Evaluación in Vitro De La Capacidad Antagónica De Hongos Endófitos Aislados De Moringa Oleífera (L) En El Control De Pestalotia Palmarum

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 1

EVALUACIÓN IN VITRO DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE HONGOS

ENDÓFITOS AISLADOS DE MORINGA OLEÍFERA (L) EN EL CONTROL DE

PESTALOTIA PALMARUM (Q).

Samia Hasay Montoya Sánchez

UNIVERSIDAD DE SANTANDER UDES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS

BUCARAMANGA

2019

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EVALUACIÓN IN VITRO DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE HONGOS

ENDÓFITOS AISLADOS DE MORINGA OLEÍFERA (L) EN EL CONTROL DE

PESTALOTIA PALMARUM (Q).

Samia Hasay Montoya Sánchez

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Microbióloga

Industrial

Director

Beatriz Elena Guerra Sierra PhD

UNIVERSIDAD DE SANTANDER UDES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS

BUCARAMANGA

2019

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“A Dios por permitirme haber llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional.

A mi madre, por ser el pilar más importante, por ser mi gran amiga y compañera, por su amor, paciencia

y esfuerzo. Gracias madre por tu apoyo incondicional eternamente agradecida contigo. TE AMO

MONA”

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Agradecimientos

Primeramente, agradecerle a Dios por ser mi guía y acompañarme en el transcurso de mi vida, brindándome paciencia y sabiduría para culminar con éxito mis metas propuestas.

A mi madre por ser mi guía, por ser mi apoyo incondicional, por su gran esfuerzo.

A mis abuelos por estar siempre a mi lado por colaborarme siempre que fuera necesario. A mis tíos, tías, primos y primas por acompañarme en este proceso.

A mi Tutora Beatriz Elena Guerra Sierra, por su confianza puesta en mí, por su apoyo para con mi trabajo. Gracias por los conocimientos brindados.

A Adriana Sandoval por su gran entrega, colaboración y seguimiento en cada uno de los momentos de mi trabajo.

Mi agradecimiento a todos, familia y amigos que de una u otra manera me brindaron su colaboración y se involucraron en este proyecto.

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Contenido

Pág.

Resumen ...... 12 Abstract ...... 13 Introducción ...... 14 1 Presentación del trabajo de grado ...... 17 1.1 Planteamiento del Problema ...... 17 1.2 Pregunta de Investigación ...... 19 1.3 Hipótesis ...... 19 1.4 Objetivos ...... 19 1.4.1 Objetivo general ...... 19 1.4.2 Objetivos específicos...... 19 1.5 Justificación ...... 20 2 Marco teórico ...... 22 2.1 Palma aceitera ...... 22 2.2 Insecto facilitador de la Pestaloptiosis ...... 24 2.3 Pestalotia palmarum...... 26 2.3.1 Generalidades...... 27 2.4 Pestalotiopsis ...... 30 2.4.1 Controles Químicos...... 30 2.5 Moringa oleífera Lam ...... 32 2.6 Hongos endófitos ...... 34 2.6.1 Metabolitos secundarios...... 36 2.6.2 Mecanismos de Acción. Los mecanismos de acción del antagonismo dual se traducen en competencia por espacio y alimento, antibiosis, parasitismo y sinergismo...... 37 3 Metodología ...... 39 3.1 Población y muestra...... 39 3.2 Sitio de estudio ...... 39 3.3 Manejo y tratamiento de las muestras ...... 39

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3.4 Siembra de los fragmentos del material vegetal ...... 40 3.5 Separación y purificación ...... 40 3.6 Pruebas de antagonismo in vitro por cultivo dual ...... 41 3.6.1 Preselección de hongos endófitos ...... 41 3.7 Análisis estadísticos ...... 42 3.8 Identificación de las morfoespecies de hongos endófitos con mayor capacidad antagónica...... 42 3.9 Evaluación de los mecanismos de antagonismo ...... 42 3.10 Prueba cualitativa de Cocultivo de endófitos ...... 43 4 Resultados y Discusión ...... 44 4.1 Aislamiento de hongos ...... 44 4.2 Pruebas de antagonismo ...... 47 4.3 Análisis estadístico ...... 51 4.3.1 Análisis de medias del crecimiento de hongos endófitos de M. oleífera en cultivo dual con P. palmarum...... 51 4.3.2 Análisis de varianza ANOVA ...... 52 4.3.3 Prueba Tukey...... 54 4.4 Identificación de los hongos (género) con mayor capacidad antagónica ...... 56 4.5 Evaluación de los mecanismos de antagonistas...... 60 4.6 Prueba cualitativa de cocultivo de endófitos ...... 61 5 Conclusiones ...... 65 6 Bibliografía ...... 67 7 ANEXOS ...... 77 7.1 Anexo 1...... 77 7.2 Anexo 2...... 77 7.3 Anexo 3...... 78 7.4 Anexo 4...... 79

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Lista de Tablas

Pág.

Tabla 1.Codificación de hongos endófitos...... 41

Tabla 2. Aislamiento de hongos endófitos de Moringa oleífera ...... 45

Tabla 3.Pruebas de antagonismos de los hongos endófitos frente a Pestalotia palmarum...... 48

Tabla 4.Análisis de varianza de los hongos que presentaron mayor capacidad antagónica ...... 53

Tabla 5.Análisis de varianza ANOVA...... 54

Tabla 6.Pruebas a posteriori Tukey ...... 55

Tabla 7.Descripción de los hongos endófitos aislados de M.oleífera con mayor capacidad antagónica a P. palmarum ...... 57

Tabla 8.Mecanismos de acción presentados entre los endófitos y el patógeno...... 61

Tabla 9.Tratamientos de hongos endófitos de M. oleífera ,utilizados en prueba de cocultivo contra P. palmarum...... 62

Tabla 10.Pruebas que potenciaron el antagonismo de P. palmarum en cocultivo con hongos endófitos ...... 63

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Lista de Figuras

Pág.

Figura 1.Ciclo de vida de Leptopharsa gibbicarina ...... 25

Figura 2.Lesión típica en el envés de los foliolos, caracterizada por manchas, semicirculares de color oliva a marrón oscuro, rodeadas por un borde amarillo indefinido de aspecto aceitoso. .... 26

Figura 3.Ciclo de vida de Pestalotia palmarum ...... 29

Figura 4.Beneficios, propiedades y aplicaciones de cada una de los tejidos de la planta Moringa oleífera...... 33

Figura 5. Porcentaje de los aislados de Moringa oleífera por tejido ...... 46

Figura 6.Prueba de cultivo dual a) MT17: Trichoderma sp, b) MH5: Curvularia sp, c) MT12:

Fusarium sp d) MT11: Fusarium sp e) MT2: Fusarium sp f) MT6: Fusarium sp g) MT3:

Curvularia sp, h) Curvularia sp...... 51

Figura 7. Análisis de medias de crecimiento de los hongos endófitos aislados de Moringa oleífera en antagonismo con P. palmarum in vitro...... 52

Figura 8.Cepas de hongos endófitos de M. oleífera que presentan los mayores porcentajes de inhibición in vitro contra el fitopatógeno P. palmarum : a. Trichoderma sp. b. Curvularia sp. c.

Fusarium sp. d. Fusarium sp e. Fusarium sp. f. Fusarium sp. g. Curvularia sp. h. Curvularia sp. 56

Figura 9.Estructuras microscópicas de hongos endófitos de M. oleífera que presentan los mayores porcentajes de inhibición in vitro contra el fitopatógeno P. palmarum : a. Trichoderma sp. b. Curvularia sp. c. Fusarium sp. d Fusarium sp . e. Fusarium sp. f. Fusarium sp. g. Curvularia sp. h. Curvularia sp...... 57

Figura 10.Prueba de cocultivo. Todas las figuras de la derecha muestran el anverso de los cocultivos y las figuras de la izquierda el reverso. a. MH5 Curvularia sp), y MH2 (Curvularia sp)

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 10 en cocultivo. b) MT11 (Fusarium sp) y MT17 (Trichoderma sp). c).

MT2(Fusarium sp) y MT12(Fusarium sp). En el centro de las cajas el patógeno...... 64

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Lista de Anexos

Pág.

7.1 Anexo 1 ...... 77

7.2 Anexo 2 ...... 77

7.3 Anexo 3 ...... 78

7.4 Anexo 4 ...... 79

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Título: Evaluación in vitro de la capacidad antagónica de hongos endófitos aislados de Moringa oleífera (L) en el control de Pestalotia palmarum

Resumen

Autor(es): Samia Hasay Montoya Sánchez

Palabras claves: Antagonismo, Endófitos, Pestalotiopsis,

La Pestalotiopsis, producida por el hongo Pestalotia palmarum, es la principal enfermedad que produce defoliación en los cultivos de palma aceitera en el trópico, esta enfermedad afecta de manera considerable la sostenibilidad de los cultivos y su tratamiento convencional, implica un daño al medio ambiente por la contaminación que genera. Por tal motivo, la búsqueda de soluciones naturales innovadoras a esta problemática en el sector agroindustrial es de gran importancia, como una alternativa al tratamiento químico. La adaptabilidad de los hongos endófitos a sus hospedantes, los beneficios ecológicos que le brinda y los diversos mecanismos antagónicos que poseen contra el control de plagas, los convierten en una buena alternativa. En este trabajo, se evaluó la capacidad antagónica de los hongos endófitos aislados de Moringa oleífera, en el control de Pestalotia palmarum, haciendo uso de métodos de aislamiento, identificación y evaluación del antagonismo en conjunto con herramientas de análisis estadísticos, que permitieran determinar si algunos de los hongos endófitos, podrían significar una alternativa para el biocontrol de la Pestaloptiosis. Se determinó el potencial de 21 cepas de hongos endófitos obtenidas de tejido sanos, como candidatas para el control biológico de P. palmarum. De estos aislados, ocho cepas fúngicas fueron las más promisorias. Destacándose entre estas, por su actividad antagónica in vitro frente al patógeno, la cepa MT17, correspondiente a Trichoderma sp con el 87% de inhibición y MH5, correspondiente a Curvularia sp con el 81 % de inhibición.

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Title: In vitro evaluation of the antagonistic capacity of endophytic fungi isolated from Moringa oleifera (L) in Pestalotia palmarum (Q).

Abstract

Author (s): Samia Hasay Montoya Sánchez

Keywords: Antagonism, Endophytes, Pestalotiopsis

Pestalotiopsis, produced by the fungus Pestalotia palmarum, is the main disease that causes defoliation in oil palm crops in the tropics. This disease considerably affects the sustainability of the crops and their conventional treatment, implies damage to the environment by the pollution it generates. For this reason, the search for innovative natural solutions to this problem in the agroindustrial sector is of great importance, as an alternative to chemical treatment. The adaptability of endophytic fungi to their hosts, the ecological benefits they provide and the various antagonistic mechanisms they have against pest control, make them a good alternative. In this work, the antagonistic capacity of the endophyte fungi isolated from Moringa oleifera was evaluated in the control of Pestalotia palmarum, making use of methods of isolation, identification and evaluation of the antagonism in conjunction with statistical analysis tools, which allowed determining if some of endophytic fungi, could mean an alternative for the biocontrol of Pestaloptiosis. The potential of 21 endophytic fungal strains obtained from healthy tissue was determined as candidates for the biological control of P. palmarum. Of these isolates, eight fungal strains were the most promising. Standing out among these, for its in vitro antagonistic activity against the pathogen, strain MT17, corresponding to Trichoderma sp with 87% inhibition and MH5, corresponding to Curvularia sp with 81% inhibition.

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Introducción

La palma africana de aceite Elaeis guineensis Jacq, también conocida como palma aceitera es considerada la principal fuente de aceite del mundo, es el cultivo oleaginoso que mayor cantidad de aceite produce; con un rendimiento de 3 a 5 toneladas de aceite crudo de palma por hectárea y de 600 a 1000kg de aceite de palmiste (Sánchez et al., 2013).

Su rendimiento es 10 veces superior a los demás cultivos, lo cual despierta un interés económico en los países con condiciones adecuadas para el desarrollo del mismo. Los principales exportadores de aceite de palma son Indonesia, Malasia, Tailandia, Nueva Guinea, Nigeria, entre otros. En América existen plantaciones en Colombia, Ecuador, Perú; países donde hay grandes extensiones de terreno dedicados a este cultivo y que siguen en crecimiento debido al desarrollo económico que genera (Genty, Garzón y García, 2014).

La siembra de grandes plantaciones de palma aceitera ha ocasionado una modificación del ambiente natural debido al establecimiento de monocultivos en grandes áreas del terreno, lo cual origina un microclima diferente, con condiciones favorables para el desarrollo de plagas y enfermedades. Dentro de las plagas encontramos una larga lista de insectos pertenecientes a grupos taxonómicos diferentes, con comportamientos y condiciones ambientales para su aparición (Calvache, 2001), estas plagas son consideradas de importancia económica por los daños que causan en el follaje, tallo, frutos y el sistema radicular. Las plagas que se alimentan del follaje tienen doble importancia ya que además de la defoliación, originan puertas de entrada o son facilitadoras para hongos oportunistas que pueden causar enfermedades, siendo una de las más importantes en América Central y América del Sur, comúnmente conocida como “añublo

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 15 foliar” o también Pestalotiopsis causada por el hongo Pestalotia palmarum (Escalante, et al.,

2010). Esta enfermedad afecta la economía del cultivo, pues dependiendo del grado de defoliación puede ocasionar pérdidas hasta de un 40% de la producción (Calvache, 2001) equivalentes a 5.6 Ton/ha/año y pérdidas en el follaje comprendidas entre el 19 y 66%(Escalante, et al., 2010).

La Pestaloptiosis es considerada como una enfermedad causada por un complejo de hongos, cuyo síntoma es la necrosis del área foliar con el consiguiente efecto sobre la capacidad fotosintética de la planta. Las especies más importantes que conforman este complejo son

Pestalotia palmarum y P. glandicola (Genly, et al., 2014).

Se menciona que esta enfermedad está asociada con algún tipo de estrés por ejemplo deficiencias en nutrientes como el magnesio, tiempos prolongados de sequía (Sánchez, 1990). El agente patógeno importante y al que se le atribuye la mayor virulencia es Pestalotia palmarum. Este género pertenece al phyllum Ascomycetes, clase Coelomycetes y a la familia

Amphisphaeriaceae. Las especies de Pestalotia palmarum, se encuentran en ecosistemas con climas tropicales, no presentan especificidad por sus huéspedes, por lo tanto, pueden tener la habilidad de infectar un amplio rango de huéspedes. Con respecto al ciclo de la enfermedad, se afirma que las especies patogénicas del genero Pestalotia palmarum inicialmente hacen contacto con el huésped en el lugar donde ocurre la infección, donde le precede una puerta de entrada

(estomas o lesiones por defoliadores), por medio de las conidias. Este inóculo puede sobrevivir a condiciones adversas y puede causar infecciones primarias, el inoculo secundario producido por el tejido enfermo puede causar infecciones secundarias e incrementar la severidad de esta enfermedad. (Escalante, et al., 2010).

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Uno de los aspectos importantes en la producción agrícola es el control y manejo de plagas y enfermedades; (Maharachikumra, Guo, Chukeatirote, Bahkali y Hyde, 2011). La utilización extensiva de compuestos químicos para el control de enfermedades, la emergencia de patógenos resistentes a fungicidas, y el deterioro en la salud de productores y consumidores, han promovido la búsqueda de alternativas viables que garanticen una mayor sostenibilidad en la producción agrícola, minimizando el impacto sobre el medio ambiente.

Una de las alternativas para el manejo de plagas en cultivos de importancia económica, es el control biológico, el cual utiliza agentes de control basados en microorganismos vivos o productos naturales, que tienen un potencial comprobado para el manejo de plagas y se han utilizado en todo el mundo (Chandler, et al., 2011)

Los hongos antagonistas utilizados en control biológico, constituyen una amplia gama de especies entre los que se encuentran los hongos endófitos, estos organismos viven en asociación con plantas en la mayor parte o en todo su ciclo de vida, se ubican en los espacios intercelulares y, algunas veces, intracelularmente en diferentes tejidos como hojas, tallos, raíces, frutos y semillas de muchas de ellas (Sánchez et al., 2013). Los hongos endófitos se han encontrado asociados a plantas con propiedades medicinales (Mosquera, 2018, Gómez, López, Martínez y

Chacón,2016). Estos hongos presentan un interés particular debido a que se consideran sintetizadores químicos al interior de la planta, ya que producen gran variedad de compuestos que han sido utilizados ampliamente en la medicina, la agricultura y la industria por sus efectos antibióticos o antimicóticos (Mosquera, 2018, Gómez, López, Martínez y Cachon 2016,

Giusiano, Rodolfi, Magianterra, Piontelli y Pico, 2010).

El propósito de este trabajo estuvo dirigido a aislar hongos endófitos de M. oleífera para evaluar la capacidad antagónica frente a Pestalotia palmarum en ensayos in vitro.

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1 Presentación del trabajo de grado

1.1 Planteamiento del Problema

La palma de aceite es el cultivo oleaginoso que mayor cantidad de aceite produce por unidad de superficie. Con un contenido del 50% en el fruto, puede rendir de 3.000 a 5.000 Kg de aceite de pulpa por hectárea (Mosquera, Gómez y Bernal, 2007) además de permitir el aprovechamiento de la tierra mediante la utilización de cultivos marginales de manera que se considera una opción supremamente rentable para la agroindustria de los países tropicales. (Gonzales, 2012)

A medida que el área de palma plantada en América latina ha logrado extenderse de manera considerable, han surgido problemas de enfermedades no registradas anteriormente en regiones tradicionalmente cultivadoras como África, Malasia e Indonesia (Sanchez, 1990). Algunas de estas enfermedades han ocasionado millones de pérdidas en plantaciones de Colombia, como es el caso de la Pestalotiopsis, causada por el hongo Pestalotia palmarum y que produce en la planta una consecuente disminución del área foliar especialmente dañina en este tipo de palmáceas, afectando considerablemente la tasa fotosintética de la planta, hecho que repercute también en la producción del fruto. La enfermedad causada por este hongo, puede encontrarse circunscrita solamente sobre los foliolos de las palmeras o avanzar hasta la base del peciolo de las hojas, llegando en ocasiones a colonizar el pseudotallo y afectar al crecimiento de la palmera, así como llegar a producir la muerte total de la planta (Gonzales, 2012)

En relación con su severidad, se han reportado disminuciones importantes en la producción de palma aceitera, así como altos sobrecostos en el tratamiento y control de la enfermedad, el cual tradicionalmente se hace mediante absorción radicular de un pesticida sistémico. Estos

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 18 tratamientos químicos, a medida que pasa el tiempo, se vuelven cada vez más ineficaces ya que, aumentan su dosificación, por efectos de resistencia microbiana, y la frecuencia de aplicación es cada vez más corta, por lo que se convierten en métodos insostenibles para las plantaciones de palma de aceite (Mendez, 2000)

Es así como el control biológico se convierte en una opción atractiva para el tratamiento de enfermedades en plantas, si se tiene en cuenta que los costos respecto al uso de tratamientos químicos pueden resultar menores y de mayor eficiencia, pues, aunque los antagonistas pueden actuar en forma más lenta y en menor escala, su acción puede ser muchísimo más estable y duradera que la de los tratamientos convencionales. (Tovar, 2008)

Constantemente los seres humanos han realizado variados esfuerzos por encontrar productos que ayuden a mejorar los cultivos partiendo específicamente desde lo sintético y recientemente teniendo un énfasis en productos de origen natural; por lo cual las investigaciones se han visto obligados a buscar fuentes naturales que promuevan la producción de componentes activos para ser aplicados a nivel farmacéutico, industrial y agronómico, llevando así a los investigadores a explorar la microbiota endófita, que ha sido objeto de atención en los últimos años debido al abundante potencial que posee este para producir gran variedad de metabolitos secundarios que bien podrían ser de gran ayuda a la sociedad en la cura o tratamiento de distintas patologías o enfermedades, así como la solución a problemas agropecuarios.

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1.2 Pregunta de Investigación

¿Los hongos endófitos de Moringa oleífera (L) presentan algún mecanismo de antagonismo para el control de Pestalotia palmarum?

1.3 Hipótesis

 Los hongos endófitos de M. oleífera tienen la capacidad de inhibir el fitopatógeno

Pestalotia palmarum in vitro

 Los hongos endófitos de M. oleífera no tienen la capacidad de inhibir el fitopatógeno

Pestalotia palmarum in vitro

1.4 Objetivos

1.4.1 Objetivo general

Evaluar la capacidad antagónica de los hongos endófitos aislados de Moringa oleífera sobre

Pestalotia palmarum.

1.4.2 Objetivos específicos

 Aislar hongos endófitos de los diferentes tejidos vegetales a partir de Moringa oleífera.

 Determinar el efecto antagónico in vitro de hongos endófitos de Moringa oleífera frente

al hongo Pestalotia palmarum.

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1.5 Justificación

Las investigaciones en los últimos años han estado enfocadas principalmente a la búsqueda de soluciones biológicas para las enfermedades de los cultivos de importancia agroindustrial, para mitigar los daños causados por productos químicos en el ambiente que también son causa del calentamiento global (Li, et al. 2008; Molina, Pimente, Bertuci y Pastore 2012). Una de las alternativas que surge para el control de fitopatógenos, son los hongos endófitos (Rodríguez

,2009); especies microbianas que son capaces de vivir y colonizar los espacios inter e intracelulares de los tejidos de plantas superiores sin causar un daño aparente de los tejidos de la planta, donde viven estos microorganismos, liberando una gran variedad de metabolitos secundarios bioactivos, algunos son antibióticos con propiedades antifúngicas, antibacteriales e insecticidas que pueden inhibir eficazmente el desarrollo de un gran número de microorganismos

,incluyendo fitopatógenos (Li, et al.,2008), como Pestalotia , un hongo fitopatógeno que aprovecha las heridas causadas por el daño mecánico o por insectos, para invadir los tejidos de las hojas de palma aceitera, causando marchitez o secamiento foliar por el complejo fungoso denominado Pestalotiopsis, , constituyendo uno de sus principales problemas fitosanitarios que reduce drásticamente el área foliar fotosintéticamente activa y afecta en forma significativa la producción de racimos de fruta fresca. (Motta, 2004).

Se han utilizado diversos controles químicos y biológicos, pero hasta el momento es escasa o nula la literatura que reporte datos de ensayos in vitro de preselección de hongos endófitos de

Moringa oleífera, con potencial antagónico para el agente causal de la Pestaloptiopsis lo que representa una oportunidad interesante para reconocer si los hongos que se aislaron en este trabajo poseen capacidad inhibitoria y por lo tanto podrían considerarse como una opción en el tratamiento de esta enfermedad que afecta la palma de aceite en Colombia. Por lo tanto, el

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 21 conocimiento de la capacidad antagónica in vitro de los hongos endófitos asociados a plantas con efectos medicinales, como Moringa oleífera, presentan un interés particular debido a que se consideran sintetizadores químicos al interior de la planta, ya que producen gran variedad de compuestos que han sido utilizados ampliamente en la medicina, la agricultura y la industria

(Sánchez, et al 2013) por sus efectos antibióticos o antimicóticos.

La preselección in vitro de los endófitos y la evaluación de su capacidad antagónica es el primer paso en investigación, para estudios posteriores de aislamiento de extractos y compuestos bioactivos de interés. El conocimiento sobre los hongos endofíticos genera gran interés por sus posibles aplicaciones como biocidas eficientes, de baja toxicidad y alta compatibilidad con el medio ambiente; además de ser promotores para el desarrollo de productos que estarían destinados al control de hongos fitopatógenos, (Strobel y Daysi 2003).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 22

2 Marco teórico

2.1 Palma aceitera

La palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq) es un cultivo de climas cálidos que crece por debajo de los 500 metros sobre el nivel del mar La expansión del cultivo en Colombia inició en la década de 1960 y hoy ya cuenta con casi 500.000 ha sembradas, distribuidas en 105 municipios y

16 departamentos, que a su vez conforman las cuatro zonas palmeras del país (Fedepalma, 2014):

 Zona Norte: Magdalena, Norte del Cesar, Atlántico, Guajira, Norte de Bolívar,

Córdoba, Urabá antioqueño y Sucre.

 Zona Central: Santander, Norte de Santander, Sur del Cesar, Sur de Bolívar.

 Zona Oriental: Meta, Cundinamarca, Casanare, Caquetá.

 Zona Occidental: Nariño y Cauca.

Este cultivo se destaca por su alta rentabilidad y por su mayor producción de aceite. Debido a su expansión en área de cultivo sembrado, ha generado un gran impacto ambiental y social debido a que se han erradicado grandes extensiones de bosques de arbustos y árboles maderables, afectando el equilibrio biológico del ecosistema y las propiedades del microclima (Henson,

1995). Esta erradicación de bosques también ha traído la aparición de enfermedades que no se habían visto antes en otras zonas cultivadas, uno los casos más conocidos es la alta incidencia de pudrición del cogollo en palma sembradas en áreas que una vez fueron bosque tropical húmedo

(Sánchez, 1990). Por otro lado, es el cambio a variedades con alguna susceptibilidad en particular lo que causa la expresión de la enfermedad, como en el caso del hibrido OxG y la

Pestalotiopsis (Labarca, Sanabria y Arcia 2006).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 23

El cultivo de la palma de aceite ha venido creciendo de manera exponencial en el país llegando a posicionarlo como el cuarto productor de aceite de palma en el mundo (Fedepalma, 2014).

Colombia tiene aproximadamente 500.000 ha en producción, de las cuales 177.000 ha están localizadas en los llanos orientales y con algunos proyectos de siembra por realizar ya que las condiciones climáticas son favorables, además hay bastante mercado para el aceite de palma

(Fedepalma, 2014). Con este aumento de área cultivada los problemas sanitarios han aumentado y se pueden encontrar enfermedades y plagas que hace 15 años no se conocían, enfermedades letales como la marchitez letal y sorpresiva son las principales que afectan el cultivo ya que hasta el momento su único control es la erradicación de las palmas enfermas; gracias al cruce de las palmas Elaeis guineensis y Elaeis oleífera se creó el hibrido OxG el cual es resistente a la marchitez letal y la pudrición de cogollo (Henson,1995). A pesar de esto hay una enfermedad a la cual ha sido muy susceptible y aunque no causa la muerte si afecta a la producción, conocida como Pestalotiopsis; esta es una enfermedad que afecta el follaje de la palma de aceite la cual es producida por un el hongo Pestalotia palmarum el cual está presente en el ambiente por medio de esporas (Labarca, et al., 2006).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 24

2.2 Insecto facilitador de la Pestaloptiosis

La chinche de encaje, Leptopharsa gibbicarina Froeschner (Hemiptera: Tingidae), se encuentra en plantaciones de palma de aceite en Colombia en las zonas Central y Norte, este insecto cobra importancia económica debido a su relación con la enfermedad conocida como Pestalotiopsis, causa un daño directo al succionar la savia de los foliolos por el envés de éstos, ocasionando la aparición de puntos cloróticos en el haz, estas heridas que ocasiona en los foliolos facilitan la entrada y establecimiento de diferentes hongos como Colletrotrichum sp., Curvularia sp.,

Helminthosporium sp., Gloesporium sp., Macrophoma sp., destacándose por su virulencia

Pestalotiopsis palmarum (Cooke) Steyaert y P. glandicola (Castagne) (Labarca et al., 2006;

Escalante et al., 2010).

El complejo Leptopharsa - Pestalotiopsis puede llegar a disminuír la producción de palma hasta un 36% y sus efectos negativos pueden llegar a afectar la producción hasta por tres (Labarca et al. 2006). La dinámica poblacional de L. Gibbicarina es afectado por varias especies de organismos benéficos como son de Predadores, parasitoides y entomopatógenos (Aldana,

Aldana, Calvache y Franco 2010).

L gibbicarina, insecto facilitador de la Pestaloptiosis, llega a medir en su estado adulto de 2,69 mm a 2,91mm, no se puede definir una caracterización morfológica precisa por cuanto esta varía de acuerdo a la patogenia. La especie está caracterizada principalmente por la presencia en el pronoto de tres carenas dorsales, de las cuales la central es muy desarrollada y termina adelante por una estructura globosa en forma de giba con células bien desarrolladas. La duración total del ciclo es de 69 a 73 días, el cual comprende un periodo de incubación de huevo 16 días, ninfales de 18 días y 36 días de vida para el adulto (Figura, 1). El ciclo dura 69 a 73 días, el cual comprende un periodo de incubación de 15 días, 5 instares ninfales de 22 días y 32 días de vida

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 25 para el adulto macho o 36 días para la hembra, todo su período de vida lo desarrolla sobre el envés de los foliólos, encontrándose el mayor número preferencialmente en los foliólos de la parte media y apical de las hojas; ubicados a lo largo del foliolo generalmente en la parte media y basal de éstos y sobre todo donde se presentan depresiones o pliegues. Son poco móviles y sólo vuelan al ser molestados o cuando se trasladan a otra hoja u otra planta. (Genty, 2014).

Figura 1.Ciclo de vida de Leptopharsa gibbicarina Fuente: (Cenipalma, 2014)

En la época de verano principalmente se desarrolla la Pestaloptiosis , las condiciones de luz, permiten al insecto desarrollarse favorablemente, contaminando poco a poco el follaje de la planta cuyo inicio generalmente se concentra en la parte media inferior, facilitando la entrada de los hongos, “En la medida que las hojas de los niveles inferiores van siendo afectadas por el

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 26 hongo, las poblaciones del chinche se van desplazando hacia los niveles superiores, en donde las hojas son más apetecibles” (Genty, 2014).

Una vez que el insecto pica la planta, provoca en ella una lesión y posteriormente en un par de días se observa la aparición de las manchas foliares (Figura, 2), “Inicialmente se observa en el envés del foliolo y por transparencia, manchas pequeñas de color azul verdoso, rodeadas por un halo clorótico indefinido, que en fondo opaco presentan un aspecto aceitoso” (Jiménez, 1977).

Sin embargo, con el paso del tiempo las manchas cambian de color, sea por la transformación e incubación del hongo, volviéndose de un color marrón rojizo, con un halo amarillento que corresponde a la fase evolutiva del hongo dentro del parénquima.

2.3 Pestalotia palmarum

Pestalotia palmarum, agente principal causante del complejo “Pestaloptiosis”, es un hongo cuyos síntomas iniciales se caracterizan por la aparición de manchas negras pequeñas y circulares en el envés de los foliolos de la palma, a medida que la infección del hongo va avanzando, estas lesiones se agrandan observándose de color blanco con bordes negros bien

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 27 marcados. En la zona central de las lesiones se observan los cuerpos fructíferos de este hongo.

Puede afectar tejidos que ya han sido afectados por otros patógenos más agresivos (Carmona,

Zapata y Wright, 1990).

Descripción Taxonómica:

Reino: Fungí

Sub-Reino: Dikarya

Filo: Ascomycota

Sub-Filo: Pezizomycotina

Clase: Sordariomycetes

Subclase: Xylariomycetidae

Orden: Xylariales

Familia: Amphisphaeriaceae

Género: Pestalosphaeria (anamorfo Pestalotiopsis).

La taxonomía de Pestalotia palmarum en sí misma resulta complicado describirla, ya que la misma varía en características dependiendo en muchos casos de la especie con la que tienen relación filogénica.

2.3.1 Generalidades.

Las especies de Pestalotiopsis no son altamente específicas del hospedador y los taxones pueden tener la capacidad de infectar un rango de hospedadores (Keith, Velásquez y Zee, 2006). Las especies de Pestalotiopsis causan una variedad de enfermedades en las plantas, incluidas las lesiones del cancro, la muerte de los brotes, las manchas foliares, el tizón de la aguja, el tizón de la punta, el tizón gris, el chancro, la clorosis severa, las pudriciones de la fruta y las manchas

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 28 foliares (Pirone 1978, Xu, Kusakari, Hosom, Todoya y Ouchi,1999, Tagne y Mathur 2001,

Sousa, Tavares, Geros y Lino,2004). Las especies de Pestalotiopsis son patógenos débiles u oportunistas y pueden causar poco daño a las plantas ornamentales (Pirone, 1978), sin embargo, algunas especies de Pestalotiopsis pueden causar graves daños a las plantas cultivadas en macetas (Tagne y Mathur, 2001). Las especies patógenas de Pestalotiopsis inicialmente hacen contacto con el huésped donde ocurre la infección (inóculo), probablemente por medio de las conidias o esporas fragmentadas (Xu, et al.,1999). Estos inóculos pueden sobrevivir durante condiciones climáticas adversas y pueden causar infecciones primarias. El inóculo secundario producido en el tejido enfermo puede causar infecciones secundarias y aumentar la gravedad de la enfermedad. (Keith et al., 2006).

Otras fuentes de contaminación están dadas por los desechos de los cultivos, las plantas en existencia, los medios de cultivo utilizados, el suelo y las herramientas de viveros contaminados, las gotas de agua salpicada (McQuilken y Hopkins, 2004, Elliott, Broschat, Uchida y Simone,

2004) y también esporas en el aire (Xu et al., 1999). La fase patógena se puede desencadenar por una combinación de factores ambientales, susceptibilidad de las plantas y la virulencia del patógeno. Sin embargo, se necesita más investigación para probar la relación patógena endofítica en el género. Pestalotiopsis también se considera un patógeno débil (Madar, Solel y Kimchi,

1991), y la mayoría de los patógenos débiles penetran en el huésped a través de aberturas naturales como estomas, lenticelas e hidatodos (Agrios, 2005).

Especies de Pestalotiopsis solo infectan plantas heridas o estresadas, por lo que las heridas de poda u otros medios físicos desempeñan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad

(Elliott et al., 2004, McQuilken y Hopkins, 2004, Keith et al., 2006, Wright, Rivera y

Flynn,1998). Las plantas también pueden estar estresadas debido a insectos, pesticidas o daños

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 29 por el sol. La alta temperatura, la alta precipitación y las actividades humanas también pueden desencadenar infecciones, y esto puede conducir al desarrollo de la enfermedad (Tuset, Hinajeros y Mira, 1999, Elliott et al., 2004). Las relaciones y ciclos de vida anamorfo-teleomorfas no son bien conocidas para la mayoría de las especies, ya que la etapa sexual no se desarrolla a menudo

(Wright, 1998). Por lo tanto, los conidios, parecen jugar un papel clave en el suministro de los inóculos. La fase anamórfica y Teleomórfica del patógeno se muestran en la Figura, 3.

Figura 3.Ciclo de vida de Pestalotia palmarum

(Maharachchikumbura, et al., 2011)

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 30

2.4 Pestalotiopsis

2.4.1 Controles Químicos.

La Pestaloptiosis ocasiona un daño económico en la palma aceitera causando la destrucción del follaje, en específico este problema ha cobrado gran importancia considerando el área de cultivos que están siendo afectadas en diversas plantaciones del país, las medidas de control han considerado medidas preventivas y medidas curativas, de modo que se evite la propagación.

Entre las medidas de control se pueden verificar:

 Nebulización de insecticidas

La aplicación de insecticidas nebulizables con equipos especiales ha resultado eficiente para pequeños focos en cultivo joven (4 a 8 años). Con este sistema el producto llega con gran facilidad a las áreas de mayor concentración de las poblaciones, ya que la nube asciende lentamente y permanece durante un buen tiempo en la masa del follaje. Con el propoxur nebulizable 5% a razón de 1 l/ha (PC) se han obtenido excelentes resultados haciendo dos aplicaciones con intervalo de 15 a 20 días y con un rendimiento de 2 hectáreas/hora. Es muy importante respetar el lapso de tiempo entre la primera y segunda aplicación, para asegurar la destrucción de las últimas posturas eclosionadas y así poder lograr el corte completo del ciclo.

Una condición inevitable, es que los tratamientos se deben realizar en tiempo fresco, es decir en las primeras horas de la mañana y de la noche (Genty,2014).

 Fumigación aérea

Este tipo de aplicación se considera especialmente útil, para el control simultáneo de poblaciones del chinche y defoliadores, los cuales en conjunto pueden ocasionar fuertes daños al cultivo. Se

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 31 usa igualmente cuando por dificultad de personal o falta de otros medios, sea éste el único recurso disponible. Es importante recordar que los insecticidas, por tóxicos que sean, si están correctamente empleados pueden evitar grandes perjuicios, no sólo a la palma directamente, sino también a la fauna auxiliar. Una de las principales razones de lo anterior, es el uso de químicos sobre áreas reducidas que permiten eliminar una fuerte infestación de plagas, con la seguridad de que la fauna útil destruida en esta ocasión, será reemplazada muy rápidamente desde las zonas exteriores. Al contrario, si se deja de tratar un sector pequeño por no dañar la fauna útil, es posible que después de 2 o 3 generaciones, el problema sea de tal amplitud que habrá necesidad de tratar con químicos una gran superficie destruyendo toda la fauna útil, sin la esperanza de recolonizar en parásitos y predadores esta área grande antes de mucho tiempo (Genty, 2014).

 Inyección Insecticidas

Este método de control ha resultado muy promisorio considerando su efectividad para la plaga e inocuidad para la fauna auxiliar. Básicamente esta práctica consiste en efectuar una perforación en el tallo de los árboles e introducirles insecticidas de acción sistémica, a la altura de 1 m., sobre el nivel del suelo. Sobre el estipe se practica una perforación con una inclinación de 45 ° y con la ayuda de una jeringa grande (50 ml.), se inyecta la dosis programada. Para impedir la entrada de agua y patógenos, al siguiente día de aplicada la dosis total, se taponan las perforaciones con trozos de madera fina (7 x 1,5 x 1,5 cm.), recubiertos por una pasta fungicida (mancozeb o maneb). (Genty,2014).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 32

2.5 Moringa oleífera Lam

M. oleífera es un árbol adaptado a trópicos y subtrópicos, nativo del Himalaya en India, pero ampliamente distribuido en otras regiones de India, Asia, África, Sur de florida, Islas del Caribe y América del Sur. Las características del árbol son: altura entre 10-12 m, tronco leñoso y recto de diámetro entre 20-40 cm, rápido crecimiento alcanzando en un año 5 m de altura, algunas variedades son anuales y pueden llegar a vivir 20 años, posee copa abierta tipo paraguas y alta resistencia a plagas y enfermedades, su cultivo aporta gran cantidad de nutrientes al suelo, además de protegerlo de factores externos como la erosión y la desecación, puede ser propagado de manera sexual o asexual y cultivado en suelos pobres con escases de lluvia. (Duke, 1983) El cultivo de M. oleífera es de rápido crecimiento y fácilmente cultivable en varias regiones secas del trópico, bajo siembra intensiva puede mantenerse con 500 mil plantas/ha, la altitud máxima del cultivo es 1.500 m.s.n.m, precipitación anual entre 250 mm y 4.000 mm, tolera varios periodos de sequía, aunque se reduce la producción de hojas, se mantiene a temperatura ente 15 -

30º C, puede sobrevivir a 0º C por cortos periodos de tiempo con pérdidas de nuevo crecimiento, requiere de suelos con pH entre 4,5-9, arenosos o con buen drenaje, tolerando suelos arcillosos

(Radovich, 2009).

Cultivo multipropósito del cual se puede derivar gran cantidad de subproductos de gran potencial económico, generando nuevas perspectivas de progreso para los campesinos de la región Andina y del Caribe Colombiano, sin generar impactos negativos al ambiente, el árbol presenta características químicas como presencia de alcaloides, flavonoides, antocianinas, proantocianinas, cinamatos y alto contenido de aceites, proteínas y azucares, por lo que la especies es una fuente importante para la aplicación en varios sectores económicos. (Martin,

2013).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 33

Los beneficios de esta planta (Figura, 4), van desde su sabor que es agradable y además no tiene efectos secundarios y, sus hojas poseen proteínas, aminoácidos, vitaminas y minerales, además de ello sus semillas segregan un aceite que contiene un 73% de ácido oleico, similar al aceite de oliva que de sus semillas también se han visto características como las de presentar coagulantes naturales, aclaramiento de aguas, indicador de contaminación. (Alfaro Y Martínez ,2008).

Figura 4.Beneficios, propiedades y aplicaciones de cada una de los tejidos de la planta Moringa oleífera. (Castro,2014).

El cultivo de M. oleífera, puede ser aprovechado para saneamiento y descontaminación de aguas superficiales a partir de la semilla y la producción de carbón activado producto de sus residuos, se ha comprobado su aplicación con éxito en programas de reforestación, protección y fertilización de suelos, mejoramiento del ganado y aplicación en la industria farmacéutica, tales características han superado las de otras especies vegetales usados con los mismos fines, por lo cual en Colombia se tienen cultivos , pero no se ha explotado según sus propiedades, para la cual se propone cultivos en la región Andina y Caribe, en donde el objetivo principal es una

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 34 sensibilización acerca de las propiedades y usos potenciales de la especie. (Alfaro y Martínez

2008).

Los metabolitos secundarios son de gran importancia en muchos campos de la investigación, estos son derivados de hongos endófitos presentes en los tejidos de plantas medicinales como

M.oleífera, sus metabolitos pueden ser aislados y procesados para beneficio, en área farmacéutica (Sousa et al., 2004). Los metabolitos secundarios mayormente obtenidos de la planta medicinal Moringa oleífera son: los flavonoides, flavonoles, antocianinas, polifenoles, alcaloides y taninos (Echavarria et al., 2016), los cuales son metabolitos de gran importancia en la agricultura y en la medicina.

2.6 Hongos endófitos

Para iniciar la conceptualización y descripción de los hongos endófitos, resulta conveniente destacar que los hongo son seres vivos con estructuras filamentosas y características morfológicas complejas, denominados organismos heterótrofos que obtienen los nutrientes por absorción de un sustrato determinado (Steinberg, 2007).Son microorganismos eucariotas, que se reproducen tanto de forma asexual como sexual (Steinberg, 2007). Constituyen un grupo bastante diverso en cuanto a su morfología, tamaño, hábitat y formas de nutrición. Están relacionados de forma lejana con las plantas y más estrechamente relacionados con los animales, pero son diferentes de cualquiera de los dos grupos. En su mayoría desarrollan cuerpos muy difusos formados por una red de filamentos muy estrechos, tubulares y ramificados llamados hifas. Estos filamentos o hifas, exudan enzimas y absorben los alimentos y su crecimiento se realiza apicalmente. Aunque estos filamentos son muy estrechos, son colectivamente muy largos y pueden explorar y explotar sustratos de alimentos de manera muy eficiente. Usualmente se

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 35 reproducen por medio de esporas, y posteriormente son liberadas al medio ambiente por diversos mecanismos, conformando una gran diversidad morfológica de estructuras tanto macroscópicas como microscópicas .El número de hongos que existe en el planeta no se puede determinar con exactitud ,pues hay aún muchos subregistros y especies nuevas por estudiar, en una reciente publicación de Hawksworth y Lücking, (2017 ), se estima que el número de especies podría estar entre 2.2 y 3.8 millones.

Por otra parte, la palabra endófito, desde la concepción etimológica significa literalmente “dentro de la planta”, pero específicamente se refiere a microorganismos, sean bacterias u hongos que no producen daño aparente a la planta hospedera(Wilson, 1995).

Los hongos endófitos fueron descubiertos más o menos en el año de 1898, pero se predice que su concepto o su palabra como tal “endófito” fue descrita por el señor Bary en (1866),con muy poca importancia en su tiempo, pero que en años siguientes tomo fuerza en el área investigativa, dando a conocer su capacidad de colonizar tejidos de plantas, sin ser patógeno para ellas y que conforman una importante base de investigación farmacológica, dándonos a conocer su gran importancia como agente antimicrobianos por la producción de metabolitos secundarios, ayudando a la disminución de infecciones causadas por patógenos adyacentes.

Los microorganismos endófitos son aquellos hongos que permanecen dentro de tejidos vivos de su hospedero, como agentes de protección, mostrando su aparición en una gran diversidad de plantas, presentando características adaptativas bióticas y abióticas. (Steinberg, 2007).Los hongos endófitos son organismos que viven en asociación simbiótica con las plantas en la mayor parte o en todo su ciclo de vida, se encuentran en los espacios intercelulares y, algunas veces, intracelularmente en las hojas y los tallos de muchas plantas, sin producir daños aparentes en los tejidos, en algunos casos, los hongos endófitos confieren beneficios a la planta que pueden

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 36 resultar mutuos; utilizan los nutrientes que sintetiza la planta y ésta se beneficia de los metabolitos bioactivos que ellos producen (Salgado y Caridad 2005).

El hongo endófito adquiere forma y función de acuerdo a la planta hospedera, así la relación entre éstas puede variar, bien desde una patogénesis hasta el mutualismo, no obstante, independiente una de la otra, en cualquiera de las relaciones ambos organismos producen metabolitos secundarios potencialmente tóxicos. El hongo endófito produce factores de virulencia, como exoenzimas y metabolitos fitotóxicos, mientras que la planta produce defensas, tanto mecánicas como bioquímicas (Schütz y Boyle, 2005).

2.6.1 Metabolitos secundarios.

Los hongos endófitos pueden contribuir a la protección de su planta hospedera contra factores bióticos (patógenos y herbívoros) y abióticos (estrés salino, térmico, presencia de metales, etc.), por medio de tres mecanismos: 1) Directos: por medio de enzimas y/o metabolitos secundarios con actividad anti-patógeno, producidos directamente por el hongo endófito. 2) Indirectos: consisten en la inducción o incremento de la expresión de mecanismos de defensa químicos o fisiológicos intrínsecos a su planta hospedera. 3) Ecológicos: se llevan a cabo por ocupación del nicho ecológico, hiperparasitismo y predación (Gao, 2010). Un ejemplo de mecanismo de defensa directo contra los patógenos de la hospedera es la producción de compuestos orgánicos volátiles (VOCs, por sus siglas en inglés) del hongo endófito Muscodor yucatanensis, aislado de

Bursera simaruba (Burseraceae). Los extractos orgánicos derivados del medio de cultivo y del micelio de M. yucatanensis y, principalmente, la mezcla de VOCs que produce, son letales para los fitopatógenos Alternaria solani, Rhizoctonia sp., Phytophthora capsici y Phytophthora parasitica. Algunos de los VOCs identificados son: octano, 2-pentilfurano, cariofileno, aromadendreno, derivados del naftaleno, entre otros. El segundo mecanismo de protección a las

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 37 hospederas es evidenciado en la investigación realizada por Waller y colaboradores (2005), en donde demostraron que la resistencia en la cebada (Hordeum vulgare, Poaceae) al ataque de microorganismos patógenos es debida a la colonización de las raíces por el endófito

Piriformospora indica.

2.6.2 Mecanismos de Acción. Los mecanismos de acción del antagonismo dual se

traducen en competencia por espacio y alimento, antibiosis, parasitismo y

sinergismo.

 Competencia por nutrientes: La inanición es la causa más común de muerte para

microorganismos, la competencia por nutrientes limitantes, resulta en un control

biológico de hongos Fitopatógenos, antagonistas y micoparasitos (Chet et al., 1997). Un

ejemplo claro de este mecanismo de acción se encuentra representado en hongos

filamentosos, donde la toma de hierro es esencial para la viabilidad de los mismos. Bajo

condiciones de deficiencias de hierro, el hongo excreto agentes quelantes específicos de

bajo peso molecular llamados sideroforos, que le permiten tomar el hierro en forma

reducida (Chávez, 2004).

 La antibioticiosis: es un mecanismo benéfico indirecto que produce una interacción

negativa, lo cual será expuesto en lo sucesivo. Es una interacción biológica que consiste

en la imposibilidad de vivir unos organismos en las inmediaciones de otros, debido a que

éstos segregan una sustancia, llamada antibiótico, que provoca la muerte de aquellos.

Este tipo de interacción es muy comúnmente estudiada entre insectos y aquellas plantas

hospedadoras de las que se alimentan. Se llama antibiosis al efecto que se produce

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 38

cuando una especie produce una sustancia nociva para otra especie que compite con ella.

(Benítez et al., 2004).

 Micoparasitismo: El ataque directo de un hongo a otro es un proceso muy complejo que

involucra eventos secuenciales, incluye reconocimiento, ataque y penetración

subsecuente y muerte al huésped. Trichoderma sp puede ejercer control directo por el

rango de parasitismo de hongo, detectando otros hongos y creciendo sobre él. (Benítez et

al., 2004).

 Sinergismo: El sinergismo entre la actividad de enzimas líticas y antibióticos, es la mejor

estrategia para ser un buen controlador, además de abrir el campo para posibles cepas

transformantes que puedan producir las diferentes enzimas logrando un sinergismo que

sea relevante (Benítez, 2004). Es una interacción positiva en la que los miembros

cooperan y comparten nutrientes. Básicamente, remueven productos inhibitorios; se

estimulan mutuamente; incrementan aspectos benéficos de su fisiología; equilibran

microbiológicamente el suelo y crean un medio ambiente favorable para el crecimiento

de la planta. (Chávez, 2004).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 39

3 Metodología

Diseño del estudio: experimental y descriptivo

3.1 Población y muestra

El muestreo se realizó en media hectárea de la Finca Manzanares, ubicada en el Municipio de

Piedecuesta, Santander, Latitud: 6.98743, Longitud: -73.0495 6° 59′ 15″ Norte, 73° 2′ 58″ Oeste.

Las muestras fueron tomadas al azar, se escogieron 20 plántulas de las cuales se tomaron hojas y tallos (Pseudotallos) de tejidos sanos, de tonalidad más verdosa, jóvenes y sin fracturas.

Población N=20 plantas.

La cepa del hongo patógeno (P. palmarum) fue donada por la Plantación de palma aceitera

Indupalma, ubicada en el municipio de San Alberto del Departamento del Cesar.

3.2 Sitio de estudio

El desarrollo de la parte experimental del trabajo de grado se realizó en las instalaciones del laboratorio de investigación e innovación en Biotecnología agroambiental de la Universidad de

Santander (LIIBAAM) UDES.

3.3 Manejo y tratamiento de las muestras

Los tejidos vegetales de M.oleífera fueron recolectadas de cultivos sanos en la finca Manzares,

Las muestras de plantas fueron recolectadas en bolsas de papel. El aislamiento de los hongos endófitos se realizó a las 24 h de la recolección de muestras de plantas. Las muestras fueron cortadas en segmentos de 1cmx 1cm. La esterilización se realizó de acuerdo al protocolo de

Arnold et al. (2007), con mínimas modificaciones.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 40

La esterilización superficial se realizó por inmersión consecutiva durante 1 min en alcohol 70%

(v/v), 3 min en hipoclorito de sodio 0,8%, 1 min en alcohol 70% (v/v) y cinco lavados de 1 min cada uno con agua destilada estéril. La efectividad del proceso de esterilización superficial se comprobó mediante impresión del tejido sobre medio de cultivo con antibiótico.

3.4 Siembra de los fragmentos del material vegetal

Posterior al tratamiento de lavado y desinfección del material “sano” de M. oleífera, se procedió con el corte de las hojas de cada lavado por separado en segmentos y después se hizo la siembra de 4 fragmentos por caja de Petri. Uno alejado del otro ocupando la mayor distancia disponible entre ellos, y este mismo proceso por triplicado de cada tratamiento en agar PDA suplementado con Cloranfenicol de 0,05g/L con el fin de evitar el crecimiento bacteriano, sellados con parafilm e incubados a 27 ± 2C por 5 - 8 día en cámara incubadora.

Se sembraron cuatro fragmentos por caja de Petri, con el fin de asegurar una amplia gama de posibilidades de crecimiento por segmento sembrado, incrementando de esta forma los organismos posibles presentes.

3.5 Separación y purificación

De las puntas hifales de los hongos en crecimiento, se recortó micelio (1x1cm2), y posteriormente se sembraron en agar PDA suplementado con cloranfenicol, transferidos asépticamente, se incubaron a 25°C por 8 días. Como medida de control de los hongos se rotularán con la siguiente codificación:

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 41

Tabla 1.Codificación de hongos endófitos

Planta Moringa oleífera (M)

Tejido vegetal : Tallo (T) Hoja(H)

Fecha: Corresponde a la fecha de aislamiento No. De aislamiento (1) Ejemplo 03/10/18 MT1

3.6 Pruebas de antagonismo in vitro por cultivo dual

3.6.1 Preselección de hongos endófitos

Cada uno de los hongos antagonistas fue colocado por triplicado en un extremo de la caja de

Petri, con un disco de 5 mm de PDA suplementado con cloranfenicol 0.005g/l. a 1cm de la pared de la placa de Petri. Después de un periodo de incubación a temperatura 25°C y con base en la velocidad de crecimiento de los hongos, en el extremo opuesto de la caja de Petri, se colocó otro disco de agar de 5 mm con el hongo patógeno a confrontar. El crecimiento de los organismos en cada uno de los enfrentamientos fúngicos, fue evaluado cada 24 h. Se consideraron tres repeticiones para cada enfrentamiento y para el tratamiento testigo. La evaluación final fue considerada a los 9 días, cuando el patógeno cubrió totalmente la caja de

Petri en el tratamiento testigo (sin hongo antagonista). Para medir el efecto inhibitorio, de los hongos antagónicos hacia el patógeno, se midió el crecimiento de estos últimos. El porcentaje de inhibición se estimó con base en la diferencia obtenida entre el crecimiento obtenido de patógeno

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 42 confrontado con la cepa antagónica y el crecimiento de la cepa del respectivo patógeno sin antagonista.

3.7 Análisis estadísticos

Los halos de inhibición del patógeno obtenidos con los veintidós hongos endófitos fueron analizados por triplicado y los resultados obtenidos se analizaron teniendo en cuenta la comparación de las medias utilizando análisis de varianza y pruebas a posteriori de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05), con un paquete estadístico SPSS versión 25.

3.8 Identificación de las morfoespecies de hongos endófitos con mayor capacidad

antagónica.

Los hongos más eficientes en el biocontrol de P.palmarum fueron identificados hasta el nivel de género, con base en las características morfológicas , tanto macroscópicas como microscópicas, estas últimas basadas en la observación, descripción e identificación de estructuras de reproducción de los hongos , visualizadas en montajes con coloraciones específicas(azul de lactofenol, Fushina, ácido láctico más etanol) y utilizando las herramientas de la microscopia fotónica de luz y contraste de fases, siguiendo el protocolo descrito en la clave taxonómica de

Villegas (2005) y Samuels et al., (1999).

3.9 Evaluación de los mecanismos de antagonismo

A partir de las pruebas de inhibición del crecimiento de P. palmarum por los hongos endófitos en los ensayos in vitro tanto en cultivo dual como cocultivos, se procedió a escoger las mejores cepas fúngicas, para la evaluación y observación de la interacción entre las hifas de

Patógeno

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 43 los antagonistas con aquellas del patógeno por separado.

Los cultivos duales se utilizaron para evaluar dos mecanismos de antagonismo: A) Antibiosis y

B) Micoparasitismo. La antibiosis se estableció al comparar el crecimiento del Fitopatógeno en la

última evaluación antes del contacto hifal con el del testigo para igual período de tiempo.

Para indicar el micoparasitismo como posible mecanismo de acción de se realizaron observaciones macroscópicas de los cultivos duales, tomándose como índice de micoparasitismo, la invasión del antagonista sobre la superficie del micelio patógeno .Fue necesario comprobar el micoparasitismo, por medio de microscopía, utilizando el microscopio de Fluorescencia y DIC con aumento de 40x, donde se debieron analizar las interacciones de las hifas antagonistas con las del patógeno, ya sea por enrollamiento o por penetración.

3.10 Prueba cualitativa de Cocultivo de endófitos

Preselección de los aislamientos nativos de los hongos endófitos por su antagonismo a Pestalotia palmarum. En el centro de cajas Petri, con medio de cultivo PDA, se colocó un disco de 5 mm de diámetro de medio PDA colonizado por el hongo patógeno y sobre el eje horizontal, a una distancia de 3 cm del borde, cada uno de los 6 hongos endófitos seleccionados. Las cajas Petri fueron incubadas a 25 °C. Durante un período de 9 de días, cada tercer día se registró la inhibición y la esporulación de los hongos.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 44

4 Resultados y Discusión

4.1 Aislamiento de hongos

A partir de hojas y tallos de M. oleífera, se lograron aislar e identificar 21 hongos, pertenecientes a la clase Ascomicetes (Tabla2), obteniendo mayor porcentaje del tallo, 62% y el 38% de hojas

(Fig.5). Mosquera, W (2018) encontró un mayor número de hongos endófitos del área foliar, sin embargo estos resultados pueden variar dependiendo de varios factores como edad de los cultivos, tipo de semillas y suelos , se sabe muy poco acerca de la distribución de los hongos endófitos en los tejidos de un mismo órgano, siendo posible encontrar diferentes especies en cada uno de los tejidos de una hoja: parénquima, haces vasculares, dermis, etc., demostrando la capacidad de cada especie de usar ciertos substratos específicos (Rodríguez, 1994).

En este trabajo aislamos 21 endófitos, un número muy similar de endófitos, fue aislado por

Souza et., al (2016) de esta misma especie vegetal, demostrando la biodiversidad endófitica en el cultivo.

En este trabajo, los principales taxa aislados, en número fueron: Fusarium sp (8 morfoespecies),

Mycelia sterilia, micelios sin fructificaciones, (5 morfoespecies), Curvularia sp (4 morfoespecies), Trichoderma sp (1 morfoespecie), Cladosporium sp (1morfoespecies), Bipolaris sp (1morfoespecie), Acremonium sp (1 morfoespecie), estos dos últimos, junto con Curvularia se encuentran comúnmente en el aire como epifitos o en asociación con diversos sustratos (Kiffer &

Morelet, 1997).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 45

Tabla 2. Aislamiento de hongos endófitos de Moringa oleífera

Género Codificación Tejido Planta fúngico fúngica Curvularia sp MH5 Hoja Mycelia MT16 Tallo sterilia Fusarium sp MT12 Tallo Fusarium sp MT6 Tallo Mycelia MT15 Tallo sterilia Fusarum sp MT11 Tallo Fusarium sp MT9 Tallo Fusarium sp MH3 Hoja

Cladosporium MT8 Tallo sp Fusarium sp MT18 Tallo Mycelia MT7 Tallo sterilia Curvularia sp MT3 Tallo Mycelia MT5 Tallo

sterilia oleífera Moringa Acremonium MH8 Hoja sp Bipolaris sp MT13 Hoja Curvularia sp MH1 Hoja Curvularia sp MH2 Hoja Trichoderma MT17 Tallo sp Fuasrium sp MT1 Tallo Mycelia MT14 Hoja sterilia

Fusarium sp MT2 Hoja

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 46

70% 62% 60% 50% 38% 40% 30%

PORCENTAJE 20% 10% 0% Porcentaje TEJIDO VEGETAL

hoja Tallo

Figura 5. Porcentaje de los aislados de Moringa oleífera por tejido

Algunos hongos endófitos, aislados se consideran patógenos como los géneros de Fusarium sp, se conoce su distribución cosmopolita, su habilidad fitopatogénica en diversos hospedadores, la producción de micotoxinas, su oportunismo y también su rol endofítico (Rubini, et al., 2005). Sin embargo, algunas especies de Fusarium sp también ha sido reportado como un endófito con amplia actividad biocontroladora. Según investigaciones recientes sobre poblaciones de hongos endofíticos presentes en tejidos internos de raíces de banano y plátano, se ha determinado que

Trichoderma sp y Fusarium sp son los géneros más abundantes y tienen un alto potencial como antagonistas de los nemátodos. Se han encontrado reducciones de hasta un 90% en la población final de Radopholus similis en el sistema radical de plantas de banano protegidas con hongos endofíticos de los géneros Fusarium sp y Trichoderma sp. (Bacony Yates, 2006). Las Cepas no patogénicas de F. oxysporum han sido ampliamente documentadas como antagonistas de los nemátodos fitoparásitos. Se ha observado que ciertos metabolitos producidos por esta especie

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 47 provocan la muerte de los nemátodos en diversos cultivos. (Bacon y Yates, 2006, Chet, Inbar y

Jadar, 2006, Howell, 2003, Schulz, y Boyle, 2005).

Esta relación plantas- endófitos sugiere una producción activa de los metabolitos secundarios, segregados por los dos organismos, el vegetal proporcionara defensas y el hongo fomentara metabolitos de característica virulenta como los fitotóxicos y además algunas enzimas dañinas como las exoenzimas. Por esta razón requiere un equilibrio conocida como la relación endofítica, si no se da una relación equilibrada, el hongo por su capacidad virulenta se mostrará como agente patógeno. (Schulz y Boyle, 2005).

4.2 Pruebas de antagonismo

Las especies de Pestalotia sp, son considerados un grupo diverso de hongos que afectan a muchos cultivos diferentes a la palma aceitera, (Satini, et al., 2013, Zhang,

Maharachchikumbura, Tian y Hyde, 2013). Con relación a su biología, no hay claridad, pues aún no se sabe si son parásitos obligados, o presentan especificidad con relación al huésped, o si son endófitos que puedan llegar a ser patógenos una vez que el huésped se debilita. Actualmente hay reportados 601 nombres de especies de Pestalotiopsis (Schulz y Boyle, 2005).

Para la selección de los hongos endófitos de M. oleífera, con mayor capacidad antagónica se realizó la prueba de cultivo dual enfrentando los veintiún (21) hongos aislados con el hongo patógeno P.palmarum , en medio de cultivo micológico agar papa dextrosa.

Se tomaron 3 medidas del crecimiento radial de los hongos endófitos a los 3,6, y 9 días, expresadas en cm. Estas mediciones del crecimiento fúngico, se evaluaron como promedios del porcentaje de inhibición del patógeno por los endófitos (Tabla 3).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 48

Tabla 3.Pruebas de antagonismos de los hongos endófitos frente a Pestalotia palmarum. Crecimiento del endófito Género Codificación en cultivo dual en la Promedi fúngico fúngica relación al patógeno (cm) Promedio o en 3 6 9 del porcentaje días días días crecimient de o inhibición Curvularia sp MH5 7 7 8 7,33 81,48% Mycelia MT16 4 4 4,5 4,17 46,30% sterilia Fusarium sp MT12 5,5 6 7 6,17 68,52% Fusarium sp MT6 4,5 4,5 5 4,67 51,85% Mycelia MT15 4 4 4 4,00 44,44% sterilia Fusarium sp MT11 5 6,5 6,5 6,00 66,67% Fusarium sp MT9 3,5 3,5 4 3,67 40,74% Fusarium sp MH3 3 4 4 3,67 40,74% Cladosporiu MT8 3 3,5 3,5 3,33 37,04% m sp Fusarium sp MT18 3 3,5 4 3,50 38,89% Mycelia MT7 3 3 3 3,00 33,33% sterilia Curvularia sp MT3 4,5 4,5 5 4,67 51,85% Mycelia MT5 3,5 4 4 3,83 42,59% sterilia Acremonium MH8 3,5 3,5 3,5 3,50 38,89% sp Bipolaris sp MT13 3,5 3,5 3,5 3,50 38,89% Curvularia sp MH1 4 4 4,5 4,17 46,30% Curvularia sp MH2 4 4,5 5 4,50 50,00% Trichoderma MT17 7,5 8 8 7,83 87,04% sp Fuasrium sp MT1 3,5 4 4 3,83 42,59% Mycelia MT14 3 3,5 5 3,83 42,59% sterilia Fusarium sp MT2 4,5 5 5,5 5,00 55,56% Medi 4,48 49,82% a

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 49

De acuerdo a los datos obtenidos en la Tabla 3, se aprecia que el mayor porcentaje de inhibición del crecimiento de P. palmarum debido al antagonismo de cada uno de los hongos endófitos, presentarón diferencias en relación al porcentaje de inhibición. Se encontraron ocho hongos, con los mayores porcentajes de inhibición para el crecimiento del patógeno, estos valores estuvieron por encima de la media de los 21 endófitos (Figura, 6). El mejor hongo fue el MT17, que correspondió al genéro Trichoderma sp no solo por su inhibición, de crecimiento del patógeno, como se observa en la figura 6, sino también por su tasa de crecimiento en cultivo dual frente al patógeno, demostrando una competencia por el sustrato de crecimiento (ver anexo 4), además estos datos fueron corroborados estadísticamente por el valor obtenido en la desviación estándar, lo cual hace, que sea un dato confiable al mantenerse entre las medias. (Figura,7).

b. 49

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a. b.

c. d.

d. e.

f. g.

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Figura 6.Prueba de cultivo dual a) MT17: Trichoderma sp, b) MH5: Curvularia sp, c) MT12: Fusarium sp d) MT11: Fusarium sp e) MT2: Fusarium sp f) MT6: Fusarium sp g) MT3: Curvularia sp, h) Curvularia sp.

4.3 Análisis estadístico

Para evaluar los halos de inhibición y/o el crecimiento de los endófitos en cultivo dual con el patógeno, se analizaron los resultados, teniendo en cuenta la comparación de las medias obtenidas en los triplicados (Figura 7), utilizando análisis de varianza y pruebas a posteriori de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05), mediante las herramientas que ofrece el programa de SPSS versión 25.

4.3.1 Análisis de medias del crecimiento de hongos endófitos de M. oleífera en cultivo

dual con P. palmarum.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 52

9,0 8,0 7,0 6,0

5,0 en en cultivo

a 4,0 Pestalotia palmarum endófitos de 3,0

M.oleifer 2,0

dualcon 1,0

Crecimiento Crecimiento in cm vitro( )de hongos 0,0

Hongos endofitos aislados

Figura 7. Análisis de medias de crecimiento de los hongos endófitos aislados de Moringa oleífera en antagonismo con P. palmarum in vitro. *Los nombres de los géneros fúngicos correspondientes a cada código, que se muestran en la tabla 2*

Como se observa en la Figura 7, inicialmente para seleccionar las mejores cepas de endófitos en el biocontrol del fitopatógeno, se consideraron los valores que se ubicaron por encima de la media promedio, para realizar el análisis de varianza y la prueba de Tukey.

4.3.2 Análisis de varianza ANOVA

Una vez realizado el análisis de media, se procedió a realizar el análisis de varianza como se muestra a continuación.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 53

Tabla 4.Análisis de varianza de los hongos que presentaron mayor capacidad antagónica ANOVA Grupos Repeticiones Suma Promedio Varianza MT17 3 23,5 7,833 0,083 MH5 3 22 7,333 0,333 MT12 3 18,5 6,167 0,583 MT11 3 18 6,000 0,750 MT2 3 15 5,000 0,250 MT6 3 14 4,667 0,083 MT3 3 14 4,667 0,083 MH2 3 13,5 4,500 0,250

Los códigos corresponden, MT17: Trichoderma sp, MH5, MT3 Y MH2: Curvularia sp, MT12 y MT2: Fusarium sp y MT11: Fusarium sp

Al realizar el análisis de varianza por los 8 grupos de hongos que obtuvieron mejor media, se obtuvieron la respectiva suma de sus cuadrados, los grados de libertad, el valor F, la probabilidad con el fin de identificar la significancia de los datos, como se muestra a continuación.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 54

Tabla 5.Análisis de varianza ANOVA Origen de Suma Grados Promedio F Probabilidad Valor las de de libertad de los crítico variaciones cuadrados cuadrados para F Entre 34,656 7 4,951 16,389 0,0000034 2,6572 grupos Dentro de 4,833 16 0,302 los grupos

Total 39,490 23

Al obtener el promedio de los cuadrados o cuadrado medio del error entre grupos se observa que el valor de F es 16,389 y es mayor al valor crítico para F (2,6572); por lo tanto, las medias difieren significativamente o existe diferencia significativa en el promedio de inhibición en los hongos.

Por lo tanto, se utilizó ANOVA, para que no se infle el error tipo 1, ya que el análisis se realizó por grupos y no por parejas. Al tener el nivel de significancia del 0,05 o nivel de confianza del

95%, como la probabilidad es de 0,0000034 y es menor que 0,05, la hipótesis nula se rechaza

“Los hongos endófitos de M. oleífera no tienen la capacidad de inhibir el fitopatógeno Pestalotia palmarum in vitro”, al menos un grupo el promedio es diferente.

4.3.3 Prueba Tukey

Para revisar los grupos que mostraron diferencias, se aplicó la prueba de Tukey, en primera medida hallamos el MSe o cuadrado del error medio dividiendo la suma de cuadrados entre los grados de libertad dentro de los grupos; el Multiplicador Qα lo hallamos a través de la tabla de valores críticos para la prueba Tukey (ver Anexo 2).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 55

Tabla 6.Pruebas a posteriori Tukey Codificació MT1 MH n fúngica 7 5 MT12 MT11 MT2 MT6 MT3 MH2 1,666 1,833 2,833 3,166 3,166 3,333 MT17 0,5000 7 3 3 7 7 3 1,166 1,333 2,333 2,666 2,666 2,833 MH5 7 3 3 7 7 3 0,166 1,166 1,500 1,500 1,666 MT12 7 7 0 0 7 1,000 1,333 1,333 1,500 MT11 0 3 3 0 0,333 0,333 0,500 MT2 3 3 0 0,000 0,166 MT6 0 7 0,166 MT3 7 MH2 Los códigos corresponden, MT17: Trichoderma sp, MH5, MT3 Y MH2: Curvularia sp, MT11, MT12 y MT2: Fusarium sp.

Los valores que se encuentran por encima del recuadro negro son la diferencia de las medias entre cada grupo; por lo tanto, los valores que causan diferencia significativa son aquellos que se encuentran subrayados en amarrillo, es decir MT17 y MH5 no tienen diferencia significativa, lo mismo pasa con los valores de MH5, MT12 y MT11; los valores de MT12 con MT11, MT2,

MT6 y MT3; los valores de MT11 con MT2, Mt6, MT3 y MH2; los valores de MT2 con: MT6,

MT3 y MH2; los valores de MT3 con MH2.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 56

4.4 Identificación de los hongos (género) con mayor capacidad antagónica

Las cepas microbianas, las estructuras y descripción de los hongos con mayor capacidad antagónica, se resumen en las figuras 8 y 9(Tabla 7).

c. a. b. d.

e. f. g. h.

Figura 8.Cepas de hongos endófitos de M. oleífera que presentan los mayores porcentajes de inhibición in vitro contra el fitopatógeno P. palmarum : a. Trichoderma sp. b. Curvularia sp. c. Fusarium sp. d. Fusarium sp e. Fusarium sp. f. Fusarium sp. g. Curvularia sp. h. Curvularia sp.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 57

a. b. c. d.

e. f. g. h.

Tabla 7.Descripción de los hongos endófitos aislados de M.oleífera con mayor capacidad antagónica a P. palmarum

Codificación Género Descripción Descripción Taxonomía fúngica fúngico Macroscópica Microscópica Presenta hifas hialinas septadas, conidióforos, fiálides Colonias que y conidios. Los División: crecen rápidamente y conidióforos Ascomycota esporulan en 3 días a Son ramificados y Clase: 25ºC en pueden Sordariomycetes , Agar papa- ocasionalmente Orden:Hypocreal dextrosa y Agar disponerse en forma es MT17 Trichoderma malta. Las colonias piramidal. Familia:Hypocrea sp son algodonosas al Las fiálides son en ceae inicio y luego se forma de botella compactan y unidas a los esporulan tomando conidióforos en color verde de textura ángulo recto. Las granular fiálides se formando parches observaron tanto concéntricos solitarias como

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 58

dispuestas en grupo. Las conidias miden entre 2,8 3,0 µm de diámetro aproximadamente de forma redonda u ovalada

Conidióforos División: Colonias: de erectos, de forma Ascomycota crecimiento recta, septados, Clase:Dothideom rápido, parecidas a conidios en sucesión ycetes MH5 Curvularia las de la gamuza, de simpodial. Conidios Orden:Pleosporal sp color negro, grisáceo. de forma semilunar, es redondeados en los Familia:Pleospora extremos marrón ceae pálido, De 3-tabiques. Colonias de El micelio está División:Ascomy crecimiento rápido , formado por hifas cota su micelio es aéreo , septadas y los Clase:Sordariomy MT12 Fusarium abundante, conidióforos cetes sp algodonoso y con presentan racimos de Orden:Hypocreal coloración variable macroconidias. es de blanco a rosado Familia:Nectriace durazno. ae División: Colonias de El micelio está Ascomycota crecimiento rápido , formado por hifas Subdivisión: MT11 Fusarium su micelio es aéreo , septadas y los Pezizomycotina sp abundante, conidióforos Clase:Dothideom algodonoso y con presentan racimos de ycetes color blanco. microconidias . Orden:Pleosporal es Familia:Pleospora ceae División:Ascomy Colonias de El micelio está cota MT2 Fusarium crecimiento rápido, formado por hifas Clase:Sordariomy sp su micelio es aéreo , septadas y los cetes abundante, conidióforos Orden:Hypocreal algodonoso y con presentan racimos de es coloración variable macroconidias. Familia:Nectriace de blanco a rosado ae durazno.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 59

Colonias de El micelio está División: crecimiento rápido, formado por hifas Ascomycota MT6 Fusarium su micelio es áereo , septadas y los Clase: sp abundante, conidióforos Sordariomycetes algodonoso y con presentan racimos de Orden:Hypocreal coloración variable macroconidias. es de blanco a rosado Familia:Nectriace durazno. ae

Colonias: de Conidióforos erectos, Curvularia sp crecimiento de forma recta, División:Ascomy rápido, parecidas a septados, conidios en cota MT3 las de la gamuza, de sucesión simpodial. Clase:Dothideom color negro verdoso. Conidios de forma ycetes semilunar, Orden:Pleosporal redondeados en los es extremos marrón Familia:Pleospora pálido, De 3-tabiques ceae

Conidióforos erectos, de forma recta, Colonias: de septados, conidios en División: crecimiento sucesión simpodial. Ascomycota MH2 Curvularia sp rápido, parecidas a Conidios de forma Clase: las de la gamuza, de semilunar, Dothideomycetes color marrón oscuro. redondeados en los Orden:Pleosporal extremos marrón es pálido, De 3-tabiques Familia:Pleospora ceae

Los hongos con mayor capacidad antagónica se identificaron como morfoespecies, hasta género, con las descripciones macroscópicamente y por los análisis microscópicos de las estructuras reproductivas de cada hongo, la identificación se realizó con el apoyo de las claves taxonómicas ya mencionadas. Los endófitos que presentaron actividad antagónica in vitro frente a P. palmarum fueron: MT17: Trichoderma sp, MH5, MT3 y MH2: Correspondiente a diferentes morfoespecies de Curvularia sp, MT11, MT12, MT2 Y MT6: Correspondiente a diferentes especies de Fusarium sp.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 60

Mosquera, et al., (2018), realizó el aislamiento de hongos endófitos de M. oleífera de diferentes tejidos de la planta, aislando diversas especies, las morfoespecies fúngicas similares con este trabajo fueron: Curvularia sp y Mycelia sterilia, demostrando que existe una biodiversidad de endófitos en esta especie de planta. Otros trabajos de endófitos con diferente especie de planta, han mostrado una baja biodiversidad de endófitos (Sánchez et al., 2013)

4.5 Evaluación de los mecanismos de antagonistas.

Los ocho hongos que presentaron mayor actividad antagónica frente al patógeno P. palmarum, mostraron tamaños de halos de inhibición significativos, expresados en diámetro (cm2) mayores a 5 cm2 de (Figura 6) y en porcentaje de inhibición de crecimiento del patógeno P. palmarum, por encima del 50% (Figura, 7), demostrando su tasa de crecimiento rápida y su actividad antagónica, la cual se resume en la Tabla 8. A excepción de Trichoderma sp que mostró

Micoparasitismo, verificado por el enrollamiento que mostraron sus hifas en el crecimiento micelial del patógeno P. palmaris en pruebas in vitro, todos los demás endófitos inhibieron al patógeno por “antibiosis” (Tabla 8).

En relación a Trichoderma sp, se pudo observar como sus hifas crecieron a una tasa que supero el crecimiento del patógeno, pudiéndose comprobar visualmente (ver anexo 3). Las especies del género Trichoderma sp son los antagonistas más utilizados para el control de enfermedades de plantas producidos por hongos Fitopatógenos, debido a su ubicuidad, a su facilidad para ser aisladas y cultivadas, a su crecimiento rápido en un gran número de sustratos ya que no atacan a plantas superiores. (Infante, et al., 2009). La actividad antagónica de cada una de las cepas seleccionadas, también fue confirmada mediante pruebas de enfrentamiento dual en cultivos modificados en lámina (ver anexo 3).

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 61

Tabla 8.Mecanismos de acción presentados entre los endófitos y el patógeno. Codificación Género Mecanismo de acción fúngica sobre Pestalotia palmarum M17 Trichoderma Micoparasitismo sp MH5 Curvularia sp Antibiosis MT12 Fusarium sp Antibiosis MT11 Fusarium sp Antibiosis MT2 Fusarium sp Antibiosis MT6 Fusarium sp Antibiosis MT3 Curvularia sp Antibiosis MH2 Curvularia sp Antibiosis

4.6 Prueba cualitativa de cocultivo de endófitos

Para esta prueba cualitativa se realizaron 56 tratamientos (Tabla 9), se logró enfrentar en varias combinaciones los ocho hongos que mostraron mayor actividad antagónica frente al patógeno

P. palmarum. Para estos tratamientos se consideraron combinaciones con dos diferentes morfoespecies de cada uno de los 8 endófitos seleccionados , los cuales se enfrentaron in vitro con el fitopatógeno en estudio. , El cocultivo se llevó a cabo en medios micológicos ,logrando evidenciar que todos los tratamientos realizados alcanzaron la inhibición del patógeno, en mayor o menor grado, sin embargo, no todos lograron un porcentaje de inhibición mayor en en relación a la acción de Trichoderma sp o de Curvularia sp. Un resultado evidente para mostrar en este trabajo consistió en que cuando se evaluaron en Cocultivo morfoespecies del mismo género por ejemplo Fusarium sp MT2 y Fusarium sp, MT12 frente al patógeno, o Curvularia sp

MH5 y Curvularia sp MH2 frente al patógeno, (Figura 10) se potenció la actividad antagónica de cada endófito, en comparación de la capacidad de antagonismo que ejerce la cepa del endófito aisladamente, cuando se enfrenta en cultivo dual con el patógeno, mostrando que el cocultivo podría favorecer a ciertas especies del mismo género para la inhibición del patógeno,

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 62 también se observó que en cocultivo, la inhibición de la esporulación del patógeno fue mayor, demostrando que en conjunto especies del mismo género ejercen acción sinérgica frente de P. palmarum. (Figura 10). Por el contrario, la cepa endófita de Trichoderma sp, no trabaja en cocultivo con los demás endófitos, demostrando su capacidad antagónica y su gran potencial para el control biológico.

En la tabla 10 se muestran los resultados de las 15 combinaciones de endófitos que mostraron la mayor inhibición del patógeno P. palmarum se muestra, en la columna de la izquierda la codificación del endófito utilizado en el ensayo y en cada una de las columnas de la derecha los tratamientos o combinaciones. Cabe resaltar que algunos hongos en la prueba de cultivo dual no tuvieron el mejor resultado, pero al colocarlo en crecimiento in vitro con otro hongo preferiblemente de su mismo género los resultados fueron los mejores.

Tabla 9.Tratamientos de hongos endófitos de M. oleífera ,utilizados en prueba de cocultivo contra P. palmarum. Tratamientos/Hong MT17 MH5 MT12 MT11 MT2 MT6 MT3 MH2 o vs vs vs vs vs vs vs vs 1 MT1 MH2 MT1 MT2 MT1 MT1 MT1 MH5 1 7 2 2 2 2 MT1 MT1 MT1 MH5 MH5 MH5 MH5 MT1 2 2 2 2 3 MT2 MT2 MT2 MH2 MH2 MH2 MH2 MT2 4 MH5 MT1 MH5 MT1 MT1 MT1 MT1 MT1 7 7 7 7 7 7 5 MH2 MT1 MH2 MT1 MT1 MT1 MT1 MT1 1 1 1 1 1 1 6 MH3 MT6 MT6 MT6 MT6 MT6 MT6 MT6 7 MH4 MT3 MT3 MT3 MT3 MT3 MT3 MT3

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 63

Tabla 10.Pruebas que potenciaron el antagonismo de P. palmarum en cocultivo con hongos endófitos Codificación Tratamientos fúngica 1 2 3 4 5 6 7 MT17 MH5 X X MT12 X X MT11 X X X MT2 X X MT6 X X MT3 X X MH2 X X

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 64

Figura 10.Prueba de cocultivo. Todas las figuras de la derecha muestran el anverso de los cocultivos y las figuras de la izquierda el reverso. a. MH5 Curvularia sp), y MH2 (Curvularia sp) en cocultivo. b) MT11 (Fusarium sp) y MT17 (Trichoderma sp). c). MT2(Fusarium sp) y MT12(Fusarium sp). En el centro de las cajas el patógeno.

Por su versatilidad, adaptabilidad y fácil manipulación, los hongos del género Trichoderma sp han sido estudiados y utilizados como fungicidas biológicos en la agricultura, son de crecimiento rápido y prolífico productor de esporas (Schuster y Schmoll, 2010) además, son conocidos como estimuladores de crecimiento en las plantas. Trichoderma sp es resistente y tolerante a diversos plaguicidas utilizados en la agricultura (Chaparro, Carvajal y Orduz, 2011), y es considerado como uno de los hongos más importantes en aplicaciones industriales y como bioplaguicida

(Shoresh, Harman y Mastouri 2010).

Los hongos endófitos son comúnmente aislados de diferentes tipos de plantas y utilizados como antagonistas, sin embargo, es escasa o nula la literatura en la que utilicen hongos endófitos aislados de Moringa oleífera como antagonistas para P. palmarum. Los resultados obtenidos en este trabajo son inéditos y por lo tanto pretenden servir como base para la continuación de los trabajos de control biológico que adelanta el grupo de investigación Microbiota de la UDES.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 65

5 Conclusiones

 En general, los hongos fitopatógenos foliares son una grave amenaza para la economía y

productividad de cultivos de interés agrícola como la palma aceitera, y también pueden

llegar a afectar la seguridad alimentaria mundial. Para contrarrestar estos patógenos, el

control biológico es una herramienta ecológicamente amigable.

 En este trabajo se aislaron ocho hongos endófitos de M. oleífera que mostraron actividad

antagónica in vitro contra Pestalotia palmarum, fitopatógeno foliar de la palma aceitera,

estos correspondieron a Trichoderma sp, 1 aislamientos, Curvularia sp 3 aislamientos y

Fusarium sp, 4 aislamientos, demostrando su potencial para la obtención de compuestos

bioactivos de utilidad en control biológico.

 Trichoderma sp, cepa MT17, fue el endófito que mostró mayor actividad antagónica para

P. palmarum por su tasa de crecimiento y micoparasitismo, este aislamiento se reporta

por primera vez en este trabajo como endófito de tallos de M. oleífera con un alto

porcentaje de inhibición en cultivo dual (87%), mostrando el gran potencial que tiene este

hongo en control de la Pestaloptiosis.

 Curvularia sp cepa MH5 es otro endófito de importancia que debe ser considerado en el

control de la Pestaloptiosis en este trabajo mostro inhibición del patógeno en un 81%

seguido de Trichoderma sp.

 Las pruebas de cocultivos con endófitos de M. oleífera para el control de P. palmarum

permitieron evidenciar mecanismos de Sinergismo entre diferentes especies, sin embargo,

los resultados de antagonismo no fueron mejores que las pruebas antagónicas del

patógeno en los ensayos de antagonismo dual.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 66

 La preselección in vitro de hongos endófitos con potencial biocontrolador frente a

fitopatógenos de interés en cultivos agrícolas de importancia económica, es el primer

paso para estudios posteriores y aplicaciones biotecnológicas en la obtención e

identificación de metabolitos secundarios activos.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 67

6 Bibliografía

 Agrios, G. (2005) Plant pathology, 5th edn. Elsevier Academic, USA Aly AH, Debbab A,

Kjer J, Proksch P.Fungal endophytes from higher plants: a prolific source of

phytochemicals and other bioactive natural products. Fungal Divers 41:1–16.

 Aldana, R., Aldana, J., Calvache, H. y Franco, P. (2010). Manual de plagas de palma de

aceite en Colombia. Cuarta edición. Convenio Sena - Cenipalma.

 Alfaro, N. y Martínez, W. (2008). Uso potencial de la moringa (Moringa oleífera, Lam).

Para la producción de alimentos nutricionalmente mejorados. Consejo Nacional de

Ciencia y Tecnología (CNCYT), Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología

(SENACYT).

 Anjorin, T., P, Ikokoh. and Okolo, S. (2010). Mineral composition of Moringa oleifera

leaves, pods and seeds from two regions in Abuja, Nigeria. International Journalof

Agriculture and Biology, 12: 431–43.

 Arakawa, Y., Murakami, M., Suzuki, K., Ito, H., Wacharotayankun, R., Ohsuka, S. y

Ohta, M. (1995). A novel integron-like element carrying the metallo-betalactamasegene

blaIMP. Antimicrobial agents and chemotherapy, 39: 1612-1615.

 Arnold, A. (2005). Diversity and ecology of fungal endophytes in tropical forests.

Biodiversity of fungi, their role in human life.

 Arnold, A., Henk, A., Eells R., Lutzoni F. y Vilgalys, R. (2007) Diversity and

phylogenetic affinities of foliar fungal endophytes in loblolly pine inferred by culturing

and environmental PCR.Mycologia 99(2):185–206.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 68

 Arnold, A., Mejía, L., Kyllo, D., Rojas, E., Maynard, Z., Robbins, N. y Herre, E. (2003).

Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropicaltree. Proceedings of the National

Academy of Sciences, 100(26), 15649-15654.

 Bacon, C. y Yates, I. (2006). Endophytic root colonization by Fusarium species:

histology, plant interactions and toxicity. Soil Biology.9: 133-152.

 Barrios, C. y Bustillo, A. (2014). Biología de la chinche de encaje Leptopharsa

gibbicarina y su control con hongos entomopatógenos. Ceniavances. 180:1-4.

 Barrios, C., Cuchimba, M. y Bustillo, A. (2015). Parámetros poblacionales de

Leptopharsa gibbicarina (Hemiptera: Tingidae) plaga de la palma de aceite. Revista

Colombiana de Entomología, 41(1): 1-4.

 Bary, A. (1866). Morphologir and physiologie der pilze, flecten and myximyceten.

 Bashan, Y. (1998). Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in

agriculture. Biotechnology advances, 16(4), 729-770.

 Benítez, T., Rincon, A., Limon, M. y Codon, A. (2004). Biocontrol mechanism of

trichoderma strainns, International Microbiology,7: 249-260.

 Buitrago, V. y Nieto, L. (1995). Fungi associated with spear and bud rots of oil palm

(Elaeis guineensis Jacq.) in the Colombian Oriental Plains.

 Calvache, H. (2001). Algunas consideraciones en el majeño de las plagas en el cultivo de

la palma de aceite. Palma, 12(1):29-37.

 Carmona, M., Zapata, R. y Wright, E. (1990). Mancha foliar del pindó (Arecastrum

romazoffianum) ocasionada por Pestalotpsis palmarum. - VII Jornadas Fitosanitarias

Argentinas. Libro de resúmenes. Ciudad de Salta.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 69

 Castro., M. (2014). El árbol Moringa (Moringa oleífera Lam.).: una alternativa renovable

para el desarrollo de los sectores económicos y ambientales de Colombia (Bachelor's

thesis, Universidad Militar NuevaGranada).

 Cenipalma. (2010). Plagas de la Palma de Aceite en Colombia. Bogotá, Colombia:

Cenipalma.

 Cenipalma. (2012). Guía de evaluación. Colombia: Cenipalma.

 Chandler, D., Bailey, A., Tatchell, G., Davidson, G., Greaves, J. y Grant, W. (2011). The

development, regulation and use of biopesticides for integrated pest management.

Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences, 366(1573),

1987-1998.

 Chaparro, A., Carvajal, H. y Orduz, S. (2011). Fungicide tolerance of Trichoderma

asperelloides and T. harzianum strains. Agricultural sciences, 2(3), 301-

 Chávez, D. (2004). Caracterización molecular de especies de Trichoderma. Trabajo de

grado, Microbiología agrícola y veterinaria.

 Chet, I, Viterbo, A., Brotman, y Lousky, T. 2006.Enhancement of plant disease resistance

by the biocontrol agent Trichoderma. Life Sciences. Weizmann Institute of Science.

 Chet, l., Inbar, J. y Hadar, L. (1997). Fungal antagonists and mycoparasites, in: eicklow

DT, soderstrom Bthe mycota lV: Enviromental and microbial relationships. Springer-

Verlag, Berlin.165-184.

 Duarte, S. (2007). Pruebas de patogenicidad in vitro con microorganismos aislados de

palmas afectadas por marchitez letal.

 Duke, J. (1983). Handbook of energy crops.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 70

 Echavarria, A., Regnault, H., Lisbeth, N., Matute, L., Jaramillo, C., de Astudillo, L. y

Benitez, R. (2016). Evaluación de la capacidad antioxidante y metabolitossecundarios de

extractos de dieciséis plantas medicinales/Evaluation ofantioxidant capacity and

secondary metabolites of sixteen medicinal plants extracts. Ciencia Unemi, 9(20), 29-35.

 Elliott. M., Broschat. T., Uchida, J. y Simone, G. (2004). Diseases and disorders of

ornamental palms. American Phytopathological Society, St. Paul.

 Escalante y otros. (2010). Diagnóstico y evaluación de Pestalotiopsis e insectos

inductores en plantaciones de palma aceitera al Sur del Lago de Maracaibo, Edo. Zulia

Venezuela. Bioagro, 22.

 Fedepalma. (2014). Sector palmero le apuesta a la conservación de la biodeversidad, de la

mano con el instituto Alexander von Humboldt y WWF.

 Gamboa, M. (2006). Hongos Endófitos tropicales: Conocimiento actual y perspectivas.

Bogotá: Universidad Nacional de Colombia.

 Gao, F. (2010). Mechanisms of fungal endophytes in plant protection against pathogens.

Microbiol Afr, 1346-1351.

 Genty, P., Garzón, A. y García, R. (2014). Daños y control del complejo Leptopharsa-

Pestalotiopsis en la palma africana. Fedepalma.

 Giménez, C. y Cabrera, R. (2009). Isolation and identification of endophytic fungi from

vascular plants. Journal of Chinese Materia Medica.

 Giusiano, G., Rodolfi, M., Mangiaterra, M., Piontelli, E., y Picco, A. (2010). Endophytic

fungi in medicinal plants of northeast of Argentina. I: Morphotaxonomic approach of

their foliar community. Boletín Micológico, 25: 15-27.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 71

 Gómez, A., López, C., Martínez, M. y Cachón, X. (2016). Caracterización morfológica

de hongos endófitos aislados de Hamelia patens Jacq. y Lantana camara L. de Chetumal,

Quintana Roo, México. Teoría y Praxis, (19): 33-44.

 Gómez, B. y Guerreo, W. (2007). Efecto de diferentes insumos y tipos de sombra sobre el

comportamiento de las principales plagas del cultivo del café.

 Gonzales, G. (2012). Caracterizacion cultural de Pestalotia. Fitopatología agrícola, 344.

 Guo, B., Dai, J., Ng, S., Huang, Y., Leong, C., Ong, W. y Carté, B. (2000). Cytonic acids

A and B: novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the endophytic fungus

Cytonaema species. Journal of Natural Products, 63(5), 602604.

 Harman, G., Howel, C., Viberto, A., Chet, l. y Lorito, M. (2004). Trichoderma species

opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature reviews 2:43-56.

 Hawksworth, D. L., & Lücking, R. (2017). Fungal Diversity Revisited: 2.2 to 3.8 Million

Species. Microbiology spectrum, 5(4).

 Henson, I. (1995). Impactos ambientales de las plantaciones de palma de aceite en

Malasia. Palmas, 16(4), 49-66.

 Hernández, E., Castillo, F., H., Herrera, R., Fuentes, S., Drouaillet, B. y Santillán, J.

(2016). Actividad antagónica de Trichoderma spp. sobre Rhizoctonia solani in

vitro. Investigación y Ciencia: de la Universidad Autónoma de Aguascalientes, (67), 5-

11.

 Howell, C. (2003). Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological

control of plant diseases: the history and evolution of current concepts. Plant disease,

87(1), 4-10.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 72

 Infante, D., Martínez, B., González, N., y Reyes, Y. (2009). Mecanismos de acción de

Trichoderma frente a hongos fitopatógenos. Revista de protección vegetal, 24(1), 14-21.

 Jiménez, O. y Reyes, R. (1977). Estudio de una necrosis foliar que afecta varias

plantaciones de palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq.) en Colombia. Fitopatología

Colombiana (Colombia) v. 6 (1) p. 15-32.

 Kusari, S., Pandey, S. y Spiteller, M. (2013). Untapped mutualistic paradigms linking

host plant and endophytic fungal production of similar bioactive secondary metabolites.

Phytochemistry, 91: 81-87.

 Labarca, M., Sanabria, N. y Arcia, A. (2006). Patogenicidad de Pestalotiopsis palmarum

Cooke, sobre plantas de vivero de palma aceitera (Elaeis guineensis Jacq.). Revista de la

Facultad de Agronomía, 23(4), 420-428.

 Li, J., Zhao, G., Chen, H., Wang, H., Qin, S., Zhu, W. y Li, W.(2008). Antitumour and

antimicrobial activities of endophytic streptomycetes from pharmaceutical plants in

rainforest. Letters in applied microbiology, 47(6), 574-580.

 Madar, Z., Solel, Z. y Kimchi, M. (1991). Pestalotiopsis canker of cypress in

Israel. Phytoparasitica, 19(1), 79-81.

 Maharachchikumbura, S., Guo, L., Chukeatirote, E., Bahkali, A. y Hyde, K. (2011).

Pestalotiopsis—morphology, phylogeny, biochemistry and diversity. Fungal

Diversity, 50(1), 167-187.

 Martín, C., Martín, G., García, A., Fernández, T., Hernández, E. y Puls, J. (2013).

Potenciales aplicaciones de Moringa oleifera. Una revisión crítica. Pastos y Forrajes,

36(2), 137-149.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 73

 Martínez, J., Herrera, A. y Román, L. (2011). Valoración de las propiedades nutricionales

de Moringa oleífera en el departamento de Bolívar. Revista de Ciencias, 15, 23-30.

 McQuilken, M. y Hopkins, K. (2004). Biology and integrated control of Pestalotiopsis on

container‐grown ericaceous crops. Pest Management Science: formerly Pesticide

Science, 60(2), 135-142.

 Méndez, G. (2000). Manejo integrado de pestalotiopsis en una plantación comercial de

palma de aceite. Integrated management of pestalotiopsis in a commercial oil palm

plantations.

 Mendieta, B. (2011). Moringa oleifera as an alternative fodder for dairy cows in

Nicaragua.

 Molano, L. (2011). LAS SEMILLAS DE Moringa Oleífera Lam. Universidad Industrial

de Santander, Bucaramanga, Departamento de Quimica, Monografia de Especialista en

Quimica Ambiental, 1-43.

 Molina, G., Pimentel, M., Bertucci, T. y Pastore, G. (2012). Application of fungal

endophytes in biotechnological processes. Chemical Engineering Transactions, 27.

 Mosquera Rivera, W. (2018). Actividad antimicrobiana de hongos endófitos de plantas

medicinales Mammea americana (Calophyllaceae) y Moringa Oleífera (Moringaceae).

 Mosquera, M., Gómez, P. y Bernal, P.(2007). Establecimiento de plantaciones

competitivas de palma de aceite en Colombia. Factores para considerar. Palmas vol. 28.

 Motta, D. (2004). Relación entre la nutrición del cultivo y la incidencia de la

pestalotiopsis de la palma de aceite en las zonas Norte y Central de Colombia. Revista

Palmas, 18-24.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 74

 Pirone, P. (1978). Diseases and pests of ornamental plants. John Wiley & Sons.

 Quiroz, V., Ferrera, R., Alarcón, A., Hernández, L. y Encarnación, M. (2008).

Antagonismo in vitro de cepas de Aspergillus y Trichoderma hacia hongos filamentosos

que afectan al cultivo del ajo. Revista mexicana de micología, 26, 27-34.

 Radovich, T. (2011). Farm and forestry production and marketing profile for Moringa

(Moringa oleifera). Specialty crops for Pacific island agroforestry.

 Rodrigues, K. (1994). The foliar fungal endophytes of the Amazonian palm Euterpe

oleracea. Mycologia, 86(3), 376-385.

 Royse, D. y Ries, S. (1978). The influence of fungi isolated from peach twigs on the

pathogenicity of Cytospora cincta. Phytopathology, 68(4), 603-607.

 Rubini, M., Silva, R., Pomella, A., Maki, C., Araújo, W., Dos Santos, D. y Azevedo, J.

(2005). Diversity of endophytic fungal community of cacao (Theobroma cacao L.) and

biological control of Crinipellis perniciosa, causal agent of Witches' Broom

Disease. International Journal of Biological Sciences, 1(1), 24

 Salgado, S. y Cepero, M. (2005). Aislamiento de hongos endófitos en rosa. Rosa hybrida,

Centro de Investigaciones Microbiológicas CIMIC, Departamento de Ciencias

Biológicas, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia.

 Sánchez, A. (1990). Enfermedades de la palma de aceite en América Latina. Revista

Palmas, 11(4), 5-38.

 Sánchez, R. (2013). Hongos endófitos: fuente potencial de metabolitos secundarios

bioactivos con utilidad en agricultura y medicina. TIP. Revista especializada en ciencias

químico-biológicas, 132-146.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 75

 Sánchez, R., Sánchez, B., Monserrat, Y., Ulloa, A., Armendáriz, B., García, M. y Macías,

M. (2013). Endophytic fungi: a potential source of bioactive secondary metabolites and

their application in agriculture and medicine.

 Sánchez, Y., Martínez, G., Sinagawa, S. y Vázquez, J. (2013). Moringa oleífera;

importancia, funcionalidad y estudios involucrados. Revista Científica de la Universidad

Autónoma de Coahuila, 5(9), 25-30.

 Santini, A., Ghelardini, L., De Pace, C., Desprez, M., Capretti, P., Chandelier, A., ... &

Hantula, J. (2013). Biogeographical patterns and determinants of invasion by forest

pathogens in Europe. New Phytologist, 197(1), 238-250.

 Schulz, B. y Boyle, C. (2006). What are endophytes? In Microbial root endophytes (pp.

1-13). Springer, Berlin, Heidelberg.

 Schuster, A., y Schmoll, M. (2010). Biology and biotechnology of Trichoderma. Applied

microbiology and biotechnology, 87(3), 787-799.

 Sousa, M. Tavares, R. Gerós, H. y Neto, T. (2004). First report of Hakea sericea leaf

infection caused by Pestalotiopsis funerea in Portugal.

 Steinberg, G. (2007). Hyphal growth: a tale of motors, lipids, and the

Spitzenkörper. Eukaryotic cell, 6(3), 351-360.

 Strobel, G. (2002). Rainforest endophytes and bioactive products. Critical reviews in

biotechnology, 22(4), 315-333.

 Strobel, G. y Daisy, B. (2003). Bioprospecting for microbial endophytes and their natural

products. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67(4), 491-502.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 76

 Tagne, A. y Mathur, S. (2001). First report of chlorotic spot of maize caused by

Pestalotiopsis neglecta: NEW DISEASE REPORT. Plant Pathology, 50(6), 791-791.

 Tovar, J. (2008). Evaluacioin de la capacidad antagonista "in vivo" de Trichoderma spp

frente al hongo fitopatógeno Rizoctonia solani. Bogota: Universidad Pontificia Javeriana.

 Tuset, J., Hinarejos, C. y Mira, J. L. (1999). First report of leaf blight on sweet

persimmon tree by Pestalotiopsis theae in Spain. Plant disease, 83(11), 1070-1070.

 Widden, P, (1997). In The Mycota IV: Environmental and Microbial relationships.

(ed.Wicklow, D. T. & Sönderström, B.). 135-147 (Springer-Verlang, Alemania, 1997).

 Wilson, D. (1995). Endophyte: the evolution of a term, and clarification of its use and

definition. Oikos, 274-276.

 Wright, E., Rivera, M. y Flynn, M. (1998). First report of Pestalotiopsis guepini and

Glomerella cingulata on blueberry in Buenos Aires (Argentina). EPPO Bulletin, 28(1‐2),

219-220.

 Xu, L., Kusakari, S., Hosomi, A., Toyoda, H. y Ouchi, S. (1999). Postharvest disease of

grape caused by Pestalotiopsis species. Japanese Journal of Phytopathology, 65(3), 305-

311.

 Zhang, Y., Maharachchikumbura, S. S., Tian, Q., & Hyde, K. D. (2013). Pestalotiopsis

species on ornamental plants in Yunnan Province, China. Sydowia, 65(1), 113-128.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 77

7 ANEXOS

7.1 Anexo 1

a. b.

Figura 1. Estructuras microscópicas y cultivo de P. palmarum. a) Conidias típicas asexuales de P.palmarum, mostrando cuatro septos, tres células centrales oscuras y una terminal hialina en cada extremo, con tres apéndices apicales y uno basal más corto. b) Cepa Fúngica de Pestalotia palmarum en agar papa-dextrosa.

7.2 Anexo 2

Tabla 1. Test de Tukey HSD= 1,554887009 b. Multiplicador= 4,9

Mse= 0,302083333

n= 3

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 78

7.3 Anexo 3

b. a.

c. d.

e. f.

Figura 2. Interacción de hifas de endófitos de M. oleífera con el patógeno, P.palmarum en prueba dual. a) MT17: Trichoderma sp, invadiendo toda la lámina e inhibiendo el crecimiento d. del patógeno b) MH5: Curvularia sp, mostrando halo de inhibición o antibiosis frente al patógeno, c) MT12: Fusarium sp mostrando halo de inhibición o antibiosis frente al patógeno d)

MT11 : Fusarium sp mostrando halo de inhibición o antibiosis frente al patógeno e) MT2: Fusarium sp mostrando halo de inhibición o antibiosis frente al patógeno f) Curvularia sp mostrando halo de inhibición frente al patógeno.

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 79

7.4 Anexo 4

10 9 8

7 resado resado en

´ 6 5 4

3 diametro (cm) diametro 2

1 Crecimiento ex Crecimiento 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Crecimiento fúngico en días

Trichoderma sp Patogeno

Figura 3. Velocidad de crecimiento de Trichoderma sp y de Pestalotia palmarum (patógeno)

en cultivo dual