Associação Dos Polimorfismos Do Tipo Indel Com O Risco De Câncer Colorretal Na População Do Rio Grande Do Norte

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DIEGO MARQUES DA COSTA SANTOS

ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DO TIPO INDEL COM O RISCO DE CÂNCER COLORRETAL NA POPULAÇÃO DO RIO GRANDE DO NORTE.

NATAL – RIO GRANDE DO NORTE AGOSTO – 2016

DIEGO MARQUES DA COSTA SANTOS

ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DO TIPO INDEL COM O RISCO DE CÂNCER COLORRETAL NA POPULAÇÃO DO RIO GRANDE DO NORTE.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêutica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêutica.

ORIENTADORA: PROFa DRa VIVIAN NOGUEIRA SILBIGER.

NATAL – RIO GRANDE DO NORTE AGOSTO – 2016

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Santos, Diego Marques da Costa. Associação dos polimorfismos do tipo INDEL com o risco de Câncer Colorretal na população do Rio Grande do Norte / Diego Marques da Costa Santos. - Natal, 2016. 120f.: il.

Orientador: Profª. Drª. Vivian Nogueira Silbiger. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Potencial biomarcardor de risco - Dissertação. 2. Câncer colorretal - Dissertação. 3. INDEL - Dissertação. I. Silbiger, Vivian Nogueira. II. Título.

RN/UF/BSCCS CDU 616.348-006

INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES E FINANCIADORAS

Instituições Participantes:

1. Laboratório de Bioanálise e Biotecnologia Molecular – Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte;

2. Laboratório de Genética Humana e Médica – Instituto de Ciências Biológicas, Universidade do Pará;

3. Departamento de Cirurgia Oncológica – Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, Natal, Rio Grande do Norte;

4. Laboratório de Patologia e Citopatologia – Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, Natal, Rio Grande do Norte.

Instituições Financiadoras:

1. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Editais: 481652/2012-4; e 483031/2013-5) – apoio financeiro à pesquisa;

2. Rede de Pesquisa em Genômica Populacional Humana (Biocomputacional/CAPES, Edital nº 051/2013) – bolsa concedida;

3. Rede de Pesquisa em Genômica Populacional Humana (CAPES-Proamazonia, Edital: 3288/2013) – apoio financeiro à pesquisa;

4. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Pará (ICAAF/FAPESPA, Edital: 155/2014) – apoio financeiro à pesquisa;

5. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte (FAPERN, Edital: 005/2011) – apoio financeiro à pesquisa.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho para a minha família, amigos, e a todos os indivíduos que participaram deste estudo de forma direta ou indireta, possibilitando a construção do conhecimento na população brasileira. Dedico também a todos os indivíduos que poderão se beneficiar com este trabalho, pois eles são o principal estímulo para o desenvolvimento da pesquisa científica.

AGRADECIMENTOS

Este espaço é dedicado àqueles que, de alguma forma, contribuíram para que esta dissertação fosse realizada. Não sendo viável nomeá‐los a todos, há, no entanto, alguns a quem não posso deixar de manifestar o meu apreço e agradecimento sincero.

Inicialmente, eu agradeço à minha família. Sem o apoio deles para que eu seguisse os meus sonhos; o suporte emocional para que eu não desistisse no meio deste processo; e o companheirismo nos momentos de conquistas e frustação eu não teria conseguido finalizar este projeto. Incluo nesta lista o Mateus (Teteu). Ele ainda nem nasceu, mas o titio sentiu o apoio dele.

Ao exemplo de força e perseverança presente na minha família, a minha mãe e as minhas avós. Guerreiras que conseguiram superar diversos obstáculos, mostrando que nunca se deve abaixar a cabeça para um “não” que a vida dá.

Aos meus amigos, Madson Miguel, Letícia Costa, Rhadamés Menezes, Iaponira Barbosa, Maria Isabel e as irmãs Lorenna e Layse Ferreira-Costa. Eles foram como uma parte estendida da minha família, dando apoio e suportando as minhas chatices durante todos os anos que nos conhecemos. E mesmo distante, devido a escolhas nas nossas vidas, eu sempre senti que podia contar com eles para compartilhar os momentos tristes e felizes.

Ao meu namorado (Pierre Almeida), ouvinte atento de algumas dúvidas, inquietações, desânimos e sucessos. Bem como pelo apoio, pela confiança, pela compreensão, pela valorização, pelo amor e pela solidariedade. Sempre tão entusiasta do meu trabalho, dando coragem para ultrapassar a culpa pelo tempo que a cada dia tirava.

Aos professores que deram todo o suporte e ensinamentos. A lista de professores se estende aos que conheci durante o período que cursei a minha graduação em Farmácia (UFRN) e a minha pós-graduação. Incluo nela aos professores que conheci durante o colégio. Entretanto, eu delimitarei aos professores que abriram espaços para mim na pesquisa.

Ao Prof. Cícero Aragão (UFRN), que me ensinou a importância de ter procedimentos padronizados dentro do laboratório.

À Profa. Janaina Crispim (UFRN), pois me mostrou o quão interessante é estudar o câncer e da importância de se estudar o sistema imunológico.

À Profa. Vivian Silbiger e ao Prof. André Luchessi (UFRN), que me mostraram a beleza que a biologia molecular traz para o entendimento das enfermidades e de como podemos aplicar o conhecimento para melhorar o diagnóstico e prognóstico. Eles me acolheram como aluno de iniciação científica em 2011, e desde então proporcionaram diversos tipos de conselhos, conhecimentos e experiências.

À relação que tive com estes dois grandes professores, que são meus pais de pesquisa. E por incrível que parece, eu até puxei algumas características deles, como por exemplo, a inquietação; a vontade de compartilhar o que aprendeu de novo e o vício pelo trabalho. Entretanto, apesar de ser uma relação longa, não foi cheia de flores. Assim como uma relação de pais e filhos, tivemos nossos momentos de desentendimentos, mas no final, acabamos entendendo o ponto de vista um do outro, e aprendemos mais um pouco.

À Profa. Ândrea Ribeiro-dos-Santos e ao Prof. Sidney Santos (UFPA), pois concederam todo o apoio financeiro para o estudo e me acolheram no seu laboratório para aprimorar meu conhecimento.

Aos profissionais da Liga Contra o Câncer, em particular ao Dr. Romualdo Correa, à Dra. Aline Borges, à Dra. Fernanda Ito e ao Dr. Carlos Ramos, pelo suporte na seleção dos pacientes.

Aos colegas do Laboratório de Bioanálise e Biotecnologia Molecular (LBBM/UFRN) e do Laboratório Multiusuário (LabMult/UFRN), em particular ao pós-doutorando Raul Bortolin. Graças a sua dedicação, paciência e conselhos, eu pude escrever este trabalho.

Eu não poderia deixar de mencionar as irmãs Lorenna e Layse Ferreira-Costa (LBBM/UFRN), as alunas de iniciação científica que me acompanharam durante diversas etapas. Juntos, trocamos conhecimentos, risadas, leseiras e frustrações. Quem mais, se não elas duas, para me aturar? Até quando eu perguntava “Vamos trabalhar nos finais de semanas e feriados para cumprir os prazos?”, elas estavam comigo.

Aos colegas do Mestrado em Ciência Farmacêutica 2014/2016, com quem vivi um ambiente de verdadeira aprendizagem colaborativa. Às pessoas que me acolheram na minha ida ao Pará, incluindo as pessoas do Laboratório de Genética Humana e Médica (LGHM/UFPA), Núcleo de Pesquisa Oncológica (NPO/UFPA), do grupo de oração chamado de “Nano” e as pessoas que conheci durante as disciplinas e fora do ambiente universitário. O acolhimento que eles me forneceram foi essencial para conseguir

passar seis meses do meu mestrado longe da minha família (principalmente da minha sobrinha, Princesa Sophia) e dos meus amigos.

Aos alunos de iniciação científica do LGHM, Rebbeca Laís, Lucas Cauê e Cíntia Helena. Eles me aturaram mais do que qualquer outra pessoa na UFPA, trabalhando junto comigo até no período de férias. Isso sem mencionar as risadas compartilhadas.

E por fim, mas não menos importante, a Deus. Pois Ele tornou tudo possível. Agradeço a Deus por ter possibilitado que uma pessoa extremamente especial tenha entrado na minha vida durante a graduação, mas que foi descansar junto d’Ele recentemente. O seu nome é Ana Celly. Ela foi uma das pessoas que olhou para mim e disse: “Criatura, vá fazer esse mestrado de uma vez! Segue o seu sonho.”. Por todas as pessoas que conheci. Pois cada pessoa que entrou na minha vida, mesmo que não tenha permanecido, contribuiu de alguma forma para eu ser quem eu sou. E sem sombra de dúvidas, eu irei carregar um pedaço de cada uma das pessoas que cruzaram na minha vida para toda a eternidade. Também sou grato pelas experiências que vivi e até mesmo pelas decepções que tive, pois estou aprendendo com todas as experiências de vida.

“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos”.

(Isaac Newton)

RESUMO

O câncer colorretal (CCR) é um tipo de câncer que acomete a região do intestino grosso e reto; sendo o terceiro câncer mais comum em homens e o segundo em mulheres no mundo. A maior parte da susceptibilidade ao CCR é proveniente de variantes genéticas múltiplas, cada uma com um efeito individual que, quando combinada, causa a diversidade de risco para o desenvolvimento desse câncer. Dentre os tipos de mutações encontrados no genoma humano, as inserções e deleções (INDEL) são a segunda classe mais comum; e o entendimento deste tipo de mutação possui um potencial de impactar na expressão, na estrutura e até mesmo função da proteína. Entretanto, sabe-se relativamente pouco sobre o impacto das INDEL no risco de CCR, especialmente na população miscigenada do Brasil. Dessa forma o objetivo deste trabalho é realizar um estudo do tipo caso-controle para determinar a associação de 16 INDEL com a susceptibilidade ao CCR na população do Rio Grande do Norte. Além disso, foi também avaliado a distribuição relativa da ancestralidade entre o grupo caso e controle. Os polimorfismos e os marcadores utilizado para a distribuição da ancestralidade foram genotipados utilizando ABI PRISM 3130 e o GeneMapper ID v3.2. A análise estatística foi realizada utilizando o R v 3.1. Em relação à ancestralidade genômica, foi observada diferença significativa na distribuição da contribuição Africana entre os grupos. Em relação à análise de associação entre o polimorfismo e o risco de desenvolver CCR, foi observado que o alelo D do polimorfismo estudado no gene IL4, e o alelo I do polimorfismo do TYMS foram associados com o aumento do risco de desenvolver CCR. No presente trabalho, também foi avaliado o risco que a combinação genotípica do TYMS (rs151264360) e do IL4 (rs79071878) aumenta consideravelmente o risco de ter CCR; e foi observado que se faz necessário a presença de pelo menos 3 alelos de risco para conferir risco de ter CCR.

Palavras-chave: Potencial biomarcardor de risco; Câncer colorretal; INDEL.

ABSTRACT

Colorectal cancer (CRC) is a type of cancer that affects large intestine and rectum region, and this is the third most common cancer worldwide in men and the second in women. The genetic susceptibility to CRC comes from multiple genetic variants. Individually, these genetic variants have modest effect. However, theses variants, when combined, cause a wide range of risk. Among all mutations types found in the human genome, insertion-deletions (INDEL) are the second most common class, which has a potential impact on the expression, structure and protein function. However, there are a few studies about INDEL impact on CRC risk. Thus the aim of this study is to evaluate the association of 16 INDEL with CRC susceptibility in Rio Grande do Norte population. Furthermore, it was also evaluated the relative ancestry distribution between case and control groups. Polymorphism and marker used for ancestry distribution were genotyped using ABI PRISM 3130 and GeneMapper ID v 3.2. Statistical analysis was performed using the R v 3.1. Regarding the genetic ancestry, there was significant difference in the distribution of the African contribution between groups. Regarding the polymorphism association in CRC risk, it was observed that the D allele of IL4 and I allele of TYMS polymorphisms were associated with increased CRC risk. In this study, it was also evaluated the combined effect of IL4 and TYMS polymorphism in CRC risk, and it was observed that at least 3 allelic risks were necessary to confer CRC risk.

Keywords: Potential biomarkers of susceptibility; Colorectal cancer; INDEL.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 1

1.1. ASPECTOS GERAIS ...... 1 1.2. EPIDEMIOLOGIA ...... 1 1.3. CLASSIFICAÇÃO ...... 2 1.3.1. Anatomia do cólon e reto ...... 2 1.3.2. Macroscopia do processo neoplásico ...... 3 1.3.3. Microscopia do câncer colorretal ...... 4 1.3.4. Tipo celular do câncer colorretal ...... 4 1.3.5. Grau de diferenciação das células tumorais...... 5 1.3.6. Sistema de Estadiamento TNM do câncer colorretal ...... 6 1.4. FATORES DE RISCO ASSOCIADOS COM O CÂNCER COLORRETAL ...... 9 1.4.1. Tabagismo ...... 9 1.4.2. Etilismo...... 9 1.4.3. Sedentarismo ...... 10 1.4.4. Sobrepeso ou obesidade ...... 10 1.4.5. Hábitos Alimentares ...... 11 1.4.6. Gênero ...... 12 1.4.7. Idade ...... 13 1.4.8. Histórico pessoal de pólipo e doença inflamatória no intestino ...... 13 1.4.9. Histórico familiar de pólipos e câncer colorretal ...... 14 1.4.10. Contribuição étnica ...... 15 1.5. GENES CANDIDATOS...... 16 1.5.1. UCP2 ...... 17 1.5.2. ACE ...... 17 1.5.3. CASP8 ...... 18 1.5.4. XRCC1 ...... 19 1.5.5. TYMS ...... 19 1.5.6. SGSM3 ...... 20 1.5.7. HLAG ...... 20 1.5.8. IL1A ...... 21 1.5.9. IL4 ...... 22 1.5.10. NFKB1 ...... 23 1.5.11 MDM2 ...... 23 1.5.12. TP53 ...... 24 1.5.13. CYP2E1 ...... 25 1.5.14. CYP19A1 ...... 25 1.5.15. UGT1A1 ...... 26 1.6. VARIAÇÕES GENÉTICAS DO TIPO INSERÇÃO-DELEÇÃO ...... 26 2. OBJETIVOS ...... 30

2.1. OBJETIVO PRINCIPAL ...... 30 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 30 3. METODOLOGIA...... 31

3.1. COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ...... 31 3.2. CASUÍSTICA ...... 31 3.3. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO...... 31 3.4. COLETAS DAS AMOSTRAS ...... 31 3.5. EXTRAÇÃO DE DNA ...... 32 3.6. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO DNA EXTRAÍDO ...... 32 3.7. VARIÁVEIS COLETADAS ...... 32 3.8. GENOTIPAGEM DOS POLIMORFISMOS ...... 33 3.9. ANÁLISE DA ANCESTRALIDADE RELATIVA POR MARCADORES AUTOSSÔMICOS ...... 35 3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA ...... 36 4. RESULTADOS ...... 37

4.1. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS E CLÍNICAS ...... 37 4.2. CONTRIBUIÇÃO DA ANCESTRALIDADE RELATIVA POR MARCADORES AUTOSSÔMICOS ..... 38 4.3. FREQUÊNCIA GENÉTICA E ALÉLICA ...... 40 4.4. ANÁLISE DE ASSOCIAÇÃO POLIMÓRFICA ...... 41 4.5. ANÁLISE COMBINADA DO GENÓTIPO DOS GENES IL4 E TYMS ...... 44 5. DISCUSSÃO ...... 45 6. CONCLUSÃO...... 52 REFERÊNCIAS ...... 53 ANEXO ...... I

ANEXO A – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA ...... II APÊNDICE ...... IV

APÊNDICE A – QUESTIONÁRIO ...... V APÊNDICE B – FICHA DE DADOS CLÍNICOS ...... VIII APÊNDICE C – RESUMOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS ...... IX APÊNDICE D – MANUSCRITO DO ARTIGO PRODUZIDO DURANTE O MESTRADO ...... X

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aspectos gerais

O câncer é caracterizado como o crescimento celular descontrolado em relação a uma célula normal, resultado do acúmulo de mutações genéticas; podendo ser iniciado em qualquer órgão do corpo (ACS, 2016). No que se refere ao Câncer Colorretal (CCR), o órgão acometido é o intestino grosso, no segmento do ceco até o reto. Essa enfermidade é a terceira neoplasia mais prevalente no mundo e a quarta no Brasil (FERLAY et al., 2015), podendo ter um bom prognóstico quando diagnosticado precocemente. Contudo, a maior problemática deste tipo de tumor é o diagnóstico tardio, no qual o paciente é diagnosticado em estágios mais avançado da doença, resultando no pior prognóstico e, portanto, em uma menor sobrevida (MENEZES; OLIVEIRA; LUNDGREN, 2012). Diversos fatores ambientais e genéticos estão fortemente associados com o processo de carcinogênese (LIU et al., 2014; ZARIDZE, 2008). Estes fatores são amplos, variam de acordo com o tipo de câncer, com a região geográfica (GOMEZ et al., 2015) e interagem entre si. Entretanto, a susceptibilidade herdada é um componente importante de predisposição do CCR, sendo atribuído um risco estimado de 12% a 35% (CZENE; LICHTENSTEIN; HEMMINKI, 2002; LICHTENSTEIN et al., 2000; PETERS; BIEN; ZUBAIR, 2015). Por se tratar de uma enfermidade com base genética, a susceptibilidade ao CCR, assim como as outras neoplasias, tem sido influenciada pela frequência das mutações herdadas no genoma, variando entre diferentes populações. Diante disso, torna-se importante analisar as características genéticas da população de Natal para avaliar a susceptibilidade ao CCR, uma vez que essa população tem influências de diversos grupos populacionais.

1.2. Epidemiologia

No mundo, estima-se a incidência de 1,4 milhões de pessoas diagnosticadas com CCR em 2015 e a mortalidade de 750 mil (FERLAY et al., 2015). E estima-se para o ano de 2020, um aumento de 13,6% na incidência e 8,5% na mortalidade (FERLAY et al., 2015). O Brasil é o décimo país a ter o maior número de incidência de CCR no mundo (FERLAY et al., 2015), com uma estimativa de 34 mil pessoas diagnosticadas durante o ano de 2015 e mortalidade de 17 mil indivíduos (FERLAY et al., 2015). Além disso, estima-se

1 para o ano de 2020 um aumento de 28,6% na incidência e 29,7% mortalidade (FERLAY et al., 2015). Mundialmente, o CCR é o terceiro câncer mais prevalente entre o gênero masculino e o segundo no gênero feminino (FERLAY et al., 2015). No Brasil a razão de incidência entre mulheres e homens é de 1,2 (INCA, 2016), significando que o número de mulheres acometidas por este processo neoplásico é 20% maior do que em homens.

1.3. Classificação

A classificação elucida as relações entre a clínica e o desenvolvimento patológico do CCR, que é o ponto em que se inicia a investigação da causa, a evolução e o histórico natural da doença (JASS, 2007). No câncer, a classificação tem sido tradicionalmente baseada na morfologia microscópica e complementada através da imunofenotipagem, para os casos mais complexos (JASS, 2007). No CCR, a conduta clínica e as pesquisas têm prosseguido por muitas décadas no conceito que esta enfermidade assumia uma condição homogênea no seu desenvolvimento, sendo majoritariamente originado devido à progressão do adenoma (JASS, 2007). Contudo, subtipos morfologicamente particulares têm sido reconhecidos e caracterizados por mostrarem diferenças de acordo com o sítio anatômico (IACOPETTA, 2002).

1.3.1. Anatomia do cólon e reto

O cólon, também conhecido como intestino grosso, é anatomicamente dividido em cinco regiões: o cólon direito (ceco e ascendente), o cólon médio (transverso), o cólon esquerdo (descendente), o cólon sigmoide e o reto (Figura 01). O CCR pode ser chamado câncer de cólon ou câncer retal, dependendo da região do intestino grosso onde se origina. A diferença entre o câncer de cólon ou o retal está na localização anatômica e na necessidade de um tratamento diferenciado entre eles. Entretanto, como a biologia tumoral deles é a mesma, eles são muitas vezes agrupados como CCR.

Figura 01 – Representação ilustrativa do Intestino Grosso, região acometida pelo Câncer Colorretal, e suas segmentações: C – Ceco; A – Cólon Ascendente; T – Cólon Transverso; D – Cólon Descentente; S – Cólon Sigmóide; R – Reto. Fonte: Elaborado pelo autor.

1.3.2. Macroscopia do processo neoplásico

A maioria dos CCR inicia-se com a formação de uma projeção do tecido no lúmen do intestino grosso (pólipo), podendo passar por um processo de diferenciação para a formação de uma massa cancerosa (Figura 02).

Figura 02 – Representação ilustrativa das etapas macroscópicas do processo de carcinogênese do Câncer Colorretal. Fonte: Johns Hopkins Digestive Disorders Library. Traduzido para o Português. Data de acesso: 14 de maio de 2016.

Os pólipos possuem um crescimento benigno, mas dependendo do tipo de pólipo o processo de carcinogênese pode ser iniciado ou não. Os pólipos pré-cancerosos são compostos principalmente por pólipo adenomatoso, séssil e displásico; e os pólipos não pré-cancerosos são principalmente compostos por pólipos hiperplásicos e os inflamatórios. Contudo, apesar dos pólipos não pré-cancerosos usualmente não se desenvolverem em câncer, os pólipos maiores do que 1 cm tem um maior risco de tornar-se câncer (LIEBERMAN et al., 2012).

O pólipo adenomatoso dá origem ao tipo de lesão mais frequente no CCR que é o adenocarcinoma (90% dos casos). Convencionalmente, o adenocarcinoma é caracterizado com uma morfologia de característica glandular, que é a sua base histológica (FLEMING et al., 2012).

1.3.3. Microscopia do câncer colorretal

O cólon é composto por várias camadas histológicas, que se inicia na mucosa e vai até a serosa (Figura 03). A característica que define um adenocarcinoma no CCR é a invasão da célula neoplásica através das camadas musculares da mucosa para a submucosa.

Figura 03 – Ilustração representativa das camadas histológicas do intestino grosso. Fonte: Comitê Americano de Câncer (AJCC). As lesões com as características morfológicas do adenocarcinoma que estão confinados ao epitélio ou invadem a lâmina, carecem de invasão da musculatura da mucosa para a submucosa, apresentando praticamente nenhum risco de metástase (BOSMAN; WHO; IARC, 2010).

1.3.4. Tipo celular do câncer colorretal

Os tipos histológicos de tumores cometidos no cólon e no reto são genericamente classificados como tumor epitelial, não epitelial e os tumores secundários. Os tumores epiteliais podem ser adenomas, neoplasia intraepitelial (displasia) associado com doença inflamatória crônica, carcinomas, carcinoides, mistura de carcinoide-adenocarcinoma e outros tipos. Os adenocarcinomas representam cerca de 95% dos casos de CCR, que se iniciam em células glandulares produtoras de muco do epitélio do colón e do reto a partir de pólipos

4 adenomatosos e possuem três variantes histológicas neste tipo de tumor: tubular, tubuloviloso e viloso. Os adenomas tubulares representam entre 75% a 85% dos pólipos adenomatosos e têm < 5% de chance de se diferenciar a um processo maligno. Os adenomas túbulo-viloso representam 10% a 15% dos pólipos e, geralmente, 20% a 25% dos casos podem vir a desenvolver um processo maligno. Os adenomas vilosos consistem 5% a 10% dos casos de pólipos e cerca de 35% a 40% podem vir a se diferenciar em um processo maligno (AMERSI; AGUSTIN; KO, 2005). Os outros tipos celulares que são menos comuns, mas que também cometem a região colorretal, são: tumor carcinóide, tumor no estroma gastrointestinal, linfomas e sarcomas. Os tumores carcinóides iniciam-se a partir de células especializadas marcadas com hormônios no intestino. Os tumores no estroma gastrointestinal têm como precursores as células especializadas na parede do cólon, chamadas de células intersticiais de Cajal, e podem ser encontradas em qualquer região topográfica do trato gastrointestinal, mas é usualmente localizada no cólon. Os linfomas são câncer das células do sistema imunológico que se originam tipicamente nos nódulos linfonoidais, mas podem também iniciar no cólon, reto ou em outros órgãos. Os sarcomas podem iniciar nos vasos sanguíneos, na camada muscular ou outros tecidos de conexão com a parede do cólon e do reto (ACS, 2016).

1.3.5. Grau de diferenciação das células tumorais

Outro fator que pode afetar o tratamento e perspectiva do paciente com CCR é o grau de diferenciação do câncer. No geral, a diferenciação histológica do CCR é bastante sugestiva e existe um vasto sistema de diferenciação sugerido pela literatura. Entre os esquemas sugeridos, o número de estratificações e os critérios adotados para distinguir são significativamente variados. Em alguns sistemas, o grau de diferenciação é descrito como o quão próximo uma célula cancerosa aparenta com uma célula normal do tecido, quando observado por microscopia (GOLDSTEIN; HART, 1999). Apesar da complexidade dos critérios de estratificação, o sistema mais adotado é dividido em quatro graus de diferenciação (do inglês, four-tiered): G1 – Bem diferenciado; G2 – Moderadamente diferenciado; G3 – Mau diferenciado; e G4 – Indiferenciado (BOSMAN; WHO; IARC, 2010; COMPTON, 2003).

Por uma grande parte, o diagnóstico patológico entre o G3 e o G4 são relativamente consistentes e associados com pouca variabilidade. Entretanto, a distinção entre G1 e G2 é menos reprodutível. A subjetividade e imprecisão na classificação do grau de diferenciação é resultado da heterogeneidade dos tumores (ACS, 2016; BOSMAN; WHO; IARC, 2010; COMPTON, 2003). Desta forma, o sistema de classificação que divide em dois graus de diferenciação (do inglês, two-tiered) elimina esta dificuldade para tornar o diagnóstico mais consistente. Este sistema é classificado como: Baixo grau – G1 e G2; e Alto grau – G3 e G4 (ACS, 2016; BOSMAN; WHO; IARC, 2010; COMPTON, 2003). O câncer com baixo grau de diferenciação tende a crescer e invadir mais lentamente do que os cânceres com alto grau de diferenciação. Na maior parte das vezes, a perspectiva é melhor para câncer com baixo grau do que para o de alto grau no mesmo estágio. Além disso, o uso do grau de diferenciação ajuda a decidir se o paciente deve receber um tratamento adjuvante com a quimioterapia depois da cirurgia (ACS, 2016).

1.3.6. Sistema de Estadiamento TNM do câncer colorretal

Em 1932, o patologista britânico Cuthber Dukes (1890 – 1977) estabeleceu o sistema de classificação para o CCR e diversas modificações surgiram dele, como o proposto por Astler e Coller em 1954. Entretanto, na prática clínica, esse tem sido amplamente substituído por um sistema de estadiamento mais detalhado, a Classificação de Tumores Maligno por TNM (do inglês, TNM Classification of Malignant Tumours), descrito pelo Comitê Americano de Articulação no Câncer (AJCC, do inglês American Joint Committee on Cancer). O sistema TNM é baseado em 3 principais características: quão profundo o tumor primário tem crescido para o interior da parede do intestino e se tem crescido para áreas próximas (T); se o câncer tem invadido uma região linfonoidal próxima (N); e se o câncer tem sofrido metástase para outro órgão do corpo (M). Ver tabela 1.

Tabela 1 – Definição das características do Sistema TNM estratificada, de acordo com a sétima edição do AJCC. Tumor primário (T) Tx – Não teve acesso ao tumor primário T0 – Sem evidências do tumor primário Tis – Carcinoma in situ: intraepitelial ou invasão da lâmina própria T1 – Tumor invade a submucosa T2 – Tumor invade a muscular própria T3 – Tumor invade através da muscular própria até o tecido pericolorretal T4a – Tumor penetra até a superfície do peritônio visceral T4b – Tumor está invadindo ou aderido diretamente a outro órgão ou estrutura Linfonodos Regionais (N) Nx – Não teve acesso a região linfonóidal N0 – Sem evidências de metástase nos linfonodos regionais N1 – Metástases em 1 a 3 linfonodos regionais N1a – Metástase em 1 linfonodo regional N1b – Metástase em 2 a 3 linfonodos regionais N1c – Tumor depositado na subserosa, mesentério ou tecido pericólico não peritonizado ou tecido perirretal sem metástase nos linfonodos regionais N2 – Metástases em 4 ou mais linfonodos regionais N2a – Metástases em 4 a 6 linfonodos regionais N2b – Metástases em 7 ou mais linfonodos regionais Metástase Distante (M) M0 – Sem metástases distantes M1 – Metástases distantes M1a – Metástases confinado em 1 órgão ou sítio M1b – Metástases em mais do que 1 órgão, sítio ou no peritônio.

O número ou letra depois do T, N e M fornece maiores detalhes sobre cada um destes fatores. Ademais, este número remete ao estágio do câncer e quanto maior, mais avançado. A categorização do TNM tem sido determinada usualmente após o procedimento cirúrgico, e essa informação pode ser combinada por estádios (Tabela 2).

Tabela 2 – Classificação do estádio do câncer colorretal de acordo com a sétima edição da AJCC. Estádio T N M Dukes* MAC**

0 Tis N0 M0 – –

I T1 N0 M0 A A

T2 N0 M0 A B1

IIA T3 N0 M0 B B2

IIB T4a N0 M0 B B2

IIC T4b N0 M0 B B3

IIIA T1-T2 N1/N1c M0 C C1

T1 N2a M0 C C1

IIIB T3-T4a N1/N1c M0 C C2

T2-T3 N2a M0 C C1/C2

T1-T2 N2b M0 C C1

IIIC T4a N2a M0 C C2

T3-T4a N2b M0 C C2

T4b N1-N2 M0 C C3

IVA Qualquer T Qualquer N M1a – –

IVB Qualquer T Qualquer N M1b – –

Nota: cTNM é uma classificação clínica, pTNM é uma classificação patológica. O prefixo y- é usado para os cânceres que são classificados após um pré-tratamento neoadjuvante (por exemplo, ypTNM). Patientes que tem uma resposta patológica completa são ypT0N0cM0, que pode ser similar ao Estágio 0 ou 1. O prefixo r- é usado para aqueles cânceres que tiveram recidiva após um intervalo livre da doença (por exemplo, rTNM). * Sistema de Estadiamento de Dukes. ** Sistema de Estadiamento de Dukes modificado por Astler-Coller.

1.4. Fatores de risco associados com o câncer colorretal

Diferentes cânceres têm diferentes fatores de risco. No contexto geral, existem dois tipos de fatores de risco, os comportamentais (estilo de vida) e os não comportamentais (idade, gênero, histórico pessoal ou histórico familiar). Além disso, a interação gene-gene e gene-fatores ambientais possuem uma influência significativa para a susceptibilidade do CCR.

1.4.1. Tabagismo

Estudos têm mostrado que o tabagismo aumenta o risco de adenomas colônicos e de CCR (JACOBSON et al., 1994). O principal agente carcinogênico encontrado na fumaça do cigarro são as aminas aromáticas, nitrosaminas, aminas heterocíclicas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (DURKO; MALECKA-PANAS, 2014). Essas substâncias são metabolizadas pelo citocromo P450, podendo levar a mutações no DNA, principalmente nos genes KRAS, BRAF e MYC (LEUFKENS et al., 2011). As nitrosaminas têm a habilidade de ativar e ligar-se aos receptores nicotínicos de acetilcolina, que resultam no aumento intracelular da concentração de espécies reativas de oxigênio. O estresse oxidativo leva a ativação da via inflamatória do NFKB e COX-2 e também promove a sinalização da cascata proliferativa pela via MAPK (YE et al., 2004). Não existem dúvidas de que evitar o tabagismo diminui o risco de CCR e de outras neoplasias, além também de prevenir o desenvolvimento de doenças (DURKO; MALECKA- PANAS, 2014).

1.4.2. Etilismo

O risco de adenomas e CCR também estão associados com o consumo de bebida alcoólica. Cho e colaboradores (2004) observaram que o consumo superior a 30 g/dia de etanol resulta em um risco de 1,16 vezes de desenvolver CCR, enquanto que o consumo superior a 45 g/dia de etanol aumenta o risco para 1,41 vezes. Em estudo in vitro, realizado por Blasiak e colaboradores (2000), foi observado que os danos causados no DNA pelos metabólitos do álcool aumentam com o aumento da dose. Esses dados são explicados pelo metabolismo do álcool, o qual é baseado principalmente na catálise e oxidação pelo álcool desidrogenase, catalase e citocromo P450, resultando na formação do acetaldeído, que é um carcinógeno de primeira classe e é o responsável por ocasionar dano no cromossomo (HAAS; YE; LÖHR, 2012).

Além disso, o consumo de álcool em longo prazo diminui a absorção de vitaminas do complexo B (B1, B2,B12 e ácido fólico), o que causa o aumento da vulnerabilidade celular ao estresse oxidativo (HAAS; YE; LÖHR, 2012). Esse aumento da concentração de espécies reativas de oxigênio induz a cascata do NADPH oxidase, levando a ativação da via do PI3K/AKT e do VEGF, que são responsáveis por promover a proliferação e metástase (JACOBSON et al., 1994). O álcool também inibe a expressão da enzima citocromo P450 2E1, que está envolvida na síntese da vitamina A; e a baixa concentração desta vitamina resulta na diminuição da expressão da proteína ativadora 1 - um fator de transcrição que controla a diferenciação e proliferação celular (HAAS; YE; LÖHR, 2012). Pelos motivos expostos, recomenda-se uma redução no consumo de bebidas alcoólicas, para reduzir o risco de desenvolvimento do CCR.

1.4.3. Sedentarismo

Muitas doenças crônicas, incluindo as cardiovasculares, pulmonares, doenças musculoesqueléticas, diabetes tipo 2 e vários tipos de cânceres estão associados com uma atividade física insuficiente (KUMOR et al., 2009). O mecanismo chave que explica sua função no risco foca na diminuição da sensibilidade a insulina, no aumento da concentração sérica de insulina, no aumento da massa corpórea e no aumento do volume do tecido adiposo, o que leva a indução da inflamação crônica (HANDSCHIN; SPIEGELMAN, 2008). Outro mecanismo está associado ao papel do hormônio leptina, produzido pelas células adiposas, que induz a sinalização de vias proliferativas através da ativação das capases MAPK (Proteína quinase ativada por mitogêno) e PI3K/AKT (Fosfoinositida 3-quinase). A diretriz do Instituto Americano de Pesquisa em Câncer recomenda uma atividade de 60 minutos com uma intensidade moderada ou 30 minutos de atividades diárias de elevada intensidade como medida preventiva (WISEMAN, 2008).

1.4.4. Sobrepeso ou obesidade

Muitos estudos têm indicado que o sobrepeso e a obesidade são fatores de risco para diversos tipos de neoplasia (NAM et al., 2010; RENEHAN et al., 2008) e, segundo a Diretriz Brasileira de Obesidade de 2016, esta classificação é feita utilizando o Índice de Massa Corpórea (IMC). Indivíduos cujo IMC é ≥ 25 são classificados como sobrepesos e os que o IMC é ≥ 30 são classificados como obesos. Além disso, avaliação combinada desse parâmetro com a circunferência abdominal possibilita uma melhor análise antropométrica e identificar os

10 riscos nutricionais (BITES; OLIVEIRA; FORTES, 2012), sendo os indivíduos que possuem a circunferência ≥ 94 cm (Homens) e ≥ 80 cm (Mulheres) têm uma elevada condensação de gordura visceral. O tecido adiposo é considerado como um órgão metabolicamente ativo, liberando diversos hormônios e citocinas, estimulando as células T a promoverem uma inflamação crônica de baixa-intensidade e também a resistência à insulina (GUTIERREZ; PUGLISI; HASTY, 2009). A secreção de hormônios produzidos pelo tecido adiposo, como leptina, adiponectina e resistina, também contribuem para o desenvolvimento do quadro inflamatório e da carcinogênese (BOOTH et al., 2002; KUMOR et al., 2009). Além disso, o aumento da concentração sérica dos triglicerídeos em indivíduos obesos aumenta ainda mais a produção destes hormônios, o que acentua o risco de carcinogênese (CHAVEZ; SUMMERS, 2010). Apesar do mecanismo que aumenta a incidência de câncer em indivíduos obesos não estar completamente esclarecido (DURKO; MALECKA-PANAS, 2014), sugere-se que a redução da massa corpórea diminui a inflamação crônica, a intolerância à glicose, a dislipidemia, podendo impactar da incidência do CCR.

1.4.5. Hábitos Alimentares

Os fatores alimentares, como dieta com predominância de carne vermelha, processada e com baixa ingestão de fibras, vêm tendo um importante papel no aumento da incidência do CCR registrados nos países (DERRY et al., 2013). Uma dieta rica em carne vermelha também já foi associada com o aumento do risco de desenvolver CCR (CHAN et al., 2011), isso pode ser explicado pelo aumento da ingestão de ferro heme, o qual é encontrado em elevadas concentrações nas carnes vermelhas (DURKO; MALECKA-PANAS, 2014). O ferro heme é degradado no intestino delgado por enzimas heme oxidase 1, liberando o íon ferroso (ISHIKAWA et al., 2010). O ferro promove a produção de espécies reativas de oxigênio, especialmente o peróxido de hidrogênio, que induz mutações genéticas e a expressão de diversas citocinas (IL- 6, IL-8, TNFα, NF-κB), levando ao aumento da citotoxicidade e estimulação da resposta inflamatória (KNÖBEL et al., 2007). O modo de preparo da carne vermelha processada, especialmente frita ou grelhada em elevadas temperaturas, também foi associado com o risco de CCR (DURKO; MALECKA- PANAS, 2014), devido a degradação da creatinina muscular e de aminoácidos, resultando na

11 formação de numerosas aminas heterocíclicas carcinogênicas (MARTÍNEZ et al., 2007; SUGIMURA et al., 2004). Uma dieta rica em fibra consiste principalmente de vegetais, frutas e grãos. A presença destes componentes em refeições contribui para diminuir o tempo de trânsito no trato gastrointestinal, a diluição do conteúdo colônico e a melhoria da fermentação bacteriana, o que leva ao aumento da produção de ácidos graxos de cadeia curta (acetato, propionato e butirato) (SCHARLAU et al., 2009). A fibra dietética também possui ação antiinflamatória, diminuindo a produção de IL-6, TNF-alfa e COX-2, além de induzir a expressão do iNOS (KACZMARCZYK; MILLER; FREUND, 2012; REDDY et al., 2000). Os ácidos graxos de cadeia curta interferem em várias regulações do ciclo celular, proliferação e apoptose, tais como nos genes: beta-catenina; p53; p21; Bax e caspase 3 (FEREGRINO-PÉREZ et al., 2008). Uma dieta pobre em vitaminas do complexo B pode impactar no reparo e na metilação do DNA, devido a sua função na síntese do DNA (POWERS, 2005). Tem sido evidenciado que baixa concentrações séricas de folato podem aumentar a capacidade de invasão das células cancerígenas através da ativação da via de sinalização Hedgehog Shh, por hipometilação, e a estimulação da via do NFKB (WANG et al., 2012). Entretanto, essa associação é apenas para a ingestão de ácido fólico na dieta natural e não para a sua suplementação farmacológica (GIOVANNUCCI, 2002).

1.4.6. Gênero

A exposição ao estrogênio tem sido reconhecida como um fator de risco para o desenvolvimento de diversos tipos de cânceres (CAVALIERI; ROGAN, 2014). O estrogênio contém um anel benzeno na sua estrutura, o benzeno e os hidrocarbonetos aromáticos cíclicos são eletrofílicos (CAVALIERI; ROGAN, 2010). Essa estrutura permite que eles reajam covalentemente com grupos nucleofílicos do DNA, RNA e proteína (MILLER; MILLER, 1966, 1981a, 1981b). Os estrogênios são metabolizados para uma ortoquinona eletrofílica que pode reagir no DNA formando adutos na posição N-3 da adenina e N-7 da guanina (CAVALIERI; ROGAN, 2010). Entretanto, a formação destes adutos na adenina e guanina desestabiliza a ligação glicosil e subsequentemente há a depurinação do aduto, onde a desoxirribose é clivada e forma o sítio apurínico (LI et al., 2004; SAEED; ROGAN; CAVALIERI, 2009; STACK et al., 1996). Pelos motivos expostos, o mecanismo de inicialização do câncer pelo estrógeno

12 tem sido esclarecedor para a prevalência no gênero feminino para alguns tipos de cânceres (CAVALIERI; ROGAN, 2014).

1.4.7. Idade

A exposição de agentes extrínsecos ou intrínsecos pode levar ao acúmulo de danos no genoma. Estes danos podem possuir mutações pontuais, translocações, perda ou ganho de cromossomos, encurtamento dos telômeros ou pela integração do material genético do vírus. Para minimizar essas lesões, os organismos evoluíram uma complexa rede de mecanismo de reparo do DNA que são coletivamente capazes de lidar com a maior parte do dano causado ao DNA (LORD; ASHWORTH, 2012). O envelhecimento pode alterar as defesas antitumorais, fazendo pessoas mais velhas serem as mais vulneráveis ao desenvolvimento de neoplasias malignas (LÓPEZ-OTÍN et al., 2013; YANCIK; RIES, 1994).

1.4.8. Histórico pessoal de pólipo e doença inflamatória no intestino

Os indivíduos que possuem histórico pessoal de pólipos adenomatosos, principalmente os grandes ou se teve um grande número de pólipos, além dos que já foram diagnosticados com CCR, mesmo que tenham removido completamente o tumor, possuem um alto risco de desenvolver CCR. As chances disso acontecer são maiores se o indivíduo for diagnosticado com CCR quando mais jovem (ACS, 2016). As doenças inflamatórias no intestino são um fator de risco bem conhecido para o desenvolvimento de displasia e carcinoma. A principal hipótese é a liberação de fatores de crescimento e citocinas que modulam o meio inflamatório no tecido tumoral (MAGER et al., 2016). Em síntese, destacam-se duas principais vias inflamatórias que são funcionalmente diferentes: a via inflamatória que conduz a atividade antitumoral para inibir o desenvolvimento do tumor (MLECNIK et al., 2014; REISSFELDER et al., 2015); e um conjunto de citocinas que desencadeiam um processo inflamatório crônico, favorecendo a carcinogênese (GRIVENNIKOV et al., 2012), Figura 04.

Figura 04 – Conjuntos de citocinas envolvidas no processo de carcinogênese. Citocinas expressas no tumor e/ou estroma celular com propriedades antitumoral, pró-tumoral ou ambas as atividades. Fonte: Mager e colaboradores (2016).

As lesões displásicas, nos pacientes com doença inflamatória crônica, podem ser planas (ou seja, endoscopicamente invisíveis) ou ter projeções para o lúmem (FLEMING et al., 2012). Além disso, as lesões proeminentes são de difícil ou impossível distinção dos adenomas esporádicos (FLEMING et al., 2012). O equilíbrio entre estas duas vias inflamatórias dentro do estroma tumoral determina o curso do desenvolvimento de CCR e são alvos de estudos para o diagnóstico e abordagens terapêuticas (MAGER et al., 2016).

1.4.9. Histórico familiar de pólipos e câncer colorretal

O CCR é tradicionalmente dividido em casos esporádicos e familiar, onde 20 – 25% dos casos de CCR são diagnosticados como familiar (DE LA CHAPELLE, 2004). O câncer, por ter um componente hereditário, é causado por mutações em células germinativas, as quais são herdadas geneticamente, contribuindo para a iniciação do processo de carcinogênese (JOHNS; HOULSTON, 2001). Esse risco torna-se maior se o familiar foi diagnosticado quando com uma idade inferior a 45 anos, ou se mais de um parente de primeiro grau foi acometido pela enfermidade (ACS, 2016; WHIFFIN; HOULSTON, 2014). As primeiras evidências da transmissão Mendeliana no CCR foram reportadas em estudos realizados com grandes famílias (WHIFFIN; HOULSTON, 2014); e mostraram que 14 mutações de alta penetrância conferem a predisposição ao CCR, principalmente para a Síndrome de Lynch (genes MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2), a Síndrome de Polipose Juvenil (genes SMAD4 e BMPR1A), a Síndrome Peutz-Jeghers (gene STK11) e na Polipose Adenomatosa Familiar (gene APC) (BOSMAN; WHO; IARC, 2010; WHIFFIN; HOULSTON, 2014). Entretanto, essas condições representam menos do que 5% de todos os casos de CCR (PETERS; BIEN; ZUBAIR, 2015). A susceptibilidade herdada para o CCR, após a exclusão dos genes de alto risco conhecidos, sugere que a maior parte desta susceptibilidade provavelmente seja poligênica com a codominância de variantes genéticas múltiplas, cada uma com um efeito individual modesto que, quando combinadas, causa uma diversidade de risco na população (WHIFFIN; HOULSTON, 2014). A identificação de mais mutações, tanto de baixa quanto de alta penetrância, contribuem significativamente para o entendimento do processo molecular que ocorre no câncer, o que facilita as estratégias de prevenção, diagnóstico e o desenvolvimento de alvos terapêuticos (DE LA CHAPELLE, 2004).

1.4.10. Contribuição étnica

Outro fator relatado como associado com o risco de desenvolver o CCR são os grupos étnicos populacionais, no qual foi evidenciado através da diferença incidência de CCR na população afro-americana em relação aos outros grupos étnicos nos EUA (ACS, 2016). A causa desta diferença epidemiológica não está totalmente esclarecida, e estudos vêm focando o fator socioeconômico como a principal causa (GUINDALINI et al., 2015; RICHARDS; REKER, 2002). Entretanto, alguns outros estudos sugerem que isto possa não ser totalmente verdade (IOANNOU; CHAPKO; DOMINITZ, 2003; SWAN et al., 2003). Um crescente número de evidências vem dando suporte aos fatores biológicos como um importante papel nesta discrepância (KUPFER; BURKE, 2014), destacando-se a diferença na susceptibilidade genética (KUPFER et al., 2010, 2014) entre estes grupos populacionais. O trabalho de Sameer e colaboradores (2011), os quais realizaram um estudo do tipo caso-controle na população de Kashmir, região noroeste do Sul da Ásia, associaram o polimorfismo no CYP2E1 com o risco de desenvolver o CCR (86 casos e 160 controles). Contudo, Silva e colaboradores (2012) realizaram o mesmo modelo de estudo na população do estado de São Paulo e não encontraram diferença significativa na frequência do genótipo entre o grupo caso-controle (131 casos e 206 controles). Essa divergência demonstra o

15 impacto que diversos polimorfismos possuem em diferentes populações étnicas, por apresentarem frequências e influências genéticas diferentes (CHONG et al., 2014). Essa teoria é reforçada com os estudos realizados por Cassiano et al. (2015) e Amador et al. (2016), no qual avaliaram a influência que a ancestralidade genômica tem sobre a distribuição dos polimorfismos na população miscigenada, mostrando a importância de investigar a frequência das variantes polimórficas em diferentes regiões da população brasileira.

1.5. Genes candidatos

Os genes listados na Figura 5 apresentam potencial atividade em vias que contribuem para o processo de carcinogênese, sendo importante investigar as suas variações genéticas com o risco de desenvolver o câncer, na resposta ao tratamento e até mesmo no prognóstico, para melhor entender o processo de patogênese do CCR.

Figura 5 – Potenciais genes que influenciam nas 10 características do câncer (do inglês, Hallmarkers of cancer). 1 – Sustentável sinalização proliferativa; 2 – Evasão da sinalização para a supressão tumoral; 3 – Evasão da destruição pelo sistema imune; 4 – Potencial replicativo ilimitado; 5 – Promoção de processo inflamatório; 6 – Invasão e metástase celular; 7 – Indução da angiogênese; 8 – Instabilidade genômica; 9 – Resistência a sinalização da apoptose; e 10 – Desregulação energética na célula. Fonte: Hanahan e Weinberg (2011). Imagem adaptada pelo autor. 16

1.5.1. UCP2

O gene da Proteína Desacoplada a Mitocôndria do tipo 2 (UCP2) [HGNC: 12518, Entrez Gene: 7351, Ensembl: ENSG00000175567, OMIM: 601693, UniProtKB: P55851] está localizado na região genômica 11q13.4. As UCP são membros de uma grande família de proteínas carreadoras de ânions da mitocôndria, facilitando a transferência de ânions tanto do interior da mitocôndria para o exterior quanto o inverso. Funcionalmente, este gene vem sendo associado com doenças relacionadas à obesidade (DE OLIVEIRA et al., 2016; PHEIFFER et al., 2016) e doenças cardiovasculares (RUBATTU et al., 2015). Ele também está associado no processo de resposta ao estímulo à hormônios como a insulina (GIRALT; VILLARROYA, 2016; NESSA; RAHMAN; HUSSAIN, 2016), a hipóxia (VARELA; SCHWARTZ; HORVATH, 2016) e superóxido. Além disso, o aumento na expressão do UCP2 está associado com diferentes tipos de câncer (DALLA POZZA et al., 2012; LEE et al., 2005; QIAO et al., 2015), assim como o CCR em humanos (DERDÁK et al., 2006). Kuai e Zhang (2010) observaram que o aumento da expressão do UCP2 pode influenciar na agressividade do tumor e na metástase. Isto se deve ao mecanismo adaptativo para reduzir a geração de espécie reativa de oxigênio (DERDAK; GARCIA; BAFFY, 2009), protegendo a célula cancerosa da via apoptótica (FÜLÖP et al., 2006). Em estudo realizado por Hu e colaboradores (2013) concluiu que mutação na região promotora (rs659366, C/T), quando associado com o consumo de carne vermelha, pode contribuir para o risco de CCR.

1.5.2. ACE

O gene da Enzima Conversora de Angiotensina do Tipo I (ACE) [HGNC: 2707, Entrez Gene: 1636, Ensembl: ENSG00000159640, OMIM: 106180, UniProtKB: P12821] está localizado na região genômica 17q23.3. A sua proteína encontra-se localizada nos lissosomos, nos endossomos, na membrana plasmática e no espaço extracelular. A ACE é uma enzima que está envolvida na catálise da conversão da angiotensina I na sua forma fisiologicamente ativa, angiotensina II, tendo um papel importante no sistema renina-angiotensina. Este gene está relacionado com a patogênese de diversos cânceres, como o de pulmão (NACAK et al., 2010), mama (HAIMAN et al., 2003), próstata (YIGIT et al., 2007), gástrico (SUGIMOTO et al., 2006) e o oral (VAIRAKTARIS et al., 2007). Além disso, a expressão deste gene pode afetar a proliferação celular do tumor, a migração, angiogênese e a metástase (RÖCKEN et al., 2005). Estudos epidemiológicos realizados por

Vairaktaris e colaboradores (2007) corroboram com estes achados, indicando que a inibição do ACE pode diminuir o risco do câncer. Zhou e Lin (2015) realizou um estudo do tipo de meta-análise que avaliou a susceptibilidade do polimorfismo do tipo inserção e deleção (INDEL) no íntron 16 deste gene (rs4646994, 247 pb sequência Alu) na população da Grécia, da Alemanha e da China. Contudo, esse polimorfismo não foi associado com o risco de CCR e sugeriram que mais estudos devem ser realizados em outros grupos populacionais para confirmar os achados, além de avaliar a interação entre gene-gene e gene-fatores ambientais.

1.5.3. CASP8

O gene da Caspase 8 (CASP8) [HGNC: 1509, Entrez Gene: 841, Ensembl: ENSG00000064012, OMIM: 601763, UniProtKB: Q14790] está localizado na região genômica 2q33.1. A sua proteína encontra-se localizada no citoplasma, no interior do núcleo e da mitocôndria. A CASP8 é membro da família de protease de cisteina e ácido aspártico e está envolvida no processo de morte celular induzida por Fas e outros estímulos apoptótico. Funcionalmente, diversas doenças, como o câncer, estão associadas com este gene. A INDEL de 6 pb na região promotora (rs3834129) impossibilita a ligação com uma proteína estimuladora e reduz a expressão da CASP8, resultando na diminuição da reatividade dos linfócitos T a apoptose, após a estimulação por células cancerosas (SUN et al., 2007). Por isso, é biologicamente razoável supor uma relação de potencial entre este polimorfismo e o câncer (PENG et al., 2014). Peng et al. (2014) realizou um estudo do tipo meta-análise na população da Grécia, da China e do Reino Unido, em que avaliou a associação do INDEL rs3834129 com a susceptibilidade ao CCR. Eles observaram que a deleção nesta região pode ter um papel protetor na susceptibilidade da população asiática. No entanto, os resultados deste estudo são inconsistentes com o que foi reportado no estudo do tipo caso-controle por Theodoropoulos e colaboradores (2011), na Grécia (402 casos e 480 controle), e por Pittman e colaboradores (2008), no Reino Unido (4016 casos e 3749 controles). Esses resultados sugerem que este polimorfismo, quando combinado com fatores dietéticos, pode estar associado com o desenvolvimento de CRC (WU et al., 2013).

1.5.4. XRCC1

O gene da Proteína de Reparo de Complemento Cruzado do Tipo 1 (XRCC1) [HGNC: 12828, Entrez Gene: 7515, Ensembl: ENSG00000073050, OMIM: 194360, UniProtKB: P18887] está localizado na região genômica 19q13.2. A sua proteína encontra-se localizada no interior do núcleo. O XRCC1 está envolvido na eficiência do reparo do DNA quebrado em fita simples pela exposição dos íons de radiação e agentes alquilantes. Essa proteína interage com a DNA ligase III, polimerase beta e outras polimerase para participar no processo de reparo. Sua ativação ocorre durante o processo de meiose e de recombinação nas células germinativas. Em células de mamíferos, quatro diferentes mecanismos de reparo do DNA têm sido identificados: reparo por excisão de bases, reparo por excisão de nucleotídeos, reparo de incompatibilidade (do inglês, mismatch) e reparo para reversão de danos/rupturas na fita dupla (CHRISTMANN et al., 2003; YU et al., 1999). Todas estas vias são estritamente reguladas para a manutenção da integridade do genoma e modular a capacidade do reparo na resposta ao dano no DNA (NACCARATI et al., 2007). Mutações neste gene podem prejudicar na eficiência da atividade de reparo do DNA (SIEWCHAISAKUL et al., 2016), resultando no aumento da instabilidade genética (DE BOER, 2002) e no aumento da susceptibilidade ao CCR quando associado com fatores ambientais (HUANG et al., 2015).

1.5.5. TYMS

O gene Timidilato Sintase (TYMS) [HGNC: 12441, Entrez Gene: 7298, Ensembl: ENSG00000176890, OMIM: 188350 e UniProtKB: P04818] está localizado na região genômica 18p11.32. A sua proteína encontra-se localizada em toda a célula, concentrando-se no núcleo e na mitocôndria. Esta enzima tem um papel chave no metabolismo do ácido fólico e catalisa o metabolismo do desoxiuridina à timina, usando o 5,10-metilenotetrahidrofolato como cofator. Esta função mantém o monofosfato de timidina-5-prime (dTMP) numa concentração crítica para a replicação e reparo do DNA (ZHOU et al., 2012). O aumento da expressão do TYMS induz a transformação de células a um fenótipo maligno, em cultura in vitro (RAHMAN et al., 2004). Além disso, polimorfismos funcionais neste gene pode afetar a resposta do paciente a monoterapia com Fluoracil (CASTILLO- FERNÁNDEZ et al., 2010).

Zhou e colaboradores (2012) realizou uma revisão sistemática para avaliar a associação entre dois polimorfismos no TYMS com o risco de ter câncer (rs151264360 e rs183205964). Eles observaram que 2 Repetição de 28 bp (VNTR, rs183205964) na região 5'- UTR possa estar associada com o aumento do risco de câncer gastresofágico na população asiática, e pode promover um efeito protetor contra o CCR na população caucasiana. Eles também observaram que a inserção de 6 pb (rs151264360) na região 3'-UTR pode estar associada com a susceptibilidade no câncer de mama nos Asiáticos (ZHOU et al., 2012). Na meta-análise realizada por Wang e colaboradores (2014) destes mesmos polimorfismos na susceptibilidade ao CCR, foi evidenciado que, no geral, estas variações polimórficas não tinham associação com o CCR. Entretanto, quando estratificado por grupos étnicos, foi encontrado associação apenas para o rs183205964 na população caucasiana (WANG et al., 2014c).

1.5.6. SGSM3

O gene da Pequena Proteína G Moduladora de Sinalização do Tipo 3 (SGSM3) [HGNC: 25228, Entrez Gene: 27352, Ensembl: ENSG00000100359, OMIM: 610440, UniProtKB: Q96HU1] está localizado na região genômica 22q13.1. A sua proteína encontra- se localizada no citoplasma celular. O SGSM3 está envolvido na atividade GTPase e tem o papel de suprimir o crescimento celular mediado por NF2 (Merlin), componente chave da via de sinalização da Hippo. A via de sinalização Hippo está envolvida em restringir a proliferação celular e promover a apoptose. Como muitos cânceres são marcados pela divisão celular não controlada, esta via de sinalização tornou-se cada vez mais importante no estudo do câncer (HALDER; JOHNSON, 2011; HARVEY; TAPON, 2007; PAN, 2010). Todavia, até o presente momento, este gene foi associado com o câncer hepático (WANG et al., 2014b) e o de mama (NOURASHRAFEDDIN et al., 2015; TAN; ZHANG; SUN, 2016), não há estudos de associação com o CCR.

1.5.7. HLAG

O gene do Complexo de Histocompatibilidade Marjoritária de Classe I do Tipo G (HLAG) [HGNC: 4964, Entrez Gene: 3135, Ensembl: ENSG00000204632, OMIM: 142871,

UniProtKB: P17693] está localizado na região genômica 6p22.1. A sua proteína encontra-se localizada no endossomo, no aparelho de golgi e no retículo endoplasmático. O HLAG, assim como os outros HLA de classe I, é um heterodímero que contém uma cadeia pesada e uma cadeia leve (microglobulina beta-2). A cadeia pesada está ancorada na membrana plasmática. Nove alterações situadas em regiões que afetam a degradação, a estabilidade e o splicing do mRNA (HVIID et al., 2003; LARSEN; HVIID, 2009); e três destas variantes genéticas estão associados com a regulação transcricional e pós-transcricional do HLAG (CASTELLI et al., 2014; PORTO et al., 2015). Em particular, a INDEL de 14 pb na posição +2960 (rs371194629) influencia na estabilidade do mRNA e é a mais estudada (GARZIERA et al., 2015). A deleção de 14 pb promove uma maior estabilidade no mRNA, causando uma maior expressão da proteína (HVIID et al., 2003). Sugere-se que as células tumorais podem escapar ao reconhecimento do sistema imunológico pela expressão do gene HLAG, o que explica o porquê que a expressão desta molécula está associada com um mau prognóstico do paciente com CCR (GARZIERA; TOFFOLI, 2014; GARZIERA et al., 2015; GUO et al., 2015; YE et al., 2007; ZEESTRATEN et al., 2014) e têm sido reportado que polimorfismos neste gene também podem afetar na susceptibilidade ao câncer hepático, de mama, de tireoide, dentre outros (DIAS et al., 2015). Entretanto, ainda não há estudos no contexto do CCR (DIAS et al., 2015).

1.5.8. IL1A

O gene da Interleucina 1 Alfa (IL1A) [HGNC: 5991, Entrez Gene: 3552, Ensembl: ENSG00000115008, OMIM: 147760, UniProtKB: P01583] está localizado na região genômica 2q14.1. A sua proteína localiza-se no citoplasma e no espaço extracelular. A IL1A é uma citocina pleiotropica envolvida em várias respostas imunes, no processo inflamatório e na hematopoese. Essa citocina é produzida pelos monócitos e macrófagos, sendo liberada durante uma resposta à injúria celular e então induzindo a apoptose. Além disso, a inflamação crônica causada pelo aumento da expressão do IL1A pode induzir a divisão celular, aumentando a possibilidade de erros na replicação, de um reparo ineficaz no DNA e uma subsequente mutação no genoma (GAO et al., 2009; TRABERT et al., 2014). Estudos têm mostrado que polimorfismos na região 3'-UTR pode alterar a regulação pós-transcricional deste gene, influenciando no risco de desenvolver câncer (CHIN et al.,

2008; GAO et al., 2009; JAZDZEWSKI et al., 2008; LANDI et al., 2008, 2011; LI et al., 2013). Diversos grupos vêm investigando a relação entre o INDEL de 4 pb na região 3'-UTR (rs3783553) no câncer hepático (DU et al., 2014; WANG et al., 2014a), no câncer nasofaríngea (YANG et al., 2011), no câncer gástrico (ZENG; LI; LI, 2014), no câncer tireoidiano papilífero (GAO et al., 2014), no câncer cervical (PU et al., 2014), no câncer epitélio ovariano (ZHANG et al., 2014) e CCR (YAN et al., 2015). Yang e colaboradores (2015) foi o primeiro estudo que avaliou o efeito do INDEL de 4 pb na região 3'-UTR (rs3783553) no CCR. Eles realizaram um estudo do tipo caso-controle (339 casos e 313 controles) em descendentes da população Han Chinesa. Entretanto, não observaram diferença significativa entre o grupo caso e controle, enquanto que os outros estudos que fizeram a associação do mesmo polimorfismo em outros cânceres observaram que o homozigoto para inserção possui menos risco de desenvolver câncer. Estes achados sugerem que o efeito do rs3783553 pode variar de acordo com o tipo de câncer (YAN et al., 2015) e grupo étnico.

1.5.9. IL4

O gene da Interleucina 4 (IL4) [HGNC: 6014, Entrez Gene: 3565, Ensembl: ENSG00000113520, OMIM: 147780, UniProtKB: P05112] está localizado na região genômica 5q31.1. A sua proteína encontra-se localizada no espaço extracelular. O IL4 é uma proeminente citocina antiinflamatória da resposta Th2 do sistema imune; e a expressão desta citocina está aumentada nos eventos iniciais do desenvolvimento do CCR, incluindo pólipos hiperplásicos, adenomas e adenomas serrilhados (MARSZAŁEK et al., 2012). O efeito que o IL4 pode estar favorecendo a proliferação celular do CCR foi confirmado através da exposição de diversas linhagens celulares desta neoplasia em elevadas concentrações de IL4, e, ao inibir a atividade do IL4 através de anticorpos, a proliferação celular é inibida (KOLLER et al., 2010). Acredita-se que isso possa servir como mecanismo de escape da resposta imune, a fim de promover a progressão do tumor (VOLONTÉ et al., 2014). A repetição de 70 pb (rs79071878) no íntron 3 pode influenciar na produção de sua respectiva citocina, e tem sido associado com o câncer gástrico (BHAYAL et al., 2015) e outras doenças inflamatórias (ANOVAZZI et al., 2010; CABANTOUS et al., 2009).

Entretanto, este é o primeiro estudo que indica uma associação entre o polimorfismo rs79071878 e o risco de desenvolver CCR.

1.5.10. NFKB1

O gene Fator Nuclear Kappa B (NFKB1) [HGNC: 7794, Entrez Gene: 4790, Ensembl: ENSG00000109320, OMIM: 164011, UniProtKB: P19838] está localizado no 4q24 e sua proteína concentra-se no interior do núcleo, mas também pode ser encontrado no citoplasma celular. O NFKB é um regulador transcricional que é ativado por vários estímulos intra e extracelulares, como as citocinas, radicais oxidantes livres, irradiação por ultravioleta e produtos de bactérias e vírus. Quando ativado, o NFKB1 se transloca do citoplasma para o núcleo e interage a sítios κB do DNA para regular a transcrição de genes relacionados com a proliferação celular, diferenciação e apoptose (CERHAN et al., 2008; CHEN et al., 1999). A ativação inapropriada do NFKB1 tem sido associada com diversas doenças inflamatórias e resistência a sinais de apoptose (HUANG et al., 2005), enquanto que sua persistente inibição pode levar ao desenvolvimento de células imunes inapropriadas ou no atraso do desenvolvimento celular. A deleção de 4 pb na região promotora do gene NFKB1 (rs28362491) foi associada com a diminuição da transcrição do gene e com o aumento do risco de CCR entre a população da Suécia (KARBAN et al., 2004) e da Malásia (MOHD SUZAIRI et al., 2013), mas não na população Chinesa (LEWANDER et al., 2007). Andersen e colaboradores (2010) avaliaram o efeito desta INDEL no risco de CCR e investigaram a possível interação com o estilo de vida da população da Dinamarca (378 casos e 756 controles). Nesse estudo, os pesquisadores observaram que indivíduos que são portadores desta variante alélica, quando expostos a carne vermelha e processada, eram mais susceptíveis ao CCR do que homozigotos para a inserção (ANDERSEN et al., 2010). Entretanto, Kopp et al. (2015) não encontraram fortes associações na interação deste polimorfismo com a dieta e o estilo de vida (915 casos e 1719 controles).

1.5.11 MDM2

O Gene da Oncoproteína MDM2 (MDM2) [HGNC: 6973, Entrez Gene: 4193, Ensembl: ENSG00000135679, OMIM: 164785, UniProtKB: Q00987] está localizado na

23 região genômica 12q15. A sua proteína encontra-se concentrada, principalmente, no interior do núcleo, podendo ser localizada no citoplasma celular. O MDM2 é uma fosfoproteína nuclear que liga e inibe a ativação da proteína TP53, como parte de um feedback negativo autoregulatório (HONDA; TANAKA; YASUDA, 1997; JONES et al., 1995; LÉVEILLARD et al., 1998). O aumento da expressão do MDM2 pode resultar em uma inativação excessiva da proteína TP53, diminuindo a função de suprimir o tumor, afetando o ciclo celular e a apoptose (BROOKS; GU, 2006), além de estar fortemente associado com o risco de CCR (BI et al., 2016). Polimorfismos na região promotora (rs2279744, G/T) impacta significativamente sobre o processo de carcinogênese, através da atenuação da função da p53 em estudos de modelo animal (POST et al., 2010) e em humanos (BOND et al., 2004). Além disso, a deleção de 40 pb na região promotora (rs3730485, INDEL) tem sido associada com uma diminuição da transcrição do MDM2 em linhagens celulares (LALONDE et al., 2012); e desequilíbrio de ligação desta INDEL é maior do que do rs2279744 (HU et al., 2006). Alguns pequenos estudos tem avaliado o potencial efeito desta deleção com a susceptibilidade ao câncer e foi reportado que esta mutação pode estar associada com o aumento do risco de CCR (GANSMO et al., 2016), bem como de outros tipos de cânceres, incluindo o hepático (DONG et al., 2012), de pulmão (HU et al., 2006), mama (MA et al., 2006), ovário (KANG et al., 2009) e esôfago (MA et al., 2012) na população chinesa.

1.5.12. TP53

O gene da Supressor de Tumor p53 (TP53) [HGNC: 11998, Entrez Gene: 7157, Ensembl: ENSG00000141510, OMIM: 191170, UniProtKB: P04637] está localizado na região genômica 17q13.1. A sua proteína encontra-se localizada no citoplasma, no interior do núcleo e na mitocôndria. A TP53 responde a diversos estresses celulares para regular genes alvos que induzem o ciclo celular, a apoptose, a senescência, o reparo do DNA e a mudanças do metabolismo celular (MCLURE; TAKAGI; KASTAN, 2004; RILEY et al., 2008). A expressão da TP53 se encontra aumentada em diversas linhas celulares transformadas, em relação a células normais, o que leva a acreditar que está envolvido no processo de diferenciação celular e de malignidade no câncer (BROSH; ROTTER, 2009; SUN et al., 2016). Aproximadamente 100 variantes genéticas têm sido identificados na TP53 (listadas no http://p53.iarc.fr) (GARRITANO et al., 2010), muitas das quais mostram uma variação na

24 frequência de acordo com a população e região geográfica. Existe evidência que rs17878362 pode influenciar a expressão da TP53 (GEMIGNANI et al., 2004) e no splicing alternativo do mRNA deste gene (MARCEL et al., 2011). O polimorfismo intrônico mais comum neste gene é a INDEL de 16 pb no intron 3 (rs17878362) (STACEY et al., 2011), tendo sido associado com o risco de desenvolver CCR (GEMIGNANI et al., 2004; PERFUMO et al., 2006) e o câncer de mama (COSTA et al., 2008; WANG-GOHRKE et al., 2002). Contudo, seus efeitos na susceptibilidade ao câncer aparentam ser inconsistentes entre os estudos (HU et al., 2010a; LU et al., 2011; STACEY et al., 2011; WHIBLEY; PHAROAH; HOLLSTEIN, 2009).

1.5.13. CYP2E1

O gene do Citocromo P450, Subfamília II E1 (CYP2E1) [HGNC: 2631, Entrez Gene: 1571, Ensembl: ENSG00000130649, OMIM: 124040, UniProtKB: P05181] está localizado na região genômica 10q26.3. A sua proteína encontra-se localizada no retículo endoplasmático. O CYP2E1 é uma monoxigenase que catalisa muitas reações envolvidas no metabolismo de fármacos e síntese de colesterol, esteroides e N-nitrosaminas. Polimorfismos que comprometem a atividade deste gene têm sido associados com o processo de carcinogênese do CCR, principalmente quando ocorre próximo a região promotora 5’-UTR (JIANG et al., 2013; NEAFSEY et al., 2009; POHL; SCINICARIELLO, 2011), especialmente a inserção de 96 pb (JIANG et al., 2013; QIAN et al., 2013). Porém, um estudo do tipo caso-controle realizado no Brasil (131 casos e 206 controles) não observou associação entre o INDEL de 96 pb com o aumento no risco de CCR (SILVA et al., 2012).

1.5.14. CYP19A1

O gene da Citocromo P450, Subfamília XIXA1 (CYP19A1) [HGNC: 2594, Entrez Gene: 1588, Ensembl: ENSG00000137869, OMIM: 107910, UniProtKB: P11511] está localizado na região genômica 15q21.2. A sua proteína encontra-se localizada no retículo endoplasmático. A aromatase (CYP19A1) é uma monoxigenase que catalisa muitas reações envolvidas no metabolismo de fármacos e síntese de colesterol e outros lipídeos. Além disso, é a principal enzima na metabolização do estrogênio a estradiol (SATO et al., 2012), um dos fatores que pode estar associado ao processo de carcinogênese (CHETRITE et al., 2000). Mutações neste gene afetam a atividade da aromatase, o que pode refletir no metabolismo do estradiol e, consequentemente, vem sendo associado com o processo de

25 carcinogênese (CHETRITE et al., 2000; SATO et al., 2012) e na sobrevida do paciente (SLATTERY et al., 2011). Lin e colaboradores (2010) observaram, no estudo do tipo caso- controle (158 casos e 563 controle), que um polimorfismo no CYP19A1 está associado com o risco de CCR.

1.5.15. UGT1A1

O gene UDP Glucuronosiltransferase 1A1 (UGT1A1) [HGNC: 12530, Entrez Gene: 54658, Ensembl: ENSG00000241635, OMIM: 191740, UniProtKB: P22309] está localizado na região genômica 2q37.1. A sua proteína encontra-se localizada no retículo endoplasmático. O UGT1A1 é uma glucuronidase que transforma pequenas moléculas de lipídeos, como o estrogênio, aminas heterocíclicas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, em metabólitos mais hidrossolúveis. A presença de alguns polimorfismos neste gene já foi associada com o risco de desenvolver CCR (TANG et al., 2005; VAN DER LOGT et al., 2004), sugerindo que alterações genéticas no UGT1A1 podem modificar o metabolismo de alguns compostos carcinogênicos (GIRARD et al., 2008). Além disso, alteração na expressão deste gene pode levar a citoxicidade severa induzida pela fluoropirimidina (OTA et al., 2009), como o fluorouracil (5-FU).

1.6. Variações genéticas do tipo inserção-deleção

O genoma humano contém um grande número de variações genéticas (IONITA-LAZA et al., 2009; LANDER et al., 2001), como as inserções/deleções de um ou mais nucleotídeos (INDEL), a variação no número de cópias (CNV, do inglês Copy-Number Variation) que pode envolver uma sequência de DNA e polimorfismos em um único nucleotídeo (SNP, do inglês Single Nucleotide Polymorphism), que é a substituição de um nucleotídeo na sequência do DNA. Os SNPs são as variações genéticas mais comuns e em estudos genéticos, podem ser usados tanto como marcador genético quanto como fator genético funcional, além de afetar a função do gene ou a expressão (SAVAS; LIU, 2009). Entretanto, estes SNPs não necessariamente afetam as funções biológicas do organismo (SAVAS; LIU, 2009). A segunda classe de variações genéticas mais comuns no genoma humano são as INDELs, que resultam na alteração da sequência dos aminoácidos (do inglês, frameshit), e quando presentes na região codificante, podem afetar a função da proteína e/ou a sua estrutura

(KHURANA et al., 2016; LIU et al., 2016). A presença desta variação genética pode também impactar na regulação do gene, quando presente na região não-codificante (KHURANA et al., 2016) (Tabela 3). Além disso, até o presente momento, um quarto de todas as doenças Mendelianas estão associadas com INDELs (STENSON et al., 2003). Entretanto, sabemos relativamente pouco sobre o impacto do INDEL sobre a biologia humana e na doença (MILLS et al., 2011), especialmente na população miscigenada do Brasil. Assim, o entendimento das INDELs é importante para determinar o perfil genético das variações genômicas (MILLS et al., 2011) e detecção de mutações (BALL et al., 2005; IENGAR, 2012).

Tabela 3 – Potencial efeito biológico de mutações em diferentes regiões do gene. Localização Biologia por trás do efeito da Potencial efeito biológico genética mutação Região Promotora Altera a expressão do gene Altera a regulação do gene, como o sítio de ligação do fator de transcrição 5'-UTR Altera a expressão do gene e a Altera a regulação do gene, como a tradução proteica estrutura cap 3'-UTR Altera a expressão do gene e a Altera a regulação do gene, como estabilidade do mRNA modificar sítios de ligação dos microRNAs Exón codificante Altera a função da proteína e a Altera a sequência de aminoácidos estrutura da proteína Altera a estabilidade do mRNA e Altera a sequência do mRNA a função da proteína Altera a sequência da região codificante e a sequência de aminoácidos da proteína Sítio de splice Altera o splice do mRNA, a Altera a sequência do sítio de splice estabilidade o mRNA e a função consenso da proteína Fonte: SAVAS e LIU (2009)

Tendo em vista que poucos estudos avaliam o efeito das INDELs no risco de CCR na população miscigenada, bem como a população Brasileira, faz-se importante avaliar se as mutações listadas na Tabela 4 afetam no risco de CCR. Isso poderá ser útil no diagnóstico na prática clínica, possibilitando um melhor prognóstico aos pacientes.

Tabela 4 – Lista das inserções-deleções analisadas no presente estudo e o local no gene em que ela ocorre. Gene dbSNP ID Variação pb Região ACE rs4646994 289 Intron 16 CASP8 rs3834129 6 Promotora SGSM3 rs56228771 4 3'-UTR CYP2E1 - 96 Flanqueada a 5'-UTR CYP19A1 rs11575899 3 Intron 4 HLAG rs371194629 14 3'-UTR IL1A rs3783553 4 3'-UTR IL4 rs79071878 70 Intron 3 MDM2 rs3730485 40 Promotora NFKB1 rs28362491 4 Promotora TP53 rs17878362 16 Intron 3 TP53 rs17880560 6 Flanqueada a 3'-UTR TYMS rs151264360 6 3'-UTR UCP2 - 45 3'-UTR UGT1A1 rs8175347 2 3'-UTR XRCC1 rs3213239 4 Flanqueada a 5'-UTR dbSNP ID = Código de registro da variação genotípica; pb = Pares de base.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo principal

Determinar a associação de 16 INDEL, em genes envolvidos no processo de carcinogênese, com o risco de desenvolver CCR na população do Rio Grande do Norte (Região Nordeste do Brasil).

2.2. Objetivos específicos

 Determinar a frequência alélica e genotípica dos polimorfismos investigados no grupo caso e controle;  Estimar o perfil de ancestralidade dos indivíduos investigados por um painel previamente desenvolvido com marcadores autossômicos;  Estimar o risco da variação alélica no diagnóstico de câncer colorretal.

3. METODOLOGIA

3.1. Comitê de Ética em Pesquisa

O presente projeto seguiu as diretrizes regulamentadas da pesquisa envolvendo seres humanos que constam na resolução do Conselho Nacional de Saúde nº 196/96 e nº340/04 e foi executado após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte-Riograndense Contra o Câncer (CEP-LIGA), Anexo A. Os indivíduos selecionados foram informados sobre o protocolo de estudo e somente participaram aqueles que assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e responderam a um questionário (Apêndice A). As informações clínicas dos participantes do grupo caso foram obtidas através do preenchimento de uma ficha (Apêndice B), através de consultas ao prontuário.

3.2. Casuística

O presente estudo é do tipo caso-controle. Os participantes do grupo caso (n = 140) foram diagnosticados com CCR e tratados na Liga Norte Riograndense Contra o Câncer (Rio Grande do Norte - Natal). Eles foram recrutados entre os anos de 2012 e 2014. O grupo controle (n = 140) é composto por doadores de sangue do serviço de hemoterapia (Hemovida, Rio Grande do Norte - Natal) que não tiveram diagnóstico de câncer prévio. Eles foram recrutados no ano de 2014.

3.3. Critérios de inclusão e exclusão

O grupo caso do estudo foi composto por indivíduos de ambos os sexos, com a idade superior a 18 anos, com diagnóstico de CCR confirmado por biópsia. Foi excluído do estudo indivíduos com diagnóstico prévio de qualquer outro tipo de neoplasia confirmado por biópsia. O grupo controle foi constituído por doadores de sangue que se autodeclararam livre de câncer prévio, de ambos os sexos e idade acima de 18 anos. Foram excluídos do estudo indivíduos que possuíam qualquer histórico pessoal de neoplasia.

3.4. Coletas das amostras

De todos os indivíduos selecionados para o estudo, foi coletado amostras de sangue periférico (5 mL), utilizando sistema de coleta a vácuo em tubo com EDTA (1mg/mL de

31 sangue). As amostras obtidas do grupo caso foram coletadas no ambulatório da Liga Norte- Riograndense Contra o Câncer e as amostras obtidas do grupo controle foram coletadas de doadores de sangue do Hemovida.

3.5. Extração de DNA

A partir do sangue total conservado em EDTA, foi realizado o isolamento do material genético utilizando o conjunto de reagente de extração de DNA QIAamp DNA Blood (Qiagen), seguindo as orientações do fabricante. O processo de extração do DNA foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL) do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia - UFRN.

3.6. Avaliação da qualidade do DNA extraído

A quantificação do DNA obtido foi determinada por meio do fluorímetro Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, EUA), a fim de se avaliar a concentração de ácidos nucleicos não degradados. A avaliação do grau de pureza foi feita através da relação 260/280 e 260/230, obtidos por meio da absorbância do material genético (260 nm), da absorbância das proteínas (280 nm) e dos eventuais resíduos de solventes orgânicos que podem interferir na amplificação do material genético (230 nm). Esses valores foram obtidos pelo equipamento NanoVue Plus™ UV/Visible Spectrophotometer (GE Healthcare Limited, Little Chalfont, UK). A integridade do DNA foi avaliada através da análise de eletroforese em gel de agarose a 0,8%, a 100 volts, 60 mA, no período de 20 minutos. O revelador utilizado foi o GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain, 10,000X in DMSO (Biotium Inc., Hayward, CA). A análise da qualidade foi realizada no Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL) do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia - UFRN.

3.7. Variáveis coletadas

As variáveis coletadas com a finalidade de descrição da amostra foram as abaixo indicadas. a) Variáveis demográficas e clínicas: - Idade: agrupada em duas categorias (maior que 45 anos e menor ou igual a 45 anos). Obtido com base na idade que o indivíduo possuía na data do diagnóstico. - Gênero: masculino ou feminino.

- Etilismo: eventualmente, frequentemente ou nunca. Obtido por autodeclaração em questionário. - Tabagismo: atualmente, parou ou nunca. Obtido por autodeclaração em questionário. - Atividade física: sim ou não. Obtido por autodeclaração em questionário. - Localização do tumor: cólon ou retossigmóide. Definida pela descrição dos exames de colonoscopia e anatomopatológico presente no prontuário médico. Considera-se reto o segmento até 12 cm da margem anal. - Recidivas: sim ou não. Definida pela descrição dos exames de colonoscopia e anatomopatológico presente no prontuário médico. Considera-se recidiva como o reaparecimento do tumor confirmado por métodos de diagnóstico por imagem, sendo local ou não. - Óbito: sim ou não. Definida pela descrição presente no prontuário médico. b) Variáveis anatomopatológicas: - Estadiamento TNM: utilizou-se a classificação TNM com base nos dados obtidos dos laudos anatomopatológicos arquivados nos prontuários médicos. A classificação foi feita de acordo com a última edição do TNM, proposta pelo American Joint Committe on Cancer (AJCC). Para fins de análise estatística, optamos por agrupar cada componente que compõe o Estadiamento TNM em duas categorias. T: T1-T2, T2-T3 e Tx; N: N0, N1-N2 e Nx; M: M0, M1. O estádio do tumor foi agrupado em quatro categorias: Estádio I; Estádio II; Estádio III e Estádio IV. - Grau de diferenciação: utilizou-se a classificação padronizada no Departamento de Anatomia Patológica da Liga Norte-Riograndense Câncer, que segue a classificação preconizada por Broders (1925), adaptada para 4 categorias. Grau 1 - Bem diferenciado; Grau 2 - Moderadamente diferenciado, Grau 3 - Pouco diferenciado; Grau 4 - Indiferenciada. Para fins de análise estatística, optamos por agrupar os graus 1,2 e 3,4 em duas categorias. Essa variável foi obtida a partir da descrição dos laudos anatomopatológicos arquivados nos prontuários médicos.

3.8. Genotipagem dos polimorfismos

A genotipagem das amostras foi realizada utilizando a técnica de PCR Multiplex para amplificar os 16 marcadores (Tabela 5) investigados simultaneamente.

Tabela 5 – Lista dos polimorfismos analisados neste estudo, o seu dbSNP, conjunto de iniciadores e tamanho do produto de PCR formado. Gene [Var. pb] dbSNP Sequência dos iniciadores (5'...3') Tam. do prod. ACE [289] rs4646994 F – ATCCTGTAAGCCACTGCTGGA 94–382 pb R – GGCGAAACCACATAAAAGTGA

CASP8 [6] rs3834129 F – CTCTTCAATGCTTCCTTGAGGT 249–255 pb R– TGCATGCCAGGAGCTAAGTAT

SGSM3 [4] rs56228771 F – CTAGTAGGCTCCTGGCCTCTTT 117–121 pb R– CAGAACCTTGGACCTGAATAC

CYP2E1 [96] - F– GTCCCAATACAGTCACCTCTTT 397–493 pb R– GGCTTTTATTTGTTTTGCATCTG

CYP19A1 [3] rs11575899 F– TGCATGAGAAAGGCATCATATT 122–125 pb R– AGGCACATTCATAGACAAAAA

HLAG [14] rs371194629 F– TGTTTAAAGTGTCACCCCTCAC 192–206 pb R – CAGTTCAGCATGAGGAAGAGG

IL1A [4] rs3783553 F – TGGTCCAAGTTGTGCTTATCC 230–234 pb R – ACAGTGGTCTCATGGTTGTCA

IL4 [70] rs79071878 F – GGGTCAGTCTGGCTACTGTGT 217–287 pb R – AAATCTGTTCACCTCAACTGC

MDM2 [40] rs3730485 F – GGAAGTTTCCTTTCTGGTAGGC 192–232 pb R – TTTGATGCGGTCTCATAAATTG

NFKB1 [4] rs28362491 F – ATGGACCGCATGACTCTATCA 366–370 pb R – GGCTCTGGCATCCTAGCAG

TP53 [16] rs17878362 F – GGGACTGACTTTCTGCTCTTGT 148–164 pb R– GGACTGTAGATGGGTGAAAAG

TP53 [6] rs17880560 F – TCCATTCATAACTCAGGAACCA 135–141 pb R – TTAAATCCCGTAATCCTTGGTG

TYMS [6] rs151264360*/ F– TCCAAACCAGAATACAGCACA 213–219 pb rs16430 R– TCAAATCTGAGGGAGCTGAGT

UCP2 [45] - F – CCCACACTGTCAAATGTCAACT 119–164 pb R – CCATGCTTTCCTTTTCTTCCT

UGT1A1 [2] rs8175347 F – CTCTGAAAGTGAACTCCCTGCT 135–137 pb R – AGAGGTTCGCCCTCTCCTAT

XRCC1 [4] rs3213239 F– AACCAGAATCCAAAAGTGACC 243–247 pb R– GGGAAGAGAGAGAAGGAGAG dbSNP = Registro da variação genética; Var. pb = Número de pares de bases que varia entre o genótipo da inserção ou deleção. Tam. do Prod. = Tamanho do produto de amplificação; F = Forward; R = Reverse; * = Registro atualizado da Inserção-Deleção, de acordo com o 1000 Genome.

A amplificação foi realizada no termocilador ABI Verity (Life Technologies, Foster City, CA, USA). O assay de genotipagem da PCR utilizado foi o QIAGEN Multiplex-PCR kit (QIAGEN), de acordo com a instrução do fabricante. As amostras foram incubadas a 95ºC

34 por 15 min, seguidos por 35 ciclos de 94ºC por 45 s, 60ºC por 90 s e 72ºC por 1 min, com a extensão final de 70ºC por 30 min. A análise do fragmento do produto da PCR foi realizada utilizando a técnica de eletroforese por capilaridade, 1,0 μL do produto da PCR foi adicionado a 8,5 μL de formamida altamente deionizada (HI-DI Formamide, Life Technologies) e 0,5 μL de GeneScan 500 LIZ size standard (Life Technologies). Os fragmentos do DNA foram separados utilizando o analisador genético ABI PRISM 3130 (Life Technologies) e analisado utilizando o GeneMapper ID v.3.2 software (Life Technologies).

3.9. Análise da ancestralidade relativa por marcadores autossômicos

A ancestralidade relativa por marcadores autossômicos foi realizada de acordo com o método descrito por Santos e colaboradores (2010), utilizando 48 marcadores autossômicos informativo da ancestralidade (AIM, do inglês Ancestry Informative Markers) padronizados e validados. Os marcadores foram selecionados empregando duas principais características: diferença significante na frequência alélica entre a população Africana, Europeia e/ou Ameríndia (≥ 40%); e localizados em diferentes cromossomos; ou em regiões físicas distantes, quando no mesmo cromossomo (SANTOS et al., 2010). A estimação da ancestralidade parental das amostras foi realizada considerando três populações parentais que foi avaliada por Santos e colaboradores (2010): Africana (da Angola, República de Moçambique, República Democrática do Congo, República dos Camerões e a Costa do Marfim), Europeia (principalmente Portugueses) e Nativos Americanos (indivíduos de tribo indígenas da região Amazônica do Brasil). A reação da PCR foi realizada utilizando o sistema multiplex, cada uma das reações contém 16 pares de iniciadores fluorescentes. O produto de amplificação foi analisado por eletroforese, utilizando o sequenciador automático ABI Prism 3130 sequencer e o GeneMapper ID v.3.2 software. A sequência dos iniciadores, as condições de ciclagem da PCR e as condições da eletroforese por capilaridade foi descrito por Santos e colaboradores (2010). A proporção individual dos ancestrais genéticos foi estimada utilizando o STRUCTURE v.2.3.3 software, assumindo a população Europeia, Africana e Ameríndia como as ancestrais.

3.10. Análise estatística

Todas as análises estatísticas e gráficas foram realizadas utilizando o R package v.3.1.2 (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2015). A comparação entre os participantes do grupo caso e controle em relação às variáveis categóricas foram testadas utilizando o teste de Qui-quadrado. As comparações feitas com variáveis contínuas foram realizadas utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney. A análise de regressão logística foi realizada utilizando o SNPassoc package v.1.9-2, para estimar a forma de associação entre cada variação genética e o CCR. O modelo genético adotado para a análise foi o Modelo Aditivo, pois permite verificar a relação entre o alelo e o risco de ter CCR, sem considerar nenhum tipo de dominância ou recessividade. Todos os testes estatísticos foram baseados na probabilidade bicaudal e o valor de p considerado significante foi 0,05.

4. RESULTADOS

4.1. Características demográficas e clínicas

O presente estudo contou com a participação de 140 indivíduos diagnosticados com CCR e 140 indivíduos sem câncer. A tabela 6 mostra as características demográficas dos participantes deste estudo. Os resultados mostraram uma diferença significativa entre os grupos caso e controle em termos de idade, gênero, etilismo e tabagismo.

Tabela 6 – Características demográficas dos participantes. Característica Total n = 280 Casos n = 140 Controles n = 140 Valor de p Idade (anos) 48 (21–93) 59 (23–93) 37 (21–81) < 0,001 < 45 136 (48,7) 23 (16,5) 113 (80,7)

≥ 45 144 (51,3) 116 (83,5) 27 (19,3)

Gênero < 0,001

Masculino 172 (61,6) 62 (44,6) 110 (78,6)

Feminino 108 (38,4) 78 (55,4) 30 (21,4)

Etilismo < 0,001

Nunca 180 (65,1) 118 (85,5) 62 (44,9)

Consome/Consumiu 96 (34,9) 20 (14,5) 76 (55,1)

Eventualmente 56 (20,4) 11 (8,0) 45 (32,6)

Frequentemente 40 (14,5) 9 (6,5) 31 (22,5)

Tabagismo < 0,001

Nunca 182 (65,4) 68 (48,9) 114 (82,0)

Consome/Consumiu 96 (24,6) 71 (48,1) 25 (18,0)

Parou 66 (23,8) 55 (39,6) 11 (7,9)

Ainda consome 30 (10,8) 16 (11,5) 14 (10,1)

Os dados categóricos estão representados por número absoluto de indivíduos (porcentagem) e foi analisado pelo Teste de Qui-quadrado. Os dados contínuos estão representados por media (mínimo – máximo) e foi analisado pelo Teste de Mann-Whitney. Valores de p considerados significativos estão destacados em negritos. Idade = Idade no diagnóstico.

As características clínicas dos pacientes com CCR são listadas na Tabela 7. O sítio do tumor em que houve uma maior prevalência no diagnóstico foi na região retossigmóide (82,1%). Utilizando o sistema de classificação TNM, observou-se predominância de tumor no Estádio III (29,3%).

Tabela 7 – Características clínicas dos pacientes com câncer colorretal no momento do diagnóstico e o tempo de acompanhamento. Característica Casos n = 140 Localização do Tumor

Cólon 25 (17,9) Retossigmóide 115 (82,1) Grau de diferenciamento

G1, G2 130 (92,9) G3, G4 10 (7,1) Profundidade do tumor (T)

T1, T2 1 (0,7) T3, T4 114 (81,4) Tx 25 (17,9) Comprometimento dos linfonodos (N)

N0 72 (51,4) N1, N2 42 (30,0) Nx 26 (18,6) Metástase em órgão distante (M)

M0 106 (75,7) M1 11 (7,9) Mx 23 (16,4) Estadiamento

I 28 (20,0) II 38 (27,1) III 41 (29,3) IV 11 (7,9) Desconhecido 22 (15,7) Ano do diagnóstico 2012 (1996–2014) Acompanhamento desde o diagnóstico (anos) 3 (1–19) Recidivas, Sim 40 (28,6) Tempo em que a recidiva foi diagnosticada após o diagnóstico (anos) 2 (1 – 8) Óbito, Sim 18 (12,86) Tempo em que o paciente foi a óbito após o diagnóstico (anos) 4 (1 – 19) Os dados categóricos estão representados por número absolutos (porcentagem), e os dados contínuos estão representados por mediana (mínimo – máximo). A classificação dos tumors foi realizada seguindo o sistema de classificação do American Joint Committee on Cancer (AJCC).

4.2. Contribuição da ancestralidade relativa por marcadores autossômicos

Em relação à ancestralidade relativa, foi observada diferença significativa na distribuição da contribuição Africana entre os grupos (valor de p = 0,049), Tabela 8. Na Figura 6, observa-se a diferença na contribuição Africana entre o grupo caso-controle.

Entretanto, ao ser realizado uma análise de regressão logística multinominal, não foi encontrada diferença entre os grupos estudados (Tabela 9).

Tabela 8 – Distribuição da contribuição da ancestralidade relativa entre os grupos casos e controles. Contribuição (%) Total n = 280 Casos n = 140 Controles n = 140 Valor de P Européia 65,3 (13,3–92,4) 64,2 (23,6–92,4) 66,4 (13,3–92,3) 0,243 Ameríndia 16,2 (2,1–55,9) 16,0 (2,1–55,9) 16,3 (2,5–49,8) 0,645 Africana 18,5 (2,8–66,0) 19,8 (2,8–61,1) 17,3 (3,0–66,0) 0,049 Os dados contínuos estão representados por media (mínimo – máximo) e foi analisado pelo Teste de Mann-Whitney. Valores de p considerados significativos estão destacados em negritos.

Figura 6 – Gráfico de densidade e de boxplot das três populações parentais contribuintes no perfil genético da população Brasileira (Europeia, Ameríndia e Africana), estratificado em grupos caso e controle. O gráfico foi gerado utilizando a função qplot do pacote ggplot2, no R. 39

Tabela 9 – Distribuição da contribuição da ancestralidade relativa entre os grupos casos e controles estratificados a cada 10%. Contribuição Total Caso Controle OR [IC 95%] Valor de p (%) n = 280 n = 140 n = 140 Europeia 95–80 50 (17,9) 21 (15,1) 29 (20,7) 1,0 [Referência] 80–70 70 (25,1) 33 (23,7) 37 (26,4) 1,23 [0,59–2,56] 0,577 70–60 67 (24,0) 38 (27,3) 29 (20,7) 1,81 [0,86–3,80] 0,117 60–50 47 (16,8) 22 (15,8) 25 (17,9) 1,21 [0,54–2,71] 0,634 50–40 26 (9,3) 14 (10,1) 12 (8,6) 1,61 [0,62–4,18] 0,327 40–30 11 (3,9) 6 (4,3) 5 (3,6) 1,66 [0,45–6,16] 0,451 30–20 7 (2,5) 5 (3,6) 2 (1,4) - - 20–10 1 (0,4) - 1 (0,7) - - Ameríndia 02–10 90 (32,3) 45 (32,4) 45 (32,1) 1,0 [Referência] 10–20 113 (40,5) 60 (43,2) 53 (38,0) 1,13 [0,65–1,97] 0,661 20–30 47 (16,8) 18 (12,9) 29 (20,7) 0,62 [0,30–1,27] 0,193 30–40 21 (7,5) 11 (7,9) 10 (7,1) 1,10 [0,42–2,85] 0,844 40–50 7 (2,5) 4 (2,9) 3 (2,1) - - 50–60 1 (0,4) 1 (0,7) - - - Africana 02–10 81 (29,0) 36 (25,9) 45 (32,1) 1,0 [Referência] 10–20 89 (31,9) 41 (29,5) 48 (34,3) 1,07 [0,58–1,95] 0,832 20–30 66 (23,7) 38 (27,3) 28 (20,0) 1,70 [0,88–3,27] 0,114 30–40 28 (10,0) 15 (10,8) 13 (9,3) 1,44 [0,61–3,42] 0,405 40–50 8 (2,9) 5 (3,6) 3 (2,1) 2,08 [0,47–9,31] 0,337 50–60 5 (1,8) 3 (2,2) 2 (1,4) - - 60–70 2 (0,7) 1 (0,7) 1 (0,7) - - Os dados contínuos estão representados por número absoluto (porcentagem) e analisadas pelo Teste de Qui-quadrado. Valores de p considerados significativos estão destacados em negritos. OR [IC 95%] = Regressão Logística com o intervalo de confiança de 95%.

4.3. Frequência genética e alélica

A frequência genotípica e alélica do grupo caso e controle estão listados na Tabela 10. A frequência genotípica e alélica do polimorfismo no gene IL4 foram significativamente diferentes entre os grupos caso e controle, quando comparado a prevalência de duas e três repetições de 70 pb no intro 3 (valor de p = 0,01 para ambas análises). Além disso, indivíduos do grupo caso apresentaram uma maior frequência de duas repetições de 70 pb do que o grupo controle.

A análise da frequência genotípica e alélica feita nos polimorfismos nos genes ACE [rs4646994], CASP8 [rs3834129], SGSM3 [rs56228771], CYP19A1 [rs11575899], CYP2E1 [INDEL, 96 pb], HLAG [rs371194629], IL1A [rs3783553], MDM2 [rs3730485], NFKB1 [rs28362491], TP53 [rs17878362 e rs17880560], TYMS [rs151264360], UCP2 [INDEL, 45 pb], UGT1A1 [rs8175347] e XRCC1 [rs3213239] não foram diferentemente significativos entre os grupos casos e controles.

4.4. Análise de associação polimórfica

Todas as análises de associação polimórfica foram realizadas pela análise de regressão logística para o modelo aditivo (Tabela 10). O alelo D do polimorfismo estudado no gene IL4, e o alelo I do polimorfismo no gene TYMS, foram associados com o aumento do risco de desenvolver CCR (valor de p = 0,001 e p = 0,0165, respectivamente). A análise feita nos polimorfismos nos genes ACE [rs4646994], CASP8 [rs3834129], SGSM3 [rs56228771], CYP19A1 [rs11575899], CYP2E1 [INDEL, 96 pb], HLAG [rs371194629], IL1A [rs3783553], MDM2 [rs3730485], NFKB1 [rs28362491], TP53 [rs17878362 e rs17880560], UCP2 [INDEL, 45 pb], UGT1A1 [rs8175347] e XRCC1 [rs3213239] não foram diferentemente significativos entre os grupos casos e controles.

Tabela 10 – Frequência genotípica e alélica do grupo caso e controle em porcentagem e a análise da regressão logística para o modelo aditivo.

Caso/Controle (n = 140/140) Gene dbSNP Frequência Genotípica Frequência Alélica OR [IC 95%]f Valor de p II ID DD Valor de p I D Valor de p ACE rs4646994 21,0/14,3 49,3/54,3 29,7/31,4 0,335 45,7/41,4 54,3/58,6 0,315 1,62 [0,91–2,91]d 0,0985 e CASP8 rs3834129 34,5/30,0 46,0/46,4 19,4/23,6 0,605 57,6/53,2 42,4/46,8 0,302 1,22 [0,72–2,07] 0,4554 SGSM3 rs56228771 7,2/3,6 30,2/36,4 62,6/60,0 0,274 22,3/21,8 77,7/78,2 0,883 0,91 [0,47–1,75]d 0,7802 CYP19A1 rs11575899 35,8/37,9 49,6/50,0 14,6/12,1 0,82 60,3/62,9 39,7/37,1 0,83 1,16 [0,64–2,10]e 0,6345 d CYP2E1 - 0,7/0,7 17,3/12,9 82,0/86,4 0,588 9,4/7,1 90,6/92,6 0,342 1,99 [0,80–4,99] 0,1397 HLAG rs371194629 14,7/13,6 43,4/50,0 41,9/36,4 0,538 36,4/38,6 63,6/61,4 0,597 1,14 [0,65–1,96]e 0,6618 IL1A rs3783553 46,0/52,1 38,8/37,9 15,1/10,0 0,368 65,5/71,1 34,5/28,9 0,154 1,42 [0,83–2,45]e 0,1982 e IL4 rs79071878 48,9/60,0 40,3/37,1 10,8/2,9 0,017 69,1/78,6 30,9/21,4 0,01 2,79 [1,48–5,26] 0,001 MDM2 rs3730485 50,4/50,7 43,2/37,1 6,5/12,1 0,219 71,9/69,3 28,1/30,7 0,49 1,37 [0,76–2,47]e 0,3001 NFKB1 rs28362491 38,1/40,7 46,0/42,1 15,8/17,1 0,806 61,2/61,8 38,8/38,2 0,877 1,30 [0,75–2,25]e 0,3483 d TP53 rs17878362 3,6/1,4 27,3/32,1 69,1/66,4 0,383 17,3/17,5 82,7/82,5 0,941 1,13 [0,53–2,42] 0,747 TP53 rs17880560 7,2/7,1 39,6/32,9 53,2/60,0 0,489 27,0/23,6 73,0/76,4 0,857 1,79 [0,98–3,24]d 0,0552 TYMS rs151264360 46,0/42,9 43,9/42,1 10,1/15,0 0,459 68,0/63,9 32,0/36,1 0,311 2,04 [1,11–3,85]d 0,0165 d UCP2 - 6,6/9,3 35,3/44,3 58,1/46,4 0,149 24,3/31,4 75,7/68,6 0,06 0,63 [0,33–1,19] 0,1471 UGT1A1 rs8175347 11,5/10,8 44,6/46,0 43,9/43,2 0,785 33,8/33,8 66,2/66,2 1 0,69 [0,38–1,23]d 0,2043 XRCC1 rs3213239 41,7/42,9 47,5/45,0 10,8/12,1 0,894 65,5/65,4 34,5/34,6 0,978 0,94 [0,53–1,68]e 0,8403 Os dados estão representados como a porcentagem dos pacientes do grupo caso/ porcentagem dos pacientes do grupo controle. O Teste de Qui- quadrado foi o utilizado. Valores de p considerados significativos estão destacados em negritos. dbSNP = Registro da variação genética; OR [IC 95%] = Regressão Logística com o intervalo de confiança de 95%; d = Modelo utilizado para a análise da regressão logística foi o D vs. I; e = Modelo utilizado para a análise da regressão logística foi o I vs. D; f = Ajustado pela idade, gênero, etilismo, tabagismo e distribuição da ancestralidade.

4.5. Análise combinada do genótipo dos genes IL4 e TYMS

A frequência do genótipo combinado do TYMS (rs151264360) e IL4 (rs79071878) entre os grupos caso-controle foram representados na Tabela 11, sendo ainda realizada uma regressão logística para observar o efeito da combinação do genótipo no risco de ter CCR (Tabela 12). As variáveis de ajustes foram idade, gênero, o perfil de ancestralidade e o estilo de vida (tabagismo e etilismo). Na regressão logística, foi associado que a presença de pelo menos 3 alelos de risco (valor de p = 0,002) aumenta o risco de desenvolver CCR.

Tabela 11 – Frequência do genótipo combinando dos genes TYMS (rs151264360) e IL4 (rs79071878) nos grupos caso e controle. Genótipo Combinado Caso Controle IL4 TYMS (n = 140) (n = 140) I/I D/D 8 (5,8) 13 (9,3) I/I D/I* 31 (22,3) 37 (26,4) I/I I/I* 29 (20,9) 34 (24,3) D/I* D/D 4 (2,9) 8 (5,7) D/I* D/I* 22 (15,8) 21 (15,0) D/I* I/I* 30 (21,6) 23 (16,4) D/D* D/D 2 (1,4) 0 (0,0) D/D* D/I* 8 (5,8) 1 (0,7) D/D* I/I* 5 (3,6) 3 (2,1) Os dados categóricos estão representados por número absoluto de indivíduos (porcentagem); * = Presença do Alelo de Risco.

Tabela 12 – Frequência aditiva do alelo de risco no grupo caso e controle para o genótipo combinado dos genes TYMS (rs151264360) e IL4 (rs79071878) e a análise de regressão logística. Variante alélica* Caso Controle OR [IC 95%] Valor de p 0 alelo 8 (5,8) 13 (9,3) 1 [Referência]

1 alelo 35 (25,2) 45 (32,1) 2,24 [0,46 - 10,81] 0,447 2 alelo 53 (38,1) 55 (39,3) 3,42 [0,72 - 16,15] 0,292 3 alelo 38 (27,3) 24 (17,1) 13,81 [2,65 - 72,09] 0,002 4 alelo 5 (3,6) 3 (2,1) 25,81 [2,20 - 303,52] 0,039 Ajustado pela idade, gênero, etilismo, tabagismo e distribuição da ancestralidade. Valores de p considerados significativos estão destacados em negritos. OR [IC 95%] = Regressão Logística com o intervalo de confiança de 95%. * = A presença aditiva do alelo de risco para a variante polimórfica do gene TYMS (rs151264360) e IL4 (rs79071878).

5. DISCUSSÃO

A diferença na incidência e sobrevivência do CCR varia de acordo com o grupo étnico (ROBBINS; SIEGEL; JEMAL, 2012; SONEJI et al., 2010), especialmente na população Americana afrodescendente, que tem a maior incidência de CCR e a menor razão de sobrevivência em 5 anos, quando comparado com outros grupos étnicos (ROBBINS; SIEGEL; JEMAL, 2012; SONEJI et al., 2010), apesar das estratégias de prevenção, de diagnóstico precoce e de tratamento (ATKIN et al., 2010; DOUBENI et al., 2013; MANDEL et al., 1993; NISHIHARA et al., 2013; SCHOEN et al., 2012; U.S. PREVENTIVE SERVICES TASK FORCE, 2008). No presente estudo, foi avaliado a associação de 16 INDEL (ACE, CASP8, SGSM3, CYP19A1, CYP2E1, HLAG, IL1A, MDM2, NFKB1, TP53 [16 e 6 bp], TYMS, UCP2, XRCC1, IL4 e UGT1A1) no risco de desenvolver o CCR na população Brasileira. Este é o primeiro trabalho que busca identificar a associação dos polimorfismos do tipo INDEL nestes genes com o risco de ter CCR em uma população miscigenada. O INDEL no íntron 3 do gene IL4 (rs79071878) e na região 3’-UTR do gene TYMS (rs151264360) foram associados com o risco de CCR. Além disso, foi observado que individualmente estas INDEL conferem um risco moderado ao CCR, mas quando combinados o risco de desenvolver o CCR aumenta consideravelmente. Estes achados são importantes por corroborarem com outros estudos descritos na literatura. A contribuição ancestral também foi avaliada entre o grupo caso e controle da população estudada, sendo o primeiro estudo a realizar este tipo de avaliação em pacientes com CCR na população miscigenada. Foi observado que há diferença significativa na contribuição ancestral Africana entre o grupo caso e controle, sendo tal descoberta consistente com outros estudos que tem sugerido que Americanos afrodescendentes possuem uma maior prevalência de CCR, quando comparado com outros pacientes (CORLEY et al., 2013; LIEBERMAN et al., 2008; WU; LONGSTRETH; NGOR, 2014). Além disso, a diferença de prevalência vai além da diferença socioeconômica, podendo estar associada com aspecto biológico e genético (KUPFER et al., 2010). Entretanto, ao se estratificar a contribuição Africana entre os grupos a cada 10%, essa diferença foi perdida e mais estudos devem ser realizados para confirmar os achados. O trabalho mostrou também que a população estudada possui uma elevada contribuição da população Europeia, bem como outros estudos que exploram a contribuição relativa da ancestralidade em diferentes estados do país, utilizando marcadores no genoma 45

autossômico (MOURA et al., 2015), embora exista algumas variações na estimativa, como mostrado por: Santos e colaboradores (2015) (Africana = 50%; Europeia = 43%; e Ameríndia = 7%, no estado da Bahia), Pinto e colaboradores (2015) (Europeia = 46,1%; Americana = 30,3%; e Africana = 23,6%, no estado do Pará), e Carvalho e colaboradores (2015) (Europeia = 50,5%; Ameríndia = 29,4%; e Africana = 20,4%, no estado do Pará). Carvalho e colaboradores (2015) observou também que o perfil de ancestralidade pode influenciar na susceptibilidade ao câncer. Além disso, Cassiano e colaboradores (2015) demonstrou a influência que a ancestralidade tem sobre a distribuição dos polimorfismos. Variações na atividade da citocina IL-4 têm sido associadas com a proliferação celular, podendo afetar na transdução dos sinais nas vias relacionadas ao câncer (BHAYAL et al., 2015). Neste trabalho, foi avaliado o INDEL de 70 pb no íntron 3 do gene IL4 (rs79071878). Esta variação gênica pode influenciar na produção de sua respectiva citocina, e tem sido associado com o câncer gástrico (BHAYAL et al., 2015) e outras doenças inflamatórias (ANOVAZZI et al., 2010; CABANTOUS et al., 2009). Entretanto, este é o primeiro estudo que indica uma associação entre o polimorfismo rs79071878 e o risco de desenvolver CCR. O aumento na produção da IL-4 pode resultar no escape das células tumorais à vigilância imunológica devido à diminuição da resposta imune celular. A resposta imune celular pode ser inibida pela diminuição da expressão de citocinas relacionadas ao perfil Th1 e por diminuir qualitativamente e quantitativamente a resposta das células T CD8+, no microambiente tumoral (BHAYAL et al., 2015; GAUR et al., 2014; NAKASHIMA et al., 2002). Nakashima e colaboradores (2002) e Amador e colaboradores (2016) observaram que a frequência dos alelos desta INDEL, é diferente entre as populações. Nakashima e colaboradores (2002) observaram também que há uma maior frequência do alelo I em caucasianos e do alelo D em asiáticos (NAKASHIMA et al., 2002). Enquanto que Amador e colaboradores (2016) observaram que o alelo I é mais frequente na população Europeia e o alelo D na população Ameríndia e na Africana. Esses resultados sugerem que a alta frequência do alelo I na população analisada neste estudo pode ter relação com a elevada contribuição da população Europeia e que a diferença genotípica entre o grupo caso-controle. Ademais, esta diferença pode ter sido influenciada pela contribuição genética da população Africana, corroborando com a importância de se realizar mais estudos na população miscigenada.

A análise de regressão logística indicou que o alelo D foi associado com o risco de desenvolver CCR (I vs. D; OR = 2,79; IC 95% = 1,48–5,26), confirmando os dados reportados por Canbantous e colaboradores (2009) e Nakashima e colaboradores (2002). Nakashima e colaboradores (2002) observaram uma diferença significativa na produção do IL-4 entre os genótipos e a proporção de células Th. Além disso, analisaram que o alelo D pode levar ao aumento da expressão desta citocina, sendo confirmados por Canbantous e colaboradores (2009). O gene TYMS atua essencialmente na biossíntese da timina e a sua expressão é requerida no processo de replicação e reparo do DNA (BURDELSKI et al., 2015). A inserção de 6 pb na região 3’-UTR pode influenciar significativamente a expressão do gene (MANDOLA et al., 2004). Estudos indicam que este gene está associado com câncer de mama (GUAN et al., 2015), gástrico (SHEN et al., 2014), colorretal (GALLEGOS- ARREOLA et al., 2008; ZHOU et al., 2012) e outros tipos de neoplasias malignas (SHAW et al., 2013; ZHOU et al., 2012). No presente estudo, não foi observado diferença significativa quando avaliado a frequência alélica e genotípica entre os grupos caso e controle. Entretanto, na população examinada há uma maior prevalência do alelo I. Estes resultados confirmam os achados reportados por Gallegos-Arreola e colaboradores (2008), que comparou 253 pacientes com CRC e 200 controles livres de câncer, no México. A análise de regressão logística do polimorfismo no gene TYMS (rs151264360) indicou que ao alelo I foi associado com o aumento do risco de CCR (D vs. I; OR = 2,04, IC 95% = 1,11–3,85; valor de p = 0,0165), consistente com os resultados de Mandola e colaboradores (2004) e Rahman e colaboradores (2004). Mandola e colaboradores (2004) observaram que essa variação polimórfica pode aumentar a estabilidade do mRNA do gene e a expressão da proteína. Além disso, Rahman e colaboradores (2004) ressaltaram que o aumento da expressão do gene TYMS pode induzir a transformação de células de mamíferos em células com fenótipo maligno. No presente trabalho, também foi avaliado o risco que a combinação genotípica dos genes TYMS (rs151264360) e IL4 (rs79071878) no risco de ter CCR, além de ter sido observado que se faz necessário a presença de pelo menos 3 alelos de risco para conferir risco de ter CCR (OR = 13,81; IC 95% = 2,65–72,09; valor de p = 0,002) e que o risco aumenta com a presença de 4 alelos (OR = 25,81; IC 95% = 2,20–303,52; valor de p = 0,039). Além

disso, nenhum estudo fez tipo de associação, o que abre um leque de possibilidades de análises para validar o achado. O presente estudo foi o primeiro a avaliar o efeito do INDEL no gene ACE (rs4646994) na população Brasileira, e ao fazer a análise de frequência genotípica e alélica, não encontrou diferença significativa. Este resultado corrobora com os achados observados por Nikiteas e colaboradores (2007) (92 casos e 102 controles, na Grécia), Toma e colaboradores (2009) (108 casos e 150 controles, Roménia) e Liu e colaboradores (2011) (241 casos e 299 controles, China). Entretanto, Röcken e colaboradores (2007) notaram que há diferença na expressão do ACE nos pacientes com CCR e que este polimorfismo pode estar associado a diferenças específicas entre o gênero (141 casos e 189 controles, Alemanha). A deleção de 6 pb na região promotora da CASP8 (rs3834129) diminui significantemente a sua expressão, afetando a atividade anti-tumoral dos linfócitos T (PARDINI et al., 2014). Essa variação genética já foi associada com o CCR na população Chinesa (930 casos e 890 controles), apesar de ter baixa penetrância (SUN et al., 2007). Entretanto, assim como no presente estudo, outros estudos de associação realizados na população Han Chinesa (305 caos e 342 controles) (XIAO et al., 2013), do Reino Unido (4016 casos e 3749 controles) (PITTMAN et al., 2008) e no Consorcio EPICOLON entre centros localizados na Espanha, Itália, EUA, Inglaterra, República Checa e Holanda (6733 casos e 7576 controles) (PARDINI et al., 2014) não observaram associação entre o rs3834129 e a susceptibilidade ao CCR. Essa discrepância entre os resultados pode estar relacionada com a diferença específica da população, não só na variação gênica, mas também na interação gene-fatores ambientais. A inserção de 4 bp na região 3'-UTR do SGSM3 (rs56228771) pode afetar a regulação pós-transcricional deste gene, influenciando na sua expressão (WANG et al., 2014b). Este INDEL já foi associado com o efeito protetor contra a susceptibilidade de ter câncer hepático na população Chinesa (502 casos e 513 controles) (WANG et al., 2014b). Contudo, não há estudos sobre o efeito desta INDEL no CCR, sendo necessário mais estudo para validar os achados obtidos neste trabalho. Baseado na importância biológica, a inserção de 96 pb na região flaqueada a 5'-UTR (alelo I) tem sido associado com o risco de CCR por aumentar (QIAN et al., 2013) o nível de transcrição e da atividade da CYP2E1 (HAYASHI; WATANABE; KAWAJIRI, 1991). Essa hipótese tem sido confirmada por diversos estudos realizados em diferentes populações (JIANG et al., 2013; LE MARCHAND et al., 2002; MORITA et al., 2008, 2009; QIAN et

al., 2013; SAMEER et al., 2011). Além do mais, assim como no presente estudo, no trabalho realizado por Silva e colaboradores (2012) não observaram diferença significativa na frequência genotípica e alélica da variação gênica da CYP2E1 entre o grupo caso e controle (131 casos e 206 controles, São Paulo - Brasil). A deleção de 3 pb no íntron 4 da CYP19A1 (rs11575899) está associado com o aumento da produção do estrogênio (CZAJKA-ORANIEC; SIMPSON, 2010) e com a susceptibilidade ao câncer de próstata (HUANG et al., 2007), de mama (DUNNING et al., 2004; KIM et al., 2009), melanoma (ESCOBAR et al., 2016) e leucemia linfoblastica aguda (CARVALHO et al., 2015). Embora a atividade da CYP19A1 possa influenciar no CCR, este trabalho foi o primeiro que avaliou a associação entre esta INDEL (rs11575899) com o risco de CCR. Além disso, não foi possível observar associação desta deleção com o risco de CCR na população Brasileira. Dessa forma, mais estudos devem ser conduzidos para confirmar os achados. A INDEL de 2 pb na região promotora (rs8175347) tem sido associado com uma menor atividade da UGT1A1, quando comparado com 6 repetições (DEMING et al., 2008). Entretanto, esta alteração vem sendo associada com efeitos tóxicos relacionados ao tratamento com fluorouracil (5-FU) e irinotecan (DUFFY, 2015; KIM et al., 2015; LI et al., 2016; SUENAGA et al., 2015), sendo este o primeiro estudo do tipo caso-controle que avalia o risco que esta INDEL tem no desenvolvimento do CCR. Apesar de não ter sido encontrado associação neste trabalho, novos estudos podem ser feitos para consolidar os resultados. A INDEL de 45 pb na região 3'-UTR do gene UCP2 pode afetar a estabilidade do mRNA (ESTERBAUER et al., 2001; LIU et al., 2012); o tempo de meia-vida do mRNA expresso em indivíduos com a inserção de 45 pb é menor dos que tem a deleção (ESTERBAUER et al., 2001). Entretanto, não há estudos relacionando este polimorfismo com o câncer, precisando ser confirmado com outros trabalhos. A INDEL de 14 pb na região 3'-UTR (rs371194629) do HLAG pode influenciar na estabilidade do mRNA onde a presença da inserção está associada com a instabilidade do mRNA e menor produção da proteína (CHEN et al., 2008; ROUSSEAU et al., 2003). Entretanto, não há estudos relacionando este polimorfismo com o CCR, e mais estudos devem ser conduzidos para confirmar os achados. A inserção de 4 pb na região 3'-UTR do gene IL1A (rs3783553) foi associado com o aumento da transcrição deste gene in vitro e in vivo (GAO et al., 2009). Diversos estudos vêm evidenciando que o genótipo homozigoto para a inserção (alelo I) diminui o risco para

diversos tipos de câncers (GAO et al., 2009; HUANG et al., 2016; WANG et al., 2016; YANG et al., 2011; YU et al., 2016; ZHANG et al., 2016). Entretanto, assim como no presente estudo, Yan e colaboradores (2015) não observaram associação desta variação polimórfica com o CCR (142 casos e 124 controles, população Han Chinesa). Ademais, Amador e colaboradores (2016) mostraram que a frequência do rs3783553 varia entre a população Ameríndia, a Africana e a Europeia, sendo o alelo I mais frequente na população Africana e Europeia, o que explica a elevada frequência do alelo I na população estudada no presente trabalho e reforça o efeito da ancestralidade na população miscigenada. Embora não se tenha encontrado associação com o CCR, são necessárias mais pesquisas para confirmar os achados, especialmente em diferentes grupos étnicos. A presença da inserção de 16 pb no íntron 3 no gene TP53 (rs17878362) pode reduzir a concentração basal da expressão deste gene (GEMIGNANI et al., 2004); e o INDEL de 6 pb na região 3'-UTR (rs17880560) afeta a estabilidade do mRNA do TP53, por interferir a regulação pós-transcricional. O rs17878362 tem sido associado com a susceptibilidade de desenvolver diversos tipos de câncer (HU et al., 2010b; SAGNE et al., 2013; VYMETALKOVA et al., 2015), inclusive para o CCR (GEMIGNANI et al., 2004; POLAKOVA et al., 2009). No entanto, não há outros estudos de associação entre rs17880560 com a susceptibilidade ao CCR e apesar de não ter sido encontrado associação neste trabalho, mais estudos devem ser conduzidos para confirmar os achados. Além disso, Sagne e colaboradores (2014) observaram que a presença da variação alélica rs17878362 e rs17880560, em homozigose, aumenta a susceptibilidade ao câncer e que a magnitude do efeito é maior em indivíduos na fase infantil ou adolescente do que na fase adulta. A deleção de 40 pb (alelo D) na região promotora do MDM2 (rs3730485) tem sido reportada por aumentar da susceptibilidade ao câncer (DONG et al., 2012; HASHEMI et al., 2014). Gansmo e colaboradores (2016) observaram que a variante polimórfica rs3730485 tem associação com o CCR (1532 casos e 3746 controles, população da Noruega), divergindo dos achados encontrados no presente estudo. Assim, se fazem necessárias mais pesquisas para confirmar a associação deste INDEL com a susceptibilidade ao CCR, especialmente em diferentes grupos étnicos. A INDEL de 4 pb na região flanqueada a 5'-UTR (rs3213239) pode afetar a expressão do XRCC1. Indivíduos homozigotos para a deleção de 4 pb foram associados com o risco de desenvolver Leucemia de células B (CARVALHO et al., 2015). Entretanto, não há estudos prévios de associação deste INDEL com o CCR. Apesar de não ter sido observado associação

entre a variante rs3213239 com a susceptibilidade de ter CCR, mais estudos devem ser conduzidos para confirmar os resultados. A INDEL de 4 pb na região promotora (rs28362491) no gene NFKB1 (ZHOU et al., 2010) pode impactar na ligação da proteína nuclear, levando a redução da atividade promotora (KARBAN et al., 2004) e está associada com o risco de ter câncer (WANG et al., 2011; YANG et al., 2014), assim como no CCR (ANDERSEN et al., 2010; MOHD SUZAIRI et al., 2013). Entretanto, a associação entre rs28362491 e o CCR têm sido divergente em alguns estudos (KOPP et al., 2015), sugerindo que o efeito que este polimorfismo tem na susceptibilidade ao câncer pode variar entre grupos étnicos e tipos específicos de câncer (YANG et al., 2014). Ademais, Amador e colaboradores (2016) mostraram que a frequência do rs28362491 varia entre a população Ameríndia, a Africana e a Europeia, sendo o alelo D mais frequente na população Ameríndia e Africana, o que explica a elevada frequência do alelo I na população estudada no presente trabalho e reforça o efeito da ancestralidade na população miscigenada. Apesar de não ter sido observado associação entre a variante rs3213239 com a susceptibilidade de ter CCR neste trabalho, mais estudos devem ser conduzidos para confirmar os achados.

6. CONCLUSÃO

No presente estudo, foi observado que os polimorfismos nos genes IL4 (rs79071878) e TYMS (rs151264360) estão associados com o aumento do risco de desenvolver CCR. Além disso, foi observado que individualmente estas INDEL conferem um risco moderado ao CCR, mas quando combinados o risco de desenvolver o CCR aumenta consideravelmente.

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ANEXO

Anexo A – Parecer do Comitê de Ética

III

APÊNDICE

Apêndice A – Questionário Questionário Nº:____

Projeto de Pesquisa: TODOS CONTRA O CÂNCER COLORRETAL - BUSCA PELO DIAGNÓSTICO PRECOCE

Pesquisadora Responsável: ______Data inclusão: _____ / _____ / _____

I PARTE: Identificação do Sujeito da Pesquisa Nome do voluntário: Sexo: M F Prontuário LNRCC: Data de nascimento: / / Endereço: Nº: Bl: apto: Bairro: Cidade: CEP: Telefone: e-mail:

II PARTE: Parâmetros Socio-econômico

01. Nacionalidade (País): ______(Brasileiro, italiano, espanhol , português, francês, etc) 02. Naturalidade (Cidade): ______

03. Raça/Cor: ( )BRANCA ( )NEGRA ( )PARDO ( )AMARELA ( )INDÍGENA ( )MESTIÇO

04. Qual Profissão exerce atualmente? ______

III PARTE: Parâmetros Clínicos pessoais e familiar

01. Apresenta alguma(s) destas Doenças?

( ) OBESIDADE Tratado? Sim ( ) Não ( ) ( ) DIABETES Tratado? Sim ( ) Não ( ) ( ) HIPERTENSÃO Tratado? Sim ( ) Não ( ) ( ) DISLIPIDEMIA Tratado? Sim ( ) Não ( ) ( ) HIPERTIREOIDISMO Tratado? Sim ( ) Não ( ) ( ) HIPOTIREOIDISMO Tratado? Sim ( ) Não ( ) ( ) DOENÇA ENAL Qual? ______( ) DOENÇA HEPÁTICA Qual? ______( ) DOENÇA PULMONAR Qual? ______( ) DOENÇA INFLAMATÓRIA CRÔNICA Qual? ______( ) INFECÇÃO Qual? ______( ) CÂNCER Qual? ______( ) ANEMIA Qual? ______( ) VIROSE Qual? ______( ) ALERGIA Qual? ______( ) PARASITOSE Qual? ______( ) ALTERAÇÃO DAS FEZES Qual? ______( ) SANGUE NO PAPEL HIGIÊNICO Qual frequência?______( ) PROBLEMA DE PRISÃO DE VENTRE ( ) DIARRÉIA CONSTANTE Qual frequência?______( ) PERÍODO MENSTRUAL ( ) NÃO APRESENTA NENHUMA DOENÇA OU DESCONHECE

02. Tem História Familiar de alguma(s) destas Doenças? ( ) OBESIDADE ( ) DIABETES Quem? ______( ) HIPERTENSÃO ARTERIAL SISTÊMICA Quem? ______DISLIPIDEMIA (Aumento de colesterol, ( ) Quem? ______triglicerídeos ou redução de HDL) ( ) HIPER ou HIPOTIREOIDISMO Quem? ______( ) FALECIDO POR CÂNCER Quem? ______( ) OUTRAS Qual? ______( ) NÃO APRESENTA HISTÓRIA FAMILIAR DE NENHUMA DOENÇA OU DESCONHECE

03. Faz uso de algum medicamento? SIM( ) NÃO( ) (Se SIM) Qual(is)? ______

04. Tem prisão de ventre/ dificuldade de evacuar? SIM( ) NÃO( ) Que frequencia? ______

05. Tem cólicas abdominais? SIM( ) NÃO( ) Que frequencia? ______

06.Já observou sangue nas fezes? SIM( ) NÃO( ) Que frequência? ______

07. Notou alguma mudança no aspecto das suas fezes ? SIM( ) NÃO( ) Qual e que frequência? ______

08. Já realizou o exame de colonoscopia? SIM( ) NÃO( ) (Se SIM) Por quê? ______Quantas vezes?______

IV PARTE: Parâmetros Físicos e Alimentares

01. Costuma praticar algum tipo de exercício? SIM( ) NÃO( ) (Se SIM) Qual (is)? ______

Com que frequência? ( )TODOS OS DIAS ( ) DE 3 A x POR SEMANA ( ) MENOS DE TRÊS x / SEMANA Duração do exercício: ( ) 30 MINUTOS ( ) 1 HORA ( ) MAIS DE 1 HORA

02. Exame Físico a) Pressão Arterial:____x___mmHg b) Peso:______Kg c) Altura:______metros

03. Faz uso de bebida alcoólica? ( ) TODOS OS DIAS ( )2 A 3x POR SEMANA ( )1x POR SEMANA ( )RARÍSSIMAS VEZES ( )NÃO

04. Fuma? SIM( ) NÃO( ) PAROU DE FUMAR( ) (Se SIM) Quantos cigarros por dia?______Há quanto tempo fuma?______Idade que começou a fumar? ______(Se PAROU DE FUMAR) Parou á quanto tempo?______

05. Você se considera uma pessoa: ( )CALMA ( )ESTRESSADA/IRRITADA ( )POUCO ANCIOSA/NERVOSA ( )MUITO ANCIOSA/NERVOSA

VII

Apêndice B – Ficha de dados clínicos

CÂNCER COLORRETAL – FICHA DE DADOS CLÍNICOS ID: Data de nascimento: ____/____/____ Prontuário: Nome completo: Sexo:

Idade do diagnóstico: Data da cirurgia: ____/____/____ Data do laudo: ____/____/____

Localização: ( ) Ceco ( ) Ascendente ( ) Transverso ( ) Descendente ( ) Sigmóide ( ) Reto

Classificação histológica (OMS): Tumor epitelial 1. ( ) Adenoma a. ( ) Tubular b. ( ) Viloso c. ( ) Tubuloviloso d. ( ) Serrado

2. ( ) Neoplasia intraepitelial (Displasia) a. ( ) Glandular de baixo grau b. ( ) Glandular de alto grau

3. ( ) Carcinoma a. ( ) Adenocarcinoma b. ( ) Adecocarcinoma c. ( ) Carcinoma de d. ( ) Carcinoma de muscinoso célula em anel-Signet pequenas células e. ( ) Carcinoma de f. ( ) Carcinoma g. ( ) Carcinoma h. ( ) Carcinoma célula escamosa adenoescamoso medular indiferenciado i. ( ) Outros:

Grau de diferenciação: ( ) Bem ( ) Moderado ( ) Pobre ( ) Indiferenciado

Estadiamento: _____ T _____ N _____ M Se houver presença de mestástase, especificar: ( ) Local ( ) Distante ______

Outro tumor primário: ( ) Não ( ) Sim Local / Idade: ______

VIII

Apêndice C – Resumos apresentados em congressos

RESUMOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS

SANTOS, DMC; COSTA, LRF; COSTA, LLF; OLIVEIRA, KM; PINTO, PDC; RIBEIRO- DOS-SANTOS, AKC; SANTOS, SEB; SILBIGER, VN; LUCHESSI, AD. Ancestry distribution effect on allelic frequency of NFKB1 (rs28362491) in Brazilian population. In: 45ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2016, Natal/RN. SANTOS, DMC; COSTA, LRF; COSTA, LLF; CORREA, RS; BORGES, AMP; ITO, FR; RAMOS, CCO; RIBEIRO-DO-SANTOS, AKC; SANTOS, SEB; BORTOLIN, RH; LUCHESSI, AD; SILBIGER, VN. Association of IL4 (rs79071878) and TYMS (rs51264360) polymorphism with colorectal câncer (CRC) risk in Brazilian populations. In: 45ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2016, Natal/RN. ARAÚJO, JNG; SANTOS, ICC; SANTOS, DMC; GENRE, J; TRINDADE, RL; RAMOS, CCO; SILBIGER, VN; LUCHESSI, AD. Genetic markers of predisposition to thyroid câncer: a pilot study in Rio Grande do Norte. In: 45ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2016, Natal/RN. SANTOS, DMC; COSTA, LRF; COSTA, LLF; PINTO, PDC; LUCHESSI, AD; SANTOS, SEB; RIBEIRO-DOS-SANTOS, AKC; SILBIGER, VN. Evaluation combined of IL4 and TYMs genes in CRC risk. In: XXVIII Congresso Brasileiro de Genética Médica/ I Congresso Latino Americano de Genética Humana/ II Congresso Brasileiro de Enfermagem em Genética e Genômica, 2016, Belém do Pará/PA. Anais do XXVIII Congresso Brasileiro de Genética Médica, Oncogenética, 2016.

1 Apêndice D – Manuscrito do artigo produzido durante o mestrado

2 Manuscript Type: Research Article

3 Reference: IEEE

4 Association of IL4 (rs79071878) and TYMS (rs51264360) Polymorphisms with

5 Colorectal Cancer (CRC) Risk in Brazilian Population: a Case-Control Study

7 Diego Marques1,2,5, Layse Raynara Ferreira Costa1,2, Lorenna Larissa Ferreira Costa1,2,

8 Romualdo da Silva Correa3, Aline Maciel Pinheiro Borges3, Fernanda Ribeiro Ito3,

9 Carlos Cesar de Oliveira Ramos4, Raul Hernandes Bortolin2, André Ducati Luchessi1,2,

10 Andrea Kely Campos Ribeiro dos Santos5, Sidney Emanuel Batista dos Santos5, Vivian

11 Nogueira Silbiger1,2*

12 1Laboratório de Bioanálise e Biotecnologia Molecular, Universidade Federal do Rio

13 Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil; 2Departamento de Análises

14 Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio

15 Grande do Norte, Brazil; 3Departamento de Cirurgia Oncológica, Liga Norte

16 Riograndense Contra o Câncer, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil; 4Laboratorio de

17 Patologia e Citopatologia, Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, Natal, Rio Grande

18 do Norte, Brazil; 5Laboratório de Genética Humana e Médica, Universidade Federal do

19 Pará, Belém, Pará, Brazil.

20 * Corresponding to: Vivian Nogueira Silbiger, Professor, Departamento de Análises

21 Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio

22 Grande do Norte, Brazil. Av. General Gustavo Cordeiro de Faria S/N, Petrópolis,

23 59012-570 - Natal - RN, Brazil. [email protected]. Telephone: +55 84 3342

24 9807, Fax: +55 84 3342 9833.

26 ABSTRACT

27 BACKGROUND: Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in men

28 and the second in women, worldwide. Among several mutations that may occur in the

29 human DNA, the influence of Insertion-Deletions (INDEL) on cancer risk. Few studies

30 have been developed in admixed population, such as Brazil. The understanding about

31 INDEL are important for profiling genetic variations within genomes because they may

32 cause human diseases, including CRC, by modifying coding region or mRNA stability.

33 The aim of this study was to perform a case-control study to determine the association

34 between CRC risk and 14 INDEL and 2 Variable Number Tandem Repeat (VNTR)

35 polymorphisms in genes involved in apoptosis signaling (CASP8 [rs3834129]),

36 GTPase-activating (SGSM3 [rs56228771]), steroids metabolism (CYP2E1 [96 bp],

37 CYP19A1 [rs28892005], and UGT1A1 [rs8175347]), immune system (HLAG

38 [rs371194629], IL1A [rs3783553], IL4 [rs79071878], and NFKB1 [rs28362491]),

39 MDM2-P53 pathway (MDM2 [rs3730485] and TP53 [rs17878362 and rs17880560]),

40 DNA replication and repair (TYMS [rs151264360] and XRCC1 [rs3213239]) and

41 angiogenesis (UCP2 [45 bp] and ACE [rs4646994]) in a population from Rio Grande do

42 Norte state (Northeast Region of Brazil). Moreover, it was also evaluated the autosomal

43 ancestry distribution between cases and controls, considering that the Brazilian

44 population is genetically influenced by many ethnic groups. METHODS: The research

45 participants were chosen based on a case-control study design, of which 140 individuals

46 were patients with CRC and 140 were cancer-free individuals from Rio Grande do

47 Norte state, Brazil. The polymorphisms and ancestry distribution were typed by

48 Multiplex-PCR using the ABI PRISM 3130 and analyzed with GeneMapper ID v3.2.

49 Statistical analysis was performed using R v3.1. RESULTS: The studied groups had

50 homogeneous ancestry distribution. Moreover, logistic regression analysis showed that

51 polymorphism variations in IL4 (p-value=0.001) and TYMS (p-value=0.0165) genes

52 were associated with increased CRC risk. CONCLUSION: In summary, in this case-

53 control study, we showed that IL4 (rs79071878) and TYMS (rs151264360) were

54 associated with increase in CRC risk. This is the first study about the relation of these

55 polymorphisms with CRC in Brazilian population and it demonstrated to be a promising

56 research field. In addition, further population-based association studies should be

57 performed in other admixed groups to increase the knowledge about CRC

58 carcinogenesis.

59 Key words: Admixed population; Potential biomarker; Colorectal cancer;

60 Insertion-deletion polymorphism; INDEL; Variable Number Tandem polymorphism;

61 VNTR; Risk association

XII

77 BACKGROUND

78 According to GLOBOCAN [1], colorectal cancer (CRC) is the third most

79 common cancer type in men and the second in women, worldwide. It is estimated that,

80 in 2015, more than 1.4 million new cases of CRC were diagnosed and there were 750

81 thousand cases of death due to this type of cancer. In addition, an increase of 13.6% in

82 the number of patients diagnosed with CRC and an increase of 8.5% in the number of

83 death cases from CRC are expected for 2020 [1].

84 In the regional context, GLOBOCAN [1] also estimated that, in 2015, more than

85 34 thousand new patients with CRC were diagnosed in Brazil and about 17 thousand

86 patients with CRC will die. In addition, these predictions are estimated to increase by

87 28.6% and 29.7%, respectively, in 2020 [1].

88 The interaction between environment and genetic factors is strongly associated

89 with carcinogenesis [2], [3]. These factors are wide and vary according to the cancer

90 geographic regions [4]. However, the inherited susceptibility is a major component of

91 CRC predisposition, with an estimated 12–35% risk attributed to genetic factors [5]–[7].

92 Among several mutations that may occur in the human DNA such as

93 substitution, insertion, and deletion [8]. The second most abundant form of genetic

94 variation in humans, after Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), are the Insertion-

95 Deletions (INDEL) [9].

96 The understanding about INDEL are important for profiling genetic variations

97 within genomes [10], [11] because they may alter human traits and cause human

98 diseases [9], [12], including CRC [13], by modifying the coding region [9], [12] or

99 mRNA stability [14].

XIII

100 Some pathways have been involved with carcinogenesis process, like as

101 apoptosis signaling [15], GTPase-activating [16], steroids metabolism [17], [18],

102 immune system [19], MDM2-P53 pathway [20], DNA replication and repair [21] and

103 angiogenesis [22].

104 Among genes involved in these pathways, recent studies have described the

105 effect of mutant allele in ACE [23], CASP8 [24], SGSM3 [25], CYP19A1 [24], CYP2E1

106 [26], HLAG [27], IL1A [28], IL4 [29], MDM2 [30], NFKB1 [31], TP53 [32], TYMS [33],

107 UCP2 [34], UGT1A1 [35], and XRCC1 [36] polymorphisms with the risk of cancer

108 development.

109 Furthermore, allele frequency varies among different populations [37], and few

110 studies have been developed in admixed populations, such as Brazil. In addition,

111 ancestry distribution in an admixed population may influence cancer development

112 susceptibility [24], [38] and impact on the polymorphism distribution [39].

113 Thus, the aim of this study was to perform a case-control study to determine the

114 association between CRC risk and 16 polymorphisms (14 INDEL and 2 Variable

115 Number Tandem Repeat (VNTR)) in genes involved in apoptosis signaling (CASP8),

116 GTPase-activating (SGSM3), steroids metabolism (CYP2E1, CYP19A1, and UGT1A1),

117 immune system (HLAG, IL1A, IL4, and NFKB1), MDM2-P53 pathway (MDM2 and

118 TP53), DNA replication and repair (TYMS and XRCC1) and angiogenesis (UCP2 and

119 ACE) in a population from Rio Grande do Norte state (in the Northeast Region of

120 Brazil). Moreover, the autosomal ancestry distribution between cases and controls was

121 also evaluated, considering that the Brazilian population is genetically influenced by

122 many ethnic groups.

123

124

XIV

125 METHODS

126 Ethics statement

127 The protocol used in this study was approved by the Committee for Research

128 Ethics of Liga Norte Riograndense Contra o Câncer (Rio Grande do Norte, Brazil). All

129 participants signed informed written consent prior to providing a blood sample.

130

131

132 Cases and controls

133 The research participants were chosen based on a case-control study design. The

134 patients in the case group (n = 140) were diagnosed with CRC as primary cancer and

135 treated in Liga Norte Riograndense Contra o Câncer (Rio Grande do Norte state,

136 Brazil). They were recruited between 2012 and 2014. The control subjects were blood

137 donors who self-declared being cancer-free (n = 140) from the hemotherapy service

138 (Hemovida, Rio Grande do Norte, Brazil) and were recruited in 2014.

139 Peripheral blood samples and questionnaire answers were collected from all

140 subjects. Clinicopathological data from the patients with CRC were obtained by

141 consulting the patients’ clinical charts.

142

143 DNA extraction and quantification

144 Genomic DNA was extracted by using a DNA extraction commercial kit,

145 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany), and quantified with Qubit®

146 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

147

148 Polymorphism analysis

149 Multiplex polymerase chain reaction (PCR) was used to simultaneously amplify

150 the 16 investigated markers, as shown in Table 1.

151 The amplification was performed on an ABI Verity thermocycler (Life

152 Technologies, Foster City, CA, USA). The PCR based genotyping assay used a

153 QIAGEN Multiplex-PCR kit (QIAGEN) according to the manufacturer’s instructions.

154 The samples were incubated at 95C for 15 min, followed by 35 cycles at 94C for 45 s,

155 60C for 90 s, and 72C for 1 min, with a final extension at 70C for 30 min. For

156 fragment analysis using capillary electrophoresis, 1.0 μL of PCR product was added to

157 8.5 μL of HI-DI deionized formamide (Life Technologies) and 0.5 μL of GeneScan 500

158 LIZ pattern size standard (Life Technologies). DNA fragments were separated by using

159 the ABI PRISM 3130 genetic analyzer (Life Technologies) and analyzed by using the

160 GeneMapper ID v.3.2 software (Life Technologies).

161

162 Analysis of genetic ancestry

163 Ancestry analysis was performed according to the method described by Santos et

164 al. [40] using 48 autosomal ancestry informative markers (AIMs). Three multiplex real

165 time-PCR reactions of 16 markers were performed and the amplicons were analyzed by

166 electrophoresis using the ABI Prism 3130 sequencer and GeneMapper ID v.3.2

167 software. The individual proportions of European, African, and Amerindian genetic

168 ancestries were estimated using STRUCTURE v.2.3.3 software, assuming three parental

169 populations (European, African, and Amerindian).

170

171 Statistical analysis

172 All statistical analysis and plotting were performed with the R package v.3.1.2

173 [41]. The comparisons between case and control participants in relation to the

XVI

174 categorical variables were tested in pairs by Chi-squared test. For the comparison of

175 ancestry index among the samples and age at diagnosis, we used Mann-Whitney test.

176 Logistic regression analyses were, performed by SNPassoc package v.1.9-2, carried out

177 to estimate additive model ORs and their 95% CIs were used to determine the

178 association strength between each genetic variation and CRC risk. All statistical tests

179 were based on a two-tailed probability and p-value < 0.05 was considered significant.

180

181

182 RESULTS

183 Demographic and clinical characteristics

184 We analyzed 140 subjects with CRC and 140 cancer-free individuals. Table 2

185 shows the demographic features of the groups. The case group was mainly composed of

186 females, while the control group had a higher proportion of males. The results showed a

187 statistically significant difference between the case and control groups in term of age at

188 diagnosis, gender and tobacco consumption. Regarding genomic ancestry, significance

189 was observed regarding African subjects (p-value = 0.049), Table 3. However, when

190 performed an analysis of multinomial logistic regression, there was no difference

191 between groups.

192 The clinical characteristics of the patients with CRC are listed in Table 4. The

193 first diagnosed prevalence was cancer in the rectosigmoid site (82.1%). Using the

194 guidelines of The American Joint Committee on Cancer (AJCC) staging system to

195 classify clinical and pathologic staging, the predominance of stage III (29.3%) is shown.

196 Additionally, they were followed-up for up to 18 years (median: 3 years).

197

198 Distribution of genotypes associated with susceptibility to CRC

XVII

199 Genotypic and allelic frequencies of the subjects are presented in the Table 5.

200 Genotypic frequency (p-value = 0.01) and allelic frequency (p-value = 0.01) of IL4 gene

201 polymorphism were significantly different between cases and controls when comparing

202 the prevalence of two (D) and three (I) tandem repeats of 70 bp in intron 3. Patients with

203 CRC presented higher frequency of two tandem repeats than the controls.

204 All analyses of polymorphism association were performed by logistic regression

205 analyses to the additive model (Table 5). The adjusted variables were age at diagnosis,

206 gender, alcohol consumption, tobacco consumption and ancestry distribution. Allele D

207 of the studied polymorphism in the IL4 gene was associated with an increased risk of

208 CRC development (p-value = 0.001). The allele insertion in the TYMS gene was also

209 associated with increased risk of developing CRC (p-value = 0.0165).

210 No statistical significance was detected when polymorphisms in ACE, CASP8,

211 CYP2E1, SGSM3, CYP19A1, HLAG, IL1A, MDM2 NFKB1, TP53 [16 and 6 bp], UCP2,

212 UGT1A1, and XRCC1 genes were analyzed using single and multiple logistic

213 regression.

214

215 DISCUSSION

216 Despite effective strategies for prevention, early detection, and treatment, [42]–

217 [47] there continue to differences in CRC incidence and survival by ethnicity [48], [49].

218 Specifically, African Americans have higher CRC incidence and lower 5-years survival

219 rates than other ethnic groups [48], [49].

220 In the present study, we evaluated the association between 14 INDEL (ACE,

221 CASP8, SGSM3, CYP19A1, CYP2E1, HLAG, IL1A, MDM2, NFKB1, TP53 [16 and 6

222 bp], TYMS, UCP2, and XRCC1) and 2 VNTR (IL4 and UGT1A1) and the risk of

223 developing CRC in a Brazilian population. To the best of our knowledge, this is the first

XVIII

224 study attempting to identify the association of these INDEL and VNTR polymorphisms

225 with CRC in this admixed population.

226 We observed that the VNTR polymorphisms in intron 3 of the IL4 gene

227 (rs79071878) and INDEL in the 3-untranslated region (UTR) of TYMS gene

228 (rs151264360) were associated with an increased risk of CRC. This is especially

229 important because it corroborates with other studies performed in different populations.

230 This study also evaluated the ancestry contribution of all subjects. Our results

231 showed that the cases and controls were significance different in relation to African

232 ancestry contribution. This finding is consistent with others studies have also suggested

233 that African Americans patients may have a higher prevalence of CRC compared with

234 others patients [50]–[52], and may have genetic association [53]. However, when

235 stratifying the African contribution between the groups every 10%, this difference was

236 lost; and more studies should be conducted to confirm the findings.

237 Studies exploring the relative contribution of ancestry in Brazilian populations

238 through autosomal genomics also showed higher European contribution across all

239 regions of the country [54], despite some variations in their estimations, as shown by

240 Santos et al. [55] (African = 50%, European = 43%, and Amerindian = 7% in Bahia

241 state), Pinto et al. [56] (European = 46.1%, American = 30.3%, and African = 23.6% in

242 Pará state), and Carvalho et al. [24] (European = 50.5%, American = 29.4%, and

243 African = 20.4% in Pará state).

244 In addition, Carvalho et al. [24] observed that ancestry distribution may

245 influence the susceptibility to cancer development and Cassiano et al. [39]

246 demonstrated that ancestry distribution impact on the distribution of gene

247 polymorphisms.

XIX

248 Variations in the IL-4 activity or in the IL-4 receptor due to mutations have been

249 associated with cell proliferation and might affect signal transduction pathways in

250 cancer [29]. We evaluated the VNTR of two and three tandem repeats of 70 bp in intron

251 3 of the IL4 gene (rs79071878), a variation that may influence the production of this

252 cytokine, and has been associated with gastric cancer [29] and other immunologic

253 diseases [57], [58]. However, this is the first study indicating an association between

254 this IL4 polymorphism and the risk of developing CRC.

255 Furthermore, higher IL-4 production may result in the escape of tumor cells

256 from immune surveillance due to diminished cell-mediated immune response. The cell-

257 mediated immune response may be inhibited by downregulating the expression of Th1

258 cytokines and by decreasing the quantity and quality of the CD8+ T-cell response in the

259 tumor microenvironment [29], [59], [60].

260 We showed a high frequency of the VNTR three tandem repeat allele in patients

261 with CRC (I = 0.69, I/I = 0.49, and I/D = 0.40) and controls (I = 0.79, I/I = 0.60, and I/D

262 = 0.37). Nakashima et al. [59] showed that allele and genotype frequency of this VNTR

263 in Japanese and Caucasian populations were strikingly different.

264 Moreover, allele D was more prevalent in Japanese (D = 0.67, D/D = 0.45, and

265 I/D = 0.45, 216 participants) than in Caucasian subjects (D = 0.09, D/D = 0, and I/D =

266 0.18, 246 participants) [59]. These results suggest that the higher frequency of allele I in

267 our population may be related to the high Caucasian contribution, confirmed by Amador

268 et al [61].

269 The logistic regression analysis indicated that the D allele was associated with

270 the risk of developing CRC (I vs. D, OR = 2.79, 95% CI = 1.48–5.26) and are consistent

271 with the data reported by Canbantous et al. [58] and Nakashima et al. [59].

272 Nakashima et al. [59] observed significant differences among genotypes in the

273 IL-4 producing proportion of peripheral Th cells using an intracellular cytokine

274 detection assay and that the D allele may lead to IL-4 overexpression. These results

275 were confirmed by Canbantous et al. [58].

276 The TYMS gene plays an essential role in the biosynthesis of the DNA-

277 component thymidylate (dTTP) and is required for DNA replication and repair [62].

278 The insertion of 6 bp in the 3-UTR of TYMS primary transcript (rs151264360) may

279 significantly influence gene expression as shown by using a luciferase assay [14].

280 Studies indicate that it is associated with breast [63], gastric [64], colorectal [65], [66],

281 and other types of cancer [65], [67].

282 In our study, no statistical significance was observed when analyzing the

283 prevalence of allele (p-value = 0.311) and genotype (p-value = 0.459) polymorphisms

284 between the cases and controls. However, insertion polymorphism was more prevalent

285 in cases (I = 0.68, I/I = 0.46, and D/I = 0.44) and controls (I = 0.64, I/I = 0.43, and D/I =

286 0.42). These results were according with the findings reported by Gallegos-Arreola et

287 al. [66], who compared 253 patients with CRC and 200 controls from Mexico.

288 The logistic regression indicated that insertion of 6bp was associated with

289 increased CRC risk development (D vs. I, OR = 2.04, 95% CI = 1.11–3.85, p-value =

290 0.0165), consistent with Mandola et al. [14] and Rahman et al. [68] in vitro results.

291 Mandola et al. [14] demonstrated that this polymorphism insertion may increase

292 TYMS mRNA stability and TYMS protein expression. Moreover, Rahman et al. [68]

293 showed that TYMS overexpression may induce the transformation of mammalian cells

294 into a malignant phenotype.

295

296 CONCLUSIONS

XXI

297 In summary, in this case-control study, we showed that polymorphisms in IL4

298 (rs79071878) and TYMS (rs151264360) genes were associated with increase in CRC

299 risk. This is the first study about these polymorphisms with CRC in the Brazilian

300 population and demonstrated to be a promising research field.

301

302 DATA AVAILABILITY

303 Data are available upon request to the corresponding author.

304

305 DECLARATIONS

306 Abbreviations:

307 CRC - Colorectal Cancer; SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms; INDEL -

308 Insertion-Deletions; ACE - Angiotensin I Converting Enzyme; CASP8 - Caspase 8,

309 Apoptosis-Related Cysteine Peptidase; SGSM3 - Small G Protein Signaling Modulator

310 3; CYP19A1 - Cytochrome P450, Family 19, Subfamily A, Polypeptide 1; CYP2E1 -

311 Cytochrome P450, Family 2, Subfamily E, Polypeptide 1; HLAG - Major

312 Histocompatibility Complex, Class I, G; IL1A - Interleukin 1, Alpha; IL4 - Interleukin

313 4; MDM2 - MDM2 Proto-Oncogene, E3 Ubiquitin Protein Ligase; NFKB1 - Nuclear

314 factor of Kappa Light Polypeptide Gene Enhancer in B-Cells 1; TP53 - Tumor Protein

315 P53; TYMS - Thymidylate Synthetase; UCP2 - Uncouplin Protein 2 (Mitochondrial,

316 Proton Carrier); UGT1A1 - UDP Glucuronosyltransferase 1 Family, Polypeptide A1;

317 XRCC1 - X-Ray Repair Complementing Defective Repair in Chinese Hamster Cells 1;

318 VNTR - Variable Number Tandem Repeat; II - Insertion Homozygous Genotype; ID -

319 Heterozygous Genotype; DD - Deletion Homozygous Genotype; OR - Odds Ratio; 95%

320 CI - Confidence Interval

321

XXII

322 Competing interests:

323 The authors declare that they have no competing interests.

324

325 Author contributions:

326 AKCRS, SEBS, ADL, and VNS conceived of the study, and participated in its

327 design and coordination. DM, LRFC and LLFC carried out the experiments. DM,

328 SEBS, RSC, AMPB, FRI, CCOR and VNS performed the statistical analysis. VNS,

329 ADL, RHB SEBS and AKCRS contributed reagents/materials/analysis tools. DM, VNS

330 e RHB helped to draft the manuscript. All authors read and approved the final

331 manuscript.

332

333 Acknowledgments:

334 We thank all participants who allowed us to carry out this study. We are also

335 grateful to the students and technicians from LGHM/UFPA/PA and LBBM-

336 LABMULT/UFRN/RN. DM, LLFC, and RHB were recipients of fellowships from

337 CAPES, and LRFC was the recipient of a fellowship from CNPq during this study.

338

339 Funding:

340 VNS received financial support by CNPq (protocol 483031/2013-5), and

341 FAPERN (protocol 005/2011). AKCRS received financial support by CAPES (protocol

342 051/2013) and FAPESPA (protocol 155/2014). The funders had no role in study design,

343 data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

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XXXI

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XXXII

632 Table 1. List of polymorphisms analyzed in this study and its dbSNP, primers 633 sequence, and amplicon length. Amplicon Gene [variation bp] dbSNP Primers sequence (5'...3') length ACE [318 bp] rs4646994 F – ATCCTGTAAGCCACTGCTGGA 94–382 bp R – GGCGAAACCACATAAAAGTGA

CASP8 [6 bp] rs3834129 F – CTCTTCAATGCTTCCTTGAGGT 249–255 bp R– TGCATGCCAGGAGCTAAGTAT

SGSM3 [4 bp] rs56228771 F – CTAGTAGGCTCCTGGCCTCTTT 117–121 bp R– CAGAACCTTGGACCTGAATAC

CYP2E1 [96 bp] - F– GTCCCAATACAGTCACCTCTTT 397–493 bp R– GGCTTTTATTTGTTTTGCATCTG

CYP19A1 [3 bp] rs28892005 F– TGCATGAGAAAGGCATCATATT 122–125 bp R– AGGCACATTCATAGACAAAAA

HLAG [14 p] rs371194629 F– TGTTTAAAGTGTCACCCCTCAC 192–206 bp R – CAGTTCAGCATGAGGAAGAGG

IL1A [4 bp] rs3783553 F – TGGTCCAAGTTGTGCTTATCC 230–234 bp R – ACAGTGGTCTCATGGTTGTCA

IL4 [70 bp]a, b rs79071878 F – GGGTCAGTCTGGCTACTGTGT 217–287 bp R – AAATCTGTTCACCTCAACTGC

MDM2 [40 bp] rs3730485 F – GGAAGTTTCCTTTCTGGTAGGC 192–232 bp R – TTTGATGCGGTCTCATAAATTG

NFKB1 [4 bp] rs28362491 F – ATGGACCGCATGACTCTATCA 366–370 bp R – GGCTCTGGCATCCTAGCAG

TP53 [16 bp] rs17878362 F – GGGACTGACTTTCTGCTCTTGT 148–164 bp R– GGACTGTAGATGGGTGAAAAG

TP53 [6 bp] rs17880560 F – TCCATTCATAACTCAGGAACCA 135–141 bp R – TTAAATCCCGTAATCCTTGGTG

TYMS [6 bp] rs151264360 F– TCCAAACCAGAATACAGCACA 213–219 bp R– TCAAATCTGAGGGAGCTGAGT

UCP2 [45 bp] - F – CCCACACTGTCAAATGTCAACT 119–164 bp R – CCATGCTTTCCTTTTCTTCCT

UGT1A1 [2 bp]a, c rs8175347 F – CTCTGAAAGTGAACTCCCTGCT 135–137 bp R – AGAGGTTCGCCCTCTCCTAT

XRCC1 [4 bp] rs3213239 F– AACCAGAATCCAAAAGTGACC 243–247 bp R– GGGAAGAGAGAGAAGGAGAG

634 dbSNP = Register of genetic variation; bp = Base pairs; F = Forward; R = Reverse; a = 635 Variable Number Tandem Repeat (VNTR); b = Two and Three Tandem Repeat of 70 636 bp; c = Six and Seven Tandem Repeat of 2 bp. 637 638 639

640 Table 2. Participant demographic and clinical characteristics and their 641 stratification by case and control groups. Characteristic Total n = 280 Cases n = 140 Controls n = 140 p-value Age (years) 48 (21–93) 59 (23–93) 37 (21–81) < 0.001 < 45 136 (48.7) 23 (16.5) 113 (80.7)

≥ 45 144 (51.3) 116 (83.5) 27 (19.3)

Gender < 0.001

Male 172 (61.6) 62 (44.6) 110 (78.6)

Female 108 (38.4) 78 (55.4) 30 (21.4)

Alcohol cons. < 0.001

Never 180 (65.1) 118 (85.5) 62 (44.9)

Already 96 (34.9) 20 (14.5) 76 (55.1)

Eventually 56 (20.4) 11 (8.0) 45 (32.6)

Frequently 40 (14.5) 9 (6.5) 31 (22.5)

Tobacco cons. < 0.001

Never 182 (65.4) 68 (48.9) 114 (82.0)

Already 96 (24.6) 71 (48.1) 25 (18.0)

Former 66 (23.8) 55 (39.6) 11 (7.9)

Current 30 (10.8) 16 (11.5) 14 (10.1)

642 643 Categorized data are presented by absolute numbers of individuals (percentage) and 644 analyzed by chi-square test. Continuous data are presented by mean (min–max) and 645 analyzed by Mann-Whitney test. Significant p-values are shown in bold. Age = Age at 646 diagnosis; Alcohol cons. = Alcohol consumption; Tobacco cons. = Tobacco 647 consumption.

648 Table 3. Genetic ancestry distribution between case and control groups. Genetic Total Cases Controls OR [95% CI] p-value ancestry (%) n = 280 n = 140 n = 140 European 65.3 (13.3–92.4) 64.2 (23.6–92.4) 66.4 (13.3–92.3) 0.243

95–80 50 (17.9) 21 (15.1) 29 (20.7) 1.0 [Reference]

80–70 70 (25.1) 33 (23.7) 37 (26.4) 1.23 [0.59–2.56] 0.577 70–60 67 (24.0) 38 (27.3) 29 (20.7) 1.81 [0.86–3.80] 0.117 60–50 47 (16.8) 22 (15.8) 25 (17.9) 1.21 [0.54–2.71] 0.634 50–40 26 (9.3) 14 (10.1) 12 (8.6) 1.61 [0.62–4.18] 0.327 40–30 11 (3.9) 6 (4.3) 5 (3.6) 1.66 [0.45–6.16] 0.451 30–20 7 (2.5) 5 (3.6) 2 (1.4) 3.45 [0.61–19.54] 0.161 20–10 1 (0.4) - 1 (0.7) -

Amerindian 16.2 (2.1–55.9) 16.0 (2.1–55.9) 16.3 (2.5–49.8) 0.645

02–10 90 (32.3) 45 (32.4) 45 (32.1) 1.0 [Reference]

10–20 113 (40.5) 60 (43.2) 53 (37.9) 1.13 [0.65–1.97] 0.661 20–30 47 (16.8) 18 (12.9) 29 (20.7) 0.62 [0.30–1.27] 0.193 30–40 21 (7.5) 11 (7.9) 10 (7.1) 1.10 [0.42–2.85] 0.844 40–50 7 (2.5) 4 (2.9) 2 (2.1) 2.00 [0.35–11.47] 0.437 50–60 1 (0.4) 1 (0.7) - -

African 18.6 (2.8–66.0) 19.8 (2.8–61.1) 17.3 (3.0–66.0) 0.049

02–10 81 (29.0) 36 (25.9) 45 (32.1) 1.0 [Reference]

10–20 89 (31.9) 41 (29.5) 48 (34.3) 1.07 [0.58–1.95] 0.832 20–30 66 (23.7) 38 (27.3) 28 (20.0) 1.70 [0.88–3.27] 0.114 30–40 28 (10.0) 15 (10.8) 13 (9.3) 1.44 [0.61–3.42] 0.405 40–50 8 (2.9) 5 (3.6) 3 (2.1) 2.08 [0.47–9.31] 0.337 50–60 5 (1.8) 3 (2.2) 2 (1.4) 1.87 [0.30–11.83] 0.504 60–70 2 (0.7) 1 (0.7) 1 (0.7) 1.25 [0.07–20.68] 0.876 649 Categorized data are presented by absolute numbers of individuals (percentage) and 650 analyzed by chi-square test. Continuous data are presented by mean (min–max) and 651 analyzed by Mann-Whitney test. Significant p-values are shown in bold. 652 653 654 655

656 Table 4. Clinical characteristics of patients with CRC at diagnosis and follow-up. Characteristics Cases n = 140 Tumor localization

Colon 25 (17.9) Rectosigmoid 115 (82.1) Tumor grade

G1, G2 130 (92.9) G3, G4 10 (7.1) Depth of invasion

T1, T2 1 (0.7) T3, T4 114 (81.4) Tx 25 (17.9) Lymph node involvement

N0 72 (51.4) N1, N2 42 (30.0) Nx 26 (18.6) Distant metastasis

M0 106 (75.7) M1 11 (7.9) Mx 23 (16.4) AJCC stage

Stage I 28 (20.0) Stage II 38 (27.1) Stage III 41 (29.3) Stage IV 11 (7.9) Unknown 22 (15.7) Year of diagnostic 2012 (1997–2014) Follow-up since diagnosis (years) 3 (1–18) Relapse, Yes 40 (28.6) Relapse since diagnosis (years) 2 (1 – 8) Death, Yes 8 (5.7) Death since diagnosis (years) 4 (2 – 4) 657 Categorized data are presented by absolute numbers (percentage) and continuous data 658 are presented as median (min–max). Tumors were classified according to the guidelines 659 of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) staging system. 660 661 662 663

Table 5. Genotype and allele frequency in percentage of patients with CRC and controls. Caso/Controle (n = 140/140) Gene dbSNP Genotype frequency Allele frequency OR [95% CI]f p-value II ID DD p-value I D p-value ACE rs4646994 21.0/14.3 49.3/54.3 29.7/31.4 0.335 45.7/41.4 54.3/58.6 0.315 1.62 [0.91–2.91]d 0.0985

CASP8 rs3834129 34.5/30.0 46.0/46.4 19.4/23.6 0.605 57.6/53.2 42.4/46.8 0.302 1.22 [0.72–2.07]e 0.4554

SGSM3 rs56228771 7.2/3.6 30.2/36.4 62.6/60.0 0.274 22.3/21.8 77.7/78.2 0.883 0.91 [0.47–1.75]d 0.7802

CYP19A1 rs11575899 35.8/37.9 49.6/50.0 14.6/12.1 0.82 60.3/62.9 39.7/37.1 0.83 1.16 [0.64–2.10]e 0.6345

CYP2E1 - 0.7/0.7 17.3/12.9 82.0/86.4 0.588 9.4/7.1 90.6/92.6 0.342 1.99 [0.80–4.99]d 0.1397

HLAG rs371194629 14.7/13.6 43.4/50.0 41.9/36.4 0.538 36.4/38.6 63.6/61.4 0.597 1.14 [0.65–1.96]e 0.6618

IL1A rs3783553 46.0/52.1 38.8/37.9 15.1/10.0 0.368 65.5/71.1 34.5/28.9 0.154 1.42 [0.83–2.45]e 0.1982

IL4a, b rs79071878 48.9/60.0 40.3/37.1 10.8/2.9 0.017 69.1/78.6 30.9/21.4 0.01 2.79 [1.48–5.26]e 0.001

MDM2 rs3730485 50.4/50.7 43.2/37.1 6.5/12.1 0.219 71.9/69.3 28.1/30.7 0.49 1.37 [0.76–2.47]e 0.3001

NFKB1 rs28362491 38.1/40.7 46.0/42.1 15.8/17.1 0.806 61.2/61.8 38.8/38.2 0.877 1.30 [0.75–2.25]e 0.3483

TP53 rs17878362 3.6/1.4 27.3/32.1 69.1/66.4 0.383 17.3/17.5 82.7/82.5 0.941 1.13 [0.53–2.42]d 0.747

TP53 rs17880560 7.2/7.1 39.6/32.9 53.2/60.0 0.489 27.0/23.6 73.0/76.4 0.857 1.79 [0.98–3.24]d 0.0552

TYMS rs151264360 46.0/42.9 43.9/42.1 10.1/15.0 0.459 68.0/63.9 32.0/36.1 0.311 2.04 [1.11–3.85]d 0.0165

UCP2 - 6.6/9.3 35.3/44.3 58.1/46.4 0.149 24.3/31.4 75.7/68.6 0.06 0.63 [0.33–1.19]d 0.1471

UGT1A1a, c rs8175347 11.5/10.8 44.6/46.0 43.9/43.2 0.785 33.8/33.8 66.2/66.2 1 0.69 [0.38–1.23]d 0.2043

XRCC1 rs3213239 41.7/42.9 47.5/45.0 10.8/12.1 0.894 65.5/65.4 34.5/34.6 0.978 0.94 [0.53–1.68]e 0.8403 Data are presented as the percentage of patients with CRC/percentage of controls. Chi-square test. Significant p-values are shown in bold. dbSNP = Register of genetic variation on NCBI database; bp = Base pairs of DNA sequence; a = Variable Number Tandem Repeat (VNTR); b = Two (D) and Three (I) Tandem Repeat of 70 bp; c = Six (D) and Seven (I) Tandem Repeat of 2 bp; d = D vs. I; e = I vs. D; f = Adjusted by age, gender, alcohol consumption, tobacco consumption and ancestry distribution.