Der Recessus Olfactorius Von Bombina Orientalis: Eine Vergleichende Analyse

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Der Recessus olfactorius von Bombina orientalis: Eine vergleichende Analyse

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Fachbereich 10, Mathematik und Naturwissenschaften Universität Kassel

vorgelegt von Sabrina Jordan

Kassel, im August 2017

Tag der Disputation: 13.12.2017 Gutachter/in: Dr. Christine Nowack Prof. Dr. Rüdiger Wagner Weitere Prüfungskommissionsmitglieder: Prof. Dr. Monika Stengl Prof. Dr. Kurt Weising Prof. Dr. Ulrich Kutschera Für Eva. Danksagung Ich möchte mich an dieser Stelle in aller Herzlichkeit bei all jenen bedanken, die mich während der Entstehungszeit dieser Dissertation begleitet haben. Zuerst danke ich Dr. Christine Nowack für ihre außerordentliche Unterstützung, die sowohl auf fachlicher als auch auf persönlicher Ebene stets konstruktiv, wertschätzend und partnerschaftlich ausfiel. Bei Prof. Dr. Rüdiger Wagner bedanke ich mich ganz herzlich für die bereitwillige Übernahme des Zweitgutachtens. Ich bedanke mich außerdem bei den Leiter/-innen und Mitarbeiter/-innen folgender Fach- und Forschungsgebiete für den kollegialen Austausch, die Zusammenarbeit und insbesondere für zur Verfügung gestellte Materialien und Arbeitsplätze: Zellbiologie unter Prof. Dr. M. Maniak, Tier- physiologie unter Prof. Dr. M. Stengl, Pflanzenphysiologie unter Prof. Dr. U. Kutschera, Biochemie unter Prof. Dr. F. Herberg und Didaktik der Biologie unter Prof. Dr. J. Mayer. Außerdem danke ich den Professor/-innen und ehemaligen Fachgebietsleiter/-innen, die bereits ihren wohlverdienten Ruhestand angetreten haben: Prof. Dr. M. Schäfer, Prof. Dr. H. Zöltzer und Prof. Dr. W. Nellen. Zudem danke ich der Universität Kassel für die Gewährung eines dreijährigen Promotionsstipendiums. Bei meinen Kolleginnen und Freundinnen Dr. Carolin Wittmer und Katrin Schröder möchte ich mich für die zahllosen Stunden bedanken, während derer wir miteinander gearbeitet, gelacht und nicht zuletzt literweise Kaffee, kiloweise Kuchen und das eine oder andere Eis verdrückt haben. Ihr habt die letzten Jahre um ein Vielfaches verschönert und maßgeblich zu meiner Ausdauer beigetragen. Meinem Partner Benjamin Rudolf danke ich für seine fortwährende Unterstützung, seine Liebe und Fürsorge insbesondere während der letzten, anstrengenden Monate. Meiner kleinen Tochter Eva danke ich für die nötige Ablenkung durch ihr Chaos, ihren Witz, ihre Kreativität und für ihre bedingungslose Liebe. Du bist mein Antrieb. Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:

Nowack, C., Jordan, S. und C. Wittmer. 2013. The Recessus Olfactorius: A Cryptic Olfactory Organ of Anuran Amphibians. In: M. L. East und M. Dehnhard (Hg.): Chemical Signals in Vertebrates 12. Springer New York; S. 37–48.

Vorträge:

Jordan, S. und C. Nowack. 2012. Show me yours – I'll show you mine! Lectinhistochemmical comparison of the olfactory epithelia of Bombina orientalis (Discoglossidae) and Xenopus muelleri (Pipidae). Deutscher Herpetologentag und SEH European Congress of Herpetology. Luxemburg und Trier.

Jordan, S. und C. Nowack. 2012. Comparative characterization of the Recessus olfactorius, a previously unregarded olfatory organ of anuran amphibians. Proteomics Day 2012/Kick-off Meeting Promotionskolleg „Funktionelle Analyse von Modifikationen an Makromolekülen“. Rothenburg a. d. Fulda.

Jordan, S. und C. Nowack. 2012. The olfactory organs of the frogs Bombina orientalis (Discoglossidae) and X. borealis (Pipidae) compared by lectin histochemistry. 105th Annual Meeting of the German Zoological Society und dem Symposium Olfaction across species and systems. Konstanz.

Jordan, S. und C. Nowack. 2013. The first steps: Presence and distribution of G protein α subunits in the three olfactory organs of the Clawed Frog Xenopus borealis. Functionomics Day 2013 (Promotionskolleg). Fuldatal.

Jordan, S. und C. Nowack. 2013. Presence and distribution of G protein alpha subunits in the three olfactory organs of the toad Bombina orientalis. 10th International Congress of Vertebrate Morphology. Barcelona.

Poster:

Jordan, S. und C. Nowack. 2012. Lectin histochemistry on the three olfactory epithelia of the toad Bombina orientalis (Anura, Amphibia) reveals a distinct staining pattern for the recessus olfactorius. 12th Meeting on Chemical Signals in Vertebrates (CsiV XII). Berlin. I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis...... IV

Abbildungsverzeichnis...... VI

Tabellenverzeichnis...... VIII

1 Zusammenfassung...... 1

2 Grundlagen...... 3

2.1 Allgemeine Biologie und Systematik der Anura...... 3 2.2 Die Geruchsorgane adulter Anura: Anatomie...... 6 2.2.1 „Normaler Typ“ mit Recessus olfactorius ...... 6 2.2.2 „Pipider Typ“ mit middle chamber epithelium...... 8 2.3 Die Geruchsorgane adulter Anura: Bau der Sinnesepithelien...... 9 2.3.1 Das Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans...... 10 2.3.2 Das vomeronasale Sinnesepithel...... 11 2.3.3 Der Recessus olfactorius...... 12 2.3.4 Das middle chamber epithelium (Pipidae)...... 13 2.4 Die nasalen Drüsen adulter Anura...... 13 2.5 Die Funktion der Geruchsorgane...... 14 2.6 Die Detektion olfaktorischer Stimuli...... 15 2.6.1 Perireceptor events...... 16 2.6.2 Olfaktorische Rezeptorproteine und -genfamilien...... 17 2.6.3 Coexpression von G-Protein-α-Untereinheiten und Duftstoffrezeptoren...... 20 2.6.4 Transduktion des Signals und Zielregion im Gehirn...... 21 2.7 Lektinhistochemie...... 23 2.8 Zielsetzung der vorliegenden Untersuchung...... 24

3 Material und Methoden...... 26

3.1 Tiermaterial...... 26 3.2 Paraffineinbettung und Anfertigung von Schnittserien...... 27 3.3 Histologische Übersichtsfärbungen...... 27 3.4 Aralditeinbettung und Anfertigung von Semidünnschnitten...... 28 II

3.4.1 Fixierung und Vorbereitung des Gewebes...... 28 3.4.2 Kontrastierung, Entwässerung und Einbettung in Kunststoff (Araldit)...... 29 3.4.3 Anfertigung und Färbung von Semidünnschnitten...... 29 3.5 Lektinhistochemie...... 30 3.5.1 Gewebevorbereitung und Durchführung der Färbung...... 30 3.5.2 Auswertung und Dokumentation...... 32 3.6 Immunhistochemie...... 34 3.6.1 Antikörper-Funktionstest...... 34 3.6.2 Immunmarkierung mit Anti-Gαolf, -Gαo und -Gαi2...... 35

4 Ergebnisse...... 38

4.1 Histologie der Geruchssinnesepithelien: Paraffinschnitte...... 38 4.1.1 Bombina orientalis...... 38 4.1.2 Xenopus borealis...... 40 4.2 Histologie der Geruchssinnesepithelien: Semidünnschnitte...... 42 4.3 Lektinhistochemie...... 46 4.3.1 Bombina orientalis...... 46 4.3.2 Xenopus borealis...... 61 4.4 Immunhistochemie...... 73 4.4.1 Antikörper-Funktionstest...... 73 4.4.2 Immunmarkierung mit Anti-Gαolf, -Gαo und -Gαi2...... 74

5 Diskussion...... 80

5.1 Morphologische Besonderheiten der Geruchsorgane...... 80 5.1.1 Basalzell-Subtypen im Hauptgeruchsorgan von B. orientalis...... 80 5.1.2 Kompartimente im Schleimfilm des Hauptgeruchsorgans von B. orientalis...... 81 5.1.3 Zellulärer Aufbau des Recessus olfactorius von B. orientalis...... 84 5.1.4 Vomeronasalorgan(e) und middle chamber epithelium...... 87 5.2 Lektinhistochemie...... 88 5.2.1 Vorbemerkungen...... 88 5.2.2 Zusammensetzung und Herkunft der nasalen Sekrete bei B. orientalis...... 88 5.2.3 Zusammensetzung und Herkunft der nasalen Sekrete bei X. borealis...... 92 5.2.4 Con A als Marker olfaktorischer Sinneszellen...... 94 5.2.5 RCA 120 als Marker für Olfactomedin...... 95 5.2.6 SBA und DBA, art- und nachweisabhängige Marker olfaktorischer Subsysteme...... 95 5.2.7 Möglichkeiten und Grenzen der Lektinhistochemie...... 97 III

5.3 Immunhistochemie...... 98 5.3.1 G-Proteinuntereinheiten im Geruchssystem von B. orientalis...... 98 5.3.2 G-Proteinuntereinheiten im Geruchssystem von X. borealis...... 100 5.4 Die Funktion des Recessus olfactorius...... 101 5.5 Die phylogenetische Beziehung von Recessus olfactorius und middle chamber epithelium...... 103

6 Ausblick...... 105

7 Literaturverzeichnis...... 107

Anhang...... i

Eidesstattliche Erklärung...... xvi IV

Abkürzungsverzeichnis In diesem Verzeichnis sind SI-Einheiten, deren Symbole sowie Zeichen und Kürzel chemischer Formeln nicht aufgeführt. Ebenso nicht enthalten sind im Duden zu findende Abkürzungen.

ABC Avidin-Biotin-Komplex (avidin-biotin-complex) ACIII Adenylatcyclase III AOB accessory olfactory bulb, akzessorischer olfaktorischer Bulbus AOG Anillinblau-Orange-G AP Alkalische Phosphatase APS Ammoniumperoxodisulfat aq. destT Destilliertes Wasser mit 0,5 % Triton® X-100 BCIP BCIP-T in DMF BCIP-T 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-Toluidiniumsalz BDMA Benzyldimethylamin B. orientalis Bombina orientalis BSA bovine serum albumin cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat CBB Coomassie-Brillant-Blau Con A Concanavalin A DAG Diacylglycerol DBA Dolichos biflorus Agglutinin DDSA Dodecenylbernsteinsäureanhydrid DMF Dimethylformamid EABA endogenous avidin binding activity Fuc Fucose Gal Galactose GalNAc N-Acetylgalactosamin Gl. Glandula Glc Glucose GlcNAc N-Acetylglucosamin Gm Glandula nasalis medialis (Jacobson'sche Drüse) Goi Glandula nasalis oralis interna GPCRs G protein-coupled receptors HG Hauptgeruchsorgan HIER heat-induced epitope retrieval, Hitzeinduzierte Antigen-Demaskierung HRP horseradish-peroxidase, Meerrettichperoxidase

IP3 Inositoltriphosphat KLSM Konfokales Laserscanning Mikroskop Man Mannose MCE middle chamber epithelium V

MOB main olfactory bulb, olfaktorischer Hauptbulbus N-CAM neural cell adhesion molecule NeuAc N-Acetylneuraminsäure NGS normal goat serum NRS normal rabbit serum OBPs odorant binding proteins OMP olfactory marker protein ORs Olfaktorische Rezeptoren OT Objektträger PBPs pheromone binding proteins PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphorbuffered saline) PBSM PBS mit Milchpulver versetzt PBST PBS mit 0,5% Triton X PBST20 PBS mit 0,05 % Tween® 20 PFA Paraformaldehyd PLC Phospholipase C PNA peanut Agglutinin PP Sörensenphosphatpuffer PVDF polyvinylidene difluoride PWS Phosphorwolframsäure RCA 120 Ricinus communis Agglutinin RO Recessus olfactorius RT Raumtemperatur SAB Säurealizarinblau SBA soybean Agglutinin SDS Natriumdodecylsulfat, sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis TAARs trace amineassociated receptors Tab. Tabelle(n) TEM Transmissionselektronenmikroskop UEA I Ulex europaeus Agglutinin v/v volume/volume VNO Vomeronasalorgan VNS vomeronasales Sinnesepithel V1R/V2R vomeronasale Rezeptoren von Typ 1/2 w/v weight/volume w/w weight/weight WGA wheat germ Agglutinin X. borealis Xenopus borealis XMEs xenobiotic metabolizing enzymes VI

Abbildungsverzeichnis Abbildung 2.1. Stark vereinfachte systematische Darstellung der Amphibien-Taxa, verändert nach (Frost et al. 2006)...... 4 Abbildung 2.2. Halbschematische Darstellung der rechten Hälfte eines Transversalschnitts durch den Kopf von Bombina variegata...... 7 Abbildung 2.3. Halbschematische Darstellung der linken Hälfte eines Transversalschnitts durch den Kopf von Xenopus laevis...... 9 Abbildung 2.4. Halbschematische Darstellung des Aufbaus vom Sinnesepithel des Haupt- geruchsorgans...... 10 Abbildung 2.5. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der drei Sinnesepithelober- flächen von B. orientalis...... 12 Abbildung 2.6. Duftstoffrezeptoren: Genfamilien und Rezeptorproteine von Wirbeltie- ren...... 18 Abbildung 2.7. Stark vereinfachte Darstellung der phylogenetischen Beziehungen zwischen Olfaktorischen Rezeptoren bei Xenopus...... 18 Abbildung 2.8. Halbschematische Darstellung des (Riech-) Hirns der Anura...... 22 Abbildung 3.1. Schematisch dargestellter Ablauf der Herstellung eines Glasmessers...... 30 Abbildung 3.2. Am KLSM aufgenommenes Bild, Recessus olfactorius von B. orientalis...... 33 Abbildung 4.1. Olfaktorische Sinnesepithelien von B. orientalis, Azanfärbung nach Pe- tersen...... 39 Abbildung 4.2. Middle chamber epithelium von X. borealis (A,B) im Vergleich zum Re- cessus olfactorius (C)...... 41 Abbildung 4.3. Hauptgeruchsorgan B. orientalis, Schnittdicke 0,5 μm...... 42 Abbildung 4.4. Zelltypen (1-5) im Recessus olfactorius, B. orientalis, Schnitt- dicke 0,5 μm...... 44 Abbildung 4.5. Vomeronasales Sinnesepithel, B. orientalis, Schnittdicke 0,5 μm...... 45 Abbildung 4.6. Querschnitt der Nasenregion von B. orientalis nach Lektinfärbung mit HRP-markiertem DBA...... 46 Abbildung 4.7. Geruchsorgane von B. orientalis nach Lektinfärbung mit rhodamingekoppeltem (links, Mitte) bzw. HRP-markiertem DBA (rechts)...... 47 Abbildung 4.8. Detaildarstellung der drei Geruchsepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit DBA-HRP...... 47 Abbildung 4.9. Olfaktorische Nerven und Riechhirn von B. orientalis...... 48 Abbildung 4.10. Laterale Nasendrüse von B. orientalis nach Behandlung mit DBA-HRP...... 49 Abbildung 4.11. Detaildarstellung der drei olfaktorischen Sinnesepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit Con A, fluoresceinmarkiert (linke Spalte) und HRP-gekoppelt (rechte Spalte)...... 50 Abbildung 4.12. Riechhirn von B. orientalis gefärbt mit Con A-Fluorescein...... 51 Abbildung 4.13. Jacobson’sche Drüse von B. orientalis nach Behandlung mit Con A- HRP...... 51 VII

Abbildung 4.14. Olfaktorische Sinnesepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit PNA-Fluorescein...... 52 Abbildung 4.15. Gewebeschnitte durch olfaktorische Bereiche von B. orientalis nach Lektin-färbung mit RCA 120...... 53 Abbildung 4.16. Gl. nasalis medialis (Jacobson’sche Drüse), behandelt mit RCA 120...... 54 Abbildung 4.17. Olfaktorische Sinnesepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit SBA-Fluorescein...... 54 Abbildung 4.18. Nerven und Hirn von B. orientalis nach Lektinfärbung mit SBA...... 55 Abbildung 4.19. Detailaufnahmen von Nebenhöhlenabschnitten von B. orientalis nach Be- handlung mit SBA...... 56 Abbildung 4.20. Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans von B. orientalis nach lektinhistochemischer Behandlung mit UEA I, Detailaufnahmen von rostral (A) nach caudal (F) sortiert...... 57 Abbildung 4.21. Olfaktorische Sinnesepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit WGA-Fluorescein (A, B, D, E) oder WGA-HRP (C)...... 58 Abbildung 4.22. Haupt- und akzessorischer Bulbus von B. orientalis nach Lektinfärbung mit WGA-Fluorescein (A,B) und WGA-HRP (C)...... 59 Abbildung 4.23. Laterale Nasendrüse und Flimmerepithel nach Lektinfärbung mit fluo- resceingekoppeltem WGA, B. orientalis...... 60 Abbildung 4.24. Unmarkierte olfaktorische Epithelien (Blindproben) von B. orientalis...... 60 Abbildung 4.25. Olfaktorische Sinnesepithelien von X. borealis nach Lektinfärbung mit DBA, HRP-markiert...... 62 Abbildung 4.26. Nervenbahnen und Gehirnabschnitte von X. borealis nach Lektinfärbung mit DBA, fluoreszenzmarkiert...... 63 Abbildung 4.27. Drüsengewebe von X. borealis nach Lektinfärbung mit DBA, fluoreszenzmarkiert...... 63 Abbildung 4.28. Sinnesepithelien von X. borealis, Lektinfärbung mit Con A-Fluorescein (A) bzw. -HRP (B,C)...... 64 Abbildung 4.29. Gehirnabschnitte von X. borealis nach Lektinfärbung mit Con A, fluoreszenzmarkiert...... 65 Abbildung 4.30. Drüsengewebe von X. borealis nach Lektinfärbung mit Con A, fluoreszenz-markiert...... 65 Abbildung 4.31. Nasenhöhlenbereiche von X. borealis nach Lektinfärbung mit PNA, fluoresceinmarkiert...... 66 Abbildung 4.32. Olfaktorische Sinnesepithelien von X. borealis nach Lektinfärbung mit RCA 120, fluoresceingekoppelt...... 67 Abbildung 4.33. Haupthöhle und assoziierte Drüsen von X. borealis nach Lektinfärbung mit RCA 120, fluoresceingekoppelt...... 68 Abbildung 4.34. Olfaktorische Sinnesepithelien von X. borealis nach Lektinfärbung mit SBA, fluoresceingekoppelt...... 68 Abbildung 4.35. Nervenbahnen und Gehirnabschnitte von X. borealis nach Lektinfärbung mit SBA, fluoreszenzmarkiert...... 69 VIII

Abbildung 4.36. Gewebeschnitte durch verschiedene mit dem Geruchssinn assoziierte Strukturen von X. borealis nach Lektinfärbung mit UEA I, fluoresceinmarkiert...... 70 Abbildung 4.37. Olfaktorische Sinnesepithelien von X. borealis nach Lektinfärbung mit WGA, fluoresceingekoppelt...... 71 Abbildung 4.38. Olfaktorische Sinnesepithelien von X. borealis nach Lektinfärbung mit WGA, fluoresceingekoppelt...... 72 Abbildung 4.39. Unmarkierte olfaktorische Epithelien (Blindproben) von X. borealis...... 72 Abbildung 4.40. Per SDS-PAGE aufgetrennte Proteine, CBB-Färbung...... 73 Abbildung 4.41. Immunmarkierte Western-Blots der lysierten Gewebeproben von B. orientalis und X. borealis...... 74 Abbildung 4.42. Detailaufnahmen der Geruchssinnesepithelien von B. orientalis nach Immunmarkierung mit Anti-Gαolf...... 75 Abbildung 4.43. Recessus olfactorius und Gl. intermaxillaris (Detail) von B. orientalis nach Immunmarkierung mit Anti-Gαi2...... 76 Abbildung 4.44. Detailaufnahmen der Geruchssinnesepithelien von B. orientalis nach Immunmarkierung mit Anti-Gαo...... 77 Abbildung 4.45. Detailaufnahmen immunmarkierter Sinnesepithelien von X. borealis: Gαolf, fluoreszierender Sekundärantikörper...... 78 Abbildung 4.46. Detailaufnahmen immunmarkierter Sinnesepithelien von X. borealis: Gαi2...... 78

Abbildung 4.47. Detailaufnahmen immunmarkierter Sinnesepithelien von X. borealis: Gαo, fluoreszierender Sekundärantikörper...... 79

Tabellenverzeichnis Tabelle 2.1. Co-expression von Duftstoffrezeptoren und G-Protein-α-Untereinheiten bei adulten Anura...... 21 Tabelle 3.1. Spezies, Herkunft und Anzahl der verwendeten Anura pro Untersuchungs- methode...... 26 Tabelle 3.2. Die in der vorliegenden Untersuchung eingesetzten Lektine...... 31 Tabelle 3.3. Die je Farbstoff eingesetzte Laserlinie sowie Intensitäten und Detektionsbe- reiche...... 33 Tabelle 4.1. Beobachtbare Zelltypen des Recessus olfactorius, B. orientalis...... 45 Tabelle 5.1. Zuckerreste der intranasalen sekretorischen Elemente bei B. orientalis zum Zeitpunkt der Fixierung...... 89 Tabelle 5.2. Zuckerreste der intranasalen sekretorischen Elemente bei X. borealis zum Zeitpunkt der Fixierung...... 92 1 Zusammenfassung 1

1 Zusammenfassung Hinter dem Begriff Recessus olfactorius (RO) verbirgt sich ein mit olfaktorischem Sinnesepithel bedeckter Bereich in der Nasenhöhle, welcher von vielen Froschlurchen (Anura) zusätzlich zum Hauptgeruchsorgan und Vomeronasalorgan ausgebildet wird. Bislang ist der Recessus olfactorius in der Literatur – mit zwei Ausnahmen (Jungblut et al. 2011; Nowack et al. 2013) – nur in Bezug auf seine äußere Form beschrieben worden. Die Zytoarchitektur des RO oder seine nervöse Anbindung an das Gehirn sind unbekannt, ebenso fehlen präzise Informationen bezüglich seiner Funktion. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde dieses geheimnisvolle Epithel mit histologischen und (immun-) histochemischen Methoden analysiert und einem eingehenden Vergleich mit dem Hauptgeruchsorgan (HG), dem Vomeronasalorgan (VNO) und dem middle chamber epithelium (MCE) unterzogen. Bei Letztgenanntem handelt es sich um ein olfaktorisches Sinnesepithel, das ausschließlich bei pipiden Fröschen wie X. borealis auftritt. Über die phylogenetische Beziehung von RO und MCE wurde in der Vergangenheit immer wieder diskutiert, eine Homologie wird von verschiedenen Autoren vermutet. Mithilfe von Semidünnschnittpräparaten ist es gelungen, den zellulären Aufbau des RO weiter zu entschlüsseln, dabei ließen sich morphologisch abgrenzbare Zelltypen darstellen. In Übereinstimmung mit den von Nowack et al. (2013) beobachteten luminalen Oberflächen- differenzierungen am RO kann davon ausgegangen werden, dass der RO sowohl über cilien- als auch mikrovillibesetzte olfaktorische Sinneszellen verfügt. Zudem sind offenbar zwei Stützzell- typen im RO vorhanden: zum einen sezernierende Stützzellen, die vermutlich mikrovillibesetzt sind, zum anderen cilientragende Stützzellen, denen möglicherweise eine Flimmerfunktion zukommt. Neben diesen vier Zelltypen wurden Basalzellen und ein derzeit nicht näher zu bestimmender Zelltyp beobachtet. Die Quelle der Schleimschicht, die den RO bedeckt, wurde mithilfe der lektinhistochemischen Untersuchungen identifiziert: Der Mucus setzt sich demzufolge aus Sekreten der sezernierenden Stützzellen des RO und der Glandula nasalis oralis interna zusammen. Darüber hinaus ließen sich interessante Unterschiede in der Zusammensetzung der Sekrete des RO, des Hauptgeruchsorgans und des Vomeronasalorgans beobachten. Es ist anzunehmen, dass diese Unterschiede sich auf die jeweiligen perireceptor events – also Prozessen, die extrazellulär vor oder nach der Interaktion der Duftmoleküle mit den Rezeptormolekülen stattfinden – auswirken. Denkbar wäre in diesem Kontext beispielsweise der Einsatz von odorant/pheromone binding proteins oder aber enzymatische (Abbau-) Prozesse. Die Färbung der Nervenbahnen der olfaktorischen Subsysteme von B. orientalis mit Lektinen ergab keine Unterscheidbarkeit. In diesem Zusammenhang wurde der offenbar nicht 1 Zusammenfassung 2 unerhebliche Einfluss des jeweiligen Nachweissystems auf die Färbeergebnisse thematisiert, mit dem Ergebnis einer klaren Empfehlung zur zukünftigen Verwendung von peroxidase- vermittelten Nachweissystemen. Darüber hinaus wurde die Speziesspezifität von Lektinbinde- mustern diskutiert und die Grenzen der Lektinhistochemie herausgearbeitet. Es wird der Schluss gezogen, dass sich diese Methode zur Beurteilung phylogenetischer Beziehungen zwischen Geruchsorganen nicht eignet.

Die Lokalisation der G-Proteinuntereinheit αo konnte immunhistochemisch ermittelt werden, die Antiseren gegen die Untereinheiten Gαolf und Gαi2 zeigten leider keine

Kreuzreaktivität mit dem Anurengewebe. Positive Gαo-Immunoreaktivität trat in erster Linie in den Zellfortsätzen des RO und des VNO auf. Gαo wird mit dem vomeronasalen Rezeptor Typ 2 (V2R) in Verbindung gebracht, weswegen die Daten auf die Expression dieser Rezeptorfamilie im RO und VNO deuten. Auf molekularer Ebene sollten die Sinnesepithelien also zur Wahrnehmung von wassergetragenen Stimuli, darunter Aminosäuren und Pheromone, befähigt sein. Außerdem wurde Gαo bei B. orientalis in den Axonen aller drei Sinnesepithelien beobachtet, hier wird eine Funktion im Zusammenhang mit axonalem Wachstum im Zuge von Regenerationsprozessen vermutet. Zusammengenommen grenzen die individuelle Zytoarchitektur, Mucuskomposition und

Ausstattung mit der G-Proteinuntereinheit αo den RO eindeutig funktionell gegen das Hauptgeruchsorgan ab, während offenbar größere Funktionsüberschneidungen mit dem Vomeronasalorgan bestehen: Die erhobenen Daten legen nahe, dass der RO, wie auch das VNO, sowohl die erwähnten wasserlöslichen, als auch luftgetragene Stimuli detektieren kann. Hier sollten weiterführende Studien anknüpfen, um potenzielle Unterschiede in den Aufgabenspektren der beiden Organe herauszuarbeiten. In einem abschließenden Vergleich wurden die erzielten Befunde in den Kontext der Frage nach der Homologie von RO und MCE gestellt. Es wurden Gemeinsamkeiten und Gegen- sätze beleuchtet, die allerdings in der Summe und in Anbetracht der nach wie vor unzurei- chenden Datenlage bezüglich des RO eine abschließende Beurteilung der Situation nicht zulassen. Denkbar wäre sowohl, dass die Geruchsorgane homolog sind und das MCE im Falle der Pipidae in Anpassung an die sekundär aquatische Lebensweise eine Änderung von Form und Funktion erfahren haben, als auch eine nicht-homologe und damit konvergente Entstehung der Organe. 2 Grundlagen 3

2 Grundlagen

2.1 Allgemeine Biologie und Systematik der Anura Anura (Froschlurche) gehören neben den Caudata (Schwanzlurche) und Gymnophiona (Blindwühlen) zum Taxon der Amphibien und stellen unter ihnen mit derzeit 7706 bekannten rezenten Spezies (abgerufen unter www.amphibiaweb.org; 03.08.2017) die weitaus artenreichste Gruppe dar. Amphibien verkörpern in der gegenwärtigen Fauna die ursprünglichsten Tetrapoden (Wehner und Gehring 2013), was sich in zahlreichen Merkmalen spiegelt. Entscheidend ist vor allem das Fehlen beschalter Eier und Embryonalhüllen, weswegen die Tiere an eine Fortpflanzung in aquatischer oder zumindest gewässernaher Umgebung gebunden sind. Zudem leben die meisten Angehörigen der Amphibien biphasisch, das heißt, nach einem aquatisch verbrachten Larvenstadium besiedeln die Adulti nach der Metamorphose einen terrestrischen Lebensraum. Dabei erfahren die Larven der Anura die umfassendsten Umwandlungen: Sie verlieren ihren Schwanz und ihre Kiemen, entwickeln Lungen, Vorder- und Hinterbeine und wechseln häufig von einer vegetarischen zu einer carnivoren Ernährung. Diese Verwandlung der Kaulquappen in Adulti wird oft mit der Rekapitulation des stammesgeschichtlichen Wasser- Land-Überganges verglichen (Kuhn und Thenius 1993; Kähler 2011; Wehner und Gehring 2013). Häufig erfährt diese urtümliche Lebensweise (Haas 2004; Hickman et al. 2008) allerdings Abwandlungen, beispielsweise indem Arten vollständig aquatisch leben (z. B. Xenopus, Pipa) oder sich direkt entwickeln (z. B. Anomaloglossus stepheni)(Pough 2016). Nicht unerwähnt bleiben soll, dass aus bisher nicht vollständig geklärten Ursachen ein weltweiter Arten- und Populationsrückgang der Amphibien bzw. Anuren verzeichnet wird (Stich- wort: Amphibienkrise, amphibian decline). Ein Grund für diesen Rückgang könnte eine erhöhte UV-B-Strahlung sein, welche in Zusammenhang mit der Ausdünnung der Ozonschicht steht und bewirkt, dass Eier durch die erhöhte Strahlung anfälliger für Pathogene sind (Kiesecker et al. 2001). Bekannt sind vor allem Infektionen mit Chytridpilzen (Batrachochytrium dendrobatidis), die neben den Larven auch adulte Tiere betreffen können und häufig zu letalen Hautkrankheiten führen. Der Chytridpilz hat seit den 1980er Jahren eine weltweite Epidemie ausgelöst und ist vermutlich für die Dezimierung oder sogar Auslöschung vieler Amphibienarten verantwortlich (Hickman et al. 2008). Auch die Klimaerwärmung und die damit in Zusammenhang stehende Schrumpfung von Gewässern, die wiederum zur Folge hat, dass die Eier in geringeren Wasser- tiefen abgelegt werden, erhöht den Einfluss von UV-B-Strahlen auf die Eier (Kiesecker et al. 2001; Hickman et al. 2008). Die wichtigste Ursache für den Rückgang der Artenzahlen und Populationsgrößen ist jedoch der Mensch. Der durch ihn hervorgerufene Verlust und die Ver- 2 Grundlagen 4 schmutzung von Lebensraum sind für über 90 % der Amphibienarten die größte Bedrohung (Duellman und Trueb 1994). Möglicherweise bieten detailliertere Kenntnisse über den Einfluss des Geruchssinnes auf das Verhalten von Anura auch Ansätze, die sich zukünftig tier- und naturschutzbezogen nutzen lassen. Die genauen verwandtschaft- lichen Beziehungen der Anuren-Taxa werden noch intensiv diskutiert, Einteilung und Nomenklatur der Familien sind umstritten und es sind mehrere Taxonomien parallel in Gebrauch (Grossenbacher 2012). Dies Abbildung 2.1. Stark vereinfachte systematische Darstellung der Amphibien-Taxa, verändert nach (Frost et al. 2006). liegt zum einen an beständig neu Anura und Caudata stellen ein Schwestertaxon der Gymnophiona dar. Innerhalb der Anura wird der Stammbaum erhobenen molekularen Daten und zum nur für diejenigen basalen Familien aufgeschlüsselt dargestellt, aus denen die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Spezies anderen an stetig neu beschriebenen stammen (s. u.). Arten. Die traditionelle systematische Gliederung der Anuren in sechs Unterordnungen erfolgte hauptsächlich aufgrund ihrer Wirbelform (Heusser 1993). Neben dieser und weiterer Systematisierungen wird vielfach der von Frost et al. 2006 aufgrund von umfassenden molekularen Untersuchungen überarbeitete Stammbaum (Abb. 2.1) akzeptiert. Demnach stellen die rezenten Amphibien insgesamt eine monophyletische Gruppe dar, innerhalb der die Gymnophiona als Schwestergruppe zu den Caudata und Anura zu sehen sind.

Die Chinesische Rotbauchunke, Bombina orientalis (Boulenger, 1882) Die Chinesische Rotbauchunke (Bombina orientalis; Boulenger 1882), mit einer Kopf- Rumpflänge von 32-55 mm eine vergleichsweise kleine Spezies, wurde in der Vergangenheit lange Zeit in die Familie der Scheibenzüngler (Discoglossidae) gestellt (Kuzmin 1995). Ford und Cannatella (1993) und Frost et al. (2006) ordnen die Gattung Bombina allerdings in eine eigene Familie, die Bombinatoridae ein (Abb. 2.1). Sie bilden demnach gemeinsam mit der Gattung Barbourula das Schwestertaxon zu den Alytidae (ehemals Discoglossidae sensu stricto; Ford und Cannatella 1993; Frost et al. 2006). Als Scheibenzüngler sensu lato besitzt B. orientalis eine rundliche, scheibenförmige Zunge, die bis auf einen schmalen Rand mit dem Mundboden verwachsen ist und zum Beutefang nicht herausgeschleudert werden kann (Cochran 1970). Die Tiere weisen eine hellgrüne, mit dunklen Flecken besetzte Körperoberfläche auf, die zudem mit spitzen Warzen bedeckt ist. Die Körperunterseite ist glatt und durch eine auffällige orange-rote Zeichnung auf einem dunklen 2 Grundlagen 5

Untergrund gekennzeichnet. Die Fingerspitzen sind ebenfalls leuchtend orange gefärbt. Männliche Rotbauchunken besitzen keine Schallblase und sind von den Weibchen vor allem während der Paarungszeit (Mai bis Mitte August) morphologisch zu unterscheiden, da sie während dieser Phase Klammerschwielen am 1. und 2. Finger ausbilden (Cochran 1970; Kuzmin 1995). Die eher nachtaktive B. orientalis kommt im nordöstlichen China sowie in Korea, Japan und Russland vor, wo die Art zumeist Waldgebiete in der Nähe von Seen, oder Sümpfe, Gräben und Pfützen besiedelt (Cochran 1970; Kuzmin 1995). Gegen Ende der Paarungszeit werden die sonst weitgehend aquatischen Tiere (Gollmann 2012) auch in größeren Entfernungen (300-400 m) von den Gewässern angetroffen. Die Winterruhe, die an Land verbracht wird, dauert etwa von Oktober bis April (Kuzmin 1995). Die Paarbildung scheint zufällig zu erfolgen, allerdings sollen Männchen beobachtet worden sein, die um Weibchen kämpfen. Die Eier werden in kleinen Ballen von den Weibchen unter Wasser an Pflanzen befestigt, Brutpflege wurde bisher nicht beschrieben. Chinesische Rotbauchunken erreichen ein Alter von bis zu 13 Jahren (Heusser 1993; Kuzmin 1995).

Der Gelbgefleckte Krallenfrosch Xenopus borealis (Parker, 1936) Der Gelbgefleckte Krallenfrosch (Xenopus borealis; Parker, 1936) wird in die Familie der Pipidae (Zungenlose) eingeordnet. Gemeinsam mit den Rhynophrynidae bilden die Pipidae die Klade Xenoanura und werden zusammen mit allen übrigen Fröschen den Leiopelmatidae als Schwestergruppe gegenübergestellt (Abb. 2.1) (Ford und Cannatella 1993; Frost et al. 2006). Es handelt sich somit um eine basale Spezies, ähnlich der zuvor beschriebenen Art B. orientalis, die jedoch starke Spezialisierungen aufweist (s. u.). X. borealis erreicht eine Körperlänge von 50-80 mm, wobei die Männchen in der Regel kleiner sind als weibliche Artgenossen. Die Tiere besitzen glatte, olivfarbene bis braune Haut, die dunkel marmoriert ist. Als vollständig aquatisch lebende Spezies besitzt X. borealis ein Seitenlinienorgan. Dieses zieht nahtförmig über den abgeflachten, stromlinienförmigen Körper und bildet um die Augen herum auffällige Kreise (Harper et al. 2010). Ein charakteristischer Augententakel am inneren Augenwinkel der Tiere dient vermutlich als Tastorgan. Eine weitere Besonderheit stellen die namensgebenden drei schwarzen Krallen an den inneren Zehen der Hinterläufe dar. Diese nutzt X. borealis wahrscheinlich zum Wühlen im Bodengrund. Der dabei aufgewirbelte Schlamm soll je nach Gegebenheit sowohl der Feindabwehr dienen, als auch Nahrung zutage fördern (Cochran 1970). Nahrung wird von den Zungenlosen entweder eingesaugt oder unter Zuhilfenahme der Vorderextremitäten, die ebenfalls zum Graben genutzt werden können, in den Mund geschoben bzw. gestrudelt. Als Mahlzeit dient den Fröschen prinzipiell alles Tierische, das sie im Wasser vorfinden, inklusive der eigenen Jungtiere (Cochran 2 Grundlagen 6

1970; Measy et al. 2009). Gelbgefleckte Krallenfrösche leben in den Wäldern des kenianischen Hochlands und angrenzender Gebiete, wo sie in Tümpeln und sogar in kleinen Brunnen vorgefunden werden. In Ausnahmefällen, z. B. während heftiger Regenfälle, oder wenn sein Teich austrocknet, kann X. borealis sich auch an Land fortbewegen, wobei die Bewegungsweise als „unsicheres Herumplumpsen“ (Measy et al. 2009) bezeichnet wird. Während der Paarungszeit, die mit der Regenzeit beginnt, entwickeln die Männchen Brunftschwielen an den Vorderextremitäten, während bei den Weibchen die Genitalregion anschwillt und sich pink verfärbt. Die als sehr territorial beschriebenen Männchen kämpfen miteinander und rufen unter Wasser nach den Weibchen. Schließlich wird ein Weibchen umklammert und Eier werden einzeln in der Vegetation abgelegt (Harper et al. 2010). Brutpflege wird nicht beschrieben (Cochran 1970).

2.2 Die Geruchsorgane adulter Anura: Anatomie Das Geruchssystem der adulten Anura lässt sich nicht völlig pauschal beschreiben. Von einem relativ konsistenten Grundbauplan, welcher bei den allermeisten Vertretern der Froschlurche vorgefunden wird, existieren Abweichungen bzw. Spezialisierungen, die zum Teil sogar erst in jüngster Zeit beschrieben wurden (Junk et al. 2014; Nowack und Vences 2016). Grundsätzlich ist, wie bei den meisten Vertebraten, ein duales olfaktorisches System vorhanden. Die dazugehörigen Elemente sind das eigentliche olfaktorische System oder Hauptgeruchsorgan und das akzessorische olfaktorische oder vomeronasale System (auch Jacobson’sches Organ)(Cuvier 1811; Scalia 1976; Trotier und Døving 1998). Die beiden in der vorliegenden Arbeit untersuchten Spezies, B. orientalis und X. borealis, sind darüber hinaus mit weiteren Geruchsuntersystemen ausgestattet, namentlich dem Recessus olfactorius bzw. dem „middle chamber epithelium“ (Föske 1934; Rowedder 1937; Helling 1938; Paterson und Hindle 1951; Altner 1962; Nowack 2008).

2.2.1 „Normaler Typ“ mit Recessus olfactorius Der Geruchssinn aller adulter Anura ist in paarigen, bilateral symmetrischen Nasenhöhlen (Cavitas nasi) lokalisiert (Gaupp 1904). Die Nasenhöhlen werden durch eine knorpelige oder teilweise verknöcherte Nasenkapsel umhüllt und gestützt (Duellman und Trueb 1994; Haas 2004). Normalerweise (Ausnahme Pipidae; s. u.) unterteilt sich das Cavum nasi im Wesentlichen in eine luftgefüllte große Haupthöhle (Cavum principale) und eine darunterliegende, mit Flüssigkeit gefüllte, Nebenhöhle (Abb. 2.2) (Seydel 1895; Døving et al. 1993; Døving und Trotier 1998; Nowack und Wöhrmann-Repenning 2010). 2 Grundlagen 7

Das dorsal liegende Cavum principale kommuniziert anterior über die äußere Nasenöffnung nach außen und posterior über die innere Nasenöffnung mit der Mundhöhle. Dabei kann sich das Cavum principale mehr oder weniger weit in anteri- orer oder posteriorer Richtung über diese Öffnungen hinauswölben und so eine orale bzw. caudale Kuppel bilden (Gaupp 1904; Matthes 1934; Helling 1938; Michael 1961). Am Boden der ansonsten annähernd runden Haupthöhle befindet sich im Abbildung 2.2. Halbschematische Darstellung der rechten Hälfte eines Transversalschnitts durch den Kopf von caudalen Abschnitt eine prominente Bombina variegata. Dargestellt wird die Situation der Nasenhöhle caudal der Apertura nasalis externa auf Höhe Aufwölbung, die sogenannte Eminentia des Recessus olfactorius. Ci: Cavum inferius; Cm: Cavum medium; Co: Cavum oris, olfactoria. Die Eminentia olfactoria erreicht Mundhöhle; Cp: Cavum principale; FE: Flimmerepithel; ihren höchsten Punkt etwa auf Höhe der Goi: Glandula nasalis oralis interna; Ro: Recessus olfactorius; SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans; Choane und verstreicht in Richtung der vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstab: 250 µm. Verändert nach (Slabbert 1945). oralen bzw. caudalen Kuppel (Mihalkovics 1898; Gaupp 1904; Matthes 1934; Helling 1938; Michael 1961). Die Nasenhaupthöhle wird, mit Ausnahme weniger Bereiche (z. B. Recessus olfactorius, s. u.), beinahe vollständig von dem Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans ausgekleidet. Dabei wird die sensorische Oberfläche durch die eben erwähnte Eminentia olfactoria, welche gleichzeitig oftmals der Sitz von besonders dickem Sinnesepithel ist, stark vergrößert. Die äußere Nasenöffnung (Apertura nasalis externa) liegt dorsolateral vorn am Kopf der Anura und mündet über ein als Vestibulum (Vorhof) bezeichnetes Areal in die Haupthöhle. Dort, im Bereich der Apertura nasalis externa und angrenzend an den Vorhof, befindet sich bei vielen Fröschen ein gesonderter mit Sinnesepithel bedeckter Bereich, der Recessus olfactorius (RO) (Rowedder 1937; Helling 1938; Nowack 2008); darüber hinaus ist vielfach auch der Ausdruck recessus ventromedianus cavi principalis (Du Toit 1930, 1933, 1943; Slabbert 1945; Michael 1961) in Gebrauch. Wie der Name impliziert, bildet der RO (artabhängig) eine mehr oder weniger flache Mulde oder schiebt sich caudad sogar blindsackförmig unter das Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. In medialer Richtung grenzt der RO an das Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, von welchem er sich bei manchen Spezies durch einen schmalen Streifen nichtsensorischen Epithels, wenigstens jedoch durch die Mündung der Glandula nasalis oralis 2 Grundlagen 8 interna (s. u.) abhebt (Rowedder 1937; Helling 1938; Du Toit 1943; Slabbert 1945; Michael 1961; Nowack 2008; Jungblut et al. 2011). Die Fläche, die der RO einnimmt, kann in ihrer Größe insgesamt variieren, so gibt Helling (1938) bei von ihm untersuchten Arten Flächenanteile zwischen 5 % und 21,3 % der Haupthöhlenlänge an. Die Nasennebenhöhle liegt unterhalb des Cavum principale und untergliedert sich in der Regel in zwei mit der Haupthöhle sowie untereinander verbundene Kammern: das Cavum medium und das Cavum inferius. Das Cavum inferius, die unterste Kammer, lässt sich funktionell in zwei Abschnitte unterteilen, einen medio-rostralen und einen latero-caudalen Anteil. Diese Komponenten sind in Abhängigkeit von der untersuchten Spezies mehr oder weniger deutlich voneinander abgrenzbar (Gaupp 1904; Helling 1938). Der medio-rostrale Abschnitt (Recessus medialis) beherbergt bei den meisten Arten das bereits erwähnte Vomeronasalorgan (Gaupp 1904; Helling 1938; Duellman und Trueb 1994). Bei der im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten Art B. orientalis liegen der Recessus medialis und damit das vomeronasale Sinnesepithel im Unterschied zu den meisten anderen Arten eher rostro-lateral als medial. Die übrigen Abschnitte des Cavum inferius sind mit Flimmerepithel ausgekleidet. Das zwischen Cavum principale und Cavum inferius liegende Cavum medium stellt im Prinzip eine mit Flimmerepithel ausgekleidete Verbindung zwischen den beiden olfaktorischen Nasenräumen dar. Es bildet rostral einen kleinen Blindsack aus und geht caudal nach unten absteigend in das Cavum inferius über. Zudem mündet der Tränennasengang (Ductus nasolacrimalis) in das Cavum medium (Born 1876; Gaupp 1904; Helling 1938).

2.2.2 „Pipider Typ“ mit middle chamber epithelium Ähnlich der oben für den „normalen Typ“ beschriebenen Situation verfügen Pipidae über paarige, bilateralsymmetrische Nasenhöhlen, die in eine knorpelige Nasenkapsel eingebettet sind. Ansonsten unterscheidet sich ihre intranasale Anatomie, besonders deutlich die Nasennebenhöhlen betreffend, stark von der aller übrigen Anuren (Abb. 2.3; Jurgens 1970). Das Cavum principale weicht in seiner Gestalt von oben beschriebenem Typus hauptsächlich durch das Fehlen der Eminentia olfactoria ab. Auch bei den Pipidae ist die Haupthöhle weitestgehend mit dem Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans bedeckt (Föske 1934). Wesentlich komplizierter aufgebaut ist derjenige Teil der Nasennebenhöhle, der dem Cavum medium entspricht (Paterson und Hindle 1951). Das Cavum medium liegt bei Pipidae lateral der Haupthöhle und wird von dieser im Bereich der äußeren Nasenöffnung durch eine Klappenstruktur abgetrennt. Das Cavum medium wird weiterhin grob in einen dorsalen und einen ventralen Abschnitt untergliedert, zudem tritt ein mittlerer Blindsack auf (Föske 1934). An vielen Stellen verkompliziert sich der Bau der Nebenhöhle durch einziehende Epithelfalten, 2 Grundlagen 9

wodurch zahlreiche weitere Blindsäcke entstehen. In der Nebenhöhle befindet sich neben Flimmerepithel auch sensorisches Epithel, das als middle chamber epithelium bezeichnet wird (Föske 1934; Saito und Taniguchi 2000). Der Tränennasengang mündet in den caudalen Blindsack des dorsalen Abschnitts des Cavum medium, ausgehend von der Spitze des Röhrententakels des Auges (Föske 1934).

Abbildung 2.3. Halbschematische Darstellung der linken Das Cavum inferius weist Hälfte eines Transversalschnitts durch den Kopf von demgegenüber einen vereinfachten Bau auf. Xenopus laevis. Dargestellt wird die Situation der Nasenhöhle caudal der Apertura nasalis externa auf Höhe Es befindet sich ventral des Grenzbereichs des rostralen Endes des Vomeronasalorgans bei einem jungen Frosch. von Cavum medium und Cavum principale Cm: Cavum medium; Co: Cavum oris; Cp: Cavum principale; Goi: Glandula nasalis oralis interna; MCE: middle und formt rostral einen Blindsack, der chamber epithelium; SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchs- organs; vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstab: weiter posterior direkt in das Cavum 250 µm. Verändert nach (Paterson 1939). principale mündet. Die Mündungszone verläuft dabei rinnenförmig und laterad versetzt am Boden der Haupthöhle bis zur Choane. Das Cavum inferius kommuniziert also nicht direkt mit dem Cavum medium. Außerdem ist das Cavum inferius fast vollständig mit vomeronasalem Sinnesepithel ausgekleidet (Föske 1934; Helling 1938).

2.3 Die Geruchsorgane adulter Anura: Bau der Sinnesepithelien Grob setzen sich Riechschleimhäute aus dem eigentlichen olfaktorischen Sinnesepithel und der darunterliegenden Lamina propria mucosae zusammen. In der Lamina propria mucosae liegen, eingebettet in Bindegewebsanteile, unter anderem Pigmentzellen, z. T. Drüsenkörper von Bowman’schen Drüsen (s. u.), ferner Bündel aus olfaktorischen Axonen und die sie umgebenden Schwannzellen. Darüber hinaus sind Blut- und Lymphgefäße sowie Zellen, die an Immun- und Entzündungsprozessen beteiligt sind, vorhanden (Getchell et al. 1984b; Ding und Xie 2015). Die eigentlichen Riechepithelien der Wirbeltiere bestehen grundsätzlich aus drei Zell- typen, nämlich den Riechsinneszellen (olfaktorische Neurone) sowie den Stütz- und Basalzellen (Moulton und Beidler 1967). Aus diesen Zelltypen wird ein mehrreihiges hochprismatisches und unverhorntes Epithel aufgebaut, das unterschiedliche Oberflächendifferenzierungen, wie zum Beispiel Cilien und Mikrovilli, aufweist. Dabei bilden die Stützzellen ein Palisadengewebe, in das die Riechsinneszellen eingebettet sind (Andres 1975). Bei Anura unterscheiden sich die 2 Grundlagen 10 verschiedenen Sinnesepithelien (z. B. die Epithelien des Hauptgeruchsorgans und des Vomeronasalorgans) in ihrem Feinbau deutlich voneinander.

2.3.1 Das Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans Wie bereits erwähnt, kleidet das Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans (Abb. 2.4) bei Anura den überwiegenden Teil des luftgefüllten Cavum principale aus. Es besitzt eine durch- schnittliche Höhe von 150-200 µm, wobei es im Bereich der Eminentia olfactoria häufig besonders dick ist (Graziadei 1971). Zusätz- lich zu den oben genannten Zelltypen zeichnet sich das Hauptgeruchsorgan der Tetrapoden durch die Anwesenheit von Bowman’schen Drüsen (Glandulae olfactoria) bzw. deren Gangzellen aus (Scalia 1976; Doty 2015). Diese röhren- oder schlauchförmigen Einzel- drüsen liefern ein seröses Sekret, das zudem

Mukopolysaccharide enthält (Graziadei 1971). Abbildung 2.4. Halbschematische Darstellung des Auf- Typischerweise entsteht durch die baus vom Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. A: Axon; BM: Basalmembran; BZ: Basalzelle; C: Cilien; spezifische Anordnung der Stütz-, Sinnes- und D: Dendrit; EK: Endknöpfchen; Fo: Fila olfactoria; MV: Mikrovilli; OR: olfaktorische Rezeptorzelle; S: Stütz- Basalzellkerne eine gewisse optische zelle; SZ: Schwannzelle; TF: Terminalfilm. Verändert nach (Andres 1966). Zonierung des Epithels. So lässt sich in der Regel unterhalb der distalen Zellgrenzen ein zellkernfreier Bereich beobachten, an den eine Reihe von mehr oder weniger auf einer Höhe liegender, eher länglich-oval geformter Stütz- zellkerne anknüpft. Darunter liegen die rundlichen Kerne der Neuronen in mehreren unregelmäßigen Reihen, gefolgt von den rundlichen oder senkrecht zum Epithel länglich geformten Zellkernen der Basalzellen (Graziadei 1971). Bei den olfaktorischen Sinneszellen handelt es sich um bipolare Neuronen. Ihre apikalen, dendritischen Enden sind knopfartig verdickt und ragen etwas über die Oberfläche des Sinnesepithels hinaus (Abb. 2.4; 2.5). Diese Endknöpfchen (auch olfaktorische Vesikel genannt) tragen zwischen fünf und zwanzig Cilien, die bei Amphibien beweglich sind und eine Länge von etwa 200 µm erreichen (Reese 1965). Die wegen ihrer Länge auch als Riechhaare bezeichneten Cilien liegen unregelmäßig-netzartig, parallel zur Oberfläche in einen Schleimfilm (Terminalfilm) eingebettet, zu dessen Verteilung sie beitragen (Andres 1975); sie sind zudem der 2 Grundlagen 11

Ort der chemisch-elektrischen Signaltransduktion (s. u.). Proximal des Endknöpfchens folgt der schmale Dendrit, dessen Länge von der Position des Perikaryons abhängt. Der Zellkörper wird fast vollständig von dem annähernd kreisrunden Nucleus ausgefüllt; oberhalb und unterhalb des Nucleus befinden sich konische Bereiche, die jeweils nach proximal bzw. distal spitz zulaufen. Hierin liegt supranucleär ein besonders kräftiger Golgi-Apparat, begleitet von rauem und glattem endoplasmatischem Retikulum (Graziadei 1971). Unterhalb des Zellkerns jedes Neurons entspringt ein unmyelinisiertes Axon. Die Axone treten in kleinen Gruppen (sogenannte Fila olfactoria) an der Basis des Epithels durch die Basalmembran, wo sie von Schwannzellen umfasst werden. In posteriorer Richtung verschmelzen die Nervenfaserbündel zu immer größeren Paketen und formen schließlich den Nervus olfactorius (s. u.), welcher zum olfaktorischen Hauptbulbus zieht (Scalia 1976). Die Stützzellen des Hauptgeruchsorgans sind bei Anuren, anders als die Riech- sinneszellen, an ihrem apikalen Ende mit Mikrovilli besetzt (Abb. 2.5). Stützzellen haben eine säulenartige Form und erstrecken sich vertikal von der Epitheloberfläche bis zur Basallamina, welche sie mit fingerförmigen Fortsätzen erreichen. Stützzellen üben sekretorische Funktionen aus, was sich in zahlreichen distal gelegenen Sekretvesikeln widerspiegelt; teilweise füllen die Vesikel den supranucleären Raum fast vollständig aus. Demzufolge findet sich in Stützzellen reichlich raues und glattes endoplasmatisches Retikulum (Graziadei 1971). Zu den sezernierten Produkten zählen Enzyme, die körperfremde Bestandteile abbauen können; auch haben die Zellen phagozytotische Funktion (Doty 2015). Zudem schirmen die Stützzellen, vergleichbar mit Schwannzellen, die Sinneszellen voneinander ab, wenn auch nicht vollständig (Moulton und Beidler 1967; Graziadei 1971; Andres 1975). Die Basalzellen liegen im Epithel proximal der Basallamina an und haben keinen Kontakt zur Oberfläche des Epithels. Sie haben eine meist rundlich-prismatische Form, wobei ihre Gestalt, ebenso wie ihre Ausstattung mit Organellen, sehr variabel sein kann (Graziadei 1971). Sie besitzen Stammzellcharakter und sind die Vorläuferzellen der kurzlebigen Riechsinneszellen, welche ein Alter von 4-8 Wochen erreichen, bevor sie absterben und ersetzt werden. Auch Stützzellen werden ersetzt und gehen aus Basalzellen hervor (Andres 1975).

2.3.2 Das vomeronasale Sinnesepithel Das vomeronasale Sinnesepithel (VNS) im Cavum inferius unterscheidet sich – trotz vieler Übereinstimmungen in der allgemeinen Architektur – in einigen wesentlichen Punkten von dem Riechepithel der Haupthöhle. Zum einen ist das Vomeronasalorgan flüssigkeitsgefüllt (Broman 1920; Døving et al. 1993; Nowack und Wöhrmann-Repenning 2010). Zum anderen ist das VNS insgesamt dicker und bildet andere Oberflächendifferenzierungen aus: Die sensorischen Neurone 2 Grundlagen 12 tragen an Stelle von langen Cilien einen dichten Besatz außergewöhnlich langer Mikrovilli, die Stützzellen hingegen tragen kürzere, senkrecht angeordnete Cilien, welche zur Bewegung der Flüssigkeit beitragen (Abb. 2.5; Graziadei 1971; Andres 1975). Die sensorischen Neurone ähneln sich, nur sind ihre Dendriten länger und zum Teil etwas gewunden, ihre Endknöpfchen sind kleiner und weniger prominent und sie enthalten weniger Mitochondrien (Graziadei 1973). Außerdem ziehen die Afferenzen (Axone) der sensorischen Neurone des VNS nicht zum Bulbus olfactorius, sondern zu einem angrenzenden Abschnitt, dem sogenannten akzessorischen olfaktorischen (oder vomeronasalen) Bulbus (Scalia 1976; Døving und Trotier 1998). Des Weiteren kommen im VNS keine Bowman’schen Drüsen vor (Matthes 1934).

2.3.3 Der Recessus olfactorius Der Feinbau des Recessus olfactorius (RO) ist bislang nicht vollständig entschlüsselt, jedoch weist sein Epithel lichtmikroskopisch betrachtet allgemeine Ähnlichkeit insbesondere zum VNS auf (Nowack 2008; Wittmer 2011). Wie das VNS besitzt der RO grundsätzlich keine Bowman’schen Drüsen und ist an seiner Oberfläche mit kurzen, senkrecht stehenden Zellfortsätzen (s. u.) ausgestattet. Auf der Oberfläche des RO befindet sich ein Schleimfilm (Jungblut et al. 2011). Außerdem lässt sich im RO eine gewisse Zonierung innerhalb des Epithels beobachten, die dahingehend interpretiert wird, dass Stütz-, Basal- und Nervenzellen in der für Riechepithelien üblichen Weise angeordnet sind (Nowack et al. 2013). Dabei scheint allerdings kein Aufbau aus drei, sondern aus mindestens fünf Zelltypen vorzuliegen: Rasterelektronen- mikroskopisch wurden vier verschiedene Oberflächendifferenzierungen ermittelt (Abb. 2.5). Im Einzelnen sind dies Endknöpfchen mit Cilien und Endknöpfchen mit langen Mikrovilli, sowie nicht hervortretende Zelloberflächen mit kurzen Mikrovilli und solche mit Cilien. Somit verfügt das Sinnesepithel offenbar über je zwei morphologisch verschiedene Rezeptor- und Stützzelltypen (Nowack et al. 2013). Damit ähnelt es nicht nur dem middle chamber epithelium

Abbildung 2.5. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der drei Sinnesepitheloberflächen von B. orientalis. A: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. 1: Endknöpfe mit z. T. abgebrochenen Cilien; 2: Stützzelloberfläche mit Mikrovilli. B: Sinnesepithel des VNO. 1: Cilien der Stützzelle; 2: lange, dünne Mikrovilli der Sinneszellen. C: Recessus olfactorius. Weißer Pfeil und schwarze Pfeilspitze zeigen auf mutmaßliche sensorische Zellen mit cilien- bzw. mikrovillibesetzten Endknöpfchen; schwarzer Pfeil und weiße Pfeilspitze weisen auf mutmaßliche Stützzellen mit kurzen Mikrovilli bzw. Cilien. Verändert nach (Nowack et al. 2013). 2 Grundlagen 13 der Pipidae (s. u.): Interessanterweise tritt diese spezifische Anordnung von Zelltypen im singulären Geruchsorgan vieler Fische aber auch im Hauptgeruchsorgan von Amphibienlarven und adulten, aquatisch lebenden Caudata und Gymnophiona auf (Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998; Stuelpnagel und Reiss 2005; Reiss und Eisthen 2008; Tierney 2015). Derzeit noch unbekannt ist neben dem Feinbau der einzelnen zellulären Bestandteile auch das Ziel der Axone des RO. So konnte Wittmer 2011 zwar darstellen, dass sich die Fila olfactoria mit denen der anderen beiden Geruchsorgane verbinden und gemeinsam zum Riechhirn ziehen, die Zielregion der Axone des RO wurde dabei jedoch nicht identifiziert.

2.3.4 Das middle chamber epithelium (Pipidae) Die Histologie der Sinnesepithelien des Hauptgeruchsorgans und des Vomeronsalorgans der Pipidae stimmt insgesamt mit den oben für diese beiden Organsysteme beschriebenen Verhältnissen überein. Auch der Aufbau des middle chamber epitheliums (MCE) entspricht grundsätzlich dem anderer olfaktorischer Sinnesepithelien und besteht aus Sinnes-, Stütz- und Basalzellen; Bowman’sche Drüsen sind nicht vorhanden (Hansen et al. 1998). Das MCE ist allerdings etwas dicker als das Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans und enthält mehr Zellen (Oikawa et al. 1998). Zudem existieren im MCE, ähnlich wie oben bereits für den RO erläutert, morphologisch unterscheidbare Typen von Sinnes- bzw. Stützzellen. So wurden transmissionselektronenmikroskopisch olfaktorische Sinneszellen mit Cilien und Sinneszellen mit Mikrovilli beobachtet. Außerdem treten cilien- und mikrovillitragende Stützzellen auf (Reiss und Burd 1997; Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998). Gleichzeitig wurde nur wenig Mucus an der Oberfläche des Epithels gefunden (Oikawa et al. 1998). Die Fila olfactoria, die dem MCE entspringen, ziehen als ventraler Teil des Riechnervs zum ventralen Teil des olfaktorischen Bulbus (Key und Giorgi 1986a; Hofmann und Meyer 1991).

2.4 Die nasalen Drüsen adulter Anura Neben den bereits erwähnten Bowman’schen Drüsen (Glandulae olfactoriae, s.o.) sind bei Anura verschiedene weitere Drüsen mit den Geruchsorganen assoziiert. Die Anzahl und Ausprägung der Drüsen unterscheidet sich dabei von Spezies zu Spezies (Saint Girons und Zylberberg 1992). Die Sekrete der nasalen Drüsen erfüllen neben dem physikalischen und chemischen Schutz der Epithelien vor Austrocknung und Fremdstoffen (Xenobiotika) verschiedene Aufgaben im Rahmen der Geruchswahrnehmung (s. u.) (Pelosi 2001; Jungblut et al. 2011). Die laterale Nasendrüse oder Glandula nasalis lateralis setzt sich aus tubulösen, verästelten und weitlumigen Schläuchen zusammen, welche durch eine einfache Schicht Zylinderzellen mit basalständigen Kernen geformt werden. Der Drüsenkörper liegt dicht hinter 2 Grundlagen 14 der äußeren Nasenöffnung an der lateralen Nasenwand unter dem olfaktorischen Sinnesepithel der Haupthöhle (Matthes 1934; Helling 1938; Saint Girons und Zylberberg 1992; Nowack 2011). Die Drüse kommuniziert mit der Haupthöhle durch einen oder mehrere Gänge, welche sich an der lateralen Nasenwand an der Grenze zwischen olfaktorischem und indifferentem Epithel öffnen (Rowedder 1937; Helling 1938; Slabbert 1945; Nowack 2011). Die Glandula nasalis lateralis ist nicht bei allen Anura vorhanden; sie fehlt bei Pipidae wie z. B. Xenopus laevis (Föske 1934; Helling 1938; Paterson 1939). Die Glandula nasalis medialis (vomeronasale oder Jacobson’sche Drüse; Abb. 2.2) ist die umfangreichste nasale Drüse, ihre Schläuche ziehen je nach Spezies unterschiedlich weit in caudaler Richtung teilweise bis an den olfaktorischen Bulbus heran (Rowedder 1937; Slabbert 1945). Rostral umgreift der Drüsenkörper das VNO bzw. den Recessus medialis halbmondförmig; die Mündung der ebenfalls tubulös verästelten Drüse liegt im Bereich des posterioren Endes des VNO (Mihalkovics 1898; Matthes 1934; Helling 1938; Swanepoel 1966). Das seröse Sekret dieser Drüse ist maßgeblich an der Flüssigkeitsfüllung des VNO beteiligt (Seydel 1895; Broman 1920). Die Glandula nasalis oralis interna steht anatomisch eng mit dem Recessus olfactorius in Verbindung und ist bei allen bislang untersuchten Arten stets nur dann vorhanden, wenn auch ein RO ausgebildet ist (Helling 1938; Rowedder 1937; Nowack 2008). Ihr Bau ähnelt trotz allgemein geringerem Umfang den beiden zuvor beschriebenen Drüsen; sie mündet am caudalen Rand des sensorischen Epithels des RO zumeist in einen Streifen indifferenten Epithels, der den RO vom Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans abgrenzt (Du Toit 1943; Helling 1938; Slabbert 1945; Michael 1961). Pipidae besitzen ebenfalls eine als Glandula nasalis oralis interna bezeichnete Drüse, die jedoch bei den verschiedenen Vertretern über z. T. stark abweichende Mündungsregionen verfügt (Föske 1934; Paterson und Hindle 1951; Saint Girons und Zylberberg 1992).

2.5 Die Funktion der Geruchsorgane Das Hauptgeruchsorgan adulter Tetrapoda wird allgemein mit der olfaktorischen Prüfung von Luft, genauer der Detektion von kleinen, luftgetragenen Stimuli, in Verbindung gebracht (Altner 1962; Hofmann und Meyer 1991; Reiss und Eisthen 2008). Neben der Ausstattung mit entsprechenden Duftstoffrezeptoren (s. u.) gelten der angesprochene Mucus und die Bowman’schen Drüsen als spezielle Anpassung an diesen Zweck (Moulton und Beidler 1967). Das VNO hingegen detektiert wahrscheinlich große, wasserlösliche Stimuli (Døving und Trotier 1998; Baxi et al. 2006). Bei Anura scheinen diese Stimuli sowohl aus der Luft – wobei sie durch Sekrete wie die der lateralen Nasendrüse zum VNO transportiert werden können (Nowack und 2 Grundlagen 15

Wöhrmann-Repenning 2010, 2011; Nowack et al. 2017) –, als auch aus dem Wasser zu stammen (Døving et al. 1993; Døving und Trotier 1998; Jørgensen 2000). Als Anpassungen an diese Funktion wird insbesondere die Assoziation mit den angesprochenen extranasalen Drüsen gesehen, außerdem die Flimmerfunktion der Stützzellen (Oikawa et al. 1998; Reiss und Eisthen 2008) sowie ein Pumpmechanismus ähnlich dem von Säugern (Nowack und Wöhrmann- Repenning 2009). Über diese physikalisch-chemische Ebene hinaus soll das VNO vor allem der Detektion von innerartlich bedeutsamen Duftstoffen, also auch Pheromonen, dienen (Halpern und Martínez-Marcos 2003). Es ist jedoch zu beachten, das eine exakte Trennung der Funktionsbereiche des HG und des VNO nicht möglich ist (Baxi et al. 2006; Martínez-Marcos 2009; Woodley 2014). Das middle chamber epithelium hat die Funktion eines Wassergeruchsorgans (water nose, Hofmann und Meyer 1991). Neben einer speziellen Morphologie der Zelloberflächen (Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998) und Abwesenheit von Mucus und Bowman’schen Drüsen haben Pipidae eine spezielle Klappenstruktur entwickelt, mit der die Haupthöhle oder die Nebenhöhle je nach Bedarf geöffnet oder verschlossen werden können (Föske 1934; Altner 1962). Über die Funktion des Recessus olfactorius sind bislang nur äußerst spärliche Daten vorhanden. In den einzigen jüngeren Arbeiten, in denen dieser Aspekt überhaupt Beachtung findet, wird anhand äußerer morphologischer Befunde spekuliert, dass es sich beim RO um ein Organ zum Riechen wassergelöster Duftstoffe handelt (Jungblut et al. 2011; Nowack et al. 2013).

2.6 Die Detektion olfaktorischer Stimuli Ein bestimmter Duft setzt sich in der Regel aus vielen unterschiedlichen chemischen Substanzen (olfaktorischen Stimuli) zusammen, deren Komposition im Gehirn zu einem spezifischen Sinnes- eindruck verarbeitet wird (Galizia und Lledo 2013). Duftstoffe liefern den Empfängern entscheidende Informationen über ihre Umwelt, wozu unter anderem Auskünfte über die Anwesenheit und den Status von Nahrung, Artgenossen und Fraßfeinden zählen (Yoshikawa und Touhara 2015). Eine Sonderstellung nehmen hierbei Pheromone ein, damit sind Duftstoffe gemeint, die der intraspezifischen Kommunikation dienen und sowohl für Sender als auch Empfänger der Botschaft einen Nutzen haben (Galizia und Lledo 2013). Pheromone rufen dabei im Empfänger eine meist angeborene Reaktion hervor, die sich in einer physiologischen Reaktion und/oder einem spezifischen Verhalten äußert (Wyatt 2014). Die Duftstoffe gelangen über die Medien Luft oder Wasser zu den olfaktorischen Sinnes- epithelien. Die eigentliche Detektion der Stimuli findet an den Rezeptormolekülen statt, die in den Membranen der Zellfortsätze olfaktorischer Neurone lokalisiert sind (s. u.; Galizia und Lledo 2013). Allerdings sind die Sinnesepithelien und somit die Duftstoffrezeptoren – wie 2 Grundlagen 16 bereits erwähnt – nicht direkt zugänglich, sondern werden von Schleimfilmen bedeckt (Hauptgeruchsorgan, RO) oder liegen in schleim- bzw. flüssigkeitsgefüllten Nebenhöhlen (VNO, MCE). Prozesse, die zwischen Bestandteilen des Mucus und Duftmolekülen ablaufen bevor und z. T., nachdem die Duftmoleküle mit den Rezeptormolekülen interagieren, werden als perireceptor events zusammengefasst (Getchell et al. 1984b; Pelosi 2001; Heydel et al. 2013).

2.6.1 Perireceptor events Der Schleimfilm des Hauptgeruchsorgans wird vor allem durch Sekrete der Stützzellen und der Bowman’schen Drüsen gebildet (Helling 1938; Andres 1975; Buck 1996; Heydel et al. 2013). Neben Ionen, welche schnelle Membranpotenzialänderungen an den Cilien ermöglichen, enthält der Mucus spezialisierte Moleküle aus der Familie der Lipocaline, sogenannte odorant binding proteins (OBPs; Buck 1996; Pelosi 2001; Heydel et al. 2013), welche bei Anura in den Bowman’schen Drüsen synthetisiert werden (Lee et al. 1987; Millery et al. 2005). Die OBPs gelten als zentrale Anpassung an die terrestrische Lebensweise, da diese Proteine höchstwahrscheinlich die Lösung von hydrophoben luftgetragenen Stimuli im Mucus ermögli- chen und deren Transport zu den Rezeptormolekülen vermitteln (Buck 1996; Millery et al. 2005). Des Weiteren werden OBPs, zumindest bei Mäusen, offenbar mitsamt gebundener Duftmoleküle von Stützzellen aufgenommen, weshalb ihnen vermutlich zusätzlich eine Bedeutung für die schnelle und lokale Beseitigung von Stimuli nach deren Detektion zukommt (Strotmann und Breer 2011). Die Funktion des Mucus wird darüber hinaus mithilfe sogenannter xenobiotic metabolizing enzymes (XMEs) erweitert: Sie dienen nicht nur dem Abbau potenziell schädlicher Stoffe, sie nehmen höchstwahrscheinlich ebenfalls direkten Einfluss auf Duftmoleküle bzw. deren Rezeptorverfügbarkeit, indem sie diese, wenigstens partiell, abbauen (Heydel et al. 2013). Ferner entdeckten Snyder et al. (1991) bei der Anurenart Rana catesbeiana ein in Stützzellen, „subepithelialen Drüsen“1 und Mucus des Hauptgeruchsorgans lokalisiertes Protein mit unklarer Funktion, das sogenannte Olfactomedin. Abgesehen von dem Hauptgeruchsorgan sind perireceptor events für weitere olfaktorische Sinnesorgane weniger gut untersucht, insbesondere fehlen Daten bezogen auf Amphibien. Bekannt ist von Nagern, dass das Sekret im VNO von verschiedenen Drüsen produziert wird, dazu zählen die laterale Nasendrüse und die Jacobson’sche Drüse (Khew-Goodall et al. 1991; Krishna et al. 1995). Bei Anura scheint zusätzlich zu dem Sekret der lateralen Nasendrüse (Nowack 2011) über den Tränennasengang auch das Sekret der Harder’schen Drüse in das VNO zu gelangen (Nowack und Wöhrmann-Repenning 2010). Bei Nagern bilden die erwähnten

1 Die Autoren benennen die Drüse nicht konkret; soweit die publizierten Abbildungen eine Einschätzung durch die Autorin zulassen dürfte es sich allerdings um die Gl. nasalis medialis, die vomeronasale Drüse handeln. 2 Grundlagen 17

Drüsen das Protein Vomeromodulin: Ihm wird, analog den OBPs, Transport- und Abbaufunktion von Duftstoffen und Pheromonen zugeschrieben; Vomeromodulin wird vor allem wenn auch nicht ausschließlich im Lumen des VNO beobachtet (Khew-Goodall et al. 1991; Krishna et al. 1995). Auch OBPs sollen dem VNO Duftmoleküle, darunter wahrscheinlich auch Pheromone, zuführen (Ohno et al. 1996). Eng verwandt mit OBPs sind sogenannte pheromone binding proteins (PBPs), diese Proteine binden Duftstoffe direkt im Substrat (z. B. in Mäuseurin), werden von Artgenossen aufgenommen und in diesem Komplex dem VNO zugeleitet (Pelosi 2001). Ob derartige Proteine bzw. Prozesse auch bei Amphibien vorkommen, ist derzeit noch nicht untersucht. Die genaue Herkunft des Schleimfilms, welcher den Recessus olfactorius bedeckt, ist noch unbekannt. Auffällig ist in diesem Zusammenhang zwar die enge räumliche Beziehung des RO zur Glandula nasalis oralis interna, und dass diese Drüse nur auftritt, wenn auch ein RO vorhanden ist; allerdings existieren bislang keine Studien, die Daten bezüglich der Eigenschaften der Sekrete dieser Drüse liefern.

2.6.2 Olfaktorische Rezeptorproteine und -genfamilien Es sind bislang vier Rezeptorgenfamilien bekannt (Abb. 2.6), deren Rezeptorproteine auch bei Amphibien exprimiert werden. Dies sind: Olfaktorische Rezeptoren (ORs); Vomeronasale Rezeptoren vom Typ I und II (V1R, V2R) und Spurenamin-assoziierte Rezeptoren (trace amineassociated receptors, TAARs; Galizia und Lledo 2013; Woodley 2014). Diese Rezeptor- genfamilien entwickelten sich evolutionär gesehen zwar weitestgehend unabhängig voneinander, sie codieren jedoch alle für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit sieben α-helikalen Trans- membrandomänen (G protein-coupled receptors; GPCRs; Niimura und Nei 2005; Niimura 2009; Galizia und Lledo 2013).

Olfaktorische Rezeptoren (ORs) Die OR-Genfamilie (Abb. 2.6) wurde zuerst entdeckt, gleichzeitig stellt sie vermutlich stammesgeschichtlich gesehen die älteste Rezeptorgenfamilie dar (Buck und Axel 1991; Galizia und Lledo 2013). Zunächst wurden zwei Klassen unterschieden, Klasse I (OR I) und Klasse II (OR II) (Freitag et al. 1995; Freitag et al. 1998). Dabei wurden OR I wegen ihrer Sequenzähnlichkeit zu zuvor bei Fischen analysierten Geruchsrezeptoren auch als fish-like, OR II analog dazu als mammal-like bezeichnet (Freitag et al. 1995). Neuere phylogenetische Analysen (z. B. Abb. 2.7) resultierten in einer leicht veränderten und ergänzten Klassifikation der ORs: Demnach bilden die als Klasse I und II bezeichneten Rezeptorproteine eine gemeinsame Familie (Typ 1), welche sich weiter in die Gruppen α, β, δ, ɛ, ζ (OR I) und γ (OR II) 2 Grundlagen 18

Abbildung 2.6. Duftstoffrezeptoren: Genfamilien und Rezeptorproteine von Wirbeltieren. A: Phylogenetische Beziehungen der fünf Rezeptorgenfamilien und deren Vorkommen in ausgewählten Taxa. Alle außer FPRs werden bei Anura exprimiert (rote Punkte). Verändert nach Galizia und Lledo (2013). B: Typen von Rezeptorproteinen und die wichtigsten daran gekoppelten Transduktionselemente. Verändert nach Bradbury und Vehrencamp (2011). untergliedert (Niimura und Nei 2005; Niimura 2009; Amano und Gascuel 2012). Demgegenüber steht eine neu entdeckte Familie von Typ 2 Rezeptorproteinen (η, θ1, θ2, κ und λ), von denen jedoch aller Wahrscheinlichkeit nach nur die Gruppe OR2η Geruchsrezeptorfunktion inne hat. Obwohl es bei einzelnen Familien zu Überschneidungen kommt (Amano und Gascuel 2012; Woodley 2014), stützen sowohl phylogenetische, als auch anatomische und funktionelle Daten eine Gliederung in Gene bzw. Rezeptormoleküle für die Detektion luftgetragener Stimuli (Gruppen α und γ / OR II) und wasserlöslicher Stimuli (Gruppen δ, ɛ, ζ / OR I und η) (Freitag et al. 1995; Freitag et al. 1998; Mezler et al. 2001a; Niimura und Nei 2005; Niimura 2009). Darüber hinaus scheinen Rezeptoren der Gruppe β Moleküle zu erkennen, die sowohl flüchtig als auch wasserlöslich sind (z. B. Alkohol)(Niimura 2009). Die unterschiedlichen Typen von Duftstoffrezeptoren werden bei adulten Vertretern der Spezies Xenopus in verschiedenen olfaktorischen Epithelien exprimiert. So wurden OR II- Proteine im Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans und OR I- Proteine im MCE nachgewiesen (Freitag et al. 1995). Dabei wurden die ORs im MCE hauptsächlich in cilientragenden Zellen mit apikalen Somata beobachtet (Date-Ito et al. 2008; Nakamuta et al. 2011). Des weiteren wurden im MCE OR2η gefunden (Amano und Gascuel 2012). Bei der einzigen diesbezüglich untersuchten nichtpipiden Art Rana esculenta Abbildung 2.7. Stark vereinfachte Darstellung der phylogenetischen Be- wurde OR II-Expression im Sinnesepithel des Hauptgeruchs- ziehungen zwischen Olfaktorischen Rezeptoren bei Xenopus. Verändert organs dokumentiert, allerdings konnte keine OR I- nach (Amano und Gascuel 2012). 2 Grundlagen 19

Expression nachgewiesen werden (Freitag et al. 1998). Ob und welche Geruchs-rezeptor- moleküle im Recessus olfactorius exprimiert werden ist noch völlig unbekannt.

Vomeronasale Rezeptoren vom Typ I und II (V1R, V2R) Die vomeronasalen Duftstoffrezeptoren vom Typ 1 (V1R) und Typ 2 (V2R) (Abb. 2.6) wurden 1995 bzw. 1997, z. T. von mehreren Arbeitsgruppen parallel, im VNO von Ratten bzw. Mäusen entdeckt (Dulac und Axel 1995; Herrada und Dulac 1997; Matsunami und Buck 1997; Ryba und Tirindelli 1997). Es handelt sich in beiden Fällen um GPCRs, die sich aufgrund ihrer Herkunft aus verschiedenen Proteinfamilien strukturell wesentlich unterscheiden. Ihre Funktion bei Nagetieren liegt nach bisherigen Erkenntnissen allgemein in der Detektion von Semiochemikalien aus Körperflüssigkeiten wie Urin, Schweiß, Tränen und Fäkalien, die bestimmte Verhaltensweisen oder endokrine Ereignisse auslösen (Rodriguez 2016). V1Rs werden bei Nagern im VNO in olfaktorischen Neuronen mit apikal liegenden Somata exprimiert. Neben ihrer Aufgabe als Chemorezeptoren spielen die Proteine außerdem eine Rolle bei der Regulation ihrer eigenen Expression sowie im Rahmen des Zellwachstums und der Zielfindung der Axone im AOB. Sie detektieren bei Mäusen kleine, flüchtige Moleküle (Yoshikawa und Touhara 2015; Rodriguez 2016). Interessant ist, dass den Säugern die als ursprünglich betrachteten V1R-Genfamilien der Knochenfische und Quastenflosser verloren gegangen sind. Stattdessen scheinen die bislang untersuchten Säuger-V1Rs von einem an der Basis der Amphibien neu entstandenen Gen abzustammen, welches zum ersten Mal bei Xenopus tropicalis beschrieben wurde (Xt_ora14; Syed und Korsching 2014; Korsching 2016). Bei Pipidae wurden V1Rs allerdings nicht im VNO, sondern hauptsächlich im MCE, genauer in Neuronen mit basal liegenden Somata, gefunden. Daneben wurden V1Rs, wenn auch in deutlich geringerer Zahl, im Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans beobachtet. Es wird angenommen, die Aufgabe sei wie bei Nagern die Detektion flüchtiger Stimuli, obwohl konkrete Liganden bislang unbekannt sind (Date-Ito et al. 2008; Yoshikawa und Touhara 2015). V2Rs werden bei Mäusen und bei Reptilien als einzige Geruchsrezeptoren paarweise in vomeronasalen Sinneszellen exprimiert, dabei formen zwei verschiedene Rezeptorproteine möglicherweise einen Rezeptorkomplex (Brykczynska et al. 2013; Galizia und Lledo 2013; Rodriguez 2016). Sie besitzen einen langen N-Terminus, an welchem vermutlich die olfaktorischen Stimuli binden (Rodriguez 2016). Bei den Stimuli handelt es sich, unabhängig von der betrachteten Spezies, mutmaßlich um lösliche Moleküle wie Peptide oder Proteine bei Mäusen bzw. Aminosäuren bei Fischen und Pipidae (Yoshikawa und Touhara 2015; Rodriguez 2016; Syed et al. 2016). Bei X. laevis wurden V2Rs sowohl im VNO als auch im MCE nachgewiesen, genauer in Mikrovilli-besetzten Neuronen (Hagino-Yamagishi et al. 2004; Date- 2 Grundlagen 20

Ito et al. 2008; Syed et al. 2016). Dabei lassen sich phylogenetisch ältere von jüngeren V2Rs unterscheiden, wobei die jüngeren V2Rs im VNO und die älteren im MCE exprimiert werden (Syed et al. 2016). Überdies ist das Genrepertoire für V2Rs bei Xenopus das umfangreichste bisher beschriebene (Korsching 2016). Nicht bekannt ist bislang, ob V2Rs bei Fröschen ebenfalls paarweise exprimiert werden, oder ob V2Rs analog zur Situation bei Nagern spezialisierte Semiochemikalien detektieren. Bezüglich nichtpipider Anura existieren bislang nur Untersuchungen, welche vomeronasale Rezeptoren indirekt, über spezielle Bestandteile des Signaltransduktionsapparates nachweisen (G-Protein-α-Untereinheiten; s. u.). Der Recessus olfactorius wurde hingegen überhaupt noch nicht auf seine Ausstattung mit VRs untersucht.

Spurenamin-assoziierte Rezeptoren (TAARs) Spurenamin-assoziierte Rezeptoren (TAARs) bilden eine Familie von GPCRs, die sich offensichtlich vergleichsweise früh, vor dem Auftreten der Gnathostomata, ausgebildet hat. Bei Mäusen wurden sie im Hauptgeruchsorgan sowie einem akzessorischen Organ, dem Grüneberg- Ganglion beobachtet. Dort sind die TAARs in den Cilien lokalisiert, aber auch in den Axonen, wo sie vermutlich eine Rolle im Rahmen des axonalen Wachstums spielen. Zu den Liganden zählen vor allem flüchtige Amine, darunter Tyramin, Octopamin, 2-Phenethylamin und Cadaverin (Li und Liberles 2016). Die detektierten Stimuli lösen meist angeborene Verhaltensweisen aus (Niimura 2009; Galizia und Lledo 2013; Li und Liberles 2016). Bei X. laevis und X. tropicalis wurden vergleichsweise wenige Gene für TAARs gefunden (Hashiguchi und Nishida 2007; Gliem et al. 2009), woraus geschlossen wird, diese Rezeptorproteine seien für Frösche nicht von großer Bedeutung. Funktionelle Daten legen in diesem Zusammenhang tatsächlich nahe, dass auch andere Duftstoffrezeptoren als TAARs für die Detektion von Aminen zuständig sein müssen (Gliem et al. 2009). TAARs werden bei X. laevis im Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans und im MCE exprimiert (Gliem et al. 2009; Korsching 2016).

2.6.3 Coexpression von G-Protein-α-Untereinheiten und Duftstoffrezeptoren Bei den oben beschriebenen Geruchsrezeptoren handelt es sich, wie bereits erwähnt, um G-Pro- tein-gekoppelte Rezeptoren (G protein-coupled receptors, GPCRs; Abb. 3.7; Yoshikawa und Touhara 2015). „G-Protein“ steht kurz für Guanosintriphosphat-bindendes Protein, dies sind heterotrimere Proteine, die sich aus den Untereinheiten α, β und γ zusammensetzen. Besondere Bedeutung kommt dabei der α-Untereinheit zu; aufgrund ihrer Eigenschaften werden im

Geruchssystem folgende Unterfamilien abgegrenzt: die Gs-Familie, die cAMP abhängige

Reaktionen vermittelt und somit stimulierend wirkt; die Gi-Familie mit inhibitorischer Wirkung; 2 Grundlagen 21

sowie die Gq-Familie, die die Phospholipase C aktiviert (Berg et al. 2013; Heinrich et al. 2014).

Mit den oben genannten Duftstoffrezeptoren sind jeweils spezifische Gα-Unterfamilien und folglich auch verschiedene Signaltransduktionskaskaden verknüpft (Tab. 2.1). Konkret heißt das in Bezug auf Xenopus (trifft aber auch auf Säuger und die meisten Fische zu): ORs werden gemeinsam mit Gαolf (kurz Golf) aus der Gs-Familie in cilientragenden Sinneszellen exprimiert;

V1R wird mit Gαi2 (kurz Gi2) co-exprimiert (Gi-Familie); V2R wird zusammen mit Gαo (kurz Go;

Gi-Familie) in mikrovilli-besetzten Sinneszellen exprimiert (Jones und Reed 1989; Buck und Axel 1991; Dulac und Axel 1995; Herrada und Dulac 1997; Mezler et al. 2001b; Hagino- Yamagishi et al. 2004; Date-Ito et al. 2008; Nakamuta et al. 2011; Korsching 2016). Außerdem werden TAARs im Hauptgeruchsorgan ebenfalls mit Golf gemeinsam exprimiert (Liberles und Buck 2006; Galizia und Lledo 2013; Li und Liberles 2016). Es gibt derzeit keine Studie, die die Assoziation von G-Proteinen und Duftstoffrezeptoren bei adulten, nichtpipiden Fröschen analysiert. Lediglich einzelne Studien an Larven (Jungblut et al. 2009; Jungblut et al. 2012) legen eine Assoziation von Go mit V2R im VNO nahe. Insbesondere der Recessus olfactorius wurde noch nicht auf diese wichtigen Bestandteile des Signaltransduktionsapparates untersucht.

Tabelle 2.1. Coexpression von Duftstoffrezeptoren und G-Protein-α-Untereinheiten bei adulten Anura. Keine der untersuchten Arten besitzt einen Recessus olfactorius. „-“: nicht untersucht; n. v.: nicht vorhanden. Nach Freitag et al. (1998), Mezler et al. (2001b), Hagino-Yamagishi et al. (2004), Date-Ito et al. (2008) und Nakamuta et al. (2011).

Spezies Hauptgeruchsorgan Middle chamber epithelium Vomeronasaorgan

Duftstoffrezeptor Gα-Protein Duftstoffrezeptor Gα-Protein Duftstoffrezeptor Gα-Protein

OR I Golf OR II Golf V1R Gi2 Xenopus spec. V1R Gi2 V2R Go V2R Go TAAR Golf TAAR Golf

- Go Bufo japonicus - - n.v. - Golf Rana esculenta OR I - n.v. - -

2.6.4 Transduktion des Signals und Zielregion im Gehirn Durch die Bindung des Liganden an den jeweiligen Duftstoffrezeptor wird das entsprechende G- Protein aktiv und die damit assoziierte Signaltransduktionskaskade in Gang gesetzt (Abb. 2.6).

Golf aktiviert beispielsweise anschließend die Adenylatcyclase (ACIII) und der intrazelluläre cAMP-Spiegel erhöht sich, wodurch ein Calcium-Kanal geöffnet wird. Einströmendes Ca2+ öffnet einen Chloridionenkanal, woraufhin das Neuron depolarisiert, folglich werden Aktionspo- tentiale entlang des Axons zum Gehirn geleitet (Wettschureck und Offermanns 2005; Yoshikawa und Touhara 2015; Corey und Ache 2016). In ähnlicher Weise, jedoch mithilfe der Phospholipase 2 Grundlagen 22

C (PLC) und der second messenger Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG), werden

Signale von V1R/Gi2 und V2R/Go an das Gehirn weitergeleitet (Hagino-Yamagishi 2008). Wie weiter oben bereits erwähnt, ziehen die Axone des Hauptgeruchsorgans als Nervus olfactorius zum rostralen Telencephalon, genauer dem olfaktorischen (Haupt-) Bulbus (main olfactory bulb, MOB) (Abb. 2.8). Die Axone der vomeronasalen Sinneszellen ziehen als Nervus vomeronasalis zu dem akzessorischen olfaktorischen Bulbus (accessory olfactory bulb, AOB), welcher weiter caudal und leicht ventrolateral versetzt dem MOB anliegt (Ecker et al. 1899; Scalia 1976; Martínez-Marcos 2009). Beide Strukturen sind paarig und bilateralsymmetrisch, allerdings sind die MOBs mittig miteinander verwachsen und wesentlich größer als die AOBs (Ecker et al. 1899; Scalia 1976). Sowohl der MOB als auch der AOB lassen von außen nach innen eine gewisse Abfolge von Zellschichten erkennen: Die äußerste Schicht, die auch als Implantationskegel bezeichnet wird, wird durch die von den Sinnesepithelien heranziehenden Axone geformt. Die Axone verteilen sich auf ihre jeweiligen Zielglomeruli in der unterhalb des Implantationskegels liegenden Glomerulischicht. Ein Glomerulus setzt sich aus einer Ansamm- lung von axonalen Endigungen der olfaktorischen Sinneszellen und den quastenförmigen dendritischen Endigungen der Mitralzellen zusammen. Gemeinsam werden diese Zellfortsätze von sogenannten periglomerulären Zellen umfasst. Die Zellkörper der Mitralzellen bilden eine weitere Schicht (Mitralzellschicht), welche durch die äußere plexiforme Schicht – bestehend aus den Dendriten der Mitralzellen – von der Glomerulischicht getrennt wird. Es folgen die aus den Axonen der Mitralzellen sowie Dendriten der Körnerzellen zusammengesetzte innere plexiforme Schicht und schließlich die Körnerzellschicht. Außerdem werden die olfaktorischen Hauptbulben von den rostralen Ausläufern der Ventrikel durchzogen; diese Hohlräume werden gegenüber der Körnerzellschicht durch Ependymzellen abgegrenzt. Die Axone der Mitralzellen verlassen die olfaktorischen Bulben und ziehen weiter in höhere Hirnzentren (Scalia 1976; Rodriguez 2016).

Abbildung 2.8. Halbschematische Darstellung des (Riech-) Hirns der Anura. A: Seitenansicht des Gehirns, gezeigt bis kurz hinter die optischen Loben. Links ist rostral, rechts caudal. B: Zell- schichten so illustriert, wie sie im histologischen Querschnitt durch den MOB zu sehen sind. AOB: accessory olfactory bulb, akzessorischer olfaktorischer Bulbus; äpS: äußere plexiforme Schicht; CH: Cerebrale Hemisphäre; GS: Glomerulischicht; ipS: innere plexiforme Schicht; Ik: Implantationskegel; KS: Körnerzellschicht; MOB: main olfactory bulb, olfaktorischer Hauptbulbus; No: Nervus opticus; Nv: Nervus vomeronasalis; Ol: Optischer Lobus; V: Ventrikel. Verändert nach (Ecker et al. 1899). 2 Grundlagen 23

Diese relativ grobe Betrachtungsweise des Riechhirns wurde in vielen Fällen bereits verfeinert. Bei zahlreichen Säugern wurden Unterteilungen sowohl im Hauptgeruchsorgan/MOB als auch bezüglich des VNO/AOB gefunden. Bei letzterem ziehen beispielsweise die Fila olfactoria der V1R/Gαi2 und V2R/Gαo exprimierenden Zellen in abgrenzbaren Trakten zum rostralen bzw. caudalen Teil des AOB (Martínez-Marcos 2009; Hagino-Yamagishi und Nakazawa 2011; Rodriguez 2016). Bei Vertretern der Gruppen Xenopus und Pipa existieren ebenfalls abgrenzbare Trakte: So konnte u. a. mithilfe bestimmter Färbemethoden (Lektinhisto- chemie, s. u.) beobachtet werden, dass die Axone des MCE zwar gemeinsam mit den Axonen des Hauptgeruchsorgans zum MOB ziehen, allerdings formen sie einen eigenen, ventralen Trakt und terminieren im ventralen Teil des MOBs (Hofmann und Meyer 1991; Franceschini et al. 1992; Meyer et al. 1997; Saito und Taniguchi 2000). Dieser ventrale Trakt wiederum wird offenbar noch weiter untergliedert, da Axone der cilien- bzw. mikrovillitragenden Sinneszellen ebenso eigene Trakte formen, welche im caudolateralen bzw. rostromedialen Teil des ventralen MOBs terminieren (Nakamuta et al. 2011). Die exakte Zielregion der Axone des Recessus olfactorius im Riechhirn ist derzeit noch nicht bekannt, genauso wenig weiß man, ob die Axone der cilien- bzw. mikrovillitragenden Sinneszellen dieses Geruchsorgans möglicherweise ebenfalls unterscheidbare Trakte formen.

2.7 Lektinhistochemie Lektine sind Proteine, die vergleichbar mit Antikörpern mit hoher Affinität und Spezifität an spezielle Kohlenhydratstrukturen von Glykoproteinen und Peptiden (Glykokonjugate) binden (Ponder 1983). Lektine werden von allen Lebewesen produziert, die meisten kommerziell erhält- lichen Lektine stammen allerdings aus Pflanzen (Mulisch et al. 2010). Für jedes Lektin wird eine Selektivität für eine Kohlenhydratstruktur (Zuckerrest, Glykotop) angegeben. Dies bedeutet allerdings nicht, dass Lektine mit derselben Selektivität ein identisches Bindungsmuster erbringen, da auch zusätzliche Merkmale durch das Lektin berücksichtigt werden (Ponder 1983). Lektine werden direkt oder indirekt nachgewiesen, dazu können sie beispielsweise an einen fluoreszierenden Farbstoff oder an Peroxidase gekoppelt sein (Mulisch et al. 2010). Eine Gruppe von Lektinen detektiert insbesondere solche Glykotope, die per O- Glykosylierung, also über ein Sauerstoffatom, an den Serin- oder Threonin-Rest eines Proteins gebunden werden. Diese posttranslationale Modifikation wird im Golgi-Apparat in vorwiegend mucösen Drüsen vervollständigt, dabei wird am häufigsten der Zuckerrest GalNAc (N- Acetylgalactosamin) verknüpft. Die große Mehrheit der so entstehenden Glykoproteine gehört zu den Mucinen (Bennett et al. 2012; Brooks et al. 1997), die wesentliche Bestandteile von Schleimen sind. Die Zuckerreste der Mucine, darunter insbesondere das durch das Lektin WGA 2 Grundlagen 24

(wheat germ Agglutinin) detektierte NeuAc (Neuraminsäure), sind die wichtigsten Bestimmungsfaktoren für Viskosität und Diffusionsdurchlässigkeit von Schleimen (Foster et al. 1991). Daneben wird für NeuAc auch eine Beteiligung an Bindung von Ionen und Bakterien- einschluss angenommen (Foster et al. 1991 und darin enthaltene Referenzen). Neben den genannten speziellen Bestandteilen des Schleims zählen Elemente der Zellmembran und extrazellulären Matrix zu den wichtigen Glykokonjugaten (Ponder 1983; Plendl und Sinowatz 1998; Zhang und Hagen 2011). Diese Verbindungen entstehen im ER und Golgi-Apparat und enthalten Mannose, welche durch das Lektin Con A detektiert werden kann. Mannose ist gleichzeitig lediglich in einem Prozent der Kohlenhydratreste „reifer“ Mucine enthalten, kann aber durch Con A in Zwischenprodukten gebunden werden (Foster et al. 1991). Glykokonjugate spielen eine wichtige Rolle für die Entwicklung, Regeneration und Funktion von olfaktorischen Systemen, daher sind Expressionsmuster von Glykokonjugaten bzw. von Zuckerresten in der Vergangenheit Gegenstand zahlreicher Untersuchungen am Geruchs- system diverser Tierarten gewesen (vgl. Review von Plendl und Sinowatz 1998). Bei solchen Untersuchungen wurden unter anderem Unterschiede in den Bindungsmustern diverser Lektine zwischen den Sinnesepithelien des VNO und des HG beobachtet. Die Lektine SBA und DBA können beispielsweise olfaktorische Untersysteme und insbesondere deren Nervenbahnen unterscheidbar machen, was auch für Anura in einer Reihe von Studien belegt worden ist (Key und Giorgi 1986a, 1986b; Key und Akeson 1990; Hofmann und Meyer 1991; Key und Akeson 1991; Franceschini et al. 1992; Meyer et al. 1997; Nakamuta et al. 2011; Saito und Taniguchi 2000; Saito et al. 2006). Auch für die Analyse der Ontogenese von Geweben und Organen wurden Lektine oftmals eingesetzt (Balla et al. 1989; Franceschini et al. 1994; Ichikawa et al. 1994; Shapiro et al. 1995; Endo et al. 2011).

2.8 Zielsetzung der vorliegenden Untersuchung Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen ist in erster Linie die genauere Analyse und Charakterisierung des Recessus olfactorius bei der Spezies B. orientalis, um die äußerst lücken- hafte Datenlage bezüglich dieses Geruchsorgans zu erweitern. Des Weiteren sollen die gewonnenen Erkenntnisse mit vergleichenden Daten zu Hauptgeruchsorgan und Vomeronasalorgan sowie dem middle chamber epithelium der Spezies X. borealis verglichen werden. Hierbei sollen funktionelle Aspekte erörtert werden, sowie der Frage nach einer möglichen Homologie zwischen RO und MCE nachgegangen werden. In einem ersten Schritt soll mithilfe von Paraffin- und Semidünnschnitten der zelluläre Aufbau des RO näher beleuchtet werden. Von besonderem Interesse ist hierbei, ob sich der durch Nowack et al. 2013 postulierte Aufbau aus je zwei Sinnes- und Stützzelltypen bestätigen lässt. 2 Grundlagen 25

Mithilfe der Lektinhistochemie soll das Geruchssystem hinsichtlich zweier Aspekte näher untersucht werden: Zum einen soll die Zusammensetzung der Schleime innerhalb der Nasenhöhlen, aber auch ihre Herkunft bestimmt werden. Wie bereits erwähnt, herrscht hier insbesondere bezüglich der Quelle des Mucus auf dem RO noch Aufklärungsbedarf. Zum anderen sollen die Sinneszellen der drei olfaktorischen Untersysteme von B. orientalis hinsichtlich ihrer Glykotope untersucht werden. Potenzielle Unterschiede in der Expression von Zuckerresten sollen, wenn möglich, aufgedeckt und auf ihren Nutzen zur Differenzierung der verschiedenen Sinnesepithelien und deren Nervenbahnen geprüft werden. Außerdem soll der Nutzen von Lektinfärbungen hinsichtlich der Beurteilung phylogenetischer Beziehungen zwischen den Geruchssystemen bewertet werden. Dazu soll durch Einsatz von sieben Lektinen mit z. T. unterschiedlichen Nachweissystemen (s. Tab. 3.2) ein möglichst breites Spektrum an Zuckerresten abgedeckt werden. Ein dritter Schwerpunkt liegt in der immunhistochemischen Untersuchung. Antikörper- färbungen sollen die Verteilung der G-Proteinuntereinheiten αolf, αo und αi2 innerhalb der olfaktorischen Sinnesepithelien und insbesondere des RO sichtbar machen. Die so gewonnenen Befunde sollen erste Anhaltspunkte zur Ausstattung des RO mit Geruchsrezeptoren geben. Vermutlich lassen sich daraus erste Hinweise auf funktionelle Eigenschaften des Recessus olfactorius ableiten. Auch hier sollen Vergleichsstudien am middle chamber epithelium von X. borealis stattfinden. 3 Material und Methoden 26

3 Material und Methoden

Kurzprotokolle der genannten Methoden, Bezugsquellen für Chemikalien und Verbrauchsmaterialien sowie Rezepte der verwendeten Lösungen sind in tabellarischer Form im Anhang aufgeführt.

3.1 Tiermaterial

Gegenstand der Untersuchungen der vorliegenden Dissertation waren die olfaktorischen Strukturen adulter Vertreter der nicht-pipiden Spezies Bombina orientalis sowie der pipiden Art Xenopus borealis (Tab. 3.1). Teilweise stand das für die Analysen notwendige Tiermaterial aus vorangegangenen Untersuchungen bzw. Abschlussarbeiten (Nowack 2008; Jordan 2010; Wittmer 2011; Bublak 2012) der Arbeitsgruppe zur Verfügung. Es handelte sich hauptsächlich um gefärbte Schnittpräparate der hier untersuchten Spezies, die dazu dienten die Anatomie und Morphologie der jeweiligen Nasenhöhlen kennen zu lernen. Des Weiteren standen ungefärbte histologische (Paraffin-) Schnitte (Wittmer 2011) zur sofortigen Weiterbearbeitung bereit.

Tabelle 3.1. Spezies, Herkunft und Anzahl der verwendeten Anura pro Untersuchungsmethode.

Genutzte Methode Artname Herkunft der Tiere Individuen Bombina 2 Schnittserien standen bereits zur Verfügung orientalis Histologische Übersichtsfärbungen Xenopus 2 Schnittserien standen bereits zur Verfügung borealis 1 Zuchtgruppe der AG Wirbeltieranatomie Semidünnschnitte B. orientalis 1 Zuchtgruppe der AG Wirbeltieranatomie B. orientalis 2 Zuchtgruppe der AG Wirbeltieranatomie Lektinfärbungen X. borealis 2 Zuchtgruppe der AG Wirbeltieranatomie

Western Blot B. orientalis 5 Zuchtgruppe der AG Wirbeltieranatomie Analysen X. borealis 1 Zuchtgruppe der AG Wirbeltieranatomie B. orientalis 10 Zuchtgruppe der AG Wirbeltieranatomie Antikörperfärbungen X. borealis 10 Zuchtgruppe der AG Wirbeltieranatomie

Sämtliche im Zuge dieser Arbeit genutzten Tiere wurden durch ein Bad in Tricain (Tricain-Methansulfat, MS-222) betäubt; die Konzentration des Anästhetikums betrug dabei 0,1 g auf 50 ml Leitungswasser. Unter Betäubung wurden die Tiere schmerz- und stressfrei dekapitiert. Die Fixierung des so gewonnenen frischen Gewebes erfolgte unverzüglich durch Einlegen in Fixierlösung (Immersionsfixierung). Dabei wurden die Nasenhöhlen stets unter Zuhilfenahme einer Pipette durchspült, um etwaige Luftblasen zu entfernen und so eine optimale Erhaltung der Riechepithelien zu gewährleisten. Welches Fixativ eingesetzt wurde, hing von der geplanten Untersuchung ab und wird daher im Zusammenhang mit der Durchführung der 3 Material und Methoden 27 jeweiligen Methoden genannt. Für die durchgeführten Analysen liegt der Arbeitsgruppe eine Erlaubnis nach § 1 Versuchstiermeldeverordnung vor (Projekt-Nr. 392/10).

3.2 Paraffineinbettung und Anfertigung von Schnittserien

Serienschnitte von in Paraffin eingebettetem Gewebe wurden im Zuge der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit vielseitig eingesetzt. Die Paraffineinbettung (vgl. auch Kurzprotokoll unter Anhang A) fand im Anschluss an die Gewebsfixierung statt. Dazu wurde zunächst die jeweilige Fixierlösung unter fließendem Leitungswasser ausgespült. Im Anschluss folgte die Entkalkung des Gewebes mit 5%iger Salpetersäure (HNO3). Etwa alle 12 Stunden wurde die Säure erneuert, solange bis das Gewebe ausreichend weich war (Nadelprobe). Um ein Aufquellen des Gewebes zu verhindern, wurde nach der Entkalkung eine Kollagenhärtung mittels 5%iger Natrium- sulfatlösung (Na2SO4) durchgeführt. Nach 12 bis 24 Stunden wurde diese unter fließendem Leitungswasser ausgespült und das Gewebe gegebenenfalls getrimmt. Als nächstes durchlief das Gewebe eine aufsteigende Alkoholreihe mit 70 %, 90 %, 96 % und 100 % Ethanol sowie Isopropanol. In Vorbereitung auf die Infiltration mit Paraffin wurde das Gewebe in zwei aufeinander folgende Stufen des Intermediums Roti®-Histol überführt. Darauf folgte eine ca. 60 °C warme Mischung aus Roti®-Histol und Paraffin im Verhältnis von 1:1. Hiernach wurde das Gewebe alle 24 Stunden in insgesamt drei frische Paraffinstufen (ebenfalls auf etwa 60 °C temperiert) umgesetzt. Schließlich wurde das Gewebe in einem mit frischem Paraffin gefüllten Wiegeschälchen ausgeblockt (Erkaltung und Verfestigung des Paraffins). Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur (alternativ nach wenigen Stunden bei 4 °C) war das Paraffin genügend erhärtet und wurde in Vorbereitung auf das Schneiden getrimmt. Dabei wurden die Kanten rund um das Gewebe so abgetragen, dass die spätere Schnittfläche eine Trapezform hatte. Der Paraffinblock wurde anschließend auf einen kleinen Holzklotz aufgeschmolzen und in einem Handrotationsmikrotom eingespannt. Schließlich wurde mit einer Dicke von 7 oder 10 µm in transversaler Ebene durch die Nasenregion geschnitten.

3.3 Histologische Übersichtsfärbungen

Histologische Übersichtsfärbungen an ausgewählten Paraffinschnitten einer Serie dienen – neben der allgemeinen Beurteilung des Erfolgs der Fixierung und der Einbettung – dazu, sich über die anatomischen Verhältnisse der Nasenregion des jeweiligen Tieres Klarheit zu verschaffen. Im Mittelpunkt stehen dabei insbesondere die Lage und Ausmaße des vergleichsweise kleinen Recessus olfactorius. Auf dieser Basis werden die Schnitte für weitergehende Untersuchungen, wie sie in vorliegender Dissertation durchgeführt wurden, ausgewählt. 3 Material und Methoden 28

Für die Übersichtsfärbungen wurden zunächst Schnitte auf mit Chromalaun-Gelatine beschichtete Objektträger (Anhang A) aufgezogen. Dazu wurde ein Tropfen destilliertes Wasser auf einen Objektträger aufgetragen und darauf der Paraffinschnitt aufgebracht. Durch Auflegen auf eine Heizplatte erwärmte sich das Wasser (bis max. 55-60 °C) und die Schnitte streckten und glätteten sich. Anschließend wurde das Präparat über Nacht bei Raumtemperatur (RT) getrocknet, dadurch wurde eine sichere Haftung am Objektträger gewährleistet. Als nächstes erfolgte die Entparaffinierung der Schnitte in zwei aufeinanderfolgenden Roticlear® Stufen. Es schloss sich die Rehydrierung in Form einer absteigenden Alkoholreihe und einer Stufe destillierten Wassers (a. dest.) an. Daraufhin folgte die erste Färbestufe Säure- alizarinblau (SAB). Überschüssige Färbelösung wurde in mehreren kurzen Spülschritten ausgespült. Nachfolgend wurden die Schnitte zum Differenzieren und Beizen in Phosphorwolframsäure (PWS) überführt, kurz gespült und anschließend in die zweite Färbestufe, Anillinblau-Orange-G (AOG), verbracht. Nach neuerlichem Spülen wurden die Präparate mit einer aufsteigenden Alkohlreihe und zwei Roticlear®-Stufen dehydriert und mit Entellan® eingedeckt. Die genauen Zeiten der beiden Färbestufen und der Differenzierung und Beizung wurden dabei für jedes zu färbende Tiermaterial zuvor in einer Probefärbung ermittelt. Die Anfärbbarkeit der Gewebe kann sich altersabhängig, von Individuum zu Individuum, von Spezies zu Spezies und in Abhängigkeit vom verwendeten Fixans stark unterscheiden. Ein detaillierter Färbeplan mit Färbezeiten, die sich für eine erste Probefärbung bewährt haben, ist im Anhang A zu finden. Die lichtmikroskopische Auswertung und Dokumentation der Übersichtsfärbungen erfolgte mit den Geräten DME (in Verbindung mit der Kamera EC3 und dem Programm LAS EZ) und DM750 (mit Kamera DFC295 und Programm LAS V 4.1) der Firma Leica.

3.4 Aralditeinbettung und Anfertigung von Semidünnschnitten

Die folgende Beschreibung der notwendigen Arbeitsschritte wurde bewusst kurz gehalten, da das Vorgehen im Wesentlichen mit dem in der Diplomarbeit der Autorin entwickelten übereinstimmt (vgl. Jordan 2010; bzw. Kurzprotokoll im Anhang). Die Gewebeproben wurden so fixiert und kontrastiert, dass zusätzlich zu den hier durchgeführten Analysen von Semidünnschnitten (500 nm) eine weitergehende transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung an Ultradünnschnitten (50 nm) möglich ist.

3.4.1 Fixierung und Vorbereitung des Gewebes Zur Fixierung des Gewebes wurde eine gekühlte 2,5%ige Glutardialdehydlösung in Sörensen- phosphatpuffer (PP) mit einem pH-Wert von 7,2 genutzt. Die frisch entnommene vollständige 3 Material und Methoden 29

Nasenregion (B. orientalis) wurde in dieser Lösung für 24 Stunden im Kühlschrank fixiert. Im Anschluss wurde das Fixans insgesamt einen Tag lang mit PP ausgespült. Dann wurden unter Verwendung eines Stereomikroskops die Nasenhöhlen aufpräpariert und Proben der drei Geruchsepithelien entnommen. Diese wurden zunächst in einem Gemisch aus PP und a. dest. (im Verhältnis 1:1) und danach in reinem destillierten Wasser gespült. Es folgte die Postfixierung und

Kontrastierung mit 2%igem Osmiumtetroxid (OsO4), welche nach zwei Stunden durch Spülen in a. dest beendet wurde.

3.4.2 Kontrastierung, Entwässerung und Einbettung in Kunststoff (Araldit) Die Entwässerung fand mithilfe einer aufsteigenden Acetonreihe (40 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %) statt. Dabei enthielt die Stufe mit 70%igem Aceton als weiteres Kontrastierungsreagenz eine Mischung aus Uranylacetat und PWS. Die fertig entwässerten Gewebestücke wurden auf die endgültige Größe und Form getrimmt und in Propylenoxid als Intermedium überführt. Es folgte eine weitere, frische Propylenoxidstufe. Das Intermedium wurde anschließend durch Aradit ersetzt. Hierzu wurden Propylenoxid und ein Aralditgemisch, bestehend aus 5,2 g2 Araldit, 4,8 g1 des Härters Dodecenylbernstein- säureanhydrid (DDSA) und 0,3 ml des Beschleunigers Benzyldimethylamin (BDMA) (Mulisch et al. 2010) im Verhältnis 1:1 vermengt. Die Infiltration wurde in einem offenen Glasgefäß vorgenommen, um das Propylenoxid verdampfen zu lassen. Dann wurde die verbliebene Flüssigkeit durch ein Aralditgemisch mit 0,2 % Beschleuniger ersetzt. Schließlich wurden kleine Kunststoffbehälter (Beem®-Kapseln) mit frischem Araldit/DDSA/BDMA-Gemisch (0,2 %) befüllt. Darin wurden die Gewebeproben mit einer Präpariernadel ausgerichtet und der Kunststoff anschließend auspolymerisiert.

3.4.3 Anfertigung und Färbung von Semidünnschnitten Semidünnschnitte mit einer Dicke von 500 nm wurden mittels eines Ultramikrotoms hergestellt. Dazu wurden Glasmesser verwendet, die aus frisch gereinigten Glasriegeln (Maße: B x H x L: 25 x 6 x 400 mm) mithilfe des Knife Makers 7800B angefertigt wurden (vgl. Abb. 3.1 a-d). Zum Auffangen der Semidünnschnitte wurden die Glasmesser mit einem Trog ausgestattet. Ein Stück Klebeband wurde zu diesem Zweck um das Glasdreieck geklebt und mit geschmolzenem Paraffin umrandet, sodass ein wasserdichter Behälter entstand (Abb. 3.1 d).

2 Wegen der zähflüssigen Konsistenz der Chemikalien lassen sich diese exakter dosieren, indem man sie abwiegt anstatt zu pipettieren. 3 Material und Methoden 30

Abbildung 3.1: Schematisch dargestellter Ablauf der Herstellung eines Glasmessers. Abbildung aus (Mulisch et al. 2010). Vor dem eigentlichen Schneidvorgang wurde der Aralditblock getrimmt, sodass sich um das Gewebe herum eine trapezoide Schnittfläche ergab. Die entstehenden Schnitte wurden mit einem Einhaarpinsel von der Wasseroberfläche des Trogs auf einen Objektträger übertragen, auf einer Wärmeplatte getrocknet und gefärbt (Färbelösung nach Richardson). Nachdem die Schnitte abermals gespült und getrocknet worden waren, wurden sie mit dem Eindeckmedium DePeX eingedeckt. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte mithilfe eines Lichtmikroskops mit integrierter digitaler Kamera (Leica Typ DM E mit EC 3 sowie Leica Typ DM750 mit DFC295).

3.5 Lektinhistochemie

3.5.1 Gewebevorbereitung und Durchführung der Färbung Die lektinhistochemischen Untersuchungen wurden an Gewebeproben der Nasen- und Hirn- regionen von B. orientalis und X. borealis durchgeführt. Dazu wurde neben den erwähnten bereits vorhandenen Schnittserien auch frisches Tiermaterial (s. o.) in einem Gemisch aus 96%igem Ethanol und 36%igem Formaldehyd (Verhältnis 7:3, entspricht ~7 % Formaldehyd) für die Dauer von etwa vier Tagen bei 4 °C fixiert. Die Einbettung in Paraffin und die Herstellung von Schnittserien verlief wie unter Kapitel 3.2 beschrieben. Die im Rahmen der vorliegenden Untersuchung eingesetzten Lektine unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Spezifität gegen bestimmte Zuckerreste; darüber hinaus standen in ihrer Spezifität identische, aber an unterschiedliche Nachweismoleküle konjugierte Lektine zur Verfügung (Tab. 3.1). Bei den Nachweismolekülen handelte es sich um die fluoreszierenden Farbstoffe Fluorescein und Rhodamin sowie um das Markerenzym Meerrettichperoxidase (horseradish-peroxidase; HRP). Grundsätzlich beinhaltete das Protokoll für jede Lektinfärbung dieselben Arbeitsschritte (s. Anhang), auch wenn die Nachweismoleküle sich unterschieden. Paraffinschnitte wurden auf mit Chromalaun-Gelatine beschichtete Objektträger aufgezogen und, im Anschluss an eine Trockenzeit von etwa 24 h bei RT, mit Rotihistol entparaffiniert. Darauf folgten die Rehydratation mittels absteigender Ethanolreihe und mindestens ein Spülschritt mit phosphatge- 3 Material und Methoden 31 pufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS). Bei an Peroxidase gekoppelten Lektinen wurde durch zehnminütige Inkubation mit 3 % H2O2 (in a. dest.) die endogene Peroxidase blockiert, gefolgt von zwei zusätzlichen Spülschritten mit PBS. Bei Anwendung fluoreszenzmarkierter Lektine fand kein solcher Peroxidaseblock statt. In zwei Fällen, nämlich bei peroxidasegekoppeltem Con A und WGA, wurde zur Reduzierung von Hintergrundfärbung eine 30 minütige Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen durch Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) vorgenommen.

Tabelle 3.2. Die in der vorliegenden Untersuchung eingesetzten Lektine. Fuc – Fucose; Gal – Galactose; GaINAc – N-Acetylgalactosamin; Glc – Glucose; GlcNAc – N-Acetylglucosamin; HRP – horseradish-peroxidase, Meerrettichperoxidase; Man – Mannose; * – Reaktionslösung enthielt 2 % BSA. Spezifitäten nach (Rehm und Letzel 2010).

Nachweis- Konzentration Inkuba- Lektin Kürzel Spezifität molekül B. orientalis X. borealis tionszeit Concanavalin A Con A α-D-Man, α-D-Glc Fluorescein 50 µg 50 µg 24 h Concanavalin A Con A α-D-Man, α-D-Glc HRP 50 µg* 50 µg* 48 h Dolichos biflorus DBA α-D-GalNAc HRP 10 µg 10 µg 48 h Agglutinin Dolichos biflorus DBA α-D-GalNAc Rhodamin 20 µg 20 µg 24 h Agglutinin Peanut β-D-Gal(1-3)-D- PNA Fluorescein 30 µg 50 µg 24 h Agglutinin GalNAc Ricinus endständige communis RCA 120 Fluorescein 50 µg 50 µg 24 h β-D-Gal Agglutinin Soybean SBA D-GalNAc Fluorescein 30 µg 30 µg 24 h Agglutinin Ulex europaeus UEA I α-L-Fuc Fluorescein 35 µg 35 µg 24 h Agglutinin Wheat germ WGA (D-GlcNAc)n Fluorescein 15 µg 30 µg 48 h Agglutinin Wheat germ WGA (D-GlcNAc)n HRP 15 µg* 15 µg* 48 h Agglutinin

Im Anschluss erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem jeweiligen Lektin. Optimale Inkubationszeiten (bei 4 °C) und die im Einzelnen verwendeten Konzentrationen der Lektine in PBS wurden in Vorversuchen ermittelt und können Tabelle 3.1 entnommen werden. Dabei weichen die Werte, die zu einer ausreichenden Differenzierung der Epithelien und/oder Nerven führten, nicht nur in Abhängigkeit des verwendeten Lektins, sondern zum Teil auch je nach untersuchter Froschspezies voneinander ab. Für die Inkubation benötigte Reaktionslösungen wurden frisch angesetzt und direkt auf das Gewebe auf dem Objektträger aufgetragen. Bei einigen Ansätzen wurde der Reaktionslösung wiederum 2 % BSA zugesetzt (s. Tab. 3.1). Zum Schutz gegen Austrocknen wurden die Objektträger für die Dauer der Inkubation in eine Feuchtkammer gelegt und die Schnitte mit 3 Material und Methoden 32 einem Deckglas versehen; diese Vorgehensweise ermöglicht gleichzeitig einen sehr sparsamen Einsatz der Lösungen. Des Weiteren ist zu beachten, dass fluoreszenzmarkierte Lektine lichtempfindlich sind, sodass an die Lösungen und die damit behandelten Schnitte möglichst wenig Licht gelangen sollte. Um dies zu gewährleisten, wurden Reaktionsgefäße und Färbeküvetten in Alufolie eingeschlagen oder lichtundurchlässig abgedeckt. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Deckgläser vorsichtig vom Gewebe abgespült, ferner wurde überschüssige Reaktionslösung durch mehrere Spülschritte in PBS entfernt. Bei Anwendung der mit HRP gekoppelten Lektine (vgl. Tab. 3.1) folgte nun der Nachweis der im Gewebe gebundenen Moleküle mittels einer Färbereaktion. Dazu wurde das Chromogen VECTOR® NovaREDTM gemäß den Herstellerangaben angemischt und ca. 1 ml auf die Gewebeproben aufgetragen. Die Peroxidase sorgt für einen Farbniederschlag in den Gewebsarealen, wo das jeweilige Lektin gebunden hatte. Nach mikroskopischer Kontrolle wurde die Farbreaktion durch einen Spülschritt in a. dest. unterbrochen, worauf Entwässerung mithilfe von aufsteigenden Alkoholstufen und eines Intermediums (Roticlear®) und Eindecken der Schnitte (Entellan®) folgten. Wurden fluoreszenzmarkierte Lektine genutzt, entfiel die Färbereaktion, sodass sich Entwässerung und Eindecken der Schnitte direkt an das Abspülen des überschüssigen Lektins anschlossen. Zur Kontrolle der Färbeergebnisse wurden regelmäßig Blindproben angefertigt. Dazu wurde zeitgleich zur Inkubation mit Reaktionslösung bei mindestens einem Schnitt kein Lektin aufgetragen und die Inkubation stattdessen mit reinem PBS (ggf. mit 2 % BSA) durchgeführt. Im weiteren Verlauf erfuhr dieses Material die gleiche Behandlung wie mit Lektin behandelte Pro- ben, auch in Bezug auf Einstellungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (KLSM, s. u.). Neben den im Rahmen der vorliegenden Studien durchgeführten Lektinfärbungen standen aus der eigenen Diplomarbeit (Jordan 2010) einige Schnittpräparate aus der Nasenregion von B. orientalis zur Verfügung, die bereits mithilfe des Lektins DBA (HRP-konjugiert) gefärbt worden waren. Dieses Material wurde durch ergänzende Färbungen vervollständigt und (unter den gegenüber der Diplomarbeit veränderten Gesichtspunkten der vorliegenden Dissertation) erneut ausgewertet.

3.5.2 Auswertung und Dokumentation

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Ein Großteil der in der vorliegenden Untersuchung genutzten Lektine lag mit fluoreszierenden Farbstoffen (Fluorophore) markiert vor. Die jeweiligen Bindemuster wurden mithilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (KLSM) der Fimra Leica (Typ TCS SP 5 II) betrachtet, 3 Material und Methoden 33 ausgewertet und dokumentiert. Die im Einzelnen verwendeten Laserlinien können Tabelle 3.3 entnommen werden. Die Proben wurden im xyz-Modus untersucht. Dabei wurden die x-, y-, und z-Ebene, ebenso wie die Anzahl und Dicke der virtuellen Schnitte (die sogenannte z-stack-size) individuell an das jeweilige Präparat angepasst. Die Ebenen wurden mehrmals, d. h. in der Regel vier Mal, gescannt und das entstehende Bild gemittelt (Funktion: Frame average). Diese Einzelbilder der virtuellen Schnitte wurden mithilfe der Software LAS AF zu einem Gesamtbild (Maximalprojektion) zusammengefasst und im TIFF-Format exportiert.

Tabelle 3.3. Die je Farbstoff eingesetzte Laserlinie sowie Intensitäten und Detektionsbereiche. Farbstoff Laserlinie Intensität Detektionsbereich Cy3 Helium-Neon (543 nm) 5-9 % 555-585 nm DiI Helium-Neon (543 nm) 5-9 % 560-590 nm Fluorescein Argon (488 nm) 5-9 % 500-530 nm Rhodamin Helium-Neon (543 nm) 5-9 % 560-590 nm

Die aus LAS AF exportierten TIFF Dateien wurden mit dem Bildbearbeitungsprogramm Adobe® Photoshop® digital bearbeitet. Die ursprünglich farbigen Fotos wurden in Graustufen umgewandelt und invertiert. Abbildung 3.2 illustriert beispielhaft ein Originalbild und die aus der digitalen Bildbearbeitung resultierende Darstellung.

Konventionelle Mikroskopie Die Auswertung der Proben, die mit den peroxidasegekoppelten Lektinen behandelt wurden, erfolgte wie zuvor beschrieben mithilfe konventioneller Lichtmikroskopie und wurde in Form digitaler Fotografien dokumentiert.

Abbildung 3.2. Am KLSM aufgenommenes Bild, Recessus olfactorius von B. orientalis. A: Vor -, B: Nach der digitalen Verarbeitung. Das Originalbild wurde beschnitten, in Graustufen umgewandelt und schließlich invertiert. 3 Material und Methoden 34

3.6 Immunhistochemie

Im Rahmen der immunhistochemischen Untersuchungen kamen drei verschiedene Antikörper der Firma SantaCruz Biotechnology, Inc. zum Einsatz, die sich gegen spezifische G-

Proteinuntereinheiten richten: Anti-Gαolf (sc-387), Anti-Gαo (sc-385) und Anti-Gαi2 (sc-7276). Es handelt sich dabei um affinitätsgereinigte, polyclonale Antikörper aus Kaninchen, wobei Anti-

Gαo und Anti-Gαolf gegen divergente Domänen eines Ratten-G-Proteins gerichtet sind und Anti-

Gαi2 gegen ein Epitop aus humanem G-Protein.

3.6.1 Antikörper-Funktionstest

Die ordnungsgemäße Funktion der Antikörper (Anti-Gαolf, -Gαo, -Gαi2; s. o.) wurde mithilfe von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) und anschließender Immunmarkierung an Western Blots überprüft, zudem wurde ermittelt, ob die Größen der detektierten Banden bzw. Proteine mit denen bereits beschriebener G-Proteinuntereinheiten korrelierten (Gαolf – 45 kDa; Gαo – 40 kDa;

Gαi2 – 41 kDa; Datenblatt Fa. SantaCruz Biotechnology, Inc.). Dafür wurden Gewebeproben (s. u.) von B. orientalis und X. borealis genutzt, wobei Letztere vor allem in Vorversuchen eingesetzt wurden. Nach der Dekapitierung wurden unter Zuhilfenahme eines Stereomikroskops Proben der Geruchsepithelien und der Gehirne frisch entnommen. Die Nasenhöhlen wurden i. d. R. vollstän- dig, zusammen mit umliegendem Gewebe und separat vom Gehirn behandelt. Bei B. orientalis wurden in einem Ansatz jeweils die rechten und linken vorderen Nasenhöhlenanteile inklusive RO und VNO gesondert von den rechten und linken hinteren Haupthöhlenanteilen und dem Gehirn bearbeitet. Das jeweilige Gewebe wurde in Eppendorf-Cups in 2-fach konzentrierten (2x-) Laemmli-Puffer überführt, direkt im Reaktionsgefäß mit einer Schere grob zerkleinert, mit einem Vortexer homogenisiert und fünf Minuten lang auf 95 °C erhitzt. Um den Erfolg der Lyse zu prüfen, wurde anschließend ein 10%iges Polyacrylamidgel mit den Proben beladen. Zudem wurde ein Marker (PageRulerTM) aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Sammelgel verworfen. Das Trenngel wurde in entsalztes Wasser gelegt und eine halbe Minute gekocht. Anschließend erfolgte eine Coomassie-Brillant-Blau- (CBB-) Färbung mit 0,1%iger Lösung über Nacht auf einem Schüttler. Nach dem Abspülen der überflüssigen Farblösung wurden die Ergebnisse mithilfe eines Scanners dokumentiert. Für den die Immunmarkierung vorbereitenden Western Blot im Anschluss an die SDS- PAGE wurden unterschiedliche Protokolle probeweise durchgeführt (siehe Anhang), wobei sich wegen der besseren Signalverstärkung „Variante II“ als zielführend erwies. Hierbei werden die 3 Material und Methoden 35 nach Größe aufgetrennten Proteine mithilfe einer wet-Blot-Apparatur von dem Gel auf eine Trägermembran (polyvinylidene difluoride; PVDF-Membran) transferiert. Dabei wurden das Gel und die Membran, auf welche die Proteine elektrophoretisch übertragen werden sollten, zwischen Filterpapier und Schaumstoff gelegt und zwischen eine Kathode und eine Anode eingespannt. Dieser Aufbau wurde in die mit Transferpuffer gefüllte Blotting-Apparatur eingesetzt. Nach dem Transfer (1 h; 350 mA; 100 V) diente die Färbung der Gele mit CBB der Kontrolle des Proteinübertrags. Die auf die PVDF-Membran übertragenen Proteine wurden mithilfe der oben genannten Antikörper sondiert. Dazu erfolgte zunächst eine eineinhalbstündige Blockierung in Milchpulver

(4 %) in PBS und, im Fall von Anti-Gαo, ein zweifaches Spülen in PBS mit 0,05 % Tween® 20 (PBST20). Darauf folgte die Inkubation mit den jeweiligen Primärantikörpern über Nacht bei

4 °C, wobei die Anti-Gαolf und Anti-Gαi2 enthaltenden Lösungen wiederum mit 4 % Milchpulver versetzt waren. Überschüssige Antikörper wurden in einem Spülschritt von drei mal 10 Minuten in PBST20 abgespült. Bei dem Sekundärantikörper handelte es sich um einen HRP-gekoppelten Anti-Kaninchen Antikörper, der in PBSM (1 %) gelöst für eine Stunde aufgetragen wurde. Nach erneutem Spülen erfolgte unter Rotlicht die Luminol-basierte Detektion durch Hinzufügen des Western LightningTM Chemilumineszenz-Substrats. Das hieraus resultierende Signal wurde nach Inkubationszeit von einer Minute auf Röntgenfilm aufgenommen. Die Belichtungszeit betrug dabei zwischen drei und 30 Minuten. Daraufhin wurde der Film entwickelt, fixiert und getrocknet. Die Proteine auf der Membran wurden abschließend mithilfe von Amidoschwarz- Lösung gefärbt.

3.6.2 Immunmarkierung mit Anti-Gαolf, -Gαo und -Gαi2

Mithilfe der Antikörper gegen die G-Proteinuntereinheiten Gαolf, Gαo und Gαi2 wurden die Geruchsepithelien von B. orientalis immunhistochemisch untersucht. Zum Vergleich wurden auch hier Gewebeproben von X. borealis herangezogen. Nach der Dekapitierung der Tiere wurden die Nasenhöhlen im Ganzen auf Eis herauspräpariert. Zur Fixierung wurden im Rahmen von Vorversuchen die Fixanzien „Bouin’sches Gemisch“ und „Zambonis Fixativ“ aus einer Reihe von Fixierlösungen (siehe Anhang) ausgewählt, da sie gleichermaßen eine befriedigende Gewebserhaltung als auch die Epitop-Zugänglichkeit im Gewebe für die Antikörper sicherstellten. Im Anschluss an die Fixierung folgten die standardmäßige Einbettung des Gewebes in Paraffin und die Herstellung von Paraffinschnitten (s. o.). Neben der Auswahl eines geeigneten Fixans waren weitere Anpassungen des Versuchsprotokolls nötig, um bestmögliche Resultate zu erzielen. So wurden in zeit- und arbeitsintensiven Vorversuchen die im Folgenden beschriebenen Arbeitsschritte auf die hier 3 Material und Methoden 36 genutzten Antikörper und Gewebe abgestimmt (s. Anhang). Der Peroxidaseblock dient der Inaktivierung im Gewebe vorhandener (endogener) Peroxidase, sodass es bei peroxidase-vermittelten Nachweisreaktionen nicht zu falsch positiven Ergebnissen kommt. Zu diesem Zweck wurden die Präparate für zehn Minuten mit 3%igem Wasserstoffperoxid in Methanol überschichtet. Anschließend folgten zwei Spülschritte in PBS. Die Präinkubation dient dem Absättigen unspezifischer Bindestellen, sodass die Antikörper diese möglichst nicht besetzen, also weniger Hintergrundfärbung auftritt. Um dies zu erreichen, wurden normal goat serum (NGS, Normalserum aus Ziegen) und bovine serum albumin (BSA, Normalserum aus Rindern) in PBST einzeln und in Kombination eingesetzt. Dabei wurden sowohl die prozentualen Anteile des Detergens und der eingesetzten Antiseren, als auch die Inkubationszeit variiert, um ein optimales Ergebnis zu erzielen. Der jeweilige Primärantikörper wurde in PBST gelöst verwendet. Zunächst wurde experimentell eine geeignete Primärantikörperkonzentration ermittelt. Der Lösung wurden zusätzlich BSA und/oder NGS zugesetzt. Auch hier galt es ein Mischungsverhältnis zu erarbeiten, welches eine möglichst spezifische Antikörperbindung zur Folge hatte. Die Inkubation fand über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtkammer statt. Im Anschluss an die Inkubation folgten drei Spülschritte in PBS oder PBST. Es kamen verschiedene Sekundärantikörper zum Einsatz: ein biotingekoppelter (goat anti-rabbit) aus einem gebrauchsfertigen VECTASTAIN® Elite® ABC System, ein peroxidase- gekoppelter (Anti-Kanin-HRP [sic] aus Ziege) und ein fluoreszenzmarkierter (goat anti-rabbit Cy3) Antikörper. Die Sekundärantikörperinkubation fand ebenfalls in der Feuchtkammer statt. Dafür wurden die Schnitte 30 Minuten lang mit der jeweiligen Antikörperlösung überschichtet. Überschüssige Lösung wurde anschließend in drei Spülschritten in PBS entfernt. Zunächst wurde auch hier experimentell eine geeignete Konzentration des Antikörpers ermittelt. Anschließend wurde, analog zum oben beschriebenen Vorgehen, das Ergebnis durch Variieren der Anteile der Antiseren und des Detergens optimiert. Bedingt durch die unterschiedlich markierten Sekundärantikörper kamen verschiedene Verfahren zum Nachweis und zur Dokumentation der Färbungen zum Einsatz. Präparate, welche mit fluoreszierendem sekundären Antikörper behandelt worden waren, wurden analog zu weiter oben beschriebenen Verfahren mit einer aufsteigenden Alkoholreihe und Roticlear® entwässert und mit Entellan® eingedeckt. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte am KLSM, dabei wurde mit HeNe (543 nm) angeregt und ein Wellenlängenbereich von 555 nm bis 585 nm detektiert. Paraffinschnitte, welche mit HRP-gekoppeltem Sekundärantikörper behandelt worden 3 Material und Methoden 37 waren, wurden mit dem Chromogen Vector® NovaREDTM gefärbt. Die Reaktion wurde durch fünfminütiges Spülen mit destilliertem Wasser gestoppt, je nach Stärke der Reaktion nach 2 – 15 Minuten. Es folgte ein zweiter, ebenfalls fünfminütiger Spülschritt in a. dest. sowie Entwässerung und Eindecken wie oben beschrieben. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte mittels konventioneller Lichtmikroskopie wie oben beschrieben. Der avidingekoppelte Antikörper wurde mit dem dazugehörigen VECTASTAIN® Elite® ABC System nachgewiesen. Dazu wurden die Avidin-Lösung und die biotinylierte Meerrettichperoxidase aus dem Kit nach Herstellerangaben gemischt. Nach 30 Minuten war die Mischung gebrauchsfertig, so lange dauert es mindestens, bis sich der Avidin-Biotin- Enzymkomplex bildet. Die Einwirkzeit auf den Schnitten betrug ebenfalls 30 Minuten. Es folgten drei Spülschritte in PBS, bevor das Chromogen aufgetragen wurde. Die weiteren Schritte entsprachen dem oben beschriebenen Vorgehen. 4 Ergebnisse 38

4 Ergebnisse

4.1 Histologie der Geruchssinnesepithelien: Paraffinschnitte

4.1.1 Bombina orientalis Das Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans von B. orientalis setzte sich aus den bekannten und oben beschriebenen Zelltypen, namentlich den Stütz-, Sinnes- und Basalzellen zusammen. Diese Zelltypen waren in der typischen Art und Weise angeordnet, sodass sich die daraus resultierende ebenfalls bereits angesprochene optische Zonierung mithilfe der histologischen Übersichtfärbung lichtmikroskopisch deutlich beobachten bzw. darstellen ließ (Abb. 4.1 A,B). Dabei färbte sich das Cytoplasma sämtlicher Zellen blau, die Zellkerne jedoch rot bis rötlich-violett. Davon abweichend färbten sich etwa 1/3 bis die Hälfte der Basalzellkerne violett-bläulich. Darüber hinaus wurde ein interessanter Befund ausgerechnet an scheinbar unzureichend fixiertem Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans erhoben (Abb. 4.1 B): Der apikale zellkernfreie Bereich wies Risse oder sogar Löcher auf und war teilweise völlig zerstört. Gleichzeitig zeigten die übrigen Bestandteile dieses Epithels sowie insbesondere der Recessus olfactorius und das VNO keinerlei Schäden. Auch der allgemeine Bau des Recessus olfactorius (Abb. 4.1 B, C-E) stellte sich lichtmikroskopisch betrachtet wie erwartet dar (vgl. Nowack 2008, Jordan 2010, Wittmer 2011). Es ließen sich analog zu den anderen beiden Geruchsorganen gewisse Zonen im Epithel beobachten: Eine Mucusschicht (fehlt im VNO), Zellfortsätze, ein apikaler zellkernfreier Bereich sowie die der Basallamina anliegenden Basalzellen waren deutlich erkennbar. Zwei Aspekte fielen jedoch bei genauerer Analyse des Epithels auf: Zum einen wurden im distalen Bereich des Epithels in erster Linie (allerdings nicht ausschließlich) zwei Zell- bzw. Zellkerntypen beobachtet. Einer war rundlich-oval und vergleichsweise groß, stellte sich manchmal (je nach verwendeter Fixierung und Färbedauer) blass-bläulich oder nahezu ungefärbt dar und war vor allem im caudalen Bereich des RO von viel Cytoplasma umgeben. Zudem wurden schmale, spindel- oder tropfenförmige Zellkerne nah an der distalen Zellgrenze beobachtet, allerdings fand sich diese Kernform auch in weiter proximal gelegenen Abschnitten des Epithels. Auffällig war zudem, dass der letztgenannte Kerntyp sich unter bestimmten Voraussetzungen (Schaffer- Fixierung und Azanfärbung) rötlich färbte und sich somit deutlich von den übrigen bläulichen Kernen abhob, unter anderen Bedingungen (Bouin-Fixierung und Azanfärbung) jedoch nicht (vgl. Abb. 4.1 D und E). In basaler Richtung folgte auf diese Zone ein Bereich mit Zellkernen, die sehr dicht 4 Ergebnisse 39

Abbildung 4.1. Olfaktorische Sinnesepithelien von B. orientalis, Azanfärbung nach Petersen. Fixierung mit Bouin (A), Alkohol-Formollösung nach Schaffer (B,E) oder Zambonis Fixativ (C,D,F). A: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. Die Pfeile weisen auf rot bzw. blau gefärbte Basalzellkerne. B: Hauptge- ruchsorgan und Recessus olfactorius nach unzureichender Fixierung. C-E: Recessus olfactorius. D: Ausschnitt aus C. Die Pfeilspitzen weisen auf dendritenähnliche Strukturen, die Sterne (*) markieren unregelmäßig geformte Zellkerne. F: Vomeronasalorgan. BD: Bowman’sche Drüsen, BG: Blutgefäß, BZ: Basalzellen, C: Cilien, FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FR: Fila olfactoria des Recessus olfactorius, FV: Fila olfactoria des Vomeronasalorgans, gaN: große apikale Nuclei, Goi: Gl. nasalis oralis interna, Gm: Gl. nasalis medialis, M: Mucus, OR: Zellkern bzw. Zone der Zellkerne der olfaktorischen Rezeptorzellen, PZ: Pigmentzelle, RO: Recessus olfactorius, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, sN: spindelförmige Nuclei, SZ: Stützzellkern, TF: Terminalfilm, Zf: Zellfortsätze. Maßstäbe: A,B: 100 µm, C,E,F:50 µm, D: 20 µm. 4 Ergebnisse 40 aneinander gepackt waren, was eine exakte Analyse dieses Abschnitts anhand der histologischen Querschnitte verkomplizierte. Viele dieser Zellkerne ähnelten zwar optisch denen der olfaktorischen Sinneszellen im HG, dazwischen wurden jedoch zahlreiche unregelmäßig geformte Zellkerne beobachtet. Teilweise entstand dieser Eindruck dadurch, dass sehr lang gestreckte Zell- kerne sich in enger räumlicher Beziehung befanden und sich umeinander zu legen schienen, was jedoch erst bei sorgfältiger Betrachtung sämtlicher Schärfeebenen der einzelnen Schnittpräparate ersichtlich wurde. In anderen Fällen erschienen die Zellkerne tatsächlich unregelmäßige, kantige Formen zu besitzen. Die Darstellung solcher Kerne wurde allerdings aufgrund inhomogener Fär- beeigenschaften insbesondere bei nach Schaffer fixiertem Material erschwert: Sie blieben weitestgehend blass und z. T. sogar farblos, sodass sie zunächst unerkannt blieben (Abb. 4.1 B,E). Die Kombination von Zambonis-Fixierung und Petersens Azan lieferte diesbezüglich deutlich bessere Resultate (Abb. 4.1 C,D). Durch die heterogene Erscheinung der Zell- bzw. Zellkern- formen unterschied sich der Recessus olfactorius nicht nur vom Sinnesepithel des HG, sondern stellte sich auch deutlich anders dar als das vomeronasale Sinnesepithel und das MCE (s. u.). Das vomeronasale Sinnesepithel (Abb. 4.1 F) stimmte in seinem Aufbau aus Basal-, Stütz- und Sinneszellen mit der in der Fachliteratur (vgl. z. B. Matthes 1934; Døving und Trotier 1998) beschriebenen Architektur vollkommen überein und bedarf an dieser Stelle keiner gesonderten Beschreibung.

4.1.2 Xenopus borealis Die Zytoarchitektur der Sinnesepithelien des Hauptgeruchsorgans und des Vomeronasalorgans von X. borealis entsprach vollständig der in der Fachliteratur beschriebenen Situation (vgl. Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998) und wird daher an dieser Stelle nicht gesondert erörtert. Der Bau des middle chamber epithelium (Abb. 4.2 A,B) soll jedoch zu Vergleichszwecken mit dem Recessus olfactorius kurz dargelegt werden. Ähnlich wie für den RO beschrieben, traten im MCE in Abhängigkeit von der eingesetzten Fixierlösung unterschiedliche Färbeeigenschaften des Gewebes hervor. Unter anderem betraf dies bestimmte Zellkerne bzw. -typen, so lagen im MCE im distalen Bereich ebenfalls zwei Kernformen vor (Abb. 4.2 B): Große länglich-runde Nuclei, die sich besonders gut nach Bouin-Fixierung und Azanfärbung darstellten, sowie schmale Nuclei, die sich vorwiegend nach Schaffer-Fixierung und Azanfärbung beobachten ließen. In den proximalen Abschnitten des MCE herrschte im Gegensatz zur Situation im RO eine nahezu kreisrunde Kernform vor. Zudem fiel auf, dass die Kerne des MCE wesentlich kleiner waren, als die des RO (vgl. Abb. 4.2 B,C). 4 Ergebnisse 41

Abbildung 4.2. Middle chamber epithelium von X. borealis (A,B) im Vergleich zum Recessus olfactorius (C). A: Bouin-Fixierung. B: Schaffer-Fixierung. Pfeilspitzen weisen auf axonähnliche Strukturen. C: Schaffer-Fixierung. BG: Blutgefäß, BZ: Basalzellen, gaN: große apikale Nuclei, OR: Zone der Zellkerne der olfaktorischen Rezeptorneurone, M: Mucus, sN: spindelförmige Nuclei, ZF: Zellfortsätze. Maßstäbe: A: 100 µm, B,C: 25 µm. 4 Ergebnisse 42

4.2 Histologie der Geruchssinnesepithelien: Semidünnschnitte Mithilfe der Semidünnschnitt-Präparate konnten gegenüber den Paraffinschnitt-Präparaten deutlich mehr morphologische Details der Geruchssinnesepithelien beobachtet werden. Im Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans (Abb. 4.3) ließen sich die Stütz-, Basal- und Sinneszellen grundsätzlich zweifelsfrei identifizieren, ebenso die intraepithelial liegenden Bowman’schen Drüsen. Die Stützzellen enthielten im distalen Abschnitt zwischen ihrem Zellkern und der Zellgrenze in der Regel zahlreiche, dunkel gefärbte Sekretgranula. Diese Granula wurden teilweise auch extrazellulär, in einem abgegrenzten Raum oberhalb der Stützzellen, beobachtet (Abb. 4.3 B-E). Den Rahmen für diesen Raum formten scheinbar die langen Cilien der Neuronen (Abb. 4.3 C), welche proximal annähernd senkrecht stehen und distal ein waagerecht zur Oberfläche liegendes Netzwerk bildeten. Dabei waren die Cilien teilweise in Mucus eingebettet. Mikrovilli konnten lichtmikroskopisch nicht beobachtet werden.

Abbildung 4.3. Hauptgeruchsorgan B. orientalis, Schnittdicke 0,5 µm. A: Übersicht. B-D: Apikaler Bereich des Epithels. E: Basaler Bereich des Epithels. Pfeilspitzen: Basalmembran, Pfeile: Axon. BD: Bowman’sche Drüsen, BZ: Basalzellen, C: Cilien, D: Dendriten, EK: Endknöpfchen, N: Nuclei der Sinnes- zellen, OR: Zone mit Zellkörpern der olfaktorischen Rezeptorneurone, S: Stützzellnuclei, SG: Sekretgranula, SR: Sekreträume oberhalb der Stützzellen, SZ: Zone der Kerne der Stützzellen, TF: Terminalfilm. Maßstäbe: A: 100 µm, B,D,E: 20 µm, C: 10 µm.

Die Zellkerne der Stützzellen und der olfaktorischen Neuronen unterschieden sich anhand ihrer Färbeeigenschaften: Die Kerne der Stützzellen erschienen hell mit dunkler Marmorierung, 4 Ergebnisse 43 die Kerne der Sinneszellen färbten sich insgesamt intensiver (dunkler) sodass die Strukturierung des Kernplasmas weniger in den Vordergrund trat (Abb. 4.3 E). Die Basalzellen wiesen ebenfalls unterschiedlich gefärbte Zellkerne auf, zudem fielen deren Nuclei durch ihre Formenvielfalt auf (Abb. 4.3 E). Im Recessus olfactorius (Abb. 4.4) wurden neben den Basalzellen eine Reihe verschieden gestalteter Zelltypen bzw. apikaler Zellabschnitte beobachtet. Ein Zelltyp (1) fiel durch Anhäufungen supranucleärer (Sekret-) Granula auf. Die Nuclei dieser Zellen lagen auf unterschiedlichen Höhen im Epithel; ihre Färbeeigenschaften schienen denen der Stützzellkerne des HG zu ähneln. Die Oberfläche der Zellen wölbte sich zum Teil über die der übrigen Zellen des RO. Die Granula selbst unterschieden sich von denen der Stützzellen im HG: Sie besaßen einen deutlich geringeren Umfang, waren wesentlich zahlreicher und nahmen eine blassere Farbe an. Die Form der Zelle stellte sich oberhalb des Nucleus zylindrisch dar, bei einer Breite von etwa 5 µm – insbesondere bei Zellen mit weit distal gelegenem Kern wurden auch Breiten von bis zu 10 µm nachgewiesen (Abb. 4.4 D). Es wurden bei diesem Zelltyp keine Oberflächenstrukturen beobachtet. Ein weiterer Zelltyp (2) zeichnete sich durch voluminöse rundliche Zellkerne aus, die häufig von viel Zytoplasma umgeben waren und sich in erster Linie nahe der distalen Zellgrenzen befanden. Die Kerne dieser Zellen färbten sich gleichmäßig und wiesen kaum dunklere Strukturen auf. Das Zytoplasma enthielt teilweise vesikelförmige ungefärbte Bereiche. Die Breite dieser Zellen betrug an der weitesten Stelle etwa 10 µm bei einer (inklusive des Kerns) annähernd zylindrischen bis becherförmigen Gestalt. An ihrer Oberfläche besaßen die Zellen vom Typ 2 cilienartige, senkrecht vom Epithel abstehende Zellfortsätze. Ein weiterer Zell- bzw. Oberflächentyp (3) mit Cilien ließ sich vom eben beschriebenen durch seine wesentlich geringere Breite deutlich abgrenzen. Leider bedingte die Breite von etwa 1-3 µm, dass es nicht möglich war, diesem Zelltyp eindeutig bestimmte Zellkerne zuzuordnen, denn die Zelle wurde an keiner Stelle auf ganzer Länge angeschnitten. Hinzukommend wurden auf allen Ebenen des Sinnesepithels auffällige, dunkel gefärbte und unregelmäßig geformte Zellkerne beobachtet. In den meisten Fällen besaßen diese Zellen (Zelltyp 4) ein kräftig angefärbtes Zytoplasma, zum Teil wurden darin helle Vakuolen beobachtet (Abb. 4.4 C). Für weiter apikal gelegene Kerne gelang es, den schmalen Ausläufer der Zelle bis zur Oberfläche des Epithels zu verfolgen, wo sie sich leicht verbreiterte und in langen, ebenfalls dunkel gefärbten Cilien auslief. Der 5. Zelltyp wies keinerlei lichtmikroskopisch beobachtbare Zellfortsätze auf und besaß im apikalen Bereich lediglich eine Breite von 1-2 µm. Auch hier war es wegen der 4 Ergebnisse 44 geringen Breite nicht möglich, die Zelle auf ganzer Länge durch das Epithel zu verfolgen und ihr Zellkerne zuzuordnen.

Abbildung 4.4. Zelltypen (1-5) im Recessus olfactorius, B. orientalis, Schnittdicke 0,5 µm. A: Übersicht. B: Übersicht, stärkere Vergrößerung. Kurze Pfeile: Axonartige Zellfortsätze. Die Sterne (*) markieren spindelförmige Zellleiber. C: Detail des apikalen Bereichs. Pfeilspitze: Zelltyp 4 mit dunkler Färbung, unregel- mäßigem Kern und Cilien. D: Apikaler Bereich, Schnitt etwas caudal zu C. Pfeilspitzen: Zelltyp 4, die rechte Zelle entspricht der markierten Zelle aus C. Stern (*): spindelförmiger Zellleib. 1: Zelltyp mit Sekretgranula, 2: Zelltyp breit mit Cilien, 3: Zelltyp schmal mit Cilien, 4: Zelltyp schmal, dunkel, Kern unregelmäßig, Cilien, 5: Zelltyp schmal, ohne Cilien. BG: Blutgefäß, BZ: Basalzellkerne, gaN: große apikale Nuclei, PZ: Pigmentzelle, Sterne (*): Kerne unbestimmten Zelltyps. Maßstäbe: A: 100 µm, B: 20 µm, C,D: 10 µm.

Insbesondere in der unteren Hälfte des Epithels vorliegende Zellkerne konnten keinem der oben genannten Zell- bzw. Oberflächentypen zugeordnet werden. Durch axonähnliche Zellausläufer und konisch zulaufende supra- und supernucleäre Zellabschnitte wirkten diese 4 Ergebnisse 45

Zellen insgesamt spindelförmig. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von mehr Zelltypen als den hier genannten anhand der lichtmikroskopisch erhobenen Daten nicht ausgeschlossen werden. Die Basalzellen bzw. deren Nuclei waren, ebenso wie im HG und VNO unterschiedlich gestaltet. Es fiel jedoch auf, dass zahlreiche Basalzellkerne sehr groß waren, so waren Durchmesser von 10 µm oder mehr keine Seltenheit.

Tabelle 4.1. Beobachtbare Zelltypen des Recessus olfactorius, B. orientalis. Die Existenz weiterer Zelltypen kann nicht ausgeschlossen werden. Zelltyp Lage des Zellkerns Oberfläche Besonderheit 1 alle Ebenen nicht beobachtbar Sekretgranula 2 distal Cilien großer Zellkern, Cytoplasmareich Oberflächen-, 3 nicht beobachtbar Cilien geringe Zellbreite (1-3 µm) bzw. distale unregelmäßig geformter Zellkern, Differenzierungen 4 alle Ebenen Cilien sehr dunkle Markierung 5 nicht beobachtbar nicht beobachtbar geringe distale Zellbreite (1-2 µm) alle Ebenen, dendriten- oder axonähnliche „spindelförmig“ schwerpunktmäßig nicht beobachtbar Zellausläufer Zellkörper untere Hälfte heterogenes Erscheinungsbild, sehr Basalzellen proximal - große Zellkerne

Im VNO (Abb. 4.5) ließen sich sowohl die Stützzellen als auch die Sinneszellen anhand ihrer Zelloberflächen identifizieren. So trugen die Stützzellen deutlich sichtbare Cilien und die Sinneszellen ragten ein wenig über die Oberfläche des Epithels hinaus, wobei die Mikrovilli lichtmikroskopisch nicht darstellbar waren. Zudem wurden vereinzelt Zellen beobachtet, deren Gestalt von den übrigen Zellen abwich: Im apikalen Areal des Epithels lagen große runde Kerne, umgeben von vergleichsweise viel Cytoplasma und ohne sichtbare Verbindung zur Epitheloberfläche.

Abbildung 4.5. Vomeronasales Sinnesepithel, B. orientalis, Schnittdicke 0,5 µm. A: Übersicht. B: Apikaler Bereich. Die Pfeile weisen auf sensorische Zellen. BG: Blutgefäß, BZ: Basalzellen, C: Cilien, FV: Fila olfactoria des VNO, gaN: großer apikaler Nucleus, PZ: Pigmentzellen, S: Stützzellkern. Maßstab: A: 100 µm, B: 25 µm. 4 Ergebnisse 46

4.3 Lektinhistochemie

4.3.1 Bombina orientalis Die Analyse der Lektinfärbungen soll sich in der vorliegenden Arbeit auf Strukturen konzentrieren, die direkt mit den olfaktorischen Systemen assoziiert sind. Hierzu zählen neben den eigentlichen Sinnesepithelien auch die entsprechenden Nervenbahnen, Hirnabschnitte und nasalen Drüsen. Neben diesen Strukturen banden die Lektine meist auch an Drüsen der Körperhaut und innerhalb der Mundhöhle (Abb. 4.6).

Abbildung 4.6. Querschnitt der Nasenregion von B. orientalis nach Lektinfärbung mit HRP-markiertem DBA. Die leicht schräge Schnittführung erlaubt rechts den Blick auf die Situation auf Höhe des Recessus olfactorius und links auf Höhe des Vomeronasalorgans. Ane: Apertura nasalis externa, FE: Flimmerepithel im Cavum medium, Gd: Gaumendach, Gi: Glandula intermaxillaris, Gm: Glandula nasalis medialis/Jacobsonsche Drüse, Goi: Glandula nasalis oralis interna, KD: Körnerdrüsen, RO: Recessus olfactorius, SD: Schleimdrüsen, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, TF: Terminalfilm, vSE: vomeronasales Sinnesepithel, (*): Nervenfasern der drei Geruchsepithelien. Maßstab: 300 µm.

Dolichos biflorus Agglutinin (DBA), HRP- und rhodamingekoppelt

Olfaktorische Sinnesepithelien Im Hauptgeruchsorgan (HG; Abb.4.7 A–C, 4.8 A) ließ sich mittels beider DBA-Varianten eine kräftige Färbung im apikalen Drittel des Sinnesepithels darstellen, direkt oberhalb der versetzt liegenden Stützzellkerne. Besonders deutlich gefärbt war hierbei ein schmaler Saum an der apikalen Epithelgrenze, der sich innerhalb der Epithelzellen befand. Der Terminalfilm mitsamt der dendritischen Zellfortsätze war dagegen schwach bis moderat gefärbt. Die unteren zwei Drittel des Epithels wiesen bei Färbung mit DBA-Rhodamin mit Ausnahme weniger einzeln liegender, punktförmiger Strukturen lediglich eine leichte Hintergrundtönung auf. Diese Hintergrundtönung stellte sich bei Verwendung von HRP-markiertem DBA deutlich kräftiger dar. 4 Ergebnisse 47

Abbildung 4.7. Geruchsorgane von B. orientalis nach Lektinfärbung mit rhodamingekoppeltem (links, Mitte) bzw. HRP-markiertem DBA (rechts). A und D zeigen exemplarisch mittels KLSM generierte Maximalprojektionen, B und E invertierte Maximalprojektionen, C und F lichtmikroskopische Aufnahmen. A-C: Haupthöhle mit den gefärbten Epithelien des Hauptgeruchsorgans und des Recessus olfactorius. Unterhalb der Haupthöhle liegt die Glandula nasalis oralis interna. Die Pfeilspitzen weisen auf Bowman’sche Drüsen. D-E: Cavum inferius mit dem vomeronasalen Sinnesepithel und daran anliegender Glandula nasalis medialis sowie darüber liegendem Cavum medium mit kräftig gefärbtem Flimmerepithel. Die Sterne (*) in E markieren dem VNO zuzuordnende Nervenfaserbündel. Ane: Apertura nasalis externa, FE: Flimmerepithel, Goi: Gl. nasalis oralis interna, Gm: Gl. nasalis medialis, RO: Recessus olfactorius, SE: Sinnesepithel des HG, sVE: Sinnesepithel des Vormeronasalorgans, TF: Terminalfilm, Pfeilspitzen: Bowman’sche Drüsen, (*): Nervenfaserbündel. Maßstäbe: 100 µm.

Im Sinnesepithel des Recessus olfactorius (RO) (Abb. 4.7 A–C, 4.8 B) wurde die kräftigste Färbung ebenfalls im distalen Abschnitt des Epithels beobachtet. Dort zogen markierte Strukturen innerhalb des Zytoplasmas vieler Epithelzellen annähernd v-förmig von der apikalen Zellgrenze in proximaler Richtung etwa bis auf die Höhe der obersten Reihe von Zellkernen. Eine vergleichbar kräftige Färbung trat an der Zelloberfläche im Bereich der Zellfortsätze auf.

Abbildung 4.8. Detaildarstellung der drei Geruchsepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit DBA-HRP. A: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. Weiße Pfeilspitzen: Stützzellkerne. B: Recessus olfactorius. Pfeile: Epi- thelzellen mit gefärbten Zellfortsätzen. C: Sinnesepithel des Vomeronasalorgans. Pfeilspitze: Apikale Zellgrenzen. BD: Bowman’sche Drüsen. Maßstäbe: 50 µm. 4 Ergebnisse 48

Hierbei schien es sich um senkrecht stehende Cilien zu handeln, die sowohl oberhalb gefärbter als auch ungefärbter Epithelzellen zu beobachten waren. Der Großteil des Epithels blieb bis auf vereinzelte punktförmige Strukturen ungefärbt (Rhodamin) bzw. wies schwachen Hintergrund auf (HRP). Im Vomeronasalorgan (VNO) (Abb. 4.7 D–F, 4.8 C) wurde unter Verwendung von DBA-Rhodamin lediglich eine minimale Schattierung an der distalen Grenze des Epithels beobachtet. Unter Verwendung von HRP-markiertem DBA (Abb. 4.7 F, 4.8 C) stellte sich das gesamte Sinnesepithel schwach markiert dar, wobei hier deutlichere Färbungen an der apikalen Zellgrenze und den Zellfortsätzen auftraten.

Abbildung 4.9. Olfaktorische Nerven und Riechhirn von B. orientalis. Oben DBA-Rhodamin, unten DBA-HRP. A: Haupthöhle mit markiertem Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans und Bowman’schen Drüsen. Unterhalb des Epithels liegen die unmarkierten Nervenfaserbündel (*). B: Links im Bild caudales Ende der Haupthöhle, rechts daneben der ungefärbte Riechnerv. C: Olfaktorische Bulben mit gefärbter Glomerulischicht. D: Akzessorische olfaktorische Bulben der rechten und linken Hirnhälfte, mit ebenfalls markierter Glomerulischicht. äpS: äußere plexiforme Schicht, aoB: Akzessorische olfaktorische Bulben, BD: Bowman’sche Drüsen, GS: Glomerulischicht, MS: Mitralzellschicht, Nv: Nervus vomeronasalis, RN: Riechnerv, SE: Sinnesepithel des HG, V: Ventrikel. Maßstäbe: 100 µm.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Die Axone und die sich daraus zusammensetzenden Nerven aller drei Geruchsepithelien blieben bei Einsatz von Rhodamin-markiertem DBA vollständig ungefärbt (Abb. 4.9 A,B). Ebenso verhielt es sich mit dem olfaktorischen Hauptbulbus (main olfactory bulb - MOB) und dem akzessorischen Bulbus (accessory olfactory bulb – AOB; o. Abb.). Im Unterschied dazu wurde nach Verwendung von DBA-HRP eine schwache Färbung in den Nervenfaserbündeln der drei Geruchssinnesepithelien beobachtet. Zudem zeigten auch der olfaktorische Haupt- und 4 Ergebnisse 49

Nebenbulbus eine deutliche Färbung innerhalb der Glomerulischichten (Abb. 4.9 C,D).

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen (Glandulae olfactoriae) blieben, unab- hängig vom genutzten Nachweissystem, weitestgehend ungefärbt. Lediglich im anterioren Abschnitt der Haupthöhle wurden einige Bowman’sche Drüsen mit einer leichten Färbung des Zytoplasmas beobachtet (Abb. 4.7 C, 4.8 A). Die mit dem RO assoziierte Gl. Abbildung 4.10. Laterale Nasendrüse von B. orienta- nasalis oralis interna nahm eine deutliche Färbung an (Abb. 4.7). lis nach Behandlung mit DBA-HRP. Das Flimmerepithel bzw. die Becherzellen, welche den RO FE: Flimmerepithel, L: gegenüber dem HG abgrenzen, war kräftig angefärbt (Abb. 4.7 A–C). Lumen. Maßstab: 50 µm. Dies galt insgesamt für das nichtsensorische Epithel der Nasenhöhle, welches unter anderem das Cavum medium auskleidet (Abb. 4.7 D–F). Unterschiede bezüglich des verwendeten Nachweissystems zeigten sich bei der Jacobson’schen Drüse (Gl. nasalis medialis, Abb. 4.7 D–F) und der Lateralen Nasendrüse (Gl. nasalis lateralis, Abb. 4.10): wurde rhodaminmarkiertes DBA genutzt, blieben die genannten Strukturen ungefärbt, bei HRP-konjugiertem DBA trat eine kräftige Färbung auf.

Concanavalin A (Con A), HRP- und fluoresceingekoppelt Das Lektin Concanavalin A (Con A) verursachte trotz Einsatz von BSA (vgl. Kapitel 3.5.1) eine relativ kräftige Hintergrundfärbung in allen ausgewerteten Geweben. Ein Nachweis-abhängiger Unterschied in den Ergebnissen trat – anders als beim zuvor beschriebenen DBA – nicht auf.

Olfaktorische Sinnesepithelien Die bereits angesprochene Hintergrundfärbung stellte sich besonders deutlich im olfaktorischen Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans dar (Abb. 4.11 A,B), so blieb dort kein Areal völlig farblos. Zudem enthielten im mittleren Abschnitt des Epithels zahlreiche Zellen dunkel angefärbte granulöse Strukturen oberhalb ihrer Nuclei. An der Oberfläche der das Epithel bedeckenden Schleimschicht waren vereinzelt dunklere Abschnitte zu beobachten. Im Recessus olfactorius (Abb. 4.11 C,D) konzentrierte sich die mit Con A erzielte Färbung eher in der unteren Hälfte des Epithels, wobei der Bereich der Basalzellen ungefärbt blieb. Innerhalb der markierten Zellen band das Lektin im zellkernnahen Cytoplasma, hierbei war eine dunklere Tönung insbesondere oberhalb der Zellkerne zu beobachten. Auch in Richtung Oberfläche ziehende, sich zum Teil sehr schmal darstellende Zellfortsätze waren gefärbt. Überdies wurden Zellen markiert, deren länglich geformte Kerne kurz unter der apikalen Zelloberfläche lagen (vgl. Abb. 4.11 C,D: apikale Nuclei). Innerhalb dieser Zellen wurde der 4 Ergebnisse 50

Bereich zwischen Nucleus und distaler Zellgrenze gefärbt. Im Vomeronasalorgan (Abb. 4.11 E,F) band das Lektin Con A hauptsächlich im Sinneszellzytoplasma im mittleren Abschnitt des Epithels, während apikal und basal ungefärbte Areale verblieben. Innerhalb der einzelnen Sinneszellen befand sich abermals eine kräftige Fär- bung um den Zellkern herum mit einem besonders stark gefärbten Bereich oberhalb des Zell- kerns. Dieser Kegel erstreckte sich in diesem Fall bis zur distalen Zelloberfläche. Die Oberfläche des Epithels blieb größtenteils ungefärbt, wobei im posterioren Abschnitt des VNOs scheinbar einige Mucusreste das Lektin banden (o. Abb.).

Abbildung 4.11. Detaildarstellung der drei olfaktorischen Sinnesepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit Con A, fluoresceinmarkiert (linke Spalte) und HRP-gekoppelt (rechte Spalte). A, B: Sinnesepithel des HG. Die schwarzen Pfeilspitzen weisen auf gebündelte Fila olfactoria. C, D: Sinnesepithel des RO. E, F: Sinnesepithel des VNO. Die Sterne (*) in A–F markieren Nervenfaserbündel unterhalb der jeweiligen Epithelien. Weiße Pfeilspitzen in B, D und F weisen auf die jeweils stärker gefärbten Areale über Zellkernen. aN: apikale Nuclei, BD: Bowman’sche Drüsen, ZF: Zellfortsätze (Dendriten). Maßstäbe: 50 µm. 4 Ergebnisse 51

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Das Lektin Con A rief eine Färbung in den Filae olfactoriae (FO) der drei olfaktorischen Sinnes- epithelien hervor, deren Intensität sich allerdings insgesamt auf dem Niveau der Hintergrund- färbung bewegte. Dies änderte sich sobald die Nervenfaserbündel das Riechhirn erreichten: die äußerste, aus den FO gebildete Schicht wies hier eine Färbung auf, ebenso wie der weiter nach caudal ziehende Nervus vomeronasalis. Im Riechhirn selbst trat eine kräftige Färbung in der Glomerulischicht sowohl im Haupt- als auch im akzessorischen Bulbus auf (Abb. 4.12).

Abbildung 4.12. Riechhirn von B. orientalis gefärbt mit Con A-Fluorescein. A: Implantationskegel des MOB. B: Weiter posterior gelegener Schnitt durch den MOB. C: Schnitt auf Höhe des akzessorischen olfaktorischen Bulbus. aoB: akzessorischer olfaktorischer Bulbus, GS: Glomerulischicht, Nv: Nervus vomeronasalis. Maßstäbe: 100 µm.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Das Cytoplasma der Bowman’schen Drüsenzellen (Abb. 4.11 A,B) war kräftig gefärbt. Dies wurde insbesondere im hinteren Teil der Nasenhaupthöhle deutlich, wo die Bowman’schen Drüsen sehr eng beieinander liegen. Zellen der Jacobson’schen Drüse (Abb. 4.13) enthielten deutlich gefärbte Granula, deren Dichte von basal nach apikal zunahm. In der lateralen Nasendrüse entsprach das Färbebild dem mit dem Lektin DBA erzielten (s. o.). Die Abbildung 4.13. Jacobson’sche Drüse von B. orientalis nach Be- nichtsensorischen Bereiche (Flimmerepithelien) innerhalb der handlung mit Con A-HRP. Nasenhöhlen zeigten heterogenes Färbeverhalten. So waren Ci: Cavum inferius, Gm: Gl. nasalis medialis (Jacobson’sche Drüse), M: Bereiche der Nebenhöhle zu beobachten (Abb. 4.13, Cavum Mucus, (*): Nervenfaserbündel des VNO. Maßstab: 50 µm. inferius) in denen nur wenige Zellen markiert worden waren, andere Bereiche wie das Vestibulum (o. Abb.) wiesen deutlich mehr gefärbte Bestandteile auf. Ungefärbt blieben die Gl. nasalis oralis interna sowie der Ductus nasolacrimalis (beide o. Abb.).

Peanut Agglutinin (PNA), fluoresceingekoppelt Das Lektin Peanut Agglutinin (PNA) lies sich in deutlich weniger Gewebe- bzw. Zelltypen 4 Ergebnisse 52 nachweisen als die beiden zuvor beschriebenen Lektine.

Olfaktorische Sinnesepithelien Das Sinnesepithel des HG im rostralen Abschnitt des Cavum principale (Abb. 4.14 A) wies in erster Linie eine kräftige Färbung der apikalen Zellfortsätze und des daran gebundenen Mucus auf. Innerhalb des Epithels ließen sich fluoreszierende Strukturen apikal nahe der Zellgrenzen detektieren. In caudaler Richtung nahm die Intensität und Anzahl der im Epithel gefärbten Strukturen zu, sodass optisch der Eindruck eines beinahe vollständig gefärbten Saums unter der apikalen Epithelgrenze entstand. Im RO (Abb. 4.14 A,C) wurden Zellen gefärbt, die schmal von basal nach apikal ziehen und sich im obersten Drittel des Epithels stark verbreitern. Daneben wurden bezüglich der Zellbreite gleichmäßiger geformte Zellen mit ebenso kräftiger Färbung beobachtet. Außerdem ließ sich stellenweise markierter Mucus beobachten (o. Abb.). Im VNO (o. Abb.) konnte keine Bindung von PNA nachgewiesen werden.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Sowohl die olfaktorischen Nerven als auch der MOB und AOB blieben unmarkiert (o. Abb).

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen (Abb. 4.14 A) blieben genauso ungefärbt wie die Gl. nasalis oralis interna und die Jacobson’sche Drüse (o. Abb). Einzig die laterale Nasendrüse wies eine Färbung auf, wobei sich hier Muster und Intensität nicht von den für DBA (s. o.) beschriebenen unterschieden. Kräftig markiertes Flimmerepithel befand sich im Recessus lateralis, bei sonst überwiegend ungefärbten nichtsensorischen Arealen.

Abbildung 4.14. Olfaktorische Sinnesepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit PNA-Fluorescein. A: Cavum principale mit Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans und des Recessus olfactorius. (*): Fila olfactoria. B: Vergrößerung aus A, Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. Pfeilspitzen weisen auf apikale Zellgrenzen des Epithels. C: Vergrößerung aus A, Sinnesepithel des Recessus olfactorius. Ane: Apertura nasalis externa, BD: Bowman’sche Drüsen, gZ: gleichmäßig gefärbte Zellen, M: Mucus, RO: Recessus olfactorius, SE: Sinnesepithel des HG, vZ: verbreiterte Zellen. Maßstab: 100 µm. 4 Ergebnisse 53

Ricinus communis Agglutinin (RCA 120), fluoresceingekoppelt

Olfaktorische Sinnesepithelien Im HG (Abb. 4.15 A,C) hat das Lektin Ricinus communis Agglutinin 120 (RCA 120) lediglich an den Zellfortsätzen des Sinnesepithels und dem daran anhaftenden Mucus gebunden. Die übrigen Bestandteile des Epithels blieben unmarkiert. Im RO (o. Abb.) war keinerlei Färbung zu beobachten. Im vomeronasalen Sinnesepithel (Abb. 4.15 B) ließ sich apikal ein schmaler fluoreszierender Saum aus punktförmigen Strukturen darstellen.

Abbildung 4.15. Gewebeschnitte durch olfaktorische Bereiche von B. orientalis nach Lektinfärbung mit RCA 120. A: Olfaktorisches Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. B: Sinnesepithel des VNO. Der Pfeil weist auf einen Saum aus punktförmigen Strukturen mit kräftiger Färbung. C: Caudaler Bereich der Nasenhaupthöhle. Unterhalb des Sinnesepithels verlaufen die ungefärbten Nervenbahnen. In der linken Haupthöhle ist viel Mucus vorhanden. D: Schnitt durch den ungefärbten MOB. Die Sterne (*) in allen Abbildungsteilen heben Nervenfaserbündel hervor, die schwarzen Pfeilspitzen weisen auf markiertes Blut. BD: Bowman’sche Drüsen, C: Cilien, GS: Glomerulischicht, M: Mucus, Nv: Nervus vomeronasalis, SE: Sinnesepi- thel des Hauptgeruchsorgans, TF: Terminalfilm, vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstäbe: 100 µm.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Die Fila olfactoria der drei Sinnesepithelien und die sich daraus zusammensetzenden Nerven (Abb. 4.15) blieben vollständig unmarkiert. Auch die olfaktorischen Bulben bzw. speziell die Glomerulischichten des MOB (Abb. 4.15 D) und AOB blieben ohne Signal. 4 Ergebnisse 54

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Bis auf die Jacobson’sche Düse, deren Drüsenschläuche apikal bzw. an ihrer luminalen Oberfläche eine Färbung aufwiesen (Abb. 4.16), blieben alle übrigen Drüsen sowie Flimmer- epithelien ungefärbt.

Soybean Agglutinin (SBA), fluoresceingekoppelt Abbildung 4.16. Gl. nasalis medi- Olfaktorische Sinnesepithelien alis (Jacobson’sche Drüse), behandelt mit RCA 120. Gm: Gl. nasalis Das Lektin Soybean Agglutinin (SBA) färbte analog dem zuvor medialis, vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstab: 50 µm. beschriebenen Lektin DBA (s. o.) diffuse Strukturen innerhalb des Sinnesepithels des HG nahe den distalen Zellgrenzen (Abb. 4.17 A,B). Zudem waren auch der dem Epithel aufliegende Schleimfilm sowie davon abgelöste Schleimreste markiert. Im RO (Abb. 4.17 A,C) ließ sich eine moderate Färbung der Zellfortsätze darstellen. Darüber hinaus war eine nahezu lückenlose Färbung an der apikalen Zelloberfläche zu beobachten. Im oberen Drittel des Epithels wurde das Zytoplasma zahlreicher Zellen markiert. Dies umschloss Zellen mit apikal fast direkt unter der Zellgrenze gelegenen Nuclei und solche, deren Nuclei in tieferen Regionen des Epithels lokalisiert waren. In beiden genannten Fällen befand sich die Färbung im Bereich um den Kern herum und zwischen Kern und distaler Zellgrenze.

Abbildung 4.17. Olfaktorische Sinnesepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit SBA-Fluorescein. A: Cavum principale mit Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans und des Recessus olfactorius. (*): Fila olfactoria. B, C: Vergrößerungen entsprechend der in A gezeigten Positionen. B: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. Pfeilspitzen: Bereich der apikalen Zellgrenzen des Epithels. C: Sinnesepithel des Recessus olfactorius. aN: Apikale Nuclei, Ane: Apertura nasalis externa, BD: Bowman’sche Drüsen, M: Mucus, RO: Recessus olfactorius, SE: Sinnesepithel des HG. Maßstab: 100 µm. 4 Ergebnisse 55

Das Sinnesepithel des VNO zeigte ein im Wesentlichen identisches Färbemuster wie im vorangegangenen Abschnitt für das Lektin RCA 120 beschrieben (vgl. Abb. 4.15 B). Darüber hinaus wurde stellenweise gefärbter Mucus im Lumen des VNO beobachtet.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Die Fila olfactoria der drei Geruchsorgane und die sich daraus zusammensetzenden Nerven- bahnen blieben durchgängig ungefärbt. Lediglich in den Glomerulischichten des Riechhirns sowohl des MOB als auch des AOB ließ sich gebundenes Lektin nachweisen (Abb. 4.18).

Abbildung 4.18. Nerven und Hirn von B. orientalis nach Lektinfärbung mit SBA. A: Auf Höhe des caudalen Endes der Nasenhöhle sammeln sich die Nervenfaserbündel der drei Riechepithelien zum Riechnerv. B: Hirnschnitt durch den rostralen Teil des MOB. C: Schnitt auf Höhe des AOB. äpS: äußere plexiforme Schicht, GS: Glomerulischicht, Nv: Nervus vomeronasalis, RN: Riechnerv, SE: Sinnes- epithel des Hauptgeruchsorgans, V: Ventrikel. Maßstab: 100 µm.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen blieben ungefärbt (Abb. 4.17 B), wohingegen die laterale Nasen- drüse (Abb. 4.19 C) und die Jacobson’sche Drüse (o. Abb.) eine deutliche Markierung aufwiesen. In der Gl. nasalis oralis interna (o. Abb) wurde eine Färbung der luminalen Oberfläche beobachtet. Markante Unterschiede traten bezüglich der in den nichtsensorischen Epithelien zu beobachtenden Färbung auf. So zeigten sich im Flimmerepithel des anterioren Abschnitts des Cavum medium (Abb. 4.19 A), sowie im Bereich der Verschmelzung mit dem Vestibulum und im Tränennasengang (Abb. 4.19 B) intensiv gefärbte Becher- und Flimmerzellen. Im Cavum inferius wies das Flimmerepithel im Bereich posterior des vomeronasalen Sinnesepithels ein starkes Signal auf. Weiter caudal nahm die Zahl der gefärbten Zellen ab, sodass sich im Bereich des Isthmus (Abb. 4.19 B,C) nur vereinzelt gefärbte Becherzellen nachweisen ließen. Zusätzlich ließ sich im Bereich des Isthmus eine kräftig gefärbte Mucusschicht darstellen. 4 Ergebnisse 56

Abbildung 4.19. Detailaufnahmen von Nebenhöhlenabschnitten von B. orientalis nach Behandlung mit SBA. A: Cavum inferius, Übergangsbereich zwischen vomeronasalem Sinnesepithel und nichtsensorischem Flimmerepi- thel. B: Das Cavum medium und der Tränennasengang verschmelzen hier mit dem Vestibulum. Der Bereich ist mit deutlich markiertem Flimmerepithel ausgekleidet. Darunter befindet sich das Cavum inferius mit Isthmus. C: Isth- musbereich mit markiertem Schleim. Ci: Cavum inferius, Cm: Cavum medium, Dn: Ductus nasolacrimalis (Tränennasengang), Gl: Laterale Nasendrüse, Is: Isthmus, M: Mucus, Ve: Vestibulum. Maßstäbe: 200 µm.

Ulex europaeus Agglutinin (UEA I), fluoresceingekoppelt Das Lektin Ulex europaeus Agglutinin I (UEA I) wurde exklusiv im Sinnesepithel des HG in örtlich deutlich begrenztem Umfang nachgewiesen (Abb. 4.20). Das Epithel wies die kräftigste Färbung im Bereich der verstreichenden Eminentia olfactoria caudal der Choane auf (Abb. 4.20 E). Von dort nahmen die Intensität und Anzahl gefärbter Strukturen ab, sodass das Epithel in den rostralen und caudalen Blindsäcken des Cavum principale ungefärbt blieb. Ebenso wies der ventrale Teil der Nasenhöhle, speziell die Eminentia olfactoria selbst, weitestgehend keine Fluoreszenz auf (Abb. 4.20 C). Bei den markierten Strukturen handelte es sich sowohl um Sekretgranula der Stützzellen (Abb. 4.20 F), als auch um perinucleäre Bereiche der Sinneszellen 4 Ergebnisse 57

(Abb. 4.20 A,D) sowie Dendriten und Zellfortsätze (Abb. 4.20 B).

Abbildung 4.20. Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans von B. orientalis nach lektinhistochemischer Behandlung mit UEA I, Detailaufnahmen von rostral (A) nach caudal (F) sortiert. A: Schnitt caudal des Recessus olfactorius mit wenigen markierten Zellen, Pfeil weist auf Sinneszellkern. B: Caudal zu A, aber noch vor der Choane gelegener Schnitt, der Pfeil deutet auf ein markiertes Endknöpfchen mit gefärbten Zellfortsätzen. C: Schnitt etwa auf Höhe der breitesten Stelle der Choane. Auf der Eminentia olfactoria ist kaum Färbung beobachtbar. D: Schnitt am caudalen Rand der Choane, der Pfeil deutet wieder auf einen Sinneszellkern. E: Caudales Ende der Eminentia olfactoria: die Färbung nimmt die größte Intensität an. F: Im caudalen Blindsack der Haupthöhle nimmt die Färbung rapide ab, hier sind im Wesentlichen Stützzellen bzw. deren Sekretgranula markiert. BD: Bowman’sche Drüsen, Eo: Eminentia olfactoria, M: Mucus, Sg: Sekretgranula, SZ: Stützzellen. Maßstäbe: A,B,D,E: 50 µm, C: 100 µm, F: 25 µm. 4 Ergebnisse 58

Wheat germ Agglutinin (WGA), fluoresceingekoppelt Das Lektin Wheat Germ Agglutinin (WGA) verursachte unter Verwendung des peroxidasegekoppelten Nachweissystems eine starke Hintergrundfärbung in allen Gewebetypen. Fluoresceingekoppeltes WGA führte zu einer moderateren Hintergrundfärbung, was gegenüber HRP-gekoppeltem WGA eine differenziertere Auswertung der Färbeergebnisse erlaubte. Davon abgesehen lieferten die beiden Nachweissysteme übereinstimmende Resultate.

Abbildung 4.21. Olfaktorische Sinnesepithelien von B. orientalis nach Lektinfärbung mit WGA-Fluorescein (A, B, D, E) oder WGA-HRP (C). A: Hauptgeruchsorgan mit apikal gefärbten Stützzellen. B, C: Nahaufnahmen des apikalen Abschnitts des Sinnes- epithels des Hauptgeruchsorgans mit kräftig gefärbten Granula innerhalb der Stützzellen. D: Recessus olfactorius, caudales Ende, seitlich von Flimmerepithel eingerahmt. Die Pfeile weisen auf Zellkerne über denen lange Fortsätze zur Epitheloberfläche ziehen. E: Vomeronasales Sinnesepithel. BD: Bowman’sche Drüsen, FE: Flimmerepithel, S: Stützzellkern, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, (*): Nervenfaserbündel. Maßstäbe: A: 100 µm, B, C: 25 µm, D, E: 50 µm. 4 Ergebnisse 59

Olfaktorische Sinnesepithelien Im Sinnesepithel des HG (Abb. 4.21 A-C) wurden neben der o. g. Hintergrundfärbung kräftig gefärbte Granula innerhalb der Stützzellen beobachtet. Diese Granula befanden sich im Bereich zwischen den apikal gelegenen Zellkernen der Stützzellen und der distalen Zellgrenzen (Abb. 4.21 B, C). Die luminalen Zellfortsätze und daran anhaftender Mucus wiesen eine ebenso kräftige Markierung auf. Im RO (Abb. 4.21 D) wurde ebenfalls gebundenes Lektin nachgewiesen: In vielen Zellen wurde unmittelbar apikal der Zellkerne eine zum Teil kappenförmige Ansammlung markierten Materials beobachtet. Davon ausgehend zogen gefärbte schmale Fortsätze in Richtung Epitheloberfläche. An der Oberfläche des Epithels waren sowohl die Zellfortsätze als auch daran gebundener Mucus gefärbt. Im vomeronasalen Sinnesepithel (Abb. 4.21 E) waren direkt oberhalb der Sinneszellkerne liegende Cytoplasmabereiche moderat gefärbt. Insbesondere in weiter apikal gelegenen Sinneszellen ließen auch die Dendriten deutlich gebundenes Lektin erkennen. Darüber hinaus war eine Markierung der luminalen Grenze des Epithels klar sichtbar, mit kräftigerem Signal wiederum an der Oberfläche der Sinneszellen.

Abbildung 4.22. Haupt- und akzessorischer Bulbus von B. orientalis nach Lektinfärbung mit WGA-Fluorescein (A,B) und WGA-HRP (C). A: Schnitt durch den Hauptbulbus rostral der Ventrikel. B,C: Schnitt durch die akzessorischen olfaktorischen Bulben. Gs: Glomerulischicht, Nv: Nervus vomeronasalis. Maßstäbe: 100 µm. 4 Ergebnisse 60

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Sämtliche Nervenfaserbündel (Abb. 4.21) wiesen eine schwache unspezifische Färbung auf (vor allem bei Verwendung des peroxidasegekoppelten Nachweissystems), die insgesamt auf dem Niveau der Hintergrundfärbung blieb. Im MOB (Abb. 4.22 A) und dem AOB (Abb. 4.22 B,C) übertraf das Signal allerdings den Hintergrund. In den Glomerulischichten beider Gehirnareale war eine moderate WGA-Markierung detektierbar.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen (Abb. 4.21 A) waren insgesamt nicht spezifisch gefärbt. Die Laterale Nasendrüse (Abb. 4.23) wurde, anders als die übrigen Drüsen, deutlich markiert, hier waren jeweils die Drüsenschläuche komplett gefärbt. Dagegen wiesen die Gl. nasalis oralis interna sowie die Gl. nasalis medialis lediglich ein schwaches Signal an den luminalen Oberflächen ihrer Drüsenschläuche auf (o. Abbildung 4.23. Laterale Nasendrüse und Flimmerepithel nach Lektinfärbung mit fluo- Abb.). Die Becherzellen der Flimmerepithelien (Abb. resceingekoppeltem WGA, B. orientalis. FE: Flimmerepithel, Gl: Gl. nasalis lateralis, 4.21 D, 4.23) ließen eine kräftige Färbung erkennen. TNG: Tränennasengang. Maßstab: 200 µm.

Blindproben Die Blindproben blieben allesamt unmarkiert, wie exemplarisch in Abb. 4.24 gezeigt.

Abbildung 4.24. Unmarkierte olfaktorische Epithelien (Blindproben) von B. orientalis. A: Haupthöhle mit Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans und des Recessus olfactorius. B: Vomeronasales Sinnes- epithel. Die Sterne (*) in beiden Abbildungsteilen markieren Nervenfaserbündel. RO: Recessus olfactorius, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, vSE: vomeronasales Sinnesepithel, (*): Nervenfaserbündel. Maßstäbe: 100 µm. 4 Ergebnisse 61

4.3.2 Xenopus borealis

Dolichos biflorus Agglutinin (DBA), HRP- und rhodamingekoppelt Die beiden eingesetzten DBA-Varianten lieferten in Bezug auf die olfaktorischen Sinnes- epithelien im Wesentlichen übereinstimmende Resultate, die lediglich Unterschiede in der allgemeinen Färbeintensität aufwiesen.

Olfaktorische Sinnesepithelien Das Sinnesepithel des HG von X. borealis (Abb. 4.25) wies im apikalen Bereich eine kräftige Färbung auf. Das Signal trat vor allem im supranucleären Bereich der Stützzellen auf, dort ließen sich eine abgeflacht-rundliche Struktur direkt oberhalb des Zellkerns sowie weitere, unmittelbar an die Zellmembran angrenzende gefärbte Zellbestandteile darstellen. Außerdem enthielt das Epithel vereinzelte Sinneszellen mit auffallender Markierung (Abb. 4.25 A, Detail). Im hinteren Abschnitt der Nasenhöhle, beginnend ungefähr am caudalen Ende des Vomeronasalorgans, trat an der ventromedialen Wand eine deutliche Markierung sämtlicher Zellkerne des Sinnesepithels auf (Abb. 4.25 B). In ähnlicher Weise färbten sich weite Bereiche des Sinnesepithels, welches das dorsal gelegene Nasenhöhlendach bedeckt. Der Riechsaum wies stellenweise ein kräftiges Signal auf, hierbei handelte es sich vorwiegend um Bereiche direkt oberhalb der Stützzellen. Eine Färbung der sensorischen Cilien wurde nicht beobachtet. Im MCE (Abb. 4.25 C) traten besonders die Sinneszellen hervor, deren Zellkerne in der unteren Hälfte des Epithels lagen. Bei diesen ließ sich im gesamten Zellkörper, inklusive der Zellfortsätze, eine kräftige Färbung beobachten. Die übrigen Bestandteile des Epithels waren demgegenüber blasser, vor allem im Bereich der Basalzellen trat kaum Farbniederschlag auf. Das VNO (Abb. 4.25 D) war insgesamt ebenfalls intensiv gefärbt und ähnelte bezüglich der Signalstärke dem MCE. Besonders traten auch hier die Sinneszellen in der unteren Epithelhälfte hervor, deren perinucleäre Abschnitte, Dendriten und Zellfortsätze das kräftigste Signal aufwiesen. Darüber hinaus ließen im VNO auch die Stütz- und Basalzellen eine moderate Markierung erkennen. 4 Ergebnisse 62

Abbildung 4.25. Olfaktorische Sinnesepithelien von X. borealis nach Lektinfärbung mit DBA, HRP-markiert. A: Hauptgeruchsorgan. Pfeilspitze und Detailaufnahme: einzelne Sinneszelle mit deutlicher Färbung. B: Bereich caudal des Vomeronasalorgans, in dem sich die Nervenfasern der drei Geruchsepithelien zu großen Paketen unterhalb des medioventralen Sinnesepithels sammeln. C: Middle chamber epithelium, die Pfeilspitze deutet auf die Zellfortsätze. D: Vomeronasalorgan, die Pfeilspitze deutet auf Zellfortsätze. BD: Bowman’sche Drüsen, FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FM: Fila olfactoria des middle chamber epithelium, FV: Fila olfactoria des Vomeronasalorgans, Gm: Gl. nasalis medialis (Jacobson’sche Drüse), SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, SZ: Stützzellen, TF: Terminalfilm. Maßstäbe: A,C,D: 50 µm, B: 130 µm.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Die Fila olfactoria des MCE und des VNO waren markiert, wiesen allerdings unter Verwendung des HRP-gekoppelten Lektins markante Unterschiede in der Farbintensität auf (Abb. 4.25 B). Besonders kräftig wurde der ventral pathway (Axone des MCE) markiert. Durch seine etwas schwächere Färbung war der Nervus vomeronasalis bzw. die sich zu diesem sammelnden Ner- venfaserbündel davon gut abzugrenzen. Die Axone des HG blieben völlig ungefärbt. Bei Einsatz von DBA-Rhodamin ließ sich kein Intensitätsunterschied darstellen (Abb. 4.26 A): Zwar wurden auch hier die Axone des MCE markiert, allerdings blieb das Signal der Axone des VNO auf Hintergrundniveau. In den entsprechenden Gehirnabschnitten (Abb. 4.26) wiederholte sich das mittels DBA-HRP beobachtete Resultat: Der dorsale Teil des MOB blieb unmarkiert, während der ventrale Teil und der AOB ein deutliches Signal lieferten. Die betreffenden Glomeruli ließen allerdings keine unterschiedliche Färbeintensität erkennen. Weiter innen liegende Schichten, wie die äußere plexiforme oder die Mitralzellschicht, blieben ungefärbt. 4 Ergebnisse 63

Abbildung 4.26. Nervenbahnen und Gehirnabschnitte von X. borealis nach Lektinfärbung mit DBA, fluoreszenzmarkiert. A: Medial am Septum gelegene Nervenbahnen und Jacobsonsche Drüse. B: Rechter olfaktorischer Hauptbulbus. Daran gut zu erkennen der ventrale Abschnitt und der daneben verlaufende Nervus vomeronasalis. C: Caudales Ende des ventralen Teils des Hauptbulbus sowie beginnender akzessorischer olfaktorischer Bulbus. aoB: akzessorischer olfaktorischer Bulbus, FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FM: Fila olfactoria des middle chamber epithelium, FV: Fila olfactoria des Vomeronasalorgans, Gm: Gl. nasalis medialis, GS: Glomerulischicht, Nv: Nervus vomeronasalis, oB: olfaktorischer (Haupt-)Bulbus, V: Ventrikel, voB: ventraler olfaktorischer Bulbus. Maßstäbe: 200 µm.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen (Abb. 4.25 A) blieben ungefärbt, ebenso wie der Drüsenkörper der Gl. nasalis oralis interna (Abb. 4.27 A). Dafür waren sowohl der ausführende Abschnitt dieser Drüse, als auch sämtliche Bestandteile der Gl. nasalis medialis (Abb. 4.25 B, 4.27 B) sehr kräftig markiert. Auch weite Teile des nichtsensorischen Flimmerepithels (Abb. 4.27), speziell die Becherzellen, ließen ein im Fluoreszenzbild alles überstrahlendes Signal erkennen. Um diese am KLSM überhaupt darstellen zu können, wurde eine geringere Laserintensität genutzt.

Abbildung 4.27. Drüsengewebe von X. borealis nach Lektinfärbung mit DBA, fluoreszenzmarkiert. Anmerkung: Die Sinnesepithelien wirken schwach markiert im Vergleich zu oben dargestellten Situationen, da für diese Aufnahmen die Intensität des Lasers reduziert wurde. A: Ausführgang der Gl. nasalis oralis interna, lateral zum Sinnesepithels des Hauptgeruchsorgans. B: Schnitt weiter caudal zu A, auf Höhe des Vomeronasalorgans. Ein Streifen Flimmerepithel grenzt das Sinnesepithel des Haupt- geruchsorgans vom vomeronasalen Sinnesepithel ab. Agoi: Ausführgag der Gl. nasalis oralis interna, Goi: Gl. nasalis oralis interna, Gm: Gl. nasalis medialis, FE: Flimmerepithel, MCE: middle chamber epithelium, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstäbe: A: 75 µm, B: 130 µm. 4 Ergebnisse 64

Concanavalin A (Con A), HRP- und fluoresceingekoppelt Die Gewebeproben von X. borealis, die mit peroxidasegekoppeltem und fluoreszenzmarkiertem Con A untersucht wurden, zeigten keine merklichen Unterschiede bezüglich des jeweils verwendeten Nachweissystems. Auch hier kam es, wie bereits für B. orientalis beschrieben, zu Chromogenniederschlag bzw. Fluoreszenz in fast allen Gewebetypen.

Olfaktorische Sinnesepithelien Im HG (Abb. 4.28 A) schienen alle Zelltypen das Lektin Con A gebunden zu haben. Der Terminalfilm wurde, besonders an seiner dem Epithel aufliegenden Basis, kräftig markiert und lieferte somit das stärkste Signal im Sinnesepithel. Die Färbung der Zellkörper der Sinneszellen überstieg die Hintergrundfärbung geringfügig, aber sichtbar.

Abbildung 4.28. Sinnesepithelien von X. borealis, Lektinfärbung mit Con A-Fluorescein (A) bzw. -HRP (B,C). A: Hauptgeruchsorgan. B: Middle chamber epithelium. C: Vomeronasales Sinnesepithel. FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FM: Fila olfactoria des middle chamber epithelium, FV: Fila olfactoria des Vomeronasalorgans, TF: Terminalfilm, ZF: Zellfortsätze. Maßstäbe: 50 µm.

Im MCE (Abb. 4.28 B) waren die Sinneszellen im mittleren Bereich des Epithels gefärbt. Hier befand sich eine kräftige Färbung direkt oberhalb der Zellkerne sowie innerhalb der Dendriten. Die Färbung der Basal- und Stützzellen sowie der Epitheloberfläche bzw. der Zellfortsätze übertraf die Farbintensität des Hintergrunds nur minimal. Im VNO (Abb. 4.28 C) blieben die Basalzellen ungefärbt, ebenso wie die Stützzellen, sodass sich basal und apikal ungefärbte bzw. durch Hintergrundfärbung blass rosafarbene Areale zeigten. Die olfaktorischen Sinneszellen hingegen wiesen einen Farbniederschlag auf, der sich hauptsächlich um den Zellkern herum konzentrierte. Die Dendriten sowie die Axone waren nicht oder nur schwach gefärbt. Ebenso wie im HG ließen sich im VNO kräftig gefärbte Zellfortsätze mit anhaftendem Mucus nachweisen.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Es ließ sich eine gleichmäßige Bindung des Lektins an die Nervenfasern (Abb. 4.28) der drei Sinnesepithelien nachweisen, ebenso wie an den entsprechenden Glomerulischichten der zugehörigen Hirnareale (Abb. 4.29). Die nach innen auf die Glomerulischicht folgenden Areale färbten sich auf Hintergrundniveau. 4 Ergebnisse 65

Abbildung 4.29. Gehirnabschnitte von X. borealis nach Lektinfärbung mit Con A, fluoreszenzmarkiert. A: Linker olfaktorischer Hauptbulbus, Ausschnitt. B: Caudaler Bereich des ventralen Teils des Hauptbulbus sowie rostraler Rand des akzessorischen olfaktorischen Bulbus. aoB: akzessorischer olfaktorischer Bulbus, Nv: Nervus vomeronasalis, oB: olfaktorischer (Haupt-)Bulbus, voB: ventraler olfaktorischer Bulbus. Maßstäbe: 100 µm.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen (Abb. 4.30 A) sowie ihr Sekret wurden kräftig markiert. Die Gl. nasalis oralis interna lieferte ein moderates Signal, welches vor allem im Bereich des Ausführ- gangs zu beobachten war (Abb. 4.30 B). Im gesamten Drüsengewebe der Gl. nasalis medialis (Abb. 4.30 C) war die Bindung des Lektins ebenfalls deutlich detektierbar. Im Flimmerepithel übertrafen nur wenige Becherzellen die Hintergrundfärbung.

Abbildung 4.30. Drüsengewebe von X. borealis nach Lektinfärbung mit Con A, fluoreszenzmarkiert. A: Bowman’sche Drüsen, sekretgefüllt. B: Gl. nasalis oralis interna auf Höhe des Ausführgangs (Pfeil) lateral des Sinnesepithels des Hauptgeruchsorgans gelegen. C: Gl. nasalis medialis caudal des Vomeronasalorgans. BD: Bowman’sche Drüsen, BG: Blutgefäß, Goi: Gl. nasalis oralis interna, Gm: Gl. nasalis medialis, MCE: middle chamber epithelium, Nv: Nervus vomeronasalis, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. Maßstäbe: A: 45µm, B,C: 100 µm.

Peanut Agglutinin (PNA), fluoresceingekoppelt Analog zu den oben für B. orientalis beschriebenen Färberesultaten band das Lektin Peanut Agglutinin (PNA) bei X. borealis nur in wenigen Arealen.

Olfaktorische Sinnesepithelien Eine PNA-Bindung wurde ausschließlich im HG (Abb. 4.31) nachgewiesen: Mit der Markierung von Sekretgranula der Stützzellen und im Bereich der Zellfortsätze entsprach der Befund optisch 4 Ergebnisse 66 dem am HG von B. orientalis beobachteten Muster. Das MCE und VNO blieben ohne Signal.

Abbildung 4.31. Nasenhöhlenbereiche von X. borealis nach Lektinfärbung mit PNA, fluoresceinmarkiert. A: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. B: Ausführgang der Gl. nasalis oralis interna, rechts davon das middle chamber epithelium. C: Vomeronasalorgan auf Höhe seines rostralen Blindsacks, im oberen Anteil des VNO mündet die Gl. nasalis medialis. D: Caudaler Nasenhöhlenabschnitt im Bereich der Choane (Pfeil). AGoi: Ausführgang der Gl. nasalis oralis interna, AGm: Ausführgang der Gl. nasalis medialis, BD: Bowman’sche Drüsen, C: Cilien, FE: Flimmerepithel, FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FM: Fila olfactoria des middle chamber epithelium, FV: Fila olfactoria des vomeronasalen Sinnesepithels, Goi: Gl. nasalis oralis interna, M: Mucus, MCE: middle chamber epithelium, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstäbe: A: 50 µm, B-C: 200 µm.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Sämtliche Fila olfactoria (Abb. 4.31), der MOB und der AOB (o. Abb.) blieben ohne Markierung.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Während in den Bowman’schen Drüsen (Abb. 4.31 A) kein Signal detektierbar war, wurde der Ausführgang der Gl. nasalis oralis interna stark markiert (Abb. 4.31 B). Ebenso deutlich banden auch der Ausführgang der Gl. nasalis medialis (Abb. 4.31 C,D) und gebietsweise die Becherzellen des Flimmerepithels (Abb. 4.31 B,C) das Lektin PNA. 4 Ergebnisse 67

Ricinus communis Agglutinin (RCA 120)

Olfaktorische Sinnesepithelien Im HG (Abb. 4.32 A) band das Lektin RCA 120 in erster Linie an Sekretgranula der Stützzellen im apikalen bzw. supranuclearen Bereich; vereinzelte Granula wurden auch in tieferen Lagen des Epithels sichtbar. Neben diesem sehr kräftigen Signal wurde eine leichte Hintergrundfärbung in allen Zelltypen des HG beobachtet. Daneben wies auch die Basalmembran eine deutliche Färbung auf. Ähnlich wie bereits für DBA (s. o.) beschrieben, trat im hinteren Abschnitt der Nasenhöhle, ab dem caudalen Ende des VNO an der ventromedialen Wand eine deutliche Markierung sämtlicher Zellkerne des Sinnesepithels auf (Abb. 4.33 B). Im MCE (Abb. 4.32 B) wurde eine sehr schwache Markierung der Sinneszellnuclei, ihrer Dendriten und Zellfortsätze detektiert. Zudem schien die Basalmembran das Lektin gebunden zu haben, allerdings in geringerem Maße als im HG. Im VNO (Abb. 4.32 C) ging das kräftigste Signal von den Zellfortsätzen an der distalen Epitheloberfläche aus. Zudem waren olfaktorische Neuronen markiert, anders als im MCE betraf dies jedoch den perinucleären Bereich mit stärkerem Signal direkt oberhalb des Kerns.

Abbildung 4.32. Olfaktorische Sinnesepithelien von X. borealis nach Lektinfärbung mit RCA 120, fluoresceingekoppelt. A: Hauptgeruchsorgan. Schwarze Pfeilspitze: vereinzelte Granula. Weiße Pfeilspitze: Basalmembran. B: Middle chamber epithelium. Pfeilspitze: Basalmembran. C: Vomeronasales Sinnesepithel. Pfeilspitze: Dendrit. N: Nuclei, ZF: Zellfortsätze. Maßstäbe: 40 µm.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Sämtliche Fila olfactoria (Abb. 4.33 B) und Riechhirnareale (o. Abb.) blieben ohne Markierung.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen (Abb. 4.33) banden das RCA 120 in unterschiedlicher Intensität, so waren sie zum Teil moderat und zum Teil sehr kräftig gefärbt. Die Gl. nasalis oralis interna (Abb. 4.33 B) lieferte vor allem im ausführenden Abschnitt ein kräftiges Signal, während die Gl. nasalis medialis (Abb. 4.33 B) vollständig, aber weniger stark markiert war. Das Flimmerepi- thel (Abb. 4.33 A) bzw. die darin enthaltenen Becherzellen waren gebietsweise kräftig gefärbt. 4 Ergebnisse 68

Abbildung 4.33. Haupthöhle und assoziierte Drüsen von X. borealis nach Lektinfärbung mit RCA 120, fluoresceingekoppelt. A: Gl. nasalis oralis interna, Pfeil deutet auf den Ausführgang. B: Gl. nasalis medialis und Fila olfactoria. BD: Bowman’sche Drüsen, FE: Flimmerepithel, FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FM: Fila olfactoria des middle chamber epithelium, FV: Fila olfactoria des Vomeronasalorgans, Goi: Gl. nasalis oralis interna, Gm: Gl. nasalis medialis, MCE: middle chamber epithelium, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. Maßstab: A: 140 µm, B: 200 µm.

Soybean Agglutinin (SBA), fluoresceingekoppelt

Olfaktorische Sinnesepithelien Im HG (Abb. 4.34 A) trat eine deutliche Markierung der supranucleären Sekretgranula der Stützzellen auf. Die restlichen Bestandteile des Epithels blieben unmarkiert. Eine Ausnahme bildete erneut der bereits angesprochene medioventrale Bereich (s. o.; Abb. 4.35 A) caudal des VNO, hier waren sämtliche Kerne des HG deutlich gefärbt. Im MCE (Abb. 4.34 B) trat ein eher schwaches Signal an den apikalen Zellfortsätzen und an den Kernen der Sinneszellen auf, im übrigen Epithel war kein Signal zu beobachten. Im VNO (Abb. 4.34 C) band das Lektin moderat an sämtliche Zellkerne und schwach an die luminalen Zellfortsätze.

Abbildung 4.34. Olfaktorische Sinnesepithelien von X. borealis nach Lektinfärbung mit SBA, fluoresceingekoppelt. A: Hauptgeruchsorgan. B: Middle chamber epithelium. C: Vomeronasales Sinnesepithel. BD: Bowman’sche Drüsen, Lp: Lamina propria, TF: Terminalfilm, ZF: Zellfortsätze. Maßstäbe: A,B: 50 µm, C: 35 µm. 4 Ergebnisse 69

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Die olfaktorischen Nervenbahnen waren schwach und nahezu gleichförmig markiert, lediglich das Signal der Fila olfactoria des MCE wirkte teilweise kräftiger (Abb. 4.35 A). In den entsprechenden Zielarealen im Riechhirn wurde ein deutliches Signal innerhalb der Glomerulischichten detektiert. Dabei war das Signal im AOB intensiver als in den ventralen bzw. dorsalen olfaktorischen Bulben (Abb. 4.35 B).

Abbildung 4.35. Nervenbahnen und Gehirnabschnitte von X. borealis nach Lektinfärbung mit SBA, fluoreszenzmarkiert. A: Medial am Septum liegen Nervenbahnen und Gl. nasalis medialis. B: Rechter olfaktorischer Hauptbulbus mit ventralem Abschnitt. C: Caudales Ende des ventralen Teils des Hauptbulbus und akzessorischer olfaktorischer Bulbus. aoB: akzessorischer olfaktorischer Bulbus, BD: Bowman’sche Drüsen, FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FM: Fila olfactoria des middle chamber epithelium, FV: Fila olfactoria des Vomeronasalorgans, Gm: Gl. nasalis medialis, oB: olfaktorischer (Haupt-)Bulbus, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, V: Ventrikel, voB: ventraler olfaktorischer Bulbus. Maßstäbe: A: 200 µm, B,C: 150 µm.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen waren im rostralen Abschnitt der Haupthöhle in der Regel unmarkiert (Abb. 4.34 A), in caudaler Richtung nahm die Anzahl der moderat bis kräftig fluoreszierenden Bowman’schen Drüsen jedoch zu (Abb. 4.35 A). Die Gl. nasalis oralis interna blieb unmarkiert, während die Gl. nasalis medialis (Abb. 4.35 A) ein deutlich detektierbares Signal lieferte. Das Flimmerepithel (o. Abb.) band in sämtlichen nicht-sensorischen Arealen das Lektin, dabei unterschied sich die Färbung nicht von bisher beschriebenen Resultaten.

Ulex europaeus Agglutinin (UEA I), fluoresceingekoppelt

Olfaktorische Sinnesepithelien Das Lektin UEA I band ausschließlich im Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans (Abb. 4.36 ). Dort wurde das kräftige Signal apikal im supranucleären Bereich der Stützzellen und an den Cilien der Neuronen beobachtet. 4 Ergebnisse 70

Abbildung 4.36. Gewebeschnitte durch verschiedene mit dem Geruchssinn assoziierte Strukturen von X. borealis nach Lektinfärbung mit UEA I, fluoresceinmarkiert. A: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans. B: Gl. nasalis oralis interna, rechts das middle chamber epithel. C: Vome- ronasalorgan und Gl. nasalis medialis. D: Caudaler Nasenhöhlenabschnitt mit den subepithelialen Nervenbahnen. BD: Bowman’sche Drüsen, C: Cilien, Cp: Cavum principale, Dn: Ductus nasolacrimalis, FE: Flimmerepithel, FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FM: Fila olfactoria des middle chamber epithelium, FV: Fila olfactoria des vomeronasalen Sinnesepithels, Goi: Gl. nasalis oralis interna, Gm: Gl. nasalis medialis, MCE: middle chamber epithelium, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, SG: Sekretgranula, vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstäbe: A: 25 µm, B: 300 µm, C: 160 µm, D: 200 µm.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Sämtliche Fila olfactoria (Abb. 4.36 D) und Areale des Riechhirns (o. Abb.) blieben ohne Markierung.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen (Abb. 4.36 D) lieferten ein sehr schwaches Signal. Die Gl. nasalis oralis interna (Abb. 4.36 B) band das Lektin hauptsächlich in ihren ausführenden Abschnitten. Die Gl. nasalis medialis war rostral kräftig markiert (Abb. 4.36 C), diese Färbung wurde nach caudal allerdings schwächer (Abb. 4.36 D). Das Flimmerepithel wies nur vereinzelte gefärbte Becherzellen auf (Abb. 4.36 B,C). 4 Ergebnisse 71

Wheat germ Agglutinin (WGA), HRP- und fluoresceingekoppelt Die Resultate der Lektinfärbung mit WGA-HRP und -Fluorescein stimmten in allen wesentlichen Punkten überein.

Olfaktorische Sinnesepithelien Die Lektinfärbung mit WGA ließ im HG (Abb. 4.37 A) die supranucleären Sekretgranula der Stützzellen besonders hervortreten. Darüber hinaus bewegte sich die Färbung im Epithel auf Hintergrundniveau. Im MCE (Abb. 4.37 B) waren die Zellfortsätze an der Oberfläche deutlich markiert. Innerhalb des Epithels wiesen alle Zellen ein schwaches Signal auf. Demgegenüber etwas kräftiger waren direkt auf dem Sinneszellkern aufliegende Strukturen markiert. Außerdem wurde auch an der Basalmembran gebundenes WGA beobachtet. Das VNO (Abb. 4.37 C) blieb im Wesentlichen ungefärbt. Auffällig war hier vor allem den apikalen Zellfortsätzen anhaftender Schleim, der eine deutliche Markierung aufwies.

Abbildung 4.37. Olfaktorische Sinnesepithelien von X. borealis nach Lektinfärbung mit WGA, fluoresceingekoppelt. A: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans und Gl. nasalis oralis interna. B: Middle chamber epithelium. C: Vomero- nasales Sinnesepithel und Gl. nasalis medialis. BD: Bowman’sche Drüsen, BS: Blindsack, FE: Flimmerepithel, FM: Fila olfactoria des middle chamber epithelium, Goi: Gl. nasalis oralis interna, Gm: Gl. nasalis medialis, M: Mucus, MCE: middle chamber epithelium, SE: Sinnes- epithel des Hauptgeruchsorgans, vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstäbe: A: 200 µm, B: 25 µm, C: 100 µm.

Olfaktorische Nerven und Bulbus olfactorius Die Fila olfactoria der drei Geruchsepithelien (Abb. 4.37 B, 4.38 A) banden das Lektin in unterschiedlichem Ausmaß, so wurden die Axone des MCE besonders kräftig markiert. In den Glomerulischichten der jeweiligen Gehirnabschnitte (Abb. 4.38 B,C) wurde ein starkes Signal identifiziert. 4 Ergebnisse 72

Abbildung 4.38. Nervenbahnen und Gehirnabschnitte von X. borealis, Lektinfärbung mit WGA, fluoreszenzmarkiert. A: Olfaktorische Nerven und Gl. nasalis medialis. B: Ventraler Teil des olfaktorischen Bulbus, olfaktorischer (Haupt-) Bulbus teilweise sichtbar. C: Caudaler Teil des ventralen olfaktorischen Bulbus und akzessorischer olfaktorischer Bulbus. aoB: akzessorischer olfaktorischer Bulbus, BG: Blutgefäß, FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FM: Fila olfactoria des middle chamber epithelium, FV: Fila olfactoria des Vomeronasalorgans, GM: Gl. nasalis medialis, KN: Knochen, Lp: Lamina propria, Nv: Nervus vomeronasalis, oB: olfaktorischer (Haupt-) Bulbus, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, V: Ventrikel, voB: ventraler olfaktorischer Bulbus. Maßstäbe: A,B: 100 µm, C: 150 µm.

Mit den Nasenhöhlen assoziierte Drüsen Die Bowman’schen Drüsen (Abb. 4.37 A) wurden durch die Behandlung mit WGA nicht angefärbt, ebenso die Gl. nasalis oralis interna (Abb. 4.37 A). Die Gl. nasalis medialis (Abb. 4.37 C, 4.38 A) wurde vollständig und kräftig gefärbt, wie auch die Flimmerepithelien (Abb. 4.37 A,C).

Blindproben Die zur Kontrolle der Färbeergebnisse durchgeführten Blindproben blieben allesamt unmarkiert (Abb. 4.39).

Abbildung 4.39. Unmarkierte olfaktorische Epithelien (Blindproben) von X. borealis. A: Ausschnitt der Haupthöhle und Vomeronasalorgan. B: Hauptgeruchsorgan. Bildbearbeitung: Kontrasterhöhung zur besseren Darstellbarkeit. FE: Flimmerepithel, FH: Fila olfactoria des Hauptgeruchsorgans, FM: Fila olfactoria des middle chamber epitheliums, Gm: Gl. nasalis medialis, SE: Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans, SZ: Stützzellnuclei, TF: Terminalfilm, vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstäbe: A: 200 µm, B: 50 µm. 4 Ergebnisse 73

4.4 Immunhistochemie

4.4.1 Antikörper-Funktionstest Mithilfe gelelektrophoretischer Auftrennung und anschließender Immunmarkierung von

Proteinen wurde die ordnungsgemäße Funktion der eingesetzten Antikörper (Anti-Gαolf, -Gαo,

-Gαi2) überprüft. Die aus Gewebeproben von B. orientalis und X. laevis erhaltenen Lysate (vgl. Kap. 4.7.1) lieferten ausreichende Mengen von Proteinen (Abb. 4.40), sodass die Immundetektion der G-Proteinuntereinheiten an den Membranen ordnungsgemäß durchgeführt werden konnte (Abb. 4.41). Zur Kontrolle der Ergebnisse der Immunmarkierung dienten Blots, bei denen bei ansonsten gleicher Behandlung der jeweilige Primärantikörper ausgelassen wurde – hier ließ sich keine Chemilumineszenz darstellen (o. Abb.).

Abbildung 4.40. Per SDS-PAGE aufgetrennte Proteine, CBB-Färbung. 1-3: B. orientalis, linker Marker, 4: X. borealis, rechter Marker. 1: 10 µl Nasenhöhlenlysat. 2: 5 µl Nasen- höhlenlysat. 3: 10 µl Gehirnlysat, 4: 10 µl Nasenhöhlenlysat.

Die Immunmarkierung der Blots lieferte, je nach verwendetem Primärantikörper, individuelle Resultate. Mit dem Antikörper gegen die G-Proteinuntereinheit αolf wurden keinerlei Banden detektiert, weder bei Gewebeproben von B. orientalis, noch bei X. borealis (o. Abb.).

Die Sondierung mit dem Antikörper gegen Gαo ergab bei Gewebeproben aus dem Gehirn (Abb. 4.41, Spur 1 und 2) bzw. den Geruchsorganen (o. Abb.) von B. orientalis und X. borealis je zwei detektierbare Banden. Die untere Bande lag bei X. borealis bei etwa 40 kDa, bei B. orientalis war sie zwar etwas schwächer ausgeprägt, lag aber auf annähernd gleicher Höhe. Die obere Bande lag bei X. borealis bei ca. 90 kDa und bei B. orientalis niedriger, bei ca. 80 kDa. 4 Ergebnisse 74

Abbildung 4.41. Immunmarkierte Western-Blots der lysierten Gewebeproben von B. orientalis und X. borealis. Spur 1 und 2: Gαo, linker Marker. Spur 3-6: Anti-Gαi2, rechter Marker. 1: X. borealis Gehirn. 2: B. orientalis Gehirn. 3: X. b. Nasenhöhlen. 4: B. o. hintere Nasenhöhlen/Haupthöhle. 5: B. o. vordere Nasenhöhlen/VNO, RO. 6: B. o. Gehirn.

Bei der Immunmarkierung mit Anti-Gαi2 (Abb. 4.41, Spur 3-6) wurden je nach vorliegen- dem Gewebetyp verschiedene Bandenmuster detektiert. So färbten sich bei Proben der Nasenhöhlen von X. borealis neben einer dünnen Bande auf Höhe von etwa 40 kDa weitere dünne (20 kDa, 100 kDa) sowie zum Teil sehr breite Banden bei etwa 50-55 kDA und 130-250 kDa. Die drei Gewebeproben von B. orientalis lieferten verschiedene Muster: Zwar enthielten alle drei Lysate eine (Doppel-) Bande bei etwa 40 kDa, darüber hinaus wurde beim Lysat des hinteren Haupthöhlenabschnitts dünne Banden mit einem Molekulargewicht von etwa 25, 45, 55, 130 und 250 kDa sowie eine sehr breite Bande mit etwa 70 kDa detektiert. Das Lysat der vorderen Nasenhöhlenabschnitte inklusive des RO und des VNO wies eine starke Hintergrundfärbung auf; dennoch wurden Banden bei etwa 50, 55 und 70 kDa beobachtet, sowie eine besonders breite Bande von ca. 130 bis 250 kDa. Das Lysat des Gehirns von B. orientalis ergab eine schwache Immunoreaktivität bei 25 kDa, die bereits erwähnte, gut sichtbare Bande bei ca. 40 kDa und eine wesentlich kräftigere Bande von 50-60 kDa.

4.4.2 Immunmarkierung mit Anti-Gαolf, -Gαo und -Gαi2 Die Sondierung der Geruchsorgane von B. orientalis und X. borealis mit den Antikörpern gegen die G-Proteinuntereinheiten αolf, αi2 und αo fand an Gewebeschnitten durch die Nasenhöhlen der Tiere statt. Umfangreiche Vorversuche resultierten in Protokollen, die individuell auf die Tiere bzw. die einzelnen Antikörper zugeschnitten wurden, sodass Färbungen mit möglichst wenig Hintergrund bei gleichzeitig aussagekräftigem Signal erzielt wurden. Die verschiedenen eingesetzten Nachweissysteme lieferten im Wesentlichen übereinstimmende Resultate; mitunter wurden bedingt durch Unterschiede in der Signalverstärkung geringe Unterschiede in der Intensität der Färbung beobachtet. 4 Ergebnisse 75

Bombina orientalis

Die Immunmarkierung der Geruchssinnesepithelien mit Anti-Gαolf rief im Hauptgeruchsorgan, ebenso wie im RO und im VNO, eine leichte (Hintergrund-) Färbung hervor (Abb. 4.42). Diese leicht rosafarbene Tönung hob sich von den übrigen Geweben, ebenso wie von der Blindprobe, ab. Zusätzlich traten in allen drei Sinnesepithelien stärkere punktförmige Signale von sehr geringem Durchmesser auf (Abb. 4.42 B-D), besonders zahlreich im VNO. Diese Punkte befanden sich zumeist in unmittelbarer Nähe von Zellkernen, welche im Falle des Hauptgeruchs- organs und des VNO den Sinneszellen zugeordnet werden können. Schließlich waren auch die Nervenfaserbündel der drei Organe von der diffusen Färbung betroffen.

Abbildung 4.42. Detailaufnahmen der Geruchssinnesepithelien von B. orientalis nach Immunmarkierung mit Anti-

Gαolf, Konzentration 1:100, ABC-Methode. A: Blindprobe, Hauptgeruchsorgan. B: Hauptgeruchsorgan. C: Recessus olfactorius. D: Vomeronasalorgan. Die Pfeile in B-D weisen auf punktförmigen Niederschlag des Chromogens. Die Sterne (*) in B-D markieren Nervenfaserbündel. Bei den dunkelbraunen Strukturen handelt es sich um pigmentierte Zellen. Maßstäbe: 100 µm.

Die Sondierung der Gewebeschnitte mit Anti-Gαi2 ergab keinerlei spezifische Färbung in den Sinnesepithelien der Geruchsorgane von B. orientalis, stattdessen traten kräftige Markierungen in den sekretorischen Zellen der Gaumendrüse auf (Gl. intermaxillaris; Abb. 4.44, Detail). Zudem wurde bei höheren Konzentrationen des Primärantikörpers ein dezenter 4 Ergebnisse 76

Farbschleier auf dem gesamten Präparat beobachtet (o. Abb.).

Abbildung 4.43. Recessus olfactorius und Gl. intermaxillaris (Detail) von B. orientalis nach Immunmarkierung mit

Anti-Gαi2, 1:100, ABC-Methode. Maßstab: 75 µm.

Mithilfe des gegen die G-Proteinuntereinheit αo gerichteten Antikörpers wurden in allen drei Geruchsepithelien spezifische Färbemuster generiert (Abb. 4.43). Die Präparate waren darüber hinaus nahezu frei von unspezifischen Hintergrundfärbungen. Im Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans ließ sich eine schwache bis moderate Färbung innerhalb der Sinneszellen beobachten, welche sich allerdings nicht in die Cilien fortsetzte. Dies ließ sich insbesondere durch Anwendung von hohen Antikörperkonzentrationen deutlich darstellen (vgl. Abb. 4.44 D,E). Die Axone hingegen wiesen eine kräftige Markierung auf, was zu einem starken Signal in den Nervenfaserbündeln führte. Im Recessus olfactorius war insgesamt eine intensive Färbung zu beobachten. Markiert wurden Zellen, deren Zellkörper eher in der unteren Hälfte des Epithels lagen und die sowohl über dendriten- als auch über axonähnliche Fortsätze verfügten. Die auffälligste Färbung wiesen diese Zellen an ihren luminalen Zellfortsätzen auf; ähnlich kräftig gefärbt waren auch die axonartigen basalen Zellausläufer und Nervenfaserbündel, die sich unterhalb des Sinnesepithels befanden. Der Befund bezüglich des vomeronasalen Sinnesepithels ähnelte dem des RO hinsichtlich der Signalstärke. Auch hier waren Sinneszellen gefärbt, deren Zellkörper häufig in der unteren Epithelhälfte lagen, allerdings keineswegs ausschließlich. Axone und Nervenfaserbündel wiesen analog den zuvor beschriebenen Sinnesepithelien ein deutliches Signal auf. Auch hier waren die Zellfortsätze der Nervenzellen an der Epitheloberfläche markiert. 4 Ergebnisse 77

Abbildung 4.44. Detailaufnahmen der Geruchssinnesepithelien von B. orientalis nach Immunmarkierung mit Anti-

Gαo. A,B,C,F: fluoreszierender Sekundärantikörper 1:75; D,E,G: ABC-Methode, D,G Konzentration des Primär- antikörpers 1:75; E: 1:50. A: Hauptgeruchsorgan, Pfeilspitze weist auf Fila olfactoria. B: Recessus olfactorius, Pfeilspitze weist auf Zellfortsätze. C: Vomeronasalorgan. D: Detail Hauptgeruchsorgan, angefärbte Neuronen, Pfeilspitze: Dendrit. E: Detail Hauptgeruchsorgan, stärkere Vergrößerung. F: Recessus olfactorius, Ausschnitt aus A, Pfeilspitze: Zellfortsätze. G: Vomeronasalorgan, Pfeilspitze: Zelllfortsätze. BD: Bowman'sche Drüsen, D: Dendriten, EK: Endknöpfchen, Fo: Fila olfactoria, SZ: Stützzellen. Maßstäbe: A,B: 75 µm; C: 50 µm; D,F,G: 15 µm; E: 5 µm.

Xenopus borealis

Die Immunmarkierung mithilfe des Anti-Gαolf-Serums (Abb. 4.45) ergab im gesamten Sinnesepithel des Hauptgeruchsorgans und im MCE eine schwache (Hintergrund-) Färbung. Zudem trat im Hauptgeruchsorgan ein Signal im apikalen, supranukleären Bereich einiger Stützzellen auf. Weiterhin ließ sich im MCE eine schwache Markierung von luminalen Zellfortsätzen beobachten. Das vomeronasale Sinnesepithel wies hingegen keinerlei Färbung auf. Allerdings wurde eine schwache Färbung der Gl. nasalis oralis interna und der Gl. nasalis medialis beobachtet (o. Abb.). 4 Ergebnisse 78

Abbildung 4.45. Detailaufnahmen immunmarkierter Sinnesepithelien von X. borealis: Gαolf. Konzentration Primärantikörper: 1:100, fluoreszierender Sekundärantikörper. A: Hauptgeruchsorgan, Pfeil deutet auf markierten Stützzellinhalt. B: Middle chamber epithelium, Pfeilspitze deutet auf markierte Zellfortsätze. C: Vomeronasales Sinnesepithel, Umrisse bzw. Lumen durch gestrichelte Linien gekennzeichnet. Maßstäbe: 100 µm.

Die Behandlung der Gewebeschnitte mit Anti-Gαi2 resultierte in einer Färbung nahezu aller ausgewerteten Gewebetypen bei X. borealis. In den drei Sinnesepithelien und den dazu gehörigen Nervenfaserbündeln wurde eine moderate Färbung beobachtet (Abb. 4.46). Dabei traten im Hauptgeruchsorgan keinerlei Strukturen markant hervor, und die Zelloberflächen bzw. Zellfortsätze blieben ohne Signal. Im MCE traten einige Zellbestandteile auf mittlerer Epithelhöhe durch stärkere Färbung hervor; auch hier blieb die Oberfläche ohne Signal. Bezogen auf das VNO wurde vor allem im Übergangsbereich zum umgebenden Flimmerepithel ein sich vom Hintergrund abhebendes Signal beobachtet.

Abbildung 4.46. Detailaufnahmen immunmarkierter Sinnesepithelien von X. borealis: Gαi2, ABC-Methode, 1:100. A: Hauptgeruchsorgan. B: Middle chamber epithelium., die Pfeilspitze weist auf markierte Zellbestandteile. C: Vomeronasales Sinnesepithel im Übergangsbereich zum Flimmerepithel. Die Sterne (*) in allen drei Teilabbildungen markieren Fila olfactoria. BD: Bowman'sche Drüse, FE: Flimmerepithel, vSE: vomeronasales Sinnesepithel. Maßstäbe: 100 µm.

Die Untersuchung mithilfe von Anti-Gαo ergab differenzierte Färbungen in allen drei Geruchssinnesepithelien (Abb. 4.47). Das Bindungsmuster im Sinnesepithel des Hauptgeruchs- organs entsprach im Wesentlichen dem bei B. orientalis erhaltenen – es trat also eine spezifische Färbung der Sinneszellen auf – wies jedoch trotz geringerer Antikörperkonzentration eine höhere Färbeintensität auf. Im MCE wurden die Oberflächenstrukturen und das Cytoplasma von Sinneszellen gefärbt, deren Somata eher in der unteren bis mittleren Zone des Epithels lagen. Auch die unter dem Epithel liegenden Nervenfasern waren markiert. Im vomeronasalen 4 Ergebnisse 79

Sinnesepithel wurden ebenfalls Neurone mitsamt ihrer dendritischen und axonalen Zellfortsätze gefärbt. Ob es sich hierbei um alle Sinneszellen oder eine Subpopulation handelt, konnte nicht abschließend beurteilt werden.

Abbildung 4.47. Detailaufnahmen immunmarkierter Sinnesepithelien von X. borealis: Gαo, fluoreszierender Sekundärantikörper (A-C) und ABC-Methode (D-E), 1:100. A: Hauptgeruchsorgan. B: Middle chamber epithelium. C: Vomeronasales Sinnesepithel, Pfeilspitze weist auf markierte Zellfortsätze. D: Oberfläche des Hauptgeruchsorgans in stärkerer Vergrößerung, das Lumen ist oben. E: Stärkere Vergrößerung des MCE, die Epitheloberfläche ist rechts. Die Pfeilspitze weist auf markierte Zellfortsätze. F: Stärkere Vergrößerung des VNO, das Lumen ist rechts. C: Cilien, D: Dendrit(en), Fo: Fila olfactoria. Maßstäbe A-C: 100 µm; D-F: 25 µm. 5 Diskussion 80

5 Diskussion

5.1 Morphologische Besonderheiten der Geruchsorgane

5.1.1 Basalzell-Subtypen im Hauptgeruchsorgan von B. orientalis Der in der vorliegenden Arbeit dokumentierte grundsätzliche Aufbau des Hauptgeruchsorgans von Bombina orientalis entspricht dem bei Fröschen bereits beschriebenen Bauplan (z. B. Dogiel 1887; Bloom 1954; Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998). Die Bestandteile des Epithels – Sinnes-, Stütz- und Basalzellen sowie intraepithelial liegende Bowman’schen Drüsen – waren eindeutig beobachtbar. Im Rahmen der Untersuchungen der Paraffinschnitte und der Semidünnschnitte war jedoch auffallend, dass die Basalzellen bzw. deren Zellkerne histochemisch und morphologisch deutliche Unterschiede aufweisen: So wurden bezüglich der Kerne zweierlei Färbeergebnisse beobachtet, darüber hinaus lagen sowohl runde als auch unregelmäßig geformte Zellkerne vor. Im Allgemeinen handelt es sich bei Basalzellen, wie bereits erwähnt, um die Stammzellen des Sinnesepithels, welche bei Säugern zwei Unterklassen zugeordnet werden: den horizontalen Basalzellen (horizontal basal cells; HBCs), die flach der Basalmembran anliegen, inaktiv sind und deren Teilungsmodus beispielsweise bei Mäusen durch Verletzungen des Epithels hervorgerufen werden kann (Farbman 1992; Herrick et al. 2017) und globuläre Basalzellen (globose basal cells; GBCs). GBCs sind mitotisch aktiv, rundlich geformt und liegen oberhalb der HBCs (Farbman 1992; Mackay-Sim et al. 2015). Aus GBCs erfolgt die ständig ablaufende Regeneration aller Epithelzellen sowie der Bowman’schen Drüsen, weshalb auch Übergangsformen zwischen GBCs und deren Abkömmlingen vorhanden sind (Graziadei und Monti-Graziadei 1979; Mackay-Sim et al. 2015). Bezüglich der Anuren gehen die Autoren bisheriger Studien nicht auf Unterschiede bei den Basalzellen ein, also auch nicht auf Ausprägung und Struktur von HBCs und GBCs (vgl. Dogiel 1887; Bloom 1954; Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998; Benzekri und Reiss 2012). Allerdings sind HBCs bei einem Vertreter der Teleostei (Paragobiodon xanthosomus; Arvedlund et al. 2007) beschrieben, daher scheint es plausibel, dass das Vorhandensein zweier Basalzelltypen phylogenetisch gesehen bereits vor dem Abzweigen der Linie der Amphibien existierte und dass auch Anura diesem Prinzip folgen. Es liegt also nahe, die im Rahmen der vorliegenden Untersuchung beobachteten Differenzierungen auf Aktivitäts- bzw. Reifeunterschiede der Basalzellen zurückzuführen, wenngleich sie anhand der oben genannten Kriterien derzeit weder den HBCs noch den GBCs eindeutig zugeordnet werden können. Da HBCs Keratin enthalten (Mackay-Sim et al. 2015), liefern zukünftige 5 Diskussion 81

Untersuchungen mittels Anti-Keratin-Antikörpern möglicherweise Hinweise zur Klärung dieses Punktes. Sollte sich dabei herausstellen, dass statt nur einem beide Basalzelltypen von B. orientalis Keratin enthalten, wofür zum Beispiel die Lage direkt an der Basalmembran spräche, so könnten o. g. Befunde Hinweise auf aktive bzw. inaktive HBCs sein. Denkbar wäre auch, dass keiner der beiden Zelltypen Antikeratin-positiv ist, so wären die o. g. Befunde zunächst alleinig auf GBCs bzw. als Übergangsformen zwischen GBCs und ihren Abkömmlingen zu interpretieren. Dabei blieben die Existenz und der Sitz der HBCs allerdings offen.

5.1.2 Kompartimente im Schleimfilm des Hauptgeruchsorgans von B. orientalis Spannende Einblicke ermöglichten die Semidünnschnittpräparate in Bezug auf den Sekretionsmodus der Stützzellen und die Eigenschaften des das HG bedeckenden Mucus. Sekretgranula wurden nicht nur innerhalb, sondern auch ober- und außerhalb der Stützzellen in einem abgegrenzten Raum („Stützzell-Sekretraum“) beobachtet. Es entsteht der Eindruck, dass die Sekrete der Stützzellen in Form von Vesikeln abgegeben werden, die sich extrazellulär auflösen. Tatsächlich wird der Sekretionsmodus von Getchell und Getchell (1992) für sezernierende Stützzellen bei Tetrapoden so beschrieben. Vom Stützzell-Sekretraum klar abgrenzbar existiert bei B. orientalis ein kompakter, dunkler gefärbter Schleimanteil, der die sensorischen Cilien enthält (Jordan 2010) und den Stützzell-Sekretraum einrahmt. Dieser die sensorischen Cilien einbettende Schleim wird von Andres (1966; 1969) als Sekret der Bowman’schen Drüsen interpretiert. Die Situation wird in einem Review des selben Autors (1975) als typisch für luftatmende Wirbeltiere im Allgemeinen beschrieben, ohne dass an der Stelle eine funktionelle Einordnung erfolgt. Interessant, jedoch ungeklärt bleibt derzeit die angesichts der beobachteten Kompartimentierung der Schleimschicht auftretende Frage, ob die Sekrete der Stützzellen sich bei B. orientalis überhaupt mit denen der Bowman’schen Drüsen vermengen oder ob die Sekrete zwei unabhängig voneinander bleibende Sekret-Kompartimente bilden – beide Szenarien sollen im Folgenden beleuchtet werden. Zwei horizontal getrennte Schleimschichten unterschiedlicher Herkunft – die eine proximal (zähflüssig und von den Stützzellen sezerniert), sowie eine weitere distal (wässrig und von den Bowman’schen Drüsen gebildet) – werden in zahlreichen älteren Studien beschrieben (z. B. Andres 1969; Getchell et al. 1984b; Vinnikov 1986; Foster et al. 1992). Ein Unterschied zu den im Rahmen der vorliegenden Arbeit erhobenen Befunden betrifft dabei allerdings die Lage der Cilien. Im überwiegenden Teil der genannten Studien wird beschrieben, dass die Cilien mit ihrem proximalen Abschnitt in der unteren und mit dem distalen Abschnitt in der oberen Schleimschicht liegen, also in Abschnitten unterschiedlicher Abkunft. Im Gegensatz dazu liegen B. orientalis' Cilien vollständig im dunklen, vom Stützzellsekret getrennt 5 Diskussion 82 vorliegenden Mucus, dessen Ursprung, wie bereits erwähnt, zunächst in den Bowman’schen Drüsen angenommen wird. Funktionell könnte eine derartige Trennung der Schleime und die Einbettung der Cilien im Sekret der Bowman’schen Drüsen durchaus begründet sein. So wäre es möglich, dass Bestandteile dieses Sekrets, wie z. B. duftstoffbindende Proteine (odorant binding proteins, OBPs; Lee et al. 1987; Millery et al. 2005) oder Natrium-/Kaliumionen (Zielinski et al. 1988; Getchell und Getchell 1992), vor vorzeitigem Abbau und/oder vor Verdünnung durch Stützzellsekrete und deren Bestandteile bewahrt werden sollen, um eine optimale Detektion von Duftstoffen zu gewährleisten. Die Funktion des Stützzellsekrets wird von Andres (1966) bei der Katze tatsächlich in der „Auflockerung“ und Verflüssigung des Mucus in Abhängigkeit von der Verdunstung innerhalb der Nasenhöhle gesehen. Bei B. orientalis scheinen darüber hinaus spezialisierte Enzyme (xenobiotic metabolizing enzymes, XMEs) innerhalb des Sekrets der Stützzellen eine Rolle zu spielen (s. u.). Hinweise auf das zweite denkbare Szenario, nämlich dass eine Durchmischung der Sekrete der Stützzellen und der Bowman’schen Drüsen auch bei B. orientalis stattfindet, liefert die vergleichende Betrachtung einer Reihe verschiedener Studien, welche insbesondere an anderen Vertretern der Amphibien durchgeführt wurden. Zunächst einmal ist der Mucus im Hauptgeruchsorgan bei sämtlichen darauf untersuchten Spezies ständig in Bewegung, wozu stetig nachgelieferter Mucus aus unterschiedlichen Quellen und in besonderem Maße der Cilienschlag der Sinneszellen und des Flimmerepithels beitragen sollen (Reese 1965; Moulton und Beidler 1967; Getchell et al. 1984b; Menco und Farbman 1992). Da davon auszugehen ist, dass B. orientalis ebenfalls über fließenden Mucus verfügt, erscheint es eher unwahrscheinlich, dass die Sekrete wider die beschriebenen mechanischen Kräfte getrennt vorliegen bleiben können. Weiterhin existieren Studien, die direkte Nachweise liefern, dass das Stützzellsekret sich in der gesamten Schleimschicht ausbreitet: In einer Untersuchung bei der Anurenart Rana pipiens pipiens von Menco (1992) wurden gleichmäßig verteilte Zonen im Mucus nachgewiesen, die positiv mit bestimmten unterschiedlichen Antikörpern markiert werden können, wobei dieselben Antikörper die Sekretgranula der Stützzellen markieren. Die Autoren folgern daraus das Stützzellsekret verteile sich im gesamten Mucus oberhalb des Hauptgeruchsorgans und gewisse Bestandteile bildeten dabei eine komplexe Morphologie. Hierbei betonen die Autoren, dass diese beobachteten „Subdomänen“ keinesfalls statisch seien sondern eine Momentaufnahme abbildeten. Foster et al. (1992) fanden zudem heraus, dass ein Bestandteil des Stützzellsekretes des von ihnen untersuchten Vertreters der Urodelen (Ambystoma tigrinum) in die Glykocalyx der Cilien der olfaktorischen Neuronen eingebaut wird. Es wird außerdem in der superfiziellen 5 Diskussion 83

Schleimschicht gefunden – also formen auch hier die Sekrete von Stützzellen und Bowman’schen Drüsen gemeinsam einen gemischten Mucus. Auf funktioneller Ebene erscheint die Mischung der Sekrete von Vorteil, da sie jeweils speziell aufeinander abgestimmte Moleküle zu enthalten scheinen (OBPs, XMEs, Ionen; s. o.). So ist nicht zuletzt bei Nagern eine Beteiligung der Stützzellen am Abbau bereits detektierter Duftstoffe nachgewiesen (Strotmann und Breer 2011), ein Umstand den getrennte Sekreträume immens erschwerten, sollte ein solcher Mechanismus auch bei B. orientalis existieren. Auch ein, im Falle getrennter Sekreträume, lokaler Verbleib der bereits angesprochenen XMEs, die von Stützzellen sezerniert werden, erscheint eher ungeeignet angesichts des Aufgabenspektrums dieser Moleküle (Heydel et al. 2013). Dafür, dass auch die Stützzellen von B. orientalis derartige Enzyme produzieren, spricht ein auffälliges Phänomen: der apikale Abschnitt des Hauptgeruchs- organs, indem typischerweise die Granula der Stützzellen liegen, wurde durch die Fixierung teilweise nur ungenügend erhalten. Auch Andres (1975) spricht von einer „ausgeprägten Neigung zur postmortalen autolytischen Reaktion“ im Hauptgeruchsorgan. Dies kann durchaus als Hinweis auf XMEs verstanden werden. Eine wahrscheinlichere Erklärung für die beobachteten Kompartimente im Schleim von B. orientalis wäre nach eingehender Betrachtung der Datenlage, dass die Stützzellen möglicherweise als Reaktion auf das Anästhetikum oder die Immersionsfixierung mit einer erhöhten Sezernierung reagiert haben. Ähnliche Mechanismen haben Getchell et al. 1984a experimentell mit gewissen Chemikalien beim Salamander (Ambystoma tigrinum) ausgelöst bzw. beobachtet und Getchell und Getchell 1992 in einem Review zusammengefasst. Dafür spricht auch, dass vergleichsweise wenige Sekretgranula direkt oberhalb des Zellkerns beobachtet wurden, wesentlich mehr Granula jedoch nahe der distalen Zellgrenzen – was als ein Zeichen für aktive Sekretion gedeutet wird (Getchell und Getchell 1992). Ein weiteres Indiz ist schließlich, dass Studien, die keine auffälligen Kompartimente dokumentieren, technisch anders ausgeführt worden sind, so wurden etwa bei Menco und Farbman 1992 die untersuchten Frösche mittels

CO2 getötet und die Proben zur weiteren Bearbeitung direkt mit flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Daraus ließe sich ableiten: Da mehr Sekret als üblich abgegeben wurde, konnte dieses sich nicht mit dem übrigen Mucus vermengen bevor die – diesen Zustand konservierende – Fixierung einsetzte, was in den auffälligen Sekreträumen resultierte. Die anfangs geäußerte Annahme das dunkler gefärbte Sekret sei ausschließlich von den Bowman’schen Drüsen sezerniert worden, kann aufgrund der hier ausgeführten Überlegungen nicht weiter unterstützt werden. Obwohl der Mucus, der das HG von B. orientalis bedeckt also aller Wahrscheinlichkeit nach ein Gemisch von Sekreten unterschiedlicher Herkunft darstellt, kann die Existenz von horizontal liegenden 5 Diskussion 84

Schichten unterschiedlicher Viskosität nicht völlig ausgeschlossen werden. Darüber hinaus ist anzunehmen, dass der Mucus auch Bestandteile anderer nasaler Drüsen oder sezernierender Bestandteile des respiratorischen Epithels enthält.

5.1.3 Zellulärer Aufbau des Recessus olfactorius von B. orientalis Der Kenntnisstand bezüglich der Zytoarchitektur des Recessus olfactorius ist außerordentlich lückenhaft. Es herrscht die Annahme vor, Stütz-, Sinnes-, und Basalzellen seien in der üblichen Weise angeordnet; außerdem wurden vier verschiedene Oberflächendifferenzierungen beschrieben, die als Beleg für die Existenz zweier Stützzelltypen und zweier Sinneszelltypen verstanden werden (Nowack et al. 2013). Die im Rahmen der vorliegenden Dissertation erhobenen Daten stützen diese Sichtweise und erweitern die bisherige Datenlage. Anhand der mithilfe der Semidünnschnitte deutlich differenzierbaren apikalen Zellabschnitte wurden fünf morphologisch unterscheidbare Zelltypen ermittelt, zudem wurden in darunterliegenden Epithelschichten spindelförmige Zellkörper und Basalzellen beobachtet. Zur Interpretation erfolgen eingehende Vergleiche dieser Befunde mit dem HG und VNO von B. orientalis sowie mit Daten anderer Autoren, die sich in erster Linie auf Anura beziehen. Der erste Zelltyp (1) verfügt über zahlreiche granuläre Strukturen in seinem peripheren Zellfortsatz, die hier als Sekretgranula gedeutet werden. Die Länge dieses mindestens kernbreiten, supranucleären Abschnitts ist variabel, die kontrastreichen marmorierten Kerne selbst liegen auf unterschiedlichen Höhen im Epithel. Die beobachtete Morphologie spricht dafür, dass es sich hierbei um eine Stützzelle vom sezernierenden Typ handelt, wie sie von einer Reihe von Autoren bei Anura dokumentiert wurden (u. a. Bloom 1954; Reese 1965; Moulton und Beidler 1967; Graziadei und Metcalf 1971; Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998). Dabei unterscheiden sich die Vesikel dieses Stützzelltyps bei B. orientalis histochemisch und morphologisch von den im Hauptgeruchsorgan beobachteten Sekretgranula: Sie sind deutlich kleiner, wesentlich zahlreicher und nehmen eine andere Färbung an. Außerdem scheint sich der Sekretionsmodus von dem im HG (s. o.) zu unterscheiden, denn es wurden keine einzelnen Granula außerhalb der Zellen an der Oberfläche des Epithels beobachtet. Stattdessen wölbte sich teilweise die Oberfläche der Zellen über das Epithel, was als Zeichen aktiver, vermutlich apokriner Sekretion angesehen werden kann. Auch dies stimmt mit Beobachtungen beispielsweise von Oikawa et al. (1998) und Benzekri und Reiss (2012) überein; zudem weisen diese Autoren transmissionselektronenmikroskopisch kurze Mikrovilli auf der Oberfläche derartiger Zellen nach. Daraus lässt sich ableiten, dass die von Nowack et al. (2013) beobachteten kurzen Mikrovilli auf der Oberfläche des Epithels von B. orientalis vermutlich diesem Stützzelltyp zuzuordnen sind. 5 Diskussion 85

Der zweite dokumentierte Zelltyp (2) besitzt Cilien, einen auffallend großen, runden Kern und viel Zytoplasma. Lichtmikroskopisch lassen sich keine Strukturen erkennen, die eindeutig auf eine sekretorische Tätigkeit hinweisen; es wurden lediglich in einigen Zellen ungefärbte vesikelförmige Bereiche beobachtet. In diesem Aspekt ähneln diese Zellen morphologisch den cilientragenden Stützzellen des VNO von B. orientalis. Gleichzeitig fehlt dem Zelltyp (2) ein sinneszelltypischer dendritischer Zellfortsatz, er hat stattdessen eine becherförmigen Gestalt. Der Vergleich mit gut dokumentierten ultrastrukturellen Untersuchungen (Oikawa et al. 1998; Benzekri und Reiss 2012) gibt Hinweise darauf, dass es sich hierbei möglicherweise um eine flimmernde bzw. non-secretory Stützzelle handelt. Hierzu passen wiederum von Nowack et al. 2013 im RO beobachtete Cilien, die nicht einem olfaktorischen Endknöpfchen, sondern flachen Zelloberflächen entsprangen. Damit bekräftigen die vorliegenden Untersuchungen die Annahme der Autoren, es seien zwei unterschiedliche Stützzelltypen im Recessus olfactorius von B. orientalis vorhanden. Es ist darüber hinaus davon auszugehen, dass auch die angesprochenen Färbeunterschiede der apikalen Zellkerne bei Anwendung histologischer Übersichtfärbungen den grundsätzlichen Unterschied dieser beiden Zelltypen widerspiegeln. Die Zelltypen (3) und (5) weisen sehr schmale distale Abschnitte auf, die wegen ihrer geringen Breite nicht zweifelsfrei zu bestimmten Zellkernen verfolgt werden konnten. Gleichzeitig liegen insbesondere in der unteren Hälfte des Epithels spindelförmige Zellkörper vor, deren dendritenähnliche Zellausläufer nicht bis zur Oberfläche verfolgt werden konnten. Es liegt nahe anzunehmen, dass diese spindelförmigen Zellkörper zu den als Typen (3) und (5) bezeichneten Zellabschnitten gehören. Daraus ergibt sich ein Bild von Zellen mit spindelförmigem Zellleib und vergleichsweise dünnen, in apikale und basale Richtung ziehenden Ausläufern, die sich außerdem in ihren apikalen Zellfortsätzen unterscheiden [(3) trägt Cilien, (5) keine darstellbaren Fortsätze]. In Anbetracht dieser Morphologie handelt es sich bei diesen beiden Zelltypen höchstwahrscheinlich um zwei unterschiedliche Sinneszelltypen, wie sie von zahlreichen Autoren einzeln oder in Kombination in olfaktorischen Sinnesepithelien vorgefunden (vgl. Paschutin 1873; Dogiel 1887; Bloom 1954; Andres 1966; Moulton und Beidler 1967; Graziadei und Metcalf 1971; Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998; Benzekri und Reiss 2012) und darüber hinaus für B. orientalis von Nowack et al. 2013 postuliert wurden. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung waren olfaktorische Endknöpfchen an der luminalen Oberfläche des RO nicht eindeutig beobachtbar, was durch Faktoren wie der leicht schrägen Schnittführung durch das Epithel bedingt sein könnte. Dennoch lässt sich vermuten, dass die Sinneszellen (Zelltyp 3) grundsätzlich in ihrem Bau typischen cilientragenden olfaktorischen Neuronen – inklusive Endknöpfchen – entsprechen, gestützt auf den Nachweis derartiger Strukturen durch 5 Diskussion 86

Nowack et al. 2013. Der zweite vermeintliche Sinneszelltyp (5) verfügte über keine offensichtlichen Zellfortsätze, es lässt sich jedoch spekulieren, dass dieser Sinneszelle die von Nowack et al. 2013 dokumentierten, langen dünnen Mikrovilli zuzuordnen sind. Lichtmikroskopisch sind derartige Mikrovilli kaum darstellbar, wie auch der Vergleich mit dem im Rahmen der vorliegenden Dissertation ebenfalls untersuchten VNO von B. orientalis oder dem middle chamber epithelium von X. borealis zeigt. Zelltyp (4) fiel durch seine besonders starke Färbung, sowie einen unregelmäßig geformten Kern auf. Auch dieser Zelltyp besitzt Cilien, die allerdings deutlich stärker gefärbt sind, als alle anderen bei B. orientalis beobachteten Cilien. Ein axonaler Ausläufer wurde nicht beobachtet, seine Existenz kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Im HG und VNO wurden an keiner Stelle vergleichbare Zellen beobachtet; auch bei Nowack et al. 2013 findet sich kein Hinweis auf derartigen Strukturen. Allerdings beobachten andere Autoren ebenfalls Unregelmäßigkeiten, die oftmals nicht direkt eingeordnet werden können. So findet Andres (1969) bei transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen am Riechepithel der Katze eine von ihm als „5. Zelltyp“ bezeichnete Struktur, die der hier vorliegenden in einigen Gesichtspunkten ähnelt: Beide Zellen verfügen über verdickte luminale Zellfortsätze, haben keinen beobachtbaren axonalen Fortsatz und färben sich wesentlich dunkler als sonst innerhalb der Riechepithelien üblich. Andres spekuliert, dass es sich vielleicht um einen epitheleigenen Rezeptor handele, der in der Grenzzone zum respiratorischen Epithel Steueraufgaben habe. Diese Interpretation lässt sich allerdings nicht ohne weiteres auf B. orientalis übertragen, da im vorliegenden Fall keine auffällige räumliche Beziehung zu umliegenden Arealen nachgewiesen wurde. Zudem ist bislang kein Fall bekannt geworden, indem ein Zelltyp mit solch einer Funktion nachgewiesen worden ist. Ein anderer Zelltyp mit vergleichbaren morphologischen Eigenschaften sind sogenannte Bürstenzellen, deren Mikrovilli als auffallend steif und mit großem Durchmesser beschrieben werden (Andres 1975). Der Sinneszellcharakter der Bürstenzellen sei nach Andres (1975) nicht klar belegt, wenn überhaupt seien sie gewissen Geschmackszellen oder Mechanorezeptoren ähnlich. Kolnberger (1971) beobachtet nach verlängerter Inkubation mit Osmiumtetroxid bei verschiedenen Spezies und in verschiedenen Zelltypen elektronendichte bzw. dunkel gefärbte Perikaryen. In Übereinstimmung mit den hier erzielten Befunden tritt das Phänomen nur in einem Epitheltyp auf – dem VNO – allerdings war in der vorliegenden Studie die Zelle vollständig von der Färbung betroffen, nicht nur einzelne Organellen. Zusätzlich dokumentiert Kolnberger in derselben Arbeit „helle“ und „dunkle“ Dendriten im VNO. Die Autorin diskutiert, ob diese Effekte auf gewisse Aktivitätsphasen bzw. mit der Degeneration der Sinneszellen 5 Diskussion 87 verbunden sein könnten. Dafür, dass eventuell auch bei B. orientalis Degeneration ein Grund für die spezielle Morphologie sein könnte, sprechen die beobachteten Vakuolen in manchen dieser Zellen: Ähnlich große Vakuolen sehen Hansen et al. (1998) in Rezeptorzellen als Anzeichen für degenerative Prozesse. Insgesamt bleibt an dieser Stelle noch unklar, ob es sich nun um degenerierende Stützzellen, Sinneszellen oder einen anderen Zelltyp handelt. Insbesondere ist rätselhaft, sollte es sich um degenerierende Zellen handeln, weshalb solche in den anderen beiden Epithelien von B. orientalis nicht in dieser Form zu beobachten waren. Die Basalzellen des RO waren unterschiedlich gefärbt, auch hier treten heterogene Kerne, darunter solche mit enormem Durchmesser, auf. Es ist davon auszugehen, dass dies – analog dem oben für das HG beschriebenem Fall – auf Aktivitäts- und Reifeunterschiede der Basalzellen im Zusammenhang mit der Regeneration des Sinnesepithels zurückzuführen ist.

5.1.4 Vomeronasalorgan(e) und middle chamber epithelium Die vomeronasalen Sinnesepithelien von B. orientalis und X. borealis entsprachen in ihrer Architektur grundsätzlich dem für diese beiden Sinnesorgane in einer Vielzahl von Publikationen dokumentierten Aufbau (Matthes 1934; Graziadei 1971; Graziadei 1973; Andres 1975; Scalia 1976; Døving und Trotier 1998; Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998). Bei B. orientalis waren zudem in der apikalen Zone des Epithels Zellen aufgefallen, die über vergleichsweise große Nuclei verfügten und von hellem Zytoplasma umgeben waren. Es handelt sich hierbei möglicherweise um Zellen des Immunsystems, wie beispielsweise Plasmazellen, deren Vorkommen in olfaktorischen Sinnesepithelien als häufig beschrieben wird (Graziadei 1973; Getchell et al. 1984b; Ding und Xie 2015). Das middle chamber epithelium von X. borealis entsprach ebenfalls dem bereits dokumentierten Aufbau (Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998). Ähnlich wie beim Recessus olfactorius wurden jedoch im oberen Drittel des Epithels unterschiedlich geformte Zellkerne beobachtet, die sich teilweise unterschiedlich anfärbten. Aufgrund ihrer distalen Position lässt sich vermuten, dass es sich um die Kerne der beiden Stützzelltypen des MCE handelt. Im Rahmen transmissionselektronenmikroskopischer Studien von Hansen et al. 1998 und Oikawa et al. 1998 an X. laevis wurde ein derartiger Befund nicht explizit erwähnt, sodass es möglich wäre, dass es sich hier um eine Besonderheit von X. borealis handelt. Da sich die genannten Studien aber im Wesentlichen auf die Zellfortsätze der Sinnes- und Stützzellen konzentrieren, kann dies nicht abschließend beurteilt werden. 5 Diskussion 88

5.2 Lektinhistochemie

5.2.1 Vorbemerkungen Mithilfe der Lektinhistochemie wurde die Verteilung bestimmter Zuckerreste in den olfaktorischen Sinnesepithelien sowie mit dem olfaktorischen System assoziierter Drüsen bei B. orientalis und X. borealis analysiert und verglichen. Die erzielten Befunde lassen sich auf zellulärer Ebene relativ unmissverständlich einordnen. Beispielsweise sind die mehrheitliche Bindung von Con A an olfaktorischen Sinneszellen sowie die Bindung der übrigen Lektine insbesondere an Schleim-assoziierte Komponenten auf die jeweilig durch das Lektin erkannten Glykosylierungen bzw. die unterschiedlichen Makromolekül-Klassen (N-glykosidische bzw. O- glykosidische Verbindung; s. Kap. 3.8) zurückführbar. Außerdem wurden bei einer Vielzahl von Lektinen intrazellulär Färbungen an kappenartigen Strukturen direkt oberhalb von Zellkernen dokumentiert, die wahrscheinlich mit den posttranslationalen Modifizierungen von Glykokonjugaten in den Organellen ER und Golgi-Apparat in Verbindung zu bringen sind. Zusätzlich enthalten auch andere Organellen wie Lysosomen und Mitochondrien Glykokonjugate, wodurch sich z. B. vereinzelte punktförmige Strukturen erklären lassen (Endo et al. 2011).

5.2.2 Zusammensetzung und Herkunft der nasalen Sekrete bei B. orientalis Die unterschiedlichen Lektinbindeeigenschaften einzelner sekretorischer Bestandteile der Sinnesepithelien und nasaler Drüsen bei B. orientalis sind in Tabelle 1 übersichtlich dargestellt. Für die Interpretation der Daten hinsichtlich der Schleimkomponenten wurden Stützzellen mit eindeutig identifizierbaren Sekreten bzw. Sekretvesikeln als positiv bewertet, färbten sich beispielsweise nur die Zellkerne gilt dies als negativer Befund. Im Falle des Recessus olfactorius werden die Bindemuster und beobachteten Granula dem oben definierten Zelltyp 1, also den sezernierenden Stützzellen zugeordnet. Zudem stützen diese Beobachtungen die ebenfalls oben formulierte Annahme, der zweite Stützzelltyp des RO sei nicht-sekretorisch. Für das Hauptgeruchsorgan war zudem eine umfassendere Analyse der Mucusschicht möglich, da diese im Allgemeinen bei der Herstellung der Präparate intakt bleibt – anders als beim Recessus olfactorius oder im Vomeronasalorgan, wobei letzteres nicht über eine derartige Schleimschicht verfügt. Hier können lediglich Schleimreste, die sich beispielsweise an den Zellfortsätzen beider Epithelien beobachten lassen, zur Deutung herangezogen werden. 5 Diskussion 89

Tabelle 5.1. Zuckerreste der intranasalen sekretorischen Elemente bei B. orientalis zum Zeitpunkt der Fixierung. + = positiver Nachweis, - = kein Nachweis, +* = Färbung auf bestimmte Areale beschränkt. BD: Bowman’sche Drüsen, Gl. n.: Glandula nasalis, M: Mucusschicht, SZ: Stützzellen. Recessus Vomero- Hauptgeruchsorgan Nasale Drüsen olfactorius nasalorgan Flimmer- Zuckerrest SZ SZ Gl. n. ora- Gl. n. Gl. n. epithel M BD SZ M M SZ Lektin (1) (2) lis interna medialis lateralis Mannose/Glc Con A +* + ------+ + +* GalNAc/Gal DBA + + + + + - + - + + + + PNA + - +* + + - - - - - + +* RCA 120 + ------+ - - SBA + - + + + - + - + + + +* Fucose UEA I +* - +* ------GlcNAc/ Neuraminsäure WGA + - + + + - + - + + + +

Aus den vergleichend aufbereiteten Daten geht hervor, dass der Mucus im Hauptgeruchsorgan sämtliche getesteten Zuckerreste enthält, wenn auch teilweise in räumlich begrenzten Arealen. Ein Lektin (RCA 120, s. u.) wurde ausschließlich im Mucus beobachtet; zwei von sieben Lektinen (Con A, DBA) wurden an den Bowman’schen Drüsen nachgewiesen; an die Stützzellen des HG banden fünf von sieben Lektinen (DBA, PNA, SBA, UEA I, WGA). Diese Unterschiede spiegeln offensichtlich die Verschiedenheit der Sekrete der Bowman’schen Drüsen und der Stützzellen wider, ähnliches wird von diversen Autoren (Foster et al. 1991, 1992; Getchell und Getchell 1992; Menco und Farbman 1992) für zahlreiche Spezies beschrieben. Insbesondere decken sich die hier erhobenen Befunde mit Veröffentlichungen, wonach die Bowman’schen Drüsen eher seröses Sekret enthielten, das arm an Neuraminsäure sei (Getchell und Getchell 1992): nur eines aus der Gruppe der GalNAc/Gal spezifischen Lektine zeigte Affinität für die Bowman’schen Drüsen und WGA nicht. Auffällig ist außerdem, dass die Glykotope von RCA 120 und UEA I bei B. orientalis in begrenzten Mucus-Arealen auftreten, was dafür spricht, dass es sich hier um spezifisch abgegebene Produkte mit örtlich umgrenzten Aufgaben handeln könnte. Bezogen auf die Herkunft der Zuckerreste im Schleim des Hauptgeruchsorgans lässt sich aufgrund der teilweisen Überschneidung der Bindeeigenschaften vermuten, dass es sich sowohl um Produkte der Bowman’schen Drüsen als auch der Stützzellen handelt. Dabei scheinen zwei Lektine Strukturen im Mucus zu binden, die nur aus je einer der beiden Quellen stammen. Zum einen der Zuckerrest Fucose, der exklusiv in Stützzellen des HG nachgewiesen wurde, zum anderen band das Lektin Con A nur an die Bowman’schen Drüsen. Zusätzlich besteht die 5 Diskussion 90

Möglichkeit, dass die Sekrete der Flimmerepithelien in gewissem Umfang zur Mucuskomposition des Hauptgeruchsorgans beitragen, da sie außer RCA 120 und UEA I ebenfalls sämtliche Lektine zu binden imstande waren. Im Gegensatz dazu lässt sich relativ sicher ausschließen, dass der Mucus den extraepithelialen nasalen Drüsen, also der Gl. nasalis lateralis, - medialis (Gm) oder - oralis interna (Goi) entstammt. Zwar sind in den Sekreten dieser Drüsen auch Zuckerreste nachgewiesen, die im Mucus des HG vorkommen, doch die anatomischen Relationen der Drüsen bzw. ihrer Ausführgänge legen den Schluss nahe, dass die Sekrete lediglich den RO (Goi) bzw. das VNO (Gm, laterale Nasendrüse) erreichen (Nowack 2011). Interessanterweise wurden spezielle, abweichend vom übrigen Mucus gefärbte Komparti- mente im Mucus oberhalb der Stützzellen, wie nach Analyse der Semidünnschnittpräparate (s. o.) zu erwägen war, nicht beobachtet. Wahrscheinlich ist, dass die Kompartimente sich in Paraffinschnitten aufgrund der Dicke des Materials nicht beobachten lassen. Es ist dennoch durchaus denkbar, dass bei Lektinfärbungen an Semidünnschnitten Subkompartimente beobachtet werden können. Im Recessus olfactorius bzw. an den dortigen Stützzell-Sekretgranula banden vier der sieben getesteten Lektine (DBA, PNA, SBA, WGA). Dieselben vier Lektine wurden auch im Mucus des RO beobachtet – wobei, wie bereits erwähnt, dieses Bild möglicherweise unvollständig ist (s. o.) – und drei der vier Lektine wurden in der mit dem RO assoziierten Goi detektiert. Diese Daten lassen sich so deuten, dass der Mucus, der den RO bedeckt, ein Gemisch der Sekrete der Stützzellen des RO und der Goi ist. Dabei scheinen die Glykotope, welche durch PNA nachgewiesen werden, ausschließlich den Stützzellen zu entstammen. Zwar käme prinzipiell auch das Flimmerepithel, welches den RO umgibt, als Produzent in Frage, allerdings wurde PNA nur im respiratorischen Epithel innerhalb des Recessus lateralis des Cavum inferius detektiert. Aus diesem Grund kann das Flimmerepithel als Quelle für die PNA-bindenden Strukturen als unwahrscheinlich betrachtet werden. Hingegen nicht völlig auszuschließen ist, dass der RO-Mucus – ohne Beteiligung der Goi – ausschließlich von den Stützzellen sezerniert wurde, da leider keines der beobachteten Glykotope des Mucus ausschließlich in der Goi auftrat. Es bliebe allerdings offen, was in diesem eher unwahrscheinlichen Fall mit dem Sekret der Goi geschehen würde. Hier bieten sich Untersuchungen mit weiteren Lektinen an, um mehr Details über die Zusammensetzung und die Herkunft der Schleimschicht des RO zu erhalten. Vergleicht man die Zusammensetzungen der beiden Sekrete, so fällt auf, dass der Mucus des RO im Gegensatz zum Mucus des HG keine Bindung von Con A, RCA 120 und UEA I aufwies. Dies lässt den vorläufigen Schluss zu, dass die Stützzellen und Bowman’schen Drüsen 5 Diskussion 91 des HG an der Produktion des RO-Mucus nicht beteiligt sind. Die Zuckerreste Fucose, Mannose und die jeweiligen Bindepartner des RCA 120 sind also im RO-Mucus nicht vertreten, was als Nachweis für die unterschiedlichen Zusammensetzungen der Schleime dieser beiden benachbarten Sinnesepithelien – zumindest zum Zeitpunkt der Fixierung – verstanden werden darf. Im Hinblick auf mögliche perireceptor events vor der eigentlichen Detektion von Duftstoffen dürfte dies eine nicht unerhebliche Rolle spielen. Das vomeronasale Sinnesepithel von B. orientalis scheint nach den vorliegenden lektinhistochemischen Befunden keine mit dem HG und dem RO direkt vergleichbaren sezernierenden Stützzellen zu besitzen. Obwohl die verwendeten Lektine zum Teil auch Stützzellen markierten, handelte es sich dabei um morphologisch nicht eindeutig zur Sekretion in Beziehung zu setzende Bestandteile, sondern beispielsweise um Zellkerne oder -membranen. Auch in der Analyse der Semidünnschnitte (s. o.) waren keinerlei sekretgefüllte Vesikel zu beobachten. Hierin ähneln die Stützzellen des VNO den nicht-sekretorischen Stützzellen des RO. Vergleichbare Ergebnisse, also die Abwesenheit von Sekretgranula in den Stützzellen des VNO bzw. negative Lektinfärbungen insbesondere für die O-glykosylierten Glykotope, wurden in zahlreichen Studien publiziert (z. B. Foster et al. 1992; Getchell und Getchell 1992; Mendoza und Kuhnel 1991; Takami et al. 1994, 1995; Takami 2002). Statt in der Sekretproduktion wird die Funktion der Stützzellen im VNO eher in struktureller und metabolischer Unterstützung der Sinneszellen gesehen (Stowers und Spehr 2015). Da bei B. orientalis, wie bei allen Anuren, die Stützzellen des VNO Cilien tragen, liegt zudem der Verdacht nahe, dass die Flimmerfunktion hier im Vordergrund stehen könnte. Dennoch wurden Mucusreste mit gebundenem Lektin im Bereich der Zellfortsätze des VNO beobachtet (DBA, SBA, WGA). Da nichtsensorische Cilien zumindest bei dem Anurenvertreter Rana ridibunda keine Glykoproteine enthalten (Chen und Lancet 1984), wird die Vermutung, dass es sich tatsächlich um eine Färbung des anhaftenden Mucus handelt, gestützt. Als Quelle für diesen Mucus kommen sowohl die Gl. nasalis medialis und die laterale Nasendrüse, aber auch das Flimmerepithel infrage (Nowack 2011); alle drei enthielten die entsprechenden Glykotope. Die Gm band darüber hinaus noch die Lektine Con A und RCA 120. Dass diese Lektine nicht im Lumen bzw. an den Zelloberflächen des VNO detektiert worden sind, ist möglicherweise in der unvollständigen Konservierung des Schleims begründet. Con A könnte überdies im Drüsengewebe an Zwischenprodukte gebunden haben, die bei Vollendung der Glykosylierung keine frei zugänglichen Mannosereste mehr besaßen (Foster et al. 1991). Nicht unerwähnt bleiben soll an dieser Stelle, dass zusätzlich zu den bereits genannten und diskutierten Drüsen auch die Harder’sche Drüse als Quelle für Sekrete in Betracht kommt 5 Diskussion 92

(Nowack und Wöhrmann-Repenning 2010), diese wurde allerdings im Zuge der vorliegenden Studien nicht analysiert.

5.2.3 Zusammensetzung und Herkunft der nasalen Sekrete bei X. borealis Die unterschiedlichen Lektinbindeeigenschaften einzelner sekretorischer Bestandteile der Sinnesepithelien und nasaler Drüsen bei X. borealis sind in Tabelle 5.2 übersichtlich dargestellt; es wurden für die Interpretation der Daten die gleichen Kriterien angewandt, wie oben für B. orientalis beschrieben. Tabelle 5.2. Zuckerreste der intranasalen sekretorischen Elemente bei X. borealis zum Zeitpunkt der Fixierung; + = positiver Nachweis, - = kein Nachweis, +* = Färbung auf bestimmte Areale beschränkt. BD: Bowman’sche Drüsen, Gl. n.: Glandula nasalis, M: Mucusschicht, SZ: Stützzelle. Middle chamber Vomero- Hauptgeruchsorgan Nasale Drüsen epithelium nasalorgan Flimmer- Gl. n. Zuckerrest Gl. n. epithel M BD SZ M SZ (1) SZ (2) M SZ oralis Lektin medialis interna Mannose Con A + + - - - - + - + + - GalNAc/Gal DBA +* - + + - - + - +* + + PNA + - + - - - - - +* +* +* RCA 120 + + + - - - + - +* + +* SBA +* +* + + - - + - - + + Fucose UEA I +* - + - - - - - +* +* +* GlcNAc/ Neuraminsäure WGA + - + + - - + - - + +

Im Hauptgeruchsorgan wird der Mucus offenbar, ähnlich wie oben für B. orientalis geschildert, von den Stützzellen und den Bowman’schen Drüsen gemeinsam gebildet. Dafür spricht die positive Lektinfärbung des Mucus bei gleichzeitig positiver Färbung der genannten Drüsen. Dabei scheinen die Mannose-tragenden Sekretionsprodukte exklusiv in den Bowman’schen Drüsen hergestellt zu werden, vier weitere Glykogene stammen ausschließlich aus dem Stützzellsekret und zwei Lektine markierten beide Quellen. Auffällig ist allerdings die vergleichsweise schwache Färbung des Schleims durch DBA und SBA, bei einer wesentlich kräftigeren Färbung der Sekretvesikel der Stützzellen. Im Falle von SBA nimmt die Färbung des Mucus in caudaler Richtung zu, ebenso werden caudad Bowman’sche Drüsen SBA-positiv. Hier liegt es nahe, einen Zusammenhang anzunehmen: Die Bowman’schen Drüsen scheinen in caudaler Richtung zunehmend einen SBA-positiven Bestandteil in den Mucus abzusondern. Ein weiteres hervorstechendes Resultat betraf das Lektin UEA I. Es wurde in den Stützzellen des Hauptgeruchsorgans und im Mucus nachgewiesen, aber hauptsächlich schien es direkt an den Cilien der Sinneszellen gebunden zu haben. Eine Erklärung dafür könnte sein, dass 5 Diskussion 93 hier möglicherweise analog zu publizierten Befunden (Foster et al. 1991, 1992) ein Produkt der Stützzellen in die Glykokalyx der Sinneszellen eingebaut wird. Im Mucus des middle chamber epitheliums wurden mit drei Lektinen Färbungen erzielt. Interessanterweise wurden mit keinem der eingesetzten Lektine Sekretgranula in den Stützzellen des MCE markiert. Auch Endo et al. (2011), Oikawa et al. (1998) und Suzuki et al. (1999) konnten in ihren ultrastrukturellen und lektinhistochemischen Untersuchungen keine Sekret- vesikel in den Stützzellen des MCE von adulten X. laevis beobachten. Im Gegensatz dazu beschreiben Hansen et al. (1998), ebenfalls an X. laevis, sezernierende Stützzellen im MCE. Die Autoren untersuchen jedoch juvenile Exemplare, sodass es vorstellbar wäre, dass eine „Reifung“ des MCE und insbesondere des Stützzellensekrets, wie sie im Rahmen der Metamorphose für die Stützzellen des HG beschrieben ist und auch im MCE auftritt (Hansen et al. 1998; Endo et al. 2011), noch unvollständig war. Die Herkunft des Mucus bzw. der darin enthaltenen Glykokonjugate im Bereich des MCE kann derzeit nicht eindeutig geklärt werden. Zwar kommt die Gl. nasalis oralis interna prinzipiell in Betracht – sie wird ähnlich wie beim RO zum MCE in Bezug gesetzt (Helling 1938; Paterson und Hindle 1951; Saint Girons und Zylberberg 1992) und enthält zumindest stellenweise die erforderlichen Glykotope. Aber die anatomische Situation des Ausführgangs bei X. borealis lässt dies bezweifeln: Er mündet medial der ventralen Grenzfalte (Föske 1934), welche die Haupthöhle von der Nebenhöhle trennt. Die Drüsenmündung verstreicht caudad in einem Gebiet, welches nach Paterson und Hindle 1951 als „ventrale Zellen“ bezeichnet wird. Diese formen eine Rinne welche bis zum Verstreichen der Grenzfalte im Bereich des caudalen Endes des MCE und des rostralen Beginns des VNO bestehen bleibt. Diese Beobachtungen legen den Gedanken nahe, dass das Sekret der Goi eher dem VNO zugeführt werden könnte als dem MCE. Dafür spricht auch, dass das Sekret der Goi Con A gebunden hat, ebenso wie der Mucus im VNO – der Mucus des MCE jedoch nicht – wobei dies auch auf Reifeprozesse der Sekrete zurückzuführen sein könnte. Möglicherweise erfüllt das Sekret der Goi auch einen Zweck speziell in Zusammenhang mit den ventralen Zellen, wobei deren Funktion zum jetzigen Zeitpunkt noch vollständig unbekannt ist. Darüber hinaus könnte auch das Flimmerepithel die Sekrete des MCE produzieren, denn die Glykotope des Mucus stimmen mit denen, die ubiquitär im Flimmerepithel verteilt waren, überein. Analog den oben für B. orientalis beschriebenen Resultaten wurden auch im vomeronasalen Sinnesepithel von X. borealis keinerlei sekretorische Vesikel oder Lektinbindung an sekretorischen Elementen beobachtet. Auch hier scheint, wie bei B. orientalis, die Quelle des lektinpositiven Mucus die Gm zu sein. Darüber hinaus kommt möglicherweise die Goi (s. o.) in 5 Diskussion 94

Frage. Das Sekret dieser Drüse wäre durch die Lage ihrer Mündung in der luftgefüllten Haupthöhle (Altner 1962) unter Umständen in der Lage, luftgetragene Duftstoffe zum VNO zu transportieren, ähnlich wie das für die laterale Nasendrüse nicht-pipider Frösche dokumentiert worden ist (Nowack 2011) – ein sehr interessanter Gedanke angesichts der Tatsache, dass den Pipidae eine laterale Nasendrüse fehlt (Saint Girons und Zylberberg 1992). Wiederum muss auch das Flimmerepithel als Quelle bedacht werden, allerdings stimmen nicht alle Zuckerreste zwischen VNO-Mucus und Flimmerepithel überein, sodass hier nicht der alleinige Ursprung der Glykokonjugate liegen kann.

5.2.4 Con A als Marker olfaktorischer Sinneszellen Sowohl in den Sinnesepithelien von B. orientalis, als auch bei X. borealis wies Con A eine starke Affinität zu den olfaktorischen Neuronen in allen vier Geruchsorganen auf. Es markierte die Neuronen bei beiden Tieren vollständig, inklusive der Axone, Dendriten, Zellfortsätze und besonders der supranucleären Strukturen, die als Golgi-Komplex interpretiert werden können (s. o.). Im Hauptgeruchsorgan von B. orientalis wiesen die übrigen Zelltypen ebenfalls eine Färbung (schwächer, aber deutlich) auf; im VNO und im RO blieben Stützzellen und Basalzellen nahezu ungefärbt. Con A scheint demnach bei B. orientalis einen Marker für differenzierte olfaktorische Neurone darzustellen. Bezüglich des RO kann allerdings anhand der Paraffinschnitte derzeit nicht abschließend beurteilt werden, ob die Färbung mit Con A tatsächlich alle Sinneszellen umfasst. Bei X. borealis wiesen das HG und das MCE vergleichbare Hintergrundfärbung auf, während das VNO analog den Befunden bei B. orientalis nahezu ungefärbte Basal- und Stützzellareale aufwies. Auch hier scheint Con A gezielt reife Sinneszellen zu detektieren. Für Con A wurde bereits mehrfach eine besondere Affinität für olfaktorische Neurone publiziert (Foster et al. 1991; Hempstead und Morgan 1983). Allerdings zeigt der Vergleich dieser Daten mit den an B. orientalis und X. borealis beobachteten Resultaten, dass auch Con A speziesspezifisch im Einzelnen unterschiedliche Bindemuster generiert. Da es in gewissem Umfang auch andere Zelltypen bindet oder in Einzelfällen wie beispielsweise von Hempstead und Morgan (1983) im VNO von Hamstern dokumentiert, nicht in jedem Sinnesepithel Neurone markiert, muss die Anwendbarkeit von Con A als neuronaler Marker im Vorfeld zukünftiger Untersuchungen individuell geprüft werden. Was die Funktion betrifft, so stehen Zuckerreste bei olfaktorischen Neuronen – im Unterschied zu Glykokonjugaten die im Kontext von Sekretion und Sekreten vorgefunden werden – allgemein mit Chemorezeption, Transduktion, Histogenese und Entwicklung des olfaktorischen Systems in Verbindung (Franceschini et al. 2003). Con A detektiert nach Anholt 5 Diskussion 95

(1986; in Snyder et al. 1991) eine große Gruppe von Proteinen mit Sitz speziell in den Cilien von Geruchssinneszellen. Con A soll außerdem eine inhibierende Wirkung auf die Fähigkeit zur Rezeption von Duftstoffen haben (Plendl und Sinowatz 1998), sodass für seine Zielproteine eine Bedeutung vor allem im Rahmen der Signaltransduktion angenommen wird.

5.2.5 RCA 120 als Marker für Olfactomedin RCA gilt nach Snyder et al. 1991 als Lektin, das zumindest bei Rana catesbeiana ausschließlich an das dort erstmalig beschriebene Protein Olfactomedin (57 kDa) bindet. Das Protein wurde bei R. catesbeiana im Hauptgeruchsorgan in den Sekretvesikeln der Stützzellen, in den Bowman’schen Drüsen, an den Cilien der Sinneszellen sowie dem direkt angrenzenden Mucus in großer Menge nachgewiesen. Zudem wurde es in der Gm beobachtet (Snyder et al. 1991; Bal und Anholt 2002). Die Autoren schließen daraus, dass Olfactomedin von den genannten Drüsen produziert und im „mucociliary complex“ als Dimer deponiert wird. Bei B. orientalis wurde RCA 120, wie bereits erwähnt, im Schleim des Hauptgeruchsorgans im Bereich der Cilien und an den Cilien selbst beobachtet. Im VNO gab es im Bereich der Zellfortsätze eine Färbung, außerdem an den luminalen Oberflächen der Gm- Schläuche. Damit stimmt die Lokalisation weitestgehend mit den von Snyder et al. 1991 und Bal und Anholt 2002 publizierten Orten für Olfactomedin überein, sodass sich vermuten lässt B. orientalis exprimiert dieses Protein ebenfalls im Geruchssystem. Das selbe gilt im Prinzip für X. borealis: Hier wurde RCA 120 allerdings an weitaus mehr Bindestellen nachgewiesen. So könnte X. borealis über sehr viel Olfactomedin verfügen, oder aber RCA 120 detektiert dort noch weitere, unbekannte Moleküle. Olfactomedin bzw. Homologe dieses Proteins wurden inzwischen in einer ganzen Reihe von Tierarten von Nematoden bis hin zu Menschen gefunden (Snyder et al. 1991; Anholt 2014). Die Proteine scheinen wichtige Aufgaben im Kontext von Entwicklung insbesondere des Nervensystems zu haben. Bei R. catesbeiana wurde angenommen, es diene als Differenzierungs- signal für olfaktorische Endknöpfchen im Rahmen der Regeneration des Epithels. Darüber hinaus soll es aufgrund seiner Aggregatbildung maßgeblich für die Strukturierung der extrazellulären Matrix und des Mucus verantwortlich sein (Bal und Anholt 2002). Sollte demnach RCA 120 tatsächlich Olfactomedin detektiert haben, so wäre die Lokalisation im Geruchssystem ein Hinweis auf ein ähnliches Aufgabenspektrum bei B. orientalis und X. borealis.

5.2.6 SBA und DBA, art- und nachweisabhängige Marker olfaktorischer Subsysteme Im Zuge der vorliegenden Studien wurden (zusätzlich zu den oben besprochenen Resultaten mit 5 Diskussion 96

Bezug zur Sekretion) unter Verwendung von DBA-HRP bei X. borealis unterschiedliche Färbeintensitäten an den primären Nervenfasern des HG, MCE und VNO beobachtet. Weder wurde ein vergleichbares Ergebnis mit einem der anderen Lektine erzielt, noch konnten die Nervenbahnen bei B. orientalis mithilfe dieser Methode unterschieden werden. Zunächst stellt sich die Frage, warum das Lektin SBA im vorliegenden Fall keine Unterscheidung der Subsysteme bei X. borealis ermöglichte, obwohl dies bei einer großen Anzahl von Studien gelungen ist (s. Kap. 3.6), darunter eine explizit an X. borealis (Key und Giorgi 1986a). Es wäre möglich, dass Unterschiede in der Prozessierung des Gewebes einen Einfluss auf die Glykotope hatten, Key und Giorgi (1986a) verwendeten eine Perfusionfixierung und Kryostat-Schnitte, während im vorliegenden Fall mit Immersionsfixierung und Paraffinschnitten gearbeitet wurde. Ein weiterer Unterschied besteht im Nachweis des gebundenen Lektins: In der überwiegenden Mehrheit der o. g. Arbeiten kommt HRP-gebundenes SBA zum Einsatz, während das Lektin in der vorliegenden Studie an Fluorescein gekoppelt vorlag. HRP hat einen gewissen Einfluss auf die Bindeeigenschaften von Lektinen (Brooks et al. 1997), der vermutlich auch für die in der vorliegenden Arbeit dokumentierten unterschiedlichen Färberesultate mit DBA-HRP und DBA-Rhodamin verantwortlich ist: Rhodamin-markiertes DBA färbte insgesamt sämtliche Strukturen bei X. borealis schwächer als HRP-markiertes, was dazu führte, dass die Unterscheidbarkeit der Axone des HG und des VNO nicht mehr gewährleistet war. Bei B. orientalis war der Effekt noch stärker, DBA-HRP markierte hier beispielsweise Riechhirnabschnitte, die unter DBA-Rhodamin völlig ungefärbt blieben. In Anbetracht dieser Situation wäre es möglich, dass der Einsatz von HRP-markiertem SBA im Gegensatz zum verwendeten fluoresceingekoppelten SBA sowohl bei X. borealis als auch bei B. orientalis ein deutlich intensiveres Ergebnis – eventuell sogar mit unterschiedlich gefärbten Nerven – erzielen würde. Wie bereits erwähnt, konnten bei keinem der verwendeten Lektine Unterschiede in der Markierung der Nervenfasern der drei Geruchssysteme von B. orientalis identifiziert werden. Dies ist ein Befund, der – wenigstens in Bezug auf DBA – die bereits angesprochene Speziesspezifität der Lektinbindungen unterstreicht. Dennoch ist davon auszugehen, dass auch bei B. orientalis eine Differenzierung der Axone aufgrund ihrer Zelloberflächen bzw. deren Zuckerresten prinzipiell existieren dürfte. Hinweise darauf liefern die zahlreichen Studien an diversen Tierarten, bei denen dieser Nachweis gelungen ist, so dürften auch die Axone der drei olfaktorischen Subsysteme von B. orientalis über eine eigene „Signatur“ (Key und Giorgi 1986a) ihrer Zelloberflächenglykokonjugate verfügen. Für zukünftige Untersuchungen sollten allerdings HRP-gekoppelte Lektine bevorzugt eingesetzt werden. 5 Diskussion 97

5.2.7 Möglichkeiten und Grenzen der Lektinhistochemie Über die genaue Identität der Makromoleküle, deren Zuckerreste Lektine detektieren, können in den meisten Fällen keine definitiven Aussagen getroffen werden (Brooks et al. 1997; Key und Giorgi 1986b). Nur ausnahmsweise existieren begründete Hinweise auf bestimmte Bindepartner (s. o.), aber: In der Regel tragen verschiedene Glykoproteine, Glykolipide und Proteoglykane dieselben Determinanten, sodass generell von mehreren Interaktionspartnern ausgegangen werden muss. Außerdem ändern sich Lektinbindemuster einzelner Strukturen offensichtlich nicht nur im Verlauf der Individualentwicklung, in einem Fall wurden sogar jahreszeitlichen Schwan- kungen beschrieben (Kondoh et al. 2012). Die Autoren beobachteten Unterschiede in der Intensität von Lektinfärbungen an Stützzellsekretgranula bei der Schlangenart Elaphe quadrivirgata, die eine reproduktionszyklisch bedingte unterschiedliche Sekretproduktion widerspiegeln sollen. Eine weitere Hürde bei der Interpretation von lektinhistochemisch generierten Daten ist die – auch in der vorliegenden Untersuchung beobachtete – Artspezifität von Lektinbindungen (Brooks et al. 1997; Ponder 1983; Snyder et al. 1991; Yokosuka et al. 2009): Als einander homolog angesehene Sinnesorgane sowie deren einzelne Elemente, namentlich das Haupt- geruchsorgan einerseits und das Vomeronasalorgan andererseits, weisen speziesabhängige Lektinbindemuster auf (eigene Untersuchung; Foster et al. 1991; Key und Giorgi 1986a; Mendoza und Kuhnel 1991; Halpern und Martínez-Marcos 2003 und darin enthaltene). Angesichts dieser Tatsachen erscheint es unhaltbar, die Fähigkeit von Lektinen bestimmte Gewebe bzw. (Sinnes-) Organe zu binden, mit schlüssigen Überlegungen zur Phylogenie von Geweben oder Sinnesorganen in Verbindung zu bringen, auch wenn diese Möglichkeit in der Vergangenheit im Kontext einiger Studien in Betracht gezogen worden ist (Franceschini und Ciani 1991; Franceschini et al. 1992; Franceschini et al. 1996; Meyer et al. 1996; Franceschini et al. 2003; Saito et al. 2006). Halpern und Martínez-Marcos (2003) haben im Zusammenhang mit heterogenen Lektinfärbeergebnissen am VNO bzw. dem AOB diverser Spezies sogar Zweifel, ob Vergleiche verschiedener Spezies überhaupt sinnvoll sind. Trotzdem stellen Lektine nützliche Hilfsmittel dar, um Zellen, Gewebe und Sekrete sowie deren Zustände zum Zeitpunkt der Fixierung phänotypisch zu charakterisieren und innerhalb einer Art zu vergleichen (Halpern und Martínez-Marcos 2003; Ponder 1983), wie dies auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit geschehen ist. Die besondere Stärke der Lektinhistochemie liegt dabei, wie dargelegt, in der Auseinandersetzung mit der Beschaffenheit von sekretorischen Strukturen. 5 Diskussion 98

5.3 Immunhistochemie

5.3.1 G-Proteinuntereinheiten im Geruchssystem von B. orientalis Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurden die Geruchsorgane von B. orientalis mithilfe von Antikörpern gegen die G-Proteinuntereinheiten αolf, αi2, und αo auf ihre Immuno- reaktivität (ir) untersucht. Ein spezifisches Ergebnis lieferten lediglich die Analysen mittels Anti-

Gαo. Im Rahmen der Funktionstests wurde eine Bande bei etwa 40 kDa detektiert, was der zu erwartenden Größe für dieses Protein entspricht (Datenblatt Fa. SantaCruz Biotechnology, Inc.), zudem wurden in allen drei Geruchsepithelien Sinneszellen markiert. Im Hauptgeruchsorgan umfasste die Markierung vor allem die axonalen Fortsätze, die Zellkörper waren demgegenüber etwas blasser gefärbt. Dies spricht dafür, dass an den Axonen die Dichte der gebundenen Moleküle wesentlich höher war als im übrigen Zellkörper. Außerdem deuten die unmarkierten

Cilien im HG darauf hin, dass hier bei der Detektion der Stimuli Gαo bzw. V2-Rezeptoren, anders als im RO und VNO von B. orientalis (s. u.) keine Rolle spielen. Bei Mäusen kommt Gαo ebenfalls in allen Axonen des Geruchssystems vor, den G-Proteinen werden dort Funktionen im Kontext der Signalweiterleitung, der Sortierung und Zielfindung der Axone zugeschrieben – wenn auch die genauen Vorgänge noch unbekannt sind (Wekesa 1999). Es lässt sich vermuten, dass Gαo bzw. damit assoziierte Rezeptoren an Axonen des Hauptgeruchsorgans von B. orientalis ein ähnliches Aufgabenspektrum zukommt.

Im Recessus olfactorius wurden mittels Anti-Gαo neben den Axonen und den Zellkörpern auch Zellfortsätze an der luminalen Oberfläche markiert. Hier scheint das G-Protein also nicht nur analog zum HG in den Axonen wichtige Funktionen zu erfüllen, sondern die vorliegenden Daten sprechen dafür, dass im RO zusätzlich der mit diesem G-Protein assoziierte Signaltrans- duktionsweg vorhanden und in die Detektion von Stimuli involviert ist. Wie bereits erwähnt, wird Gαo auch bei Amphibien mit Rezeptoren des Typs V2R co-exprimiert (Hagino-Yamagishi et al. 2004; Date-Ito et al. 2008; Jungblut et al. 2009; Jungblut et al. 2012). Obwohl zur endgültigen Klärung dieser Frage ein direkter Nachweis für die Co-expression nötig ist, kann vor dem Hin- tergrund bereits publizierter Daten angenommen werden, dass auch in den Geruchsorganen von

B. orientalis Gαo mit V2Rs verknüpft ist. Diese Rezeptoren sind bei Xenopus und Fischen höchstwahrscheinlich an der Detektion von in Wasser gelösten Stimuli wie Aminosäuren (Gliem et al. 2013; Syed et al. 2013; Yoshikawa und Touhara 2015; Rodriguez 2016; Syed et al. 2016) beteiligt, gleichzeitig sollen sie potentielle Pheromonrezeptoren bei Anura sein (Takami 2001; Takami 2002; Hagino-Yamagishi et al. 2004; Date-Ito et al. 2008). Demnach könnte die An- wesenheit dieser Moleküle den RO dazu befähigen, wassergelöste Stimuli inklusive 5 Diskussion 99

Aminosäuren und Pheromonen zu detektieren.

Die V2R- und Go-vermittelte Signaltransduktionskaskade tritt bei Anuren (wie bei Fischen und Säugern) stets in mikrovillitragenden Zellen auf, z. B. im MCE und im VNO von Xenopus (Hagino-Yamagishi und Nakazawa 2011; Yoshikawa und Touhara 2015; Rodriguez 2016; Syed et al. 2016) oder im VNO von Anurenlarven (Jungblut et al. 2009; Jungblut et al. 2012). Auch die in der vorliegenden Studie erzielten Daten deuten auf einen solchen Zusammen- hang. Wie aus der vorliegenden Studie in Verbindung mit den von Nowack et al. (2013) publizierten rasterelektronenmikroskopischen Daten hervorgeht, verfügt der RO höchstwahrscheinlich über mit Mikrovilli ausgestattete olfaktorische Neuronen. Die beobachteten Färbungen am RO lassen, gestützt durch die vorliegende Literatur und die Befunde am VNO von B. orientalis vermuten, dass auch hier die Expression von Gαo in den mikrovillibesetzten Zellen stattfindet.

Im vomeronasalen Sinnesepithel erzielte die Immunfärbung mittels Anti-Gαo ein mit dem

RO nahezu völlig übereinstimmendes Resultat. Auch hier spricht die Anti-Gαo-ir in den Zellfort- sätzen für das Vorhandensein des damit assoziierten Rezeptors V2R, wie dies im VNO von Xenopus (Hagino-Yamagishi et al. 2004; Nakamuta et al. 2011) und Bufo japonicus (Hagino- Yamagishi und Nakazawa 2011) zutrifft. Im vorliegenden Fall bleibt noch unklar, ob die Färbung alle Sinneszellen des VNO einbezieht und somit Xenopus ähnelt oder ob es sich um eine Subpopulation handelt wie dies auch bei B. japonicus und verschiedenen Säugern (Wekesa 1999) beobachtet wurde. Das VNO von B. orientalis sollte demnach analog dem RO wasserlösliche Stimuli, Aminosäuren und Pheromone detektieren können. In Übereinstimmung mit den zusätzlich durchgeführten Western Blots, bei denen keine

Proteinbanden detektiert worden waren, kam es bei Einsatz von Anti-Gαolf zu keiner spezifischen Färbung in den olfaktorischen Geweben. Der leichte Hintergrund, der sich gegenüber der Blindprobe abzeichnete sowie einzelne punktförmige Färbungen im Gewebe sind als unspezifisch zu betrachten. Gαolf ist, wie bereits erwähnt, assoziiert mit den Rezeptortypen OR I, OR II und den TAARs (Mezler et al. 2001b; Liberles und Buck 2006; Galizia und Lledo 2013; Li und Liberles 2016). Jede bis heute untersuchte Wirbeltiergruppe exprimiert mindestens einen der genannten Rezeptortypen (vgl. Niimura und Nei 2005) oder das assoziierte G-Protein, darunter auch Anura (Freitag et al. 1995; Freitag et al. 1998; Date-Ito et al. 2008; Jungblut et al. 2009; Hagino-Yamagishi und Nakazawa 2011; Nakamuta et al. 2011). Daher ist davon auszugehen, dass auch B. orientalis über diese Signaltransduktionskaskade verfügt und das negative Ergebnis bei Einsatz des gegen Säuger-Gαolf gerichteten Antikörpers auf eine mangelnde Kreuzreaktivität mit dem Gewebe von B. orientalis zurückzuführen ist.

Unter Verwendung des gegen die G-Proteinuntereinheit αi2 gerichteten Antiserums 5 Diskussion 100 wurden bei den Antikörperfunktionstests mehrere Banden mit unterschiedlichen Stärken und Molekulargewichten detektiert. Von sämtlichen in Querschnittspräparaten durch die Nasenregion enthaltenen Geweben wurde der Antikörper allerdings nur in der Gaumendrüse nachgewiesen, es wurde insbesondere keinerlei Anti-Gαi2-ir in den Sinnesepithelien beobachtet. Gαi2 wird mit dem vomeronasalen Rezeptor Typ 1 (V1R) co-exprimiert (Hagino-Yamagishi 2008). Obwohl Date-Ito et al. (2008) potentielle V1R Gene bzw. deren mRNAs in X. tropicalis beschrieben haben, die dort im MCE mit Gαi2 co-exprimiert werden, fügen sich die hier erzielten Befunde in eine ganze

Reihe von erfolglosen Versuchen ein, Gαi2 mit kommerziell erhältlichen Antiseren bei Anuren zu detektieren (Jungblut et al. 2009; Menco et al. 2001; Hagino-Yamagishi und Nakazawa 2011; Nakamuta et al. 2011). Bei B. orientalis besteht offenbar ähnlich den genannten Publikationen eine unspezifische Kreuzreaktion des Säuger-Antiserums mit verschiedenen Proteinen.

5.3.2 G-Proteinuntereinheiten im Geruchssystem von X. borealis

Unter Einsatz von Anti-Gαo fielen der Funktionstest und die Analyse der Gewebeproben positiv aus. Für das Hauptgeruchsorgan decken sich die Befunde mit den für B. orientalis beschriebenen und deuten eine ähnliche Funktionsweise der beiden Geruchsorgane an. Im MCE und VNO wurde die Färbung an Zelloberflächen und an den Zellkörpern beobachtet. Demnach scheint das G-Protein auch an dieser Stelle auf die Anwesenheit von V2-Rezeptoren hinzudeuten, womit die Befunde in Einklang mit zahlreichen Publikationen stehen (Shi und Zhang 2007; Date-Ito et al. 2008; Nakamuta et al. 2011; Gliem et al. 2013). Allerdings kann auch hier nicht endgültig geklärt werden, ob die Immunmarkierung Subpopulationen oder alle Neuronen umfasst. Auf Basis bisher veröffentlichter Studien kann jedoch vermutet werden, dass im MCE nur die mikrovillitragenden Zellen markiert sind. Auch für X. borealis kann damit angenommen werden, dass das MCE und VNO wasserlösliche Stimuli, Aminosäuren und Pheromone wahrnimmt. Wie oben für B. orientalis beschrieben, trat auch im Fall von X. borealis unter

Verwendung von Anti-Gαolf relativ kräftige Hintergrundfärbung vor allem im HG und MCE auf. Zwar band der Antikörper im Bereich der luminalen Oberfläche des MCE, was als „korrektes“

Ergebnis zu werten sein könnte, allerdings markierte Anti-Gαolf ebenso Stützzellgranula im HG und die Drüsen Goi und Gm. Aus diesem Grund muss auch hier von einer unspezifischen Bindung und mangelnder Kreuzreaktion ausgegangen werden.

Ähnlich stellt sich die Situation für Anti-Gαi2 dar. Im Rahmen der Funktionstests markierte das Antiserum verschieden breite Banden mit unterschiedlichen Molekülmassen und auf den Gewebeschnitten kam es zu einer Hintergrundfärbung der gesamten Präparate. Im MCE übertraf das Signal in einigen Zellen den Hintergrund, aber auch hier bleibt zunächst offen, ob es sich dabei um ein spezifisches Resultat handelt. 5 Diskussion 101

5.4 Die Funktion des Recessus olfactorius Du Toit bemängelte 1943, der von Helling (1938) gewählte Begriff „Recessus olfactorius“ sei irreführend, da eine olfaktorische Funktion impliziert werde, die für dieses Epithel nicht belegt sei. Angesichts der im Rahmen der vorliegenden Arbeit erhobenen neuen Befunde bezüglich der

Morphologie, des Mucus und der Ausstattung mit Gαo – einem Schlüsselelement olfaktorischer Signaltransduktion – wird deutlich, dass der von Helling gewählte Name durchaus seine Berechtigung hat. Diese Auffassung stützt eine Untersuchung von Jungblut et al. (2010), bei der die Autoren immunhistochemisch NCAMs (neural cell adhesion molecules) im RO von Rhinella arenarum nachweisen, Moleküle die spezifisch für die olfaktorischen Neurone dieser Spezies sein sollen. Darüber hinaus belegen die hier dokumentierten Unterschiede zwischen RO, HG, VNO aber auch dem MCE, dass es sich beim Recessus olfactorius offenbar um ein Geruchsorgan mit individueller Funktion handelt. Eine interessante Frage betrifft das Medium, in dessen Prüfung die einzelnen Geruchsorgane funktionell involviert sind. Die spezielle Architektur des Recessus olfactorius umfasst morphologisch verschiedene Sinnes- und Stützzelltypen die sowohl mikrovilli- als auch cilienbesetzt sind. Damit gleicht der RO einer Reihe von olfaktorischen Sinnesorganen, deren Hauptaufgabe in der Detektion von Duftstoffen im aquatischen Lebensraum gesehen wird. Dazu zählen das ungeteilte Geruchsorgan der Fische (Hansen et al. 2005), das Hauptgeruchsorgan der Amphibienlarven (Taniguchi et al. 1996; Hansen und Zeiske 1998; Benzekri und Reiss 2012; Syed et al. 2013), aber auch das middle chamber epithelium der Pipidae (Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998) oder das sogenannte larval type epithelium. Letzteres wurde bei Ascaphus truei beschrieben und bedeckt bei diesen Tieren große Teile der rostralen Nasenhöhle (Benzekri und Reiss 2012). Es wäre demnach aufgrund der auffallenden Ähnlichkeit der (Oberflächen-) Morphologie des RO zu den genannten anderen Geruchssystemen denkbar, dass der RO ebenfalls auf die Detektion wasserlöslicher Stimuli spezialisiert sein könnte. Diese Auffassung wird gestützt durch Jungblut et al. (2010), die im Rahmen ihrer Untersuchungen an Rhinella arenarum zu dem Schluss gelangen, bei dem RO handele es sich um ein über das Larvenstadium hinaus bestehendes larvales Sinnesepithel, das die adulten Tiere zur olfaktorischen Wahrnehmung in Wasser befähige. Neben den Befunden bzgl. der Oberflächenmorphologie deutet die Abwesenheit von Bowman’schen Drüsen ebenfalls darauf, dass Wasser durch den RO geprüft wird – denn diese Drüsen erscheinen im HG im Rahmen der Metamorphose und werden, wie bereits erwähnt, allgemein als Anpassung an terrestrische Lebensweise gesehen (Hansen et al. 1998; Jungblut et al. 2011). Die im RO vermutlich mit dem dort auftretenden Gαo assoziierten V2-Rezeptoren 5 Diskussion 102 würden in diesem Fall, ebenso wie bei Larven oder im MCE, die Detektion von wassergetragenen Stimuli, Aminosäuren und Pheromonen ermöglichen (Takami 2001; Hagino- Yamagishi et al. 2004; Date-Ito et al. 2008; Gliem et al. 2013; Yoshikawa und Touhara 2015; Rodriguez 2016; Syed et al. 2016). Der Umstand, dass der RO bei den meisten Arten eine Mulde in der Nähe der äußeren Nasenöffnung formt, sollte dafür sorgen, dass sich hier durch die Nasenöffnung eindringende Flüssigkeit sammeln und detektiert werden kann. An ein etwas anderes Szenario lassen allerdings insbesondere die Befunde bezüglich der Schleimschicht und der Herkunft der Sekrete des RO denken. Im Gegensatz zum MCE verfügt der RO über sezernierende Stützzellen, die gemeinsam mit der Goi eine Mucusschicht über dem RO bilden. Diese Mucusschicht unterscheidet sich deutlich von der des Hauptgeruchsorgans, sodass davon auszugehen ist, dass das Sekret eine individuelle Funktion ausübt. Eine Schleimschicht ist essentiell für die olfaktorische Wahrnehmung luftgetragener Stimuli (Oikawa et al. 1998 und darin enthaltene Referenzen). So wäre es möglich, dass die eben angesprochene Mulde, die der RO auskleidet, als eine Art Becken für das Drüsensekret von Goi und Stützzellen dient, in dem luftgetragene Stimuli gelöst und anschließend detektiert werden. Letztendlich findet im RO wahrscheinlich beides statt: So wäre es möglich, dass B. orientalis mit dem RO luftgetragene Stimuli detektiert während sich das Tier an Land aufhält und wassergetragene, wenn es sich im Wasser aufhält. Im Gegensatz zu bestimmten semiaquatischen Caudata (Triturus vulgaris, T. alpestris), deren Geruchsorgan sich je nach Lebensphase erst an das Medium Luft oder Wasser anpassen muss, bevor es vollständig funktionstüchtig ist (Matthes 1927; Meyer et al. 1996; Reiss und Eisthen 2008) verleiht der RO B. orientalis möglicherweise die Fähigkeit, jederzeit ohne Funktions- und somit Informationsverlust das Medium wechseln zu können. Offen bleibt allerdings die Frage, worin der Unterschied im Aufgabenspektrum des RO und des VNO liegt, da das VNO ebenfalls Stimuli aus Wasser und Luft bezieht (s. Kap. 2.4). Hier fehlen weiterführende Studien, insbesondere bezüglich der Rezeptorausstattung der beiden Organe (s. Ausblick Kap. 6). Die beobachteten Unterschiede in der Zusammensetzung des Mucus des RO und VNO geben zumindest einen ersten Hinweis darauf, dass hier Abstufungen im Rahmen der perireceptor events bestehen könnten. So könnten Duftstoffmoleküle innerhalb des jeweiligen Mucus unterschiedlich prozessiert und für spezifische Rezeptoren in beiden Sinnesorganen aufbereitet werden. Denkbar sind hier beispielsweise enzymatische Prozesse oder aber der Einsatz von odorant/pheromone binding proteins. 5 Diskussion 103

5.5 Die phylogenetische Beziehung von Recessus olfactorius und middle chamber epithelium Die phylogenetische Beziehung zwischen Recessus olfactorius und dem middle chamber epithelium ist in der Vergangenheit des Öfteren thematisiert worden (Föske 1934; Helling 1938; Trahms 1936; Rowedder 1937; Paterson und Hindle 1951; Benzekri und Reiss 2012). Zu den Argumenten, die bislang für eine Homologie formuliert wurden, zählen nach Helling (1938) die von ihm beschriebenen histologischen Ähnlichkeiten (Bowman’sche Drüsen fehlen, umgebendes Flimmerepithel), die Assoziation mit einer extraepithelialen Drüse (Goi) und Übereinstimmungen der Ontogenese der beiden Sinnesepithelien (Auftreten während der Metamorphose). Auch Benzekri und Reiss (2012) sehen aufgrund ihrer vergleichenden morphologischen Studien den RO, gemeinsam mit dem von ihnen beobachteten larval type epithelium, als Homologon zum MCE. Gegen eine Homologie sprechen sich Paterson und Hindle (1951) aus, da sie – zumindest in der Entwicklung – einen parallel zum MCE auftretenden Recessus olfactorius bei Pipidae entdeckt haben wollen. Zu diesem Punkt ist anzumerken, dass diese Beobachtung bislang einzigartig ist und es sich bei eingehender Betrachtung der durch die Autoren zur Verfügung gestellten Abbildungen möglicherweise um eine Fehlinterpretation der Drüsenmündung der Goi handelt. Als weiteres Gegenargument führen die Autoren die Position des MCE lateral zur Pliqua terminalis bzw. ventralen Grenzfalte im Gegensatz zur medialen Position des RO an. Durch die vorliegende Untersuchung wurden Hellings (1938) Befunde bezüglich der morphologischen Übereinstimmungen des RO und MCE bestätigt. Das Auftreten beider Organe im Rahmen der Metamorphose wurde ebenfalls durch eine Reihe von Studien belegt (Rowedder 1937; Hansen et al. 1998; Jungblut et al. 2011; Benzekri und Reiss 2012; Dittrich et al. 2016). Hinzu kommt die hier beobachtete identische Ausstattung der Sinnesepithelien bzw. der luminalen Zellfortsätze mit dem G-Protein αo. Die Übereinstimmungen in den genannten Punkten könnten nach wie vor für eine Homologie von RO und MCE im Sinne Hellings sprechen. Kritisch sollte allerdings das Argument der gemeinsamen assoziierten Drüse, der Goi, betrachtet werden. Die vorliegenden Befunde sprechen deutlich gegen eine funktionelle Beziehung der Goi zum MCE (s. Kap. 6.2.3); wohingegen der Mucus der Goi von B. orientalis eine entscheidende Rolle bei der Geruchswahrnehmung durch den RO zu spielen scheint. Die anatomische Relation ist dementsprechend verschieden: Die Goi von X. borealis mündet medial der ventralen Grenzfalte, aber das MCE liegt lateral zu dieser Struktur. Dagegen liegt die Drüsenmündung bei B. orientalis medial des RO und beide Strukturen liegen gemeinsam medial zur Pliqua terminalis. Derartige anatomische Beobachtungen lassen auch Saint-Girons und Zylberberg (2012) an der Korrelation von MCE und Goi zweifeln, genauso steht für Oikawa et 5 Diskussion 104 al. (1998; S. 304) fest „[…] the MCE was devoid of such an associated gland.“. Damit einher geht auch ein weiterer markanter Unterschied zwischen dem MCE und dem RO: Der RO verfügt über eine deutlich beobachtbare Mucusschicht (eigene Untersuchung; Nowack 2008; Jungblut et al. 2011; Nowack et al. 2013), das MCE hingegen nicht (eigene Untersuchung; Hansen et al. 1998; Oikawa et al. 1998). Wie weiter oben dargelegt, ist eine Schleimschicht unerlässlich für die Detektion luftgetragener Duftstoffmoleküle, wird allerdings vom MCE in seiner Eigenschaft als water-nose nicht benötigt (Hofmann und Meyer 1991; Reiss und Eisthen 2008). Diese offenkundigen anatomischen und funktionellen Diskrepanzen stehen einer Homologie der Sinnesepithelien prinzipiell nicht entgegen (Ax 1984), so könnten sie insgesamt Folge und Ausdruck der starken Abwandlung der Nasenhöhlen der Pipidae in Zusammenhang mit der sekundär aquatischen Lebensweise (Reiss und Eisthen 2008; Pough 2016) sein. Ebenso wäre es möglich, dass der RO und das MCE konvergent entstandene Strukturen darstellen, deren Gemeinsamkeit es ist, ihren Trägern nach der Metamorphose einen noch differenzierteren Eindruck ihrer Umwelt zu vermitteln als HG und VNO allein. Die vorliegenden Kenntnisse bezüglich der Morphologie und Funktion der Sinnesepithelien RO und MCE lassen derzeit eine abschließende Beurteilung der Situation nicht zu, was besonders der immer noch äußerst lückenhaften Datenlage hinsichtlich des RO geschuldet ist. 6 Ausblick 105

6 Ausblick Der Recessus olfactorius von B. orientalis wurde im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen eindeutig als Geruchsorgan identifiziert, dessen Eigenschaften eine besondere Rolle in der Wahrnehmung olfaktorischer Stimuli nahelegen. Dabei wurden durch die dokumentierten Befunde markante anatomische Unterschiede zwischen dem RO und dem Hauptgeruchsorgan einerseits und dem Vomeronasalorgan andererseits deutlich, während eine große morphologische Ähnlichkeit zum middle chamber epithelium von X. borealis vorliegt. Im Kontrast dazu bilden die erhobenen Daten eine größere Übereinstimmung zwischen dem RO und dem VNO auf funktioneller Ebene ab. Offen bleibt dabei zunächst allerdings die höchst interessante Frage nach der funktionellen Abgrenzung zum Vomeronasalorgan, da derzeit, abgesehen von Hinweisen auf unterschiedliche perireceptor events, keinerlei Daten dazu vorliegen. Folglich sollte in einem ersten Schritt geprüft werden, ob sich neben Gαo/V2R weitere Bestandteile des

Signaltransduktionsapparates wie Gαolf und Gαi2 im RO oder VNO nachweisen lassen. Dies wäre als ein erster Anhaltspunkt auf die Existenz und Verteilung von verschiedenen Rezeptorfamilien bei B. orientalis zu verstehen. Weiterführend ist natürlich von Interesse, ob die postulierten V2Rs im RO und VNO übereinstimmen, oder ob eine heterogene Ausstattung mit Rezeptormolekülen vorliegt. Neben Antikörperfärbungen kämen hierzu prinzipiell auch in-situ-Hybridisierungen in Betracht. Ergänzend dazu könnten beispielsweise Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen Tubulin oder Phalloidin vorgenommen werden, um die Lokalisation der Zielproteine in den cilien- oder mikrovillibesetzten Neuronen des RO zu ermitteln. In diesem Kontext muss zudem die nach wie vor unbekannte Zielregion der Axone des Recessus olfactorius aufgeklärt werden. Eine entsprechende Untersuchung am RO von B. orientalis mithilfe des neuronalen Tracers DiI ist daher bereits in Vorbereitung. Interessant wäre überdies die Untersuchung der Larven von B. orientalis hinsichtlich der G-Proteine und/oder Rezeptorenausstattung. Ein spannendes Thema ist hierbei, ob und in wie weit der RO, der morphologisch dem Hauptgeruchsorgan der Larven ähnelt, sich in seiner Ausstattung mit Geruchsrezeptoren von diesem abhebt. Auch hier bietet sich die vergleichende Analyse mit dem MCE an. Verhaltensstudien wären ebenfalls denkbar, um die Aufgaben des RO weiter ein- und gegenüber VNO und HG abzugrenzen. So wurde in der Vergangenheit bereits ein set-up in der Arbeitsgruppe entwickelt, dass es erlaubt, die Aktivität eines bestimmten Geruchsepithels bzw. Gehirnareals mithilfe eines Antikörpers gegen c-fos zu analysieren (Nowack et al. 2017). Mit diesem Ansatz könnte beispielsweise der Frage nach dem getesteten Medium nachgegangen 6 Ausblick 106 werden, indem Duftstoffe direkt im Wasser oder oberhalb des Wassers platziert werden. Durch Einsatz unterschiedlicher Konzentrationen von Duftstoffen könnten außerdem auch Duftschwellen und deren individuelle Unterschiede zwischen den Geruchsorganen ermittelt werden. Schließlich sollten die erhobenen morphologischen Befunde und Interpretationen bezüglich des zellulären Aufbaus des Recessus olfactorius durch weiterführende transmissionselektronenmikroskopische Studien belegt werden. Das in Araldit eingebettete Material, aus dem die Semidünnschnitte hergestellt wurden, ist hierzu optimal vorbereitet und kann zukünftig zur Anfertigung von Ultradünnschnitten herangezogen werden. 7 Literaturverzeichnis 107

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Anhang

A Kurzprotokolle

Paraffineinbettung von fixiertem Material

Fixierung ausspülen PBS (Schüttler) ODER 3 x 2 h Fließendes Leitungswasser ~ 12 h Entkalken 5% Salpetersäure, dabei den Fortschritt ~ 48 h regelmäßig per Nadelprobe prüfen, Lösung alle 12 h erneuern (Schüttler) Kollagenhärtung 5 % Natriumsulfatlösung 12 h Spülen Fließendes Leitungswasser ~ 24 h Entwässern Aufsteigende Alkoholreihe (Schüttler) 70% Ethanol 2 h 90% Ethanol 2 h 96% Ethanol 2 h 100% Ethanol 2 h Isopropanol 2 h Roti®-Histol I über Nacht Roti®-Histol II 4-8 h Paraffinstufen Im Wärmeschrank je mindestens 24 h Roti®-Histol/Paraffin 1:1 Paraffin I Paraffin II Paraffin III Ausblocken Umsetzen in Schälchen mit frischem ~ 4 h Paraffin, ausrichten, Paraffin aushärten lassen

Beschichtung von Objektträgern mit Chromalaun-Gelatine

Objektträger reinigen Eintauchen in 70 % Ethanol mit 1 Tropfen 10 s Eisessig, anschließend polieren Beschichten Eintauchen in frische, warme Chromalaun- 10 s Gelatine Trocknen Im Wärmeschrank ~ 3 h ii

Histologische Übersichtsfärbung an aufgezogenen Paraffinschnitten (Säurealizarinblau- Anillinblau-Orange-Gemisch-Färbung)

Entparaffinieren: Roticlear® I 12 min Roticlear® II 12 min Rehydrieren Ethanol 99 % 2 min Ethanol 96 % 2 min Ethanol 70 % 2 min Aq. dest 1 min Färbestufe I Säurealizarinblau (SAB) 2 min* Spülen H2O 10 s H2O 10 s Aq. dest. 1 min Differenzieren und Phosphorwolframsäure (PWS) 3 min* Beizen Spülen Spülen Aq. dest. 1 min Färbestufe II Anillinblau-Orange-G (AOG) 13 min* Spülen H2O 10 s H2O 30 s Aq. dest. 10 s Dehydrieren Ethanol 96 % 12 min Ethanol 99 % 12 min Roticlear® III 2 min Roticlear® IV 2 min Eindecken Entellan® *Die genauen Zeiten sind für jedes zu färbende Material in Probefärbungen zu ermitteln. iii

Aralditeinbettung für Elektronenmikroskopie

Fixierung Frisches Tiermaterial in 2,5 % 24 h Glutardialdehyd, Sörensen gepuffert, pH 7,2 Fixierung ausspülen In PP auf Schüttler 2 x 12 h Präparation der In PP Riechepithelien Spülen PP:Aq. dest. 1:1 1 h Spülen Aq. dest. 1 h Kontrastieren bzw. OsO4 2 %, ca. 300 µl/Probe 2 h Postfixieren Spülen Aq. dest. 3 x 30 min Entwässern Aceton 40 % 15-30 min Aceton 60 % 15-30 min (Kontrastierung Part 2) Aceton 70 % + Kontrastierung, RT, Abzug über Nacht Aceton 80 % 15-30 min Aceton 90 % 15-30 min Aceton abs. I 45-60 min Aceton abs. II 45-60 min Gewebe trimmen In Aceton abs., Hilfsmittel ggf. Millimeterpapier Intermedium Propylenoxid I 1 h Propylenoxid II 1 h Kunststoffinfiltration Propylenoxid:Aralditgemisch, 1:1 (3 % Beschleuniger), offen stehen lassen über Nacht Aralditgemisch (2 % Beschleuniger) ~ 6 h Proben vereinzeln Frisches Aralditgemisch (2 % Bescheuniger) 12 h bei 45 °C In Beem®-Kapsel (Inhalt 1,5 ml) erst wenig 2 d bei 60 °C Kunststoff einfüllen, dann Material mit Nadel ausrichten, auffüllen + (optional) 1 „Blindprobe“ für Prüfung der Härtung des Materials iv

Lektinfärbung an Paraffinschnitten (peroxidasegekoppelt)

Aufziehen Beschichtete OT, trocknen lassen 24 h Deparaffinieren Roticlear® I 12 min Roticlear® II 12 min Rehydratation Ethanol 99 % 2 min Ethanol 96 % . 2 min Ethanol 70 % 2 min Aq. dest. 1 min Peroxidaseblock 3 % H2O2, ca. 700 µl direkt auf OT 10 min Spülen PBS 3 x 5 min Blockierungsschritt* BSA 30 min Lektinfärbung** In Feuchtkammer, bei 4 °C 24 h ODER 48 h Kontrolle PBS statt Lektin Spülen PBS 3 x 5 min N ovaRED NovaRED TM In Herstellerkonzentration, ca. 700 µl pro ~ 15 min OT direkt aufpipettieren (mikroskopische Kontrolle) Spülen Aq. dest. 5 min Entwässern 70 % Ethanol 2 min 96 % Ethanol 2 min 99 % Ethanol 2 min Roticlear® 15 min Roticlear® 15 min Eindecken Entellan® * Blockierung bei Bedarf durchführen, anschließend 3 x 5 min in PBS spülen. ** Lektinkonzentration und Inkubationsdauer werden in Vorversuchen ermittelt. v

Lektinfärbung an Paraffinschnitten (fluoreszenzmarkiert)

Aufziehen Beschichtete OT, trocknen lassen 24 h Deparaffinieren Roticlear® I 12 min Roticlear® II 12 min Rehydratation Ethanol 99 % 2 min Ethanol 96 % . 2 min Ethanol 70 % 2 min Aq. dest. 1 min Blockierungsschritt* BSA 30 min Lektinfärbung** In Feuchtkammer, 4 °C 24 h ODER 48 h Kontrolle PBS statt Lektin Spülen PBS 3 x 5 min N ovaRED NovaRED TM In Herstellerkonzentration, ca. 700 µl pro ~ 15 min OT direkt aufpipettieren (mikroskopische Kontrolle) Spülen Aq. dest. 5 min Entwässern 70 % Ethanol 2 min 96 % Ethanol 2 min 99 % Ethanol 2 min Roticlear® III 15 min Roticlear® IV 15 min Eindecken Entellan® * Blockierung bei Bedarf durchführen, anschließend 3 x 5 min in PBS spülen. ** Lektinkonzentration und Inkubationsdauer werden in Vorversuchen ermittelt. Ab hier alle Schritte Lichtgeschützt durchführen. vi

Antikörper-Funktionstest (Variante I, Vorversuche)

Gewebe lysieren Laemmli Puffer (2x), 95 °C 5 min SDS-PAGE 10%iges Acrylamidgel, 0,75 mm 45 min 10 µl Probe, 5 µl Marker, SDS-Laufpuffer, 200 V Sem i-dry- Semi-dry- Blot Semi-dry-Puffer, 300 mA (bei 4 Gelen) 40 min Protein-Färbung* 0,1 % Coomassie-Brillantblau, Schüttler über Nacht Blockierungsschritt 4 % Milchpulver in PBS, RT, Schüttler 30 min Primär-Antikörperinkubation** Bei 4 °C, in PBS über Nacht Gαo 1:200 Gαi2 1:200 Gαolf 1:20 Spülen PBST20 (0,05 %) 3 x 10 min Sekundär-Antikörperinkubation** Goat-anti-rabbit, AP-gekoppelt, RT 3 h 1:5000 in PBS Spülen PBST20 (0,05 %) 3 x 10 min Umpuffern AP-Puffer kurz schwenken Nachweisreaktion 37 µl Substrat (BCIP) hinzufügen 2 bis 3 h * Nur das Gel wird hier gefärbt, die Membranen durchlaufen die weiteren Schritte. ** Konzentrationen ggf. in Vorversuchen ermitteln.

Antikörper-Funktionstest (Variante II)

Gewebe lysieren Laemmli-Puffer 2x, 105 °C 10 min SDS-PAGE 12%iges Acrylamidgel, 0,75 mm 40 min 10 µl Probe, 5 µl Marker, SDS-Laufpuffer, 200 V W et Wet -Blot Wet-Puffer, 100 V, 350 mA 1 h Protein-Färbung* Coomassie-Brillantblau, RT, Schüttler über Nacht Blockierungsschritt 4 % Milchpulver in PBS, RT, Schüttler 1,5 h ggf. zusätzlicher Spülschritt 2 x 5 min PBST20 (0,05 %) Primär-Antikörperinkubation** In PBSM (4 %), 4 °C über Nacht Gαo 1:100 Gαi2 1:100 Gαolf 1:100 Spülen PBST20 (0,05 %) 3 x 10 min Sekundär-Antikörperinkubation** Anti-Rabbit IgG, HRP-gekoppelt, RT 1 h 1:10000 (1:5000) in PBSM (1 %) Spülen PBST20 (0,05 %) 3 x 10 min Nachweisreaktion ECLTM-Reaktion, Rotlicht, Röntgenfilm 3/10/30 min Protein-Färbung der Membran Amidoschwarz 30 min * Nur das Gel wird hier gefärbt, die Membranen durchlaufen die weiteren Schritte. ** Konzentrationen ggf. in Vorversuchen ermitteln. vii

Antikörperfärbung an Paraffinschnitten (Nachweis: Fluoreszenz)

Antikörperfärbung an Paraffinschnitten (Nachweis: Peroxidase)

Aufziehen Beschichtete OT, trocknen lassen 24 h Deparaffinieren Roticlear® I 12 min Roticlear® II 12 min Rehydratation Ethanol 99 % 2 min Ethanol 96 % . 2 min Ethanol 70 % 2 min Aq. dest. 1 min Spülen PBS 2 x 5 min Peroxidaseblock 3 % H2O2 in MetOH 10 min Blockierungsschritt PBST-BSA-NGS (5/2/1 %) 1 h Spülen PBS 2 x 8 min Primär-Antikörperinkubation* In PBST-BSA-NGS (1/1/1 %) (4 °C) über Nacht Gαolf 1:100 Gαo 1:75-100 Gαi2 1:100 Spülen PBST (0,5 %) 30 s PBS 2 x 8 min Sekundär-Antikörperinkubation* Ziege Anti-Kaninchen HRP 1:200 in PBST- 30 min BSA-NGS (1/0/1 %) ODER Goat anti-rabbit-HRP in PBST mit 1,5 % NGS und 0,5 % Sekundärantikörper (= nach Herstellerangaben, ABC Kit), RT Spülen PBS 3 x 8 min Vectastain ABC Reagent** Nach Herstellerangaben, mindestens 30 min 30 min vorher herstellen Spülen** PBS 3 x 8 min Peroxidase Substrat NovaREDTM, nach Herstellerangaben 2-15 min Spülen PBS 3 x 8 min Entwässern 70 % Ethanol 2 min 96 % Ethanol 2 min 99 % Ethanol 2 min Roticlear® III 15 min Roticlear® IV 15 min Eindecken Entellan® * Konzentration und Inkubationsdauer werden in Vorversuchen ermittelt ** Nur bei peroxidasegekoppeltem sekundären Antikörper aus ABC Kit ix

B Materiallisten

Antikörper und Lektine

Primärantikörper Rabbit Anti-Gαi2 (sc-7276) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Rabbit Anti-Gαo (sc-387) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Rabbit Anti-Gαolf (sc-385) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sekundärantikörper Ziege Anti-Kanin-HRP (Art. 4750.1) Carl Roth ECL anti-Rabbit IgG HRP (aus Kit, s. u.) GE Healthcare Goat anti-Rabbit Cy 3 (111-165-144) JacksonImmunoresearch Goat anti-rabbit (aus ABC Kit, s. u.) Vector laboratories Lektine Concanavalin A (L6397) Sigma-Aldrich Dolichos biflorus Agglutinin (L1287) Sigma-Aldrich Dolichos biflorus Agglutinin (RL-1032) Vector laboratories Fluorescein Lektin Kit I (FLK-2100) Vector laboratories Wheat germ Agglutinin (PL-1026) Vector laboratories

Kits und Standards

Araldite CY212 Kit Agar scientific Amersham ECL™ Western Blotting-System GE Healthcare VECTASTAIN® Elite® ABC Kit anti-goat (PK 6105) Vector laboratories VECTASTAIN® Elite® ABC Kit anti-rabbit (PK 6101) Vector laboratories Vector® NovaREDTM Peroxidasesubstrat Kit Vector laboratories

PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder Thermo Fisher Scientific

Fixierlösungen

Bouinsches Gemisch (Mulisch et al. 2010) 15 ml gesättigte, wässrige Pikrinsäure 5 ml Formaldehyd 37 % 1 ml Essigsäure 100 % (Eisessig)

Formaldehyd (Roti®-Histofix) 4 %: 40 ml Roti®-Histofix 10 % 60 ml Aq. dest.

Formaldehyd (Merck) 4 %: 10,8 ml Formaldehyd 37 % (Merck) 89,2 ml Aq. dest.

Formol-Alkoholgemisch nach Schaffer 30 ml Formaldehyd 37 % (Merck) 70 ml Ethanol 96 %

Glutaraldehydfixierung 2,5 % 45 ml PP 45 ml Aq. dest. 10 ml Glutaraldehyd 25 %

Osmiumtetroxid 2 % OsO4 2 % (w/v): 100 mg in 5 ml aq. dest. Lösen dauert mindestens 1 Tag.

Paraformaldehyd (PFA) 4 %: 4 g PFA 100 ml PBS x

Natronlauge (NaOH) PFA in PBS rühren, dabei auf ca. 65 °C erhitzen. Tropfenweise NaOH zugeben bis die Lösung aufklart. Nach Abkühlen auf RT auf pH 7,4 einstellen.

PFA 4 % („anders angesetzt“) 4 g PFA 70 ml + 10 ml Aq. dest. 20 ml PBS Natronlauge (NaOH) 70 ml aq. dest. auf 55-60 °C erhitzen. PFA und dann tropfenweise NaOH zugeben bis Lösung aufklart. PBS hinzugeben, filtrieren. PH auf 7,4 einstellen, mit aq. dest. auf 100 ml auffüllen.

PFA 4 % in 0,1 M Phosphatpuffer: 4 g PFA 100 ml Phosphatpuffer 0,1 M Natronlauge (NaOH) Phosphatpuffer auf ca. 65 °C erhitzen, PFA zugeben. Tropfenweise NaOH zugeben, bis Lösung aufklart, bei RT pH 7,4 einstellen.

Zambonis Fixativ: 70 ml PFA 4 % 20 ml Phosphatpuffer 0,1 M 7 ml Pikrinsäure, wässrig, gesättigt Lösungen mischen, filtrieren und pH 7,4 einstellen. Danach mit aq. dest. auf 100 ml auffüllen.

Puffer und Lösungen

AdestT 0,5 % 0,75 ml Triton® X 100 150 ml aq. dest.

Alkalische Phosphatase (AP)-Puffer 100 mM Tris/HCl pH 9,5 100 mM NaCl 5 mM MgCl2

Amidoschwarz-Färbelösung 0,1 % (w/v) Amidoschwarz 2 % (w/v) Essigsäure 100 % 10 % Methanol

Anilinblau-Orange-G (AOG)-Färbelösung 0,5 g Anilinblau nach Mallory 2 g Orange G 8 ml Essigsäure 100 % Farbstoffe in 100 ml warmem aq. dest. lösen, Essigsäure zugeben, nach Erkalten filtrieren.

Araldit-Einbettgemisch mit 2 (3) % Beschleuniger 5,2 g Araldite CY212 (nach Mulisch et al. 2010) 4,8 g DDSA 0,2 (0,3) ml BDMA Lösungen ggf. zur leichteren Mischbarkeit erwärmen.

BCIP-Lösung 50 mg/ml BCIP-T in DMF

Citratpuffer (pH 6,0) 1,89 g Zitronensäure xi

12,05 g Natriumcitrat ad 500 ml Aq. dest.

Chromalaun-Gelatine 1 g Gelatine 0,1 g Kaliumchrom-III-sulfat-Dodecahydrat (CrH24KO20S2) ad 200 ml Aq. dest.

Coomassie Farbelösung, kolloidal (Variante II) 0,1 % (w/v) Coomassie Brillant Blau G 250 1,7 % (v/v) Phosphorsäure 5 % (w/v) Aluminiumsulfat

Coomassie Färbelösung, kolloidal (Variante I) 0,02 % (w/v) Coomassie Brilliant Blau G 250 5 % (w/v) Aluminiumsulfat 2 % Phosphorsäure 10 % Ethanol

Färbelösung nach Richardson (Romeis 2010) 1 g Azur II 1 g Methylenblau 1 g Borax (Na-Borat) Azur II in in 100 ml aq. dest. lösen. Methylenblau und Borax ebenfalls lösen, 2x filtrieren. Lösungen gut miteinander vermischen.

Gelatine 25 % 12,5 g Gelatine 50 ml PBS oder aq. dest. Flüssigkeit auf max. 55 °C erwärmen, Gelatine unter Rühren darin auflösen.

Kontrastierlösung Uranylacetat/PWS 0,05 g Uranylacetat 0,1 g Wolframatophosphorsäure-Hydrat 10 ml Aceton 70 % Uranylacetat und Wolframatophosphorsäure- Hydrat in je 5 ml Aceton 70 % auflösen, vermischen und filtrieren. Auf 55 °C erwärmen, sofort auf -18 °C abkühlen. Bei RT mehrmals filtrieren.

Laemmli-Puffer (2x) 65,8 mM Tris HCl pH 6,8 20 % Glycerin 2,1 % SDS 5 % β-Mercaptoethanol 0,01 % Bromphenolblau

Laemmli-Puffer (5x) 100 mM Tris-HCL (pH 6,8) 4,8 % SDS 16 % Glycerin 0,1 % Bromphenolblau 2 % β-Mercaptoethanol

Milchpulver-Blockierlösung, 4 % 2 g Milchpulver 50 ml PBS

Natriumsulfatlösung 5 %: 50 g Natriumsulfat (Na2SO4) ad 1000 ml Aq. dest.

Peroxidaseblock 0,3 % (3 %) 0,05 ml (0,5 ml) Wasserstoffperoxid (H2O2) 30 % 5 ml Aq. dest. oder Methanol

Phosphate-buffered Saline 0,2 g Kaliumchlorid (KCl) (PBS, nach Mulisch et al. 2010) 0,24 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) xii

8 g Natriumchlorid (NaCl) 1,44 g Natriumdihydrogenphosphat (Na2HPO4) Ad 1 l Aq. dest, mit HCl pH 7,4 einstellen.

PBSM 500 µl 10x PBS 0,2 g Milchpulver

PBST 5 % 95 ml PBS 5 ml Triton® X 100

PBST20 0,05 % 100 ml 10x PBS 0,5 ml Tween® 20 1 l Aq. dest.

Phosphatpuffer 0,1 M 0,155 g Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) 0,545 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) 10 ml Aq. dest.

Phosphatpuffer nach Sörensen Stammlösung A: (PP, Mulisch et al. 2010) 13,61 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) ad 1000 ml Aq. dest Stammlösung B: 35,81 g Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x H2O) ad 1000 ml Aq. dest PH 7,2: 3 Teile A + 7 Teile B

Phosphorwolframsäure (PWS) 5 % 5 g Wolframatophosphorsäure-Hydrat 100 ml Aq. dest.

Pikrinsäure, wässrig, gesättigt (Romeis 2010) 50 g Pikrinsäure 500 ml heißes Wasser Pikrinsäure in große Flasche wiegen, mit heißem Wasser übergießen, schütteln, abkühlen lassen.

Säurealizarinblau, Stammlösung nach Petersen 10 g Aluminiumsulfat (Al2H36O30S3) 0,5 g Säurealizarinblau (SAB) 2 x 100 ml Aq. dest. Aluminiumsulfat in 100 ml aq. dest. lösen und erwärmen. SAB einrühren und 5-10 min kochen lassen. Nach abkühlen auf RT mit aq. dest. auf 100 ml auffüllen.

Salpetersäure (HNO3) 5 % 76,92 ml HNO3 (65 %) ad 1000 ml Aq. dest.

SDS-Laufpuffer (1x) 25 mM Tris-HCl (pH 8,3) 192 mM Glycin 0,1 % (w/v) SDS

Semi-dry-Transferpuffer (Variante I) 11,6 g Tris 5,84 g Glycin 0,76 g SDS 400 ml Ethanol auf 2 l H2O auffüllen

Sucroselösung 40 g (D)-Saccharose 160 ml PBS

Tris-Puffer (Sammelgelpuffer/Upper) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) 0,4 % (w/v) SDS xiii

Tris-Puffer (Trenngelpuffer/Lower) 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 0,4 % (w/v) SDS

Wet-Transferpuffer (Variante II) 3,03 g Tris Pufferan® 14,4 g Glycin Pufferan® 1 l Aq. dest.

Verbrauchsmaterialien

Beem® -Kapseln Beem Deckgläschen, div. Größen Menzel, Roth DePeX Serva Electrophoresis GmbH Einmalwiegeschälchen Carl Roth Entellan® Merck Filterpapier Whatman Glaswaren (Bechergläser u. v. m.) Schott Handschuhe: Microflex® XCEED CIT Healthcare LLC Mikroliterpipetten Proline® Sartorius Biohit Multiwell-Platten Corning, Inc. Nagellack Rossmann Nitrocellulosemembran 0,45 µm Porengröße Machery Nagel Objektträger, geschnitten, Mattrand Carl Roth Pasteur-Pipetten Brand PVDF-Membran, Immobilon-P, 0,45 μM Millipore Reaktionsgefäße 1,5 und 2 l Eppendorf AG Röntgenfilm, HyperfilmTM ECLTM GE Healthcare Roti®-Plast mit DMSO (Paraffin) Carl Roth Silberband 9 mm x 66 m Plano GmbH Tissue-Tek® O.C.T.TM Compound Sakura Finetek Zellstofftücher (KimtechScience) Kimberly-Clark Worldwide Inc.

Chemikalien

Aceton (C3H6O) Carl Roth Acrylamid (Rotiphoresegel® Gel 30) Carl Roth Aluminiumsulfat Carl Roth Aluminiumsulfat-Octadecahydrat (Al2H36O30S3) Merck Amidoschwarz 10 B (C22H14N6Na2O9S2) Carl Roth Ammoniumperoxodisulfat (APS) Carl Roth Anilinblau (C38H31N3), wasserlöslich Merck Araldite CY212 Agar scientific Azur II Merck

Benzyldimethylamin (BDMA, C9H13N) Agar scientific 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat-Toluidiniumsalz (BCIP-T) ThermoFisher Scientific Borax (Dinatriumtetraborat-Decahydrat) Sigma-Aldrich BSA (bovine serum albumin, Rinderserumalbumin) Sigma-Aldrich

Coomassie Brillant Blau G 250 Carl Roth

DePeX Serva Electrophoresis GmbH DiI Sigma-Aldrich Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei (Na2HPO4) Merck Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x H2O) Carl Roth Dimethylformamid (DMF) Carl Roth Dodecenylbernsteinsäureanhydrid (DDSA) Agar Scientific xiv

Eisessig (HAc, Essigsäure 100 %) Sigma-Aldrich Entellan® Merck Essigsäure 100 % (HAc, Eisessig) Sigma-Aldrich Ethanol, >99 % Carl Roth Ethyl 3-Aminobenzoat-Methansulfonat 98 % (MS-222) Sigma-Aldrich Ethylendiamin-Tetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat ≥ 99 % Carl Roth (EDTA)

Formaldehyd 10 % Roth Formaldehyd mind. 37 %, säurefrei Merck

Gelatine Sigma-Aldrich Glutardialdehydlösung 25 % Merck Glycin Pufferan® Carl Roth Glycerin Carl Roth

Haemalaun, Mayer sauer Chroma-Gesellschaft, Schmid & Co. Hemalum, Mayer Matheson, Coleman & Bell

Isopropanol (C3H8O) 99,5 % Acros Organics

Kaliumchlorid (KCl) Merck Kaliumchrom-III-sulfat-Dodecahydrat (CrH24KO20S2) Merck Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck

Magermilchpulver Carl Roth Magnesiumclorid (MgCl2) Carl Roth β-Mercaptoethanol Fluka/Carl Roth Methanol Carl Roth Methylenblau Merck MS-222 (Ethyl 3-Aminobenzoat-Methansulfonat, Tricain) Sigma-Aldrich

Natriumacetat (C2H3NaO2), wasserfrei Merck Natriumchlorid (NaCl) >99,5 % Sigma-Aldrich Natriumcitrat Carl Roth Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) >98 % Carl Roth Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 x H2O) Merck Natriumsulfat (Na2SO4), wasserfrei Merck Natronlauge (NaOH) NGS (normal goat serum, normales Ziegenserum) Jackson Immunoresearch, Vector laboratories NRS (normal rabbit serum) Vector laboratories NovaREDTM Peroxidase Substrat Kit Vector laboratories

Orange G (C16H10N2Na2O7S2) Merck Osmiumtetroxid (OsO4) Merck

Paraffin (Roti®-Plast) Carl Roth Paraformaldehyd (PFA, CH2O), reinst Carl Roth PBS (phosphate-buffered saline) Sigma-Aldrich Phosphorsäure Merck Pikrinsäure (C6H3N3O7) Aldrich Chemistry Propylenoxid (C3H6O) Merck

Rinderserumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich Roticlear® Carl Roth Rotiphoresegel® Gel 30 Carl Roth Roti®-Histol Carl Roth Roti®-Histofix 10 % Carl Roth xv

Roti®-Mount Aqua Carl Roth Roti®-Plast (Paraffin) Carl Roth

Saccarose (C12H22O11) Carl Roth Säurealizarinblau (SAB) Chroma-Gesellschaft, Schmid & Co. Salpetersäure (HNO3), mind. 65 % Merck Salzsäure (HCl), rauchend, > 37 % Carl Roth SDS (Natriumdodecylsulfat) Carl Roth TEMED (C6H16N2) Carl Roth Tricain (Ethyl 3-Aminobenzoat-Methansulfonat, MS-222) Sigma-Aldrich Tris Pufferan® Carl Roth Triton® X 100 Carl Roth Tween® 20 Carl Roth

Uranylacetat (C4H9Na3O9) Merck

Wasserstoffperoxid (H2O2), 30 % Carl Roth Western Lightning® ECL, Enhanced Chemiluminescence Perkin Elmer, Inc. Substrate Wolframatophosphorsäure-Hydrat (H3PW12O40) Merck

Zitronensäure (C6H8O7) Carl Roth

Geräte

Elektrophoresekammer I Metallwerkstatt Uni Kassel Elektrophoresekammer II Bio-Rad Laboratories, Inc. Handrotationsmikrotom Leitz Heizblock, Thermomixer 5436 Eppendorf Heizplatte Medax Nagel Knife Maker Type 7800B LKB Konfokales Laserscanning Mikroskop TCS SP 5 II Leica Kryostat CM3050 Leica Lichtmikroskop Typ DME mit Kamera EC3 Leica Lichtmikroskop Typ DM750 mit Kamera DFC295 Leica Magnetrührer IKA-COMBIMAG RCT IKA Labortechnik Präzisionswaage EW-N/EG-N Kern&Sohn GmbH Schüttler KS 125 basic IKA Labortechnik Stereomikroskop (Binokular) Typ EZ4 D Leica Ultramikrotom Ultracut E Reichert Jung Vortexer REAX Heidolph Vibratom VT1000S Leica Wasserbad WNB 7 memmert GmbH und Co. KG Wärmeschrank Heraeus xvi

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe Dritter angefertigt und andere als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Dies gilt auch für Zeichnungen, Skizzen und bildliche Darstellungen. Dritte waren an der inhaltlichen Erstellung der Dissertation nicht beteiligt; insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines kommerziellen Promotionsberaters in Anspruch genommen. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions- oder Habilitationsverfahren verwendet worden.

Kassel, im August 2017 Sabrina Jordan