PAPRASTŲJŲ KARAGANŲ (Caragana Arborescens Lam.) LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS, KIEKYBINĖS SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

NERINGA BIVEINYTĖ

PAPRASTŲJŲ KARAGANŲ (Caragana arborescens Lam.) LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS, KIEKYBINĖS SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Vientisųjų studijų programa „Farmacija“, valstybinis kodas 6011GX003 Studijų kryptis „Farmacija“

Darbo vadovas Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis

KAUNAS, 2021

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU: Farmacijos fakultelo dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data

PAPRASTŲJŲ KARAGANŲ (Caragana arborescens Lam.) LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS, KIEKYBINĖS SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis Data Recenzenzentas Dr. Vilma Gudienė Data Darbą atliko Magistrantė Neringa Biveinytė Data

KAUNAS, 2021 3

TURINYS

SANTRAUKA ...... 5

SUMMARY ...... 6

SANTRUPOS...... 7

ĮVADAS ...... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ...... 10

1.1. Karaganų (Caragana Lam.) genties augalų apibūdinimas, morfologiniai požymiai, paplitimas...... 10

1.2. Paprastųjų karaganų lapų, žiedų, šaknų ir sėklų cheminės sudėties tyrimai ...... 12

1.3. Paprastųjų karaganų žaliavų panaudojimas medicinoje ir biologiškai aktyvių junginių poveikio tyrimas ...... 14

1.4. Fenolinių junginių ekstrakcijos iš augalinių žaliavų ėminių metodai ...... 16

1.5. ESC metodo taikymas fenolinių junginių analizei ...... 18

1.6. Spektrofotometrijos metodo taikymas fenolinių junginių analizei ...... 19

1.7. Antioksidantinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai ...... 20

1.8. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ...... 21

2. TYRIMO METODIKA ...... 22

2.1. Tyrimo objektas ...... 22

2.2. Naudoti reagentai ...... 22

2.3.Naudota aparatūra ...... 23

2.4. Paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų paruošimas...... 23

2.5. Tyrimo metodai ...... 24

2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin – Ciocalteu metodika ...... 24

2.5.2. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas ...... 25

2.5.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ...... 26

2.5.4. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas ...... 26 4

2.5.5. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ...... 28

2.5.6. Tyrimo metu gautų duomenų statistinis vertinimas ...... 29

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...... 30

3.1. Paprastųjų karaganų (Caragana arborescens Lam.) lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymas ...... 30

3.2. Paprastųjų karaganų lapų ėminių fenolinių junginių kiekio nustatymas ...... 32

3.3. Paprastųjų karaganų lapų ėminių hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas ...... 33

3.4. Paprastųjų karaganų lapų ėminių bendro flavonoidų kiekio nustatymas ...... 35

3.5. Paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų antioksidantinio aktyvumo in vitro nustatymas ...... 36

3.6. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas ESC metodu paprastųjų karaganų lapų ėminiuose ...... 38

3.7. Rezultatų apibendrinimas ...... 44

4. IŠVADOS ...... 45

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...... 46

6. LITERATŪROS ŠALTINIAI ...... 47

PRIEDAI ...... 52

SANTRAUKA

N.Biveinytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. habil. dr. Valdimaras Janulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra, Kaunas. Pavadinimas: Paprastųjų karaganų (Caragana arborescens Lam.) lapų fenolinių junginių kokybinės, kiekybinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas. Tyrimo tikslas: nustatyti paprastųjų karaganų (Caragana arborescens Lam.) lapų ėminių fenolinių junginių kokybinę, kiekybinę sudėtį ir lapų ištraukų antioksidantinį poveikį in vitro. Uždaviniai: Nustatyti tinkamas fenolinių junginių ekstrahavimo iš paprastųjų karaganų lapų ėminių sąlygas; įvertinti paprastųjų karaganų lapų ėminių fenolinių junginių įvairavimą vegetacijos periodu; nustatyti paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų antioksidantinį aktyvumą in vitro, taikant UV regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą; efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti ir įvertinti fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį karaganų lapų ėminių ištraukose. Tyrimo objektas ir metodai: paprastųjų karaganų lapų ėminiai, surinkti 2020 metais augalo vegetacijos periodu. Bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidantinis aktyvumas in vitro nustatytas UV regimosios šviesos spektrofotometriniu analizės metodu. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyta kiekybinė ir kokybinė fenolinių junginių sudėtis. Tyrimo rezultatai ir išvados: Nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis išgaunamas ekstrahuojant paprastųjų karaganų lapų ėminius su 40 proc. (v/v) etanoliu, taikant 20 min. trukmės ekstrahavimą ultragarso vonelėje, kai jos galia 1130 W, dažnis 80 kHz. Bendras fenolinių junginių kiekis lapų ištraukose įvairuoja nuo 15,65±0,67 mg GRE/g, p<0,05 iki 23,22±0,59 mg GRE/g, p<0,05. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis lapuose nustatytas augalo vegetacijos periodo pradžioje ir iki augalo vegetacijos periodo pabaigos mažėja. Taikant ABTS metodiką stipriausias antiradikalinis aktyvumas – 66,78±28,35 µmol TE/g, <0,05; taikant FRAP metodiką stipriausias redukcinis aktyvumas – 95,65±7,86 µmol TE/g, p<0,05. Stipriausias antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas paprastųjų karaganų lapų ėminiuose nustatytas liepos mėnesį, augalo žydėjimo laikotarpiu. Taikant ESC metodą, identifikuoti šie fenoliniai junginiai: kemferolis, izoramnetinas, kemferol-3-O-gliukozidas, hiperozidas, galanginas ir pinocembrinas.

SUMMARY

Final Master‘s thesis by N.Biveinytė/ scientific supervisor prof. habil. dr. V.Janulis; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacog- nosy, Kaunas.

The title of the master thesis: Qualitative and quantitative composition variability and antioxidant activity of phenolic compounds in siberian peashrub (Caragana arborescens Lam.) leaves.

The aim of the research: To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds and to evaluate the antioxidant activity in vitro of siberian peashrub (Caragana arborescens Lam.) leaves.

The objectives of the research: To determine the appropriate extraction conditions of phenolic compounds in the samples of siberian peashrub leaves; to evaluate the diversification of phenolic compounds in the samples of siberian peashrub leaves during vegetation period; using UV spectrophotome- try to determine the antioxidant activity in vitro in the samples of siberian peashrub leaves extract; to determine and to evaluate the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in the samples of peashrub leaves extract by HPLC methodology.

The object and methods of the research: The object is siberian peashrub leaves samples, collected in 2020 during different vegetation period of the plant. Total phenolic compounds amount and antioxidant activity in vitro were determined by using UV spectrophotometric methods. The qualitative and quantitative composition of phenolic compounds were determined by high performance liquid chromatography method.

Results and conclusions of the study: The highest total amount of phenolic compounds from extracts of Siberian peashrub leaves samples were determined by using 40 % (v/v) ethanol in 1130 W ultrasound power bath for 20 minutes, with frequency set to 80 kHz. The total amount of phenolic compounds in the raw material extract varies from 15,65±0,67 mg GRE/g, p<0,05 to 23,22±0,59 mg GRE/g, p<0,05. The highest total amount of phenolic compounds content in the plant leaves extract material predominates at the beginning of the plant vegetation period and decreases until the end of the plant vegetation period. Using the ABTS methodology, the highest antiradical activity is – 66,78±28,35 µmol TE/g, <0,05; using the FRAP methodology, the highest reduction activity is – 95,65±7,86 µmol TE/g, p<0,05. The strongest antiradical and reduction activity in the samples of peashrub leaves extract were detected in July, during the flowering period of the plant. Phenolic compounds kaemferol, isorhamnetin, kaemferol-3-O-glucoside, hyperoside, galangin, and pinocembrin were identified by the HPLC method. 7

SANTRUPOS

ABTS – 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis);

CRE – chlorogeno rūgšties ekvivalentas;

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas;

ESC (angl. HPLC) – efektyvioji skysčių chromatografija (high performance liquid chromatography);

FRAP – geležies antioksidantinė redukcijos galia;

GRE – galo rūgšties ekvivalentas;

PSO – pasaulinė sveikatos organizacija;

TE – trolokso ekvivalentas;

TPTZ – 2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazinas;

UESC – ultra efektyvioji skysčių chromatografija;

UV – ultravioletiniai spinduliai.

ĮVADAS

Sveikata yra fizinė, dvasinė ir socialinė gerovė [49]. PSO Europos regiono biuro atstovų teigimu, sveikata ir gerovė yra visuotiniai tikslai, kurie šiuo metu priskiriami prie pagrindinių žmogaus teisių ir yra svarbūs ekonominio ir socialinio vystymosi komponentai bei kasdienio gyvenimo išteklius [50]. Jau nuo senų laikų žmonija naudoja augalines žaliavas sveikatinimo tikslais – ligoms gydyti, simptomams slopinti. Nustatyta, jog šiuo tikslu 80 proc. pasaulio populiacijos gyventojų vartoja augalines žaliavas arba augalinius vaistinius preparatus [46]. Augaluose yra daug biologiškai aktyvių junginių, tokių kaip alkaloidai, steroidai, taninai, glikozidai, fenoliniai junginiai, flavonoidai, amino rūgštys, lektinai, vitaminai. Augaluose randamos biologiškai veiklios medžiagos gali pasižymėti priešmikrobinėmis, antioksidantinėmis, priešgrybelinėmis, imunomoduliuojančiomis ir kitomis savybėmis [44]. Nustatyta, jog iš 225 žmogaus sveikatai gyvybiškai būtinų vaistų net 11 proc. yra augalinės kilmės [18]. Todėl didėja mokslininkų susidomėjimas sistemingesniu ir visapusišku mažiau ištirtų augalų rūšių charakterizavimu, vis daugiau lėšų ir dėmesio skiriama vaistinių augalų tyrinėjimui [45]. Plačiai tiriama biologiškai aktyvių junginių grupė yra fenoliniai junginiai, kurie pasižymi priešvirusinėmis, priešmikrobinėmis, priešbakterinėmis ir priešvėžinėmis savybėmis [3]. Fenoliniai junginiai geba apsaugoti organizmo ląsteles nuo oksidacinio streso – pasižymi antioksidantiniu poveikiu. Oksidacinis audinių pažeidimas yra veiksnys, skatinantis senėjimą, imuninės sistemos nusilpimą, vėžio, aterosklerozės ir kitų ligų atsiradimą. Atlikta daug mokslinių tyrimų ir įrodyta, kad augalinėje žaliavoje esantys antioksidantai gali apsaugoti žmogaus organizmo ląsteles nuo neigiamo ir per didelio laisvųjų radikalų kiekio poveikio, kuris siejamas su daugelio lėtinių ligų išsivystymu. Todėl fenoliniai junginiai, dėl jų biologinio aktyvumo, yra labai vertingi farmacijoje [47]. Fenoliniai junginiai pasiskirstę visuose paprastųjų karaganų organuose ir jų kiekis vegetacijos metu kinta. Dėl šios priežasties, fenolinių junginių kokybinės, kiekybinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo nustatymas yra svarbus vertinant žaliavų kokybę ir parenkant optimalų žaliavos rinkimo laiką. Darbo naujumas. Paprastųjų karaganų žaliavos fenolinių junginių sudėties nepakankamas tyrimų kiekis paskatino ištirti Lietuvoje augančių paprastųjų karaganų lapų kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei įvertinti jų ištraukų antioksidantinį aktyvumą in vitro. Pagal gautus tyrimų rezultatus galima bus įvertinti Lietuvos klimato sąlygomis augančių paprastųjų karaganų lapų sudėties įvairavimą bei antioksidantinį poveikį. Įvertinus gautus rezultatus, bus galima pateikti moksliškai pagrįstas išvadas apie tolesnių tyrimų būtinybę, siekiant įvertinti paprastųjų karaganų lapų panaudojimo perspektyvas farmacijoje ir medicinoje. Šio mokslinio darbo tikslas – nustatyti paprastųjų karaganų (Caragana arborescens Lam.) lapų ėminių fenolinių junginių kokybinę, kiekybinę sudėtį ir lapų ištraukų antioksidantinį poveikį in vitro. 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Nustatyti paprastųjų karaganų (Caragana arborescens Lam.) lapų ėminių fenolinių junginių kokybinę, kiekybinę sudėtį ir lapų ištraukų antioksidantinį poveikį in vitro.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti tinkamas fenolinių junginių ekstrahavimo iš paprastųjų karaganų lapų ėminių sąlygas. 2. Įvertinti paprastųjų karaganų lapų ėminių fenolinių junginių įvairavimą vegetacijos periodu. 3. Nustatyti paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų antioksidantinį aktyvumą in vitro, taikant UV regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą. 4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti ir įvertinti fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį karaganų lapų ėminių ištraukose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Karaganų (Caragana Lam.) genties augalų apibūdinimas, morfologiniai požymiai, paplitimas

Karalystė: Augalai – Plantae; Skyrius: Magnolijūnai (Gaubtasėkliai) – Magnoliophyta (Angiospermae); Klasė: Magnolijainiai (Dviskilčiai) – Magnoliopsida (Dicotyledones); Eilė: Pupiečiai – Fabales; Šeima: Pupiniai – Fabaceae; Gentis: Karaganų – Caragana; Rūšis: Paprastosios karaganos – Caragana arborescens Lam.

Paprastosios karaganos (Caragana arborescens Lam.), dar vadinamos geltonosiomis akacijomis, žirnmedžiais – pupinių (Fabaceae) šeimos augalai priklausantys karaganų genčiai (1 lentelė). Pupinių šeima – trečia pagal dydį žydinčių augalų šeima, kurioje yra apie 19 000 augalų rūšių [4]. 1763 m. Philip Caragana Fabricicus sukūrė karaganų gentį, aprašė daugiau nei 100 karaganų rūšių. Labiausiai Rusijoje ir Kinijoje paplitę karaganų genties augalai yra: paprastosios karaganos (Caragana arborescens Lam.), dvispalvės karaganos (Caragana bicolor Kom.), krūminės karaganos (Caragana frutex L.), smulkialapės karaganos (Caragana microphylla Lam)., rausvažiedės karaganos (Caragana rosea L.), kininės karaganos (Caragana sinica Buchoz.), trumpalapės karaganos (Caragana brevifolia Kom.) ir daug kitų [4]. Lietuvoje auga trys rūšys: paprastosios karaganos (Caragana arborescens Lam.), siauralapės karaganos (Caragana aurantiaca Koehne.) ir krūminės karaganos (Caragana frutex L.) [5]. Karaganų genties augalai kilę iš Sibiro (Altajaus regiono) [3]. Paprastosios karaganos kilusios iš Sibiro ir išplitusios visoje Rusijoje [2]. Į Šiaurės Ameriką paprastosios karaganos įvežtos 1700–ųjų viduryje, vėliau išplito beveik visoje Kanadoje, ir maždaug pusėje JAV valstijų. Buvo tikima, kad šie augalai gali sukelti problemų ekosistemai, gali būti nuodingi, pasižymėti toksinėmis savybėmis [1,4]. Pirmą kartą paprastosios karaganos įvežtos į Europą XVIII amžiaus viduryje, buvo augintos kaip dekoratyviniai augalai, gyvatvorėms [1]. XX a. pradžioje paprastosios karaganos aptiktos Lietuvoje, Kauno rajone, Viršužiglio kaime [2]. Šie augalai daugiausiai paplitę miškuose tarp spygliuočių ir lapuočių, pakrantėse, laukuose [3]. Paprastoji karagana (Caragana arborescens Lam.) – krūmas arba medis, kuris gali siekti nuo 2 iki 6 m aukščio [4,8]. Dažniausiai tai krūmas, kurio stiebo žievė tamsiai pilkos spalvos. Šakos tamsiai 11 pilkos spalvos, šakelės nuo žalios iki gelsvai rudos spalvos, žievė lygi [3]. Lapai sudėtiniai 3 – 10 cm ilgio, sudaryti iš 8 –12 (16) lapelių, prisitvirtinusių ant vieno lapkočio. Lapeliai atvirkščiai kiaušiniški ar pailgai elipsiški, 1 – 2,5 cm ilgio ir 0,5 – 1,5 cm pločio, pavasarį plaukuoti. Jauni lapeliai gali būti plaukuoti, o senieji – be plaukelių [3,1]. Turi prielapius, kurie virtę nedideliais 5 – 10 mm, aštriais dygliukais [3]. Žiedai yra zigomorfiniai, geltonos spalvos. Dažniausiai jie yra pavieniai arba 2 – 5 žiedai sudaro grupelę lapų pažastyse, susijungia į vieną pluoštą. Taurelės yra vamzdelio formos, plaukuotos, 6 mm ilgio, su trumpais plačiais danteliais [3,7]. Žiedkotis tiesus, lygus, gali turėti kelis lapelius. Vainikėlis dažniausiai geltonas, gali būti baltos, rausvos ar oranžinės spalvos. Mezginė plika arba gali būti plaukuota, linijiška, suspausta ar elipsės formos ir turi daug sėklapradžių [3,8,7]. Karaganų genties augalai yra savidulkiai [1,10]. Žydėjimo sezono metu vienas krūmas išaugina nuo 16710 iki 28407 žiedų. Atskiras žiedas žydi nuo 5 iki 8 dienų [1]. Paprastoji karagana žydi gegužės – liepos mėnesiais, ankštys prinoksta liepą – rugpjūtį, išdžiūsta ir išbarsto sėklas aplink augalą [3,10]. Paprastųjų karaganų vaisiai cilindriški, linijiški ar plokšti. Vaisius – 3,5 – 5 cm ilgio ankštis, ji subrandina 3 – 5 tamsiai rudos spalvos, lygias sėklas, kurių forma skiriasi nuo pailgos iki rutuliškos formos. Ankštis būna šviesiai žalios spalvos, kai subrandina sėklas – tampa rusva [3]. Vaisiai – ankštys – subręsta liepos pabaigoje ar rugpjūčio mėnesiais ir išbarsto sėklas [3,10]. Sėklos nedidelės 0,4 – 0,5 cm dydžio, apvalios, šiek tiek pailgos, rudos spalvos, labai maistingos [3]. Kanadoje mokslininkai atliko tyrimus įvertinti, kiek laiko išlieka daigios ir nepakitusios surinktos paprastųjų karaganų sėklos. Tyrimai parodė, kad sėklos išlieka gyvybingos mažiausiai 5 metus, jei jos laikomos kambario temperatūroje, kai drėgmė yra 9,6 proc. ir 13,5 proc. [6]. Karaganų genties augalai gali daugintis sėklomis ir vegetatyviniu dauginimosi būdu – auginant ūglius nuo šaknų vainikų [3,6]. Paprastosios karaganos auga įvairiomis klimato sąlygomis: žemoje temperatūroje iki -38 °C, esant sausrai, saulėtoje vietoje, nevaisingame, šarmingame ir druskingame dirvožemyje [10]. Paprastosios karaganos nėra reiklios dirvai, jos auga vidutinio derlingumo normalaus drėgnumo ir sausokuose priemoliuose [1,3]. W.Guoa ir kt. atliko tyrimą, kuris patvirtino, kad karaganų genties augalai yra prisitaikę išgyventi ir drėgname dirvožemyje ir esant sausrai [13]. Augalas toleruoja karpymą, dažnai veisiamas karpomose gyvatvorėse, kurios būna ilgaamžės. Paprastosios karaganos gali įsitvirtinti aukštuose upių šlaituose, kurie yra ardomi vandens [1,3]. Jungtinėje karalystėje paprastosios karaganos buvo laikomos invaziniais augalais [11]. Augalų ir gyvūnų rūšys, patekusios į naujas, joms neįprastas, gamtos buveines, gali nustelbti vietinę augaliją arba gyvūniją ir pakenkti aplinkai. Tokie organizmai vadinami invazinėmis rūšimis [12]. Atlikti stebėjimai ir tyrimai parodo, kad karaganų genties augalai pasižymi ir teigiamomis ir neigiamomis savybėmis. Besikeičiančios klimato sąlygos, nuolatinis kitų augalų buveinių nykimas gali tapti priežastimi, kad paprastosios karaganos bus laikomos invaziniais augalais [10]. Dėl šios priežasties 12 karaganų genties augalus reikia stebėti, analizuoti, atlikti kuo daugiau fitocheminių tyrimų. Šiuo metu karaganų gentis laikoma invazine tik trijose vietose: Minesotoje, Manitoboje ir Albertoje [10]. Karaganos įvairiems gyvūnams, vabzdžiams ir paukščiams – maisto šaltinis [3]. Karaganų genties augalai svarbūs bitininkystei, nes žieduose gausu nektaro, kurio pagrindą sudaro angliavandeniai, o žiedadulkės – baltymų šaltinis [15]. Tai pagrindiniai mitybos elementai, reikalingi bitėms gyvuoti [15].

1.2. Paprastųjų karaganų lapų, žiedų, šaknų ir sėklų cheminės sudėties tyrimai

Karaganų genties augalų pirmieji cheminiai tyrimai pradėti 1972 m. Pirmiausia iš augalų organų išskirti cheminiai junginiai – flavonoliai, o iki 1990 m. didesnis dėmesys skirtas flavonoidų tyrimams. Plačiausiai ištirta cheminė sudėtis – kininių karaganų (Caragana sinica Buchoz.) [1]. Paprastosios karaganos, nors ir plačiai išplitusios po pasaulį, tačiau tyrinėtos mažiau.

Karaganų genties augalų organuose nustatyti fenoliniai junginiai [1,23], flavonoidai [1,23], stilbenoidai [56,51], fenilpropanoidai [23], lektinai [1], eteriniai aliejai [3,59], terpenoidai [3], triterpenai [23], saponinai [57,51], organinės rūgštys [1], vitaminas C [51], mikroelementai, makroelementai [51,55] ir alantoinas [42].

Olennikov D.N. ir kiti Rusijoje atliko mokslinį tyrimą, kurio tikslu buvo siekama išanalizuoti paprastųjų karaganų augalų organų fitocheminę sudėtį. Straipsnio duomenimis, paprastųjų karaganų lapų žaliavoje nustatyta 20 skirtingų cheminių komponentų. Mokslininkai analizavo karaganų žaliavos ištraukas, pagamintus su 70 proc. etanoliu. Analizė atlikta taikant plonasluoksnės chromatografijos metodą, lapų ištraukose nustatyta: 9 flavonoliai (kemferolis, kvercetinas, izoramnetinas, izokvercitrinas, izoramnetin-3-O-glikozidas, nikotiflorinas (kemferol-3-O-rutinozidas, rutinas (kvercetin-3-O- rutinozidas), narcizinas (izoramnetin-3-O-rutinozidas), miricetin-3-O-rutinozidas); 3 izoflavonai (formononetinas, ononinas (formononetin-7-O-glikozidas), formononetin-7-O-rutinozidas); 4 fenilpropanoidai (kofeino rūgštis, 3-O-kofeoilchinino rūgštis, 5-O-kofeinochinino rūgštis, 3,5-di-O- kofeoichinino rūgštis); triterpenai (β-sitosterolis, β-sitosterol-3-O-glikozidas, umbeliferonas) ir sacharozė [23]. Kuklina A.G. ir kt. atliko fitocheminę paprastųjų karaganų analizę ir identifikavo augalo lapuose kaupiamus flavonoidus: rutiną, kemferolį, kvercetiną, kvercetino-3-O-gliukozidą, astragaliną (kemferolio-3-O-gliukozidą), liuteolin-3-O-gliukozidą, apigenin-3-O-gliukozidą ir akacetin-3-O- gliukozidą [55]. 13

Chen Y.G. ir kiti ištyrė karaganų genties augalų žieduose esančio eterinio aliejaus sudėtį. Identifikuota 16 skirtingų lakių cheminių komponentų esančių eterinio aliejaus sudėtyje: seskviterpenai α-kadinolis (35,8 proc.), kubenolis (7,2 proc.), α-humulenas (0,5 proc.), viridiflorolis (7,2 proc.), δ- kadinenas (2,4 proc.), monoterpenai α-pinenas (2,2 proc.) ir β-pinenas (3,6 proc.), aldehidai – nonanalis (1,2 proc.) ir dekanalis (0,4 proc.), ketonai – germakronas (9,0 proc.), trans-β-jononas (1,8 proc.) ir kiti [61]. Olennikov D.N. ir kiti žiedų ištraukose, lyginant su lapų ištraukomis, nenustatė flavonolių: kvercetino ir izoramnetin-3-O-glikozido bei fenilpropanoido 3,5-di-O-kofeoichinino rūgšties, bet identifikavo žiedų ištraukose esančius flavonolius: izokvercitriną (kvercetin-3-O-gliukozidą), izorhamnetin-3-O-gliukozidą, rutiną, narciziną (izorhamnetin-3-O-rutinozidą); fenilpropanoidą: 3-O- kafoilchinino rūgštį [23]. Karaganų žiedų ištraukose identifikuoti triterpeno junginiai oleonolio rūgštis ir betulino rūgštis [3,59].

Stiebų ištraukoje Olennikov D.N. ir kiti identifikavo flavonolius kvercetiną ir rutiną [23]. Xiang T. ir kiti karaganų genties stiebų ištraukoje identifikavo stilbenoidus: piceatanolį, kasigarolį E, kasigarolį G, resveratrolį ir medikarpiną [65].

Karaganų genties augalų šaknyse Korėjos mokslininkai Jin Q. ir kiti nustatė antrinius metabolitus priklausančius skirtingų grupių gamtiniams junginiams. Etilacetatinėje karaganų šaknų ištraukoje buvo identifikuoti stilbenoidai – karagazininas A ir karagazininas B, kobofenolis A, (+)-α- viniferinas, (+)-izoampelopsinas, karazinauronas, karafenolis B [62]. Karaganų genties augalų šaknų ištraukoje identifikuoti stilbenoidai resveratrolis, piceatanolis, resveratrolio tetrameras karorizinolis B [56,51]. Nustatyta, jog karaganų genties augalų šaknyse kaupiami triterpenoidiniai saponinai karaganinas A, karaganinas B [57,51], karaganozidas C ir karaganozidas D [63]. Jin G.Z. ir Piao H.S. karaganų šaknų ištraukoje identifikavo fenolinę rūgštį – ferulo rūgštį, flavonoidą – trifoliriziną, terpenoidus – daukosterolį ir beta sitosterolį, izoflavonus – ononiną, pseudobaptigeniną [66].

Karaganų genties augalų sėklose identifikuoti triterpenoidiniai saponinai: karaganinas A, karaganinas B [57,51], karaganozidas C ir karaganozidas D [63]. Taylor W. ir kiti identifikavo paprastųjų karaganų sėklų etanolinėje ištraukoje triterpenoidinius saponinus I, III, VI [64]. Lektinai – yra glikoproteinai, randami ankštiniuose augaluose [4]. Paprastųjų karaganų sėklose mokslininkai identifikavo dviejų rūšių lektinus, specifiškus D-galaktozei ir N-acetil-D-galaktozaminui [1,29]. Lektinai prisijungia prie ląstelių sienelių arba membranų cukrinės dalies ir sukelia agliutinaciją, mitozę. Augalų lektinai pasižymi plačiu biologiniu veikimu, priešvėžinėmis ir proapoptozinėmis savybėmis [1].

Kuklina A.G. ir kt. mokslininkai augalo etanolinėje ištraukoje identifikavo makroelementus kalcį ir magnį, bei mikroelementus varį, nikelį ir cinką [55]. Nustatyta, kad karaganos genties augalai kaupia vitaminą C [51]. 14

Paprastųjų karaganų žaliavoje identifikuotas antrinis metabolitas alantoinas – 5- ureidohidantoinas arba 2,5-dioksimidazolidin-4-ilkarbamidas. Alantoinas pasižymi degeneracinėmis, antimikrobinėmis ir uždegimą mažinančiomis savybėmis. Pupinių šeimos augaluose alantoinas paverčiamas transportine azoto forma. Dėl šios cheminės medžiagos, paprastųjų karaganų žaliavos gali būti naudojamos dermatologinių, uždegimą mažinančių, degeneraciją skatinančių vaistų kūrime [42].

Apibendrinant galima teigti, jog karaganų genties augalų žaliavoje nustatyta daug biologiškai aktyvių junginių, kurie gali daryti teigiamą poveikį žmogaus sveikatai. Fenoliniai junginiai yra antriniai augalų metabolitai, randami visuose augalų organuose [24]. Tai yra labai svarbi natūralių antioksidantų grupė, kuri skirstoma į: fenolines rūgštis, flavonoidus, kumarinus, stilbenoidus ir taninus [27]. Tarpusavyje jie skiriasi konfigūracija ir anglies atomų skaičiumi [25,26]. Paprastųjų karaganų lapų ištraukoje nustatyti flavonoliai, izoflavonai, fenilpropanoidai, triterpenai ir flavonoidai, žiedų ištraukoje nustatyti eteriniai aliejai ir jų sudedamosios dalys, flavonoliai, izoflavonai, flavonoidai, fenilpropanoidai. Stiebuose nustatyti stilbenoidai ir flavonoliai, šaknyse – stilbenoidai, triterpenoidiniai saponinai, fenolinės rūgštys, flavonoidai, izoflavonai ir terpenoidai. Sėklose identifikuoti triterpenoidiniai saponinai ir lektinai.

1.3. Paprastųjų karaganų žaliavų panaudojimas medicinoje ir biologiškai aktyvių junginių poveikio tyrimas

Karaganų genties augalų žaliavos, kaip gydomoji priemonė, pradėtos naudoti tradicinėje kinų medicinoje. Augalų žaliavų nuovirais buvo gydomas galvos skausmas, kosulys, mažinama įtampa bei nuovargis [58]. Karaganų genties augalų žaliavos buvo naudojamos astenijai, gimdos, gimdos kaklelio bei krūties vėžiui gydyti [1]. Paprastųjų karaganų žaliavos pasižymi teigiamu terapiniu poveikiu gydant raumenų uždegimą ir patinimą, malšinant skausmą, gydant skausmingą reumatoidinį artritą [1,58]. Mokslininkai Min G.Y. ir kiti publikavo straipsnį apie karaganų genties augalų šaknų ištraukos teigiamą poveikį osteoartrito gydymui. Teigiamas terapinis veikimas gydant osteoartritą buvo įrodytas atliekant ikiklinikinius tyrimus su žiurkėmis [58]. Augalų žaliavos pasižymi teigiamu poveikiu gydant įvairias odos ligas, nes kaupia alantoiną, kuris slopina uždegimus, skatina degeneracijos procesus [42]. Karaganų žaliavomis gydomos įvairios odos ligos, pvz. psoriazė, įvairios traumos, žaizdos, opos ir paviršinės infekcijos [1]. Geltonžiedžių akacijų lapuose nustatytas flavonoidas rutinas, kuris turi P vitaminį aktyvumą ir yra reikalingas kraujagyslių sienelių stiprinimui, kraujagyslių uždegimui mažinti, kraujavimui slopinti [1]. Mokslinėje 15 literatūroje nurodoma, kad bioflavonoidai pasižymi P vitamininiu aktyvumu - gerina vitamino C įsisavinimą, sumažina kojų, nugaros skausmus, padeda išvengti alergenų sukeliamų pojūčių, dideli bioflavonoidų kiekiai stabdo kataraktos, akies geltonosios dėmės degeneracijos išsivystymą, mažina akispūdį. Flavonoidai yra biologiškai aktyvūs junginiai, turintys antioksidantį, uždegimą mažinantį, priešvėžinį, priešvirusinį ir priešbakterinį poveikius [3]. Paprastųjų karaganų žaliavoje identifikuotas flavonoidas kvercetinas, kuris, atlikus in vitro tyrimus, nustatyta, pasižymi hipoglikeminėmis savybėmis ir gali būti naudojamas cukriniam diabetui gydyti, taip pat pasižymi P vitamininiu aktyvumu [19]. Karaganų genties augaluose identifikuotas flavonoidas – kemferolis, kuris, remiantis klinikiniais tyrimais, apsaugo organizmą nuo plaučių, skrandžio, kasos ir kiaušidžių vėžio [68]. Moksliniais tyrimais in vitro ir in vivo patvirtinta, kad kemferolį kaupiančios augalų žaliavos pasižymi antioksidantiniu veikimu. Mokslininkai Kataoka ir kt. atliko ikiklinikinius tyrimus su Mongolijos smiltpelėmis vertinant kemferolio priešbakterinį aktyvumą. Pelėms, sergančioms Helicobacter pylori infekcija, 10 dienų 2 kartus per dieną buvo duodamas kemferolis. Nustatyta, kad Mongolijos smiltpelių skrandyje sumažėjo H.pylori bakterijų kolonijos po kemferolio vartojimo [68]. Flavonoidai sintetinami visuose karaganų genties augalų organuose [22], tai labai svarbi junginių grupė farmacijos, kosmetikos bei natūralios mitybos srityse [19]. Atlikti moksliniai tyrimai ir stebėjimai patvirtino flavonoidų teigiamą poveikį širdies ir kraujagyslių sistemai, nustatyta, jog flavonoidų vartojimas mažina mirštamumą nuo širdies ligų [3]. Kinijoje He Q., Li S. ir kiti mokslininkai atliko ikiklinikinį tyrimą, kurio tikslas įvertinti karaganų genties augaluose esančių flavonoidų terapinę naudą išeminio insulto atveju. Tyrimas atliktas su žiurkėmis. Gauti rezutatai patvirtino, jog karaganų genties augaluose esantys flavonoidai skatina kraujotaką, pasižymi reikšmingu neuroprotekciniu ir angiogeniniu poveikiu, yra naudingi gydant širdies ligas [9]. Siekiama kuo plačiau išanalizuoti karaganų genties augalų fitochemines ir farmakologines savybes, daug dėmesio skiriama antioksidantiniui, priešvėžiniui, imunostimuliaciniui ir imunosupresiniui poveikiams [1]. Būtent šiomis savybėmis pasižymi paprastųjų karaganų žaliavoje sintetinami fenoliniai junginiai, flavonoidai, stilbenoidai. Resveratrolis – vienas pagrindinių stilbenoidų, randamų paprastųjų karaganų žaliavoje. Šis biologiškai aktyvus junginys vartojamas visame pasaulyje, kaip antioksidantinė, priešvėžinė, širdies darbą stimuliuojanti priemonė. Resveratrolio antioksidantinės savybės pasireiškia gebėjimu sujungti metalo jonus ir moduliuoti fermentus, pavyzdžiui didinant katalazės, aktyvumą. Šio stilbenoido antioksidantinis aktyvumas buvo įrodytas ikiklinikinio tyrimo su diabetu sergančiomis žiurkėmis metu, joms vartojant resveratrolį, sumažėjo lipidų peroksidacija hipokampe [4]. Taip pat atlikti moksliniai tyrimai ir stebėjimai, parodė resveratrolio teigiamą poveikį aterosklerozės gydymui bei gydant išemijas, jis slopina trombocitų agregaciją, gerina širdies veiklą, mažina cholesterolį, slopina vėžinių ląstelių dauginimąsi bei apsaugo odą nuo pigmentacijos [28]. 16

Paprastųjų karaganų žaliavoje nustatyti 2 rūšių lektinai, kurie gali būti naudojami kaip kontraceptinė ir lytiškai plintančių infekcijų profilaktikos priemonė. Nustatyta, karaganų sėklose kaupiami lektinai in vitro tyrimuose selektyviai sunaikino užkrėstas ląsteles su žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV) [1]. JAV mokslininkų atliktuose tyrimuose nustatyta - karaganų genties augalų žaliava, dėl sudėtyje esančių lektinų, gali būti naudojama, kaip profilaktinė priemonė gydant krūties ir gimdos vėžį [1].

Karaganų genties augalų žaliavoje identifikuoti terpenoidai, seskviterpenai, terpeno junginiai - eterinio aliejaus sudedamosios dalys. Eteriniai aliejai pasižymi priešbakteriniu, priešvirusiniu, priešgrybeliniu, priešparazitiniu, antioksidantiniu poveikiu. Daugelis eterinių aliejų veikia fungistatiškai, o didelė eterinio aliejaus koncentracija veikia fungicidiškai [59].

Tradicinėje kinų ir mongolų medicinoje karaganų genties augalų gydymo tikslais naudojama žaliava yra šaknys. Iš išdžiovintų, susmulkintų ir tinkamai apdorotų šaknų verdamas nuoviras, kuris naudojamas įvairiems susirgimams gydyti – hipertenzijai, astenijai, sumušimams, žaizdoms, reumatui, artritui. Taip pat išdžiovintų ir susmulkintų augalo žiedų nuoviras naudojamas gerklei skalauti, paviršinėms žaizdoms bei odos grybeliui gydyti [4].

1.4. Fenolinių junginių ekstrakcijos iš augalinių žaliavų ėminių metodai

Pasak Pasaulinės sveikatos organizacijos, iš 225 pagrindinių, žmogaus sveikatai būtinų, vaistų, net 11 proc. yra augalinės kilmės [18]. Todėl nuo seno domimasi, kaip iš augalo išgauti biologiškai aktyvias medžiagas, kurios pasižymi teigiamu terapiniu poveikiu [34].

Ekstrakcija – procesas, kurio metu iš augalinės ar gyvūninės kilmės žaliavos, naudojant tirpiklius, išgaunami biologiškai aktyvūs junginiai. Mokslininkų Altemimi A. ir kt. teigimu, norint iš vaistinės augalinės žaliavos pagaminti kokybišką ir veiksmingą ištrauką, būtina pasirinkti tinkamiausią ekstrahavimo metodą, tinkamas ekstrahavimo sąlygas, naudoti kokybišką ekstrahentą ir žaliavas [30]. Biologiškai aktyvių junginių išgavimas iš augalinės žaliavos susideda iš kelių procesų – ekstrakcijos, filtracijos, koncentracijos tikslinimo. Ekstrakcijos metu, į žaliavos ląsteles patenka tirpiklis, kuriame ištirpsta biologiškai aktyvios medžiagos esančios augale, ir prisotintas tirpiklis yra atskiriamas nuo netirpios dalies [14,18,34]. Ekstrakcijos proceso veiksmingumas priklauso nuo tirpiklio kilmės, temperatūros, ekstrakcijos proceso trukmės, augalinės žaliavos dydžio bei žaliavoje esančių aktyvių junginių cheminių savybių [52]. 17

Ekstrahentas – tirpiklis naudojamas ekstrahavimo procese apdorojant žaliavas. Pagal naudotą ekstrahentą, ekstraktai skirstomi į vandeninius, etanolinius, eterinius ir aliejinius [32]. Nustatyta, jog ekstrahuojant etanoliu arba etanolio ir vandens mišiniu, gaunama didžiausia fenolinių junginių išeiga, todėl šis ekstrahentas naudojamas dažniausiai [14]. Mokslininkai pastebėjo, kuo didesnė etanolio koncentracija, tuo mažesnis ekstrahuotų medžiagų kiekis, todėl dažniausiai ekstrakcijai pasirenkama etanolio koncentracija yra 40 – 70 proc. Ekstrahentas turi užtikrinti pagamintų ištraukų stabilumą ir antimikrobinę apsaugą [52]. Prieš atliekant ekstrakciją ir norint pagerinti ekstrakcijos proceso kokybę, augalinė žaliava yra smulkinama, nes į smulkią žaliavą geriau prasiskverbia tirpiklis, ir pagreitėja ištirpusių medžiagų difuzija [18]. Tačiau smulkinant žaliavą, suardomos ląstelės iš kurių išsiskiria baltymai, pektinai ir kiti didelės molekulinės masės junginiai, kurie pablogina ekstrahavmo procesą. Jei augalinė žaliava nepakankamai smulki, ekstrahavimo procesas vyksta ilgesnį laiką, išekstrahuojami ne visi biologiškai aktyvūs junginiai. Dėl šios priežasties susmulkinta augalinė žaliava sijojama per atitinkamo dydžio sietus ir parenkamas optimalus susmulkintos žaliavos dalelių dydis [52].

Ekstrakcijos trukmė gali daryti įtaką ištraukos kokybei. Nustatyta, kad biologiškai aktyvios medžiagos turi didesnį difuzijos greitį nei balastinės medžiagos, todėl, norint gauti kokybišką ištrauką, turėtų būti parenkama optimali ekstrakcijos trukmė [52]. Temperatūra taip pat gali daryti įtaką ekstrakcijos procesui. Aukštoje temperatūroje tirpumas ir medžiagų difuzija vyksta greičiau. Tačiau svarbu pasirinkti optimalią temperatūrą, nes esant per aukštai temperatūrai, ištraukoje gali atsirasti nepageidaujamų priemaišų [18,34]. Visi ekstrahavimo faktoriai turi būti atsakingai parenkami, nes netinkamos sąlygos gali sukelti biologiškai aktyvių junginių destrukciją.

Yra išskiriami keli biologiškai aktyvių medžiagų išgavimo metodai: ekstrakcija Soksleto aparate [18], ekstrakcija organiniais tirpikliais – maceracija ir perkoliacija [31], superkritinių skysčių ekstrakcija [18,30], kietafazė mikroekstrakcija [18,30], mikrobangomis skatinama ekstrakcija [18,30], mikrodistiliacija [34], ultragarsu skatinama ekstrakcija [18], membraninė ekstrakcija [34] ir kt. Ekstrakcija organiniais tirpikliais ir ekstrakcija Soksleto aparate – tradiciniai metodai, o mikrobangų ekstrakcija, ekstrakcija ultragarsu (sonifikacija), suslėgtų ir superkritinių skysčių ekstrakcija yra šiuolaikiniai ekstrakcijos metodai [33].

Ekstrakcija organiniais tirpikliais – naudojant organinius tirpiklius biologiškai aktyvių medžiagų išskyrimas iš augalo [31]. Maceracija ir perkoliacija yra plačiai naudojamos technologijos dėl metodikos paprastumo, efektyvumo ir plataus pritaikomumo. Šiuo metodu iš augalinės žaliavos išekstrahuojamos ne visos biologiškai aktyvios medžiagos, metodo trukmė ilga, todėl dažniausiai taikomi naujesni metodai žaliavai ekstrahuoti [34]. Efektyvesnis ekstrakcijos organiniais tirpikliais metodas yra perkoliacija. Metodo principas – ekstrahentas tam tikru greičiu košiamas pro žaliavą ir tuo metu iš žaliavos į tirpiklį difunduoja ištirpusios ekstrakcinės medžiagos. Žaliava prieš ekstrakciją 18 sudrėkinama tirpikliu, išbrinkinama ir paliekama maceruotis 24 – 48 valandas iki perkoliavimo. Parinktas perkoliacijos greitis nulemia augalinės žaliavos ekstrakcijos veiksmingumą [34].

Ekstrakcija Soksleto aparate taikoma kietų mėginių ekstrakcijai. Ekstrahuojant šiuo metodu, biologiškai aktyvių junginių išgavimas priklauso nuo tirpiklio parinkimo. Tirpiklis turi būti giminingas analitėms, mažiau giminingas matricai, lakus ir neklampus. Soksleto aparate tirpiklis išgarinamas, kondensuojasi šaldytuve ir teka per mėginį. Šio metodo privalumas – nebūtina stebėti ir prižiūrėti ekstrakcijos, nereikalingas filtracijos procesas, metodas pigus. Tačiau Soksleto ekstrakcija yra ilgai trunkantis metodas, kurio metu sunaudojamas didelis kiekis tirpiklio [18,35].

Tradicinius ekstrahavimo metodus pakeitė šiuolaikinė ekstrahavimo metodika – ekstrakcija ultragarsu (sonifikacija), kuri yra efektyvi, nebrangi ir kokybiška [18,33]. Metodo esmė yra suardyti ląstelių membraną ir tokiu būdu padidinti junginių išgavimą, sutrumpinant ekstrakcijos laiką. Sonifikacija lengvai ir greitai atliekama laboratorijos sąlygomis [36,30]. Ekstrahuojant žaliavą šiuo būdu, gaunama didesnė išeiga aukštos kokybės ištraukos per labai trumpą ekstrahavimo laiką. Dail J. ir kitų mokslininkų teigimu, sonifikacija yra ekonomiškas, greitas ir veiksmingas metodas, kai sunaudojamas nedidelis kiekis ekstrahento ir šiuo metodu galima ekstrahuoti nestabilius junginius. Atliekant ekstrakciją ultragarso vonelėje lengvai galima keisti parametrus (laiką, temperatūrą ir ultragarso stiprumą), o išekstrahavus žaliavą, būtina ją perfiltruoti [35,36]. Ekstrakciją ultragarsu taikė Zheng Z. ir kiti mokslininkai atlikdami karaganų genties augalų žaliavų ėminių fenolinių junginių nustatymą [73].

1.5. ESC metodo taikymas fenolinių junginių analizei

Fenolinių junginių nustatymas yra svarbus, norint nustatyti augalinių žaliavų cheminę sudėtį, jos įvairavimą skirtinguose augalo organuose ir siekiant užtikrinti augalinės žaliavos kokybės parametrus. Fenolinių junginių kokybiniams tyrimams naudojama masių spektroskopija, IR bei UV spektroskopija, kapiliarinė elektroforezė, dujų ir skysčių chromatografija. Kiekybinei fenolinių junginių analizei naudojama kapiliarinė elektroforezė, spektrofotometrija, skysčių ir dujų chromatografija [37]. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) – vienas iš plačiausiai šiuolaikinėje analizėje taikomų metodų, naudojamas kokybiniam ir kiekybiniam junginių nustatymui [37]. Šis metodas plačiai naudojamas medicinos srityje, siekiant išanalizuoti vaistinių preparatų, kenksmingų medžiagų, anabolinių steroidų kiekiams kraujyje ar šlapime [48]. Vienas iš pagrindinių efektyviosios skysčių 19 chromatografijos metodo privalumų – galimybė naudojant tą pačią įrangą nustatyti labai platų junginių spektrą [38]. Šis analizės metodas naudojamas mišinių junginiams atskirti, remiantis skirtingomis junginių sulaikymo trukmėmis, kai mobili fazė (eliuentas), kurioje būna ištirpęs tiriamasis medžiagų mišinys, pereina per nejudančią fazę (sorbentą) kolonėlėje. Mišinyje esančių biologiškai aktyvių junginių atskyrimas vyksta dėl skirtingos mišinio komponentų fizikinės – cheminės sąveikos su nejudria ir judria fazėmis [48]. Augalinių žaliavų ištraukų fenolinių junginių kiekybiniam nustatymui ESC metodu dažniausiai taikoma atvirkštinių fazių efektyvioji skysčių chromatografija, o fenolinių junginių detekcija atliekama naudojant UV – regimosios šviesos, masių spektrometrinius, diodų matricos detektorius [39]. ESC yra ekonomiškas ir greitas chromatografijos būdas, todėl naudojamas biochemijos, molekulinės biologijos, biotechnologijos, farmacijos laboratorijose. Šio analizės metodo geras efektyvumas, didelė skiriamoji geba, labai greitas atskyrimas [48]. Mokslininkai Zheng Z. ir kiti analizuodami karaganų genties augalų žaliavų fenolinių junginių kokybines ir kiekybines sudėtis taikė ESC metodą. Mokslininkai norėjo palyginti, ar fenolinių junginių detekcija atlikta taikant fluorescencinį detektorių yra veiksmingesnė lyginant su UV – regimosios šviesos detektoriumi. Pagal gautus rezultatus mokslininkai padarė išvadą, kad detekcija taikant UV – regimosios šviesos detektorių yra veiksmingesnė [73]. Chromatografija yra nuolat tobulinama, ieškoma būdų sistemos efektyvumui pagerinti. Mokslininkai teigia, jog veiksmingas būdas padidinti skysčių chromatografijos metodikos efektyvumą, greitį ir atskyrimo atrankumą yra sorbento dalelių mažinimas. ESC metode efektyvumas ir greitis priklauso nuo masių mainų tarp fazių proceso, todėl sumažinus sorbento daleles galima didinti eliuento tekėjimo greitį be ryškių efektyvumo nuostolių [69]. Dėl šios priežasties buvo sukurtas ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, kurį Gonzalez–Burgos ir kt. mokslininkai taikė atliekant augalinių žaliavų chromatografinę analizę [21]. Padaryta reikšminga pažanga prietaisų ir kolonėlių technologijoje, kad būtų galima reikšmingai padidinti skiriamąją gebą, greitį ir jautrumą skysčių chromatografijoje [69].

1.6. Spektrofotometrijos metodo taikymas fenolinių junginių analizei

Spektrofotometrija – kiekybinės analizės metodas, kurio esmė paremta medžiagos savybe praleisti arba atspindėti tam tikro ilgio šviesos bangas. Analizė atliekama naudojant prietaisą spektrofotometrą. Tyrimo metu leidžiamas tam tikros bangos šviesos spindulys per analizuojamos medžiagos tirpalu užpildytą kiuvetę ir matuojamas praeinančios šviesos intensyvumas. Analizės 20 pradžioje per spektrą yra praleidžiamas žinomos absorbcijos tirpalas. Šio metodo privalumas, kad tiriamoji medžiaga nesuardoma, tyrimas gali būti modifikuojamas, metodas yra tikslus, greitai atliekamas ir nereikalauja didelių kaštų [40,41]. Fenoliniams junginiams tirpaluose identifikuoti taikoma metodika naudojant Folin – Ciocalteu reagentą. Šią metodiką taikė mokslininkai Zheng Z. ir kiti atlikdami karaganų genties augalų bendro fenolinių junginių kiekio nustatymą [73]. Fenoliniai junginiai augalų ištraukose reaguoja su specifiniais redokso reagentais, susidaro mėlyni kompleksiniai junginiai, kurie kiekybiškai nustatomi matuojant šviesos absorbciją esant 760 nm bangos ilgiui [40]. Flavonoidai augalų ištraukose kiekybiškai identifikuojami atliekant reakciją su AlCl3 rūgščioje aplinkoje, išmatuojama spektrofotometriškai, esant 420 nm bangos ilgiui [40,41]. Fenoliniai junginiai identifikuojami pagal galo rūgšties ekvivalentą, o flavonoidai – pagal rutino ekvivalentą. Dažniausiai naudojamas kalibravimo kreivės metodas. Taikant spektrofotometrinę analizę galima nustatyti augalų žaliavos ėminių bendrą biologiškai aktyvių junginių kiekį ir žaliavos ištraukų antioksidantinį aktyvumą [41].

1.7. Antioksidantinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai

Oksidacinis stresas – būsena, kai organizme sutrinka pusiausvyra tarp aktyvių deguonies formų, vadinamų laisvaisiais radikalais, susidarymo ir pašalinimo. Šios būsenos atsiradimo priežastis yra sumažėjęs antioksidantų kiekis organizme. Oksidacinis stresas organizme lemia patologinės būklės išsivystymą, imuninės sistemos nusilpimą, senėjimo procesus. Padidėjęs reaktyvių deguonies ir azoto formų kiekis didina riziką susirgti širdies ir kraujagyslių ligomis, ateroskleroze, reumatoidiniu artritu, neurodegeneracinėmis ligomis, vėžiu, cukriniu diabetu, kvėpavimo sistemos ligomis ir kt. Oksidacinis stresas yra nesubalansuota būsena, kai per didelis laisvų radikalų kiekis įveikia endogeninį antioksidantų pajėgumą ir sukelia makromolekulių – DNR, fermentų, baltymų ir lipidų – oksidaciją [40,16]. Laisvieji radikalai yra atomai, molekulės arba jonai, turintys nesuporuotą elektroną. Laisvieji deguonies radikalai yra superoksido anijonas, hidroksilo, peroksilo, alkoksilo, hidroperoksilo, taip pat yra du azoto laisvieji radikalai - azoto dioksido ir azoto oksido. Žmogaus organizmas gamina laisvuosius radikalus vykstant audinių kvėpavimui, fermentinėm, autooksidacijos reakcijom ir kt. Taip pat išoriniai aplinkos veiksniai skatina laisvųjų radikalų susidarymą: ultravioletinė spinduliuotė skatina reaktyvių deguonies formų susidarymą odoje, aplinkos tarša skatina reaktyvių deguonies formų susidarymą kvėpavimo takuose [71].

Biologiškai aktyvių junginių antioksidantinis poveikis organizme gali pasireikšti skirtingais mechanizmais: fermentinių antioksidantų ir nefermentinių antioksidantų veikimu. Fermentiniai 21 antioksidantai yra superoksido dismutazė, katalazė, glutationo reduktazė ir glutationo peroksidazė. Nefermentiniai antioksidantai gali būti metaboliniai – melatoninas, glutationas, kofermentas Q10, bilirubinas, lipoidinė rūgštis, arba organizme negaminami, gaunami su maistu antioksidantai – vitaminai, flavonoidai, riebiosios rūgštys. Antioksidantai neutralizuoja laisvuosius radikalus dviem mechanizmais: prisijungią laisvą elektroną arba atiduoda vandenilio atomą [71].

Augalai yra natūralūs gamtoje randami antioksidantų šaltiniai. Fenoliniai junginiai veikdami kaip natūralūs antioksidantai suriša laisvuosius radikalus ir inhibuoja jų reakcijų produktus, geba stimuliuoti antioksidantinių fermentų sintezę, o tai apsaugo nuo oksidacinio streso sukeltos organizmo molekulinių struktūrų pažaidos. Norint išanalizuoti augalų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą, taikomos kelios skirtingos analitinės metodikos [60]. Elektronų perdavimu pagrįstos antioksidantinio aktyvumo tyrimo metodikos yra DPPH radikalų ir ABTS radikalų-katijonų surišimo nustatymas bei geležies (FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidantinės galios nustatymas. Antioksidantinis tyrimas dažniausiai atliekamas spektrofotometriškai, taikant regimosios šviesos absorbcijos pokyčio detekciją. Tai paprastas, patikimas ir tinkamas metodas grynų junginių antioksidantinėms savybėms įvertinti bei struktūros – aktyvumo ryšiui nustatyti. Antioksidantiniai junginiai tiriamuosiuose mėginiuose nustatomi, kai susidaro spalvoti produktai, reaguojant netiesioginiam antioksidantui su reagentu. Antioksidantinis aktyvumas nustatomas esant atitinkamam šviesos bangos ilgiui [40].

1.8. Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Moksliniuose straipsniuose aprašytos karaganų genties augalų lapų, žiedų, šaknų ir vaisių biologiškai aktyvių junginių sudėtys. Literatūroje yra duomenų apie mokslininkų taikytas metodikas analizuojant karaganų genties augalų žaliavas. Dažniausiai taikomas žaliavų ekstrakcijos metodas, norint gauti kokybišką ištrauką per trumpą laiką – ekstrakcija ultragarsu. Dažniausiai taikyti analizės metodai kiekybiniam ir kokybiniam žaliavos tyrimui – dujų ir skysčių chromatografija, spektrofotometrija taikyta kiekybiniam žaliavos tyrimui. Analizuojant mokslinius straipsnius, pastebėta, kad karaganų genties augalų žaliavose yra daug fenolinių junginių ir flavonoidų. Svarbiausia šių biologiškai aktyvių junginių savybė yra antioksidantinis poveikis.

Paprastųjų karaganų (Caragana arborescens Lam.), augančių skirtingose augavietėse Lietuvoje, lapų fitocheminė sudėtis nėra plačiai ištirta. Tai paskatino atlikti lapų ėminių ištraukų fenolinių junginių kokybinės, kiekybinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo analizę. 22

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo metu analizuojami natūralioje augavietėje augančių paprastųjų karaganų (Caragana arborescens Lam.) lapų ištraukų ėminiai. Tiriamųjų augalų lapai buvo renkami Jauneikių kaime Zarasų rajone 2020 metais nuo pavasario iki rudens (gegužės – rugsėjo mėnesiais) kas dvi savaites (2 lentelė). Išdžiovinta žaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose, sausoje ir gerai vėdinamoje patalpoje.

2 lentelė. Paprastųjų karaganų lapų rinkimo Jauneikių k. Zarasų raj. augalo vegetacijos periodu data Paprastųjų karaganų lapų Paprastųjų karaganų lapų rinkimas rinkimo data 1 2020 metų gegužės 4 2 2020 metų gegužės 28 3 2020 metų birželio 18 4 2020 metų liepos 2 5 2020 metų liepos 25 6 2020 metų rugpjūčio 10 7 2020 metų rugpjūčio 21 8 2020 metų rugsėjo 6

2.2. Naudoti reagentai

Tyrimo metu naudoti tirpikliai, reagentai ir standartai buvo analitinio švarumo ir atitiko visus jiems keliamus kokybės reikalavimus. Tyrimo metu naudota: etanolis 96 proc. (v/v) (gamintojas AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva), Folin – Ciocalteau reagentas („Sigma – Aldrich Chemie“, Vokietija), natrio karbonatas (Na2CO3) („Carl Roth Gmbh“, Vokietija), galo rūgšties monohidratas (C7H8O6) („Sigma – Aldrich Chemie“, Vokietija), heksametilentetraminas (C₆H₁₂N₄) („Sigma – Aldrich“,

Anglija), rutinas (C27H30O16) („Carl Roth GmbH“, Vokietija), aliuminio chlorido heksahidratas

(AlCl3×6H2O) („Fluka“, Vokietija), ledinė acto rūgštis 30 proc. (CH₃COOH), natrio molibdatas

(Na₂MoO₄,), natrio nitritas (NaNO2), natrio hidroksidas (NaOH) („Chempur“, Lenkija). Antioksidantinio aktyvumo nustatymui buvo naudojami: ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6- sulfoninė rūgštis), troloksas (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis), kalio persulfatas (K₂S₂O₈), geležies chlorido heksahidratas (FeCl3×6H2O), natrio acetato trihidratas 23

(CH3COONa×3H2O) („Sigma – Aldrich Chemie“, Vokietija), 2,4,6-tripiridil-striazinas (TPTZ) („Alfa Aesar“, Vokietija), koncentruota druskos rūgštis (HCl) („Fluka – Chemie“, Šveicarija), troloksas ((±)- 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) (,,Sigma – Aldrich“, JAV).

Chromatografinei analizei naudoti: 0,1 proc. skruzdžių rūgšties tirpalas (CH2O2) (Sigma – Aldrich, Vokietija), acetonitrilas (C₂H₃N) (Sigma – Aldrich, Vokietija). Chromatografijai naudoti junginių standartai: pinocembrinas, galanginas, kemferolis, izoramnetinas, kemferol-3-O-gliukozidas, hiperozidas. Išgrynintas vanduo paruoštas naudojant „Milli – Q“ („Millipore“, Bedforfas, JAV) vandens gryninimo sistemą.

2.3. Naudota aparatūra

 Elektrinis malūnėlis „Retsch GM 200“ (Hanas, Vokietija) – naudotas paprastųjų karaganų lapų smulkinimui;  Analitinės svarstyklės „Sartorius CP64 – 0CE“ (Getingenas, Vokietija) – naudotos smulkintos augalinės žaliavos ir cheminių reagentų svėrimui;  Ultragarso vonelė „Bandelin Sonorex Digital 10 P“ (Darmštatas, Vokietija) – naudota karaganų lapų etanolinėms ištraukoms gaminti;  Vakuuminis siurblys „2511 Dry Vacuum Pump/Compressor“ („Welch“, Skokie, JAV) – naudotas pagamintų etanolinių mėginių filtravimui;  Vandens gryninimo sistema „Milli – Q“ („Millipore“, Bedforfas, JAV) – naudota išgryninto vandens gamybai;  UV regimosios šviesos spektrofotometras „M550“ („Spectronic Camspec“, Garfortas, Jungtinė Karalystė) – naudotas tiriamųjų mėginių absorbcijos dydžiui nustatyti;  ESC chromatografas „Waters 2695 Alliance“ chromatografine sistema („Waters“, Milfordas, JAV), naudojant diodų matricos detektorių „Waters 2998“.

2.4. Paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų paruošimas

Žaliavos paruošimas. Tiriamoji žaliava elektriniu malūnėliu susmulkinama iki smulkių miltelių ir laikoma popieriniuose maišeliuose tamsioje, sausoje vietoje. Nuodžiūvio nustatymas. Nuodžiūvis – vienas iš žaliavos kokybę apibūdinančių parametrų. Žaliavos nuodžiūvis apibūdinamas masės sumažėjimu, kai iš augalinės žaliavos yra pašalinamas vanduo 24 ir lakieji junginiai. Nuodžiūviui nustatyti tiksliai sveriamas 1,0 g žaliavos ir džiovinama 2 val 105 °C temperatūroje iki pastovios masės džiovinimo spintoje. Procedūra kartojama tris kartus kiekvienam mėginiui ir išvedamas vidurkis. Žaliavos nuodžiūvio tyrimas atliekamas pagal Europos farmakopėjoje Ph.Eur.01/2008:20232 nurodytą metodą [70]. Etanolinių ištraukų paruošimas. Gaminant ištraukas, kiekvieno lapų ėminio atsveriamas 2 g (tikslus svėrinys) susmulkintos žaliavos, kuri užpilama tamsaus stiklo buteliukuose su 15 ml 40 proc. v/v etanoliu. Buteliukai sandariai užsukami ir patalpinami į ultragarso vonelę, kurioje 20 min. ekstrahuojami ultragarsu veikiant 1130 W galiai ir 80 kHz dažniui. Ištraukos atvėsinamos ir filtruojamos naudojant vakuuminį filtrą. Po filtracijos, tikslinamas ištraukų tūris su 40 proc. v/v etanoliu iki žymės 25 ml matavimo kolbutėje. Gautos ištraukos perpilamos į tamsaus stiklo buteliukus ir iki analizės laikomos kambario temperatūroje. Prieš atliekant chromatografinę analizę etanolinės ištraukos papildomai filtruojamos per 0,22 μm porų dydžio membraninius filtrus.

2.5. Tyrimo metodai

2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin – Ciocalteu metodika

Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas UV regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu, naudojant darbinį Folin – Ciocalteu reagentą. Darbinio tirpalo ruošimas. Darbinis Folin – Ciocalteu reagentas ruošiamas 10 kartų praskiedžiant motininį tirpalą distiliuotu vandeniu. 5 ml motininio Folin – Ciocalteu reagento praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės 50 ml matavimo kolboje. 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo paruošimas: 7,5 g natrio karbonato miltelių tirpinama distiliuotame vandenyje 100 ml matavimo kolboje. Mėginio ruošimas. 0,2 ml ištraukos praskiedžiama 4 ml 40 proc. etanoliu ir pridedama 5 ml 10 proc. Folin – Ciocalteu reagento bei 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Lyginamojo tirpalo ruošimas. Imama 0,2 ml 40 proc. etanolio, pilama 5 ml 10 proc. Folin – Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Visi paruošti mėginiai buvo laikomi tamsioje vietoje apie 1val. Po to atliekama analizė spektrofotometru, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, matuojama 10 mm tirpalo sluoksnio absorbcija. Kiekvienas ištraukos mėginys matuojamas po 3 kartus ir apskaičiuojamas vidurkis. Kalibracinis grafikas (y=0,3956x + 0,0825; R2 = 0,9958) sudaromas naudojant 0,1; 0;25; 0,5; 0,75; 1,0 mg/ml koncentracijos etaloninius galo rūgšties tirpalus. Bendras fenolinių junginių kiekis yra išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) vienam gramui sausos žaliavos (mg/g). 25

Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas pagal formulę: 푥 × 푉 퐶 = (푚푔 퐺푅퐸/푔) 푚 C – bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g); x – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką (mg/ml); V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris (ml); m – sausos žaliavos masė (g).

2.5.2. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas

Hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustatomas UV regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu, taikant metodiką su Arnow reagentu. Atliekant hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio analizę, pirmiausia pasigaminamas Arnow reagentas. Pasveriama 10,0 g natrio molibdato, kuris tirpinamas nedideliame kiekyje išgryninto vandens. Pasveriama 10,0 g natrio nitrito, kuris pridedamas į tirpalą. Tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolbutėje, kurioje tirpalas praskiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki žymės. Mėginio ruošimas. Mėginys gaminamas 10 ml matavimo kolbutėje. Į kolbutę pilamas 1 ml tiriamosios ištraukos, pridedama 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 2 ml Arnow reagento ir 2 ml 8,5 proc. natrio hidroksido. Turinys kolbutėje praskiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki brūkšnio. Lyginamojo tirpalo paruošimas. Į 10 ml matavimo kolbutę įpilama 1 ml tiriamos ištraukos, 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 2 ml natrio šarmo hidroksido ir praskiedžiama išgrynintuoju vandeniu iki brūkšnio. Spektrofotometru, esant 525 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis. Kalibravimo grafikas (푦 = 1,8694x + 0,1263; R2 = 0,9963) sudarytas, naudojant 0,03125; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5 mg/ml koncentracijos etaloninius chlorogeno rūgšties tirpalus. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis apskaičiuotas pagal formulę: 푥×푉 퐶 = (mg CRE/g) 푚 C – bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis (mg/g); X – chlorogeno rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką (mg/ml); V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris (ml); m – absoliučiai sausos žaliavos masė (g).

2.5.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas

Paprastųjų karaganų lapų ištraukose buvo spektrofotometriškai, taikant flavonoidų reakcijos su aliuminio chloridu metodiką, nustatomas bendras flavonoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu. Mėginio ruošimas: į 10 ml kolbutę pilama 0,4 ml tiriamosios ištraukos, 4 ml 96 proc. (v/v) etanolio, 0,2 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,6 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Gautas mišinys laikomas kambario temperatūroje, tamsioje vietoje 30 min. Tada įpilama 0,8 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo ir kolbutės turinys praskiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki žymės. Lyginamojo tirpalo ruošimas: į 10 ml matavimo kolbutę įpilama 4 ml 96 proc. (v/v) etanolio, pridedama 0,2 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,4 ml ištraukos ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. Mėginių analizė atliekama spektrofotometru, esant 407 nm šviesos bangos ilgiui, matuojamas 10 mm tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis. Suminis flavonoidų kiekis, esantis žaliavos lapų ištraukoje, išreiškiamas rutino ekvivalentu ir apskaičiuojamas pagal formulę: 푉 푣푎ž × 푚푅 × 퐷 푣푎ž 푋 = 푚푔 푅퐸/푔 푚 푣푎ž × 퐷 푅 × 푉 푟푢푡 m(R) – rutino masė, kuri buvo reikalinga rutino tirpalui paruošti (g); V(važ) – visas paruoštas vaistinės augalinės žaliavos ištraukos tūris (ml); D(važ) – paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; m(važ) – vaistinės augalinės žaliavos masė sunaudota ištraukai ruošti (g); V(rut) – pagaminto rutino tirpalo tūris (ml); D(R) – tiriamojo rutino tirpalo absorbcijos dydis.

2.5.4. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas

2.5.4.1. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS laisvųjų radikalų surišimo metodika

Pradinio tirpalo paruošimas. Į tamsaus stiklo buteliuką suberiama 0,548 g atsvertų ABTS miltelių ir jie ištirpinami 50 ml išgryninto vandens. Į gautą tirpalą įdedama 0,0095 g kalio persulfato. Indas užkemšamas, jame esantis tirpalas gerai sumaišomas ir paliekamas tamsoje 16 valandų. ABTS tirpalas laikomas tamsoje 16 val., kol vyksta oksidacijos − redukcijos reakcija, kurios metu susidaro 27 radikalas – katijonas ABTS•+. Susidaręs katijonas išlieka aktyvus dvi paras ir turi būti laikomas tamsioje vietoje, tamsaus stiklo inde. Darbinio tirpalo paruošimas. Po 16 valandų pirminis ABTS tirpalas skiedžiamas distiliuotu vandeniu tol, kol nustatoma 0,8±0,03 absorbcijos reikšmė, esant 734 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas yra naudojamas išgrynintas vanduo. Į mėgintuvėlį analizei imama 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir įpilama 20 µl tiriamos ištraukos, gerai sumaišoma ir laikoma tamsoje valandą. Po to spektrofotometru išmatuojama 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis esant 734 nm bangos ilgiui. Antiradikalinis aktyvumas yra išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos, remiantis trolokso kalibracinės kreivės ( y= -0,0792x + 0,7391; R2 = 0,9989) tiesinės regresijos lygtimi. Kalibravimo grafikas sudarytas, naudojant 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 µmol/ml koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus. Antioksidantinis aktyvumas absoliučiai sausai paprastųjų karaganų lapų žaliavai apskaičiuojamas pagal formulę: 푥 × 푉 퐶 = (µ푚표푙 푇퐸/푔) 푚

C – antiradikalinis aktyvumas (µmol/g); X – trolokso koncentracija, nustatyta iš kalibracinės kreivės (µmol/ml); V – pagamintos ištraukos tūris (ml); m – sausos žaliavos masė (g)

2.5.4.2. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas FRAP redukcinio aktyvumo metodika

FRAP – (geležies antioksidantinė redukcijos galia) taikant šią metodiką, įvertinamas antioksidantų gebėjimas redukuotis iš juodos spalvos geležies 2,4,6-tripyridyl-s-triazino (Fe(III)-TPTZ) komplekso į intensyviai mėlynos spalvos (Fe(II)-TPTZ) kompleksą. Atliekant tyrimą pagal FRAP metodiką antioksidantinio aktyvumo nustatymui, pirmiausia turi būti pasigaminamas darbinis FRAP reagentas. Darbinio FRAP reagento paruošimas. Tirpalas gaminamas santykiu 10:1:1 iš natrio acetato buferinio tirpalo, TPTZ tirpalo vandenilio chlorido rūgštyje ir geležies chlorido heksahidrato. Tirpalų gamyba: 1. Natrio acetato buferiniam tirpalui pagaminti atsveriama 3,1 g natrio acetato trihidrato miltelių, suberiama į 1 l matavimo kolbą, užpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiama išgrynintuoju vandeniu iki žymės. 2. TPTZ tirpalui pagaminti, į 100 ml kolbutę įpilama 0,34 ml 28 koncentruotos druskos rūgšties ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. Gautame tirpale tirpinami 0,31 g TPTZ miltelių. 3. Geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalui pagaminti, 0,54 g geležies (III) chlorido heksahidrato ištirpinama išgrynintame vandenyje 100 ml kolbutėje. Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į 20 µl ištraukos įpilama 3 ml darbinio FRAP tirpalo. Paruošti bandiniai laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 30 min. Spektrofotometru išmatuojama 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis esant 593 nm bangos ilgiui. Lyginamasis tirpalas – darbinis FRAP tirpalas. Antioksidantinis aktyvumas yra išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos, remiantis trolokso kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtimi (y = 0,1149x + 0,1374; R2= 0,9986). Kalibravimo grafikas sudarytas, naudojant 400; 800; 1200; 1600; 2000; 2400 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus. Redukcinis aktyvumas absoliučiai sausai paprastųjų karaganų lapų žaliavai apskaičiuojamas pagal formulę: 푥 × 푉 × 푎 퐶 = µ푚표푙 푇퐸/푔 푚

C – antiradikalinis aktyvumas (µmol TE /g); X - trolokso koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (µmol/l); V - pagamintos ištraukos tūris (l); a – kiek kartų praskiesta ištrauka; m – tikslus atvertas žaliavos kiekis (g).

2.5.5. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė atlikta taikant atvirkščių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodą „Waters 2695 Alliance“ su chromatografine sistema („Waters“, JAV), naudojant diodų matricos detektorių „Waters 2998“. Chromatografinio skirstymo valdymas, chromatogramų registravimas, duomenų kaupimas ir apdorojimas atliktas naudojantis „Empower® 2 Chromatography Data Software” („Waters“, JAV) programine įranga. Junginiams skirstyti naudota kolonėlė „YMC – Pack ODS – A“ (250×4,6 mm, C18, dalelių dydis 5 µm) su prieškolone „YMC – Triart“ (10×3,0, C18, dalelių dydis 5 µm) („YMC Europe GmbH“, Vokietija). Kolonėlė termostatuota 25°C temperatūroje. Judri fazė sudaryta iš 2 proc. (v/v) acto rūgšties tirpalo vandenyje (eliuentas A) ir 29

100 proc. (v/v) acetonitrilo (eliuentas B). Gradiento kitimas: 0 – 30 min. 3 – 15 proc. B, 30 – 45 min. 15 – 25proc. B, 45 – 50 min. 25 – 50 proc. B, 50 – 55 min. 50 – 95 proc. B. Judrios fazės tėkmės greitis – 1 ml/min., injekcijos tūris – 10 µl. Chromatografinės smailės nustatytos pagal analičių ir standartinių junginių sulaikymo trukmių bei UV absorbcijos spektro 200 – 400 nm šviesos bangos ilgio ribose sutapimus. Ištraukose identifikuotų flavanoidų kiekiai apskaičiuoti bangos ilgiui esant 360 nm [72].

2.5.6. Tyrimo metu gautų duomenų statistinis vertinimas

Duomenų analizė atlikta „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) ir „SPSS Statistics 21“ („IBM“, JAV) kompiuterinėmis programomis. Visi tyrimai kartoti tris kartus, gauti duomenys apskaičiuoti pagal formules, suvesti į duomenų bazes, statistiškai įvertinti, apskaičiavus eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį ± standartinį nuokrypį. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp vienoje augavietėje kas 14 dienų rinktų paprastųjų karaganų lapų nustatyti atlikus vienfaktorinę dispersinę analizę (ANOVA), taikant daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijų. Nustatytas Pirsono koreliacijos koeficientas, siekiant įvertinti identifikuotų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo koreliaciją. Koreliacijos koeficientų ryšiai įvertinti pagal stiprumą: kai r reikšmė 0,2 – 0,5, koreliacijos ryšys silpnas, kai 0,5 – 0,7 vidutinis, 0,7 – 0,9 stiprus, o kai 0,9 – 1 labai stiprus. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jeigu p<0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Paprastųjų karaganų (Caragana arborescens Lam.) lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymas

Biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija yra labai svarbus etapas, siekiant kuo efektyviau išgauti norimus junginius iš augalinės žaliavos. Tyrimo metu, siekiant gauti kuo didesnę fenolinių junginių išgavą iš augalinės žaliavos, buvo atliktas ekstrakcijos sąlygų parinkimas. Ekstrakcijos sąlygos nustatytos atsižvelgiant į etanolio koncentraciją, ekstrakcijos trukmę ir ultragarso vonelės galią. Siekiant iš vaistinės augalinės žaliavos išgauti biologiškai aktyvias medžiagas, labai svarbu pasirinkti tinkamą ekstrahentą. Ekstrakcijai tinkamas ekstrahentas turi būti: farmakologiškai indiferentiškas, nedegus, bekvapis, lengvai išgarinamas, pigus. Maišant etanolį su vandeniu, galima keisti dielektrinę konstantą, todėl tokiais mišiniais galima išekstrahuoti daug įvairių biologiškai aktyvių medžiagų [52]. Dėl šių priežasčių paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukoms gaminti ir buvo pasirinktas ekstrahentas etanolis.

30 a 25 a,b a,b

20 b b

15 GRE/g GRE/g 10 c c 5

0 Bendras fenolinių junginių kiekis mg 20 ⁒ 30 ⁒ 40 ⁒ 50 ⁒ 60 ⁒ 70 ⁒ 80 ⁒ Etanolio koncentracija (v/v) ⁒

1 pav. Etanolio koncentracijos įtaka paprastųjų karaganų lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai. Raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) bendro fenolinių junginių kiekio skirtumus, ekstrahuojant žaliavą skirtingos koncentracijos etanoliu

Pirmajame ekstrakcijos sąlygų nustatymo etape buvo atliktas etanolio koncentracijos parinkimas. Dažniausiai ekstrakcijai naudojamos etanolio koncentracijos yra 40 – 70 proc. (v/v), tačiau paprastųjų karaganų lapų ėminiams ekstrahuoti buvo pasirinkti 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80 proc. (v/v) koncentracijos etanolio tirpalai. Ultragarso vonelės galia − 1130 W, dažnis − 80 kHz, ekstrakcijos trukmė − 20 min. Tyrimo metu didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (24,90±0,0,59 mg GRE/g, 31 p<0,05) paprastųjų karaganų lapų ėminiuose nustatytas naudojant 40 proc. (v/v) etanolį. Bendras fenolinių junginių kiekis su 50 proc. (v/v) ir 60 proc. (v/v) etanoliu gautas statistiškai reikšmingai mažesnis lyginant su 40 proc. (v/v) etanoliu. Dėl šios priežasties paprastųjų karaganų lapų ištraukų analizės metu buvo naudojamas 40 proc. (v/v) etanolis (1 pav.). Kitame ekstrakcijos sąlygų parinkimo etape buvo nustatyta ekstrakcijos trukmė. Trumpa ekstrahavimo proceso trukmė nulemia didelį kiekį farmakologiškai aktyvių junginių ir mažą kiekį balastinių medžiagų [53]. Tyrimo metu buvo ekstrahuojama skirtingomis trukmėmis (5 min; 10 min; 15 min; 20 min; 25 min; 30 min; 35 min; 40 min; 45 min; 50 min; 55 min; 60 min.), siekiant nustatyti tinkamiausią. Ekstrakcija buvo atliekama naudojant 40 proc. (v/v) etanolį, esant ultragarso vonelės 1130 W galiai ir 80 kH dažniui. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (29,50±0,31 mg GRE/g, p<0,05) nustatytas ekstrahuojant paprastųjų karaganų lapų ėminius 20 min. Statistiškai reikšmingai bendras fenolinių junginių kiekis nepakito ekstrahuojant 20 min., 25 min. ir 30 min. Ilgėjant ekstrakcijos trukmei, nustatyta, jog bendras fenolinių junginių kiekis statistiškai reikšmingai sumažėjo (2 pav.), todėl tolesniems tyrimams buvo pasirinkta 20 min. ekstrakcijos trukmė.

35 a a a 30 b b,c b 25 c c c c,d 20 c,d d 15 10

5 BENDRAS FENOLINIŲ 0

JUNGINIŲ JUNGINIŲ KIEKIS, MGGRE/G 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 EKSTRAKCIJOS LAIKAS, MIN

2 pav. Ekstrakcijos trukmės įtaka paprastųjų karaganų lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai. Raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių, ekstrahuojant žaliavą skirtingais laiko intervalais

Ekstrakcijos sąlygų parinkimo metu buvo nustatoma tinkamiausia ultragarso vonelės galia. Ekstrakcija ultragarsu dar kitaip vadinama sonifikacija, ji yra paremta ekstrahentu sklindančių ultragarso bangų sukeliamu kavitacijos reiškiniu. Ekstrakcija ultragarsu yra laikoma viena paprasčiausių ekstrakcijos metodų, nes yra lengvai atliekama su laboratorijoje esančia įranga – ultragarsine vonele. Ekstrahuojant ultragarsu, sumažinamas reikalingas tirpiklio kiekis ir sutrumpinamas ekstrakcijos laikas [54]. 32

40 a a 35 b 30 c 25 20

15 mg mg GRE/g 10 5 0 Bendras fenolinių junginių kiekis, 791 904 1017 1130 Ultragarso vonelės galia, W

3 pav. Ultragarso vonelės galios įtaka paprastųjų karaganų lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai. Raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių, ekstrahuojant žaliavas skirtingos galios ultragarsu

Tyrimo metu atlikta paprastųjų karaganų lapų ėminių ekstrakcija, esant skirtingai ultragarso vonelės galiai (791 W; 904 W; 1017 W; 1130 W). Ekstrakcijos trukmė 20 min., ultragarso vonelės dažnis 80 kHz, tiriamos ištraukos pagamintos su 40 proc. (v/v) etanolio koncentracija. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (33,2±0,18 mg GRE/g, p<0,05) paprastųjų karaganų lapų ėminiuose nustatytas, kai ultragarso galia 1130 W (3 pav.).

Atlikus paprastųjų karaganų lapų ėminių ekstrakcijos sąlygų parinkimą ir įvertinus gautus rezultatus, augalo žaliava buvo ekstrahuojama naudojant 40 proc. (v/v) etanolį, ekstrakcija buvo vykdoma 20 min. ultragarso vonelėje, kai jos galia 1130 W, dažnis 80 kHz. Šios ekstrakcijos sąlygos buvo taikytos tolimesniuose tyrimuose.

3.2. Paprastųjų karaganų lapų ėminių fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendras fenolinių junginių kiekis augalo žaliavoje gali varijuoti dėl įvairių priežasčių: klimato sąlygų pokyčiai, augalo vegetacijos periodas, augavietės vieta, ar augalas yra natūraliai augantis ar kultivuojamas. Atlikta fenolinių junginių UV regimosios šviesos spektrofotometrinė analizė, taikant metodiką su Folin – Ciocalteu reagentu, paprastųjų karaganų lapų etanolinėje ištraukoje, norint įvertinti fenolinių junginių įvairavimą žaliavoje surinktoje skirtingu vegetacijos periodu vienoje augavietėje (2 lentelė). Atlikus UV regimosios šviesos spektrofotometrinius tyrimus, nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis žaliavoje yra augalo vegetacijos periodo pradžioje. Bendras fenolinių junginių 33 kiekis žaliavos ištraukoje varijuoja nuo 15,65±0,67 mg GRE/g, p<0,05 iki 23,22±0,59 mg GRE/g, p<0,05 (4pav.).

30 a a 25 a a a 20 a a a 15

10 GRE/g 5

0 Fenolinių junginių kiekis Fenolinių junginių kiekis mg

Rinkimo data

4 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas paprastųjų karaganų lapų, surinktų 2020 m. Jauneikių k. Zarasų raj., ėminių ištraukose (mg GRE/g). Raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Gegužės 28 d. nustatytas didžiausias kiekis fenolinių junginių paprastųjų karaganų lapų ištraukoje – 23,22±0,59 mg GRE/g, p<0,05. Liepos mėnesį žaliavos ištraukoje bendras fenolinių junginių kiekis sumažėjo iki 15,65±0,67 mg GRE/g, p<0,05, tačiau statistiškai reikšmingai nepakito. Vidutiniškai paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose fenolinių junginių nustatyta 18,35±2,38 mg GRE/g, p<0,05. Bendro fenolinių junginių kiekio kitimas vegetacijos periodu pateiktas 4 paveikslėlyje.

3.3. Paprastųjų karaganų lapų ėminių hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas

Fenolinės rūgštys yra aromatiniai antriniai augalų metabolitai, jos skirstomos į dvi grupes: hidroksibenzo rūgšties darinius, kurių pirmtakas – benzo rūgštis, ir hidroksicinamono rūgšties darinius, kurių pirmtakas – cinamono rūgštis. Hidroksicinamono rūgštys, dar vadinamos fenilpropanoidais, augalų žaliavoje retai randamos laisvos, dažniausiai jos būna esterių, glikozidų ar amidų pavidalu. Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad fenolinės rūgštys pasižymi priešbakteriniu, priešgrybeliniu, priešvirusiniu ir priešvėžiniu aktyvumu. Svarbiausias fenolinių rūgščių biologinis aktyvumas yra antioksidantinis ir antiradikalinis fenolinių rūgščių veikimas dėl gebėjimo atiduoti elektroną ar vandenilio atomą [72,74]. Platus fenolinių rūgščių biologinis aktyvumas didina mokslininkų susidomėjimą ir skatina vystyti junginių analizės metodikas. 34

Atliekant hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymą paprastųjų karaganų lapų ėminiuose, buvo naudojama žaliava, surinkta 2020 metais Jauneikių kaime Zarasų rajone vienoje augavietėje augalo vegetacijos periodu (2 lentelė). Taikant UV regimosios šviesos spektrofotometrijos analizės metodą, atliktas bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekinės sudėties kitimo vegetacijos metu tyrimas. Vertinant gautus rezultatus, galima teigti, kad hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis paprastųjų karaganų lapų ėminiuose įvairuoja nuo 0,44±0,16 mg CRE/g, p<0,05 iki 1,48±0,09 mg CRE/g, p<0,05 (5 pav.).

1.8 a 1.6 1.4 1.2 b b,c 1 b,c b,c 0.8 c,d c,d 0.6 d 0.4 0.2

darinių kiekis darinių kiekis mg CRE/g Bendras hidroksicinamono Bendras hidroksicinamono rūgšties

Rinkimo data

5 pav. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas paprastųjų karaganų lapų, surinktų 2020 m. Jauneikių k. Zarasų raj., ėminių ištraukose(mg CRE/g). Raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Didžiausias hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis paprastųjų karaganų lapų ėminiuose nustatytas augalo vegetacijos periodo pradžioje. 2020 m. gegužės 4 d. nustatytas didžiausias hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis – 1,48±0,09 mg CRE/g, p<0,05. Šiek tiek mažesnis hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis žaliavoje nustatytas birželio mėnesį – 0,93±0,03 mg CRE/g, p<0,05. Mažiausiai hidroksicinamono rūgšties darinių žaliavoje nustatyta liepos 0,44±0,16 mg CRE/g, p<0,05 ir rugpjūčio 0,62±0,07 mg CRE/g, p<0,05 mėnesiais. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis augalo vegetacijos periodu statistiškai reikšmingai kito. Vidutiniškai paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose hidroksicinamono rūgšties darinių nustatyta 0,79±0,06 mg CRE/g, p<0,05. Hidroksicinamono rūgšties kiekio kitimas vegetacijos periodu pateiktas 5 paveikslėlyje.

3.4. Paprastųjų karaganų lapų ėminių bendro flavonoidų kiekio nustatymas

Flavonoidų biologinis aktyvumas yra reikšmingas oksidacinio streso sukeltų ligų (vėžio, širdies ir kraujagyslių sistemos ligų, neurodegeneracinių ir kt.) prevencijai. Mokslininkai nustatė, kad flavonoidai pasižymi antioksidantiniu, uždegimą mažinančiu, priešvėžiniu, priešvirusiniu ir priešbakteriniu poveikiu [3]. Dėl plataus flavonoidų biologinio aktyvumo ir teigiamų terapinių savybių, didėja mokslininkų susidomėjimas kiekybiniais ir kokybiniais augalų žaliavų analizės metodais. Bendras flavonoidų kiekis paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose nustatytas UV regimosios šviesos spektrofotometrijos analizės metodu, taikant flavonoidų reakcijos su aliuminio chloridu metodiką. Vertinant diagramoje pateiktus duomenis, matoma, kad augalo vegetacijos periodo laikotarpiu bendras flavonoidų kiekis lapuose kinta nuo 1,31±0,25 mg RE/g, p<0,05 iki 2,43±0,14 mg RE/g, p<0,05. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas gegužės 4 d., kuris buvo 2,43±0,14 mg RE/g, p<0,05. Mažiausias bendras flavonoidų kiekis lapuose nustatytas augalo vegetacijos pabaigoje – rugpjūčio 21 d., kuris buvo 1,31±0,25 mg RE/g, p<0,05. Vidutiniškai paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose bendras flavonoidų kiekis nustatytas 1,79±0,16 mg RE/g, p<0,05. Pagal atliktą tyrimą ir gautus rezultatus, galima daryti išvadą, jog didžiausias bendras flavonoidų kiekis augalo lapuose nustatytas augalo vegetacijos periodo pradžioje ir iki augalo vegetacijos periodo pabaigos statistiškai reikšmingai mažėja. Flavonoidų kiekio kitimas vegetacijos periodu pateiktas 6 paveikslėlyje.

3 a a,b,c a,b 2.5 b,c,d 2 d,c b,c,d d d 1.5

1 RE/g 0.5

0 Bendras flavonoidų kiekis flavonoidų Bendras kiekis mg

Rinkimo data

6 pav. Bendras flavonoidų kiekio įvairavimas paprastųjų karaganų lapų, surinktų 2020 m. Jauneikių k. Zarasų raj., ėminių ištraukose (mg RE/g). Raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Rusijos mokslininkų atliktame tyrime, kurio tikslas nustatyti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį karaganų genties augaluose, nustatyta, kad paprastųjų karaganų žaliavoje yra didžiausi fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai. Paprastųjų karaganų lapų ištraukoje bendras fenolinių junginių 36 kiekis 112,78 mg/g, bendras flavonoidų kiekis 107,78 mg/g [67]. Lyginant mano atlikto tyrimo rezultatus su mokslininkų gautais rezultatais, bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio rezultatai mažesni mano atliktame tyrime. Rezultatai galėjo skirtis dėl skirtingų ištraukų paruošimo būdų ar skirtingų tyrimo sąlygų.

3.5. Paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų antioksidantinio aktyvumo in vitro nustatymas

Tiriamojo mėginio antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo in vitro nustatymui yra taikomos kelios skirtingos metodikos. Augalo sudėtyje yra daug biologiškai aktyvių junginių, kurie skiriasi struktūra, chemine sudėtimi, farmakologiniu poveikiu. Tuo tarpu, antioksidantinis aktyvumas pasireiškia skirtingais reakcijų mechanizmais, dėl šios priežasties, norint kuo tiksliau įvertinti augalinių ištraukų antioksidantinį aktyvumą, reikia taikyti keletą skirtingų metodikų [60]. Antioksidantinis aktyvumas in vitro nustatytas UV regimosios šviesos spektrofotometrijos analizės metodu. Analizės metu buvo tiriamos ištraukos, pagamintos iš paprastųjų karaganų lapų žaliavos, surinktos 2020 m. Jauneikių kaime Zarasų rajone vienoje augavietėje augalo vegetacijos periodu. Paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų ABTS antiradikalinis aktyvumas in vitro. Tyrimas atliktas UV regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu, taikant ABTS metodiką. Vertinant duomenis, galima teigti, jog tiriamojo augalo lapų ėminių ištraukose ABTS antiradikalinis aktyvumas įvairuoja nuo 51,06±32,44 µmol TE/g, <0,05 iki 66,78±28,35 µmol TE/g, <0,05 (7 pav.).

80 a a 70 a a a a a a 60 50 40 30 20 TE/g 10

0 Antiradikalinis Antiradikalinis aktyvumas µmol

Rinkimo data

7 pav. Antiradikalinis ABTS aktyvumas in vitro paprastųjų karaganų lapų, surinktų 2020 m. Jauneikių k. Zarasų raj., ėminių ištraukose (µmol TE/g). Raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Stipriausias antiradikalinis aktyvumas in vitro augalo lapų ištraukose nustatytas liepos 2 d. 66,78±28,35 µmol TE/g, p<0,05. Augalo vegetacijos periodo pradžioje, gegužės 4 d. nustatytas silpniausias antiradikalinis aktyvumas in vitro – 51,06±32,44 µmol TE/g, p<0,05. Mažas ABTS antiradikalinis aktyvumas nustatytas rugsėjo 6 d. – 56,41±21,09 µmol TE/g, p<0,05. Vidutiniškai paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose antiradikalinis aktyvumas in vitro nustatytas 57,55±25,84 µmol TE/g, p<0,05. Antiradikalinio aktyvumo kitimas vegetacijos periodu pateiktas 7 paveikslėlyje. Pasiremdama 7 paveikslėlio diagramoje pateiktais antiradikalinio aktyvumo tyrimo rezultatais, galiu teigti, kad paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose ABTS antiradikalinis aktyvumas stipriausias žaliavoje, surinktoje augalo žydėjimo fazėje, tačiau augalo vegetacijos periodu antiradikalinis aktyvumas statistiškai reikšmingai nepakito. Paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų FRAP redukcinis aktyvumas in vitro. Taikant spektrofotometrijos analizės metodą, nustatytas redukcinis FRAP aktyvumas in vitro paprastųjų karaganų lapų ištraukose. Redukcinis FRAP aktyvumas žaliavos ėminiuose įvairuoja nuo 57,35±4,44 µmol TE/g, p<0,05 iki 95,65±7,86 µmol TE/g, p<0,05. Stipriausias redukcinis FRAP aktyvumas in vitro nustatytas liepos 2 d. – 95,65±7,86 µmol TE/g, p<0,05. Statistiškai mažesnis FRAP redukcinis aktyvumas in vitro nustatytas rugpjūčio mėnesį 74,33±5,37 µmol TE/g, p<0,05, o mažiausias aktyvumas 57,35±4,44 µmol TE/g, p<0,05 nustatytas rugsėjo 6 d. Vidutiniškai paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose redukcinis aktyvumas in vitro yra 79,66±5,08 µmol TE/g, p<0,05. Pasiremdama 8 paveikslėlio diagramoje pateiktais redukcinio aktyvumo kitimo tyrimo rezultatais, galiu teigti, kad paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose vegetacijos periodu FRAP redukcinis aktyvumas statistiškai reikšmingai kito.

120 a,b a a,b 100 a,b a,b b,c 80 c c 60 40 20

0 Redukcinis Redukcinis aktyvumas µmol TE/g

Rinkimo data

8 pav. Redukcinis FRAP aktyvumas in vitro paprastųjų karaganų lapų, surinktų 2020 m. Jauneikių k. Zarasų raj., ėminių ištraukose (µmol TE/g). Raidės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių 38

Atlikus paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų sudėties ir antioksidantinio aktyvumo in vitro tyrimus, taikant UV regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą, galima teigti, kad vienoje augavietėje skirtingais vegetacijos periodais augančio augalo žaliavoje fenolinių junginių kiekinė sudėtis ir antioksidantinis aktyvumas įvairuoja. Šį įvairavimą galėjo nulemti kintančios oro sąlygos, sezoniškumas, kintantis augalo vegetacijos periodas. Vertinant tyrimo rezultatus, galima teigti, kad paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukos stipriausiu tiek antiradikaliniu tiek redukciniu aktyvumu pasižymi liepos mėnesį. Mokslininkų stebėjimais nustatyta, kad būtent šiuo laikotarpiu vyksta paprastųjų karaganų žydėjimas [3]. Tad galima daryti prielaidą, kad žydėjimo periodu paprastųjų karaganų lapuose yra didžiausias antioksidantų kiekis.

3.6. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas ESC metodu paprastųjų karaganų lapų ėminiuose

Fenolinių junginių tyrimai yra svarbūs, norint nustatyti augalinių žaliavų cheminę sudėtį, jos įvairavimą skirtinguose augalo organuose ir siekiant užtikrinti augalinės žaliavos kokybės parametrus. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) – vienas iš plačiausiai šiuolaikinėje analizėje taikomų metodų, naudojamas kokybiniam ir kiekybiniam junginių nustatymui [37]. Vienas iš pagrindinių efektyviosios skysčių chromatografijos metodo privalumų – galimybė naudojant tą pačią įrangą nustatyti labai platų junginių spektrą [38]. ESC yra ekonomiškas ir greitas chromatografijos būdas, metodo geras efektyvumas, didelė skiriamoji geba, labai greitas atskyrimas [48]. Mokslinėje literatūroje yra nepakankamai duomenų apie paprastųjų karaganų lapų ištraukų kokybinę ir kiekybinę sudėtį, todėl atliekami tyrimai yra aktualūs. Taikant atvirkščių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodą buvo atlikta paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų analizė, įvertinta kokybinė ir kiekybinė sudėtis.

9 pav. Paprastųjų karaganų lapų, surinktų 2020 m. Jauneikių kaime Zarasų rajone, ėminio ištraukos chromatograma: λ= 360 nm. Skaičiai žymi identifikuotus junginius: 1 – hiperozidas; 2 – kemferol-3-O-gliukozidas; 3 – kemferolis; 4 – izoramnetinas; 5 – pinocembrinas; 6 – galanginas. 39

Paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose dentifikuoti 6 fenoliniai junginiai: pinocembrinas, galanginas, kemferolis, hiperozidas, kemferol-3-O-gliukozidas ir izorhamentinas. Identifikuotų fenolinių junginių chromatograma pavaizduota 9 paveikslėlyje. Visi paprastųjų karaganų lapų ėminiuose ESC metodu identifikuoti junginiai priklauso flavonolių junginių grupei. Paprastųjų karaganų lapuose esančių flavonolių didžiausią procentinę dalį 36 proc. sudarė kemferolis, šiek tiek mažiau 24 proc. sudarė izoramnetinas ir 19 proc. kemferol-3-O- gliukozidas. Tarp identifikuotų ir kiekybiškai įvertintų fenolinių junginių 10 proc. sudarė galanginas, 7 proc. hiperozidas ir mažiausiai tik 4 proc. sudarė pinocembrinas. Identifikuotų flavonolių procentinė sudėtis pateikta 10 paveikslėlyje.

4% 10% 24% izorhamnetinas kempherol-3-O-gliukozidas 36% hiperozidas 19% kemferolis 7% galanginas pinocembrinas

10 pav. Fenolinių junginių, identifikuotų paprastųjų karaganų lapų ėminiuose taikant ESC metodą, procentinės dalies įvairavimas

Rusijos mokslininkų atliktas tyrimas, kurio metu taikant plonasluoksnę chromatografiją, identifikuoti fenoliniai junginiai esantys paprastųjų karaganų lapų ėminiuose. Tyrimo metu mokslininkai identifikavo 20 junginių esančių žaliavoje. Lyginant mano tyrimo rezultatus su Rusijos mokslininkų gautais rezultatais, identifikuoti vienodi flavonoliai – kemferolis, izoramnetinas, kemferol-3-O- gliukozidas [23]. Dar viename mokslininkų Kuklinos A.G. ir kt. atliktame paprastųjų karaganų lapų analitiniame tyrime taikant efektyviąją skysčių chromatografiją identifikuoti kemferolis ir kemferol-3- O-gliukozidas [55]. Izoramnetino kiekis esantis paprastųjų karaganų lapų ėminiuose, rinktuose augalo vegetacijos laikotarpiu, kas 14 dienų, įvairuoja nuo 0,49±0,16 mg/g gegužės 4 d. iki 2,44±0,81 mg/g rugsėjo 6 d., p<0,05. Vidutiniškai vegetacijos periodo laikotarpiu paprastųjų karaganų lapų ėminiuose izoramnetino kiekis nustatytas 1,16±0,74 mg/g, p<0,05. Vertinant diagramoje pateiktus duomenis, matoma, kad izoramnetino kiekis didėja augalo vegetacijos periodo pabaigoje. Didžiausias izoramnetino kiekis 2,44±0,81 mg/g nustatytas rugsėjo 6 d., p<0,05. Izoramnetino kiekybinis kitimas vegetacijos periodu pateiktas 11 paveikslėlyje. 40

3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50

0.00 Izoramnetino kiekis Izoramnetino mg/g kiekis

Rinkimo data

11 pav. Fenolinio junginio izoramnetino kiekis (mg/g) paprastųjų karaganų lapų ėminiuose augalo vegetacijos periodu

Vertinant efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatus, nustatyta, kad fenolinio junginio kemferol-3-O-gliukozido kiekis, paprastųjų karaganų lapų ėminiuose, įvairuoja nuo 0,38±0,16 mg/g iki 2,09±0,28 mg/g, p<0,05, augalo vegetacijos periodu. Didžiausias kemferol-3-O-gliukozido kiekis nustatytas augalo vegetacijos periodo pradžioje – gegužės 4 d. 1,26±0,17 mg/g, p<0,05 ir pabaigoje – rugsėjo 6 d. 2,09±0,28 mg/g, p<0,05. Mažiausias fenolinio junginio kiekis nustatytas liepos mėnesį 0,38±0,16 mg/g, p<0,05. Kemferol-3-O-gliukozido kiekybinis kitimas vegetacijos periodu pateiktas 12 paveikslėlyje.

2.50 2.00 1.50

gliukozido gliukozido 1.00

- O

- 0.50

mg/g kiekis kiekis

- 0.00 Kemferol

Rinkimo data

12 pav. Fenolinio junginio kemferol-3-O-gliukozido kiekis (mg/g) paprastųjų karaganų lapų ėminiuose augalo vegetacijos periodu

Identifikuoto fenolinio junginio kemferolio kiekis paprastųjų karaganų lapų ėminiuose įvairuoja nuo 0,66±0,11 mg/g iki 3,54±0,59 mg/g, p<0,05, augalo vegetacijos periodu. Didžiausias kemferolio kiekis nustatytas augalo vegetacijos periodo pradžioje gegužės 4 d. 2,98±0,49 mg/g ir gegužės 28 d. 3,54±0,59 mg/g, p<0,05. Mažiausias kemferolio kiekis nustatytas liepos 25 d. 0,66±0,11 mg/g, p<0,05. Vidutiniškai augalo vegetacijos periodo laikotarpiu paprastųjų karaganų lapų ėminiuose 41 kemferolio kiekis nustatytas 1,71±0,68 mg/g, p<0,05. Kemferolio kiekybinis kitimas vegetacijos periodu pateiktas 13 paveikslėlyje.

4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50

0.00 Kemferolio kiekis mg/g kiekis Kemferolio

Rinkimo data

13 pav. Fenolinio junginio kemferolio kiekis (mg/g) paprastųjų karaganų lapų ėminiuose augalo vegetacijos periodu

Fenolinio junginio hiperozido kiekis paprastųjų karaganų lapų ėminiuose įvairuoja nuo 0,28±0,04 mg/g iki 0,55±0,09 mg/g, p<0,05, augalo vegetacijos periodu. Didžiausias hiperozido kiekis nustatytas augalo vegetacijos pabaigoje rugsėjo 6 d. 0,55±0,09 mg/g, p<0,05. Mažiausias hiperozido kiekis nustatytas vegetacijos pradžioje, gegužės 28 d. 0,28±0,04 mg/g, p<0,05. Vidutiniškai augalo vegetacijos periodo laikotarpiu paprastųjų karaganų lapų ėminiuose kemferolio kiekis nustatytas 0,34±0,06 mg/g, p<0,05. Hiperozido kiekybinis kitimas vegetacijos periodu pateiktas 14 paveikslėlyje.

0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10

0.00 Hiperozido kiekis Hiperozido kiekis mg/g

Rinkimo data

14 pav. Fenolinio junginio hiperozido kiekis (mg/g) paprastųjų karaganų lapų ėminiuose augalo vegetacijos periodu

Fenolinio junginio galangino kiekis paprastųjų karaganų lapų ėminiuose įvairuoja nuo 0,03±0,01 mg/g iki 1,56±1,04 mg/g, p<0,05, augalo vegetacijos periodu. Didžiausias galangino kiekis 42 nustatytas augalo vegetacijos pradžioje gegužės 4 d. 1,56±1,04 mg/g, p<0,05. Mažiausias galangino kiekis nustatytas vegetacijos pabaigoje rugsėjo 6 d. 0,03±0,01 mg/g, p<0,05. Vidutiniškai augalo vegetacijos periodo laikotarpiu paprastųjų karaganų lapų ėminiuose galangino kiekis nustatytas 0,48±0,68 mg/g, p<0,05. Galangino kiekybinis kitimas vegetacijos periodu pateiktas 15 paveikslėlyje.

1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20

0.00 Galangino kiekis Galangino kiekis mg/g

Rinkimo data

15 pav. Fenolinio junginio galangino kiekis (mg/g) paprastųjų karaganų lapų ėminiuose augalo vegetacijos periodu

Pinocembrino kiekis paprastųjų karaganų lapų ėminiuose įvairuoja nuo 0,10±0,06 mg/g iki 0,32±0,22 mg/g, p<0,05, augalo vegetacijos periodu. Didžiausias pinocembrino kiekis nustatytas augalo vegetacijos periodo pradžioje gegužės 4 d. 0,32±0,22 mg/g, p<0,05. Pinocembrino kiekis vegetacijos periodu statistiškai reikšmingai kinta (16 pav.).

0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05

0.00 Pinocembrino Pinocembrino kiekis mg/g

Rinkimo data

16 pav. Fenolinio junginio pinocembrino kiekis (mg/g) paprastųjų karaganų lapų ėminiuose augalo vegetacijos periodu

Mažiausias pinocembrino kiekis nustatytas birželio 18 d. 0,10±0,06 mg/g, p<0,05. Vidutiniškai augalo vegetacijos periodu paprastųjų karaganų lapų ėminiuose pinocembrino kiekis nustatytas 43

0,18±0,31 mg/g, p<0,05. Pinocembrino kiekybinis kitimas vegetacijos periodu pateiktas 16 paveikslėlyje. Fenolinių junginių, identifikuotų taikant ESC metodą, kiekio ir spektrofotometriniu būdu nustatyto antioksidantinio aktyvumo koreliaciniai ryšiai pateikti 4 lentelėje. Gauti fenolinių junginių ryšio su antioksidantiniu aktyvumu in vitro rezultatai leidžia prognozuoti antioksidantinį aktyvumą in vivo.

4 lentelė. Jauneikių k. Zarasų raj. 2020m. surinktų paprastųjų karaganų lapuose ESC metodu identifikuotų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo Pirsono koreliacijos koeficientai, p<0,05 Junginiai Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas ABTS FRAP Izoramnetinas 0,713 0,792 Kemferolis 0,649 0,761 Kemferol-3-O-gliukozidas 0,536 0,659 Hiperozidas 0,502 0,657 Galanginas 0,336 0,489 Pinocembrinas 0,412 0,476

Stipri koreliacija nustatyta izoramnetino su ABTS ir FRAP tyrimais nustatytu antioksidantiniu aktyvumu. Taip pat stipri koreliacija kemferolio su FRAP redukciniu aktyvumu nustatytu paprastųjų karaganų lapų ėminiuose. ABTS ir FRAP antioksidantinis aktyvumas vidutiniškai koreliuoja su kemferol–3–O–gliukozidu, hiperozidu, o ABTS antioksidantinis aktyvumas vidutiniškai koreliuoja su kemferoliu. Silpniausia koreliacija nustatyta pinocembrino ir galangino su ABTS ir FRAP tyrimais nustatytu antioksidantiniu aktyvumu.

Apibendrinant vegetacijos periodu rinktų paprastųjų karaganų lapų ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą, tarp identifikuotų fenolinių junginių lapų ėminiuose vyravo flavonolis kemferolis. Jis sudarė 36 proc. visų identifikuotų fenolinių junginių kiekio. Mažiausią visų tirtų fenolinių junginių kiekio dalį – 4 proc. – sudarė pinocembrinas. Didžiausias izoramnetino, kemferol-3-O-gliukozido ir hiperozido kiekis vyrauja rugsėjo mėnesį, augalo vegetacijos periodo pabaigoje. Didžiausias kemferolio, galangino ir pinocembrino kiekis vyrauja gegužės mėnesį, augalo vegetacijos periodo pradžioje. Vertinant statistinius koreliacijos rezultatus, stipriausia koreliacija nustatyta izoramnetino su ABTS ir FRAP tyrimais nustatytu antioksidantiniu aktyvumu. O silpniausias 44 koreliacinis ryšys nustatytas pinocembrino ir galangino su ABTS ir FRAP tyrimais nustatytu antioksidantiniu aktyvumu.

3.7. Rezultatų apibendrinimas

Tyrimo metu buvo analizuojami vegetacijos periodu rinktų paprastųjų karaganų lapų ėminiai. Vidutiniškai fenolinių junginių paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose nustatyta 18,35±2,38 mg GRE/g, p<0,05. Didžiausias fenolinių junginių kiekis žaliavoje nustatytas gegužės 28 d. ir augalo vegetacijos periodu statistiškai reikšmingai nepakito. Didžiausias hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekis žaliavoje nustatytas augalo vegetacijos periodo pradžioje gegužės 4 d. ir statistiškai reikšmingai mažėja iki augalo vegetacijos periodo pabaigos. Vidutiniškai paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose hidroksicinamono rūgšties darinių nustatyta 0,79±0,06 mg CRE/g, p<0,05, o flavonoidų – 1,79±0,16 mg RE/g, p<0,05.

Vertinant paprastųjų karaganų lapų ėminių antioksidantinį aktyvumą, antiradikalinis aktyvumas in vitro įvertintas spektrofotometriniu ABTS metodu, redukcinis aktyvumas in vitro įvertintas spektrofotometriniu FRAP metodu. Paprastųjų karaganų lapų ėminių ištrauka stipriausiu tiek antiradikaliniu tiek redukciniu aktyvumu pasižymi liepos mėnesį. Galima daryti išvadą, kad žydėjimo laikotarpiu paprastųjų karaganų lapų žaliavoje yra didžiausias antioksidantų kiekis. Vidutiniškai paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose antiradikalinis aktyvumas in vitro nustatytas 57,55±25,84 µmol TE/g, p<0,05, o redukcinis aktyvumas in vitro nustatytas 79,66±5,08 µmol TE/g, p<0,05. Paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukose augalo vegetacijos periodu ABTS antiradikalinis aktyvumas statistiškai reikšmingai nepakito, o FRAP redukcinis aktyvumas statistiškai reikšmingai kito.

Kokybinė ir kiekybinė sudėtis įvertinta taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. Atlikus lapų ėminių ištraukų chromatografinę analizę, identifikuoti 6 fenoliniai junginiai: pinocembrinas, galanginas, kemferolis, hiperozidas, kemferol-3-O-gliukozidas ir izoramentinas. Tarp žaliavos ėminiuose identifikuotų fenolinių junginių daugiausia vyravo kemferolis, izoramnetinas ir kemferol-3-O-gliukozidas.

4. IŠVADOS

1. Atliktas paprastųjų karaganų lapų ekstrakcijos sąlygų parinkimas. Nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis išgaunamas ekstrahuojant paprastųjų karaganų lapų ėminius su 40 proc. (v/v) etanoliu, taikant 20 min. trukmės ekstrahavimą ultragarso vonelėje, kai jos galia 1130 W, dažnis 80 kHz. 2. Bendras fenolinių junginių kiekis paprastųjų karaganų lapų ištraukose, nustatytas UV regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu taikant metodiką su Folin – Ciocalteu reagentu, ištraukų ėminiuose varijuoja nuo 15,65±0,67 mg GRE/g, p<0,05 iki 23,22±0,59 mg GRE/g, p<0,05. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis lapų ištraukose, nustatytas UV regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu, taikant metodiką su Arnow regentu, varijuoja nuo 0,44±0,16 mg CRE/g, p<0,05 iki 1,48±0,09 mg CRE/g, p<0,05. Bendras flavonoidų kiekis lapų ištraukose, nustatytas UV regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu, taikant flavonoidų reakcijos su aliuminio chloridu metodiką, varijuoja nuo 1,31±0,25 mg RE/g, p<0,05 iki 2,43±0,14 mg RE/g, p<0,05. 3. Didžiausias antiradikalinis aktyvumas – 66,78±28,35 µmol TE/g, p<0,05, UV regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu, taikant ABTS metodiką, nustatytas liepos 2 d. 4. Didžiausias redukcinis aktyvumas 95,65±7,86 µmol TE/g, p<0,05, UV regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu, taikant FRAP metodiką, nustatytas liepos 2 d. 5. Atlikus augalo vegetacijos periodu rinktų paprastųjų karaganų lapų ėminių ištraukų analizę ESC metodu, identifikuoti šie fenoliniai junginiai: kemferolis, izoramnetinas, kemferol-3-O- gliukozidas, hiperozidas, galanginas ir pinocembrinas. 6. Didžiausias izoramnetino kiekis 2,44±0,81 mg/g, p<0,05, kemferol-3-O-gliukozido kiekis 2,09±0,28 mg/g, p<0,05, ir hiperozido kiekis 0,55±0,09 mg/g, p<0,05, nustatytas rugsėjo 6 d. Didžiausias kemferolio kiekis 3,54±0,59 mg/g, p<0,05, nustatytas gegužės 28 d. Didžiausias galangino kiekis 1,56±1,04 mg/g, p<0,05, ir pinocembrino kiekis 0,32±0,22 mg/g, p<0,05, nustatytas gegužės 4 d.

1. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Išanalizavus vegetacijos periodu paprastųjų karaganų lapų ėminių fenolinių junginių sudėtį ir jų ištraukų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą in vitro, rekomenduojama paprastųjų karaganų lapus individualių junginių išskyrimui ar preparatų gamybai rinkti augalo vegetacijos periodo pradžioje ir žydėjimo laikotarpiu, nes šiuo metu surinktų lapų ėminiuose nustatyti didžiausi tirtų fenolinių junginių – natūralių antioksidantų – kiekiai.

Paprastųjų karaganų lapuose yra daug biologiškai aktyvių junginių, todėl tikslinga pradėtus tyrimus tęsti, išanalizuoti kituose paprastųjų karaganų organuose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą.

2. LITERATŪROS ŠALTINIAI

1. Shortt K. B.,Vamosi S. M. A review of the biology of the weedy Siberian peashrub, Caragana arborescens, with an emphasis on its potential effects in North America. 2011. Botanical Studies, 53(1), 1–8 2. Kuklina A.G., Vinogradova Yu.K., Tkacheva E.V. About Flowering Biology of Alien Species: Caragana arborescens Lam. And C. Laeta Kom. 2013, Russian Journal of Biological Invasions 6(4). 3. Lam C., Xie H., Zhao Y.T., Medikus C. Robinia L. Siberian peashrub. 2011. University of Alaska anchorage. 4. Meng Q., Niu Y., Niu X., Roubin R.H., Hanrahan J.R. Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of the genus Caragana used intraditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 2009. Journal of Ethnopharmacology 124(3):350-368 5. Patalauskaitė D. Visuotinė Lietuvių enciklopedija. 2021 Mokslo ir enciklopedijų leidybos centras. 6. Dietz D.R., Slabaugh P.E., Bonner F.T. Siberian Pea-shrub Caragana arborescens Lam. Garcia- Salas, P., Morales-Soto, A., Segura-Carretero, A., & Fernández-Gutiérrez, A. (2010). Phenolic- compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules, 15(12), 8813–8826. 7. Duan L., Yang X., Liu P., Johnson G., Wen J., Chang Z. A molecular phylogeny of Caraganeae (Leguminosae, Papilionoideae) reveals insights into new generic and infrageneric delimitations. 2016.Garcia-Salas, P., Morales-Soto, A., Segura-Carretero, A., & Fernández-Gutiérrez, A. (2010). Phenolic-compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules, 15(12), 8813–8826. 8. Fabricius C. Caragana. Flora of China. 2010. Garcia-Salas, P., Morales-Soto, A., Segura- Carretero, A., & Fernández-Gutiérrez, A. (2010). Phenolic-compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules, 15(12), 8813–8826. 9. He Q., Li S., Li L., Hu F. ir kiti. Total Flavonoids in Caragana (TFC) Promotes Angiogenesis and Enhances Cerebral Perfusion in a Rat Model of Ischemic Stroke. 2018. Garcia-Salas, P., Morales- Soto, A., Segura-Carretero, A., & Fernández-Gutiérrez, A. (2010). Phenolic-compound- extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules, 15(12), 8813–8826. 10. Shortt K.B., Vamosi S.M. A review of the biology of the weedy Siberian peashrub, Caragana arborescens, with an emphasis on its potential effects in North America. 2012, CanadaGarcia- Salas, P., Morales-Soto, A., Segura-Carretero, A., & Fernández-Gutiérrez, A. (2010). Phenolic- compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules, 15(12), 8813–8826. 11. Luan Z., Zhou D., Shao D. Vascular bundle connection between seed stalk and seed coat of Caragana arborescens. 2017, Kinija. Garcia-Salas, P., Morales-Soto, A., Segura-Carretero, A., & 48

Fernández-Gutiérrez, A. (2010). Phenolic-compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules, 15(12), 8813–8826. 12. ES. Invazinės svetimos rūšys. 2009. 13. Guo B., Zhang B.L., Wang R. Architectural plasticity and growth responses of Hippophae rhamnoides and Caragana intermedia seedlings to simulated water stress. 2007. Volume 69, Issue 3, 385-399. 14. Zhang Q.W., Lin L.G., Yecor W.C. Techniques for extraction and isolation of natural products: a comprehensive review. China, 2018. 15. Stawiarz E., Wróblewska A. Flowering of siberian peashrub (Caragana arborescens lam.) and its forage value to pollinating insects. 2014, University of Life Sciences in Lublin. 67(3):13-20. 16. Kuršvietienė L., Stanevičienė I. Aktyviųjų deguonies formų ir antioksidantų poveikis biomolekulėms ir reikšmė ligų patogenezėje. Kaunas, 2016. Visuomenės Sveikata, 4(75), 10–14. 17. Issah G., Kimaro A.A., Kort J., Knight J.D. Nitrogen Transfer to Forage Crops from a Caragana Shelterbelt. 2015, Canada. Forests, 6(6), 1922–1932. 18. Gupta A., Naraniwal M., Kothari V. Modern extraction methods for preparation of bioactive plant extracts. 2012, International Journal of Applied and Natural Sciences, 1(1), 8–26. 19. Brodowska K.M. Natural flavonoids: classification, potential role, and application of flavonoid analogues. 2017, European Journal of Biological Research, 7(2), 108–123. 20. Panche A.N., Diwan A.D., Chandra S.R. Flavonoids. 2016. Journal of Nutritional Science, 5. 21. González-Burgos E., Liaudanskas M., Viškelis J., Žvikas V., Janulis V., Gómez-Serranillos M. P. Antioxidant activity, neuroprotective properties and bioactive constituents analysis of varying polarity extracts from Eucalyptus globulus leaves. Journal of food and drug analysis. 2018;26(4):1293-1302. 22. Mierziak J., Kostyn M., Kulma A. Flavonoids as Important Molecules of Plant Interactions with the Environment. 2014. Molecules, 19(10), 16240–16265. 23. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Partilkhaev V.V. Chemical Investigation of Caragana arborescens Shoots. 2013. Natural Product Communications, 8(5), 585–586. 24. Huyut Z., Beydemir S., Gülçin I. Antioxidant and Antiradical Properties of Selected Flavonoids and Phenolic Compounds. 2017. Biochemistry Research International, 2017. 25. Yordi E.G., Perez E.M., Matos M.J., Villares E.U. Antioxidant and pro-oxidant effects of polyphenolic compounds and structure – activity relationship evidence. 2009, Spain. 26. Tsao R. Chemistry and Biochemistry of Dietary Polyphenols. 2010, Canada. Nutrients, 2(12), 1231–1246. 27. Kaurinovic B., Vastag D. Flavonoids and Phenolic Acids as Potential Natural Antioxidants. 2018. 49

28. Akinwumi B.C., Bordun K.M., Anderson H.D. Biological Activities of Stilbenoids. 2018. International Journal of Molecular Sciences, 19(3), 1–25. 29. Hoff P.D., Brill L.M., Hirsch A.M. Plant lectins: the ties that bind in root symbiosis and plant defense. 2009. Molecular Genetics and Genomics, 282(1), 1–15. 30. Garcia-Salas P., Morales-Soto A., Segura-Carretero A., Fernández-Gutiérrez A. Phenolic- compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. 2010. Molecules, 15(12), 8813– 8826. 31. Šaučiūnas E., Ragažinskienė O., Maruška A.S., Stankevičius M. Vaistinių (aromatinių) augalų eterinių aliejų ekstrakcijos metodų palyginimas. 2016, Kaunas. 86-89. 32. Velžienė S., Saviskas A., Briedis V. Augalinio preparato ekstrakto technologijos ir analizės savybės. 2002, Kaunas. 2, 162–166. 33. Azwanida NN. A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants, Principle, Strength and Limitation. 2015, Medicinal & Aromatic Plants, 04(03), 3–8. 34. Handa S.S., Khanuja S.P.S., Longo G., Rakesh D.D. Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants. International centre for science and high technology. 2008, Trieste. 35. Vičkačkaitė V. Ekstrakciniai mėginio paruošimo dujų chromatografinei analizei metodai. 2008, Kaunas. 36. Dail J., Mumper R.J. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties. 2010. 15(10): 7313–7352. 37. Kupiec T. Quality-Control Analytical Methods: High-Performance Liquid Chromatography. 2004. International Journal of Pharmaceutical Compounding 8(3):223-227. 38. Maruška A., Kornyšova O., Machtejevas E. Efektyviosios skysčių chromatografijos pagrindai. Vytauto Didžiojo universiteto leidykla, Kaunas, 2005. 39. Khoddami A, Wilkes MA, Roberts TH. Techniques for analysis of plant phenolic compounds. Molecules. 2013 Feb;18(2):2328-75. 40. Dai J., Mumper J.R. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties. 2010, USA. 15(10):7313-52. 41. Bernatonienė L. Baikalinės kalpokės ekstraktų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos ir spektrofotometrijos metodais. 2010, Kaunas. 42. Stepanova S. I., Boynik V. V., Gontova T. M., Kozyra S. A. Determination of ureid content in shoots of russian pea shrub and siberian pea tree. 2020, Rusija. Farmatsevtychnyi Zhurnal, (2), 59-66. 43. Stravinskienė V. Lietuvos svetimžemiai augalai. 2016, Kaunas. 44. Ragažinskienė O. Lietuvoje gaminamos vaistažolių arbatos – puiki priemonė žmogaus sveikatai stiprinti ir išsaugoti. 2006, Kaunas. 77–78. 50

45. Miknienė I., Milašienė R., Ratautaitė V., Ragažinskienė O., Proscevičius J., Kornyšova O., Maruška A. Vaistinių augalų cheminės sudėties tyrimas. 2008. 75-76. 46. Manoharachary C., Nagaraju D. Medicinal plants for human health and welfare . 2016, India. Medicinal plants for human health and welfare. 47. Strugala P., Gabrielska J. Biological activity and stability in vitro of polyphenolic extracts as potential dietary supplements. 2014, Wroclaw University of Environmental and Life Sciences. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej, 68, 1028–1035. 48. Sasnauskienė S., Firantienė R., Jablonskienė V. Chromatografijos metodai ir jų taikymas. 2012. Laboratorinė medicina. 49. Juozulynas A., Venalis A., Jurgelėnas A., Gocentas A., ir kt. Jaunų vilniečių sveikata ir vertybės bei jų internalizacija. 2014, Vilnius. Sveikatos Mokslai, 24(2), 15–19. 50. Jakab Z., Tsouros A.D. Health 2020 – achieving health and development in today’s Europe. 2013, Kopenhaga. Visuomenės Sveikata, 4(63), 5–12. 51. Kakorin P.A., Tereshkina O.I. , Ramenskaya G.V. Medicinal plants. 2018, Pharmaceutical Chemistry Journal volume 52, pages531–535(2018). 52. Kalvėnienė Z. Neuroventralio tinktūros ir skystojo raminamojo ekstrakto bei tablečių vaikams technologijos ir jų vertinimas. Daktaro disertacija. 2005, Kauno medicinos universitetas. 53. Velžienė S, Savickas A, Briedis V. Augalinio preparato ekstrakto technologijos ir analizės savybės. Biomedicina 2002, Kaunas. 54. Salas G.P., Soto M.A., Carretero S.A., Gutiérrez F.A. Phenolic-Compound-Extraction Systems for Fruit and Vegetable Samples. 2010. Molecules, 15(12), 8813–8826. 55. Kuklina A.G., Šelepova O.V., Kolesnikov M.P. Fitocheminė papratosios karaganos lapų analizė. 2013, Rusija. 56. Yang G.X., Hu C.Q. A new resveratrol tetramer from Caragana rosea. China, 2006. 57. Zheng C.J., Jin G.L., Zou J.P., ir kt. Two new triterpenoid saponins from Caragana microphylla seeds. China, 2007. 67(1):190-5. 58. Min G.Y., Park J.M., Joo I.H., Kim D.H. Inhibition effect of Caragana sinica root extracts on Osteoarthritis through MAPKs, NF-κB signaling pathway. 2021. International Journal of Medical Sciences, 18(4), 861–872. 59. Chen Y.G., Liu Y., Setzer W.N. Chemical Composition of the Essential Oil of Caragana sinica Flowers. 2008. Chemistry of Natural Compounds volume 44, pages537–538(2008). 60. Liaudanskas M., Viškelis P., Raudonis R., Kviklys D., Uselis N., Janulis V. Phenolic Composition and Antioxidant Activity of Malus domestica Leaves. 2014. 61. Chen Y.G., Liu Y., Setzer W.N. Chemical Composition of the Essential Oil of Caragana sinica Flowers. 2008. 44(4), 537–538. 51

62. Jin Q., Han X.H., Hong S.S. ir kt. Antioxidative oligostilbenes from Caragana sinica. 2012. 22(2), 973–976. 63. Jin G.L., Zheng C.J., Xin W.B., ir kt. Triterpenoid saponins from the seeds of Caragana microphylla. 2011. 34(6), 869–873. 64. Taylor W.G., Sutherland H.D., Richards K.W., Zhang H. Oleanane Triterpenoid Saponins of Caragana arborescens and Their Quantitative Determination. 2015. Industrial Crops and Products, 77(), 74–80. 65. Ting X., Toshio U., Fumino O., ir kt. Antioxidant Constituents of Caragana tibetica. Chemical & pharmaceutical bulletin. 2005. 53(9), 1204–1206. 66. Jin G.Z., Piao H.S. Studies on chemical constituents from roots of Caragana microphylla. 2007. 32(8):698-700. 67. Olennikov D.N., Tanchaeva L.M., Partilchaev V.V. Cодержание фенольных соединений в побегах сибирских видов caragana. Химия растительного сырья, 2013. № 1. С. 143-150. 68. Calderón-Montaño J.M., Burgos-Morón B., Pérez-Guerrero C., López-Lázaro M. A Review on the Dietary Flavonoid Kaempferol. 2011. Mini Reviews in Medicinal Chemistry 11(4):298-344 69. Guillarme, D. D., Veuthey, J. Guidelines for the Use of UHPLC Instruments. 2006. LCAP, Univserity of Geneva, 11. 70. Europos farmakopėja 9 leidimas, straipsnis 20232. 2017.p.51. 71. Kasparavičienė G., Briedis V. Kai kurie antioksidantų veikimo aspektai mažinant neigiamą laisvųjų radikalų poveikį. 2002. 2(2), 187–191. 72. Liaudanskas M. Naminių obelų (Malus domestica Borkh.) vaisių ir lapų fenolinių junginių sudėties tyrimas. Daktaro disertacija. 2015. 73. Zeng Z., Ji Z., Hu N., Chen S. ir kt. Synchronous determination with double-wavelength by RP- HPLC-UV and optimization of ultrasound-assisted extraction of phenolic acids from Caragana species using response surface methodology. 2017. S0731-7085(16)31512-6. 74. Žilius M. Dermatologinių puskiečių formų su propolio produktais modeliavimas, optimizavimas ir biofarmacinis vertinimas. Daktaro disertacija. 2014.

PRIEDAI

1. LSMU Bioetikos centro pritarimas atlikti tyrimą. Nr. BEC–FF–113. 2. Darbo rėmimo, autoriaus indėlio ir galimo interesų konflikto deklaracija.

1 priedas.

2 priedas.

Patvirtinta Farmacijos fakulteto Tarybos posėdyje ______protokolo Nr. ______

DARBO RĖMIMO, AUTORIAUS INDĖLIO IR GALIMO INTERESŲ KONFLIKTO DEKLARACIJA

Baigiamojo darbo autorius Neringa Biveinytė

Baigiamojo darbo pavadinimas lietuvių kalba: „Paprastųjų karaganų (Caragana arborescens Lam.) lapų fenolinių junginių kokybinės, kiekybinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas“.

Baigiamojo darbo pavadinimas anglų kalba: “Qualitative and quantitative composition variability and antioxidant activity of phenolic compounds in siberian peashrub (Caragana arborescens Lam.) leaves”.

Darbas remiamas farmacijos fakulteto lėšomis.

Patvirtinu, kad baigiamasis darbas atliktas ir parašytas savarankiškai, nepažeidžiant kitiems asmenims priklausančių autorinių teisių.

Neringa Biveinytė