T.C. ERCĐYES ÜĐVERSĐTESĐ FE BĐLĐMLERĐ ESTĐTÜSÜ

TÜRKĐYE ECHIOPS L. CĐSĐ RITRODES BUGE SEKSĐYOU TAKSOLARII POGP (PEROKSĐDAZ GE POLĐMORFĐZM) YÖTEMĐ KULLAILARAK ARATIRILMASI

Tezi Hazırlayan Serkan KAYA

Tezi Yöneten Doç. Dr. Cem VURAL

Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi

Ocak 2011 KAYSERĐ

T.C. ERCĐYES ÜĐVERSĐTESĐ FE BĐLĐMLERĐ ESTĐTÜSÜ

TÜRKĐYE ECHIOPS L. CĐSĐ RITRODES BUGE SEKSĐYOU TAKSOLARII POGP (PEROKSĐDAZ GE POLĐMORFĐZM) YÖTEMĐ KULLAILARAK ARATIRILMASI

Tezi Hazırlayan Serkan KAYA

Tezi Yöneten Doç. Dr. Cem VURAL

Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi

Bu çalıma Erciyes Üniversitesi Bilimsel Aratırma Projeleri Birimi tarafından FBY08565 kodlu proje ile desteklenmitir.

Ocak 2011 KAYSERĐ

ii

TEEKKÜR

Çalımalarım boyunca bana göstermi olduğu yardım ve yönlendirmelerden dolayı değerli hocam sayın Doç. Dr. Cem VURAL’a teekkürü bir borç bilirim. Laboratuar imkanlarını sağlayan ve malzeme temininde büyük emeği olan değerli hocam sayın Yrd. Doç. Dr. Servet ÖZCAN’a teekkürlerimi sunarım. Değerli katkıları ve yardımlarını benden esirgemeyen sayın hocam Doç. Dr. Osman GÜLEN’e sonsuz teekkür ediyorum.

Laboratuar çalımalarım boyunca desteklerini hep hissettiğim değerli arkadalarım Sezin DEMĐRTA, Güler TOPRAK ve Osman ĐBĐ’e yardım ve desteklerinden dolayı, laboratuvar ortamını uyum içinde paylatığım çalıma arkadalarım eyda ERDOĞAN, Dilek CEYLAN, engül HASKILIÇ, Leyla KIRIM ve Esma ÖZHÜNER’e, dostluğuyla bana güç veren Ersin KARABULUT, Muhammer KARABACAK ve Erman AIK’a teekkürlerimi sunarım.

Hayatımın her amasında olduğu gibi yüksek lisans döneminde maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme sonsuz teekkürlerimi sunarım. iii

TÜRKĐYE ECHIOPS L. CĐSĐ RITRODES BUGE SEKSĐYOU TAKSOLARII POGP (PEROKSĐDAZ GE POLĐMORFĐZM) YÖTEMĐ KULLAILARAK ARATIRILMASI

Serkan KAYA

Erciyes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, Ocak 2011 Tez Danımanı: Doç. Dr. Cem VURAL

ÖZET

Türkiye’de doğal yayılı gösteren Echinops (Asteracea) cinsi Ritrodes seksiyonu; Echinops spinosissimus ve Echinops orientalis türleri ile temsil edilmektedir. Bu çalımada bu iki tür ve tür altı taksonları moleküler tekniklerlerden “Peroksidaz Gen Polimorfizm (POGP) marker tekniği” kullanılarak incelenmitir. Böylece Ritrodes seksiyona ait taksonlar arasındaki akrabalık ilikileri aratırılmı ve bu türlerin evrimleriyle ilgili ipuçları elde edilmitir. Çalımada Ritrodes seksiyonuna ait 2 tür ve 2 alt tür 42 birey ve 4 dı grup kullanılmıtır. Analizler için 14 POGP primer kombinasyonu kullanılarak 104 polimorfik bant elde edilmitir. En fazla sayıda bant (15 bant) Pox1F/Pox1R primer kombinasyonlarından elde edilirken, en az sayıda bant (3 bant) Pox11F/Pox11R primer kombinasyonundan elde edilmitir. Bireyler arasındaki genetik mesafe 0.66 ile 0.96 arasında bulunmutur. Bu sonuçlar Echinops türlerinin karılatırılmasında POGP markırlarının kullanılabileceğini göstermitir.

Anahtar Kelimeler: Asteraceae , Echinops, Ritrodes, POGP, Türkiye. iv

IVESTIGATIO OF TAXA OF RITRODES BUGE SECTIO I GEUS ECHIOPS L. I TURKEY BY USIG POGP (PEROXIDASE GEE POLYMOPHISM)

Serkan KAYA

Erciyes University, Graduate School of atural and Applied Sciences M. Sc. Thesis, January 2011 Thesis Supervisors: Assoc. Prof. Dr. Cem VURAL

ABSTRACT Ritrodes section in Genus Echinops (Asteracea) in Turkey is represented by Echinops spinosissimus and Echinops orientalis . The aim of this study to detect the similarity and variety of Ritrodes section of Echinops genus which spread naturally in Turkey by practice on In this study, POGP (Peroxidase gene polymorphism) were studied to determine diversity and relationships among 2 species and 2 subspecis of Ritrodes . Fourty two individuals of Ritrodes and 4 outgroup were used in the current study. The 104 polymorphic bands were produced by using selected 14 combinations of forward and reverse POGP primers. The highest number of bands (15) with primer combinations Pox1F/Pox1R and the lowest number of bands (3) with primer combinations Pox11F/Pox11r were obtained. Genetic distances among individuals were between 0.66 and 0.96. This results indicate that the POGP markers used were highly informative and were discussed in terms of their implications for Echinops species.

Keywords: Asteraceae, Echinops , Ritrodes , POGP, Turkey. v

KISALTMA VE SĐMGELER

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism (Çoğaltılmı Fragment Uzunluk Polimorfizmi) cpDNA : Kloroplast DNA

CTAB : Setil 3Metil Amonyum Bromid

DNA : Deoksiribonükleik asit

dH 2O : Distile su dNTP : Deoksiribonükleik asit trifosfat

EDTA : Etilen diamin tetra asetikasit gDNA : Genomik DNA

HCI : Hidrojen klorür

ISSR : Internal Simple Sequence Repeats (Basit Dizi Tekrarları Arası)

M : Molar

MgCI 2 : Magnezyum klorür mM : Milimolar

NaCI : Sodyum klorür

PAGE : Poli Akrilamid Jel Elektrforezi (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

PCA : Principal Components Analysis (Temel bileen analizi)

PIC : Polymorphism information content (Polimorfizm bilgi içeriği)

PZR(PCR) : Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA (Rastgele Çoğaltılmı Polimorfizm DNA) vi

RE : Restriksiyon endonükleaz

RFLP :Restriction Fragment Length Polymorphism (Kesilen Parça Uzunluk Polimorfizmi)

SDS : Sodyum dodesil sülfat

TAE : Tris asetik asit – EDTA

TE : Tris – EDTA

Tris : Trisodyum tuzu

Tm : Çözülme (Melting) sıcaklığı

V : Volt

UPGMA : Unweighted pair group method using arithmetic averages (ağırlıksız aritmetik ortalamayı kullanan çift grup metodu) vii

ĐÇĐDEKĐLER

TEEKKÜR ...... ii

ÖZET ...... iii

ABSTRACT ...... iv

KISALTMA ve SĐMGELER ...... v

HARĐTALAR LĐSTESĐ ...... ix

EKĐLLER LĐSTESĐ ...... x

TABLOLAR LĐSTESĐ ...... xii

1.BÖLÜM GĐRĐ ...... 1

2.BÖLÜM GENEL BĐLGĐLER ...... 5

2.1. Echinops Cinsinin Taxsonomik Sınıflandırılması ...... 5

2.2. Seksiyon Hakkında Bilgiler ...... 6

2.3. Moleküler Sistematik ...... 8

2.4. Türler Hakkındaki Bilgiler ...... 8

2.4.1. Echinops spinosissimus Turra ...... 8

2.4.2. Echinops orientalis Trautv...... 8

2.5. Peroksidazlar ...... 11

2.6. Moleküler Markırlar ...... 12

2.6.1. Moleküler Markır Çeitleri...... 13

2.6.1.1. Morfolojik Markırlar ...... 13

2.6.1.2. Biyokimyasal Markırlar ...... 13

2.6.1.3. DNA Markırları ...... 13

2.6.1.4. RAPD ...... 14

2.6.1.5. RFLP ...... 14 viii

2.6.1.6. AFLP ...... 15

2.6.1.7. Mikrosatellit DNA Markırları (Basit Dizin Tekrarları) ...... 15

2.6.1.8. SNP...... 16

2.6.1.9. SCAR ...... 16

2.6.1.10. SRAP ...... 16

2.6.1.11. ISSR ...... 17

3.BÖLÜM MATERYAL METOD ...... 18

3.1. Bitki Materyalinin Toplanması ...... 18

3.2. POGP Çalımaları Đçin DNA Đzolasyonu ...... 21

3.3. POGP Analizi ...... 23

3.3.1. Primer Özellikleri ...... 23

3.3.2. Agaroz Jel Elektroforezi...... 24

3.3.3. Đstatistiksel Analiz ...... 25

4.BÖLÜM BULGULAR ...... 26

4.1. POGP Analizi ...... 26

4.1.1. Agaroz Jelde Yürütülen Örneklerin Çekilen Fotoğrafları ...... 29

5.BÖLÜM TARTIMA VE SONUÇ ...... 42

KAYNAKÇA ...... 47 ix

HARĐTALAR LĐSTESĐ

Harita 3.1. Echinops orientalis türünün ülkemizdeki yayılı alanları ...... 20

Harita 3.2. Echinops spinosissimus supsp. bithynicus türünün ülkemizdeki yayılı alanları ...... 21

Harita 3.3. Echinops spinosissimus supsp. spinosissimus türünün ülkemizdeki yayılı alanları...... 21

x

EKĐLLER LĐSTESĐ

ekil 2.1. E. orientalis’ e ait habitat fotoğrafı...... 9

ekil 2.2. E. spinosissimus subsp. bithynicus ’e ait habitat fotoğrafı...... 10

ekil 2.3. E. spinosissimus subsp. spinosissimus ’e ait habitat fotoğrafı...... 10

ekil 2.5.: Bayırturpu (Horseradish) peroksidaz izoenzim C’nin yapısı ...... 12

ekil 4.1. Pox1F/Pox1R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 29

ekil 4.2. Pox2F/Pox2R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 30

ekil 4.3. Pox3F/Pox3R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 30

ekil 4.4. Pox4F/Pox4R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 31

ekil 4.5. Pox5F/Pox5R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 31

ekil 4.6. Pox6F/Pox6R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 32

ekil 4.7. Pox7F/Pox7R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 32

ekil 4.8. Pox8F/Pox8R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 33

ekil 4.9. Pox9F/Pox9R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 34

ekil 4.10. Pox10F/Pox10R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 34

ekil 4.11. Pox11F/Pox11R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 35 xi

ekil 4.12. Pox12F/Pox12R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 35

ekil 4.13. Pox13F/Pox13R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 36

ekil 4.14. Pox14F/Pox14R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı ...... 36

ekil 4.15. 14 ileri 14 geri POX primeri kullanılarak elde edilen sonuçlara göre 47 örnek arasındaki benzerliğe göre oluturulan UPGMA dendogram...... 40

ekil 4.16. 14 ileri 14 geri POX primeri kullanılarak elde edilen sonuçlara göre 47 örnek arasındaki benzerliğe göre oluturulan NJ dendogram...... 41

xii

TABLOLAR LĐSTESĐ

Tablo 2.1. Ritrodes taksonlarının tehis anahtarı...... 9

Tablo 2.2. Peroksidazların Sınıflandırılması ...... 11

Tablo 3.1. E. orientalis' in toplama alanları ...... 18

Tablo 3.2. E. spinosissimus subsp. bithynicus 'un toplama alanı ...... 19

Tablo 3.3. E. spinosissimus subsp. spinosissimus‘ un toplama alanı ...... 20

Tablo 3.4. Dı grupların toplama alanı ...... 20

Tablo 3.5. POGP çalımalarında kullanılan ileri primerler...... 23

Tablo 3.6. POGP çalımalarında kullanılan geri primerler...... 23

Tablo 4.1. POGP çalımalarından elde edilen sonuçların istatistik değerleri ...... 26

Tablo 4.2. Dı grupların dahil edilmediği POGP çalımalarından elde edilen sonuçların istatistik değeri ...... 28

Tablo 4.3. 14 ileri 14 geri POX primerleri kullanılarak elde edilen sonuçlara göre 47 örnek arasındaki genetik uzaklıklar...... 37

1. BÖLÜM GĐRĐ

Echinops cinsi 125 ila 130 türle temsil edilmektedir. Çoğunlukla kuzey yarıkürede yayılı göstermektedir. Yoğun olarak tropik Afrika’nın yarı nemli alanları, Kuzey Afrika’nın yarı kurak alanları, Akdeniz havzası ve Orta Asya’ya kadar Avrasya’nın ılıman kuağında yayılı göstermektedir. Genel olarak, birkaç tek yıllık ve iki yıllık tür içeren çok yıllık bir cinstir [1,2].

Echinops L. cinsi Türkiye Florası’nın 5. cildinde Hedge tarafından yazılmıtır. 11. ciltte (ek cilt 2) Güner ve arkadaları tarafından bir ve daha sonra Vural ve arkadaları tarafından bir tür olmak üzere iki tür daha ilave edilmitir [3, 4, 5]. Son flora kayıtlarına göre bu cins, Türkiye’de 23 takson ile temsil edilmektedir (18 tür, 2 alttür ve 3 varyete). 23 taksonun 10’u Türkiye için endemiktir ve cinsin endemizm oranı % 43.47’dur [5]. Echinops bu özelliklerinden ve ülkemizdeki yüksek endemizm oranından dolayı oldukça ilgi çekici bir aratırma konusudur.

Echinops cinsi üyeleri genellikle insanların yaama ortamlarına yakın alanlarda, yol kenarlarında, kurak talık alanlarda, step alanlarda, az olarak da korunmu alanlar ile dağlık bölgelerde yayılı göstermektedir. Çoğu botanikçi bu cinsin taksonlarını toplamaktan kaçınır. Çünkü Echinops dikenli ve hacimli olduğundan toplaması ve preslemesi zordur. Aynı zamanda toplanan örneklerin de kapitulumları kurudukça dağılarak muhafazası çok zor bir duruma gelmektedir. Çoğu herbaryum örneğinde rastladığımız dağılmamı kapitulumlar ise çok genç olduğundan bu örneklerin tehisi oldukça zordur. Çünkü tehisler olgun kapitulum özelliklerine dayanmaktadır [3,6].

Echinops taksonlarının Türkiye’de bilinen ekonomik bir kullanımı yoktur. Yine de bu bitkiler tamamen yararsız olarak değerlendirilemez. Tarım arazilerinde tarla yabancı otu olarak görülen taksonları tarımsal alanlara çok fazla zarar vermez. Çünkü klasik 2

tarımsal tekniklerle kolayca yok edilebilirler. Bu alanlar dıında da dikenli görüntüsünden dolayı çoğu zaman insanlar tarafından tahrip edilmektedir [7].

Echinops cinsinin bazı türleri uzun zamandır peyzaj amaçlı süs bitkisi olarak kullanmak için batı ülkelerinde yetitirilmektedir. Örneğin bazı Echinops türlerinin Batı Avrupa’da yaygın olarak kültürü yapılır. Bu açıdan bakıldığında henüz kullanılmayan pek çok türün de aynı ekilde süs bitkisi olarak değerlendirilebileceği açıktır. Bazı türlerin süs bitkisi olarak değeri, çiçek açmadan önce ya da çiçekli iken taban yaprakların kurumasıyla azalmaktadır. Bu durum ise step ve yarı çöl alanlardaki çoğu tür için geçerlidir [7].

Echinops türlerinin bazıları ise bal üretiminde kullanılır ve bu türlerin bal üretimini artırmak için kültürü yapılır. Bu açıdan düünüldüğünde normalde kültüre uygun olmayan arazilerde kolayca yetitirilip arıcılıkta kullanılabilir [7].

Echinops cinsinin türlerinin bazı hastalıkların tedavisinde kullanıldığı belirtilmektedir. Örneğin Etiyopya geleneksel tıbbında, migren, diyare, kalp ağrısı, enfeksiyonların farklı formları, bağırsak kurdu istilası, hemoroid ve diğer bazı hastalıkların tedavisinde kullanıldığı belirtilmektedir [7,8].

Bazı taksonlar alkoloidler içerir. Yapılan çeitli çalımalar sonucunda bazı hastalıkların tedavisinde Echinops cinsinin kullanımını bilimsel olarak ispatlandığı, Echinops cinsi türlerinin flavanoid ve tiyofen asetilen bileenlerini içerdiği bilinmektedir [9]. Tiyofen asetilen bileeni antihelmintik (bağırsak solucanı düürücü) aktiviteye sahiptir. Bu güçlü antihelmintik aktivite E. longisetus A. Rich. ve E. ellenbeckii O. Hoffm. türlerinin köklerinde güçlü ve çiçeklerinde ise zayıf ekilde görülür [10].

E. longisetus ’un yaprak ve gövde ekstraksiyonlarında bulunan flavanoid bileenlerinin gramnegatif organizmalara karı güçlü inhibitör etkiye sahip olduğu rapor edilmitir. Bu tür organizmalar dıında bazı bulaıcı hastalıkların tedavisinde Echinops cinsi türlerinin kullanılı olduğu; ayrıca yumuakçalar ile yapılan çalımada % 100 öldürücü aktiviteye sahip olduğu gözlenmitir [10].

Çoğu bitki türünde çeitler arasındaki genetik varyasyonu ortaya çıkarmakta hangi moleküler DNA tekniğinin en uygun olduğunu belirlemek amacıyla RFLP, AFLP, 3

RAPD, SSR ve ISSR DNA markır teknikleri karsılatırılmı ve polimorfizm bakımından SSR ve AFLP teknikleri, maliyet bakımından RAPD ve ISSR teknikleri, tekrarlanabilirlik bakımından RFLP, SSR, ISSR ve AFLP DNA tekniklerinin avantajlı oldukları belirlenmitir [12].

Genetik çeitlilik bir türün hayatta kalabilmesi veya yaadığı ortama adapte olabilmesinde büyük bir role sahiptir. Bu yüzden büyük oranda genetik çeitliliğe sahip olan türler hayatta kalma mücadelesinde daha avantajlı bir konuma sahiptirler. Alternatif gen kaynaklarına sahip olmayan türler ise büyük bir risk altındadırlar. Özellikle genetik çeitliliğin az olduğu bitkiler yaygın hastalıklara karı aırı derecede hassastırlar [11]. Bitki genetik çeitliliğinin tanımlanmasında morfolojik markırlar, biyokimyasal markırlar ve DNA markırları yoğun olarak kullanılmaktadır. Morfolojik markırlar çevre koullarının etkisi altında kalabildiklerinden ve kısıtlı olmalarından dolayı karakterizasyon çalımalarında kullanım limitleri azdır. Aynı ekilde biyokimyasal markırların da polimorfizm seviyesinin düük olması, bu markırların kullanımını da sınırlandırmaktadır. Bitki gen kaynaklarının karekterizasyonunda DNA markır sisteminin seçimi; aratırmanın amacına göre, populasyonun yapısına, çalıılan bitki türün çeitliliğine, markır sisteminin çalıılacak laboratuarda bulunma durumuna, analiz için gerekli zamana ve maliyete bağlı olarak değiir. Her bir markır sistemi avantaj ve dezavantajlara sahiptir [12]. Peroksidazlar düük maliyetleri ve yüksek derecede polimorfizm gösterdiklerinden dolayı bitkiler aleminde yaygın bir markır olarak kullanılabilirler [13]. Peroksidaz gen polimorfizm (POGP) markırlarının farklılığı, maruz kalınan stres faktörlerini yansıtabileceği için farklı coğrafik bölgelerde bulunan bitki genotipleri arasındaki akrabalığı tanımlamada, biyotik ve abiyotik stres varlığında oluan gen ifadesi çalımalarında da kullanılabilirler [14].

Türkiye’de yayılı gösteren Asteraceae familyasından E. orientalis türünün ve E. spinosissimus türünün iki alt türü (E. spinosissimus Turra subsp. bithynicus (Boiss.) Greuter, E. spinosissimus Turra subsp. spinosissimus Greuter) bu çalıma için belirlenmitir. Tüm alttürlerinin ayrımında yaprak morfolojisi, tüy örtüsü ve tüy örtüsünün gövde üzerinde dağılımı eklindeki morfolojik farklılıklar kullanılmaktadır [3]. Fakat Ritrodes seksiyonuna ilikin polimorfizme yönelik POGP markır sistemi kullanılan bir çalımaya rastlanmamıtır. Bu çalımada ülkemiz biyoçesitliliğine katkısı bulunan Echinops cinsinin Türkiye’de yetien taksonlarının, DNA marker 4

tekniklerinden biri olan PCR (Polimerase Chain Reaction) yöntemini kullanılmıtır. Bu çalımayla taksonlar arasındaki genetik iliki ve çeitliliğe spesifik primerlerle moleküler düzeyde açıklık getirilmesi amaçlanmıtır. Kullanılan bitkiler çesitli zamanlarda gerçekletirilen arazi çalımalarından elde edilmi ve saklanmı herbaryum örnekleridir.

2. BÖLÜM GEEL BĐLGĐLER

2.1. Echinops Cinsinin Taxsonomik Sınıflandırılması

Alem : Plantae

Bölüm : Magnoliophyta Cronquist, Takht. & Zimmerm. ex Reveal

Sınıf : Magnoliopsida Brongn.

Altsınıf : Asteridae Takht.

Takım : Asterales Lindl.

Familya : Asteraceae Martynov

Cins : Echinops L.

Familyanın ismi yıldız eklinde çiçeklere sahip olan Aster cinsinden gelmektedir. Cinse ait bitkilerin yaprakları basit durumda, çiçekleri ise kapitulum durumundadır. Bunlarda kapitulum birçok küçük veya florat olarak adlandırılan çiçekler; küresel bir reseptakulum veya diskten çıkarlar. Bütün kapitulum fillari olarak adlandırılan involukral brakteler tarafından sarılmıtır. Bunlar birkaç seri halinde ve imbrikat dizilmitir [15].

Braktenin ikinci bir tipi de bulunabilir. Bu yapı reseptakulum üzerinde bireysel çiçeklerin tabanında bulunur. Fakat braktelerde bulunmaz, çıplaktır. Reseptakulum (çiçek tablası) tüyler, dikenler ve oyuklar taır. Kapitulumda bulunan çiçekler çift eeyli, aktinomorftur. Çiçeklerin yalnızca bir periyant serisi iyi gelimitir. Kaliks pappus olarak adlandırılan tüysü ekilde ya da tamamen indirgenmitir. Korolla 5 petallidir. Her bir çiçeği örten 15 – 35 adet fillari vardır. Androkeum 5 stamenli, 6

anterleri birleik, filamentleri serbesttir (singenezik). Ginekeum tek karpelli ve tek odalı; ovaryum üst durumludur. Meyve akendir [15].

Cinse ait bitki örnekleri genellikle iki yıllık ya da çok yıllık dikenli bitkiler olmakla beraber oluklu gövdeleri dik olarak yükselir. Yapraklar basit 3 pinnatisekt, petiolat ya da sesil olabilir. Korolla erdiil, küresel ba üzerinde (pseudocephalia) korolla kalabalık ve çok sık dizililidir. Fillariler genellikle pluriserrat, imbrikat veya üst üste çevrili dizilmi her bir fillari birbirinden farklılamıtır. Bralar genellikle beyaz saç eklinde, uçları spatulat, uçlarda genilemi veya indirgenmi olabilir. Hermafrodit çiçekler tubular, mavi, yeil veya beyaz renkte olabilirler. Aken oblong, silindirik formlarda ve yoğun villusludur. Papuslar taç (Coroniform) biçimindedir [16,17].

2.2. Seksiyon Hakkında Bilgiler

Türkiyede yayılı gösteren Ecihops ’a ait bitki örneklerini Türkiye florasında Hedge (1975) üç seksiyon ( Echinops , Ritro, Oligolepis ) altında 18 taksonu sınıflandırmıtır [16]. Güner ve arkadaları (2000) tarafından E. mersinensis yeni tür olarak Echinops seksiyonuna eklenmitir [5]. Vural ve arkadaları (2010) E. dumanii yeni tür olarak Oligolepis seksiyonuna eklenmitir [4]. Ülkemizde yayılı gösteren üç seksiyondan birinin Türkiye Florası’ndaki ismi sinonim olmutur. Bunge (1863) Rytrodes seksiyonunu E. orientalis Trautv. tip türü ile yayınlamıtır [17]. Ancak bu seksiyon 1979’da Greuter ve Rechinger tarafından yine aynı tip türle Ritropsis seksiyonunun sinonimi yapılmıtır [18].

Echinops seksiyonunun genel özellikleri: Gövde tek, ya da çok sayıda, tabandan itibaren ve üst kısımda bolca dallanır, dik ya da yükselici, 40–65 cm, 1,6 –6,5mm çapta, bazen oluklu, üst kısımlarda glandular tüyü yok, yoğun, beyaz tomentoz ya da lanat tüyler ile örtülü. Alt kısımlarda ise glandular tüyler büyüklü küçüklü iki farklı boyda, gövdenin alt kısımlarında yoğundur. Yaprak meinimsi (coriaceus) darca lansolat’tan linear eliptik’e kadar, 12 adede kadar düz ya da pinnatifid linear segmentli pinnatisekt yaprakları vardır. Yaprak kenarı, batıcı dikenli ve geriye kıvrık (revulate). Yaprak üst yüzeyinde araknoid ya da seyrek lanat tüyler bulunur, glandular tüyler bulunmaz nadiren kısa glandular tüylere rastlanır. Alt yüzey yoğun, beyaz lanat tüylü, glandular tüyler de bulunabilir. Çiçek durumu balar 3,5 – 6 cm arasında, mavi. Kapitulum 1,5 – 2,5 cm boyunda, brush genelde seyrek, 3–7 (8) mm. Fillariler 20–24, glabroz, en 7

dıtakiler ort. 4,5 mm, ortadakiler ort. 9 mm, en içtekiler ort. 14 mm, tabanda hafifçe birlemi. Korolla açık ya da koyu mavi, tüp 5–8 mm, loplar 8 mm’ye kadar. Papuspentagonal ekilli, tüyleri 1,5–2 mm, tabanda boylarının yarısına kadar birleik. Meyve 5–7 mm boyunda [19].

Ritrodes seksiyonunun genel özellikleri: Gövde bir ya da çok sayıda, fazlaca dallanır, 3 m’ye kadar. 25 mm çapına kadar genilemektedir. Morumsu glandular seta ve lanat ya da araknoid tüy örtüsü bulunur. Yapraklar oblonglanseolattan oblonga kadar değien genel ekilde, 2 pinnatisekt; üst yüzey yoğun glandular; alt yüzey lanat ve damarlar salgı tüylü. Farklı boyutlarda çok sayıda diken bulunur. Balar 10 cm’e kadar çapta. Kapitulum 25–40 mm, tüysü fillariler (brush) 1024 mm. Fillariler 1824 adet; en dıtakiler, glabroz, puberuloz yada glandular 917 mm; orta sıradakiler ort. 18 mm, uçlarında uzun dikensi çıkıntılar varsa 35 mm’ye kadar boya sahiptir. En içtekiler 20–25 mm uzunluklarının yarısına kadar zayıfça birlemi. Korolla koyu mavi, mavi ya da soluk mavi. Tüp 10–18 mm, salgı tüylü; loplar 10–14 mm. Papus 1 mm, uzunluklarının yarısına kadar birlemi. Aken 7–12 mm [19].

Oligolepis seksiyonunun genel özellikleri: Gövde çok sayıda bir arada, dik ya da yükselici, yapraklı, soliter ya da üst tarafta 2–3 dallı, 15 mm’ye kadar kalınlıkta, 30–60 cm boyunda, hafifçe oluklu (sulcate), seyrek lanat tüylerle kaplı, kahve rengikızıl renkte görünür, üst kısım genellikle salgı tüylü taban glabroz, yüksek alanlardaki bireylerin gövdesi tamamen salgı tüysüz. Yaprak kenarları düzensiz, 1 cm’e kadar uzun, ince dikenli. Genel görünüü oblongeliptik, eliptikten ovat’a kadar değiebilir, basit, 4 7 loplu, Üst yapraklar sapsız ve hafifçe gövdeyi sarar (amplexicaule), aurikulatkordat. Üstü yoğun salgı tüylü, alt yüzey yoğun lanat tüylü seyrek salgı tüyleri var. Salgı tüyleri damarlar üzerinde bolca bulunur. Çiçek durumu balar çiçekte iken 5 cm’ e kadar; meyvede iken 8 cm’e kadar çapa sahip olabilir. Kapitulum 16–35 mm boyunda, çiçekte ort. 16 mm boyunda ve 3 mm eninde iken meyvede ort. 8 mm’ ye kadar geniler ve 35 mm’ ye kadar uzar. Brush seyrek, 5–12 mm. Fillariler meyvede koyu kahverengi olur, sayısı (19)20–24, tamamı glabroz, pektinatsiliat kenarlara sahip . En dıtakiler 7 mm (meyvede 10 mm) civarında, ortadakiler geniçe obovat ort. 30 mm, en içtekiler meyvede 1628 mm civarında, boylarının en az yarısına kadar kaynaarak birlemi. Korolla koyu mavi, tüp 6–9 mm, loplar 7,5–13 mm. Papus pentagonal ekilli, tüyleri 2– 8

3 mm, tabanda boylarının yarısına kadar birleik. Aken eliptik, 15–16,5 mm boyunda, 5–5,5 mm eninde[19].

2.3. Moleküler Sistematik

Uzun yıllar boyunca aratırmacılar dünyadaki biyolojik çeitliliği anlamaya ve değerlendirmek için büyük bir çaba göstermilerdir. 17. yy’da Linnaeus tarafından yapılan hiyerarik tabanlı sistem, bu biyolojik çeitliliği sınıflandırmada ve tanımlamada temel oluturmutur. Linnaeus’tan sonraki aratırıcılar ise filogenetik akrabalıkların önemini ön plana çıkarmı ve böylece moleküler sistematik diye adlandırılan yöntem sistematikte yer almaya balamıtır [20]. 1960’larda moleküler sistematiğin temelini oluturan genetik materyalin yani DNA’nın kefi ile bu alandaki çalımalar daha da hızlanmıtır. Moleküler sistematik alanındaki ilerlemeyle elde edilen sonuçlar morfoloji temelli sistematik yaklaımını tamamen devre dıı bırakmasa da, filogenetik çalımalarda moleküler düzeyde bir yaklaımın daha güçlü sonuçlar elde edeceğini ortaya koymutur [21].

2.4. Türler Hakkındaki Bilgiler

Türkiye Florası’nda Hedge (1975) E. spinosissimus , Avrupa florasında Kuzharov (1976) E. spinossimus ’un sinonimi olarak tanımlamıtır [17]. Bu çalımada Hedge’nin sistematik tanımlamaları uygun görülmütür.

2.4.1. Echinops spinosissimus Turra

Gövde birkaç noktadan dallanmı, 1,5 m boyunda veya daha fazla, güçlü, oyuklu, sert ve morumsu çok hücreli salgı tüyler mevcuttur. Yapraklar oblonglanseolat, oblong ekilde, yaprak kenarı 23 pinnatisekt, yaprağın üst yüzeyi yoğun salgı tüylü, alt yüzeyi beyaz lanat tüylü ve salgı tüyler damarların üzerinde mevcuttur. Dikenleri farklı boylardadır. Çiçek durumu 10 cm çapından fazla ve her bir sapta birkaç tanelerdir [3].

2.4.2. Echinops orientalis Trautv.

Gövde üst kısımlarından birçok dala ayrılmı, 11,5 m boyunda, göreceli olarak ince, kahverengimsi, gövdenin alt kısımlarında çok yoğun ve sert, uzun saplı salgı tüyleri (capitat glandular) mevcuttur. Yapraklar 23 pinatid ya da pinnatisekttir. Lamina yoğun olarak glandular tüylerle örtülü, nadiren de ağsı tüyler de bulunmaktadır. Kapitulumun boyu 47 cm arasındadır. Çiçekler ise 2030 mm, kısa ve uzun fillariler 620 mm, 9

sayıları 2025 adettir. Dı fillariler 812 mm’dir. Korolla mavi, soluk mavi ya da beyazımtıraktır. Tüp boyu 1215 mm, lop boyu 812 mm’dir [3].

Tablo 2.1. Ritrodes taksonlarının tehis anahtarı [3].

1. Gövde morumsu, çok hücreli salgı tüyleri ile lanat tüyler var yada lanat tüyler bulunmaz uzun salgı tüyleri bulunur. Gövde beyaz veya pembemsidir...... 2. 1. Gövde yukarıdaki gibi değildir. Yoğun bir ekilde kısa salgı tüyleri ile örtülmü. Gövde rengi kahverengimsidir...... E. orientalis

2. Gövde yoğun lanat tüylerle kaplı, nadiren birlikte araknoid tüy de mevcuttur. Yer yer dağınık ve morumtrak setalar görülür...... E. spinosissimus subsp. bithynicus

2. Gövdede lanat tüy bulunmaz. Yoğun bir ekilde morumsu glandular setalar ya da tüylerle kaplıdır. .. E. spinosissimus subsp. spinosissimus

ekil 2.1. E. orientalis’e ait habitat fotoğrafı [19]. 10

ekil 2.2. E. spinosissimus subsp. bithynicus ’e ait habitat fotoğrafı [19].

ekil 2.3. E. spinosissimus subsp. spinosissimus ’e ait habitat fotoğrafı [19]. 11

2.5. Peroksidazlar

Hayvan, bitki ve mikroorganizma dokularındaki enzimlerin bir sınıfı olan peroksidazlar, peroksit (H 2O2) veya oksijen (O 2)’in varlığında bileikleri oksitleyebilen proteinlerdir

[22]. Peroksidaz H2O2’yi kullanarak fenoller ve hidrokinonlar gibi çok sayıda aromatik bileenlerin dehidrojenasyonunu katalizleyen [23] Hem yapısına sahip proteinlerdir [24, 25]. Hem grubundaki Fe (demir) katalitik aktiviteden sorumludur. Çoklu moleküler formlara ve geni bir hücre altı dağılımına sahip olan peroksidaz, bitkilerde büyük oranda bulunur. Peroksidazların yüksek sıcaklıktaki stabilliği ve aktivitelerinin basit kromojenik reaksiyonlarla kolayca ölçülmesinden dolayı, protein yapısı, enzim reaksiyonları ve enzim fonksiyonu çalımalarında model bir enzim olarak kullanılmaktadır [22].

Peroksidazlar yapısal ve katalitik özellikleri temel alındığında 3 sınıfa ayrılırlar [26]. Sınıf I peroksidaz ailesi hayvanlarda glutatyonperoksidaz, miyeloperoksidaz, eozinofilperoksidaz, laktoperoksidaz, ve prostoglandinperoksidaz sentazın bazı kısımları gibi enzimleri içerir. Glutatyonperoksidaz, hayvan peroksidazları arasında gösterilmesine rağmen aktivitesi bitkilerde de saptanmıtır [27]. Sınıf II peroksidaz ailesi, hayvan, bitki, bakteri, mantar ve mayalardaki katalazlardan meydana gelir. Sınıf III peroksidaz ailesi, bitki, mantar, bakteri ve mayalardaki peroksidazlardan meydana gelir [28].

Tablo 2.2. Peroksidazların Sınıflandırılması [27]

Üst sınıf Sınıf Üye (EC Numarası) Orijin Moleküler Ağırlık (kDa)

Hayvan peroksidazları Eozinofilperoksidaz (EC 1.11.1.7) Hayvan 5075 Laktoperoksidaz (EC 1.11.1.7) Hayvan 7885 Miyeloperoksidaz (EC 1.11.1.7) Hayvan 79150 Troidperoksidaz (EC 1.11.1.7) Hayvan 90110 Glutatyonperoksidaz (EC 1.11.1.9) Hayvan ve Bitki 622 ve 75112 Prostaglandin endoperoksit sentaz (EC 1.14.99.1) Hayvan 115140

Katalaz Katalaz (EC 1.11.1.6) Hayvan, bitki, mantar ve maya 140530

Bitki Peroksidazları I sitokrom c peroksidaz (EC 1.11.1.5) Maya ve bakteri 3263 Katalaz peroksidaz (EC 1.11.1.6) Bakteri ve mantar 150240 Askorbat peroksidaz (EC 1.11.1.6) Bitki 3058 II Manganez bağımlı peroksidaz (EC 1.11.1.13) Mantar 4349 Ligninaz (EC 1.11.1.14) Mantar 4043 III Peroksidaz (EC 1.11.17, POX) Bitki 2860

12

Bitki peroksidazları geni bir multigen ailesi tarafından kodlanırlar. Bitki peroksidazları lignifikasyon [29], suberizasyon [30], oksin metabolizması [31], hücre duvar proteinlerinin bağlanması [32], patojen ataklarına karı koruma [33], tuz toleransı [34], senesens [35], çimlenme [36] ve oksidatif stres [22] gibi birçok fizyolojik olaylarda çok önemli görevler üstlenirler.

Primer yapılarındaki farklılıklardan dolayı bitki peroksidazları kendi içlerinde 3 farklı sınıfa ayrılırlar [37]. Sınıf I bitki peroksidazları, intraselüler peroksidazları içerir [38]. Sınıf II bitki peroksidazları ekstraselüler peroksidazları içerir. Sınıf III bitki peroksidazları hem intraselüler hem ekstraselüler peroksidazları içerir.

Peroksidazlar, distal ve proksimal hem bağlama domaini ve fonksiyonu tam olarak belirlenememi bir merkezi domain olmak üzere üç tane yüksek derecede korunmu bölge içerirler [22].

ekil 2.4.: Bayırturpu (Horseradish) peroksidaz izoenzim C’nin yapısı (HRPC). SP: Nterminal sinyal peptidi, CE: Cterminal uzantısı, I: distal hembağlama domaini, II: merkezi korunmu bölge, III: proksimal hembağlama domaini, Hd: distal histidin, Hp: proximal histidin, C1’den C8’e: sekiz sistein kalıntısı [39, 40].

2.6. Moleküler Markırlar

Moleküler markır ile genomda herhangi bir gen bölgesi ya da gen bölgesi ile ilikili DNA parçası temsil edilmektedir. Son yıllarda moleküler genetik alanındaki gelimelere paralel olarak moleküler markır (belirteç) çeitlerinin de artması genom analizlerinde ve bitki genetiği çalımalarında devrim niteliğinde gelimelere yol açmıtır. Moleküler markır yöntemleri DNA molekülündeki polimorfik bölgelerin çoğaltımındaki farklılığın saptanması amacıyla çeitli tipteki primerlerin ve Polimer Zincir Reaksiyonu (PCR) metodunun kullanımına dayanır [41]. 13

2.6.1. Moleküler Markır Çeitleri

2.6.1.1. Morfolojik Markırlar

Morfolojik özellikleri tek genle kontrol edilebilir ve genetik markır olarak kullanılabilir. Görsel olarak değerlendirilebilen kalitatif özelliklerdir. Bu markırlar bitki doğasında vardır ve mutasyon sonucu ortaya çıkmılardır. Morfolojik markırların kullanım potansiyelleri uzun bir süredir bilinmesine rağmen sınırlı sayıda olmaları nedeniyle pratikte uygulanabilirliği kısıtlı kalmıtır [42].

2.6.1.2. Biyokimyasal Markırlar

Biyokimyasal markırlar genlerin ürettikleri proteinlerdeki polimorfizminden elde edilir. Đzoenzimler farklı olarak yüklere sahip proteinlerdir. Elektroforez tekniği kullanılarak kolayca ayrılabilirler. Enzimler spesifik biyokimyasal reaksiyonları katalizlerler. Belirli enzimlerin substrat ve kofaktörleri eklenerek jel üzerinde görülmesi sağlanır ve enzimatik reaksiyonların ürünleri renkli olarak üretilir. Renkli ürünler jel üzerinde görülür bantlar oluturur. Bu bantlar genetik temellere sahiptir ve kodominant markır olarak genetik bilgi sağlar. Bununla birlikte morfolojik karakterlere göre çok daha yaygın kullanılmakla birlikte izoenzim lokuslarının azlığı ve bazı enzim sistemlerinin çevre koullarından etkileniyor olması kullanımlarını sınırlar [42].

2.6.1.3. DA Markırları

Moleküler markırlar DNA’nın aktif bölgelerinden veya herhangi bir genetik kodlama fonksiyonuna sahip olmayan DNA dizilerinden gelitirilebilirler.

Her biri ökaryotik DNA’daki özelliklere dayalı olarak tasarlanan ve kalıtsal olarak izlenebilen moleküler markırlar günümüzde bitki moleküler biyolojisi alanında yoğun bir ekilde kullanılmaktadır. Moleküler markırların bitki moleküler biyolojisinde kullanıldığı alanlara örnek olarak bitki genom haritalanması, markırlar yardımıyla ıslah, gen klonlama, tohum saflığı testleri ve saflık tayini verilebilir.

DNA markırları kullanılarak genetik çeitlilik aratırılabilir. Örneğin birbirlerine çok yakın olan kültür çeitleri ayrılabilir ve tanımlabilir. Türlerin taksonomik tanımlanması yapılabilir ve filogenetik akrabalıkları bulunabilir [42]. 14

2.6.1.4. RAPD

Genetik polimorfizmin taranmasında kullanılan moleküler tekniklerden bir tanesi Rasgele Çoğaltılmı Polimorfik DNA (RAPD) yöntemidir. PCR tekniği ilk defa DR. Alec Jefferys ve arkadaları tarafından 1986 yılında Leicester Üniversitesi’nde insanlar üzerinde uygulanmı ve aynı yıl Nobel Ödülü’nü almıtır. Daha sonra diğer canlılarda yoğun bir ekilde uygulanmasına balamıtır [43].

RAPD yöntemi ilk tanımlandığından itibaren önemli bir değiikliğe uğramamıtır. Rasgele dizilerden oluan oligonükleotit dizileri, kalıp DNA kullanılarak PCR ile çoğaltılır. Bu teknikte 910 baz çifti uzunluğundaki primerler kullanılmaktadır. Reaksiyon baına tek primer ve 1025 ng DNA gerekmektedir. Genomik DNA; primer, DNA polimeraz, dNTP, magnezyum ve uygun bir tampon çözelti varlığında PZR cihazında çoğaltılır. Uygun bağlanma ısısı ve reaksiyon artları sağlandığında primerlerin kendileri ile homolog DNA dizilerine bağlanması ve dur kodonuna kadar sentezin devam etmesini sağlanır. Polimorfizmlerin varlığı, primer bağlanma noktalarındaki mutasyon ve dizi değiikliklerinin sonucu olarak bantların varlığı ve yokluğuna dayalı olarak tespit edilir. RAPD markırları genelde dominanttır. RAPD PCR yöntemi ile çoğaltılan ürünler; elektiriksel alanda uygun tampon bulunan ortamda, jel elektroforezinde yürütülür [44].

2.6.1.5. RFLP

Bu markır, çeitli ekillerde etiketlenmi bir DNA parçasının aratırılan bir DNA örneğindeki benzer veya aynı diziliteki DNA’ya melezlenebilmesini baz almaktadır. Bu teknik RFLP analizi ile çok yaygın bir kullanım alanı bulmutur.

RFLP analizi dokulardan izole edilen genomik DNA’nın nükleik asit dizililerini tanıyan DNA kesim enzimlerince spesifik olarak kesilmesi ve prob DNA’nın melezlendiği DNA etrafındaki farklı kesim yapılarının saptanması esasına dayanır. Genomik DNA’nın kesimi tipik olarak 46 nükleotid tanıyan enzimlerce yapılır. Kesim sonrasında DNA bir jel destek sistemi içinde elektroforeze tabi tutulduğunda taıdığı negatif yüklerden dolayı pozitif yöne doğru hareket edecektir. DNA’nın bu hareketi kütlesinin logaritması ile ters orantılıdır. Kesilen parçalar elektroforez sonucunda jel içinde büyüklüklerine göre sıralanırlar. Bu sıralama sonrası DNA jel ortamdan daha 15

kullanılı olan naylon filtrelere tek iplik halinde Southern Transfer Metodu’yla transfer edilir [45].

2.6.1.6. AFLP

AFLP tekniği, toplam kesim yapılmı genomik DNA’dan elde edilen restriksiyon fragmentlerinin selektif PCR amplifikasyonu ile çoğaltılması prensibine dayanmaktadır. AFLP markır tekniğinde PZR ürünleri floresan boyalarla veya radyoaktif maddeler ile iaretlenerek tespit edilebilmektedir. Floresan boyalarla tespit radyoaktivite ile tespite göre daha hassas olduğu için DNA’nın daha fazla seyreltilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. PZR ürünlerine denatüre poliakrilamid jelde ayrımlanırlar. AFLP yöntemi avantajlı olan bir metottur. Bu metot ile çok sayıda polimorfizm elde edilebilmektedir. AFLP metodu ile yüksek çözünürlükte haritalama kalitesi elde edilebilmektedir. AFLP tekniğinde zaman ve maliyet verimi, tekrarlanabilirlik, çözünürlük diğer markırlara göre daha iyi veya eit seviyededir. Ancak kodominant markırlar elde edilemez, elde edilen markırlar dominanttır. Geni uygulama alanıyla; sistematik, populasyon genetiği, DNA ve parmakizi analizi çalımalarında yararlanılmaktadır [46].

2.6.1.7. Mikrosatellit DA Markırları (Basit Dizin Tekrarları)

Mikrosatellit veya basit dizin tekrarları (Simple Sequence Repeats = SSR) nisbeten yeni tip DNA markırları olarak bilinmektedir. Mikrosatellitler, herhangi bir canlı organizma genomunda ardı ardına dizilmi, genellikle 2 ile 5 baz çifti uzunluğunda olumu DNA tekrarlarıdır. Bu tekrarlar genellikle 10 veya daha fazladır. Mikrosatellit tekrarlamaları tam tekrar, eksik tekrar veya karıık tekrarlar olarak bitki genomunda bulunmaktadır.

Mikrosatellitler, dizi tekrarlarını kapsayacak ekilde gelitirilen iki primer yardımıyla PZR ile çoğaltılabilir. Herhangi iki bitki veya birey arasındaki farklılık dizilerin tekrarlanma sayılarındaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Herhangi bir mikrosatellit lokusu bir veya birden fazla allele sahip olabilir.

Mikrosatellit markırlar kodominant kalıtım göstermekte olup, farklı melezlerden oluturulan genetik haritalar arasında kolaylıkla kullanılabilirler. Buna karılık dominat (baskın) kalıtım gösteren RAPD gibi markır sistemlerinde her bir melez için ayrı bir genetik harita oluturma zorunluluğu vardır. Tek lokus markırları olmaları nedeniyle 16

skorlamaların yapılması, genetik analizleri ve gen haritalarının oluturulması, multi lokuslu DNA markırlarına göre daha kolaydır [47].

2.6.1.8. SP

DNA dizisinde, aynı pozisyonda farklı nükleotidlerin ortaya çıkarılmasında kullanılmaktadır. Đnsanda her 100300 baz çiftinde SNP’ler görülmektedir. SNP, kodlanan bölgelerdeki protein fonksiyonları ile direk ilikilendirilebilir. Atasal kalıtımda sabit olduğundan dolayı seleksiyon için uygun iaretleyicileridir. Son yıllarda, insan genetik hastalıklarının aratırılmasında, insan evrim çalımalarında ve çeitli çiftlik hayvanları üzerinde yapılan aratırmalarda tercih edilmektedir. Đnsan genom haritalamasında, insan evrimi ile ilgili çalımalarda da kullanılmaktadır. Ayrıca diğer hayvanlar ile ilgili genom projelerinde geni ölçüde kullanılmaya balanmıtır [44].

2.6.1.9. SCAR

Bireysel RAPD parçalarından köken alan PCR tabanlı markırlardır ancak uzun, özel primerlerin kullanımıyla tanımlanırlar. Spesifik SCAR markırlarını elde etmek için RAPD veya ISSR parçaları jelden kesilir, klonlanır ve dizi analizi yapılır. Dizi analizinden sonra genellikle 2025 baz uzunluğundaki parçaların terminal bölgeleri için SCAR primerleri seçilir [48].

2.6.1.10. SRAP

SRAP patates pirinç, kıvırcık, kereviz gibi pek çok üründe baarıyla kullanılmı yeni, basit ve güvenilir PCRtabanlı markır sistemidir. Pek çok yayın SRAP marker sisteminin genetik çeitlilik analizlerinde, kültürlerin tanımlanmasında ve filogenetik çalımalarda çok etkili bir araç olduğunu göstermitir. Ferriol ve ark. (2003) SRAP markırlar tarafından verilen bilginin morfolojik çeitlilik ve morfotiplerin evrimsel geçmii ile AFLP markırlarından daha uygun olduğunu bildirmitir [49].

SRAP, bitkilerde genetik farklılık çalımaları için son dönemlerde gelitirilmi bir moleküler markır sistemidir. ISSR’dan farklı olarak SRAP tekniği primer dizilerinin kendine has dizaynını kullanarak genomdaki kodlanmı dizileri hedefler ve bir kısım kodominant markırların tanımlanmasında sonuçlanır. SRAP primerleri, 17 veya 18 nükleotid uzunluğundadır. 13 veya 14 bazlık bir öz dizi ve bunun içinde 5’ucunda spesifik olmayan 10 veya 11 nükleotidden oluur, bu diziyi forward primerde CCGG ve 17

reverse primerde AATT izler. SRAP markırları genetik farklılığı belirlemek ve aynı zamanda gen iaretleme ve genom hatiralanması için kullanılı bir yöntem olarak tanımlanmıtır [48].

2.6.1.11. ISSR

Mikrosatelitler genellikle az çok tüm genoma yayılmılardır. Bununla birlikte, bu dizileri bol miktarda içeren bölgeler bulunmu ve “SSR Hot Spots” olarak isimlendirilmitir. Böyle bölgeler ISSR markır kaynakları olarak ilev görebilirler.

ISSR teknolojisi ters düzenlenmi yakın aralıklı mikrosatelitlerin arasındaki bölgelerin (100300bç) amplifikasyonuna dayanmaktadır. Bu bölgelerin amplifikasyonu için kullanılan 1618 bç uzunluğunda tek primerleri içeren çok sayıda basit dizi tekrarları herhangi bir SSR motifi ve 5’veya 3’ucuna bağlanmı tesadüfi seçilmi nükleotidlere dayanabilir. Ayrıca bağlanmamı primerler de kullanılmaktadır. PZR ürünlerine belirsiz SSR bölgeleridir. ISSR’lar genellikle bir reaksiyonda 2050 ürün çoğaltabilirler. Basmati ve non Basmati pirinç çeitleri arasındaki genetik akrabalığı ortaya koyan Nagaraju ve ark.(2002) tarafından gösterildiği gibi oluan bantların sayısı motifin tekrarlayan biriminin nükleotid sayısı ile ters orantılı olabilir. Bu metodun en büyük avantajı genomik kütüphanelerin yapım aaması pahalı değildir ve çok fazla zaman gerektirmez. ISSR markırları daha çok dominant kalıtım gösterirler; eğer mikrosatelitlerde primerlerin bağlanma bölgeleri arasındaki mesafe değimise nadiren kodominant kalıtım gösterirler. ISSR markırları özellikle filogenetik çalımalar genetik çeitliliğinin değerlendirilmesi ve kültürlerin tanımlanması çalımaları için uygundur. ISSR markırların kolaylığı onları gen iaretleme için de öncül kılar [48]. 3. BÖLÜM MATERYAL METOD

3.1. Bitki Materyalinin Toplanması

Aratırmamızın materyallerini TBAG106T526 numaralı TÜBĐTAK projesinde toplanan örnekler oluturmaktadır. Erciyes Üniversitesi Biyoloji Bölümü Herbaryumu’nda saklanmaktadır. Toplanan bitki örnekleri ., Tablo 3.1., Tablo 3.2. ve Tablo 3.4.’de verilmitir. Örnekler tabloda belirtilen tarihlerde ve bölgelerden toplanmıtır. Ritrodes seksiyonuna ait taksonların türkiyedeki yayılıları Harita 3.1., Harita 3.2. ve Harita 3.3.’de verilmitir.

Tablo 3.1. E. orientalis' in toplama alanları

Örn. Top. o: Toplama Yeri Rakım Tarih GPS Toplayıcı o: Koordinatları 1 CV3743 Bursa; Orhangazi, Đznik Gölü 80 m 23.08.2005 40 025.779 1 K Cem VURAL kenarı 29 020.674 1 D 2 CV4290 Afyon, Banoz Afyon 25. km. 1135 m 11.07.2007 38 047.568 1 K Cem VURAL 30 016.979 1 D 3 CV3740 Ankara, Çevre yolu Eskiehir 1023 m 19.08.2005 39 048,049 1 K Cem VURAL çıkıı. 32 047.477 1 D 4 CV3739 Kırehir, Kırerhir’e 1 km. 1042 m 19.08.2005 39 008.373 1 K Cem VURAL 34 010.813 1 D 5 CV4411 Tokat, Erba, ErbaNiksar 23. km. 287 m 22.08.2007 40 035.334 1 K Cem VURAL 36 050.431 1 D M.Y.DADANDI 6 CV4417 Giresun, iranKalkit arası. 1584 m 22.08.2007 40 009.776 1 K Cem VURAL Çilhoroz geçidi. 39 017.053 1 D M.Y.DADANDI 7 CV4439 Bayburt, Gümhane 23. km. 1589 m 24.08.2007 40 000.343 1 K Cem VURAL 40 020.444 1 D M.Y.DADANDI 8 CV4444 Erzurum, Akalekaz 15 km kaz 1763 m 24.08.2007 39 058.657 1 K Cem VURAL dağı 40 033.816 1 D M.Y.DADANDI 9 CV4448 Ağrı, Diyadin yol ayrımı 1747 m 25.08.2007 39 034.418 1 K Cem VURAL Doğu Beyazıt 17. Km. 43 049.227 1 D M.Y.DADANDI 10 CV4466 Bingöl , Bingöl Karlıova 12. km. 1151 m 26.08.2007 38 055.649 1 K Cem VURAL 40 037.133 1 D M.Y.DADANDI 11 CV4467 Elazığ , ElazığBingöl 114. km. 1548 m 26.08.2007 30 056.983 1 K Cem VURAL 40 010.696 1 D M.Y.DADANDI 12 CV4378 Malatya, KozlucaDarende 6.km 1809 m 06.08.2006 38 020.430 1 K Cem VURAL 37 037.883 1 D M.Y.DADANDI 13 CV4477 Mara, Ahır dağı 1649 m 07.07.2007 36 032.262 1 K Cem VURAL 29 010.414 1 D M.Y.DADANDI 14 CV4502 Adana, Ceyhan Gölovası köyü 10 m 02.07.2008 36 046.371 1 K Cem VURAL 35 045.420 1 D 19

Tablo 3.1.’in devamı

Örn. Top. o: Toplama Yeri Rakım Tarih GPS Toplayıcı o: Koordinatları 15 CV4496 Mersin, Çamlıyayla 896 m 01.07.2008 37 039.132 1 K Cem VURAL 34 042.256 1 D 16 CV4585 Mardin – Diyarbakır, 10. km. 907 m 07.08.2008 37 021.047 1 K Cem VURAL 40 039.537 1 D 17 CV4747 Mersin, Erdemlilimonlu 84 m 24.07.2009 36 033.577 1 K Cem VURAL kalesi çevresi 34 014.453 1 D 18 CV4748 Mersin, Kanlıdivane 106 m 24,07.2009 36 031.099 1 K Cem VURAL 34 011.845 1 D 19 CV4751 Mersin, Paasuyu kenarı 24.07.2009 36 028.643 1 K Cem VURAL 20 m 34 010.294 1 D 20 CV4752 Mersin, Paasuyu kenarı 20 m 24.07.2009 36 028.643 1 K Cem VURAL 34 010.294 1 D 21 CV4770 Artvin, Yusufeliafat yolu 632 m 19.08.2009 41 009.095 1 K Cem VURAL 41 055.162 1 D

Tablo 3.2. E. spinosissimus subsp. bithynicus 'un toplama alanı

Örn. Top. o: Toplama Yeri Rakım Tarih GPS Toplayıcı o: Koordinatları 22 CV4555 Sakarya , Sakaryapamukova. 67 m 09.07.2008 40 034.239 1 K Cem VURAL 30 019.658 1 D 23 CV4560 Bursa , ZeytinbağıKaracabey 9 m 11.07.2008 40 0219.97 1 K Cem VURAL 2. km. 28 0426.25 1 D 24 CV4516 Çanakkale , AyvacıkEzine 113 m 08.07.2008 39 0406.65 1 K Cem VURAL 11. km. 26 0234.10 1 D 25 CV4568 Balıkesir, BalyaGönen 40. 297 m 11.07.2008 39 0499.56 1 K Cem VURAL km. 27 0374.51 1 D 26 CV4295 Manisa Đzmir, Đzmir'e 40 km. 276 m 02.07.2007 38 0340.66 1 K Cem VURAL 27 0191.69 1 D 27 CV4509 Đzmir Zeytin Dağı yakını. 31 m 08.07.2008 38 0589.84 1 K Cem VURAL 27 0030.32 1 D 28 CV4327 Antalya, SeydiehirAkseki 1519 m 18.07.2007 37 0084.99 1 K Cem VURAL arası 29. km. 31 0525.15 1 D M.Y.DADANDI 29 CV4323 Konya, YağcılarHabiller 933 m 17.07.2007 37 0025.16 1 K Cem VURAL 10. km. 32 0428.01 1 D M.Y.DADANDI 30 CV4316 Karaman, Bucakkıla yolu 1050 m 17.07.2007 37 0093.94 1 K Cem VURAL 2. km. 33 0089.95 1 D M.Y.DADANDI 31 CV4387 Mersin, Tarsus. 1457 m 08.08.2007 38 0402.05 1 K Cem VURAL 35 0391.42 1 D M.Y.DADANDI 32 CV4311 iğde, 25. km. 1372 m 17.07.2007 38 0083.90 1 K Cem VURAL 34 0355.74 1 D M.Y.DADANDI 33 CV3408 Kayseri, Erciyes Dağı. 2200 m 18.07.2002 38 0325.62 1 K Cem VURAL 35 0321.49 1 D 34 CV4397 Yozgat, Sorgun Göldere 1190 m 21.08.2007 39 0587.76 1 K Cem VURAL Çiğdemli 2. km. 35 0237.33 1 D M.Y.DADANDI 35 CV4409 Amasya , Taova yol kenarı. 252 m 21.08.2007 40 0463.02 1 K Cem VURAL 36 0195.21 1 D M.Y.DADANDI 36 CV4357 Mara , Suçatı – Mara 485 m 04.08.2007 37 0375.87 1 K Cem VURAL 27. km. 36 0462.70 1 D M.Y.DADANDI 37 CV4357 Mara , Suçatı – Mara 485 m 04.08.2007 37 0375.87 1 K Cem VURAL 27. km. 36 0462.70 1 D M.Y.DADANDI 38 CV4572 Gaziantep, Mara yolu 896 m 05.08.2008 37 0020.55 1 K Cem VURAL 50. km. 37 0129.15 1 D 39 CV4771 Çankırı, Kastamonu 20. km. 632 m 20.08.2009 41 0090.95 1 K Cem VURAL 41 0551.62 1 D 20

Tablo 3.3. E. spinosissimus subsp. spinosissimus‘un toplama alanı

Örn. Top. o: Toplama Yeri Rakım Tarih GPS Toplayıcı o: Koordinatları 40 CV4331 Antalya, Finike Kale arası 16. 2 m 18.07.2007 36 0 16.189 1 K Cem VURAL km. 30 0 03.589 1 B M.Y.DADANDI 41 CV4333 Antalya, KaFinike 34. km. 74 m 19.07.2007 36 0 13.891 1 K Cem VURAL 29 0 26.283 1 B M.Y.DADANDI 42 CV4334 Antlaya, Kalkan çıkıı. 176 m 18.07.2007 36 0 16.525 1 K Cem VURAL 29 0 26.777 1 B M.Y.DADANDI 43 CV4605 Antalya, Kemer Keane Boğazı, 970 m 21.08.2008 36 038.025 1 K Cem VURAL 30 026.645 1 B

Tablo 3.4. Dı grupların toplama alanı

Örn. Top. o: Toplama Yeri Rakım Tarih GPS Toplayıcı o: Koordinatları 44 CV4543 Echinops microcephalus 124 m 09.07.2008 41 031.825 1 K Cem VURAL Kırklareli, Babaeski 22. km 27 007.463 1 B 45 CV4523 Echinops ritro 120 m 09.07.2008 40051.027 1 K Cem VURAL Tekirdağ, Kean 26050.122 1 B 46 SK2200 Crepis foetida 1360 m 08.05.2009 38 070.764 1 K Serkan KAYA Kayseri, Erciyes Üniversitesi 35 052.961 1 D Kampüsü, Talas 47 SK2201 Taraxacum macropium 1360m 08.05.2009 38 070.764 1 K Serkan KAYA Kayseri, Erciyes Üniversitesi 35 052.961 1 D Kampüsü, Talas.

Harita 3.1. Echinops orientalis türünün ülkemizdeki yayılı alanları (Kırmızı renkli yıldızlarla gösterilmitir). 21

Harita 3.2. Echinops spinosissimus supsp. bithynicus türünün ülkemizdeki yayılı alanları (Kırmızı renkli yıldızlarla gösterilmitir).

Harita 3.3. Echinops spinosissimus supsp. spinosissimus türünün ülkemizdeki yayılı alanları (Kırmızı renkli yıldızlarla gösterilmitir).

3.2. POGP Çalımaları Đçin DA Đzolasyonu

DNA izolasyonu için QIAGEN (DNeasy Plant Mini Kit) kullanılmıtır. Kurutulmu herbaryum örneklerinin yaprak dokularından DNA kontaminasyonuna izin verilmeden havan ve tokmak kullanılarak sıvı azot ile ezilmitir. Ezilen örnekler 20 OC’de saklanmıtır.

QIAGE Kit Protokolü; 22

1) Azotla öğütülmü yaprak dokularından 20 mg tartılarak steril bir tüp içine tartılır.

2) Tüp içerisindeki doku örnekleri üzerine 500 µl, AP1 buffer ve 100 mg/µl, 5 µl l RNase eklenir ve vortekslenir.

3) 65 OC’de 10 dakika muamele edilir (birkaç defa altüst yaparak karıtırılır).

4) Tüplerin üzerine 130 µl AP2 tamponu eklenip vortekslenir ve 5 dakika buzda bekletilir.

5) Tüpler 20000 g’de 5 dakika santrifüj edilir. Süpernatant kısmı mor kolonlara alınır.

6) Kolonlar 20000 g’de 2 dakika santrifüj edilir. Kolon atılır, süpernatant temiz ependorfa alınır.

7) Alınan süpernatantın 1,5 katı kadar AP3 tamponu eklenir ve çökelmeye izin vermemek için pipetleyerek karıtırılır. Bundan 650 µl alınarak beyaz kolona aktarılır.

8) 6000 g’de 1 dakika santrifüj edilir. Kolonun altında kalan kısım atılır. Tüpte kalan örnek aynı kolona eklenir ve 6000 g’de yine 1 dakika santrifüj edilir.

9) Kolon 2 ml’lik temiz reaksiyon tüplerine aktarılır. Üzerine 500 µl, AW tamponu eklenir.

10) 6000 g’de 1 dakika santrifüj edilir. Süpernatant kısmı dökülür ve tekrar 500 µl AW tampon eklenir.

11) 20000 g’de 2 dakika santrifüj edilir. Kolon 1.5 ml’lik temiz tüplere aktarılır.

12) Üzerine 150 µl AE tamponu eklenir. 5 dakika beklenir.

13) 6000 g’de 1 dakika santrifüj edilir. Kolon atılır ve DNA’nın bulunduğu kolonun altına geçen kısım ya hemen kullanılır ya da sonraki kullanımlar için20 OC’de saklanır. 23

3.3. POGP Analizi

3.3.1. Primer Özellikleri

POGP çalımalarında 14 ileri (forward) ve 14 geri (reverse) olmak üzere toplam 28 primer kullanılmıtır. POGP çalımalarında kullanılan primerler Tablo 3.5’de ve Tablo 3.6‘de verilmitir.

Tablo 3.5. POGP çalımalarında kullanılan ileri primerler.

Baz Uzunluğu Primer adı Đleri Baz Dizilimi % GC (bç)

POX1F 5′CTCGACCTACAAGGAC3′ 56.3 16 POX2F 5′CTCGACGTCAAGGACCTC3′ 61.1 18 POX3F 5′CAACGAGACCAACATCGA3′ 50.0 18 POX4F 5′TTACGCTACATACAATTTCAA3′ 28.6 21 POX5F 5′CACACGATCGGGGCGATC3′ 66.7 18 POX6F 5′TACCCGACGGTGAGC3′ 66.7 15 POX7F 5′CTCGACACAACCGATGTTG3′ 52.6 19 POX8F 5′CACCATCAAGAGCGTCATAAC3 47.6 21 POX9F 5′GGCGTCGGCGTCG3′ 84.6 13 POX10Fa 5′CCACGCCCTCATCGC3′ 73.3 15 POX11F 5′CCTTCTTCTTGCCATCTTGC3′ 50.0 20 POX12Fa 5′CGAGCTGAGAGTGAATCGATC3′ 52.4 21 POX13F 5′GACGGTTCTATTGGGAAGAAG3′ 47.6 21 POX14F 5′CTCATCGTTAACGTCGCATC3′ 50.0 20

Tablo 3.6. POGP çalımalarında kullanılan geri primerler.

Primer % Baz Uzunluğu Geri Baz Dizilimi adı GC (bç) POX1R 5`ATGTAGGCGCTGGTGA3′ 56.3 16 POX2R 5`GCCCATCTTCACCATGG3′ 58.8 17 POX3R 5`CCTGATCTGTCCCTGCG3′ 64.7 17 POX4R 5`ACTCGACTGCGACCAG–3′ 62.5 16 POX5R 5`AATCTGCCGGCAGAGCC3′ 64.7 17 POX6R 5`CTTGATCGTACTGACTCTA3′ 42.1 19 POX7R 5`TTCACAAACTAGTCACAATCACA3′ 34.8 23 POX8Ra 5`TTGGGCGTCGTCGTGT3′ 62.5 16 POX9R 5`ATCGGGAAGCTTCCCCTC3′ 61.1 18 POX10Ra 5`CATCTGGCCGTGCGTC3′ 68.8 16 POX11R 5`CATATCGCTCCACGACCTTT3′ 50.0 20 POX12Ra 5`CTTGAACGCCTGGATGAGC3′ 57.9 19 POX13R 5`CATGAAAGTGATGAGATGGC3′ 45.0 20 POX14R 5`GATGCAAGGAGTATAGTGCAAATG3′ 41.7 24 24

POGPPCR reaksiyon karıımı toplamda 15 µl olacak ekilde aağıdaki gibi hazırlanmıtır [14].

ddH 2O : 7 ,25 µl PCR tamponu (stok 10X) : 1,5 µl

MgCl 2 (stok 25mM) : 1,3 µl Đleri Primer (stok 10M) : 0,5 µl Geri Primer (stok 10M) : 0,5 µl dNTPs (stok 10mM) : 0,5 µl BSA (stok 10mg/ml) : 1,2 µl Taq DNA Polimeraz : 0 ,25 µl Genomik DNA : 2 µl Toplam Hacim : 15 µl POGPPCR döngü koulları aağıdaki gibidir [14].

94 OC 2 dk, 30 sn 1 döngü 94 OC 1 dk 36 OC 1 dk 40 döngü 72 OC 1 dk 72 OC 5 dk 1 döngü

3.3.2. Agaroz Jel Elektroforezi

Bütün çalımalar agaroz jel elektroforezi yapılarak değerlendirilmitir. Total DNA eldesini görüntüleyebilmek için % 0,8’lik, PCR reaksiyonu sonucu hedef dizinin çoğaltılıp çoğaltılmadığını görüntüleyebilmek için % 2’lik agaroz jel kullanılmıtır. DNA’nın görüntülenebilmesi için jel 0,5 µg/ml oranında Ethidium Bromide eklenerek hazırlanmıtır. Her bir örneğe ait 15 l PCR ürününe 6 X stok yükleme boyasından 3 l (% 0,025 ksilen siyanol, % 0,025 bromfenol blue ve % 40 sukroz) ilave edilerek örneklerin tamamı 0,5 X TAE tamponu ile 110 V sabit voltaj uygulanarak 4 sa 50 dk yürütülmütür [51].

PCR reaksiyonları Sensoquest labcycler marka gradiyent thermocycler kullanılarak yapılmıtır. Jeller Kodak Gel Logic 1500 marka görüntüleme sistemi ile dökümante edilmitir. 25

3.3.3. Đstatistiksel Analiz

Çalımamızda primerlerinden elde edilen bantlara göre PAUP (Version 4.0b10) istatistik programından yararlanarak genotipler arasındaki genetik uzaklıkları (sm) ve yakınlıkları (dist) ifade eden dendrogramlar “UPGMA cluster analizi, ve NJ cluster analizi” ile oluturulmutur.

4. BÖLÜM BULGULAR

4.1. POGP Analizi

Tez çalımasında, 14 adet ileri ve 14 geri adet POGP primer denenmi ve tamamı istenilen bantları vermitir. PCR sonucu elde edilen bantların varlığı (1) ve yokluğu (0) olarak değerlendirilmitir. Bu değerlendirme sonucunda elde edilen toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve polimorfizm oranı Tablo 4.1.’de verilmitir.

14 ileri ve 14 geri primer kombinasyonu sonucunda 104 adet bant elde edilmitir. 14 farklı jelde 104 adet bant elde edilmitir. Bunların 74 adedi polimorfizm, 3 adedi ise monomorfizm göstermitir. Tamamı polimorfik olan bu bantların 100 2500 bç aralığında olduğu gözlenmitir. Elde edilen bant sayılarına bakıldığında en az bant veren primer pox11F/pox11R (3 bant), en fazla bant veren primer pox1F/pox1R (15 bant) olarak tespit edilmitir. 47 örnek için uygulanan POGP primer kombinasyonları sonucunda Tablo 4.1.’de görüldüğü gibi % 97,22 polimorfizm gözlenmitir.

Tablo 4.1. POGP çalımalarından elde edilen sonuçların istatistik değerleri

Primer Adı TBS a BA (bç) b MBSc PBS d Polimorfizm (%)

POX1F/POX1R 15 1001500 0 15 100

POX2F/ POX2R 9 2002500 0 9 100

POX3F/ POX3R 12 1002500 1 11 91

POX4F/ POX4R 10 2501700 0 10 100

POX5F/ POX5R 7 2001500 0 7 100

POX6F/ POX6R 6 1202000 0 6 100 27

Tablo 4.1. ’in devamı.

POX7F/ POX7R 7 1001000 0 7 100

POX8F/ POX8R 5 2001700 0 5 100

POX9F/ POX9R 5 80500 0 5 100

POX10F/ POX10R 5 1201500 0 5 100

POX11F/ POX11R 3 3001500 0 3 100

POX12F/ POX12R 8 901500 0 8 100

POX13F/ POX 13R 8 2001300 0 8 100

POX14F/ POX14R 4 1201300 2 2 50 a) TBS: Toplam Bant Sayısı b) BA (bç): Bant Aralığı c) MBS: Monomorfik Bant Sayısı d) PBS: Polimorfik Bant Sayısı 14 iler ve 14 geri primer kombinasyonu sonucunda Ritrodes seksiyonundan elde edilen veriler ekil 4.15.’de NJ dendogramında verilmitir.

Çalıma kapsamında E. orientalis , E. spinosissimus subsp. bthynicus ve E. spinosissimus subsp. spinosissimus ait örnekler değerlendirildiğinde elde edilen bulgular Tablo 4.1.’de verilmitir. 14 farklı jelde 85 adet bant elde edilmitir. Bunların 74 adedi polimorfizm, 11 adedi ise monomorfizm göstermitir. 1101300 bç aralığında elde edilen bu bantların polimorfizm oranı % 88’dir. 14 ileri ve 14 geri primer kombinasyonu içerisinde hiç polimorfizm göstermeyen POX1, POX2, POX3, POX7, POX8, POX10, POX11, POX12, POX13, POX14 en düük polimorfizm değerine, % 100 polimorfizm oranı ile POX4, POX5, POX6, POX9 primer kombinasyonları en yüksek polimorfizm değerine sahiptirler. Elde edilen bant sayılarına bakıldığında en az bant veren primer kombinasyonu POX8, POX9 (3 bant), en fazla bant veren primer kombinasyonu ise POX1, POX3 (10 bant) olmutur. 28

Tablo 4.2. Dı grupların dahil edilmediği POGP çalımalarından elde edilen sonuçların istatistik değeri

% Primer Adı TBS a BA (bç) b MBSc PBS d Polimorfizm

POX1F/POX1R 10 1001500 1 9 89

POX2F/ POX2R 9 2002500 1 8 87,5

POX3F/ POX3R 10 1002500 1 9 89

POX4F/ POX4R 8 2501700 0 8 100

POX5F/ POX5R 7 2001500 0 7 100

POX6F/ POX6R 6 1202000 0 6 100

POX7F/ POX7R 5 1001000 1 4 75

POX8F/ POX8R 3 2001500 1 2 66

POX9F/ POX9R 3 80450 0 3 100

POX10F/ POX10R 4 1201500 1 3 75

POX11F/ POX11R 3 3001500 1 2 66

POX12F/ POX12R 8 901500 1 7 85,75

POX13F/ POX 13R 5 2001300 1 4 80

POX14F/ POX14R 4 1201300 2 2 50 a) TBS: Toplam Bant Sayısı b) BA (bç): Bant Aralığı c) MBS: Monomorfik Bant Sayısı d) PBS: Polimorfik Bant Sayısı

29

4.1.1. Agaroz Jelde Yürütülen Örneklerin Çekilen Fotoğrafları

Pox1F/Pox1R kombinasyonu: Pox1F ileri Pox1R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 1001500 bç aralığında 15 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 10 bant elde edilmitir (ekil 4.1.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 89 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 9 adet polimorfik bant elde edilmitir.

ekil 4.1. Pox1F/Pox1R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox2F/Pox2R kombinasyonu: Pox2F ileri Pox2R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 2002500 bç aralığında 9 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 9 bant elde edilmitir (ekil 4.2.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 87,5 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 8 adet polimorfik bant elde edilmitir.

Pox3F/Pox3R kombinasyonu: Pox3F ileri Pox3R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 1002500 bç aralığında 12 bant elde edilmitir. Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 91 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 11 adet polimorfik bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 10 bant elde edilmitir (ekil 4.3.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 89 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 9 adet polimorfik bant elde edilmitir. 30

ekil 4.2. Pox2F/Pox2R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

ekil 4.3. Pox3F/Pox3R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox4F/Pox4R kombinasyonu: Pox4F ileri Pox4R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 2501700 bç aralığında 10 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 8 bant elde edilmitir (ekil 4.4.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 100 oranında polimorfizm göstermitir. 31

ekil 4.4. Pox4F/Pox4R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox5F/Pox5R kombinasyonu: Pox5F ileri Pox5R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 2001500 bç aralığında 7 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 7 bant elde edilmitir (ekil 4.5.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 100 oranında polimorfizm göstermitir.

ekil 4.5. Pox5F/Pox5R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox6F/Pox6R kombinasyonu: Pox6F ileri Pox6R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 1202000 bç aralığında 6 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç 32

aralığında 6 bant elde edilmitir (ekil 4.6.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 100 oranında polimorfizm göstermitir.

ekil 4.6. Pox6F/Pox6R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox7F/Pox7R kombinasyonu: Pox7F ileri Pox7R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 1001000 bç aralığında 7 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 5 bant elde edilmitir (ekil 4.7.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 80 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 4 adet polimorfik bant elde edilmitir.

ekil 4.7. Pox7F/Pox7R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı 33

Pox8F/Pox8R kombinasyonu: Pox8F ileri Pox8R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 2001700 bç aralığında 5 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 3 bant elde edilmitir (ekil 4.8.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 66 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 2 adet polimorfik bant elde edilmitir.

ekil 4.8. Pox8F/Pox8R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox9F/Pox9R kombinasyonu: Pox9F ileri Pox9R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 80500 bç aralığında 5 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 3 bant elde edilmitir (ekil 4.9.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 100 oranında polimorfizm göstermitir.

Pox10F/Pox10R kombinasyonu: Pox10F ileri Pox10R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 1201500 bç aralığında 9 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 4 bant elde edilmitir (ekil 4.10.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 80 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 3 adet polimorfik bant elde edilmitir.

34

ekil 4.9. Pox9F/Pox9R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

ekil 4.10. Pox10F/Pox10R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox11F/Pox11R kombinasyonu: Pox11F ileri Pox11R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 3001500 bç aralığında 3 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 3 bant elde edilmitir ( ekil 4.11 .). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 87,5 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 2 adet polimorfik bant elde edilmitir. 35

ekil 4.11. Pox11F/Pox11R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox12F/Pox12R kombinasyonu: Pox12F ileri Pox12R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 901500 bç aralığında 8 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 8 bant elde edilmitir (ekil 4.12.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 85,75 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 7 adet polimorfik bant elde edilmitir.

ekil 4.12. Pox12F/Pox12R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox13F/Pox13R kombinasyonu: Pox13F ileri Pox13R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 2001300 bç aralığında 8 bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç 36

aralığında 5 bant elde edilmitir (ekil 4.13.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 80 oranında polimorfizm göstermitir. 1 adet monomorfik bant, 4 adet polimorfik bant elde edilmitir.

ekil 4.13. Pox13F/Pox13R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Pox14F/Pox14R kombinasyonu: Pox14F ileri Pox14R geri primerleri kullanılarak yapılan çalıma sonucunda 1201300 bç aralığında 4 bant elde edilmitir. Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 50 oranında polimorfizm göstermitir. 2 adet monomorfik bant, 2 adet polimorfik bant elde edilmitir. Aynı primer kombinasyonu sonuçları dı gruplar dahil edilmeden değerlendirildiğinde 1101300 bç aralığında 4 bant elde edilmitir (ekil 4.14.). Tablo 4.3.’de görüldüğü gibi % 50 oranında polimorfizm göstermitir. 2 adet monomorfik bant, 2 adet polimorfik bant elde edilmitir.

ekil 4.14. Pox14F/Pox14R kombinasyonu sonucu agaroz jelde yürütülen örneklerin çekilen fotoğrafı

Tablo 4.3. 14 ileri 14 geri POX primerleri kullanılarak elde edilen sonuçlara göre 47 örnek arasındaki genetik uzaklıklar. 37 37

Tablo 4.3.’ün devamı. 38 38

39

Tablo 4.3.’ün devamı

40

ekil 4.15. 14 ileri 14 geri POX primeri kullanılarak elde edilen sonuçlara göre 47 örnek arasındaki benzerliğe göre oluturulan UPGMA dendogram. 41

ekil 4.16. 14 ileri 14 geri POX primeri kullanılarak elde edilen sonuçlara göre 47 örnek arasındaki benzerliğe göre oluturulan NJ dendogram. E. orientalis (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 21 numaralı bireyler), E.spinossimus spp bithynicus, (22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 38, 39 numaralı bireyler), E.spinossimus spp. spinossimus: (40, 41, 42, 43 numaralı bireyler), E. chardinii (34 numaralı birey), E. adenocaulos , (14, 17, 18 15 numaralı bireyler), E. gaillardotii (28, 36, 37 numaralı bireyler).

5. BÖLÜM TARTIMA VE SOUÇ

Türkiye Florası’nın yazımı tamamlandıktan sonraki yıllarda toplanan çok sayıda materyal tehis edilirken karılaılan olumsuzluklar nedeni ile bazı cinslerdeki problemler dikkati çekmitir [3]. Birçok cinsin bazı türlerinde, hatta seksiyonlarında açıklığa kavuturulamamı taksonomik sorunlar vardır. Flora’nın yazımı esnasında sınırlı zaman ve materyal ile çalııldığı için çoğu cins veya seksiyonlardaki eksiklikler florada belirtilmi, ancak çözüm getirilememitir. Bu durumda olan cinslerin problemleri saptanarak üzerlerinde daha ayrıntılı çalımaların yapılması gerektiği flora editörünün bazı yayınlarında da kaydedilmitir [3]. Bu problemli cinslerin arasında Asteraceae familyasından Echinops cinsi de bulunmaktadır. Bu durum göz önüne alınarak Echinops ’un morfolojik revizyonu TBAG106T526 kodlu TÜBĐTAK projesi kapsamında çalıılmıtır [19]. Türkiye’de yayılı gösteren Echinops cinsi üyelerine ait sınıflandırma 1975 yılında Hedge tarafından morfolojik özelliklere dayandırılarak düzenlenmitir [3]. Cinsin üyeleri içinde yer alan E. orientalis ve E. spinosissimus Türkiye florası ile Rus florası arasındaki farklılıklar aratırıcıları bu türün ve tür altı gruplarının tekrar gözden geçirilmesine yönlendirmitir.

Morfolojik karakterler kolay gözlenebilmeleri yanında çevresel faktörlerden etkilenebilmektedir. Fenotipik özelliklerin genetik kontrol mekanizmasının iyi bilinmemesi ve aranılan fenotipik özelliklerin uygun büyüme aamasında ortaya çıkıının uzun zaman alması gibi nedenler, aratırıcıları daha hızlı ve doğru karar vermeye yardımcı olan DNA markır sistemlerine yönelten etkenlerdir. Polimorfik DNA markır tekniklerinin bitkiden alınan çok az miktarda DNA ile bütün bir genomun analizine olanak vermesi, büyüme koullarının markırın ifadesini etkilememesi gibi üstünlükleri nedeniyle, bu yöntemler son zamanlarda sınıflandırma çalımalarında yaygın olarak kullanılmaktadır [50]. Böylece bitki genetik kaynaklarının doğru ve etkin bir ekilde tanımlanmasına olanak sağlanmaktadır. Ritrodes seksiyonunda yaanan 43

tehis karııklığının sebebi Hedge tarafından tehis anahtarındaki tanımları geni tutmasıdır [3].

Çalımamızda E. orientalis’e ait 21 örnek, E. spinosissimus subsp. bthynicus ait 17 örnek, E. spinosissimus subsp. spinosissimus ait 4 örnek ve dı grup olarak da E. microcephalus, E.ritro, Crepis foetida ve Taraxacum macropium türlerinden birer örnek çalımaya eklenmitir. Toplam 47 örnek arasındaki genetik iliki, POGP kullanılarak yapılan skorlamalar sonucunda ortaya konmutur. UPGMA 36 örnek 2 ana kola ayrılmıtır (ekil 4.15 .). Đlk ana grupta E. orientalis ’e ait örneklerin alt gruplar halinde birbirinden ayrıldığı görülmektedir. Đlk ana grupta E. orientalis’ e ait genotipler (1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 34, 21). Đkinci ana grupta E. spinosissimus ’a ait alt türlerden E. spinosissimus subsp. bthynicus ve E. spinosissimus subsp. spinosissimus (14, 15, 17, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 38, 39, 40, 41, 42, 43) gruplar halinde birbirinden ayrıldığı görülmektedir. Bu iki ana grubun dıında ilk kladı oluturan örneklerin (13, 18, 28), ikinci kladı oluturan örnekler ve (19, 20), üçüncü kladı oluturan örneklerin (36, 37) ayrıldıkları görülmektedir. En son grupta dı grup örneklerinin genotipleri (44, 45, 46, 47) görülmektedir.

Bu çalımada, POGP yöntemin doğru çalıtığını kontrol etmek için aynı bireyden iki ayrı örnek çalımaya eklenmi ve bu örnekler 36 ve 37 nolu örnekler olarak belirlenmitir. Bu iki örneğin %100 benzediği ve UPGMA dendogramında aynı çıktığı verisi elde edilmitir. Bu da POGP primerin doğru çalıtığını göstermektedir.

Bu çalımaya balarken örnek seçiminde E. orientalis olarak tehis edilmi fakat E. orientalis ’ten morfolojik olarak faklılık gösteren 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 nolu olanlar çalımaya eklenmitir. Aynı ekilde E. spinossimus olarak tehis edilmi fakat E. spinosissmus’tan morfolojik olarak farklılık gösteren 28, 34, 36,37 nolu örnekler çalımaya eklenmitir.

UPGMA dendogramı incelendiğinde 34 numaralı örnek TÜBĐTAK 106T526 nolu Türkiye Echinops L. (Asteraceae) türlerinin taksonomik revizyon çalımasında morfolojik olarak tehisi sonucu E. chardinii olduğu ve E. orientalis’e morfolojik olarak en yakın olduğu belirtilmitir [19]. Bu çalımada 34 nolu örnek (E. chardinii ) E. spinosissimus ’un bulunduğu grupta yer almamıtır. E. chardinii türünün birden fazla örnekle birlikte E. orientalis ’le yapılacak bir çalıma ile birbirinden ayrılabileceği öngörülmektedir. 44

15 numaralı örnek Vural ve Dadandı (2010)’nın çalımasında mofolojik tehisi sonucu E. gaillardotii olduğu bildirilmektedir. Ayrıca E. spinosissimus’a morfolojik olarak en yakın tür olduğu tehis anahtarıyla da gösterilmektedir [19]. Bu çalımada, 15 numaralı bireyin E. orientalis ’lerin bulunduğu grupta yer almadığı görülmektedir. Bu birey E. spinosissimus ’ların bulunduğu grupta yer almıtır. Yine ayrıntılı bir çalıma ile E. gaillardotii ’nin E. spinosissimus ’tan ayrılacağı düünülmektedir. 15 numaralı bireyin E spinosissimus ’la aynı grupta yer alması morfolojik olarak E. chardinii ’nin E. spinosissimus ’e yakın olduğu [19] verisini desteklemektedir.

13, 17, 18 ve 28 numaralı örnekler Doç. Dr. Cem Vural tarafından tekrar tehis edildiğinde morfolojik olarak E. adenocaulos ’a benzer morfolojik özellikler göstermektedir. Bu çalımada 13, 18 ve 28 numaralı bireyler E. spinossimus ve E. orientalis ’ten daha önce ayrılmıtır. Bu ekilde ayrılması farklı tür olduğu fikrini vermektedir. Daha kapsamlı yapılacak çalımalarla ortaya konabilir.

19 ve 20 numaralı bireyler E. spinossimus ve E. orientalis ’ten daha önce ayrıldığı görülmektedir. UPGMA dendogramına göre yorumladığımızda yeni bir tür olabileceği fikrini vermektedir. Doç. Dr. Cem VURAL tarafından tehis edildiğinde bu bireylerin E. borae olarak tespit edilmi fakat bu yeni türün adı henüz yayınlanmamıtır.

36 ve 37 nolu örnekler aynı bireye ait örneklerdir. iki ana gruptan önce ayrıldığı görülmektedir. UPGMA dendogramına göre yorumladığımızda yeni bir tür olabilceği fikrini vermektedir. Tekrar tehis edildiğinde morfolojik bazı veriler sonucunda E. gaillardotii ’ye benzer özellikler göstermesine karın yeni tür olduğunu düündürmektedir. Yeni yapılacak çalımalarla bu sonuç desteklenebilir.

Bu çalımada dı gruplar dâhil edilmeden sadece Ritrodes seksiyonuna ait örneklerden elde edilen sonuçlar kendi içinde değerlendirildiğinde polimorfizm oranı %88 olarak hesaplanmı, Ankara’dan toplanan 3 numaralı birey ve Kırehir’den toplanan 4 numaralı bireyin genotiplerin % 96 benzerlik oranı ile en yakın genotipler olduğu belirlenmitir. Örneklerin toplanma yerleri de coğrafik olarak yakın bölgelerde bulunduğu için bu benzerlik anlamlı bulunmutur. Mara’tan toplanan 36 numaralı birey ile Mersin’den toplanan 19 numaralı bireyin genotipleri ve Mara’tan toplanan 36 numaralı birey ile Antalya’dan toplanan 28 numaralı bireyin genotipleri %66 benzerlik oranı ile birbirlerine en uzak genotipler olarak belirlenmitir (Tablo 4.3.). 45

Gülen ve ark. (2010) Toplam 192 adet elma ( Malus spp.) örneğinin analizinde POGP yöntemi kullanmılardır. POGP yönteminde 14 adet spesifik peroksidaz primeri kullanmılar ve 80 – 1000 bç aralığında 46 bant elde etmilerdir. Bu bantlardan 44 adedi polimorfik olup polimorfizm oranı % 96’dır. Elma örnekleri arasındaki genetik yakınlığı ve evrimsel iliki tespiti için POGP yöntemi kullanılı olduğunu bildirmilerdir [51]. Çalımamızda Ritrodes seksiyonuna ait örneklerden elde edilen sonuçlar kendi içinde değerlendirildiğinde polimorfizm oranı % 96,22’dır. Bu sonuç Gülen ve arkadalarının elde ettikleri sonuçlarla bu çalıma arasında metot olarak doğru olduğunu göstermektedir.

Gülen ve ark (2007) bir çimen türü olan Buffalo grass ’nin 28 genotipi ile yaptığı çalımada POGP yöntemini kullanmı ve 14 ileri ve 16 geri peroksidaz primerleri 22 adet kombinasyonunu kullanarak 100750 bç aralığında 52 adet bant elde etmitir. Bu bantların 41 tanesi polimorfik olup polimorfizm oranı % 79 olarak bildirilmitir [14]. Ceylan’ın (2010) Angiosperm olan buğdaylar (Triticum ) üzerinde yapılan polimorfizm belirleme çalımalarında 59 örnek ile yaptığı çalımada POGP yöntemini kullanmı ve 14 ileri ve 14 geri peroksidaz primerleri kullanarak 145 adet bant elde etmitir. Bu bantların 108 (% 75)’inin polimorfik olduğu gözlenmitir. Kullanılan buğdaylarda gözlemlenen peroksidaz gen polimorfizm (POGP) bantları %64 ve %100 oranları arasında (ortalama %82) benzerlik göstermitir [52].

Ismael ve akralarının (2010) nrDNA’ların ITS analizlerinden faydalanarak yaptığı çalımaya göre, Echinopsinae alt familyasına ait 88 takson üzerinde çalıılmı, moleküler analizlerin sonucunda taksonlar 9 farklı klad altında toplandığı görülmütür. Bu çalımada Ritrodes seksiyonuyla temsil edilen türlerin yer aldığı 8. kladda E. orientalis, E. spinossimus subsp. spinossimus ve E. spinossimus subsp. bithynicus taksonları aynı kolda beraber yeraldığı görülmektedir [53]. POPG yönteminde olduğu gibi UPGMA dendogramında da E. orientalis, E. spinossimus taksonları birbirine yakın çıkmı ve bu iki çalımanın sonucu birbiri ile örtütüğü görülmütür. Bu çalımayla POGP yönteminin tür ayrımında yeterli olduğu görülebilmektedir.

Çalımamızda kullanılan iki türün E. orientalis ile E. spinosissimus net bir ekilde birbirinden ayrıldı görülmektedir. Fakat E. spinosissimus subsp. spinosissimus ve E. spinosissimus subsp. bithynicus’un morfolojik farklılık göstermesine karın bu iki alt 46

türün dendaogram üzerinde ayrı gruplara ayrılmamıtır. POGP yöntemi Ritrodes seksiyonun alttür ayrımında kullanılı olmadığı söylenebilir. Ancak sadece E. spinosissimus ’un alttürlerinin bulunduğu bir çalımada birbirinden ayrılabileceği öngörülmektedir.

Yapmı olduğumuz literatür aratırması doğrultusunda daha önce Echinops’ lar üzerinde Peroksidaz Gen Polimorfizm Markırları (POGP) ile yapılmı polimorfizm belirlemeye yönelik herhangi bir çalımaya rastlanmamıtır. Dolayısı ile bu çalıma bu alanda ilk olma özelliğindedir. Alınan sonuçlar doğrultusunda POGP markır sisteminin Echinops çeitlerinde polimorfizm belirleme çalımalarında kullanılması uygun görülmektedir. 47

KAYAKÇA

1. Jäger, E., J., Arealkarten der AsteraceenTribus als Grunlage der ökogeographischen Sippencharakteristik, Botanische Jahrbücher für Systematik, Pflanzengeshichteund, Pflanzengeographie, cilt 108, 481–497, 1987.

2. Petit, D., P., Le genre Echinops L. (Compositae, Cardueae), 1. Position phylétique et interprétation de l’incapitulescence, Candollea, cilt 43, 467–481, 1988.

3. Hedge, I.,C., Davis, P.,H., Flora of Turkey and the East Aegean Islands, Echinops L., Edinburgh University Press, Edinburgh, 5: 609622, 1975.

4. Vural, C., Biter, M., K., Dadandı, M., Y., A new species of Echinops (Asteraceae) from Turkey, Turk. J. Bot., cilt 34, 513519, 2010.

5. Güner, A., Özhatay, N., Ekim, T., Baer, K.,H.,C., Flora of Turkey and the East Aegean Islands, 11: 166167, Edinburgh University Press, Edinburgh., 2000.

6. Mossaffarian, V., A., Taxonomic Survey of Echinops L. Tribe Echinopeae (Asteraceae) in Iran: 14 new species and diagnostic keys, Iran J. Bot. Cilt11, s.197239, 2006.

7. Dawit, A., Ahadu, A., Medicinal Plants and Enigmatic Health Practices of Northern Ethiopia, Birhanena Selam, Addis Ababa, 3789., 1993.

8. Desta, B., Ethiopian traditional herbal drugs. Part II: antimicrobial activity of 63 medicinal plants. J. Ethnopharmacol. 39, 129139, 1993.

9. Singh, R., P., Pandey, V.B., Further flavonoids of Echinops niveus, Fitoterapia 65 (4), 374, 1994.

10. Hymete, A., Iversen., T., H., Rohloff, J., Erko, B., Screening of Echinops ellenbeckii and Echinops longisetus for biological and chemical constituents, Phytomedicine, 2005.

11. White, R., Genetic Diversity, University of Southampton Pres, UK, 2003.

12. Powell, W., Morgante, M., Andre, C., Hanafey, M., Vogel, J., Tingey, S., and Rafalski, A.,The Comparison of RFLP, RAPD AFLP and SSR Markers For Germplazm Analysis, Molecular Breeding, 2, 225238, 1996.

13. Obinger, C., Burner, U., Ebermann, R., Penel, C., and Greppin, H.,Plant Peroxidases, Biochemistry and Physiology, University of Agriculture, Vienna and University of Geneva, Geneva. 1996.

48

14. Gülsen, O., Shearman, R.C., HengMoss, T., M., Mutlu N., Lee, D. J. and Sarath, G., Peroxidase Gene Polymorphism in Buffalograss and Other Grasses, Crop Science, 47, MarchApril, 2007.

15. Simpson, M., G., Plant Systematics, Elsevier Academic Press, 326, California, 2006.

16. Davis, P., H., Flora of Turkey and The East Aegean Islands, Edinburg at the University Press, 5: 609, 1975.

17. Kuzharov, S., Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burges, N.A., Moore, D., M., Valentine, D., H., Walters, S., M., Webb, D., A., Flora Europaea, 4: 212–214, Cambridge University Press, Cambridge, 1976.

18. Greuter, W., Pleger, R., Raus, T., The Vascular Flora of the Karpathos Island Group (Dodecanesos, Greece). A Preliminary Checklist, Willdenowia, Bd. 13, H.1, Jul 23, s. 4378, 1983.

19. Vural, C., Dadandı, M., Y., Türkiye Echinops L. (Asteraceae) Türlerinin Taksonomik Revizyon Çalıması, TÜBĐTAK projesi, 106T526, Kayseri, Mayıs 2010.

20. Karcicio, M., Analysis of Genetic Diversity in Landraces of Macoroni Wheat (Triticum durum Desf.) by RAPD Tecnique, Ph.D. Thesis, Hacettepe University, Ankara, 2006.

21. Moritz, C., Hillis, D. M., Molecular Systematics: Context And Controversies, Sinauer Associates, Inc. Sunderland, Massachusetts, USA, 1990.

22. Hiraga, S., Sasaki, K., Yamakawa, H., Mitsuhara, I., Toshima, H., Matsui, H., Honma, M., and Ohashi, Y., A Large Family of ClassIII Plant Peroxidases, Plant Cell Physiol, 42, 462468, 2001.

23. Bergmeyer J, Grabl M., Methods of Enzymatic Analysis (Thrid Edition), pp.190302, Germany, 1983.

24. Banci, L., Structural Properties of Peroxidase, J. Biotech., 53, 253263, 1997.

25. Kim, K.Y., Kwon, H. K., Kwon, S.Y., Lee, H. S., Hur, Y., Bang, J.W., Choi, K.S., and Kwak, S.S., Differantial Expression of Four Sweet Potato Peroxidase Genes in Response to Abscisic Acid and Ethaphon, Phytochemistry, 54, 1922, 2000.

26. Welinder, K.G. In Biochemical, Molecular and Physiological Aspects of Plant Peroxidases, pp. 313, University of Genève, Switzerland, 1991.

49

27. Churin, Y., Schilling, S., Börner, T., A Gene Family Encoding Glutathione Peroxidase Homologues in Hordeum Vulgare (Barley), FEBS Lett., 459, 3338, 1999.

28. Taurog, A., Molecular Evolution of Thyroid Peroxidase, Biochimie, 81:557– 562, 1999.

29. Whetten, R.W., Mackay, J.J., Sederoff, R.R., Recent Advances in Understanding Lignin Biosynthesis, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 49, 585609, 1998.

30. Espelie, K.E, Franceschi, V.R., Kolattukudy, P.E., Immunocytochemical Localization and Time Course of Appearance of an Anionic Peroxidase Associated With Suberization in WoundHealing Potato Tuber Tissue, Plant Physiol., 81, 487492, 1986.

31. Lagrimini, L.M., Joly, R.J., Dunlap, J. R., and Liu T.T.Y., The Consequence Of Peroxidase Overexpression In Transgenic Plants On Root Growth And Development. Plant Mol. Biol., 33, 887895, 1997.

32. Fry, S.C., CrossLinking of Matrix Polymers in the Growing Cell Walls of Angiosperms, Annu. Rev. Plant Physiol., 37, 165186, 1986.

33. Chittoor, J.M., Leach, J.E. White, F.F., In PathogenesisRelated Proteins in Plants. pp. 171193, CRC Press, Boca Raton, FL, 1999.

34. Amaya, I., Botella, M.A., et al., Improved Germination Under Osmotic Stress of Tobacco Plants Overexpressing a Cell Wall Peroxidase, FEBS Lett., 457, 8084, 1999.

35. Abeles, F.B., Dunn, L.J., Morgens, P., Callahan, A., Dinterman, R.E., and Schmidt, J.,Dinterman, R.E., and Schmidt, J., Induction of 33kD and 60kD Peroxidases During Ethyleneinduced Senescence of Cucumber Cotyledons, Plant Physiol., 87, 609615, 1988.

36. Morohashi, Y. Peroxidase Activity Develops in The Micropylar Endosperm of Tomato Seeds Prior to Radicle Protrusion, Journal of Experimental Botany, 53, No. 374, 16431650, Temmuz 2002.

37. Welinder, K.G., Superfamily of Plant Fungal And Bacterial Peroxidases, Curr. Opin. Struct. Biol., 2, 388393, 1992.

38. Wada, N., Kinoshita, S., Matsuo, M., Amako, K., Miyake, C., and Asada, K., Purification and Molecular Properties of Ascorbate Peroxidase from Bovine Eye, Biochem. Biophys. Res. Commun., 242, 256261, 1998.

50

39. Welinder, K., G., Covalent Structure of The Glycoprotein Horseradish Peroxidase, FEBS Lett., 72, 19–23, 1976.

40. Gajhede, M., Schuller, D.J., Henriksen, A., Smith, A.T., and Poulos, T.L., Crystal Structure Determination of Classical Horseradish Peroxidase at 2.15Å Resolution, Nature Structural Biology, 4, 1032 1039, 1997.

41. Filiz, E., Poaceae (Gramineae) Familyasının Bazı Taksonlarından Coğrafik Dağılımın Sitoplazmik Analiz Yöntemiyle (mtDNAcpDNA) incelenmesi, Doktora Tezi, Marmara Üniversitesi, Đstanbul, 2009.

42. Ağar, A., Aurantionideae Alt Familyasındaki Cinslerde Yer Alan Bazı Türlerin SSR Markırlarıyla Moleküler Karakterizasyonu, Çukurova Üniversitesi, Adana, 2007.

43. Jeffreys, A., J., Wilson, V., Thein, S., L., Weatherall, D., J., and Ponder, B., A., DNA "fingerprints" and segregation analysis of multiple markers in human pedigrees, Am. J. Hum. Genet. 39(1), 11–24, Temmuz 1986.

44. Budak, A., Karayaka, Sakız ve Bafra Koyun ırklarının RAPDPCR yöntemi ile moleküler genetik analizi, Kırıkkale Üniversitesi, Kırıkkale, 2003.

45. Yıldırım, A., ve Kandemir, N., Genetik markırlar ve Analiz Metodları, Selçuk Üniv. Vakıf yayınları, 112159, 2001.

46. Özatay, S., Mercimek genomunun AFLP, RAPD, ISSR ve Bazı Morfolojik Markırlar Kullanarak haritalanması, Ege Üniversitesi, Đzmir, 2007.

47. Varlı, Đ., Microsatellit (SSR) DNA Markırlarının Mercimek Genom Haritalamasında Kullanılması, Harran Üniversitesi, anlıurfa, 2009.

48. Gürkök, T., Türkiye Doğal Florasında Yetien Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonuna ait Gen Havuzunun ISSR Tekniği ile Genetik Karakterizasyonu, Gazi Osman Pasa Üniversitesi, Tokat, 2009.

49. Ferriol, M., Pico, B., Nuez, F., Genetic diversity of some accessions of Cucurbita maxima from Spain using RAPD and SRAP markers, Genet. Resour. Crop. Evol., 50: 227–238, 2003.

50. Çalıkan, M., Rapd Analizi ile Güllerde ( Rosa sp.) Genetik Tanımlama, Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi, Ankara, 2005.

51. Gülsen, O., Kaymak, S., Ozongün, ., Uzun, A., Genetic analysis of Turkish apple germplasm using peroxidase genebased markers, Scientia Horticulturae, 125: 368–373, 2010.

51

52. Ceylan, H., Bazı Buğday (Triticum) Çeitlerinde Peroksidaz Gen Polimorfizminin Belirlenmesi, Erciyes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Y. Lisans Tezi, Kayseri, Temmuz 2010.

53. Sánchez, J., I., Lazkov, G.,A., Hidalgo, O., Garnatje, T., Molecular systematics of Echinops L. (Asteraceae, Cynareae): A phylogeny based on ITS and trnLtrnF sequences with emphasis on sectional delimitation, Taxon, 59 (3), 698708:11, 2010.

ÖZGEÇMĐ

Serkan KAYA 1983 yılında Kayseri’de doğdu. Đlköğretim ve Orta öğretimini Kayseri’de tamamladı. Lise eğitimini ise Antalya Karatay Lisesi’nde tamamladı. 2003 yılında Kayseri Erciyes Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümünde eğitim hakkı kazandı. 2007 yılında biyoloji bölümünden mezun oldu ve aynı yıl Kayseri Erciyes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Ana Bilimdalı’nda yüksek lisans eğitimine hak kazandı. Eğitimine halen devam etmektedir.

Adres : Mevlana Mh. Kaya Sk. Anaehir Kına Evleri E.19 Blok No:1/33

TALAS / KAYSERĐ

Tel : 0.537 463 50 53

Email : [email protected]

[email protected]