Analyse Der Expression Der Humanen Induzierbaren NO-Synthase (Inos)
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Analyse der Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase (iNOS) Einfluss der 5’-UTR auf die Expression der humanen iNOS und Expression der humanen iNOS in Modellen der neuronalen Differenzierung Dissertation zur Erlangung des Grades „Doktor der Naturwissenschaften“ im Promotionsfach Chemie am Fachbereich Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Fabian Matthias Gather geb. am 24.12.1988 in Neuss Mainz, 2019 Dekan: 1. Berichterstatter: 2. Berichterstatterin: Tag der mündlichen Prüfung: 21.02.2020 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG Die vorgelegte Dissertation wurde von September 2015 bis November 2019 am Institut für Pharmakologie der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz zur Erlangung des Grades „Doktor der Naturwissenschaften“ angefertigt. Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und nur mit den angegebenen Hilfsmitteln angefertigt habe. Diese Dissertation wurde noch nicht als Prüfungsarbeit für eine andere Prüfung eingereicht. Zudem wurden bisher weder die gleiche noch Teile der Abhandlung als Dissertation bei einer anderen Fakultät oder einem anderen Fachbereich eingereicht. Ort, Datum Fabian Matthias Gather „Der Mensch muss das Gute und Große wollen! Das Übrige hängt vom Schicksal ab.“ Alexander von Humboldt INHALTSVERZEICHNIS Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................... V Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... IX Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... XI Zusammenfassung ....................................................................................................... XVII Abstract ......................................................................................................................... XIX 1 Theoretischer Teil .................................................................................................... 1 1.1 Einleitung .......................................................................................................................... 1 1.2 Regulation der Genexpression .......................................................................................... 1 1.2.1 Transkriptionelle Genregulation .............................................................................. 1 1.2.2 Post-transkriptionelle Genregulation ...................................................................... 3 1.2.3 Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) ............................................................... 8 1.3 Die induzierbare NO-Synthase ........................................................................................ 11 1.3.1 Die Struktur der iNOS ............................................................................................. 12 1.3.2 Regulation der iNOS-Expression ............................................................................ 15 1.4 Neuronale Differenzierung ............................................................................................. 19 1.4.1 NO in der neuronalen Entwicklung ........................................................................ 21 2 Zielsetzung ............................................................................................................. 24 3 Material ................................................................................................................. 25 3.1 Laborgeräte ..................................................................................................................... 25 3.2 Verbrauchsmaterialien ................................................................................................... 27 3.3 Puffer, Lösungen und Reagenzien .................................................................................. 27 3.3.1 Reagenzien ............................................................................................................ 27 3.3.2 Puffer und Lösungen .............................................................................................. 29 3.3.3 Kits ......................................................................................................................... 32 3.3.4 Cytokine ................................................................................................................. 33 3.3.5 Marker ................................................................................................................... 33 3.3.6 Enzyme ................................................................................................................... 33 3.3.7 Oligonukleotide ..................................................................................................... 34 3.3.8 Plasmide ................................................................................................................ 37 3.3.9 Antikörper .............................................................................................................. 40 3.4 Bakterien ......................................................................................................................... 40 3.5 Zellen ............................................................................................................................... 40 I Inhaltsverzeichnis 4 Methoden .............................................................................................................. 43 4.1 Zellbiologische Arbeitsmethoden .................................................................................. 43 4.1.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen ........................................................................ 43 4.1.2 Kryokonservierung und Rekultivierung eukaryoter Zellen .................................... 43 4.1.3 Bestimmung der Lebendzellzahlen ....................................................................... 44 4.1.4 Transiente Transfektion eukaryoter Zellen mit Plasmid-DNA............................... 44 4.1.5 Stabile Transfektion eukaryoter Zellen mit Plasmid-DNA ..................................... 45 4.1.6 Knockout und Knockdown von Genen ................................................................... 46 4.1.7 Stimulation eukaryotischer Zellen ......................................................................... 51 4.1.8 Analyse der mRNA-Stabilität mit Hilfe von DRB ................................................... 51 4.2 Molekularbiologische Arbeitsmethoden ........................................................................ 52 4.2.1 Klonierung von DNA-Fragmenten in Plasmide...................................................... 52 4.3 Proteinbiochemische Arbeitsmethoden ........................................................................ 62 4.3.1 Proteinextraktion aus Zellen ................................................................................. 62 4.3.2 Photometrische Quantifizierung nach Bradford ................................................... 62 4.3.3 Proteinfällung mit Methanol/Chloroform............................................................. 63 4.3.4 Immundetektion mittels Western Blot-Analyse .................................................... 64 4.3.5 Luciferase-Assay .................................................................................................... 66 4.4 RNA-Analysen ................................................................................................................. 67 4.4.1 Isolierung von RNA aus Zellen ............................................................................... 67 4.4.2 Photometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren ............................................ 67 4.4.3 DNAse-Verdau ....................................................................................................... 68 4.4.4 Reverse Transkription ........................................................................................... 68 4.4.5 quantitative Real-Time-PCR .................................................................................. 70 4.4.6 5’-RACE zur Bestimmung des 5’-Endes der mRNA ................................................ 73 4.5 Bioinformatische Untersuchen ...................................................................................... 76 4.6 Statistik ........................................................................................................................... 76 5 Ergebnisse .............................................................................................................. 77 5.1 Phylogenetische Analyse des iNOS-Gens ....................................................................... 77 5.2 Bestimmung des TSS mittels 5’-RACE ............................................................................ 80 5.3 Translatierbarkeit des uORF ........................................................................................... 84 5.4 Funktion des uORF in der 5’-UTR der iNOS .................................................................... 87 5.4.1 Mutation des uORF-ATG hat keinen Einfluss auf die Expression eines Reportergens ......................................................................................................... 87 5.4.2 cap-Abhängigkeit der Translation des iNOS-Transkripts ...................................... 89 5.4.3 iNOS-5’-UTR enthält keine IRES ............................................................................ 93 5.4.4 Einfluss