Universidade Federal Da Paraíba Centro De Ciências Agrárias Programa De Pós-Graduação Em Agronomia Diversidade Da Heterocr

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

AGRONOMIA

DIVERSIDADE DA HETEROCROMATINA NA SUBTRIBO LAELIINAE (EPIDENDROIDEAE: ORCHIDACEAE), COM ÊNFASE NO GÊNERO Cattleya Lindl.

BRUNO CÉSAR QUERINO DE SOUZA

AREIA, PB 2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

AGRONOMIA

DIVERSIDADE DA HETEROCROMATINA NA SUBTRIBO LAELIINAE (EPIDENDROIDEAE: ORCHIDACEAE), COM ÊNFASE NO GÊNERO Cattleya Lindl.

BRUNO CÉSAR QUERINO DE SOUZA

Orientador: Leonardo Pessoa Felix

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, em cumprimento às exigências para obtenção do grau de Doutor em Agronomia. Área de Concentração: Ecologia, Manejo e Conservação de Recursos Naturais.

AREIA, PB 2015

Ficha Catalográfica Elaborada na Seção de Processos Técnicos da

Biblioteca Setorial do CCA, UFPB, campus II, Areia - PB

S729d Souza, Bruno César Querino de.

Diversidade da heterocromatina na subtribo Laeliinae (Epidendroideae: Orchidaceae) com ênfase no gênero Cattleya Lindl. / Bruno César Querino de Souza. - Areia: UFPB/CCA, 2015. 77 f. : il.

Tese (Doutorado em Agronomia) - Centro de Ciências Agrárias. Universidade Federal da Paraíba, Areia, 2015.

Bibliografia. Orientador: Leonardo Pessoa Felix.

1. Orchidaceae – Heterocromatina 2. Orchidaceae – Citogenética 3. Laeliinae – Subtribo 4. Cattleya Lindl. – Gênero I. Felix, Leonardo Pessoa (Orientador) II. Título.

UFPB/CCA CDU:

A minha família, base de tudo que construí até hoje

AGRADECIMENTOS

Acima de tudo a Deus, por sempre guiar meus passos pelo caminho correto. Ao Prof. Leonardo Pessoa Felix, pela orientação, paciência, confiança e por ser um exemplo de profissional que vou seguir pelo resta da vida. Ao Prof. Luiz Gustavo, pela colaboração e pela grande ajuda em todas as fases de elaboração desse trabalho. Sempre estava disposto a ajudar. A Profa. Ana Emília, pela colaboração em várias etapas desse trabalho. Ao Prof. Marcelo Guerra, pela disponibilidade do laboratório de Citogenética Vegetal da UFPE. A profa. Dilma trovão, pelas correções que são cruciais para a conclusão desse trabalho. A Maria Lucia, um exemplo de mãe, dedicação e amor. Foi sempre ela a quem recorri nas horas de incertezas. A meu pai Antonio Querino, pelos bons conselhos e um exemplo de caráter e honestidade. A meus irmãos Djane e Geandson, pelo amor, carinho e compreensão. A Luana Ferreira, pelo apoio, carinho e ajuda durante a realização desse trabalho. Em vários momentos foi com quem podia contar. A minha grande amiga Sarah do Nascimento, pela amizade sincera e pela força nos momentos difíceis. A minha mais recente amiga Carol, pela colaboração e ajuda na reta final da realização desse trabalho. Aos meus queridos amigos e colegas do Laboratório Angeline, Enoque, Joel, Maria Clara, Amanda, Laís, Achilles, Cláudio, Nalvinha, Erton, Helen e Saulo, pela convivência e momentos de descontração. Aos amigos Iago, Helton, Fábio e Jeferson, pois mesmo sem entender, aceitavam, compreendiam e apoiavam. Ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, pela oportunidade de doutoramento. À Coordenação do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, pela concessão de bolsa.

Agradeço!

SUMÁRIO

Resumo...... 1 Abstract...... 2 1 Introdução...... 3 2 Fundamentação Teórica...... 4

2.1 A família Orchidaceae...... 4

2.1.1 Morfologia, taxonomia e filogenia da família Orchidaceae...... 4

2.1.2 Citogenética da família Orchidaceae...... 6

2.1.3 Distribuição da heterocromatina na família Orchidaeceae...... 6

2.2 Aspectos gerais sobre Laeliinae...... 7

2.2.1 Taxonomia e filogenia de Laeliinae...... 8

2.2.2 Citgenética da subtribo Laeliinae...... 9

2.3 O gênero Cattleya Lindl...... 10

2.4 Quantificação do conteúdo de DNA nuclear em Orchidaceae...... 11

3 Referências bibliográficas...... 14 4 Capítulo 1: Diversidade da Heterocromatina e conteúdo de DNA nuclear em espécies do gênero Cattleya Lindl. (Epidendroidae, Orchidaceae)...... 24 5 Capítulo 2: Tendências evolutivas de sequências repetitivas em representantes da subtribo Laeliinae (Epidendroidae, Orchidaceae)...... 49 6 Considerações Finais...... 77

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1

Fig. 1 – Relações evolutivas entre os principais clados do gênero Cattleya (Epidendroideae, Orchidaceae). Em A, C. grandis; B, C. sincorana; C, C. rupestris; D, C. cernua; E, C. labiata; F, C. granulosa. Proposta de classificação e topologia da árvore filogenética baseada em van den Berg (2014)...... 29

Fig. 2 - Principais padrões de distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies do gênero Cattleya, correspondente aos clados Crispae (A), Cattleya (B) e Intermediae (C). Metáfases mitóticas de C. crispata (A, A’ e A’’), C. labiata (B, B’ e B’’) e C. tenuis (C, C’ e C’’). Imagens em A’’, B’’ e C’’ correspondem à sobreposição. Setas indicam as principais bandas CMA+/DAPI- no grupo. Barra em 37 C’’ corresponde a 5µm......

Fig. 3 - Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies gênero Cattleya dos subclados Cattleya e Crispae. Metáfases mitóticas de C. grandis (A), C. pfisterii (B), C. rupestris (C), C. sincorana (D), C. cernua (E), C. triane (F) e C. warnei (G). Setas indicam bandas CMA+/DAPI– pericentroméricas. Cabeças de setas indicam bandas terminais CMA+/DAPI–. Barra em G corresponde a 5µm...... 38

Fig. 4 - Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies do gênero Cattleya do clado Intermediae. Metáfases mitóticas de C. aclandiae (A); C. amethytoglossa (B); C. elongata (C), C. granulosa (D), C. guttata (E), C. intermedia (F), C. loddigesii (G), C. nobillior (H) e C. walqueriana (I). Cabeças de setas indicam bandas terminais CMA+/DAPI–. Barra em I corresponde a 39 5µm......

Fig. 5 – Relações filogenéticas das espécies do gênero Cattleya e reconstrução ancestral de caracteres para bandas DAPI+. O modelo de reconstrução utilizado foi máxima verossimilhança sob o modelo ‘Markov k-state one-parameter (Mk1)’ no software Mesquite...... 40

Fig. 6 – Histograma mostrando o tamanho do genoma de Cattleya trianae com múltiplos derivados de endopoliploidia (2C, 4C e 8C)...... 41

Capítulo 2

Fig. 1 – Relações evolutivas entre os clados estudados da subtribo Laeliinae (Epidendroideae, Orchidaceae) com base na proposta de classificação e topologia da árvore filogenética baseada em van den Berg et al. (2009). Em A, Cattleya intermedia; B, Brassavola nodosa; C, Guarianthe skinneri; D, Laelia gouldiana; E, Scaphyglottis fusiformis; F, Prosthechea fragrans; G, Encyclia alboxantina...... 54

Fig. 2 - Principais padrões de distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies da subtribo Laeliinae. Metáfases mitóticas de Brassavola ceboletta (A), B. nodosa (B), B. tuberculata (C), Cattleya labiata (D), C. trianae (E), C. intermedia (F), Prosthechea faresiana (G), P. fragrans (H), Guarianthe skinneri (I), Scaphyglottis fusiformis (J), S. sickii (K), Laelia marginata (L) e L. gouldiana (M). Setas em A, L, N, indicam bandas CMA+/DAPI– pericentroméricas, em M, cromossomo supranumerário. Cabeças de setas indicam bandas terminais CMA+/DAPI–. Barra em N corresponde a 5µm...... 62 Fig. 3 - Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies do gênero Encyclia. Metáfases mitóticas de E. advena pop. União dos Palmares (A), E. advena pop. Brejo da Madre de Deus (B), E. andrichii (C), E. flava (D), E. alboxantina (E), E. ionosma (F), E. aff. osmanta, (G), E. jeneschiana (H), E. oncidioides (I), E. seidelii (J). Setas em E, F, indicam bandas CMA–/DAPI+, em H, bandas CMA+/DAPI– pericentroméricas. Cabeças de setas indicam bandas terminais CMA+/DAPI–. Barra em J corresponde a 5µm...... 63

Fig. 4 – Relações filogenetéticas das espécies da subtribo Laeliinae e reconstrução ancentral de caracteres para ‘bandas DAPI+. O modelo de reconstrução utilizado foi máxima verossimilhança sob o modelo ‘Markov k-state one-parameter (Mk1)’ no software Mesquite...... 64

Fig. 5 – Evolução das bandas CMA (amarelo), DAPI (azul), número cromossômico e relações filogenéticas nas espécies no gênero Encyclia. Proposta de topologia da árvore filogenética baseada em Bastos (2014)...... 65

LISTA DE TABELAS

Capítulo 1 Tabela 1. Lista de táxons analisados, números de coletor, locais de coleta, números cromossômicos, tamanho do genoma em 2C e tipos de bandas fluorescentes mais evidentes. T= terminais, I= intersticiais, P= proximais, PG = pictogramas e ca.= cerda de. * Jones et al., 1998...... 32

Capítulo 2 Tabela 1. Lista de táxons analisados da subtribo Laeliinae, Voucher, locais de coleta, números cromossômicos, tipos de bandas fluorescentes mais evidentes, sítios de DNAr 45S e 5S e tamanho do genoma em 2C. T= bandas terminais, I= intersticiais, P= proximais, PG = pictogramas e ca.= cerda de...... 57

Diversidade da Heterocromatina na subtribo Laeliinae (Epidendroideae: Orchidaceae), com ênfase no gênero Cattleya Lindl.

Resumo

A subtribo Laeliinae compreende cerca de 2000 espécies distribuídas em 38 gêneros, exclusivamente neotropical, sendo considerada a terceira maior subtribo da família. Citologicamente apresenta a maioria das espécies com número cromossômico básico x = 20 e evolução cariotípica principalmente associada a poliploidia. O presente trabalho objetivou realizada uma análise citogenética comparativa em 42 espécies da subtribo Laeliinae com base em bandeamento com fluorocromos, CMA/DAPI, além de estimar o conteúdo de DNA nuclear de várias dessas espécies através de citometria de fluxo. Todas as espécies apresentaram 2n = 40, exceto Cattleya nobilior com 2n = 42 e os poliploides C. elongata, C. crispata, Encyclia alboxanthina, E. jenischiana, E. seidelii, Laelia gouldiana e Prosthechea faresiana (2n = 80). Foram observados pelo menos dois blocos CMA+/DAPI terminais em todas as espécies, além de bandas DAPI+/CMA– proximais ou terminais em várias outras espécies. O conteúdo de DNA das espécies variou de 2C = 3,45 pg em Brassavola nodosa até 2C = 7,96 pg em C. guttata, com ciclos de endoreduplicação na maioria das espécies. Nossos dados sugerem que embora ocorra uma aparente estabilidade cariotípica macroestrutural (2n = 40) nas espécies da subtribo Laeliinae e no gênero Cattleya como um todo, em geral, o padrão de diversificação da heterocromatina foi compatível com os agrupamentos filogenéticos, identificando possíveis sinapomorfias que permitem um melhor entendimento de espécies taxonomicamente complexas.

Palavras-chave: Laeliinae, Cattleya, Heterocromatica, CMA/DAPI, Conteúdo de DNA nuclear.

Diversity of heterochromatin in subtribe Laeliinae (Epidendroideae: Orchidaceae), with emphasis on genus Cattleya Lindl.

Abstract

The subtribe Laeliinae comprises about 2000 species in 38 genera, exclusively neotropical and is considered the third largest family of subtribe. Cytological features most species with basic chromosome number x = 20 and karyotype evolution mainly associated with polyploidy. This study aimed performed a comparative cytogenetic analysis in 42 species of Laeliinae subtribe based on banding fluorochromes with CMA/DAPI, and estimate the nuclear DNA content of many of these species through citmetria of flow. All species presented 2n = 40 except Cattleya nobilior with 2n = 42 and the polyploid C. elongata, C. crispata, Encyclia alboxanthina, E. jenischiana, E. seidelii, Laelia gouldiana and Prosthechea faresiana (2n = 80). We observed two blocks CMA+/DAPI terminals in all species. The DNA content of species ranged from 2C = 3.45 pg in Brassavola nodosa to 2C = 7.96 pg in C. guttata. The leaf tissues of the analyzed representatives presented endoreduplication cycles in most species. Our data suggest that although it occurs an apparent macrostructural stable karyotype (2n = 40) in the species of the subtribe Laeliinae as well as the genus Cattleya studied, they present a pattern of diversification of heterochromatin consistent with the phylogenetic clusters and identify possible sinapomorphies that allow better understanding of taxonomically complex species.

Keywords: Laeliinae, Cattleya, Heterochromatic, CMA/DAPI, Nuclear DNA content.

1 INTRODUÇÃO

A subtribo Laeliinae pertence à família Orchidaceae, e está inserida na subfamília Epidendroidae, tribo Epidendreae, composta por cerca de 2000 espécies distribuídas em 38 gêneros (Chase et al., 2015). É exclusivamente neotropical com seus representantes espalhados pelos trópicos e subtrópicos das Américas e Caribe (Dressler, 1981; 1993). Alguns gêneros como Brassavola R.Br, Cattleya Lindl, Guarianthe Dressler & WE.Higgins e Laelia Lindl. apresentam elevado valor ornamental (van den Berg et al., 2009). Caracteriza-se por apresentar flores ressupinadas, raramente não-ressupinadas, com labelo livre ou aderido à coluna (Pridgeon et al., 2005), um número variável de polínias (dois, quatro, seis ou oito), em geral achatadas lateralmente (Dressler, 1993), com espécies epífitas, rupícolas ou terrestres. A subtribo Laeliinae tem passado por importantes alterações nomenclaturais nos últimos anos a partir de filogenia molecular (Chase et al., 2015; van den Berg, 2000; 2008; van den Berg & Chase, 2000; van den Berg et al., 2009). Foi verificado que os gêneros Ponera Lindl., Isochilus R.Br. e Helleriella A.D.Hawkes deveriam ser transferidos para a subtribo Ponerinae. Outra alteração importante na subtribo foi a inclusão de todas as espécies brasileiras de Laelia, juntamente com Sophronitis Lindl. para Cattleya (van den Berg et al., 2000; van den Berg et al., 2009), que atualmente são considerados séries dentro do gênero (van den Berg, 2014). Em termos cariológicos, a subtribo Laeliinae apresenta contagens cromossômicas para apenas cerca de 3% de seus representantes, com 2n = 40 para a maioria das contagens da subtribo, com raras ocorrências de poliploidia e disploidia. Dentro da subtribo alguns gêneros, como Cattleya e Laelia são mais estudados citologicamente, enquanto gêneros como Encyclia, com um número de espécie maior que Cattleya, apresenta apenas sete espécies com registros cromossômicos (Felix & Guerra, 2010). A incorporação de técnicas de coloração diferencial tem auxiliado no melhor entendimento da evolução cariotípica na família Orchidaceae (Cabral et al., 2006; Koehler et al., 2008; Moraes et al., 2012; Moraes et al., 2013; Moscone, et. al., 2007; Lan & Albert 2011), principalmente para táxons que apresentam número, tamanho e morfologia cromossômicas estáveis, como na subtribo Laeliinae. Por outro lado, a integração de análises cito-moleculares, bandeamento cromossômico e análise do conteúdo de DNA nuclear, combinados com filogenia através de métodos de reconstrução

de caracteres tem ainda auxiliado no entendimento do significado evolutivo das mudanças cromossômicas num contexto filogenético (Vaio et al., 2013). O objetivo do presente trabalho foi analisar evolução cariotípica da subtribo Laeliinae e do gênero Cattleya através de técnicas de bandeamento CMA/DAPI, do conteúdo de DNA nuclear, buscando esclarecer aspectos das relações taxonômicas e os mecanismos de evolução cromossômica nesse grupo de plantas.

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 A família Orchidaceae

A família Orchidaceae apresenta cerca de 27.000 espécies distribuídas por aproximadamente 740 gêneros (Chase et al., 2015; Dressler, 2005; The Plant List, 2015), sendo considerada uma das duas maiores e mais diversa famílias de angiospermas (Phillips et al., 2012). Está presente em todos os continentes com exceção do Antártida, porém a maior diversidade encontra-se nas regiões tropicais (Pridgeon et al., 2005). O Brasil é considerado o terceiro país mais rico em espécies, (Pabst & Dungs 1975; Dressler, 1981), sendo reconhecidos aproximadamente 238 gêneros com 2.500 espécies, dessas, 692 espécies e 156 gêneros ocorrem na Região Nordeste (Pabst e Dungs, 1975; 1977; van den Berg et al., 2009; Barros et al., 2015) e muitas delas com elevado potencial ornamental e valor econômico.

2.1.1 Morfologia, taxonomia e filogenia da família Orchidaceae

Esse grupo é caracterizado por incluir plantas herbáceas pseudobulbosas, com vários tipos de adaptações a diferentes habitats, com predomínio de espécies epífitas, embora também ocorram espécies rupícolas e terrestres e, mais raramente, saprófitas (Gravendeel et al., 2004). Apresenta raízes com velame, inflorescência do tipo cimosa ou racemosa, às vezes reduzida a uma única flor. Possuem flores zigomorfas, trímeras, geralmente ressupinadas com uma pétala distinta das demais, denominada labelo. Possui ovário ínfero, geralmente um único estame fértil, com filete concrescido com o estilete formando o ginostêmio mais conhecido como coluna. O pólen é aglutinado em polínias,

e o fruto, uma cápsula deiscente com grande número de sementes minúsculas e tegumento membranáceo, com endosperma ausente (Souza & Lorenzi, 2005; Judd, et al., 2009). Por muito tempo os aspectos morfológicos foram os únicos caracteres utilizados na reconstrução da história evolutiva dos grupos vegetais, sendo fundamentais para a descrição formal de famílias, gêneros e espécies. Com o surgimento da biologia molecular, foi possível acessar várias informações genéticas através de análises moleculares que são extremamente úteis para inferências filogenéticas. Essas análises fornecem informações adicionais que não são possíveis através das análises morfológicas. Desde então, os caracteres moleculares juntamente com os morfológicos, têm auxiliado os taxonomistas no aprimoramento das relações entres táxons (ver, por exemplo, Renner, 1999; Bremer et al., 2001; Donoghue & Doyle, 1989; Doyle & Zimmer, 1994; Doyle & Endress, 2000). A família Orchidaceae apresenta uma grande e complexa diversidade morfológica, o que contribuiu para criação de vários sistemas de classificação ao longo do tempo (ver, por exemplo, Schlechter, 1926; Dressler, 1981; Dressler, 1993; Szlachetko, 1995), porém todos baseados fundamentalmente em evidências morfológicas (Freudenstein & Rasmussen, 1999). Contudo, nos últimos anos, vários sistemas de classificação das orquídeas têm utilizado além das evidencias morfológicas, informações de sequências de DNA, contribindo para a formação de grupos taxonômicos com maior suporte filogenético. Chase et al., (2003; 2015), confirmaram a subdivisão das Orchidaceae em cinco subfamílias: Apostasioideae, Cypripedioideae, Epidendroideae, Orchidoideae e Vanilloideae, das quais a subfamília Epidendroideae com 21.000 espécies, compreende cerca de 78% de todas as espécies da família (Govaerts et al., 2015). Esta subfamília é caracterizada por possuir um único estame fértil, antera terminal e duas, quatro, seis ou oito polínias, geralmente com apêndices e inflorescência lateral ou terminal (Pridgeon et al., 2005). Ocorre em clima temperado, porém está distribuída principalmente, na região tropical, com cerca de 99% de suas espécies nessa região (Cribb & Chase, 2005; Freudenstein & Chase, 2015). Essa maior distribuição da subfamília na região tropical está intimamente relacionada com a ocupação do habitat epifítico para aproximadamente 90% das espécies (Atwood, 1986).

2.1.2 Citogenética da família Orchidaceae

A análise do número cromossômico tem sido utilizada como uma ferramenta importante na compreensão de relações taxonômicas e evolutivas em diversos grupos de angiospermas (ver, por exemplo, Shan et al., 2003; Vanzela, 2003; Weiss-Schneeweiss et al., 2003; Bernardello et al., 2008; Guerra, 2008). O número cromossômico pode permanecer constante dentro de um gênero ou podem variar entre espécies e até mesmo entre populações de uma mesma espécie (Assis et al., 2013). Dentro da família Orchidaceae vários estudos já foram realizados com contagens de número cromossômico (Tanaka & Kamemoto, 1984; Aoyama et al., 1994; Dawson et al., 2007; Daviña et al., 2009; Felix & Guerra, 2010) e esses dados permitem inferir os mecanismos envolvidos na evolução numérica, bem como caracterizar táxons nesse grupo de plantas. Por apresentar um número elevado de espécies, a família é relativamente pouco conhecida em termos de número cromossômico, apresentando cerca de 15% de seus representantes citologicamente estudados (Arditti, 1992; Felix & Guerra, 2001). O grupo apresenta grande variação cromossômica numérica, desde 2n = 12 em Erycina pusilla (como Psygmorchis pusilla) a 2n = 240 em Epidendrum cinnabarinum, sendo 2n = 40 considerado o número cromossômico mais comum na família (Felix & Guerra, 1999; Guerra, 2000; Conceição et al., 2006; Felix & Guerra, 2010). Na subfamília Epidendroideae os números variam de 2n = 24 em E. fulgens e Malaxis pubescens a 2n = 240 em Epidendrum cinnabarinum, que também é a maior contagem para a família (Felix & Guerra, 2010; Assis et al., 2013).

2.1.3 Distribuição da heterocromatina na família Orchidaeceae

Em termos de padrão de distribuição da heterocromatina dentro da família, alguns grupos foram mais estudados que outros. Na subfamília Orchidoideae, por exemplo, alguns trabalhos foram realizados com a heterocromatina constitutiva de algumas espécies dos gêneros Orchis L. e Serapias L., sugerindo que Serapias parece apresentar uma evolução da heterocromatina mais rapida do que Ophrys (D’Emerico et al., 2005; D’Emerico et al., 2002; D’Emerico et al., 2000). Dentre as subfamílias, Epidendroideae é a mais bem conhecida em relação ao padrão de distribuição da heterocromatina, porém os estudos ainda são incipientes. A subfamília apresenta aproximadamente 100 espécies analisadas, o que corresponde a menos de 0,5% do total de espécies reconhecidas para a

subfamília. Para o gênero Cephalanthera Rich., C. damasonium e C. longifolium foram caracterizadas com base no padrão de bandas C e CMA/DAPI ou CMA/Quinacrina que diferiram em relação ao número, localização de bandas e composição de bases da heterocromatina constitutiva. Kao et al., (2001) estudaram os padrões de acúmulo da heterocromatina de nove espécies do gênero Phalaenopsis Blume e concluíram que o acúmulo de heterocromatina constitutiva é uma das principais causas para a variação cariótipo nesse gênero. Através do bandeamento cromossômico aplicado por Koehler et al., (2008) em 18 espécies da subtribo Maxillariinae foi possível esclarecer os mecanismos que estavam envolvidos na evolução cariotípica desse grupo. De acordo com os resultados foi sugerido que eventos de fusão ou fissão cêntrica é a explicação mais provável para a variação da disploidia do número cromossômico para algumas espécies do gênero Christensonella Szlach., como por exemplo, em C. ferdinandiana (Barb.Rodr.) Szlachem. Amplificação da heterocromatina tem sido observada na subtribo Maxillariinae, como em Brasiliorchis schunkeana (Campacci & Kautsky) R.B.Singer, S.Koehler & Carnevali, e é provavelmente o resultado da atividade intensiva de retrotransposons ou evolução em concerto do DNA repetitivo em tandem, especialmente após rearranjos cromossômicos e hibridação (Moraes et al., 2012). Ainda na subtribo Maxillariinae o trabalho de Cabral et al. (2006) analisaram os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva em quatro espécies do gênero Maxillaria Ruiz & Pav., observaram que os sítios de DNAr 5S e 45S co-localizam com algumas das bandas CMA+. Na subtribo Pleurothallidinae foram analisados a variação cromossômica numérica e os padrões de bandas CMA/DAPI em 48 espécies pertencentes a 12 gêneros (Oliveira et al., 2015). Foi verificado que a variação nos padrões de bandas heterocromáticas segue a classificação das secções do gênero Acianthera. Além disso, mudanças na organização da heterocromatina também desempenham um papel importante na formação dos cariótipos em Pleurothaliidinae.

2.2 Aspectos gerais sobre Laeliinae

Atualmente a subtribo está inserida na tribo Epidendreae, e compreende aproximadamente e 2.000 espécies distribuídas em 38 gêneros (Pridgeon et al., 2005; Chase et al., 2015). Ocupa o terceiro lugar em número de espécie dentro da subfamília Epidendroideae logo após Pleurothallidinae e Oncidiinae. Alguns de seus gêneros como

Cattleya e Laelia apresentam grande valor horticultural, outros como Encyclia e Prosthechea são gêneros representativos na florística dos neotrópicos. A grande diversidade presente na subtribo provavelmente deve estar relacionada à especialização em particular dos polinizadores bem como adaptações aos diferentes hábitats (van der Pijl e Dodson, 1966). A ocorrência de híbridos natural é um evento recorrente na família Orchidaceae (Dressler, 1993; Azevedo et al., 2006) e vários intergenéricos e interespecíficos já foram descritos para o grupo (ver, por exemplo, Pabst e Dungs 1975; 1977; Borba & Semir, 1998). A subtribo constitui um grupo de interesse em relação aos padrões de diversificação, devido justamente a grande variação das características morfológicas e ao grande número de espécies e grupos genéricos e infragenéricos, (van den Berg et al., 2009).

2.2.1 Taxonomia e filogenia de Laeliinae

A subtribo Laeliinae foi descrita por Bentham (1881) com dois grupos, "Laelieae" e "Stenoglosseae", que continham gêneros agora colocados em Laeliinae. Já em 1889 Pfitzer uniu "Laeliae" e "Stenoglosseae" numa única subtribo, estabelecendo o conceito de Laeliinae. Dressler (1971) removeu o gênero Meiracyllium Rchb. f. à sua própria subtribo monogenérica Meiracylliinae. Em 1981 o mesmo autor posiciona 43 gêneros em Laeliinae e propõe seis alianças baseadas em Baker (1972), o gênero Meiracyllium é mantido em sua própria subtribo e Arpophyllum La Llave & Lex. é considerado parte da Sobraliinae e Basiphyllaea Schltr. é inserido em Laeliinae. Dressler (1990) descreve uma nova subtribo monogenérica Arpophyllinae, para o gênero Arpophyllum. No ano seguinte Szlachetko (1991) publicou uma nova subtribo Isochilinae baseado em Isochilus R. Br. e, posteriormente, Dressler (1993) apresentou três subtribos: Meiracylliinae, Arpophyllinae e Laeliinae, enquanto Szlachetko (1995) posicionou os gêneros de Laeliinae sensu Dressler (1993) em três subtribos diferentes: Laeliinae, Epidendrinae e Ponerinae, sendo Isochilus reintroduzida em Laeliinae. A partir de análises moleculares van den Berg et al., (2000), reposicionaram os gêneros Ponera, Isochilus e Helleriella que anteriormente eram incluídos em Laeliinae, para a subtribo Ponerinae. Dessa forma, a subtribo é considerada monofilética desde que sejam incluídos todos os membros de Meiracyllinae e Arpophyllinae (sensu Dressler, 1993) e excluídos

os gêneros: Basiphyllaea Schltr. para Bletiinae, Helleriella A.D. Hawkes, Isochilus R.Br. e Ponera Lindl. para Ponerinae, e Dilomilis Raf. e Neocogniauxia Schltr. para Pleurothallidinae (van den Berg et al., 2005). A subtribo ocorre em todas as áreas tropicais e subtropicais das Américas e do Caribe e, na América do Sul, a distribuição de algumas espécies de Cattleya e Epidendrum estende-se desde a Colômbia até o Uruguai e norte da Argentina (van den Berg et al., 2009). A subtribo pode ser facilmente identificada por apresentar hábito epifítico, rupícola ou terrícola, pseudobulbos recobertos por várias bainhas, folhas apicais caules delgados e alongados e folhas dísticas articuladas com as bainhas adpressas. Apresenta inflorescência terminal, às vezes coberta por bráctea (espata), flores geralmente vistosas, ressupinadas ou não, com labelo livre ou adnado em diversos graus à coluna e polínias em número de dois, quatro, seis ou oito, geralmente achatadas lateralmente, raramente clavadas (Dressler 1981; van den Berg & Chase, 2005).

2.2.2 Citgenética da subtribo Laeliinae

Citologicamente a subtribo é caracterizada por possuir número básico x = 20 e evolução principalmente por poliploidia (Felix & Guerra, 2010) que pode ser observada para os gêneros Cattleya, Laelia e Prosthechea Knowles & Westc. (Tanaka & Kamemoto 1974, 1984; Felix & Guerra, 2000), que algumas vezes parece associada a hibridização interespecífica (Yamagishi-Costa & Forni-Martins, 2009). A subtribo Laeliinae apresenta contagens cromossômicas para apenas cerca de 3% de suas mais de 2000 espécies, porém, alguns gêneros são notavelmente mais bem estudados, como o gênero Cattleya que apresenta vinte e seis espécies (22,8% do total do total do gênero) estudadas cariologicamente, enquanto Encyclia, com um número de espécie maior que Cattleya, apresenta apenas sete espécies com registros cromossômicos (Felix & Guerra, 2010). Não são conhecidos para a subtribo Laeliinae, dados puplicados relativos à localização e composição em pares de base da heterocromatina, bem como a localização dos sítios de DNAr 45S e 5S, enquanto a quantificação do DNA é conhecida apenas para três espécies de Cattleya (Bennett & Leitch, 2015). Essa escassez de dados constitui uma lacuna importante para o conhecimento da variação cromossômica nos representantes brasileiros dessa subtribo, bem como a compreensão dos mecanismos de evolução cariotípica atuantes nesse grupo de plantas.

2.3 O gênero Cattleya Lindl.

O gênero Cattleya foi proposto em 1822 por Lindley, que descreveu Cattleya labiata Lindl. que é reconhecida como espécie tipo do gênero, embora algumas espécies já tenham sido descritas para outros gêneros, como por exemplo, C. forbesii Lindl. descrita com Epidendrum pauper Vell., C. guttata Lindl., como Epidendrum eleganse Vell. e C. loddigesii Lindl. como Epidendrum canaliculatum Vell. que na "Flora Fluminensis" de Vellozo em 1790 (publicada em 1829) e C. violacea como Cymbidium violaceum em 1815 por Kunth, na obra "Nova Genera et Species Plantarum" publicada em 1815. (Braem 1994; van den Berg, 1996). O gênero é caracterizado por possuir flores grandes e labelo não fundido com a coluna, por apresentar rizomas fortes e semi-lenhosos, ligeiramente reptantes, com uma nova brotação a cada estação de crescimento. Existem dois grupos de espécies dentro do gênero: um com pseudobulbos fusiformes, lateralmente comprimidos, com uma folha apical (unifoliada), e outro com pseudobulbos cilíndricos com duas folhas apicais (bifoliadas), eventualmente três. Os botões florais estão rodeados por uma bráctea, a espata. (Braem, 1994). A inflorescência é terminal, embora em algumas espécies as flores sejam produzidas sobre pseudobulbos especiais, desprovidos de folhas, o que dá a impressão de saírem do rizoma (Withner, 1988). Suas flores são compostas por três sépalas e três pétalas, sendo uma modificada e bem mais elaborada, o labelo que envolve a coluna (formada pela fusão dos estames e estigma). Existe apenas uma antera funcional, e ainda uma estrutura modificada chamada rostelo, que evita a autofecundação por ocasião da visita de um polinizador. Embora haja poucas publicações, a polinização da maioria das espécies ocorre por melitofilia, e mais raramente, por ornitofilia (van der Pijl e Dodson, 1966; Withner, 1988; Dressler, 1993). Algumas características morfológicas separam as Cattleya dos demais grupos relacionados. Por exemplo, o labelo não fundido à coluna, separa o grupo das espécies de Epidendrum, enquanto coluna não protrusa dorsalmente, o separa de Encyclia. A principal diferença entre Laelia e Cattleya era definida pelo número de polínias, oito e quatro, respectivamente (Withner, 1988), embora houvesse registro de algumas espécies com número intermediário, o que tornava frágil a separação dos dois gêneros conforme delimitado por Dressler (1993). A partir de uma hipótese de filogenia com dados moleculares utilizando sequências de ITS (van den Berg et al., 2000), o gênero Laelia foi considerado polifilético, pelo fato das Laélias brasileiras apresentarem maior proximidade com Cattleya e Sophronitis do que com as espécies mexicanas de Laelia.

Para solucionar o problema os autores propuseram transferir todas as espécies de Laelia registradas para o Brasil, para o gênero Sophronitis (van den Berg et al., 2000; van den Berg & Chase 2000). Chiron & Castro (2002) subdividiram as antigas espécies de Laelia brasileiras em diversos gêneros menores, Hadrolaclia (Schlechter) Chiron & V. P. Castro, Dungsia Chiron & V. P. Castro, Microlaelia (Schlechter) Chiron & V. P. Castro Hadrolaelia (Schlechter) Chiron & V. P. Castro e Hoffmannseggella H. G. Jones, geralmente correspondentes aos antigos subgêneros ou secções de Laelia. Mais recentemente, estudos mostraram que todas as espécies do gênero Sophronitis mais as Laelia brasileiras se agrupavam dentro de Cattleya (van den Berg, 2008; van den Berg et al., 2009), uma forma a manter a monofilia de Cattleya e de evitar a criação de vários nomes para gêneros menores. Com a atual circunscrição, Cattleya abrange aproximadamente 114 espécies, distribuídas pela América latina (Govaerts et al., 2015; van den Berg, 2014), são plantas usualmente epífitas e, mais raramente, rupícolas ou terrestres (Pabst e Dungs 1975; Chase et al. 2003; van den Berg 2008). Para o Brasil, são referidas 90 espécies sensu van den Berg et al. (2009), a maior parte do Planalto Brasileiro, nas porções leste, sul e central do Brasil (Barros et al., 2015).

2.4 Quantificação do conteúdo de DNA nuclear

A técnica de quantificação de DNA tem sido reconhecida como um relevante parâmetro para caracterização genômica, com aplicabilidade em estudos evolutivos, biologia celular, ecologia, filogeografia e sistemática (Knight & Beaulieu, 2008; Jones et al., 1998; Suda et al., 2006). A técnica de quantificação de DNA auxilia na compreensão sobre a variação cromossômica numérica, nível de ploidia, estimativa do tamanho do genoma de diferentes espécies, detecção de híbridos interespecíficos (Mizuhiro et al., 2001; Suda et al., 2006; Leitch et al., 2009; ) e mecanismos de evolução cariotípica que atuam em um determinado grupo vegetal (Suda et al., 2006). A análise do conteúdo de DNA nuclear a partir da citometria de fluxo resulta em um histograma típico que avalia a intensidade de fluorescência relativa dos núcleos ou células em suspensão, obtidas a partir de tecidos vegetais ou animais (Loureiro & Santos, 2004). Esses núcleos são corados com um fluorocromo específico para o DNA. A forma de calcular o conteúdo de DNA nuclear é em função da relação da fluorescência entre

duas espécies (Dolezel & Bartos, 2005), sendo uma espécie em estudo e outra, uma espécie de conteúdo de DNA nuclear conhecido (padrão de referência). Em plantas, alguns autores (calibraram o tamanho do genoma de algumas cultivares) sugeriram assim alguns genomas de cultivares, como padrões internos de referência [Raphanus sativus L. (2C = 1,11 pg), Lycopersicon esculentum Mill. (2C = 1,96 pg), Glycine max L. (2C = 2,50 pg), Zea mays L. (2C = 5,72 pg), Pisum sativum L. (2C = 9,09 pg), Vicia faba L. (2C = 26,90 pg), e Allium cepa L. (2C = 34,89 pg)] (Dolezel et al., 1992). O histograma resultante apresenta dois picos, um representa os núcleos em G1 e o segundo os núcleos em G2. A estimativa do tamanho do genoma é dada em picogramas (pg) de DNA ou em milhões de pares de bases (Mpb), sendo que 1pg=0,960Mpb (Price, et al., 2000; Doležel & Bartoš 2005). Atualmente já se conhece o conteúdo de DNA nuclear de um grande número de espécies. Nas angiospermas, a quantidade de DNA nuclear varia até 2.500 vezes, com os menores conteúdo de DNA nuclear nas plantas carnívoras Genlisea aurea A.St.-Hil. e G. margaretae Hutch. (Lentibulariaceae), com 1C = 0,065 pg (Greilhuber et al. 2006) e o maior valor em Paris japonica (Franch. & Sav.) Franch. (Melanthiaceae), com 1C=152.23 pg (Pellicer et al., 2010). Dentro de uma mesma família a quantidade de DNA também pode variar. Em Orchidaceae a variação é de 168 vezes em termos de conteúdo de DNA, com valores bastante distintos, que variam de 1C = 0.33 pg em Oncidium maduroi (como Trichocentrum maduroi) à 1C = 55.4pg em Pogonia ophioglossoides (Leitch et al., 2009). A família apresenta apenas 223 entre as mais de 27.000 espécies com estimativas para o valor C de DNA (Bennett & Leitch, 2015). Porém alguns gêneros dentro da família não apresentam sequer estimativas de conteúdo de DNA nuclear para nenhuma de suas espécies, como para os gêneros Brassavola R. Br., Encyclia Hook. e Guarianthe entre inúmeros outros. Para outros gêneros, como Epidendrum L. e Laelia Lindl., as estimativas são mínimas. No gênero Cattleya, por exemplo, das 114 espécies descritas, apenas três apresentam quantificação do conteúdo DNA nuclear registrado na literatura (Bennett & Leitch, 2015). Essa variação no conteúdo de DNA nuclear pode ocorrer devido a polimorfismo na heterocromatina, presença de cromossomos extranumerários, aneuploidia, poliploidia e hibridação (Bennet & Leitch, 2005; Garcia et al., 2006). Genomas eucarióticos contêm grandes quantidades de todas as classes de sequências de DNA repetitivas, que contribuem em grande parte para a ausência de correlação entre o valor C e complexidade do organismo, essa lacuna é conhecida como paradoxo do valor de C (Gregory, 2005).

Em plantas, as diferenças no tamanho do genoma entre espécies podem estar a milhares de ordens de grandeza, mesmo entre espécies intimamente relacionadas (Bennet e Leitch, 2005; Gregory, 2005). Entre as principais causas do aumento no tamanho do genoma estão os eventos de poliploidização (Bennet & Leitch, 2005). Esse fenômeno aumenta o nível de ploidia, em algumas espécies e consiste na duplicação de todo o complemento cromossômico (Wendel, 2000; Guerra, 2008). Acredita-se que cerca de 80% de todas as angiospermas tenham passado por um ou mais episódios de poliploidização (Ramsey & Schemske, 2002; Adams & Wendel, 2005), porém se forem considerados os eventos antigos de duplicação, a polipliodia teria ocorrido em todas as angiospermas (Adams & Wendel, 2005; Soltis & Soltis, 2009). A endoreduplicação é essencialmente a replicação de um genoma, sem a posterior divisão celular e é tipicamente encontrado em células diferenciadas em tecidos especializados (Masonbrink et al., 2013). A endopoliploidia em plantas já foi observada em vários tecidos diferentes (Emshwiller, 2002; Loureiro et al., 2007). Em plantas superiores sua ocorrência é uma característica comum, sendo observada na maior parte das espécies, tecidos e órgãos (Barow & Jovtchev, 2007). Em cotilédones de Arabidopsis thaliana, por exemplo, foram constatadas células com quantidade de DNA de até 256C (Barow & Jovtchev, 2007). Na família Orchidaceae foi verifica a ocorrência de endopoliploidia nos gêneros Cymbidium (Fukai et al., 2002), Vanda (Lin & Loh, 2002) Polystachya (Rupp et al., 2010), Spathoglottis (Yang & Loh, 2004) e Vanilla (Lepers- Andrzejewski et al., 2011). Na subtribo Laeliinae, Assis, (2013) ao estudar o conteúdo de DNA do gênero Epidendrum verificou a ocorrência de endorreduplicação em suas espécies.

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Capítulo 1

Relação entre diversidade da heterocromatina e conteúdo de DNA em espécies do gênero Cattleya Lindl. (Epidendroidae, Orchidaceae)

Bruno Querino1,3, Gustavo Souza2, Ana C. M. de Sousa1, Leonardo P. Felix1

1 Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Paraíba, Campus III, 58.397.000, Areia, PB, Brasil. 2 Laboratório de Citogenética e Evolução Vegetal, Departamento de Botânica, CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil 3 Autor para correspondência - e-mail: [email protected]

Resumo Cattleya é um gênero exclusivamente neotropical e apresenta em torno de 114 espécies, distribuídas pela região neotropical. O gênero apresenta uma taxonomia complexa, estando dividido em quatro grandes clados, correspondentes a subgêneros, dos quais se destacam o clado Intermedia e os subclados Crispae e Cattleya e por apresentar a maior diversidade. O gênero apresenta poucas espécies estudadas cariologicamente, com números cromossômicos variando de 2n = 40, em C. labiata a 2n = 80 em C. elongata. O presente trabalho tem por objetivo inferir os mecanismos de evolução cariotípica no gênero Cattleya com base em análises filogenéticas comparativas. Para isso, foram analisado número e morfologia cromossômica, distribuição de heterocromatina CMA e DAPI e estimativa do tamanho genômico por citometria de fluxo. O padrão de bandas CMA/DAPI foi bastante variável, porém todas as espécies analisadas apresentaram bandas heteromórficas CMA+/DAPI nas regiões terminais de um par cromossômico. Bandas CMA+/DAPI proximais foram visualizadas na maioria das espécies (exceto em C. trianae, C. crispata, C. rupestris, C. aclandiae, C. amethystoglossa e C. elongata). Foram observados grandes blocos CMA/DAPI+ terminais em ambos os braços cromossômicos de todas as espécies do clado Intermediae e do subclado Crispae. Por outro lado, os representantes do subclado Cattleya não apresentaram bandas CMA/DAPI+. O conteúdo de DNA das espécies estudadas variou de 2C = 3,6 pg em C. grandis até 2C = 7,96 pg em C. guttata. Os tecidos foliares dos representantes analisados apresentaram ciclos de endoreduplicação em todas as espécies analisadas. As espécies do clado Intermediae apresentaram tamanhos de genoma maiores que os outros clados do gênero. Embora esse resultado pudesse sugerir que exista alguma relação entre o aumento do conteúdo de DNA e a amplificação da heterocromatina

terminal DAPI+, os baixos conteúdos de DNA do subclado Crispae revela que esses caracteres evoluem de forma independente. As análises filogenéticas revelam que essa heterocromatina é uma característica plesiomórfica no gênero e que houve a desamplificação da mesma no subclado Cattleya. Esses dados sugerem que, apesar da estabilidade cromossômica numérica, o gênero Cattleya apresenta uma grande diversidade heterocromática, sem uma associação direta entre a amplificação de sequencias repetitivas CMA ou DAPI positivas e mudanças nos conteúdos de DNA.

Palavras-chave: Cattleya, Heterocromatina, CMA/DAPI, Tamanho do genoma.

INTRODUÇÃO

O gênero Cattleya Lindl. (Epidendroideae, Orchidaceae) constitui um grupo de plantas exclusivamente neotropical com aproximadamente 114 espécies (Pridgeon et al., 2005; van den Berg, 2008; van den Berg, 2014). Dessas aproximadamente 90 são reportadas para o Brasil (Barros et al., 2015; Govaerts et al., 2015), sendo predominantemente epífitas ou mais raramente rupícolas/terrestres (Pabst & Dungs 1975, Chase et al., 2003, van den Berg, 2008). O gênero é caracterizado por apresentar flores vistosas, labelo não fundido à coluna (ao contrário dos gêneros relacionados Epidendrum L. e Encyclia Hook.) e anteras com quatro a oito políneas (Withner, 1988). O relacionamento de Cattleya com gêneros relacionados da subtribo Laeliinae foram bastante alterados com base em analises de filogenia molecular. van den Berg et al. (2000) observaram que o gênero Laelia Lindl., conforme tradicionalmente delimitado (Dressler, 1993), é polifilético e as espécies brasileiras são filogeneticamente mais relacionadas aos gêneros Cattleya e Sophronitis Lindl. Com base nisso, as Laelia brasileiras foram transferidas para o gênero Sophronitis (van den Berg et al., 2000; van den Berg & Chase 2000). Contudo, Chiron & Castro (2002) optaram por subdividir as antigas espécies de Laelia brasileiras em gêneros menores (Hoffmannseggella H.G.Jones, Microlaelia (Schltr.) Chiron & V.P.Castro, Dungsia Chiron & V.P.Castro e Hadrolaelia (Schltr.) Chiron & V.P.Castro e Sophronitis Lindl.), correspondendo a antigos subgêneros ou secções. Mais recentemente, as espécies de Sophronitis juntamente com as Laelia brasileiras foram inseridas em Cattleya (van den Berg, 2008; van den Berg et al., 2009; van den Berg, 2014). Dessa forma, o gênero Cattleya sensu lato é dividido em quarto subgêneros [Cattleya Lindl, Cattleyella (van den Berg & M.W.Chase) Van den Berg, Intermediae (Cogn.) Withner e Maximae (Withner) Van den Berg]. Com o subgênero Cattleya subdividido em três secções [Cattleya Lindl, Crispae (Pfitzer) van den Berg e Lawrenceanae van den Berg]. A secção Crispae apresenta cinco séries [Cattleyodes (Schltr.) van den Berg, Hadrolaelia (Schltr.) van den Berg, Microlaelia (Schltr.) van den Berg, Parviflorae (Lindl.) van den Berg e Sophronitis (Lindl.) van den Berg] (van den Berg, 2014), resumidamente ilustrados na Fig. 1. Cattleya apresenta 26 espécies com registro de números cromossômicos (22,8% do total), a maioria delas com 2n = 40 (Felix & Guerra, 2010). Apesar de número cromossômico ser o parâmetro cariológico mais amplamente utilizado em vegetais (Guerra, 2008), seu emprego citotaxonômico é muito limitado em grupos numericamente

estáveis. Nesses casos, é necessário o emprego de abordagens citogenéticas mais refinadas que possibilitem um melhor detalhamento do cariótipo. Entre essas abordagens, o bandeamento cromossômico com fluorocromos tem sido utilizado como ferramenta citotaxonômica em diferentes grupos de orquídeas (D’emerico et al., 2005; Kao et al., 2001; Cabral et al., 2006; Moraes et al., 2007; Moraes et al., 2012; Koehler et al., 2008; Oliveira, et al., 2015). Dentre esses, os mais usuais são a cromomicina A3 (CMA) e 4’, 6-diamidinino-2-fenilindol (DAPI) que coram regiões do genoma ricas em GC e AT, respectivamente. Outra abordagem frequentemente empregada é a quantificação do DNA nuclear por citometria de fluxo (Loureiro et al., 2007). Em orquídeas, apesar do pequeno número de espécies com tamanho do genoma estimado (327 espécies), diferentes subfamílias podem ser caracterizadas com base nos seus respectivos tamanhos dos genomas (Leitch et al., 2009; Jersáková et al., 2013). A caracterização cariotípica mais detalhada de espécies do gênero Cattleya, assim como de gêneros relacionados pode contribuir para uma melhor compreensão da sistemática do grupo. O somatório dessas informações, como a disponibilidade de filogenias moleculares recentes (van den Berg et al., 2000; van den Berg et al., 2009; van den Berg, 2014) e de sequencias de DNA da maioria das espécies disponíveis em bancos de dados (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) tornam Cattleya um excelente modelo para estudar tendências de evolução da heterocromatina em Orchidaceae. No presente trabalho foram estudadas citologicamente dezenove espécies do gênero Cattleya (sensu van den Berg, 2014), através da análise de número e morfologia cromossômica, dupla- coloração com os fluorocromos CMA e DAPI. Além disso, foi estimado o conteúdo de DNA nuclear para doze dessas espécies por citometria de fluxo. Estes dados foram interpretados com base em filogenias moleculares e análises de reconstruções caráteres, permitindo interpretar de forma mais clara a evolução cariotípica do grupo (Vaio et al., 2013; Souza et al., 2015).

MATERIAL E MÉTODOS

Material Botânico Todo o material analisado foi proveniente de coletas de campo (ver locais de coletas na Tabela 1), com plantas mantidas em cultivo no jardim experimental do Laboratório de Citogenética Vegetal, do Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal da Paraíba, com exsicatas depositadas no Herbário Prof. Jayme Coelho de Moraes (EAN) do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba. Todos os binômios foram atualizados de acordo com World Orchid Checklist - www.kew.org/data/monocotsRedirect.html (Govaert et al., 2015).

Bandeamento cromossômico Para as análises mitóticas, foram realizadas coletas de pontas de raízes jovens pré- tratadas com 8-HQ (8-hidroxiquinoleína) por 24 horas ou paradiclorobenzeno por 3h a 4ºC, e posteriormente fixadas em Carnoy 3:1 (etanol: ácido acético glacial) por 3 horas a temperatura ambiente e, posteriormente, estocadas em freezer a –20ºC. Para o preparo das lâminas, as raízes foram lavadas duas vezes em água destilada por dez minutos e digeridas a 37ºC por 30 minutos em solução contendo 2% de celulase (Onozuka) e 20% de pectinase (Sigma, Saint Louis, MO) (w/v). Em seguida, foram lavadas duas vezes em água destilada e esmagadas em uma gota de ácido acético 45%, congeladas em nitrogênio líquido para remoção das lamínulas, secas ao ar e envelhecidas por três dias a temperatura ambiente. Após o envelhecimento, as lâminas foram coradas com uma gota de CMA (0.5 mg/ml) durante uma hora, lavadas em água destilada, secas ao ar, coradas com DAPI (1 µg/ml) por 30 minutos, lavadas novamente, secas, e montadas em glicerol/tampão McIlvaine (pH 7,0) (1:1, v/v) e estocadas por três dias à temperatura ambiente para a estabilização dos fluorocromos. As melhores metáfases foram capturadas em fotomicroscópio Zeiss com câmera de vídeo Axio Cam MRC5 usando o software Axiovision 4.8 ou uma vídeo-câmera Cohu usando o software Leica QFISH®. Para a montagem das pranchas e ideograma utilizou-se o software Photoshop CS6.

Quantificação do DNA nuclear Para a quantificação do DNA, uma suspensão de núcleos oriunda de folhas jovens foi preparada como descrito por Loureiro et al., (2007) com 1.500 µL de tampão WPB (Woody Plant Buffer), 1g de tecido foliar da amostra e do padrão macerados juntos. A suspensão obtida foi filtrada em uma malha de 30 µm e posteriormente corada com 25 µL de iodeto de propídeo. O tamanho do genoma foi estimado através de um citômetro de fluxo CyFlow® SL (Partec, Görlitz, Germany). O conteúdo de DNA final para cada acesso foi calculado com base em pelo menos três diferentes medições realizadas em três dias distintos para cada planta individualmente, com três repetições. Foram realizados testes preliminares para a escolha do controle interno, utilizando folhas jovens de Glycine max cv. ‘Polanka’ 2C = 2,5 pg DNA (Dolezel et al., 1992). Para o processamento dos dados utilizou-se o software FloMax®.

Relações filogenéticas e reconstrução de caracteres As relações filogenéticas para o gênero Cattleya (Fig. 1 e 5) foram baseadas em uma filogenia molecular prévia (van den Berg, 2014). Para a reconstrução de estados ancestrais dos caracteres cariotípicos (bandas CMA/DAPI), foi utilizado o programa Mesquite v.3.03 (Maddison & Maddison, 2015). A topologia baseada em van den Berg (2014), foi baseada numa análise Bayesiana usando caracteres de DNA nuclear (ITS) e regiões plastidiais (trnL-F, matK e rbcL). O estado ancestral foi inferido usando a máxima verossimilhança sob o modelo “Markov k-state one-parameter” (Mk1). O programa Corel DRAW® versão X7 foi usado para desenhar a topologia da árvore e plotar os dados de conteúdos de DNA nuclear.

Tabela 1. Lista de táxons analisados, números de coletor, locais de coleta, números cromossômicos, tamanho do genoma em 2C e tipos de bandas fluorescentes mais evidentes. T= terminais, I= intersticiais, P= proximais, PG = pictogramas e ca.= cerda de. * Jones et al., 1998. Táxon Local de coleta Voucher 2n 2C DNA (pg) CMA+/DAPI– DAPI+/CMA– Fig. Clado Cattleya Cattleya Lindl. subg. Cattleya Withner Cattleya sect. Cattleya Withner C. labiata Lindl. Águas Belas, PE L.P.Felix, 14828 40 5,44 2T + 4P - 2B C. trianae Linden & Rchb.f. Cultivada Não documentado 40 5,10 2T - 3F C. warneri T.Moore ex R.Warner Cultivada Não documentado 40 2T + 6P - 3G Subclado Crispae Cattleya sect. Crispae (Pfitzer) Van den Berg Cattleya ser. Cattleyodes (Schltr.) Van den Berg C. grandis (Lindl.) A.A.Chadwick Itatim, BA L.P.Felix, 13201 40 3,60 2T + ca. 20P ca. 76P 3A Cattleya ser. Hadrolaelia (Schltr.) Van den Berg C. sincorana (Schltr.) Van den Berg Ibicoara, BA L.P.Felix, 14550 40 2T + 2P + 4I ca. 40T 3D Cattleya ser. Parviflorae (Lindl.) Van den Berg C. crispata (Thunb.) Van den Berg Diamantina, MG L.P.Felix, 15372 80 3T ca.152T 2C C. pfisteri (Pabst & Senghas) Van den Berg Barra da Estiva, BA L.P.Felix, 14501 40 4,34 2T + 2P ca.12T 3B C. rupestris (Lindl.) Van den Berg Diamantina, MG L.P.Felix, 15346 40 4,39 2T ca.12T 3C Cattleya ser. Sophronitis (Lindl.) Van den Berg C. cernua (Lindl.) Van den Berg Peruíbe, SP Não documentado 40 5,26 2T + 10I ca.76T 3E Clado Intermediae Cattleya subg. Intermediae (Cogn.) Withner C. aclandiae Lindl. Itabuna, BA L.P.Felix, 14498 40 1T + 1I ca. 76T 4A

C. amethystoglossa Linden & Rchb.f. Morro do Chapéu, BA E.M.Almeida, 40 7,52 2T ca. 78T 4B 696 C. elongata Barb.Rodr. Ibicoara, BA L.P.Felix, 14559 80 7,09 4T + ca. 20P ca. 140T 4C C. granulosa Lindl. Alcaçuz, RN L.P.Felix, 11963 40 7,77 2T + ca. 34P ca. 76T 4D C. guttata Lindl. Itaibó, BA L.P.Felix, 14450 40 7,96 2T + ca. 36P ca. 76T 4E C. intermedia Graham ex Lindl. Cultivada Não documentado 40 5,20 2T + ca. 36P ca. 76T 4F C. loddigesii Lindl. Cultivada Não documentado 40 2T + ca. 38P ca. 72T 4G C. nobilior Rchb.f. Brasília, DF Não documentado 42 6,22 2T + ca. 38P ca. 80T 4H C. tenuis Campacci & Vedovello Bonina, BA L.P.Felix, 15454 40 2T + ca. 28P ca. 76T 2A C. walkeriana Gardner Goiana, GO E.M.Almeida, 40 5,97* 2T + ca. 34P ca. 76T 4I 508

RESULTADOS

Citogenética A lista das espécies analisadas, seus respectivos locais de coleta, números cromossômicos e conteúdo de DNA nuclear e bandas mais evidentes encontram-se sumarizados na Tabela 1. Todas as espécies analisadas apresentaram 2n = 40, exceto C. nobilior Rchb.f. (Fig. 4H) com 2n = 42 e os poliploides C. elongata Barb.Rodr. (Fig. 4C) e C. crispata (Thunb.) van den Berg (Fig. 2A) com 2n = 80. Todas as espécies apresentaram cromossomos pequenos (~ 2 m), cariótipos simétricos, cromossomos metacêntricos/submetacêntricos ou acrocêntricos, conforme ilustrado em C. labiata Lindl. (Fig. 2B). O padrão de bandas CMA e DAPI foi bastante variável entre as diferentes espécies do gênero. Pelo menos um par de bandas terminais CMA+/DAPI em todas as espécies estudadas. Além disso, foram observadas um número variável de bandas CMA+/DAPI proximais também em todas as espécies analisadas, exceto em C. trianae, C. crispata, C. rupestris, C. aclandiae, C. amethystoglossa e C. elongata. Foram visualizados grandes blocos CMA/DAPI+ terminais em ambos os braços cromossômicos de todas as espécies do clado Intermediae e do subclado Crispae (Fig. 3, 4 e 5). No subclado Crispae foram analisados representantes dos subclados Cattleyodes, Hadrolaelia, Parviflorae e Sophronitis (van den Berg, 2014), correspondendo às espécies brasileiras de Laelia sensu Dresler (1993). No subclado Cattleyodes, a única espécie analisada, C. grandis (Lindl.) A.A.Chadwick, apresentou duas bandas terminais CMA+, além de pequenas bandas CMA+ proximais em um par cromossômico (Fig. 3A). Para o subclado Hadrolaelia foi analisada C. sincorana (Schltr.) van den Berg, que apresentou duas bandas terminais CMA+ e bandas CMA+ proximais em três pares cromossômicos (Fig. 3D). No subclado Parviflorae, foram observados regiões DAPI+ em todos os terminais cromossômicos de C. crispata (Thunb.) van den Berg (Fig. 2A), C. rupestris (Lindl.) Van den Berg (Fig. 3C) e C. pfisteri (Pabst & Senghas) van den Berg, sendo essa última diferenciada por apresentar pequenas bandas CMA+ proximais (Fig. 3B, setas). No subclado Sophronitis, C. cernua (Lindl.) van den Berg apresentou bandas CMA+ terminais em um par cromossômico e bandas CMA+ proximais na maioria dos cromossomos do complemento (Fig. 3E). No subclado Cattleya, C. trianae (Fig. 3F) apresentou apenas um par de bandas CMA+ terminais, enquanto C. labiata (Fig. 2B) e C. warnerii (Fig. 3G) apresentaram além

dessas, pequenas bandas CMA+ proximais difíceis de visualizar em outros pares cromossômicos. No clado Intermediae, foram estudados dez espécies correspondentes ao subgênero Intermediae (Cogn.) Withner (sensu van den Berg, 2014). Em todas as espécies foram verificadas duas bandas terminais CMA+ (Fig. 4, setas), exceto em C. aclandiae Lindl. que foi observado apenas uma banda CMA terminal e um intersticial (Fig. 4A). Em C. elongata Barb.Rodr., destaque por apresentar o maior número cromossômico para a presente amostra (2n = 80), apresentou bandas heteromórficas CMA+/DAPI nas regiões terminais de quatro cromossomos (Fig. 4C). A espécie C. lodigesii, além de apresentar dois cromossomos totalmente corados com CMA+/DAPI, também apresentou bandas CMA+/DAPI proximais puntiformes (Fig. 4G).

Tamanho do Genoma O conteúdo de DNA das espécies de Cattleya variou de 2C = 3,6 pg em C. grandis até 2C = 7,96 pg em C. guttata Lindl. (Tabela 1). Os tecidos foliares apresentaram ciclos de endoreduplicação em todas as espécies analisadas. Esse fenômeno resultou na presença de picos 2C, 4C e 8C na maioria das medições (Fig. 6). No subclado Cattleya, o conteúdo de DNA foi de 2C = 5,44 pg em C. labiata e 2C = 5,11 pg em C. trianae (Tab. 1), com um valor médio de 2C = 5,27 pg. O conteúdo de DNA médio para o subclado Crispae foi de 2C = 4,39 pg, com valores variando de 3,60 pg em C. grandis até 5,26 pg em C. cernua. Já o clado Intermediae, apresentou valores que variaram de 4,30 pg em C. tenius até 7,96 pg em C. guttata, com valor médio de 2C = 6,82 pg DNA. A C. elongata apresentou 2C = 7,09 pg DNA, bem como dois ciclos de endoreduplicação somática equivalentes a 4C e 8C. Todavia, essa espécie poliploide (2n = 80) manteve uma quantidade de DNA próximo das espécies diploides.

Filogenia As análises do cladograma de representantes do gênero Cattleya (van den Berg, 2014) demonstra que o gênero pode ser dividido em clados: Cattleya, Cattleyella, Intermediae e Maximae (Fig. 1). As análises de reconstrução de caracteres para os dados de bandeamento CMA e DAPI revelaram que as bandas DAPI+ são plesiomórficas no grupo e provavelmente já existiam no ancestral do gênero Cattleya. Dessa forma, o compartilhamento de heterocromatina rico em AT nos clados Intermediae e subclado

Crispae parecem ter se dado de forma homóloga. Dessa forma, essa heterocromatina foi conservada nessas linhagens e perdida exclusivamente no subclado Cattleya. Os tamanhos de genoma nas espécies de Cattleya foram relativamente constantes (~ 5.84 pg), com uma leve tendência de aumento no clado Intermediae com média de 6,82 pg (Fig. 5). Embora esse resultado pudesse sugerir que exista alguma relação entre o aumento do conteúdo de DNA e a amplificação da heterocromatina terminal DAPI+, os baixos conteúdos de DNA do subclado Crispae (média 4,39 pg) revela que esses caracteres evoluem de forma independente.

Fig. 2 - Principais padrões de distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies do gênero Cattleya, correspondente aos clados Crispae (A), Cattleya (B) e Intermediae (C). Metáfases mitóticas de C. crispata (A, A’ e A’’), C. labiata (B, B’ e B’’) e C. tenuis (C, C’ e C’’). Imagens em A’’, B’’ e C’’ correspondem à sobreposição. Setas indicam as principais bandas terminais CMA+/DAPI-. Barra em C’’ corresponde a 5µm.

Fig. 6 – Histograma mostrando o tamanho do genoma de Cattleya trianae com múltiplos derivados de endopoliploidia (2C, 4C e 8C).

DISCUSSÃO

Dos 19 representantes analisados do gênero Cattleya, nove (C. aclandiae, C. cernua, C. crispata, C. grandis, C. loddigesii, C. pfisterii, C. rupestris, C. sincorana e C. tenuis), não possuíam registro cromossômico prévio na literatura. As demais espécies tiveram suas contagens prévias confirmadas. Além disso, dados inéditos de quantificação do genoma para as espécies C. amethytoglossa, C. cernua, C. elongata, C. grandis, C. granulosa Lindl., C. guttata, C. intermedia, C. labiata, C. nobillior, C. pfisterii, C. rupestres e C. triane são aqui apresentados. A utilização de bandeamento com fluorocromos CMA e DAPI em Orchidaceae, tem se mostrado bastante útil na comparação de espécies próximas dos gêneros Acianthera (Scheidw.) Luer, Stelis Sw. (Oliveira et al., 2015), Phalaenopsis Blume (Kao et al., 2001), Ophrys L. (D’ Emerico et al., 2005), Maxillaria Ruiz & Pav (Cabral et al., 2006) e Christensonella Szlach. (Koehler et al., 2008). Para o gênero Cattleya, com raras exceções, as espécies tiveram a ocorrência de duas bandas CMA+ terminal em um par cromossômico. Este padrão também foi observado em outros gêneros da família, como em Maxillaria Ruiz & Pav. (Cabral et al., 2006; Moraes et al., 2012) e Vanilla Plum. ex Mill. (Lepers- Andrzejewski et al., 2011). Essa característica recorrente, possivelmente representa uma condição plesiomórfica mantida em algumas espécies do grupo e devem corresponder as RONs dessas espécies. A ocorrência de heterocromatina DAPI+ nos terminais cromossômicos pode caracterizar as espécies do subclado Crispae e clado Intermidieae. Este último clado tem um padrão de distribuição geográfica predominantemente atlântico-brasileiro, é bem caracterizado em termos morfológicos (Withner, 1988; Fowlie, 1977) e molecular (van den Berg et al., 2009). Quando comparado a outros grupos de Orchidaceae parece uma característica comum. Há registro de bandas DAPI+ terminais para uma única espécie de Christensonella Szlach. da subtribo Maxilarrinae (Cabral et al., 2006), porém outras espécies do mesmo gênero possuem apenas bandas proximais (Koheler et al., 2008). Em outros grupos de orquídeas, a heterocromatina DAPI+ é observada nas regiões cromossômicas proximais e intersticiais, como em Phalaenopsis Blume da subtribo Aeridinae (Kao et al., 2001) e em Anathallis Barb.Rodr da subtribo Pleurothallidinae (Oliveira et al., 2015). Entre as espécies do clado Intermediae, C. walkeriana e C. nobilior típicas do cerrado brasileiro, são morfologicamente similares e filogeneticamente relacionadas (van den Berg

et al, 2000). As espécies diferiram em relação ao número cromossômico e por apresentar padrões de banda claramente distintos. Regiões heterocromáticas são notáveis pela sua variabilidade, o que lhes oferece um grande valor citotaxonômico (Almeida et al., 2007; Brasileiro-Vidal et al., 2009; Souza et al., 2012). Uma característica constante nas espécies de Cattleya analisadas foi a presença de endopoliploidia, com picos 2C, 4C e 8C (Fig. 6). Esse fenômeno é reportado para outros grupos de Orchidaceae, como por exemplo, em Vanilla planifolia Andrews e ocorrem em consequência de levar a produção de tecidos poliploides e possivelmente a geração de descendentes poliploides (Soltis et al., 2003; Bennett, 2004; Lepers-Andrzejewski et al., 2011). Alguns autores relacionam este fenômeno ao aumento da expressão de certos genes e ao controle do crescimento foliar em plantas (Larkins et al., 2001; Bourdon et al., 2011; Massonnet et al., 2011), porém muitas questões relacionadas a exata função da endoreduplicação no desenvolvimento vegetativo permanecem desconhecidas. Na espécie poliplóide C. elongata com 2C = 7,09 pg não foi verifica uma duplicação no conteúdo de DNA nuclar, quando comparado as suas espécies próximas, ficando na média do clado Intermediae de 2C = 6,82 pg. Acredita-se que os eventos de poliploidização estejam entre as principais causas do aumento no tamanho do genoma em plantas (Bennett & Leitch 2005). Porém, em alguns casos o aumento no tamanho do genoma não apresenta nenhuma ligação com a poliploidia, como em alguns gêneros de Orchidaceae (Leitch et al., 2009). A maioria das espécies analisadas apresentam valores de conteúdo de DNA relativamente próximos, com uma variação entre o menor valor (C. grandis) e o maior valor (C. guttata) de duas vezes. Embora os maiores valores de conteúdo de DNA nuclear ocorreram no clado Intermediae, com espécies que apresentam uma maior quantidade de heterocromatina (blocos de DAPI+), no subclado Crispae, que também apresenta abundancia de blocos heterocromáticos, os valores de DNA nuclear foram relativamente baixos. Investigações moleculares de conteúdo de DNA nuclear em plantas demonstraram que a maior variabilidade de tamanho do genoma está associada com diferenças entre conteúdo de DNA repetitivo, especialmente DNA satélite e elementos móveis (transposons e retrotransposons) (Bennetzen et al., 2005). Embora exista uma clara relação entre variações de conteúdo de DNA e de retrotransposons (Bennet & Leitch 2005; Bennetzen et al., 2005; Moraes et al., 2012), a contribuição de variações na abundancia do DNA satélite ainda não é clara. Em Fritillaria a proporção de sequencia satélite no genoma variou de 0,64% em F. camschatcensis a 36% em Fritillaria falcata, com manutenção de tamanhos de genomas

similares (Ambrožová et al., 2011). Por outro lado, em Prospero autumnale o DNA satélite contribui significativamente para consideráveis diferenças entre o tamanho do genoma (Emadzade et al., 2014). Nossos dados mostram que não há uma associação direta entre a amplificação de sequencias repetitivas CMA ou DAPI positivas e mudanças nos conteúdos de DNA.

AGRADECIMENTOS

Nossos agradecimentos ao Dr. Marcelo Guerra da Universidade Federal de Pernambuco, por disponibilizar seu laboratório, ao CNPq e a CAPES pelo auxílio financeiro e concessão da bolsa e ao INSA (Instituto Nacional do Semiárido) pela concessão de transporte para diversas coletas de campo.

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Capítulo 2

Tendências evolutivas de sequências repetitivas em representantes da subtribo Laeliinae (Epidendroidae, Orchidaceae)

Bruno Querino1, 3, Gustavo Souza2, Ana E. Barros e Silva1, Leonardo P. Felix1

1 Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Paraíba, Campus III, 58.397.000, Areia, PB, Brasil. 2 Laboratório de Citogenética Vegetal e Evolução, Departamento de Botânica, CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil 3 Autor para correspondência - e-mail: [email protected]

 Introdução A subtribo Laeliinae se caracteriza por apresentar cariótipos estáveis com 2n = 40 (x = 20) na maioria dos gêneros. A integração de análises cito-moleculares e de bandeamento cromossômico combinados com filogenia tem refinado as análises cariotípicas, melhorando o entendimento da diversificação de grupos com números cromossômicos estáveis. O presente trabalho objetivou fazer uma análise citogenética comparativa em representantes subtribo Laeliinae, através da coloração cromossômica diferencial com fluorocromos, distribuição de sítios de DNAr, quantificação do DNA nuclear e interpretação desses dados num contexto filogenético utilizando métodos de reconstrução de caracteres.  Material e Métodos Foram estudadas 23 espécies da subtribo Laeliinae, baseado em número cromossômico, fórmula cariotípica e distribuição de bandas CMA/DAPI. Foi realizada a quantidade de DNA nuclear através de citômetro de fluxo em nove dessas espécies de Laeliinae. Foi construída uma filogenia para as espécies cariotipicamente analisadas, baseada em sequências nucleares ITS1-5.8S-ITS2. A melhor topologia Bayesiana usada foi a reconstrução de caracteres cromossômicos usando métodos de máxima verossimilhança baseada nos caracteres obtidos no presente trabalho e na distribuição ds sítios de DNAr préveamente reportada.  Resultados Todas as espécies apresentaram 2n = 40, exceto os poliploides Encyclia alboxanthina, E. jenischiana, E. seidelii, Laelia gouldiana e Prosthechea faresiana (2n = 80). Foram observados prlo menos dois blocos CMA+/DAPI terminais em todas as espécies. Blocos CMA+/DAPI percentromericos foram visualizados em todas as espécies do geneor

Brassavola e Laelia, enquanto no gênero Cattleya, apenas C. trianae não apresentou CMA+ pericentroméricas. Além disso, blocos de CMA/DAPI+ terminais foram visualizadas em todas as espécies estudadas dos gêneros Brassavola, Laelia e Guarianthe. O conteúdo de DNA nuclear variou de 2C = 3,45 pg em Brassavola nodosa até 2C = 5,76 pg em Laelia gouldiana. Conclusões Nossos dados sugerem que embora ocorra uma aparente estabilidade cariotípica macroestrutural (2n = 40) as espécies da subtribo Laeliinae apresentam uma grande diversificação na abundância e distribuição de DNAs repetitivos. A heterocromatina e os sítios de DNAr 5S apresentam uma padrão de diversificação congruente com os agrupamentos filogenéticos, identificando sinapomorfias que permitem um melhor entendimento de espécies taxonomicamente complexas. Nossos dados sugerem que não há relação entre o número de sítios de DNAr, número de bandas CMA ou DAPI e tamanho do genoma, assim como reportado para outros grupos de plantas.

Palavras-chave: Laeliinae, Citotaxonomia, CMA/DAPI, DNAr 5S.

INTRODUÇÃO

A subtribo Laeliinae (Epidendroidae, Orchidaceae) compreende aproximadamente 2000 espécies e cerca de 38 gêneros (Chase et al., 2015), sendo considerada a terceira maior subtribo da família. É um grupo estritamente neotropical, amplamente distribuída pelas regiões tropicais e subtropicais das Américas e do Caribe (Dressler, 1981; 1993). Alguns gêneros têm uma distribuição preferencial pelo Brasil, como Cattleya Lindl. que apresenta um total de 114 espécies, das quais 90 sensu van den Berg (2014) ocorrem no país (Barros et al., 2015). A subtribo é formada por plantas epífitas, rupícolas ou terrestres, com flores ressupinadas, raramente não-ressupinadas, com labelo livre ou aderido à coluna (Pridgeon et al., 2005), com um número variável de polínias (dois, quatro, seis ou oito), em geral achatadas lateralmente (Dressler, 1993). Apresenta caules secundários cilíndricos com folhas dísticas, ou formando pseudobulbos com uma, duas, raramente três folhas apicais, inflorescência terminal, simples ou ramificada, com uma a muitas flores de tamanhos variados. Filogenias moleculares recentes levaram a importantes alterações taxonômicas na subtribo Laeliinae (van den Berg, 2000, 2008; van den Berg & Chase, 2000, 2001; van den Berg et al., 2009; Chase et al., 2015). A primeira análise, baseada em sequências ITS, sugeriu que vários gêneros, conforme delimitados por Dressler (1993), não eram monofiléticos e que os gêneros Ponera Lindl., Isochilus R.Br. e Helleriella A.D.Hawkes deveriam ser transferidos para a subtribo Ponerinae e que os gêneros Laelia Lindl., Cattleya e Sophronitis Lindl. deveriam ser re-delimitados. Inicialmente, foi sugerida a inclusão de todas as espécies brasileiras de Laelia em Sophronitis (van den Berg et al., 2000). Por outro lado, Chiron & Castro (2002) optaram por subdividir as antigas espécies brasileiras de Laelia em diversos gêneros menores, geralmente correspondentes aos antigos subgêneros ou secções de Laelia sensu strictu. Mais recentemente, foi proposta a inclusão de todas as antigas espécies brasileiras de Laelia, juntamente com Sophronitis no gênero Cattleya (van den Berg et al., 2009; Chase et al., 2015). Um resumo das relações filogenéticas dos grupos da subtribo em nível genérico é apresentado na Fig. 1. Citologicamente a subtribo Laeliinae apresenta a maioria das espécies com número básico x = 20 e evolução cariotípica principalmente associada à poliploidia (Felix & Guerra, 2010). Cattleya, o gênero cromossomicamente mais bem estudado da subtribo é relativamente estável, com 2n = 40 para a maioria das espécies com registro numérico (Felix

& Guerra, 2010), ao contrário de Epidendrum L., subgênero Amphiglottium Lindl. que apresenta uma surpreendente variação numérica, desde 2n = 24 a 2n = 240 (Assis, et al., 2013). Para táxons que apresentam número, tamanho e morfologia cromossômica estável, como na subtribo Laeliinae, a incorporação de técnicas cito-moleculares tem auxiliado no melhor entendimento da evolução cariotípica (Cabral et al., 2006; Koehler et al., 2008; Moraes et al., 2012; Moraes et al., 2013; Moscone, et. al., 2007; Lan & Albert, 2011). Por outro lado, a integração de análises cito-moleculares, bandeamento cromossômico e análise do conteúdo de DNA nuclear, combinados com filogenia através de métodos de reconstrução de caracteres tem auxiliado no entendimento do significado evolutivo das mudanças cromossômicas num contexto filogenético (Vaio et al., 2013). No presente trabalho foi realizada uma análise citogenética comparativa em 23 espécies da subtribo Laeliinae, baseada em bandeamento com os fluorocromos, cromomicina A3 (CMA) e 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e conteúdo de DNA nuclear através de citometria de fluxo. Além disso, foi realizada uma filogenia molecular dessas espécies baseada em sequência nucleares ITS, com base na árvore filogenética de van den Berg et al., 2009, visando discutir a variação cariotípica num contexto evolutivo.

MATERIAL E MÉTODOS

Material Botânico Foram analisadas 23 espécies da subtribo Laeliinae pertencentes a sete gêneros: Brassavola R. Br., Cattleya, Encyclia Hook., Guarianthe, Laelia Lindl., Prosthechea Knowles & Westc. e Scaphyglottis Poepp. & Endl. Todo o material foi proveniente de coletas, e durante as análises citogenéticas as plantas foram mantidas em cultivo no orquidário do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, com exsicatas depositadas no Herbário Jayme Coelho de Moraes (EAN). Para a identificação dos materiais, foi utilizado essencialmente Pabst & Dungs (1975; 1977), além de comparações com materiais previamente identificados do Herbário EAN. Contudo, para o gênero Encyclia foi utilizado um estudo taxonômico não publicado para o gênero (Bastos, 2014). Todos os binômios foram atualizados de acordo com o World Checklist os Selected Plant Families - www.kew.org/data/monocotsRedirect.html (Govaert et al., 2015). As espécies estudadas, seus respectivos locais de coleta, coletor e dados cromossômicos estão sumarizadas na Tabela 1.

Bandeamento com Fluorocromos Cromomicina A3 e 4’, 6-diamidinino-2-fenilindol - CMA/DAPI Para as análises cromossômicas, foram utilizadas pontas de raízes jovens pré-tratadas com 8-HQ (8-hidroxiquinoleína) por 24 horas a 4ºC ou paradiclorobenzeno por 3h, e posteriormente fixadas em Carnoy 3:1 (etanol: ácido acético glacial) por 3 horas a temperatura ambiente e, posteriormente, estocadas em freezer a –20ºC. Para o preparo das lâminas, as raízes foram lavadas duas vezes em água destilada por cinco minutos e digeridas a 37ºC por 30 minutos em solução contendo 2% de celulase (Onozuka) e 20% de pectinase (Sigma, Saint Louis, MO) (w/v). Em seguida, foram esmagadas em uma gota de ácido acético 45%, congeladas em nitrogênio líquido para remoção das lamínulas, secas ao ar e envelhecidas por três dias a temperatura ambiente. Procedimentos CMA/DAPI foram realizados de acordo com Souza et al. (2009). Após o envelhecimento, as lâminas foram coradas com uma gota de CMA3 (0.5 mg/ml) durante uma hora, lavadas em água destilada, secas ao ar, coradas com DAPI (1 µg/ml) por 30 minutos, lavadas novamente, secas, e montadas em glicerol/tampão McIlvaine (pH 7,0) (1:1, v/v) e estocadas por três dias à temperatura ambiente para a estabilização dos fluorocromos. As melhores metáfases foram

capturadas em fotomicroscópio Zeiss com câmera de vídeo Axio Cam MRC5 usando o software Axiovision 4.8 ou uma vídeo-câmera Cohu usando o software Leica QFISH®. Para a montagem das pranchas e ideograma utilizou-se o software Photoshop CS3.

Quantificação do DNA nuclear Para a quantificação do DNA, uma suspensão de núcleos oriunda de folhas jovens foi preparada como descrito por Loureiro et al. (2007) com 1.500 µL de tampão WPB (Woody Plant Buffer), 1g de tecido foliar da amostra e do padrão macerados juntos. A suspensão obtida foi filtrada em uma malha de 30 µm e posteriormente corada com 25 µL de iodeto de propídeo. O tamanho do genoma foi estimado através de um citômetro de fluxo CyFlow® SL (Partec, Görlitz, Germany). O conteúdo de DNA final para cada acesso foi calculado com base em pelo menos três diferentes medições realizadas em três dias distintos para cada planta individualmente, com três repetições. Foram realizados testes preliminares para a escolha do controle interno, utilizando folhas jovens de Glycine max cv. ‘Polanka’ 2C = 2,5 pg DNA (Dolezel et al., 1992). Para o processamento dos dados utilizou-se o software FloMax®.

Relações filogenéticas e reconstrução de caracteres As relações filogenéticas para a subtribo Laeliinae (Fig. 1, 4 e 5) foram baseadas em uma filogenia molecular prévia (van den Berg et al., 2009). Para a reconstrução do estado ancestral do cariótipo (bandas CMA/DAPI e sítio de DNAr 45S e 5S), os caracteres foram plotados no programa Mesquite v.3.03 (Maddison & Maddison, 2015). A topologia baseada em van den Berg (2014), foi baseada numa análise Bayesiana usando caracteres de DNA nuclear (ITS) e regiões plastidiais (trnL-F, matK e rbcL). O estado ancestral foi inferido usando a máxima verossimilhança sob o modelo “Markov k-state one-parameter” (Mk1). O programa Corel DRAW® versão X7 foi usado para desenhar a topologia da árvore e plotar, tanto os dados de distribuição de heterocromatina e conteúdo de DNA nuclear, bem como os sítio de DNAr 45S e 5S.

Tabela 1. Lista de táxons analisados da subtribo Laeliinae, Voucher, locais de coleta, números cromossômicos, tipos de bandas fluorescentes mais evidentes, sítios de DNAr 45S e 5S e tamanho do genoma em 2C. T= bandas terminais, I= intersticiais, P= proximais, PG = pictogramas e ca.= cerda de. Táxon Voucher Local 2n CMA+/DAPI DAPI+/CMA 2C DNA (pg) Fig. Brassavola R. Br. B. ceboletta Rchb. f. L.P.Felix 13253 Ilhéus, BA 40 2T + 2P ca. 76T  2A B. nodosa (L.) Lindl L.P.Felix 12725 Cultivada 40 2T + ca. 28P ca. 76T 3,45 2B B. tuberculata Hook. L.P.Felix 12728 Puxinanã, PB 40 2T + ca. 32P ca. 76T  2C Cattleya Lindl. C. intermedia Graham ex Hook. Não documentado Cultivada 40 2T + ca. 38P ca. 76T 5,19 2F C. labiata Lindl. L.P.Felix 12094 Brejo M. Deus, PE 40 2T + 2P  5,36 2D C. trianae Linden e Rchb.f. Não documentado Cultivada 40 2T  5,10 2E Encyclia Hook. E. advena (Rchb.f.) Porto & Brade J.M.P.Cordeiro 478 União dos Palmares, AL 40 2T + ca. 16P 4T  3A Não documentado Brejo da M. de Deus, PE 40 2T + ca. 16P 4T 5,07 3B E. alboxanthina Fowlie L.P.Felix 14557 Ibicoara, BA 80 3T + 8P 8T + 4P  3E E. andrichii L.C.Menezes L.P.Felix 13391 Morro do Chapéu, BA 40 6T + 2P 6T 3,46 3C E. flava (Lindl.) Porto & Brade L.P.Felix 12658 Belém, PA 40 2T + 4P  5,20 3D E. ionosma (Lindl.) Schltr. L.P.Felix 15258 São Roque de Minas, 40 ca. 14T 8T + 2P  3F MG E. jenischiana (Rchb.f.) Porto & Brade L.P.Felix 13323 Serra da Jiboia, BA 80 4T + 4P   E. oncidioides (Lindl.) Schltr. E.M.Almenida 693 Morro do Chapéu, BA 40 2T  5,20 3I

E. seidelii Pabst L.P.Felix 15373 Diamantina, MG 80 4T   3J Encyclia sp. aff. osmantha L.P.Felix 13298 Salvador, BA 40 2T ca. 16T  3G Guarianthe Dressler & W.E.Higgins G. skinneri (Bateman) Dressler & Não documentado Cultivada 40 2T ca. 76T  2I W.E.Higgins Laelia Lindl. L. gouldiana Rchb.f. L.P.Felix 14400 Cultivada 80 2T + 6P ca. 140T 5,76 2M L. marginata (Lindl.) L.O.Williams Não documentado Viçosa, CE 40 2T + ca. 32P + 1B ca. 40T - 2L Prosthechea Knowles e Westc. P. faresiana (Bicalho) W.E.Higgins, J.P.Castro 127 Morro do Chapéu, BA 80 6T   2G P. fragrans (Sw.) W.E.Higgins L.P.Felix 13390 Alcaçuz, RN 40 2T   2H Scaphyglottis Poepp. e Endl.  S. fusiformis (Griseb.) R.E.Schult. Não documentado Bezerros, PE 40 2T 2T + 6P  2J S. modesta (Rchb.f.) Schltr. Não documentado 40 2T + 2P 2T + 8P  2L S. sickii Pabst. Não documentado Taquaritinga do Norte, 40 2T + 2P 4T + 4P  2K PE

RESULTADOS

Números cromossômicos e bandeamento CMA/DAPI Todas as espécies analisadas apresentaram 2n = 40, exceto os poliploides Encyclia alboxanthina Fowlie, E. jenischiana (Rchb.f.) Porto & Brade, E. seidelii Pabst., Laelia gouldiana Rchb.f. e Prosthechea faresiana (Bicalho) W. E. Higgins com 2n = 80. Todas apresentaram cariótipos simétricos, com cromossomos principalmente metacêntricos, submetacêntricos e raros acrocêntricos, com o tamanho dos cromossomos diminuindo de forma gradativa, desse 3,6 µm em Laelia gouldiana Rchb.f. até 1,3 µm em Scaphyglottis fusiformis (Griseb.) R.E.Schult. Após a dupla coloração com os fluorocromos CMA e DAPI, todas as espécies apresentaram blocos CMA+/DAPI terminais em um par cromossômico (Figs. 2, 3 e 4), localizados preferencialmente nos braços curtos de um dos pares cromossômicos menores. Em geral, esse par foi heteromórfico, com uma banda CMA+ claramente maior que a outra do par homólogo. Adicionalmente, várias espécies apresentaram blocos CMA+/DAPI e CMA/DAPI+ na região terminal, proximal e intersticial em um número variável de cromossomos. No gênero Brassavola as três espécies apresentaram bandas CMA/DAPI+ na região terminal da maioria dos cromossomos. Bandas proximais CMA+/DAPI foram observadas na maioria dos cromossomos de B. nodosa (L.) Lindl (Fig. 2B) e B. tuberculata Hook., (Fig. 2C) e em somente um par cromossômico de B. cebolleta Rchb. f. (Fig. 2A), que também diferiu por apresentar cromossomos maiores que as demais espécies de Brassavola. No gênero Cattleya, foram observadas bandas proximais CMA+/DAPI em C. intermedia Graham ex Hook. e C. labiata Lindl., enquanto C. trianae Linden e Rchb.f. (Fig. 2E) mostrou apenas duas bandas CMA+/DAPI terminais. Além das bandas CMA+, bandas CMA/DAPI+ foram visualizadas nos terminais de vários cromossomos de C. intermedia (Fig. 2F). No gênero Guarianthe, a única espécie analisada, G. skinneri (Bateman) Dressler & W. E. Higgins apresentou bandas CMA/DAPI+ nos terminais de ambos os braços de quase todos os cromossomos, além de regiões pericentroméricas mais fortemente coradas com CMA (Fig 2I). O gênero Encyclia, com nove espécies analisadas, apresentou um padrão de bandas bastante variável. Contudo, todas as espécies apresentaram duas a seis bandas 59

CMA+/DAPI terminais. Um número variável de bandas CMA+ pericentroméricas foram visualizadas em E. advena (Rchb.f.) Porto & Brade (Fig. 3A ), E. alboxanthina Fowlie (Fig. 3E), E. andrichii L.C.Menezes (Fig. 3C), E. flava (Lindl.) Porto & Brade (Fig. 3D ), E. ionosma (Fig. 3F ) e E. jenischiana (Rchb.f.) Porto & Brade (Fig. 3H). Essas bandas foram excepcionalmente grandes, ocupando toda ou quase toda a extensão cromossômica de um ou mais pares cromossômicos de E. advena, E. alboxanthina e E. ionosma. Blocos terminais DAPI+ variáveis em número e tamanho foram observados em E. advena (Fig. 3A, B ), E. alboxanthina (Fig. 3E ), E. andrichii (Fig. 3C), E. ionosma (Fig. 3F ) e Encyclia sp. aff. osmantha (Barb.Rodr.) Schltr. (Fig. 3G). Nas espécies E. alboxanthina e E. ionosma foram observadas bandas CMA/DAPI+ pericentromericas em pelo menos um par com ambos os braços cromossômicos total ou parcialmente corados positivamente como CMA (Fig. 3E-F). As duas populações analisadas de E. advena (Fig. 3A-B) apresentaram pequenas diferenças na intensidade das bandas CMA+/DAPI terminais que foram mais fortemente coradas na população de Brejo da Madre de Deus (Fig. 3B), que na população de União dos Palmares, além desta última apresentar algumas bandas DAPI+ que não foram claramente visualizadas na primeira (Fig. 3A). No gênero Laelia, L. marginata (Lindl.) L.O.Williams com 2n = 40 + 1B (Fig. 2L) e L. gouldina Rchb.f. com 2n = 80 (Fig. 2N) apresentaram bandas terminais CMA/DAPI+ em quase todos os cromossomos. Além disso, L. marginata apresentou um cromossomo supranumerário totalmente heterocromático CMA+/DAPI (Fig. 2M, seta). Para o gênero Prosthechea, P. faresiana (Bicalho) W.E.Higgins com 2n = 80 (Fig. 2G), exibiu bandas CMA+/DAPI terminais, distribuídas nos braços curtos de dois pares cromossômicos, enquanto em P. fragrans (Sw.) W.E.Higgins (2n = 40), foram observadas apenas duas pequenas bandas CMA+/DAPI terminais nos braços curtos de um par cromossômico (Fig. 2H ). Em Scaphyglottis, todas as três espécies analisadas apresentaram 2n = 40. Contudo, S. sickii Pabst. (Fig. 2k) e S. modesta (Fig. 2L) se diferenciaram de S. fusiformis (Griseb.) R.E.Schult., por esta apresentarem um par de cromossomos com uma banda proximal CMA+/DAPI. Blocos DAPI+ pericentroméricos foram observados em vários outros cromossomos de ambas as espécies, visualizados nos núcleos interfásicos como cromocentros CMA/ DAPI+ (Fig. 2L).

Conteúdo de DNA nuclear Os valores de conteúdo de DNA nuclear (2C) são apresentados na tabela 1 para nove espécies de quatro gêneros: Brassavola, Cattleya, Encyclia e Laelia. O conteúdo de DNA nuclear apresentou uma pequena variação de 2C = 3,45 pg em B. nodosa até 2C = 5,76 pg em L. gouldiana, representando uma variação de aproximadamente 1,7 vezes. Os menores valores ocorreram nos gêneros Brassavola e Encyclia, com valores muito próximos em B. nodosa com 2C = 3,45 pg e E. andrichii com 2C = 3,46 pg. Já os gêneros Cattleya e Laelia apresentaram um valor médio de 2C = 5,2 pg.

Análises filogenéticas Foi feita uma estimativa do estado ancestral para os padrões da heterocromatina CMA/DAPI, apresentada na Figura 4 e 5. A reconstrução foi baseada na árvore de consenso estrito obtida a partir das análises de DNA nuclear (ITS) e regiões plastidiais (trnL-F, matK e rbcL), baseado em van den Berg (2009). A reconstrução do padrão de bandas mostrou que o estado plesiomórfico seria uma menor quantidade de bandas, tanto CMA+ como bandas DAPI+, porém em alguns grupos mais derivados ocorreu a perda dessas bandas, com no clado de C. labiata e C. trianae. Enquanto espécies do clado de Brassavola, Laelia e C. intermedia tiveram um aumento no número de bandas, principalmente de DAPI+ (Fig. 4). Para a estimativa do estado ancestral para os sítio de DNAr 45S e 5S, foram utilizados os dados previamente obtidos por Querino (2011), com resultados apresentados na Figura 6. A reconstrução mostrou que a presença de sítio de DNAr 45S heteromórficos é uma característica presente para todos os membros de Laeliinae. Todas os clados apresentaram dois sítios de DNAr 5S proximais, porém no clado de E. oncidioides ocorreu o aparecimento de dois sítios de DNAr 5S intersticiais. Os clados de Cattleya e Laelia apresentaram mais dois sítios de DNAr 5S proximais, que parece ser perdido no clado de Brassavola.

Fig. 3 - Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies do gênero Encyclia. Metáfases mitóticas de E. advena pop. União dos Palmares (A), E. advena pop. Brejo da Madre de Deus (B), E. andrichii (C), E. flava (D), E. alboxantina (E), E. ionosma (F), E. aff. osmanta, (G), E. jeneschiana (H), E. oncidioides (I), E. seidelii (J). Setas em E, F, indicam bandas CMA–/DAPI+, em H, bandas CMA+/DAPI– pericentroméricas. Cabeças de setas indicam bandas terminais CMA+/DAPI–. Barra em J corresponde a 5µm.

CMA DAPI

2 até 5,8 0,0 até 14 5,8 até 9,6 14 até 28 96 até 13,4 28 até 42 13,4 até 17,2 42 até 56 17,2 até 21 56 até 70 21 até 24,8 70 até 84 24,8 até 28,6 84 até 98 28,6 até 32,4 98 até 112 32,4 até 36,2 112 até 126 36,2 até 40 126 até 140 40 até 43,8 140 até 154

DISCUSSÃO

Dos 23 representantes analisados da subtribo Laeliinae, onze espécies (B. ceboletta, C. grandis, E. alboxanthina, E. andrichii, E. ionosma, E. jenischiana, E. seidelii, Encyclia sp. aff. osmantha, Guarianthe skinneri, P. faresiana e S. sickii), não possuíam registro cromossômico prévio na literatura. Para as demais espécies foram confirmadas todas as contagens, exceto L. gouldiana (2n = 80) que divergiu de duas contagens prévias, com 2n = 40, 60 (Tanaka & Kamemoto, 1984). As variações numéricas observadas para L. goudiana é consistente com os registros prévios para outros representantes da subtribo Laeliinae, como observado para Cattleya bicolor Lindl. com 2n = 40, 80 e para C. walkeriana Gardn. (Felix & Guerra, 2010). Variabilidade numérica intraespecífica, normalmente está relaciono ao isolamento reprodutivo de raças cromossômicas e constitui um importante componente da especiação em plantas (Grant, 1989). Em Orchidaceae, porém, espécies com números cromossômicos divergentes são amplamente conhecidas por formarem híbridos artificiais (Arditi, 1992) ou naturais (Bernardos et al., 2003) viáveis, o que parece relacionado à ampliação na diversidade morfológica e ao estabelecimento de híbridos naturais como observado, por exemplo, em Epidendrum subg. Amphyglottium (Moraes et al., 2013). As análises da distribuição de heterocromatina revelou grande variabilidade cromossômica estrutural entre os diferentes grupos de Laeliinae, como previamente observado para outros grupos de orquídeas, como em Ophrys (Demerico et al., 2005), Maxillariinae (Cabral et al., 2006, Koehler et al., 2008, Moraes et al., 2012), Paphiopedilum (Lan & Albert, 2011) e subtribo Pleurothallidinae (Oliveira et al., 2015). Para o gênero Brassavola, o padrão de bandas CMA/DAPI claramente distinto entre B. tuberculata e B. cebolleta, consideradas conspecíficas na lista de espécies da flora do Brasil (Barros et al., 2015), corrobora a separação dessas espécies como táxons distintos (Govaerts et al., 2015). Por outro lado, B. nodosa da secção Cuneilabia Rolfe, originária da América Central apresentou um padrão de bandas muito similar ao de B. tuberculata da secção Sessililabia Rolfe (Jones, 1975) sugerindo que o acumulo de heterocromatina CMA+ pericentromérica nas duas espécies possa ter origens independentes, ou que esse seja um padrão plesiomórfico no grupo. Gêneros próximos

como Citrus e Murraya da subfamília Aurantioideae (Rutaceae) apresentam padrões similares de bandas CMA, porém formados por DNA satélite molecularmente distintos, o que sugere origens paralelas daquele padrão de bandas CMA+ (Barros e Silva et al., 2010). As espécies brasileiras de Brassavola são de difícil delimitação taxonômica, sendo em geral polimórficas para os caracteres florais e homomórficas quanto aos caracteres vegetativos (Chacur, 1973; Pabst & Dungs, 1975), sendo assim, a diferenciação observada com bandeamento CMA/DAPI pode constituir uma importante marca citotaxonômica para o gênero. As espécies analisadas de Scaphyglottis divergiram em relação aos demais membros da subtribo pela presença de blocos DAPI+ proximais em alguns cromossomos, enquanto os demais gêneros em geral, apenas tiveram blocos DAPI terminais ou não exibiram bandas DAPI. O gênero Scasphyglottis juntamente com três outros gêneros de Laeliinae formaram a Alliance Scaphyglottis desta subtribo (van den Berg et al., 2009) e esse padrão de distribuição da heterocromatina pode representar uma sinapomomorfia para o grupo. Uma característica recorrente relativa à distribuição da heterocromatina na subtribo Laeliinae, é a presença de blocos ricos em AT nos terminais cromossômicos de um número significativo de espécies. Esse padrão foi característico para os gêneros Brassavola, Guarianthe e Laelia (Fig. 7), nas espécies brasileiras de Cattleya bifoliadas (aqui representado por C. intermedia) (Querino, em preparação) e nas espécies do gênero Epidendrum L. (Assis, 2013). No gênero Scaphyglottis, entretanto, ocorreram blocos DAPI+ terminais em uma espécie e predominantemente proximais em outra. Esse tipo de heterocromatina também é visualizado em grupos de orquídeas não relacionados, como nos gêneros Cypripedium (Kondo et al., 1994), Anacamptis (Demerico et al., 2001), em Cephalanthera (Moscone et al., 2007) e em Maxillariinae (Cabral et al., 2006 Moraes et al., 2012), entre outros, sugerindo eventos independentes na aquisição desse tipo de heterocromatina. Para Encyclia, as diferenças relacionadas ao padrão de bandas CMA/DAPI mostram que o gênero é bastante variável em relação à quantidade e distribuição da heterocromatina, semelhante a outros gêneros da família Orchidaceae como Phalaenopsis Blume (Kao et al., 2001), Christensonella Szlach. (Koehler et al., 2008) e Acianthera

(Scheidw.) Luer (Oliveira et al., 2015) que também são bastante variáveis em termos de quantidade e distribuição da fração heterocromática. Para o gênero Acianthera, por exemplo, vários grupos, incluindo a subsecção Pectinata (Luer) Chiron & van den Berg, foram caracterizados por apresentarem padrões de bandas CMA/DAPI distintos, enquanto para Encyclia a variabilidade de distribuição da heterocromatina parece não estar relacionada a qualquer linhagem filogenética ou taxonômica. A sobreposição da variabilidade no padrão de bandas CMA/DAPI com a árvore obtida para o clado Sul- Americano de Encyclia (Fig. 5; Bastos, 2014), não evidenciou qualquer correlação padrão de bandas/linhagem monofilética, sugerindo que as sequências heterocromáticas em Encyclia provavelmente possuem uma evolução muito rápida e aleatória, nesse caso, não são filogeneticamente informativas.

Evolução do DNAr na subtribo Laeliinae Todas as espécies analisadas com FISH apresentaram um par heteromórfico de sítios de DNAr 45S co-localizados com bandas CMA+ (Querino, 2011). Esse heteromorfismo pode ser consequência de deleções e/ou amplificação diferenciada de DNA satélite das RONs (Kovarik et al., 2008) e tem sido observado em outros grupos de orquídeas, como na subtribo Maxillariinae (Cabral et al., 2006; Koehler et al., 2008; Moraes et al., 2012) e em outras famílias (Liu & Davis, 2011). A estabilidade no número de sítios de DNAr 45S em Laeliinae contrasta com o observado em outros grupos de Orchidaceae (Cabral et al., 2006; Moscone et al., 2007; Begum et al., 2009; Moraes et al., 2011). Por outro lado, foi observada uma grande variabilidade no número e posição de sítios de DNAr 5S, que foram localizados preferencialmente nas regiões proximais e intersticiais de um número variável de cromossomos. Em Catleya intermedia, foi observada associação dos sítios de DNAr 5S com bandas CMA positivas, o que não é muito frequentemente referida em vegetais, provavelmente por que são raros os trabalhos onde a FISH com sondas de DNAr é realizada sequencialmente à dupla coloração CMA/DAPI. Esse tipo de associação tem sido reportada em outros grupos de plantas como em Hypochaeris (Roa et al., 2005), Quercus (Zoldos et al., 1999) e Lilium (Siljak- Yakovlev et al., 2003) e, para orquídeas, em Maxillaria notylioglossa (Cabral et al., 2006), Christensonella subullata e Trigonidium egertonianum (Moraes et al., 2012).

A localização de quatro sítios de DNAr 5S nas regiões proximais parece ser comum às espécies do gênero Cattleya e não foi observado em outros gêneros analisados (Querino, 2011). Esse mesmo padrão de localização foi observado em C. grandis, uma espécie anteriormente incluída no gênero Laelia, corroborando a hipótese de filogenia (van den Berg et al., 2009) que incluiu as espécies brasileiras de Laelia e Sophronitis em Cattleya. No clado formado por E. oncidioides, P. fragrans e S. sickii o padrão mais frequente foi a presença de um par de cromossomos com sítios de DNAr 5S proximais. Contudo, E. oncidioides apresentou dois sítios extra heteromórficos sugerindo uma condição derivada em relação a Scaphyglottis e Prostechea. A presença de apenas um par de sítios de DNAr 5S pericentromérico parece ser um característica comum para as espécies desse clado, provavelmente relacionada a uma condição plesiomórfica que foi conservada na evolução cromossômica dessas espécies. Nas demais espécies ocorreram uma ampliação do número de sítios 5S pericentroméricos e/ou a dispersão desses sítios por outras regiões do genoma. Três diferentes mecanismos tem sido propostos para explicar a variabilidade em número e tamanho de sítios de DNAr: atuação de elementos transponíveis (Schubert & Wobus, 1985; Raskina et al., 2004; Altinkut et al., 2006), rearranjos cromossômicos (translocação, inversão, duplicação, deleção) e conversão gênica (Raskina et al., 2008; Hanson et al., 1996; Thomas et al., 1996; Moscone et al., 2007). Esses mecanismos podem atuar conjuntamente, ou não e não implicam obrigatoriamente em alterações na morfologia cromossômica (Hall & Parker, 1995; Datson & Murray, 2006). Em orquídeas uma comparável variação em número e posição de sítios de DNAr 5S tem sido observada apenas para o gênero Paphiopedilum da subfamília Cypripedioideae (Lan & Albert, 2011). Em outros grupos de Epidendroideae, embora também ocorra variabilidade de sítios 5S, os sítios de DNAr 45 parecem ser mais variáveis (Cabral et al., 2006; Begun et al., 2009; Moraes et al., 2012).

Conteúdo de DNA nuclear Todos os resultados aqui apresentados são inéditos e os resultados de 2C = 3,45 pg para Brassavola nodosa, 2C = 5,07 pg para Encyclia advena, 2C = 3,46 pg para E.

andrichii, 2C = 5,20 pg para E. flava e 2C = 5,20 pg para E. oncidioides são os primeiros registros para os gêneros Brassavola e Encyclia. A subtribo Laeliinae ainda é pouco estuda em termos de conteúdo de DNA, com registro para apenas 16 das aproximadamente 2000 espécies conhecidas para a subtribo (Assis, 2013; Leitch et al., 2009). Na família Orchidaceae, como um todo, existe uma grande variação de 168 vezes em relação ao conteúdo de DNA, com valores bastante distintos, desde 2C = 0,66 pg até 2C = 110,8 pg. Na subfamília Epidendroideae essa diferença no conteúdo de DNA varia de 2C = 0,6 pg até 2C = 39,6 pg, com uma média de 2C = 7,2 pg DNA para a maioria das espécies (Leitch et al., 2009). Todavia, essa variação não foi observada na presente amostra, com uma variação menor que duas vezes (2C = 3,45 pg em B. nodosa até 2C = 5,76 em L. gouldiana). Embora tenha sido analisado um número pequeno de espécies, a subtribo Laeliinae parece ter um tamanho genômico relativamente estável, especialmente quando comparada a grupos relacionados como Epidendrum, cujos valores 2C DNA variaram cerca de 6,8 vezes entre E. obliquum Schltr. (2C = 2,98 pg) e E. cinnabarinum Salzm. ex Lindl, com 2C = 20,2 pg (Assis, 2013).

AGRADECIMENTOS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

 A subtribo Laeliinae apresenta estabilidade de número cromossômico, 2n = 40, e possuem uma grande variabilidade cariotípica no que diz respeito ao padrão de bandas heterocromáticas CMA e DAPI e sítios de DNAr.  No gênero Cattleya apresenta como característica plesiomórfica a presença de bandas DAPI+ terminais, que foram perdidas exclusivamente nos prepresentantes do clado Cattleya.  O gênero Encyclia não apresenta qualquer correlação entre os agrupamentos filogenéticos e a distribuição de heterocromatina, o que sugere que a amplificação e desamplificação dessas sequências repetitivas seja um evento randômico, ou que essas sequências possuem uma evolução muito rápida.  A distribuição dos sítios de DNAr 5S (Querino, 2011) foi variável na subtribo Laeliinae, sendo a amplificação do número desses sítios uma sinapomorfia do clado Cattleya.  Não há relação entre o número de sítios de DNAr 5S, número de bandas CMA ou DAPI e tamanho do genoma, assim como reportado para outros grupos de plantas.  A variabilidade para sítios de DNAr e padrões de bandas CMA/DAPI constitui importante ferramenta para entendimento de relações filogenéticas e cariotípicas em Orchidaceae.