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Cara terização e

modelação da

celularidade muscular do

linguado (Solea

senegalensis ) através da dieta

Jealinda da Cruz Fortes Dissertação de Mestrado em Engenharia Agronómica Departamento de Geociências, Ambiente e Ordenamento do Território 2015

Orientadora Ana Rita Jordão Bentes Cabrita, Professora Auxiliar do Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar, Universidade do Porto

Co orientadora Luísa Maria Pinheiro Valente, Professora Associada do Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar, Universidade do Porto

Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas.

O Presidente do Júri,

Porto, ______/______/______

I

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi desenvolvido no âmbito do projeto “Sustainable Aquaculture and Animal Welfare (AQUAIMPROV)” parcialmente suportado pelo NORTE-07-0124-FEDER- 000038, no contexto do Programa Operacional da Região Norte (ON.2 – O Novo Norte).

A realização deste trabalho não teria sido possível sem a colaboração e o apoio de várias pessoas. Desta forma gostaria de expressar o meu sincero agradecimento:

À Professora Doutora Luísa Valente por aceitar ser minha co-orientadora, pela disponibilidade, orientação, motivação, apoio e paciência demonstrada ao longo da realização deste trabalho.

À Professora Doutora Rita Cabrita pela orientação e paciência demonstrada na realização deste trabalho.

À Vera Sousa, Graciliana Lopes, Lúcia Barriga Negra e à Paula Canada pela simpatia, motivação e ajuda prestada.

À minha família por todo o apoio, compreensão e motivação ao longo do meu percurso académico. Sou vos eternamente grata!

Aos meus amigos pelo companheirismo e pelas palavras amigas. Vocês sabem quem são!

II

RESUMO

A aquacultura é um setor em grande expansão, sendo o linguado do Senegal (Solea senegalensis) uma das espécies prioritárias para a sua diversificação, dado ao seu elevado valor comercial e boa taxa de crescimento. Um dos principais fatores extrínsecos que influenciam o crescimento nos peixes é a composição das dietas. Portanto, o conhecimento das necessidades nutricionais e da sua influência no crescimento e desenvolvimento muscular das larvas é importante para a aquacultura devido às alterações que ocorrem na morfologia, fisiologia e metabolismo durante o período larval de peixes planos. As dietas inertes têm sido utilizadas durante o período de desmame das larvas de linguado para a substituição do alimento vivo (artémia), embora a fase da adaptação a estas dietas seja, ainda, difícil resultando em mortalidades elevadas.

O presente trabalho teve como objetivo a avaliação da influência de diferentes dietas inertes no crescimento e na celularidade muscular de larvas do linguado 19 dias após eclosão. Foi ainda avaliada a distribuição das fibras musculares brancas pelos quatro quadrantes de cortes transversais da região anal. As larvas de linguado foram co- alimentadas recorrendo a alimento vivo e inerte, desde da abertura da boca. Para tal, foram formuladas três dietas com fontes proteicas distintas (CTRL – baseada na composição proteica dos rotíferos composta por ingredientes práticos utilizados pela indústria, nomeadamente um hidrolisado de peixe encapsulado; PBALL - baseada na composição de aminoácidos (AA) do linguado, em que 4% da proteína do hidrolisado de peixe encapsulado foi substituído por um encapsulado de AA cristalinos livres; WBALL - baseada na dieta PBALL tendo-se no entanto corrigido o perfil de aminoácidos atendendo à sua biodisponibilidade, 8% da proteína do hidrolisado de peixe encapsulado foi substituído por um encapsulado de AA cristalinos livres).

No final do ensaio verificou-se que a dieta CTRL promoveu o crescimento das larvas, levando a um peso seco final significativamente superior ao obtido pelas larvas alimentadas com as restantes dietas. Contudo, a taxa de crescimento ralativo não foi significativamente afetada pela dieta. O comprimento padrão das larvas apresentou diferenças significativas entre os tratamentos, tendo sido superior com a dieta CTRL e menor com a dieta WBALL. A dieta PBALL promoveu um comprimento padrão das larvas não significativa diferente das outras dietas experimentais. As dietas utilizadas não afetaram significativamente o crescimento muscular nos quatro quadrantes (dorsal, ventral, direito e esquerdo) analisados individualmente em corte transversal.

III

No que diz respeito à celularidade, não houve diferenças significativas entre a parte dorsal e ventral de uma secção transversal mas houve entre o lado direito e esquerdo. O lado esquerdo apresentou maior área muscular, maior número de fibras musculares brancas e maior densidade de fibras. O lado direito apresentou maior área média de fibras musculares brancas.

Com este estudo concluiu-se que a composição das dietas inertes não afeta a celularidade muscular. No que respeita às medidas morfométricas, este estudo permitiu avaliar pela primeira vez a simetria muscular em larvas de linguado, concluindo-se assim que existe simetria entre os quadrantes dorsal e ventral de uma seção transversal. Estes resultados sugerem que a avaliação da celularidade numa seção transversal poderá ser estimada de forma segura e representativa através da duplicação dos resultados determinados apenas para o quadrante dorsal ou ventral, sem necessidade de avaliar ambos. Dada a morosidade desta avaliação, este resultado irá traduzir-se numa imensa poupança de tempo na determinação da celularidade muscular em linguado.

Palavras-chave: Solea senegalensis, Crescimento, Celularidade, Simetria muscular, Dietas inertes.

IV

ABSTRACT

Aquaculture is a growing industry, and the Senegalese sole (Solea senegalensis) is one of the priority species for diversification, given its high commercial value and good growth rate. The composition of the diets is one of the main extrinsic factors that influence the growth and muscle cellularity in fish. Therefore, knowledge of the nutritional needs and its influence on the growth and development of larvae is important for aquaculture due to the changes that occur in the morphology, physiology and metabolism during the larval stage of flatfish. The inert diets have been used during the weaning period for replacing live feed (artemia) while the phase of adaptation to inert diet, this is still an obstacle resulting in a high mortality.

This study aimed to verify the influence of different inert diets on growth and cellularity of sole larvae 19 days after hatching and evaluation of its symmetry in the distribution of muscle fibers in the four quadrants of cross sections of the anal region. The sole larvae were co-fed using live and inert food from the mouth opening. Three diets were formulated with different protein sources (CTRL - based protein composition comprising rotifers practical ingredients used by industry, including an encapsulated fish hydrolyzate; PBALL - based on the amino acid composition (AA) of the sole, in which 4% of the encapsulated fish protein hydrolyzate was replaced by a free encapsulated crystalline AA; WBALL - based diet PBALL where the amino acid profile were corrected according to their bioavailability, 8% of the encapsulated fish protein hydrolyzate was substituted by one encapsulated crystalline free AA).

Regarding growth, the CTRL diet promoted a significantly higher final dry weight of larvae than other diets. However, relative growth rate was not significantly affected by dietary tretaments. The standard length of larvae showed significant differences between treatments, being higher in the CTRL diet and lower in the WBALL diet. The PBALL diet caused a standard length of larvae not significantly different from the other experimental diets. The diets did not affect muscle growth in all four quadrants (dorsal, ventral, right and left) of cross-section when analyzed individually.

With regard to cellularity, no significant differences between the dorsal and ventral part of the cross section were observed but there was between right and left. The left side had more muscle area, the greater number of white muscle fibers and increased fiber density. The right side showed higher average area of white muscle fibers.

V

In summary the composition of the inert diets did not affect muscle cellularity. Regarding the morphometric measurements, this study allowed for the first time the evaluation of muscular symmetry in sole larvae, thus concluding that there is symmetry between the dorsal and ventral quadrants of a cross section suggesting that the evaluation of cellularity in a cross section may be estimated securely and representatively through the doubling of the determined results of the dorsal or ventral quadrant, without a need to measure both. This result will have a strong practical implication in morphometric studies due to the morosity of such determinations.

Key-words: Solea senegalensis, Growth, Cellularity, Muscle symmetry, Inert diets.

VI

ÍNDICE

Págs.

AGRADECIMENTOS...... I

RESUMO ...... II

ABSTRACT ...... IV

ÍNDICE DE FIGURAS ...... VIII

ÍNDICE DE QUADROS ...... X

LISTA DE ABREVIATURAS ...... XI

1. INTRODUÇÃO GERAL ...... 1 1.1. Biologia do Linguado Senegalês (Solea Senegalensis) ...... 3 1.2. Desenvolvimento embrionário e estágios larvais em Solea Senegalensis ...... 4 1.2.1. Fases do desenvolvimento larval ...... 7 1.3. Estágios da metamorfose larval ...... 7 1.4. Morfologia e tipos de fibras musculares ...... 11 1.4.1. Fibras musculares vermelhas ou lentas ...... 14 1.4.2. Fibras musculares brancas ou rápidas ...... 14 1.4.3. Fibras musculares rosas ou intermédias ...... 14 1.5. Mecanismo do crescimento muscular ...... 15 1.5.1. Hipertrofia ...... 16 1.5.2. Hiperplasia ...... 16 1.6. Fatores que influenciam o crescimento muscular ...... 18 1.6.1. Fatores intrínsecos ...... 18 1.6.1.1. Genéticos ...... 18 1.6.1.2. Manipulação hormonal ...... 19 1.6.2. Fatores extrínsecos ...... 19 1.6.2.1. Temperatura ...... 20 1.6.2.2. Dieta ...... 20 2. TRABALHO EXPERIMENTAL ...... 23 2.1. Introdução ...... 23 2.2. Objetivos ...... 24 2.3. Material e Métodos ...... 25 2.3.1. Condições zooténicas e dietas experimentais ...... 25 VII

2.3.2. Amostragem e preparação da amostra ...... 27 2.3.3. Análise estatística ...... 31 2.4. Resultados ...... 32 2.4.1. Crescimento, celularidade muscular e avaliação da simetria ...... 32 2.5. Discussão ...... 36 2.6. Conclusão ...... 37 3. BIBLIOGRAFIA ...... 38

VIII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 - Distribuição geográfica de Solea senegalensis (em cor de rosa) (Porta, 2006).2 Figura 2 - Solea Senegalensis na fase adulta (LANUCE: www.ciimar.up.pt). Consultado a 08/05/2015 ...... 3 Figura 3 - Fase de Segmentação: Divisões do zigoto, formação da mórula e da blástula (fonte: http://www.coladaweb.com/biologia/desenvolvimento/desenvolvimento- embrionario-dos-animais. Consultado a 04/06/2015)...... 6 Figura 4 - Organogénese: Formação dos tecidos e órgãos dos animais (fonte: http://bio- consequencias.blogspot.pt/2013_06_01_archive.html. Consultado a 04/06/2015)...... 7 Figura 5 - Migração do olho no Sub-estágio 0 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001)...... 8 Figura 6 - Migração do olho no Sub-estágio 1 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001)...... 9 Figura 7 - Migração do olho no Sub-estágio 2 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001)...... 9 Figura 8 - Migração do olho no Sub-estágio 3 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001)...... 10 Figura 9 - Migração do olho no Sub-estágio 4 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001)...... 10 Figura 10 - (a) Ilustração de um extrato paralelo de interações de moléculas de miosina formando um filamento bipolar. A miosina é composta de uma haste e uma região globular, conhecida como cabeça da miosina, a qual interage com filamentos de actina para produzir a força muscular. (b) Ilustração dos principais componentes do filamento de actina (fino): dupla hélice de actina globular conectada à molécula de tropomiosina e complexos de troponina. Tropomiosina e troponina estão envolvidas na regulação da atividade contráctil (Santos, 2007)...... 12 Figura 11 - Esquema do arranjo das fibras musculares dentro do miótomo dos teleósteos: (A) vista dorsal e lateral, (B) Seção transversal, com fibras vermelhas e brancas. (C) Vista lateral de três miótomos ao longo do corpo e segmentos do músculo em forma de W (Sänger e Stoiber, 2001)...... 13 Figura 12 - Esquematização de um corte transversal da musculatura de peixe demonstrado a organização anatómica da musculatura estriada (Mareco, 2012)...... 13 Figura 13 - Mecanismos de crescimento muscular: hipertrofia e hiperplasia (Mareco, 2012)...... 15 Figura 14 - Exemplo de fotografia para determinar o comprimento standart da larva (SL = desde a extremidade da cabeça até ao pedúnculo caudal)...... 28 IX

Figura 15 - Exemplo de frasco adequado ao armazenamento para fixação de larvas (fundo plano)...... 28 Figura 16 - Exemplo de larvas incluídas em parafina (solidificada) e suportada por cassete devidamente identificada. Note-se que a cassete do lado esquerdo foi aparada e cortada e a do lado direito ainda não...... 29 Figura 17 - Cortes transversais em diferentes zonas no eixo antero – posterior 19 dias após eclosão A: Corte muito anterior à localização desejada. B: Corte anterior à localização desejada. NC – notocorda; TB – tubo neural; IA – intestino anterior. C: Corte seleccionado para caracterização do crescimento muscular; NA – ânus; Área delimitada a amarelo - Área Total Transversal (ATT); Área delimitada a azul - Área Muscular Dorsal Esquerdo (AMDEsq); Área delimitada a laranja - Área Muscular Ventral Esquerdo (AMVEsq); Área delimitada a vermelho - Área Muscular Ventral Direito (AMVDto); Área delimitada a verde-escuro - Área Muscular Dorsal Direito (AMDDto); D: Corte posterior à localização desejada...... 29 Figura 18 - Programa CellB, Olympos para análise morfomérica das larvas...... 30 Figura 19 - Exemplos de contagem de fibras transversais em todo o quadrante de músculo dorsal esquerdo, imagem à esquerda (como parcela da AMT) e medição da área media de fibras transversais, imagem à direita...... 30 Figura 20 - Eixo de simetria de uma secção transversal muscular em larva de S. senegalensis (19 DAE): Abertura do ânus, o lado Dorsal e Ventral, eixo de simetria entre o lado Direito e Esquerdo...... 34

X

ÍNDICE DE QUADROS

Quadro 1 - Composição em ingredientes e análise proximal das dietas experimentais ...26 Quadro 2 - Composição de aminoácidos (mg AA/g amostra) das dietas experimentais ...27 Quadro 3 - Dados de crescimento: Peso seco (mg) e comprimento padrão (mm) de larvas de linguado alimentados com diferentes dietas...... 32 Quadro 4 - Efeito das dietas no crescimento muscular das larvas (19 DAE) ...... 33 Quadro 5 - O efeito entre as diferentes áreas amostradas quanto à celularidade e simetria muscular ...... 35

XI

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA – Analysis of Variance AM Esquerdo - Área Muscular Esquerdo AM Direito - Área Muscular Direito AMVEsq - Área Muscular Ventral Esquerdo AMVDto - Área Muscular Ventral Direito AMDDto - Área Muscular Dorsal Direito AA – Aminoácidos ATT - Área Total Transversal Dietas: CTRL (Controlo), BALL (Parcialmente Balanceada) e WBALL (Muito balanceada) DAE - Dias Após Eclosão DHA – Ácido Docosahexaenóico DPX - Meio de Montagem com Resina Sintética ED – Energia Digestível FAO – Food and Agriculture Organization GH Hormona de Crescimento INE – Instituto Nacional de Estatística HE - Coloração com Hematoxilina e Eosina HC - Hidratos Carbono IPIMAR - Instituto de Investigação das Pescas e do Mar IGF-I - Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo I MA - Metanauplios de Artémia MS - Matéria Seca NA - Nauplios de Artémia NRC - National Research Council PD – Proteína Digestível PB – Proteína Bruta PFA - Paraformaldeído PBS - Tampão Fosfato RGR - Taxa de Crescimento Relativo SPSS - Statistical Package for the Social Science STATISTICA - Statistics and Analytics Software Package

FCUP 1 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

1. INTRODUÇÃO GERAL

A aquacultura pode ser definida como sendo a produção de organismos aquáticos, tais como peixes, moluscos, crustáceos e algas. Trata-se de uma atividade muito diversificada que abrange uma vasta gama de espécies e práticas de produção em águas doces, salobras e salgadas (IPIMAR, 2008), em regime extensivo, regime semi- intensivo e em regime intensivo.

Segundo dados estatísticos da FAO, em 2011, o país com maior produção em aquacultura foi a China com 38,6 milhões de toneladas, seguida da Índia, Vietname e Indonésia. O continente asiático contém as maiores produções de pescado em aquacultura, sendo a Noruega o maior produtor da Europa com 1,14 milhões de toneladas, o Egito possui a maior produção de África com 9,87 mil toneladas e, por fim, o Chile é o maior produtor da América com 9,55 mil toneladas (FAO, 2013).

Portugal encontra-se sob influência do Mar Mediterrânico e do Oceano Atlântico e devido às suas características geográficas, apresenta boas condições para o desenvolvimento da aquacultura, nomeadamente através da cultura de novas espécies com interesse comercial (Diniz, 1998). A aquacultura nacional baseia-se na cultura em águas continentais, fundamentalmente a cultura de salmonídeos e enguias, e na cultura em águas oceânicas, produzindo principalmente robalo, dourada, rodovalho, ostra e amêijoa (Diniz, 1998). Segundo dados do INE (2014), as principais espécies produzidas em Portugal, em águas salobras e marinhas, em toneladas (t) foram: Pregado (2353 t), seguido de Dourada (1201 t), Robalo (455 t), Linguado (154 t), Corvina (5 t) e outros (2 t), correspondendo a um total de 4171 t de peixes produzidas. Moluscos e crustáceos correspondem a um total de 5012 t, principalmente amêijoas (2372 t), seguido de mexilhões (1547 t), ostras (995 t) e outros (98 t).

O cultivo do linguado (Solea senegalensis) tem vindo a aumentar, pois esta é uma espécie com elevado valor comercial e bem adaptada às águas temperadas, tornando-se numa espécie prioritária para a diversificação da aquacultura (Dinis et al., 1999). O linguado é um peixe bentónico e pouco ativo, conseguindo resistir a longos períodos de fome (Dinis et al., 1999).

FCUP 2 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Geograficamente, a S. senegalensis ocorre em águas subtropicais e temperadas do Oceano Atlântico e distribui-se desde a costa Atlântica e África (Senegal) até ao Golfo de Biscaia (Quéro et al., 1989), e é menos frequente no mediterrâneo (Quéro et al., 1986) (figura 1). Esta espécie adapta-se bem a climas quentes, sendo produzida de forma extensiva em viveiros ao longo da costa sul de Portugal e de Espanha (Drake et al., 1984; Dinis, 1992).

Figura 1 - Distribuição geográfica de Solea senegalensis (em cor de rosa) (Porta, 2006).

Na aquacultura, os custos totais relacionados com a alimentação representam cerca de 50% a 80% do total dos custos de produção (Turchini et al., 2011). Para a formulação de uma dieta tem que se ter conhecimento adequado da espécie a ser criada, das suas fases de crescimento, assim como o valor nutritivo dos ingredientes que irão compor a dieta. O uso de alimentos compostos na aquacultura surge assim com o objetivo de ajudar a balancear os nutrientes adequados para os peixes, promovendo um melhor crescimento e levando a uma aquacultura mais sustentável (Sussel, 2008). Para formular dietas de alto teor proteico, capazes de proporcionar bons índices de conversão, com taxas elevadas de crescimento, mais baratas e com menores desperdícios (Tacon e Cowey, 1985).

O conhecimento das necessidades nutricionais e da sua influência no crescimento e no desenvolvimento das larvas é de grande importância para a aquacultura, devido às alterações que ocorrem na morfologia, fisiologia e metabolismo, durante o período larval dos peixes teleósteos (Zambonino-Infante et al., 2008) e à dificuldade na manipulação da composição nutricional dos alimentos vivos, que são indispensáveis na primeira alimentação das espécies marinhas produzidas (Conceição et al., 2010).

FCUP 3 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

O desenvolvimento de dietas inertes que sejam bem ingeridas, digeridas e assimiladas pelas larvas desde a abertura da boca, têm sido um objeto primordial de investigação. Atualmente, dietas de substituição de artémia são uma estratégia de alimentação amplamente utilizada na larvicultura de peixes, uma vez que estas dietas, sendo inertes, são mais fáceis de usar e têm uma composição estável, quando comparadas com alimentos vivos, os quais podem variar de acordo com o tipo de cultivo. Isto é especialmente importante no linguado Senegalês, uma vez que o tipo de dieta inerte usado durante o período de desmame pode atrasar ou promover a maturação digestiva (Engrola et al., 2009).

1.1. Biologia do Linguado Senegalês (Solea Senegalensis)

O linguado do Senegal (figura 2) pertence à classe Actinopterygii, ordem Pleuronectiformes, família Soleidae, género Solea.

Figura 2 - Solea Senegalensis na fase adulta (LANUCE: www.ciimar.up.pt). Consultado a 08/05/2015

S. senegalensis é um pleuronetiforme, com os dois olhos situados no lado direito da cabeça em juvenis e adultos. Na fase larvar, os olhos são simétricos e a migração do olho esquerdo ocorre durante a metamorfose (Padrós et al., 2011). Passando por um processo de metamorfose complexo (Ribeiro et al., 1999; Fernández-Díaz et al., 2001), a passagem de uma larva pelágica a pós-larva bentónica ocorre através de uma série de alterações drásticas no corpo, incluindo o rearranjo dos órgãos internos e a reorganização do trato digestivo (Ribeiro et al., 1999). Apresenta um comprimento total de 32 cm quando as fêmeas atingem a maturidade aos 3 anos (Dinis, 1986). Os linguados adultos vivem em águas marinhas próximo da costa a 80 m de profundidade (Dinis, 1986), em lagos de água salobra e estuários.

FCUP 4 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

É um peixe gonocórico, ovíparo, sendo os ovos fertilizados externamente. A reprodução ocorre no mar e a desova em águas costeiras. A época de reprodução desta espécie é muito variável e tem em geral dois períodos anuais, de janeiro a junho e de outubro a novembro (García-Lopez et al., 2006). A época de postura estende-se por um período de 4 meses (abril a julho) com um máximo de emissão de ovos em maio (Dinis, 1986). A desova é influenciada pela temperatura ambiente, (intervalo óptimo entre 15-21 °C) (Anguis e Cañavate, 2005). Estando o início da desova, relacionado com o aumento da temperatura da água na primavera.

S. senegalensis tem uma boa taxa de crescimento, sendo por isso uma boa opção para a aquacultura, quando comparado com outras espécies de Solea (Howell, 1997; Imsland et al., 2003). Esta espécie tem um elevado potencial económico nos países do atlântico e norte de África, onde se produz à escala comercial (Dinis et al., 1999; Imsland et al., 2003). Sendo importante para diversificar a oferta, a produção de S. senegalensis pode melhorar o valor comercial das espécies produzidas em aquacultura (Dinis et al., 1999).

No que respeita ao regime alimentar, estudos realizados nos conteúdos estomacais desta espécie, identificaram anfípodes e isópodes, embora os adultos se alimentem de poliquetas e moluscos (Arias e Drake, 1990). As pós-larvas e juvenis (até 7cm de comprimento total) consomem pequenos crustáceos, entre os quais predominam os copépodes harpacticóides, mas também consomem poliquetas em quantidades apreciáveis (Arias e Drake, 1990).

1.2. Desenvolvimento embrionário e estágios larvais em Solea Senegalensis

O linguado do Senegal possui duas fases de desenvolvimento. Primeiro passa por um processo embrionário como peixe, apresentando uma forma simétrica, com simetria dorso-ventral e posteriormente passa por um processo de metamorfose no qual adquire a forma assimétrica.

O desenvolvimento embrionário (embriogénese) é um processo que se inicia com a fertilização do ovócito e se prolonga até a eclosão das larvas (Kimmel et al., 1995). Após a fertilização, o ovo absorve água e ocorre a formação do espaço perivitelino, com a separação entre o córion e a membrana vitelina. O pólo do ovo onde o embrião se desenvolve é desprovido ou pobre em vitelo e é denominado de pólo animal, enquanto

FCUP 5 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta que o pólo oposto, rico em vitelo, não participa na formação do embrião propriamente dito, mas assegura a sua nutrição e é denominado de pólo vegetativo (Browder, 1984; Gilbert, 1997). Os ovos dos peixes são telolécitos, com um elevado suprimento de vitelo, necessário para nutrir o embrião durante a embriogénese, assim como as larvas, algum tempo após a eclosão (Nakatani et al., 2001). Os mecanismos básicos do desenvolvimento de teleósteos são semelhantes, mas diferem no que diz respeito ao tempo de desenvolvimento, pois são eventos controlados por fatores genéticos e ambientais (Falk-Petersen, 2005). A duração do período embrionário e o padrão de desenvolvimento variam consideravelmente entre as diferentes espécies de peixes, pelo que, as características morfológicas das larvas diferem significativamente no momento da eclosão (Balon, 1981).

A embriogénese e o desenvolvimento larval são estágios importantes do ciclo biológico por prover informações sobre a biologia e evolução dos peixes, principalmente no que respeita aos aspetos relacionados com a ontogenia, alimentação, reprodução e comportamento (Gomes et al., 2007). A duração da embriogénese varia de acordo com a estratégia reprodutiva de cada espécie e é afetada por fatores ambientais, principalmente a temperatura (Gomes et al., 2007).

A embriogénese inclui a maioria das fases de desenvolvimento dos animais. A maioria das espécies passa por estádios embrionários comparáveis, apesar de existirem particularidades que variam consideravelmente entre os vários grupos (Browder, 1984). Consideram-se, assim, 3 fases comuns:

1 Segmentação: Esta fase é caraterizada por uma série de divisões celulares que asseguram a passagem do estado unicelular (zigoto) para o estado pluricelular (figura 3). Nos teleósteos, a segmentação é meroblástica e discoidal (clivagem incompleta) e ocorre nos ovos telolecíticos, originando o blastodisco localizado no pólo animal. No final da segmentação, os blastómeros encontram-se organizados numa camada única, resultando de sucessivas divisões que darão ao embrião o aspeto de mórula. Com a continuidade da segmentação, algumas células marginais fundem-se com o vitelo, formando uma camada celular entre o vitelo e o embrião, o sincício vitelino. As células mais periféricas formam uma camada envolvente. Entre estas duas camadas situam-se os blastómeros profundos, que vão formar o embrião, o qual, neste estado, é denominado de blástula (Gilbert, 1997). A camada envolvente e o sincício vitelino irão formar os anexos embrionários específicos dos teleósteos. A camada envolvente dá

FCUP 6 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta origem à periderme externa, uma camada protetora que desaparecerá posteriormente, tal como o sincício vitelino, após a reabsorção do vitelo (Solnica-krezel et al., 1995).

Figura 3 - Fase de Segmentação: Divisões do zigoto, formação da mórula e da blástula (fonte: http://www.coladaweb.com/biologia/desenvolvimento/desenvolvimento-embrionario-dos-animais. Consultado a 04/06/2015).

2 Gastrulação: Nesta fase ocorre a transformação de uma blástula de um embrião em uma gástrula constituída de três folhetos embrionários (ectoderme, mesoderme e endoderme). A ectoderme (camada exterior) dá origem à epiderme e ao sistema nervoso. A mesoderme (camada intermédia) produz o sistema circulatório, o músculo, o esqueleto e o tecido conjuntivo. A endoderme (camada interior) produz o intestino e os seus órgãos associados. A gastrulação começa pela involução simultânea dos blastómeros profundos situados à volta da blastoderme, conduzindo à formação do anel germinativo. Os blastómeros intercalam-se alongando assim o botão embrionário e formando rapidamente um eixo embrionário antero-posterior (Warga e Kimmel, 1990; Solnica-krezel et al., 1995). Esta fase do desenvolvimento corresponde também ao aparecimento da notocorda e dos primeiros pares de sómito. Os sómitos diferenciam-se por segmentação da mesoderme paraxial, segundo um gradiente rostral-caudal que acompanha o alongamento do embrião (Holley e Nüsslein-Volard, 2000; Stickney et al., 2000).

3 Histogénese ou Organogénese: Nesta fase ocorre a diferenciação celular em tecidos e órgãos, a partir dos três folhetos germinativos (ectoderme, mesoderme e endoderme) (figura 4).

FCUP 7 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Figura 4 - Organogénese: Formação dos tecidos e órgãos dos animais (fonte: http://bio- consequencias.blogspot.pt/2013_06_01_archive.html. Consultado a 04/06/2015).

1.2.1. Fases do desenvolvimento larval

A fase larval pode durar de alguns dias a meses, dependendo da temperatura e também da espécie. A maioria das larvas de peixes de água doce eclode transparente, com boca e mandíbulas ainda não formadas, olhos com pouca pigmentação e saco vitelino grande (Nakatani et al., 2001). Em muitas espécies, a maioria dos órgãos começam a ser funcionais após a primeira alimentação e durante a diferenciação dos estágios larvais e de metamorfose, embora alguns peixes de desenvolvimento direto e longo período de incubação apresentem larvas com morfologia e funcionamento de órgãos imediatamente a seguir à eclosão (Falk-Petersen, 2005).

O período de absorção do saco vitelino é vital para a larva, pois, nesse período, o sistema digestivo ainda se encontra em diferenciação. A abertura da boca, do lúmen intestinal e a pigmentação da retina estão estreitamente ligados à primeira alimentação da larva (Godinho et al., 2003).

1.3. Estágios da metamorfose larval

A metamorfose nos peixes planos é caracterizada por transformações anatómicas complexas durante o desenvolvimento e envolve uma rotação de 90° na posição do corpo e a migração de um olho para o lado ocular superior (Fernández-Díaz et al., 2001), assim como, a ossificação e o desenvolvimento do esqueleto (Saele et al., 2003). Essas transformações estão associadas com o assentamento das larvas no substrato e com a mudança do habitat pelágico para o habitat bentónico, o que implica alterações importantes nos hábitos alimentares e na fisiologia digestiva (Tanaka et al., 1996). As

FCUP 8 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta transformações nos peixes planos ocorrem numa grande variedade de tamanhos dependendo das espécies e das condições ambientais (Osse e Van den Boogaart, 1997).

Em peixes planos como S. Senegalensis, o tamanho é mais determinante para mostrar o estado da ontogenia do que a idade, tornando-se assim necessário fazer a referência à idade e ao tamanho sempre que se utilizam os estágios de desenvolvimento em estudos morfométricos (Fernández-Díaz et al., 2001).

Um ponto fundamental para definir o início da metamorfose seria a mudança do crescimento isométrico para o crescimento alométrico. Uma boa medida de transformação morfométrica em S. senegalensis é a determinação do estado de desenvolvimento através da posição do olho (Fernández-Díaz et al., 2001). Porém, há outras transformações que ocorrem após o olho alcançar a posição final, tais como a ossificação cranial (Brewster, 1987) e o desenvolvimento completo dos intestinos (Ribeiro et al., 1999).

São cinco os sub-estágios de desenvolvimento durante a metamorfose larval de S. senegalensis (Fernández-Díaz et al., 2001).

Sub-estágio 0: 8 dias após eclosão (DAE)

As larvas são simétricas e possuem um plano de natação vertical. Este estágio ocorre próximo da primeira alimentação e antes das transformações nos músculos se tornarem visíveis (Fernández-Díaz et al., 2001) (figura 5).

Figura 5 - Migração do olho no Sub-estágio 0 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001).

Sub-estágio 1: 13 dias após eclosão (DAE)

FCUP 9 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Nesta fase, o olho esquerdo inicia a migração para a posição dorsal, até tocar a linha média da superfície dorsal. Os indivíduos não são completamente simétricos (Fernández-Díaz et al., 2001) (figura 6).

Figura 6 - Migração do olho no Sub-estágio 1 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001).

Sub-estágio 2: 19 dias após eclosão (DAE)

A migração do olho esquerdo para o lado direito, pode ser visto a partir do lado ocular direito, até atingir a linha média da superfície dorsal (Fernández-Díaz et al., 2001) (figura 7).

Figura 7 - Migração do olho no Sub-estágio 2 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001).

Sub-estágio 3: 22 dias após eclosão (DAE)

FCUP 10 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Os indivíduos mudam de plano de natação e a migração do olho continua para o lado ocular oposto (Fernández-Díaz et al., 2001) (figura 8).

Figura 8 - Migração do olho no Sub-estágio 3 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001).

Sub-estágio 4: 25 dias após eclosão (DAE)

O olho esquerdo completa a sua translocação e o arco orbital é claramente visível (Fernández-Díaz et al., 2001) (figura 9).

Figura 9 - Migração do olho no Sub-estágio 4 (Adaptado de Fernández-Díaz et al., 2001).

Durante a metamorfose, as larvas de peixes planos passam a maior parte do tempo na coluna de água, alimentando-se de presas planctónicas (Fernández-Díaz et al.,

FCUP 11 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

2001). Em algumas espécies a metamorfose está relacionada com o tamanho das larvas, enquanto noutras depende mais da taxa de crescimento. Isto faz com que em algumas espécies haja um limite de tamanhos para a metamorfose, o que resulta num assentamento sincronizado e numa distribuição de tamanhos uniformes após o assentamento das larvas (Fernández-Díaz et al., 2001). Em S. senegalensis, uma má alimentação resulta num crescimento larval mais lento e numa metamorfose menos sincronizada (Fernández-Díaz et al., 2001).

O crescimento após a metamorfose varia entre as diferentes espécies de peixes planos. Portanto, variações individuais nas taxas de crescimento são uma característica importante nas larvas e juvenis (Benoit e Pepin, 1999).

1.4. Morfologia e tipos de fibras musculares

O músculo esquelético representa 40-60% do peso total dos peixes (Bone, 1978) e constitui uma importante fonte de proteína utilizada na alimentação humana (Weatherley e Gill, 1985). Nos peixes teleósteos é constituído por unidades idênticas, os miótomos, que se encontram separados uns dos outros por uma camada de tecido conjuntivo, os miosetos (Alexander, 1969). O mioseto forma uma série de cones sobrepostos ao longo do eixo, paralelos à linha média, dando origem à aparência característica dos miótomos em forma de W, em corte longitudinal (Van Leeuwen, 1999). Cada miótomo contém uma região superficial em forma de cunha, situada abaixo da linha lateral, na qual as fibras musculares ocorrem paralelamente ao eixo do corpo, e uma região profunda, em que as fibras musculares estão arranjadas em forma helicoidal, formando ângulos de aproximadamente 40º e está associado à necessidade de quantidades constantes de encurtamento do sarcómero em diferentes zonas de flexão do corpo (Sänger e Stoiber, 2001).

As fibras musculares são compostas por várias miofibrilas. As miofibrilas cilíndricas são formadas por sarcómeros. Os componentes do sarcómero incluem dois tipos de miofilamentos, constituídos por proteínas, a actina e a miosina. Estas proteínas estão dispostas alternadamente. A miosina é uma proteína motora que interage com os filamentos da actina levando à contração das células musculares através da hidrólise de ATP. No músculo esquelético, a contração é regulada por quatro proteínas associadas à actina: tropomiosina e troponina C, I e T, dispostas longitudinalmente. A concentração de

FCUP 12 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Ca2 + citosólico influencia a posição destas proteínas e controla a interação actina-miosina (Purves et al., 2001) (figura 10).

Figura 10 - (a) Ilustração de um extrato paralelo de interações de moléculas de miosina formando um filamento bipolar. A miosina é composta de uma haste e uma região globular, conhecida como cabeça da miosina, a qual interage com filamentos de actina para produzir a força muscular. (b) Ilustração dos principais componentes do filamento de actina (fino): dupla hélice de actina globular conectada à molécula de tropomiosina e complexos de troponina. Tropomiosina e troponina estão envolvidas na regulação da atividade contráctil (Santos, 2007).

O músculo axial do peixe é composto por fibras musculares distintas: o músculo vermelho (superficial), com metabolismo oxidativo e contração lenta e músculo branco (profundo), com metabolismo glicolítico e contração rápida (Johnston et al., 1977; Bone, 1978) (figura 11). Em vários peixes, o músculo rosa localizado na zona de transição entre o músculo branco e vermelho contém fibras caracterizadas por contratação rápida com resistência intermediária à fadiga e com velocidade intermediária (Johnston et al., 1977). O músculo axial consiste principalmente de fibras brancas, cobertas por uma fina camada de fibras musculares vermelhas, e por uma camada de fibras-rosa, ou intermediárias, entre elas. A cor do músculo indica o grau de vascularização dos diferentes tipos de fibras. O músculo vermelho é mais escuro devido ao teor elevado de mioglobina, elevada densidade mitocondrial e elevado grau de capilarização, em contraste com os valores baixos desses parâmetros no músculo branco. O músculo rosa possui características intermediárias (Sänger e Stoiber, 2001).

FCUP 13 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Figura 11 - Esquema do arranjo das fibras musculares dentro do miótomo dos teleósteos: (A) vista dorsal e lateral, (B) Seção transversal, com fibras vermelhas e brancas. (C) Vista lateral de três miótomos ao longo do corpo e segmentos do músculo em forma de W (Sänger e Stoiber, 2001).

O músculo natatório dos peixes compreende uma grande parte da massa corporal. Os fortes músculos axiais, que flexionam a coluna vertebral e a região caudal de um lado para o outro, durante a natação, estão divididos em porção epiaxial (dorsal) e hipoaxial (ventral) por meio de um septo lateral ou transverso (horizontal) de tecido conjuntivo, localizado na região do nervo da linha lateral. A coluna vertebral é flexível e suporta um septo medial que divide o corpo em antímeros direito e esquerdo (Videler, 2011) (figura 12).

Figura 12 - Esquematização de um corte transversal da musculatura de peixe demonstrado a organização anatómica da musculatura estriada (Mareco, 2012).

FCUP 14 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

1.4.1. Fibras musculares vermelhas ou lentas

As fibras musculares vermelhas constituem 10% a 30% da musculatura miotomal, estando presentes em maior proporção na região caudal (Zhang et al., 1996). Estão limitadas por uma estreita faixa superficial ao longo da linha lateral, inserindo-se na região do septo horizontal. Alinhadas em paralelo ao eixo do corpo, as fibras vermelhas são responsáveis por movimentos corporais lentos e de sustentação, como durante a migração, sendo utilizadas principalmente para manter a eficiência energética na natação (Rome, 1994). Apresentam um metabolismo oxidativo e de contração lenta, elevada densidade de mitocôndrias, gotículas de lípidos e reservas de glicogénio, assim como concentrações elevadas de mioglobina e citocromo (Sänger e Stoiber, 2001).

A proporção de músculo vermelho na região posterior (caudal) reflete um determinado estilo de vida, sendo que por, exemplo, peixes predadores possuem menos de 5% de músculo vermelho nesta região (Luther et al., 1995).

1.4.2. Fibras musculares brancas ou rápidas

As fibras brancas representam mais de 70% da massa do músculo miotomal e são as fibras com maior diâmetro, entre 50 e 100 μm ou mais (Sänger e Stoiber, 2001). A proporção da área da secção transversal do músculo miotomal correspondente ao músculo branco varia ao longo do comprimento do peixe, sendo maior na parte anterior do animal, diminuindo caudalmente (Zhang et al., 1996; Sänger e Stoiber, 2001).

As fibras musculares brancas possuem contração rápida e metabolismo glicolítico, menor suprimento de capilares sanguíneos, baixa concentração de mioglobina e poucas mitocôndrias (Sänger e Stoiber, 2001). Estas fibras são utilizadas durante a realização de movimentos bruscos de natação, como na captura de alimento ou durante a fuga de predadores (Altringham e Johnston, 1981). Há uma baixa vascularização no músculo glicolítico branco, assim como um teor reduzido em glicogénio com grânulos localizados principalmente entre miofibrilas (Sänger e Stoiber, 2001).

1.4.3. Fibras musculares rosas ou intermédias

As fibras musculares rosas apresentam propriedades morfofisiológicas intermédias em relação às fibras musculares brancas e vermelhas. Na maioria das

FCUP 15 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta espécies de teleósteos juvenis e adultos, as fibras musculares intermédias encontram-se inseridas entre as fibras musculares vermelhas e brancas, e a sua quantidade difere entre as espécies e estágios de desenvolvimento dos peixes (Zhang et al.,1996; Sänger e Stoiber, 2001). Por exemplo, na carpa comum, as fibras intermédias correspondem normalmente a cerca de 10% da massa miotomal e são ligeiramente maiores do que as fibras vermelhas (Gill et al., 1989), enquanto nos ciprinídeos (Sänger et al., 1988) a quantidade de fibras vermelhas é sempre maior do que as fibras intermédias. O diâmetro médio destas fibras situa-se entre o diâmetro das fibras de músculo branco e vermelho. Apresentam contração rápida, resistência intermédia à fadiga e metabolismo oxidativo ou glicolítico intermédio (Johnston et al., 1977; Mascarello et al., 1986)

1.5. Mecanismo do crescimento muscular

O crescimento muscular nos peixes envolve os mecanismos de hipertrofia e hiperplasia das fibras a partir da proliferação e diferenciação de mioblastos indiferenciados ou células miossatélites (Johnston et al., 2000). A hipertrofia consiste no alargamento das fibras musculares já existentes enquanto a hiperplasia consiste no recrutamento de novas fibras musculares (Koumans e Akster, 1995; Rowlerson e Veggetti, 2001) (figura 13).

Figura 13 - Mecanismos de crescimento muscular: hipertrofia e hiperplasia (Mareco, 2012).

Nos peixes, o crescimento difere dos mamíferos, uma vez que ocorre recrutamento muscular contínuo ao longo do ciclo de vida, ou seja, a hiperplasia continua com o crescimento hipertrófico no período pós-larval (Stickland, 1983). O aspeto mosaico das fibras brancas é devido ao crescimento hiperplásico em várias espécies (Weatherley e Gill, 1984; Rowlerson et al., 1985). Nos mamíferos, o crescimento muscular pós-natal

FCUP 16 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta envolve apenas a hipertrofia das fibras musculares formadas durante o desenvolvimento embrionário (Rowe e Goldspink, 1969), no entanto a hiperplasia cessa num curto período de tempo após o nascimento (Johnston et al., 2000).

A contribuição da hiperplasia e da hipertrofia para o crescimento muscular variam entre as espécies e as diferentes fases de crescimento, dependendo também do tamanho final e de fatores ambientais (Johnston, 1993; Aguiar et al., 2005). Nos peixes que atingem um tamanho pequeno, o crescimento muscular pós-natal ocorre principalmente por hipertrofia das fibras e a hiperplasia ocorre somente nas fases iniciais do desenvolvimento. Por outro lado, nas espécies de crescimento indeterminado e que atingem um tamanho maior, a hiperplasia das fibras estende-se por um período de tempo mais prolongado (Rowlerson e Veggetti, 2001).

1.5.1. Hipertrofia

Durante o crescimento hipertrófico, as células satélites ativas fundem-se com fibras musculares existentes, aumentando o número de núcleos para uma maior síntese de miofibrilas, levando ao aumento do diâmetro ou da área das fibras musculares (Johnston, 1999, 2001). As fibras musculares crescem por hipertrofia durante todo o período de crescimento pós-embrionário na maioria das espécies, situando-se o diâmetro máximo funcional entre os 100-300 μm para as fibras brancas. A taxa de crescimento hipertrófico varia com a taxa de crescimento somático em diferentes estágios de vida (Rowlerson e Veggetti, 2001).

No crescimento hipertrófico, as fibras aumentam em tamanho de modo a manterem constante a razão entre o núcleo e o citoplasma (Koumans et al., 1994). Portanto, o crescimento pós-embrionário é conseguido através do aumento em diâmetro das fibras musculares imaturas. O diâmetro máximo das fibras é determinado por limitações que variam com a massa corporal, padrões de atividade e requisitos metabólicos (Johnston et al., 2004). Após terminar o crescimento hiperplástico, o crescimento hipertrófico continua durante a vida juvenil até à fase adulta (Rowlerson e Veggetti, 2001).

1.5.2. Hiperplasia

O crescimento muscular hiperplástico refere-se ao aumento do número de fibras musculares devido à formação de novas fibras. A fusão entre células satélites ativas leva

FCUP 17 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

à formação de novos miotubos na superfície das fibras existentes, com posterior diferenciação em fibras musculares (Stellabotte e Devoto, 2007). O número de fibras recrutadas varia entre espécies e estirpes da mesma espécie (Weatherley et al., 1979).

Na fase embrionária, após a formação das duas primeiras camadas musculares, o crescimento hiperplástico prossegue sucessivamente em duas fases distintas: a primeira fase é a continuação da miogénese embrionária e da formação definitiva das camadas musculares vermelha, rosa e branca, seguida por um segundo processo hiperplástico diferente que resulta num grande aumento do número total de fibras em todas as camadas musculares, especificamente na camada muscular branca, conferindo-lhe um aspeto mosaico (Rowlerson e Veggetti, 2001).

A primeira fase, denominada de hiperplasia estratificada, é uma continuação da miogénese embrionária e ocorre no final do desenvolvimento embrionário e durante todo o período larval da maioria das espécies de peixes. Ocorre em zonas germinativas distintas situadas principalmente nas regiões dorsal e ventral do miótomo, originando novas fibras ao longo de zonas discretas germinais para ambas as fibras musculares lenta e rápida, durante os estágios larvais (Rowlerson e Veggetti, 2001; Rescan, 2005). Presume-se que, em várias espécies, novas fibras brancas continuam a ser adicionadas durante a fase embrionária e larval que surgem na camada germinal ou na zona de proliferação sob a monocamada superficial e que se estendem ao longo da parte dorsal, a partir do seto horizontal até ao ápice do miótomo. Inicialmente, a monocamada superficial é uma camada completa que reveste toda a superfície do miótomo (Rowlerson e Veggetti, 2001).

O acréscimo de novas fibras musculares continua durante parte da vida larval, principalmente na maioria das áreas dorsal e ventral do músculo lateral (Rowlerson et al., 1995; Stoiber e Sänger, 1996). Várias espécies de peixes apresentam uma pausa entre a primeira e a segunda fase da miogénese (Rowlerson e Veggetti, 2001), enquanto, peixes como a truta, inicialmente não apresentam pausa entre a primeira e a segunda fase da miogénese (Steinbacher et al., 2007).

A seguir ao período larval, inicia-se a segunda fase do crescimento hiperplástico, denominada de crescimento hiperplástico mosaico, em que a formação de novas fibras musculares não se encontra apenas restrita às zonas de proliferação de mioblastos, mas ocorre por toda a extensão do miótomo a partir da proliferação, fusão e diferenciação das

FCUP 18 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta células satélites. Verifica-se um mosaico de fibras com diferentes diâmetros associadas (fibras grandes e pequenas) e em diferentes estágios de diferenciação. Esse padrão de organização das fibras é melhor observado na musculatura branca (Johnston, 1999; Rowlerson e Veggetti, 2001). Em peixes de maior tamanho, a formação de fibras musculares continua durante o processo hiperplástico, disperso ao longo do miótomo, dando uma aparência típica em mosaico nas secções transversais do músculo, e ocorrendo, principalmente, durante o período juvenil e contribuindo para o crescimento muscular de espécies de peixes de interesse comercial para a aquacultura (Rowlerson e Veggetti, 2001), enquanto que em espécies de pequeno tamanho não se verifica a hiperplasia mosaica (Veggetti et al., 1993).

1.6. Fatores que influenciam o crescimento muscular

1.6.1. Fatores intrínsecos

1.6.1.1. Genéticos

As características genéticas que influenciam a taxa de crescimento e a sobrevivência das espécies produzidas em aquacultura resultam em variações genéticas que variam entre as diferentes espécies. A genética pode contribuir muito para a eficiência da produção e da sua sustentabilidade, através do melhoramento genético das espécies (Dunham, 2004). O potencial para o melhoramento genético de características de importância económica tem sido bem documentado em várias espécies de peixes (Gjedrem, 2000). No entanto, em aquacultura, a reprodução seletiva tem sido utilizada para melhorar a tolerância à salinidade, crescimento e resistência a doenças (Kamal e Mair 2005).

Existem algumas evidências da influência genética sobre os padrões de crescimento muscular em salmonídeos, nomeadamente no que respeita ao número e ao tamanho das fibras musculares. O trabalho de Valente et al., (1999) vai de encontro a esta evidência, mostrando que a percentagem de fibras inferiores a 25 µm de diâmetro é superior nos peixes de estirpe de crescimento rápido. Os padrões de crescimento muscular também podem variar entre indivíduos diplóides e triplóides das mesmas famílias, como foi anteriormente verificado para o Salmão do Atlântico, em que o número reduzido de fibras musculares nos indivíduos triplóides foi associado a uma baixa densidade de células satélites do músculo (Johnston et al., 1999).

FCUP 19 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Estudos sobre a avaliação da sobrevivência, crescimento e competência fisiológica de peixes diplóides e triplóides mostram que, dentro de uma dada espécie, o desempenho comparativo de triplóides e diplóides é muito variável (Ihssen et al., 1990; Galbreath et al., 1994). Por exemplo, triplóides de robalo europeu (Dicentrarchus labrax) cresceram mais lentamente do que os diplóides, mas após a maturidade sexual, os triplóides cresceram mais rápido do que os diplóides, resultando em peixes adultos de tamanho semelhante (Felip et al., 2001).

1.6.1.2. Manipulação hormonal

Uma vez que nos peixes o crescimento continua durante toda a vida, estes tornam-se um modelo importante para a compreensão da regulação hormonal (Mommsen, 2001). O crescimento e o desenvolvimento muscular são processos dinâmicos controlados por uma série de fatores endócrinos e parácrinos, incluindo a hormona de crescimento (GH), fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF-I), hormona da tiróide e esteróides sexuais (Mommsen e Moon, 2001).

A GH e o IGF-I são os principais reguladores de crescimento muscular nos vertebrados. A GH tem funções importantes além da regulação do crescimento somático em peixes. Um estudo recente com salmão-prateado transgénico (Oncorhynchus kisutch), aponta para um aumento do apetite como uma possível explicação para o crescimento acelerado (Stevens e Devlin, 2005). Este aumento do apetite pode ser induzido pelo aumento dos efeitos anabólicos da GH sobre a síntese de proteínas ou sobre o crescimento do músculo esquelético e de outros tecidos (Fauconneau et al., 1996). Assim como a GH, outras hormonas como a insulina e o IGF-I estão envolvidas no crescimento muscular dos vertebrados (Mommsen e Moon, 2001).

1.6.2. Fatores extrínsecos

Os fatores extrínsecos são particularmente importantes no crescimento de vertebrados ectotérmicos, como os peixes teleósteos, que dependem da temperatura, salinidade, teor de oxigénio, pH, fotoperíodo e disponibilidade de alimento para os processos iniciais de desenvolvimento (Johnton, 2006). Destes, a temperatura e a dieta serão abordadas em mais pormenor.

FCUP 20 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

1.6.2.1. Temperatura

A temperatura é considerada como um dos principais fatores extrínsecos que afetam o crescimento e o desenvolvimento muscular nos peixes teleósteos. Muitos peixes mostram alterações sazonais na taxa de crescimento, e um dos principais fatores envolvido nessas alterações é a temperatura da água. Os efeitos da temperatura no crescimento muscular em diferentes estágios da vida e em diferentes espécies de peixe têm sido descritos e incluem a resposta à aclimatação, bem como alterações na dinâmica de crescimento muscular (Rowlerson e Veggetti, 2001; Johnston et al., 2011).

As condições térmicas durante as fases iniciais do desenvolvimento podem influenciar a celularidade das fibras musculares (Campos et al., 2013a). Campos et al. (2013a) observaram que as larvas de S. senegalensis com 30 dias após o nascimento e incubadas a 15 °C, apresentaram elevado número de fibras de menor diâmetro e um baixo número total de fibras musculares em relação às larvas cultivadas a temperaturas mais elevadas (18 °C e 21 °C). Também se verificou que larvas cultivadas a temperaturas inferiores de 15 °C apresentaram um peso corporal e comprimento menor. Assim, é possível que temperaturas mais baixas durante a fase inicial de crescimento possam influenciar o recrutamento e o desenvolvimento das fibras musculares e, portanto, influenciar o tamanho final do peixe (Campos et al., 2013a).

Vários padrões de resposta da celularidade do músculo à temperatura têm sido descritos durante o nascimento e no início da alimentação exógena. Em robalo, o ligeiro aumento da temperatura da água durante a incubação teve um efeito positivo sobre o crescimento muscular tanto hipertrófico como hiperplástico, desde o início da alimentação exógena (Ayala et al., 2000).

1.6.2.2. Dieta

A alimentação é um dos principais fatores que afetam a viabilidade de qualquer empreendimento de aquacultura (Rothlisberg, 1998). Para uma aquacultura sustentável é necessário conhecer as bases fisiológicas da nutrição (processos de digestão e metabolismo e necessidades nutritivas) e os aspetos práticos relativos à composição dos alimentos, dos sistemas de alimentação, bem como a avaliação da sua eficácia nutritiva (Volkoff et al., 2010). Os três principais nutrientes utilizados pelos peixes são: proteínas, lípidos e hidratos carbono (HC). Em geral, as espécies de peixes marinhos carnívoros

FCUP 21 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta têm capacidade para utilizar de forma mais eficaz a energia proveniente de proteínas e lípidos na dieta do que dos HC, relativamente aos omnívoros (Shimeno et al., 1996). O aumento das fontes de energia não-proteicas como HC e lípidos nas dietas é desejável, uma vez que estes têm a capacidade de poupar proteína (Dias et al., 1998), reduzindo assim o seu catabolismo e melhorando a sua retenção e o crescimento (Halver e Hardy, 2002).

A proteína incluída nas dietas para peixes representa cerca de 30-60% do peso seco da dieta, conforme as espécies consideradas (NRC, 2011). Portanto, a otimização das concentrações de proteína é essencial para minimizar o custo da dieta e permitindo o melhor crescimento com a utilização mínima de proteína (Alvarez-González et al., 2001). Nos juvenis de linguado, os requisitos proteicos para um melhor desempenho global do crescimento foram estimados em mais de 53% da proteína bruta (PB), enquanto as exigências proteicas para garantir a deposição máxima de PB foram estimadas em 60% em relação a matéria seca (MS) (Rema et al., 2008). Estudos recentes em juvenis da S. senegalensis provaram a sua elevada capacidade de usar as proteínas vegetais, oferecendo boas perspetivas de altos níveis de substituição da farinha de peixe (Silva et al., 2010; Dias et al., 2010).

As dietas utilizadas atualmente na produção do linguado são baseadas na utilização de farinha de peixe de elevada qualidade, como sendo a principal fonte de proteína para satisfazer os requisitos proteicos devido ao seu perfil em aminoácidos ser semelhante ao das espécies cultivadas. O aumento da procura por farinha de peixe em aquacultura faz com que esta se torne cada vez mais cara e limitada (Gatlin et al., 2007; Sales, 2009). Sendo a proteína um fator limitante para o crescimento é importante formular dietas com as quantidades adequadas de proteína para maximizar o crescimento, minimizando custos e impacto ambiental (Sá et al., 2006). Os níveis de substituição proteica podem variar muito em função da espécie e da composição da dieta (Gatlin et al., 2007; Silva et al., 2009). Por outro lado, é importante considerar a disponibilidade das matérias-primas e o seu valor nutritivo (caraterização química e digestibilidade dos nutrientes). As formulações de dietas em aquacultura tendem a aumentar o teor em lípidos, como uma fonte energética não-proteica para aumentar o crescimento, poupar proteína, reduzir a matéria orgânica e as perdas de azoto (Sargent et al., 2002). Apesar dos recentes avanços sobre as necessidades nutricionais do linguado, pouco se conhece acerca do seu metabolismo lípidico e dos mecanismos que o regulam. Os lípidos são a principal fonte de energia em vertebrados, incluindo peixes

FCUP 22 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta teleósteos. No entanto, o linguado do Senegal não parece utilizar os lípidos de uma forma eficiente, verificando-se um decréscimo da taxa de crescimento quando alimentado com dietas com teores lipídicos acima de 8% (Borges, 2014).

A farinha de peixe constitui uma fonte natural e equilibrada de proteína de elevada qualidade nutricional para a produção de peixes em aquacultura. É caracterizada por um elevado conteúdo em proteína e lípidos, e contém menos de 0,5% de hidratos de carbono (Huss, 1995). A farinha de peixe contém todos os aminoácidos essenciais capazes de suprir os requisitos nutricionais dos peixes. Já na proteína vegetal, alguns destes, nomeadamente a lisina e a metionina, são deficitários (De Silva e Anderson, 1995). A substituição da farinha de peixe em dietas para linguado foi estudada quanto à sua influência no crescimento e composição corporal (Silva et al., 2009; Valente et al., 2011). Uma elevada ou total substituição de farinha de peixe exige uma mistura equilibrada de diferentes fontes de proteína vegetal e suplementação com aminoácidos de modo a suprir as necessidades de cada espécie. Segundo Silva et al. (2010), os juvenis da S. senegalensis crescem igualmente bem com dietas desprovidas de farinha de peixe desde que os aminoácidos da dieta estejam equilibrados.

O potencial de crescimento em peixes é influenciado por fatores externos, tais como o regime alimentar e a composição das dietas (Galloway et al., 1999). A transição entre a alimentação endógena e exógena após a eclosão nos peixes, é fundamental no desenvolvimento e no crescimento dos órgãos e tecidos incluindo os músculos (Koumans & Akster, 1995). A composição de dietas ideais foi determinada para um pequeno número de espécies de aquacultura em vários estágios de vida. A fonte de proteínas, e especialmente a sua composição em aminoácidos, tem um efeito particularmente importante no crescimento dos peixes (Murai, 1992). A alimentação pode aumentar a concentração de aminoácidos disponíveis, aumentando a taxa metabólica e auxiliando o crescimento do tecido muscular (Houlihan et al., 1995).

Os estudos sobre o efeito da dieta no crescimento muscular durante os estágios juvenis são limitados. Johnston et al. (2002) estudaram o efeito de dois níveis de proteína na dieta (alto e baixo) na celularidade do músculo em duas estirpes de salmão; em uma estirpe não encontraram diferenças, quer no tamanho ou no número das fibras, enquanto na outra estirpe, o alto teor de proteína na dieta favoreceu o crescimento pelo recrutamento de fibras.

FCUP 23 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

2. TRABALHO EXPERIMENTAL

2.1. Introdução

O linguado do Senegal (S. senegalensis) é um peixe plano de elevado valor comercial, que se tornou uma espécie prioritária para a diversificação da aquacultura nos países banhados pela costa mediterrânea, sendo que a sua produção situa-se no sudoeste do mediterrâneo, em Espanha e Portugal (Dinis et al., 1999; Imsland et al., 2003).

A nutrição de larvas de peixes marinhos continua a depender da produção de presas vivas tais como artémia e rotíferos. Os custos elevados e flutuantes desta produção e a falta de formulação da dieta adequada para as larvas retardam o desenvolvimento de peixes marinhos na aquacultura (Zambonino Infante e Cahu, 2001). A substituição de presas vivas por dietas compostas é fundamental para reduzir os custos da produção e para manter a produção sustentável elevada e de qualidade de juvenis constantes (Cahu e Zambonino Infante, 2001).

Os alimentos vivos favorecem elevadas taxas de sobrevivência e crescimento nos estágios larvares, quando comparados com as dietas compostas. No entanto, a utilização de dietas vivas possui algumas desvantagens, nomeadamente: podem atuar como vetores de doenças, apresentarem valor nutritivo variável, dificuldade em manipular a sua qualidade nutricional e, ainda, requerem tempo considerável para produzir, sendo, consequentemente, dispendiosos. Essas razões levaram à procura de dietas mais adequadas para susbtituir as dietas vivas nos estágios larvares dos peixes marinhos (Ribeiro et al., 2005).

A co-alimentação de peixes tem demonstrado que além de melhorar o desempenho larvar permite ainda o desmame num curto período de tempo (Ribeiro et al., 2005). Contudo, a co-alimentação com alimentos vivos e dietas inertes, desde a abertura da boca, tem demonstrado que diminui o crescimento do linguado nos estágios iniciais mas promove, no entanto, melhor qualidade pós-larvar a seguir ao desmame (Engrola et al., 2010).

O crescimento nos peixes é determinado por alterações no peso e tamanho, os quais dão uma rápida estimativa do crescimento muscular. A celularidade muscular é frequentemente utilizada como indicador das alterações no crescimento, ou seja no

FCUP 24 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta balanço entre hipertrofia e hiperplasia (Johnston, 1999). O balanço entre estes dois mecanismos determina a taxa específica de crescimento e o tamanho final das espécies, mas é dependente de alguns fatores extrínsecos como a temperatura (Ayala et al., 2000; López-Albors et al., 2003) e a dieta (Johnston et al., 2002; Alami-Durante et al., 2010).

2.2. Objetivos

O presente trabalho teve como objectivos gerais:

 Verificar a influência de diferentes dietas inertes no crescimento e celularidade muscular de larvas de linguado 19 DAE;  Avaliar a simetria na distribuição das fibras musculares brancas nos quatro quadrantes de cortes transversais de larvas de linguado (região anal).

FCUP 25 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

2.3. Material e Métodos

2.3.1. Condições zooténicas e dietas experimentais

A experiência foi conduzida na estação experimental de campo (Ramalhete) e nas instalações de LEOA, Universidade de Algarve, Faro, Portugal. Os ovos fertilizados foram fornecidos pela Sea8, Safiestela, Póvoa do Varzim, Portugal.

As larvas de linguado foram co-alimentadas recorrendo a alimento vivo e inerte, desde da abertura da boca. Começou-se por distribuir rotíferos enriquecidos (Easy DHA selco), durante três dias, seguidos de Nauplios de Artémia (NA) e Metanauplios (MA) enriquecidos com Easy DHA selco, que foram gradualmente substituídos por metanauplio congelado. A dieta inerte foi distribuída de forma semi-contínua em ciclos de 2 h de alimentação, seguidos de 1 h de intervalo. As larvas foram alimentadas com presas vivas fornecidas três vezes ao dia, em que a primeira alimentação foi fornecida uma hora após as luzes estarem acesas e depois da dieta inerte estar disponível. Todos os tratamentos foram realizados em triplicado. Foram formuladas três dietas experimentais, baseadas em fontes proteicas distintas: 1) A dieta CTRL baseada na composição proteica dos rotíferos composta por ingredientes práticos utilizadas pela indústria (nomeadamente um hidrolisado de peixe encapsulado);

2) A dieta PBALL baseada na composição de aminoácidos (AA) do linguado (em que 4% da proteína do hidrolisado de peixe encapsulado foi substituído por um encapsulado de AA cristalinos livres, de acordo com Aragão et al., 2004);

3) A dieta WBALL foi baseada na dieta PBALL, tendo-se no entanto corrigida o perfil de AA atendendo à sua biodisponibilidade (8% da proteína do hidrolisado de peixe encapsulado foi substituído por um encapsulado de AA cristalinos livres, de acordo com Saavedra et al., 2007).

A composição em ingredientes e a análise proximal das dietas experimentais encontram-se no Quadro 1, assim como a determinação da composição de AA (mg AA/g amostra) das dietas experimentais está descrita no Quadro 2.

Para a realização desta experiência, utilizou-se uma densidade de 100 larvas por litro (L), em tanques com capacidade para 100 L, sendo a substituição da água realizada

FCUP 26 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta quando necessário e o fotoperíodo foi mantido a 10 h de luz e 14 h de escuridão, a uma intensidade de luz de 1000 lux. O oxigénio dissolvido na água foi mantido a 90,8±8,5% de saturação, a temperatura a 18,9±0,5 ºC e a salinidade a 36,8±0,1%.

Quadro 1 - Composição em ingredientes e análise proximal das dietas experimentais

Dietas experimentais

CTRL PBALL WBALL

Ingredientes (% matéria seca) Cristais de isolado proteico de trigo 10,00 10,00 10,00 CPSP – 90 - não encasulado 10,00 10,00 10,00 Farinha de lula 8,50 8,50 8,50 1 CPSP - 90 Encasulado 20,00 16,00 11,15

Gelatina de peixe 14,00 14,00 13,00 Levedura autolisada 1,70 1,70 1,70 Farinha de krill 9,00 9,00 9,00 Óleo de peixe 4,50 4,50 5,50

Algatrium 2,00 2,00 2,00

Fósforo (Phosphonorse) 5,50 5,50 5,50 Premix PVO 0402 5,00 5,00 5,00 Vitamina C 3,00 3,00 3,00 Vitamina E 1,00 1,00 1,00

Taurina (Sigma) 1,50 1,50 1,50

Quitosano 3,30 3,30 3,30 Mono-fosfato de Ca 1,00 1,00 1,00 L-Arginina HCl 1,00 DL-Metionina 0,25 0,75 L-Lisina HCl 0,75 2,00

L-Triptofano 0,25 0,50

L-Histidina HCl 0,15 0,60 L-Leucina 1,00 1,00 L-Isoleucina 0,30 0,50

L-Fenilalanina 1,30 2,50

Análise proximal (% matéria seca) Proteína bruta 69,43 67,86 69,47 Proteína digestível (PD) 52,07 51,35 52,10 Gordura bruta 14,74 15,03 16,54 Energia bruta (MJ kg-1) 23,32 23,50 23,87 Energia digestível (ED) (MJ kg-1) 18,65 18,80 19,09 PD/ED (g MJ-1) 27,92 27,31 27,29

1- CPSP 90 Concentrado proteico solúvel de peixe, com cerca de 90% de proteína.

FCUP 27 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

2- Premix PVO 040 (Pre-mistura Peixes F76D2C PVO 040®, Premixportugal, Portugal).

Quadro 2 - Composição de aminoácidos (mg AA/g amostra) das dietas experimentais

Dietas

CTRL PBALL WBALL Aminoácidos essenciais Arginina 4,93 5,02 6,02

Histidina 1,04 1,15 1,50 Lisina 5,84 6,03 5,96 Treonina 2,95 2,81 2,54 Isoleucina 2,69 2,88 2,76 Leucina 4,49 5,34 4,91

Valina 3,12 2,93 2,49

Metionina 1,71 2,12 2,34 Fenilalanina 2,08 3,61 5,41 Cisteína 0,16 0,17 0,15 Tirosina 1,46 1,57 1,47 Somatório de AA essenciais 30,47 33,61 35,55

Aminoácidos não essenciais Ácido aspártico + Asparagina 6,15 5,53 4,64 Ácido glutâmico + Glutamina 9,52 9,24 7,65 Alanina 4,91 4,50 3,73

Glicina 7,14 7,47 6,68

Prolina 4,65 4,76 4,13 Serina 2,90 2,89 2,61 Taurina 2,10 2,09 2,33

2.3.2. Amostragem e preparação da amostra

Para efetuar este trabalho, as larvas de linguado (S. senegalensis) foram alimentadas como descrito anteriormente até aos 19 DAE o que corresponde à fase pelágica do crescimento. Nesta fase, para a análise do crescimento e da celularidade muscular, foram recolhidas 4 a 5 larvas de linguado por tanque. As larvas foram pesadas (mg), medidas (mm) (figura 14) e fixadas em paraformaldeído (PFA) a 4% em tampão fosfato (PBS) e pH 7,4 durante 24 h (figura 15). A seguir, foram lavadas em PBS e fixadas em etanol a 70%, sendo depois desidratadas gradualmente em etanol e incluídas em parafina (figura 16).

Efetuaram-se cortes transversais seriados de 7 μm na região anterior que foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e montados com DPX (meio de montagem com

FCUP 28 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta resina sintética) em lâminas para análise histológica muscular (Identificação da lâmina = “Idade DAE. Código da dieta. Nº da larva”, e.g. “19 CTRL 4”. Exemplo: 19.A.4). A seleção do corte a analisar foi efetuada usando sempre os mesmos critérios (conservação do corte, qualidade da fixação, secção transversal tão completa quanto possível, 3) Ao nível abertura do ânus; coincide com a presença do rim anterior e maior número possível de fibras transversais possível em relação às fibras longitudinais) em todas as larvas, ou seja, ao nível da abertura do ânus, de forma a analisar a mesma região em todos os animais e assim obter resultados comparáveis (figura 17).

Figura 14 - Exemplo de fotografia para determinar o comprimento standart da larva (SL = desde a extremidade da cabeça até ao pedúnculo caudal).

Figura 15 - Exemplo de frasco adequado ao armazenamento para fixação de larvas (fundo plano).

FCUP 29 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Figura 16 - Exemplo de larvas incluídas em parafina (solidificada) e suportada por cassete devidamente identificada.

Note-se que a cassete do lado esquerdo foi aparada e cortada e a do lado direito ainda não.

B AMVEsq AMDEsq

AMDDto

AMVDto

ATT

Figura 17 - Cortes transversais em diferentes zonas no eixo antero – posterior 19 dias após eclosão A: Corte muito anterior à localização desejada. B: Corte anterior à localização desejada. NC – notocorda; TB – tubo neural; IA – intestino anterior. C: Corte seleccionado para caracterização do crescimento muscular; NA – ânus; Área delimitada a amarelo - Área Total Transversal (ATT); Área delimitada a azul - Área Muscular Dorsal Esquerdo (AMDEsq); Área delimitada a laranja - Área Muscular Ventral Esquerdo (AMVEsq); Área delimitada a vermelho - Área Muscular Ventral Direito (AMVDto); Área delimitada a verde-escuro - Área Muscular Dorsal Direito (AMDDto); D: Corte posterior à localização desejada.

Utilizou-se o sistema de análise de imagens do programa Cell^B (figura 18) para determinar os seguintes parâmetros: a área total do corte transversal (ATT) (mm²), utilizando a objetiva de 10x; a área total do músculo (ATM) dorsal (mm²) e ventral (mm²),

FCUP 30 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta com a objetiva de 20x. Foram contadas todas as fibras de cada uma das áreas do músculo (figura 19) e determinadas as respetivas densidades (nº/mm²). A área média das fibras musculares brancas (figura 19) (µm²) foi determinada recorrendo à objetiva de 40x. Todas as áreas referidas foram determinadas depois de se circunscrever os limites das mesmas recorrendo ao software do Cell^B.

Figura 18 - Programa CellB, Olympos para análise morfomérica das larvas.

Figura 19 - Exemplos de contagem de fibras transversais em todo o quadrante de músculo dorsal esquerdo, imagem à esquerda (como parcela da AMT) e medição da área media de fibras transversais, imagem à direita.

FCUP 31 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

2.3.3. Análise estatística

Utilizando o programa SPSS, versão 20, os resultados dos dados histológicos foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov ou o Shapiro Wilk que permitem inferir sobre a normalidade das distribuições e a uma análise de homogeneidade de variância, testada através do teste de Levene. Quando se verificaram os pressupostos da ANOVA, os dados foram submetidos a uma ANOVA a um fator, mas quando o mesmo não se verificou, recorreu-se ao teste não paramétrico de Kruskal Wallis no programa STATISTICA, versão 11. Sempre que se encontraram diferenças significativas entre grupos, as médias individuais foram comparadas recorrendo ao teste de Tukey. Em todos os casos, as diferenças foram consideradas significativas sempre que P ≤ 0,05.

FCUP 32 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

2.4. Resultados

2.4.1. Crescimento, celularidade muscular e avaliação da simetria

Os dados de crescimento dos diferentes tratamentos durante a fase pelágica (19 DAE), estão representados no Quadro 3. A dieta CTRL promoveu significativamente maior peso seco final (1,04±0,34 mg) do que as dietas PBALL (0,84±0,14 mg) e WBALL (0,86±0,26 mg). O comprimento padrão apresentou diferenças significativas entre os tratamentos (p≤0,05), tendo sido superior com a dieta CTRL (6,90±0,84 mm) e menor com a dieta WBALL (6,46±0,65 mm). A dieta PBALL promoveu um comprimento padrão das larvas não significativas diferente do das outras dietas experimentais. A taxa de crescimento relativo não foi afetada significativamente pela dieta.

Quadro 3 - Dados de crescimento: Peso seco (mg) e comprimento padrão (mm) de larvas de linguado alimentados com diferentes dietas.

Tratamento

CTRL PBALL WBALL

Peso inicial (mg) à abertura da boca (2 DAE) 0,02 ± 0,004 0,02 ± 0,004 0,02 ± 0,004

Peso seco final (mg) 1,04 ± 0,34a 0,84 ± 0,14b 0,86 ± 0,26b

Comprimento padrão (mm) 6,90 ± 0,84a 6,51 ± 0,46ab 6,46 ± 0,65b

Taxa de crescimento relativo (RGR (%)) 22,02 ± 1,78 20,81 ± 0,41 20,94 ± 0,96

Os valores com diferentes índices (a,b) apresentam diferenças significativas (P≤0,05) entre os grupos. Os valores apresentados são média ± desvio padrão (n=3). RGR (%/dia) = (eg -1) *100, onde g= (ln (peso final) - ln (peso inicial)) x t -1, e (constante de Néper = 2,71) e t é a duração da experiência (Ricker, 1958).

Os diferentes tratamentos (dietas) utilizados não afetaram significativamente (P>0,05) o crescimento muscular relativamente aos parâmetros analisados individualmente (Quadro 4).

FCUP 33 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Quadro 4 - Efeito das dietas no crescimento muscular das larvas (19 DAE)

Tratamentos

CTRL PBALL WBALL P

Total

ATT (mm²) 0,65 ± 0,15 0,67 ± 0,06 0,64 ± 0,08 0,82 ATM (mm²) 0,08 ± 0,03 0,09 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0,62 Nº Total Fibras Musculares 1299,00 ± 221,95 1274,33 ± 149,18 1419,67 ± 257,10 0,32 Densidade (nº/mm²) x 103 18,78 ± 12,40 13,73 ± 2,15 15,80 ± 2,68 0,36 Área Média Fibras Musculares (µm²) 69,89 ± 32,76 68,53 ± 13,09 63,34 ± 11,08 0,79 Dorsal (Dto+Esq)

Área Muscular (mm²) 0,04 ± 0,02 0,05 ± 0,01 0,05 ± 0,01 0,65 Nº Fibras 645,33 ± 114,32 620,11 ± 92,75 694,56 ± 126,36 0,37 Densidade (nº/mm²) x 103 18,76 ± 11,60 13,38 ± 2,31 14,91 ± 2,63 0,41 Área Média Fibras Musculares (µm²) 78,48 ± 51,97 71,06 ± 13,21 65,30 ± 10,94 0,61 Ventral (Dto+Esq)

Área Muscular (mm²) 0,04 ± 0,02 0,05 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,68 Nº Fibras 653,67 ± 133,37 654,22 ± 98,49 725,11 ± 138,93 0,39 Densidade (nº/mm²) x 103 18,86 ± 13,28 14,20 ± 3,26 16,76 ± 3,02 0,24 Área Média Fibras Musculares (µm²) 61,31 ± 19,16 66,01 ± 16,35 61,38 ± 12,05 0,78 Direito (Dorsal+Ventral)

Área Muscular (mm²) 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,31 Nº Fibras 391,56 ± 84,81 401,67 ± 55,79 434,56 ± 71,81 0,59 Densidade Fibras (nº/mm²) 15,38 ± 8,74 11,88 ± 1,83 12,98 ± 1,41 0,35 Área Média Fibras Musculares (µm²) 89,06 ± 50,64 80,34 ± 19,32 73,31 ± 15,60 0,83 Esquerdo (Dorsal+Ventral)

Área Muscular (mm²) 0,05 ± 0,02 0,06 ± 0,01 0,06 ± 0,01 0,77 Nº Fibras 907,44 ± 145,95 872,67 ± 120,60 985,11 ± 214,75 0,35 Densidade Fibras (nº/mm²) 20,90 ± 15,04 14,79 ± 2642,68 17,43 ± 3,81 0,31 Área Média Fibras Musculares (µm²) 50,73 ± 17,24 56,72 ± 7,58 53,37 ± 7,90 0,59

Os valores apresentados são média ± desvio padrão (n=9). Não apresentam diferenças significativas (P>0,05).

Os efeitos das diferentes áreas amostradas na celularidade muscular e a avaliação da simetria muscular (figura 20) encontram-se representados no Quadro 5.

Os lados, direito e esquerdo diferiram significativamente (P≤0,05). O lado esquerdo apresentou maior área muscular (AM Esquerdo/AM Direito (mm²) = 0,06±0,01 mm²/ 0,03±0,01 mm²), maior número de fibras musculares brancas (nº Fibras Esquerdo/Direito = 921,74±165,87/409,26±71,47) e maior densidade de fibras

FCUP 34 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

(Densidade Fibras Esquerdo/Direito (nº/mm²) = 17708,93±9093,47/13412,82 ± 5232,35). O lado direito apresentou maior área média de fibras musculares brancas (área média fibras musculares Direito/Esquerdo) = 80,91±31,97 µm² / 53,61±11,60 µm²).

Figura 20 - Eixo de simetria de uma secção transversal muscular em larva de S. senegalensis (19 DAE): Abertura do ânus, o lado Dorsal e Ventral, eixo de simetria entre o lado Direito e Esquerdo.

As áreas dorsal e ventral não apresentaram diferenças significativas (P>0,05). O que demonstra que existe simetria entre os quadrantes dorsal e ventral de uma secção transversal.

FCUP 35 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

Quadro 5 - O efeito entre as diferentes áreas amostradas quanto à celularidade e simetria muscular

Área amostrada

Dorsal / Ventral Dorsal Ventral P Área Muscular (mm²) 0,04 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,87 Nº Fibras 653,33 ± 112,13 677,67 ± 124,76 0,45 Densidade Fibras (nº/mm²) *103 15,68 ± 7,10 16,61 ± 8,00 0,46 Área Média Fibras Musculares (µm²) 71,62± 30,85 62,90 ± 15,65 0,19

Direito / Esquerdo Direito Esquerdo

Área Muscular (mm²) 0,03 ± 0,01 b 0,06 ± 0,01 a <0,001 Nº Fibras 409,26 ± 71,47 b 921,74 ± 165,87 a <0,001 Densidade Fibras (nº/mm²) *103 13,41± 5,23 b 17,71 ± 9,09 a <0,001 Área Média Fibras Musculares (µm²) 80,91 ± 31,97 a 53,61 ± 11,60 b <0,001

Os valores apresentados são média ± desvio padrão (n=27). Os valores com diferentes índices (a,b) apresentam diferenças significativas (P≤0,05) entre os grupos.

FCUP 36 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

2.5. Discussão

O crescimento muscular depende de um equilíbrio positivo entre a síntese e a degradação de proteína, o qual é grandemente influenciado por fatores extrínsecos, como a composição da dieta. Embora existam vários estudos acerca do crescimento somático de peixes, a maioria refere-se a estágios juvenis (Valente et al., 2013). Assim, os estudos referentes ao crescimento das fibras musculares sob influência de diferentes dietas em estágios larvais são escassos.

A temperatura de incubação durante estágios precoces de desenvolvimento afeta a composição e o recrutamento de fibras musculares, bem como os padrões de crescimento nos adultos. Num trabalho efetuado por Campos et al. (2013a) foram avaliadas as variáveis morfométricas na região pós-anal de larvas de linguado, desde a eclosão até 30 DAE. Verificou-se um aumento da área total muscular, do número total de fibras musculares e do seu diâmetro, com o aumento da temperatura de incubação. Na idade correspondente à metamorfose, na qual se enquadram os 19 DAE avaliados neste trabalho, verificou-se uma concordância de resultados no que respeita à ordem de grandeza relativa ao comprimento das larvas, área média e número de fibras musculares, para temperaturas equivalentes.

O crescimento da indústria de produção de linguado está restringido pela má sobrevivência durante o período de desmame do alimento vivo (Artémia) para dietas artificiais. Alguns estudos têm focado esta problemática, centrando-se na viabilidade da utilização de dietas inertes. Engrola et al. (2009) avaliaram o efeito da co-alimentação de larvas com alimento vivo e dietas inertes no início da fase pelágica, verificando que esse regime alimentar levava à produção de larvas maiores e de melhor qualidade, promovendo o crescimento e levando à produção de juvenis de melhor qualidade. Um outro estudo comprovou a viabilidade do desmame precoce de S. senegalensis e demonstrou que a co-alimentação larval aumentava o crescimento e a sobrevivência após o desmame (Canavate et al., 1999). No entanto, as dietas inertes avaliadas neste trabalho levaram a diferenças significativas no peso e comprimento final das larvas. A composição de aminoácidos nas dietas tem assim um grande impacto no crescimento das larvas de linguado aos 19 DAE.

No que diz respeito à celularidade muscular, as diferenças registadas no comprimento das larvas entre dietas não se refletiram na estrutura do tecido muscular

FCUP 37 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta aos 19 DAE. Os valores médios encontrados no presente trabalho, relativos ao número e tamanho de fibras musculares brancas, são concordantes com os resultados obtidos em trabalhos anteriores efetuados por Campos et al. (2013a, 2013b) para idades equivalentes. Estes autores efetuaram uma medição em toda a área transversal de larvas de linguado até aos 30 DAE. Neste trabalho avaliou-se pela primeira vez a simetria muscular em larvas de S. senegalensis, no que diz respeito à celularidade muscular numa secção transversal, considerando os quadrantes dorsal, ventral, direito e esquerdo. Assim, foi possível verificar que existe simetria na estrutura muscular entre os quadrantes dorsal e ventral das larvas, para os parâmetros analisados, não se mantendo essa simetria no que respeita aos quadrantes direito e esquerdo. Independentemente das dietas estudadas, o quadrante esquerdo das larvas apresentou um número de fibras musculares e densidade de fibras significativamente superior ao encontrado no quadrante direito. Já no quadrante direito, a área média das fibras musculares foi significativamente superior ao quadrante esquerdo. Quando se comparam os mesmos parâmetros entre o lado ventral e dorsal de uma secção transversal, não se verificam diferenças significativas entre os parâmetros analisados. Desta forma, é possível concluir que existe uma simetria bilateral nas larvas de linguado no que respeita aos quadrantes dorsal e ventral, não se mantendo essa simetria se forem considerados os quadrantes direito e esquerdo. O presente trabalho vem provar que, havendo simetria bilateral (dorsal/ventral), a avaliação dos parâmetros morfométricos poderá ser feita apenas num dos quadrantes da larva, podendo os resultados obtidos ser multiplicados por 2 para se estimar o valor para o peixe todo de uma forma segura e representativa.

2.6. Conclusão

O presente estudo permitiu avaliar o efeito de diferentes dietas no crescimento e morfometria de larvas de linguado, bem como a simetria transversal do tecido muscular. A composição das dietas inertes não afetou a celularidade muscular. No que respeita às medidas morfométricas, este estudo permitiu avaliar pela primeira vez a simetria muscular em larvas de linguado. Concluiu-se que existe simetria entre os quadrantes dorsal e ventral de uma secção transversal. Este trabalho sugere assim que a avaliação da celularidade numa secção transversal poderá ser estimada de forma segura e representativa através da duplicação dos resultados determinados para o quadrante dorsal ou ventral.

FCUP 38 Caraterização e modelação da celularidade muscular do linguado (Solea senegalensis) através da dieta

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