR pufr 2 µl

MgCl 2 1,5 µl dNTP 1 µl primer SP6 5 pmol primer T7 5 pmol Taq polymeráza 0,2 µl sterilní miliQ H 2O 4,3 µl

Namíchaná reak ční sm ěs byla p řipipetovaná do 10 µl suspenze degradovaných bakteriálních bun ěk. PCR reakce byla provád ěna v termocykléru se stejným teplotním nastavením jako pro klasickou PCR reakci (viz Tab č. 8).

38 Délka amplifikovaného úseku plasmidu byla zjišt ěna na horizontální elektroforéze. Kolonie, jejichž plasmid obsahoval fragment požadované délky, byly p řeneseny do 4 ml tekutého LB média s přídavkem 4 µl ampicilinu (100 µl/ml) a p ěstovány p řes noc v třepa čce p ři 37 °C a při nastavení otá ček 225 rpm.

5.4.6. Izolace plasmid ů

Izolace plasmid ů byla provád ěna pomocí kitu Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega). Plasmidová DNA byla skladována v -20 °C. Množství DNA bylo zjiš ťováno pomocí NanoDropu, tj. spektrofotometrem pro měř ení koncentrace DNA v mikroobjemu (NanoDrop® ND-1000, ThermoFisher Scientific).

5.4.7. Sekvena ční reakce

Sekvena ční reakce, její p řečišt ění a vlastní sekvenace byla provád ěna v Laborato ři sekvenace DNA na P řF UK. Vzorky pro sekvena ční reakci byly p řipravovány do mikrozkumavek smícháním templátové DNA, primeru a vody do celkového objemu 14µl. Požadovaná koncentrace primeru byla 3,2 pmol a u PCR fragment ů 50 až 100 ng či 300 až 500 ng u plasmidové DNA (tj. 100 ng na 1000 bp).

Tab č. 19: Primery použité pro sekvenaci primer sekvence SP6 GATTTAGGTGACACTATAG T7 TAATACGACTCACTATAGGG Medlin A AYCTGGTTGATYYTGCCAG Medlin B TGATCCATCTGCAGGTTCACCT 577F GCCAGCMGCCGCGGT 577R ACCGCGGCKGCTGGC 1262F GGTGGTGCATGGCCG 1262R CGGCCATGCACCACC FAB F2 CGCGAGAAATCTGTAA FAB R1 CATCACTGACCTGTTA CHILO SEKVF1 TGTATGGAGGTGAAGAT CHILO SEKVF2 TGGTTGGGATCGTCCCT CHILO SEKVR1 TCCTGTCAATCCCGAG CHILO SEKVR2 TAAGCCGCAGGCTCC CHILO SEKVR3 CTGCTTGAGACACTC

39 Tab č. 19: Primery použité pro sekvenaci (Pokra čování) primer sekvence LEMESOS F1 GCCATCTAGGGATTG LEMESOS F2 CAGACACCTCCGTAT LEMESOS F3 GACAATTGCCGCAAG LEMESOS R1 GACGCACAGCGCGGCT PI1 SEKVF1 GATATATCACGAACAT PI1 SEKVF4 GATTTATAATCTGG PI1 SEKVR1 ATGGTAACTAATTC PI1 SEKVR2 GTCAGTGATATGTA

Primery SP6 a T7 nasedají na plasmid poblíž inzertu. Primery Medlin A, Medlin B, 577F, 577R, 1262F a 1262R jsou často používané univerzáln ě eukaryotické sekvena ční primery. Primery FABF2 a FABR1 byly navrženy I. Čepi čkou p ři sekvenaci Chilomastix mesnili (Cepicka et al., 2008). Zbylé primery byly navrženy specificky pro sekvenaci SSU rDNA izolát ů PI1, LEMESOS a CHILO1 rodu Chilomastix .

5.5. Vyhodnocování sekvencí a fylogenetická analýza

Jednotlivé osekvenované části sekvencí byly složeny v programu SeqMan (sou část programového balíku DNASTAR). Z kone čných sekvencí byly odstran ěny sekvence primer ů.

5.5.1. Tvorba a úprava alignmentu

Alignment byl vytvo řen metodou MAFFT (Katoh et al., 2002) pomocí internetového serveru http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/. Byl vybrán algoritmus G-INS-i, ostatní parametry nastavení nebyly m ěněny. Výsledný alignment byl ru čně upraven v programu BioEdit 7.0.9.0 (Hall, 1999). Z alignmentu byly odstran ěny variabilní oblasti, z kterých jsme si nemohli být jisti, že byly správn ě zalignovány. Za čátek a konec alignmentu byl o řezán tak, aby všechny sekvence za čínaly a kon čily na stejné pozici. U neúplných sekvencí byl za čátek a konec nahrazen neur čitými bázemi (n). Výsledná délka alignmentu byla 1295 bp.

40 5.5.2. Tvorba fylogenetických strom ů

Fylogenetické stromy byly konstruovány metodou maximum likelihood a Bayesovskou metodou. Maximum likelihood analýza byla provedena v programu Phyml (Guindon & Gascuel, 2003). Substitu ční model (GTR + Γ + I) byl vybrán pomocí AKAIKE information criterion v programu ModelTest 3.7 (Posada and Crandall, 1998). Pro odhad statistické podpory získané topologie byla v programu Phyml provedena bootstrapová analýza s 1000 replikáty. Bayesovská analýza byla provedena v programu MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck & Ronquist, 2001) s modelem GTR + Γ + I + covarion. Po čet generací Monte Carlo Markov chain byl 2 .10 6, topologie strom ů byla zaznamenána každou 100. generaci. Prvních 5000 strom ů bylo odstran ěno jako „burnin“. Konsenzus zbylých 15 000 strom ů byl použit jako nejlepší topologie. Program MrBayes spo čítal odhady Bayesovské „posterior probability“ jednotlivých v ětví.

41 6. VÝSLEDKY

6.1. Izoláty

6.1.1. Vyšet ření hostitelé

Celkem bylo vypitváno 44 hostitel ů z 8 druh ů hmyzu. Tabulka č. 20 ukazuje seznam vypitvaných hostitel ů a po čet pozitivních nález ů retortamonád v jejich st řevním obsahu. Šváby pocházeli z chov ů, zatímco larvy tiplic, zlatohlávk ů a brusla řky byly odchyceny ve volné přírod ě.

Tab č. 20: Seznam vyšet řených hostitel ů pitvaný hostitel po čet pitvaných jedinc ů pozitivní na retortamonády šváb Eublaberus distanti 3 1 šváb Byrsotria funigata 3 - šváb Blaberus gagantea 2 1 šváb Archimandrita tessellata 2 - šváb Periplaneta americana 2 - larva tiplice Tipula sp. 23 23 larva zlatohlávka (č. Cetoniidae) 2 - brusla řky ( č. Gerridae) 7 -

U pozitivních nález ů retortamonád byl st řevní obsah nao čkován do r ůzných médii. Bylo testováno n ěkolik typ ů médií: Wenrichovo médium, dvoufázové médium Dobell-Leidlaw, ATCC médium 802 a také kombinace média Dobell-Leidlaw a ATCC 802 v různých pom ěrech. Ani v jednom p řípad ě se nepoda řilo stabilizovat v kultu ře získané izoláty retortamonád z hmyzího hostitele. DNA byla dvakrát nezávisle izolována ze st řevního obsahu larev tiplic. Celkem bylo k dispozici p ět vzork ů DNA. Ze získané DNA byl celkem osmkrát amplifikován gen pro SSU rRNA, pruhy r ůzných délek byly vy říznuty z gelu, p řečišt ěny a zaklonovány. Analyzováno (tj. částe čně osekvenováno) bylo celkem 20 klon ů. Ani v jednom p řípad ě nepat řila získaná sekvence retortamonádám, ale ve v ětšin ě p řípad ů šlo o SSU rDNA tiplice. V jednom p řípad ě pat řila sekvence blíže neur čené trichomonád ě a jedna sekvence pat řila diplomonád ě rodu Hexamita .

42 6.1.2. Kultury

Tabulka č. 21 shrnuje dlouhodob ě kultivované kmeny, které jsem pro ú čely práce obdržela od Ivana Čepi čky. Kmen FAB2 druhu Chilomastix mesnili mi byl poskytnut prof. Kuldou. Všechny kmeny byly v polyxenické agnotobiotické kultu ře s bakteriemi. Kmen FAB2 zanikl, ostatní kmeny jsou k dispozici na Kated ře parazitologie P řF UK. Ve v ětšin ě kultur byli krom ě retortamonád p řítomni i jiní prvoci, zejména trichomonády. Teplota kultivace byla volena v závislosti na typu hostitele: kmeny izolované ze studenokrevných hostitel ů (BOMB3, CERAT3R, DIGU1, FPAR2, CHILO1, LASE1, LEP1, PI1, PSEUD) byly p ěstovány v pokojové teplot ě, zatímco kmeny z teplokrevných hostitel ů (CAVIA2, CAVIA2C, FAB2, KLRUD, SENT1) p ři 37 °C. Kmeny LEMESOS a LUC3N voln ě žijícího druhu Chilomastix cuspidata byly p ěstovány v pokojové teplot ě.

Tab č. 21 : Seznam stabilních kultur kmen druh prvoka hostitel médium Chilomastix sp. CAVIA2 Chilomastix wenrichi mor če Cavia porcellus DL CAVIA2C 1, 2 Chilomastix wenrichi mor če Cavia porcellus DL FAB21 Chilomastix mesnili člov ěk Homo sapiens DL CHILO1 1 Chilomastix caulleryi rákosni čka Kassina senegalensis TY LEMESOS 1 Chilomastix cuspidata voln ě žijící SW LUC3N Chilomastix cuspidata voln ě žijící SW PI1 1 Chilomastix aulastomi pijavka Haemopis sanguisuga DL Chilomastix caulleryi + Retortamonas sp. Retortamonas sp., rákosni čka Leptopelis sp. LEP1 DL Chilomastix caulleryi Retortamonas sp. BOMB3 Retortamonas sp. ku ňka Bombina bombina DL CAVIA-R1 Retortamonas sp. mor če Cavia porcellus DL CERAT3R 1 Retortamonas sp. rohatka Ceratophrys ornata DL DIGU1 Retortamonas sp. parosni čka Dyscophus guineti DL FPAR2 Retortamonas sp. chameleon Furcifer pardalis DL KLRUD Retortamonas sp. klokan Wallabia rufogrisea DL LASE1 Retortamonas sp. bazilišek Laemanctus serratus DL PSEUD Retortamonas sp. želva Trachemys scripta elegans DL SENT1 Retortamonas sp. hulman Semnopithecus entellus DL

1monoeukaryotické kultury. 2kmen CAVIA2C byl p řipraven z kmene CAVIA2 odstran ěním blastocyst. DL – Dobell-Leidlaw, SW – ATCC 1525 Seawater 802, TY - TYSGM.

43 6.2. Fylogenetická analýza

Celkem bylo získáno 16 sekvencí SSU rDNA retortamonád a jedna sekvence SSU rDNA diplomonád. Naše analýza zahrnovala velký po čet sekvencí taxonu Fornicata. Krom ě 14 nov ě osekvenovaných kmen ů rodu Retortamonas i Chilomastix a 12 sekvencí retortamonád získaných z GenBanku, bylo do analýzy zahrnuto také 40 sekvencí ostatních fornikát v četn ě naší nové sekvence nepopsané enteromonády (DIGU1). Jako outgroup bylo použito 31 sek- vencí eukaryotických organism ů nepat řících mezi Fornicata: Parabasalia ( Trichomonas vaginalis , Honigbergiella ruminantium , Trichonympha agilis ), Heterolobosea ( Naegleria gruberi , Acrasis rosea , „Macropharyngomonas halophila“), Euglenozoa ( Eutreptiella gymnastica , Diplonema ambulator , Bodo caudatus ), Jakobida (Seculamonas ecuadoriensis , Jakoba libera , Reclinomonas americana , Andalucia incarcerata , Andalucia godoyi ), Amoebozoa (Acanthamoeba sp., Acanthamoeba castellanii ), Dinoflagellata (Noctiluca scintillans ), Apicomplexa (Cryptosporidium parvum ), Preaxostyla (Trimastix marina , Trimastix pyriformis , Oxymonas sp.), druh Malawimonas jakobiformis , Choamoflagellata (Monosiga brevicollis ), Cercozoa (Cercomonas longicauda ), Opisthokonta (Mucor racemosus , Schizosaccharomyces pombe , Mus musculus ), Cryptophyta (Guillardia theta ), Glaucophyta (Cyanophora paradoxa ), Viridiplantae (Mesostigma viride , Volvox carteri ) Fylogenetický strom ze sekvencí genu pro SSU rRNA (obr. 7) byl konstruován metodou maximum likelihood.

44

Obr. 7: Fylogenetický strom taxonu Fornicata zako řen ěný řadou eukaryotických linií. Outgroupy byly pro p řehlednost odstran ěny. Červenou barvou jsou zvýrazn ěny nov ě získané sekvence. Čísla v uzlech znamenají hodnotu bootstrapu získaného metodou maximum likelihood a hodnotu Baysovské posteriorní pravd ěpodobnosti. Hv ězdi čkou jsou ozna čeny hodnoty bootstrapu nižší než 50.

Monofylie taxonu Fornicata byla v naší analýze podpo řena nízkou hodnotou bootstrapu (BS 56), zato vysokou hodnotou bayesovské posteriorní pravd ěpodobnosti (1). Nedávno objevené skupiny mo řských voln ě žijících fornikát se rozpadají na šest linií (CL1 až CL6) a spolu s rodem Chilomastix tvo ří bazální v ětve taxonu Fornicata. Bazální v ětev zahrnovala tři linie: linie CL5, rod Carpediemonas (CL4) a Hicanonectes (CL3). Dále následovala

45 spole čná v ětev rodu Kipferlia (CL6) a nepopsané linie CL2. Další odv ětvující se skupinou byl rod Chilomastix . Sesterskou linii k diplomonádám a rodu Retortamonas v naší analýze tvo řil rod Dysnectes (CL1). Statistická podpora monofylie jednotlivých linií/rod ů byla vysoká, ale jejich vzájemné vztahy nebyly statisticky podpořeny. Rod Chilomastix se dle naší analýzy rozpadl na p ět samostatných skupin. Voln ě žijící druh Chilomastix cuspidata (kmen LEMESOS) tvo řil bazální linii, p říbuznou ostatním, parazitickým druh ům rodu Chilomastix , avšak jeho bazální pozice nebyla statisticky podpo řena (BS 67, PP 0,97). Další odv ětvující se druh byl Chilomastix wenrichi , který m ěl relativn ě dlouhou v ětev. Ostatní druhy rodu Chilomastix vytvá řely dob ře podpo řenou monofyletickou skupinu. Druhy Chilomastix caulleryi a Chilomastix aulastomi tvo řily spole čnou, statisticky dob ře podpo řenou (BS 100, PP 1) linii. Oba izoláty druhu Chilomastix mesnili (FAB, FAB2) si byly blízce p říbuzné. Fylogenetická pozice enviromentální sekvence získané z velryby byla v rámci této skupiny nejasná. Rod Retortamonas a řád Diplomonadida tvo řily spole čnou linii, která m ěla ve vý- sledcích naší analýzy robustní statistickou podporu (BS 100, PP 1). Řád Diplomodadida se roz- padl na tradi ční skupiny Giardiinae a Hexamitinae. Monofylie obou skupin byla statisticky velmi dob ře podpo řena (BS 100, PP 1). Skupina Giardiinae zahrnovala dva rody: rod Giardia a Octomitus . Bazální linii skupiny Hexamitinae tvo řil parafyletický rod Spironucleus . Enteromonády se rozpadly na t ři r ůzné v ětve uvnit ř taxonu Hexamitinae: Enteromonas , Trimitus a doposud nepopsaná linie enteromonád. Tato poslední jmenovaná linie vytvá řela dlouhou v ětev a zahrnovala námi získanou sekvenci kmene DIGU1. Vnit řní skupina taxonu Hexamitinae zahrnovala rody Trepomonas , Hexamita a již zmín ěný rod Trimitus . Vzájemný vztah t ěchto rod ů a nepopsané linie enteromonád ale nebyl statisticky dob ře podpo řen. Rod Retortamonas se rozpadl na t ři linie: A, B a C. Statistická podpora tohoto v ětvení byla velmi silná (BS 100, PP 1). Jednotlivé linie se od sebe sekven čně lišily zejména v hypervariabilních oblastech (viz kap. 3.3). Skupina A zahrnovala krom ě již publikovaných sekvencí kmene KOZA, CAVIAE, LOS a OVCE i nov ě získané sekvence kmen ů CAVIA-R, KLRUD, LASE1, SENT1, SENT2. Tato skupina byla tvo řena výhradn ě kmeny izolovanými z obratlovc ů a zahrnovala řadu d říve popsaných druh ů rodu Retortamonas . Linie B obsahovala retortamonády izolované z plaz ů (FPAR2, PSEUD) a žáby (DIGU1). Skupina C měla v naší analýze bazální postavení a skládala se z již publikovaných sekvencí kmen ů ATCC a VALE, a nov ě osekvenovaných kmen ů BOMB3, LEP1 a CERAT3R. Do této skupiny spadaly pouze kmeny izolované z obojživelník ů.

46 6.3. Porovnání délek a hypervariabilních oblastí u blízce příbuzných druh ů retortamonád

Jednotlivé izoláty rodu Chilomastix se od sebe výrazn ě lišily délkou sekvence SSU rDNA. Sekvence druhu Chilomastix wenrichi dosahovala délky 1447 bp, Chilomastix mesnili 2400 bp, Chilomastix cuspidata 2517 bp, Chilomastix caulleryi 3270 bp a Chilomastix aulastomi dokonce 4026 bp. Alignment ukázal, že tyto rozdíly v délce SSU jednotlivých druh ů jsou zp ůsobeny p řítomností r ůzn ě dlouhých inzercí a hypervariabilních úsek ů. Tyto části sekvencí nebylo v ůbec možno alignovat. Jelikož byly tyto variabilní inzerce p ři analýze odstran ěny, na výsledném strom ě se n ěkteré ze sekvencí rodu Chilomastix jevily jako tém ěř identické. Abychom alespo ň částe čně postihli r ůznorodost t ěchto hypervariabilních oblastí, porovnávali jsme jejich délku u vybraných kmen ů: FAB vs. FAB2 (viz tab č. 22), PI1 vs. CHILO1 (viz. tab č. 23). Práv ě u t ěchto kmen ů rodu Chilomastix jsme se domnívali, že naše analýza nepostihla skute čnou odlišnost jejich sekvencí. U rodu Retortamonas nedošlo v evoluci k tak výraznému rozr ůzn ění sekvencí SSU rDNA, ale i p řesto bylo možné pozorovat u linií rodu Retortamonas p řítomnost 6 variabilních oblastí. K porovnání vnitrodruhové variability jsme z každého druhu/linie vybrali pouze sekvence jednoho kmene a teprve u nich jsme provedli porovnání variability. Z linie A byl vybrán kmen SENT1, z linie B kmen PSEUD a z linie C kmen LEP1 (viz. tab č. 24). Jednotlivé linie rodu Retortamonas byly sekven čně zna čně homogenní, nejvíce se od sebe lišily kmeny skupiny C, tedy kmeny izolované z obojživelník ů.

Tab č. 22: Chilomastix mesnili FAB vs. FAB2 Variabilní oblast Pozice u FAB 1_1 Délka u FAB 1_1 Délka u FAB2 1_2 1. 656 – 934 278 320 2. 1108 – 1232 124 139 3. 1809 – 2082 273 187

Tab č. 23: Chilomastix aulastomi PI1 vs. Chilomastix caulleryi CHILO1 Variabilní oblast Pozice u CHILO1 Délka u CHILO1 Délka u PI1 1. 684 – 1600 916 1750 2. 1745 – 1910 165 150 3. 2464 – 2868 404 337

47 Tab č. 24: Retortamonas sp. SENT1 (linie A) vs. Retortamonas sp. PSEUD (linie B) vs. Retortamonas sp. LEP1 (linie C) Variabilní oblast Pozice u SENT1 Délka u SENT1 Délka u PSEUD Délka u LEP1 1. 156 – 208 52 59 94 2. 608 – 771 163 142 197 3. 808 – 854 46 51 44 4. 1438 – 1551 113 112 74 5. 1668 – 1727 59 92 36 6. 1893 – 1930 37 37 40

6.4. Morfologie

Protargolem bylo obarveno 12 kmen ů st řevních retortamonád (BOMB3, CAVIA2C, CAVIA- R, CERAT3R, DIGU1, FPAR2, CHILO1, KLRUD, LASE1, LEP1, PSEUD, SENT1) a 2 kme- ny voln ě žijících bi číkovc ů rodu Chilomastix (LEMESOS, LUC3N). Bohužel se nám ne- poda řilo p řipravit dobré preparáty druhu Chilomastix mesnili (FAB) a Chilomastix aulastomi (PI1). Kultury v dob ě fixace preparátu nebyly v dobrém stavu a po čet bun ěk v kultu ře byl p říliš nízký. Pro porovnání znak ů zástupc ů rodu Retortamonas z hmyzích a obratlov čích hostitel ů byly po řízeny i fotografie preparát ů druh ů Retortamonas agilis (obr. 9) a Retortamonas alexeieffi (obr. 8) z larev tiplic, které byly pro tento ú čel zap ůjčené prof. Kuldou. Rod Retortamonas se vyzna čoval oválným tvarem bu ňky s mírn ě zašpi čat ělým posteriorním koncem. U všech bun ěk byly pozorovány dva bi číky, z nichž jeden byl zp ětný a asociovaný s cytostomem. U linie A (CAVIA2C, CAVIA-R, KLRUD, LASE1, SENT1) a linie B (DIGU1, FPAR2, PSEUD) se velikost buněk pohybovala mezi 5 až 8 µm, zatímco u linie C (BOMB3, CERAT3RET, LEP1) v ětšinou bu ňky dosahovaly velikosti 10µm. Linie A se dále vyzna čovala tím, že oba bi číky byly p řibližn ě stejn ě dlouhé a zárove ň kratší než délka bu ňky. Naproti tomu u linie B byly bi číky v ětšinou nestejn ě dlouhé a anteriorní bi čík dosahoval p řibližn ě stejné délky jako bu ňka. U linie C jsme pozorovali bi číky nestejné délky a vždy kratší než byla délka bu ňky. U všech linií rodu Retortamonas zp ětný bi čík p řesahoval délku cytostomu. Na základ ě našeho pozorování m ůžeme říci, že morfologické znaky potvrdily dělení rodu Retortamonas na t ři linie, kde linie C se od ostatních odlišovala v ětší velikostí bu ňky a linie A a B se od sebe navzájem lišily r ůznou délkou bi čík ů.

48 Druhy Retotortamonas agilis a Retortamonas alexeieffi izolované z larev tiplic se na rozdíl od výše zmín ěných kmen ů rodu Retortamonas vyzna čovaly více protáhlým tvarem bu ňky a výrazn ě zašpi čat ělým koncem. Bi číky byly u t ěchto druh ů nestejn ě dlouhé s delším anteriorním a kratším zp ětným bi číkem. Délka bi čík ů dosahovala p řibližn ě poloviny délky bu ňky. Rod Chilomastix se vyzna čoval protáhlým tvarem bu ňky s oblým anteriorním a dlouze protaženým a zašpi čat ělým posteriorním koncem. U všech kmen ů rodu Chilomastix byly pozorovány t ři anteriorní bi číky a jeden zp ětný bi čík, který nep řesahoval délku cytostomu. Druh Chilomastix wenrichi (kmen CAVIA2C) se od ostatním nabarvených kmen ů výrazn ě lišil svou velikostí, která dosahovala v ětšinou délky mezi 15 až 18 µm. Velikost druhu Chilomastix cuspidata (kmeny LEMESOS a LUC3N) se pohybovala okolo 25 µm. Anteriorní bi číky druhu Chilomastix cuspidata byly nestejn ě dlouhé, bu ňka byla na ventrální stran ě zplošt ělá a široce otev řený cytostom dosahoval 1/2 až 2/3 délky bu ňky. V apikální oblasti druhu Chilomastix cuspidata (kmeny LEMESOS, LUC3N) bylo možné pozorovat p řítomnost mohutné denzní fibrily, „lapelu“ (viz Bernard et al., 1997). U jiných druh ů rodu Chilomastix jsme tuto fibrilu nepozorovali. Bu ňky druhu Chilomastix caulleryi u kmene LEP1 dosahovaly délky přibližn ě 30 µm a u kmene CHILO1 p řekra čovala délka bu ňky i 40µm. U kmene LEP1 i CHILO1 se cytostom spiráln ě obtá čel okolo bu ňky a vytvá řel tak dojem, že má tvar osmi čky. Délka cytostomu na barvených preparátech nep řesahovala 1/3 délky bu ňky. Anteriorní bi číky těchto kmen ů byly všechny stejn ě dlouhé.

49 Obrazová tabule č. 1:

Obr. 1 – 9. Fotografie trofozoit ů rodu Retortamonas . 1. Kmen KLRUD. 2. Kmen SENT1. 3. Kmen CAVIA-R. 4. Kmen LASE1. 5. Kmen LEP1. 6. Kmen CERAT3. 7. Kmen BOMB3. 8. Retortamonas alexeieffi . 9. Retortamonas agilis .

50 Obrazová tabule č. 2:

Obr. 10, 11, 12. Fotografie trofozoit ů rodu Retortamonas . Obr. 13-17. Fotografie trofozoit ů rodu Chilomastix . 10. kmen DIGU1. 11. kmen PSEUD 12. kmen FPAR2. 13. kmen CAVIA2C. 14. kmen CHILO1. 15. kmen LEP1. 16. kmen LEMESOS. 17. kmen LUC3N.

51 7. DISKUZE

7.1. Získávání nových izolát ů a sekvence:

Cílem naší práce bylo získat sekven ční data co možná nejv ětšího po čtu izolát ů retortamonád (rod Retortamonas i Chilomastix ) z různých hostitel ů či volné p řírody. Zam ěř ili jsme se na zís- kání dvou gen ů: genu pro SSU rRNA a genu pro protein teplotního šoku HSP90. Tém ěř u všech sekvenovaných kmen ů jsme také p řipravili preparáty barvené protargolem, které v budoucnu poslouží pro podrobnou morfologickou studii. B ěhem naší práce jsme ale po řídili pouze „ilustra ční“ fotografie jednotlivých kmen ů, ze kterých jsme zjistili p řibližnou velikost a tvar bun ěk. Na základ ě zjišt ěných morfologických znak ů jsme se poté pokusili popsat jednotlivé linie rodu Retortamonas a Chilomastix a vzájemn ě je porovnat. Při amplifikaci genu pro SSU rRNA jsme museli nejprve optimalizovat nastavení teplotního cyklu. Teprve když jsme optimalizovali hodnotu annealingové teploty primer ů na 58 °C, poda řilo se nám osekvenovat v ětšinu našich kmen ů rodu Retortamonas a Chilomastix . V případ ě rodu Chilomastix jsme uvažovali o tom, že p říčinou tohoto jevu by mohla být extrémní délka sekvencí SSU rDNA n ěkterých kmen ů. Na rozdíl od již známých sekvencí druhu Chilomastix wenrichi (1447 bp) a Chilomastix mesnili (2460 bp), dosahovala nov ě získaná sekvence druhu Chilomastix caulleryi (kmen CHILO1) délky 3200 bp a u druhu Chilomastix aulastomi (kmen PI1) dokonce 4200 bp. Zdálo se být pravd ěpodobné, že práv ě tato odlišnost mohla zap říčinit obtíže p ři amplifikaci DNA. P ři nižší annealingové teplot ě se mohly primery navazovat p řednostn ě na kratší fragmenty DNA, které byly obsaženy ve vzorku. Toto vysv ětlení by bohužel nijak neobjasnilo, pro č se dlouhou dobu nepoda řilo osekvenovat voln ě žijící druh Chilomastix cuspidata (kmen LEMESOS), jehož délka sekvence SSU rDNAje p řibližn ě stejná jako u druhu Chilomastix mesnili . DNA všech druh ů rodu Chilomastix byla izolována z monoeukaryotických dob ře narostlých kultur, takže není pravd ěpodobné, že by obtíže s amplifikací jejich SSU rDNA zp ůsobilo malé množství DNA ve vzorku, nebo že by primery mohly být p řednostn ě navazovány na kratší fragmenty DNA jiných eukaryot. Z řejm ě existuje jiná p říčina toho, že některé druhy rodu Chilomastix bylo možno zachytit pouze za použití vyšší annealingové teploty, ale doposud nevíme, o jakou p říčinu se jedná.

52 Některé kmeny rodu Retortamonas jsme byly schopni naamplifikovat i p ři standartním nastavení teplotního cyklu, ale výt ěžky amplifika ční reakce byly v ětšinou nízké a DNA bylo proto nezbytné často klonovat. Tento postup byl ale časov ě náro čný a ne vždy p řinesl pozitivní výsledek v podob ě sekvence retortamonád. Použití vyšší annealingové teploty primer ů a výt ěžn ější polymerázy (LA polymeráza) zvýšilo procento záchytu DNA rodu Retortamonas a také zvýšilo výt ěžnost amplifika čních reakcí. Díky tomu se nám poda řilo podstatn ě zv ětšit vzorek osekvenovaných kmen ů rodu Retortamonas ze šesti na sedmnáct . Druhým sekvenovaným genem m ěl být gen pro protein teplotního šoku HSP90. Přestože existuje n ěkolik publikovaných sekvencí tohoto genu z fornikát, my jsme se n ě- kolikrát neúsp ěšn ě snažili tuto sekvenci získat u všech kmen ů rodu Chilomastix a u n ěkolika vybraných kmen ů rodu Retortamonas . P ři amplifikaci jsme zkoušeli r ůzné annealingové teploty či r ůznou kombinaci primer ů, pruhy r ůzných délek jsme zaklonovávali, ale v naprosté většin ě případ ů se nám nepoda řilo získat správnou sekvenci. Po roce intenzivní práce se nám poda řilo získat pouze sekvence kmen ů PSEUD a CAVIA-R, tedy kmen ů rodu Retortamonas . Předb ěžné analýzy ale nep řinesly nová data o fylogenezi fornikát, oba izoláty tvo řily spole čnou větev s již osekvenovaných kmenem VALE. Během sekvenování genu pro hsp90 jsme se soust ředili zejména na rod Chilomastix , abychom mohli potvrdit či vyvrátit bazální postavení tohoto rodu v rámci taxonu Eopharyngia a tedy potvrdit názor, že řád Retortamonadida je parafyletický či polyfyletický. Bohužel jsme ani u jednoho kmene rodu Chilomastix nebyli úsp ěšní ve snaze získat úplnou sekvenci daného genu. Zejména kv ůli časové náro čnosti a malé výt ěžnosti jsme se proto rozhodli upustit od sekvenace genu pro hsp90 a soust ředili jsme se na analýzu genu pro SSU rRNA. Z doposud nepublikované multigenové analýzy fornikát (Kolisko et al., in prep.) vyplývá, že postavení rodu Chilomastix je nejen bazální ke spole čné linii rodu Retortamonas a řádu Diplomonadida, ale i k voln ě žijícím rod ům Dysnectes a Kipferlia , a že řád Retortamonadida opravdu není monofyletický, ale polyfyletický. Jinou samostatnou kapitolou naší práce byla snaha o získání retortamonád z hmyzu. Doposud nebyla publikována sekvence žádného druhu rodu Retortamonas z hmyzu a také se zatím nikomu nezda řilo úsp ěšn ě kultivovat tyto druhy retortamonád. Testovali jsme n ěkolik různých známých médií, ale ani v jednom p řípad ě se nám nepoda řilo retortamonády kultivovat ani dv ě pasáže. Krom ě snahy o kultivaci jsme izolavali DNA p římo ze st řevního obsahu larev tiplic. Tyto larvy mají ve svém st řev ě po četnou sm ěs r ůzných endosymbiont ů a jelikož nevíme, jak dlouhou SSU mají retortamonády z hmyzu, po čítali s tím, že bude nutné prov ěř it v ětší po čet r ůzn ě dlouhých naamplifikovaných úsek ů. P řekvapením bylo, že tém ěř ve všech

53 případech jsme získali sekvenci samotného hostitele. Z těchto výsledk ů je z řejmé, že DNA hostitele musí mnohonásobn ě p řekra čovat koncentraci DNA endosymbiont ů a my tedy nejsme schopni amplifikací zachytit nic jiného než práv ě DNA hostitele. V budoucnu bude nezbytné přijít na zp ůsob, jak retortamonády z hmyzu kultivovat. Dlouhodob ější úsp ěšnou kultivací by došlo postupn ě k vymytí DNA hostitele, k udržení či nár ůstu populace retortamonád, a tedy i ke zvýšení pravd ěpodobnosti získání jejich sekven čních dat.

7.2. Molekulárn ě-fylogenetická analýza

Naše analýza zahrnovala velký vzorek fornikát a dalších eukaryotických taxonů, které byly použity k zako řen ění skupiny Fornicata. Na našem strom ě nemá monofylie taxonu Fornicata, na rozdíl od p ředchozích studií, p říliš silnou statistickou podporu. Je to ale s nejv ětší pravd ěpodobností zp ůsobeno tím, že jsme v alignmentu ponechali pom ěrn ě velký po čet pozic (1295 pozic v našem datasetu vs. 914 pozic u Kolisko et al. 2010). Spíše než vztahy v rámci taxonu Fornicata nás totiž zajímala variabilita retortamonád, a tak jsme se necht ěli p řipravit o příliš mnoho variabilních pozic. Taxon Fornicata se v naší analýze rozpadá na osm skupin (CL 1-6, rod Chilomastix , rod Retortamonas + řád Diplomonadida). Tento výsledek se shoduje se závěry nedávno publikované studie (Kolisko et al., 2010) a tém ěř shodné výsledky vyplývají i z doposud nepublikované multigenové analýzy (Kolísko, in prep.). Rod Retortamonas vytvá ří již tradi čně spole čnou linii s diplomonádami (Cepicka et al., 2008; Kolisko et al., 2008; Park et al., 2009; Kolisko et al., 2010). Na rozdíl od p ředchozích prací byla v naší analýze silně podpo řena monofylie diplomonád. Pozice rodu Chilomastix není doposud zcela jasná. Cepicka et al. (2008) ve své práci uvedli, že rod Chilomastix tvo ří sesterskou skupinu k taxonu „ Retortamonas + Diplomonadida“, i když s nízkou podporou, a řád Retortamonadida je tedy nejspíše parafyletický. Na našem strom ě se rod Chilomastix větví bazáln ěji než voln ě žijící rod Dysnectes , což je shodné s výsledkem, který ve své práci publikovali Park et al. (2009). Je ale nezbytné říci, že statistická podpora tohoto v ětvení je v obou p řípadech velmi nízká. V nedávno publikované práci (Kolisko et al., 2010) rod Chilomastix op ět tvo ří sesterskou linii k taxonu Diplomonadida + Retortamonas , ale ani v této práci není pozice rodu Chilomastix zcela jasná. P říbuzenské vztahy z ůstaly nevy řešeny i u ostatních bazálních linií fornikát (linie CL1 až CL6).

54 Již zmín ěná dosud nepublikovaná multigenová analýza z řejm ě pomohla vyjasnit nevy řešené fylogenetické vztahy bazálních linií fornikát. Ze záv ěrů této analýzy jasn ě vyplývá, že rod Dysnectes (CL1) je, se silnou statistickou podporou (BS 100), sesterskou linií taxonu Retortamonas + Diplomonadida, poté následuje slab ě podpo řená v ětev rodu Kipferia (BS 53) a rod Chilomastix se v ětví více bazáln ě (BS 100). Potvrzené fylogenetické vztahy ale vnášejí velký otazník do evoluce morfologických znak ů v rámci taxonu Fornicata. Otázkou je, pro č rod Dysnectes vypadá spíše jako ostatní bazální, voln ě žijící fornikáti (nap ř. rod Carpediemonas ) a jemu bazální rod Chilomastix vypadá jako příbuzný rodu Retortamonas . Vyvinuly se snad charakteristické znaky retortamonád n ěkolikrát nezávisle na sob ě? V sou časné dob ě nejsme schopni na tuto otázku odpov ědět, ale domníváme se, že p říčinou toho m ůže být skute čnost, že retortamonády stále z ůstávají jednou z málo prostudovaných skupin exkavát.

7.3. Rod Retortamonas

Do naší analýzy byly k šesti již publikovaným sekvencím rodu Retortamonas p řidány sekvence jedenácti nov ě osekvenovaných kmen ů (BOMB3, CAVIA-R, CERAT3R, FPAR2, KLRUD, LASE1, LEP1, PSEUD, SENT1, SENT2). Sekvenované kmeny rodu Retortamonas se roz- padly na t ři linie (A, B, C). V ětvení na našem strom ě ukazuje, že linie A a B jsou vzájemn ě blíže p říbuzné a linie C k nim tvo ří sesterskou větev. Bez podrobné morfologické analýzy je jen velmi obtížné definovat specifické morfologické znaky jednotlivých linií (A, B, C) rodu Retortamonas a hledat mezi nimi signifikantní rozdíly. P řesto na základ ě našeho mikroskopické pozorování barvených preparát ů usuzujeme, že trofozoiti linie C se liší v ětší velikostí bu ňky od trofozoitů linie A a B, a že kmeny linie A je možné odlišit od kmen ů linie B na základ ě délky bi čík ů. V rámci linií A a C je možné pozorovat ur čitou hostitelskou specifitu. Do linie C spadají pouze kmeny izolované z obojživelník ů. Linie A zahrnuje tém ěř výhradn ě kmeny izolované ze st řev savc ů. Jedinou výjimkou je kmen LASE1, který izolován z baziliška. V linii B najdeme jeden kmen získaný z kloaky žáby (DIGU1) a dva kmeny z plaz ů (FPAR2, PSEUD). Na základ ě naší fylogenetické analýzy, morfologického pozorování a hostitelského spektra usuzujeme, že linie C je nejspíše shodná s druhem Retortamonas dobelli (Bishop, 1931) popsaným z obojživelník ů. Linie B by mohla být shodná s druhem Retortamonas

55 saurarum (Moskowitz, 1951) popsaným z plaz ů. Morfologické znaky retortamonád linie B jsou sice shodné se popsanými znaky druhu Retortamonas saurarum (viz Moskowitz, 1951), ale tento druh byl již d říve synonimizován s druhem Retortamonas dobelli (Kulda, 1958). Linie A zahrnuje kmeny izolované z různých savc ů (a jednoho ješt ěra), a tedy r ůzné popsané druhy rodu Retortamonas (nap ř. Retortamonas intestinalis , Retortamonas caviae , Retortamonas ovis a Retortamonas mitrula ).

7.4. Rod Chilomastix

Během naší práce jsme získali sekven ční data čty ř druh ů rodu Chilomastix: Chilomastix mesnili (FAB2), Chilomastix caulleryi (CHILO1), Chilomastix aulastomi (PI1) a Chilomastix cuspidata (LEMESOS). Rod Chilomastix se v naší analýze rozpadl na p ět linií. Bazální linii rodu Chilomastix , i když s nízkou podporou, tvo řil voln ě žijící druh Chilomastix cuspidata . V sou časné dob ě máme k dispozici stabilní kulturu dalšího voln ě žijícího druhu rodu Chilomastix (LUC3N), který se po morfologické stránce zdá být shodný z druhem Chilomastix cuspidata LEMESOS. V budoucnu by bylo vhodné získat sekvenci kmene LUC3N a zjistit, zda je konspecifický s kmenem LEMESOS. V případ ě, že by se nejednalo o daný druh, bylo by zajímavé zjistit, zda se také jedná o linii bazální parazitickým druh ům, nebo zda volný zp ůsob života vznikl u rodu Chilomastix n ěkolikrát nezávisle na sob ě. Druh Chilomastix wenrichi (kmen CAVIA2) vytvá ří v naší analýze pom ěrn ě dlouhou větev, jejíž pozice nemá silnou statistickou podporu. Tento výsledek je z řejm ě dán tím, že sekvence SSU rDNA tohoto druhu je dlouhá pouze 1447 bp. Jedná se o jednu z nejkratších eukaryotických sekvencí tohoto genu. Pokud zohledníme délky sekvencí ostatních kmen ů rodu Chilomastix , zejména bazálního kmene LEMESOS, pak byla nejspíše b ěhem evoluce sekvence druhu Chilomastix wenrichi sekundárn ě zkrácena. Naše molekulárn ě-fylogenetická analýza vyhodnotila sekvence kmen ů FAB a FAB2 jako tém ěř identické. Jelikož ale byla b ěhem úprav alignmentu odstran ěna řada variabilních pozic, rozhodli jsme se porovnat variabilitu sekvencí obou kmen ů. P řesto, že jsme objevili tři hypervariabilní oblasti, nedomníváme se, že by možné na jejich základ ě charakterizovat kmeny FAB a FAB2 jako dva samostatné druhy. S nejv ětší pravd ěpodobností se jedná o ne- obvykle velikou vnitrodruhovou variabilitu druhu Chilomastix mesnili . Spole čnou linii v naší analýze vytvá ří druhy Chilomastix caulleryi a Chilomastix aulastomi . Z morfologického hlediska se jedná o tém ěř identické organismy a již d říve se

56 uvažovalo o tom, že by se mohlo jednat o jeden druh, který se vyskytuje nejen u obojživelník ů, ale i u pijavek (Bishop, 1935). Ale proto, že nebyly žádné jasné d ůkazy o konspecifit ě obou druh ů, byly i nadále kmeny rodu Chilomastix z obojživelník ů popisovány jako Chilomastix caulleryi a kmeny z pijavek jako Chilomastix aulastomi . Na našem strom ě oba druhy sice vytvá ří jednu linii, ale jelikož víme, že se oba kmeny velmi výrazn ě liší délkou své sekvence SSU rDNA, nejsme v sou časné dob ě schopni s jistotou říci, jestli jsou izoláty CHILO1 a PI1 jedním či dv ěma blízce p říbuznými druhy. K vy řešení této otázky bude v budoucnu zapot řebí získat a osekvenovat další izoláty druhu Chilomastix caulleryi z obojživelník ů a druhu Chilomastix aulastomi z pijavek. V sou časné dob ě máme k dispozici kmen LEP1 z parosni čky, který obsahuje mimo řady r ůzných druh ů eukaryot i druh Chilomastix caulleryi . Bohužel se nám z tohoto izolátu doposud nepoda řilo získat sekvenci rodu Chilomastix , pouze sekvenci rodu Retortamonas . Do doby než se nám poda ří nashromáždit více sekvencí druh ů Chilomastix aulastomi a Chilomastix caulleryi , považujeme na základ ě znalosti variability získaných sekvencí obou kmen ů (CHILO1, PI1) za reálné dv ě možné situace: kmeny z obojživelník ů a z pijavek se roz- dělí na dva, sekven čně dob ře odlišitelné druhy, které budou charakterizovány přítomností specifických hypervariabilních míst a hostitelskou specifitou, nebo se bude jednat o jedinou linii s obrovským vnitrodruhovým polymorfismem a schopností p řeskoku mezi obojživelníky a pijavkami.

7.5. Řád Retortamonadida

Řád Retortamonadida byl vytvo řen na základ ě sv ětelné mikroskopie v první polovin ě 20. století (Wenrich, 1932) a pozd ěji byla jeho monofylie potvrzena studií ultrastrukturních znak ů (Brugerolle, 1973, 1977). První molekulárn ě-fylogenetická analýza zahrnující sekvence obou rod ů retortamonád (Cepicka et al., 2008) ale ukázala, že se nejedná o monofyletický taxon, ale že řád Retortamonadida by mohl spíše p ředstavovat parafyletický stupe ň obsahující diplomonády jako svou vnit řní linii. To by znamenalo, že p ředek diplomonád musel být organismus typu Chilomastix nebo Retortamonas . Rozdílné výsledky morfologických a molekulárn ě-fylogenetických analýz byly s nejv ětší pravd ěpodobností zp ůsobeny tím, že sekven ční data zahrnutá do analýz byla získána pouze z retortamonád z obratlov čích hostitel ů, zatímco ultastruktura byla po řízena u druhu izolovaného z hmyzu.

57 Předpoklad, že retortamonády z hmyzu by mohly být jiným rodem než retortamonády z obratlovc ů, byl potvrzen ultrastrukturní studií, kterou provedl prof. Kulda (unpubl.; viz. Cepicka et al., 2008). Ultrastrukturní studie byla provedena u kmene PSEUD (Retortamonas izolovaný z želvy Trachemys scripta elegans ), u kterého jsme potvrdili, že spa- dá mezi ostatní, již d říve osekvenované retortamonády z obratlovc ů. Ukázalo se, že bu ňky tohoto kmene se od druh ů Retortamonas alexeieffi a Chilomastix aulastomi (jediní zástupci retortamonád, u kterých byla publikována ultrastruktura) liší zejména tím, že postrádá korzet subpelikulárních mikrotubul ů. Nep řítomnost mikrotubulárního korzetu spojuje retortamonády z obratlovc ů s řádem Diplomonadida. Výsledky provedené studie tedy podporují záv ěry molekulárn ě-fylogenetických analýz, kde retoramonády z obratlovc ů tvo ří sesterskou skupinu k řádu Diplomonadida a rod Chilomastix se v ětví více bazáln ě. Na základ ě morfologické analýzy lze říci, že retortamonády z obratlovc ů tvo ří samostatný rod, blízce p říbuzný diplomonádám. Jedním z cíl ů naší práce bylo získat sekvenci jakéhokoliv izolátu retortamonád z hmyzu a zjistit jeho pozici na fylogenetickém strom ě. Teprve to by nám umožnilo p řesn ě ur čit příbuzenské vztahy uvnit ř taxonu Eopharyngia. Jak už bylo výše zmín ěno, naše snahy o získání kultur a sekvencí retortamonád z hmyzu byly ale neúsp ěšné, a proto vztahy uvnit ř taxonu Eopharyngia z ůstávají doposud nevy řešeny.

58 8. ZÁV ĚREČNÉ SHRNUTÍ

Celkem bylo získáno 16 nových sekvencí SSU rDNA rodu Retortamonas a Chilomastix a jedna sekvence SSU rDNA doposud nepopsané linie enteromonád.

Poprvé byly získány sekvence SSU rDNA druh ů Chilomastix caulerryi , Chilomastix aulastomi a Chilomastix cuspidata . Sekvence SSU rDNA druhu Chilomastix caulleryi byla poskytnuta do multigenové analýzy taxonu Fornicata provedené v laborato ři Dr. A. Rogera (Dalhousie University, Halifax, Kanada). V sou časné dob ě je p řipravován manuskript, kde jsem uvedena jako spoluautorka.

U kmen ů rodu Chilomastix byla pozorována obrovská variabilita sekvencí SSU rDNA nejen mezi jednotlivými druhy, ale i v rámci jednoho druhu ( Chilomastix mesnili ). U kmen ů FAB, FAB2, CHILO1 a PI1 byly v rámci sekvence SSU rDNA identifikovány t ři hypervariabilní oblasti.

Druhy Chilomastix caulleryi a Chilomastix aulastomi jsou si blízce p říbuzné. Oba druhy se ale velmi výrazn ě liší v hypervariabilních oblastech a pro p řesné ur čení jejich p říbuzenského vztahu bude nezbytné získat další sekvence druh ů Chilomastix caulleryi z obojživelník ů a Chilomastix aulastomi z pijavek.

Rod Retortamonas se rozpadá na t ři linie, které je možné identifikovat nejen molekulárn ě, ale i na základ ě morfologických znak ů. Kmeny t ěchto t ří linií vykazují ur čitou hostitelskou specifitu.

Při porovnávání sekvencí SSU rDNA t ří linií rodu Retortamonas bylo identifikováno šest hypervariabilních sekvencí. Kmeny v rámci linií A a B vykazují zna čnou míru homogenity, zatímco u kmen ů linie C je možné v rámci hypervariabilních oblastí pozorovat mírné odlišnosti.

59 9. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

Sekundární citace jsou ozna čeny *.

Abraham R., 1961a. A New Protozoon of the Genus Chilomastix . Parasitol. Res. 21, 159-163

Abraham R., 1961b. Chilomastix equi n. sp., from the Intestine of the Indian Horse. J. Protozool. 8, 291-293

*Alexeieff A., 1912. Sur quelques noms de genre des flagellés qui doivent disparaître de la nomenclature pour cause de synonymie ou pour toute autre raison. Diagnoses de quelques genres récemment étudiés. Zool. Anz. 39, 674-680

*Alexeieff A., 1917. Mitochondries et corps parabasal chez les flagellés. C. R. Soc. Biol. 80, 358-361

Arisue N., Sánchez L.B., Weiss L.M., Müller M. and Hashimoto T., 2002. Mitochondrial-type hsp70 genes of the amitochondriate protists, Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica and two microsporidians. Parasitol. Int. 51, 9-16

Arisue N., Hasegawa M. and Hashimoto T., 2005. Root of the Eukaryotic Tree as Inferred from Combined Maximum Likelihood Analyses of Multiple Molecular Sequence Data. Mol. Biol. Evol. 22, 409-420

Baldauf S.L, Roger A.J,Wenk-Siefert I., Doolittle W.F., 2000. A Kingdom-Level Phylogeny of Eukaryotes Based on Combined Protein Data. Science 290, 972-976

Becker E.R., 1926. The Flagellate Fauna of the Coecum of the Striped Ground Squirrel, Citellus tridecemlineatus , with Special Reference to Chilomastix magna sp. nov. Biol. Bull. 51, 287-298

Bernard C., Simpson A.G.B. and Patterson D.J., 1997. An Ultrastructural Study of a Free-living Retortamonad, Chilomastix cuspidata (Larsen  Patterson, 1990) n. comb. (Retortamonadida, Protista). Eur. J. Protistol. 33, 254-265

Bishop A., 1931. A Description of Embadomonas n. spp. From Blatta orientalis , Rana temporaria , Bufo vulgaris , Salamandra muculosa ; with a Note upon the „Cyst“ of Trichomonas batrachorum . Parasitol. 23, 286-300

60

Bishop A., 1934. Observation upon Embadomonas intestinalis in Culture. Parasitology 26, 17-25

Bishop A., 1935. Observations upon Chilomastix from Bufo vulgaris , with Notes on Chilomastix auslastomi . Parasitology 28, 507-518

Boeck W.C., 1921. Chilomastix mesnili and a Method for Its Culture. J. Exp. Med. 33, 147-175

Boeck W.C. and Tanabe M., 1926. Chilomastix gallinarum , Morphology, Division and Cultivation. Am. J. Epidem. 6, 319-

Brugerolle G., 1986. Séparation des gendres Trimitus (Diplomonadida) et Tricercomitus (Trichomonadida) d'après leur Ultrastructure. Protistologica 22, 31-37

Brugerolle G., 1973a. Etude Ultrastructurale du Trophozoite et du Kyste chez le Genre Chilomastix Alexeieff, 1910 (Zoomastigophorea, Retortamonadida Grassé, 1952). J. Protozool. 20, 574-585

Brugerolle G., Joyon L. et Oktem N., 1973b. Contribution a l'étude Cytologique et Phylétique des Diplozoaires (Zoomastigophorea, Diplozoa, Dangeard 1910). II. Etude Ultrastructurale du Genre Spironucleus (Lavier 1936). Protistologica 9, 495-502

Brugerolle G., 1974a. Contribution a l'étude Cytologique et Phylétique des Diplozoaires (Zoomastigophorea, Diplozoa, Dangeard 1910). III. Étude Ultrastructurale du Genre Hexamita (Dujardin 1836). Protistologica 10, 83-90

Brugerolle G., Joyon L. and Oktem N., 1974. Contribution a l’étude cytologique et phylétique des diplozoaires (Zoomastigophorea, Diplozoa Dangeard 1910). IV. Étude ultrastructurale du genre Octomitus (Prowazek 1904). Protistologica 10, 457-463

Brugerolle G., 1975a. Contribution a l'étude Cytologique et Phylétique des Diplozoaires (Zoomastigophorea, Diplozoa, Dangerd 1910). V. Nouvelle Interprétation de l'organisation Cellulaire de Giardia . Protostologica 9, 99-109

Brugerolle G., 1975b. Contribution a l'étude Cytologique et Phylétique des Diplozoaires (Zoomastigophorea, Diplozoa, Dangerd 1910). VI. Caractères Généraux des Diplozoaires. Protistologica 9. 111-118

61 Brugerolle G., 1977. Ultrastructure du Genre Retortamonas Grassi 1879 (Zoomastigophorea, Retortamonadida Wenrich 1931). Protistologica 13, 233-240

Brugerolle G., 1991. Flagellar and Cytoskeletal Systems in Amitochondrial Flagellates: Archamoeba, Metamonada and Parabasala. Protoplasma 164, 70-90

Brugerolle G., 2000. Nothing is Never Acquired; or the Confusion between Two Intestinal Parasitic Flagellates: the Retortamonad Chilomastix and a Trichomonad. Parasitol. Res. 86, 1014

Brugerolle G. and Regnault J.P., 2001. Ultrastructure of the Enteromonad Flagellate Caviomonas mobilis . Parasitol. Res. 87, 662-665

Brugerolle G., 2005. The Symbiotic Fauna of the African Termite Hodotermes mossambicus identification of Four Flagellate Species of the Genera Spironympha , Trichomonoide s and Retortamonas . Parasitol. Res. 98, 257-263

Bui E.T.N., Bradley P.J. and Johnson P.J., 1996. A Common Evolutionary Origin for Mitochondria and Hydrogenosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 9651-9656

Carpenter K.J., Waller R.S. and Keeling P.J., 2008. Surface Morphology of Saccinobaculus (Oxymonadida): Implications for Character Evolution and Function in Oxymonads. Protist 159, 209- 221

*Cavalier-Smith T., 1981. The Origin and Early Evolution of the Eukaryotic Cell. In M. J. Carlile, J. F. Collins, and B. E. B. Moseley (ed.), Molecular and cellular aspects of microbial evolution. 33-84, Cambridge University Press, Cambridge

*Cavalier-Smith T., 1983. A 6-kingdom Classification and a Unified Phylogeny. In W. Schwemmler and H. E. A. Schenk (ed.), Endocytobiology II. de Gruyter, 1027-1034

Cavalier-Smith T., 1993. Kingdom Protozoa and Its 18 Phyla. Microbiol. Rev. 57, 953-994

Cavalier-Smith T., Chao E.E., 1996. Molecular Phylogeny of the Free-Living Archezoan Trepomonas agilis and the Nature of the first Eukaryot. J. Mol. Evol. 43, 551-562

Cavalier-Smith T., 1998. A Revised Six-Kingdom System of Life. Biol. Rev. 73, 203-266

62 Cavalier-Smith T., 2002. The Phagotrophic Origin of Eukaryotes and Phylogenetic Classification of Protozoa. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 297-354

Cavalier-Smith T., 2003. The Excavate Protozoan Phyla Metamonada Grassé emend. (Anaeromonadea, Parabasalia, Carpediemonas , Eopharyngia) and Loukozoa emend. (Jakobea, Malawimonas ): their Evolutionary Affinities and New Higher Taxa. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53, 1741-1758

Cepicka I., Kostka M., Uzlíková M., Kulda J., Flegr J., 2008. Non-monophyly of Retortamonadida and High Genetic Diversity of the Genus Chilomastix Suggested by Analysis of SSU rDNA. Mol. Phylogenet. Evol. 48, 770-775

Clark C.G. and Roger A.J., 1995. Direct Evidence for Secondary Loss of Mitochondria in Entamoeba histolytica . Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 6518-6521

Collier J. and Boeck W.C., 1926. The Morphology and Cultivation of Embadomonas cuniculi n. sp. J. Parasitol. 12, 131-140

Dacks J.B., Silberman J.D., Simpson A.G.B., Moryia S., Kudo T., Ohkuma M. and Redfield R.J., 2001. Oxymonads are Closely Related to the Excavate Taxon Trimastix . Mol. Biol. Evol. 18, 1034-1044 da Fonseca O.O.R., 1916. Estudos sorbe os flajelatos parasitos dos mamiferos do Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 8,5-39 da Fonseca O.O.R., 1920. Estudos sorbe os flagellados Parasitos. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 12, 51-66

Dagley M.J., Dolezal P., Likic V.A., Smid O., Purcell W.A., Buchanan S.K., Tachezy J., Lithgow W., 2009. The Protein Important Channel in the Outer Mitosomal Membrane of Giardia intestinalis . Mol. Biol. Evol. 26, 1941-1947

Desser S.S., Hong H. and Siddall M.E., 1993. An Ultrastructural Study of Brugerolleia algonquinensis gen. nov., sp. nov. (Diplomonadina; Diplomonadida), a Flagellate Parasite in the Blood of Frogs from Ontario, Canada. Eur. J. Protistol. 29, 72-80

Dobell C.C., 1935. Researches on the Intestinal Protozoa of Monkey and Man. VII. On Enteromonas of Mackaques and Embadomonas intestinalis . Parasitology 27, 564-592

63 Dyall S.D. and Johnson P.J., 2000. Origins of Hydrogenosomes and Mitochondria: Evolution and Organelle Biogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 3, 404-411

Ferguson H.W., 1979. Scanning and Transmission Electron Microscopical Observations on Hexamita salmonis (Moore, 1922) Related to Mortalities in Rainbow Trout Salmo gairdneri Richardson. J. Fish Dis. 2, 57-67

Friend D.S., 1966. The Fine Structure of Giardia muris . J. Cell Biol. 29, 317-332

Germani Q.M., 1932. Retortamonas caudatus (n. sp.), an Intestinal Flagellate from a Beetle Larva, Gyrinidae sp. Trans. Amer. Micr. Soc. 51, 219-224

Germot A., Philippe H. and Le Guyarder H., 1996. Presence of a Mitochondrial-Type 70-kDa Heat Shock Protein in Trichomonas vaginalis Suggests a Very Early Mitochondrial Endosymbiosis in Eukaryotes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 14614-14617

Germot A., Philippe H., Le Guyader H., 1997. Evidence for Loss of Mitochondria in Microsporidia from a Mitochondrial-Type HSP70 in Nosema locustae . Mol. Bioch. Parasitol. 87, 159-168

*Grassé P.P., 1952. Traité de Zoologie 1, fasc. 1, Masson, Paris, 824-835

*Grassi B., 1879. Dei protozoi parassiti e specialmente di quelli che sono nell'uomo. Gaz. Med. Ital. Lombardi. 39, 445-448

Guindon, S., Gascuel, O., 2003. A Simple, Fast, and Accurate Algorithm to Estimate Large Phylogenies by Maximum Likelihood. Syst. Biol. 52, 696-704

Hall, T.A., 1999. BioEdit: a User-Friendly Biological Sequence Alignment Editor and Analysis Program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 41, 95-98

Hampl V., Horner D.S., Dyal P., Kulda J., Flegr J., Foster P.G., Embley T.M., 2005. Inference of the Phylogenetic Position of Oxymonads Based on Nine Genes: Support for Metamonada and Excavata. Mol. Biol. Evol. 22, 2508-2518

Hampl V. and Simpson A.G.B., 2007. Possible Mitochondria-Related Organelles in Poorly-Studied „Amitochondriate“ Eukaryotes. In Tachezy J. (ed.): Hydrogenosomes and Mitosomes: Mitochondria of Anaerobic Eukaryotes, 265-279, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg

64 Hampl V., Silberman J.D., Stechmann A., Diaz-Trivino S., Johnson P.J., Roger A.J. 2008. Genetic Evidence for a Mitochondriate Ancestry in the ‘Amitochondriate’ Flagellate Trimastix pyriformis . PloS One 3, 1383-1391

Hampl V., Hug L., Leigh J.W., Dacks J.B., Franz Langf B., Simpson A.G.B. and Roger A.J., 2009. Phylogenomic Analyses Support the Monophyly of Excavata and Resolve Relationships among Eukaryotic ‘Supergroups’. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3859-3864

Hashimoto T., Sánchez L.B., Shirakura T., Müller M. and Hasegawa M., 1998. Secondary Absence of Mitochondria in Giardia lamblia and Trichomonas vaginalis Revealed by Valyl-tRNA Synthetase Phylogeny. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 6860-6865

Hegner R.W., 1924. Giardia and Chilomastix from Monkey, Giardia from the Wild Cat and Balamutium from the Sheep. J. Parasitol. 11, 75-78

Hegner R.W. and Schumaker E., 1928. Some Intestinal Amoebae and Flagellates from the Chimpanzee, Three-Toed Sloth, Sheep and Guinea-Pig. J. Parasitol. 15, 31-37

*Honigberg B.M., Balamuth W., Bovee E.C., Corliss J.O., Gojdics M., Hall R.P., Kudo R.R., Levine N.D., Loeblich A.R. Jr., Weiser J. and Wenrich D.H., 1964. A Revised Classification of the Phylum Protozoa. J. Protozool. 11, 7-20

Hogue M.J., 1933. A New Variety of Retortamonas (Embadomonas ) intestinalis from Man. Am. J. Hyg. 18, 433-441

Horner D.S. and Embley T.M., 2001. Chaperonin 60 Phylogeny Provides Further Evidence for Secondary Loss of Mitochondria Among Putative Early-Branching Eukaryotes. Mol. Biol. Evol. 18, 1970-1975

Huelsenbeck, J.P., Ronquist, F., 2001. MRBAYES: Bayesian Inference of Phylogenetic Trees. Bioinformatics 17, 754-755

Cheissin E.M., 1965. Ultrastructure of Lamblia duodenalis 2. The Locomotory Apparatus, Axial Rod and Other Organelles. Arch. Protistenk. 108, 8-18

Janakidevi K., 1961. A New Species of Chilomastix Alefeieff, 1912 (Protozoa: Retortamonadines, Grassé, 1952) from Lizard. Parasitol. Res. 20, 563-567

65

Janakidevi K., 1962. On Retortamonas cheloni sp. nov., a Parasitic Protozoon from the Starred Tortoise. Parasitology 52, 165-168

Jørgensen A. and Sterud E., 2007. Phylogeny of Spironucleus (Eopharyngia: Diplomonadida: Hexamitinae). Protist 158, 247-254

Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K., Miyata, T., 2002. MAFFT: a Novel Method for Rapid Multiple Sequence Alignment Based on Fast Fourier Transform. Nucleic Acids Res. 30, 3059-3066

Keeling P.J. and Doolittle W.F., 1996. Alpha-Tubulin from Early-Diverging Eukaryotic Lineages and the Evolution of the Tubulin Family. Mol. Biol. Evol. 13, 1297-1305

Keeling P.J. and Brugerolle G., 2006. Evidence from SSU rRNA Phylogeny that Octomitus is a Sister Lineage to Giardia . Protist 157, 205-212

Kofoid C.A. and Swezy O., 1920. On the Morphology and Mitosis of Chilomastix mesnili (Wenyon), a Common Flagellate of the Human Intestine. Univ. Calif. Publ. Zool. 20, 117-144

Kolisko M., Cepicka I., Hampl V., Kulda J., Flegr J., 2005. The Phylogenetic Position of Enteromonads: a Challenge for the Present Models of Diplomonad Evolution. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 1729-1933

Kolisko M., Cepicka I., Hampl V., Leigh J., Roger A.J., Kulda J., Simpson A.G.B., Flegr J., 2008. Molecular Phylogeny of Diplomonads and Enteromonads Based on SSU rRNA, Alpha-Tubulin and HSP90 Genes: Implications for the Evolutionary History of the Double Karyomastigont of Diplomonads. BMC Evol. Biol. 8, 205-218

Kolisko M., Silberman J.D., Cepicka I., Yubuki N., Takishita K., Yabuki A., Leander B.S., Inouye I., Inagaki Y., Roger E.J. and Simpson A.G.B., 2010. A Wild Diversity of Previously Undetected Free- Living Relatives of Diplomonads Isolated from Marine/Saline Habitats. Envir. Microbiol., in press

Kowalczyk S.A., 1938. A Report on the Intestinal Protozoa of the Larva of the Japanese Beetle (Popillia Japonica newm., Coleoptera). Trans. Am. Microsc. Soc. 58, 229-244

66 Kulda J., 1959. Retortamonas boae n. sp. (Retortamonadidae, Flagellata, Protozoa) a New Flagellate from the Cloaca of Constrictor c. constrictor and a Contribution to the Knowledge of the Species Retortamonas dobelli (Bishop 1931). A. Univ. Carol. 1, 37-49

Kulda J. and Nohynkova E., 1978. Flagellates of the Human Intestine and of Intestine of Other Species. In J.P. Kreier (ed): Parasitic Protozoa, Vol. 2., 1-138. Academic Press, New York

Laird M., 1956. Intestinal Flagellates from Some New Zealand Insects. Trans. R. Soc. N. Z. 84, 297- 308

Larsen J. and Patterson D.J., 1990. Some Flagellates (Protista) from tropical marine sediments. J. Nat. Hist. 24, 801-937

Leiva L., 1921. Observation on Chilomastix intestinalis Kuczinski. J. Parasitol. 8, 49-57

Lindmark D.G. and Müller M., 1973. Hydrogemosome, a Cytoplasmatic Organelle of the Anaerobic Flagellate Tritrichomonas foetus , and Its Role in Pyruvate Metabolism. J. Biol. Chem. 248, 7724-7728

Ludwig F.W., 1946. Studies on the Protozoan Fauna of the Larvae of teh Crane-Fly, Tipula abdominalis . I. Flagellates, Amoebae, and Gregarines. Trans. Am. Micr. Soc. 65, 189-214

Mackinnon D.L., 1911. On Some More Protozoan Parasites of Trichoptera. Parasitology 4, 28-38

Mackinnon D.L., 1915. Studieson Parasitic Protozoa. III. (a) Notes on the Flagellate Embadomonas . (b) Multiplication Cysts of Trichomastiginae. J. Cell Sci. 2, 105-120

Mai Z., Ghosh S.,Frisardi M., Rosenthal B., Rogers R. and Samuelson J., 1999. Hsp60 Is Targeted to a Cryptic Mitochondrion-Derived Organelle (“Crypton”) in the Microaerophilic Protozoan Parasite Entamoeba histolytica . Mol. Cell. Biol. 19, 2198-2205

Martínez-Díaz R.A., Castro A.T., Herrera S., Ponce F., 2001. First Report of the Genus Retortamonas (Sarcomastigophora: Retortamonadidae) in Birds. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 96, 961-963

Medlin L., Elwood H.J., Stickel S. and Sogin M.L., 1988. The Characterization of Enzymaticaly Amplified Eukaryotic 16S-Like rRNA-Coding Regions. Gene 71, 491-499

67 Morrison H.G., McArthur A.G., Gillin F.D., Aley S.B., Adam R.D., Olsen G.J., Best A.A., Cande W.Z., Chen F., Cipriano M.J., Davids B.J., Dawson S.C., Elmendorf H.G., Hehl A.B., Holder E.M., Huse S.M., Kim U.U., Lasek-Nesselquist E., Manning G., Nigam A., Nixon J.E.J., Palm D., Passamaneck N.E., Prabhu A., Reich C.I., Reiner D.S., Samuelson J., Svard S.G. and Sogin M.L., 2007. Genomic Minimalism in the Early Diverging Inatestinal Parasite Giardia lamblia . Science 317, 1921- 1926

Moskowitz N., 1951. Observations on Some Intestinal Flagellates from Reptilian Host (Squamata). J. Morphol. 89, 257-321

Nikolaev S.I., Berney C., Fahrni J.F., Bolivar I., Polet S., Mylnikov A.P., Aleshin V.V., Petrov N. and Pawlowski J., 2004. The Twilight of Heliozoa and Rise of Rhizaria, an Emerging Spergroup of Amoeboid Eukaryotes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 8066-8071

Nie D., 1948. The Structure and Division of Chilomastix intestinalis Kutzynski, with Notes on Similar Forms in Man Other vertebrates. J. Morphol. 82, 287-318

Nie D., 1950. Morphology and Taxonomy of the Intestinal Protozoa of the Guinea-pig, Cavia porcella . J. Morphol. 86, 381-493

Park J.S., Kolisko M ., Heiss A.A., Simpson A.G., 2009. Light Microscopic Observations, Ultrastructure, and Molecular Phylogeny of Hicanonectes teleskopos n. g., n. sp., a Deep-Branching Relative of Diplomonads. J. Eukaryot. Microbiol. 56, 373-384

Patterson D.J., Simpson A.G.B., Weerakoon N., 1999. Free-Living Flagellates form Anoxic Habitats and the Assembly of Eukaryotic Cell. Biol. Bull. 196, 381-383

Posada, D., Crandall, K.A., 1998. Modeltest: Testing the Model of DNA Substitution. Bioinformatics 14, 817-818

Poynton S.L. and Sterud E., 2002. Guidelines for Species Descriptions of Diplomonad Flagellates from Fish. J. Fish Dis. 25, 15-31

Rada P., Smid O., Sutak R., Dolezal P., Pyrih J., Zarsky V., Montagne J.J., Hrdy I., Camadro J.M. and Tachezy J., 2009. The Monothiol Single-Domain Glutaredoxin Is Conserved in the Highly Reduced Mitochondria of Giardia intestinalis . Eukaryot. Cell 8, 1584-1591

68 Roger A.J., Svörd S.G., Tovar J., Clark C.G., Smith M.W., Gillin F.D. and Sogin M.L., 1998. A Mitochondrial-Like Chaperonin 60 Gene in Giardia lamblia : Evidence that Diplomonads once Harbored an Endosymbiont Related to the Progenitor of Mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 229- 234 Roger A.J., 1999. Reconstructing Early Events in Eukaryotic Evolution. Am. Nat. 154, 146-163

Sidall M.E., Hong H. and DesserS.S., 1992. Phylogenetic Analysis of the Diplomonadida (Wenyon, 1926) Brugerolle, 1975: Evidence for Heterochrony in Protozoa and Against Giardia lamblia as a „Missing Link“. J. Protozool. 39, 361-367

Silberman J.D., Simpson A.G.B.,Kulda J.,Cepicka I.,Hampl V., Johnson P.J. and Roger A.J., 2002. Retortamonad Flagellates are Closely Related to Diplomonads - Implications for the History of Mitochondrial Function in Eukaryote Evolution. Mol. Biol. Evol. 19, 777-786

Simpson A.G.B. and Patterson D.J., 1999. The Ultrastructure of Carpediemonas membranifera (Eukaryota) with Reference to the "Excavate Hypothesis". Eur. J. Protistol. 35, 353-370

Simpson A.G.B., Roger A.J., Silberman J.D., Leipe D.D., Edgcomb V.P., Jermiin L.S., Patterson D.J., Sogin M.L., 2002a. Evolutionary History of "Early-Diverging" Eukaryotes: The Excavate Taxon Carpediemonas is a Close Relative of Giardia . Mol. Biol. Evol. 19, 1782-1791

Simpson A.G.B., Radek R.,Dacks J.B. and O’Kelly C.J., 2002b. How Oxymonads Lost Their Groove: An Ultrastructural Comparison of Monocercomonoides and Excavate Taxa. J. Eukaryot. Microbiol. 49, 239-248

Simpson A.G.B., 2003. Cytoskeletal organization, phylogenetic affinities and systematics in the contentious taxon Excavata (Eukaryota). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53, 1759-1777

Simpson A.G.B. and Roger A.J., 2004. Excavata and the Origin of Amitochondriate Eukaryotes. In Hirt R.P and Horner D.S. (ed.): Organelles, Genomes and Eukaryote Phylogeny, 27-45. CRC Press, London

Simpson A.G.B., Inagaki Y., Roger A.J., 2006. Multigene Phylogenies of Excavate Protists Reveal the Evolutionary Positions of "Primitive" Eukaryotes. Mol. Biol. Evol. 23, 615-625

Sogayar M.I. and Gregório E.A., 1998. Giardia agilis : Ultrastructure of the Trofozoites in the Frog Intestine. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 93, 357-361

69 Sogin M.L., 1989. Evolution of Eukaryotic Microorganisms and their Small Subunit Ribosomal RNAs. Am. Zool. 29, 487-499

Stabler R.M., 1944. A New Species of Retortamonas (Protozoa) from the Common Mole Cricket, Gryllotalpa hexadactyla . J. Parasitol. 30, 173-176

Sterud E., Mo T.A. and Poppe T.T., 1997. Ultrastructure of Spironucleus barkhanus n.sp. (Diplomonadida: Hexamitidae) from Grayling Thymallus thymallus (L.) (Salmonidae) and Atlantic Salmon Salmo salar L. (Salmonidae). J. Eukaryot. Microbiol. 44, 399-407

Sterud E., 1998. Electron Microscopical Identification of the Flagellate Spironucleus torosa (Hexamitidae) from Burbot Lota lota (Gadidae) with Comments upon its Probable Introduction to This Freshwater Host. J. Parasitol. 84, 947-953

Tachezy J., Sánchez L.B. and Müller M., 2001. Mitochondrial Type Iron-Sulfur Cluster Assembly in the Amitochondriate Eukaryotes Trichomonas vaginalis and Giardia intestinalis , as Indicated by the Phylogeny of IscS. Mol. Biol. Evol. 18, 1919-1928

Tovar J., Fischer A. and Clark C.G., 1999. The Mitosome, a Novel Organelle Related to Mitochondria in the Amitochondrial Parasite Entamoeba histolytica . Mol. Microbiol. 32, 1013-1021

Tovar J., León-Avila G., Sánchez L.B., Sutak R., Tachezy J., van der Giezen M., Hernández M., Müller M. and Lucocq J.M., 2003. Mitochondrial Remnant Organelles of Giardia Function in Iron-Sulphur Protein Maturation. Nature 426, 172-176

Travis B.V. and Becker E.R., 1931. A Preliminary Report on Intestinal Protozoa of White Grubs (Phyllophaga spp., Coleoptera). Iowa State Coll. J. Sci. 5, 223-235

Weerakoon N.D., Harper J.D.I., Simpson A.G.B. and Patterson D.J., 1999. Centrin in the Groove: Immunolocalisation of Centrin and Microtubules in the Putatively Primitive Protist Chilomastix cuspidata (Retortamonadida). Protoplasma 210, 75-84

Wenrich D.H., 1932. The Relation of the Protozoan Flagellate, Retortamonas gryllotalpae (Grassi, 1879) Stiles, 1909 to the Species of the Genus Embadomonas Mackinnon, 1911. Trans. Am. Micr. Soc. 51, 225-238

70 Yubuki N., Inagaki Y., Nakayama T., Inouye I., 2007. Ultrastructure and Ribosomal RNA Phylogeny of the Free-Living Heterotrophic Flagellate Dysnectes brevis n. gen., n. sp., a New Member of the Fornicata. J. Eukaryot. Microbiol. 54, 191-200

Zaman V., Howe J., Ng M. and Goh T.K., 2000. Scanning Electron Microscopy of Chilomastix mesnili (Wenyon 1910) Alexieieff, 1912. Parasitol. Res. 86, 327-329

71 10. SEZNAM ZKRATEK

AMP – ampicilin BS – bootstrap BSA – hov ězí sérový albumin (bovine serum albumin) DMSO – dimethyl sulfoxid dNTP – deoxyribonukleotidy GTR + Γ + I – general time reversible model s gama korekcí a s invariantami (model nukleotidové substituce) IPTG – isopropyl-β-D-1-thiogalaktopyranosid LB médium – „lysogeny broth“ médium MAFFT – „multiple sequence alignment based on fast Fourier transform“ PP – bayesovská posteriorní pravd ěpodobnost rpm – „rotates per minute“, otá čky za minutu SSU rRNA – RNA malé podjednotky ribosomu TYSGM – trypton-yeast extract-salt-gastric mucin médium X-gal – bromo-chloro-indolyl-galaktopyranosid

72