ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

Ashabil AYGAN

HALOALKALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU, AMİLAZ, SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA KULLANILABİLİRLİĞİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2008 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HALOALKALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU, AMİLAZ, SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA KULLANILABİLİRLİĞİ

Ashabil AYGAN DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Bu tez 04/01/2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir.

İmza ………………… İmza …………………. İmza ……………………….

Prof. Dr. Burhan ARIKAN Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Doç.Dr.Gökhan CORAL DANIŞMAN ÜYE ÜYE

İmza ...... İmza …………………

Doç.Dr. Hatice Kormaz Doç.Dr.Mutlu Nisa Ünaldı Güvenmez Coral ÜYE ÜYE

Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır.

Kod No: Prof. Dr Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza-Mühür

Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FBE 2003-D-18

Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ DOKTORA TEZİ

HALOALKALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU, AMİLAZ SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA KULLANILABİLİRLİĞİ

Ashabil AYGAN

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Danışman: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Yıl: 2008, Sayfa:186 Jüri:Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Doç.Dr. Gökhan CORAL Doç.Dr. Mutlu Nisa ÜNALDI CORAL

Bu çalışmada, Van Gölü topraklarından izole edilen haloalkaloflik Bacillus sp. suşlarından amilaz, selülaz ve ksilanaz enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla bakterilerin besiyerlerinde üreme ve enzim üretme yetenekleri ve aktivite gösterdiği optimum sıcaklık, pH ve NaCl konsantrasyonu saptanmıştır. Bacillus sp. AB-17 suşundan üretilen amilazın SDS-PAGE analizinde iki band elde edilmiş ve moleküler ağırlıkları 66.25 ve 58 kDa olarak belirlenmiştir. Enzim, optimum aktivitesini 150ºC ve pH 10.5’da gösterirken, 0.5-3.4M NaCl’de ortalama %67’lik aktivite ile halofil özellikte olduğu saptanmıştır. Bacillus sp.C-14 suşundan izole edilen endoglukanaz enzimin molekül ağırlığı 61 kDa olarak belirlenmiş, optimum aktivite ise 50°C’de pH 11.0’de görülmüştür. Maksimum enzim aktivitesi %20 (3.4M) NaCl konsantrasyonunda (%133) elde edilmiştir. Bacillus sp X13 suşundan elde edilen ksilanaz enziminin optimum aktivitesi 40ºC de pH 6.0’da gerçekleşmiştir. Enzim pH 5.0-6.0 aralığında 15 dk süreyle aktivitesini %100 koruyabilmiş, SDS-PAGE analizinde ise moleküler ağırlıkları 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kDa olan dört band tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre AB-17 amilaz enziminin Nişastanın sıvılaştırılması ve tekstil endüstrisinde nişastanın uzaklaştırılmasında kullanılabilecek bir enzim olduğu belirlenmiştir. C14 endoglukanaz enziminin tuzlu ortamlarda yüksek düzeyde aktivite göstermesi, halo-stabilitesinin yüksek olması ve deterjanlara dirençli olması bu enzimin tekstil uygulamaları, kağıt endüstrisi ve hayvan yemi üretimi gibi uygulamalarda kullanılabileceğini göstermektedir. X13 Ksilanaz enzimi ise besin endüstrisinde prebiyotik üretiminde ve selülaz ve pektinaz enzimine gerek kalmadan meyve suyu üretiminde kullanılabileceği önerilebilir. Anahtar Kelimeler: Bacillus, amilaz, selülaz, ksilanaz,, haloalkalofil

I ABSTRACT Ph.D. THESIS

ISOLATION OF HALOALKALOPILIC BACILLUS SP., PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND DETERMINATION OF BIOTECHNOLOGICAL APPLICATION OF THEIR AMYLASE, CELLULASE AND XYLANASE

Ashabil AYGAN

DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA

Supervisor:Prof. Dr. Burhan ARIKAN Year: 2008, Page: 186 Jury: Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Doç.Dr. Gökhan CORAL Doç.Dr. Mutlu Nisa ÜNALDI CORAL

In this study, the amylase, cellulase, xylanase enzymes from Bacillus sp. strains isolated from Van lake soil were produced and characterized. The strains were tested for determination of temperature, pH range and NaCl concentration for growth and enzyme production on plate. Molecular weight of the amylase from Bacillus sp.AB-17 was estimated as 66.25 and 58 kDa on SDS-PAGE. The optimum activity was obtained at 150oC, pH 10.5. the enzyme also presented halophilic properties with an activity around 67% between 0.5-3.4M NaCl concentration. Molecular weight of the Endoglucanase from Bacillus sp.C14 was detected as 61kDa on SDS-PAGE, and the optimum enzyme activity was obtained at 50oC, pH 11.0. Maximum endoglucanase activity (%133) was recorded at 20% (3.4M) NaCl. On the other hand the xylanase from Bacillus sp.X13 presented and optimum activity at 40oC and pH 6.0. The enzyme was 100% stable between pH 5.0-6.0 for 15 min. The enzyme was consist of 4 unit as 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kDa on SDS-PAGE. The results showed that the amylase AB-17 is a relevant enzyme for desizing processes in textile industries. The increased activity of C14 endoglucanase in high saline conditions, high halo- stability, resistance to detergents makes the enzyme C14 endoglucanase appropriate for textile, paper, animal feed preparation processes. X13 Xylanase enzyme could also be used for prebiotic preparation in food industries and fruit juice production without needing pectinase and cellulase usage.

Key Words: Bacillus, amylase, cellulase, xylanase, haloalkalophile

II

TEŞEKKÜR

Çalışmamın her aşamasında bana yardımcı olan, bilgi ve deneyimleriyle yol gösteren danışman hocam sayın Prof. Dr. Burhan ARIKAN’a, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı Başkanı sayın Prof.Dr.Ömer ÇOLAK’a, sayın Prof.Dr.Sadık DİNÇER’e ve Doç.Dr.Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ’e çok teşekkür ederim. Bazı suşların dizi analizlerinde yardımlarını esirgemeyen Dr.A.Akın DENİZCİ’ye, bölüm teknisyeni sayın Mustafa TOMAK’a ve bölüm sekreteri sayın Mediha KURTOĞLU’na teşekkür ederim. Ayrıca bütün çalışmalarım süresince manevi desteğini esirgemeyen annem Meliha, eşim Arife ve kızım Irmak Zehra AYGAN’a sonsuz teşekkür ederim.

III

İÇİNDEKİLER SAYFA NO

ÖZ...... I ABSTRACT...... II TEŞEKKÜR...... III İÇİNDEKİLER...... IV ÇİZELGELER DİZİNİ...... XII ŞEKİLLER DİZİNİ ...... XIV SİMGELER VE KISALTMALAR...... XVI 1.GİRİŞ...... 1 1.1.Enzimler ve Bazı Özellikleri...... 3 1.2. Enzimlerin Sınıflandırılması ...... 5 1.2.1. Enzimlerin Numaralandırılması ve Sınıflandırılması...... 5 1.3.Amilazlar (Amylase)...... 6 1.3.1.Amilazların Bazı Uygulama Alanları...... 7 1.4. Selülazlar (Endoglukanaz)...... 9 1.4.1.Kompleks Olmayan Selülaz Sistemleri...... 10 1.4.2. Kompleks Selülaz sistemleri (Selülozom)...... 11 1.4.3. Selülazların Bazı Uygulama Alanları ...... 13 1.4.3.1. Gıda endüstrisinde Selülazlar...... 13 1.4.3.2. İçecek ve Şarap Endüstrisinde Selülazlar...... 14 1.4.3.3. Hayvan Yemi Endüstrisinde Selülazlar...... 14 1.4.3.4. Tekstil Endüstrisinde...... 14 1.5. Ksilanazlar (Xylanase)...... 15 1.5.1. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları ...... 17 1.6. Ekstremofilik Enzimler (Ekstremozimler)...... 19 1.7. Bacillus Cinsi...... 21 1.8. Elektroforez Uygulamaları...... 22 1.8.1. Jel Elektroforezleri...... 24

IV 1.8.2. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)...... 26 1.8.3. Doğal (Native) Jel Elektroforezi...... 28 1.9. Protein İzolasyonu...... 28 1.9.1. Çöktürme ile Proteinlerin İzolasyonu...... 31 1.9.1.1. TCA ile Çöktürme...... 31 1.9.1.2. Nötral tuzlar ile Proteinlerin Çöktürülmesi...... 31 1.9.1.3. Organik Çözücülerle Proteinlerin Çöktürülmesi...33 1.9.1.4. Non-İyonik Organik Polimerlerle Çöktürme...... 33 1.10. Kromatografi...... 34 1.10.1. İnce Tabaka Kromatografisi (TLC)...... 35 1.11. Araştırmanın Amacı...... 37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR...... 39 3. MATERYAL VE METOD...... 49 3.1. Materyal...... 49 3.1.1.Bakteri İzolasyonunda ve Teşhisinde Kullanılan Besiyerleri...... 49 3.1.1.1. LB Agar...... 49 3.1.1.2. M9-Nişasta Agarı...... 49 3.1.1.3. CMC-Agar Besiyeri...... 50 3.1.1.4. CEPM (Selüloz Enzim Üretimi Besiyeri)...... 50 3.1.1.5. Ksilanlı Besiyeri...... 51 3.1.1.6. Nutrient Broth...... 51 3.1.2. Kullanılan Çözeltiler...... 51 3.1.2.1. NaOH Çözeltisi...... 51 3.1.2.2. Etanol...... 52

3.1.2.3. Na2CO3 Çözeltisi...... 52 3.1.2.4. Lügol...... 52 3.1.2.5. Kongo Kırmızısı ...... 52 3.1.2.6. NaCl Çözeltisi...... 53 3.1.2.7. Sodyum Fosfat Tamponu (0.1 M)...... 53

V 3.1.2.8. Sitrat Tamponu...... 53 3.1.2.9. Sodyum-Fosfat Tamponu...... 53 3.1.2.10. Glisin-NaOH Tamponu...... 54 3.1.2.11. Borax-NaOH Tamponu...... 55 3.1.2.12. Dinitro Salisilik Asit (DNS)...... 55 3.1.3. Elektroforezde Kullanılan Solüsyonlar...... 55 3.1.3.1. Solüsyon A (Akrilamid Solüsyonu)...... 55 3.1.3.2. Solüsyon B (4X)...... 55 3.1.3.3. Solüsyon C (4X)...... 56 3.1.3.4. Amonyum Persülfat (AMPS)...... 56 3.1.3.5. Elektroforez Tamponu ...... 56 3.1.3.6. Örnek Yükleme Tamponu...... 56 3.1.3.7. SDS Jel boyama (Staining) Solüsyonu...... 56 3.1.3.8.SDS Jelden Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu...... 57 3.1.3.9.SDS-PAGE’nde Zymogram Analizleri İçin Renatürasyon Solüsyonları...... 57 3.1.3.10.Nişastalı Glisin-NaOH Tamponu Çözeltisi...... 57 3.1.4. İnce Tabaka Kromatografisi Solüsyonları ...... 57 3.1.4.1. Bütanol-Asetik Asit-Distile Su...... 57

3.1.4.2. %20’lik Sülfirik Asit (H2SO4) Çözeltisi...... 58 3.1.4.3. Kloroform-Asetik Asit-Distile Su Çözeltisi...... 58 3.1.4.4. Anilin-Difenilamin-Ortofosforik Asit Çözeltisi....58 3.1.4.5. D-Glikoz Çözeltisi...... 58 3.1.4.6. Maltoz Çözeltisi...... 58 3.1.4.7. Ksiloz Çözeltisi...... 58 3.1.5.16S rRNA Dizisinin Belirlenmesi İçin Kullanılan Solüsyonlar...... 59 3.1.5.1 DNazolDirect...... 59 3.1.5.2.TAE (Tris-Asetik Asit-Edta)Tamponu...... 59

VI 3.1.5.3.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için Kullanılan Primerler...... 59 3.2. Metod...... 59 3.2.1. Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi...... 59 3.2.1.1. Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu...... 59 3.2.1.2. Bakteri Teşhisi...... 60 3.2.1.3. Bakteri Teşhisi İçin Genomik DNA Hazırlanması 60 3.2.1.4. Agaroz Jel Hazırlanması ...... 60 3.2.1.5.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için Reaksiyon Koşulları...... 61 3.2.1.6. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Koşulları .....61 3.2.1.7. 16S rDNA Dizisinin Belirlenmesi...... 61 3.2.2. Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi...... 62 3.2.2.1.Katı Besiyerlerinde Amilaz Aktivitelerinin Belirlenmesi...... 62 3.2.2.2.Katı Besiyerlerinde Selülaz Aktivitelerinin Belirlenmesi...... 62 3.2.2.3.Katı Besiyerlerinde Ksilanaz Aktivitelerinin Belirlenmesi...... 62 3.2.2.4. Bakterilerin Katı Besiyerinde Ürediği ve Enzim Sentezlerinin Gerçekleştiği pH Aralığının Saptanması...... 63 3.2.2.5.Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyon Sıcaklığının Saptanması...... 63 3.2.2.6.Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyonu İçin Gerekli Tuz Konsantrasyonlarının Saptanması...... 63 3.2.3.1.Sıvı Kültürde Amilaz Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma...... 64 3.2.3.2.Sıvı Besiyerinde Selülaz ve Ksilanaz Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma...... 64

VII 3.2.3.3.Enzimin Optimum Aktivite Göstediği pH Değerinin Saptanması ...... 65 3.2.3.4.Enzimin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerinin Saptanması ...... 65 3.2.3.5.Enzimin Termal (Sıcaklık) Stabilitesinin Saptanması...... 65 3.2.3.6. Enzimin pH Stabilitelerinin Belirlenmesi...... 66 3.2.3.7.NaCl’ün Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkisinin Belirlenmesi...... 67 3.2.3.8.İnhibitörlerin Enzim Aktivitesine Etkisi...... 67 3.2.4.Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (PAGE) Moleküler Ağırlık ve Zimogram Analizi...... 68 3.2.4.1.Moleküler Ağırlık Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması...... 68 3.2.4.2.Zimogram Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması...... 69 3.2.4.3.Amilaz Enzimi Zimogram Analizi Için Doğal (Nativ) Jelin Hazırlanması ...... 69 3.2.4.4.Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi...... 69 3.2.4.5.SDS-PAGE Jelinin Boyanması ve Zimogram Analizleri...... 70 3.2.5.Enzim Substrat Reaksiyonu Sonunda Açığa Çıkan Son Ürünlerin Saptanması ...... 71 3.2.5.1.İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) Plakalarının Hazırlanması...... 71 3.2.5.2. Amilaz Enzimine Ait Son ürünlerin Saptanması...72 3.2.5.3.Selülaz ve Ksilanaz Enzimlerine Ait Son Ürünlerin Saptanması...... 72 4. BULGULAR VE TARTIŞMA...... 73 4.1.Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu...... 73

VIII 4.2.Bakterilerin Teşhisi...... 73 4.2.1.1Bakterilerin Morfolojik ve Biyokimyasal Özellikleri...... 73 4.2.2.AB-17 Suşunun 16S rDNA Dizi Analizi sonuçları...... 74 4.3.AB-17 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları...... 74 4.3.1.AB-17 Suşunun Farklı pH Değerleri ve 37oC’de Üreme ve Amilaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular...... 74 4.3.2.AB-17 Suşunun Farklı Sıcaklık Değerleri ve pH 9.5’deki Üreme ve Amilaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular...... 75 4.3.3.M9 Nişastalı Agar Besiyerinde Farklı NaCl Konsantrasyonlarında Bakteri Üreme Davranışı ve Enzim Sentezine Ait Bulgular...... 76 4.4.C-14 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları...... 77 4.4.1.C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı pH Değerleri ve 37ºC’de Üreme ve Selülaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular...... 77 4.4.2.C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklık Değerleri ve pH 9.5’teki Üreme ve Enzim Aktivitesine Ait Bulgular77 4.4.3.C-14 Suşunun Farklı NaCl (%3-20) İçeren CMC’li Agarda Üreme ve Enzim Sentezine Ait Bulgular...... 78 4.5.X-13 Suşunun Katı Besiyerinde 37ºC ve Farklı pH eğerlerinde Enzim Sentezleme ve Ürem Davranışına Ait Bulgular...... 79 4.5.1.X-13 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklıklar ve pH 7.0’deki Ürem ve Enzim Sentezlemesine Ait Bulgular...... 80 4.6. AB-17 Amilaz’ın Enzimatik Özellikleri...... 81 4.6.1. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum pH Aralığı...... 81 4.6.2. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Sıcaklık Aktivitesi...83 4.6.3. AB-17 Amilaz Stabilitesi Üzerine pH’nın Etkisi...... 86 4.6.4.AB-17 Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular...... 88

IX 4.6.5.AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine NaCl’ün Etkisi..89 4.6.6. AB-17 Amilaz Enzimi Üzerine İnhibitörlerin Etkisi...... 90 4.6.7. AB-17’nin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi...... 94 4.6.8.AB-17 Amilaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları ...... 95 4.7. Kısmi Saflaştırılmış C-14 Selülaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Görüntüsü...... 96 4.7.1.C-14 Selülaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değeri ve Aralığına Ait Sonuçlar...... 97 4.7.2.C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine Ait Sonuçlar...... 99 4.7.3.C-14 Endoglukanaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Sonuçlar...... 100 4.7.4.C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite Analizlerine Ait Sonuçlar...... 102 4.7.5.C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesi ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün Etkisine Ait Sonuçlar...... 105 4.7.6.C-14 Endoglukaaz Enzimi Üzerine İhibitör, Şelatör, Deterjan ve Metal İyonlarının Etkisine Ait Sonuçlar...... 108 4.7.7.C-14 Selülaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi...... 110 4.7.8. C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları ...... 111 4.8.Kısmi Saflaştırılmış X-13 Ksilanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu...... 113 4.8.1.X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değeri ve Aralığına Ait Sonuçlar...... 113 4.8.2.X-13 Ksilanaz’ın Sıcaklık Optimumu...... 115 4.8.3.X-13 Ksilanaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Sonuçlar...117 4.8.4.X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Sonuçlar...... 120

X 4.8.5.X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün Etkisine Ait Sonuçlar...... 122 4.8.6.X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi...... 125 4.8.7.X-13 Ksilanaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi Bulguları...... 128 4.8.8.X-13 Ksilanaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları ...... 129 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER...... 133 KAYNAKLAR...... 157 ÖZGEÇMİŞ ...... 176 EK 1 Nişasta...... 177 EK 2 Selüloz (Cellulose)...... 180 EK 3 Ksilan (Xylan)...... 184 EK 4 İnce Tabaka Kromatografisi Plakalarının Hazırlanması...... 186

XI

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA NO

Çizelge 1.1. İnce Tabaka Kromatografileri İçin Kaplama Malzemeleri...... 37 Çizelge 1.2. İnce Tabaka Kromatografisi için Bazı Geliştirme Çözeltileri...... 38 Çizelge 3.1. Sitrik asit Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması...... 53 Çizelge 3.2. Sodyum Fosfat Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması ...... 54 Çizelge 3.3. Glisin-NaOH Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması...... 54 Çizelge 3.4. Ayırıcı Jelin Bileşimi...... 68 Çizelge 3.5. Dengeleyici Jelin Bileşimi...... 69 Çizelge 4.1. AB-17 suşunun farklı pH değerleri ve 37oC’de ki üreme ve Enzim Üretme sonuçları...... 75 Çizelge 4.2. AB-17 suşunun farklı Sıcaklık değerleri ve pH 9.5’de ki Üreme ve Enzim Üretme sonuçları...... 75 Çizelge 4.3. AB-17 Suşunun Farklı Tuz Konsantrasyonunda Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları...... 76 Çizelge 4.4. C-14 Suşunun Katı Besiyerinde ve Farklı pH Değerlerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme Sonuçları ...... 77 Çizelge 4.5. C-14 Bakterisinin Farklı Sıcaklık ve pH 9.5’teki CMC Agar Besiyerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme Sonuçları ...... 78 Çizelge 4.6.C-14 Suşunun Katı Besiyeri ve Farklı Tuz Konsantrasyonlarında Üreme ve Enzim Sentezlemesiyle İlgili Sonuçlar ...... 78 Çizelge 4.7. X-13 Suşunun 37ºC ve Farklı pH değerlerinde Üreme ve Enzim Üretimine Ait Sonuçlar ...... 79 Çizelge 4.8. X-13 Suşunun Farklı Sıcaklık ve pH 7.0 de Gösterdiği Üreme ve Enzim Sentezine Ait Bulgular...... 80 Çizelge 4.9. AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi...... 91

XII Çizelge.4.10. C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyon ve Deterjanların Etkisine Ait Sonuçlar...... 109 Çizelge 4.11. X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi...... 126 Çizelge Ek 1.1.Amiloz ve Amilopektinin Bazı Özellikleri...... 178

XIII ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA NO

Şekil 1.1. Ksilanın Tam Hidrolizinde Gerekli Enzimler ve Etki Bölgeleri...... 17 Şekil 4.1. AB-17 Suşundan Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle İzole Edilmiş Enzim Çözeltisinin Nişastalı Agar Ortamında Oluşturduğu Aktivite Reaksiyonu...... 81 Şekil 4.2.AB-17 Suşundan Elde Edilen Amilaz Enziminin Optimum pH’sı ...... 82 Şekil 4.3. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Verileri...... 84 Şekil 4.4. AB-17 Amilaz Enziminin pH Stabilitesi...... 86 Şekil 4.5. AB-17 Amilaz Enziminin Sıcaklık Stabilitesi...... 88 Şekil 4.6. NaCl’ün AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi...... 89 Şekil 4.7. AB-17 Amilaz Enziminin SDS-PAGE ve Doğal PAGE Zymogram Sonuçları...... 94 Şekil 4.8. AB-17 Amilaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi ile Son Ürünlerinin Saptanması...... 96 Şekil 4.9. Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Endoglukanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu...... 97 Şekil 4.10. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerine Ait Sonuçlar...... 98 Şekil 4.11. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Sıcaklığına Ait Sonuçlar...... 100 Şekil 4.12. C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait pH Stabilite Sonuçları ...... 102 Şekil 4.13. C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları...... 104 Şekil 4.14. Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesine Etkisi...... 106 Şekil.4.15. Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim Stabilitesine Etkisi...... 107

XIV Şekil 4.16. C-14 Selülaz Enziminin Molekül Büyüklüğü ve Zymogram Analizi...... 112 Şekil 4.17. C-14 Endoglukanaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi ile Son Ürünlerinin Belirlenmesi...... 113 Şekil 4.18. Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Ksilanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu...... 114 Şekil 4.19. X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerine Ait Sonuçlar...... 115 Şekil 4.20. X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine ait Sonuçlar...... 117 Şekil 4.21. X-13 Ksilanaz Enziminin 15 dakika, 60 dakika ve 24 Saat Ön İnkübasyon İşleminden Sonraki pH Stabilitesine Ait Sonuçlar...... 119 Şekil 4.22. X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları...... 121 Şekil.4.23. X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün Etkisine Ait Sonuçlar...... 124 Şekil 4.24. X-13 Ksilanaz Enzimi Zymogram Analizi Sonuçları...... 129 Şekil 4.25. X-13 Ksilanaz Enziminin Hidroliz Ürünlerine ait Bulgular...... 131 Şekil Ek 1.1.Amiloz...... 179 Şekil Ek 1.2.Amilopektin...... 180 Şekil Ek 2.1.Selüloz, β-D-glukoz polimeri...... 182 Şekil Ek 3.1.Ksilanaz Yapısı...... 186 Şekil Ek 4.1.Cam Plakaların Yerleştirilmesi...... 187 Şekil Ek 4.2.Silika Jel karışımının Hazırlanması...... 187 Şekil Ek 4.3.Silika Jel Karışımının Yayma Aparatına Dökülmesi...... 187 Şekil Ek 4.4.Silika Jelin Cam Plakalar Üzerine Yayılması ...... 187 Şekil Ek 4.5.Kuruyan Plakaların Magazine Yerleştirilmesi...... 187 Şekil.Ek.4.6.Plakaların Dikey Pozisyonda Aktivasyon için Fırına Yerleştirilmesi...... 187 Şekil Ek 4.7.İnce Tabaka Kromatografisinin Uygulanması ...... 187

XV SİMGELER VE KISALTMALAR

AMPS : Amonyum persülfat CMC : Karboksimetilselüloz DNS : Dinitrosalisilikasit CMCaz: Karboksimetilselülaz EDTA : Etilendiaminotetraasetik asit L : Litre LB : Luria Bertani M : Molar mL : Mililitre mM : Milimolar mg : Miligram µg : Mikrogram µL : Mikrolitre SDS : Sodyum dodesil Sülfat SDS-PAGE: Sodyum dodesil süüfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi α : Alfa β : Beta rpm : dakikada devir sayısı Tris : 2-Amino-2-Hidroksimetilpropan-1,3-diol TEMED : N,N,N,N-Tetrametil etilendiamin TAE : Tris-Asetik Asit-Edta

XVI

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

1. GİRİŞ

Canlı yaşamı sürekli bir değişim temeline dayanmaktadır. İnorganik maddeler dünyadaki yaşamı oluşturup karmaşık yapıları meydana getirdikten sonra tekrar cansız yapılara dönüşürler. Bu süreçte güneş ışığı temel bir rol oynamakta olup, bitkilerin yaşam için gerekli maddelerin sentezini geçekleştirmesini sağlar. Sentezlenen bu bileşikler, hayvansal organizmaların yaşamları için gerekli temel besin kaynağını oluştururlar. Bu bileşiklerin sentezi veya yıkımı mucize moleküller olarak adlandırılan enzimler tarafından gerçekleştirilirler. Enzimler, doğal olarak canlılar tarafından sentezlenen protein yapısında ya da bir kısmı protein olan biyo-moleküllerdir. Enzimler, binlerce yıldır içecek, ekmek ve peynir yapımı gibi işlemlerde varlığı ve görevi bilinmeden kullanılmıştır. İlk bulgular eski Mısıra kadar dayanmaktadır. Yakın tarihte ise Doğu ülkelerinde birçok gıda fermentasyonu için ipliksi mantarlar enzim kaynağı olarak kullanılmaktadır. Batıda 1896’da gerçek modern mikrobiyal enzim teknolojisi ‘takadiastase’ın ticareti ile başlamıştır. Bu Doğudan Batı toplumuna önemli bir teknolojik transferdir (Smith, 1996). Dericilikte, derinin yumuşatılması köpek ya da güvercin dışkıları ile muamele edilerek yapılırken, bu yüzyıl başlarında Alman kimyacı ‘Otto Röhm’ köpek dışkılarındaki aktif bileşenlerin proteinleri parçalayan proteaz enzimi olduğunu, hayvansal organlardan bu enzimin elde edilebileceğini ve bu işlemlerde köpek dışkısı yerine kullanılabileceğini ortaya koymuştur. Böylece 1905 den itibaren domuz ve sığır pankreasları sosyal açıdan ve güvenilir bir enzim kaynağı olarak ön plana çıkmıştır (Smith, 1996). Bitkisel kaynaklı enzimlerden bira üretiminde kullanılan malt amilazı içecek endüstrisinde önemli bir yer tutmaktadır (John, 1987). Tarihsel gelişim açısından bakıldığında enzimlerin çok farklı kaynaklardan elde edildiği görülmektedir. Bunlar bitkisel, hayvansal ya da endüstriyel anlamda ihtiyacı karşılayabilen mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir (Gupta ve ark, 2003). Bugüne kadar yaklaşık 2500 farklı enzim tanımlanmış ve bunların ancak %10’u ticari alanda kullanım için kendilerine yer bulmuşlardır. Bu %10 içinde 25 tanesi nişasta sanayi ile deterjan katkı maddesi olarak kullanılmış olup, ticari alanda yararlanılan bütün

1

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

enzimlerin %80 ini oluşturmaktadırlar (Woodley, 2000). Bitkisel ve hayvansal enzimlerin endüstriyel ihtiyacı karşılayamaması, bu alandaki ilginin giderek artan bir şekilde mikrobiyal enzimlere yönelmesini sağlamıştır. Mikroorganizmalar, biyokimyasal çeşitlilikleri ve genetik manipülasyonlara uygunluğu gibi sebeplerden dolayı mükemmel bir enzim kaynağı olarak değerlendirilmektedir (Rao ve ark, 1998). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90’ı mikroorganizmaların fermentasyonu ile üretilmektedir (Godfrey ve West, 1996). Bacillus cinsi bakteriler, toprakta, hayvan dışkılarında ve bitkisel ürünler üzerinde yaygın olarak bulunurlar. Bu cinsin bireylerinin çoğu zararsız, izolasyonu ve teşhisi kolay, hızlı büyüme oranı ile fermentasyon süresi kısa, genel olarak güvenli olması, sentezledikleri proteinlerin dış ortama salgılama kapasiteleri gibi birçok sebepten dolayı cazip endüstriyel organizmalardır. Çünkü gram negatif bakteriler, ürettikleri proteinleri protoplazmalarında ya da periplazmik boşluklarında biriktirirler. Bu da üretilen ürünün izolasyonunu güçleştirerek suştan birden fazla kez yararlanılmasını engeller. Ayrıca sentezlenen ürünlerin organizmaya karşı toksik etki oluşturması da söz konusudur. İntrasellüler ortamda sentez ürünlerinin biriktirilmesi çözünmez protein oluşumu, yanlış protein katlanmaları ve etkin olmayan disülfit bağ formasyonu gibi problemleri beraberinde getirmektedir. Ayrıca gram negatif bakteriler, insanlara toksik olan endotoksin üretimi ve intrasellüler protein üretimi ile izolasyon ve saflaştırma için ekstra maliyet oluşturmaktadırlar (Schallmey ve ark, 2004). Mantarlardaki aflatoksin gibi toksik ya da alerjen (Sander ve ark, 2000) bileşik üretimi de göz önünde bulundurulduğunda, gram pozitif bakterilerin, özellikle Bacillus türlerinin endüstriyel enzim üretiminde öncelikli olarak tercih edilmesine neden olmaktadır. Dünya geneli incelendiğinde endüstriyel enzimlerin ticari pazar payının yaklaşık 1,6 milyar dolar olduğu tahmin edilmektedir (Schallmey ve ark, 2004). Bu enzimlerin kullanım alanlarına göre dağılımına bakıldığında, %29’unun gıda endüstrisinde, %15’inin hayvan yemi sektöründe ve %56’sının ise genel amaçlı teknik alanlarda yer aldığı görülmektedir (Outtrup ve Jorgensen, 2002).

2

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

Endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %75’ini hidrolitik enzimler oluşturmaktadır. Proteaz grubundaki enzimler kullanımda ilk sırayı alırken, karbohidratları parçalayan enzimler ikinci sırada yer almaktadır (Harwood, 1992; Bhat, 2000). Karbonhidrat parçalayan enzimlerden amilazlar, enzim piyasasında yaklaşık %25’lik bir paya sahiptir (Sidhu ve ark, 1997; Rao ve ark, 1998). Son zamanlardaki en etkin uygulamaları kağıt hamurunun beyazlatılması için ksilanazların endüstride kullanılması Viikari ve arkadaşlarının (1986) buluşu ile artışa geçmiştir. Hidrolazlardan selülozlar ise selülozik materyallerin şekerlere dönüştürülerek biyo-etanol gibi biyolojik temelli ürünlere dönüştürülmesi söz konusu olduğunda enzim piyasasındaki payı ciddi bir şekilde artması beklenmektedir (Cherry and Fidantsef, 2003). Sellülazların bitkisel atıkların hidrolizinde kullanılması durumunda Amerika Birleşik Devletleri’nde yıllık 400 milyon dolarlık bir ticaret hacmine sahip olabileceği tahmin edilmektedir. Bu durum, endüstriyel enzim pazarının %33 lük bir orana yükselebileceğini göstermektedir (Percival Zhang ve ark, 2006).

1.1.Enzimler ve Bazı Özellikleri

Biyolojik katalizör olan enzimler hücre içerisinde üretilmelerine rağmen birçoğu hücre dışına salınarak aktivitelerine devam ederler. Enzimlerin bu özellikleri endüstriyel uygulamalarda kullanılmalarının yolunu açmıştır. Enzimin aktivasyonu, sahip olduğu katalitik yapısından kaynaklanmakta olup aktivasyonunu reaksiyon esnasında enzim tüketilmeksizin gerçekleşir. Enzimin etki gösterdiği maddeye ‘substrat’ adı verilir ve enzimin adlandırılmaları etkilediği maddenin isminin sonuna –az (-ase) eki getirilerek yapılır. Bütün enzimlerin şifresi genler üzerindedir. Dolayısıyla amino asit dizilimi kendine özgüldür. Doğada her metabolik reaksiyon enzimler tarafından kontrol edilir. Enzim reaksiyon sırasında değişikliğe uğramadan yapısını korur ve başka bir substrat ile tekrar reaksiyona girer. Kimyasal katalizör maddelerin büyük çoğunluğu birçok

3

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

reaksiyonu katalizleyebilir. Fakat bunlar genellikle hem özgül hem de seçici değildirler. Buna rağmen enzimler oldukça selektif olup spesifik reaksiyonlara katalizör etkisi yaparlar. Bu özellik, enzim molekülünün şeklinden kaynaklanır. Enzim substrat ilişkisi ‘kilit-anahtar’ uyumu ile açıklanmaktadır. Enzimlerin bazıları iki farklı kısımdan oluşur. Bunlar Apoenzim (protein kısım) ve Koenzim (Organik ya da İnorganik kısım) yapılarıdır. Ne Koenzim (vitaminler olabilir) ne de apoenzim tek başına işlevsel değildir. Bazı enzimler ise etkinlikeri için belirli iyonlara ihtiyaç duyarlar. Örneğin tükrükteki amilaz nişastayı yalnız klor (Cl-1) iyonlarının bulunduğu ortamda parçalayabilir. Canlı bünyesinde bulunan eser elementler, mangan (Mn+2), bakır (Cu+2), çinko (Zn+2), demir (Fe+2) ve diğer elementler bu enzimatik işlevlerde aktivatör olarak kullanılır. Ayrıca bazı enzimlerin etkinliği yapılarındaki metal iyonlarına bağlıdır. Yani koenzim kısmı kalsiyum (Ca+2), potasyum (K+), magnezyum (Mg+2), çinko (Zn+2) ise kofaktör adını alır. Koenzim kısmının organik olduğu durumlarda, bu kısmın apoenzime kovalent bağlarla bağlanması söz konusu ise prostetik grup olarak adlandırılır. Koenzim (Prostetik grup) ve apoenzim birlikteliğine holoenzim denir. Bir enzim molekülü genel anlamda globüler yapıda bulunur ve molekül içi veya arası bağlar ile sekonder ya da tersiyer yapıda tutulur. Proteinlerin bu yapıları sıcaklık ve pH daki değişmeler ile bozulabilir. Bu yüzden, bir enzimin katalitik aktivitesi pH ve sıcaklığa duyarlıdır. Sıcaklığın yükselmesi, reaksiyona girecek moleküllerin kinetik enerji ile yüklenmesini sağlar. Böylece etkileşime girecek moleküllerin reaksiyon için karşılaşma şansını artırır. Her enzimin katalitik aktivitesinin en yüksek seviyede olduğu bir sıcaklık değeri vardır. Buna ‘optimal sıcaklık’ denir. Bu değerden yüksek sıcaklıklarda enzim yapısı molekül içi veya arası bağların kopması sonucu bozulmaya başlar. Aynı zamanda her enzimin en iyi çalıştığı bir pH aralığı (optimum pH) mevcuttur. Bu, enzimin molekül yapısının pH daki değişime bağlı olarak etkilenmesinden kaynaklanmaktadır. Bazı maddeler ise enzimlerin aktif bölgelerinin tutulması sonucu enzimin deformasyonunu sağlayarak, katalitik aktivitesini düşürebilir. Hatta tamamen durdurabilir. Bu tür maddelere ‘inhibitör’ adı verilir (Aehle,2004).

4

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

1.2.Enzimlerin Sınıflandırılması

Bilinen enzimlerin sayısı 1950’lerin sonuna kadar çok hızlı bir şekilde artmış ve birçok kişinin aynı enzime farklı isimler vermelerinden dolayı adlandırmada karmaşa ortaya çıkmıştır. Aynı zamanda adlandırılması yapılan birçok enzimin katalizlediği reaksiyonun tabiatı hakkında herhangi bir bilgi içermemesi de bu karmaşayı artırmaktaydı. Bu karışıklığın düzenlenmesi amacı ile 1956 yılında bir Uluslararası Enzim Komisyonu (International Comission on Enzyme) kurulmuştur. Enzimlerin sınıflandırılması ve isimlendirilmesi için kabul edilen sistem 3 genel prensibi içermektedir. Birincisi, -az (-ase) eki ile sonlanan enzim isimleri, tek enzimler için kullanılmalıdır. Bu durum birden fazla sistem içeren enzimler için kullanılmamalıdır. İkincisi, enzimler katalizledikleri reaksiyonlara göre sınıflandırılır ve adlandırılırlar. Son prensip ise katalizlenen reaksiyonların tipine göre adlandırılır ve sınıflandırılır. Bu sistem enzim komisyonu (E.C.) tarafından belirlenen kod numaraları kullanılarak enzimlerin açık bir şekilde tanımlanmalarını sağlar. Bir enzimin genellikle iki ismi mevcuttur. Biri sistematik yada tavsiye edilen, diğeri ise yaygın olarak kullanılan, daha kısa ve kolayca uygulanan genel ismidir. Bir enzim, sistematik ismi ve E.C. kod numarası ile tanımlandıktan sonra önerilen isim herhangi bir karışıklık olmaksızın sorunsuzca kullanılabilir. Bu tür yaklaşımlar literatürlerde yaygın olarak uygulanmaktadır (Aehle, 2004).

1.2.1.Enzimlerin Numaralandırılması ve Sınıflandırılması

Enzim komisyonu raporuna göre enzimler katalizledikleri reaksiyona göre 6 ana sınıfa ayrılır ve kod numaraları ile tanımlanırlar. E.C. ön eki ile başlayan numaralar noktalarla birbirinden ayrılmış 4 temel öğeyi ifade ederler. 1. İlk rakam, enzimin altı sınıftan hangisine ait olduğunu belirtir. 2. İkincisi, enzimin alt sınıfını (Subclass) ifade eder. 3. Üçüncü rakam, ikinci alt grubu (Sub-Subclass),

5

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

4. Dördüncü rakam ise enzimin sub-subclass içindeki seri numarasını ifade eder. Örneğin E.C. 3.2.1.1 fungal alfa-amilaz enziminin kod numarası ile ifade edilmesidir. Bu sisteme göre ilk rakamın ifade ettiği sınıflar kısaca aşağıdaki gibidir. 1. Oksidoredüktazlar, 2. Transferazlar, 3. Hidrolazlar, 4. Liyazlar, 5. İzomerazlar, 6. Ligazlar. (Aehle, 2004)

1.3.Amilazlar (Amylase)

Amilazlar, glikoz birimlerinden oluşan nişasta ve benzer polimer moleküllerini parçalayan “glikozid hidrolaz” olarak da bilinen enzimlerdir. Doğada bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalarda bulunur ve amiloz, amilopektin ve glikojeni oluşturan glikoz birimleri arasındaki glikozidik bağları parçalayabilme yeteneğine sahiptir. Amilaz enzimleri, “endoamilaz” ve “ekzoamilaz” olmak üzere iki kategoriye ayrılabilirler. Endoamilazlar nişasta molekülünü, farklı uzunluklarda düz ya da dallanmış oligosakkarit oluşturacak şekilde rastgele parçalarlar. Ekzoamilazlar ise indirgen olmayan uç kısmından itibaren kısa son ürün bırakacak şekilde parçalar (Gubta ve ark, 2003). Son yıllarda, nişasta ve benzeri polisakkaritleri parçalayan birçok yeni enzimler tespit edilmiştir. Polisakkarit yapıları oluşturan α-1,4 ya da α-1,4 ve/veya α- 1,6 bağlarını parçalayabilen, ticari öneme sahip mikrobiyal veya başka kaynaklı enzimler 6 sınıfa ayrılabilirler (Fogarty ve Kelly, 1979). Bunlar: a) α-1,4 bağlarını hidrolize edebilen ve α-1,6 dallanma noktalarını atlayabilen zincir üzerinde rastgele aktivasyon gösterebilen (Endoakting) α-amilaz enzimleri (E.C:3.2.1.1)

6

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

b) α-1,4 bağlarını hidrolize edebilen fakat α-1,6 dallanma noktalarını geçemeyen β-amilaz gibi nişasta zincirinin indirgen olmayan ucundan itibaren parçalayan (Ekzoakting) ve maltozu son ürün olarak açığa çıkaran enzimler (E:C:3.2.1.2). c) Glukoamilaz (amiloglikozidaz) gibi α-1,4 ve α-1,6 bağlarını parçalayabilen ekzoakting amilazlar (γ-amilaz) (E.C:3.2.1.3). d) Sadece α-1,6 bağlanmalarını parçalayabilen Pullulanaz ve diğer dallanmaları parçalayan enzimler (örn, E.C:3.2.1.41). e) α-Glukozidaz gibi özellikle amiloz ve amilopektin üzerine etki eden diğer enzimler sayesinde meydana gelmiş kısa zincirli oligosakkaritler üzerindeki α-1,4 bağlanmalarını hidrolize eden enzimler (E.C:3.2.1.20). f) Nişastayı, Siklodekstrin (Cyclodextrin) adı verilen, indirgenmeyen siklik D-glukozil (non-reducing D-Glucosyl) polimerlerine parçalayan enzimler (E.C:3.2.1.19) (Cyclodextrin Producing Enzyme) (Reddy ve ark, 2003;Aiyer, 2005). Günümüzde amilazlar, bitki, hayvan ve mikroorganizmalar olmak üzere birçok farklı kaynaktan elde edilmelerine rağmen, mikrobiyal kaynaklı olanlar endüstriyel alanda kullanılmaktadır. Nişasta endüstrisinde enzim kullanımı nedeniyle nişastanın kimyasal uygulamalarla parçalanması işlemine son verilmiştir (Gupta ve ark, 2003). Özellikle α-amilazlar endüstride kullanılan enzimlerin en popüler ve önemli formlarından biridir.

1.3.1.Amilazların Bazı Uygulama Alanları

Yaklaşık on yıldır unlu mamüllerde amilazlar yaygın bir şekilde yer bulmuştur. Özellikle ekmek ve unlu mamüllerde daha iyi kabarma, renk ve daha yumuşak ürün eldesi amacıyla kullanılmaktadır. Amilaz ilavesi ile fermentasyon oranı artmakta, hamur viskozitesi azaltmakta, ürün hacmi ve hamurda şeker miktarı yükseltilerek ekmek kalitesi artırılmaktadır. Ayrıca son zamanlarda ürünlerde raf ömrünü uzatıcı olarak da değerlendirilmektedir. Alfa amilazların en büyük pazarı, glukoz ve fruktoz gibi nişastanın parçalanmasından açığa çıkan ürünlerin üretimin alanıdır. Tatlandırıcı

7

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

özelliklerinden dolayı alkolsüz içecek endüstrisinde çok büyük oranlarda kullanılırlar. Aynı zamanda içecek endüstrisinde, alkol fermentasyonu için nişastanın sıvılaştırılması ve şekerleştirilmesi için kullanılmaktadır. Tekstil endüstrisinde nişasta, haşıllama işleminde kullanılır. İpliğin kırılmasını önlemek amacı ile sonradan giderimi kolay koruyucu bir tabaka uygulaması yapılır. Bu amaçla nişasta ile muamele edilmesine ‘sizing’, nişastanın uzaklaştırılmasına ise ‘desizing’ (Haşıllama) denir. Haşıllama dokuma esnasında tekstile direnç kazandırır. Dokuma işleminden sonra nişastanın uzaklaştırılmasını takiben yumuşatma ve boyama işlemi başlar. Nişastanın giderilmesi ise genellikle α-amilaz uygulaması ile gerçekleştirilir (Gupta ve ark, 2003; Aiyer, 2005). Alfa-amilazların kağıt ve kağıt hamuru endüstrisinde kullanımı, kağıt kaplamasında nişastanın modifikasyonu iledir. Tekstilde olduğu gibi, kağıdın nişasta ile kaplanması kağıdı mekanik hasarlara karşı korumaktadır. Aynı zamanda son ürün halindeki kağıdın sertliğini, direncini ve kalitesini de artırmaktadır. Doğal nişastanın viskozitesi kağıt işlemleri için çok yüksektir. Nişastanın istenilen yoğunluğa ulaşması, amilaz enzimi kullanılarak nişastanın belirli düzeyde hidrolizasyonu sonucu elde edilir. Deterjan endüstrisinde ise, nişasta temelli kirliliklerin temizlenmesi amacı ile alfa amilaz enzimi detejanlarda katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Özellikle sıvı deterjanların %90’dan fazlasında amilaz enzimi vardır. Son yıllarda bulaşık makinelerinde kullanılan deterjanlara her geçen gün daha fazla amilaz enzimi katılmaya başlanmıştır. Deterjanlardaki enzim ilavelerinin en büyük avantajı enzimsiz deterjanlara nazaran daha iyi temizleme sağlaması ve ortam koşullarını yumuşatmasıdır. İlk üretilen enzimsiz deterjanlar, solunduğunda sağlığa zararlı olduğu ve çin porselenleri ile ahşap malzemelere zarar verdiği görülmüştür. Medikal ve klinik kimya analizleri ile biyoteknoloji uygulamalarında da amilaz enzimi kullanılmaktadır. Amilaz uzun moleküllü oligosakkaritlerin saptanmasında gümüş nitrat testinden daha başarılı olarak kullanılmaktadır (Giri ve ark,1990). Aynı zamanda elektrolit, izolatör ve yarı-iletken kapasitörlü biyosensörlerde de amilaz enzimi kullanılmaktadır (Menzel ve ark, 1998).

8

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

1.4. Selülazlar (Endoglukanaz)

Selülazlar, selülozu glikoza parçalayabilme kapasitesindeki hidrolitik enzim grubudurlar. Mikroorganizmalar, bitkiler ve hayvanlar (memeliler hariç) tarafından üretilirler ve genellikle bir selülaz sistemi olarak birden fazla farklı enzimden oluşurlar. Selülaz sistemi bileşenleri, başlangıçta katalitik etki şekillerine göre sınıflandırılırken, günümüzde sınıflandırma yapısal özellikler temeli dikkate alınarak yapılmaktadır. Üç ana enzimatik aktivite tipi söz konusdur. Bunlar: a) Endoglukanazlar (endo-1,4-β-glucanases, yada 1,4-β-D-glucan-4- glucanohydrolases, EC 3.2.1.4). b) Ekzoglukanazlar (Sellodextrinazlar, 1,4- β-D-glucan glucanohydrolases) (EC 3.2.1.74) ve Sellobiyohidrolazlar (exo-1,4-β-glucanases, ya da 1,4-β-D- glucan cellobiohydrolases, EC 3.2.1.91). c) Sellobiyazlar (β-glucosidases, yada β-D-glucoside glucohydrolases, EC 3.2.1.21). Endoglukanazlar, selülozu meydana getiren polisakkarit zincirinin iç bölgelerinde rastgele hidroliz yaparlar ve değişik uzunlukta oligosakkaritler meydana getirirler. Ekzoglukanazlar ise selüloz zincirinin indirgenen ve indirgenmeyen ucundan itibaren sırasal olarak hidroliz yaparlar ve son ürün olarak glukoz (glukanohidrolaz) ya da sellobioz (Sellobiohidrolaz) açığa çıkarırlar. Ekzoglukanazlar aynı zamanda mikrokristal selülozu da hidrolize etmektedirler. β- Glikozidazlar sellodekstrin ve sellobiozu glikoza parçalayan enzimlerdir. Selülazların çoğunluğunun genel özelliği, hem katalitik hemde karbonhidrat bağlayan yapıları içeren modüler bir şekilde olmalarıdır. Selüloz bağlayan modül (CBM: Cellulose Binding Module) çözünmeyen selülozda muhtemelen katalitik bölgeyi substrata yaklaştırıp selülozun hidrolizini kolaylaştırmaktadır. CBM özellikle ekzoglukanazların hidroliz işlevinin başlangıcında önemlidir. Selüloz sistemleri, her bir enzimin kendi bireysel aktivitelerinin toplamından daha yüksek bir sinerjik aktiviteye sahiptir. Sinerjik aktivitenin 4 formu bildirilmiştir. Bunlar:

9

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

a) Endoglukanazlar ve ekzoglukanazların arasındaki endo-ekzo sinerji. b) Selüloz zincirinin indirgenen ve indirgenemeyen uçlarından ekzoglukanaz uygulamaları arasındaki ekzo-ekzo sineji. c) İlk iki enzimin son ürünü olarak sellobiozu (ve Sellodekxtrin) alan β-glukozidaz ve ekzoglukanazların arasındaki sinerji. d) Katalitik domain ve CBM arasındaki intra-moleküler sinerji. Selüloz sistemleri sadece üç enzimi de temsil eden bir birliktelik değil, daha çok selülozun etkin hidrolizi için koordinasyon sunan bir etkiye sahiptirler. Mikroorganizmalar selülozun tam hidrolizi için, doğal olarak lignin ve hemiselüloz polimeri içine gömülmüş substratlar için farklı adaptasyonlar geliştirmişlerdir. Selülolitik filamentöz mantarlar ve aktinomisetlerin, lif uzantıları boyunca selülozik substratlara nüfuz etme kabiliyetleri vardır. Serbest selülazların (CBM’li ya da CBM’siz) üretimi bu şartlarda selülozun etkin hidrolizi için yeterli olmaktadır. Bu sistemlerdeki enzimler molekül ağırlık bakımından büyük stabil kompleksler oluşturmazlar. Bu yüzden kompleks olmayan (Non-Complex) sistem olarak adlandırılır. Buna rağmen, anaerobik bakterilerin selülozik materyal içine etkin olarak nüfuz olma kabiliyetleri yoktur. Bu yüzden selülozun parçalanabilmesi için diğer mikroorganizmalar selülaz sentezi yapabilmek için ATP’nin sınırlı olması nedeniyle alternatif mekanizma bulmak zorundadırlar. Bu durum mikroorganizmaların Selülozom (Cellulosomes) denen kompleks selülaz sistemlerini geliştirmelerini zorunlu hale getirmiştir. Clostridium’lar ve ruminant bakterilerde hidrolizin gerçekleştiği bölgelerde selülaz üreten hücrelerin yerleştiği gözlenmiştir (Doi ve ark, 2003).

1.4.1.Kompleks Olmayan Selülaz Sistemleri

Son 50 yılın en fazla incelenen konusu Tricoderma reesei’ nin selülaz sistemi olmuştur. T.reesei en az 2 ekzoglukanaz (CBH-I ve II), 5 endoglukanaz (EGI, II,III, IV, ve V), ve 2 β-glukozidaz (BGL-I ve II) üretir.

10

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

İki ekzoglukanazın (sellobiohidrolaz) varlığı, mikrokristal selüloz zincirinin indirgenen (CBH-I) ve indirgenmeyen (CBH-II) uçları için T.reseei’ nin gösterdiği özel tercihe bağlanmıştır. Bu düşünce iki enzim arasında gözlenen ekzo-ekzo sinerji ile de desteklenmiştir. Sellobiohidrolaz aktivitesi mikrokristal selülozun hidrolizi için gereklidir. Sellobiohidrolazların her ikisi de selüloz polimerizasyonunu (zincir uzunluğu) düşürmede çok yavaştırlar. Endoglukanazların amorfoz bölgelerden selüloz zincirini keserek zincirin kısaltılmasından birincil olarak sorumlu olduğu düşünülmektedir. Böylece CBH ların etkisine açık yeni selüloz zinciri oluşturulmaktadır. Henüz T.reesei de 5 endoglukanaz varlığının nedeni tam olarak açıklanamamıştır. Aynı zamanda endoglukanazlar arasındaki sinerji de gösterilememiştir. Buna rağmen bazı endoglukanazların (EG-I) ksilanaz aktiviteleri gibi geniş substrat özgüllüğü de vardır. CBM nin varlığı bir endoglukanaz aktivitesi ya da endo-ekzo sinerjisi için gerekli değildir. CBH-I ve CBH-II’ nin temel ürünü olan sellobiozlar sellobiohidrolazların ve endoglukanazların aktivitesini de inhibe ederler. T.reesei nin en az iki β-glukozidaz enzimi üretmesi sellobioz ve kısa oligosakkaritlerin hidrolizini kolaylaştırır. Hem BGL-I ve hem de BGL-II’nin büyük çoğunluğu hücre duvarına bağlı olarak kalsalar da, süpernatantlardan da izole edilmişlerdir. β-glukozidazın mantar hücre duvarlarına yakın bulunması, selüloz hidrolizinden açığa çıkan glukozun, çevreye dağılarak kaybını azaltmaktadır. Termofilik mantar H.insolens’ in selülaz sistemi T.reesei sistemine homolog iken Phanerochaete chrysoporium’ un ürettiği selülaz sistemi CBH-II ve 6 CBH-I yapılarına homoloji oluşturur (Doi ve ark, 2003).

1.4.2. Kompleks Selülaz sistemleri (Selülozom)

Selülozomlar, selüloz, hemiselüloz ve pektini parçalayabilen ekstrasellüler enzim komplekleridir. Selülozom sistemlerine sahip mikroorganizmalar anerobik ortamlarda ürerler. Selülozomların kompozisyonları türden türe değişkenlik

11

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

göstermesine rağmen, Clostridium ve ruminant bakterilerden Ruminococcus türlerinde benzerlik gösterirler. Selülozomların yapısı incelendiği zaman enzimatik özelliği olmayan, scaffoldin adı verilen temel bir protein ile buna bağlanmış enzimatik alt ünitelerden oluştuğu görülür. Skafoldin (Scaffoldin) proteini CbpA, CipA ya da CipC denen proteinlerden oluşur ve bunlarla kompleks oluşturan bir çok selülozomal enzimler vardır. Non- enzimatik protein (scaffoldin) bir çok kohezin (cohesin) denen bölgeyi ve selüloz bağlayan bölgeleri (CBM yada CBD, Cellulose Binding Domain) içerir. Bunlardan başka, hidrofilik bölge, dockerin II bölgesi, enzim kodlayan bölge ve görevi bilinmeyen tanımlanmamış bölgeler mevcuttur. Kohezin bölgeleri, skafoldin proteinlerde her zaman mevcut olup, selülozomal enzimlerin dockerin bölgeleri için bağlanma noktalarına sahiptir. Kohezin-dockerin birlikteliği selülozomun bir araya gelmesinde anahtar rol oynar. CBM selülozomu, selülazı substrata sıkıca bağlamakla görevlidir. Kristal selüloza amorfoz selülozdan daha etkin bağlanma özelliği göstermektedir. Ayrıca CBM selülozomu, omurgası selülozunkine benzeyen kitine de bağlanır. CBM selülozomları farklılık gösterebilirler ve aminoasit dizilerine göre birçok familyaya ayrılabilirler. Aynı zamanda, CBM selülozomlar sadece skafoldin proteinlerle bulunmaz daha önce de bahsedildiği gibi selülozomal ya da selülozomal olmayan selülazlarla da bulunabilirler. Selülozomal Enzimler: Minimal olarak bir katalitik ve dockerin bölgesi içerir. Bir enzimde dockerin varlığı genellikle enzimin selülozomal enzim olduğunu gösterir. Çünkü dockerin, skafoldinin kohenzin ile etkileşimi sonucu enzim kompleksini oluşturur. Selülozomal enzimlerin esas kısmını oluşturan selülazlar 5. ve 9. familyanın endoglukanazları ve 48. familyanın ekzoglukanazlarını içeren glikozit hidrolazların 3 familyasına aittirler. Dokuzuncu familyanın üyeleri özellikle selüloz liflerini internal olarak parçalayabildikleri gibi kesme noktasından başlayarak selüloz polimerini kesintisiz olarak da parçalayabilir. Selülozomal hemiselülozlar enzimleri ksilanazları ve mannanazlardan meydana gelirler. Ksilanazlar enzimleri, glikozit hidrolazların 11. familyası içerisinde yer alırlar. Mannanazlar ise 5. familyanın üyeleridirler. Dokuzuncu familyaya ait olan

12

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

pektat liyazlar enzimleri da selülozomlar içerisinde tespit edilmişlerdir. Bu bulgu, selülozomların selüloz, hemiselüloz ve pektini yani tüm hücre duvarı bileşenlerini parçalayabileceğini göstermektedir. Selülozomal kitinazlar da C.thermocellum’ dan izole edilmiş enzimler olup, lignoselülozu parçalayamamalarına karşın, mantar ve böceklerin ekzo-iskeletini oluşturan kitini parçaladığı gösterilmiştir. Selülolitik mikroorganizmaların çoğunun karbon ve azot kaynağı olarak mantar ve ölü böceklerdeki kitini kullandığı saptanmıştır (Doi ve ark, 2003).

1.4.3. Selülazların Bazı Uygulama Alanları

Selülazların ana uygulama alanları gıda, hayvan yemi üretimi, tekstil, biyo yakıt, kimya, kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi, atıkların giderimi, tıbbi ve farmasötik endüstrisi, protoplast üretimi, genetik mühendisliği ve kirlilik giderimidir (Bhat ve Bhat, 1997). Bazı uygulamalar ayrıntılı olarak incelendiğinde çok farklı kullanım alanlarının olduğu görülür.

1.4.3.1. Gıda endüstrisinde Selülazlar

a) Tohumlardan yağ ve meyve suyu ekstraksiyonunda, b) Meyve sularının berraklaştırılmasında, c) Tahılların homojen olarak su çekmesini sağlamak ve yeterince ıslanmasının artırılmasında, d) Soya sosu gibi fermente soya gıdaların üretiminde soyanın dış zarının uzaklaştırılmasında, e) Kokonat ve soya fasulyesinden protein izolasyonunda, f) Mısır ve tatlı patatesten nişasta üretiminde, g) Sindirimini artırmak amacı ileyosunlarının jelatinizasyonunda, h) Su yosunlarından agar ekstraksiyonunda i) Gıda katkısı maddesi olarak kullanılan öğütülmüş lignoselülozik materyalin parçalanmasında,

13

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

j) Selülozik atıklardan çözünür şeker, glikoz ve sello- oligosakkarit üretiminde. k) Bioetanol üretimi için substrat eldesinde. l) Kurutulmuş sebze ve çorba karışımlarının geri sulandırımının artırılmasında. m) Polisakkarit, protein, enzim ve tat verici maddelerin açığa çıkışını kolaylaştırmak amacıyla bitki hücre duvarlarının uzaklaştırılmalarında kullanılmaktadır(Bhat ve Bhat, 1997).

1.4.3.2. İçecek ve Şarap Endüstrisinde Selülazlar

Rekombinant mayalardan elde edilen β-1,3 ve β-1,4 glukanazlar şaplarda aroma artışının sağlanması, biranın filtrasyonunun kolaylaştırılması ve düşük kalite arpada bulunan β-1,3 ve β-1,4 glukan hidrolizinde kullanılmaktadırlar.

1.4.3.3. Hayvan Yemi Endüstrisinde Selülazlar

a) Ruminant ve monogastrik hayvanlar yemlerinde sindirilebilirliği artırmak amacı ile, b) Lignoselülozik materyallerin ön işlemden geçirilmesinde, hububatların kabuklarından arındırılmasında, ruminant ve monogastrik hayvanların selülozda yararlanmalarını artırmak için silaj yapımında kullanılırlar.

1.4.3.4. Tekstil Endüstrisinde

a) Kumaşlarda boyanın fazlasını almada (biostoning), b) Bir çok yıkama sonunda pamuk kumaşlardan çıkan mikrofibrillerin giderilmesinde,

14

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

c) Pamuk yada pamuklu kumaşların yıkanması, renk parlaklığının artırılması ve yumuşaklığının geri kazandırılmasında kullanılır. (Bhat ve Bhat, 1997)

1.5. Ksilanazlar (Xylanase)

Ksilanın kompleks yapısı nedeniyle molekülün tamamen hidrolizi için farklı enzimlere gereksinim duyulmaktadır. Ksilanı hidroliz eden enzimlerin tamamına ksilanolitik enzim sistemi adı verilir. Bu gurupta β-1,4-Endoksilanaz, β-Ksilozidaz, α-L-araninofuranozidaz, α-Glukuronidaz, Asetil Ksilan Esteraz ve Fenolik asit (Ferulik ve p-Kumarik asit) esteraz yer almaktadır. Endo-1,4,-β-Ksilanaz (1,4-β-D-xylanxylanohydrolase, EC. 3.2.1.8) Endoksilanaz enzimi, ksilan omurgasını rastgele hidrolize ederek depolimerizasyonu sağlar. β-Ksilozidaz (β-Xylosidase; 1,4-β-D-Xylosidase; 1,4-β-D-Xylan Xylohydrolase EC.3.2.1.37) kısa oligosakkaritleri parçalar. Ksilanda bulunan yan gruplar, α-L-Arabinofuranozidaz, α-D-glukuronidaz, galaktozidaz ve asetil ksilan esterazlar tarafından molekülden kopartılarak serbest kalırlar (Şekil 1.1). Endoksilanazların genel olarak bakteri ve mantarlardan meydana gelen mikroorganizmalar tarafından üretildikleri bulunmuştur. Bununla birlikte, bitkisel kökenli endoksilanazların da bulunduğu ve bazı meyvelerin aşırı olgunlaşma dönemi sonunda üretildikleri saptanmıştır. Su yumuşakçaları dahil bazı gelişmiş hayvanlarda da ksilan üretiminin gerçekleştiği bildirilmiştir. Exo-1,4-β-D-Ksilozidaz enzimi (EC.3.2.1.37) indirgen olmayan uçtan D-ksiloz birimlerini başarılı bir şekilde kopartarak 1,4-β-D-ksilo-oligosakkarit hidrolizini katalizler. Ksilanın hidrolizi sırasında ksilozun koparılmasını sağlayan endoksilanazların, β-ksilozidaz tarafından kolayca hidrolize edilebilen ksilobioza (Xylobiose) karşı aktiviteleri yoktur. α-Arabinofuranozidazlar (EC:3.2.1.55),

15

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

arabinanların, arabinoksilanların ve arabinogalaktanların indirgenmeyen α-L- arabinofuranosil ucunu hidrolize ederler. α-D-Glukuronidazlar (EC.3.2.1.1) ksiloz ve D-glukuronik asit veya 4-0- metileter arasındaki α-1,2-glikozidik bağlarının hidrolizinde görev yapan enzimlerdir. Ksilanın enzimatik hidrolizinde α-1,2 bağları, hidrolizi yavaşlatan bölgelerdir ve α-glukuronidazlar ise farklı substrat ile çalışırlar. Lignin karbohidrat bağlarına benzer şekilde 4-0-metil glukuronik asit bağları ile odunun degredasyonunda engeller. Doğal glukuronidazların hidrolizasyon işleminde tam etki gösterebilmeleri için esterazlara gereksinim vardır. Bu enzimler, ksilan molekülündeki asetik asit ve fenolik asit birimlerinin koparılmasını sağlarlar. Asetil, feruloyl ve p-kumoryl gruplarının ksilandan koparılması, ligninin uzaklaştırılmasında önemli bir basamaktır. Aynı zamanda hemiselüloz ve lignin arasında ester bağlarının koparılmasıyla ligninin çözülmesine katkıda bulunurlar (Subramaniyan ve Prema, 2000).

Şekil 1.1: Ksilanın Tam Hidrolizinde Gerekli Enzimler ve Etki Bölgeleri (Beg ve ark,2001)

16

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

Ksilan hidrolizinde görevli enzimler arasında da sinerjik etkiden söz etmek mümkündür. Hidroliz sırasında 1,4-β-D-Ksilan omurgasında etkin olan (β-1,4- Endoksilanaz) ve yan zincirleri koparan enzimlerin aktif olduğu gözlemlenir. Asetil ksilan esteraz ve endoksilanaz arasındaki sinerjik etki asetil ksilanların degredasyonunda etkindir. Asetik asitin asetil ksilan esterazla ayrılması, ksilan omurgasını endoksilanaz etkisi için uygun duruma getirecektir. Böylece daha hızlı bir hidroliz meydana gelir. β-ksilozidazlar endoksilanazların inhibisyonuna neden olacak son ürünleri parçalayarak ksilanın hidrolizasyon düzeyini artıracaktır. Benzer şekilde, α-arabino- furanozidazların endoksilanazlara eklenmesi arabinoksilanların şekerleştirilmesini artırmaktadır.

1.5.1. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları

Özellikle mikroorganizmalardan elde edilen ksilanolitik enzimler, birçok endüstriyel işemlerde biyoteknolojik potansiyellerinden dolayı büyük bir ilgi odağı olmuştur. Bilhassa kağıt ve kağıt hamuru başta olmak üzere gıda ve hayvan yemi endüstrisi gibi alanlarda temel endüstriyel enzim olma yolunda çok büyük öneme sahiptir. Ksilanazların ekonomik önemi yüksek birçok faydalı ürünün istenilen düzeyde üretimi için önemli bir potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Tek hücre proteini, enzimler, sıvı ya da gaz yakıtların üretimi, çözücüler ve şeker şuruplarının üretimi genel uygulamalar arasındadır (Beg ve ark, 2001). Ksilanazların kullanımı sadece kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi ile sınırlı olmayıp aynı zamanda ligno-sellülozik materyallerin dönüşümü, tarımsal atıkların fermentatif ürünlere parçalanması, meyve sularının berraklaştırılması, biranın kıvamının gelişimi, hayvan gıdalarının sindiriminin artırılması alanlarında özel bir öneme sahiptir. Ksilanaz enziminin kullanım alanları arasında; a) Ksilanazların en ümit verici uygulamalarından birisi, kağıt hamuru hazırlamada beyazlaştırma ajanı olarak klor kullanımınının azaltılması ve kağıt

17

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

hamurundan lignini ayırma özelliğidir. Enzim uygulaması kağıt hamurunun fibrilasyonunu ve su tutuşunu artırır, işlenmemiş kağıt hamurunda çırpma yada dövme sayısını düşürür, hurda kağıt hamurunda bağları onarır, çözünen hamurdan ksilanın selektif giderimi sağlar. Ksilanazlardan ayrıca odun hamurunda biobeyazlatma, sentetik ipek üretiminde ise hamurdan selüloz eldesinde faydalanılır (Viikari ve ark, 1986; Beg ve ark, 2001). b) Çavdardan elde edilen yemler ile beslenen et tavuklarında yemden geri dönüşüm oranı ve kilo kaybı intestinal viskozite ile ilişkilendirilmiştir. Et tavukçuluğunda çavdar temelli yemlere ksilanaz uygulamaları intestinal viskoziteyi düşürmüş ve böylece yemden etkin yararlanma, dolayısıyla kilo artışı sağlanmıştır. Ksilanazların etkinliği ekmek kalitesi artışında da ekmek hacmini artırarak gözlenmiştir. Bu durum ksilanazlarla birlikte amilazların kullanılmasıyla daha da artmıştır (Maat ve ark, 1992). c) Ksilan tarım ve gıda endüstrisi atıklarında bol miktarda bulunmaktadır. Ksilanaz uygulamaları ile bunlar ksiloza dönüştürülür (Rani ve Nand,1996). Bitki hücrelerinde ise ksilanaz uygulamaları firosterollerin yağ açilasyonu (fatty acylation) ve glikozilasyonunu indüklerler. Tütün süspansiyon hücrelerinin endoksilanazlarla muamele edilmesi, açillenmiş sterol glikozidlerinin seviyesinin 13 kat artmasına ve fitoaleksinlerin sentezini sağlamaktadır (Moreau ve ark, 1994). d) Meyve ve sebzelerin sıvılaştırılması (eritilmesi) ve meyve sularının berraklaştırılması amacıyla pektinaz ve selülaz ile birlikte aynı anda kullanılır. Ayrıca kompostlamayı ve ruminantların beslenmesinde sindirimi artırmak amacıyla yem bitkilerinin ön işleminde kullanılmaktadır (Gilbert ve Hazlewood,1993). e) Alkil glikozitler yeni surfaktanlar için geleceği en parlak adaylardan biridir. D-glikoz ve yağ alkolü gibi monomerik şekerlerden üretilirler. Fakat polisakkarit kullanımı ile doğrudan glikozilasyonu endüstriyel üretim için daha uygundur. Çünkü polisakkaritlerin hidrolizine ve daha sonraki aşamalara gerek kalmaz. Bu yüzden bu işlemlerde ksilanaz kullanımı kolaylık arzeden bir fırsat sağlar.

18

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

f) α-L-Arabinofuranozidaz ve β-D-Glukopiranozidazlar meyve suyu, şarap ve aroma özütleri için gıda işlemede kullanılırlar. Bazı ksilanazlar bitki hücrelerinden protoplast üretimi için hücre duvarının yumuşatılmasında da kullanılır. g) Mannanaz, ligninaz, ksilozidaz, glukanaz, glukozidaz gibi diğer enzimlerle birlikte ksilanazlar, lignoselülozik materyallerden etanol ve ksilitol gibi biyolojik yakıt üretimi için kullanılabilir. Etanol üretiminde kullanılacak serbest şekerlerin üretimi amacıyla, karbohidrat polimerlerinin depolimerizasyonunu takiben lignin, hemiselüloz ve selülozun ayrıştırılması ile delignifikasyon gerçekleştirilir. Sonuçta etanol üretimi için pentoz ve heksoz şekerlerinden oluşan karışım fermentasyon için kullanılır. h) Ksilanolitik enzim sistemlerinin pektinolitik enzim sistemleri ile birlikte önemli uygulamalarından biri de, jüt ve kenevir gibi lif bikilerinin reçine benzeri maddelerden arındırılmasıdır. Ksilanaz-pektinaz kombinasyonu odun işlemede ilk basamak olan kabuktan arındırma işlemlerinde de kullanılabilmektedir (Beg ve ark, 2001).

1.6. Ekstremofilik Enzimler (Ekstremozimler)

Ekstremofilik enzimler sıcaklık, basınç, pH ve tuzluluk gibi ekstrem şartlarda çalışabilen ve endüstriyel uygulamalar için büyük öneme sahip enzimlerdir. Mezofilik enzimler enzim stabilitelerindeki eksikliklerden dolayı endüstriyel enzimlerden istenen zorlu reaksiyon şartları için, pek uygun değillerdir. Ekstremofilik organizmalar ise ekstrem ortamlarda bulunabilen organizmalar olup termofil, asidofil, halofil, alkalofil, psikrofil gibi bir çok farklı sınıflar altında grublandırılabilirler. Dolayısı ile bu organzimalar, mezofillerin yaşamlarını sürdüremeyecekleri koşullarda aktivite gösteren enzimleri üretebilirler. Mikroorganizmalar optimum büyüme sıcaklıkları dikkate alındığında psikrofiller (20oC altında), mezofiller (20-55oC) ve termofiller (55oC üzeri) olmak üzere üç ana gruba ayrılırlar. Bunlara ilaveten Kristjansson ve Stetter (1992)’ termofil grubu daha da genişletilerek 60-80oC arasında üreyenleri ekstremofil, 80oC’nin üzerinde üreyenler için hipertermofil tanımını kullanılmaktadırlar.

19

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

Gerek termofilik gerekse hipertermofilik enzimler karakteristik olarak 40oC’nin altında etkin bir aktivite göstermezler (Gomes ve Steiner, 2004). Sıcaklığa dirençli proteinlerin amino asit kompozisyonu mezofilik organizmaların amino asit kompozisyonu ile karşılaştırıldığında glisin yerine alanin, lizin yerine arjinin amino asitinin sıcaklığa dirençli proteinlerde daha fazla yer aldığı görülmüştür. Aynı zamanda arjinin termofilik proteinlerin yapısında bol bulunurken sıcaklığa en hassas amino asit olan sistein bu proteinlerin yapısında daha sınırlı düzeyde bulunmaktadır. Deneysel çalışmalar hidrofobik interaksiyonların termofilik proteinlerin stabilizasyonunda önemli bir rol aldığını göstermiştir. Sıcaklığa dirençli proteinler hidrofobik interaksiyonlarla dimer oluşturarak termal hidrolize karşı daha dirençli hale geçmektedir. Bunlardan başka sıcaklığa dirençli proteinler disülfit bağları, molekül içi aromatik yapılar, zengin hidrojen bağları içermekte ve elektrostatik mekanizmalarla yüksek sıcaklığı tolere edebilmektedirler (Kumar ve Nussinov, 2001). Deterjan, gıda, yem, nişasta, tekstil, deri, kağıt hamuru, farmasötik endüstrisi, termofilik enzimlerin en geniş kullanıldığı alanlardır (Gomez ve Steiner, 2004). Örneğin nişasta endüstrisi, termostabil amilazın en yaygın kullanıldığı alandır. Halofilik mikroorganizmalar üremeleri için yüksek tuz konsantrasyonuna ihtiyaç duyarlar. Bunlar dış ortamdaki tuz konsantrasyonu ile izotonik dengenin kurulabilmesi için NaCl ya da KCl akümülasyonu yaparlar. Halofil ortama uyum sağlanması halofilik organizmalarda yüksek tuz konsantrasyonunda aktivite gösteren proteinlerin sentezlenmesiyle mümkün olur. Uyum olayının gerçekleşmesine, termofiliklerde olduğu gibi, halofilik proteinlerin amino asit kompozisyonlarındaki farklılık neden olmaktadır. Halofilik proteinlerin yüzeyinde özellikle glutamik asit ve aspartik asit gibi asidik amino asitler fazlaca bulunur (Ventosa ve ark, 1998). Halofilik proteinlerin yüzeylerinde bulunan negatif yüklü yapılar sudaki pozitif yüklü iyonlara sıkıca bağlanarak, yüzey hidrofobitesini düşürür ve proteinlerin yüksek tuz konsantrasyonu nedeniyle agregasyonu engellemiş olurlar (Gomez ve Stainer, 2004). Halofilik proteinler aynı özelliğe sahip olmayan diğer protein yapılarından düşük tuz konsantrasyonlarındaki stabilitelerinin eksik olması buna karşılık yüksek tuz

20

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

konsantrasyonlarında çözünürlüklerinin yüksek oluşu ve aktif konformasyonları ile ayrılırlar. Alkalifilik mikroorganizmalar alkalifiller ve haloalkalofiller olmak üzere iki ana fizyolojik gruptan toplanırlar. Alkalifil organizmalar, genellikle üreyebilmek için 8’in üzerinde bir pH’ya ihtiyaç duymaktadırlar. Optimum üreme pH değeri ise 9-10 aralığıdır. Haloalkalofil organizmalar ise üreyebilmek için hem 8 ve daha yüksek pH ortamına hem de yüksek tuz konsantrasyonuna ihtiyaç duyarlar. Alkalifilik enzimlerin başlıca uygulama alanı deterjan endüstrisidir. Ayrıca deri işletmeciliğinde, tabaklama uygulamaları ile derideki kılların uzaklaştırılması amacıyla kullanılmaktadırlar (Horikoshi,1999).

1.7. Bacillus Cinsi

Gram pozitif, çomak şekilli, sıcağa dirençli endosporlara sahip ve aerobik şartlarda üreyebilen mikroorganizmalar Bacillus cinsi içerisinde sınıflandırılırlar. Endospor oluşturan bakterilerden obligat anaerobik olanlar ise Clostridium cinsi mikroorganizmalardır. Bacillus cinsi bakterilerin bu özellikleri nedeniyle, cins düzeyinde tanımlanması ve izolasyonları oldukça kolaydır. Tek ya da çok sayıda hücreden oluşan uzun zincirler meydana getirebilirler. Hücrede bulunan sporun şekli ve yeri, türler arasında farklılık gösterir. Sporlar genellikle silindirik, elipsoidal, oval ya da yuvarlaktır. Sporun hücre üzerindeki konumu ise merkezde, merkeze yakın veya uçta bulunabilir (Lennete ve ark,1985). Bacillus’ların tanımlanması ve türler arasındaki farklılıkların belirlenmesinde spor ve konumları temel alınabilmektedir. Bazı türler fakültatif anaerob özellikte olsalar ve oksidaz testleri değişkenlik gösterse de, daima katalaz pozitiftirler. Bilinen birkaç tür hareketsizdir. Tür düzeyinde tanımlamada önemli bir yer tutan spor şekilleri ve konumları, faz-kontrast veya spor boyama ile kolayca saptanabilir.

21

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

Bu cinse ait bakterilerin çoğunun tanımlanması, hala klasik biyokimyasal testlerle yapılabilse de, bu işlemin hem çeşitli olumsuzlukları vardır hemde oldukça iş yüküne neden olmaktadır. Koloni özellikleri genellikle çevresel faktörlere göre değişebilmektedir. Kültürün ürediği besiyerinin bileşimi ve inkübasyon sıcaklığı gibi etmenler, koloni büyüklüğü ve mofolojisini değiştirebilir. Katı besiyerlerinde genellikle daha geniş ve şekilli koloniler oluşturmaları, ön tanımlama için büyük yarar sağlamakadır. Koloni morfolojilerine göre seçilen örnekler biyokimyasal testler kullanılarak tanımlanırlar. Günümüzde, API ve VITEK teknikleri kullanılarak tanımlama yapılabilmektedir. Bu sistemlerin temeli, sistemde kayıtlı referans organizmalar ile doğal organizmanın biyokimyasal özellikleri bakımından karşılaştırılması esasına dayanmaktadır. Bacillus’ların teşhisinde kullanılabilen bir diğer uygulama ise yağ asiti kompozisyonu temeline dayalı tanımlama sistemleridir. Bu yöntem, hücresel yağ asitleri metil-esterlerinin (FAME) Gaz-Chromatografisi (GC) ile analizi ve referans değerler ile karşılaştırılması esasına dayanmaktadır. Belirtilen yöntemlerin yanısıra günümüzde, moleküler tanılama şeklinde de adlandırılan ve 16S rRNA/DNA sekans analizi esas alınarak gerçekleştirilen ileri tanımlama yöntemleri de kullanılmaktadır. Bu teknik ağırlıklı olarak filogenik çalışmalarda tercih edilmektedir (Barrow ve Feltham,1993).

1.8. Elektroforez Uygulamaları

İyonlaşabilir gruplara sahip amino asitler, peptidler, proteinler, nükleotidler ve nükleik asitler gibi biyolojik moleküller, ayırıcı bir ortamın bulunduğu elektriksel alanda, sahip oldukları elektrik yüküne bağlı olarak, anod veya katoda bölgesine göç ederler. Moleküller aynı yüke sahip olsalar dahi, molekül ağırlık farklılığı nedeniyle sahip olunan yükün molekül ağırlığına oranı (yük/kütle) farklı olacaktır. Bu farklılıklar sayesinde solüsyon içindeki iyonlar bir elektriksel alana tabii tutulduklarında moleküllerin göçüne yönelik farklılıklar ortaya çıkar.

22

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

Elektroforez için gereken gereçler güç kaynağı ve elektroforez tankından oluşur. Güç kaynağı elektrodlar arasında doğru akımın dengeli ve düzgün şekilde akışını sağlayarak elektriksel alanın istenilen özellikte oluşmasını neden olur. Elektriksel alanda sürekli olarak, pozitif yüklü moleküller negatif kutba, negatif yüklü moleküller pozitif kutba doğru göç ederler. Örnekler elektroforezin düzgün gerçekleşmesi için tampon içinde çözülürerek hazırlanmalıdır. Ayrıca elektroforzde istenilen başarının elde edilmesi için ayırıcı ortamın mutlaka elektroforez tamponu ile hazırlanması şarttır. pH değişikliği elektroforezi yapılan molekülün iyonik yükünü değiştirebileceğinden, tampon pH’sının stabil tutulması önemlidir. Ayırıcı ortam olarak filtre kağıdı, selüloz asetat, agaroz, nişasta, agar veya poliakrilamid gibi sitemler kullanılabilir. Her sistemin ayırma gücü bir birinden farklılık gösterir. Elektroforez işlemi ayırıcı ortamın konsantrasyonu, ortam sıcaklığı, uygulanan akımın türü ve şiddeti, kullanılan tamponun iyonik gücü, elektroforez süresi, molekül şekli ve ağırlığı gibi parametrelerden etkilenmektedir. Elektrodlar arasındaki akımı genel olarak tampon iyonları az bir kısmı örnek iyonları iletilir. Voltajdaki iletilen toplam yükün artışına neden olur. Sıcaklık artışı elektroforez sırasında direncin düşmesine neden olur. Isı artışı tomponun buharlaşmasına neden olduğunda iyonik gücün değişmesine yol açar. Elektroforez düzeyi örneğin net elektriksel yükü arttıkça artacaktır. Diğer taraftan molekül büyüklüğü arttıkça göç oranı düşecektir. Örnekler aynı molekül büyüklüğüne sahip olsalar bile moleküllerin globüler ya da fibröz oluşu moleküllerin göçünde farklılığa neden olacaktır. Elektroforez işlemi, kullanılan tamponun bileşimi ve iyonik yükünden farklı şekilde etkilenir. Yaygın olarak kullanılan tamponlar agaroz için tris-asetat, tris-fosfat ve tris-borat, poliakrilamid için tris-glisin karışımlarıdır. Örnekle bağlanma davranışı göstermeyen tamponlar molekülün göç oranını değiştirirken, karbonhidratların analizinde kullanılan borik asit tamponu moleküle bağlandığı için elektroforezde olumsuzluğa yol açar. Aynı şekilde tamponun iyonik gücü artarsa, tampondan geçen elektrik akımıda artacaktır. (Wilson ve Goulding, 1986).

23

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

1.8.1. Jel Elektroforezleri

Ayırıcı ortam olarak jellerin kullanılmaya başlanması, nükleik asit ve protein gibi büyük moleküllü maddelerin seperasyonunda “düşük voltajlı ince tabaka elektroforez” sistemlerinin devre dışı kalmasına sebep olmuştur. Suda çözünmez, hidrofilik ve yarı-katı kolloid yapıda olmaları gibi fiziksel özellikleri tercih edilmelerinde önemli faktörleri oluşmuştur. Nişasta, agar ve poliakrilamid jel elektroforez uygulamalarında kullanılan malzemeler olup, kullanmadan hemen önce hazırlanırlar. Nişasta jeller, uygun tampon içerisinde kısmen hidrolize olmuş nişasta karışımı ısıtılıp soğutularak hazırlanır. Nişastanın amilopektin bileşeni dallanmış zincirlerinin sarılmaları ile yarı katı jelin oluşumu sağlar. Nişastanın moleküler elek özelliğinde olması, fizyolojik aktif proteinler ve kompleks yapısal molekül karışımlarının analizinde tercih edilmelerine neden olmuştur. Agar ucuz, toksik olmayan, zararsız bir malzeme olup agaroz ve agaropektinden oluşmuştur. Agar tampon içerisinde kaynatılarak çözülürken ortam sıcaklığı 40oC ye düşürüldüğünde katılaşarak jelleşir. Geniş por çapına sahip olmaları nedeniyle elektroforez esnasında iyonların hareketi çok hızlı gerçekleşmektedir. Bu özellik makromoleküllerin separasyonunu için bir avantajdır. Agar, separasyondan sonra boyama için çok uygun bir materyal olup, özelleklikle difüzyon direncinin düşük olması nedeniyle, immünelektroforez uygulamalarında fazlaca tercih edilmektedir. Saflaştırılmış agaroz jel saf halde izole edilmiş nükleik asit yapılarının analizi için yaygın bir kullanım alanına sahiptir. Poliakrilamid jeller oldukça toksik kimyasal bileşiklerle hazırlanır. Akrilamid monomerleri (CH2=CHCONH2) taze hazırlanmış amonyumpersülfat ve TEMED (Kimyasal katalizör sistemi) varlığında genellikle N,N-metilenbisakrilamidin

(CH2(NHCOCH=CH2)2) çapraz bağlanmaları ile polimerize olurlar. Moleküler oksijenin polimerizasyonu inhibe etmesi nedeniyle monomer, tampon ve su sistemine AMPS ve TEMED in ilavesinden önce degaz işlemi gerçekleştirilir. Bu

24

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

amaçla karışım vakum pompası ya da vakumlu desikatörde veya ultrasonik su banyosunda 5 dakika bekletilir. Jelin dökümünden hemen sonra üst yüzeydeki yüzey gerilimi nedeniyle meydana gelen eğimli yüzey oluşumunun separasyonu olumsuz etkilemesi ve atmosferik oksijen difüzyonunun engellenmesi için jelin üst tabakası distile su veya suya doyurulmuş bütanol ile kapatılır. Jelin polimerizasyonunda riboflavin ve TEMED sisteminden yararlanılacaksa (foto-polimerizasyon) reaksiyon ışık altında gerçekleştirilir (Wilson ve Goulding, 1986). Akrilamid jel uygulamaları Kesiksiz (Continuous) ve Kesikli (discontinuous) olmak üzere iki farklı şekilde gerçekleştirilebilir. Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel vardır ve tanklarla jelde aynı tampon kullanılır. Kesikli sistemde ise jel, farklı tamponlarla hazırlanmış iki kısımdan oluşur. Büyük porlu stacking (dengeleme jeli) ve küçük porlu separating (ayırıcı) jel şeklindedir. Jelin porlarının büyüklüğü/küçüklüğü akrilamid monomerinin konsantrasyonu ile değişir. Jeller mevcut akrilamidin toplam yüzdesi ile %3 ila %30 arasında bir konsantrasyonda hazırlanabilir. Düşük konsantrasyonlarda geniş por yapıları oluşur ve büyük moleküllerin separasyonu için tecih edilir. Proteinlerin seperasyonu çoğunlukla %5 ile %15 lik jellerde gerçekleştirilmektedir. Benzer yüklere sahip olsalar bile farklı şekil ve büyüklükteki moleküllerin analizinde çok uygun bir elektroforez tekniğidir. Elektroforetik separasyon sonunda proteinler ya doğrudan jel içerisinde ya da sabit bir yüzeye (örn: nitroselüloz veya naylon membran) aktarıldıktan sonra saptanır ve analiz edilir. Protein bandlarının görünür hale getirilmesinde en uygun yöntem boyamadır. Jeldeki proteinler genellikle Coomassie Brillant Blue veya Gümüş Nitrat ile filtreye emdirilmiş proteinler ise amido black ve ponceau S gibi boyalarla boyanır. Boyama sonunda bir birinden ayrılmış proteinler jel ya da membran üzerinde bantlar şeklinde görünürler. Herhangi bir yöntemle boyanmış protein bantlarının bulunduğu jel çeşitli çözeltiler içinde birkaç ay veya jel kurutma aletinde kurutulduktan sonra yıllarca saklanabilir. Ancak görüntünün kalıcı olması açısından en pratik yol fotoğrafının çekilmesidir. Ayrıca görüntünün bir bilgisayar ortamına

25

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

aktarılması veya spektrofotometrik ölçüm temeline dayanan bir densitometre ile analiz edilmeside mümkündür. Bu temele göre çalışan ve renkli bölgelerin jeldeki konumunu ve alanını standartlar ile karşılaştıran jel görüntüleme sistemleri ile günümüzde geniş bir kullanım alanı bularak nitel analiz yanı sıra nicel analiz yapmak da mümkün olmaktadır (Temizkan ve Arda, 2004). Proteinlerin elektroforez uygulamaları farklı amaçlara göre denatüre veya native (Doğal) jel elektroforezi olmak üzere iki şekilde gerçekleştirilir. Denatüre jeller SDS veya üre gibi denatüre edici ajanların jel içerisine karıştırılması ile hazırlanırlar. Bu tür uygulama başta molekül ağırlık belirlenmesi olmak üzere, proteinlerin saflıklarının araştırılması, konsantrasyonlarının tanımlanması ve enzim aktivitelerinin saptanmasına olanak verir (Hames ve Rickwood,1996).

1.8.2. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)

Proteinlerin molekül ağırlıklarını belirlemede en yaygın kullanılan yöntem poliakrilamid jel elektroforez tipidir. Sodyum dodesil sülfat (SDS) bir anyonik deterjan olup, proteinlere sıkıca bağlanarak proteinlerin denatürasyonunu sağlar. Yaklaşık 1 g proteine 1.4g SDS bağlanır. Proteinler, birim kütle başına sabit negatif elektriksel yük kazanırlar. Yani SDS, protein molekülünde her üç aminoasitlik birime bağlanarak proteinlere homojen negatif bir yük kazandırır. Böylece proteinler yük bakımından eşitlendiği için moleküler ağırlıklarına göre separasyonları geçekleşecektir. Oluşan SDS-protein kompleksi elektroforez sırasında anoda doğru göç ederler. Jelin moleküler elek özelliğinden dolayı belirli bir sürede katettikleri mesafe moleküler ağırlığa göre proteinden proteine farklılık gösterecektir. Moleküler ağırlığı bilinen standart bir protein ile analizi yapılacak örnek aynı ortamda yürütülecek olursa, örnek proteinlerin moleküler ağırlıkları bulunabilir. Standart SDS-PAGE uygulamaları dikey elektroforez şeklinde gerçekleştirilir. Protein örnekleri genellikle pH’sı 6,8 olan örnek hazırlama tamponu içinde çözülür. Bu tampon denatüran olarak SDS, disülfit bağlarını indirgeyen β-

26

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

merkaptoetanol, yoğunluk oluşturan sükroz veya gliserol ve bromfenol mavisi içermektedir. Elektroforez uygulamasında kullanılan jel, genellikle stacking (Dengeleme) ve separating (ayırma) jeli olarak iki kısımdan oluşur. Her iki jel de içerdikleri akrilamid konsantrasyonları bakımından birbirlerinden farklılık gösterir. Bu iki jeldeki pH ve konsantrasyon farklılığı sayesinde, protein karışımlarının birbirlerinden ayrılması ve belirgin bandlar oluşması sağlanır. SDS-PAGE uygulamalarının diğer bir şekli gradient jellerdir. %5 ila %25 arasında dikey pozisyonda hazırlanan jel içerisinde, aşağıdan yukarı doğru jel konsatrasyonunun farklılaşması söz konusudur. En altta en yoğun jel tabakası oluşurken en üstte yoğunluğu en düşük tabaka meydana gelir. Bunun sonucunda elde edilen jelin en üst tabakasındaki por çapı en geniş, en alt tabakasındaki por çapı ise en dar olmuş olur. Gradient SDS-PAGE uygulaması ile homojen jelde tek bir band şeklinde görülen, moleküler ağırlığı bir birine çok yakın protein yapıları birbirinden ayrılarak ayrı ayrı bandlaşma meydana gelir. İki boyutlu (two-dimesional) jeller kompleks protein karışımlarınının yüksek bir resolüsyon oranı ile ayrılmalarını sağlar. Örnekler birinci boyutta izoelektrik fokuslama ile izoelektrik nokta farklılıklarına göre kısmen separe edilirler. İkinci boyutta örnekler, SDS-PAGE ortamında separating jel ortamına doğru yürütülerek moleküler büyüklüklerine göre ayrıştırılırlar. İzo Elektrik Fokuslama (IEF) tekniğinde aminoasitler ve peptidler gibi amfoterik yapıların hem voltaj hem de pH gradientinin olduğu bir alanda elektroforetik analizleri gerçekleştirilir. Bu yöntemde jelin her noktasında pH gradienti oluşturmak için izo elektrik noktaları belli olan düşük moleküler ağırlıklı amfolitler kullanılır. Bellirli pH aralıklarının oluşmasını sağlayan bu bileşikler sentetik alifatik poliamino polikarboksilik asit yapısındadırlar. Düşük pH gradienti anod bölgesinde oluşur. Başlangıçta izo elektrik noktalarının altında bir pH da bulunan maddeler, pozitif olarak yüklenecekler ve katoda doğru ilerleyeceklerdir. İzo elektrik nokta değerine bağlı olarak çevresel pH’sı kademeli olarak yükselecektir.

27

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

Net yükün yok olduğu, yani zwitterion formunda, proteinler daha fazla hareket yapmayacaklardır. Diğer taraftan zıt reaksiyon izo elektrik noktasının üzerinde bir pH’da bulunan maddeler de negatif yük kazanarak net yüklerinin dengede olduğu ana kadar anoda doğru hareket edeceklerdir. Bu teknik izo enzim separasyonunda oldukça kullanışlıdır. İzo elektrik noktalarındaki 0.01 ünitelik pH farklılığı separasyon için yeterlidir.

1.8.3. Doğal (Native) Jel Elektroforezi

Doğal jel elektroforezinde kullanılan tamponlar, deterjan ve diğer denatüre edici ajanları içermediğinden, işlemler doğal şartlarda gerçekleştirilir. Fazla sayıda protein içeren karışımların bir birinden ayrılmasında, bir protein ya da protein kompleksinin aktivite veya yapısı ile ilgili elektroforetik çalışmalarda, protein saflık kontrolü ve proteinin denatüre olup olmadığının saptanmasında kullanılır. Doğal jel elektroforez uygulamasında, örneklerin molekül ağırlıkları hakkında kesin bir bilgi edinmek mümkün değildir. Bunun nedeni, molekül büyüklüğünün yanında molekül şekli ve yükünün de ayrımı etkilemesidir (Wilson ve Goulding, 1986; Hames ve Rickwood, 1996;Temizkan ve Arda, 2004).

1.9. Protein İzolasyonu

Proteinler doğada diğer moleküllerle beraber karışık olarak bir molekül havuzunda ya yapısal veya işlevsel bir birliktelik içinde bulunurlar. Böyle bir ortamda bir proteinin fizikokimyasal yapısını ve işlevini doğru bir şekilde tanımlayabilmek hemen hemen imkansızdır. Yapı, fonksiyon ve bazı aktivitelerin belirlenmesi çalışmalarında saf proteinlere ihitiyaç duyulur. Ayrıca bazı endüstriyel üretim süreçleri de tamamen saflaştırılmış proteinlerle yürütülmektedir. İzolasyon protokollerinin çoğu, istenen seviyede bir saflığın elde edilebilmesi için birden fazla basamak gerektirmektedir. Örnekler kolay elde edilebildiklerinde az miktarda kimyasal bileşik ekleyerek veya birkaç kez tekrarlanmak suretiyle saflaştırma yapılabilir. Her bir basamak bir miktar ürün kaybına neden olur. Proteini

28

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

denatürasyon ve inaktivasyondan korunmak için çalışmanın her aşamasında pH ve sıcaklık kontrol altında tutulmalıdır. Sıcaklığın olumsuz etkisi, işlemlerin genellikle +4oC’de yapılması ile önlenir. pH ise bu moleküllerin fizikokimyasal gereksinimleri doğrultusunda hazırlanmış tampon çözeltilerin kullanımı ile istenen değerde tutulur. Bir proteinin nasıl izole edileceğine, hangi yöntemle ve ne kadar saflaştırma yapılacağına karar vermeden önce materyal, çalışılacak protein tipi ve miktarı gibi kriterler göz önünde bulundurulmalıdır. İzolasyonu yapılacak protein kaynağı hayvansal, bitkisel veya mikrobiyal olabilir. Her üç kaynak için farklı izolasyon protokolünün izlenmesi gerekir. Örneğin bitkisel proteinlerle çalışmak zordur. Çünkü açık arazide gerçekleştirilen üretimde, mevsimsel değişikliklerin protein içeriklerini etkilemesi farklılıklara yol açacağı için, sera veya bitki büyüme odalarında yetiştirilen bitkilerle çalışmak daha avantajlıdır. Yaprak ve tohumlar protein izolasyonunun nisbeten kolay olduğu bitki yapılarını oluştururken, birçok enzimin bulunduğu sitoplazma toplam hücre hacminin ancak %1-2 sini kapsar. Bu nedenle, bitkisel özütler çok az miktarda tamponlarla hazırlansalar bile, elde edilen protein miktarı oldukça düşüktür. Mikroorganizmalarla yapılan çalışmalarda, kullanılacak organizmaların belli ve sabit koşullarda üretilmesi gerekir. Algler, küf mantarları, mayalar ve bakteriler için özel üretme ve izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir. En önemli sorun, üremenin çeşitli fazlarında protein kompozisyonlarının farklı olmasıdır. Bu nedenle, bakteriler ve diğer tek hücreli organizmalarla çalışılırken, protein izolasyonu genellikle logaritmik üreme fazındaki organizmalardan yapılır. Protein izolasyonunun ilk aşamasındaki işlemler, söz konusu proteinin hücrenin içindemi yoksa dışında mı olduğuna, içindeyse bulunduğu yere göre farklılık gösterir. Çalışılacak molekül ekstraselüler yani sentezlendikten sonra hücre dışına salınan ve aktivitesini orada gösteren bir enzim ise, kullanılacak yöntem oldukça basittir. Bu işlemlerde bitki, hayvan veya hücre içi protein izolasyonlarında yapılması zorunlu olan dokuların parçalanması, hücrelerin lizi edilmesi ve gereksiz

29

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

maddelerden kurtulmak amacı ile gerçekleştirilen sentrifügasyon işlemlerine gerek kalmadan, hedef protein, hücrelerin ürediği substrat ortamından izole edilebilir. Bacillus cinsi bakterilerde, organizma substratın bulunduğu ortama aşılandığı andan itibaren enzim sentezi başlar ve sentezlenen enzimler hücre dışına salınır. İstenilen üreme fazına ulaştıktan sonra, santrifüjleme veya filtrasyon tekniği kullanılarak bakteri ve oluşan ürün birbirinden ayrılır. Salgılanan enzim organizmanın uzaklaştırılması sonucu elde edilen üst sıvıda (Süpernatant) bulunur. Enzim üretimi sonunda hücrelerin ortamdan uzaklaştırılması amacı ile katyonik bir polielektrolit olan chitosandan da yararlanılmaktadır. Bu bileşik ortamdaki mikroorganizmalara yapışarak yumak oluşumna neden olur. Oluşan yumak çökerek ürünün bulunduğu sıvı fazdan ayrılır (flokulasyon). Hedef proteinlerin süpernatant içerisinden izolasyonu ürünün su ve diğer küçük moleküllü yapılardan kurtarılmasıyla olur. Sonuçta proteinler daha konsantre hale gelir ve çözelti hacmi daha azalmış olur. Dolayısı ile birim hacimdeki protein miktarı artar. Daha iler saflaştırma işlemleri ve daha küçük hacimde örnekle çalışmak, kimyasal madde kullanımını azaltacak işlemleri kolaylaştıracaktır. Yoğunlaştırma işlemi, ultrafiltrasyon veya diyaliz yöntemi kullanılarak küçük moleküllü yapıların uzaklaştırılması, liyofilizasyonla ile suyun uçurulması ve çeşitli kimyasallarla proteinlerin çöktürülmesi/presipitasyonu teknikleri kullanılarak gerçekleştirilir. Ultrafiltrasyon tekniğinde, su ve diğer küçük moleküller santrifüjleme veya yüksek basınç altında yarı geçirgen bir zardan geçirilerek proteinler konsantre hale getirilir. Diyaliz yönteminde ise seyreltik protein çözeltilerinin dializ torbalarına doldurulması ve konsantre edilmeleri söz konusudur. Konsantrasyonu sağlanacak protein çözeltisi diyaliz tüpüne konduğunda örneğin üst kısmı toz halde polietilen glikol (PEG), sephadex G-25 veya karboksimetil selüloz ile tamamen kapatılarak suyun örnekten uzaklaşması sağlanır. Dializ işlemi, aynı zamanda saflaştırma işlemi sırasında ortamdaki tuzların uzaklaştırılması içinde kullanılmaktadır. Dondurarak vakumda kurutma tekniği şeklinde de tanımlanan Liyofilizasyon yönteminde, dondurulmuş protein çözeltisi yüksek vakum altında bırakılarak,

30

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

donmuş haldeki suyun sıvı hale geçmeden buharlaşması ve örneğin toz formunda geri kazanımı gerçekleştirilir. Bu işlemden önce çözeltide bulunan tuzların diyaliz ile uzaklaştırılması gerekmektedir.

1.9.1. Çöktürme ile Proteinlerin İzolasyonu

Çöktürme yöntemi, proteinlerin çözeltiden ayrılması ve yoğunlaştırılması için kullanılan en yaygın metoddur. Presipite edilmiş proteinlerin, az miktarda ve uygun bir tampon içerisinde çözülmesi sonucu daha konsantre protein örneği elde edilmiş olur. Çöktürme uygulamalarında, trikloroasetik asit (TCA), aseton, etil alkol, metil alkol veya amonyum sülfat gibi tuzlarla polietilen glikol (PEG) gibi organik polimerler kullanılır.

1.9.1.1. TCA ile Çöktürme

Kuvvetli bir asit olan TCA, proteindeki amino asitlerin yan zincirlerindeki iyonik grupların yüklerini değiştirerek iç elektrostatik dengeyi bozar ve proteinin denatürasyonuna yol açar. Denatüre olan proteinler, çözünürlükleri değişeceğinden çökerler. Eğer çalışmada denatürasyonun önemi yoksa TCA çöktürülmesi uygulanır.

1.9.1.2. Nötral tuzlar ile Proteinlerin Çöktürülmesi

Nötral tuzlar kansantrasyona bağlı olarak proteinler arasında elektrostatik ve nonpolar (hidrofobik) etkileşimle etkilerini gösterirler. Birçok protein, seyreltik tuz çözeltilerinde yüksek düzeyde çözünme özelliğine sahiptirler. Bununla birlikte, sulu otamda konformasyonu etkilemeyen yüzeylerindeki elektrostatik yüklerden dolayı (agregasyonu önlemeyecek düzeyde) çok az çözünürler. Proteinlerin çözünürlüğü yüzeydeki elektrostatik kuvvetleri nötralize edecek miktarda (0.1M) tuz ilavesi ile artırılabilir. Diğer taraftan, 0.2 M’dan daha yüksek tuz konsantrasyonları, sadece proteinin yüzeyindeki elektrostatik güçleri nötralize etmez, aynı zamanda su moleküllerinin proteinden uzaklaşmasına neden olur. Böylece iyon konsantrasyonu yeterince yüksek olduğu zaman, proteinler diğer protein molekülleri

31

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

ile ilişkiye girerek, yüzey yüklerini nötralize etmeye yönelirler. Su molekülleri ile olan bu rekabet çeşitli tuzlar, organik çözücüler ve PEG gibi nötral polimerlerle gözlenen presipitasyonu açıklamaktadır (Scopes, 1982;Temizkan ve Arda, 2004). Suda yüksek düzeyde çözünebilirliği, düşük çözelti sıcaklığı, ucuz ve saf halde bulunma gibi nedenlerden dolayı, proteinlein presipitasyonda en fazla kullanılan tuz, amonyum sülfattır. Ayrıca amonyum sülfatın birçok protein üzerine koruyucu etkisi vardır. Genellikle işlemlerin düşük sıcaklıklarda yürütülmesine gerek yoktur. Presipite olmuş proteinin eldesi santrifüjle gerçekleştirilir. Amonyum sülfat gibi tuzlarla proteinlerin konsantrasyonu, ya bulk presipitasyon ya da fraksiyonlu presipitasyon şeklinde gerçekleştirilebilir. Proteinlerin bazıları çözeltideki amonyum sülfat konsantrasyonu %25 olduğunda presipite olurken, bazı proteinler ise, amonyumsülfat konsantrasyonu ancak %75 düzeyine ulaştığında presipite olmaktadırlar. Hedef proteinin hangi konsantrasyonda presipite olduğunun saptanması, sonraki izolasyon çalışmalarında uygulamanın standart duruma getirilmesini sağlayacaktır. Gerekli amonyum sülfat miktarı hesaplanarak süpernatanta kademeli olarak eklenip, hedef protein bulk presipitasyon şeklinde çöktürülür. Fraksiyonlu presipitasyon metodunda ise değişik konsatrasyonda amonyum sülfat tartılarak çözeltiye eklenerek, kullanılan her farklı konsantrasyon uygulamasında çöken proteinlerin ayrı ayrı izolasyonu sağlanır. Santrifüjleme ile çöken proteinler ortamdan izole edilerek geri kazanılır. Bu işlem sonunda %20-%80 lik konsantrasyonlardaki presipitatlar ayrı ayrı toplanarak hedef proteinin hangi fraksiyonda olduğu belirlenir. Böylece örneğin izole edildiği tuz konsantrasyonundaki fraksiyonlar daha saf elde edileceklerdir. Örneğin %50 lik amonyumsülfat ile çöktürülen protein, daha düşük veya daha yüksek konsantrasyonda çöken diğer proteinlerden de ayrılmış olurlar. Tuz çöktürme yöntemiyle izole edilen proteinler, pratikte kullanılmadan önce dializ tekniği kullanılarak tuzdan kurtarılmak zorundadırlar.

32

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

1.9.1.3. Organik Çözücülerle Proteinlerin Çöktürülmesi

Etanol, metanol ve aseton gibi organik çözücülerin hedef proteinlerin bulunduğu çözeltiye eklenmesi, protein presipitasyonuna sebeb olur. Ana etki su aktivitesini düşürme şeklindedir. Elektrik yüküne sahip hidrofil enzim molekülü için suyun çözücü gücü, organik çözücünün ortamdaki konsantrasyonu arttıkça azalacaktır. Bu durum, çözücünün dielektrik sabitesinin indirgenmesi veya basitçe suyun kütlesel yer değişimi ile açıklanabilir. Proteinin yüzeyindeki hidrofobik bölgelerin kısmen daha fazla çözünürlüğünü ortaya çıkarır. Agregasyon olayı ise muhtemelen proteindeki elektrostatik ve dipolar van der Waals kuvvetlerinden kaynaklanmaktadır. Genel olarak düşük molekül ağırlıklı proteinler için daha yüksek konsantrasyonda çözücü gerekir. Ayrıca sıcaklık artışıyla birlikte denatürasyon artacağından (10oC’nin üzerinde denatürasyon hızı artar), çalışmalar 0-4oC de gerçekleştirilmelidir.

1.9.1.4. Non-İyonik Organik Polimerlerle Çöktürme

Polietilen glikol (PEG), dekstran ve polivinilpirolidon gibi non-iyonik lineer polimerler, oda sıcaklığında kullanılabilmeleri ve proteinleri stabilize etmelerinden dolayı, proteinlerin çöktürülmesinde tercih edilmekedirler. Bunların arasında PEG çözeltideki proteinin denatürasyonuna izin vermemesi ve daha az viskoz olması nedeniyle en uygun olanıdır. Protein presipitasyonunda en fazla kullanılan PEG tipi, PEG-6000 ve PEG- 20000 türevleridir. Proteinlerin davranışı organik çözücülerle gerçekleştirilen presipitasyondakine benzer şekildedir. Fakat protein fraksiyonundan PEG’ün uzaklaştırılması, organik çözücü veya tuzların uzaklaştırılması kadar kolay değildir. PEG polimer olduğu için molekülün diyalizle ortamdan uzaklaştırılması oldukça zordur. Örneğin bu amaçla sephadex G25 kolonu kullanılsa da, istenilen sonucu elde etmek oldukça zordur. Bununla birlikte az miktardaki PEG kalıntısının çeşitli uygulamalarda zarar vermediği belirtilmektedir. Genellikle presipitasyon

33

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

%20’ nin altındaki konsantrasyonlarda gerçekleşir. PEG’in uzaklaştırılması tuz destekli faz separasyonu ile gerçekleştirilebilir Bu aşamaya kadar kısmen saflaştırılan proteinler için, kullanım alanının özelliğine göre istenirse, tam saflaştırma işlemi yapılır. İleri saflaştırma uygulaması, proteinin toplam elektrik yükü, büyüklük ve şekli, sahip olduğu hidrofilik grupları ve kullanılan sabit faz ile bağlanma kapasitesi gibi farklı özelliklerinden biri temel alınarak, kromatografik yöntemlerle gerçekleştirilir. Bu yöntemlerden en çok kullanılanı kolon kromatografisidir. Kolon Kromatografisi, dolgu maddesi ile doldurulmuş musluklu veya benzer bir mekanizmaya sahip basit bir cam boruda gerçekleştirilir. Protein çözeltisi uygun bir elüsyon (Proteinin separasyonuna imkan verecek hareketli tampon) çözeltisi yardımıyla kolondan geçirilir. Kolondaki dolgu maddesinin porları ile bir etkileşim gösteren proteinler, hareketli faz ile etkileşimi olanlara göre daha yavaş hareket ederler ve belli zaman aralıklarında veya hacimlerde fraksiyonlar halinde toplanarak tam saflaştırmalar gerçekleştirilir. (Scopes, 1982; Temizkan ve Arda, 2004)

1.10. Kromatografi

Bir karışımın bileşenlerini, iki ya da daha çok fazdan oluşan sistemler arasındaki göç farklılıklarına bakarak tanımlamak ve niceliklerini belirlemek amacıyla yapılan bir analitik ayırma işlemidir. İlk olarak bir Rus bilim adamı Mikhail Semyonovich Tsvet tarafından bitki pigmentlerini ayırma metodu olarak geliştirilmiş ve ismini oradan almıştır. Günümüzde son derece duyarlı ve etkin bir yöntem olarak geçerliliğini sürdürmektedir. Genel olarak kromatografi molekül büyüklüğü, şekil, elektrik yükü, uçuculuk, çözünürlük veya yüzeye tutunabilme (adsorptiviti) gibi fiziksel özelliklerdeki farklılıklar temelinde bir karışımın bileşenlerine ayrılmasında kullanılır. Ktomatografik sistemin temel bileşenleri, sabit faz, kromatografik yatak, hareketli faz, dağıtım sistemi ve bazı durumlarda tespit sisteminden meydana gelir. Sabit faz, destek matriksle tutulmuş katı, jel veya immobilize sıvıdır. Hareketli faz ise kromatografik yatakta, sabit faz boyunca bir sıvı veya bir çözücü olarak etki eden

34

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

gazdan oluşur. Test materyalini izlemek ve tespit etmek için mevcut otomatik veya yarı otomatik olabilen bir sistemdir (Temizkan ve Arda, 2004). Saflaştırılacak malzeme, sabit faz üzerinde hareket ederken, karışım içindeki moleküllerin sabit fazla etkileşimleri farklı olur. Sabit faz ile sıkı ilişki gösteren moleküllerin hareketi, daha zayıf ilişki gösteren moleküllerinkine göre sabit faz boyunca daha yavaş bir ilerleme gösterir. Böylece farklı tipteki moleküller destek materyali boyunca hareket ederken birbirlerinden ayrılırlar. Kromatografik ayırma işlemleri, cam yada benzer malzemeler üzerine sabitlenmiş silika (Thin Layer Chromatography/İnce Tabaka Kromatografisi , TLC), uçucu gazlar (Gaz Kromatografisi), Kağıt (Kağıt Kromatografisi) ve hidrofilik çözünmez molekülleri içerebilen sıvı (Likit Kromatografisi)’lar dahil, bir çok destek malzemesi ile gerçekleştirilebilir (Erich,1975).

1.10.1. İnce Tabaka Kromatografisi (TLC)

Kimyasal bileşikleri ayrımak için yaygın olarak kullanılan kromatografi yöntemidir. Genellikle bir yüzey üzerine tutturulmuş silika jel, alüminyum oksit ya da selüloz gibi ince bir adsorbent tabakadan oluşan sabit faz kullanılır. Sıvı faz ise, saflaştırılması istenen karışımın, içinde çözündüğü kapiller etki ile çekilebilen uygun bir çözücüdür. İnce tabaka kromatografi tabakaları, silika jel, (adsorbent malzeme), kalsiyum sülfat (bağlayıcı) ve su ile hazırlanır. Hazırlanan karışım genellikle reaksiyon vermeyen cam, kalın alüminyum folyo ya da plastik malzemeler üzerine yayılır. Hazırlanan plakalar havada kurutulduktan sonra, 110oC’lik fırnda 30 dakika dikey pozisyonda tutularak, aktive edilirler. Adsorban tabakanın kalınlığı genellikle, analitik amaçlı işlemlerde 0.1-0.25 mm, preperatif çalışmalarda 1-2 mm aralığında kullanılmaktadır. İşlemler kağıt kromatografisine benzese de daha hızlı ve ayırımın daha başarılı olması ve sabit fazın farklı kalınlıklarda kullanılmasıyla bu teknikten ayrılır. İnce tabaka kromatografisi, karışımdaki bileşenlerin miktarını belirlemede, maddenin

35

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

tanımlanmasında, kolon kromatografisi için uygun şartları belirlemede, kolondan elde edilen fraksiyonların analizinde kullanılırlar. Tabakalar ya laboratuarda hazırlanır ya da kullanıma hazır olarak satın alınır. Laboratuar hazırlamasında cam plakalar tercih edilir. Alüminyum plakalar çok kullanılan malzemeler olmasa da, endüstriyel uygulamalarda, kalın alüminyum folyolar sıkça kullanılmaktadır. Plakaların sabit faz malzemeleriyle kaplanması farklı tiplerdeki yayma aparatları ile gerçekleştirilir. Temelde iki tipi vardır. Birinci tipte, yan yana dizilmiş plakaların sabit jel dökme ekipmanı hareketli, ikincisinde ise jel dökme ekipmanı sabit malzemenin döküleceği tabakalar hareketlidir (Poole, 2003). İnce tabaka kromatografisinde molekülün jeldeki hareketi genellikle aşağıdan yukarıya doğru yükselen yöntem ile gerçekleştirilir. Bunun için cam plakanın/plakaların yerleştirileceği ekipman değişik boyutlar ve şekilde olabilir. Sistemin çoklu uygulamalara uygun olması ve solvent sistemi ile atmosfer doygunluğunun sağlanabilmesi için kapağının olması gerekir. Yürütme işlemi tamamlanmış tabakalar, genellikle havada, infrared ışık altında veya fırınlarında kurutulur. Seperasyonu gerçekleştirilmiş malzemelerin görünür hale gelmesi için kullanılan çözeltiler zehirli veya korozif olabilecekleri için, çeker ocak ya da özel kabinlerde püskürtme yapılarak gerçekleştirilir. Birçok madde ince tabaka üzerinde herhangi bir özel tespit metoduna gerek kalmadan görülebilir. Kâğıt kromatografisinde kullanılan indikatörlerin çoğu ince tabakaya da uygulanabilir. Bu teknikte örneğin saptanması için kullanılan teknikler kağıt kromatografisine göre 10-100 kat daha hassastır. Kullanılan korozif spreyler uçucu olmayan organik maddelerin fırında kömürleştirilmesi için kullanılır (Poole, 2003). İnce tabaka kromatografilerinde, örneğin görünmesini sağlayan çözeltiler kullanılacak kromatogafi tipine göre tercih edilir. Kromatografi tipleri ve kullanılabilecek geliştirme solüsyonları Çizelge 1.1ve 1.2’de gösterilmiştir.

36

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

Çizelge 1.1: İnce Tabaka Kromatografileri İçin Kaplama Malzemeleri (Erich, 1975) Silisik Asit (Silika Jel) Adsorpsiyon Alüminyum Oksit İnce Tabaka Kromatografisi Kieselguhr (Diatom toprağı) Hidroksilapatit Polietilenimin selüloz İyon-Değişimi İTK Selüloz fosfat DEAE Selüloz Selüloz Kieselguhr Partisyon İTK Hidroksilapatit Silika jel Dekstran Jel İTK Sephadex G-25,G50,G-75,G-100 Poliakrilonit Poliamid İTK Asetil ε-Polikaprolaktam

Çizelge 1.2:İnce Tabaka Kromatografisi için Bazı Geliştirme Çözeltileri (Erich,1975) Adsorpsiyon n-Hekzan-Dietil eter-asetik asit (90:10:1) İnce Tabaka Klororoform-Metanol (19:1) Kromatografisi Benzen-Aseton (1:1) Hidroklorik asit, 0.001-1N İyon-Değişimi İTK Sodyum Hidroksil, 0.001-1N Sodyum Klorür, 0.001-1N Bütanol-Aseton-Dietilamin-Su (10:10:2:5) Partisyon İTK Bütanol-Astik asit-Su (4:1:5) Propanol-Formik asit-Su (2:1:5) Asetik asit (0.01-0,1N) Dekstran Jel İTK Amonyak (0.01-0,1) Su-Etanol (1:1) Su-Aseton (1:1) Poliamid İTK Su-Etanol-AsetikAsit-Dimetilformamid (6:4:2:1)

1.11. Araştırmanın Amacı

Bu çalışmada, endüstriyel uygulamalarda kullanılacak halofil alkalin amilaz, glukanaz (selülaz) ve xylanase enzim üreticisi Bacillus sp. bakterilerinin doğal ortamdan izolasyonu, identifikasyonu, enzim izolasyonu ve kısmi saflaştırılması,

37

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

enzim karekterizasyonu ve biyoteknolojik kullanım olanaklarının araştırılması amaçlanmıştır.

38

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

İlk enzimatik yıkım reaksiyonu 1783 yılında, İtalyan rahip Spallanzani tarafından gözlemlenmiştir. Kirchhoff 1814 yılında, arpanın nişasta lapalarını şekere dönüştürdüğünü görmüştür. Pasteur 1877 yılında fermentasyonla canlı mayalar arasında ilişki olduğunu ileri sürmüş, hücresel ve soluble mayalanmaların bir birinden farklı gerçkleştiğini saptamıştır. Künhe 1878 yılında, canlı hücre kullanılmadan gerçekleşen mayalanmayı, enzim olarak tanımlamıştır (Uhlig, 1998). Endüstriyel öneme sahip mikrobiyal enzimlerinin gelişimi Japon Jokichi Takamine ile başlamıştır. Takamine küflerden enzim üretimi üzerine çalışmış ve 1894’de mantarlardan elde ettiği diastatik enzime patent almıştır. 1913 yılında Röhm, deterjanlarda enzim kullanılabileceğini belirtmiştir. Biodin ve Effront (1917), B. subtilis kültürlerinden enzim hazırlanmasıyla ilgili çalışmalar yapmıştır. Kneen ve Sandstedt (1946), bakteriyel amilazların diğer alfa amilazlardan daha büyük sıcaklık stabilitesine sahip olduklarını ortaya koymuştur. Conn ve ark (1950), alfa amilazlar içerisinde yer alan bir grubun inaktivasyon sıcaklığını bulmak için 60 ile 85oC’de çeşitli testler yapmışlardr. Stark ve Tetrault (1951), Nişastayı şekere dönüştüren enzimi üreten Bacillus stearothermophilus bakterisini 70oC’de izole etmiştir. Enzimin 90oC de inaktive olduğunu saptamışlardır. Campbell (1952), 35oC’de ve 55oC’deki üreyen hem Bacillus stearothermophilus hemde Bacillus coagulans’dan elde eilen amilazların karşılaştırmasını yapmıştır. 55oC’de üretilen amilazların 35 oC’de üretilenlerden bir şekilde daha yüksek optimum aktiviteye sahip olduklarını ortaya koymuştur. 35oC’de elde edilen amilazların 90oC’ye maruz bırakıldıklarında 2 saat sonra aktivitelerini kaybettikleri fakat 55 oC’de elde edilen amilazların ise 24 saat sonuda aktivitelerini %50 oranında koruduklarını belirtmiştir. Hartman ve ark (1954), B.stearothermophilus’dan ürettikleri amilaz enziminin hem pH hemde termal stabilitelerini belirlemişlerdir. Elde ettikleri termofilik

39

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

bakteriyel amilazın, mezofilik olanlara göre daha yüksek pH stabilitesine sahip olduklarını belirtmişlerdir. Miller (1951), Karbonidrataz etkisi gösteren enzimlerin aktivite analizlerinde indirgen şeker miktarının saptanması için Dinitrosalisilik asit (DNS) yöntemini kullanmıştır. Bu metod ile 3,5-dinitrosalisalisilik asitin, 3-amino-5-nitrosalisilik asite indirgendiğini ve aldehit grupların karboksilik gruplara okside olarak gelişen renk reaksiyonunu oluşturduklarını bildirmiştir. Friedmann ve Epstein (1967), inaktive olmuş taka-amilaz enziminin yeniden aktif duruma gelmesinde kalsiyumun etkisini araştırmıştır. Saito (1973), B.licheniformis bakterisinden amilaz enzimi üretimi için hangi karbon kaynaklarının daha etkili olduğunu araştırmştır. Onishi ve Sonoda (1979), orta düzeyde halofilik Micrococcus halobius’ tan elde ettikleri amilazlarda optimum aktivite için gerekli olan NaCl ve KCl konsantrasyonlarını saptamışlardır. Morgan ve Priest (1981), 40oC’nin üzerinde aktivitelerini kaybeden Bacillus suşlarında termostabilite yeteneklerini araştırmışlardır. Zhang ve ark (1983), Bacillus amiloliquefacien suşunda, ortamda glisin bulunduğu zaman alfa-amilaz üretiminde artış gerçekleştiğini saptamışlardır. Glisin etkisinin murein tabakasının sentezinde rekabetçi inhibisyona neden olarak amilaz üretimini artırdığını belirtmişlerdir. Bajpai ve Bajpai (1987), termostabil alfa-amilaz üreten Bacillus licheniformis suşunun izolasyon, tanımlama, kültür ve enzim özelliklerini araştırmışlardır. Bacillus licheniformis TCRDC-B13 suşunun üremesinin pH 3.0-11.0 arasında olup, besiyeri pH’sının arttırılması ile üremenin azaldığını, enzim üretiminin pH 5.0-10.0 aralığında gerçekleştiği ve maksimum enzim aktivitenin pH 6.0-9.0 arasında olduğunu bulmuşlardır. Bu suş için enzim üretim sıcaklık aralığının 25-50oC maksimum enzim üretim sıcaklığının ise 35oC olduğunu saptamışlardır. Ayrıca bu enzimin, nişastanın sıvılaştırılması amacıyla geniş pH aralıklarında kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Srivastava (1987), topraktan izole ettiği B.stearothermophilus suşunda iki farklı amilaz enzimi izole etmiş ve karakterizasyonunu gerçekleştirmiştir. Bakteriyel alfa-

40

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

amilazların endüstride kullanımının giderek arttığını ve bu nedenle amilaz üreten yeni suşların izole edilmelerinin gerekli olduğunu belirtmiştir. Igarashi ve ark (1988), alkalifilik Bacillus türlerinden alkali izoamilaz, alkali dirençli neopullulanaz ve yüksek alkali pullulanaz gibi bazı enzimleri karakterize etmişler ve bunların alkali koşullarda alfa-amilazlar ile birlikte çamaşır ve bulaşık deterjan sanayinde etkili olarak kullanılabilirliğini göstermişlerdir. Ayrıca izolasyonunu yaptıkları amilazın maksimum aktivitesinin pH 8.0-8.5 civarında olduğunu gözlemlemişlerdir. Vihinen ve Mantsala (1990), B.stearothermophilus’dan elde edilen alfa-amilazı enziminin aktivite gösterdiği optimum sıcaklığın 50-70oC olduğunu belirtmişler ve alfa-amilaz aktivitesinin en yüksek 70-80oC sıcaklıkta gerçekleştirdiğini göstermişlerdir. Shaw ve ark (1995), ekstrem termofilik Thermus sp. suşundan ekstrasellüler amilaz izolasyonu ve karakterizasyonunu yapmış, bu enzimin pH 5.5-6.5 arasında ve 70oC’de optimum aktivite gösterdiğini saptamışlardır. Kim ve ark (1995), alkalifilik Bacillus sp. izolatından pH 11.0 ve 12.0 da en iyi aktivite gösteren maltotrioz üreten alkali alfa-amilaz üretimini gerçekleştirmiştir. Sidhu ve ark (1997), termostabil amilaz üretimi amacı ile suş geliştirme deneyleri yapmışlar ve etilmetan sülfonat ile mutasyon çalışmaları sonucunda, enzim üretiminde 40 kat daha yüksek miktarda ürün almayı başarmışlardır. Lin ve ark (1998), Bacillus sp. TS-23 suşundan izole ettikleri enzimde moleküler ağırlıkları 42 ve 150 kDa olan iki amilaz bandı bulmuşlardır. Enzimin optimum aktivite gösterdiği pH ve sıcaklığının 9.0 ve 70oC olduğu ve enzimin ham nişastayı kısmen parçalayabildiği belirlenmiştir. Egas ve ark (1998), Thermus filiformis suşundan ürettikleri alfa-amilazın optimum pH 5.5-6.0 ve 95oC’de çalıştığını belirlemişlerdir. Enzimin 80oC’nin üzerinde ve Ca+2 varlığında yarılanma ömrünün, 85oC’de 8 saat, 90oC’de 80 dakika ve 95 oC’de 19 dakika olduğunu belirlemişlerdir. Mamo ve ark (1999), Etiopyada sıcak su kaynaklarından izolasyonunu yaptıkları termofilik Bacillus sp.’ den izole edilen amilaz enziminin optimum 75-

41

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

80oC’de ve pH 5.0 –8.0 arasında çalıştığını saptamışlar ve 105oC’de termal stabilite üzerine Ca+2 etkisinin olmadığını belirtmişlerdir. Malhotra ve ark (2000), ekstrem termofil özellikte olan Bacillus thermooleovarans suşundan termostabilite için Ca+2’a ihtiyaç duymayan amilaz izolasyonunu ve karakterizasyonunu gerçekleştirmiştir. Duedahl-Olesen ve ark (2000), Bacillus clausii’den optimum pH 9.5 ve 55oC de aktivite gösteren, moleküler ağırlığı 101 kDa olan, nişastadan maltoheksoz oluşturabilen amilaz izolasyonu ve karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Hagihara ve ark (2001), Optimum pH 8.0-9.5 ve 55-60oC’de aktivite gösteren, şelatörlere ve kimyasal oksidantlara karşı oldukça dirençli olduğunu bildirdikleri alfa-amilazın molekül ağırlığını 55 kDa olarak bulmuşlardır. Deutch (2002), tuza karşı toleransı bulunan Bacillus dipsosauri’den ürettikleri amilazın optimum pH 6.5 ve 60oC aktivite gösterdiğini ve yüksek tuz konsantrasyonlarında da büyük bir aktivite toleransına sahip olduğunu belirtmişlerdir. Burhan ve ark (2003), Bacillus sp. Ant-6 dan izolasyonunu yaptıkları amilaz enziminin optimum aktivitesinin pH 10.5 ve 80oC’ de gerçekleştiğini bulmuşlardır. Aynı zamanda alkali, termostabil ve şelatör dirençli bu enzimin nişasta, tekstil ve deterjan endüstrisi için uygun bir potansiyel olduğunu belirtmişlerdir. Amoozegar ve ark (2003), yüksek tuz gibi stres altında üretilen ekstrasellüler amilazın enziminin optimum aktivite sıcaklığının 50oC ve optimum pH aktivitesinin ise pH 7.5-9.0 arasında olduğunu rapor etmişlerdir. Pomares ve ark (2003), halofilik arkeon Haloferax mediterranei’ den 58 kDa büyüklüğünde ve maksimum aktivitesini 3M NaCl’de gösterebilen halofilik alfa- amilaz izolasyonu yapmışlardır. İzole edilen enzimin maksimal aktivitesini pH 7.0- 8.0 arasında ve 60oC’de gerçekleştirdiğini saptamışlardır. Das ve ark (2004), Bacillus subtilis suşundan, moleküler ağırlığı 42.8 kDa optimum aktivite sıcaklığı 52-55oC ve pH 9.0 olan, alkali alfa-amilaz izolasyonu yapmışlardır. Konsula ve ark (2004), mezofilik Bacillus subtilis suşundan izolasyonunu yaptıkları ekstrasellüler termostabil alfa-amilaz enziminde en yüksek aktivitenin

42

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

135oC ve pH 6.5’da gerçekleştiğini bulmuşlardır. Artan termostabilitenin varlığı bu enzim için de rapor edilmiştir. Bernhardsdotter ve ark (2005), alkali şelatör dirençli fakat Ca+2 varlığında termostabilitesi yükselmeyen ve EDTA varlığında aktivitesi yükselen amilazın izolasyonunu ve özelliklerini rapor etmişlerdir. Hutcheon ve ark (2005), halofilik arkeon Haloarcula hispanica’dan elde edilen alfa-amilazın yüksek tuz konsantrasyonlarında stabil olduklarını hatta üre varlığında dahi stabilitesinin devam ettiğini bulmuşlardır. Normalde tuz bulunmayan ortamlarda ürenin enzim inhibisyonunu gerçekleştirdiği belirtilmiştir. Saxena ve ark (2007), izole ettikleri amilaz enziminin, maksimum aktivitesini pH 10.0 ve 90oC’ gerçekleştirdiği ve enzimin 80-100oC arasında %100 stabil davranış gösterdiğini saptamışlardır. Asgher ve ark (2007), Bacillus subtilis’den izolasyonunu yaptıkları termostabil alfa-amilazın optimum aktivitesinin pH 8.0 ve 70oC olduğunu bulmuşlar ve 60oC’de 1 saat süreyle stabilitesini koruduğunu saptamışlardır. Robson ve Chambliss (1984), Bacillus sp.’den üretilen selülaz enziminde aktivite analizi yapmışlar ve maksimum selülaz aktivitesin pH 4.8 ve 58oC’de gerçekleştiğini bulmuşlardır. Soutschek-Bauer ve Staudenbauer (1987), Clostridium thermocellum’dan elde edilen genini B.subtilis’e ve B.stearothermophilus’a transfer ederek CMC-az üretimi gerçekleştirmişlerdir. Hreggvidsson ve ark (1996), Rhodothermus marinus’ tan izole edilen termostabil selülaz enziminin optimum aktivitesini pH 7.0 de gösterdiği ve enzim 100oC’de 3,5 saat bekletildikten sonra, orijinal aktivitesini %50 koruduğu sapamışlardır. Hakamada ve ark (1997), alkalifilik Bacillus sp. KSM-S237’den izole edilmiş termostabil alkali selülazın optimum aktivitesini pH 8.6-9.0 ve 45oC’de gösterdiği bildirmişlerdir. Yernool ve Eveleigh (1998), iki termostabil endoselülaz izolasyonu yapmış ve moleküler ağırlıkları 29 ve 30kDa olan enzimlerin optimum pH 6.0-6.6 ve 95oC’de aktif olduklarını bulmuştur.

43

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

Krishna (1999), katı faz fermentasyon ile B.subtilis’ten selülaz enzimi üretimini gerçekleştirmişler ve substrat, nem, parça büyüklüğü, ortam pH’sı, inkübasyon sıcaklığı azot ve karbonun, enzim üretimine etkilerini araştırmışlardır. Mawadza ve ark (2000), iki Bacillus suşundan üretilen selülazın karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Her iki enzimin molekül ağırlığı 40 kDa olup, enzimlerin otimum aktivitelerini pH 5.0-6.5’de ve 65 ve 70oC’de gösterdiklerini belirlemişlerdir. Hakamada ve ark (2002), Bacillus circulans’dan izole ettikleri alkalin endoglukanazın pH 8.5’da 55oC’de optimal çalıştığını ve 43 kDa moleküler ağırlığa sahip olduğunu saptamışlardır. Singh ve ark (2001), termostabil alkali CMC-az enzimini Bacillus sp. VG1 suşundan izole etmişler ve enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 9.0- 10.0, yarılanma ömrünün ise 100oC’de 12 dakika olduğunu bulmuşlardır. Endo ve ark (2001), Bacillus sp. KSM-N252 suşundan izole edilen endoglukanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği pH’nın 10.0 sıcaklığın 55oC ve molaküler ağırlığının 50 kDa olduğunu saptamışlardır. Coral ve ark (2002), Aspergillus niger’den moleküler ağırlıkları 83 ve 50kDa olan, optimum aktivitesini pH 3.0-9.0 aralığında gösteren CMC-az enzimi izole etmişlerdir. Enzimin optimum aktivite sıcaklığını 40oC bulmuşlardır. Kang ve ark (2004), Aspergillus niger KK2 suşundan solid state fermentasyon tekniği ile pirinç ve buğday kabukları kullanılarak selülaz enzimi üretimi gerçekleştirmişlerdir. Saha (2004), Mucor circinelloides’ten izole ettikleri endoglukanazın optimum aktivitesini pH 4.0-6.0 ve 55oC’de gösterdiğini, enzimin moleküler ağırlığının 27 kDa olduğunu belirtmiştir. Huang ve Monk (2004), Caldibacillus cellulovorans’dan izolasyonunu yaptıkları CMC-az enziminin 85.1 kDa molekül ağırlığa sahip olduğunu ve maksimum aktivitenin ise 80oC’de gerçekleştiğini belirtilmiştir. Singh ve ark (2004), Bacillus sphaericus JS1suşundan alkali selülaz enzimi izole ederek enzimin üretimi ve karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Enzimin SDS-PAGE analizinde moleküler ağırlığının 42 kDa olduğu saptamış ve enzimin

44

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

termostabilite, pH stabilitesi ve hidrolitik kapasitesi açısından, deterjen sanayi için uygun olduğunu belirtmişlerdir. Kim ve ark (2005), alkalifilik Bacillus sp. suşundan HSH-810’dan alkali selülaz izolasyonu yapmışlar ve enzimin pH 10.0’da ve 50oC’de optimum aktivite gösterdiğini belirtmişlerdir. Zverava ve ark (2006), haloalkalifilik anaerobik bakteriden izole ettikleri selülaz enziminin moleküler ağırlığının 75 ve 84 kDa olduğunu bildirmişlerdir. Hirasawa ve ark (2006), Bacillus agaradhaerens suşundan endoglukanaz enzimi izolasyonu gerçekleştirmişler, farklı sıcaklık ve pH’larda enzim aktivitesine bakarak, NaCl ile enzim aktivitesinde artış olduğunu belirlemişlerdir. NaCl’ün enzim aktivitesini artırıcı yöndeki etkisinin pH 6.5-7.0 arasında ve 60oC’de, altı kat daha yüksek olduğunu ortaya koymuşlardır. Kang ve ark (2007), Pyrococcus horikoshii’den, kristalin selüloza karşı oldukça etkin hipertermofilik selülaz izolasyonu gerçekleştirmişler ve enzimin disülfit bağına sahip olduğunu belirtmişlerdir. Blanco ve ark (1995), alkali-tolerant Bacillus sp. BP23’den ürettikleri ksilanaz enziminin özelliklerini belirlemişlerdi. Enzimin 32 kDa molekül ağırlığa sahip olduğu, optimum aktivitesini 50oC ve pH 5.5’de gösterdiğini saptamışlardır. Yang ve ark (1995), Kağıt hamurundan izole ettikleri alkalifilik Bacillus sp.den alkali ksilanaz üretmişlerdir. Enzimin maksimum aktivitesini pH 8.5 ve 55oC’de gösterdiğini saptamışlardır. Archana ve Satyanarayana (1997), solid state fermentasyon tekniği kullanılarak termofilik B.licheniformis A99 suşundan ksilanaz enzim üretimi gerçekleştirmişler. Enzimlerin optimum aktivite gösterdikleri pH değerinin 6.0-7.0 sıcaklık değerinin ise 45oC ve 50oC olduğunu bildirmişler. Lopez ve ark (1998), alkali tolerant Bacillus’tan izole edilen ksilanaz enziminin 45oC’de 5 saat’lik inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini %72 koruduğunu saptamışlardır. Son üründe ksiloz yerine ana ürün olarak ksilotrioz ve ksilotetroz oluştuğunu belirtmişlerdir. Breccia ve ark (1998), Bacillus amyloliquefaciens’den termostabil ksilanaz izolasyonu ve karakterizasyonu yapmışlardır. Saflaştırma sonunda SDS-PAGE

45

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

analizi sonucuna göre, enzimin, 18.4 ve 19.6 kDa ağırlığa sahip iki alt birimden meydana geldiğini belirtmişlerdir. Enzimin optimum ativitesini pH 6.8-7.0’de gösterirken pH stabilitesinin 9.0 olduğu saptanmıştır. Enzim otimum aktivitesini 80oC’de göstermiş ve termal stailitesinin ise 50oC olduğu gözlenmiştir. Gessesse ve Mamo (1999), solid state fermentasyon tekniği kullanarak alkalifilik Bacillus sp. den bol miktarda ksilanaz üretimi gerçekleştirmişlerdir. Çalışmalarında ksiloz, laktoz, glikoz ve sükroz gibi şekerlerin enzim üretimine etkilerini araştırmışlardır. Duarte ve ark (1999), İzolasyonunu gerçekleştirdikleri 500 mikroorganizma içerisinden ksilanaz üreten 22 suş seçmişler ve pH 10.0’da enzim üreten organizmadan alkali ksilanaz enzimi üreterek saflaştırmışlardır. Saflaştırılan enzim aktivitesi üzerine NaCl’ün etkisini araştırmışlardır. Dhillon ve ark (2000), Bacillus circulans AB16 suşundan selülaz aktivitesi zayıf olan termostabil ve alkalitolerant ksilanaz üretimi ve karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Moleküler ağırlıkları farklı olan enzimleri, ksilanaz A ve B şeklinde adlandırmışlardır. Enzimlerin optimum aktivite göstedikleri pH ve sıcaklık değerleri birbirinden farklı olup, ksilanaz A’nın moleküler ağırlığı 30 kDa, optimum aktivite gösterdiği pH 6.0, sıcaklık değeri 75-80oC’dir. Ksilanaz B’nin moleküler ağırlığı 22 kDa, optimum aktivite gösterdiği pH 6.0, sıcaklık değeri 65-70oC’dir. Sa-Pereira ve ark (2002), Sıcak su kaynaklarından izole ettikleri B. Subtilis organizmasından, selülaz aktivitesi bulunmayan (selülaz free) termostabil ksilanaz enzimi üretmişlerdir. Enzim üretimini pH 6.0 da 50oC’de 18 saat ve 55oC’de 11 saat’lik fermentasyon işlemleri uygulayarak, enzim verimini karşılaştırmışlardır. Tseng ve ark (2002), Alkalifilik Bacillus firmus suşundan selülaz aktivitesi olmayan iki farklı ksilanazı izole etmişlerdir. Moleküler ağırlıkları 45 ve 23 kDa olan enzimlerin optimum aktivitelerini 37oC’de ve pH 5.0-11.0’da gösterdiklerini saptamışlardır. Enzim aktivitesi sonucu oluşan son ürünün ksiloz, ksilotrioz ve ksiloheksoz olduğu saptanmıştır.

46

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

Saha (2002), Fusarium proliferatum suşundan ksilanaz enzimi üretip özelliklerini belirlemiştir. Enzimin moleküler ağırlığının 22.4 kDa optimum aktivite pH’sının 5.0-5.5, sıcaklığının ise 55oC olduğunu saptamıştır. Wejse ve ark (2003), Halofilik bakteriden iki ekstrem halotolerant ksilan enzimi üreterek karakterizasyonunu yapmışlardır. Moleküler ağırlığı 43 ve 62 kDa olan iki alt birimden meydana gelmiş ksilanaz-1 optimum aktivitesini pH 6.0 ve 60oC’de göstermektedir. Ksilanaz-2 ise optimum 65oC ve 4 M NaCl’de etki göstermektedir. Enzimlerin yarılanma ömürleri 60oC’de 97 ve 192 dakikada olarak bulunmuştur. Cardoso ve Filho (2003), Acrophialophora nainiana’dan selülaz aktivitesi göstermeyen ksilanaz izolasonu ve karakterizasyonu gerçekleştirmişlerdir. β- Ksilanaz 55oC’de ve pH 6.5 de optimum aktivite gösterirken moleküler ağırlığı 54 kDa olarak belirtilmiştir. Anthony ve ark (2003), alkali tolerant Aspergillus fumigatus’dan selülaz aktivitesi göstermeyen büyük moleküler ağırlığı sahip ksilanaz üretimi gerçekleştirmişlerdir. Ksilanazın optimum pH’sının 6.0-6.5, sıcaklığın ise 60oC olduğunu bulmuşlardır. Ryan ve ark (2003), Penicillium capsulatum’dan düşük molekül ağırlığına sahip endoksilanaz üretmişlerdir. Enzimin aktivite gösterdiği sıcaklık ve pH optimumu 48oC ve 3.8 olurken, yarılanma ömrü 50oC’de 25 saat olarak bulunmuştur. WainØ ve Ingvorsen (2003), ekstrem halofilik arkeon Halorhabdus utahensis’den β-Ksilanaz ve β-ksilozidaz üretimi gerçekleştirmişlerdir. Her iki enzim de %0-%30 arasında NaCl konsantrasyonu gibi geniş bir aktivite spektrumuna sahip olup kısmen de olsa termofilik özelliktedirler. Enzimlerden β-ksilanaz 55oC ve 70oC olarak iki optimum aktivite sıcaklığına sahiptir. β-Ksilozidaz ise 65oC optimum sıcaklığa sahiptir. Lama ve ark (2004), termofilik Bacillus thermantarcticus’dan termostabil ksilanaz ve β-Ksilozidaz izole etmişlerdir. Ksilanaz için optimum aktivite sıcaklığı 80oC ve pH 5.6 iken, β-Ksilozidaz için 70oC ve pH 6.0 olarak bulunmuştur. Kumar ve ark (2004), alkalifilik Bacillus sp.NCL’den ürettikleri alkali ksilanazı ticari ksilanazlar ile kıyaslamışlardır. Değerlendirdikleri 4 ksilanaz arasında

47

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

alkalifilik Bacillus sp.den elde edilen enzimin, ticari deterjanlar için en uyumlusu olduğunu belirtmişlerdir. Gallordo ve ark (2004), Bacillus sp.BP7’den ksilanaz kodlayan gen izolasyonu yaparak E.coli’ye klonlamışlardır. Genin ekspresyonu sonunda elde edilen enzimin maksimum pH 6.0 ve 60oC’de aktivite gösterdiğini, moleküler ağırlığının ise 24 kDa olduğunu bulmuşlardır. Avcıoğlu ve ark (2005), topraktan izole ettikleri Bacillus sp. suşlarından ksilanaz üretimi ve karakterizasyonu yapmışlardır. Ksilanaz üretimini tarımsal atık ürünler üzerinde Bacillus sp. izolatlarının üretilmesi ile gerçekleştirmişlerdir. Moleküler ağırlıkları 22, 23 ve 40 kDa olan üç endoksilanazın optimum 70oC’ ve pH 6.5’de aktivite gösterdiğini saptamışlardır.

48

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3. MATERYAL VE METOD

3.1. MATERYAL 3.1.1. Bakteri İzolasyonunda ve Teşhisinde Kullanılan Besiyerleri 3.1.1.1. LB Agar

Alkalifilik ve halofilik bakterilerin izolasyonu ve eğik katı agarda stok kültürlerin saklanması için kullanılmıştır (Sambrook ve Russell, 2001).

Bileşimi g/L

Tripton 10 Maya Ekstraktı 5 NaCl 10 Agar 15

İstenen özellikteki bakteri izolasyonu için NaCl miktarı %10, ve pH:10.0 olarak modifiye edilmiştir.

3.1.1.2. M9-Nişasta Agarı

Amilaz aktivitesinin saptanması ve enzim üretimi amacıyla kullanılmıştır (Shibuya ve ark, 1986). Test edilmek istenen özelliklere göre NaCl ve pH değerleri değiştirilmiştir.

Bileşimi g/L

Na2HPO4.7H2O 6 KH2PO4 3 NaCl 0.5 NH4Cl 1 MgSO4.7H2O 0.24 CaCl2.2 H2O 0.24 Pepton 3 Nişasta 10 Agar 15

49

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

NaCl miktarı istenen tuz konsantrasyonuna göre modifiye edilir ve agar hariç diğer besiyeri bileşenleri distile suda çözülüp pH’sı istenen değere ayarlanır. Agar eklenip manyetik karıştırıcıda eritilir ve otoklavda 15 dakika steril edilir.

3.1.1.3. CMC-Agar Besiyeri

Selülaz aktivitesinin saptanması amacıyla kullanılmıştır (Kim ve ark, 2005). Bileşimi g/L

CMC 10 Pepton 5 Maya özütü 5 KH2PO4 1 MgSO4.7H2O 0.2 NaCl 10 Agar-agar 15

3.1.1.4. CEPM (Selüloz Enzim Üretimi Besiyeri)

g/L Bileşimi

Na2HPO4 .7H2O 1.18 KH2PO4 0.9 NaNO3 1 KCl 0.5 MgSO4.7H2O 0.5 Maya Özütü 0.5 Pepton 0.5 CMC 10

Besiyerinin pH’sı otoklavdan sonra %10 luk Na2CO3 ile ayarlanır (Krishna, 1999).

50

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.1.1.5. Ksilanlı Besiyeri

Ksilanaz aktivitesinin saptanması ve enzim üretimi amacıyla kullanılmıştır (Gessesse, 1998). Amaca göre NaCl ve pH değerleri değiştirilmiştir.

Bileşimi g/L

Pepton 5 Maya Özütü 1 MgSO4.7H2O 0.2 CaCl2.2H2O 0.1 K2HPO4 1 NaCl 5 Ksilan ( Oat Spelt) 5 Agar-agar 15

3.1.1.6. Nutrient Broth

İzolasyonu yapılan Bacillus sp. suşlarından genomik DNA izolasyonu için bakteri üretimi amacı ile kullanılmıştır. Bileşim g/L Et Özütü 10 Pepton 10 NaCl 5 (Barrow ve Feltham, 1993).

3.1.2. Kullanılan Çözeltiler

3.1.2.1. NaOH Çözeltisi

Besiyerlerinin pH’sını ayarlamak ve tampon çözeltilerin hazırlanması amacı ile 0.2N ve 2N NaOH çözeltisi kullanılmıştır.

51

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.1.2.2. Etanol

Sıvı besiyerlerinde üretilen enzimlerin süpernatanttan kurtarılması için proteinlerin presipitasyonu amacı ile daha önceden soğutulmuş %96’lık soğuk etanol kullanılmıştır.

3.1.2.3. Na2CO3 Çözeltisi

Besiyerlerinin pH’sını otoklavdan sonra ayarlamak için %10 luk Na2CO3 ten faydalanılmıştır (Gessesse, 1998).

3.1.2.4. Lügol

Katı besiyerinde ve Poliakrilamid Jel Elektroforez (PAGE) uygulamalarında amilaz aktivitesinin saptanması için kullanılmıştır.

Bileşimi g/100mL

İyot 7 g Potasyum iyodür 3 g Distile Su 100 mL

20 kat sulandırılarak kullanılmıştır (Çetin, 1968).

3.1.2.5. Kongo Kırmızısı (%0.1)

Katı besiyeri ve SDS-PAGE jelinde selülaz ve ksilanaz aktivitesinin gösterilmesi için %0.1’lik kongo kırmızısı 100 mL distile suda çözülerek hazırlanmıştır (Voget ve ark, 2006).

52

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.1.2.6. NaCl Çözeltisi (1M)

Petri kutusunda selülaz ve ksilanaz aktivitesini saptamak ve zimogram analizinde jelde bulunan aktivite bandını görünür hale getirmek amacıyla kullanılmıştır (Voget ve ark, 2006).

3.1.2.7. Sodyum Fosfat Tamponu (0.1 M)

Çöktürme sonucu elde edilen enzimin çözülerek resüspanse edilmesi için kullanılmıştır.

3.1.2.8. Sitrat Tamponu

Enzimin pH 4.0-5.5 aralığındaki aktivitesini saptamak için kullanılır.

Tamponun hazırlanmasında 0.2 M Sitrik asit ve 0.2M Na2HPO4.7H2O çözeltileri ve distile su’dan uygun hacimlerde karıştırılarak, istenilen pH değerine sahip yeni bir karışım elde edilir. Hangi pH değerine sahip tampon hazırlanacaksa, Çizelge 3.1 de verilen oranlar kullanılır (Temizkan ve Arda, 2004).

Çizelge 3.1: Sitrik asit Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması 0.2M Sitrik Asit 0.2M Na HPO 2 4 Distile Su PH (19.21g/L) (53.65g/L) mL mL mL 4.0 30.7 + 19.3 + 50 4.6 26.7 23.3 50 5.0 24.3 25.7 50 5.6 21.0 29.0 50

3.1.2.9. Sodyum-Fosfat Tamponu

Enzimlerin pH 6.0-8.0 arasındaki aktivite düzeylerinin saptanmasında kullanılmıştır. Tamponun hazırlanmasında 0.2M NaH2PO4 ile 0.2M Na2HPO4.7H2O çözeltileri ve distile sudan uygun hacimlerde karıştırılarak, istenilen pH değerine

53

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

sahip yeni bir karışım elde edilir. Hangi pH değerine sahip tampon hazırlanacaksa, Çizelge 3.2 de verilen oranlar kullanılır (Temizkan ve Arda, 2004).

Çizelge 3.2: Sodyum Fosfat Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması 0.2M 0.2M Na HPO NaH PO 2 4 Distile Su PH 2 4 (53.65g/L) (27.8g/L) mL mL mL 6.0 87.7 + 12.3 + 100 6.5 68.5 31.5 100 7.0 39.0 61.0 100 7.5 16.0 84.0 100 8.0 5.3 94.7 100

3.1.2.10. Glisin-NaOH Tamponu

Enzimlerin pH 8.5-10.5 aralığındaki aktivitelerini saptamak için kullanılır. Tamponun hazırlanmasında 0.2M Glisin ile 0.2M NaOH çözeltileri ve distile su’dan uygun hacimlerde karıştırılarak, istenilen pH değerine sahip yeni bir karışım elde edilir. Hangi pH değerine sahip tampon hazırlanacaksa, Çizelge 3.3 de verilen oranlar kullanılır (Temizkan ve Arda, 2004).

Çizelge 3.3: Glisin-NaOH Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması 0.2M Glisin 0.2M NaOH Distile Su PH (15.01g/L) (8g/L) mL mL mL 8.6 4.0 50 146 + + 9.0 8.8 50 141.2 9.6 22.4 50 127.6 10.0 32.0 50 118 10.6 45.5 50 104.5

54

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.1.2.11. Borax-NaOH Tamponu

Enzimlerin pH 11.0-12.5 arasındaki aktivitelerini saptamak amacı ile kullanılır. Tamponu hazırlamak için 0.05M Boraks (19.05g/L) çözeltisinden 50 mL alınarak üzerine istenilen pH değeri elde edilinceye kadar (0.2M NaOH ve yüksek pH değerleri için de 2N NaOH) uygun NaOH çözeltisinden eklenerek son hacim 200mL olacak şekilde distile su ilave edilir (Temizkan ve Arda, 2004).

3.1.2.12. Dinitro Salisilik Asit (DNS)

Enzim aktivitesi sonucu açığa çıkan indirgen şeker miktarını belirlemek amacı ile kullanılır. 1g DNS 50 mL distile su içerisinde çözülür. Üzerine 30g K-Na-Tartarat ve 20 mL 2N NaOH ilave edilerek son hacim 100mL ye tamamlanır (Miller, 1951).

3.1.3. Elektroforezde Kullanılan Solüsyonlar

3.1.3.1. Solüsyon A (Akrilamid Solüsyonu)

29.2 g Akrilamid, 0.8g Bisakrilamid bir miktar distile suda çözülür ve son hacim 100 mL olacak şekilde distile su ile ayarlama yapılır. Monomer çözeltisi koyu renkli şişede ve buzdolabında saklanır (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.2. Solüsyon B (4X)

75 mL 2M Tris-HCl (pH 8.8), 4 mL %10’luk SDS, ve 21 mL distile su karışımından oluşur. Nativ jel uygulamalarında SDS kullanılmadığı için son hacim 100 mL oluncaya kadar distile su eklenir (Bollag ve ark, 1996).

55

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.1.3.3. Solüsyon C (4X)

50 mL 1M Tris-HCl (pH 6.8), 4 mL %10’luk SDS, 46 mL distile su karışımından meydana gelir. Nativ jel uygulamalarında SDS kullanılmadığı için son hacim 100 mL oluncaya kadar distile su eklenir (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.4. Amonyum Persülfat (AMPS) %10

0.5g AMPS 5mL distile su içerisinde çözülerek hazırlanır (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.5. Elektroforez Tamponu

3g Tris, 14.4g Glisin, 1g SDS bileşikleri bir miktar distile suda çözülür ve son hacim 1 L olacak şekilde distile su eklenerek hazırlanır. Nativ Jel uygulamasında SDS karışımdan çıkartılarak yürütme tamponu hazırlanır (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.6. Örnek Yükleme Tamponu (5X)

0.6 mL 1M Tris-HCl (pH 6.8), 5 mL Gliserol (%50), 2 mL %10’luk SDS, 0.5 mL β-Merkaptoetanol, 1 mL %1’lik Bromfenol mavisi ve 0.9 mL distile su karışımından meydana gelir (Bollag ve ark, 1996). Nativ jel uygulmasında SDS içermeyen bir örnek yükleme tamponu hazırlanır.

3.1.3.7. SDS Jel boyama (Staining) Solüsyonu

1g Coomassie Brillant Blue R-250, 450 mL metanol içerisinde çözülüp filtre kağıdından süzüldükten sonra, karışımın üzerine 100 mL asetik asit ve 450 mL distile su eklenerek hazırlanır (Bollag ve ark, 1996).

56

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.1.3.8. SDS Jelden Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu

100 mL metanol, 100 mL asetik asit ve 800 mL distile su karışımından oluşur (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.9. SDS-PAGE’nde Zimogram Analizleri İçin Renatürasyon Solüsyonları

Renatürasyon Solüsyonu-1 ( pH 7.5): 10mM Tris, 5mM β-Merkaptoetanol ve %20 izoproplanol karıştırılarak istenilen miktarda hazırlanır. Renatürasyon Solüsyonu-2 (pH 7.5): 50mM Tris, 5mM β-Merkaptoetanol ve 1mM EDTA karıştırılarak istenilen miktarda hazırlanır. Renatürasyon Solüsyonu-3 (pH 6.8): 50mM sodyum fosfat tamponu şekilde hazırlanır (Saul ve ark, 1990)

3.1.3.10. Nişastalı Glisin-NaOH Tamponu (pH 10.0) Çözeltisi

Nativ PAGE elektroforezde gerçekleştirilen analiz sonucunda, jeldeki amilaz aktivitesinin saptanması amacıyla kullanılır. Bu amaçla 50mM Glisin-NaOH tamponuna (pH 10.0) son konsantrasyon %1 (w/v) olacak şekilde çözünür nişasta eklenerek hazırlanır (Hashim ve ark, 2005).

3.1.4. İnce Tabaka Kromatografisi Solüsyonları

3.1.4.1. Bütanol-Asetik Asit-Distile Su

Amilaz enzimine ait reaksiyon ürünlerinin saptanması amacıyla yapılan ince tabaka kromatografi çalışmalarında geliştirme solüsyonu olarak kullanılmıştır. Bütanol-asetik asit-distile su, 3:1:1 (v/v/v) şeklinde hazırlanır (Kim ve ark, 1995).

57

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.1.4.2. %20’lik Sülfirik Asit (H2SO4) Çözeltisi

80 mL Etil alkol (%96) içerisine 20 mL H2SO4 çözeltisi (v/v) eklenerek hazırlanır (Kim ve ark, 1995).

3.1.4.3. Kloroform-Asetik Asit-Distile Su Çözeltisi

Selülaz ve ksilanaz enzimlerine ait hidroliz ürünlerinin belirlenmesinde hareketli faz olarak kullanılmıştır. Kloroform-asetik asit-distile su (6:7:1 v/v/v) karıştırılarak hazırlanır (Singh ve ark, 2004).

3.1.4.4. Anilin-Difenilamin-Ortofosforik Asit Çözeltisi

Anilin (%1) ve v/v-difenilamin (%1) w/v-aseton içerisinde çözüldükten sonra karışıma, çözeltideki konsantrasyonu %10 olacak şekilde ortofosforik asit (v/v) ilave edilir (Singh ve ark, 2004).

3.1.4.5. D-Glikoz Çözeltisi (%1 w/v)

İnce tabaka kromatografisinde son ürünlerin tanımlanması amacı ile standart olarak kullanılmıştır.

3.1.4.6. Maltoz Çözeltisi (%1 w/v)

İnce tabaka kromatografisinde son ürünlerin tanımlanması amacı ile standart olarak kullanılmıştır.

3.1.4.7. Ksiloz Çözeltisi (%1 w/v)

İnce tabaka kromatografisinde son ürünlerin tanımlanması amacı standart olarak kullanılmıştır.

58

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.1.5. 16S rDNA Dizisinin Belirlenmesi İçin Kullanılan Solüsyonlar 3.1.5.1 DNazolDirect Molecular Research Center Inc.’ den temin edilmiştir ve bakterilerden DNA izolasyonu için kullanılmıştır.

3.1.5.2.TAE (Tris-Asetik Asit-Edta)Tamponu (1X) Agaroz jelinin hazırlanmasında ve agaroz jel elektroforezinde yürütme tamponu olarak kullanılmıştır.

3.1.5.3.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için Kullanılan Primerler

Primer1F 5’GAGTTTGATCCTGGCTCA 3’ (27F) Primer2R 5’CGGTGTGT[A/G]CAAGGCCC 3’(1385R)

3.2. Metod

3.2.1. Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi

3.2.1.1. Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu

Van gölü çevresinden 20 farklı bölegeden alınan toprak örnekleri, halo- alkalofilik Bacillus sp. suşlarının izolasyonu için 1 g tartılarak 4.5 mL steril distile su içerisine ilave edilip homojen şekilde karıştırıldıktan sonra, 80 oC de 10 dakika sıcaklık uygulaması gerçekleştirilmiştir (Lennette ve ark, 1985). Tek koloni elde edilmesi amacıyla steril su bulunan tüplerde seri sulandırma yapılarak %10 NaCl içeren ve pH’sı 10.0 olan LB agar besiyerine yayma ekim şeklinde ekim yapılarak 37 oC de inkübasyona bırakılmıştır. Inkübasyondan sonra besiyerinde tek düşmüş koloniler morfolojilerine göre değerlendirilmiş, karakteristik Bacillus görünümüne sahip koloniler LB agar besiyerine çizgi şeklinde ekilerek 37 oC bir gece inkübasyona bırakılmıştır. LB agar ortamında üreyen suşlar sonraki analizler için stok kültür şeklinde saklanmışlardır.

59

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.2.1.2. Bakteri Teşhisi

Seçilen bakteri örneklerinin teşhisi için Gram boyama, hareketlilik, spor oluşumu gibi mikroskopi testlerinin yanısıra katalaz ve kültür morfolojisinin incelenmesi ile glikoz, ksiloz ve mannitolden asit oluşumu gibi biyokimyasal testler yapılmıştır (Ratanakhanokchai ve ark, 1999).

3.2.1.3. Bakteri Teşhisi İçin Genomik DNA Hazırlanması

5 mL Nutrient Broth 37 °C’de çalkalayıcıda 24 saat inkübe edilmiştir. Eppendorfa 1.5 mL alınarak 7000 dev/dak 5 dakika santrifüj edildi. Üst sıvı atılarak hücre pelletine 0.1 mL DNazolDirect (Molecular Research Center Inc,) ilave edildikten sonra 80°C 15 dakika bekletilerek genomik DNA elde edilmiştir. Agaroz jelde kontrolu yapılmıştır.

3.2.1.4. Agaroz Jel Hazırlanması

%0.7’ lik jel hazırlamak amacı ile 0.48 g agaroz 40 mL 1X TAE agaroz elektroforez tamponuna eklenmiş ve mikrodalga fırında çözülmüştür. Karışımın homojen olması sağlanmıştır. Yaklaşık 40-45 °C’ ye kadar soğutularak son konsantrasyonu 0.3 µg/mL olacak şekilde 10mg/mL’ lik Etidyum Bromür’den 3 µL eklenmiştir. Jel kasete dökülerek 30-60 dakika süre ile donması beklenmiştir. Taraklar çıkarılarak ve jel içinde 1XTAE bulunan elektroforez tankına yerleştirilmiştir.

60

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.2.1.5. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için Reaksiyon Koşulları

Bileşenler Miktar 10x PCR buffer 2,5µL MgCl2 (25 mM) 2 µL Primer 1 F (25pmol/ µL) 1 µL Primer 2 R (25pmol/ µL) 1 µL DNA (genomik) 2 µL dNTP (25mM) 0,3 µL Taq polimeraz (5U/ µL) 0,5 µL Distile Su 25 µL

3.2.1.6. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Koşulları

Sıcaklık Süre 94 °C 5:00 dakika 94 °C 1:00 dakika 56°C 1:00 dakika 35 döngü 72°C 3:00 dakika 72°C 10:00 dakika

Döngüler tamamlandığında PCR ürünü daha sonraki kullanımlar için +4oC’ de bekletilmiştir.

3.2.1.7. 16S rDNA Dizisinin Belirlenmesi

İki farklı primer [Primer 1: 27 F ( 5’-GAG TTT GAT CCT GGC TCA-3’) ve Primer 2: (1385R) (5’-CGGTGTGT[A/G]CAAGGCCC-3’) kullanılarak elde edilen PCR ürünü EZ-10 Spin Column PCR saflaştırma kiti (Bio Basic Inc.) ile firma tarafından verilen yönteme göre temizlendi. Dizi analizi ABI310 ile aynı primerler kullanılarak gerçekleştirildi. Benzerlik araştırması (GenBank/EMBL/DDBJ) Basic Local Alignment Search Tools (BLAST) programı (Altschul ve ark, 1990) kullanılarak ve referans veritabanları kullanılarak yapılmıştır. 16S rDNA dizisi Clustal Multiple Alignment Program (Clustal W 1.8) (Thompson ve ark, 1994) kullanılarak dizinler oluşturulmuştur.

61

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.2.2. Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi

3.2.2.1. Katı Besiyerinde Amilaz Aktivitesinin Belirlenmesi

Nişastalı M9 (pH:10.0 ve % 10 NaCl içeren) besiyerine çizgi şeklinde ekilen suşlar, 3 gün 37oC de inkübasyona bırakıldıktan sonra besiyeri petri kutusunun kapağına dökülen iyod buharına tutularak boyama işlemi gerçekleştirilmiştir. Nişasta içeren zemin koyu maviye boyanırken, amilaz enzimi üreten kolonilerin çevresinde şeffaf zon oluşumunun gözlenmesiyle, bu suşlar amilaz pozitif olarak değerlendirilmişlerdir (Hols ve ark, 1994).

3.2.2.2. Katı Besiyerinde Selülaz Aktivitesinin Belirlenmesi

Topraktan izole edilen suşlar CMC agar besiyerine (pH:10.0 ve % 10 NaCl içeren) çizgi şeklinde ekilerek 37oC’de bir gece inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda petri kutusuna %0.1’lik kongo kırmızısı çözeltisinden dökülerk örnekler 15 dakika süreyle boyanmıştır. Bu sürenin sonunda boya dökülerek boyanın geri alınması amacıyla besiyerine 1M NaCl çözeltisi ilave edilir ve 15 dakika inkübasyon yapılmıştır. Boyama işlemi sonunda etrafında sarı hidroliz zonu gözlenen suşlar selülaz (glukanaz) pozitif olarak değerlendirilmiştir.

3.2.2.3. Katı Besiyerinde Ksilanaz Aktivitesinin Belirlenmesi

Oat spelt ksilan içeren besiyerine çizgi şeklinde ekilen örnekler 37oC’de bir gece süreyle inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda besiyerine %0.1’lik kongo kırmızısı çözeltisinden dökülerek ve 15 dakika boyama işlemi gerçekleştirilmiştir. Boyama süresinin sonunda fazla boyanın ortamdan uzaklaştırılması için besiyerine 1M NaCl çözeltisi ilave edilmiş ve 15 dakika inkübasyon yapılmıştır. Etraflarında sarı hidroliz zonu bulunan suşlar ksilanaz pozitif olarak değerlendirilmiştir(Voget ve ark, 2006).

62

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.2.2.4. Bakterilerin Katı Besiyerinde Ürediği ve Enzim Sentezlerinin Gerçekleştiği pH Aralığının Saptanması

Bu amaçla 5.0-12.5 arasında pH değerine sahip Nişastalı M9, CMC agar, ve oalt spelt ksilan agar besiyerleri hazırlanarak, tanımlamaları yapılan amilaz, selülaz ve ksilanaz pozitif suşlar, içerisinde substrat bulunan katı besiyerlerine çizgi şeklinde ekilmişlerdir. Örneklerden amilaz pozitif sular 72 saat, selülaz ve ksilanaz pozitif suşlar 24 saat süresince 37oC’de inkübe edilmişlerdir. İnkübasyon sonunda üreme ve enzim sentezinin gerçekleştiği pH aralığı, koloni ve aktivite zon çapları ölçülerek saptanmıştır (Hols ve ark, 1994; Voget ve ark, 2006).

3.2.2.5.Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyon Sıcaklığının Saptanması

Bakteriler substratlarının bulunduğu ve optimum üreme gösterdikleri pH’da besiyerlerine çizgi şeklinde ekilerek 25oC, 37 oC, 45 oC ve 50 oC’ de inkübe edilmiş ve üremenin ve enzim sentezinin gerçekleştiği sıcaklık aralığı ve optimum sıcaklık değerleri saptanmıştır (Voget ve ark, 2006).

3.2.2.6.Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyonu İçin Gerekli Tuz Konsantrasyonlarının Saptanması

Enzim sentezleme yetenekleri pozitif suşlardan AB-17, C-14 ve X-13, içerisinde her üç enzim için uygun substratların bulunduğu, faklı konsantrasyonlarda tuz içeren (%3, %5, %7, %10, %13, %15, %20) besiyerlerine çizgi ekim yapılarak bakteriler her üç enzim için uygun süreyle 37 oC de üretilmişler ve aktivite analizleri yapılmıştır.

63

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.2.3.1. Sıvı Kültürde Amilaz Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma

Katı besiyerinde farklı pH, NaCl konsantrasyonu ve sıcaklıklarda test edilen bakteriler içerisinden seçilen AB-17 suşu pH’sı 9.5 olan %10 NaCl tuz içeren M9- Nişastalı sıvı besiyerlerine ekilerek 37oC’de 3 gün süreyle 250 devir/dakika çalkalayıcıda üretilmiştir. Bakteriler +4oC ve 8000 dev/dak de 30 dakika santrifüj edilerek çöktürülmüş ve hücresiz süpernatant elde edilmiştir. Yeni bir ortama aktarılan süpernatant’ın üzerine, orijinal hacmin %70’i oranında %96’lık soğuk etanol eklenmiş ve –33oC de bir gece bekletilmiştir. Çökmüş olan örnek, +4 oC de 15 dakika süreyle 10000 dev/dak santrifüj edilerek enzim sıvı fazdan geri kazanılmıştır. Çökelti, pH’sı 7.0 olan 0.1M’lık sodyum fosfat tamponunda çözülerek +4oC’de saklanmıştır (Srivastava, 1987).

3.2.3.2. Sıvı Besiyerinde Selülaz ve Ksilanaz Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma

Bakteri örneklerinde C-14 ve X-13 olarak adlandırılan suşlar enzim üretimi için pH’sı 9.5’a ayarlanmış (%10’luk Na2CO3 ile), %10 NaCl içeren CMC ve Ksilanlı sıvı besiyerlerine ekilerek inkübasyona bırakılmışlardır. Bakteriler 37oC’de 250 dev/dak çalkalamak suretiyle bir gece inkübe edilmiştir. Kültür +4oC ve 8000 dev/dak’da çöktürülerek bakterilerin fermentasyon ortamından ayrılması sağlanmıştır. Elde edilen hücresiz sıvı faz amilaz eldesinde olduğu gibi soğuk etanol presipitasyonu çöktürülmüştür. Uygun sıcaklık ve süreyle gerçekleştirilen çökeltme işleminden sonra hazırlanan örnek, +4 oC de 15 dakika süreyle 10000 dev/dak santrifüj edilerek enzim sıvı fazdan geri kazanılmıştır. Çökelti, pH’sı 7.0 olan 0.1M’lık sodyum fosfat tamponunda çözülerek +4oC’de saklanmıştır.

64

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.2.3.3. Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerinin Saptanması

Kısmi saflaştırma yöntemi ile elde edilen enzimlerin optimum aktivite gösterdikleri pH değerlerinin saptanması için Na-fosfat (pH 6.0-8.0), Glisin-NaOH (pH 8.5-10.5) ve Boraks-NaOH (pH 11.0-12.5) tamponları kullanılarak farklı pH değerlerine sahip (pH 6.0-13.0) ve içerisinde %1 Nişasta, CMC ve Ksilan bulunan substrat çözeltileri hazırlanmıştır. Aktivite tayini için 0.5 mL enzim ve 0.5 mL substrat tüpte karıştırılarak 37oC’de 30 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda enzim substrat karışımına toplam hacim kadar DNS ayıracı eklenerek, 5 dakika kaynar suda kaynatılmış, soğutma işleminden sonra 550nm dalga boyunda UV visible spektrofotometre (Cecil-5500) kullanılarak, köre karşı absorbans değerleri kaydedilmiştir. Kör, eşit hacimde substrat ve DNS karışımı kullanılarak hazırlanmıştır. En yüksek absorbans değerinin elde edildiği pH değeri baz alınarakr % rölatif enzim aktivitesi bulunmuştur. Her test üç seri tüpün ortalaması alınarak, üç kez tekrarlanmıştır. Her üç enzim için aynı uygulama gerçekleştirilmiştir.

3.2.3.4.Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerlerinin Saptanması

Enzimleri optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerinin belirlenmesi amacı ile 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100oC’lik sıcaklık değerlerinde inkübasyonlar gerçekleştirilmiştir. Amilaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerinin saptanmasında aktivitenin 20-100 aralığında stabil olması nedeniyle analizlere 110, 120, 130, 140, 150 ve 160oC’ye kadar devam edilmiştir. Analizler 20-90oC aralığında su banyosunda, 100-160 oC aralığındar ise yağ banyosunda gerçekleştirilmiştir (Tatar, 2007). Enzim (0.5 mL) ve substrat (0.5 mL) karışımı (optimum aktivitenin gerçekleştiği pH değerinde hazırlanmış) belirtilen sıcaklıklarda 30 dakika inkübe edildikten sonra örnek karışımına eşit hacimde DNS eklenerek 5 dakika kaynatma işlemi uygulanmıştır. Soğutulan örnekler 550nm dalga boyunda UV visible

65

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

spektrometrede değerlendirilmiştir. En yüksek absorbansın elde edildiği sıcaklık değeri baz alınarak % rölatif aktivite saptanmıştır.

3.2.3.5. Enzimlerin Termal (Sıcaklık) Stabilitelerinin Saptanması

Termal (sıcaklık) stabilitelerinin saptanması için enzimler 20-100oC aralığındaki sıcaklıklarda 30 dakika ön inkübasyona bırakılmışlardır. Ön inkübasyon uygulamasından sonra 0.5 mL enzim ve 0.5 mL substrat (optimum aktivitenin gerçekleştiği pH değerinde hazırlanmış) karıştırılarak optimum aktivitenin görüldüğü sıcaklıkta 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda karışıma eşit hacimde DNS çözeltisi eklenmiş, 5 dakikalık soğutmanın ardından spektroskopik ölçüm yapılmıştır. Orijinal enzim aktivitesinin saptanması için inaktivasyon amacı ile ön işlem yapılmamış enzim ve substrat uygun miktarlarda karıştırılarak, optimum sıcaklık değerinde aktivite analizi yapılmıştır.

3.2.3.6. Enzimlerin pH Stabilitelerinin Belirlenmesi

Etanol presipitasyon tekniği kullanılarak izole edilen ve stok örnek şeklinde tamponda resüspanse edilerek saklanan enzimden 2 mL alınarak eppendorf tüpüne transfer edilmiş ve 10.000dev/dak 5 dakika çöktürülmüştür. Üst faz atıldıktan sonra tüpe yeni hazırlamış tampon çözeltiden 2 mL (pH 8.0; 9.0; 10.0; 11.0 ve 12.0) eklenerek, enzim yeniden resüspanse edilmiştir. Karışım 37 oC de 42 saat ön inkübasona bırakılmıştır. Aktivite analizi için ön inkübasyonu yapılmış enzim ve optimum pH daki tamponda hazırlanmış substrat çözeltisinden 0.5’er mL alınarak optimum sıcaklığın gerçekleştiği sıcaklık değerinde 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Örneğin üzerine eşit hacimda DNS ayıracı eklendikten sonra soğutma işlemi uygulanmış ve spektrofotometrede okuma yapılarak sonuç değerlendirilmiştir.

66

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.2.3.7. NaCl’ün Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkisinin Belirlenmesi

Sıvı enzim örneğinden 2 mL alınarak eppendorf tüpünde çöktürülmüş, sıvı faz atılarak tüpe farklı konsantrasyonda NaCl (%3, %5, %7,5, %10, %15 ve %20) çözeltilerinden 2 mL eklenmiş ve enzim tekrar resüspanse edilmiştir. Sıvılaşmış enzim 37 oC de 15 dakika inkübasyona bırakılmıştır. Ön inkübasyon aşamasından sonra, 0.5 mL enzim ve 0.5 mL substrat (optimum aktivitenin görüldüğü pH değerinde hazırlanmış) karıştırlarak optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklıkta 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Örneğin üzerine eşit hacimde DNS ayıracı eklendikten sonra soğutma işlemi uygulanmış ve spektrofotometrede okuma yapılarak sonuç değerlendirilmiştir.

3.2.3.8. İnhibitörlerin Enzim Aktivitesine Etkisi

Enzim inhibitörü olarak 5mM EDTA, %1’lik SDS, %1’lik TritonX-100, 5mM

CaCl2, 5mM ZnCl2, 5mM KCl, 5mM Na2SO3, 5mM PMSF, %1’lik β- Merkaptoetanol ve 8M Üre kullanılmıştır. Her inhibitör madde için 2 mL enzim örneği alınarak eppendorfa transfer edilmiş ve 10.000 dev/dak santrifüj edilerek çöktürülmüştür. Sıvı faz atıldıktan sonra enzimin üzerine 2 mL inhibitör madde eklenerek 37 oC de 15 dakika ön inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Ön inkübasyon aşamasından sonra, 0.5 mL enzim ve 0.5 mL substrat (optimum aktivitenin görüldüğü pH değerinde hazırlanmış) karıştırılarak optimum aktivitenin görüldüğü sıcaklıkta 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Örneğin üzerine eşit hacimde DNS ayıracı eklendikten sonra soğutma işlemi uygulanmış ve spektrofotometrede okuma yapılarak sonuç değerlendirilmiştir.

67

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

3.2.4. Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (PAGE) Moleküler Ağırlık ve Zimogram Analizi

Enzimlerin moleküler ağırlıkları ve enzim fraksiyonuna ait aktivitenin (zimogram) analizi için SDS-PAGE jel ve Nativ jel sistemlerinden yararlanılmıştır (Laemmli, 1970).

3.2.4.1. SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması

Çizelge 3.4: Ayırıcı Jelin Bileşimi (%10’luk) Solüsyonlar Miktar Sol A 6.5 mL Sol B 5.0 mL Distile Su 8.4 mL AMPS (%10) 66 µL TEMED 13 µL

Sol A, Sol B ve distile su Çizelge 3.4’de belirtilen miktarda alınarak şişe içerisine konur, moleküler oksijenin uzaklaştırılması için 5 dakika vakum pompası ile degaz işlemi gerçekleştirilir. Örneğin üzerine uygun miktarda yeni hazırlanmış AMPS çözeltisi ve TEMED ilave edildikten sonra cam plakalara dökülür. Jelin üst yüzeyi atmosferik oksijenin difüzyonunu önlemek ve düzgün bir tabaka elde etmek amacı ile ince bir su tabakası ile kapatılarak oda sıcaklığında polimerizasyona bırakılır.

Çizelge 3.5: Dengeleyici Jelin Bileşimi Solüsyonlar Miktar Sol A 1.5 mL Sol C 2.25 mL Distile Su 5.25 mL AMPS (%10) 30 µL TEMED 7.5 µL

68

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

Ayırma jelinin polimerizasyonu tamamlandıktan sonra jelin üst yüzeyindeki distile su atılarak, üzerine uygun hacimde dengeleme jeli dökülür. Jele örnek sayısına uygun tarak yerleştirdikten sonra oda sıcaklığında polimerizasyona bırakılır. Jelin hazırlanmasında izlenecek yol ayırma jeli ile aynıdır (Bollag ve ark, 1996).

3.2.4.2. Zimogram Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması

Selülaz ve Ksilanaz enzimlerinin zimogram analizleri CMC ve ksilan içeren SDS-PAGE’de gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla uygun konsantrasyonda hazırlanan jel karışımına %3’lük CMC (w/v) ve ksilan (w/v) çözeltilerinden 1 mL eklenerek polimerizasyon gerçekleştirilmiştir. Polimerizasyon işleminden sonraki uygulamalar standart SDS-PAGE uygulamasına göre yapılmıştır.

3.2.4.3. Amilaz Enzimi Zimogram Analizi Için Doğal (Nativ) Jelin Hazırlanması

Doğal jel elektroforezi için kullanılacak jel bileşenleri (Sol B, Sol C, Elektroforez tamponu, ve örnek yükleme tamponu) SDS’siz olarak hazırlanır. Jel karışımlarının hazırlanması ve elektroforez uygulaması bir önceki aşamaya (3.2.4.1) uygun şekilde gerçekleştirilir. Elektroforez işlemi tamamladıktan sonra sonra, Jel pH’sı 10 olan Nişastalı 50 mM Glisin-NaOH tamponu içerisinde 50oC de çalkalamalı inkübatör kullanılarak (50 dev/dak) 30 dakika inkübe edilir. İnkübasyon sonunda lügol çözeltisi kullanılarak 5- 10 dak. boyama yapılıp, aktivite zonu aranır.

3.2.4.4. Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi

Polimerize olmuş jeldeki tarak, oluşan örnek yükleme gözleri yırtılmadan çıkarılır ve örnek yükleme tamponu ile karıştırılmış protein örnekleri ceplere 15-30 µL arasında gözlere doldurulur. Jel uygulaması SDS-PAGE ise örnek yükleme tamponu ile 1/3 oranında karıştırılan protein örnekleri yüklemeden önce 2 dakika

69

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

kaynatılarak tam bir denatürasyon sağlanır. Eğer uygulama doğal jel ise kaynatma işlemi yapılmaz. Elektroforez işlemi sonunda moleküler ağırlıkları doğru saptamak için gözlerden birine içeriği ve moleküler ağırlığı bilinen protein standart’ı (marker) konur. Örnek yükleme işlemi tamamlandıktan sonra elektroforez uygulaması başlatılır. Örnekte bulunan izleme boyası ayırma jeli içine girinceye kadar yaklaşık 30 mA, daha sonra 20 mA akım uygulanır. İzleme boyası jelin diğer ucuna 2 cm uzaklığa ulaştığı zaman elektroforez işlemi sonlandırılır.

3.2.4.5. SDS-PAGE Jelinin Boyanması ve Zimogram Analizleri

Elektroforezden sonra jel, cam plakalar arasından çıkarılarak Boyama solüsyonuna (Staining) konulur. Yaklaşık 12 saat boyunca boyama solüsyonu içinde bırakıldıktan sonra birkaç kez saf sudan geçirilir ve jele bağlanmış fazla boyanın uzaklaştırılması için bir gece boyayı geri alma çözeltisinde inkübasyon gerçekleştirilir. Protein örneklerine bağlanan boya jelden çıkmadığı halde jelin diğer bölgelerindeki boya ortamdan uzaklaşır ve örnekler görünür hale gelirler. SDS-PAGE uygulamasında zimogram analizi amaçlandığında elektroforez işlemi sonlandırıldıktan sonra boyama işlemi yerine, renatürasyon uygulaması yapılır. Bu işlem ya jelin tamamı kullanılarak ya da tek bir örnek analiz edilip jel ikiye bölünerek yapılır İkinci uygulama gerçekleştirildiğinde, jelin bir parçası boyama işlemi diğer parçası renatürasyon uygulaması için kullanılır. Renatürasyon uygulaması üç farklı çözeltide farklı sıcaklık ve süreler kullanılarak jedeki SDS’nin çıkarılması temeline dayanır. Bu amaçla, jel, solüsyon- 1’de 1 saat (50 dev/dak çalkalanarak), sol-2’de bir gece +4oC’de bekletilerek ve sol- 3’te inkübasyon yapılır. Renatürasyon işleminden sonra, jel cam plaka üzerine alınarak plastik kapaklı bir kutu içerisine konur ve enzimin izole edildiği sıcaklıkta (sıcaklığın jele zarar vermediği durumlarda optimum aktivite sıcaklığında) 6 saat inkübasyon yapılır. İnkübasyon sonunda selülaz ve ksilanaz enzimlerinin aktivasyon zonlarını belirlemek

70

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

için %0.1’lik Kongo Kırmızısı (w/v) içerisinde 15 dakika boyama yapılır. Ardından 1M NaCl çözeltisi kullanarak 15 dakika süre ile fazla boyanın geri alınma işlemi gerçekleştirilir. Sarı zonlar, enzimin aktivite gösterdiği bölgelerdir.

3.2.5. Enzim Substrat Reaksiyonu Sonunda Açığa Çıkan Son Ürünlerin Saptanması

Enzim substrat etkileşimine bağlı olarak substratların hidrolizi sonucu açığa çıkan son ürün veya ürünlerin saptanması amacı ile İnce Tabaka Kromatografisi analizleri gerçekleştirilmiştir.

3.2.5.1. İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) Plakalarının Hazırlanması

Daha önceden yıkanmış ve kurutulmuş standart ölçüdeki (20x20) cam plakalar, plaka hazırlama sistemine (leveling device) yerleştirilerek, kenar raylar ve sabitleme mandalı ile tutturulurlar. Kieselguhr “Silika Jel-GF254” materyalinden 25 g alınarak 50 mL (yaklaşık iki kat) distile su içerisinde, kabarcık oluşturmamasına dikkat edilerek karıştırılır (ortalama 45 saniye). Hazırlanan karışım, yayma aparatına doldurulur ve 0.25 mm kalınlıkta tabaka oluşturacak şekilde cam plaka üzerine yayılır. Cam plakalar, örneğin kuruması için 30-45 dakika oda sıcaklığında tutulur. Beyaz renk oluşumu kurumanın göstergesidir. Kuruyan plakalar tek tek ya da topluca (birbirine değmeden) dikey pozisyonda fırına yerleştirilir ve 110-120oC sıcaklıkta 30-60 dakika aktive edilirler.

3.2.5.2. Amilaz Enzimine Ait Son Ürünlerin Saptanması

Fırında aktifleştirilmiş cam plakalara, optimum aktivite sıcaklığında bir saat inkübe edilmiş enzim+substrat karışımının hidrolizi sonucu açığa çıkan son üründen, mikropipet kullanılarak farklı miktarlarda (5µL ve 10µL) örnek konur. Damlatma şeklinde gerçekleştirilen örnek uygulama işleminde, damla çapının 3 mm’den büyük

71

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

olamamasına özen gösterilmelidir. Aynı plaka üzerine son ürünün doğruluğunu saptamak amacı ile markır olarak, %4’lük glikoz ve maltoz çözeltileri de ilave edilir. Oluşan son ürünlerin bir birinden ayrılabilmesi için hazırlanan cam plaka, örneklerin yüklendiği kenardan itibaren, solvent çözeltisine batırılarak (Butanol- Asetik Asit-Distile Su karışımı, 3:1:1), moleküllerin silika jelde göç etmeleri sağlanır. Bu işlem kapalı ortamda, 4-8 saat süreyle uygulanır. Kromatografik analizi yapılan ürünlerin görünür hale gelebilmesi için plakanın

üzerine, etil alkolde hazırlanmış %20lik H2SO4 çözeltisi püskürtülür. Bu uygulamanın hemen ardından, cam plakalar 120oC’lik fırına konulara, yaklaşık 30-45 dakika inkübe edilir.

3.2.5.3. Selülaz ve Ksilanaz Enzimlerine Ait Son Ürünlerin Saptanması

Selülaz ve ksilanaz enzimleri uygun substrat çözeltileri ile enzimler için optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklıkta reaksiyona sokulurlar. Oluşan reaksiyon ürünleri 5 ve 10 µL miktarlarda silika jel üzerine yüklenirler. Selülaz ve ksilanaz ürünlerinin doğrulanabilmesi için silika jel plağına %1’lik ksiloz, glikoz ve maltoz örneklerinden 5’er µL hacimde marker ilave edilir. Bu enzimlere ait son ürünlerin silika jel ortamında yürütülmesi için hareketli faz olarak kloroform-asetik asit-distile su (6:7:1) karışımından yararlanılmıştır. Yürütme işlemi, amilaz enzimi reaksiyon ürünlerinin analizindeki gibi gerçekleştirilir. Reaksiyon ürünlerinin görünür hale getirilmesi için anilin- difenilamin-ortofosforik asit karışımı jelin üzerine püskürtülür. Jel 120oC’lik fırında 30-45 dak. kurutulur.

72

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

4. BULGULAR VE TARTIŞMA

4.1. Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu

Van Gölünde suların çekildiği kıyı şeridinin 20 farklı bölgesinden toprak örnekleri alınmıştır. Laboratuarda ısısal ön işlemden geçirilen topraklar (80 oC de 10 dakika) pH’sı 9.5 olan ve %10 NaCl içeren LB agar besiyerine tek koloni düşecek şekilde yayılmışlardır. Örnekler 24 saat süreyle 37oC’ de inkübe edildikten sonra koloni morfolojileri farklı toplam 242 bakteri suşu izole edilmiştir. İzole edilen bakteriler LB agar ortamına çizgi şeklinde üretildikten sonra, enzim aktivitesi, üreme pH değerleri, üreme sıcaklık değerleri ve enzim üretiminde kullanılmak üzere, stok kültür şeklinde saklanmışlardır. Toplam 242 bakteri suşu içerisinde 76 suşun (%31.66) amilaz enzimi ürettiği saptanmış, yapılan analizlerde en iyi sonucu veren AB-17 suşu enzim üretimi ve karakterizasyonu için seçilmiştir. Bu suş biyokimyasal testlerden yararlanılarak Bacillus sp. şeklinde tanımlanmıştır. İzolasyonu yapılan suşlar, selülaz ve ksilanaz enzimlerini üretme yetenekleri için de analiz edilmişlerdir. Toplam 242 örnek içerisinde 35 (%14.6) selülaz, 32 (%13.2) suş, ksilanaz pozitif özelliktedir. Bunlar içerisinde en yüksek verimin elde edildiği C-14 suşu selülaz, X-13 suşu ise ksilanaz enziminin üretimi ve karakterizasyon için seçilmiştir. Bu suşlar, biyokimyasal analiz sonuçlarına göre Bacillus sp. olarak tanımlanmıştır.

4.2. Bakterilerin Teşhisi

4.2.1.Bakterilerin Morfolojik ve Biyokimyasal Özellikleri

Enzim üretimi ve karakterizasyonu için kullanılmak üzere seçilen suşlar, geniş, beyaz renkli ve dalgalı kenarlı koloni morfolojisine sahiptirler. Suşlar gram pozitif, aerob, spor oluşturan, çubuk şekilli ve hareketli bakterilerdir. Glikoz, ksiloz ve mannitolü asit oluşturarak parçalamaka ve katalaz pozitif özellik göstermektedirler.

73

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Koloni morfolojileri ve diğer özelliklerine göre seçilen suşlar Bacillus sp. şeklinde tanımlanmıştır.

4.2.2. AB-17 Suşunun 16S rDNA Dizi Analizi Sonuçları

GGGCGAGTGGGCTATCTGCAGTCGAGCGAACGAAGGGAGCTTGCTCCCGG ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGAC TGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCG CATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCC GCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGC GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCT CTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGG TACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGG CGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCA TTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTG TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAC TCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAG GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTANACGATGAGTGCTAAGTGTTA GGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC

16S rDNA dizisi Clustal Multiple Alignment Programı kullanılarak elde edilen dizi sonuçlarına göre Bacillus sp.AB17 suşu %99 oranında Bacillus pumilus olarak tanımlanmıştır.

4.3. AB-17 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları

4.3.1. AB-17 Suşunun Farklı pH Değerleri ve 37oC’de Üreme ve Amilaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular

AB-17 suşunun 37oC’de ve farklı pH’da hazırlanmış M9 besiyerinde üreme ve enzim sentezine ait bulgular Çizelge 4.1’de gösterilmiştir.

74

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Çizelge 4.1. AB-17 suşunun 37oC’de farklı pH’larda üreme ve Enzim Üretme sonuçları. pH 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 KÇ 0 2 2 2 3 4 4 4 2 2 2 2 2 ZÇ 0 6 14 14 14 14 18 14 8 6 2 2 0 (KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Enzim Hidroliz Zon Çapı (mm)

AB-17 suşu pH:7.0-12.5 arasında üreme göstermekle birlikte pH 9.0-10.0 aralığında optimum değer elde edilmiştir. Analiz edilen pH değerlerinden 7.0-12.0 aralığında enzim sentezi gerçekleştiği bulunmuştur. Özellikle pH 7.5-10.0 aralığında 14 mm’lik aktivite zon çapına ulaşılırken, pH 11.5-12.0 değerlerinde 2 mm zon çapı elde edilmiştir. Enzim sentezi optimum (18 mm aktivite zon çapı) pH 9.5 de gözlenmiştir. En iyi üreme ve en yüksek enzim sentezinin pH 9.5 de geçekleşmesi, bakterileri izolasyonlarının gerçekleştirildiği pH değeri ile (pH 9.5) uygunluk göstermektedir. Bu sonuçlar enzim üretimi için seçilen AB-17 suşunun orta düzeyde halofil ve alkali olduğunu göstermektedir.

4.3.2. AB-17 Suşunun Farklı Sıcaklık Değerleri ve pH 9.5’deki Üreme ve Amilaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular.

AB-17 suşu pH’sı 9.5’e ayarlanmış nişastalı M9 besiyerinde 25oC, 37oC, 45 oC ve 50 oC’de inkübe edilmiş, üreme ve enzim üretme yetenekleri araştırılmıştır.

Çizelge 4.2. AB-17 suşunun pH 9.5’da farklı Sıcaklıklarda Üreme ve Enzim Üretme sonuçları. Sıcaklık 25oC 37 oC 45 oC 50 oC

KÇ 4 4 1 0 ZÇ 15 17 0 0 (KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Hidroliz Zon Çapı (mm)

Elde edilen verilere göre en iyi üreme 4 mm’lik koloni çapı ile 25 ve 37oC‘lerde görülürken, 45oC de 1 mm koloni çapına ulaşılmıştır. Buna karşılık

75

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

50oC’de üreme gerçekleşmemiştir. Aynı scaklık değerlerindeki enzim sentezleme özelliği araştırıldığında ise sadece 25 ve 37 oC’lerde aktivite zonu oluşmuştur. Maksimum zon oluşumu 17 mm ile 37oC de gerçekleşmiştir. Sıcaklık değerlerinden 45 ve 50 oC’ler de ise enzim sentezi gözlenmemiştir. Bu sonuçlar enzim üretimi amacı için seçilen suşun mezofil özellikte olduğunu göstermektedir.

4.3.3. M9 Nişastalı Agar Besiyerinde Farklı NaCl Konsantrasyonlarında Bakteri Üreme Davranışı ve Enzim Sentezine Ait Bulgular

AB-17 suşu pH:9.5 ve %3-20 konsantrasyonda NaCl içeren M9 nişastalı agarda 37oC’de inkübe edilmiş, üreme ve enzim sentezleme yeteneği araştırılmıştır. Elde edile bulgular Çizelge 4.3’ de gösterilmiştir.

Çizelge 4.3.AB-17 Suşunun Farklı Tuz Konsantrasyonunda Üreme ve Enzim Üretimi Sonuçları Tuz Kons %3 %5 %7 %10 %13 %15 %20

KÇ 3 3 3 4 2 1 0 ZÇ 14 14 18 14 6 0 0 (KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Hidroliz Zon Çapı (mm)

AB-17 suşu %3-%15 aralığındaki NaCl konsantrasyonlarında üreme gösterirken, %20 NaCl’lü ortamda üreme saptanmamıştır. Optimum üreme 4 mm koloni çapı ile %10 NaCl’lü ortamda gerçekleşirken, %3-7 aralığında 3 mm koloni çapı elde edilmiştir. Üreyen kolonilerdeki enzim üretimi ise %3-13 aralığındaki NaCl’lü ortamlarda gerçekleşmiştir. Katı besiyerinde optimum enzim üretimi 18 mm zon çapı ile %7’lik NaCl’lü ortamda görülürken, %3, %5 ve %7 NaCl bulunan ortamlarda 14 mm, %13 NaCl’lü ortamda ise 6 mm zon çapı elde edilmiştir. Bu sonuçlar enzim üretiminde kullanılan suşun orta düzeyde halofil olduğunu göstermektedir (Ventosa ve ark, 1998).

76

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

4.4. C-14 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları

4.4.1. C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı pH Değerleri ve 37ºC’de Üreme ve Selülaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular

CMC’li katı besiyerinde C-14 suşunun inkübasyonu sonucu elde edilen üreme ve enzim sentezine ait bulgular, Çizelge 4.4 de gösterilmiştir.

Çizelge 4.4.C-14 Suşunun Katı Besiyerinde ve Farklı pH Değerlerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme Sonuçları pH 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 KÇ 1 6 8 12 16 12 13 6 6 6 6 2 0 ZÇ 1 16 22 22 24 23 24 11 9 6 7 0 0 (KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Hidroliz Zon Çapı (mm)

C-14 suşunun 37oC’lik inkübasyon ortamında pH 6.6-12.0 aralığında ürediği bulunmuştur. Enzim sentezine ilişkin çalışmalarda ise pH 7.0-11.5 aralığında 16-7 mm arasında aktivite zonu elde edildiği, optimum aktivite zonunun 24 mm ile pH 8.5 ve 9.5’te gerçekleştiği saptanmıştır. pH 7.5-9.5 aralığında ise ortalama 23 mm aktivite zonu gözlenmiştir. En yüksek aktivite zonunun pH 8.5-9.5 aralığında gözlenmesi, bakterinin alkalifil özellikte olduğunu göstermektedir. Horikoshi (1999), pH 8.5’in üzerinde bakteri üremesi ve enzim sentezinin gerçekleşmesinin alkali organizmaların en büyük özellikleri olduğunu bildirmiştir.

4.4.2. C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklık Değerleri ve pH 9.5’teki Üreme ve Enzim Aktivitesine Ait Bulgular

C-14 suşu pH’sı 9.5 olan CMC agar besiyerinde 25, 37, 45 ve 50ºC’de inkübe edilerek üreme ve enzim üretme yeteneği araştırılmıştır. Elde edilen veriler, Çizelge 4.5’ de gösterilmiştir.

77

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Çizelge 4.5. C-14 Bakterisinin Farklı Sıcaklık ve pH 9.5’teki CMC Agar Besiyerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme Sonuçları Sıcaklık 25oC 37 oC 45 oC 50 oC

KÇ 9 10 8 6 ZÇ 11 22 9 9 (KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Hidroliz Zon Çapı (mm)

C-14 suşu, test edilen sıcaklık aralıklarında 25-50ºC aralığında 9-6 mm koloni çapı oluşturarak üremiştir. Bacillus sp. C-14 suşunun optimum üremesi 10 mm koloni çapı ile 37ºC de gerçekleşirken, 25ºC de 9 mm, 45ºC de ise 8 mm’lik koloni çapı elde edilmiştir. Aynı sıcaklık değerlerinin kullanıldığı enzim sentezleme çalışmalarında optimum sentezin 22 mm aktivite zonu ile 37ºC de gerçekleştiği saptanmıştır. Bacillus sp. C-14 suşu, optimum üreme ve enzim sentezleme yeteneği dikkate alındığında mezofil ve alkalin özellik göstermektedir. Bununla birlikte, suşun 25ºC de 9 mm çaplı koloni, 11 mm aktivite zonu, 55ºC de ise 6 mm çaplı koloni 9 mm çapında aktivite zonu oluşturması, psikrotolerant- termotolerant aralığında yüksek düzeyde üreme ve enzim sentezleme yeteneğinde olduğunu göstermektedir.

4.4.3. C-14 Suşunun Farklı NaCl (%3-20) İçeren CMC’li Agarda Üreme ve Enzim Sentezine Ait Bulgular

C-14 suşunun pH 9.5 ve %3-20 NaCl içeren katı besiyerindeki üreme ve enzim üretimine ait sonuçlar Çizelge 4.6’te gösterilmiştir

Çizelge 4.6. C-14 Suşunun Katı Besiyeri ve Farklı Tuz Konsantrasyonlarında Üreme ve Enzim Sentezlemesiyle İlgili Sonuçlar Tuz Kons %3 %5 %7 %10 %13 %15 %20

KÇ 9 7 6 5 1 0 0 ZÇ 11 12 12 10 0 0 0 (KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Hidroliz Zon Çapı (mm)

C-14 suşu %3-%13 NaCl içeren katı besiyerinde 9-1 mm koloni oluşturacak şekilde üremiştir. Konsantrasyon arttıkça koloni çapında da azalma meydana

78

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

gelmiştir. NaCl konsantrasyonu %15-20 düzeylerine çıkarıldığında ise her hangi bir üreme gözlenmemiştir. Maksimum koloni oluşumu 9 mm ile %3’lük konsantrasyonda gerçekleşirken %10 NaCl içeren ortamda koloni çapı 5 mm olarak gerçekleşmiştir. Optimum enzim sentezi 12 mm ile %5-7 konsantrasyonda gözlenirken, %3’de 11 mm %10’da ise 10 mm aktivite zonu meydana gelmiştir. Bu sonuçlar C-14 suşunun halofil özellikte olduğunu göstermektedir. Literatür bilgilerinde %3-15 NaCl içeren ortamlarda üreyen organizmaların orta düzeyde halofil özelliğe sahip olduklarını belirtilmektedir (Ventosa ve ark, 1998).

4.5. X-13 Suşunun Katı Besiyerinde 37ºC ve Farklı pH Değerlerinde Enzim Sentezleme ve Üreme Davranışına Ait Bulgular

X-13 suşunun 37ºC ve pH 6.0-12.0 aralığında katı besiyerinde enzim üretme ve üreme ile ilgili sonuçlar, Çizelge 4.7 de gösterilmiştir.

Çizelge 4.7. X-13 Suşunun 37ºC ve Farklı pH Değerlerinde Üreme ve Enzim Üretimine Ait Sonuçlar pH 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 KÇ 10 10 8 8 6 4 0 ZÇ 25 25 22 21 17 16 0 (KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Hidroliz Zon Çapı (mm)

X-13 suşu pH 6.0-11.0 arasında üreme gösterirken en büyük koloni oluşumu 10 mm ile pH 6.0-7.0 değerlerinde gerçekleşmiştir. X-13 suşu oldukça aktif bir enzim üreticisi olup, elde edilen aktivite zon çapları, pH 6.0-7.0 değerlerinde 25 mm, pH 8.0-9.0 değerlerinde ortalama 22 mm ve pH 10.0-11.0 değerlerinde ortalama 17 mm olarak saptanmıştır. pH 11.0 de elde edile aktivite zon çapı, koloni çapının dört katına ulaşmıştır. Bu sonuçlar suşun ve enzimin çok geniş pH aralığında üreme (asidikten- alkaliye) ve enzim sentezleme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.

79

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Buna karşılık özellikle pH 6.0-7.0 değerlerinde 25 mm gibi oldukça geniş aktivite zonu elde edilmesi, enzimin daha çok asidik pH da aktif olduğunu düşündürmektedir.

4.5.1. X-13 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklıklar ve pH 7.0’deki Ürem ve Enzim Sentezlemesine Ait Bulgular

X-13 suşunun pH 7.0 ve 20-60ºC’lik sıcaklık değerlerinde inkübe edilmesi sonucu katı besiyerinde elde edilen koloni ve aktivite zon çaplarına ait bulgular Çizelge 4.8’de gösterilmiştir.

Çizelge 4.8. X-13 Suşunun Farklı Sıcaklık ve pH 7.0 de Gösterdiği Üreme ve Enzim Sentezine ait Bulgular. Sıcaklık 20ºC 30ºC 40ºC 50ºC 60ºC

KÇ 4 10 10 4 2 ZÇ 24 18 25 20 16 (KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Hidroliz Zon Çapı (mm)

X-13 suşu inkübasyon gerçekleştirilen bütün sıcaklık değerlerinde oldukça iyi üreme göstermiştir. Özellikle 30 ve 40ºC de gerçekleştirilen inkübasyonlarda 10 mm koloni çapı oluşumu gerçekleşmiştir. İnkübasyon için seçilen 20ºC (4 mm) ve 60ºC (2 mm) sıcaklık aralığında üreme geçekleşmiştir. Bu özellikler dikkate alındığında suşun oldukça geniş bir sıcaklık toleransına sahip olduğu görülmektedir. Diğer taraftan aynı sıcaklıklarda oldukça geniş aktivite zon çapları oluşturacak şekilde enzim üretimi gerçekleşmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 20-40ºC seçildiği zaman ortalama 22 mm aktivite zon çapına ulaşmıştır. Bütün sıcaklık değerleri ayrı ayrı değerlendirildiği zaman ise en yüksek enzim üretiminin 25 mm ile 40ºC de gerçekleştiği görülmektedir. Bununla birlikte 20ºC de 24 mm zon çapına ulaşılması, enzimin psikrofil, 60ºC deki zon çapının koloni çapının 8 katı büyüklüğe (16 mm) ulaşması ise aynı zamanda termofil özellikte olduğunu göstermektedir. Bir başka ifade ile X-13 suşu 20-60ºC’ler arasında, oldukça iyi üreyebilen ve bu değerlerde yüksek düzeyde enzim sentezleme yeteneğinde olan bir organizmadır.

80

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Bu sonuçlar ışığında X-13 suşunun, inkübasyon sıcaklığına göre farklı aktivite düzeyine sahip enzim sentezleyebilecek özel bir organizma olduğu söylenebilir.

4.6. AB-17 Amilaz’ın Enzimatik Özellikleri

AB-17 suşunun sıvı kültüründen alkol presipitasyonu ile elde edilen amilaz enzimi %1’lik nişasta içeren agar besiyerine 20µL damlatılarak 1 saat 37oC’de inkübe edilmiş, boyama işleminden sonra, enzimin yaklaşık 10 mm aktivite zonu oluşturduğu saptanmıştır.

Şekil 4.1. AB-17 Suşundan Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle İzole Edilmiş Enzim Çözeltisinin Nişastalı Agar Ortamında Oluşturduğu Aktivite Reaksiyonu

4.6.1. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum pH Aralığı

AB-17 suşuna ait amilaz enzimi kullanılarak Na-fosfat (pH 6.5-8.0), Glisin- NaOH (pH 8.5-10.0) ve Boraks-NaOH (pH 10.5-12.5) tampon sistemleri ile aktivite analizleri yapılmıştır. Bacillus sp. AB-17 suşundan izole edilen amilaz enziminin 6.5-12.5 aralığındaki bütün pH değerlerinde yüksek düzeyde aktiviteye

81

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

sahip olduğu saptanmıştır. Enzim pH 6.5 de %81, 7.5’de %82, 8.5’de %84, 9.5’de %84 aktiviteye sahipken optimum aktivitesini pH 10.5’de göstermektedir. Optimum aktivitenin gözlendiği pH değerinin üstündeki değerlerde ise aktivite hızla düşüş göstermiştir (pH 11.5 de %64, 12.5 de %61). Analizler sonunda pH 6.5-9.5 aralığında ortalama %83 aktivite elde edilmiştir. Enzim aktivitesi pH 11.5- 12.5 aralığında hızla düşerek ortalama %62.5’e gerilemiştir. Analiz edilen bütün pH değerleri ortalama %79.4 düzeyinde, oldukça stabil bir aktivitenin gerçekleştiği görülmektedir (Şekil 4.2). Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi geniş pH spektrumuna sahip, alkalin özellik göstermektedir.

120

100

80

60

R ö l a t i f A k v e ( %) 40

20

0 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5 11,5 12,5 pH

Şekil 4.2. AB-17 Suşundan Elde Edilen Amilaz Enziminin Optimum pH’sı

Farklı bir çalışmada alkalin özellik gösteren amilaz enzimi izole etmişlerdir. Horikoshi, izole ettiği alkalin amilaz enziminin pH 10.0-10.5

82

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

aralığında çok aktif olduğunu, pH 9.0-11.5 aralığında ise yaklaşık %50 aktivite gösterdiğini belirtmiştir (Horikoshi, 1999). McTigue ve ark. Bacillus halodurans A-59 (ATCC 21591), Bacillus sp. NCIB 11203 suşu ve Bacillus sp. IMD370 suşlarının üçünden de amilaz enzimi izolasyonu gerçekleştirmişler. Optimum aktivite görülen pH değerinin 10.0 olduğunu belirtmişlerdir (McTigue ve ark, 1995). Bacillus sp. ANT-6 amilaz enziminin optimum aktivitesini 10.5 de gösterdiğini pH 9.5-13.0 aralığında ise yüksek düzeyde aktiviteye sahip olduğunu belirtmişlerdir (Burhan ve ark, 2003). Termofil Bacillus sp. A3-15 suşundan izole edilen amilaz enziminin optimum aktivitesini pH 11.0 de gösterdiği, özellikle pH 10.0-11.5 aralığında %95 aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır (Arıkan, 2007). Termofil ve halofil Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen amilaz enziminin optimum aktivitesini pH 12.5 de gösterdiği, pH 8.5-12.0 aralığında ise ortalama %86.25 aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur (Tatar, 2007). Bacillus halodurans A-59 suşundan izole edien amilaz enzimi pH 10.0’da optimum enzim aktivitesi göstermiştir (Horikoshi, 1999). Diğer yandan, Bacillus sp. PN5 suşundan izole edilen amilaz enziminin ise optimum pH 10.0 da aktivite gösterdiği belirtilmektedir (Saxena ve ark, 2007). Doğal halofil Bacillus sp. AB-17 suşundan izole edilen amilaz enzimine ait pH optimum sonuçları, alkalin ve termofil Bacillus sp. ANT-6 amilazı ile tam bir uyum içindedir. Bu sonuçlar AB- 17 amilaz enziminin alkalin özellikte olduğunu göstermektedir.

4.6.2. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Sıcaklık Aktivitesi

AB-17 amilaz enziminin en yüksek aktiviteyi gösterdiği sıcaklık değerinin saptanması amacı ile 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 ve160˚C aralığında aktivite analizleri yapılmıştır. Analizler için kullanılan substrat optimum aktivitenin geçekleştiği pH 10.5 değerinde hazırlanmıştır. Aktivite tayininde inkübasyon süresi 30 dakika olarak seçilmiştir. Analizler sonucu elde edilen veriler Şekil 4.3’de gösterilmiştir.

83

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

110 100 90 80 70 60 50 40 30 R e l a ti f enz i m ak v it es ( %) 20 10 0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160 İnkübasyon sıcaklığı

Şekil 4.3. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Verileri.

AB–17 amilaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değeri 150ºC olarak bulunmuştur. Enzim 30ºC de %16, 40ºC % 21 gibi nisbeten düşük bir aktiviteye sahiptir. İnkübasyon sıcaklığı 50ºC’ye yükseltildiğinde aktivite değeri %27’ye ulaşmıştır. İnkübasyon sıcaklığının 30–40ºC aralığında gerçekleşen %18.5’lik aktivite değeri dikkate alındığı zaman, 50ºC de aktivitenin yaklaşık %50 oranında artış gösterdiği görülmektedir. Buna karşılık 50–130ºC aralığında gerçekleştirilen inkübasyonlarda, enzim aktivitesinde tam bir stabilite görülmüş ve ortalama %27.3’lük aktivite elde edilmiştir. İnkübayon sıcaklığı 140ºC’ye yükseltildiği zaman, enzim aktivitesi %81 değerine ulaşarak çok hızlı bir artış gerçekleşmiştir. Aktivitedeki artış oranının 30–130ºC aralığındaki verilerle karşılaştırıldığı zaman (ortalama %26) yaklaşık %311 düzeyine ulaştığı görülmektedir. Optimum aktivite 150ºC (%100) elde edilirken, sıcaklık 160ºC’ye yükseltildiğinde enzim aktivitesinin %82’ye düştüğü bulunmuştur.

84

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

En yüksek aktivitenin gerçekleştiği 140–160ºC aralığında elde edilen ortalama aktivite değeri %87.6’dır. Bu aralıktaki aktivite artışının 30–130ºC aralığı ile karşılaştırıldığı zaman yaklaşık %337 olduğu görülmektedir (Şekil. 4.3). Bu sonuçlar dikkate alındığı zaman, enzimin özellikle 130ºC den sonra çok yüksek bir aktiviteye sahip olduğu ve bu özelliği ile ultratermofil özellik gösterdiği söylenebilir. Konsoula ve Kyriakides, Bacillus sp. suşundan izole ettikleri amilaz enziminin optimum aktivitesini 135˚C de gösterdiğini belirtmişler, 160˚C de ise yaklaşık %70 aktivite saptamışlardır (Konsoula ve Kyriakides, 2004). Tatar, termofil alkalin-halofil Bacillus sp. SB-28 suşundan izole ettiği amilaz enziminde optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklığı 140˚C olarak bulmuştur. Tatar, amilaz enziminin optimum aktivitesini 140˚C de göstermekle birlikte 130˚C de %91, 150˚C de %93 ve 10˚C de %86.5 aktiviteye sahip olduğunu bulmuştur (Tatar, 2007). Yukardaki bulguların dışında bir çok araştırıcı, yüksek sıcaklıkta aktivite gösteren amilaz enzimi izolasyonu gerçekleştirdiklerini belirtmişlerdir. Literatürde belirtildiğine göre, Goyal ve ark (2005), 70˚C, Saxena ve ark (2007), 90˚C, Burhan ve ark (2003), 80˚C, Arıkan (2007), 70˚C ve Mamo ve Gessesse (1999), 80˚C’de optimum aktivite gösteren bakteri kökenli amilaz enzimi izolasyonu gerçekleştirdiklerini belirtmişlerdir. Goyal ve ark (2005), izolasyonunu gerçekleştirdikleri amilaz enziminin 50- 100ºC aralığında aktivite gösterdiğini, optimum aktivite sıcaklığının ise 70ºC olduğunu belirtmişlerdir. Literatür verileriyle karşılaştırıldğı zaman, Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi bugüne kadar mezofil bakterilerden izolasyonu yapılan, optimum aktivite değeri en yüksek olan (150˚C) enzimdir. Bu özelliği ile amilaz enzimi, literatürler arasında en üst noktaya yerleşecek ultra-termofil alkalin özellikte bir enzimdir.

85

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

4.6.3. AB-17 Amilaz Stabilitesi Üzerine pH’nın Etkisi

Bacillus sp. AB–17 amilaz enzimi pH 8.0; 9.0; 10.0; 11.0 ve 12.0 ve 37ºC’de 42 saat ön inkübasyon yapılarak enzimin farklı pH değerlerindeki stabilitesi araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar Şekil 4.4 de gösterilmiştir. Kalan aktivitenin saptanması için enzim, optimum pH değerinde hazırlanmış substrat kullanılarak optimum aktivite sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilerek analiz gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar Şekil 4.4 de gösterilmiştir.

100

90

80

70

60

50

40

30

K a l an R ö ti f E nz i m A k v it es ( %) 20

10

0 Kontrol 8 9 10 11 12 42 saat Ön İnkübasyon yapılan pH değerleri

Şekil 4.4. AB-17 Amilaz Enziminin pH Stabilitesi.

Analizler sonunda pH 8.0 de kalan enzim aktivitesi %62 olarak gerçekleşirken, pH 9.0 da %50’ye düşmüştür. Enzim pH 10.0-12.0 aralığında stabil bir aktivite göstermiş, kalan enzim aktivitesi ortalama %54.3 olarak gerçekleşmiştir. pH 9.0-12.0 aralığında elde edilen stabilite değeri ise ortalama %53.2 olarak bulunmuştur.

86

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Analiz edilen bütün pH değerlerinde ortalama %55 enzim stabilitesi elde edilmiştir. Özellikle pH 10.0-12.0 aralığında aktivite sonuçlarının birbirine yakın çıkması ve pH 9.0 daki %50 değerinin aksine, ortalama %54.2 kalan aktivite değeri elde edilmesi, enzimin alkali özelliği ile bütünlük göstermektedir. Bütün pH değerlerinde 24 saatlik inkübasyon sonunda enzim stabilitesi ortalama %55 düzeyinde gerçekleşmiştir. Bu sonuçlar enzimin pH stabil olduğunu kanıtlamaktadır. Bacillus sp. TS-23 suşundan üretilen amilaz enziminin, pH 9.0 da 10 dakikalık inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini %100 koruduğu bulunmuştur (Lin ve ark, 1998). Alkalin termofil Bacillus sp. A3-15 suşuna ait amilaz enzimiyle yapılan pH stabilitesi çalışmalarında enzim, 60˚C de ve pH 10.0-11.0 aralığnda 24 saat inkübe edildiği zaman, orijinal aktivitesini %70 koruduğu bulunmuştur (Arikan, 2007). Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen amilaz enziminin ise pH 10.0-12.0 aralığında 55˚C de 72 saat inkübe edildiği zaman aktivitesini yaklaşık %54 koruduğu bulunmuştur (Tatar, 2007). Bacillus subtilis’ten elde edilen alfa amilaz enziminin 24 saatlik inkübasyon sonunda aktivitesini pH 7.0’de %80 korurken, pH 10.0’da aktivitenin %40’a düştüğü bulunmuştur (Lin ve ark, 1998). Igarashi ve ark (1998), amilaz enziminin 30 dakika süreyle 40˚C ve pH 7.0-9.0 aralığında inkübe edildiği zaman aktivitenin %100 korunduğunu, pH 10.0-12.0 aralığında ise %75 e düştüğünü saptamışlardır. Thermus filiformis suşundan üretilen amilaz enzimine 70˚C ve pH 5.0-7.0 aralığında 30 dakika ön inkübasyon uygulandığı zaman, aktivitenin %90 korunduğunu belirtmişlerdir (Egas ve ark, 1998). Bacillus sp. PN5 suşundan izole edilen termostabil alkalin amilazın enziminin 1 saat pH 10.0’da inkübasyonu sonucu aktivitenin %80 koruduğu saptanmıştır (Saxena ve ark, 2007). Bernhardsdotter ve ark (2005), izole ettikleri amilaz enzimini 1 saat 37˚C ve pH 7.0-11.0 aralığında ön inkübasyona bıraktıkları zaman orijinal aktivitenin %80’e düştüğünü saptamışlardır. Lo ve ark (2001), TS-23 α-amylase enziminin orijinal aktivitesini pH 9.0 da %100, pH 10.0 da %86 koruduğunu belirtmişlerdir. Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi 60˚C ve pH 9.0-12.0 aralığında 24 süreyle aktivitesini %53.2 koruması enzimin, pH stabil özellikte olduğunu göstermektedir.

87

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Uygulanan inkübasyon süresi, inkübasyon sıcaklığı ve pH aralıkları dikkate alındığında enzimin, literatür verilerinin bir çoğundan daha yüksek stabiliteye sahip olduğu görülmektedir.

4.6.4. AB-17 Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular

AB-17 amilaz enziminin termal stabilitesinin satanması için 30-160ºC aralığında 30 dakika süreyle ön inkübasyon yapıldıktan sonra, optimum aktivite sıcaklığı ve pH değerindeki substrat ile gerçekleştirilen analiz sonuçları şekil 4.5 de gösterilmiştir.

120

100

80

60

40 Kalan Aktivite(%)

20

0 Kont 30 40 50 60 70 80 90 100 110120 130140 150160 Sıcaklık

Şekil 4.5. AB-17 Amilaz Enziminin Sıcaklık Stabilitesi.

Enzim ön inkübasyon gerçekleştirilen bütün sıcaklık değerlerinde (30- 160˚C) 30 dakika süreyle yaklaşık %51 oranında orijinal aktivitesini korumuştur. Goyal ve ark (2005), Bacillus sp. I-3 suşundan izole edilen termostabil amilaz enziminin 70ºC de 3.5 saat’lik inkübasyondan sonra orijinal aktivitesini %100, 2.5 saatlik inkübasyon sonunda ve 80ºC’de ise %90 koruduğunu bulmuşlardır. Araştırmacılar aynı enzimi 30 dakika süreyle 90 ve 100ºC de ön

88

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

inkübasyon bıraktıkları zaman orijinal aktivitenin %59 ve %26’ya düştüğünü saptamışlardır. Mamo ve Gessesse (1999), Termofilik Bacillus’lardan izole edilen termostabil amilaz enzimini 80ºC de 4 saatlik inkübasyona bıraktıkları zaman orijinal aktivitenin %50’ye düştüğünü belirtmişlerdir. Arikan (2007), termofil Bacillus sp. A3-15 amilaz enziminin orijinal aktivitesini 100ºC de 30 dakika süreyle %96 koruduğunu bulmuştur. Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin 30-160ºC aralığında 30 dakika süreyle orijinal aktivitesini yaklaşık %51 koruması, enzimin yüksek düzeyde termostabil ve stabil bir enzim özelliğinde olduğunu göstermektedir.

4.6.5. AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine NaCl’ün Etkisi

Amilaz enzim aktivitesi üzerine NaCl’ün etkisini saptamak için enzim %3, %5, %7.5, %10, %15 ve %20’lik tuz konsantrasyonlarında 30 dakika süreyle 37ºC de ön inkübasyona tabi tutulmuştur. Optimum aktivite sıcaklığı ve pH değerinde gerçekleştirilen analiz sonuçlarına ait veriler şekil 4.6. da gösterilmiştir.

120

100

80

60

40

20

K a l n R ö ti f E z i m A k v it e s ( %) 0 Kontrol 3 5 7,5 10 15 20 NaCl Konsantrasyonu (%)

Şekil 4.6. AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine NaCl’ün Etkisi

Analizler sonunda kalan enzim aktivitesi %3, %5, %7.5, %10, %15 ve %20 NaCl konsantrasyonları için sırasıyla ortalama %68.4, %67.3, %67.5, %67, %67 ve %64 olarak bulunmuştur. En yüksek enzim aktivitesi %68.4 ile %3’lük NaCl

89

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

konsantrasyonunda sağlanmıştır. %5-15 aralığındaki konsantrasyonlarda kalan enzim aktivitesi ortalama %67 düzeyinde gerçekleşmiştir. En yüksek kalan aktivite değeri %68.4 ile %3 NaCl konsantrasyonunda (0.5M) elde edilirken, diğer konsantrasyonların hepsinde yaklaşık %67 aktivite bulunmuştur. Bir başka ifade ile enzim 0.5-3.4 M aralığındaki NaCl konsantrasyonlarında, ortalama %67 ile aynı aktiviteyi ve stabiliteyi göstermiştir. Tuz konsantrasyonu %20’ye yükseltildiği zaman, enzim aktivitesi %64’e düşmüştür. Bütün konsantrasyonlar (%3-20) dikkate alındığı zaman kalan enzim aktivitesinin, ortalama %67 olduğu görülmektedir. Bu sonuçlar enzimin halofil özelliğe sahip olduğunu göstermektedir. Haloferax mediterranei suşundan izole edilen amilaz enziminin 2-4M aralığındaki NaCl konsantrasyonunda aktif ve stabil olduğunu, optimum aktivitenin ise 3M konsantrasyonda elde edildiğini bulmuşlardır (Pomarez ve ark, 2003). WainØ ve Ingvorsen (2003), β-xylanase enziminin %5-%15 NaCl konsantrasyonlarında optimum aktivite gösterdiğini, 24 saat üreyle %20 NaCl içerisinde bırakılan enzimin aktivitesini %55 oranında koruduğunu saptamışlardır. Halofilik arkeal enzimlerin özellikleri arasında, yüksek tuz konsantrasyonlarında aktivitenin giderek artmasının bulunduğunu belirtmişlerdir (Dym ve ark, 1995). Literatür verileri ile karşılaştırıldığı zaman, AB-17 amilaz enziminin %3-20 arasındaki NaCl konsantrasyonlarında ortalama %67 aktivite ve stabilite göstermesi, enzimin halofil olduğunu göstermektedir.

4.6.6. AB-17 Amilaz Enzimi Üzerine İnhibitörlerin Etkisi

Enzim aktivitesine şelatör, metal iyonları, inhibitörler ve deterjanların etkisi ile ilgili sonuçlar Çizelge 4.9 da verilmiştir. Çalışmada 5mM EDTA, 5mM CaCl2,

3mM PMSF, 5mM Na2SO3, 5mM NaCl, 5mM ZnCl2 , 5mM 1,10-phenantroline, 8M Üre, %1’lik SDS(v/v), %1’lik TritonX-100 (w/w) ve %1’lik β-Merkaptoetanol (v/v) kullanılmıştır.

90

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Çizelge 4.9: AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi İnhibitörler İnhibitör kons. Kalan aktivite(%) Kontrol Yok 100 EDTA 5 mM 69.21 CaCl2 5 mM 63.42 PMSF 3 mM 70.52 β-Merkaptoetanol %1 v/v 67.36 SDS %1 v/v 69.21 TritonX-100 %1 v/v 72.36 Na2SO3 5 mM 73.15 NaCl 5 mM 78.15 ZnCl2 5 mM 59.21 1,10-phenantroline 5 mM 67.10 Üre 8 M 2.22

Kalan aktivite analizleri sonuçlarına göre 8M üre aktiviteyi %97.8 oranında inhibe etmiştir. Bu sonuç enzimin alkali ve termofil özellikte olduğunu göstermektedir. İnhibisyon oranı metal iyonlarında ortalama CaCl2 de %37,

Na2SO3 te %27, NaCl de %22 ve ZnCl2 de %41 düzeyinde gerçekleşmiştir.

Metal iyonları arasında en yüksek inhibisyon %41 ile ZnCl2 de saptanırken, en düşük inhibisyon %22 ile NaCl de elde edilmiştir. Metal iyonlarına karşı elde edilen ortalama dirençlilik %68.40 düzeyindedir. Enzimin özellikle ZnCl2 ile önemli düzeyde inhibe olması, temostabilitesinin yüksek olmadığını fakat termofil özellikte olduğunu göstermektedir. Termostabilite çalışmalarından elde edilen sonuçlar dikkate alındığında (bütün sıcaklık değerleri için otalama %53 kalan aktivite saptanmıştır) metal iyonları ile yapılan analizlerden elde edilen sonuçların birbirini desteklediği görülmektedir. Deterjanlar arasında en yüksek inhibisyon oranı ortalama %32 ile β- Merkaptoetanol de elde edilirken, SDS de %31 ve Triton X-100 de %28 inhibisyon saptanmıştır. Her üç deterjanda gözlenen inhibisyon ortalama %30.3 düzeyindedir. Bir başka ifade ile AB-17 amilaz enzimi deterjanlara ortalama %70 dirençlilik göstermişlerdir. Hashim ve ark (2005), Bacillus halodurans LBK

34’den izolasyonunu yaptıkları alfa amilazda orijinal aktivitenin 5 mM CaCl2 ile %59, 1 mM EDTA ile %58 oranında korunduğunu bulmuşlardır. Berhardsdotter ve ark (2005) ise, alkalin-şelatör dirençli amilaz enziminde orijinal aktivitenin 5

91

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

mM CaCl2 ile %34, ZnCl2 ile %30.6 korunduğunu, buna karşılık EDTA ile aktivitenin indüklenerek %120.7’ye yükseldiğini bulmuşlardır. Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi 5 mM EDTA’ya yaklaşık %69.2, PMSF’ ye ise %70.52 direnç göstermiştir. Bu sonuç enzimin metallo enzim yapısında fakat düşük düzeyde serin amino asitleri içerdiğini göstermektedir. Szilagyi ve Zavodszky (2000), Termofilik proteinlerde serin amino asitlerinin düşük düzeyde bulunduğunu belirtmiştir. Literatürde Bacillus sp. SPS-0 suşundan izole edilen orta düzeyde termostabiliteye sahip ksilanaz enziminin orijinal aktivitesini 1 mM CaCl2 ile %92, , 5 mM Triton-X100 ile %43, ve 5 mM EDTA ile %93 oranında koruduğu belirtilmektedir (Bataillon ve ark, 2000). Horikoshi (1999) ile Hutscheon ve ark (2005) amilaz enziminin 8M üre ile tamamen inhibe olmasının alkalofil ve halofil özelliğin göstergesi olduğunu belirtmektedir (Horikoshi, 1999; Hutscheon ve ark, 2005). Fukuchi ve ark (2003), halofilik enzimlerin üre ve guanidin hidroklorid gibi kaotrapik tuzlarda genellikle stabil olmadıklarını ve inhibisyon gerçekleştiğini belirtmektedirler. Bacillus sp. AB-17 enzimi 8M üre ile tamamen (yaklaşık %97.8) EDTA ile önemli düzeyde (%30.79) inhibe olmuştur. Bu sonuçlar enzimin alkalin, halofil ve metalloenzim özellikte olduğununu göstermektedir. Lo ve ark (2001), Bacillus sp. TS-23 amilaz enziminin %6’lık SDS bulunan ortamda 30ºC de 1 saat inkübe edildiği zaman stabilitesini koruduğunu, 60ºC ise inaktive olduğnu bulmuşlardır. Bacillus sp. ANT-6 amilaz enziminin ZnCl2 ile yapılan inaktivasyon çalışması sonucunda orijinal aktivitenin %63 oranında korunduğunu belirtmişler ve bunun termostabilitenin göstergesi olduğunu bildirmişlerdir (Burhan ve ark, 2003). Termofilik Bacillus sp. TS–23 suşuna ait amilaz enzimi 5 mM ZnCl2 ile %40 oranında inhibe olmuştur (Lin ve ark, 1998).

AB-17 amilaz enziminin orijinal aktivitesi 5 M ZnCl2 ile yaklaşık %40.8 oranında kaybolmuştur. Bu sonuç literatür verileri ile son derece uyumludur termofilliğin göstergesidir.

92

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Bacillus sp. suşundan izole edilen ağartıcılara dirençli alkalin proteaz enziminin %1 SDS bulunan ortamda 40˚C de 30 dakikalık inkübasyon sonunda %85, 60 dakikada ise %60 aktivitesini koruduğu belirtilmiştir (Gupta ve ark, 1999). Haloalkalofilik Bacillus sp. bakterisinden izole edilen alkalin proteaz enziminin 1 mM EDTA %10, 1 mM PMSF ile %94 inhibe olduğu, 5 mM CaCl2 ile aktivitenin %71’e düştüğü belirtilmektedir (Gupta ve ark, 2005). Termofil Bacillus sp. A3-15 suşundan izole edilen amilaz enziminin orijinal aktivesini 60˚C de 30 dakika süreyle inkübasyo gerçekleştirildiği zaman, %1 SDS ile %82, 8M üre ile

%20, 5 mM ZnCl2 ile %82, 3 mM PMSF ile %90 koruduğu belirtilmektedir (Arıkan, 2007). Halofil alkalin termofil Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen ve optimum aktivitesini 140˚C de gösteren amilaz enziminin 55˚C, 30 dakika süreyle aktivitesini %1 SDS de %71, β-Merkaptoetanol de %81, triton X-100 de %82, 8 M ürede %11,

3 mM PMSF de %74, 5 mM CaCl2 de %70, ZnCl2 de %68 koruduğu belirtilmektedir (Tatar, 2007). Saxena ve ark (2006), Bacillus sp. PN5 suşundan üretilen termostabil alkalin amilaz enziminin 5 M SDS ile 1 saat inkübe edildiği zaman atvitesini %70 koruduğunu bulmuşlardır. AB-17 amilaz enziminin %1 SDS ile %69.21, β-Merkaptoetanol ile %67.36 ve triton X-100 ile %72.36 oranında orijinal 30 dakika süreyle koruduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar, AB-17 amilaz eziminin çeşitli deterjan, sürfaktan ve ağartıcı bileşiklere karşı dirençli olduğunu ve deterjan endüstrisi için uygun özellik taşıdığını göstermektedir. Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminden elde edilen sonuçlar, literatür verileriyle önemli bezerlikler göstermektedir. Özellikle, Tatar (2007)’ın tanımladığı ultratermofil ve termostabil alkalin halofil amilaz enzimiyle üre dışındaki değerler çok büyük uyum göstermektedir. Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin PMSF ye %70, EDTA’ya %69 dirençlilik göstermesi, üre ile tamamen inhibe olması, ZnCl2 ile inhibe olması, enzimin serin amino asitlerince zengin olmadığı, metal atomları bulunduran, termofilik halofil özellikte olduğunu göstermektedir. Bacillus sp. AB-17 amilaz

93

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

enzimi bu özellikleri ile, nişasta, tekstil ve deterjan başta olmak üzere, nişastanın kullanıldığı bütün biyoteknolojik alanlar için öncelikli kullanım olanağına sahiptir.

4.6.7. AB-17’nin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi

%10’luk homojen SDS-PAGE sistemi kullanılarak yapılan analiz sonuçları Şekil 4.7. de gösterilmiştir.

Şekil 4.7.AB-17 Amilaz Enziminin SDS-PAGE ve Doğal PAGE Zimogram Sonuçları (N: Doğal PAGE jelde elde edilen aktivite görüntüsü). 1,2,3 ve 4 numaralı örnekler SDS-PAGE’de analiz edilmiş amilaz enzimine ait protein bandları M: Markır (Merck Standart Protein Mixture: 78, 66.25, 42.7, 30 kDa).

Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin SDS-PAGE analizinde moleküler ağırlıkları 66.25 ve 58 kDa olan iki farklı protein bandı elde edilmiştir. Aynı enzim örneği nişastalı doğal PAGE’i kullanılarak analiz edildiği zaman, SDS- PAGE jelinde saptanan bandlarla aynı moleküler ağırlığa sahip (A ve B şeklinde görülmektedir) iki aktivite bandının saptanması, SDS-PAGE’de elde edilen bandların amilaz enzimine ait olduğunun kanıtıdır. Bu sonuç enzimin moleküler ağırlıkları farklı iki alt birimden oluştuğunu göstermektedir. Literatürde amilaz enzimleri ile yapılan SDS-PAGE çalışmalarında moleküler ağırlıkların 51 ve 70 kDa arasında değiştiğine ait çok sayıda bulgu

94

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

vardır (Horikoshi, 1971; Igarashi ve ark, 1998; Hamilton ve ark, 1999; Ben ve ark, 2001; Bernhardsdotter ve ark, 2007). Kim ve ark (1995) Bacillus sp. GM-8901 suşundan kültür süresine bağlı olarak farklı moleküler ağırlıkta 5 farklı aktivite bandı elde ettiğini belirtmiştir. Arıkan (2007) termofil Bacillus sp. A3-15 suşundan izole ettiği alkalin amilaz enziminin SDS-PAGE zimogram analizi sonucunda moleküler ağırlıkları 60500 ve 86 kDa olan iki alt birimden meydana geldiğini bulmuştur. Mamo ve Gessesse (1999), termofilik Bacillus sp. WN11 suşuna ait amilaz enziminin moleküler ağırlıkları 76 kDa ve 53 kDa olan, AmyI ve AmyII şeklinde tanımladığı iki alt birimden medana geldiğini belirtmişlerdir. Literatürde Bacillus sp.PS-7 suşundan izole edilen amilaz enziminin 55 ve 71 kDa’luk iki alt birimden oluştuğu ve bunların izoenzim oldukları belirtilmiştir (Sodhi ve ark, 2005). Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi zimogram sonuçları, literatür verileriyle oldukça uyumludur.

4.6.8. AB-17 Amilaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları

Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin optimum aktivite sıcaklığı ve pH değerinde nişastayı parçalaması sonucu ince tabaka kromatografisinde elde edilen hidroliz ürünleri Şekil 4.8 de gösterilmiştir.

Şekil 4.8. AB-17 Amilaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi ile Son Ürünlerinin Saptanması. (G: Glikoz; M: Maltoz; AB-17 Amilaz enzimi Hidroliz ürünleri; Ti: Ticari α-Amilaz hidroliz ürünleri; N: Enzim ilave edilmemiş Nişasta çözeltisi).

95

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

İnce tabaka kromatografi analizi sonucunda, Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin nişastayı maltoz ve diğer oligosakkaritlere parçaladığı saptanmıştır. Ticari alfa amilaz enziminin kullanıldığı çalışmaya ait hidroliz ürünleri ile AB-17 amilaz enzimine ait hidroliz ürünleri karşılaştırıldığında, oluşan oligosakkaritlerin büyük benzerlik gösterdiği, dahası AB-17 enziminin aktivitesi sonucu elde edilen sondan ikinci bandın farklı bir oligosakkarite ait olduğu açıkça görülmektedir. Bu sonuçlar, izole edilen AB-17 amilaz enziminin alfa amilaz olduğunu ve ticari alanda kullanılabilecek özellik taşıdığını göstermektedir. Lee ve ark, (1994)’nın termofilik alkalifilik Bacillus sp. XAL601 suşundan ürettikleri α-amilaz enziminin nişastayı hidrolizi sonucu maltoz ve uzun zincirli oligosakkaritlerin oluştuğu, buna karşılık glikoz üretilmediğini belirtmişlerdir. İzole ettiğimiz AB-17 amilaz enzimine ait hidroliz ürünlerinin, Lee ve arkadaşlarının (1995) bulguları ile tam bir benzerlik gösterdiği görülmektedir. Bacillus amyloliquefaciens geninin E.coli’de ekspresyonu sonucu elde edilen amilazların nişastayı hidrolizinde son ürün olarak maltoz, maltotrioz ve maltotetroz gibi oligosakkaritler ile çok az glikoz oluştuğunu bildirilmiştir (Demirkan ve ark, 2005). Bununla birlikte, Morgan ve Pires (1981), Bacillus subtilis bakterisinden üretilen amilaz enziminin nişastayı glikoz ve maltoza dönüştürdüğü belirtilmektedir. Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimine ait hidroliz bulguları literatür verileriyle karşılaştırıldığı zaman sonuçlar arasında tam bir uyum olduğu görülmektedir.

4.7. Kısmi Saflaştırılmış C-14 Selülaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Görüntüsü

C-14 suşundan kısmi saflaştırma yöntemiyle elde edilen endoglukanaz enziminin katı besiyerindeki aktivitesi Şekil 4.9 da görülmektedir. Enzimin aktivite bölgesi sarı renkte görülürken, hidrolize edilmemiş CMC’li bölgeler, kırmızı renkte görülmektedirler.

96

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Şekil 4.9.Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Endoglukanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu

4.7.1. C-14 Selülaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değeri ve Aralığına Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enzimi üç farklı tampon sistemi (Na-fosfat, pH 6.5-8.0 Glisin-NaOH, pH 8.5-10.0 ve Boraks-NaOH, pH 10.5-12.5) kullanılarak en iyi aktivite gösterdiği pH değerinin ve aralığının saptanması için analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçlar Şekil 4.10 da gösterilmiştir.

100 90 80 70 60 50 40 30 R ö l a t i f A k v e ( %) 20 10 0 6 7 8 9 10 11 12 pH

Şekil 4.10. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerine Ait Sonuçlar.

97

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

İzole edilen enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değeri 11.0 olarak saptanmıştır. Enzim, pH 8.0-11.0 aralığında ortalama 96.5 aktiviteye sahiptir. pH aralığı 9.0-11.0 aralığında ise aktivite ortalama %98 değerine ulaşmaktadır. pH 12.0 ye yükseltildiğinde enzim aktivitesi %92 değerine düşmektedir. Analiz edilen bütün pH değerleri dikkate alındığı zaman gerçekleşen aktivite ortalama %92 düzeyindedir. Bu sonuçlar, enzimin özellikle pH 9.0-11.0 aralığında çok yüksek bir aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. Bütün pH değerlerinde yüksek aktivite elde edilmesi (pH 6.0 da %81, pH 12.0 de %12) enzimin aktivite pH aralığının son derece geniş olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte özellikle pH 9.0 dan itibaren (pH 9.0 da %96, pH 11.0 de %100) aktivitenin yüksek değerlere ulaşması, enzimin yüksek düzeyde alkali özellik taşıdığının kanıtıdır. Birçok araştırmacı değişik organizmalarda alkalin özellik gösteren çok sayıda selülaz enzimi izolasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Robson ve Chambliss (1984), Hreggvidsson ve ark (1996), Tahara ve ark (1997), Mawadza ve ark (2000), George ve ark (2001), Murashima ve ark (2002), Saha (2004), Huang ve ark (2004), Li ve ark (2006), Voget ve ark (2006), izolasyonun gerçekleştirdikleri selülaz enzimlerinin optimum pH 4.0 ve 7.0 aralığında aktivite gösterdiklerini belirtmişlerdir. Zvereva ve ark (2006), haloalkaofil anaerob bakteriden optimum pH 6.0-9.0 arasında aktivite gösteren selülaz enzimi izole etmişlerdir. Hakamada ve ark (2002), Bacillus circulans suşundan optimum enzimatik aktivitesini pH 8.5 de gösteren endoglukanaz enzimi izole etmişlerdir. Hakamada ve ark (1997), alkalifilik Bacillus sp.KSM-S237 suşundan optimum aktivite pH’sı 8.6- 9.0, Bacillus sp.VG1 suşundan ise pH 9.0-10.0 olan endoglukanaz izolasyonu gerçekleştirmişlerdir. Literatürlerde değişik Bacillus sp. izolatlarından optimum enzimatik aktivitesini pH 10.0 da gösteren iki endoglukanaz enziminin izole edildiği belirtilmektedir (Endo ve ark, 2001; Kim ve ark, 2005). Çalışmamızda izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilen C-14 endoglukanaz enzimi optimum aktivitesini pH 11.0 de göstermektedir. Bu özellik, literatür verilerinde şu ana kadar Bacilus sp. suşlarından izole edilen endoglukanaz

98

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

enzimleri dikkate alındığında en yüksek pH değerine sahip olması açısından oldukça önemlidir. C-14 enzimi oldukça güçlü alkali endoglukanaz özelliği göstermektedir.

4.7.2. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine Ait Sonuçlar

C-14 Endoglukanaz enziminin en yüksek aktiviteyi gösterdiği sıcaklık değerinin saptanması için 20oC-100oC arasındaki sıcaklıklarda optimum pH değerinde hazırlanmış substrat kullanılarak aktivite analizleri yapılmıştır. Sonuçlar Şekil 4.11 de gösterilmiştir.

110

100

90

80

70

60 R öla t i f E n z m A k v e ( %)

50

40 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Sıcaklık (oC)

Şekil 4.11. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Sıcaklığına Ait Sonuçlar

Analiz sonuçlarında C-14 endoglukanaz enziminin optimum aktiviteyi 50°C de gösterdiği saptanmıştır. Bununla birlikte enzimin 20-80°C aralığında yaklaşık %85 aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur. Bu sonuç enzimin psikrofilden termofile kadar geniş bir sıcaklık aralığında kullanılabilir özellikte olduğunu göstermektedir.

99

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Farklı sıcaklık aralıkları değerlendirildiği zaman en iyi aktivitenin sırasıyla 40- 60°C arasında ortalama %90, 40-70°C arasında %88.5 olduğu görülmektedir. İnkübasyon sıcaklığı 80°C’ye yükseltildiği zaman enzim aktivitesi %71 düzeyine düşmüştür. Sıcaklığın 100°C ‘ye yükseltilmesi sonucunda aktivite değeri %64 düzeyine düşmüştür. 80-100°C aralığındaki aktivite sonuçları incelendiği zaman ortalama aktivitenin %67 düzeyinde gerçekleştiği görülmektedir. Bu bulgular endoglukanaz enziminin optimum aktivite değeri açısından olmasa bile, yüksek sıcaklık değerlerinde %67 düzeyinde aktiviteye sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Bu açıdan değerlendirildiği zaman enzim, oldukça geniş bir sıcaklık aralığında kullanılabilme özelliği taşımaktadır. Literatürler verilerinde optimum aktivite sıcaklığı farklı olan çok sayıda endoglukanaz enzimi yer almaktadır. Bunlardan bir kısmı pH optimum açısında asidofil özellikte olup, optimum aktivite sıcaklıkları 65-70oC (Mawadza ve ark, 2000), 70oC (Li ve ark, 2006), ve 80oC (Huang ve Monk, 2004) olarak bulunmuştur. Alkali pH değerinde aktivite gösteren endoglukanaz enzimleri arasında optimum aktivite sıcaklığı 65ºC olan enzim termofil olarak tanımlamıştır (Singh ve ark, 2001). Alkali pH değerlerinde aktivite gösteren enzimler arasında optimum aktivitenin 50-55ºC olduğu belirtilmektedir (Hakamada ve ark, 1997 ve 2002; Endo ve ark, 2001; Kim ve ark, 2005). Çalışmamızda Halofil Bacillus sp. suşundan izole edilen C-14 endoglukanaz enzimi alkali özellikte olup, optimum aktivitesini 50ºC de göstermektedir. Bu özellikleri açısından literatür verileri ile büyük bir benzerlik göstermektedir.

4.7.3. C-14 Endoglukanaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enzimi pH stabilitesinin saptanması için pH 6.0-12.0 aralığında 24 saat 50ºC de ön inkübasyon gerçekleştirilmişti. İnkübasyon sonunda optimum pH değerinde hazırlanmış subatrat kullanılarak optimum aktivite sıcaklığında kalan aktivitenin saptanması için uygun süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Analizler sonunda elde edilen bulgular Şekil 4.12 de gösterilmiştir.

100

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

120

100

80

60

40

20 R ö l a ti f K n E z im A k v it e s i ( %)

0 K 7 8 9 10 11 12 Ön İnkübasyon Yapılan pH değerleri

Şekil 4.12. C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait pH Stabilite Sonuçları

Aktivite analizleri sonunda C-14 endoglukanaz enzimin orijinal aktivitesini pH 9.0 da %68 düzeyinde koruduğu saptanmıştır. Enzimin analiz edildiği diğer pH değerlerinde orijinal aktivitenin 24 saatlik ön inkübasyon sonunda, sırasıyla 7.0, 8.0, 10.0, 11.0 ve 12.0 için ortalama %63, %64, %66, %63 ve %63 oranında korunduğu bulunmuştur. Enzim pH 7.0-12.0 aralığında orijinal aktivitesini ortalama %64.5 oranında korumuştur. Enzim bu özellikleri ile (özellikle pH 9.0 ve 10.0 aralığında) yüksek düzeyde pH stabilitesi göstermektedir. Ezimin optimum aktivite gösterdiği pH değeri ve en yüksek aktivitenin elde edildiği pH aralıkları dikkate alındığında, pH stabilitesi sonucu kalan aktivite değerlerinin bu sonuçlarla paralellik gösterdiği görülmüştür. Yani enzim, en yüksek aktivitenin gözlendiği pH değerlerinde en iyi stabiliteyi göstermiştir. İzole edilen endoglukanaz enzimin optimum aktivitesinin pH 6.0-8.0 aralığında gerçekleştiği saptanmıştır. Enzim pH 5.0 de ve 50ºCde 1 saat inkübe edildiğinde orijinal aktivitenin %100 korunduğu, pH 6.0 da ise aktivitenin %55’e düştüğü gözlenmiştir (George ve ark, 2001).

101

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Optimum aktivitesini pH 4.5-6.5 ve 70ºC gösteren Ba-EGA endoglukanaz enziminin pH 7.5 de 2 saat 30ºC de inkübe edildikten sonra orijinal ativitesini büyük ölçüde koruduğu saptanmıştır (Li ve ark, 2006) . Alkalifilik Bacillus sp.KSM-S237 suşundan izole edilen alkalin selülaz enziminin pH 5.0-11.0 aralığındaki taponlarda 30 dakika süreyle 30ºC de inkübe edildiği zaman orijinal ativitesini ortalama %80 oranında koruduğu bulunmuştur (Hakamada ve ark,1997). Bacillus circulans suşundan izole edilen ve optimum aktivitesini pH 8.5 ve 55ºCde gösteren endoglukanaz enziminin, pH 5.0-11.0 aralığında ve 30ºC’de 1 saatlik inkübasyondan sonra orijinal aktivitesini %100’e yakın koruduğu bulunmuştur (Hakamada ve ark, 2002). Bacillus sp.HSH-810 suşundan izole edilen alkalin selülaz enzimi optimum aktivitesini pH 10.0 göstermektedir. Enzim pH 7.0-9.0 aralığında ve 50ºC 10 dakika inkübe edildiğinde aktivitenin yaklaşık %10 kaybolduğu saptanmıştır (Kim ve ark, 2005). Endo ve ark (2001) alkalin endoglukanaz enzimini pH 6.0-9.0 aralığında, 30ºC’de 30 dakika süreyle inkübe ettiklerinde, orijinal enzim aktivitesinin belirtilen pH aralığında %100’e yakın düzeyde korunduğunu belirtmişlerdir. C-14 alkalin endoglukanaz enzimin 24 saat sonunda orijinal aktivitesini %64.5 (pH 7.0-12.0 aralığında) koruduğu dikkate alınırsa, enzimin aktivitesini, literatür verilerinden çok daha uzun süreyle ve geniş pH aralığında koruduğu görülmektedir.

4.7.4. C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite Analizlerine Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enziminin termal stabilitesini saptamak amacıyla 20-90 ºC aralığında 15, 30 ve 60 dakikalık ön inkübasyon uygulamaları gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar Şekil 4.13 de gösterilmiştir.

102

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

15 30 60

120

100

80

60 40

20 K a l an E n z i m A k t v e s ( %)

0 Kont 20 30 40 50 60 70 80 90 Ön İnkübasyon Sıcaklıkları (ºC)

Şekil 4.13. C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları

C-14 selülaz enziminin 20-40ºC aralığında 15 dakikalık ön inkübasyondan sonra orijinal aktivitesini ortalama %94, 30 dakikada %89, 60 dakikada ise %64 oranında koruduğu saptanmıştır. Ön inkübasyon süresine bağlı olarak termal stabilitenin düştüğü gözlenmiştir. Termal stabilite 20-40º aralığındaki 15 dakikalık inkübasyon sonunda %94 iken 60 dakika sonunda %64 olarak gerçekleşmiştir. Stabilitedeki düşüş oranı yaklaşık %32 düzeyindedir. Ön inkübasyon sıcaklığı 20-60ºC olarak seçildiğinde 15 dakika sonunda orijinal aktivitenin ortalama %90, 30 dakika sonunda %77 ve 60 dakika sonunda %54’e düştüğü saptanmıştır. Bu aralıkta da ön inkübasyon süresinin değişmesiyle birlikte termal stabilite de önemli düşüşler gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlara termal stabilite 60 dakika sonunda 15 dakikaya göre yaklaşık %40 oranında düşüş göstermiştir.

103

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Ön inkübasyon sıcaklık değeri 70ºC ye yüksetildiğinde termal stabilite 15 dakika sonunda %62, 30 dakika sonunda %51 olarak gerçekleşirken 60 dakika sonunda bu değer %10 düzeyine düşmüştür. Sıcaklığın ve ön inkübason süresinin yükseltilmesine paralel olarak stabilite giderek düşmüştür. Örneğin ön inkübasyon sıcaklığı 90ºC’ye yükseltildiğinde kalan aktivitenin 15 dakika sonunda %28, 30 dakika sonunda ise %5’e düştüğü saptanırken 60 dakikada hiç aktivite gerçekleşmemiştir. Kalan enzim aktivitesinin 15 ve 30 dakikalık ön inkübasyonlar sonunda 70ºC de %50 değerine düşmesine karşılık 60 dakikalık inkübasyon dikkate alındığında 40ºC de %45’e düştüğü saptanmıştır. Bu sonuçlara göre C-14 endoglukanaz enzimi, 70ºC’ye kadar ısısal işlemlerin kullanıldığı uygulamalarda 15 ve 30 dakika süreyle başarıyla kullanılabilme özelliği göstermektedir. Elde edilen veriler değerlendirildiği zaman enzimin, 20-70ºC aralığında termostabil olduğu görülmektedir. Endo ve ark, (2001) optimum aktivite sıcaklığı 55ºC olan alkalin endoglukanaz enzimininin, orijinal aktivitesini 40ºC 15 dakika inkübasyon sonunda %100’e yakın koruduğunu, ortam sıcaklığı 60ºC’ye yükseltildiğinde ise aktivitenin yaklaşık %50 düzeyine düştüğünü belirtmişlerdir. Optimum sıcaklığı 50oC olan Bacillus sp. KSM-S237’den izole edilen ve optimum aktivite sıcaklığı 50ºC olan endoglukanaz enziminin 10 dakikalık inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini 20ºC’de tamamen koruduğunu, 40ºC’de aktivitenin %90’a, 50ºC’de %50’ye 100ºC’de ise %30’a düştüğü bulunmuştur (Hakamada ve ark, 1997). Bacillus circulans suşundan üretilen ve optimum aktivite sıcaklığı 55ºC olan alkalin endoglukanaz enziminin, 15 dakikalık ön inkübasyon sonunda, orijinal aktivitesini 55ºC de %100 koruduğu 60ºC de ise aktivitenin %50’ye düştüğü, sıcaklığın 65ºC‘ye yükseltilmesiyle aktivitenin tamamen kaybolduğu saptanmıştır (Hakamada ve ark, 2002). C-14 alkalin endoglukanaz enziminin ön inkübasyon sıcaklık aralığı 20-60º olarak seçildiğinde orijinal aktivitesini 15 dakika sonunda ortalama %90, 30 dakika sonunda %77 ve 60 dakika sonunda %54 koruduğu saptanmıştır. Bu sonuçlara göre

104

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

C-14 endoglukanaz enzimi literatür verilerinden daha yüksek termal stabiliteye sahiptir.

4.7.5. C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesi ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün Etkisine Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enzim aktivitesine NaCl’ün etkisini saptamak amacı ile içerisinde %3.5-30 NaCl bulunan optimum pH değerine sahip substratlar kullanılarak optimum aktivite sıcaklığında standart enzim aktivitesi analizleri yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar Şekil 4.14 de gösterilmiştir.

140

130

120

110

100

90

80 R ö l a ti f E n z im A k v it e s i (%) 70

60 K 3,5 5 7,5 10 12,5 15 20 25 30 NaCl Konsantrasyonları (%)

Şekil 4.14: Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesine Etkisi

Yapılan analizler sonunda NaCl’ün bütün konsantrasyonlarda enzim aktivitesini artırdığı saptanmıştır. En yüksek aktivite %133 ile %20 tuz konsantrasyonunda elde edilirken %12.5-25 aralığındaki aktivitelerin ortalama %128 olarak gerçekleştiği bulunmuştur. NaCl konsantrasyonu %30 düzeyine çıkartıldığında ise aktivite %95 düzeyine düşmüştür. Enzim aktivitesi %15-25 aralığında ortalama %128.3 olarak gerçekleşmiştir. Optimum enzim aktivitesinin %20 (3.4M) tuz konsantrasyonunda elde edilmesi

105

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

enzim aktivitesinin yüksek NaCl düzeylerinde uyarıldığını ve enzimin halofil karakterde olduğunun kanıtıdır. C-14 endoglukanaz enziminin tuz stabilitesinin saptanması amacı ile %3-25 aralığında değişen konsantrasyonlarda NaCl çözeltileri hazırlanarak enzim optimum inkübasyon sıcaklığında (50ºC) 1 ve 6 saat ön inkübasyona bırakılmıştır. Ön inkübasyon işleminden sonra optimum pH değerinde hazırlanmış substrat kullanılarak standart aktivite analizi yapılarak kalan enzim aktivitesi saptanmıştır. Elde edilen bulgular Şekil 4.15 de gösterilmiştir.

1 saat 120 6 saat 100 80 60 40 20

K a l n E z i m A k ti v t e s ( %) 0 K 3 5 7 10 15 20 25 NaCl Konsantrasyonu (%)

Şekil.4.15: Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim Stabilitesine Etkisi

C-14 endoglukaaz enzimi 1 saatlik ön inkübasyon işleminden sonra %3-7 tuz konsantrasyonu içeren aralıkta orijinal aktivitesini ortalama %70 oranında korumuştur. Ön inkübasyon uygulaması 6 saat gerçekleştirildiği zaman, aynı konsantrasyon aralığında yaklaşık %69 kalan aktivite gözlenmiştir. Her iki sürede elde edilen kalan aktivite değerleri hemen hemen aynı düzeydedir. Tuz konsantrasyonu %10-15 aralığına 1 saatlik inkübasyon sonunda kalan aktivite %77 bulunurken, 6 saat sonunda %71.5 olarak gerçekleşmiştir.

106

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

NaCl konsantrasyonu %20’ye yükseltildiğinde kalan aktivite değerinde önemli bir yükselme meydana gelmiştir. Buna göre 1 saat sonunda %88 aktivite elde edilirken, 6 saat sonra %75’lik aktivite bulunmuştur. Özellikle 1saatlik uygulamada %3-7 aralığındaki değere göre enzimin stabilitesi %20 tuz konsantrasyonunda yaklaşık %25 oranında artmıştır. Her iki inkübasyon süresi için %25 tuz konsantrasyonunda elde edilen kalan aktivite değeri %50’nin üzerinde olup 1 saat sonunda %73, 6 saat sonunda %63 olarak saptanmıştır. Bu sonuçlara göre enzim yüksek düzeyde tuz stabil özellik göstermektedir. Bu açıdan özellikle tuz uygulamalarının fazlaca gerçekleştiği endüstriyel alanlar için oldukça kullanışlı özelliğe sahiptir. Alkalifilik Bacillus agaradhaerens’ten izole edilen endoglukanaz enziminin aktivitesi üzerine tuzların etkisini araştırmışlardır. 0.2M tuz konsantrasyonunun enzim aktivitesini 4 kat (%400) artırdığını ve 0.2-1.5 M aralığında aktivitenin sabit kaldığını, tuz konsantrasyonun artmasına paralel olarak aktivitede keskin bir düşüşün gözlendiğini belirtmişlerdir (Hirasawa ve ark, 2006). Egl-AG endoglukanaz enziminde ise konsantrasyondaki artışla birlikte aktivitenin arttığı saptanmışlardır (Hirasawa ve ark, 2006). C-14 enziminde, Hirasawa ve ark (2006)’nın bulgularına benzer sonuçlar gözlenmiştir. Enzim aktivitesi %3.5 (0.6M) NaCl konsantasyonunda %119’a yükselirken, %20 (3.45M) tuz konsantrasyonunda %133 ile en yüksek değerine ulaşmıştır. Konsantrasyon %30’a (5.17 M) yükseldiğinde ise aktivite hızla azalarak %95 değerine düşmüştür. Bununla birlikte, özellikle %15-25 (2.6-4.3M) aralığındaki tuz konsantrasyonlarında enzim aktivitesinin ortalama %128.3’e yükselmesi enzimin ekstrem halofil olduğunu göstermektedir. Rekombinant endoglukanaz enziminin Cel5A ile yapılan çalışmalarda enzimin 20 saatlik inkübasyon sonunda (3 M NaCl) orijinal aktivitesini %87 koruduğu bulunmuştur (Voget ve ark, 2006). C-14 Endolukanaz enziminin orijinal aktivitesini 3.45 M NaCl de 1 saatlik inkübasyon sonunda %87, 6 saat sonunda ise %74 oranında koruduğu saptanmıştır.

107

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Bu sonuçlar C-14 endoglukanaz enziminin aktivite açısından Egl-AG’den çok daha iyi olduğunu göstermektedir. Stabilite çalışmalarından elde edilen sonuçlar ise Cel5A ile uygunluk (1 saat için) göstermektedir. Bu sonuçlara göre C-14 endoglukanaz enziminin ekstrem halofil ve halostabil özellikte olduğu söylenebilir.

4.7.6. C-14 Endoglukaaz Enzimi Üzerine İhibitör, Şelatör, Deterjan ve Metal İyonlarının Etkisine Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enzimi üzerine metod bölümünde belirtilen konsantrasyondaki bileşikler kullanılarak uygun süreyle uygun sıcaklıkta ön inkübasyon gerçekleştirilmiş ve standart enzim aktivite analizi yapılarak kalan enzim aktivitesi saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar Çizelge.4.10 da verilmiştir.

Çizelge.4.10:C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyon ve Deterjanların Etkisine Ait Sonuçlar İnhibitörler İnhibitör Konsantrasyonu Kalan Aktivite (%) Kontrol none 100 EDTA 5mM 93.00 SDS 1% 81.00 CaCl2 5mM 132.00 Na2SO3 5mM 102.00 ZnCl2 5mM 77.00 PMSF 5mM 43.00 KCl 5mM 40.33 β-Merkaptoetanol 1% 69.00 Triton X-100 1% 52.00 Üre 8M 42.33

Enzim deterjanlardan SDS’ye %81 düzeyinde direnç gösterirken, bu oran triton X-100 de %52, β-merkaptoetanol’de %69 olarak saptanmıştır. C-14 endoglukanaz enziminin aktivitesi CaCl2 ve Na2SO3 ile artış göstermiştir. Aktivitedeki artış CaCl2 de %132, Na2SO3 ise %102 düzeyinde gerçekleşmiştir.

Buna karşılık 5 mM ZnCl2 de %77, KCl de ise %40.33 düzeyinde kalan aktivite değeri elde edilmiştir. Bir başka ifade ile ZnCl2 de yaklaşık %23 düzeyinde inhibisyon gerçekleşmiştir.

108

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Analiz edilen endoglukanaz enzimi EDTA ile %7 inhibe olurken, PMSF kullanıldığı zaman %57 oranında inibisyon gerçekleşmiştir. Üre ile yapılan analizlerde ezim aktivitesindeki inhibisyon düzeyi yaklaşık %58 olarak gerçekleşmiştir. Bütün bu özellikler enzimin, serin amino asitlerce zengin, deterjanlara oldukça dirençli, yüksek düzeyde halofil ve kısmi termofil/termostabil özellik taşıdığını göstermektedir. Buna örnek olarak PMSF ile yüksek düzeyde inhibe olurken EDTA ile önemli bir inhibisyonun gerçekleşmemesi, KCl ile önemli düzeyde inhibisyon görülmesi, SDS ve β-merkaptoetanol gibi deterjanlara yüksek düzeyde dirençlilik görülmesi, ZnCl2’ dirençli olması buna karşılık üre ile yaklaşık %60 inhibisyon gerçekleşmesini verebiliriz. Literatür bilgilerinde kalsiyumun endoglukanaz aktivitesi üzerindeki etkisinin

çok farklı yönde olduğunu göstermektedir. Örneğin, 8.4 ve 5 mM CaCl2 endoglukanaz aktivitesini inhibe ettiği belirtilmektedir (Huang ve Monk, 2004; Li ve ark, 2006).

Bazı araştırmacılar CaCl2 ün endoglkanaz aktivitesi üzerine herhangi bir etkisinin olmadığını saptamışlardır (Hakamada ve ark, 2002; Singh ve ark, 2004). Bazı araştırmalarda ise aktiviteyi artırdığı yönünde sonuçlar elde edilmiştir. Buna göre aktivite artışı sırasıyla %109 (Murashima ve ark, 2002), %108 (Saha, 2004), %140 (Han ve ark, 1995) ve %118 (Singh ve ark, 2001) olarak bulunmuştur.

C-14 Endoglukanaz enziminin orijinal aktivitesinde 5mM CaCl2 ile %131,

Na2SO3 ile %102 oranında artış meydana gelmiştir. Literatürde kalsiyumun aktiviteyi artıran etkisi enzimin substrata bağlanma isteğini artırmak ve katalitik bölgenin daha stabil hale gelmesini sağlama şeklinde açıklanmaktadır (Mansfield ve ark, 1998). Literatürde Zn+ ve K+ gibi metal iyonlarının enzim aktivitesini değişik oranlarda (sırasıyla %23 ve %60) inhibe ettiği belirtilmektedir. Murashima ve ark, (2002) Zn+ ile %73 oranında Han ve ark, (1995) % 63 oranında bir inhibisyon belirlerken Hakamada ve ark, (2002) herhangi bir inhibisyon gözlemlememişlerdir. KCl ile yapılan çalışmalarda endoglukanaz enziminde orijinal aktivitenin sırasıyla %125; %117 ve %102 düzeyinde arttığı bulunmuştur (Singh ve ark., 2001; Murashima ve ark, 2002; Singh ve ark,2004). C-14 endoglukanaz enziminde yukarda

109

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

verilen literatür verilerinden farklı olarak yaklaşık %60 düzeyinde inhibisyon gerçekleşmiştir. Halofilik enzimlerin büyük çoğunluğunun 2M’dan daha düşük KCl konsantrasyonlarında bile orijinal aktivitelerinin inhibe olduğu, aktivitedeki düşüş oranının halofilik düzeyinin göstergesi olarak ifade edildiği belirtilmektedir (Madern ve ark, 2000). C-14 endoglukanaz enziminin KCl sonuçları, enzimin halofil özellikte olduğunu kanıtlamaktadır. Literatür bulgularında EDTA ile gerçekleştirilen aktivite çalışmalarında kalan enzim aktivitesinin %90-%95 aralığında gerçekleştiği belirtilmiştir (Singh ve ark, 2001; Huang ve Monk, 2004; Li ve ark, 2006). C-14 endoglukanaz enzimi 5mM EDTA ile muamele edildiği zaman kalan enzim aktivitesi %93 bulunmuştur. Bu sonuç literatür verileri ile tam bir uyum göstermektedir. İzolasyonun geçekleştirdiğimiz C-14 endoglukanaz enzimi %1’lik SDS bulunan ortamda orijinal aktivitesini %81 oranında korumuştur. Bu sonuç literatürde verilen sonçlarla karşılaştırıldığı zaman (%34, %60 ve %0) oldukça yüksek bir dirençliliği göstermektedir (Li ve ark, 2006; Singh ve ark, 2001; Mawadza ve ark, 2000). Buna karşılık diğer araştırmacıların yaptıkları çalışmalarda endoglukanaz enziminin SDS’ye %91.5, β-Merkaptoetanol’e ise %88.7 dirençi olduğu bulunmuştur (Huang ve Monk, 2004). C-14 endoglukanaz enziminin SDS’ye %81, β- Merkaptoetanol’e %69 dirençli olması, enzimin bir çok literatür değerinden daha yüksek direçlilik gösterdiğini, bu nedenle detejanlara dirençli olduğunu göstermektedir.

4.7.7. C-14 Selülaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi

C-14 endoglukanaz enzimi %10’luk SDS-PAGE’de (%1’lik CMC içeren) yürütüldükten sonra jel iki parçaya ayrılarak, marker bölgesi Comassie Brillant Blue R-250 ile boyanırken, diğer parça renatürasyon işlemlerinden sonra aktivitenin saptanması için kongo kırmızısı ile boyanarak analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçlar Şekil 4.16 da gösterilmiştir.

110

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Şekil 4.16. C-14 Selülaz Enziminin Molekül Büyüklüğü ve Zimogram Analizi (1: C- 14 selülazın SDS-PAGE’de zimogramı, 2: Markır Albümin-66 kDa)

Elektroforetik analiz sonucunda enzime ait 61 kDa ağırlığa sahip tek bir protein bandı elde edilmiştir. Literatürde endoglukanaz enzimlerinin büyük çoğunluğunda moleküler ağırlıkların 35 kDa 85 kDa arasında değiştiği belirtilmiştir (Han ve ark,1995; Hakamada ve ark., 1997; Mawadza ve ark.,2000; Hakamada ve ark., 2002; Singh ve ark., 2001; Endo ve ark.,2001; Kim ve ark., 2005;Voget ve ark., 2006; Zvereva ve ark, 2006; Zhang ve ark, 2007). Bir başka kaynakta ise termo-asidofilik endoglukanaz (Ba-EGA) enziminin 67 kDa moleküler ağırlıkta olduğu saptanmıştır (Li ve ark, 2006). Çalışmamızda izole edilen C-14 halofil alkalin endoglukanaz enziminin moleküler ağırlığı 61 kDa olarak bulunmuştur. C-14 endoglukanaz enzimine ait moleküler ağırlık değeri literatür verileriyle uygunluk içindedir.

4.7.8. C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları

C-14 endoglukanaz enziminin ince tabaka kromatografisi analizlerine ait sonuçlar Şekil 4.17’de gösterilmiştir.

111

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Şekil 4.17. C-14 Endoglukanaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi ile Son Ürünlerinin Belirlenmesi.(G1: Glikoz; G2: Maltoz; C14 selülaz enzimi Hidroliz ürünleri; CMC: enzim ile muamele edilmemiş karboksimetil selüloz)

Analiz sonunda C-14 selülaz enziminin CMC’yi maltoz ve diğer uzun zincirli sellooligosakkaritlere (sellobioz, sellotrioz, sellotetroz gibi) parçaladığı fakat glikoza dönüştürmediği saptanmıştır. Bu konuda daha önce yapılan çalışmalarda termofilik Rhodothermus marinus’dan izole edilen endoglukanaz enzimi ile CMC’nin hidrolizi sonucu ortaya çıkan ürünlerin glikoz, sellobiyoz, sellotrioz, sellotetraoz ve sellopentaoz olduğu bulunmuştur (Hreggvidsson ve ark, 1996). Bacillus sphaericus JS1’den izole edilen endoglukanaz enziminin CMC’yi hidrolizi sonucu ouşan son ürünlerin glikoz, sellobiyoz, sellotrioz ve daha uzun zincirli sellooligosakkarit olduğu saptanmıştır (Singh ve ark, 2004). Başka bir araştırmada ise halotolerant selülaz enziminin CMC’yi hidrolizi sonunda sellobioz, sellotrioz, sellotetraoz ve diğer sellooligosakkaritlerin meydana geldiği saptanmıştır (Voget ve ark, 2006). C-14 endoglukanaz enzimin CMC’yi hidrolizasyonu sonunda maltoz, sellobioz, sellotrioz, sellotetroz gibi uzun zincirli sellooligosakkaritler açığa çıkmıştır. Bu sonuç literatür verileriyle tam bir uyum göstermektedir (Voget ve ark, 2006).

112

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

4.8. Kısmi Saflaştırılmış X-13 Ksilanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu

X-13 suşundan kısmi saflaştırma yöntemiyle elde edilen ksilanaz enziminin oalt spealt ksilan içeren katı besiyerindeki aktivite sonucu Şekil 4.18’de görülmektedir. Enzimin aktivite gösterdiği bölge sarı renkte görülürken parçalanmamış ksilanlı bölgeler, kırmızı renkte görülmektedirler. Elde edilen sonucun 50µl enzim kullanılarak 1 saatlik imkübasyon sonunda geçekleştiği göz önüne alındığında, ksilanaz enziminin oldukça aktif olduğu görülmektedir.

Şekil 4.18.Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Ksilanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu

4.8.1. X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değeri ve Aralığına Ait Sonuçlar

X-13 suşuna ait ksilanaz enziminin pH optimumunun saptanması için Sitrat- fosfat (pH 4.0-5.5); Na-fosfat (pH 6.0-8.0); Glisin-NaOH (pH 8.5-10.0) ve Borax- NaOH (pH 10.5-11.0) oluşan 4 farklı tampon sistemi kullanılmıştır. Ksilanaz enziminin pH optimumuna ait veriler Şekil 4.19’da gösterilmiştir.

113

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

100

90

80

70 60

50

40

R ö l a t i f A k v e ( %) 30

20

10

0 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pH

Şekil 4.19.X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerine Ait Sonuçlar.

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi ile gerçekleştirilen ön çalışmalardan elde edilen veriler ışığında, optimum pH analizlerinin alt sınırı diğer enzimlerden farklı olarak 4.0 şeklinde belirlenmiş ve analizler pH 4.0-12.0 aralığında gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle analizde kullanılan tampon sistemine Sitrat-fosfat (pH: 4.0-5.5) tamponu eklenmiştir. Enzimin optimum aktivite gösterdiği pH aralığı ağırlıklı olarak 4.0-7.0 arasında yer almıştır. Enzim optimum aktivitesini pH 6.0 da gösterirken, pH 5.0 te %97 aktivite gerçekleşmiştir. Bu sonuçlara göre pH 5.0-6.0 aralığında ortalama %98.5 düzeyinde aktivite varlığı söz konusudur. Asidik pH aralığı olan 4.0-7.0 değerleri arasındaki ortalama aktivite oranı %90.25 düzeyindedir. pH değerinin yükselmesiyle birlikte enzimin ativitesi hızla düşmeye başlamış ve pH 9.0 da %51 aktivite elde edilmiştir. Alkali pH ortamlarında, enzim aktivitesini önemli düzeyde kaybedip pH 10.0 da %26, pH 11.0 de %8 aktivite değerine ulaşılırken, pH 12.0 de aktivite tamamen kaybolmuştur. Bu sonuçlar X-13 ksilanaz enziminin asidik karakterde olduğunu göstermektedir.

114

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Ksilanaz enzimi ile bu güne kadar yapılan değişik çalışmalarda farklı pH optimumuna sahip sonuçlar elde edilmiştir. Örneğin, Sulfolobus solfataricus’tan izole edilen ksilanazın optimum aktivitesini pH 7.0, Humicola insolens’ten izole edilen ksilanaz pH 6.0-6.5 ve Halorhabdus utahensis’ten izole edilen ksilanazın pH

7.0’de gösterdiği saptanmıştır (Düsterhöft ve ark, 1997; WainØ ve Ingvorsen, 2003; Cannio ve ark, 2004). Optimum pH değerinin saptanmasıyla ilgili çok farklı organizmalara ait çalışmalardan değişik sonuçlar elde edilmiştir. Yaplan analizlerde Penicilliun capsulatum’dan izole edilen ksilanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 3.8, Fusarium proliferatum ksilanazının 5.0-5.5 ve Aspergillus fumigatus ksilanazının 6.0-6.5 olduğu bulunmuştur (Saha ve ark, 2002; Ryan ve ark, 2003; Anthony ve ark, 2003). Bacillus sp. suşlarından izole edilen ksilanaz enzimlerinin optimum aktivite gösterdikleri pH değerleri literatürlerde değişik şekilde (5.5, 5.6, 6.0, 6.5 ve 7.0) yer almıştır (Blanco ve ark, 1995; Pham ve ark, 1998; Dhillon ve ark, 2000; Lama ve ark, 2004; Gallardo ve ark, 2004; Avcioglu ve ark, 2005). Bu verilerin yanı sıra alkalifilik Bacillus sp. suşundan izole edilen ksilanaz enziminin optimum aktivitesini pH 8.0de gösterdiği belirtilmiştir (Kumar ve ark, 2004). Optimum aktivitesini pH 6.0 da gösteren Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi literatür verileriyle tam bir uygunluk içerisinde olup, ağırlıklı olarak asidik özellik göstermektedir. Bu özelliği dikkate alındığı zaman, özellikle kanatlı hayvan yemlerinin hazırlanması ve kağıt endüstrisinde kullanılabilecek uygun pH değerine sahip, ideal bir enzimdir.

4.8.2. X-13 Ksilanaz’ın Sıcaklık Optimumu

X-13 ksilanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerinin bulunabilmesi için enzim 20-100ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde metod bölümünde açıklanan standartlara uygun şekilde analiz gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar Şekil.4.20’de gösterilmiştir.

115

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

120

100

80

60

40

R ö l a ti f enz i m ak v it es ( %) 20

0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 İnkübasyon sıcaklığı (ºC)

Şekil 4.20. X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine ait Sonuçlar.

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi optimum aktivitesini 40ºC de göstermektedir. Enzim 20ºC de %19 aktivite gösterirken, sıcaklık 30ºC’ye yükseldiğinde aktivite %67 düzeyine çıkmıştır. İnkübasyon sıcaklığının 50-60ºC olarak uygulandığı aşamada aktivite yaklaşık %78.5’e düşse de, bu iki sıcaklık değerinde stabil bir aktivite saptanmıştır. İnkübasyon sıcaklığının yükselmesine paralel olarak aktivitede de lineer bir düşüş meydana gelmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 70, 80, 90 ve 100ºC olarak uygulandığı zaman, aktivite değerleri sırasıyla %70, %58, %45 ve %42 şeklinde saptanmıştır. En yüksek aktivite 40ºC de gerçekleşmekle birlikte enzim, 30-70ºC aralığında ortalama %78.8 aktiviteye sahiptir. Bu özellikler dikkate alındığı zaman, Bacillus sp. X-13 enziminin özellikle mezofil olmak üzere, termofil sıcaklık aralığında gerçekleştirilecek uygulamalar için ideal özellikler taşıdığı görülmektedir.

Halofilik bakterilerden elde edilen ksilanazlarda gözlenen optimum sıcaklık değerlerinin 55-90ºC arasında değiştiği belirtilmiştir (Düsterhöft ve ark, 1997; Wejse ve ark, 2003; Waino ve ark, 2003; Cannio ve ark, 2004). Mantar kasilanazlarında

116

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

elde edilen optimum aktivite değerlerinin ise 48-60ºC arasında dağılım gösterdiği bildirilmiştir (Saha ve ark, 2002; Anthony ve ark, 2003; Ryan ve ark, 2003). Değişik literatürlerde Bacillus sp. suşlarından izole edilen ksilanaz enzimlerinin optimum aktivite gösterdikleri sıcaklık değerlerinin 60-80ºC arasında olduğu bildirilmiştir (Breccia ve ark, 1998; Dhillon ve ark, 2000; Gallardo ve ark, 2004; Avcioglu ve ark, 2005). Diğer Bacillus sp. suşlarında ise daha düşük aktivite sıcaklıkları bulunmuş olup, bir çok araştırmacının çalışmalarında optimum aktivitenin 50ºC de gözlendiği saptanmıştır (Blanco ve ark, 1995; Pham ve ark, 1998; Lama ve ark, 2004; Poorna ve Prema, 2006;). Pham ve ark (1998), ise analizini geçekleştirdikleri ksilanaz enziminin en iyi aktiviteyi 40ºC de gösterdiğini bulmuşlardır. Çalışmalarımızda doğal ortamdan izole edilen Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin optimum aktivitesini 40ºC’de gösterdiği saptanmıştır. Bacillus sp. X-13 ksilaz enzimine ait sonuçlar, Pham ve ark, (1998)’nın bulguları ile tam bir uyum göstermektedir. Bu özellik enzimin tavuk yemlerinin hazırlanmasında ne kadar uygun olduğunu bir kez daha kanıtlamaktadır (Tavukların vücut sıcaklığı 40ºC civarındadır).

4.8.3. X-13 Ksilanaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Sonuçlar

X-13 ksilanaz enziminin pH stabilite analizleri için enzim, pH 3.0-10.0 arasındaki tampon çözeltilerde 15 dakika, 60 dakika ve 24 saat süreyle, 40ºC de ön inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar Şekil.4.21’ de gösterilmiştir.

117

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

110 100 90 80

70 15 dk 60 60 dk 50 24 saat 40 30

K ala n Rö lati f E zim A k ti v ite s i (%) 20 10 K 3 4 5 6 7 8 9 10 Ön İnkübasyon Gerçekleştirilen pH Değerleri

Şekil 4.21:X-13 Ksilanaz Enziminin 15 dakika, 60 dakika ve 24 Saat Ön İnkübasyon İşleminden Sonraki pH Stabilitesine Ait Sonuçlar.

Enzim 15 dakikalık ön inkübasyondan sonra özellikle pH 5.0-6.0 aralığında aktivitesini %100 korumuştur. İnkübasyon pH’sının 3.0-4.0 aralığındaki değerlerde ise kalan aktivite yaklaşık %94.5 düzeyinde korunmuştur. Ön inkübasyon pH’sının yükselmesiyle birlikte kalan enzim aktivitesinde düşme gözlenmiştir. pH 7.0’de kalan aktivite %91düzeyinde gerçekleşirken, 8.0-10.0 aralığında ortalama %85’lik aktivite saptanmıştır. Bununla birlikte özellikle pH 9.0 da kalan enzim aktivitesinin pH 8.0 e göre arttığı, pH 10.0 ise yeniden düştüğü saptanmıştır. X-13 ksilanaz enzimi 15 dakikalık ön inkübasyon uygulaması sonucunda pH 3.0- 10.0 aralığında orijinal aktivitesini ortalama %92 düzeyinde korumuştur. Ön inkübasyon süresinin 60 dakika olarak seçildiği deneyler sonucunda enzimin pH 3.0 de %81 aktivite gösterdiği bulunurken pH 4.0-6.0 aralığında yaklaşık %73.3 kalan aktivite saptanmıştır. Ön inkübasyonun 60 dakika olarak seçildiği uygulamalarda da pH 9.0 da kalan enzim aktivitesinin pH 8.0 e göre yükseldiği, pH 10.0 tekrar düştüğü görülmüştür.

118

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Enzim 60 dakikalık inkübasyon sonunda bütün pH değerleri dikkate alındığında (pH 3.0-10.0) orijinal aktivitesini yaklaşık %71.5 korumuştur. X-13 ksilanaz enziminde 24 saatlik ön inkübasyon uygulaması sonunda en yüksek kalan enzim aktivitesi pH 6.0 da %55 olarak bulunmuştur. Ezim pH 3.0 de %50 kalan aktivteye sahipken, pH 4.0-5.0 aralığında kalan aktivite değeri yaklaşık %45.5 olarak ölçülmüştür. Bu inkübasyon süresinde de pH 9.0 da kalan enzim aktivitesinde pH 8.0 e göre yükselme gerçekleşmiş, fakat pH 10.0 da aktivite tekrar düşmüştür. Ksilanaz enzimi pH 3.0-10.0 aralığındaki tampon çözeltilerde 24 saat inkübe edildiğinde başlangıç aktivitesini ortalama %44 düzeyinde korumaktadır. Ksilanaz enzimi özellikle asidik pH değerlerinde yüksek düzeyde stabilitesini korumuştur. Enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 6.0 olduğu dikkate alınırsa, elde edilen souçlar, optimum pH değeriyle tamamen uyum göstermetedir. pH 9.0 da bütün inkübasyon sürelerinde kalan aktivitenin yükselmesi, pH 8.0 ve 10.0 azda olsa düşmesi, zimogram analizinde de görüldüğü enzime ait diğer alt birimlerin sonucu olabilir (dört band gözlenmiştir). Bu sonuçlar ışığında X-13 ksilanaz enziminin, özellikle asidik pH değerlerinde 24 saat süreyle ön inkübasyon gerçekleştirildiği zaman, %50’nin üzerinde stabil olduğunu söylemek mümkündür. Bacillus circulans’dan izole edilen ksilanaz A ve Ksilanaz B enzimlerine 50ºC’de ve pH 8.0’de 10 dakika süreyle ön inkübasyon uygulandığı zaman orijinal aktivitenin %60-70 devam ettiğini belirtmişlerdir (Dhillon ve ark, 2000). B. amyloliquefaciens suşundan izole edilen ksilanaz enziminin orijinal aktivitesini pH 9.0’da %71, pH 10,0’da ise %43 oranında koruduğunu bulmuşlardır (Breccia ve ark, 1998). Gallardo ve ark, (2004) optimum ativitesini pH 6.0 ve 60ºC gösteren ksilanaz enziminin 3 saat süreyle pH 7.0 ve 50ºC de inkübe edildiği zaman, enzimin stabil kaldığını saptamışlardır. Fusarium suşundan izole edilen ksilanaz enziminin pH 5.0-7.0 aralığında 55ºC sıcaklığa kadar tamamen stabil kaldığını belirtmiştir (Saha, 2002). Halofilik bakterileriden elde edilen iki ekstrem halotolerant ksilanaz enziminlerinin pH 4-11 aralığında stabil oldukları saptanmıştır (Wejse ve ark, 2003). Bacillus sp. X-13 suşundan izole edilen ksilanaz enzimi, pH 3.0-10 aralığında 15 dakika süreyle optimum aktivite sıcaklığında inkübe edildiği zaman orijinal

119

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

aktivitesini %92, 60 dakika inkübe edildiği zaman %71.5 ve 24 saat inkübe edildiği zaman %44 koruduğu saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar literatür verilerinden (10 dakikalık uygulama dikkate alındığında) oldukça yüksek olup, enzimin geniş bir pH aralığında stabil olduğunu göstermektedir.

4.8.4. X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Sonuçlar

X-13 ksilanaz enzimin termal stabilitesini saptamak için 20-90ºC sıcaklık aralığında 15 ve 60 dakika süreyle ön inkübasyon gerçekleştirilmiş ve optimum pH değerindeki substrat kullanılarak standart aktivite tayini yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar Şekil 4.22’ de verilmiştir.

120

100

80

15 dk 60 60 dk

40

20 K a l n R ö ti f E z i m A k v it e s ( %)

0 K 20 30 40 50 60 70 80 90 Ön İnkübasyon Gerçekleştirilen Sıcaklık Değerleri (ºC )

Şekil 4.22:X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları.

Enzim 15 dakikalık ön inkübasyon sonunda 20ºC de orijinal aktivitesini %94 oranında devam ettirmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 30-40ºC seçildiğinde orijinal aktivitenin yaklaşık %70 düzeyine düştüğü saptanmıştır. İnkübasyon sıcaklığı 50ºC ye yükseltildiği zaman kalan aktivitenin %50’nin altına düştüğü bulunmuştur.

120

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Sıcaklık 90ºC ye yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesi %20 düzeyine düşmüştür. 20-40ºC’lik sıcaklık aralığında elde edilen ortalama aktivite değeri %78 olurken, 50-90ºC aralığındaki aktivite ortalama %32 düzeyinde gerçekleşmiştir. Ön inkübasyon süresi 60 dakika olarak uygulandığı zaman, 20ºC de %75 aktivite gözlenirken, 30-40ºC sıcaklık aralığında ortalama aktivite %67.5 düzeyinde gerçekleşmiştir. Ön inkübasyon sıcaklığı 50ºC’ye yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesinin %40 düzeyine düştüğü saptanmıştır. Sıcaklığın 90ºC ye yükseltilmesi sonucu kalan enzim aktivitesi %20’ye düşmüştür. 20-40ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde ortalama %70 kalan aktivite değeri saptanırken, 50-90ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde kalan enzim aktivitesi ortalama %26 olarak bulunmuştur. Enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerinin 40ºC olduğu göz önüne alınırsa, 20-40ºC aralığındaki stabilitenin optimum aktivite sıcaklığı ile uyum gösterdiği görülmektedir. Bununla birlikte 50ºC nin üzerindeki sıcaklıklarda hem 15 hemde 60 dakikalık uygulamalarda, X-13 ksilanaz enziminin stabil olmadığı bulunmuştur. Yapılan çalışmalarda ksilanaz enzimlerinin çok farklı termal stabilite profilleri gösterdikleri bulunmuştur. Bacillus amyloliquefaciens’den izole edilen ksilanaz enzimi 60ºC de 15 dakika inkübe edildiği zaman, orijinal aktivitesini %100 korurken, inkübasyon sıcaklığı 65-70ºC’ye yükseltildiğinde aktivitenin %50’nin altına düştüğü saptanmıştır (Breccia ve ark,1998). Aspergillus fumigatus ile yapılan çalışmalarda izole edilen ksilanaz enzimi ile 40ºC’lık sıcaklıkta 30 dakika ön inkübasyon uygulandığında orijinal aktivitenin %100’e yakın korunduğu, inkübasyon sıcaklığı 60ºC ‘ye yükseltildiğinde ise 10 dakikalık uygulama sonunda aktivitenin %50’nin altına düştüğü saptanmıştır (Anthony ve ark, 2003). Sa-Pereira ve ark, (2002) Bacillus subtilis’ten izole edilen ksilanaz enziminin 20 dakikalık inkübasyon sonunda 60ºC sıcaklığa kadar orijnal aktivitesin %60’ın üzerinde koruduğunu, sıcaklığın yüksetilmesiyle birlikte aktivitenin %40’ların altına düştüğünü bulmuşlardır.

121

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Bacillus sp.Bp-7 suşundan üretilen ksilanaz enziminin pH 7.0 ve 50ºC sıcaklıkta 3 saat süreyle stabil kaldığını bulmuşlardır (Gallardo ve ark, 2004). Yang ve ark (1995)’nın yaptığı çalışmada Bacillus sp. V1-4 suşundan izole edilen ksilanaz enziminin 50ºC ve pH 9.0’da 30 dakikalık inkübasyon sonuda orijinal aktivitesini %95 koruduğunu bildirmişlerdir. Bacillus pumilus’a ait ksilanaz enziminin 40ºC ‘ye kadarki sıcaklıklarda aktivitesini 1 saat süreyle koruduğu, 60ºC de ise aktivitenin %30 düzeyine düştüğü bulunmuştur (Poorna ve Prema, 2006). Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi 20-40ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde 60 dakika süreyle orijinal aktivtesini ortalama %70 oranında korurken, 50-90ºC aralığındaki sıcaklıklarda aktivite ortalama %26 düzeyine düşmüştür. Bu sonuçlar Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin optimum aktivite sıcaklığında termostabil olduğunu göstermektedir.

4.8.5. X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün Etkisine Ait Sonuçlar

X-13 ksilanaz enzim aktivite ve stabilitesi üzerine NaCl’ün etkisini saptamak amacıyla enzim değişik tuz konsantrasyonlarında (%3-25) 1 ve 6 saat süreyle ön inkübasyona tabi tutulmuştur. Ön inkübasyon işleminden sonra optimum aktivite sıcaklığı ve pH değerinde standart enzim aktivitesi saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar Şekil.4.23’ de gösterilmiştir.

122

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

110

100

90

80 1 Saat 70 6 saat 60

50 K a l an R ö ti f E nz i m A k v it es ( %) 40

30 K 3 5 7 10 15 20 25 Ön İnkbasyon yapılan NaCl Konsantrasyonu (%)

Şekil.4.23: X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün Etkisine Ait Sonuçlar.

Ksilanaz enziminin 1 saatlik ön inkübasyon uygulaması sonunda %3-20 aralığındaki tuz konsantrasyonlarında kalan enzim aktivitesi ortalama %91 olarak gerçekleşmiştir. En yüksek kalan enzim aktivitesi değeri %97 ile %3 tuz konsantrasyonunda gerçekleşirken, %3-7 aralığında ortalama %93.3 kalan enzim aktivitesi saptanmıştır. Enzim %3-25 aralığındaki tuz konsantrasyonuna 1 saatlik ön inkübasyon sonunda ortalama %89 direnç göstermiştir. Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin ön inkübasyon süresi 6 saat olarak uygulandığı zaman en yüksek kalan enzim aktivitesi %3 tuz konsantrasyonunda elde edilmiştir. %3-20 aralığındaki tuz konsantrasyonlarında kalan enzim ativitesi ortalama %74.3 düzeyinde gerçekleşmiştir. %25’lik tuz konsantrasyonu ve 6 saat ön inkübasyon sonundaki kalan aktivite yaklaşık %64 düzeyinde gerçekleşmiştir. Bütün tuz konsantrasyonları dikkate alındığında (%3-25) elde edilen kalan aktivite ortalama %73 olarak bulunmuştur. Her iki inkübasyon süresi sonunda da ksilanaz enziminin %3-25 tuz konsantrasyonlarında %73’ün üzerinde aktivite gösterdiği saptanmıştır.

123

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Ekstrem halofilik Halorhabdus utahensis suşundan izole edilen β-ksilanaz enziminin %5-15 NaCl konsantrasyonunda optimum aktivite gösterdiğini saptamışlardır. β-ksilanaz enzimi orijinal aktivitesinin %20 NaCl bulunan ortamda

24 saatlik inkübasyon sonucunda yaklaşık %53’e düştüğü bulunmuştur (WainØ ve Ingvorsen, 2003). Bir başka çalışmada, halofilik bakteriden izole edilen ksilanaz-1 ve ksilanaz-2 enzimlerinin en yüksek aktiviteyi 1M NaCl konsantrasyonunda, 50ºC ve pH 6.0’da gösterdiği saptanmıştır. Ksilanaz-1 enziminin aktivitesi 1-2M NaCl aralığında %100’den %54’e hızlı bir düşüş göstermiştir. NaCl konsantrasyonu 2’den 5 M’a yükseltildiğinde ksilanaz-2 enziminde aktivitenin %31’e düştüğü saptanmıştır. Analiz edile enzimlerden ksilanaz-1’in 4M NaCl konsantrasyonunda optimum aktiviteyi 60ºC de, ksilanaz-2 ‘nin ise 65ºC ‘de gösterdiği bulunmuştur (Wejse ve ark, 2003). Çalışmada analiz edilen X-13 ksilanaz enzimin 1 saatlik inübasyon sonunda %3-20 NaCl konsantrasyonunda, orijinal aktivitesi yaklaşık %91, 6 saatlik inkübasyon sonunda ise %74 oranında korunmuştur. Bu sonuçlar enzimin halofil olduğunu göstermektedir. Halofilik özellik göstermeyen enzimler yüksek tuz konsantrasyonlarında genellikle presipite olup inaktif hale gelirken, aynı durum halofillerde düşük tuz konsatrasyonlarında ortaya çıkmaktadır (Ryu ve ark,1994; Madern ve ark, 2000; Wright ve ark, 2002). Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin pH optimumu ve pH stabilitesinin asidik bölgede gerçekleşmesi, literatür bulgularıyla uyumluluk göstermektedir. Enzimin halofilik özelliği hemiselüloz parçalanmasıyla ilgili çalışmalarda, polisakkaridlerin hidrolizi ve karbonhidrat üretimi ile kanatlı hayvan yemlerinin verimliliklerinin artırılması alanlarında öncelikli olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

124

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

4.8.6. X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi

X-13 ksilanaz enzimin aktivitesi üzerine deterjan, şelatör, metal iyonu ve inhibitör maddelerin etkisini saptamak için enzim 15 dakika ve 60 dakika olmak üzere iki farklı süre ile ön inkübasyona tabii tutulmuştur. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.11’de gösterilmiştir.

Çizelge 4.11:X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi İnhibitör İnhibitörler Kalan aktivite (%) * Kalan aktivite (%)** Konsantrasyonu Kontrol Yok 100.00 100.00 EDTA 5mM 89.31 84.40 SDS 1% 69.00 62.00 Triton X-100 1% 86.00 80.24 CaCl2 5mM 99.00 86.00 ZnCl2 5mM 94.00 82.24 KCl 5mM 95.00 82.00 Na2SO3 5mM 92.34 83.14 PMSF 5mM 89.31 80.14 β-Merkaptoetanol 1% 94.00 82.34 Üre 8M 38.20 28.30 *: 15 dakika ön inkübasyon; **:60 dakika ön inkübasyon

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi EDTA ile kısmen inaktive olurken, orijinal enzim aktivitesi 15 dakika da yaklaşık %89, 60 dakikada %84 korunmuştur. İzole edilen ksilanaz enzimi 15 dakikalık ön inkübasyon sonunda bütün metal iyonlarına karşı oldukça yüksek direnç göstermiştir. Kalan enzim aktivitesi CaCl2 de %99,

ZnCl2 de %94, Na2SO3 de ise %92 düzeyinde geçekleşmiştir. Aynı metaller kullanılarak ön inkübasyon süresi 60 dakikaya yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesi bütün metal iyonlarında yaklaşık %11 düzeyinde düşüş göstermiştir. Elde edilen kalan aktivite değerleri CaCl2 de %86, ZnCl2 de %82,

Na2SO3 de ise %83 olarak saptanmıştır. Metal iyonlarında 15 dakikalık ön inkübasyon sonunda ortalama %5 inhibisyon meydana gelirken, 60 dakika sonundaki inhibisyon oranı yaklaşık %16 olarak gerçekleşmiştir.

125

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

KCl kullanılan analizlerde diğer metal iyonlarındakilere benzer sonuçlar alınmıştır. İnkübasyon süresi 15 dakika olduğunda %5 inhibisyon gerçekleşirken, 60 dakikada %17 inhibisyon meydana gelmiştir. Bütün bu sonuçlar enzimin 15 dakikalık ön inkübasyon süresinde metal iyonlarına ve şelatörlere yüksek düzeyde dirençli olduğunu göstermektedir. Deterjanlar arasında en yüksek dirençlilik %94 ile β-merkaptoetanol’de saptanırken bunu sırasıyla %86 ile triton X-100 ve %69 ile SDS izlemiştir. İnkübasyon süresi 60 dakika’ya yükseltildiğinde dirençlilik %80 düzeyine düşse de deterjanların sırasında değişme meydana gelmemiştir. En yüksek dirençlilik %82 ile β-merkaptoetanol’de gözlenirken bunu %80 ile triton X-100 ve %62 ile SDS izlemiştir. Sonuçlardan da görülebileceği gibi özellikle β-merkaptoetanol ve triton X- 100’e karşı önemli düzeyde direçlilik söz konusudur. PMSF kullanılan çalışmalarda kalan enzim aktivitesi 15 dakika %89, 60 dakika %80 olarak bulunmuştur. Enzim PMSF ile her iki sürede de kısmen inhibe olmuştur. Üre kullanılan çalışmalarda kalan enzim aktivitesi diğer ajanlara göre daha fazla düşmüştür. Buna göre orijinal enzim aktivitesi 15 dakikada %38, 60 dakikada %28 düzeyine düşmüştür. Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin şelatör, metal iyonları, deterjanlar ve inhibitörlere karşı (üre hariç) önemli düzeyde dirençli olduğu söylenebilir. Yapılan çalışmalarda ksilanaz enzimlerinin EDTA ile muamele edildiği zaman aktivitenin etkilenmediği veya arttığı yönünde bulgular saptanmıştır (Düsterhöft ve ark, 1997; Breccia ve ark, 1998; Wejse ve ark, 2003; Anthony ve ark, 2003; Lama ve ark, 2004). Bazı araştırmacılar ise EDTA kullanıldığı zaman aktivitenin düştüğünü saptamışlardır (Saha, 2002; Sa-Pereira, 2002).

Bazı araştırmacılar CaCl2 ile enzim aktivitesinde artış saptamalarına rağmen, genellikle divalent katyonların ksilanaz aktivitesi için gerekli olmadığını belirtmişlerdir (Wejse ve ark, 2003; Saha, 2002). Bununla birlikte yapılan bazı çalışmalarda aktivitenin inhibe olduğu yönünde sonuçlar elde edilmiştir (Breccia ve ark, 1998; Sa-Pereira ve ark, 1998; Heck ve ark, 2004). Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi orijnal aktivitesini 5 mM EDTA ile 15 dakikada %89, 60 dakikada %84 devam ettirmiştir. X-13 enzimine ait bu sonuçlar

126

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

literatür değerleriyle uygunluk göstemektedir. Lama ve ark, (2004) karakterizasyon

çalışması gerçekleştirdikleri ksilanaz enziminde CaCl2 ile aktivitede artış veya inhibisyon gerçekleşmediğini belirtmişlerdir. Diğer taraftan 1mM SDS kullanılan çalışmalarda aktivitede %5’lik inhibisyon gerçekleştiği bulunmuştur (Lama ve ark, 2004). Bir diğer çalışmada, halofil bakteriden elde edilen halotolerant ksilanaz-1 enziminin orijinal aktivitesini 1 mM SDS ile %60 koruduğu belirtilmektedir (Wejse ve ark, 2003). Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminde %1 SDS kullanılan çalışmalarda 15 dakikada %69, 60 dakikada %62 kalan aktivite elde edilmiştir. Bu sonuç literatürde belirtilen enzime göre, X-13 enziminin daha dirençli olduğunu göstermektedir.

ZnCl2 (1 mM) ile yapılan çalışmalarda ksilanaz-1 enziminde %57, ksilanaz-2 enziminde %39 oranında inhibisyon gerçekleştiğini saptamışlardır (Wejse ve ark, 2003). Çalışmamızda analizini gerçekleştirdiğimiz Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminde 5 mM ZnCl2 ile 15 dakikalık inkübasyon sonunda orijinal aktivitenin yaklaşık %14, 60 dakika sonunda %18 inhibe olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlara göre Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi, ZnCl2’e literatür verilerinden çok daha yüksek düzeyde dirençlidir. Halofil bakteriden elde edilen ksilanaz-1 enzimi 1 mM β-Merkaptoetanol ile muamele edildiğinde enzim %95 direnç göstermiştir (Wejse ve ark, 2003). Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi 5 mM β-Merkaptoetanol ile 15 dakikalık inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini %94 korumuştur. Bu açıdan literatür verisi ile tam bir uyum görülmektedir. Halotolerant ksilanaz enziminin orijinal aktivitesini 1 mM PMSF’de %99, 10 mM’ da ise %76 koruduğu saptanmıştır. Üre ile yapılan analizlerde ise orijinal aktivitenin 1mM’da %81 korunduğu bulunmuştur (Wejse ve ark, 2003). Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi 5 mM PMSF ile 15 dakikalık inkübasyon sonunda orijial aktivitesini %89, 60 dakikada %80 korumuştur. Bu sonuç literatürle uygunluk göstermektedir. Diğer taraftan Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin 8M üre kullanılan çaışmalarda 15 dakika sonunda orijinal aktivitesini %38, 60 dakika sonunda %28 koruduğu saptanmıştır.

127

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

4.8.7. X-13 Ksilanaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi Bulguları

Bacillus sp.X-13 ksilanaz enziminin zimogram analizi %10’luk homojen SDS-PAGE (%1’lik ksilan içeren) sisteminde gerçekleştirilmiştir. Elektroforez uygulamasından sonra jel iki parçaya bölünerek, parçalardan birisi moleküler ağırlık saptaması için Comassie Blue R250 ile boyanmıştır. Diğer parça enzim aktivitesinin saptanması amacıyla renatürasyon işlemlerinde kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar Şekil 4.24’ de gösterilmiştir.

Şekil 4.24. X-13 Ksilanaz Enzimi Zimogram Analizi Sonuçları (1: X-13 Ksilanazın SDS-PAGE’de Zimogramı 2: Markır Sığır Albümin-66 kDa)

Zimogram analizi sonucunda Bacillus sp.X-13 ksilanaz enzimin, moleküler ağırlıkları 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kDa olan dört alt birimden meydana geldiği saptanmıştır. Literatürde Penicillium capsulatum ve Fusarium proliferatum organizmalarından izole edilen ksilanazlar enzimlerinin 22-22.4 kDa ağırlığa sahip oldukları, buna karşılık Aspergillus fumigatus mantarından elde edilen enzimin moleküler ağırlıkları 212-253 kDa arasında değişen 4 alt birimden meydana geldiği bulunmuştur (Ryan ve ark, 2003; Saha, 2002). Farklı Bacillus sp. izolatlarından moleküler ağırlıkları 24-45 kDa arasında değişen ksilanaz enzimlerinin izole edildiği belirtilmiştir (Lama ve ark, 2004; Gallardo ve ark, 2003; Blanco ve ark, 1995). Bacillus circulans suşundan üretilen

128

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

ksilanaz enziminin moleküler ağırlıkları 22 ve 30 kDa olan iki at birimden meydana geldiğini bulunmuştur (Dhillon ve ark, 2000) . Bacillus firmus suşundan izole edilen ksilanaz enziminin 18.4 ve 19.6 kDa, Bacillus amyloliquefaciens ksilanaz enziminin ise 23 ve 45 kDa ağırlığa sahip iki alt birimden meydana geldiği bulunmuştur (Tseng ve ark, 2002; Breccia ve ark, 1998; Lopez ve ark, 1998). Ekstrem halofilik archaeon Halorhabdus utahensis organizmasından izole edilen β-ksilanaz enzimi 45 kDa, β-ksilosidaz enzimi ise 67 kDa moleküler ağırlığa sahiptir (WainØ ve Ingvorsen, 2003). Halophilic bakteriden izole edilen ekstrem halotolerant ksilanaz-1 ve ksilanaz-2 enzimlerinin moleküler ağırlıkları sırası ile 43 ve 62 kDa olarak bulunmuştur (Wejse ve ark, 2003). Bacillus sp. X-13 suşundan izole ettiğimiz halofil ksilanaz enziminin, moleküler ağırlıkları 68.5-108.4 kDa arasında değişen 4 alt birimden meydana geldiği bulunmuştur.

4.8.8. X-13 Ksilanaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları

Enzim substrat karışımının optimum aktivite sıcaklığında 1 saatlik inkübasyonu sonucu açığa çıkan hidroliz ürünlerinin ince tabaka kromatografisi sonuçları Şekil 4.25’de gösterilmiştir.

Şekil 4.25. X-13 Ksilanaz Enziminin Hidroliz Ürünlerne ait Bulgular

129

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

Gerçekleştirilen analiz sonucunda enzimin hidroliz ürünleri arasında ortaya çıkan en önemli ürünün, bandın yoğunluğundan da görüldüğü gibi ksiloz olduğu saptanmıştır. Ayrıca reaksiyon ürünleri arasında konsantrasyonları farklı olan ve kromatografi ortamında bir birinden belirgin şekilde ayrılmış çok sayıda uzun zincirli ksilo-oigosakkarit ürünlerinin açığa çıktığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar enzimin yüksek düzeyde aktif olduğunu ve ksilanaz endüstrisinde önemli bir yer edinebileceğini göstermektedir. Alkali tolerant özellik gösteren Bacillus sp. suşuna ait ksilanaz enzimi, substrat ile 1 saat inkübe edildiğinde ortaya çıkan hidroliz ürünlerinin ksilotrioz ve daha uzun zincirli ksilo-oligosakkaritler olduğu bulunmuştur. Enzim 3 saat inkübe edildiğinde ise ksilobiyoz ve uzun zincirli ksilooligosakkaritlerin meydana geldiği gözlenmiştir (Lopez ve ark, 1998). Bacillus halodurans organizmasından elde edilen ksilanaz enzimi huş agacı ksilanı ile inkübasyona bırakıldığında, 6 saat sonunda ksilobiyoz, 24 saat sonunda ise çok az ksiloz açığa çıktığı saptanmıştır (Mamo ve ark, 2006). Halofilik bakteri suşundan elde edilen halotolerant ksilanaz enzimlerinin ksilanı ksilobiyoz ve ksilotrioza parçaladıkları saptanmıştır (Wejse ve ark, 2003). Tanaka ve ark (2005), Penicillium citrinum ksilanazının huş ağacı ksilanını 1 saatlik inkübasyon sonunda çok az miktarda ksiloz ve diğer ksilo-oligosakkaritlere, 48 saatlik inkübasyon sonunda ise önemli miktarda ksilobiyoz, ksiloz ve diğer ksilo- oligosakkaritlere hidroliz ettiğini bulmuşlardır. Alkalifilik Bacillus sp. suşundan izole edilen ksilanaz enzimi 3 saatlik inkübasyon sonunda ortamdaki ksilanı ksilobiyoz ve daha uzun zincirli ksilo-oligosakkaritlere dönüştürmüştür (Li ve ark, 2006). Bacillus sp. X-13 suşundan izole edilen halofil ksilanaz enzimi oalt spealt ksilanı pH 6.0 ve 40˚C’de 1 saatlik inkübasyon sonunda, önemli miktarda ksiloz, farklı konsantrasyonda ve çok sayıda ksilotrioz ve ksilotetrozdan oluşan uzun zincirli ksilooligosakkaritlere hidroliz etmiştir. Enzimin hidroliz ürünleri dikkate alındığında, literatürde belirtilen farklı organizmalara ait ksilanaz enzimlerinden daha yüksek aktiviteye sahip olduğu görülmektedir. Enzim, bu özellikleri ile özellikle besin

130

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

endüstrisi alanında, prebiyotiklerin üretiminde öncelikle kullanılabilecek özelliğe sahiptir.

131

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER

Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle mikroorganizma kaynaklıdırlar. Bunun nedeni mikroorganizma kökenli enzimlerin, bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, ekstrem koşullarda aktivite gösterebilmeleri ve büyük boyutlarda üretilebilmeleridir. Yüksek bitkilerin vakuollerde artık ürünler olarak, bir tür enzim inhibitörleri ve/veya toksik karakterli maddeleri depoladıkları bilinmektedir. Bitkilerden enzim elde edilmesi sırasında bu yapılar ürüne karıştıkları için, bitki enzimleri, endüstri ve klinikte enzim kaynağı olarak tercih edilmemektedirler (Wiseman, 1987). Her ne kadar mikrobiyal enzimlerin kullanımı için yukarıda belirtildiği gibi çok geçerli nedenler varsa da, her mikrobiyal enzim endüstriyel alanda kullanılmamaktadır. Endüstride kullanılan enzimlerin, bir ürünün üretilmesinde bazı avantajlara sahip olması gerekmektedir. Buna göre, bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi maliyet bakımından ucuz olması, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması ve en önemlisi de enzimin alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olmasına bağlıdır (Wiseman, 1987). Bugüne kadar 2000’den fazla enzim tanımlanmış ve bunlardan yaklaşık 100 tanesi ticari olarak kullanıma uygun bulunmuştur. Fakat günümüzde bunlardan sadece 18 tanesi endüstriyel amaçla üretilmektedir (Zeman ve McCrea, 1985). Biyoteknoloji kaynaklı çalışmalar A.B.D. de odaklanmış olmakla birlikte, günümüzde, Japonya ve Kanada, biyoteknolojiyi (özellikle moleküler biyoteknolojiyi) stratejik alan kategorisinde değerlendirerek, özel şirketlerin yanı sıra, hükümetler düzeyinde destekleme ve geliştirme kararı almışlardır (Glick ve Pasternak, 1994). Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle, biyoteknolojinin endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar, daha da önem

133

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

kazanmaktadır. Özellikle birkaç ülke dışındaki diğer ülkeler bu konuda tamamen dışa bağımlı durumdadırlar. Endüstride faydalı olan ve ticari olarak kullanılan enzimlerin bazı avantajlara sahip olması gerekmektedir. Buna göre bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi için, işlem maliyeti bakımından ucuz olması, fiziksel ve kimyasal koşullara bağlı olmadan aktivitesini en yüksek düzeyde koruması ve mümkün olan en uzun süreyle sürdürmesi, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması, allerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olması gerekir (Sarıkaya, 1995). Endüstriyel alanda kullanılan enzimler bitkisel, hayvansal ve mikroorganizma kökenli olmakla birlikte ağırlıklı olarak mikroorganizmalardan izole edilmektedirler. Bunun nedeni, mikroorganizma kaynaklı enzimlerin katalitik aktivitelerinin yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve daha ucuz olmaları, büyük boyutlarda ve yüksek saflıkta elde edilmesi gibi avantajlara sahip olmasıdır. Örneğin mikrobiyal enzimler ekstrem sıcaklık ve pH değerlerinde çok yüksek düzeyde aktivite gösterirler (Wiseman, 1987; Horikoshi, 1999). Endüstride yaygın şekilde kullanılan enzimler arasında Bacillus cinsine ait tür ve alttürleri tarafından sentezlenen ondan fazla enzim vardır. Örneğin ticari olarak üretilen ve kullanılan termostabil amilaz enzimlerinin üretilmelerinde B. amyloliquefaciens ve B. licheniformis en çok kullanılan iki Bacillus türüdür (Lin ve ark, 1998). Bacillus sp. suşları, proteolitik enzimler ve karbohidratazların önemli bir kaynağını oluşturmaktadırlar. Örneğin α-amilaz enzimi Bacillus sp. grubunda oldukça yaygın şekilde bulunur ve başlıca, gıda endüstrisinde nişastanın maltoza hidrolize edilmesi, maltoz şuruplarının hazırlanması ile ekmek ve bira üretiminde kullanılmaktadır. Ekstremofilik organizmalar yüksek sıcaklık, ekstrem pH, yüksek tuz konsantrasyonu ve yüksek basınç gibi ekolojik koşullara uyum sağlamış organizmalardır. Bu mikroorganizmalar, ekstrem koşullar altında fonksiyonel olan biyokatalistik ürünler sentezlemektedirler. Sentezledikleri ürünler arasında amilaz,

134

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

pullulanaz, selülaz, ksilanaz, kitinaz, proteazlar, esterazlar, glikoizomerazlar, alkoldehidrojenazlar ve DNA modifiye eden enzimler ilk sayılabileceklerdir. Bu enzimler gıdadan tekstile, ekmekten deterjana, içecek üretiminden saflaştırmasına, yenilenebilir enerji kaynaklarından alkol üretimine ve kimya endüstrisinden farmasötik alanına kadar çok yaygın bir yelpazede, belki de en önemlisi bir çok farklı uygulamalarla tedavide kullanım alanı bulmuşlardır (Niehaus ve ark, 1999). Alkalifilik özellikteki organizmalar, prokaryot, eukaryot ve archea grubu içerisinde yer almaktadırlar. Alkalifiller arasında çok değişik taksonomik gruplar olmakla birlikte, bunların bazıları taksonomiye yeni girmişlerdir. Alkalifiller, bahçe toprağı gibi normal çevresel ortamlardan izole edilebileceği gibi, yüksek alkalik özellik gösteren topraklardan da izole edilebilirler. Alkalofilik enzimler endüstriyel uygulamalarda büyük öneme sahiptirler. Alkalin selülaz, alkalin proteaz ve alkalin amilaz gibi alkalofilik organizmalardan izole edilen enzimler, çeşitli deterjanların içerisine karıştırılmışlar ve biyolojik deterjanlar şeklinde tanımlanmışlardır. Dünyada üretilen toplam alkalifilik enzimlerin %30 dan büyük kısmı çamaşır deterjanları içerisine karıştırılarak değerlendirilmektedir. (Horikoshi, 1996). Alkalifilik amilaz, selülaz ve proteazlar aynı zamanda endüstrinin diğer birçok alanında da yoğun şekilde değerlendirilmektedirler. Bunlar arasında, dericilik, tekstil, gıda endüstrisi, içecek endüstrisi, ekmek ve pasta ürünleri, çeşitli soya ürünlerinin üretimi, protein hidrolizatlarının tatlandırılması, farmasötik endüstrisi ve tıbbi uygulamalar, kimya endüstrisi, atıkların temizlenmesi, nişastadan etanol üretimi gibi kendi içlerinde birer endüstri olan çok değişik alanlar vardır (Rao ve ark, 1998; Igarashi ve ark, 1998; Kumar ve Takagi, 1999). Mikrobiyal enzimlerin dünya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığı zaman, alkalin proteaz %25, diğer proteazlar %21, Amilaz %18, Renin %10, Trypsin %3, Lipaz %3, diğer karbonhidrat parçalayan enzimler (selülaz ve ksilanaz gibi) %10, analitik ve farmasötik enzimler %10 şeklinde bir dağılımla karşılaşılmaktadır (Rao ve ark, 1998).

135

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

Halofil organizmalar, halofil, moderately halofil ve ekstrem halofil olmak üzere genel olarak üç grup içerisinde toplanmaktadırlar. Bu gruptaki mikroorganizmalar archea adı verilen grup içerisinde değerlendirilirler ve yüksek tuz içeren çevre koşullarında yaşamaya uyum sağlamışlardır. Orta düzeyde halofil organizmaların optimum üreyebildikleri tuz konsantrasyonu %3 ile %15 aralığında değişiklik gösterir (Ventosa ve ark, 1998). Halofil organizmalar özellikle soda gölleri, çöller ve tuzlu yiyecekler gibi tuz içeren çok değişik habitatlarda bulunmaktadırlar (Ventosa ve ark, 1998). Alkalin, halofil ve termofil özellik gösteren extremophile mikroorganizmaların enzim üretim alanında mikrobiyal fabrikalar şeklinde kullanılacakları ve bu şekilde adlandırılacakları belirtilmektedir (Aguilar ve ark, 1998). Halofilik mikroorganizmalar arasında özellikle gram negatifler ile çalışılmıştır. Gram pozitifler ise bu alanda henüz yeni araştırılmaya başlanmış organizmalardır. Ekstrem olarak adlandırılan birçok mikroorganizma adaptasyon gösterdikleri ortam koşullarına bağlı olarak çeşitli özelliklere sahiptirler. Bu nedenle bu organizmaların biyoteknolojik ve ticari önemleri oldukça yüksektir. Halofil mikroorganizmalar arasında Halobacillus halophilus (Spring ve ark, 1996), Marinococcus halophilus (Marquez ve ark, 1992), ve Bacillus halophilus (Ventosa ve ark, 1998) en fazla bilinen organizmalardır. Halofil organizmaların sentezlediği ürünler arasında bakteriorodopsin, Ektoin, amilaz, lipaz, selülaz, proteaz, biyosürfaktanlar, lektinler ve biyoplastikler en önemlileridir (Adams ve Kelly, 1995; Banat ve ark, 2000). Halotolerant veya halofilik mikroorganizmalar tuz içeren çevresel ortamlarda üreyebildikleri için biyoteknolojinin değişik alanlarında ve güncel uygulamalar için potansiyel oluşturmaktadırlar. Halofillerden elde edilen bakteriyel rodopsin uzaysal ışık modülatörleri, optik hafızalar, optik bilgisayarlar ve optik holograf teknoloji alanlarında kullanılmaktadır. Halotolerant mikroorganizmalar fermente gıda ve gıda katkı maddelerinin üretimi için gıda biyoteknolojisinde temel bir rol oynamaktadır. Değişik organik kirleticilerin transformasyonu veya parçalanmasında ve alternatif enerji üretim alanlarında halofil mikroorganizmalar kilit bir öneme sahiptirler (Margesin ve Schinner, 2005).

136

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

Endüstriyel öneminin ve kullanımının yaygın olması nedeniyle çalışmamızda Van soda gölünden izole edilen ve mezofil ortamda üreyebilen Bacillus sp. suşları izole edilerek analizleri gerçekleştirilmiştir. Çalışmalarımızda Van soda gölünden izole edilen doğal Bacillus sp. AB-17, Bacillus sp. C-14 ve Ardıçlı Köyü/Tarsus’tan izolasyonu gerçekleştirilerek Bacillus sp. X-13 şeklinde adlandırılan amilaz, selülaz ve ksilanaz enzimi üretme yeteneğine sahip üç bakteri suşu kullanılmıştır. Organizmalar, ilk izolasyon aşaması gerçekleştirildikten sonra saf kültür ve biyokimyasal analizler yapılarak Bacillus sp. şeklinde adlandırılmışlardır. Seçilen suşlar, geniş, beyaz renkli ve dalgalı kenarlı koloni morfolojisine sahiptirler. Suşlar gram pozitif, aerob, spor oluşturan, çubuk şekilli ve hareketli bakterilerdir. Glikoz, ksiloz ve mannitolü asit oluşturarak parçalamakta ve katalaz pozitif özellik göstermektedirler. Koloni morfolojileri ve diğer özelliklerine göre seçilen suşlar Bacillus sp. şeklinde tanımlanmışlardır. Tanımlama çalışmalarından sonra her üç suş için birinci aşamada, içerisinde uygun substrat bulunan katı besiyerleri kullanılarak farklı sıcaklık ve pH değerlerinde üreme ve enzim sentezleme özelliklerinin saptanması için analizler yapılmıştır. Bacillus sp. AB-17 suşu pH:7.0-12.5 arasında üreme göstermekle birlikte pH 9.0-10.0 aralığında optimum değer elde edilmiştir. Analiz edilen pH değerlerinden 7.0-12.0 aralığında enzim sentezi gerçekleştiği bulunmuştur. Özellikle pH 7.5-10.0 aralığında 14 mm’lik aktivite zon çapına ulaşılırken, optimum sentez (18 mm aktivite zon çapı ile) pH 9.5 de gözlenmiştir. Horikoshi (1999), pH 8.5’in üzerinde bakteri üremesi ve enzim sentezinin gerçekleşmesinin alkali organizmaların en büyük özellikleri olduğunu bildirmiştir. Bacillus sp.AB-17 suşu 4 mm’lik koloni çapı ile 25 ve 37 oC arasında optimum üreme gösterirken, sadece 25 ve 37 oC’lerde aktivite zonu saptanmıştır. Optimum zon oluşumu ise 17 mm ile 37 oC de gerçekleşmiştir. Bacillus sp AB-17 suşu %3-%15 aralığındaki NaCl konsantrasyonlarında üreme gösterirken, %20 NaCl’lü ortamda üreme saptanmamıştır. Optimum üreme 4 mm koloni çapı ile %10 NaCl’lü ortamda gerçekleşmiştir. Optimum enzim üretimi 18 mm

137

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

zon çapı ile %7’lik NaCl’lü ortamda görülürken, %3, %5 ve %7 NaCl içeren ortamlarda 14 mm, %13 NaCl’lü ortamda ise 6 mm zon çapı elde edilmiştir. Bacillus sp AB-17 suşu ie katı besiyeri çalışmalarından elde edilen bu sonuçlar, bakteri suşunun mezofil, orta düzeyde halofil ve alkali özellik gösterdiğini kanıtlamaktadır. Bacillus sp. C-14 suşunun pH 6.5-12.0 aralığında ürediği, optimum üremenin 16 mm ile pH 8.5 de gerçekleştiği bulunmuştur. Enzim sentezi pH 7.0-11.5 aralığında gerçekleşirken 16-7 mm arasında zon çapı elde edilmiştir. Optimum aktivite zonu ise 24 mm ile pH 8.5 ve 9.5’te gerçekleşirken, pH 7.5-9.5 aralığında ise ortalama 23 mm aktivite zonu gözlenmiştir. Bacillus sp. C-14 suşu, test edilen sıcaklık aralıklarında (25-50ºC aralığında) 9-6 mm koloni çapı oluşturarak üremiştir. Bacillus sp. C-14 suşunun optimum üremesi 10 mm koloni çapı ile 37ºC de gerçekleşirken, 25ºC de 9 mm, 45ºC de ise 8 mm’lik koloni oluşumu saptanmıştır. Aynı sıcaklık değerlerinin kullanıldığı enzim sentezleme çalışmalarında optimum sentezin 22 mm aktivite zonu ile 37ºC de gerçekleştiği saptanmıştır. Bacillus sp. C-14 suşu, optimum üreme ve enzim sentezleme yeteneği dikkate alındığında mezofil ve alkalin özellik göstermektedir. Bununla birlikte, suşun 25ºC de 9 mm çapında koloni ve 11 mm aktivite zonu, 55ºC de ise 6 mm çapında koloni ve 9 mm aktivite zonu oluşturması, suşun psikrotolerant-termotolerant aralığında yüksek düzeyde üreme ve enzim sentezleme yeteneğinde olduğunu göstermektedir. Bacillus sp. C-14 suşu %3-%13 NaCl içeren katı besiyerinde 9-1 mm çaplı koloni oluşturacak şekilde üremiştir. Konsantrasyon arttıkça koloni çapında azalma meydana gelmiştir. NaCl konsantrasyonu %15-20 düzeylerine çıkarıldığında her hangi bir üreme gözlenmemiştir. Maksimum koloni oluşumu 9 mm ile %3’lük konsantrasyonda gerçekleşirken %10 NaCl içeren ortamda koloni çapı 5 mm olarak ölçülmüştür. Optimum enzim sentezi 12 mm ile %5-7 konsantrasyonda gözlenirken, %3’de 11 mm %10’da ise 10 mm aktivite zonu elde edilmiştir. Bu sonuçlar C-14 suşunun halofil özellikte olduğunu göstermektedir. Literatür bilgilerinde %3-15 NaCl içeren ortamlarda üreyen organizmaların orta düzeyde halofil özelliğe sahip olduklarını belirtilmektedir (Ventosa ve ark, 1998).

138

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

Bacillus sp. X-13 suşu pH 6.0-11.0 arasında üreme gösterirmiş pH 6.0-7.0 değerleri arasında 10 mm’lik koloni çapına ulaşılmıştır. Aynı koşullarda gerçekleştirilen enzim sentezi analizlerinde, pH 6.0-7.0 aralığında 25 mm, pH 8.0-9.0 aralığında ortalama 22 mm ve pH 10.0-11.0 aralığında ortalama 17 mm aktivite zonu elde edilmiştir. Bu sonuçlar Bacillus sp. X-13 suşunun oldukça aktif bir enzim üreticisi olup, pH 11.0 de elde edile aktivite zon çapının, koloni çapının dört katına ulaştığı bulunmuştur. Üreme ve enzim sentezleme özelliği suşun çok geniş pH aralığında aktif olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, pH 6.0-7.0 aralığında zon çapının 25 mm’ye ulaşması, suşun asidik aralıkta daha iyi çalıştığını göstermektedir. Bacillus sp. X-13 suşu inkübasyon gerçekleştirilen bütün sıcaklık değerlerinde 20ºC (4 mm) ve 60ºC (2 mm) üreme göstermiştir. Bakteri suşu, 20- 40ºC’lik inkübasyon aralığında ortalama 22 mm aktivite zonu oluşturmuştur. Bütün sıcaklık değerleri dikkate alındığında en yüksek enzim üretiminin 25 mm’lik zon çapı ile 40ºC de gerçekleştiği görülmektedir. Diğer taraftan 20ºC de 24 mm, 40ºC de 25 ve 60ºC’de 16 mm (koloni çapının 8 katı) aktivite zon çapı elde edilmesi suşun psikrofil-termofil aralığında çok yüksek aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. Çalışmanın ikinci aşamasında sıvı besiyerinde enzim üretimi, kısmi saflaştırma ve karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Suşlar sıra ile incelendiği zaman; Bacillus sp. AB-17 suşunun optimum aktivitesini pH 10.5’ de gösterdiği bulunmuştur. Enzim pH 6.5 de %81, 7.5’de %82, 8.5’de %84, 9.5’de %84 aktivite göstermiştir. Analizler sonunda pH 6.5-9.5 aralığında ortalama %83 aktivite elde edilmiştir. Enzim aktivitesi pH 11.5-12.5 aralığında hızla düşerek ortalama %62.5’e gerilemiştir. Analiz edilen bütün pH değerlerinde ortalama %79.4 düzeyinde, oldukça stabil bir aktivitenin gerçekleştiği görülmektedir (Şekil 4.2). Horikoshi, izole ettiği alkalin amilaz enziminin pH 10.0-10.5 aralığında çok aktif olduğunu, pH 9.0-11.5 aralığında ise yaklaşık %50 aktivite gösterdiğini belirtmiştir (Horikoshi, 1999). McTigue ve ark. Bacillus halodurans A-59 (ATCC 21591), Bacillus sp. NCIB 11203 suşu ve Bacillus sp. IMD370 suşlarının üçünden de amilaz enzimi

139

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

izolasyonu gerçekleştirmişler ve optimum aktivite görülen pH değerinin 10.0 olduğunu belirtmişlerdir (McTigue ve ark, 1995). Bacillus sp. ANT-6 amilaz enziminin optimum aktivitesini 10.5 de gösterdiğini pH 9.5-13 aralığında ise yüksek düzeyde aktiviteye sahip olduğunu belirtmişlerdir (Burhan ve ark, 2003). Termofil Bacillus sp. A3-15 suşundan izole edilen amilaz enziminin optimum aktivitesini pH 11.0 de gösterdiği, özellikle pH 10.0-11.5 aralığında %95 aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır (Arikan, 2007). Termofil ve halofil Bacilus sp. SB-28 suşundan izole edlen amilaz enziminin optimum aktivitesini pH 12.5 de gösterdiği, pH 8.5-12.0 aralığında ise ortalama %86.25 aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur (Tatar, 2007). Bacillus halodurans A-59 suşundan izole edien amilaz enzimi pH 10.0’da optimum enzim aktivitesi göstermiştir (Horikoshi, 1999). Diğer yandan, Bacillus sp. PN5 suşundan izole edilen amilaz enziminin ise optimum pH 10.0 da aktivite gösterdiği belirtilmektedir (Saxena ve ark, 2007). Bu sonuçlar AB-17 amilaz enziminin alkalin özellikte olduğunu kanıtlamaktadır. Enzim pH 10-12 aralığında stabil bir aktivite göstermiş, kalan enzim aktivitesi ortalama %54.3 olarak gerçekleşmiştir. pH 9-12 aralığında elde edilen stabilite değeri ise ortalama %53.2 olarak bulunmuştur. Bütün pH değerlerinde 24 saatlik inkübasyon sonunda enzim stabilitesi ortalama %55 düzeyinde gerçekleşmiştir. Bu sonuçlar enzimin pH stabil olduğunu kanıtlamaktadır. Alkalin termofil Bacillus sp. A3-15 suşuna ait amilaz enzimiyle yapılan pH stabilitesi çalışmalarında enzim, 60˚C de ve pH 10.0-11.0 aralığında 24 saat inkübe edildiği zaman, orijinal aktivitesini %70 koruduğu bulunmuştur (Arikan, 2007). Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen amilaz enziminin ise pH 10.0- 12.0 aralığında 55˚C de 72 saat inkübe edildiği zaman aktivitesini yaklaşık %54 koruduğu bulunmuştur (Tatar, 2007). Bacillus subtilis’ten elde edilen alfa amilaz enziminin 24 saatlik inkübasyon sonunda aktivitesini pH 7.0’de %80 korurken, pH 10.0’da aktivitenin %40’a düştüğü bulunmuştur (Lin ve ark, 1998). Bacillus sp AB–17 amilaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değeri 150ºC olarak bulunmuştur. AB-17 amilaz enzimi 50–130ºC aralığında

140

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

inkübe edildiğinde enzim aktivitesinde tam bir stabilite görülmüş ve ortalama %27,3’lük aktivite elde edilmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 140ºC’ye yükseltildiği zaman, enzim aktivitesi %81değerine ulaşarak çok hızlı bir artış gerçekleşmiştir. Optimum aktivite 150ºC’de (%100) elde edilirken, sıcaklık 160ºC’ye yükseltildiği zaman enzim aktivitesinin %82’ye düştüğü bulunmuştur. En yüksek aktivitenin gerçekleştiği 140–160ºC aralığında elde edilen ortalama aktivite değeri %87.6’dır. Bu aralıktaki aktivite artışının 30–130ºC aralığı ile karşılaştırıldığı zaman yaklaşık %337 olduğu görülmektedir (Şekil. 4.3). Konsoula ve Kyriakides, Bacillus sp. suşundan izole ettikleri amilaz enziminin optimum aktivitesini 135˚C de gösterdiğini belirtmişler, 160˚C de ise yaklaşık %70 aktivite saptamışlardır (Konsoula ve Kyriakides, 2004). Tatar, Termofil alkalin-halofil Bacillus sp. SB-28 suşundan izole ettiği amilaz enziminde optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklığı 140 ˚C olarak bulmuştur. Tatar, amilaz enziminin optimum aktivitesini 140˚C de göstermekle birlikte 130˚C de %91, 150˚C de %93 ve 160˚C de %86.5 aktiviteye sahip olduğunu bulmuştur (Tatar, 2007). Literatürde bu güne kadar en yüksek optimum aktivite sıcaklığının 135˚C olduğu ve 160˚C de yaklaşık %70 aktivite elde edildiği belirtilmektedir (Konsoula ve Kyriakides, 2004). Bir başka literatürde ise gelecek on yılda 150˚C civarında aktivite gösteren enzimin bulunamayacağı iddia edilmektedir (Daniel ve ark, 1996). Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminde, optimum aktivitenin 150˚C de gerçekleşmesi, bu güne kadar elde edilen en yüksek aktivite sıcaklığı değeri olup, literatür verilerini değiştirecek özelliktedir. Bu özelliği ile AB-17 amilaz enzimi, mikrobiyal enzim literatürleri arasında en üst noktaya yerleşecek, ultra-termofil alkalin özellikte bir enzimdir. AB-17 amilaz enzimi 30-160ºC arasında orijinal aktivitesini yaklaşık %51 oranında korumuştur. Bununla birlikte 150ºC de diğer sıcaklıklara göre daha yüksek bir stabilite gerçekleşmiştir (%53). Goyal ve ark (2005), Bacillus sp. I-3 suşundan izole edilen termostabil amilaz enziminin 70ºC de 3.5 saat inkübasyondan sonra orijinal aktivitenin 2.5 saatlik inkübasyon sonunda ve 80ºC’de %90 korunduğunu bulmuşlardır. Araştırmacılar aynı enzimi 30 dakika

141

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

süreyle 90 ve 100ºC de ön inkübasyon bıraktıkları zaman orijinal aktivitenin %59 ve %26’ya düştüğünü saptamışlardır. Literatür verileri dikkate alındığı zaman AB- 17 amilaz enziminin yüksek düzeyde olmamakla birlikte 30-160ºC arasında oldukça stabil (Şekil 4.5) aktivite gösterdiği bulunmuştur (150ºC de %53). Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi en yüksek aktiviteyi %68.4 ile %3’lük NaCl konsantrasyonunda göstermiştir. %5-15 aralığındaki konsantrasyonlarda kalan enzim aktivitesi ortalama %67 düzeyinde gerçekleşmiştir. Enzim 0.5-3.4M aralığındaki NaCl konsantrasyonlarında ortalama %67 ile stabil bir aktivite göstermiştir. Bu sonuçlar, enzimin halofil olduğunu göstermektedir. Wainø ve Ingvorsen (2003), β-ksilanaz enziminin %5-%15 NaCl konsantrasyonlarında optimum aktivite gösterdiğini, 24 saat üreyle %20 NaCl içerisinde bırakılan enzimin aktivitesini %55 oranında koruduğunu saptamışlardır. Haloferax mediterranei suşundan izole edilen amilaz enziminin 2-4M aralığındaki NaCl konsantrasyonunda aktif ve stabil olduğunu, optimum aktivitenin ise 3M konsantrasyonda elde edildiğini bulmuşlardır (Pomares ve ark, 2003).

Metal iyonları arasında en yüksek inhibisyon %41 ile ZnCl2 de saptanırken, en düşük inhibisyon %22 ile NaCl de elde edilmiştir. Enzimin özellikle ZnCl2 ile önemli düzeyde inhibe olması temostabilitesinin yüksek olmadığını fakat termofil özellikte olduğunu göstermektedir. Deterjanlar arasında en yüksek inhibisyon oranı ortalama %32 ile β- Merkaptoetanol ile elde edilirken, SDS de %31 ve Triton X-100 de %28 inhibisyon saptanmıştır. Her üç deterjandaki inhibisyon ortalama %30.3 düzeyindedir. Bir başka ifade ile AB-17 amilaz enzimi deterjanlara ortalama %70 dirençlilik göstermişlerdir. Bacillus halodurans LBK 34’den izolasyonunu yaptıkları alfa amilazda orijinal aktivitenin 5mM CaCl2 ile %59 1 mM EDTA ile %58 oranında korunduğunu bulmuşlardır (Hashim ve ark, 2005). Berhardsdotter ve ark (2005) ise, alkalin-şelatör dirençli amilaz enziminde orijinal aktivitenin 5 mM CaCl2 ile

%34, ZnCl2 ile %30.6 koruduğunu bulmuşlardır. AB-17 amilaz enzimi, PMSF’ye ise %70.52 direnç göstermiştir. Bu sonuç enzimin düşük düzeyde serin amino asitleri içerdiğini göstermektedir. Szilagyi ve

142

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

Zavodszky (2000), Termofilik proteinlerde serin amino asitlerinin düşük düzeyde bulunduğunu belirtmiştir. Bacillus sp. AB-17 enzimi 8M üre ile tamamen (yaklaşık %97.8) EDTA ile önemli düzeyde (%30.79) inhibe olmuştur. Bu sonuçlar enzimin alkalin, halofil ve metalloenzim özellikte olduğununu göstermektedir. Horikoshi (1999) ile Hutcheon ve ark (2005), amilaz enziminin 8M üre ile tamamen inhibe olmasının alkalofil ve halofil özelliğin göstergesi olduğunu belirtmektedirler.

AB-17 amilaz enziminin orijinal aktivitesi 5 M ZnCl2 ile yaklaşık %40.8 oranında kaybolmuştur. Bacillus sp. ANT-6 amilaz enziminin ZnCl2 ile yapılan inaktivasyon çalışması sonucunda orijinal aktivitenin %63 oranında korunduğunu belirtmişler ve bunun termostabilitenin göstergesi olduğunu bildirmişlerdir (Burhan ve ark, 2003). Termophilik Bacillus sp. TS–23 suşuna ait amilaz enzimi 5 mM ZnCl2 ile %40 oranında inhibe olmuştur (Lin ve ark, 1998). Halofil alkalin termofil Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen ve optimum aktivitesini 140˚C de gösteren amilaz enziminin 55˚C, 30 dakika süreyle aktivitesini %1 SDS de %71, β-Merkaptoetanol de %81, triton X-100 de %82, 8 M ürede %11,

3 mM PMSF de %74, 5 mM CaCl2 de %70, ZnCl2 de %68 koruduğu belirtilmektedir (Tatar, 2007). Saxena ve ark (2006), Bacillus sp. PN5 suşundan üretilen termostabil alkalin amilaz enziminin 5 M SDS ile 1 saat inkübe edildiği zaman aktivitesini %70 koruduğunu bulmuşlardır. Bu sonuçlar Bacillus sp.AB-17 amilaz enziminin ekstremtermofil, alkali, termostabil, deterjan stabil ve halofil olduğunun göstergesidir. AB-17 amilaz enziminin SDS-PAGE analizinde moleküler ağırlıkları 66.25 ve 58 kDa olan iki farklı protein bandı elde edilmiştir. Bu sonuç enzimin moleküler ağırlıkları farklı iki alt birimden oluştuğunu göstermektedir. Literatürde amilaz enzimleri ile yapılan SDS-PAGE çalışmalarında moleküler ağırlıkların 51 kDa.ve 70 kDa arasında değiştiğine ait çok sayıda bulgu vardır (Horikoshi, 1971; Igarashi ve ark, 1998; Hamilton ve ark, 1999; Ben ve ark, 2001;Bernhardsdotter ve ark, 2007).

143

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

İnce tabaka kromatografi analizi sonucunda AB-17 amilaz enziminin nişastayı parçalaması sonucu maltoz ve diğer oligosakkaritlerin meydana geldiği bulunmuştur. Lee ve ark (1994)’nın termofilik alkalifilik Bacillus sp.XAL601 suşundan ürettikleri α-amilaz enziminin nişastayı hidrolizi sonucu maltoz ve uzun zincirli oligosakkaritlerin oluştuğu, buna karşılık glikoz üretilmediğini belirtmişlerdir. AB-17 amilaz enzimine ait ince tabaka kromatografisi sonuçları enzimin, alfa amilaz olduğunu ve ticari alanda kullanılabilecek özellik taşıdığını göstermektedir. Bacillus sp. C-14 suşundan elde edilen endoglukanaz enzimi optimum aktivitesini pH değeri 11.0 de göstermektedir. pH 9.0-11.0 aralığında yapılan çalışmalarda, aktivitenin ortalama %98 değerine ulaştığı bulunmuştur. Elde edilen sonuçlar enzimin, özellikle pH 9.0-11.0 aralığında çok yüksek bir aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. Bütün pH değerlerinde yüksek aktivite elde edilmesi (pH 6.0 da %81, pH 12.0 de %12) enzimin aktivite pH aralığının son derece geniş olduğunu göstermektedir (Şekil 4.10). Hakamada ve ark (2002), Bacillus circulans suşundan optimum enzimatik aktivitesini pH 8.5 de gösteren endoglukanaz enzimi izole etmişlerdir. Hakamada ve ark (1997), alkalifilik Bacillus sp.KSM-S237 suşundan optimum aktivite pH’sı 8.6- 9.0, Bacillus sp.VG1 suşundan ise pH 9.0-10.0 olan endoglukanaz izolasyonu gerçekleştirmişlerdir. Literatürlerde değişik Bacillus sp. izolatlarından optimum enzimatik aktivitesini pH 10.0’da gösteren iki endoglukanaz enziminin izole edildiği belirtilmektedir (Endo ve ark, 2001; Kim ve ark, 2005). Bacillus sp.C-14 endoglukanaz enziminin pH 9.0 da orijinal aktivitesinin %68 düzeyinde korunduğu saptanmıştır. Bütün pH değerleri incelendiği zaman (pH 7.0- 12.0 aralığında) orijinal aktivitenin ortalama %64.5 oranında devam ettiği saptanmıştır. İzole edilen endoglukanaz enzimin optimum aktivitesinin pH 6.0-8.0 aralığında gerçekleştiği saptanmıştır. Enzim pH 5.0 de ve 50ºC’de 1 saat inkübe edildiğinde orijinal aktivitenin %100 korunduğu, pH 6.0 da ise aktivitenin %55’e düştüğü gözlenmiştir (George ve ark, 2001).

144

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

Alkalifilik Bacillus sp.KSM-S237 suşundan izole edilen alkalin selülaz enziminin pH 5.0-11.0 aralığındaki taponlarda 30 dakika süreyle 30ºC de inkübe edildiği zaman orijinal aktivitesini ortalama %80 oranında koruduğu bulunmuştur (Hakamada ve ark, 1997). Bacillus sp.HSH-810 suşundan izole edilen alkalin selülaz enzimi optimum aktivitesini pH 10.0 göstermektedir. Enzim pH 7.0-9.0 aralığında ve 50ºC 10 dakika inkübe edildiğinde aktivitenin yaklaşık %10 kaybolduğu saptanmıştır (Kim ve ark, 2005). Enzim, bu özellikleri ile (özellikle pH 9.0 ve 10.0 aralığında) yüksek düzeyde pH stabilitesi göstermektedir (Şekil 4.12) Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enziminin optimum 50°C de aktivite gösterdiği saptanmıştır. Bununla birlikte enzim 20-80°C aralığında yaklaşık %85 aktiviteye sahiptir (Şekil 4.11). C-14 endoglukanaz enzimin en yüksek aktivite gösterdiği sıcaklık aralığı %90 ile 40-60°C’ler arasıdır. İnkübasyon sıcaklığı 80°C olduğunda %71, 100°C’de ise %64 aktivite elde edilmiştir. Alkali pH değerinde aktivite gösteren endoglukanaz enzimleri arasında optimum aktivite sıcaklığı 65ºC olan enzim termofil olarak tanımlamıştır (Singh ve ark, 2001). Bir çok araştırmacı alkali pH değerinde aktivite gösteren enzimlerin optimum aktivite gösterdikleri sıcaklık aralığınn 50-55ºC olduğunu belirtmişlerdir (Hakamada ve ark, 1997 ve 2002; Endo ve ark, 2001; Kim ve ark, 2005). Literatür verileriyle karşılaştırıldığı zaman C-14 endoglukanaz enzimi termotolerant özelliktedir (şekil 4.11). Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enzimi 20-60ºC’lik sıcaklık değerlerinde orijinal aktivitesini 15 dakika sonunda ortalama %90, 30 dakika sonunda %77 ve 60 dakika sonunda %54 oranında koruduğu saptanmıştır. İnkübasyon sıcaklığı 70ºC ye yükseltildiğinde kalan aktivite değeri 15 dakika %62, 30 dakika %51 olarak gerçekleşirken, 60 dakika sonunda bu değer %10 düzeyine düşmüştür (Şekil 4.13). Bu sonuçlara göre C-14 endoglukanaz enzimi, 70ºC’ye kadar ısısal uygulamaların gerçekleştirildiği çalışmalarda 15 ve 60 dakika süreyle başarıyla kullanılabilme özelliği göstermektedir. Optimum sıcaklığı 50oC olan Bacillus sp. KSM-S237’den izole edilen ve optimum aktivite sıcaklığı 50ºC olan endoglukanaz enziminin 10 dakikalık

145

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini 20ºC’de tamamen koruduğunu, 40ºC’de aktivitenin %90’a, 50ºC’de %50’ye 100ºC’de ise %30’a düştüğü bulunmuştur (Hakamada ve ark, 1997). Bacillus circulans suşundan üretilen ve optimum aktivite sıcaklığı 55ºC olan alkalin endoglukanaz enziminin, 15 dakikalık ön inkübasyon sonunda, orijinal aktivitesini 55ºC de %100 koruduğu 60ºC de ise aktivitenin %50’ye düştüğü, sıcaklığın 65ºC ‘ye yükselilmesiyle aktivitenin tamamen kaybolduğu saptanmıştır (Hakamada ve ark, 2002). Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enzimi, ön inkübasyon sıcaklığı 20-60ºC olarak seçildiği zaman, orijinal aktivitesini 15 dakikada ortalama %90, 30 dakikada %77 ve 60 dakikada %54 koruduğu saptanmıştır. Bu sonuçlara göre C-14 endoglukanaz enzimi literatür verilerinden daha yüksek termal stabiliteye sahiptir. Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enzim aktivitesi kullanılan bütün NaCl konsantrasyonlarında aktiviteyi artırmıştır. En yüksek aktivite %133 ile %20 tuz konsantrasyonunda elde edilirken, %12.5-25 aralığındaki aktivite artışı ortalama %128 olarak gerçekleşmiştir. NaCl konsantrasyonu %30 düzeyine çıkartıldığında ise aktivite %95 düzeyine düşmüştür. Optimum enzim aktivitesinin %20 (3.4M) tuz konsantrasyonunda elde edilmesi, enzim aktivitesinin yüksek NaCl konsantrasyonlarında uyarıldığını ve enzimin halofil karakterde olduğunun kanıtıdır (Şekil 4.14). Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enzimi ile %3-7 NaCl içeren ortamda 1 saat sonunda %70, 6 saat sonunda %60 oranında aktivitesini korumuştur. NaCl konsantrasyonu %10-15 kullanıldığında kalan enzim aktivitesi 1 saat sonunda %77, 6 saat sonunda %71.5 olarak gerçekleşmiştir. NaCl konsantrasyonu %20’ye yükseltildiği zaman, kalan enzim aktivitesinde önemli düzeyde artış gerçekleştiği saptanmıştır. Bu konsantrasyonda 1 saat sonunda %88, 6 saat sonunda %75 aktivite değeri elde edilmiştir. NaCl konsantrasyonu %25’e yükseltildiğinde kalan aktivitenin 1 saat sonunda %73, 6 saat sonunda %63’e düştüğü bulunmuştur. Rekombinant endoglukanaz enziminin Cel5A ile yapılan çalışmalarda enzimin 20 saatlik inkübasyon sonunda (3 M NaCl) orijinal aktivitesini %87 koruduğu bulunmuştur (Voget ve ark, 2006). Egl-AG endoglukanaz enziminde ise

146

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

konsantrasyondaki artışla birlikte aktivitenin arttığı saptanmışlardır (Hirasawa ve ark, 2006). İzolasyonunu geçekleştirdiğimiz C-14 endoglukanaz enziminin NaCl ile gösterdiği reaksiyon sonuçları literatür verileri ile tam bir uyum içindedir. Bu sonuçlar ışığında, C-14 endoglukanaz enzimini ekstrem halofil ve halostabil şeklinde tanımlamak mümkündür. Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enziminin SDS’ye %81 dirençli olduğu bulunmuştur. Huang ve Monk (2004), yaptıkları çalışmada endoglukanaz enziminin

SDS’ye %91.5, β-Merkaptoetanol’e ise %88.7 dirençli olduğu bulunmuştur. CaCl2 ve Na2SO3 ile aktivitede önemli artışlar saptanmış, artış oranı CaCl2 de %132,

Na2SO3 ise %102 düzeyinde gerçekleşmiştir. Metal iyonları ile yapılan analizlerde kalan enzim aktivitesi 5 mM ZnCl2 de %77, KCl de ise %40.33 olarak gerçekleşmiştir. C-14 endoglukanaz enziminde 5 mM EDTA ile %7, PMSF ile %57 oranında inhibisyon gerçekleşmiştir. Üre ile yapılan analizlerde (8M) enzim aktivitesindeki inhibisyon düzeyi yaklaşık %58 olarak saptanmıştır (Çizelge 4.10). Literatürde Zn+ ve K+ gibi metal iyonlarının enzim aktivitesini değişik oranlarda (sırasıyla %23 ve %60) inhibe ettiği belirtilmektedir (Murashima ve ark, 2002). Halofilik enzimlerin büyük çoğunluğunun 2M’dan daha düşük KCl konsantrasyonlarında bile orijinal aktivitelerinin inhibe olduğu, aktivitedeki düşüş oranının halofilik düzeyinin göstergesi olarak ifade edildiği belirtilmektedir (Madern ve ark, 2000). C-14 endoglukanaz enziminin KCl sonuçları, enzimin halofil özellikte olduğunu kanıtlamaktadır. Literatür bulgularında EDTA ile gerçekleştirilen aktivite çalışmalarında kalan enzim aktivitesinin %90-%95 aralığında gerçekleştiği belirtilmiştir (Singh ve ark, 2001; Li ve ark, 2006; Huang ve Monk, 2004). C-14 endoglukanaz enzimi 5mM EDTA ile muamele edildiği zaman kalan enzim aktivitesi %93 bulunmuştur. Bu sonuç literatür verileri ile tam bir uyum göstermektedir Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enziminde, SDS-PAGE elektroforez analizi sonunda 61 kDa ağırlığa sahip tek bir protein bandı elde edilmiştir (Şekil 4.16). Termoasidofilik endoglukanaz (Ba-EGA) enzimi ile yapılan çalışmalarda enzimin 67 kDa moleküler ağırlıkta tek bir protein bandından meydana geldiği

147

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

belirtilmiştir (Li ve ark, 2006). Diğer taraftan bir çok araştırmada endoglukanaz enzimlerinin 35-85 kDa arasında moleküler büyüklüğe sahip oldukları belirtilmiştir (Voget ve ark, 2006; Zvereva ve ark, 2006; Kim ve ark, 2005; Zhang ve ark, 2007). Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enziminin 1 saat’lik inkübasyon sonunda CMC’yi maltoz, sellobioz, sellotrioz ve sellotetroz gibi diğer uzun zincirli oligosakkaritlere hidroliz ettiği, fakat glikoza dönüştürmediği saptanmıştır. Termofilik Rhodothermus marinus’dan izole edilen endoglukanaz enzimi ile CMC’nin hidrolizi sonucu ortaya çıkan ürünlerin glikoz, sellobiyoz, sellotrioz, sellotetraoz ve sellopentaoz olduğu bulunmuştur (Hreggvidsson ve ark, 1996). Başka bir araştırmada ise halotolerant selülaz enziminin CMC’yi hidrolizi sonunda sellobioz, sellotrioz, sellotetraoz ve diğer sellooligosakkaritlere dönüştürdüğü saptanmıştır (Voget ve ark, 2006). Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin pH analizlerinin alt sınırı diğer enzimlerden farklı olarak 4.0’ten başlatılmış ve analizler pH 4.0-12.0 aralığında gerçekleştirilmiştir. Enzim optimum aktivitesini pH 6.0 da gösterirken, pH 5.0 te %97 aktivite gerçekleşmiştir. Asidik pH aralığında (4.0-7.0) ortalama enzim aktivitesi %90.25 olarak bulunmuştur. Alkali pH koşullarında enzim, aktivitesini tamamen kaybederek pH 10.0 da %26, pH 11.0 de %8 aktivite saptanırken, pH 12.0 de aktivite tamamen kaybolmuştur (Şekil 4.19). Bu sonuçlar X-13 ksilanaz enziminin asidik özellikte olduğunu göstermektedir. Sulfolobus solfataricus’tan izole edilen ksilanazın optimum aktivitesini pH 7.0, Humicola insolens’ten izole edilen ksilanaz pH 6.0-6.5 ve Halorhabdus utahensis’ten izole edilen ksilanaz pH 7.0’de gösterdiği saptanmıştır (Düsterhöft ve ark, 1997; WainØ ve Ingvorsen, 2003 ;Cannio ve ark, 2004). Yapılan analizlerde Penicilliun capsulatum’dan izole edilen ksilanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 3.8, Fusarium proliferatum ksilanazının 5.0-5.5 ve Aspergillus fumigatus ksilanazının 6.0-6.5 olduğu bulunmuştur (Ryan ve ark, 2003; Saha ve ark, 2002; Anthony ve ark, 2003). Bu verilerin yanı sıra alkalifilik Bacillus sp. suşundan izole edilen ksilanaz enziminin optimum aktivitesini pH 8.0 de gösterdiği belirtilmiştir (Kumar ve ark, 2004).

148

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi 15 dakikalık ön inkübasyon uygulaması sonucunda pH 3.0-10.0 aralığında orijinal aktivitesini ortalama %92 düzeyinde korumuştur. Bununla birlikte, özellikle pH 5.0-6.0 aralığında aktivite %100, 3.0-4.0 aralığında yaklaşık %94.5 düzeyinde korunmuştur. pH 9.0 (%86) da kalan enzim aktivitesinin pH 8.0’e göre arttığı (%84), pH 10.0 ise yeniden düştüğü saptanmıştır (%84). Bacillus sp. X-13 enzimi 30 dakikalık inkübasyon sonunda bütün pH değerleri dikkate alındığında (pH 3.0-10.0) orijinal aktivitesini yaklaşık %71.5 korumuştur. Ksilanaz enzimi pH 3.0-10.0 aralığındaki 24 saat inkübe edildiğinde orijinal aktivitenin ortalama %44 düzeyinde korunduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar enzimin özellikle asidik pH bölgesinde oldukça dirençli olduğunu, fakat inkübasyon süresinin artışıyla birlikte stabilitenin azaldığını göstermektedir. Özellikle asidik pH değerleri incelendiğinde 24 saat süreyle 40ºC de inkübasyon gerçekleştirildiği zaman, %50’nin üzerinde stabilite saptanmıştır (Şekil 4.21). Bacillus circulans’dan izole edilen ksilanaz A ve Ksilanaz B enzimlerine 50ºC’de ve pH 8.0’de 10 dakika süreyle ön inkübasyon uygulandığı zaman orijinal aktivitenin %60-70 devam ettiğini belirtmişlerdir (Dhillon ve ark, 2000). Halofilik bakterilerden elde edilen iki ekstrem halotolerant ksilanaz enzimlerinin pH 4-11 aralığında stabil oldukları belirtilmiştir (Wejse ve ark, 2003). B. amyloliquefaciens suşundan izole edilen ksilanaz enziminin orijinal aktivitesini pH 9.0’da %71, pH 10.0’da ise %43 oranında devam ettirdiğini bulmuşlardır (Breccia ve ark, 1998). Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 40ºC bulunmuştur. Enzim aktivitesi 20ºC de %19, 30ºC %67 iken 50-60ºC arasında ortalama %8.5 düzeyinde gerçekleşmiştir. İnkübasyon sıcaklığının yükseltilmesiyle birlikte aktivite düşmüş ve 100ºC de yaklaşık %42 düzeyine gerilemiştir. Aktivitede bu denli yüksek farklılık olmakla birlikte 30-70ºC aralığında ortalama %79’luk aktivite elde edilmesi, enzimin mezofil-termotolarant aralığında aktif olduğunu göstermektedir.

149

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

Literatürde halofilik bakterilerden elde edilen ksilanazlarda gözlenen optimum aktivite sıcaklığının 55-90ºC arasında değiştiği belirtilmektedir (Cannio ve ark, 2004). Bacillus sp suşlarında ise daha düşük aktivite sıcaklıkları bulunmuş olup, bir çok araştırmacının çalışmalarında optimum aktivitenin 50ºC de gözlendiği saptanmıştır (Lama ve ark, 2004; Poorna ve Prema, 2006). Pham ve ark (1998), ise analizini geçekleştirdikleri ksilanaz enziminin en iyi aktiviteyi 40ºC de gösterdiğini bulmuşlardır. Bu sonuçlar, X-13 ksilanaz enzimine ait sonuçlarla tam bir uyum göstermektedir. Termal stabilite çalışmalarında 20-40ºC’lik sıcaklık aralığında 15 dakika sonunda elde edilen ortalama aktivite %78 iken, 50-90ºC aralığında ortalama %32 düzeyinde gerçekleşmiştir. İnkübasyon süresinin 60 dakika olarak uygulandığı çalışmalarda, 20-40ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde kalan aktivite ortalama %70, 50-90ºC aralığındaki %26 olarak bulunmuştur (Şekil 4.22). Yapılan çalışmalarda ksilanaz enzimlerinin çok farklı termal stabilite profilleri gösterdikleri bulunmuştur. Bacillus amyloliquefaciens’den izole edilen ksilanaz enzmi 60ºC de 15 dakika inkübe edildiği zaman, orijinal aktivitesini %100 korurken, inkübasyon sıcaklığı 65-70ºC’ye yükseltildiğinde aktivitenin %50’nin altına düştüğü saptanmıştır (Breccia ve ark,1998). Sa-Pereira ve ark (2002), Bacillus subtilis’ten izole edilen ksilanaz enziminin 20 dakikalık inkübasyon sonunda 60ºC sıcaklığa kadar orijnal aktivitesin %60’ın üzerinde koruduğunu, sıcaklığın yüksetilmesiyle birlikte aktivitenin %40’ların altına düştüğünü bulmuşlardır. Bacillus pumilus’a ait ksilanaz enziminin 40ºC ‘ye kadarki sıcaklıklarda aktivitesini 1 saat süreyle koruduğu, 60ºC de ise aktivitenin %30 düzeyine düştüğü bulunmuştur (Podorna ve Prema, 2006). Bu sonuçlar Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin optimum aktivite sıcaklığında termostabil olduğunu göstermektedir. En yüksek kalan enzim aktivitesi değeri %97 ile %3 tuz konsantrasyonunda gerçekleşirken, %3-7 aralığında ortalama %93.3 olarak saptanmıştır. Enzim %3-25 aralığındaki tuz konsantrasyonuna ortalama %89 direnç göstermiştir.

150

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

Ksilanaz enzimi %3-20 aralığındaki tuz konsantrasyonlarında 6 saat inkübe edildiği zaman orijinal aktivitenin ortalama %74.3, %25’lik tuz konsantrasyonu ise %64 düzeyinde devam ettiği bulunmuştur (Şekil 4.23). Her iki inkübasyon süresi sonunda da ksilanaz enziminin %3-25 tuz konsantrasyonlarında %73’ün üzerinde aktivite gösterdiği saptanmıştır. Literatürde, β-ksilanaz enzimine ait orijinal aktivitenin %20 NaCl bulunan ortamda 24 saatlik inkübasyon sonucunda yaklaşık %53’e düştüğü bulunmuştur

(WainØ ve Ingvorsen, 2003). Bir başka çalışmada, halofilik bakteriden izole edilen ksilanaz-1 ve ksilanaz-2 enzimlerinin en yüksek aktiviteyi 1M NaCl konsantrasyonunda, 50ºC ve pH 6.0’da gösterdiği saptanmıştır. Ksilanaz-1 enziminin aktivitesi 1-2M NaCl aralığında %100’den %54’e hızlı bir düşüş göstermiştir. NaCl konsantrasyonu 2’den 5 M’a yükseltildiğinde ksilanaz-2 enziminde aktivitenin %31’e düştüğü saptanmıştır (Wejse ve ark, 2003). Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi EDTA ile kısmen inaktive olurken, orijinal enzim aktivitesi 15 dakika da yaklaşık %89, 60 dakikada %84 korunmuştur. Kalan enzim aktivitesi (15 dakikalık uygulama sonunda) CaCl2 de %99, ZnCl2 de %94,

Na2SO3 de ise %92 düzeyinde geçekleşirken, 60 dakika sonunda CaCl2 de %86,

ZnCl2 de %82, Na2SO3 de ise %83 olarak bulunmuştur. En yüksek dirençlilik (60 dakika sonunda) %82 ile β-Merkaptoetanol’de gözlenirken bunu %80 ile triton X- 100 ve %62 ile SDS izlemiştir. PMSF kullanılan çalışmalarda kalan enzim aktivitesi 15 dakika %89, 60 dakika %80 olarak bulunmuştur. Üre kullanılan çalışmalarda kalan enzim aktivitesi diğer ajanlara göre daha fazla düşmüştür. Buna göre orijinal enzim aktivitesi 15 dakikada %38, 60 dakikada %28 düzeyine düşmüştür (Çizelge 4.11). Bir diğer çalışmada, halofil bakteriden elde edilen halotolerant ksilanaz-1 enziminin orijinal aktivitesini 1 mM SDS ile %60 koruduğu belirtilmektedir (Wejse ve ark, 2003). ZnCl2 (1 mM) ile yapılan çalışmalarda ksilanaz-1 enziminde %57, ksilanaz-2 enziminde %39 oranında inhibisyon gerçekleştiğini saptamışlardır (Wejse ve ark, 2003). Halofil bakteriden elde edilen ksilanaz-1 enzimi 1 mM β- Merkaptoetanol ile muamele edildiğinde enzim %95 direnç göstermiştir (Wejse ve ark, 2003). Halotolerant ksilanaz enziminin orijinal aktivitesini 1 mM PMSF’de

151

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

%99, 10 mM’ da ise %76 koruduğu saptanmıştır. Üre ile yapılan analizlerde ise orijinal aktivitenin 1mM’da %81 korunduğu bulunmuştur (Wejse ve ark, 2003). Zimogram analizi sonucunda Bacillus sp.X-13 ksilanaz enzimin, moleküler ağırlıkları 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kDa olan dört alt birimden meydana geldiği saptanmıştır (Şekil 4.24). Literatürde Penicillium capsulatum ve Fusarium proliferatum organizmalarından izole edilen ksilanazlar enzimlerinin 22-22.4 kDa ağırlığa sahip oldukları, buna karşılık Aspergillus fumigatus mantarından elde edilen enzimin moleküler ağırlıkları 212-253 kDa arasında değişen 4 alt birimden meydana geldiği bulunmuştur (Ryan ve ark, 2003; Saha, 2002). Farklı Bacillus sp. izolatlarından moleküler ağırlıkları 24-45 kDa arasında değişen ksilanaz enzimlerinin izole edildiği belirtilmiştir (Lama ve ark,2004). Ekstrem halofilik archaeon Halorhabdus utahensis organizmasından izole edilen β-ksilanaz enzimi 45 kDa, β-ksilosidaz enzimi ise 67 kDa moleküler ağırlığa sahiptir (Waino ve Ingvorsen, 2003). Halophilik bakteriden izole edilen ekstrem halotolerant ksilanaz-1 ve ksilanaz-2 enzimlerinin moleküler ağırlıkları sırası ile 43 ve 62 kDa olarak bulunmuştur (Wejse ve ark, 2003). Bacillus sp. X-13 suşunun 1 saatlik inkübasyon uygulaması sonunda oalt spelt ksilanı ksiloz ve çok sayıda uzun zincirli ksilooligosakkaritlere dönüştürdüğü bulunmuştur. Bacillus halodurans organizmasından elde edilen ksilanaz enzimi huş agacı ksilanı ile inkübasyona bırakıldığında, 6 saat sonunda ksilobiyoz, 24 saat sonunda ise çok az ksiloz açığa çıktığı saptanmıştır (Mamo ve ark, 2006). Halofilik bakteri suşundan elde edilen halotolerant ksilanaz enzimlerinin ksilanı ksilobiyoz ve ksilotrioza parçaladıkları saptanmıştır (Wejse ve ark, 2003). Tanaka ve ark (2005), Penicillium citrinum ksilanazının huş ağacı ksilanını 1 saatlik inkübasyon sonunda çok az miktarda ksiloz ve diğer ksilo-oligosakkaritlere, 48 saatlik inkübasyon sonunda ise önemli miktarda ksilobiyoz, ksiloz ve diğer ksilo- oligosakkaritlere hidroliz ettiğini bulunmuşlardır. Enzimin hidroliz ürünleri dikkate alındığında, literatürde belirtilen farklı organizmalara ait ksilanaz enzimlerinden daha yüksek aktiviteye sahip olduğu ve

152

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

ancak 48 saatik inkübasyon sonunda elde edilen ürünlerin, 1 saatlik sürede ortaya çıktığı görülmektedir. Enzim, bu özellikleri ile özellikle besin endüstrisi alanında, prebiyotiklerin üretiminde öncelikle kullanılabilecek özelliğe sahiptir. Sonuç olarak; 1.Nişasta işletmelerinde birinci aşama olan jelatinleştirmenin 140-150°C de 5 dakika süreyle gerçekleştirilip, 100-105°C’ye soğutulduktan sonra ikinci ve en önemli aşama olan sıvılaştırmanın 2 saat süreyle yapılması düşünüldüğünde, soğutma işlemleri için çok önemli bir enerji kullanılması söz konusudur. Diğer taraftan, bu konuda en fazla arzulanan durum jelatinleştirme (100- 110°C) ve sıvılaştırma (80-90°C) çalışmalarında çok yüksek sıcaklıklarda aktivite gösteren α-amilaz enziminin bulunması ve kullanılmasıdır. Oysa, 140-150°C-160°C de uzun süre aktif bir enzim kullanılsa soğutmaya gerek kalmayacaktır. Dolayısı ile, soğutma için ekstra enerji kullanılmaması ve moleküller arası bağların kopması sonucu enzimden daha yüksek verim alınacaktır Optimum aktivitesini 150°C de gösteren, 30 dakika süreyle 150°C inkübe edildiği zaman yaklaşık %53 kalan aktivite özelliği gösteren AB-17 amilaz enzimi nişastanın hidrolizi çalışmalarında maliyeti düşürerek, yüksek düzeyde verim alınmasını sağlayacaktır. 2. Amilaz enzimlerinin uygulama alanı oldukça geniş olup klinik, medikal, analitik kimya, nişastanın şekerleştirilmesiyle ilgili bütün alanlar, tekstil, gıda, fermentasyon, kağıt, biracılık ve damıtma uygulamaları sayılabilir. Bacillus sp. AB- 17 amilaz enzimi sahip olduğu üstün yetenekleri (optimum aktivitesini 150°C, pH 10.5 ve halofil koşullarda göstermesi, deterjanlara dirençli olması, 20-160°C aralığında stabil olması gibi) nedeniyle bütün alanlar için oldukça uygundur. Nişastanın parçalanması aşamasındaki ilk adım molekülün oligomaltodekstrinlere dönüştürülmesidir. Özellikle nişastanın şekerleştirme ve sıvılaştırma işlemlerinin uygulandığı 1. ve 2. basamaklarda bugüne kadar istenilip de gerçekleştirilemeyen bütün görevleri (110°C’nin zerinde akivite) fazlasıyla yerine getirecek yetenektedir. 3.Tekstil endüstrisinde haşıllama işlemlerinde yoğun nişasta kullanımı söz konusudur. Tekstil endüstrisi pH’nın yaklaşık 12, sıcaklığın en az 80°C olduğu

153

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

işletmelerdir. Nişastanın ortamdan uzaklaştırılmasında son yıllarda enzim kullanımı önemli bir yer tutmaktadır. Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin alkalin, termofil, termostabil ve halofil özelliği dikkate alındığında bu işletmeler için ideal bir enzim olduğu görülmektedir. 4. Amilaz enzimlerinin en fazla kullanıldığı alanlardan bir diğeri deterjan endüstrisidir. Özellikle alkalin, termostabil, halofil, SDS, triton X-100 ve β- merkaptoetanol gibi deterjan ve yüzey aktif ajanlara dirençli özellik gösteren enzimler, deterjan formülasyonunda öncelikli bir yere sahiptir. Bu açıdan Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi, ideal endüstriyel enzim özelliğindedir. 5. Halofil organizmaların sentezlediği ürünler arasında bakteriorodopsin, ektoin, amilaz, lipaz, sellülaz, proteaz, biyosürfaktanlar, lektinler ve biyoplastikler en önemlileridir. Halotolerant ve halofilik organizmalar ve bulardan elde edilen enzimler, biyoteknolojik uygulamalarda her geçen gün daha ön plana çıkmaktadırlar. Bunlar arasında optik bilgisayarlar, optik hafızalar, biyoçipler, uzay çalışmalarındaki ışık modülatörlerinin yapımı, yağların geri kazanılmalarında kullanılan biyopolimer özelliğindeki biyosürfaktan üretimi, fermente gıdaların üretimi, organik kirliliklerin temizlenmesi ve alternatif enerji üretim alanları sayılabilir. İzolasyonunu gerçekleştirdiğimiz her üç enzimde halofil özellikte olup, özellikle alternatif enerji üretim alanı için ideal özelliktedirler. 6. Geçen son 20 yıl içerisinde selülaz kullanımı özellikle tekstil, temizlik, kağıt, içecek ve şarap endüstrisinde önemli düzeyde artış göstermiştir. Ayrıca hayvan yemlerinin üretimi, tekstil ve temizlik endüstrisi, kağıt hamuru hazırlama işletmeleri ile tarımsal uygulamalar endoglukanazların kullanım alanları arasındadır. Günümüzde selülaz (enduglukanaz) enziminin dünya enzim ticaretindeki yeri yaklaşık %20 düzeyindedir. İzolasyonunu gerçekleştirdiğimiz Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enziminin optimum aktivitesinin pH 11.0 gerçekleşmesi, optimum aktivite sıcaklığının 50°C de olması, halofil koşullarda özellik yüksek düzeyde aktivite göstermesi, halofilik stabilitesinin yüksek olması, deterjanlara dirençli olması, enzimin tekstil uygulamaları, kağıt endüstrisi, hayvan yemi hazırlanması gibi uygulamalarda kullanılacak özelliktedir.

154

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

Son yıllarda özellikle selülozdan biyoetanol üretimi, üzerinde en fazla çalışılan konular arasında birinci sırada yer almaktadır. Selülozun tamamen oligosakkaritlere dönüşümünün sağlanmasında endoglukanaz ve ksilanaz enzimleri birlikte kullanılması başarı oranını üst düzeylere taşıyacaktır. Bu alanın giderek önem kazanması, selülozu kısa sürede hidrolize edecek enzimlere olan ihtiyacı giderek artırmaktadır. Çalışmamızda izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilen C-14 endoglukanaz ve X-13 ksilanaz enzimlerinin hidroliz ürünlerine arasında yoğun miktarda maltoz, sellobioz, sellotrioz ve sellotetroz, ksiloz ve uzun zincirli olgosakkaritlerin bulunması (1 saat gibi kısa bir inkübasyon sonunda), enzimin endüstriyel uygulamalar için ideal özellik taşıdığını göstermektedir. 7. Günümüzde, özellikle çevre koruma önlemleri sayesinde, ksilanazların en yaygın kullanım alanı kağıt endüstrisi olmuştur. Ksilanaz enziminin kullanımı nedeniyle (dioxin gibi) toksik organik klorlu bileşiklerin kağıt endüstrisindeki kullanımı azalmakta, selüloza zarar vermediği ve yan etkisi olmadığı için uygulamada daha başarılı sonuçlar sağlandığı belirtilmektedir.Gıda (unlu mamuller) ve içecek (meyve suyu, kahve), et tavukçuluğunda (Yem verimi artışı amacıyla, besin katkı maddesi), yem sanayinde (Silaj etkiliğini artırmada) ve biyoteknoloji de (Protoplast oluşumu, Tek hücre proteini üretimi, Düşük kalorili tatlandırıcılar ve sıvı yakıt üretimi gibi) önemli bir yere sahiptir. Halofilik ksilanaz’ların saflaştırılmasına fazla gerek duyulmaması ekstrem koşullar gerektiren endüstriyel uygulamalarda, kullanılabilecek bu enzimlerin önemini bir kat daha artırmaktadır. Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzmi, optimum aktivitesini pH 7.0 ve 40°C de göstermesi, asidik pH koşullarında yüksek stabilite göstermesi, 70°C’ye kadar termostabil olması nedeniyle, özellikle kanatlı hayvan yemlerinin üretimi için ideal özellik göstermektedir. Hemiselüloz selülozik materyalde en fazla bulunan ikinci yenilenebilir polisakkarit molekülüdür. Her yıl yaklaşık 1010 ton düzeyinde üretilmektedir. Ksilan hemiselülozu meydana getiren en önemli yapı olup, heteropolimer özelliği taşır. Bu yapı ksilanaz enzimleri ile ksiloz başta olmak üzere diğer oligosakkaritlere parçalanır. Kağıt endüstrisinde ligninin molekülden uzaklaştırılması için NaOH

155

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

çözeltisinde yaklaşık 170°C’lik koşullarda iki saat parçalama işlemleri gerçekleştirilir. Buna rağmen molekülde kalan lignin kalıntıları nedeni ile elde edilen kağıdın rengi kahverengi görünüme sahiptir. Bu yüzden birçok kimyasal işlem uygulanarak rengi giderme işlemi gerçekleştirilir. Beyazlatma işlemlerinde klor kullanılmakla birlikte ligninin tamamen uzaklaştırılmasının mümkün olmadığı bilinmektedir. Klor uygulamasına alternatif olarak son yıllarda ksilanaz enzimi kullanımı hızla yaygınlaşmış ve çok başarılı sonuçlar alınmıştır. İzolasyonunu gerçekleştirdiğimiz enzim taşıdığı aktivite özellikleri nedeniyle bu alan için ideal bir çözüm oluşturacaktır. Enzimin hidroliz ürünleri arasında yoğun şekilde ksiloz açığa çıkması, çok sayıda uzun zincirli ksilo-oigosakkarit ürünlerinin oluşması, enzimin besin endüstrisinde prebiyotik üretimi için son derece uygun özelliktedir. X-13 ksilanaz enzimi özellikleri nedeniyle meyve suyu üretiminde selülaz ve pektinaz enzimi kullanılmadan tek başına berraklaştırma yapabilecek özellikte olup, etkin şekilde kullanılabilir.

156 KAYNAKLAR

ADAMS,M.W.W., and KELLY,R.M., 1995. Enzymes in extreme environments. Chem. Eng. News. 73:32-42. AEHLE, W.,2004. Enzymes in Industry Production and Application. Wiley-VCH Verlag,Weinheim, 484s. AGUILAR, A., INGEMANSSON, T., and MAGNIEN, E., 1998. Extremophile microorganisms as cell factories: supprt frm the Europian Union. Extremophiles. 2:367-373. AIYER, P.V., 2005. Amylases and their applications. African Journal of Biotechnology. 4: 1525-1529. ALTSCHUL, S.F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E.W. and LIPMAN, D.J., 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol., 215: 403-410. AMOOZEGAR, M.A., MALEKZADEH, F. and MALIK, K.A., 2003. Production of amylase by newly isolated moderate halophile, Halobacillus sp. strain MA-2. Journal of Microbiological Methods, 52: 353-359. ANTHONY, T., RAJ, K.C., RAJENDRAN,A., GUNASEKARAN,P., 2003. High molecular weight cellulase-free xylanase from alkali-tolerant Aspergillus fumigatus AR1. Enzyme.Microb.Technol., 32: 647-654. ARCHANA, A. and SATYANARAYANA,T., 1997. Xylanase production by thermophilic Bacillus licheniformis A99 in solid-state fermentation. Enzyme.Microbial.Technol.,21: 12-17. ARIKAN, B., 2007. Highly Thermostable, Thermophilic, Alkaline, SDS and Chelator Resistant Amylase from a Thermophilic Bacillus sp. Isolate A3-15. Bioresource Technology. (Basımda). ASGHER, M., ASAD, M.J., RAHMAN, S.U., LEGGE, R.L., 2007. A thermostable α-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. J. Food Engineering, 79:950-955. ASI, T., 1996. Tablolarla Biyokimya. Nobel Tıp Kitabevi, İstanbul,282s. ATALLA, R.H., VANDERHART, D.L., 1984. Native Cellulose: a composite of two distinct crystalline forms. Science, 223: 283-285.

157 AVCIOGLU, B., EYUPOGLU,B.and BAKIR,U., 2005. Production and characterization of xylanase of a Bacillus strain isolated from soil. World Journal of Microbiology&Biotechnology,21:65-68. BAJPAI, P. and BAJPAI, K.P., 1987. High temğerature alkaline α-amylase from Bacillus licheniformis TCRDC-B13. Biotechnology and Bioengineering, 33:72-78. BANAT, I.M., MAKKAR, R.S., and CAMEOTRA, S.S., 2000. Potential commercial applications of microbial surfactans. Appl microbiol Biotechnol. 53:495-508. BARROW, G.I and FELTHAM, R.K.A., 1993. Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria. Cambridge Uni.Pres. BEG, Q.K., KAPOOR, M., MAHAJAN, L., and HOONDAL, G.S., 2001. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. Appl.Microbiol.Biotechnol.,56: 326-338. BERNHARDSDOTTER, E.C.M.J., NG, J.D., GARRIOTT, O.K., PUSEY, M.L.,2005. Enzymic properties of an alkaline chelator-resistant α- amylase from alkaliphilic Bacillus sp. isolate L1711.Process Biochem., 40:2401-2408. BHAT, M.K., 2000. Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnolgy Advances, 18(5): 355-383. BHAT, M.K., and BHAT, S., 1997. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications. Biotechnology Advances, 15: 583-620. BIODIN, A. and EFFRONT,J.,1917. Process manufacturing diastases and toxins by oxidizing ferments. U.S.Patent 1, 227,525. BLANCO, A., VIDAL, T., COLOM, J. F .and PASTOR, F. I. J.,1995. Purification and Properties of Xylanase A from Alkali-Tolerant Bacillus sp. Strain BP-23. Appl. Environ.Microbiol.,61: 4468-4470. BOLLAG,D.M., ROZYCKI, M.D., EDELSTEIN, S.J., 1996. Protein Methods (2nd Edt). Viley-Liss Press, USA. 414s. BRECCIA, J.D., SIFIERIZ, F,. BAIGORI, M. D., CASTRO, G. R. and HATTI- KAUL, R.,1998. Purification and characterization of a thermostable

158 xylanase from Bacillus amyloliquefaciens. Enzyme.Microb.Tech.,22:42- 49. BURHAN, A., NISA, U., GOKHAN, C., OMER, C., ASHABIL, A., OSMAN, G., 2003. Enzymatic properties of a novel thermostable, thermophilic, alkaline and chelator resistant amylase from an alkaliphilic Bacillus sp. isolate ANT-6. Process Biochem., 38: 1397-1403. CAMPBELL, L.L.,Jr., 1952. Physiological studies on thermophilic bacteria. Ph.D.Thesis, University of Texas, Austin, Teksas. CARDOSO, O.A.V., FILHO, E.X.F., 2003. Purification and characterizaiton of a novel cellulase-free xylanase from Acrophialophora nainiana. FEMS Microbiol.Lett., 223:309-314. CHERRY, J.R., and FIDANTSEF A.I., 2003. Directed evolution of industrial enzymes: an update. Current Opinion in Biotechnology, 14: 438-443. CHUNG, Y.C., KOBAYASHI, T., KANAI, H., AKIBA, T., KUDO, T., 1995.

Purification and properties of extracellular amylase from the

hyperthermophilic archeon Thermococcus profundus DT5432. Appl.

Environ. Microbiol., 1502-1506.

CONN, J.F., JOHNSON, J.A. and MILLER, B.S., 1950. An investigation of commercial fungal and bacterial alpha-amylase preparations in baking. Cereal Chem., 27: 191-205. CORAL, G., ARIKAN, B., UNALDI, M.N., GUVENMEZ, H., 2002. Some Properties of Crude Carboxymethyl Cellulase of Aspergillus niger Z10 wild type strain. Turk. J. Biol., 26:209-213. DANIEL, R.M., DINES,M., and PETACH, HH., 1996. The denaturation and degradation of stable enzymes at high temperatures. Biochem. J. 317:1- 11. DAS, K., DOLEY,R. and MUKHERJEE,A.K., 2004. Purification and biochemical characterization of a thermostable, alkaliphilic, extracellular α-amylase from Bacillus subtilis DM-03, a strain isolated from the tradition fermented food of India. Biotechnol.Appl.Biochem.,40:291-298.

159 DEMIRKAN, E.S., BUNZO, M., ADACHI, M., HIGASA, T., UTSUMI, S., 2005. α-Amylase from B.amyloliqefaciens: purification, characterization, raw starch degradation and expression in E.coli. Process. Bichemistry., 40: 2529-2636. DEUTCH, C.E.,2002. Characterization of a salt-tolerant extracellular a-amylase from

Bacillus dipsosauri. Letters in Applied Microbiology, 35: 78–84. DEY, D., HINGE, J., SHENDYE, A., RAO, M., 1991. Purification and properties of extracellular endoxylanase from alkalophilic thermophilic Bacillus sp. Can. J. Microbiol., 38: 436-442. DHILLON, A., GUPTA,J.K., KAHNA, S., 2000. Enhanced production, purification and characterization of a novel cellulase-poor thermostable, alkalitolerant xylanase from Bacillus circulans AB16. Process Biochem.,35:849-856. DOI, R.H., KOSUGI,A., MURASHIMA, K., TAMARU, Y., and HAN, S.O., 2003. Cellulosomes from mesophilic Bacteria. Journal of Bacteriology,185: 5907-5914. DONG, X.M., REVOL, J-F., GRAY, D.G., 1998. effect of microcrystallite preparation conditions on the formation of colloid crystals of cellulose. Cellulose, 5: 19-32. DUARTE, M.C.T., PORTUGAL, E.P., PONEZI,A.N., BIM, M.A., TAGLIARI, C.V., FRANCO, T.T., 1999. Production and purification of alkaline xylanase. Bioresource Tech.,68:49-53. DUEDAHL-OLESEN, L., KRAGH, K.M. and ZIMMERMANN, W., 2000. Purification and characterisation of a malto-oligosaccharide-forming amylase active at high pH from Bacillus clausii BT-21. Carbohydrate Research 329: 97–107. DYM, O., MEVARECH, M., SUSSMAN, J.L., 1995. Structural features that

stabilize halophilic malate dehydrogenase from archaebacterium.

Science., 267:1344-1346.

160 EGAS, M.C.V., daCOSTA, M.S., COWAN, D.A., PIRES, E.M.V., 1998. Extracellular α-amylase from Thermus filiformis Ork A2: purification and biochemical characterization. Extremophiles., 2:23-32. ENDO, K., HAKAMADA, Y., TAKIZAWA, S., KUBOTA, H., 2001. A novel alkaline endoglucanase from an alkaliphilic Bacillus isolate: enzymatic properties, and nucleotide and deduced amino acid sequences. Appl. Microbiol. Biotechnol., 57: 109-116. ERICH,H., 1975. Chromatography, A laboratory Handbook of Chromatographic and Electrophoretic Methods. Van Reinhold Comp., New York. 968s. FLEMING, K., GRAY, D.G., MATTHEWS, S. Cellulose crystallites. Chemistry, 7: 1831-1835. FOGARTY, W.M., and KELLY, C.T., 1979. Developments in microbial extracellular enzymes. (A.Wisemann editör) Topics in Enzyme and fermentation biotechnology, Wiley,New York, s.45-108. FRIEDMANN, T. and EPSTEIN, C.J., 1967. The role of calcium in the reactivation of reduced taka-amylase. The Journal of Biological Chemistry, 242:5131-5140. FUKUCHI, S., YOSHIMUNE, K., WAKAYAMA, M, MORIGUCHI, M., and NISHIKAWA, K., 2003. Unique amino acid composition of proteins in halophilic bacteria. J. Mol. Biol. 327:347-357 GALLORDO, O., DIAZ, P., PASTOR,F.I.J., 2004. Cloninig and characterization of xylanase A from the strain Bacillus sp.BP-7: Comparison with alkaline pI-low molecular weight xylanase of family 11. Current Microbiology, 48:276-279. GEORGE, S.P., AHMAD, A., RAO,M.B., 2001. Studies on carboxymethyl cellulase produced by an alkalothermophilic actinomycete. Bioresource Tech., 77: 171-175. GESSESSE, A. and MAMO,G.,1999. High level xylanase production by an alkaliphilic Bacillus sp. by using solid state fermentation. Enzyme.Microb.Technol.,25:68-72.

161 GESSESSE, A., 1998. Purification and Properties of Two Thermostable Alkaline Xylanases from an Alkaliphilic Bacillus sp. Appl.Environ.Microbiol.,64: 3533-3535. GILBERT, H.J., and HAZLEWOOD, G.P.,1993. Bacterial cellulases and Xylanases. J.Gen.Microbiol.,139: 187-194. GIRI, N.Y., MOHAN, A.R., RAO, L.V., RAO, C.P., 1990. Immobilization of α- amylase complex in detection of higher oligosaccharides on paper. Curr.Science., 59: 1339-1340. GLICK,B.R., and PASTERNAK,S.S., 1994. Molecular biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. GODFREY, T. and WEST, S., 1996. Introduction to Industrial Enzymology. (T.Godfrey and S. West editör) Industrial Enzymology,2nd Edition, Stockton Pres, New York. GOMES, J. and STEINER,W., 2004. The biocatalytic Potential of Extremophiles and Extremozymes. Food Technology and Biotechnology, 42(4): 223- 235. GOYAL, N., GUPTA, J.K., and SONI, S.K., 2005. A novel raw starch digesting thermostable α-amylase from Bacillus sp. I-3 and its use in the direct hydrolysis of raw starch. Enzyme and Microbial Technology. 37:723- 734. GUPTA, A., ROY, I., PATEL, R.K., SINGH, S.P., KHARE, S.K., and GUPTA , M.N., 2005.One-step purification and characterization of an alkaline protease from haloalkalophilic Bacillus sp. Journal of Chromathography A. 1075:103-108. GUPTA, R., GIGRAS, P., MOHAPATRA, H., GOSWAMI, V.K., CHAUHAN, B.,2003. Microbial α-amylases: a biotechnological perspective. Process Biochem., 1-18. GUPTA, R., GUPTA, K., SAXENA, R.K., and KHAN, S., 1999. Bleach-stable alkaline protease from Bacillus sp. Bioechnology Letters,21:135-138.

162 HAGIHARA, H., IGARASHI, K., HAYASHI, Y.,ENDO, K., IKAWA-ITAYAMA, K., OZAKI, K., KAWAI, S. and ITO,S.,2001. Novel a-Amylase That Is Highly Resistant to Chelating Reagents and Chemical Oxidants from the Alkaliphilic Bacillus Isolate KSM-K38. Appl. and Env. Microbiol.,67:1744-1750. HAKAMADA, Y., ENDO, K., TAKIZAWA, S., KOBAYASHI, T., SHIRAI, T., YAMANE, T., ITO, S., 2002. Enzymatic properties, crystallization and deduced aminoacid sequence of an alkaline endoglucanase from Bacillus circulans. Biochimica et Biophysica Acta,1570: 174-180. HAKAMADA, Y., KOIKE, K., YOSHIMATSU, T., MORI, H., KOBAYASHI, T., ITO,S., 1997. Thermostable alkaline cellulase from an alkaliphilic isolate, Bacillus sp. KSM-S237. Extremophiles, 1:151-156. HAMES, B.D. and RICKWOOD, D., 1996. Gel Electrophoresis of Proteins A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford.383s. HARTMANN ,P.A., WELLERSON,R.Jr., and TETRAULT, P.A., 1954. Bacillus stearothermophilus I. Thermal and pH Stability of the Amylase. Journal of Bacteriology, 7-10. HARWOOD, C.R., 1992. Bacillus subtilis and its relatives: Molecular Biological and Industrial Workhorses. Elsevier Science Publishers Ltd (U.K.), 10:247- 256. HASHIM,S.O., DELGADO, O.D., MARTINEZ,M.A., KAUL, R-H., MULAA, F.J., MATTIASSON,B., 2005. Alkaline active maltohexaose-forming α- amylase from Bacillus halodurans LBK 34. Enzyme.Microbial Technol.,36:139-146. HIRASAWA, K., UCHIMURA, K., KASHIWA, M., GRANT, W.D., ITO, S., KOBAYASHI, T., HORIKOSHI, K., 2006. Salt-activated endoglucanase of a strain of alkaliphilic Bacillus agaradhaerens. Antonie v Leeuwenhoek 89:211-219.

163 HORIKOSHI, K., 1971. Production of alkaline amylase by alkalophilic

microorganisms II Alkaline amylase produced by Bacillus no A-40-2.

Agric. Biol. Chem., 35: 1783-1791.

HORIKOSHI, K., 1996. Alkaliphiles-from an industrial point of view. FEMS Microbiology Reviews, 18:259-270. HORIKOSHI, K., 1999. Alkaliphiles: some Applications of Their Products for Biotechnology. Microbiol. Mol.Biol.Rev.,63:735-750. HREGGVIDSSON, G.O., KAISTE, E., HOLST, O., EGGERTSSON, G.,PALSDOTTIR, A and KRISTJANSSON, J.K., 1996. An Extremely Thermostable Cellulase from the Thermophilic Eubacterium Rhodothermus marinus. Appl. Environ. Microbiol.,62: 3047-3049. HUANG, X.P., MONK, C., 2004. Purification and characterization of a cellulase (CMCase) from a newly isolated thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovarans gen.nov., sp. nov. World J. Microbiol. Biotechnol., 20: 85-92. HUTCHEON, G.W., VASIST, N., BOLHUIS, A.,2005. Characterization of a highly stable α-amylase from the halophilic archeon haloarcula hispanica. Extremophiles,9:487-495. IGARASHI, K., HATADA, Y., HAGIHARA, H., SAEKI, K., TAKAIWA, M., EUMURA, T., ARA, K., OZAKI, K., KAWAI, S., KOBAYASHI, T., ITO, S., (1998). Enzymatic properties of a novel liquefying α-amylase from an alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid sequences. Appl. Environ. Microb., 64:3382-3389. IGARASHI, K., HATADA, Y., HAGIHARA, H., SAEKI, K., TAKAIWA, M., UEMURA, T., ARA, K., OZAKI, K., KAWAI, S., KOBAYASHI, T. and ITO, S., 1988. Enzymatic properties of a novel liquefying α-amylase from an alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid sequences. Appl.Env.Microbiol.,64:3282-3289.

164 JOHN, F.K., 1987. Enzyme Technology (H.J.Rehm ve G.Reed editör). Biotechnology,Vol.7A. New York s 37-62. KANG, S.W., PARK, Y.S., LEE, J.S., HONG, S.I., KIM, S.W., 2004. Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass. Bioresource Tech.,91: 153-156. KANG,H-J.,UEGAKI, K., FUKADA, H., ISHIKAWA,K.,2007. Improvement of the enzymatic activity of the hyperthermophilic cellulase from Pyrococcus horikoshii.Extremophiles,11, 251-256. KIM, J-Y., HUR, S-H., HONG, J-H., 2005. Purification and characterization of an alkaline cellulase from a newly isolated alkalophilic Bacillus sp. HSH- 810. Biotechnol. Lett., 27:313-316. KIM, T.U., GU, B.G., JEONG, J.Y., BYUN S.M. and SHIN, Y.C., 1995. Purification and Characterization of a maltotetraose-forming alkaline α- amylase from and alkalophilic strain, GM8901. Appl.Environ. Microbiol., 61:3105-3112. KNEEN, E. and SANDSTEDT, R.M., 1946. Application of the amylases in milling and baking technology. (J.A.Anderson, Editör), Enzyme and Their Role in Wheat Technology. Interscience Publishers,Inc.,New York. s,89-126. KONSULA, Z. and LIAKOPOULOU-KYRAIDES, M., 2004. Hydrolysis of starches by the action of an α-amylase from Bacillus subtilis.Process Biochem.,39:1745-1749. KRISHNA, C., 1999. Production of bacterial cellulases by solid state bioprocessing of banana waste. Bioresorce Tech., 69:231-239. KRISTJANSSON, J.K., and STETTER, K.O., 1992. Thermophilic Bacteria. (J.K.Kristjansson, editör) Thermophilic Bacteria. CRC Pres, London,1- 18s. KULKARNI, N., SHENDYE, A., RAO, M., 1999. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiology Reviews, 23: 411.456. KUMAR, B.K., BALAKRISHNAN, H. and RELE, M.V., 2004. Comptibility of alkaline xylanases from an alkaliphilic Bacillus NCL (87-6-10) with

165 commercial detergents and proteases. J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,31: 83- 87. KUMAR, G.C., and TAKAGI, H., 1999. Microbial alkaline proteases from a bioindustrial viewpoint. Biotechnology Advances. 17:561-594. KUMAR, H.D. and NUSSINOV, R., 2001. How Do Thermophilic Proteins Deal with Heat? A review. Cellular and Molecular Life Sciences, 58: 1216- 1233. LAMA, L., CALANDRELLI, V., AGATA, GAMBACORTA, A., NICOLAUS, B.,2004. Purificaion and characterization of thermostable xylanase and β-xylosidase by the thermophilic bacterium Bacillus thermantarcticus. Research in Microbiology,155: 283-289. LEE, S-P., MORIKAWA, M., TAKAGI, M., IMANAKA, T., 1994. Cloning of the aapT Gene and Characterization of Its product, α-Amylase-Pullulanase (AapT), from Thermophilic and Alkaliphilic Bacillus sp. Strain XAL601. Appl.Environ.Microbiol.,60:3764-3773. LENNETE, E.H., BALLOWS, A., HAUSLER, J.W.Jr.,SHADOMY, J.H., 1985. Manuel of Clinical Microbiology. Vol 4.USA.1149s. LI, L., TIAN, H., CHENG,Y., JIANG, Z., YANG,Z., 2006. Purification and characterization of a thermostable cellulase-free xylanase from the newly isolated Paecilomyces themophila. Enzyme.Microbiol.Technol.,38: 780- 787. LI, Y-H., DING,M., WANG, J., XU, G-J., ZHAO, F., 2006. A novel thermoacidophilic endoglucanas, Ba-EGA, from a new cellulose- degrading bacterium, Bacillus sp.AC-1. Appl. Microbiol.Biotechnol., 70: 430-436. LIN, L.L., CHYAU, C.C., HSU, W.H., 1998. Production ad properties of a raw starch-degrading amylase from the thermophilic and alkalophilic Bacillus sp. TS-23. Biotechno. Appl. Biohem. 28:61-68. LOPEZ, C., BLANCO, A. and PASTOR, F.I.J., 1998., Xylanase production by a new alkali tolerant Bacillus. Biotechnology Letters,20:243-246.

166 LYND , L.R., WEIMER, P.J., van ZYL, W.H., 2002. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol.Mol.Biol.Rev.,66: 506-577. MAAT, J., ROZA, M., VERBAKEL, J., STAM, H., daSILRA, M.J.S., EGMOND, M.R., HAGEMANS, M.L.D., vanGARCOM, R.F.M., HESSING, J.G.M., vanDERHONDEL, C.A.M.J.J., vanRPTTERDAM, C., 1992. Xylanases and their application in bakery. (J.Visser, G.Beldman, M.A.K. vanSomeren, A.G.J. Voragen, editörler) Xylan and Xylanases. Elsevier, Amsterdam, 349-360s. MADERN, D., EBEL, C. and ZACCAI, G., 2000. Halophilic adaptationof

enzymes. Extremophiles 4: 91 –98.

MALHOTRA,R., NOORWEZ, S.M. and SATYANARAYANA,T., 2000. Production and partial characterization of thermostable and calciun- independent α-amylase of an extreme thermophile Bacillus thermooleovorans NP54. Letters in Applied Microbiology, 31: 378-384. MAMO, G., GASHE, B.A. and GESSESSE, A., 1999. A highly thermostable from a newly isolated thermophilic Bacillus sp.WN11. Journal of Applied Microbiology, 86: 557-560. MAMO, G., HATTI-KAUL, R., MATTIASSON,B., 2006. A thermostable alkaline active endo-β-1-4-xylanase from Bacillus halodurans S7: Purification and Characterization. Enzyme.Microb.Technol., 39: 1492-1498. MANSFIELD, S.D., SADDLER, J.N, and GUBITZ, G.M., 1998. Characterisation of endoglucanases from the brown rot fungi Gloeophyllum sepiarium and Gloeophyllum traberium. Enzyme. Microbiol. Biotechnol., 23:133-140. MARGESIN, R., AND SCHINNER, F., 2005. Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles. 5:73-83. MARQUEZ, M.C., VENTOSA, A., and CORMENZANA, R., 1992. Phenotypic and chemotaxonomic characterization of Marinococcus halophilus. Syst Appl Microbiol, 15:63-69.

167 MAWADZA, C., HATTI-KAUL, R., ZVAUYA, R., MATTIASON, B., 2000. Purification and characterization of cellulases produced by Bacillus Strain. J. Biotechnol., 83: 177-187. McTIGUE, M.A., KELLY,C.T., DOYLE, E.M. and FOGARTY, W.M., 1995. The alkaline amylase of the alkalophilic Bacillus sp IMD370.Enzyme Microb. Technol., 17:570-573. MENZEL,C., LERCH, T., SCHNEIDER, K., WEIDEMAN, R., TOLLNICK, C., KRETYMER, G., SCHEPER, T., SCHUGERT, K., 1998. Application of biosensors with an electrolyte isolator semiconductor capacitor (EIS- CAP) transducer for process monitoring. Process Biochemistry, 33: 175- 180. MILLER, G.L., 1951. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry,426-428. MOREAU, R.A., POWELL, M.J., WHITAKER, B.D., BAILEY, B.A., ANDERSON, J.D., 1994. Xylanase treatment of plant cells induces glycosylation and fatty acylation of photosterols. Physiol.Plant., 91: 575- 580. MORGAN, F.J. and PRIEST, F.G., 1981. Characterization of a thermostable α- amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346. J.Appl. Bacteriol., 50: 107-114. MURASHIMA, K., NISHIMURA, T., NAKAMURA, Y., KOGA, J., MORIYA, T., SUMIDA, N., YAGUCHI, T., KONO,T., 2002. Purification and characterization of new endo-1,4-β-D-glucanases from Rhizopus oryzae. Enzyme. Microbial Technol., 30: 319-326. NIEHAUS,F., BERTOLDO,C., KAHLER,M., AND ANTRANIKIAN,G., 1999. Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. App Microbiol Biotechnol, 51:711-729. ONISHI, H. and SONADO, K., 1979. Purification and some properties of an extracellular amylase from a moderate halophile, Micrococcus halobius. Applied and Environmental Microbiology, 38:616-620.

168 OUTTRUP, H and JORGENSEN,S.T., 2002. The Importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes. (R.Berkley editör) Applications and systems of Bacillus and relatives. Blackwell Science Inc., Malden, Mass.,206-218. PERCIVAL ZHANG, Y.H., HIMMEL, M.E., MIELENZ, J.R., 2006. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances,24: 452-481. POMARES, F.P., BAUTISTA,V., FERRER, J., PIRE, C., MARHUENDA-EGAE, F.C., BONETE,M.J., 2003. α-Amylase activity from the halophilic archaeon Haloferax mediterranei. Extremophiles,7: 299-306. POOLE, C.F., 2003. The Esence of Chromatography. Elsevier Science B.V. Amsterdam, 925s. PRIEST, F.G., (1977). Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus.

Bacteriol. Rev., 41:711-753.

PULS, J., SCHUSEIL, J., 1993. Chemistry of hemicelluloses: relationship between hemicellulose structure and enzyme required for hydrolysis.(COUGHLAN,M.P. ve HAZLEWOOD, G.P. Editorler) Hemicellulose and hemicellulases . Portland Pres. London. s:1-28. RANI, S., and NAND, K., 1996. Development of cellulase-free xylanase producing anaerobic consotria for the ıse of lignocellulosic wastes. Enzyme. Microb. Technol., 18: 23-28. RAO, M.B., TANKSALE, A.M. GATHE, M.S., DESHPANDE, W., 1998. Molecular and Biotechnological aspect of Microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(3):597-635. RATANAKHANOKCHAI, K., KYU, K.L., TANTICHAROEN, M., 1999. Purification and Properties of a Xylan-Binding Endoxylanase from Alkaliphilic Bacillus sp. Strain K-1. Appl.Environ.Microbiol., 65: 694- 697.

169 REDDY, N.S., NIMMAGADDA, A., and RAO, K.R.S.S., 2003. An overview of the microbial α-amylase family. African Journal of Biotechnology. 2(12):645-648. ROBSON, L.M. and CHAMBLISS, G.H., 1984. Characterization of the cellulolytic activity of a Bacillus isolate. Appl. Environ.Microbiol.,47:1039-1046. RYAN, S.E., NOLAN,K., THOMPSON,R., GUBITZ,G.M., SAVAGE, A.V., TUOHY, M.G., 2003. Purificaiton and characterization of a new low molecular weight endoxylanase from Penicillium capsulatum. Enzyme.Microb.Technol., 33: 775-785. RYU, K., KIM, J., DORDICK, J.S., 1994. Catalytic properties and potential of an extracellular protease from an extreme halophile. Enzyme. Microb. Technol.,16:266-275. SAHA, B.C., 2002. Production,purification and properties of xylanase from a newly isolated Fusarium proliferatum. Process Biochem., 37: 1279-1284. SAITO, N., 1973. Thermophilic Extracellular α-amylase from Bacillus licheniformis. Archieves in Biochemistry and Biophysics, 155:290-298. SAMBROOK, J. and RUSSELL, D.W.,2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. SANDER,I., RAULF-HEIMSOTH, M., VAN KAMPEN, V., BAUR,X., 2000. Is fungal amylase in bread an allergen? Clinical and Experimental Allergy, 30: 560-565. SA-PEREIRA, P., MESQUITA, A., DUARTE, J.C., BARROS, M.R.A., COSTA- FERREIRA,M., 2002. Rapid production of thermostable cellulase-free xylanase by a strain Bacillus subtilis and its properties. Enzyme.Microb.Technol.,30: 924-933. SARIKAYA, E., 1995. α-amilase üreten bazı Bacillus suşlarının gelişme parametreleri, enzim özellik ve üretim koşullarının optimizasyonu. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Doktora Tezi. SAUL, D.J., WILLIAMS, L.C., GRAYLING, R.A., CHAMLEY, L.W., LOVE,D.R. and BERGQUIST, P.L., 1990. ceiB, a Gene Coding for a Bifunctional

170 Cellulase from the Extreme Thermophile "Caldocellum saccharolyticum". Appl.Environ.Microbiol., 56: 3117-3124. SAXENA, R.K., DUTT, K., AGARWAL, L., NAYYAR, P,. 2007. A highly thermostable and alkaline amylase from a Bacillus sp.PN5. Bioresource Tech., 98:260-265. SCHALLMEY, M., SINGH, A. and WARD, O.P., 2004. Developments in the Use of Bacillus Species for Industrial Production. Canadian Journal of Microbiology, 50:1-17. SCOPES, R.K.,1982. Protein Purification Principles and Practice. Springer-Verlag, New York.282s. SHAW, J-F., LIN, F-P., CHEN, S-C. and CHEN, H-C., 1995. Purification and properties of an extracellular α-amylase fron Thermus sp. Bot.Bull.Acad.Sin.,36:195-200. SHIBUYA, I., IIMURA, Y., ISHIKAWA, T., OUCKI, K., MATSUYAMA, A., YAMAMOTO,T., 1986. Isolation and characterization of starch utilizing mutants of Escherichia coli. Agric.Biol.Chem.,50: 875-882. SIDHU, G.S., SHARMA, P., CHAKRABARTI, T., GUPTA, J.K., 1997. Strain improvement for the production of a thermostable α-amylase. Enzyme. Microb. Technol., 21:525-530. SINGH, J., BATRA, N., SOBTI, R.C., 2001. A highly thermostable, alkaline CMCase produced by a newly isolated Bacillus sp.VG1. World J. Microbiol. Biotechnol., 17: 761-765. SINGH, J., BATRA, N., SOBTI, R.C., 2004. Purification and characterization of alkaline cellulase produced by a novel isolate, Bacillus sphaericus JS1. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 31: 51-56. SMITH, J.E.,1996. Biotechnology. Chambridge University Pres, Chambridge, 233s. SODHI, H.K., SHARMA, K., GUPTA, J.K., SONI, S.K., 2005. Production od a thermostable α-amylase from Bacillus sp. PS-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the hydrolysis of malt starch for alcohol production.Process Biochem.,40: 525-534.

171 SOUTSCHEK-BAUER, E. and STAUDENBAUER L., 1987. Synthesis and secretion of a heat stable carboxymethylcellulase from Clostridium thermocellum in Bacillus subtilis and Bacillus stearothermophilus.Mol.Gen. Genet., 208: 537-541. SPRING, S., LUDWIG, W., MARQUEZ, M.C., VENTOSA, A., AND SCHLEIFER, K.H., 1996. Halobacillus gen. Nov. , with descriptions of Halobacillus litoralis sp. nov. and Halobacillus trueperi sp. nov., and transfer of Sporosarcina halophila to Halobacillus halophilus comb. nov. Int. J Syst Bacteriol. 46:492-496. SRIVASTAVA, R.A.K., 1987. Purification and chemical characterization of thermostable amylase produced by Bacillus stearothermophilus. Enzyme. Microb. Technol., 9: 749-754. STARK, E., and TETRAULT, P.A., 1951. Isolation bacterial, cell-free, starch saccharifying enzymes from the medium at 70 C. Journal of Bacteriology, 62: 247-249. SUBRAMANIYAN, S., and PREMA, P.,2000. Cellulase-free xylanases from Bacillus and other microorganisms. FEMS Microbiology Letters, 183:1-7. SUNNA, A., ANTRANIKIAN, G., 1997. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria. Crit.Rev. Biotechnol.,17: 39-67. SZILAGYI, A., ve ZAVODSZKY, P., 2000. Structural differences between

mesophilic, moderately thermophilic and extremely thermophilic protein

subunits: results on a comprehensive survey. Structure, 8: 493-504.

TAHARA, N., YANA, H., YOSHINAGA, F., 1997. Two types of Cellulase Activity Produced by a cellulose-producing Acetobacter Strain. Journal of Fermentation and Bioengineering, 83: 389-392. TANAKA, H., NAKAMURA, T., HAYASHI, S., OHTA,K.,2005. Purification and properties of an extracellular Endo-1,4-β-Xylanase from Penicillium citrinum and Characterization of the Encoding Gene. Journal of Bioscience and Bioengineering, 100: 623-630.

172 TATAR, S., 2007. Termofil Moderately Halofilik Bacillus.sp. Suşlarindan Amilaz Enzimi Üretimi ve Endüstriyel Kullanim Olanaklarinin Araştirilması. Ç.Ü. FBE. Yüksek Lisans Tezi. TEMİZKAN, G. ve ARDA, N., 2004. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. Nobel Tıp Kitabevi, İst.345s. THOMPSON, J. D., HIGGINS, D. G. AND GIBSON, T. J., 1994. ClustalW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res., 22:4673-4680. TSENG, M-J., YAP,M-N., RATANAKHANOKCHAI, K., KYU, K.L., CHEN, S-T., 2002. Purification and characterization of two cellulase free xylanase from an alkaliphilic Bacillus firmus. Enzyme.Mibrob.Technol.,30: 590- 595. UHLIG, H., 1998. Industrial Enzymes and Their Application. John Wilet and Sons, Canada. 454s. VENTOSA, A., NIETO, J.J., and OREN, A., 1998. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62:504-544. VIHINEN, M. and MANTSALA, P., 1990. Characterization of a thermostable Bacillus stearothermophilus α-amylase. Biotechnol. Appl. Biochem.,12: 427-435. VIIKARI, L., RANVA, M., KANTELINEN, A., SANDQUİST, J., LINKO,M., 1986. Bleecing with Enzymes. Third International Conference in biotechnology in pulp and paper industry.16-19 June, Stockholm, s67-69. VOGET, S., STEELE, H.L., STREIT, W.R., 2006. Characterization of

metagenome-derived halotolerant cellulase. J Biotechnol 126:26-36.

WAINØ, M. and INGVORSEN, K.,2003. Production of β-xylanase and β-xylosidase bt the extremely halophilic archaeon Halorhabdus utahensis. Extremophiles, 7:87-93.

173 WEJSE,P.L., INGVORSEN, K., MORTENSEN, K.K.,2003. Xylanase production by a novel halophilic bacterium increased 20-fold by response surface methodology. Enzyme.Microb.Technol., 32: 721-727. WILSON, K. And GOULDING, K.H., 1986. A Biologist’s Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry. Edward Arnold, London.396s. WISEMAN, A., 1987. Handbook of enzyme biotechnology. Second Edition. Chapter 3. The application of enzymes in industry, p.274-373. WONG, K.K.Y., TAN, L.U.L., SADLER, J.N., 1988. Multiplicity of β-1,4-xylanase in microorganisms: functions and applications. Microbiol.Rev., 52: 305- 317. WOOD, T.M., 1988. Preparation of crystalline, amorphous and dyed cellulase substrate. Methods.Enzymol.,166: 19-45. WOODLEY, J.M., 2000. Advances in Enzyme Technology-UK Contributions. (Th.scheperi editör). Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, s. 94- 107. WRIGHT, D.B., BANKS, D.D., LOHMAN, J.R., HILSENBECK, J.L., GLOSS, L.M.,2002. The effect of salts on the activity and stability of Escherichia coli and Haloferax volcanii dihydrfolate reductases. J.Mol.Biol.., 323: 327-344. YANG, V.W., ZHUANG, Z ., ELEGIR, G., and JEFFRIES, T.W.,1995. Alkaline- active xylanase produced by an alkaliphilic Bacillus sp. isolated from

kraft pulp. Journal of Industrial Microbiology, 15: 434-441. YERNOOL, J-D.B.D., and EVELEİGH, D.E., 1998. Purification, characterization and molecular analysis of thermostable cellulase CelA and CelB from Thermotoga neapolitana. Appl.Environ.Microbiol,64:4774-4781. ZEMAN, N.W. and McCREA, J.M., 1985. Alpha-amylase Production Using a Recombinant DNA Organism. Cereal Foods World. 30 (1): 777-780. ZHANG, Q., TSUKAGOSHI, N., MIYASHIRO, S. and UDAKA, S., 1983. Increased production of α-amylase by Bacillus amyloliquefaciens in the

174 presence of glycine. Applied and Environmental Microbiology,46: 293- 295. ZVERAVA, E.A., FEDOROVA,T.V., KEVBRIN, V.V., ZHILINA, T.N. and RABINOVICH,M.L.,2006. Cellulase activity of a haloalkaliphilic anaerobic bacterium, strain Z-7026. Extremophiles, 10: 53-60.

175 ÖZGEÇMİŞ

1969 yılında Kahramanmaraş İlinde doğdum. 1991 yılında Selçuk Üniversitesi FEF Biyoloji Bölümünde lisans eğitimimi tamamladıktan sonra 2 yıl İstanbul Eyüp Lisesinde Öğretmen olarak çalıştım. 1996 yılında Yüksek Lisansımı The University of Manchester’da tamamladım. 2002 yılında Çukurova Üniversitesinde Doktora proğramına başladım ve halen Araştırma Görevlisi olarak çalışmaktayım.

176 EK 1 Nişasta

Bitkiler tarafından fazla glikozun depo edilmiş şekli olan kompleks bir karbohidrat polimeridir. Polisakkaritler arasında en çok öneme sahip olanıdır. Bazen bitkilerde yaş ağırlığın %70’ini oluşturabilirler. Genellikle, suda çözünmez granül formunda yer alırlar. Granüllerin şekli ve büyüklükleri bitki türlerine göre değişebilir. Suda ısıtıldıklarında, granülü bir arada tutan hidrojen bağları zayıflayarak şişer ve jelatinize olurlar. Ticari olarak, mısır, buğday, sorgum ve pirinç gibi bitkilerin tohumlarından yada patates gibi bitkilerinköklerinden elde edilirler. Nişasta, amiloz ve amilopektin denen iki molekülün karışımından oluşan bir polisakkarittir. Bu iki molekül farklı yapı ve fiziksel özelliklere sahiptir.

Çizelge Ek 1.1:Amiloz ve Amilopektinin Bazı Özellikleri (Aiyer, 2005). Özellik Amiloz Amilopektin Basit yapı Temelde lineer Dallanmış Kendiliğinden Sıvı solüsyonlarda stabilitesi presipite stabil olabilir Polimerizasyon Derecesi (DP) C.103 C.104-C.105 Ortalama Zincir Uzunluğu C.103 C.20-25 β amilaz hidrolizi %87 %54 β amilaz ve dallanmaları %98 %79 parçalayabilen enzim hidrolizi Doğal nişastada bulunmaları %15-25 %75-85

Nişasta n-butanol gibi polar bir solvent ilavesi ile iki bileşenine ayrılabilir. Çözünmez amiloz yapıları çözünür amilopektin birimlerinden kolayca ayrılabilirler. Amiloz, α-1,4 glikozid bağları ile bağlanmış D-Glukoz birimlerinden oluşur, bu yüzden α-amilaz enzimi ile son derece yüksek düzeyde hidroliz olur. Bazı amilozlar bu enzimlerle tam olarak maltoza kadar parçalanamayabilirler. Binlerce glukoz molekülünün polimerizasyonu sonucu oluşmuş bu molekül, lineer yapının sıvı içerisinde kendi üzerine katlanmalar yapması ve amilaz enziminin sıvı ortamda

177 stabil olmaması nedeniyle, presipite olmaları ve hidrojen bağlarının etkisi sonucu irreversible agregatlar oluştururlar.

Şekil Ek 1.1: Amiloz (Ası,1996)

Amilopektin, nişastanın %75-85’ini oluşturur, moleküler ağırlıkları 107-108 arasında olup yaklaşık α-1,4 D-glukoz bağlanması yapan 20-25 birimde bir dallanma gösterirler. α-1,6 bağları ile dallanmalarda %4-5 oranında α-1,6-D-Glukozidik bağlara sahiptirler. Amilopektin kısmen dallanma gösterdiğinden sıvı içerisinde daha stabil olup agregat oluşturmaz. Nişastanın gıda endüstrisi dışında kullanıldığı alanların başında kağıt endüstrisi gelmektedir. Örneğin bir fotokopi kağıdında kullanılan nişasta %8’e kadar çıkabilmektedir. Ayrıca, kısmen jelatinize edilmiş nişasta karton imalatında oluklu orta tabakanın dış tabakalara yapıştırılması amacı ile yapıştırıcı olarak yaygın uygulama alanına sahiptir. Bunların yanısıra, sıcakla eriyen yapıştırıcıların (Hot-melt glues) yapımı, pul, zarf, kitap ciltleme işlemleri, normal ve suya dayanıklı etiketler, ağaç tutkalı ve sunta imalatı, kağıt keselerde yapıştırıcı ve katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Nişasta bu alanların dışında çocuk bezi imalatında, patlayıcı endüstrisinde bağlama ajanı olarak, otomotiv endüstrisi ve inşaat sektöründe beton blok bağlayıcılarda, yangına dirençli duvar blokları imalatında, asbest, kil ve kireç taşı katkı maddesi olarak, kontraplak ve sunta imalatında, ve boya dolgu maddesi olarak kullanılmaktadır. Metal endüstrisinde kum kalıpların bir arada tutulması, madencilikte cevher flotasyonu ve sedimentasyonunda, yağlı delik matkapları çamurunda kullanılmaktadır. Bu alanların dışında, kozmetik ve ilaç endüstrisinde toz

178 pudra yapımı, makyaj malzemelerinde, yüz kremlerinde, sabun üretiminde, tablet kaplamalarında yada tablet dolgu materyali olarak kullanılmaktadır. Ayrıca nişasta çürüyebilen (gerid önüşümlü) plastik filmlerde, kuru pillerde, deri cilalama işlemlerinde de kullanılmaktadır. (Ref: Functional properties of starches).

Şekil Ek 1.2: Amilopektin (Ası, 1996)

179 Ek 2 Selüloz (Cellulose) Selüloz, doğada en bol bulunan yenilenebilir bir biyopolimer olup yaygın olarak bitki hücre duvarlarında bulunur. Glikoz birimlerinin β-1,4 glikozidik bağlarla bağlanmasıyla oluşan polimerlerdir. Nişastadan farklı olarak düz bir zincir şeklinde olup herhangi bir sarmal yapı göstermez. Selüloz zincirleri hidrojen bağlari ile bağlanarak bir arada tutulurlar. Bazı durumlarda selüloz neredeyse saf olarak bulunur. Birçok durumda ise selüloz lifleri hemiselüloz ve lignin gibi diğer yapısal biyopolimerler arasına katılabilmektedir. Selüloz önemli bir özelliği diğer polisakkaritlerden farklı olarak kristal yapıda oluşturabilmeleridir. Doğada glikoz birimleri bir zincir halinde sentezlenirken biyosentez bölgesinde kendiliğinden birleşerek elementer fibril olarak adlandırılan yaklaşık 30 selüloz zincirinden oluşan birimlere dönüşür. Bunlar da daha geniş üniteler halinde paketlenerek mikrofibril denen yapıları oluştururlar. Mikrofibriller ise selüloz fibrillerini oluştururlar. Hidrojen bağları, zincirleri zincir içi ve zincirler arası bağlarla birbirlerine bağlar ve sert bir yapı oluşmasını sağlar.

Selülozun kristal tabiatı, atomların bir diğerine göre uygun pozisyonda bağlanması ile oluşan yapısal bir düzen ile elde edilir. Bu kristal yapı mikrofibrillerin düzenleri sayesinde enzim yada su gibi küçük moleküllerin girmesini önleyici bir paketleme şekli oluşturur. Kristal yapıya rağmen selüloz fibrilleri doğada her zaman saf kristal halde bulunmazlar. Kristal yapı zamanla değişir ve ikincil düzen şekline (amorf: biçimsiz) dönüşür. Kristal ve amorf bölgelere ilaveten selüloz fibrilleri dolaşmış yumak veya bükülmüş gibi bir çok düzensizlikler içerebilir.

Saflaştırılmış selülozlar önemli oranda yapısal özelliklerde değişkenlik gösterirler ve düşük yoğunluk arzederler. Mikrokristal yapıdaki selülozlar nerdeyse saf olup seyreltik asit uygulamaları ile hemiselüloz ve amorfoz bölgelerinin fibrilden uzaklaştırılması ile elde edilir. Saf selülozun değişen yapısal kompleksliği ve çözünmez substratlar ile çalışma zorluğu karboksimetil selüloz (CMC) adı verilen

180 çözünürlüğü yüksek selüloz eterinin kullanımının yaygınlaşmasına neden olmuştur (Lynd ve ark.2002).

Şekil Ek 2.1. Selüloz, β-D-glukoz polimeri (Ası, 1996).

Selüloz çeşitleri: Çözünmez (Insoluble) selülozlar Çözünmez selülozların başında pamuk, filtre kağıdı, bakteriyel selüloz, mikrokristal selüloz, amorf selüloz gibi saf olarak kabul edilebilecek selülozlar gelir. Saf olmayan selülozlara örnek olarak da boyanmış selülozlar, α-selüloz, ve ligno- selülozlar sayılabilir. Selüloz-I olarak tanımlanan doğal selülozların iki farklı kristal formu vardır. Iα bakteri ve alglerdeki selülozlarda çokça bulunur (Atalla ve

Vanderhart,1984). Iβ ise yüksek bitkilerde bol bulunan türüdür. Selüloz-I çeşitli işlemlerden geçirildikten sonra diğer kristal formlara (II-IV) da dönüştürülebilir. Pamuk lifleri selülozu, doğal pamuktan pektin, mumsu ve renk veren maddelerin uzaklaştırılması sonucu elde edilirler(Wood 1988). Whatman No.1 filtre kağıdı uzun pamuk lifleri hamurundan yapılır (Dong ve ark.1998). Hidroselüloz (hydrocellulose) yada avicel olarak adlandırılan mikrokristal selülozlar ise odun hamurunun hidroklorik asit muamelesi ile amorf selüloz fraksiyonların uzaklaştırılması ile elde edilir (Fleming ve ark.2001). Avicel exoglukanaz aktivite tayinleri için iyi bir substrattır. Bir çok araştırmacı avicelaz aktivitesini ekzoglukanaz aktivitesi ile eşdeğer tutmaktadır (Percival Zhang ve ark, 2006). Bakteriyel Selülozlar, Acetobacter xylinum(ATCC 23769) pelikülünden hazırlanır. Bakteriyel mikrokristal selüloz ise bakteriyel selülozdan asit hidrolizi ile amorf selüloz fraksiyonunun uzaklaştırılması sonucu elde edilir.

181 Amorf selüloz, selülozun mekanik veya kimyasal metotlarla kristal fraksiyonunun amorf forma dönüştürülmesi ile hazırlanır. Bunlar mekanik olarak hazırlanmış amorf selülozlar alkali ortamda şişmiş selülozlar ve fosforik asitle işlenmiş selülozları içerir. Farklı elde edilişlerinden dolayı hidroliz oranlarında da bir farklılık oluşur. Rejenere selüloz genellikle insoluble selülozların nitrik asit, sülfirik asit, amonyaklı kuprik hidroksil, 1-butil-3-metil imidazolium gibi selüloz solventleri ile sçözünür forma dönüştürülmesi ve bunu takiben fiziksel olarak çözünmez formun geri kazandırılması sonucu elde edilir. Rejenere amorf selülozlar (RAC) selülaz aktivite çalışmaları için uygun bir substrattır. Total selülazların hidroliz kabiliyetlerinin belirlenmesi amacı ile kullanılan ve referans olarak kabul edilen α- selüloz çok az miktarda hemiselüloz içeren selüloza verilen isimdir. Holoselüloz, lignini uzaklaştırılmış odunun katı kalıntısı olup, alkali ekstraksiyon ile hemiselülozun kısmen gideriminden sonra geriye kalan katı α- selüloz yapısıdır. Holoselülozun, çözünebilen, alkali ekstraksiyon materyalinin nötralizasyonundan sonra çözünmeyen fraksiyonu β-selüloz, çözünmüş fraksiyonu ise γ-selüloz adını alır. Boyanmış selüloz, Remazol Brillant Blue, Reactive orange, Reactive Blue 19, ve floresan boya aminofloressein gibi bazı çeşitli boyalarla selülozun karıştırılması sonucu elde edilen bir üründür.

Selüloz Türevleri: Selülozun hidroksil grupları birçok kimyasal bileşik ile kısmen yada tam olarak reaksiyona girebilir. Selüloz ester ve eterleri çok önemli ticari materyallerdir. Esterleri arasında film ve fiber oluşturan selüloz asetat ve selüloz triasetat’ın birçok kullanım alanı vardır. Inorganik ester olan nitroselüloz önceleri bir patlayıcı olarak kullanılırdı. Selülozun eter türevleri ise etilselüloz, metilselüloz, hidroksipropil selüloz, karboksimetil selüloz, hidroksipropil metil selüloz, hidroksietil metil selüloz şeklinde adlandırılırlar. Etil selüloz, kaplamalarda, mürekkeplerde, kontrollü ilaç salınım tabletlerinde kullanılan suda çözünmez ticari termoplastikdir.

182 Metil selüloz, soğuk suda çözünebilen ve jel yada şeffaf viskoz solusyon oluşturabilen hidrofilik selüloz türevidir. Birçok gıda ve kozmetik ürün içerisinde yoğunlaştırıcı olarak kullanılır, allerjik ya da toksik değildir. Emülsiyon etkisi ile karışımdaki iki sıvının birbirlerinden ayrılmasını önler. Hidroksipropil selüloz, hem suda hem de organic çözünürlüğü olan bir selüloz türevidir. Hidrofilik ve hidrofobik gruplara sahip olmasından dolayı düşük kritik çözünürlük sıcaklığına sahiptir. Diğer bir ifade ile 45°C nin altında çözünürken bu sıcaklığın üzerinde çözünmez. Klinik uygulamalarda yapay gözyaşı oluşturma, gıda katkı maddesi olarak ise kıvam artırıcı ve emülsiyon ajanı şeklinde gıda katkı maddesi olarak kullanılır. Karboksimetil selüloz (CMC), omurgayı oluşturan glikoz birimlerinin hidroksil gruplarının bazılarına karboksimetil gruplarının bağlanması ile oluşan bir selüloz türevidir. Kloroacetik asit ile selülozun alkali olarak katalizlenen reaksiyonu ile sentezlenir. Gıda endüstrisinde ve kozmetik sanayinde kullanılır. Hidroksipropil metil selüloz viskozite düzenleyicisi, jel, köpük ve dolgu maddesi olarak kullanılır. Hidroksietil metil selüloz ise selüloz film üretiminde kullanılmaktadır.

183 Ek 3 Ksilan (Xylan) Ksilan, β-1,4 bağları ile bağlanmış ksilopiranosil birimlerinden oluşan bitki hücre duvarlarında ana bileşen ve doğadaki en çok bulunan ikinci polisakkarittir. Ksilan, hemiselülozun yapısında mannan, galaktan ve arabinanın yanısıra ana bileşen olarak yer alır. Selüloz ve lignin ile beraber hemiselüloz yapısına katılan bir bileşen olarak bitki hücre duvarlarının ana kompozisyonunu oluştururlar. Hücre duvarı yapısında bu üç bileşen kovalent ya da non-kovalent bağlarla bir ilişki halindedirler. Ksilanın ya da hemiselülozun lignin ve selüloz arasına yerleşmesi selülozun bütünleşmesinin devamı ve selülaz degredasyonuna karşı liflerin korunması açısından önemlidir (Beg ve ark, 2001). Ksilan, ksiloz birimlerinin β-1,4 glikozidik bağlarla bağlanması ile oluşan bir omurgayı içeren kompleks bir polisakkarit olup ana zincir β-Ksilopiranoz (β- xylopyranose) birimlerinden oluşur. Sert odunlu bitkilerdeki ksilan 0-asetil-4-0- metilglukuronoksilan (0-acetyl-4-0-methylglucuronoxylan) dır. Bu polisakkarit 70 β- ksilopiranoz biriminden oluşur ve β-1,4 glikosidik bağlarla bağlıdır. Her 10 ksiloz biriminde bir ksiloz biriminin 2 numaralı karbonuna bir 4-0-metilglukuronik asit bağlanmıştır. Sert odunlu ksilanlar yüksek oranda asetilleşmiştir. Örneğin huş ağacı ksilanı 2 mol ksiloz başına 1 mol asetik asit içerir. Asetilasyon 2 numaralı karbondan (C-2) daha çok 3 numaralı karbonda (C-3 ) gerçekleşmektedir. Bu asetil grupların varlığı ksilanın su içinde kısmi çözünmesinden sorumludur. Eğer ksilan alkali ekstraksiyona maruz bırakılırsa asetil gruplar kolayca yapıdan uzaklaştırılabilir (Sunna ve Antranikian, 1997). Yumuşak odunlulardaki ksilan ise arabino-4-0- metilglukuroksilandan oluşur. Sert odunlulardan daha yüksek oranda 4-0- metilglukuronik asit içeriğine sahiptir. Bunlar 2 numaralı karbon atomunda (C-2) yerleşmişlerdir. Sert odunlulardakinin aksine yumuşak odunlulardaki ksilan asetillenmemiştir. Bunun yerine α-L-arabinofuranoz üniteleri ksilozun 3 numaralı karbon (C-3) atomuna α-1,3 glikozidik bağlarla bağlanmıştır (Puls ve Schuseil,1993). Bu arabinozil eklentileri ksiloz birimlerinin hemen hemen %12 sinde görülür (Wong ve ark, 1988). β-D-ksilopiranoz, 4-0-metil -α-D-glukuronik asit ve L- arabinofuranoz oranı 100:20:13 dür. Ksilanların çoğu ana ve yan zincirlerinde

184 değişen grupları içeren bir heteropolisakkarit olarak bulunur. Ksilanın ana omurgasındaki yaygın yer alan radikal gruplar asetil, arabinosil ve glukuronisil birimleridir. Diğer taraftan, oransal olarak ksiloz birimlerince zengin ksilanlar da vardır ve bunlar Homoksilan adını alır. Bu tip ksilanlar doğada çok yaygın olmayıp bazı çimenler, tütün sapları ve tohum kapçıklarından izole edilmişlerdir.

Şekil Ek 3.1: Ksilanaz Yapısı (Kulkarni ve ark,1999)

185 EK-4 İnce Tabaka Kromatografisi Plakalarının Hazırlanması

Şekil Ek 4.1: Cam Plakaların Şekil Ek 4.2: Silika Jel karışımının Yerleştirilmesi Hazırlanması

Şekil Ek 4.3:Silika Jel Karışımının Şekil Ek 4.4: Silika Jelin Cam Plakalar Yayma Aparatına Dökülmesi Üzerine Yayılması

Şekil Ek 4.5: Kuruyan Plakaların Şekil Ek 4.6: Plakaların Dikey Magazine Yerleştirilmesi Pozisyonda Aktivasyon için Fırına Yerleştirilmesi

Şekil Ek 4.7: İnce Tabaka Kromatografisinin Uygulanması

186