Daniella Mota Silva

DANIELLA MOTA SILVA

CULTIVO IN VITRO E CITOGENÉTICA DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação de Genética e Melhoramento de Plantas, da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas, área de concentração: Conservação e melhoramento de espécies do Cerrado.

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov

Coorientadora: Profa. Dra. Daniela Melo Silva

Goiânia, GO - Brasil 2012 2

“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível”.

(Charles Chaplin)

Ao meu pai, João Batista da Silva (in memorian) pelo exemplo de amor incondicional, honestidade e determinação, a minha mãe, Maria José Mota Silva pelo seu amor, simplicidade, meu ancoradouro seguro em todos os momentos da vida. Aos meus irmãos Diego e Virginia pelo apoio e incentivo de sempre. DEDICO

Ao meu amor Luciano presente em todos os 3

momentos de minha vida, e parte fundamental desse trabalho. OFEREÇO

Amo todos vocês! 4

AGRADECIMENTOS

A Deus, primeiramente por proporcionar em minha vida grandes realizações. À Universidade Federal de Goiás pela oportunidade concedida para a realização desse curso de mestrado e a CAPES pela concessão da bolsa de estudo. Ao Programa de Pós-Graduação de Genética e Melhoramento de Plantas e Programa de Pós-Graduação em Agronomia, a Coordenação, professores, funcionários e alunos (colegas de aula), sobretudo pelas pessoas que cruzaram meu caminho, seja por curtos ou longos momentos, porém com a certeza das lições compartilhadas. Ao Professor Orientador Dr. Sérgio Tadeu Sibov meus sinceros agradecimentos pela enorme paciência, dedicação, amizade e, sobretudo confiança, apoio e credibilidade que me deu em todo curso de mestrado, obrigada. Ao Luciano, meu querido amor, que sempre esteve nos bons e maus momentos, pelo companheirismo, apoio, incentivo, paciência, pelas sugestões que enriqueceram este trabalho, pela ajuda na elaboração da estatística, e principalmente por todo seu amor. Ao Laboratório de Anatomia Vegetal e professoras Maria Helena, Maria Tereza e Letícia pela disposição, atenção e uso dos equipamentos do laboratório. À professora Doutora Daniela Melo pelo auxílio, sugestões, apoio e contribuição com reagentes para a citogenética e principalmente pela amizade e simpatia de sempre. Ao Professor Doutor Aparecido Divino da Cruz (Peixoto) por disponibilizar as instalações do Laboratório Replicon (PUC-Goiás) para tentativas com a citogenética. Ao Professor Doutor Cláudio Carlos pelas sugestões e auxílio sobre a citogenética. Ao Alex do Laboratório Replicon (PUC-Goiás) pelo auxílio e dúvidas sobre o experimento de citogenética. Às professoras e amigas Maurízia e Iraídes pelo apoio e incentivo na área de cultura de tecidos, pelas divertidas viagens a congressos e principalmente pela amizade. À professora Doutora Leila Garcês pelo auxílio e sugestões e uso de equipamentos do laboratório de Microorganismos. Às seguranças Selma e Vaneide, pela amizade e boas conversas na frente do ICB. À todos do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, os novos e os antigos, Talita, Fernanda, Marina, Diego, Lívia, Paulo, Marcos I, Marcos II, as minhas ex- estagiárias Juliana e Barbara, Catherine, Nicholas, Diego II, Gabriel, Gessika, Lílian, 5

Daniella pelo auxílio,ótimo convívio, pela amizade e alegria em muitos momentos de descontração e divertidas horas de confraternização, que são essenciais nesse trajeto. À todos do Laboratório de Microorganismos em especial, Kellen, Jacque, Carlos, Alini, Acássio pelo apoio e auxílio em muitos momentos, pela amizade e brincadeiras pelo corredor do ICB e pelas divertidas horas de confraternização. A minha querida Mãe pela paciência, compreensão, apoio, dedicação, amor incondicional e por fornecer todas as condições para que eu me dedicasse ao mestrado, e por acreditar em mim. Ao meu querido irmão Diego pela atenção, auxílio na montagem de figuras e tabelas, por todo seu apoio, generosidade e fraternidade. A todos meus amigos que, mesmo sem muito compreender o que acontecia comigo, me apoiaram neste período, e compreenderam a minha ausência em muitos momentos. A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho, mesmo que não foram citados, meu muito obrigado.

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ...... 8 LISTA DE FIGURAS ...... 9 LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS ...... 111 RESUMO ...... 13 ABSTRACT ...... 14 1 INTRODUÇÃO...... 17 2.1 FAMÍLIA ORCHIDACEAE ...... 17 2.1.2 Importância econômica e mercado mundial de orquídeas ...... 20 2.2 O GÊNERO Cyrtopodium R. Br...... 22 2.3 A ESPÉCIE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f...... 23 2.4 PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ORQUÍDEAS ...... 25 2.4.1 Cultura de tecidos vegetais ...... 25 2.4.2 Reguladores de Crescimento ...... 27 2.4.2.1 Auxinas ...... 27 2.4.2.2 Citocininas ...... 29 2.4.3 Germinação assimbiótica ...... 30 2.4.3.1 Teste de viabilidade de sementes...... 30 2.4.3.2 Germinação assimbiótica de orquídeas ...... 31 2.5 CITOGENÉTICA DE ORQUÍDEAS ...... 33 2.7 REFERÊNCIAS ...... 35 3 MICROPROPAGAÇÃO DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae) RESUMO ...... 43 ABSTRACT ...... 44 3.1 INTRODUÇÃO ...... 44 3.2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 46 3.2.1 Teste de viabilidade das sementes ...... 46 3.2.2 Germinação assimbiótica in vitro ...... 47 3.2.3 Desenvolvimento de protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum ...... 48 3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 50 3.3.1 Teste de viabilidade das sementes ...... 50 7

3.3.2 Germinação assimbiótica in vitro ...... 51 3.3.3 Desenvolvimento de protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum ...... 55 3.3.3.1 Altura ...... 55 3.3.3.2 Número de brotos ...... 57 3.3.3.3 Número de folhas ...... 59 3.3.3.4 Número de raízes e comprimento da maior raiz ...... 60 3.3.3.5 Formação de calos ...... 62 3.4 CONCLUSÕES ...... 63 3.5 REFERÊNCIAS ...... 64 4 CITOGENÉTICA DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae) RESUMO ...... 70 ABSTRACT ...... 70 4.1 INTRODUÇÃO ...... 71 4.2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 72 4.2.1 Material Vegetal ...... 72 4.2.2 Germinação assimbiótica in vitro ...... 73 4.2.3 Testes para análises cromossômicas ...... 733 4.2.3.1 Protocolo de digestão enzimática com celulase/pectinase ...... 74 4.2.3.2 Protocolo usando corante reativo de Schiff seguido de esmagamento ...... 74 4.2.3.3 Protocolo usando corante orceína acética seguido de esmagamento ...... 74 4.2.3.4 Protocolo usando raízes tratadas com regulador de crescimento ...... 75 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 76 4.4 CONCLUSÕES ...... 80 4.5 REFERÊNCIAS ...... 81 5 CONCLUSÕES GERAIS ...... 83 6 ANEXO ...... 84 LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 Escala de estádios de diferenciação de plântulas de Cyrtopodium saintlegerianum germinadas in vitro (Stewart et a., 2003) ...... 48

Tabela 3.3 Efeito das concentrações de ANA e BAP na altura de Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo...... 56

Tabela 3.4 Efeito das concentrações de ANA e BAP na produção de brotações de Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo...... 57

Tabela 3.5 Efeito das concentrações de ANA e BAP na produção de folhas Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo...... 59

Tabela 3.6 Efeito das concentrações de ANA e BAP no número de raízes de Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo...... 61

Tabela 3.7 Efeito das concentrações de ANA e BAP na formação de calos de Cyrtopodium saintlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo...... 63

Tabela 3.8 Lista de espécies do gênero Cyrtopodium com os respectivos números cromossômicos (2n) ...... 79

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 Plantas de Cyrtopodium saintlegerianum fixadas em troncos de palmeira (macaúba) (A). Folhas e raízes pneumatóforas e pseudobulbos em período chuvoso (B)...... 24

Figura 2.2 Orquídea Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. epífita, apresentando inflorescência paniculada e ramificada (A). Flor (B) e cápsula (C). Barras = 1 cm...... 25

Figura 3.1 Protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum nas fases de crescimento 3 a 5 inoculados em meio de multiplicação com diferentes concentrações de ácido naftalenacético (ANA) e 6-benzilaminopurina (BAP) (Ae B) ...... 49

Figura 3.2 Sementes de Cyrtopodium saintlegerianum submetidas ao teste de tetrazólio (TTC). A - sementes no tratamento T1 (12 h imersas no TTC); B - sementes no tratamento T2 (24 h imersas no TTC) ...... 50

Figura 3.3 Porcentagem de germinação de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum 35 dias após a inoculação em diferentes tratamentos. MS: meio Murashige & Skoog (1962) completo; MS ½: meio Murashige & Skoog (1962) com redução da metade da concentração dos macronutrientes; KC: meio Knudson (1946) e KC (modif.): meio Knudson modificado (Arditti et al., 1977) ...... 52

Figura 3.4 Efeito comparativo de meios de cultura e estádio de desenvolvimento na germinação assimbiótica de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum após 15 semanas. Meio MS (T1), meio MS ½ (T2), meio KC (T3), meio KC modificado (T4). ( Média Média ±0,95 Intervalo de confiança). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5% ...... 54

Figura 3.5 Estádios de desenvolvimento da germinação assimbiótica de Cyrtopodium santlegerianum após 15 semanas de cultivo. Sementes com embrião intumescido no meio MS ½ macronutrientes estádio 1 (A); Estádio 2 ruptura do tegumento sem rizóides no meio MS (B); Estádio 2 e 3, tegumento rompido e aparecimento de rizóides (C); Estádio 3, protomeristema com presença de muitos rizóides no meio KC (D); Estádio 4, protocormos emitindo a primeira folha meio KC modificado (E); Estagio 5, desenvolvimento e alongamento da primeira folha meio KC modificado (F) ...... 55

Figura 3.6 Metáfases mitóticas pouco coradas e de difícil visualização utilizando o protocolo 2 para pontas de raízes de Cyrtopodium saintlegerianum obtidas de plântulas germinadas e desenvolvidas in vitro. Setas indicam células em metáfases. Barra = 36 μm ...... 77

Figura 3.7 Metáfases mitóticas e núcleos interfásicos visualizados após utilização do protocolo 4 para pontas de raízes de Cyrtopodium saintlegerianum obtidas de plântulas germinadas e desenvolvidas in vitro. Tratamento (T1) com regulador de crescimento ANA (A e B); Tratamento (T2) sem regulador de crescimento (C e D). Barra = 50 μm ...... 78

LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS

º ’ – Coordenadas geográficas, em graus e minutos, respectivamente % – Porcentagem ± – Amplitude de variação µm - Micrômetro µmol – Micromol µg – Microgramas °C – Grau Celsius A – altura ABCSEM - Associação Brasileira do Comércio de Sementes e Mudas ANA – Ácido naftaleno acético BAP – 6-benzilaminopurina C - calos CR - comprimento da maior raiz cm – Centímetro EUA – Estados Unidos da América g – Grama g kg-1 - gramas por kilo g.L-1 – Grama por litro h – Hora ha – Hectare is – Índice de seleção IBAMA – Instituto Brasileiro de Meio Ambiente ICMBIO - Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade KC – Meio Knudson C

KH2PO4 – Fosfato de potássio monobásico km2 – quilômetro quadrado L – Litro m – Metro m2 – Metro quadrado mg.L-1 – Miligrama por litro mL – Mililitro 12

mm – Milímetro MS – Meio Murashige & Skoog (1962) MS½ - Meio Murashige & Skoog (1962) com redução da metade da concentração dos macronutrientes mS/cm – metro siemens por centímetro

Na2HPO4 – Fosfato de sódio dibásico NB – Número de brotos NF - Número de folhas NR - Número de raízes NPK – Nitrogênio/ Fósforo e Potássio pH – Potencial hidrogeniônico PVC – Plástico feito de policloreto de polivinila ® - Marca registrada SEBRAE – Serviço Brasileiro de Apoio as Micro e Pequenas Empresas sp. – Espécie T – Tratamentos TDZ - Thidiazuron Tz ou TTC - Cloreto de 2, 3, 5 trifenil tetrazólio

RESUMO

MOTA-SILVA, D. Micropropagação e citogenética de Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (Orchidaceae: Cyrtopodiinae) 2012. 95 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) - Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012.1 2

Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f é espécie epífita da região Centro-Oeste, distribuída no Planalto Central brasileiro, e tem ampla distribuição geográfica no Brasil. É encontrada em de troncos de palmeiras, formando grandes touceiras. Possui características para ornamentação, pela beleza de sua inflorescência, contudo não são encontrados na literatura estudos sobre sua conservação ou propagação. Assim, esse trabalho teve como objetivo o estabelecimento de protocolos para germinação assimbiótica, efeitos de fitohormônios, aclimatização e a caracterização cromossômica da espécie. Em 2010, para o estabelecimento de protocolos para a micropropagação, cápsulas foram coletadas em uma área de pastagem no município de Mossâmedes, GO, foram previamente desifestadas em seguida parte das sementes foram separadas e testadas em corante tetrazólio a 1%. Para o cultivo assimbiótico, foram testados diferentes meios de cultura e diferentes concentrações e combinações de BAP/ANA em 16 tratamentos. Foram testados substratos combinados e adubação com fertilizante químico e orgânico para a aclimatização das plântulas. Para o cariótipo da espécie, o material vegetal foi proveniente de plantas cultivadas in vitro em meio de cultura. Foram testados quatro protocolos, com diferenças quanto a solução enzimática para o amolecimento das raízes, os corantes, concentração do anti-mitótico e solução de hidrólise, e o uso de regulador de crescimento para indução de raízes in vitro. Todos os protocolos tiveram em comum raízes pré-tratadas com anti-mitótico 8- hidroxiquinoleína (0,002M) em geladeira durante 24 horas. Em seguida nos protocolos as raízes foram fixadas em Carnoy 3:1 por 18 horas o primeiro e o segundo protocolo e o terceiro e o quarto por 24 horas em temperatura ambiente. Depois estocados a -20ºC no próprio fixador, para posterior análise (apenas o quarto protocolo). As raízes dos protocolos foram coradas com diferentes corantes: hematoxilina, reativo de Schiff, orceína acética e Giemsa respectivamente. A germinação foi satisfatória em todos os meios de cultura. Para o meio suplementado com auxina/citocinina combinadas as melhores concentrações para a variável altura foi 0,2 mg L-1 de ANA sem adição de BAP e o controle sem adição de reguladores. Os melhores meios que induziram grande número de brotações foram 4 mg L-1 de BAP e 4 mg L-1 de BAP / 0,2 mg L-1 de ANA. O número de folhas foi melhor avaliado nas concentrações de BAP sem ANA nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 mg L-1. Os tratamentos com maior número de raízes foram o controle sem adição de reguladores de crescimento, e nas dosagens de 0,2, 0,5, 1,0 mg L-1 de ANA sem adição de BAP, assim como o comprimento da maior raiz foi favorecido pelos mesmos tratamentos. O maior número de calos se deu no tratamento com concentrações de 1,0 BAP mg L-1 sem adição de ANA. Para a citogenética de C. saintlegerianum o melhor protocolo avaliado foi com regulador no qual foi obtido metáfases, no entanto os cromossomos se encontravam condensados, e o numero de cromossomos encontrado foi de 2n=48.

Palavras chave: orquídeas, cultura de tecidos, cariótipo.

1 Orientador: Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov. EA-UFG. 2 Co-Orientadora: Profa. Dra. Daniela Melo Silva. ICB-UFG 14

ABSTRACT

MOTA-SILVA, D. Micropropagation and cytogenetic of Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae) 2012 95 f. Dissertation (Master in Genetic and Plant Bredding) – College of Agronomy, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012.1 2

Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f is an epiphytic species typical of the Midwest, especially in distributed Brazilian Central Plateau, and has a wide geographical distribution in Brazil. It is usually found in the trunks of palm trees, forming large clumps. It has good features for ornamentation, for the beauty and size of its inflorescence, however, are not found in the literature about its conservation, methods for its spread or that could be used in floriculture and landscaping. Thus, this study aimed to establishing protocols for germination asymbiotic effects of phytohormones and acclimatization and characterization of chromosomal species. In 2010, the establishment of micropropagation protocols, capsules were collected in a pasture area in the municipality of Mossâmedes, GO, then the part previously sterilized seeds were separated and tested in a 1% tetrazolium dye.. For cultivation was tested asymbiotic different culture media and then tested after different concentrations and combinations in treatments BAP 16 / ANA, to finally evaluate the acclimatization substrates combined and fertilized with chemical fertilizers and organic. For the karyotype of the species, the plant material is derived from plants grown in vitro in culture medium. We tested four protocols, with differences in enzyme solution for softening the roots, dyes, anti-mitotic concentration of the solution and hydrolysis, and the use of growth regulators for root induction in vitro. All protocols were in common roots pretreated with anti-mitotic 8-hydroxyquinoline (0.002 M) in refrigerator for 24 hours. Then protocols roots were fixed in Carnoy 3:1 for 18 hours the first and second and third and fourth protocol for 24 hours at room temperature. After stored at -20 º C in the same fixative for further analysis (only the fourth protocol). The roots of the protocols were stained with different dyes: hematoxylin, Schiff, acetic orcein and Giemsa respectively.The results of germination was satisfactory in all culture media. For medium supplemented with auxin / cytokinin combined the best concentrations for variable height were 0.2 mg L-1 NAA and BAP without adding control without addition of regulators. The best means to induce large numbers of shoots were 4 mg L-1 BAP and 4 mg L-1 BAP / 0.2 mg L-1 NAA. The number of leaves was rated best in the concentrations of BAP without NAA at concentrations of 1.0, 2.0 and 4.0 mg L-1. The treatments with the highest number of roots were control without added growth regulators at doses of 0.2, 0.5, 1.0 mg L-1 NAA without addition of BAP, as well as the length of roots was favored by the same treatments. The largest number occurred in callus treatment with concentrations of 1.0 mg L-1 BAP without adding ANA. For cytogenetics C. saintlegerianum the best protocol was evaluated with the regulator which was obtained metaphases, however chromosomes were condensed, and the number of chromosomes was found to be 2n = 48.

Key words: orchids, tissue culture, karyotype.

1 Advisor: Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov. EA-UFG. 2 Co-Advisor: Profa. Dra. Daniela Melo Silva. ICB-UFG.

1 INTRODUÇÃO

A família Orchidaceae constitui um dos maiores e mais diversos agrupamentos de angiospermas, compreende 40% do grupo das monocotiledôneas (Dressler, 1993). Apresenta cerca de 25.000 espécies (Croix, 2008) e mais de 100.000 híbridos em todo o mundo o que possibilita a ocorrência de grande variabilidade de cores, formas e tamanhos de folhas e flores (Pasqual et al., 2005). Segundo Barros (2012) são aceitos no Brasil 2432 espécies sendo 1622 endêmicas no país, distribuídas em todos os domínios fitogeográficos. São descritas para o Cerrado 682 espécies de orquídeas (Barros et al., 2012). Dentre as espécies encontradas nesse Bioma, o gênero Cyrtopodium Rchb. f compreende 50 espécies de origem neotropical distribuídas do sul da Florida até o norte da Argentina (Romero-González et al., 2008). Segundo Batista & Bianchetti (2005) o centro de diversidade do gênero é o Cerrado brasileiro, onde ocorrem pelo menos 29 espécies. Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f é uma espécie epífita típica da região Centro-Oeste, especialmente distribuída no Planalto Central brasileiro, e tem ampla distribuição geográfica no Brasil. Geralmente é encontrada na metade superior de troncos de palmeiras do gênero Acrocomia (macaúba) formando grandes touceiras de raízes pneumatóforas que abrigam uma grande diversidade de organismos (Menezes, 2000) onde oferecem boas condições para a germinação e desenvolvimento dessa espécie e de outras orquídeas epífitas. O bioma Cerrado encontra-se distribuído em 24% do território brasileiro. É considerado um dos hostspots para conservação da biodiversidade mundial, pois possui alto nível de endemismo (Myers et al., 2000). No entanto, a expansão das atividades agropastoris modificou cerca de dois milhões de km2 originais do bioma que foram transformados em pastagens e plantações de culturas anuais (Klink & Machado, 2005). Assim, nos últimos 50 anos, organismos e ecossistemas tem se tornado cada vez mais vulneráveis à extinção, e as orquídeas correspondem a 10% de toda flora predisposta a esse risco (Koopowitz et al., 2003). 16

Técnicas de cultura de tecidos vegetais são empregadas principalmente na produção de plantas em larga escala, as quais permitem multiplicar genótipos superiores isentos de vírus e outros patógenos em curto espaço de tempo (Souza et al., 2006). Tem sido amplamente aplicadas na propagação de orquídeas, garantido a preservação de muitas espécies e atendendo a demanda do mercado por esta família de plantas consideradas as mais apreciadas pelo consumidor brasileiro (SEBRAE, 2010). Visando a preservação da espécie e de suas características com alto potencial ornamental, além da inexistência de publicações sobre a espécie, esse trabalho teve como objetivo o estabelecimento de protocolos para germinação assimbiótica, efeitos de fitohormônios e a caracterização cromossômica da espécie C. saintlegerianum.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 FAMÍLIA ORCHIDACEAE

A família Orchidaceae, pertence a Ordem Asparagales, classe Liliopsida e à Divisão Magnoliophyta (Dressler, 1993). Constituem um dos maiores e mais diversos agrupamentos das angiospermas, com 20.000 a 30.000 espécies distribuídas por todo o mundo (Dressler, 2005; Mendonça et al., 2008). Apresenta distribuição cosmopolita, mas sua maior concentração ocorre nas regiões tropicais (Hall, 2009). A família Orchidaceae era dividida em cinco subfamílias: Apostasioideae, Cypripedioideae, Epidendroideae, Orchidoideae e Spiranthoideae. Porém, segundo Pridgeon et al. (2006) as mais recentes análises filogenéticas demonstraram que Spiranthoideae está inserida dentro de Orchidoideae e apontaram Vanilloideae como uma subfamília separada de Epidendroideae. Mais de 3.500 espécies são encontradas no Brasil sendo considerado o terceiro país do mundo em diversidade, perdendo apenas para Equador e Colômbia (Souza & Lorenzi, 2008). A família Orchidaceae é notável pela sua diversificada morfologia floral e vegetativa sendo essa última mais variável que a primeira e isso pouco surpreende quando se considera a variedade de habitats que as espécies dessa família podem habitar. As orquídeas adaptaram-se aos mais variados ambientes. Podem ser terrestres crescendo em savanas, campos, em ambientes turfosos de mata fechada e em áreas úmidas como brejos. Podem ser epífitas sobre árvores ou arbustos abrigadas ou não da luz e rupícolas com a difícil tarefa de se manterem vivas nos afloramentos rochosos, apesar das constantes oscilações de temperatura desses ambientes (Arditti, 1992). 18

São monocotiledôneas e perenes, em grande parte. Ao contrário da maioria das plantas, as quais produzem endosperma e são capazes de alimentar o embrião em seus primeiros estágios de vida, as orquídeas utilizam-se de processos simbióticos, ou seja, fungos simbiontes (tambem chamados micorrízicos) para induzir o processo de germinação. Estes fungos simbiontes tornam-se fonte de nutrientes advindos de sua digestão enzimática pela própria planta hospedeira e que são utilizados para o desenvolvimento do protocormo, a partir do embrião contido na semente madura (Peterson et al., 1998; Pereira et al., 2003). Gradativamente, o protocormo torna-se capaz de realizar a fotossíntese e este processo será o responsável pela nutrição da planta desenvolvida (Pereira et al., 2003). Assim, na planta adulta a micorriza não é mais necessária, no entanto, algumas espécies de orquídeas saprófitas nunca serão capazes de realizar fotossíntese plenamente e permanecem dependentes do fungo por toda a vida (Arditti, 1967). As orquídeas são constituídas morfologicamente de raiz, caule, folha, inflorescência, flor, fruto e semente (Paula & Silva, 2001). Quanto ao hábito de crescimento, as orquídeas podem ser monopodiais (ereto) ou simpodiais (prostrado). As monopodiais tem crescimento contínuo do caule, desenvolvimento sempre na vertical, as raízes aéreas são expostas quando envasadas, não apresentam bulbos e as hastes florais saem das axilas das folhas. As simpodiais apresentam um eixo cujo crescimento cessa no fim de cada estação, emitindo na base um novo ramo, que forma um pseudobulbo e eventualmente uma nova flor (Pasqual et al., 2005). Segundo Kerbauy (1998), as raízes das orquídeas são responsáveis principalmente pela fixação além de ser o único sítio ativo de fixação de dióxido de carbono e atuar na propagação vegetativa realizando a fotossíntese. Pode também estimular o enraizamento, permitir o maior acúmulo de nutrientes aumentando a sobrevivência das plantas ex vitro. O sistema radicular das orquídeas é dotado de um tecido multisseriado denominado velame, que reveste as raízes e aloja fungos micorrízicos, que auxiliam na nutrição destas plantas e permite estocar água evitando o déficit hídrico, uma adaptação imprescindível, o qual funciona como uma barreira física a transpiração e a desidratação (Pridgeon et al., 19

1999) em períodos de seca prolongada, especialmente em áreas de cerrado. Além de oferecer proteção mecânica e suporte. As folhas das orquídeas estão dispostas disticamente no caule, e podem ser sustentadas pelo caule ou pseudobulbo, Sua venação foliar é disposta paralelamente e podem ser caducas com zona de abcisão limitada no pseudobulbo (Dressler, 1981). Possuem diferentes formas e formatos, podem ser membranosas, carnosas ou coriáceas, nesse caso armazenam água e outras substâncias (Withner et al., 1974). Os caules ou pseudobulbos são responsáveis por armazenar água e auxiliam na manutenção do balanço hídrico da planta, principalmente quando há pouca disponibilidade desse elemento (Braga, 1977). Algumas espécies que não possuem pseudobulbo, as folhas e raízes se transformam nesse órgão e passam a acumular substâncias de reservas e água (Stancato, 1999). Nessas espécies sem pseudobulbos, a grande maioria epífita e monopodial, o caule é aéreo, ereto e herbáceo e nele são inseridas as folhas. Após a floração, ocorre a emissão de brotações, que podem ser divididas dando origem a uma nova planta (Moraes et al., 2002). Em algumas orquídeas do gênero Cyrtopodium os pseudobulbos são caracterizados por apresentarem vários nós e, após a floração, as gemas axilares se desenvolvem formando novos brotos (Caramaschi, 2001). As orquídeas são apreciadas principalmente pela grande diversidade de formas, cores e aromas de suas flores. Seu tamanho pode variar de 2 - 3 mm a 15 – 20 cm (Arditti, 1967). As flores são compostas pela coluna e perianto com seis elementos. A coluna é fusionada com o filete da antera fértil e o estilete. O perianto possui três sépalas externas e três pétalas internas, sendo uma delas modificada denominada labelo, que é responsável muitas vezes por atrair o polinizador ou como plataforma para outros insetos visitantes, otimizando o transporte do pólen para outra flor, possibilitando a fecundação (Ferrarezi et al., 2007). Alguns grupos de orquídeas formam inflorescências com centenas de flores, que podem ser apicais, laterais ou paniculadas, formando ramos, corimbo ou umbelas. Suas flores podem abrir simultaneamente ou em sucessão. Outras geralmente apresentam brácteas em sua base. Estas brácteas, de tamanhos 20

diferenciados, são, em algumas espécies, até mais vistosas que as flores como em espécies do gênero Cyrtopodium (Cribb et al., 2003). O fruto formado caracteriza-se por ser deiscente, seco e fotossintetizante do tipo cápsula. Possui três carpelos que ao atingir a maturação abrem e liberam no ambiente milhões de sementes minúsculas e sem endosperma (Dressler, 1993). A partir disso, as poucas sementes que germinam são associadas a fungos micorrízicos, característica singular que torna a densidade das populações relativamente baixa (Shimura & Koda, 2005).

2.1.2 Importância econômica e mercado mundial de orquídeas

O setor de floricultura movimenta mundialmente US$ 18 bilhões (produtor) e US$ 54 bilhões (base mercado consumidor). No Brasil, os números no varejo giram em torno de R$ 2,6 bilhões. O mercado produtor movimenta R$ 700 milhões e o atacadista R$ 1,1 bilhão (ABCSEM, 2011). A média anual de consumo de flores e plantas ornamentais no Brasil é de R$ 13,00 a R$ 15,00 por pessoa, constatando-se, ainda, diferenças consideráveis no consumo das populações das diversas regiões do País. Os maiores índices de compra dessas mercadorias ocorrem nos Estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, São Paulo, Minas Gerais e também no Distrito Federal. O Brasil possui cerca de 5,1 mil produtores de plantas e flores de todos os tamanhos responsáveis pelo cultivo de quase oito mil hectares. O consumo brasileiro de flores e plantas ornamentais está abaixo do consumo per capita europeu, que é de US$ 70,00 por habitante/ano (ABCSEM, 2011). Os maiores consumidores são: Alemanha, Suíça, Holanda (SEBRAE, 2010). A comercialização e cultivo de orquídeas ocorrem principalmente devido a beleza, exoticidade e aroma de suas flores. Esta atração teve inicio no século XVIII (Rocha & Cavalheiro, 2001) se tornando mais sofisticada, competitiva e com maior demanda a partir do final da década de 90 (Stancato et al., 2001). A análise do mercado brasileiro global de flores e folhagens envasadas para o ano de 2008 permite constatar que as orquídeas em geral são as principais espécies comercializadas com 20,55% de participação nas vendas finais ao 21

consumidor. Esses números agregam as duas principais espécies comerciais de orquídeas no Brasil: Phalaenopsis e Cymbidium. As orquídeas do gênero Cymbidium foram contempladas com vendas globais de pouco mais de R$ 8,76 milhões (que representaram 1,32% de participação no mercado global de flores e folhagens envasadas), enquanto as Phalaenopsis agregaram vendas totais de pouco mais de R$ 6,9 milhões em 2008 (que representaram 1,05% de participação no mercado de flores e folhagens envasadas). Outras espécies aparecem em segundo lugar que são os crisântemos envasados, com vendas anuais da ordem de R$ 70,88 milhões (10,71%), seguidos por lírios (5,64%), violetas (4,77%), kalanchoes (4,76%), azaléias (4,15%), bromélias (2,38%) e begônias (1,67%) (SEBRAE, 2010). A cadeia produtiva de flores em especial as orquídeas, tornou-se com o tempo mais especializada, atendendo todas as exigências do mercado. Com isso, o produto (orquídea) tornou-se mais competitivo, e outras classes sociais (C e D), não apenas a classe A passaram a consumir de forma compulsória para várias ocasiões. A compra foi facilitada em diversos postos de vendas como gardens, supermercados e mais ainda via internet. As vendas desbancaram os principais concorrentes como chocolates, CDs e perfumes. Assim, o setor vem se tornando mais consistente e cresce continuamente (SEBRAE, 2010). Em relação às exportações de orquídeas, o valor total foi de US$ 219,86 mil em 2009. Os principais países de destino foram Japão (53,08%), Alemanha (21,74%), EUA (12,27%) e Holanda (8,08%), além de Ucrânia, Taiwan, Hong Kong, África do Sul e Chile (Junqueira & Peetz, citado por Faria et al., 2011). O verdadeiro valor das orquídeas provém da produção de flores para corte, principalmente híbridos dos gêneros Phalaenopsis, Cattleya, Dendrobium, Paphiopedilum e Cymbidium, compondo principalmente cenários decorativos de casamentos, aniversários e em arranjos florais de eventos variados (Faria et al., 2010). As mesmas espécies são também bastante vendidas em vasos para ornamentação e cultivo doméstico. A Tailândia, por exemplo, vem especializando-se na produção de flores de orquídeas de exportação para grandes cidades ao redor do mundo. Em 2001, exportou mais de 3 milhões de plantas vendidas por cerca de 40 milhões de 22

dólares. Desde então, o ministério da agricultura da Tailândia reconheceu o potencial desta produção e tem procurado melhorar a qualidade e atratividade de seus clones concedendo certificados aos melhores produtores (Thailand News, 2008). No Brasil, há também grande potencial de mercado em exposições organizadas por associações de orquidófilos em todo país, e os híbridos são os mais procurados. Muitas pessoas cultivam orquídeas como hobby, havendo inúmeros grupos preocupados com a preservação dessas plantas por todo o mundo (ex.: American Orchid Socity; International Orchid Conservation; Coordenadoria das Associações de Orquidófilos do Brasil), além dos órgãos ambientais competentes (IBAMA; ICMBIO). Além do forte potencial comercial das orquídeas, elas possuem importante papel na indústria. São utilizadas na composição de perfumes e aromatizantes de alimentos, a exemplo da espécie Vanilla planifolia Andrews, fonte do aromatizante baunilha, o qual é extraído de frutos secos desta espécie (Raven et al., 1999). Outros gêneros têm importância em outros países como Dendrobium que são usados em infusões de efeito calmante na China e suas flores desempenham importante papel em cerimônias religiosas em outros países da Ásia. Na Turquia, usam-se os tubérculos da Anacamptis morio (L.) R. M. Bateman para preparação de sorvetes conhecido como salep. No século XIX, pseudobulbos de Cyrtopodium, mais conhecido como Sumaré, eram utilizados como adesivos domésticos no Brasil (Arditti, 1992). Tendo em vista o alto valor comercial e a progressiva procura por muitas espécies e híbridos de orquídeas, novas tecnologias como a micropropagação foram utilizadas para obter maior número de plantas em curto espaço de tempo e com elevado potencial ornamental.

2.2 O GÊNERO Cyrtopodium R. Br.

O gênero Cyrtopodium Rchb.f pertece a subfamília Epidendroidae e a subtribo Cyrtopodiinae (Pridgeon, 2006). Compreende 50 espécies de origem neotropical distribuídas do sul da Florida até o norte da Argentina (Romero- González et al., 2008). Sendo o centro de diversidade do gênero o Cerrado 23

brasileiro, onde ocorrem pelo menos 29 espécies desse grupo (Batista & Bianchetti, 2005). Caracterizam-se por serem terrestres, rupícolas ou epífitas, folhas bastante longas multinervuradas, herbáceas e caducas. A inflorescência pode ser vigorosa e em grande número, apresenta brácteas em sua base de tamanhos diferenciados, unduladas e coloridas, algumas até mais vistosas que as próprias flores (Pridgeon et al., 2006). Os pseudobulbos das espécies de Cyrtopodium podem ser fusiformes, cilíndrico-fusiformes ou cônico-ovóides e podem variar consideravelmente em tamanho desde pequenos com alguns centímetros ou medindo até mais de um metro de altura (Menezes, 2000). O gênero Cyrtopodium etimologicamente siginifica “pé curvado” uma denominação que faz alusão ao pequeno arco que estende ao prolongamento basal da própria coluna. São encontradas em ambientes secos, rochosos, mas também em solos úmidos (veredas no Cerrado) apresentando hábito epífito, rupícola ou terrestre. O gênero Cyrtopodium em muitas regiões tem diferentes denominações, em Goiás a denominação mais usada é “cola-de-sapateiro” pois, o sumo extraído dos pseudobulbos de C. brasiliensis era muito usado para colagem do couro, papel e madeira (Menezes, 2000). Muitas pessoas utilizam Cyrtopodium punctatum (L.) Lindl. para fins medicinais, para cicatrizar lesões, estancar o sangue de feridas e cortes, tratamento de coqueluche e tosse (Vieira, 2000). O gênero é bastante resistente ao estresse hídrico e necessita de alta luminosidade e grande período de insolação, além de substratos bem aerados para um bom desenvolvimento (Dressler, 1981). Algumas espécies de hábito terrestre e principalmente as de hábito rupícula apresentam baixa tolerância ao excesso de umidade, isso porque a maioria das espécies do gênero passa por um período anual de estresse hídrico (seis meses em média). Nesse período de estiagem, as espécies de hábito paludícula permanecem enterradas esperando a próxima chuva para vegetar, uma vez que elas crescem em substrato permanentemente encharcado (Dressler, 1990).

2.3 A ESPÉCIE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f.

Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f é uma espécie epífita típica da região Centro-Oeste, especialmente distribuída no Planalto Central brasileiro, com ampla distribuição geográfica no Brasil. Geralmente é encontrada na metade superior de troncos de palmeiras do gênero Acrocomia (macaúba) formando grandes touceiras de raízes pneumatóforas que abrigam uma grande diversidade de organismos (Menezes, 2000). Troncos de palmeiras oferecem boas condições para a germinação e desenvolvimento dessa espécie e de outras orquídeas epífitas (Figura 2.1a).

Figura 2.1 Plantas de Cyrtopodium saintlegerianum fixadas em troncos de palmeira (macaúba) (A). Folhas e raízes pneumatóforas e pseudobulbos em período chuvoso (B).

Apresenta pseudobulbos fusiformes que podem atingir até 70 cm de altura (Figura 2.1b). A floração ocorre na estação seca, com início em julho e vai até o final de agosto. A inflorescência é paniculada, vistosa e ramificada geralmente maiores que as folhas, as flores tem em média 4,5 cm de diâmetro. As sépalas são amarelo esverdeadas com manchas fortes de tom marrom avermelhadas e as pétalas amarelas com pontos minúsculos da mesma cor das 25

sépalas. As cápsulas têm em média 10 a 13 cm e maturam aproximadamente com onze a doze meses (Menezes, 2000) (Figura 2.2). O crescimento é simpodial, ou seja, crescem lateralmente de gemas em sua base, o caule principal cessa seu desenvolvimento no fim de cada estação e novos pseudobulbos surgem de gemas axilares e crescerão até a maturidade (Menezes, 2000). Pela beleza e porte de sua inflorescência tornou-se de interesse em programas de domesticação e melhoramento vegetal.

Figura 2.2 Orquídea Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. epífita, apresentando inflorescência paniculada e ramificada (A). Flor (B) e cápsula (C). Barras = 1 cm.

2.4 PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ORQUÍDEAS

2.4.1 Cultura de tecidos vegetais

A cultura de tecidos vegetais pode ser definida como a cultura de células vegetais isoladas in vitro. Pode também ser chamada de multiplicação de plantas in vitro. Tem início a partir de sementes ou pequenos pedaços de tecidos 26

vegetais, denominados explantes. Após assepsia, os explantes são introduzidos em recipientes estéreis, sobre um meio sólido ou líquido contendo nutrientes e reguladores de crescimento, necessários ao estabelecimento, multiplicação, proliferação e desenvolvimento de brotos. Ao serem retirados do meio in vitro, os brotos desenvolvidos são aclimatizados em substratos especiais, sob luminosidade controlada, formando mudas destinadas às condições de cultivo. Esta tecnologia produz mudas matrizes de alta qualidade, vigor e sanidade (Ferreira et al., 1998; Souza et al., 2006). As condições da cultura in vitro são essenciais para que haja um bom crescimento vegetativo, além de taxa de multiplicação adequada. Os meios nutritivos são responsáveis por fornecer os sais minerais macro e micronutrientes, quantidades mínimas de nitrogênio, fontes de carbono (sacarose), vitaminas e reguladores de crescimento necessários para manter a divisão celular e a proliferação de explantes (Pasqual, 2001). A associação desses componentes e as condições ideais da cultura como fotoperíodo e temperatura em um frasco formam a tecnologia da cultura de tecidos vegetais (Kerbauy, 1995). Vários meios têm sido testados para diversas finalidades e objetivos, sendo um meio especifico identificado quanto a composição de sais minerais na proporção de macro e micronutrientes, vitaminas, reguladores de crescimento e suplementos orgânicos que variam em concentração (Da Silva, 2003). No processo histórico de desenvolvimento dos meios de cultura, muitas substâncias orgânicas foram acrescidas ao meio como água de coco, poupa de tomate, poupa de batata entre outros complexos. O Brasil foi o primeiro país a utilizar polpa de banana para a germinação de orquídeas com sucesso, contudo seus efeitos na cultura são muito discutidos entre vários pesquisadores (Arditti, 2008). O sucesso dessa técnica de cultura de tecidos vegetais foi consolidada como setor estratégico e crucial do conhecimento científico e tecnológico, contribuindo para a solução de importantes problemas na agricultura como a produção de muitas cultivares agronomicamente importantes em larga escala (Fontes, 2000). A micropropagação é uma das técnicas de cultura de tecidos vegetais de maior impacto na agricultura. É um meio de desenvolver células, tecidos ou órgãos vegetais sob condições controladas de temperatura, fotoperíodo e umidade, 27

e tem o potencial de produzir grande número de plantas livres de patógenos em curto período de tempo (Souza et al., 2006). A propagação in vitro de plantas tem atraído pesquisadores desde o inicio do século. Segundo Yam & Arditti (2009) o pesquisador Haberlandt em 1902 foi o primeiro a cultivar células de tecido somático de várias espécies de plantas em solução nutritiva. Knudson, por sua vez com seu grande interesse em orquídeas, em 1922 cultivou embriões na ausência de micorriza e observou a importância da sacarose para o crescimento e desenvolvimento desses embriões in vitro (Torres et al.,1998). Morel & Martin em 1952 recuperaram plantas de dália livres de vírus do mosaico por meio de cultura de ápices caulinares. Em 1960, Morel, repetindo experimentos com orquídeas, empregou erroneamente o termo “meristema” para se referir ao ápice caulinar, e por muito tempo pesquisadores empregaram o termo erroneamente. Importante técnica empregada no melhoramento foi descoberta por Cocking em 1960. O método consistia no isolamento de protoplastos de plantas por meio de enzimas de degradação da parede celular, o que permitia a obtenção de híbridos interespecíficos e intergenéricos, bem como a utilização deste sistema na engenharia genética (Torres et al., 1998).

2.4.2 Reguladores de Crescimento

Reguladores de crescimento são moléculas sintéticas que em pequenas concentrações, promovem, inibem ou modificam processos fisiológicos (Raven et al., 1999). O equivalente natural destas moléculas são os denominados hormônios vegetais que são biomoléculas produzidas pela planta que, em concentrações muito baixas, promovem respostas bioquímicas, fisiológicas e/ou morfológicas como: indução de raízes, brotos, alongamento de entrenós, divisão celular, entre outras respostas (Cid & Teixeira, 2010). A composição e concentração destes reguladores no meio de cultura são determinantes no padrão de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultivo in vitro (Caldas et al., 1998).

2.4.2.1 Auxinas 28

As auxinas foram os primeiros hormônios vegetais a serem descobertos. No final do século XIX Darwin em seus estudos sobre os movimentos das plantas contribuíram para a descoberta das auxinas, no estudo da curvatura de plântulas de gramíneas em resposta a iluminação unilateral fenômeno conhecido como fototropismo (Mercier, 2004). O termo foi assim denominado a partir de uma palavra grega que significa crescer, para descrever compostos naturais e sintéticos que apresentam uma atividade similar ao ácido indol acético (AIA), o primeiro hormônio natural isolado de plantas (Cid, 2005). A auxina natural mais abundante é o AIA. Entretanto, dependendo da espécie da planta, estação do ano, e as condições sob as quais as plantas se desenvolvem, outras auxinas naturais são encontradas como um análogo clorado do AIA, por exemplo o ácido fenilacético e o acido indolil-3-butírico (AIB). As auxinas sintetizadas em laboratório que causam respostas fisiológicas comuns ao AIA são: ácido α-naftalacético (ANA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4 D), ácido 4-amino-3,5,5-tricloropicolínico (picloram) (Mercier, 2004). As concentrações mais utilizadas nos meios de cultivo in vitro variam de 0,01 a 10 mg L-1 (Torres et al., 1998). Auxinas são substâncias essenciais no cultivo de plantas. Promovem modificações plásticas na parede celular vegetal durante o processo de divisão celular, permitindo a extensibilidade da célula. Promovem várias respostas fisiológicas quando utilizadas na indução de raízes, folhas, gemas axilares ou apicais, embriões e calos. Além de ter papel fundamental nas aplicações comerciais e agronômicas como a iniciação de raízes em estacas caulinares pelos reguladores ANA e AIB (Rodrigues & Leite, 2004; Cid, 2005). O transporte de auxinas é fundamental no desenvolvimento dos vegetais, agindo como um fator determinante nos movimentos trópicos, na divisão das células, diferenciação vascular, dominância apical, senescência e abscisão. São transportadas polarmente, ou seja, unidirecionalmente do ápice a base da planta, além do transporte apolar através do floema para as demais partes da planta (Mercier, 2004). 29

Faria et al. citado por Sorace et al. (2007) trabalhando com aclimatização de Dendrobium nobile observou que a auxina, ácido naftalenoacético (ANA), proporcionou melhor desenvolvimento de raízes e crescimento vegetativo do que ácido indol-acético (AIA) e o ácido indol-butírico (AIB). Assim como na aclimatização de Oncidium baueri o ácido naftalenoacético na concentração de 200 mg L-1 foi mais eficiente no enraizamento e desenvolvimento vegetativo das plântulas (Sorace et al., 2007) Na cultura de tecidos as auxinas são frequentemente utilizadas na indução de calos a partir de explantes e no enraizamento a partir de brotos. (Kerbauy, 1984a; 1984b) trabalhando com Oncidium varicosum, conseguiu regenerar um grande número de plantas a partir de ápices radiciais. Souto et al. (2010) mostraram que em Cattleya bicolor a ausência de ANA foi significativa na inibição do alongamento radical e concentrações mais elevadas de ANA (2 mg L-1) foram importantes para o crescimento desse órgão.

2.4.2.2 Citocininas

A primeira citocinina descoberta foi a chamada cinetina, através de estudos de Skoog & Miller (1957) sobre as substâncias promotoras da divisão celular. Os autores constataram que somente a auxina AIA não promovia esse processo (citado por Cid, 2005). Em 1964, Letham isolou citocinina natural a partir de endosperma imaturo de sementes do milho, passando depois, a ser chamada de zeatina (citado por Rodrigues & Leite, 2004) As citocininas têm seu nome derivado da função em promover a divisão celular ou citocinese e sua origem está relacionada com a adenina (Peres & Kerbauy, 2004). Entre as citocininas sintéticas destacam-se a cinetina (6-furfurilaminopurina) e o 6-benzilaminopurina (BAP). O Thidiazuron (TDZ), derivado da uréia, também pode agir como citocinina na indução de brotos adventícios (Cid, 2010). As citocininas tem papel fundamental na etapa de regeneração de calos, multiplicação de gemas axilares e apicais, podem também ser utilizadas na indução de brotos, bem como na quebra de dominância apical e indução na formação de gemas axilares (Peres & Kerbauy, 2004; Rodrigues & Leite, 2004). 30

As citocininas são sintetizadas principalmente nos pontos de crescimento do sistema radicular, como o BAP que induz a formação de brotações aumentando a taxa de multiplicação em várias espécies de plantas (Grattapaglia & Machado, 1998). BAP também é eficiente na multiplicação de partes aéreas e indução de gemas adventícias. É a citocinina mais aplicada na cultura de tecidos vegetais seguida pela cinetina (Cid, 2010). Cid (2000) enfatiza que concentrações altas de citocinina podem aumentar a ação da citocinina-oxidase, inibindo a divisão celular e logo, impedindo a indução de brotações. Desse modo, o efeito tóxico caracteriza-se pelo excessivo ou baixo crescimento da planta, redução no tamanho das folhas, aspecto de hiperhidricidade dos tecidos levando a sérios problemas na fase de enraizamento (Leshen et al., 1988). Conciliar o balanço entre os reguladores de crescimento auxina/citocinina é de suma importância na indução de caules e raízes para o desenvolvimento integrado da planta (Peres & Kerbauy, 2004).

2.4.3 Germinação assimbiótica

2.4.3.1 Teste de viabilidade de sementes

A germinação de sementes de orquídeas ocorre quando o embrião incha, rompe o tegumento e uma esfera esverdeada é formada (Arditti, 1967). No entanto, o embrião é ainda indiferenciado, havendo muitas vezes interrupção do desenvolvimento do protocormo, por vários motivos. Não sendo, portanto, indicador confiável de crescimento e desenvolvimento subsequente (Johnson & Kane, 2007). Um método rotineiro para determinar a qualidade das sementes é germinando-as. Embora útil, esse processo não informa o vigor, longevidade e emergência em campo (Mcdonald, 1998). Além disso, há necessidade de um prazo grande de até 28 dias para informar os resultados da germinação, período considerado longo, para atender aos interesses comerciais dos produtores de sementes, por exemplo. Em função destas premissas, a agricultura moderna recomenda testes complementares, confiáveis, reproduzíveis e rápidos. A rapidez 31

na avaliação da qualidade das sementes permite antecipar operações como colheita, recepção, beneficiamento e comercialização, diminuindo riscos e prejuízos. Por isto, alguns testes rápidos são justificáveis para a avaliação da qualidade física e fisiológica das sementes (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2009). O teste de tetrazólio (Tz ou TTC) é rápido e de grande importância para a avaliação da qualidade das sementes, pois, além da viabilidade, o mesmo pode informar sobre o vigor e identificar diversos problemas que afetam o desempenho das sementes (Mcdonald, 1998). O teste reflete a atividade das enzimas desidrogenases, envolvidas no processo de respiração. Pela hidrogenação do 2-3-5-trifenil cloreto de tetrazólio é produzida nas células vivas uma substância vermelha, estável e não difusível, o trifenil formazan (Moore, 1972). Isto torna possível distinguir as partes vivas, coloridas de vermelho, daquelas mortas que mantêm a sua cor (Oliveira et al., 2005). O teste de viabilidade de sementes seguindo a coloração dos embriões de orquídeas tem finalidade de determinar a percentagem de sementes com embriões viáveis, sendo esse um importante passo na conservação de orquídeas e propagação in vitro (Pritchard & Prendergast, 1990). As orquídeas têm sementes diminutas medindo de 0,250 a 1.2 mm e pesam entre 0,3 a 14 μg, e são desprovidas de endosperma. Assim, normalmente a durabilidade da semente fora do fruto é variável ou quase nula (Arditti, 1967). Dessa forma, o tetrazólio é essencial para testar a viabilidade e o vigor das sementes. Entretanto, o teste se mostrou muitas vezes inconsistente quanto a sua eficácia. (Mweetwa et al., 2008) testaram sementes de Phalaenopsis pelo teste de TTC de cápsulas colhidas aos 90, 105 e 120 dias. Segundo o teste de viabilidade de sementes da cápsula aos 90 dias, 41% das sementes eram viáveis, da cápsula de 120 dias 65% estavam viáveis, no entanto, a porcentagem de germinação in vitro foi de 0 e 2,8%, contrariando o teste de tetrazólio.

2.4.3.2 Germinação assimbiótica de orquídeas

O primeiro método para propagação de orquídeas foi descrito por Moore (1849), que espalhava sementes de orquídeas na base das raízes de orquídeas adultas. Este método foi uma mudança importante e radical da maneira 32

de germinar sementes de orquídeas que era utilizada há mais de 160 anos (Yan & Arditti, 2009). Meio século depois da descoberta de Moore, Noel Bernard em 1899 formulou um método em que sementes de orquídeas germinavam pelo método simbiótico in vitro, foi provavelmente o primeiro método de germinação de plantas in vitro. Ele também previu que um dia surgiriam muitos produtores e laboratórios de orquídeas. Sendo esse o caso no presente não apenas para as orquídeas, mas também para outras plantas (Yan & Arditti, 2009). Lewis Knudson (1921, 1922) formulou o método de germinação assimbiótica de sementes de orquídeas e foi o primeiro procedimento prático para a propagação in vitro de qualquer planta em cultura axênica. Seu método era uma inovação tecnológica significativa e conceitual que prenunciava a biotecnologia moderna (Yan & Arditti, 2009). Em vista da descoberta de Knudson, estudos posteriores possibilitaram a propagação vegetativa in vitro de orquídeas como Rotor (1949), Morel (1960, 1964, 1969) e Reinert & Mohr (1967) todos exemplos de pesquisadores que tiveram êxito no cultivo in vitro desse grupo (Yam & Arditti, 2009). A micropropagação de orquídeas surgiu como alternativa para a propagação via sementes que, na natureza, é quase nula (Arditti, 1967) e na propagação vegetativa é muito demorada (Arditti, 1992) . Outras técnicas de cultura de tecidos in vitro para orquídeas tem sido enpregadas na fisiologia vegetal, nutrição mineral, criopreservação, propagação clonal e melhoramento genético, entre outros estudos (Arditti, 2008). Vários tipos de explantes podem ser utilizados na micropropagação in vitro de orquídeas, as sementes por sua vez, são utilizadas principalmente por apresentarem grande potencial regenerativo e morfogenético, tornando-se fenotipicamente semelhante à matriz a qual foi coletada (Arditti, 1967). Os meios nutritivos foram empregados na cultura de tecidos vegetais para atender as exigências das plantas, com modificações para suprir a necessidades especificas in vitro (Caldas et al., 1998). Knudson, em 1946 aperfeiçoou o meio de cultura de acordo com as exigências nutricionais específicas, sendo, portanto o meio mais utilizado na germinação e desenvolvimento de orquídeas. A partir dele novas modificações nos 33

meios de cultivo foram apresentadas com objetivos e respostas diferentes para muitos outros gêneros e espécies de orquídeas (Arditti, 1992). Nas formulações básicas dos meios de cultura mais utilizados como: o meio KC (Knudson, 1946); MS (Murashige & Skoog, 1962); VW (Vacin & Went, 1949) e White (White, 1943) vários compostos são adicionados para suprir as necessidades metabólicas, energéticas e estruturais da célula. A maioria dos meios nutritivos é composta por macro e micronutrientes minerais, vitaminas, açúcares, reguladores de crescimento, além de compostos orgânicos, tendo em vista que as constituições químicas são conhecidas e suas concentrações podem ser previamente determinadas. Algumas formulações específicas são descritas para a germinação de espécies do gênero Cyrtopodium. Dutra et al. (2008) relatou que altas porcentagens de germinação de C. punctatum foram obtidas no meio comercial específico para orquídeas PhytoTechnology com 20% de sacarose e concentração de mais sais que o meio Knudson C (1946). Assim como, Nunes (2009) na germinação assimbiótica de C. eugenii, testou vários meios de cultivo obtendo sucesso apenas no meio MS com metade da concentração de macronutrientes.

2.5 CITOGENÉTICA DE ORQUÍDEAS

A taxonomia clássica baseia-se, em geral, apenas em características morfológicas, as quais são fundamentais para analisar a biodiversidade. Contudo, os dados adquiridos pela citogenética têm contribuído de forma excepcional e decisiva na reformulação de hipóteses filogenéticas com base nas informações dos cromossomos, sendo esse um caractere bem conservado nas espécies (Heslop- Harrison, 2000). Informações citogenéticas também são de fundamental importância para o melhoramento genético e na caracterização do germoplasmas (Brasileiro-Vidal e Guerra, 2002). O estudo da genética por meio da citogenética engloba todo e qualquer estudo relacionado com o cromossomo, isolado ou em conjunto, condensado ou distendido, tanto no que diz respeito a sua morfologia, organização, função e replicação, quanto a sua variação e evolução (Guerra, 1988). 34

A caracterização cromossômica foi baseada por muitos anos em parâmetros morfológicos, como o tamanho dos braços, posição dos centrômeros e localização das constrições secundárias. Ao longo do tempo aplicações e técnicas na citogenética, como o bandeamento, foram implantadas a fim de permitir a visualização de blocos de coloração diferenciada (bandas) e melhorar a caracterização cromossômica significativamente (Brasileiro-Vidal e Guerra, 2002). Novas técnicas em citologia tem sido empregadas possibilitado uma análise mais detalhada dos cariótipos a partir de dados citomoleculares, como os bandeamentos com fluorocromos 4’-6’ diamidino-2-fenilindol (DAPI), que destaca regiões heterocromáticas ricas em bases AT, e acromomicina A3 (CMA3), que tem afinidade por regiões heterocromáticas ricas em bases GC. A aplicação destes fluorocromos associada à distamicina-A (DA), que é um contrastante negativo, favorece a distinção das bandas. Os relatos mais recentes de análise de cromatina com auxílio de fluorocromos indicam que em diversos grupos vegetais a heterocromatina constitutiva é rica em AT (Nakamura et al., 2001; Besendorfer et al., 2002). Outra técnica empregada na citogenética e relacionada ao desenvolvimento da biologia molecular foi a hibridização fluorescente in situ ou FISH (Pedrosa et al., 2002). Esta técnica têm permitido um detalhamento minucioso dos cariótipos, admitindo o reconhecimento de pequenas variações cromossômicas, difíceis de serem detectadas com técnicas convencionais. Chatterji, citado por Than et al. (2011) considera difícil a obtenção de cariótipo em orquídeas, devido principalmente a morfologia da raiz (coberta por tecido chamado velame) e frequência de divisões muito baixa. Dessa forma, observa-se poucos estudos relacionados a dados cromossômicos da grande família Orchidaceae. Embora, o número cromossômico forneça informações indispensáveis como a filogenética entre as espécies (Semple et al., 1989). Assim, a evolução cromossômica dentro dessa família permanece inconclusiva (Daviña et al., 2009). Alguns cariótipos de orquídeas já foram descritos e observa-se que ocorre uma grande variação no número cromossômico. Daviña et al. (2009) analisaram 43 espécies pertencentes a 28 gêneros de orquídeas argentinas com grande variação no número cromossômico com 2n = 28 a 2n=108. 35

Pouco se conhece o número cromossômico da subtribo Cyrtopodiinae, o que tem dificultado a interpretação das relações taxonômicas e filogenéticas entre diferentes gêneros e entre espécies de grandes gêneros (Félix & Guerra, 2000). Sobre o gênero Cyrtopodium apenas onze das cinquenta espécies existentes (Romero-González et al., 2008) foram citologicamente analisadas. Diferentemente do que apresentam Daviña et al. (2009) pouca variação dos números cromossômicos, podem ser sugeridos para o gênero Cyrtopodium. Até o momento, apenas dois números básicos de x=22 e x=23, para as espécies Cyrtopodium hatschbachii, Cyrtopodium palmifrons, Cyrtopodium blanchetii Rchb. f., Cyrtopodium gigas (Vell.) Hoehne, Cyrtopodium inaldianum L.C. Menezes, Cyrtopodium intermedium Brade, Cyrtopodium. paranaense Schltr., Cyrtopodium eugenii Rchb. f., Cyrtopodium andessonii e Cyrtopodium. punctatum (Surenciski et al., 2007). Dados obtidos com a coloração convencional têm permitido um entendimento de alterações numéricas e estruturais na evolução cariotípica também no gênero Habenaria (Felix & Guerra, 1998) e no reconhecimento do número básico na subtribo Oncidinae (Felix & Guerra, 2000).

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3 MICROPROPAGAÇÃO DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)

RESUMO

O Cerrado é considerado um dos hostspots para conservação da biodiversidade mundial. Porém, devido a expansão agrícola, muitos organismos tem entrado em declínio e as orquídeas correspondem a 10% de toda flora predisposta a esse risco. Orquídeas adaptaram-se aos mais variados ambientes e com peculiaridades singulares como a germinação que ocorre a partir de um processo simbiótico com fungos micorrízicos. Esse processo é lento e poucas sementes são germinadas. Assim, devido a alta complexidade em se obter mudas de orquídeas via sementes ou propagação vegetativa, a cultura de tecidos vegetais tornou-se importante alternativa para acelerar o desenvolvimento da germinação produzindo mudas sadias em curto espaço e tempo. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer o cultivo in vitro da espécie Cyrtopodium saintlegerianum Rchb.f . Esta orquídea é típica da região Centro-Oeste, mas apresenta ampla distribuição geográfica no Brasil. É epífita e de grande interesse ornamental pela grande inflorescência paniculada com dezenas de flores. Foram testados a viabilidade das sementes obtidas para a germinação via teste de tetrazólio, protocolos para melhor germinação das sementes, o efeito dos reguladores de crescimento BAP e ANA no desenvolvimento de protocormos gerados a partir de sementes e o melhor substrato e adubação na aclimatização de mudas para os primeiros meses de estabelecimento ex vitro. O material vegetal foi coletado no município de Mossâmedes, GO. Cápsulas foram previamente desifestadas e testadas em corante tetrazólio a 1%. Para o cultivo assimbiótico foram testados diferentes meios de culturas e diferentes concentrações de BAP/ANA, para finalmente avaliar a aclimatização em substratos combinados e adubados com adubo químico e orgânico. Resultados da germinação mostraram-se satisfatórios em todos os meios de cultura. As melhores concentrações para a variável altura foram 0,2 mg L-1 de ANA sem adição de BAP e o controle sem adição de reguladores. Os melhores meios que induziram grande número de brotações foram 4 mg L-1 de BAP e 4 mg L-1 de BAP / 0,2 mg L-1 de ANA. O maior número de folhas foi obtido nas concentrações de BAP sem ANA nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 mg L-1. Os tratamentos com maior número de raízes foram o controle sem adição de reguladores de crescimento nas dosagens de 0,2, 0,5, 1,0 mg L-1 de ANA sem adição de BAP, assim como o comprimento da maior raiz foi favorecido pelos mesmos tratamentos. O maior número de calos se deu no tratamento com concentrações de 1,0 BAP mg L-1 sem adição de ANA.

Palavras-chave: orquídeas, germinação assimbiótica, cultura de tecidos 44

ABSTRACT MICROPROPAGATION OF Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)

The Cerrado is considered one of hostspots for global biodiversity conservation due to agricultural expansion many organisms has gone into decline and orchids account for 10% of the entire flora prone to this risk. Orchids adapted to the most varied environments and peculiarities germination as natural occurring aa from a symbiotic process with mycorrhizal fungi. This process is slow and few seeds are germinated. Thus, due to the high complexity of obtaining seedlings orchids via seeds or vegetative propagation using conventional propagation of plants, plant tissue culture is an important alternative to accelerate the development of healthy seedlings germinating producing short space and time. This study aimed to establish the in vitro cultivation of the species Cyrtopodium saintlegerianum Rchb.f. This is a typical orchid of the Midwest but it has wide distribution in Brazil. It is epiphytic and of great interest for ornamental purpose due its large paniculate inflorescences with dozens of flowers. We tested the seeds viability for germination via tetrazolium test, protocols for better seed germination, the effect of growth regulators BAP and NAA in protocorms developing generated from better seeds and fertilizer, substrate and the acclimatization sets for seedlings in the first months of establishment ex vitro. The plant material was collected in municipality of Mossâmedes, GO. The capsules were then were sterelized of the seeds were separated and tested in a 1% tetrazolium dye. For cultivation was tested asymbiotic different culture media and then tested after different concentrations and combinations in treatments BAP 16 / ANA, to finally evaluate the acclimatization substrates combined and fertilized with chemical fertilizers and organic. The results of germination was satisfactory in all culture media. For medium supplemented with auxin / cytokinin combined the best concentrations for variable height were 0.2, 0.5, 1.0 mg L-1 NAA and BAP without adding control without addition of regulators. The best means to induce large numbers of shoots were 4 mg L-1 BAP and 4 mg L-1 BAP / 0.2 mg L-1 NAA. The number of leaves was rated best in the concentrations of BAP without NAA at concentrations of 1.0, 2.0 and 4.0 mg L-1. The treatments with the highest number of roots were control without added growth regulators at doses of 0.2, 0.5, 1.0 mg L-1 NAA without addition of BAP, as well as the length of roots was favored by the same treatments. The largest number occurred in callus treatment with concentrations of 1.0 mg L-1 BAP without adding ANA.

Key words: orchids, asymbiotic germination, tissue culture

3.1 INTRODUÇÃO

Quanto à fequência e a diversidade da família Orchidaceae, o Cerrado sempre foi considerado como centro secundário de espécies (Batista & Bianchetti, 2005). Segundo Barros et al. (2012), o Cerrado tem cerca de 682 espécies de orquídeas (23%) e aparece na 45

terceira posição em relação ao número total de espécies, atrás da Mata Atlântica com 1421 e Amazônia com 765 espécies. Dentre as espécies de orquídeas encontradas no Cerrado, o gênero Cyrtopodium Rchb.f compreende 50 espécies de origem neotropical distribuídas do sul da Florida até o norte da Argentina (Romero-González et al., 2008). O centro de diversidade do gênero é o Cerrado brasileiro, onde ocorrem pelo menos 28 espécies deste gênero (Batista & Bianchetti, 2005). A espécie Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. apresenta grande inflorescência paniculada e flores de 4,5 cm de diâmetro. Tem ampla distribuição geográfica no Brasil, sendo uma espécie típica da região Centro-Oeste (Menezes, 2000). Possui hábito epífito e, em áreas de cerrado, espécies de palmeiras como as do gênero Acrocomia (macaúba) oferecem boas condições para a germinação e desenvolvimento desta espécie e de outras orquídeas epífitas. Nos últimos 50 anos, organismos e ecossistemas tornaram-se cada vez mais vulneráveis à extinção e orquídeas correspondem a 10% de toda flora predisposta a esse risco (Koopowitz et al., 2003). Alterações dos ambientes naturais causadas pela ação antrópica levam ao declínio das poluções de diversas espécies de orquídeas e dos fungos micorrízicos que são fundamentais para a germinação e desenvolvimento inicial destas espécies em ambiente natural (Swarts & Dixon, 2009). Técnicas de cultura de tecidos vegetais são empregadas principalmente na produção de plantas em larga escala, as quais permitem multiplicar genótipos superiores isentos de vírus e outros patógenos em curto espaço de tempo (Souza et al., 2006). Tem sido amplamente aplicada na propagação de orquídeas, garantido a preservação de muitas espécies e atendendo a demanda do mercado de plantas ornamentais (Faria, et al., 2012). Alguns pesquisadores têm obtido sucesso em protocolos de germinação e desenvolvimento de espécies do gênero Cyrtopodium como: C. palmifrons Rchb.f. & Warm. (Araújo et al., 1999), C. cristatum Lindl. (Caramaschi & Caldas, 1999), C. paranaensis Schlt. (Rego-Oliveira & Faria, 2005), C. punctatum (L.) Lindl. (Dutra et al., 2009), C. eugenii Rchb.f. & Warm. (Nunes, 2009) e C. glutiniferum Raddi (Vogel & Macedo, 2011). Considerando o grande potencial ornamental da espécie C. saintlegerianum, e visando o início de um processo de domesticação e melhoramento da espécie, este trabalho teve como objetivos o estabelecimento de protocolos para 46

germinação assimbiótica, desenvolvimento in vitro com a utilização de fitoreguladores, garantindo mudas de alta qualidade.

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás. Em agosto de 2010, frutos de C. saintlegerianum foram coletados de uma população localizada no município de Mossâmedes, GO (Latitude 16o 07.666' Sul e Longitude 050o 10.044' Oeste). As cápsulas estavam em fase de maturação com aproximadamente onze meses, apresentando coloração verde amarelado, e textura macia. Em seguida, as cápsulas foram conduzidas ao LCTV, pesadas e a de maior peso foi selecionada para a retirada de sementes para a germinação assimbiótica in vitro. Após a seleção, foram lavadas em água corrente e detergente líquido neutro retirando a primeira camada de sujeira vinda de campo. Posteriormente, foram desinfestadas por um minuto em solução contendo álcool 70%, em câmara de fluxo laminar, 15 minutos com hipoclorito de sódio comercial (2,5% de cloro ativo) e lavadas por três vezes consecutivas em água destilada autoclavada.

3.2.1 Teste de viabilidade das sementes

Em câmara de fluxo laminar, a cápsula previamente desinfestada foi cortada longitudinalmente com bisturi e com auxílio de uma pinça. Uma das metades da cápsula foi retirada e uma amostra de sementes foi retirada para a realização do teste de viabilidade das sementes. Esta primeira amostra foi dividida em duas amostras de 0,001 g e transferidas para tubos de ensaio. A parte restante das sementes foi destinada a germinação assimbiótica in vitro. A viabilidade das sementes foi testada utilizando solução a 1% de cloreto de 2,

3, 5 trifenil tetrazólio (TTC) composta por 1,815 g de KH2PO4, 2,275 g de Na2HPO4 e 2 g de TTC dissolvidos em 200 mL de água destilada (adaptado por Alvarez-Pardo & Ferreira, 2006). As sementes foram imersas em solução de TTC e mantidas na ausência de luz. O delineamento experimental consistiu em dois tratamentos e quatro repetições: T1: 0,001 g de sementes imersas em tubos de ensaio na solução TTC 1% por 12 47

horas; T2: 0,001 g de sementes imersas no TTC por 24 horas, os tratamentos foram mantidos a temperatura de 30º C em banho-maria. Com auxílio de um microscópio estereoscópico realizou-se a contagem das sementes, considerando-se viáveis sementes com embriões corados de cores laranja a vermelho (Lauzer et al., 1994). A porcentagem de sementes viáveis em cada amostra foi submetida à transformação de arcseno da raiz quadrada. A média dos valores transformados para cada tratamento foi submetida ao teste t de Student (Zar, 1999).

3.2.2 Germinação assimbiótica in vitro

Os meios de cultura para germinação assimbiótica de sementes de orquídeas foram avaliados quanto à sua eficácia na promoção da germinação e desenvolvimento subsequente de protocormos de sementes de C. saintlegerianum. Os meios de cultura utilizados foram o meio MS completo (Murashige & Skoog, 1962), o MS com redução da metade da concentração dos macronutrientes (MS½), meio KC (Knudson, 1946) e meio KC modificado (Arditti et al., 1977) (ANEXO). O pH foi ajustado para 5,7-5,8, a solidificação dos meios foi feita com 0,6 % de ágar e os meios foram autoclavados à temperatura de 120º C, por vinte minutos. Após a autoclavagem, em câmara de fluxo laminar foram distribuídos 20 mL de meio em placas de Petri. Após o resfriamento, todas as placas foram vedadas com uma camada de filme plástico PVC. Após a desinfestação da cápsula, e em câmara de fluxo laminar, aproximadamente 200 a 300 sementes foram retiradas e distribuídas uniformemente com uma espátula em cada placa. Após a semeadura, as placas permaneceram em sala de crescimento, em condições de 16 horas de luz, intensidade luminosa de 35 µmol m-2 s-1 e temperatura de 24°C ± 2°C. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com quatro tratamentos e dez repetições. O processo de germinação das sementes de orquídeas teve início com a ruptura do tegumento do embrião e a formação de estruturas esféricas clorofiladas denominadas protocormos (Arditti, 1967). Aos diferentes estádios de germinação e desenvolvimento das sementes foram atribuídas uma escala de 0 – 6 (Stewart et al., 2003) (Tabela 3.1). Foram avaliados a porcentagem de germinação de cada tratamento, dividindo o número total de sementes inoculadas pelo número de sementes 48

germinadas em todas as repetições por tratamento. A avaliação do número de protocormos obtidos nos quatro tratamentos foi feita semanalmente, durante 15 semanas. Os dados referentes ao número de protocormos obtidos por placa e por meio foram submetidos à análise de variância. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de significância.

Tabela 3.1 Escala de estádios de diferenciação de plântulas de Cyrtopodium saintlegerianum germinadas in vitro (Stewart et a., 2003). Estádio Descrição 0 Tegumento intacto, sem germinação 1 Embrião intumescido (= germinação) 2 Ruptura do tegumento, presença de rizóides 3 Aparecimento do protomeristema 4 Emergência da primeira folha 5 Elongação da primeira folha e desenvolvimento 6 Emergência da segunda folha

3.2.3 Desenvolvimento de protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum

Nessa etapa, objetivou-se avaliar as influências das concentrações de reguladores de crescimento no desenvolvimento e multiplicação de novas plântulas de C. saintlegerianum a partir de protocormos na fase 3 a 5 (Figura 3.1). Os protocormos inoculados tiveram média de tamanho e peso de 2,72 cm e 0,015 g respectivamente. O meio de cultura utilizado para inoculação dos protocormos foi o KC modificado (Arditti, 1977) suplementado com reguladores de crescimento. Foram testados 16 tratamentos utilizando como auxina o ácido naftalenacético (ANA) e como citocinina 6- benzilaminopurina (BAP) combinadas ou não (Tabela 3.2). A solidificação dos meios foi feita com 0,6 % de ágar, o pH foi ajustado para 5,8±0,1 antes da adição do ágar e distribuídos 20 mL de meio de cultura por tubo de ensaio e autoclavados à temperatura de 120°C, por vinte minutos. O experimento foi mantido em sala de crescimento com fotoperiodo de 16 horas de luz, intensidade luminosa de 35 µmol m-2 s-1 e temperatura de 24°C ± 2°C.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 16 tratamentos e 40 repetições. Após 90 dias, foram avaliadas as seguintes variáveis: número de brotações (NB), número de folhas (NF), número de raízes (NF), comprimento da maior raiz (CR), altura (A) e número de calos (C). Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de significância.

Tabela 3.2 Concentrações dos reguladores de crescimento ANA (Ácido naftalenoacético) e BAP (6-Benzilaminopurina) nos tratamentos utilizando o meio KC modificado (Arditti, 1977) para a diferenciação dos protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum. Tratamentos ANA (mg L-1) BAP (mg L-1) T1 0.00 0.00 T2 0.00 1.00 T3 0.00 2.00 T4 0.00 4.00 T5 0.20 0.00 T6 0.20 1.00 T7 0.20 2.00 T8 0.20 4.00 T9 0.50 0.00 T10 0.50 1.00 T11 0.50 2.00 T12 0.50 4.00 T13 1.00 0.00 T14 1.00 1.00 T15 1.00 2.00 T16 1.00 4.00 50

3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.3.1 Teste de viabilidade das sementes

A viabilidade das sementes de cada amostra foi 75% para o tratamento T1 e 90% para o tratamento T2. No total, foram avaliadas 445 sementes. Os tratamentos de coloração para viabilidade não diferiram (t = 1,73; p = 0,133), ou seja, não houve diferenças significativas na porcentagem média de embriões corados observados entre os dois tratamentos (Figura 3.2). O TTC há muito tempo é utilizado para testar a viabilidade das sementes de orquídeas pela coloração do embrião (sendo viáveis embriões corados de cores laranja a vermelho) (Pritchard, 1985). No entanto, ocorrem grandes discrepâncias entre a germinação e viabilidade do embrião em sementes de várias espécies, o qual pode ser devido a diferenças na permeabilidade do tegumento de cada espécie (Kauth et al., 2011).

Figura 3.2 Sementes de Cyrtopodium saintlegerianum submetidas ao teste de tetrazólio (TTC). A - sementes no tratamento T1 (12 h imersas no TTC); B - sementes no tratamento T2 (24 h imersas no TTC).

Jonhson & Kane (2007) testando a viabilidade de sementes de híbridos de Vanda com TTC, observaram que a taxa de embriões viáveis foi consideravelmente maior que a de embriões germinados in vitro. (Mweetwa et al., 2008) testaram sementes de Phalaenopsis pelo teste de TTC de cápsulas colhidas aos 90, 105 e 120 dias. Segundo o teste de viabilidade de sementes da cápsula de 90 dias, 41% das sementes eram viáveis e 51

para a cápsula de 120 dias, encontraram 65% de viabilidade. No entanto, a porcentagem de germinação in vitro foi de 0 (cápsula de 90 dias) e 2,8% (cápsula de 120 dias), contrariando o teste de tetrazólio. Alguns pesquisadores relatam que os resultados do teste TTC devem ser interpretados com cautela, pois a viabilidade do embrião é muitas vezes imprecisa, devido à impermeabilidade do tegumento à solução com TTC para algumas espécies de orquídeas (Lauzer et al. 1994; Vujanovic et al., 2000). Pode também ser devido a dependência de reação do tecido a presença de corantes específicos para cada espécie (Pritchard, 1985). Arditti (1992) afirma que quando as sementes de orquídeas são submetidas diretamente à solução de tetrazólio, sem pré-condicionamento, ou seja, sem serem tratadas com solução de sacarose (responsável pela ativação do embrião, pois as sementes não possui substâncias de reservas, logo a sacarose fornece nutriente e regula o equilíbrio osmótico) boa parte delas flutuam ou aderem às paredes dos frascos, diminuindo a área de contato com a solução de tetrazólio pois, dependendo da espécie ocorre a presença de um espaço de ar interno colorindo as sementes fracamente. Apesar de alguns autores apresentarem discrepâncias entre o teste e a germinação das sementes in vitro, o teste TTC é tradicionalmente utilizado para várias espécies de orquídeas (Alvarez-Pardo & Ferreira, 2006; Hosomi et al., 2012).

3.3.2 Germinação assimbiótica in vitro

O início da germinação in vitro ocorreu 15 dias após a inoculação das sementes nos meios de cultura. Observou-se o intumescimento dos embriões em todos os tratamentos e ruptura da testa em 80% das placas. Após 35 dias, todos os tratamentos apresentaram intumescimento do embrião e presença de rizóides. Elevadas taxas de germinação ocorreram independentemente do meio de cultura. Não houve diferenças significativas entre os tratamentos. A germinação total das sementes de C. saintlegerianum nos tratamentos ocorreu após 35 dias e variou entre 55 a 62% (Figura 3.3). Embora as porcentagens tenham sido inferiores ao teste de viabilidade pelo TTC, a taxa de germinação para a espécie foi alta quando comparada com taxas de germinação de sementes de orquídeas de outros autores que utilizaram diferentes tratamentos, fotoperíodos, temperaturas e adição de reguladores de crescimento no meio de cultura, Estas taxas de germinação ficaram abaixo 52

de 60% em C. palmifrons Rchb.f. & Warm. (Araújo et al., 1999); C. punctatum (L.) Lindl. (Dutra et al., 2009); C. eugenii Rchb.f. & Warm. (Nunes, 2009); C. glutiniferum Raddi (Vogel & Macedo, 2011). Mello (2000) obteve 60% de germinação em várias espécies do gênero Cyrtopodium trabalhando com conservação de sementes de orquídeas do Cerrado. Após 15 semanas foram avaliados o número total de protocormos em cada estádio de desenvolvimento. Nos primeiros estádios (1 e 2) de intumescimento do embrião e ruptura do tegumento, os melhores resultados foram observados no meio MS ½. Protocormos de coloração verde (estádio 3) foram observados em todos os tratamentos com médias estatisticamente iguais. O meio de cultura com mais protocormos nos estádios 5 e 6 foi o KC modificado (Figura 3.4 e Figura 3.5). Dutra et al. (2009) também observaram maiores porcentagens de sementes nos primeiros estádios (1 e 2) no meio de cultura MS ½ dos macronutrientes com Cyrtopodium punctatum. Híbridos de Vanda também tiveram melhores desenvolvimentos nos estádios iniciais no meio MS ½ (Jonhson & Kane, 2007).

a 62 a

58 a

56 a

50 MS MS 1/2 macro KC KC (modif.)

Alguns pesquisadores relataram a influência do fotoperíodo na germinação do gênero Cyrtopodium. Observaram que tanto a taxa de germinação quanto desenvolvimento 53

nos últimos estádios foram maiores em fotoperíodo de 8/16 luz/escuro para a espécie epífita Cyrtopodium punctatum (Dutra et al., 2009). Orquídeas epífitas germinam tanto sob luz quanto no escuro (Arditti, 1967). Diferentemente de Cyrtopodium glutiniferum que é uma orquídea terrestre, as maiores médias para germinação ocorreram sob luz branca com maior intensidade luminosa (Vogel & Macedo, 2011). Barros et al. (2003) relatam que, independentemente do hábito de crescimento ou taxonomia da orquídea, cada espécie tem exigências diferentes para o sucesso na germinação. Muitos autores obtiveram sucesso adicionando reguladores de crescimento ao meio de cultura a fim de obter altos índices na germinação para muitas espécies de orquídeas (Deb & Pongener, 2011; Vogel & Macedo, 2011; Pedroza-Manrique & Mican- Gutiérrez, 2006). No entanto, Araújo et al. (1999) não obtiveram sucesso germinando Cyrtopodium palmifrons em meio de cultura com regulares de crescimento, assim como Caramaschi (2001) com resultados similares em Cyrtopodium eugenii e Cyrtopodium cristatum. Rego-Oliveira & Faria (2005) apresentaram bons resultados utilizando orquídeas nativas (Catasetum fimbriatum e Cyrtopodium paranaensis) em meios de cultura tradicionais e formulações com fertilizantes comerciais sem reguladores de crescimento. Ramos (2005) sugere que formulações mais simples sem adição de hormônios são mais eficazes na fase de germinação e desenvolvimento inicial de algumas espécies de Cyrtopodium. O autor coloca que algumas espécies nativas apresentam melhores respostas com baixas dosagens de reguladores de crescimento e, em outras espécies, a resposta é nula. O desenvolvimento posterior de C. saintlegerianum foi melhor observado no meio KC modificado, após o primeiro subcultivo, pois apresentou maiores comprimentos da parte aérea, maior número de raízes e até mesmo mais brotações. Portanto, a espécie C. saintlegerianum germina facilmente em todos os meios apresentados. As maiores médias de protocormos no estádio 4 foram observadas no meio MS e nos últimos estádios (5 e 6) mostraram-se melhores os meios KC e KC modificado.

Figura 3.4 Efeito comparativo de meios de cultura e estádio de desenvolvimento na germinação assimbiótica de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum após 15 semanas. Meio MS (T1), meio MS ½ (T2), meio KC (T3), meio KC modificado (T4). ( Média ± 0,95 Intervalo de confiança). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%

3.3.3 Desenvolvimento de protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum

3.3.3.1 Altura 56

Para a variável altura, verificou-se que os tratamentos que proporcionaram melhor desenvolvimento dos protocormos e consequentemente aumento no comprimento das plântulas foram o controle (T1) sem adição de reguladores de crescimento e T5 (0,2 mg L-1 ANA/ 0,0 mg L-1 BAP), ou seja, sem a presença de citocininas exógenas (Tabela 3.3). Provavelmente, os níveis endógenos destes dois hormônios nos protocormos em desenvolvimento já se encontrem em equilíbrio e nas concentrações adequadas para o crescimento da parte aérea (Peres & Kerbauy, 2004). A adição de reguladores de crescimento exógenos estaria alterando este equilíbrio prejudicando o desenvolvimento da plântula (Lemos, 2010).

Tabela 3.3 Efeito das concentrações de ANA e BAP na altura de Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo. Descrição Tratamento Altura Controle T1 3.2 a 1,0 BAP/ 0 ANA T2 1.87 bcde 2,0 BAP/ 0 ANA T3 1.17 e 4,0 BAP/ 0 ANA T4 1.25 de 0 BAP/ 0,2 ANA T5 3.48 a 1,0 BAP/0,2 ANA T6 2.01 bcd 2,0 BAP/0,2 ANA T7 1.79 bcde 4,0 BAP/0,2 ANA T8 1.09 e 0 BAP/ 0,5 ANA T9 2.25 b 1,0 BAP/0,5 ANA T10 1.51 bcde 2,0 BAP/0,5 ANA T11 1.63 bcde 4,0 BAP/0,5 ANA T12 1.16 e 0 BAP/1,0 ANA T13 2.18 bc 1,0 BAP/1,0 ANA T14 1.64 bcde 2,0 BAP/1,0 ANA T15 1.35 cde 4,0 BAP/1,0 ANA T16 1.29 de Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%.

Porém, a presença de citocinina combinada com auxina otimiza o desenvolvimento vegetal em muitas espécies de orquídeas (Peres & Kerbauy, 2004). Long et al. (2010) trabalharam com quatro espécies de Paphiopedilum, seus melhores 57

tratamentos em relação ao comprimento da parte aérea foram com auxina associada a citocinina em maiores concentrações desses reguladores (4 mg L-1 BAP/ 0,5 mg L-1 ANA). Abraham et al. (2012) observaram maiores comprimentos da parte aérea com citocininas combinadas com auxina (3 mg L-1 BAP e 0,5 mg L-1 ANA) em protocormos de Coelogyne nervosa em meio MS cultivados depois de 90 dias. Os melhores resultados para crescimento também foram obtidos por Hossain et al. (2010) utilizando citocinina igualmente combinada com auxina (2 mg L-1 BAP e 2 mg L-1 ANA) em PLBs (Protocorm- like-bodies) de Cymbidium giganteum cultivados em meio Phytamax® após 30 dias.

3.3.3.2 Número de brotos

No período de 90 dias após a inoculação dos protocormos no meio de cultura, observou-se a interação das concentrações 4 mg L-1 de BAP (T4) e 4 mg L-1 de BAP / 0,2 mg L-1 de ANA (T8) na produção de brotações com as maiores médias 13,17 e 14,05 de brotos por explante, respectivamente (Tabela 3.4).

Tabela 3.4 Efeito das concentrações de ANA e BAP na produção de brotações de Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo.

Descrição Tratamento Brotos Controle T1 2.4 f 1,0 BAP/ 0 ANA T2 9.03 bcde 2,0 BAP/ 0 ANA T3 9.72 bc 4,0 BAP/ 0 ANA T4 13.17 a 0 BAP/ 0,2 ANA T5 2.45 f 1,0 BAP/0,2 ANA T6 9.03 bcde 2,0 BAP/0,2 ANA T7 9.32 bcd 4,0 BAP/0,2 ANA T8 14.05 a 0 BAP/ 0,5 ANA T9 2.11 f 1,0 BAP/0,5 ANA T10 6.3 e 2,0 BAP/0,5 ANA T11 7.78 bcde 4,0 BAP/0,5 ANA T12 9.81 b 0 BAP/1,0 ANA T13 2.1 f 1,0 BAP/1,0 ANA T14 6.6 de 2,0 BAP/1,0 ANA T15 6.22 e 4,0 BAP/1,0 ANA T16 6.75 cde Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%. 58

Mahendran & Bai (2009) relataram que citocininas sem a presença de auxinas promovem a proliferação de brotações em Satyrium nepalense, assim como ocorreu com o tratamento T13. Sabe-se que, em muitas culturas, a indução de brotações e raízes dependem do balanço entre auxinas/citocininas (Cid, 2005). Contudo, Vogel & Macedo (2011) testando reguladores de crescimento combinados com thidiazuron (TDZ) e ácido- indol-acético (AIA) discordaram desta afirmação, pois não obtiveram brotações em Cyrtopodium glutiniferum. Muitas vezes a adição exógena de reguladores de crescimento no meio de cultura desencadeia mudanças do balanço hormonal endógeno dos tecidos de explantes. Desse modo ao combinar auxina/citocinina exógena no meio pode-se alterar o balanço interno das citocininas endógenas proporcionando uma resposta de indução a novos brotos (Lemos, 2010). De acordo com Da Silva (2003) e Hu & Wang (1983), altos níveis de ANA inibem a formação de novas brotações. Para a espécie C. saintlegerianum as concentrações mais altas de ANA também inibiram a formação de novas brotações. As menores médias para número de brotações foram obtidas nos tratamentos T1, T5, T9 e T13, exatamente os tratamentos sem a presença da citocinina BAP. Assim, foi possível observar que tratamentos apenas com BAP são eficientes na indução de brotações em C.saintlegerianum. Concordando com Vasudevan & Van Staden (2010); Soares et al. (2010); Giatti & Lima (2007) e Ramos (2005) que maiores concentrações de BAP e outras citocininas são eficientes para estimular brotações. Porém, é importante lembrar que estas respostas estão associadas à interação genótipo/citocinina (Suzuki et al., 2004). No entanto, no presente estudo apesar de ter obtido maiores números de brotos nos tratamentos T4 e T8, as brotações apresentaram-se bastante agrupadas e com tamanho reduzido. Fato este que poderia dificultar o desenvolvimento e o crescimento nas próximas fases. Foi observado também que concentrações mais altas de BAP associadas com ANA (T16) tiveram efeito inibitório, diminuindo o número de brotos e causando mortalidade de 10,81% dos protocormos recém-inoculados. Logo, há a necessidade de otimizar níveis exógenos de reguladores de crescimento no meio para cada tipo de genótipo (Soares et al., 2010). Segundo Cid (2000), altas concentrações de citocinina podem aumentar a ação da citocinina-oxidase, inibindo a divisão celular e a indução de brotações. Desse modo, o efeito tóxico caracteriza-se pelo excessivo ou baixo crescimento da planta, redução no 59

tamanho das folhas e aspecto de hiperhidricidade dos tecidos levando a sérios problemas na fase de enraizamento (Leshen et al., 1988; Cid, 2000).

3.3.3.3 Número de folhas

Analisando a Tabela 3.5 é possível afirmar que o número de folhas foi influenciado pelas altas concentrações de BAP combinadas com a ausência ou baixas concentrações de ANA: tratamentos T3, T4, T6, T8 e T12. Maiores concentrações de BAP sem auxinas foram avaliados também por (Roy et al., 2011) em experimentos com Vanda coerulea.

Tabela 3.5 Efeito das concentrações de ANA e BAP na produção de folhas Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo. Descrição Tratamento Folhas Controle T1 6.66 e 1,0 BAP/ 0 ANA T2 13.06 bc 2,0 BAP/ 0 ANA T3 16.18 ab 4,0 BAP/ 0 ANA T4 20.54 a 0 BAP/ 0,2 ANA T5 7.7 de 1,0 BAP/0,2 ANA T6 16.29 ab 2,0 BAP/0,2 ANA T7 13.21 bc 4,0 BAP/0,2 ANA T8 16.96 ab 0 BAP/ 0,5 ANA T9 6,22 e 1,0 BAP/0,5 ANA T10 7,02 e 2,0 BAP/0,5 ANA T11 8.07 cde 4,0 BAP/0,5 ANA T12 17.19 ab 0 BAP/1,0 ANA T13 5.61 e 1,0 BAP/1,0 ANA T14 10.63 cde 2,0 BAP/1,0 ANA T15 12.31 bcd 4,0 BAP/1,0 ANA T16 12.29 bcd Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%.

Tratamentos com concentrações crescentes de ANA na ausência de BAP resultam em um decréscimo no número médio de folhas: tratamentos T5, T9 e T13 (médias 7,7, 6,22, 5,61 respectivamente). Resultados semelhantes foram encontrados em Phalaenopsis amabilis com o trabalho de (Ori, 2006) em que concentrações mais baixas de 60

ANA promoveram maior número de folhas e concentrações acima de 1 mg L-1 inibiram essa variável. Souto et al. (2010) apresentaram resultados diferentes com maiores concentrações de ANA (2 mg L-1) em Cattleya bicolor influenciaram positivamente o aumento de folhas. A resposta inconsistente dos reguladores de crescimento exógenos pode variar de gênero para gênero e até mesmo de espécie para espécie (Arditti 1967). Em C. saintlegerianum, as maiores médias para concentrações conjugadas de citocinina/auxina foram os tratamentos T8 (16,96) e T12 (17,19). Porém, estas médias não apresentam diferenças significativas entre os tratamentos T3 (16,18) e T4 (20,54) que utilizaram apenas citocinina.

3.3.3.4 Número de raízes e comprimento da maior raiz

A Tabela 3.6 indica que tratamentos com os maiores valores para número e comprimento de raízes foram o controle (T1) sem adição de reguladores de crescimento, T5, T9 e T13 que possuem 0,2, 0,5 e 1,0 mg L-1 de ANA sem adição de BAP, evidenciando o efeito negativo de citocininas na indução de enraizamento em C. saintlegerianum. Resultados obtidos por Souto et al. (2010) com Cattleya bicolor mostraram que a ausência de ANA foi significativa na inibição do alongamento radical e concentrações mais elevadas de ANA (2 mg L-1) foram primordiais para o crescimento desse órgão. Resultados similares foram encontrados em Cattleya bicolor em que concentrações mais altas de 0,5 e 1,0 mg L-1 de ANA promoveram maior número de raízes (Souto et al., 2010). Zhao et al. (2008), em seu trabalho com Dendrobium candidum constatou que concentrações acima de 0,5 mg L-1 de ANA reduzia o número de raízes, o mesmo verificado por Da Silva (2003) com híbridos de orquídeas. Auxinas são importantes reguladores frequentemente utilizadas no cultivo in vitro para indução de raízes adventícias (Haissig, 1972; Cid & Teixeira, 2010), nesse caso, as citocininas conjugadas são omitidas, sendo muitas vezes dispensáveis no meio de cultura para o enraizamento (Santos-Serejo et al., 2006). Desse modo, tratamentos apenas com a citocinina BAP (T3 e T4) se mostraram ineficientes inibindo raízes em C. saintlegerianum, bem como tratamentos conjugados citocinina/auxina com maiores níveis de BAP (T7, T8 e T11). 61

Tabela 3.6 Efeito das concentrações de ANA e BAP no número de raízes de Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo. Comprimento Descrição Tratamento Nº Raiz da maior raiz Controle T1 5.3 a 2.48 a 1,0 BAP/ 0 ANA T2 2 b 0.66 b 2,0 BAP/ 0 ANA T3 0 - 0 - 4,0 BAP/ 0 ANA T4 0 - 0 - 0 BAP/ 0,2 ANA T5 5.47 a 3.17 a 1,0 BAP/0,2 ANA T6 1.8 b 0.2 b 2,0 BAP/0,2 ANA T7 0 - 0 - 4,0 BAP/0,2 ANA T8 0 - 0 - 0 BAP/ 0,5 ANA T9 5.34 a 2.94 a 1,0 BAP/0,5 ANA T10 1.8 b 0.4 b 2,0 BAP/0,5 ANA T11 0 - 0 - 4,0 BAP/0,5 ANA T12 1.5 c 0.2 c 0 BAP/1,0 ANA T13 5.33 a 2.69 a 1,0 BAP/1,0 ANA T14 1.66 b 0.16 b 2,0 BAP/1,0 ANA T15 1.85 b 0.14 b 4,0 BAP/1,0 ANA T16 1.33 c 0.1 c Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%.

O balanço entre reguladores de crescimento auxina/citocinina é de suma importância na indução de caules e raízes para o desenvolvimento integrado da planta (Peres & Kerbauy, 2004). Contudo, os tratamentos: T6, T10, T12, T14, T15 e T16 que tiveram auxina/citocinina combinada indicaram baixas respostas em relação ao número de raízes, não tendo, portanto, efeitos favoráveis no incremento desta variável. O desenvolvimento final da planta depende da interação entre os sistemas caulinares e radiculares, nos quais a interação auxina/citocinina tem posição primordial nesse processo, favorecendo o crescimento e desenvolvimento completo desses órgãos que são essenciais para a sobrevivência do vegetal (Peres & Kerbauy, 2004). Em muitas situações, quando são abordados os efeitos sinérgicos dos reguladores de crescimento em relação a algumas espécies vegetais, são comumente desconhecidas as respostas quanto a capacidade de absorção, transporte e inativação pelo tecido do regulador de crescimento aplicado. Evidências comprovam que as auxinas, hormônio associado a indução de raízes, são predominantemente produzidas pelos brotos 62

(Davies, 1995) e as citocininas são produzidas pelas raízes estimulando o crescimento e a produção de brotações (Pillay & Railton, 1983). No entanto, há algumas espécies de orquídeas praticamente sem caules que não se enquadram, de forma plena, neste contexto de desenvolvimento integrado. Assim, a sobrevivência depende em grande parte da capacidade de realizar simultaneamente as funções de ambos os sistemas, tornando-se materiais interessantes para estudos de diferentes aspectos fisiológicos (Peres et al., 1997).

3.3.3.5 Formação de calos

Durante a avaliação dos tratamentos aos 90 dias de cultivo constatou-se a formação de calos em todos os tratamentos, exceto no tratamento T5 (0,2 mg L-1 de ANA sem BAP), após essa observação, essa variável foi incluída na avaliação dos tratamentos. Na Tabela 3.7 é interessante observar que a formação de calos parece ter sido favorecida em baixas concentrações de citocinina e ausência de auxina (T2, T3 e T4). No entanto, não foi demonstrada diferença estatística entre a maioria dos tratamentos. A formação de calos ocorreu até mesmo no tratamento controle (sem adição de regulador de crescimento). Na Tabela 3.7 é possível observar um decréscimo da taxa de formação de calos a medida que aumenta as concentrações de ambos reguladores. A propagação via calo é considerada bastante difícil em comparação com outras vias de regeneração (Roy et al., 2007). Ng et al. (2011) trabalhando com protocormos de Paphiopedilum, com o objetivo de induzir a formação de PLBs (Protocorm-like bodies), sugeriram que diferentes tipos de explantes têm diferentes requisitos para vários tipos de reguladores de crescimento. Os autores testaram diferentes citocininas (BAP e Kinetina) para a indução de calos a partir da haste floral de Paphiopedilum, em meio MS ½ como meio de cultivo básico. Todos os tratamentos tiveram altas taxas de produção de calos e formação de PLBs. Sánchez (1988) trabalhando com reguladores de crescimento para regeneração a partir de raízes de Cyrtopodium punctatum mostrou que altas concentrações de ANA (0,5 e 1,0 mg L-1) aumentaram a proliferação de calos e, em seguida, apresentaram oxidação e morte dos explantes. Segundo Souza et al. (2006), auxinas em altas dosagens no meio de cultura resulta na formação de calos e compromete a rizogênese e o crescimento da parte aérea. Outros trabalhos tiveram as mesmas respostas com o uso da auxina ANA (Pedroza- Manrique & Mican-Gutiérrez, 2006; Kuo et al., 2005). 63

Tabela 3.7 Efeito das concentrações de ANA e BAP na formação de calos de Cyrtopodium saintlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de cultivo. Descrição Tratamento Calos Controle T1 3.83 c 1,0 BAP/ 0 ANA T2 11.73 a 2,0 BAP/ 0 ANA T3 8.36 b 4,0 BAP/ 0 ANA T4 8.58 b 0 BAP/ 0,2 ANA T5 0 - 1,0 BAP/0,2 ANA T6 6.08 b 2,0 BAP/0,2 ANA T7 7.08 b 4,0 BAP/0,2 ANA T8 7.2 b 0 BAP/ 0,5 ANA T9 3.33 c 1,0 BAP/0,5 ANA T10 6.83 b 2,0 BAP/0,5 ANA T11 2.5 c 4,0 BAP/0,5 ANA T12 6.93 b 0 BAP/1,0 ANA T13 4 bc 1,0 BAP/1,0 ANA T14 4.71 bc 2,0 BAP/1,0 ANA T15 4.6 bc 4,0 BAP/1,0 ANA T16 4.86 bc Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%.

Tokuhara & Mii (2001) avaliaram o efeito de reguladores de crescimento combinados na indução de calos em Phalaenopsis a partir de hastes florais. Melhores resultados ocorreram com concentrações de 2,0 BAP / 0,1 mg L-1 ANA. Concentrações mais altas de ANA (2,0 mg L-1) tornaram-se tóxicas, prejudicando a de sobrevivência dos explantes.

3.4 CONCLUSÕES

 O teste de tetrazólio é eficaz para verificação da viabilidade de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum

 Para a germinação assimbiótica, sementes de Cyrtopodium saintlegerianum não são exigentes em relação ao tipo de meio de cultura nos primeiros estádios da germinação. Porém, nas últimas fases de desenvolvimento dos protocormos o meio nutritivo KC modificado (Arditti, 1977) é o mais indicado. 64

 Para o crescimento da parte aérea de plântulas de Cyrtopodium saintlegerianum germinadas in vitro não é necessária a adição de reguladores de crescimento ao meio. Além disso, a adição de citocininas foi prejudicial ao crescimento de novas folhas e dosagens de auxinas não diferiram do controle.

 Para o surgimento de novas brotações, quanto maior a concentração de citocinina no meio maior o número de novos brotos. A conjugação citocinina/auxina não resultou em melhores resultados para esta variável.

 O enraizamento de plântulas de Cyrtopodium saintlegerianum estabelecidas in vitro não requer a adição de reguladores de crescimento. Embora tratamentos com diferentes concentrações de auxina e sem a presença de citocinina tenham estimulado o número e comprimento das raízes, as médias não foram estatisticamente diferentes do tratamento controle. O efeito isolado da citocinina mostrou ser o mais inibitório para o enraizamento.

 Observou-se a formação de calos em todos os tratamentos, sem repicagens nem indução com outros reguladores de crescimento.

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4 CITOGENÉTICA DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)

RESUMO O gênero Cyrtopodium Rchb. f. compreende 50 espécies de origem neotropical distribuídas do sul da Flórida até o norte da Argentina. O centro de diversidade do gênero é o Cerrado brasileiro, onde ocorrem pelo menos 28 espécies. A espécie Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. tem ampla distribuição geográfica no Brasil, sendo uma espécie típica da região Centro-Oeste e de grande interesse para a domesticação e melhoramento genético devido a suas características ornamentais. O número cromossômico das espécies da subtribo Cyrtopodiinae ainda é pouco conhecido, o que tem dificultado a interpretação das relações taxonômicas e filogenéticas entre diferentes gêneros e entre espécies de grandes gêneros. Os dados cromossômicos são importantes, pois há a necessidade de se avaliar maior número de espécies do grupo o que contribuirá de forma significativa para a delimitação dos táxons infragenéricos e entendimento de suas relações filogenéticas. Além disso, poderá garantir a preservação das espécies, inserir espécies do gênero em programas de melhoramento genético, contribuindo para sua preservação. Logo, o presente estudo consistiu da análise cromossômica mitótica da espécie C. saintlegerianum, sendo esse um dado inédito para a referida espécie. O material vegetal foi proveniente de plantas cultivadas in vitro em meio de cultura. Foram testados quatro protocolos, com diferenças quanto a solução enzimática para o amolecimento das raízes, os corantes, concentração do anti-mitótico e solução de hidrólise, e o uso de regulador de crescimento para indução de raízes in vitro. Todos os protocolos tiveram em comum raízes pré-tratadas com anti- mitótico 8-hidroxiquinoleína (0,002M) em geladeira durante 24 horas. Em seguida nos protocolos as raízes foram fixadas em Carnoy 3:1 por 18 horas o primeiro e o segundo protocolo e o terceiro e o quarto por 24 horas em temperatura ambiente. Depois estocados a -20ºC no próprio fixador, para posterior análise (apenas o quarto protocolo). As raízes dos protocolos foram coradas com diferentes corantes: hematoxilina, reativo de Schiff, orceína acética e Giemsa respectivamente. O melhor protocolo avaliado para C. saintlegerianum foi o quarto protocolo utilizando regulador de crescimento, no qual foi obtido 42 metáfases, no entanto os cromossomos se encontravam condensados, e o numero de cromossomos encontrado para a referida espécie foi de 2n=48.

Palavras chaves: Orquídea, Cerrado, cariótipo.

ABSTRACT CYTOGENETIC OF Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae) 71

The genus includes 50 species Cyrtopodium Rchb. f. source neotropical distributed from southern Florida to northern Argentina. The center of diversity of the genus is the Brazilian Cerrado, where there are at least 28 species. The species Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. has a wide geographical distribution in Brazil, is a typical species of the Midwest and of great interest to the domestication and breeding because of their ornamental features. The chromosome number of the subtribe Cyrtopodiinae is still poorly understood which has hindered the interpretation of taxonomic and phylogenetic relationships between genders and between different species of large genera. Chromosome data are important because there is a need to evaluate a greater number of species of the group which will contribute significantly to the delimitation of taxa and the understanding of their phylogenetic relationships. Besides ensuring the preservation of the species, insert the genus in breeding programs, contributing to its preservation. Therefore, the present study consisted of mitotic chromosome analysis of the specie Cyrtopodium saintlegerianum, as the first report for that specie. The plant material was derived from plants grown in vitro in culture medium. We tested four protocols, with differences in enzyme solution for softening the roots, dyes, anti-mitotic concentration of the solution and hydrolysis, and the use of growth regulators for root induction in vitro. All protocols were in common roots pretreated with anti-mitotic 8-hydroxyquinoline (0.002 M) in refrigerator for 24 hours. Then protocols roots were fixed in Carnoy 3:1 for 18 hours the first and second and third and fourth protocol for 24 hours at room temperature. After stored at -20 º C in the same fixative for further analysis (only the fourth protocol). The roots of the protocols were stained with different dyes: hematoxylin, Schiff, acetic orcein and Giemsa respectively. The best protocol evaluated for C. saintlegerianum was fourth protocol using growth regulator, which was obtained in 42 metaphases, however chromosomes were condensed, and the number of chromosomes found for that species was 2n = 48.

Key words: orchid, cerrado, karyotype.

4.1 INTRODUÇÃO

A subtribo Cyrtopodiinae inserida na grande tribo CYMBIDIEAE compreende doze gêneros que caracterizam-se por serem terrestres, rupícolas ou epífitos. Possuem pseudobulbos bem marcados por anéis, folhas bastante longas multinervuradas e caducas, e flores cuja coluna apresenta rostelo não saliente e polínias ceróides. Os gêneros brasileiros mais conhecidos são Cyrtopodium, Galendra e Grobya (Pridgeon et al., 1999). O gênero Cyrtopodium Rchb.f compreende 50 espécies de origem neotropical distribuídas do sul da Flórida até o norte da Argentina (Romero-González et al., 2008). São caracterizados por apresentarem vários nós, e após a floração as gemas axilares se desenvolvem formando novos brotos (Caramaschi & Caldas, 1999). A inflorescência é vigorosa e em grande número, apresentam brácteas em sua base de tamanhos 72

diferenciados, unduladas e coloridas algumas até mais vistosas que as próprias flores (Cribb et al., 2003). O gênero é bastante resistente ao estresse hídrico e necessita de alta luminosidade e grande período de insolação, além de substratos bem aerados para um bom desenvolvimento (Dressler, 1981). A subtribo Cyrtopodiinae quanto ao número cromossômico das espécies ainda é pouco conhecida, o que tem dificultado a interpretação das relações taxonômicas e filogenéticas entre diferentes gêneros e entre espécies de grandes gêneros (Félix & Guerra, 2000). Sobre o gênero Cyrtopodium apenas onze das cinquenta espécies existentes (Romero-González et al., 2008) foram citologicamente analisadas. Tais espécies apresentam pouca variação dos números cromossômicos com a ploidia variando de 2n = 44 a 2n =46 (Surenciski et al., 2007). Nesse contexto, em decorrência da escassez de dados cromossômicos faz-se necessária a avaliação de maior número de espécies vegetais que contribuirá de forma significativa para a delimitação dos táxons infragenéricos, assim como o entendimento das relações filogenéticas. Logo, o presente estudo consistiu da análise cromossômica mitótica da espécie Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f., cujos dados foram comparados com outras abordagens, de espécies do mesmo gênero disponíveis na literatura.

4.2 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.1 Material Vegetal

O material vegetal utilizado foi proveniente de cápsulas maduras de C. saintlegerianum coletadas de uma população localizada no município de Mossâmedes, GO (Latitude 16o 07.666' Sul e Longitude 050o 10.044' Oeste). Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás (LCTV). As cápsulas foram lavadas em água corrente e detergente líquido neutro retirando a primeira camada de sujeira vinda de campo. Posteriormente, as cápsulas foram desinfestadas por um minuto em solução contendo álcool 70%, em câmara de fluxo laminar, tratadas por quinze minutos com hipoclorito de sódio comercial (2,5% de cloro ativo) e lavadas por três vezes consecutivas em água destilada autoclavada.

4.2.2 Germinação assimbiótica in vitro

O meio de cultura utilizado para a germinação das sementes foi o meio KC modificado (Arditti et al., 1977). O pH foi ajustado para 5,8, a solidificação dos meios foi feita com 0,6 % de ágar e autoclavados à temperatura de 120º C, por vinte minutos. Após a autoclavagem, em câmara de fluxo laminar foram distribuídos 40 mL de meio em frascos do tipo baby-food. O meio foi resfriado para em seguida ser usado para a inoculação das sementes. Em câmara de fluxo laminar a cápsula previamente desinfestada foi cortada longitudinalmente com bisturi e com auxílio de uma pinça, uma das metades da cápsula foi retirada. Aproximadamente 200 sementes foram distribuídas com uma espátula e semeadas uniformemente nos frascos. Após a semeadura, os frascos permaneceram em sala de crescimento, em condições de 16 horas de luz, intensidade luminosa de 35 µmol m-2 s-1 e temperatura de 24°C ± 2°C por três meses. Após três meses, foi feita a primeira repicagem das plântulas provenientes da germinação, em novo meio KC modificado para o desenvolvimento das plântulas.

4.2.3 Testes para análises cromossômicas

Para obtenção de células mitóticas em C. saintlegerianum raízes de plântulas in vitro foram submetidas inicialmente a três diferentes protocolos. A diferença entre os protocolos utilizados foram o uso da solução enzimática celulase/pectinase para obter raízes mais macias para o esmagamento lâmina-lamínula, testar qual o corante mais eficiente para a espécie, o tempo de exposição ao anti-mitótico (8-hidroxiquinoleína) e a concentração da solução de ácido clorídrico para hidrolizar as raízes. Foi testado um quarto protocolo com dois tratamentos diferenciados para observar se havia diferença na obtenção de raízes induzidas ou não com regulador de crescimento ácido α-naftalenoacético (ANA). Nesse protocolo foi utilizado também nitrogênio líquido para acelerar o congelamento do conjunto lâmina-lamínula na retirada da lamínula e outro tipo de corante, a fim de melhorar a coloração das células mitóticas. Todos os protocolos foram testados segundo as recomendações de Guerra e Souza (2002) e Mondin & Neto (2006) para citogenética vegetal.

4.2.3.1 Protocolo de digestão enzimática com celulase/pectinase

Em câmara de fluxo laminar pontas de raízes foram coletadas de plantas in vitro e seccionadas em cortes de três centímetros em seguida as raízes foram submetidas ao pré- tratamento com 8-hidroxiquinoleína (0,002M), em geladeira, durante 20 horas. Em seguida, as raízes foram fixadas em Carnoy 3:1 por 18 horas em temperatura ambiente. Foram lavadas três vezes em água destilada por cinco minutos, e hidrolisadas em ácido clorídrico 1N por 20 minutos. Posteriormente, as raízes foram mantidas imersas em solução enzimática de celulase 2% e pectinase 3% a 37 ºC no banho-maria em tempos variados de 10 a 30 minutos, até ficarem macias. As pontas das raízes foram transferidas para uma lâmina limpa, e esmagada com lamínula, em seguida o conjunto lâmina-lamínula foi congelada no freezer a -20 ºC por 20 minutos para a retirada da lamínula. Deixou-se a lâmina secar ao ar e em seguida gotejou uma gota de hematoxilina 1% sobre a mancha de células espalhadas na lâmina, cobriu com uma nova lamínula (a coloração é instantânea) para ser em seguida examinada.

4.2.3.2 Protocolo usando corante reativo de Schiff seguido de esmagamento

Os primeiros passos foram idênticos ao protocolo anterior. No preparo das lâminas, as raízes foram lavadas duas vezes em água destilada por cinco minutos, hidrolisadas em ácido clorídrico 1N por 20 minutos, novamente lavadas em água destilada por cinco minutos. Em seguida foram imersas no corante reativo de Schiff por trinta minutos. Após a coloração as raízes foram lavadas gotejando-se água destilada constantemente por alguns segundos, até a retirada do excesso de corante. Posteriormente, sob uma lâmina limpa foi pingado uma gota de carmin acético 1% junto com a ponta da raiz, sendo posteriormente esmagada com auxílio da lamínula para posterior visualização em microscópio Leica® com sistema de câmera integrada e software Leica®.

4.2.3.3 Protocolo usando corante orceína acética seguido de esmagamento

Em câmara de fluxo laminar raízes de plântulas in vitro foram seccionadas em cortes de três centímetros e submetidas ao pré-tratamento com 8-hidroxiquinoleína (0,002M), em geladeira, durante 24 horas. Em seguida, as raízes foram fixadas em Carnoy 75

3:1 por 24 horas em temperatura ambiente e depois estocados a -20 ºC no próprio fixador. Após serem fixadas, as raízes foram lavadas três vezes em água destilada por cinco minutos, hidrolisadas em ácido clorídrico 5N por 20 minutos, novamente lavadas em água destilada por cinco minutos. Em seguida as raízes foram coradas convencionalmente com orceína acética 2% por 30 minutos, para a coloração convencional das raízes. Após a coloração, sob uma lâmina limpa as pontas das raízes foram seccionadas deixando apenas o meristema, e esmagadas com auxílio da lamínula, para posterior visualização em microscópio óptico.

4.2.3.4 Protocolo usando raízes tratadas com regulador de crescimento

Nesse protocolo inicialmente as plântulas in vitro foram repicadas e divididas em dois tratamentos a fim de induzir raízes com regulador de crescimento e observar se havia diferença na visualização dos cromossomos. O primeiro tratamento consistiu em plântulas repicadas em meio KC modificado (Arditti et al., 1977) com 1,0 mg L-1 de ácido α-naftalacético (ANA). O segundo tratamento foi utilizado o mesmo meio sem regulador de crescimento. Foram feitas seis repetições para cada tratamento, sendo mantida em sala de crescimento por mais trinta dias para indução de novas raízes. Plântulas nos frascos in vitro foram submetidas a temperatura controlada de 28ºC por dois dias em estufa. Posteriormente, foram realizadas as análises mitóticas dessas plântulas, nas quais foram utilizadas pontas de raízes em tratamentos separados, sendo T1 – raízes provenientes dos tratamentos com regulador de crescimento e T2 – pontas de raízes sem regulador de crescimento. Em câmara de fluxo laminar raízes dos dois tratamentos foram seccionadas em cortes de três centímetros e submetidas ao pré-tratamento com 8-hidroxiquinoleína (0,002M), em geladeira, durante 24 horas. Em seguida, os dois tratamentos foram fixados em Carnoy 3:1 por 24 horas em temperatura ambiente e depois estocados a -20º no próprio fixador, para posterior análise. No preparo das lâminas, as raízes dos tratamentos foram lavadas três vezes em água destilada por cinco minutos, hidrolisadas em ácido clorídrico 5N por 20 minutos, novamente lavadas em água destilada por cinco minutos. Com auxílio de um microscópio estereoscópico para melhor visualização do meristema a ponta da raiz foi esmagada em ácido acético 45% com a lamínula. As lâminas foram congeladas em nitrogênio líquido por 76

alguns segundos, para remoção da lamínula e, em seguida, coradas convencionalmente com Giemsa 3% Merck® por oito minutos.

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

No primeiro protocolo testado não foi possível fazer coloração convencional das raízes testadas, pois com o uso da solução enzimática celulase-pectinase em todos os tempos testados a digestibilidade da parede celular foi severa, ou seja, as raízes ficaram totalmente amolecidas. A atividade da solução enzimática celulase-pectinase favorece o preparo das lâminas na citogenética, deixando as raízes mais macias e fáceis de serem esmagadas com o auxílio da lamínula para posterior coloração. A solução enzimática é muito utilizada quando as raízes são muito rígidas dificultando seu manuseio, principalmente em gramíneas (Guerra & Souza, 2002). No entanto, essa técnica não foi aplicável para raízes de orquídeas in vitro, pois as deixaram totalmente digeridas impedindo a obtenção de células mitóticas e posterior coloração para serem analisadas. No segundo protocolo foram obtidas cinco lâminas e oito metáfases pouco coradas e de difícil visualização (Figura 3.6). As metáfases se encontravam bastante fechadas dificultando a contagem dos cromossomos. Foi utilizada a coloração convencional de Feulgen (reativo de Schiff) por um período de trinta minutos. Segundo Guerra & Souza (2002) a coloração com reativo de Schiff pode variar de trinta minutos a duas horas para obter células bem coradas. Conforme os mesmos autores, essa é uma coloração clássica de bons resultados e que dispensa a retirada da lamínula, contudo a intensidade da coloração, nesse caso, depende muito das condições de fixação e hidrólise, alem de ser melhor aplicada em espécies com cromossomos maiores, não sendo o caso das espécies de orquídeas. Para o terceiro protocolo foram adotadas as recomendações de Guerra & Souza (2002), utilizando tempo maior do pré-mitótico de 24 horas e maior concentração do ácido clorídrico 5N para hidrolisar as raízes. No entanto, nesse procedimento, foram obtidas lâminas com excesso de coloração, impedindo a visualização das células no microscópio. As lâminas foram observadas apenas em microscópio óptico e não foram fotografadas. De acordo com os mesmos autores, em cromossomos pequenos devem ser utilizados corantes como Giemsa e hematoxilina que garantem uma coloração mais intensa e menos contrastada dos cromossomos. 77

No quarto protocolo foram obtidas quinze lâminas e 42 metáfases no total com melhor contraste na coloração e melhor visualização. Entre as 42 metáfases obtidas, 17 eram originadas de raízes de plântulas do tratamento com reguladores (T1) e 25 metáfases do tratamento sem regulador de crescimento (T2). Os tratamentos analisados de C. saintlegerianum apresentaram núcleos interfásicos semi-reticulados com cromatina condensada. Em ambos os tratamentos foram obtidos metáfases, nas quais os cromossomos se encontravam condensados, e após a contagem de 42 metáfases, o número cromossômico foi de 2n=48 (Figura 3.7). Em relação à condensação dos cromossomos supõe-se que pode ter ocorrido aderência entre os cromossomos. Guerra & Sousa (2002) afirmam que o tempo 78

ideal para o pré-tratamento com o anti-mitótico pode variar entre as espécies, além da temperatura e concentração serem primordiais para o sucesso da análise.

Não houve diferença entre os tratamentos com e sem regulador de crescimento para na indução de raízes in vitro quanto à visualização das células mitóticas, os dois tratamentos se mostraram idênticos. Porém, maior número de raízes, principalmente pontas novas, foi obtido no tratamento com regulador de crescimento ANA. Sabe-se que auxinas têm o importante papel em promover o alongamento celular e a morfogênese vegetal. É também determinante na divisão celular em diferentes processos. A auxina aumenta o conteúdo de cinases dependente de ciclina do tipo (CDK/a) e, nesse contexto, a divisão consiste em uma série de alternância de fases que são reguladas pela atividade de algumas proteínas, particularmente as cinases dependentes da ciclina. Assim a célula adquire a capacidade de passar para a fase seguinte iniciando a síntese de DNA (Mercier, 2004). 79

Os estudos sobre citogenética de orquídeas são considerados insuficientes, visto que é uma importante ferramenta para o entendimento da evolução, genética e estabilidade cariotípica das espécies, assim como as lacunas filogenéticas e as tendências evolutivas da família (Daviña et al., 2009). Até o momento, são conhecidos os números cromossômicos de poucas espécies do gênero Cyrtopodium (Tabela 3.8).

Tabela 3.8 Lista de espécies do gênero Cyrtopodium com os respectivos números cromossômicos (2n). Espécies 2n Referência Subtribo Cyrtopodiinae Cyrtopodium hatschbachii Pabst 46 Surenciski et al., 2007 C. palmifrons Rchb. f & Warm. 46 Felix & Guerra, 2000 Cyrtopodium blanchetii Rchb. f 92 Felix & Guerra, 2000 C. gigas (Vell.) Hoehne 46 Felix & Guerra, 2000 C. inaldianum L.C. Menezes 46 Felix & Guerra, 2000 C. intermedium Brade 46 Felix & Guerra, 2000 C. paranaense Schltr. 46 Felix & Guerra, 2000 C. eugenii Rchb. f. 44 Felix & Guerra, 2000 C. andessonii (Lamb. ex Andrews) R. Br. 46 Aoyama, 1989 C. punctatum (L.) Lindl 46 Aoyama, 1989

De acordo com Surenciski et al. (2007) o gênero Cyrtopodium tem dois números básicos de cromossomos, 2n=44 e 2n=46, pois a maioria das espécies são diplóides, não apresentando significativa variabilidade em número cromossômico. Os resultados apresentados para C. santlegerianum, com 2n=48, indicam um novo número cromossômico para o gênero., com importantes desdobramentos em relação às relações filogenéticas entre as espécies. Muitos protocolos são utilizados para melhorar a eficiência do teste. Para vegetais, a 8-hidroxiquinoleína é um anti-mitótico bastante empregado na concentração de 0,002%, podendo haver variação no tempo do tratamento. No protocolo utilizado por Surenciski et al. (2007) as raízes de plantas in vitro foram tratadas em solução de 8- hidroxiquinoleína por cinco horas a 25ºC. Ao contrário de Felix & Guerra (2000) que utilizaram o mesmo anti-mitótico, porém em tempo e temperatura diferenciadas (24 horas a 4ºC) em raízes in vivo, seguindo o protocolo de Guerra & Sousa (2002). Outros procedimentos que podem variar são o fixador e o tempo de exposição, além dos corantes e suas concentrações. Diferentemente do utilizado nesse trabalho, 80

Surenciski et al. (2007) fixaram as raízes em solução de ácido lático e álcool etílico 5:1 por 12 horas a 4ºC e coraram as lâminas por 8 minutos com reativo de Schiff. Felix & Guerra (2000) fixaram as raízes em Carnoy 3:1 (acido acético/álcool etílico) por um período que variou de 3 a 24 horas em temperatura ambiente, e em seguida, foram estocadas no próprio fixador em temperatura de -20ºC. Apesar dos protocolos serem diferenciados, o resultado foi satisfatório para todas as espécies testadas (Anexo 1). Assim, é necessário adequar o protocolo para a espécie estudada, testando reagentes, concentrações, tempo e temperatura ideais, para obter metáfases de qualidade, visando, além da obtenção do número cromossômico, a montagem do cariótipo e a classificação dos cromossomos, de acordo com o tamanho e a posição dos centrômeros. A subfamília Epidendroideae, na qual está inserida a subtribo Cyrtopodiinae, é um grupo que compreende 18.000 espécies e 650 gêneros (Cribb & Chase, 2006). Essa família possui grande diversidade morfológica em cores, tamanhos e formas (Dressler, 1993) além de alta variação cariotípica como Psygmorchis pusilla com número cromossômico 2n=10 e Epidendrum cinnabarinum com 2n=240. Desse modo, essa ampla variação em números cromossômicos remete a grande diversidade taxonômica que o grupo possui. Nesse contexto, grandes heterogeneidades numéricas em populações naturais estabelecem um eficiente mecanismo de isolamento reprodutivo, com destacado desempenho na especiação (Levin, 2002). Entretanto, poucos são os registros cariotípicos do gênero Cyrtopodium, tendo em vista que é um grupo com grande potencial ornamental, é necessário um conhecimento maior das espécies do gênero para a obtenção de um cenário concreto sobre a evolução cromossômica para inserí-la em futuros programas de melhoramento.

4.4 CONCLUSÕES

 Dos protocolos utilizados, o mais eficiente para obtenção de células em metáfases com melhor contraste e coloração foi o protocolo utilizando regulador de crescimento, no qual foi utilizado o corante Giemsa 3%.

 Não houve diferença entre os tratamentos do protocolo utilizado com e sem regulador de crescimento na visualização das metáfases. Contudo, o tratamento utilizado para induzir raízes in vitro foi eficaz, promovendo pontas de raízes novas. 81

 Foram obtidas metáfases com núcleos interfásicos semi-reticulados e cromatina condensada. O novo número cromossômico obtido para a espécie Cyrtopodium saintlegerianum foi 2n=48.

4.5 REFERÊNCIAS

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5 CONCLUSÕES GERAIS

 Em virtude do grande numero de artigos sobre germinação assimbiótica utilizando reguladores de crescimento, sugere-se testar o efeito dos reguladores de crescimento na germinação in vitro de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum.

 Para o desenvolvimento de protocormos ou plântulas de Cyrtopodium saintlegerianum sugere-se testar outros reguladores de crescimento (citocinina e auxina) conjugados ou não, a fim de induzir, brotações, enraizamento, crescimento ou regeneração de plantas a partir de calos.

 Recomenda-se testar novos protocolos, com tempos diferenciados do anti-mitótico, temperatura e concentração da solução para a referida espécie. O objetivo é obter maior contração cromossômica permitindo visualizar melhor as constrições primárias e secundárias, para definir a morfologia dos cromossomos de C. saintlegerianum.

6 ANEXO

Anexo 1 Comparação de metáfases mitóticas de protocolos diferenciados das espécies: Cyrtopodium intermedium 2n=46 (A), Cyrtopodium inaldianum (2n = 46) (B), Cyrtopodium gigas (2n = 46) (C) Imagens de Felix & Guerra (2000); Cyrtopodium hatschbachii (2n=46) (D) imagem de Surenciski et al. (2007).