Konzentrationsabhängige Funktionelle Hemmung Der Sauren Sphingomyelinase Durch Antidepressiva

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Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Universitätsklinikum Erlangen Psychiatrische und Psychotherapeutische Klinik Direktor: Prof. Dr. Johannes Kornhuber

Konzentrationsabhängige funktionelle Hemmung der sauren Sphingomyelinase durch Antidepressiva

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von Sven Städtler aus Kulmbach

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: Prof. Dr. med. Johannes Kornhuber Korreferent: PD Dr. med. Juan Manuel Maler

Tag der Mündlichen Prüfung: 30. März 2011

Meinen Eltern gewidmet

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ...... 7 1.1 Hintergrund und Ziele ...... 7 1.2 Material und Methode ...... 7 1.3 Ergebnisse ...... 8 1.4 Schlussfolgerungen ...... 8 2 Abstract ...... 9 2.1 Background and Aims ...... 9 2.2 Materials and Methods ...... 9 2.3 Results ...... 9 2.4 Conclusion ...... 10 3 Sphingolipide als Teil der Zellmembran ...... 11 4 Sphingomyelinasen ...... 11 4.1 Die saure Sphingomyelinase ...... 12 4.1.1 Eigenschaften ...... 12 4.1.2 ASM-Hemmung über zellbiologische Mechanismen ...... 12 4.1.3 Pharmakologische Hemmung der ASM...... 12 4.2 Die ASM generiert das bioaktive Lipid Ceramid ...... 15 5 Dysregulierte ASM-Aktivität bei unterschiedlichen Krankheiten ...... 16 5.1 Reduzierte ASM-Aktivität als Ursache der NPD ...... 16 5.2 Tumorerkrankungen zeigen erniedrigte ASM-Aktivität ...... 17 5.3 Arteriosklerose ...... 18 5.4 Diabetes mellitus ...... 19 5.5 Wilson-Krankheit ...... 19 5.6 Infektionen ...... 20 5.7 Endotoxischer Schock und Inflammation ...... 21 5.8 Emphysem und Cystische Fibrose ...... 21 5.9 Neuropsychiatrische Krankheitsbilder: Depression, Alzheimer, Apoplex...... 22 6 Ziele der Arbeit ...... 23 7 Material und Methoden ...... 24 7.1 Material ...... 24 7.1.1 Eukaryote Zellen ...... 24 7.1.2 Puffer und Lösungen ...... 24 7.1.3 Verwendete Wirkstoffe ...... 25 7.2 Methoden ...... 31 7.2.1 Zellkultur ...... 31 7.2.2 Proteinkonzentrationsbestimmung ...... 32 7.2.3 Bestimmung der ASM-Aktivität ...... 33 7.2.4 Statistische Auswertung ...... 34 8 Ergebnisse ...... 35 8.1 Antidepressiva unterschiedlichster Klassen hemmen die ASM ...... 35 8.2 Trizyklische Antidepressiva ...... 36 8.2.1 Amitriptylin ...... 36 8.2.2 Desipramin ...... 37 8.2.3 Clomipramin ...... 38 8.3 Tetrazyklische Antidepressiva ...... 39 8.3.1 Mianserin ...... 39 8.3.2 Maprotilin ...... 40 8.4 Selektive-Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmer ...... 41 8.4.1 Sertralin ...... 41 8.4.2 Paroxetin ...... 42 8.4.3 Fluoxetin ...... 43 8.4.4 Citalopram ...... 44 8.4.5 Alaproclate ...... 45 8.5 Selektive-Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (NRI) - Reboxetin ...... 46 8.6 Noradrenalin- und selektiver Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (NaSSA) – Mirtazapin ...... 47 9 Diskussion ...... 48 9.1 ASM-Inhibtoren finden sich in den unterschiedlichsten Antidepressiva- Klassen ...... 48 9.2 Bewertung der Ergebnisse ...... 49 9.3 Lysosomotropismus als mögliche Erklärung der klinischen Latenz von Antidepressiva ...... 53 9.4 Therapeutische Konzentrationen von Antidepressiva hemmen ASM ohne pathologisch zu niedrige ASM-Restaktivität zu erzeugen ...... 55 9.5 Spezifische Hemmung der ASM durch therapeutische Konzentrationen Antidepressiva ...... 56 9.6 ASM-Hemmung ist bei vielen Krankheitsbildern von Vorteil...... 56 9.7 Die verwendeten Antidepressiva hemmen die sekretierte Form der ASM nicht 58 9.8 Vorteile und Limitationen des verwendeten Zellkulturmodells ...... 58 9.9 Die Chance der erweiterten klinischen Anwendung der ASM-hemmenden Antidepressiva ...... 59 10 Literaturverzeichnis...... 61 11 Abkürzungsverzeichnis ...... 70 12 Abbildungsverzeichnis ...... 72 13 Anhang ...... 73 13.1 Chemikalien ...... 73 13.2 Hilfsmittel ...... 74 13.3 Geräte und Apparaturen ...... 74 13.4 Kommerziell erhältliche Systeme ...... 74 14 Danksagung ...... 75

1 Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

Die saure Sphingomyelinase (ASM) nimmt eine entscheidende Rolle im Sphingolipid- stoffwechsel ein, indem sie die Hydrolyse von Sphingomyelin zu Ceramid und Phos- phorylcholin katalysiert. Hierrüber ist die ASM am normalen Zellmembranumsatz be- teiligt und reguliert über ihr Reaktionsprodukt, dem bioaktiven Lipid Ceramid, intrazel- luläre Signalkaskaden. Initiiert werden diese Signalkaskaden durch diverse Stressstimu- li, die zu einer Aktivitätssteigerung der ASM führen und somit eine erhöhte Produktion an Ceramid verursachen. Ceramid stellt ein bioaktives Lipid dar und ist in der Lage Apoptose zu induzieren. Liegt, wie bei ASM knock-out Mäusen, ein Defizit der ASM vor, so bewirkt dies unter zellulären Stressbedingungen einen Schutz des Gewebes vor Apoptose. Darüber hinaus findet sich bei einer Vielzahl von Krankheitsbildern eine dysregulierte, meist jedoch erhöhte Aktivität der ASM. Wie seit längerem bekannt sind kationisch amphiphile Substanzen (KAS) wie Antidepressiva in der Lage die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. KAS induzieren eine Verdrängung der ASM von der inneren Lysosomenmembran, was zu einer Inaktivierung der ASM führt und sie somit funktionell inhibiert. Kationisch amphiphile Substanzen, die die ASM funktionell inhibieren bezeichnet man als FIASMAs ( Functional Inhibitor of Acid SphingoMyelinAse ). Die Inhibition der ASM wurde in vorausgehenden Studien allerdings mit Substanzkon- zentrationen gemessen, die um ein Vielfaches über den Konzentrationen lagen, die im Plasma von Patienten unter Antidepressivatherapie vorliegen. Somit war Ziel dieser Arbeit den Einfluss von Antidepressiva unterschiedlichster Klassen auf die saure Sphingomyelinase zu untersuchen und das im therapeutisch relevanten Plasmakonzent- rationsbereich.

1.2 Material und Methode

Die Hemmung der ASM durch Antidepressiva in deren therapeutisch relevanten Kon- zentrationsbereichen wurde in vitro durch ein gut etabliertes Zellkulturmodell gemessen. In diesem Zellkulturmodell wurde eine Glioblastomzelllinie (H4) für 24 Stunden mit therapeutisch relevanten Konzentrationen gebräuchlicher Antidepressiva inkubiert. Anschließend wurden die Zellen geerntet, Proteinlysate erstellt und die Proteinkonzent- ration der erhaltenen Lysate bestimmt. Die Ermittlung der ASM-Aktivität erfolgte durch 8 einen spezifischen Enzym-Aktivitätsassay. Die Enzymaktivität wurde auf die jeweils mitgeführte unbehandelte Kontrolle bezogen und in Prozent angegeben. Ausgewertet wurden die erhobenen Werte mittels Origin in einer Logistic dose response Funktion.

1.3 Ergebnisse

Unter den verwendeten Antidepressiva zeigten Reboxetin, Alaproclate und Mirtazapin keinen eindeutigen hemmenden Einfluss auf die ASM. Im therapeutischen Plasmakon- zentrationsbereich waren Amitriptylin, Desipramin, Clomipramin, Maprotilin und Fluo- xetin in der Lage die saure Sphingomyelinase zu inhibieren. Die restlichen verwendeten Antidepressiva mit Mianserin, Sertralin, Paroxetin und Citalopram erreichten zwar eine Hemmung der ASM, diese allerdings bei Konzentrationswerten, die über den therapeutisch empfohlenen Plasmaspiegeln liegen.

1.4 Schlussfolgerungen

Die Ergebnisse verdeutlichen, dass FIASMAs, die in vitro bei sehr hohen Wirkstoff- konzentrationen die ASM hemmen, in therapeutisch relevanten Konzentrationsberei- chen nicht zwangsläufig die Aktivität dieses Enzyms inhibieren. Die Identifikation von ASM-Inhibitoren, die auch in therapeutischen Konzentrationen effektiv und bereits als Medikament zugelassen sind, ermöglicht jedoch eine unkomplizierte und schnelle Auf- nahme dieser Substanzen zur Evaluation für eine erweiterte klinische Anwendung. 9

2 Abstract

2.1 Background and Aims

Acid Sphingomyelinase (ASM) plays an important role in sphingolipid catabolism, catalyzing the hydrolysis of sphingomyelin to ceramide and phosphorycholine. Thus ASM participates in normal membrane turnover and regulates ceramide-mediated intra- cellular signal transduction. ASM activity is increased by various stress stimuli and raises cellular ceramide concentrations. Ceramid is a bioactive lipid and induces apoptosis. ASM knock-out mice, which are characterized by a genetic deficiency in ASM activity, are resistant to stress-induced apoptosis. Additionally, increased ASM-activity is present in many common. Cationic amphiphile drugs, such as antidepressants, are potent inhibitors of ASM. Cationic amphiphile drugs inhibit ASM, which induces a detachment of ASM protein from inner lysosomale men- branes causing successive inactivation. These Inhibitors of ASM, which functional inhibit ASM are named FIASMAs (Functional Inhibitor of Acid SphingoMyelinAse). The inhibitory effect was shown for extreme drug concentrations, which were above the recommended therapeutic range of plasma concentration present in patients undergoing antidepressant therapy. The purpose of this work was to explore the effect of antidepressants within their recommended therapeutic range of concentration on ASM activity.

2.2 Materials and Methods

The inhibition of ASM-activity by antidepressants in their recommended therapeutic range was measured in vitro in a well-established cell-culture-model. In this model human brain neuroglioma H4 cells were incubated for 24 hours with antidepressants in their recommended therapeutic concentrations. The activity of ASM was determined in whole-cell lysates and measured in a specific enzyme-activity-assay. The enzyme- activity was measured by percent comparing to the untreated control. The results were analyzed using a dose-response function.

2.3 Results

No ASM-inhibiting effect was identified for reboxetine, alaproclate and mirtazapin. Amitriptylin, desipramine, clomipramine, maprotiline and fluoxetine were able to reduce the activity of ASM in their recommended therapeutic range of concentration. The antidepressants mianserine, sertraline, paroxetine and citalopram were also able to re- 10 duce the activity of ASM, but with concentrations that were slightly above the recommended plasma range.

2.4 Conclusion

The results demonstrate that FIASMAs which reduce ASM activity in vitro at very high concentrations do not necessarily inhibit ASM in therapeutic recommended plasma concentrations. The identification of ASM-inhibitors, which are effective in therapeutic concentrations and are already approved in clinical use, may offer the opportunity of an uncomplicated and quick evaluation of these substances for further medical use. 11

3 Sphingolipide als Teil der Zellmembran

Das fluid-mosaic-model der Zellmembran aus den 1970er Jahren deutete darauf hin, dass Zellmembranen in einem Zustand des stetigen Wandels und der Unordnung vorliegen [102]. In den folgenden Jahren konnte dieses Modell durch das Konstrukt der microdomains ergänzt werden. Diese Bereiche inmitten der Zellmembran besitzen die Fä- higkeit sich abhängig von diversen Stimuli zusammen zu lagern beziehungsweise zu reorganisieren [55]. Mit Sphingolipiden und Cholesterol angereicherte microdomains werden als lipid „rafts“ bezeichnet und spielen eine wesentliche Rolle in der Funktion der Zellmembran [3, 101]. Sphingolipide wie Sphingomyelin sind entscheidende Kom- ponenten aller Lipidmembranen des menschlichen Körpers. Vor allem als Membranli- pide im Nervensystem spielen sie eine wichtige Rolle.

4 Sphingomyelinasen

Sphingomyelinasen sind Enzyme, die die Hydrolyse von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin katalysieren [5].

Abbildung 1: Sphingomyelinase: Hydrolyse von Sphingomyelin zu Phosphorylcholin und Ceramid

Das menschliche Erbgut kodiert für unterschiedliche Sphingomyelinasen, die sich in ihrem pH-Optimum unterscheiden. Die neutrale Sphingomyelinase besitzt ihr pH- Optimum nahe 7 und findet sich in allen Zellen des menschlichen Körpers, wobei sich die höchste Aktivität der neutralen Sphingomyelinase im Gehirn nachweisen lässt [29]. Die zweite Form stellt die alkalische Sphingomyelinase dar, die ihre optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 9-9,5 hat und ausschließlich im Darm exprimiert wird [12]. 12

Vervollständigt wird die Gruppe durch die saure Sphingomyelinase (ASM), deren pH- Optimum bei einem pH-Wert von 5 liegt [5]. Die ASM ist in allen Zellen zu finden und wird durch zelluläre Stressbedingungen aktiviert. Die Tatsache, dass die ASM extensiv durch zelluläre Stresssignale in ihrer Aktivität reguliert wird zeigt, dass die pharmakologische Regulation dieses Enzyms ein interessantes Forschungsgebiet darstellt [29].

4.1 Die saure Sphingomyelinase

Die ASM wurde somit das am intensivsten beforschte Enzym dieser Gruppe. Erste Hinweise auf die Existenz eines solchen Enzyms ergaben sich bereits im Jahre 1938 [110].

4.1.1 Eigenschaften

Das Gen der sauren Sphingomyelin-Phosphodiesterase (SMPD1), was auf Chromosom 11p15.1-p15.4 lokalisiert ist, kodiert für die ASM [97]. SMPD1 liegt als imprintetes Gen vor und wird vorzugsweise vom maternalen Chromosom exprimiert, was als Form der Regulation typisch für Gene ist, welche eine entscheidende Rolle in der Entwick- lung spielen [87]. Neben der lysosomalen, enzymatisch aktiven Form existieren eine sekretorische und eine zytoplasmatische Form der ASM, die durch Spleißen, posttranslationale Modifikation und alternative zelluläre Transportmechanismen generiert werden [56].

4.1.2 ASM-Hemmung über zellbiologische Mechanismen

Die saure Sphingomyelinase stellt ein stark reguliertes Enzym dar und kann über diverse zellbiologische Mechanismen in ihrer Aktivität beeinflusst werden. Beispiele hierfür sind transkriptionelle und posttranslationale Modifikationen sowie regulatorische Fakto- ren, wie zum Beispiel der pH-Wert, Sphingolipid-Aktivator-Proteine (SAP), Tumor- suppressor-Gen p53 oder auch lysosomale Lipide wie Diacylglycerol oder Phosphatidy- linositol [56].

4.1.3 Pharmakologische Hemmung der ASM

Neben diesen zellbiologische Mechanismen der ASM-Hemmung spielt die pharmakologische Intervention und damit Hemmung der ASM eine entscheidende Rolle. Medi- kamente aus unterschiedlichsten pharmakologischen Klassen vermögen eine Inhibition der ASM zu berwirken. Darunter finden sich neben Antidepressiva Neuroleptika, Anti- 13 histaminika, Medikamente gegen Bluthochdruck, Angina pectoris oder auch funktionelle gastrointestinale Beschwerden, Muskelrelaxanzien oder auch Hustenstopper [64].

4.1.3.1 Kationisch amphiphile Substanzen

Kationisch amphiphile Substanzen (KAS) sind in vielen interessanten therapeutischen Substanzklassen vertreten. Die Klasse der Antidepressiva zeigt hierbei einen überpro- portional hohen Anteil an KAS. Die KAS, die schwache organische Basen darstellen, sind charakterisiert durch ein hohes Verteilungsvolumen im Körper und ihre Eigen- schaft sich in sauren Kompartimenten der Zelle (z.B. Lysosomen) zu konzentrieren [72]. Als chemische Gemeinsamkeit besitzen KAS ein hydrophobes Strukturelement sowie eine hydrophile Seitenkette mit einer kationisch geladenen Amingruppe [43]. Neben der sauren Sphingomyelinase hemmen kationisch amphiphile Substanzen, wie Antidepressiva, weitere lysosomale Enzyme [61, 116]. Dieser unspezifische funktionelle Mechanismus wird im Folgenden näher erläutert.

4.1.3.2 pK a und log P als entscheidende Substanzeigenschaften Bisherige Untersuchungen zeigten, dass für die Hemmung der ASM vor allem der log P sowie der pK a als Substanzeigenschaften der kationisch amphiphilen Substanzen eine entscheidende Rolle spielen. Bezüglich des log P ist darüber hinaus eine Korrelation zwischen der Akkumulation der KAS und ihrem log P-Wert gezeigt [54]. Der log P-Wert lässt eine Aussage zu, ob eine Substanz liphophile oder hydrophile Ei- genschaften besitzt. Ist der log P positiv, so zeigt die Substanz bessere Lösungseigen- schaften in Octanol und ist somit lipophil. Besitzt eine Substanz negative Werte als log P, so ist sie hydrophil. Antidepressiva zeigen aufgrund ihres positiven log P überwie- gend lipophile Substanzeigenschaften.

Der pK a entspricht dem negativen dekadischen Logarithmus der Säurekonstante K a, die eine Stoffkonstante darstellt, welche aufzeigt in welchem Maß ein Stoff in einer Gleich- gewichtsreaktion mit Wasser unter Proteolyse reagiert. Entspricht in einer Gleichge- wichtsreaktion der pK a dem pH-Wert, so liegen die Säure und die korrespondierende

Base im Verhältnis 1:1 vor. Die pK a-Werte der meisten Antidepressiva liegen über dem Wert von 8, was bedeutet, dass im sauren Milieu, wie zum Beispiel intralysosomal, überwiegend die protonierte Form, das heißt die Säure vorliegt. Frühere Studien konnten zeigen, dass ein Zusammenhang zwischen den Substanzeigen- schaften, wie pK a und log P, und der Hemmwirkung der jeweiligen Substanz besteht 14

[64]. Eine hemmende Eigenschaft auf die Aktivität zeigen demnach vor allem Substan- zen, deren pK a ≥ 8 und der log P ≥ 3 sind [Abbildung 2]. Dies macht deutlich, dass lipophile (positiver log P) Substanzen, die im sauren Milieu als protonierte Säuren (hoher pK a) vorliegen vor allem in der Lage sind die Aktivität der ASM zu inhibieren.

Abbildung 2: pK a-log P-Diagramm

Anhand ihrer pK a- und log P-Werte sind 38 Substanzen aufgetragen. Eine Hemmwirkung (Aktiv) wurde charakterisiert durch eine mindestens 50%ige Inhibition der ASM nach einer Inkubation von 24 Stunden im H4-Zellkulturmodell mit einer Substanzkonzentration von 10 µM. Modifiziert nach [64].

4.1.3.3 Die ASM wird funktionell gehemmt

Der für die hemmende Wirkung der Antidepressiva auf die lysosomale ASM entscheidende Regulationsmechanismus erfolgt mittels Degradation. Wie bereits seit Mitte der 80er Jahre bekannt, hemmen trizyklische Antidepressiva wie Desipramin oder Imipra- min die zelluläre Aktivität der ASM [2]. Grundlegend für diese Hemmung ist der saure intralysosomal pH-Wert, der durch eine ATP-abhängige Protonenpumpe aufrecht erhalten wird. Kationisch amphiphile Subs- tanzen wie Antidepressiva können aufgrund ihrer Lipophilie (positiver log P) frei über Lipidmembranen diffundieren. Nachdem sie im Inneren des Lysosoms bei saurem pH protoniert wurden, verlieren sie diese Eigenschaft (pK a im basischen). Dies wird als Lysosomotropismus bezeichnet [19]. Die kumulierten, protonierten Basen interferieren mit den ionischen Wechselwirkungen der ASM zur Lysosomenmembran und führen zu 15 einer Verdrängung [59] mit anschließender proteolytischer Spaltung und damit Inakti- vierung des Enzyms [52]. Kationisch amphiphile Substanzen wie Antidepressiva hemmen die ASM somit nicht spezifisch durch kompetitive beziehungsweise allosterische Mechanismen, sondern funktionell [Abbildung 3]. KAS, die die ASM funktionell inhibieren bezeichnet man als FIASMAs ( Functional Inhibitor of Acid SphingoMyelinAse ) [63].

Abbildung 3: Funktionelle Inhibition der ASM durch intralysosomal kumulierende schwache organische Basen. Schwache organische Basen (B) kumulieren in sauren intrazellulären Kompartimenten (1), da die lysosomale Membran für die protonierte Base (BH +) weniger permeabel ist als für die unprotonierte Base (B). Dieses Phänomen wird als Lysosomotropismus bezeichnet. Hohe Konzentrationen protonierter Ba- sen stören die Bindung der ASM zur inneren Lysosomenmembran und bewirken somit eine Verdrängung der ASM von der Membran (3). Infolgedessen erfolg die proteolytische Spaltung und damit Inaktivierung der ASM (4) [64].

4.2 Die ASM generiert das bioaktive Lipid Ceramid

Für den Umsatz von Sphingomyelin ist die saure Sphingomyelinase verantwortlich. Sie katalysiert den Abbau von Sphingomyelin in Phosphorycholin und Ceramid [103]. Ce- ramid stellt wiederrum ein bioaktives Lipid dar. Ceramid induziert Apoptose, indem es die Bündelung von CD95 ( cluster of differetiation 95) Rezeptoren auslöst. Dementspre- chend führt eine Aktivierung der ASM und die daraus resultierende Ceramidproduktion zu Apoptose [39]. Stressstimuli wie Bestrahlung, Hitzeschock oder auch UV-Licht induzieren eine Aktivitätssteigerung der ASM und führen mit dem damit vermehrt produ- ziertem Ceramid, als bioaktives Lipid, zur Apoptoseinduktion [40]. Wichtig in diesem 16

Zusammenhang ist die Entdeckung der Translokation der ASM von ursprünglich lyso- somaler beziehungsweise endosomaler Lage, hin zur Außenseite der Zelloberfläche nach unterschiedlichsten Stressstimuli auf die Zelle [35, 112]. Eine Erklärung für die Translokation der ASM erbrachte ein Modell in dem beobachtet wurde, dass Proteinki- nase C-delta (PKC δ) unter UV-Stress die ASM an einem spezifischen Serin-Rest phos- phoryliert. Diese Phosphorylierung führt hier zur Translokation der ASM und einer ver- besserten Funktion im physiologischen pH [122]. Durch Forschungsarbeiten an ASM knock-out Mäusen (ASMKO) wurde beobachtet, dass bei einem Defizit an ASM in unterschiedliche Zelltypen eine Stresseinwirkung auf die Zelle nicht wie gewöhnlich mit einer Aktivierung der ASM und vermehrten Produk- tion von Ceramid einhergeht und damit das Gewebe vor Apoptose geschützt wurde. Unter den zellulären Stressstimuli, die eine ASM-Aktivierung hervorrufen konnten sind zu nennen: Ionisierende Strahlung [92] sowie Photodynamische Therapie [99] bei human Lymphoblasten, Lipopolysaccharide (LPS) [41] und Cisplatin [86] bei Endothel- zellen, Ischämie/Reperfusions-Schäden [70], Fas- [69] und TNF-α-induzierte Apoptose bei Hepatozyten. Darüberhinaus zeigten ASMKO im Vergleich zu Wild-Typ Mäusen einen Schutz gegen T-Zell-induzierte Apoptose von Hepatozyten [58].

5 Dysregulierte ASM-Aktivität bei unterschiedlichen Krankheiten Nachdem die ASM durch unterschiedliche zelluläre Stressbedingungen aktiviert werden kann und die Produkte, der ASM katalysierten Reaktion, Apoptose auslösen können, ist es nicht verwunderlich, dass eine dysregulierte, meist erhöhte ASM-Aktivität in verschiedenen Krankheitsbildern beobachtet wird. Ob die erhöhte ASM-Aktivität die Ursa- che oder die Konsequenz der Pathologie darstellt ist bisher in den wenigsten Fällen ge- klärt. Dennoch ist die pharmakologische, funktionelle Hemmung der ASM von großem Nutzen und könnte eine erhöhte ASM-Aktivität verhindern helfen, selbst wenn die ASM-Aktivität nicht kausal für die Erkrankung ist.

5.1 Reduzierte ASM-Aktivität als Ursache der NPD

Im Jahre 1914 beschrieb der deutsche Pädiater Albert Niemann erstmals einen Patien- ten, der an der Niemann-Pick-Krankheit (NPD) litt. Diese Erkrankung beruht auf einer fehlerhaften lysosomalen Lipid-Anreicherung. 20 Jahre später wurde diese bei Patienten beobachtete Lipid-Anreicherung auf Sphingomyelin zurückgeführt [10, 14]. Wie man heute weiß kommt es neben der pathologischen Speicherung von Sphingomyelin auch 17 zur Anreicherung anderer Lipide, wie Cholesterol oder Gangliosiden, was zu diversen zellulären Fehlfunktionen führt [93]. Als Ursache für die seltene, autosomal-rezessiv vererbte, lysosomale Speicherkrankheit Niemann-Pick (Typ A und B) ist eine Mutation im SMPD1 Gen, das für die saurer Sphingomyelinase kodiert, anzusehen. Dies führt zu einer verminderten Aktivität der ASM [10, 96]. Es sind zwei Typen der Niemann-Pick-Krankheit bekannt. Der Typ A der Niemann- Pick-Erkrankung stellt die infantile Form der Erkrankung dar und ist klinisch gekenn- zeichnet durch einen schnellen, progressiven Krankheitsverlauf, der im Alter von zwei bis drei Jahren zum Tode führt. Im Gegensatz dazu, kommt es beim Typ B der NPD zu einem späteren Auftreten der Erkrankung, bei dem die Patienten von wenigen bis keinen neurologischen Symptomen, bis hin zu ernst zu nehmenden und fortschreitenden Beteiligungen innerer Organe, wie Hepatosplenomegalie, pulmonale Insuffizienz oder kardiovaskuläre Auffälligkeiten, aufweisen können [71]. Es kommt desweiteren zu unterschiedlichen Ausprägungen des klinischen Erscheinungsbildes des Typ A und B der NPD, was abhängig von Unterschieden in der Restaktivität der ASM ist. Die Restaktivi- tät beträgt dabei beim Typ A lediglich 0,15% der normalen Aktivität, beim Typ B sind es immerhin noch 4% [32]. Während die meisten klinischen Auffälligkeiten der NPD mit Lipid-Speicherungen in Lysosomen und/oder Endosomen erklärt werden können, deuten aktuelle Studien darauf hin, dass die Fehlfunktion der sauren Sphingomyelinase an der Oberfläche der Zell- membran, die einen wichtigen Beitrag zur Formation und Funktion der Zellmembran leistet, ebenfalls einen Teil der Pathophysiologie der Niemann-Pick-Krankheit erklären kann [39, 93]. Eine Studie an ASMKO Mäusen hat in diesem Zusammenhang zeigen können, dass es aufgrund der Akkumulation von Sphingolipiden, die dem ASM-Defizit geschuldet ist, zu einer Reduktion der Fluidität der Zellmembran kommt [93].

5.2 Tumorerkrankungen zeigen erniedrigte ASM-Aktivität Tumore zeichnen sich im Vergleich zu gesundem Gewebe durch eine erhöhte Prolifera- tion und reduzierte Apoptose aus. Bezogen auf die reduzierte Apoptose ist die Tatsache bemerkenswert, dass Tumoren wie das Kolonkarzinom [98], Gliome [88] oder auch Ovarialkarzinome [91] signifikant erniedrigte Level an Ceramid, einem Mediator für den programmierten Zelltod, aufweisen. Ceramid ist wie bereits erwähnt das Reaktionsprodukt der ASM, was auf eine erniedrigte Aktivität der ASM im klinischen Bereich der Tumoren schließen lässt. 18

Ceramid und somit auch die ASM spielen darüberhinaus eine wichtige Rolle in der Antwort von Tumorzellen auf unterschiedlichste Chemotherapeutika. Bei einem mit Cisplatin behandelten Kolonkarzinom fiel auf, dass es zu einer Aktivierung der ASM sowie einer vermehrten Produktion von Ceramid mit daraus folgender Apoptose kommt. Durch eine Hemmung der ASM mittels Imipramin konnte die Cisplatin- induzierte Apoptose reduziert werden [66]. Ähnliche Beobachtungen zeigten sich bei Ovarialkarzinomen, welche mit Paclitaxel, einem Mitose-Hemmstoff, behandelt wurden. Die bei Paclitaxel-Behandlung beobachtete Apoptose ist von Ceramid abhängig und Paclitaxel-resistente Tumoren sind durch eine erniedrigte Bildung an Ceramid ge- kennzeichnet [84]. Dies unterstreicht die Rolle der ASM in der chemotherapeutisch induzierten Apoptose. Neuere Studien ergaben, dass eine Transfektion humaner Gliomzellen mit ASM cDNS zu einer Sensibilisierung dieser Tumorzellen für Chemotherapien mit Doxorubicin oder Gemcitabin führen. Diese Sensibilisierung beruht auf der erhöhten ASM-Aktivität verbunden mit einem Mehr an Ceramid, welches Apoptose induziert. Gleichzeitig ist davon auszugehen, dass Doxorubicin und Gemcitabin über eine Aktivierung der ASM ihre chemotherapeutische Wirkung entfalten [33]. Hier zeigt sich die Möglichkeit einer Sen- sibilisierung von Tumoren über eine Aktivitätssteigerung der ASM, was eine interessan- te Behandlungsweise von Tumoren darstellen könnte. Bemerkenswert bleibt schließlich die Beteiligung der ASM bei toxischen Nebeneffekten der Tumortherapie, wie einem Gastrointestinalen-Syndrom nach Strahlentherapie [27] oder auch einer möglichen Sterilität nach Doxorubizin-Therapie [76]. Hier bleibt abzu- warten, ob eine spezifische Hemmung der ASM toxische Nebeneffekte einer Chemothe- rapie in gesunden Zellen minimieren hilft.

5.3 Arteriosklerose

Erste Hinweise auf einen Einfluss der sauren Sphingomyelinase in die Pathogenese der Arteriosklerose ergaben sich, als Kinder mit NPD (Typ A & B) Auffälligkeiten in ihren Blutfettprofilen zeigten, was in diesem Alter untypisch ist [74]. Eine mögliche Erklä- rung hierfür bietet ein Konzept, das auf der sekretorischen Form der ASM (S-SMase) beruht [107]. Dieses Enzym, dessen Aktivität abhängig von Zink ist und im Zellplasma sowie im Endothel vorhanden ist, besitzt die Fähigkeit das in low-density lipoprotein (LDL) vorhandene Sphingomyelin, selbst bei einem pH-Wert von 7,5, der deutlich über denen intralysosomal liegt, zu spalten. Dies führt zu einer vermehrten Aggregation der 19

LDL-Partikel im Subendothel, bedingt durch ihre erhöhte Affinität zueinander [94, 108]. Aggregierte LDL-Partikel rekrutieren Gewebemakrophagen, welche sich nach einer Zeit in Schaumzellen umwandeln. Diese nehmen über diverse Mechanismen Ein- fluss auf die Pathogenese der Arteriosklerose [119]. Die Tatsache, dass sich in humanen arteriosklerotischen Läsionen Ceramid-angereicherte, aggregierte LDL-Partikel befindet, ist ebenfalls ein Indiz für die Beteiligung der S-SMase bei der Retention von Lipop- roteinen in der extrazellulären subendothelialen Matrix [95]. Weitere Studien stellten einen Zusammenhang zwischen einem hohen Gehalt an Sphingomyelin in zirkulieren- den Lipoproteinen und einem damit verbundenem erhöhtem KHK-Risiko beim Men- schen heraus [53].

5.4 Diabetes mellitus

Diabetes mellitus, eine Stoffwechselkrankheit, die mit erhöhten Blutzuckerwerten einhergeht, stellt einen Risikofaktor für die Entwicklung einer Arteriosklerose dar. Studien ergaben hierzu, dass bei schlanken Typ-II Diabetikern die Aktivität der Zink- abhängigen, im Plasma vorhandenen ASM auf das Doppelte der Norm erhöht ist. Diese Tatsache verbunden mit der Rolle der ASM in der Pathogenese der Arteriosklerose könnten den Zusammenhang des erhöhten Risikos bei Diabetikern an Arteriosklerose zu erkranken erklären [31]. Die Skelettmuskulatur von Patienten mit Diabetes mellitus Typ II weist desweiteren erhöhte Level an Ceramid auf, welches über unterschiedlichste Mechanismen einen Beitrag an der bei Diabetikern beobachteten Insulinresistenz leisten soll [105]. Auf diesen Zusammenhang des Sphingomyelin-Stoffwechsels mit einer Insu- lin-Resistenz bezogen, zeigten Inkubationsversuche des Insulin-Rezeptor-Substrates (IRS-1) mit saurer Sphingomyelinase oder Ceramid eine Phosphorylierung des IRS-1. Dies führte zu einer Unterbrechung des Insulin-Signalweges am Rezeptor [50]. Somit stellt die ASM und ihre selektive Inhibition ein interessantes Gebiet für therapeutische Strategien zur Intervention der Entwicklung einer Arteriosklerose bei Typ-II Dia- betikern und zur Behandlung der Insulin-Resistenz dar.

5.5 Wilson-Krankheit

Die Wilson-Krankheit ist eine Speicherkrankheit bei der eine Mutation im ATP7B- Protein zu einer Akkumulation von Kupfer in vielen Organen, aber vor allem der Leber, führt. Kupfer wirkt dabei, wie andere Schwermetalle auch, zytotoxisch auf das Leber- 20 gewebe. Neben der Irritation des Leberstoffwechsels führt die Akkumulation von Kup- fer auch zu Symptomen im kardialen, hämatopoetischen und auch nervalen System. In Studien konnte gezeigt werden, dass eine Exposition von Hepatozyten mit Kupfer die ASM aktiviert und die zelluläre Ceramidkonzentration erhöht. Durch die bioaktive Funktion des Ceramid wird schließlich Apoptose induziert. In vivo zeigten Patienten, die an der Wilson-Krankheit leiden, erhöhte ASM-Aktivität im Plasma. Hepatozyten aus ASMKO-Mäusen sowie humane HepG2 Zellen, deren ASM-Aktivität durch Amit- riptylin oder ASM-spezifische siRNA gehemmt wurde, wiesen einen Schutz gegenüber Kupfer-induzierter Apoptose auf. Schließlich bleibt noch ein Morbus-Wilson- Rattenmodell zu erwähnen, bei dem mittels pharmakologischer Inhibition der ASM, eine Leberzirrhose verhindert und ein erhöhtes Überleben gesichert werden konnte [68].

5.6 Infektionen

Ein Einfluss der sauren Sphingomyelinase wurde ebenfalls bei vielen Infektionen gezeigt, darunter Infektionen mit Staphylococcus aureus [23], Salmonella thyphimurium [73], Escherichia coli [24], Mycobacterien [115] und Pseudomonas aeruginosa [120]. Letzteres Bakterium hat besondere Auswirkungen auf Patienten mit systemischen Infek- tionen, Cystischer Fibrose oder beatmungs-assoziierten Pneumonien. Kommt es zu einer Infektion von Lungenepithel mit Pseudomonas aeruginosa , oder anderen Pathoge- nen, führt dies bei der ASM zu deren schneller Aktivierung und Translokation an den extrazellulären Anteil der Zellmembran [36]. Diese Aktivierung der sauren Sphingo- myelinase an der Zellaußenseite führt zur Bildung von Ceramid-angereicherten rafts , welche entscheidend für die Aufnahme des Bakteriums in die Zelle, die Einleitung des Zelltodes sowie der schrittweisen Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen sind. Bei einer Infektion mit Neisseria gonorrhoe wurde ermittelt, dass durch eine sowohl pharmakologisch mittels Imipramin als auch genetisch (ASMKO-Mäuse) bewirkte Hemmung der ASM ein Eindringen von Neisseria gonorrhoe in Epithelzellen [34] und phagozytische Zellen verhindert werden kann. Bei der pharmakologischen Hemmung zeigte sich eine dosisabhängige Reduktion der Bakterieninvasion [47]. Eine Infektion menschlicher Epithelzellen mit pathologischen Rhinoviren wird ebenfalls über Ceramid-angereicherte rafts vermittelt und lässt sich durch genetische und pharmakologische Hemmung der ASM blocken [37]. 21

Verschiedenste Pathogene lassen somit erahnen welch großen Einfluss die ASM in Verbindung mit ihrem Hydrolyseprodukt Ceramid in der Pathophysiologie von ver- schiedensten Infektionskrankheiten besitzt.

5.7 Endotoxischer Schock und Inflammation

In Modellen zum Lipopolysaccahrid (LPS)-induzierten endotoxischem Schock konnte gezeigt werden, dass ASMKO Mäuse letale LPS-Dosen überleben [41]. Makrophagen benötigen zur LPS-induzierten Stressantwort eine Aktivierung des Toll-like Rezeptor 4 Komplexes (TLR4). Dieser Rezeptorkomplex benötigt wiederum Ceramid- angereicherte microdomains , sogenannte lipid rafts , um sich aufzubauen. Das für die lipid rafts nötige Ceramid entstammt der Reaktion, die die ASM katalysiert. Somit besteht eine Verbindung zwischen der ASM-Aktivität und dem durch LPS induzierten Zellstress. Untermauert wird diese Tatsache durch die Möglichkeit, die Formierung des TLR4-Komplexes über eine pharmakologische Hemmung der ASM mittels Imipramin zu unterbinden. Desweiteren blockierte Imipramin eine LPS-induzierte Freisetzung von TNF-α [17]. ASMKO-Mäuse, welchen das SMPD1-Gen, das für die ASM kodiert, fehlt, zeigten erhöhte Überlebensraten bei endotoxischem Schock. Dies unterstreicht die Rolle der sauren Sphingomyelinase im Zusammenhang mit apoptotischem Zelltod [13].

5.8 Emphysem und Cystische Fibrose

Bei dem Endstadium vieler chronischer Lungenerkrankungen, dem Emphysem, was vor allem durch Zigarettenrauch verursacht wird, konnte gezeigt werden, dass Ceramid ein entscheidender Mediator für die alveolären Schädigung ist, die bei einem Lungen- emphysem auftritt. Intratracheale Instillationen von Ceramid in Wild-Typ Mäuse verur- sachten eine Emphysembildung, während die Reduktion von Ceramid diese verhinder- ten. Auf den Menschen bezogen, finden sich bei rauchenden Emphysempatienten erhöh- te Level an Ceramid im Lungengewebe [83]. Nicht nur bei der Pathophysiologie des Emphysems sondern auch in der der Cystischen Fibrose (CF) spielt die saure Sphingomyelinase eine Rolle. Bei Patienten mit CF sowie im Mausmodell weisen Studien darauf hin, dass in der Zellmembran der Lungengewebe erhöhte Level an Ceramid vorliegen. Desweiteren führte eine pharmakologische Hem- mung der ASM mittels Amitriptylin zu einer Normalisierung der Ceramid Level und einem Schutz des Lungenepithels vor einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa [109]. Dieser Schutz vor einer Infektion mit Pseudomonas konnte bei CF-Mäusen auch 22 mittels einer Inhalation von ASM-Inhibitoren wie Amitriptylin, Desipramin, Fluoxetin aber auch Sertralin erreicht werden. Die Inhalation hatte dabei keine systemischen Ef- fekte [8]. Darüber hinaus stellte die Anreicherung eines transmembranen Regulators (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator / CFTR) in rafts einen entscheidenden Faktor zur Abwehr einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa dar und fehlte CF-Patienten aufgrund ihres genetischen Defekts [65]. Eine klinische Studie an CF-Patienten konnte zeigen, dass bei drei von vier CF- Patienten eine 14-tägige Therapie mit Amitriptylin, im Vergleich zur Placebotherapie, zu einer signifikanten Verbesserung ihres forcierten endexspiratorischen 1-Sekunden- Volumens (FEV1) führte. Amitriptylin könnte somit eine sichere und effiziente Anwen- dung bei Patienten mit Cystischer Fibrose finden [90].

5.9 Neuropsychiatrische Krankheitsbilder: Depression, Alzheimer, Apop- lex Eine Lebenserwartung von wenigen Jahren verbunden mit neurologischen Auffälligkei- ten bei Patienten mit Niemann-Pick Typ A lässt darauf schließen, dass die ASM- Aktivität einen wichtigen Stellenwert in der normalen Hirnfunktion einnimmt [71]. Ne- ben der NPD spielt die ASM-Aktivität aber auch bei anderen neurologischen Krankhei- ten, wie Depression, Alzheimer oder auch bei einer Ischämie des Hirngewebes eine Rol- le. In einer prospektiven Fall-Kontroll-Studie an Patienten mit depressiver Episode konnte in peripheren Blutzellen eine erhöhte Aktivität der sauren Sphingomyelinase nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Antidepressiva wie Imip- ramin und Amitriptylin zu einer Reduktion dieser Aktivitätssteigerung führen [61]. In frühen klinischen Stadien der Alzheimer Erkrankung konnten erhöhte Level an Ce- ramid in Patientenhirnen festgestellt werden [44]. Spätere Studien ergänzten die Ergeb- nisse indem gezeigt wurde, dass ebenfalls ein erhöhtes Aktivitätsniveau der ASM sowie erniedrigte Level an Sphingosine-1-Phosphat (S1P) vorliegen. Das bei der Alzheimer- Erkrankung im Gehirn aggregierte Amyloid-beta-Protein führte hierbei zu einer Akti- vierung der ASM im Zellkulturmodell, einem Anstieg von Ceramid im Gewebe und einer gesteigerten Apoptoserate [49]. Ein ischämischer Insult stellt ein schwerwiegendes Krankheitsbild dar. Eine wichtige Rolle spielt hierbei ebenfalls die Signalkaskade rund um die saure Sphingomyelinase. Es zeigte sich bei einer transienten zerebralen Ischämie eine steigende Aktivität der 23

ASM, erhöhte Level an Ceramid sowie die Ausschüttung inflammatorischer Zytokine in Wild-Typ-Mäusen, nicht jedoch in ASMKO-Mäusen. ASMKO-Mäuse als auch Wild- Typ-Mäuse unter pharmakologischer Hemmung der ASM wiesen darüber hinaus einen geringeren Gewebeschaden sowie ein geringeres Verhaltensdefizit in der Nachbeobach- tung des Insults auf [121]. Zusammengenommen zeigt die Aktivität der ASM nicht nur bei der NPD sondern auch bei anderen neurologischen Krankheitsbildern ihren Einfluss. Daher verspricht die pharmakologische Regulierung der ASM neue Ansätze für Therapiestrategien.

6 Ziele der Arbeit

Die ASM und ihre Reaktionsprodukte nehmen entscheidenden Einfluss auf zelluläre Lipidmembranen und die Pathophysiologie unterschiedlichster Krankheitsbilder. Hier- bei finden sich, mit Ausnahme der NPD und den Tumorerkrankungen, überwiegend erhöhte Aktivitätsgrade der ASM, wobei die expliziten Regulationsmechanismen, welche zu diesen führen noch unbekannt sind. FIASMAs beziehungsweise kationisch amphiphile Substanzen wie Antidepressiva, die in der Lage sind die ASM funktionell zu inhibieren, bieten eine enorme Chance für neue therapeutische Strategien. Dies beruht auf der Tatsache, dass diese Art der pharmakologischen Intervention unabhängig vom zu Grunde liegenden Aktivierungsmechanismus über die Degradation der ASM deren Aktivität reduziert. Es wurde bereits für unterschiedlichste Antidepressiva in experi- mentellen Systemen eine Hemmung der ASM gezeigt, nur lagen die dazu verwendeten Konzentrationen des jeweiligen Antidepressivums meist weit über den bei Therapie physiologisch auftretenden Plasmakonzentrationen. In dieser Arbeit wurde die tatsächliche Hemmwirkung von Antidepressiva unterschiedlichster Klassen in deren therapeutischen und damit physiologischen auftretenden Kon- zentrationen untersucht. 24

7 Material und Methoden

7.1 Material

7.1.1 Eukaryote Zellen

Zelllinie: H4 Herkunft: Glioblastom (human) Referenz: PMid: 4544026

7.1.2 Puffer und Lösungen

Medium: Dulbecco´s Mem 500 ml Glutamin 4 mM Penicillin/Streptomycin 1% FCS 10%

PBS: NaCl 80 g KCl 2 g

Na 2HPO 4 11,5 g

KH 2PO 4 2 g pH mit HCl auf 7,4 eingestellt

H20bidest ad 1000 ml

Enzympuffer: Natriumacetat pH 5.0 250 mM EDTA 1,3 mM NP40 0,1%

Lysepuffer: Natriumacetat pH 5.0 250 mM EDTA 1,3 mM NP40 0,1% Complete EDTA-Tabletten (1 Tablette/10 ml) 25

7.1.3 Verwendete Wirkstoffe

Alle verwendeten Wirkstoffen stammen aus der Substanzklasse der Antidepressiva. Antidepressiva zeichnen sich durch die von ihnen vermittelte Verbesserung depressiver Symptome aus. Abhängig von der Substanz wirken Antidepressiva depressionslösend und stimmungsaufhellend sowie psychomotorisch aktivierend oder dämpfend. Der ge- naue Wirkmechanismus ist noch nicht endgültig geklärt. Klar ist dagegen, dass Antidep- ressiva den Neurotransmitter-Stoffwechsel beeinflussen und ebenfalls auf Rezeptorebe- ne Einfluss nehmen [77].

7.1.3.1 Trizyklische Antidepressiva

Namensgebend für diese Gruppe von Antidepressiva ist ein trizyklischer Anteil in der chemischen Struktur. Die Wirkungsweise beruht auf einer nichtselektiven Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmung sowie einen Neurotransmitter-Rezeptor blockierendem Effekt. Eine zusätzliche Beeinflussung von α1-Adrenorezeptoren und eine Blockade muscarinerger Rezeptoren begründet eine Vielzahl der Nebenwirkungen [77].

7.1.3.1.1 Amitriptylin

Unter den trizyklischen Antidepressiva stellt Amitriptylin [pubchem CID 2160] die Standartsubstanz dar. Seine Wirkung entfaltet es über eine Wiederaufnahmehemmung von Noradrenalin und Serotonin im synaptischen Spalt monoaminergen Neuronen, was zu einer potenzierten Wirkung der Neurotransmitter führt. Amitriptylin interagiert desweiteren mit muscarinergen und α1-adrenergen Rezeptoren, worin sich die sedativen und anticholinergen Eigenschaften begründen [85]. MW: 277,5 g/mol [6] Empfohlener therapeutischer Plasma-Konzentrations-Bereich (ETPKB): 0,288-0,721 µM [6] pK a: 9,40 [64] log P: 5,04 [64] Halbwertszeit (HWZ): 16 h [117]

Lösungsmittel: H2O

7.1.3.1.2 Desipramin

Eine trizyklische chemische Struktur in Form eines Dibenzazepin stellt Desipramin [pubchem CID 2995] dar. Seine Wirkung besteht in einer selektiven Wiederaufnahme- hemmung von Noradrenalin am synaptischen Spalt und einem anzunehmenden Eingrei- fen in den Serotonintransport. Eine als Nebeneffekt einzustufende anticholinerge Wir- kung wird durch eine Affinität zum muscarinergen Rezeptor vermittelt. MW: 266,5 g/mol [6] ETPKB: 0,375-1,126 µM [6] pK a: 10,20 [64] log P: 4,90 [64] HWZ: 21 h [45]

Lösungsmittel: H2O

7.1.3.1.3 Clomipramin Verwand mit dem ebenfalls trizyklischem Antidepressivum Imipramin [pubchem CID 2801] führt Clomipramin zu einer selektiven Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmung im Gehirn. Dies bewirkt eine erhöhte Konzentration von Serotonin im synaptischen Spalt was wiederrum eine vermehrte Aktivierung der Serotoninrezeptoren bedingt. Das klinische Einsatzgebiet erstreckt sich neben depressiven Syndromen in Panik- und Zwangs- störungen, die Schmerztherapie, sowie die Adipositas- und Bulimiebehandlung. Es ist gut gastrointestinal resorbierbar und wird in der Leber mittels Demethylierung in seinen aktiven Metaboliten Desmethylclomipramine überführt [85]. Bezüglich seiner Wirkungsweise wäre eine Zuordnung von Clomipramin in die Gruppe der SNRIs ebenfalls denkbar [111]. MW: 315,0 g/mol [6] ETPKB: 0,556-1,429 µM [6] pKa: 9,38 [64] log P: 5,19 [64] HWZ: 24 h [4]

Lösungsmittel: H2O

7.1.3.2 Tetrazyklische Antidepressiva

Eine tetrazyklische chemische Struktur und ihre antidepressive Wirkung definieren diese Gruppe [77]. 27

7.1.3.2.1 Mianserin

Die Wirkungsweise von Mianserin [pubchem CID 4184] besteht vor allem in einer an- tagonistischen Blocke von α-adrenergen Rezeptoren. Darüber hinaus ist ein Antagonis- mus bei Histamin (H1)- und einigen Typen von Serotoninrezeptoren anzutreffen. Häma- tologische Nebenwirkungen, wie Agranulozytosen oder aplastische Anämien, sowie Benommenheits- beziehungsweise Schläfrigkeitszustände wurden bei der Therapie mit Mianserin vereinzelt beobachtet [85]. MW: 264,4 g/mol [6] ETPKB: 0,057-0,265 µM [6] pK a: 8,26 [64] log P: 3,67 [64] HWZ: 10-27 h [100] Lösungsmittel: Ethanol

7.1.3.2.2 Maprotilin

Ein sowohl funktionell als auch mechanistisch den Trizyklischen ähnliches, jedoch den Tetrazyklischen zugehöriges Antidepressivum stellt Maprotilin [pubchem CID 4011] dar. Als Besonderheit findet sich in der chemischen Struktur ein Brückenringsystem. MW: 277,5 g/mol [6] ETPKB: 0,45-0,721 µM [6] pK a: 10,50 [64] log P: 4,50 [64] HWZ: 43 h [118]

Lösungsmittel: H2O

7.1.3.3 Selektive-Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (SSRI)

Wie der Name bereits ableiten lässt besteht die Wirkung der Gruppe der SSRI in einer spezifischen Wiederaufnahmehemmung von Serotonin im Gehirn [77]. In der Therapie depressiver Syndrome gelten Sie als Mittel der ersten Wahl, da sie sich aus Gründen der leichteren Therapieeinstellung, den geringeren störenden Nebeneffekten, einer größeren Sicherheit bei Überdosierungen und nicht zuletzt aufgrund ihrer effektiveren Wirkung gegen die Trizyklischen durchgesetzt haben. Neben depressiven Syndromen finden sie Anwendung bei Angststörungen, dem Prämenstruellen Syndrom oder der Bulimie [111]. 28

7.1.3.3.1 Sertralin

Sertralin [pubchem CID 68617] führt nicht nur zu einer Blockade der Serotonin- Wiederaufnahme sondern blockiert ebenfalls die Wiederaufnahme von Dopamin [30]. Als unerwünschte Nebenwirkungen treten neben kardiovaskulären und extrapyramida- len [67] Effekten auch sexuelle Funktionsstörungen auf [89]. MW: 306,2 g/mol [6] ETPKB: 0,033-0,163 µM [6] pK a: 9,16 [64] log P: 4,30 [64] HWZ: 25 h [21] Lösungsmittel: DMSO

7.1.3.3.2 Paroxetin

Aufgrund seiner hohen Affinität zum muscarinergen Acetylcholinrezeptor, der Höch- sten in der Klasse der SSRI [80], besitzt Paroxetin [pubchem CID 43815] die Eigen- schaft durch seine moderate anticholinerge Sedation, Krankheitsbilder wie Schlaflosig- keit oder Angststörungen positiv zu beeinflussen [78]. Darüberhinaus besitzt Paroxetin im Verhältnis zu den anderen SSRIs eine stärkere hemmende Wirkung auf die Noradre- nalin-Wiederaufnahme [18, 28]. MW: 329,4 g/mol [6] ETPKB: 0,213-0,364 µM [6] pK a: 9,51 [64] log P: 3,89 [64] HWZ: 24 h [20] Lösungsmittel: DMSO

7.1.3.3.3 Fluoxetin

Verglichen mit den anderen Antidepressiva aus der Gruppe der selektiven Serotonin Wiederaufnahme ist Fluoxetin [pubchem CID 3386] ein potenterer Inhibitor des 5-

HT 2c -Rezeptors [81]. Diese Hemmung moduliert das Noradrenalin- und Dopaminsys- tem im Gehirn und führt hierüber zu einer Aktivierung sowie einem Gewichtsverlust [11]. Dieser Effekt ist bei antriebsarmen Patienten durchaus erwünscht, verfehlt jedoch bei ängstlichen Patienten mit Schlaflosigkeit oder Agitiertheit die gewünschte Wirkung.

MW: 309,3 g/mol [6] ETPKB: 0,388-0,970 µM [6] pK a: 9,50 [64] log P: 4,05 [64] HWZ: 24-72 h [82]

Lösungsmittel: H2O

7.1.3.3.4 Citalopram

Citalopram [pubchem CID 2771] ist einer der selektivsten SSRIs und besitzt so gut wie keine aktivierenden beziehungsweise sedierenden Eigenschaften. Annähernd keine Wechselwirkung besteht mit dem Noradrenalin-Rezeptor, dagegen besitzt Citalopram die höchste Affinität zum Histamin-H1-Rezeptor in der Gruppe der selektiven Serotonin Wiederaufnahme Hemmern [80]. Unerwünschte Nebenwirkung bestehen in einer mög- lichen Gewichtszunahme, Konzentrationsschwäche sowie in einer sexueller Dysfunkti- on [9, 46]. MW: 324,4 g/mol [6] ETPKB: 0,092-0,401 µM [6] pK a: 9,50 [64] log P: 2,51 [64] HWZ: 33 h [75]

Lösungsmittel: H2O

7.1.3.3.5 Alaproclate

Einen der älteren spezifischen Serotonin-Wiederaufnahmehemmer repräsentiert Alap- roclate [pubchem CID 2081]. Andere Rezeptoren wie 5-HT, Histamin-H1, α1-, α2- adrenerg sowie Dopamin D2-Rezeptoren werden nicht beeinflusst. Auffällig ist eine in vivo regional selektive Wiederaufnahmehemmung von Serotonin, besonders ausgeprägt im Hippocampus und Hypothalamus [79]. MW: 255.7 [g/mol] [pubchem CID 2081] ETPKB: 0,4-2 µM [106] pK a: 7,76 [64] log P: 2,93 [64] HWZ: 5 h [106]

Lösungsmittel: H2O 30

7.1.3.4 Selektive-Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (NRI) - Rebo- xetin

Seine hohe Affinität zum Noradrenalin-Rezeptor machen Reboxetin [pubchem CID 65856] zu einem, im Vergleich zu trizyklischen Antidepressiva, sehr nebenwirkungsar- men Medikament. Im Gegensatz zu den SSRI kommen unerwünschte Arzneimittelwir- kungen wie sexuelle Dysfunktion oder gastrointestinale Störungen bei Reboxetin selte- ner vor [42]. MW: 313,4 g/mol [6] ETPKB: 0,032-0,319 µM [6] pK a: 8,37 [64] log P: 2,82 [64] HWZ: 12 h [25]

Lösungsmittel: H2O

7.1.3.5 Noradrenalin- und selektiver Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (NaSSA) – Mirtazapin

Von der Struktur einem tetrazyklischen Antidepressivum ähnlich gehört Mirtazapin

[pubchem CID 4205] in die Gruppe der NaSSA und agiert als ein Antagonist am α2- adrenergen Rezeptor sowie an postsynaptischen 5-HT 2 und 5-HT 3 Rezeptoren. Deswei- teren besitzt Mirtazapin antagonistische Eigenschaften am Muskarin-Rezeptor sowie insbesondere am Histamin-H1 Rezeptor. In der Therapie der Depression aber auch für andere psychiatrische Indikationen steht mit Mirtazapin ein effektives Medikament zur Verfügung. Stark sedierende Eigenschaften, Mundtrockenheit, Schwindel sowie gestei- gerter Appetit verbunden mit Gewichtszunahme stellen unerwünschte Nebenwirkungen dar [15]. MW: 265,4 g/mol [6] ETPKB: 0,151-0,301 µM [6] pK a: 7,30 [64] log P: 2,75 [64] HWZ: 20-40 h [113] Lösungsmittel: DMSO 31

7.2 Methoden

7.2.1 Zellkultur

Kultiviert wurden H4-Zellen, die einer Glioblastom-Zelllinie angehören. Die Kultur der H4-Zellen erfolgte in Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) bei 37°C und 5%

CO 2. Zugesetzt wurde dem Grundmedium 4 mM Glutamin, 1 % Penicil- lin/Streptomycin sowie 10% FCS. Für die Routinezellkultur erfolgte eine regelmäßige Splittung der Zellen in T75-Zellkulturflaschen. Dazu wurde das überschüssige Medium entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend 5 Minuten mit Trypsin inkubiert bevor das Resubstituieren der Zellen mit vorgewärmten Medium erfolgte. Um im Anschluss 1x10 6 Zellen pro T75 neu auszubringen zu können, wurde eine Zählung der Zellen mittels des Casy-Systems durchgeführt.

7.2.1.1 Bestimmung der Zellzahl

Mit Hilfe des Casy-Systems (Innovatis/Schärfe Systhems) erfolgten die Zählung der Zellen sowie die Überprüfung auf deren Viabilität und Aggregation, um die Qualität der Zellen stetig zu überwachen. Das Casy-System beruht auf ISO 13319, was der interna- tionalen standardisierten Referenzmethode für Partikelzählungen entspricht. Darüber hinaus ermöglich die zusätzlich integrierte Puls-Flächen-Analyse einen maximierten Informationsgewinn bezüglich der Zellbeschaffenheit.

7.2.1.2 Mykoplasmentestung

Mykoplasmen wurden lange Zeit in der fortlaufenden Zellkultur als gewöhnliche Kon- tamination erachtet. Mittlerweile ist allerdings bekannt, dass ihre Präsenz zu einem Konkurrieren der kultivierten Zelle und der Mykoplasmen um die im Medium vorhandenen Nährstoffe führt. Ausdruck eines mangelten Nährstoffangebotes ist eine reduzier- tee Zellproliferationsrate sowie Veränderungen in der Zellantwort. Aus diesem Grund erfolgte eine regelmäßige Testung der H4-Zellen auf Mykoplasmen-Kontamination mittels MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Köln), welche sich stets als negativ erwies.

7.2.1.3 Hemmung der ASM

Für die Hemmung der ASM wurden die H4-Zellen mit 1,5 x 10 5 Zellen pro Well aus- gebracht und für 24 Stunden kultiviert. Anschließend erfolgte die Stimulation mit Anti- depressiva in einer Konzentrationsreihe. Als Kontrolle diente das entsprechende subs- 32 tanzspezifische Lösungsmittel. Unter den erwähnten Standardbedingungen wurden die Zellen weitere 24 Stunden kultiviert, worauf im Anschluss die Ernte der Zellen und die Proteinlysatgewinnung folgte.

7.2.1.4 Erstellung von Proteinlysaten

Um aus den adhärenten Zellen das gesamte Protein zu gewinnen wurde zunächst das Medium entfernt, um anschließend die Zellen zweimalig mit PBS zu waschen. Darauf- hin wurden 100 µl Lysepuffer pro Well zugegeben und für eine Stunde bei 4°C inkubiert. Um die unlöslichen Zellbestandteile abzutrennen, wurden die Zelllysate für 10 Minuten bei 16000 g und 4°C zentrifugiert und schließlich das Proteinlysat abgenommen und bei -80°C gelagert.

7.2.2 Proteinkonzentrationsbestimmung Der BCA Assay (Perbio, Bonn) diente der Bestimmung der Proteinkonzentration in den Zelllysaten. Basis dieser kolorimetrischen Messung stellt die Biuret-Reaktion dar, die dadurch charakterisiert ist, dass nach Zugabe von Kupfer-Ionen zu Proteinen in alkali- scher Lösung eine Komplexbildung und eine Reduktion des Kupfers vonstatten gehen. Die durch die Komplexbildung verursachte violette Farbreaktion ist stabil, proportional zur Proteinkonzentration und lässt sich mittels eines Photometers kolorimetrisch quanti- fizieren [104]. Zu Beginn der Bestimmung der Proteinkonzentrationen erfolgte die Verdünnung der Proben. Dazu wurden 10 µl Zelllysat mit 240 µl Lysepuffer vermischt. Anschließend erfolgte die Herstellung der BSA-Eichlösungen. Dazu wurde der BSA-Standard mit Lysepuffer so verdünnt, dass 7 Eichlösungen in den Konzentrationen 5, 10, 15, 25, 50, 75 und 100 µg BSA/ml entstanden. Für die zusätzlich benötigte BCA-Färbelösung wurde zu 5 ml BCA 100 µl 4%iges Kupfersulfat (CuSO 4) beigefügt. Die Durchführung des BCA-Assay geschieht mittels einer Doppelbestimmung. Dazu werden Blank(s), die 7 Eichlösungen sowie die Probenverdünnungen jeweils mit 2 x 100 µl in die Mikrotitierplatte (96-well) pipettiert. Anschließend pipettiert man jeweils 100 µl BCA-Färbelösung zu jedem Ansatz dazu. Dann werden die Ansätze für 30 Mi- nuten bei 37°C inkubiert bevor die auswertende Messung im Microplate-Reader (Bio- Rad) vonstatten geht. Hierbei erfolgt die Messung mit einem dualen Filtersystem (Mes- sungs-Filter 550 nm, Referenz-Filter 655 nm). Bei der Messung besteht eine Korrelation zwischen der Absorption und der Proteinkonzentration. Der Vergleich der Absorpti- 33 onswerte der Proben mit den mitgeführten Standards lässt aufgrund der Korrelation die anschließende Bestimmung der Proteinkonzentrationen der Proben zu.

7.2.3 Bestimmung der ASM-Aktivität

14 C-Sphingomyelin, das radioaktiv markierte Substrat der ASM, dient der Bestimmung der Enzymaktivität der ASM. Die saure Sphingomyelinase, die im Zelllysat enthalten ist, vermittelt die Spaltung von 14 C-Sphingomyelin in 14 C-Phosphorylcholin und Cera- mid. Ein Chloroform-Methanol-Gemisches stoppt diese Reaktion und führt zu einer Phasentrennung in eine lipophile und eine hydrophile Phase. Während das ungespaltene Substrat 14 C-Sphingomyelin und Ceramid in der lipophilen Phase verbleiben, ist in der hydrophilen, wässrigen Phase das Reaktionsprodukt 14 C-Phosphorylcholin zu finden. 14 C ist ein β-Strahler, der mittels Flüssigszintillation nachgewiesen wird. Zur Durchführung des Versuchs erfolgt eingangs die Verdünnung von jeweils circa 10 µg Proteinlysat in 250 µl Lysepuffer. Das zu Beginn getrocknet vorliegende, radioaktiv markierte Substrat 14 C-Sphingomyelin (4620 pM/4,62 nM-PerkinElmer, NEC-663) wird anschließend in 315 µl Enzympuffer rekonstituiert, für 10 Minuten im Ultraschallwas- serbad beschallt und kurz anzentrifugiert. 30 µl (440 pmol) dieses in Enzympuffer ge- lösten Substrats werden anschließend zu den verdünnten Proteinlysaten (10 µg in 250 µl) gegeben. Daraufhin wird dieses Gemisch für 20 Minuten bei 37°C unter leichter Bewegung (Thermoschüttler, 350 rpm Rotation) inkubiert. Durch Zugabe von 800 µl Chloroform/Methanol-Gemisch (Verhältnis 2:1) wird diese Reaktion gestoppt. Mit dem Ziel der Phasentrennung werden die Ansätze dann für 5 min bei 16.000 g Rotation zentrifugiert und darauffolgend 200 µl aus der wässrigen Oberphase abgenommen und in ein Countröhrchen überführt. Diese 200 µl entsprechen hierbei 2/5 des umgesetzten Substrats [34]. Somit ist es mit einer Probe der wässrigen, 14 C-Phosphorylcholin-haltigen Phase und der Flüssigszintillationszählung möglich, eine quantitative Aussage über die Aktivität der ASM zu treffen. Schließlich erfolgt die Berechnung der ASM-Aktivität in nmol Substratumsatz/ µg Pro- tein/h Reaktionszeit. Dieser Wert wird auf die jeweilige substanzspezfische Kontrolle, welche bei jedem Experiment mitgeführt wurde, bezogen und ergibt somit einen Aktivi- tätswert der ASM in % bezogen auf die Kontrolle. 34

7.2.4 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der erhobenen Daten erfolgte mit Hilfe von Origin (Version 8.1G). Es wurde eine Logistic dose response in Pharmacology/Chemistry Funktion aus- gewählt und die Daten damit gefittet. Die Funktionsgleichung lautet:

A − A y = 1 2 + A + p 2 1 x /( x0 ) y = Hemmung ASM [%] x = Konzentration Competitor [µM] A1 = maximaler y-Wert A2 = minimaler y-Wert x0 = IC50 (Konzentration der halbmaximalen Hemmung) p = power Die Gewichtung erfolgte auf die jeweilige Standardabweichung. Desweiteren wurde A1 auf Werte zwischen 70 und 120 % sowie A2 auf Werte zwischen 0 und 40 % be- schränkt. 35

8 Ergebnisse

8.1 Antidepressiva unterschiedlichster Klassen hemmen die ASM

In zahlreichen Studien wurde bisher gezeigt, dass kationisch amphiphile Substanzen die saure Sphingomyelinase hemmen. Leider wurde dieser Effekt bisher nur in sehr hohen, physiologisch irrelevanten Konzentrationen dieser Verbindungen nachgewiesen. In der Gruppe der Antidepressiva finden sich sehr viele kationisch amphiphile Substanzen. Sie sind in allen Klassen der Antidepressiva vertreten. Zudem sind die Plasmakonzentratio- nen dieser Medikamente sehr gut charakterisiert. Mit dem Ziel den Einfluss solcher Wirkstoffe auf die Aktivität der ASM im therapeutisch relevanten Konzentrationsbe- reich zu analysieren, wurde ein etabliertes Zellkulturmodell genutzt. 36

8.2 Trizyklische Antidepressiva

8.2.1 Amitriptylin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Amitriptylin [µM]

Abbildung 4: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Amitriptylin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Amitriptylin inkubiert [0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/3/5/10 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Proteinkon- zentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations-Bereich von Amitriptylin [0,288-0,721 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unab- hängigen Versuchen.

Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen Amitriptylin und der ASM-Aktivität zeigt einen logarithmischen Verlauf. Die maximale ASM-Akitvität im Vergleich zur Kontrol- le H2O liegt bei 87,2% und fällt unter dem Einfluss von Amitriptylin konzentrationsab- hängig [0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/3/5/10 µM] auf einen minimalen Wert von 13,4%. Im Empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations-Bereich [0,288-0,721 µM] fällt die ASM-Aktivität von 82,1% auf 66,9% ab. Der IC50, das heißt der Konzentrations- wert bei dem eine halbmaximale Hemmung der ASM vorliegt, hat einen Wert von 1,24

µM. Die Funktion besitzt in diesem Punkt eine Steigung von -26,6. 37

8.2.2 Desipramin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Desipramin [µM]

Abbildung 5: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Desipramin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Desipramin inkubiert [0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Proteinkon- zentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations-Bereich von Desipramin [0,375-1,126 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unab- hängigen Versuchen.

Wie die Graphik zeigt, bewirkt Desipramin konzentrationsabhängig [0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM] eine Hemmung der sauren Sphingomyelinase im

Vergleich zur Kontrolle H2O. Die Aktivität fällt hier von maximal 85,5% auf 18,8% ab. Die logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung verdeutlicht im Bereich der therapeutisch empfohlenen Plasmakonzentration [0,375-1,126 µM] ebenfalls einen Abfall der Aktivität von 74,5% auf 51,2%. Desipramin besitzt einen IC50 von 1,1 µM. Die Stei- gung des Graphen beträgt in diesem Punkt -23,3. 38

8.2.3 Clomipramin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Clomipramin [µM]

Abbildung 6: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Clomipramin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Clomipramin inkubiert [0,1/0,25/0,5/0,75/1/1,5/2,5/3/5/10]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Proteinkon- zentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations-Bereich von Clomipramin [0,556-1,429 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unab- hängigen Versuchen.

Clomipramin zeigt im Vergleich zu den anderen verwendeten trizyklischen Antidepres- siva keinen sigmoidalen Kurvenverlauf. Die Beziehung entspricht eher einem linearen Verlauf mit konzentrationsabhängiger [0,1/0,25/0,5/0,75/1/1,5/2,5/3/5/10] Abnahme der ASM-Aktivität. Der Mittelwert aus den drei unabhängigen Versuchen mit einer Clomip- ramin-Konzentration von 10 µM beträgt 18,05% Restaktivität der ASM und bestätigt somit einen hemmenden Einfluss. Auffällig ist eine hohe Standardabweichung bei den ermittelten Restaktivitäten nach Stimulation mit 0,1 und 0,25 µM Clomipramin. Zwi- schen 0,5 und 1,5 µM, was in etwa dem therapeutischen Bereich entspricht [0,556-1,429 µM], nimmt die ASM-Aktivität von 76,92% auf 39,07% ab. 39

8.3 Tetrazyklische Antidepressiva

8.3.1 Mianserin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Mianserin [µM]

Abbildung 7: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Mianserin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Mianserin inkubiert [0,01/0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Pro- teinkonzentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations- Bereich von Mianserin [0,057-0,265 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen.

Die logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen Mianserin und der ASM- Aktivität wurde in einer Konzentrationsreihe [0,01/0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM] untersucht. Es kommt zu einer Hemmung von ursprünglich 105,2% auf minimale Werte von 8,2%. Im ETPKB [0,057-0,265 µM] nimmt die Aktivität der ASM von 102,9% auf 91,7% ab. Somit findet der Hauptteil der Hemmung bei Konzentrationen statt, die über dem empfohlenen Plasmakonzentrationsbereich liegen. Die halbmaximale Hemmung (IC50) liegt bei 1,15 µM. Bei diesem Wert fällt die Kurve mit einer Steigung von -26,2. 40

8.3.2 Maprotilin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Maprotilin [µM]

Abbildung 8: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Maprotilin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Maprotilin inkubiert [0,1/0,25/0,5/0,75/0,85/1/1,25/1,5/2,5/5/10 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Proteinkonzentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma- Konzentrations-Bereich von Maprotilin [0,45-0,721 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen.

Die Auswertung der ASM-Aktivität nach 24 Stunden Stimulation mit Maprotilin erbrachte diese logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung, die eine Hemmung der ASM zeigt. Die Aktivitätswerte der ASM sinken unter dem Einfluss von Maprotilin von 108,3% auf ein Minimum von 8,7% im Vergleich zur Kontrolle ab. Im therapeutischen Bereich [0,45-0,721 µM] nimmt die Aktivität der sauren Sphingomyelinase von 66% auf 44,6% ab. Der IC50-Wert, in dem die Kurvensteigung bei -87,7 liegt, befindet sich bei 0,53 µM. 41

8.4 Selektive-Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmer

8.4.1 Sertralin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Sertralin [µM]

Abbildung 9: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Sertralin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Sertralin inkubiert [0,01/0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1,5/3 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Protein- konzentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations- Bereich von Sertralin [0,033-0,163 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen.

Mit einer Konzentrationsreihe [0,01/0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1,5/3 µM] wurde die Bezie- hung von Sertralin auf die ASM-Aktivität ermittelt und in einer dose -response -Kurve dargestellt. Sertralin bewirkt eine Aktivitätsabnahme der ASM von 99,2% auf 10,3%. Im therapeutischen empfohlenen Plasma-Konzentrations-Bereich [0,033-0,163 µM] fällt die Aktivität der ASM von 96,6% auf 78,3% ab. Der IC50 liegt bei 0,366 µM. Die Steigung der Funktion beträgt in diesem Punkt -88,4. 42

8.4.2 Paroxetin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Paroxetin [µM]

Abbildung 10: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Paroxetin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Paroxetin inkubiert [0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/3/5 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Proteinkon- zentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations-Bereich von Paroxetin [0,213-0,364 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unabhän- gigen Versuchen.

Die logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Paroxetin wurde in einer Konzent- rationsreihe [0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/3/5 µM] untersucht und zeigt einen sigmoiden Kurvenverlauf, der bei einer Konzentration um 0,4 µM beginnt. Dieser Wert entspricht in etwa dem oberen Ende des Plasma-Konzentrationsspiegels, welcher therapeutisch empfohlen wird [0,213-0,364 µM]. Somit zeigt Paroxetin zwar eine eindeutige Hemm- wirkung auf die ASM bis auf Werte um 14% verglichen zur Kontrolle DMSO, aber keine Hemmung im therapeutischen Bereich, in welchem die ASM-Aktivität lediglich von 106,2% auf 104,2% abfällt. Somit kommt es erst zu einer Abnahme der ASM- Aktivität bei im Vergleich zum ETPKB höheren Konzentrationswerten. Die Steigung des Graphen beträgt bei 1,21 µM Paroxetin, was dem IC50 entspricht, -57,4. 43

8.4.3 Fluoxetin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Fluoxetin [µM]

Abbildung 11: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Fluoxetin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Fluoxetin inkubiert [0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/3/5 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Proteinkonzent- ration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations-Bereich von Fluoxetin [0,388-0,970 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unabhän- gigen Versuchen.

Logarithmisch in einer dose -response -Kurve aufgetragen sieht man eine konzentrati- onsabhängige [0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/3/5 µM] Hemmung der ASM durch das Antidep- ressivum Fluoxetin. Im Vergleich zur Kontrolle Wasser fällt die Aktivität der sauren Sphingomyelinase unter dem Einfluss von Fluoxetin von 93,9% auf 5,7% ab. Im ETPKB [0,388-0,970 µM] ist ebenfalls eine Hemmung von 78,3% auf 39,7% zu sehen. Der Wert der halbmaximalen Hemmung (IC50) liegt bei 0,8 µM. Die Funktion besitzt in diesem Punkt eine Steigung von -61,4. 44

8.4.4 Citalopram

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Citalopram [µM]

Abbildung 12: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Citalopram auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Citalopram inkubiert [0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Protein- konzentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations- Bereich von Citalopram [0,092-0,401 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen.

Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen Citalopram und der ASM-Aktivität zeigt einen logarithmischen Verlauf. Die maximale ASM-Akitvität im Vergleich zur Kontrolle liegt bei 106,2% und fällt unter dem Einfluss von Clomipramin konzentrationsabhängig [0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM] auf einen minimalen Wert von 25,1%. Im Emp- fohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations-Bereich [0,092-0,401 µM] fällt die ASM-Aktivität von 105,7% auf 101,3% ab, liegt damit aber nicht unter dem Kontroll- wert. Eine ausgeprägtere Hemmwirkung auf die ASM-Aktivität ist ab Konzentrations- werten von 1 µM zu sehen und liegt damit über dem ETPKB. Die Steigung der Funkti- on beträgt bei 2,25 µM (IC50) -14,4. 45

8.4.5 Alaproclate

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Alaproclate [µM]

Abbildung 13: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Alaproclate auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Alaproclate inkubiert [0,01/0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Pro- teinkonzentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations- Bereich von Alaproclate [0,4-2 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unab- hängigen Versuchen.

Alaproclate zeigt im Vergleich zu den anderen untersuchten Selektiven-Serotonin- Wiederaufnahme-Inhibitoren keinen sigmoidalen Verlauf der Dosis-Wirkungs- Beziehung. Die Funktion zeigt eher einen konzentrationsabhängigen [0,01/0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM], linearen Abfall der ASM-Aktivität. Bei der Stimulationsreihe mit 5 µM Alaproclate sinkt die Aktivität auf im Mittel 74,97% Rest- aktivität. Verdoppelt man die Konzentration des Medikaments auf 10 µM sind es im Mittel noch 38,69%. Im therapeutischen Bereich [0,4-2 µM] ist keine eindeutige Hemmwirkung von Alaproclate auf die ASM zu verzeichnen. 46

8.5 Selektive-Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (NRI) - Reboxe- tin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Reboxetin [µM]

Abbildung 14: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Reboxetin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Reboxetin inkubiert [0,01/0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/5/10 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Protein- konzentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations- Bereich von Reboxetin [0,032-0,319 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen.

Eine weitere Substanz, die keinen sigmoidalen Verlauf der Dosis-Wirk-Beziehung zeigt ist Reboxetin. Die mit einer Konzentrationsreihe [0,01/0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/5/10 µM] von Reboxetin ermittelte dose-response -Kurve zeigt einen nahezu linearen Verlauf. Bei der höchsten verwendeten Konzentration von 10 µM des Antidepressivums nahm die Aktivität der ASM auf einen Wert von 65,34% ab. Bei der nächstniedrigeren der verwendeten Konzetrationen (5 µM) zeigte sich noch eine Aktivität von 122,34% im Ver- gleich zur Kontrolle. Im empfohlenen Bereich der Plasma-Konzentration des Medika- ments [0,032-0,319 µM] ist keine Hemmung der ASM ersichtlich. 47

8.6 Noradrenalin- und selektiver Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (NaSSA) – Mirtazapin

0,01 0,1 1 10 160 160

140 140

120 120

100 100

80 80

60 60

ASM-Restaktivität 40 40

[%bezogen auf Kontrolle] 20 20

0 0 0,01 0,1 1 10 Mirtazapin [µM]

Abbildung 15: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Mirtazapin auf die ASM-Aktivität. H4-Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Mirtazapin inkubiert [0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM]. Nach der Ernte der Zellen wurden diese lysiert und die Protein- konzentration der Zelllysate bestimmt. Anschließend wurde die ASM-Aktivität im Zelllysat ermittelt und in Substratumsatz/mg Protein/h berechnet. Angegeben ist die ASM-Aktivität in % bezogen auf die substanzspezifische Kontrolle. aaa Entspricht dem empfohlenen therapeutischen Plasma-Konzentrations- Bereich von Mirtazapin [0,151-0,301 µM]. Die angegebenen Werte repräsentieren die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen.

Einen angedeuteten sigmoidalen Verlauf nimmt die Dosis-Wirkungs-Kurve von Mirta- zapin. Die ebenfalls mittels einer Konzentrationsreihe [0,05/0,1/0,25/0,5/0,75/1/2,5/5/10 µM] ermittelte Beziehung zeigt tendenziell eine Inhibition der ASM mit steigender Me- dikamentenkonzentration. Die minimale Aktivität wird bei 2,5 µM gemessen und be- trägt im Mittel 33,92% im Vergleich zur Kontrolle DMSO. Eine weitere Steigerung der Konzentration von Mirtazapin führt zu gemessenen Restaktivitäten von 46,53% bei 5 µM und 68,31% bei 10 µM. Im therapeutischen Plasma-Konzentrations-Bereich [0,151- 0,301 µM] fällt die Aktivität der sauren Sphingomyelinase von 78,0 % auf 70,9 %. Der IC50 liegt bei 0,45 µM. 48

9 Diskussion

9.1 ASM-Inhibtoren finden sich in den unterschiedlichsten Antidepressiva- Klassen

Betrachtet man die Klassen der verwendeten Antidepressiva so zeigen vorhergehende Untersuchungen, dass in fast allen Klassen von Antidepressiva ASM-Inhibitoren zu finden sind [64]. Diese Inhibitoren hemmen die ASM funktionell, charakterisieren sich chemisch als kationisch amphiphile Substanzen und werden als FIASMAs ( Functional Inhibitor of Acid SphingoMyelinAse ) bezeichnet [63]. Die hier durchgeführten Versuche mit therapeutischen Substanzkonzentrationen konnten diese Beobachtung bestätigen. Ausnahme bildeten sowohl bei früheren Studien als auch bei der aktuellen Arbeit die Klassen der Selektiven-Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (NRI) mit ihrem Vertreter Reboxetin und die Klasse der Noradrenalin- und selektiven Serotonin- Wiederaufnahmehemmer (NaSSA), für die Mirtazapin beispielhaft untersucht wurde. Bei diesen beiden Substanzen konnten die Untersuchungen keine eindeutigen Hemm- wirkungen zeigen. Für die Tri- und Tetrazyklischen Antidepressiva verdeutlichten die Experimente für jede der untersuchten Medikamente inhibitorische Einflüsse auf die saure Sphingomyelinase. In der Gruppe der SSRI war diese Hemmwirkung ebenfalls bei allen verwendeten Strukturen, mit Ausnahme von Alaproclate zu beobachten. Somit finden sich in nahezu allen Antidepressiva Klassen Inhibitoren der ASM. Bezieht man die Hemmwirkung allerdings auf den empfohlenen therapeutischen Plasma- Konzentrations-Bereich und definiert einen im therapeutischen wirksamen ASM- Inhibitor durch eine minimale Hemmwirkung auf 55% ASM-Restaktivität, so weisen diese Eigenschaft lediglich Desipramin (51,2%), Clomipramin (39,07%), Maprotilin (44,6%) und Fluoxetin (39,7%) auf. Insgesamt konnte die bei bereits durchgeführten Studien beobachtete, funktionelle Hemmung der ASM durch Antidepressiva insoweit konkretisiert werden, dass eine Hemmung auch bei therapeutisch, im Menschen vorkommenden Konzentrationen auftritt. Diese Aussage ist entscheidend, um von einer hemmenden Wirkung der verwendeten Antidepressiva im menschlichen Körper auszugehen und eröffnet somit die Mög- lichkeit der erweiterten Anwendung von Antidepressiva in diversen Krankheitsprozes- sen mit erhöhter Aktivität der ASM. 49

9.2 Bewertung der Ergebnisse

Im Vergleich zu vorangegangenen Studien zeigt diese Arbeit, dass ein in vitro identifi- zierter ASM-Inhibitor unter therapeutischen Bedingungen nicht zwangsläufig die die saure Sphingomyelinase hemmt. Das trizyklische Antidepressivum Amitriptylin wurde als FIASMA identifiziert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen einen Abfall der ASM-Aktivität im therapeutischen Bereich sowie eine minimale Restaktivität von 13,4% im Vergleich zur Kontrolle bei einer verwendeten Konzentration von 10 µM. Bei vorrausgehenden Untersuchungen konnte eine Hemmwirkung in hohen Konzentrationen ebenfalls beobachtet werden. Diese Arbeit zeigt, dass Amitriptylin auch unter therapeutischen Bedingungen in der Lage ist die ASM zu hemmen [64, 68]. Die Untersuchungen zu Desipramin, einem weiteren trizyklischen Antidepressiva bestä- tigten ebenfalls die Ergebnisse vorrausgehender Studien, bei welchen Desipramin in sehr hohen Konzentrationen (10 µM) die ASM hemmt [16].

Desweiteren sind die Steigungswerte von Amitriptylin (log P 5,04 / pK a 9,40) und De- sipramin (log P 4,90 / pK a 10,20) im Punkt der halbmaximalen Hemmung (IC50) nahezu identisch. Außerdem zeigten beide Substanzen eine deutliche Abnahme der ASM- Aktivität in ihrem jeweiligen therapeutisch im Plasma zu findenden Konzentrationsbe- reich. Bei Amitriptylin fiel die Aktivität in diesem Bereich bis auf 66,9% Restaktivität, bei Desipramin sogar bis auf 51,2%. Diese ähnlichen Ergebnisse sind wohl in der bis auf eine Methylgruppe identischen chemischen Struktur sowie dadurch bedingter ähnli- cher Substanzeigenschaften (log P, pK a) begründet. Die Reduktion der ASM-Aktivität um 34,1% bzw. 48,8% ist ein deutlicher Effekt, der in vivo zu einer entscheidenden Veränderung des Sphingolipidstoffwechsels führen sollte. Die Ergebnisse des ebenfalls trizyklischen Clomipramin besitzen dazu im Gegensatz keinen sigmoidalen Kurvenverlauf der Dosis-Wirkungs-Beziehung. Dies liegt vermut- lich an den hohen Standardabweichungen bei den ersten zwei verwendeten Konzentra- tionen [0,1/0,25 µM], da dies zu einer geringeren Gewichtung der Werte führt. Somit ist keine verlässliche Aussage über die Wirkung im niedrigen Konzentrationsbereich von Clomipramin auf die ASM zu treffen. Bei hohen Konzentrationen von 1 µM oder höher ist allerdings eine deutliche Hemmwirkung erkennbar (10µM / 18%). Dieser Trend fiel schon in früheren Studien mit einer Restaktivität der ASM von 21,76 % nach 30 minü- tiger Stimulation mit 10 µM Clomipramin auf [64]. 50

Mit einer funktionellen Hemmung der ASM im therapeutischen Konzentrationsbereich von 60,93% kann man davon ausgehen, dass Clomipramin auch unter therapeutischen Bedingungen, wie einer oralen Therapie mit Clomipramin, den Sphingolipidmetabolis- mus beeinflusst. Letztlich bleibt noch erwähnenswert, dass Doxepin, ein weiteres trizyklisches Antidep- ressivum nach einer 30 minütigen Stimulation der Zellen mit einer Konzentration von 10 µM eine Restaktivität der ASM von 46,6% bewirkt [64]. Dies unterstreicht den ver- mutlich hohen Anteil der auf die ASM hemmend wirkenden Substanzen in der Klasse der trizyklischen Antidepressiva. Die beiden verwendeten tetrazyklischen Antidepressiva Mianserin und Maprotilin zeigen beide eindeutige, sigmoidale Kurvenverläufe der Dosis-Wirkungs-Beziehung in Form einer Hemmung auf die ASM-Aktivität. Vergleicht man die beiden Hemmwir- kungen der tetrazyklischen Antidepressiva miteinander fällt ein großer Unterschied in den Kurvensteigungen auf. Diese liegen bei Mianserin bei -26,2 und bei Maprotilin bei - 87,7 und wurden im jeweiligen Konzentrationswert der halbmaximalen Hemmung gemessen. Dies ist womöglich abhängig von Substanzeigenschaften wie dem log P oder auch dem pK a. Beide Werte sind bei Maprotilin etwas höher als bei Mianserin [64]. Aus diesem Grund ist Maprotilin etwas lipophiler sowie leichter protonierbar und erfüllt damit die chemischen Voraussetzungen, welche zum Lysosomotropismus [19] und zur ASM-Hemmung [52, 59] führen, besser als Mianserin. Dies könnte die besseren Hemmeigenschaften von Maprotilin im Vergleich zu Mianserin erklären. In einer vorausgegangenen Arbeit wurde bei einer Inkubationszeit von 30 Minuten und einer Konzentration von 10 µM Mianserin keine ASM-Hemmung festgestellt. In dieser Studie reduzierte Mianserin im therapeutischen Konzentrationsbereich bei einer Inkuba- tion von 24 Stunden die ASM um 8,3%. Unter therapeutischen Gesichtspunkten könnte dieser geringe Effekt jedoch dennoch von Bedeutung sein, da Medikamente dieser Klas- se meist über längere Zeiträume verabreicht werden. Die Tatsache, dass Maprotilin in therapeutischen Konzentrationen die ASM-Aktivität um 55,4% reduziert, könnte auch in den lysosomotropen, chemischen Eigenschaften von Maprotilin begründet sein. Eine weitere Möglichkeit diese Unterschiede zu erklären, könnte in der unterschiedlichen Halbwertszeit der Substanzen zu finden sein. Die HWZ von Mianserin liegt im Mittel zwischen 10 und 24 Stunden [100]. Die HWZ von Maprotilin ist mit 43 Stunden [118] sehr lang. Somit wäre durchaus denkbar, dass bei längerfristiger Stimulation mit konzentrationsstabilen Verhältnissen (HWZ berücksichtigt) mit Mianserin der ASM- 51 hemmende Effekt deutlicher wird. Eine langfristige Therapie mit Mianserin könnte de- mentsprechend dazu führen, dass die ASM-Hemmung effektiver wird als in den Expe- rimenten dieser Studie. Bei der nächsten untersuchten Gruppe von Antidepressiva handelt es sich um Selektive- Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (SSRI). In einer vorrausgehenden Studie bewirkte eine halbstündige Stimulation mit 10 µM Sertralin eine Abnahme der ASM- Aktivität um 87,7% [64]. Nach einer Stimulationsdauer von 24 Stunden reichten bereits 3 µM um eine Restaktivität von 10,3% zu bewirken. Dies bestätigt die gute Hemmwir- kung von Sertralin, vor allem nach längeren Stimulationsdauern. Im therapeutischen Wirkbereich zeigt sich allerdings nur eine Abnahme der ASM-Aktivität von 96,6% auf 78,3%. Die Erklärung für diese im Vergleich zu anderen Antidepressiva nur relativ geringe Abnahme in diesem Bereich bleibt offen. Die HWZ, welche bei 25 Stunden [21] liegt dürfte die erhaltenen Ergebnisse nicht beeinflussen. Eine Steigung von -88,4 im Wert der halbmaximalen Hemmung (IC50) lässt sich wiederrum durch die für den

Hemmmechanismus wichtigen Substanzeigenschaften eines hohen log P (4,30) und pK a (9,16) erklären. Paroxetin zeigt ebenfalls eine eindeutige inhibitorische Wirkung auf die Aktivität der ASM. Darüberhinaus zeigt sich keine entscheidende Hemmung im therapeutischen Konzentrationsbereich, wo die Aktivität im Mittel lediglich von 106,2% auf 104,2% abfällt. Die HWZ von Paroxetin ist mit 24 Stunden, bezogen auf die durchgeführten Experimente, die ebenfalls eine 24 stündige Stimulation beinhalten, genau an der Gren- ze. Desweiteren hat Paroxetin einen sehr niedrigen log P-Wert (3,89). Somit bleibt offen, ob längerfristige Stimulationen im therapeutischen Konzentrationsbereich die lysosomale Konzentration von Paroxetin erhöhen und damit eine bessere Hemmung ermög- lichen könnten. Bei kürzeren Stimulationsversuchen mit einer eingesetzten Konzentrati- on von 10 µM konnte eine Hemmung bis auf einen Restwert von 31,7% ASM-Aktivität verzeichnet werden. Eventuell kompensiert hier die hohe Konzentration die relativ niedrige Lipophilie. Fluoxetin ist der SSRI mit dem besten ASM-Hemmpotential im therapeutischen Be- reich. Hier ist eine Abnahme der ASM-Aktivität von 78,3% auf 39,7% zu verzeichnen. Dies könnte daran liegen, dass Fluoxetin zum einen eine mit 24-72 Stunden sehr lange HWZ besitzt und zum anderen einen aktiven Metaboliten aufweist, der ebenfalls in der Lage ist die ASM zu inhibieren und dessen HWZ zwischen 7 und 15 Tagen beträgt [82]. Die von einer vorrausgehenden Studie mit 10 µM Fluoxetin erreichte Restaktivität 52 von 13% nach 30 Minuten Stimulation konnte bei einer Stimulationsdauer von 24 Stun- den auf 5% gedrückt werden und wurde mit einer Konzentration von 5 µM erreicht. Diese Tatsache unterstreicht die exzellente Hemmwirkung von Fluoxetin. Als nächstes SSRI wurde Citalopram untersucht. Hier ist eine Hemmung bis auf eine Restaktivität der ASM von 25,1% nach 24 Stunden Stimulation erkennbar. Allerdings zeigt sich keine eindeutige Hemmung im therapeutischen Konzentrationsbereich, da hier die Aktivität im Mittel lediglich von 105,7% auf 101,3% abfällt. Eine 30 minütige Stimulation mit 10 µM erbrachte in vorhergehenden Studien die Erkenntnis, dass Cita- lopram unter diesen Bedingungen die ASM lediglich auf eine Restaktivität von 79,9% reduzieren kann. Eine Erklärung hierfür und auch für die geringe Hemmwirkung von Citalopram in dessen therapeutischen Bereich ist im log P und damit den lipophilen Eigenschaften von Citalopram zu finden [64]. Der log P ist mit 2,51 im Vergleich zu den anderen verwendeten Antidepressiva eher gering ausgeprägt und lässt Spekulatio- nen zu, ob sich über eine Stimulation über mehr als 24 Stunden eine verbesserte Hemmwirkung im therapeutischen Bereich erzielen lässt. Ein möglicher Ausdruck der geringen Lipophiie ist auch die Steigung der Funktion bei IC50. Diese stellt sich mit - 14,41 im Vergleich zu den anderen Substanzen auch als eher gering dar. In einer vorhergehenden Studie konnte für Alaproclate kein hemmender Effekt auf die ASM-Aktivität nachgewiesen werden [64]. In dieser Studie wurden die Zellen für 30 Minuten mit einer Alaproclate-Konzentration von 10 µM behandelt und eine Rest- Aktivität von 93,3% beobachtet. Nachdem die therapeutische Konzentration für diese Substanz zwischen 0,4 und 2 µM liegen [106] war diese verwendete Konzentration 25- 5x zu hoch. Allerdings könnte die Inkubationszeit von 30 Minuten zu kurz sein, um eine messbare ASM-Hemmung zu erzeugen. Eine 24 stündige Inkubation mit Alaproclate zeigte eine Hemmung der ASM Aktivität auf eine Restaktivität von 38,69% bei einer, wie in der vorrausgehenden Studie, verwendeten Konzentration von 10 µM. Allerdings zeigte sich kein sigmoidaler Kurvenverlauf und eine nur gering ausgeprägte Hemmung im therapeutischen Wirkbereich von Alaproclate, was an der mit 5 Stunden recht kurzen HWZ liegen könnte [106]. Auffallend ist der deutliche Unterschied der Restaktivitäten bei einem Einsatz von 10 µM Alaproclate (30 min / 93,3%, 24 h / 38,69%). Zum einen wäre die 48-fache Einwirkzeit eine Erklärung, zum anderen sind aber auch toxische Effekte von Alaproclate auf die Zellen und damit verbundener sinkender ASM- Aktivität, unabhängig von lysosomotropen Effekten, denkbar. 53

Die Dosis-Wirkungs-Beziehung von Reboxetin, einem Selektiven-Noradrenalin- Wiederaufnahme-Inhibitor, auf die ASM-Aktivität zeigt keine eindeutige Hemmwir- kung der Substanz und damit auch keinen sigmoidalen Kurvenverlauf. Vorrausgehende Studien kamen nach einer Stimulation von 30 Minuten und einer Konzentration von 10 µM Reboxetin mit einer daraus resultierenden Restaktivität von 105,3% ebenfalls zu dem Ergebnis, dass keine hemmende Wirkung vorliegt [64]. Auffällig ist die Restaktivi- tät der ASM von 65,34% bei einer Stimulationsdauer von 24 Stunden und einer Kon- zentration wie in der früheren Studie von 10 µM. Eine Erklärung ist womöglich in dem, im Vergleich zu den anderen verwendeten Substanzen geringen, log P (2,82) zu sehen. Die niedrige Lipophilie könnte Reboxetin somit über eine längere Einwirkdauer kom- pensieren. Die letzte, auf ihre ASM hemmenden Eigenschaften hin untersuchte, Substanz ist der Noradrenalin- und selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Mirtazapin. Untersu- chungen mit einer Stimulationsdauer von 30 Minuten und einer Mirtazapin- Konzentration von 10 µM zeigten keinen hemmenden Einfluss von Mirtazapin auf die saure Sphingomyelinase. Die Restaktivität lag hier im Vergleich zur Kontrolle bei 100,2%. Die durchgeführten Experimente mit einer Stimulationsdauer von 24 Stunden zeigten einen leichten Effekt auf die ASM-Aktivität. Im therapeutischen Plasma- Konzentrationsbereich nahm die ASM-Aktivität von 78% auf 70,9% ab. Betrachtet man die chemische Struktur von Mirtazapin und vergleicht diese mit der von Mianserin so stellt man fest, dass bis auf einen Stickstoff in einer Ringstruktur, den Mirtazapin mehr beinhaltet, die chemischen Strukturen der beiden Substanzen identisch sind. Bezogen auf die Hemmwirkung auf die saure Sphingomyelinase zeigt Mianserin aber deutlichere

Unterschiede zu Mirtazapin. Mianserin (log P 3,67 / pK a 8,26) erreicht in hohen Kon- zentrationen von 10 µM eine Restaktivität der ASM von 8,2% während Mirtazapin (log

P 2,75 / pK a 7,30) unter gleichen Bedingungen die ASM auf eine Aktivität von 68,31% hemmt. Die höheren und damit für den Mechanismus des Lysosomotropismus besseren

Werte für log P und pK a von Mianserin könnten hier den Unterschied ausmachen.

9.3 Lysosomotropismus als mögliche Erklärung der klinischen Latenz von Antidepressiva

Wie aus der Therapie depressiver Patienten bekannt, stellt die Latenz bis zum Eintritt der antidepressiven Wirkung der Antidepressiva ein Problem dar. Eine pharmakokineti- sche Hypothese macht für diese therapeutische Latenz die langsame intrazelluläre Ak- 54 kumulation der Antidepressiva verantwortlich. Viele Antidepressiva stellen kationisch amphiphile Substanzen dar, die durch ein hohes Verteilungsvolumen im menschlichen Körper und ihre Eigenschaft sich in sauren Kompartimenten der Zelle zu konzentrieren charakterisiert sind. Diese Anreicherung in sauren Kompartimenten, wie zum Beispiel den Lysosomen, erfolgt über den Mechnismus des Lysosomotropismus [19]. Ein Beispiel hierfür stellt das Antidepressivum Fluoxetin dar. Nach wiederholter oraler Verabreichung der therapeutischen Dosis von 20-60 mg Fluoxetin pro Tag wurde bei den behandelten Patienten ein Blutkonzentration von 0,7 µM gemessen [7]. Im Hirnge- webe hingegen wurden Plateau-Konzentrationswerte von Fluoxetin und seinem Meta- boliten Norfluoxetine von 10-30 µM nachgewiesen [57]. Um die Plateau-Konzentration im Hirngewebe und somit auch ein Konzentrationsgleichgewicht zwischen dem Raum intra- und extralysosomal zu erreichen war eine Therapie über einen Zeitraum zwischen 6 und 8 Monaten nötig, was eine Erklärung für die therapeutische Latenz wäre. Ein Grund für die lange Dauer der Einstellung einer Plateau-Konzentration im Hirnge- webe liegt eventuell in der im Vergleich zum hohen Verteilungsvolumen geringen Menge an verabreichter Substanz. Eine weitere Erklärung ist in der enormen Gewebe- bindung und dem hohen Verteilungsvolumen, welche die kationisch amphiphilen Subs- tanzen aufgrund ihrer Substanzeigenschaften unterliegen, zu suchen. Diese führen zu einer langsamen Gewebesättigung verbunden mit langsamen Erreichen der Plateau- Konzentration und könnten somit die therapeutische Latenz ebenfalls begründen [62]. Die Experimente im Zellkulturmodell und einer 24 stündigen Stimulation mit Fluoxetin zeigen eine deutliche Hemmung der ASM im therapeutischen Konzentrationsbereich (0,7 µM). Es wurde für das genutzte Zellkulturmodell bereits gezeigt, dass Antidepres- siva sich innerhalb von Stunden im Lysosom anreichern [60]. Somit ist im Zellkultur- modell bereits nach einigen Stunden von einem Konzentrations-Gleichgewicht zwischen dem Lysosom und dem extralysosomalen Raum für die jeweilig verwendete Substanz auszugehen. Die Zeit bis zum Erreichen des Gleichgewichts ist dabei abhän- gig von der Gewebegängigkeit beziehungsweise der Lipophilie, welche durch den log P-Wert beschrieben wird. Je größer dieser Wert, desto leichter penetrieren Substanzen zelluläre Membranen und desto kürzer ist somit die Zeit bis zum Erreichen des Kon- zentrationsgleichgewichts. Im menschlichen Körper, wie am Bespiel Fluoxetin zu sehen, kommt es erst nach 6-8 Monaten zum Erreichen dieses Konzentrations- Gleichgewichts. Aufgrund dessen lassen die Ergebnisse aus den Zellkulturexperimenten eine Aussage über den Einfluss der Antidepressiva auf die ASM nach Erreichen des 55

Konzentrations-Gleichgewichts im menschlichen Organismus zu. Fluoxetin, das in der Zellkultur nach 24 Stunden einen hemmenden Einfluss auf die ASM zeigt, sollte diesen auch im menschlichen Körper nach einer Latenz von 6-8 Monaten aufweisen beziehungsweise abhängig von der Halbwertszeit und der lysosomotropen Eigenschaftgen eine stärkere ASM-Hemmung ermöglichen. Bei Citalopram ist das Hirn/Plasma-Verhältnis mit 6,7:1 [26] kleiner als bei anderen Substanzen. Darüber hinaus besitzt Citalopram mit 2,51 den kleinsten log P aller verwendeten Antidepressiva. Diese geringe Lipophilie verbunden mit dem kleinen Hirn/Plasma-Verhältnis könnten dazu führen, dass mehr Zeit nötig ist, damit sich Cita- lopram im Lysosom konzentrieren kann. Dies wäre wiederrum eine Erklärung, dass eine Hemmung der ASM erst bei Citalopram-Konzentrationen stattfindet, die über den therapeutisch empfohlen Plasmakonzentration liegen.

9.4 Therapeutische Konzentrationen von Antidepressiva hemmen ASM ohne pathologisch zu niedrige ASM-Restaktivität zu erzeugen

Bemerkenswert ist weiterhin die Tatsache, dass alle eingesetzten Antidepressiva keine vollständige Hemmung der ASM bewirkten. Vielmehr erfolgte die Hemmung der ASM im therapeutischen Bereich nur teilweise. Die Restaktivität variiert zwischen den eingesetzten, hemmenden Substanzen und liegt zwischen 91,7% bei Mianserin und lediglich noch 39,07% bei Clomipramin in deren jeweiligen therapeutischen Konzentrationsbe- reichen. Diese in vitro Ergebnisse zeigten sich ebenfalls in vivo [8]. Wie man am Krankheitsbild Niemann-Pick sieht, wird durch eine zu geringe Aktivität der sauren Sphingomyelinase die Pathologie verursacht. Hier zeigt der Typ A eine Rest- aktivität von 0,15%, der Typ B von circa 4%. Somit führen Antidepressiva zwar zu einer Inhibition der ASM, aber nie zu derart geringen Aktivitätswerten der ASM, welche eine Niemann-Pick-Pathologie auslösen könnten. Daher zeigen Patienten unter Antidep- ressiva-Therapie keine Niemann-Pick-Symptome. Somit sind Antidepressiva in ihren therapeutischen Konzentrationen in der Lage einen hemmenden Einfluss auf eine erhöhte ASM-Aktivität zu nehmen ohne pathologisch zu niedrige ASM-Aktivitäten zu erzeugen. Erhöhte ASM-Aktivität findet sich bei Krank- heitsbildern wie der Wilson-Krankheit [68], bei Infektionen mit unterschiedlichsten Pathogenen [23-24, 73, 120], dem LPS-induzierten Schock [41], der Cystischen Fibrose [90], der Alzheimer Krankheit [48] und nicht zuletzt bei der Depression [61]. Darüber hinaus geschieht die Hemmung nicht ohne Grenze, sondern es verbleibt immer eine 56 gewisse Restaktivität der ASM, was entscheidend dazu beiträgt, keine Niemann-Pick- Symptome zu induzieren. Somit hemmen die untersuchten Antidepressiva in ihren therapeutischen Konzentrationen die ASM-Aktivität in einen physiologischen Bereich hi- nein. Weiterführende Untersuchungen zeigten eine additive funktionelle Inhibition der ASM bei einer Mehrfach-Therapie mit verschiedenen ASM-Inhibitoren [Kornhuber et al ., unpublished ]. Da hier noch keine Aussage über eine mögliche Induktion von Niemann- Pick-Symptomen geklärt ist, sollten sich zusätzliche Untersuchungen mit Kombinatio- nen von ASM-Hemmern in deren jeweiligen therapeutischen Konzentrationsbereichen anschließen.

9.5 Spezifische Hemmung der ASM durch therapeutische Konzentrationen Antidepressiva

Ein Punkt der nicht missachtet werden sollte ist, dass neben der ASM nach heutigem Stand der Dinge weitere 60 lösliche, luminale Enzyme, die im Sauren positiv geladen vorliegen und wie die ASM an die negativ geladene Lipidmembran im Lysosom adhe- rieren. Darunter Enzyme wie die saure Ceramidase [22], die lysosomale, saure Lipase [1] sowie die Phospholipasen A und C [51], welche wie die ASM durch kationisch amphiphile Substanzen, darunter auch Desipramin, gehemmt werden. Dies macht deutlich, dass kationisch amphiphile Substanzen, wie auch die verwendeten Antidepressiva, nicht nur die ASM funktionell hemmen. Diese funktionelle Hemmung, die über die Verdrängung der Enzyme von der inneren lysosomalen Membran mit anschließender Degradation der Enzyme vonstatten geht, ist somit eher unspezifisch und betrifft neben der ASM noch weitere Enzyme. Fraglich bleibt in welchem Ausmaß und mit welchen Auswirkungen die verwendeten Antidepressiva Einfluss auf weitere lysosomale Enzy- me neben der ASM nehmen. Ebenfalls offen bleibt die Frage, ob konzentrationsabhän- gig eine Spezifität der Hemmung erreicht werden könnte beziehungsweise ob in therapeutischen Konzentrationsbereichen diese spezifische Hemmung bereits stattfindet. Dies sollte in zukünftigen Studien geprüft werden, verbunden mit dem Ziel ASM- spezifische Inhibitoren zu entwickeln.

9.6 ASM-Hemmung ist bei vielen Krankheitsbildern von Vorteil

Wie bereits erwähnt finden sich bei Patienten mit CF sowie im Mausmodell in den Zellmembranen des Lungengewebes erhöhte Level an Ceramid. Darüber hinaus führte 57 eine pharmakologische, funktionelle Hemmung der ASM mittels Amitriptylin zu einer Normalisierung der Ceramid Level und einem Schutz des Lungenepithels vor einer Pseudomonas aeruginosa Infektion [109]. Eine Therapie mit Amitriptylin bei CF- Patienten zeigte darüber hinaus eine signifikante Verbesserung der FEV1 im Vergleich zur Placebotherapie [90]. Diese positiven Auswirkungen bei hemmendem Einfluss auf die ASM mittels Antidep- ressiva bei Patienten mit Cystischer Fibrose können andere Studienergebnisse entge- gengestellt werden. Diese aktuellen Forschungsergebnisse zeigen, dass bei CF-Patienten erniedrigte Level an Ceramid zu finden sind. Darüber hinaus beobachtete die Forscher- gruppe, dass CFTR-knockout -Mäuse, die mit dem Chemotherapeutikum Fenretinid, was ASM-aktivierend wirkt, behandelt wurden, aufgrund der gesteigerten Ceramidlevels besser in der Lage waren eine Infektion mit Pseudomonas zu kontrollieren [38]. Im Gegensatz dazu starben mehr ASMKO Mäuse an den Folgen einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa als Wild-Typ Mäuse, was womöglich an der fehlenden Bil- dung Ceramid-angereicherter Membran-Plattformen lag. Dies führte zu einer überschie- ßenden Immunantwort verbunden mit einer Ausschüttungen inflammatorischer Zytoki- ne und dem Zelltod [36]. Diese widersprüchlichen Ergebnisse stellen die Komplexität der Rolle der ASM heraus, sind aber kein Grund die Forschung in diesem Bereich einzustellen, um die möglichen Chancen für neue Therapieoptionen nicht zu verpassen. Wie bereits erwähnt weisen viele Krankheitsbilder eine dysregulierte, meist erhöhte Aktivität der lysosomalen ASM auf. Interessant in diesem Zusammenhang ist die Tatsa- che, dass die prozentuale ASM-Hemmung trotz unterschiedlicher ASM-Aktivitäten verschiedener Zelltypen gleich bleibt [Tripal et al ., unpublished ]. Durch diese Arbeit ist nun weiterhin bekannt, dass einige der untersuchten Antidepressiva diese Hemmung auch in ihren jeweiligen therapeutischen Konzentrationsbereichen ausüben können. Diese neue Erkenntnis leistet einen entscheidenden Beitrag zur Beantwortung der Frage beziehungsweise zur Lösung der Aufgabe, den Anwendungsbereich der ASM hemmenden Antidepressiva auf eben diese Krankheitsbilder (Cystische Fibrose, Alzheimer, Wilson-Krankheit usw.) zum Wohle des Patienten auszuweiten. 58

9.7 Die verwendeten Antidepressiva hemmen die sekretierte Form der ASM nicht

Die Krankheitsbilder der Arteriosklerose und des Diabetes mellitus nehmen eine besondere Stellung in Bezug auf die saure Sphingomyelinase ein. Es wurden zwar auch hier erhöhte Aktivitätslevel der ASM gemessen, allerdings handelt es sich hierbei um die sekretierte Form der ASM. Die eingesetzten Antidepressiva sind nach heutigem Stand der Dinge und allein schon aufgrund ihres Hemmmechanismus allerdings nur in der Lage die lysosomale Form der ASM zu beeinflussen. Begründet wird dies durch den Lysosomotropismus, der zu einer Akkumulation der kationisch amphiphilen Antidep- ressiva im Lysosom führt und somit die Grundlage für die funktionelle ASM-Hemmung schafft. Funktionelle ASM-Inhibitoren benötigen hohe lysosomale Medikamentenkon- zentrationen [59] und finden diese somit vor allem in Lysosomen vor. Aus diesem Grund ist es denkbar, dass die verwendeten, hemmend auf die lysosomale ASM wirkenden Antidepressiva keinen Einfluss auf die Aktivität der sekretierten, im Plasma vorliegenden Form der ASM besitzen [8]. Nachdem in dieser Studie die Aktivität der sekretierten ASM nicht untersucht wurde, kann man nur vermuten, dass die sekretierte ASM nicht durch kationisch amphiphile Substanzen gehemmt wird. Eine definitive Aussage wird erst durch weiterführende Experimente möglich.

9.8 Vorteile und Limitationen des verwendeten Zellkulturmodells

Zur Durchführung der Versuche diente ein Zellkulturmodell. Verwendet wurden H4- Zellen, die einer Glioblastom-Zelllinie angehören. Die Kultivierung erfolgte in DMEM- Medium, welches darüber hinaus mit Glutamin, den Antibiotika Penicillin und Strepto- mycin sowie FCS versetzt wurde. Die Kulturbedingungen wurden bei 37°C und 5%

CO 2 festgelegt. Die Stimulation der Zellen erfolgte für 24 Stunden mit Antidepressiva in Konzentrationsreihen. Antidepressiva stellen kationisch amphiphile Substanzen dar, die für den Transport vom Extrazellularraum in die intrazellulären, sauren Komparti- mente, wie die Lysosomen, im Zellkulturmodell Minuten bis Stunden benötigen [60, 114]. Das Konzentrieren von kationisch amphiphilen Substanzen in Lysosomen sowie das Erreichen eines Konzentrationsgleichgewichtes im Gewebe benötigt dazu im Ge- gensatz im menschlichen Körper bis zu mehreren Monaten, wie am Beispiel Fluoxetin bereits gezeigt wurde [57]. Dies verdeutlicht, dass ein System wie das Zellkulturmodell die reale Situation, wie sie im menschlichen Organismus vonstatten geht nur bedingt nachempfinden kann. Antidepressiva, die in das Medium einer Zellkultur gegeben wur- 59 den, unterliegen keinem Metabolismus oder Eliminationsprozessen wie im menschlichen Organismus. Dies könnte aber auch eine Erklärung für die therapeutische Latenz darstellen. Die geringe Menge der verabreichten Medikamente im Vergleich zur Masse des menschlichen Körpers, das hohe Verteilungsvolumen dieser Substanzen, der Meta- bolismus sowie die Eliminationsprozesse, denen die Medikamente unterliegen, bilden ebenfalls Teile der Erklärung für die therapeutische Latenz. Darüber hinaus stammen die verwendeten Zellen aus einer Glioblastom-Zelllinie (H4). Tumoren wie Kolonkarzinome [98], Ovarialkarzinome [91] und nicht zuletzt Gliome[88], wozu auch das Glioblastom zu zählen ist, zeigen signifikant erniedrigte Level an Ceramid. Ceramid ist ein Mediator für den programmierten Zelltod und stellt das Reaktionsprodukt der sauren Sphingomyelinase dar. Somit ist davon auszugehen, dass in Tumoren wie dem Glioblastom eine erniedrigte Aktivität der ASM zu finden ist. Mit diesem Hintergrund bleibt fraglich welchen Einfluss die verwendete H4- Tumorzelllinie auf die generierten Ergebnisse hat. Dennoch bleibt erwähnenswert, dass unabhängig vom verwendeten Zelltyp und ebenfalls unabhängig vom ausgehenden Ak- tivitätslevel der ASM eine prozentual identische ASM-Hemmung zu verzeichnen ist [Tripal et al ., unpublished ].

9.9 Die Chance der erweiterten klinischen Anwendung der ASM- hemmenden Antidepressiva

Mittlerweile ist für viele Krankheitsbilder bekannt, dass sie mit einer erhöhten ASM- Aktivität einhergehen. FIASMAs beziehungsweise kationisch amphiphile Substanzen, wie die hier verwendeten Antidepressiva, sind in der Lage die Aktivität der ASM auf ein normales Niveau zu inhibieren. Dies wurde allerdings bisher nur bei sehr hohen, physiologisch irrelevanten Konzentrationen gemessen. Diese Arbeit konnte zeigen, dass einige Antidepressiva bei Konzentrationen, wie sie bei antidepressiv behandelten Pa- tienten vorliegen, ebenfalls eine Hemmung der ASM bewirken. Diese Aussage war entscheidend, um von einer Wirkung der Antidepressiva auf die ASM im menschlichen Organismus ausgehen zu können. Schließlich bleibt zu erwähnen, dass alle der hier experimentell verwendeten Antidep- ressiva für den medizinischen Gebrauch am Menschen lizensiert sind. Darüber hinaus bestätigt die jahrelange klinische Erfahrung mit diesen Medikamenten eine gute Ver- träglichkeit sowie eine geringe Toxizität. Dies eröffnet die Chance einer schnellen Auf- nahme dieser Substanzen in präklinische beziehungsweise klinische Studien zur Evalua- 60 tion der Wirksamkeit der Antidepressiva bei anderen Indikationen beziehungsweise Krankheitsbildern, deren Pathophysiologie sich in einer erhöhten Aktivität der sauren Sphingomyelinase begründet. Somit stellen die untersuchten Antidepressiva, die in ihren jeweiligen therapeutischen Konzentrationen die ASM funktionell zu hemmen ver- mögen, vielversprechende Medikamente dar. 61

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11 Abkürzungsverzeichnis

5-HT 5-Hydroxytryptamin, Serotonin ADP Adenosindiphophat ASM saure Sphingomyelinase ASMKO saure Sphingomyelinase knock-out ATP Adenosintriphosphat B Base BH + protonierte Base CD95 cluster of differetiation 95 CF Cystische Fibrose CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNS Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ETPKB Empfohlener therapeutischer Plasma-Konzentrations-Bereich FCS Fetales Kälberserum FEV1 forciertes endexspiratorisches 1 Sekunden Volumen H+ Proton HWZ Halbwertszeit IC50 Konzentration der halbmaximalen Hemmung IRS-1 Insulin-Rezeptor-Substrat 1 KAS Kationisch amphiphile Substanzen KHK Koronare Herzkrankheit LDL low-density lipoprotein LPS Lipopolysaccharid MW Molekulargewicht NaSSA Noradrenalin- und selektiver Serotonin-Wiederaufnahmehemmer NPD Niemann-Pick-Disease NRI Selektiver-Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor PBS phosphatgepufferte Salzlösung PKC δ Proteinkinase C-delta S1P Sphingosine-1-Phosphat 71

SAP Sphingolipid-Aktivator-Proteine siRNA Small interfering Ribonukleinsäure SMPD1 Sphingomyelin-Phosphodiesterase 1 SNRI Serotonin-Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer S-SMase sekretorischen Form der sauren Sphingomyelinase SSRI Selektiver-Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitor TLR4 Toll-like Rezeptor 4 TNF-α Tumornekrosefaktor α UV Ultraviolett 72

12 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Sphingomyelinase: Hydrolyse von Sphingomyelin zu Phosphorylcholin und Ceramid ...... 11

Abbildung 2: pK a-log P-Diagramm ...... 14 Abbildung 3: Funktionelle Inhibition der ASM durch intralysosomal kumulierende schwache organische Basen...... 15 Abbildung 4: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Amitriptylin auf die ASM-Aktivität...... 36 Abbildung 5: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Desipramin auf die ASM-Aktivität...... 37 Abbildung 6: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Clomipramin auf die ASM-Aktivität...... 38 Abbildung 7: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Mianserin auf die ASM- Aktivität...... 39 Abbildung 8: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Maprotilin auf die ASM- Aktivität...... 40 Abbildung 9: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Sertralin auf die ASM- Aktivität...... 41 Abbildung 10: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Paroxetin auf die ASM- Aktivität...... 42 Abbildung 11: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Fluoxetin auf die ASM- Aktivität...... 43 Abbildung 12: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Citalopram auf die ASM-Aktivität...... 44 Abbildung 13: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Alaproclate auf die ASM-Aktivität...... 45 Abbildung 14: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Reboxetin auf die ASM-Aktivität...... 46 Abbildung 15: Logarithmische Dosis-Wirkungs-Beziehung von Mirtazapin auf die ASM-Aktivität...... 47

13 Anhang

13.1 Chemikalien

Alaproclate hydrochloride (A164) Sigma-Aldrich, München Amitriptyline hydrochloride (A8404) Sigma-Aldrich, München Chloroform Roth, Karlsruhe Citalopram hydrobromide (C7861) Sigma-Aldrich, München Clomipramine hydrochloride (C7291) Sigma-Aldrich, München Complete mini EDTA free Tabletten Roche, Mannheim Desipramine hydrochloride (D3900) Sigma-Aldrich, München Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe DMEM-Medium Gibco, Eggenstein Ethanol Merck, Darmstadt Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, München Fluoxetine hydrochloride (F132) Sigma-Aldrich, München Fötales Kälberserum (FCS) Biochrom, Berlin Kaliumchlorid (KCl) Sigma-Aldrich, München

Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2HPO 4) Merck, Darmstadt L-Glutamin Roth, Karlsruhe Maprotiline hydrochloride (M9651) Sigma-Aldrich, München Methanol Roth, Karlsruhe Mianserin hydrochloride (M2525) Sigma-Aldrich, München Mirtazapine (M0443) Sigma-Aldrich, München

Natriumacetat (C2H3NaO 2) Roth, Karlsruhe Natriumchlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe

Natriumhydrogenphospahat (Na 2HPO 4) Sigma-Aldrich, München Nonidet P40 Sigma-Aldrich, München Paroxetine maleate (P1372) Sigma-Aldrich, München Penicillin/Streptomycin Biochrom, Berlin Reboxetine mesylate hydrate (R6527) Sigma-Aldrich, München Salzsäure (HCl) Roth, Karlsruhe Sertraline hydrochloride (2395) Tocris, Ellisville Trypsin Biochrom, Berlin Ultima Gold PerkinElmer, Waltham 74

13.2 Hilfsmittel

Casy-Cup Innovatis, Reutlingen Einmalhandschuhe Kimberly-Clark, England Elisa Microplate (96-well) GreinerBio-One, Eppendorfgefäße Eppendorf, Hamburg Frickenhausen Kulturplatten (6-well, 24-well) TPP, Schweiz Pasteurpipetten aus Glas Roth, Karlsruhe Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg Safe-Lock Eppendorfcups (0,5 ml 1,5 ml, 2,0 ml) Multimed, Deutschland Serologische Pipetten TPP, Schweiz Zellkulturflaschen (T75, T150) TPP, Schweiz Zentrifugenröhrchen TPP, Schweiz

13.3 Geräte und Apparaturen

Brutschrank Hera cell Heraeus, Hanau Casy Innovatis, Reutlingen Eismaschine Scotsman, Herborn Gilson, Frankreich Hicclave HV-85 Autoklav (Wolf) Schubert-Weiss, München Kühl-/Gefrierschrank Liebherr Bulle, Schweiz Kühlzentrifuge Eppendorf, Hamburg Laminarflow Werkbänke Heraeus, Hanau Lichtmikroskop DM IL HC Bio Leica, Benzheim Microplate Reader Biorad, München pH-Meter WTW, Weilheim Pipetten Eppendorf, Hamburg/ Pipettenpistole Pipetboy (Falcon) Schubert&Weiss, München Vortex Mixer NeoLab, Heidelberg Wasserbad GFL, Wunstorf

13.4 Kommerziell erhältliche Systeme

BCA-Protein-Assay-Kit Perbio, Bonn MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit Lonza, Köln 75

14 Danksagung

Herrn Prof. Dr. Johannes Kornhuber danke ich vielmals für die Überlassung des interessanten Themas und die Möglichkeit, diese Arbeit an der Psychiatrischen und Psychothe- rapeutischen Universitätsklinik Erlangen durchzuführen.

Mein ganz besonderer Dank gilt Philipp Tripal für die hervorragende wissenschaftliche Betreuung, die rasche und unkomplizierte Hilfe sowie die angenehme und sehr kollegia- le Zusammenarbeit.

Bedanken möchte ich mich auch bei den Mitarbeitern des molekularbiologischen La- bors Cosima Rhein, Martin Reichel, Michaela Schäfer, Andreas Henkel.

Ein Dank gilt auch meiner Freundin, die mir stets zur Seite stand.

Vor allem danke ich meinen Eltern, die immer für mich da waren und mich unterstütz- ten und mir somit ein Studium erst ermöglichten.