Vranka Pruhoploutvá, Rod Cottus, Haplotypy, Taxonomie, Fylogeneze, DNA Barcoding

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

Genetická diverzita vranky pruhoploutvé (Cottus poecilopus, Heckel, 1837) ve vodách Karpatského oblouku (hraniční oblast Baltského a Černého moře)

Disertační práce

Mgr. Eva Marešová

Školitel: Mgr. Jan Mendel, Ph.D. Brno 2017

Bibliografický záznam

Autor: Mgr. Eva Marešová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Genetická diverzita vranky pruhoploutvé (Cottus poecilopus, Heckel, 1837) ve vodách Karpatského oblouku (hraniční oblast Baltského a Černého moře)

Studijní program: Biologie

Studijní obor: Obecná a molekulární genetika

Vedoucí práce: Mgr. Jan Mendel, Ph.D. Ústav biologie obratlovců, AV ČR, v. v. i

Akademický rok: 2016/2017

Počet stran: 105

Klíčová slova: genetická diverzita, mitochondriální geny, cytochrom b, kontrolní oblast, COI, jaderný intron S7 r-proteinu, hybridizace, mikrosatelity, sekvenace, vranka pruhoploutvá, rod Cottus, haplotypy, taxonomie, fylogeneze, DNA barcoding

Bibliographic entry

Author: Mgr. Eva Marešová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis: Genetic diversity of the Alpine bullhead (Cottus poecilopus, Heckel, 1837) in the Carpathian arc (Baltic and Black Sea basins contact zone)

Degree Programme: Biology

Field of Study: General and Molecular Genetics

Supervisor: Mgr. Jan Mendel, Ph.D. Institute of Vertebrate Biology, Czech Academy of Sciences

Academic Year: 2016/2017

Number of Pages: 105

Keywords: genetic diversity, mitochondrial genes, cytochrome b, control region, COI, nuclear intron of the S7 ribosomal protein gene, hybridization, sequencing, Alpine bullhead, genus Cottus, haplotypes, taxonomy, phylogenetics, DNA barcoding

ABSTRAKT

Předkládaná dizertační práce vychází z malé lokální studie, která poprvé odhaluje vysokou vnitrodruhovou variabilitu vranky pruhoploutvé. Do té doby byl region střední Evropy považován za geneticky homogenní. Dizertace rozšiřuje molekulárně-genetické analýzy na celou hlavní oblast výskytu tohoto druhu a přináší nový pohled na taxonomii vranky a nové poznatky o vnitro- a mezidruhové diverzitě v oblasti Karpatského oblouku. Odhalili jsme dvě vysoce divergentní linie a vymezili území jejich výskytu. Skandinávská linie (I) pokrývá oblast povodí Odry a je pravděpodobně členem North European-West linie ze Švédska, což potvrdila i analýza COI genu (DNA barcoding). Všechny ostatní populace z povodí Dunaje, Visly a Dněstru náleží ke Karpatské linii (II), včetně typové lokality. Uvnitř obou linií byla zjištěna další diferenciace do sublinií Ia - Ib a IIa - IIf, kterou považujeme za projev zvýšené vnitrodruhové variability. Při začlenění linií I a II do euro-asijského komplexu C. poecilopus jsme zjistili nesrovnalosti v současné taxonomii tohoto druhu. K domnělému zástupci evropské vranky byla mylně přiřazena Skandinávská linie s populacemi z povodí Odry. Naopak, Karpatská linie s typovou lokalitou C. poecilopus vytvořila ve fylogenetickém stromě novou, zcela samostatnou větev komplexu. Tuto linii považujeme za korektního zástupce C. poecilopus s. stricto a povodí Dunaje, Visly a Dněstru za areál jejího rozšíření. Vybrané populace vranky pruhoploutvé byly společně s většinou druhů české ichtyofauny zapojeny i do mezinárodní iniciativy FISH-BOL. Na základě porovnání získaných sekvenčních vzorů a sekvencí všech druhů vranek v BoLD databázi bylo zjištěno propojení skandinávského a evropského regionu.

Součástí práce byla i analýza hybridních zón z povodí Odry a Moravy. Česká republika je prvním regionem ve střední Evropě, odkud byl popsán, publikován a geneticky charakterizován výskyt nativních hybridních jedinců vranky pruhoploutvé a obecné. Jedná se o hybridní zóny bez reprodukčních bariér, jelikož byli nalezeni, na základě mikrosatelitů, i zpětní kříženci. Dle analýz mtDNA byl zjištěn možný mateřský příspěvek obou vranek - obecné i pruhoploutvé, v hybridních událostech. Byly navrženy některé morfologické znaky k jejich identifikaci v terénu, meristické znaky pro odlišení hybridů od čistých druhů nebyly signifikantní. Pro spolehlivé určení hybridních jedinců byl doporučen komplexní přístup genetické i morfologické analýzy u intenzivně se křížících populací.

Pro taxonomický status Skandinávské linie jsme navrhli na základě získaných výsledků tři možné hypotézy. Než bude situace zcela vyjasněna, navrhli jsme u oderské populace zvážit přísnější ochranářský status, pro zamezení možné ztráty nově zjištěné unikátní variability v evropském areálu jejího výskytu.

ABSTRACT

This dissertation thesis is the continuation of a small local study, which first revealed the high intraspecific variability of the Alpine bullhead. Until then, the Central European region was considered genetically homogeneous. The dissertation extends molecular-genetic analyzes to the entire area of the species and brings new insights into the taxonomy of the bullheads and new insights into the intra and interspecies diversity of the Carpathian Arc. We have revealed two highly divergent lineages and have defined the territory of their occurrence. The Scandinavian lineage (I) covers the Odra basin and is probably a member of the North European-West lineage from Sweden, as confirmed by the DNA barcoding analysis. All other populations of the Danube, Vistula and Dniestr catchment areas belong to the Carpathian lineage (II), including the type locality. Within both lineages, further differentiation was found into sublineages Ia - Ib and IIa - IIf, which we consider to be an expression of increased intraspecific variability. When integrating our lineages into the Euro-Asian C. poecilopus complex, we found discrepancies in current taxonomy of the species. The Scandinavian lineage, with populations from the Odra river basin, was mistakenly associated with the supposed representative of the Alpine bullhead. Conversely, the Carpathian lineage, with the C. poecilopus type locality, created a new, completely separate branch in the phylogenetic tree of the complex. This lineage we consider a correct representative of C. poecilopus s. stricto and the Danube, Vistula and Dniestr basins the areas of its occurrence. Selected populations, together with most species of the Czech Ichthyofauna, have been involved in the international FISH-BOL initiative. Based on the comparison of samples with all species of bullheads in the BoLD database, an interconnection of the Scandinavian and European regions was found.

Part of the work was also the analysis of hybrid zones from the Odra and Morava basins. The Czech Republic is the first region in Central Europe where the occurrence of the native hybrids of the Alpine and Common bullheads was described, published and genetically characterized. These are hybrid zones without reproductive barriers as indicated by backcross hybrids based on microsatellites. According to mtDNA analyses, a possible maternal contribution of both – Alpine and Common bullheads, in hybrid events was found. Some morphometric traits have been suggested in order to identify hybrids in the field; meristical signs for distinguishing hybrids from pure species were not significant. However, for the reliable determination of hybrids, a comprehensive approach of genetic and morphological analyses is required in intensively hybridizing populations.

For the taxonomic status of the Scandinavian lineage, we suggested three possible hypotheses based on the obtained results from all analyses. Before the situation is fully clarified, we suggested stricter conservation status in order to prevent the possible loss of a newly discovered unique variability in the European area of its occurrence.

Poděkování Ráda bych poděkovala první školitelce RNDr. Věře Luskové, CSc a doc. Ing. Stanislavu Luskovi, CSc. za podporu a cenné rady do začátku a poté nynějšímu školiteli Mgr. Janu Mendelovi, Ph.D. za ochotu a pomoc při dokončení práce. Manželovi děkuji za trpělivost a vytvoření podmínek k dokončení studia. Tato dizertační práce byla řešena v rámci výzkumných projektů: VaV/SM/6/3/05 Ministerstva životního prostředí ČR a M200930901 finančně podporovaného z Programu interní podpory projektů mezinárodní spolupráce AV ČR, dále projektu VaV SPII2d1/9/07 Ministerstva životního prostředí ČR a projektu Grantové agentury Lesů ČR. Byla podpořena také projektem MSM6215648905 Ministerstva školství ČR.

OBSAH

1 ÚVOD ...... 11

2 PŘEHLED PROBLEMATIKY ...... 12

2.1 Stručná biologie a morfologie druhu ...... 12

2.2 Taxonomie a rozšíření ...... 13

2.2.1 Sudeto-karpatský region ...... 15 2.2.2 Severský region ...... 16 2.3 Evoluční diverzifikace sladkovodních vranek ...... 17

2.4 Ochranářský status vranky pruhoploutvé a terminologie ...... 17

2.4.1 Jednotky ESU (Evolutionary Significant Unit) a MU (Management Unit) . 18 2.5 Genetická diverzita ...... 18

2.5.1 Historie a současnost analýzy vnitrodruhové a mezidruhové diverzity ...... 20 2.6 Hybridizace ...... 23

2.6.1 Analýza hybridizace ...... 24 2.7 DNA barcoding ...... 25

2.7.1 Český projekt DNA barcoding (IFCZE) ...... 26 2.8 Nejvýznamnější genetické studie rodu Cottus ...... 28

3 CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE ...... 31

4 MATERIÁL A METODY...... 32

4.1 Sběr materiálu ...... 32

4.2 Morfologická a morfometrická analýza ...... 34

4.3 Izolace DNA ...... 37

4.4 PCR amplifikace a sekvenační analýza ...... 37

4.5 Amplifikace mikrosatelitů...... 39

4.6 Statistická analýza sekvenačních dat ...... 39

4.7 Fylogenetická analýza ...... 40

4.8 Analýza mikrosatelitů ...... 41

5 VÝSLEDKY ...... 43

5.1 Analýza genetické diverzity populací Karpatského oblouku ...... 43

5.1.1 Kontrolní oblast (control region, CR) ...... 43 5.1.2 Cytochrom b (cyt b) ...... 50 5.1.3 S7 ribozomální protein (1. intron, S7RP1) ...... 56 5.2 Taxonomická pozice jednotlivých populací i z typové lokality v rámci euro- asijského komplexu C. poecilopus ...... 57

5.3 DNA barcoding a porovnání výsledků s mezinárodní databází BoLD ...... 59

5.4 Analýza hybridních zón v povodí Odry a Moravy (Svratky) ...... 64

5.4.1 Morfologie a meristika ...... 64 5.4.2 Genetická charakterizace hybridních událostí...... 65 6 DISKUSE ...... 77

6.1 Diverzita populací Karpatského oblouku - popis linií I a II a jejich postavení v euroasijském kontextu...... 79

6.2 Genetická struktura linií I a II a genový tok mezi populacemi ...... 83

6.3 Taxonomický status Skandinávské linie ...... 84

6.4 DNA barcoding analýza a porovnání s mezinárodní databází BoLD ...... 87

6.5 Hybridní zóny v povodí Odry a Moravy a charakterizace hybridních populací ...... 88

7 ZÁVĚR ...... 92

SEZNAM ZKRATEK ...... 93

LITERATURA ...... 95

Žijeme v době velkého vymírání druhů, jehož příčinnou je hlavně člověk. Snaha států, vlád a různých organizací na poli ochrany životního prostředí a biodiverzity proto nabývá na intenzitě, což potvrdil i poslední kongres Mezinárodní agentury pro ochranu přírody (IUCN) na Havaji (IUCN World Conservation Congress). Na ochranu biodiverzity byla, a stále je přijímána řada opatření, nicméně pro její efektivní ochranu je nutná znalost všech jejích úrovní. IUCN rozeznává tři základní úrovně biodiverzity – ekosystémy, druhy a geny, nicméně v reálném prostředí má mnohem více úrovní. Genetická diverzita je již několik let nedílná součást celkové variability druhu. Identifikace a ochrana co nejvyššího počtu geneticky rozdílných populací uvnitř druhu by měla být prioritou, neboť zvyšuje jeho evoluční potenciál a tak snižuje riziko jeho vymření. Ochranářská genetika, jako vědní obor zabývající se genetikou populací a druhů ve spojitosti s jejich ochranou, nabývá proto na významu.

Ryby všeobecně, zejména pak vranka, patří mezi druhy s přirozeně vysokou mírou variability. Jejich závislost na prostředí je velká a proto každý neopatrný a nepromyšlený zásah do jejich přirozeného prostředí může mít fatální následky. Každá malá lokální populace je důležitá nejen pro celkovou funkci ekosystému, ale jejich znalost je zásadní také pro efektivní management (rybaření, translokace jedinců, reintrodukce, aj.), aby nedocházelo k nepřirozenému mísení unikátních populací, a tak ke ztrátě cenné diverzity. V neposlední řadě hraje roli i dostatek finančních prostředků. Někdy je třeba vybrat a upřednostnit jen některé populace či ochranářské jednotky, protože nelze chránit vše. Takovým příkladem může být evropská soustava NATURA 2000, jejímž cílem je zabezpečit ochranu druhů a typů přírodních stanovišť, které jsou z evropského pohledu nejcennější, nejvíce ohrožené, vzácné či endemické.

Při studiu variability se využívá celá řada přístupů a molekulárních nástrojů, kdy každý je vhodný pro studium určité úrovně biodiverzity. V naší práci jsme se snažili identifikovat a geneticky popsat většinu populací vranky pruhoploutvé ve střední Evropě. Chtěli jsme přinést nové poznatky z regionu, který je v současnosti považován za geneticky homogenní a který obývá více sympatricky se vyskytujících druhů vranek. Populace z hlavního areálu výskytu jsme chtěli studovat v euroasijském kontextu z důvodu pochopení jejich zvláštností a taxonomických souvislostí.

PŘEHLED PROBLEMATIKY

1.1 Stručná biologie a morfologie druhu

Vranka pruhoploutvá Cottus poecilopus, Heckel, 1837 (Obr. 1) je původní druh české ichtyofauny, obývající sladkovodní či brakické vody, především horské toky a říčky s kamenitým dnem (pstruhové vody) zasahující až do pramenných oblastí. Lze ji však nalézt i ve studených a dobře okysličených stojatých vodách. Množství kyslíku a tedy i teplota vody, je pro její přežití zásadní, stejně jako intenzita proudění a struktura dna. Tyto specifické nároky na habitat a její anatomická charakteristika ji nedovolují rozsáhlejší migrace. Uplatňuje se u ní tzv. pozitivní reotaxe (Nybelin 1969), tzn., má tendenci migrovat proti proudu, což limituje genový tok opačným směrem (po proudu). Teplota a množství kyslíku bývají během většiny roku relativně stabilní, ale intenzita proudění a struktura dna jsou náchylné ke změnám, což může vést až k vymizení druhu z lokality (např. při povodních). Tyto periodicky se opakující destrukce mohou být lokálně příčinou její nízké vnitropopulační variability (efekt zakladatele).

Obr. 1. Vranka pruhoploutvá Cottus poecilopus, Heckel, 1837

Zdroj:http://www.ittiofauna.org/webmuseum/pesciossei/scorpaeniformes/cottidae/cottus/cottuspoecilopus/cottus poecilopus_big.htm.

Protože nemá vytvořen plynový měchýř, pohybuje se krátkými poskoky a loví v okolí svého úkrytu. To je také příčinnou neschopnosti překonat jezy, vodopády a překážky vyšší jak 20 cm (Utzinger et al. 1998). Má vřetenovité tělo s velkou hlavou a velkými ústy. Hřbet je hnědý až zelenohnědý s drobnými skvrnkami pro dokonalé přizpůsobení se dnu. Dorůstá velikosti 15, vzácně až 20 cm. Charakteristickými znaky jsou zbarvení břišních ploutví, na nichž tmavé skvrnky splývají a vytvářejí výrazné tmavé příčné pruhy a jejich délka, která vždy dosahuje k řitnímu otvoru. Kůže je slizovitá bez šupin. Obvykle se dožívá 5 - 6 let.

Vranka pruhoploutvá nemá přímý hospodářský význam. Slouží jako potrava větších pstruhů, a pro svou citlivost ke znečištění a nedostatku kyslíku se uplatňuje jako významný bio-indikační druh horských a podhorských toků (Hanel and Lusk 2005).

1.2 Taxonomie a rozšíření

Systematické zařazení druhu je následující: říše: Živočichové (Animalia) kmen: Strunatci (Chordata) třída: Paprskoploutví (Actinopterygii) řád: Ropušnicotvární (Scorpaeniformes) čeleď: Vrankovití (Cottidae) rod: vranka (Cottus) druh: pruhoploutvá (poecilopus)

Rod Cottus (angl. bullhead, nebo také sculpin) je rozšířen prakticky po celé Evropě (16 druhů), kromě Kavkazu, jihu Itálie, Iberského poloostrova, Egejského a většiny Adriatického povodí. Dále se vyskytuje na Sibiři (9 druhů), ve východní Asii (11 druhů) a v Severní Americe (19 na pobřeží Severní Ameriky a 15 v jejím vnitrozemí; Goto et al. 2014). U takto rozšířeného druhu, navíc s velkým počtem fragmentovaných populací (jezera v Polsku, Rusku, v minulosti i v Německu), lze proto přirozeně očekávat vysokou vnitrodruhovou variabilitu. Ta je způsobena tendencí druhů k lokální adaptaci, jejíž příčinou je velmi nízká či žádná aktivita jedinců. Často proto dochází k izolaci areálů, či dokonce samotných populací (v jezerech), což vede k další divergenci uvnitř druhu. Ta je pak příčinou nejasné taxonomie a existence mnoha druhových komplexů (Englbrecht et al. 2000, Volckaert et al. 2002, Šlechtová et al. 2004, Kinziger et al. 2007, Yokoyama et al. 2008 aj.). Tato skutečnost je potvrzena několika studiemi, jež popisovaly nízkou vnitropopulační, ale vysokou vnitrodruhovou variabilitu u tohoto taxonu (Okamura and Goto 1996, Eppe et al. 1999, Kontula and Vainola 2001).

Dřívější autoři rozeznávali na základě morfologie a morfometrie několik druhů, či poddruhů vranek např. C. microstomus v povodí Visly v Polsku, C. g. microcephalus v jezeře Oněga v Rusku, C. ferrugineus v přítocích Adriatického moře, C. g. pellegrini v povodi Tisy na Ukrajině, C. pettiti z izolovaného toku ve Francii a další (Kottelat 1997). V Evropě však byly všechny uvedené druhy v minulosti považovány za lokální varianty vranky obecné C. gobio. Kottelat (1997) rozeznával kromě dvou tradičních druhů C. gobio a C. poecilopus,

další dva C. pettiti a C. ferrugineus, a diskutoval další potenciální druh C. haemusii v Bulharsku. Zároveň ale podotýkal, že je nutná další revize rodu Cottus a důkladné prozkoumání a srovnání všech materiálů, neboť dle severských studií jsou na základě morfologie zjevné dvě skupiny, které mají odlišnou migrační historii. Ke stejnému závěru došel také Witkowski (1995) na polských populacích z povodí horní a dolní Visly.

V přehledu sladkovodních ryb Freyhof et al. (2005) a kapitole věnované evropským vrankám, rozeznávají autoři na základě evolučního a fylogenetického druhového konceptu již 16 druhů vranek, z toho osm popsali nově. V případě evropských vranek je snaha vyřešit především nejasnou taxonomii vranky obecné (C. gobio; Witkowski 1995, Engelbrecht et al. 2000, Kontula and Vainola 2001, Volckaert et al. 2002, Knapen et al. 2003, Knaepkens et al. 2004, Kontula and Vainola 2004, Nolte et al. 2006, Vonlanthen et al. 2007, Neuenschwander et al. 2008), protože dle Kottelat (1997) by v tomto komplexu mohlo být doposud nerozpoznáno několik dalších nových druhů (cryptic species).

Dalším tradičně rozeznávaným druhem na evropském území je vranka pruhoploutvá (C. poecilopus, Heckel, 1837), která má mezi vrankami zvláštní postavení, dle autorů Kontula et al. (2003) není s žádným jiným druhem vranky blízce příbuzná. Dříve byly popisovány dvě variety - C. poecilopus var. macrostomus a C. poecilopus var. microstomus, obě z území Slovenska. Kdy varieta microstomus je homonymem k nyní platnému druhu C. microstomus, Heckel, 1837. Dříve Berg (1949) považoval druhy C. szanaga a C. kuznetsovi za synonyma C. poecilopus, ty však byly v roce 2009 vyčleněny z euro-asijského komplexu C. poecilopus jako platné druhy (Sideleva and Goto 2009). Nyní se nejčastěji jako areál výskytu vranky pruhoploutvé uvádějí dva regiony tzv. sudeto-karpatský a skandinávský a několik izolovaných populací např. jezero Hancza v Polsku, jezero Oněga a Ladoga v Rusku, izolovaná populace na severu Polska, či již vymizelé populace v Německu (Witkowski 1979; Obr. 2).

Na východě Evropy zasahuje až na asijský kontinent (Rusko - Sibiř), kde má status druhového komplexu (Yokoyama et al. 2008). Asijský komplex C. poecilopus obsahuje šest linií, které odpovídají geografickému rozšíření. Od roku 2009 získala každá z těchto linií druhový status, když Sideleva and Goto (2009) popsali na základě genetických poznatků, doplněných morfometrickou analýzou, tři nové druhy: C. szanaga, C. altaicus a C. kuznetsovi.

Na americkém kontinentu došlo v posledních letech k velké progresi v poznávání rodu Cottus, kdy vznikly studie, které pomohly více porozumět diverzitě tamních druhů (Kinziger and Wood 2003, Kinziger and Wood 2010, Dennenmoser et al. 2013, Day et al. 2014, Lemoine et al. 2014).

Obr. 2. Výskyt a rozšíření vranky pruhoploutvé na evropském kontinentu. Žlutě je vyznačen současný areál výskytu, červeně již neexistující populace z německých jezer. Z mapky je patrno rozdělení areálu na severský (I) a sudeto-karpatský (II).

Zdroj: http://maps.iucnredlist.org/map.html?id=5446

1.2.1 Sudeto-karpatský region

Do uvedeného regionu lze zahrnout státy střední Evropy, a to hraniční oblasti Polska, České republiky a Slovenska (dolní tok povodí Visly a Odry) a dále území Ukrajiny (povodí Dněstru) v rámci Karpatského pohoří (Obr. 2).

Česká republika

Vranku v ČR mimo dunajský systém uvádí poprvé Oliva (1949). Dosud je její výskyt omezen na povodí Moravy (úmoří Černého moře) a Odry (úmoří Baltského moře), v povodí Labe (úmoří Severního moře) se nevyskytuje (Obr. 3). V povodí Moravy je rozšířena v horním úseku vlastního toku a pramenných oblastech především levostranných přítoků (Hanel and Lusk 2005). Velmi omezený je výskyt v povodí Dyje, kde obývá potok Fryšávka s výskytem v přilehlé části řeky Svratky (Lusk 1993) od ústí až po pramennou oblast Loučky (Bobrůvka). Na základě genetických analýz tento druh není pro povodí Svratky původní, pravděpodobně byl zavlečen s násadami pstruha obecného z populací v povodí Moravy (Lusk et al. 2008). V povodí Odry najdeme vranku v potocích Beskyd a Jeseníků (Lojkásek and Lusk 2000).

Obr. 3. Výskyt vranky pruhoploutvé v České republice. Barvami jsou odlišena jednotlivá úmoří. Elipsy vyznačují areál rozšíření v povodí Odry a Moravy, černými tečkami jsou zaznačeny nepůvodní populace v povodí Svratky.

Slovensko

Na Slovensku je vranka pruhoploutvá rozšířena v povodí Dunaje, Tisy (úmoří Černého moře) a v tocích směřujících na sever do úmoří Baltského moře (Koščo and Pekárik 2007). Nachází se zde také typová lokalita. Jedná se o potok (pravděpodobně Červený) v povodí Visly v podhůří Vysokých Tater nedaleko Vel’kého Slavkova a Kežmaroku (Heckel 1940).

Polsko V Polsku je vranka pruhoploutvá rozšířena na jihu, zejména v severním okraji Karpatského oblouku, v horských tocích v dolních částech povodí Visly, Odry a Dněstru. Izolovaný je pak výskyt v tocích a jezerech v severovýchodní přímořské části Polska např. jezero Hancza (Witkowski 1979). Podle některých morfologických studií (Witkowski 1979, Witkowski 1995) jsou v povodí Visly přítomny dvě linie (horní a dolní povodí Visly) s odlišnou migrační historií, zde je potřeba genetických analýz pro potvrzení této skutečnosti. V roce 2005 byla nově zjištěna populace v povodí Odry na severu Polska (z pobřeží Baltského moře), která je dle morfologických analýz velmi podobná jedincům ze Skandinávie (Radtke et al. 2005).

1.2.2 Severský region

Výskyt vranky je uváděn ve státech Norska, Švédska i Finska, kde je několik izolovaných populací v potocích v jižním Finsku a některých finských jezerech. Nevyskytuje se v řekách ústících do Baltského nebo Barentsova moře. Dále je přítomna v povodí Skjernaa v Dánsku. Kontula (2003) uvádí ve Skandinávské oblasti dvě linie lišící se evoluční historií, reprezentující dvě odlišné cesty kolonizace poloostrova z kontinentální Evropy. V tomto

regionu byla také podrobně zkoumána hybridizace C. poecilopus x C. gobio (Andreasson 1968, Nymann and Westin 1968, Andreasson 1969).

1.3 Evoluční diverzifikace sladkovodních vranek

Z fylogenetického hlediska mají sladkovodní vranky polyfyletický původ a pravděpodobně se vyvinuly ze svých mořských předků. Vyskytují se v Euroasii, Japonsku a Severní Americe. Sladkovodní vranky jsou v rámci čeledi, kde jsou především mořské druhy, vysoce specializovanou skupinou, kdy buď celý životní cyklus (fluviální druhy), nebo alespoň jeho část (diadromní druhy), probíhá ve sladkých nebo brakických vodách (Goto et al. 2014). Evoluční hypotéza přechodu ze slané do sladké vody byla navržena nejen dle genetických studií, ale také na základě znalostí o ontogenetickém vývoji a fyziologických vlastnostech amfidromních a fluviálních druhů. Aby mohlo dojít ke změně životního cyklu, byla nutná změna velikosti vajíček, tedy následně larev, nebo získání tolerance larev ke sladké vodě. Naopak u druhů, žijících převážně ve sladkých vodách (anadromní druhy), byla ponechána od mořských předků tolerance k vodě slané (Goto et al. 2014).

1.4 Ochranářský status vranky pruhoploutvé a terminologie

Dle poslední verze Červeného seznamu IUCN (3.1) je tento druh zařazen v kategorii „málo dotčený“ (LC - least concern), což platí lokálně i pro Slovensko (Koščo and Holčík 2008), kde je hojně se vyskytujícím druhem. V Polsku je uváděn jako zranitelný (VU - vulnerable) dle Witkowski et al. (2009). Na našem území je dle poslední verze českého Červeného seznamu (Lusk et al. 2011a) řazena do kategorie „téměř ohrožený“ (NT - near threatened), ale ještě v předchozí verzi (Lusk et al. 2006) byla hodnocena jako „zranitelná“. Lze tedy pozorovat pozitivní trend ve výskytu vranky v uplynulých desetiletích. Lusk et al. (2008) uvádí, že rozšíření vranky pruhoploutvé není negativně dotčeno rybářským obhospodařováním toků, které jsou využívané pro odchov násad pstruha obecného, ani úpravami toků prováděnými v dřívějších obdobích. Naopak, stabilizace dnových sedimentů štěrkovitého charakteru v souvislosti s úpravou koryta měla pozitivní vliv na početnost její populace.

Vranka Cottus poecilopus nepatří k bezprostředně ohroženým rybím druhům v Evropě, ani lokálně v jednotlivých státech. Přesto na některých lokalitách v minulosti došlo k jejímu vymizení (jezera v Německu) a je proto důležité poznat a chránit každou lokální populaci, jež by mohla nést jedinečnou variabilitu.

1.4.1 Jednotky ESU (Evolutionary Significant Unit) a MU (Management Unit)

Definice a identifikace taxonomických a ochranářských jednotek je zásadní ve snaze o účinnou a dostatečnou ochranu biologické diverzity. Přesná identifikace potřebných populací je nutná, aby mohly být záchranné programy dostatečně účinné a nedošlo k vymizení populací s jedinečnou variabilitou (Allendorf et al. 2003). Je ovšem třeba nepodlehnout snaze chránit téměř vše, co je odlišné. Pojem druhu, či poddruhu je již na poli ochranářském nedostatečný, proto je trendem zabývat se i souvislostmi mezi populacemi a jejich prostředím.

Stále více se využívá ochranářských jednotek ESU a MU. Termín ESU byl poprvé použit Ryderem (1986). Stejně jako je více druhových konceptů, se kterými je spojena řada polemik, co se týče jejich užívání a aplikovatelnosti, tak je i několik definicí pro jednotku ESU. V naší práci vycházíme ze dvou definic: 1) Waples (1991), který poprvé učinil detailní popis jednotky a jehož požadavky byly a) dlouhodobá reprodukční izolace - taková, že ESU reprezentuje výsledek jedinečných evolučních událostí, které nejdou zvrátit, b) ekologická a adaptivní jedinečnost - taková, že jednotka ESU je rezervoárem genetické a fenotypové variace, která je důležitá pro budoucí evoluční události.

2) Definice dle Fraser and Bernatchez (2001) říká:

„A lineage that demonstrates highly restricted gene flow from other such lineages within the higher organizational level (lineage) of the species.”

V rámci jednotky ESU je pro krátkodobý management rozlišována jednotka MU, zpravidla pro subpopulace (Palsboll et al. 2007). MU jednotka by měla reprezentovat populaci důležitou pro přežití ESU, či celého druhu. U obou jednotek ještě neproběhla dlouhodobá nezávislá evoluce, či vysoká míra diferenciace (Allendorf et al. 2013). I když jsou různá kritéria pro identifikaci těchto jednotek, hlavní společné principy jsou: reprodukční izolace (absence genového toku), adaptivní diferenciace a shoda různých typů dat (genetické, morfologické, geografické, life history). Obecně je platné, že čím více odlišných technik vykazuje stejné výsledky, tím je větší podpora pro status ESU jednotky (Allendorf et al. 2013).

1.5 Genetická diverzita

Ve svých publikacích jsem uváděla rozličné statistiky a populační parametry a zde uvádím jejich stručné definice.

Celková genetická diverzita druhu (HT) se nejčastěji rozděluje na dvě základní úrovně:

1. Genetické rozdíly mezi jednotlivci uvnitř jedné populace (někdy označováno též jako subpopulace) - vnitropopulační diverzita.

2. Genetické rozdíly mezi populacemi (subpopulacemi) v rámci jednoho druhu - mezipopulační diverzita. Jedním z nejstarších, ale také nejčastěji používaných

parametrů pro měření genetické variability mezi populacemi je hodnota FST. Jedná se o parametr F-statistiky, která byla vyvinuta k matematickému popisu genetické variace v přírodních populacích (Wright 1931). F-statistika měří deficit heterozygotnosti vzhledem k očekávané heterozygotnosti v panmiktické populaci při stejných alelových

frekvencích. FST nabývá hodnot od 0 (alelové frekvence mezi populacemi jsou stejné)

do 1, kde mezi populacemi jsou fixovány různé alely. Proto bývá FST označován také

jako fixační index. Analogem v případě užití markerů s více alelami je GST index u

alozymů, či RST index u mikrosatelitů.

Další hojně využívanou metodou měření rozdílů mezi populacemi je genetická vzdálenost. Používá se mnoho algoritmů, jedním z nejstarších je tzv. Nei’s genetic distance (D, Nei 1972), která je ale vhodná spíše pro měření mezi neizolovanými populacemi (Paetkau et al. 1997).

Fenomén tzv. vnitrodruhové, či genetické diverzity začal hrát v posledním desetiletí významnou roli v poznávání a ochraně druhů. Ta je dle IUCN (International Union for Conservation of Nature - Mezinárodní svaz ochrany přírody) jednou ze tří forem biodiverzity zasluhující legislativní ochranu, společně s druhovou diverzitou a diverzitou ekosystémů. Genetická diverzita je významná především pro přežití druhu jako takového (druhy s vyšší genetickou diverzitou mají vyšší fitness, tedy vyšší šanci přizpůsobit se měnícímu se prostředí a přežít), v tomto případě se jedná o studium evolučního potenciálu populací, či druhu do budoucna (evoluční biologie). Umožňuje nám ale také vhled do současné vnitropopulační, či mezipopulační struktury (populační genetika) nebo do evoluční historie druhu (fylogenetika). Proto je snaha u všech druhů popsat tuto složku rozmanitosti, abychom dostali co nejvěrnější obraz jejich historie, ale i přítomnosti a očekávaného trendu v budoucnosti.

Speciálním pojmem je fylogenetická diverzita, která odráží genetickou divergenci mezi taxony ve fylogenetickém stromě. Zjištěná fylogeneze je odraz proběhlého evolučního procesu, což nám umožní interpretaci současného stavu genetické diverzity a umožní nám přijmout kroky vedoucí k maximálnímu uchování biodiverzity do budoucna (Faith 2008).

Genetická variace mezi populacemi je výsledkem dvou protichůdných procesů, a to náhodného genetického driftu, který je příčinou divergence populací a probíhajícího genového

toku, díky kterému dochází k výměně genů mezi populacemi a tedy k jejich homogenizaci. Genový tok snižuje mezipopulační variabilitu, ale naopak zvyšuje variabilitu vnitropopulační. Další silou, která přispívá do celkové variability, je přírodní výběr. Ten ovšem na rozdíl od předchozích procesů neovlivňuje všechny lokusy stejně.

Mezi jednotlivými druhy jsou značné rozdíly ve vnitrodruhové variabilitě. Míra fragmentace druhu (population subdivision) přímo souvisí s jeho evolučním potenciálem, tedy schopností adaptovat se na měnící se prostředí (Allendorf et al. 2013). V případě nulové populační struktury, tedy vysokého genového toku mezi populacemi, není šance vytvořit rozdílné genotypy pro případné lokální adaptace. V opačném extrémním případě, pokud je genový tok nulový, nemůže dojít k rozšíření výhodných mutací do všech populací. Nejvyšší evoluční potenciál má proto intermediální struktura, kde dochází k vyvážení genového toku a genetického driftu.

Znalost populační struktury je ale také klíčová pro identifikaci jednotek v rámci ochranářského procesu. V případě translokace jedinců z geneticky jedinečné populace na nevhodnou lokalitu může dojít ke ztrátě genetické biodiverzity. Příkladem nevhodného přesunu může být právě vranka pruhoploutvá. Doporučujeme na základě zjištěných rozdílů mezi populacemi v povodí Odry a Moravy neprovádět přesuny mezi těmito povodími, aby nedošlo k zániku jedinečné genetické struktury, která byla v povodí Odry objevena (Mendel et al. 2012a).

1.5.1 Historie a současnost analýzy vnitrodruhové a mezidruhové diverzity

Morfologie a morfometrie

Před rozmachem genetických metod byly hlavním nástrojem identifikace čistých druhů i kříženců metody morfologické a morfometrické, které se zabývají především fenotypem jedince. Morfologie sleduje přítomnost, či nepřítomnost určitého morfologického znaku, případně jeho počet, tvar nebo umístění na těle. Morfometrie pak tyto znaky popisuje metricky. Na poli laboratorním jsou spolu s genetickými metodami nedílnou součástí komplexního identifikačního přístupu, ale přímo v terénu jsou zatím stále jedinou a také nejlevnější možností identifikace jedinců.

Chromozomy a proteiny

Na počátku 20. století se začaly zkoumat genetické příčiny změny fenotypu, a to nejprve analýzou chromozomů a proteinů. Jednalo se o stanovení počtu chromozomů, sestavování karyotypů, výzkum chromozomových aberací nebo pohlavních chromozomů.

Z genetických metod se jako první začaly uplatňovat metody biochemické genetiky. Analýza alozymů pomocí škrobové elektroforezy umožnila najednou poměrně rychlé zhodnocení genetické variability u velkého počtu druhů (různé formy jednoho enzymu, lišící se elektromobilitou). Tato metodika se udržela dlouhých 40 let (Lewontin 1991) a je stále využívána i v současnosti, např. při analýzách hybridně polyploidního komplexu sekavců (Janko et al. 2007), při testování národních genetických zdrojů v chovných zařízeních, pro první identifikaci jedinců, v případě zcela neznámého taxonu (Close and Gouws 2007), atd. Alozymy je možné považovat za první genetický marker pro studium genetické variability populací. Má však svá omezení: invazivní charakter odběru tkání a nemožnost využívat odumřelé tkáně (nutný aktivní enzym). Metoda také neodhalí mutace v primární struktuře DNA, při kterých nedochází ke změně sekvence aminokyselin v proteinu (synonymní substituce, mutace v nekódujících oblastech). I díky těmto podstatným nevýhodám byla analýza alozymů postupně nahrazována molekulárně-genetickými metodami zabývajícími se přímo analýzou DNA sekvencí pomocí metody PCR.

DNA markery

Objev metody PCR Karl Mullisem znamenal v 80. letech minulého století revoluci v molekulární biologii. Bylo umožněno namnožit vybraný úsek DNA rychle a efektivně, což vedlo k širokému uplatnění v mnoha odvětvích biologie. DNA genetických markerů je celá řada, já uvedu především ty, se kterými jsem pracovala. Všechny patří do tzv. single-copy lokusů.

Mitochondriální genetické markery (mtDNA marker)

Z důvodu snadné izolace (malá molekula ve vysokém počtu kopií) byly použity pro studium DNA variability jako první. Mitochondriální DNA (mtDNA) je charakterizována obvykle absencí rekombinace a zároveň vysokou mutabilitou, a tedy rychlou evolucí. Tyto markery jsou proto vhodné především pro analýzu vnitro- a mezidruhové diverzity, tj. zejména identifikaci jedinců nebo fylogeografii. Zpravidla jsou děděny uniparentálně, a to většinou po mateřské linii, proto jsou hojně využívány k identifikaci mateřského příspěvku u hybridních jedinců. Pro mtDNA je charakteristický také jev, který se označuje jako heteroplazmie - přítomnost více než jednoho genotypu v buňce.

K nejvíce využívaným mt genům při studiu ryb patří geny pro kontrolní oblast D smyčky (CR nebo také D-loop; Yokoyama and Goto 2002, Shedko and Miroschnichenko 2007, Yokoyama et al. 2008, Day et al. 2014), pro cytochrom b

(Kontula 2003, Marešová et al. 2011), cytochrom c oxidasu (studie DNA barcodingu) a mnohé další, např. pro podjednotky enzymů ATPázy (Kontula et al. 2003, Kinziger et al. 2005) nebo geny pro podjednotky rRNA (Yokoyama and Goto 2005) či geny pro jednotlivé tRNA (Smith and Wheeler 2004).

Jaderné genetické markery

U jaderných markerů se v ichtyologii využívají dvě základní kategorie a to regiony kódující a nekódující. Z nekódujících oblastí, tedy těch, co se nepřepisují do proteinů, se nejvíce využívají repetitivní sekvence (mikrosatelity; Dudu et al. 2011, Marešová et al. 2012, Mendel et al. 2012b), introny (např. 1. intron S7 r-proteinu; Mendel et al. 2008, Stierandova et al. 2015), či ITS sekvence (sekvence mezi podjednotkami rRNA). Tyto oblasti jsou více náchylné k mutacím, využívají se proto především v populačních otázkách, ale také fylogenetice na druhové úrovni. Specifickým případem je analýza a užití mikrosatelitů, jež je detailněji popsána v kaptitole o hybridizaci (2. 6). Z kódujících oblastí se amplifikují exony, tedy části genu, které se přepisují do mRNA a následně do proteinu. Zde se obraz proběhlé evoluce zapisuje mnohem déle, proto jsou vhodné především pro studium na úrovni vyšších taxonů, např. u fylogeografie rodů (Smith and Wheeler 2004).

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Jednonukleotidové polymorfismy (SNP) jsou nejrozšířenějším typem polymorfismu v genomu, kdy jeden připadá na každých 200-500 bp (Morin et al. 2004). Jsou to bialelické markery, proto na jedné pozici u jedince mohou být nejvýše dva stavy. Častěji dochází ke vzniku tranzicí oproti transverzím, což je kromě chemických a fyzikálních důvodů dáno i tím, že vedou jen k tichým mutacím a nejsou tak pod vlivem selekčního tlaku. U zcela neznámých druhů je nutno provést screening (sekvencování) velkého počtu lokusů a jedinců, což ale v dnešní době celogenomového sekvencování (NGS) přestává být zásadním problémem. Protože se vyskytují v kódujících i nekódujících oblastech genomu, jejich využití je velmi široké v ochranářské, forenzní nebo populační genetice (struktura, genový tok, demografická historie). Zde je výhodou snadnější analýza malého nebo degradovaného množství DNA, kdy pro analýzu je dostačující délka 50 bp (Allendorf et al. 2013). Z výše uvedených důvodů se SNP analýza stává žádanou analýzou současnosti.

Je důležité poznamenat, že neexistuje univerzální marker, či metoda. Vždy je zásadní, jaký je cíl studie a jaké jsou k dispozici informace o genetice studovaného objektu. Tento fakt krásně vystihuje přirovnání:

„The toolkit of a molecular geneticist is analogous to the toolbox of a carpenter. Whether a hammer or power screwdriver is the best tool depends on whether you are trying to drive in a nail or set a screw.”

Allendorf et al. 2013

1.6 Hybridizace

Mezidruhové křížení je v přirozeném prostředí navzdory předpokladům častým jevem u ryb, a to u sympatricky, či parapatricky se vyskytujících druhů, kde dochází k trvalému nebo dočasnému překrytí areálů. Dříve se však mělo za to, že tento proces je spíše náhodným jevem, protože hybridní jedinci jsou většinou neživotaschopní nebo sterilní. Někteří hybridi jsou ovšem plně, či částečně plodní (dochází tak ke vzniku hybridních zón). Ti mohou být výsledkem křížení mezi nedávno divergovanými druhy, u kterých ještě nedošlo plně k vytvoření reprodukčních bariér a/nebo jejichž nároky ekologické, či reprodukční jsou podobné. Hybridizace je tak jeden z faktorů, jež umožňuje genový tok mezi druhy a napomáhá zvyšování vnitrodruhové genetické variability (Mallet 2007). Pokud je tedy reprodukční izolace mezi druhy konečným stadiem speciace, můžeme hybridní jedince považovat za určitý mezistupeň na cestě k divergenci. Analýza těchto procesů pak může pomoci v pochopení faktorů, jež ovlivňují divergenci linií (Nolte et al. 2006). Hybridní zóny se tak mohou stát „přírodními laboratořemi“ pro studium počátečních fází speciace, či adaptace (Sweigart 2009). Většinou v těchto zónách dochází k selekci proti hybridům, ale v některých případech jsou stabilní a přetrvávají dlouhou dobu, kdy dojde k vyvážení selekce a šíření parentálních genotypů (Harrison 1993).

V případě, že díky hybridizaci dojde ke vzniku nové, reprodukčně izolované populace, mluvíme o tzv. hybridní speciaci (Mallet 2005). Částečným příkladem může být hybridizace mezi původním (C. rhenanus) a invazivním (C. perifretum) druhem vranky pro povodí Rýna. Nolte et al. (2006) zjistili, že invazivní linie je morfologicky i geneticky podobná druhu Cottus perifretum, přirozeně se vyskytujícím v Holandsku, ale obsahuje i fragmenty DNA z původního druhu pro povodí Rýna C. rhenanus. Jedná se pravděpodobně o výsledek křížení mezi těmito druhy, ke kterému došlo po propojení povodí Sheldt a Rýn umělým kanálem cca před 200 lety. Tato hybridní populace vykazuje stabilitu a udržuje si svou genetickou integritu oproti rodičovským druhům, i když její izolace je pouze geografická a určitý genový tok s rodičovskými druhy stále probíhá. Je příkladem hybridizace, kdy hybridní jedinci získali novou vlastnost, a to potenciál osídlit nový biotop (Gross and Riesberg 2005).

Hybridizace uvnitř rodu Cottus je častým jevem díky podobným ekologickým a reprodukčním nárokům jednotlivých druhů. O křížení mezi druhy C. poecilopus a C. gobio spekulovali již dřívější autoři na základě morfometrie a morfologie, Zelinka (1951) na řece Vsetínská Bečva a Čihař (1969) na řece Morávka. Také na Slovensku se domníval Mahen (1927) dle morfologie, že mohl zachytit hybrida na řece Váh. Nicméně jediný nativní potvrzený výskyt byl až dosud ze Švédska (Nyman and Westin 1968), i když Andreasson (1968) a Andreasson (1969) prokázali již dříve existenci hybridů experimentálně.

Dobře prostudována je hybridizace v severských zemích ve Finsku a Švédsku mezi tamními druhy C. gobio a C. koshewnikowi (Kontula and Vainola 2001, Kontula and Vainola 2004), posledně jmenovaný byl vyčleněn z komplexu C. gobio jako nový druh. Tyto druhy reprezentují dvě odlišné linie postglaciální kolonizace severní Evropy, které se dostaly do kontaktu na pobřeží Botnického zálivu.

Spekuluje se i o dalších, dosud nepotvrzených hybridních zónách. Např. mezi druhy C. gobio a C. koshewnikowi ve východní části Baltského povodí, nebo mezi C. gobio a C. microstomus v povodí Odry (Freyhof et al. 2005).

1.6.1 Analýza hybridizace

Stejně jako u identifikace jedinců, se i v případě prokázání hybridizační události nejdříve uplatňovaly metody morfologické. Předpokládalo se, že fenotyp hybrida bude intermediální mezi oběma rodiči (Smith 1992), dnes však již víme, že ve většině případů toto neplatí. V případě několikanásobného zpětného křížení nelze hybridní jedince fenotypově odlišit od rodičů (v tzv. hybridním hejnu) a navíc také morfologie nedokáže odlišit jednotlivé generace křížení. Ty nám pomohou zjistit, jak dlouho v konkrétní lokalitě ke křížení dochází (přítomnost zpětných kříženců a absence F1 hybridů a parentálních genotypů indikuje dlouhodobé křížení). K průkazu hybridizace se pak využívala převážně metoda alozymové analýzy, jež je dnes nahrazována analýzou jaderných lokusů. I přesto, že genetické metody přinesly velký potenciál pro studium hybridizace, stále je rozlišení rodičů od F2 generace a zpětných kříženců velmi obtížné. Dle Boecklen and Howard (1997) je pravděpodobnost rozlišení BC-5 od rodičů při použití 30 mikrosatelitových lokusů něco málo přes 30 %.

Mikrosatelity

Též nazývané VNTR lokusy (variable number of tandem repeats), SSR sekvence (single sequence repeats) nebo STR (short tandem repeats) se skládají z krátkých repetitivních sekvencí, jejichž počet se liší mezi jedinci i uvnitř populace. Délka repetice je obvykle 2 - 5

bp a dělíme je na dokonalé (bez přerušení) a nedokonalé (repetice je přerušena jiným nukleotidem), nebo složené z více typů repetic. Počet opakování kolísá mezi 5 až 100 (Allendorf et al. 2013). Vyskytují se po celém genomu, zpravidla však v nekódujících oblastech (telomery, centromery, introny). Jednou z příčin jejich vysoké mutability je tzv. DNA slippage (sklouznutí), kdy při replikaci dochází díky přítomnosti repetic ke sklouznutí DNA polymerázy po řetězci zpravidla o jednu jednotku. Výsledkem je jiný zpravidla nižší počet opakování. Druhým mechanismem vzniku nestejného počtu opakování je nerovnoměrný crossing-over při rekombinaci, kdy na jedné chromatidě vzniká delece a na druhé inzerce.

Jejich výhodami jsou kodominantní dědičnost, vysoká mutabilita, nebo konzervativnost přiléhajících míst (flanking regions), na která se designují primery, jež jsou díky tomu využitelné i pro příbuzné druhy (cross-amplifikace). Naopak problémem mohou být nulové alely, které se neamplifikují v důsledku vzniku mutace v primerovém místě. Takoví jedinci se v důsledku toho jeví jako homozygotní a v populaci může docházet k přebytku falešných homozygotů (excess of homozygotes). K možným rizikům při vyhodnocování patří také existence jevu tzv. short allele dominance nebo sttuter píky, které mohou být zaměněny se skutečnou alelou. Existují však programy, které jsou schopny tyto problémy detekovat.

1.7 DNA barcoding

V posledním desetiletí vznikla snaha zmapovat diverzitu všech organismů na Zemi, přičemž ideální nástroj poskytly metody molekulární genetiky. V roce 2003 přišel kanadský profesor Paul D. N. Hebert z Biodiversity Institute of Ontario s myšlenkou, využít k tomuto zmapování mitochondriální gen pro podjednotku I cytochrom c oxidasy (COI). Mutační rychlost genu se jevila dost vysoká pro vznik rozdílů mezi druhy, a naopak dost nízká na to, aby bylo možno identifikovat jedince patřící ke stejnému druhu (Mendel et al. 2012a). Každému jedinci, jemuž je osekvenován COI gen a je vložen do databáze BoLD (Barcode of Life Database), je přiřazen po splnění určitých kritérií tzv. DNA barkód. Vzniká tak pozvolna celosvětová databáze DNA barkódů, do které přispívají vědci z celého světa. K dubnu 2017 je v databázi 5 374 045 barkódů pro 264 240 druhů.

Myšlenka DNA barkódu je založena na principu podobnému EAN kódu u zboží (Hebert et al. 2003a; Obr. 4). Ten se skládá z 11 pozic, přičemž na každé může být 10 číslic, je to tedy 1011 kombinací. Přesto, že DNA barkód má jen 4 varianty na jedno místo, je několikanásobně delší (cca 650 bp, Obr. 4). Přes některé skeptické hlasy, nakonec řada studií potvrdila, že COI je vhodným markerem pro daný účel. Hebert et al. (2003b) provedli analýzu COI genu mezi

blízce příbuznými druhy z 11 kmenů a ukázalo se že, kromě jednoho, lze DNA barcoding využít pro rutinní identifikaci druhů. Po realizaci a vyhodnocení mnoha studií byl pro vnitrodruhovou variabilitu (tedy druhovou hranici) navržen limit 2 % divergence mezi jedinci, a pravidlo, že vnitrodruhová variabilita by měla být 10x nižší než variabilita mezi potenciálními druhy (Hebert et al. 2004).

V rámci projektu DNA barcoding byla v roce 2005 založena iniciativa FISH-BOL, která má za cíl zmapovat všechny druhy ryb na Zemi, a to právě prostřednictvím DNA barkódů. Každý vložený vzorek má v databázi stránku s podrobnými údaji tzv. “specimen page“ (lokalita nálezu vč. GPS souřadnic, fotografie, morfometrie, morfologie, taxonomie) a “sequence page“ (Obr. 5; COI sekvence, příp. barkód, AMK sekvence, primery).

Obr. 4. Ilustrativní EAN kód a DNA barkód (vranka pruhoploutvá, projekt IFCZE - Ichthyofauna of the Czech Republic).

1.7.1 Český projekt DNA barcoding (IFCZE)

Naše vědecká skupina realizovala v letech 2009 - 2011 celostátní projekt: „Inventarizace molekulární biodiverzity ichtyofauny ČR (IFCZE, Ichthyofauna of the Czech Republic), který byl jedním z prvních projektů barcodingu v Evropě. Podílel se na něm Ústav biologie obratlovců AV ČR se Zoologickým oddělením Národního muzea v Praze. Cílem projektu bylo moderními molekulárními metodami zmapovat a popsat genetickou diverzitu většiny

původních i nepůvodních druhů ryb a připravit novou ucelenou druhovou sbírku. Navíc u nich byla provedena i jaderná sekvenace pro zjištění rozsahu hybridizačních událostí na českém území.

Obr. 5. Sequence page vranky pruhoploutvé v BoLD databázi (projekt IFCZE).

1.8 Nejvýznamnější genetické studie rodu Cottus

Pasko L. and Maslak R. 2003: Genetics of the peripheral populations of the alpine bullhead, Cottus poecilopus (Scopraniformes, Cottidae) in Poland. J. Zool. Syst. Evol. Research 41: 196-204.

Genetická studie vranky pruhoploutvé lokálního charakteru (Polsko) založená na alozymových lokusech. Autoři porovnávali genetickou variabilitu sudetské populace z povodí Odry, Karpatské populace z povodí Visly a izolované populace z jezera Hancza. Na základě výsledků 11 alozymových lokusů dospěli k závěru, že C. poecilopus z Polska je vysoce polymorfní v sedmi lokusech, ale naopak má nízkou hetorozygozitu způsobenou pravděpodobně metapopulační strukturou. Největší rozdíly našli mezi sudeto-karpatskou skupinou a izolovanou populací jezera Hancza. Dle autorů se může jednat buď o oddělené populace, které díky absenci genového toku dospěly k vzájemné izolaci, anebo o dvě odlišné kolonizační vlny. Naopak nenašli žádné rozdíly mezi sudeto-karpatskými populacemi navzájem.

Kontula T. 2003: Phylogeography and evolution of freshwater cottid fishes. Dizertační práce, University of Helsinki, Helsinki.

V severském regionu je nejrozsáhlejší studií zabývající se fylogeografií a evolucí celé čeledi Cottidae. Tato práce se zabývá vrankami z obou regionů, i když hlavně klade důraz na ten severský. Na základě mtDNA byly odhaleny tři linie; tzv. Far-Eastern linii, u které by dle autorů měl být zvážen druhový status. Další dvě byly nazvány Euro-sibiřská (severní Evropa a Sibiř) a Karpatská (centrální Evropa), které jsou vysoce divergentní. Uvnitř obou linií byla zjištěna fylogeografická struktura. V Karpatské linii (Carpathian lineage) se oddělily povodí Dunaj + Visla a Dněstr, což značí nedávné propojení povodí Dunaje a Visly navzdory Karpatským horám. V Euro-sibiřské linii (Euro-Siberian lineage) došlo k separaci severní a východní části Skandinávie (NEur-E) oproti jižní Skandinávii + Dánsko (NEur-W). Uvedená separace naznačuje odlišnou postglaciální kolonizaci z refugií. Morfologické rozdíly pozoroval již Witkowski (1984), který je vysvětlil jako nedávnou adaptaci na říční vs. jezerní habitat. Rozdíly jsou však dle datování mnohem starší. Autoři proto navrhují rozeznávat linie taxonomicky.

Yokoyama R. and Goto A. 2005: Evolutionary history of freshwater sculpins, genus Cottus (Teleostei; Cottidae) and related taxa as inffered from mitochondrial DNA phylogeny. Mol. Phylogenet. Evol. 36: 654-668.

Na základě dvou mt markerů (12S rRNA a dloop) byla zkoumána evoluční historie rodu Cottus (celkem14 druhů) a příbuzných druhů Leocottus kesslerii a Trachidermus fasciatus, evropská vranka byla zastoupena pouze vzorkem z řeky Duna z Oderského povodí. Ve fylogenetickém stromě došlo k oddělení pěti linií A - E, původ linií je polyfyletický. Linie A se oddělila jako první, jsou v ní sesterské taxony Trachidermus fasciatus a C. kazika. Společného předka pak mají linie B - E, přičemž evropská C. poecilopus se začlenila do linie B spolu se dvěma vzorky z Ruska z povodí Amuru (později ovšem popsaného jako nový druh C. czanga; Sideleva and Goto 2009). Autoři považují jedince z povodí Odry, za typického zástupce evropské C. poecilopus s. stricto. Dále uvádějí návrh popisu nového druhu C. koreanus v linii C, což učinili Fuji et al. (2005).

Kinziger A. P., Wood R. M. and Neely D. A. 2005: Molecular Systematics of the Genus Cottus (Scopraniformes: Cottidae). Copeia 2: 303-311.

Velmi obsáhlá studie zabývající se molekulární systematikou rodu Cottus pomocí analýzy sekvencí mt DNA (cyt b, ATPása 8/6). Analyzovali 36 ze 42 v té době platných druhů, se snahou nasbírat vzorky co nejblíže typových lokalit. Jedná se tedy o nejobsáhlejší studii v rámci rodu, zařadili také jedince z pěti dalších rodů k porovnání v rámci čeledi Cottidae. Studie odhalila pět monofyletických kládů nazvaných Cottopsis (Severní Amerika), Uranidea, Baikalian, Cephalocottus a Cottus. Nicméně pozice u devíti druhů zahrnutých do analýzy zůstala nevyjasněná, patří k nim i druh C. poecilopus.

Yokoyama R., Sideleva V. G., Shedko S. V. and Goto A. 2008: Broad-scale phylogeography of the Palearctic freshwater fish Cottus poecilopus complex (Pisces: Cottidae). Mol. Phylogenet. Evol. 48: 1244-1251.

Studie se zabývá fylogenezí rodu Cottus v euro-asijském kontextu. Na základě kontrolní oblasti mtDNA sledovali autoři fylogeografii napříč areály výskytu v Asii a v Evropě. Jako typického zástupce evropské C. poecilopus autoři zvolili jedince z řeky Duna, v Oderském povodí (linie I). Vycházeli ze studie Pasko and Maslak (2003), kteří uvedli, že jsou si karpatské populace z povodí Odry a Visly blízké. Mimo platných příbuzných druhů, jež byly do studie zařazeny, separovali sedm linií tvořících C. poecilopus komplex. Izolace těchto linií proběhla v jednotlivých regionech v pleistocénu během dob ledových,

pravděpodobně ze tří různých refugií. Autoři také podotýkají, že neměli k dispozici zástupce ze skandinávské populace, nemohli tedy určit jejich postavení.

Goto A., Yokoyama R. and Sideleva V. G. 2014: Evolutionary diversification in freshwater sculpins (Cottoidea): review of two major adaptive radiations. Environ. Biol. Fish, doi: 10.1007/s10641-014-0262-7.

Zahrnuje jak sladkovodní tak mořské druhy rodů Cottus, Trachidermus, Mesocottus, Myxocephalus a také vranky z Bajkalského jezera a postuluje hypotézu o vzniku sladkovodních vranek. Pracuje s liniemi A - E z práce Yokoyama and Goto (2005) a zaměřuje se více na evoluční proces a vznik těchto linií na základě konstruovaných superstromů. Uvádí, že všechny linie mají pravděpodobně původ na pobřeží Tichého oceánu, odkud se začaly šířit ve chvíli, kdy byly schopny využívat sladkovodní habitat. Po úplné adaptaci došlo k dalšímu šíření do vnitrozemí a následné diverzifikaci a speciaci jednotlivých druhů. C. poecilopus je součástí linie B, která se dle autorů rozšířila z pobřeží Tichého oceánu nejdříve do vnitrozemí severní Asie a poté přes povodí staré řeky Amur do dalších regionů. Existence mnoha sublinií ovšem napovídá, že došlo k více speciačním událostem. Po rozšíření do dalších regionů došlo k jejich izolaci díky klimatickým změnám v Pleistocénu.

2 CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE

1. Charakterizace diverzity vranky pruhoploutvé v říčních systémech Karpatského oblouku (úmoří Baltského moře - povodí Odry a Visly, úmoří Černého moře - povodí Moravy, Dunaje, Tisy a Dněstru).

2. Genetická charakterizace jedinců z typové lokality Velký Slavkov a určení jejich postavení v rámci areálu rozšíření druhu.

3. Určit postavení populací ze střední Evropy v rámci euro-asijského komplexu C. poecilopus (Yokoyama et al. 2008) a přesněji definovat výskytový areál C. poecilopus s. stricto.

4. Zapojit vybrané jedince do projektu DNA barcodingu a porovnat je se všemi dostupnými sekvencemi v mezinárodní databázi BoLD. Učinit vzájemné molekulární porovnání jedinců z povodí Odry, Dunaje, Visly, Dněstru a Skandinávie za účelem vyjasnění jejich taxonomického statusu.

5. Potvrdit či vyvrátit existenci hybridní zóny v povodí Odry a Moravy pomocí molekulárně-genetických metod a učinit genetickou charakterizaci hybridních populací. Přinést nové poznatky ohledně druhových participací v hybridních událostech.

3 MATERIÁL A METODY

3.1 Sběr materiálu

pro účely analýzy mezidruhové a vnitrodruhové diverzity Sběr vzorků vranky pruhoploutvé byl proveden u 39 populací na území tří států - Česká republika, Slovensko a Polsko mezi lety 2007 - 2011 (Tab. 1). Vzorkování pokrylo všechna hlavní povodí sudeto-karpatského regionu: povodí Odry (5 lokalit) a Visly (8; obě úmoří Baltského moře), povodí Dunaje (24) a Dněstru (2; obě úmoří Černého moře). Na Slovensku byly získány vzorky z typové lokality Velký Slavkov, případně z další blízké lokality - Kežmarok (povodí Visly - úmoří Baltu). U všech 332 jedinců byla osekvenována oblast CR a na základě těchto výsledků byly vybráni jedinci nesoucí unikátní haplotypy pro analýzy genů cytochrom b a 1. intronu S7 r-proteinu (S7RP1).

Pro srovnání rozdílů mezi druhy vyskytujícími se sympatricky v dolním povodí Visly, bylo v roce 2015 dodatečně sesbíráno 24 jedinců druhu C. microstomus ze čtyř lokalit v jižní části Polska, přičemž pět bylo sebráno na typové lokalitě tohoto druhu na řece Dlubina (poblíž Krakowa).

pro účely DNA barcodingu Výběr a sběr vzorků pro účely DNA barcodingu byl proveden na základě dřívějších taxonomických a genetických studií na našem území, aby bylo zastoupeno rovnoměrně více než 70 druhů ryb. Území České republiky bylo rozděleno do tří úrovní:

1. Klasifikace na základě hydrologické polohy ČR do tří celků dle úmoří - Baltské, Černé a Severní moře (Obr. 6). 2. Další stupeň rozdělení na šest oblastí (Obr. 7): I Ohře (povodí Ohře a některé přítoky Labe), II Vltava (úmoří Severního moře bez povodí Ohře a Labe), III Labe (úmoří Severního moře bez povodí Ohře a Vltavy), IV Dyje a dolní tok Moravy, V Morava (střední a horní tok Moravy), VI Odra. 3. Klasifikace třetí úrovně byla již dána aktuálními poznatky o výskytu jednotlivých druhů na lokalitách. Zahrnovala jejich početnost a distribuci v jednotlivých povodích. Zohledňovaly se i evropsky významné lokality systému NATURA 2000. Pro analýzu ohrožených a kriticky ohrožených druhů byla využita databáze vzorků v laboratoři Ústavu biologie obratlovců AV ČR.

Obr. 6 Klasifikace první úrovně rozdělení vzorků

Obr. 7. Klasifikace druhé úrovně rozdělení vzorků

Pro účely katalogizace naší ichtyofauny byl každý vzorek opatřen kompletním voucherem, tzn. délka těla (TL a SL), váha, fotodokumentace, místo nálezu (GPS koordináty a nadmořská výška), datum popisu, jméno identifikátora a místo uložení. Kvalitně osekvenovaným jedincům s délkou sekvence COI nad 500 bp byl pak přidělen DNA barkód.

Z celkového počtu 945 jedinců v této studii byly uvedenou metodou vybrány lokality vranky pruhoploutvé na řece Morávka v povodí Odry - 5 jedinců a v povodí Moravy řeka Svratka - 10 jedinců. Pro účely naší studie byla ještě analýza COI markeru doplněna o 4

vzorky z typové lokality na Slovensku a dále o 5 vzorků z řeky Czarny Dunajec v Polsku (povodí Visly). Pro srovnání jsme také analyzovali všechny jedince C. microstomus (24 ks).

pro účely průkazu hybridizace Úseky sympatrického výskytu (hybridní zóny) vranky pruhoploutvé a vranky obecné v oderském povodí, v řekách Opava, Moravice a Ostravice byly vytipovány na základě dřívějších ichtyologických průzkumů. Bylo náhodně odebráno celkem 64 jedinců, a to na řece Opava 34 jedinců (hybridní zóna 11 km dlouhá, ř. km 70-81, sběr na ř. km 76,3), Ostravice – 16 jedinců (hybridní zóna 12 km dlouhá, ř. km 25-37, sběr na ř. km 32,4) a Moravice – 14 jedinců (hybridní zóna 11 km dlouhá, ř. km 75-86, sběr na ř. km 81,3). Pro porovnání s čistými druhy byli sebráni i jedinci mimo hybridní zónu v počtu 23 jedinců u vranky pruhoploutvé a 17 jedinců u vranky obecné (řeka Moravice - Žirnovice). U vranky pruhoploutvé z lokalit: na řece Morávka 7 jedinců, Kotelný potok 4 jedinci, potok Malý Lipový 6 jedinců a Bílá Ostravice 6 jedinců.

Hybridní zóna v povodí Svratky byla identifikována na základě tří opakovaných odlovů v daných lokalitách v červenci a říjnu 2009 a v květnu 2010. Celkem bylo analyzováno 5 lokalit: řeka Fryšávka (pravostranný přítok Svratky), řeka Svratka u města Jimramov, dále u vesnice Sedliště a Strachujov, a Trhonický potok (levostranný přítok Svratky). Z celkového počtu 124 jedinců bylo geneticky analyzováno po morfologicko- meristické analýze 14 ryb z hybridní zóny Jimramov z odlovu v roce 2009.

3.2 Morfologická a morfometrická analýza

Protože jsou v České Republice oba druhy vranek, C. poecilopus i C. gobio, pod legislativní ochranou, a také jejich lokality patří do systému NATURA 2000 (Evropsky významné lokality), sběr vzorků byl limitován pouze na ustřižení části ploutve pro genetickou analýzu. Morfologie musela být většinou provedena přímo v terénu a poté byla ryba vrácena do vody. Morfologická identifikace ryb z povodí Odry byla provedena doc. S. Luskem. Hybridní jedinci byli označeni na základě nepravidelného příčného pruhování na břišních ploutvích a přítomnosti či náznaku pruhování na krátké břišní ploutvi.

Jedinci z povodí Svratky byly identifikování metodami tradiční morfometrie Ing. Halačkou a Ing. Vítkem, dle metodiky Holčík (1989) s drobnými modifikacemi. Pro další popis hybridů a jejich rozlišení od čistých druhů byly odebrány i vzorky kůže pro provedení mikrotenkých řezů, s následným histochemickým barvením. Dále byla analyzována tloušťka epidermis a relativní počet sekrečních buněk. Všechny výše uvedené techniky provedl Ing.

Halačka. Tyto metodiky uvádím pouze pro ucelený obraz rozsahu identifikace hybridů, dále se budu zabývat jen genetickou analýzou těchto jedinců, kterou jsem prováděla.

Morfologická analýza u vybraných jedinců byla také součástí česko - kanadského projektu DNA barcodingu, pro účely sestavení referenční sbírky dokladových jedinců z celého území ČR. U všech dokladových exemplářů je k dispozici celé tělo, tkáň i alikvot DNA pro budoucí analýzy. Tyto vzorky jsou uloženy v Národním muzeu v Praze v ichtyologické kolekci. U všech těchto jedinců byl také osekvenován jaderný gen S7RP1 k vyloučení přítomnosti hybridů, kteří jsou, jak se ukázalo, poměrně hojní v některých oblastech.

Tabulka 1. Přehled analyzovaných vzorků vranky pruhoploutvé.

Úmoří Lokalita Stát CR cyt b S7RP1 COI (povodí) N haplotyp N haplotyp N haplotyp N haplotyp Baltské moře Morávka CZ 12 Hap 48- 52 11 Hap 21 - 29 6 Hap 1 5 Hap 1-2 (Odra) Kotelný potok CZ 9 Hap 53- 55 9 Hap 21, Hap 27, Hap 29-30 6 Hap 1 Bílá Ostravice CZ 18 Hap 56- 58 18 Hap 21, Hap 27, Hap 29 7 Hap 1 Analýza bnebyla Malý Lipový p. CZ 14 Hap 58- 61 14 Hap 21, Hap 27, Hap 29, Hap 31-32 5 Hap 1 provedena Olše CZ 10 Hap 52, 56, 62 - 63 3 Hap 21, Hap 34 3 Hap 3 (Visla) Velký Slavkov SK 9 Hap 13 9 Hap 3, Hap 8 4 Hap 1, Hap 4 4 Hap3 Kežmarok SK 13 Hap 17- 20 13 Hap 9 - 10 6 Hap 1 Slavkovský p. SK 15 Hap 13, Hap 33 2 Hap 8, Hap 14 2 Hap 1 Analýza Jasiolka PL 4 Hap 10 - 12 4 Hap 3 1 Hap 1 nebyla Wisloka PL 5 Hap 11, Hap 13- 14 5 Hap 3 3 Hap 1 provedena Zawoja PL 5 Hap 10, Hap 12 5 Hap 3 2 Hap 1 Wislznia PL 4 Hap 13, Hap 15 4 Hap 3 2 Hap 1 Hoczewka PL 3 Hap 16 3 Hap 11 1 Hap 1 Czarny Dunajec PL NA NA NA NA NA NA 5 Hap3 Černé moře Bystřice Hanácká CZ 10 Hap 1, Hap 2 10 Hap 1 - 3 5 Hap 1 (Dunaj, Morava) Kněhyně CZ 13 Hap 4 - 7 12 Hap 3 - 5 6 Hap 1 Analýza Malá Haná CZ 13 Hap 3 13 Hap 3 4 Hap 1 nebyla Morava CZ NA NA 5 Hap 3 2 Hap 1 provedena Vsetínská Bečva CZ 9 Hap 46 - 47 2 Hap 3, Hap 19 1 Hap 1 Červený p. CZ 9 Hap 43- 45 3 Hap 3 3 Hap 3 Svratka CZ NA NA NA NA NA NA 10 Hap3-6 (Dunaj, Ipel) Krupinica SK 10 Hap 22 10 Hap 20 1 Hap 4 Gondova Jama SK 7 Hap 23 NA NA NA NA

C o t t u s s u t o C p t e o c ou p l i s (Dunaj, Hron) Zolná SK 9 Hap 24 9 Hap 20 1 Hap 4 Bystrica SK 10 Hap 10, Hap 12, Hap 35 1 Hap 3 1 Hap 1 (Dunaj, Váh) Borovský p. SK 10 Hap 21 1 Hap 13 1 Hap 1 Škrípavka SK 10 Hap 21 1 Hap 13 1 Hap 1 Liešenský p. SK 1 Hap 37 1 Hap 3 1 Hap 1 Studený p. SK 10 Hap 10 - 13, Hap 21 4 Hap 3, Hap 10 1 Hap 1 Analýza Drietomica SK 8 Hap 32, Hap 36 - 37 2 Hap 3, Hap 17 6 Hap 1, Hap 3 Belá SK 9 Hap 10 1 Hap 3 1 Hap 1 nebyla Žárnovica SK 8 Hap 13 1 Hap 18 1 Hap 1 Riečka SK 7 Hap 20, Hap 38-40 4 Hap 3 4 Hap 1 provedena Bacúch SK 9 Hap 41 1 Hap 20 1 Hap 5 (Dunaj, Tisa) Ida SK 10 Hap 25, Hap 28-30 10 Hap 6 5 Hap 5 Opatka SK 10 Hap 25-27 10 Hap 7 6 Hap 1 (Dunaj, Laborec) Udava SK 10 Hap 13, Hap 21, Hap 31- 34 3 Hap 8, Hap 14 3 Hap 2 Ulička SK 8 Hap 42 1 Hap 15 1 Hap 2 (Dněstr) Jasienka PL 3 Hap 8 3 Hap 12 2 Hap 2 Strwijaz PL 8 Hap 8 - 9 8 Hap 12 4 Hap 2 Baltské moře Dlubina PL 5 Hap 2, Hap 4 5 Hap1 3 Hap 1 5 Hap 1

(Visla) San PL 10 Hap 1-2, Hap 6 2 Hap1 4 Hap 1 10 Hap 1, Hap 3

CM Dunajec PL 8 Hap 1-5 3 Hap1 6 Hap 1 8 Hap 1-2, Hap 4 Czarna Nida PL 1 Hap 1 NA NA 1 Hap 1 1 Hap 1 NA - analýza nebyla provedena, CM - C. microstomus 36

3.3 Izolace DNA

Vzorky části ploutve byly vloženy do zkumavek z 96 % etanolem. Izolace DNA byla provedena dvěma způsoby. Fenol-chloroform-izoamylalkoholovou metodou dle Sambrook et al. (1989) s drobnými modifikacemi nebo pomocí komerčního kitu Genomic DNA Mini kit (KRD) dle popisu výrobce.

3.4 PCR amplifikace a sekvenační analýza

Analyzovány byly čtyři genetické markery. Tři oblasti mitochondriálního (mt) genomu a jeden jaderný intron. Část kódujícího genu pro trans membránový protein cytochrom b (cyt b) pomocí primerů H15149 a L14735 (Ludwig et al. 2000). Nejvariabilnější úsek mtDNA, nekódující oblast kontrolní region (CR) s přilehlými geny pro tRNAThr a tRNAPro pomocí primerů HV2 a CSBD (Nesbo et al. 1998). U vybraných jedinců byl amplifikován první intron jaderného genu pro ribosomální protein S7 (S7RP1) pomocí primerů S7RPEX1F a S7RPEX2R dle podmínek Chow and Hazama (1998). U všech 104 jedinců z hybridních zón byl pro genetické určení druhu a záchyt hybridů amplifikován jaderný intron a u hybridů sloužící k určení mateřské linie také mt kontrolní oblast. Po elektroforetické vizualizaci (agarozový 1,5 % gel) byly produkty přečištěny pomocí PEG/Mg/NaAc precipitace nebo komerčním kitem DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research). Přečištěné produkty byly osekvenovány. Obousměrná sekvenace vzorků proběhla na genetickém analyzátoru ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) v laboratořích ÚBO AV ČR nebo pomocí komerčního servisu (Macrogen, Jižní Korea) na přístroji ABI 3730XL DNA sequencer (Applied Biosystems). Všechny sekvence byly zarovnány pomocí programu ClustalX a ručně překontrolovány v programu MEGA 6 (Tamura et al. 2013). Kódující sekvence byly přeloženy do proteinu pro detekci nežádoucích stop kodonů. Pro zjištění saturace byly zkonstruovány grafy korigované vs. nekorigované (p-distance) genetické vzdálenosti (Obr. 8). Nepřítomnost saturace indikuje křivka jdoucí k nule.

Jako součást projektu DNA barcodingu byl amplifikován také gen pro mt protein cytochrom c oxidasa podjednotka I (COI) pomocí primerů FishF1 a FishR1 (Hubert et al. 2008).

Obr. 8. Saturační křivka genů pro CR a cyt b. Nepřítomnost saturace indikuje křivka jdoucí k nule.

saturační křivka

0,12

0,1 distance)

- 0,08

0,06 dloop 0,04 cyt b

0,02

0 0,05 0,1 0,15 0,2 nekorigovaná (p vzdálenost nekorigovaná korigovaná vzdálenost

Všechny jedinečné haplotypy byly vloženy do databaze GenBank pod následujícími přístupovými čísly:

Vranka pruhoploutvá (C. poecilopus)

část genu pro cyt b: KX961438 - 1471 CR: JN315849 - 852, KX961472 - 1534 COI: HQ960874 - 878, HQ961093 (mimo projekt DNA barcoding) S7RP1: JN181865 - 866, KX961434 - 1437 C. microstomus

část genu pro cyt b: KY290491 CR: KY246936 - 941 COI: KY246942 - 945 S7RP1 KY246946

Sekvence COI, jež byly analyzovány jako součást projektu DNA barcoding jsou primárně uloženy v BoLD systému jako součást celosvětové databáze a jsou automaticky odeslány do INSDC (International Nucleotide Sequence Database Collaboration) a odtud do databází GenBank, EMBL a DDBJ.

3.5 Amplifikace mikrosatelitů

Z osmi testovaných mikrosatelitů bylo pro další analýzu vybráno šest Cgo05ZIM (FAM), Cgo18ZIM (FAM), Cgo22ZIM (TET), Cgo42ZIM (HEX), Cgo1016PBBE (FAM) a Cgo1033PBBE (TET), které byly amplifikovány s drobnými modifikacemi od podmínek Englbrecht et al. (1999) v objemu 15 µl. V případě lokusu Cgo1016PBBE byla navýšena koncentrace Mg iontů na 1,0 mM. U vzorků vranky obecné byl u lokusu Cgo1033PBBE navýšen čas elongace na 10 min. U populace z Moravice se vyskytly nečekané komplikace s amplifikací všech mikrosatelitů, proto jsme přistoupili k vyzkoušení kitu (Phire® Animal Tissue Direct PCR Kit), který obsahuje DNA polymerázu (Phire® Hot Start II DNA polymerase) extrémně rezistentní k různým inhibitorům PCR reakce. Tímto kitem se podařilo amplifikovat čtyři z šesti testovaných lokusů.

Amplifikované produkty byly detekovány kapilární elektroforezou na genetickém analyzátoru ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) v laboratořích ÚBO AV ČR. K posouzení délky fragmentů byl použit standard GeneScan100 TAMRA Size Standard a software GeneScan analyses 3.7 od firmy Applied Biosystems.

3.6 Statistická analýza sekvenačních dat

Počet variabilních a parsimonně informativních míst, nekorigované genetické vzdálenosti (p-distance) a vzdálenosti tzv. mean number of pairwise differences byly spočítány v programu MEGA 6 (Tamura et al. 2013). Program DnaSP 5.0 (Librado and Rozas 2009) byl použit pro vygenerování tzv. haplotypového listu (počet a zastoupení haplotypů na lokalitách) a pro zjištění míry genetické diferenciace mezi liniemi, či subliniemi, která byla stanovena na základě fixačního koeficientu FST (u CR byly delece zahrnuty jako pátá báze). Míra statistické signifikance byla otestována pomocí 10 000 permutací. Další statistické analýzy Kishino-Hasegawa test (KH test; Kishino and Hasegawa 1989) a výpočet korigovaných a nekorigovaných genetických vzdáleností u saturačních křivek byly provedeny pomocí programu PAUP* ver 4.0b10 (Swofford 2001). Pro zhodnocení mezipopulačních vztahů byla zkonstruována haplotypová síť v programu TCS využívající přístup “statistical parsimony” (Clement et al. 2000).

U sekvencí, jež byly součástí projektu DNA barcoding, byla použita pro analýzu a uložení dat platforma BoLD (http://www. barcodinglife.org) se třemi statistickými identifikačními moduly - MAS, IDS a ECS. Správné taxonomické zařazení bylo potvrzeno srovnáním vzorku s jedinci již uloženými v databázích BoLD a GenBank.

3.7 Fylogenetická analýza

Nukleotidové fylogenetické stromy byly sestrojeny pomocí metod maximum parsimony (MP, delece počítány jako pátá báze) a neighbour-joining (NJ) v programu PAUP* ver 4.0b10 (Swofford 2001). Nejvhodnější model evoluce byl vybrán pomocí hLRT (hierarchical likelihood ratio test) v programu Modeltest 3.7 (Posada and Crandall 1998). Pro CR byl vybrán model s proporcí invariabilích míst a gamma korekcí HKY+I+G, pro cyt b model GTR+I. Nejlepší stromy byly vyhledávány pomocí heuristického vyhledávání s TBR algoritmem (tree bisection reconnection), všechny pozice v kodonu a tranzice/transverze byly váženy rovnoměrně. Pro zhodnocení statistické významnosti větví byl použit neparametrický bootstrap test s počtem 1000 replikací. Cut off hodnota byla nastavena na 60 %.

Bayesovská analýza (BI) byla počítána pomocí programu MrBayes verze 3 (Ronquist and Huelsenbeck 2003), ve čtyřech paralelních bězích (Markov chain runs) po dobu 3.5 x 106 generací pro CR a 2 x 106 generací pro cyt b, se sampling frekvencí 100. Prvních 25 % stromů bylo odstraněno z analýzy, z ostatních stromů byl vytvořen 50 % konsenzus. Uvedené analýzy byly počítány na počítačovém clusteru na ÚBO AV ČR v Brně. K sestrojení fylogramu pomocí maximum likelihood algoritmu (ML) byl využit program PhyML (Guindon and Gascuel 2003) pracující online na ATGC bioinformatrické platformě patřící institutu “French National Institute of Bioinformatics (IFB)” pomocí standardně nastavených parametrů (HKY substituční model) s 10 000 bootstrap replikacemi.

U kódujícího genu pro protein cyt b byl sestrojen pomocí programu MEGA 6 (Tamura et al. 2013) i aminokyselinový strom, metodami MP a NJ s aminokyselinovým substitučním modelem a pomocí BI analýzy s kodon modelem. Pro MP a NJ analýzu byl proveden bootstrap test s počtem 1000 replikací, u BI běžela analýze po dobu 3 x 106 generací.

Fylogenetický strom u markeru COI byl konstruován online pomocí aplikace na webových stránkách BoLD databáze s přednastavenými parametry (K2P substituční model). V případě jaderného markeru S7RP1 nebyl fylogenetický strom sestrojen z důvodu téměř nulového fylogenetického signálu - existence pouze pěti haplotypů se šesti substitucemi a indelovou absencí.

Pro porovnání populací z povodí Dunaje, Visly a Dněstru s dalšími regiony, jsme do studie zařadili sekvence z databáze GenBank: z řeky Lena v Rusku jedinci vranky obecné C. gobio AY116366 (Kontula et al. 2003) a AF35956-570 (Kontula and Vainola 2001), kteří byli použiti jako outgroup. Dále jsme zařadili vybrané sekvence C. poecilopus komplexu (Yokoyama et al. 2008) pro zhodnocení postavení populace vranky pruhoploutvé z typové lokality a postavení ostatních populací (sekvence na Obr. 21), společně s nimi jsme zařadili

další druhy rodu Cottus: C. czanaga z řek Porovinka (AB188165) a Manoma (AB188164) v Rusku a C. poecilopus (AB188166) z řeky Duna v Polsku (všechny z Yokoyama and Goto 2005). Jako další byly ještě zahrnuty sekvence vranky pruhoploutvé AY453767-768 a vranky obecné AY453695, 704, 729, 747, 754, 763 a 766; vše ze studie Šlechtová et al. (2004).

3.8 Analýza mikrosatelitů

K zachycení možných chyb během amplifikace, či při odečítání délky alel jsme využili program Micro-checker 2.2.1 (Van Oosterhout et al. 2004), který zjišťuje pravděpodobnost nulových alel, možné chyby při odečítáni délky alel díky stutter píkům, či dominanci krátkých alel v průběhu amplifikace.

Počet alel (Na) byl spočítán v programu Fstat ver. 2.9 (Goudet 2001), protože však závisí na velikosti vzorku, byla také do statistiky zahrnuta hodnota alelové bohatosti – allelic richness (AR). Uvedené parametry byly spočítány pro minimální velikost vzorku 32 jedinců.

Pro posouzení genetické diferenciace mezi jedinci byl spočítán FST index (jako počet různých alel mezi skupinami) v programu Arleqiun ver. 3.5 (Excoffier and Lischer 2010) a také hodnoty očekávané (Ho) a pozorované (He) heterozygozity. Alelové rozsahy (allelic range) u lokusů jednotlivých druhů a počet jedinečných alel (private alleles) byl zhodnocen pomocí programu GeneAlEx 6 (Peakall and Smouse 2006). Všechny uvedené parametry byly stanoveny u čistých jedinců druhů vranek pruhoploutvé a obecné potvrzených morfologickou analýzou, sekvenací jaderného genu i 3D PCA analýzou.

Detekce cytonukleární nerovnováhy (cytonuclear disequillibrium) byla provedena pomocí programu CNDm (Asmussen and Basten 1996), statistická významnost byla testována Fisher exact testem, jež je doporučován pro menší vzorky (n < 100; Basten and Asmussen 1997). Nerovnováha byla testována jen mezi mt a jadernými lokusy, u kterých se vyskytovaly alely obou druhů.

Pro znázornění vztahů mezi alelami a jedinci ve 3D prostoru jsme provedli 3D Principle Component Analysis (3D PCA) v programu Genetix 4.05.2 (Belkhir et al. 1996 - 2004). Nejprve jsme zahrnuli pouze jedince identifikované jako čisté druhy pomocí morfologie i sekvencování jaderného genu, do druhé analýzy jsme již vložili jedince identifikované jako hybridní pomocí obou metod, či jen jednou z nich.

Pomocí programu Structure (Pritchard et al. 2000) jsme zhodnotili příslušnost jednotlivců ke dvěma skupinám, každou tvořil jeden čistý druh (K=2). Vzorky byly přiřazovány na základě Q hodnoty (koeficient příslušnosti jedince ke každé skupině). Použili

jsme admixture a correlated allele frequency modely. Všechny vstupní formáty byly připraveny v programu Create v. 1.33 (Coombs et al. 2008).

Pro charakterizaci genetické variability ve vodách Karpatského oblouku jsme analyzovali tři mitochondriální (CR, cyt b a COI) a jeden jaderný marker (S7RP1). Geny pro CR a cyt b byly použity pro zhodnocení vnitro- a mezidruhových vztahů a postavení typové lokality v rámci druhu. S7 diagnostika (substituce a indely v 1. intronu jaderného genu S7 pro r-protein) byla využita ke zhodnocení potenciálních rozdílů mezi druhy/liniemi, ale také k zachycení hybridních jedinců a k rozlišení druhové participace. Analýza COI genu byla provedena jako součást rozsáhlé studie DNA barcodingu v ČR na některých populacích, vybraných dle uvedené metodiky (viz. Materiál a metody). BoLD databáze s COI sekvencemi byla využita k vzájemnému porovnání populací z povodí Odry, Dunaje, Visly, Dněstru a Skandinávie za účelem vyjasnění jejich taxonomického statusu. Sesbíraní jedinci druhu C. microstomus, sympatricky se vyskytující v povodí Visly, byli analyzováni na všechny uvedené markery k porovnání s druhy C. poecilopus a C. gobio.

4.1 Analýza genetické diverzity populací Karpatského oblouku

4.1.1 Kontrolní oblast (control region, CR)

Z celkového počtu 332 jedinců C. poecilopus z 38 populací bylo zjištěno 63 haplotypů s celkovým počtem 72 variabilních míst (14,9 %), 60 parsimonně informativních míst (12,4 %) a dva diagnostické indely (Obr. 9). Celková délka CR alignmentu byla 483 bp.

Všechny fylogenetické metody (NJ, MP, ML a BI) ukázaly shodné výsledky. Jemné odlišnosti v topologiích MP a NJ stromu nebyly statisticky významné dle provedeného KH testu (Kishino and Hasegawa 1989) s plně optimalizovaným modelem (p = 0,000). Ve fylogenetickém stromě se oddělily dvě sesterské monofyletické linie I (Hap48 - Hap63) a II (Hap1 - Hap47) s vysokými podporami větví (100 % pro NJ a MP, 97 % pro ML a 1,0 posterior probability pro BI; Obr. 10 - 11). Uvnitř obou linií došlo k podrobnějšímu rozlišení haplotypů, přičemž v linii II se jedná o substituce specifické pro jednotlivá povodí. Linie I z povodí Odry se dělí na sublinie Ia a Ib, které se odlišují pěti substitucemi (Obr. 9). K sublinii Ib se zařadilo 14 jedinců, a 12 z nich je z populace obývající potok Malý Lipový. Mezi subliniemi Ia a Ib nebyly identifikovány sdílené haplotypy, nicméně Hap52, Hap56 a Hap58 se vyskytují v různých populacích (Obr. 12). Linie II byla rozdělena dle haplotypů na sublinie IIa - IIf, kdy tyto se překrývaly s jednotlivými povodími: IIa – povodí Moravy, IIb – povodí Hronu a Ipelu, IIc – povodí Hornádu, IId – povodí Laborce, IIe – povodí Visly a Dunaje a IIf – povodí Dněstru (Obr. 9 -11). V linii II jsme identifikovali pět sdílených haplotypů mezi

subliniemi (Obr. 12), které naznačují historické propojení populací uvnitř regionu. Hap7 z povodí Moravy byl přiřazen k sublinii IIe, tedy povodí Visly a Dunaje. Haplotypy 13 a 21 z povodí Visly (IIe) byly přiřazeny k povodí Laborce (IId) a naopak haplotypy Hap32 a Hap33 z povodí Laborce (IId) byly nalezeny v povodí sublinie IIe (Visla + Dunaj). I když nebyla vysoká podpora všech sublinií u všech fylogenetických metod, rozhodli jsme se je rozlišit na základě vysokého fixačního indexu (Tab. 2), struktury haplotypové sítě (Obr. 13) a spočítaných p-distancí (Tab. 3). Sublinie IIa (povodí Moravy) a IIe (povodí Dunaje + Visly) vytvořili sesterskou skupinu, stejně jako IIb (Hron a Ipel) a IIf (Dněstr), pro větší přehlednost jsou sesterské klády zakresleny i do radiálního fylogenetického stromu (Obr. 11). Sesterské sublinie IIc (Hornád) a IId (Laborec; obě z povodí Tisy) měly dost rozdílných substitucí k vytvoření samostatné sítě (Obr. 13). Protože mezi subliniemi IIa - IId nebyly nalezeny žádné společné haplotypy lze se domnívat, že v současnosti patrně nedochází k migraci mezi horním a dolním tokem Dunaje, stejně jako mezi toky (povodí Laborce a Hornádu) v povodí Tisy.

Tabulka 2. Hodnoty FST indexu mezi jednotlivými subliniemi Ia - Ib a IIa - IIf (přepočet na % = x100). Ia Ib IIa IIb IIc IId IIe IIf

Ia Ib 0,073 IIa 0,790 0,871 IIb 0,707 0,786 0,663 IIc 0,802 0,894 0,726 0,679 IId 0,733 0,894 0,614 0,647 0,631 IIe 0,705 0,813 0,569 0,633 0,733 0,650 IIf 0,815 0,791 0,661 0,646 0,807 0,675 0,679

Tabulka 3. Spočítané nekorigované genetické vzdálenosti (p-distance, nad diagonálou) a hodnoty mean number of pairwise differences (pod diagonálou) mezi subliniemi (přepočet na % = x100). Ia Ib IIa IIb IIc IId IIe IIf Ia - 0,0121 0,0657 0,0583 0,0659 0,0689 0,0599 0,0640 Ib 0,0157 - 0,0615 0,0586 0,0637 0,0649 0,0559 0,0601 IIa 0,0756 0,0691 - 0,0194 0,0226 0,0223 0,0090 0,0169 IIb 0,0678 0,0652 0,0262 - 0,0232 0,0263 0,0178 0,0185 IIc 0,0751 0,0702 0,0250 0,0289 - 0,0186 0,0232 0,0259 IId 0,0812 0,0748 0,0283 0,0339 0,0247 - 0,0229 0,0226 IIe 0,0717 0,0653 0,0172 0,0271 0,0285 0,0299 - 0,0167 IIf 0,0730 0,0668 0,0237 0,0254 0,0314 0,0300 0,0253 -

Obr. 9. Variabilní místa CR pro všechny zjištěné haplotypy C. poecilopus u Skandinávské (I) a Karpatské (II) linie a jejich sublinií (Ia - Ib, IIa - IIf) a u haplotypů C. microstomus.

111111111 1111111111 1111112222 2222222222 2222233333 3333333333 3333333333 3333333333 344444 1222334567 8112222333 3344555566 7788891122 2234455778 8889900112 2222223333 3334444455 7778888999 911334 9357369649 2340289347 8935236712 2515706735 8904578253 4684578471 3456790234 5672567989 7893789123 528181 Hap1 CCCTCATTGA CGAGACT-AA T-TAATAATT TACATGCAAG CCAACAGGGG TATGATAATG CCCAAACATT ATTATAATTT GGCCTCACCC AGACTG Hap2 ...... -.. .-...... G...... Hap3 ...... -.. .-...... A...... Hap4 ...... -.. .-...... T ...A...G...... C...... Hap5 IIa ...... -.. .-...... T ...A...G...... Hap6 ...... -.. .-...... T ...A...... C...... Hap43 ...... -.. .-...... G...... C...... Hap44 ...... -.. .-...... A...G...... C...... Hap45 ...... -.. .-...... A ...... G...... C...... Hap46 ...... -.. .-...... C...... Hap47 ...... -.. .-...... A ...... C...... ------Hap22 ...... A. .AG..A.-.. .-...... A...... A..AC..G...... C. .C...... TCAG...... A Hap23 IIb ...... A. .A...A.-.. .-...... A...... A..AC..G...... C. .C...... TCAG...... A Hap24 ...... A. .A...A.-.. .-...... A...... A..AC..G...... C. .C...... T...... Hap41 ...... A. .A...A.-.. .-...... A...... A..AC..G...... C...... T...... A ------Hap25 ...... A. .A...G.-.. .-...... G..ACCG..A ...... CG...... Hap26 ...... A. .A..?G.-.. .-...... G..ACCG..A ...... CG...... Hap27 IIc ...... A. .A..GG.-.. .-...... G..ACCG..A ...... CG...... G.. Hap28 ..G.....A. .A...G.-.. .-...... G..ACCG..A ...... CG...... Hap29 .AG.....A. .A...G.-.. .-...... G..ACCG..A ...... CG...... Hap30 .AG.....A. .A...G.-.. .-...... G..ACCG..A ...... CG...... ?..?. ------Hap31 ...... CA. .A...G.-.. .-...... G...... C.. ...AC....A ....G...... C.T.T.A...... C.... Hap32 ...... CA. .A...G.-.. .-...... G...... C.. ...AC....A ....G...... C.T.T.A...... Hap33 IId ...... ACA. .A...G.-.. .-...... G...... C.. ...AT.G..A ...... C.T...A...... Hap34 ...... CA. .A...G.-.. .-...... G...... C.A ...AC....A ....G...... C.T.T.A...... Hap42 ...... CA. .A...G.-.. .-...... C.A ...AC....A ...... C.T...A...... ------Hap7 ...... A...... -.. .-...... A...G...... C .C...... G...... Hap10 ...... A. .A.....-.. .-...... C.A ...A...G...... C CC...... G...... Hap11 ...... A. .A.....-.. .-...... C.A ...A...G...... C CC...... G...... A Hap12 ...... A. .A.....-.. .-...... C.. ...A...G...... C CC...... G...... A Hap13 ...... A. .A.....-.. .-...... C.. ...A...G...... C CC...... G...... Hap14 ...... AG .A.....-.. .-...... C.. ...A...G...... C CC...... G...... Hap15 ...... A. .A.....-.. .-...... C.. ...A...G...... C CC...... G...... ? Hap16 ...... A. .A.....-.. .-...... C.A ...A...G.. T...... C CC...... G...... A Hap17 ...... A. .A.....-.T AA...... C.A ...A...G...... C CC...... G...... Hap18 IIe ...... A. .A.....-.T AA...... ?.A ...A...G...... C CC...... G...... Hap19 ...... A. .A.....-.. .-...... A...G...... C CC...... Hap20 ...... A. .A.....-.T AA...... C.. ...A...G...... C CC...... G...... Hap21 ...... A. .A.....-.T AA...... A...... A...G...... C...... G...... A Hap35 ...... A. .A.....-.. .-...... C.C ...A...G...... C CC...... G...... Hap36 ...... A. AA.....-.. .-...... C.. ...A...G...... C CC...... G...... Hap37 ...... A. AA....C-.. .-...... C.. ...A...G...... C CC...... G...... Hap38 ...... A...... -.. .-...... A...G...... C CC...... Hap39 ...... A. .A.....-.. .-...... C.. ...A...G...... C .C...... G...... Hap40 ...... A. .A.....-.. .-...... C.. ...A...G...... C CC....T...... ------Hap8 IIf ...... A. .A...G.-.. .-...... A.....A.A ...AT..G.. ..G...... G...... A Hap9 ...... A. .A...G.-.. .-...... A.....A.A ...AT..G.. ..G...... T...... A ------Hap48 T..A....A. .A...TC-T. .-AGC.C.CG ...... G. ..TGT.T... G.CAC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap49 T..A....A. .A...TC-.. .-AGC.C.CG ...... G. ..TGT.T..A G.?AC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap50 T..A....A. .A...TC-.. .-AGC.C.CG ...... G. ..TGT.T..A G..AC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap51 T..A....A. .A...TC-.. .-AGC.C.CG ...... G. ..TGT.T... G.CAC..G.. ..G...... C .CC.....A. A-TT-.GTGT G.T..A Hap52 T..A....A. .A...TC-.. .-AGC.C.CG ...... G. ..TGT.T... G.CAC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap53 T..A....A. .A...TC-.. .-AGC.C.CG ...... G. ..T...T... G.CAC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap54 Ia T..A....A. .A...TC-.. .-AGC.C.CG ...... G. ..T...T.A. G.CAC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap56 T..A....A. .A...TC-.. .-AGC.C.CG ...... G. ..TG..T... G.CAC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap57 T..A....A. .A...TC-TG .-AGC.C.CG ...... G. ..TG..T..A G.CAC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap60 T..A....A. .A...TC-.. .-AGC.C.CG ...... G. ..TG..T..A G.CAC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap62 T..A....A. .A...TC-.. .-AGC.C.CG ...... G. ..TG..T.A. ..CAC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap63 T..A....A. .A...TCA.. .-AGC.C.CG ...... G. ..TG..T... G.CAC..G.. ..G...... C .CC...... A-TT-.GTGT G.T..A ------Hap55 T..A....A. .A...TC-.. .-A.T.C.CG ...... G. ..TG..T... G.CAC..G.. ..G....G.C .C...... A-T.-.GTGT G.T..A Hap58 T..A....A. .A...TC-.. .-A.T.C.CG ...... G. ..TG..T... G..AC..G.. ..G....G.C .C...... A-T.-.GTGT G.T..A Hap59 Ib T..A....A. .A...TC-.. .-A.T.C.CG ...... G. ..TG..T... G..AC..G.. ..G....G.C .C...... A-T.-.GTGT G.T.AA Hap61 T..A....A. .A...TC-.. .-A.T.C.CG ...... G. ..TG..T..A G..AC..G.. ..G....G.C .C...... A-T.-.GTGT G.T..A ------Hap1_C.microstomus T..A....A. .A..G..-T. .GA.TAC.CG GC..C...G...... G..C .GCAC..G...... TA... .C...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap2_C.microstomus T..A....A. ....GT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G...... G..C .GCAC..G...... TA... .C...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap3_C.microstomus T..A....A. .T..GT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G...... G..C .GCAC..G...... TA... .C...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap4_C.microstomus T..A....A. .A..GT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G...... G..C .GCAC..G...... TA... .C...... A-TT-.GTGT G.T..A Hap5_C.microstomus T..A....A. ....GT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G...... G..C .GCAC..G...... TA... .C...... C A-TT-.GTGT G.T..A Hap6_C.microstomus T..A....A. ....GT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G...... G..C .GCAC..G...... -T... .C...... A-TT-.GTGT G.T..A AF359572_SE1_C.microstomus T..A....A. .A.....-T. .GA.TAC.CG GC..C...G...... G...C .GCAC..G...... -T.A. .C...... A-TT-.GTGT G.T..A ------AY453766_C.gobio ??????..A. .A.AGT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G. ...G..A..C ..CAC...... -T.A. .C...... A-TT-.GTGT G.T..A AY453763_C.gobio ??????..A. .A..GT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G...... C ..CAC..G...... -T.A. .C.....A.. A-TT-.GTGT G.T..A AY453695_C.gobio ??????..A. .A..GT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G. ...G.....C ..CAC..G...... -T.A. .C.....A.. A-TT-.GTGT G.T..A AY453704_C.gobio ??????..A. .A.AGT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G. ...G..A..C ..CAC..G...... -T.A. .C...... C A-TT-.GTGT G.T..A AY453707_C.gobio ??????..A. .A..GT.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G. ..TG.....C ..CAC..G...... -T.A. .C...... A-TT-.GTGT G.T..A AY453729_C.gobio ??????..A...... T.-T. .GA.T.C.CG GC..C...G. ...G.....C ..CAC..GC. .GAG.-T.A. .C...... A-TT-.GTGT G.T..A AY453747_C.gobio ??????..A...... T.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G...... C ..CAC..G.. .GTG.-T.A. .C...... A-TT-.GTGT G.T..A AY453754_C.gobio ??????..AG .A...T.-T. .GA.TAC.CG GC..C...G. ..TG.....C ..CAC..G...... -T.A. .C...... A-TT-.GTGT G.T..A

Obr. 10. Fylogenetický strom CR dle BI metody. Bayesian posterior probabilites a bootstrap hodnoty jsou uvedeny v uzlech stromu v pořadí BI/MP/NJ/ML. Uvedeny jsou pouze hodnoty ≥ 50 %. Ve stromě jsou zakresleny linie I a II a jejich sublinie odpovídající jednotlivým povodím.

1/99/100/99 Hap8 IIf Dn str Hap9 0.72/-/-/- Hap22 Hap23 Hap24 IIb Hron + Ipel 0.92/70/88/- Hap41 Hap25 1/98/100/99 Hap26 Hap27 Hap28 IIc Hornád Hap29 1/100/100/100 0.95/82/79/77 Hap30 Hap31 Hap32 Hap34 IId Laborec Hap33 0.81/91/95/93 Hap42 Hap7 Hap10 Hap11 Hap16 Hap12 IIe Hap13 0,52/-/-/ Hap14 Hap15 Visla + Dunaj 0.81/-/-/- Hap17 Hap18 Hap20 Hap21 Hap35 Hap36 Hap37 Hap39 0.85/81/82/- Hap40 1/100/100/97 Hap19 Hap38 Hap4 Hap5 Hap6 Hap44 Hap2 Hap43 IIa Morava Hap45 Hap46 Hap47 Hap1 Hap3 Hap48 Hap49 Hap50 Hap51 Hap52 Hap53 Ia Odra Hap54 0.97/79/88/- Hap56 Hap57 Hap60 Hap62 0.98/92/97/72 Hap63 Hap55 Hap58 0.71/78/79/68 Hap59 Ib Odra Hap61 AY4537 54_C.gob io AY4537 63_C.gob io AY4536 95_C.gob io AY4537 66_C.gob io 1/50/81/89 AY4537 04_C.gob io AY4537 29_C.gob io AY4537 47_C.gob io AY4537 07_C.gob io

0.3

Obr. 11. Sublinie Ia - Ib a IIa - IIf zakreslené pro větší přehlednost v radiálním fylogenetickém stromě.

Obr. 12. Distribuce haplotypů CR u Skandinávské (žlutá) a Karpatské (černá) linie. Červeně značené haplotypy jsou sdílené, mezi subliniemi Ia a Ib (černá čísla) nebo mezi subliniemi IId a IIe (bílá čísla). Pro přehlednost kroužky značí sublinie IIa, IIb, IIc, IId a IIf, IIe zakroužkována není. Číslo v kolečku značí číslo haplotypu.

Obr. 13. Haplotypvá síť zobrazující vztahy a historická propojení mezi haplotypy linií I a II druhu C. poecilopus v Evropě.

Haplotypová síť (Obr. 13) ukázala jako základní nejvíce rozšířenou sublinii IIe, s haplotypem Hap13, který se vyskytuje v sedmi z 32 populací a je i sdíleným haplotypem mezi populacemi (Obr. 12). Vyskytuje se i na typové lokalitě Velký Slavkov. Kromě sublinií IIc a IId, vytvořily samostatnou síť také sublinie Ia a Ib.

Mezi subliniemi jsme spočítali nekorigované p-distance (1,57 - 8,12 %) i hodnoty „mean number of pairwise differencies“ (1,21 - 6,89; Tab. 3) pro porovnání se studií Yokoyama et al. (2008). Nejkratčí vzdálenost byla spočítána mezi subliniemi Ia a Ib (1,57 %) a mezi IIa (Morava) a IIe (Dunaj a Visla; 1,72 %). Naopak největší vzdálenost uvnitř linie II jsme zjistili mezi subliniemi IIc (Hornád) a IIf (Laborec), a to 3,14 %. Celková hodnota p- distance mezi liniemi I a II dosáhla 6,83 % a mean no. of pairwise diff. 7,28 %. Hodnoty p- distancí mezi liniemi I resp. II a druhy C. microstomus a C. gobio byly od 4,55 do 7,84 % (Tab. 4). Průměrné vzdálenosti uvnitř linií dosáhly: u linie I 0,85 % a u linie II v povodí Dunaje, Visly a Dněstru hodnoty 0,69 %, nejvyšší hodnota byla zjištěna u sublinie IIc (Hornád) a to 1,45 %.

Tabulka 4. Souhrnná tabulka vypočítaných p-distancí u všech markerů mezi druhy C. poecilopus (I, II), C. microstomus (CM) a C. gobio (CG). Hodnoty CR jsou zaznačeny tučně. CR cyt b COI S7RP1 CR cyt b COI S7RP1 CR cyt b COI S7RP1 I II CM I II 0,0683 0,0308 0,0236 0 CM 0,0455 0,0629 0,0727 0,0288 0,0747 0,0771 0,0722 0,0288 CG 0,0461 0,0652 0,0759 0,0278 0,0784 0,0745 0,0719 0,0278 0,0185 0,0026 0,0037 0

4.1.2 Cytochrom b (cyt b)

Analýza 213 jedinců z 37 populací odhalila 34 haplotypů. Haplotypy byly charakterizovány pomocí 34 variabilních (7,9 %) a 23 parsimoně- informativních míst (5,4 %) při délce alignmentu 428 bp. Protein cytochrom b se skládal ze 142 aminokyselin, z toho bylo 12 variabilních (8,5 %; Obr. 14).

Všechny topologie fylogenetických stromů potvrdily existenci dvou divergentních linií I a II (Obr. 15 - 16). Haplotypy z povodí Dunaje, Visly a Dněstru Hap1 - Hap20 tvořily linii II, haplotypy z povodí Odry Hap21 - Hap34 linii I. Rozdělení linií mělo u všech metod vysoké statistické podpory (1,0 u BI, 99 % bootstrap podpora u MP a NJ a 100 % u ML analýzy).

Obr. 14. Variabilní nukleotidy a aminokyseliny pro gen a protein cytochrom b mezi liniemi I a II C. poecilopus, doplněné o druhy C. microstomus a C. gobio.

Oddělení linií bylo podpořeno i čtyřmi nesynonymními substitucemi aminokyselin, které je znázorněno ve stromě (Obr. 15). Linie I má charakteristické substituce A2T (na pozici dvě má alanin a linie II threonin) a V118I (na pozici 118 má linie I valin a linie II isoleucin). U linie II byly charakteristické substituce G67N (na pozici 67 má linie I asparagin a linie II glycin) a M96V (na pozici 96 má linie I valin a linie II methionin). Na rozdíl od CR markeru, žádná další struktura uvnitř linií nebyla zřetelná. Ve všech topologiích se odděluje pouze Hap30 (zřetelné především v radiálním stromě; Obr. 16), což je dáno specifickými nukleotidovými substitucemi, které jsou ale synonymní, tedy neprojevují se v primární struktuře proteinu.

Linie I a II vytvořily dvě samostatné haplotypové sítě (Obr. 17). U linie I byly tři haplotypy Hap21, Hap27 a Hap29 distribuovány ve více populacích (Obr. 18). Uvnitř linie II je základním haplotypem Hap3, který se vyskytuje v 17 populacích napříč celou oblastí Karpat (Obr. 18) a to včetně typové lokality. Ostatní haplotypy u této linie jsou specifické pro jednotlivá povodí např. Hap20 pro povodí Ipelu a Hronu, Hap12 pro populace v povodí Dněstru, Hap6 - 8 a Hap14 - 15 pro populace v povodí Tisy. Na typové lokalitě Velký

Slavkov se vyskytuje pouze haplotyp Hap3. Sdílené haplotypy mezi liniemi I a II jsme nenalezli.

Linie I a II se odlišují 16 nukleotidy a čtyřmi aminokyselinami (Obr. 14). C. gobio a C. microstomus se odlišují od linie I a II třemi aminokyselinami. Průměrná genetická vzdálenost (p-distance) mezi liniemi I a II dosahovala 3,08 %, odlišnost od druhu C. gobio byla u linie I 6,52 % a u linie II 7,45 % (Tab. 5). P-distance mezi C. microstomus a linií I byla 6,29 % a k linii II 7,71 %. Sekvence cyt b u druhů C. gobio a C. microstomus se odlišovaly jen dvěma nukleotidy, p-distance proto nepřesáhla 0,36 %. Průměrná vnitropopulační variabilita činila 0,09 %, nejvyšší byla u populace ze Slavkovského potoka 0,53 %, u typové lokality Velký Slavkov dosáhla 0,15 %. Uvnitř linií I a II dosahovala průměrná vnitrodruhová diverzita hodnot 0,46 resp. 0,20 %.

Obr. 15. Fylogenetický strom genu a proteinu cytochrome b. V uzlech stromu jsou zobrazeny hodnoty podpor pro BI/MP/NJ/ML analýzy. Nesynonymní záměny aminokyselin jsou vyjádřeny symbolem trojúhelníku.

Obr. 16. Radiální fylogenetický strom genu pro cytochrom b.

Obr. 17. Haplotypová síť pro linie I (Skandinávská) a II (Karpatská) na základě haplotypů cytochromu b.

Obr. 18. Distribuce haplotypů genu cytochrom b u Skandinávské (žlutá) a Karpatské (černá) linie. Červeně značené haplotypy jsou sdílené v rámci linií - u linie I červená kolečka s černým popisem, u linie II červená kolečka s bílým popisem. Číslo v kolečku značí číslo haplotypu.

Tabulka 5. Souhrnná tabulka vypočítaných p-distancí u všech markerů mezi druhy C. poecilopus (linie I, II), C. microstomus (CM) a C. gobio (CG). Hodnoty cytochromu b jsou zvýrazněny tučně. CR cyt b COI S7RP1 CR cyt b COI S7RP1 CR cyt b COI S7RP1 I II CM I II 0,0683 0,0308 0,0236 0 CM 0,0455 0,0629 0,0727 0,0288 0,0747 0,0771 0,0722 0,0288 CG 0,0461 0,0652 0,0759 0,0278 0,0784 0,0745 0,0719 0,0278 0,0185 0,0026 0,0037 0

4.1.3 S7 ribozomální protein (1. intron, S7RP1)

Dle unikátních haplotypů CR a cyt b jsme vybrali jedince pro analýzu S7RP1 genu. Z celkového počtu 110 vzorků jsme identifikovali pouze pět haplotypů, které obsahovaly šest variabilních pozic (1,1 %), z toho dvě parsimonně-informativní (0,4 %, Obr. 19). Délka alignmentu byla 538 bp.

Obr. 19. Variabilní místa genu S7RP1 u druhů C. poecilopus, C. microstomus a C. gobio.

11112222 2333333333 3333333334 44444 6904771345 6111111111 3444445894 67788 3121239872 1123456789 1012343101 13445 C.poecilopus_Hap_1 TTGTTCGGAC T------GCTCGTCTGG AATCC C.poecilopus_Hap_2 ...... C.. .------.CTCGT.... .AT.. C.poecilopus_Hap_3 C...... ------.CTCGT.... .AT.. C.poecilopus_Hap_4 ..A...... T .------.CTCGT.... .AT.. C.poecilopus_Hap_5 ..A...... T .------.CTCGT.... .ATTT C.microstomus_Nida_PL .C.CGAA.C. CAGAGGCTCT T-----TGCA G--.. C.microstomus_San_PL .C.CGAA.C. CAGAGGCTCT T-----TGCA G--.. C.microstomus_Dlubina_PL .C.CGAA.C. CAGAGGCTCT T-----TGCA G--.. JN181866_C.gobio_Opava_CZE .C.CGAA.C. CAGAGGCTCT T-----TGCA G--.. C.gobio_Moravice_CZE .C.CGAA.C. CAGAGGCTCT T-----TGCA G--..

Obr. 20. Haplotypová síť odvozená z haplotypůZákladním genu S7RP1. haplotypem sítě j Základním haplotypem sítě je Hap1, který se vyskytuje u většiny jedinců (87 %). Od něj odvozené haplotypy Hap2 a Hap3 se liší v jednom nukleotidu, Hap4 ve dvou a Hap5 ve čtyřech nukleotidech (Obr. 19 - 20). Na typové lokalitě byly identifikovány dva haplotypy Hap1 a Hap4.

Vypočítané mezipopulační p-distance nepřesáhly 0,21 %, mezi haplotypy to bylo 0,19 - 0,99 % (Tab. 6). Vnitropopulační genetické vzdálenosti byly kromě tří populací nulové

(Udava, Drietomica a Slavkovský potok). Vzdálenosti mezi druhy C. poecilopus a příbuznými druhy C. gobio příp. C. microstomus nepřesáhly 2,78 % resp. 2,88 % (Tab. 7). Navíc mezi druhy C. poecilopus a C. gobio/C. microstomus byly zjištěny druhově-diagnostické indely. C. poecilopus má unikátní 9 bp deleci a dvě inzerce 5 a 2 bp (Obr. 19).

Tabulka 6. P-distance mezi haplpotypy genu S7RP1. Hap1 Hap2 Hap3 Hap4 Hap5 Hap1 Hap2 0,0019 Hap3 0,0020 0,0040 Hap4 0,0040 0,0061 0,0061 Hap5 0,0079 0,0099 0,0099 0,0040

Tabulka 7. Souhrnná tabulka vypočítaných p-distancí u všech markerů mezi druhy C. poecilopus (I, II), C. microstomus (CM) a C. gobio (CG). U S7RP1 nedošlo k rozlišení linií I a II, proto je hodnota mezi nimi nulová. Hodnoty S7RP1 jsou zvýrazněny tučně. CR cyt b COI S7RP1 CR cyt b COI S7RP1 CR cyt b COI S7RP1 I II CM I II 0,0683 0,0308 0,0236 0 CM 0,0455 0,0629 0,0727 0,0288 0,0747 0,0771 0,0722 0,0288 CG 0,0461 0,0652 0,0759 0,0278 0,0784 0,0745 0,0719 0,0278 0,0185 0,0026 0,0037 0

4.2 Taxonomická pozice jednotlivých populací i z typové lokality v rámci euro-asijského komplexu C. poecilopus

Vyhodnocení taxonomické pozice linií, příp. sublinií v rámci Evropy a Asie, včetně posouzení jedinců z typové lokality, jsme provedli začleněním zjištěných CR haplotypů k sekvencím (viz. Materiál a metody) euro-asijského komplexu C. poecilopus (Yokoyama et al. 2008). Všechny haplotypy linie I (Skandinávská), tedy z povodí Odry, byly začleněny do linie I komplexu, která je tvořena vzorky z řeky Duna v povodí Odry v Polsku (Obr. 21). Tato linie je dle autorů reprezentantem evropské vranky C. poecilopus.

Druhá linie II (Karpatská), zahrnující také typovou lokalitu Velký Slavkov (Hap13, sublinie IIe) vytvořila ve stromě novou větev se svou vlastní evoluční historií. Nezačlenila se k žádnému jinému druhu, či skupině (Obr. 21). Jedinci z typové lokality nebyli tedy začleněni k linii I, autory Yokoyama et al. (2008) předkládané jako C. poecilopus s. stricto.

Obr. 21. Fylogenetický strom sestrojený na základě sekvencí CR ze studie Yokoyama et al. (2008) a z mé dizertační práce (tučně a barevně). Haplotypy patřící k linii I (Skandinávská) jsou značeny červeně, k linii II (Karpatská) modře. Šipkou je označen haplotyp vyskytující se také na typové lokalitě. V uzlech stromu jsou znázorněny hodnoty podpor pro BI/MP analýzy (uvedeny jen hodnoty ≥ 50 %).

Haplotypy Hap1 - Hap5 druhu C. microstomus z Polska z povodí Visly (tučně), zahrnující také typovou lokalitu druhu, byly začleněny k příbuzným druhům C. gobio a C. sibiricus (Obr. 21).

4.3 DNA barcoding a porovnání výsledků s mezinárodní databází BoLD

Celkově jsme provedli analýzu 945 jedinců 71 původních a nepůvodních druhů ryb české ichtyofauny (Tab. 8, Obr. 22) a do databáze BoLD poskytli COI sekvence v délce 500 - 652 bp. Z tohoto počtu bylo 17 jedinců druhu C. poecilopus, pět z povodí Odry a 12 z povodí Moravy (Svratka). Tyto sekvence byly vloženy do databáze BoLD a jsou sdíleny i s databází GenBank. Dodatečně jsme analyzovali čtyři vzorky z typové lokality Velký Slavkov a pět vzorků z oblasti blízké typové lokalitě C. microstomus Dlubina, které byly vloženy do databáze GenBank.

U druhu C. poecilopus jsme detekovali v celkové délce genu COI (645 bp) 19 variabilních (2,9 %) a 17 parsimonně informativních míst (2,64 %; Obr. 23). Přeložená nukleotidová sekvence do aminokyselinové struktury v délce 215 aminokyselin nenesla žádnou variabilitu.

Tabulka 8. Analyzované druhy v projektu DNA barcoding v České republice (IFCZE). Haplotypy sdílené s jiným druhem v závorce.

Čeleď Druh Počet Počet jedinců haplotypů Acipenseridae Acipenser 3 (+1) 1 (+1)* gueldenstaedtii Acipenser ruthenus 4 1 Acipenser stellatus 5 1 Anguillidae Anguilla anguilla 5 5 Anguilla rostrata 2 2 Nemacheilidae Barbatula barbatula 27 13 Centrarchidae Lepomis gibbosus 10 1 Micropterus salmoides 5 1 Cobitidae Cobitis elongatoides 3 2 Misgurnus fossilis 1 1 Sabanejewia balcanica 1 1 Cottidae Cottus gobio 21 4 Cottus poecilopus 17 6 Cyprinidae Abramis brama 29 4 Alburnoides 14 5 bipunctatus Alburnus alburnus 26 4 Aspius aspius 14 2 Ballerus ballerus 3 1 Ballerus sapa 2 1 Barbus barbus 25 2 Blicca bjoerkna 14 (+1) 4 (+1)** Carassius carassius 16 5 Carassius gibelio 27 6 Carassius langsdorfii 3 1 Ctenopharyngodon 3 1 idella Cyprinus carpio 10 2

Gobio gobio 27 (+1) 3 (+1)*** Gobio obtusirostris 5 3 Hypophthalmichthys 3 1 molitrix Chondrostoma nasus 25 5 Leucaspius delineatus 5 2 Leuciscus idus 13 4 Leuciscus leuciscus 21 (+5) 2 (+1) † Pelecus cultratus 2 1 Phoxinus phoxinus 25 10 Pseudorasbora parva 22 7 Rhodeus amarus 18 7 Romanogobio 4 2 banaticus Romanogobio belingii 3 1 Romanogobio 7 3 vladykovi Rutilus rutilus 31 7 Scardinius 16 1 erythrophthalmus Squalius cephalus 28 4 Tinca tinca 24 3 Vimba vimba 4 1 Esocidae Esox lucius 22 4 Gasterosteidae Gasterosteus 2 1 aculeatus Gobiidae Neogobius 5 1 melanostomus Proterorhinus 6 2 semilunaris Ictaluridae Ameiurus nebulosus 2 1 Lotidae Lota lota 16 3 Percidae Gymnocephalus baloni 1 1 Gymnocephalus 16 5 cernua Gymnocephalus 2 1 schraetser Perca fluviatilis 29 5 Sander lucioperca 16 1 Sander volgensis 2 1 Zingel streber 1 1 Zingel zingel 1 1 Petromyzontidae Eudontomyzon mariae 2 2 Lampetra planeri 14 3 Salmonidae Coregonus maraena 4 (+1) 1 (+1)†† Coregonus peled 5 4 Hucho hucho 2 1 Oncorhynchus mykiss 24 5 Salmo salar 3 2 Salmo trutta 31 4 Salvelinus fontinalis 16 4 Thymallus thymallus 16 2 Siluridae Silurus glanis 11 1 Umbridae Umbra krameri 5 1 * - sdílený haplotyp s Acipenser ruthenus. ** - sdílený haplotyp s Abramis brama. *** - sdílený haplotyp s Romanogobio vladykovi. † - sdílený haplotyp s Leuciscus idus. †† - sdílený haplotyp s Coregonus peled.

Obr. 22. Mapa sběru vzorků v projektu DNA barcoding (Mendel et al. 2012a).

Obr. 23. Variabilní místa genu COI u linií druhu C. poecilopus, haplotypů C. microstomus a druhu C. gobio.

1111 1112222222 2233333333 3344444444 4444455555 5556666 456771258 8990134569 9900123356 6900222345 5667800445 5780111 3878891066 9261040571 4736873913 6725039840 9284917062 5183258 IFCZE701|C.poecilopus|HQ961093 AAGGAGAGAA CTTACGCTCA ATTATTTGCA CTAGTATTCT ATTTTGTTGT CTACCGT IFCZE716|C.poecilopus ...... A...... IFCZE775|C.poecilopus G...... A...... ?.... IFCZE776|C.poecilopus ?...... A...... IFCZE777|C.poecilopus ?...... A...... IFCZE815|C.poecilopus ...... A...... T...... IFCZE816|C.poecilopus ...... A...... IFCZE817|C.poecilopus ...... A...... IFCZE818|C.poecilopus II ...... A...... IFCZE824|C.poecilopus G...... A...... IFCZE947|C.poecilopus ...... A...... IFCZE984|C.poecilopus ...... A...... 1927_C.poecilopus_CzarnyDunajec ...... 1928_C.poecilopus_CzarnyDunajec ...... 1929_C.poecilopus_CzarnyDunajec ...... 1930_C.poecilopus_CzarnyDunajec ...... 1932_C.poecilopus_CzarnyDunajec ...... 9216_C.poecilopus_VelkySlavkov ?...... 9218_C.poecilopus_VelkySlavkov ?...... 9222_C.poecilopus_VelkySlavkov ???...... 9223_C.poecilopus_VelkySlavkov ???...... ------SWE_KJ128471_C.poecilopus .CA...... G.A...G G..G..A..G ..G.G...... C..CA. A...T.. NOR_NOFIS007_C.poecilopus .CA...... G.A...G G..G..A..G ..G.G...... C..CA. A...T.. IFCZE477|C.poecilopus|HQ960874 .CA...... G.A...G G..G..A..G ..G.G...... C..CA. A...T.. IFCZE478|C.poecilopus|HQ960875 I .CA...... G.A...G G..G..A..G ..G.G...... C..CA. A...T.. IFCZE479|C.poecilopus|HQ960876 .CA...... G.A...G G..G..A..G ..G.G...... C..CA. A...T.. IFCZE480|C.poecilopus|HQ960877 .CA...... G.A...G G..G..A..G ..G.G...... C..CA. A...T.. IFCZE481|C.poecilopus|HQ960878 .CA...... G.A...G G..G..A..G ..G.GG...... C..CA. A...T.. ------GER_C.microstomus_KM286618 ???AC..AGG A.CGT.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC .CCAGACCAC .CTT.AG GER_C.microstomus_KM286617 .CA.C..AGG A.CGT.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC .CCAGACCAC .CTT.AG 2173_C.microstomus_Hap_1 .CA.C..AGG A.CGT.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC .CCAGACCAC .CTT.AG 2174_C.microstomus_Hap_2 .CA.C..AGG ACCGT.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC .CCAGACCAC .CTT.AG 1595_C.microstomus_Hap_3 .CA.C.GAGG A.CGT.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC .CCAGACCAC .CTT.AG 1823_C.microstomus_Hap_4 .CA.CA.AGG A.CGT.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC .CCAGACCAC .CTT.AG IFCZE0894_C.gobio_HQ96101 .CA.C..AGG A.C.T.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC GCCAGACCAC .CTT.AG IFCZE0893_C.gobio_HQ961010 .CA.C..AGG A.C.T.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC GCCAGACCAC .CTT.AG IFCZE0185_C.gobio_HQ960512 .CA.C..AGG A.C.T.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC GCCAGACCAC .CTT.AG .IFCZEO544_C.gobio_HQ960694 .CA.C..AGG A.C.T.TCTG GCATACGCA. .C.T.GCCTC GCCAGACCAC .CTT.AG

Obr. 24. Nezakořeněný fylogenetický strom, který byl vygenerován z platformy BoLD systému. Zahrnuje všechny dostupné druhy a jedince rodu Cottus. Pro lepší orientaci jsou linie I a II označeny barevně.

Dle fylogenetické analýzy došlo stejně jako u kódujícího mt mrkeru cyt b k rozdělení karpatských populací do dvou linií I a II bez dalšího členění (Obr. 24 - 25). Linie I obsahovala dva haplotypy lišící se jen jedním nukleotidem (Obr. 23). Linie II obsahovala čtyři haplotypy a je zde zahrnuta i typová lokalita Velký Slavkov. Vnitropopulační diverzita nepřesáhla 0,06 % v každé linii.

Když jsme provedli fylogenetickou analýzu zahrnující všechny jedince C. poecilopus a dále i všechny druhy rodu Cottus dostupné aktuálně v mezinárodní databázi BoLD, k naší linii I byli přiřazeny vzorky ze Švédska a Norska (Obr. 23 - 24). Tyto sekvence byly s těmi našimi 100 % identické (Obr. 23).

Obr. 25. Radiální fylogenetický strom genu COI z databáze BoLD zahrnující všechny dostupné sekvence druhů rodu Cottus. Jedinci linie I a II jsou vyznačeni barevně.

P-distance byly mezi liniemi I a II 2,36 %, mezi I a II a druhem C. gobio 7,59 % resp. 7,19 %. Hodnoty genetické vzdálenosti k druhu C. microstomus byly 7,27 % u linie I a 7,22 % u linie II (Tab. 9). Sesterské druhy C. microstomus a C. gobio si byly podobné z 0,37 %.

Tabulka 9. Souhrnná tabulka vypočítaných p-distancí u všech markerů mezi druhy C. poecilopus (I, II), C. microstomus (CM) a C. gobio (CG). Hodnoty COI jsou zaznačeny tučně. CR cyt b COI S7 CR cyt b COI S7 CR cyt b COI S7 I II CM I II 0,0683 0,0308 0,0236 0 CM 0,0455 0,0629 0,0727 0,0288 0,0747 0,0771 0,0722 0,0288 CG 0,0461 0,0652 0,0759 0,0278 0,0784 0,0745 0,0719 0,0278 0,0185 0,0026 0,0037 0

4.4 Analýza hybridních zón v povodí Odry a Moravy (Svratky)

4.4.1 Morfologie a meristika

U všech jedinců z povodí Odry i Moravy byla nejprve provedena morfologická a meristická analýza k identifikaci čistých jedinců a potenciálních hybridů (tato měření prováděli kolegové z ichtyologického oddělení, viz. Materiál a metody). V oderském povodí bylo identifikováno 49 jedinců C. poecilopus, 36 jedinců C. gobio a 19 vzorků bylo určeno jako hybridních (Tab. 10). Sedm jedinců z Opavy určených dle morfologie jako hybridi, bylo na genu S7RP1 určeni jako C. poecilopus.

Z celkového počtu 124 jedinců odchycených v povodí Svratky při třech odlovech (červenec 2009, říjen 2009 a květen 2010), byla morfometrická a morfologická analýza provedena u 37 vzorků při sběru v červenci 2009. Z celkového počtu 14 jedinců na hybridní zóně Svratka - Jimramov bylo pět identifikováno jako hybridní, jeden vzorek jako C. poecilopus a osm C. gobio (Tab. 10).

Signifikantně se hybridi lišily jen v parametru výška těla pod postranní čárou (body depth bellow lateral line) a v poměru výšky těla nad a pod postranní čárou. V parametru výšky těla nad postranní čárou byly shodné s C. poecilopus. V případě meristických vlastností nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly mezi hybridy a čistými druhy.

Tabulka 10. Souhrn analyzovaných vzorků z hybridních zón (tučně) i mimo ně dle morfologie. Z povodí Svratky v tabulce zapsány jen vzorky ze sběru v červenci 2009, u kterých byla provedena morfometrie. lokalita C. poecilopus C. gobio hybrid celkem Povodí Odry Morávka 7 0 0 7 Malý Lipový 6 0 0 6 Kotelný potok 4 0 0 4 Bílá Ostravice 6 0 0 6 Moravice-Žirnovice 0 17 0 17 Opava 8 16 10 (7*) 34 Moravice 4 2 8 14 Ostravice 14 1 1 16 celkem 49 36 19 104 Povodí Svratky Fryšávka 5 0 0 5 (červenec 2009) Trhonický potok 3 0 0 3 Svratka-Sedliště 0 11 0 11 Svratka-Strachujov 0 4 0 4 Svratka-Jimramov 1 8 5 14 celkem 9 23 5 37 * jedinci určení dle S7RP1 jako C. poecilopus

4.4.2 Genetická charakterizace hybridních událostí

První intron S7 r-proteinu (S7RP1) Genetická identifikace jedinců proběhla u 104 vzorků z povodí Odry a u 14 vzorků z hybridní zóny Svratka-Jimramov z odlovů v roce 2009. Druhově-diagnostickým rozdílem v sekvenci S7RP1 mezi druhy C. poecilopus a C. gobio je existence 3 indelů - 9 bp delece a dvě menší inzerce (5 bp a 2 bp). Hybridní jedinci tak díky indelům vykazují posun čtecího rámce ve specifických pozicích (Obr. 25). Navíc v místech, kde se vyskytují druhově- diagnostické substituce, dochází ke zřetelnému překryvu píků. Sedm hybridů určených dle morfologie mělo S7RP1 haplotyp čistého druhu C. poecilopus.

Obr. 25. Ukázka hybridního elektroforetogramu s druhově-diagnostickými pozicemi mezi C. poecilopus a C. gobio, včetně zřetelného posunu čtecího rámce.

Mikrosatelity

Fragmentační analýza proběhla u 64 jedinců z povodí Odry. Analyzovali jsme šest vybraných mikrosatelitových lokusů (Cgo05ZIM, Cgo18ZIM, Cgo22ZIM (TET), Cgo42ZIM (HEX), Cgo1016PBBE (FAM) a Cgo1033PBBE (TET) z osmi, které byly polymorfní u obou druhů. Monomorfní byl pouze lokus Cgo18ZIM u vranky obecné z Moravice. Test HWE byl u populace z Opavy spočítán pro dva datové sety (Tab. 11a). Datový set I zahrnoval ve skupině čistých druhů sedm chybně identifikovaných hybridních jedinců, jenž nebyli rozlišeni na S7RP1 markeru. V tomto případě byla odchylka od HWE pozorována u lokusů CgoZIM22, Cgo1033PBBE u C. gobio a u pěti lokusů C. poecilopus (Cgo18ZIM, Cgo22ZIM, Cgo42ZIM, Cgo1016PBBE a Cgo1033PBBE). U datového setu II byli dodatečně detekovaní hybridní jedinci (pomocí mikrosatelitů) vyřazeni z analýzy jedinců představující jen čisté druhy. V tomto případě došlo ke snížení počtu lokusů odchylujících se od HWE na dva (Cgo22ZIM, Cgo1033PBBE) u obou druhů (Tab. 11a). Ostatní lokusy byly v HWE (p > 0,05). Ve všech případech, kdy byla pozorována odchylka od HWE, byla signifikantní hodnota Fis indexu, což ukazuje na nadbytek homozygotů v populaci (Tab. 11a - c). Analýzy provedené v programu Microchecker však ukázaly, že v případě lokusu Cgo22ZIM je nadbytek homozygotů způsoben nulovými alelami. Alelové frekvence u tohoto lokusu byly proto pro další analýzy korigovány pomocí navržených frekvencí metodou Brookfield (1996). Nicméně nebyly pozorovány odlišné výsledky ve srovnání s nekorigovaným datasetem. Počet alel byl v rozmezí 2 - 32 u C. gobio a 6 - 18 u C. poecilopus (Tab. 12). Osm hybridů bylo odhaleno při analýze alel v jednotlivých lokusech (Tab. 13). Lokusy Cgo05ZIM, Cgo1016PBBE a Cgo1033PBBE lze označit jako diagnostické, s alelami typickými pro každý ze zkoumaných druhů. V případě lokusu Cgo1016PBBE je délka alel 121 - 131 bp typická pro C. gobio a 175 - 225 bp pro C. poecilopus, stejně tak u Cgo1033PBBE se délka 121 - 141 bp vyskytovala jen u C. gobio a 101 - 119 bp jen u C. poecilopus. V lokuse Cgo1016PBBE byly u sedmi jedinců identifikovaných S7RP1 markerem jako C. poecilopus odečteny alely typické pro C. gobio o délce 121 a 125 bp, všichni jedinci byli v tomto lokuse homozygotní. Uvedených osm jedinců bylo dodatečně zařazeno do skupiny hybridů. U tří hybridů identifikovaných pomocí jaderného markeru S7RP1 byly genotypy v diagnostických lokusech následující: vzorek 9629: Cgo1016PBBE- 181/181 jako C. poecilopus, Cgo1033PBBE-141/141 jako C. gobio, 9636: Cgo1016PBBE- 121/121 bp jako C. gobio, Cgo1033PBBE-101/101 bp jako C. poecilopus, u vzorku 9640 byly délky všech alel shodné s délkami C. poecilopus 181/193 resp. 101/101. U jednoho vzorku vranky obecné z Moravice jsme v lokuse Cgo1033PBBE identifikovali heterozygotní genotyp 103/141.

Tabulka 11. Genetická charakteristika jednotlivých markerů u populací z Opavy (a), Moravice (b) a Ostravice (c). U populace z Opavy je test HWE spočítán pro dva datové sety. a) Opava datový set I datový set II

N Na AR alelový rozsah alely (bp) Ho He p Fis p Ho He p Fis p C. gobio ZIM05 15 4 5 12 182,190-194 0,529 0,636 0,531 ns 0,172 0,258 ns 0,533 0,662 0,438 ns 0,200 0,181 ns ZIM18 15 2 7 12 219,231 0,059 0,059 1.000 ns 0,000 1.000 ns 0,067 0,067 1.000 ns 0,000 1.000 ns ZIM22 13 15 10 150 183,195-201,283, 0,800 0,947 0,005 ** 0,160 0,044 * 0,769 0,948 0,002 * 0,195 0,025 * 291,297-299,305, 309-311,315,327, 333 ZIM42 14 4 6 8 224,228-232, 0,625 0,619 0,920 ns -0,010 0,631 ns 0,643 0,640 1.000 ns -0,004 0,650 ns 1016PBBE 15 2 3.5 6 121, 127 0,118 0,114 1.000 ns -0,032 1.000 ns 0,133 0,129 1.000 ns -0,037 1.000 ns 1033PBBE 15 5 3.0 20 121,131-133,139-141 0,188 0,573 0,000 *** 0,680 0,003 ** 0,133 0,556 0,000 *** 0,767 0,003 * celkem 32 C. poecilopus ZIM05 8 4 4 8 198-206 0,533 0,729 0,215 ns 0,275 0,081 ns 0,625 0,775 0,285 ns 0,205 0,242 ns ZIM18 8 7 1.5 20 263,271-275,279-283 0,600 0,784 0,021 * 0,239 0,044 * 0,750 0,817 0,480 ns 0,087 0,431 ns ZIM22 8 9 11 150 183,195-201,283,291, 0,667 0,929 0,000 *** 0,089 0,003 ** 0,625 0,925 0,003 ** 0,340 0,019 * 297-299,305,309-311, 315,327,333 ZIM42 8 5 3.5 42 236-242,278 0,733 0,740 0,016 * 0,010 0,567 ns 0,625 0,775 0,136 ns 0,205 0,253 ns 1016PBBE 8 5 2 16 179-181,189,193-195 0,200 0,717 0,000 *** 0,728 0,003 ** 0,375 0,533 0,289 ns 0,311 0,136 ns 1033PBBE 8 2 4 2 101-103 0,067 0,434 0,002 *** 0,851 0,003 ** 0,125 0,525 0,049 * 0,774 0,036 * celkem 32 hybrid ZIM05 11 6 4 22 182,190-192,198-204 ZIM18 11 9 7 54 231,263-265,271, 275,279-285 ZIM22 11 13 9 150 183,195,199,203,207, 271,279,283,303- 305,313,323,333 ZIM42 11 7 5 52 230-234,238- 240,278,282 1016PBBE 11 4 5 72 121,125,181,193 1033PBBE 11 3 2 40 101-103, 141 celkem 42

N – počet vzorků, Na – počet alel, Ho – pozorovaná heterozygozita, He – očekávaná heterozygozita, Fis – index homozygotnosti, ns – p-hodnota není signifikantní, * p < 0,05.

b) Moravice

N Na alelový rozah alely (bp) Ho He p-hodnota Fis p-hodnota

C. gobio ZIM18 18 1 0 231 monomorfní NA NA

ZIM22 18 22 116 183,203,239,253-257,281,287-291,295-299 0,833 0,960 0,113 ns 0,122 0,063 ns

ZIM42 18 10 34 230,234,244,252-264 0,944 0,876 0,135 ns -0,080 0,946 ns

1016PBBE 18 4 10 121, 125,129-131 0,111 0,259 0,006 ** 0,578 0,008 ** celkem 37 C. poecilopus ZIM18 4 5 100 185,265,279-281,285 0,750 0,857 0,661 ns ZIM22 4 4 18 193-197,211 0,500 0,821 0,310 ns ZIM42 4 3 10 240,248-250 0,500 0,607 0,426 ns 1016PBBE 1 2 8 181, 189 1,000 1,000 1,000 ns celkem 14 hybrid ZIM18 3 2 4 275,279

ZIM22 3 1 0 191

ZIM42 3 2 10 250,250

1016PBBE 3 2 8 181,189 celkem 7

N – počet vzorků, Na – počet alel, Ho – pozorovaná heterozygozita, He – očekávaná heterozygozita, Fis – index homozygotnosti, ns – p-hodnota není signifikantní, * p < 0,05.

c) Ostravice

N Na alelový rozsah alely (bp) Ho He p-hodnota Fis p-hodnota

C. poecilopus ZIM05 21 2 4 194, 198 0,048 0,048 1,000 ns 0,000 1,000 ns ZIM18 21 9 16 273-289 0,524 0,791 0,015 * 0,343 0,014 **

ZIM22 21 8 22 179-183, 193-201 0,857 0,810 0,230 ns -0,060 0,814 ns

ZIM42 21 7 16 228-234, 238-244 0,762 0,816 0,005 ** 0,068 0,314 ns

1016PBBE 21 11 50 175-177,181, 187, 191-193, 197,217, 221-225 0,714 0,811 0,332 ns 0,122 0,178 ns

1033PBBE 21 7 18 101, 109-119 0,619 0,703 0,049 * 0,122 0,178 ns celkem 44

N – počet vzorků, Na – počet alel, Ho – pozorovaná heterozygozita, He – očekávaná heterozygozita, Fis – index homozygotnosti, ns – p-hodnota není signifikantní, * p < 0,05

Tabulka 12. Statistické parametry pro šest analyzovaných lokusů u druhů C. poecilopus a C. gobio. druh lokus N Na AR rozsah jedinečné alel alely C. gobio ZIM05 31 7 7 182-196 5 ZIM18 32 2 1.9 219, 231 2 ZIM22 31 32 31.5 183-343 25 ZIM42 32 13 12.8 224-274 10 1016PBBE 32 5 4.9 121-131 5 1033PBBE 30 13 13 121-141* 8 celkem 72 55 C. poecilopus ZIM05 53 6 5.1 198-298 5 ZIM18 57 14 12.1 185-289 14 ZIM22 57 18 14.3 169-321 12 ZIM42 48 12 11.2 216-278 9 1016PBBE 57 14 11.5 175-225 14 1033PBBE 53 8 7.5 101-119* 4 celkem 72 58

N - počet jedinců, Na - počet alel, AR - alelová bohatost (allelic richness), * není zahrnuta populace z Moravice

Jediný hybrid identifikovaný na řece Ostravici nesl alely C. gobio u jednoho lokusu, u dalších pak alely C. poecilopus. Všechny genotypy u hybridů z řeky Moravice pocházely z druhu C. poecilopus. Žádný z hybridů nenesl heterozygotní genotyp (každá alela od jiného druhu) typický pro hybridní F1 generaci (Tab. 13).

Tabulka 13. Souhrn vybraných parametrů pro identifikaci hybridů z hybridní zóny v povodí Odry. Alely C. gobio jsou zvýrazněny tučně. vzorek lokalita morfologie S7RP1 mtDNA Cgo05ZIM Cgo18ZIM Cgo1016ZIM Cgo1033ZIM

25 Ostravice hybrid hybrid NA 180/180 277/277 181/181 105/107

9625 Opava hybrid C.poecilopus C.poecilopus 200/204 263/271 125/125 103/103

9626 Opava hybrid C.poecilopus C.poecilopus 198/200 279/279 121/121 101/101

9629 Opava hybrid hybrid C.gobio 182/190 231/231 181/181 141/141

9630 Opava hybrid C.poecilopus C.poecilopus 198/204 279/279 121/121 103/103

9636 Opava hybrid hybrid C.poecilopus 198/200 275/279 121/121 101/101

9640 Opava hybrid hybrid C.poecilopus 200/200 281/285 181/193 101/101

9644 Opava hybrid C.poecilopus C.poecilopus 198/198 279/281 121/121 103/103

9645 Opava hybrid C.poecilopus C.poecilopus 200/200 265/265 121/121 103/103

9648 Opava hybrid C.poecilopus C.poecilopus 198/198 279/279 121/121 103/103

9649 Opava hybrid C.poecilopus C.poecilopus 204/204 275/283 121/121 103/103

9742 Moravice hybrid hybrid C.poecilopus NA 279/279 181/189 NA

9745 Moravice hybrid hybrid C.poecilopus NA 279/279 181/189 NA

9747 Moravice hybrid hybrid C.poecilopus NA NA 181/189 NA

9748 Moravice hybrid hybrid C.poecilopus NA 275/279 181/189 NA

9750 Moravice hybrid hybrid C.poecilopus NA NA 181/181 NA

9751 Moravice hybrid hybrid C.poecilopus NA NA NA NA

9752 Moravice hybrid hybrid C.poecilopus NA NA 181/189 NA

9753 Moravice hybrid hybrid C.poecilopus NA NA 181/181 NA NA - nebylo analyzováno

Genetickou diferenciaci mezi čistými druhy a hybridy ukázaly i signifikantní hodnoty pairwise FST (p < 0,05) spočítané jako distanční matice počtu odlišných alel (Tab. 14a - c) nebo alelový rozsah, který je u hybridů součtem alelových rozsahů čistých druhů (Obr. 25 - 26).

Tabulka 14. Genetická diferenciace mezi druhy v jednotlivých populacích vyjádřená pomocí FST indexu (pod diagonálou) a její p-hodnoty (nad diagonálou). a) Opava C. gobio C. poecilopus hybrid C. gobio * * C. poecilopus 0,4779 * hybrid 0,2709 0,1158 b) Moravice C. gobio C. poecilopus hybrid C. gobio * * C. poecilopus 0,3378 * hybrid 0,4767 0,2615 c) Ostravice C. gobio C. poecilopus hybrid C. gobio * ns C. poecilopus 0,3882 ns hybrid 0,6667 0,3632 * p < 0,05, ns - hodnota není signifikantní

U lokusu Cgo1033PBBE se u jedinců z Opavy vyskytují pouze dvě alely 101 a 103 bp (Obr. 25), u dalších populací se vyskytují až do délky 119 bp. Na Obr. 25 - 26 lze pozorovat u některých lokusů překrytí alel hybridních jedinců s oběma čistými druhy. Populaci z Ostravice neuvádím z důvodu zachycení pouze jednoho hybrida a jednoho jedince C. gobio.

Obr. 25. Distribuce alelových frekvencí u jednotlivých lokusů v populaci z Opavy hodnocené pomocí GenAlEx 6. Alelové frekvence byly u lokusu 22ZIM korigovány na přítomnost nulových alel metodou Brookfield (1996). Pop1 - hybridní jedinci (modrá), Pop2 - C. gobio (fialová), Pop3 - C. poecilopus (bílá).

Allele Frequency for 05ZIM

0,600 0,500 Pop1 0,400 0,300 Pop2 0,200 0,100 Pop3 Frequency 0,000 182 190 192 194 198 200 204 206 05ZIM Locus

Allele Frequency for 18ZIM

1,200 1,000 Pop1 0,800 0,600 Pop2 0,400 0,200 Pop3

Frequency 0,000 219 231 263 265 271 273 275 279 281 283 285 18ZIM Locus

Allele Frequency for 22ZIM

0,250 0,200 Pop1 0,150 0,100 Pop2 0,050 Pop3

Frequency 0,000

183 195 197 199 201 203 207 271 279 283 285 291 297 299 303 305 309 311 313 315 321 323 327 333 22ZIM Locus

Allele Frequency for 42ZIM

0,500 0,400 Pop1 0,300 0,200 Pop2 0,100 Pop3

Frequency 0,000 224 228 230 232 234 236 238 240 242 278 282 42ZIM Locus

Allele Frequency for 1016PBBE

1,000 0,800 Pop1 0,600 0,400 Pop2 0,200 Pop3

Frequency 0,000 121 125 127 179 181 189 193 195 1016PBBE Locus

Allele Frequency for 1033PBBE

0,600 0,500 Pop1 0,400 0,300 Pop2 0,200 0,100 Pop3

Frequency 0,000 101 103 121 131 133 139 141 1033PBBE Locus

Obr. 26. Distribuce alelových frekvencí u jednotlivých lokusů v populaci z Moravice hodnocené pomocí GenAlEx 6. Pop1 - hybridní jedinci (modrá), Pop2 - C. gobio (fialová), Pop3 - C. poecilopus (bílá).

Allele Frequency for 18ZIM

1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 Pop1 0,000 Frequency Pop2 185 231 265 275 279 281 285 Pop3 18ZIM Locus

Allele Frequency for 22ZIM

1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 Pop1 0,000

Frequency Pop2

191 193 195 197 203 211 239 253 257 281 287 289 291 295 297 299 301 303 305 309 317 319 323 341 343 183 Pop3 22ZIM Locus

Allele Frequency for 42ZIM

0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 Pop1 0,100 0,000

Frequency Pop2 230 234 240 244 248 250 252 254 256 258 260 262 264 Pop3 42ZIM Locus

Allele Frequency for 1016PBBE

1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 Pop1 0,000

Frequency Pop2 121 125 129 131 181 189 Pop3 1016PBBE Locus

Pro vizualizaci druhů a hybridů v 3D prostoru jsme provedli 3D PCA analýzu. Nejdříve byla provedena jen s čistými druhy pro zhodnocení pozice a identifikaci clusterů čistých druhů. Následně byli do analýzy vloženi hybridní jedinci. Většina z nich vytvořila cluster uprostřed mezi čistými druhy (Obr. 27), i když blíže ke skupině C. poecilopus. Jeden hybridní vzorek leží blíže k druhu C. gobio a jeden vzorek z řeky Opava (9640) leží v clusteru C. poecilopus. V případě populace z Moravice jsme provedli analýzu pouze na čtyřech lokusech (viz. Materiál a metody) a jedincích, u kterých byly skórovány všechny tyto lokusy. Do analýzy proto vstoupili tři jedinci C. poecilopus, jeden C. gobio a tři hybridní jedinci.

Pomocí programu NewHybrids jsme provedli přibližný odhad jednotlivých generací zpětných kříženců (advanced backcrosses - BC). Ze zastoupení jednotlivých alel je patrno, že došlo k několikanásobnému zpětnému křížení a počet lokusů pro jejich rozlišení by musel být mnohonásobně vyšší (Boecklen and Howard 1997). Program nám poskytl pouze představu o zařazení hybridů do některé z kategorií BC-1 (zpětný kříženec první generace) až BC-5 (zpětný kříženec páté generace), protože je použitelný hlavně pro rozlišení čistých jedinců a nedávných hybridů (Anderson and Thomson 2002). S pravděpodobností okolo 20 a 10 % byli zařazeni dva hybridi do kategorie BC-3, což znamená, že s 10 příp. 20 % pravděpodobností jsou to hybridi třetí generace zpětného křížení. U ostatních hybridů byly pravděpodobnosti distribuovány v různých kategoriích, nejvyšší byla v kategorii BC-5. Na základě pěti markerů

můžeme spolehlivě říci, že jsme neidentifikovali žádného F1 hybrida ani BC-1. Rozlišení dalších kategorií nebylo možné.

Obr. 27. Separace čistých druhů C. poecilopus a C. gobio a jejich hybridů v 3D prostoru na základě šesti mikrosatelitových lokusů. Čisté druhy jsou zakroužkovány, jedinci nepatřící do žádné ze zakroužkovaných skupin jsou hybridi. Osy vysvětlují 100 % variability.

Analýza mateřské linie hybridů

K detekci mateřské linie a ke zjištění cytonukleární nerovnováhy (CND - cytonuclear disequillibrium) jsme amplifikovali mt gen pro kontrolní oblast. Detekce mateřské linie byla provedena u hybridů z obou hybridních zón, v povodí Odry i Moravy. V povodí Moravy jsme zjistili mateřský příspěvek pouze druhu C. gobio, v oderském povodí obou druhů. Z 19 hybridů u opavské populace byla matkou 17 jedinců C. poecilopus a jednoho C. gobio. U jednoho hybrida jsme mateřský haplotyp nezjistili (Ostravice), ale z postavení hybridů ve 3D PCA analýze u populací z Opavy (Obr. 28a) a Moravice (Obr. 28b) vyvozujeme, že hybridi vždy leží blíže k mateřským druhům. Proto u hybrida z Ostravice by mohla být matkou C. poecilopus (Obr. 28c).

Obr. 28. Postavení obou druhů ve 3D prostoru u jednotlivých populací (a - Opava, b - Moravice, c - Ostravice) na základě mikrosatelitových lokusů. Čisté druhy jsou zakroužkovány, hybridi jsou mimo kroužky. Postavení hybridních jedinců je vždy blíže mateřskému druhu. a) Opava (jedinec ve čtverečku je heterozygot 103/141 nejasného postavení, viz. Diskuse).

b) Moravice

c) Ostravice

Jak bylo zmíněno v úvodu, zástupci rodu Cottus jsou rozšířeni téměř po celém světě. V posledních letech vznikla v různých distribučních oblastech řada studií s cílem vyjasnit komplikovanou a nejasnou taxonomii (Englbrecht et al. 2000, Kontula and Vainola 2001, Volckaert et al. 2002, Kinziger et al. 2007, Shedko and Miroshenko 2007, Yokoyama et al. 2008, Baumsteiger et al. 2014, Day et al. 2014, Goto et al. 2014, aj.), která vyplývá z ekologických, etologických a morfologických charakteristik vranek. Vzhledem k jejich způsobu života, především omezené schopnosti pohybu díky absenci plynového měchýře, vzniká velké množství částečně, či plně izolovaných populací, a to i v rámci jednoho toku (Knapen et al. 2003). Díky tomu se vranky vyznačují vysokou vnitrodruhovou variabilitou ve srovnání s jinými druhy ryb. Tato vysoká variabilita vede k problematické identifikaci jednotlivých populací a popisu mnoha druhových komplexů (Lemoine et al. 2014). Tyto komplexy nacházíme na mnoha kontinentech: C. gobio komplex v Evropě, komplexy C. pollux a C. nozawae v Japonsku, komplexy C. carolinae a C. hypselurus v Severní Americe nebo C. poecilopus komplex v Euroasii (Goto et al. 2014).

V Evropě je nejvíce studovaným druhem, respektive komplexem vranka obecná - C. gobio (Englbrecht et al. 2000, Kontula and Vainola 2001, Volckaert et al. 2002, Kontula and Vainola 2004, Šlechtová et al. 2004). Dříve byly prakticky všechny druhy vranek označovány jako druh C. gobio. Se zpřesněním metod druhové identifikace, především s nástupem molekulárně-genetických metod, začaly vznikat poddruhy, později komplexy. Na základě molekulárních dat (Englbrecht et al. 2000, Volckaert et al. 2002, Hanfling et al. 2002) byl popsán tzv. C. gobio komplex s osmi divergentními liniemi. Jeho součástí se staly druhy C. gobio, C. microstomus, C. koshewnikovi, C. rhenanus, C. perifretum, C. sibiricus, C. aturi a C. durani, přičemž tyto druhy jsou popsány především na základě genetických rozdílů, ale stále zůstávají pochybnosti. Nejasné postavení má např. druh C. microstomus, který obývá povodí Dněstru, Visly a Odry. Když jsme provedli na pozadí morfologické determinace porovnání sekvenačních vzorů čtyř genetických markerů (jaderný S7RP1, mt markery: cyt b, CR a COI) mezi druhy C. gobio, C. microstomus a C. poecilopus z povodí Visly, tak mezi druhy C. gobio a C. microstomus jsme nenalezli prakticky žádné genetické rozdíly. Jen v případě nejvariabilnějšího mt markeru CR, jsou patrny odlišné substituce, které jsou ale v porovnání s rozdíly k druhu C. poecilopus jen na úrovni vnitrodruhové variability.

U dalšího, typicky popisovaného druhu v Evropě, u vranky pruhoploutvé C. poecilopus, Heckel 1837 byla situace obdobná. Na euro-asijském kontinentu byl popsán na základě analýzy kontrolního regionu C. poecilopus komplex (Yokoyama et al. 2008), jehož

součástí je pět linií (I - V); linii I (Odra) autoři považují za reprezentanta evropské C. poecilopus na základě studie alozymů (Pasko and Maslak 2003). Postupně došlo k vyčlenění druhů C. altaicus (linie II), C. kuznetsovi (III), C. szanaga (V), přičemž status linií IV a VI zůstává nejasný. Poslední popis nových druhů z tohoto komplexu učinili Sideleva and Goto (2009). Stejně jako v rámci komplexu druhů vranky obecné, jsou si i druhy uvnitř komplexu vranky pruhoploutvé geneticky podobné a jejich rozlišení díky vysoké přirozené variabilitě může být problematické.

Zajímavostí je, že variabilita evropských populací zůstávala na okraji zájmu. Všeobecně byl přijímán fakt, kdy Pasko and Maslak (2003) na základě alozymové analýzy učinili závěr, že populace z povodí střední Evropy (Odra a Visla) jsou si blízké. Po vyloučení populace z jezera Hancza, nenašli signifikantní mezipopulační rozdíly. Všechny následné studie tento poznatek přejímaly (Yokoyama and Goto 2005, Yokyama et al. 2008, Sideleva and Goto 2009), což vedlo k tomu, že v žádné ze studií již dále nezjišťovali variabilitu uvnitř evropského regionu. Všichni autoři přijali jako typického zástupce středoevropské vranky jedince z oderského povodí, či z povodí Visly nebo Dunaje. Bylo tedy akceptováno, že tento region je geneticky homogenní, přestože právě Pasko and Maslak (2003) ve své práci zmiňují vysoký potenciál divergence u vranky pruhoploutvé, který si zasluhuje pozornost a další zkoumání. Tento zdánlivě rozporuplný fakt objasňuje porovnání sekvencí jaderných a mitochondriálních genů, což učinila naše studie. V případě analýzy intronu jaderného genu S7RP1 jsme dospěli ke stejným závěrům jako Pasko and Maslak (2003). Tedy, že nejsou genetické rozdíly mezi sudeto-karpatskými populacemi vranky pruhoploutvé. I přesto, že se jednalo o porovnání nukleotidové sekvence z nekódující oblasti s mutabilitou mnohem vyšší, než u alozymových lokusů, tedy alelických forem enzymů s projevem pouze takové mutace, která mění smysl kodonu. Společně s dalšími analýzami mt genů, které popisuji níže, můžeme postulovat závěr, že genetická homogenita jaderných genů v porovnání se zjištěnou vysokou divergencí mt genů mezi populacemi naznačuje nedávné oddělení těchto populací, kdy se genetické rozdíly projevují nejdříve na rychleji mutujících oblastech genomu (Baumsteiger et al. 2014). Na druhé straně z našich analýz vyplynula vysoká spolehlivost S7RP1 markeru (jaderná intronová diagnostika) při rozlišování již divergovaných druhů. Učinili jsme porovnání druhů vranky pruhoploutvé C. poecilopus, vranky obecné C. gobio a C. microstomus z povodí Visly na jihu Polska, kde se dle Freyhof et al. (2005) vyskytují sympatricky. Druhy C. gobio a C. poecilopus, u kterých došlo k divergenci již na počátku osidlování Evropy, se liší kromě 13 substitucí, především třemi indely. C poecilopus má 9 bp deleci a dvě inzerce (5 bp a 2 bp) oproti C. gobio/C. microstomus. Metoda intronové diagnostiky byla využita také v projektu Inventarizace ichtyofauny ČR (Mendel et al. 2012a),

kde primárně analýza jaderného genu sloužila k odhalení hybridních jedinců a jejich vyloučení z referenční muzejní sbírky. Avšak ukázala se i velmi přínosná pro rozlišování čistých druhů pouhou elektroforetickou separací amplikonů využívající polymorfismů délek PCR produktů zapříčiněných přítomností různých indelů (např. mezi druhy jelců, či právě vranek).

5.1 Diverzita populací Karpatského oblouku - popis linií I a II a jejich postavení v euroasijském kontextu

V České Republice byla provedena první analýza populací vranky pruhoploutvé nejprve na základě projektu, který mapoval genetickou diverzitu zdejších ohrožených druhů ryb („Genetická diverzita ohrožených druhů ryb - nezbytný základ efektivní ochrany biodiverzity“ : VaV-SM/6/3/05). Vedle zpřesnění aktuálního rozšíření druhu v ČR měla za cíl také identifikaci genetické diverzity, neboť jsme se domnívali, že obdobně jako u vranky obecné je reálná možnost, že taxon vranka pruhoploutvá má ve skutečnosti hodnotu „druhového komplexu“ (Lusk et al. 2008). Do studie jsme zahrnuli pět populací z povodí Moravy, čtyři z povodí Odry a také jednu z povodí Tisy, které byly analyzovány na dva mitochondriální markery, cytochrom b a kontrolní region. Zjistili jsme existenci dvou divergentních komplexů; které jsme nazvali dle příslušnosti k povodí komplex „baltica“ (povodí Odry) a „danubialis“ (černomořský, povodí Dunaje). V místním měřítku byly závěry spíše ochranářského charakteru, tedy doporučení zamezit přesunu jedinců mezi povodím Odry a Moravy, aby nedošlo ke ztrátě jedinečné genetické diverzity (Lusk et al. 2008).

Získané výsledky v porovnání s doposud publikovanými studiemi ukázaly řadu nejasností a otázek. Chtěli jsme proto zhodnotit a porovnat postavení českých populací v rámci střední Evropy a v návaznosti na to i v kontextu euro-asijského komplexu C. poecilopus (Yokoyama et al. 2008). V průběhu několika let jsme provedli podrobný sběr jedinců na téměř všech hlavních evropských tocích a povodích, kde je výskyt vranky pruhoploutvé uváděn. Kromě populací z nejsevernějších částí Polska z pobřeží Baltského moře, případně Skandinávie, které, jak se později ukázalo, jsou jedny z klíčových pro celkové posouzení situace.

Analyzovali jsme čtyři genetické markery – kódující mitochondriální geny cyt b a COI i nekódující mitochondriální CR a jaderný S7RP1. Na základě CR a cyt b jsme definovali dvě vysoce divergentní linie I a II (p-distance COI 2,36 %, cyt b 3,08 %, CR 6,83 %). K linii I byly začleněny pouze vzorky z oderského povodí (úmoří Baltského moře), a později na základě COI markeru také sekvence z BoLD databáze ze Švédska (Baltské úmoří) a Norska

(Aakershus, úmoří Severního moře), které byly s těmi oderskými 100 % identické. Nazvali jsme proto tuto linii Skandinávskou (Scandinavian lineage). Podobná situace u C. poecilopus byla zjištěna i ve Skandinávii, kde na základě genetických dat byly haplotypy na poloostrově rozděleny na linie tzv. „Far-Eastern“ a Euro-sibiřskou linii a linie obývající severo-východ „North European-East“ a jih poloostrova „North European-West“ linie. Naše Skandinávská linie je pravděpodobně identická s North European-West linií (NEur-W), ke které patří vzorky z jižní Skandinávie a Dánska. Uvedenou hypotézu potvrdila i studie Yokoyama and Goto 2005 a přiřazení další oderské populace z řeky Duna (jižní Polsko, Sudety) ke Skandinávské linii I. Z těchto faktů odvozujeme stejný původ jižně skandinávských a oderských populací z naší studie. Pravděpodobně pochází ze stejného refugia v severní části Karpatských hor, které Kontula (2003) také naznačil. Zjištěné haplotypy reprezentují jižní rekolonizační cestu Skandinávského poloostrova z Centrální Evropy (Obr. 29), což bylo možné díky dávnému spojení evropského kontinentu a Skandinávského poloostrova v oblasti jižního Švédska (Kontula and Vainola 2001). Hypotéza je podpořena i faktem, že populace ze severo- západního Polska na pobřeží Baltského moře jsou morfologicky velmi podobné těm Skandinávským (Radtke et al. 2005), chybí ovšem data genetická. Naše data poskytla chybějící poznatky k propojení mezi Skandinávií a Centrální Evropou.

Linii II jsme označili jako Karpatskou (Carpathian lineage), vzhledem k její geografické poloze. Byly sem zařazeny všechny ostatní populace; tedy z povodí Visly (úmoří Baltského moře) a z povodí Dunaje a Dněstru (úmoří Černého moře). Naše výsledky souhlasí s prací Kontula (2003), kdy všechny jím zkoumané populace z Dunaje, Visly a Dněstru vytvořily linii, kterou také označil jako Karpatskou.

Variabilita mezi liniemi I a II u všech tří sledovaných mt markerů byla několikrát vyšší (8x u CR a cyt b, 20x u COI), než variabilita uvnitř linií, což je u druhů s velkým geografickým výskytem a zároveň vysokou mírou alopatricky izolovaných populací typické. Podobné hodnoty zjistily i další studie u C. poecilopus (Pasko and Maslak 2003), ale také u příbuzného druhu vranky obecné C. gobio z Evropy (Kontula and Vainola 2001), Severní Ameriky (Strauss 1989, Day et al. 2014) a Asie (Okamura and Goto 1996). Vysoký stupeň genetické diferenciace mezi liniemi vranek (vnitrodruhové variability) proti většině ostatních druhů ryb pravděpodobně odráží jejich omezenou schopnost pohybu a jejich vysoký potenciál přežití během dob ledových v refugiích (Kontula 2003).

Obr. 29. Pravděpodobné kolonizační cesty (šipky) Skandinávského poloostrova a střední Evropy odvozené na základě analýzy mt genů. Hvězdičkami jsou označeny sublinie Karpatské linie II, kroužky sublinie a populace patřící ke Skandinávské linii I.

Mezi popsanými liniemi I a II v sudeto-karpatském regionu je na nejvariabilnějším markeru CR míra diferenciace vyšší (6,83 %), než mezi linií I a příbuzným druhem vranky obecné (4,61 %). Hodnota p-distance je mezi linií II a vrankou obecnou na podobné úrovni (7,84 %). I přes značné genetické rozdíly mezi liniemi nebyly ovšem zatím dostatečně podrobně zkoumány rozdíly morfologické, které nejsou na první pohled zřetelné (S. Lusk, ústní sdělení). Podobná situace jako mezi evropskou C. gobio a subliniemi C. poecilopus byla popsána i mezi druhem C. specus a subliniemi sesterského druhu C. carolinae v Severní Americe, hodnota divergence dosáhla 7,7 - 8,0 % (Day et al. 2014). Na druhou stranu ve Švédsku byly definovány linie (E, SE a W) u C. gobio „jen“ při rozdílech 1,7 - 2,5 % u CR a 0,5 - 1 % u cyt b (Kontula and Vainola 2001). Mezi našimi subliniemi I a II je genetická distance u CR 6,83 % a u cyt b 3,08 %. Linie SE je nyní považována za platný druh C. microstomus (Freyhof et al. 2005) i přes velmi malé genetické rozdíly proti sesterskému druhu C. gobio.

Také v rámci euro-asijského komplexu C. poecilopus (Yokoyama et al. 2008) autoři navrhli vyčlenění každé linie jako platného druhu. Hodnoty divergence mezi liniemi (počítané

jako mean number of pairwise differences) dosáhly 3,4 - 5,6 %. K porovnání míry divergence mezi našimi liniemi I a II s liniemi komplexu jsme přepočítaly genetické vzdáleností na „mean number of pairwie differencies“. Celková hodnota mezi našimi liniemi I (Skandinávská) a II (Karpatská) dosáhla 7,28 %, mezi jednotlivými subliniemi to bylo 1,57 - 8,12 %. Podrobný popis sublinií bude uveden níže. Později byly linie II, III a V euro- asijského komplexu popsány jako druhy C. altaicus, C. kuznetsovi a C. szanaga (Sideleva and Goto 2009). V tomto případě došlo k redeskripci druhů, již dříve popsaných s určitými morfologickými rozdíly. Na druhou stranu, Sideleva and Goto (2009) nedoporučují popis odlišného fylogenetického kládu VI (autory označena jako „unclear“) jako samostatného druhu, kdy nenašli morfologické rozdíly od druhu C. szanaga a také se domnívají, že jejich genetické rozdíly jsou malé, a to pouze na vnitrodruhové úrovni. Nicméně jejich genetická vzdálenost je dle studie 3,4 %, což je stejná vzdálenost jako mezi druhy Cottus sp. a C. kuznetsovi, nebo C. szanaga, C.altaicus a C. kuznetsovi.

Také Kontula (2003) navrhl na základě „exceptionally high sequence divergence“ (6 %) popis tzv. „Far Eastern“ linie (severní Švédsko, pobřeží Baltského moře) jako samostatného druhu, navzdory absenci morfologických rozdílů k ostatním liniím. To může být dle autora dáno skutečností, že vranky obývající brakické vody mohou být z evolučního hlediska v tzv. morfologické stázi, která je zapříčiněna stabilizační selekcí.

Pro posouzení postavení všech námi zkoumaných středoevropských populací v rámci Evropy a Asie jsme provedli jejich začlenění do fylogenetického stromu euro-asijského komplexu C. poecilopus (Yokoyama et al. 2008). Jak již bylo zmíněno výše, naše výsledky nepodporují představu genetické homogenity středoevropského regionu a ani taxonomicko- geografické vymezení zástupců C. poecilopus s. stricto. Na základě provedených analýz mt genu CR nebyla přiřazena naše Karpatská linie II k linii I C. poecilopus komplexu, která měla být dle Yokoyama et al. (2008) a Sideleva and Goto (2009) reprezentantem evropské C. poecilopus. Naopak vytvořila samostatnou větev s vlastní evoluční historií, mimo všechny ostatní linie ve fylogenetickém stromě. Ke kládu I (jedinci z Duny, povodí Odry) C. poecilopus komplexu byla přiřazena naše Skandinávská linie I. Z těchto skutečností vyplývá, že nemůžeme souhlasit s autory, kteří definovali linii I jako zástupce evropského druhu C. poecilopus, Heckel 1837. Za tohoto reprezentanta považujeme Karpatskou linii II s typovou lokalitou Velký Slavkov.

5.2 Genetická struktura linií I a II a genový tok mezi populacemi

Pouze na základě sekvencí CR lze u obou linií rozeznat jemnější genetickou strukturu. Ve Skandinávské linii I můžeme aktuálně rozpoznat další členění do dvou sublinií Ia - Ib, u Karpatské linie II do šesti sublinií IIa - IIf.

Přesto, že hodnoty fixačního koeficientu (0,073) i p-distance byly nízké (1,2 %) rozhodli jsme se sublinie Ia a Ib rozlišit na základě výrazné struktury v haplotypové síti a také signifikantní podpory u všech fylogenetických stromů. U sublinií Ia a Ib nedošlo k jejich překrytí s geografickou polohou populací, kdy zastoupení haplotypů v subliniích bylo promícháno. Většina jedinců sublinie Ib pochází z potoka Malý Lipový (12 ze 14), ale najdeme zde i po jednom zástupci z populací Kotelný potok a Bílá Ostravice. Naopak, v sublinii Ia jsou jedinci z lokalit Kotelný potok, Bílá Ostravice, Morávka, Olše a dva zástupci z potoka Malý Lipový. Zastoupení haplotypů v jednotlivých populacích a jejich distribuce v oderském povodí naznačuje existující či nedávné propojení mezi lokalitami. Genový tok mezi populacemi a subliniemi ve Skandinávské linii je vyšší, než zjištěný tok v rámci populací Karpatské linie. Spolu s nízkou hodnotou FST indexu a p-distancí nahrává hypotéze o pozdější separaci sublinií Ia a Ib. Genový tok zde stále ještě v malé míře probíhá, což může být i odraz občasných povodňových stavů na horských tocích v jarních obdobích. Dle

Allendorf et al. (2013) hodnota FST kolem 0.10 odpovídá asi dvěma migrantům na generaci.

Zcela jiná situace je viditelná v rámci genetické struktury Karpatské linie. Ve fylogenetickém stromě, haplotypové síti i dle variabilních pozic CR je zřetelné oddělení šesti sublinií. V případě Karpatské linie se překrývají geograficky se zkoumanými populacemi. Dle distribuce a počtu sdílených haplotypů je patrná výrazná vzájemná izolace jednotlivých regionů i populací. To podporují i hodnoty FST indexu (0,614 - 0,815) a p-distancí (1,7 - 2,6 %). Podobnou míru diferenciace mezi populacemi zjistili také v Německu u příbuzného druhu C. gobio (Englbrecht et al. 2000) nebo u C. gulosus (Baumstiger et al. 2014), C. specus (0,10 - 2,70 %), C. szanaga (2,43 %, Sideleva and Goto 2009) a C. carolinae (Day et al. 2014) v USA.

Popsané sublinie Ia - Ib a IIa - IIf můžeme identifikovat pouze analýzou CR, tedy na nejvariabilnějším markeru, nikoliv na dalších analyzovaných markerech - mt kódujících genech a jaderném intronu. Přesto u genu pro cyt b můžeme pozorovat specifické haplotypy pro jednotlivé sublinie, kromě sdíleného haplotypu Hap3, napříč všemi populacemi v Karpatské linii. Nebyly nalezeny žádné morfologické rozdíly mezi nimi, a proto je považujeme jen za výsledek zvýšené variability na vnitrodruhové úrovni. Zajímavostí je, že ke genovému toku nedochází nejen mezi vzdálenými regiony (např. mezi Moravou a Tisou),

což by se dalo očekávat, ale ani mezi sesterskými subliniemi ze stejného povodí. Nenašli jsme žádný společný haplotyp mezi povodími Hornádu (IIc) a Laborce (IId), které navíc měli dostatečné množství substitucí k vytvoření samostatné haplotypové sítě. Je proto zřejmé že historicky zde genový tok probíhal (sdílené haplotypy), ale poté došlo k postupné izolaci populací a dnes již není viditelný. To lze vysvětlit právě již několikrát zmiňovanou omezenou schopností pohybu, která vede ke genetické izolaci a někdy i k tvorbě subpopulací i v rámci stejného toku (Downhower et al. 1990).

Celkem jsme u Karpatské linie zaznamenali pět sdílených haplotypů, jeden mezi sesterskými subliniemi IIa (Morava) a IIe (Visla a Dunaj) a čtyři mezi subliniemi IIe (Visla a Dunaj) a IId (Laborec). Tyto sdílené haplotypy a struktura haplotypové sítě ukazuje možná historická spojení mezi dílčími regiony a povodími v Karpatské oblasti. Haplotyp 13, jež má vedoucí postavení v celé síti, náleží do sublinie IIe, která sdružuje toky povodí Dunaje a Visly. Vyskytuje se ve všech populacích z podhůří Vysokých Tater (včetně typové lokality Velký Slavkov), odkud pravděpodobně došlo k následnému osídlení dalších lokalit. Vysoké Tatry proto mohly být refugiem pro předky jedinců Karpatské linie. V době meziledové pak z refugia jedinci následovaly tající ledovec a to směrem na západ do povodí Moravy (sublinie IIa), na jih do povodí Hronu a Ipelu (IIb), na jiho-východ do povodí Tisy (IIc a IId) a také severně přes Karpatské hory dále do povodí Visly (Obr. 29). Jak již víme z předchozích studií, hory nemusí znamenat efektivní bariéru v migraci vranek (Šlechtová et al. 2004). Naše výsledky souhlasí s již dříve publikovanými poznatky Kontula (2003), který zjistil diversifikaci především ve Skandinávském regionu (NEur-W a NEur-E linie) a částečně i v Karpatském v podobě fylogeneticky vyčleněných kládů z povodí Dunaje a Visly (naše sublinie IIe) a z povodí Dněstru (naše sublinie IIf). Kontula (2003) uvažuje o propojení Dněstru se středoevropským regionem přes Karpatské hory, my ale dle haplotypové sítě nemůžeme vyloučit ani kolonizaci přes toky směřující do Černého moře, jak napovídá pozice sublinií IIb a IIf .

5.3 Taxonomický status Skandinávské linie

Na základě sekvenace tří markerů jsme zjistili vysokou míru genetické diferenciace v oblasti Karpatského oblouku. Kromě zvýšené mezipopulační variability, byla objevena v této oblasti nová, dosud neznámá variabilita, v porovnání s genetickými vzdálenostmi C. poecilopus k ostatním vrankám ve středoevropském regionu. Ve Švédsku byla variabilita temnějších populací popsána již dřívějšími autory na základě morfologických dat (Koli 1969), stejně jako v oblasti Polska mezi horním a dolním povodím Visly (Witkowski 1995). V oblasti Karpatského oblouku, který byl dosud považován za geneticky homogenní, se však

jedná o první poznatky. V těchto regionech jsou dvě odlišné linie, ať už morfologicky (Koli 1969, Witkowski 1995) nebo geneticky (Kontula 2003) vysvětlovány jako důsledek dvou různých migračních vln. Pokud se odlišné linie potvrdí i v dalších analýzách navrhuje Kottelat and Freyhof (2007) přiřadit těmto odlišným liniím alespoň status „species under Phylogenetic Species Concept (PSC)“. V případě námi zjištěné Skandinávské linie, která se geneticky výrazně odlišuje od zástupců evropského druhu C. poecilopus, je popis nového druhu jednou z možností. Morfologické rozdíly mezi liniemi I a II nebyly patrné (S. Lusk, ústní sdělení), což ale pro odlišení druhů u rodu Cottus nemusí být překážkou, protože se jedná o rod s nejhůře zjistitelnými morfologickými rozdíly mezi druhy ryb (Wydowski and Whitney 2003). To je již známo např. mezi druhy C. rhenanus a C. gobio, které jsou rozlišitelné pouze pomocí mtDNA nebo jaderné DNA – alozymů či mikrosatelitů. Linie I a II však nejsou odlišitelné nejen morfologicky, ale ani na jaderném genu S7RP1. Může to být dáno nedávnou divergencí těchto linií, kdy se změny projevují nejdříve v rychleji mutujících mitochondriálních oblastech (tedy na CR, cyt b a COI). Nový pohled by proto mohla přinést analýza rychleji mutujících jaderných markerů - mikrosatelitů. Takovou studii jsme sice provedli (Marešová et al. 2012), ale pouze v rámci studia hybridních zón, byly tedy analyzovány pouze mikrosatelity z oderského povodí. Přesto jsme identifikovali markery, potenciálně využitelné i pro zjištění rozdílů mezi liniemi I a II (tři lokusy s druhově specifickými alelami). Bylo by proto do budoucna vhodné provést analýzu mikrosatelitů u zástupců sublinií Karpatské linie (IIa - IIf), ale také u jedinců ze Skandinávské populace.

U komplexu C. gobio je dle Freyhof et al. (2005) problém v existenci morfologického rozlišení - „příliš velká variabilita u druhu C. gobio“. Lze však popsat druh s absencí rozlišitelných morfologických znaků, v případě existence specifických genetických markerů (Freyhof et al. 2005). Toto bude platné také u C. poecilopus. Radtke et al. (2005) uvádí možnost potenciálně nepopsaného druhu v oblasti Baltského pobřeží v Polsku, kde nalezl morfologicky shodnou populaci se Švédskou. Dle našich provedených analýz s využitím techniky DNA barcoding vyplývá, že populace švédská a oderská jsou shodné a domníváme se, že je zcela reálné, že polské populace popsané ve studii Radtke et al. (2005) s nimi tvoří společnou skupinu. Do budoucna bude vhodné učinit podrobný morfologicko-genetický popis vranek z oblasti pobřeží Baltského moře.

Při pohledu na genetická data a geografické srovnání areálů C. poecilopus, C. gobio a C. microstomus se nabízí ještě jedna možná hypotéza. Areály těchto tří druhů se v dolním povodí Visly a Odry překrývají (Freyhof et al. 2005). Díky velmi podobným ekologickým a etologickým charakteristikám všech tří druhů lze očekávat v místech současného výskytu

jejich hybridizaci, dle Freyhof et al. (2005) se tak děje v řece Nisa a není to vyloučeno ani v jiných částech povodí Odry či Visly. Již o dva roky později se ale Kottelat and Freyhof (2007) přiklání k názoru, že se jedná v povodí Odry i Visly o čistý druh C. microstomus. Je tedy patrno, že fenomén hybridizace přináší další proměnou do již tak složité taxonomie rodu Cottus.

Naše studie předkládá na základě analýz mt a jaderného markeru ještě další možnou hypotézu o statusu Skandinávské linie. Genetická odlišnost (genetické vzdálenosti a mutace) mezi druhy C. gobio a C. microstomus je ve srovnání s rozdíly mezi liniemi I a II pouze na vnitrodruhové úrovni. To potvrzuje i studie DNA barkodingu v Německu. Knebelsberger et al. (2015) stejné haplotypy mezi C. gobio a C. microstomus vysvětluje existencí hybridizace. Zde však vyvstává otázka, zda má smysl uvedené druhy rozeznávat samostatně. Na markerech S7RP1, cyt b i COI jsou prakticky shodné (S7RP1 0 %, cyt b 0,26 % a COI 0,37 %), na CR je vzdálenost 1,85 %. Morfologické znaky C. microstomus jsou velmi variabilní, kdy prakticky v každém povodí nese tamní populace určitou zvláštnost. Také znak, který dle Freyhof et al. (2005) odlišuje C. microstomus od většiny jedinců druhu C. gobio, vykazuje u C. gobio velkou mezipopulační variabilitu.

Mezi liniemi I a II dosahují hodnoty divergence druhové úrovně (kromě S7RP1 0 %): cyt b 3,08 %, COI 2,36 % a CR 6,83 %. Linie II, jak již bylo řečeno, je korektním reprezentantem C. poecilopus s. stricto. Skandinávská linie I by mohla být pravým reprezentantem druhu C. microstomus a nyní popisovaní jedinci C. microstomus reprezentovat jen variabilitu v rámci druhu C. gobio. Tento návrh předkládáme, i když víme, že Kottelat and Freyhof (2007) poskytují morfologické znaky, které odlišují C. microstomus od druhu C. gobio. Je proto třeba detailní morfologická studie obou popsaných linií v rámci druhu C. poecilopus, společně s dosud známými druhy C. gobio a C. poecilopus z oblasti povodí Visly a Odry a také vzorků ze Skandinávie (NEur-W linie), případně i domnělých hybridních jedinců.

Vysoce divergentní linii I navrhujeme přiřadit status jednotky ESU (Evolutionary Significant Unit), dokud se nevyjasní její pozice, aby nedošlo ke ztrátě cenné variability uvnitř evropského regionu. Oderské populace splňují kritérium dlouhodobé reprodukční izolace, jejímž výsledkem je unikátní populace jedinečná v daném regionu, která má do budoucna evoluční potenciál (Waples 1991).

5.4 DNA barcoding analýza a porovnání s mezinárodní databází BoLD

Projekt „Inventarizace molekulární biodiverzity ichtyofauny ČR“ znamenal první celoplošný genetický screening většiny druhů ryb na našem území a v rámci DNA barcoding projektů jsme byli prvním evropským státem, jež se do iniciativy zapojil (Mendel et al. 2012a). Analyzovali jsme původní i introdukované druhy, u kriticky ohrožených bylo využito sbírek oddělení. Jeden druh byl považován za lokálně vyhynulý v přírodě, 12 druhů bylo kriticky ohrožených, pět ohrožených a šest zranitelných dle kritérií IUCN (Lusk et al. 2011b). Dle techniky DNA barcodingu jsme spolehlivě rozlišili všechny testované druhy (Mendel et al. 2012a), hybridní jedinci a obecně přínos druhého partnera byl detekován pomocí analýzy jaderného markeru S7RP1.

Na základě studií rozličných druhů ryb na různých kontinentech byla navržena 2 % hranice pro rozpoznání druhu (Hebert et al. 2003b). Jako potenciální „skrytý druh“ (cryptic species) je označován takový, kde genetická vzdálenost taxonu je 10x vyšší než jeho průměrná vnitrodruhová vzdálenost (Hebert et al. 2004). Mezi jedinci vranky pruhoploutvé, jež vstoupili do DNA barcoding analýzy, jsme zjistili genetickou vzdálenost 2,68 % mezi liniemi (Mendel et al. 2012a), které se shodují s detekovanými liniemi I a II na ostatních mitochondriálních markerech. Když jsme k již analyzovaným vzorkům na COI marker přidali další lokality, obdrželi jsme vzdálenost mezi liniemi 2,36 % (16 substitucí), přičemž vnitrodruhová variabilita byla více než 20x nižší než variabilita mezi liniemi. Ještě vyšší hodnoty divergence mezi liniemi byly u české ichtyofauny zjištěny také pro dalších osm druhů, přičemž všechny patří k druhům s velkým areálem rozšíření (Mendel et al. 2012a). Nejvyšší míra divergence byla zjištěna u mřenky mramorované - tři odlišné linie s až 5,97 % divergencí, zde však byly tyto rozdíly částečně známy od dřívějších autorů (Šedivá et al. 2008), stejně jako u jelce tlouště (Seifertová et al. 1998, Perea et al. 2010). Naopak u úhoře říčního, karasa obecného nebo slunky obecné se jednalo o první poznatky genetické variability, stejně jako v případě vranky pruhoploutvé, u které jsme tyto poznatky rozšířili analýzami dalších mt markerů.

Existují ale i uznávané druhy, mezi kterými genetická vzdálenost navrhované 2 % hranice nedosahuje (Mendel et al. 2012, Lemoine et al. 2014). To platí např. pro druhy v komplexu vranky obecné C. gobio, C. microstomus, C. rhenanus a C. ricei, jež se odlišují pouze čtyřmi variabilními místy. Nízké hodnoty divergence u vranek Cottus sp. zjistil i v Německu Knebelsberger et al. (2015), jež je přisuzuje nedávné speciaci. V takovém případě by Skandinávská (I) a Karpatská linie (II) byly separovány dříve, než druhy vranek v Německu.

5.5 Hybridní zóny v povodí Odry a Moravy a charakterizace hybridních populací

Jak již bylo zmíněno v předchozích kapitolách, hybridizace je mezi druhy rodu Cottus poměrně častým jevem, který přináší další komplikace při studiu taxonomie vranek. V některých oblastech jsou tato místa dobře prostudována, ale jsou i taková, kde jsou hybridní zóny pouze domnělé na základě sympatrického výskytu druhů. To je právě příklad dolního povodí Odry a Visly, kde se současně vyskytují C. gobio, C. microstomus a C. poecilopus, odkud ještě výskyt hybridů nebyl publikován. Dobře prostudovaná je hybridními zóna ve Švédsku a Finsku mezi C. gobio a C. koshewnikowi (Kontula and Vainola 2004), kde se tyto druhy vyskytují alopatricky a do úzkého kontaktu přicházejí v oblasti Botnického zálivu. Dlouhodobě studovaná je i hybridizace v Německu v povodí Rýna mezi původním druhem C. rhenanus a invazivním druhem C. perifretum (Volckaert et al. 2002, Nolte et al. 2006, Nolte et al. 2009).

V oblasti Karpatského oblouku byl domnělý výskyt hybridů mezi druhy C. poecilopus a C. gobio zaznamenán v literatuře na základě morfologie v povodí Moravy (Zelinka 1951) a Odry (Čihař 1961) a v povodí Váhu (Mahen 1927). Morfologicko-genetická analýza potvrdila jejich výskyt až skoro o 60 let později (Marešová et al. 2012, Vítek et al. 2014). Studovali jsme dvě oblasti v České republice, povodí Odry (Marešová et al. 2012) a povodí Moravy (Vítek et al. 2014). V oderském povodí bylo kombinací morfologické a genetické analýzy (mikrosatelity, jaderný gen S7RP1 a mt gen pro CR) nalezeno ve třech populacích (Moravice, Opava a Ostravice) 19 hybridů. Analýza mikrosatelitů neodhalila u žádného z nich u všech lokusů heterozygotní kombinaci alel, což ukázalo na absenci jedinců hybridní F1 generace. Podobných výsledků dosáhli i Nolte et al. (2006) při studiu hybridní zóny v povodí Rýna mezi druhy C. rhenanus a C. perifretum, kde nalezli velmi nízký počet hybridů F1 generace. Nejedná se ovšem ještě o vznik tzv. hybridního hejna, protože byl nalezen i velký počet čistých jedinců obou druhů. Příčinou absence F1 hybridů může být jejich selektivní mortalita nebo asortativní páření (Nolte et al. 2006). Mortalita F1 hybridů však při laboratorních experimentech nebyla zjištěna (Andreasson 1968, Nolte et al. 2006), což potvrzuje i existence velkého množství zpětných kříženců. U hybridů s mt haplotypem C. poecilopus, jsme u jednoho lokusu skórovali homozygotní genotypy C. gobio, ostatních pět lokusů mělo délku alel typickou pro C. poecilopus. Naopak u hybridů s mt haplotypem C. gobio, jsme zjistili v lokusu Cgo1033PBBE alely charakteristické pro C. poecilopus. Pouze jeden exemplář v jednom lokusu měl heterozygotní genotyp s alelalmi obou druhů.

V případě populace z Moravice nebyly u hybridů nalezeny druhově specifické alely, jejich kombinace u čtyř lokusů však byla dostatečná pro jejich rozlišení od rodičovských genotypů. V této populaci nebyl do analýzy zahrnut lokus 1033PBBE z důvodu skórovaných alel jen u jedinců C. gobio. Jako čistí C. gobio byli určeni dle všech kritérií: morfologie, S7RP1, mtDNA i všech čtyřech analyzovaných mikrosatelitových lokusů. Nicméně jsme u nich v případě lokusu 1033PBBE zjistili alely v rozsahu 101 - 135 bp. Tedy i délky charakteristické pro čisté C. poecilopus (101 - 119 bp). K vyjádření toho zda se jedná o hybridní jedince je ale nutná analýza čistých C. poecilopus u této populace, neboť je možné, že uvedený rozsah délek může být u Moravice charakteristický pro C. gobio. Proto u heterozygota v tomto lokuse 103/141 z opavské populace určeného dle všech kritérií jako vranka obecná, se může jednat o zpětného křížence nebo o heterozygota mezi vrankou obecnou z populací Opava a Moravice, kdy Moravice je levostranným přítokem Opavy.

Hodnoty fixačního indexu ukazují stejnou míru diferenciace mezi čistými druhy jako mezi populací C. gobio a hybridy (Tab. 15). Z těchto hodnot můžeme usuzovat v oderském povodí na asymetrickou hybridizaci ve prospěch C. poecilopus. To potvrdila i sekvenace mt genu, kdy C. poecilopus byla mateřským druhem pro většinu hybridních jedinců (Marešová et al. 2012). Přesně naopak tomu bylo u hybridní zóny v povodí Moravy, kde u všech hybridů byla matkou C. gobio (Vítek et al. 2014).

Tabulka 15. Hodnoty fixačního indexu mezi čistými druhy C. gobio a C. poecilopus a hybridy v povodí Odry.

FST hodnoty jsou znázorněny pod diagonálou, p-hodnoty nad diagonálou (* p < 0.05). C. gobio C. poecilopus hybrid C. gobio * * C. poecilopus 0,3124 * hybrid 0,2834 0,0820

Směr hybridizace tedy záleží především na populační struktuře (aktuálním počtu samců a samic každého druhu) v době tření (Dermandt and Bergek 2009) a habitatu, kde se hybridní zóna nachází. V hybridní zóně povodí Svratky byl zjištěn v době tření (květen) mnohem vyšší počet samic C. gobio, než v období mezi nimi. Současně v době tření v přítoku Svratky (odkud jedinci C. poecilopus migrují do hybridní zóny) byl vyšší počet samců C. poecilopus. Samci C. poecilopus tedy pravděpodobně v době tření migrují proti proudu (upstream) do hlavního toku (Vítek et al. 2014). Toto chování může být podobné jako v případě invazivního druhu C. perifretum v povodí Rýna (Nolte et al. 2006), kdy hybridní zóna ve Svratce reprezentuje oblast střetu areálu nativního druhu C. gobio a invazivního druhu C. poecilopus.

V povodí Odry je směr hybridizace také ve směru upstream habitatu, ale tentokrát ve prospěch C. poecilopus. V této v hybridní zóně je však počet jedinců čistých druhů vyvážený a hraje zde roli o něco posunutá doba schopnosti tření. I když se překrývá, C. poecilopus dosahují v čase pohlavní dospělosti o něco dříve, k čemuž se přičítá i všeobecná schopnost samců dospět o něco dříve. Samci C. poecilopus mají tedy vyšší a delší možnost výběru proti samcům druhého druhu. V hybridních zónách, kde je počet obou druhů přibližně stejný (Opava, Moravice), je tedy větší pravděpodobnost matek C. poecilopus, protože samci C. gobio již jsou schopni tření ale jejich samice ještě ne (Marešová et al. 2012).

Fragmentační analýza nám ukázala v povodí Odry na existenci hybridní zóny se současným výskytem čistých druhů i zpětných kříženců. Vysoký podíl hybridních genotypů v populacích Opavy a Moravice proti rodičovským ukazuje na kontinuální hybridizační proces bez existence reprodukčních bariér (Nolte et al. 2006), což se ukázalo i ve zkoumané hybridní zóně v povodí Moravy, kde hybridi tvořili až 36 % populace (Vítek et al. 2014). Na řece Ostravici jsme identifikovali pouze jediného hybrida, ale jednalo se o zpětného křížence. Můžeme tedy vyvodit, že i na této lokalitě hybridizační proces probíhá, pouze jsme měli malý vzorek populace.

Devět hybridních jedinců z řeky Opavy nebylo možno identifikovat pomocí S7RP1, ale pouze pomocí mikrosatelitů. Chybná identifikace hybridů jako čistých druhů pomocí S7 RP1 markeru způsobila u C. poecilopus odchylky od HWE u tří lokusů z pěti. Po korekci data setu (data set I na data set II) zůstala odchylka od HWE na dvou lokusech (CgoZIM22 and Cgo1033PBBE), což bylo způsobeno ztrátou heterozygozity, jak ukazují signifikantní hodnoty Fis indexu, což platí pro oba druhy. U lokusu Cgo22ZIM, který jako jediný nemá druhově specifické alely, byl nadbytek homozygotů způsoben nulovými alelami. U markeru Cgo1033PBBE je patrný nadbytek homozygotů u obou druhů. C. poecilopus nemá v tomto lokusu žádný heterozygotní genotyp, u C. gobio se vyskytují pouze tři. Pravděpodobně docházelo k opakovanému křížení hybridů s druhem, jemuž jsou nejblíže (dle 3D PCA, složení alel a mtDNA). Následkem toho u těchto hybridních jedinců došlo v důsledku rekombinace ke ztrátě jaderné alely genu S7RP1 druhého druhu agenotypově jsme nalezli pouze čistý druh. Tito hybridi leželi ve 3D PCA analýze mimo clustery čistých druhů a také pomocí Structure analýzy měli nižší Q hodnoty než čisté druhy (Marešová et al. 2012). Naopak, jeden hybrid, jež byl identifikován dle morfologie a S7RP1, se zařadil k čistým druhům ve 3D PCA i Structure analýze.

Identifikace dle morfologických znaků je možná u F1 generace ale s dalšími generacemi její spolehlivost klesá. V naší studii Vítek et al. (2014) jsme se zaměřili

především na morfologickou identifikaci, a došli jsme k závěru, že je třeba vysoký počet zkoumaných jedinců k poskytnutí identifikačních morfometrických či morfologických znaků. Nicméně pro předběžné určení v terénu navrhujeme jako identifikační znak pozici postranní čáry. Dále jedinci, kteří jsou morfologicky určeni jako C. gobio, ale liší se v poměru výšky těla nad a pod postranní čárou a v počtu sekrečních epidermálních buněk jsou pravděpodobně hybridní. Meristické znaky k odlišení hybridů nebyly průkazné.

Výskyt hybridů vranky v úsecích sympatrického výskytu bude pravděpodobně běžný (Nolte et al. 2006, Nolte et al. 2009, Lusk et al. 2011b). Hybridizace v tomto typu hybridní zóny probíhá pravděpodobně kontinuálně bez existence efektivních reprodukčních bariér. Identifikace post-F1 na základě vizuální prohlídky je problematická, nicméně ani genetická analýza pouze jaderného genu nemusí být dostačující v intenzivně se křížících populacích. Je tedy zřejmé, že ke spolehlivé identifikaci hybridních jedinců, především v populacích se zpětnými kříženci, je nutný komplexní přístup morfologie, sekvenace jaderných a mitochondriálních genů i analýzy mikrosatelitů.

V dizertační práci jsme k odhalení genetické variability populací vranky pruhoploutvé v oblasti Karpatského oblouku použili analýz jaderné a mitochondriální DNA, kódujících i nekódujících oblastí genomu. Jejich sekvenace nám poskytla komplexní představu o genetické struktuře zkoumaného regionu. Ten vykazuje vysokou vnitrodruhovou a mezipopulační variabilitu, včetně potvrzené existence hybridních zón na našem území.

Zjistili jsme dvě vysoce divergentní linie. Karpatská linie je dále geneticky strukturovaná, nicméně mezi jednotlivými povodími již patrně nedochází ke genovému toku. Rozprostírá se na Slovensku a v jižním Polsku v povodí Dunaje, Visly a Dněstru. Do této linie patří i typová lokalita druhu, můžeme tedy říci, že pokrývá areál výskytu C. poecilopus s. stricto, tedy evropské vranky pruhoploutvé. Skandinávská linie z oderského povodí nese proti ostatním populacím v regionu jedinečnou variabilitu druhové úrovně a geneticky se shoduje s populacemi z jihu Skandinávského poloostrova. Pro konečné potvrzení jedné z navržených hypotéz ohledně jejího taxonomického postavení však bude nutná genetická analýza populací ze severu Polska a především rozsáhlá morfologická revize validity druhu C. microstomus. Studium hybridních zón ukázalo na využitelnost některých mikrosatelitových lokusů v této otázce. V uvedeném případě navrhujeme jako nejvhodnější využit statusu ochranářské jednotky ESU k ochraně odhalené variability, která je ve středoevropském regionu unikátní.

V oblastech sympatrického výskytu vranky pruhoploutvé a obecné byl, díky prakticky stejným ekologickým nárokům, očekáván výskyt hybridních jedinců. Naše práce jako první potvrdily výskyt nativních hybridů těchto druhů v Evropě, a to pro povodí Odry i Moravy. I když vranka pruhoploutvá není pro povodí Moravy původním druhem, její populace zde byla potvrzena několika sběry v minulosti a stala se stabilní. Dá se rovněž očekávat i tvorba hybridních zón v povodí Visly, či Odry v Polsku, a to i s nyní platným druhem C. microstomus. Zde ovšem záleží v návaznosti na námi zjištěné poznatky, na vyjasnění taxonomického statusu vranek v povodí Odry.

Populace vranky pruhoploutvé byly také součástí projektu „Inventarizace molekulární biodiverzity ichtyofauny ČR“, spolu s většinou původních a nepůvodních druhů ryb. Tento projekt zmapoval genetickou diverzitu ryb celého českého území, a v návaznosti na to vyvodil doporučení, především ochranářského charakteru. Pomocí DNA barcodingu jsme u některých druhů potvrdili vysokou míra variability z předchozích studií (i u vranky), u některých byla zjištěna zcela nově. Díky DNA barcodingu se nám podařilo odhalit shodu mezi evropskými a skandinávskými populacemi vranky pruhoploutvé a nalézt nečekané propojení mezi nimi.

3D PCA 3D Principal Component Anlaysis

BI Bayesian analysis (Bayesova analýza)

BoLD Barcode of Life Database bp base pairs (párů bází)

COI cytochrom c oxidasa I

CR control region (kontrolní oblast) cyt b cytochrom b

ECS systém externího spojení

ESU Evolutionary Significant Unit

Fis index homozygotnosti

Fish-BOL The Fish Barcode of Life Iniciative

FST fixační index

He očekávaná heterozygozita (expected heterosygosity)

Ho pozorovaná heterozygozita (observed heterosygosity)

HWE Hardy-Weinberg equilibrium (Hardy-Weinbergova rovnováha)

IDS identifikační systém

IUCN International Union for Conservation of Nature (Mezinárodní svaz ochrany přírody)

MAS správa a analýza sekvencí mRNA mediátorová RNA

MP Maximum Parsimony mt mitochondriální

MU Management Unit

NEur-W North European West lineage

NEur-E North European East lineage

NGS Next Generation Sequencing

NJ Neighbour-Joining

PCR Polymerase Chain Reaction (polymerázová řetězová reakce) rRNA ribozomální RNA

S7RP1 1. intron jaderného genu S7 r-protein s. stricto sensu stricto

SL standart length (délka těla)

TL total length (celková délka těla) tRNAPro gen pro tRNA prolinu tRNAThr gen pro tRNA threoninu

ÚBO AV ČR Ústav biologie obratlovců Akademie věd ČR

Allendorf F. W., Luikart G. and Aitken S. N. 2013: Conservation and the genetics of populations, 2nd edition, pp. 601, Willey-Blackwell. ISBN 978-0-470-67146-7.

Anderson E. C. and Thompson E. A. 2002: A Model-Based Method for Identifying Species Hybrids Using Multilocus Data. Genetics 160: 1217-1229.

Andreasson S. 1968: Hybridisering mellan stensimpa och bergsimpa. Fauna och Flora 63 (6): 242-251.

Andreasson S. 1969: Interrelation between Cottus poecilopus Heckel and C. gobio L. (Pisces) in regulated North Swedish river. Oikos 20: 540-546.

Asmussen M. A. and Basten Ch. J. 1996: Constraints and normalized measures for cytonuclear disequilibria. Heredity 76 (Pt 3): 207-214.

Basten Ch. J. and Asmussen M. A. 1997: The exact test for cytonuclear disequilibria. Genetics 146: 1165-1171.

Baumsteiger J., Kinziger A. P., Reid S. B. and Aguilar A. 2014: Complex phylogeography and historical hybridization between sister taxa of freshwater sculpin (Cottus). Mol. Ecol. 23: 2602-2618.

Belkhir K., Borsa P., Chikhi L., Raufaste N. and Bonhomme F. 1996-2004: GENETIX 4.05, logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions, CNRS UMR 5171, Université de Montpellier II, Montpelier (France).

Berg L. S. 1949: Freshwater fishes of the U.S.S.R and adjacent countries. Vol. 3. Zoological Institute, Academic Scinence of the USSR, Moskva, Leningrad.

Boecklen W. J. and Howard D. J. 1997: Genetic analysis of hybrid zones: numbers of markers and power of resolution. Ecology 78 (8): 2611-2616.

Clement M., Posada D. and Crandall K. 2000: TCS: a computer program to estimate gene genealogies. Mol. Ecol. 9(10): 1657-1660.

Close P. G. and Gouws G. 2007: Cryptic estaurine gobiid fish larvae (Pisces: Gobfidae) identified as Pseudogobius olorum using allozyme markers. J. Fish Biol. 71: 288-293.

Coombs J. A., Letcher B. H. and Nislow K. H. 2008: CREATE: a software to create input files from diploid genotypic data for 52 genetic software programs. Mol. Ecol. Res. 8 (3): 578-580.

Čihař J. 1969: Taxonomical and ecological notes on Cottus gobio Linnaeus, 1758, and Cottus poecilopus Heckel, 1836 (Osteichthyes: Cotidae). Acta Soc. Zool. Bohemoslov. 33 (2): 102-110.

Day J. L., Starkey D. E., Adams G., Brummett S. and Keeney D. 2014: Population genetics of grotto sculpin (Cottus specus), a new cave-adapted fish species. Environ. Biol. Fish. 97(12): 1305-1315.

Dennenmoser S., Nolte A. W., Vamosi S. M. and Rogers S. M. 2013: Conservation genetics of prickly sculpin (Cottus asper) at the periphery of its distribution range in Peace River, Canada. Conserv. Genet. 14: 735-739.

Dermandt M. H and Bergek S. 2009: Identification of cyprinid hybrids by using geometric morphometrics and microsatellites. J. Appl. Ichthyol. 25 (6): 695-701.

Downhower J. F., Lejeune P., Gaudin P. and Brown L. 1990: Movements of the chabot (Cottus gobio) in a small stream. Polskie Archiwum Hydrobiologii 37: 119-126.

Dudu A., Suciu R., Paraschiv M., Georgescu S. E., Costache M. and Berrebi P. 2011: Nuclear markers of Danube sturgeons hybridization. Int. J. Mol. Sci. 12 (10): 6796-6809.

Englbrecht C. C., Freyhof J., Nolte A., Rassmann A., Schliewen U. and Tautz D. 2000: Phylogeography of the bullhead Cottus gobio (Pisces: Teleostei: Cottidae) suggests a pre-Pleistocene origin of the major central European populations. Mol. Ecol. 9: 709- 722.

Englbrecht C. C., Largiader C. R., Hanfling B. and Tautz D. 1999: Isolation and characterization of polymorphic loci in the European bullhead Cottus gobio L. (Osteichthyes) and their aplicability to related taxa. Mol. Ecol. 8 (11): 1966-1969.

Eppe R., Persat H., Beaudou D. and Berrebi P. 1999: Genetic variability in sculpin (genus Cottus) from southern France, with reference to the taxonomic status of an endemic species, C. pettiti. Heredity 83: 533-540.

Excoffier L. and Lischer H. E. L. 2010: Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Mol. Ecol. Res. 10: 564-567.

Faith D. P. 2008: Phylogenetic diversity and conservation. pp. 99-115. In: Caroll S. P. and Fox C. V. eds. Conservation Biology: Evolution in Action. Oxford University Press, New York.

Fraser D. J. and Bernatchez L. 2001: Adaptive evolutionary conservation: towards a unified concept for defining conservation units. Mol. Ecol. 10: 2741-2752.

Freyhof J., Kottelat M. and Nolte A. 2005: Taxonomic diversity of European Cottus with description of eight new species (Teleostei: Cottidae). Ichthyol. Explor. Fresh. 16: 107- 172.

Fujii R., Choi Y. and Yabe M. 2005: A new species of freshwater sculpin, Cottus koreanus (Pisces: Cottidae) from Korea. Species Diversity 10 (1): 7-17.

Goudet J. 2001. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3). Lausanne University, Lausanne, Switzerland.

Gross, B. L. and Riesberg L. H 2005: The Ecological Genetics of Homoploid Hybrid Speciation. J. Hered. 96 (3): 241-252.

Guindon S. and Gascuel O. 2003: PhyML: "A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood." Syst. Biol. 52(5): 696-704.

Hanel L. and Lusk S. 2005: Ryby a mihule České republiky: rozšíření a ochrana. ZO ČSOP Vlašim, ISBN 80-86327-49-3.

Hanfling B., Hellemans B., Volckaert F. A. M. and Carvalho G. R. 2002: Late glacial history of the cold-adapted freswater fish Cottus gobio, revealed by microsatellites. Mol. Ecol. 11: 1717-1729.

Harrison R. G. 1993: Hybrids and hybrid zones: historical perspective, pp 3-12, In: Harrison R. G. ed. Hybrid Zones and the Evolutionary Proccess. Oxford University Press, Oxford.

Hebert, P. D. N., Cywinska, A., Ball, S. L and deWaard, J. R. 2003a: Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B: Biological Science 270: 313-321.

Hebert, P. D. N., Ratsingham, S. and Dewaard, J. R. 2003b: Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Science 270 (Suppl 1): 96-99.

Hebert P. D. N., Stoeckle M. Y., Zemlak T. S. and Francis Ch. M. 2004: Identification of Birds through DNA Barcodes. PLoS Biology 2 (10): e312.

Heckel J. 1940 (1937): Ichthyologische Beiträge zu den Familien der Cottoiden, Scorpaenoiden, Gonioiden und Cyprinoiden. Annalen Wiener Museums der Naturgeschichte, Zweiter B: 143-161.

Holčík J. 1989: The freshwater fishes of Europe. Vol. 1. Part II. Aula Verlag, Wiesbaden.

Hubert N., Hanner R., Holm E., Mandrak N. E. et al. 2008: Identifying Canadian Freshwater Fishes through DNA Barcodes. PloS ONE 3(6): e2490.

Chow S. and Hazama K. 1998: Universal PCR primers for S7 ribosomal protein gene introns in fish. Primer Notes, Mol. Ecol. 7: 1255-1256.

Janko K., Flajšhans M., Choleva L., Bohlen J., Šlechtová V., Rábová M., Lajbner Z., Šlechta V., Ivanova P., Dobrovolov I., Culling M., Persat H., Kotusz J. and Ráb P. 2007: Diversity of European spined loaches (genus Cobitis L.): an update of the geographic distribution of the Cobitis taenia hybrid complex with a description of new molecular tools for species and hybrid determination. J. Fish Biol. 71: 387-408.

Kinziger A. P., Goodman D. H. and Studebaker R. S. 2007: Mitochondrial DNA variation in the Ozark highland members of the banded sculpin Cottus carolinae complex. Trans. Amer. Fish. Soc. 136: 1742-1749.

Kinziger A. P. and Wood R. M. 2003:Molecular systematice of the polytypic species Cottus hypselurus (Teleostei: Cottidae). Copeia 2003: 624-627.

Kinziger A. P. and Wood R. M. 2010: Cottus immaculatus, a new species of sculpin (Cottidae) from the Ozark highlands of Arkansas and Missouri, USA. Zootaxa 2340: 50-64.

Kinziger A. P., Wood R. M. and Neely D. A. 2005: Molecular Systematics of the Genus Cottus (Scopraniformes: Cottidae). Copeia 2: 303-311.

Kishino H. and Hasegawa M. 1989: Evaluation of the maximum likelihood estimate of the evolutionary tree topologies from DNA sequence data, and the branching order in Hominoidea. J. Mol. Evol. 29: 170-179.

Knaepkens G., Verheyen E., Galbusera P. and Eens M. 2004: The use of genetic tools for the evaluation of a potential migration barrier for the bullhead. J. Fish. Biol. 64: 1737-1744.

Knapen D., Knaepkens G., Bervoets L., Taylor M. I., Eens M. and Verheyen E. 2003: Conservation units based on mitochondrial and nuclear DNA variation among European bullhead populations (Cottus gobio L., 1758) from Flanders, Belgium. Conserv. Genet. 4: 129-140.

Knebelsberger T., Dunz A. R., Neumann D. and Geiger F. 2015: Molecular diversity of Germany freshwater fishes and lampreys assessed by DNA barcoding. Mol. Ecol. Res. 15: 562-572.

Koli L. 1969: Geographical variation of Cottus gobio L. (Pisces, Cottidae) in northern Europe. Annales Zoologici Fennici 6: 353-390.

Kontula T. 2003: Phylogeography and evolution of freshwater cottid fishes. Dizertační práce, University of Helsinki, Helsinki.

Kontula T., Kirilchik S. V. and Vainola R. 2003: Endemic diversifikation of the monophyletic cottoid fish species flock in Lake Baikal explored with mtDNA sequencing. Mol. Phylogenet. Evol. 27: 143-155.

Kontula T. and Vainola R. 2001: Postglacial colonization of Northern Europe by distinct phylogeography lineages of the bullhead Cottus gobio. Mol. Ecol. 10: 1983-2002.

Kontula T. and Vainola R. 2004: Molecular and morphological analysis of secondary contact zones of Cottus gobio in Fennoscandia: geographical discordance of character

transitions. Biol. J. Linn. Soc. 81: 535-552.

Kottelat M. 1997: European freshwater fishes. An heuristic checklist of the freshwater fishes of Europe (exclusive of former USSR), with an introduction for non-systematists and comments on nomenclature and conservation. Biologia, Bratislava, Section Zoology 52 (5): 1-271.

Kottelat M. and Freyhof J. 2007: Handbook of European Freshwater Fishes, Kottelat M. vydáno soukromě, pp. 646, ISBN . Koščo J. and Holčík J. 2008: Anotovaný Červený zoznam mihúľ a rýb Slovenska – verzia 2007. Biodiverzita ichtyofauny ČR (VII): 119-132.

Koščo J. and Pekárik L. 2007: Súčasný stav rozšírenia hlaváčov (Cottus) na Slovensku a príčiny zmien. Sb. X. České ichtyologické konference, Praha: 67-73.

Lemoine M., Young M. K., McKelvey K. S., Eby L., Pilgrim K. L. and Schwartz M. K. 2014: Cottus schitsuumsh, a new species of sculpin (Scopraniformes: Cottidae) in the Columbia River basin, Idaho-Montana, USA. Zootaxa 3755(3): 241-258.

Lewontin R. C. 1991: 25 years ago in genetics – electrophoresis in the development of evolutionary genetics: milestone or millestone.Genetics 128: 657-662.

Librado P. and Rozas J. 2009: DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics 25: 1451-1452.

Lojkásek B. and Lusk S. 2000: Výskyt vranek (Cottus) ve vodních tocích na území okresu Frýdek-Místek. Biodiverzita ichtyofauny ČR (III): 87-90.

Ludwig A., Becker J. and Bohlen J. 2000: Small differences in Cytochrome-b sequences within the genus Sabanejewia. Folia Zool. 49: 85-90.

Lusk S. 1993. Fish communities and their management in the Fryšávka stream. Folia Zool. 42: 183-192.

Lusk S., Bartoňová E., Lusková V., Lojkásek B. and Koščo J. 2008: Vranka pruhoploutvá – rozšíření a genetická diverzita v povodí řek Morava, Odra (Česká republika) a Hornád (Slovensko). Biodiverzita ichtyofauny ČR (VII): 67-80.

Lusk S., Hanel L., Lusková V., Lojkásek B. and Hartvich P. 2006: Červený seznam mihulí a ryb České republiky – verze 2005. Biodiverzita ichtyofauny ČR (VI): 7-16.

Lusk S., Lusková V., Bartoňová E. and Havelka J. 2011b: Ryby a mihule v horní části řeky Svratky. Biodiverzita ichtyofauny ČR (VIII): 98-108.

Lusk S., Lusková V., Hanel L., Lojkásek B. and Hartvich P. 2011a: Červený seznam mihulí a ryb České republiky – verze 2010, Biodiverzita ichtyofauny ČR (VII): 68-78.

Mahen J. 1927: Naše vranky. Rybářský věstník 7: 100-101, 116-117, 132-133.

Mallet J. 2005: Hybridization as an invasion of the genome. Trends Ecol. 20 (5): 229-237.

Mallet J. 2007: Hybrid speciation. Nature 446 (7133): 279-283.

Marešová E., Delic A., Kostov V., Maric S., Mendel J. and Šanda R. 2011: Genetic diversity of Sabanejewia balcanica (Actinopterygii: Cobitidae) in the western Balkans and comparison with other regions. Folia Zool. 60 (4): 335-342.

Marešová E., Lusková V. and Lojkásek B. 2012: Hybridization between Cottus gobio and Cottus poecilopus in the Odra River drainage basin (Czech Republic). Biologia 67(4):788-795.

Mendel J., Lusk S., Vasil’eva E. D., Vasil’ev V. P., Lusková V., Ekmekci F. G., Erk’akan F., Ruchin A., Koščo J., Vetešník L., Halačka K., Šanda R., Pashkov A. N. and Reshetnikov S. I. 2008: Molecular phylogeny of the genus Gobio Cuvier, 1816 (Teleostei: Cyprinidae) and its contribution to taxonomy. Mol. Phylogenet. Evol. 47: 1061–107.

Mendel J., Marešová E., Papoušek I., Halačka K., Vetešník L., Šanda R., Koníčková M. and Urbánková S. 2012a: Molecular Biodiversity Inventory of the Ichthyofauna of the

100

Czech Republic. In: Caliskan M (ed) Analysis of genetic variation in animals, 1st edn. InTech, Rijeka, pp. 287-314, ISBN 978-953-51-0093-5.

Mendel J., Papoušek I., Marešová E., Vetešník L., Halačka K., Nowak M. and Čížková D. 2012: Permanent Genetic Resources added to Molecular Ecology Resources Database 1 April 2012 – 31 May 2012b: Microsatellite loci for Palaearctic gudgeons: markers for identifying intergeneric hybrids between Romanogobio and Gobio, Mol. Ecol. Res. 12: 972-974. Morin P. A, Luikart G., Wayane R. K. and the SNP workshop group 2004: SNPs in ekology, evolution and conservation. Trends Ecol Evol. 19: 208-216.

Nei M. 1972: Genetic distance between populations. Am. Nat. 106: 283-292.

Nesbo C. L., Arab M. O. and Jakobsen K. S. 1998: Heteroplasmy, Length and Sequence variation in the mtDNA Control Regions of Three Percid Fish Species (Perca fluviatilis, Acerina cernua, Stizostedion lucioperca). Genetics 148: 1907-1919.

Neuenschwander S., Largiader C. R., Ray N., Currat M., Vonlanthen P. and Excoffier L. 2008: Colonization history of the Swiss Rhine basin by the bullhead (Cottus gobio): inference under a Bayesian spatially explicit Framework. Mol. Ecol. 17: 757-772.

Nolte A. W., Freyhof J. and Tautz D. 2006: When invaders meet locally adapted types: rapid moulding of hybrid zones between sculpins (Cottus, Pisces) in the Rhine system. Mol. Ecol. 15: 1983-1993.

Nolte A. W., Gompert Z. and Buerkle C. A. 2009: Variable patterns in two sculpin hybrid zones suggest that genomic isolation differs among populations. Mol. Ecol. 18: 2615- 2627.

Nybelin O. 1969: Om stensimpans, Cottus gobio L., och bergsimpans, C. poecilopus Heckel, utbredningshistoria i sodra och mellersta Sverige. Acta Regiae Scientarium et Litterarum Gothoburgensis Zoologica 4: 1-56.

Nymann L. and Westin L. 1968. Spontanneous hybridization in Cottidae. Acta Zool. 49: 219- 226.

Okamura N. and Goto A. 1996: Genetic variation and differentiation of the two river sculpins, Cottus nozawae and Cottus amblystomopsis, deducted from alloyzme and restrictiob enzyme-digested mtDNA fragment length polymorphism analyses. Jpn. Ichthyol. Res. 43: 65-71.

101

Oliva O. 1949: K rozšíření vranky karpatské (Cottus poecilopus Heckel 1748) na Moravě. Akv. Listy 21: 62-64.

Paetkau D., Waits L. P., Clarkson P. L., Craighead L. and Strobeck C. 1997: An empirical evaluation of genetic distance statistic using microsatellite data from bear (Ursidae) populations. Genetics 147: 1943-1957.

Pallsboll P. J., Berube M. and Allendorf F. W. 2007: Identifikation of management units using population genetic data. Trends Ecol. Evol. 22: 11-16.

Pasko L. and Maslak R. 2003: Genetics of the peripheral populations of the alpine bullhead, Cottus poecilopus (Scopraniformes, Cottidae) in Poland. J. Zool. Syst. Evol. Research 41: 196-204.

Peakall R. and Smouse P. E. 2006: GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Mol. Ecol. Notes 6: 288-295.

Perea S., Böhme M., Zupančič P., Freyhof J., Šanda R., Özuluğ M., Abdoli A. and Doadrio I. 2010: Phylogenetic relationships and biogeographical patterns in Circum-Mediterranean subfamily Leuciscinae (Teleostei, Cyprinidae) inferred from both mitochondrial and nuclear data. BMC Evol. Biol. 10: 265.

Posada D. and Crandall K. A. 1998: MODELTEST: testing the model of bDNA substitution. Bioinformatics 14: 817-818.

Pritchard J. K., Stephens M. and Donnelly P. 2000: Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics 155: 945-959.

Radtke G., Witkowski A., Grochowski A., Debowski P. and Kotisz J. 2005: Odkrycie glowacza pregopletwego Cottus poecilopus Heckel, 1840 (Cottidae) v polskich przymorskich rzekach. Przeglad zoologiczny XLIX (3-4): 145-151.

Ronquist F. and Huelsenbeck J. P. 2003: MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19: 1572-1574.

Ryder O. A. 1986: Species conservation and systematics:the dilemma of subspecies. Trends Ecol. Evol. 1: 9-10.

Sambrook J., Fritsch E. and Maniatis T. 1989: Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Seifertová M., Vyskočilová M., Morand S. and Šimková A. (1998). Metazoan parasites of freshwater cyprinid fish (Leuciscus cephalus): testing biogeographical hypotheses of species diversity. Parasitology 135 (12): 1417-35.

102

Shedko S. V. and Miroschnichenko I. L. 2007: Phylogenetic relationships of sculpin Cottus volki Taranetz, 1933 (Scorpaneiformes:Cottidae) according to results of analysis of control region in mitochondrial DNA. J. Ichthyol. 47: 21-25.

Sideleva V. G. and Goto A. 2009: Species Status and Redescription of Three Species of the Group Cottus poecilopus (Cottidae) from Eurasia. J. Ichthyol. 49(8): 599-613.

Smith G. R. 1992: Introgression in fishes – signifikance for paleontology, cladistics, and evolutionary rates. Syst. Biol. 41: 207-217.

Smith W. L. and Wheeler W. C. 2004: Polyphyly of the mail-cheecked fishes (Teleostei: Scorpaeniformes): evidence from mitochondrial and nuclear sequence data. Mol. Phylogenet. Evol. 32: 627-646.

Stierandová S., Vukic J., Vasileva E. D., Zogaris S., Shumka S., Halačka K., Vetešník L., Švátora M., Nowak M., Stefanov T, Koščo J. and Mendel J. 2015: A multilocus assesement of nuclear and mitochondrial sequence data elucidates phylogenetic relationships among European spirlins (Alburnoides, Cyprinidae). Mol. Phylogenet. Evol. 94: 479-491.

Strauss R. E. 1989: Associations beetwen genetic heterozygosity and morphological variability in freshwater sculpins, genus Cottus (Teleostei: Cottidae). Biochem. Syst. Ecol. 17: 333-340.

Sweigart A. 2009: Sculpins hybrid zones: natural laboartories for the early stages of speciation. Mol. Ecol. 18: 2547–2548.

Swofford D. L. 2001: PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.

Šedivá A., Janko K., Šlechtová V., Kotlík P., Simonović P., Delic A. and Vassilev M. 2008: Around or across the Carpathians: colonization model of the Danube basin inferred from genetic diversification of stone loach (Barbatula barbatula) populations. Mol. Ecol. 17 (5): 1277-1292.

Šlechtová V., Bohlen J., Freyhof J., Persat H. and Delmastro G. B. 2004: The Alps as barrier to dispersal in cold-adapted freshwater fishes? Phylogeographic history and taxonomic status of the bullhead in the Adriatic freshwater drainage. Mol. Phylogenet. Evol. 33: 225-239.

Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A. and Kumar S. 2013: MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30: 2725-2729.

103

Utzinger J., Roth C. and Peter A. 1998: Effects of enviromental parametrs on the distribution of bullhead Cottus gobio with particular consideration of the effects of obstructions. J. Appl. Ecol. 35: 882-892.

Van Oosterhout C., Hutchinson W. F., Wills D. P. M. and Shipley P. 2004: MICRO- CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Mol. Ecol. Notes 4: 535-538.

Vítek T., Halačka K., Bartoňová-Marešová E., Vetešník L. and Spurný P. 2014: Identification of natural hybrids between Cottus poecilopus, Heckel, 1837, and Cottus gobio, Linnaeus, 1758, at a hybrid zone on the Svratka River (Czech Republic). J. Appl. Ichthyol. 30: 102-108.

Volckaert F. A., Hanfling M. B., Hellemans B. and Carvalho G. R. 2002: Timing of the population dynamics of bullhead Cottus gobio (Teleostei:Cottidae) during the Pleistocene. J. Evol. Biol. 15: 930-944.

Vonlanthen P., Excoffier L., Bittner D., Persat H., Neuenschwander S. and Largiader C. R. 2007: Genetic analysis of potential postglacial watershed crossings in Central Europe by the bullhead (Cottus gobio L.). Mol. Ecol. 16: 4572-4584.

Waples R. S. 1991: Pacific salomon, Onchorhynchus spp. and the definition of „species“ under the Endangered Species. Act. Marine Fisheries Review 53: 11-22.

Witkowski A. 1979: A taxonomic study on fresh-water Sculpins of genus Cottus Linnaeus, 1758 (Cottus gobio L and Cottus poecilopus Heck.) in Poland. Acta Universitatis Wratislaviensis 458, Pracr. Zoologiczne X: 95.

Witkowski A. 1984: Morphological variability in lake and river populations of Cottus poecilopus Heckel, 1836 (Pisces: Cottidae). Acta Ichthyologica et Piscatoria, XIV: 43- 57.

Witkowski A. 1995: Phenotypic variability of Cottus gobio Linnaeus, 1758 in Polish waters (Teleostei: Scorpaeniformes: Cottidae). Zoologische Abhandlungen aus dem Staatlichen Museum für Tierkunde in Dresden 48: 177-183.

Witkowski A., Kotusz J. and Przybylski M. 2009: Stopień zagrożenia słodkowodnej ichtiofauny Polski: Czerwona lista minogów i ryb – stan 2009. Chrońmy Przyr. Ojcz. 65 (1): 33-52.

Wright S. 1931: Evolution in Mendelian populations. Genetics 16: 97-159.

104

Wydowski R. S. and Whitney R. R. 2003: Inland Fishes of Washington, 2nd edn. American Fisheries Society, Bethesda.

Yokoyama R. and Goto A. 2002: Phylogeography of a freshwater sculpin , Cottus nozawae, from the northeastern part of Hinshu Island, Jpn. Ichthyol. Res. 49: 147-155.

Yokoyama R. and Goto A. 2005: Evolutionary history of freshwater sculpins, genus Cottus (Teleostei; Cottidae) and related taxa, as inffered from mitochondrial DNA phylogeny. Mol. Phylogenet. Evol. 36: 654-668.

Zelinka 1951: K zeměpisnému rozšíření vranek na Moravě Akv. listy 23: 30-32.

105