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Département de Biotechnologie

Thèse de Doctorat en Microbiologie

Thème

Diversité taxonomique et symbiotique des rhizobia associés aux Acacia sp. d’Algérie

Présentée par : Boukhatem Zineb Faiza

Dirigée par : Mr BEKKI Abdelkader , Professeur à l’Université d’Oran.

Devant les membres de jury constitué de:

Président e : FYAD Zohra , Professeur à l’Université d’Oran.

Examinateur : HADJAJ AOUEL Seghir, Professeur à l’Université d’Oran.

Examinateur : ABDELWAHED Djaml Eddine, Professeur à l’Université de Tlemcen.

Examinateur : de LAJUDIE Philippe, Directeur de recherches à l’IRD, France.

Co-Directeur de thèse : GALIANA Antoine , Directeur de recherches au CIRAD, France.

Dédicace

Je dédie ce travail à ma mère, ses sacrifices ont pavé mon chemin vers la réussite, je ne saurais lui exprimer ma gratitude pour tout ce qu’elle a inculqué

en moi. J’espère que ce modeste travail récompensera en partie son

dévouement.

A feu mon père qui aura toujours une place dans mon cœur.

A mes trois trésors, mon mari ma fille et mon fils qui donnent un sens à ma vie.

A mon frère, mes deux sœurs ainsi que les prunelles de mes yeux, mes petites

nièces chéries.

A toute ma famille, ma belle famille et mes amis. RemerciementRemerciementssss

Merci tout d’abord à Dieu miséricordieux de m’avoir donné la force d’accomplir cette tâche.

Ce travail s’est déroulé en alternance au LBRAP (Laboratoire de Biotechnologie des

Rhizobiums et amélioration des plantes à l’université d’Oran, Es-Senia et au LSTM

(Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes) de Montpellier, France.

Je remercie Pr. BEKKI Abdelkader d’avoir accepté d’encadrer ce travail et pour tous ses conseils avisés.

Un grand merci au Dr. GALIANA Antoine pour tous les efforts fournis, pour ses approches intéressantes et pour sa disponibilité qui lui a gâché bien des weekends et des vacances.

Ainsi qu’aux directeurs successifs du LSTM (Laboratoire des Symbioses Tropicales et

Méditerranéennes) de Montpellier : DREYFUS Bernard et LEBRUN Michel pour avoir accepté ma candidature à des stages plus que fructueux qui m’ont permis d’avancer dans mon travail.

Je tiens à remercier les membres du jury : Pr. FYAD qui a accepté sans hésitation de présider ce jury, Pr. HADJAJ et Pr.ABDELWAHED qui m’ont accordé leur temps afin d’examiner ce travail en cette fin d’année toujours surchargée, et enfin un grand merci au Pr. de LAJUDIE qui répond toujours présent quant on a besoin de lui.

Je ne saurais remercier ma collègue et amie Dr MERABET Chahinez pour son aide précieuse sur la construction phylogénétique, ainsi que pour son soutient et sa bonne humeur contagieuse.

J’exprime aussi ma reconnaissance à tous mes collègues du département de biotechnologie, enseignants, personnel technique et à l’équipe du laboratoire de Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des Plantes, enseignants et post-graduants pour leurs encouragements.

Je ne saurais oublier de remercier toute l’équipe du LSTM (Laboratoire des Symbioses

Tropicales et Méditerranéennes) de Montpellier ; Odile pour son aide précieuse, Christine pour son humanisme, Philippe et tous les autres : chercheurs et doctorants qui m’ont aidé ne serait ce que d’un mot, d’un sourire. Mes courts séjours m’ont beaucoup enrichi autant sur le plan scientifique qu’humain.

Mes remerciements s’adressent aussi à la direction des forêts de toutes les wilayas que j’ai visitées, les moyens généraux ainsi que l’INRF spécialement Salah, Mme Sahki ainsi que Réda et Ibrahim, nos guides à Tamanrasset.

Enfin, j’exprime toute ma gratitude à toute ma famille, mes amis d’ici et d’ailleurs que j’ai délaissés mais qui ont été compréhensifs et patients et à toutes les personnes qui m’ont encouragées, soutenues durant les moments difficiles.

Une thèse est un investissement en temps, en énergie, en santé, avec quelques manips qui ne vont pas dans le sens qu’on

aurait voulu, mais avant tout, c’est une grande expérience

humaine, alors MERCI à tous ceux qui y ont contribué.

Sommaire

Chapitre I : Recherche bibliographique

I : « Les rhizobia » I-1- Définition des rhizobia…………………………………………….……………. 01 I-2- La symbiose légumineuse-rhizobium : définition et évolution…..…………… 02 I-3- Formation des nodules……...…………………………………………………… 03 I-4- Taxonomie des BNL……...……………………………………………………... 05 I-4-1- Outils de la taxonomie bactérienne………………………………...…………. 05 I-4-2- Position taxonomique actuelle des BNL…..………………………..………… 09 I-4-3- Taxonomie des rhizobia associés aux Acacias………………………..……... 12 I-5- Spectre d’hôte des rhizobia associés aux Acacias…………………………….… 19 I-6- Effet des contraintes édaphiques sur la croissance des rhizobia…………….….. 19

II: « Les Acacias » II-1- Généralités……………………………………………………………………… 25 II-2- Origine et évolution de la nodulation chez les légumineuses………………….. 25 II-3- Taxonomie des Acacia …………………………………………………………. 26 II-4- Répartition des Acacias dans le monde………………………………………… 29 II-5- Intérêts et importance des Acacias……………………………………………... 29 II-6- Les Acacias en Algérie…………………………………………………………. 34 II-6-1- Description et répartition géographique des Acacias étudiés………………... 35 II-6-2- Utilisation et caractéristiques des Acacias étudiés…………………………... 40 II-7- Résistance des Acacias aux contraintes édaphiques…………………………… 42

III: « La fixation d’azote atmosphérique » III-1- Introduction……………………………………………………………………. 46 III-2- Comparaison entre les arbres et les plantes annuelles fixateurs d’azote ……... 46 III-3- Méthodes d’estimation de la fixation d’azote atmosphérique………………… 47 III-3-1- Méthodes indirectes……………………………………………………….. 47 III-3-2- Méthodes directes (isotopiques)………………………………………… 49 III-4- Le potentiel fixateur de N 2 des Acacias ………………………………………. 54 III-5- Classification des Arbres Fixateurs d’A zote selon leur potentiel de fixation du N2……………………………………………………………………………………………………………………………… 57

Chapitre II : Etude expérimentale

Partie I : Caractérisation des rhizobia associés aux espèces d’ Acacia d’Algérie

Matériel et méthodes: Caractérisation des rhizobia

Introduction…………………………………………………………………………. 58 Méthodologie………………………………………………………………………… 58 1-Echantillonnage………………………………………………………………….. 58 2-Analyse physico-chimique du sol……………………………………………….. 61 3- Isolement des rhizobia………………………………………………………….. 61 3-1-Piégeage …………………………………………………………………. 61 3-2- Isolement et purification des souches ………………………………….. 63 4- Test de nodulation et d’efficience ……………………………………………… 64 5- Analyse statistique ……………………………………………………………… 66 Sommaire

6- Caractérisation phénotypique des isolats……………………………………….. 67 6-1- Tolérance à la température. ……………………………………………. 67 6-2- Tolérance aux pH……………………………………………………….. 67 6-3- Tolérance à la salinité…………………………………………………… 67 7- Phénodendogramme……………………………………………………………. 67 8- Caractérisation génétique des isolats……………………………………………. 69

Résultats et discussion : Caractérisation des rhizobia 1- Distribution des Acacias…………………………………………………..... 73 2- Caractérisation des sites et sols prospectés …………………………………. 75 3- Taux de germination des graines après les différentes méthodes de désinfection et de scarification………………………………………………. 77 4- Impact de la profondeur d’échantillonnage dans les lits d’oueds desséchés sur l’isolement des populations rhizobiennes………………………………... 79 5- Isolement, purification et statut symbiotique des souches …………………. 82 6- Caractérisation génétique par le séquençage partiel du 16S rARN…………. 88 7- Détermination de la spécificité d’hôte des BNL isolées par AFC ……...... 98 8- Tolérance des souches à la salinité, température et pH……………………… 100 9- Tests d’efficience des souches 108 d’Acacias…………………………………….. 10- Caractérisation phénotypique des souches isolées d’Acacias phénodendogramme 115

Partie II : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie

Matériel et méthodes : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie Introduction…………………………………………………………………………. 121 1- Méthode de la dilution isotopique par enrichissement du sol en 15 N …………… 122 a- Protocole d’échantillonnage sur le terrain ……………………………...... 122 a-1 Description des sites de prélèvement …………………………………….. 122 a-2 Prélèvement du sol ………………………………………………………… 123 b- Protocole expérimental en serre……………………………………… ………… 123 c- Analyse du sol………………………………………………………………….. 127 2- Abondance naturelle en 15 N………………………………………………………. 127

Résultats et discussion : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie 1- Résultats des analyses du sol des trois sites étudiés…………………………….. 130 2- Effet du sol sur la croissance de trois espèces d’ Acacia …………………………… 131 3- Effet de l’inoculation sur la croissance de trois espèces d’ Acacia sur quatre types de sols………………………………………………………………………………..... 136 4- Estimation du potentiel fixateur de trois espèces d’ Acacia sur différents types de sols par la méthode de la dilution isotopique en 15 ………………………...... 140 5- Estimation du potentiel fixateur in situ de trois espèces d’ Acacia sur différents types de sols par la métho de de l’abondance naturelle…………………………...... 146 Conclusion et perspectives ………………………………………………………….. 152 Références bibliographiques Annexes

Liste des tableaux Page Tableau 1 Classification des Bactéries Nodulant les Légumineuses (Weir, 10 2011). Tableau 2 Classification des espèces de rhizobia nodulant les Acacias. 13 Tableau 3 Les classifications les plus importantes dans le genre Acacia de 27 Bentham (1875) à Maslin et al . (2003) Tableau 4 Nom génériques et infragénériques de Acacia sens. lat . 28 Tableau 5 Classification d’Acacia sens. lat. dans le monde (Maslin et al., 29 2003). Tableau 6 Caractéristiques morphologiques, distribution géographique et 35 conditions édaphiques des Acacias étudiés (Dommergues et al., 1999 ; Baumer, 1999 ; Sahki et al., 2004 ; Hazem, 2009) Tableau 7 Comparaison entre la tolérance de quelques espèces d’ Acacia à la 44 salinité (Ansari et al., 2007) Tableau 8 Estimation de l’azote fixé par les arbres au champ par les 56 méthodes isotopiques (d’après Galiana et al., 2004) Tableau 9 Interprétation de la salinité du sol en fonction de sa texture et de sa 61 conductivité électrique de l’extrait aqueux au 1/5 en mS/cm, selon le département d’agriculture et d’Alimentation d’Australie. Tableau 10 Description climatique, écologique et situation géographique des 76 sites étudiés. Tableau 11 Salinité et pH des sols échantillonnés. 77 Tableau 12 Taux de germination des graines de 08 espèces d’ Acacia selon le 78 mode de scarification (chimique ou manuelle) en fonction du

temps d’immersion. Tableau 13 Résultats du taux de nodulation du piégeage sur tubes Gibson et 81 dans les pots. Tableau 14 Nombre d’isolats par espèce d’ Acacia et par site prospecté. 83 Tableau 15 Liste des souches renodulantes, leur statut symbiotique et aspects 86 des nodosités. Tableau 16 Comparaisons des séquences obtenues par séquençage partiel du 90 16S rARN avec les séquences de référence de la base de données Genbank du site NCBI. Tableau 17 Tolérance des souches à la température, salinité et Ph selon leur 100 provenance et leur plante hôte. Tableau 18 Résultats du test d’efficience (poids sec, hauteur de la tige, nombre 109 des nodules) des différentes souches sur les différentes espèces d’ Acacia . Tableau 19 Résistance intrinsèque aux antibiotiques et métaux lourds des 16 115 souches isolées de différentes espèces d’ Acacia . Tableau 20 Réduction des sucres et utilisation des acides aminés par les 116 souches isolées de différentes espèces d’ Acacia. Tableau 21 Croissance à différents pH, aptitude à hydrolyser l'urée et à réduire 117 les nitrates des 16 souches isolées de différentes espèces d’ Acacia. Tableau 22 Profil de tolérance à différentes concentrations de NaCl et à 117 différentes températures 16 souches isolées de différentes espèces d’ Acacia. Tableau 23 Densité du sol prélevé dans chaque site d’études 125 Tableau 24 Résultats de l’analyse physico-chimique des trois sites étudiés 130 Tableau 25 Hauteur des plants et nombre de nodules obtenus chez les 131 différentes espèces d’ Acacia testées , après 9 mois de culture en serre dans des pots contenant du sol enrichi en 15 N provenant des quatre sites étudiés. Tableau 26 Poids sec des feuilles, tiges et racines des plants des différentes 134 espèces d’Acacia testées, après 9 mois de culture en serre dans des pots contenant du sol enrichi en 15 N provenant des quatre sites étudiés. Tableau 27 Excès isotopiques en 15 N et teneur en N total mesurés chez les 142 plants des différents traitements, et calcul du pourcentage de N fixé et de la quantité de N total fixé chez les différentes espèces d’ Acacia après application d’azote minéral enrichi en 15 N et neuf mois de croissance en serre sur différentes origines de sols. Tableau 28 Teneur en N et excès isotopique en 15 N dans les différents organes 144 (racines, tiges et feuilles) des Acacias non inoculés après application d’azote minéral enrichi en 15 N et neuf mois de croissance en serre sur différentes origines de sols. Tableau 29 Teneurs en N et abondance naturelle en 15 N d’échantillons 149

foliaires d’espèces fixatrices de N 2 et de plantes références non- fixatrices présentes dans les trois sites d’étude et calcul de la proportion de N fixée par les Acacias in situ .

Liste des figures Page Figure 1 Aspect du rhizobium dans le sol 01 Figure 2 Aspect des bactéroides dans le nodule 01 Figure 3 Le dialogue moléculaire de la symbiose légumineuse-rhizobium 04 d’après Rosenberg (1997). Figure 4 Pouvoir discriminant des différentes techniques de la taxonomie 07 polyphasique (d’après Vandamme et al. 1996, modifié par Zakhia et de Lajudie, 2006). Figure 5 Aspect d’A.tortilis : -a- Aspect général de l‘arbre (route de Taghit, 37 Béchar), BZF, 2004 ; -b- Branches et gousses (Oued Tassena, Tamanrasset), INRF, 2003 Figure 6 Aspect d ’A.nilotica : -a- Aspect général de l‘arbre (Oued Idekel, 37 Tamanrasset), BZF, 2004 ; -b- Fleurs et gousses, INRF, 2003 Figure 7 Aspect d ’A.seyal : -a- Aspect général de l‘arbre; -b- Branches et 38 gousses, (Oued Taghemout, Tamanrasset), BZF, 2004 Figure 8 Aspect d ’A.albida : -a- Aspect général de l‘arbre; -b- Branches et 38 gousses, (Oued Tassena, Tamanrasset), BZF, 2004 Figure 9 Aspect d ’A.ehrenbergiana : -a- Aspect général de l‘arbre (Oued In- 39 Tounin Tssekra, Tamanrasset), BZF, 2004; -b- Branches et épines (Tindouf, BZF, 2006) Figure 10 Aspect d’A.saligna : -a- Aspect d’un jeune arbre (Les dunes d’El- 39 Mactaa, Oran, BZF, 2002) Figure 11 Principe de la mesure de la quantité du N2 fixé en utilisant la 52 méthode de dilution isotopique après enrichissement du sol en 15N (Peoples et al., 1989). Figure 12 Carte topographique de l’Algérie d’après Oussedik et al., 2003. 60 Figure 13 Les grandes subdivisions phytogéographiques du Sahara d’après 60 Quezel et Simmoneau, 1963. Figure 14 Schéma représentant le dispositif de mise en place des plantules dans 66 les tubes Figure 15 Schématisation des différents cycles du programme de la PCR utilisé. 71 Figure 16 Position des amorces internes du gène ADNr 16S . 72 Figure 17 Répartition des Acacias autochtones et introduits en Algérie. 74 Figure 18 Aspect macroscopique de la souche SE2 après 48h d’incubation à 84 28°C. Figure 19 Aspect macroscopique de la souche SE2 au grossissement X1000. 84 Figure 20 Effet PGPR (Plant Growth Promoting) de la souche SAB3. 88 Figure 21 Arbre phylogénétique des souches de rhizobia renodulantes associées 96 aux Acacias d’Algérie, basé sur le séquençage partiel du gène ARNr 16S obtenu par la méthode du Neighbor-Joining, en utilisant la distance de Kimura. Les valeurs indiquées sont des valeurs de bootstrap issues de 1000 répétitions.

Figure 22 Projection factorielle plane (AFC) entre les taxa bactériens, définis 98 selon la phylogénie basée sur le séquençage partiel du 16Sr-ARN et les 04 espèces d’ Acacia . Figure 23 Analyse en composantes principales (ACP) représentant la relation 103 entre la tolérance in vitro des isolats rhizobiens au NaCl (NaCl tolerance) et aux hautes températures (Tpre tolerance) et les caractéristiques édaphoclimatiques des sites d’échantillonnage correspondants, i.e conductivité du sol (soil CW) et la moyenne maximale annuelle de température (Site Tpre). Figure 24 Aspect des boîtes inoculées par étalement de souches résistantes aux 106 conditions de pH et de température extrêmes. Figure 25 Aspect d’un plant inoculé avec la souche ASB5 après 48 jours 110 d’incubation. (1) : aspect général du plant inoculé comparativement au plant non inoculé ; (2) : aspect des nodules au grossissement X20. Figure 26 Résultats du test d’efficience des souches de rhizobium vis à vis de 6 111-113 espèces d’ Acacia . Figure 27 Phénodendrogramme illustrant les similarités phénotypiques entre 16 119 souches de rhizobia isolées de différentes espèces d’ Acacia de régions arides et semi-arides d’Algérie. Figure 28 Aspect général des plants cultivés en pots sur sol enrichi en 15 N et 132 disposition des différents traitements après neuf mois d’expérimentation en serre. Figure 29 Aspect des plants témoins non-fixateurs (Eucalyptus camaldulensis ) 132 cultivés sur sols des quatre sites étudiés, après neuf mois de croissance en serre et enrichissement du sol en 15 N. Figure 30 Aspect des plants d’ A. karroo non inoculés cultivés sur sols de la 136 Ferme de Messerghine (S1) et de la forêt de M’sila (S2), après neuf mois de croissance en serre et enrichissement du sol en 15 N. Figure 31 Aspect de différents plants d’ A. seyal et de l’espèce témoin non- 138 fixatrice E. camaldulensis cultivés sur sol de la Sebkha d’Oran enrichi en 15N après neuf mois de croissance en serre et enrichissement en 15 N. Figure 32 Aspect de différents plants d’ A. saligna et de l’espèce témoin non- 138 fixatrice E. camaldulensis cultivés sur sol de dunes d’El Mactaa enrichi en 15 N après neuf mois de croissance en serre. Figure 33 Aspect de différents plants d’ A. karroo et de l’espèce témoin non- 139 fixatrice E. camaldulensis cultivés sur sol de la Ferme de Messerghine enrichi en 15 N après 9 mois de croissance en serre. Figure 34 Aspect de différents plants d’ A. karroo et de l’espèce témoin non- 139 fixatrice E. camaldulensis sur sol de la forêt de M’sila enrichi en 15 N après neuf mois de croissance en serre. Figure 35 Aspect de certaines plantes non fixatrices des régions étudiées : (1) 148 Quercus suber, (2) Ballota hirsuta Bentham, (3) Centaurea calcitrapa, (4) Olea europaea

Abréviations :

- Act : Acid tolerance. - ADN : Acide DésoxyriboNucléique. - AFN : Arbre Fixateur d’Azote. - ARA : Activité Réductrice d'Acétylène. - ARDRA: Amplified Ribosomal Restriction Analysis. - ASPs: Acid Shock Proteins. - BNL : Bactéries Nodulant les Légumineuses. - BZF : Boukhatem Zineb Faiza. - CIRAD : Centre de coopération International en Recherche Agronomique pour le Développement. - CW: Conductivity of Water. - DO: Densité Optique. - dS : deci siemens.

- Ei : excès isotopique dans la plante fixatrice.

- Eo: excès isotopique dans la plante de référence. - EPS: Exopolysaccharides. - FAO: Food and Agriculture Organization. - FCA : Factorial Correspondence Analysis (analyse multifactorielle en composantes principales). - G/C: Guanine/Cytosine. - GST: Glutathion S transferase. - HSPs: Heat Shock Proteins. - IAA : Indole-3-Acetic Acid. - IGS : Espace intergénique entre les gènes d’ADNr 16S et 23S. - INRF : Institut National de la Recherche en Foresterie. - IRD : Institut de Recherche pour le Développement. - IS: Insertion Sequences. - ITS: Internal Transcribed Spacer. - Kcal: Kilo Calorie. - LCOs : Lipochito-oligosaccharides. - LPS : Lipopolysaccharides. - LSTM : Laboratoire des Symbioses Méditerranéennes et Tropicales.

- N: Azote. - NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards.

- Ndfa : Azote dérivé de l’atmosphère (quantité de N 2 fixé).

- Ndff i : N dérivé de l’engrais marqué dans la plante fixatrice de N 2.

- Ndff o : N dérivé de l’engrais marqué dans la plante non fixatrice de N 2 (de référence). - Ndfs : Azote dérivé du sol.

- Ndfs i : N dérivé du sol dans la plante fixatrice de N 2.

- Ndfs o : teneur en azote total de la plante de référence (témoin non fixateur). - NOPs : Nodulation Outer Proteins. - NPP : Nombre le Plus Probable. - Nt : Quantité de N total dans la plante fixatrice. - Pai : Ilots de symbiose correspondant aux Îlots de pathogénicité chez les bactéries pathogènes. - PAR : Photosynthetically Active Radiation. - PCA : Principal Component Analysis (analyse en composante principale). - PCR: Polymerase Chain Reaction ou en français : Réaction de Polymérisation en Chaîne. - PCR-RFLP : Polymorphisme de Fragments de Restriction. - PGPR: Plant Growth Promoting Rhizobacteria. - pSym: plasmide symbiotique. - rRNA :Acide ribonucléique ribosomique. - Sens.str: sensu strictu . - UFC : Unité Formant les Colonies. - YEMA: Yeast Extraxt Manitol Agar.

Introduction

Introduction et problématique

Les zones arides et semi arides couvrent approximativement quatre dixièmes des régions terrestres du monde (Olivares et al, 1988) et selon la FAO (1993), 66% de ces zones écologiques se situent sur le continent Africain. De même qu’en Algérie, l’étage bioclimatique saharien couvre 89.5% de la superficie globale tandis que pour les régions arides et semi arides, il est de 4.78% et 4.12% respectivement (Nedjraoui, 2001). La réduction de la végétation et spécialement le remplacement des arbres périnéaux par des plantes annuelles causent une diminution de la biomasse de la litière, des matières organiques et de la fertilité des sols, et subséquemment mènent à l’érosion (Kirmse et Norton, 1984). Ces facteurs conjugués aggravent le phénomène de désertification ; d’où la nécessité d’un programme de revégétalisation réfléchi incluant des arbres robustes, adaptés à la sécheresse (Nedjraoui, 2001) et fixateurs d’azote (Zahran, 1999). Les légumineuses ligneuses font parties des espèces pouvant établir des symbioses bénéfiques en plus de leur capacité à croître sur des sites arides qui sont inadéquats pour de nombreuses cultures (Mohamed et al., 2000). L’ Acacia en fait partie, c’est un bon candidat pour lutter contre la déforestation des régions marginales souffrant de sécheresse et caractérisées par un niveau de fertilité bas et/ou un haut degré de salinité car la plupart de ces espèces tolèrent la sécheresse et la salinité (Piha, 1995). La plupart des Acacias sont capables de former des nodules sur leurs racines en symbiose avec des bactéries appelées rhizobia. Dans ces nodules, ces bactéries fixent l’azote atmosphérique et le transforment en une forme disponible pour la plante hôte. Grâce à cette symbiose, ils sont capables de régénérer, stabiliser, fertiliser et lutter contre l’érosion du sol (Lal et Khana, 1993; Zerhari et al., 2000). Sans compter, qu’en plus de son haut potentiel fixateur d’azote, l’Acacia a des usages et intérêts multiples, à titre d’exemple, il peut être utilisé comme source de fourrage, de fuel et de tannins et il est même utilisé à des fins médicinales (Räsänen, 2000 ; Midgley et al., 2001). Dans les régions arides où l’humidité du sol et la faible fertilité souvent limitent les récoltes ; la recherche des légumineuses ligneuses symbiotiques natives qui sont quelques fois négligées constitue une base saine pour augmenter le rendement global dans ces régions (Zahran, 1999). En effet, l’introduction d’arbres fixateurs d’azote atmosphérique est largement acceptée comme étant l’une des méthodes les plus efficaces pour améliorer la productivité des agrosystèmes à travers l’amélioration de la balance azotée du sol Introduction et problématique

(Galiana, 2004). C’est dans ce contexte que s’intègre notre travail. La diversité et la topographie des Acacias ainsi que leurs symbiotes restent pauvrement documentée en Algérie, sauf deux études menées sur des plants en pépinières sur A.saligna (Amrani et al., 2010) et A.tortilis (Noureddine et al., 2010). C’est pour cela qu’un recensement des espèces d’ Acacia , spécialement dans les régions aride et semi arides dominantes sur le territoire algérien s’impose, ainsi que la révélation de la diversité phénotypique, symbiotique et taxonomique des rhizobia qui leurs sont associés in natura . L’étude de ces Acacias et la diversité des rhizobia qui leurs sont associés encouragera l’exploitation des espèces autochtones ou introduites qui ont prouvé leur robustesse, en symbiose avec des souches performantes et tolérantes à diverses conditions pédo-édaphiques extrêmes dans des projets de reforestation ciblés et spécifiques à chaque région, ce qui contribuera à freiner le phénomène de désertification. De plus, la révélation de la population rhizobienne spécifique à ces arbres participe à la valorisation de la biodiversité autant botanique que microbienne de différentes régions d’Algérie. Sans compter que l’investigation du potentiel fixateur contribuera à choisir l’essence forestière qui améliorera le plus la balance azotée des sols à revégétaliser.

Cette thèse s’articule autour de deux volets, le premier est une analyse bibliographique qui résume l’état de connaissance général des deux partenaires de la symbiose végétale, à savoir les rhizobia d’un côté, avec la diversité qui leur est connue et plus spécialement ceux associés aux Acacias, et d’un autre côté la plante hôte avec ses spécificités et la description botanique des espèces étudiées ainsi que leurs intérêts. On s’intéressera aussi dans cette recherche bibliographique à l’évaluation de la fixation d’azote chez les ligneuses. Le chapitre qui suit est l’étude expérimentale proprement dite. La première partie de ce travail s’intéresse à la diversité des rhizobia associés aux Acacias par des méthodes phénotypiques (physiologiques et biochimiques) qui sont complétées par des approches moléculaires (séquençage partiel du16S r-ARN). Le profil de résistance à la salinité, aux hautes températures et différentes gammes de pH des souches isolées est établi, tout en recherchant parmi ces dernières celles qui sont tolérantes et initiatrices de symbioses efficientes. Ceci permettra l’élection de couples Rhizobium-Acacia complémentaires ayant une grande tolérance face aux conditions extrêmes. La deuxième partie de cette étude expérimentale s’intéresse au potentiel de fixation d’azote de trois espèces d’ Acacia largement répandues au nord ouest algérien en pépinière sur différents sols par la méthode de dilution isotopique du 15 N et sur champs par la méthode de l’estimation de l’abondance naturelle δ15 N, afin de définir l’espèce qui offre le potentiel le plus élevé en terme de fixation d’azote. Cette thèse est clôturée par une conclusion générale et des perspectives qui restent à réaliser dans un avenir proche.

Chapitre I :

Recherche Bibliographique

Recherche bibliographique. I: « Les rhizobia »

I : « Les rhizobia »

I-1- Définition des rhizobia

Les rhizobia font partie des procaryotes appartenant aux α-Proteobacteria qui peuvent convertir l’azote gazeux stable atmosphérique (N 2) en une forme biologique utile (Beijerinck, 1888). Cette conversion ne peut se faire que dans des organes spécialisés racinaires ou caulinaires de légumineuses appelés nodosités. Ce qui résulte en une interaction symbiotique exceptionnelle entre une bactérie du sol qui procure à la plante de l’ammoniac assimilable et qui en contrepartie trouve un micro-habitat favorable et des substrats carbonés issus de la photosynthèse (Dommergues et al., 1999 ). Cette association symbiotique plantes-microorganismes est la plus importante sur le plan agronomique et environnemental en terme de quantité d’azote fixé biologiquement (Bekki et al., 1987 ; Zakhia et de Lajudie, 2001). Les rhizobia constituent entre 0.1-8% de la flore bactérienne totale du sol (Sadowsky et Graham, 1998). Ces bactéries vivent à l’état libre dans le sol et se présentent sous forme de bâtonnets, Gram-négatif, aérobies et asporulées (Jordan, 1984 ; Bekki, 1986) et se différencient en bactéroïdes à l’intérieur du nodule pour fixer l’azote (Figures 1 et 2).

5 µm 2 µm

Figure 1 : Aspect du Rhizobium dans le sol Figure 2 : Aspect des bactéroides dans le (TEM : Transmission Electron Micrograph) nodule (microscope electronique à transmission)

Cependant le terme rhizobia pourrait prêter à confusion avec le nom du genre Rhizobium et en considérant la découverte d’une diversité grandissante des symbiotes

Recherche bibliographique. I: « Les rhizobia »

associés aux légumineuses, il est préférable de les désigner sous le nom de Bactéries Nodulant les Légumineuses (BNL) (Zakhia et de Lajudie, 2006).

I-2- La symbiose légumineuse-rhizobium : définition et évolution

La symbiose est la forme la plus ancienne des interactions plantes-microorganismes, cette dernière a pris plus de temps comparativement au processus pathogène car elle agit sur les deux partenaires : la plante hôte et la bactérie. Cette évolution influe donc de façon concomitante sur la plante qui fabrique de nouveaux tissus pour abriter les microorganismes et acquière de nouvelles capacités métaboliques (fixation d’azote) et sur la bactérie où des récepteurs spécifiques évoluent permettant une reconnaissance et un attachement spécifique à la plante (Steinert et al., 2000). Elle inclut plusieurs genres bactériens très éloignés, présente des caractéristiques phénotypiques diverses d’un couple symbiotique à un autre et est soutenue par diverses stratégies génétiques (Boivin et al., 2009). Il semble que l’acquisition du modèle de vie symbiotique soit apparu de façon répétée et indépendante par le transfert horizontal de gènes de fonction clés (en particulier les loci nod et nif ) convertissant des bactéries du sol prédisposées en symbiontes avec des stratégies de fixation d’azote (Martinez-Romero, 2009). Ce point de vue est confirmé par quelques évidences: (i) des rhizobia et des non-rhizobia coéxixtent dans l’arbre phylogénétique du 16S avec des génomes rhizobiens et non- rhizobiens très similaires (Amadou et al., 2008) ; (ii) les gènes essentiels nod et nif sont localisés sur des plasmides symbiotiques ou des ilots qui sont transférables et présentent des caractéristiques d’acquisition récente de matériel génétique (Sullivan et al., 2002 ; Brom et al., 2004) ; (iii) le transfert des îlots ou plasmides symbiotiques confère une capacité symbiotique de la bactérie receveuse sous conditions de laboratoire ou au champ (Finan, 2002 ; Martinez et al., 1987); (iv) les gènes nodC sont monophylétiques (Chen et al ., 2003) et (v) le moment de l’apparition des légumineuses (il y a 60 millions d’années) (Sprent et James, 2007) est celui où la nodulation a probablement déjà émergée et où les différentes lignées rhizobiennes avaient déjà divergé (Turner et Young, 2000). Tout ceci suggère que les ancêtres de rhizobia possédaient un potentiel d’infection latent et que les fonctions locales ont été recrutées pour une expression totale de la symbiose (Boivin et al., 2009). Cependant le mécanisme d’activation de ce potentiel d’infection demeure encore inconnu. L’amélioration ultérieure de la symbiose chez les rhizobia émergeants, aussi bien que l’adaptation à de nouveaux hôtes durant l’évolution s’est produite par des variations

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allèliques, de paralogie, de recrutement et de néo-fonctionnalisation de nouveaux gènes mais aussi par leur remplacement (Boivin et al., 2009). Sur le plan moléculaire, l’évolution de la symbiose s’est accompagnée d’une amplification de séries de gènes particuliers et/ou de réduction de génome. La réduction de la taille du génome ainsi que l’accumulation du IS (Insertion Sequences) caractérisent souvent les bactéries qui ont passé récemment un goulot d’évolution et se sont adapté à un environnement stable (Stinear et al ., 2007). Les ilots de symbiose constituent environ 10% du génome entier, ce qui est énorme comparativement aux Pai (Ilots de symbiose correspondant aux Îlots de pathogénicité chez les bactéries pathogènes) connus à ce jour (Steinert et al., 2000).

I-3- Formation des nodules

La symbiose chez les rhizobia se traduit par l’induction de la formation de nodosités sur les racines ou les tiges des légumineuses. La nodulation commence quand les racines initient un dialogue moléculaire avec des rhizobia compatibles du sol (Figure 3). La plupart des rhizobia répliquent en secrétant des facteurs de nodulation lipochitooligosaccharidiques qui leur permettent d’entrer dans la légumineuse. L’échange moléculaire est continu, ce qui permet dans les interactions compatibles, aux rhizobia d’envahir les cellules racinaires corticales, de se différentier en bactéroides et de là à fixer l’azote (Deakin et Broughton, 2009). Du point de vue physiologique et selon Dénarié et Cullimore, (1993) ; Dénarié et al., (1996) ; Parniske et Downie, (2003) ; plusieurs composés dérivés des plantes et des bactéries jouent un rôle crucial dans l’établissement de l’association symbiotique (Figure 3). Les flavonoïdes libérés par les légumineuses et les lipochitooligosaccharides (LCOs) ou facteurs de nodulation (facteurs Nod) secrétés par les rhizobia sont les deux principaux signaux moléculaires impliqués dans l’établissement de la symbiose. Il existe cependant d’autres composants tels que les exopolysaccharides (EPS), lipopolysaccharides (LPS) attachés à la membrane bactérienne, les β-glucanes cycliques et les protéines externes de nodulation (Nodulation Outer Proteins : NOPs) qui jouent un rôle intégral dans la formation nodulaire. Cette pléthore de facteurs Nods, LPS, EPS et NOPs associée avec une nodulation effective sur différentes plantes légumineuses indique qu’il y a une combinaison spécifique de ces signaux chimiques qui permet l’union finale de la bactérie avec la plante.

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Figure 3 : Le dialogue moléculaire de la symbiose légumineuse-rhizobium d’après Rosenberg, (1997).

Concrètement, la contribution de la plante au dialogue commence par une sécrétion de flavonoïdes dans la rhizosphère (Redmond et al., 1986), ces métabolites secondaires agissent conjointement avec le produit rhizobien exprimé constitutionnellement : le nodD qui est un activateur transcriptionel de multiples gènes de nodulation avec les abréviations suivantes : nod , nol , et noe. Du moment que le NodD se combine aux signaux flavonoïdes à partir de légumineuses spécifiques et potentielles seulement, ils servent aussi à la détermination du spectre d’hôte. De point de vu génétique (Amadou et al., 2008), il existe 12 gènes symbiotiques impliqués dans la nodulation ( nodA, nodC and nodD ) et dans la fixation d’azote ( nifDKE, nifN, nifB, fixA, fixC, fixX et fdxB). En plus du nodA, 03 gènes sont spécifiques aux rhizobia : SMb21483 , SMc03842 et SMa1329. Parmi d’autres gènes significativement surexprimés chez les rhizobia sont rencontrés 3 gènes adenylate cyclase : cyaH , cyaG1 et cyaG2 qui possèdent un domaine d’organisation similaire, l’expression du premier gène cyaH est augmentée dans les nodules comparativement à l’état libre (Capela et al., 2006). On reporte d’autres gènes d’intérêt tels que les nthA et nthB qui codent pour des enzymes contribuant à la synthèse de phytohormones indole-3-acétique-acide (IAA) chez quelques souches de Rhizobium et Agrobacterium (Kobayashi et al., 1995). De plus il y a le nrtA et le SMa0585 qui sont des transporteurs de nitrates, ces derniers ont un effet inhibiteur sur la nodulation et la fixation d’azote chez tous les rhizobia. Deux gènes sont très présents chez les rhizobia, ils codent pour des glutathion S-transferase (GST) (Amadou et al., 2008). Il

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faut savoir que la protection contre les dommages causés par l’oxydation est connue pour être cruciale à différentes étapes des interactions symbiotiques, citons l’exemple de Sinorhizobium meliloti qui possède une panoplie de 15 GSTs qui détoxifient les composés générés durant l’interaction symbiotique (Capela et al., 2001). Une des questions les plus fondamentales posée dans le domaine de l’évolution est s’il existe un corps commun de génome pour les rhizobia ? La réponse est non ; ceci peut être expliqué par le fait qu’il n’existe pas un gène qui soit en même temps commun et spécifique à tous les rhizobia (Amadou et al., 2008). A ce jour tous les BNL, excepté les Bradyrhizobium photosynthétiques possèdent deux gènes nod, NodA et nodH qui leur sont spécifiques (Giraud et al., 2007). Les gènes nif ainsi que les gènes ccoNOP, ccoGIS et fixABC sont communs à tout les rhizobia mais sont aussi présents chez certaines bactéries non rhizobiennes ; de ce fait la symbiose des rhizobia avec les légumineuses n’a pas de stratégie génétique commune (Amadou et al., 2008) . Ceci suggère que les stratégies rhizobiennes ont émergé largement de façon indépendante pour chacun d’entre eux, même si le transfert latéral a contribué à leur évolution, ce dernier étant prédominent chez des microorganismes possédant la même taille de génome, avec une même composition en G/C, utilisation du carbone et tolérance à l’oxygène (Jain et al., 2003).

I-4- Taxonomie des BNL

1-4-1- Outils de la taxonomie bactérienne

Les études taxonomiques traitent des relations naturelles existant entre les organismes permettant leur classification. Selon Grimont (1998), la taxonomie comprend : − La caractérisation des organismes ; − La classification sur la base de la similitude ; − La nomenclature pour donner un nom aux groupes ; − L’identification d’organismes inconnus pour déterminer s’ils appartiennent ou non à l’unité classée et ou nommée. Le concept central de la taxonomie bactérienne est l’espèce. Le fait est que les bactéries possèdent des caractéristiques morphologiques et physiologiques limitées contrairement aux animaux et aux plantes, ce qui est insuffisant pour leur description taxonomique. Il est maintenant reconnu que la classification bactérienne doit refléter aussi étroitement que possible les relations phylogénétiques entre les bactéries par les

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informations qui sont codées par les séquences du 16S ou du 23S rRNA (Woese, 1987). En premier lieux, Colwell (1970) a établi les bases de la taxonomie bactérienne en recommandant l’intégration de toutes les pièces d’informations obtenues à différents niveaux de la cellule ; ADN, ARN, caractères exprimés et phénotypiques (protéines et leurs fonctions, acides gras, marqueurs chimiotaxonomiques) évalués par diverses techniques, contribuant à une taxonomie polyphasique qui probablement assurera une classification plus stable. Par la suite, Wayne et al., (1987) ont proposé une définition phylogénétique de l’espèce bactérienne basée sur diverses méthodologies incluant l’étude du 16S ARN ribosomal et l’hybridation ADN/ADN, mais recommandent de prendre en compte des caractéristiques phénotypiques pour nommer les nouvelles espèces. Cependant, Vandamme et al., (1996) ont reformulé le concept phylogénétique de l’espèce bactérienne, ils l’ont défini come étant un assemblage d’isolats qui ont pour origine une population ancestrale commune dans laquelle une génération stable de diversité génétique résultent en des clones avec différents degrés de recombinaison et caractérisés par : (i) un certain degré de cohérence phénotypique, (ii) par un degré significatif d’hybridation ADN/ADN (70%) et (iii) par plus de 97% de 16S rADN d’homologie de séquences. Durant ces vingt dernières années, plusieurs techniques de caractérisation bactérienne ont été développées à chaque niveau d’information, par ailleurs, il a été crée plus d’équipements informatiques pour les analyses numériques des données. Chaque technique utilisée en taxonomie a son propre pouvoir discriminant et son champ d’application (Figure 4). Le niveau de discrimination d’une technique peut varier selon le taxon bactérien étudié. Dans une approche polyphasique, plusieurs techniques complémentaires avec différents niveaux de discrimination sont choisies pour classer les souches. La conclusion devra être établie à partir d’un consensus avec un minimum de contradictions (Zakhia et de Lajudie, 2001).

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Figure 4 : Pouvoir discriminant des différentes techniques de la taxonomie polyphasique (d’après Vandamme et al., 1996, modifié par Zakhia et de Lajudie, 2006).

On peut conclure qu’actuellement, les méthodes dominantes dans la taxonomie moderne sont les méthodes génotypiques qui ciblent directement les molécules d’ADN et d’ARNr. Les avantages qui ont encouragé leur utilisation sont la stabilité et la fiabilité des systèmes de classification (Zakhia et de Lajudie, 2006). Parmi ces méthodes nous pouvons citer :

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Le séquençage de l’ADNr 16S : Les ARN ribosomiques (5S, 16S et 23S) constituent un outil de choix pour étudier les relations phylogénétiques grâce à leur présence chez toutes les bactéries, leur fonction constante et la présence de zones très conservées ainsi que des parties à séquences variables (Woese, 1987; Schleifer et Ludwig, 1989; Stackebrandt et Goebel, 1994). Ces ARNr sont considérés comme des molécules qualifiées « d’horloges moléculaires universelles », en particulier l’ARNr 16S, qui s’est vite imposé comme étant un bon chronomètre moléculaire (Woese, 1987). Les taxonomistes bactériens sont aujourd’hui unanimes pour considérer que le séquençage de l’ADNr 16S reste le critère taxonomique le plus précieux de la classification bactérienne, et qu’au niveau de l’espèce, il reste salutaire pour décider ou non de l’opportunité de faire des hybridations ADN:ADN. Après l’analyse des séquences disponibles dans les banques de données, il est actuellement bien établi que deux microorganismes qui présentent moins de 97 % d’homologie de séquences d’ADNr 16S n’associent pas leur ADN à plus de 60 % et dans ce cas, selon la définition de l’espèce (Stackebrandt et Goebel, 1994), il n’est pas nécessaire de recourir à l’hybridation ADN:ADN. Les deux microorganismes en question appartiennent donc à deux espèces différentes. A ce jour la classification des BNL est basée majoritairement sur les séquences de l’ADNr 16S (Willems, 2006).

Les méthodes de typage basées sur la PCR utilisées pour la classification des BNL: Les méthodes de typage génétique utilisent généralement des techniques qui permettent de classer les microorganismes étudiés en un nombre distinct de types génotypiques. La PCR a permis le développement de nombreuses techniques de typage génétique qui ont l’intérêt d’être universelles, simples et rapides. Elles ont beaucoup servi pour la description de nouveaux taxons de BNL. Parmi elles : - PCR-RFLP ou Polymorphisme de Fragments de Restriction : La PCR combinant l’utilisation d’enzymes de restriction est une des méthodes de typage. L’ADNr 16S ou 23S avec ou sans l’IGS (espace intergénique entre les gènes d’ADNr 16S et 23S), ou bien d’autres gènes impliqués dans la symbiose ou la fixation d’azote, sont amplifiés avec des amorces universelles définies en alignant les séquences disponibles. Le produit de la PCR est ensuite digéré par des enzymes de restriction. Cette technique fournit principalement des profils spécifiques (Gürtler et al., 1991; Jayaro et al., 1991;

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Vaneechoutte et al., 1992; Ralph et al. , 1993; Laguerre et al. , 1994). Quand la région de l’ADN amplifié correspond à l'opéron ribosomique, la technique est aussi appelée ARDRA (Amplified Ribosomal Restriction Analysis). Dans l’étude des collections de BNL isolées de nodules, la PCR-RFLP du gène codant pour l’ARNr 16S (ADNr 16S) est employée pour grouper un grand nombre de souches. D’autres gènes peuvent être ciblés tels que les gènes de nodulation nodC ou de fixation d’azote nifH (Laguerre et al., 2001). Cette technique, très utilisée dans le passé, reste très performante, rapide, informative et relativement accessible à de nombreux laboratoires (Zakhia et de Lajudie, 2006).

1-4-2 Position taxonomique actuelle des BNL

Les BNL présentent des groupes très diversifiés et leur classification subit continuellement de grands remaniements grâce aux données phylogénétiques et polyphasiques qui ont permis la description de nouveaux taxa (Young et Haukka, 1996). C’est un domaine en pleine expansion car de plus en plus de rhizobia sont isolés chaque jour, spécialement des régions tropicales et méditerranéennes qui restent à ce jour faiblement documentés. Jusqu’aux années 80, toutes les bactéries symbiotiques fixatrices d’azote isolées des légumineuses étaient classées en un seul genre Rhizobium incluant six espèces : R. leguminosarum, R. meliloti, R. trifolii, R. phaseoli, R. lupini et R. japonicum . Cette taxonomie se basait sur le concept d’inoculation croisée qui stipulait qu’une bactérie d’une espèce donnée nodulait toutes les plantes d’un même groupe (Fred et al., 1932). Mais ce concept n’a pas perduré car c’est un marqueur taxonomique peu fiable (Graham, 1964; Wilson, 1944). Par la suite, les espèces de Rhizobium ont été classées en deux genres, le genre redéfini Rhizobium qui incluait les souches à croissance rapide et le nouveau genre Bradyrhizobium qui incluait les souches à croissance lente (Jordan, 1982). De nos jours, c’est la taxonomie polyphasique qui est de mise (Vandamme et al., 1996) avec des données génétiques, phénotypiques, chimiotaxonomiques et phylogénétiques combinées . A ce jour (dernière actualisation en 2011 de Weir), la combinaison de toutes ces données a permis de définir 93 espèces de BNL répartis en 13 genres (Tableau 1). Toutes ces espèces sont incluses dans le phylum des Proteobacteria et la plupart font partie de la classe des α- Proteobacteria.

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Tableau 1 : Classification des Bactéries Nodulant les Légumineuses (Weir, 2011).

Genre et espèce Références a Rhizobium Frank, 1889 Rhizobium alamii Berge et al ., 2009 Rhizobium alkalisoli Lu et al., 2010 Rhizobium cellulosilyticum García-Fraile et al ., 2007 Rhizobium daejeonense Quan et al ., 2005 Rhizobium etli Segovia et al ., 1993 Rhizobium galegae Lindström, 1989 Rhizobium gallicum Amarger et al ., 1997 Rhizobium giardinii Amarger et al ., 1997 Rhizobium hainanense Chen et al ., 1997 Rhizobium huautlense Wang et al ., 1998 Rhizobium indigoferae Wei et al ., 2002 Rhizobium leguminosarum (Frank., 1879); Frank., 1889 Rhizobium loessense Ancien nom " Rhizobium huanglingense " Wei et al ., 2003 Rhizobium lusitanum Valverde et al. , 2006 Rhizobium mesosinicum Lin et al ., 2009 Rhizobium miluonense Gu et al ., 2008 Rhizobium mongolense van Berkum et al ., 1998 Rhizobium multihospitium Han et al ., 2008a Rhizobium oryzae Peng et al ., 2008 Rhizobium phaseoli Ramírez -Bahena et al ., 2008 Rhizobium pisi Ramírez -Bahena et al ., 2008 Rhizobium sullae Ancien nom " Rhizobium hedysari " Squartin et al ., 2002 Rhizobium tibeticum Hou et al ., 2009 Rhizobium tropici Martinez-Romero et al ., 1991 Rhizobium tubonense Zhang et al ., 2011 Rhizobium undicola "Allorhizobium undicola " de Lajudie, 1998a; Young et al .,2001 Rhizobium vigna Ren et al ., 2011 Rhizobium yanglingense Tan et al ., 2001 Mesorhizobium Jarvis et al ., 1997 Mesorhizobium albiziae Wang et al ., 2007 Mesorhizobium alhagi Chen et al ., 2009 Mesorhizobium amorphae Wang et al ., 1999 Mesorhizobium australicum Nandasena et al. , 2009 Mesorhizobium camelthorni Chen et al ., 2011 Mesorhizobium caraganae Wang et al ., 2007 Mesorhizobium chacoense Velàzquez et al ., 2001 Mesorhizobium ciceri "Rhizobium ciceri "(Nour et al ., 1994); Jarvis et al ., 1997 Mesorhizobium gobiense Han et al ., 2008b Mesorhizobium huakuii "Rhizobium huakuii " (Chen et al ., 1991); Jarvis et al .,1997 Mesorhizobium loti "Rhizobium loti " (Jarvis, 1982); Jarvis et al. , 1997 Mesorhizobium mediterraneum "Rhizobium mediterraneum "(Nour et al ., 1995); Jarvis et al ., 1997 Mesorhizobium metallidurans Vidal et al ., 2009 Mesorhizobium robiniae Zhou et al ., 2010 Mesorhizobium opportunistum Nandasena et al ., 2009 Mesorhizobium plurifarium de Lajudie et al ., 1998b Mesorhizobium septentrionale Gao et al ., 2004 Mesorhizobium tarimense Han et al ., 2008b Meorhizobium temperatum Gao et al ., 2004 Mesorhizobium tianshanense "Rhizobium tianshanense " Chen et al ., 1995; Jarvis et al ., 1997

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Tableau 1 (suite) : Classification des Bactéries Nodulant les Légumineuses (Weir, 2011).

Genre et espèce Références a Ensifer Ancien nom Sinorhizobium Willems et al ., 2003; Young, 2003 Ensifer abri Ogasawara et al ., 2003 Ensifer adhaerens "Sinorhizobium morelense " (Wang et al., 2002); Young, 2003 Ensifer americanum Toledo et al ., 2003 Ensifer arboris (Nick et al ., 1999b) ; Young, 2003 Ensifer fredii "Rhizobium fredii" (Scholla et al ., 1984); Young, 2003 Ensifer garamanticus Merabet et al ., 2010 Ensifer indiaense Ogasawara et al ., 2003 Ensifer kostiense (Nick et al ., 1999b); Young, 2003 Ensifer kummerowiae (Wei et al ., 2002); Young, 2003 Ensifer medicae (Rome et al ., 1996); Young, 2003 Ensifer meliloti "Rhizobium meliloti " (Dangeard, 1926); Young, 2003 Ensifer mexicanum Lioret et al ., 2007 Sinorhizobium morelense Cette espèce se distingue de Ensifer adhaerens mais pas encore nommé Ensifer . Voir Martens et al ., 2007 pour détails, "Sinorhizobium morelense " (Wang et al. , 2002) Ensifer numidicus Merabet et al ., 2010 Ensifer saheli Young, 2003 Ensifer soja Li et al., 2010 Ensifer terangae (de Lajudie et al ., 1994); Young, 2003 Ensifer xinjiangense (Chen et al ., 1988); Young, 2003 Bradyrhizobium Jordan, 1982 Bradyrhizobium canariense Vinuesa et al ., 2005 Bradyrhizobium elkanii Kuykendall et al ., 1992 Bradyrhizobium iriomotense Islam et al. , 2008 Bradyrhizobium japonicum "Rhizobium japonicum " (Kirchner, 1896); Jordan, 1982 Bradyrhizobium jicamae Ramírez-Bahena et al. , 2009 Bradyrhizobium liaoningense Xu et al ., 1995 Bradyrhizobium pachyrhizi Ramírez-Bahena et al ., 2009 Bradyrhizobium yuanmingense Yao et al ., 2002 Azorhizobium Dreyfus et al., 1988 Azorhizobium caulinodans Dreyfus et al ., 1988 Azorhizobium doebereinerae "Azorhizobium johannae " Moreira et al ., 2006 Methylobacterium Methylobacterium nodulans Jourand et al ., 2004 Burkholderia Burkholderia caribensis Vandamme et al. , 2002 Burkholderia cepacia Vandamme et al ., 2002 Burkholderia mimosarum Chen et al ., 2006 Burkholderia nodosa Chen et al ., 2007 Burkholderia phymatum Vandamme et al ., 2002 Burkholderia sabiae Chen et al ., 2008 Burkholderia tuberum Vandamme et al ., 2002 Cupriavidus Ancien nom " Wautersia " puis " Ralstonia " Cupriavidus taiwanensis (Chen et al ., 2001); Vandamme et Coenye, 2004 Devosia Devosia neptuniae Rivas et al ., 2003 Herbaspirillum Herbaspirillum lusitanum Valverde et al ., 2003

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Tableau 1 (suite) : Classification des Bactéries Nodulant les Légumineuses (Weir, 2011).

Genre et espèce Références a Ochrobactrum Ochrobactrum cytisi Zurdo-Piñeiro et al., 2007 Ochrobactrum lupini Trujillo et al ., 2005 Phyllobacterium Phyllobacterium trifolii Valverde et al ., 2003 Phyllobacterium ifriqiyense Mantelin et al. , 2006 * Phyllobacterium leguminum Mantelin et al ., 2006 * Shinella Shinella kummerowiae Lin et al. , 2008

* Bactéries isolées de nodules mais qui n’ont pas prouvé leur pouvoir de renoduler a Les parenthèses indiquent la publication originale, suivie de la référence de sa reclassification

1-4-3- Taxonomie de rhizobia associés aux Acacias

Les rhizobia associés aux Acacias sont présents à la surface du sol et en profondeur jusqu’à 34 mètres (Dupuy et Dreyfus, 1992). Ils peuvent croitre sur tous types de sol sur lesquels vivent les arbres, même dans des conditions extrêmes comme dans les sols arides (Barnet et Catt 1991 ; Schulze et al., 1991; Dupuy et Dreyfus, 1992) ou sur le sable des dunes (Barnet et al. , 1985; Hatimi, 1999) . Une large variété de rhizobia s’associe avec les Acacias pour initier la formation de nodosités. Les Acacias Africains sont principalement compatibles avec Sinorhizobium , Mesorhizobium et Rhizobium (Odee et al., 2002) et les Acacias australiens majoritairement avec les Bradyrhizobium (Lafay et Burdon, 2001) (Tableau 2).

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Tableau 2 : Classification des espèces de rhizobia nodulant les Acacias .

Genre et espèce Plante hôte Références

*Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp. A. longifolia ; A. albida ; Barnet et al., 1985; Dupuy et al ., 1994 ; A. nudica; A. cyclops ; Lafay et Burdon, 1998 ; Odee et al., A. obliquinervia ; A. salicina, 2002 ; Mohamed e t al., 2000 ; Hoque et A. stenophylla. al., 2011. B. elkanii A. mangium ; A. albida ; Galiana et al., 1990; Le Roux et al., A. auriculiformis ; A. salicina ; 2009; Dupuy et al ., 1994; Lafay et A. cincinnata; A. mearnsii, Burdon, 2001; Odee et al., 2002; Joubert A. longifolia. et al. , 2003 ; Rodríguez-Echeverría, 2010. B. japonicum A. albida; A. saligna ; Dupuy et al., 1994, Mc lnroy et al., A. obliquinervia, A. decurrens, 1999; Marsudi et al., 1999; Lafay et A. cangaiensis, A. dealbata, Burdon, 1998. A. deanei, A. decurrens, A. fulva, A. glaucocarpa, A. implexa, A. irrorata, A. mearnsii, A. melanoxylon, A. parramattensis, A. parvipinnula. B. liaoningense A. mangium; A. saligna, Clapp et al., 2001; Wolde-Meskel et al. , A. albida; A. salicina. 2005; Hoque et al., 2011. B. canariense A. longifolia; A. saligna. Rodríguez-Echeverría et al., 2007; 2011. *Rhizobium Rhizobium sp. A. auriculiformis ; A. senegal ; Nuswantara et al ., 1997; Nick et al., A. tortilis; A. dealbata ; 1999a; Joubert et al. , 2003 ; Wolde- A. salicina, A. stenophylla. Meskel et al. , 2005; Hoque et al., 2011;. R. tropici A. karroo; A. mearnsii, Mc lnroy et al., 1999; Lafay et Burdon, A. melanoxylon; 2001; Ngom et al ., 2004; Noureddine et A. auriculiformis; A. dealbata ; al., 2010 A. tortilis. R. tropici IIA A. tortilis. Ben Romdhane et al., 2006. R. tropici IIb A. tortilis. Ben Romdhane et al., 2006. R. leguminosarum A. senegal, A. salicina, Wolde-Meskel et al. , 2005 ; Hoque et al. , A. stenophylla; A. dealbata; 2011 ; Joubert et al. , 2003. A. mearnsii. Bv phaseoli A. saligna. Marsudi et al., 1999. Bv tropici A. saligna. Marsudi et al., 1999 ; Lafay et Burdon, 2001. R. undicola Acacia sp. de Lajudie et al., 1998a. R. etli A. albida; A. seyal. Mc lnroy et al., 1999; Wolde-Meskel et al., 2005. R. giardinii A. abyssinica. Wolde-Meskel et al., 2005. R. gallicum A. longifolia, A. melanoxylon, Amrani et al., 2009; Hoque et al., 2011. A. saligna ; A. salicina, A. stenophylla R. mongolense A. salicina, A. stenophylla Hoque et al., 2011 R. rhizogenes A. salicina Hoque et al., 2011. R. lusitanum A. dealbata Rodríguez-Echeverría, 2011.

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Tableau 2 (suite) : Classification des espèces de rhizobia nodulant les Acacias .

Genre et espèce Plante hôte Références *Mesorhizobium Mesorhizobium sp. A. polycantha, Haukka et al., 1998; Odee et al ., 2002; A. xanthophloea; A. tortilis; Joubert, 2003; Hoque et al., 2011. A. dealbata; A. salicina, A. stenophylla. M. huakuii A. arenaria; Acacia sp. Haukka et al., 1998, Mc lnroy et al., 1999 ; Jarvis et al ., 1997. M. loti A. senegal, A. tortilis subsp Mc lnroy et al., 1999; Kumar et al., heteracantha; A. catechu, 1999; Clapp et al., 2001. A. nilotica ; A. auriculiformis.

M. plurifarium A. seyal, A. senegal, A. tortilis, de Lajudie et al., 1998b; Diouf et A. laeta; A. senegal, al., 2007; Hoque et al., 2011. A. raddiana; A. salicina. M. amorphae A. saligna, A. dealbata. Rodríguez-Echeverría et al., 2011. *Ensifer Ensifer sp. A. auriculiformis ; A. cyanophylla, Nuswantara et al ., 1997; A. gummifera, A. horrida; Khbaya et al., 1998; Nick et al., 1999b; A. raddiana; A. seyal, Diouf et al., 2007. A. senegal. E. arboris A. senegal; A. salicina, Nick et al., 1999b; Hoque et al., 2011. A. stenophylla. E. kostiense A. senegal. Nick et al ., 1999b. E. saheli bv acaciae Acacia sp .; A. seyal, A. tortilis. Boivin et Giraud, 1999; Wolde-Meskel et al., 2005. E. terangae A. laeta; A. seyal. de Lajudie et al., 1994 ; Diouf et al., 2007. E. terangae bv A. horrida, A. mollisima; de Lajudie et al., 1994 ; Lortet et al., acaciae A. raddiana; A. senegal; 1996 ; Nick et al ., 1999b ; Ba et al ., A. tortilis. 2002. E. americanus sp nov Acacia sp. Toledo et al., 2003. E. fredii A. nilotica; A. seyal, A. tortilis; Mc lnroy et al., 1999; Wolde-Meskel et A. salicina, A. stenophylla. al., 2005; Hoque et al., 2011. E. medicae A. tortilis. Wolde-Meskel et al., 2005. E. meliloti A. mangium; A. longifolia, Clapp et al., 2001; Wolde-Meskel et al., A. melanoxylon; A. tortilis ssp. 2005; Ben Romdhane et al., 2006; raddiana; A. saligna; Amrani et al. , 2009; Hoque et al., 2011. A. salicina, A. stenophylla. A. tortilis. E. meliloti bv . acaiea Ba et al ., 2002. E. morelense A. salicina. Hoque et al., 2011. E. adhaerens A. salicina, A. stenophylla. Hoque et al., 2011.

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Tableau 2 (suite) : Classification des espèces de rhizobia nodulant les Acacias .

Genre et espèce Plante hôte Références *Agrobacterium A. tumefasciens A. karroo, A. tortilis, A. saligna; De Lajudie et al., 1999; Diouf et al., A. seyal; Acacia abyssinica; 2007; Wolde-Meskel et al., 2005; Ben A. tortilis. Romdhane et al., 2006.

A. vitis A. saligna. Wolde-Meskel et al. 2005.

A. albertimagni A. senegal, A. seyal. Wolde-Meskel et al., 2005.

*Burkholderia A. stenophylla; A. pycnantha. Hoque et al., 2011; Rodríguez- Echeverría, 2011. B. cepacia A. seyal. Diouf et al., 2007. * Allorhizobium A. undicola Acacia sp . de Lajudie et al., 1998a. *Phyllobacterium A. salicina. Hoque et al., 2011.

*Devosia A. salicina. Hoque et al., 2011.

*Tableau récapitulatif des souches renodulantes et dont la taxonomie est basée essentiellement sur le séquençage du 16S rADN .

Etant donné l’importance de ces légumineuses ligneuses dans les programmes de reforestation, plusieurs études sur la diversité des rhizobia associés aux Acacias ont été menées par beaucoup d’équipes de recherche dans plusieurs pays. En Afrique par exemple, des symbiotes isolés d’ Acacia tortilis subsp . raddiana du nord et du sud du Sahara appartiennent aux genres Mesorhizobium et Sinorhizobium (Ba et al., 2002). Dans une autre étude, 82 souches isolées d’A. senegal et d’ A. nilotica du Sénégal et de la Mauritanie (Sarr et al., 2005) se sont révélées proches de Mesorhizobium suite au séquençage de la région intergénique de l’ADNr 16S-23S. De plus Fall et al., (2008) ont rapporté qu’ Acacia senegal (L.) Willd était nodulé par les genres Mesorhizobium et Rhizobium , ces souches isolées du Sénégal ayant démontré leur capacité à s’adapter à différents stress environnementaux telles que la température, la sécheresse et la salinité. En Tunisie, Ben Romdhane et al., (2006) ont démontré que les populations rhizobiennes qui nodulaient spécifiquement et efficacement Acacia tortilis ssp. raddiana dans des sols représentatifs en Tunisie sont dominées par les genospecies (espèce caractérisées seulement au niveau du genre) proches de Ensifer .

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Au Maroc, les souches associées à A. horrida, A. gummifera, A. radianna et A. cyanophylla (A. saligna) sont subdivisées en trois groupes A, B et C ; A et B sont proches de Sinorhizobium (S. meliloti et S. fredii ) respectivement et le troisième groupe au phylum Agrobacterium-Rhizobium galegae (Khbaya et al., 1998). On note qu’ A. albida espèce native de l’Afrique est préférentiellement nodulée par le genre Bradyrhizobium (Galiana et al., 1990 ; Dupuy et Dreyfus,1992 ; Odee et al., 1997). Cette dernière a été renommée Faidherbia albida dans la famille des Acaciae (Polhill et Raven, 1981) mais demeure largement nommée A. albida . Ceci indique que les légumineuses ligneuses sont nodulées par des rhizobia à croissance lente même dans les régions tropicales arides où prédominent les souches à croissance rapide ou intermédiaire (Räsänen, 2000). Alors que la littérature rapporte que les Bradyrhizobium ont une distribution essentiellement tropicale (Young et Haukka, 1996), beaucoup d’études faites dans le bassin méditerranéen ont prouvé le contraire, comme en Espagne et aux Iles Canaries où les légumineuses arbustives natives Spartium junceum et Chamaecytisus proliferus respectivement étaient nodulées par des souches de Bradyrhizobium (Quatrini et al., 2001 ; Vinuesa et al., 1998). Différents résultats sur la localisation des Bradyrhizobia en méditerranée, en Afrique ainsi qu’en Amérique du nord (Parker, 1999) montrent une aire de distribution plus large de cette lignée bactérienne s’étendant bien au-delà des zones tropicales (Martinez-Romero et Caballero-Mellado, 1996). Ce qui demeure certain, c’est qu’ A. albida est nodulée in natura exclusivement par des Bradyrhizobia, ce qui ne l’empêche pas de répondre à des inoculations avec certains genres rhizobiens, tels que Sinorhizobium sp. du Mexique isolé de différentes légumineuses ligneuses, R. tropici provenant d’Indonésie ou du Costa Rica (Bala et Giller, 2001) ainsi qu’Ochrobactrum (Ngom et al., 2004). Quoique la phylogénie des rhizobia n’ait aucune relation avec celle des légumineuses (Doyle, 1998), il a été rapporté que le mode de transport de l’azote fixé chez A. albida (transport à amides) est le même que celui observé chez la plupart des Acacia australiens (Van Kessel et al., 1988) qui sont eux nodulés majoritairement par des Bradyrhizobia dans les zones tempérées d’Australie (Lafay et Burdon, 2001). En Algérie, les seules études menées sur les rhizobia associés aux Acacias, ont été menées sur A. saligna (Amrani et al., 2009) et A. tortilis (Noureddine et al., 2010). Pour la première espèce, les souches bactériennes isolées de sols forestiers en pépinières ont révélé que ces dernières étaient nodulées par des souches à croissance lente (échantillons prélevés de régions humides et subhumides), proches de Bradyrhizobium betae , bactérie connue

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pour provoquer des déformations tumorales sur les racines de la betterave sucrière et des souches à croissance rapide proches de Sinorhizobium meliloti et Rhizobium gallicum provenant de sols représentatifs des régions arides. En ce qui concerne A. tortilis subsp. Raddiana , la caractérisation symbiotique de 51 souches de rhizobia qui lui étaient associées a montré une prédominance du genre Ensifer et plus particulièrement de Ensifer meliloti et dans une moindre mesure des espèces des genres Mesorhizobium et Rhizobium. Ces souches ont montré leur capacité à renoduler d’autres espèces d’ Acacia propres aux régions désertiques, en particulier A. seyal Del. et A. ehrenbergiana Hayne. Pendant longtemps, il a été établi que l’Australie hébergeait des souches rhizobiennes à croissance lente de façon prépondérante (Barnet et Catt, 1991 ; Barnet et al., 1985 ; Prin et al., 1993). Cependant des études ultérieures ont établi que des génomospecies de Bradyrhizobium se trouvaient plutôt dans le Queensland (Liesack et Stackebrandt. 1992 ; Lafay et Burdon, 2001), tandis que des génomospecies de Rhizobium , Mesorhizobium , et Bradyrhizobium étaient plutôt représentés parmi les rhizobia associés symbiotiquement avec des légumineuses indigènes dans l’ouest de l’Australie qui est une région plus aride (Marsudi et al., 1999). Lafay et Burdon (1998) ont émis l’hypothèse que la prédominance des Bradyrhizobia était due à leur résistance à l’acidité sévissant dans les sols australiens. Par la suite, ces même chercheurs ont trouvé que pratiquement 96,6% des souches nodulant les Acacias étaient des Bradyrhizobium à croissance lente et le reste était affilié à R. tropici dans des régions possédant un climat qui variait de subtropical humide à tempéré (Lafay et Burdon, 2001). Barnet et Catt (1991) ainsi que Nada et al. (1999) ont conclu que les Acacias australiens étaient autant nodulés par les Bradyrhizobium à croissance lente que par les rhizobia à croissance rapide. Ils ont ainsi émis l’hypothèse que les Acacias provenant des régions chaudes étaient associés aux rhizobia à croissance rapide alors que ceux des régions tempérées étaient nodulés par des souches à croissance lente. Barnet et Cat (1991) ont supposé qu’en plus de l’effet du facteur d’aridité, la pauvreté du sol influait aussi sur la prédominance des rhizobia à croissance rapide. Ces résultats sont confortés par les travaux de Hoque et al., (2011) qui ont étudié la diversité des rhizobia associés à deux espèces prédominantes en Australie : A. salicina et A. stenophylla . Cette dernière étude a traité les sols de 58 sites différents de régions arides et semi-arides et 1285 souches ont été isolées. Le séquençage du 16S rARN des souches renodulantes a révélé une prédominance des souches à croissance rapide, dont la majorité faisait partie du genre

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Rhizobium , en plus des souches affiliées aux Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Ensifer et de Phyllobacterium, Devosia , Burkholderia et Achromobacter en plus faibles proportions. Au Brésil, de nombreux chercheurs (de Faria et al., 1984; 1987 ; Moreira et al., 1992; 1993) se sont intéressés aux microsymbiotes associés aux légumineuses de la forêt tropicale et y ont révélé une grande diversité, les Acacias étudiés étaient nodulés plutôt par les membres du groupe des bradyrhizobia. De nouveaux genres nodulent les espèces de Mimosa tropicales comme Burkholderia représenté par différentes espèces telles que B. mimosarum (Chen et al., 2006), B. nodosa (Chen et al., 2007) et B. sabiae (Chen et al., 2008). Les Mimosoideae sont aussi largement nodulées par Burkholderia au Panama (Craig et Parker, 2005), mais aussi par Cupriavidus , Burkholderia et Rhizobium sp. par ordre de prévalence au Costa Rica (Craig et Parker, 2006). Des souches indigènes de Sinorhizobium et Mesorhizobium ont été isolées à partir d’ Acacia sp. mexicains, ce qui a conduit par la suite à la caractérisation d’une nouvelle souche de Sinorhizobium americanus qui a été isolée d’ Acacia acatlensis (Toledo et al., 2003). Une équipe néozélando-japonaise, Ngom et al., (2004) a étudié la diversité des bactéries nodulant A. mangium aux Philippines et en Thaïlande ; en plus de Rhizobium et de Bradyrhizobium , ces chercheurs ont mis en évidence une souche qui nodulait et fixait l’azote en association avec A. mangium et A. albida qui est proche de Ochrobacter. Les néo-nodules formés ont toutes les caractéristiques d’un nodule classique. En Chine, l'analyse taxonomique de 63 isolats correspondant à 21 espèces de légumineuses d'une région tropicale, dont certaines espèces d' Acacia , montre également une grande diversité avec 3 groupes de Bradyrhizobium et 3 groupes de souches à croissance rapide (Gao et al., 1994) tandis qu’en Indonésie, les rhizobia associés avec A. mangium sont à 46% groupés avec B. elkanii , 50% avec B. liaoningensi et 4% avec S. meliloti (Clapp et al., 2001). Une autre étude comparative des rhizobia associés à A. mangium et A. auriculiformis dans des pays répartis sur les quatre continents : la Malaisie, la Guyane française, la Côte d’Ivoire et Hawaï, a révélé qu’ils appartenaient à un seul clade de B. elkanii (Le Roux et al., 2009). On peut conclure qu’une diversité importante d’espèces de Rhizobium existe dans les différents sites occupés par différentes espèces d’Acacia et même au niveau de chaque arbre chez une même espèce. Les diverses conditions existant entre microsites constituent

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une source significative de variation parmi les souches collectées à partir de différents lieux de prospection (Diouf et al., 2007). Grâce à leur large spectre d’hôte, les rhizobia assurent leur survie dans les conditions adverses qui prévalent dans les régions arides et semi-arides, en formant des nodules même inefficients sur les légumineuses ligneuses, ce qui leur permet de survivre à l’intérieur d’une niche protectrice (Räsänen et al., 2001).

1-5- Spectre d’hôte des rhizobia associés aux Acacias

Selon l’analyse de Perret et al., (2000), la promiscuité (la non spécificité de nodulation) est largement distribuée dans la nature. Elle n’est pas associée avec un groupe taxonomique bactérien ou végétal particulier et n’est pas corrélée avec l’habitat de l’hôte. Cependant, l’origine géographique paraît tout de même avoir un effet sur la diversité des rhizobia qui nodulent les légumineuses ligneuses dans le sens où les microsymbiotes avec des spectres d’hôte restreints sont limités à des niches spécifiques et représentent une spécialisation des symbioses à large spectre largement distribuées et plus ancestrales. La seule similitude entre les bactéries et les légumineuses à large spectre est leur prédominance dans les milieux chauds ou tropicaux dans le monde. La majorité des études réalisées sur la nodulation chez les Acacias montent leur aptitude à établir des symbioses sur le terrain avec les souches à croissance lente et à croissance rapide (Diouf et al ., 2007; Dreyfus and Dommergues, 1981; Odee et al., 2002 ). On peut ainsi les classer en trois groupes : (i) Acacia senegal , Acacia raddiana , et Acacia cyanophylla sont nodulés par la branche Rhizobium-Sinorhizobium-Mesorhizobium (de Lajudie et al., 1994 ; 1997 ; Khbaya et al ., 1998 ; Nick et al., 1999b), (ii) Acacia albida , Acacia mangium , et Acacia auriculiformis par Bradyrhizobium (Galiana et al., 1990 ; Dupuy et Dreyfus, 1992) ; (iii) Acacia seyal par les deux types de rhizobia (Dreyfus et Dommergues, 1981). Par ailleurs, en plus de la variabilité de l’infectivité, l’efficience peut différer même parmi un seul genre bactérien (Galiana et al., 1990; Murray et al., 2001; Thrall et al., 2000; Turk et Keyser, 1992; Wolde-Meskel et Sinclair, 1998). C’est pour cela qu’à court terme, la connaissance de la biodiversité des rhizobia et celle des populations locales mènera à la mise au point de stratégies d'inoculation efficaces (Lindström et al., 2010) d’autant que les gains provenant de la fixation d'azote ont surtout été observés après inoculation avec des souches autochtones (Sutherland et al., 2000) et

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que les meilleurs résultats concernant la restauration écologique des sites dégradés ont été obtenus en utilisant un inoculum consitué de socuhes natives (Requena et al., 2001).

1-6- Effet des contraintes édaphiques sur la croissance des rhizobia

Il est bien connu que les facteurs environnementaux tels que la salinité, la sécheresse, l'acidité, l'alcalinité, les engrais chimiques, les métaux lourds et les pesticides compromettent la survie, la croissance et la capacité à fixer l'azote des rhizobia (Zahran et al., 1994). l’ Acacia est un genre cosmopolite représenté par diverses espèces adaptées aux conditions environnementales extrêmes (Leary et al ., 2006) et plusieurs études ont montré que les rhizobia qui lui sont associés sont généralement plus résistants aux facteurs environnementaux que ceux associés à d’autres légumineuses (Odee et al., 1997 ; Zhang et al., 1991 ). Pour répondre au choc hyperosmotique, situation présente dans la plupart des stress environnementaux, la plupart des bactéries adoptent des mécanismes universels d’osmoadaptation qui consistent en l’accumulation du potassium et/ou de petits solutés organiques de faible poids moléculaire désignés sous le nom de « solutés compatibles » (Bremer et Krämer, 2000). Ces derniers protègent les cellules et les macromolécules biologiques non seulement du stress hyperosmotique mais aussi d’autres stress tels que la chaleur, le froid et la dessication. Tous ces stress déclenchent une réduction importante de la disponibilité de l’eau. L’accumulation de ces solutés élève donc leur concentration intracellulaire pour contrebalancer la pression osmotique du milieu de croissance et maintenir la turgescence cellulaire (Welsh, 2000). En plus du tréhalose, d’autres solutés tels que le sucrose, l’ectoine et l’hydroxyectoine sont connus pour leur rôle osmorégulateur (Leslie et al., 1995; Welsh, 2000 ; Manzanera et al., 2002). Les solutés compatibles ont une grande diversité structurale, les plus abondantes étant les sucres non-réducteurs et leurs dérivatifs ainsi que les aminoacides et leurs dérivés (Bremer et Krämer, 2000). L’accumulation de ces solutés en réponse au stress se produit par une synthèse de novo et/ou par le transport actif à partir de l’environnement immédiat. L’effet bénéfique de ces solutés n’est pas toujours lié à leur accumulation, comme chez S. meliloti où l’ectoine (Talibart et al., 1994) et le sucrose (Gouffi et Blanco, 2000) ne sont jamais accumulés mais plutôt catabolisés. Par conséquent ils stimulent les capacités endogènes d’osmoprotection chez cette bactérie.

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• Effet de la salinité sur la croissance des rhizobia

Les rhizobia d’Acacias différent dans leur capacité à tolérer le sel (Zhang et al., 1991; Lal & Khanna 1994; Surange et al., 1997; Hashem et al., 1998). Le stress salin affecte d’une manière délétère la croissance et la persistance des souches rhizobiennes dans le sol. Ces dernières varient d’une espèce à l’autre et d’un type de sol à l’autre (El Sheikh et Wood., 1989). En général, la plupart des rhizobia sont inhibés par des concentrations de NaCl de l’ordre de 100 mM (Singleton et al ., 1982). L’effet néfaste du sel est essentiellement dû à l’augmentation de l’osmolarité du milieu environnant la bactérie. Cette osmolarité entraîne un efflux d’eau entraînant une diminution du volume du cytoplasme. Cette plasmolyse affecte le métabolisme de la cellule et le fonctionnement des macromolécules et finalement conduit à l’arrêt de la croissance (Le Rudulier, 2005). L’excès de sel peut également provoquer des modifications du contenu protéique (Soussi et al., 2001) et de la synthèse des lipopolysaccharides (LPS), essentielles à l’initiation de la nodulation chez des rhizobia (Lioret et al., 1995). Plusieurs mécanismes peuvent être cités dans la réponse des rhizobia face au stress salin, tels que la production de glutamate libre intracellulaire, comme c’est le cas chez R. meliloti –renommée S. meliloti - (Le Rudulier et Bernard, 1986) ou plus encore la modification dans l’expression des exoplysaccharides (EPS) et les lipopolysaccharides (LPS) chez les symbiotes associés aux légumineuses herbacées (Zahran, 1992) ou ligneuses (Zahran et al., 1994), Parmi les souches isolées d’ Acacia , les Bradyrhizobium ont été décrits comme ayant un niveau de tolérance à la salinité généralement moins élevé que les autres genres de rhizobia (Marsudi et al., 1999; Zou et al., 1995), mais cette règle a ses exceptions et Thrall et al. (2008) ont aussi trouvé des Bradyrhizobium tolérants au sel. Plusieurs souches rhizobiennes nodulant les légumineuses ligneuses comme Acacia , Prosopis , et Leucaena , peuvent tolérer des concentrations de NaCl allant de 500 à 850 mM (Lal et Khanna, 1995. Zahran et al , 1994 ; Zhang et al , 1991). Au Maroc, des tests in vitro ont montré que presque 50% des rhizobia obtenus par piégeage des régions sahariennes du Sud-Est (sable sans végétation) et nodulant A. raddiana et A. gummifera étaient capables de croître sur milieu YEM solide avec plus de 1 M de NaCl (Essendoubi et al., 2007). D’autres études menées au Maroc ont montré que les souches associées à Acacia cyanophylla, A. gummifera, A. horrida et A. raddiana tolèraient 510 mM de NaCl (Zerhari et al. , 2000). D’autre part, des souches associées à A.

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raddiana d’origines sénégalaises et tunisiennes se sont révélées tolérantes à 170 mM et 340 mM respectivement (Cacciari et al., 2003). En inde, des souches de Rhizobium isolées d’A. farnesiana peuvent tolérer des concentrations de NaCl de plus 850 mM (Surange et al., 1997). Il existe une corrélation positive entre la tolérance au sel et l’adaptation au pH alcalin comme cela a été démontré pour 600 souches de Sinorhizobium isolées de Medicago sativa dans diverses régions d’Iran (Abolhasani et al., 2010). De plus, les rhizobia tolérant le sel ont montré une plus haute efficience comparée à ceux qui y sont sensibles chez l’espèce africaine A. nilotica sous conditions salines (Lal & Khanna, 1995). Des résultats similaires ont été rapportés chez d’autres espèces par Zou et al., (1995); Hashem et al., (1998); Shamseldin et Werner, (2005). Cependant, d’autres études n’ont trouvé aucun effet bénéfique des rhizobia tolérant le sel sur les performances des plantes sur sols salés (Lal & Khanna, 1994). Les symbioses rhizobium-légumineuses et la formation des nodules sont plus sensibles à la salinité que les rhizobia en culture pure (Zahran, 1991). Dans quelques cas, la capacité à fixer l’azote peut chuter de 75% après augmentation de la salinité (Lal & Khanna, 1994). Cependant d’autres souches peuvent maintenir leur capacité symbiotique à plus de 200 mM de NaCl (Zou et al., 1995). De ce fait, la sélection des deux partenaires les plus tolérants est une stratégie appropriée pour les programmes forestiers dans des zones souffrant de conditions salines (Zhang et al., 1991).

• Effet de la température sur la croissance des rhizobia

Tous les microorganismes répondent à une soudaine augmentation de température par l’induction de la synthèse d’un certain nombre de protéines protectrices contre le choc thermique connues sous le nom de HSPs (Heat Shock Proteins) (Räsänen, 2000). Pour la plupart des rhizobia, la température optimale de croissance se situe entre 28–31°C et beaucoup d’entre eux sont incapables de croitre à 38°C (Graham et al., 1992), cependant quelques souches associées aux légumineuses ligneuses tels que Acacia et Prosopis peuvent bien croitre à 40 et 44°C respectivement (Zahran et al., 1994). Les rhizobia peuvent perdre leur infectivité sous une haute température, cela est dû à une déformation de leurs plasmides ou une altération des polysaccharides cellulaires nécessaires à l’infection (Zahran et al., 1994; Zahran, 1999). Par ailleurs, la température du

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sol de l’ordre de 35-40°C est responsable de l’induction de nodules inefficients (Zahran, 1999). Des études menés par Zhang et al., (1991) sur 60 isolats de nodules d' A. senegal et de Prosopis juliflora du Soudan ont montré que ces derniers étaient caractérisés par une température maximum de croissance élevée allant de 38 à 44°C ; toujours au Soudan, la même constatation a été faite par Zahran et al., (1994) concernant des rhizobia isolés des nodules racinaires d’ A. senegal natifs de régions sèches qui ont une température maximum de croissance de 44.2°C. D’autres souches isolées d’ A. saligna et d’ A. karroo isolées de Lybie peuvent croitre à des températures de 44°C (Mohamed et al., 2000), tandis qu’au Maroc, des souches associées à Acacia cyanophylla, A. gummifera, A. horrida et A. raddiana tolèrent des températures qui variant entre 35 et 45°C (Zerhari et al., 2000). Toutes ces études suggérent que les souches associées aux Acacia et isolées de régions arides présentent une adaptation et des profils de tolérance aux températures élevées.

• Effet du pH sur la croissance des rhizobia

En se basant sur différents travaux (Lafay et Burdon 2001 ; Bala et al., 2003), il semblerait que l’acidité ait un impact sur la population rhizobienne en diminuant leur densité dans le sol et en favorisant en général la prolifération des rhizobia à croissance rapide, surtout R. tropici (Martinez-Romero et al., 1991; Graham et al., 1994). Mais une autre étude réalisée par Lesueur et al., (1996) atteste que les bradyrhizobia isolés d’A. mangium et de F. albida étaient résistants à l’acidité et poussaient mieux sur pH acide que sur pH alcalin. Ceci a été aussi rapporté par Marsudi e t al., (1999) qui ont conclu que les Bradyrhizobium étaient plus tolérants à l’acidité que les autres genres bactériens associés aux Acacias. Il serait possible que la composition et la structure de la paroie externe puissent aussi être des facteurs de tolérance au pH (Graham et al., 1994). Il existe une réponse commune aux bactéries face au choc acide, ce sont les ASPs (Acid Shock Proteins) qui contribuent à une protection face à l’acidité au niveau de la bactérie sans altérer le pH interne de cette dernière (Foster, 1993). Il existe deux types d’ASPs : les chaperones et les protéases ; les premières protègent les protéines du choc acide ou les réparent si elles sont altérées tandis que les dernières détruisent les protéines endommagées par l’acidité que les chaperones n’ont pas pu réparer (Foster, 1993 ; 2000). Au moins 20 gènes act (acide tolerance) ont été identifiés chez R. leguminosarum comme spécifiques de la réponse au stress acide (Kurchak et al ., 2001). Pour initier une réponse au choc acide, la

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bactérie doit avoir des mécanismes de sensibilité (Glenn & Dilworth, 1994). De tels systèmes de sensibilité environnementale et de réponse sont constitués de deux composantes : un récepteur et un régulateur. Ce système a été trouvé chez S. meliloti ; les gènes actR et actS codent pour le régulateur et le récepteur respectivement (Tiwari et al ., 1996b). ActS est le produit de actS qui active ActR (produit de actR ) à la détection d’une extrême acidité via la phosphorylation. Ce dernier initie alors d’autres gènes de réponses à l’acidité à l’intérieur de la bactérie (Tiwari et al ., 1996b). D’autres recherches sur S. meliloti ont aussi prouvé que le calcium pouvait jouer un rôle clé dans la tolérance à l’acidité (Tiwari et al ., 1996a), de même que le glutathion chez R. tropici (Riccillo et al ., 2000). Toutes ces données laissent entrevoir de bonnes perspectives dans le domaine de reforestation, de réhabilitation des sites dégradés ainsi que dans la lutte contre la désertification. Les deux partenaires végétal et bactérien, avec Acacia , dont quelques espèces sont connues pour leur bonne adaptabilité aux sols salins et acides (Rodríguez- Echeverría et Pérez-Fernández, 2005), et des souches rhizobiennes tolérantes et efficaces pour les plantations en zones marginales (Thrall et al., 2005), peuvent s’associer et s’établir dans des régions où prévalent des conditions adverses, en contribuant ainsi à restaurer des sols pauvres en azote.

Recherche bibliographique. II: « Les Acacia »

II: « Les Acacias »

II-1- Généralités

Les légumineuses, regroupées dans la famille botanique des Fabaceae ou Leguminosae , sont actuellement divisées en trois sous-familles : les Papilionoideae , Mimosoideae et Caesalpinioideae (Lewis et al ., 2001). Environ 97% des espèces recensées chez les Papilionoidea e et 90% chez les Mimosoideae sont capables de former des nodules fixateurs d’azote tandis que 23% seulement des Caesalpinioideae possèdent cette aptitude (Allen et Allen, 1981; de Faria et al., 1989). Le nom botanique des Acacias dérive du grec « akis » qui signifie épine, ceci étant plutôt une caractéristique des Acacias africains (Brockwell et al. , 2005). La plupart des Acacias sont des arbustes ou de petits arbres, rarement herbacés mais peuvent être des arbres gigantesques (Menninger, 1962). Leur habitat peut varier de régions arides à basse pluviométrie jusqu’à des forêts humides et des berges de rivières. Ils peuvent être rencontrés dans toutes sortes de sols (Allen et Allen, 1981). Chez les Acacias d’origine africaine et américaine, les feuilles sont petites et bipennées. Chez les Acacia Australiens par contre, les feuilles sont réduites après le stade jeune de germination à un pétiole qui s’élargit pour former des feuilles entières nommées phyllodes, et les arbres tendent à rester toujours verts pendant la saison sèche (Roshetko, 2001). Exception faite pour les Acacia australiens, cet arbre présente des épines qui peuvent limiter sa culture dans les fermes. Les fleurs sont parfumées de couleur crème à jaune vif (Allen et Allen 1981 ; Hocking, 1993). La longueur des gousses varie selon les espèces de 3 à 30 cm (Hocking, 1993 ; Roshetko, 2001).

II-2- Origine et évolution de la nodulation chez les légumineuses

La biogéographie est une science qui explique la distribution actuelle des organismes vivants de point de vue de facteurs historiques et écologiques, surtout concernant les légumineuses à large distribution (Doyle et Luckow, 2003). Les familles des légumineuses fixatrices d’azote ne semblent pas partager un ancêtre commun, le phénomène de nodulation est certainement apparu tout à fait indépendamment parmi et même à l’intérieur de certaines familles. Certaines espèces d’ Acacia du sous-genre Aculeiferum section Monacanthea rencontrées en Amérique du sud, au Texas et à certains endroits en Afrique

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ont perdu leur capacité à noduler (Sprent, 2001). L’analyse phylogénétique faite par Miller et al., en 2003 montre que certaines de ces espèces non-nodulantes forment un clade très distinct, suggérant qu’un seul événement a mené à la perte de la nodulation. Ceci illustre le mode de séparation des espèces apparentées trouvées entre les continents qui se base sur l’hypothèse d’une origine commune située au nord de la mer de Téthys, une étroite bande de mer peu profonde qui séparait les deux principales masses terrestres, laquelle a déterminé la distribution ultérieure des légumineuses (Schrire et al ., 2005a, 2005b). Sur le plan symbiotique, même si quelques espèces d’ Acacia sp. sont capables de noduler avec une large gamme de rhizobia, la littérature montre une différentiation entre le sous-genre Phyllodineae qui nodule majoritairement avec les Bradyrhizobium et les sous- genres Acacia et Aculieferum qui nodulent préférentiellement avec les Mesorhizobium et Sinorhizobium. Dans plusieurs études phylogénétiques, le sous-genre Phyllodineae montre une relation étroite avec la tribu des Ingeae tandis que le sous-genre Acacia montre une relation étroite avec la tribu des Mimoseae (Miller and Bayer, 2001; Miller et al., 2003; Robinson et Harris, 2000). Parallèlement, plusieurs membres de la tribu des Ingeae (i.e. Albizzia sp.) sont nodulés par des Bradyrhizobium tandis que d’autres membres de la tribu des Mimoseae (i.e. Prosopis sp. et Leuceana sp.) sont nodulés par des Mesorhizobium et Sinorhizobium (Doignon-Boucier et al., 1999; Haukka et Lindström, 1994; Lindström et Zharan, 1993; Moreira et al., 1998; Zhang et al., 1991). Il apparaît donc y avoir congruence entre la compatibilité symbiotique et les relations phylogénétiques parmi les sous-genres.

II-3- Taxonomie des Acacia

Selon Ross (1973), Acacia a été nommé en premier lieu par Miller en 1858 en décrivant un arbre épineux d’Egypte : A. nilotica qui est devenu l’espèce type du genre. Acacia est le deuxième genre le plus important après Astragalus en nombre d’espèces dans la famille des Leguminoseae . De plus, avec les outils moléculaires de plus en plus développés, ce groupe ne cesse de s’élargir, les études génétiques et cladistiques récentes prouvant également son statut polyphylétique (Chappill et Maslin, 1995 ; Clarke et al., 2000 ; Robinson et Harris, 2000 ; Miller et Bayer, 2000, 2001 et 2003). Il y a eu des remaniements constants dans la nomenclature des Acacias depuis Bentham en 1875, les plus importants étant ceux de Vassal (1972), Pedley (1978), Pedley (1986), Maslin et al., (2003) qui sont résumés dans le Tableau 3.

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Tableau 3: Les classifications les plus importantes dans le genre Acacia de Bentham (1875) à Maslin et al., (2003)

Bentham (1875) Vassal (1972) Pedley (1978) Pedley (1986) Maslin et al., (2003)

ACACIA ACACIA ACACIA ACACIA ACACIA s Gummiferae sg Acacia sg Acacia s Vulgares sg Aculeiferum sg Aculeiferum SENEGALIA SENEGALIA sc Monacanthea sc Aculeiferum sc Spiciflorae sc Senegalia GENUS ‘X’ s Filicinae sc Filicinae 1 sc Filicinae sc Filicinae ACACIELLA

sg Phyllodineae sg Phyllodineae RACOSPERMA RACOSPERMA

(syn. sg Heterophyllum )

s Botrycephalae sc Botrycephalae

s Phyllodineae sc Uninervea sc Phyllodineae ss Uninerves sc Racosperma

ss Continuae sc Alatae ss Alatae

ss Pungentes ss Calamiformes sc Heterophyllum sc Plurinerves sc Plurinervi a ss Plurinerves sc Juliflorae ss Juliflorae

ss Brunioideae 2 sc Lycopodiifoliae sc Lycopodiifolia

Ser Pulchellae sc Pulchelloidea 3 sc Pulchellae sc Pulchella

1Définit dans Guinet & Vassal (1978) 2Le type de la sous-série Brunioideae peut être référé à la sous-classe Phyllodineae, cependant la plupart des taxa que Bentham inclus dans ce groupe peuvent être référé à la sc Lycopodiifoliae; aucune de ces espèces n’a été inclus dans la classification de Vassal. 3la sous classe Pulchelloidea inclus des sous-séries de Bentham : Pulchellae, Alatae, Continuae, Calamiformes, Plurinerves et Uninerves s= série ; ss= sous série ; sg= sous genre ; sc =sous classe

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Au final, la proposition de Ochrad et Maslin (2003) de changer l’espèce type de Acacia nilotica africaine pour une espèce australienne A. penninervis Sieber ex DC. a été acceptée et par cette décision, le genre Acacia est attaché au groupe nommé subg. Phyllodineae ou genre Racosperma dont la plupart des espèces sont australiennes, le genre Acacia est renommé Vachellia Wight & Arn tandis qu’ Acacia subg. Aculeiferum a été renommée comme Senegalia (du Bocage et Queiroz, 2006). A ce jour, Acacia est traité comme un seul genre mais cela pose quelques problèmes, tout d’abord le précédent sous-genre Acacia qui incluait l’espèce type A. nilotica devra être nommé Acacia subg. X, de plus le groupe « Acacia coultri» recevra bientôt le nom de Meriousa . D’ici une position taxonomique unanime, Maslin (2006) propose un Tableau récapitulatif clarifiant l’état des connaissances actuelles (Tableau 4). D’un autre côté, le genre monophylétique Faidherbia (originaire d’Afrique et du moyen orient) a été jusqu’à tout récemment classifié comme une espèce d’ Acacia mais aujourd’hui il est largement reconnu qu’il est distinct des autres Acacia sp. (Maslin et Stirton, 1997), en conséquence, un grand nombre d’articles s’y réfèrent encore comme étant A. albida. Tableau 4: Nom génériques et infragénériques de Acacia sens. lat.

(Décision de la session de nomenclature du 17 th International Botanical Congress (IBC) à Vienne pour adopter et ratifier les recommandations du comité de Spermatophyta et le comité général de IAPT (International Association for Plant Taxonomy) d’accepter la proposition de Orchard & Maslin (2003) pour retenir une autre espèce type pour Acacia )

Noms Pré-IBC Noms post-IBC (Espèce type de Acacia : A. nilotica ) (Espèce type de Acacia : A. penninervis ) Acacia sens. Lat traité Acacia traité comme genre unique 1 comme genres multiples ACACIA ACACIA VACHELLIA (161) Subgenus Acacia “subgenus x”

Subgenus Aculeiferum Subgenus Aculeiferum Section Spiciflorae Section Spiciflorae SENEGALIA (203) Section Filicineae Section Filicinae ACACIELLA (15)

Groupe Acacia coulteri “Acacia coulteri group” “MARIOSOUSA ”ms (13)

Subgenus Phyllodineae Subgenus Acacia ACACIA (960) 1 Nombre selon Maslin et al., 2003.

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II-4- Répartition des Acacias dans le monde

Le genre Acacia est pantropical, avec un nombre estimé à 1350 espèces (Turnbull, 2004). Il a une large distribution dans les zones tropicales humides à arides (Norris, 1956) et en Australie (Brenan, 1965). Une large majorité d’espèces sont natives d’Australie (>940 espèces), mais le genre est aussi bien représenté aux Amériques (>180 espèces), en Afrique (>140 espèces) qu’en Asie (>90 espèces) et reste rare en Europe (Maslin et Stirton 1997; Orchard et Maslin, 2003 ; Turnbull, 2004). Le Tableau 5 résume cette distribution dans le monde :

Tableau 5: Classification d’Acacia sens. lat. dans le monde (Maslin et al., 2003)

Groupe Australie Nombre taxonomique Amérique Afrique Asie & total Pacifique d’espèces

Sous-tribu Acacia 60 73 36 1 9 163 (Acacia ; syn. Vachellia ) Sous-tribu Aculeiferum 97 69 43 2 23 203 sens.str. (Senegalia ) Section Filicinae 15 / / / 15 (Acaciella ) « Acacia coulteri » 13 / / / 13 (nouvelle tribu) Sous-tribu Phyllodineae / 24 10 982 5 987 (Racosperma ) Nombre total 185 144 89 6 993 7 1381 d’espèces (((1(111.).).).) inclut 15 espèces trouvées aussi en Afrique. (((2(222.).).).) inclut 7 espèces trouvées aussi en Afrique. (((3(333.).).).) inclut 1 espèce trouvée aussi en Asie. (((4(444.).).).) 2 espèces de Madagascar, Réunion et L’île Maurice (Note : Du Puy& Villiers 2002, considèrent que seulement une espèce de groupe trouvée dans cette région). (((5(555.).).).) inclut 7 espèces trouvées aussi en Australie. (((6(666.).).).) 975 espèces en Australie, et 7 espèces au Pacifique.

II-5- Intérêts et importance des Acacias

L’humanité a utilisé les Acacias pendant des milliers d’années, leur bois a été utilisé du temps des pharaons pour la fabrication de leur sépulture (NAS, 1979). De nos jours ces arbres gardent leur importance pour les habitants des régions arides et semi-arides. Intérêt fourrager : En Afrique, le feuillage et les gousses sont une source importante de fourrage autant pour les animaux domestiques que pour les animaux sauvages du fait de la rareté des

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pâturages (Ibrahim, 1988). Le brout est indispensable à tous les herbivores vivant en milieu aride ou semi-aride, les graminées ne suffisant pas à satisfaire leurs besoins et à assurer leur croissance (Wickens, 1996). La teneur moyenne en protéines digestibles est de 8 et 11,5% pour les feuilles et les gousses d’Acacias respectivement, de plus ils sont riches en minéraux et les graines ont une teneur élevée en phosphore brut (Räsänen, 2000). En Australie, le bétail se nourrit de phyllodes en saison sèche (Norton, 1994 ; Roshetko, 2001). Cependant certaines feuilles et gousses d’Acacias sont toxiques pour le bétail car elles contiennent des glycosides cyanogénétiques qui peuvent se transformer en alcaloïdes et des acides hydrocyaniques toxiques (Allen et Allen, 1981). De même, le tannin contenu dans le feuillage est une cause majeure de la diminution de son appétibilité et digestibilité (Makkar, 1993). Des études ont été menées sur la valeur fourragère des feuilles de certaines espèces d’ Acacia et ont prouvé leur teneur élevée en protéines brutes, c’est pour cela qu’elles recommandent leur utilisation en complément diététique et non en apport exclusif (Degen, 1995 ; Abdulrazak, 2000). Cependant, ceci peut être vrai dans les élevages intensifs mais dans le mode de transhumance et d’élevage extensif, l’animal lui-même trie ce qu’il peut manger et les races caprines qui prévalent dans les régions arides digèrent mieux le tannin que les ovins (Distel et Provensa, 1991). En plus du fourrage, cet arbre est une excellente source de pollen et de nectar pour les abeilles. Le miel sauvage d'Acacias reste cependant un aliment sous-exploité (Wickens, 1996). Bois de chauffage : En Afrique, les Acacias sont une source importante de bois de combustion (valeur calorifique de 3000-5000 kcal/kg) et de charbon (Hocking, 1993). Acacia ehrenbergiana, A. tortilis subsp. raddiana, et A. nilotica subsp. adstringens, nilotica et tomentosa ont un fort pouvoir calorifique et une combustion sans fumée ni étincelles et de ce fait sont très prisés (Guinko, 1991). Acacia seyal joue un rôle tout particulier dans l'approvisionnement en charbon de bois des villes en expansion de la zone soudano-sahélienne, ce qui a contribué à l'épuisement de vastes zones naguère recouvertes par des peuplements purs de cette espèce (Wickens, 1996). Le bois est généralement dur et dense et est utilisé pour la construction et la fabrication de meubles et d’outils (Von Maydell, 1990 ; Hocking, 1993).

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Intérêt industriel : Le tanin toxique pour le bétail qui est trouvé en grande quantité dans les feuilles, les gousses et l’écorce des Acacias est utilisé dans le tannage du cuir (Wickens, 1996). De plus, la majorité des espèces exsudent de la gomme, produit caractéristique des plantes supérieures, qui est composée de carbohydrates complexes très utilisés dans l’industrie alimentaire et médicamenteuse (Anderson et al. , 1971, 1984). L’espèce qui en produit le plus est A. senegal, elle est la source de la gomme arabique, composé hautement hydrosoluble à faible viscosité qui est un additif alimentaire des plus recommandés. Acacia seyal produit aussi de la gomme mais cette dernière est utilisée pour un autre usage que la production alimentaire et plutôt dans l’industrie textile et papetière (Allen et Allen, 1981 ; Roshetko, 2001) ainsi que pour des spécifications pharmaceutiques. En cosmétique enfin, elle sert d'agent adhésif dans la préparation de poudres et des masques faciaux et assure l'onctuosité des lotions (Wickens, 1996). La gomme issue d’ A. seyal ainsi que d’autres gommes extraites d’ A. xanthophloea , A. karroo et A. nilotica , qui contiennent des tanins, ne sont plus autorisées dans l'alimentation et se vendent, par conséquent, moins cher, du fait que le tanin est considéré comme cancérigène (Anderson, 1993). Intérêt alimentaire : Dans certaines régions, les graines séchées d’ A. senegal (Hocking, 1993) ou les gousses d’ A. nilotica (Von Maydell, 1990) sont incluses dans le régime alimentaire des habitants. On peut aussi citer à titre d’exemple que les natifs d’Australie se nourrissent des graines de plus de 44 espèces d’ Acacia (Thomson, 1992). Les gousses jeunes peuvent être consommées crues ou cuites et les graines séchées peuvent se transformer en farine, base de plusieurs plats (Rinaudo et Thomson, 1991). Une compilation de résultats publiée par Orr et Hiddins (1987) indiquent que le taux protéique des graines d’Acacias est de 17-26%, la matière grasse est de 3-16% et celui des carbohydrates est de 30-50%, ce qui constitue une source nutritive non négligeable surtout dans les pays pauvres où les populations souffrent de malnutrition. Intérêt médicinal : Les feuilles, l’écorce, la gomme, les racines, les gousses et les graines ont un usage médicinal contre une large gamme de maladies, brûlures et blessures (Hocking, 1993). La médecine traditionnelle fait grand cas des gommes qu'elle utilise depuis l'époque des pharaons; elle s'en sert comme calmant et comme agent adoucissant. A usage interne, elles entrent dans la préparation de médicaments destinés à calmer la toux, la diarrhée, la

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dysenterie et les hémorragies; à usage externe, on en badigeonne les inflammations. Grâce à ses propriétés astringentes, le tanin se révèle très utile pour soigner les hémorragies bénignes (Brown, 1977). L’écorce d' A. tortilis subsp. raddiana, est utilisée en Somalie contre l'asthme (Hagos et al., 1987). L'acide acétique, l'alcool et l'eau extraits des fruits d' A. dudgeoni et d' A. nilotica subsp. adstringens et nilotica ont une activité molluscocide, de ce fait la plantation de subsp. nilotica le long des cours d'eau pourrait aider à combattre la schistosomiase (Ayoub, 1982, 1985; Kloos et McCullough, 1987). Intérêt environnemental et fixation d’azote: Les Acacia sont communément utilisés comme brise-vent, pour la stabilisation des dunes et comme plantes ornementales. Les espèces épineuses sont aussi utilisées comme haies défensives (Von Maydell, 1990 ; Hocking, 1993 ; Roshetko, 2001). La contribution que peut apporter l’ombre des Acacia et des arbres en général est d’une grande importance surtout dans les régions où prévaut une chaleur et un rayonnement importants, à titre d’exemple, il a été rapporté par Grouzis et Akpo (2006) qu’environ 50 % de PAR (Photosynthetically Active Radiation) du rayonnement est intercepté par l’arbre et réfléchi vers l’atmosphère, ce qui diminue la température de 6°C à 1 m de profondeur dans les biotopes sous couvert, comparativement à hors couvert (Grouzis et Akpo, 1993). L’utilisation d’engrais azotés chimiques a des incidences économiques et environnementales très néfastes alors que les potentialités des légumineuses qui sont sous- exploitées dans l’agriculture aujourd’hui pourraient représenter une réelle alternative grâce à la fixation biologique de l’azote qui fixe 70–100 millions de tonnes annuellement (Brockwell et al ., 1995 ). Etant donné que les espèces d’ Acacia connues représentent approximativement 6-7% des 20.000 espèces de légumineuses recensées et compte-tenu de l’importante phytomasse qu’ils produisent, la litière en particulier, les Acacias devraient avoir une contribution substantielle à la quantité d’azote fixé totale dans les agro- écosystèmes terrestres. La littérature rapporte que les Acacias fixent moins que les autres légumineuses, mais si on regarde de plus près, on se rend compte que ces résultats sont dus aux particularités des écosystèmes étudiés plutôt qu’au potentiel fixateur de l’arbre, les sites étudiés étant assez riches en azote, inhibant ainsi l’activité fixarice d’azote (Brockwell et al ., 2005). De même, dans les milieux très chauds, secs ou salés où les acacias abondent, leur nodulation et leur fixation d'azote sont altérées (Danso et al., 1992). De plus, il existe une variabilité génétique dans l’aptitude des Acacias à fixer l’azote, en plus de l’impact de leur provenance (Gueye et N’Doye, 1998). On peut donc considérer que les arbres

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augmentent la production des cultures et des herbages à travers les pratiques agroforestières et sylvo-pastorales (Kessler et Breman, 1991) et ceci en améliorant les disponibilités en eau et en augmentant la fertilité du sol (Grouzis et Akpo, 1997). Cette contribution des espèces d' Acacia à la fertilité du sol est double; elle se fait d'abord par le biais de la fixation de l'azote et ensuite par accumulation et décomposition de la litière, en plus d’un rôle écologique complémentaire dans la fixation du sol grâce à son système racinaire (Dommergues, 1994). L'apport de la litière tient au recyclage des minéraux extraits du sol par le système racinaire (Radwanski et Wickens, 1967). L'apport azoté est minime, le feuillage tombé au sol étant probablement soumis à deux cycles successifs de décomposition rapide, le premier consiste en une déshydratation rapide de la litière qui s'accompagne de la perte de tous les composés volatiles, de sorte qu'au terme de la longue saison sèche, le second cycle de décomposition affectera la masse fibreuse et les minéraux (Wickens, 1996). L'enrichissement du sol en azote à partir de la litière est un processus complexe où intervient la qualité de cette dernière qui doit permettre l'accumulation d'humus tout en assurant un taux de minéralisation de l'azote satisfaisant pour la nutrition végétale (Palm et Sanchez, 1990 ; Cortes et al., 1996 ; Gower et Son, 1992). Les facteurs en jeu comprennent les facteurs climatiques, pédologiques et biotiques (Bernhard-Reversat et al ., 1998). La teneur en azote total du sol dépend fortement de sa teneur en argile et, pour une même teneur de cet élément, on trouve de plus fortes teneurs en azote sous Acacia que dans les autres végétations (Bernhard-Reversat et al., 1998). La teneur en azote total du sol est également corrélée avec l'azote minéralisable, une minéralisation plus forte sous Acacia pour une même teneur en azote de la matière organique traduit un turn-over plus rapide (Rhoades, 1995). Quant à l’utilisation des Acacias en agroforesterie, en association avec les cultures céréalières, les résultats sont très variables. L’espèce d’ Acacia la plus indiquée est Acacia albida (Syn. Faidherbia albida ) qui perd ses feuilles en saison humide donc en saison de culture des céréales et de ce fait apporte par la décomposition de la litière les nutriments et l’azote fixé par la légumineuse nécessaires au développement des cultures (Von Maydell, 1986). Le feuillage d’ Acacia albida repousse en saison sèche, ce qui protège le sol de l’évapotranspiration (Schoch, 1966), de plus le sol sous A. albida se caractérise par une augmentation du carbone organique, de rétention hydrique ainsi que des échanges cationiques (Jung, 1967 ; Charreau et Vidal, 1965). Cependant, les résultats sont contradictoires : pour les uns il y a un gain en production pour le mil et le sorgho de 250%

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et de 36% respectivement (Poschen, 1983 ; Charreau et Vidal, 1965) et pour d’autres il y a une baisse de productivité comme pour l’association avec le maïs (Jam et Getahun, 1991). Cependant, on note que les légumineuses ligneuses n’ont pas été inoculées et que la population symbiotique native n’a pas été étudiée. Des études plus précises et qui prennent en compte plusieurs facteurs interagissant tel que le climat, la microflore du sol, les caractéristiques pédologiques et enfin le partenaire végétal, sont nécessaires pour étudier l’impact réel des ligneux sur les pratiques agroforestières, cela afin d’utiliser un modèle adéquat pour améliorer le rendement de façon globale.

II-6- Les Acacias en Algérie

Selon Ozenda (1977), les vallées sèches à fond limoneux ou caillouteux hébergent une formation à Acacias que l’on retrouve dans l’ensemble du désert. Au Sahara septentrional, cette « steppe arborée » est caractérisée par Acacia tortilis associé à Panicum qui remonte jusqu’à l’Atlas Saharien Oranais. Cette association est aussi décrite au Zemmour (Sauvage, 1949), ainsi que dans la région de la Saoura (Guinet, 1953) et s’observe dans tout le pourtour du Grand erg occidental (Guinochet et Quezel, 1954). Mais c’est dans le Sahara central que cette formation atteint son plein développement. Au Sahara septentrional, en plus d’ A. tortilis , on retrouve A. nilotica et A. ehrenbergiana, cette dernière a été longtemps confondue avec A. seyal, alors que cette espèce se trouve seulement dans une station du Hoggar en Algérie (Sahki et Sahki, 2004) et au sud du Sahara (Celles et Manière, 1980). Cependant, A. nilotica est rare au Sahara central alors qu’A. ehrenbergiana s’étend du Sahara central jusqu’au Tadmait. De plus, il a été reporté la présence d’ A. albida dans le Sahara méridional qui remonte jusqu’au Hoggar, Tassili des Ajier et au Tefedest ainsi que celle d’ A. ehrenbergiana et enfin A laeta dans le Tibesti et l’Aïr (Ozenda, 1983). Depuis cette description d’Ozenda (1983), il y a eu plusieurs études sur la répartition des Acacias en Algérie mais qui furent localisées à des endroits spécifiques, il manque à ce jour une cartographie globale et récapitulative de la distribution de ces légumineuses ligneuses. De nouvelles espèces introduites se sont adaptées telles que les espèces australiennes qui ont été utilisées pour la fixation des dunes littorales et pour un usage d’ornementation tel qu’ A. saligna depuis 1870 (El Lakany, 1987) et A. karroo d’origine Sud-Africaine (Ross, 1973) que l’on retrouve comme haies défensives dans tout le nord algérien.

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II-6-1- Description et répartition géographique des Acacias étudiés

Les caractères morphologiques, l’origine et la répartition géographique des Acacias étudiés sont résumés dans le Tableau 6 et illustrés dans les Figures 5, 6, 7, 8, 9, 10 et 11.

Tableau 6 : Caractéristiques morphologiques, distribution géographique et conditions édaphiques des Acacias étudiés (Dommergues et al., 1999 ; Baumer, 1999 ; Sahki et al., 2004 ; Hazem, 2009).

A. karroo Hayne A. saligna (Labill.) A. seyal Del. Caractéristiques H.Wend .

Synonyme A. horrida A. cyanophylla A. fistula, A. stenocarpa Syn arabe Tahl Syn Tamâhaq Ouref Origine Afrique du sud Sud ouest d’Australie Sahélienne Répartition Afrique du nord, Afrique du nord et du sud, Sénégal jusqu’au Soudan ; géographique Libye et Arabie moyen Orient, Amérique, de la Somalie au Sud de l’Europe Mozambique et en Namibie Type Arbre ou arbuste Arbuste Buisson, arbuste ou arbre Hauteur (m) 8-15 2-5 12 Ecorce Epineuse, fissurée Lisse Epineuse Couleur Rouge brun Rouge brun à gris foncé et Variable: Crème, jaune fissuré quand il est âgé verdâtre, brun rouge ou noire. Epines Paires blanches Axillaires en paires Longueur (cm) 15 3-5 Feuilles Bipennées Phyllodes Bipennées groupées en touffe Couleur Vert sombre Vert foncé Longueur (cm) 8 8-25 3-8 Fleurs Jaunes, très Jaunes vifs, groupées en Jaunes d’or, groupées en parfumées, glomérules sphériques glomérules groupées en glomérules sphériques, pelucheux. Diamètre (cm) 7-8 1.5-2 Gousses Noires, étroites, Brun foncé à noires, Brun rougeâtre à maturité. aplaties. étroites, légèrement arquées. Longueur (cm) 5-13 3-14 7-20 Précipitation Supérieur à 250 300-1000 Supérieur à 350 annuelle (mm) Sol Sablonneux Sablonneux, salin, alcalin. Hydromorphe, pierreux, argileux

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Tableau 6 (suite) : Caractéristiques morphologiques, distribution géographique et conditions édaphiques des Acacias étudiés (Dommergues et al., 1999 ; Baumer, 1999 ; Sahki et al., 2004 ; Hazem, 2009). Acacia tortilis (Forsk.) A. albida Del. A. ehrenbergiana A. nilotica* L. Caractéris- Hayne subsp raddiana Hayne tiques (Savi) Synonyme A. raddiana, A. Faidherbia albida A. flava A. arabica fasciculata Syn arabe Talha Azara, Haraz Selem Amora, Tsent Syn Tamâhaq Absegh Ahtes Tamat Taggart Origine Afrique tropicale et Afrique tropicale Nord sahélienne Régions arrosées par le Arabie Nil Répartition Sénégal jusqu’à Du Sénégal jusqu’à Du Tibesti Du Sénégal au Soudan, la géographique l’Arabie l’Ethiopie et jusqu’à l’Arabie péninsule arabique, l’Inde Afrique Australe, et du sud et le Sahara central Moyen Orient et marocain jusqu’à Arabie la Mauritanie Type Arbuste ou arbre Arbre Arbuste Arbre Hauteur (m) 7-13 12-35 4 10-20 Ecorce Epineuse Lisse puis Lisse se Fissurée avec une gomme écailleuse à détachant en rouge maturité lambeaux comme du papyrus Couleur Brun foncé, rameaux Grise à blanchâtre Brun vert avec un Brun foncé presque noire âgés blanc ivoire aspect vernissé Feuilles Bipennées Bipennées, alternes Bipennées, Bipennées alternes Couleur Vert sombre Vert bleuté Vert gris

Longueur (cm) 2.5-4 0.5-1.2 4-8cm Epines Axillaires en paires, Paires, fortes à la Paires, axillaires Acérées, blanches à la longues, blanches et base des feuilles longues et base des feuilles petites brunâtres et petites courbées

Longueur (cm) 2-10 0.2-3.2 5 0.7 Fleurs Blanches à jaune Blanches puis Jaune Jaune vif, odorantes pâle, odorantes jaunes, axillaires

Diamètre 1-2 10-15 1.2-1.5 Gousses Contorsionnées ou Enroulées en Etroites Linéaires, parfois spiralées spirale, orange vif à légèrement légèrement incurvées brun rouge spiralées, rouges vif à l’état jeune Longueur (cm) 8-12 10-15 7-10 7-15 Précipitation 100-1000 300-800 - 250-1500 annuelle (mm) Sol Alcalin, dune de Sablonneux Graveleux Sablonneux, sable Salin, alcalin et argileux

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b a

Figure 5 : Aspect d’A. tortilis : -a- Aspect général de l‘arbre (route de Taghit, Béchar), BZF, 200420042004 ;;; - b- Branches et gousses (Oued Tassena, Tamanrasset), INRF, 2003

a b

Figure 6 : Aspect d’A. nilotica : -a- Aspect général de l‘arbre (Oued Idekel, Tamanrasset), BZF, 2004 ; -b- Fleurs et gousses, INRF, 2003

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a b

Figure 7: Aspect d’A. seyal : -a- Aspect général de l‘arbre; -b- Branches et gousses, (Oued Taghemout, Tamanrasset), BZF, 2004

a b

Figure 8 : Aspect d’A. albida : -a- Aspect général de l‘arbre; -b- Branches et gousses, (Oued Tassena, Tamanrasset), BZF, 2004

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a b

Figure 9 : Aspect d’A. ehrenbergiana : -a- Aspect général de l‘arbre (Oued In-Tounin Tassekra, Tamanrasset), BZF, 2004; -b- Branches et épines (Tindouf, BZF, 2006)

Figure 10 : Aspect d’A. saligna : -a- Aspect d’un jeune arbre (Les dunes d’El-Mactaa, Oran, BZF, 2002)

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II-6-2- Utilisation et caractéristiques des Acacias étudiés : a- Acacia tortilis (Forsk.) Hayne subsp raddiana (Savi)

Cet arbre est considéré comme l’emblème des régions désertiques grâce à son port en parasol caractéristique, il supporte l’aridité, la salinité ainsi que les sols rocailleux ; c’est une espèce caractérisée par une faible consommation en eau et une optimisation relative du rapport assimilation de CO 2 / transpiration, cet arbre améliore la strate herbacée (Hazem, 2009) et peut être utilisé dans la fixation des dunes (Kavia et Harsh, 1993). Il est apprécié comme bois de feu ou charbon de bois, de plus c’est une espèce très appétée par les ruminants et entre même dans l’alimentation humaine (Sahki et al., 2004 ; Hazem, 2009) . b- A. seyal Del.

A. seyal est considérée comme une espèce pionnière des terres inondées (Dommergues et al., 1999), de plus il peut servir à des fins domestiques : comme source de charbon de bois de qualité et comme bois de charpente car il est résistant aux chocs. C’est un important arbre fourrager : feuilles, pousses fraîches et fruits. Sa gomme est de qualité inférieure à celle d’A. nilotica. Il est aussi utilisé à des fins médicinales (Sahki et al., 2004 ; Dommergues et al., 1999). c- A. ehrenbergiana Hayne

Cette espèce est particulièrement xérophile, elle peut avoir un usage domestique comme bois de chauffage et d’œuvre. Les fibres de l’écorce des jeunes rameaux servant à la fabrication de cordes et l’écorce est productrice de tannin. Les feuilles et les fruits sont consommés en période de disette (Sahki et al., 2004, Von Maydell, 1983). d- A. nilotica L.

Cet arbre est utilisé pour réhabiliter les sols très salés ou alcalins à condition que la teneur en sels solubles soit inférieure à 3% (Dommergues et al., 1999). Cette ligneuse ne peut être utilisée en agroforesterie car elle entre en compétition avec les cultures et diminue de 40 à 60% de la production en blé (Puri, 1992 ; Sharma, 1992). Cependant cet Acacia a d’autres usages : il est utilisé comme bois dur et lourd, plus dense que le teck et c’est un excellent combustible. L’écorce et les gousses contiennent du tannin, la meilleure qualité est extraite des gousses vertes et la gomme n’a pas d’usage alimentaire, elle est utilisée

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pour la fabrication de teintures (noire, jaune ou rouge). Les feuilles et les rameaux sont appréciés par les chèvres, les dromadaires et les moutons. Les graines et gousses entrent dans l’alimentation humaine. La gomme, la décoction d’écorce et de gousses (sans les graines), les racines et les feuilles ont un usage médicinal (Sahki et al., 2004 ; Dommergues et al., 1999 ; Von Maydell, 1983). e- A. albida Del .

C’est un arbre assez exigeant en eau (Sahki et Sahki, 2004). Grâce à son système phénologique inversé, il peut être associé aux cultures mais les résultats sont contradictoires (Voir intérêt des Acacias). Il a différentes utilisations: c’est un excellent combustible et son bois est utilisé en artisanat et charpente. Les feuilles et fruits sont broutés par les chèvres et les dromadaires. La valeur nutritive des gousses est élevée. Les fruits sont consommés par l’homme. L’écorce et les gousses ont un usage vétérinaire et médicinal (Sahki et al., 2004 ; Dommergues et al., 1999) . f- A. karroo Hayne

C’est un indicateur de présence d’eau dans le sol aussi bien en surface qu’en profondeur (Palmer et Pitman, 1972). Il est surtout utilisé pour clôturer des parcs à bestiaux en Afrique du sud, sinon il sert comme haies défensives autour des vergers. Il peut être aussi utilisé comme un bon combustible, le charbon de bois est apprécié. Ce dernier peut être utilisé pour la fabrication de meubles et d’outils agricoles et l’écorce est utilisée pour le tannin. Les feuilles, gousses et fleurs sont consommés par les chèvres et les moutons. Sa gomme est parfois utilisée comme confiserie et le miel dont il est issu est d’excellente qualité (le Houérou et Pontanier, 1987). g- A. saligna (Labill.) H.Wend .

A. saligna supporte des gelées très légères mais souffrent de températures inférieures à -4C° (Crompton, 1992), de même qu’il résiste mal à la sécheresse. Cette espèce peut être introduite en régions semi-arides, c’est un excellent stabilisateur de dunes et brise-vent (Le Houérou et Pontanier, 1987). Cependant, cet arbre a un caractère envahissant qu’il faut prendre en considération car il risque d’éliminer la végétation native (Avis, 1989). Il donne un bois de feu assez médiocre mais sa gomme pourrait avoir un

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intérêt industriel. Ses feuilles sont un excellent complément alimentaire fourrager (Degen, 1995).

II-7- Résistance des Acacias aux contraintes édaphiques

Les conditions adverses prévalant dans les régions arides obligent les espèces végétales à des adaptations nécessaires à leur survie. Ces adaptations aux conditions de milieu et leurs mécanismes ont été décrits dans tous les groupements végétaux (Frontier et al ., 2004).

Ces adaptations se traduisent par des régulations physiologiques et morphologiques qui permettent aux plantes de palier à une alimentation en eau déficitaire s’opérant à différentes échelles. Il faut dire que la majorité des stress se traduisent par un déficit hydrique. Dès que ce dernier apparaît, la plante ajuste, rapidement et de façon réversible, les flux d’eau qui la traversent par la fermeture de ses stomates. Des déficits hydriques plus longs induisent des changements moins réversibles, notamment de morphologie tels que la réduction des surfaces d’évaporation (Frontier et al ., 2004). Dans les situations de sécheresse très longue et sévère, cette réduction peut devenir complète (Scheromm, 2000). Il se produit dans ces cas-là, des changements progressifs dans la structure de la plante qui visent à réduire sa surface transpirante (surface foliaire, épaississement des cuticules), parfois même les feuilles sont transformées en épines (Ozenda, 1977), mais tous ces changements résultent également en une baisse de la production végétale (Scheromm, 2000). Les espèces adaptées à la sécheresse sont qualifiées de végétaux xérophiles ou xérophytes, elles se caractérisent par diverses adaptations. Face au stress hydrique, la plante peut réduire son cycle végétatif (Dajoz, 2003) ou augmenter le rapport des parties souterraines/parties aériennes (Frontier et al ., 2004). Parmi les facteurs dépressifs affectant la croissance des végétaux en général et les Acacias dans ce cas, la salinité et la dessiccation (sécheresse et température) sont les plus importants:

• Effet de la salinité sur la croissance des Acacias :

La salinité affecte la croissance des plantes suite à l’effet de rétention d’eau du sol provoqué par des concentrations élevées de sel. La plante privée d’eau réagit et se défend en fermant les stomates présents au niveau des feuilles empêchant ainsi l’évaporation de

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l’eau mais en conséquence entrave également la diffusion du CO 2 nécessaire à la photosynthèse affectant ainsi la croissance de la plante (Rhodes et Nadolska-Orczyk, 2001; Reddy et al., 2004). Les sels présents en grande quantité dans le sol peuvent également provoquer une intoxication de la plante par absorption déséquilibrée des cations, tel que le Cl -, Na + qui interfèrent dans l’assimilation d’autres ions par la plante et provoquent un déficit nutritionnel critique, créant des sols stériles avec des quantités d’azote loin d’être optimum, ce qui conduit à la nécessité d’enrichissement en fertilisants (Kijne et al., 1998). La baisse de production de la biomasse est une réponse classique à la contrainte saline. Néanmoins, la tolérance des plantes vis-à-vis de la salinité varie largement en fonction de l’espèce, de la variété, du stade végétatif et des facteurs liés au milieu (température, humidité, intensité de la lumière et fertilité du sol) (Cordovilla et al., 1995). L’osmorégulation ainsi que la compartimentation des ions inorganiques sont parmi les mécanismes d’adaptation de la plante au stress salin (Xlang Ming et al., 2000). Les mécanismes développés par les plantes résistantes au sel sont basés sur l’exclusion des ions de Cl - et de Na + du cytoplasme : par l’inhibition de leur absorption et la stimulation de leur excrétion par la cellule. Les plantes résistantes au sel peuvent être groupées en plantes exclusives ou inclusives. Dans le premier groupe des exclusives, plusieurs mécanismes d’adaptation tel que la sélectivité dans l’absorption de certains ions par les racines fait que le sel atteint les parties aériennes seulement en petites quantités ; alors que celui des inclusives absorbent le sel en grande quantité et le stocke dans leurs organes d’excrétion (Cramer, 1984). En plus de ces mécanismes, la plante synthétise des solutés organiques (Proline, Glycine, Sucres solubles, etc.…). La famille des légumineuses a une large gamme de tolérance au sel, une de ses réponses au stress est sa capacité d’exclure le Na + de la tige et de l’absorber à partir du xylème (Soliman et Pitman, 1983). Les Acacias sont généralement tolérants à la salinité (Zhang et al., 1991) mais Craig (1996) a démontré que la provenance des Acacia déterminait leur résistance au stress salin, parmi dix espèces étudiées, celles issues de régions salées avaient un potentiel plus élevé de supporter un apport externe en sel. Selon Hussain (2008), l’espèce A. nilotica semble très résistante à un taux élevé de sel allant jusqu’à 12.80 dS m-1 de sel dans l’eau et elle est recommandée pour être introduite dans des sols arides. Par ailleurs, Acacia tortilis subsp. raddiana présente le pouvoir germinatif le plus élevé sur milieu riche en sels (55 % de germination à une concentration

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de NaCl de 4.3 M) comparativement à A. saligna et de ce fait, il se présente comme un meilleur candidat face au stress salin (Jaouadi, 2008). Dans une étude menée au Pakistan (Ansari et al., 2007), on a utilisé l’espèce africaine A. nilotica et des Acacia australiens sur une durée de plus de trois ans dans des régions salées à modérément salées, les résultats obtenus démontrent qu’A. nilotica croît sur des sols modérément salés (4-8 dSm -1) ainsi qu’A. saligna , alors qu’Acacia ampliceps qui est une espèce australienne supporte plus que 16 dSm -1 (Tableau 7). Mais l’auteur recommande la plus grande précaution dans le choix de la provenance des graines, elles doivent être issues de sites proches des conditions des terres à restaurer ; en plus d’introduire l’essence forestière la plus profitable pour les populations autochtones. Donc une approche réfléchie qui passe obligatoirement par des expérimentations au laboratoire devra précéder une introduction d’espèce ligneuse exotique pour la réhabilitation des zones souffrant de salinité.

Tableau 7 : Comparaison entre la tolérance de quelques espèces d’Acacia à la salinité (Ansari et al., 2007).

-1 Salinité (Conductivité électrique d’extrait de sol saturé en dSm ) 4-8 8-16 >16 Acacia auriculiformis Acacia salicina Acacia ampliceps Acacia nilotica Acacia machonochieana Acacia saligna Acacia stenophylla Acacia tortilis

Remarques: 1. La provenance des espèces est d’une importance capitale dans la réponse des plantes à la salinité -1 -1 2. 1 dSm = 1 mScm = 10 mM ou 0.06 % NaCl approximativement.

Il semblerait que l’inoculation d’Acacias et de légumineuses en général avec des souches tolérantes à la salinité induit la formation de nodules effectifs sous conditions légèrement salines (Craig et al., 1991 ; Zou et al., 1995 ; Lal et Khanna, 1995). Mais en fait, la meilleure fixation symbiotique de l’azote ne pourra être obtenue que si on recherche deux partenaires symbiotiques qui soient résistants à ce stress à toutes les étapes de leur interaction (formation et activité nodulaire) (Georgiev et Atkias, 1993 ; Beecher, 1993 ; Zahran et al., 1994).

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• Effet de la température et de la sécheresse sur la croissance des Acacias

Peu de plantes supportent des températures excédant les 45°C, les températures élevées inhibant la photosynthèse et la respiration (Räsänen, 2000). Parmi elles, A.raddiana (A.tortilis) et A. nilotica supportent une température allant jusqu'à 50C° et A. seyal jusqu’à 55°C (Räsänen, 2000). Beaucoup de résultats mettent en avant la remarquable capacité d'adaptation d' A tortilis qui survit, croît et se développe dans des zones très sèches malgré la forte évapotranspiration et les précipitations limitées. Grouzis et Akpo (2006) ont rapporté que cet arbre était caractérisé par une grande plasticité écologique puisqu’il colonise les régions recevant entre 50 et 1000 mm de précipitations annuelles. Cette adaptation est à mettre en relation avec une consommation en eau particulièrement faible et une certaine optimisation du rapport assimilation de CO 2 / transpiration. La consommation annuelle d' A. tortilis évaluée dans le nord du Sénégal, est seulement de 66 mm, ce qui représente 44 % des précipitations annuelles, la stratégie développée par cette espèce face aux fluctuations pluviométriques interannuelles est un ajustement de sa surface foliaire transpirante pour contrôler les pertes en eau (Grouzis et Le Floc’h, 2003). Les Acacias présentent d’énormes potentialités économiques, agronomiques et écologiques qui ont été largement détaillées dans la littérature (Sprent, 1983; Dommergues, 1987 ; Giller et Wilson, 1991 ; Danso et al., 1992 ). Ils sont hautement tolérants à la sécheresse et à différents degrés à la salinité, ils sont utiles en tant que source de fourrage et de bois, de plus ils peuvent être utilisés pour des programmes ambitieux de reforestation dans les écosystèmes désertiques (Toledo et al., 2003).

Recherche bibliographique. III : « La fixation de l’azote atmosphérique »

III : « La fixation de l’azote atmosphérique »

III-1- Introduction

La capacité à fixer l’azote moléculaire (N 2) est un critère important en agroforesterie mais extrêmement variable en fonction du génotype des plantes (Galiana et al., 2004) et des micro-organismes. Il est donc essentiel avant toute introduction d'espèces pressenties fixatrices du N 2 dans les systèmes de production ou d'aménagement, de vérifier leur potentiel de fixation d’azote atmosphérique (Sougoufara et al ., 1990 ).

III-2- Comparaison entres les arbres fixateurs d’azote et les plantes annuelles fixatrices d’azote

Les plantes annuelles et les arbres fixateurs d’azote contribuent à l’enrichissement des différents écosystèmes, qu’ils soient fermés ou ouverts (Zahran, 1998, Dommergues, 1987). Selon Dommergues et al., (1999), l’écosystème fermé peut être défini comme un système où la litière se décompose et l’azote est recyclé grâce à sa minéralisation et devient disponible pour la plante fixatrice ainsi que pour toutes les autres essences végétales associées ; contrairement au système ouvert où l’azote disponible du sol est très faible. Cela a pour incidence directe probable que dans le système fermé, il y ait une diminution de fixation du N2 au fur et à mesure que la minéralisation de l’azote atteint un certain seuil, au contraire du système ouvert où la fixation perdure par manque d’azote assimilable. L’impact positif pencherait plutôt du côté des espèces ligneuses que de celui des espèces annuelles pour plusieurs raisons :

• Les nodules sont généralement indéterminés, annuels, ligneux et situés en profondeur chez les arbres (Sprent, 2001), ce qui leur confère une activité prolongée par rapport à ceux des espèces fixatrices annuelles. De plus, cette profondeur contribue à maintenir une humidité relative entourant le nodule qui favorise son activité symbiotique. De même, après une période de sécheresse, un nodule indéterminé sec peut développer un lobe fonctionnel, ce qui nécessite moins d’énergie que d’en former un nouveau (Reddell, 1993). • Le système racinaire des arbres est plus développé que celui des plantes annuelles et peut ainsi atteindre les nappes phréatiques, ce qui assure une activité racinaire annuelle. Par ailleurs, chez certains arbres fixateurs d’azote, les nodules peuvent se

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former à des profondeurs de 10 mètres tel que chez Prosopis juliflora (Felker et Clark, 1982) ou 30 m chez Faidherbia albida (Dupuy et Dreyfus, 1992). Même si pour certains arbres la capacité à fixer l’azote diminue avec l’âge, surtout en écosystème fermé due à l’accumulation de l’azote, cela n’a pas toujours été vérifié, comme c’est le cas chez Casuarina equisetifolia au Sénégal (Ganry et Dommergues, 1995).

III-3- Méthodes d’estimation de la fixation d’azote atmosphérique

Différents auteurs, Danso, (1985, 1995); Hardarson et Danso, (1993) ont présenté les méthodes actuellement disponibles permettant de mesurer, directement ou indirectement la contribution de la fixation du N 2 dans la nutrition azotée des plantes. Il existe des méthodes indirectes qui ne différencient pas les différentes sources d’azote prélevées par les plantes de façon précise, plus particulièrement l’azote dérivé de l’atmosphère (Ndfa) et l’azote dérivé du sol (Ndfs) à l’inverse des méthodes directes qui sont basées sur des mesures de l’isotope 15 N (Danso, 1988 ; Dommergues et al., 1999).

III-3-1- Méthodes indirectes

Parmi les méthodes indirectes de mesure de la fixation du N 2, les plus utilisées sont les suivantes: a- La différence de production de matière sèche (Sekhon et al. , 1978) entre plants inoculés et non inoculés avec des micro-organismes fixateurs du N 2. b- La mesure du nombre et de la biomasse des nodosités (Graham, 1981). c- La méthode par différence (Talbott et al., 1982) : Dans cette méthode, les plantes sont cultivées en serre ou en tubes placés en chambre de culture sur un support stérilisé dépourvu d’azote où l’on mesure la différence entre la quantité de N contenue chez des légumineuses inoculées avec celle obtenue avec les mêmes légumineuses non inoculées. Cette méthode peut aussi s’appliquer en serre ou au champ, en présence d’azote disponible dans le sol, en comparant l’azote total d’une légumineuse fixatrice d’azote à une plante de référence non fixatrice, en assumant qu’elles absorbent toutes deux les mêmes sources d’azote du sol, ou en comparant la légumineuse fixatrice avec des plants de la même espèce où cette dernière est non inoculée ou inoculée

Recherche bibliographique. III : « La fixation de l’azote atmosphérique » avec une souche inefficiente, ou bien lorsque le génotype de cette légumineuse de référence (témoin) est un mutant non nodulant. Cette méthode est fiable lorsque le sol est pauvre en azote (sol dunaire) (Ndoye et Dreyfus, 1988 et Sougoufara et al., 1990) ou que la litière n’a pas eu le temps de se décomposer et d’interférer avec les résultats (Danso et al., 1992). d- La technique de mesure de l'activité réductrice d'acétylène (ARA) (Hardy et al. , 1968) : basée sur le fait que la nitrogénase, enzyme impliquée dans la fixation d’azote est aussi + - capable de catalyser la réduction de l’acétylène en éthylène : C 2H2 +2H +2 e ‰ C2H4 [1] De ce fait l’éthylène prélevé et mesuré sur chromatographie en phase gazeuse est corrélé à l’activité de la nitrogénase ce qui permet de calculer l’azote fixé grâce à l’équation globale : - + N2 + (6+n) e + (6+n) H ‰2NH 3 + n/2 H 2 [2] - De l’équation [1] et [2] on conclut que la réduction d’une molécule de N 2 implique (6+n) e - alors que celle d’une molécule de C 2H2 implique 2 e . Le coefficient de conversion ƿ est calculé comme suit : ƿ = (6+n)/2 On admet souvent que n =2, la réaction globale est alors :

- + N2 + 4 e + 8 H ‰2NH 3 + n/2 H 2

NB : ll se peut que la valeur de ƿ soit différente de 4, cette valeur changeant avec le génotype de la plante, la température, l’irradiance, etc.… (Witty et Minchin, 1988). L’ARA était la méthode la plus utilisée dans les années 70, grâce à son faible coût et à sa simplicité (Danso, 1995), mais de nos jours elle est accueillie avec beaucoup de réserve, surtout pour examiner la fixation de N sur une longue durée. Les principales critiques de cette méthode étant que cette dernière s’étend sur une courte période de temps et que la fixation subit des variations diurnes et nocturnes (Ayanaba et Lawson, 1977), en plus des changements saisonniers (Zapata, 1987). De plus, l’activité nitrogénase est perturbée lors du transport du plant du champ vers l’appareillage de mesure (Witty et Minchin, 1988) et il est impossible de recouvrir 100% des nodules actifs lors du déracinement (Westermann et al., 1981), le facteur ƿ de conversion reste imprécis, sans calibration préalable (Witty et Minchin, 1988), et enfin l’incubation des échantillons devrait se faire dans un système ouvert de flux continuel de 10% d’acétylène avec analyse d’éthylène dans le gaz effluent (Witty et Minchin, 1988).

Recherche bibliographique. III : « La fixation de l’azote atmosphérique » e- Analyse des composés azotés du xylème : Cette méthode est basée sur la détermination de la composition des tissus végétaux ou du N circulant dans la sève du xylème de la tige. Ce procédé a été développé pour différencier l’azote fixé et l’azote dérivé des nitrates du sol (Mc Clure, 1979) mais seulement chez les légumineuses exportatrices d’uréides où le N 2 fixé est transporté sous formes d’allantoïne ou d’acide allantoïque (uréides) alors que les nitrates absorbés directement du sol sont - transportés sous forme de NO 3 . Cette méthode ne peut malheureusement pas être appliquée aux légumineuses exportatrices d’amides où les produits qui proviennent de la - fixation de N 2 et ceux qui proviennent des NO 3 du sol sont essentiellement les mêmes. Dans cette méthode, on prélève le xylème de la tige un peu au-dessus du sol ou on l’extrait - à partir des rameaux, puis on dose les uréides, les acides α-aminés et les NO 3 . On convertit le % d’uréides en % de Ndfa grâce à une courbe de calibration qu’on obtient avec la plante étudiée inoculée avec une souche effective, dans des conditions contrôlées au laboratoire, - en présence de doses croissantes de NO 3 et en mesurant d’une part le % d’uréides dans la sève et d’autre part le Ndfa % déterminée par une autre méthode telle que la méthode de dilution isotopique (Peoples et al. , 1989). Cependant, cette analyse est instantanée et nécessite la destruction de plusieurs plants pour suivre l’évolution de la fixation (Dommergues et al., 1999), sans compter que la sécheresse du sol entrave la collecte de sève (Herridge, 1982). De plus, la production substantielle d’uréides est restreinte à un nombre limité de légumineuses tropicales et aucune légumineuse tempérée n’a cette aptitude (Peoples et al. , 1989), ce qui limite l’utilisation de cette méthode spécialement dans le cas des arbres fixateurs d’azote (Dommergues et al., 1999).

III-3-2- Méthodes directes :

Ces méthodes de mesure sont fondées sur la distribution de l'isotope 15 N, soit naturelle dans le cas de la méthode d'abondance naturelle du 15 N, ou artificielle par la méthode de la dilution isotopique du 15 N, cette dernière nécessitant l'incorporation de fertilisants enrichis en 15 N dans le milieu de culture des plantes. Cependant l'approche véritablement directe, bien que très peu pratique, est celle qui fait appel au traceur gazeux 15 azoté ( N2), mais cette méthode ne peut s’appliquer que sur une durée assez courte (Giller et Wilson, 1991).

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Le principe commun à ces trois méthodologies est que les plantes fixatrices de N 2 croissent dans un sol ou sous une atmosphère contenant un ratio 15 N/ 14 N mesurablement différent du ratio constant de 0,3663% présent naturellement dans l’atmosphère. L’incorporation de N 2 à partir de la fixation va de ce fait résulter en une différence de ratio 15 N/ 14 N entre le tissu végétal et le substrat sur lequel croit la plante. Dans ce cas, les plantes fixatrices incubées sous le gaz marqué 15 N présenteront un azote avec un ratio 15 N/ 14 N significativement plus élevé contrairement au cas où l’azote du sol disponible est marqué (Danso, 1995). En d’autres termes, si la composition isotopique du sol diffère de celle de l’atmosphère (naturellement ou artificiellement après enrichissement en 15 N), on peut calculer chez une plante fixatrice de N 2 la quantité d’azote dérivée de chacune de ces deux sources, azote dérivé de l’atmosphère, c'est-à-dire le N 2 fixé (Ndfa), et azote dérivé du sol (Ndfs), en déterminant les abondances isotopiques dans les échantillons de plantes non fixatrices et fixatrices de N 2 poussant dans le même pool d’azote disponible. 15 14 Notons que le N 2 atmosphérique contient deux isotopes, le N et le N, et que l’isotope le plus lourd 15 N y est présent à une proportion constante de 0,3663%, l’isotope le plus léger 14 N restant représentant 99,6336% du N total (Dommergues et al., 1999). a - Méthode de la dilution isotopique après enrichissement du sol en 15 N :

Le principe de dilution isotopique et les équations impliquées ont été largement développés et discutés dans la littérature, notamment par Rennie et al . (1978), Rennie et

Rennie (1983) et Danso et al. (1986). Son utilisation pour l’estimation du N 2 fixé nécessite l’application d’un même niveau d’azote et de 15 N enrichi (exemple : pour 2g d’azote/m 2 ou 0.5g/arbre, on ajoute un engrais enrichi de 10 à 20% atomes de 15 N) en un fertilisant donné (à une quantité non inhibitrice de la fixation biologique de l’azote) pour la plante fixatrice d’azote étudiée et pour la plante de référence non-fixatrice adéquate (il est nécessaire que l’architecture racinaire soit aussi proche que possible de la plante fixatrice et qu’elle assimile les mêmes sources d’azote qu’elle). En principe, du moment que la légumineuse et la plante de référence absorbent la même source d’azote au même endroit, on s’attend à ce que le ratio de 15 N/ 14 N de l’azote dérivé du sol soit le même chez les deux types d’espèces (Figure 11). Cependant, en plus de l’azote dérivé du sol, la plante fixatrice de N 2 15 14 assimile aussi le N 2 atmosphérique donc avec un ratio N/ N plus faible que celui du sol.

Ceci résulte, au niveau de la plante entière chez l’espèce fixatrice de N 2, en une dilution du ratio 15 N/ 14 N provenant de l’azote du sol, lequel est évalué à partir de la plante référence

Recherche bibliographique. III : « La fixation de l’azote atmosphérique » non fixatrice. L’importance de la dilution du ratio 15 N/ 14 N du sol reflète la magnitude de l’efficience de la fixation du N2. Si on se base sur l’hypothèse que la plante fixatrice et la plante de référence absorbent des proportions identiques (mais pas nécessairement des quantités identiques) d’azote du sol et d’azote marqué, on aboutit à cette équation finale (Danso, 1985) :

Ndfa% = 100 x (1 - Ei / E0) où :

Ndfa% : Pourcentage de N2 fixé par la plante fixatrice

Ei : excès isotopique dans la plante fixatrice de N 2

E0 : excès isotopique dans la plante non-fixatrice de référence

Si Nt est la quantité de N total dans la plante fixatrice, la quantité de N 2 fixé est alors de :

Ndfa = Ndfa% x Nt / 100

Cependant il existe des sources d’erreur dans cette méthodologie, dont la différence possible entre les architectures des systèmes racinaires de la plante fixatrice et de la plante de référence, le décalage dans le temps dans l’absorption de l’azote marqué par les deux plantes fixatrice et de référence et enfin le cas d’un sol très pauvre en azote où la plante de référence aura du mal à pousser et où on est obligé d’augmenter la dose de l’engrais marqué (méthode de la valeur A) (Fried et Boeshart, 1975).

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Plante de Plante référence fixatrice

Figure 11 : Principe de la mesure de la quantité du N 2 fixé en utilisant la méthode de dilution isotopique après enrichissement du sol en 15 N. Le sol est enrichi assez fortement en 15 N. La plante N 2-fixatrice qui utilise deux sources d’azote (N 2 atmosphérique et azote du sol), dilue dans ses tissus l’azote du sol enrichi en 15 N : elle renferme donc moins de 15 N que la plante de référence. Dans cette méthode, on néglige le 15 N de l’air car son abondance isotopique est seulement de 0.3663% atome (Peoples et al., 1989). b - Abondance naturelle en 15 N :

Il existe une augmentation de l’abondance du 15 N dans la fraction azotée de la plupart des sols parce que cet isotope est plus lourd que le 14 N et que les composés qui l’englobent tendent à réagir plus lentement particulièrement dans le cas de réactions gazeuses. Dans les études traitant des isotopes stables, les niveaux d’abondance naturelle sont souvent décrits sous forme de valeurs delta ( δ) exprimées en parts /cent ou /mille (" o/oo "). Les valeurs delta ne sont pas des valeurs absolues d’abondance d’isotopes mais expriment les différences entre les échantillons avec le standard d’abondance naturelle qui est considéré 15 comme delta = 0 (dans le cas du N 2 atmosphérique : Atome% N =0,3663033).

Le pourcentage d’azote N 2 fixé (Ndfa%) est calculé comme suit (Shearer et Kohl, 1986) :

Ndfa% = ([ δ15 N (pl. réf.) - δ15 N (pl. fix.)] / [ δ15 N (pl. réf.) – β]) x 100

Recherche bibliographique. III : « La fixation de l’azote atmosphérique » où : δ15 N (pl. réf.) : composition is otopique de la plante de référence non fixatrice. 15 δ N (pl. fix.) : composition isotopique de la plante fixatrice de N 2 . β : coefficient de fractionnement isotopique (appelé aussi facteur d’enrichissement isotopique). Le coefficient β est calculé en mesurant la composition isotopique de la plante fixatrice de

N2 croissant sur un sol dépourvu d’azote combiné et fixant 100% d’azote (Mariotti, 1983).

Cette méthodologie donne une estimation cumulée de la fixation du N 2. Contrairement à la méthode de dilution isotopique, elle ne nécessite pas l’adjonction d’engrais marqués onéreux et, de plus, évite le risque d’erreur dû à la décroissance souvent rapide de l’excès isotopique exogène plus instable que celui du sol. Par ailleurs, le choix de la plante de référence semble moins critique (Dommergues et al., 1999). Cependant cette méthode est inutilisable dans le cas où le δ15 N‰ du sol est inférieur à 4‰ (Peoples et al., 1989). Par ailleurs, il faut disposer d’un spectromètre de masse à double introduction capable de déceler des différences de 0.1 partie/mille (soit environ 0.00004% atome 15 N).

III-4- Le potentiel fixateur de N 2 des Acacias :

Il faut tout d’abord différencier la fixation du N2 potentielle et la fixation du N 2 réelle (Dommergues et al ., 1999 ; Galiana et al., 2004) :

- La fixation du N 2 potentielle correspond à l’aptitude d’un système fixateur à fixer N 2 en l’absence de tout facteur limitant.

- La fixation du N 2 réelle correspond à l’aptitude d’un système fixateur à fixer N 2 en présence de facteurs limitants qui interviennent toujours dans les conditions au champ. Il existe une forte variabilité génétique dans l'aptitude d’une espèce à la nodulation et à la fixation du N 2 (Sanginga et al. , 1990), la fixation de N 2 potentielle étant intrinsèque au système fixateur considéré au sein de l’interaction « génotype de l’arbre fixateur de l’azote (AFN) x souches de symbiotes bactériens ». Ceci peut être réalisé en serre en réunissant les conditions les plus favorables telles que l’inoculation avec une souche efficiente, l’utilisation d’un sol pauvre en azote minéral et une irrigation suffisante (Dommergues et al., 1999). Le pouvoir fixateur, lequel varie en fonction des facteurs limitants externes, est exprimé en Ndfa% (pourcentage d’azote provenant de la fixation dans une plante fixatrice), et est déterminé au niveau de la plante entière ou d’un échantillon représentatif. Le pouvoir

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fixateur est aussi exprimé en Ndfa (quantité de N 2 fixé) et, si on connaît la biomasse totale -1 exprimée en azote total (Nt), il est exprimé en g N2 fixé.arbre . Une étude réalisée en Namibie par Schulze et al., (1991) in situ sur des arbres fixateurs d’azote en utilisant la méthode d’abondance naturelle 15 N a révélé que la contribution de l’azote fixé par rapport à l’azote total N t % était la plus élevée chez Acacia mellifera (71%), suivi de Dichrostachys cinerea et Acacia hereroensis (49%), Acacia karroo situé dans la moyenne (35%), Acacia tortilis (17%), tandis que Faidherbia albida se positionnait en dernière place parmi les espèces étudiées avec seulement 2%. Cependant l’âge des arbres n’est pas indiqué dans cette étude. les échantillons de feuilles ont été prélevés en fin de saison humide pour ne pas surestimer l’azote fixé en rajoutant la valeur de l’azote stocké qui remonte vers les nouvelles feuilles en début de saison. Une autre étude menée par Sellstedt et al., (1993) a comparé le potentiel fixateur d’azote entre différents arbres fixateurs d’azote : Faidherbia albida . Del, Leuceana leucocephala (symbiose rhizobienne) et Casuarina equisetifolia (symbiose actinorhizienne). Les différentes méthodes utilisées, à savoir la différence en N total, l’ARA, la technique de dilution isotopique du 15 N ont révélé que la fixation d’azote était plus élevée après quatre mois d’expérimentation en pots chez L. leucocephala (56.3 g N plante -1) suivi de F. albida (30.7 g N plante -1) et enfin par C. equisetifolia (12.3 g N plante - 1). Il se peut que chez cette dernière espèce, la fixation se fasse plus tardivement que chez les deux légumineuses. Une autre expérimentation en pot a été faite par Ndoye et al. (1995) qui ont utilisé la dilution isotopique du 15 N pour comparer le pouvoir fixateur d’azote de quatre espèces d’ Acacia simultanément. Les résultats obtenus cinq mois après la mise en culture montraient que le Ndfa d’ A. seyal était supérieur à celui des trois autres espèces d’arbres: A. raddiana , A. senegal et A. albida, mais puisque le Ndfa% était le même pour A. seyal et A. raddiana (63 et 62% respectivement) on pouvait classer ces deux espèces dans la catégorie des AFN (arbre fixateur d’azote) à haut potentiel fixateur de N 2. Alors qu’au champ, Sanginga et al., (1995) ont estimé qu’A. mangium utilisé comme arbre de haie pouvait fixer 100-300 kg N/hectare/an alors qu’A. albida et A. senegal fixaient un peu moins de 20 kg N/hectare/an. D’autres études estimant la fixation d’azote chez les arbres au champ par les méthodes isotopiques sont résumées dans le Tableau 8. Ces résultats sont assez difficiles à comparer, compte tenu da la différence d’âge des plantations, de climat et de facteurs pédologiques. Mais d’une façon générale, il semblerait que le pourcentage d’azote fixé augmente avec l’âge de la plantation (Ovalle et al., 1996). Il ressort des différentes études

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faites sur Alnus incana que cette dernière ait une capacité à fixer l’azote atmosphérique qui dépasse de loin celle des autres espèces (Hurd et al., 2001), exception faite de l’espèce ligneuse Leuceana leucocephala (Parrotta et al., 1994 ; Sanginga et al. , 1996).

Tableau 8 : Estimation de l’azote fixé par les arbres au champ par les méthodes isotopiques (d’après Galiana et al., 2004). Age de la Méthode N total fixé Espèces Localisation plantation %NDFa a isotopique Références (kg/hectare) en année utilisée b 01 14 0.5 Acacia caven Chili DI Ovalle et al., 1996 02 86 9 Acacia dealbata Australie 05 - 2-140 AN May, 2001 Acacia holosericea Sénégal 10 39 NF AN Ndyaye et Ganry,1997 Acacia mangium Côte d’Ivoire 02 50 NF AN Galiana et al., 2002 Acacia melanoxylon 2.25 43 <1 AN Australie Hamilton et al., 1993 Acacia mucronata 2.25 48 <1 AN Acacia senegal Soudan 04 24-61 28.7-46.7 AN Raddad et al., 2005 Alnus glutinosa France >15 94 NF AN Beaupied et al., 1990 Alnus incana USA - 85-100 43/an AN Hurd et al., 2001 spp.rugosa Alnus incacana France 5-6 75 - AN Domenach et al., 1989 Calliandra calothyrsus Australie 01 50 76 AN Purwantari et al., 1996 Casuarina equisetifolia Porto Rico 02 42-67 82-94/an DI Parrotta et al., 1994 Casuarina equisetifolia Sénégal 03 38 15/an AN Mariotti et al., 1992 Erythrina lanceolata Costa Rica 01 0-53 0-72 AN Salas et al., 2001 Faidherbia albida Sénégal 01 15-23 NF DI Gueye et Ndoye, 2000 Flemingia macrophylla Burundi 01 - 10 AN Snoeck, 1995 Gliricidia sepium 10 0-17 NF AN Sénégal Ndiaye et Ganry, 1997 Hardwickia binata 10 0-22 NF AN Leuceana leucocephala Porto Rica 02 70 103/an DI Parrotta et al., 1994 Pterocarpus lucens Sénégal - 26-49 10.8-20.8 AN Sylla et al., 2002 Leuceana leucocephala Nigeria 3 62-75 98-119/an DI Sanginga et al., 1996 Prosopis alba Chili 01 25 0.4 02 52 1.8 DI Ovalle et al., 1996 Prosopis chilensis Chili 01 31 0.5 02 70 02 Prosopis cineraria Sénégal 10 21 NF AN Ndyaye et Ganry,1997 Prosopis glandulosa USA 01 41-63 40 AN Shearer et Kohl, 1991 Robinia pseudoacacia Autriche 02 90 110/an DI Danso et al., 1995

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Tableau 8 (suite): Estimation de l’azote fixé par les arbres au champ par les méthodes isotopiques, d’après Galiana et al., (2004).

Age de la Méthode N total fixé Espèces Localisation plantation %NDFa a isotopique Références (kg/hectare) en année utilisée b

Dalbergia riparia 54-62 Lonchocarpus sp. 47-57 Machaerium 44-55 aristulatum Mimosa pigra 42-53 Zygia inaequalis 41-52 Campsiandra 38-50 comosa Brésil - NF AN Kreibich et al., 2006 Albizia multiflora 31-48 Dalbergia inundata 35-48 Pterocarpus 6-24 amazonum Crudia amazonica 0 Macrolobium 0 acaciafolium Anadenanthera 42.3-60.4 1.2- 1.7 colubrina Brésil AN de Freitas et al ., 2006 Mimosa tenuiflora 54.6-78.0 2.5-3.6 Piptadenia stipulacea 54.2-77.5 6.9-9.8 Robinia pseudoacacia 63-83 30.5-59.2 Hippopha rhamnoides Allemagne - 56 AN Veste et al., 2012 Genista scuparia 79

a : - : Non Fait ; %NDFa : pourcentage de l’azote dérivé de l’atmosphère ; b : DI, dilution isotopique, AN, abondance naturelle

III-5- Classification des Arbres Fixateurs d’Azote (AFN) selon leur potentiel de fixation du N 2 Le classement du potentiel de fixation de l’azote est basé sur le seuil établi par

Dommergues (1987), Sanginga et al., (1990) et Schulze et al., (1991) qui est de 30 g N 2 fixé.arbre -1.an -1. Les espèces sont considérées à haut potentiel fixateur d’azote lorsqu’ils dépassent cette limite. En résumé, les espèces citées comme intéressantes pour leur capacité de fixation azotée sont les suivantes (Ganry et Dommergues, 1995 ; Dommergues et al., 1999):

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-1 Espèces connues pour leur fixation de N 2 potentielle élevée (> 30 g N 2 fixé arbre an -1) : Robinia pseudoacacia, Sesbania rostrata, Leucaena leucocephala, Casuarina equisetifiolia, C. glauca, Albizia lebbeck, Gliricidia sepium.

Espèces ayant un potentiel de fixation de N 2 moyen à élevé : Acacia mearnsii, A. auriculiformis, A. seyal, A. crassicarpa, A. dealbata, A. galpinii, A. mangium, A. saligna, Calliandra calothyrsus, Casuarina cunninghamiana, C. junghuhniana, Erythrina poeppigiana, Flemingia macrophylla, Inga edulis, Paraserianthes Falcataria mollucana, Prosopis tamarugo, P. juliflora, P. glandulosa. -1 Espèces connues pour leur fixation de N 2 potentielle faible (< 30 g N 2 fixé arbre an -1) : Acacia senegal, Pterocarpus erinaceus. Espèces à potentiel de fixation faible mais ayant des avantages importants en matière de culture associée, d'élevage ou de lutte contre l'érosion : Acacia raddiana, A. cyclops, Faidherbia albida . Cependant tous les résultats d’expérimentation de la fixation d’azote sur une espèce donnée doivent être pris avec beaucoup de recul et de précaution, que le test soit fait en pépinière sous conditions contrôlées ou au champ. Dans le premier cas, les résultats peuvent être hétérogènes pour une seule espèce selon la provenance des graines et de l’efficience de la souche inoculée, comme cela a été rapporté pour A. saligna (Nasr et al., 1999). Dans les conditions naturelles, l’interaction des facteurs environnementaux tels que la fertilité du sol (Galiana et al., 2002), la pluviométrie (Hansen et Pate, 1987), la salinité (Koreish et al., 1997) etc…, peuvent influer sur l’estimation de la fixation d’azote quel que soit la méthode utilisée.

De plus chez les arbres et arbustes, d’autres contraintes concernant l’estimation du N 2 fixé sont prises en compte, à savoir : la croissance pérenne et les variations saisonnières et annuelles (Ladha et al., 1993; Peoples et al., 1996).

A la lumière de toutes ces données, la meilleure approche pour utiliser un arbre fixateur d’azote adéquat pour une région donnée est tout d’abord de tester cette ligneuse sur le sol à revégétaliser, sous conditions contrôlées, avec une inoculation adéquate et avec des graines de plusieurs provenances dont les conditions se rapprochent de la zone ciblée. Cette étape constitue un préalable indispensable pour optimiser l’expression du potentiel fixateur de la légumineuse ligneuse in situ .

Chapitre II : Etude expérimentale

Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:: Caractérisation des rhizobia. Matériel et méthodes

Partie I : Caractérisation des rhizobia associés aux espèces d’ Acacia étudiés d’Algérie

Matériel et méthodes

Introduction

Des études ont été menées sur la flore des régions arides et semi-arides en Algérie, mais aucune ne s’est intéressée exclusivement aux Acacias. Ces arbres offrent un potentiel intéressant dans la réhabilitation, la régénération et la fertilisation du sol (Zahran, 1999). Grâce à leur système racinaire développé, ils survivent dans des régions marginales arides et semi-arides. De plus, ces derniers forment une symbiose avec des bactéries fixatrices d’azote du sol qui donne naissance à des nodules où siège la fixation de l’azote atmosphérique (Räsänen et al , 2001). De ce fait, répertorier les espèces d’Acacias autochtones et introduites acclimatées à toutes les contraintes pédo-édaphiques de différentes régions arides et semi- arides d’Algérie, ainsi que la mise en évidence de la diversité des souches bactériennes fixatrices qui leur sont associées sont une première étape vers la conservation de la biodiversité autant du partenaire végétal que microbien. L’étude des caractéristiques phénotypiques et symbiotiques des isolats est un préalable indispensable à la sélection des souches résistantes et efficientes. Ceci permettra d’utiliser le couple symbiotique plante- microorganisme le plus performant dans la lutte contre la désertification et la réhabilitation des zones dégradées.

Méthodologie

1-Echantillonnage

28 wilayas ont été prospectées pour la présence d’Acacias. Ici, sont reportées seulement les wilayas des zones arides et semi-arides, classées en 4 zones climatiques (Figures 12 et 13) selon Ozenda, (1977) : • Climat méditerranéen sec (région tellienne): Tlemcen, Sidi-Bel-Abbès, Ain- Temouchent, Oran, Mostaganem, Djelfa, Chlef, Blida, Sétif et Guelma. • Climat présaharien (région steppique et pré steppique): M’sila, Saida, Relizane, Tiaret, Ain Sefra, El-Bayadh, Naâma. • Sahara septentrional (région saharienne) : El Oued, Béchar, Ghardaïa. • Sahara central (région saharienne) : Adrar, Tamanrasset.

Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:: Caractérisation des rhizobia. Matériel et méthodes

Environ 500g-1 Kg de sol sont prélevés autour de plusieurs arbres/site, dans un périmètre de 1m autour des arbres et à 20 cm de profondeur après dégagement de la litière. Graines et nodules sont récoltés au niveau de chaque arbre quand elles sont présentes et accessibles. L’échantillonnage a été effectué généralement en novembre et en mars. Le prélèvement du sol dans les lits d’oueds desséchés a suscité une interrogation quant à la profondeur optimum où persisteraient les souches rhizobiennes, du fait qu’après la saison des pluies, une grande partie de sol est transportée par les flots. De ce fait, le sol a été prélevé à 20, 40 et 60 cm autour des arbres.

100km

Figure 12 : Carte topographique de l’Algérie d’après Oussedik et al., 2003.

Algérie N

Figure 13 : Les grandes subdivisions phytogéographiques du Sahara (d’après Quezel et Simmoneau, 1963).

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2-Analyse physico-chimique du sol

2-a- Mesure de la conductivité et du Ph selon Aubert, (1978) ; Callot et Dupuis, (1980)

La détermination de la salinité d’un sol est basée sur le principe de l’extraction d’un électrolyte dont ont mesurera la concentration (Robinson et Stockes, 1970), cette méthode étant difficile on préférera estimer directement la capacité de cet électrolyte à conduire un courant, ce paramètre est nommé conductivité électrique. Cette dernière est effectuée en plongeant une cellule de mesure directement dans l’électrolyte (extrait aqueux), elle est exprimé en mS/cm (1 dS.m -1 = 1 mS.cm -1 = 10 mM ou 0.06 % NaCl). A condition que la température optimum pour cette mesure soit de 25°C (Montoroi, 1997). Le conductimètre (EC 215 Hanna instrument) utilisé, s’auto-calibre à cette température. Le sol prélevé a été analysé pour le pH et la conductivité : une suspension de 1/5 (sol : eau) est préparée puis mélangée pendant 1h, cette suspension est laissée à décanter pendant 5 min puis l’électrode du pH-mètre (H19024 HANNA instrument) et du conductimètre sont immergées, 5 répétions sont faites et la moyenne est interprétée. Selon l’échelle de salure internationale en millisiemens.cm -2 au 1/5 évaluée à l’aide de l’échelle de Durand, 1983 : / / / / Non salé 0.5 Peu salé 1 Salé 2 Très salé 4 Extrêmement salé

Le département d’agriculture et d’Alimentation d’Australie apporte plus de précisions à cette échelle en rapport avec la texture du sol (Tableau 9).

Tableau 9 : Interprétation de la salinité du sol en fonction de sa texture et de sa conductivité électrique de l’extrait aqueux au 1/5 en mS/cm, selon le département d’agriculture et d’Alimentation d’Australie (URL : www.Department of Agriculture and Food - Salinity measures, units and classes [consulté le 10/04/2012]). Taux de Sablo- Argilo- Limoneux Argileux sablonneux Limoneux salinité limoneux limoneux argileux lourd

Non salé <1.3 <1.7 <2.0 <2.2 <2.5 <3.3

Légèrement 1.3-2.6 1.7-3.3 2.0-4.0 2.2-4.4 2.5-5.0 3.3-6.7 salé

Salé 2.6-5.2 3.3-6.7 4.0-8.0 4.4-8.9 5.0-10.0 6.7-13.3

Très salé 5.2-10.6 6.7-13.3 8.0-16.0 8.9-17.8 10.0-20.0 13.3-26.7

Extrêmement >10.6 >13.3 >16.0 >17.8 >20.0 >26.7 salé

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2-b- Détermination de la texture du sol Selon la dimension de ses particules, le sol est constitué de trois composants majeurs : le sable (0.05 - 2 mm), le limon (0.002 - 0.05 mm) et l’argile (0.0002-0.002 mm) (Soil Survey Staff, 1995). La texture varie selon l’abondance de chaque composant (Annexe 1). Pour déterminer la texture des échantillons des sols récoltés, une méthode simple a été utilisée: un échantillon de sol est mélangé avec de l’eau remplissant les deux tiers d’un Becher, la suspension est mélangée pendant 1h et laissée à décanter pendant une autre heure. Les différents composants du sol se déposeront alors selon leur poids : cailloux et graviers, suivis du sable, du limon et enfin de l’argile. Le pourcentage approximatif des trois éléments peut être évalué pour déterminer la texture du sol étudié (FAO, 1992).

3- Isolement des rhizobia

Dans les zones arides et semi-arides prospectées, il était impossible d’accéder à des nodules in situ , c’est pourquoi la méthode de piégeage in vitro a été utilisée pour révéler les microsymbiotes des sols prélevés autour des différentes espèces d’ Acacia .

3-1-Piégeage :

Chaque sol est piégé avec les plants des espèces d’Acacia qui y poussent afin d’obtenir des nodules racinaires et d’isoler ensuite les souches rhizobiennes qui leur sont associées. Les graines utilisées proviennent du site prospecté quand la saison s’y prêtait ou ont été fournies gracieusement par l’INRF (Institut National de la Recherche en Foresterie -Tamanrasset-) et le LSTM (Laboratoire de Symbiose Méditerranéenne et Tropicale –Montpellier-). Ces dernières ont été triées, répertoriées et stockées à 4°C.

3-1-a- Désinfection et scarification des graines Bien que le taux de germination des graines soit souvent lié à la date de leur récolte et les conditions de leur stockage, il dépend aussi de la technique de scarification, c’est pour cela que plusieurs méthodologies ont été testées.

• Désinfection chimique à l’hypochlorite de sodium à différentes concentrations et scarification mécanique :

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Les graines sont désinfectées par immersion dans l’hypochlorite de sodium 32° pendant 6min, 16° pendant 10 min et 12° pendant 6 et 20 min. Elles sont rincées 8 fois avec l’eau distillée stérile et trempées pendant 1h dans la dernière eau de lavage. Par la suite, les graines scarifiées à l’aide d’un poinçon chauffé à blanc sont déposées aseptiquement dans des boîtes de Pétri contenant de l’eau gélosée à 0.8% (Annexe 2) et placées inversées à l’obscurité dans l’étuve à 28°C pendant 3 à 8 jours. Les boites ne doivent pas être surchargées pour minimiser le risque de contamination.

• Désinfection et scarification à l’acide sulfurique 98% :

Les graines sont trempées dans l’acide sulfurique pendant 20, 60 et 120 minutes pour chaque espèce. Elles sont rincées à l’eau distillée stérile 10 fois afin d’éliminer toute trace d’acide sulfurique. Lors du dernier rinçage, les graines sont immergées dans l’eau distillée stérile pendant 1h avant de les placer aseptiquement dans des boites de Pétri contenant de l’eau gélosée à 0.8%. Ces dernières sont placées à l’obscurité dans l’étuve à 28°C pendant 3 à 8 jours.

3-1-b- Mise en place des plantules :

Les plants avec les radicelles mesurant 2 à 3 cm sont transférés aseptiquement dans des pots en plastiques désinfectés ou dans des tubes Gibson stérilisés :

• Pots stérilisés :

Des pots en plastique, d’une contenance de 250 ml sont désinfectés avec de l’hypochlorite de sodium à 12° puis rincés à l’eau distillée, ils sont par la suite remplis de 200g du sol de chaque site avant de repiquer trois plants d’Acacia par pot, les plants correspondant à l’espèce d’ Acacia spécifique à chaque site. Avant de transférer le sol, l’échantillon global est homogénéisé. Les plants sont arrosés un jour sur deux avec une solution nutritive pour plante dépourvue d’azote (Broughton and Dilworth, Annexe 3) et de l’eau distillée stérile en alternance.

• Tubes Gibson :

Des tubes Gibson (Gibson, 1980) sont préparés (Annexe 4). Les plants y sont introduits par une petite ouverture (à l’opposé de l’ouverture fermée avec un embout) de façon à ce que ne dépasse que la tige feuillée et que la racine soit immergée dans le milieu et supportée par la 62

Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:: Caractérisation des rhizobia. Matériel et méthodes gélose inclinée. Il y a 4 répétitions par site, par espèce et par profondeur. Les plants sont recouverts de coton imbibé d’eau distillée stérile pour éviter leur desséchement. Après 24h, les téguments sont enlevés et les tubes sont incubés dans une chambre de culture avec une photopériodicité de 16h (lumière du jour) et 8h d’obscurité (nuit), à une température de 30 ± 1 °C, une humidité relative de 70 ± 5% et une radiation photosynthétiquement active de 120 mol/m 2/s. Les tubes sont placés dans des bacs de façon à ce que les racines soient maintenues à l’obscurité. Après une semaine d’incubation les plants sont inoculés avec 1ml de suspension de sol à 10% (Annexe 5). Des tubes non inoculés serviront de témoins. Les racines sont observées après 6 semaines de la germination des graines (Diouf et al., 2007) pour la présence de nodules.

3-2- Isolement et purification des souches :

3-2-a- Isolement :

Les nodules récoltés des racines des arbres in natura (lorsque cela était possible, principalement en terrain sablonneux) ou obtenus par piégeage sont directement utilisés pour l’isolement ; la majorité de ces nodules sont stockés dans du glycérol à 60% ou conservés secs dans des tubes contenant du CaCl 2 surmonté de coton cardé (Date, 1982). Au laboratoire, les nodules sont réhydratés dans de l’eau distillée stérile (pendant une heure) dans des tubes Eppendorf. Après avoir éliminé l’eau, les nodules sont désinfectés en surface par immersion dans du H 2O2 (56%) pendant 30-90 secondes, selon la taille du nodule. Les nodules, de tailles et de formes différentes pour chaque espèce d’ Acacia sont écrasés à l’aide d’une pince stérile. Le broyat nodulaire obtenu est déposé sur du milieu YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) additionné ou non de rouge Congo* (Annexe 6), ce dernier est étalé par méthode de stries et les boites sont incubées jusqu'à 10 jours à 28°C. * La majorité des rhizobia n’absorbent pas ou peu le rouge Congo et présentent un aspect blanchâtre, transparent et à contour régulier (Vincent, 1970) ce qui permet de les différencier des autres bactéries Gram négatifs ( Agrobacterium sp., Klebsiella, Pseudomonas, etc). Cependant, certaines souches de R. leguminosarum absorbent fortement ce colorant (Kneen et Larue, 1983). Les isolats sont repiqués jusqu’à obtention d’une culture pure.

Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:: Caractérisation des rhizobia. Matériel et méthodes

3-2-b- Vérification de la pureté des isolats :

Vérification de la pureté des isolats par repiquage et microscopie : La pureté des isolats est vérifiée par la méthode d’épuisement sur milieu YEMA jusqu’à l’obtention de colonies isolées. Il est conseillé d’observer les colonies bactériennes à l’aide d’une loupe binoculaire. De plus, cette pureté est vérifiée par observation microscopique de préparations de cultures entre lames et lamelles à l’état frais, ce qui permet de vérifier l’homogénéité des cellules, les différentes formes présentes, et leur mobilité.

Coloration de Gram : La coloration de Gram (Annexe 7) permet de différencier sur la base de la composition de la paroi cellulaire les bactéries Gram négatives (comme les rhizobia) des bactéries Gram positives. L’observation microscopique au grossissement X100 avec huile à immersion permet de voir si les cellules sont colorées en violet (Gram-positif) ou bien en rose (Gram- négatif).

Conservation des isolats : Les isolats purifiés sont conservés selon les deux procédés suivants : ° Pour une courte durée (<6 mois), on les repique sur le milieu YEMA incliné après une incubation de 48-72 heures à 28°C, les tubes sont ensuite conservés au réfrigérateur à 4°C. ° Pour une conservation de longue durée, les isolats sont conservés dans des cryotubes contenant 0.75 ml de glycérol (50%) additionné de 0.75 ml de suspension bactérienne en phase exponentielle. Le mélange homogénéisé est conservé à -80°C.

4- Test de nodulation et d’efficience

Les isolats obtenus à partir des broyats nodulaires ne peuvent être considérés comme BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) qu’après avoir vérifié leur aptitude à renoduler leur plante hôte en conditions bactériologiques contrôlées. Ce test a été réalisé en plusieurs étapes comme suit:

4-1- Désinfection des graines et mise en germination :

Le même protocole que celui décrit précédemment au §3-1-a a été appliqué

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4-2- Transfert des plantules :

Après germination (3 à 5 jours selon l’espèce) les plantules obtenues sont transférées dans : - Des pots en plastique, désinfectés et remplis de sable autoclavé trois fois pendant 20 min à 120°C, à 24h d’intervalle, un premier pot est troué pour éviter la saturation du sol en eau, il est doublé d’un autre pot pour éviter toute perte d’inoculum.; - Des tubes (150 X 20 mm) contenant une languette de papier munie d’un support sur la partie supérieure où sont déposées les graines germées et où est percé un trou permettant aux racines de passer à travers et de se développer à l’intérieur du tube (Figure 14). Ces tubes sont remplis avec 45 ml de milieu nutritif sans azote de Broughton and Dilworth (Annexe 3). Ils sont fermés avec du papier aluminium serré avec des élastiques, puis sont stérilisés par autoclavage pendant 20 min à 120°C. A la sortie de l'autoclave, on pratique un trou pour introduire délicatement la radicelle de manière à ce que la partie racinaire soit accolée au papier.

Cotylédons

Hypocotyle

Racines

Solution nutritive pour plantes

Languette de papier

Figure 14 : Schéma représentant le dispositif utilisé pour le test de nodulation.

4-3- Inoculation :

L’inoculation des plantes est réalisée une semaine après la mise en tube avec 1 ml de culture bactérienne à une concentration de 1.5 x10 7 UFC/ml, équivalent au tube Mc Farland

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05 (Annexe 8), en effectuant six répétitions par souche. Chaque essai comprend un témoin négatif non inoculé.

4-4- Evaluation de l’efficience :

Après neuf mois de culture en tubes, le nombre de nodules, leur aspect, la hauteur de la tige sont relevés. Le poids sec des nodules et de la plante entière sont mesurés après séchage au four à 60°C pendant 3 jours.

5- Analyse statistique

• La PCA (Principal Component Analysis ou analyse en composantes principales) est effectuée pour étudier la relation entre la conductivité du sol et la température ambiante maximale des sites échantillonnés et la tolérance in vitro des souches isolées des sites correspondant au NaCl et température. Les calculs et le graphe ont été obtenus grâce au logiciel XLSTAT TM (version 2010.5.04, Addinsoft, Paris, France, http://www.xlstat.com ) (Annexe B). • La FCA (Factorial Correspondence Analysis ou analyse factorielle des correspondances) est appliquée pour visualiser la relation entre les taxa rhizobiens comme ils ont été définis par la phylogénie basée sur le séquençage partiel du 16S rARN et l’espèce d’ Acacia hôte, en utilisant le logiciel XLSTAT TM (version 2010.5.04, Addinsoft, Paris, France, http://www.xlstat.com ) (Annexe A). • Dans le test d’efficience et pour chaque paramètre étudié, toutes les données collectées ont été soumises à une analyse de variance à 1 facteur. Quand l’effet du facteur souche de rhizobium a un effet significatif pour un paramètre donné, les moyennes obtenues pour chaque souche sont classées par groupes homogènes en appliquant le test multiple de classement des moyennes de Duncan (Dagnélie, 1975). L’analyse de variance a été effectuée en utilisant le logiciel « SUPERANOVA software » (Abacus concepts Inc., version 1989, CA) (Annexe C).

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6- Caractérisation phénotypique des isolats

Tous les isolats sont testés pour leur tolérance aux pH, à la température et à la salinité. Les colonies bactériennes sont ensemencées dans du YEM liquide, incubées jusqu’à une turbidité équivalente au tube Mc Farland 0.5 (Annexe 8) à une concentration approximative de 1.5 x10 7 UFC/ml. Par la suite, 10 µl de la suspension bactérienne obtenue est étalée sur les boites de Petri contenant du milieu YEMA lesquelles sont soumises aux différents facteurs testés : 6-1- Températures : Les boites ensemencées et scellées sont placées en chambre froide ou en incubateurs à 4, 30, 35, 40, 45, et 50C° pendant 7 jours. 6-2- pH Les isolats sont évalués pour leur tolérance au pH sur du YEM solide ajusté à des pH de: 4, 9, 10, 11, 12 et 13. Après une semaine d’incubation à 28°C, la lecture est faite en comparant la croissance des tapis bactériens des différents isolats à un témoin à pH 6.8. 6-3- Salinité La croissance bactérienne est réalisée sur du milieu YEM solide, additionné de différentes concentrations de NaCl : 0 , 0.5 , 1 , 2 , 3 , 3.5 , 4 , 5 , 6 et 7%.

7- Phénodendogramme

Les tests phénotypiques ont été étudiés sur 16 souches. Au total, 59 tests sont réalisés selon le même protocole que celui décrit au §6. 7-1-Tolérance au sel : La croissance bactérienne est observée sur milieu YEM solide, additionné de différentes concentration de NaCl : 0 , 0.5 , 1 , 2 , 3 , 3.5 , 4 , 5 , 6 et 7%. 7-2-Tolérance à la température : des boites de Petri contenant du milieu YEM solide inoculées sont incubées pendant 7 jours à différentes températures : 4, 14, 19, 25, 28, 35, 39, 44, 46 et 50C° pendant 7 jours. 7-3-Croissance sur une gamme croissante de pH : les isolats sont cultivés sur du milieu YEM solide, dont le pH est ajusté à : 3 , 3.5 , 4.5 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 et 12.

7-4-La résistance intrinsèque aux antibiotiques et aux métaux lourds : ce test est réalisé dans des boîtes contenant du YEM solide sur lequel sont déposés des filtres stériles imprégnés des antibiotiques et des métaux lourds suivants: Streptomycine (3 et 120 µg /ml), Spectinomycine (5 et120 µg /ml), Kanamycine (10 et100 µg/ ml), Chloramphénicol (15 et

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200 µg/ml), Erythromycine (30 et 66·6 µg /ml), CuCl2.2H 2O (100 µg /ml), HgCl 2 (5 µg /ml) et CdCl 2.2H2O (20 µg /ml).

Une souche bactérienne est considérée comme résistante si le diamètre de la zone d’inhibition est supérieur ou égale aux diamètres reportés pour chaque antibiotique selon le NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards -, (2000).

Dans les tests qui suivent, le milieu synthétique (GMS) (Zevenhuizen, 1986) est utilisé (Annexe 9).

7-5-Hydrolyse de l’urée : Les souches sont ensemencées sur du milieu solide contenant une solution de sels salins GMS et 1 g/l NH 4Cl au lieu du Na glutamate comme source d’azote, 2% d’urée et 0·012% de rouge phénol (Lindström et Lehtomäki, 1988).

7-6-Réduction de nitrates : Les bactéries sont cultivées sur milieu GMS pendant 4 jours, additionné de 0·1% de KNO 3 (Lindström et Lehtomäki, 1988).

7-7-Assimilation des sucres : L’utilisation des différents sucres a été évaluée sur un milieu solide contenant une solution de sels salins GMS et 1 g/l NH 4Cl au lieu du Na-glutamate comme source d’azote. Du D-glucose, D-galactose, L-arabinose, D-fructose, D-xylose, sucrose, lactose ou mannitol ont été ajoutés au milieu à une concentration finale de 1g/l. Le milieu est additionné de bleu de bromophénol qui se colore en jaune lorsque le pH devient acide (<4.5), ce qui indique l’utilisation des sucres.

7-8-Utilisation des sources d’azote : Le milieu GMS agar dépourvu de sodium glutamate a été supplémenté par des solutions d’acides aminés stérilisés par filtration à une concentration finale de 10 mM/L. Les acides aminés testés sont : DL-valine, L-proline, acide L-glutamique, L-leucine, DL-phénylalanine, DL-serine, DL-tryptophane, L-méthionine et acide L- aspartique. Le milieu GMS a été utilisé comme un control positif et le milieu GMS sans source d’azote comme contrôle négatif.

7-9-Analyse numérique : Les données sont reportées sur Excel et traduites en code binaire: 0 pour une croissance négative et 1 pour une croissance positive. La matrice finale contient 16 isolats et 59 caractères. Le logiciel Statistica (Statistica version 5.1 ; eds 1997 -Annexe D-) est utilisé pour interpréter les résultats. Les données sont utilisées pour une analyse de groupe hiérarchique basée sur le carré des distances euclidiennes et une moyenne non pondérée des groupes associés (Hack et al., 2004).

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8- Caractérisation génétique des isolats

8-1- Extraction de l’ADN génomique : Une colonie pure, fraîchement isolée sur milieu gélosé YEMA, est repiquée en masse, sur milieu YEMA gélosé sur boîte de Petri. Après 48 heures d’incubation, le tapis bactérien est lavé 2 fois à l’eau distillée stérile et la densité optique est mesurée. A 100 µL de suspension cellulaire de DO (620nm) = 2, sont ajoutés 100 µL de Tris-HCl (10 mM, pH 8.3) puis 20 µL de protéinase K à 1 mg/ml d’eau milliQ stérile (Boehringer). Le mélange est mis à incuber 2 heures à 55°C, puis 10 min dans l’eau bouillante pour dénaturer la protéinase K. Les tubes sont stockés à –20°C jusqu’à utilisation ultérieure. Pour les souches très muqueuses, le milieu TY (Annexe 10) est utilisé pour la culture bactérienne. NB : Pour certaines souches, quelques colonies étaient suspendues dans 0.5 ml d’eau milliQ stérile, les suspensions obtenues sont centrifugées à 12000 tours/min puis lavées deux fois à l’eau milliQ stérile, le culot final étant resuspendu dans 50 µL d’eau miliQ. Les homogénats sont stockés à -20°C pour une utilisation ultérieure.

8-2- Amplification par PCR :

La PCR (Mullis et Faloona, 1987) a été utilisée pour amplifier l’ADNr 16S.L’amplification est réalisée à partir de 2 µL d’ADN obtenu par traitement à la protéinase K. Le volume du mélange réactionnel est de 25 µL et contient : 2 µL d’ADN, 5 µL de tampon de réaction 5X (Gibco), 2 µL de dNTPs chacun à 2.5 mM (Sigma –ALDRICH, Allemagne), 1 µL à 20 µM de chacune des deux amorces FGPS6-forward- (5’-GGA GAG TTA GAT CTT GGC TCA G-3’) et FGPS1509-reverse (5’-AAG GAG GGG ATC CAG CCG CA-3’) (Biotech AG) (Normand et al., 1992), 0.15 µl de Taq polymérase (Gibco) et 13.85 µL d’eau milliQ stérile. Un contrôle négatif contenant 2 µL d’eau milliQ stérile au lieu de l’ADN est inclus dans chaque réaction PCR. L’amplification est réalisée dans un thermocycleur de type Gene Amp PCR system 2400 (Perkin Elmer, Nieuwerkerk a/d Ijssel, Hollande) avec le programme suivant : Un cycle de dénaturation initial à 94°C pendant 5 min; 36 cycles de dénaturation à 94°C pendant 30 s ; hybridation à 56°C pendant 30 s ; élongation à 72°C pendant 2 min; et une élongation finale à 72°C pendant 7 min (Figure 15).

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Nombre de cycles : 36 T° 94°C T° 94°C T° 72°C T° 72°C T= 5 min 30 s T° 56 °C 2 min 7 min T° 20°C 30 s

Figure 15 : Schéma des différents cycles du programme de la PCR utilisé.

Les produits d’amplification sont visualisés par électrophorèse (cuve à électrophorèse 15,5 x 24,5 cm, Easy Cast, Electrophoresis system, Model #B1, OWI Scientific, Inc.) en prenant 4 µL d’ADN amplifié de chaque souche avec une goutte de bleu de charge (bleu de bromophénol 0.025 %, glycérol 3 %, EDTA 1 mM) sur un gel d’agarose 1 % (Agarose type II : Medium EEO, Sigma, Allemagne, 12 x 13 cm) mélangé avec 2 gouttes de Bromure d’Ethidium (solution à 0.625 mg/ml). La migration se fait dans du tampon TAE 1X (40 mM Tris-acétate, 1 mM EDTA, pH 8.3). Le gel est photographié (perfect image V-5.3 Clara Vision). La taille du produit d’amplification attendu varie suivant le gène amplifié. La totalité de l’amplifiât est visualisé et découpé après migration sur gel d’agarose à 1 % à 100 volts. La bande correspondant à la taille du gène amplifié est découpée et purifiée à l’aide d’un kit QIAquick Extraction Qiagen (Annexe 11). La quantité de l’ADN éluée est ensuite évaluée sur un gel de 1% agarose dans du TAE 1X (mêmes conditions de gel que pour découper les bandes), visuellement en le comparant aux bandes du Smart Ladder. Le Smart Ladder est un marqueur de poids moléculaire qui sert d’étalon puisqu’il est composé de fragments d’ADN double-brin linéaires de tailles connues, régulièrement réparties respectivement entre 100 et 10000 pb. De plus il permet après migration, de quantifier approximativement la quantité d’ADN déposé en fonction de l’intensité des bandes puisque le mélange est composé d’une quantité connue de chaque fragment (Annexe 12).

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8-3- Séquençage partiel de l’ADNr 16S :

L’étude de l’opéron ribosomique (codant pour les ARNr 5S, 16S et 23S) constitue un outil de choix pour étudier les relations phylogénétiques (Woese, 1987 ; Schleifer et Ludwig, 1989 ; Stackebrandt et Goebel, 1994). Actuellement la plus importante base de données pour le développement de la classification des BNL (Bactérie Nodulant les Légumineuses) et de l’ensemble des bactéries est constituée par les séquences du gène codant pour l’ARNr 16S (Figure 15). Après l’amplification par PCR du gène codant pour l’ARNr 16S, l’ADN est utilisé (40 à 50 ng) pour une réaction de séquence en utilisant le kit de ABI Prism BigDye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). 3 amorces sont utilisées : FGPS6 (5’-GGA GAG TTA GAT CTT GGC TCA G-3’), FGPS1509 (5’-AAG GAG GGG ATC CAG CCG CA-3’) et 16S-1080r -reverse- (GGG ACT TAA CCC AAC ATC T) (Sy et al., 2001). La réaction de séquençage est ensuite analysée dans un séquenceur (Applied Biosystems model 310 DNA sequencer). Les séquences d’ADN sont obtenues sous forme de pics colorés avec 4 couleurs différentes correspondant chacune à une base de l’ADN. Elles sont ensuite corrigées à l’aide de logiciels disponibles sur Internet tels que CLUSTALX ou CHROMAS-Pro et comparées avec d’autres séquences stockées dans des bases de données GENEBANK.

FGPS6

16S

FGPS 1509 16S-1080r

Figure 16 : Position des amorces internes du gène ADNr 16S utilisés dans la présente étude.

8-4- Construction phylogénétique :

Pour l’exploitation des données de séquences, après corrections, ces dernières sont comparées avec d’autres séquences stockées dans des bases de données GENEBANK. Cette recherche est dite par « BLAST », du nom du programme informatique (Altschul et al., 1997) et se fait via Internet ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ). Le résultat est donné sous forme d’une liste des 100 séquences les plus proches de celle que l’on a soumises.

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Les séquences corrigées doivent être ensuite alignées avec celles de souches de référence pour le même gène. Cet alignement peut être réalisé automatiquement par CLUSTALX et amélioré manuellement avec « GENDOC software » (Nicholas et al., 1997). Le fichier d’alignement doit être transféré sous un format reconnaissable par le logiciel de construction d’arbre phylogénétique. Les formats possibles sont FASTA, NEXUS ou PIR. Le logiciel de construction d’arbres phylogénétiques utilisé est « MEGA 3.1 software ». La méthode de construction phylogénétique choisie était celle du maximum de vraisemblance (Maximum-Likelihood) car cette dernière est plus probabiliste : en se basant sur le taux de substitution pour chaque élément de base (nucléotide pour les séquences d’ADN) au cours du temps, on estime la vraisemblance de la position et de la longueur des branches.

En taxonomie actuelle, les méthodes du maximum de vraisemblance permettent une meilleure optimisation des données de séquences et l’obtention de résultats de phylogénie les plus robustes. Plusieurs études actuelles de diversité des rhizobia ont utilisé cette méthode pour la construction d’arbres phylogénétiques (Vinuesa et al., 2005 ; Stepkowski et al., 2003).

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Partie I : Caractérisation des rhizobia

Résultats et discussion

1-Cartographie des Acacias Les espèces répertoriées lors des prospections sur sites étaient : Acacia ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis, A. nilotica, A. albida et A. laeta considérées comme espèces autochtones (Ozenda, 1977) alors que celles introduites étaient: A. farnesiana , originaire d’Amérique (Berhaut, 1975), A. karroo, originaire d’Afrique du sud (Palmer et Pitman, 1972) et enfin A. saligna et A. decurrens toutes deux originaires d’Australie (Chopinet, 1951). La Figure 17 montre que les espèces sont réparties de la façon suivante : A. karroo , A. saligna, A. seyal, A. decurrens et A. farnesiana dans le nord ; A. ehrenbergiana et A. tortilis dans tous les lits d’oueds desséchés du Sud Ouest et six espèces dans la wilaya de Tamanrasset: A. ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis, A. nilotica, A. albida et A. laeta. On ne s’est intéressé ni à A. decurrens, ni à A. farnesiana du fait que la première est rencontrée dans la zone humide d’El-Kala et que la deuxième est une espèce exotique, plutôt utilisée comme plante d’ornementation (Le Floc’h, 1988). A. karroo et A. seyal sont très communs au nord où ils servent comme haies défensives grâce à leurs épines acérées, tandis qu’A. saligna est utilisé surtout dans la stabilisation des dunes côtières en plus de son emploi dans les espaces verts pour son intérêt ornemental. Les Acacias sont quasi-absents dans les hauts plateaux à l’exception de quelques arbres plantés autour des potagers (Exemple à Labiodh Sidi El-Cheikh dans le potager d’un des derniers jésuites dans la région). L’introduction d’ A. saligna dans cette région où les températures nocturnes peuvent atteindre -11°C a été un échec car cette espèce ne tolère pas le gel. En dehors des palmeraies, les lits d’oueds et vallées sont les seuls milieux où l’on rencontre véritablement des arbres sous le nom de «steppes arborées» ou «forêts-steppes» et les vallées sèches à fond limoneux ou caillouteux hébergent des formations d’Acacias. Nos observations rejoignent celles d’Ozenda (1983) qui attestent de la présence d’ A. seyal ; A. tortilis ; A. arabica (A. nilotica) et A. albida au Sahara central et seulement A. tortilis au Sahara septentrional. Néanmoins, A. seyal cité dans les travaux d’Ozenda n’était

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autre qu’ A. ehrenbergiana, ces deux espèces ayant été longtemps confondues (Celles et Manière, 1980). Dans la wilaya d’Adrar, A. nilotica est rarement rencontré tandis qu’A. albida y est inexistant, contrairement à la région de Tamanrasset où sont rencontrés un nombre important d’individus de ces deux espèces. Cette dernière héberge le nombre le plus important d’Acacias en termes de diversité (Sahki et al., 2004). Outre les deux espèces citées précédemment, on y rencontre : A. ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis et A. laeta. Il existe un seul site à Tamanrasset (Oued Taghemsut) hébergeant A. seyal , l’aire de distribution de cette espèce s’étend vers le sud en direction du Niger, par contre, elle est introuvable dans tout le reste du sud Algérien. Le sol algérien semble héberger une diversité intéressante d’espèces d’ Acacia d’une grande rusticité qui survivent dans des conditions pédoclimatiques extrêmes et qu’il serait bon de réhabiliter et d’introduire dans des programmes de reforestation. L’espèce phare mise en avant à ce jour est A. tortilis qui est considérée comme espèce protégée (Décret exécutif n°93/285 du 23 novembre 1993), et les études faites à ce jour prouvent que son taux de régénération naturelle est en équilibre « fragile » dans la région de la Saoura (Bensaid et al., 1996). Ceci encourage sa protection et n’empêche pas d’envisager d’utiliser les autres espèces répertoriées.

Abadllah

Tidikelt Aoulef

A.tortilis A.ehrenbergiana A.seyal. A.nilotica A.karroo A.laeta A.Albida A.saligna Figure 17 : Répartition des Acacias autochtones et introduits en Algérie.

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2- Caractérisation des sites et sols prospectés :

La position géographique, la description écologique ainsi que les moyennes des précipitations annuelles et des températures minimales et maximales durant la période d’échantillonnage de 2004 à 2009 sont reportés dans le Tableau 10. Il est à noter que presque toutes les régions prospectées dépassent des températures maximales estivales de 40°C, avec un pic avoisinant les 50°C à Adrar et toutes connaissent des températures négatives hivernales atteignant -5°C, spécialement à Labiod Sidi El Cheikh. La connaissance des moyennes de température peut influencer les programmes de reforestation car cela détermine le choix des essences forestières utilisées selon leur résistance ou non aux températures extrêmes, ainsi, l’introduction d’ A. saligna qui ne supporte pas les gelées par la direction des forêts de Naâma (wilaya limitrophe d’El- Bayadh) dans cette région a été un échec. Cependant, ces données ne reflètent pas les conditions climatiques des lieux des sites d’échantillonnage, sachant que les relevés sont effectués dans des stations météorologiques à des endroits bien précis. Comme les wilayas ont des superficies importantes, on peut supposer qu’il y ait des différences de température à différents endroits. A titre d’exemple, les habitants d’Oran ressentent une différence de température entre la daïra d’Es-Senia, de Messerghine et d’Oran qui se situent dans la même wilaya. Cependant, ces observations restent une bonne indication des conditions climatiques sur les différents sites. Selon la classification des étages bioclimatiques en Algérie, Oran et Mostaganem font partie des régions semi-arides (pluviométrie entre 300- 600 mm), M’sila et El Bayadh des régions arides (pluviométrie entre 300-100mm) et enfin Adrar et Tamanrasset des régions sahariennes (pluviométrie <100mm).

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Tableau 10 : Description climatique, écologique et situation géographique des sites étudiés.

Position T° moyenne : Moyenne de la géographique (2004 à 2009) pluviométrie Plante hôte Caractéristiques Origine (latitude, annuelle associée du site T° min T° maxi longitude, De 2004 à 2009 °C °C altitude) (mm) Sebkha 35°60.806 N, 500M d'une Messerghine A. seyal 000°65.746 W, dépression saline -0,38 40,65 372,3 (Oran) Alt 1640FT (sebkha) 35°63.874 N, Couvert végétal Es-Senia (Oran) A. seyal 000°61.399 W, -0,38 40,65 369,8 important Alt 1640FT 35°75.124 N, Dunes de Bomo- A. saligna 0°82.921 W, Dunes costales -0,38 40,65 369,8 plage (Oran) Alt 1640FT 35°62.144 N, Forêt de M’sila A. karroo 000°88.963 W, Forêt de pin - 0,38 40,65 369,8 (Oran) Alt 6561FT 35°62.657 N, Messerghine Ferme de culture A. karroo 000°64.905 W, - 0,38 40,65 369,8 (Oran) céréalière Alt 3280 FT 35°45.05 N, Dunes El-Mactaa A. saligna 000°07.328 W, Dunes costales 0,06 41,83 369,8 (Mostaganem) Alt 2FT 35°42.980 N, Khemaissa Couvert végétal A. saligna 4°24.535 E, -2,6 44,71 184,8 (M'sila) important Alt 500FT 36°48.049 N, Couvert végétal Oued Jer (Blida) A. saligna 2°83.390 E, ND ND ND important Alt 2000FT Labiod Sidi El 32°89.465 N, Cheikh A. seyal 000°54.551 E, Verger -4,76 38,34 293,6 (El Bayadh) Alt 500FT 27°89.966 N, Ain Belbel A. ehrenbergiana 1°16.716 E, "Forêt" d' Acacia -0,58 48,96 26,3 (Adrar) Alt 1000FT A. ehrenbergiana 22°56.004 N, Oued In Deladg A. nilotica 005°52.851 E, "Forêt" d 'Acacia -1 38,56 48,16 (Tamanrasset) A. albida Alt 4554FT A. ehrenbergiana 22°35.218 N, Oued Tin 005°23.815 E, "Forêt" d' Acacia Amezzegin (Tam) -1 38,56 48,16 A. tortilis Alt 3740FT 35°35.240 N, Oued Tassena A. ehrenbergiana 000°48.527 O, "Forêt" d' Acacia (Tamanrasset) -1 38,56 48,16 Alt 358FT 22°44.543 N, Tamanrasset A. tortilis 005°38.291 E, "Forêt" d' Acacia -1 38,56 48,16 Alt 4569FT 27°40N, Arbres d'Acacias Tindouf A. tortilis 008°08 W, ND ND ND très espacés Alt 1414 FT ND : Données non disponibles, FT : feet : pieds, T° : température, Min : minimale, Max : maximale

La conductivité électrique, le pH ainsi que la granulométrie des sols sont reportés dans le Tableau 11. Les analyses des différents sols prélevés révèlent que la plupart sont à

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pH alcalin avoisinant 8 et qu’ils sont classés non salés selon l’échelle de Durand (1989); seuls les sols prélevés de la daïra d’Es-Senia et de la Sebkha d’Oran sont considérés comme légèrement salé et salé respectivement. Plusieurs types de sols des régions arides et semi-arides contiennent du CaCO 3, et lorsque de tels sols calcaires ont un excès d’ions Na et un pH élevé ils sont appelés sols alkali et peuvent être peu fertiles (Gupta et Abrol, 1990).

Tableau 11 : Salinité et pH des sols échantillonnés.

Interprétation Conductivité selon l'échelle pH du Origine Texture du sol électrique du de Durand, sol sol mS/cm2 1989 Sebkha Messerghine (Oran) Limoneux 1,29 S 7.92 Es-Senia (Oran) Argileux 0.6 SS 7.94 Dunes de Bomo-plage (Oran) Sablonneux 0,097 NS 8.17 Messerghine (Oran) Pierreux, limoneux, sablonneux 0,234 NS 8,01 Forêt de M’sila (Oran) Argileux 0,14 NS 8.19 Dunes El-Mactaa (Mostaganem) Sablonneux 0,124 NS 8.16 Khemaissa (M'sila) Limoneux 0,28 NS 8.12 Oued Jer (Blida) Argileux 0,29 NS 8.17 Labiod Sidi El-Cheikh (El Bayadh) Argileux, sablonneux 0,29 NS 7,79 Ain Belbel (Adrar) Pierreux, argileux, sablonneux 0,075 NS 7.66 Pierreux, limoneux, sablonneux ( A. 0,105 NS 7.70 Oued In Deladg (Tamanrasset) ehrenbergiana ) Limoneux, sablonneux ( A. tortilis ) 0,105 NS 7.70

Sablonneux ( A. nilotica ) 0,105 NS 7.70 Pierreux, argileux, sablonneux ( A. Oued Tin Amezzegin 0,149 NS 7.80 ehrenbergiana ) (Tamanrasset) Pierreux, limoneux, sablonneux ( A. 0,149 NS 7.80 tortilis ) Oued Tassena (Tamanrasset) Pierreux, limoneux, sablonneux 0,078 NS 8.17 Tamanrasset Pierreux, limoneux, sablonneux 0,326 NS 7.69 Oued Tan-Assennane Pierreux, limoneux, sablonneux 0,081 NS 7.04 (Tamanrasset) Tindouf Pierreux, limoneux, sablonneux 0.440 NS 7.98 NS : non salé ; SS : légèrement salé ; S : salé

3- Taux de germination des graines après les différentes méthodes de désinfection et de scarification La majorité des graines des différentes espèces ont bien germé après désinfection à l’hypochlorite de sodium à 16° pendant 10 minutes et à la scarification manuelle, avec au minimum 95% de germination et même jusqu’à 100% de germination pour A. karroo (Tableau 12), à l’exception des graines d’ A. saligna qui ont mieux germé (75%) à une concentration de 32° pendant 6 minutes. Cependant avec cette méthode de désinfection on 77

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note un taux plus au moins élevé de contamination selon la provenance des graines. Pour des conditions optimales de récolte, les graines doivent provenir de gousses matures prélevées sur l’arbre. La scarification manuelle donne d’assez bon taux de germination selon la littérature (Doran et al., 1986) mais ne peut être utilisée que pour des quantités de graines réduites.

Tableau 12 : Taux de germination des graines de huit espèces d’Acacia selon le mode scarification (chimique ou manuelle) et en fonction du temps d’immersion.

Scarification manuelle Scarification chimique

Espèce Provenance Désinfection à l’hypochlorite de sodium : Désinfection à l’acide d’ Acacia des graines degrés de chlorure/durée d’immersion (minutes) sulfurique à 98% (36N)

12°/6min 12°/20min 16°/10min 32°/6min 20min 60min 120min A. tortilis INRF 5% 32% 95% 42% / 30% 56% A. seyal INRF 15% 20% 98 % 31% 96 % 34% / A. albida INRF 86% / / 90% 96% / / A. laeta INRF 33% 7% / 35% / / / A. ehrenbergian a INRF 5% 36% 95% 44% 90% / / A. nilotica INRF 26% 37% 98% 50% / / 80% A. karroo Oran 100% 100% 100% 100% 19% 94% 100% A. saligna Oran 69% 6% 69% 75% 13% 94% 100% / : Absence de germination, INRF : Institut National de Recherche en Foresterie (Tamanrasset).

La scarification à l’acide sulfurique concentré donne différents résultats selon le temps d’immersion qui est spécifique à chaque espèce. Le taux de germination est de 56% à 120 minutes pour A. tortilis alors qu’il a atteint 95% avec la scarification manuelle. Ce taux de germination après scarification chimique est faible comparativement aux résultats obtenus

par Danthu (2003) qui a reporté des taux de 96, 97 et 97% après trempage dans du H 2SO 4 pendant 60, 120 et 240 min respectivement. Par contre, une immersion de 20 minutes dans de l’acide concentré a donné un taux de germination supérieur à 90% pour A. seyal, A. albida et A. ehrenbergiana , ce qui rejoint la littérature concernant A. seyal , dont le temps de trempage est de 20-30 minutes (Lortet et al., 1996) et celui d’ A. albida qui est de 20-60 minutes (Doran et al., 1986). Le temps de scarification n’a pas été étudié pour A. ehrenbergiana. D’un autre côté , A. nilotica a germé à 80% après immersion dans du

H2SO 4 pendant 120 minutes en accord avec Nas (1980) qui a donné l’intervalle de 60-120 minutes. Malheureusement, le taux de germination de A. laeta était très faible, surtout avec la scarification chimique car selon la littérature, son temps d’immersion optimal est de 14 minutes, semblable à A. senegal , donc inférieur à 20 minutes (de Lajudie et al., 1994).

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Contrairement à la germination d’ A. karroo qui était de 100% après 120 minutes d’immersion, ce qui rejoint les résultats de Mohamed et al., (2000) ; le même résultat est obtenu pour A. saligna (100% de germination), on note qu’il est plus élevé que celui obtenu par Shaybany et Rouhani (1976) qui était de 80%. Les graines provenant de ces deux arbres ne dépassaient pas un an de stockage, ce qui confirme que le temps et les conditions d’entreposage jouent un rôle important dans le taux de germination. La scarification est une étape primordiale dans l’utilisation des plantules autant au laboratoire qu’en pépinière. La levée de la dormance est indispensable pour optimiser la germination des graines et par le même biais permet d’économiser ces dernières dont le stock peut être limité, surtout si elles proviennent d’individus rares, ayant un génotype tolérant des contraintes pédoclimatiques extrêmes.

4- Impact de la profondeur d’échantillonnage dans les lits d’oueds desséchés sur l’isolement des populations rhizobiennes Aucune nodosité n’ayant été rencontrée in natura en zone aride, le recours à une étape intermédiaire de piégeage était indispensable, comme cela l’a été dans de nombreux travaux qui ont utilisé cette méthode pour mettre en évidence la diversité des populations rhizobiennes en particulier chez les légumineuses ligneuses (Odee et al., 1997 ; de Lajudie et al ., 1998b ; Diouf et al ., 2007). De plus, la sécheresse est un facteur qui limite la formation de nodosités même si le sol abrite des souches compatibles (Fagg & Allison, 2004). L’abondance de la population rhizobienne est elle-même fortement corrélée à l’intensité de la nodulation et de la croissance de l’hôte (Thrall et al., 2007), sachant que les végétaux dans les régions arides ne se développent que lorsque les conditions favorables sont réunies (Dajoz, 2003 ; Frontier et al ., 2004), en outre, ils privilégient le développement végétal (principalement racinaire) au détriment de la formation nodulaire qui est friande en énergie (Sprent et Vandamne, 2007). La profondeur de l’échantillonnage du sol ne semble pas avoir un impact sur l’abondance de la nodulation (Tableau 13), quoiqu’il y ait un nombre de nodosités légèrement supérieur obtenus à la profondeur de 40 cm, peut être lié à son humidité relative (Danso, 1992). L’abondance de la nodulation pourrait également être liée au phénomène d’érosion, si l’on considère que pendant la période des crues, de grosses quantités de substrat de sol sont transportées sur des distances importantes, bien que ces changements d’état du sol soient difficilement estimables, et fluctuent selon sa composition et des précipitations.

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Les deux méthodes de piégeage ont réussi majoritairement dans trois sites (Tableau 13). Dans le cas du site Oued Taghemsut, le piégeage en pot était plus fructueux contrairement au site Oued In Daladg où c’était plutôt l’utilisation des tubes Gibson. On ne peut pas établir de conclusion générale quant à la meilleure méthode de piégeage, le meilleur taux de nodulation semble plutôt lié à la bonne homogénéisation de l’échantillon du sol qu’à la méthodologie elle-même. On note l’absence de nodosités chez A. albida sur le sol de Oued Tassena contrairement à celui de Oued In Daladg, ainsi qu’une pauvreté en nodosités chez A. laeta sur le sol de Oued Tan-Assennane comparativement à celui originaire de Oued Tassena. Dans le cas de A. nilotica , il y a eu peu de nodosités obtenus en général quelque soit le site. Le meilleur taux de nodulation est observé chez A. ehrenbergiana suivi d’A. tortilis. En général, les méthodes d’échantillonnage affectent l’évaluation de la diversité des rhizobia, autant quantitativement que qualitativement (Bala et Giller, 2001). En ce qui concerne cette étude, l’utilisation d’une dilution de 10 -1 de sol a été fructueuse, sans les complications de contaminations fongiques souvent rencontrées (Alberton et al., 2005), ceci pourrait s’expliquer par la nature aride du site de prélèvement contrairement aux zones tropicales. Cependant, il semble qu’une faible dilution privilégie les souches les plus compétitives, alors qu’une forte dilution favorise la révélation d’une plus grande diversité, dans le sens où les souches les moins compétitives peuvent induire la formation de nodosités sans être entravées par les plus compétitives qui sont moins nombreuses (Bala et al., 2001). La dilution choisie dépend du but recherché par l’échantillonnage, on peut s’intéresser à la diversité des populations rhizobiennes, ou bien alors on cible les rhizobia les plus compétitifs et efficients qui seront utilisés pour une amélioration du rendement ainsi qu’une meilleure survie au champ après le transfert des plants inoculés. Quant à la forme et la croissance des nodosités, elles variaient de déterminées à indéterminées quelque soit l’espèce et le site prospecté, alors que les nodosités des légumineuses ligneuses, en particulier les Acacias ont une croissance indéterminée et sont ligneuses (Dommergues et al., 1999).

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Tableau 13: Résultats du taux de nodulation du piégeage sur tubes Gibson et dans les pots.

Nombre de Nombre de Profondeur Site d'échantillonnage Espèce hôte plants nodulés/4 nodosités dans les du sol Tubes Gibson pots 20 cm 0 0 A. albida 40 cm 0 0 60 cm 0 0 20 cm 2 1 A. tortilis 40 cm 4 5 Oued Tassena 60 cm 4 7 (Tamanrasset) 20 cm 3 0

A. leata 40 cm 3 0 60 cm 2 14 20 cm 2 0 A. 40 cm 4 4 ehrenbergiana 60 cm 3 5 20 cm 3 1 A. 40 cm 4 0 ehrenbergiana 60 cm 4 3 Oued Tin Amezzegin 20 cm 2 0 (Tamanrasset) A. nilotica 40 cm 0 0 60 cm 1 0 20 cm 3 4 A. tortilis 40 cm 4 4 60 cm 3 5 20 cm 0 0 Oued Idekel A. nilotica 40 cm 0 2 (Tamanrasset) 60 cm 1 0 20 cm 0 2 Oued Tan-Assennane A. leata (Tamanrasset) 40 cm 2 0 60 cm 1 0 20 cm 1 0 A. albida 40 cm 2 0 60 cm 2 0 Oued In Daladg 20 cm 4 0 A. (Tamanrasset) 40 cm 2 0 ehrenbergiana 60 cm 3 0 20 cm 0 0 A. nilotica 40 cm 2 0 60 cm 2 0

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Tableau 13 (suite): Résultats du taux de nodulation du piégeage sur tubes Gibson et dans les pots.

Nombre de plants Site Profondeur Espèce hôte nodulés/4 Nombre de nodosité dans les pots d'échantillonnage du sol Tubes Gibson 20 cm 0 0 A. tortilis 40 cm 1 4 Oued In Tounin Tassekra 60 cm 1 3 (Tamanrasset) 20 cm 2 4 A. 40 cm 3 3 ehrenbergiana 60 cm 3 5 20 cm 0 3 A. seyal 40 cm 2 5 60 cm 0 4 Oued Taghemsut 20 cm 0 3 (Tamanrasset) A. seyal 40 cm 0 3 60 cm 1 7 20 cm 0 2 A. tortilis 40 cm 0 3 60 cm 0 2 20 cm 0 NF A. nilotica 40 cm 0 NF A. 20 cm 2 NF Ain Belbel (Aoulef, ehrenbergiana 40 cm 2 NF Adrar) A. 20 cm 3 NF ehrenbergiana 40 cm 2 NF 20 cm 0 NF A. tortilis 40 cm 0 NF 0: Pas de nodosités ; NF : Non fait

5- Isolement, purification et statut symbiotique des souches

Une totalité de 288 isolats ont été obtenus à partir de nodosités récoltés in situ ou après piégeage: 61 associés à A. ehrenbergiana , 55 à A. saligna , 44 à A. seyal , 37 à A. tortilis , 36 à A. karroo , 29 à A. nilotica , 16 à A. laeta et 10 à A. albida. La distribution des isolats par espèce et par site géographique est illustrée dans le Tableau 14. Le nombre de souches par site n’est pas homogène, malgré une large couverture des sites arides et semi- arides, cela étant dû au fait que pour certaines zones de prospection, la quantité de sol prélevé était insuffisante pour des piégeages à répétition et que le nombre de nodosités obtenues était faible.

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Tableau 14: Nombre d’isolats par espèce d’Acacia et par site prospecté.

Nombre d’isolats Sites prospectés Climat A. A. A. A. A. A. A. A. karroo saligna seyal tortilis ehrenbergiana laeta albida nilotica 100M de la sebkha de Semi aride 20 Messerghine -Oran Es-Senia -Oran Semi aride 2 Dunes de Bomo-plage - Semi-aride 1 37 Oran Ferme de Messerghine - 13 Oran Semi aride Forêt de M’sila -Oran Semi aride 16 Dune d'El Mactaa- Zone côtière: 16 Mostaganem méditerranéen Madagh -Oran sec 2 Khemais -Relizane Aride 1 Oued Djer -Blida Semi aride 4 Ain Defla Aride 1 Verger (Labiod Sidi El Aride 4 Cheikh) -El Bayadh- Hauts plateaux Ain Belbel (Aoulef-Adrar Aride 1 14 Oued In Deladg (Tam) Aride 15 10 18 Oued Tin Amezzejin Aride 12 7 7 (Tam) Oued Tassena (Tam) Aride 19 12 12 Potager (Tam) Aride 3 Oued Idekel (Tam) Aride 2 Oued Tan-Assennane Aride 4 (Tam) Oued (In Tounin) Aride 1 10 Tassekra (Tam) Oued Taghemsut (Tam)* Aride 18 Tindouf Aride 2 2 Bechar Aride 2 *: seul site avec A.seyal, Tam : Tamanrasset

En général, l’abondance des rhizobia est corrélée négativement avec certains facteurs pédologiques incluant l’azote et positivement avec le carbone organique et les capacités d’échange cationique (Thrall et al., 2007), ce qui pourrait expliquer l’abondance de la nodulation dans des sols provenant de certains endroits comme pour A. albida à Oued In Daladg contrairement à Oued Tassena. L’abondance rhizobienne dans ces sols est aussi fortement corrélée aux variations dans la nodulation et la croissance de l’hôte (Thrall et al., 2007) , alors comme cela a été évoqué dans le paragraphe §4, la nodulation est un phénomène qui se produit sous certaines conditions en zones arides où la plante favorise d’abord son développement végétal au dépend de la formation coûteuse en énergie de nouveaux organes comme les nodosités.

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La majorité des souches purifiées présentaient une couleur blanchâtre, crème ou transparente, un aspect muqueux, quelques fois marbré (Figure 18). Les colonies isolées avaient un contour régulier et étaient plus au moins bombées, de plus elles étaient sans odeur et sans pigments. Sous microscopie, elles se présentaient sous forme de coccobacilles ou de bâtonnets Gram négatif (Figure 19), ce qui est en accord avec les caractères morphologiques et microscopiques déjà décrits pour les rhizobia dans la littérature (Dommergues et Mangenot, 1970 ; Jordan et Allen, 1974). Les souches à croissance lente présentaient un aspect plus « sec », les colonies étaient plus petites après un temps d’incubation de 3 jours.

1 µµµ m

Figure 18 : Aspect macroscopique de la Figure 19 : Aspect macroscopique de la souche SE2 après 48h d’incubation à 28°C . souche SE2 au grossissement X1000.

Cependant pour confirmer leur statut de BNL, les souches doivent renoduler leur plante hôte, alors que cette condition n’a été remplie que par 83 souches, ce qui constitue le quart des isolats listés dan le Tableau 15. Dans un premier temps les plantes inoculées ont été comparées globalement aux plantes témoins : la hauteur, le développement général et la couleur. Les souches considérées infectives (I) ont initié la formation de nodosités mais les plantes inoculées ne présentaient aucune différence de croissance comparativement aux témoins non inoculés contrairement aux souches considérées comme efficientes (E) qui ont induit une croissance plus importante des parties aériennes. Le nombre de nodosités a été reporté ainsi que leur aspect morphologique (Tableau 15). Elles se présentaient sous une forme déterminée (ronde) ou indéterminée (allongée) et leur couleur variait de rose à blanche et était même noirâtre. La forme indéterminée est caractérisée par un méristème apical persistant tandis que la forme déterminée en est dépourvue, la première est allongée car de nouvelles cellules sont constamment ajoutées à l’extrémité distale du nodule tandis

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que la deuxième est arrondie du fait que les cellules s’élargissent et que leur division cesse tôt (Hirch, 1991). D’après Allen et Allen (1981), les légumineuses ligneuses possèdent généralement des nodosités indéterminées chez les Mimosoideae tandis que les nodosités formées sur les racines des différents plants testés étaient déterminés et indéterminés, ceci pourrait peut être s’expliquer par le fait que le méristème apical persistant n’est pas facilement détectable chez les Acacias (Räsänen, 2002). La couleur rose révélant la présence de leghémoglobine, un pigment transporteur d’oxygène et élément indispensable à l’activité de la nitrogénase, semble être indicatrice de l’efficience du nodule (Kaminski et al ., 1998). Les résultats du Tableau 15 démontrent qu’environ 56% des souches renodulantes sont efficientes, améliorent nettement la masse de feuillage et sa couleur. Cette première estimation étant légèrement subjective, les souches fixatrices seront retestées sous les mêmes conditions en quantifiant le poids sec, le nombre et le poids des nodosités. Cela permettra de mettre en évidence les souches les plus performantes, résultats §9, pp 108. Notons que l’efficience est un critère majeur dans le choix de souches de rhizobia utilisables dans le cadre de programmes de reforestation, cependant, l’étude de la biodiversité des souches renodulantes associées aux Acacias reste de mise. Le phénomène de la non-renodulation observé chez les 2/3 des souches purifiées dans cette étude peut être expliqué par le fait que ces dernières ont pu perdu leur information symbiotique notamment leurs gènes nod, durant la symbiose ou après des repiquages successifs sur des milieux artificiels (Macharet, 1997). Il se peut également que lors des purifications, les souches endophytes naturellement présentes dans les nodosités (Rosenblueth et Martinez-Romero, 2006 ; Lin et al. , 2008) aient été isolées au dépend de souches de rhizobia nodulantes coexistantes. A noter que certaines souches non renodulantes ont quand même permis l’amélioration de la croissance végétale comparativement aux plantes non inoculées, présentant un effet PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) notable, comme c’est le cas de la souche SAB3 (Figure 20).

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Tableau 15 : Liste des souches renodulantes, leur statut symbiotique et aspects des nodosités. Nombre Statut Aspect des Souches Plante hôte Origine moyen des symbiotique nodosités nodosités SE21a E 3 Bl Det SE21b E 4 Bl Det SE23bc E 6 Bl Det 100M de la sebkha de Messerghine SE24a A. seyal E 8 Bl Indet (Oran) SE24c E 3 Bl Det SE25a E 3 Bl Det SE25d E 4 Bl Det SE3 E 2 RS Det A. seyal Es-Senia (Oran) SE2 E 1 RS Indet SAO2B I 1 RS Indet SABS I 1 Bl Indet SABN1 I 1 Bl Indet SAB3* E 0 / SAB4a E 7 RS Det SAB4b E 3 Bl Det SAB4c E 3 RS Det SAB4 I / / SAB5 E 4 RS Det SAB7 E 3 RS Indet SAB9 E 7 RS Det SAB10 E 8 RS Det SAB11 E 5 RS Det SAB12b E / / SAB13 E 3 Rs indet A. saligna SAB8a Dunes de Bomo-plage (Oran) E 6 RS Det SAB8b E 13 RS Det SAB15a E 2 Bl Det SAB15b E 3 Bl Det SAB17a I 1 Bl Det SAB17b I 1 Bl Det SABN1a I 1 Bl Det SABN1b I 1 Bl Det SABN1c I 1 Bl Det SABN2a I 1 Bl Det SABN2c I 1 Bl Det SABN4a I 1 Bl Det SABN4b I 1 Bl Det SABN5b I 1 Bl Det KHB A. karroo E 6 RS et Bl Indet K31 I 3 Bl Det K32a I 2 RS Det K32c A. karroo Ferme de Messerghine I 5 RS Det K33b I 5 Bl Det K34a E 3 Bl Det

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Tableau 15 (suite) : Liste des souches renodulantes, leur statut symbiotique et aspects des nodosités. Nombre Statut Aspect des Souches Plante hôte Origine moyen des symbiotique nodosités nodosités K1a E 6 RS Indet K1b E 3 Bl Det K2b I 6 RS Det A. karroo Forêt de M’sila K2d E 9 RS Indet K4a I 5 RS Det K4c I 2 Bl Indet SA13b E 12 RS Det SA14b A. saligna Dune d'El Mactaa (Mostaganem) E 8 RS Det SA15b E 6 RS Det KHML E 1 RS Indet A. karroo Madagh –Oran KHMR I 3 Bl Indet SAKS A. saligna Khemais (Relizane) E 2 RS Indet KOH I 1 Bl Det A. karroo Oued Jer (Blida) KO1 E 1 RS Indet SAAIS A. saligna Ain Defla E 2 RS Indet SE243a E 4 Bl Det SE243b E 5 Bl Det A. seyal Labiod Sidi El Cheikh (El Bayadh) SE243c E 12 Bl Indet SE243d E 8 Bl Indet E231a I 3 Bl Det

E231b A. ehrenbergiana Ain Belbel (Adrar) E 5 Bl Det E231c E 14 Bl Det E232 I 1 Bl Det N145 A. nilotica I 1 Bl Det E134ab E 4 RS Det E134b A. ehrenbergiana Oued In Daladg (Tamanrasset) E 11 RS Det E128Eb I 4 RS Det A121 A. albida E 1 RS Det E60 A. ehrenbergiana Oued Tin Amezzegin (Tamanrasset) I 3 Bl Indet E45 I 3 RS Det E39 I 2 Bl Det A. ehrenbergiana E42 I 2 Bl Det E47 Oued Tassena (Tamanrasset) I 2 Bl Det T80 I 2 Bl Det A. tortilis T18 E 1 Bl Indet E86 A. ehrenbergiana Djenen ben Mbarek (Tamanrasset) I 1 Bl Det N8 I 2 RS Indet A. nilotica N81 Tindouf I 2 RS Indet T82 A. tortilis I 3 RS Indet T120 A. tortilis Tamanrasset I 2 /

E : efficient, I : infectif ;RS : rose ; Bl : blanche ; Det : déterminé ; Indet :indéterminé ; / :Non reportés. *SAB3 montre un effet PGPR important et a été gardée dans le Tableau des souches renodulantes, afin de l’inclure dans les différentes analyses et caractérisation par séquençage partiel du 16s-ADN (Figure 20)

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Témoin

03 plants inoculés avec SAB3 sans nodosités

Figure 20 : Effet PGPR (Plant Growth Promoting) de la souche SAB3.

6- Caractérisation génétique par séquençage partiel du 16S rARN

En plus des caractères morphologiques, microscopiques et le test de nodulation, le séquençage du gène 16S-rARN a été effectué sur 60 souches choisies en fonction de l’aspect macroscopique des colonies sur boîtes de Petri. Ce dernier critère est recommandé généralement pour le typage et l’identification des bactéries au niveau spécifique et générique (Gürtler et Stanisich, 1996 ; Vandamme et al., 1999). Pour mieux discuter des résultats phénotypiques, la caractérisation moléculaire basée sur le séquençage partiel du 16S rARN est présentée ici en premier. Le résultat du BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) des séquences (Tableau 16) a révélé une grande diversité génétique ente les différentes souches isolées avec une homologie toujours ≥98%. Les souches isolées appartiennent aux 9 genres suivants: Rhizobium, Ochrobactrum, Agrobacterium, Ensifer, Phyllobacterium, Mesorhizobium, Devosia, Bradyrhizobia et Burkholderia . Sur la base des résultats du BLAST, les souches renodulant A. seyal appartiennent aux espèces : Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (4 souches) et bv. viciae (1), Rhizobium sp. (3), Ochrobactrum sp. (2), montrant ainsi une prépondérance de Rhizobium . Celles associées à A. saligna se rapprochent pour la plupart aux souches à croissance lente de Bradyrhizobium sp. (10) et pour le reste des souches à croissance rapide de Rhizobium sp. (6), Ensifer sp. (3), Mesorhizobium sp. (1), Phyllobacterium sp. (1), Devosia neptuniae (1) et Agrobacterium tumefaciens (1), ainsi qu’à des souches bactériennes indéterminées (quatre Uncultured bacteriu et une Uncultured alpha-proteobacterium). Quant à A. ehrenbergiana , les souches qui lui sont associées sont affiliées à Ensifer terangae (1) et

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Ensifer sp. (1), Mesorhizobium sp. (1), Burkholderia cepacia (1) et Devosia yakushimanensis (1) ainsi qu’une souche indéterminée (Uncultured alpha proteobacterium ). Concernant A. karroo, les souches associées sont classées comme Ensifer meliloti (5) et E. fredii (1) ainsi que Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (5). Les souches isolées de nodosités d’A. tortilis et renodulantes sont Ensifer sp . (1) ; Burkholderia cenocepacia (1) et Agrobacterium tumefaciens (1), celle isolée de A. nilotica se rapprochant plutôt de Rhizobium sp . tandis qu’A. albida est associé à Mesorhizobium sp .

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Tableau 16 : Comparaison des séquences obtenues par séquençage partiel du gène 16S rARN avec les séquences de référence de la base de données Genbank du site NCBI.

Résultat du BLAST du séquençage partiel du 16S rARN à partir de la base de données NCBI Souches Plante hôte (National Center for Biotechnology Information) % de similitude genbank

SE21a R. leguminosarum bv. trifolii 99 SE21b R. leguminosarum bv . trifolii 99 SE23bc R. leguminosarum bv . viciae 99 SE24a Rhizobium sp . 99 SE25a A. seyal R. leguminosarum bv . trifolii 99 SE25d R. leguminosarum bv . trifolii 99 SE3 Rhizobium sp . 99 SE243a Ochrobactrum sp. 99 SE243c Rhizobium sp. 99 SE243d Ochrobactrum sp. 99 SAB3 Rhizobium sp . 99 SAB5 Rhizobium sp . 99 SAB9 Rhizobium sp . 99 SAB10 Mesorhizobium sp . 99 SAB11 Devosia neptuniae 99 SAB12b Rhizobium sp . 100 SAB13 Ensifer sp . 100 SAB4a Uncultured bacterium clone KPF200711-118 99 SAB4b Uncultured bacterium clone KPF200711-118 99 SAB8a Uncultured bacterium clone KPF200711-118 99 SAB8b Uncultured bacterium clone KPF200711-118 99 SAB15a Phyllobacterium sp . 97 SAB15b Rhizobium sp . 100 SAB17a Ensifer sp . 100 A. saligna SABN1a Bradyrhizobium sp . 98 SABN1b Bradyrhizobium sp . 99 SABN1c Bradyrhizobium sp . 99 SABN2a Bradyrhizobium sp . 98 SABN2c Bradyrhizobium sp . 99 SABN4a Bradyrhizobium sp . 98 SABN4b Bradyrhizobium sp . 98 SABN5a Bradyrhizobium sp . 98 SAB17b Ensifer sp . 99 SA13b Bradyrhizobium sp . 99 SA14b Uncultured alpha proteobacterium 99 SA15d Bradyrhizobium sp . 100 SAKS Agrobacterium tumefaciens 99 SAAIS Rhizobium sp . 99

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Tableau 16 (suite) : Comparaisons des séquences obtenues par séquençage partiel du gène 16S rARN avec les séquences de référence de la base de données Genbank du site NCBI.

K31 Rhizobium leguminosarum bv . trifolii 99 K32a Rhizobium leguminosarum bv . trifolii 99 K32c Rhizobium leguminosarum bv . trifolii 100 K33b Rhizobium leguminosarum bv . trifolii 99 K34a Rhizobium leguminosarum bv . trifolii 99 K1a A. karroo Ensifer meliloti 99 K1b Ensifer meliloti 99 K2b Ensifer meliloti 99 K2d Ensifer fredii 100 K4a Ensifer meliloti 99 K4c Ensifer meliloti 99 N145 A. nilotica Rhizobium sp . 99 A121 A. albida Mesorhizobium sp . 99 E231a Mesorhizobium sp . 99 E231b Burkholderia cepacia 99 E231c A. ehrenbergiana Ensifer sp . 99 E134ab Devosia yakushimanensis 98 E60 Ensifer terangae 99 E42 Uncultured alpha proteobacterium 99 T18 A. tortilis Burkholderia cenocepacia 99 T82 A. tortilis Ensifer sp. 99 T120 Agrobacterium tumefaciens 99

Pour élucider la position taxonomique des souches, les séquences alignées de ces dernières ont été comparées à des espèces reconnues de BNL, d’ Agrobacterium et d’autres espèces phylogénétiquement proches, symbiotiques et non symbiotiques. On peut distinguer 10 groupes bien distincts dans l’arbre de l’ARNr 16S obtenu (Figure 21) : - Le premier groupe proche de Rhizobium comporte 18 souches : 10 d’entres elles sont proches de R. leguminosarum : 5 isolées d’A. seyal (SE21a, SE23bc, SE24a, SE25a et SE25d) et 5 d’A. karroo (K31, K32a, K32c, K33b et K34a). Il se détache de ce groupe la souche SE21b associée à A. seyal avec un bootstrap de 87%. Notons qu’A. seyal est généralement associé à Mesorhizobium plurifarium (de Lajudie et al ., 1998b; Diouf et al ., 2007), à Ensifer sp. (Diouf et al., 2007), à E. saheli bv acaciae et E. fredii (Wolde-Meskel et al., 2005) et à E. terangae (Diouf et al., 2007), sauf en Ethiopie où A. seyal a été décrit comme étant associé à R. etli (Wolde-Meskel et al., 2005). En revanche, A. karroo, a été rapporté comme étant associé symbiotiquement avec Rhizobium tropici au Kenya (Mac Inroy et al. , 1999) mais jamais avec R. leguminosarum. Les deux autres souches restantes

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dans ce groupe sont SAAIS qui est associée à A. saligna et SE3 associée à A. seyal, la première groupant avec R. tropici , comme décrit par Nada et al. (1999) et Amrani et al. (2010), la seconde groupant avec Rhizobium sullae , cette affiliation différant de celles observées chez A. seyal dans les études précédentes. Un sous-groupe fort (bootstrap à 99%) se détache de l’ensemble, incluant 5 souches associées à A. saligna isolées de Bomo plage –Oran- (SAB15b, SAB5, SAB12b, SAB3 et SAB9). Afin de préciser la position taxonomique de ce dernier groupe, le séquençage de gènes de ménage s’avère nécessaire. - Le deuxième groupe comprend deux souches isolées d’A. seyal en provenance de Labiod Sidi El Cheikh qui sont phylogénétiquement proches d’Ochrobactrum et groupées séparément (Bootstrap 99%) des 3 souches d’Ochrobactrum renodulantes, à savoir : O. lupini, O. cytisi et O. ciceri (Trujillo et al. , 2006 ; Zurdo-Pinero et al. , 2007 et Imran et al., 2010). Ces souches SE243d et SE243a des régions arides de Labiod Sidi El-Cheikh, sont hautement efficientes (Tableau 13). Une seule étude à ce jour, menée chez A. mangium et A. albida , a prouvé la capacité d’ Ochrobactrum à renoduler et fixer l’azote chez des légumineuses arborées (Ngom et al. , 2004). - Le troisième groupe est proche d’ Agrobacterium et compte 5 souches. Cependant, il existe une grande disparité à l’intérieur même du clade, deux souches se détachant d’ Agrobacterium tumafeciens et A. radiobater , SE243C et T120 précisément, qui sont associées à A. seyal et A. tortilis respectivement, et qui pour la première a été classée après BLAST comme Rhizobium sp et évaluée comme efficiente (Tableau 13). Différentes études de taxonomie des BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) associées aux Acacias ont déjà mis en évidence la présence d’ Agrobacterium dans les nodosités (de Lajudie et al., 1999; Khbaya et al., 1998). Cependant, ils formaient des nodules inefficients, comme pour Agrobacterium tumafeciens associé à A. seyal (Diouf et al , 2007), tandis que d’autres au contraire ne renodulaient pas du tout (Odee et al ., 2002). Dans ce groupe proche d’ Agrobacterium se détache également la souche SA14b associée à A. saligna et efficiente (Tableau 13), de même qu’un sous-groupe de deux souches, N145 et E42, associées à A. nilotica et A. ehrenbergiana respectivement. Ces trois dernières souches très proches (bootstrap 98 et 96%) sont groupées entre A. rubi et A. vitis . A noter que N145 a été aussi classée comme Rhizobium sp. après BLAST (Tableau 13). Il ressort de ces observations que le séquençage partiel ne permet pas une affiliation optimale des souches nouvellement isolées et que l’analyse de la séquence complète du 16S, ainsi que d’autres séquences comme celles de gènes de ménage, donnerait une position taxonomique plus précise, d’autant que le groupe des rhizobia et des agrobacteria est considéré comme

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étant monophylétique et dont les positions taxonomiques font l’objet de travaux et de réflexions approfondis (Young et al., 2001 ; Sawada et al., 2003 ; Farrand et al., 2003). Les uns militent pour renommer tous les agrobacteria en rhizobia tandis que les autres refusent de grouper ensemble des bactéries symbiotiques fixatrices d’azote et des bactéries pathogènes. De plus, il ressort des différentes études effectuées sur les Agrobacterium que ces derniers sont très réceptifs au transfert latéral des gènes de nodulation, ce qui pourrait expliquer leur capacité à réinfecter leur plante hôte (de Lajudie et al., 1999 ; Martinez et al., 1987). Cet arbre phylogénétique démontre aussi que R. giardinii n’a aucune appartenance stable avec l’un ou l’autre des groupes de Rhizobium ou d’ Agrobacterium, ce qui rejoint ce qui a été déjà évoqué par Young et al. (2001). - Le quatrième groupe est proche d’ Ensifer et englobe 13 souches. Le sous-groupe le plus important incluant E. meliloti comporte 9 souches : SAB13, SAB17a et SAB17b associées à A. saligna, ce qui est en accord avec les résultats de Amrani et al. (2010). K1a, K2b et K4a sont associées à A. karroo, leur affiliation à E. meliloti diffèrant de ce qui a été mentionné chez cette espèce d’ Acacia au Maroc où les souches qui leur étaient associées étaient groupées avec E. fredii et Ensife r sp. (Khbaya et al., 1998) ainsi qu’au Sénégal où elles étaient proches de E. terangae biovar acaciae (de Lajudie et al. , 1994). La septième souche est E231c associée à A. ehrenbergiana, alors que les deux dernières K1b et K4c, toutes deux associées à A. karroo se détachent de l’ensemble et forment un groupe à part, ceci pouvant être dû à leur longueur de séquence trop courte. Plus haut dans l’arbre phylogénétique, la souche E60 isolée des nodosités d’ A. ehrenbergiana est proche de E. terangae, alors que SAKS isolée d’ A. saligna rejoint Ensifer kostiense. Il faut noter que cette dernière rejoint Agrobacterium après BLAST (Tableau 13), et que le seul Acacia qui soit associé à cette espèce bactérienne (Ensifer kostiense) est A. senegal (Nick et al., 1999b) . La souche T8 associée à A. tortilis se détache de la branche d’ Ensifer kostiense. Les rhizobia du groupe Ensifer associés à A. tortilis sont généralement caractérisés comme E. fredii, E. medicae et E. saheli bv acaciae en Ethiopie (Wolde-meskel et al., 2005), E. terangae bv acaciae (Ba et al ., 2002) et E. meliloti en Tunisie et au Maroc (Ben Romdhane et al., 2006; Khbaya et al., 1998). La souche K2d isolée des nodosités d’ A. karroo est proche de E. fredii qui n’était décrit jusqu’alors qu’associé à A. nilotica A. seyal, A. tortilis; A. salicina et A. stenophylla (Mc lnroy et al., 1999; Wolde-Meskel et al., 2005; Hoque et al., 2011). Une seule souche SAB15a isolée d’ A. saligna fait partie du cinquième groupe des Phyllobacterium, proche de P. bourgognense . Ce groupe pourrait être rattaché au groupe

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des Mesorhizobium (Young et al. , 2001) mais ils sont suffisamment distincts pour les séparer (bootstrap 99%). Cette souche isolée de Bomo plage –Oran- forme des nodules effectifs (Tableau 13). Les mêmes résultats ont été signalés par Van Veen et al. (1988) qui a rapporté la formation de nodosités racinaires chez Vicia sativa par Phylobacterium myrsinacearum après l’introduction du plasmide symbiotique (pSym) de Rhizobium leguminosarum , indiquant que le gène chromosomal impliqué dans la formation nodulaire est fonctionnellement présent chez la bactérie. D’autres chercheurs (Valverde et al., 2005) ont récemment isolé une souche de Phyllobacterium qui forme des nodosités infectives sur les racines de Trifolium pratense et Lupinus albus , ainsi que chez une légumineuse ligneuse Dalbergia sp. à Madagascar (Rasolomampianina et al., 2005) et chez A. saligna en Australie (Hoque et al., 2011). - Le sixième groupe proche de Mesorhizobium renferme trois souches : SAB10 associée à A. saligna qui est groupée avec Mesorhizobium mediterraneum et deux souches très proches (bootstrap 99%) A121 et E231a associées à A. albida et A. ehrenbergiana respectivement et qui sont groupées séparément des souches de Mesorhizobium de référence utilisées. Le genre Mesorhizobium a prouvé sa capacité à renoduler A. saligna (Amrani et al., 2010 ; Lafay et al. 2001), A. ehrenbergiana (Noureddine et al., 2010) et A. albida (Odee et al., 2002) mais les souches correspondantes n’ont pas été isolées directement à partir des nodosités de ces arbres sauf chez M. amorphae associée à A. saligna (Rodríguez-Echeverría et al., 2011). - Le septième groupe incluant Devosia comporte deux souches : SAB11, efficiente et associée à A. saligna groupe avec le seule espèce de ce genre nodulant une légumineuse aquatique : Devosia neptuniae ( Rivas et al., 2003) et une autre souche à part, E134c associée à A. ehrenbergiana efficiente elle aussi (Tableau 13). Les deux sites d’échantillonnage sont très éloignés et contrastés, l’un étant situé sur des dunes côtières à proximité d’Oran et l’autre sur un lit d’oued desséché, l’Oued In Deladg à Tamanrasset. Des souches associées à A. saligna en Australie ont aussi été caractérisées comme Devosia neptuniae (Hoque et al., 2011). - Le huitième groupe incluant le genre Bradyrhizobium comporte exclusivement des souches isolées d’ A. saligna : SABN5a groupe avec B. elkanii alors qu’au Kenya, A. saligna avait été décrit comme associé à B. liaoningense (Wolde-Meskel et al. , 2005) et en Australie à B. canariense (Rodríguez-Echeverría et al., 2011). Dans cet arbre, neuf souches sont proches de B. betae. Ces résultats rejoignent ceux rapportés dans la littérature qui montrent qu’ A. saligna peut être nodulé à la fois par des rhizobia à croissance lente et à

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croissance rapide avec une prédominance de ceux à croissance lente (Barnet et Catt, 1991; Marsudi et al., 1999; Nada et al. , 1999). Ces auteurs ont conclu que les souches isolées des régions arides étaient à croissance rapide et qu’à l’opposé, celles isolées des régions humides étaient plutôt à croissance lente. Plus précisément, Barnet et Catt (1991) ont conclu que la proportion des souches rhizobiennes à croissance rapide était corrélée avec la sévérité des conditions de dessiccation, de chaleur et de pauvreté en apports organiques. Cette hypothèse pourrait expliquer la différence de populations entre les deux sites de Bomo-plage (Oran) où prédominent les Rhizobium et Ensifer et d’El Mactaa (Mostaganem) où sont rencontrés majoritairement les Bradyrhizobium . En effet, bien que les deux sites soient localisés sur des dunes côtières, elles diffèrent au niveau édapho- climatique avec une température plus élevée et un sol plus pauvre en éléments minéraux à Bomo-plage par rapport à El Mactaa (Tableau 12). Amrani et al. (2010) ont également isolé plusieurs souches de B. betae chez A. saligna mais n’étaient pas majoritaires comme dans notre étude. Cette espèce bactérienne a été initialement isolée de racines de Beta vulgaris, une betterave sucrière affectée par des déformations tumorales, mais aucune souche ne possédait de gènes Nod D ou Nif H ni était considérée comme renodulante (Rivas et al., 2004). A l’inverse, les souches isolées dans le cadre de ce travail étaient capables de renoduler. Deux hypothèses peuvent être avancées: La première est que le séquençage partiel du gène 16S rARN n’était pas bien adapté à une étude taxonomique des Bradyrhizobium , certaines souches ayant des divergences de séquences de l’ordre de 0.1– 2.0% pour ce gène (Willems, 2006), et de ce fait peuvent ne pas appartenir à cette espèce. Deuxièmement, ces souches peuvent être des souches renodulantes de B. betae, propriété acquise après un transfert latéral des gènes de nodulation d’autres rhizobia (Amrani et al., 2010). - Le neuvième groupe proche de Burkholderia englobe deux souches : E231 et T18 associées à A. ehrenbergiana et A. tortilis respectivement qui sont groupées avec B. cepacia. Des travaux de caractérisation de souches isolées de nodosités de Mimosa sp. en Amérique du sud ont prouvé la capacité de Burkholderia à renoduler leur espèce hôte (Chen et al., 2006) ainsi que deux souches isolées chez A. stenophylla (Hoque et al., 2011). - Le dixième et dernier groupe comporte quatre souches isolées de A. saligna , i.e. SAB4a, SAB4b, SAB8a et SAB8b, et constitue un groupe à part qui n’inclue aucune souche de référence. A noter que toutes ces souches sont efficientes alors qu’elles ne rejoignent aucune BNL caractérisée après BLAST (Tableau 13). La position taxonomique de toutes les souches de bactéries indéterminées devraient être précisées par des analyses plus

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poussées (hybridations ADN-ADN, Multilocus Sequence Analysis, …) afin de savoir si elles peuvent constituer de nouvelles espèces de BNL.

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Figure 21 : Arbre phylogénétique des souches de rhizobia renodulantes associées aux Acacias d’Algérie, basé sur le séquençage partiel du gène ARNr 16S obtenu par la méthode du Neighbor-Joining, en utilisant la 01 distance de Kimura. Les valeurs indiquées sont des valeurs de bootstrap issues de 1000 répétitions.

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A la lumière de ces résultats, on peut attester d’une grande diversité des rhizobia nodulant les Acacias, isolées de différentes régions d’Algérie, lesquels incluent des souches renodulantes appartenant aux ß-protéobactéries. Il est vrai qu’il existe une hétérogénéité dans la représentativité des souches et de leur diversité d’un site à l’autre, mais on peut voir que même s’il y a un groupe homogène de souches isolées d’un site donné, leur profil d’efficience et de tolérance à la salinité, aux températures extrêmes et au pH n’est pas le même. Beaucoup de souches isolées d’un seul site ayant formé des groupes très homogènes, on peut supposer que la dilution de sol de 10 -1 utilisée pour les piégeages a révélé les BNL les plus compétitives. Néanmoins, plusieurs zones d’échantillonnage sont présentes dans plusieurs groupes phylogénétiques. Ainsi, pour mieux comprendre la relation qui peut exister entre les espèces végétales étudiées et la taxonomie des BNL qui leurs sont associées, une Analyse Factorielle des Correspondances (AFC) a été réalisée (Figure 22) :

7-Détermination de la spécificité d’hôte des BNL isolées par AFC

L’AFC (Analyse Factorielle des Correspondances –Annexe A-) a inclu les plantes hôtes les plus représentatives en termes de nombre d’isolats, à savoir : A. saligna, A. seyal A. karro et , A. ehrenbergiana , les autres espèces végétales ne l’ont pas été du fait du trop faible nombre de souches isolées. Le graphique issu des calculs de l’AFC (Figure 22) démontre que chaque espèce d’ Acacia possède sa propre spécificité en termes d’association préférentielle avec les groupes de bactéries renodulantes comme définie par l’analyse phylogénétique mentionnée plus haut (Figure 21). Comme le montre la Figure 22 de la projection factorielle plane incluant les axes F1 et F2 qui représentent environ 80% de la variabilité totale, A. saligna a le spectre d’hôte le plus large en étant associé à quatre espèces qui lui sont propres, soit M. mediterraneum, R. tropici, Rhizobium sp. et Bradyrhizobium sp., ainsi qu’à Ensifer meliloti et E. fredii , deux espèces bactériennes à large spectre partagées avec A. karroo et A. ehrenbergiana . Par ailleurs, ces deux dernières espèces d’Acacia s’associent avec R. leguminosarum et Mesorhizobium sp. respectivement. Enfin, A. seyal est associé avec R. leguminosarum et deux groupes lui appartiennent exclusivement, à savoir Ochrobactrum sp. et R. sullae . En se basant sur cette analyse, A. saligna semble être l’espèce au plus large spectre d’hôte. Ces résultats sont en accord avec la littérature, cette espèce pouvant en effet être nodulée autant par des souches à croissance lente que des souches à croissance rapide (Rodríguez-

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Echeverría et al., 2011; Hoque et al., 2011 ; Amrani et al., 2010; Wolde-Meskel et al. 2005; Marsudi et al., 1999). Ceci, contrairement aux Acacias africains qui eux ne sont nodulés que par des rhizobia à croissance rapide et principalement par Sinorhizobium , Mesorhizobium et Rhizobium (Noureddine et al., 2010; Amrani et al., 2010; Diouf et al., 2007; Ben Romdhane et al., 2006; Wolde-Meskel et al. , 2005; Odee et al., 2002 ; Ba et al ., 2002; Mohamed et al., 2000 ; Mc lnroy et al., 1999 ; Nick et al., 1999b ; Khbaya et al., 1998; de Lajudie et al., 1998a ; Lortet et al., 1996 ; de Lajudie et al., 1994).

Graphe symétrique

E. meliloti

E. fredii

Figure 22: Projection factorielle plane de l’AFC entre les taxa bactériens (cercles), définis selon la phylogénie basée sur le séquençage partiel du gène 16S rARN et les quatre espèces d’Acacia (triangles). Lorsque les taxa bactériens sont superposés sur un même point (cercle), ces mêmes points sont légèrement décalés et alignés diagonalement pour une meilleure visibilité.

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8- Tolérance des souches à la salinité, température et pH

Les résultats du Tableau 17 montrent que les deux souches SE24a et 60E isolées respectivement de la région de la sebkha et de Oued Tin Amezzegin à Tamanrasset résistent à une température de 50°C. On peut aussi remarquer que les hautes températures extrêmes de ces deux régions n’atteignent pas ce seuil contrairement à la région de Ain Belbel (Aoulef) à Adrar, alors que les deux seules souches originaires de cette dernière région résistent seulement à 40°C, de même que des souches provenant du site ombragé de la forêt de M’sila dont la thermotolérance atteint 45°C. D’une façon générale, on remarque qu’au sein d’un même site d’échantillonnage, les souches présentent des profils de résistance très variables allant de 35 à 45°C, avec une moyenne de 26% des souches tolérant 45°C en conditions in vitro (Tableau 17). Les résultats du Tableau 17 nous permettent de conclure que l’origine n’influe apparemment pas sur la tolérance des souches aux hautes températures, ce constat étant appuyé par l’analyse PCA (Principal Component Analysis ou Analyses en Composantes Principales) de la Figure 23 qui montre qu’il n’y a aucune corrélation ente la température atmosphérique maximale et la tolérance aux hautes températures des souches testées in vitro (r=-0.162 –Tableau B2, Annexe B-). Il existe tout de même sur ce graphique de PCA (Figure 23) une proximité entre les variables « Soil CW » (salinité du sol) et « Tpre tolerance » (tolérance des souches aux hautes températures) malgré la faible corrélation (r=0.247) entre ces deux paramètres (Tableau B-2 en Annexe B). Cependant, il n’y a pas ici de relation de cause à effet entre la tolérance aux hautes températures et la conductivité du sol malgré leurs corrélations élevées respectives avec le facteur F1 (0.698 et 0.738 respectivement, cf Tableau B-4 en Annexe B), d’autant que l’axe F3 qui représente 21% de la variabilité totale n’est pas représenté sur le graphique.

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Tableau 17 : Tolérance des souches à la température, à la salinité et au pH, selon leur site de provenance et leur plante hôte d’isolement.

Souches Plante hôte Température Max Intervalle de pH Seuil de tolérance Site d’origine d’isolement de croissance °C de croissance au NaCl en mM SE21a 45 04 - 13 340 SE21b 45 04 - 13 860 SE23bc 35 04 - 13 170 100M de la sebkha SE24a A. seyal 50 04 - 13 860 de Messerghine SE24c 40 04 - 13 510 SE25a 45 04 - 13 680 SE25d 45 04 - 13 680 SE3 35 03 - 11 1034 A. seyal Es-Senia (Oran) SE2 40 03 - 11 1034 SAO2B 35 05 - 09 170 SABS 40 03 - 11 860 SABN1 45 03 - 11 340 SAB3 40 04 - 12 860 SAB4 35 05 - 11 860 SAB5 40 05 - 11 860 SAB7 40 03 - 11 340 SAB9 45 04 - 13 510 SAB10 35 04 - 13 340 SAB11 35 04 - 12 680 SAB12b 40 03 - 12 860 A. saligna SAB13 40 05 - 10 860 SAB4a 40 04 - 13 680 SAB4b 35 04 - 13 510 SAB4c 35 04 - 13 510 Dunes de Bomo- SAB8a 35 04 - 13 680 plage (Oran) SABN8b 40 04 - 13 510 SAB15a 45 04 - 13 510 SAB15b 45 04 - 13 510 SAB17a 40 05 - 11 680 SAB17b 40 05 - 11 680 SABN1a 40 04 - 13 510 SABN1b 45 05- 11 510 SABN1c 40 05- 11 340 SABN2a 45 04 - 12 340

SABN2c 40 04 -13 340 SABN4a 45 04 -12 510 SABN4b 40 05- 11 510 SABN5b 40 05- 11 680 KHB A. karroo 40 03 - 11 510

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Tableau 17 (suite) : Tolérance des souches à la température, à la salinité et au pH, selon leur provenance et leur plante hôte.

Souches Température Max Intervalle de pH Seuil de tolérance Plante hôte Provenance de croissance °C de croissance au NaCl en mM K31 40 06 - 10 680 K32a Ferme de 35 04 - 10 1034 K32c A. karroo Messerghine 45 06 - 13 170 K33b (Oran) 45 06 - 12 102 K34a 35 06 - 12 102 K1a 35 04 - 12 510 K1b 35 04 - 13 1034 K2b 45 06 - 10 340 A. karroo Forêt de M’sila K2d 35 04 - 13 680 K4a 40 06 - 12 1034 K4c 35 04 - 13 1034 K13b Dune d'El Mactaa 35 04 - 13 340 K14b A. saligna (Mostaganem) 35 04 - 13 860 K15b 35 04 - 12 860 KHML 40 03 - 11 170 A. karroo Madagh (Oran) KHMR 45 03 - 11 170 SAKS A. saligna Khemais (Relizane) 40 03 - 11 170 KOH 35 04 - 10 170 A. karroo Oued Jer (Blida) KO1 40 03 - 11 340 SAAIS A. saligna Ain Defla 40 03 - 11 340 SE243a 45 04 - 13 1034

SE243b Labiod Sidi El 45 04 - 13 340 A. seyal SE243c Cheikh 45 04 - 13 860 (El Bayadh) SE243d 45 04 - 13 1034 E231a 40 04 - 13 680 E231b 40 04 - 12 340 A. ehrenbergiana Ain Belbel (Adrar) E231c 40 04 - 13 1034 E232 40 04 - 11 340 N145 A. nilotica 40 04 - 11 680 E134ab 35 04 - 13 680 Oued In Daladg E134b A. ehrenbergiana 35 04 - 13 340 (Tamanrasset) E128b 40 04 - 13 680 A121 A. albida 40 04 - 13 510 Oued Tin Amezzegin E60 A. ehrenbergiana 50 04 - 11 340 (Tamanrasset)

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:::: Caractérisation des rhizobia. Résultats et discussion

Tableau 17 (suite) : Tolérance des souches à la température, à la salinité et au pH, selon leur provenance et leur plante hôte.

Souches Température Max Intervalle de pH Seuil de tolérance Plante hôte Provenance de croissance °C de croissance au NaCl en mM E45 45 04 - 11 1034 E39 40 04 - 11 340 A. ehrenbergiana E42 Oued Tassena 45 04 - 13 860 E47 (Tamanrasset) 40 04 - 11 340 T80 40 04 - 11 340 A. tortilis T18 45 04 - 13 680 Djenen Ben Mbarek E86 A. ehrenbergiana 40 04 - 11 340 (Tamanrasset) N8 35 04 - 11 1034 A. nilotica N81 35 03 - 11 680 Tindouf T82 A. tortilis 40 03 - 11 1034 T120 A. tortilis 40 04 - 11 340

On note que les deux principaux contributeurs de structuration de cette PCA en deux dimensions, où les axes F1 et F2 représentent 60.22% de la variabilité totale, sont : (i) les souches bactériennes originaires de la Sebkha d’Oran (indiqués par le symbole O3) qui sont logiquement groupés le long de l’axe de la conductivité du sol (soil CW) et l’axe F1 ; ainsi que (ii) les souches de Ain Belbel –Adrar- (indiquées par le symbole A) groupées le long de l’axe de température du site (site temp). Ces deux sites d’échantillonnage de la Sebkha d’Oran et d’Aïn Belbel étant caractérisés par une concentration en NaCl du sol élevée et une température extrêmement élevée respectivement.

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:::: Caractérisation des rhizobia. Résultats et discussion

Figure 23: Analyse en composantes principales (ACP) représentant la relation entre la tolérance in vitro des souches rhizobiennes au NaCl (NaCl tolerance) et aux hautes températures (Tpre tolerance) et les caractéristiques édaphoclimatiques des sites d’échantillonnage correspondants, soit la conductivité du sol (soil CW) et la moyenne maximale annuelle de température (Site Tpre). Chaque point correspond à un seul isolat bactérien et son origine est indiquée par des symboles comme suit : O1: Es-Senia/Oran; O2: Messerghine/Oran; O3: Sebkha, Messerghine/Oran; O4: Bomo-plage, dunes/Oran ; O5: Foret de M’sila /Oran; M: El Mactaa dunes/Mostaganem; R: Khemaissa/Relizane; AD: Ain Defla; EB: Labiod Sidi El Cheikh/El Bayadh; A: Ain Belbel/Adrar; T1: Oued In Deladg/Tamanrasset; T2: Oued Tassena/Tamanrasset; T3: Oued Tin Amezzegin/Tamanrasset .

• Tolérance des souches isolées des Acacias à la température

La température optimum pour la croissance des rhizobia en culture est de 28 à 31°C et une une majorité de souches sont incapables de croître à 37°C (Graham, 1992). Néanmoins, la tolérance des rhizobia associés aux Acacias varient en fonction des régions d’échantillonnage et des espèces hôtes. Des rhizobia isolés d’ A. senegal au Soudan et d’A.

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:::: Caractérisation des rhizobia. Résultats et discussion

saligna en Egypte pouvaient croître à environ 40°C (Zahran et al ., 1994 ; Swelim, 1996) ainsi que des souches associées à A. gummifera, A. karroo et A. raddiana au Maroc (Zerhari et al., 2000). Des souches plus résistantes ont été isolées, comme une souche associée à A. senegal au Soudan qui a pu croître à une température de 44°C (Zhang, 1991) ainsi que cinq souches originaires du Sénégal associées à A. tortilis subsp raddiana qui ont supporté une température de 45°C (Cacciari et al., 2003). Le seuil des 45°C a été dépassé par deux souches associées respectivement à A. cyanophylla (syn. A . saligna ) et F. albida en Libye qui ont toléré 46°C (Mohamed et al., 2000). Si on analyse un lien éventuel entre le profil de tolérance des souches aux hautes températures et leur position taxonomique (Tableaux 16 et 17), on remarque que les deux souches qui présentent une croissance au seuil de 50°C, sont Rhizobium sp. (SE24a) et Sinorhizobium sp. (E60). Selon la littérature, une seule souche associée à une légumineuse ligneuse, Albizia lebbeck, a toléré 50°C (Surrange et al., 1997). De plus, les 26% des souches rhizobiennes isolées qui tolèrent les 45°C appartiennent majoritairement au groupe des souches à croissance rapide, et par ordre décroissant aux genres : Rhizobium qui est majoritaire suivi de Ochrobactrum et Bradyrhizobium , puis Ensifer et Phyllobacterium . Cependant, on ne peut pas faire de conclusion générale quant à une éventuelle corrélation entre l’affiliation des souches et leur tolérance aux hautes températures car, même parmi un genre qui semble globalement résistant, on peut trouver des souches qui ne le sont pas. Cependant, beaucoup d’études ont prouvé que les Rhizobium possédaient un grand nombre de Heat Shock Proteins (HSPs) comparativement aux autres genres (Michiels et al., 1994; Wallington & Lund, 1994). Par exemple, R. leguminosarum possède trois copies du gène HSP cpn60 (Wallington & Lund, 1994), ce qui pourrait expliquer sa grande tolérance aux hautes températures. Néanmoins, il a été reporté qu’une souche sensible à la chaleur associée au haricot possédait plusieurs HSPs tandis qu’une autre tolérante en possédait seulement deux (Michiels et al., 1994).

• Tolérance des souches isolées des Acacias à la salinité

Concernant la salinité, le seuil testé le plus élevé de la croissance bactérienne était de 1034 mM (6% w/v de NaCl), ce dernier ayant été relevé pour environ 20% des souches renodulantes isolées de sites non salés, excepté deux : E2 et E3 de la région d’Es-Senia (Oran) dont le site est considéré comme légèrement salée. Chaque site présente des souches natives avec différents profils de résistance à la salinité allant de 170 à 1034 mM

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:::: Caractérisation des rhizobia. Résultats et discussion

de NaCl. Tout comme la température, la tolérance à la salinité ne semblent pas être corrélée avec la conductivité électrique du sol (Figure 23), (r=-0.004 –Annexe B-). Il est reconnu que les rhizobia isolés des légumineuses ligneuses et des Acacias en particulier sont généralement halotolérants (Diouf et al ., 2008 ; Zahran, 1999; Zahran et al ., 1994). Néanmoins, cette tolérance varie en fonction des espèces hôtes et même entre les souches associées au même arbre (Zhang et al., 1991; Lal & Khanna, 1994; Surange et al., 1997; Hashem et al., 1998). Si on se réfère à la littérature, beaucoup d’études ont fait mention de profils de résistance très intéressants. Merabet, et al. (2006) ont montré que des souches de leur collection, associées à A. tortilis subsp. raddiana en provenance de Djanet (Algérie) étaient capables de croitre à plus de 800 mM, d’autres associées à A. senegal en Inde tolèrant 850 mM (Lal & Khanna, 1994). Par ailleurs, des souches associées à A. gummifera et A. raddiana issues d’une région désertique du Maroc supportaient plus de 1000 mM de NaCl (Essendoubi et al ., 2006), de même que des souches associées à A. saligna isolées de pépinières de régions désertiques également (Tamanrasset, Bechar et Djanet) et aride (Tlemcen) en Algérie (Amrani et al., 2010). Un record de tolérance a été reporté pour une souche de Libye associée à A. cyanophylla qui atteignait 1378 mM (8%) (Mohamed et al., 2000), ce qui n’est pas courant chez les légumineuses ligneuses, seules une souche associée à Lupinus sp. ayant pu croître à 10% de NaCl (Zahran et al., 1994) et une souche associée au fenugrec qui a pu continuer à croître jusqu’à un seuil de 2,4 mM de NaCl (14%) (Abdelmoumen et al., 1999). Le plus haut profil de résistance qui est de 1034 mM se trouve majoritairement parmi les souches appartenant au genre Ensifer (E. meliloti et Ensifer sp.) suivi de Rhizobium et Ochrobactrum . Plusieurs études ont révélé la résistance notable que présente le genre Ensifer à la salinité, il lui a été attribué une tolérance à 800 mM (Merabet et al., 2006), 1000 mM (Mashady et al . 1998) ou seulement 500 mM (Mohammad et Campbell, 1985 ; Rome et al ., 1996). Cependant, ce qui est remarquable, c’est que les souches isolées dans notre étude se distinguaient par un seuil de tolérance minimum au NaCl de 340 mM.

• Tolérance des souches isolées des Acacias à l’acidité

Quant au pH, environ 20% des souches étudiées résistaient à un pH de 3 tandis que la majorité résistait à pH 4. Le pH de croissance le plus élevé atteignait 13 pour 46% des souches. Il n’y a pas de rhizobia associés aux légumineuses ligneuses présentant une croissance à un pH 3 dans la littérature. La plupart des souches isolées d’ A. saligna et d’ A.

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tortilis au Maroc tolèrent un pH égal à 4 de même qu’une seule souche d’ A. saligna isolée en Libye (Zerhari et al ., 2000; Mohamed et al ., 2000). La majorité des souches tolérantes au pH 3 faisaient partie des Rhizobium sp., ce qui rejoint une étude réalisée par Kurchak et al . (2001) qui ont établi que R. leguminosarum possédait vingt gènes spécifiques en réponse au stress acide appelés gènes act (ac id tolerance). De plus, comme cela a été suggéré par Cunningham et Munns (1984), il semble que la production d’exoplysaccharides contribuerait à cette résistance, comme observé pour des souches à croissance rapide. En ce qui concerne les souches à croissance lente, Fujihara & Yoneyama (1993) ont reporté que Bradyrhizobium japonicum était dans l’incapacité de croître dans un intervalle de pH de 4 à 9,5, ce qui est en contradiction avec nos résultats obtenus avec des souches à croissance lente qui tolérent un pH allant de 4 à 13 comme limites extrêmes.

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Figure 24 : Aspect des boites inoculées par étalement de souches résistantes aux conditions de pH et de température extrêmes:

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:::: Caractérisation des rhizobia. Résultats et discussion

(1) : Aspect muqueux de la souche E231 sur du YEMA à pH 4 incubée 7 jours à 28°C ; (2) : Aspect de la souche E42 sur milieu YEMA à pH12, incubée 7 jours à 28°C ; (3) : Aspect de la souche SE243 sur milieu YEMA à pH13, incubée 7 jours à 28°C ; (4) : Aspect de la souche SE21b sur milieu YEMA incubée 7 jours à 45°C.

Beaucoup d’études ont montré que les rhizobia isolés des Acacias sont généralement plus résistants aux facteurs environnementaux extrêmes que les autres bactéries fixatrices d’azote (Odee et al., 1997), ce qui conforte les résultats de cette étude sur les rhizobia associés aux espèces d’ Acacia introduites et autochtones des régions arides et semi-arides d’Algérie.

9- Tests d’efficience des souches d’Acacias :

Le test d’efficience a été effectué en utilisant une sélection de souches qui avaient prouvé leur efficience d’après l’aspect général des plantes lors du test de nodulation. L’expérimentation a été refaite afin de quantifier le poids sec des plantes, leur hauteur ainsi que le nombre et le poids sec des nodosités sur un plus grand nombre de plantes par souche (Tableau 18, Figure 25). Les analyses statistiques de variance à un facteur ont été effectuées pour chaque espèce. Seul le poids sec a été pris en considération pour estimer l’efficience des souches. Sept semaines après inoculation, toutes les plantes testées étaient nodulées. Toutes les souches étaient efficientes (le poids de la plante inoculée était significativement supérieur à celui du témoin) vis-à-vis d’ A. saligna et A. laeta ( Figures 26-2 et 26-6), la majorité l’étaient chez A. seyal , A. karroo , A. ehrenbergiana (Figures 26- 1, 26-3, 26-4) tandis que la souche associée à A. tortilis était seulement infective (Figure 26-5). Chez A. seyal, SE243c est la plus efficiente, en améliorant presque de trois fois et demi le poids sec des plantes témoins non inoculées. Elle est suivie du groupe SE243a et SE243d, ces dernières ayant amélioré trois fois le poids sec de la plante inoculée comparativement au témoin (Tableau 18, Figure 26-1, Annexe C1). Le troisième groupe par ordre décroissant d’efficience inclut SE21a, SE21b, SE24a, SE243b, SE22a, SE25a, SE24c et SE25d (Figure 26-1, Annexe C1). Le dernier groupe le moins efficient inclut SE25d qui a légèrement amélioré le poids sec (0,032g) comparativement au témoin (0,024g) (Tableau 18 et Annexe C1). La dernière souche SE24b groupe avec le témoin et n’est donc pas efficiente mais juste infective car le poids sec de la plante inoculée par cette souche (0,023g) et celui du témoin (0,024g) ne sont pas significativement différents (Tableau 18, Figure 26-1). Chez A. saligna , les différences d’efficiences sont moins

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marquées entre souches. Il y a trois groupes, dont deux efficients et un incluant le traitement témoin. Dans l’ordre décroissant d’efficience, SAB15b, SA13b, SAB4a et SAB3 ont amélioré de plus de trois fois et demi la croissance des plants comparativement au témoin (Tableau 18, Figure 26-2), suivi de SAB5, SAB10, SAB9, SAB8b, SAB11, SA15b, SA14b et SAB8a améliorant d’environ trois fois la croissance des plants inoculés comparativement au témoin, tandis que SAB4b et SAB15a étaient les souches les moins efficientes (Figure 26-2). Pour le test d’efficience des souches isolées d ’A. ehrenbergiana , ont été utilisées des graines d’ A. karroo , dans la mesure où leurs spectres d’hôtes sont proches et que nous n’avions pas de graines d’A. ehrenbergiana disponibles. Les souches efficientes sont inclues dans deux groupes : E134ab, E134b et E231 qui ont amélioré de presque quatre à trois fois le poids sec des plantes inoculées comparativement au témoin, tandis que l’effet des souches E42 et E128b sur la croissance des plants comparativement aux témoins non inoculés sont statistiquement non significatifs et sont donc considérées comme inefficientes (Figure 26-3). Concernant A. karroo , Les deux souches les plus efficientes qui se démarquent des autres sont K1a et K2d, ces dernières améliorant cinq fois la croissance de la plante inoculée comparativement au témoin. Elles sont suivies du groupe incluant les souches K34a, K1b, K2b, K33b et K4a, alors que K32c, K31 et K4c peuvent être considérées comme infectives seulement puisqu’il n’y a pas de différences significatives à p=0,05 entre la biomasse des plantes inoculées par ces différentes souches et celle des témoins (Figure 26-4). Pour les deux dernières espèces d’ Acacia testées, la souche A121a associée à A. albida est efficiente et améliore deux fois et demie la croissance de la plante inoculée comparativement au témoin (Figure 26-6) contrairement à la souche 18T isolée d’une nodosité d’ A. tortilis qui est groupée avec le témoin et donc inefficiente (Figure 26-5).

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Tableau 18 : Résultats du test d’efficience (poids sec, hauteur de la tige, nombre de nodosités) des différentes souches sur les différentes espèces d’Acacia.

Moyenne du Hauteur Nombre moyen Moyenne du poids Souches Plante hôte poids sec moyenne des de sec de nodosités /plant (g) tiges (cm) nodosités/plant /plant (g) Témoin 0,059 6 0 0 E134ab* 0,1 7,47 4 0,01 E134b* 0,106 6,5 11 0,011 E128Eb* 0,031 6,33 4 0,002 231E* 0,104 6,67 14 0,016 E 42* 0,0335 3,25 2 0,002 K1a 0,11 6 6 0,014 K1b 0,083 6,33 3 0,002 K2b A. karroo 0,064 4,84 6 0,008 K2d 0,107 7,5 9 0,021 K4a 0,042 3,03 5 0,0077 K4c 0,0265 5,811 2 0,005 K31 0,03 7,4 3 0,0009 K32a 0,028 4,4 2 0,009 K32c 0,0325 2,75 5 0,009 K33b 0,047 5,4 5 0,0025 K34a 0,097 6,17 3 0,00445 Témoin 0,024 3,33 0 0 SE243a 0,073 4,8 4 0,007 SE243b 0,045 5,33 5 0,0055 SE243c 0,08 6,5 12 0,005 SE243d 0,0715 8,25 8 0,011 SE21a 0,0685 3,25 3 0,009 SE21b 0,058 6 4 0,007 A. seyal SE22a 0,0443 6,5 6 0,007 SE23bc 0,067 7,1 0 0 SE24a 0,057 5,33 8 0,009 SE24b 0,024 4,33 0 0 SE24c 0,042 4,87 3 0,003 SE25a 0,043 4 3 0,009 SE25d 0,033 5,33 4 0,009

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Tableau 18 (suite) : Résultats du test d’efficience (poids sec, hauteur de la tige, nombre de nodosités) des différentes souches sur les différentes espèces d’Acacia.

Moyenne du Hauteur Nombre moyen Moyenne du poids Souches Plante hôte poids sec moyenne des de sec de nodosités /plant (g) tiges (cm) nodosités/plant /plant (g) Témoin 0,0065 3,9 0 0 SAB3 0,0427 5,67 0 0 SAB5 0,04 7 4 0,009 SAB9 0,0373 5,8 7 0,017 SAB10 0,04 6,5 8 0,02 SAB11 0,0406 5,86 5 0,014 SAB4a 0,043 7,8 7 0,012 SAB4b 0,03 7,27 3 0,0034 A. saligna SAB4c 0,0303 5,03 3 0,004 SAB8a 0,0306 5,57 6 0,0153 SAB8b 0,0356 5,67 13 0,014 SAB15a 0,02 4,17 2 0,001 SAB15b 0,046 7,1 3 0,0046 SA13b 0,0453 6,67 12 0,02 SA14b 0,0343 6,17 8 0,014 SA15b 0,0343 5,53 6 0,014 Témoin 0,025 4,2 0 0 A. tortilis T18 0,028 5 1 0,0009 Témoin 0,035 5 0 0 A. albida A121 0,142 10,5 1 0,001 Les souches isolées d’A. ehrenbergiana ont été testées avec des plantules d’A. karroo.

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Figure 25: Aspect d’un plant inoculé avec la souche ASB5 après 48 jours d’incubation. (1) :

aspect général du plant inoculé comparativement au plant non témoin inoculé ; (2) : aspect des nodosités Témoin au grossissement X20. NI ASB5

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Figure 26 : Résultats du test d’efficience des souches de rhizobium vis à vis de 6 espèces d’Acacia. (1) : A. seyal ; (2) : A. saligna ; (3) : A. ehrenbergiana ; (4) : A. karroo ; (5) : A. tortilis ; (6): A. albida. Les moyennes groupées sous les barres horizontales surmontées de lettres différentes sont significativement différentes selon le test de Duncan à p=0,05.

Concernant A. seyal, le groupe d’efficience le plus fort est constitué de SE243c et SE243a. Néanmoins la souche SE243a semble la plus intéressante compte-tenu de son profil de tolérance : elle croît à une concentration de NaCl de 1034 mM et à une température de 45°C ainsi qu’entre des pH de 4 à 13 et est proche de Ochrobactrum sp. Pour A. saligna , quatre souches candidates forment un groupe d’efficience élevé, dont trois sont à croissance rapide et une à croissance lente. En se basant sur leur profil de tolérance, deux souches, SAB4 et SAB13, proches de Rhizobium sp. et Sinorhizobium sp. respectivement, se distinguent des autres car elles tolèrent 860 mM NaCl, ce qui conforte l’hypothèse qu’en zone aride, les souches à croissance rapide sont plus indiquées dans les programmes d’inoculation que celles à croissance lente (Barnet et Catt, 1991). La croissance d’ A. karroo quant à lui est nettement améliorée par une seule souche candidate, K2d proche d’Ensifer fredii , cette dernière montrant une tolérance moyenne au NaCl à 680 mM. Il en est de même pour A. albida dont la souche associée, proche de Mesorhizobium sp., est tolérante à 510 mM de NaCl. Cependant, pour A. ehrenbergiana , la souche la plus efficiente appartient au groupe des Devosia , dont certains auteurs avaient déjà rapporté la capacité à renoduler A. saligna (Hoque et al., 2011) bien que leur profil d’efficience n’avait pas été caractérisé. Ces souches offrent un potentiel intéressant d’efficience et de

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tolérance aux conditions extrêmes telles que les hautes températures, la salinité ainsi que les pH alcalin et acide, ce qui pourrait en faire des inocula performants.

10- Caractérisation phénotypique des souches isolées d’Acacias: phénodendogramme

Les résultats des tests phénotypiques sont présentés dans les Tableaux 19, 20, 21 et 22. Les observations sont interprétées en code binaire, 1 pour une croissance positive sur des milieux aux différents pH, concentrations en NaCl, températures d’incubation, croissance en présence de différents acides aminés, ou lorsque les souches expriment une résistance aux métaux lourds ou aux antibiotiques, si le diamètre d’inhibition dépasse les diamètres indiqués pour chaque antibiotique selon le NCCLS (2000) (National Committee for Clinical Laboratory Standards), ou enfin lorsqu’il y a dégradation des sucres avec virage de couleur, indicateur d’une baisse de pH. A l’opposé, 0 indique une absence de croissance ou une sensibilité aux antibiotiques et aux métaux lourds. Le Tableau 19 montre le profil de résistance aux antibiotiques et aux métaux lourds des 16 souches isolées : trois souches se démarquent avec une résistance à tous les agents antimicrobiens : SAO2B, SAB1 et SAKS, toutes étant associées à A. saligna isolées respectivement de Oued Jar, Bomo plage et Khemaissa. Les antibiotiques agissent selon différents modes d’action et il est largement reconnu que les rhizobia résistent différemment aux antibiotiques, c’est pour cela que le profil d’antibiorésistance est utilisé comme critère de différenciation entre les souches (Jordan, 1984), ayant prouvé son statut discriminant au même rang que l’approche moléculaire chez des souches associées au pois- chiche au Portugal (Alexandre et al., 2006). Ce profil de résistance intrinsèque aux antibiotiques permet aussi de suivre une souche une fois inoculée au champ (Beynon et Josey, 1980). Il semblerait que la Kanamycine soit la moins inhibitrice de la croissance des rhizobia contrairement au Chloramphénicol (Zerhari et al., 2000 ; Diouf et al ., 2008). Ceci ne rejoint pas les résultats présentés ici, où l’on remarque que la majorité des souches était sensible au Chloramphénicol à 15 et 200µg/l, alors que 30% des souches testées avaient résisté à la Kanamycine à 100µg/l. Concernant les autres antibiotiques, les souches sont majoritairement résistantes à la Streptomycine à 5µg/l, la Spectinomycine à 5 et 120µg/l et l’Erythromycine à 30 et 66.6µg/l, contrairement au profil variable de résistance des souches associées aux Acacias en Lybie vis-à-vis des mêmes antibiotiques (Mohamed et al ., 2000). Cependant, la résistance des souches libyennes est variable à la Streptomycine à 120µg/l comme pour les 16 souches isolées dans notre étude.

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La majorité des souches sont résistantes au cadmium et au cuivre et un peu moins au plomb, la même résistance ayant été rapportée pour les souches rhizobiennes isolées de nodosités d’ Acacia sp. au Maroc (Zerhari et al., 2000) et en Lybie (Mohamed et al ., 2000). Ceci suggère que ces souches pourraient être de bonnes candidates à utiliser comme inocula pour la réhabilitation des sites pollués par les métaux lourds.

Tableau 19 : Résistance intrinsèque aux antibiotiques et aux métaux lourds de 16 souches isolées de différentes espèces d’Acacia.

Antibiotiques (µg/ml) Métaux lourds (µg/ml)

Souches Strepto- Spectino- Kana- Chloram- Erythro- CuCl 2 CdCL 2 HgCL 2 mycine mycine mycine phénicol mycine 2H 20 2H 20 3 120 5 120 10 100 15 200 30 66.6 100 5 20 SAO2B 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 SAB1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 SAO1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 SABS 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 SAKS 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 KHO 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 KHB 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 KHMR 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 KHML 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 SAAIS 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 N8 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 N81 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 N82 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 T8 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 SE2 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 SE3 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1

L’utilisation des sucres est un bon indicateur de l’adaptabilité des souches dans les conditions adverses (Diouf et al., 2008). On a ainsi constaté que neuf souches sur les seize isolées pouvaient utiliser la gamme des sept sources carbonées (Tableau 20), en plus du mannitol qui est la source carbonée de choix pour les rhizobia (Vincent, 1970). Ces résultats rejoignent ceux de Marsudi et al. (1999) qui trouvaient que les souches à croissance rapide métabolisaient bien les disaccharides, de même que ceux de Mohamed et al . (2000) rapportant que des souches d’origine libyenne associées aux Acacias utilisaient 23 sucres en plus des sept sources carbonées testées dans notre étude. A l’inverse, huit souches à croissance rapide d’un même cluster associées aux Acacias au Maroc n’assimilaient pas le sucrose, le maltose et le lactose (Zerhari et al., 2000). Quant aux acides aminés, seuls la L-proline, l’acide L-glutamique ainsi que le l’acide L- aspartique étaient utilisés par les 16 souches testées (Tableau 20). Ces résultats sont en

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:::: Caractérisation des rhizobia. Résultats et discussion

contradiction avec ceux obtenus chez des souches associées aux Acacias en Lybie qui utilisaient majoritairement tous les acides aminés utilisés dans notre étude (Mohamed et al ., 2000), de même que huit souches de Mesohizobium sp. associées à A. seyal du Sénégal (Diouf et al., 2008).

Tableau 20 : Réduction des sucres et utilisation des acides aminés par 16 souches isolées de différentes espèces d’Acacia.

Réduction des sucres (1g/l) Utilisation des acides aminés (10 mM/L) L- D- D- L- d- d- DL- L- L-Ac- L- DL- DL- DL- L- Souches Lact- Su- ac- glu- Gala- Ara- Fruc- Xy- Va- Pro- gluta- Leu- pheny- Se- trypto- Methio- ose crose aspar cose ctose binose tose lose line line mique cine lalanine rine phane Nine tique SAO2B 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 SAB1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 SAO1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 SABS 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 SAKS 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 KHO 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 KHB 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 KHMR 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 KHML 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 SAAIS 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 N8 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 N81 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 N82 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 T8 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 SE2 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 SE3 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1

Concernant le nitrate, on constate que la moitié des souches les réduisaient alors que onze souches sur les seize testées hydrolysaient l’urée (Tableau 21). Ces proportions sont supérieures à celles obtenues par Zhang et al. (1991) qui trouvaient que 88% des 62 souches testées à croissance rapide associées à Acacia et Prosopis étaient incapables d’hydrolyser l’urée tandis que seulement huit d’entre pouvaient réduire le nitrate. Lindstrom et Lehitomaki (1988) ont obtenu des résultats plus proches des nôtres avec 30% des 82 souches à croissance rapide testées qui pouvaient réduire le nitrate, tandis que 68% d’entre elles hydrolysaient l’urée. Il est largement reconnu que l’apport de nitrate minéral inhibe la nodulation, il serait peut être intéressant d’utiliser de telles souches dans des sols enrichis en fertilisants chimiques, ne serait-ce qu’en assurant leur survie jusqu'au lessivage de ces composés exogènes. Le Tableau 21 montre que la majorité des seize souches testées toléraient une gamme de pH allant de 3 à 11. Parallèlement, quatre de ces mêmes souches toléraient 6%

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de NaCl et une seule poussait à 46°C (Tableau 22). La tolérance des rhizobia aux pH ainsi qu’à différentes concentrations de NaCl a déjà été discutée précédemment.

Tableau 21 : Croissance à différents pH, aptitude à hydrolyser l'urée et à réduire le nitrate de 16 souches isolées de différentes espèces d’Acacia.

Réduction Hydrolyse Croissance à différents pH Souches de nitrate de l'urée 1 g/l 20 g/l pH=3 pH=3.5 pH=4.5 pH=5 pH=6 pH=8 pH=9 pH=10 pH=11 SAO2B 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 SAB1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 SAO1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 SABS 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 SAKS 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 KHO 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 KHB 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 KHMR 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 KHML 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 SAAIS 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 N8 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 N81 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 N82 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 T8 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 SE2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 SE3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

Tableau 22 : Profil de tolérance à différentes concentrations de NaCl et à différentes températures de 16 souches isolées de différentes espèces d’Acacia.

Concentrations de NaCl Températures d’incubation Souches 0.5% 1% 2% 3% 3.5% 4% 5% 6% 7% 4°C 14°C 19°C 25°C 35°C 39°C 44°C 46°C 50°C SAO2B 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 SAB1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 SAO1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 SABS 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 SAKS 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 KHO 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 KHB 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 KHMR 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 KHML 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 SAAIS 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 N8 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 N81 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 N82 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 T8 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 SE2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 SE3 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:::: Caractérisation des rhizobia. Résultats et discussion

Il est bien connu que les facteurs environnementaux tels que la salinité, la sécheresse, l'acidité, l'alcalinité, les engrais chimiques, les métaux lourds et les pesticides compromettent la survie, la croissance et la capacité à fixer l'azote des souches de rhizobia (Zahran et al., 1994), d’où l’intérêt de connaître leurs caractéristiques phénotypiques et biochimiques qui conditionnent leur survie, leur adaptabilité ainsi que leur compétitivité une fois introduites, préalable indispensable à la réponse des plantes à l’inoculation au champ (Zerhari et al., 2000 ; Diouf et al., 2008). Au total, 58 caractères phénotypiques ont été pris en compte dans l’établissement d’une matrice basée sur 16 observations (16 souches), laquelle a été utilisée pour une analyse en groupes hiérarchiques basée sur le carré des distances euclidiennes et une moyenne non pondérée des groupes associés (Statistica version 5.1 ; eds 1997, Annexe D). Cette matrice a permis de dessiner un phénodendogramme (Figure 27) qui différencie trois groupes distincts, groupe 1 (N82-A. nilotica et KHMR-A. karroo ), groupe 2 (N8 et N81-A. nilotica ; SE3, SE2-A. seyal et SABS-A. saligna ) et enfin le groupe 3 qui renferme le plus grand nombre de souches (KHML-A. karroo et SAKS-A. saligna ; SAAIS-A. saligna et KO1-A. karroo ; KHB -A. karroo et SAB1-A. saligna ; T8 -A. tortilis , KOH-A. karroo et SAO2B-A. saligna . On constate d’une manière générale que les souches associées à une même espèce d’ Acacia n’appartiennent pas aux mêmes sous-groupes, ceci montrant une grande diversité de phénotypes rhizobiens au sein d’une même espèce échantillonnée, à l’instar des résultats obtenus par Zerhari et al. (2000) qui ont rencontré une diversité phénotypique aussi élevée dans la rhizosphère d’une seule espèce d’arbre que dans celle de deux espèces différentes présentes sur un même site d’échantillonnage.

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Arbre de seize observations Moyenne non pondérée des Groupes Associés

KHB

sp. sp. sp.

r sp. sp. r

Ensife Rhizobium Rhizobium Rhizobium Rhizobium A.tumafeciens

Figure 27 : Phénodendrogramme illustrant les similarités phénotypiques entre 16 souches de rhizobia isolées de différentes espèces d’Acacia de régions arides et semi-arides d’Algérie.

De plus, en essayant de jumeler les résultats du séquençage partiel du gène 16S rARN qui malheureusement n’a pas été fait pour toutes les souches utilisées dans cet arbre sauf pour quatre, on peut noter qu’ Ensifer sp. est à part ainsi qu’ Agrobacterium tumafeciens . Au final, les deux Rhizobium sp. ne sont pas groupés dans le même cluster, ce qui rejoint l’arbre phylogénétique basé sur le séquençage partiel du 16S-rARN (Figure 21) qui révèle que SE3 est groupée avec R. sullae tandis que SAAIS rejoint R. tropici . Ces résultats suggèrent que la caractérisation basée sur les traits phénotypiques est assez discriminante et qu’elle rejoint la caractérisation moléculaire du séquençage partiel du gène 16S rARN, contrairement aux résultats obtenus par Zerhari et al. (2000) et Khbaya et al. (1998) qui trouvaient des résultats incongruants entre la caractérisation phénotypique et génotypique. Cependant, la connaissance des caractères phénotypiques reste primordiale pour la sélection du meilleur profil de tolérance des inocula candidats aux conditions pédo- édaphiques extrêmes (Zerhari et al., 2000).

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:::: Caractérisation des rhizobia. Résultats et discussion

Conclusion

Les résultats obtenus démontrent une grande diversité autant phénotypique que génétique des souches isolées associées aux espèces autochtones et introduites d’ Acacia en Algérie en région arides et semi-arides. Malgré le fait qu’il y ait une pauvre représentativité des souches d’origines sahariennes, surtout des souches associées à A. tortilis, A. laeta et A. nilotica dû à un phénomène de non-renodulation qui n’a pas été rencontré chez les souches isolées des zones côtières, cette étude révèle une biodiversité des plus intéressantes : un groupe phylogénétique très homogène basé sur le séquençage partiel du 16S rARN regroupant des souches de Bradyrhizobium associées à A. saligna ) qui mériterait d’être caractérisé à l’aide d’outils moléculaires plus puissants, de même que l’affiliation de certaines souches qui nécessiterait d’être affinée. Cette étude confirme que les BNL associées aux Acacias africains sont exclusivement à croissance rapide, proche de Ensifer, Rhizobium et Mesorhizobium ; tandis qu’ A. saligna originaire d’Australie est associé aux souches à croissance lente et rapide. Deux souches atypiques isolées d’ A. seyal de Labiod Sidi El Cheikh, proches d’ Ochrobactrum se sont révélées efficientes, ainsi qu’une souche associée à A. saligna isolée de Bomo-plage proche de Phyllobacterium ; la renodulation et l’efficience chez ces espèces bactériennes demeurent des phénomènes assez nouveaux (Hoque et al., 2010). La position phylogénétique des souches de rhizobia isolées n’a aucune relation avec leur efficience, bien qu’on ait trouvé quelques souches très performantes en conditions contrôlées associées à A. saligna, A. ehrenbergiana et A. karroo qui triplaient le poids sec des plantes inoculées comparativement aux plantes témoins non inoculées. En outre, cette phylogénie n’a aucune relation avec le profil de tolérance des souches à la salinité et aux températures élevées. Ce profil est remarquable comparativement à ce qui a été rapporté par la littérature concernant les souches isolées d’Acacias des zones arides et semi-arides ; le seuil de tolérance le plus bas pour les souches isolées étant de 340 mM de NaCl et de 35°C pour la température. De plus l’étendue de la zone d’échantillonnage, avec des sites possédant des conditions pédoclimatiques assez diverses, a aussi permis de montrer que ce profil de tolérance in vitro était indépendant de l’origine géographique des souches isolées, de la conductivité du sol échantillonné ainsi que de la température maximale enregistrée. Ces résultats permettent de conclure que les souches utilisées comme inoculum pour la réhabilitation de sites marginaux doivent être indigènes et sélectionnées préalablement sur la base de leur efficience et de leur tolérance aux contraintes abiotiques dominantes dans ces régions.

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie. Matériels et méthodes

Partie II : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie

Matériel et méthodes

Introduction L’utilisation des Arbres Fixateurs d’Azote (AFN) en foresterie et en agroforesterie est devenue un atout indispensable dans les programmes de revégétalisation, il existe une longue tradition d’approche biotechnologique d’inoculation pour augmenter la fixation biologique de l’azote et la productivité, cependant, l’estimation de cette capacité de fixation d’azote est soumise à différentes contraintes autant méthodologiques qu’inhérentes aux légumineuses. La fixation de l’azote atmosphérique chez ces dernières dépend de plusieurs facteurs, liés aux trois partenaires : la plante, le sol et le symbionte microbien. C’est pour cela qu’il faut différencier entre deux concepts de fixation d’azote : la fixation potentielle d’un arbre qui correspond à l’aptitude de ce dernier à fixer le N2 en l’absence de tout facteur limitant, et la fixation réelle qui correspond à la fixation du N2 en présence de facteurs limitants intervenants toujours dans les conditions au champ. On sait qu’il existe une forte variabilité génétique dans l'aptitude d’une espèce à la nodulation et à la fixation du N 2 (Sanginga et al. ,

1990) et que la fixation de N 2 potentielle est intrinsèque au système fixateur considéré au sein de l’interaction « génotype de l’arbre fixateur de l’azote (AFN) x souches de symbiotes bactériens ». Ceci peut être réalisé en serre en réunissant les conditions les plus favorables telles que l’inoculation avec une souche efficiente, l’utilisation d’un sol pauvre en azote minéral et une irrigation suffisante (Dommergues et al., 1999). La première approche de dilution isotopique dans notre expérimentation se situe entre ces deux types de fixation, par le biais de l’utilisation des sols des quatre sites étudiés avec leur caractères physico-chimiques favorisant ou pas la croissance des végétaux, tout en en les soumettant à des conditions optimum d’éclairage, de température et d’arrosage en serre, la seconde approche in natura dans les conditions naturelles révèle la fixation réelle par la méthode d’abondance naturelle. Le pouvoir fixateur est exprimé en Ndfa% (pourcentage d’azote provenant de la fixation dans une plante fixatrice), il est déterminé pour la plante entière ou un échantillon représentatif (cas de l’abondance naturelle), ce dernier n’est pas une caractéristique intrinsèque et varie en fonction des facteurs limitant externes. Ce pouvoir fixateur peut aussi être exprimé en Ndfa

(quantité de N 2 fixé) et, si on connaît la biomasse totale exprimée en azote total (Nt), il est -1 exprimé en g N 2 fixé arbre .

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Dans notre approche méthodologique, les variables étudiées, qui sont l’effet du facteur ‘inoculation rhizobienne’ chez les trois espèces d’Acacia testées (A. seyal, A. karroo et A. saligna) et l’effet combiné de l’inoculation et du facteur ‘sol’ chez A. karroo uniquement, tenteront de révéler tout d’abord la pertinence de l’utilisation du mélange d’inoculum rhizobien sélectionné en fonction de chaque type de sol de même que leur compétitivité par rapport aux souches de rhizobia autochtones mais aussi le potentiel fixateur de ces trois espèces d’ Acacia . L’expérimentation est réalisée à partir de sols prélevés dans quatre sites d’étude de zones littorales dans la région d’Oran où la diversité rhizobienne a été caractérisée (Chapitre I et Boukhatem et al., 2012): Sebkha d’Oran, Ferme de Meserghine-Oran; Dunes d’El Mactaa-Mostaganem et Forêt de M’sila, Boutlilis-Oran. Cette approche de dilution isotopique est complétée par une estimation de l’abondance isotopique des Acacia étudiés au champ sur les sites cités préalablement sauf celui situé sur les rives de la Sebkha d’Oran, dans la mesure où un seul pied d’ Acacia était présent, a fortiori introduit et peu représentatif du lieu. La méthode directe d’estimation quelle soit basée sur l’abondance naturelle du 15 N ou sur la méthode de la dilution isotopique du 15 N donnera une idée précise sur le potentiel fixateur du partenaire végétal. L’estimation de ce dernier est un atout important dans l’action introductive de couples symbiotiques dans différents écosystèmes.

1- Méthode de la dilution isotopique après enrichissement du sol en 15 N a- Protocole d’échantillonnage sur le terrain a-1 Description des sites de prélèvement :

Les sites ont été sélectionnés sur la base se leur représentativité écologique, à savoir : • Site n°1 : situé à 500 m du rivage de la sebkha (Daïra de Messerghine –Oran-) où vivent seulement trois arbres d’ Acacia seyal en plus de légumineuses herbacées. L’arbre autour duquel le sol a été prélevé est développé et semble dépasser 10 ans d’âge. • Site n°2 : situé à 1 km de la sebkha (Daïra de Messerghine –Oran-), dans une ferme à vocation céréalière, on y rencontre Acacia karroo utilisé comme haie défensive. • Site n°3 : forêt de M’sila peuplée de chêne-liège et de pins, des terres ont été récupérées pour la production agricole entourée de haies d’ A. karroo .

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• Site n°4 : zone côtière de Bomo-plage (Oran), les dunes ont été fixées par A. saligna dans le cadre d’un programme de stabilisation des dunes initié par la direction des forêts de Mostaganem. Le sol est sablonneux, les nodosités pouvant être ainsi récoltées in situ , très près de la surface. a-2 Prélèvement du sol :

La quantité de sol prélevé variait entre 1 à 2 Kg. Après enlèvement de la litière, le sol a été prélevé dans la rhizosphère de l’arbre à une profondeur de 0 à 10 cm pour les sols argileux ou limoneux et de 10 à 20cm pour les sols sablonneux. Les prélèvements ont été effectués au pied de 05 arbres dans chaque site, avant de mélanger les différents sous- échantillons pour constituer l’échantillon final représentatif de chaque site. b- Protocole de l’expérimentation en serre

Quatre sites, soient quatre sols ont été sélectionnés pour quantifier le pouvoir fixateur d’azote de trois espèces différentes d’acacias : A. seyal, A. karroo et A. saligna. La densité de chaque sol a été calculée pour évaluer la quantité d’azote enrichi en 15 N à ajouter à chaque pot, cet apport d’azote n’étant pas inhibiteur de la nodulation. Eucalyptus camaldulensis a été utilisé comme plante témoin non-fixatrice d’azote car elle présentait la même vitesse de croissance ainsi que la même architecture racinaire qu’ A. saligna (Nasr et al., 2005) et par extrapolation a servi également de plante de référence non-fixatrice à A. seyal et A. karroo. Les pots utilisés avaient une contenance de 0.8 l. De la vermiculite stérilisée a été déposée dans la moitié inférieure des pots, leurs moitié supérieures ayant été remplies de sol selon sa densité (protocole §b-2). Pour chaque type de sol on a procédé à trois traitements différents: - 1er pot : 5 plants d’ Acacia . - 2éme pot : 5 plants témoins non-fixateurs d’Eucalyptus camaldulensis . - 3éme pot : 5 plants d’Acacia inoculé avec 04 souches efficientes* à raison de 5ml/pot d’une suspension bactérienne à 10 7 CFU/ml. On a préparé 3 pots pour chaque type de sol, soit 12 pots au total pour cette expérimentation. *Les souches sélectionnées présentent un spectre d’hôte assez large qui a été testé au préalable (Tableau n°1, annexe E), à savoir : SE3, T82, KHB et E60. Les souches ont été ensemencées avant de les mélanger dans du YEM liquide et incubées jusqu’à obtention d’une turbidité équivalente à 10 7 CFU/ml, les suspensions bactériennes sont utilisées à égales

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proportions pour constituer le mélange de l’inoculum final. Les plants ont été inoculés avec ce dernier à raison de 1 ml/plant. b-1 Scarification des graines

• Graines d’Acacias : les graines prélevées de chaque site ont été scarifiées chimiquement à l’acide sulfurique (95%) pendant 30, 30 et 60 minutes respectivement pour A. seyal, A. karroo et A. saligna. Elles ont ensuite été lavées abondamment à l’eau distillée stérile et laissées 1 heure dans la dernière eau de rinçage. Puis elles ont été mises à germer dans des boîtes avec de l’eau gélosée à 0,8% et incubées à l’obscurité pendant 7 jours à 25°C. Les graines germées ayant développé une radicelle de 2 cm ont été transférées ensuite dans les pots. • Graines d’ Eucalyptus camaldulensis (lot CIRAD_Forêt n°93/9778N, Australie) : les graines ont été désinfectées à l’hypochlorite de calcium (5%) pendant 20 minutes. Elles ont été ensuite rincées dans 3 bains de lavage avec de l’eau distillée stérile. Les graines ont été par la suite déposées dans des boîtes de Petri contenant de l’eau gélosée à 0.8%, puis incubées à l’obscurité pendant 9 jours à 25°C. b-2 Préparation de la solution isotopique N 15

Il faut obtenir une concentration finale de 20 mg d’azote /kg de sol, le marquage se 15 faisant avec du NH 4NO 3 enrichi à 10% de N. Cette quantité d’azote n’affecte pas la fixation de N 2 et correspond à la dose standard utilisée chez les arbres pour la mesure de l’excès isotopique 15 N avec un spectromètre de masse (Sanginga, 1992).

Soit : (20x100)/35 = 57.14 mg de NH 4 NO 3 à 10% / kg de sol. Pour évaluer la quantité de la solution d’azote marqué 15 N à utiliser, il faut calculer la densité de chaque sol.

Calcul de la densité des sols

*La densité apparente (da) exprimée en g/cm 3 est le rapport du poids de sol sec (g) sur le volume total de l'échantillon (cm 3). En d'autres termes, elle représente la masse volumique du sol sec.

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Humidité volumique q Densité apparente (da) = = Humidité pondérale p

*L'humidité volumique (q) est égale au rapport du volume d'eau d'un échantillon sur le volume total de l'échantillon.

Volume d’eau d’un échantillon Humidité volumique (q) = Volume total de l’échantillon

*L'humidité pondérale (p) est la relation de masse entre l'eau contenue dans un échantillon et la matière sèche de cet échantillon.

Masse d’eau Humidité pondérale (p) = Masse de sol sec

Après avoir mesuré la densité, on calcule la quantité de sol nécessaire pour le marquage :

Quantité de sol /site (kg) = Nombre de pots (3) x Quantité de sol par pot (0.4kg) x Densité apparente (da). La densité calculée pour chaque sol et la quantité du sol utilisée a été réalisée comme suit :

Tableau8 : Densité du sol prélevé dans chaque site d’étude et quantité du sol total estimée

p : humidité q : humidité Quantité de Densité apparente pondérale volumique sol/site (kg) Echantillon Bomo plage 0.026 0.034 1.3 1.56 Forêt de Msila 0.056 0.081 1.44 1,73 Ferme de Messerghine 0.25 0.27 1.09 1,31 Sebkha 0.22 0.22 1 1.2 Quantité du sol total 5.8

Un volume de 25 ml de la solution de dilution de l’azote marqué a été utilisé pour chaque pot.

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Le volume final de la dilution = nombre de pots x 25ml = 12 X 25ml = 300 ml

15 Quantité totale de NH 4NO 3 à 10% de N = nombre de pots x quantité de sol par pot x da

x quantité de NH 4 NO3 à 10% par kg de sol (57.14 mg).

= quantité totale de sol x quantité de NH 4 NO 3 à 10% / kg de sol (57,14 mg). = 5.8 kg x 57.14 mg /kg. = 331,412 mg.

Finalement 331,4 mg de NH 4 NO 3 à 10% ont été dilués dans 300ml d’eau distillée et 25 ml ont été administré à chaque pot. L’arrosage a été réalisé par nébulisation d’eau stérilisée (1 fois/semaine) pour éviter la déperdition de la solution d’azote marqué par lessivage. Après une semaine d’adaptation, on a administré aux plantes 25 ml de la solution de N 15 préparée préalablement pour obtenir une concentration de 25 mg d’azote marqué/kg de sol testé. b-3 Dosage du 15 N :

Après 9 mois de croissance en pépinière, les plantes ont été récoltées, Les nodules ont été délicatement détachés, comptés, décrits et conservés par la suite dans du glycérol à 60% à une température de -20°C. La hauteur des plants a été mesurée et leur poids frais estimé. Ces derniers ont été mis à sécher à l’étuve pendant 3 jours à 60°C, avant de les peser puis les broyer. Le broyat fin des tiges, feuilles et racines a été analysé pour le dosage du 15 N. L’excès isotopique des différents échantillons a été déterminé par spectrométrie de masse pour le calcul du Ndfa% (N dérivé de la fixation du N 2 exprimé en pourcentage d’azote total dans la plante fixatrice) et du Ndfa (N2 dérivé de la fixation d’azote dans la plante fixatrice = N2 fixé total) selon les différents traitements, ces valeurs ont été estimées au niveau de chaque partie des plantes après avoir mélanger les cinq répétitions par traitement, afin de déterminer la quantité d’azote fixé selon

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les différentes modalités testées et dans chaque partie de la plante. Les équations utilisées sont (Peoples et al., 1989):

Ndfa% = 100 x (1 - Ndff i% / Ndff o%)

Ndff i : N dérivé de l’engrais marqué dans la plante fixatrice de N 2,

Ndff o : N dérivé de l’engrais marqué dans la plante non-fixatrice de N 2 (de référence).

En d’autres termes :

Ndfa% = [1- Ei / E o] x 100

Ei : excès isotopique dans la plante fixatrice,

Eo: excès isotopique dans la plante de référence non-fixatrice de N2, Alors que E = % atome du 15 N dans l’échantillon du sol ou de la plante, 15 0.3663% : représentant l’abondance isotopique naturelle en N contenu dans le N2 atmosphérique.

La quantité de N 2 fixé est de : Ndfa = Ndfa% x Nt / 100

Nt : Azote fixé total. c- Analyse du sol :

Les différents échantillons de sol ont été envoyés à un laboratoire d’analyse pédologique afin d’évaluer la teneur des sols en azote , phosphore , CEC et carbone .

2- Abondance naturelle en 15 N :

Au niveau de chaque site d’étude existe un cortège floristique particulier. Pour évaluer la fixation de l’azote par la méthode de l’abondance naturelle en 15 N, des échantillons représentatifs des plantes entières ont été prélevés, à la fois de légumineuses et de plantes non-fixatrices du même gabarit et un système racinaire d’une architecture et d’un développement proches.

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Ces conditions n’étant pas réunies au même endroit dans les quatre sites d’étude, l’approche pragmatique fut de récolter des rameaux, feuilles de l’année sur cinq arbres de la même espèce, espacés de 20 mètres en moyenne les uns des autres. Parallèlement, nous avons prélevé des rameaux et feuilles d’espèces d’arbres non fixateurs, situés à proximité de chaque arbre fixateur ainsi que de petites légumineuses et non-légumineuses herbacées, lorsqu’elles étaient présentes.

- Prélèvement de matériel végétal : Afin d’évaluer la fixation de l’azote par les Acacias, les feuilles ont été prélevées sur des rameaux vigoureux de l’année, une longueur de 20 cm à différentes hauteurs de branches des Acacias étudiés. Trois sites ont été retenus : Bomo-plage, Forêt de M’sila et la Ferme de Messerghine. Après prélèvement, les échantillons végétaux ont été séchés à l’étuve pendant 3 jours à 60°C, broyés puis analysés au spectromètre de masse pour la détermination de l’abondance naturelle en 15 N. Le pourcentage d’azote atmosphérique fixé (Ndfa%) est calculé comme suit (Shearer et Kohl, 1986) :

Ndfa% = ([ δ15 N (pl. réf.) - δ15 N (pl. fix.)] / [ δ15 N (pl. réf.) – β]) x 100 où :

δ15 N (pl.réf.) : composition isotopique de la plante de référence non fixatrice. 15 δ N (pl. fix.) : composition isotopique de la plante fixatrice de N 2 . β : coefficient de fractionnement isotopique (appelé aussi facteur d’enrichissement isotopique) 15 est calculée en mesurant l’abondance naturelle en N de la plante fixatrice de N 2 inoculée avec une souche rhizobienne efficiente et fixant 100% d’azote, croissant sur un substrat dépourvu d’azote combiné (Mariotti, 1983).

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Partie II : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie

Résultats et discussion

1- Résultats des analyses du sol des trois sites étudiés

Les analyses de sols ont été réalisées à partir d’échantillons prélevés dans l’horizon 0-20 cm dans chacun des sites étudiés. Les résultats obtenus pour les trois sites sont représentés dans le Tableau 24.

Tableau 24 : Résultats de l’analyse physico-chimique des trois sites étudiés.

Paramètres Sites d’étude

Ferme St Anne, Dunes d’El Mactaa Forêt de M’sila, Messerghine (Oran) (Mostaganem) Boutlilis (Oran)

-1 0,34 0,44 0,42 N total (g.kg sol)

Phosphore (g.kg -1 sol) 0,0167 0,0130 0,0109

* CEC (mEqH +.g -1 sol) 93,6 95,6 82,4

C (%) 5,83 1,13 3,43

M.O. (%) 10,05 1,95 5,91

* CEC : Capacité d’Echange Cationique, MO% (Matière Organique)= C% x 1,724

Le sol des dunes d’El Mactaa, bien que sablonneux, s’avère assez fertile si l’on considère sa capacité d’échange cationique (CEC) (0,956 meq/100g.sol ) comparée aux normes (Doucet, 2006 ; Annexe 13) et sa teneur en N total relativement élevée (0,44 g.kg -1 sol) très supérieure à 0,01 g.kg -1 qui est considérée comme la limite inférieure de carence azotée (Boyer, 1983). Ces valeurs sont proches de celles des sols francs-limoneux (loams) de la ferme de Messerghine et de la forêt de M’sila. Sachant que les sols sont considérés comme carencés en P et en N lorsque ces teneurs sont inférieures à 0,030 et 0,01 g.kg -1sol respectivement (Boyer, 1983), les sols des trois sites présentent un faible niveau en P mais des teneurs en N assez élevées. Ces résultats sont assez étonnants pour les sols dunaires, si on considère qu’en général ces derniers sont assez pauvres en éléments nutritifs (Sidda

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Ould Dah et al., 2005 ; Hatimi et Tabrouche, 2007), cela est peut être du à la présence de plusieurs légumineuses (une ligneuse et des herbacées) sur le site qui enrichissent le sol par l’azote fixé grâce à la décomposition de la litière (Dommergues et al., 1999). Le taux de matière organique est corrélé avec un indice de 1,724 (appelé facteur de Van Bemmelen) (Broadbent, 1953) et après calcul de la matière organique de chaque site (M.O. %), on conclu que le sol de la Ferme de Messerghine est le plus riche en matière organique suivi du sol de la forêt de M’sila et enfin des dunes d’El Mactaa. Pour le sol de ce dernier site, le faible taux de M.O n’est pas corrélé à la CEC laquelle est assez élevée (Tableau 24), la matière organique ne participant probablement que d’une manière limitée aux échanges de cations (Ben Hassin et al., 2008). Néanmoins le taux de M.O% traduit un pouvoir de résistance à l’érosion (Leprun, 1988), ce qui loin d’être le cas pour les dunes en général. De plus, il semble que la teneur élevée en N d’un sol donné comme c’est le cas des dunes d’El Mactaa traduise la forte minéralisation de ce composé, ce qui est une caractéristique des écosystèmes fermés (Dommergues et al., 1999).

2- Effet du sol sur la croissance de trois espèces d’ Acacia

Trois espèces d’ Acacia , i.e. A. karroo, A. seyal et A. saligna , ont été testées et cultivées en serre sur quatre types de sols provenant de quatre écosystèmes différents. Pour la première espèce, deux sites ont été sélectionnés : la Ferme de Messerghine à vocation céréalière et la forêt de M’sila ; pour la deuxième espèce, un site proche de la Sebkha d’Oran ; quant à la dernière, le sol utilisé provient des dunes côtières d’El Mactaa qui a été l’objet d’un projet de stabilisation de dunes initié par la direction des forêts de Mostaganem. Neuf mois après l’addition d’azote marqué 15 N à des doses non inhibitrices de nodulation dans le but d’évaluer la quantité d’azote fixé par les trois espèces d’ Acacia sur les différents types de sols, et ceci à raison de 5 plants inoculés avec un mélange de 4 souches de rhizobium et 5 plants non inoculés par traitement, les plants cultivés sur le sol de la forêt de M’sila étaient les plus développés, suivis par ceux cultivés sur le sol de la Sebkha puis par ceux ayant poussé sur le sols de la Ferme de Messerghine et des dunes d’El-Mactaa (Figure 28). Sachant que seul A. karroo était testé sur deux sols différents et que les trois espèces d’ Acacia testées avaient des vitesses de croissance propres variables, ces résultats montrent seulement que le sol de la forêt de M’sila est plus fertile que celui de la Ferme de Messerghine. La croissance des plants d’ Eucalyptus camaldulensis utilisés comme espèces d’arbres témoins non-fixateurs, cultivés dans les mêmes conditions variait

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également selon le type de sol utilisé, on remarque aussi que la meilleure croissance était obtenue sur le sol de la forêt de M’sila, comme l’ont montré les mesures de hauteur et de poids sec moyen des parties aériennes (Figure 29, Tableaux 25 et 26 respectivement).

I S4

T S2 S3 NI S1

Figure 28 : Aspect général des plants cultivés en pots sur sol enrichi en 15 N et disposition des différents traitements après neuf mois d’expérimentation en serre. S1 : sol de la ferme de Messerghine (A. karroo) ; S2 : sol de la forêt de M’sila (A. karroo) ; S3 : sol de la Sebkha d’Oran, (A. seyal) ; S4 : Sol des dunes d’El Mactaa (A. saligna). I : Acacias inoculés avec rhizobia ; NI : Acacias témoins non inoculés avec rhizobia ; T : Plants témoins non-fixateurs (Eucalyptus camaldulensis).

Figure 29 : Aspect des plants témoins non- fixateurs (Eucalyptus camaldulensis) cultivés sur les sols des quatre sites étudiés, après neuf mois de croissance en serre et enrichissement du sol en 15 N.

S1 : sol de la ferme de Messerghine ; S2 : sol de la forêt de M’sila ; S3 : sol de la Sekha d’Oran ; S4 : sol des dunes d’El Mactaa.

S1 S3 S2 S4

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Tableau 25 : Hauteur des plants et nombre de nodules obtenus chez les différentes espèces d’Acacia testées , après 9 mois de culture en serre dans des pots contenant du sol enrichi en 15 N provenant des quatre sites étudiés.

Espèce Espèce d’ Acacia inoculée avec Site de prélèvement témoin non- Espèce d’ Acacia non inoculée rhizobia fixatrice de N

Ferme de Meserghine Eucalyptus A. karroo A. karroo (site n°1) camaldulensis

Hauteur tige Hauteur tige Nombre Hauteur tige Nombre nodules (cm) (cm) nodules (cm)

Moyenne 17,2±9,54 15,4±7,09 11±17,68 14,8±7,6 15±10,71

Eucalyptus A. karroo A. karroo Forêt de M'sila camaldulensis (site n°2) Hauteur tige Hauteur tige Nombre Hauteur tige Nombre nodules (cm) (cm) nodules (cm)

Moyenne 39,3±20,41 54,8±25,03 8±4,93 44,6±31,08 53,4±124,16

Eucalyptus A. seyal A. seyal Sebkha d’Oran camaldulensis (site n°3) Hauteur tige Hauteur tige Nombre Hauteur tige Nombre nodules (cm) (cm) nodules (cm)

Moyenne 33,7±19,21 35,2±16,77 19±9,79 23,3±8,73 31±38,77

Eucalyptus Dunes d'El Mactaa A. saligna A. saligna camaldulensis (site n°4) Hauteur tige Hauteur tige Nombre Hauteur tige Nombre nodules (cm) (cm) nodules (cm)

Moyenne 28,2±34,97 10,37±7,57 35±26,56 7,2±1,52 18±6,76

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Tableau 26: Poids sec des feuilles, tiges et racines des plants des différentes espèces d’Acacia testées, après 9 mois de culture en serre dans des pots contenant du sol enrichi en 15 N provenant des quatre sites étudiés. Site de Espèce témoin non-fixatrice Espèce d’ Acacia non Espèce d’ Acacia inoculée avec prélève- de N inoculée rhizobia ment

Ferme de A. karroo A. karroo Eucalyptus camaldulensis Messer- ghine Poids sec (g/plante) Poids sec (g/plante) Poids sec (g/plante) (site n°1) feuilles tiges racines plante feuilles tiges racines plante feuilles tiges racines plante

1,4 0,4 0,8 2,6 0,9 3,6 6,1 10,7 1,1 4,3 3,9 10,7 Moyenne ±0,7 ±0,2 ±0,4 ±1,2 ±0,15 ±0,5 ±1,5 ±2,1 ±0,2 ±0,5 ±0,6 ±0,6

Forêt de M'sila Eucalyptus camaldulensis A. karroo A. karroo (site n°2) Poids sec (g/plante) Poids sec (g/plante) Poids sec (g/plante) feuilles tiges racines plante feuilles tiges racines plante feuilles tiges racines plante

2,5 4,7 4,2 12,4 5,4 13,0 7,7 26,2 4,2 11,9 5,4 21,5 Moyenne ±1,9 ±1,1 ±0,8 ±3,46 ±0,8 ±1,8 ±1,4 ±4 ±0,8 ±2,4 ±1,1 ±4,2

Sebkha Eucalyptus camaldulensis A. seyal A. seyal d’Oran (site n°3) Poids sec (g/plante) Poids sec (g/plante) Poids sec (g/plante) feuilles tiges racines plante feuilles tiges racines plante feuilles tiges racines plante

4,2 1,6 2,4 8,2 2,9 6,8 7,5 17,2 2,0 4,0 4,1 10,1 Moyenne ±1,1 ±0,4 ±0,9 ±2,4 ±0,4 ±0,9 ±0,9 ±2,1 ±0,3 ±0,6 ±0,8 ±1,8

Dunes d'El Eucalyptus camaldulensis A. saligna A. saligna Mactaa (site n°4) Poids sec (g/plante) Poids sec (g/plante) Poids sec (g/plante) feuilles tiges racines plante feuilles tiges racines plante feuilles tiges racines plante

1,5 0,4 0,7 2,6 3,1 1,6± 3,5 8,1 2,8 0,7 5,9 10,1 Moyenne ±0,1 ±0,03 ±0,08 ±0,21 ±0,7 0,5 ±0,9 ±2,14 ±0,43 ±0,06 ±0,61 ±1,04

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Ainsi, comme le montre le Tableau 25, après neuf mois de croissance en serre, les plants d’ E. camaldulensis cultivés sur du sol de la forêt de M’sila ont une hauteur moyenne (39,3cm) supérieure à celle de plants cultivés sur les sols de la Sebkha (33,7 cm), des dunes d’El Mactaa (28,2cm) et surtout de la Ferme de Messerghine (17,2 cm), cependant selon le test ANOVA à un seul facteur (Tanagra, 1,4) au seuil de 5%, il n y a pas de différence significative entre les 04 sols (Annexe E-2), de même que pour la variable ‘Poids sec total des plants’ qui donne une indication plus fiable que celles de la hauteur de la tige (Tableau 26) (Annexe E-2). En ce qui concerne les plantes fixatrices, le poids sec des parties aériennes d’ A. karroo obtenu sur le sol de la forêt de M’sila était de loin supérieur à celui obtenu sur sol de la Ferme de Messerghine, comme l’atteste le test de Student-Newman-Keuls qui montre un effet significatif du facteur sol sur la croissance des plants au seuil de signification P=0,95 (Annexe E-3 et Figure 30). Ces résultats sont en contradiction avec les analyses de sols (Tableau 24) puisqu’on a constaté que leurs teneurs en N et C étaient plus élevés dans le sol de la Ferme de Messerghine. Dans l’absolu, il n’est pas étonnant de trouver que le sol prélevé de forêt soit plus riche, du fait de la richesse du cortège floristique qui prévaut dans cette zone de Boutlelis. Le sol de la Sebkha offre aussi un potentiel intéressant bien que cette région ait été transformée en décharge publique ces dernières années. Il est tout de même étonnant de ne pas observer de différences de croissance significative entre les plants cultivés sur sols de dunes côtières, pourtant connues pour leur pauvreté en éléments nutritifs (Sidda Ould Dah et al., 2005 ; Hatimi et Tabrouche, 2007) même si nos analyses de sol l’infirment, et ceux cultivés sur le sol de la Ferme de Messerghine.

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Figure 30 : Aspect des plants d’A. karroo non inoculés cultivés sur sols de la Ferme de Messerghine (S1) et de la forêt de M’sila (S2), après neuf mois de croissance en serre et enrichissement du sol en 15 N.

S1 S2

3- Effet de l’inoculation sur la croissance de trois espèces d’ Acacia sur quatre types de sols

L’inoculation de souches de rhizobium appropriées sur des substrats ayant des teneurs faibles ou nulles en N minéral, a toujours un effet positif sur la croissance des légumineuses, du moins en conditions contrôlées où le potentiel d’efficience des souches rhizobiennes est pleinement exprimé en l’absence de facteurs limitant édapho-climatiques (Dommergues, 1995). Cependant les modalités d’inoculation au champ doivent respecter certaines règles, en particulier les critères de choix de la souche de rhizobium à utiliser voire d’un mélange de souches, même si pour la première hypothèse le contrôle de qualité est plus facile (Thompson, 1980). Certains auteurs comme Somasegaran et Bohlool (1990) qui ont comparé l’effet d’inocula mono et multi souches, ont montré que la seconde option était la plus efficace en raison des adaptations et compétitivités variables des souches selon le type de sol de culture. D’autres auteurs (Thompson, 1980 ; Keyser et al., 1992 ; Brockwell et Bottomley, 1995) ont aussi préconisé l’utilisation d’inocula multi-souches sur la base de leur résistance aux différents facteurs environnementaux et d’un spectre d’hôte assez large leur permettant de fixer l’azote avec le plus grand nombre d’espèces de plantes

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hôtes possibles. Pour ces raisons, nous avons opté pour l’utilisation d’un mélange de quatre souches sélectionnées, propre à chacune des trois espèces d’ Acacia testées (Annexe E-1). Les résultats indiquent que l’inoculation n’a aucun effet positif et significatif sur la croissance des Acacias et que dans deux cas, elle diminuerait même le développement des plantes de façon sensible (Tableau 26). Les résultats de poids sec entre A. karroo inoculés, non inoculés de la ferme de Messerghine et de la forêt de M’sila sont proches, le test de Student-Newman-Keuls sur l’effet inoculation (Annexe E-4) révélant qu’il n’y a pas de différence significative au seuil P=0,95 entre traitement des plantes inoculées et non inoculées (Figures 33 et 34, Annexe E-4). De même qu’on constate qu’il y a pas de différence significative à P= 0,95 entre les plants inoculés et non inoculés d’ A. seyal et d’ A. saligna (Annexe E-5 et Annexe E-6 respectivement) (Figures 31 et 32 respectivement). Ces résultats révèlent la nécessité d’inoculer en pépinière avant transfert au champ, les plants sur le sol du site où le couple symbiotique légumineuse-rhizobia sera introduit. Les tests in vitro de nodulation et d’efficience en conditions contrôlées sont indispensables pour juger de l’efficience de chaque souche, mais une fois que les souches efficientes sélectionnées sont mélangées au sein d’un inoculum et entrent en compétition avec la population rhizobienne autochtone de chaque type de sol, les résultats peuvent être très aléatoires. Ces résultats sont en contradiction avec les travaux de Galiana et al., 1994 en Côte d’ivoire, où l’inoculation avait eu un effet positif sur la croissance de Acacia mangium pendant plus de trois ans après transfert des arbres en plantation, la souche inoculée ayant été retrouvée 42 mois après l’expérimentation (Galiana et al., 1994), alors que la fixation d’azote atmosphérique variait de 50 à 90% au sein de la parcelle (Galiana et al., 1996). Le résultat positif obtenu chez A. mangium pourrait être attribué à la relative spécificité de cette espèce vis à vis de certaines souches de bradyrhizobia, comme la souche Aust13c qui a démontré son potentiel d’efficience et de compétitivité en Côte d’Ivoire ainsi que dans d’autres pays d’introduction, malgré le spectre d’hôte relativement large généralement observé chez les bactéries du genre Bradyrhizobium (Galiana et al., 1994). Une autre étude de Lal et Khanna (1996) a aussi démontré une croissance améliorée d’A. nilotica au champ après inoculation en Inde. Dans ce dernier cas, il a été montré que la réponse positive à l’inoculation était due à la faible densité de la population rhizobienne du sol, qui par ailleurs quand elle est trop basse, peut empêcher l’établissement des arbres fixateurs d’azote (Thrall et al., 2001a). Une autre étude de Shetta (2010) a montré qu’A. karroo répondait mieux à l’inoculation (en termes de biomasse totale et de fixation d’azote estimée par la méthode ARA) avec des souches indigènes plutôt qu’avec une souche

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exogène, probablement en raison de la meilleure adaptation des premières aux conditions d’aridité locales et à leur meilleure compétitivité vis-à-vis des autres souches autochtones déjà présentes dans le sol. En conclusion, le recours à l’inoculation massive de différentes espèces d’ Acacia par des souches de rhizobium dans le cadre de programmes de plantation doit respecter un certain nombre de règles et doit prendre en compte des indicateurs environnementaux et édaphiques tels que : l’absence ou la présence d’autres espèces de légumineuses dans le site à revégétaliser, le degré de dégradation du sol consécutif à la surexploitation de l’écosystème d’origine (Allen et Allen, 1961), la teneur en N du sol ; mais également des critères microbiologiques tels que la spécificité d’hôte des rhizobia (Roughley et Brockwell, 1987) et la compétitivité des rhizobia indigènes vs celle des souches introduites (Thies et al., 1991) qui est une propriété aussi importante que leur efficience (Triplett, 1990) .

NI I T NI I T

Figure 31 : Aspect de différents plants d’A. Figure 32 : Aspect de différents plants d’A. seyal et de l’espèce témoin non-fixatrice E. saligna et de l’espèce témoin non-fixatrice E. camaldulensis cultivés sur sol de la Sebkha camaldulensis cultivés sur sol de dunes d’El d’Oran après neuf mois de croissance en serre. Mactaa après neuf mois de croissance en serre.

I : A. seyal inoculé ; T : témoin non- I : A. saligna inoculé ; T : témoin non-fixateur (E. fixateur (E.camaldulensis) ; NI : A. seyal non inoculé. camaldulensis) ; NI : A. saligna non inoculé

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NI I T NI I T

Figure 33 : Aspect de différents plants d’A. Figure 34 : Aspect de différents plants d’A.

karroo et de l’espèce témoin non-fixatrice E. karroo et de l’espèce témoin non-fixatrice E. camaldulensis cultivés sur sol de la Ferme de camaldulensis sur sol de la forêt de M’sila après Messerghine après 9 mois de croissance en serre. neuf mois de croissance en serre.

I : A. karroo inoculé ; T : témoin non fixateur (E. I : A. karroo inoculé ; T : témoin non fixateur (E. camaldulensis) ; NI : A. karroo non inoculé. camaldulensis) ; NI : A. karroo non inoculé.

4- Estimation du potentiel fixateur de trois espèces d’ Acacia sur différents types de sols par la méthode de la dilution isotopique en 15 N

Les plants une fois séchés ont été analysés suivant deux modalités : la première en analysant l’excès isotopique en 15 N et la teneur en N total de chaque plant, avec différents traitements (inoculés, non inoculés), le deuxième en analysant l’excès isotopique en 15 N et la teneur en N total des mélanges des feuilles, tiges et racines des cinq plants non inoculés. La comparaison entre ces deux approches, intégrant l’analyse du plant en entier ou du mélange des différentes parties végétales (feuilles, tiges et racines) nous permettra de sélectionner la meilleure approche pour le dosage de l’excès isotopique en 15 N et en N total des plants. La seconde approche (analyse du mélange) permet de quantifier l’excès isotopique en %15 N et %N dans les différents compartiments végétaux (feuilles, tiges et racines). Il faut rappeler que la dilution isotopique après enrichissement du sol en 15 N ou dilution isotopique est fondée sur deux hypothèses : i) L’excès isotopique en 15 N de la plante de référence non fixatrice d’azote est identique à celui du sol. Cette première hypothèse est toujours satisfaite car la discrimination isotopique éventuelle au moment de

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l’absorption par la plante peut être négligée dans le cas de cette méthode d’enrichissement 15 en N. ii) La plante fixatrice de N2 et la plante de référence non fixatrice explorant le même pool d’azote du sol ont la même abondance isotopique (la plante fixatrice et de référence absorbent des proportions identiques de 15 N mais pas nécessairement des quantités identiques de N minéral du sol et de N provenant de l’engrais enrichi en 15 N). Ainsi, en cas de fixation de N, l’enrichissement en 15 N de la plante de référence non fixatrice doit être plus élevé que celui de la plante fixatrice, le 15 N de cette dernière étant dilué par le N 2 atmosphérique dans ses tissus. Comme l’indique le Tableau 27, ce dernier cas de figure n’a été observé que chez A. saligna dans notre expérimentation où Eucalyptus camaldulensis était l’espèce de référence non-fixatrice utilisée. Chez A. karroo cultivé sur sol de la ferme de Messerghine et de la forêt de M’sila ainsi qu’ A. seyal sur sol de la 15 Sebkha, le Ndffi % (excès isotopique en N de la plante fixatrice de N 2) est par contre 15 largement supérieur au Ndffo % (excès isotopique en N de la plante non fixatrice de N 2). Par ailleurs, l’excès isotopique en 15 N mesuré chez les différentes espèces d’ Acacia varie entre les plants inoculés et les plants non-inoculés de même que selon le type de sol chez A. karroo , cette espèce étant présente sur deux types de sol, à savoir la ferme de Messerghine et la forêt de M’sila, nous avons procédé à l’étude de l’effet sol sur la teneur en N total et l’excès isotopique en 15 N, sur la base du test de Student à P=0.95, il y a un effet significatif du sol de la forêt de M’sila avec un excès moins élevé chez les plants sur ce sol comparativement à ceux de la ferme de Messerghine (Annexe F2), de même qu’une teneur en azote total supérieure (Annexe F1). On peut toutefois considérer qu’ A. karroo ne fixe ni sur le sol de la forêt de M’sila ni sur celui de la ferme de Messerghine, l’excès 15 N de l’espèce non fixatrice inferieur à celui d’ A. karroo sur sol de Messerghine étant dû à un artefact expérimental ou à une erreur de mesure. L’effet de l’inoculation sur les teneurs en azote total des trois espèces ( A. karroo, A. seyal et A. saligna ) sur les quatre types de sol est statistiquement non significatif d’après le test de Student à P=0,05 chez toutes les espèces testées (Annexes F-3, F-5, F-7,et F- 9), il n’est pas non plus significatif en ce qui concerne l’excès isotopique en 15 N chez A. karroo cultivé sur le sol de la forêt de M’sila (Annexe 6), alors que l’effet de l’inoculation est statistiquement significatif sur les trois autres espèces des trois autres sites (Annexes F-4, F-8 et F-10). L’excès en 15 N est plus dilué chez A. seyal et A. saligna non inoculés et chez A. karroo inoculé croissant sur le sol de Messerghine, ce qui sous- entend que l’inoculation n’a un effet positif sur la fixation que dans le cas d’ A. karroo cultivé sur le sol de Messerghine.

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Les plus faibles excès isotopiques en 15 N observés chez la plante de référence non- fixatrice E. camaldulensis par rapport à ceux mesurés chez les Acacias cultivés sur les sols de la Ferme de Messerghine et dans une moindre mesure de la Sebkha d’Oran pourraient être attribués à la très faible croissance initiale d’ Eucalyptus camaldulensis observée sur ces deux types de sols, lesquels sont également moins développés comparativement aux Acacias que ceux cultivés sur les sols de la Forêt de M’Sila et des Dunes d’El Mactaa après 9 mois de croissance (Tableau 27). Les espèces d’ Acacia cultivées sur ces mêmes sols, i.e. A. karroo et A. seyal , sans doute plus adaptées à ces deux types de sols puisque déjà naturellement présentes sur les deux sites correspondants, contrairement à E. camaldulensis seulement utilisée pour les besoins de l’expérimentation, se sont donc bien mieux développées que les eucalyptus. Ayant pris toutes nos précautions pour ne pas avoir de perte d’azote minéral enrichi en 15 N (lequel a

été mélangé au substrat-sol à T 0) pendant neuf mois de croissance des plants, notamment à travers un arrosage régulier des plants au goutte-à-goutte, les pertes de 15 N par lixiviation peuvent être considérées comme mineures. La vitesse de croissance trop faible observée chez la plante de référence non-fixatrice par rapport à la plante fixatrice sur les deux sols en question suffit à expliquer les faibles excès en 15 N obtenus chez les premières. Bien que l’application de la méthode de dilution isotopique nécessite le choix d’une espèce de référence non-fixatrice de N 2 ayant la même vitesse et le même rythme de croissance que la plante fixatrice étudiée (Dommergues et al., 1999), ces conditions sont rarement réunies chez les arbres, a fortiori lorsqu’ils croissent sur du sol plutôt que sur substrat artificiel en raison des capacités adaptatives très souvent différentes entre espèces.

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Tableau 27 : Excès isotopiques en 15 N et teneur en N total mesurés chez les plants des différents traitements, et calcul du pourcentage de N fixé et de la quantité de N total fixé chez les différentes espèces d’Acacia après application d’azote minéral enrichi en 15 N et neuf mois de croissance en serre sur différentes origines de sols.

Poids sec Excès Teneur N total N total Origine du Espèce Traite- cumulé isotopique en Ndfa% fixé (mg/ a des plants 15 mg/ c sol d’arbre ment en N (%) N total (g) b plant d (%) plant)

Inoculé 9,3 3,97 ±1,52 0,61 ±0,09 0,06 0 0 Ferme A. karroo Non 0 0 Messerghine 10,7 5,46 ±0,37 0,62±0,14 0,07 inoculé

E. - - 2,6 1,93 0,5 0,01 camaldulensis

Inoculé 21,5 1,12 ±0,31 0,69 ±0,12 0,18 0 0 Forêt de A. karroo Non 0 0 26,2 1,00±0,25 0,64 ±0,25 0,24 M'Sila inoculé

E. - - 12,4 1,10 0,44 0,06 camaldulensis

Inoculé 10,1 2,23 ±0,05 0,84 ±0,31 0,10 0 0 A. seyal Sebkha Non 0 0 17,2 1,46 ±0,12 0,9 ±0,25 0,11 inoculé

E. 8,2 1,05 0,51 0,04 camaldulensis

Inoculé 5,9 5,55 ±0,48 1,31 ±1 0,08 45,43 0,035 Acacia Dune El saligna Non Mactaa 8,1 4,14 ±0,11 1,03 ±1,14 0,08 59,35 0,049 inoculé

E, 2,6 10,17 0,61 2,6 - - camaldulensis

aLes plants d’Acacia ont été inoculés ou non par un mélange de 04 souches de rhizobium ( SE3, T82, KHB et E60) ; b L’excès isotopique en 15 N moyen a été mesuré au niveau des plants entiers à raison de 5 plants ou répétitions par traitement ; c Le pourcentage de N dérivé de la fixation atmosphérique a été calculé comme suit : Ndfa% = 100 x (1 - Ndff i% /// Ndff o%,

15 Ndff i représentant l’excès isotopique en N mesuré chez la plante fixatrice de N 2, (soient les différentes espèces d’Acacia

15 testées) et Ndff o ,l’excès isotopique en N mesuré chez la plante de référence non-fixatrice de N 2, (Eucalyptus camaldulensis) ; d La quantité moyenne de N total fixé par la plante fixatrice a été calculé comme suit : NdNdNdfaNd fafafa = Ndfa% x Nt / 100.

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Si l’on s’intéresse plus particulièrement à l’excès isotopique en 15 N et au N total contenus dans les différentes parties végétales à savoir les racines, les feuilles et les tiges, on note que majoritairement, la valeur en N est plus élevée au niveau des feuilles (Tableau 28). Cela est observé pour A. karroo sur les sols de Messerghine et de la forêt de M’sila et A. seyal sur le sol de la Sebkha (1,24 ; 1,42 et 0,81 % N respectivement), à l’inverse d’A. saligna sur le sol des dunes d’El Mactaa qui a une teneur plus élevée au niveau des racines (0,75), ceci est sans doute dû à un caractère propre à cette espèce et à une légère carence des feuilles en azote malgré une fixation de N active. Mais dans tous les cas et chez toutes les espèces testées, le taux de N le plus bas est mesuré dans les tiges. Concernant l’excès isotopique en 15 N, le taux le plus élevé se situe au niveau des racines chez A. karroo cultivé sur sol de Messerghine et de la forêt de M’sila (7,19 et 1,22 respectivement, Tableau 28). On sait que les racines sont le site d’absorption du 14 N (issu du sol et de l’azote atmosphérique après fixation) et du 15 N (issu de l’engrais marqué), et même si les racines sont le siège de la fixation d’azote atmosphérique via les nodules, tout se passe comme si cette ligneuse gardait l’azote marqué au niveau des racines et transportait l’azote fixé vers la tige et les feuilles. Quant à A. seyal sur le sol de la Sebkha, il concentre l’azote marqué au niveau de la tige et des feuilles (2,48 et 2,26 respectivement, Tableau 28) tandis qu’A. saligna le concentre majoritairement au niveau des feuilles (4,53). On peut supposer que le transport de l’azote marqué se fait activement chez A. saligna et A. seyal (d’où la concentration élevée en %15 N au niveau des feuilles,) et faiblement chez A. karroo . D’où la nécessité d’agir avec la plus grande prudence lorsqu’on ne peut pas prélever toute la plante, notamment chez les arbres, sachant que les échantillons de feuilles ne permettent pas d’estimer de façon précise le taux de fixation au niveau de la plante entière.

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Tableau 28 : Teneur en N et excès isotopique en 15 N dans les différents organes (racines, tiges et feuilles) des Acacias non inoculés après application d’azote minéral enrichi en 15 N et neuf mois de croissance en serre sur différentes origines de sols. Teneur en N Excès Espèce (%) moyenne Excès isotopique en Teneur en 15 Origine du sol d' Acacia non Organe de la plante isotopique N moyen (%) N (%) inoculée entière a en 15 N (%) de la plante entière b Racines 1 à 5 0,44 7,19 Ferme Messerghine Acacia karroo Tiges 1 à 5 0,37 0,48 5,79 6,5

Feuilles 1 à 5 1,24 5,42 Racines 1 à 5 0,75 1,22 Forêt de M'Sila Acacia karroo Tiges 1 à 5 0,51 0,77 1,06 1,07

Feuilles 1 à 5 1,42 0,89 Racines 1 à 5 0,70 1,79 Sebkha d’Oran Acacia seyal Tiges 1 à 5 0,40 0,6 2,48 0,38

Feuilles 1 à 5 0,81 2,26 Acacia Racines 1 à 5 0,75 3,760 Dune El Mactaa saligna Tiges 1 à 5 0,42 0,64 3,72 4,09

Feuilles 1 à 5 0,60 4,53 a N% moyen/plante= : [%N racines x Pds sec racines) + (%N tiges x Pds sec tiges) + (%N feuilles x Pds sec feuilles)] / Poids sec de la plante entière b Excès en 15 N % moyen/plante = : [%15N racines x Pds sec racines) + (% 15 N tiges x Pds sec tiges) + (% 15 N feuilles x Pds sec feuilles)] / Poids sec de la plante entière

La plante de référence non fixatrice représentée par d’ Eucalyptus camaldulensis ayant un excès isotopique en 15 N inférieur à celui mesuré chez A. karroo et A. seyal , on peut considérer que ces deux espèces ne fixent pas sur es sols correspondants avec un Ndfa% nul, à l’inverse, le Nsfs% d’ A. saligna estimé à 45,3% pour les plants inoculés et de 59,35% pour ceux non inoculés (Tableau 27). Si l’on se réfère à la littérature (Ganry et Dommergues, 1995 ; Dommergues et al., 1999 ) A. saligna fait partie du groupe d’espèces de légumineuses ligneuses à potentiel de fixation de N 2 moyen à élevé. Ceci est confirmé par la comparaison du Ndfa% d’A. saligna dans cette expérimentation avec ceux calculés chez d’autres espèces comme A cacia caven , Prosopis alba et Prosopis chilensis qui, dans une étude menée au Chili, atteignaient à l’âge de 1 an des valeurs moyennes de Ndfa% nettement plus basses, soit 14, 25 et 31% respectivement d’après la méthode de dilution isotopique (Ovalle et al., 1996). De la même façon, les valeurs de fixation (Ndfa%) obtenues chez Faidherbia albida au Sénégal étaient inférieures à celles estimées chez A. saligna dans notre étude, inoculés ou pas, puisqu’elles variaient de 15 à 23% à l’âge de 1 an d’après la méthode de dilution isotopique (Gueye et Ndoye, 2000).

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La dilution isotopique a donné une bonne estimation de la fixation d’azote atmosphérique chez A. saligna et les désavantages majeurs ont été contournés, tels que les pertes d’azote enrichi en 15 N par lessivage grâce à une irrigation en eau au goutte-à-goutte. Car l’une des limitations majeures de cette méthode réside dans la baisse du ratio 15 N/ 14 N au cours du temps après l’application initiale d’azote minéral enrichi en 15 N (Fried et al., 1983). Par ailleurs, si l’expérimentation avait été réalisée sur le terrain, d’autres contraintes plus difficiles à surmonter auraient dû être levées, tel que l’épandage graduel et à intervalles réguliers de l’azote enrichi en 15 N (Danso et al., 1992 ; 1993) ou bien la nécessité d’avoir un sol ou un substrat suffisamment drainant qui permette une diffusion homogène et optimale de l’isotope (Fried et al., 1983, Witty et Ritz, 1984), conditions faciles à obtenir en expérimentation en pots et en pépinière. Cependant le point crucial dans cette méthodologie est le choix de la plante référence non fixatrice qui doit répondre à plusieurs critères, comme ceux rapportés par Fried et al., 1983, notamment avoir une vitesse de développement et un rythme de croissance similaires à ceux de l’espèce fixatrice de N 2 étudiée, avoir le même taux d’absorption des différentes formes de N en le puisant dans le même pool d’azote du sol. Or, on a vu que ce n’était pas le cas entre les deux espèces fixatrices A. seyal , A. karroo et E. camaldulensis et que la nature du sol interagissait aussi. Ndoye et al , (1995) ont déjà utilisé deux plantes non fixatrices pour A. seyal qui sont Parkia biglobosa et Tamarindus indica , deux espèces de légumineuses de la famille des Caesalpiniacées, la première ayant sous-estimé la fixation comparativement à la deuxième. En revanche, aucune étude d’estimation de la fixation d’azote n’a été effectuée chez A. karroo . La meilleure approche pour parer contre toute source d’erreur liée aux plantes de référence non fixatrices est d’utiliser plusieurs plantes de références dans la même expérimentation (Awonaike et al., 1993), même s’il existe une autre alternative basée sur l’utilisation de modèles dépendants ou indépendants au champ basés sur l’analyse de différents paramètres d’extrait du sol, à savoir l’azote marqué et l’azote total mais qui nécessite d’autres mises au point prélables (Chalk et Ladha, 1999). Les résultats obtenus pour A. saligna en pépinière sont très encourageants pour l’utilisation de cette espèce d’arbre en tant qu’espèce pionnière à introduire dans le cadre de programmes de revégétalisation, puisqu’elle est susceptible d’enrichir rapidement les sols en azote.

Il ne faut tout de même pas oublier que les valeurs obtenues en pépinière doivent être interprétés avec prudence, il semble que ces dernières soient très largement supérieures à

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celles enregistrées sur le terrain. A titre d’exemple, les valeurs obtenues en pépinières ont été estimées à 130-230 fois supérieures en matière sèche et 110-160 fois supérieures en azote total comparativement aux paramètres obtenus au champ pour les deux espèces Acaia alata et Acacia pulchella (Hansan et Pate, 1987).

5- Estimation du potentiel fixateur in situ de trois espèces d’ Acacia sur différents types de sols par la méthode de l’abondance naturelle

Sur chaque site, sur 5 individus par espèce et par site, les échantillons de feuilles ont été prélevés chez les différentes espèces d’ Acacia ainsi que chez trois à quatre espèces de références non-fixatrices présentes sur le même site, ligneuses ou herbacées, représentatives des différents sites en termes d’abondance (Figure 35). Ainsi, dans la ferme de Messerghine ont été prélevées des feuilles d’ A. karroo bien développées portées par de jeunes rameaux, et des échantillons foliaires des trois espèces suivantes: Oxalis sp ., Ballota hirsuta Bentham .et Atriplex sp . Dans le site de la forêt de M’sila, les échantillons foliaires étaient collectés sur des arbres d’ A. karroo , des plants Oxalis sp ., Ballota hirsuta ainsi que d’ Olea europaea et de Quercus suber. Enfin, sur les dunes d’El Mactaa où A. saligna a été introduit depuis 2004, les échantillons foliaires ont été récoltés sur les 3 uniques espèces présentes sur ce site : Retama monosperma , espèce de légumineuse arbustive spontanée, Eucalyptus sp . planté au même moment que les A. saligna et Centaurea calcitrapa une espèce d’Astéracée herbacée sauvage. Le choix d’espèces non ligneuses parmi les espèces de référence non-fixatrices résulte du faible nombre d’espèces ligneuses disponibles dans chaque site. Cependant, ces espèces herbacées peuvent constituer des espèces de référence tout à fait adaptées à l’estimation de la fixation de N 2 comme l’ont démontré plusieurs auteurs qui observaient des abondances naturelles en 15 N ( δ15 N‰) très proches entre arbres fixateurs et espèces herbacées présents dans une même région (Van Kessel et al ., 1994 et Boddey et al., 2000).

Les teneurs en N des plantes de référence non-fixatrices varient fortement à l’intérieur d’un même site. Celles présentes à la fois sur les sites de la ferme de Messerghine et la forêt de M’sila, soit Oxalis sp . et Ballota hirsuta Bentham ont des teneurs en N qui ne varient pas significativement d’un site à l’autre, i.e. de 28,9 à 29,7 g.kg -1 et de 43,6 à 42,4 g.kg -1 chez chacune de ces deux espèces respectivement (Tableau 29). Par contre, les abondances naturelles en 15 N (δ15 N‰) mesurées chez ces deux dernières espèces sont beaucoup plus élevées sur le site de la Ferme de Messerghine que sur celui de la Forêt de M’Sila, i.e. 3

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fois plus chez Ballota hirsuta Bentham et 2,5 fois plus chez Oxalis sp ., de même que chez A. karroo dont les valeurs de δ15 N obtenues sont 2,7 fois plus élevées à Messerghine qu’à M’Sila (9,4 et 3,5 ‰ respectivement). Parmi les espèces exclusives d’un site, O.europaea et Q.suber , uniquement présentes sur le site de la Forêt de M’Sila, ont des valeurs de δ15 N basses et similaires à celles des autres espèces de ce site, i.e. 2,0 et 3,7‰ respectivement, tandis que l’espèce arbustive Atriplex sp ., seulement présente sur le site de Messerghine, possède un δ15 N très élevé (9,9‰) dont la valeur est proche de celles mesurées chez les autres espèces de ce même site, herbacées ou même fixatrice de N 2 comme A. karroo . Globalement, on observe que les valeurs d’abondance en 15 N varient d’une espèce de référence à l’autre, et ce, sur un même site et que certaines d’entre elles ont un δ15 N nettement supérieur à la moyenne, comme Oxalis sp ., d’autres ayant un δ15 N nettement inférieur à la moyenne, comme Olea europaea (Tableau 29). Chez cette dernière espèce, ceci a déjà été observé dans des travaux réalisés au Maroc (Galiana A., communication personnelle).

On remarque une assez grande homogénéité entre les teneurs en N et δ15 N chez les différents individus d’une même espèce prélevés dans chaque site sauf pour Oxalis sp . dans la ferme de Messerghine dont l’écart-type à la moyenne est élevé (6,5) et pour Centaurea calcitrapa des dunes d’El Mactaa avec des valeurs d’écart-type de l’ordre de 18,53 et 6,99 pour la teneur en N total et l’abondance isotopique en 15 N respectivement (Tableau 29). 15 La comparaison des valeurs de δ N obtenues chez les espèces non-fixatrices de N2 et A. karroo dans ces deux derniers sites indiquent clairement que cette dernière espèce d’ Acacia ne fixe pas d’azote ou très peu dans les deux cas, comme le montrent les valeurs de Ndfa% calculées en fonction de chaque espèce non-fixatrice de référence (Tableau 29). Par contre, sur le site des Dunes d’El Mactaa, A. saligna a une abondance naturelle en 15 N proche de 0 et même négative ( δ15 N = -0,4), tout comme l’espèce de légumineuse arbustive 15 Retama monosperma (δ N = -0,2), ce qui suggère des activités fixatrices de N 2 élevées chez ces deux espèces si on compare leurs abondances en 15 N avec celle de Centaurea calcitrapa (δ15 N = 3,3), seule espèce herbacée (annuelle) non-fixatrice présente sur le même site (Tableau 29). Par contre, la valeur d’abondance en 15 N mesurée chez l’arbre de référence non-fixateur Eucalyptus sp . (δ15 N = 0,1), également présent sur les Dunes d’El Mactaa à proximité immédiate des A. saligna , contredit l’affirmation précédente. Plusieurs hypothèses peuvent être émises : i) Les horizons de sol explorés par les deux espèces non-

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fixatrices sont très différentes en raison de leur statuts herbacé et arboré respectivement. Or, on sait que l’abondance naturelle en 15 N d’un sol varie avec la profondeur, laquelle 15 influe directement sur les valeurs de δ N des espèces non-fixatrices de N 2 (Högberg, 1997) ; ii) Les différentes espèces de plantes de référence non-fixatrices poussant sur un même sol n’assimilent pas forcément les mêmes sources d’azote minéral, les ions nitrate vs ammonium en particulier, lesquelles peuvent avoir des signatures isotopiques très différentes ; iii) Il est possible qu’un transfert d’azote fixé se soit produit à partir de la minéralisation de la litière des A. saligna qui s’est accumulée au pied des Eucalyptus, baissant ainsi progressivement le δ15 N de ces derniers arbres au cours du temps, d’autant que la teneur en azote des sols sableux est en général très faible, surtout en profondeur et donc que les sources de N extérieures sont rares ; iv) Chaque espèce de plante a également son propre facteur discriminant en 15 N naturel, ce qui explique ces variations de δ15 N observées entre les différentes espèces non-fixatrices des sites de Messerghine et de la forêt de M’Sila, mais qui restent assez faibles contrairement à El Mactaa.

1 2

3 4

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Figure 35 : Aspect de certaines plantes non fixatrices des régions étudiées : (1) Quercus suber, (2) Ballota hirsuta Bentham, (3) Centaurea calcitrapa, (4) Olea europaea.

Pour estimer de façon la plus fiable et précise possible la fixation de N 2 par la méthode de l’abondance naturelle, il faut que le δ15 N de la plante référence soit différent de zéro, que les variations du δ15entre les différentes plantes de références soient relativement peu importantes et que la valeur du δ15 N de la plante fixatrice se situe entre la valeur ß et la valeur du δ15N de la plante de référence (Shearer & Kohl, 1986; Högberg, 1997; Boddey et al ., 2000). Les deux premières conditions ont été remplies (Tableau 29).

Tableau 29 : Teneurs en N et abondance naturelle en 15 N d’échantillons foliaires d’espèces fixatrices de N 2 et de plantes références non-fixatrices présentes dans les trois sites d’étude et la proportion de N fixée (Ndfa%) par les différentes espèces d’Acacias en fonction des différentes espèces non fixatrices dans trois sites d’Algérie.

Site Espèce Teneur N (g/kg ) δ15N‰ Ndfa% ª ß=0 ß=-2 Oxalis sp . 29,7±0,73 12,0±6,5 21,7 18,6

Atriplex sp . 46,3±2,7 9,9±0,05 5 ,0 4,2 Ferme de Messeghine Ballota hirsuta Bentham 42,4±0,8 8,6 ±3,26 /

Acacia karroo 20,2±0,18 9,4±0,19 - -

Oxalis sp . 28,9±1,86 4,8±1,86 27,1 19,1 -

Ballota hirsuta Bentham 43,6* 3,3* / / Forêt de M'sila Olea europaea 25,3±1,5 2±4,5 / /

Quercus suber 23,8* 3,7* 5,4 3,5

Acacia karroo 19,1±1,49 3,5±2,3 - -

Centaurea calcitrapa 29,5±18,53 3,3±6,99 112 69,8

Eucalyptus sp . 16,2±0,55 0,1±1,2 - 23,8 Dunes d'El Mactaa Retama monosperma 29,4±0,32 -0,2±1,56 - -

Acacia saligna 27,7±1,26 -0,4±3,7 - - a Ndfa% calculé chez les acacias en fonction de la plante de référence non-fixatrice considérée et des deux valeurs β (coefficient de fractionnement isotopique) extrêmes d’hypothèse. *Un seul individu

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Pour la dernière, il faut tout connaitre cette valeur ß qui correspond au δ15N de la plante fixatrice, fixant 100% de N en absence de tout facteur contraignant (estimé sur un milieu dépourvu d’azote et après inoculation avec une souche rhizobienne adéquate), lequel se situe généralement entre -3 et 0‰ (Handley et Raven, 1992 ; Kurdali et al., 1993). Cependant, la plupart des valeurs du δ15 N chez les arbres semblent converger entre -2 et - 1,4 (Domenach et al., 1992 ; Ladha et al., 1993 ; Nygren et al., 2000 et Yoneyama, 1987). Comme les valeurs ß ne sont pas disponibles pour A. karroo et A. saligna , nous avons utilisé les deux valeurs extrêmes de 0 et de -2 comme hypothèse de calcul du Ndfa% pour couvrir l’intervalle probable le plus étendu possible (Koponen et al., 2003 ; Roggy et al., 1999 et Shearer et Kohl, 1986). Ainsi, on a pu calculer le Ndfa% pour A. karroo sur les deux sites seulement avec les plantes de références dont le δ15 N‰ était supérieur à celui de la plante fixatrice. Cette condition était satisfaite chez Oxalis sp . et Atriplex sp . sur le site de la ferme de Messerghine, ainsi que chez Oxalis sp .et Quercus suber sur le sol de la forêt de M’sila (Tableau 29). Nos résultats montrent que les valeurs de Ndfa% calculées en fonction des différentes hypothèses varient plus en fonction du δ15 N de la plante de référence que la valeur du facteur ß. Le Ndfa% varie peu en fonction de ce dernier facteur ( β=0 vs β=−2 ) quand les valeurs de Ndfa% sont basses, comme c’est le cas pour A. karroo , mais varient beaucoup plus lorsque le Ndfa% est élevé, comme chez A. saligna . Malgré la variabilité de l’abondance naturelle en 15 N chez les différentes espèces de référence non-fixatrices échantillonnées sur un même site, nos résultats montrent clairement qu’ A. karroo a un très faible potentiel fixateur d’azote puisque, selon les différentes hypothèses, elle fixe très peu de N 2 ou pas du tout sur les deux sites choisis malgré leurs sols très différents. Par ailleurs, l’utilisation d’ Oxalis sp . comme plante de référence surestime la proportion de N 2 fixé chez A. karroo dans les deux sites et si l’on prend le δ15 N moyen de toutes les espèces de référence non-fixatrices d’un même site, le Ndfa% calculé chez A. karroo est quasi-nul dans les deux sites. A l’inverse, A. saligna fixe de fortes proportions de N sur les dunes d’El Mactaa, jusqu’à 100%, même si les résultats restent contradictoires puisque l’on obtient des Ndfa% extrêmes selon l’espèce de référence non-fixatrice considérée (Tableau 29). Une seule étude d’estimation de la fixation a été réalisée chez A. karroo (Schulze et al., 1991), laquelle révélait une proportion d’azote fixé de 25% d’après les mesures d’abondance naturelle en 15 N des feuilles prélevées sur des arbres de zones arides en Namibie.

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Chapitre II. Etude expérimentale. Partie II:::: Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie. Résultats et discussion

Il est intéressant de constater que les valeurs des Ndfa% obtenues par la méthode d’abondance isotopique sont finalement assez similaires à celles obtenues par dilution isotopique (Tableaux 27 et 29) malgré des conditions expérimentales totalement différentes. Ceci est d’autant plus remarquable que les valeurs de Ndfa% obtenues dans l’expérimentation en serre par dilution isotopique en utilisant les sols rapportés des différents sites ont été estimées à partir de plantes entières âgées de 9 mois tandis que le Ndfa% des acacias in situ a été estimé par détermination de l’abondance isotopique en 15 N de feuilles collectées sur des arbres matures. Ceci montre la validité de cette dernière méthodologie qui a été largement utilisée pour estimer la fixation de N 2 par les légumineuses dans les écosystèmes naturels en raison de la difficulté, et souvent l’impossibilité chez des arbres âgés que représente la mesure du δ15 N au niveau de l’arbre entier (Schulze et al., 1991 ; Yoneyama et al., 1993 ; Bouillet et al., 2008). Globalement, ceci confirme que l’abondance naturelle en 15 N varie en fonction d’un grand nombre de facteurs environnementaux et physiologiques (Högberg, 1997 ; Galiana et al. , 2004 ; Pfautsch et al., 2008) qui donne souvent une estimation semi-quantitative de la fixation de N 2 (Pons et al., 2006) et que sa variabilité naturelle in situ nécessite un échantillonnage assez intensif pour minimiser les variations individuelles chez les différentes espèces de référence non-fixatrices de N choisies.

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Conclusion et Perspectives

Conclusion et perspectives

Conclusions et perspectives

Cette étude a permis de dresser une ébauche de recensement des Acacia sp. de la région Nord Ouest et Sud algérien. Les espèces rencontrées sont pour la plupart xériques, elles offrent une grande plasticité et une bonne adaptation dans les sites prospectés. On a répertorié Acacia ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis, A. nilotica, A. albida et A. laeta considérées comme espèces autochtones ainsi qu’ A. karroo et A. saligna comme espèces introduites. Un assez faible nombre de BNL a été isolé des sols échantillonnés du Sud algérien, ce qui a conduit à une pauvre représentation de la diversité rhizobienne d’ A. nilotica et Faidherbia albida exclusifs à la wilaya de Tamanrasset ainsi qu’ A. tortilis . Seul un quart des 288 isolats ont pu renoduler leur plantes hôtes. Cela peut être expliqué par la perte des gènes de nodulation après des repiquages successifs, cela est prouvé dans le cas d’une souche qui a suscité notre intérêt nettement en améliorant la croissance végétale de la plante inoculée sans initier la formation de nodosités par son effet PGPR (Plante Growth Promoting), après séquençage, cette dernière a prouvé son appartenance à l’espèce de Rhizobia sp. Ce phénomène de non renodulation est peut être du aussi au repiquage des endophytes qui ont proliféré sur les boites de Petri au détriment des rhizobia au nombre plus faible. Cependant, cette absence de renodulation n’a été fréquente qu’en zones désertiques au contraire des régions méditerranéennes où la majorité des isolats ont pu initier la formation de nodosités chez leur plante hôte. La collection des nouvelles souches a montré une grande diversité génétique qui a formé 10 groupes phylogénétiques distincts, représentant cinq genres bactériens : Ensifer, Mesorhizobium, Rhizobium, Bradyrhizobium et Ochrobactrum . La diversité génétique et phénotypique ne reflètent pas une relation particulière entre la position phylogénétique des souches bactériennes et i) leur tolérance à la salinité et ii) leur efficience envers leurs plantes hôtes. De plus grâce à la variété des espèces hôtes et l’étendue géographique des zones prospectées à travers l’Algérie, on a clairement démontré qu’il n y avait pas de corrélation entre les tolérances in vitro des souches à la salinité et aux températures élevées et les caractéristiques édapho-climatiques de leurs régions d’origine et plus précisément les températures maximales et la conductivité électrique des sols échantillonnés. Néanmoins, la tolérance des souches isolées à la salinité et hautes températures est très intéressante,

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Conclusion et perspectives comparativement à ce qui a été rapporté par la littérature concernant les souches associées aux Acacias, isolées d’autres pays en général et d’Afrique en particulier. Le séquençage partiel du 16S rADN même s’il demeure un bon indicateur d’affiliation, ce dernier ne révèle pas la position taxonomique exacte des souches rhizobiennes, surtout concernant les souches de Bradyrhizobium qui nécessitent le séquençage de leur 16S-23S rARN-ITS pour indiquer leur appartenance au niveau de l’espèce. Par ailleurs, toujours en ce qui concerne la caractérisation bactérienne, le phénodendrogramme établi à partir de 58 caractères phénotypiques a prouvé un haut potentiel discriminant, cependant il demeure très insuffisant pour permettre une identification. La deuxième partie de cette étude a révélé la nécessité de conduire des essais d’évaluation de l’efficience des inocula sélectionnés en pépinière ou au champ en complément des essais in vitro pour évaluer leur comportement en conditions réelles face aux contraintes biotiques et abiotiques se trouvant au niveau du site de leur introduction. L’estimation de la fixation d’azote a révélé qu’A. saligna avait le plus haut potentiel fixateur d’azote d’après la méthode de dilution isotopique en pépinière, de même que pour le pouvoir fixateur d’azote réel qui a été évalué in situ par la méthode de l’abondance naturelle en δ15 N, comparativement à A. karoo et A. seyal . Ces résultats démontrent qu’A. saligna est un bon candidat pour les essais de réhabilitation des zones dégradées. En parallèle, on doit rechercher des provenances d’arbres tolérant des conditions édaphoclimatiques particulières, notemment à partir de zones marginales. Ceci implique des explorations in situ de matériel génétique pour des espèces de plantes d’intérêt afin d’établir une base génétique plus large sachant que la distribution géographique des Acacias en Algérie reste peu documentée. En outre, il faudrait rechercher des plantes de référence non fixatrices spécifiques aux espèces d’Acacias répertoriées: A. karoo , A. ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis, A. nilotica, A. laeta et Faidherbia albida et cela afin de pouvoir estimer le potentiel réel de fixation de l’azote atmosphérique chez ces espèces grâce à la méthode de dilution isotopique. En complément de l’expérimentation de l’estimation du potentiel fixateur d’azote en serre, il faudrait évaluer le taux d’occupation des nodules obtenus chez les trois espèces testées par les souches de l’inoculum mixte utilisé comparativement aux souches indigènes à chaque sol. Cela pourra expliquer plus clairement l’absence de l’effet inoculation sur la fixation d’azote. Dans un futur proche, il faudrait préciser la position taxonomique d’un groupe indéterminé mais très différentié de souches de BNL renodulantes, isolées de nodosités

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Conclusion et perspectives d’ A. saligna de Bomo Plage et qui ne sont apparentées à aucune souche de référence incluse dans l’arbre phylogénétique. D’un autre côté, en complément du profil de tolérance des rhizobia isolés, aux différents contraintes de salinité, de température élevée et de Ph, on doit s’intéresser à l’étude de la symbiose Acacia -BNL dans les conditions adverses qui prévalent dans les zones à revégétaliser. Cette étude a révélé une diversité botanique et microbienne intéressante, avec un potentiel d’efficience prometteur de certains symbiotes dans les conditions contrôlées pour des souches associées principalement à A. seyal, A. saligna et A. karro o. Cependant, à ce stade de connaissance, on peut conclure que la meilleure approche pour des programmes de reforestation devrait se baser sur une étude approfondie du site à revégétaliser portant sur les caractéristiques pédologiques, l’historique botanique et la caractérisation des populations rhizobiennes indigènes du site. Une fois ces paramètres établis, il faudrait, sur la base des résultats obtenus opter pour des souches rhizobiennes autochtones efficientes et compétitives déjà associées aux espèces cibles provenant de conditions pédo-climatiques similaires à la région à réhabiliter. Un programme de coopération doit être établi avec les services de foresterie dans le futur afin de mener des projets de revégétalisation basés sur la symbiose rhizobienne qui augmentera les chances de survie des plants transférés au champ et favorisera leur pérennité. Ces résultats encouragent la valorisation des espèces végétales autochtones hautement xérophiles et en faire des espèces protégées tel que cela a été fait pour A. tortilis. Cela ouvrira le champ à la création d’entreprises spécialisées dans le domaine de réhabilitation de sites dégradés qui pourront contribuer au programme de lutte contre la désertification, en plus de l’utilisation des différents sous produits d’ Acacia sp. à des fins industrielles. La symbiose Acacia-BNL inclus trois partenaires qui sont : la plante hôte, le partenaire microbien et le sol ; pour des projets de réhabilitation réussis, ces trois acteurs doivent être étudiés pour optimiser leur interaction visant un rendement fixateur d’azote optimal.

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Annexe

Annexe 1 Triangle de texture: Classe de texture du sol fin (<2 mm) (Schoeneberger et al., 2002). Clay: argile Sand: sable Loam: Silt: Limon

Annexe 2 :

Eau gélosée - Agar 8g - Eau distillée 1L Autoclavage pendant 20 min à 120°C

Annexe 3

Solution nutritive: (Broughton et Dilworth, 1971)

(Nitrogen-free nutrient solution for in vitro nodulation of Acacia) solutions Produits chimiques Concentration Volume de la solution stock/ Stock g /l volume final ml/l 1 CaCl 2,2H 2O 294 0,5 ml 2 KH 2PO 4 196 0,5 ml 3 MgSO4,7H 2O 123 0,5 ml K2SO 4 87 MnSO 4 ,H 2O 0,338 4 H3BO 3 0,247 0,5 ml ZnSO 4 ,7H 2O 0,288 CuSO 4 ,5H 2O 0,100 CoSO 4,7H 2O 0,056 Na Mo O 2, 2H 2O 0,048

5 Na Fe_EDTA 0,734 0,5ml pH=6,7

Annexe 4 :

Préparation des tubes Gibson (Gibson, 1980) :

Les tubes (150 X 20 mm) contenant 25 ml de milieu de culture Jensen avec agar (Vincent, 1970) sont fermés avec de l’aluminium qui est serré avec des élastiques, ils sont stérilisés par autoclavage pendant 20 min à 120°C. A la sortie de l'autoclave ils sont disposés de façon inclinée le temps que la gélose se fixe en pente et ensuite ils sont remplis avec le milieu liquide sans azote Jensen (60 ml par tube) à travers une ouverture qui est par la suite rebouchée avec un embout de plastique stérile.

Annexe 5 :

Suspension de sol à 10% :

• 10 g de sol

• 90 ml de tampon salin stérile à pH 7 (0.15 M NaCl, 0.002 M de KH 2PO 4, 0.004 M de

Na 2HPO 4) • La solution est mélangée pendant 1 h.

Annexe 6 :

• Milieu Yeast Extract Mannitol -YEM- (Vincent, 1970)

La composition en g/L : mannitol : 10 g ; glutamate de sodium : 0,5 g ; K 2HPO 4 : 0,5 g ;

MgSO 47H 2O : 0,2 g ; NaCl : 0,05 g ; CaCl 2 : 0,04 g ; FeCl 3 : 0,004 g ; extrait de levure: 1 g. Le pH du milieu est ajusté à 6,8 avec du HCl 0,1 N. • Le milieu gélosé (YEMA) correspondant est obtenu par addition de 20 g/L d’agar- agar.

• Le milieu est stérilisé par autoclavage pendant 20 min à 120°C.

• Pour du YEMA à rouge Congo, rajouter 0,025g/l de colorant.

NB : Il faut noter que c’est un colorant hautement cancérigène surtout lorsqu’il est sous forme de poudre, il est fortement recommandé de le manipuler sous hotte aspirante, avec un personnel expérimenté. Annexe 7 :

Protocole de la coloration de Gram

• Une colonie est suspendue dans une goutte d’eau et étalée à l’aide de l’anse ;

• Les cellules sont fixées à la flamme ;

• Le frottis est coloré au violet de Gentiane pendant 1-2 minutes ;

• Les bactéries sont fixées au lugol (iodure de potassium KI) pendant 30 secondes ;

• La préparation est abondamment rincée à l’eau distillée afin d’évacuer l’excès de colorant puis elle est décolorée (éthanol 95 %, 5 sec) et rincée de nouveau abondamment à l’eau distillée ;

• Une deuxième coloration avec de la fuschine ou safranine est réalisée (1-2 min) ;

• La préparation est rincée à l’eau et séchée à température ambiante.

Annexe 8 :

Tube de Mac Farland n°0,5 (1,5 x10 7UFC/ml) (NCCLS, 2000)

BaCl 2 (1,175%) 0,5ml

H2 SO 4 99,5ml

iii

Annexe 9:

Milieu GMS (Zevenhuizen, 1986) : contient par litre : acide glutamique : 1g ; mannitol : 10g ;

KH 2PO 4 : 1g ; MgSO 4 7H 2O : 0,2g ; CaCl 2 : 0,04.

Traces d’éléments : FeCl 3 : 2,5mg ; H 3BO 3 : 0,01mg ; ZnSO 4, 7H 2O : 0,01mg ; CaCl2, 6H 2O :

0,01 mg ; CuSO 45H 2O : 0,01 ; MnCl 2 : 1mg ; Biotine : 10µl et Thiamine : 100µl. Annexe 10 :

Milieu TY (Beringer, 1974)

Il contient par litre : tryptone (oxoid) : 5 g; extrait de levure (oxoid) : 0,75 g;

KH 2PO 4 : 0,454 g ; Na 2HPO 4, 12 (H2O) : 2,388 g ; CaCl 2, 2H 2O (13,4 g / 100 mL) : 5 mL (ou

CaCl 2, 6H 2O à 20g /100 mL : 5 mL); Le pH est ajusté à 6,8 – 7,0. agar LabM : 20 g. Annexe 11:

Protocole de purification du fragment amplifié, sur colonne avec le kit « QIAquick Gel Extraction Kit » (Quiagen) :

• Peser les fragments de gel d’agarose (dans les tubes). • Ajouter 3volume de tampon QG (µl) pour volume de gel (mg). • Incuber a 50°C pendant 10 minutes en agitant vigoureusement toutes les 2 minutes. Ce tampon permet la solubilisation de l’agarose et augmente l’affinité de l’ADN pour la membrane de la colonne QIAquick spin. Lorsque le gel est complètement dissous, vérifier que la couleur du mélange est jaune. Si la couleur est orange ou violet, ajouter 10 u1 de la solution d’acétate de sodium 3 M PH 5 et mélanger. L’adsorption de l’ADN à la membrane QIAquick n’est efficace qu’à un pH< 7 ,5. Le tampon QG contient un indicateur de pH qui vire au jaune pour des pH<7,5 et devient orange ou violet pour des pH plus basiques. • Ajouter 1 volume d’isopropanol correspondant au volume du gel de départ et mélanger. Ce produit fait précipiter l’ADN. ne pas centrifuger a cette étape. • Placer une colonne QIAquick sur un tube collecteur de 2ml. • Transférer a l’aide d’une pipette a mixture sur la colonne (volume maximum de colonne 800 µl ; au delà, répéter l’étape suivant le nombre de fois suffisant). • Centrifuger pendant 1mn a 14000 tours par minute, puis vider le tube collecteur.

• Remettre la colonne sur le même tube, puis ajouter 0,5 ml de tampon QG. Ceci a pour but d’éliminer les éventuels reste d’agarose. • Centrifuger pendant 1 mn a 14000 tours par minute. Le filtrat est jeté. • Ajouter 0,75 ml de tampon PE pour laver la colonne et laisser reposer 2 à 5 minutes. • Centrifuger pendant 1 mn à 14000 tours par minute, puis vider le tube collecteur. • Centrifuger a nouveau pendant 1 mn à 14000 tours par minute, puis placer la colonne sur un tube Eppendorf de 1,5 ml. • Pour éluer l’ADN, ajouter 50 µl de tampon EB (10mM tris-Cl ph 8,5 au centre de la membrane QIAquick, attendre 1 mn et centrifuger pendant 1 mn à 14000 tours par minute. • Jeter la colonne. • L’ADN est conservé à –20°C. Annexe 12 :

Le smart ladder: 2-LogDNA Ladder (0.1–10.0 kb) : C’est un marqueur de taille. Il indique les poids moléculaire standards avec des enzymes de restriction adéquats après électrophorèse sur gel d’agarose. L’ADN digéré inclue 19 bandes de 100bp à 10kb. Les bandes de 0,5 ; 1,0 et 3,0 kb ont une intensité supérieure pour servir de références. La masse approximative d’AND pour chaque bande (en assumant un dépôt de 1,0 µg) se compare au tableau suivant en comparant l’intensité.

Annexe 13 :

Annexe A L’analyse factorielle des correspondances (AFC) est une méthode qui sert à représenter graphiquement un tableau croisé. Elle vise à réunir les informations les plus utiles de façon à donner une image claire de l’association de deux variables qualitatives. Dans l’analyse des correspondances, les lignes représentent les catégories d’une première variable et les colonnes, les catégories d’une deuxième variable. Dans l’analyse factorielle en composantes principales, les colonnes sont nécessairement des variables et les lignes, des individus ; les principaux résultats reposent sur les corrélations entre ces variables. La carte des correspondances doit être interprétée en termes de territoire, de géographie de plan, où les distances entre les catégories expriment l’un ou l’autre des qualificatifs propres aux couples des oppositions : centre/périphérie ; éloignement/proximité ; ressemblance/dissemblance et attraction/répulsion.

Tableau A1 : représentation des variables en colonne (caractérisation génétique) et des individus en lignes (espèce d’Acacia hôte) : répartition des espèces rhizobiennes selon les espèces d’Acacia.

A. saligna A. seyal A. karroo A.ehrenbergiana R. leguminosarum bv trifolii 0 4 5 0 R. leguminosarum bv viciae 0 1 0 0 Rhizobium sp . 6 2 0 0 Ensifer terengae 0 0 0 1 Ensifer fredii 0 0 1 0 Ensifer meliloti 0 0 5 0 Ensifer sp . 3 0 0 1 Mesorhizobium sp . 1 0 0 1 Bradyrhizobium sp . 10 0 0 0 20 7 11 3

Les résultats selon le logiciel XLSTAT (version 2010.5.04, Addinsoft, Paris, France, http://www.xlstat.com ) de l’ Analyse Factorielle des Correspondances (AFC) :

Tableau A2 : tableau de contingence (tableau initial)

A. saligna A. seyal A. karroo Somme R. leguminosarum bv trifolii 0,000 0,105 0,132 0,24 R. leguminosarum bv viciae 0,000 0,026 0,000 0,03 Rhizobium sp . 0,158 0,053 0,000 0,21 Sinorhizobium fredii 0,000 0,000 0,026 0,03 Sinorhizobium meliloti 0,000 0,000 0,132 0,13 Sinorhizobium sp . 0,079 0,000 0,000 0,08 Mesorhizobium sp . 0,026 0,000 0,000 0,03 Bradyrhizobium sp . 0,263 0,000 0,000 0,26 Somme 0,53 0,18 0,29 1,00

Figure A1 : vue 3D du tableau de contingence

Tableau A3 : Test d'indépendance entre les lignes et les colonnes (résumé)

Khi² (Valeur observée) 61,462 Khi² (Valeur critique) 40,113 DDL 27 p-value 0,000 alpha 0,05 La formule de distance du khi-carré servira donc à mesurer les systèmes d’opposition des éléments étudiés. Interprétation : • H0 : Les lignes et les colonnes du tableau sont indépendantes.

vii

• Ha : Il existe un lien entre les lignes et les colonnes du tableau. • Etant donné que la p-value calculée est inférieure au niveau de signification seuil alpha=0,05, on peut rejeter l'hypothèse nulle H0 et retenir l’hypothèse alternative Ha. • Le risque de rejeter l'hypothèse nulle H0 alors qu'elle est vraie est de 0.02%. • L’inertie totale est de 1.609

Tableau A4 : Valeurs propres et pourcentages d'inertie

F1 F2 F3 Valeur propre 0,824 0,538 0,246 Inertie (%) 51,237 33,474 15,289 % cumulé 51,237 84,711 100,000

I-Résultats pour les lignes :

Tableau A5 : poids, distances et distances quadratiques à l'origine, inerties et inerties relatives (lignes)

Poids (relatif) Distance Distance² Inertie Inertie relative Rhizobium leguminosarum 0,131 1,336 1,786 0,23373 0,145 Rhizobium sullae 0,026 2,060 4,243 0,11191 0,070 Rhizobium tropici 0,026 0,905 0,819 0,02145 0,013 Rhizobium sp. 0,132 0,890 0,792 0,10445 0,065 Ensifer meliloti 0,209 0,902 0,813 0,17032 0,106 Ensifer fredii 0,079 1,100 1,210 0,09523 0,059 Mesorhizobium mediterraneum 0,026 0,905 0,819 0,02145 0,013 Mesorhizobium sp . 0,026 3,426 11,736 0,30716 0,191 Bradyrhizobium sp . 0,266 0,875 0,766 0,20346 0,126 Ochrobactrum sp . 0,079 2,079 4,324 0,33949 0,211

Tableau A6 : résultats des coordonnées principales, coordonnées standard, contributions et des Cosinus carrés pour les lignes.

Coordonnées principales Coordonnées standard Contributions Cosinus carrés F1 F2 F3 F1 F2 F3 Poids (relatif) F1 F2 F3 F1 F2 F3

Rhizobium leguminosarum 1,271 -0,049 -0,409 1,400 -0,067 -0,825 0,131 0,257 0,001 0,089 0,905 0,001 0,094 Rhizobium sullae 1,911 0,560 0,527 2,105 0,763 1,063 0,026 0,117 0,015 0,030 0,861 0,074 0,066 Rhizobium tropici -0,719 0,530 0,146 -0,792 0,722 0,295 0,026 0,016 0,014 0,002 0,631 0,343 0,026 Rhizobium sp . -0,699 0,530 0,150 -0,770 0,723 0,301 0,132 0,078 0,069 0,012 0,617 0,355 0,028 Ensifer meliloti -0,155 -0,639 -0,617 -0,171 -0,871 -1,245 0,209 0,006 0,159 0,325 0,029 0,502 0,469 Ensifer fredii -0,222 -1,073 0,098 -0,244 -1,462 0,197 0,079 0,005 0,168 0,003 0,041 0,952 0,008 Mesorhizobium mediterraneum -0,719 0,530 0,146 -0,792 0,722 0,295 0,026 0,016 0,014 0,002 0,631 0,343 0,026 Mesorhizobium sp . -0,256 -2,782 1,983 -0,282 -3,791 3,999 0,026 0,002 0,376 0,419 0,006 0,659 0,335 Bradyrhizobium sp . -0,683 0,527 0,147 -0,752 0,718 0,297 0,266 0,150 0,137 0,023 0,609 0,363 0,028

Ochrobactrum sp . 1,923 0,572 0,546 2,118 0,779 1,100 0,079 0,352 0,048 0,095 0,856 0,076 0,069

viii

II- Résultats pour les colonnes :

Tableau A7 : Poids, distances et distances quadratiques à l'origine, inerties et inerties relatives (colonnes)

Poids (relatif) Distance Distance² Inertie Inertie relative A. saligna 0,526 0,870 0,758 0,399 0,335 A. seyal 0,184 1,242 1,542 0,284 0,238 A. karoo 0,289 1,325 1,757 0,509 0,427 A.ehrenbergiana 0,079 2,278 5,187 0,407 0,253

Tableau A8 : Résultats des calculs de Coordonnées principales, Coordonnées standard, Contributions et de Cosinus carrés pour les lignes

Coordonnées principales Coordonnées standard Contributions Cosinus carrés

F1 F2 F3 F1 F2 F3 Poids (relatif) F1 F2 F3 F1 F2 F3

A. saligna 0,984 0,984 0,984 -0,719 0,530 0,146 0,550 0,284 0,154 0,012 0,731 0,260 0,009 A. seyal 0,984 0,984 0,984 1,923 0,572 0,546 0,188 0,695 0,061 0,056 0,924 0,053 0,022 A. karoo 0,984 0,984 0,984 0,293 -0,980 -1,841 0,184 0,016 0,177 0,623 0,050 0,364 0,586 A.ehrenbergiana 0,984 0,984 0,984 -0,256 -2,782 1,983 0,079 0,005 0,607 0,309 0,010 0,803 0,186

Figure A2 : Graphiques symétriques

Annexe B L’Analyse en Composantes Principales (PCA) est une analyse exploratoire. C’est une procédure mathématique qui utilise une transformation orthogonale pour convertir une série d’observations de variables (exclusivement quantitatives) probablement corrélées et les transformer en une série de valeurs de variables linéairement non corrélées appelées composantes principales. Le nombre des composantes principales est égal ou moindre que les variables originales. Cette transformation est définie de telle façon à ce que la première composante principale ait la variance la plus large possible, et chaque composant qui suit ait à son tour la variable la plus haute possible sous la contrainte qu’il soit orthogonal au composant précédent. La PCA est garantie d’être indépendante seulement si la série de donnés est distribuée normalement et conjointement. La PCA peut être exécutée par la décomposition des valeurs Eigen ou les matrices de covariance (ou corrélation), souvent après centrage de la moyenne. Les résultats de la PCA sont souvent discutés en terme de scores de facteurs : valeurs de variables transformées à un point de données particulier, ou bien de chargements (loadings) : le poids par lequel chaque variable originale standardisée devait être multipliée pour avoir le score de la composante. La PCA révèle la structure interne des données de telle façon que la variance des données est la mieux expliquée.

Les résultats selon le logiciel XLSTATTM (version 2010.5.04, Addinsoft, Paris, France, http://www.xlstat.com ) de la Principal Component Analysis (PCA) • PCA type: Pearson (n). • Type of biplot: Correlation biplot / Coefficient =Automatic.

Tableau B1: Summary statistics: (Résumé statistique).

Obs. Obs. with without Std. Variables missing missing Mean Deviation Obs data data Minimum Maximum (moyenne) (écart type) Tolerance to Tpre (°C) 57 0 57 35,000 50,000 40,789 3,985 Tolerance to salinity (mM) 57 0 57 102,000 1034,000 622,842 289,477 Soil CW 57 0 57 0,075 1,290 0,298 0,390 Site Tpre 57 0 57 38,000 49,000 40,421 2,598 Tpre: température; CW: conductivité électrique; Obs: observation; Std : standard

Tableau B2 : Correlation matrix (Pearson (n)): Matrice des corrélations entre les variables

Variables Tol/ Tpre (°C) Tol/salinity (mM) Soil CW Site Tpre Tolerance to Tpre (°C) 1 -0,051 0,247 -0,162 Tolerance to salinity (mM) -0,051 1 -0,004 -0,082 Soil CW 0,247 -0,004 1 -0,118 Site Tpre -0,162 -0,082 -0,118 1

Tol: tolérance, Tpre : tempeérature Dans ce tableau, plus le chiffre est élevé, plus la relation entre les variables est forte (1 = relation « totale » et 0 = relation nulle). Ici les deux variables les plus corrélées sont la tolérance à la température et la conductivité électrique du sol : 000,0,,,247247247247.. De plus, la négativité de certaines corrélations indique que ces variables ne varient pas dans le même sens .

Analyse en Composantes Principales

Tableau B3 : Valeurs propres ; variances expliquée

F1 F2 F3 F4

Eigenvalue (valeurs propres) 1,357 1,052 0,855 0,737 Variability (%) (pourcentage de variance) 33,920 26,301 21,367 18,413 Cumulative % (cumul des pourcentages) 33,920 60,221 81,587 100,000

Interprétation : chaque colonne correspond à une variance virtuelle ; vavavaleurs va leurs propres : variance du facteur correspondant ; pourcentage de variance : pourcentage de variance de chaque colonne par rapport au total. Si on additionne toutes les valeurs propres : 1,357+1,052+0,855+0,737=4,001 qui représente la dispersion du nuage de points en 04 dimensions, on voit que toutes les composantes (facteurs) sont proches et doivent être représentées.

Tableau B4 : Corrélations entre variables et facteurs.

F1 F2 F3 F4

Tolerance to Tpre (°C) 0,738 -0,217 0,027 0,638 Tolerance to salinity (mM) 0,017 0,897 0,400 0,188 Soil CW 0,698 -0,140 0,503 -0,490 Site Tpre -0,569 -0,426 0,664 0,232

Interprétation : le premier facteur est fortement corrélé à deux variables (tolérance à la température et la conductivité électrique), presque nul avec la troisième (tolérance à la salinité) et négativement à la dernière (température du site)

Figure B1 : Principaux axes des facteurs étudiés : tolérance à la salinité, tolérance à la température (hautes) ; salinité du sol (CW) et température du site (températures maximales aériennes)

Tableau B5: Contribution of the variables (%):

F1 F2 F3 F4

Tolerance to Tpre (°C) 40,194 4,459 0,088 55,259 Tolerance to salinity (mM) 0,021 76,452 18,741 4,786 Soil CW 35,895 1,858 29,598 32,648 Site Tpre 23,890 17,230 51,573 7,307

Tableau B6: Squared cosines of the variables: cosinus carré des variables

F1 F2 F3 F4

Tolerance to Tpre (°C) 0,545 0,047 0,001 0,407 Tolerance to salinity (mM) 0,000 0,804 0,160 0,035 Soil CW 0,487 0,020 0,253 0,240 Site Tpre 0,324 0,181 0,441 0,054

Les valeurs en gras correspondent pour chaque variable au facteur à partir duquel le cosinus au carré est le plus élevé

Figure B2 : Analyse en Composantes Principales (ACP) représentant la relation entre la tolérance in vitro des isolats rhizobiens au NaCl (NaCl tolerance) et aux hautes températures (Tpre tolerance) et les caractéristiques édaphoclimatiques des sites d’échantillonnage correspondants, i.e conductivité du sol (soil CW) et la moyenne maximale annuelle de température (Site Tpre). Chaque point correspond à un seul isolat bactérien et son origine est indiquée par des symboles comme suit : O1: Es-Senia/Oran; O2: Messerghine/Oran; O3: Sebkha, Messerghine/Oran; O4: Bomo-plage, dunes/Oran ; O5: Foret de Msila /Oran; M: El Mactaa dunes/Mostaganem; R: Khemaissa/Relizane; AD: Ain Defla; EB: Labiod Sidi El Cheikh/El Bayadh; A: Ain belbel/Adrar; T1: Oued In Dalagd/Tamanrasset; T2: Oued Tassena/Tamanrasset; T3: Oued Tin Amezzegin/Tamanrasset .

xii

Tableau B7 : Souches incluses dans l’ACP et résultats de l’analyse sur les individus

Symbole des Nomen- Scores de facteurs (coordonnées des Cosinus carré des souches clature des Contribution des observations (%) individus) observations (observa souches tions F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4

O3 SE21a 2,277 -1,368 0,882 -0,932 6,703 3,123 1,596 2,069 0,596 0,215 0,089 0,100 O3 SE21b 2,303 0,216 1,666 -0,535 6,859 0,078 5,699 0,683 0,630 0,006 0,330 0,034 O3 SE23bc 0,663 -1,352 0,550 -2,943 0,569 3,048 0,621 20,636 0,039 0,163 0,027 0,771 O3 SE24a 3,106 -0,051 1,704 0,406 12,470 0,004 5,959 0,392 0,759 0,000 0,228 0,013 O3 SE24c 1,483 -0,583 1,101 -1,743 2,844 0,567 2,487 7,238 0,324 0,050 0,178 0,448 O3 SE25a 2,294 -0,332 1,395 -0,673 6,805 0,184 3,993 1,078 0,677 0,014 0,250 0,058 O3 SE25d 2,294 -0,332 1,395 -0,673 6,805 0,184 3,993 1,078 0,677 0,014 0,250 0,058 O1 SE3 -0,361 1,524 0,884 -1,266 0,169 3,873 1,603 3,816 0,027 0,480 0,161 0,331 O1 SE2 0,441 1,257 0,921 -0,325 0,252 2,634 1,742 0,251 0,071 0,579 0,311 0,039 EB SE243a 1,143 1,421 -0,035 0,864 1,690 3,368 0,003 1,778 0,321 0,496 0,000 0,183 EB SE243b 1,108 -0,694 -1,082 0,335 1,588 0,803 2,403 0,267 0,410 0,161 0,391 0,037 EB SE243c 1,134 0,891 -0,298 0,731 1,664 1,323 0,182 1,274 0,476 0,294 0,033 0,198 EB SE243d 1,143 1,421 -0,035 0,864 1,690 3,368 0,003 1,778 0,321 0,496 0,000 0,183 O2 K31 -0,143 0,307 -0,128 -0,054 0,027 0,157 0,033 0,007 0,154 0,703 0,121 0,022 O2 K32a -0,928 1,653 0,369 -0,725 1,114 4,556 0,280 1,253 0,202 0,642 0,032 0,124 O2 K32c 0,633 -1,515 -0,859 0,498 0,519 3,825 1,516 0,590 0,109 0,623 0,201 0,067 O2 K33b 0,630 -1,722 -0,962 0,446 0,513 4,944 1,900 0,474 0,088 0,661 0,206 0,044 O2 K34a -0,975 -1,187 -1,037 -1,436 1,229 2,350 2,208 4,911 0,173 0,256 0,196 0,375 O5 K1a -1,100 0,089 -0,554 -0,986 1,565 0,013 0,629 2,316 0,485 0,003 0,123 0,389 O5 K1b -1,074 1,686 0,237 -0,586 1,490 4,741 0,115 0,819 0,262 0,647 0,013 0,078 O5 K2b 0,496 -0,963 -0,735 0,766 0,319 1,548 1,109 1,398 0,107 0,403 0,235 0,255 O5 K2d -1,091 0,607 -0,297 -0,856 1,540 0,615 0,181 1,747 0,500 0,155 0,037 0,308 O5 K4a -0,271 1,419 0,274 0,354 0,095 3,357 0,155 0,299 0,032 0,880 0,033 0,055 O5 K4c -1,074 1,686 0,237 -0,586 1,490 4,741 0,115 0,819 0,262 0,647 0,013 0,078 O4 KHB -0,364 -0,163 -0,577 0,018 0,171 0,044 0,683 0,001 0,270 0,054 0,676 0,001 A E231a -2,098 -1,088 2,159 1,125 5,692 1,974 9,569 3,017 0,382 0,103 0,405 0,110 A E231b -2,113 -1,990 1,713 0,900 5,773 6,604 6,020 1,928 0,367 0,325 0,241 0,067 A E231c -2,080 -0,009 2,693 1,395 5,595 0,000 14,889 4,637 0,320 0,000 0,536 0,144 A E232 -2,115 -2,124 1,646 0,866 5,785 7,524 5,562 1,787 0,359 0,363 0,218 0,060 T3 E60 1,503 -1,073 -0,964 1,589 2,919 1,919 1,907 6,013 0,329 0,168 0,135 0,368 T1 N145 -0,153 0,514 -0,588 0,031 0,030 0,440 0,709 0,002 0,037 0,416 0,545 0,002 T2 T80 -0,177 1,602 -0,092 0,341 0,041 4,279 0,017 0,277 0,012 0,943 0,003 0,043 T2 T18 0,607 0,256 -0,588 1,012 0,477 0,109 0,710 2,440 0,204 0,036 0,192 0,568 T2 T82 -0,212 -0,513 -1,139 -0,188 0,058 0,439 2,662 0,084 0,027 0,160 0,791 0,022 T1 E134b -0,973 -0,255 -1,138 -1,169 1,224 0,109 2,660 3,255 0,258 0,018 0,353 0,372 T1 E128b -0,153 0,514 -0,588 0,031 0,030 0,440 0,709 0,002 0,037 0,416 0,545 0,002 T2 E45 0,625 1,335 -0,054 1,282 0,505 2,970 0,006 3,915 0,102 0,466 0,001 0,430 T2 E39 -0,212 -0,513 -1,139 -0,188 0,058 0,439 2,662 0,084 0,027 0,160 0,791 0,022 T2 E47 -0,212 -0,513 -1,139 -0,188 0,058 0,439 2,662 0,084 0,027 0,160 0,791 0,022 T1 A121 -0,153 0,514 -0,588 0,031 0,030 0,440 0,709 0,002 0,037 0,416 0,545 0,002 O4 SAB3 -0,346 0,904 -0,049 0,285 0,155 1,362 0,005 0,194 0,118 0,800 0,002 0,080 O4 SAB5 -0,346 0,904 -0,049 0,285 0,155 1,362 0,005 0,194 0,118 0,800 0,002 0,080 O4 SAB9 0,438 -0,430 -0,539 0,959 0,248 0,309 0,597 2,192 0,121 0,117 0,183 0,580 O4 ASB10 -1,175 -0,414 -0,871 -1,052 1,786 0,285 1,556 2,637 0,404 0,050 0,222 0,324 O4 SAB12b -0,346 0,904 -0,049 0,285 0,155 1,362 0,005 0,194 0,118 0,800 0,002 0,080 O4 SAB13 -0,346 0,904 -0,049 0,285 0,155 1,362 0,005 0,194 0,118 0,800 0,002 0,080 O4 SAB15b 0,438 -0,430 -0,539 0,959 0,248 0,309 0,597 2,192 0,121 0,117 0,183 0,580 O4 SAB17a -0,356 0,355 -0,320 0,148 0,163 0,210 0,210 0,052 0,335 0,335 0,272 0,058 O4 SABN1a -0,364 -0,163 -0,577 0,018 0,171 0,044 0,683 0,001 0,270 0,054 0,676 0,001 O4 SABN2a 0,430 -0,948 -0,796 0,830 0,239 1,499 1,299 1,640 0,077 0,374 0,263 0,286 O4 SABN4a 0,438 -0,430 -0,539 0,959 0,248 0,309 0,597 2,192 0,121 0,117 0,183 0,580 O4 SABN5a -0,356 0,355 -0,320 0,148 0,163 0,210 0,210 0,052 0,335 0,335 0,272 0,058 O4 SAB17b -0,356 0,355 -0,320 0,148 0,163 0,210 0,210 0,052 0,335 0,335 0,272 0,058 M SA13b -1,513 -0,746 -0,275 -0,882 2,960 0,927 0,155 1,853 0,619 0,150 0,020 0,210 M SA15d -1,487 0,839 0,510 -0,486 2,858 1,174 0,533 0,561 0,648 0,206 0,076 0,069 R SAKS -1,047 -2,070 0,562 0,014 1,418 7,142 0,649 0,000 0,193 0,752 0,056 0,000 AD SAAIS 0,445 -0,458 -0,993 -0,739 0,256 0,350 2,024 1,301 0,102 0,108 0,508 0,281

Les valeurs en gras correspondent pour chaque observation au facteur pour lequel le cosinus au carré est le plus important

xiii

Annexe C: Interprétation de l’efficience: Analyse de variance à 1 facteur sur la variable poids sec : Les résultats sont obtenus grâce au logiciel XLSTAT : Test de Duncan New Multiple Range

C1: Acacia seyal

Type III Sums of squares source df Sums of square Mean square F-value P-value

Strain 12 ,012 ,001 2,062 ,0681 Residual 22 ,010 4,729E-4 Dependent: plant dry weight

Mean Table Effect: strain Dependent: Plant dry weight (g)

Count Mean Std.deviation Std.error SE243d 2 ,071 ,012 ,008 SE243a 3 ,073 ,048 ,028 SE243b 3 ,045 ,024 ,014 SE243c 3 ,080 ,017 ,010 Control 3 ,024 ,008 ,005 SE22a 3 ,044 ,021 ,012 SE21a 2 ,069 ,016 ,011 SE21b 2 ,058 ,018 ,013 SE24a 3 ,057 ,025 ,015 SE24b 3 ,023 ,017 ,010 SE24c 3 ,042 ,010 ,006 SE25a 2 ,043 ,004 ,003 SE25d 3 ,032 ,011 ,006

Duncan New Multiple Range Effect: Strain Dependent: plant dry weight Significance level : ,05

Count Mean SE24b 3 ,023 a Control 3 ,024 a SE25d 3 ,032 a b SE24c 3 ,042 a b c SE25a 2 ,043 a b c SE22a 3 ,044 a b c SE243b 3 ,045 a b c SE24a 3 ,057 a b c SE21b 2 ,058 a b c SE21a 2 ,069 a b c SE243d 2 ,071 b c SE243a 3 ,073 b c SE243c 3 ,080 c

Les moyennes sont obtenues à partir de trois répétitions par souches testées. Les moyennes suivies par différentes lettres dans la même colonne sont significativement différents selon le test de Duncan.

xiv

C2: Acacia saligna

Type III Sums of squares source df Sums of square Mean square F-value P-value

Strain 15 ,003 2,116E-4 3,614 ,0012 Residual 31 ,002 5,854E-5 Dependent: plant dry weight

Mean Table Effect: strain Dependent: Plant dry weight (g)

Count Mean Std.deviation Std.error SAB10 3 ,040 ,005 ,003 SAB11 3 ,036 ,007 ,004 SAB15a 3 ,019 ,002 ,001 SAB15b 3 ,046 ,006 ,003 SAB3 3 ,043 ,016 ,009 SAB4a 3 ,043 ,003 ,001 SAB4b 3 ,029 ,004 ,002 SAB4c 3 ,030 ,002 ,001 SAB8a 3 ,031 ,004 ,002 SAB8b 3 ,036 ,010 ,006 SAB5 3 ,040 ,010 ,006 SAB9 3 ,037 ,004 ,002 Control 2 ,013 ,008 ,006 SABN13b 3 ,045 ,008 ,004 SABN14b 3 ,034 ,013 ,007 SABN15b 3 ,034 ,005 ,0063

Duncan New Multiple Range Effect: Strain Dependent: plant dry weight Significance level: ,05

Count Mean Control 2 ,013 a SAB15a 3 ,019 a b SAB4b 3 ,029 b SAB4c 3 ,030 b c SAB8a 3 ,031 b c SA14b 3 ,034 b c SA15b 3 ,034 b c SAB11 3 ,036 b c SAB8b 3 ,036 b c SAB9 3 ,037 b c SAB10 3 ,040 b c SAB5 3 ,040 b c SAB3 3 ,043 c SAB4a 3 ,043 c SA13b 3 ,045 c SAB15b 3 ,046 c

C3: Acacia ehrenbergiana

Type III Sums of squares source df Sums of square Mean square F-value P-value

Strain 5 ,016 ,003 4,041 ,0196 Residual 13 ,010 ,001 Dependent: plant dry weight

Means Table Effect: strain Dependent: Plant dry weight (g)

Count Mean Std.deviation Std.error E128b 2 ,031 ,018 ,013 E134ab 4 ,098 ,020 ,010 E134b 4 ,090 ,045 ,023 E231 4 ,069 ,029 ,015 E42 2 ,033 ,008 ,005 Control 3 ,024 ,008 ,005

Duncan New Multiple Range Effect: Strain Dependent: plant dry weight Significance level: ,05

Count Mean Control 3 ,024 a E128b 2 ,031 a E42 2 ,033 a E231 4 ,069 a b E134b 4 ,090 b E134ab 4 ,098 b

xvi

C4: Acacia karroo

Type III Sums of squares source df Sums of square Mean square F-value P-value

Strain 9 ,027 ,003 5,085 ,0020 Residual 17 ,010 ,001 Dependent: plant dry weight

Mean Table Effect: strain Dependent: Plant dry weight (g)

Count Mean Std.deviation Std.error K1a 3 ,110 ,016 ,009 K1b 3 ,084 ,015 ,009 K2b 3 ,064 ,034 ,020 K2d 3 ,107 ,029 ,016 K31 3 ,029 ,017 ,010 K32c 2 ,033 ,028 ,020 K33b 2 ,047 ,010 ,007 K34a 2 ,097 ,041 ,024 K4a 3 ,042 ,008 ,004 K4c 2 ,026 ,008 ,006

Duncan New Multiple Range Effect: Strain Dependent: plant dry weight Significance level: ,05

Count Mean K4c 2 ,026 a K31 3 ,029 a K32c 2 ,033 a K4a 3 ,042 a b K33b 2 ,047 a b K2b 3 ,064 a b K1b 3 ,084 a b K34a 2 ,097 a b K2d 3 ,107 b K1a 3 ,110 b

xvii

C5: Acacia tortilis

Type III Sums of squares source df Sums of square Mean square F-value P-value

Strain 1 8,167E-6 8,167E-6 ,085 ,7847 Residual 4 3,827E-4 9,567E-4 Dependent: plant dry weight

Means Table Effect: strain Dependent: Plant dry weight (g)

Count Mean Std.deviation Std.error 18T 3 ,027 ,011 ,006 Control 3 ,025 ,009 ,005

Duncan New Multiple Range Effect: Strain Dependent: plant dry weight Significance level: ,05

Count Mean 18T 3 ,027 a Control 3 ,025 a

C6: Acacia albida

Type III Sums of squares source df Sums of square Mean square F-value P-value

Strain 1 ,010 ,010 32,890 ,0046 Residual 4 ,001 3,117E-4 Dependent: plant dry weight

Means Table Effect: strain Dependent: Plant dry weight (g)

Count Mean Std.deviation Std.error A121a 3 ,142 ,009 ,005 Control 3 ,059 ,023 ,013

Duncan New Multiple Range Effect: Strain Dependent: plant dry weight Significance level: ,05

Count Mean Control 3 ,059 a A121a0 3 ,142 b

xviii

Annexe D:

Phenodendrogramme basé sur l’analyse de 58 caractères phénotypiques de 16 souches étudiés associées à différentes espèces d’ Acacia par l’utilisation du logiciel Statistica ((Statistica version 5.1 ; eds 1997).

Tableau D-1 : Résumé de l’analyse statistique des groupes hiérarchiques

Tableau D-2 : Résumé de l’analyse du cas traité, (a) : la valeur est différente pour 1 et o ; (b) : la moyenne des liaisons à l‘intérieur des groupes

xix

Tableau D-3 : Matrice de similitude

Tableau D-4 : Moyenne des liaisons entre groupes et groupage

Tableau D-5 : Nombre des groupes

Figure D-1 : Phenodendrogramme illustrant les rapports de liaisons entre groupes (analyse hiérarchique de groupe)

xxi

Annexe E

Annexe E-1 : Test de cross nodulation de quelques souches sur quelques espèces d’Acacia

Espèce d’ Acacia testées Souches Plante hôte d’origine A. karoo A. saligna A. seyal A. nilotica A. mangium A. tortilis

Nod+ Nod+ Nod+ Nod+ SEE3 A. seyal Fix - Fix + Fix + Fix - Nod+ Nod+ SABS A. saligna fix+ Fix + Nod+ Nod + SAB1 A. saligna Fix- Fix+ Nod+ Nod+ SAKS A. saligna Fix + Fix + Nod+ Nod+ Nod- SAAIS A. saligna Fix- Fix + Fix - Nod+ Nod+ Nod+ Nod+ KHB A. karroo Fix + Fix + Fix - Fix + Nod - Nod+ KO1 A. karroo Nod+ Fix - Fix + Nod+ Nod+ E45 A. ehrenbergiana Fix + Fix + Nod+ E47 A. ehrenbergiana Fix + Nod+ Nod+ 6E0 A. ehrenbergiana Fix + Fix + Nod+ E223 A. ehrenbergiana Fix + Nod+ Nod+ T80 A. tortilis Fix - Fix - Nod+ Nod+ Nod+ Nod+ Nod+ Nod + T82 A. tortilis Fix - Fix + Fix - Fix - Fix - Fix - Nod+: souche infective, Fix+: souche efficiente, Nod -: souche non infective, Fix-: souche inefficiente.

Annexe E-2 : Effet du sol dur la hauteur d’E. camaldulensis avec ANOVA à un facteur (Tanagra 1.4)

Tableaux des moyennes ( E. camaldulensis ) Effet : sol Variable : Hauteur de la tige Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type F-value P-value a NS Messerghine 3 17,2 9,54 0,48 0,6 a M’sila 5 39,3 20,41 a Sebkha 3 33,7 19,21 a Mactaa 6 28,2 34,97 NS : non significatif

Annexe E-3 : Effet du sol sur le poids sec d’E. camaldulensis avec ANOVA à un facteur (Tanagra 1.4)

Tableaux des moyennes ( E. camaldulensis ) Effet : sol Variable : poids sec Seuil de confiance : 0.05

xxii

Répétition Moyenne Ecart type F-value P-value Messerghine 3 2,6 a 1,24 1,5 0,25 NS M’sila 5 12,4 a 3,46 Sebkha 3 8,2 a 2,38 Mactaa 6 2,6 a 0,21 NS : non significatif

Annexe E-4 : Effet site et inoculation sur le poids sec des parties aériennes: Test de StudentStudent----NewmanNewmanNewman---- Keuls

Type III Sums of Squares

Source df Sum of Squares Mean Square F-Value P-Value Site 1 30,160 30,160 6,702 ,0198 Inoculation 1 ,117 ,117 ,026 ,8739 Site * Inoculation 1 ,490 ,490 ,109 ,7456 Residual 16 72,004 4,500 Dependent: PS parties aériennes Means Table Effect: Site Dependent: PS parties aériennes

Count Mean Std. Dev. Std. Error M'sila 10 3,452 2,779 ,879 Messerghine 10 ,996 ,587 ,186

Means Table Effect: Inoculation Dependent: PS parties aériennes

Count Mean Std. Dev. Std. Error + 10 2,148 2,439 ,771 0 10 2,301 2,337 ,739

Means Table Effect: Site * Inoculation Dependent: PS parties aériennes

Count Mean Std. Dev. Std. Error M'sila, + 5 3,219 3,193 1,428 M'sila, 0 5 3,685 2,654 1,187 Messerghine, + 5 1,076 ,560 ,250 Messerghine, 0 5 ,916 ,668 ,299

Student-Newman-Keuls Effect: Site Dependent: PS parties aériennes Significance level: ,05

Count Mean Messerghine 10 ,996 a M'sila 10 3,452 b All were significantly different at this level.

Student-Newman-Keuls Effect: Inoculation Dependent: PS parties aériennes Significance level: ,05

Count Mean + 10 2,148 a 0 10 2,301 a None were significantly different at this level.

xxiii

Annexe E-5 : Effet de l’inoculation sur le poids sec d’A. seyal. Test Student

Tableaux des moyennes ( A. seyal ) Effet : inoculation Variable : poids sec Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral Inoculé 4 17 a 2,38 1,19 0,141 NS

Non inoculé 5 10,1 a 1,81 0,81 NS : effet non significatif

Annexe E-6 : Effet de l’inoculation sur le poids sec d’A. saligna. Test Student

Tableaux des moyennes ( A. saligna ) Effet : inoculation Variable : poids sec Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral Inoculé 4 8,1 a 2,14 1,07 0,228 NS

Non inoculé 5 10,1 a 1,04 0,46 NS : effet non significatif

Annexe F

Annexe F-1 : Effet du site d’échantillonnage sur la teneur en N total d’A. karroo selon le test Student

Tableaux des moyennes ( A. karroo ) Effet : site Variable : Teneur en N total Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Seuil de signification unilatéral a S Messerghine 10 0,61 0,11 0,001 b M’sila 10 0,87 0,19

Annexe F-2 : Effet du site d’échantillonnage sur l’excès isotopiques en 15 N d’A. karroo selon le test Student

Tableaux des moyennes ( A. karroo ) Effet : site Variable : l’excès isotopiques en 15 N et Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Seuil de signification unilatéral a S Messerghine 10 4,71 1,3 0,000 a M’sila 10 0,87 0,19

xxiv

Annexe F-3 : Effet de l’inoculation sur la teneur en N total d’A. karroo sur le sol de Messergine

Tableaux des moyennes ( A. karroo ) Effet : Inoculation Variable : Teneur en N total Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral a NS A. karroo Messerghine Inoc 5 0,61 0,09 0,04 0,456 a A.karroo Messerghine Non Inoc 5 0,62 0,14 0,06 NS : effet non significatif

Annexe F-4 : Effet de l’inoculation sur l’excès isotopiques en 15 N d’A. karroo sur le sol de Messergine

Tableaux des moyennes ( A. karroo ) Effet : Inoculation Variable : l’excès isotopiques en 15 N Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral a S Messerghine Inoc 5 0,64 0,12 0,05 0,032 b Messerghine Non Inoc 5 0,84 0,25 0,12 S : effet significatif

Annexe F-5 : Effet de l’inoculation sur la teneur en N total d’A. karroo sur le sol de la forêt de M’sila

Tableaux des moyennes ( A. karroo ) Effet : Inoculation Variable : Teneur en N total Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral a NS A.karroo M’sila Inoc 5 1,12 0,3 1,13 0,318 a A.karroo M’sila Non Inoc 5 1 0,16 0,07 NS : effet non significatif

Annexe F-6 : Effet de l’inoculation sur l’excès isotopiques en 15 N d’A. karroo sur le sol de la forêt de M’sila Tableaux des moyennes ( A. karroo ) Effet : Inoculation Variable : l’excès isotopiques en 15 N Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral a NS A.karroo M’sila Inoc 5 0,84 0,25 0,11 0,228 a A.karroo M’sila Non Inoc 5 0,9 0,16 0.07 NS : Non significatif

xxv

Annexe F-7 : Effet de l’inoculation sur la teneur en N total d’A. seyal sur le sol de la Sebkha

Tableaux des moyennes ( A. seyal ) Effet : Inoculation Variable : Teneur en N total Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral a NS A.seyal Sebkha Inoc 5 0,69 0,05 0.02 0,245 a A.seyal Sebkha Non Inoc 5 0,64 0,12 0,05 NS : Effet non significatif

Annexe F-8 : Effet de l’inoculation sur l’excès isotopiques en 15 N d’A. seyal sur le sol de la Sebkha

Tableaux des moyennes ( A. seyal ) Effet : Inoculation Variable : l’excès isotopiques en 15 N Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral a S A.seyal Sebkha Inoc 5 2,23 0,31 0,14 0,004 b A.seyal Sebkha Non Inoc 5 1,45 0,25 0,11 S : Effet significatif Annexe F-9 : Effet de l’inoculation sur la teneur en N total d’A. saligna sur le sol des dunes d’El Mactaa Tableaux des moyennes ( A. saligna ) Effet : Inoculation Variable : Teneur en N total Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral a NS A.saligna El Mataa Inoc 5 5,55 1 0,45 0,13 a A.saligna El Mactaa Non Inoc 4 4,13 1,14 0,57 NS : Effet non significatif

Annexe F-10 : Effet de l’inoculation sur l’excès isotopiques en 15 N d’A. saligna sur le sol des dunes d’El Mactaa Tableaux des moyennes ( A. saligna ) Effet : Inoculation Variable : l’excès isotopiques en 15 N Seuil de confiance : 0,05 Répétition Moyenne Ecart type Erreur standard Seuil de signification unilatéral a S A.saligna El Mataa Inoc 5 1,31 0,48 0,35 0,0429 b A.saligna El Mactaa Non Inoc 4 1,01 0,11 0,05 S : Effet significatif

xxvi

Annexe G : Effet de la méthodologie d’analyse de l’excès isotopique 15N et du N total sur les résultats du dosage Tableaux des moyennes Effet : Méthode d’analyse Variable : Excès isotopique en 15 N et Seuil de confiance : 0,05 Seuil de Ecart Erreur Répétition Moyenne signification type standard unilatéral Moyennes de l’excès isotopique en 15 N % (méthode NS 4 10,02 a 6,66 3,33 0,057 dosage du mix des différentes parties des plants) Moyennes de l’excès isotopique en 15 N % (méthode 4 3,45 a 2,52 1,75 dosage individuel des plants) NS : Effet non significatif

Tableaux des moyennes Effet : Méthode d’analyse Variable : Teneur en N total et Seuil de confiance : 0,05 Ecart Erreur Seuil de signification Répétition Moyenne type standard unilatéral Moyennes de N % (méthode dosage du mix S 4 2,12 a 0,2 0,40 0,0004 des différentes parties des plants) Moyennes de N % (méthode dosage 4 0,735 b 0,12 0,18 individuel des plants) S : Effet significatif

xxvii