Izolácia Obsahových Látok Z Frakcií Získaných Z Plodov Paulownia Tomentosa

FARMACEUTICKÁ FAKULTA

Izolácia obsahových látok z frakcií získaných z plodov Paulownia tomentosa

Diplomová práca

MIRIAMA DUPĽÁKOVÁ

Vedúci práce: prof. PharmDr. Karel Šmejkal, Ph.D.

Konzultant: PharmDr. Lenka Molčanová

Ústav přírodních léčiv Program: Farmacie

Brno, jar 2021

Bibliografický záznam

Autorka: Miriama Dupľáková Farmaceutická fakulta Masarykova univerzita Ústav přírodních léčiv Názov práce: Izolácia obsahových látok z frakcií získaných z plodov Paulownia tomentosa Študijný program: Farmacie Vedúci práce: prof. PharmDr. Karel Šmejkal, Ph.D. Konzultant: PharmDr. Lenka Molčanová Akademický rok: 2020/2021 Počet strán: 130 Kľúčové slová: Paulownia tomentosa, Flavonoidy, Mnohopočetná lieková rezistencia (MDR), ABC liekové efluxné transportéry, Chromatografické metódy

Anotácie

Predkladaná diplomová práca sa v teoretickej časti zaoberá flavonoidmi, ktoré by mohli inhibíciou efluxných púmp zvrátiť mnohopočetnú liekovú rezistenciu a zvýšiť účinnosť chemoterapie. Medzi najvýznamnejšie efluxné pumpy, ktoré sa podieľajú na vzniku rezistencie nádorových buniek k cytostatickej liečbe patria P-gp, MRP1 a BCRP,a preto sa práca zaoberá hlavne týmito efluxnými transportérmi. V práci je priblížený rýchlorastúci strom Paulownia tomentosa (Paulowniaceae), ktorý je bohatý na obsah flavonoidov, hlavne geranylovaných. V experimentálnej časti práce je popísaná izolácia a identifikácia látok z frakcie PT3K, ktorá pochádza z chloroformového podielu etanolového extraktu plodov P. tomentosa. Frakcie boli separované pomocou rôznych chromatografických metód. Identifikácia bola prevedená pomocou UV/VIS spektrofotometrie, IČ, HRMS, NMR spektrometrie a cirkulárneho dichroizmu, pomocou ktorého bola určená absolútna konfigurácia látky. Po preparatívnej HPLC bola získaná jedna čistá látka, ktorú sanám podarilo plne identifikovať ako tomentón B. Bibliographic record

Author: Miriama Dupľáková Faculty of Pharmacy Masaryk University Department of Natural Drugs Title of Thesis: Isolation of content compounds from fruits of Paulownia tomentosa Degree Programme: Pharmacy Supervisor: prof. PharmDr. Karel Šmejkal, Ph.D. Consultant: PharmDr. Lenka Molčanová Academic Year: 2020/2021 Number of Pages: 130 Keywords: Paulownia tomentosa, flavonoids, multidrug resistance, ABC drug efflux transporters, chromatographic methods

Annotation

The theoretical part of the diploma thesis deals with flavonoids that could reverse multidrug resistance and increase the effectiveness of chemotherapy by inhibiting efflux pumps. P-gp, MRP1 and BCRP are among the most important efflux pumps that are involved in the development of resistance of tumor cells to cytostatic treatment, therefore this thesis is mainly focused on these efflux transporters. Part of work is focused on fast growing tree Paulownia tomentosa (Paulowniaceae) rich in flavonoids, especially that geranylated. The experiment describes the isolation and identification of substances from PT3K fraction that was obtained from chloroform portion of the ethanolic extract of P. tomentosa fruits. The fractions were separated by various chromatographic methods. The identification of the obtained compounds was performed by UV/VIS spectrophotometry, IR, HRMS, NMR spectrometry and circular dichroism, which determined the absolute configuration of the substance. Using preparative HPLC we isolated and identified one pure substance – tomentone B. Vyhlásenie

Vyhlasujem, že som predloženú diplomovú prácu vypracovala samostatne len s použitím uvedenej literatúry a prameňov.

Miriama Dupľáková Poďakovanie

Touto cestou by som sa chcela poďakovať môjmu vedúcemu diplomovej práce prof. PharmDr. Karlovi Šmejkalovi, Ph.D. (Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Masarykova univerzita) za jeho vedenie a cenné rady. Moja veľká vďaka patrí mojej školiteľke PharmDr. Lenke Molčanovej (Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Masarykova univerzita) za jej odborné vedenie, trpezlivosť, poznatky a pripomienky, ktoré mi boli nápomocné pri tvorbe celej práce. Rada by som sa jej poďakovala tiež za meranie a vyhodnocovanie čistej látky pomocou identifikačných metód. Obsah

Úvod 1

I Teoretická časť 3

1 Mnohopočetná lieková rezistencia4 1.1 Typická a atypická MDR ...... 6

2 ABC liekové efluxné transportéry7 2.1 P-glykoproteín (ABCB1) ...... 8 2.2 Proteín spojený s mnohopočetnou liekovou rezistenciou (MRP1/ ABCC1)9 2.3 Proteín rezistencie na rakovinu prsníka (BCRP/ABCG2) ...... 11

3 Flavonoidy, ktoré inhibujú efluxné pumpy 13 3.1 Efluxná pumpa MRP1 ...... 23 3.2 Efluxná pumpa P-glykoproteín ...... 29 3.3 Efluxná pumpa BCRP ...... 41

4 Paulownia tomentosa Steud. 50 4.1 Taxonomická klasifikácia ...... 51 4.2 Pôvod a geografický výskyt ...... 51 4.3 Morfológia ...... 52 4.4 Tradičné využitie ...... 53 4.5 Obsahové látky ...... 54

5 Cieľ práce 55

II Experimentálna časť 56

6 Materiál a metódy 57 6.1 Rastlinný materiál ...... 57 6.2 Chemikálie ...... 57 6.3 Materiál pre chromatografiu ...... 58 6.4 Prístroje ...... 58 6.5 Separačné metódy ...... 59 6.6 Identifikačné metódy ...... 62

7 Pracovný postup 64 7.1 Vzorka PT3K ...... 64 7.2 Určenie mobilnej fázy pre stĺpcovú chromatografiu ...... 64 7.3 Separácia vzorky PT3K stĺpcovou chromatografiou ...... 65 7.4 Spojenie frakcií stĺpcovej chromatografie ...... 66 7.5 Výber metódy pre preparatívnu HPLC frakcia PT3K/13-15 ...... 67 7.6 Výber metódy pre preparatívnu HPLC frakcia PT3K/26-28 ...... 68

8 Výsledky 70 8.1 Analýza získaných frakcií ...... 70 8.2 Identifikácia látky získanej z frakcie PT3K/13-15/2 ...... 73

9 Diskusia 78

10 Záver 82

Bibliografia 83

Zoznam použitých skratiek 93

Prílohy 97

A HPLC chromatogram ghost píkov zo systému 98

B Prehľad flavonoidov, ktoré boli testované na inhibíciu efluxných púmp 99 Zoznam tabuliek

2.1 Podrodiny ľudských génov ABC 8 3.1 Isoflavóny, ktoré inhibujú efluxné pumpy 15 3.2 Flavóny, ktoré inhibujú efluxné pumpy 17 3.3 Syntetizované flavóny testované na inhibíciu BCRP 18 3.4 Syntetizované deriváty chryzínu, ktoré inhibujú efluxné pumpy 19 3.5 Flavanóny, ktoré inhibujú efluxné pumpy 21 3.6 Séria flavonoidov, ktoré inhibujú MRP1 24 3.7 Účinky icaritínu (63) 30 3.8 Účinky baicaleínu (23) 32 3.9 Účinky izoprenylovaných derivátov chryzínu na akumuláciu DNM 39 3.10 Účinky derivátov 2,3-dehydrosilybínu na inhibíciu P-gp 41 3.11 Účinky flavónov na inhibíciu BCRP 43 3.12 Vzťah štruktúry a aktivity flavonoidov na inhibíciu BCRP 44 3.13 Účinky série flavonoidov na inhibíciu BCRP 46 3.14 Inhibícia efluxnej pumpy BCRP polyfenolmi 47 3.15 Účinnosť syntetizovaných benzoflavónov na inhibíciu BCRP 48 3.16 Syntetizované flavóny a ich inhibičný potenciál voči BCRP 49 4.1 Taxonomická klasifikácia P. tomentosa 51 6.1 Metóda 1 pre analytickú HPLC 60 6.2 Metóda 2 pre analytickú HPLC 60 6.3 Metóda 3 pre analytickú HPLC 60 6.4 Metóda 4 pre preparatívnu HPLC 61 6.5 Metóda 5 pre preparatívnu HPLC 62 7.1 Hmotnosť frakcií spojených na základe TLC a HPLC 66 8.1 Hmotnosť frakcií získaných z preparatívnej HPLC 70 Zoznam obrázkov

1.1 Hlavné mechanizmy vzniku získanej MDR 5 2.1 Štruktúra transportného P-glykoproteínu 9 2.2 Štruktúra multirezistentného proteínu 1 (MRP1) 11 2.3 Štruktúra transportého proteínu BCRP 12 3.1 Všeobecná základná štruktúra flavonoidov a ich podtried 13 3.20 Inhibícia MRP1 spôsobená 8-prenylnaringenínom (106) 25 3.21 Vplyv flavonoidov na akumuláciu 3H-DNM a 3H-VBL v bunkách Panc-1 26 3.22 Účinok icaritínu (63) na akumuláciu ADR 31 3.23 Účinok baicaleínu (23) na akumuláciu rhodamínu 123 v bunkách MCF-7/ADR 32 3.24 Účinky silymarínu (112) a biochanínu A (3) na akumuláciu VBL a 3H-digoxínu v bunkách Caco-2 33 3.25 Účinky biochanínu A (3), morínu (60), silymarínu (112) a phloretínu (119) na akumuláciu daunomycínu v bunkách MDA435/LCC6 34 3.26 Účinky quercetínu (19) na akumuláciu kalceínu 35 3.27 Účinky extraktu z K. parviflora na akumuláciu rhodamínu 123 a daunorubicínu 36 3.28 Účinky 3,5,7,3´,4´-pentametoxyflavónu (41) na akumuláciu daunorubicínu 37 3.29 Účinky wogonínu (61) na akumuláciu kalceínu v bunkách HL-60 38 3.30 Súhrn štruktúrnych znakov ovlyvňujúcich inhibíciu BCRP 42 3.31 Vplyv substitúcie na inhibíciu BCRP 45 3.32 Vplyv rôznych substituentov benzoflavónov na inhibíciu BCRP 47 4.1 Paulownia tomentosa 50 4.2 Paulownia tomentosa– kvety, kôra, listy a plody 53 7.1 HPLC chromatogram vzorky PT3K 64 7.2 TLC vzorky PT3K 65 7.3 Kolóna stĺpcovej chromatografie 66 7.4 HPLC chromatogram vzorky PT3K/13-15 pri 280 nm 67 7.5 HPLC chromatogram vzorky PT3K/26-28 pri 280 nm 67 7.6 Chromatogram preparatívnej HPLC vzorky PT3K/13-15 68 7.7 Chromatogram preparatívnej HPLC vzorky PT3K/26-28 69 8.1 Chromatogram analytickej HPLC vzorky PT3K/13-15/1 71 8.2 Chromatogram analytickej HPLC vzorky PT3K/13-15/2 71 8.3 Chromatogram analytickej HPLC vzorky PT3K/26-28/2 72 8.4 Chromatogram analytickej HPLC vzoriek PT3K/26-28/3 a PT3K/26-28/4 73 8.5 Knižnica látok izolovaných z Paulownia tomentosa 74 8.6 HPLC chromatogram spoločného nástreku vzorky PT3K/13-15/2 a štandardu tomentónu B 74 8.7 IČ spektrum vzorky PT3K/13-15/2 75 8.8 HRMS spektrum látky PT3K/13-15/2 v pozitívnom móde 76 8.9 HRMS spektrum látky PT3K/13-15/2 v negatívnom móde 76 Úvod

Nádorové ochorenia predstavujú globálne vážne zdravotné riziko pre populáciu na celom svete, a to potvrdzuje aj fakt, že po kardiovaskulárnych ochoreniach sú druhou najčastejšou príčinou smrti. Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) uvádza, že v roku 2018 spôsobili nádorové ochorenia približne 9,6 milióna úmrtí. Medzi najčastejšie nádorové ochorenia patrí rakovina pľúc, prostaty, hrubého čreva, žalúdka, pečene a rakovina krčka maternice a štítnej žľazy, ktoré sú typické u žien [1], [2]. Jeden z hlavných problémov liečby nádorových ochorení (chemoterapie) sa týka nepredvídateľnosti terapeutických účinkov v dôsledku toho, že rakovinové bunky zís- kavajú rezistenciu voči liekom a prírodným produktom, ktoré sa na liečbu používajú. Tento jav je známy ako mnohopočetná lieková rezistencia (MDR), ktorá je hlavným dôvodom vysokej úmrtnosti na nádorové ochorenia. Jedným z najbežnejších mechanizmov, ako nádor získava rezistenciu, je indukcia a aktivácia efluxu ABC transportnými proteínmi. Tento mechanizmus ovplyvňuje transmembránovú rovnováhu liečiva na úrovni plazmatickej membrány. Zvýšená expresia týchto ABC transportných proteínov vedie k zníženiu akumulácie liečiva v bunke, a teda k výraznému zníženiu až zlyhaniu účinnosti chemoterapie. Onkológia nevyhnutne potrebuje novú účinnú terapiu, ktorá dokáže prekonať MDR s použitím tolerovateľných dávok [3], [4]. Látky prírodného pôvodu mali vždy svoje nezastupiteľné miesto v liečbe rozličných ochorení. Tradícia v používaní prírodných látok a ich deklarované úspechy podnietili štú- dium účinných látok herbálneho pôvodu a moderné metódy biochémie a farmakológie umožnili ich chemickú identifikáciu a exaktné testovanie. Látky s protinádorovým účin- kom boli zistené v stovkách rastlín, po určení ich chemickej štruktúry sa stali predmetom štúdia a inšpiráciou pre vhodnú modifikáciu ich molekuly, čo umožnilo ich klinickú aplikáciu. Taktiež niektoré z dnes využívaných liečiv v terapii nádorových ochorení sú rastlinného pôvodu ako napr. vinka alkaloidy vinkristín a vinblastín nachádzajúce sa v Catharanthus roseus alebo taxány paklitaxel z Taxus brevifolia a docetaxel z Taxus baccata či podophyllotoxíny etopozid a tenipozid z Podophyllum peltatum. Rastliny sú cenným zdrojom látok s protinádorovým a chemopreventívnym účinkom [5], [6]. V tejto práci sme sa nezameriavali na protinádorovú aktivitu ako takú, ale na schop- nosť prírodných látok, konkrétne flavonoidov, inhibovať efluxné pumpy. To znamená, že určité flavonoidy môžu pôsobiť ako inhibítory, ktoré zabraňujú transportným proteínom ABC (efluxným pumpám), odvádzať liečivo von z bunky, a tým zvyšujú akumuláciu liečiva v bunke, čím zvyšujú taktiež účinnosť chemoterapie. V závere teoretickej časti

1 práce sme priblížili strom Paulownia tomentosa, ktorým sa zaoberáme v experimentálnej časti tejto práce. Pre experimentálnu časť sme si zvolili extrakt z rastliny Paulownia tomentosa, ktorá je bohatým zdrojom flavonoidov a fenolických glykosidov. Naším cieľom bolo izolovať čisté látky z tohto extraktu. V priebehu našej práce sme využívali rôzne chromatografické metódy. Vhodnú metódu sme vyberali vzhľadom k hmotnosti skúmanej vzorky a množ- stve látok v nej obsiahnutých. Využívali sme tenkovrstvú a stĺpcovú chromatografiu, analytickú a semipreparatívnu vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu. V našom záujme bolo izolovanú látku taktiež identifikovať. Pomocou HPLC chromatogramu bolo možné určiť čistotu látky a podľa UV spektra zasa predpokladať hrubú štruktúru látky. IČ spektrum nám poskytlo informácie o funkčných skupinách a HRMS spektrum zasa o sumárnom vzorci. Pomocou cirkulárneho dichroizmu bolo možné určiť konfiguráciu látky. Konečná identifikácia prebehla po vyhodnotení NMR spektier.

2 ČASŤ I

TEORETICKÁ ČASŤ

3 1 Mnohopočetná lieková rezistencia

Najčastejšou príčinou a komplikáciou zlyhania protinádorovej liečby je schopnosť nádo- rových buniek odolávať účinkom cytotoxických látok (= rezistencia). Pokiaľ nádorové bunky odolávajú účinkom cytostatickej látky už pri prvej liečbe, ide o rezistenciu pri- márnu (vrodenú). Sekundárna (získaná) rezistencia vzniká až v priebehu liečby, kedy sa pôvodne citlivé bunky stávajú k danej cytotoxickej látke rezistentné, a tým sa účin- nosť liečby znižuje. Pri strate citlivosti k určitému cytostatiku môže však byť zachovaná citlivosť voči inému liečivu. Pokiaľ pri vzniku rezistencie na jedno cytostatikum vzniká rezistencia aj na iné (často štrukturálne príbuzné) cytostatikum, ide o rezistenciu skrí- ženú [7]. Boli však popísané prípady mnohopočetnej liekovej rezistencie (MDR), ktorá je defi- novaná ako rezistencia nádorových buniek na cytotoxické pôsobenie viacerých štruktu- rálne a funkčne odlišných chemoterapeutických látok. Rezistencia tohto typu sa považuje za jeden z hlavných dôvodov zlyhania chemoterapie u väčšiny pacientov s rakovinou. Obrázok 1.1 znázorňuje hlavné mechanizmy vzniku získanej viacnásobnej liekovej rezistencie. Existuje mnoho molekulárnych dráh, prostredníctvom ktorých sa bunky stávajú rezistentnými na liečivá [8]. Medzi tieto molekulárne dráhy patria napríklad:

• Farmakokinetické zmeny liečiva, ktoré sa zvyčajne vyskytujú z dôvodu nadmernej expresie metabolizujúceho enzýmu, najmä rôznych podtypov cytochrómu P450 (CYP 450) a glutatión–S–transferázy (GST-p).

• Zvýšený odtok liečiva spôsobený nadmernou expresiou efluxnej pumpy (trans- portéry ABC) na povrchu bunky, najmä P-glykoproteín (P-gp), proteín spojený s mnohopočetnou liekovou rezistenciou (MRP) a proteín rezistencie na rakovinu prsníka (BCRP).

• Zvýšená oprava deoxyribonukleovej kyseliny (DNA), kde sa v niektorých prípa- doch vnútorné opravné systémy menia, aby sa ovplyvnila citlivosť na liečivá, ako je zmena DNA metyltransferázy.

• Zmeny cieľového miesta, čo predstavuje kvalitatívne alebo kvantitatívne zmeny v niektorých cieľových skupinách, najmä intracelulárnych enzýmov, ktoré ovplyv- ňujú účinnosť cytotoxických liekov vrátane dihydrofolátreduktázy a topoizome- rázy II.

4 1. MNOHOPOČETNÁ LIEKOVÁ REZISTENCIA

• Poruchy apoptických dráh (nadmerná alebo nedostatočná expresia niektorých génov) [8], [9].

Obr. 1.1: Hlavné mechanizmy vzniku získanej mnohopočetnej liekovej rezistencie. Vstu- pom liečiva do bunky je vydaný signál, prostredníctvom ktorého sú vo zvýšenej miere exprimované gény kódujúce proteíny biotransformačných enzýmov, ktoré premieňajú liečivá na neaktívne metabolity a gény kódujúce proteíny efluxných transportérov, ktoré aktívne vymršťujú liečivá von z bunky a tým znižujú účinnú plazmatickú koncentráciu liečiva. Prevzaté a upravené z: https://www.nature.com/articles/nrc2789 [10]

Znížená akumulácia liečiva v bunke spôsobená jeho zvýšeným efluxom z bunky je hlavným mechanizmom liekovej rezistencie. Tento zvýšený eflux spôsobujú liekové efluxné transportéry, ktoré maju v organizme dôležitú detoxikačnú a ochrannú rolu, ale negatívne ovplyvňujú priebeh a úspešnosť farmakoterapie rady ochorení. Efluxná aktivita v nádorovom tkanive znižuje akumuláciu chemoterapeutík a znemožňuje tak ich cytotoxický a cytostatický efekt [11].

5 1. MNOHOPOČETNÁ LIEKOVÁ REZISTENCIA

1.1 Typická a atypická MDR

Jednou z najbežnejších klasifikácií je rozdelenie MDR na typické MDR alebo MDR sprostredkované adenosíntrifosfát (ATP)- väzbovou kazetou (ABC) a atypické MDR, ktoré zahŕňa ďalšie mechanizmy [7]. Typickú MDR spôsobuje P-glykoproteín, ktorý je produktom MDR1 génu. P-gp patrí medzi ATP dependentnú pumpu, ktorá exportuje toxické látky z bunky a spôsobuje tak zníženú intracelulárnu koncentráciu liečiv. V nádorovej terapii je možné typickú MDR obísť pomocou chemosenzitorov, tzv. modulátorov. Modulátory MDR sú látky, ktoré obnovujú citlivosť nádorových buniek k chemoterapeutikám. Medzi modulátory MDR patrí napr. verapamil, tamoxifen, cyklosporin A [8], [12]. Atypická MDR zahŕňa všetky mechanizmy MDR, na ktorých sa nepodieľa P-gp. Spôsobiť ju môže zmena farmakologicky účinnej štruktúry liečiva, zmena subcelulárnej distribúcie liečiva, rozdielna kapacita DNA opravných procesov alebo zmena v detoxifi- kačných metabolických dráhach bunky. Od typickej sa odlišuje hlavne tým, že nezahŕňa rezistenciu na vinca alkaloidy. Atypická MDR je často asociovaná s MRP (proteín spojený s mnohopočetnou liekovou rezistenciou), LRP (proteín spojený s pľúcnou rezistenciou) a taktiež s p-izoformou enzýmu glutatión-S-transferázy (GST-p) [8], [12].

6 2 ABC liekové efluxné transportéry

Transport špecifických molekúl cez lipidové membrány je základnou funkciou všetkých živých organizmov a na vykonávanie tejto funkcie sa vyvinulo veľké množstvo špeci- fických transportérov [13]. Toxické látky sú z buniek odstraňované pomocou rôznych mechanizmov. Jedným z týchto mechanizmov je eflux toxínov z bunky cez membránu pomocou transportných proteínov. Medzi tieto transportné proteíny radíme tiež ABC- transportné proteíny so širokou substrátovou špecifitou a obsahujúce ATP–väzbovú kazetu (z angl. ATP-binding cassette) [14]. ABC transportéry reprezentujú veľkú rodinu transmembránových proteínov, ktoré viažu ATP a energiu z tohto zdroja využívajú k riadenému transportu chemicky rôznoro- dých látok cez bunkové membrány smerom do (influx) alebo z (eflux) bunky u všetkých organizmov. Tvoria jednu z najväčších proteínových rodín a sú dôležité pre množstvo biomedicínskych javov, vrátane nádorovej rezistencie k liečivám. Transmembránové pro- teíny zaisťujú transport mnohých látok. Medzi endogénne látky, na ktorých transporte sa zástupci tejto transportnej rodiny podieľajú patria lipidy, steroidy, hormóny či bilirubín. Taktiež sa podieľajú na exkrécii toxínov z pečene, obličiek, gastrointestinálneho traktu a obmedzujú prienik toxínov do dôležitých orgánov ako je mozog, placenta či semenníky. Významne sa tiež podieľajú na transporte xenobiotík. Aktivita týchto transportných systémov je geneticky determinovaná a fenotypová zmena genotypu sa odráža vo va- riabilnom efluxe látok. Na modifikácii aktivity sa podieľajú viac či menej aj jednotlivé substráty transportných proteínov [7], [14]. Ľudský genóm obsahuje 49 génov pre ABC transportéry. Sú usporiadané do sied- mych podrodín označených od A po G na základe organizácie domén a podobnosti aminokyselín, ktoré sú pomenované podľa rozdielnej evolúcie (Tabuľka 2.1). Systém nomenklatúry bol schválený Výborom pre genetické názvoslovie HUGO a je uspo- riadaný podľa percentuálnej zhody sekvencie aminokyselín. Táto rozmanitá rodina transportérov má členov, ktorí hrajú rozhodujúce úlohy v mnohých bunkových proce- soch. Mutácia týchto génov spôsobuje alebo sa podieľa na vzniku niekoľkých ľudských genetických defektov ako cystická fibróza, neurologické ochorenia či zmenená odpoveď na liečivá [15].

7 2. ABC LIEKOVÉ EFLUXNÉ TRANSPORTÉRY

Tabuľka 2.1: Podrodiny ľudských génov ABC [15].

Názov podrodiny Alias Počet génov ABCA ABC1 12 ABCB MDR 11 ABCC MRP 13 ABCD ALD 4 ABCE OABP 1 ABCF GGN20 3 ABCG white 5

Rodina ABC transportérov obsahuje samostatnú skupinu, do ktorej patria tie trans- portéry, ktoré sprostredkuvávajú len eflux a ich spoločným znakom je transport liečiv, označujú sa ako ABC liekové efluxné transportéry. Do tejto skupiny liekových efluxných transportérov bývajú zvyčajne zaradení zástupcovia štyroch podrodín: ABCA (ABCA2), ABCB (ABCB1), ABCC (ABCC1–6 a ABCC11) a ABCG (ABCG2). Medzi najvýznamnej- šie liekové efluxné transportéry podieľajúce sa na vzniku rezistencie nádorových buniek k cytostatickej liečbe patria: P-glykoproteín (ABCB1), proteín spojený s mnohopočet- nou liekovou rezistenciou 1 (MRP1/ ABCC1) a proteín rezistencie na rakovinu prsníka (BCRP/ABCG2) [16].

2.1 P-glykoproteín (ABCB1)

Juliano a Ling v roku 1976 identifikovali prvého člena ABC transportérov, ako 170-kDa membránový glykoproteín nadmerne exprimovaný v bunkových líniách rezistentných na kolchicín. Pomenovali ho Permeabilita (P)-glykoproteín, pretože sa predpokladalo, že spôsobuje rezistenciu voči liekom zníženou priepustnosťou membrány [17]. P-glykoproteín je transportér viažúci kazetu s adenozíntrifosfátom (ATP), ktorý využíva energiu z hydrolýzy ATP na prečerpávanie substrátov cez membránu. Je ex- primovaný v mnohých membránových „bariérach“ tela, vrátane hematoencefalickej bariéry, gastrointestinálneho traktu, pečene, obličiek, vaječníkov a placenty. Je teda prav- depodobné, že fyziologická funkcia P-gp chráni citlivé tkanivá a plod pred endogénnou a exogénnou toxicitou [17]. ABCB1 je taktiež lokalizovaný na membránach cirkulujúcich buniek ako lymfocytov či hematopoetických kmeňových buniek, čím prispieva k zníženej odpovedi na liečbu HIV či leukémie [18]. Rôznorodosť liekov transportovaných P-gp je obrovská. Zahŕňa nie len protinádorové liečivá ako taxány (paklitaxel, docetaxel), epipodophyllotoxíny (etopozid, teniposid), vinca alkaloidy (vinblastín, vinkristín), antracyklíny (doxorubicín a daunorubicín), ale

8 2. ABC LIEKOVÉ EFLUXNÉ TRANSPORTÉRY taktiež mnoho iných liečiv ako antibiotiká (aktinomycín D), srdcový glykozid digoxín, antihelmintikum ivermektín, glukokortikoid dexametazón, imunosupresívum cyklo- sporín A, tiež inhibítory tyrozínkináz či inhibítory HIV proteáz a mnoho ďalších. P-gp vymršťuje a rozpoznáva taktiež štrukturálne a biochemicky nesúvisiace substráty, preto je veľmi komplikované nájsť nejaké spoločné znaky, ktoré by sa dali využiť pri liekovom dizajne [19].

2.1.1 Štruktúra P-gp

P-gp sa skladá z 1280 aminokyselín a je vyjadrený ako jediný reťazec obsahujúci dve homológne časti rovnakej dĺžky, z ktorých každá obsahuje šesť transmembránových domén (TMD) a dve oblasti viažúce ATP oddelené oblasťou flexibilného linkerového polypeptidu. P-gp má amino aj karboxylové zakončenie, kde obe môžu hydrolyzovať ATP. Domény viažuce ATP umiestnené na strane cytosolu sú tiež známe ako záhyby viažuce nukleotidy (NBD), prenášajú energiu potrebnú na transport substrátov cez membrány [20].

Obr. 2.1: Štruktúra transportného P-gp [20]

2.2 Proteín spojený s mnohopočetnou liekovou rezistenciou (MRP1/ ABCC1)

MRP1 tiež známy ako ABCC1 je 190 kDa transportér. Prvýkrát bol identifikovaný v roku 1992 na bunkovej línii pľúcneho nádoru rezistentného voči protinádorovým látkam a nadmerne neexprimujúceho P-gp [21].

9 2. ABC LIEKOVÉ EFLUXNÉ TRANSPORTÉRY

Ľudský MRP1 je exprimovaný takmer vo všetkých ľudských tkanivách. Jeho hladina expresie je vysoká v pľúcach, slezine, semenníkoch, obličkách, placente, štítnej žľaze, močovom mechúre a nadobličkách, ale nízka alebo žiadna expresia v niektorých bunkách obehového systému, ako sú eozinofily a pomocné T-bunky [22]. Taktiež je exprimovaný v bazolaterálnej membráne polarizovaných buniek, čím sa odlišuje od ABCB1 a ABCG2, vďaka čomu tieto dva efluxné systémy spolupracujú na rôznych stranách buniek a slúžia tak ako fyziologická ochrana. Výnimku tvorí jeho poloha v hematoencefalickej bariére, kde je umiestnený apikálne a spolu s ABCB1 a ABCG2 zaisťujú ochranu mozgu pred toxickými zlúčeninami z krvného obehu [23]. Nadmerná expresia MRP1 bola zaznamenaná u niektorých nádorov ako pľúcnych, žalúdočných či nádorov hrubého čreva, prsníka, prostaty, neuroblastómu, gliómu, či leukémie. Vo viacerých klinických štúdiách bola pozorovaná zvýšená expresia ABCC1 a bola vyvodená prognóza, že zvýšená prítomnosť ABCC1 by mohla byť dôležitým indi- kátorom zlej odpovede na liečbu a skrátenej doby prežitia pacientov s nemalobunkovým a malobunkovým pľúcnym nádorom či rýchlejší čas relapsu u rakoviny prsníka [23]. MRP1/ABCC1 môže transportovať široké spektrum substrátov od protinádorových liečiv až po fluorescenčné farbivá. Transportuje širokú škálu protirakovinových liekov vrátane antracyklínov, epipodophyllotoxínov, vinka alkaloidov, kamptotecínov, metot- rexátu a mitoxantrónu, tie sú známe ako substráty MRP1, a preto nadmerná expresia MRP1/ABCC1 vedie pri chemoterapii rakoviny k multirezistencii. Ďalšou dôležitou skupinou substrátov MRP1/ABCC1 sú organické aniónové konjugáty vrátane glutatiónu, glukuronidov a síranových konjugátov. Transport týchto konjugátov pomáha bunkám odstraňovať toxíny, uľahčuje zápalové reakcie sprostredkované leukotriénmi, chráni bunky pred oxidačným stresom, ale taktiež zabezpečuje ochranu ľudských buniek pred toxickými endobiotikami a xenobiotikami, čím hrá esenciálnu úlohu pri MDR rôznych typov nádorov [23], [24]. Nájsť špecifický inhibítor ABCC1 k prekonaniu rezistencie na lieky, ktoré sú jehosub- strátmi je stále predmetom výskumu vedúceho k pochopeniu vzťahu medzi štruktúrou a funkciou tohto transportéra [23].

2.2.1 Štruktúra MRP1

MRP1 transportér má podobnú štruktúru ako P-gp v tom, že obsahuje dve väzbové miesta pre ATP. Okrem 12 TMD obsahuje aj ďalších 5 TMD na aminoterminálnom konci. Medzi ďalšie transportéry s podobnou štruktúrou patria MRP2, MRP3 a MRP6. Aj keď oba transportné proteíny P-gp aj MRP1 patria do nadrodiny kaziet viažúcich ATP (ABC),

10 2. ABC LIEKOVÉ EFLUXNÉ TRANSPORTÉRY

Obr. 2.2: Štruktúra multirezistentného proteínu 1 (MRP1) [20]. ich primárne štruktúry sú celkom odlišné a zdieľajú približne iba 15 % aminokyselinovej homológie [20].

2.3 Proteín rezistencie na rakovinu prsníka (BCRP/ABCG2)

V roku 1998 Doyle a kol. identifikovali nového ABC transportéra, ktorý bol objavený ako posledný zo spomínaných ABC liekových efluxných transportérov, ktoré hrajú rolu v MDR in vitro aj in vivo, na línii nádorových buniek prsníka rezistentných k doxorubicínu, podľa čoho dostal aj pomenovanie BCRP [25]. Neskôr bol tento proteín objavený tiež v ľudskej placente ako aj v nádorových bunkách rezistentných na mitoxantrón, preto sa v literatúre môžeme stretnúť tiež s označením ABCP či MXR1 [26]. Transportér BCRP je široko distribuovaný v čreve, pečeni, obličkách, mozgu a navyše hlavne v plazmatickej membráne. U ľudí je BCRP exprimovaný na apikálnom povrchu buniek proximálneho tubulu, enterocytov, hepatocytov a mozgových kapilárnych endo- telových buniek, čo prispieva k absorpcii, distribúcii a eliminácii liekov a endogénnych zlúčenín, ako aj k ochrane tkanív pred expozíciou toxických xenobiotík [27]. BCRP spolu s P-gp sú tiež lokalizované v apikálnej membráne ľudských syncytiotrofoblastov a sprostredkuvávajú ochranu plodu pred xenobiotikami a toxínmi z prostredia, ktoré sa môžu nachádzať v matkinom obehu. Substráty sa vylučujú z vnútra syncytiotrofoblastu späť do obehu matky, čím sa znižuje ich akumulácia v obehu plodu [28]. Nádorová rezistencia je spájaná s teóriou nádorových kmeňových buniek, teda buniek schopných dlhodobej sebaobnovy, pomaly sa deliacich, rezistentných voči liekom a exprimujúcich ABCG2. V kostnej dreni sa z nich môžu diferencovať všetky krvné elementy [26].

11 2. ABC LIEKOVÉ EFLUXNÉ TRANSPORTÉRY

BCRP/ABCG2 dodáva rezistenciu na užšie spektrum protirakovinových látok ako P-gp a MRP1. Spektrum napriek tomu zahŕňa antracyklíny, mitoxantrón a inhibítory topoizomerázy I, ako je kamptotecín. Na druhej strane BCRP/ABCG2 neposkytuje rezistenciu na alkaloidy z rodu vinca, epipodophyllotoxíny, paklitaxel alebo cisplatinu. BCRP/ABCG2 ovplyvňuje tiež biliárnu sekréciu niektorých ihibítorov HMG-CoA re- duktáz (rosuvastatín, pravastatín, pitavastatín, cerivastatín) či transport anthelmintík zo skupiny benzimidazolov (albendazol, fenbendazol) [26], [29].

2.3.1 Štruktúra BCRP

BCRP/ABCG2 je 72-kDa proteín, ktorý pozostáva z 655 aminokyslín. Na rozdiel od P-gp, ktorý má 12 TMD a dve väzbové miesta pre ATP, je BCRP len polovičným transportérom a obsahuje len 6 TMD a jedno väzbové miesto pre ATP. Je označovaný ako homo- alebo heterodimér [30], [20].

Obr. 2.3: Štruktúra transportného proteínu BCRP [20].

12 3 Flavonoidy, ktoré inhibujú efluxné pumpy

Flavonoidy patria medzi prírodné zlúčeniny, ktoré sú v poslednej dobe predmetom značného vedeckého a terapeutického záujmu. Patria do dôležitej triedy sekundárnych metabolitov nazývaných polyfenoly a sú široko distribuované v rôznych častiach rastlín. Charakterizované sú 2-fenylchrománovým kruhovým systémom a možno ich rozdeliť do rôznych podtried na základe substitúcie v kruhu B a na základe oxidačného stavu kruhu C. Podtriedy flavonoidov sú flavóny, flavanóny, flavonoly, flavány, isoflavóny, antokyány a chalkóny. Táto rôznorodosť štruktúrnych vzorcov vedie k tomu, že sú flavonoidy uznávané ako bohatý zdroj zlúčenín s potenciálnymi protirakovinovými vlastnosťami. Schopnosť flavonoidov blokovať bunkový cyklus, vyvolávať apoptózu, narušiť tvorbu mitotického vretienka alebo inhibovať angiogenézu z nich robí sľubných kandidátov v protirakovinovom výskume. V rastlinách majú rôzne ochranné funkcie a pre ľudský organizmus liečivé a výživové hodnoty. Účinky flavonoidov sú antioxidačné, protizápalové, antimutagénne a antikarcinogénne. Používajú sa pri liečbe rakoviny, Alzheimerovej choroby, aterosklerózy a taktiež sa využívajú pri multirezistencii, pretože majú silnú afinitu k P-gp. Zistilo sa, že štrukturálne vlastnosti flavonoidov pozitívne prispievajú k inhibícii P-gp, MRP1, MRP2 a BCRP. V posledných rokoch sa flavonoidy a ich syntetické deriváty intenzívne skúmajú pri liečbe rakoviny vaječníkov, prsníkov, krčka maternice, pankreasu a prostaty [31], [32].

Obr. 3.1: Všeobecná základná štruktúra flavonoidov a ich podtried

13 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Bolo objavených veľa štrukturálne odlišných zlúčenín, ktoré sú schopné minimalizo- vať MDR moduláciou buď transportnej alebo ATPázovej aktivity transportérov ABC. Flavonoidy boli najskôr popísané ako silné inhibítory MRP1, následne bola objavená ich schopnosť interagovať s BCRP a P-gp. Bolo pozorované, že prítomnosť prenylových skupín vo flavonoidnej štruktúre spôsobila zvýšenie schopnosti inhibovať P-gp [33].

V práci sme zhrnuli dostupné údaje týkajúce sa flavonoidov, ktoré dokážu inhibovať efluxné pumpy. Zamerali sme sa na tri efluxné transportéry– P-gp, MRP1 a BCRP,tieto efluxné pumpy sa najčastejšie podieľajú na vzniku rezistencie nádorových buniek k cytostatickej liečbe. Pri vyhľadávaní dostupných štúdii sme používali kľúčové slová ako: multidrug resistance, cancer, P-gp, MRP1, BCRP, efflux pumps, ABC transporters, flavonoid a prenyl, ktoré sme obmieňali. Čerpali sme najmä z databáz Science Direct, Web of Science, Springer, Sci Finder. Hľadanie sme obmedzili na flavóny, flavanóny a isoflavonoidy, avšak natrafili sme aj na zaujímavé účinky štruktúrne iných flavonoidov, ktoré sme nakoniec tiež zahrnuli, aj keď pôvodne neboli našim zámerom. Cieľom tohto zhrnutia bolo poskytnúť ucelené informácie o flavonoidoch, ktoré dokážu inhibovať efluxné pumpy a môžu byť užitočné pri liečbe rôznych druhov nádorových ochorení.

Lavandulyl

Prenylové jednotky [34]

14 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Tabuľka 3.1: Isoflavóny, ktoré inhibujú efluxné pumpy

Isoflavóny R1 R2 R3 R4 R5 R6 Genisteín (1) OH H OH H H OH Daidzeín (2) H H OH H H OH Biochanín A (3) OH H OH H H OCH3 Formononetín (4) H H OCH3 H H OH Afrormosín (5) H OCH3 OCH3 H H OH Licoisoflavón A6 ( ) OH H OH OH prenyl OH

Licoisoflavón B (7) Sophoraisoflavón A (8)

IFG10 (9)

15 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

IFG12 (10)

Amorphigenín (11) Rotenón (12)

6a,12a-dehydroamorphigenín (13) Dalbinol (14)

16 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Tabuľka 3.2: Flavóny, ktoré inhibujú efluxné pumpy

Flavóny RR 1 R2 R3 R4 R5 R6 Flavón (15)HHHHHHH 3-Hydroxyflavón (16) OH H H H H H H 5-Hydroxyflavón (17) H OH H H H H H 7-Hydroxyflavón (18) H H H OH H H H Quercetín (19) OH OH H OH OH OH H Apigenín (20) H OH H OH H OH H Galangín (21) OH OH H OH H H H Myricetín (22) OH OH H OH OH OH OH Baicaleín (23) H OH OH OH H H H 3´,4´-Dihydroxyflavón24 ( ) H H H H OH OH H Kaempferol (25) OH OH H OH H OH H Luteolín (26) H OH H OH OH OH H Robinetín (27) OH H H OH OH OH OH Chryzín (28) H OH H OH H H H Fisetín (29) OH H H OH H OH OH Acacetín (30) H OH H OH H OCH3 H 5-Hydroxy-7-metoxyflavón (31) H OH H OCH3 HHH 5,7,4´-Trimetoxyflavón32 ( ) H OCH3 H OCH3 H OCH3 H 3,5,7,4´- Tetrametoxyflavón (33) OCH3 OCH3 H OCH3 H OCH3 H 5-Hydroxy-3,7- OCH3 OH H OCH3 HHH dimetoxyflavón (34) 5-Hydroxy-3,7,4´-trimetoxy OCH3 OH H OCH3 H OCH3 H flavón (35) 5,7,3´,4´-Tetrametoxyflavón36 ( ) H OCH3 H OCH3 OCH3 OCH3 H Diosmetín (37) H OH H OH OH OCH3 H Chrysoeriol (38) H OH H OH OCH3 OH H Tamarixetín (39) OH OH H OH OH OCH3 H Izorhamnetín (40) OH OH H OH OCH3 OH H 3,5,7,3´,4´-Pentametoxyflavón41 ( ) OCH3 OCH3 H OCH3 OCH3 OCH3 H 5,7-Dimetoxyflavón (42) H OCH3 H OCH3 HHH 5,6,7-Trimetoxyflavón (43) H OCH3 OCH3 OCH3 HHH 6,4´-Dimetoxy- OH H OCH3 H H OCH3 H -3-hydroxyflavón (44) Penduletín (45) OCH3 OH OCH3 OCH3 H OH H Ayanín (46) OCH3 OH H OCH3 OH OCH3 H Retusín (47) OCH3 OH H OCH3 OCH3 OCH3 H Tectochryzín (48) H OH H OCH3 HHH Hispidulín (49) H OH OCH3 OH H OH H

17 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Tabuľka 3.3: Syntetizované flavóny testované na inhibíciu BCRP [35].

Flavón R3 R5 R7 R20 R30 R40 3-Hydroxy-7,3´,4´-trimetoxyflavón (50) OH H OCH3 H OCH3 OCH3 3-Hydroxy-5,7,4´-trimetoxyflavón51 ( ) OH OCH3 OCH3 H H OCH3 3-Metoxyflavón (52) OCH3 HHHHH 3,4´-Dimetoxyflavón (53) OCH3 H H H H OCH3 3,3´,4´-Trimetoxyflavón54 ( ) OCH3 H H H OCH3 OCH3 3,7,3´,4´-Tetrametoxyflavón55 ( ) OCH3 H OCH3 H OCH3 OCH3 3,5,7,3´,4´-Pentametoxyflavón41 ( ) OCH3 OCH3 OCH3 H OCH3 OCH3 3,5,7,2´,4´-Pentametoxyflavón57 ( ) OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 H OCH3 5-Hydroxy-3,3´,4´-trimetoxyflavón (58) OCH3 OH OCH3 H OCH3 OCH3 5-Hydroxy-3,7,2´,4´-tetrametoxyflavón (59) OCH3 OH OCH3 OCH3 H OCH3

Morín (60) Wogonín (61)

8-Metylflavón62 ( ) Icaritín (63)

18 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Tabuľka 3.4: Syntetizované deriváty chryzínu, ktoré inhibujú efluxné pumpy. Me –metyl, iPr – izopropyl, Bn – benzyl, pre – prenyl, 1,1-dma – 1,1-dimetylallyl, ger – geranyl, far – farnesyl

Flavóny R1 R2 R3 6-Metylchryzín (64) Me H H 7-O-Metylchryzín (65) H H Me 6,7-Dimetylchryzín (66) Me H Me 6-Izopropylchryzín (67) iPr H H 7-O-Izopropylchryzín (68) H H iPr 6,7-Diizopropylchryzín (69) iPr H iPr 6,7,8-Triizopropylchryzín (70) iPr iPr iPr 6-Benzylchryzín (71) Bn H H 8-Benzylchryzín (72) H Bn H 6,8-Dibenzylchryzín (73) Bn Bn H 7-O-Benzylchryzín (74) H H Bn 6-Prenylchryzín (75) pre H H 8-Prenylchryzín (76) H pre H 6,8-Diprenylchryzín (77) pre pre H 6-(1,1-DMA)chryzín (78) 1,1-DMA H H 8-(1,1-DMA)chryzín (79) H 1,1-DMA H 6-Geranylchryzín (80) ger H H 8-Geranylchryzín (81) H ger H 6,8-Digeranylchryzín (82) ger ger H 6-Farnesylchryzín (83) far H H

Artochamín C (84) Rhoifolín (85)

19 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Robinín (86) Rutín (87)

Diosmín (88)

5,6-benzoflavón89 ( ) 7,8-benzoflavón90 ( )

2´-hydroxy-α-naftoflavón (91)

20 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Tabuľka 3.5: Flavanóny, ktoré inhibujú efluxné pumpy. pre – prenyl, ger – geranyl, lav– lavandulyl

FlavanónyR R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 Flavanón (92)HHHHHHHHHH Dihydroquercetín (93) OH OH H OH H H H OH OH H Dihydrorobinetín (94) OH H H OH H H OH OH OH H Naringenín (95) H OH H OH H H H OH H H Dihydrofisetín (96) OH H H OH H H OH OH H H 6,7,2´,3´-Tetrahydroxy- H H OH OH H OH OH H H H flavanón (97) Hesperetín (98) H OH H OH H H H OCH3 OH H Sakuranetín (99) H OH H OCH3 H H H OH H H 5,6,7-Trimetoxyflavanón H OCH3 OCH3 OCH3 HHHHHH (100) 7-Metoxyflavanón (101) H H H OCH3 HHHHHH Kushenol E (102) H OH pre OH pre H H OH H OH Euchrestaflavanón A103 ( ) H OH H OH pre H H OH pre H Sophoraflavanón B (104) H OH H OH pre H H OH H H 6-Prenylnaringenín (105) H OH pre OH H H H OH H H 8-Prenylnaringenín (106) H OH H OH pre H H OH H H Sophoraflavanón A (107) H OH H OH ger H H OH H H Sophoraflavanón E (108) H OH H OH ger OH H OH H OH Sophoraflavanón D (109) H OH ger OH H OH H OH H OH Sophoraflavanón G (110) H OH H OH lav OH H OH H H

Sophoraflavanón H (111) Silymarín (112)

21 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Neohesperidín (113) Naringín (114)

Sakuranín (115)

Catechín (116) Epigallocatechín (117)

Chalkón (118) Phloretín (119)

22 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

3.1 Efluxná pumpa MRP1

Bolo preukázané, že nadmerná expresia MRP1 (tiež MRP2) spôsobuje rezistenciu na široké spektrum protirakovinových látok. Identifikácia transportu sprostredkovaného MRP1, (tiež MRP2) ako dôležitého mechanizmu v rezistencii na viac liečiv počas liečby rakoviny, viedla k identifikácii látok, ktoré by mohli zvrátiť rezistenciu spôsobenú aktivitou tohto transportéra. Jednou z možných stratégií na zvrátenie multirezistencie sprostredkovanej MRP je inhibícia aktivity tohoto proteínu. Hľadanie inhibítorov transportu ukázalo, že mnoho prírodných zlúčenín, vrátane rastlinných polyfenolov, ako sú flavonoidy, sú nádejnými kandidátmi na možnú inhibíciu MRP1 [31]. MRP1 je lokalizovaný v bazolaterálnych membránach polarizovaných buniek a je prítomný vo všetkých tkanivách. Transportuje celý rad toxických a xenobiotických anió- nových zlúčenín, ale aj neutrálnych a katiónových zlúčenín a taktiež rôzne látky konju- gované s glutatiónom, glukuronátom alebo sulfátom. Ďalej sa predpokladá, že nastáva kotransport zlúčenín s glutatiónom. Okrem vylučovania vo vode rozpustných substrá- tov z cytoplazmy do vonkajšieho média, môže MRP1 tiež transportovať hydrofóbne molekuly, ako sú fosfolipidové sondy, z vnútorného prostredia na vonkajšiu membránu. Narozdiel od P-gp transportuje tiež endobiotiká, ako sú napríklad prozápalové molekuly (leukotriény C4), hormóny (estrogény a prostaglandíny) a antioxidanty (oxidovaný a redukovaný glutatión). Bolo zistené, že MRP1 hrá úlohu pri akútnej myeloblastickej a lymfoblastickej leukémii, nemalobunkovej rakovine pľúc, neuroblastóme, rakovine prostaty a rakovine prsníka [31].

3.1.1 Účinnosť série flavonoidov na inhibíciu MRP1

Boborowská a kol. (2003) a Barbara Lanie–Pietrzak a kol. (2005) testovali sériu flavonoidov (Tabuľka 3.6) na inhibíciu efluxnej pumpy MRP1. Modelovým systémom boli ľudské erytrocyty, ktoré obsahujú efluxnú pumpu MRP1, čo je potenciálne užitočné pri štúdiu funkcie a účinnosti inhibítorov tejto efluxnej pumpy. Substrátom bol poly- aniónový BCPCF [2’,7’-bis-(carboxypropyl)-5(6)-carboxyfluorescein], ktorý je dobrým substrátom pre efluxné čerpanie sprostredkované efluxnou pumpou MRP1 v ľudských erytrocytoch [36], [37]. Pre porovnanie účinnosti flavonoidov boli použité známe inhibítory MRP1 ako napr. benzbromaron, indometacín, probenecid, verapamil a iné. Cytotoxicita flavonoidov bola stanovená pozorovaním hemolýzy erytrocytov. Účinok zlúčenín patriacich do rôznych tried prírodných flavonoidov: flavón, flavanón, isoflavóny a flavanolignan bol porovná-

23 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY vaný s účinkom nových syntetických derivátov genisteínu (IFG10, IFG12). Analýzou vzťahu štruktúra-aktivita bolo preukázané, že najsilnejšie inhibítory sa našli medzi fla- vanónmi nesúcimi hydrofóbnu prenylovú, geranylovú alebo lavandulylovú skupinu v polohe 8 a hydroxylové skupiny v polohe 5 a 7. Prenylová skupina v polohe 5’ alebo stilbén v polohe 4’-5’ v kruhu B akoby ďalej zvyšovali potenciál inhibítora. Výsledky štúdii ukazujú, že niekoľko flavonoidov inhibuje odtok BCPCF z ľudských erytrocytov. Taktiež poukazujú na to, že eflux BCPCF je závislý na ATP a je inhibovaný poruchami energetického metabolizmu. Flavonoidmi indukovaná inhibícia efluxu BCPCF závisí na 1 koncentrácii. S prihliadnutím na IC50 hodnoty, môžeme konštatovať, že medzi najúčin- nejšie flavonoidy, ktoré sú najmä účinnými inhibítormi patria zlúčeniny 103, 111 a 112 v uvedenom poradí (Tabuľka 3.6) [36], [37].

Tabuľka 3.6: Testované flavonoidy [36][37].

Isoflavóny IC50 (µM) Flavanóny IC50 (µM) Licoisoflavón A6 ( ) 17 Euchrestaflavanón A (103) 3 Sophoraisoflavón A8 ( ) 50 Sophoraflavanón H (111) 3 Licoisoflavón B (7) 50 Sophoraflavanón A (107) 7 Genisteín (1) 65 Sophoraflavanón B (104) 17 IFG10 (9) 16 Sophoraflavanón E (108) 16 IFG12 (10) 16 Sophoraflavanón G (110) 25 Flavóny IC50 (µM) Quercetín (19) 35 Sophoraflavanón D (109) 25 Apigenín (20) 50 Naringenín (95) 50 Acacetín (30) 50 6-Prenylnaringenín (105) 100 Galangín (21) 100 Silybín (112) 5 Myricetín (22) 100 Morín (60) 7

3.1.2 8-prenylnaringenín (106)

V nasledujúcej štúdii je predmetom skúmania flavanón izolovaný z chmeľu obyčajného (Humulus lupulus), 8-prenylnaringenín. Ako modelový systém na skúmanie transportnej aktivity MRP1 boli použité ľudské erytrocyty. Vplyv flavanónu 8-prenylnaringenínu na MRP1 bol študovaný funkčným testom založeným na meraní odtoku fluorescenčnej sondy BCECF-AM [2’,7’-bis-(3-karboxyetyl-5-(a-6)) -karboxyfluoresceín acetoxymetylester] z erytrocytov [38].

1. Polovica maximálnej inhibičnej koncentrácie

24 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Obr. 3.20: Inhibícia efluxnej pumpy MRP1 spôsobená 8-prenylnaringenínom. Závislosť koncentrácie 8-prenylnaringenínu na percentách inhibície [38].

Obrázok 3.20 znázorňuje, ako 8-prenylnaringenín účinne inhiboval odtok BCECF, ktorý bol sprostredkovaný efluxnou pumpou MRP1 z erytrocytov. Transportná aktivita tohto proteínu bola znížená o 50 % pri koncentrácii 5, 76 ± 1, 80 µM, zatiaľ čo pri vyšších koncentráciách flavanónu bola aktivita MRP1 inhibovaná takmer o 90 % [38].

3.1.3 Účinnosť polyfenolov na inhibíciu MRP1

V štúdii od Zandena a kol. (2005) boli skúmané účinky veľkej série flavónov na rezistenciu spôsobenú MRP proteínmi. Inhibícia aktivity MRP1 a MRP2 bola študovaná s použitím fluorescenčného kalceínu2 ako modelového substrátu, a to v prítomnosti alebo v neprítomnosti flavonoidov. Odtok kalceínu bol sprostredkovaný MRP1 alebo MRP2v transfekovaných bunkách MDCKII3 [39]. Štúdia poukazuje na to, že väčšina flavónov je schopná inhibovať aktivitu MRP1. Je prekvapujúce, že metoxylované flavóny 5,7,3´,4´- tetrametoxyflavón36 ( ), diosmetín (37), chrysoeriol (38), tamarixetín (39) a izorhamnetín (40) patria medzi najlepšie inhibítory MRP1. Ostatné flavóny schopné inhibovať viac ako 50 % aktivity MRP1 pri koncentrácii 25 µM boli 3´,4´-dihydroxyflavón24 ( ), luteolín (26), quercetín (19), robinetín (27), kaempferol (25) a myricetín (22). Narozdiel od širokej palety flavónov inhibujúcich MRP1, iba niekoľko testovaných flavónov inhibovalo MRP2 sprostredkovaný odtok kalceínu pri koncentráciách 25 µM. Najvýraznejšie účinky sa zistili pri robinetíne (27) a myri- cetíne (22), ktoré pri koncentráciách 25 µM inhibovali aktivitu MRP2 o viac ako 50 % [39].

2. Do buniek sa aplikuje nefluorescenčný kalceín, ktorý sa prevádza na fluorescenčný MRP–substrátový kalceín intracelulárnymi esterázami. 3. Bunkové línie psích obličiek Madin-Darby

25 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

V nasledujúcej štúdii bolo účelom preskúmať účinky flavonoidov na transport dau- nomycínu (DNM) a vinblastínu (VBL) v bunkách Panc-14. Akumulácia trvala 2 hodiny a bola stanovená v prítomnosti a neprítomnosti 22 flavonoidov. Biochanín A(3), genis- teín (1), quercetín (19), chalkón (118), silymarín (112), phloretín (119), morín (60) a kaempferol (25) pri koncentrácii 100 µM, všetky významne zvýšili akumuláciu DNM aj VBL v bunkách Panc-1 (viď. príloha B). Štúdie závislé na koncentrácii preukázali významné účinky na akumuláciu VBL pri 50 µM. Výsledky naznačujú, že uvedené flavonoidy môžu inhibovať transport liečiva sprostredkovaný MRP1, účinky, ktoré môžu zahŕňať väzbové interakcie s MRP1, ako aj moduláciu koncentrácie glutatiónu (GSH) [40].

A B

Obr. 3.21: Vplyv flavonoidov na akumuláciu 3H-DNM (A) a 3H-VBL (B) v bunkách Panc-1. A, (B) – bunky boli inkubované s 3H-DNM, (3H-VBL) a 100 µM flavonoidu a po 2 hodinách bola meraná akumulácia 3H-DNM, (3H-VBL). Verapamil bol použitý ako pozitívna kontrola [40].

V štúdii od Leslieho a kol. (2005) boli skúmané bioflavonoidy pre ich schopnosť ovplyvňovať rôzne funkcie MRP1. Je dobré pripomenúť, že MRP1 aktívne transportuje určité xenobiotiká kotransportom s GSH a trasnportuje tiež organické anióny, ako je leukotrién C4 (LTC4), ktorý vedci použili ako substrát [29]. Väčšina flavonoidov inhibovala transport LTC4 sprostredkovaný MRP1 v membrá- nových vezikulách a inhibícia niekoľkými flavonoidmi bola vylepšená kotransportom s GSH. V neprítomnosti GSH boli genisteín (1) a naringenín (95) relatívne slabými inhibítormi, GSH zosilňoval ich inhibičnú schopnosť 2 až 7-násobne. Flavón apigenín (20) bol silným inhibítorom transportu LTC4 a za prítomnosti GSH sa inhibícia zvýšila

4. Panc-1 je bunková línia ľudského pankreatického adenokarcinómu, ktorá exprimuje proteín viažúci sa na rezistenciu na viac liekov (MRP1).

26 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY približne 3,4-násobne. Flavón-3-oly myricetín (22), quercetín (19) a kaempferol (25) boli účinnejšie inhibítory transportu LTC4 ako apigenín, ale pridanie GSH malo malý účinok na tieto zlúčeniny. Bolo dokázané, že tieto flavonoidy sa správali ako kompetitívne inhibítory transportu LTC4, sprostredkovaného MRP1. Zlúčeniny 20 a 95 mali najväčší inhibičný účinok na transport LTC4 pomocou MRP1, keď bol prítomný GSH. Tieto dve zlúčeniny boli tiež najsilnejším stimulátorom GSH transportu [29]. Druhým substrátom tejto štúdie bol 17β- estradiol. Boli použité rovnaké flavonoidy a modelovým systémom boli znova membránové vezikuly obohatené o MRP1. Celkovo boli flavonoidy menej účinné, ako keď bol substrátom LTC4. Okrem toho je aj ich poradie inhibičnej účinnosti pre tento substrát iné: zl. 20 > 25 > 95 > 19 > 22. Výsledky štúdie naznačujú, že flavonoidy majú potenciál ovplyvňovať konjugovaný organický anión a transport GSH, vyvolávajúci rezistenciu na lieky, ako aj vlastnosti efluxnej pumpy MRP1 [29].

Článok publikovaný vo vedeckom časopise The Febs Journal, bol zameraný na efluxné pumpy MRP1, MRP4 a MRP5, ktoré sa nachádzajú v čreve. Narozdiel odMRP1 sú MRP4 a MRP5 schopné transportovať cyklické nukleotidy, ako sú cGMP (cyklický guanozínmonofosfát) a cAMP (cyklický adenozínmonofosfát), antivírusové lieky a prostaglandíny. V tejto štúdii skúmali šesť najbežnejších rastlinných polyfenolov pre ich schopnosť modulovať funkciu MRP1, -4, -5 v nízkom molekulárnom rozmedzí. Medzi skúmané rastlinné polyfenoly patrí: quercetín (19), silymarín (112), naringenín (95), hesperetín (98) a daidzein (2) [41]. Výsledky naznačujú, že tieto rastlinné polyfenoly interagujú s MRP4 a -5 a ovplyvňujú ich transportnú funkciu vo väčšom rozsahu ako transportnú funkciu MRP1. Niektoré polyfenoly sú vysokoafinitné inhibítory, zatiaľ čo iné môžu byť samy o sebe substrátmi [41]. Modelovým systémom boli bunkové línie HEK2935, ktoré exprimujú MRP1. Neto- xické koncentrácie polyfenolov vykazovali potenciál pri zvrátení liekovej rezistencie sprostredkovanej MRP1. Je známe, že bunky HEK293 sú vysoko rezistentné na etopozid. V tejto štúdii bolo preukázané, že zlúčeniny 112, 95, a 98 mohli v týchto prípadoch znížiť túto rezistenciu zvýšením citlivosti na etopozid v závislosti na koncentrácii, pričom najúčinnejší je silymarín (112), (viď. príloha B). Je známe, že bunky exprimujúce MRP4 a MRP5 vykazujú rezistenciu na thioguanín. Boli použité bunkové línie HEK293/MRP4 (exprimujúce MRP4) a HEK293/MRP5 (exprimujúce MRP5). Polyfenol hesperetín (98)

5. bunky ľudskej embryonálnej obličky exprimujúce MRP1

27 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY výrazne zvýšil citlivosť na thioguanín v bunkách HEK293/MRP4. Zatiaľ čo zl. 19, 2 a 95 to urobili v bunkách exprimujúcich MRP5 [41]. Výsledky naznačujú, že polyfenoly priamo komunikujú s MRP1, MRP4 a MRP5 a niektoré z nich ako zl. 19 a 112 sa osvedčili ako substráty MRP. Modulujú ako trans- portnú aktivitu, tak činnosť ATPázy MRP1 a MRP4. Napriek tomu, že tieto polyfenoly patria do rovnakej triedy zlúčenín a sú štrukturálne podobné, každý z nich má jedinečné vlastnosti a mal by sa študovať individuálne. Pochopenie interakcií týchto polyfenolov s MRP môže byť užitočné pri liečbe rôznych druhov rakoviny [41].

J. Molnár a kol. (2005), (2010) študovali flavonoidy ako látky reverzujúce MDR v niekoľkých líniách nádorových buniek nadexprimujúcich proteíny MDR. Štúdie sa uskutočňovali na bunkových líniách myšieho lymfómu transfekovaných ľudským génom MDR1, exprimujúcim P-gp a na bunkách ľudskej rakoviny prsníka exprimujúcej MRP1 (HTB26) a porovnávali sa v prítomnosti a neprítomnosti prirodzene sa vyskytujúcich isoflavonoidov odvodených z rastlín [42], [43]. Skúmali sa účinky isoflavonoidov amorphigenínu (11), rotenónu (12), 6a,12a- de- hydroamorphigenínu (13), dalbinolu (14), afrormosínu (5) a formononetínu (4) na akumuláciu rhodamínu 123 6 v bunkách myšieho lymfómu exprimujúceho P-gp. Zlúče- niny 11, 12 a 4 sa ukázali ako najúčinnejšie v reverzii MDR (viď. príloha B). Rovnaké flavonoidy sa testovali v bunkách HTB26 meraním fluorescenčnej akumulácie BCECF, špecifického substrátu MRP1. Analyzovala sa expresia a transportná aktivita MRP1 prietokovou cytometriou. Všetky testované zlúčeniny mierne zvýšili akumuláciu BCECF v bunkách HTB26 (viď. príloha B) [42], [43]. Druhá sada testovaných flavonoidov obsahovala dihydroflavonoly (dihydroquercetín (93), dihydrorobinetín (94), dihydrofisetín96 ( ) a sakuranín (115)), flavonoly (kaempferol (25), robinetín (27), robinín (86)), flavanóny (sakuranetín99 ( ), neohesperidín (113), naringín (114)), dihydrochalkón (phloretín (119)), flavón (chryzín28 ( )), rotenoid (ro- tenón (12)) a flavan-3-oly (catechín (116), epigallocatechín (117)). V bunkách myších lymfómov exprimujúcich P-gp, najúčinnejšie zvyšovali akumuláciu rodamínu 123 zl. 12, 28, 117. Tieto flavonoidy boli účinnejšie pri akumulácii fluorescenčnej sondy ako referenčná zlúčenina verapamil. Taktiež boli testované účinky flavonoidov na pumpu MRP1, meraním akumulácie BCECF v bunkách HTB26. Zlúčeniny 28, 86, 25, 93, 94, 96, 117 vykazovali rovnaký účinok na zvýšenie akumulácie BCECF, ako indometacín. Vedci testovali flavonoidy tiež na akumuláciu rodamínu 123 v ľudských bunkách rakoviny

6. fluorescenčné farbivo

28 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY hrubého čreva exprimujúcich P-gp (Colo320), kde najúčinnejší inhibítor bol rotenón (12) [42], [43]. Štúdie akumulácie preukázali, že flavonoidy účinnejšie inhibujú P-gp ako MRP1. Tieto dva efluxné systémy nemusia byť rovnako citlivé na inhibíciu flavonoidmi ana antiproliferatívne účinky súčasne podávaných protirakovinových liekov. Jeden z roz- dielov medzi týmito dvoma efluxnými systémami je to, že P-gp viaže nemodifikované transportované liečivo, zatiaľ čo MRP1 prevažne pumpuje lieky konjugované s gluta- tiónom (GSH). Jeho substráty sú často aniónové zlúčeniny. Dospelo sa k záveru, že citlivosť MDR a mechanizmy rezistencie na lieky sprostredkované MRP, voči inhibičným flavonoidom a isoflavonoidom sa líšia v závislosti od chemickej štruktúry [42][43].

3.2 Efluxná pumpa P-glykoproteín

P-glykoproteín je nadmerne exprimovaný v mnohých vnútorne rezistentných nádo- roch (leukémia, lymfómy, sarkómy dospelých a detí, neuroblastómy) a v tých, ktoré si získavajú rezistenciu počas chemoterapie. Pokrok v biotechnologickej oblasti dokázal prítomnosť P-gp nielen v nádorových bunkách, ale aj v širokej škále normálnych tkanív, kde zohráva úlohu pri absorpcii, distribúcii, metabolizme a exkrécii (ADME). Eflux sprostredkovaný P-gp, ovplyvňuje mnoho procesov, s ktorými sa liek stretne počas svojho pobytu v tele. Ovplyvňuje absorpciu cez črevné nosiče, ktoré vylučujú molekuly liečiva späť do lumenu; distribúciu zabránením vstupu liečiva do tkanív, ako je mozog; metabolizmus, pretože pôsobí synergicky s cytochrómom P450 3A4; vylučovanie ovplyvňuje pôsobením na žlčové aj obličkové tubulárne funkcie. Týmto spôsobom P-gp pôsobí ako bariéra, ktorá zabraňuje vstupu xenobiotík do tela a vylučuje ich, keď už vstúpili [20]. Prvým krokom pri efluxe liečiva je rozpoznávanie liečiva P-gp, po ktorom nasleduje väzba ATP a hydrolýza. Energia uvoľnená v tomto procese sa využíva na eflux substrátu mimo bunkovú membránu cez centrálne póry. Existuje mnoho hypotéz týkajúcich sa efluxného mechanizmu transportéra P-gp. Presné miesto interakcie substrátu a proteínu však nie je jasné. Medzi najobľúbenejšie modely patrí model pórov a hydrofóbny vy- sávač. Spomedzi týchto modelov si hydrofóbny vysávač získal veľkú pozornosť. Podľa teórie tohto modelu, P-gp rozpoznáva substrát zaliaty vo vnútornej vrstve plazmatickej membrány a prenáša ho cez proteínový kanál. Podľa modelu pórov dochádza k veľkej reorganizácii transmembránových domén po celej hĺbke membrány, až po naviazaní nukleotidu. Táto reštrukturalizácia otvára stredový pór spôsobom, ktorý umožňuje prístup hydrofóbnych substrátov priamo z lipidovej dvojvrstvy do centrálneho póru

29 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY transportéra. Druhý katalytický cyklus začína hydrolýzou inej molekuly ATP a uvoľnená energia sa využije na obnovenie pôvodného proteínu, kde sa opäť viaže so substrátom a nukleotidom na zahájenie ďalšieho cyklu [20]. Bolo hlásené, že mnoho flavonoidov zvrátilo P-gp sprostredkovanú multirezistenciu v nádorových bunkách in vitro a sú známe ako chemosenzibilizátory alebo modulátory. Proces chemosenzitizácie zahŕňa súčasné podávanie inhibítora P-gp s protirakovinovým liečivom, aby sa zvýšila akumulácia intracelulárneho protirakovinového liečiva prostred- níctvom zhoršenej efluxnej funkcie P-gp. Ukázalo sa, že množstvo zlúčenín inhibuje efluxnú funkciu P-gp, a preto zvyšuje intracelulárnu koncentráciu liečiva s konečným poklesom bunkovej rezistencie [44].

3.2.1 Icaritín (63)

V štúdii sa vedci zamerali na účinky icaritínu vo vzťahu k P-gp. Icaritín je prenylflavonoid, izolovaný z Epimedii herba, ktorá sa bežne používa v tradičnej čínskej medicíne. Icaritín je hydrolytický produkt icarínu a vykazuje rôzne farmakologické a biologické aktivity vrátane antireumatických a antidepresívnych účinkov, stimuluje srdcovú a neuronálnu diferenciáciu a taktiež inhibuje bunkovú apoptózu [45]. Modelový systém tvorila bunková línia HepG27/ADR8, rezistentná voči viacerým liekom a bola charakterizovaná jej MDR. Reverzný účinok icaritínu na nádorové bunky MDR bol skúmaný pomocou buniek HepG2 citlivých na adriamycín a buniek, ktoré sú na adriamycín rezistentné (HepG2/ADR). Súčasné výsledky ukázali, že icaritín významne zvýšil intracelulárnu akumuláciu ADR (Obrázok 3.22) a znížil expresiu génu MDR1 v bunkách HepG2/ADR (Tabuľka 3.7) v porovnaní s bunkami HepG2 citlivými na liek [45]. Tabuľka 3.7: Účinky icaritínu na cytotoxicitu adriamycínu k bunkám HepG2/ADR. Ošet- renie icaritínom viedlo k významnému zvratu rezistencie na ADR pri koncentráciách 1, 15 a 30 µM [45]

Koncentrácia (µM) HepG2/ADR (IC50) Reverzný zvrat 0 0, 596 ± 0, 063 1 1 0, 362 ± 0, 112 1, 65 15 0, 238 ± 0, 085 2, 50 30 0, 083 ± 0, 011 7, 18 .

7. HepG2 je bunková línia ľudského hepatocelulárneho karcinómu (HCC) 8. adriamycín je chemoterapeutický liek, ktorý sa používa hlavne na liečbu solídnych nádorov, vrátane HCC.

30 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Obr. 3.22: Účinok icaritínu na akumuláciu ADR v bunkách HepG2 citlivých na ADR a v bunkách HepG2/ADR rezistentných na ADR. Na obrázku je viditeľné, ako icaritín pri koncentrácii 15 a 30 µM významne zvyšuje akumuláciu adriamycínu [45].

Súčasné pozorovania naznačujú, že icaritín účinne reverzuje MDR prostredníctvom zvýšenia intracelulárnej akumulácie ADR a downregulácie expresie génu MDR1. Pred- ložené výsledky naznačujú, že icaritín je nové a účinné činidlo na zvátenie MDR a môže byť sľubným liekom na chemoterapiu nádorov [45].

3.2.2 Baicaleín (23)

Účelom nasledujúcej štúdie bolo preskúmať účinky baicaleínu na farmakokinetiku tamo- xifénu9 a jeho aktívneho metabolitu 4-hydroxytamoxifénu u potkanov. Baicaleín patrí medzi hlavné obsahové látky izolované zo Scutellariae radix. Pôsobí antioxidačne, antiví- rusovo, antitromboticky, protizápalovo a pomáha pri kardiovaskulárnych ochoreniach. Tamoxifén a baicaleín interagujú s enzýmami cytochrómu P450 a tiež s P-gp [46]. Vedci študovali možnosť súčasného užívania baicaleínu s tamoxifénom, ako prevenciu alebo kombinovanú liečbu rakovinových ochorení. Farmakokinetické parametre tamoxifénu a 4-hydroxytamoxifénu sa stanovili u potkanov po perorálnom podaní 10 mg/kg tamoxifénu v prítomnosti a neprítomnosti baicaleínu (Tabuľka 3.8). V porov- naní s kontrolnou orálnou skupinou (podávaný samotný tamoxifén) plocha pod krivkou a maximálna plazmatická koncentrácia tamoxifénu významne vzrástla. Absolútna bio- logická dostupnosť tamoxifénu sa v prítomnosti baicaleínu (3 a 10 mg/kg) významne zvýšila o 47, 5 ∼ 89, 1 % v porovnaní s kontrolnou orálnou skupinou (20, 2 %), tento

9. Tamoxifén je selektívny modulátor estrogénových receptorov, používa sa pri prevencii alebo liečbe rakoviny prsníka.

31 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

účinok môžeme pripísať hlavne inhibícii sprostredkovanej CYP3A4 (metabolizmus tamoxifénu v tenkom čreve alebo v pečeni), inhibícii P-gp (efluxná pumpa v tenkom čreve) alebo znížení celkového telesného clearance a to všetko vďaka baicaleínu [46]. Tabuľka 3.8: Priemerné farmakokinetické parametre 4-hydroxytamoxifénu po perorál- nom podaní tamoxifénu (10 mg/kg) potkanom v prítomnosti alebo neprítomnosti baicaleínu. AUC0−∞ – plocha pod krivkou závislosti plazmatickej koncentrácie od času 0 do nekonečna, Cmax – max. plazmatická koncentrácia, tmax – čas na dosiahnutie Cmax, t1/2 – terminálny polčas, M.R. – pomer AUC medzi metabolitom a podaným liečivom [46].

Parameter Kontrola Tamoxifén + baicaleín 0,5 mg/kg 3 mg/kg 10 mg/kg AUC0−∞ (ng.h/ml) 284 ± 65 304 ± 87 327 ± 87 359 ± 95 Cmax (ng/ml) 13, 3 ± 2, 8 13, 6 ± 3, 2 14, 0 ± 3, 3 14, 5 ± 3, 5 tmax (h) 2, 2 ± 0, 4 2, 3 ± 0, 5 2, 3 ± 0, 5 2, 3 ± 0, 5 t1/2 (h) 15, 3 ± 3, 6 15, 8 ± 4, 1 16, 4 ± 4, 2 16, 8 ± 4, 3 M.R. (%) 15, 4 ± 2, 6 14, 2 ± 2, 4 12, 1 ± 2, 2 10, 3 ± 2, 0

Taktiež bola preskúmaná aktivita CYP3A4 a P-gp pomocou retenčného testu ro- damínu 123 v bunkách MCF-710/ADR exprimujúcich P-glykoproteín. Obrázok 3.23 znázorňuje stanovenie retencie rodamínu 123. Tieto výsledky naznačujú, že baicaleín významne inhibuje aktivitu P-gp [46].

Obr. 3.23: Akumulácia rhodamínu 123 (substrát P-gp) v bunkách MCF-7/ADR (bunky exprimujúce P-gp) sa významne zvýšila v prítomnosti baicaleínu v závislosti na kon- centrácii v porovnaní s bunkami MCF-7, ktoré P-gp neexprimujú. [46].

10. bunková línia rakoviny prsníka

32 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

3.2.3 Biochanín A (3) a silymarín (112)

Účelom štúdie od Marilyn E. Morris a kol. (2003) bolo preskúmať potencionálne účinky flavonoidov biochanínu A a silymarínu na intestinálnu absorpciu liečiv digoxínu avin- bastínu (VBL), ktoré sú substrátmi P-gp. Účinky na absorpciu a obojsmerný transport boli skúmané na ľudských Caco-2 bunkách11, ktoré slúžili ako modelový systém. Tes- tovala sa bunková akumulácia a obojsmerný transport v prítomnosti a neprítomnosti flavonoidov [47]. Bolo dokázané, že biochanín A a silymarín môžu významne zvýšiť bunkovú aku- muláciu digoxínu a VBL v Caco-2 bunkách a ich účinky na akumuláciu sú závislé na koncentrácii (Obrázok 3.24). Je zaujímavé, že obidva flavonoidy majú silnejšie účinky na akumuláciu VBL ako na akumuláciu digoxínu. Presný dôvod tohto pozorovania nie je jasný, ale mohol by súvisieť s presným väzbovým miestom týchto substrátov na P-gp alebo môže byť spôsobený inhibíciou viacerých transportérov v bunkách Caco-2 týmito flavonoidmi. Ukázalo sa, že digoxín je relatívne špecifický substrát pre P-gp, aleVBL je substrát aj MRP2, preto je možné, že flavonoidy inhibovali obidve efluxné pumpy v bunkách Caco-2, a tak viedli k silnejším účinkom pri zvyšovaní akumulácie VBL. Tieto výsledky naznačujú, že biochanín A a silymarín môžu inhibovať P-gp sprostredkovaný bunkový odtok v Caco-2 bunkách [47].

A B

Obr. 3.24: A – Účinky na bunkovú akumuláciu 3H-digoxínu v bunkách Caco-2. Kontrola – bunky MCF-7, kde P-gp nie je prítomný. Bunková akumulácia digoxínu po pridaní 150 µM biochanínu A bola zvýšená o 32, 9 % a po pridaní silymarínu o 23, 3 %. B – podobne bola aj akumulácia 3H-VBL významne zvýšená pri použití 150 µM bio- chanínu A o 73, 3 % a pri použití 150 µM silymarínu o 80, 3 %. Verapamil (100 µM bol použitý ako pozitívna kontrola [47].

11. bunková línia rakoviny hrubého čreva

33 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

3.2.4 Morín (60), phloretín (119), silymarín (112) a biochanín A (3)

Cieľom skúmania Shuzhong Zhang a Marilyn E. Morris (2003) bolo charakterizovať účinok flavonoidov na bunkový eflux sprostredkovaný P-gp a určiť molekulárny mechanizmus interakcie flavonoid–liek. Štúdie sa uskutočňovali na citlivých viacnásobne rezis- tentných bunkových líniách ľudského karcinómu prsníka MCF-712 a MDA435/LCC613 a skúmali sa účinky flavonoidov (3, 60, 112, 119) na akumuláciu daunomycínu (DNM) a cytotoxicitu doxorubicínu [48]. Flavonoidy zvyšovali akumuláciu v P-gp pozitívnych bunkách, ale nie v bunkách, ktoré P-gp neexprimujú, pričom tieto účinky záviseli na koncentrácii flavonoidov (Ob- rázok 3.25). Verapamil (známy inhibítor P-gp) bol použitý ako pozitívna kontrola. Phloretín a biochanín A stimulovali aktivitu P-gp ATPázy, zatiaľ čo morín a silymarín ju inhibovali, čo potvrdzuje, že tieto flavonoidy interagujú s P-gp. Morín a silymarín významne inhibovali 3H-azidopínové fotoafinitné značenie P-gp, čo naznačuje priamu interakciu väzbou na substrát P-gp. Výsledky naznačujú, že všetky testované flavonoidy inhibovali P-gp sprostredkovaný eflux a mechanizmus interakcie zahŕňal aspoň čiastočne priamu interakciu [48].

Obr. 3.25: Na obrázku je znázornená 2 hod. akumulácia DNM v bunkách MDA435/LCC6. CON – kontrola,BA – biochanín A, MO – morín, PH – phloretín, SI – silymarín, VER – verapamil. Pri použití 30 µM biochanínu A a morínu akumulácia dosiahla 502 ± 16 % pre biochanín A a 604 ± 32 % pri použití morínu. Phloretín a silymarín boli účinné pri koncentrácii 50 µM, kde akumulácia pri použití silymarínu bola 445 ± 12 % a pri phloretíne 431 ± 28 % [48].

12. bunková línia ľudského karcinómu prsníka, závislá od estrogénu 13. bunková línia ľudského karcinómu prsníka, nezávislá od estrogénu 34 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

3.2.5 Quercetín (19)

Cieľom štúdie Sylwie Borskej a kol. (2012) bolo preskúmať účinok quercetínu. Ako bunkový model bola použitá rodičovská bunková línia EPG85-257P (P-línia) a jej va- riant odolný voči daunorubicínu EPG85-257RDB (bunkové línie karcinómu žalúdka). Quercetín má širokú škálu biologických aktivít, vrátane antiproliferatívneho pôsobenia proti niekoľkým rakovinovým bunkám ľudského pôvodu, ako prooxidant navyše indukuje apoptózu v rakovinových bunkách a ako antioxidant chráni normálne bunky pred oxidačným stresom a mutagenézou [49]. V štúdii skúmali antiproliferatívny a pro-apoptický účinok quercetínu a jeho poten- ciál meniť expresnú a transportnú aktivitu P-gp. Vyhodnotenie imunocytochemickej a imunofluorescenčnej reakcie preukázalo, že expresia P-gp v bunkách RBD sa poliečbe 12 µM quercetínu významne znížila. Iné koncentrácie nespôsobili žiadne významné zmeny v expresii proteínov. Expresia P-gp v P-línii sa nezistila. Transportná funkcia bola testovaná pomocou akumulácie kalceínu (Obrázok 3.26). Experimenty navyše odhalili, že quercetín a daunorubicín pôsobili synergicky v P-bunkách, zatiaľ čo v prípade RDB buniek, polyfenol senzibilizoval bunky na cytostatické liečivo (jednostranný efekt) [49].

Obr. 3.26: Pri sledovaní akumulácie kalceínu v porovnaní s kontrolou, iba pôsobenie 12 µM quercetínu spôsobilo štatisticky významný rozdiel, kde R(CAM) – retenčný koeficient pre RDB bunky sa po liečbe quercetínom zvýšilo 130 % [49].

Je obzvlášť dôležité, aby sa vysoká cytotoxicita rastlinných polyfenolov primárne týkala rakovinových buniek. Zdá sa, že pri nízkych koncentráciách neovplyvňujú mnoho typov normálnych buniek. Posledné výskumy ukazujú, že silný účinok quercetínu na transformované bunky sa dokonale zhoduje s takmer úplnou absenciou poškodenia normálnych tkanív. Posledné štúdie v Európe a USA priniesli dôkazy o priaznivých

35 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

účinkoch quercetínu a o jeho bezpečnosti pri aplikácii u človeka. Existujú však niektoré kontroverzné správy, ktoré naznačujú genotoxický potenciál quercetínu. Preto by sa mal jeho priaznivý účinok zvážiť individuálne pre každý typ bunky. Výsledky ukazujú, že quercetín sa môže považovať za perspektívny liek na prekonanie rezistencie v bunkách rakoviny žalúdka [49].

3.2.6 Metoxyflavóny

Predmetom skúmania v nasledujúcej štúdii bola vytrvalá bylina Kaempferia parviflora z čeľade Zingiberaceae. Podzemok tejto rasliny bol často používaný v tradičnej thajskej medicíne pre liečbu rôznych chorôb ako je hypertenzia či koliky. Z podzemku tejto rastliny boli izolované rôzne metoxyflavóny, ktoré vykazujú farmakologické účinky. V thajskej tradičnej medicíne sa čerstvý alebo sušený podzemok K.parviflora používa ako tinktúra, ktorá sa pripravuje konzervovaním podzemku (400 ∼ 500 g pre čerstvú rastlinu alebo 30 g pre sušenú) v 750 ml whisky vrátane 28 ∼ 40 % etanolu [50].

Obr. 3.27: Účinky extraktu K.parviflora na akumuláciu rodamínu 123 (20 µM) (A) a daunorubicínu (50 µM) (B) v bunkách LLC-GA5-COL150 (◦) a v bunkách LLC-PK1 (4). Os x predstavuje pomer výťažku z pôvodnej tinktúry, ktorá bola pripravená podľa všeobecného zloženia tradičnej thajskej medicíny. Významné účinky boli pozorované pri použití extraktu nariedeného na ekvivalent 3 % a 30 % (v/v) originálnej tinktúry [50].

Skúmali, či extrakt z tinktúry K. parviflora má účinok na funkciu P-gp s využitím bunkovej línie LLC-PK1, ktorá MDR1 gén neexprimuje a buniek LLC-GA5-COL150 (epite- lové bunky prasačích obličiek) transfekovaných ľudským MDR1 génom, kódujúcim P-gp. Expresia P-gp bola detekovaná v bunkách LLC-GA5-COL150, ale nie v bunkách LLC- PK1. Verapamil (100 µM) bol použitý ako pozitívna kontrola. Extrakt z tinktúry zvýšil

36 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY akumuláciu rhodamínu 123 a daunorubicínu v bunkách LLC-GA5-COL150 spôsobom závislým na koncentrácii, ale nezvýšil akumuláciu v bunkách LLC-PK1 (Obrázok 3.27) [50]. Niektoré flavóny boli izolované z podzemku K. parviflora a boli skúmané ich účinky na akumuláciu rhodamínu 123 v bunkách LLC-GA5-COL150. Medzi izolované flavóny, ktorých účinky boli skúmané patria zlúčeniny 32, 33, 34, 35, 41, 42. Zo všetkých testo- vaných flavónov, bol najúčinnejší 3,5,7,3´,4´-pentametoxyflavón (41) a jeho stimulačný účinok bol významný pri koncentrácii 3 µM alebo vyššej. Ostatné flavóny nemali vý- znamný účinok na akumuláciu rhodamínu 123 v rovnakom rozmedzí koncentrácií. Účinok 3,5,7,3´,4´-pentametoxyflavónu (41) bol taktiež preskúmaný na akumuláciu daunorubicínu v bunkách LCC-GA5-COL150 a v bunkách LCC-PK1 (Obrázok 3.28). Štúdia preukázala, že výťažky z podzemku K.parviflora a jej flavóny inhibovali funkciu P-gp v bunkách LCC-GA5-COL150 spôsobom závislým na koncentrácii [50].

Obr. 3.28: Akumulácia daunorubicínu (50 µM) v bunkách LLC-GA5-COL150 (◦) a v bun- kách LLC-PK1 (4) v prítomnosti alebo neprítomnosti 3,5,7,3´,4´-pentametoxyflavónu (1 ∼ 300 µM). Akumulácia bola významne zvýšená pri koncentrácii 30 µM a vyššej [50].

3.2.7 Wogonín (61)

Eibai Lee a kol. (2009) skúmali účinky wogonínu, je to flavón pochádzajúci z koreňov Scutelaria baicalensis Georgi. Uvádza sa, že tento flavón inhibuje rast buniek a/alebo indukuje apoptózu rakovinových buniek u rôznych nádorov. Etopozid 14 je dobre známy ako liek používaný pri liečbe solídnych nádorov či leukémie. Indukuje apoptózu rôznych typov buniek, vrátane buniek HL-60 (bunková línia leukémie). Je o ňom známe, že je

14. inhibítor topoizomerázy II 37 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Obr. 3.29: Wogonín zvyšuje akumuláciu kalceínu v bunkách HL-60, podobne ako verapamil, typický inhibítor P-gp [51] pumpovaný z buniek von cez transportéry ABC, ktorým je aj P-gp. Za účelom objasnenia mechanizmu indukcie apoptózy wogonínom boli skúmané jeho účinky na P-gp. Funkčný test P-gp bol uskutočňovaný pomocou kalceínu-AM 15 [51]. Nízke koncentrácie wogonínu nemali žiaden účinok na fragmentáciu DNA. Na druhej strane sa fragmentácia DNA indukovaná etopozidom zvýšila v prítomnosti wo- gonínu, toto zosilnenie záviselo na koncentrácii wogonínu. Je teda pravdepodobné, že wogonín potencuje apoptický účinok etopozidu. Za účelom objasnenia mechanizmu zvyšovania účinku etopozidu pomocou wogonínu, bol prevedený funkčný test P-gp pomocou kalceínu-AM (Obrázok 3.29). Bolo zistené, že vysoká koncentrácia wogonínu (100 µmol/l) indukuje apoptózu v bunkách HL-60. Na druhej strane nízka koncentrácia wogonínu potencuje apoptózu vyvolanú etopozidom. Taktiež bolo spozorované, že wo- gonín znižoval apoptózu indukovanú etopozidom v normálnych bunkách, ako sú napr. thymocyty 16. Tieto výsledky naznačujú, že wogonín zvyšuje akumuláciu etopozidu v bunkách a zosilňuje apoptický účinok tohto činidla. Nadmerná expresia P-gp spúšťa rezistenciu na viac liečiv, wogonín môže hrať rolu pri prekonávaní odporu voči viacerým liekom [51].

15. nefluorescenčné farbivo, ktoré je vysoko rozpustné v tukoch a tak môže rýchlo preniknúť doplazma- tickej membrány, je taktiež rýchlo vytláčaný z buniek exprimujúcich P-gp 16. lymfocyty dozrievajúce v thymuse

38 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

3.2.8 Izoprenylované deriváty chryzínu

Vedci v nasledujúcej štúdii syntetizovali mnoho C- alebo O- substituovaných hydro- fóbnych derivátov chryzínu (28). Tým, že štúdie ukázali, že flavóny sa viažu na P-gp s vyššou afinitou ako isoflavóny, flavanóny alebo glykosylované deriváty, zamerali sa práve na spomínané flavóny. Zvýšenie hydrofobicity v polohe 6, 8 alebo 7 zvyšovalo afinitu väzby in vitro k purifikovanej cytosolickej doméne P-gp, ale len benzyl a3,3- dimetylallyl (prenyl), spôsobili maximálne zvýšenie vnútornej fluorescencie proteínu [44], [52]. Pre štúdium efluxu sprostredkovaného P-gp bola použitá bunková línia K562/R7 (ľudské leukemické bunky), exprimujúca vysoké hladiny P-gp. Ako cytostatikum bol zvolený daunomycín (DNM) pri koncentrácii 10 µM a účinky boli skúmané v prí- tomnosti alebo neprítomnosti modulátorov. Len izoprenylované deriváty boli schopné inhibovať P-glykoproteínom sprostredkovaný eflux daunomycínu z leukemickej bunky K562/R7, čo vedie k zvýšenej intracelulárnej akumlácii DNM (Tabuľka 3.9). Zatiaľ čo chryzín (28) spôsobil obmedzenú inhibíciu efluxu DNM v porovnaní s cyklosporí- nom A, omnoho vyšší účinok bol pozorovaný s prenylovou substitúciou v polohe 6 (6-prenylchryzín (75)) alebo ešte vyšší v polohe 8 (8-prenylchryzín (76)). V skutočnosti bol účinok 8-prenylchryzínu (76) silnejší než účinok cyklosporínu A, ktorý je pova- žovaný za jeden z najsilnejších dostupných modulátorov. Rozdiel pozorovaný medzi dvoma pozíciami substitúcie prenylom, môže naznačovať určitý rozdiel v orientácii väzby [44], [52].

Tabuľka 3.9: V tabuľke sú uvedené izoprenylované deriváty chryzínu. Relatívna akumu- lácia DNM (inhibícia efluxu DNM) je vyjadrená ako pomer účinku dosiahnutého s 10 µM daného derivátu chryzínu k účinku cyklosporínu A (2 µM). Index hydrofobicity každého derivátu chryzínu bol stanovený pomocou TLC na reverznej fáze silikagél C18. Ostatné testované deriváty chryzínu sú uvedené v prílohe [44].

Flavón Akumulácia daunomycínu Index hydrofobicity Chryzín (28) 0,2 0,358 6-prenylchryzín (75) 0,83 0,812 8-prenylchryzín (76) 1,52 0,853 6,8-diprenylchryzín (77) 0,84 1,296 6-geranylchryzín (80) 0,81 1,288 8-geranylchryzín (81) 0,90 1,350

Je dôležité spomenúť, že modulačné účinky C-izoprenylovaných derivátov chryzínu boli pozorované pri koncentráciách, ktoré neboli toxické pre bunky, čo naznačuje, že

39 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY tieto zlúčeniny by mali byť skúmané in vivo, ako potencionálne modulátory P-gp v nádorových bunkách [44] [52].

3.2.9 Silymarín (112)

Vedci sa zamerali na silymarín získaný zo semien Silybum marianum. Používa sa už od dôb starodávnych lekárov a bylinkárov na liečbu rôznych porúch pečene a žlčníka vrátane hepatitídy, cirhózy a žltačky, tiež na ochranu pečene pred otravou chemickými látkami a toxínmi zo životného prostredia. To sú typické aplikácie, na ktoré sa doteraz používal silymarín, jeho hlavná zložka silybín a prípravky z nich. Avšak boli objavené jeho ďalšie účinky. Jednou z najsľubnejších aktivít tejto zlúčeniny je jej protirakovinová aktivita, ktorá je aspoň čiastočne výsledkom jej cytoprotektívnych, antioxidačných a chemopreventívnych vlastností. Silybín sa tiež skúmal, ako cytoprotektívne činidlo alebo senzibilizátor na protinádorovú chemoterapiu s použitím klasických cytostatík ako je cisplatina či adriamycín. Bolo jasne preukázané zosilnenie protirakovinovej aktivity týchto liekov silybínom. Jedným z prijateľných vysvetlení synergických účinkov silybínu a protirakovinových liekov je inhibícia efluxnej funkcie transportéra P-gp [53]. Cieľom štúdie bolo preskúmať protirakovinovú a inhibičnú aktivitu nových derivátov 2,3-dehydrosilybínu (120) (Tabuľka 3.10). Analýza efluxnej aktivity P-gp v prítomnosti alebo neprítomnosti 2,3-dehydrosilybínových derivátov bola založená na meraní obsahu intracelulárneho daunorubicínu (DNR)17 prietokovou cytometriou. Výsledky ukazujú, že vybrané silybínové deriváty účinne inhibovali P-gp sprostredkovaný odtok DNR z buniek K56218 exprimujúcich P-gp. Inhibícia bola závislá na koncentrácii a vykazovala klasickú sigmoidálnu krivku dávka–odpoveď, čo naznačuje kompetitívnu inhibíciu s konštantnou koncentráciou DNR. Pre silybínové deriváty bola 50 % účinná koncentrácia liečiva (EC50) v rozmedzí 0, 1 ∼ 20, 1 µM, a teda vo vybraných prípadoch prekročila účinnosť štandardného inhibítora P-gp, cyklosporínu A (4, 09 µM) [53]. Vedci našli novú skupinu netoxických inhibítorov P-gp na báze O-alkylovaných derivátov 2,3-dehydrosilybínu (zlúčeniny 123, 125, 126, 127). Tieto zlúčeniny sú veľmi účinnými inhibítormi pri nižších dávkach, ako je najnižšia LD50 (koncentrácia liečiva letálna pre 50 % buniek) hodnota. Zlúčeniny 120, 121, 122, 124 sú účinnými inhibítormi efluxu P-gp, ale vykazujú vysokú vnútornú cytotoxicitu pre všetky testované bunkové línie [53].

17. fluorescenčný substrát P-gp (antracyklínové antibiotikum) 18. bunková línia ľudskej myeloidnej leukémie

40 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Základná štruktúra 2,3-dehydrosilybínu (120)

Tabuľka 3.10: deriváty 2,3-dehydrosilybínu, Imax – maximálna inhibičná aktivita, EC50 − 50% účinná koncentrácia, Bn – benzyl, Me – metyl [53].

Zlúčenina R1 R2 R3 Imax (%) EC50 (µM) 2,3-dehydrosilybín (DHS) (120) H H H 58 9,4 7-O-benzyl-2,3-DHS (121) Bn H H 68 0,88 3-O-metyl-2,3-DHS (122) H H Me 130 4,8 20-O-metyl-2,3-DHS (123) H Me H 48 0,1 3,7-di-O-metyl-2,3-DHS (124) Me H Me 66 1,37 7,20-di-O-metyl-2,3-DHS (125) Me Me H 65 0,89 3,20-di-O-metyl-2,3-DHS (126) H Me Me 48 2,7 3,7,20-tri-O-metyl-2,3-DHS (127) Me Me Me 79 0,16

3.3 Efluxná pumpa BCRP

BCRP funguje v normálnych tkanivách ako obranný mechanizmus proti toxínom a xenobiotikám s expresiou v črevách, žlčových kanáloch, placente, hematotestikulárných a hematoencefalických bariérach, ktoré uľahčujú vylučovanie a obmedzujú absorpciu potenciálne toxických molekúl substrátu, vrátane mnohých chemoterapeutických liekov proti rakovine [54]. BCRP hrá kľúčovú úlohu v homeostáze hemov a folátov, čo môže pomôcť normál- nym bunkám prežiť v podmienkach hypoxie. Expresia BCRP sa javí ako charakteristika určitých kmeňových buniek normálneho tkaniva nazývaných „bunky bočnej populácie“, ktoré sú identifikované na základe prietokovej cytometrickej analýzy podľa ich schopnosti vylúčiť Hoechst 33342, fluorescenčné farbivo, ktoré je substrátom BCRP. Expresia BCRP teda môže prispievať k prirodzenej rezistencii a dlhovekosti týchto normálnych kmeňových buniek. Pribúdajú dôkazy o tom, že mnoho druhov rakoviny vykazuje subpopulácie kmeňových buniek, ktoré sú zodpovedné za samoobnovu nádoru. Takéto

41 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY kmeňové bunky často prejavujú fenotyp „vedľajšej populácie“ charakterizovaný expresiou BCRP a iných transportérov ABC. Spolu s ďalšími faktormi môžu tieto transportéry prispievať k rezistencii týchto novotvarov a k ich neliečeniu [54].

Obr. 3.30: Súhrn štruktúrnych znakov ovplyvňujúcich inhibíciu BCRP pomocou flavonoidov. Znaky plus označujú pozitívny príspevok štrukturálnych prvkov k anti-BCRP aktivite. Mínusové znaky ilustrujú negatívny vplyv na inhibíciu BCRP. Výsledky sú založené na dátach z prístupov 2D a 3D QSAR z predloženej štúdie, ako aj zistenia z 2D analýz prevzatých z literatúry [55].

3.3.1 Ayanín (46) a retusín (47)

Vedci sa zamerali na štrukturálne rôznorodú sadu flavonoidov a testovali jej účinnosť na inhibíciu proteínu rezistencie na rakovinu prsníka (BCRP) kódovaného ABCG2 génom. Modelový systém tvorili bunkové línie MCF-7 MX19 a MDCK BCRP20, nadmerne exprimujúce gén ABCG2 (bunková línia MDCK BCRP obsahuje vyššiu hladinu expresie ABCG2 ako bunková línia MCF-7 MX). Na stanovenie inhibičnej účinnosti flavonoidov proti BCRP v bunkách MCF-7 MX a MDCK BCRP bol aplikovaný test Hoechst 3334221. Bolo preukázané, že Hoechst je dobrým substrátom pre BCRP [55]. Vedci sa zamerali na veľkú sadu flavonoidov, ktorá pozostávala z flavanónov, fla- vónov, isoflavónov, glykozidov a biflavonoidov. Z tejto veľkej sady flavonoidov, medzi najúčinnejšie patrili flavónové deriváty penduletín (45), ayanín (46) a retusín (47)tie

19. Bunková línia rakoviny prsníka, nadmerne exprimujúca BCRP 20. Bunky boli generované transfekciou epiteliálnej bunkovej línie psích obličiek MDCKII s ľudským cDNA divokého typu 21. Bisbenzimid (Hoechst 33342) je organická zlúčenina používaná ako fluorescenčné farbivo pre DNA v aplikáciách molekulárnej biológie

42 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY vykazovali najnižšie hodnoty IC50 (Tabuľka 3.11). Retusín (47) bol iba o niečo menej účinný ako Ko14322 pri inhibícii BCRP. Z dôvodu slabej inhibície MRP1, ako aj nízkej inhibičnej účinnosti proti P-gp, je možné ayanín a retusín klasifikovať ako selektívne BCRP modulátory [55]. Podľa QSAR analýzy bol odhalený vplyv substituentov na rôznych pozíciach flavó- nového reťazca. Zistilo sa, že nasledujúce štrukturálne znaky pozitívne prispievajú k inhibícii BCRP: hydroxylová skupina v polohe 5, dvojitá väzba medzi polohou 2 a 3 a metoxy skupina v polohe 3. Medzi týmito štrukturálnymi znakmi, najsilnejšie zvýšilo interakciu s BCRP zavedenie metoxyskupiny v polohe 3. Ayanín a retusín zdieľajú všetky tieto štrukturálne prvky a patria k najúčinnejším a najselektívnejším doteraz známym inhibítorom BCRP [55].

Tabuľka 3.11: Účinky flavónov na inhibíciu BCRP v bunkách MDCK BCRP aMCF-7MX pomocou testu Hoechst 33342 [55].

Flavón IC50 (µM) MDCK BCRP MCF-7 MX Penduletín (45) 1,2 ± 0,6 2,0 ± 1,3 Ayanín (46) 0,46 ± 0,04 0,68 ± 0,08 Retusín (47) 0,39 ± 0,14 0,90 ± 0,32 Ko143 0,21 ± 0,15 0,39 ± 0,01

3.3.2 Deriváty flavonoidov, ktoré inhibujú BCRP

V nasledujúcich štúdiách bola preskúmaná séria zlúčenín z prirodzene sa vyskytujúcich flavonoidov. Zlúčeniny boli hodnotené na bunkových líniách nadmerne exprimujúcich BCRP/ABCG2. Na skríning ich inhibičnej aktivity boli použité ľudské bunky HEK-29323 transfekované divokým typom (R482) ABCG2, ktoré aktívne efluxujú mitoxantrón. Druhou bunkovou líniou boli mutantné (T482) bunky transfekované ABCG2 (túto bunkovú líniu používali len v štúdii [34]). Tieto bunkové línie boli vystavené pôsobeniu mitoxantrónu a derivátov flavonoidov. Boli vyhodnotené účinky na inhibíciu podľa počtu a pozície OH skupín a hydrofobicity (Tabuľka 3.13) [34], [56].

22. Doteraz najúčinnejší inhibítor BCRP 23. Bunky ľudskej embryonálnej obličky 293

43 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Tabuľka 3.12: Vzťah štruktúry a aktivity flavonoidov na inhibíciu transportnej aktivity ABCG2. Účinky substitúcie na odtok mitoxantrónu sprostredkovaný BCRP. Hodnoty IC50 boli stanovené prietokovou cytometriou po inkubácii s R482 alebo T482, BCRP transfekovaných buniek HEK293 v prítomnosti mitoxantrónu a rôznych koncentrácii de- rivátov flavonoidov. C log P – logaritmus rozdeľovacieho koeficientu medzi n-oktanolom a vodou je miera hydrofilnosti zlúčeniny [56] [34].

Zlúčeniny IC50 (µM) BCRP-R482 BCRP-T482 C log P Flavón (15) 2, 8 ± 0, 6 1, 7 ± 0, 4 3,48 3-Hydroxyflavón16 ( ) 8, 1 ± 1, 9 4, 9 ± 0, 1 3,04 5-Hydroxyflavón17 ( ) 5 ± 1, 5 – 4,11 7-Hydroxyflavón18 ( ) 7, 1 ± 0, 3 13, 9 ± 1, 51 3,21 Chryzín (28) 4, 6 ± 0, 5 4, 5 ± 0, 8 3,56 5-Hydroxy-7-metoxyflavón31 ( ) 3, 0 ± 0, 9 – 4,68 5,7,4´-Trihydroxyflavón20 ( ) 15 ± 2 – 2,91 3,5,7-Trihydroxyflavón21 ( ) 17 ± 3 – 2,76 5,7,4´-Trihydroxyflavanón95 ( ) 34 ± 5 – 2,44 5,7,4´-Trihydroxyisoflavón (1) 21 ± 3 – 2,41 Tectochryzín (48) 3, 0 ± 0, 9 1, 9 ± 0, 3 – 6-Geranylchryzín (80) 1, 0 ± 0, 4 –– 6-Farnesylchryzín (83) > 10 –– 6,8-Digeranylchryzín (82) 2, 1 ± 0, 5 –– GF 120918 0, 31 ± 0, 14 6, 9 ± 2, 6 – 6-Prenylchryzín (75) 0, 29 ± 0, 06 3, 6 ± 1, 9 5,56 6-(1,1-DMA)chryzín (78) 0, 78 ± 0, 15 > 10 5,23 8-Prenylchryzín (76) 0, 89 ± 0, 31 > 10 5,51 8-(1,1-DMA)chryzín (79) 1, 4 ± 0, 5 > 10 5,33 Kushenol E (102) 5 ± 1 – 5,79 Artochamin C (84) 7, 5 ± 1, 5 – 4,38

C-izoprenylácia buď v polohe 6 alebo 8 výrazne zvýšila inhibičnú účinnosť, pričom najvyšší účinok vyvoláva prenyl v polohe 6, s 15-násobne zvýšenou afinitou v porov- naní s chryzínom (28). Inhibičná účinnosť 6-prenylchryzínu (76) bola ekvivalentná s GF12091824. Mierne nižšie účinky boli vyvolané buď 1,1-dimetylallylom isomerovým substituentom v rovnakej polohe, alebo prenylom v polohe 8. Ukázalo sa, že tvarové parametre a hydrofóbnosť sú hlavnými fyzikálno–chemickými parametrami zodpoved- nými za inhibičnú aktivitu derivátov flavonoidov voči BCRP, zatiaľ čo kapacita donora vodíkových väzieb sa javila ako veľmi nepriaznivá [56], [34]. Zlúčeniny 84 a 102 boli prvýkrát testované ako inhibítory BCRP. Zaujali pozornosť vedcov, pretože majú štrukturálne kritériá, ktoré sa nachádzajú medzi inhibítormi BCRP:

24. silný inhibítor P-gp a BCRP 44 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY prenylový reťazec a flavonoidnú štruktúru. Tieto zlúčeniny boli získané z kmeňovej kôry Morus mesozygia Stapf. (Moraceae) [34] [56].

Cieľom nasledujúcej štúdie bolo objasniť vzťah štruktúra–aktivita (SAR) a odvodiť kvantitatívny vzťah štruktúra–aktivita (QSAR) interakcií flavonoid–BCRP s cieľom predpovedať inhibičné aktivity BCRP mnohých ďalších netestovaných flavonoidov a nasmerovať syntézu flavonoidných zlúčenín s vyššou účinnosťou na potenciálne klinické použitie [57].

Obr. 3.31: Vplyv substitúcie na inhibíciu BCRP. Hrubé šípky – pozitívna substitúcia, tenké šípky – negatívna substitúcia [34].

S cieľom zistiť či flavonoidy vybrané pre túto štúdiu sú inhibítormi BCRP, vedci najskôr vyhodnotili účinky flavonoidov na akumuláciu mitoxantrónu (MX) v bunkách MCF-7/ senzitívnych ako aj v bunkách MCF-7/MX100 rezistentných. Všetky testované flavonoidy zvýšili akumuláciu MX o viac ako 300 % v porovnaní s kontrolou. Zvýšenie akumulácie MX v bunkách MCF-7 MX100 týmito flavonoidmi možno pripísať inhibícii BCRP. Na uskutočnenie SAR a QSAR analýzy je potrebné zmerať účinnosť flavonoidov na inhibíciu BCRP. V predloženej štúdii bola účinnosť na inhibíciu BCRP predstavovaná 25 hodnotami EC50 flavonoidov, na zvýšenie akumulácie MX v bunkách MCF-7 MX100 nadmerne exprimujúcich BCRP (Tabuľka 3.13). Vplyv substitúcie flavonoidov (vzťah štruktúra–aktivita) znázorňuje Obrázok 3.31, ktorý sa zhoduje s už spomínaným v tejto práci (Obrázok 3.30) [57].

25. Polovica maximálnej efektívnej koncentrácie

45 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Tabuľka 3.13: Akumulácia MX bola hodnotená v prítomnosti rôznych koncentrácií jed- notlivých flavonoidov a taktiež boli vypočítané EC50 hodnoty flavonoidov na zvýšenie akumulácie MX [57].

Flavóny EC50 (µM) Flavanóny EC50 (µM) 6,4´-Dimetoxy- 0, 45 ± 0, 25 5,6,7-Trimetoxy- 5, 67 ± 4, 74 3-hydroxyflavón44 ( ) flavanón (100) Chryzín (28) 0, 39 ± 0, 13 Flavanón (92) 24, 6 ± 5, 21 Flavón (15) 3, 99 ± 1, 78 Hesperetín (98) 12, 4 ± 2, 21 2´-Hydroxy-α- 0, 09 ± 0, 05 6, 7,2´,3´-Tetrahydroxy- 14, 2 ± 1, 48 naphthoflavón (91) flavanón (97) Kaempferol (25) 6, 04 ± 0, 09 7-metoxyflavanón101 ( ) 16, 3 ± 4, 25 5,7-Dimetoxyflavón42 ( ) 1, 41 ± 0, 26 Naringenín (95) 32, 0 ± 3, 22 7,8-Benzoflavón90 ( ) 0, 07 ± 0, 02 Isoflavóny Baicaleín (23) 1, 21 ± 0, 35 Biochanín A (3) 1, 62 ± 1, 02 5,6,7-Trimetoxyflavón43 ( ) 1, 09 ± 0, 41 Daidzeín (2) 57, 3 ± 15, 8 Apigenín (20) 1.66 ± 0, 55 Genisteín (1) 14, 9 ± 2, 69 Galangín (21) 1, 21 ± 0, 27 silybín (112) 182 ± 21, 7 8-Metylflavón62 ( ) 0, 61 ± 0, 15

3.3.3 Polyfenoly, ktoré inhibujú efluxnú pumpu BCRP

Vedci v nasledujúcej štúdii skúmali účinky polyfenolov, na funkciu BCRP prietokovou cytometrickou analýzou akumulácie mitoxantrónu v dvoch bunkových líniách exprimu- júcich vysoké hladiny BCRP. Boli použité bunkové línie MCF7/MR26 a K562/BCRP27.V žiadnej z bunkových línii nebola pozorovaná expresia P-gp [58]. Prietoková cytometria odhalila, že všetky polyfenoly zvýšili akumuláciu mitoxan- trónu v bunkových líniách nadmerne exprimujúcich BCRP, ale nie v bunkových líniách materského typu (Tabuľka 3.14). Pri 30 µM vyvolal citrusový flavonoid hesperetín (98), najväčšiu inhibíciu aktivity BCRP, podobnú inhibícii produkovanej Ko143 pri 10 µM. Polyfenoly produkovali väčšie zvýšenie akumulácie substrátu v bunkách MCF7/MR ako v bunkách K562/BCRP, čo je v súlade s väčšou expresiou BCRP v bunkách MCF7/MR a teda pravdepodobne vyšší stupeň efluxu, ktorý je možné inhibovať [58].

26. Bunková línia rakoviny prsníka nadmerne exprimujúca BCRP 27. Ľudská myelogénna leukemická bunková línia nadmerne exprimujúca BCRP

46 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Tabuľka 3.14: Stredná fluorescencia buniek ošetrených ako substrátom tak aj polyfenolom je významne vyššia ako stredná fluorescencia buniek ošetrených samotným substrátom pre dve bunkové línie nadmerne exprimujúce BCRP,ale nie pre bunkové línie materského typu (MCF7/WT, K562) z čoho vyplýva inhibícia BCRP polyfenolmi [58].

Polyfenoly 5 µM mitoxantrónu MCF7/WT MCF7/MR K562 K562/BCRP Kontrola (samotný mitoxantrón) 73 ± 6 26 ± 1 80 ± 20 36 ± 8 10 µM KO143 71 ± 3 78 ± 10 77 ± 22 79 ± 16 30 µM daidzeín (2) 66 ± 1 72 ± 11 73 ± 16 69 ± 16 30 µM hesperetín (98) 68 ± 6 90 ± 21 77 ± 23 67 ± 16 30 µM quercetín (19) 59 ± 4 84 ± 15 66 ± 18 60 ± 13 30 µM silymarín (112) 71 ± 3 78 ± 13 81 ± 23 63 ± 19

Kapil Juvale a kol. (2013) syntetizovali sériu flavónov, 7,8-benzoflavónov a 5,6- benzoflavónov s rôznymi substituentmi v pozíciách 3,3´, 4´ (benzo) flavónovej štruktúry. U syntetizovaných zlúčenín sa skúmala ich schopnosť inhibovať BCRP meraním aku- mulácie Hoechst 33342 a feoforbidu A28 v bunkách MDCK29 exprimujúcich BCRP (Tabuľka 3.16, Tabuľka 3.15), [35]. Obrázok 3.32 znázorňuje vplyv rôznych substituentov na inhibíciu BCRP. V štúdii bolo preukázané, že 7,8-benzoflavóny sú aktívnejšie v porovnaní s flavónmi, zatiaľ čo 5,6-benzoflavóny sú najmenej aktívnou skupinou s výnimkou zlúčeniny 129, o ktorej sa zistilo, že je silným inhibítorom BCRP. Zlúčenina 145 je silným netoxickým inhibítorom a má 50 násobnú selektivitu voči BCRP. Zlúčenina 137 by mohla byť dobrým širokos- pektrým MDR modulátorom. Všetky zlúčeniny sa taktiež skúmali na inhibíciu P-gp a MRP1, zistilo sa, že väčšina zlúčenín je selektívna voči BCRP [35].

Obr. 3.32: Vplyv rôznych substituentov benzoflavónov na inhibíciu BCRP [35]

28. Feoforbid A je produktom rozkladu chlorofylu, používa sa ako fotosenzibilizátor 29. Bunková línia psích obličiek Madin-Darby

47 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

A – 5,6-benzoflavón (89) 89 ∼ 135 B – 7,8-benzoflavón (90) 90 ∼ 146

Tabuľka 3.15: Syntetizované 5,6-benzoflavóny a 7,8- benzoflavóny a ich inhibičný potenciál proti bunkách MDCK BCRP v teste Hoechst a v teste feoforbid A. Ko143 – doteraz najúčinnejší inhibítor BCRP [35].

Hoechst 33342 Feoforbid A Zlúčenina R3 R30 R40 IC50 ± SD(µM) IC50 ± SD(µM) 89 HHH 8, 32 ± 0, 61 6, 05 ± 1, 62 128 H H OCH3 2, 46 ± 0, 15 1, 69 ± 0, 07 129 H OCH3 OCH3 0, 590 ± 0, 064 0, 458 ± 0, 053 130 OH H H 11, 0 ± 2, 98 13, 6 ± 2, 40 131 OH H OCH3 8, 93 ± 2, 37 6, 12 ± 1, 54 132 OH OCH3 OCH3 6, 12 ± 0, 35 4, 84 ± 0, 99 133 OCH3 HH 11, 1 ± 1, 37 12, 5 ± 0, 65 134 OCH3 H OCH3 3, 07 ± 0, 04 8, 02 ± 1, 39 135 OCH3 OCH3 OCH3 4, 27 ± 0, 64 5, 25 ± 0, 67 90 HHH 1, 31 ± 0, 12 1, 40 ± 0, 18 136 H H OCH3 1, 28 ± 0, 07 1, 29 ± 0, 09 137 H OCH3 OCH3 1, 23 ± 0, 08 1, 13 ± 0, 19 138 H OCH3 F 0, 522 ± 0, 082 0, 457 ± 0, 124 139 OH H H 2, 89 ± 0, 73 1, 59 ± 0, 14 140 OH H OCH3 6, 93 ± 1, 58 4, 97 ± 0, 88 141 OH OCH3 OCH3 0, 724 ± 0, 049 1, 52 ± 0, 08 142 OH OCH3 F 22, 5 ± 4, 90 17, 9 ± 0, 29 143 OCH3 HH 2, 71 ± 0, 41 2, 31 ± 0, 04 144 OCH3 H OCH3 1, 06 ± 0, 26 3, 07 ± 0, 38 145 OCH3 OCH3 OCH3 0, 426 ± 0, 019 0, 468 ± 0, 034 146 OCH3 OCH3 F 2, 44 ± 0, 25 4, 01 ± 0, 77 Ko143 - - - 0, 215 ± 0, 017 0, 354 ± 0, 042

48 3. FLAVONOIDY, KTORÉ INHIBUJÚ EFLUXNÉ PUMPY

Tabuľka 3.16: Syntetizované flavóny a ich inhibičný potenciál proti bunkám MDCK/BCRP v teste Hoechst 33342 a v teste feoforbidu A [35].

Hoechst 33342 Feoforbid A Zlúčenina IC50 ± SD (µM) IC50 ± SD (µM) 50 1, 01 ± 0, 1 1, 77 ± 0, 14 51 12, 4 ± 0, 47 8, 95 ± 0, 65 52 1, 21 ± 0, 12 1, 28 ± 0, 17 53 7, 74 ± 0, 35 6, 50 ± 0, 58 54 1, 18 ± 0, 29 1, 34 ± 0, 19 55 1, 18 ± 0, 18 2, 14 ± 0, 31 41 0, 82 ± 0, 169 1, 88 ± 0, 24 57 5, 98 ± 0, 45 5, 92 ± 0, 74 58 0, 54 ± 0, 079 0, 57 ± 0, 093 59 3, 27 ± 0, 15 3, 89 ± 0, 16

3.3.4 Hispidulín (49)

Hispidulín je primárne prítomný v rastlinách z čeľade Asteraceae a Lamiaceae. Dô- kazy z výskumu ukazujú, že hispidulín má širokú škálu biologických aktivít vrátane protizápalových, antimykotických, antikonvulzívnych, antiosteoporotických a najmä protirakovinových. Štúdie in vitro a in vivo preukázali, že hispidulín vykazuje významnú protirakovinovú aktivitu u rôznych typov rakoviny inhibíciou rastu nádoru a neovasku- larizácie, potlačením metastáz v nádorových bunkách a indukciou apoptózy [59], [60]. Okrem toho, že hispidulín vykazuje významné protinádorové účinky na rôzne druhy rakoviny, je možné ho tiež použiť v kombinácii s konvenčnými chemoterapeutickými liekmi. Hispidulín významne zvyšuje protirakovinový účinok chemoterapeutických liekov inhibíciou efluxu liečiva a zvyšovaním chemosenzitivity rakovinových buniek rezistentných na liečivo [59], [60]. Vedci skonštruovali stabilné transfekované bunky ľudského hepatocelulárneho karci- nómu (HepG2) nadmerne exprimujúceho P-gp, BCRP a MRP1. Výsledky ukázali, že his- pidulín významne potlačil eflux mitoxantrónu sprostredkovaný BCRP (IC50 = 20 µM). Inhibícia efluxu liečiva podporovaná hispidulínom sa javila ako celkom špecifická pre ABCG2, pretože nikdy nebola pozorovaná žiadna inhibícia ani mitoxantrónového efluxu pomocou ABCB1, ani kalceínového efluxu pomocou ABCC1. Okrem toho sa ukázalo, že hispidulín pôsobí ako multišpecifický inhibítor BCRP a významne zvyšuje chemo- senzitivitu chemorezistentných rakovinových buniek nadmerne exprimujúcich BCRP [59], [60].

49 4 Paulownia tomentosa Steud.

Paulownia tomentosa slovensky nazývaná paulownia plstnatá, známa tiež ako čínsky cisársky strom (Obrázok 4.1). Pomenovanie paulownia získala na počesť holandskej kráľovny Anny Pavlovny Romanovovej, dcéry ruského cára Pavla I. a prívlastok tomentosa odkazuje na plstnatú, husto ochlpenú spodnú stranu listov [61], [62].

V diele "Zhuang Tze" (400 p.n.l.) je zaznamenané, že fénix, ktorý prelietal z Juho- čínskeho mora do Severného mora vyhľadával len stromy paulownie a preto Číňania vysádzali stromy paulownie už po mnoho storočí, aby prilákali fénixa a priniesol im šťastie [62].

Obr. 4.1: Paulownia tomentosa [63]

50 4. PAULOWNIA TOMENTOSA STEUD.

4.1 Taxonomická klasifikácia

Tabuľka 4.1: Taxonomická klasifikácia P. tomentosa podľa APG IV. [64], [65].

Ríša Plantae Klady Angiosperms Eudicots Core Eudicots Asterids Euasterids Rad Lamiales Čeľaď Paulowniaceae Rod Paulownia Siebold & Zucc. Druh Paulownia tomentosa (Thunb.) Steud.

Švajčiarsky botanik Thunberg v roku 1781 pomenoval rod Paulownia a zaradil ho do čeľade Bignoniaceae. V roku 1835 holandskí učenci Zuccarini a Siebold po preštudovaní ďalších podrobností o rastline presunuli tento rod do čeľade Scrophulariaceae [62]. V roku 1949 na základe najnovších molekulárnych fylogenetických štúdií Nakai rod Paulo- wnia kategorizoval ako svoju vlastnú čeľaď Paulowniaceae [66]. Taxonomické zaradenie rastliny upresňuje Tabuľka 4.1.

Rod Paulownia, patriaci k monogenerickej čeľadi Paulowniaceae sa skladá z deviatich druhov: P. albiphloea, P. australis, P. catalpifolia, P. elongata, P. fargesii, P. fortunei, P. kawakamii, P. taiwananiana, P. tomentosa. Druhy Paulownie sú široko rozšírené v rôznych regiónoch v Číne a niektoré z týchto druhov sú taktiež pestované v mnohých krajinách po celom svete [67].

4.2 Pôvod a geografický výskyt

Paulownia tomentosa je mimoriadne rýchlo rastúci strom pochádzajúci zo strednej a západ- nej Číny, ktorý sa tradične používa v čínskej medicíne. Tento listnatý strom je rozšírený po celej Číne, Kórei a Japonsku. Dnes je už pestovaná na všetkých kontinentoch okrem Antarktídy, predovšetkým ako dekoratívna drevina. Vo východnej časti Severnej Ame- riky je však inváznym druhom [61] [68].

51 4. PAULOWNIA TOMENTOSA STEUD.

Rastie rovnako dobre v rovinách aj horských oblastiach až do výšky 2000 m. n. m.. Je svetlomilnou drevinou, v mladosti toleruje aj mierny bočný tieň. Neznáša tieň iných stromov, darí sa jej, keď ich prevyšuje. Kvitnúť začína už po ôsmich rokoch veku. Je relatívne náročná na vlahu, no znesie aj v lete vysychavé pôdy. Uprednostňuje skôr hlboké, mierne kyslé až neutrálne piesčito-hlinité pôdy s dostatkom živín. Nie je príliš odolná voči klimatickým výkyvom, pri silných mrazoch nahé kvetné puky a mladé výhonky odmŕzajú. Je celkovo tolerantná k znečistenému ovzdušiu priemyselných oblastí. Paulownia je nazývaná aj kysličníkový strom, 600 stromov na ploche 1 ha dokáže pohltiť až 100 ton CO2 ročne [68], [62].

4.3 Morfológia

P. tomentosa je listnatý strom vysoký asi 10–20 m so širokou korunou a silnými vetvami, ktoré sú v mladom veku pokryté tmavou plsťou. Stromy sú nápadné voňavými kvetmi a veľkými listami (Obrázok 4.2). Pri optimálnych podmienkach zhruba po šiestich rokoch rastu, je priemerná veľkosť kmeňa 30–40 cm. Kmeň môže dosiahnuť v priemere až 1,2 m. Dospelé stromy sa dožívajú viac ako 70 rokov [69], [70]. Kmeň je rovný, sfarbený olivovo až tmavohnedo. Sivohnedá borka je v mladosti hladká, neskôr pozdĺžne brázditá s prerušovanými lesklými a hladkými oblasťami. Nápadné sú biele lenticely. Typickým znakom je tvorba silných letokruhov s pozdĺžnou stredovou dutinou [71]. Listy sú mimoriadne veľké, celokrajné, široko vajcovité alebo 3–5 laločnaté, na bázi srdco- vito vykrojené a na rubovej strane husto plstnaté. Zvyčajne dosahujú dĺžku 15–30 cm, na bujných letorastoch však môžu byť ešte väčšie. Opadávajú skoro na jeseň, bez jesenného sfarbenia. Puky sa v kvetných pupeňoch zakladajú už na jeseň a zimu prežívajú chránené obalom z hnedočervenej plsti [71]. Kvety paulownie kvitnú koncom apríla alebo začiatkom mája skôr než sa objavia listy. Kvety sú 5–6 cm dlhé, sfarbené do biela až svetlo fialova a tvoria súkvetie 15–30 cm veľké s názvom metlina. Kvetné puky sa začínajú objavovať koncom júla alebo začiatkom augusta a ďalej sa rozvíjajú cez leto. Cez zimu ostávajú vo vzpriamených metlinách s priemerom asi 1 cm. Plody sú suché červenohnedé tobolky, dlhé približne 3–4 cm. Obsahujú početné drobné okrídlené semená, ktoré sú rozptýlené vetrom a vodou [66], [72].

Boli opísané dve príbuzné odrody, P. tomentosa – var. tsinlingensis má okrúhlu až srdcovitú bázu listu a holý alebo riedko chlpatý spodný povrch listov, zatiaľ čo var.

52 4. PAULOWNIA TOMENTOSA STEUD.

Obr. 4.2: Paulownia tomentosa– kvety, kôra, listy a plody [73], [74], [75] tomentosa sa vyznačuje srdcovitou bázou listovej čepele a abaxiálnym povrchom, ktorý je po dozretí husto chlpatý [61].

4.4 Tradičné využitie

Okrem rozsiahleho použitia v priemyselných a poľnohospodárskych oblastiach bola P. tomentosa taktiež používaná v tradičnej čínskej medicíne. Kôra, listy a plody boli používané na liečbu alebo prevenciu bronchitídy, astmy, enteritídy, konjunktivitídy či hemoroidov. Vodné roztoky pripravené z listov sa používali na podporu rastu vlasov a odvary z listov zasa na hojenie rán a vredov. Kvety sa používali na liečbu kožných ochorení ako acne vulgaris, či na liečbu plesňových ochorení chodidiel. Dnes je praktické

53 4. PAULOWNIA TOMENTOSA STEUD. využitie P. tomentosa zatiaľ nezodpovedanou otázkou. Preto je snaha o izoláciu a identifi- káciu obsahových látok a určenie ich biologickej aktivity, ktoré by mohli mať klinické využitie [67].

4.5 Obsahové látky

P. tomentosa je bohatým zdrojom rozmanitých sekundárnych metabolitov, hlavne feno- lového charakteru. Z rôznych častí rastlín boli izolované flavonoidy, lignány, fenolové glykozidy, fenolové kyseliny, terpenoidy, chinóny, glyceridy a rôzne ďalšie zlúčeniny. Bolo izolovaných viac ako 130 fyziologicky aktívnych látok, kde najpočetnejšou skupinou sekundárnych metabolitov sú flavonoidy a to hlavne prenylované. Väčšina izolovaných prenylovaných flavonoidov patrí do C-geranylovej skupiny. Tieto zlúčeniny priťahujú pozornosť vedcov, pretože majú silné farmakologické účinky ako napr. antibakteriálne a antivirotické, cytotoxické a tiež antioxidačné, protizápalové alebo neuroprotektívne [72], [61].

54 5 Cieľ práce

Cieľom teoretickej časti predkladanej diplomovej práce bolo zhrnúť dostupné údaje týkajúce sa flavonoidov, ktoré inhibujú efluxné pumpy a týmto pôsobením môžu zvýšiť účinnosť chemoterapie. Hlavným zdrojom informácii boli vedecké články z rôznych odborných databáz a webových zdrojov. Hlavným cieľom experimentálnej časti práce bolo separovať látky z frakcie PT3K, ktorá pochádza zo skôr získaného extraktu plodov P. tomentosa. Pri práci sme používali rôzne druhy chromatografických metód, pomocou ktorých sme látky izolovali, pričom sme brali ohľad na hmotnosť vzorky a jej zloženie. Následná identifikácia získanej látky prebiehala pomocou UV/VIS spektrofotometrie, IČ, HRMS a NMR spektrometrie a cirkulárneho dichroizmu.

55 ČASŤ II

EXPERIMENTÁLNA ČASŤ

56 6 Materiál a metódy

6.1 Rastlinný materiál

Rastlinný materiál tvorili nezrelé plody zo stromu Paulownia tomentosa, ktoré boli v jeseni v roku 2008 nazbierané v areáli VFU Brno. Maceráciou v etanole bol získaný etanolový extrakt, ktorý bol následne vytrepávaný v sústave voda/chloroform. Chloroformový podiel s vysokým obsahom fenolických zlúčenín bol podrobený stĺpcovej chromatografii. Pracovalo sa s dvoma kolónami, z ktorých bolo získaných spolu 700 frakcií a tie boli na základe podobnosti určenej pomocou TLC chromatografie spojené do 20 frakcií [76]. Zaoberala som sa analyzovaním jednej z týchto frakcií a to konkrétne frakciou PT3K (3600 mg).

6.2 Chemikálie

• Chemikálie pre stĺpcovú chromatografiu a analytickú TLC

– Metanol p.a. (Lach–ner)

– Chloroform p.a. (Lach–ner)

– Etylacetát p.a. (Lach–ner)

– Acetón p.a. (Penta)

– Toluén p.a. (Lach–ner)

– Kyselina mravčia p.a. 98 % (Honeywell, Fluka)

– TLC detekcia: činidlo s kys. sírovou (65 ml H2SO4 v 250 ml dietyléteru)

• Chemikálie pre analytickú a preparatívnu HPLC

– Metanol pre HPLC (J.T. Baker)

– Acetonitril pre HPLC (J.T. Baker)

– Kyselina mravčia p.a. 98 % (Honeywell, Fluka)

– Deionizovaná voda pre HPLC

• Chemikálie pre NMR

– Chloroform-d (Sigma-Aldrich)

57 6. MATERIÁL A METÓDY

6.3 Materiál pre chromatografiu

• Materiál pre TLC

– Analytická TLC: hliníková fólia Silikagel 60 F254, 20 × 20 cm, hrúbka vrstvy 0, 2 mm (Merck)

• Materiál pre stĺpcovú chromatografiu

– Morský piesok p.a. (Dorapis)

– Sklenená kolóna: dĺžka – 71 cm, priemer – 4, 6 cm, výška silikagélu – 51, 5 cm

– Silikagél Sigma-GDA 40 − 63 µm (Sigma-Aldrich)

• Materiál pre HPLC

– Analytická kolóna – Ascentis Express RP-Amide 10 cm x 2, 1 mm x 2, 7 µm

– Semipreparatívna kolóna – Ascentis RP-Amide 25 cm x 10 mm x 5 µm

6.4 Prístroje

• Vákuová rotačná odparka – Waterbath B-480, Rotavapor R-114 (Bűchi)

• Lyofilizátor – CHRIST ALPHA 1-2 LD

• UV lampa – detekcia pri vlnových dĺžkach 254 nm a 365 nm

• Ultrazvukový vodný kúpeľ – Sonorex Digitec (Bandelin)

• Analytické váhy – Ohaus Analytical Plus (Ohaus)

• Prístroj pre výrobu čistenej vody Milli-Q (Millipore)

• Prístroj pre analytickú HPLC – Vysoko účinný kvapalinový chromatograf Agilent 1100, detektor DAD UV/Vis (Agilent Technologies)

• Prístroj pre preparatívnu HPLC – YL 9100 HPLC System , Dionex UltiMate 3000 (detektor Viariable Wavelength detector, termostat ECOM Column oven LCO 101) (Thermo Scientific)

• Infračervený spektrometer – Nicolet Impact 400 D FT-IR

58 6. MATERIÁL A METÓDY

• Hmotnostný spektrometer – Systém UPLC-HRAM-MS pozostávajúci z hmotnost- ného spektrometra q-TOF ImpactII (Bruker Daltonik, Bremen, Nemecko) spojený s chromatografickým systémom UPLC Ultimate 3000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)

6.5 Separačné metódy

6.5.1 Stĺpcová chromatografia

• Stacionárna fáza – silikagél o veľkosti zŕn 0,04 – 0,063 mm

• Mobilná fáza – chloroform : metanol : toluén v pomere 95 : 2,5 : 2,5 (v/v/v)

6.5.2 Chromatografia na tenkej vrstve (TLC)

• Stacionárna fáza – hliníková fólia Silikagél 60 F254

• Mobilná fáza – metanol, chloroform, etylacetát, acetón, toluén a kyselina mravčia v rôznych pomeroch

• Detekcia – UV pri vlnovej dĺžke 254 nm a 365 nm, činidlo s kys. sírovou (65 ml H2SO4 v 250 ml dietyléteru)

6.5.3 Vysoko účinná kvapalinová chromatografia (HPLC)– analytická

• Prístroj – Vysokoúčinný kvapalinový chromatograf AGILENT 1100 s detektorom DAD UV/VIS

• Stacionárna fáza – analytická kolóna Ascentis Express RP–Amide

• Detekcia – DAD detektor pri vlnových dĺžkach λ = 230, 254, 280, 350 a 520 nm

• Elúcia – gradientová

Metóda 1 Nástrek – 1 µl Prietok – 0, 3 ml/min ◦ Teplota – 40 C Mobilná fáza – Metóda KAREL-ST-EXPRESS 03 pre analytickú HPLC (Tabuľka 6.1), metóda PAULOWNIA – LENKA pre analytickú HPLC (Tabuľka 6.2), metóda PAULO- WNIA – LENKA – MeOH pre analytickú HPLC (Tabuľka 6.3)

59 6. MATERIÁL A METÓDY

Tabuľka 6.1: Metóda KAREL-ST-EXPRESS 03 pre analytickú HPLC

Čas (min) Metanol (%) Acetonitril (%) 0, 2% kys. mravčia (%) 0, 00 0 10 90 36, 00 0 100 0 45, 00 0 100 0 45, 01 100 0 0 50, 00 100 0 0 50, 01 0 10 90 60, 00 0 10 90

Metóda 2

Tabuľka 6.2: Metóda PAULOWNIA – LENKA pre analytickú HPLC

Čas (min) Metanol (%) Acetonitril (%) 0, 2% kys. mravčia (%) 0, 00 0 40 60 25, 00 0 85 15 25, 01 100 0 0 30, 00 100 0 0 30, 01 0 100 0 35, 00 0 100 0 35, 01 0 40 60 45, 00 0 40 60

Metóda 3

Tabuľka 6.3: Metóda PAULOWNIA – LENKA-MeOH pre analytickú HPLC

Čas (min) Metanol (%) Acetonitril (%) 0, 2% kys. mravčia (%) 0, 00 50 0 50 25, 00 95 0 5 25, 01 100 0 0 30, 00 100 0 0 30, 01 0 100 0 35, 00 0 100 0 35, 01 50 0 50 45, 00 50 0 50

60 6. MATERIÁL A METÓDY

6.5.4 Vysoko účinná kvapalinová chromatografia (HPLC)– preparatívna

• Prístroj – Vysokoúčinný kvapalinový chromatograf Young-Lin YL9100 s automa- tickým zberačom frakcií, Dionex UltiMate 3000 (detektor Viariable Wavelength detector, termostat ECOM Column oven LCO 101) (Thermo Scientific)

• Stacionárna fáza – Semipreparatívna kolóna Ascentis RP–Amide

• Detekcia – DAD detektor pri vlnových dĺžkach λ = 254, 280 a 350 nm

• Elúcia – gradientová

Metóda 4 Nástrek – 10 µl Prietok – 5 ml/min ◦ Teplota – 40 C Mobilná fáza – Tabuľka 6.4

Tabuľka 6.4: Mobilná fáza preparatívnej HPLC

Čas (min) Metanol (%) Acetonitril (%) 0, 2% kys. mravčia (%) 0, 00 60 0 40 27, 00 75 0 25 27, 01 100 0 0 32, 00 100 0 0 32, 01 0 100 0 37, 00 0 100 0 37, 01 60 0 40 42, 00 60 0 40

Metóda 5 Nástrek – 20 µl Prietok – 5 ml/min ◦ Teplota – 40 C Mobilná fáza – Tabuľka 6.5

61 6. MATERIÁL A METÓDY

Tabuľka 6.5: Mobilná fáza preparatívnej HPLC

Čas (min) Metanol (%) Acetonitril (%) 0, 2% kys. mravčia (%) 0, 00 70 0 30 20, 00 75 0 25 20, 10 100 0 0 25, 00 100 0 0 25, 10 0 100 0 30, 00 0 100 0 30, 10 70 0 30 35, 00 70 0 30

6.6 Identifikačné metódy

6.6.1 Vysokorozlišovacia hmotnostná spektrometria (HRMS)

• Prístroj – Systém UPLC-HRAM-MS pozostávajúci z hmotnostného spektrometra q-TOF ImpactII (Bruker Daltonik, Bremen, Nemecko) spojený s chromatografic- kým systémom UPLC Ultimate 3000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)

• Meranie v pozitívnom aj negatívnom móde

• Rozpúšťadlo: metanol

6.6.2 Nukleárna magnetická rezonancia (NMR)

• Prístroj – JEOL ECZR 400 MHz NMR spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan)

• Rozpúšťadlo – chloroform-d

• Experimenty – 1H, HSQC

6.6.3 Cirkulárny dichroizmus (CD)

• Prístroj – JASCO J-815 CD spectrometer (Jasco, Easton, MD, USA)

• Rozpúšťadlo – metanol

• Koncentrácia – 0,025 mg/ml

62 6. MATERIÁL A METÓDY

6.6.4 Infračervená spektrometria (IČ)

• Prístroj – Nicolet Impact 400D FT-IR instrument (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)

• Metóda – ATR

63 7 Pracovný postup

7.1 Vzorka PT3K

Získanie vzorky PT3K, s ktorou sme pracovali bolo popísané v predchádzajúcej podkapi- tole 6.1. Vzorku sme rozpustili v zmesi metanolu a chloroformu, odparili a nasledovalo jej váženie. Hmotnosť našej frakcie bola stanovená na 3600 mg. Na základe hmotnosti a ana- lytického HPLC chromatogramu (Obrázok 7.1), na ktorom bolo viditeľné, že vo vzorke sa nachádza množstvo látok, sme ako ďalší postup zvolili stĺpcovú chromatografiu.

Obr. 7.1: HPLC chromatogram vzorky PT3K

7.2 Určenie mobilnej fázy pre stĺpcovú chromatografiu

Výber vhodnej mobilnej fázy pre stĺpcovú chromatografiu sme skúmali pomocou tenko- vrstvej chromatografie (TLC) a UV detekcie. TLC metódu sme zvolili vzhľadom ktomu, že je veľmi rýchla a vyžaduje len malé množstvo vzorky. Vzorku sme rozpustili v zmesi metanolu a chloroformu a naniesli na štart, ktorý sme mali vyznačený na TLC doštičke. Po odparení rozpúšťadla sme TLC doštičku nechali vyvíjať v nasýtenej chromatografic- kej komore so skúšanou mobilnou fázou. Po ukončení vyvíjania sme na TLC doštičke označili čelo. Skúšali sme rôzne mobilné fázy s rôznym pomerom chemikálii:

• metanol : chloroform : HCOOH v pomere 5 : 95 : 0,1 ml (v/v/v)

• etylacetát : chloroform v pomere 30 : 70 (v/v)

64 7. PRACOVNÝ POSTUP

Obr. 7.2: TLC vzorky PT3K (pod UV lampou λ= 253 nm)

• etylacetát : metanol : chloroform v pomere 2,5 : 2,5 : 95 (v/v/v)

• acetón : chloroform v pomere 10 : 90 (v/v)

• chloroform : metanol : toluén v pomere 95 : 2,5 : 2,5 (v/v/v)

Po vyskúšaní rozličných chemikálii a ich pomerov sme vybrali mobilnú fázu, kde naj- lepšie dochádzalo k separácii jednotlivých zložiek. Nami zvolená mobilná fáza mala zloženie chloroform : metanol : toluén v pomere 95 : 2,5 : 2,5 (v/v/v) (Obrázok 7.2).

7.3 Separácia vzorky PT3K stĺpcovou chromatografiou

Sklenená kolóna, ktorú sme vybrali pre stĺpcovú chromatografiu mala dĺžku 71 cma vnútorný priemer 4,6 cm. Silikagél sme zhomogenizovali s mobilnou fázou a naplnili kolónu touto suspenziou asi do výšky 15 cm od horného okraja. Na povrch silikagélu sme umiestnili krúžok filtračného papiera a zafixovali asi 1 cm morského piesku. Výška silikagélu bola 51,5 cm. Kolónu sme nechali jeden deň ustáť a nasledovalo nanášanie vzorky rozpustenej v asi 20 ml mobilnej fázy. Následne, ako bola kolóna pripravená, začali sme zbierať frakcie o objeme zhruba 125 ml do varných baniek (Obrázok 7.3). Celkom bolo získaných 92 baniek s eluátom. Približne v polovici separácie bolo potrebné zmeniť mobilnú fázu na polárnejšiu, pretože súčasná fáza už nedelila vzorku efektívne. V okamihu, keď už sa vzorka výrazne ďalej nedelila, bol ako mobilná fáza použitý metanol, ktorý slúžil na premytie kolóny. Tým bola stĺpcová chromatografia ukončená.

65 7. PRACOVNÝ POSTUP

7.4 Spojenie frakcií stĺpcovej chromatografie

Získané frakcie zo stĺpcovej chromatografie sme odparili na rotačnej vákuovej odparke a následne sme ich analyzovali a spájali na základe výsledkov z TLC a HPLC. Mobilnú fázu pre TLC sme zvolili tú istú akú sme používali pri stĺpcovej chromatografii. Výsledky z TLC sa ukázali len ako orientačné pre spájanie frakcií, preto sme pre podrobnejšiu analýzu podrobili frakcie HPLC s použitím metódy 1. Na základe získaných výsledkov sme jednotlivé frakcie spojili do konečného počtu 25 frakcií ako znázorňuje Tabuľka 7.1.

Frakcia Hmotnosť vzorky (mg) PT3K/4 33,04 PT3K/5 35,82 PT3K/6-7 411,63 PT3K/8-9 340,27 PT3K/10-12 125,22 PT3K/13-15 435,50 PT3K/16-17 174,88 PT3K/18-19 246,60 PT3K/20-21 204,10 PT3K/22-23 256,26 PT3K/24-25 237,94 PT3K/26-28 298,19 PT3K/29-30 71,50 PT3K/31-34 128,27 PT3K/35-36 62,13 PT3K/37-38 51,54 PT3K/39-48 135,51 PT3K/49-52 116,11 PT3K/53-56 47,89 PT3K/57-60 39,51 PT3K/61-64 60,00 PT3K/65-69 65,70 PT3K/70-73 23,79 PT3K/74-81 147,76 PT3K/82-92 59,10

Tabuľka 7.1: Hmotnosť frakcií Obr. 7.3: Kolóna stĺpcovej chromatografie spojených na základe TLC a HPLC

Zlúčené frakcie sme opäť analyzovali pomocou TLC a HPLC a rozhodovali sme sa, s ktorými budeme pracovať ďalej. Zo získaných chromatogramov sme usúdili, že

66 7. PRACOVNÝ POSTUP zaujímavé pre ďalšiu separáciu budú frakcie PT3K/13-15 (Obrázok 7.4) a PT3K/26-28 (Obrázok 7.5). Tieto frakcie mali dostatočnú hmotnosť a na chromatograme vykazovali silnejšie odozvy, a preto sme predpokladali, že látky tu budú v dostatočnej koncentrácii pre ďalšiu separáciu selektívnejšou metódou – preparatívnou HPLC.

Obr. 7.4: HPLC chromatogram vzorky PT3K/13-15 pri 280 nm

Obr. 7.5: HPLC chromatogram vzorky PT3K/26-28 pri 280 nm

7.5 Výber metódy pre preparatívnu HPLC frakcia PT3K/13-15

Frakcia PT3K/13-15 vykazovala na chromatograme zmes látok s dvoma výraznejšími píkmi, ktoré sme sa rozhodli oddeliť a zozbierať. Skúšali sme nájsť vhodnú metódu, aby sa látky dobre separovali. Prvá frakcia bol vo forme dvojpíku, skúšali sme separáciu acetonitrilom a 0, 2 % HCOOH, ale dvojpík sa dobre nedelil. Druhou možnosťou bola

67 7. PRACOVNÝ POSTUP separácia metanolom a 0, 2 % HCOOH, ale ani tam sa nám nepodarilo dvojpík oddeliť, nakoniec sme sa rozhodli, ho zbierať dokopy. Použili sme metódu 4. Druhá látka sa delila od ostatných pekne a tak sa nám ju podarilo zozbierať v čistom stave (v čistom stave na základe DAD detektora). Pri chromatografickom delení frakcií sme zbierali dve frakcie, ktoré sme následne zbavili rozpúšťadiel pomocou vákuovej rotačnej odparky a bol odstránený aj obsah prebytočnej vody lyofilizátorom. Nakoniec sme frakcie zvážili.

Obr. 7.6: Chromatogram preparatívnej HPLC vzorky PT3K/13-15

7.6 Výber metódy pre preparatívnu HPLC frakcia PT3K/26-28

Frakcia PT3K/26-28 vykazovala na chromatograme analytickej HPLC výrazný dvojpík (frakcia PT3K/26-28/2) v 19 min a ďalšie minoritné látky. Zamerali sme sa na tento dvojpík a hľadali vhodnú metódu na separáciu. Najprv sme zvolili separáciu pomocou acetonitrilu a 0, 2 % HCOOH, avšak látka sa správne nedelila. Dvojpík sa nám podarilo oddeliť od ostatných látok za použitia metanolu a 0, 2 % HCOOH (metóda 5). Rozhodli sme sa zozbierať aj ostatné píky s väčšími odozvami. Pri chromatografickom separovaní sme zbierali štyri frakcie, ktoré sme následne odparili, zlyofilizovali a zvážili.

68 7. PRACOVNÝ POSTUP

Obr. 7.7: Chromatogram preparatívnej HPLC vzorky PT3K/26-28

69 8 Výsledky

8.1 Analýza získaných frakcií

Frakcie získané z preparatívnej HPLC boli odparené zlyofilizované a zvážené. Hmotnosti daných frakcií uvádza Tabuľka 8.1. Na chromatogramoch sa vyskytujú ghost píky zo systému. Chromatogram ghost píkov je uvedený v prílohe A.

Tabuľka 8.1: Hmotnosť frakcií získaných z preparatívnej HPLC

Frakcia Hmotnosť (mg) PT3K/13-15/1 93,5 PT3K/13-15/2 11,4 PT3K/26-28/1 6,1 PT3K/26-28/2 68,8 PT3K/26-28/3 3,9 PT3K/26-28/4 2,0

8.1.1 PT3K/13–15/1

Po zlyofilizovaní frakcie sme zistili jej hmotnosť m1 = 93,5 mg. Ako ďalší postup sme zvolili analýzu prostredníctvom analytickej HPLC (UV/VIS spektrofotometria), kde sme použili metódu 1. Chromatogram (Obrázok 8.1) ukázal výrazný dvojpík, to znamená, že vzorka obsahuje dve látky s retenčnými časmi 24,191 min a 24,363 min. Podľa retenčných časov sme usúdili, že by sa mohlo jednať skôr o menej polárne látky. V UV spektrách majú látky maximá pri ≈ 212 nm a ≈ 295 nm, pričom maximum ramena je pri ≈ 230 nm a ≈ 340 nm. Na základe týchto údajov sme usúdili, že by sa mohlo jednať o látky s flavanónovým skeletom [77]. Frakciu sme skúšali analyzovať aj pomocou metódy2a metódy 3. Za použitia metódy 3 sa nám na chromatograme zobrazil len jeden pík, to znamená, že táto metóda nie je pre túto frakciu vhodná. Pokiaľ by sa s frakciou pracovalo ďalej, bolo by zrejme lepšie použiť metódu s acetonitrilom. Na základe hmotnosti, by sa oplatilo s frakciou pracovať ďalej a skúsiť píky oddeliť s možnosťou získania dvoch látok.

8.1.2 PT3K/13-15/2

Po vysušení frakcie PT3K/13-15/2 sme zistili jej hmotnosť, ktorá bola m2 = 11,4 mg. Ďalej sme pokračovali jej analýzou prostredníctvom analytickej HPLC (UV/VIS spektrofotometria), kde sme použili metódu 1. Na chromatograme (Obrázok 8.2) sa ukázalo, že táto

70 8. VÝSLEDKY

Obr. 8.1: Chromatogram analytickej HPLC vzorky PT3K/13-15/1 pri 280 nm a jej UV spektrá frakcia obsahuje látku s čistotou 92 %, ktorá poskytuje súmerný pík s retenčným časom 26,611 min. Vzhľadom k tomuto retenčnému času môžme predpokladať, že sa jedná skôr o látku s nižšou polaritou, ktorá by mohla obsahovať nejaký prenylový reťazec. Látka má UV spektrum, v ktorom sa nachádzajú absorpčné maximá pri ≈ 205 nm a ≈ 275 nm a maximum ramena je pri ≈ 230 nm, 265 nm, 295 nm a 350 nm. Z týchto údajov sme usúdili, že by sa mohlo jednať o látku s pyranoflavanónovým skeletom [78]. S touto frakciou sme sa rozhodli pracovať ďalej a identifikovať ju pomocou IČ, NMR, HRMS a CD.

Obr. 8.2: Chromatogram analytickej HPLC vzorky PT3K/13-15/2 pri 280 nm a jej UV spektrum

71 8. VÝSLEDKY

8.1.3 PT3K/26-28/1

Frakcia PT3K/26-28/1 bola získaná ako zmes viacerých látok. Po lyofilizácii sme zistili hmotnosť frakcie, ktorá bola m3 = 6,1 mg. Vzhľadom k hmotnosti a množstve látok v tejto frakcii sme sa rozhodli, že s ňou nebudeme ďalej pracovať.

8.1.4 PT3K/26-28/2

Po lyofilizácii frakcie PT3K/26-28/2 sme ju zvážili. Hmotnosť frakcie bola m4 = 68,8 mg. Nasledovala analýza pomocou analytickej HPLC (UV/VIS spektrofotometria), kde sme znova použili metódu 1. Na chromatograme je výrazný dvojpík s retenčnými časmi 18,206 min a 18,374 min. Táto frakcia obsahuje dve látky, ktoré by mali byť podľa retenčných časov polárnejšie ako predchádzajúce látky. Pri hodnotení UV spektier vidíme, že sa v nich nachádzajú maximá pri ≈ 210 nm a ≈ 295 nm, pričom maximum ramena je pri ≈ 235 nm a ≈ 330 nm. Na základe UV spektier môžeme predpokladať, že sa jedná o látky s flavanónovým skeletom [77]. Vzhľadom k hmotnosti frakcie by bolo možné látky oddeliť a identifikovať ich.

Obr. 8.3: Chromatogram analytickej HPLC vzorky PT3K/26-28/2 pri 280 nm a jej UV spektrá

8.1.5 Frakcie PT3K/26-28/3 a PT3K/26-28/4

Vzorky sme odparili na vákuovej rotačnej odparke a zvyšnú vodu sme odstránili lyo- filizátorom. Hmotnosť vysušených vzoriek bola m5 = 3,9 mg pre PT3K/26-28/3 a m6 = 2,0 mg pre PT3K/26-28/4. Pokračovali sme analýzou za pomoci analytickej HPLC (UV/VIS spektrofotometria), použili sme metódu 1. Na prekrývajúcich sa chromatogra-

72 8. VÝSLEDKY moch vidíme, že píky frakcie PT3K/26-28/3 sa prekrývajú s píkmi frakcie PT3K/26-28/4 a naopak. Taktiež retenčné časy týchto prekrývajúcich sa píkov boli takmer zhodné. Retenčné časy frakcie PT3K/26-28/3 pre prvý pík 19,089 min pre druhý pík 19,278 min a tretí pík 19,386 min. Frakcia PT3K/26-28/4 mala retenčný čas pre prvý pík 19,099 min pre druhý pík 19,275 a pre tretí pík 19,386 min. Z toho sme usúdili, že tieto dve frakcie, by mohli obsahovať rovnaké látky a k malým posunom v retenčných časoch mohlo dôjsť v priebehu merania. Retenčné časy nám taktiež naznačujú, že by sa mohlo jednať o látky s nižšou polaritou. Látky majú zhodné UV spektrá, v ktorých sa absorpčné maximá nachádzajú pri ≈ 212 nm a ≈ 275 nm a maximum ramena je pri ≈ 230 nm a 295 nm. Prie- beh spektra nám naznačuje, že by sa mohlo jednať o flavonoidy s pyranoflavanónovým skeletom [78]. Bolo by možné tieto dve frakcie spojiť, aby sme získali väčšie množstvo, avšak ani to by nám zrejme nestačilo na to, aby bolo možné látky separovať.

Obr. 8.4: Chromatogram analytickej HPLC vzoriek PT3K/26-28/3 a PT3K/26-28/4 pri 280 nm a ich UV spektrá

8.2 Identifikácia látky získanej z frakcie PT3K/13-15/2

Podľa orientačného UV spektra, ktoré bolo zmerané súčasne s HPLC analýzou (podkapi- tola 8.1.2) bola zhruba odhadnutá základná štruktúra zlúčeniny. Na základe absorpčných maxím sa dalo odhadnúť, že sa bude jednať o flavonoid s pyranoflavanónovým skeletom. Taktiež sa nám podarilo zistiť, že táto frakcia obsahuje látku s čistotou 92%. Na základe hmotnosti a čistoty látky sme sa rozhodli s ňou pracovať ďalej a identifikovať ju.

73 8. VÝSLEDKY

Pre bližšiu identifikáciu sme porovnali UV spektrum a retenčný čas našej látkys knižnicou látok izolovaných z Paulownia tomentosa. Najväčšiu zhodu a taktiež prekryv UV spektier mala naša látka s tomentónom B (Obrázok 8.5).

Obr. 8.5: Knižnica látok izolovaných z Paulownia tomentosa

Rozhodli sme sa spraviť spoločný nástrek našej látky so štandardom Tomentónu B. Látky v knižnici boli merané pri koncentrácii 0,1 mg/ml, takže aj našu látku sme nariedili na túto koncentráciu a previedli sme spoločný nástrek s použitím metódy 2. Na chromatograme spoločného nástreku sa zobrazil jeden výrazný pík (Obrázok 8.6) (pík v 32 min je ghost pík zo systému). To znamená, že s veľkou pravdepodobnosťou by naša frakcia mohla obsahovať práve tomentón B.

Obr. 8.6: HPLC chromatogram spoločného nástreku vzorky PT3K/13-15/2 a štandardu tomentónu B

74 8. VÝSLEDKY

8.2.1 IČ spektrometria

Pomocou IČ spektrometrie sme sa pokúsili získať informácie o funkčných skupinách − a väzbových interakciách v molekule. Absorpčný pás v oblasti 3200 − 3500 cm 1 by − mal patriť hydroxylovým skupinám. V oblasti 2800 − 3000 cm 1 sa pravdepodobne nachádzajú absorpčné pásy metylových a metylénových skupín. Absorpčný pás v − oblasti 1631 cm 1 pravdepodobne patrí karbonylovej skupine. Vibrácie v oblasti od − 1400 − 1600 cm 1 by mali patriť vibráciám aromatického kruhu. Absorpčný pás v oblasti − 1375 cm 1 by mohol patriť tzv. dáždnikovej vibrácii metylovej skupiny [79], [80].

Obr. 8.7: IČ spektrum vzorky PT3K/13-15/2

8.2.2 Vysokorozlišovacia hmotnostná spektrometria (HRMS)

Molekulová hmotnosť bola určená pomocou HRMS. Meranie prebehlo v pozitívnom aj negatívnom móde. Spektrum v pozitívnom móde ukázalo prítomnosť iónu protónovanej + molekuly [M+H] pri m/z 453.1904, na základe čoho bol určený sumárny vzorec látky + ako C26H28O7 (kalkulované pre C26H29O7 453,1913).

75 8. VÝSLEDKY

Obr. 8.8: HRMS spektrum látky PT3K/13-15/2 v pozitívnom móde

Obr. 8.9: HRMS spektrum látky PT3K/13-15/2 v negatívnom móde

8.2.3 NMR spektrometria

Výsledkom hodnotenia NMR spektier bolo získanie informácie o štruktúre látky. Keďže sme na základe spoločného nástreku a molekulovej hmotnosti predpokladali zhodu s tomentónom B, boli prevedené len dva experimenty na potvrdenie (1H, HSQC), pričom namerané chemické posuny odpovedali literatúre (NMR dáta dostupné u školiteľky). Látka bolo identifikovaná ako´ 3 ,4´-dihydroxy-5´-metoxy-6´´-metyl-6´´-(4-metylpentén- 1-yl)pyráno[2´´,3´´:7,8]flavanón, tejto látke je priradený názov tomentón B [81].

76 8. VÝSLEDKY

8.2.4 Cirkulárny dichroizmus (CD)

Pomocou cirkulárneho dichroizmu bolo zistené, že látka vykazuje pri 343 nm pozitívny − Cottonov efekt [θ = +2189 deg.cm2.dmol 1] a pri 295 nm negatívny Cottonov efekt [θ = − −1556 deg.cm2.dmol 1]. Porovnaním s už publikovanými dátami bola látke priradená konfiguráciaS 2 [82].

Látka PT3K/13-15/2

77 9 Diskusia

V teoretickej časti práce sme sa zamerali na flavonoidy, ktoré dokážu inhibovať efluxné pumpy. Touto tématikou sme sa rozhodli zaoberať práve preto, že MDR je považovaná za jeden z hlavných dôvodov zlyhania chemoterapie u väčšiny pacientov s rakovinou a jed- ným z hlavných dôvodov vzniku MDR sú práve tieto ABC liekové efluxné transportéry (efluxné pumpy) [8], [11]. Položili sme si za cieľ vytvoriť prehľad flavonoidov, ktoréby mohli inhibíciou efluxných púmp zvrátiť túto MDR a tým zvýšiť účinnosť chemoterapie. V priebehu písania práce sme však museli vyhľadávanie štúdii, ktoré sa zaoberajú touto problematikou obmedziť na heslovité hľadanie a iba na určité typy efluxných púmp a taktiež typy flavonoidného skeletu. Zamerali sme sa na tri efluxné pumpy (P-gp, MRP1, BCRP), ktoré sa najčastejšie podieľajú na vzniku rezistencie nádorových buniek k cytostatickej liečbe. Naším zámerom bolo obmedziť vyhľadávanie na flavóny, flavonoly, flavanóny, dihydroflavonoly a isoflavonoidy, avšak natrafili sme taktiež nazaujímavé účinky flavonoidov v glykozidickej či syntetickej forme a zahrnuli sme taktiež rotenoidy, ale pterokarpány už nie. Pri vyhľadávaní štúdii sme natrafili taktiež na zaujímavé účinky chalkónov, ktoré sme však už nezahŕňali kvôli rozsahu práce. Do budúcna, by sme radi prácu rozšírili a zamerali sa na prenylované fenolické látky. Vo výslednom zhrnutí sme uviedli 145 štruktúr flavonoidov, ktoré boli testované na inhibíciu efluxných púmp. Vedci vo vedeckých štúdiách, z ktorých sme vychádzali, používali rôznu metodológiu a taktiež rôzne typy bunkových línii pre testovanie inhi- bičnej aktivity. To znamená, že výsledky daných štúdii sa líšili. Rozdiely v konzistencii výsledkov v štúdiách od rôznych autorov sa však objavili, aj keď bola použitá rovnaká metodológia a taktiež zhodné bunkové línie. Výskum sme začali efluxnou pumpou MRP1. Výbornú inhibičnú aktivitu preuká- zali flavanóny euchrestaflavanón A (103) a sophoraflavanón H (111) na bunkovej línii ľudských erytrocytov. Analýzou vzťahu štruktúra–účinok u týchto flavanónov bolo pre- ukázané, že inhibičnú aktivitu zvyšuje prenylová skupina v polohe 8 a hydroxylové skupiny v polohe 5 a 7. Prenylová skupina v polohe 5’ alebo stilbén v polohe 4’, 5’ v kruhu B akoby ďalej zvyšovali potenciál inhibítora. Sľubnú inhibičnú aktivitu preuká- zal taktiež silymarín (112) [36], [37]. Tento vzťah štruktúra–účinok potvrdzuje tiež 8-prenylnaringenín, ktorý na bunkovej línii ľudských erytrocytov preukázal významnú inhibičnú akivitu voči efluxnej pumpe MRP1 [38]. Veľmi dobrú aktivitu preukázali taktiež metoxylované flavóny na bunkových líniách psích obličiek Madin-Darby (MDC- KII) zl. 36, 37, 38, 39, kde najúčinnejší bol diosmetín (37), ktorý pri 25 µM inhiboval MRP1 pumpu na 84 % [39]. Flavonoidy 1, 3, 19, 25, 60, 112, 118, 119 boli pri akumulácii

78 9. DISKUSIA

DNM na línii ľudského pankreatického adenokarcinómu (Panc-1) účinnejšie ako liečivo verapamil. Pri akumulácii VBL na tej istej bunkovej línii bol výrazne účinnejší morín (60) [40]. Flavón apigenín (20) bol silným inhibítorom transportu LTC4 v membránových vezikulách a za prítomnosti GSH sa inhibícia zvýšila 3,4-násobne. Pri 30 µM za pridania 3 µm GSH inhiboval MRP1 efluxnú pumpu na 80 %. O niečo nižšiu aktivitu mali zlúče- niny 25 a 95 [29]. Meraním akumulácie BCECF v ľudskej bunkovej línii rakoviny prsníka (HTB26) preukázali zl. 25, 28, 86, 93, 94, 96 rovnaký účinok na zvýšenie akumulácie ako indometacín [42], [43]. Následne sme sa zaoberali P-gp. Veľmi významnú aktivitu preukázal prenylflavonoid icaritín (63) na bunkovej línii ľudského hepatocelulárneho karcinómu (HepG2), ktorá vykazuje rezistenciu na adriamycín. Icaritín (63) významne zvýšil akumuláciu adriamycínu a znížil expresiu MDR1 génu, čím dokázal, že je schopný účinne reverzovať MDR [45]. Rotenón (12), chryzín (28) a epigallocatechín (117) zvyšovali akumulá- ciu rhodamínu 123 v bunkách myších lymfómov účinnejšie ako verapamil [42], [43]. Rotenón vykazoval vysokú účinnosť taktiež na bunkovej línii rakoviny hrubého čreva (Colo320), kde bol dvakrát účinnejší ako verapamil [43]. Biochanín A (3) a silyma- rín (112) významne zvyšovali bunkovú akumuláciu VBL na bunkovej línii rakoviny hrubého čreva (Caco-2) [47] a taktiež preukázali významné zvýšenie akumulácie dau- nomycínu na bunkovej línii ľudského karcinómu prsníka (MDA435/LCC6), avšak na tejto bunkovej línii preukázal najvyššiu aktivitu morín (60), ktorý bol účinnejší ako verapamil [48]. Bolo preukázané, že quercetín (19) pri koncentrácii 12 µM sa môže po- važovať za perspektívny liek na prekonanie rezistencie v bunkách rakoviny žalúdka [49]. 8-Prenylchryzín (76) dosiahol na bunkovej línii leukémie (K562/R7) vyšší účinok ako cyklosporín A, v tejto štúdii bolo preukázané, že len izoprenylové deriváty chryzínu boli schopné inhibovať P-gp sprostredkovaný eflux DNM z bunkovej línie K562/R7 [44], [52]. Taktiež 2,3-dehydrosilibínové deriváty, konkrétne zl. 123, 125, 126 a 127 na bunkovej línii ľudskej myeloidnej leukémie (K562) prekročili účinnosť cyklosporínu A [53]. Baicaleín (23) bol testovaný v štúdii in vivo, kde bol potkanom perorálne podávaný tamoxifén spolu s baicaleínom. Absolútna biologická dostupnosť tamoxifénu sa v prítomnosti baicaleínu (23) významne zvýšila o 47,5 ∼ 89,1 % v porovnaní s kontrolnou orálnou skupinou (20,2 %) [46]. Posledným transportným proteínom, ktorým sme sa zaoberali bol BCRP. Významnú inhibičnú účinnosť na bunkovej línii psích obličiek Madin-Darby (MDCK) vykazoval ay- anín (46) a retusín (47), ktorý bol iba o niečo menej účinný ako Ko143 pri inhibícii BCRP [55]. 6-Prenylchryzín (75) na bunkovej línii ľudskej embryonálnej obličky (HEK293) vykazoval ekvivalentnú až vyššiu inhibičnú účinnosť voči BCRP ako GF120918. Za túto

79 9. DISKUSIA vysokú inhibičnú účinnosť je zodpovedná prenylová skupina v polohe 6. Mierne nižšie účinky vyvolával isomerový substituent 6-(1,1-DMA)chryzín (78) alebo 8-prenylchryzín (76) [34], [56]. Citrusový flavonoid hesperetín (98) vykazoval vyššiu inhibičnú účin- nosť na bunkovej línii rakoviny prsníka (MCF-7) ako Ko143 [58]. Pri testovaní flavónov a benzoflavónov na bunkovej línii psích obličiek Madin-Darby bolo dokázané, že7,8- benzoflavóny sú aktívnejšie v porovaní s flavónmi, zatiaľ čo 5,6-benzoflavóny sú najmenej aktívnou skupinou s výnimkou zl. 129, ktorá je silným inhibítorom BCRP. Zl. 145 je silným netoxickým inhibítorom a má 50 násobnú selektivitu voči BCRP [35]. Z tohto prehľadu najaktívnejších zlúčenín môžme konštatovať, že vysokú inhi- bičnú aktivitu vykazovali prenylované zlúčeniny a taktiež benzoflavóny a deriváty 2,3-dehydrosilibínu, čo môže znamenať, že k vyššej inhibičnej účinnosti dopomáha hydrofóbnosť. Veľmi účinné boli taktiež rotenoidy. Bolo preukázané, že flavonoidy v glykozidickej väzbe nevykazujú významnú inhibičnú aktivitu. Avšak nájsť najaktívnej- šiu či najúčinnejšiu zlúčeninu nie je možné, pretože ako už bolo spomínané, autori v štúdiách používali rôznu metodológiu, ako aj rozličné bunkové línie. Tento prehľad by bolo možné rozšíriť o ďalšie vyhľadávanie nových vedeckých štúdii, ako aj zaradenie ďalších typov flavonoidov. Experimentálna časť diplomovej práce bola zameraná na izoláciu a identifikácu obsa- hových látok z frakcie PT3K. Táto frakcia, ktorá bola delená stĺpcovou chromatografiou, pochádza z chloroformového podielu etanolového extraktu plodov P. tomentosa. Pri izolácii látok sme používali rôzne typy chromatografických metód. Na základe hmotnosti a analytického HPLC chromatogramu sme ako vhodný postup k separácii zvolili stĺpcovú chromatografiu, kde sme zo základnej frakcie PT3K získali 92 frakcií, ktoré sme na základe výsledkov z TLC a HPLC postupne spájali do konečného počtu 25 frakcií. Pre ďalšiu analýzu sme si zvolili frakcie PT3K/13-15 a PT3K/26-28. Tieto frakcie mali dostatočnú hmotnosť a na HPLC chromatograme vykazovali silnejšie odozvy, a preto sme sa rozhodli pre separáciu preparatívnou HPLC. Frakcia PT3K/13-15 vykazovala na chromatograme zmes látok s dvoma výraznejšími píkmi, ktoré sme sa rozhodli oddeliť od minoritných látok a zozbierať. Frakcia PT3K/26-28 vykazovala na chromatograme analytickej HPLC výrazný dvojpík, ktorý sa nám podarilo oddeliť od ostatných látok a zozbierať, túto frakciu sme pomenovali PT3K/26-28/2. Rozhodli sme sa zbierať aj ostatné píky s väčšími odozvami. Dokopy sme zozbierali štyri frakcie. Frakciu PT3K/13-15/1 sme podrobili analytickej HPLC (UV/VIS spektrofotometria) za použitia metódy 1. Na chromatograme bol viditeľný výrazný dvojpík, čo znamená, že frakcia obsahuje dve látky. Na základe maxím v UV spektrách sme usúdili, že by sa

80 9. DISKUSIA mohlo jednať o látky s flavanónovým skeletom [77]. Bolo zaujímavé, že analýza frakcie pri použití metódy 3 zobrazila na chromatograme len jeden pík, z toho sme usúdili, že táto metóda nie je pre túto frakciu vhodná a pokiaľ by sa s frakciou pracovalo ďalej bolo by vhodnejšie použiť metódu s acetonitrilom. Hmotnosť frakcie umožňuje tento dvojpík oddeliť s účelom získania dvoch látok, avšak my sme sa touto frakciou už ďalej nezaoberali, ale mohla by byť predmetom skúmania ďalšej práce. Na chromatograme analytickej HPLC frakcie PT3K/13-15/2 bol viditeľný jeden pík. Na základe UV spektra, hmotnosti a čistoty látky sme sa rozhodli s ňou pracovať ďalej a identifikovať ju. Frakcia PT3K/26-28/2 vykazovala na analytickom HPLC chromatograme výrazný dvojpík, ktorý by podľa maxím v UV spektrách mohol patriť látkam s flavanónovým skeletom [77]. Vzhľadom k hmotnosti frakcie by bolo možné skúsiť píky oddeliť a identifikovať ich ako čisté látky. Frakcie PT3K/26-28/3 a PT3K/26-28/4 vykazovali na HPLC analytickom chromatograme píky v rovnakých retenčných časoch, preto sme sa rozhodli tieto chro- matogramy prekryť. UV spektrá týchto píkov boli taktiež zhodné. Predokladali sme, že tieto dve frakcie obsahujú rovnaké látky a preto by bolo vhodné ich spojiť, aby sme získali väčšie množstvo, ale ani to by nám zrejme nestačilo k tomu, aby bolo možné látky separovať. Zo všetkých získaných frakcií sa k identifikácii dostala len jedna a to frakcia PT3K/13- 15/2, ktorá vykazovala dostatočnú hmotnosť a taktiež čistotu. Podľa absorpčných maxím v orientačnom UV spektre bola zhruba odhadnutá základná štruktúra látky, kde sme predpokladali, že by sa mohlo jednať o flavonoid s pyranoflavanónovým skeletom [78]. UV spektrum našej látky sme porovnali s knižnicou látok izolovaných z P. tomentosa, kde najväčšiu zhodu mala naša látka s tomentónom B. Práve preto sme sa rozhodli pre spo- ločný nástrek našej látky so štandardom tomentónu B. Na chromatograme spoločného nástreku sa zobrazil jeden výrazný pík. Z toho sme usúdili, že s veľkou pravdepodobnos- ťou by našou látkou mohol byť práve tomentón B. Pre bližšiu identifikáciu látky sme pou- žili IČ spektrometriu, ktorá nám poskytla informácie o funkčných skupinách v molekule. Vysokorozlišovacia hmotnostná spektrometria (HRMS) nám poskytla sumárny vzorec látky. Vďaka výsledkom z NMR spektrometrie sme mohli určiť výslednú štruktúru látky a CD nám poskytol informácie o konfigurácii. Vzhľadom k prítomnosti flavanónového skeletu a cyklického geranylu bola látka identifikovaná ako 3´,4´-dihydroxy-5´-metoxy- 6´´-metyl-6´´-(4-metylpentén-1-yl)pyráno[2´´,3´´:7,8]flavanón tejto látke bol priradený názov tomentón B. Táto látka mohla vzniknúť cyklizáciou geranylového reťazca 3´-O- metyl-5´-hydroxydiplakónu [81]. Nedávno bola publikovaná štruktúra tomentónu B a bola preukázaná jeho antiproliferatívna a cytotoxická aktivita voči bunkovej línii THP-1 [83].

81 10 Záver

V teoretickej časti práce sme zhrnuli flavonoidy, ktoré spôsobujú inhibíciu efluxných púmp, pričom sme využívali vedecké články z rôznych databáz a webových zdrojov. K písaniu práce sme využívali typografický systémA LTEX. Všetky získané údaje o inhibičnej aktivite týchto flavonoidov sme zhrnuli do prehľadnej tabuľky v Prílohe B. Podarilo sa nám vytvoriť prehľad zahŕňajúci 145 flavonoidov, avšak tento prehľad je stále možné rozšíriť o nové vedecké články či ďalšie flavonoidy, ktoré v tejto práci neboli zahrnuté.

Z frakcie PT3K pochádzajúcej z chloroformového podielu etanolového extraktu plodov P. tomentosa bola pomocou rôznych chromatografických metód izolovaná jedna čistá látka, ktorá svojou dostatočnou čistotou a množstvom bola vhodná na identifikáciu a stanovenie biologickej aktivity (napr. protizápalovej). Pomocou rôznych identifikačných metód bola zistená presná štruktúra tejto látky, ktorej systematický názov je 3´, 4´-dihydroxy-5´-metoxy-6´´-metyl-6´´-(4-metylpentén-1- yl) pyráno[2´´,3´´:7,8] flavanón. Tejto látke bol priradený názov tomentón B, štruktúra a biologická aktivita tejto látky bola publikovaná len nedávno [83].

Látka PT3K/13-15/2

82 Bibliografia

1. Cancer [online] [cit. 2021-02-12]. Dostupné z: https://www.who.int/health- topics/cancer#tab=tab_1. 2. MBAVENG, A. T.; NOULALA C, G. T.; SAMBA, A.R.M.; TANKEO, S. B.; FOTSO, G. W.; HAPPI, E. N.; NGADJUI, B. T.; BENG, V. P.; KUETE, V.; EFFERTH, T. Cyto- toxicity of botanicals and isolated phytochemicals from Araliopsis soyauxii Engl. (Rutaceae) towards a panel of human cancer cells. Journal of Ethnopharmacology. 2021, roč. 267, s. 113535. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.jep.2020. 113535. 3. EL-READI, M. Z.; EID, S.; ABDELGHANY, A. A.; AL-AMOUDI, H. S.; EFFERTH, T.; WINK, M. Resveratrol mediated cancer cell apoptosis, and modulation of multidrug resistance proteins and metabolic enzymes. Phytomedicine. 2019, roč. 55, s. 269–281. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.phymed.2018.06.046. 4. GARCIA-MAYEA, I.; MIR, C.; MASSON, F.; PACIUCCI, R.; LLEONART, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 2020, roč. 60, s. 166–180. Dostupné z doi: https://doi. org/10.1016/j.semcancer.2019.07.022. 5. KLENER, P.; JR., Klener P. Léky přírodního původu a jejich potenciální protiná- dorový účinek. Onkologie. 2013, roč. 7, s. 41–49. Dostupné tiež z: https://www. onkologiecs.cz/pdfs/xon/2013/01/11.pdf. 6. SLÍVA, J. Léčiva rostlinného původu z pohledu farmakologa. Farmi news. 2013, roč. 11, s. 7. Dostupné tiež z: http://www.edukafarm.cz/data/soubory/casopisy/ 20/07-pohled_farmakologa.pdf. 7. NOSKOVA, V.; HAJDUCH, M.; MIHAL, V.; CWIERTKA, K. Mechanisms of multidrug resistance and their clinical implications I. typical MDR. Onkologie. 2000, roč. 2, s. 4–9. Dostupné tiež z: https://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/62/ 1455.pdf. 8. MIRI, R.; MEHDIPOUR, A. Dihydropyridines and atypical MDR: A novel per- spective of designing general reversal agents for both typical and atypical MDR. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2008, roč. 16, č. 18, s. 8329–8334. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.bmc.2008.07.025. 9. SAMPSON, A; PETERSON, B. G.; TAN, K. W.; IRAM, S. H. Doxorubicin as a fluorescent reporter identifies novel MRP1 (ABCC1) inhibitors missed by calcein- based high content screening of anticancer agents. Biomedicine & Pharmacotherapy.

83 BIBLIOGRAFIA

2019, roč. 118, s. 109289. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.biopha. 2019.109289. 10. FLETCHER, J.; HABER, M.; HENDERSON, M. J.; NORRIS, M. D. ABC transporters in cancer: more than just drug efflux pumps. Nature reviews. Cancer. 2010, roč. 10, č. 2, s. 147–156. Dostupné z doi: 10.1038/nrc2789. 11. HOFMAN, J. Interakce inhibitorů cyklin-dependetních kináz s ABC lékovými transportéry in vitro a in situ. 2012. Diz. pr. Univerzita Karlova v Praze. 12. KÝROVÁ, K. Mnohočetná léková rezistence u nádorových onemocnění. 2008. Dipl. pr. Masarykova univerzita. 13. DEAN, M.; HAMON, Y.; CHIMINI, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. Journal of lipid research. 2001, roč. 42, č. 7, s. 1007–1017. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/S0022-2275(20)31588-1. 14. DOSTÁLEK, M. Transportní proteiny rodiny ABC (ATP binding cassette). Farmako- terapie. 2005, roč. 1, č. 6, s. 583–586. 15. VASILIOU, V.; VASILIOU, K.; NEBERT, D. W. Human ATP-binding cassette (ABC) transporter family. Human genomics. 2009, roč. 3, č. 3, s. 1–10. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1186/1479-7364-3-3-281. 16. GILLET, J. P.; EFFERTH, T.; REMACLE, J. Chemotherapy-induced resistance by ATP-binding cassette transporter genes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Cancer. 2007, roč. 1775, č. 2, s. 237–262. Dostupné z doi: https://doi.org/10. 1016/j.bbcan.2007.05.002. 17. KIM, Y.; CHEN, J. Molecular structure of human P-glycoprotein in the ATP-bound, outward-facing conformation. Science. 2018, roč. 359, s. 7389. Dostupné z doi: 10. 1126/science.aar7389. 18. CHANDLER, B.; DETSIKA, M.; KHOO, S.; WILLIAMS, J.; BACK, D.; OWEN, A. Factors impacting the expression of membrane-bound proteins in lymphocytes from HIV-positive subjects. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 2007, roč. 60, č. 3, s. 685–689. Dostupné z doi: 10.1093/jac/dkm230. 19. HODGES, L.; MARKOVA, S.; CHINN, L.; GOW, J.; KROETZ, D.; KLEIN, T.; ALT- MAN, R. Very important pharmacogene summary: ABCB1 (MDR1, P-glycoprotein). Pharmacogenetics and genomics. 2011, roč. 21, č. 3, s. 152. Dostupné z doi: 10.1097/ FPC.0b013e3283385a1c. 20. GUPTA, V.; BHALLA, Y.; JAITAK, V. Impact of ABC transporters, glutathione conjugates in MDR and their modulation by flavonoids: an overview. Medicinal Chemistry Research. 2013, roč. 23, s. 1–15. Dostupné z doi: https://doi.org/10. 1007/s00044-013-0612-6.

84 BIBLIOGRAFIA

21. JOHNSON, Z. L.; CHEN, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 2017, roč. 168, č. 6, s. 1075–1085. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.01.041. 22. JIYE, Y.; JIANTING, Z. Multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1/ABCC1) polymorphism: from discovery to clinical application. Zhong nan da xue xue bao. Yi xue ban= Journal of Central South University. Medical sciences. 2011, roč. 36, č. 10, s. 927. Dostupné z doi: 10.3969/j.issn.1672-7347.2011.10.002. 23. MO, W.; LIU, J. Y.; ZHANG, J. T. Biochemistry and Pharmacology of Human ABCC1/MRP1 and Its Role in Detoxification and in Multidrug Resistance of Cancer Chemotherapy. In: 2012, s. 371–404. isbn 9780123978332. Dostupné z doi: 10.1016/ B978-0-12-397833-2.00014-5. 24. COLE, S. P. C. Multidrug Resistance Protein 1 (MRP1, ABCC1), a “Multitasking” ATP-binding Cassette (ABC) Transporter*. Journal of Biological Chemistry. 2014, roč. 289, č. 45, s. 30880–30888. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1074/jbc. R114.609248. 25. DOYLE, L. A.; YANG, W.; ABRUZZO, L. V.; KROGMANN, T.; GAO, Y.; RISHI, A. K.; ROSS, D. D. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1998, roč. 95, č. 26, s. 15665–15670. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1073/pnas.95.26.15665. 26. ROBEY, R. W.; POLGAR, O.; DEEKEN, J.; TO, K. W.; BATES, S. E. ABCG2: determi- ning its relevance in clinical drug resistance. Cancer and Metastasis Reviews. 2007, roč. 26, č. 1, s. 39–57. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1007/s10555-007- 9042-6. 27. CHEN, Z.; SHI, T.; ZHANG, L.; ZHU, P.; DENG, M.; HUANG, C.; HU, T.; JIANG, L.; LI, J. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family in multidrug resistance: A review of the past decade. Cancer Letters. 2016, roč. 370, č. 1, s. 153–164. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.canlet.2015.10.010. 28. MARTINELLI, L.M.; REGINATTO, M.W.; FONTES, K.N.; ANDRADE, C.B.V.;MON- TEIRO, V.R.S.; GOMES, H.R.; ALMEIDA, F.R.C.L.; BLOISE, F.F.; MATTHEWS, S.G.; ORTIGA-CARVALHO, T.M.; BLOISE, E. Breast cancer resistance protein (Bcr- p/Abcg2) is selectively modulated by lipopolysaccharide (LPS) in the mouse yolk sac. Reproductive Toxicology. 2020, roč. 98, s. 82–91. Dostupné z doi: https: //doi.org/10.1016/j.reprotox.2020.09.001. 29. LESLIE, E. M.; DEELEY, R. G.; COLE, S. P.C. Multidrug resistance proteins: role of P-glycoprotein, MRP1, MRP2, and BCRP (ABCG2) in tissue defense. Toxicology

85 BIBLIOGRAFIA

and applied pharmacology. 2005, roč. 204, č. 3, s. 216–237. Dostupné z doi: https: //doi.org/10.1016/j.taap.2004.10.012. 30. MARTINS, E. G.; BARBOSA, D. J.; SILVA, V.; REMIÃO, F.; SILVA, R. Dysfunction of ABC transporters at the blood-brain barrier: Role in neurological disorders. Pharmacology & Therapeutics. 2020, roč. 213, s. 107554. Dostupné z doi: https://doi. org/10.1016/j.pharmthera.2020.107554. 31. KUMAR, A.; JAITAK, V. Natural products as multidrug resistance modulators in cancer. European journal of medicinal chemistry. 2019, roč. 176, s. 268–291. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2019.05.027. 32. RAVISHANKAR, D.; RAJORA, A. K.; GRECO, F.; OSBORN, H. M.I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The international journal of biochemistry & cell biology. 2013, roč. 45, č. 12, s. 2821–2831. Dostupné z doi: https: //doi.org/10.1016/j.biocel.2013.10.004. 33. ALVAREZ, A. I.; REAL, R.; PÉREZ, M.; MENDOZA, G.; PRIETO, J. G.; MERINO, G. Modulation of the activity of ABC transporters (P-glycoprotein, MRP2, BCRP) by flavonoids and drug response. Journal of pharmaceutical sciences. 2010, roč. 99, č. 2, s. 598–617. Dostupné z doi: 10.1002/jps.21851. 34. AHMED-BELKACEM, A.; POZZA, A.; MUÑOZ-MARTÍNEZ, F.; BATES, S.; CASTA- NYS, S.; GAMARRO, F.; DI PIETRO, A.; PÉREZ-VICTORIA, J. Flavonoid structure- activity studies identify 6-prenylchrysin and tectochrysin as potent and specific inhibitors of breast cancer resistance protein ABCG2. Cancer research. 2005, roč. 65, č. 11, s. 4852–4860. Dostupné z doi: 10.1158/0008-5472.can-04-1817. 35. JUVALE,K.; STEFAN, K.; WIESE, M. Synthesis and biological evaluation of flavones and benzoflavones as inhibitors of BCRP/ABCG2. European Journal of Medicinal Chemistry. 2013, roč. 67, s. 115–126. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j. ejmech.2013.06.035. 36. BOBROWSKA-HAGERSTRAND, M.; WROBEL, A.; MROWCZZDSKA, L.; SODER- STROM, T.; SHIRATAKI, Y.; MOTOHASHI, N.; MOLNAR, J.; MICHALAK, K.; HDGERSTRAND, H. Flavonoids as inhibitors of MRP1-like efflux activity in human erythrocytes. A structure-activity relationship study. Oncology research. 2003, roč. 13, č. 11, s. 463–9. Dostupné z doi: https://doi.org/10.3727/000000003108747983. 37. LANIA-PIETRZAK, B.; MICHALAK, K.; HENDRICH, A. B.; MOSIADZ, D.; GRYN- KIEWICZ, G.; MOTOHASHI, N.; SHIRATAKI, Y. Modulation of MRP1 protein transport by plant, and synthetically modified flavonoids. Life sciences. 2005, roč. 77, č. 15, s. 1879–1891. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.lfs.2005.04.005.

86 BIBLIOGRAFIA

38. WESOLOWSKA, O.; WISNIEWSKI, J.; SRODA, K.; KRAWCZENKO, A.; BIELAWSKA- POHL, A.; PAPROCKA, M.; DUS, D.; MICHALAK, K. 8-Prenylnaringenin is an inhibitor of multidrug resistance-associated transporters, P-glycoprotein and MRP1. European Journal of Pharmacology. 2010, roč. 644, č. 1, s. 32–40. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2010.06.069. 39. ZANDEN, J. J. van; WORTELBOER, H. M.; BIJLSMA, S.; PUNT, A.; USTA, M.; BLADEREN, P. J. van; RIETJENS, I.; CNUBBEN, N. Quantitative structure activity relationship studies on the flavonoid mediated inhibition of multidrug resistance proteins 1 and 2. Biochemical pharmacology. 2005, roč. 69, č. 4, s. 699–708. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.bcp.2004.11.002. 40. NGUYEN, H.; ZHANG, S.; MORRIS, M. Effect of flavonoids on MRP1-mediated transport in Panc-1 cells. Journal of pharmaceutical sciences. 2003, roč. 92, č. 2, s. 250– 257. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1002/jps.10283. 41. WU, C.; CALCAGNO, A. M.; HLADKY, S.; AMBUDKAR, S.; BARRAND, M. Mo- dulatory effects of plant phenols on human multidrug-resistance proteins 1,4and 5 (ABCC1, 4 and 5). The FEBS Journal. 2005, roč. 272, č. 18, s. 4725–4740. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2005.04888.x. 42. MOLNAR, J.; ENGI, H.; HOHMANN, J.; MOLNÁR, P.;DELI, J.; WESOLOWSKA, O.; MICHALAK, K.; WANG, Q. Reversal of Multidrug Resistance by Natural Substances from Plants. Current topics in medicinal chemistry. 2010, roč. 10, č. 17, s. 1757–68. Dostupné z doi: 10.2174/156802610792928103. 43. GYÉMÁNT, N.; TANAKA, M.; ANTUS, S.; HOHMANN, J.; CSUKA, O.; MAN- DOKY, L.; MOLNAR, J. In vitro search for synergy between flavonoids and epi- rubicin on multidrug-resistant cancer cells. in vivo. 2005, roč. 19, č. 2, s. 367–374. Dostupné tiež z: https://dea.lib.unideb.hu/dea/bitstream/handle/2437/ 285545/FILE_UP_0_76_367.full.pdf?sequence=1. 44. COMTE, G.; DASKIEWICZ, J. B.; BAYET, C.; CONSEIL, G.; VIORNERY-VANIER, A.; DUMONTET, C.; DI PIETRO, A.; BARRON, D. C-Isoprenylation of flavonoids enhances binding affinity toward P-glycoprotein and modulation of cancer cell che- moresistance. Journal of medicinal chemistry. 2001, roč. 44, č. 5, s. 763–768. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1021/jm991128y. 45. SUN, L.; CHEN, W.; QU, L.; WU, J.; SI, J. Icaritin reverses multidrug resistance of HepG2/ADR human hepatoma cells via downregulation of MDR1 and P-glycoprotein expression. Molecular medicine reports. 2013, roč. 8, č. 6, s. 1883–7. Dostupné z doi: 10.3892/mmr.2013.1742.

87 BIBLIOGRAFIA

46. LI, C.; KIM, M.; CHOI, H.; CHOI, J. Effects of baicalein on the pharmacokinetics of tamoxifen and its main metabolite, 4-hydroxytamoxifen, in rats: Possible role of cytochrome p450 3A4 and P-glycoprotein inhibition by baicalein. Archives of pharmacal research. 2011, roč. 34, č. 11, s. 1965–72. Dostupné z doi: 10.1007/s12272- 011-1117-9. 47. ZHANG, S.; MORRIS, M. Effect of the Flavonoids Biochanin A and Silymarin onthe P-Glycoprotein-Mediated Transport of Digoxin and Vinblastine in Human Intestinal Caco-2 Cells. Pharmaceutical research. 2003, roč. 20, č. 8, s. 1184–91. Dostupné z doi: 10.1023/A:1025044913766. 48. ZHANG, S.; MORRIS, M. E. Effects of the flavonoids biochanin A, morin, phloretin, and silymarin on P-glycoprotein-mediated transport. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2003, roč. 304, č. 3, s. 1258–1267. Dostupné z doi: https: //doi.org/10.1124/jpet.102.044412. 49. BORSKA, S.; CHMIELEWSKA, M.; WYSOCKA, T.; DRAG-ZALESINSKA, M.; ZA- BEL, M.; DZIEGIEL, P. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma: targeting cancer cells death and MDR. Food and chemical toxicology. 2012, roč. 50, č. 9, s. 3375–3383. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.fct.2012.06.035. 50. PATANASETHANONT, D.; NAGAI, J.; YUMOTO, R.; MURAKAMI, T.; SUTTHA- NUT, K.; SRIPANIDKULCHAI, B.; YENJAI, C.; TAKANO, M. Effects of Kaempferia parviflora extracts and their flavone constituents on P-glycoprotein function. Jour- nal of pharmaceutical sciences. 2007, roč. 96, č. 1, s. 223–233. Dostupné z doi: https: //doi.org/10.1002/jps.20769. 51. LEE, E.; ENOMOTO, R.; KOSHIBA, C.; HIRANO, H. et al. Inhibition of P-glycoprotein by wogonin is involved with the potentiation of etoposide-induced apoptosis in cancer cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 2009, roč. 1171, č. 1, s. 132. Dostupné z doi: 10.1111/j.1749-6632.2009.04722.x. 52. DI PIETRO, A.; CONSEIL, G.; PEREZ-VICTORIA, J.M.; DAYAN, G.; BAUBICHON- CORTAY, H.; TROMPIER, D.; STEINFELS, E.; JAULT, J-M; DE WET, H.; MAITRE- JEAN, M. et al. Modulation by flavonoids of cell multidrug resistance mediated byP- glycoprotein and related ABC transporters. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 2002, roč. 59, č. 2, s. 307–322. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1007/s00018- 002-8424-8. 53. DZUBÁK, P.; HAJDÚCH, M.; GAZÁK, R.; SVOBODOVÁ, A.; PSOTOVÁ, J.; WALTE- ROVÁ,D.; SEDMERA, P.;KREN, V.New derivatives of silybin and 2,3-dehydrosilybin and their cytotoxic and P-glycoprotein modulatory activity. Bioorganic & Medicinal

88 BIBLIOGRAFIA

Chemistry. 2006, roč. 14, č. 11, s. 3793–3810. Dostupné z doi: https://doi.org/10. 1016/j.bmc.2006.01.035. 54. NATARAJAN, K.; XIE, Y.; BAER, M. R.; ROSS, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochemical Pharmacology. 2012, roč. 83, č. 8, s. 1084–1103. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.bcp.2012. 01.002. 55. PICK, A.; MÜLLER, H.; MAYER, R.; HAENISCH, B.; PAJEVA, I. K; WEIGT, M.; BÖNISCH, H.; MÜLLER, C.; WIESE, M. Structure–activity relationships of flavonoids as inhibitors of breast cancer resistance protein (BCRP). Bioorganic & medicinal chemistry. 2011, roč. 19, č. 6, s. 2090–2102. Dostupné z doi: https://doi.org/10. 1016/j.bmc.2010.12.043. 56. NICOLLE, E.; BOCCARD, J.; GUILET, D.; DIJOUX-FRANCA, M. G.; ZELEFAC, F.; MACALOU, S.; GROSSELIN, J.; SCHMIDT, J.; CARRUPT, P. A.; DI PIETRO, A. et al. Breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2): New inhibitors and QSAR studies by a 3D linear solvation energy approach. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2009, roč. 38, č. 1, s. 39–46. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j. ejps.2009.05.012. 57. ZHANG, S.; YANG, X.; COBURN, R. A.; MORRIS, M. Structure activity relationships and quantitative structure activity relationships for the flavonoid-mediated inhibition of breast cancer resistance protein. Biochemical Pharmacology. 2005, roč. 70, č. 4, s. 627–639. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.bcp.2005.05.017. 58. COORAY, H. C.; JANVILISRI, T.; VEEN, H. van; H., Hladky S.; M., Barrand. Inte- raction of the breast cancer resistance protein with plant polyphenols. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2004, roč. 317, č. 1, s. 269–275. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2004.03.040. 59. LIU, K.; ZHAO, F.; YAN, J.; XIA, Z.; JIANG, D.; MA, P. Hispidulin: A promising flavonoid with diverse anti-cancer properties. Life Sciences. 2020, roč. 259, s. 118395. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118395. 60. SCOPARO, C.; VALDAMERI, G.; WORFEL, P.; GUTERRES, F.; MARTINEZ, G.; WINNISCHOFER, S.; DI PIETRO, A.; ROCHA, M. Dual properties of hispidulin: antiproliferative effects on HepG2 cancer cells and selective inhibition ofABCG2 transport activity. Molecular and cellular biochemistry. 2015, roč. 409, č. 1, s. 123–133. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1007/s11010-015-2518-8. 61. SCHNEIDEROVÁ, K.; ŠMEJKAL, K. Phytochemical profile of Paulownia tomentosa (Thunb). Steud. Phytochemistry Reviews. 2015, roč. 14, č. 5, s. 799–833. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1007/s11101-014-9376-y.

89 BIBLIOGRAFIA

62. ZHU, Z.; CHAO, C.; LU, X. Y.; XIONG, Y. G. et al. Paulownia in China: cultivation and utilization. Ed. RAO, A. N. International Development Research Centre, 1986. isbn 9971-84-546-6. 63. Paulownia tomentosa [online] [cit. 2021-01-12]. Dostupné z: https://www.etsy. com / listing / 843042697 / paulownia - tomentosa - 20 - seeds - empress ? ref = landingpage_similar_listing_top-5. 64. CHASE, M. W.; CHRISTENHUSZ, M.J.M.; FAY, M.F.; BYNG, J.W.; JUDD, W. S.; SOLTIS, D.E.; MABBERLEY, D.J.; SENNIKOV, A.N.; SOLTIS, P. S.; STEVENS, P. F. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG IV. Botanical Journal of the Linnean Society. 2016, roč. 181, s. 1–20. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1111/boj.12385. 65. XIA, Z.; WEN, J.; GAO, Z. Does the Enigmatic Wightia Belong to Paulowniaceae (Lamiales)? Frontiers in Plant Science. 2019, roč. 10, s. 528. Dostupné z doi: 10.3389/ fpls.2019.00528. 66. ERBAR, C.; GÜLDEN, C. Ontogeny of the flowers in Paulownia tomentosa –A contribution to the recognition of the resurrected monogeneric family Paulownia- ceae. Flora - Morphology, Distribution, Functional Ecology of Plants. 2011, roč. 206, č. 3, s. 205–218. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.flora.2010.05.003. 67. HE, T.; VAIDYA, B.; PERRY, Z.; PARAJULI, P.; JOSHEE, N. Paulownia as a medicinal tree: traditional uses and current advances. European Journal of Medicinal Plants. 2016, roč. 14, s. 1–15. Dostupné z doi: https://doi.org/10.9734/EJMP/2016/25170. 68. ÚRADNÍČEK, L. Paulownie plstnatá. Lesnická práce. 2013, roč. 92, s. 36–37. Dostupné tiež z: http://www.lesprace.cz/casopis-lesnicka-prace-archiv/rocnik-92- 2013/lesnicka-prace-c-5-13/paulovnie-plstnata. 69. ŠMEJKAL, K.; GRYCOVÁ, L.; MAREK, R.; LEMIERE, F.; JANKOVSKÁ, D.; FO- REJTNÍKOVÁ, H.; VANCO, J.; SUCHÝ, V. C-geranyl compounds from Paulownia tomentosa fruits. Journal of natural products. 2007, roč. 70, č. 8, s. 1244–1248. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1021/np070063w. 70. RAK, L. Paulownia tomentosa (Thunb.) Steudel- pavlovnie plstnatá/ paulovnia plst- natá [online] [cit. 2021-01-12]. Dostupné z: https://botany.cz/cs/paulownia- tomentosa/. 71. Paulownia tomentosa [online] [cit. 2021-01-12]. Dostupné z: https://www.uspza. cz/index_sub.php?id=10317. 72. MOLČANOVÁ, L. Isolation of active constituents from Paulownia tomentosa Steud. fruit. 2019. Dipl. pr. University of Veterinary a Pharmaceutical Sciences Brno.

90 BIBLIOGRAFIA

73. Paulownia tomentosa [online] [cit. 2021-01-12]. Dostupné z: https://www.vdberk. com/trees/paulownia-tomentosa/. 74. Paulownia tomentosa [online] [cit. 2021-01-12]. Dostupné z: https://faune-flore. be/plante_detail_id.php?id=62386&nom_latin=Paulownia%5C%20tomentosa% 5C%20lilacina. 75. Blauglockenbaum Paulownia tomentosa [online] [cit. 2021-01-12]. Dostupné z: https: //www.stanze-gartencenter.de/artikel/2798/paulownia-tomentosa. 76. PROCHÁZKOVÁ, P. Studium obsahových látek Paulownia tomentosa. 2012. Dipl. pr. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno. 77. RIJKE, E. de; OUT, P.; NIESSEN, W.; ARIESE, F.; GOOIJER, C.; UDO, A. et al. Ana- lytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of chromatography A. 2006, roč. 1112, č. 1-2, s. 31–63. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j. chroma.2006.01.019. 78. HANÁKOVÁ, Z.; HOŠEK, J.; BABULA, P.; DALL’ACQUA, S.; VÁCLAVÍK, J.; ŠMEJ- KAL, K. C-Geranylated Flavanones from Paulownia tomentosa Fruits as Potential Anti-inflammatory Compounds Acting via Inhibition of TNF- Production. Journal of Natural Products. 2015, roč. 78, č. 4, s. 850–863. Dostupné z doi: 10.1021/acs. jnatprod.5b00005. 79. NAVRÁTILOVÁ, A.; SCHNEIDEROVÁ, K.; VESELÁ, D.; HANÁKOVÁ, Z.; FON- TANA, A.; DALL’ACQUA, S.; CVAČKA, J.; INNOCENTI, G.; NOVOTNÁ, J.; UR- BANOVÁ, M.; PELLETIER, J.; ČÍŽEK, A.; ŽEMLIČKOVÁ, H.; ŠMEJKAL, K. Minor C-geranylated flavanones from Paulownia tomentosa fruits with MRSA antibacte- rial activity. Phytochemistry. 2013, roč. 89, s. 104–113. Dostupné z doi: 10.1016/j. phytochem.2013.01.002. 80. ŠMEJKAL, K.; MUSELÍK, J.; MOKRÝ, P. Laboratorní metody experimentální fytochemie. Brno, 2013. isbn 978-80-7305-649-0. 81. PLASKOŇOVÁ,D. Izolácia obsahových látok z plodov Paulownia tomentosa pomocou kom- binácie rôznych chromatografických metód. 2017. Dipl. pr. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno. 82. GAFFIELD, W. Circular dichroism, optical rotatory dispersion and absolute configuration of flavanones, 3-hydroxyflavanones and their glycosides: Determination of aglycone chirality in flavanone glycosides. Tetrahedron. 1970, roč. 26, č. 17, s. 4093– 4108. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/S0040-4020(01)93050-9. 83. MOLČANOVÁ, L.; KAUEROVÁ, T.; DALL’ACQUA, S.; MARŠÍK, P.; KOLLÁR, P.; ŠMEJKAL, K. Antiproliferative and Cytotoxic Activities of C-Geranylated Flavono-

91 BIBLIOGRAFIA ids from Paulownia tomentosa Steud. Fruit. Bioorganic Chemistry. 2021, s. 104797. Dostupné z doi: https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2021.104797.

92 Zoznam použitých skratiek

1,1-DMA 1,1-dimetylallyl

ABCB1 P-glykoproteín ABCP proteín rezistencie na rakovinu prsníka ADME absorpcia, distribúcia, metabolizmus, exkrécia ADR adriamycín ATP adenosíntrifosfát ATR metóda zoslabenia úplného odrazu (Attenuated Total Reflectance) AUC plocha pod krivkou závislosti plazmatickej koncentrácie od času

BA biochanín A BCECF-AM 2’7’-bis-(3-karboxyetyl-5-(a-6))-karboxyfluoresceín acetoxymetylester BCPCF 2’7’-bis-(karboxypropyl)-5(6)-karboxyfluorescein, substrát pre MRP1 BCRP proteín rezistencie na rakovinu prsníka (Breast Cancer Resistance Protein) Bn benzyl

Cmax maximálna plazmatická koncentrácia CaCo-2 bunková línia rakoviny hrubého čreva cAMP cyklický adenosínmonofosfát CD cirkulárny dichroizmus cGMP cyklický guanosínmonofosfát Colo320 bunková línia ľudskej rakoviny hrubého čreva CYP3A4 podtyp cytochrómu P450 CYP450 cytochróm P450

DAD detektor s diódovým poľom DHS dehydrosilibín DNA deoxyribonukleová kyselina DNM daunomycín DNR daunorubicín

93 ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK

EC50 stredná účinná koncentrácia liečiva EPG85-257P rodičovská bunková línia karcinómu žalúdka EPG85-257RDB bunková línia karcinómu žalúdka odolná voči daunorubicínu

FAR pomer fluorescenčnej aktivity Far farnesyl

Ger geranyl GF120918 silný inhibítor P-gp a BCRP GSH glutatión GST-p glutatión-S-transferáza

HEK293 bunková línia ľudskej embryonálnej obličky HEK293/MRP4 bunková línia ľudskej embryonálnej obličky exprimujúce MRP4 HEK293/MRP5 bunková línia ľudskej embryonálnej obličky exprimujúce MRP5 HepG2 bunková línia ľudského hepatocelulárneho karcinómu HepG2/ADR bunková línia ľudského hepatocelulárneho karcinómu rezistentná na adriamycín HL-60 bunková línia leukémie HMG-CoA hydroxymetylglutaryl koenzým A HPLC vysokoúčinná kvapalinová chromatografia HRMS vysokorozlišovacia hmotnostná spektrometria HTB26 bunková línia ľudskej rakoviny prsníka

Imax maximálna inhibičná aktivita IČ infračervená spektrometria IC50 stredná inhibičná koncentrácia IFG10 syntetický derivát genisteínu IFG12 syntetický derivát genisteínu iPr izopropyl IR Infračervená spektrometria (Infrared spectroscopy)

K562 bunková línia ľudskej myeloidnej leukémie

94 ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK

K562/BCRP bunková línia ľudskej myeloidnej leukémie nadmerne exprimujúca BCRP K562/R7 bunková línia ľudskej myeloidnej leukémie odolná voči doxorubi- cínu Kalcein-AM kalcein acetoxymetylester Ko143 (3S, 6S 12aS)-1,2,3,4,6,7,12,12a-Oktahydro-9-metoxy-6-( 2- metylpropyl)-1,4-dioxo-pyrazino-[1’,2’:1,6]pyrido[3,4- b]indolo- 3-propánová kyselina 1,1-dimetyletyl ester hydrát

Lav lavandulyl LD50 stredná letálna koncentrácia LLC-GA5-COL150 bunková línia prasačích obličiek transfekovaná ľudským MDR1 génom LLC-PK1 bunková línia prasačích obličiek LRP proteín pľúcnej rezistencie (lung resistance protein) LTC4 leukotrién C4

M.R. pomer AUC medzi metabolitom a podaným liečivom MCF-7 bunková línia rakoviny prsníka MCF-7/ADR bunková línia rakoviny prsníka rezistentná na adriamycín MCF-7/MR bunková línia rakoviny prsníka rezistentná na mitoxantrón MCF-7/MX bunková línia rakoviny prsníka rezistentná na mitoxantrón MCF-7/WT bunková línia rakoviny prsníka materského typu MDA435/LCC6 bunková línia ľudského karcinómu prsníka, nezávislá od estro- génu MDCK/BCRP bunková línia psích obličiek Madin–Darby transfekovaných ľud- ským cDNA divokého typu MDCKII bunková línia psích obličiek Madin–Darby MDR mnohopočetná lieková rezistencia (Multidrug resistance) Me metyl MO morín MRP proteín spojený s mnohopočetnou liekovou rezistenciou (Multid- rug resistance-associated protein) MRP1 proteín spojený s mnohopočetnou liekovou rezistenciou 1 (Mul- tidrug resistance-associated protein 1)

95 ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK

MRP2 proteín spojený s mnohopočetnou liekovou rezistenciou 2 MRP4 proteín spojený s mnohopočetnou liekovou rezistenciou 4 MRP5 proteín spojený s mnohopočetnou liekovou rezistenciou 5 MX mitoxantrón MXR1 proteín rezistencie na rakovinu prsníka

NBD doména viažúca nukleotidy (nucleotide-binding domain) NMR nukleárna magnetická rezonancia

P-gp P-glykoproteín Panc-1 bunková línia ľudského pankreatického adenokarcinómu PH phloretín Pre prenyl

QSAR kvantitatívny vzťah medzi štruktúrou a aktivitou

R(CAM) retenčný koeficient

SI silymarín

t1/2 terminálny polčas tmax čas na dosiahnutie Cmax THP-1 bunková línia ľudskej monocytárnej leukémie TLC chromatografia na tenkej vrstve TMD transmembránová doména (transmembrane domain)

UV ultrafialové žiarenie UV/VIS ultrafialovo-viditeľná spektroskopia

VBL vinblastín VER verapamil

WHO Svetová zdravotnícka organizácia (World Health Organization)

96 Prílohy

97 A HPLC chromatogram ghost píkov zo systému

Obr. A.1: HPLC chromatogram ghost píkov zo systému (použitá metóda 1)

98 B Prehľad flavonoidov, ktoré boli testované na inhibíciu eflux- ných púmp

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 65 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

IC50 80 ± 5 µM, Imax 88 ± 4,5 % ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [37]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 191 ± 11,2 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40] Genisteín (1) (100µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 156 ± 9,7 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

EC50 14,9 ± 2,69 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

IC50 21 ± 3 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

IC50 (etopozid) 38,8 ± 5,6 µM + 10 µM (daidzein) → IC50 MRP1-HEK293 MRP1 etopozid [41] (etopozid) 39,5 ± 4,6 µM

IC50 (thioguanín) 3,4 ± 0,7 µM + 20 µM (daidzein) → IC50 HEK293/MRP5 MRP5 thioguanin [41] (thioguanín) 1,9 ± 0,2 µM

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 126 ± 8,9 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

Daidzein (2) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 102 ± 5,5 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

EC50 57,3 ± 15,8 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

akumulácia(mitoxantrón) 26 ± 1, + 30 µM(daidzeín) akumulácia 72 ± MCF-7/MR BCRP mitoxantrón [58] 11

akumulácia(mitoxantrón) 36 ± 8, + 30 µM(daidzeín) akumulácia 69 ± K562/BCRP BCRP mitoxantrón [58] 16

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 330 ± 20,3 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 178 ± 11,1 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

(150 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 73,3 % Caco-2 bunky P-gp VBL [47] Biochanín A (3) (150 µM) akumulácia 3H-digoxínu sa zvýšila o 32,9 % Caco-2 bunky P-gp digoxín [47]

MDA435/LCC6MDR1 (30 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 502 ± 16 % P-gp DNM [48] bunky

EC50 1,62 ± 1,02 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,5 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43] Formononetín (4) Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 18,3 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,4 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43] Afrormosín (5) Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 3,1 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

Licoisoflavón A (6) IC50 17 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

IC50 50 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36] Licoisoflavón B (7)

IC50 13 ± 2,5 µM, Imax 83 ± 1 % ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [37]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 50 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36] Sophoraisoflavón A (8)

IC50 50 ± 5 µM, Imax 92 ± 4,5 % ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [37]

IFG10 (9) IC50 16 ± 1 µM, Imax 60 ± 6 % ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [37]

IFG12 (10) IC50 16 ± 2 µM, Imax 76 ± 1 % ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [37]

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,0 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43] Amorphigenín (11) Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 46,4 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR (akumulácia BCECF) 0,3 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 Rotenón (12) (40 µg/ml), FAR(akumulácia rhodamínu 123) 28,6 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 40,04 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,2 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43] 6a, 12a- dehydroamorphigenín (13) Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 3,0 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,1 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43] Dalbinol (14) Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 2,8 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 2,8 ± 0,6 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [34][56] Flavón (15)

IC50 1,7 ± 0,4 µM BCRP-T482 BCRP mitoxantrón [34]

IC50 8,1 ± 1,9 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [34][56] 3-Hydroxyflavón (16)

IC50 4,9 ± 0,1 µM BCRP-T482 BCRP mitoxantrón [34]

5-Hydroxyflavón (17) IC50 5,0 ± 1,5 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [34][56]

IC50 7,1 ± 0,3 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [34][56] 7-Hydroxyflavón (18)

IC50 13,9 ± 1,51 µM BCRP-T482 BCRP mitoxantrón [34]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 35 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

(60 µM) 30 % inhibícia MRP1 Vezikuly MRP1 17β-estradiol [29]

(25 µM) 63 % inhibícia MRP1 , IC50 21,8 ± 3,5 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

IC50 (etopozid) 38,8 ± 5,6 µM + 10 µM (quercetín) → IC50 HEK293/MRP1 MRP1 etopozid [41] (etopozid) 55,5 ± 6,8 µM

IC50 (thioguanín) 3,4 ± 0,7 µM + 10 µM (quercetín) → IC50 HEK293/MRP5 MRP5 thioguanin [41] (thioguanín) 0,9 ± 0,3 µM

Quercetín (19) IC50 8,1 ± 1,7 µM Vezikuly MRP1 LTC4 [29]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 268 ± 14,5 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 199 ± 11,6 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

(12 µM) RCAM sa zvýšil o 130 % EPG85-257RDB P-gp kalceín [49]

akumulácia(mitoxantrón) 26 ± 1, + 30 µM(quercetín) akumulácia 84 ± MCF-7/MR BCRP mitoxantrón [58] 15

akumulácia(mitoxantrón) 36 ± 8, + 30 µM(quercetín) akumulácia 60 ± K562/BCRP BCRP mitoxantrón [58] 13

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(30 µM + 3 µM GSH) 80% inhibícia MRP1 Vezikuly MRP1 17β-estradiol [29]

IC50 50 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

IC50 40 ± 16 µM, Imax 66 ± 4 % ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [37]

(25 µM) 47 % inhibícia MRP1, IC50 35,1 ± 9,6 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

Apigenín (20) IC50 4,9 ± 0,7 µM Vezikuly MRP1 LTC4 [29]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 184 ± 4,9 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 62,3 ± 5,3 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

EC50 1,66 ± 0,55 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

IC50 15,0 ± 2,0 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 100 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

(25 µM) 43 % inhibícia MRP1, IC50 35,3 ± 7,3 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 102 ± 14,8 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40] Galangín (21) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 67,9 ± 14,4 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

EC50 1,21 ± 0,27 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

IC50 17 ± 3 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

IC50 100 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

(25 µM) 63 % inhibícia MRP1, IC50 20,2 ± 4,3 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

(25 µM) 68 % inhibícia MRP2, IC50 22,2 ± 3,9 µM MDCKII MRP2 kalceín [39] Myricetín (22)

IC50 13,3 ± 2,7 µM Vezikuly MRP1 LTC4 [29]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 87,7 ± 9,5 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 76,8 ± 2,8 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(25 µM) 48 % inhibícia MRP1, IC50 30,9 ± 4,4 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

Baicaleín (23) (10 ~ 30 µM) zvýšená akumulácia rhodamínu 123 MCF-7/ADR P-gp rhodamín 123 [46]

EC50 1,21 ± 0,35 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

3´, 4´-Dihydroxyflavón (24) (25 µM) 57 % inhibícia MRP1, IC50 24,4 ± 4,1 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

(25 µM) 72 % inhibícia MRP1, IC50 19,4 ± 3,6 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

(30 µM) 70 % inhibícia MRP1 Vezikuly MRP1 17β-estradiol [29]

IC50 2,4 ± 1,6 µM Vezikuly MRP1 LTC4 [29]

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,3 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42][43]

Kaempferol (25) (100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 196 ± 6,3 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 280 ± 17,1 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 0,8 P-gp rhodamín 123 [42][43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 0,81 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42][43]

EC50 6,04 ± 0,09 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(25 µM) 53 % inhibícia MRP1, IC50 22,4 ± 4,8 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

Luteolín (26) (100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 128 ± 11,5 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 65,3 ± 5,6 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

(25 µM) 75 % inhibícia MRP1, IC50 13,6 ± 3,9 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

(25 µM) 76 % inhibícia MRP2, IC50 15 ± 3,5 µM MDCKII MRP2 kalceín [39]

Robinetín (27) (40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,6 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42][43]

Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 0,7 P-gp rhodamín 123 [42][43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 0,83 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42][43]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,5 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42][43]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 180 ± 19,4 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 198 ± 26,0 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

Myší lymfóm/MDR1 Chrysín (28) (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 14,6 P-gp rhodamín 123 [42][43] bunky

EC50 0,39 ± 0,13 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

IC50 4,6 ± 0,5 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [34][56]

(10 µM) akumulácia DNM 0,20 vzhľadom k cyklosporínu A (2 K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,358

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 53,6 ± 3,1 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40] Fisetín (29) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 59,6 ± 8,8 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

Acacetín (30) IC50 50 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

5-Hydroxy-7-metoxyflavón (31) IC50 3,0 ± 0,9 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

(300 µM) významne zvýšená akumulácia rhodamínu 123 LLC-GA5-COL150 P-gp rhodamín 123 [50] 5,7,4´-Trimetoxyflavón (32)

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

3,5,7,4´-Tetrametoxyflavón (33) (300 µM) významne zvýšená akumulácia rhodamínu 123 LLC-GA5-COL150 P-gp rhodamín 123 [50]

5-Hydroxy-3,7-dimetoxyflavón (300 µM) významne zvýšená akumulácia rhodamínu 123 LLC-GA5-COL150 P-gp rhodamín 123 [50] (34) 5-Hydroxy-3,7,4´- (300 µM) významne zvýšená akumulácia rhodamínu 123 LLC-GA5-COL150 P-gp rhodamín 123 [50] trimetoxyflavón (35)

5,7,3´,4´-Tetrametoxyflavón (36) (25 µM) 76 % inhibícia MRP1, IC50 7,9 ± 1,5 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

Diosmetín (37) (25 µM) 84 % inhibícia MRP1, IC50 2,7 ± 0,6 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

Chrysoeriol (38) (25 µM) 85 % inhibícia MRP1, IC50 4,0 ± 0,7 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

Tamarixetín (39) (25 µM) 68 % inhibícia MRP1, IC50 7,4 ± 3,4 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

Izorhamnetín (40) (25 µM) 60 % inhibícia MRP1, IC50 14,3 ± 2,8 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

(3 µM) významne zvýšená akumulácia rhodamínu 123 LLC-GA5-COL150 P-gp rhodamín 123 [50]

(30 µM) významne zvýšená akumulácia daunorubicínu LLC-GA5-COL150 P-gp daunorubicín [50] 3,5,7,3´,4´-Pentametoxyflavón (41) IC50 0,82 ± 0,169 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35]

IC50 1,88 ± 0,24 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(300 µM) významne zvýšená akumulácia rhodamínu 123 LLC-GA5-COL150 P-gp rhodamín 123 [50] 5,7-Dimethoxyflavón (42)

EC50 1,41 ± 0,26 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

5,6,7-Trimetoxyflavón (43) EC50 1,09 ± 0,41 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

6,4´-Dimetoxy-3-hydroxyflavón EC50 0,45 ± 0,25 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57] (44)

IC50 1,2 ± 0,6 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [55] Penduletín (45)

IC50 2,0 ± 1,3 µM MCF-7/MX BCRP Hoechst33342 [55]

IC50 0,46 ± 0,04 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [55] Ayanín (46)

IC50 0,68 ± 0,08 µM MCF-7/MX BCRP Hoechst33342 [55]

IC50 0,39 ± 0,14 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [55] Retusín (47)

IC50 0,90 ± 0,32 µM MCF-7/MX BCRP Hoechst33342 [55]

Tectochrysín (48) IC50 1,9 ± 0,3 µM BCRP-T482 BCRP mitoxantrón [34]

Hispidulín (49) IC50 20 µM HepG2 BCRP mitoxantrón [59][60]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 1,01 ± 0,1 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Hydroxy-7,3´,4´- trimetoxyflavón (50) IC50 1,77 ± 0,14 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 12,4 ± 0,47 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Hydroxy-5,7,4´- trimetoxyflavón (51) IC50 8,95 ± 0,65 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 1,21 ± 0,12 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Metoxyflavón (52)

IC50 1,28 ± 0,17 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 7,74 ± 0,35 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3,4´-Dimetoxyflavón (53)

IC50 6,50 ± 0,58 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 1,18 ± 0,29 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3,3´,4´-Trimetoxyflavón (54)

IC50 1,34 ± 0,19 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 1,18 ± 0,18 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3,7,3´,4´-Tetrametoxyflavón (55)

IC50 2,14 ± 0,31 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 5,98 ± 0,45 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3,5,7,2´,4´-Pentametoxyflavón (57) IC50 5,92 ± 0,74 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 0,54 ± 0,079 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 5-Hydroxy-3,3´,4´- trimetoxyflavón (58) IC50 0,57 ± 0,093 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 3,27 ± 0,15 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 5-Hydroxy-3,7,2´,4´- tetrametoxyflavón (59) IC50 3,89 ± 0,16 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 7 ± 1 µM, Imax 95 ± 1 % ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [37]

(25 µM) 30 % inhibícia MRP1, IC50 49 ± 7,6 µM MDCKII MRP1 kalceín [39]

Morín (60) (100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 553 ± 36,7 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 546 ± 50,1 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

MDA435/LCC6MDR1 (30 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 604 ± 32 % P-gp DNM [48] bunky

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

Zvýšená akumulácia kalceínu HL-60 P-gp kalceín-AM [51] Wogonín (61) Zvýšená akumulácia etoposidu HL-60 P-gp etopozid [51]

8-Metylflavón (62) EC50 0,61 ± 0,15 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

Icaritín (63) (30 µM) IC50 (ADR) 0,083 ± 0,011, reverzný zvrat 7,18 HepG2/ADR P-gp ADR [45]

(10 µM) akumulácia DNM 0,20 vzhľadom k cyklosporínu A (2 6-Methylchrysín (64) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,512 (10 µM) akumulácia DNM 0,23 vzhľadom k cyklosporínu A (2 7-O-Metylchrysín (65) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,719 (10 µM) akumulácia DNM 0,30 vzhľadom k cyklosporínu A (2 6,7-Dimetylchrysín (66) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,842 (10 µM) akumulácia DNM 0,24 vzhľadom k cyklosporínu A (2 6-Isopropylchrysín (67) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,608 (10 µM) akumulácia DNM 0,30 vzhľadom k cyklosporínu A (2 7-O-Isopropylchrysín (68) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,898 (10 µM) akumulácia DNM 0,29 vzhľadom k cyklosporínu A (2 6,7-Diisopropylchrysín (69) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 1,248 (10 µM) akumulácia DNM 0,29 vzhľadom k cyklosporínu A (2 6,7,8-Triisopropylchrysín (70) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 1,479 (10 µM) akumulácia DNM 0,09 vzhľadom k cyklosporínu A (2 6-Benzylchrysín (71) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,754

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(10 µM) akumulácia DNM 0,25 vzhľadom k cyklosporínu A (2 8-Benzylchrysín (72) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,754 (10 µM) akumulácia DNM 0,39 vzhľadom k cyklosporínu A (2 6,8-Dibenzylchrysín (73) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 1,060 (10 µM) akumulácia DNM 0,27 vzhľadom k cyklosporínu A (2 7-O-Benzylchrysín (74) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 1,076 (10 µM) akumulácia DNM 0,83 vzhľadom k cyklosporínu A (2 K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,812

6-Prenylchrysín (75) IC50 0,29 ± 0,06 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [34] [56]

IC50 3,6 ± 1,9 µM BCRP-T482 BCRP mitoxantrón [34]

(10 µM) akumulácia DNM 1,52 vzhľadom k cyklosporínu A (2 K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 0,853

8-Prenylchrysín (76) IC50 0,69 ± 0,31 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [34] [56]

IC50 > 10 µM BCRP-T482 BCRP mitoxantrón [34]

(10 µM) akumulácia DNM 0,84 vzhľadom k cyklosporínu A (2 6,8-Diprenylchrysín (77) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 1,296

IC50 0,78 ± 0,15 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [34] [56] 6-(1,1-DMA)chrysín (78)

IC50 > 10 µM BCRP-T482 BCRP mitoxantrón [34]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 1,4 ± 0,5 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [34] [56] 8-(1,1-DMA)chrysín (79)

IC50 > 10 µM BCRP-T482 BCRP mitoxantrón [34]

(10 µM) akumulácia DNM 0,81 vzhľadom k cyklosporínu A (2 K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 1,288 6-Geranylchrysín (80)

IC50 1,0 ± 0,4 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

(10 µM) akumulácia DNM 0,90 vzhľadom k cyklosporínu A (2 8-Geranylchrysín (81) K562/R7 P-gp DNM [44] µM), Index hydrofobicity 1,350

6,8-Digeranylchrysín (82) IC50 2,1 ± 0,5 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

6-Farnesylchrysín (83) IC50 > 10 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

Artochamín C (84) IC50 7,5 ± 1,5 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 120 ± 6,8 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40] Rhoifolín (85) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 58,2 ± 3,5 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,6 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 Robinín (86) (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 1,5 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 1,18 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 71,8 ± 3,5 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40] Rutín (87) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa výšila o 107 ± 2,2 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 106 ± 6,9 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40] Diosmín (88) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 116 ± 8,4 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

IC50 8,32 ± 0,61 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 5,6-Benzoflavón (89)

IC50 6,05 ± 1,62 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

EC50 0,07 ± 0,02 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

7,8-Benzoflavón (90) IC50 1,31 ± 0,12 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35]

IC50 1,40 ± 0,18 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

2´-hydroxy-α-naftoflavón (91) EC50 0,09 ± 0,05 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

Flavanón (92) EC50 24,6 ± 5,21 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,3 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 Dihydroquercetín (93) (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 0,6 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 0,91 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,1 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 Dihydrorobinetín (94) (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 0,7 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 0,83 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 50 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

(30 µM + GSH) 60 % inhibícia MRP1 Vezikuly MRP1 17β-estradiol [29]

IC50 20,8 ± 6,4 µM Vezikuly MRP1 LTC4 [29]

IC50 (etopozid) 38,8 ± 5,6 µM + 20 µM (naringenín) → IC50 MRP1-HEK293 MRP1 etopozid [41] (etopozid) 30,2 ± 5,6 µM

IC50 (thioguanín) 3,4 ± 0,7 µM + 20 µM (naringenín) → IC50 Naringenín (95) HEK293/MRP5 MRP5 thioguanin [41] (thioguanín) 1,8 ± 0,3 µM

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 89,5 ± 2,0 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 112,9 ± 4,7 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

EC50 32,0 ± 3,22 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

IC50 34 ± 5 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,0 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 Dihydrofisetín (96) (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 0,5 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 1,21 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

6,7,2´,3´-Tetrahydroxyflavanón EC50 14,2 ± 1,48 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57] (97)

IC50 (etopozid) 38,8 ± 5,6 µM + 20 µM (hesperetín) → IC50 MRP1-HEK293 MRP1 etopozid [41] (etopozid) 24,7 ± 3,8 µM

IC50 (thioguanín) 4,8 ± 1,3 µM + 20 µM (hesperetín) → IC50 HEK293/MRP4 MRP4 thioguanín [41] (thioguanín) 2,5 ± 0,5 µM

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 132 ± 8,8 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

Hesperetín (98) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 126 ± 2,4 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

EC50 12,4 ± 2,21 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

akumulácia(mitoxantrón) 26 ± 1, + 30 µM(hesperetín) akumulácia 90 ± MCF-7/MR BCRP mitoxantrón [58] 21

akumulácia(mitoxantrón) 36 ± 8, + 30 µM(hesperetín) akumulácia 67 ± K562/BCRP BCRP mitoxantrón [58] 16

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 0,8 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 Sakuranetín (99) (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 2,4 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 5,2 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

5,6,7-Trimetoxyflavanón (100) EC50 5,67 ± 4,74 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

7-Metoxyflavanón (101) EC50 16,3 ± 4,25 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

Kushenol E (102) IC50 5 ± 1 µM BCRP-R482 BCRP mitoxantrón [56]

Euchrestaflavanón A (103) IC50 3 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

Sophoraflavanón B (104) IC50 17 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

6-Prenylnaringenín (105) IC50 100 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

8-Prenylnaringenín (106) IC50 6 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCECF [38]

Sophoraflavanón A (107) IC50 7 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

Sophoraflavanón E (108) IC50 16 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

Sophoraflavanón D (109) IC50 25 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

Sophoraflavanón G (110) IC50 25 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

Sophoraflavanón H (111) IC50 3 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [36]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 (etopozid) 38,8 ± 5,6 µM + 20 µM (silymarín) → IC50 MRP1-HEK293 MRP1 etopozid [41] (etopozid) 21,7 ± 3,3 µM

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 329 ± 27,4 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 305 ± 12,6 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

(150 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 80,3 % Caco-2 bunky P-gp VBL [47] Silymarín (112) (150 µM) akumulácia 3H-digoxínu sa zvýšila o 23,3 % Caco-2 bunky P-gp digoxín [47]

MDA435/LCC6MDR1 (50 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 445 ± 12 % P-gp DNM [48] bunky

akumulácia(mitoxantrón) 26 ± 1, + 30 µM(silymarín) akumulácia 78 ± MCF-7/MR BCRP mitoxantrón [58] 13

akumulácia(mitoxantrón) 36 ± 8, + 30 µM(silymarín) akumulácia 63 ± K562/BCRP BCRP mitoxantrón [58] 19

IC50 5 ± 0,5 µM ľudské erytrocyty MRP1 BCPCF [37] Silybín (112)

EC50 183 ± 21,7 µM MCF-7/MX BCRP mitoxantrón [57]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 0,9 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 Neohesperidín (113) (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 2,8 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 1,55 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 2,3 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 1,18 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

Naringín (114) (40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 0,8 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 109 ± 5,1 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

(100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 94,5 ± 3,4 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 0,7 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 Sakuranín (115) (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 0,8 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 0,52 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 0,6 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

Myší lymfóm/MDR1 Catechín (116) (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 2,9 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 1,57 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,3 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 164 ± 7,9 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

Epigallocatechín (117) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 108 ± 6,8 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 36,1 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky

(40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 3,8 COLO320/MDR1 bunky P-gp rhodamín 123 [42] [43]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 342 ± 19,3 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40] Chalkón (118) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 241 ± 8,4 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

(40 µg/ml) FAR(akumulácia BCECF) 1,0 HTB26/MRP1 bunky MRP1 BCECF [42] [43]

(100 µM) akumulácia 3H-VBL sa zvýšila o 251 ± 9,8 % Panc-1 bunky MRP1 VBL [40]

Phloretín (119) (100 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 295 ± 49,6 % Panc-1 bunky MRP1 DNM [40]

Myší lymfóm/MDR1 (40 µg/ml) FAR(akumulácia rhodamínu 123) 4,9 P-gp rhodamín 123 [42] [43] bunky MDA435/LCC6MDR1 (50 µM) akumulácia 3H-DNM sa zvýšila o 431 ± 28 % P-gp DNM [48] bunky

2,3-Dehydrosilybín (120) Imax 130 %, EC50 9,4 µM K562 P-gp DNR [53]

7-O-benzyl-2,3-dehydrosilybín Imax 68 %, EC50 0,88 µM K562 P-gp DNR [53] (121) 3-O-metyl-2,3-dehydrosilybín Imax 130 %, EC50 4,8 µM K562 P-gp DNR [53] (122) 20-O-metyl-2,3-dehydrosilybín Imax 48 %, EC50 0,1 µM K562 P-gp DNR [53] (123) 3,7-di-O-metyl-2,3- Imax 66 %, EC50 1,37 µM K562 P-gp DNR [53] dehydrosilibín (124) 7,20-di-O-metyl-2,3- Imax 65 %, EC50 0,89 µM K562 P-gp DNR [53] dehydrosilibín (125) 3,20-di-O-metyl-2,3- Imax 48 %, EC50 2,7 µM K562 P-gp DNR [53] dehydrosilibín (126)

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

3,7,20-tri-O-metyl-2,3- Imax 79 %, EC50 0,16 µM K562 P-gp DNR [53] dehydrosilibín (127)

IC50 2,46 ± 0,15 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 4´-Metoxy-5,6-benzoflavón (128)

IC50 1,69 ± 0,07 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 0,590 ± 0,064 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3´,4´-Dimetoxy-5,6-benzoflavón (129) IC50 0,458 ± 0,053 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 11,0 ± 2,98 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Hydroxy-5,6-benzoflavón (130)

IC50 13,6 ± 2,40 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 8,93 ± 2,37 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Hydroxy-4´-metoxy-5,6- benzoflavón (131) IC50 6,12 ± 1,54 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 6,12 ± 0,35 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Hydroxy-3´,4´-dimetoxy-5,6- benzoflavón (132) IC50 4,84 ± 0,99 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 11,1 ± 1,37 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Metoxy-5,6-benzoflavón (133)

IC50 12,5 ± 0,65 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 3,07 ± 0,04 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3,4´-Dimetoxy-5,6-benzoflavón (134) IC50 8,02 ± 1,39 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 4,27 ± 0,64 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3,3´,4´-Trimetoxy-5,6- benzoflavón (135) IC50 5,25 ± 0,67 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 1,28 ± 0,07 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 4´-Metoxy-7,8-benzoflavón (136)

IC50 1,29 ± 0,09 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 1,23 ± 0,08 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3´,4´-Dimetoxy-7,8-benzoflavón (137) IC50 1,13 ± 0,19 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 0,522 ± 0,082 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 4´-Fluoro-3´-metoxy-7,8- benzoflavón (138) IC50 0,457 ± 0,124 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 2,89 ± 0,73 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Hydroxy-7,8-benzoflavón (139)

IC50 1,59 ± 0,14 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 6,93 ± 1,58 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Hydroxy-4´-metoxy-7,8- benzoflavón (140) IC50 4,97 ± 0,88 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 0,724 ± 0,049 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Hydroxy-3´,4´-dimetoxy-7,8- benzoflavón (141) IC50 1,52 ± 0,08 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 22,5 ± 4,90 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 4´-Fluro-3-hydroxy-3´-metoxy- 7,8-benzoflavón (142) IC50 17,9 ± 0,29 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 2,71 ± 0,41 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3-Metoxy-7,8-benzoflavón (143)

IC50 2,31 ± 0,04 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 1,06 ± 0,26 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3,4´-Dimetoxy-7,8-benzoflavón (144) IC50 3,07 ± 0,38 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

Flavonoidy Účinok Modelový systém Pumpa Substrát Referencie

IC50 0,426 ± 0,019 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 3,3´,4´-Trimetoxy-7,8- benzoflavón (145) IC50 0,468 ± 0,034 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]

IC50 2,44 ± 0,25 µM MDCK/BCRP BCRP Hoechst33342 [35] 4´-Fluro-3,3´-dimetoxy-7,8- benzoflavón (146) IC50 4,01 ± 0,77 µM MDCK/BCRP BCRP Feoforbid A [35]