The 10th National Conference in Toxicology “Toxicology and COVID­19” Abstracts and Proceedings The 10th National Conference in Toxicology (NCT10)

28-29 October 2020 Bangkok International Trade & Exhibition Center (BITEC), Bangkok, Thailand

การประชุมวชิ าการพษิ วทิ ยาแห่งชาตคิ ร้ังที่ 10

The 10th National Conference in Toxicology (NCT10)

การประชุมใหญ่สามญั ประจ าปี 2563 ของ สมาคมพิษวิทยาแห่งประเทศไทย

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) การประชุมวิชาการพิษวิทยาแห่งชาติครั้งที่ 10

The 10th National Conference in Toxicology (NCT10) “Toxicology and COVID-19”

สารบัญ

สารจากนายกสมาคมพิษวิทยาแห่งประเทศไทย 1

คณะกรรมการดาเนินการจัดการประชุมวิ ชาการพิษวิทยาแห่งชาติ ครั้งที่ 10 2 กาหนดการประชุม วิชาการพิษวิทยาแห่งชาติ ครั้งที่ 10 5 Special lecture 1: National program in new normal lifestyle for COVID-19: policy and limitation นายแพทย์ดนัย ธีวันดา (รองอธิบดีกรมอนามัย)

Special lecture 2: Immune response to SARS-CoV-2 and immunopathological changes in COVID-19 9 อาจารย์ ดร.ภก. อนันต์ชัย อัศวเมฆิน Special lecture 3: Management of snakebite in Thailand 10 ผศ. นพ. สุชัย สุเทพารักษ์ Special lecture 4: Food safety issues in agricultural product in the market 17 รศ.ดร.ทรงศักดิ์ ศรีอนุชาต Special lecture 5: Present situation of vaccine development for COVID-19 in Thailand 18 ผศ.ดร.ภก.วิสิฐ ตั้งเคียงศิริสิน

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) สารบัญ (ต่อ)

Symposium 1: Toxic gourmet 21

 รศ. พญ. สุดา วรรณประสาท  ผศ.นพ.สหภูมิ ศรีสุมะ Symposium 2: Safety and efficacy of alcohol sanitizer 22

 นาวาอากาศตรีหญิง เกษศิรินทร์ พุฒิโชติ 23  พญ.เมษญา ชาติกุล Symposium 3: Food safety in new normal lifestyle 26

 มาตรการความปลอดภัยของอาหารในภาคอุตสาหกรรม ดร.วิศิษฐ์ ลิ้มลือชา  Food service and delivery system คุณกาธร ศิลาอ่อน Symposium 4: Safety assessment of vaccine development 27

 Pre-clinical study in COVID-19 vaccine development 28 รศ.ดร.วรัญญู พูลเจริญ

 Clinical vaccine trials: Benefits, risks and safety 29 ศ.นพ. ชัยรัตน์ ฉายากุล

Symposium 5: Risk assessment for novel food development 31

 การกากับด ูแลอาหารใหม่ (novel food) 32 คุณจิรารัตน์ เทศะศิลป์

 การประเมินความปลอดภัยเพื่อการขออนุญาต 36 รศ.ดร.ชนิพรรณ บุตรยี่

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) สารบัญ (ต่อ)

Proceedings

การศึกษาฤทธิ์ก่อกลายพันธ์ของสารสกัดกัญชาที่สกัดด้วยวิธีของไหลวิกฤตยิ่งยวดุ 41 พราว ศุภจริยาวัตร สุจริต อุ่นกาศ วิจิตรา สุดห่วง เสกรชตกร บัวเบา ศรายุธ ระดาพงษ์ พรชัย สินเจริญโภไคย

ปริมาณโลหะหนักและซาซิท็อกซินในหอยสองฝาที่จ าหน่ายในประเทศไทย 54 เมธาวี แพทย์กูล ปรัญรัชต์ ธนวิยุทธภัคดี วีรยา การพานิช

การจัดการปัญหาการตกค้างของสารกาจัดศัตร ูพืชในผักและผลไม้สดที่ผ่านโรงคัดบรรจุด้วยระบบตาม 69 สอบย้อนกลับ ธนพรรณ แก้วศรีหาวงษ์ สมพนธ์ วรรณวิมลรักษ์ วรงค์ศิริ เข็มสวัสดิ์ ชนิพรรณ บุตรยี่

การยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียก่อโรคอาหารเป็นพิษ Staphylococcus aureus โดยสารสกัดจากใบทับทิม 86 ในเอทานอลและน ้า ภิญญาพัชญ์ ดุงโคกกรวด ชุติภากาญจน์ ก้านกิ่ง นุชรีย์ ถามูลเลศ พรรณวดี ศรีตะวัน พวงเพชร ศรีวิพันธ์

Abstracts: Poster presentation 97

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 1

สารจากนายกสมาคมพิษวิทยาแห่งประเทศไทย

Message from the President Thai Society of Toxicology

The 10th National Conference in Toxicology (NCT10) organized by the Thai Society of Toxicology is held at BITEC Bangna, during 28-29 October 2020. The theme of this year conference is “Toxicology and COVID-19” and is meant to update the situation of Covid-19 pandemic in Thailand and the link of toxicological sciences to the situation including vaccine development and its safety assessment, the safety efficacy of hand sanitizers in the market. This year as usual, the update in toxicology of various fields is emphasized, such as food safety in new normal life, risk assessment of novel food, and clinical toxicology. As before, Thai Society of Toxicology hold the NCT10 in collaboration with allied organizations, Institute of Nutrition Mahidol University (INMU), Thai Society of Clinical Toxicology (TSCT), Thai Environmental Mutagen Society (TEMS), Thailand Lab International 2020, and Thailand Risk Assessment Center (TRAC).

The NCT10 will be held in conjunction with the exposition of laboratory instrumentation and technology (Thailand Lab international 2020). The NCT10 will also serve as the platform for Thai toxicologists and allied scientists to prepare for the ASIATOX2020 to be held in China next year (June 2021) and International Toxicology Conference in Developing Countries (TCDC2020) in 2021 in Malaysia. I am confident that the participants will gain substantial benefit from NCT10 and to be useful to your organization and individuals, as well as to meet colleagues and make new friends to establish connection and collaboration in the future.

Last but not least, I would like to thank all our collaborators and supporters for their contribution and support. I also sincerely thank all the speakers for their effort and share their expertise. Thanks also go to hard working executive committee members, organizing committee members and staffs as well.

Assoc. Prof. Dr. Songsak Srianujata President of Thai Society of Toxicology October 2020

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 2

คณะกรรมการด าเนินการจัดการประชุมวิชาการพิษวิทยาแห่งชาติ ครั้งที่ 10 (NCT10) The 10th National Conference in Toxicology (NCT10) “Toxicology and COVID-19”

วันที่ 28 -29 ตุลาคม พ.ศ. 2563 ณ ห้อง MR 214-216 ศูนย์นิทรรศการและการประชุมไบเทค บางนา กรุงเทพมหานคร

จัดโดย สมาคมพิษวิทยาแห่งประเทศไทย

ร่วมกบั สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล สมาคมพิษวิทยาคลินิก ชมรมพันธุพิษแห่งประเทศไทย ศูนย์ประเมินความเสี่ยงประเทศไทย และ THAILAND LAB 2020

ประธานฯ รศ.ดร.ทรงศักดิ์ ศรีอนุชาต รองประธานฯ ศ.นพ.วินัย วนานุกูล ศ.ดร.มาลิน อังสุรังสี รศ.ดร.ชลัท ศานติวรางคณา รศ.พญ.สุดา วรรณประสาท

กรรมการ รศ.สพ.ญ.ดร.อนงค์ บิณฑวิหค รศ.พญ.สาทริยา ตระกูลศรีชัย ผศ.ดร.จินตนา ศิริวราศัย รศ.ดร.พนิดา นวสัมฤทธิ์ ผศ.ดร.รจนา ชุณหบัณฑิต ผศ.ดร.เพ็ญศรี วัจฉละญาณ น.ส.กนิษฐา จันทร์วิทยานุชิต ดร.ขวัญยืน ศรีเปารยะ สพ.ญ.จุฬาพร ศรีหนา อ.ดร.วีรยา การพานิช น.ส.จารุณี วงศ์เล็ก ดร.ศศิธร เอื้อวิริยะวิทย์ ดร.สรียา เรืองพัฒนพงศ์ น.ส.ชฎามาศ พรหมคา

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 3

กรรมการและเลขานุการ รศ.ดร.ชนิพรรณ บุตรยี่ อ.ดร.มลฤดี สุขประสารทรัพย์ น.ส.สุชาดา ไกรเพชร

คณะอนุกรรมการ 1. ฝ่ายวิชาการ คณะอนุกรรมการฝ่ายวิชาการ ผศ.ดร.รจนา ชุณหบัณฑิต ผศ.ดร.จินตนา ศิริวราศัย รศ.ดร.พนิดา นวสัมฤทธิ์ ผศ.นพ.สุชัย สุเทพารักษ์ ดร.ฐิติรัตน์ เงาเทพพฤฒาราม ผศ.นพ.สหภูมิ ศรีสุมะ รศ.พญ.สาทริยา ตระกูลศรีชัย รศ.พญ.สุดา วรรณประสาท ผศ.ดร.ปรัญรัชต์ ธนวิยุทธภักดี อ.ดร.มลฤดี สุขประสารทรัพย์ ผศ.ดร.สุพัตรา ปรศุพัฒนา ดร.ศศิธร เอื้อวิริยะวิทย์ ดร.นลินรัตน์ เพชร์พิรุณ ดร.ศุลีพร แสงกระจ่าง ผศ.ดร.เพ็ญศรี วัจฉละญาณ นายฐิติพัฒน์ ลิขิตพฤกษ์ไพศาล

2. ฝ่ายการเงิน คณะอนุกรรมการฝ่ายการเงิน รศ.สพ.ญ.ดร.อนงค์ บิณฑวิหค น.ส.อุษา อาดา ดร.ศิริมา ทองรวย น.ส.กิติยา ศรีศักดิ์วัฒนะ น.ส.วรรณวิภา สุทธิไกร นางสุพิชญา ตรีบุญเมือง น.ส.ราตรี จินตนา

3. ฝ่ายลงทะเบียน คณะอนุกรรมการฝ่ายลงทะเบียน อ.ดร.วีรยา การพานิช น.ส.ชฎามาศ พรหมคา น.ส.กนกนาฏ แขงามขา น.ส.จารุณี วงศ์เล็ก ดร.ขวัญยืน ศรีเปารยะ

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 4

4. ฝ่ายประชาสัมพันธ์ คณะอนุกรรมการฝ่ายประชาสัมพันธ์ ผศ.ดร.เพ็ญศรี วัจฉละญาณ นาง อิษยา วิธูบรรเจิด ดร.สรียา เรืองพัฒนพงศ์ สพ.ญ.จุฬาพร ศรีหนา น.ส.ชลธร เหมทานนท์

5. ฝ่ายหาทุน คณะอนุกรรมการฝ่ายหาทุน รศ.ดร.ทรงศักดิ์ ศรีอนุชาต ศ.นพ.วินัย วนานุกูล นายอนุชา พันธุ์พิเชฐ

6. ฝ่ายเลขานุการ คณะอนุกรรมการฝ่ายเลขานุการ รศ.ดร.ชนิพรรณ บุตรยี่ อ.ดร. มลฤดี สุขประสารทรัพย์ น.ส.กนิษฐา จันทร์วิทยานุชิต นายฐิติพัฒน์ ลิขิตพฤกษ์ไพศาล น.ส.สุชาดา ไกรเพชร น.ส.กนกนาฏ แขงามขา น.ส.ธนพรรณ แกวศรีหาวงษ์้

7. ฝ่ายจัดทา เล่มเอกสารงานประชุม อ.ดร. มลฤดี สุขประสารทรัพย์ ดร.ณัฐกานต์ หนูรุ่น อ.ดร.ปรียาภรณ์ พลายมี พิบูลชัยนันท์ น.ส.วันจันทร์ ดีคุ้ม

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 5

การประชุมพิษวิทยาแห่งชาติครั้งที่ 10 (NCT10) The 10th National Conference in Toxicology (NCT10) “Toxicology and COVID-19” วันที่ 28-29 ตุลาคม พ.ศ. 2563 ณ ห้อง MR 214-216 ศูนย์นิทรรศการและการประชุมไบเทค บางนา กรุงเทพมหานคร

กาหนดการประช ุม วันพุธที่ 28 ตุลาคม พ.ศ. 2563 08.00-09.00 ลงทะเบียน 09.00-09.15 พิธีเปิด 09.15-10.00 Special lecture 1: National program in new normal lifestyle for COVID-19: policy and limitation นายแพทย์ดนัย ธีวันดา (รองอธิบดีกรมอนามัย) 10.00-10.45 Special lecture 2: Immune response to SARS-CoV-2 and immunopathological changes in COVID-19 อาจารย์ ดร.ภก. อนันต์ชัย อัศวเมฆิน (คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล) 10.45-11.00 อาหารว่าง (coffee break) 11.00-12.00 Symposium 1: Toxic gourmet  รศ. พญ. สุดา วรรณประสาท (คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น)  ผศ. นพ. สหภูมิ ศรีสุมะ (คณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลรามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล) ประธาน: รศ.ดร.พนิดา นวสัมฤทธิ์ 12.00-14.00 พักรับประทานอาหารกลางวัน ชมนิทรรศการงาน Thailand LAB2020 และโปสเตอร์แสดงผลงานวิชาการ 13.00-14.00 ประชุมสมาชิกสามัญประจาปี พ.ศ.2563 สมาคมพิษวิทยาแห่งประเทศไทย 14.00-15.00 Symposium 2: Safety and efficacy of alcohol sanitizer  นาวาอากาศตรีหญิง พญ. เกษศิรินทร์ พุฒิโชติ (กองตรวจโรคผู้ป่วยนอก โรงพยาบาลภูมิพลอดุลยเดช)  พญ.เมษญา ชาติกุล (ศูนย์อุบัติเหตุฉุกเฉิน โรงพยาบาลกรุงเทพจันทบุรี) ประธาน: รศ.พญ. สุดา วรรณประสาท 15.00-15.45 Special lecture 3: Management of snakebite in Thailand ผศ. นพ. สุชัย สุเทพารักษ์ (คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย) 15.45-16.00 อาหารว่าง (coffee break)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 6

วันพฤหัสบดีที่ 29 ตุลาคม พ.ศ. 2563 เวลา หัวข้อ 09.00-09.45 Special lecture 4: Food safety issues in agricultural product in the market รศ.ดร.ทรงศักดิ์ ศรีอนุชาต (ศูนย์ประเมินความเสี่ยงประเทศไทย) 09.45-11.15 Symposium 3: Food safety in new normal lifestyle  มาตรการความปลอดภัยของอาหารในภาคอุตสาหกรรม ดร.วิศิษฐ์ ลิ้มลือชา  Food service and delivery system คุณกาธร ศิลาออน่ (S&P Syndicate Public Co.,Ltd) ประธาน: รศ.ดร.ทรงศักดิ์ ศรีอนุชาต 11.15-11.30 อาหารว่าง (coffee break) 11.30-12.15 Special lecture 5: Present situation of vaccine development for COVID-19 in Thailand ผศ.ดร.ภก.วิสิฐ ตั้งเคียงศิริสิน (สานักพัฒนาศักยภาพด้านวัคซีนของประเทศ สถาบันวัคซีนแห่งชาติ) 12.15-13.00 พักรับประทานอาหารกลางวัน ชมนิทรรศการงาน Thailand LAB2020 และโปสเตอร์แสดงผลงานวิชาการ 13.00-14.15 Symposium 4: Safety assessment of vaccine development  Pre-clinical study in COVID-19 vaccine development รศ.ดร.วรัญญู พูลเจริญ (บริษัท ใบยาไฟโตฟาร์ม จาก ดั )  Clinical vaccine trials: Benefits, risks and safety ศ.นพ. ชัยรัตน์ ฉายากุล (คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล มหาวิทยาลัยมหิดล) ประธาน: ศ.ดร.มาลิน จุลศิริ 14.15-15.30 Symposium 5: Risk assessment for novel food development  การกาก บดูแลอาหารใหมั ่ (novel food) คุณจิรารัตน์ เทศะศิลป์ (สานักงานคณะกรรมการอาหารและยา )  การประเมินความปลอดภัยเพื่อการขออนุญาต รศ.ดร.ชนิพรรณ บุตรยี่ (ศูนย์ประเมินความเสี่ยงประเทศไทย) ประธาน: ผศ.ดร.รจนา ชุณหบัณฑิต 15.30-16.00 ปิดการประชุม อาหารว่าง (coffee break)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 7

บทคัดย่อ และ บทความ การประชุมวิชาการพิษวิทยาแห่งชาติครั้งที่ 10

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 8

Special Lectures

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 9

Immune Response to SARS-CoV-2 and Immunopathological Changes in COVID-19 Anunchai Assawamakin

B.Sc. in Pharm, Ph.D. (Immunology)

Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, Bangkok, Thailand

Abstract

COVID-19 as a zoonotic disease that has already spread globally to several million human beings and possibly to domestic and wild animals. For COVID-19, similar to many other viral infections, asymptomatic disease is present in a significant but currently unknown fraction of the affected individuals. In the majority of the patients, the innate and adaptive immunity was elicited with the development of neutralizing antiviral T cell and antibody immunity. Some patients get moderate and severe symptoms, it should be noted that many aspects of severe patients are unique to COVID‐19 and are rarely observed in other respiratory viral infections, such as severe lymphopenia and eosinopenia, extensive pneumonia and lung tissue damage, a cytokine storm leading to acute respiratory distress syndrome, and multiorgan failure. Lymphopenia causes a defect in antiviral and immune regulatory immunity. A growing body of clinical data suggests that a cytokine storm is associated with COVID‐19 severity and is also a crucial cause of death from COVID‐19. Elevated levels of acute‐phase reactants and lymphopenia are early predictors of high disease severity. Prevention of development to severe disease, cytokine storm, acute respiratory distress syndrome, and novel approaches to prevent their development will be main routes for future research areas. In this talk aim to improve our understanding on the immune response and immunopathological changes in patients linked to deteriorating clinical conditions such as cytokine storm, acute respiratory distress syndrome, autopsy findings and changes in acute‐phase reactants, and serum biochemistry in COVID‐19. In the absence of antivirals and vaccines for COVID‐19, there is a pressing need to improve our understanding of the immunology of this disease to contain the pandemic by developing vaccines and medicines for the prevention and treatment of patients. During this time “Don’t let your guard down and keep social distancing!”, and it has still been reiterated to the public to control COVID-19 outbreak in Thailand.

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 10

Management of Snakebite in Thailand ผศ.นพ. สุชัย สุเทพารักษ์ คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

บทคัดย่อ งูพิษกดยังเป็นปัญหาสาธารณสุขในประเทศไทยั จากสถิติของกระทรวงสาธารณสุขพบวา่ ประเทศ ไทยมีผู้ป่วยถูกงูกดประมาณั 2,000-5,000 รายต่อปี งูพิษที่ส าคัญในประเทศไทย ได้แก่ 1. งูที่มีพิษต่อระบบประสาท (Neurotoxin) - งูเห่าไทย และ งูเห่าพนพิษสยาม่ (Thai monocled cobra & Siamese spitting cobra; Naja kaouthia & Naja siamensis) - งูจงอาง (King cobra; Ophiophagus hannah) - งูสามเหลี่ยม (Banded krait; Bungarus fasciatus) - งูทับสมิงคลา (Malayan krait; Bungarus candidus) 2. งูที่มีพิษต่อระบบโลหิต (Hematotoxin) 2.1 Viper - งูแมวเซา (Russell’s viper; Daboia russelii) 2.2 Pit viper - งูกะปะ (Malayan pit viper; Calloselasma rhodostoma) - งูเขียวหางไหม้ (Green pit vipers; Trimeresurus spp) 3. งูที่มีพิษต่อกล้ามเนื้อ (Myotoxin) - งูทะเล (Laticudinae spp, Hydrophiinae spp) - งูแมวเซา (Russell’s viper; Daboia russelii)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 11

4. งูที่มีพิษอ่อน - กลุ่มงูพิษเขี้ยวหลัง ได้แก่ งูปล้องทอง งูต้องไฟ งูลายสาบคอแดง งูหัวกะโหลก ฯลฯ งูกลุ่มนี้มีพิษออน่ มักไมมีอาการ่ หรือมีเพียงแคปวด่ บวม แดง ร้อนบริเวณที่ถูกกดั แต่กมีรายงาน็ การเป็นพิษต่อระบบโลหิตรุนแรงจากการถูกงูลายสาบคอแดงกดั งูพิษที่มีทาให้ผู้เสียชีวิตได้บ ่อย ได้แก่ งูเห่า งูทับสมิงคลา และงูกะปะ แตงูพิษก่ ดที่พบบั อยที่สุด่ ได้แก่ งูเชียวหางไหม้ และงูกะปะ

ขั้นตอนการดูแลผ้ป่วยที่ถู ูกงูพิษกัดประกอบด้วย 1. การวินิจฉัย 2. การรักษา

1. การวินิจฉัย 1.1 การยืนยันวาถูกงูพิษก่ ดั ได้แก่อยางใดอย่ างหนึ่งในต่ ่อไปนี้ ก. ผู้ป่วยนางูพิษมาด้วย หรือเห็นงูพิษชัดเจนและรู้จักชนิดของงู ข. มีรอยเขี้ยวพิษของงู (fang marks) เป็นรอยแผลที่เป็นรูขนาดเล็กคล้ายถูกเข็มตา ค. มีอาการและอาการแสดงเฉพาะของการถูกงูพิษกดั ทั้งบริเวณที่ถูกกดั (local) และ/หรืออาการทัว่ ร่างกาย (systemic) โดยดูรายละเอียดในการแยกชนิดของงูพิษ ง. การทา serodiagnosis จากตัวอยางเลือด่ ซึ่งนอกจากจะบอกวาเป็นงูพิ่ ษกดั ยังบอกได้อีกวาเป็นงู่ พิษชนิดใด 1.2 การแยกชนิดของงูพิษ 1. นางูมาด้วย หรือผู้ถูกกดหรือผู้อยูั ในเหตุการณ์รู้จักงูชัดเจน่ หรือเทียบกบภาพของงูั 2. ในกรณีที่ไมรู้จักชนิดของงู่ ต้องอาศัย 2.1 serodiagnosis แตเทคนิคการท่ ายังไม สามารถน่ ามาใช้ประโยชน์ทางคลินิกได้ เนื่องจากใช้ เวลานานเกินไป

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 12

2.2 อาการและอาการแสดง อาการเฉพาะที่ - ปวด บวม น้อยมาก หรือไม่มี ได้แก่ งูพิษกดแตั ไม่ ปล่ ่อยพิษ งูสามเหลี่ยม งูทับสมิงคลา งูพิษเขี้ยว หลัง - ปวด บวม แดง ร้อน แตไม่ ่มาก ได้แก่ งูแมวเซา หรืออาการระยะแรกของงูเห่าและงูจงอาง - ปวด บวม แดง ร้อน มีอาการอักเสบชัดเจน และมีเนื้อตาย (tissue necrosis) ได้แก่ งูเห่า และงู จงอาง - ปวด บวม แดง ร้อน และมี hemorrhagic blebs, ecchymosis ได้แก่ งูกะปะ งูเขียวหางไหม้ ในกรณี ที่มี multiple hemorrhagic blebs ให้คิดถึงงูกะปะ ส่วนงูเขียวหางไหม้จะมีอาการบวมเป็นอาการเด่น อาการทั่วร่างกาย งูที่มีพิษตอระบบประสาท่ พิษของงูจะมีผลตอ่ neuromuscular junction โดยที่พิษของงูเห่าและงูจงอาง จะไปจับกบั receptor บนกล้ามเนื้อ (post-synaptic block) ทาให้ acetylcholine ไมสามารถจะไปจับก่ บั receptor ได้ ทาให้ระบบ ประสาทสั่งงานกล้ามเนื้อไม่ได้ สาหรับพิษของงูสามเหลี่ยมและงูทับสมิงคลาจะไปจับก บปลายประสาทั (pre-synaptic block) ทา ให้ไมสามารถหลั่ ง่ acetylcholine ออกมาได้ ในตอนแรกผู้ป่วยจะมีอาการออนแรงของกล้ามเนื่ ้อมัดเล็ก เช่น หนังตา มีอาการหนังตาตก ตอมา่ อาการจะเป็นมากขึ้น มีอาการกลืนลาบาก พูดไมชัด่ สาลัก ตามด้วยแขนขาออนแรง่ หายใจไมสะดวก่ และ หยุดหายใจ งูที่มีพิษตอระบบเลือด่ พิษของงูกลุ่มนี้ออกฤทธิ์ไปกระตุ้นให้ร่างกายใช้ปัจจัยการเป็นลิ่มเลือด (coagulation factors) จน หมด งูกลุ่ม viper ซึ่งได้แก่ งูแมวเซา มีพิษที่ออกฤทธิ์คล้าย thromboplastin (thromboplastin-like) สามารถกระตุ้นให้เกิด cross-linked clot ได้ ส่วนงูกลุ่ม pit vipers มีพิษที่ออกฤทธิ์คล้าย thrombin (thrombin-like) ทาให้เก ิดการใช้สาร fibrinogen จนหมด (defibrination)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 13

ผู้ป่วยจะมีอาการเลือดออกผิดปกติ ได้แก่ เลือดออกจากแผลงูกดมากั มีจ้าเลือดบริเวณแผล เลือดออกตามไรฟัน จุดเลือดออกตามตัว ปัสสาวะเป็นเลือด อาเจียนเป็นเลือด ในกรณีงูแมวเซา จะพบมีอาการปวดกล้ามเนื้อตามตัวได้จากภาวะ rhabdomyolysis มีอาการและ อาการแสดงของภาวะ DIC (disseminated intravascular coagulation) และมีอาการของ ไตวายเฉียบพลัน (acute renal failure) งูที่มีพิษตอกล้ามเนื่ ้อ ผู้ป่วยที่ถูกงูทะเลกดั จะแยกจากงูชนิดอื่นได้ง่าย เนื่องจะถูกงูในทะเล หรือริมทะเล ผู้ป่ วยจะมีอาการ ปวดกล้ามเนื้อทั้งตัว ปัสสาวะสีเข้ม ปัสสาวะออกน้อย 2.3 การตรวจทางห้องปฏิบัติการ ในกรณีสงสัยงูที่มีพิษตอระบบประสาท่ โดยปกติจะไมมีการทางห้องปฏิบัติการที่ช่ ่วยในการ วินิจฉัย แตควรมีการตรวจ่ peak flow จาก Wright’s peak flow meter เป็นระยะ ๆ เพื่อดูการเปลี่ยนแปลง ถ้า ผู้ป่วยเริ่มมีคา่ peak flow ลดลงเรื่อย ๆ กจะเป็นการช็ ่วยบอกให้ทราบวากล้ามเนื่ ้อเริ่มอ่อนแรง ในกรณีสงสัยงูที่มีพิษตอระบบโลหิต่ การตรวจทางห้องปฏิบัติการที่ดีคือ ระดับ fibrinogen ในเลือด หรือใช้ thrombin time กได้็ แตเป็น่ การตรวจทางห้องปฏิบัติการที่ทาได้ในโรงพยาบาลบางแห ่งเทานั่ ้น การตรวจพบ Venous clotting time (VCT) ยาว และ เกล็ดเลือดต่า เพื่อประเมินคนไข้เป็นการตรวจ ที่ทาได้ทั วไป่ รวมทั้งโรงพยาบาลชุมชน และ มีประสบการณ์ในการใช้ทางคลินิกมานาน อยางไรก่ ตามการ็ ทา VCT เพื่อการตรวจข้างเตียงเป็นการตรวจที่ยุงยาก่ ใช้ทรัพยากรบุคลากร และมีโอกาสผิดพลาดได้ง่าย ปัจจุบันแนะนาให้ใช้ 20-minute whole blood clotting test (20WBCT) เป็นการตรวจข้างเตียงแทนโดยเจาะ เลือดใส่ในหลอดแกว้ ตั้งทิ้งไว้และเอียงครั้งเดียวที่ 20 นาที การตรวจ Prothrombin time (PT) และดูคา่ International normalized ratio (INR) จะมีความไวและ ความเฉพาะเจาะจงเช่นเดียวกบั 20WBCT

ในงูแมวเซา จะมีภาวะ disseminated intravascular coagulation ดังนั้นเสมียร์เลือดพบเม็ดเลือดแดง แตกชนิด Microangiopathic hemolytic anemia (MAHA) ได้แก่ การพบ schistocyte บนเสมียร์เลือด และมี ระดับ blood urea nitrogen และ serum creatinine สูงขึ้น การเป็นพิษจากงูทะเลจะพบภาวะ acute renal failure ร่วมกบั rhabdomyolysis และ hyperkalemia

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 14

2.4 ถิ่นที่อยูอาศัยของงู่ (habitat) งูแตละชนิดมักจะมีถิ่ ่นที่อยูอาศั่ ยที่แตกตางก่ นั เช่น งูแมวเซามักจะชุกชุมในบริเวณภาคกลางและ ภาคตะวันออก งูกะปะมักจะชุกชุมในภาคใต้และภาคตะวันออก งูเขียวหางไหม้ชุกชุมในกรุงเทพมหานคร ในขณะที่งูเห่าจะพบได้ทัวประเทศไทย่ ในกรณีที่ประเมินสภาพผู้ป่วยในระยะแรกโดยใช้ข้อมูลและวิธีการดังกล่าวข้างต้นทั้งหมดแล้ว ยัง ไมสามารถแยกชนิดของงูได้่ ให้เฝ้าสังเกตอาการ โดยเฉพาะอยางยิ่ งอาการกล้ามเนื่ ้อออนแรง่ โดยจาก การศึกษาในผู้ป่วยที่ถูกงูเห่ากดั ส่วนใหญเก่ ิดอาการภายใน 2 ชัวโมง่ ดังนั้นการเฝ้าดูอาการ 24 ชัวโมงก่ จะ็ พอเพียง

ถ้ามีอาการกล้ามเนื้อออนแรง่ ส่วนใหญจะเป็่ นงูเห่า โดยเฉพาะอยางยิ่ งถ้าพบว่ าแผลที่ถูกก่ ดมีอาการั อักเสบ และ/หรือมีเนื้อตาย ถึงแม้อาการทางคลินิกจะแยกจากงูจงอางไมได้่ แตงูจงอางเป็นงูพิษที่มีขนาด่ ใหญมาก่ และพบได้เฉพาะในป่ารก หรือเลี้ยงไว้ ดังนั้นสามารถวินิจฉัยแยกชนิดออกได้ง่าย ถ้ามีอาการกล้ามเนื้อออน่ แรง แตไม่ มีอาการอักเสบบริเวณที่ถูกก่ ดั หรืออักเสบน้อยมาก ให้วินิจฉัย วาเป็นงูทับสมิงคลา่ มากกวางูสามเหลี่ยม่ เนื่องจากงูสามเหลี่ยมมีอุบัติการณ์การกดคนตั ่ามาก ถ้าไมมีอาการกล้ามเนื่ ้อออนแรง่ ให้ดูที่บริเวณแผลที่ถูกกดั ถ้ามีอาการอักเสบ ปวดบวมมาก ให้ คิดถึงงูกะปะ หรืองูเขียวหางไหม้ ซึ่งจะแยกได้โดยอาศัยถิ่นที่อยูอาศัยของงู่ ถ้าอาการอักเสบมีน้อย ให้คิดถึง งูแมวเซา และให้ตรวจ 20WBCT เป็นระยะ ๆ ส่วนงูพิษเขี้ยวหลังนั้นมีอุบัติการณ์ต่า

2. การรักษา 2.1 การรักษาทัวไป่ 2.2 การรักษางูพิษเฉพาะกลุ่ม 2.3 การให้เซรุ่มต้านพิษงู (antivenom)

2.1 การรักษาทัวไป่ การรักษาก่อนมาโรงพยาบาล (Pre-hospital treatment) 1. นาผู้ป่วยมาพบแพทย์โดยเร็วที่สุด และนางูที่ก ดมาด้วยถ้าเป็นไปได้ั แต่ต้องไมเสียเวลาตามหางู่ 2. ให้ผู้ป่วยมีการเคลื่อนไหวเฉพาะเทาที่จ่ าเป็น โดยเฉพาะอยางยิ่ งบริเวณที่ถูกงูก่ ดั 3. ล้างแผลด้วยน้าสะอาด ห้ามการกรีด ตัด ดูด ไฟจี้ และพอกยา บริเวณแผลที่ถูกงูกดั

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 15

4. การขันชะเนาะ (tourniquet) จากการศึกษาพบวาไม่ มีประโยชน์่ และยังอาจเพิ่มความรุนแรงของ แผล โดยเฉพาะในงูที่มีพิษต่อระบบโลหิต การรักษาในโรงพยาบาล (In-hospital treatment) 1. รักษาภาวะฉุกเฉินเช่น anaphylactic shock, apnea, shock

2. ปลอบใจและให้ความมันใจแก่ ่ผู้ป่วย 3. พักการใช้แขนขาบริเวณที่ถูกงูกดั ในกรณีที่มีอาการบวมมาก ให้ยกบริเวณนั้นสูง 4. ให้สารน้าให้เพียงพอ โดยเฉพาะอยางยิ่ งผู้ป่วยที่มีอาการบวมมาก่ 5. ยาแกปวด้ เช่น acetaminophen ไมควรให้ยาแก่ ปวดที่มีฤทธิ้ ์กดประสาทส่วนกลางแกผู้ป่วยที่ถูกงู่ ที่มีพิษตอระบบประสาทก่ ดั และห้ามให้ aspirin ในผู้ป่วยที่ถูกงูที่มีพิษตอระบบเลือดก่ ดั 6. ควรฉีดวัคซีนและเซรุ่มป้องกนโรคบาดทะยักั แตในกรณีที่ถูกก่ ดโดยงูที่มีพิษตั อระบบโลหิตและ่ มีภาวะเลือดออกง่าย ต้องหลีกเลี่ยงการฉีดยาเข้ากล้ามเนื้อ ดังนั้นจะฉีดเซรุ่มให้ผู้ป่วยเมื่อ 20WBCT หรือ PT เป็นปกติ 2.2 การรักษางูพิษเฉพาะกลุ่ม งูที่มีพิษตอระบบประสาท่ การช่วยการหายใจ เป็นหัวใจส าคัญของการรักษา

ผู้ป่วยทุกรายควรได้รับการเฝ้าสังเกตอาการกล้ามเนื้อออนแรงอย่ างใกล้ชิด่ และตรวจ peak flow เป็นระยะ ๆ ทุก 1 ชัวโมง่ และเตรียมพร้อมสาหรับการใส ่ endotracheal tube และการใช้เครื่องช่วยหายใจ (ventilator) เป็นเวลา 12-24 ชัวโมง่ งูที่มีพิษตอระบบเลือด่

bleeding precaution และมีการติดตามเฝ้าระวังภาวะเลือดออกผิดปกติ ทั้งอาการ อาการแสดง และ การตรวจทางห้องปฏิบัติการที่สาคัญ คือ การตรวจหาคา่ VCT/20WBCT/PT ถ้าได้ผลเป็นปกติ ให้ตรวจซ้า อยางน้อยทุก่ 24 ชัวโมง่ หรือเมื่อมีอาการเปลี่ยนแปลงไปในทางเลวลง เป็นเวลาประมาณ 3 วัน เนื่องจาก พบวามีผู้ป่วยจ่ านวนที่ถูกงูพิษเหล ่านี้กดั ไมมีอาการเลือดออกผิดปกติในระยะแรก่ แต่มีอาการเกิดขึ้นในวัน หลัง ๆ ได้

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 16

งูที่มีพิษตอกล้ามเนื่ ้อ (งูทะเล) ประเทศไทยยังไมมี่ antivenom ของงูทะเล การรักษาที่สาคัญคือการรักษา acute renal failure, rhabdomyolysis และ hyperkalemia โดยการแกไข้ metabolic acidosis และการทา hemodialysis 2.3 การให้เซรุ่มต้านพิษงู (antivenom)

ปัจจุบันสถานเสาวภา สภากาชาดไทยได้ผลิตเซรุ่มต้านพิษงู เป็น F(ab)’2 แบงเป็่ น 2 ประเภทคือ 1. เซรุ่มต้านพิษงูเฉพาะชนิด (Monovalent antivenin) มี 7 ชนิด คือ เซรุ่มต้านพิษงูเห่า (ใช้แกพิษงู้ Naja kaouthia), เซรุ่มต้านพิษงูจงอาง, เซรุ่มต้านพิษงูสามเหลี่ยม, เซรุ่มต้านพิษงูทับสมิงคลา, เซรุ่มต้านพิษงู แมวเซา, เซรุ่มต้านพิษงูกะปะ, เซรุ่มต้านพิษงูเขียวหางไหม้ (ใช้แกพิษงู้ Trimeresurus albolabris) 2. เซรุ่มต้านพิษงูรวม (Polyvalent antivenin) ผลิตจากการนาพิษงูหลายชนิดไปกระตุ้นในม้าตัวเดียว มี 2 ชนิด คือ เซรุ่มต้านพิษงูระบบประสาท (Neuro polyvalent snake antivenin) ใช้แกพิษงูเห้ ่า งูจงอาง งู สามเหลี่ยม และงูทับสมิงคลา เซรุ่มต้านพิษงูระบบโลหิต (Hemato polyvalent snake antivenin) ใช้แกพิษงูแมวเซา้ งูกะปะ และงู เขียวหางไหม้ ข้อบงใช้่ กรณีงูพิษตอระบบประสาท่ มีข้อใดข้อหนึ่งในตอไปนี่ ้ 1. การมีกล้ามเนื้อออนแรง่ เริ่มตั้งแตมีหนังตาตก่ ไมต้องรอให้มีภาวะหายใจล้มเหลว่ 2. สงสัยงูทับสมิงคลา หรือ งูสามเหลี่ยมกดั ควรให้เซรุ่มทันทีที่วินิจฉัยได้แม้ยังไมมีอาการ่ เพราะมี ฤทธิ์ทาลายปลายประสาทท าให้ฟื ้นตัวช้ามากถ้าให้เซรุ่มหลังมีอาการ งูที่มีพิษผลตอระบบโลหิต่ มีข้อใดข้อหนึ่งในตอไปนี่ ้ 1. มีเลือดออกตามระบบ 2. Venous clotting time นานกวา่ 20 นาที หรือ unclotted 20WBCT หรือ มี prothrombin time (PT) ยาวกวาปกติ่ หรือ คา่ International normalized ratio (INR) มากกวา่ 1.2 3. เกล็ดเลือดต่ากว า่ 50 x109/L 4. มีอาการปวดปวดบวมเฉพาะที่อยางรุนแรง่ กลัววาอาจเก่ ิด compartmental syndrome ก่อนการให้ไมต้องการทดสอบการแพ้ทางผิวหนัง่ (skin test) เนื่องจากการตรวจดังกล่าวเป็นการ ทดสอบการแพ้ที่มีกลไกผาน่ IgE แตการแพ้เซรุ่ ่มต้านพิษงูไมผ่ านกลไกนี่ ้

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 17

Food Safety Issues of Agricultural Products in the Markets รศ.ดร. ทรงศักดิ์ ศรีอนุชาต ที่ปรึกษอาวุโส สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล นายก สมาคมพิษวิทยาแห่งประเทศไทย รศ.ดร. ชนิพรรณ บุตรยี่ สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล เลขาธิการ สมาคมพิษวิทยาแห่งประเทศไทย

บทคัดย่อ ปัจจุบันประเทศไทยได้มีมาตรฐานทางการเกษตรหลายอย่างเพื่อดูและการผลิตที่ดี โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มาตรฐานการปฏิบัติทางการเกษตรที่ดี (Good Agricultural Practice) และคาแนะน าในการปฏิบัติ ทั้งทางด้านพืช ด้านสัตว์ และด้านการประมง หลายชนิด อย่างไรก็ตามมาตรฐานเหล่านี้ส่วนใหญ่เป็นมาตรฐานทัวไป่ หมายความว่าไม่ได้บังคับให้ต้องปฏิบัติ หรืออีกนัยหนึ่งคือเป็นมาตรฐานสมัครใจ ผู้ใดต้องการเครื่องหมาย เกษตรปลอดภัย จึงจะมาขอการรับรอง ซึ่งต้องมีการตรวจเพื่อรับรองก ่อน จึงมักจะเป็นฟาร์มใหญ่ๆ จึงจะมาขอ การรับรอง ส่วนเกษตรกรรายย่อยมักจะมีความสามารถมาขอการรับรองได้ไม่มากนัก ส่วนใหญ่จึงไม่ได้ ดาเนินการตามมาตรฐาน ข้อมูลที่เคยมีการทาวิ จัยไว้สองประเภท คือ (1) การศึกษาการปนเปื้อนของเนื้อสัตว์โดยเฉพาะอย่างยิ่งเนื้อหมู ที่พบการปนเปื้อนของจุลินทรีย์ที่อาจ ก ่อโรค (pathogenic bacteria) เช่น Salmonella ที่ปนเปื้อนมาจากโรงฆ่าสัตว์ที่ไม่ได้มาตรฐาน และระบบการ ขนส่งเนื้อสัตว์ที่ไม่ได้ดาเนินการตามระบ บรักษาอุณหภูมิ (cold chain) และมิได้ระมัดระวังป้องก ันการปนเปื้อน ข้ามของจุลินทรีย์ก ่อโรคที่มาก ับเครื่องในหมู จนกระทังถึงการปนเ่ ปื้อนที่เขียงหมู และที่ร่างกายของผู้ขายหมู จึง ทาให้เกิดการปนเปื้อนที่เนื้อหมูจนถึงผู้บริโภค ดังนั้นการดูแลเนื้อหมูตั้งแต่ออกจากโรงฆ่าสัตว์จนถึงตลาดสดที่ ขายตรงให้ก ับผู้บริโภคจึงมีความสาคัญอย่างยิ ่ง (2) การศึกษาเพื่อ “การยกระดับมาตรฐานการกาก ับดูแลผักและผลไม้สดปลอดภัยตลอดห่วงโซ่สู่การ ปฏิบัติ” พบว่าผักและผลไม้สดที่จาหน่ายในประเทศและน าเข้ายังคงมีความเสี่ยงด้านความปลอดภัย ทั้งนี้อาจมี สาเหตุมาจากหลายปัจจัย ได้แก ่ ด้านวัตถุอันตรายทางการเกษตร ด้านการตลาด ด้านระบบกาก ับดูแลความ ปลอดภัยของภาครัฐ และด้านผู้บริโภค เป็นต้น จึงเกิดโครงการระบบผักและผลไม้ปลอดภัยขึ้น โดยการดูแล ระบบตั้งแต่ต้นน้า กลางน้า และปลายน้า กระทรวงเกษตรและสหกรณ์ดูแลต้นน้าด้า นการใช้วัตถุอันตรายทาง การเกษตร กระทรวงสาธารณสุขดูแลกลางน้าและปลายน ้า ตั้งแต่โรงคัดบรรจุ สถานที่จาหน่าย ภัตตาคารและ ร้านอาหาร โรงพยาบาล ตลอดจนผู้บริโภคเพื่อการบริโภคผักและผลไม้ให้เกิดความปลอดภัย จัดทาคู่มือ จัดการ อบรม จัดทามาตรฐานเกี่ยวก ับสถานที่คัดบรรจุผักผลไม้ จัดทาเมนูอาหารผักผลไม้ และจัดทาสื่อเพื่อการสื่อสาร ในช่องทางที่ผู้บริโภคเข้าถึงได้ง่าย เช่น สื่อออนไลน์ ในรูบแบบของ infographic ให้สวยงามและน่าสนใจ การดาเนินการศึกษวิจัยและรูปแบบเพื่อการปฏิบัติได้ จะได้นาเสนอในรายละเอียดในที่ประชุม

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 18

Present situation of vaccine development for COVID-19 in Thailand Wisit Tangkeangsirisin, PhD

National Vaccine Institute

บทคัดย่อ

ด้วยสถานการณ์การแพร่ระบาดของโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 ยังพบอยูในหลายประเทศทั่ ว่ โลก ข้อมูล ณ วันที่ 24 กนยายนั 2563 มีผู้ป่วยยืนยันกวา่ 32.14 ล้านคน เสียชีวิตกวา่ 980,000 คน ทั้งนี้ โรคติด เชื้อไวรัสโคโรนา 2019 เริ่มแพร่เข้าสู่ประเทศไทยตั้งแต่ต้นเดือนมกราคม พ.ศ. 2563 ผลกระทบที่เกิดขึ้นอยาง่ หลีกเลี่ยงไมได้่ คือ การสูญเสียชีวิตและความสูญเสียทางเศรษฐกิจและสังคม ธนาคารแห่งประเทศไทยได้ สรุปประมาณการอัตราการขยายตัวทางเศรษฐกิจ พ.ศ. 2563 ที่ร้อยละ -5.3 และสูญเสียทางเศรษฐกิจเป็น มูลคามหาศาล่ อาจสูงถึง 5.6 พันล้านเหรียญสหรัฐ หรือคิดเป็นร้อยละ 1.11 ของผลิตภัณฑ์มวลรวมของ ประเทศ (ข้อมูลจาก ASEAN Development Bank) ภาคธุรกิจประสบปัญหาจนต้องปิดกิจการและลดจานวน พนักงาน ส่งผลให้มีประชาชนชั้นกลางและประชากรกลุ่มเปราะบางจานวนมากที่ได้รับผลกระทบต อความ่ มันคงในการด่ ารงชีวิตพื ้นฐาน แม้วา่ ประเทศไทยจะประสบความสาเร็จ ในการควบคุมป้องกนโรคได้อยั างดียิ่ ง่ แต่กมีโอกาสเก็ ิด การระบาดของโรคได้ ในระลอกที่ 2 เนื่องด้วยยังมีผู้ติดเชื้อเพิ่มจานวนมากทั วโลก่ หากสถานการณ์การ ระบาดไมสามารถยุติได้ในระยะเวลาอันใกล้่ การเปิดประเทศเพื่อเดินหน้าสู่การดาเนินชีวิต New Normal คูขนานไปก่ บการขับเคลื่อนเศรษฐกั ิจจึงเป็นไปได้ยาก ดังนั้น วัคซีนโควิด-19 จึงเป็นเครื่องมือสาคัญ เป็น นวัตกรรมทางสุขภาพและเป็นยุทธปัจจัยที่มีประสิทธิภาพสูงที่จะเป็นคาตอบในการป้องก นควบคุมโรคั และ เป็นความหวังของทุกประเทศทัวโลก่ รวมถึงประเทศไทย การเร่งรัดให้มีวัคซีนใช้ในประเทศเร็วขึ้นเพื่อลด ผลกระทบทางเศรษฐกิจ และสังคม รวมถึงการสร้างความเชื่อมันของประชาชนต่ ่อการกลับมาใช้ชีวิตได้ อยางปกติ่ สถาบันวัคซีนแห่งชาติร่วมกบเครือขั ายด้านวัคซีน่ ได้จัดทาพิมพ์เขียว (blueprint) เพื่อการเข้าถึง วัคซีนป้องกนโรคโคั วิด-19 ของ ประชาชนไทย ประกอบด้วย 2 ยุทธศาสตร์ คือ 1) นาวัคซีนต้นแบบที่มี ศักยภาพสูงจากตางประเทศมาทดสอบในประเทศไทยพร้อมขอรับการถ่ ่ายทอดเทคโนโลยีเพื่อการผลิต และ 2) พัฒนาวัคซีนต้นแบบจากนักวิจัยในประเทศไทยตั้งแต่ต้นน้าจนได้ผลิตภัณฑ์ ซึ่งพิมพ์เขียวเพื่อการเข้าถึง

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 19

วัคซีนฉบับดังกล่าวได้รับความเห็นชอบจากคณะกรรมการวัคซีนแห่งชาติ เมื่อวันที่ 22 เมษายน พ.ศ.2563 การดาเนินงานตามยุทธศาสตร์ทั ้ง 2 ด้าน จาแนกเป็น 3 แนวทาง คือ 1. การวิจัยพัฒนาต้นแบบวัคซีนในประเทศตั้งแตต้นน่ ้า 2. การรับถ่ายทอดเทคโนโลยีการพัฒนาและการผลิตจากต่างประเทศที่มีศักยภาพ 3. การจัดหาผลิตภัณฑ์วัคซีนที่มีประสิทธิภาพจากตางประเทศ่

การดาเนินการทั ้ง 3 แนวทางมีความกาวหน้าโดยล้ าดับ โดยเฉพาะอยางยิ่ ่งด้านการเจรจาเพื่อร่วมทา การทดสอบวัคซีนในมนุษย์และรับถ่ายทอดเทคโนโลยีนั้น สถาบันอยู่ระหว่างทาข้อตกลงและแสวงหา แนวทางความร่วมมือกบประเทศชัั ้นนาในการพัฒนาวัคซีน เช่น สหรัฐอเมริกา จีน เยอรมัน ในส่วนการวิจัย พัฒนาต้นแบบในประเทศก็มีความก้าวหน้าอย่างมาก โดยสถาบันร่วมกับหน่วยงานให้ทุนทั้งในและ ต่างประเทศมีการสนับสนุนต้นแบบวัคซีน จานวนทั ้งสิ้น 6 แพลตฟอร์ม ได้แก่ ดีเอ็นเอ เอ็มอาร์เอ็นเอ ซับยู นิตโปรตีน เชื้อตาย ไวรัลเวคเตอร์ และ อนุภาคเสมือนไวรัส โดยความกาวหน้า้ พบวา่ วัคซีนต้นแบบที่ผาน่ การทดสอบการกระตุ้นภูมิคุ้มกนทัั ้งในหนูและในลิง จานวน 3 ชนิด คือ ชนิดเอ็มอาร์เอ็นเอ (mRNA) โดย ศูนย์วิจัยวัคซีน คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย วัคซีนจากใบยาสูบ โดยบริษัทใบยา ไฟโตฟาร์ม จาก ดั และ ดีเอนเอวัคซีนจากบริษัทไบโอเนท เอเชีย จาก ดั สถาบันวัคซีนแห่งชาติ การสนับสนุนและสร้าง ความร่วมมือกบสถาบันวิจัยพัฒนาั และหน่วยผลิตวัคซีนในประเทศ ตลอดจนส านักงานคณะกรรมการ อาหารและยา และกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ เพื่อส่งเสริมการผลิตวัคซีนใช้ได้เองในประเทศตั้งแต่ต้นน้า สถาบันวัคซีนการเจรจาสร้างความร่วมมือกบตั ่างประเทศเพื่อการขอรับถ่ายทอดเทคโนโลยีการ ผลิตทั้งจากประเทศจีน และยุโรป ผลการวิเคราะห์ข้อมูลพบว่าการรับถ่ายทอดเทคโนโลยีจากผู้ผลิตที่มี แนวโน้มจะได้วัคซีนมาใช้ภายในต้นปี 2564 น่าจะเป็นทางเลือกที่รัฐบาลควรลงทุน เพื่อสร้างโอกาสให้ ประเทศไทยกาวข้ามสถานการณ์การระบาดได้อย้ างก่ าวกระโดด้ วัคซีนโควิด-19 หลายชนิดที่มีการพัฒนาในโลก วัคซีนกลุ่ม Adenovirus เป็นที่ยอมรับในระดับโลก และมีการพัฒนาที่ใกล้สาเร็จ โดยเฉพาะวัคซีนชนิด Chimpanzee Adenovirus ที่พัฒนาโดย Oxford University ร่วมกบผู้ผลิตคือบริษัทั AstraZeneca ขณะนี้มีผลการวิจัยในมนุษย์ที่ดีมาก สามารถกระตุ้นภูมิคุ้ม กนได้ดีั กาลังศึกษาวิจัยในมนุษย์ ระยะที่ 3 คาดการณ์วาจะสามารถได้รับอนุมัติทะเบียนที่ยุโรปภายใน่ ธันวาคม พ.ศ. 2563 โดยมีผู้ผลิตในประเทศที่มีความพร้อมเป็นอยางยิ่ งในการรับถ่ ่ายทอดเทคโนโลยี และ คาดวาจะสามารถมีผลิตภัณฑ์วัคซีนให้ประชาชนไทยได้ในปี่ 2564 ด้วยศักยภาพการผลิตวัคซีนได้ 200 ล้าน โด๊สต่อปี ซึ่งเพียงพอตอการใช้ในประเทศ่ เพื่อให้ประชาชนสามารถเข้าถึงวัคซีนวัคซีนโควิด-19 ที่มีคุณภาพ มีความปลอดภัย และมีประสิทธิภาพ อยางทั่ วถึง่ เป็นธรรม ในเวลาใกล้เคียงกบประเทศอื่นั ๆ ในโลก รวมถึง

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 20

การลดผลกระทบตอเศรษฐก่ ิจ สังคมของประทศได้อยางรวดเร็วขึ่ ้น กระทรวงสาธารณสุข โดยสถาบัน วัคซีนแห่งชาติได้จัดทาโครงการเตรียมความพร้อมรับการถ ่ายทอดเทคโนโลยีการผลิตวัคซีนโควิด-19 จาก ตางประเทศ่ เพื่อเตรียมหน่วยผลิตวัคซีนในประเทศให้มีความพร้อมสาหรับการผลิตวัคซีนชนิด Adenovirus ตั้งแต่ต้นน้า ด้วยกาลังการผลิต 200 ล้านโด๊สตอปี่ นอกจากนี้ ยังได้มีการเจรจาสร้างความร่วมมือกบตั างประเทศเพื่อการขอรับถ่ ่ายทอดเทคโนโลยีการ ผลิตทั้งจากประเทศจีน และยุโรป รวมทั้งการเจรจาเพื่อให้ได้มาซึ่งวัคซีนส าหรับใช้ในประเทศไทย ผาน่ องค์กรกลางระหว่างประเทศที่เรียกว่า COVID-19 vaccine global access (COVAX) facility ซึ่งเป็นความ ร่วมมือระหว่างองค์การอนามัยโลก (WHO), Global Alliance for Vaccines and Immunization (Gavi Alliance) และ Coalition for Epidemic Preparedness Innovations (CEPI) มีเป้าหมายส าคัญ 5 ข้อ คือ 1) เพื่อ สนับสนุนให้ประชาชนในแตละประเทศได้เข้าถึงวัคซีนโควิด่ -19 ได้ร้อยละ 3 (ในระยะแรก) และร้อยละ 20 (ระยะถัดมา) ของจานวนประชากร 2) เพื่อบริหารจัดการและให้การสนับสนุนวัคซีนโควิด-19 ที่กาลังพัฒนา อยูในขณะนี่ ้ให้สาเร็จ 3) เพื่อให้มีการกระจายวัคซีนโควิด-19 ได้อยางรวดเร็ว่ และเหมาะสม หากการพัฒนา ส าเร็จ 4) เพื่อหยุดยั้งการแพร่ระบาดของ COVID-19 และ 5) เพื่อลดผลกระทบ และฟื้ นฟูเศรษฐกิจของ ประเทศที่เสียหายจาก COVID-19 ความร่วมมือส าคัญของ COVAX facility คือ การจัดหาวัคซีนล่วงหน้า (Advance Market Commitment; AMC) โดยประเทศที่ประสงค์เข้าร่วมจะได้รับสิทธิในการเข้าถึงวัคซีนที่มี ราคาที่เหมาะสม ตามสัดส่วนของประชากรในประเทศ ระยะแรก ไมเก่ ินร้อยละ 3 ระยะที่สอง ไมเก่ ินร้อยละ 20 โดยผานระบบการจัดหาวัคซีนล่ ่วงหน้าของ COVAX facility ประเทศไทย โดยกระทรวงสาธารณสุขได้ ส่งหนังสือแสดงเจตนารมณ์ในการเข้าร่วมใน COVAX facility (Expression of Interest) เมื่อวันที่ 9 กรกฎาคม 2563 และได้มอบหมายให้สถาบันวัคซีนแห่งชาติร่วมกบกรมควบคุมโรคั กองการต่างประเทศ ส านักงานปลัดกระทรวงสาธารณสุข และหน่วยงานที่เกี่ยวข้องกบการจัดซืั ้อและบริหารจัดการวัคซีนใน ประเทศ เร่งประสานความร่วมมือ เพื่อให้ประเทศสามารถเข้าถึงวัคซีน COVID-19 ได้ในเวลาที่ใกล้เคียงกบั ประเทศอื่น ๆ

จากการดาเนินการดังกล ่าวทั้ง 3 แนวทาง จะทาให้ประเทศไทยสามารถเข้าถึงวัคซีนโควิด-19 ได้ อยางทั่ วถึง่ และเป็นธรรม ในระยะเวลาที่ไมช้าไปกว่ าประเทศอื่นๆ่

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 21

Symposium 1

Toxic Gourmet

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 22

Symposium 2

Safety and Efficacy of Alcohol Sanitizer

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 23

Safety and Efficacy of Alcohol Sanitizer

Kessirin Putichote, M.D. Emergency department, Bhumibol Adulyadej Hospital, The Royal Thai Air Force, Bangkok, Thailand

Maesaya Chartkul, M.D. Emergency department, Bangkok Chanthaburi hospital, Chanthaburi, Thailand

Abstract

There is currently an outbreak of respiratory disease caused by a novel coronavirus. The virus has been named “SARS-CoV-2” and the disease it causes has been named “Coronavirus Disease 2019” (COVID-19). Hand hygiene is an important part of the response to COVID-19. Washing hands often with soap and water for at least 20 seconds is essential, especially after going to the bathroom; before eating; and after coughing, sneezing, or blowing one’s nose. If soap and water are not readily available, the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) recommends consumers use an alcohol-based hand sanitizer that contains at least 60 percent alcohol.

Hand sanitizer formulations vary by manufacturer and contain different concentrations of ethanol and/or isopropanol, as well as additional potential inactive ingredients such as acetone, 1-propanol, 2-propanol, benzyl alcohol, hydrogen peroxide, glycerin, water, and different perfumes.1,2 Ingestion of these products for their alcohol content has been previously reported human intoxication. Young children who accidentally ingest these products and adolescents and adults who drink these products as an alcohol (ethanol) substitute are most at risk. According to the Ramathibodi Poison Center, the number of consulted case on hand sanitizer increased 2.3 times during the outbreak of COVID-19. Acute ethanol intoxication can result in several serious, even life-threatening clinical effects. These include hypothermia, central nervous system and respiratory depression, cardiac dysrhythmias or arrest, hypotension, nausea and vomiting, acute liver injury, myoglobinuria, lactic and ketoacidosis and hypoglycemia.3 The immediate life-threatening events relate to the anesthetic effects of high doses of ethanol that produce hypoventilation and hypoxia that may result in anoxic brain injury. Ethanol toxicity can be lethal in the range of 400 mg/dL or greater, although death has occurred at lower levels.4 Ingesting propanol can cause central nervous

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 24

system (CNS) depression, which can result in death. Symptoms propanol exposure can include confusion, decreased consciousness, and slowed pulse and breathing. Animal studies indicate that the central nervous system depressant effects of propanol are 2 to 4 times as potent as ethanol. Therapy of both ethanol and propanol overdose is primarily supportive by providing airway protection, respiratory support and addressing associated metabolic disturbances.5 While hemodialysis has been used in some patients who had severe organ dysfunction and did not respond to supportive measures, it is usually not necessary.1

Methanol (methyl alcohol) is not an acceptable ingredient. However, sporadic cases of acute poisoning indicate that alcohol-based hand rub with undeclared methanol may be found in the market from time to time. Whereas early clinical effects of methanol and ethanol poisoning are similar (e.g., headache, blurred vision, nausea, vomiting, abdominal pain, loss of coordination, and decreased level of consciousness), persons with methanol poisoning might develop severe anion gap metabolic acidosis, seizures, and blindness. If left untreated methanol poisoning can be fatal.6 Survivors of methanol poisoning might have permanent visual impairment, including complete vision loss; data suggest that vision loss results from the direct toxic effect of formate, a toxic anion metabolite of methanol, on the optic nerve.7 Although methanol can be absorbed through the skin8, transcutaneous methanol poisoning is rare and has been reported under unusual circumstances. The extent and rate of transcutaneous methanol absorption depends on variables such as its form (e.g., vapors, liquid, or solution), contact time, dose, concentration, and size of the exposure area.9 In China, methanol poisoning was diagnosed in a hospital mistakenly purchased industrial (denatured) alcohol for surgeons to disinfect the hands and forearms before surgery. It was used 3–5 sessions per week. Six months later, 6 surgeons in the same unit developed erythema and rash in the affected areas, with intense itching, especially the fingers and finger web. Four surgeons stopped using this product and recovered spontaneously. The fifth surgeon had further exposures until the skin condition worsened. About 1 month after stopping using the product, he developed mild visual impairment which gradually improved after treatment. The sixth surgeon continued to use the hand rub until blurred vision occurred.10 When methanol is metabolized, those breakdown products are toxic. The antidote is an intravenous medicine called fomepizole, which makes the methanol less toxic, but fomepizole is unavailable in Thailand. Ethanol has a greater affinity than methanol for the enzyme alcohol dehydrogenase, which is responsible for the initial step in methanol metabolism. A suggested method of treating methanol poisoning is the administration of ethanol, thus reducing the formation of the toxic metabolites of methanol. Excess methanol

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 25

is then removed from the body by hemodialysis.11 Clinicians should have high index of suspicious for methanol poisoning when evaluation patients with either a history of swallowing an alcohol-base hand sanitizer or compatible signs and symptoms and, if needs, obtain medical management advice from poison center.12

In summary, alcohol sanitizer can be toxic if used improperly. People should not consume alcohol sanitizer as this can lead to systemic toxicity. Treatment is mainly supportive. Methanol-based antiseptics should be considered illegal use and methanol poisoning may occur transdermally. Methanol poisoning should be kept in mind because methanol is more lethal and poisoning often requires antidotal therapy, in addition to supporting therapy and critical care.

Reference 1. Gormley NJ, Bronstein AC, Rasimas JJ, et al. The rising incidence of intentional ingestion of ethanol- containing hand sanitizers. Crit Care Med. 2012;40(1):290-294. 2. Archer JR, Wood DM, Tizzard Z, Jones AL, Dargan PI. Alcohol hand rubs: hygiene and hazard. BMJ. 2007;335:1154. 3. Vonghia L, Leggio L, Ferrulli A, et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 2008;19(8):561– 567. 4. Sanap M, Chapman MJ. Severe ethanol poisoning: a case report and brief review. Crit Care Resusc. 2003;5(2):106–108. 5. Pittet D, Boyce JM. Revolutionizing hand hygiene in health-care settings: guidelines revisited. Lancet Infect Dis. 2003;3(5):269-270 6. Kraut JA, Mullins ME. Toxic alcohols. N Engl J Med 2018;378:270–80. 7. Jacobsen D, McMartin KE. Methanol and ethylene glycol poisonings. Mechanism of toxicity, clinical course, diagnosis and treatment. Med Toxicol 1986;1:309–34. 8. Batterman SA, Franzblau A. Time-resolved cutaneous absorption and permeation rates of methanol in human volunteers. Int Arch Occup Environ Health 1997;70:341–51. 9. Dutkiewicz B, Kończalik J, Karwacki W. Skin absorption and per os administration of methanol in men. Int Arch Occup Environ Health 1980;47:81–8. 10. Chan APL, Chan TYK. Methanol as an Unlisted Ingredient in Supposedly Alcohol-Based Hand Rub Can Pose Serious Health Risk. Int J Environ Res Public Health. 2018;15(7):1440 11. Ekins BR, Rollins DE, Duffy DP, Gregory MC. Standardized treatment of severe methanol poisoning with ethanol and hemodialysis. West J Med. 1985;142(3):337-340. 12. Yip L, Bixler D, Brooks DE, et al. Serious Adverse Health Events, Including Death, Associated with Ingestion Alcohol-Based Hand Sanitizers Containing Methanol-Arizona and New Mexico, May-June 2020. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2020;69:1070-1073

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 26

Symposium 3

Food Safety in New Normal Lifestyle

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 27

Symposium 4

Safety Assessment of Vaccine Development

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 28

Pre-clinical Study in Plant-produced COVID-19 Vaccine Development

รศ.ดร.วรัญญู พูลเจริญ ภาควิชาเภสัชเวทและเภสัชพฤกษศาสตร์ คณะเภสัชศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย บริษัท ใบยาไฟโตฟาร์ม จาก ดั

บทคัดย่อ

การระบาดของโรคไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ (Coronavirus disease 2019: COVID-19) ส่งผล กระทบต่อสุขภาพ เศรษฐกิจ และการท่องเที่ยวเป็นอยางมาก่ ในปัจจุบัน โรคดังกล่าวยังไม่มีวิธีการรักษา หรือวัคซีนที่จ าเพาะต่อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2: SARS-CoV-2) ดังนั้นจึงจาเป็นต้องมีการพัฒนายาหรือวัคซีนที่จ าเพาะต ่อไวรัสกล่าวอยางเร่ ่งด่วนเพื่อการ ควบคุมโรคอยางมีประสิทธิภาพ่ โดยในการศึกษานี้ได้มีการพัฒนาวัคซีนแบบซับยูนิต ซึ่งเป็นส่วน receptor binding domain (RBD) ของไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ในใบยาสูบ (Nicotiana benthamiana) และน าไป กระตุ้นภูมิคุ้มกนในสัตว์ทดลองั 2 ชนิด ได้แก่ หนูขาว (Mus musculus) สายพันธุ์ ICR และลิงแสม (Macaca fascicularis) ผลการทดลองพบว่า โปรตีน RBD ที่ผลิตขึ้นจากใบยาสูบสามารถกระตุ้นภูมิคุ้มกันใน สัตว์ทดลองทั้ง 2 ชนิดภายในระยะเวลา 14 วันหลังจากได้รับวัคซีนเข็มแรก และสามารถกระตุ้นการสร้าง แอนติบอดีได้สูงมากอย่างมีนัยส าคัญ หลังได้รับวัคซีนในเข็มที่ 2 นอกจากนั้นแอนติบอดีในซีรั่มของ สัตว์ทดลองทั้ง 2 ชนิด สามารถยับยั้งการติดเชื้อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ในหลอดทดลองได้ (in vitro) ดังนั้น วัคซีนแบบซับยูนิตที่ผลิตจากพืชสามารถกระตุ้นการสร้างภูมิคุ้มกันในสัตว์ทดลองได้อย่างมี ประสิทธิภาพ และมีความเป็นไปได้ในการนาไปพัฒนาเป็นวัคซีน ที่ใช้ในการป้องกนโรคไวรัสโคโรนาสายั พันธุ์ใหมในอนาคตต่ อไปได้่

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 29

Clinical Vaccine Trials: Benefits, Risks and Safety ศ.นพ.ชัยรัตน์ ฉายากุล คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล มหาวิทยาลัยมหิดล

บทคัดย่อ

ในการพัฒนาวัคซีนใหม่เพื่อใช้กับมวลมนุษยชาตินั้น มีสิ่งที่ต้องคานึงถึงอยู ่ 3 เรื่องใหญ่ คือ ความสามารถในการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (Immunogenicity) ประสิทธิภาพในการป้องกันโรค (Protective Efficacy) และความปลอดภัยของผู้ได้รับวัคซีน (Safety) ซึ่งต้องอาศัยการศึกษาวิจัยอย่างถูกต้องตาม มาตรฐานและเป็นไปตามล าดับขั้น จนถึงการน ามาใช้ทดสอบในคน อันเป็นขั้นตอนที่ต้องใช้ความ ระมัดระวังสูงที่สุด และจะทาได้ต ่อเมื่อมีข้อมูลสนับสนุนอยางเพียงพอในทั่ ้ง 3 เรื่องจากการศึกษารูปแบบ อื่นแล้ว ความเป็นห่วงเรื่องภาวะแทรกซ้อนของวัคซีนเป็นที่สนใจของสาธารณะอยางกว้างขวางในช่ ่วงที่ ผานมา่ ทั้งที่เกิดแบบเฉียบพลัน เช่น การแพ้วัคซีนหรือโปรตีนในไข่ (ส าหรับวัคซีนไข้หวัดใหญ่ วัคซีนไข้ เหลือง) หรือในระยะต่อมา เช่น การเกิดโรคจากวัคซีนชนิดเชื้อเป็นอ่อนฤทธิ์ (live attenuated) ในผู้ที่มี ภูมิคุ้มกนบกพรั ่องหรือกาลังได้รับยากดภูมิคุ้มก นั นอกจากนั้น ยังมีภาวะอื่น ๆ ที่อาจเกิดขึ้นหลังการให้ วัคซีนแต่ยังไม่ทราบกลไกที่แน่ชัดว่าเกี่ยวข้องกบองค์ประกอบหลักหรือสารเสริมฤทธิั ์ (adjuvant) ของ วัคซีนหรือไม่ เช่น ภาวะลาไส้กลืนก นในเด็กหลังได้รับวัคซีนโรต้าชนิดกั ิน โรคทางระบบประสาทชนิด demyelination ภาวะ autism โรคภูมิคุ้มกนต้าั นตนเอง หรือการเกิดภูมิคุ้มกนผิดปกติั เรื่องเหล่านี้สร้างความ กงวลและทั าให้ความเชื่อถือต ่อโปรแกรมการให้วัคซีนของประชาชนลดลง ดังนั้น แผนดาเนินการวิจัยจึง ต้องมีความชัดเจนเมื่อน ามาใช้ทดสอบในคน ว่าได้มีการเฝ้าระวังผลข้างเคียงอย่างเหมาะสมและนาน เพียงพอ ทั้งต้องได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในคนและหน่วยงานที่เกี่ยวข้องก่อน ด้วย เพื่อให้มันใจว่ าจะไม่ ก่ ่อให้เกิดความเสี่ยงตออาสาสมัครที่เข้าร่ ่วมในการวิจัยมากเกินไป อยางไรก่ ็ตาม ในสถานการณ์โรคระบาดรุนแรง เช่น โควิด-19 ในปัจจุบัน การพัฒนาให้ได้ยาและ วัคซีนใหม ่ ๆ มาใช้เพื่อรักษาและป้องกนไมั ให้โรคแพร่ ่กระจายจนควบคุมไม่ได้ เป็นสิ่งสาคัญ ขั้นตอนที่ใช้ สร้างความมันใจว่ าวัคซีนนั่ ้นดีเพียงพอจึงควรใช้เวลาที่กระชับที่สุด และนาไปสู ่รูปแบบการดาเนินการที่ยัง เป็นข้อวิพากษ์กนอยูั ในปัจจุบัน่ เช่น การทดลองนาเชื ้อเข้าสู่คน (human challenge study) หลังได้รับวัคซีน หรือการใช้อ านาจตามมาตรการฉุกเฉิน (emergency use authorization) เพื่ออนุมัติการใช้วัคซีนก่อน การศึกษาในระยะที่ 3 เสร็จสมบูรณ์ เป็นต้น แนวทางการพิจารณาเหล่านี้ ขึ้นกบการประเมินประโยชน์ตั ่อ ความเสี่ยง (Benefit-Risk assessment) จากการให้วัคซีน ว่าอย่างไรถึงจะมีความเหมาะสม โดยคานึงถึง ประโยชน์แก่มวลมนุษยชาติเป็นสาคัญ

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 30

ในการบรรยาย จะกล่าวถึงปัญหาเรื่องความปลอดภัยที่เกิดขึ้นจากการพัฒนาวัคซีนในอดีต และ นาเสนอแนวทางเพื่อประเมินความปลอดภัยของการวิจัยวัคซีนในคน จากแนวทางขององค์การอนามัยโลก (WHO) องค์การยาแห่งสหภาพยุโรป (EMA) และส านักงานอาหารและยาของสหรัฐอเมริกา (USFDA) เพื่อ ประโยชน์ตอการติดตามการพัฒนาวัคซีนป้องก่ นโรคโควิดั -19 ที่จะมีการนามาใช้ในอนาคตอันใกล้

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 31

Symposium 5

Risk Assessment for Novel Food

Development

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 32

การกากับด ูแลอาหารใหม่ (Novel Food) ตามประกาศกระทรวง สาธารณสุขว่าด้วยเรื่องอาหารใหม่ จิรารัตน์ เทศะศิลป์ นักวิชาการอาหารและยาชานาญการพิเศษ หัวหน้ากลุมกาหนดมาตรฐาน่ กองอาหาร สานักงานคณะกรรมการอาหารและยา กระทรวงสาธารณสุข

บทคัดย่อ

ด้วยปัจจุบันมีการนาวัตถุที่ไม ่มีประวัติใช้บริโภคเป็นอาหาร มาเป็นส่วนประกอบหรือส่วนผสมใน อาหารหรือจาหน ่ายเป็นอาหารโดยตรง รวมทั้งมีการพัฒนาเทคโนโลยีการผลิตในกระบวนการผลิตอาหาร ซึ่ง วัตถุหรืออาหารเหล่านั้น อาจไม่ปลอดภัยในการบริโภคหรืออาจก่อให้เกิดอันตรายต่อผู้บริโภคได้ ดังนั้น จึง จาเป็นต้องมีมาตรการก าก บดูแลให้รัดกุมั เพื่อขจัดปัญหาดังกล่าวและคุ้มครองความปลอดภัยของผู้บริโภค ใน การนี้ กระทรวงสาธารณสุข โดยส านักงานคณะกรรมการอาหารและยา จึงได้ออกประกาศกระทรวง สาธารณสุข (ฉบับที่ 376) พ.ศ. 2559 เรื่องอาหารใหม่ (Novel food)1 ซึ่งมีผลบังคับใช้ตั้งแต่ 16 กรกฎาคม 2559 โดยมีสาระสาคัญสรุปได้ ดังนี้ 1. กาหนดให้อาหารใหม ่ ต้องผ่านการประเมินความปลอดภัยก่อนและต้องส่งมอบฉลากให้ สานักงานคณะกรรมการอาหารและยาตรวจอนุมัติก ่อนนาไปใช้ 2. กาหนดนิยามและขอบเขตของอาหารใหม ่ ซึ่งหมายถึง (1) วัตถุที่ใช้เป็นอาหารหรือเป็นส่วนประกอบของอาหารที่ปรากฏหลักฐานทางวิชาการวามี่ ประวัติการบริโภคเป็นอาหารน้อยกวาสิบห้าปี่ หรือ (2) วัตถุที่ใช้เป็นอาหารหรือเป็นส่วนประกอบของอาหารที่ได้จากกระบวนการผลิตที่มิใช่ กระบวนการผลิตโดยทัวไปของอาหารนั่ ้นๆ ที่ทาให้ส ่วนประกอบของอาหาร โครงสร้างของอาหาร หรือ รูปแบบของอาหารนั้นเปลี่ยนแปลงไปอยางมีนัยส่ าคัญ ส่งผลต่อคุณค่าทางโภชนาการ กระบวนการทางเคมี ภายในร่างกายของสิ่งมีชีวิตหรือเมแทบอลิซึม (Metabolism) หรือระดับของสารที่ไม่พึงประสงค์ (Level of undesirable substances) (3) ผลิตภัณฑ์อาหาร ที่มีวัตถุ (1) หรือ (2) เป็นส่วนประกอบ ทั้งนี้ ไมรวมถึงวัตถุเจือปนอาหาร่ และอาหารที่ได้จากเทคนิคการดัดแปรพันธุกรรม

1 รายละเอียดประกาศกระทรวงฯ (http://food.fda.moph.go.th/law/data/announ_moph/P376.PDF)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 33

ดังนั้น ขอบเขตของอาหารใหม่ คือ อาหารหรือวัตถุที่ใช้เป็นอาหารหรือเป็นส่วนประกอบของ อาหาร ซึ่งครอบคลุมถึงอาหารควบคุมเฉพาะ อาหารกาหนดคุณภาพหรือมาตรฐาน อาหารที่ต้องแสดงฉลาก และอาหารทัวไปที่เข้าข่ ายตามนิยามอาหารใหม่ ข้างต้น่ ยกเว้น วัตถุเจือปนอาหารและอาหารที่ได้จากเทคนิค การดัดแปรพันธุกรรม ซึ่งมีรายละเอียดของการประเมินความปลอดภัยอาหารที่แตกตางก่ นั “อาหารที่มีประวัติการบริโภคเป็นอาหาร” หมายถึง อาหารที่มีการบริโภคตามปกติของอาหารนั้นๆ โดยอ้างอิงประวัติจากข้อมูลทางวิชาการ ตัวอยางเช่ ่น - โสม มีรูปแบบการบริโภคเป็นอาหาร คือ รับประทานส่วนราก หากนาส ่วนอื่นๆ เช่น ใบของ โสมมาบริโภค ซึ่งมีประวัติการบริโภคน้อยกวา่ 15 ปี ถือวาใบของโสมเป็นอาหารใหม่ ่ ทั้งนี้ แหล่งของข้อมูลทางวิชาการที่น่าเชื่อถือเพื่อแสดงประวัติการบริโภคเป็นอาหาร เช่น บทความที่ตีพิมพ์ในวารสารทางวิชาการที่เกี่ยวข้องและเป็นที่ยอมรับ ตาราพืชสมุนไพรที่ตีพิมพ์ (ที่ระบุวามี่ การใช้เป็นอาหาร) หนังสือรับรองจากหน่วยงานรัฐ หน่วยงานหรือองค์กรที่ได้รับมอบหมายจากหน่วยงาน รัฐ (ทั้งในและตางประเทศ)่ เป็นต้น “กระบวนการผลิตที่มิใช่กระบวนการผลิตทัวไป่ ” หมายรวมถึง กระบวนการผลิตใดๆ ที่ส่งผลให้ เกิดการเปลี่ยนแปลงของส่วนประกอบของอาหาร หรือโครงสร้างของอาหาร หรือรูปแบบของอาหารอยางมี่ นัยส าคัญ ซึ่งส่งผลต่อคุณค่าทางโภชนาการ (เช่น เพิ่มสารอาหาร เป็นต้น) หรือกระบวนการทางเคมีใน ร่างกายหลังจากบริโภค หรือระดับของสารที่ไม่พึงประสงค์ (เช่น สารปนเปื้ อนจากสิ่งแวดล้อม สารพิษจาก เชื้อรา สารก่อภูมิแพ้ สารพิษที่เกิดจากธรรมชาติ สารยับยั้งสารอาหาร จุลินทรีย์ที่เป็นอันตราย เป็นต้น) ยกตัวอยางกระบวนการผลิตใหม่ ่ เช่น - นาโนเทคโนโลยี ที่ส่งผลให้ส่วนประกอบของอาหารมีอนุภาคเล็กกวาการผลิต่ โดยวิธีดั้งเดิม - กระบวนการพาสเจอร์ไรส์โดยไมใช้ความร้อน่ (Non-thermal food pasteurization processes) ทั้งนี้ การพิจารณาความวา่ “การเปลี่ยนแปลงอยางมีนัยส่ าคัญ” นั้น ให้ใช้การเปรียบเทียบคุณค่า ทางโภชนาการ หรือเมแทบอลิซึม (Metabolism) หรือระดับของสารไมพึงปร่ ะสงค์ที่เกิดขึ้นเทียบกนระหวั าง่ กระบวนการผลิตใหม่กบกระบวนการผลิตแบบดัั ้งเดิมของผลิตภัณฑ์นั้นๆ วามีความแตกต่ ่างหรือไม่หรือ ส่งผลตอความปลอดภัยในการบริโภคหรือไม่ อย่ างไร่ 3. การประเมินความปลอดภัยของอาหารใหม ่ ต้องยื่นผลการประเมินความปลอดภัยจากหน่วยงาน ประเมินความปลอดภัยที่ส านักงานคณะกรรมการอาหารและยาให้การยอมรับพร้อมกบหลักฐานอื่นั ตาม บัญชีแนบท้ายประกาศกระทรวงสาธารณสุขวาด้วยเรื่องอาหารใหม่ ่ เอกสารหลักฐานที่กาหนดไว้ในบัญชีแนบท้ายครอบคลุมถึงข้อมูลทั วไปของอาหารใหม่ ่ คุณภาพหรือมาตรฐาน (Specification) ข้อมูลประวัติการใช้เป็นอาหาร กระบวนการผลิต วิธีการตรวจ วิเคราะห์ ผลการตรวจวิเคราะห์ วิธีการบริโภคหรือคาแนะน าในการบริโภค ข้อมูลความปลอดภัยซึ่ง ประกอบด้วยหลักฐานการทดลองทางพิษวิทยาในสัตว์ทดลองหรือในมนุษย์ ข้อมูลด้านโภชนาการ และ

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 34

รายงานผลการพิจารณาความปลอดภัยจากหน่วยงานสากลหรือต่างประเทศหรือข้อมูลการอนุญาตให้ จาหน ่ายเป็นอาหารในตางประเทศ่ หน่วยประเมินความปลอดภัยที่ส านักงานคณะกรรมการอาหารและยาให้การยอมรับ คือ หน่วยงานที่มีคุณสมบัติตามที่ส านักงานคณะกรรมการอาหารและยากาหนด โดยได้จัดทารายชื่อไว้ใน ประกาศส านักงานคณะกรรมการอาหารและยา เรื่อง รายชื่อหน่วยประเมินความปลอดภัยที่ส านักงาน คณะกรรมการอาหารและยาให้การยอมรับ2 ส าหรับการด าเนินการเพื่อขอประเมินความปลอดภัยนั้น ผู้ประกอบการต้องยื่นเอกสาร หลักฐานตามที่กาหนดในบัญชีแนบท้ายของประกาศฯ ให้แก่หน่วยประเมินความปลอดภัยที่ส านักงาน คณะกรรมการอาหารและยายอมรับ เพื่อดาเนินการประเมินความปลอดภัย และจัดทารายงานผลการประเมิน ความปลอดภัยโดยมีรายละเอียดตามที่กาหนดไว้ในบัญชีแนบท้ายของประกาศฯ จากนั้น ผู้ประกอบการต้อง นาผลการประเมินและเอกสารหลักฐานที่ได้รับมามอบให้ส านักงานคณะกรรมการอาหารและยา เพื่อเสนอ ให้คณะอนุกรรมการเพื่อศึกษาวิเคราะห์ปัญหาและวินิจฉัยในเชิงวิชาการเกี่ยวกบอาหารั พิจารณาให้ ข้อคิดเห็นและเห็นชอบอีกครั้ง เพื่อกาหนดคุณภาพหรือมาตรฐาน และเงื่อนไขหรือวิธีการใช้ในประเภท อาหาร และปริมาณสูงสุดที่อนุญาตให้ใช้ได้อยางเหมาะสมและปลอดภัยก่ บการบริโภคของกลุั ่มประชากร ไทย ตามหลักการประเมินความเสี่ยงของสากล และคู่มือส าหรับประชาชน เรื่องการขอประเมินความ ปลอดภัยอาหาร3 4. อาหารใหม่ต้องมีคุณภาพหรือมาตรฐาน และเงื่อนไขการใช้ตามที่ส านักงานคณะกรรมการ อาหารและยาเห็นชอบ ซึ่งเป็นไปตามผลการประเมินความปลอดภัย 5. อาหารใหม่ นอกจากต้องปฏิบัติตามประกาศฉบับนี้แล้ว ยังต้องปฏิบัติตามประกาศกระทรวง สาธารณสุขวาด้วยเรื่องนั่ ้นๆ และประกาศกระทรวงสาธารณสุข ฉบับที่เกี่ยวข้องแล้วแตกรณี่ ด้วย ตัวอยางเช่ ่น ผลิตภัณฑ์ของนมพาสเจอร์ไรส์ ที่มีส่วนประกอบของอาหารใหม่ ต้องดาเนินการ ดังนี้ (1) ได้รับการประเมินความปลอดภัยและฉลากต้องได้รับอนุมัติก่อนใช้ (2) มีคุณภาพมาตรฐานตามประกาศฯ (ฉบับที่ ๓๕๒) พ.ศ. ๒๕๕๖ เรื่อง ผลิตภัณฑ์ของนม (3) มีกระบวนการผลิตตามประกาศฯ (ฉบับที่ 298) พ.ศ.2549 เรื่อง วิธีการผลิตเครื่องมือ เครื่องใช้ในการผลิตและการเก็บรักษาผลิตภัณฑ์นมพร้อมบริโภคชนิดเหลวที่ผานกรรมวิธีฆ่ ่าเชื้อด้วยความ ร้อนโดยวิธีพาสเจอร์ไรส์ 6. การแสดงฉลากของอาหารใหม่ ให้ปฏิบัติตามประกาศกระทรวงสาธารณสุขวาด้วยการแสดง่ ฉลากอาหาร ในภาชนะบรรจุ ยกเว้นการแสดงวันเดือนปีที่ควรบริโภคก่อน ให้แสดงวันเดือนปีที่ผลิตและวัน

2 รายละเอียดประกาศสานักงานฯ (http://food.fda.moph.go.th/law/data/announ_fda/name_unit.pdf) 3 รายละเอียดคูมือประชาชน่ (https://www.fda.moph.go.th/sites/food/manual/9.3_Novel_food.pdf)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 35

เดือนปีที่หมดอายุการบริโภค โดยเรียงวันเดือนปีตามลาดับ และมีข้อความวา่ “ผลิต” “หมดอายุ” หรือ “ควร บริโภคก่อน” กาก บไว้ด้วยั แล้วแตกรณี่ และต้องแสดงข้อความเพิ่มเติม ดังนี้ (1) ชื่อสารสาคัญ (ถ้ามี) (2) วิธีการบริโภค วิธีการใช้หรือเงื่อนไขการใช้ เช่น ประเภทหรือชนิดอาหารและปริมาณการ ใช้สูงสุดที่อนุญาตให้ใช้ได้ ตัวอยางของการแสดงชื่อสารส่ าคัญ เช่น - สารสกัดต้นกระบองเพชร Caralluma fimbriata extract 100% ประกอบด้วยสารส าคัญ Pregnane glycosides และ Saponin glycosides ตัวอยางวิธีการบริโภค่ วิธีการใช้หรือเงื่อนไขการใช้ ซึ่งเป็นไปตามผลการประเมินความปลอดภัย เช่น - สาร Oligonol ที่สกดจากผลลิั ้นจี่และใบชาเขียว ให้ใช้ได้ในผลิตภัณฑ์เสริมอาหารในปริมาณ ไมเก่ ิน 200 มิลลิกรัมตอวัน่ เนื่องจากเป็นปริมาณที่ไมเก่ ินคาความปลอดภัย่ (Upper Intake Level, UL) 7. ประกาศนี้ ไมใช้บังคับก่ บั (1) อาหารใหมที่ผลิตเพื่อการส่ ่งออก (2) อาหารใหม่ที่ผู้ผลิตหรือผู้นาเข้าได้รับอนุญาตให้ผลิตหรือน าเข้าก ่อนวันที่ประกาศนี้ใช้ บังคับ 8. อาหารใหม่ที่ผานการประเมินความปลอดภัย่ และได้รับอนุมัติฉลากก่อนวางจาหน ่ายแล้วนั้น สามารถผลิตหรือนเข้าเพื่อจาหน ่ายแก่ผู้บริโภคได้ โดยผู้ประกอบการต้องควบคุมคุณภาพและความปลอดภัย ตามที่ได้รับอนุญาต และจัดเก็บเอกสารหลักฐานวิชาการและหลักฐานที่ได้รับอนุญาตไว้ให้เจ้าหน้าที่ ตรวจสอบหลังจากที่ผลิตภัณฑ์ออกสู่ตลาดแล้ว เพื่อการกาก บดูแลความปลอดภัยแกั ่ผู้บริโภค ซึ่งสรุป ภาพรวมของระบบการกาก บดูแลอาหารใหมั ได้ดังภาพด้านล่ ่างนี้

------

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 36

การประเมินความปลอดภัยเพื่อการขออนุญาตอาหารใหม่ (Novel Foods) รศ.ดร.ชนิพรรณ บุตรยี่ ศูนย์ประเมินความเสี่ยงประเทศไทย สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล

บทคัดย่อ

ประกาศกระทรวงสาธารณสุข ฉบับที่ 376 พ.ศ. 2559 เรื่องอาหารใหม ่ (Novel food) กาหนดให้ผู้ขอ อนุญาตอาหารใหมต้องยื่นผลการประเมินความปลอดภัยตามบัญชีแนบท้ายประกาศฯจากหน่ ่วยงานประเมิน ความปลอดภัยที่ส านักงานคณะกรรมการอาหารและยา (อย.) ให้การยอมรับเพื่อให้หน่วยประเมินจัดทา รายงานการประเมินความปลอดภัยของผลิตภัณฑ์รวมทั้งส่วนประกอบของวัตถุดิบ การดาเนินการเตรียม เอกสารประกอบการประเมินฯ แบ่งเป็น 2 ส่วนคือ 1. ข้อมูลทัวไป่ 2. ข้อมูลการประเมินความปลอดภัยของ ส่วนประกอบที่ต้องการประเมินฯ ซึ่งข้อมูลดังกล่าวจะได้จากข้อมูลด้านการผลิต การวิเคราะห์คุณภาพ มาตรฐานวัตถุดิบและผลิตภัณฑ์อาหารใหม่ จากผู้ผลิต ส่วนผลการทดสอบด้านพิษวิทยาของผลิตภัณฑ์ที่ ต้องการประเมินจะเป็นการศึกษาด้านพิษวิทยาของผลิตภัณฑ์อาหารใหม่ที่ต้องการขออนุญาตหรือสามารถ ใช้ข้อมูลที่อ้างอิงสืบค้นจากแหล่งข้อมูลทางวิชาการจะเป็นการทางานร ่วมกนระหวั ่างผู้ผลิตและหน่วย ประเมินฯ โดยข้อมูลการประเมินความปลอดภัยประกอบด้วย 1) ลักษณะทางชีวเคมีของสาร (การดูดซึม การกระจายและการขับออกจากร่างกาย การเปลี่ยนแปลง ของสาร ผลต่อเอนไซม์และค่าอื่นทางชีวเคมี ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นและวิถีในกรณีที่มีส่วนประกอบหลายตัวใน ผลิตภัณฑ์) 2) ผลการทดสอบความเป็นพิษต่อหน่วยพันธุกรรม (Genotoxicity testing) รายงานการศึกษาที่ ปฏิบัติตามระเบียบวิธีวิจัยที่ดีตามมาตรฐานสากล เช่น OECD guideline เป็นการศึกษาทั้งการศึกษานอก ร่างกายสิ่งมีชีวิต (in vitro) โดยใช้ แบคทีเรีย ยีสต์ หรือ เซลล์สิ่งมีชีวิต เช่น bacterial reverse mutation test หรือ Ames testสามารถดูรายละเอียดใน OECD Test No.471 และ การศึกษาในสิ่งมีชีวิต (in vivo) โดยใช้ หนู หรือสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมชนิดอื่นๆ เช่น mammalian micronucleus test, mammalian chromosome aberration และอื่นๆ 3) ผลการศึกษาด้านพิษวิทยาในสัตว์ทดลอง กรณีข้อมูลได้จากรายงานการวิจัยที่ไม่ใช่การศึกษาที่ ผานการตีพิมพ์ในวารสารวิชาการที่เป็นที่ยอมรับ่ ต้องมีการออกแบบการทดลองที่ดี (well-designed study) ตามระเบียบวิจัยที่ดีตามมาตรฐานสากล เช่น WHO, OECD การศึกษาพิษวิทยากึ่งเรื้อรัง (Repeated Dose 90-

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 37

Day Oral Toxicity Study in Rodents: Test Guideline No.408, OECD, 1998a) หรือมาตรฐานสากลที่เทียบเท่า หรือจากห้องปฏิบัติการที่ได้รับการรับรอง Good Laboratory Practice (GLP) เป็นต้น ทั้งนี้ข้อมูลการศึกษาด้านพิษวิทยาจะพิจารณาความเป็นพิษต่อระบบทัวไปเพื่อสามารถระบุอวัยวะ่ เป้าหมายที่จะเกิดความเป็นพิษ โดยใช้สัตว์ เช่น หนูเมาส์ หนูแรท กระต่าย สุนัข หรือสามารถทดสอบใน มนุษย์ โดยการประเมินความปลอดภัยของอาหารใหม่ (Novel food) ประกอบด้วยการทดสอบต่อไปนี้ 1) พิษเฉียบพลัน (acute toxicity) 2) พิษกึ่งเฉียบพลัน (sub-acute toxicity) 3) พิษกึ่งเรื้อรัง (sub-chronic toxicity) 4) พิษเรื้อรัง (chronic toxicity) 5) พิษทางคลินิก (clinical toxicity study)

การกาหนดค่าความปลอดภัยในการได้รับสารต่อวัน (ADI) จากการศึกษาพิษกึ่งเรื้อรัง (sub-chronic toxicity study) หรือพิษเรื้องรัง (chronic toxicity study) การเกิดพิษแบบกึ่งเรื้อรัง (sub-chronic toxicity) หมายถึง การแสดงอาการความผิดปกติหลังจาก ได้รับสารเป็นเวลาติดต่อกนั 13 สัปดาห์ (กรณีใช้หนูแรท)สามารถนาผลการศึกษามาใช้เพื่อการขออนุญาต ขึ้นทะเบียนผลิตภัณฑ์อาหาร อ้างอิงวิธีทดสอบตาม OECD guideline Test No. 408 เพื่อก าหนดค่า Acceptable Daily Intake (ADI) โดยค่า NOAEL มาจากการศึกษาในสัตว์ ต้องค านึงถึงความแตกต่าง ระหว่างสปีชีย์และความแปรปรวนภายในตัวคือน าค่า uncertainty factor (UF) จากสัตว์ไปยังมนุษย์มา พิจารณาร่วมด้วย กรณีค่า NOAEL มาจากการศึกษาพิษกึ่งเรื้อรังโดยใช้หนูในการศึกษาสามารถกาหนดค ่า uncertainty factor (UF) โดยประมาณเท่ากบั 1000 (มาจากแฟกเตอร์ 10x10x10 โดยมาจากความแตกต่าง ระหวางสปีชีย์่ ความแปรปรวนภายในตัวและข้อมูลที่ได้มาจากการศึกษาพิษกึ่งเรื้อรัง) ADI = NOAEL UF เมื่อ ADI คือคาความปลอดภัยในการได้รับสารต่ อวันของมนุษย์่ (หน่วยเป็น mg/d) NOAEL คือขนาดสูงสุดของสารที่ได้รับแล้วไมท่ าให้เก ิดความผิดปกติ (หน่วยเป็น mg/kgBW/d) UF คือ คาความไม่ แน่ ่นอนจากความแตกตาง่ ระหวางสปีชีย์่ (เทาก่ บั 1000 กรณีการศึกษาพิษกึ่งเรื้อรัง)

ทั้งนี้คาน่ ้าหนักเฉลี่ยมาตรฐานคนไทยเท าก่ บั 57.57 kg กรณีการศึกษาพิษแบบเรื้อรัง (chronic toxicity) หมายถึง การแสดงอาการความผิดปกติหลังจาก ได้รับสารเป็นเวลาติดต่อกนมากกวั ่า 3 เดือนในหนูแรทหรือหนูเมาส์ให้อ้างอิงวิธีทดสอบตาม OECD guideline Test No. 452 หากนาผลมาพิจารณาก าหนดค ่า ADI สามารถกาหนดค ่า UF โดยประมาณเท่ากบั 100 เนื่องจากระยะเวลาที่สัตว์ได้รับสารทดสอบนานกวาการศึกษา่ แบบพิษกึ่งเรื้องรัง

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 38

การกาหนดค่าความปลอดภัยจากการศึกษาในมน ุษย์ทางคลินิก การศึกษาในมนุษย์ที่สามารถนามาใช้ก าหนดค ่า NOAEL หรือค่า ADI จะต้องเป็นการศึกษาที่อยู่ ภายใต้จริยธรรมการวิจัยในมนุษย์ และถูกตีพิมพ์ในวารสารวิชาการที่อยูในฐานข้อมูลน่ ่าเชื่อถือในระดับ สากล ได้แก่ Scopus, PubMed, Science direct, TOXLINE, TOXNET, NAPRALERT เป็นต้น หรือวารสารที่ อยูในฐานข้อมูลระดับชาติ่ เช่น ศูนย์ดัชนีอ้างอิงวารสารไทยหรือ Thailand Citation Index (TCI) หรือรายงาน การศึกษาระบุปฏิบัติตามระเบียบวิธีวิจัยที่ดีตามมาตรฐานสากล (Good Clinical Practice; GCP) การศึกษา ทางคลินิกที่มีการออกแบบอย่างดี (well-designed human intervention study) สามารถน ามาก าหนดค่า NOAEL หรือ LOAEL ได้จะต้องออกแบบการศึกษาแบบ Randomized controlled trial (RCT) ซึ่งมีกลุ่ม อาสาสมัครที่ได้รับสารทดสอบและกลุ่มควบคุมที่ไมได้รับสารทดสอบหรือได้่ รับยาหลอก (placebo) ควรมี กลุ่มศึกษาที่ได้รับสารในขนาด (dose) ที่แตกต่างกนเพื่อดูผลลัพธ์ที่เปลี่ยนแปลงวั ่าเป็น dose response หรือไม่โดยระยะเวลาที่ได้รับสารทดสอบนานกว่า 3 เดือน ผลลัพธ์ที่จะใช้ประเมินความเสี่ยงที่มีผลต่อ สุขภาพ ได้แก่ ความไม่ทน (intolerance) ภาวะโภชนาการและลักษณะการท าหน้าที่ของอาหารและ องค์ประกอบอาหาร เมตาบอลิสม (metabolic process) และพิษจลนศาสตร์ (toxicokinetics) ของสารรวมทั้ง กลไกหรือรูปแบบการท างาน ดัชนีชี้วัดทางชีวภาพ (biomarkers) ระบบภูมิคุ้มกัน (immune system) ผลกระทบต่อการทางานของระบบกระเพา ะอาหารและลาไส้ (gastrointestinal tract) ดัชนีชี้วัด (biomarkers) ของค่าเคมีคลิกนิกในเลือด เช่น ตับ (ค่าเอนไซม์ต่างๆในตับ) หรือไต (Blood urea nitrogen) ทั้งนี้สามารถ กาหนดค ่า UF เท่ากบั 1 แต่หากเงื่อนไขไม่เป็นไปตามที่กล่าวมาสามารถเพิ่มค่า UF มากกวา่ 1 ได้ (UF อยู่ ระหวาง่ 1-10) เมื่อผู้ประเมินสามารถกาหนดค ่า ADI (หน่วยเป็นมิลลิกรัมต่อวัน) ได้แล้วจึงพิจารณาขนาดบริโภค ต่อวันที่ผู้ประกอบการจะแนะนาให้บริโภค โดยปริมาณที่แนะนาต ่อวันจะต้องมีค่าต่ากว าค่ ่า ADI ที่กาหนด (ปริมาณแนะนาบริโภคต อวัน่ < ADI)นอกจากนั้นหากมีประเด็นใดที่มีหลักฐานทางวิชาการระบุวาก่ ่อให้เกิด ความเสี่ยงของการบริโภคในบางสภาวะ หรืออาจมีสารพิษที่มีผลกระทบต่อสุขภาพที่ต้องกาจัดออกให้ หลงเหลือน้อยสุดที่จะไม่ส่งผลกระทบต่อสุขภาพ หน่วยประเมินฯจะต้องระบุเป็นข้อคิดเห็นเพื่อเสนอ รายงานต่อ อย.เพื่อพิจารณาต่อไป ทั้งนี้ผลิตภัณฑ์อาหารใหม่ (novel foods) ที่มีการจัดทารายงานความ ปลอดภัยโดยหน่วยประเมินฯจะได้รับอนุญาตจาหน ่ายหรือไม่จะต้องผานการพิจารณาจาก่ อย.ซึ่งทาหน้าที่ เป็นผู้จัดการความเสี่ยง (risk manager) ซึ่งในขั้นตอนนี้จะมีการพิจารณาประเด็นด้านการบริหารจัดการความ เสี่ยงด้วยในขณะที่หน่วยประเมินฯทาหน้าที่ในเชิงวิชาการพิจารณาด้านความปลอดดภัยเป็นหลักเรียกว ่าผู้ ประเมินความเสี่ยง (risk assessor) ซึ่งเป็นไปตามหลักการประเมินความเสี่ยงที่ควรแยกกนระหวั างผู้ประเมิน่ ความเสี่ยงและผู้จัดการความเสี่ยงนันเอง่

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 39

เอกสารอ้างอิง ชนิพรรณ บุตรยี่ สุชาดา ไกรเพชร กนกนาฏ แขงามขา . คู่มือการเตรียมข้อมูลประเมินความปลอดภัยเพื่อยื่นขอรับรอง อาหารใหม ่ (NOVEL FOOD). นครปฐม:ศูนย์ประเมินความเสี่ยงประเทศไทย (TRAC) มูลนิธิส่งเสริมโภชนาการในพระ ราชูปถัมภ์สมเด็จพระเทพรัตนราชสุดาฯสยามบรมราชกุมารี, 2563. 75 หน้า. OECD (1997). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4-Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test.[https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-471-bacterial-reverse-mutation-test_9789264071247-en] OECD (2018). Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents (OECD TG 408). In Revised Guidance Document 150 on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption, OECD Publishing, Paris. DOI: https://doi.org/10.1787/9789264304741-23-en.[https://www.oecd-ilibrary.org/docserver/9789264304741-23- en.pdf?expires=1589894949&id=id&accname=guest&checksum= 556C447355FFF88FC31A916757A29A00] OECD (2018). Chronic Toxicity Study (OECD TG 452).[https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-452-chronic- toxicity-studies_9789264071209-en]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 40

Proceedings

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 41

การศึกษาฤทธิ์ก่อกลายพันธ์ของสารสกัดกัญชาที่สกัดด้วยวิธีของไหลวิกฤตยิ่งยวดุ พราว ศุภจริยาวัตร* สุจริต อ่นกาศุ วิจิตรา สุดห่วง เสกรชตกร บัวเบา ศรายุธ ระดาพงษ์ พรชัย สินเจริญโภไคย ห้องปฏิบัติการพิษวิทยา สถาบันวิจัยสมุนไพร กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข ประเทศไทย

บทคัดย่อ

กญชาั (Cannabis sativa L.) เป็นพืชเสพติดที่มีการอนุญาตให้ใช้ทางการแพทย์ และในปัจจุบันประเทศ ไทยได้มีความพยายามจากหลายภาคส่วนในการผลักดันให้มีการใช้ประโยชน์จากกญชาอยั างถูกกฎหมาย่ และได้มี การดาเนินการศึกษาวิจัยพัฒนา ผลิตผลิตภัณฑ์ ทดสอบประสิทธิภาพและความปลอดภัยอยางกว้างขวาง่ มีการอ้าง ถึงสรรพคุณในการป้องกนและรักษาโรคั รวมถึงมีการผลิตผลิตภัณฑ์สมุนไพรกญชาออกมาใช้และั บริโภค กนั อยางแพร่ ่หลาย แต่ข้อมูลด้านพิษวิทยาและความปลอดภัยมีอยูน้อย่ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษา ฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ของสารสกดั กญชาที่สกั ดด้วยั วิธีของไหลวิกฤตยิงยวด่ (supercritical fluid extraction)โดย ใช้วิธีอ้างอิงจาก OECD test guideline 471 ใช้เชื้อ Salmonella typhimurium 4 สายพันธุ์ (TA98, TA100, TA1535, TA1537) และ Escherichia coli WP2 ที่ขนาดทดสอบ 5 ระดับ (1250, 2500, 5000, 10000 และ 20000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ในระบบที่มีและไมมีเอนไซม์กระตุ้น่ ผลการทดลองพบวาสารสก่ ดั กญชาั ทุก ขนาดทดสอบทุกสายพันธุ์ ทั้งในระบบที่มีและไมมีเอนไซท์กระตุ้น่ ไมมีฤทธิ่ ์ก่อกลายพันธุ์ และ background lawn ปกติ การศึกษาครั้งนี้ชี้ให้เห็นในเบื้องต้นว่า สารสกดั กญชาั ที่สกดด้วยวิธีของไหลวิกฤตยิั ่งยวดใน ขนาดที่ทดสอบให้ผลลบไมมีฤทธิ่ ์ก่อกลายพันธุ์ในแบคทีเรียทุกสายพันธุ์ที่ใช้ในการทดสอบเอมส์

คาส าคัญ: สารสกดั กญชาั ฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ การสกดด้วยของไหลวิกฤตยิั งยวด่ การทดสอบเอมส์

*ผ้รับผิดชอบบทความู พราว ศุภจริยาวัตร ห้องปฏิบัติการพิษวิทยา สถาบันวิจัยสมุนไพร 88/7 กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข ต.ตลาดขวัญ อ.เมือง จ.นนทบุรี ประเทศไทย 11000 Email: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 42

Investigation of Mutagenic Activity of Cannabis sativa L. Extract Using Supercritical Fluid Extraction Assay Praw Suppajariyawat* Sutjarit Aunkat Wijittra sudhong Sekrachatakorn Buabao Sarayut Radapong Pornachai Sincharoenpokai Toxicology Laboratory, Medicinal Plant Research Institute, Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Thailand

Abstract

Cannabis sativa L. is an addictive plant allowed for medical or recreational use in some countries. In Thailand, several sectors currently have tremendous effort to make use of this plant legally by conducting the research and development to prove the efficacy and safety of its products more extensively. There have been reported that this plant shows the property of prevention and treatment to various diseases. Cannabis products have been launched and consumed dramatically by the public; however toxicity and safety data are still limited. This study, therefore, aimed to investigate the mutagenic activity of C. sativa extract by supercritical fluid extraction, following the method complied with the OECD GLP test guideline 471. The four strains of Salmonella typhimurium (TA98, TA100, TA1535, TA1537) and Escherichia coli (WP2) were treated with five different doses of the extract at 1250, 2500, 5000, 10000 and 20000 µg/ ml with and without metabolic activation enzymes. The results showed that the extract did not produce significantly the revertant colonies and showed normal of the background lawn in all strains of bacteria and all concentrations of the extract compared to the control groups (both non- and enzymatic activation). In conclusion, the compound did not cause mutagenicity. This preliminary study indicated that the C. sativa extract obtained from supercritical fluid extraction was considered non-mutagenic in the current bacterial reverse mutation test.

Keywords: Cannabis sativa’s extract, Mutagenic activity, Supercritical fluid extraction, Ames test

*Corresponding author Praw Suppajariyawat Toxicology Laboratory, Medicinal Plant Research Institute 88/7 Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Talad kwan, Muang, Nonthaburi, Thailand 11000 Email: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 43

บทน า แยกเพศต่างต้น ออกเป็นช่อกระจุกตามง่ามใบและ ในช่วง 1-2 ปีที่ผานมา่ จากกระแสสังคม ปลายก่ิง ช่อดอกและใบของต้นเพศผู้เรียงตัวกนั โลกรวมทั้งในประเทศไทยมีการพูดถึงเรื่องการ ห่างๆ ตางจากต้นเพศเมียที่เรียงชิดก่ นั เกสรเพศผู้ 5 ปลดล็อคให้มีการน าพืชกัญชามาใช้อย่างถูก อัน ดอกเล็ก ดอกเพศเมียมีกลีบเลี้ยงหุ้ม ไม่มีกลีบ กฎหมาย ส าหรับประเทศไทยถือเป็นประเทศแรก ดอก รังไข่อยูเหนือวงกลีบ่ มี 1 ช่อง มีออวุล 1 เม็ด ในอาเซียนที่อนุญาตให้ใช้กญชาอยั างถูกกฎหมาย่ ผลแบบผลแห้งเมล็ดล่อน เล็ก เรียบ สีน้าตาล ยอด เพื่อประโยชน์ทางการแพทย์และการวิจัยทาง ของต้นเพศเมียที่กาลังออกดอกเรียก กะหลี่กญชาั วิทยาศาสตร์ ซึ่งรัฐบาลได้มีนโยบายสนับสนุนให้ เมื่อตากให้แห้งแล้วนิยมน ามาใช้สูบ(6) ปัจจุบัน ดาเนินการวิจัย จากรายงาน The Global Cannabis สารส าคัญในกญชาถูกพบมากกวั า่ 538 ชนิด และ Report คาดว่ามูลค่าตลาดกัญชาทั่วโลกจะมี ในจานวนนี ้สารกวา่ 100 ชนิด ที่ถูกระบุวาเป็นไฟ่ แนวโน้มเติบโตต่อเนื่อง หรือคิดเป็นมูลค่ากว่า โตแคนนาบินอยด์ (phytocannabinoids) ซึ่งเป็น 103.9 พันล้านดอลลาร์สหรัฐฯ และในปี 2567 จะมี สารกลุ่มหลัก มีโครงสร้างทางเคมีที่คล้ายคลึงกนั ตลาดกญชาเพื่อการแพทย์มีสัดสั ่วนราวร้อยละ 60 และเป็นสารออกฤทธิ์ที่พบในกญชาั (7) โครงสร้าง ของมูลค่าตลาดกัญชาทั้งหมด(1) นอกจากนี้ ทางเคมีของแคนนาบินอยด์ประกอบด้วยส่วนที่ ปัจจุบันเริ่มมีผู้ประกอบการกลุ่มอาหารและ เ ป็ น ไ ข มัน ( lipid) แอลคิลเรซอซินอล เครื่องดื่มหรือผลิตภัณฑ์สุขภาพ สนใจที่จะใช้สาร (alkylresorcinol) เทอร์ปีน (terpene) และโมโนเทอร์ สกดจากกั ญชาเป็นสั ่วนประกอบในผลิตภัณฑ์กลุ่ม ปีน (monoterpene) ซึ่งสารส าคัญของกญชาั 2 ชนิด ดังกล่าว ส่งผลให้คาดวา่ มูลค่าตลาดกญชาโลกจะั ที่ มี ก า ร ก ล่ า ว ถึ ง ค่ อ น ข้ า ง ม า ก คื อ เติบโตและกระจายไปในหลายธุรกิจมากขึ้น Tetrahydrocannabinol (THC) และ Cannabidiol กัญชาเป็นพืชในวงศ์ Cannabaceae มีชื่อ (CBD) วิทยาศาสตร์คือ Cannabis sativa L. Subsp. indica กัญชามีการใช้ประโยชน์ทางแพทย์มา (Lam.)(2) มีชื่อเรียกอื่นว่า กญชาจีนั (ทัวไป)่ , ปาง อยางยาวนาน่ จากฤทธิ์ต่อจิตประสาทที่เกิดขึ้น ใน (เงี้ ยว-แม่ฮ่องสอน), ยานอ (กะเหรี่ ยง - ปัจจุบันมีข้อมูลที่กล่าวถึงการใช้ประโยชน์จาก แม่ฮ่องสอน), คุนเช้า คุณเช้า (จีน), ต้าหมา (จีน กญชาอยั างหลากหลาย่ เช่น รักษามะเร็ง เป็นยากนั กลาง) เป็นต้น(3,4,5) ลักษณะทางพฤกษศาสตร์ของ ชัก ลดการปวด ใช้ในโรคเอดส์ ทั้งหมดเหล่านี้ทา ต้นกญชาั มีดังนี้ กญชาเป็นไม้ล้มลุกปีเดียวั ลาต้น ให้กญชาเป็นกระแสในสังคมไทยเป็นอยั ่างมาก ตั้งตรง สูง 0.9-1.5 เมตร มีขนสีเขียวอมเทาและไม่ สารกลุ่มแคนนาบินอยด์ในกัญชาอาจยังมี คอยแตกสาขา่ ใบเดี่ยว รูปฝ่ามือ เรียงสลับ ขอบใบ ประโยชน์ทางการแพทย์อื่น ๆ เช่น ช่วยให้เจริญ เว้าลึกจนถึงจุดโคนใบเป็น 5-7 แฉก แต่ละแฉกรูป อาหาร เพื่อเพิ่มน้ าหนักในผู้ป่วย HIV/AID ลด ยาวรี กว้าง 0.3-1.5 เซนติเมตร ยาว 6-10 เซนติเมตร ความดันในลูกตาส าหรับโรคต้อหิน, บาบัดผู้ป่วย โคนและปลายสอบ (oblanceolate leaf) ขอบจักฟัน กลุ่มโรคระบบประสาท เช่น การช่วยให้นอนหลับ เลื่อย แผนใบด้านบนสีเขียวเข้มกว่ าด้านล่ ่าง ดอก โรคพาร์กินสัน ความจาเสื่อม

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 44

กญชาั (C. sativa L.) cannabis หรือ marijuana ตัวอย่างนั้นๆ อาจจะไม่ปลอดภัยที่จะใช้ในการ เป็นพืชเสพติดที่มีการอนุญาตให้ใช้ทางการแพทย์ บริโภค เนื่องจากมีแนวโน้มในการก่อโรคที่ หรือเพื่อสันทนาการอยางถูกกฏหมายใน่ บางประเทศ ผิดปกติทางพันธุกรรม หรือโรคมะเร็งได้ การ ปัจจุบันในประเทศไทยได้มีความพยายามจากหลาย ทดสอบเอมส์ เป็นหนึ่งการทดสอบในความ ภาคส่วนในการผลักดันให้มีการใช้ประโยชน์จาก ต้องการของผู้ประกอบการที่จะขึ้นทะเบียน กัญชาอย่างถูกกฎหมาย และได้มีการด าเนินการ ผลิตภัณฑ์สุขภาพจากสมุนไพร รวมถึงส านักงาน ศึกษาวิจัยทดสอบประสิทธิผลและความปลอดภัย คณะกรรมการอาหารและยาที่เป็นหน่วยขึ้น รวมถึงพัฒนาผลิตผลิตภัณฑ์จากกญชาั การนา กญชาั ทะเบียน ที่ต้องใช้ข้อมูลด้านความปลอดภัยนี้ใน มาใช้ประโยชน์จะต้องศึกษาถึงชนิดและสายพันธุ์ การประเมินผลิตภัณฑ์สุขภาพตางๆ่ ดังนั้นผู้วิจัยจึง ของกญชาให้ถูกต้องั รวมถึงสิ่งแวดล้อมและปัจจัย ด าเนินการทดสอบนี้ ตาม test guideline ที่เป็ น ต่างๆ ของสภาวะปลูกซึ่ งจะมีผลต่อการผลิต มาตรฐาน เพื่อยกระดับให้ผลงานมีความน่าเชื่อ สารส าคัญ โดยเฉพาะปริมาณสาร THC ที่มีฤทธิ์ต่อ ทางวิชาการ และผลการทดสอบเป็นที่น่าเชื่อถือทั้ง จิตประสาทและทาให้เสพติด การวิเคราะห์ปริมาณ ในและต่างประเทศ เป็นการลดการกีดกันทาง สารส าคัญที่มีมาตรฐาน การศึกษาฤทธิ์ทางเภสัช การค้าได้ด้วย วัตถุประสงค์การวิจัยนี้ คือ เพื่อ วิทยา การออกแบบผลิตภัณฑ์ ตลอดจนการ ศึกษาการก่อกลายพันธุ์ในเชื้ อ Salmonella ประเมินความปลอดภัยหรือความเป็นพิษต้องมีการ typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537 ดาเนินการอย ่างรอบด้าน นอกจากเพื่อสร้างองค์ และ Escherichia coli WP2 ต่อสารสกัดกัญชาที่ ความรู้ทางวิชาการแล้ว ยังสามารถใช้เป็นข้อมูล สกัดด้วย Supercritical Fluid Extraction ทั้งใน สนับสนุนทางกฎหมายเพื่อควบคุมการใช้กญชาั ใน ระบบที่มีและไม่มีเอนไซม์ S9 โดยอ้างอิงวิธีจาก อนาคตได้ กญชาั เป็นสมุนไพรที่มีศักยภาพสูงใน OECD test guideline 471 เพื่อดูผลต่อการก่อกลาย หลาย ๆ ด้านรวมถึงมีความโดดเด่นในด้านของ พันธุ์ตอ่ DNA ซึ่งตัวแทนเชื้อแบคทีเรียที่ทดสอบมี การเป็นสมุนไพรที่สามารถรักษาโรคได้ แต่ข้อมูล การกลายพันธุ์ทั้งแบบ frameshift mutation และ ด้านความปลอดภัยในการใช้ยังมีอยูน้อยมาก่ การ base-pair substitution mutation เพื่อให้ทราบถึง ทดสอบการก่อกลายพันธุ์โดยใช้แบคทีเรีย โดย แนวโน้มในการเป็นสารก่อกลายพันธุ์ของ อ้างอิงวิธีจากองค์การเพื่อความร่วมมือและการ สมุนไพร พัฒนาทางเศรษฐกิจ หรือ โออีซีดี (OECD) test guideline ที่ 471 หรือเรียกว่าวิธีทดสอบเอมส์ วัสดุ อุปกรณ์ และวิธีด าเนินการวิจัย (Ames test) เป็นการทดสอบในหลอดทดลองเพื่อ สารเคมี หาการก่อกลายพันธุ์ของสารเคมี/สารสมุนไพร/ Oxoid nutrient broth No. 2, LB broth เครื่องมือทางการแพทย์ ฯลฯ โดยจะดูความ (Miller), Agar, Magnesium sulfate heptahydrate, ผิดปกติในระดับ DNA หากตัวอยางสามารถท่ าตัว Citric acid monohydrate, Potassium phosphate, เสมือนสารก่อกลายพันธุ์ (Mutagen) จะชี้ให้เห็นวา่

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 45

dibasic ( anhydrous) , Ammonium Sodium เปตต์ ปริมาตร 1,000 ไมโครลิตร, 100 ไมโครลิตร, phosphate dibasic tetrahydrate, Sodium chloride, 10ไมโครลิตร, ลวดเขี่ยเชื้อ L- Histidine HCl, Biotin, Sodium dihydrogen ขั้นตอนการเตรียมวัตถุดิบ phosphate monohydrate, Disodium hydrogen ตัวอยางสมุนไพรช่ ่อดอกตัวเมียสมุนไพร phosphate, Potassium chloride, Glucose, Crystal กญชาเกั บจาก็ อาเภอสะเมิง จังหวัดเชียงใหม่ โดย violet, Sodium hydroxide, Mitomycin C, L- ร่วมมือกบั สานักงานป้องก นและปราบปรามยาั Tryptophan, Dimethyl sulfoxide เสพติดภาค 5

เชื้อแบคทีเรีย ขั้นตอนการสกัด 1. Salmonella typhimurium (TA98) นาตัวอย างช่ ่อดอกเพศเมียมาสกดด้วยการั 2. Salmonella typhimurium (TA100) สกดด้วยของไหลวิกฤตยิั ่งยวด supercritical fluid 3. Salmonella typhimurium (TA1535) extraction โดยใช้เครื่ องสกัดรุ่น Spe-ed SFE 4. Salmonella typhimurium (TA1537) บริษัท Applied Separations ประเทศสหรัฐอเมริกา 5. Escherichai coli WP2 โดยใช้ แรงดัน 250 bar อุณหภูมิของตู้อบ (oven) 40 องศาเซลเซียส วิเคราะห์ปริมาณ THC และ เครื่องมือและอุปกรณ์ CBD ในสารสกดั ด้วย HPLC โดยประยุกต์ใช้วิธี (8) ตู้อบเพาะเชื้อ, อ่างน้ าแบบควบคุม จาก UNODC ปี 2009 โดยน าสารสกัด 20 mg อุณหภูมิและเขย่า, อ่างน้ าแบบควบคุมอุณหภูมิ ปรับปริมาตรด้วย methanol : chloroform 1:1 ใน แบบน้าวน, เครื่องวัดค่าการดูดกลืนแสง, เครื่อง volumetric flask ขนาด 10 มิลลิลิตร กรองด้วย นับโคโลนีแบบอัตโนมัติ, กล้องจุลทรรศน์แบบอิน nylon syringe filter 0.45 micron ส าหรับการนาไป เวิอร์ทพร้อมระบบถ่ายภาพแสง, เครื่องผสม ฉีด HPLC ส าหรับหลอดทดลอง, เครื่องล้างอัลตร้าโซนิค,

เครื่องชังไฟฟ้า,่ ตู้ชีวนิรภัย, เครื่องนึ่งฆ่าเชื้อโรค, ขั้นตอนการทดสอบคุณสมบัติเชื้อ ขวดรูปชมพู่ ขนาด 50 มิลลิลิตร, กระบอกฉีดยา ความต้องการกรดอะมิโนฮิสทิดีนส าหรับ ขนาด 10 มิลลิลิตร, หลอดทดลองฝาเกลียว, หลอด เ ชื้ อ S. typhimurium TA98, TA100, TA1535, เซนติฟิวก์พลาสติก ขนาด 15 มิลลิลิตร, ขวดปรับ TA1537 ปริมาตร ขนาด 10 มิลลิลิตร, จานอาหารเลี้ยงเชื้อ เ ต รี ย ม Minimal Glucose Agar plate แบบพลาสติก, ช้อนตักสาร, ตะแกรงใส่หลอด (MGA) เคลือบผิววุ้นด้วย L-histidine และ D-biotin ทดลอง, ตัวกรองขนาด 0.45 ไมครอน, ออโต้ปิ ดังนี้ เพลทที่ 1 ไม่เคลือบผิววุ้น เพลทที่ 2 เคลือบ ผิววุ้นด้วย D-biotin เพลทที่ 3 เคลือบผิววุ้นด้วย L- histidine เพลทที่ 4 เคลือบผิววุ้นด้วย L-histidine

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 46

และเคลือบ D-biotin นา single colony ที่เลี้ยงไว้ 1 ผลการทดสอบ R-factor สังเกตเห็นการ คืนไปขีดลงบนวุ้น นาเพลทบ ่มที่ตู้บ่มอุณหภูมิ 37 เจริญเติบโตของแบคทีเรียรอบ ๆ paper disc ที่จุ่ม องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แบคทีเรียที่มี 8 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร ampicillin เพราะมี R-factor การเจริญมากที่สุดคือ เพลทที่ 4 ซึ่ งสามารถ ซึ่งทาให้แบคทีเรียต้านทาน ampicillin ได้ ซึ่งสาย นาไปใช้ในการทดลองเพื่อทดสอบฤทธิ ์ก่อกลาย พันธุ์ TA98 และ TA100 เชื้อจะต้าน Ampicillin พันธุ์ได้ ส่วนสายพันธุ์อื่นจะเกิด clear zone รอบ ๆ disc ความต้องการกรดอะมิโนทริปโตเฟน ampicillin ส าหรับเชื้อ E. coli WP2 การตรวจความผิดปกติ uvr B mutation เตรี ยม Minimal Glucose Agar plate ที่ โดยใช้ mitomycin C ผสม tryptophan นา single colony ที่เลี้ยงไว้ 1 คืน จุ่ม Blank paper disc ใน mitomycin C ที่ ไปขีดลงบนวุ้น น าเพลทบ่มที่ตู้บ่มที่ 37 องศา ความเข้มข้น 0.2 ไมโครกรัม/disc วางลงใน MGA เซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ผลการทดสอบ plate ที่ผสม histidine และ biotin ส าหรับเชื้อ S. แบคทีเรียต้องมีการเจริญบนผิววุ้น ซึ่งสามารถ typhimurium และผสม tryptophan ส าหรับเชื้อ E. นาไปใช้ในการทดลองเพื่อทดสอบฤทธิ ์ก่อกลาย coli ดูผลการทดสอบโดยสังเกตรอบ ๆ paper disc พันธุ์ได้ จะเห็นโซนใส (clear zone) การตรวจ rfa mutation และ R-factor เตรียม Minimal Glucose Agar plate ผสม ขั้นตอนการทดสอบฤทธิ์ก่อกลายพันธ์ในเชื้อุ L-histidine ปริมาตร 100 ไมโครลิตร ส าหรับเชื้อ แบคทีเรียของสารสกัดกัญชา (อ้างอิงวิธีจาก S. typhimurium ส่วนเชื้อ E. coli ใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ OECD TG 471, 1997)[9] MGA ผ ส ม tryptophan แ ล ะ bacterial culture ในการทดสอบฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ใช้วิธี ปริมาตร 300 ไมโครลิตร ลงใน top agar ที่มี plate incorporation method โดยนาสารสก ดั กญชาั ส่วนผสมของ histidine+ biotin ปริมาณ 2,000 ที่ระดับ 5 ความเข้มข้น 1250, 2500, 5000, ไมโครลิตร ส่วน E.coli trypophan ผสมเข้าไป 10000 และ 20000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ผสมกบั จากนั้นเทส่วนผสมลงบน MGA plate จุ่ม blank เชื้อที่ใช้ทดสอบ 0.1 มิลลิลิตร (เชื้อที่ใช้คือ S. paper disc ที่ผ่านการฆ่าเชื้อลงใน crystal violet typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537 แล้วจุ่ม blank paper disc ใน ampicillin วางไว้อีก และ E. coli WP2 บ่มไว้ 8-12 ชัวโมง่ การทดลอง ด้านหนึ่งของเพลท นาเพลทบ มที่ตู้่ Incubator ที่ 37 อยู่ในระบบที่มีและไม่มีเอนไซม์กระตุ้น ทาการ

องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ดูผลการ เติม 0.1M NaPO4-KCl buffer (สาหรับในระบบไม ่ ทดสอบโดยสังเกตรอบ ๆ blank paper disc ที่จุ่ม มีเอนไซม์ S9) และ S-9 mix (ส าหรับในระบบที่มี violet ถ้าเป็นเชื้อที่มี rfa จะเห็นโซนใส (clear เอนไซม์ S9) ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร และสารสกดั zone) คือ ไม่มีแบคทีเรียเจริญอยู ่ โดยวัดขนาดเส้น สมุนไพรทั้ง 5 ความเข้มข้นลงในแต่ละหลอด ผานศูนย์กลางได้ประมาณ่ 12-14 มิลลิเมตร ส่วน จากนั้นเติม top agar และเทลง minimal glucose

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 47

agar plate และบมที่่ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 effect คือบริเวณพื้นหลังของอาหารเลี้ยงเชื้อจะพบ ชั่วโมง ส่วนการทดสอบ E. coli WP2 จะเติม ช่องวาง่ โคโลนีมีลักษณะผิดปกติ (รูปภาพ 1B) ใน tryptophan ลงไปแทน histidine/biotin เมื่อครบ ส่วนของ Normal background lawn จะเห็นว่าพื้น เวลา น าเพลทมาส่องภายใต้กล้องจุลทรรศน์ หลังมีเชื้อเกิดขึ้นเต็มไม่พบช่องวาง่ (รูปภาพ 1A) inverted microscope ว่า เ กิ ด killing effect บ น นาเพลทมานับจ านวน revertant colony background lawn หรือไม่ ลักษณะการเกิด Killing

A B

10X Negative Control 10X Killing effect

ภาพที่ 1. แสดง Background lawn ของเชื้อ S. typhimurium สายพันธุ์ TA100 โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบหัว กลับ ที่กาลังขยาย 10X ภาพ 1A แสดง background lawn ที่ปกติจะเห็นภาพพื้นหลังเต็มไม่มีการตายของเชื้อ ภาพ 1B แสดงการเกิด Killing effect background lawn จะพบลักษณะของช่องวางที่พื่ ้นหลัง แสดงถึงการตาย ของเชื้อ

การวิเคราะห์ผลและแปลผล ผลการวิจัย สารที่ทดสอบมีฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์จะพบ ผลการสกัดกัญชา ความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณสารสมุนไพรที่ สารสกัดช่อดอกตัวเมียของกัญชาด้วย ทดสอบกับจานวน revertant colony เพิ่มขึ้นด้วย supercritical fluid extraction ไ ด้ส า ร ส กัด ที่ มี และพบวามีอย่ างน้อย่ 2 ความเข้มข้นที่ให้จานวน ลักษณะเป็นของกึ่งแข็งกึ่งเหลว (semisolid) สี แบคทีเรียกลายพันธุ์มีจานวนมากกว ่าจานวนที่ เหลืองน้าตาล จากการวิเคราะห์ตัวอยางได้ปริมาณ่ กลายพันธุ์ตามธรรมชาติ (negative control) ใน สารส าคัญ THC คิดเป็นร้อยละ 28.19 และ CBD ขณะเดียวกนต้องมีอยั างน้อยที่ความเข้มข้นจุดหนึ่ง่ คิดเป็นร้อยละ 1.83โดยน้าหนัก สามารถทาให้จ านวนแบคทีเรียกลายพันธุ์สูงเก ิน 2 เท่า ของการกลายพันธุ์ตามธรรมชาติ จึงนับวาสาร่ ผลการทดสอบคุณสมบัติเชื้อ ที่นามาทดส อบนี้เป็นสารก่อกลายพันธุ์ ผลการตรวจคุณสมบัติเชื้อก่อนท าการ ทดสอบเอมส์พบว่า เชื้อ S. typhimurium 4 สาย

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 48

พันธุ์ และ E. coli 1 สายพันธุ์ มีคุณสมบัติครบถ้วน ผิดปกติ uvr B mutation โดยใช้ mitomycin C ทุกการทดสอบคือ ความต้องการกรดอะมิโนฮิส (ตารางที่ 1) ทิดีน/ทริปโตเฟน rfa mutation R-factor และความ

ตารางที่ 1. ตารางแสดงคุณสมบัติที่ทดสอบของ S. typhimurium และ E. coli ทั้ง 5 สายพันธุ์ คุณสมบัติที่ทดสอบของ S. typhimurium/E. coli

สายพันธ์ุ ความต้องการกรดอะมิโนฮิสทีดีน/ทริปโตแฟน rfa mutation R-factor Uvr B mutation Neg His Bi His+bi Tryp

TA98 - ++ - +++ N/A เกิด clear zone ไมเก่ ิด clear zone เกิด clear zone

TA100 - ++ - +++ N/A เกิด clear zone ไมเก่ ิด clear zone เกิด clear zone

TA1535 - ++ - +++ N/A เกิด clear zone เกิด clear zone เกิด clear zone

TA1537 - ++ - +++ N/A เกิด clear zone เกิด clear zone เกิด clear zone

WP2 - N/A N/A N/A +++ เกิด clear zone เกิด clear zone เกิด clear zone

หมายเหตุ: เครื่องหมาย – หมายถึง ไมมีการเจริญของเชื่ ้อ เครื่องหมาย ++ หมายถึง เชื้อมีการเจริญแตไม่ เท่ ่ากบั +++ เครื่องหมาย +++ หมายถึง เชื้อมีการเจริญมากที่สุด N/A หมายถึง ไมได้ท่ าการทดสอบ

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 49

ผลการทดสอบฤทธิ์ก่อกลายพันธ์ในเชื้อแบคทีเรียุ WP2 ที่ขนาดทดสอบ 5 ระดับ (1250, 2500, ของสารสกัดกัญชาที่สกัดด้วย supercritical fluid 5000, 10000 และ 20000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ใน extraction ในระบบไม่มีเอนไซม์ S9 (Without S9 ระบบที่ไม่มีเอนไซม์ S9 ผลการทดลองพบวาทุก่ enzyme) สายพันธุ์และทุกขนาดทดสอบไม่ก่อให้เกิดการก่อ การศึกษาฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ของสารสกดั กลายพันธุ์ โดยดูจากจานวนโคโลนีกลายพันธุ์ กญชาที่สกั ดด้วยั supercritical fluid extraction ซึ่ง ไม่ได้เป็น 2 เท่าเมื่อเทียบกบั negative control และ ใช้เชื้อแบคทีเรีย 5 สายพันธุ์ (S. typhimurium ไม่พบความผิดปกติของ background lawn ในทุก TA98, TA1535 TA100, TA1537) และ E. coli สายพันธุ์และทุกความเข้มข้น (ตารางที่ 2)

ตารางที่ 2. แสดงจานวนโคโลนีกลายพันธุ์ (Revertant colony) ของสารสกดั กญชาตั อเชื่ ้อแบคทีเรีย 5 สายพันธุ์ ในระบบไมมีเอนไซม์่ S9 (Without S9 enzyme) ความ โคโลนีกลายพันธ์ุ (mean±S.D.) สารสกัด เข้มข้น TA98 BL TA100 BL TA1535 BL TA1537 BL WP2 BL (µg/ml) Negative 20.00±4.00 N 179.33±21.08 N 14.67±3.79 N 3.33±0.58 N 53.00±17.52 N สารสกดั 20000 24.67±2.31 N 132.67±6.81 N 14.33±8.08 N 3.67±2.52 N 44.67±6.66 N กญชาั 10000 22.33±1.53 N 132.00±18.68 N 13.67±3.21 N 4.67±2.52 N 40.00±5.19 N (CST) 5000 21.00±2.65 N 161.33±17.89 N 9.00±3.00 N 4.00±2.65 N 48.67±8.33 N (- S9) 2500 17.00±2.65 N 141.33±22.72 N 11.67±3.51 N 5.00±1.00 N 43.00±16.37 N 1250 19.33±4.04 N 170.00±6.25 N 11.33±3.51 N 4.00±1.00 N 38.00±14.11 N หมายเหตุ: BL หมายถึง Background Lawn N หมายถึง Normal จ านวนโคโลนีกลายพันธ์ในเชื้อแบคทีเรียในระบบไม่มีเอนไซม์ุ S9

200 180

) 160 140 Negative ug/ml

( 120 20000 100 80 10000 60 5000

ความเข้มข้น 40 20 2500 0 1250 TA98 TA100 TA1535 TA1537 WP2 สายพันธุ์

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 50

ผลการทดสอบฤทธิ์ก่อกลายพันธ์ในเชื้อแบคทีเรียุ WP2 ที่ขนาดทดสอบ 5 ระดับ (1250, 2500, ของสารสกัดกัญชาที่สกัดด้วย supercritical fluid 5000, 10000 และ 20000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ใน extraction ในระบบมีเอนไซม์กระต้นุ (With S9 ระบบที่มีเอนไซม์S9 ผลการทดลองพบวาทุกสาย่ enzyme) พันธุ์และทุกขนาดทดสอบไม่ก่อให้เกิดการก่อ การศึกษาฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ของสารสกดั กลายพันธุ์ โดยดูจากจานวนโคโลนีกลายพันธุ์ กญชาที่สกั ดด้วยั supercritical fluid extraction ซึ่ง ไม่ได้เป็น 2 เท่าเมื่อเทียบกบั negative control และ ใช้เชื้อแบคทีเรีย 5 สายพันธุ์ (S. typhimurium ไม่พบความผิดปกติของ background lawn ในทุก TA98, TA1535 TA100, TA1537) และ E. coli สายพันธุ์และทุกความเข้มข้น (ตารางที่ 3)

ตารางที่ 3. แสดงจานวนโคโลนีกลายพันธุ์ (Revertant colony) ของสารสกดกั ญชาตั อเชื่ ้อแบคทีเรีย 5 สายพันธุ์ ในระบบมีเอนไซม์ S9 (With S9 enzyme) ความ โคโลนีกลายพันธ์ุ (mean±S.D.) สารสกัด เข้มข้น TA98 BL TA100 BL TA1535 BL TA1537 BL WP2 BL (µg/ml) Negative 20.33±3.21 N 177.00±27.87 N 16.00±4.36 N 7.33±5.13 N 52.67±4.04 N สารสกดั 20,000 26.00±10.82 N 169.67±20.82 N 14.00±2.00 N 3.33±1.53 N 58.67±17.21 N กญชาั 10,000 23.00±5.00 N 147.67±22.19 N 16.00±6.08 N 3.33±0.58 N 44.67±2.89 N (CST) 5,000 23.00±5.19 N 181.67±43.09 N 12.33±6.43 N 5.33±2.08 N 64.00±13.53 N (+S9) 2,500 17.33±8.39 N 155.33±39.58 N 9.00±0.00 N 5.67±1.53 N 45.00±14.73 N

1,250 25.00±10.39 N 198.66±11.06 N 11.00±3.61 N 5.33±0.58 N 54.33±8.08 N หมายเหตุ: BL หมายถึง Background Lawn N หมายถึง Normal จ านวนโคโลนีกลายพันธ์ในเชื้อแบคทีเรียในระบบมีเอนไซม์ุ S9

250

200 ) Negative ug/ml

( 150 20000

100 10000 5000 ความเข้มข้น 50 2500 1250 0 TA98 TA100 TA1535 TA1537 WP2 สายพันธุ์

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 51

สรุปและวิจารณ์ผลการวิจัย ต่อร่างกาย ในปัจจุบันข้อมูลการทดสอบการก่อ การทดสอบฤทธิ์ ก่อกลายพันธุ์แบบ กลายพันธุ์เป็นหนึ่งในข้อมูลที่ถูกใช้เป็นเกณฑ์ใน ย้อนกลับโดยใช้แบคทีเรียหรือเรียกวาวิธีทดสอบ่ การประเมินความปลอดภัยของสารเคมี ยา เอมส์ (Ames test) ซึ่งอ้างอิงวิธีจาก OECD test เครื่องมือแพทย์ และอาหารทั่วโลก โดยมี guideline 471 เป็นการทดสอบขั้นแรก เพื่อให้ได้ หน่วยงานหลักในการใช้ข้อมูลเพื่อประเมินอยู่ 2 ข้อมูลพื้นฐานขั้นต้น ก่อนจะทาการศึกษาในวิธีเชิง หน่วยงานใหญ ่ ๆ ได้แก่ Environmental Protection ลึก เช่น ในสัตว์ทดลอง ทาให้ได้ข้อสรุปที่แน ่นอน Agency ( EPA) แ ล ะ Food and Drug ในด้านความปลอดภัยของสารที่น าไปทดสอบ Administration (FDA) รวมถึงเกณฑ์การขึ้ น ต่อไป ซึ่งการทดสอบฤทธิ์ ก่อกลายพันธุ์ในเชื้อ ทะเบียนผลิตภัณฑ์จากสมุนไพรบางประเภทของ แบคทีเรียโดยวิธีเอมส์ เป็นการทดสอบสารเคมี/ ส านักงานคณะกรรมการอาหารและยา และกรม สารสมุนไพร/ผลิตภัณฑ์สุขภาพ เพื่อหาการ พัฒนาการแพทย์แผนไทยก็ใช้ผลด้านความ เปลี่ยนแปลงโครงสร้างพันธุกรรมในเชื้อแบคทีเรีย ปลอดภัยเบื้องต้นในการประเมินการขึ้นทะเบียน ซึ่งสารเคมีที่ส่งผลให้เกิดการกลายพันธุ์ต่อเซลล์ เช่นเดียวกนั จากผลการทดลองในการวิจัยครั้งนี้ ร่างกายเมื่อมีการบริโภคสิ่งเหนี่ยวนาให้เก ิดการก่อ พบว่าสารสกัดกัญชาที่สกัดด้วย Supercritical กลายพันธุ์นั้น ๆ อาจทาให้เซลล์ถูกพัฒนาไปเป็น Fluid Extraction ทุกสายพันธุ์ (S. typhimurium สาย เซลล์มะเร็งหรือก่อให้เกิดโรคความผิดปกติทาง พันธุ์ TA98, TA100 TA1537, TA1535 และ E. coli พันธุกรรมได้ และการใช้ S9 enzyme เนื่องจาก WP2) ทุกขนาดทดสอบไม่ก่อให้เกิดการก่อกลาย แบคทีเรียไม่มีระบบเอนไซม์กระตุ้นสารพิษเช่น พันธุ์ ทั้งในระบบที่มีและไมมีเอนไซม์กระตุ้น่ โดย ระบบมิกซ์ฟังชันออกซิเดส่ ซึ่งมีในไมโครโซมใน ดูจากจานวนโคโลนีกลายพันธุ์ไม ได้เป็น่ 2 เทาเมื่อ่ เซลล์เนื้อเยื่อสัตว์ชั้นสูง ดังนั้นในการทดสอบ เทียบกบั negative control ความเข้มข้นที่ใช้ในการ เอมส์ที่คาดวาสารก่ ่อกลายพันธุ์เป็นชนิดที่ต้องการ ทดสอบผู้วิจัยเริ่ มที่ ขนาดทดส อบ 20000 เอนไซม์กระตุ้นก่อนจะแสดงความเป็นพิษ ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ซึ่งในการทดสอบจะต้องทา (indirect mutagen) จึงต้องมีการเติมเอนไซม์กลุ่มนี้ การส่องดู background lawn ภายใต้กล้อง inverted ในขั้นตอนที่ทดสอบฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ เป็นการ microscope เนื่องจากลักษณะของ background จาลองรูปแบบเมื่อมีสารแปลกปลอมที่เป็นพิษเข้า lawn เป็นเกณฑ์หนึ่งของ guideline ที่ใช้ในการ สู่ร่างกาย จะถูกเปลี่ยนแปลงโดยระบบเมทาบอลิ ตัดสินใจว่าสารตัวอย่างมีการยับยั้งการเจริญของ ซึมของร่างกาย ซึ่งการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นอาจ เชื้อที่ใช้ทดสอบหรือไม่ ถ้าพบว่าสารทดสอบ ช่วยสลายความเป็นพิษ หรือกระตุ้นความเป็นพิษ สามารถยับยั้ง นั่นคือการเกิด killing effect ที่

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 52

background lawn จะต้องลดความเข้มข้นลง ผล ทั้งในระบบที่มีและไม่มีเอนไซม์กระตุ้น แต่ การทดลองจึงจะอยูในเกณฑ์ที่ย่ อมรับได้ ซึ่งพบวา่ เนื่องจากยังไม่มีข้อมูลการศึกษาถึงผลของอันตร สารสกัดกัญชาในการทดสอบนี้ ไม่เกิด Killing กิริยาระหว่างสมุนไพรกญชาั และยาแผนปัจจุบัน effect background Lawn ในทุกสายพันธุ์และทุก อาจต้องระมัดระวังในการใช้สมุนไพรชนิดนี้ ซึ่ง ขนาดทดสอบทั้งใน 2 ระบบ ซึ่งมีรายงานการวิจัย ผลการทดลองนี้สามารถนาผลไปอ้างอิงและใช้ใน ของ Tennille และคณะ (2018) (10) ได้ทดสอบ การวิจัยเชิงลึก เช่น การศึกษาพิษเรื้ อรังใน ประเมินความปลอดภัยของสารสกดกั ญชาั ที่มีสาร สัตว์ทดลอง การศึกษากลไกต่างๆ ในสัตว์ทดลอง CBD ประมาณ 96% และ THC น้อยกวา่ 1% สกดั ตอไปได้่ ด้วย Supercritical Fluid Extraction โดยใช้วิธี กิตติกรรมประกาศ bacterial Reverse Mutation ตาม OECD Guideline งานวิจัยนี้ ได้รับการสนับสนุนเงินจาก No.471 ที่ขนาดทดสอบ 5000, 1600, 500, 160, 50, งบประมาณกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ 16, 5 ไมโครกรัม/เพลท ผลการทดลองพบว่าทุก ขอขอบพระคุณ นักวิจัยจากสถาบันวิจัยสมุนไพร สายพันธุ์และทุกขนาดทดสอบไม่ก่อให้เกิดการก่อ และส านักงานป้องกนและปราบปรามยาเสพติดภาคั กลายพันธุ์ ทั้งในระบบที่มีและไม่มีเอนไซม์ และ 5 ในการเก็บตัวอยางสมุนไพรก่ ญชาั ศูนย์ตรวจสอบ (11) รายงานการวิจัยของ Margitta และคณะ (2020) และรับรองคุณภาพสมุนไพรในการควบคุมคุณภาพ ซึ่งดาเนินการเหมือนก นกั บของั Tennille และผล ทางเคมีและแยกปริมาณสารส าคัญ THC CBD ของ การทดลองก็สอดคล้องกนั ซึ่งเมื่อเปรียบเทียบกบั ตัวอยางก่ ญชาั และเจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการพิษวิทยา ผลการทดลองของผู้วิจัยและคณะ พบวา่ สารสกดั ทุกท่านที่ให้ความช่วยเหลือในการทางานวิจัยเป็น กญชาั ที่มีปริมาณ THC คิดเป็นร้อยละ 28.19 และ อยางดี่ CBD คิดเป็นร้อยละ 1.83 โดยน้าหนัก ซึ่งเป็นสาย

พันธุ์ที่แตกต่างจากของต่างประเทศ เพราะสาย เอกสารอ้างอิง พันธุ์ต่างประเทศจะมีปริมาณสารส าคัญ CBD สูง 1. “กัญชา” จะกลายเป็นพืชเศรษฐกิจไทยได้หรือไม่. แต่พบว่าผลการทดลองให้ผลที่เหมือนกนนัั ่นคือ [ออนไลน์]. เข้าถึงได้จาก : ทุกสายพันธุ์ทุกขนาดทดสอบไม่ก่อให้เกิดการก่อ https://kasikornresearch. com/ th/ analysis/ k- social- กลายพันธุ์ที่ขนาดทดสอบ ทั้งในระบบที่มีและไม่ media/Pages/FB-Cannabis-14-01-20.aspx. [14 มกราคม 2563]. มีเอนไซม์ S9 ผลการทดลองแสดงให้เห็นวา่ สาร 2. Small E, Cronquist A. A practical and natural สกดั กญชาั ที่สกดด้วยั supercritical fluid extraction taxonomy for Cannabis. Taxon. 1976;25: 405–435. ไม่ส่งผลให้เกิดการก่อกลายพันธุ์ในขนาดทดสอบ

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 53

3. หนังสือพจนานุกรมสมุนไพรไทย, ฉบับพิมพ์ครั้งที่ and Analysis of Cannabis and Cannabis Products. New 5. (ดร.วิทย์ เที่ยงบูรณธรรม). “กัญชา”. 56-7. York: 2009: 41-43. 4. ข้อมูลพรรณไม้, ส านักงานโครงการอนุรักษ์ 9. OECD GUIDELINE FOR TESTING OF พันธุกรรมพืชอันเนื่องมาจากพระราชดาริ สมเด็จพระเทพ CHEMICALS. Bacterial Reverse Mutation Test. รัตนราชสุดาฯ สยามบรมราช [Internet]. 1997. [cited 2020 May 28]; [1-11 pages]. กุมารี . “กัญชา”. [ออนไลน์]. เข้าถึงได้จาก : Available from: https://www. oecd- www.rspg.or.th/plants_data/. [19 มิ.ย. 2015]. ilibrary.org/environment/test-no-471-bacterial-reverse- 5. ราชบัณฑิตยสถาน. หนังสืออนุกรมวิธานพืช อักษร ก. mutation-test_9789264071247-en: 1-11. พิมพ์ครั้งที่ 2. กรุงเทพฯ: หจก. อรุณการพิมพ์; 2547. 10. Tennille KM, Robin R, Amy EC, et al. An 6. Anderson LC. Leaf variation among Cannabis species Assessment of the Genotoxicity and Subchronic Toxicity from a controlled garden. Harv Univ Botanical Musem of a Supercritical Fluid Extract of the Aerial Parts of Leaflets 1980;28:61–9. Hemp. J Toxicol. 2018; 26 pages. 7. Hanus LO, Meyer SM, Munoz E, Taglialatela-Scafati 11. Margitta D, Robert C, Alexander MC, et al. Safety O, Appendino G. Phytocannabinoids: a unified critical Assessment of a Hemp Extract using Genotoxicity and inventory. Nat Prod Rep. 2016;33(12):1357-92. Oral Repeat-Dose Toxicity Studies in Sprague-Dawley 8. United Nations Office on Drugs and Crime Rats. Toxicology Reports 2020; Volume 7: Pages 376-85. (UNODC). Recommended Methods for the Identification

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 54

ปริมาณโลหะหนักและซาซิท็อกซินในหอยสองฝาที่จ าหน่ายในประเทศไทย เมธาวี แพทย์กูล1 ปรัญรัชต์ ธนวิยุทธภัคดี2 วีรยา การพานิช2* 1 หลักสูตรวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาพิษวิทยาและโภชนาการเพื่ออาหารปลอดภัย สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล 2 สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล

บทคัดย่อ

หอยสองฝาเป็นสัตว์น้ าที่นิยมน ามาบริโภคเป็นอาหาร อย่างไรก็ตามปัญหามลพิษปนเปื้ อนใน สิ่งแวดล้อมโดยเฉพาะบริเวณชายฝั่งทะเล อาจทาให้มีการสะสมสารพิษในหอยสองฝาปริมาณสูงได้ การศึกษา นี้มีวัตถุประสงค์เพื่อวิเคราะห์ปริมาณตะกวและแคดเมียม่ั และซาซิท็อกซิน ในหอยสองฝาที่คนไทยนิยม บริโภค ได้แก่ หอยลาย หอยแมลงภู่ และหอยแครง ที่จาหน ่ายในตลาดขายส่งอาหารทะเลใน ประเทศไทย ผล การศึกษาพบปริมาณเฉลี่ยตะกวในหอยทั่ั ้ง 3 ชนิด เทาก่ บั 0.07 และ 0.45 มิลลิกรัม/กิโลกรัม น้าหนักเปียก และ น้าหนักแห้ง ตามลาดับ พบปริมาณแคดเมียมเฉลี่ย เทาก่ บั 0.16 และ 1.08 มิลลิกรัม/กิโลกรัม น้าหนักเปียก และ น้าหนักแห้งตามล าดับ ปริมาณซาซิท็อกซินที่พบในตัวอย่างหอยสองฝาเฉลี่ย เท่ากบั 2.36 ไมโครกรัม/ กิโลกรัม น้ าหนักเปียก โดยหอยแครงมีปริมาณตะก่วั แคดเมียม และซาซิท็อกซินสูงกว่าหอยลาย และ หอยแมลงภู่ อยางมีนัยส่ าคัญทางสถิติ จากผลการศึกษาพบวา่ ตัวอยางหอยสองฝาทุกตัวอย่ างที่ซื่ ้อจากตลาด ขายส่งอาหารทะเลแหล่งใหญ่ของประเทศไทย มีปริมาณตะกว่ั แคดเมียม และซาซิท็อกซินไม่เกินปริมาณ สูงสุดที่กาหนดโดยส านักงานคณะกรรมการอาหารและยา หรือ องค์กรระหวางประเทศ่ ผลที่ได้จากการศึกษา นี้ อาจใช้เป็นข้อมูลให้หน่วยงานที่เกี่ยวข้องใช้จัดทาแผนเฝ้าระวังความปลอดภัยของอาหาร และประกอบการ พิจารณากาหนดมาตรฐานสารปนเปื ้อนในอาหารต่อไป

คาส าคัญ: ตะกว่ั แคดเมียม ซาซิท็อกซิน หอยสองฝา

*ผ้รับผิดชอบบทความู วีรยา การพานิช สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล ต.ศาลายา อ.พุทธมณฑล จ.นครปฐม 73170 โทรศัพท์ 0-2800-2380 ตอ่ 311 โทรสาร 0-2441-9344 Email: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 55

Heavy Metals and Saxitoxin Contents in Bivalve Mollusk Sold in Thailand Mathavee Phatkul1 Pharrunrat Tanaviyutpakdee2 Weeraya Karnpanit2* 1Master of Science Program in Toxicology and Nutrition for Food Safety, Institute of Nutrition, Mahidol University 2Institute of Nutrition, Mahidol University

Abstract

Bivalves are popular aquatic animals for human consumption. However, the environmental pollution problems, especially in the coastal areas can lead to high accumulation of toxins in bivalves. The present study aimed to determine lead (Pb) and cadmium (Cd), and saxitoxin in commonly consumed bivalves namely clam, mussel and cockle sold in large seafood markets in Thailand. The results showed that the average contents of Pb in three types of bivalve samples were 0.07 and 0.45 mg/kg wet weight and dry weight, respectively. The average levels of cadmium in the bivalve samples were 0.16 and 1.08 mg/kg wet weight and dry weight, respectively. The average saxitoxin level in the bivalve samples was 2.36 mg/kg (wet weight). It was found that the average levels of Pb, Cd and saxitoxin in cockles were significantly higher than those of clam and mussel. It is noteworthy that all of the bivalve samples purchased from large seafood markets of Thailand contained Pb, Cd and saxitoxin complying with the national or international standards. The outcomes from this study may be used as a supporting information for development of food safety surveillance plans and establishment of the standard on contaminants in foods.

Keywords: Lead, Cadmium, Saxitoxin, Bivalve

*Corresponding author Weeraya Karnpanit Institute of Nutrition, Mahidol University, Salaya, Phutthamonthon, Nakhon Pathom 73170 Tel. 0-2800-2380 Ext. 311 Fax. 0-2441-9344 Email: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 56

บทน า ตะกว่ั (Lead; Pb) ถูกนา ไปใช้ในผลิตภัณฑ์ หอยสองฝาเป็นอาหารทะเลที่เป็นที่นิยม หลายชนิด เช่นแบตเตอรี่, เม็ดสีโลหะ, เป็ น ของประชากรไทย หอยสองฝาที่คนไทยนิยม ส่วนผสมในสารป้องกนกั าจัดศัตรูพืช เป็นต้น เมื่อ บริโภค 3 อันดับแรก คือ หอยแครง (Tegillarca มนุษย์ได้รับตะกวจากการบริโภค่ั หลังจากดูดซึม granosa), หอยแมลงภู่ (Perma viridis) และหอย และกระจายในระบบเลือด ตะกวจะถูกกระจายไป่ั ลาย (Paphia undulata)1 จากข้อมูลสถานการณ์การ ยังเนื้อเยื่ออ่อนทัวร่ ่างกาย โดยครึ่งชีวิตของตะกว่ั ส่งออกของสินค้าประเภทหอยและผลิตภัณฑ์จาก ในเลือดและเนื้อเยื่ออ่อนอื่นๆ ประมาณ 28-36 วัน หอยของประเทศไทยในปี 2560 มีปริมาณ 5200 ตะกว่ั สามารถถูกสะสมในกระดูกและมีคาครึ่งชีวิต่ ตัน มูลค่าประมาณ 400 ล้านบาท ซึ่งมีแนวโน้ม ที่ยาวนานขึ้น5 การเกิดพิษเฉียบพลันจากสารตะกว่ั เพิ่มขึ้นร้อยละ 14 โดยหอยที่มีการส่งออกมากที่สุด ในเด็ก ท าให้เกิดอาการเบื่ออาหาร อาเจียน คือ หอยแครง นอกจากนี้การนาเข้าสินค้าประเภท อ่อนเพลีย และเกิดการชัก ส่วนการเกิดพิษ หอย และผลิตภัณฑ์จากหอย มีปริมาณสูงถึง 15700 เฉียบพลันในผู้ใหญ่ ส่งผลต่อระบบทางเดินอาหาร ตัน คิดเป็นมูลคา่ ประมาณ 1700 ล้านบาท โดยหอย มีอาการปวดแขนขา และมีอาการความดันโลหิต ที่นาเข้ามากที่สุด คือ หอยแมลงภู่ และหอยแครง2 สูง และถ้าได้รับสัมผัสในปริมาณที่สูงมากจะทา การเพิ่มขึ้นของกิจกรรมมนุษย์ และอุตสาหกรรม ให้เกิดอาการสั่น ความจาเสื่อม เกิดอาการมึนงง ไต ต่างๆ ที่ดาเนินการโดย ไม่มีการควบคุมมลพิษที่ วาย และเกิดอาการโคม่าได้6 ตะกวส่ั ่งผลกระทบ เหมาะสมอาจท าให้เกิดปัญหาโลหะหนักที่ เรื้อรังต่อสุขภาพของมนุษย์ ได้แก่ ระบบประสาท ก่อให้เกิดมลพิษปนเปื้ อนในสิ่ งแวดล้อม หัวใจและหลอดเลือด ไต ระบบทางเดินอาหาร โดยเฉพาะในแหล่งน้าต ่างๆ ได้แก่ แม่น้า ทะเล ระบบเลือด และระบบสืบพันธุ์7 ประชากรกลุ่ม และมหาสมุทร ดังนั้นอาจเกิดการสะสมของโลหะ เสี่ยง คือ ทารกและเด็ก โดยทารกสามารถรับสาร หนักในเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิตที่อาศัยอยู่บริเวณ ตะกวจากมารดาโดยผ่ั านทางสายสะดือและได้รับ่ ชายฝั่งทะเลได้3,4 มีการศึกษาก่อนหน้าพบโลหะ จากน้านมแม ่ที่มีสารตะกว่ั การเกิดพิษของตะกว่ั หนักปริมาณสูงในหอยสองฝา เนื่องจากลักษณะ ในเด็กส่วนมากท าให้สมองพิการและมีผลต่อ การกินอาหารแบบกรองน้าทะเลเข้าสู ่ตัวหอย ทา ระดับสติปัญญา และส่งผลกระทบต่อพัฒนาการ ให้โลหะหนักมีความเข้มข้นและถูกสะสมใน และการเรียนรู้5,6 ปริมาณที่สูงกวาเมื่อเปรียบเทียบก่ บสภาพแวดล้อมั ปั จจุบัน The Joint FAO/WHO Expert 3,4 ตะกวและแคดเมียมเป็นโลหะหนักที่่ั มีความเป็น Committee on Food Additives (JECFA) ได้ยกเลิก พิษ แล ะ ถูกน ามาใช้อย่างแพร่ หล าย ใ น ค่าปริมาณที่แนะน าให้ได้รับต่อวันแล้วไม่เกิด อุตสาหกรรมหลากหลายประเภท ทาให้เก ิดการ อันตรายต่อสุขภาพตลอดช่วงชีวิต (health based ปนเปื้ อนในสิ่งแวดล้อมและเข้าสู่ห่วงโซ่อาหาร guidance value; HBGV) ของตะกว่ั ซึ่งถูกกาหนด ของมนุษย์ได้ โดยเฉพาะอาหารกลุ่มเสี่ยง เช่น เป็นคา่ provisional tolerable weekly intake (PTWI) อาหารทะเล รวมถึงหอยสองฝา ที่ 25 ไมโครกรัม/กิโลกรัมน้ าหนักตัว/สัปดาห์8

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 57

เนื่องจากจากการวิเคราะห์อภิมาน (meta-analysis) ประกอบอาชีพ และการได้รับสัมผัสทางอาหาร จากการศึกษาทางระบาดวิทยาพบว่าปริมาณการ และน้า ซึ่งเป็นแหล่งส าคัญส าหรับผู้ที่ไม่สูบบุหรี่ ได้รับตะกว่ั จากการบริโภคแบบระยะยาวที่ระดับ การได้รับสัมผัสแคดเมียมก่อให้เกิดผลกระทบทั้ง 0.6 ไมโครกรัม/กิโลกรัมน้าหนักตัว/วัน ในเด็ก ทา แบบเฉียบพลันและเรื้อรังในมนุษย์10 พิษเฉียบพลัน ให้ไอคิวลดลง 1 คะแนน และจากการศึกษาทาง ของแคดเมียม คือ อาเจียนและอุจจาระร่วง ซึ่งอาจ ระบาดวิทยาใน 4 การศึกษา สรุปได้ว่าการได้รับ เป็นสาเหตุของการเสียชีวิตจากการสูญเสียน้า การ ตะกวจากการบริโภค่ั อาหารและน้าดื่มที่ปริมาณ บวมน้า และอาจทาให้อวัยวะล้มเหลว การเกิดพิษ 1.3 ไมโครกรัม/กิโลกรัมน้าหนักตัว/วัน ในผู้ใหญ่ เรื้อรังของแคดเมียมทาให้เก ิดโรคอิไต-อิไต (itai- ท าให้ความดันโลหิตค่าบน (systolic blood itai disease) โดยทาให้เก ิดอาการปวดกระดูกอยาง่ pressure) เพิ่มขึ้น 1 มิลลิเมตรปรอท ดังนั้นหาก รุนแรงโดยเฉพาะ ที่กระดูกสันหลังและข้อ ได้รับตะก่ัวที่ระดับ 25 ไมโครกรัม/กิโลกรัม นอกจากนี้ความเป็นพิษแบบเรื้อรังของแคดเมียม น้าหนักตัว/สัปดาห์ (ค่า PTWI ที่ยกเลิก) จะทาให้ ยังมีผลต่อระบบไตซึ่งเป็นอวัยวะเป้าหมายหลัก เด็กมีไอคิวลดลง 3 คะแนน และผู้ใหญ่มีความดัน แคดเมียมจะสะสมในท่อไตส่วนต้น ทาให้เก ิด โลหิตค่าบนเพิ่มขึ้น 3 มิลลิเมตรปรอท8 ในปี ค.ศ. ความเสียหายของเซลล์ท่อไตและเป็นสาเหตุของ 2010 European Food Safety Authority (EFSA) ได้ ความผิดปกติของการทางานของไต 11, 12 JECFA พิจารณาใช้ค่ า benchmark dose lower limit ก าหนดค่า Provisional Tolerable Monthly Intake (BMDL) ส าหรับการแสดงลักษณะความเสี่ยงการ (PTMI) ของแคดเมียมที่ 25 ไมโครกรัม/กิโลกรัม 13 ได้รับสัมผัสตะกว่ั สาหรับผู้ใหญ ่กาหนด BMDL01 น้าหนักตัว/เดือน ที่ 1.50 ไมโครกรัม/กิโลกรัมน้าหนักตัว/วัน โดยค่า ใ น ก า ร ก า ห น ด ค่ าปริมาณสูงสุด นี้จะสัมพันธ์กบการั เพิ่มขึ้นของความดันโลหิตค่า ( maximum level; ML) ของโลหะหนัก

บน และค่า BMDL10 ที่ 0.63 ไมโครกรัม/กิโลกรัม คณะกรรมาธิการมาตรฐานอาหารระหวางประเทศ่ น้าหนักตัว/วัน ซึ่งสัมพันธ์กบการเกั ิดโรคไตเรื้อรัง ( Codex Alimentarius Commission; CAC) ไ ด้

ส าหรับเด็ก มีการก าหนดค่า BMDL01 ที่ 0.50 กาหนดค า่ ML สาหรับแคดเมียมในหอยสองฝาที่ 2 ไมโครกรัม/กิโลกรัมน้าหนักตัว/วัน โดยสัมพันธ์ มิลลิกรัม/กิโลกรัม 14 และตามประกาศกระทรวง กับการเกิดผลกระทบต่อระบบประสาทและ สาธาณสุข (ฉบับที่ 414) พ.ศ. 2563 เรื่อง มาตรฐาน พัฒนาการ9 อาหารที่มีสารปนเปื้ อน ก าหนดปริมาณสูงสุด แคดเมียม (Cadmium; Cd) เป็นผลพลอย (maximum level; ML) ของแคดเมียมในหอยสอง ได้จากการทาเหมืองแร ่สังกะสี แคดเมียมถูกใช้ ฝา (เฉพาะส่วนที่กินได้) ที่ 2 มิลลิกรัม/กิโลกรัม อยางแพร่ ่หลายในการชุบโลหะ การผลิตแบตเตอรี่ เช่นเดียวกนั แต่ไม่ได้มีการกาหนดค ่า ML ส าหรับ นิกเกิล – แคดเมียม แคดเมียมที่ปนเปื้ อนใน ตะก่ัวในหอยสองฝา แต่ก าหนดในอาหารอื่น ธรรมชาติอาจเข้าสู่ร่างกายมนุษย์ได้หลายทางที่ นอกจากรายการที่ระบุที่ 1 มิลลิกรัม/กิโลกรัม15 ส าคัญคือทางการหายใจผานการสูบบุหรี่่ หรือการ

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 58

สารพิษจากหอยเป็ นสารประกอบที่ ขากรรไกร และกล้ามเนื้อใบหน้า อัมพาตเฉพาะที่ เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ ส่งผลกระทบต่างๆ เช่น การพูดและกลืนล าบาก อาการเกี่ยวกับหัวใจ อาหารเป็นพิษ และผลต่อระบบประสาทซึ่งทาให้ หลอดเลือด และระบบทางเดินหายใจ ได้แก่ หัว สารพิษจากหอยที่มีต่อสุขภาพของมนุษย์ได้รับ ใจเต้นเร็ว ความดันโลหิตสูงหรือ ความดันโลหิต ความสนใจเพิ่มขึ้น สารพิษจากหอยที่ผลิตโดย ต่า เจ็บหน้าอก หายใจล าบาก และเสียชีวิตจาก สาหร่ายและจุลินทรีย์สามารถเข้าสู่ร่างกายมนุษย์ อัมพาตของทางเดินหายใจ16,17 ปริมาณที่ท าให้ ผาน่ ทางห่วงโซ่อาหารและการสะสมทางชีวภาพ เสียชีวิตโดยประมาณในมนุษย์ (lethal dose) คือ (bioaccumulation) ในหอยสองฝา16 ตามอาการของ 0.3-1 มิลลิกรัม EFSA กาหนดปริมาณที่ท าให้เก ิด การเกิดพิษจากสารพิษในหอยถูกจัดเป็นหลายกลุ่ม พิษเฉียบพลัน (acute reference dose; ARfD) ของ คือ พิษอัมพาต (paralytic shellfish poisoning; PSP) ซาซิท็อกซินที่ 0.5 ไมโครกรัม STX equivalents/ พิษท้องร่วง (diarrhetic shellfish poisoning; DSP) กิโลกรัมน้ าหนักตัว 17 ปั จจุบันส านักงาน พิษที่ท าให้ความจ าเสื่ อม (amnesic shellfish คณะกรรมการอาหารและยา ประเทศไทยยังไม่มี poisoning; ASP) และพิษต่อระบบประสาท กฎหมายกาหนดค า่ ML ของซาซิท็อกซินในอาหาร (neurotoxic shellfish poisoning; NSP) โดย PSP แต่มีการกาหนดในประกาศของกรมประมง 18ซึ่ง เป็นสารที่มีความเป็นพิษสูง ซึ่งสามารถยับยั้งการ สอดคล้องกบคั ่ามาตรฐานของสหภาพยุโรป มีการ ส่งผ่านโซเดียมไอออนในระบบประสาทและ กาหนดค ่า ML ของซาซิท็อกซินในหอย (เฉพาะ กล้ามเนื้อ ทาให้เส้นประสาทรับความรู้สึกและ ส่วนที่กินได้) ที่ 800 ไมโครกรัม/กิโลกรัม19,20 แขนขาเป็นอัมพาต หายใจล าบาก อาจท าให้ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อหาปริมาณ เสียชีวิตได้16,17 การศึกษาก่อนหน้ารายงานว่า ตะกว่ั แคดเมียม และซาซิท็อกซินในหอยสองฝาที่ สารพิษกลุ่ม PSP มีมากถึง 57 อนุพันธ์ โดยซาซิท็ นิยมบริโภคโดยประชากรไทย ผลลัพธ์ที่ได้จะทา อกซิน (Saxitoxin; STX) เป็นสารพิษที่พบสูงถึง ให้ทราบสถานการณ์การปนเปื้ อนโลหะหนัก และ ร้อยละ 85 ซึ่งอาจส่งผลกระทบตอสุขภาพผู้บริโภค่ ซาซิท็อกซินในหอยสองฝา ซึ่งเป็นอาหารกลุ่ม ได้17 ซาซิท็อกซิน ถูกดูดซึมได้ง่ายจากระบบ เสี่ยงที่มีรายงานการปนเปื้ อนสารเหล่านี้ เพื่อเป็น ทางเดินอาหารและผานเยื่อเมือก่ สามารถละลายได้ ฐานข้อมูลให้หน่วยงานที่เกี่ยวข้องออกมาตรการ ง่ายทั้งในน้า และเมทานอล แต่ไม่ละลายในไขมัน ในการเฝ้าระวังในการดาเนินงานคุ้มครองผู้บริโภค และสามารถคงอยู่ในร่างกายได้จนกว่าจะถูกขับ ตอไป่ ออกจากร่างกาย การเมตาบอไลท์ จะเกิดขึ้นช้า เนื่องจากซาซิท็อกซินมีความเสถียรที่ pH ต่า และที่ วิธีด าเนินการวิจัย อุณหภูมิสูง อาการจากการได้รับสัมผัสสารซาซิท็ การคัดเลือกตัวอย่าง และการเก็บตัวอย่าง อกซินเริ่มปรากฏในเวลาน้อยกวา่ 24 ชัวโมง่ โดย ดาเนินการเลือกหอยสองฝาที่คนไทยนิยม ปกติจะใช้เวลาเพียงไมก่ ี่นาที อาการจากพิษของซา บริโภค จ านวน 3 ชนิด ได้แก่ หอยแครง ซิท็อกซิน เช่น ตาบอดชั่วคราว ปัญหาเกี่ยวกับ (Tegillarca granosa) หอยแมลงภู่ (Perna viridis)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 59

และหอยลาย (Paratapes undulates) โดยพิจารณา จากสิ่งแวดล้อมภายในห้องปฏิบัติการ เก็บรักษา จากข้อมูลการบริโภคอาหารของประเทศไทย จาก ตัวอย่างที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส จนกว่าจะ ข้อมูลการบริโภคหอยสองฝาในประชากรอายุ 3 ปี นามาวิเคราะห์ ขึ้นไป ของประชากรทั้งหมด (per capita) พบวา่ มี ปริมาณการบริโภคหอยแครง สูงที่สุด (ค่าเฉลี่ย การวิเคราะห์ปริมาณความชื้น 1.34 กรัม/คน/วัน และค่าที่ 97.5 เปอร์เซ็นไทล์ วิเคราะห์ปริมาณความชื้นในตัวอยางหอย่ 10.29 กรัม/คน/วัน) รองลงมา คือ หอยแมลงภู่ ที่ผานการปั่ ่นละเอียดเป็นเนื้อเดียวกนโดยปรับจากั (ค่าเฉลี่ย 0.92 กรัม/คน/วัน และค่าที่ 97.5 เปอร์ วิธี AOAC 925.4021 วิธีวิเคราะห์โดยยอ่ คือ ทาการ เซ็นไทล์ 8.00 กรัม/คน/วัน) และหอยลาย (ค่าเฉลี่ย ชังทรายสะอาดที่ผ่ านการล้างแช่ ่กรดประมาณ 15- 0.59 กรัม/คน/วัน และค่าที่ 97.5 เปอร์เซ็นไทล์ 20 กรัมในถ้วยเซรามิคพร้อมแท่งแกวส้ าหรับคน 5.86 กรัม/คน/วัน) ร้อยละของผู้บริโภค หอยแครง น าเข้าอบในตู้อบลมร้อนที่อุณหภูมิ 105 องศา หอยแมลงภู่ และหอยลาย ในกลุ่มประชากรอายุ 3 เซลเซียส นาน 30 นาที ทาให้เย็นในเดซิกเคเตอร์ ปีขึ้นไป เทาก่ บั ร้อยละ 26, 23 และ 12 ตามลาดับ 1 ชังตัวอย่ างประมาณ่ 2 กรัม ใส่ในถ้วย พร้อมบันทึก ดาเนินการเก ็บตัวอย่างจากตลาดขายส่ง น้ าหนักที่แน่นอน และคนให้เข้ากันและน าไป อาหารทะเลขนาดใหญ่ของประเทศไทย จานวน 5 ระเหยแห้งบนอ่างน้าควบคุมอุณหภูมิ หมันคนเพื่อ่ ตลาด ได้แก่ ตลาดมหาชัยเมืองใหม่ ตลาดมหาชัย ไมให้จับตัวเป็นก่ อนแข็ง้ นาเข้าอบในตู้อบลมร้อน เมืองเก่า ตลาดลีลา และตลาดทะเลไทย จังหวัด ที่อุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียส ทาให้เย็นในเดซิกเค สมุทรสาคร และตลาดแม่กลอง จังหวัด เตอร์ ทาซ ้า จนได้น้าหนักที่คงที่ บันทึกน้าหนักแล้ว สมุทรสงคราม ในช่วงฤดูฝน (มิถุนายน ถึง น าไปคานวณปริมาณความชื ้นในตัวอย่าง น าค่า กนยายนั พ.ศ.2560) โดยสุ่มเกบตัวอย็ างหอยแต่ ่ละ ความชื้นที่วิเคราะห์ได้ในตัวอย่างไปค านวณ ชนิด อยางน้อยตัวอย่ ่างละ 1000 กรัม จากร้านค้า ปริมาณโลหะหนักเทียบกบนั ้าหนักแห้ง ในตลาด ชนิดละ 9 ตัวอยาง่ รวม 27 ตัวอยาง่ บรรจุ ตัวอยางในถุงพลาสติกสะอาด่ พร้อมระบุชื่อ และ การวิเคราะห์ปริมาณโลหะหนัก รหัสตัวอย่าง เก็บรักษาตัวอย่างในกล่องโฟมที่มี ทาการย อยตัวอย่ างหอยสองฝา่ โดยวิธียอย่ น้ าแข็งควบคุมอุณหภูมิ จนถึงห้องปฏิบัติการ สลายในระบบปิด (Closed System Wet Digestion) ดาเนินการชั ่งน้าหนักตัวอย ่างเฉลี่ย (ทั้งตัว และ ด้วยกรดไนตริกเข้มข้น ภายใต้อุณหภูมิ 110 องศาส เฉพาะส่วนที่กินได้) ถ่ายรูปลักษณะตัวอยาง่ และ เซลเซียส อย่างน้อย 9 ชั่วโมง เพื่อย่อยสลาย เตรียมตัวอย่างโดยแกะเปลือก นาตัวอย ่างเฉพาะ สารอินทรีย์ สกัดตะก่ัวและแคดเมียม ออกจาก ส่วนที่กินได้มาปั่นให้ละเอียดเป็นเนื้อเดียวกนั เกบ็ ตัวอยางโดยการเติมสารแอมโมเนียม่ -1-ไพไรลิดีน ในขวดพลาสติกที่ผ่านการล้างแช่กรดไนตริก ไดไธโอคาร์บาเมต ( APDC) เ พื่ อ ส ร้ า ง (20%) ข้ามคืน ล้างด้วยน้าปราศจากอิออน และอบ สารประกอบเชิงซ้อนกับโลหะหนัก และสกัด จนแห้ง เพื่อป้องกนการปนเปืั ้ อนของโลหะหนัก โลหะหนักในตัวอยาง่ ด้วยสารละลายกรดไนตริก

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 60

เจือจาง (3%) วิเคราะห์ปริมาณตะกว่ั และแคดเมียม ปริมาณต่าสุดที่ตรวจวัดได้ (LOD) เท่ากับ 3 โ ด ย ใ ช้ เ ค รื่ อ ง Graphite Furnace Atomic ไมโครกรัม/กิโลกรัม Absorption Spectrometer22 ขีดจาก ดของการตรวจั พบ (Limit of Detection; LOD) ของตะก่ัวและ การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ แคดเมียมเท่ากบั 4 และ 3 ไมโครกรัม/กิโลกรัม วิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติด้วยโปรแกรม ตามล าดับ และขีดจาก ัดของการวัดเชิงปริมาณ SPSS (IBM SPSS statistics for Windows, version (Limit of Quantitation; LOQ) ของตะก่ัวและ 19.0) โดยทดสอบการกระจายตัวของข้อมูลด้วย แคดเมียมเท่ากบั 13 และ 10 ไมโครกรัม/กิโลกรัม Kolmogorov- Smirnov Test หากข้อมูลมีการ ตามลาดับ กระจายตัวแบบปกติ ใช้สถิติ ANOVA และ Post การควบคุมคุณภาพการวิเคราะห์โลหะ hoc Tukey เพื่อทดสอบความแตกต่างของกลุ่ม หนัก ดาเนินการทดสอบความถูกต้อง (accuracy) ข้อมูล หากข้อมูลมีการกระจายตัวแบบไม่ปกติ ใช้ ของการวิเคราะห์ โดยการหาร้อยละการกลับคืน สถิติ Kruskal-Wallis และ Mann-Whitney U Test (% recovery) โดยการเติมสารละลายมาตรฐาน โดยกาหนดระดับนัยส าคัญทางสถิติที่ P-value < ตะก่ัว ความเข้มข้น 20 ไมโครกรัม/ลิตร และ 0.05 สารละลายแคดเมียม ความเข้มข้น 2 ไมโครกรัม/ ลิตร ใน 1 ตัวอย่าง ของการวิเคราะห์แต่ละครั้ง ผลการวิจัย (batch) ทาการสร้างกราฟมาตรฐาน ทุกครั้งที่ทา การควบคุมคุณภาพการวิเคราะห์ตะกั่วและ การทดสอบ โดยช่วงการวัดของตะกว่ั เท่ากบั 10- แคดเมียม 100 ไมโครกรัม/ลิตร และช่วงการวัดของแคดเมียม ผลการทดสอบความถูกต้อง (accuracy) เทาก่ บั 2-8 ไมโครกรัม/ลิตร ของการวิเคราะห์โลหะหนักทั้ง 2 ชนิด โดยการหา ร้อยละการกลับคืนของการวิเคราะห์ตะก่ัวและ การวิเคราะห์ปริมาณซาซิท็อกซิน แคดเมียม พบวา่ อยูในช่ ่วงร้อยละ 85-113 และร้อย ทาการวิเคราะห์ปริมาณซาซิท็อกซินใน ละ 82-115 ตามลาดับ โดยเกณฑ์ยอมรับร้อยละการ ตัวอยางหอย่ โดยใช้ Saxitoxin (PSP) ELISA Test กลับคืน23 ส าหรับความเข้มข้นที่ระดับ 1-100 kit ( MaxSignal®, Bioo Scientific Corporation, ไมโครกรัม/ลิตร คือ อยู่ในช่วงร้อยละ 70-125 USA) อาศัยหลักการ Competitive colorimetric ความเป็นเส้นตรงของกราฟมาตรฐานตะกวและ่ั ELISA ความเข้มของสีที่เกิดขึ้นจะแปรผกผักกบั แคดเมียมบ่งชี้ โดยพิจารณาค่าสัมประสิทธิ์ ความเข้มข้นของซาซิท็อกซินในตัวอยาง่ ข้อดีของ สหสัมพันธ์ (r) ของกราฟสารมาตรฐานตะกว่ั (ช่วง ชุดทดสอบนี้ คือ มีค่าร้อยละการกลับคืนมากกว่า การวัด 10-100 ไมโครกรัม/ลิตร) และแคดเมียม 80 สามารถตรวจวิเคราะห์ได้รวดเร็ว (10-30 นาที) (ช่วงการวัด 2-8 ไมโครกรัม/ลิตร) พบว่าค่า มีความไวสูง (0.05 ไมโครกรัม/กิโลกรัม) และ สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ (r) มีค่ามากกวา่ 0.99 ทุก ครั้งที่ทาการทดสอบ

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 61

ปริมาณตะกั่วและแคดเมียมในหอยสองฝา กิโลกรัม (น้ าหนักเปียก) และ0.320±0.237 ผลการวิเคราะห์ปริมาณตะก่ัวและ มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้ าหนักแห้ง) หอยแครง แคดเมียมในหอยสองฝา จานวน 27 ตัวอยาง่ ได้แก่ เท่ากบั 0.080±0.043 มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้าหนัก หอยลาย หอยแมลงภู่ และหอยแครง ชนิดละ 9 เปี ยก) และ 0.509±0.240 มิลลิกรัม/กิโลกรัม ตัวอย่าง จากตลาดขายส่งอาหารทะเลขนาดใหญ่ (น้ าหนักแห้ง) เมื่อพิจารณาปริมาณตะก่ัวต่อ ของประเทศไทยใน จังหวัดสมุทรสาคร และ น้าหนัก เปียก พบวา่ ค่าเฉลี่ยตะกวในหอยแครงสูง่ั สมุทรสงคราม แสดงในตารางที่ 1 จากผล กว่าปริมาณที่พบในหอยแมลงภู่อย่างมีนัยส าคัญ การศึกษาพบว่า ค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบน ทางสถิติ ในขณะที่หอยลายมีปริมาณตะก่ัวไม่ มาตรฐานของตะก่ัวในหอยลาย เท่ากับ แตกต่างจากหอยแครงและหอยแมลงภู่อย่างมี 0.077±0.040 มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้ าหนักเปียก) นัยส าคัญทางสถิติ เมื่อพิจารณาปริมาณตะก่ัวต่อ และ 0.495±0.259 มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้ าหนัก น้ าหนักแห้ง พบว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมี แห้ง) หอยแมลงภู่ เท่ากบั 0.039±0.031 มิลลิกรัม/ นัยสาคัญทางสถิติระหว างหอย่ ทั้ง 3 ชนิด

ตารางที่ 1. ปริมาณตะกวและแคดเมียม่ั (มิลลิกรัม/กิโลกรัม) ในหอยสองฝาที่เกบจากตลาดจ็ าหน ่ายอาหารทะเล แหล่งใหญของประเทศไทยในจังหวัดสมุทรสาคร่ และสมุทรสงคราม

ชนิดหอย สถิติ ความชื้น ปริมาณโลหะหนัก ปริมาณโลหะหนัก สองฝา (ร้อยละ) (มิลลิกรัม/กิโลกรัม น ้าหนักเปียก) (มิลลิกรัม/กิโลกรัม น ้าหนักแห้ง) ตะกั่ว แคดเมียม ตะกั่ว แคดเมียม หอยลาย Mean ± SD 83.81 ± 2.22 0.077 ± 0.040ab 0.103 ± 0.068b 0.495 ± 0.259a 0.629 ± 0.428b Median 84.03 0.097 0.096 0.553 0.516 Min-Max 80.17-87.24 ND-0.122 0.020-0.195 ND-0.786 0.123-1.254 หอยแมลงภู่ Mean ± SD 87.42 ± 1.40 0.039 ± 0.031b 0.131 ± 0.147b 0.320 ± 0.237a 0.985 ± 0.932ab Median 87.96 0.036 0.082 0.302 0.687 Min-Max 84.87-89.32 ND-0.090 0.040-0.488 ND-0.692 0.373-3.225 หอยแครง Mean ± SD 84.26 ± 1.83 0.080 ± 0.043a 0.252 ± 0.082a 0.509 ± 0.240a 1.625 ± 0.584a Median 84.98 0.077 0.269 0.540 1.587 Min-Max 80.59-86.65 ND-0.161 0.073-0.362 ND-0.827 0.487-2.299 รวม Mean ± SD 85.17 ± 2.42 0.067 ± 0.041 0.163 ± 0.118 0.446 ± 0.251 1.084 ± 0.770 Median 85.04 0.072 0.130 0.498 0.940 Min-Max 80.17-89.32 ND-0.161 0.020-0.488 ND-0.827 0.123-3.225 หมายเหตุ a, b อักษรตัวยกตางก่ นั หมายถึงมีความแตกตางก่ นอยั างมีนัยส่ าคัญทางสถิติระหว าง่ ชนิดหอยสองฝา ที่ P-value < 0.05. ND = not detected หมายถึง ตรวจไมพบ่ (น้อยกวาค่ า่ LOD)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 62

ค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของ ซินในหอยแครงสูงกว่าปริมาณที่พบในหอยลาย แคดเมียมในหอยลาย เท่ากับ 0.103±0.068 และหอยแมลงภู่อย่างมีนัยส าคัญทางสถิติ ส่วน มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้ าหนักเปียก) และ ค่าเฉลี่ยซาซิท็อกซินในหอยแมลงภู่สูงกวาปริมาณ่ 0.629±0.428 มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้ าหนักแห้ง) ที่พบในหอยลาย แต่ไม่มีความแตกต่างอย่างมี หอยแมลงภู่ เท่ากับ 0.131±0.147 มิลลิกรัม/ นัยสาคัญทางสถิติ กิโลกรัม (น้ าหนักเปียก) และ 0.985±0.932 มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้ าหนักแห้ง) หอยแครง วิจารณ์ผลการวิจัย เท่ากบั 0.252±0.082 มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้าหนัก พบปริมาณตะก่ัวและแคดเมียมใน เปียก) และ 1.625±0.584 มิลลิกรัม/กิโลกรัม หอยแครงมีแนวโน้มสูงกว่าในหอยชนิดอื่นอาจ (น้าหนักแห้ง) เมื่อพิจารณาปริมาณแคดเมียมต่อ เนื่องมาจากหอยแครงเป็นหอยที่ชอบฝังตัวอยูตาม่ น้าหนักเปียก พบวาค่ ่าเฉลี่ยแคดเมียมในหอยแครง หาดโคลน หรือเลนละเอียดที่ความลึก 1-12 นิ้ว สูงกว่าปริมาณที่พบในหอยลาย และหอยแมลงภู่ บริเวณปากแม่น้ า และชายฝั่งทะเล ซึ่งบริเวณ อย่างมีนัยส าคัญทางสถิติ เมื่อพิจารณาปริมาณ ดังกล่าวอาจมีปัญหาสภาพน้ าเสียจากโรงงาน แคดเมียมต่อน้ าหนักแห้ง พบว่าในหอยแครงมี มลพิษจากสารเคมี และจากชุมชนชายฝั่ง จึงอาจทา ปริมาณแคดเมียมสูงกวาหอยลายอย่ างมีนัยส่ าคัญ ให้เกิดการสะสมโลหะหนักในหอยแครงได้24 ทางสถิติ ในขณะที่หอยแมลงภู่มีปริมาณแคดเมียม ในขณะที่การเลี้ยงหอยแมลงภู่เป็นการปักหลักที่ ไมแตกต่ างจากหอยลาย่ และหอยแครง ความลึกประมาณ 4-6 เมตรในทะเล หรือเลี้ยงแบบ ราวเชือกที่ระดับน้าลึกห ่างชายฝั่ง และหอยลายมี ปริมาณซาซิท็อกซินในหอยสองฝา ถิ่นอาศัยในทะเลน้าลึกไม ่เกิน 8 เมตร โดยขุดรูอยู่ ผลการวิเคราะห์ปริมาณซาซิท็อกซินใน ใต้โคลนลึกประมาณ 20 เซนติเมตร25 หอยส่วน หอยสองฝา จานวน 27 ตัวอย่าง ได้แก่ หอยลาย ใหญ่มีพฤติกรรมการดารงชีวิตที่อยู ่กบที่ั และกิน หอยแมลงภู ่ และหอยแครง ชนิดละ 9 ตัวอยาง่ จาก อาหารโดยการกรอง หากพื้นที่เลี้ยงหอย หรือ ที่อยู่ ตลาดขายส่งอาหารทะเลขนาดใหญ่ของประเทศ อาศัยมีการปนเปื้ อนโลหะหนักจะทาให้ถูกสะสม ไทยใน จังหวัดสมุทรสาคร และสมุทรสงคราม ในหอยได้24,25 จากประกาศกระทรวงสาธารณสุข แสดงในตารางที่ 2 จากผลการศึกษาพบวา่ ค่าเฉลี่ย (ฉบับที่ 414) พ.ศ. 2563 เรื่อง มาตรฐานอาหารที่มี และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของซาซิท็อกซินใน สารปนเปื้ อน กาหนด ปริมาณสูงสุดของแคดเมียม หอยลาย เท่ากับ 0.78±0.30 มิลลิกรัม/กิโลกรัม ในหอยสองฝา (เฉพาะส่วนที่บริโภคได้) เท่ากบั 2 (น้ าหนักเปียก) หอยแมลงภู่ เท่ากับ 1.34±0.26 มิลลิกรัม/กิโลกรัม ส าหรับตะก่ัวไม่ได้มีการ มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้ าหนักเปียก) หอยแครง กาหนดเฉพาะในหอยสองฝา แต่กาหนดปริมาณ เท่ากับ 4.84±3.10 มิลลิกรัม/กิโลกรัม (น้ าหนัก สูงสุดในอาหารทั่วไปที่ 1 มิลลิกรัม/กิโลกรัม เปี ยก) เมื่อพิจารณาปริ มาณซาซิท็อกซิน ดังนั้นเมื่อเปรียบเทียบปริมาณตะกวและแคดเมียม่ั เปรียบเทียบในหอย 3 ชนิด พบวาค่ าเฉลี่ย่ ซาซิท็อก ในตัวอยางหอยสองฝาในการศึกษานี่ ้กบมาตรฐั าน

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 63

โลหะหนักในอาหารของประเทศไทย14 พบว่า การศึกษาอื่น การสะสมโลหะหนักในหอยสองฝา ตัวอย่างหอยทุกตัวอย่าง มีปริมาณตะก่ัวและ เป็นผลมาจากหลายปัจจัย ยกตัวอย่างเช่น เพศ, แคดเมียม ไมเก่ ินคา่ มาตรฐานที่กาหนด น้าหนักตัวและขนาด, ฤดูกาล, ความเค็มของน้า เมื่อเปรียบเทียบปริมาณโลหะหนักในหอย ทะล, ถิ่นที่อยูอาศัย,่ แหล่งอาหาร, และสารอินทรีย์ สองฝาจากการศึกษานี้กบการศึกษาอื่นั 26-34 (ตาราง และสารอนินทรีย์ตางๆในสิ่ ่งแวดล้อม35 นอกจากนี้ ที่ 3) พบว่า ปริมาณตะก่ัวที่พบในหอยลายและ เทคนิคที่ใช้ในการวิเคราะห์โลหะหนักในตัวอยาง่ หอยแมลงภู่มีค่าต่ากว ่าในการศึกษาของประเทศ ที่แตกต่างกัน ในขั้นตอนของการสกัด และ อื่น ในขณะที่ปริมาณตะก่ัวในหอยแครงมีค่า เครื่องมือที่ใช้ในการวิเคราะห์ที่แตกต่างกนั เช่น ใกล้เคียงหรือสูงกวาการศึกษาอื่นเล็กน้อย่ ส าหรับ Flame Atomic Absorption Spectrophotometer ปริมาณแคดเมียมในหอยสองฝาจากการศึกษานี้ ( FAAS) , Graphite- Furnace Absorption เมื่อเปรียบเทียบกบการศึกษากั ่อนหน้า26-34 พบวามี่ Spectrophotometer ( GFAAS) , Inductively ความแตกต่างกันขึ้นกับพื้นที่ศึกษา โดยพบทั้ง Coupled Plasma (ICP) อาจส่ งผลกระทบต่อ ปริมาณแคดเมียมที่ต่ากว ่า ใกล้เคียง และสูงกว่า ปริมาณโลหะหนักที่ตรวจวิเคราะห์ได้

ตารางที่ 2. ปริมาณซาซิท็อกซินในหอยสองฝาที่เกบจากตลาดจ็ าหน ่ายอาหารทะเลแหล่งใหญของประเทศไทย่ ในจังหวัดสมุทรสาคร และสมุทรสงคราม

ชนิดหอยสองฝา สถิติ ซาซิท็อกซิน (ไมโครกรัม/กิโลกรัมน ้าหนักเปียก) หอยลาย Mean ± SD 0.781 ± 0.305b Median 0.830 Min-Max 0.253-1.167 หอยแมลงภู ่ Mean ± SD 1.340 ± 0.262b Median 1.334 Min-Max 1.002-1.848 หอยแครง Mean ± SD 4.845 ± 3.100a Median 3.678 Min-Max 1.539-10.381 รวม Mean ± SD 2.360 ± 2.565 Median 1.334 Min-Max 0.253-10.381 หมายเหตุ : a, b อักษรตัวยกตางก่ นั หมายถึงมีความแตกตางก่ นอยั างมีนัยส่ าคัญทางสถิติระหว างชนิดหอยสองฝา่ ที่ P-value < 0.05

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 64

ปรากฏการณ์น้าทะเลเปลี่ยนสี (red tide) 853/200420 จากผลการศึกษาไม่พบตัวอย่างหอย เกิดจากแพลงก์ตอนพืชบริเวณแนวชายฝั่งทะเลมี สองฝาในการศึกษานี้มีปริมาณซาซิท็อกซินเกิน การเจริญเติบโตเพิ่มจานวนอย างรวดเร็ว่ (bloom) มาตรฐานของสหภาพยุโรป จากการศึกษาก่อน จนทาให้น ้าทะเลเปลี่ยนสีไปจากปกติ เช่น สีเขียว หน้าโดย Yue และคณะในปี 2020 รายงานปริมาณ แดง น้าตาล เนื่องจากสีของแพลงก์ตอนพืช โดย ซาซิท็อกซินที่วิเคราะห์โดยเทคนิค High แพลงก์ตอนพืชบางชนิด เช่น Alexandrium spp., Performance Liquid Chromatography- Tandem Gymnodinium catenatum แ ล ะ Pyrodinium Mass Spectrometry ในหอยสองฝาที่เก็บตัวอย่าง bahamense var. compressum สามารถสร้างสารชีว ใน 6 เมืองของมณฑลกวางตุ้งประเทศจีน ดังนี้ พิษที่ทาให้เก ิดอาการอัมพาต ซึ่งสามารถถ่ายทอด หอยแมลงภู่ (ND-0.89 ไมโครกรัม/กิโลกรัม) หอย ไปสะสมในตัวสัตว์น้ า โดยเฉพาะหอยต่างๆได้ เชลล์ (ND-2.8 ไมโครกรัม/กิโลกรัม) และหอย จากการศึกษาพบวา่ ตัวอยางหอยสองฝาทั่ ้ง 3 ชนิด นางรม (ND-0.91 ไมโครกรัม/กิโลกรัม)38 เมื่อ ที่จาหน ่ายในประเทศไทย มีปริมาณสารชีวพิษซา เปรียบเทียบปริมาณซาซิท็อกซินในหอยชนิด ซิท็อกซินต่า ทั้งนี้อาจเนื่องจากมีรายงานวา่ แพลงก์ เดียวกันกับการศึกษานี้ คือ หอยแมลงภู่ พบว่า ตอนพืชที่ทาให้เก ิดปรากฎการณ์น้าทะเลเปลี่ยนสี ปริมาณซาซิท็อกซินในการศึกษานี้ มีค่าสูงกว่า ที่พบในประเทศไทยส่วนใหญ่เป็นชนิดที่ไม่สร้าง ประมาณ 2 เท่า (1.00-1.85 ไมโครกรัม/กิโลกรัม) ส า ร ชี ว พิ ษ ก ลุ่ ม PSP เ ช่ น Trichodesmium ทั้งนี้อาจเนื่องมาจากเทคนิคที่ใช้ในการวิเคราะห์ erythraeum, Noctiluca scintillans แ ล ะ แตกต่างกนั รวมถึงสาหร่ายที่สามารถผลิตซาซิท็ Chaetoceros spp.36 ,37 อกซินได้ในทะเลทางใต้ของจีนมีปริมาณค่อนข้าง ปัจจุบันส านักงานคณะกรรมการอาหาร น้อยเมื่อเปรียบเทียบกบั ภูมิภาคอื่น38 นอกจากนี้มี และยาของประเทศไทย และคณะกรรมาธิการ การศึกษาปริมาณซาซิท็อกซินในหอยแมลงภู่ ที่ โครงการมาตรฐานอาหาร FAO/WHO (Codex เกบตัวอย็ างบริเวณอ่ าวอิชิโนมาก่ ิของจังหวัดมิยากิ Alimentarius Commission – CAC) ยังไม่มีการ ประเทศญี่ปุ่น ที่ระดับความลึกต่างๆ ได้แก่ 1, 5 กาหนดปริมาณสูงสุดของซาซิท็อกซินในอาหาร และ 9 เมตร พบว่าหอยแมลงภู่ที่เก็บจากทะเลที่ แตมีประกาศกรมประมง่ เรื่อง เกณฑ์มาตรฐานสาร ความลึก 1 และ 5 เมตร มีปริมาณซาซิท็อกซินสูง ชีวพิษและแบคทีเรียในหอยสองฝา พ.ศ. 2561 กว่าที่ระดับความลึก 9 เมตร39 ดังนั้นการเก็บ กาหนดให้มีสาร พิษที่ทาให้เก ิดอาการอัมพาตน้อย ตัวอย่างหอยสองฝาที่ระดับความลึกแตกต่างกนั กว่า 800 ไมโครกรัม ซาซิท็อกซินเทียบเท่า/ อาจมีผลตอปริมาณซาซิ่ ท็อกซินที่สะสมในตัวหอย กิโลกรัม18 ซึ่งสอดคล้องกบข้อกั าหนดของ สหภาพ ได้ ยุ โ ร ป Commission Regulation ( EU) No

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 65

ตารางที่ 3. ปริมาณตะกว่ั แคดเมียม (มิลลิกรัม/กิโลกรัมน้าหนักแห้ง) ในหอยสองฝาจากการศึกษาอื่น

การศึกษา ประเทศ/แหล่งที่เก็บ ชนิดหอยสองฝา ตะกั่ว แคดเมียม ตัวอย่าง หอยลาย (clam) Kucuksezgin et al. อ่าวอิซมีร์ ประเทศตุรกี Carpet shell clam 0.38-1.20 0.026-0.24 (2010)26 Tapes decussatus Nwabueze & ตลาด ประเทศไนจีเรีย Freshwater clam 1.38-5.38 0.92-1.35 Oghenevwairhe Egeria radiata (2012)27 Bilgin & Uluturhan- ทะเลสาบโฮมา Palourde clam 0.80-1.35# 0.10-0.33# Suzer (2017)28 ประเทศอิตาลี Tapes decussatus การศึกษานี้ ตลาดอาหารทะเล Saltwater clam ND-0.79 0.12-1.25 ประเทศไทย Paratapes undulatus ND-0.12# 0.02-0.20# หอยแมลงภู่ (mussel) Locatelli et al. อ่าวโกโร Mediterranean mussel 15.8-29.0 3.70-4.30 (2003)29 ประเทศอิตาลี Mytilus galloprovincialis Sunlu et al. (2006)30 ชายฝั่งทะเลอีเจียน Mediterranean mussel 0.49-1.72 0.04-0.52 ประเทศตุรกี Mytilus galloprovincialis Maanan et al. (2007)31 ชายฝั่งเมืองเอลจาดิด้า Mediterranean mussel 0.50-34.2 1.33-25.3 ประเทศโมรอคโค Mytilus galloprovincialis Bilgin & Uluturhan- ทะเลสาบโฮมา Mediterranean mussel 0.81-2.47# 0.22-0.51# Suzer (2017)28 ประเทศอิตาลี Mytilus galloprovincialis การศึกษานี้ ตลาดอาหารทะเล Asian Green Mussel ND-0.69 0.37-3.23 ประเทศไทย Perna viridis ND-0.09# 0.04-0.49# หอยแครง (cockle) Ishak et al. (2016)32 เมืองกวลาสลังงอร์ั Blood cockle 0.01-0.07# 0.01-0.04# ประเทศมาเลเซีย Anadara granosa Alkarkhi et al. (2008)33 รัฐปีนัง Blood cockle 0.11- 0.14# 0.79-0.93# ประเทศมาเลเซีย Anadara granosa Sudsandee et al. อ่าวไทยตอนบน Blood cockle 0.001–0.057# 0.07–0.74# (2017)34 ประเทศไทย Anadara granosa การศึกษานี้ ตลาดอาหารทะเล Blood cockle ND-0.83 0.49-2.30 ประเทศไทย Anadara granosa ND-0.16# 0.07-0.36# ND = Not detected # มิลลิกรัม/กิโลกรัมน้าหนักเปียก

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 66

สรุปผลการศึกษา 4. Beyer J, Green NW, Brooks S, Allan IJ, Ruus A, แม้ว่าหอยสองฝาอาจเป็นอาหารกลุ่ม Gomes T, et al. Blue mussels (Mytilus edulis spp.) as เสี่ยงที่สามารถสะสมโลหะหนัก และสารชีวพิษที่ sentinel organisms in coastal pollution monitoring: a review. Mar Environ Res 2017; 130: 338-365. เกิดตามธรรมชาติได้ แต่จากการศึกษานี้พบ 5. WHO. 1995. Enviromental Health Criteria 165: ปริมาณตะกว่ั แคดเมียม และซาซิท็อกซินในหอย Inorganic lead, Geneva: International Programme on ลาย หอยแมลงภู่ และหอยแครงที่เก็บจากตลาด Chemical Safety. Available at จาหน ่ายอาหารทะเลแหล่งใหญ่ของประเทศไทย http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc165.htm. มีค่าไม่เกินปริมาณสูงสุดที่กาหนดโดยส านักงาน 6. UNEP Chemicals. 2006. Interim review of scientific คณะกรรมการอาหารและยา หรือ องค์กรระหวาง่ information on lead. Available at ประเทศ ปริมาณโลหะหนัก และซาซิท็อกซินใน http://www.unepchemicals.ch/pb_and_cd/SR/Files/Inter im_reviews/UNEP_Lead_review_InterimOct2006.pdf. หอยสองฝาที่ได้จากการศึกษานี้ อาจเป็ น 7. Nordic Council of Ministers. 2003. Lead review. ฐานข้อมูลให้หน่วยงานที่เกี่ยวข้องใช้พิจารณาใน Available at http://www. who. int/ ifcs/ การกาหนดมาตรฐานอาหารในประเทศ หรือเมื่อ documents/forums/forum5/nmr_lead.pdf. มีการเวียนสอบถามข้อมูลจากองค์กรมาตรฐาน 8. WHO. 2019. Evaluation of the Joint FAO/WHO อาหารระหว่างประเทศในการพิจารณากาหนด Expert Committee on Food Additives; Lead. Available ปริมาณสูงสุดของสารปนเปื้ อนในอาหารระหวาง่ at https://apps.who.int/food-additives-contaminants- ประเทศ jecfa-database/chemical.aspx? chemID=3511. 9. EFSA. 2010. Scientific opinion on lead in food.

EFSA Journal 2010; 8( 4):1570. Available at เอกสารอ้างอิง https://efsa. onlinelibrary. wiley. com/ doi/ 1. สานักงานมาตรฐานสินค้าเกษตรและอาหารแห ่งชาติ pdf/10.2903/j.efsa.2010.1570. ข้อมูลการบริโภคอาหารของประชากรไทย, ส านัก 10. UNEP Chemicals. 2006. Interim review of scientific กาหนดมาตรฐาน , สานักงานมาตรฐานสินค้าเกษตรและ information on cadmium. Available at อาหารแห่งชาติ. กระทรวงเกษตรและสหกรณ์; 2559. http://www.unepchemicals.ch/pb_and_cd/SR/Files/Inter 2. จิตรลดา ศรีตระกูล. สถานการณ์การผลิตและการค้า im_reviews/UNEP_Cadmium_review_Interim_Oct. สินค้าหอยสองฝาปี 2560. Available at 11. United States Environmental Protection Agency https://www.fisheries.go.th/strategy/UserFiles/files/256 (EPA). 2000. Technology Transfer Network Air Toxics 1.pdf. Web Site. Cadmium compounds. Available at 3. Bilgin M & Uluturhan-Suzer E. Assessment of trace http://www.epa.gov/ttn/ atw/hlthef/cadmium.html. metal concentrations and human health risk in clam 12. UNEP Chemicals. 2006. Interim review of scientific ( Tapes decussatus) and mussel ( Mytilus information on cadmium. Available at galloprovincialis) from the Homa Lagoon ( Eastern http://www.unepchemicals.ch/pb_and_cd/SR/Files/Inter Aegean Sea). Environ Sci Pollut Res 2017; 24: 4174- im_reviews/ UNEP_Cadmium_review_Interim_Oct 4184. 2006.pdf.

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 67

13. WHO. 2019. Evaluation of the Joint FAO/WHO 23. Latimer, GW. 2019. Official methods of analysis of Expert Committee on Food Additives; Cadmium. AOAC International. Appendix K: Guidelines for Available at https:// apps. who. int/ food- additives- Dietary Supplements and Botanicals. 20th ed. , contaminants- jecfa- database/ chemical. aspx? Rockville, MD: AOAC International. chemID=1376. 24. สานักพัฒนาและถ ายทอดเทคโนโลยีการประมง่ กรม 14. CAC ( Codex Alimentarius Commission) . 2019 . ประมง. การเลี้ยงหอยแครง. 2550. ส านักพัฒนาและ General standard for contaminants and toxins in food and ถ่ายทอดเทคโนโลยีการประมง กรมประมง กระทรวง feed ( CODEX STAN 193– 1995) . Available at: เกษตรและสหกรณ์. Available at http://www.codexalimentarius.org /standards/list‐of standards https://www. fisheries. go. th/ it- 15. ประกาศกระทรวงสาธารณสุข เรื่อง มาตรฐานอาหาร database/dbweb/ebook/pdf. ที่มีสารปนเปื้ อน (ฉบับที่ 414) พ.ศ. 2563. (2563, 20 25. สานักพัฒนาและถ ายทอดเทคโนโลยีการประมง่ กรม พฤษภาคม). ราชกิจจานุเบกษา. เล่ม 137 ตอนพิเศษ 118 ประมง. การเพาะเลี้ ยงหอยทะเล. Available at ง. หน้า 17-18. https://www4.fisheries. go. th/ local/ 16. Thottumkara AP, Parsons WH & Du Bois J. Angew file_document/20190612162228_1_file.pdf. Chem 2014; 53: 5760–5784. 26. Kucuksezgin F, Kacar A, Kucuksezgin G. , et al. 17. Gad SE. 2019. Saxitoxin. Encyclopedia of Monitoring metal contamination levels and fecal Toxicology, Volume 4. Gad Consulting Services, Cary, pollution in clam ( Tapes decussatus) collected from NC, USA. pp 218-220. Izmir Bay (Turkey). Environ Monit Assess 2010; 162: 18. ประกาศกรมประมง เรื่อง เกณฑ์มาตรฐานสารชีวพิษ 407-415. และแบคทีเรียในหอยสองฝา พ.ศ. 2561 (2561ม 9 27. Nwabueze A & Oghenevwairhe E. Heavy metal กรกฎาคม). ราชกิจจานุเบกษา. เลมที่่ 135 ตอนพิเศษ 161 concentrations in the West African clam, Egeria radiate ง. หน้า 47. (Lammark, 1804) from Mclver market, warri, Nigeria. 19. Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in Int J Sci Nat 2012; 3: 309-315. the Food Chain on a request from the European 28. Bilgin M, Uluturhan-Suzer E. Assessment of trace Commission on Marine Biotoxins in Shellfish – metal concentrations and human health risk in clam Saxitoxin Group. The EFSA Journal (2009) 1019, 1–76. (Tapes decussatus) and mussel (Mytilus 20. Regulation (EC) No 853/2004 of the European galloprovincialis) from the Homa Lagoon (Eastern Parliament and of the Council of 29 April 2004 laying Aegean Sea). Environ Sci Pollut Res 2017; 24: 4174- down specific hygiene rules for food of animal origin. 4184. OJ L 139, 30.4.2004, p. 55–205. 29. Locatelli C. Heavy metal determinations in algae, 21. AOAC 2016, Official methods of analysis of AOAC mussels and clams. Their possible employment for International, AOAC International. assessing the sea water quality criteria. J Phys IV France 22. เวณิกา เบ็ญจพงษ์, ทรงศักดิ์ ศรีอนุชาต และ รจนา 2003; 107: 785-788. ชุณหบัณฑิต. สารตะกวและแคดเมียมในอาหาร:่ั เทคนิค 30. Sunlu, U. Trace metal levels in mussels (Mytilus ในการวิเคราะห์หาปริมาณโดยวิธีการยอยสลายในระบบ่ galloprovincialis L. 1758) from Turkish Aegean sea ปิด วารสารมหาวิทยาลัยมหิดล 2537; 1: 133-139. coast. Environ Monit Assess 2006; 114: 273-286.

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 68

31. Maanan M. Heavy metal concentrations in marine 39. R. Watanabe, et al. , Development of ultra- molluscs from the Moroccan coastal region, Environ performance liquid chromatography with post-column Pollut 2008; 153: 176-183. fluorescent derivatization for the rapid detection of 32. Ishak AR, Mohamad S, Soo TK & Hamid FS. saxitoxin analogues and analysis of bivalve monitoring Leachate and surface water characterization and heavy samples, Toxins, 2019, 11, 57. metal health risk on cockles in Kuala Selangor. Procedia-Soc Behav Sci 206; 222: 263-271. 33. Alkarkhi AFM, Ismail N & Easa AM. Assessment of arsenic and heavy metal contents in cockles (Anadara granosa) using multivariate statistical techniques. J Hazard Mater 2008; 150: 783-789. 34. Sudsandee S, Tantrakarnapa K, Tharnpoophasiam P. et al. Evaluating health risks posed by heavy metals to humans consuming blood cockles (Anadara granosa) from the Upper Gulf of Thailand. Environ Sci Pollut Res 2017; 24: 14605-14615. 35. Szefer P, Kim B-S, Kim C-K, Kim EH & Lee CB. Distribution and coassociations of trace elements in soft tissue and byssus of Mytilus galloprovincialis relative to the surrounding seawater and suspended matter of the southern part of the Korean peninsula. Environ Pollut 2004; 129: 209-228. 36. ก้องเกียรติ ปานพรหมมินทร์ และวารินทร์ ธนา สมหวัง. 2556. ความสัมพันธ์ระหวางแพลงก่ ์ตอนพืชที่ ทาให้เก ิดปรากฏการณ์น้ าทะเลเปลี่ยนสีกบคุณภาพนั ้า บริเวณชายฝั่งทะเลจังหวัดสมุทรสาคร. รหัสทะเบียนวิจัย เลขที่ 52-0332-52130. ส านักวิจัยและพัฒนาประมง ชายฝั่ง กรมประมง. 54 หน้า. 37. กรมทรัพยากรทางทะเลและชายฝั่ง. แพลงก์ตอนที่ ส ร้ า ง ส า ร ชี ว พิ ษ . Available at https://www.dmcr.go.th/miniprojects/114/31205. 38. Yue Y, Zhu B, Lun L & Xu N. Quantifications of saxitoxin concentrations in bivalves by high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry with the purification of immunoaffinity column. J Chromatogr B 2020; 1147: 122133.

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 69

การจัดการปัญหาการตกค้างของสารก าจัดศัตรูพืชในผักและผลไม้สดที่ผ่านโรงคัดบรรจุด้วย ระบบตามสอบย้อนกลับ ธนพรรณ แก้วศรีหาวงษ์ 1 สมพนธ์ วรรณวิมลรักษ์2 วรงค์ศิริ เข็มสวัสดิ์3 ชนิพรรณ บุตรยี่ 3,* 1 หลักสูตรวิทยาศาสตรมหาบัณฑิตสาขาพิษวิทยาและโภชนาการเพื่ออาหารปลอดภัย สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล ศาลายา นครปฐม 73170 2 คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยมหิดล ศาลายา นครปฐม 73170 3 สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล ศาลายา นครปฐม 73170

บทคัดย่อ

วัตถุประสงค์ของการศึกษาเพื่อเปรียบเทียบชนิดและปริมาณของสารกาจัดศัตรูพืชตกค้างในผักและ ผลไม้ที่ผานโรงคัดบรรจุที่มีระบบตามสอบย้อนกลับก่ ่อนและหลังดาเนินการบริหารจัดการด้านคุณภาพเพื่อ แกปัญหาการตกค้างในผลผลิต้ วิธีการศึกษาเลือกผลไม้ 2 ชนิด คือ กล้วยและส้ม ผัก 4 ชนิด คือ กระเพรา/ โหระพา คะน้า ถัวฝักยาวและพริก่ โดยสุ่มตัวอยางจาก่ โรงคัดบรรจุ 10 แห่ง วิเคราะห์ชนิดและปริมาณของสาร กาจัดศัตรูพืชตกค้าง ด้วย GC-MS/MS เปรียบเทียบกบั ปริมาณสารพิษตกค้างสูงสุด(MRLs)โดยใช้โปรแกรม NSPPR ชนิดและปริมาณสารกาจัดศัตรูพืชตกค้างถูกน ามาเปรียบเทียบก ่อนและหลังการจัดการด้านคุณภาพ เพื่อลดการตกค้างที่พบ ผลจากการเก็บตัวอยางครั่ ้งแรกพบวากล้วย่ จากโรงคัดบรรจุ 4 แห่งไม่พบการตกค้าง และส้ม 2 ตัวอยาง่ พบการตกค้างของสารกาจัดศัตรูพืชแต ่มีปริมาณต่า กวาค่ า่ MRLs ส่วนผักจากโรงคัดบรรจุที่ รับผลผลิตอินทรีย์ตรวจไมพบการตกค้างของสารก่ าจัดศัตรูพืช คะน้า 2 ตัวอยาง่ จากโรงคัดบรรจุ 4 แห่ง ตรวจ ไมพบสารตกค้าง่ และ 2 ตัวอยาง่ ตรวจพบ Metalaxyl ในปริมาณที่ต่ากว าค่ า่ MRLs ชนิดของสารที่ตรวจพบใน กะเพรา คะน้า ถัวฝักยาว่ ที่สุ่มครั้งแรกพบเกินค่า MRLs ได้แก่ Chlorpyrifos Profenofos และ Metalaxyl จาก โรงคัดบรรจุ 2 แห่ง เมื่อเก็บตัวอยางครั่ ้งที่ 2 หลังจากใช้ระบบตามสอบย้อนกลับเพื่อแกปัญหาพบว้ าตรวจไม่ ่ พบการตกค้างของสารกาจัดศัตรูพืช สรุปได้วา่ การจัดการปัญหาการตกค้างโดยตามสอบย้อนกลับไปยังแปลง ปลูกสามารถแกปัญหาการตกค้างในผลผลิต้

คาส าคัญ: ผักผลไม้สด โรงคัดบรรจุผักผลไม้สด ระบบตามสอบย้อนกลับ สารกาจัดศัตรูพืชตกค้าง คาการตกค้างสูงสุด่

*ผ้รับผิดชอบบทความู ชนิพรรณ บุตรยี่ สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล อาเภอพุทธมณฑล จังหวัดนครปฐม 73170 E-mail: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 70

Management of Pesticide Residue Contamination in Fresh Vegetables and Fruits Produced in Packing Houses Using Traceability System Thanapan Kaewsrihawonga Sompon Wanwimolrukb Varongsiri Kemsawasdc Chaniphun Butryeec,* a Master of Science Program in Toxicology and Nutrition for Food safety, Institute of Nutrition, Mahidol University, Salaya, Nakhon Pathom 73170, Thailand b Faculty of Medicinal Technology, Mahidol University, Salaya, Nakhon Pathom 73170, Thailand c Institute of Nutrition, Mahidol University, Salaya, Nakhon Pathom 73170, Thailand

Abstract

The aims of this study are to compare the amount and type of pesticide residues found in some fruits and vegetables collected from Packing houses with traceability system before and after implementing the quality management system to solve the problem of pesticide contamination in their produces. Two types of fruit (banana and orange) and 4 types of vegetable (holy/sweet basil, Chinese kale, long bean and chili pepper) were collected from 10 Packing houses. All samples were quantified pesticide residues using GC-MS/MS. Data were analyzed in comparison with MRLs using NSPPR software. The types and amounts of pesticide residues were compared between before (collection 1) and after (collection 2) implementation of management. Results showed all banana samples from 4 Packing house were not detected any pesticide residues whereas orange samples from 1 Packing house were detected pesticide residues with lower level than MRLs. Holy basil, Chinese kale and long bean from 1 Packing house that receive vegetables directly from contracted organic farm were not detected pesticide residues. Two of four samples of Chinese kale from each 4 Packing house were not detected pesticide residues whereas 2 samples were found Metalaxyl with lower level than MRLs. Furthermore, Chlorpyrifos, Profenofos and Metalaxyl that were detected and exceeded the MRLs in some samples (holy basil, sweet basil and red chili pepper) from 2 Packing houses in collection 1 could not be detected in collection 2 after implementation of the management. In conclusion, management system that able to trace back to the source of cultivation done by packing house can reduce pesticide residues in their produces.

Keywords: Fresh fruits and vegetables, Packing houses, Traceability system, Pesticide residues, Maximum Residue Limit

*Corresponding author Chaniphun Butryee Institute of Nutrition, Mahidol University, 25/25 Phutthamonthon 4 Road, Salaya, Phutthamonthon, Nakhon Pathom 73170, Thailand Tel. +6602-8002380 ext. 119, Fax. +6602-8893673 Email: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 71

Introduction MRLs are safe for human consumption 4. In Pesticide is any substance intended Thailand, the pesticide residue use to repel, destroy, prevent, or control contamination in fruits and vegetables are certain forms of plant or animal life that are follow to the Notification of the Ministry of considered to be pests1. Pesticides are Public Health No.387: Food Containing widely used in many countries. In Thailand, Pesticide Residues (Pesticide Residues in pesticides are also used as a powerful tool Food) base on the MRLs in Codex for crop protection in order to increase Alimentarius Commission5. production levels, product quality, and Surveillance study in Thailand product appearance2. Although pesticides demonstrated that many fruits and are commonly used in agriculture, but vegetables have contaminated with pesticide pesticides are potentially toxic to other residues at the amounts that higher than the organisms in humans, including farmers and Maximum Residue Limits (MRLs). Butryee consumers who exposed to pesticides 3. To C. and Wimonpeerapattana W. showed that protect consumer health, most countries 16.9% (191 samples) of fruit and vegetable have implemented the regulation of samples (n = 1,131) were contaminated with Maximum Residue Limits (MRLs) for pesticide residues at the level exceeding the pesticide residues in foods. This is mainly to MRLs as analyzed by GC-MS-MS protect the health of consumers. technique6. In addition, data of Thailand A maximum residue limit (MRL) is Pesticide Alert Network (Thai PAN) and the the maximum concentration of a pesticide study of Faculty of Medical Technology, residue (expressed as mg/kg), recommended Mahidol University have reported that some by the Codex Alimentarius Commission to fruits and vegetables were contaminated be legally permitted in food commodities with pesticide residues at the amounts higher and animal feeds. MRLs are based on Good than the MRLs7-12. Agricultural Practice (GAP) data and foods Food supply chain of fresh fruits and derived from commodities that comply with vegetables has structure as flow of water, the respective GAP. MRLs are intended to including upstream, middle-stream, and be toxicologically acceptable. Consideration downstream. Upstream represents the of the various dietary residue estimates and farmers who grown the fruits and vegetables determinations both at the National and in farm. Middle-stream stands for processers International level in comparison with the (in processing and packaging). Downstream Acceptable Daily Intake (ADI) should is sellers and consumers13. In Thailand, indicate that foods complying with Codex processing, packaging, selling of fresh fruits

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 72

and vegetables are authorized and controlled of fruits and vegetables, efficiently by Food and Drug Administration, Ministry traceability system will be able to trace back of Public Health. For efficient control at from products sold in market place to the packing house, the notification of the farm level. All traceable items must be Ministry of public Health No.386 Re: uniquely identified and this information Prescription of production process, would be shared within all affected supply equipment and utensil for production and chain partners15. storage of some fresh fruits or vegetables Thailand has introduced the and labeling has launched. This notification monitoring program of pesticide residues in requires the place for producing fruits and fruits and vegetables for several years. The vegetables (including the packing house) to monitoring method includes random have mandatory standard certification and collection of fruit and vegetable samples traceability system that can trace back to the from markets for pesticide residues farm. To exaltation the packing house detection. Department of medical sciences, produced fresh fruits and vegetables, not Ministry of Public Health reported that only the Good Manufacturing Practice several types of fruits and vegetables are ( GMP) and a traceability system to contaminated with pesticide residues farm/farmer that conform with the criteria of exceeding the maximum residue limits 6. Primary GMP but they also concern in the However, it is whether if the traceability item of control production. The items of system at the packing house can actually control production are composed of reduce the problem of pesticide residues selecting of fresh fruits or vegetables, lists of exceeding MRLs in Thai fruits and farmers/ collector or procurement agent, vegetables. The aims of this study are to non-toxic containers, measures for regular compare the amount and type of pesticide testing of residual chemicals in starting residues found in fruits and vegetables from materials and identifying of batch or date in Packing houses with traceability system production to traceability. In case of self- before and after implementing the quality monitoring in regular practice, the packing management system in order to solve the house can use the high-throughput screening problem of the pesticide contamination in kits (TM test-kits) for monitoring their their produce. suppliers14. Traceability is the ability to trace the history, application or location of that which is under consideration. In the supply chain

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 73

Materials and Methods Chemicals Packing house of fruits and vegetables All organic solvents used were Packing houses conformed to the HPLC grade. Anhydrous magnesium scope of Notification of the Ministry of sulfate, sodium chloride, primary and Public Health Number 386, B.E. 2560 secondary amines (PSA, particle size 40 (2017) Re: Prescription of production μm), graphited carbon black (GCB) and C18 process, equipment and utensil for sorbent (particle size 40 μm) were obtained production and storage of some fresh fruits from Supelco (Sigma-Aldrich Corp., or vegetables and labeling 5 were invited to St.Louis, USA). Acetonitrile was purchased participate in this study. Participants must be from Merck (Darmstadt, Germany). signed in informed consent and were interviewed for Packing house assessment Pesticide standards before their fruit and vegetable products One hundred and five pesticide were sampling. The criteria used to assess standards including 4,4- DDD, 4,4- DDE, GMP for Packing houses were based on Tor- 4,4- DDT, Alachlor, Aldrin, Atrazine, Sor. 13 (60): checklist for auditing of Azinphos- ethyl, Azoxystrobin, Bifenthrin, premise designed for sorting and packing of Butachlor, Cadusafos, Captan, Carbaryl, some fresh fruits or vegetables that present Carbofuran, Carbosulfan, Chlordane, in annex 3 that attached to the Notification Chlorfenvinphos, Chlormefos, of the Ministry of Public Health Number Chlorothalonil, Chlorpyrifos, Chlorpyrifos- 386, B.E. 2560 (2017) 5. The criteria for methyl, Chlorthiophos, Cyfluthrin, packing house with or without traceability Cyhalothrin-ʎ, Cypermethrin, Deltamethrin, system was evaluated by using checklist Diazinon, Dichlorvos, Dicloran, form for auditor. The results of assessment Difenoconazole, Dicofol, Dicrotophos, were divided into 2 types: the packing house Dimethoate, Endosulfan- α, Endosulfan- β, that obtained total scores in all items more Endrin, EPN, Ethion, Fenitrothion, than 60% was classified as packing house Fenobucarb, Fenoxycarb, Fenpropathrin, with traceability system and ones that have Fenthion, Fenvalerate, Fipronil, Flutolanil, scores less than 60% was classified as Flumethrin, Folpet, Fonofos, HCH- γ or Packing house without traceability system. BHC, Heptachlor, Heptachlor epoxide, Finally, ten Packing houses with traceability Hexaconazole, Imibenconazole, system were accepted to participate in our Imidacloprid, Indoxacarb, Iprodione, project. Isofenphos, Isoprocarb, Leptophos, Malathion, Mefenacet, Mepronil,

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 74

Metalaxyl, Methamidophos, Methidathion, reaction monitoring (MRM) acquisition Methiocarb, Methomyl, Methoxychlor, method and two ion transitions at the Metolachlor, Mevinphos, Monocrotophos, experimentally optimized collision energy Omethoate, Paraoxon- methyl, Parathion- (CE) were monitored for each pesticide ethyl, Parathion-methyl, Permethrin, analyte. Phenthoate, Phosalone, Phosmet, Pirimicarb, Pirimiphos-ethyl, Pirimiphos- Fruit and vegetable samples collection and methyl, Prochloraz, Procymidone, preparation Profenofos, Promecarb, Propachlor, Two types of fruit ( banana and Propagite, Propazine, Propiconazole, orange) and 4 types of vegetable (holy basil Propoxur, Prothiophos, Pyraclostrobin, or sweet basil, long bean, Chinese kale and Pyridaben, Tebuconazole, Terbufos, chili or bell pepper) were studied for Tetraconazole, Thiabendazole, pesticide contamination. The criteria for Triadimefon, Triazophos, Trifloxystrobin, sample selection were based on their high Trifluralin, Quintozene and Vinclozolin consumption in Thailand reported in the were purchased from Dr. Ehrenstorfer Food Consumption Data of Thailand16 with (Augsburg, Germany). The purity of these high pesticide residues reported by pesticide standards was more than 98%. authorized organization6. A total of samples Individual stock of standard solutions (1,000 was collected randomly from 10 Packing mg/L) was prepared in acetonitrile. Working houses with traceability system. surrogate spiking standard solutions were Approximately 1 kg of each fruit or prepared by an appropriate dilution of the vegetable was collected and the samples stock solutions with acetonitrile. These were transported to the laboratory for standard solutions were protected from light analysis which was done within 24 hours. and kept at −20 °C until used for experiment. The representative portion ( 150-200 g) of each sample was chopped into tiny pieces Equipments and homogenized using a food processor Detection of pesticides was and mixed carefully. The homogenized performed using a Bruker 456 gas samples were then extracted and treated as chromatography (GC) coupled with Bruker described in the following section 11. Scion Triple Quadrupole mass spectrometer (GC–MS/MS). Details of GC–MS/MS conditions were followed the previous report (Duff and Voglino, 2012). Multiple

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 75

Extraction and analysis of pesticide Management system for reduce pesticide residues residue The analysis of pesticide residues Results obtain from Packing house was performed using the pesticide with traceability system were considered in multiresidue QuEChERS (Quick Easy the amount of the pesticide residues in their Cheap Effective Rugged and Safe) method products. The pesticide residues in some as explained previously 17-19. Extraction of vegetable and fruit samples that found to pesticides was performed by extracting 15 g exceed the MRLs in the first collection of homogenized vegetables or fruits with 15 ( collection 1) were implemented with ml acetonitrile saturated with 6 g of management system (quality control to magnesium sulphate and 1.5 g of sodium reduce the pesticide contamination). The chloride. This extraction process was management systems for each packing pursued by a cleaning up procedure. This house were depend on the source of the was achieved by transferring the supernatant pesticide residue contamination in the (1 mL) into another tube comprising 50 mg starting material using the traceability of primary-secondary amine (PSA), 7.5 mg system that considering by the researcher graphite carbon black (GCB) and 150 mg and the Packing house such as the Pre- magnesium sulphate. After shaking and Harvest Interval (PHI) of raw materials or centrifugation, the extract supernatant was un-intended use of pesticide etc. then transferred to an auto sampler vial for The samples were sampling in the direct injection into the Bruker GC/MS second collection and analyzed the pesticide system. residues after implemented management ( collection 2) . The type and amount of Data analysis pesticides were compared between before The amount of pesticide residue in (collection 1) and after implemented fruit and vegetable samples obtained from management (collection 2). the analysis were compared with MRLs (The Ministry of Public Health No.3875 or Results Codex4) using NSPPR (National Survey Information of packing house with Program on Pesticide Residues) which was traceability system established by Thai FDA in collaboration A number of Packing house of fruits with the Institute of Nutrition, Mahidol and vegetables that participate in our project University. was 10 Packing houses (5 Packing houses for fruit produces and 5 Packing houses for

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 76

vegetable produces) . All Packing houses Packing house was collected depend on were assessed to have a traceability system different suppliers. Two orange samples based on assessments score more than 60%. different type of cultivations (organic and Four in ten Packing houses were passed by pesticide used) were collected from Packing obtained the score at 100%. Six Packing house no.10. For 5 Packing houses of houses were obtained the score lower than vegetable produces, only one type of 100% due to they did not pass some vegetable was produced from each 2 checkpoint (Table 1). Five important Packing houses (Packing houses no.8 and checkpoints that make them to obtain the no.9) for long bean or Chinese kale, score lower than 100% are 1)testing of the respectively. Various types of vegetables chemical residue in regularly that performed were produced in each 3 Packing houses by using high-throughput screening kits and (Packing no.2, no.4 and no.5). One long by laboratories testing, 2) the records bean sample from packing house no. 8 and showing type and volume of production one Chinese kale sample from Packing including selling information, 3) documents house no. 9 were collected. Three types of certified conformity to any standard related vegetable sample (holy basil, Chinese kale to chemical control system in crop and long bean) were collected from Packing cultivation, 4) records showing results of house no. 2 whereas, there were 4 types of chemical residue test in incoming fresh vegetable sample (holy basil, Chinese kale, fruits or vegetables performed by high- long bean and green chili pepper) were throughput screening kit and 5) records collected from Packing house no. 4, and 6 showing results of chemical residue test in types of vegetable sample (holy basil, sweet incoming fresh fruits or vegetables basil, Chinese kale, long bean, red chili performed at least once a year by standard pepper and bell pepper) were collected from accredited laboratories. Packing house no. 5. The numbers of fruit or vegetable sample collected from each Packing house Pesticide standard profiles are shown in Table 1. Five Packing houses of fruits produced banana ( 4 Packing Profile of 105 pesticide standards houses) and orange ( 1 Packing house) . from GC/MS/MS is shown in Figure 1. Different number of banana sample in each

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 77

Figure 1. Chromatogram of pesticide standards using GC/MS/MS

Pesticide residue in fruit and vegetable coded as Packing house no.1 and no.3 were samples collected from packing house not detected pesticide residues in banana There were 25 samples collected samples. Packing house no.6 and no.7 from 10 Packing houses: 8 samples from produces banana samples with different banana, 2 samples from orange, 3 samples supplier (4 suppliers for Packing house no.6 from holy basil, 1 sample of sweet basil, 4 and 2 suppliers for Packing house no.7) that samples from Chinese kale, 4 samples from pesticide residues were not detected. For long bean, 2 samples from chili pepper and Packing house no.10, 2 orange samples from 1 sample of bell pepper. Data on the types of different method of cultivation were produce in each packing house at the first detected pesticide residues ( Chlorpyrifos) time of sample collection is shown in Table but the amount of residue was lower than 1. Five Packing houses of fruit produces MRLs. Samples of pesticide-free orange and

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 78

pesticide-used orange were found MRLs was detected in holy basil whereas Chlorpyrifos at 0.023 and 0.24 ppb, Chlorpyrifos at 0.028 ppb was detected in respectively. Pesticide-used orange was sweet basil that exceeding the MRLs. found the residue of Metalaxyl (a type of However, pesticide residues were not fungicide) at 0.041 ppb; however, these detected in long bean produce of Packing range of residues were lower than MRLs. house no.5. In addition, Metalaxyl was All banana samples were not detected the found at 0.032 ppb that lower than MRLs in pesticide residues. Chinese kale sample and Profenofos was Results from 5 Packing houses of found at 3.26 ppb that exceeding the MRLs vegetable produce participated in our study in red chili pepper sample from Packing showed residue of Metalaxyl in long bean house no.5. Pesticide residues was not sample from Packing house no.8 was detected in Bell pepper. detected at 0.032 ppb that exceeding the MRLs. Metalaxyl at 0.044 ppb was detected Pesticide residues in vegetable samples in Chinese kale sample from Packing house after management with traceability system no.9 but this level was lower than MRLs. The management system for For Packing house no.2, pesticide residues reduction of pesticide residue was were not detected in holy basil, Chinese kale implemented for Packing house no.4, no.5 and long bean samples. In Packing house and no.8. Results of the pesticide residues in no.4, Chlorpyrifos at 0.016 ppb was detected some vegetable and fruit samples from in holy basil sample that exceed the MRLs, Packing house with traceability system were whereas Profenofos and Metalaxyl were found pesticide residues in 11 samples from detected at 0.003 ppb and 0.003 ppb, 5 Packing houses in the first collection respectively, which were lower than MRLs. before implementing management system. Chinese kale was not found to have pesticide There were 5 samples from 3 Packing residues, whereas long bean sample was houses were detected pesticide residues but found Metalaxyl at 0.013 ppb that exceeded these amounts were lower than MRLs and 6 the MRLs. Green chili pepper sample was samples collected from 3 Packing houses found Profenofos at 4.742 ppb that exceeded were detected pesticide residues that the MRLs. In packing house no.5, exceeding the MRLs. Chlorpyrifos at 0.001 ppb that lower than

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 79

Table 1. Pesticide residues in fruit and vegetable samples collected from Packing house at the first collection (collection 1) Packing Score Type of fruits and Type of Pesticide MRLs house obtained vegetables pesticides residues value (ppb) no. (%) (ppb) 1 72.62 Banana ND ND 2 80.29 Holy basil ND ND Chinese kale ND ND Long bean ND ND 3 72.62 Banana ND ND 4 100 Holy basil Chlorpyrifos 0.016 0.01a Profenofos 0.003 0.01a Metalaxyl 0.003 0.01a Chinese kale ND ND Long bean Metalaxyl 0.013 0.01a Green chili pepper Profenofos 4.742 3b 5 100 Holy basil Chlorpyrifos 0.001 0.01a Sweet basil Chlorpyrifos 0.028 0.01a Long bean ND ND Chinese kale Metalaxyl 0.032 2a Red chili pepper Profenofos 3.26 3b Bell pepper ND ND 6 100 Banana ND ND Banana ND ND Banana ND ND Banana ND ND 7 100 Banana ND ND Banana ND ND 8 84.92 Long bean Metalaxyl 0.032 0.01a 9 92.46 Chinese kale Metalaxyl 0.044 2a 10 68.65 Orange (organic) Chlorpyrifos 0.023 1a Orange (pesticide use) Chlorpyrifos 0.24 1a Metalaxyl 0.041 5a a MRLs were obtained from The Notification of the Ministry of Public Health No.387 b MRLs were obtained from Codex ND: Any residue was not determined. (LOD = 0.001 ppb)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 80

The pesticide residues in 6 samples collection 2, only Pirimicarb at 0.003 ppb from 3 Packing houses that found to exceed (MRL) was detected in sweet packing house no.4, holy basil sample was basil sample and Profenofos was detected at found to have Chlorpyrifos, Profenofos and 3.26 ppb (>MRL) in red chili pepper sample Metalaxyl at 0.016 ppb (>MRL), 0.003 ppb in the collection 1; however, no pesticide (

Table 2. Pesticide residue in vegetable samples after management system in Packing house with traceability system

Packing Type of fruits and Collection 1 Collection 2 house no. vegetables Type of ppb Type of ppb pesticides pesticides 4 Holy basil Chlorpyrifos 0.016 ND ND Profenofos 0.003 ND ND Metalaxyl 0.003 ND ND ND ND Pirimicarb 0.003a 5 Sweet basil Chlorpyrifos 0.028 ND ND Red chili pepper Profenofos 3.26 ND ND a MRL of Pirimicarb for holy basil = 0.01 ppb

Discussion pesticide residues in all samples from The obtained score more than 60% packing houses no.1, no.2, no.3, no.6 and was set to classified the packing house with no.7, were not detected. Details about the traceability system in our criteria. This traceability system in each packing house classification did not confirm the produces obtained from manager showed that Packing without pesticide residue according to the house no.2 receives vegetables directly from MRLs but the traceability system in these contracted farm that cultivated organically. packing house can be used to solve the Then, the vegetables from contracted farm problem. The results showed that the were packed in plastic bag by Packing

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 81

houses no.2 with the QR code for used). Sample of pesticide-free was found to traceability that shown the name of packing have pesticide residues namely Chlorpyrifos house, name of farmers and location of at the level of 0.023 ppb that lower than planting area. For Packing houses no.6 and MRLs and this level was lower than the no.7, packaging of banana products has a amount of the orange sample collected from traceability system by using the code the pesticide-used sample that found at 0.24 number due to they have their own farm in ppb. It was noted that higher amount at ten various area. They sent the experts to visit times of residue was found in pesticide-used the farm and control the cultivation until orange than pesticide-free orange. The cause harvest. Although, packing houses no.1 and of pesticide residue in the products that did no.3 met the criteria for having the not use pesticide may due to contamination traceability system for our study but in the washing and sorting step at the packaging of products does not have any packing process that they used the same symbol of traceability. Thus, the consumer machine. Orange cultivation with pesticide- cannot trace back to the source of cultivation used was found Chlorpyrifos (0.24 ppb) and and pool of banana from farms at the step of Metalaxyl (0.041 ppb) but these levels were washing, cutting and incubating process at lower than the MRLs (1 ppb and 5 ppb, the collecting area in packing house can respectively). The fungicide namely have the inefficiently of traceability system. Metalaxyl was detected in the pesticide used Packing houses no.9 and no.10, crop due to using it at the trunk of orange pesticide residues were detected in samples tree whereas the orange crop with pesticide- but lower than the MRLs due to pesticide free did not use them. This is the reason why has been used in each cultivation. Metalaxyl we did not find the fungicide in pesticide- is a fungicide that used at the beginning step free crop. of seeding that the Packing house no.9 has In Packing houses no.4, no.5 and used regularly before preparation of no.8, pesticide residues were detected in seedling. This is the step for hydroponic some samples that exceeding the MRLs. For products in this packing house. The reason Packing houses no.8 in collection 1 (Table of Metalaxyl residue in Chinese kale 1), sample was found Metalaxyl (0.032 ppb) collected from Packing houses no.9 may due that exceed to the MRLs (default limit at to this fungicide was used for seeding 0.01 ppb) however, the Packing houses’ process. For Packing houses no.10, it has manager confirmed that farmers do not use different method of cultivation in 2 products any pesticide in the process of cultivation in of orange (pesticide-free and pesticide- pesticide- free long bean. So, we need the

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 82

sample of long bean to confirm the residue basil and red chili pepper in collection 2 for further analysis in collection 2. However, after implement the management system, the sample has not yet analyzed for samples were not detected any pesticide pesticides/fungicides residue in collection 2 residue. So, strictly practice follow to GAP due to the limitation of plantation period. particularly PHI regulation, can solve the This is the reason that the Packing houses problem of pesticide residue. It is confirmed does not have the product for this time. For that the packing house obtained the highest Packing houses no.5 that obtained score at score (100%) evaluated by check list can 100%, information obtained from solve the problem of pesticide residue in interviewing the manager showed that their produces using traceability system. Packing house was self-grown of some This is confirmed by the Packing house no. vegetable and Packing house received 4 where obtained the score at 100%. vegetable from contracted farms that they For Packing houses no. 4, data was used pesticides in cultivation of vegetable obtained from interviewing the manager. crops. In collection 1, long bean sample There were 2 types of vegetable that was produced by their own farm that GAP self-grown by Packing house (long bean and certified, was not detected any pesticide Chinese kale). Therefore, holy basil and residue. Bell pepper produced by their green chili pepper were received from contracted farm was also not detected any supplier in central distribution market. In pesticide residue. Holy basil received from collection 1, there was no any pesticide new contracted farm was detected residue in Chinese kale due to the pesticide Chlopyrifos at 0.001 ppb that lower than did not use in the cultivation area but MRL (0.01 ppb) whereas Sweet basil was Metalaxyl was detected in long bean that we detected Chlopyrifos at 0.028 ppb that postulate that the farmer used the biological exceeding the MRL (0.01 ppb). Tracing fertilizer that it was made from dry back from Packing house to the source of strawberry, which can cause residues in the cultivation, we found that samples that sample. However, we cannot confirm our detected the pesticide residue exceeding the postulation due to no sample collection in MRLs did not follow the GAP in Pre- collection 2 because the packing houses Harvest Interval (PHI) regulation. Packing have not cultivated this product. house solved the problem by recommending Chlorpyrifos and Profenofos were found farmer members to leave time for an with the level exceed than MRLs in holy appropriate pre-harvest period during which basil and green chili pepper samples, no chemicals was used. The results of sweet respectively, from packing house that

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 83

received from supplier in central distribution were found in the level that lower than the market. Packing house solves the problem MRLs in red chili pepper and Metalaxyl was by tracing back to central distribution found at the level that lower than the MRLs market but they can follow the trace back to in Chinese kale samples. They also found one step only. So, trace back for further step Metalaxyl that exceeding the MRLs in holy in order to identify farm was not possible. basil and yard-long bean samples 11, 23. This is the reason that we found the pesticide contamination in collection 2. Pirimicarb Conclusion were not detected in collection 1 but it was Traceability system is an important detected in collection 2 of holy basil. This tool for the management of pesticide probably because various supplier from residues in fresh fruit and vegetable products unknown source sent their products to at the Packing house. Implementation of the central distribution market. quality management system that able to In consideration with the types of trace back to the source of contamination at pesticides or fungicides residue in collected farm level can solve the problem of pesticide samples, we found Chlorpyrifos, Profenofos residue in their produces. Finally, the and Metalaxyl in some samples. determination of pesticide residue should be Chlorpyrifos and Profenofos is a well- regularly performed for monitoring their known pesticide of the organophosphorus suppliers. family.20, 21 It is used to prevent and reduce insect damage on vegetable crops. Conflict of interest Metalaxyl is a systemic fungicide and has There is no conflict of interest to been used to control plant diseases caused by declare for all authors. Oomycete fungi such as late blight, downy mildews, and Pythium damping-off. References

Application of Metalaxyl is foliar or soil 1. National Institute of Environmental Health incorporation, surface spraying, drenching, sciences pesticides. Available: and seed treatment 22. The results of this https://www.niehs.nih.gov/health/topics/agents study are consistence with other studies, / pesticides /index.cfm, accessed Sep 22, 2018. they found Chlorpyrifos, Profenofos and 2. Panuwet P., Siriwong W., Prapamontol T. and et al. 2012. Agricultural pesticide management Metalaxyl in some samples. Chlorpyrifos in Thailand: Situation and population health level was exceeding to the MRLs in holy risk. Environmental science police: March basil samples and its level was lower than 2012; 17: 72–81. the MRLs in orange samples. Profenofos

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 84

3. Pesticide Action Network UK. Impacts of from local markets and supermarkets in pesticides on health. Available: Thailand. Peer J. 1-23. http://www.pan-uk.org/health-effects-of- 12. Wanwimolruk S, Duangsuwan W, Phopin K, et pesticides, accessed Oct 17, 2018. al. 2017. Food safety in Thailand 5: the effect 4. Codex. Maximum Residue Limits. Available: of washing pesticide residues found in http://www.fao.org/fao-who- cabbages and tomatoes. J Consum Prot Food codexalimentarius/codex-texts/maximum- Saf (2017) 12:209–221. residue limits/en/, accessed Oct 17, 2018 13. Aladdin D. Rillo and Suryo A. Nugroho. 2016. 5. Ministry of Public Health. 2560. The Promoting agricultural value chain integration Notification of the Ministry of Public Health in central asia and the caucasus. ADBI Policy No.387, B.E. 2560 (2017) Re: Food containing Brief: 4. pesticide residues (pesticide residues in food). 14. Ministry of Public Health. 2560. The 6. Butryee C. and Wimonpeerapattana W. 2018. Notification of the Ministry of Public Health Report on database of packing house for No. 386, B.E. 2560 (2017) Re: Prescription of vegetables and fruits production. production process, equipment and utensil for 7. Thailand Pesticide Alert Network: Thai-PAN. production and storage of some fresh fruits or 2559. Report on the results of random sampling vegetables and labeling. of residues in fruits and vegetables No. 2/2559. 15. The Global Language of Business. 2015. 8. Wanwimolruk S, Kanchanamayoon O, Traceability for fresh fruits and vegetables Boonpangrak S, et al. 2015a. Food safety in implementation guide: May 2010; 2: 8-10. Thailand 1: it is safe to eat watermelon and 16. National Bureau of Agricultural Commodity durian in Thailand Environ Health. Prev Med and Food Standards. 2016. Food Consumption 20:204–215. Data of Thailand. 9. Wanwimolruk S, Kanchanamayoon O, Phopin 17. Anastassiades M, Lehotay SJ, Stajnbaher D, et K, et al. 2015b. Food Safety in Thailand 2: al. 2003. Fast and easy multiresidue method pesticide residues found in Chinese kale employing acetonitrile extraction/partitioning (Brassica oleracea), a commonly consumed and “dispersive solid-phase extraction” for the vegetable in Asian countries. Sci Total Environ determination of pesticide residues in produce. 532:447–455. J AOAC Int 86:412–431. 10. Phopin K, Wanwimolruk S and 18. Lehotay SJ. 2007. Determination of pesticide Prachayasittikul V. 2016. Food safety in residues in foods by acetonitrile extraction and Thailand. 3: Pesticide residues detected in partitioning with magnesium sulfate: mangosteen (Garcinia mangostana L.), queen collaborative study. J AOAC Int 90:485–520. of fruits. J Sci Food Agric 2017; 97: 832–840. 19. Lehotay SJ, Lehotaya SJ, Sonb KA, et al. 2010. 11. Wanwimolruk S., Phopin K., Boonpangrak S. Comparison of QuEChERS sample preparation et al. 2016. Food safety in Thailand 4: methods for the analysis of pesticide residues in comparison of pesticide residues found in three fruits and vegetables. J Chromatogr A commonly consumed vegetables purchased 1217:2548–2560.

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 85

20. Alberto A, Fabrizio D, Anna G, et al. 2011. Chlorpyrifos residues levels in fruits and vegetables after field treatment. J Environmental Science and Health, Part B 2011; 46: 544–549 21. M.A. Radwan, M.M. Abu-Elamayem, M.H. Shiboob, et al. 2005. Residual behaviour of profenofos on some field-grown vegetables and its removal using various washing solutions and household processing. Food Chem Toxicol 2005;43: 553–557 22. National Center for Advancing Translational Sciences. Inxigh: Drugs Metalaxyl. Available: https://drugs.ncats.io/drug/16K4M187IF, accessed Sep 24, 2020. 23. Thailand Pesticide Alert Network: Thai-PAN. 2562. Report on the results of random sampling of residues in fruits and vegetables from modern trades and markets.

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 86

การยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียก่อโรคอาหารเป็นพิษ Staphylococcus aureus โดยสารสกัดจาก ใบทับทิมในเอทานอลและน ้า ภิญญาพัชญ์ ดุงโคกกรวด* ชุติภากาญจน์ ก้านกิ่ง นุชรีย์ ถามูลเลศ พรรณวดี ศรีตะวัน พวงเพชร ศรีวิพันธ์ คณะสาธารณสุขศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหาสารคาม

บทคัดย่อ

Staphylococcus aureus (S.aureus) เป็นแบคทีเรียก่อโรคอาหารเป็นพิษที่พบมากในประเทศไทย ทั้ง ในอาหารทะเลที่ปรุงไม่สุกและอาหารค้างคืน การยับยั้งการเจริญของเชื้อจะช่วยป้องกนไมั ่ให้อาหารเน่าเสีย ลดการปนเปื้ อนและการปล่อยสารพิษของเชื้อในอาหาร ซึ่งเป็นสาเหตุที่ก่อให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษใน ผู้บริโภค งานวิจัยนี้มุ่งศึกษาฤทธิ์ต้านการเจริญของเชื้อจุลินทรีย์โดยใช้สารสกดจากใบพืชตามธรรมชาติั และ ประเมินประสิทธิภาพของสารสกดหยาบจากใบทับทิมในการยับยัั ้งการเจริญของแบคทีเรีย S.aureus ผล การศึกษาการสกดใบทับทิมโดยการหมักเย็นด้วยั 95%เอทานอล ได้สารสกดหยาบั 19.15% ปริมาณสารโพลีฟี นอลทั้งหมด 1.486 มก. แทนนิค แอซิด อิควิวาเลนท์/มล. การยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียได้วงใสได้เท่ากบั 1.33-2.60 มม. มีประสิทธิภาพสูงกวาสารสก่ ดจากนั ้ากลั น่ ความเข้มข้นต่าสุดที่สามารถยับยั ้งการเจริญของเชื้อ เทาก่ บั 250 มก./มล. ส่วนการสกดใบทับทิมด้วยนั ้ากลั น่ ได้สารสกดหยาบั 19.42% ปริมาณโพลีฟีนอลทั้งหมด 1.004 มก.แทนนิค แอซิด อิควิวาเลนท์ /มล. การยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียเท่ากบั 1.06 มม. ความเข้มข้น ต่าสุดที่สามารถยับยั ้งการเจริญของเชื้อมากกวา่ 250 มก./มล. จากผลการศึกษาพบวาทั่ ้งสารสกดหยาบจากใบั ทับทิมด้วยเอทานอลและน้าสามารถ แสดงกิจกรรมการยับยั้งเชื้อ S.aureus ได้

คาส าคัญ: สารสกดจากพืชั ใบทับทิม การยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรีย Staphylococcus aureus

*ผ้รับผิดชอบบทความู ภิญญาพัชญ์ ดุงโคกกรวด คณะสาธารณสุขศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหาสารคาม ตาบลขามเรียง อาเภอก นทรวิชัยั จังหวัดมหาสารคาม 44150 E-mail: [email protected], [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 87

Growth Inhibition of Food Poisoning Bacteria Staphylococcus aureus by Ethanoic and Water Pomegranate (Punica granatum Linn.) Leaf Extracts Pinyapach Dungkokkruad* Chutipakan Kanking Nutcharee Tamoonlat Phanwadee Sritawan Puangpech Sriwiphan Faculty of Public Health, Mahasarakham University

Abstract

Bacteria Staphylococcus aureus is the most common cause of food poisoning in Thailand, it is found not only in uncooked seafood but also in overnight foods. Inhibition of microbial growth could prevent food spoilage, food infection and intoxication which are causes of food poisoning in consumer. This research focused on antimicrobial activity of the natural plant leaf extract. The experiments aimed to evaluate the efficiency of pomegranate (Punica granatum Linn.) leaf crude extract for inhibiting food poisoning bacteria Staphylococcus aureus. The results found that pomegranate leaves extracted by maceration method with 95% ethanol produced yield of 19.15%, total polyphenol content of 1.486 mg / ml of tannic acid equivalent. The ethanol pomegranate leaf extract had the higher growth inhibition of bacteria compared with that of water extract, with clear zone diameter at 1.33-2.60 mm. The minimum inhibition concentration (MIC) equaled to 250 mg/ml. However, the pomegranate leaves extracted with distilled water produced the yield of 19.42% and total polyphenol equal to 1.004 mg / ml of tannic acid equivalent. Water extract demonstrated 1.06 mm clear zone with MIC more than 250 mg/ml. The results from this study have shown that both ethanol and water extracts of pomegranate leaves exhibit inhibitory activity against Staphylococcus aureus.

Keywords: Plant extract, Pomegranate leaves, Bacterial growth inhibition, Staphylococcus aureus

*Corresponding author Pinyapach Dungkokkruad Faculty of Public Health, Mahasarakham University, Khamreung, Kantaravichai, Mahasarakham 44150, Thailand E-mail: [email protected], [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 88

Introduction toxemias. Staph bacteria are killed by The estimated global burden cooking, but the toxins are not destroyed and of foodborne illnesses were 9.4 million will still be able to cause illness. Food illnesses, 56,000 hospitalization cases and contaminated with S. aureus toxin may not 1,300 deaths1. There were reported that smell bad or look spoiled5. foodborne pathogens, Staphylococcus Preventing food borne disease by aureus (S. aureus) caused approximately inhibition of the microbial growth can 241,000 illnesses in the United States (US)2. prevent food spoilage, which is cause of Increased infections associated with food poisoning in consumer. Various staphylococcal toxins in 32 European chemical preservatives added in foods raise countries are reported3. The most commonly concern because of their side effects such as reported foods associated with carcinogenicity and teratogenicity. The staphylococcal food poisoning differ widely natural preservatives show the grate results among countries, with poultry, red meat, in their extended utility6. Some reports egg, seafood and dairy products4, raw showed tannin inhibitory activity on animal foods or undercooked meat and different microbial pathogens. The poultry, including an overnight food origin condensed tannins of sainfoin inhibited the are the most likely to be contaminated with proteolytic activity of the ruminal bacteria S. aureus. Moreover, foods that are not Butyrivibrio fibrisolvens A38 and cooked after handling are especially risky if Streptococcus bovis 45S17. contaminated with various bacterial cells, Recently, the great antioxidant especially S. aureus. Normally, people and potency of tannin from different components animals have S. aureus on their skin and in of pomegranate fruit such as juice, peel and their nose. It usually does not cause illness seeds have been discovered. The antioxidant in healthy people, but people who carry S. activity of pomegranate juice is higher than aureus can contaminate food if they don’t other fruit juices and beverages8. Tannin is wash their hands before touching it. Bacteria one of the most abundant compositions of can multiply in the food and produce pomegranate with deferent amount in peels Staphylococcal Enterotoxin (SE), less than 1 and leaves9. There is limited information on microgram of SE can make people ill within the microbial inhibitory effects of natural 1-6 hours after eating the food. substance from pomegranate (Punica Contaminated food with S. aureus 100,000 granatum Linn.) leaves. Therefore, the cells per gram can cause acute infection such objective of this study was to determine the as abscess, pus, septicemia, and acute antimicrobial activity of pomegranate leaf

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 89

extract on bacterial causing food poisoning water were transferred to a 50 mL Staphylococcus aureus. volumetric flask and the volume was filled with a solution of anhydrous sodium

Materials and Methods carbonate (Na2CO3) at 29% (w/v). After 20 Pomegranate leaf extraction minutes, the absorbance corresponding to The pomegranate leaves (Punica total polyphenols was measured at 760 nm granatum Linn.) were obtained from the with spectrophotometer using distilled water farm in Takhonyang district, Mahasarakham for zero adjustment10. province. The leaves were washed with water and then soaked in baking soda mixed Bacterial culture with water for cleaning the pesticide residue. A strain of Staphylococcus aureus The leaves were tested for pesticide TISTR 746 was maintained on agar slope at contamination by using GT-Test kit, and 4°C and sub-cultured for 24 hr before use. then dried in hot air oven at 50 °C for 40 minutes. The dried pomegranate leaves were Bacterial susceptibility testing ground into powder. Fifty grams of the leaf A standardized inoculum (106 cfu/ml powder were dissolved in 200 ml of 95% correspond to 0.5 McFarland standards) was ethanol or distilled water for 24 hours with introduced onto the surface of sterile agar shaking at 200 rpm. The powder was plates, and a sterile glass spreader was used manually separated and ground passed for even distribution of the inoculum. A through muslin cloth, then filtered through sterile paper disc previously soaked in a Whatman No. 1 filter paper. The filtrate was known concentration (15.6,31.5,62.5,125, concentrated using rotary vacuum and 250 mg/ml in sterile water) of crude evaporator at 45 oC, 200 rpm speed., the extract (10 µl per disc) was carefully placed prepared crude extract was stored at 4 ± 2 °C at the center of the labeled seeded plate. The for further experiments. plates were incubated aerobically at 37°C and examined for zones of inhibition after 24 Quantification of total polyphenol content hr. The inhibition zones were measured by a from the pomegranate crude extract Vernier caliper and compared with the An aliquot of 5. 0 mL of the crude control disc (disc containing only sterile extract was taken and diluted with distilled water)11. water in a 50 mL volumetric flask. Then, 1.0 mL of this solution, 1. 0 mL of Folin- Ciocalteu reagent and 10 mL of distilled

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 90

Determination of minimum inhibitory tube containing the growth medium, concentration (MIC) distillated water and the inoculum). The MIC of the extracts was determined lowest concentration (highest dilution) of by dilution of crude extract in sterile water the extract that produced no visible bacterial to various concentrations of 0.48, 0.97, 1.95, growth when compared with the control 3.90, 7.81, 15.62, 31.5, 62.5, 125, and 250 tubes was regarded as MIC. mg/ml respectively. Equal volume of each extract and nutrient broth were mixed in a Results test tube. Specifically, 1 ml of standardized Pomegranate crude extract inoculum (106 cfu/ml) was added to each The 95% ethanol extraction of tube. The tubes were incubated aerobically pomegranate leaves produced the brown at 37°C for 18 - 24 hr. Two control tubes viscous crude extract with gave 19.15% were maintained for each test batch. These yield, whereas, the water extraction included the extraction control (tube produced 19.42% yield of the green powder containing extract and the growth medium extract (Table 1). without inoculum) and organism control (the

Table 1. Crude extract of pomegranate leaf by 95% ethanol compared with water

Extract with 95% Parameter Extract with water Ethanol Dry weight of Pomegranate leaf (g) 200 200

Weight of Pomegranate leaf extract (g) 38.85 38.31

% yield 19.42 19.15

Dark green Dark brown Characteristic of extraction color/Powder color/Viscosity

Quantification of total polyphenol content pomegranate leaves extracted with 95% from the pomegranate crude extract ethanol was higher following the Tannic acid standard curve was pomegranate crude extract, no significance operated as shown in Figure 1. From the different from the extracted with distilled results, tannin quantity from the water. Total polyphenol content was at 1.486

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 91

and 1.004 mg / ml of tannin equivalent, Determination of minimum inhibitory respectively (Figure 2). concentration (MIC) Figure 5 shows the minimum inhibition

concentration (MIC) values obtained for the Bacterial susceptibility testing varied concentration of extracts against the Both water and ethanol pomegranate S. aureus. Bacterial growth was measured leaf extracts were effective on S. aureus using spectrophotometer (730 nm). The strains as judged by the zones of inhibition lowest concentration of the extract that (Figure 3). The water and ethanol produced no visible bacterial growth was pomegranate leaf extract gave the maximum determined as MIC. The ethanol inhibitory effects on the growth of bacteria pomegranate leaves extract showed MIC at with inhibition zone of 1.06 and 2.60 mm, 250 mg/ml, whereas, the MIC raise higher respectively. At the same concentration, more than 250 mg/ml by water pomegranate tetracycline positive control demonstrated leaves extract. Therefore, ethanol the inhibition zone of 24.0 mm. (Figure 4). pomegranate leaves extract had higher effect on S. aureus (Figure 5).

Figure 1. Tannic acid standard curve (wavelength 735 nm)

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 92

Figure 2. Quantification of total polyphenol content from the pomegranate crude extract

Figure 3. Inhibition zone of Staphylococcus aureus strains by 250 mg/ml of pomegranate leaves extract. (A) extract with water (B) extract with 95% ethanol (C) Control (water) (D) Control (95% ethanol) and (E) tetracycline antibiotic.

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 93

Figure 4. Bacterial susceptibility testing. The inhibition zones were measured by a Vernier caliper and compared with the control disc.

Figure 5. Determination of minimum inhibitory concentration (MIC). Bacterial growth was measured using spectrophotometer (730 nm)

Discussion pomegranate extracts contain of alkaloid, It is well-known that plant extract is flavonoid, saponin, and tannin13. Alkaloid a complex mixture of phytochemicals, causes destruction of peptidoglycan in acting on microorganisms via different bacterial cell wall14. Tannin and flavonoid mechanisms, and interacting synergistically affect the permeable ability of cell to achieve antimicrobial effect12. The membrane and reduce the bacterial growth.

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 94

Moreover, saponin could destroy bacterial bacteria by destroying the bacterial plasma cell wall15. membrane. Tannins also can react with Based on our results, the yield of phospholipids found in cell membranes, pomegranate leaves crude extract obtained resulting in damage of the cell membrane, by 95% ethanol and water extractions were causing leakage of essential metabolites that different in color. This finding revealed the inactivate the bacterial enzyme system. compositions in pomegranate leaves such as Damage of the cell membrane can prevent tannin, cellulose, chlorophyll, protein and the entry of food ingredients or nutrients that lipid were differently dissolved by these two are necessary for bacteria to generate solvents16. However, the yield of energy. These experiences result in bacterial pomegranate leaves extracted from ethanol growth inhibition and even death18. and water were not different in this study. Moreover, the inhibitory effects of From our results showed that crude tannins on bacteria have been associated extract of pomegranate leaves had the ability with the binding to extracellular polymers, to inhibit the growth of S. aureus bacteria. inhibition of cell membrane and enzyme This inhibition ability may cause by the activity, and substrate and metal ion biological activity, which is associated with deprivation19. They were reported that an ability to bind and precipitate proteins tannins may inhibit pathogenic bacteria such and other macromolecules from solution17. as Clostridium perfringens20. In these There was reported that tannins can form studies, as in our own, the exact causes of hydrogen bonds with the protein contained tannin in bacterial sensitivity were not in bacterial cells to form a bond tannin- identified. protein. Bonding is the dominant hydrogen The inhibitory effect of bonding between the carboxyl groups of the pomegranate leaf crude extracts on S. aureus peptide bond with the hydroxyl groups of the bacteria may be due to the strong iron tannins causing the denaturation of proteins, binding capacity of tannic acid. Other so that the protein will undergo coagulation. reports suggest that the growth of E. However, tannin can also inhibit growth and coli was restored by the addition of iron to kill bacteria by reacting with the cell the medium after the precipitate caused by membrane. Tannin compounds including tannic acid was removed21. polyphenols, these compounds can inhibit

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 95

Conclusion natural preservative agent for extended shelf- From the results found that the life food products. Modified Atmosphere and Active Packaging Technologies 2012; 685-730. pomegranate leaves extracted with 95% 7. Jones GA, Mccallistf RTA, Muir AD, and ethanol have higher ability to inhibit Cheng KJ. Effects of sainfoin (Onobrychis pathogen bacteria Staphylococcus aureus viciifolia Scop.) condensed tannins on growth with higher total polyphenol content as and protcolysis by four strains of ruminal tannic acid equivalent. The pomegranate bacteria. Appl Environ Microbiol 1994: 60: leaves have active ingredient such as 1374-1378. flavonoid, tannin, sterols, and triterpenes, 8. Seeram NP, Aviram M, Zhang Y, et al. Comparison of antioxidant potency of which are able to inhibit the bacterial commonly consumed polyphenol-rich growth. However, their ability to kill beverages in the United States. Journal of bacteria were lower than the antibiotic, Agricultural and Food Chemistry 2008; 56(4): tetracycline. 1415-1422. 9. Vázquez AL, Koppel K, Chambers IvE, et al. References Instrumental and sensory aroma profile of 1. WHO. Estimates of the Global Burden of pomegranate juices from the USA: differences Foodborne Diseases: Foodborne Disease between fresh and commercial juice. Flavour Burden Epidemiology Reference Group 2007- and Fragrance Journal 2011; 26(2): 129-138. 2015, WHO 2016: 1-254. 10. Marcos AMG, Alice OA, Isabelle CFB, et al. 2. Scharff R.L. Economic burden from health Evaluation of the Folin-Ciocalteu Method and losses due to foodborne illness in the United Quantification of Total Tannins in Stem Barks States. J. Food Prot., 2012; 75: 123-131. and Pods from Libidibia ferrea (Mart. ex Tul). 3. EFSA (European Food Safety Authority) and Braz arch biol technol 2018: 61. ECDC (European Centre for Disease 11. Kabir OA, Olukayode O, Chidi EO, et al. Prevention and Control). The European Union Screening of crude extracts of six medicinal summary report on trends and sources of plants used in South-West Nigerian unorthodox zoonoses, zoonotic agents and food-borne medicine for anti-methicillinresistant outbreaks in 2013. EFSA J. 2015;13(1) : 3991. Staphylococcus aureus activity. BMC 4. LeLoir Y., Baron F., Gautier M. Complementary and Alternative Medicine Staphylococcus aureus and food poisoning 2005; 5(6). Genet. Mol. Res., 2003; 2: 63-76. 12. Burt S. Essential oils: Their antibacterial 5. Yves LL., Florence B, Michel G. properties and potential applications in foods-A Staphylococcus aureus and food poisoning. review. Int J Food Microbiol 2004; 94(3): 223- Genet. Mol. Res. 2003 : 2(1): 7-28. 253. 6. Giatrakou V. and Savvaidis I. Bioactive 13. Kittakoop, P, Mahidol C, Ruchirawat S. packaging technologies with chitosan as a Alkaloids as important Scaffolds in therapeutic

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 96

drugs for the treatments of cancer, tuberculosis inhibitory properties of the synthesis of fungal and smoking cessation. Cur Top Med Chem cell wall polymers. Bioorganic & Medicinal 2014; 14(2): 239-252. Chemistry 2003; 11(7): 1531-1550. 14. Arni ID, Vidya YT. Effectiveness of siwak salvadora persica extract to aggregatibacter actinomycetemcomitans as one of pathogenic bacteria causing periodontal disease. J Dentomaxillofac Sci 2017; 2(1): 28-31. 15. Wina E, Muetzel S, Becker K. The dynamics of major fibrolytic microbes and enzyme activity in the rumen in response to short‐ and long‐term feeding of Sapindus rarak saponins. Journal of Applied Microbiology 2006; 100(1): 114-122. 16. Sultana B, Anwar F, Przybylski R. Antioxidant activity of phenolic components present in barks of Azadirachta indica, Terminalia arjuna, Acacia nilotica, and Eugenia jambolana Lam. trees. Food chemistry 2007; 104(3): 1106- 1114. 17. Mailoa MN, Mahendradatta M, Laga A. Antimicrobial Activities of Tannins Extract from Guava Leaves (Psidium Guajava L) On Pathogens Microbial. Int. J. Sci. Technol 2014; 3(1). 18. Scalbert A. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry 1991; 30(12): 3875-3883. 19. Alexandra HS, Erwin Z, Roderick IM. Bacterial Mechanisms to Overcome Inhibitory Effects of Dietary Tannins. Microbial Ecology 2005; 50: 197–205. 20. Henis Y, Tagari H and Volcani R. Effect of water extracts of carob pods, tannic acid, and their derivatives on the morphology and growth of microorganisms. Applied microbiology 1964; 12(3): 204-209. 21. Sortino M, Enriz RD, Ribas JC and Zacchino S. In vitro antifungal activity of new series of homoallylamines and related compounds with

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 97

Abstracts

Poster Presentation

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 98

P1. Protective Effect of Phyllanthus acidus Fruit Extract against UVB-induced Oxidative Stress in Human Keratinocytes HaCaT Cells Napasorn Somkiat1 Cholticha Niwaspragrit2 Kittiya Malaniyom1 Piyanee Rattanachomnong2 Yamaratee Jaisin1* 1Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Srinakarinwirot University, Bangkok 10110, Thailand 2Agricultural Technology Department, Thailand institute of Scientific and Technological Research (TISTR), Pathum Thani 12120, Thailand 3Department of Pharmacology, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok 10400, Thailand

Abstract

Ultraviolet B or UVB (wavelength spectrum from 280 to 320 nm), a component of sunlight plays a harmful role in producing sunburn. UVB irradiation on skin cells induces the generation of reactive oxygen species (ROS) which leads to oxidative cell damage, directly causes DNA damage, and partially triggers skin cancer by long term exposure. Phyllanthus acidus, known as star gooseberry, is one of Thai native fruits that widely used in Thai traditional medicine. It contains high vitamin C and antioxidants. Thus, this study firstly investigated its protective and antioxidant effects against UVB-irradiated human keratinocytes, HaCaT cells. Resazurin assay was performed to evaluate the nontoxic concentrations of Phyllanthus acidus fruit extract and its protective effect on UVB-induced cell death, while Griess assay was conducted to evaluate the free radical scavenging effect of the extract on NO generated inside the cells-irradiated UVB. It discovered that pretreatment with the extract at the concentrations of 12.5, 25, and 50 µg/mL before exposure to UVB on cells; the cell viability was significantly increased and the extract was also not toxic. Moreover, the extract could significantly inhibit NO radicals. These results demonstrated that the extract improves the survival rate of UVB-irradiated human keratinocytes via protective and antioxidative effects. Based on these results, we suggest that Phyllanthus acidus is worthwhile for use as a herbal cosmetic ingredient to protect skin from UVB exposure, however, further investigate needs to study protective effects on the other cascade signaling, like apoptosis.

Keywords: Phyllanthus acidus fruit extract, Ultraviolet B, Keratinocyte cells, Antioxidant, Protective effect

*Corresponding author

Yamaratee Jaisin Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Srinakarinwirot University, Bangkok 10110, Thailand Tel. +66818993490 E-mail: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 99

P2. Physiologically-based Pharmacokinetic Model Development for Morphine and NSAIDS: Application to Predict Potential Pharmacokinetic Drug-Drug Interaction in Humans Verawan Uchaipichat* Faculty of Pharmaceutical Sciences, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailand

Abstract

Previous in vitro study in this laboratory has shown that NSAIDs can inhibit morphine 3- and 6- glucuronidation with varying degree. Of interest, diclofenac and naproxen exhibit moderate inhibition, and thus may potentially cause pharmacokinetic drug-drug interaction (DDI) when co- administered with morphine in vivo. This study aims to investigate DDI potential arising from diclofenac or naproxen inhibition on morphine glucuronidation by using physiologically-based pharmacokinetic (PBPK) modelling. Simcyp software was employed to construct PBPK model in healthy and cirrhotic subjects and to predict the magnitude of the in vivo DDI. The models were verified by comparing the predicted pharmacokinetic parameters with those observed in literature. Results showed that PBPK models for morphine intravenous and oral in healthy and cirrhosis subjects were successfully constructed as the predicted versus observed ratio of pharmacokinetic parameters were within a two-fold range. Moreover, the predicted morphine clearance in cirrhosis were about 1.7 to 2.4-fold lower than those predicted in healthy subjects which is consistent with those reported in humans. The PBPK model also well predicted diclofenac and naproxen pharmacokinetic in healthy subjects. Validated models were further employed to simulate DDI trials based on usual dose of morphine and NSAIDs. The predicted DDI magnitude were found negligible (morphine AUC increase less than 2%), although potential DDI tends to be higher in cirrhosis subjects. In conclusion, PBPK models for morphine, diclofenac and naproxen were successfully developed, however based on simulated trials, potential DDI arising from morphine glucuronidation inhibition by both NSAIDs is found clinically irrelevant.

Keywords: Morphine, NSAIDs, Glucuronidation, Drug-drug interaction, Physiologically-based pharmacokinetic

*Corresponding author

Verawan Uchaipichat Clinical Pharmacy Division, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailand Tel. +66834033382 E-mail: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 100

P3. Air–Liquid Interface Culture Enhances the Structural and Functional Differentiation of Caco-2 Cell Line Chanikarn Kunyanee* Ratjika Wongwanakul Sasitorn Aueviriyavit Nano Environmental and Health Safety Research Team, National Nanotechnology Center (NANOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Pathum Thani 12120, Thailand

Abstract

Caco-2 cell line derived from human colon carcinoma and cultured in liquid-liquid interface (LLI) condition has been widely used as a model of intestinal barrier. One of the most important merit is its capability to spontaneously differentiate to be the intestinal epithelial cells with several typical characteristics of absorptive enterocytes with brush border layers as shown in the small intestine. However, Caco-2 cell model cultured in the LLI condition failed to predict absorption of some drugs especially the carrier-mediated drugs. In this study, we aimed to compare structure and function of Caco-2 cell model developed from two culture methods, LLI and air- liquid interface (ALI) condition. Compared with submerged (LLI) condition, ALI condition enhances oxygen permeability during culture and differentiation. Our results show that ALI culture increases the thickness of intestinal epithelial cell layer and the height of microvilli as characterized by Haemotoxylin and Eosin staining and scanning electron microscope. In addition, we compared the drug permeation in LLI and ALI condition using furosemide, atenolol and carbamazepine. Subsequently, the drug absorption fraction was quantified by liquid chromatography-mass spectrometry. Furosemide and atenolol were selected as poor correlation drugs between Caco-2 cells and human intestine; whereas, carbamazepine represents a high correlation drug. Our results indicate that ALI culture enhances the drug absorption of furosemide and atenolol in comparison to LLI condition. In conclusion, the ALI culture enhances the structural and functional differentiation of Caco-2 cell line and supports the usefulness of ALI cultured Caco-2 model as a model intestinal epithelium.

Keywords: Caco-2, Human intestine, Air-liquid interface (ALI), Drug absorption, Intestinal Differentiation

*Corresponding author

Chanikarn Kunyanee Nano Environmental and Health Safety Research Team, National Nanotechnology Center (NANOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Pathum Thani 12120, Thailand Tel. +66894275529 E-mail: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 101

P4. Development of 3D-intestinal Model for Applications in Food, Nutraceutical, Agricultural, Pharmaceutical and Herbal Industries Ratjika Wongwanakul* Chanikarn Kunyanee Narinrat Petpiroon Sasitorn Aueviriyavit

Nano Environmental and Health Safety Research Team, National Nanotechnology Center (NANOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Pathum Thani 12120, Thailand

Abstract

The conventional Caco-2 cell model cultured in two dimensional (2D) structure are widely used as a model of intestinal barrier. However, low physiological relevance of cancerous Caco-2 cells and 2D culturing technique leads to poor accuracy of in vivo prediction. To overcome the above limitation, we aim to establish the 3D-intestinal model as an in vitro testing platform to resemble the structure and function of intestinal tissues. In our research, intestinal organoids derived from human and porcine intestinal crypts were established and used as the cell sources in the 3D-intestinal model development. The developed 3D-intestinal model shows the structure and functionality of intestinal epithelium. The histological images and scanning electron micrographs clearly demonstrated mucus layer, villi and sub-villi structure. The expression of differentiated markers (tight junction protein, villin) was confirmed by immunofluorescence. Furthermore, 3D- intestinal model is able to co-culture with other cell types such as immune cells and gut microbiota to mimic complexity of intestinal tissues. Our biomimetic 3D-intestinal model could bridge the gap between in vitro and in vivo model and improve the prediction of the biological response occurred in the small intestine. The 3D-intestinal model can be applied in the fields of pharmacological and toxicology such as drug absorption, drug toxicity, microbial interaction and food allergy in food, nutraceutical, agricultural, pharmaceutical and herbal industries.

Keywords: Intestinal organoid, 3D-intestinal model, Nutraceuticals, Food safety

*Corresponding author

Ratjika Wongwanakul Nano Environmental and Health Safety Research Team, National Nanotechnology Center (NANOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Pathum Thani 12120, Thailand Tel. +66868972229 E-mail: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 102

P5. Effects of Arsenic Treatment on Oxidative Damage and Telomere Length in Human Cholangiocyte (MMNK-1 Cells) Chanya Archapraditkul1,* Jutamas Bussarakum1,* Panida Navasumrit1,2 Jeerawan Promvijit1 Thitirat Ngaotepruttaram1 Potchanee Hunsonti1 Mathuros Ruchirawat1,2 1Laboratory of Environmental Toxicology, Chulabhorn Research Institute, Bangkok 10210, Thailand 2Center of Excellence on Environmental Health and Toxicology, Bangkok 10400, Thailand

Abstract

Cholangiocarcinoma (CCA), a bile duct cancer with a poor prognosis, is increasing worldwide. Currently, the high incidence of CCA was found in various areas in Thailand especially in north and northeast regions. Environmental contamination of arsenic has been found in these areas. The present study aimed to investigate the effects of arsenic exposure on oxidative damage and telomere length in cholangiocyte cell line (MMNK-1). MMNK-1 cells were treated with various concentration of sodium arsenite (0-2 µM) for 24 hours. HPLC-MS/MS analysis revealed a dose-response relationship of arsenite treatment induces oxidative damage determined as protein oxidation (dityrosine) and lipid peroxidation (8-isoprostane and malondialdehyde). In addition, the formation of 1,N6-ethenodeoxyadenosine (1,N6ɛdA), a mutagenic DNA adduct derived from lipid peroxidation, was significantly increased by 1.6-fold (p<0.05) in arsenic-treated cells. Furthermore, telomere length was measured by monochrome multiplex quantitative PCR (MMQPCR). The telomere length of arsenite-treated cholangiocytes was significantly lower than that of untreated cells by 1.12-fold (p<0.05). In conclusion, this study demonstrated that arsenite treatment causes oxidative damage, particularly mutagenic DNA adduct and telomere shortening in cholangiocytes. These molecular alterations may contribute to genetic damage and development of cholangiocarcinogenesis.

Keywords: Cholangiocarcinoma, Arsenic, Oxidative damage, Telomere length

*Corresponding author

Chanya Archapraditkul, Jutamas Bussarakum Laboratory of Environmental Toxicology, Chulabhorn Research Institute, Bangkok 10210, Thailand E-mail: [email protected], [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 103

P6. Assessment of Exposure to Ambient Ultrafine Particles and DNA Damage in Population Living in Traffic-congested Areas Auravee Puttinad1 Panida Navasumrit1 Chalida Chompoobut1 Samroeng Chanjamsai1 Natenapa Nakngam1 Mathuros Ruchirawat1 1Laboratory of Environmental Toxicology, Chulabhorn Research Institute, Laksi, Bangkok 10210, Thailand

Abstract

Particulate air pollution has become a major environmental health concern worldwide. Outdoor particulate matter (PM) is now classified as human carcinogen (IARC Group1, 2013). The toxicity of PM depends on its chemical compositions and particle size, especially with fine PM (≤ 2.5 μm), submicron (≤ 1 μm) and ultrafine PM (≤ 0.1 μm) which can lead to oxidative damage. This study aimed to assess personal exposure to ultrafine PM (UFPs) and oxidative DNA damage in individuals residing in high-traffic urban area of Bangkok and less traffic congested in peri-urban area. A total of 60 volunteers were recruited from subjects residing in high- and low- traffic areas. The results showed that levels of ambient UFPs increased by 1.6-fold in high-traffic area. Mean levels of individual exposure to UFPs and number of UFPs in exhaled breath condensate (EBC) were higher in subjects residing in high traffic are by 1.5-fold (p<0.01) and 2- fold, (p<0.001), respectively. Biomarkers of oxidative DNA damage, 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) and 8-nitroguanine, were determined by HPLC-MS/MS analysis. These mutagenic DNA adducts were significantly increased by 1.43-fold in subjects residing in high-traffic area. In conclusion, the levels of ambient UFPs were higher in high-traffic area suggesting that traffic is a major source of UFPs in urban setting. Subjects living in high traffic area are at greater risk of exposure and therefore to oxidative damage to DNA. These results can be used as guidelines for regulating particulate vehicles emissions including UFPs in order to improve air quality and reduce risk to human health.

Keywords: Ultrafine particles, Oxidative damage biomarkers, 8-hydroxydeoxyguanosine and 8- nitroguanine

*Corresponding author

Auravee Puttinad Laboratory of Environmental Toxicology, Chulabhorn Research Institute, Bangkok 10210, Thailand E-mail: auravee @cri.or.th

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 104

P7. Exposure to Arsenic in Utero Associated with Various Types of DNA Damage and Micronuclei in Newborns Panida Navasumrit1 Jeerawan Promvijit1,* Varabhorn Parnlob1 Somchamai Waraprasit1 Mathuros Ruchirawat1 1Laboratory of Environmental Toxicology, Chulabhorn Research Institute, Laksi, Bangkok 10210, Thailand

Abstract

Exposure to arsenic in utero may increase the risk of adverse health effects and development of diseases later in life. The present study aimed to evaluate potential health risks of in utero arsenic exposure on genetic damage in newborns in relation to maternal arsenic exposure. A total of 205 pregnant women residing in arsenic-contaminated areas in Hanam province, Vietnam, were recruited. Maternal arsenic exposure was stratified as low, medium and high exposure groups according to toenail arsenic levels <0.5 µg/g, 0.5-1 µg/g and >1 µg/g, respectively. Genetic damage in newborns was assessed by various biomarkers of early genetic effects including oxidative/nitrative DNA damage (8-hydroxydeoxyguanosine, 8-OHdG, and 8- nitroguanine), DNA strand breaks and micronucleus (MN) in cord blood. Arsenic exposure in utero is associated with genotoxic effects in newborns indicated as increased levels of 8-OHdG (p<0.05), 8-nitroguanine (p<0.05), DNA strand breaks (p<0.001) and MN frequency in cord blood (p<0.01) with increasing levels of maternal arsenic exposure. Maternal toenail arsenic level was significantly associated with all biomarkers of early genetic effects. The results obtained provide evidences to support an association between arsenic exposure in utero and genetic damage in newborns which may increase risk for disease, including cancer development later in life. Therefore, the establishment of national and global policies for prevention and mitigation of arsenic exposure especially in pregnant women and children is needed.

Keywords: In utero arsenic exposure, Genetic damage, Oxidative/Nitrative DNA damage, DNA strand breaks, Micronucleus

*Corresponding author

Jeerawan Promvijit Laboratory of Environmental Toxicology, Chulabhorn Research Institute, Bangkok 10210, Thailand E-mail: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 105

P8. Assessment of Arsenic Exposure and Arsenic Methylation Capacity in Pregnant Woman Krittinee Chaisatra1,* Panida Navasumrit1 Thundorn Sanenukul1 Suppachai Chunvises1 Mathuros Ruchirawat1 1Laboratory of Environmental Toxicology, Chulabhorn Research Institute, Laksi, Bangkok 10210, Thailand

Abstract

Cumulative evidence indicates that maternal arsenic exposure may lead to health hazards in fetus and newborns. Maternal capabilities of arsenic biotransformation and elimination may influence the susceptibility of arsenic toxicity. This study aimed to assess arsenic exposure and arsenic methylation capacity in pregnant women in Hanam Province, Vietnam. This province has high levels of arsenic contamination in groundwater and in household drinking water. The study comprised 205 healthy pregnant volunteers at the mean age 26.6 years old and gestational age at 25 weeks. Maternal arsenic exposure was determined by arsenic concentration in toenail (biomarker of long term exposure) and in urine (biomarker of recent exposure). When arsenic- exposed groups stratified by toenail arsenic concentration as low (<0.5 µg/g), medium (0.5-1 µg/g) and high (>1 µg/g), arsenic concentrations in toenails and urine were significantly higher (p< 0.01) in medium- and high-exposed groups than low-exposed group. Urinary arsenic metabolites measured as inorganic arsenic (iAs), monomethylated arsenic (MMA) and dimethylated arsenic (DMA) were significantly increased with increasing exposure level. The arsenic methylation capacity, determined as (DMA/MMA+DMA), was significantly decreased in high arsenic exposed group (p<0.05) suggesting that the ability to methylate arsenic metabolites was lower with higher arsenic exposure. Additionally, arsenic exposure in newborns, determined by cord blood arsenic concentrations, increased significantly with increasing levels of maternal exposure (p<0.001) indicating that arsenic exposure occurs in newborns as a result of maternal exposure during pregnancy. This study highlights the importance of prevention and the need for effective strategies to reduce the risk of arsenic exposure during pregnancy.

Keywords: Arsenic, Maternal arsenic exposure, Arsenic metabolites, aAsenic methylation capacity

*Corresponding author

Krittinee Chaisatra Laboratory of Environmental Toxicology, Chulabhorn Research Institute, Bangkok 10210, Thailand E-mail: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 106

P9. Insulin Signaling Promotes DNA Damage Response and Is Required for Cell Cycle Arrest Induced by Etoposide in Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells Kanjanamas Maliphol1,2 Naphada Leelaprachakul1,2 Daranee Visitnonthachai1 Kanjana Chaiyot1 Piyajit Watcharasit1,2,3,* Jutamaad Satayaviavad1,2, 3 1Laboratory of Pharmacology, Chulabhorn Research Institute, Thailand 2Environmental Toxicology, Chulabhorn Graduate Institute, Thailand 3Center of Excellence on Environmental Health and Toxicology (EHT), Ministry of Higher Education Science Research and Innovation, Thailand

Abstract

Insulin and Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) are closely related proteins known to have protective effect against many toxic insults including DNA damage. IGF-1 receptor disruption has been shown to abrogate activation of DNA damage response proteins. IGF-1 and insulin signaling are often crosstalk thus the present study investigated whether disruption of insulin signaling affected DNA damage response. Human neuroblastoma SH-SY5Y cells which have intact insulin signaling and etoposide, a topoisomerase II inhibitor, were used as a cell model and DNA damaging agent, respectively. Following etoposide treatment, γH2AX (a DNA double strand break marker), DNA damage response proteins, pChk2 and p53, as well as p21 (a cell cycle arrest marker) were prominently increased. Pretreatment with HNMPA (insulin receptor tyrosine kinase inhibitor) resulted in a significant decrease of γH2AX (a DNA damage marker) and p53 following etoposide treatment while insulin increased these effects. Etoposide-induced Chk2 phosphorylation at 1 and 3 hours were reduced by HNMPA but at 6 hours was increased. Oppositely, this induction was potentiated by insulin stimulation. Intriguingly, p21 induction by etoposide was abolished by HNMPA while it was potentiated by insulin. Therefore, we conclude that insulin signaling i) provides protection against DNA double strand break ii) promotes DNA damage response iii) is required for DNA damage-induced cell cycle arrest. Hence, insulin impairment condition such as diabetes may lead to improper responses to DNA damage and consequently leading to inefficient repair and eventually permanent damage to DNA.

Keywords: Insulin signaling, Insulin inhibitor, DNA damage, cell cycle arrest

*Corresponding author

Piyajit Watcharasit Laboratory of Environmental Toxicology, Chulabhorn Research Institute, Bangkok 10210, Thailand E-mail: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 107

P10. Investigation of Mutagenic Activity of Cannabis sativa L. Extract Using Supercritical Fluid Extraction Assay Praw Suppajariyawat* Sutjarit Aunkat Wijittra Sudhong Sekrachatakorn Buabao Sarayut Radapong Pornachai Sincharoenpokai Toxicology Laboratory, Medicinal Plant Research Institute, Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Thailand

Abstract

Cannabis sativa L. is an addictive plant allowed for medical or recreational use in some countries. In Thailand, several sectors currently have tremendous effort to make use of this plant legally by conducting the research and development to prove the efficacy and safety of its products more extensively. There have been reported that this plant shows the property of prevention and treatment to various diseases. Cannabis products have been launched and consumed dramatically by the public; however toxicity and safety data are still limited. This study, therefore, aimed to investigate the mutagenic activity of C. sativa extract by supercritical fluid extraction, following the method complied with the OECD GLP test guideline 471. The four strains of Salmonella typhimurium (TA98, TA100, TA1535, TA1537) and Escherichia coli (WP2) were treated with five different doses of the extract at 1250, 2500, 5000, 10000 and 20000 µg/ml with and without metabolic activation enzymes. The results showed that the extract did not produce significantly the revertant colonies and showed normal of the background lawn in all strains of bacteria and all concentrations of the extract compared to the control groups (both non- and enzymatic activation). In conclusion, the compound did not cause mutagenicity. This preliminary study indicated that the C. sativa extract obtained from supercritical fluid extraction was considered non-mutagenic in the current bacterial reverse mutation test.

Keywords: Cannabis sativa’s extract, Mutagenic activity, Supercritical fluid extraction, Ames test

*Corresponding author

Praw Suppajariyawat Toxicology Laboratory, Medicinal Plant Research Institute 88/7 Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health Talad kwan Muang Nonthaburi, Thailand 11000 Email: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 108

P11. Heavy Metals and Saxitoxin Contents in Bivalve Mollusk Sold in Thailand Mathavee Phatkul1 Pharrunrat Tanaviyutpakdee2 Weeraya Karnpanit2* 1Master of Science Program in Toxicology and Nutrition for Food Safety, Institute of Nutrition, Mahidol University 2Institute of Nutrition, Mahidol University

Abstract

Bivalves are popular aquatic animals for human consumption. However, the environmental pollution problems, especially in the coastal areas can lead to high accumulation of toxins in bivalves. The present study aimed to determine lead (Pb) and cadmium (Cd), and saxitoxin in commonly consumed bivalves namely clam, mussel and cockle sold in large seafood markets in Thailand. The results showed that the average contents of Pb in three types of bivalve samples were 0.07 and 0.45 mg/kg wet weight and dry weight, respectively. The average levels of cadmium in the bivalve samples were 0.16 and 1.08 mg/kg wet weight and dry weight, respectively. The average saxitoxin level in the bivalve samples was 2.36 mg/kg (wet weight). It was found that the average levels of Pb, Cd and saxitoxin in cockles were significantly higher than those of clam and mussel. It is noteworthy that all of the bivalve samples purchased from large seafood markets of Thailand contained Pb, Cd and saxitoxin complying with the national or international standards. The outcomes from this study may be used as a supporting information for development of food safety surveillance plans and establishment of the standard on contaminants in foods.

Keywords: Lead, Cadmium, Saxitoxin, Bivalve

*Corresponding author

Weeraya Karnpanit Institute of Nutrition, Mahidol University, Salaya, Phutthamonthon, Nakhon Pathom 73170 Tel. 0-2800-2380 Ext. 311 Fax. 0-2441-9344 Email: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 109

P12. Management of Pesticide Residue Contamination in Fresh Vegetables and Fruits Produced in Packing Houses Using Traceability System Thanapan Kaewsrihawonga Sompon Wanwimolrukb Varongsiri Kemsawasdc Chaniphun Butryeec,* a Master of Science Program in Toxicology and Nutrition for Food safety, Institute of Nutrition, Mahidol University, Salaya, Nakhon Pathom 73170, Thailand b Faculty of Medicinal Technology, Mahidol University, Salaya, Nakhon Pathom 73170, Thailand c Institute of Nutrition, Mahidol University, Salaya, Nakhon Pathom 73170, Thailand

Abstract

The aims of this study are to compare the amount and type of pesticide residues found in some fruits and vegetables collected from Packing houses with traceability system before and after implementing the quality management system to solve the problem of pesticide contamination in their produces. Two types of fruit (banana and orange) and 4 types of vegetable (holy/sweet basil, Chinese kale, long bean and chili pepper) were collected from 10 Packing houses. All samples were quantified pesticide residues using GC-MS/MS. Data were analyzed in comparison with MRLs using NSPPR software. The types and amounts of pesticide residues were compared between before (collection 1) and after (collection 2) implementation of management. Results showed all banana samples from 4 Packing house were not detected any pesticide residues whereas orange samples from 1 Packing house were detected pesticide residues with lower level than MRLs. Holy basil, Chinese kale and long bean from 1 Packing house that receive vegetables directly from contracted organic farm were not detected pesticide residues. Two of four samples of Chinese kale from each 4 Packing house were not detected pesticide residues whereas 2 samples were found Metalaxyl with lower level than MRLs. Furthermore, Chlorpyrifos, Profenofos and Metalaxyl that were detected and exceeded the MRLs in some samples (holy basil, sweet basil and red chili pepper) from 2 Packing houses in collection 1 could not be detected in collection 2 after implementation of the management. In conclusion, management system that able to trace back to the source of cultivation done by packing house can reduce pesticide residues in their produces.

Keywords: Fresh fruits and vegetables, packing houses, traceability system, pesticide residues, Maximum Residue Limit

*Corresponding author

Chaniphun Butryee Institute of Nutrition, Mahidol University, 25/25 Phutthamonthon 4 Road, Salaya, Phutthamonthon, Nakhon Pathom 73170, Thailand Tel. +6602-8002380 ext. 119, Fax. +6602-8893673 Email: [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10) 110

P13. Growth Inhibition of Food Poisoning Bacteria Staphylococcus aureus by Ethanoic and Water Pomegranate (Punica granatum Linn.) Leaf Extracts Pinyapach Dungkokkruad* Chutipakan Kanking Nutcharee Tamoonlat Phanwadee Sritawan Puangpech Sriwiphan Faculty of Public Health, Mahasarakham University, Khamreung, Kantaravichai, Mahasarakham 44150, Thailand

Abstract

Bacteria Staphylococcus aureus is the most common cause of food poisoning in Thailand, it is found not only in uncooked seafood but also in overnight foods. Inhibition of microbial growth could prevent food spoilage, food infection and intoxication which are causes of food poisoning in consumer. This research focused on antimicrobial activity of the natural plant leaf extract. The experiments aimed to evaluate the efficiency of pomegranate (Punica granatum Linn.) leaf crude extract for inhibiting food poisoning bacteria Staphylococcus aureus. The results found that pomegranate leaves extracted by maceration method with 95% ethanol produced yield of 19.15%, total polyphenol content of 1.486 mg/ ml of tannic acid equivalent. The ethanol pomegranate leaf extract had the higher growth inhibition of bacteria compared with that of water extract, with clear zone diameter at 1.33-2.60 mm. The minimum inhibition concentration (MIC) equaled to 250 mg/ml. However, the pomegranate leaves extracted with distilled water produced the yield of 19.42% and total polyphenol equal to 1.004 mg/ml of tannic acid equivalent. Water extract demonstrated 1.06 mm clear zone with MIC more than 250 mg/ml. The results from this study have shown that both ethanol and water extracts of pomegranate leaves exhibit inhibitory activity against Staphylococcus aureus.

Keywords: Plant extract, Pomegranate leaves, Bacterial growth inhibition, Staphylococcus aureus

*Corresponding author

Pinyapach Dungkokkruad Faculty of Public Health, Mahasarakham University, Khamreung, Kantaravichai, Mahasarakham 44150, Thailand Tel. +6643754353, Moblie. +66823168235, Fax. +6643754353 E-mail: [email protected], [email protected]

THE 10th NATIONAL CONFERENCE IN TOXICOLOGY (NCT10)

The 10th National Conference in Toxicology

“Toxicology and COVID─19”