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Universidad De La República UNIVERSIDAD DE LA REPÚBLICA FACULTAD DE AGRONOMÍA ESTUDIOS DE LAS VARIEDADES DE Olea europaea L. ESTABLECIDAS EN URUGUAY, CON ÉNFASIS EN SU HISTORIA, CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA, Y DIVERSIDAD GENÉTICA A PARTIR DE MARCADORES MOLECULARES por Sylvia Alejandra LÓPEZ CASTIGLIONI Verónica Alejandra SILVEIRA SILVA TESIS presentada como uno de los requisitos para obtener el título de Ingeniero Agrónomo. MONTEVIDEO URUGUAY 2011 II Tesis aprobada por: Director -------------------------------------------------------------------------------- Ing. Agr. MSc. Gabriela Pagliano -------------------------------------------------------------------------------- Lic. MSc. Jorge Pereira -------------------------------------------------------------------------------- Ing. Agr. Gianfranca Camussi Fecha: 22 de diciembre de 2011 Autor: -------------------------------------------------------------------------------- Sylvia Alejandra López Castiglioni -------------------------------------------------------------------------------- Verónica Alejandra Silveira Silva III AGRADECIMIENTOS Esta tesis fue enmarcada dentro del Proyecto DICyT S/PSP/01/28: “Prospección y Caracterización de variedades de ( Olea europaea L.) mediante el uso de microsatélites y caracteres morfológicos”. Deseamos agradecer a los directores de tesis por su constante apoyo y colaboración en la realización de este trabajo. Del mismo modo debemos agradecer a productores y viveristas, por su atención y material suministrado, ya que a que se trata del único antecedente a nivel nacional. Además debemos considerar el apoyo invalorable de nuestras familias durante el tiempo empleado en esta propuesta. IV TABLA DE CONTENIDO Página PÁGINA DE APROBACIÓN................................................................................. II AGRADECIMIENTOS.......................................................................................... III LISTA DE CUADROS E ILUSTRACIONES......................................................... IX 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1 1.1 CONCEPTOS GENERALES……………………………………………....... 1 1.2 OBJETIVOS…………………………………………………………............... 2 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 3 2.1 CARACTERÍSTICAS DE LA ESPECIE…………………………................ 3 2.1.1 Clasificación taxonómica …............................................................ 3 2.1.2 Descripción botánica ………………………………………................ 6 2.1.3 Biología reproductiva …………………………………………............ 8 2.1.4 Estructuras reproductivas ……………………………………............ 9 2.1.4.1 La inflorescencia.............................................................. 9 2.1.4.2 La flor…………………...................................................... 10 2.1.4.3 El fruto……………………………………........................... 10 2.1.5 Distribución a nivel mundial ............................................................ 11 2.1.6 Situación de la olivicultura en el Uruguay ………………….…......... 15 2.1.7 Variedades y usos ………………………….………………............... 18 2.1.8 Referencias históricas del uso del olivo …………………………….. 18 2.1.9 Uso actual y propiedades del olivo ………………………………….. 19 2.2 DIVERSIDAD GENÉTICA………………………………………………….... 21 2.2.1 Poblaciones naturales de Olea europaea .......…………................. 21 2.2.2 Historia del cultivo y su difusión ............…...................................... 23 2.2.3 Inicio del cultivo en Uruguay ……............….................................... 29 2.3 MARCADORES APLICABLES EN ESTUDIOS DE 37 DIVERSIDAD…………………………………………………………………. 2.3.1 Marcadores morfológicos …...............................................……..... 37 2.3.2 Antecedentes morfológicos ...............................................……...... 38 2.3.3 Marcadores moleculares ……………………………………….….…. 40 2.3.4 Microsatélites .…………….…………………………………….……... 44 2.3.5 Antecedentes en Olea europaea …………………………….…….... 45 3. MATERIALES Y MÉTODOS ...............................................................…......... 48 3.1 PROSPECCIÓN…………………………........................................…........ 48 3.2 ENTREVISTA………………………………………....................….............. 50 3.3 METODOLOGÍA DE MUESTREO..........................................….............. 51 V 3.4 METODOLOGÍA DE RECOPILACIÓN DE DATOS HISTÓRICOS………………………………………..………………………… 52 3.5 ALMACENAMIENTO DEL MATERIAL……………................................... 53 3.6 REGISTRO DE MUESTRAS.................................................................... 53 3.7 MATERIAL DE REFERENCIA PARA ESTUDIO MORFOLÓGICO…………………………………………………………..….. 54 3.8 MATERIAL DE REFERENCIA PARA ESTUDIO MOLECULAR………………………………………………………………..… 54 3.9 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA……………………………….….... 54 3.9.1 Caracterización de hoja ................................................................. 55 3.9.1.1 Forma……………...……………………………………………. 55 3.9.1.2 Longitud……………………………………….…………...…… 56 3.9.1.3 Ancho………………………………………….…………...…… 56 3.9.1.4 Curvatura longitudinal del limbo……………………………... 56 3.9.2 Caracterización de fruto ….............................................................. 57 3.9.2.1 Forma (en posición A)……………..………………………….. 57 3.9.2.2 Simetría (en posición A)………..………………...…………… 58 3.9.2.3 Posición del diámetro transversal máximo (en posición B)………………………………………………………………... 58 3.9.2.4 Ápice (en posición A)…………………………..……………… 59 3.9.2.5 Base (en posición A)………………………...………………... 59 3.9.2.6 Pezón………………………………….………….………..…… 60 3.9.3 Caracterización de endocarpo ……………..….……..…….………... 60 3.9.3.1 Forma (en posición A)…………….………………..……….… 61 3.9.3.2 Simetría (en posición A)………….…………………...………. 61 3.9.3.3 Posición del diámetro transversal máximo (en posición B)………………………………………………………………… 62 3.9.3.4 Ápice (en posición A)….………………………………………. 62 3.9.3.5 Base (en posición A)………….………………………......…... 62 3.9.3.6 Terminación del ápice…...……………………………...….…. 63 3.10 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR-MICROSATÉLITES…………….... 63 3.10.1 Extracción y cuantificación de ADN .............................................. 63 3.10.2 Selección de microsatélites .......................................................... 65 3.10.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) y electroforesis ….……….…. 67 3.11 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE RESULTADOS OBTENIDOS…..……..... 67 4. RESULTADOS ............................................................................................ 70 4.1 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE HOJA…………………...…… 70 4.1.1 Comparación del carácter forma de hoja a nivel de variedades ……………………………………………………………….. 70 4.1.2 Comparación del carácter forma de hoja por sitio de colecta ……………………………………………………………………. 74 VI 4.1.3 Comparación del carácter forma de hoja entre sitios de colecta …..………………………………………………………………... 82 4.1.4 Comparación de medias de forma de hoja de muestras colectadas (T test P. Statistica)………………………………………... 86 4.2 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE FRUTO………………...…..... 89 4.2.1 Comparación de los caracteres de frutos por sitio de colecta …………………………………………………………..…....… 89 4.2.2 Comparación de los caracteres de fruto entre los sitios de colecta …………………………………………………………..…..….. 92 4.2.3 Comparación de los caracteres de fruto a nivel de variedades ……………………………………….……………..………. 93 4.2.4 Comparación de los estados de los caracteres del fruto obtenidos en las muestras identificadas a nivel varietal con la información de referencia …………………………….………………. 95 4.3 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE ENDOCARPO………………. 100 4.3.1 Comparación de caracteres de endocarpo por sitio de colecta ………………………………………………………………...... 100 4.3.2.Comparación de caracteres de endocarpo entre sitios de colecta …………………………………………………………..…….… 105 4.3.3 Comparación de caracteres de endocarpo a nivel de variedades ………………………………………………..………..…… 107 4.3.4 Agrupamiento de las muestras de endocarpo por igualdad en los estados de cada característica ………………………………….. 110 4.3.5 Dendograma de endocarpo …………………………..…………....... 117 4.3.6 Comparación de los estados de los caracteres de endocarpo de muestras de variedades conocidas con información de referencia ……………………………………..…………………..……. 120 4.3.7 Comparación de los estados en los caracteres de endocarpo de muestras no identificadas con información de referencia …………………………………………………………..…… 123 4.4 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR………………………………………… 127 4.4.1 Patrones de bandas obtenidos a partir de los pares de cebadores utilizados ………………………………………………..…. 127 4.4.2 Tamaño (pb) y frecuencia de alelos (%) obtenidos en los diferentes cebadores para el total de muestras …….……….…..…. 128 4.4.3 Tamaño (pb) y porcentaje de bandas polimórficas ………………..…………………………………………… 130 VII 4.4.4 Perfil de bandas (pb) obtenido para cada sitio de colecta con los distintos pares de cebadores ……..………………………….………. 131 4.4.5 Comparación de los fragmentos amplificados (pb) entre sitios de colecta para los diez pares de cebadores ………………………….. 140 4.4.6 Comparación de los fragmentos amplificados (pb) dentro de cada sitio de colecta para los cebadores UDO99-028 y UDO99- 014 …………………………………………………………………..….. 144 4.4.7 Comparación de los fragmentos amplificados (pb) entre variedades de Los Ranchos y Santa Rosa para los diez pares de cebadores …………………………………........................................ 145 4.4.8 Comparación de los fragmentos amplificados (pb) entre variedades de Los Ranchos para el cebador UDO99- 028 …………………..………………………………………………….. 147 4.4.9 Comparación de los fragmentos amplificados (pb) para tres pares de cebadores entre muestras de la variedad Arbequina ……………..………………………..……………………… 147 4.4.10 Comparación de los fragmentos
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