Universidade Federal Do Ceará Faculdade De Medicina Departamento De Fisiologia E Farmacologia Programa De Pós-Graduação Em Farmacologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

THAIS MURATORI HOLANDA

EFEITO FARMACOLÓGICO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO COM LIGANTES 2- IMIDAZOLIDINETIONA NA REATIVIDADE VASCULAR IN VITRO E DA INTERAÇÃO FÁRMACO-RECEPTOR IN SILICO

FORTALEZA 2019

THAIS MURATORI HOLANDA

EFEITO FARMACOLÓGICO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO COM LIGANTES 2- IMIDAZOLIDINETIONA NA REATIVIDADE VASCULAR IN VITRO E DA INTERAÇÃO FÁRMACO-RECEPTOR IN SILICO

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Farmacologia. Área de Concentração: Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho.

Coorientador: Prof. Dr. Francisco Vagnaldo Fechine

FORTALEZA 2019

THAIS MURATORI HOLANDA

EFEITO FARMACOLÓGICO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO COM LIGANTES 2- IMIDAZOLIDINETIONA NA REATIVIDADE VASCULAR IN VITRO E DA INTERAÇÃO FÁRMACO-RECEPTOR IN SILICO

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho (Orientador) Universidade Federal do Ceará (UFC)

Profª. Drª. Roberta Jeane Bezerra Jorge Universidade Federal do Ceará (UFC)

Prof. Dr. Luiz Gonzaga de França Lopes Universidade Federal do Ceará (UFC)

Profª. Drª. Karilane Maria Silvino Rodrigues Universidade Federal do Amapá (UNIFAP)

Profª. Drª. Mirizana Alves de Almeida Centro Universitário Christus (UNICHRISTUS)

À minha família, que tanto me apoia e torce por mim.

AGRADECIMENTOS

À Deus, primeiramente, por traçar e iluminar meus caminhos, por me permitir oportunidades engrandecedoras e conhecer pessoas extraordinárias, pela minha saúde e capacidade de agregar e repassar conhecimento.

À Universidade Federal do Ceará (UFC) e ao Departamento de Fisiologia e Farmacologia (DFF) da Faculdade de Medicina pela oportunidade da realização do trabalho e pelo suporte docente, físico e administrativo.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro no custeio da bolsa.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho, pelo meu acolhimento como orientanda, por todos os conhecimentos compartilhados e confiança em mim depositada para a realização deste trabalho.

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Francisco Vagnaldo Fechine, por todos os ensinamentos, pela disponibilidade e pelo incessante estímulo ao conhecimento científico.

Aos Professores integrantes das bancas de qualificação (Profs. Drs. Mirizana Alves de Almeida, Renata Bessa Pontes e Gilmara Holanda da Cunha) e defesa (Profs. Drs. Roberta Jeane Bezerra Jorge, Luiz Gonzaga de França Lopes, Karilane Maria Silvino Rodrigues e Mirizana Alves de Almeida), pelas ideias e sugestões no aprimoramento do trabalho.

Aos meus colegas de pós-graduação e parceiros nesse trabalho João Alison Moraes Silveira e Danilo Galvão Rocha, pela intensa colaboração na realização desse estudo.

À equipe integrante do grupo de pesquisa Bioinorgânica do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da UFC, pela parceria nesse trabalho.

À Adelânia Roque por estar sempre disponível e de portas abertas.

À toda a minha família, meu pai (José Nilson), meus irmãos (Débora e Guilherme) e especialmente à minha mãe (Maria Kátia) por estar sempre ao meu lado incentivando e torcendo pelas minhas conquistas.

Aos meus sogros (Cristiany e Erisvaldo) pelo apoio e suporte incondicional.

Ao meu amado, Pedro, por toda ajuda, companheirismo e suporte, no trabalho e na vida.

Aos meus amigos pela positividade e torcida. Aos meus sobrinhos e sobrinhas que aquecem meu coração e me estimulam a ver um mundo melhor no futuro.

Aos animais experimentais, verdadeiros heróis da ciência, que entregaram suas vidas para a realização deste trabalho e progresso do conhecimento científico.

“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.” (José de Alencar)

RESUMO

É notória a participação do endotélio no processo contrátil do vaso produzindo substâncias vasoativas como o óxido nítrico (NO). Atualmente nota-se um grande interesse por fármacos com a capacidade de liberar NO, devido à sua importância. Derivados de rutênio com ligantes piridínicos mostram uma ampla diversidade de aplicações. O objetivo desse trabalho é avaliar o efeito farmacológico de complexos de rutênio com ligantes 2-imidazolidinetiona na reatividade vascular. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos, anestesiados com cetamina e xilazina e exsanguinados. Foram retirados 4 anéis da artéria aorta de cada animal e montados em um sistema de banho de órgãos que foram incubados com solução nutridora de Krebs-Henseleit. Inicialmente foi realizado um protocolo para verificar o efeito vasorrelaxante dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis pré-contraídos com fenilefrina ou KCl, seguido de protocolos para testar a influência de vias de relaxamento vascular, entre elas a via do NO, participação endotelial e canais de K+. Também foi realizada dosagem de GMPc por ELISA e o docking molecular com a guanilato ciclase solúvel (GCs). Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média, a comparação entre dois grupos foi realizada através do teste t, de múltiplos grupos por ANOVA e para comparações múltiplas foi utilizado o teste de Tukey. Foi observado que o FOR011B e FOR811B apresentaram efeito relaxante máximo similar aos controles com nitroprussiato de sódio e BAY 41-2272 quando pré contraídos com fenilefrina, porém esse efeito foi reduzido na pré- contração com KCl. O FOR011B apresentou uma diminuição estatisticamente significante na potência de vasorrelaxamento quando pré-incubado com L-NAME, ODQ, hidroxicobalamina, L-cisteína, wortmanina, tetraetilamônio e 4-aminopiridina e uma redução no efeito máximo com glibenclamida. Já o FOR811B mostrou uma redução estatisticamente significante na potência de vasorrelaxamento quando pré-incubado com L-NAME, ODQ, wortmanina e tetraetilamônio e uma diminuição do efeito máximo também com glibenclamida. Pode-se concluir, portanto, que o efeito vasodilatador do FOR011B e FOR811B parece advir da via do NO possivelmente no bloqueio da GCs, adicionalmente o FOR011B também atua nos canais de potássio. A presença de ODQ não alterou a dosagem de GMPc nas preparações. Ambos os complexos de rutênio se ligaram aos sítios da GCs reduzida e oxidada.

Palavras-chave: Reatividade vascular. Rutênio. Guanilato ciclase solúvel. Óxido nítrico.

ABSTRACT

Pharmacological effect of ruthenium complexes with 2-imidazolidinethione ligands in vascular reactivity in vitro and receptor interaction in silico. Thais Muratori Holanda. Ph.D. Thesis. Postgraduate Program in Pharmacology, Federal University of Ceara, 2019.

The participation of endothelium in the contractile process of vessels is known to produce vasoactive substances such as nitric oxide (NO). Currently there is a great interest in drugs with the ability to release NO, due to its importance. Ruthenium derivatives with pyridine binders show a wide variety of applications. The objective of this work is to evaluate the pharmacological effect of ruthenium complexes with 2-imidazolidine ligands on vascular reactivity. For this, male Wistar rats were anesthetized with ketamine and xylazine and exsanguinated. Four rings of the aortic artery were removed from each animal and mounted in an organ bath system where were incubated with Krebs-Henseleit nutrient solution. Initially, a protocol was used to verify the vasorelaxant effect of FOR011B and FOR811B metalloprugs in pre-contracted rings with phenylephrine or KCl, followed by protocols to test the influence of vascular relaxation pathways, including NO pathway, endothelial participation and K +. We also performed cGMP dosing by ELISA and molecular docking with soluble guanylate cyclase (sGC). Data were expressed as mean ± standard error of the mean, the comparison between two groups was performed through t test, of multiple groups by ANOVA and Tukey test was used for multiple comparisons. It was observed that FOR011B and FOR811B presented a maximum relaxing effect similar to the controls with sodium nitroprusside and BAY 41-2272 when pre-contracted with phenylephrine, but this effect was reduced in the pre- contraction with KCl. FOR011B showed a statistically significant decrease in vasorelaxation potency when pre-incubated with L-NAME, ODQ, hydroxocobalamin, L-cysteine, wortmannin, tetraethylammonium and 4-aminopyridine and a reduction in maximal effect with glibenclamide. FOR811B showed a statistically significant reduction in vasorelaxation potency when pre-incubated with L-NAME, ODQ, wortmanine and tetraethylammonium also a decrease in maximal effect with glibenclamide. It can be concluded, that the vasodilatory effect of FOR011B and FOR811B appears to proceed from the NO pathway possibly by blocking of sGC, in addition FOR011B also acts on potassium channels. The presence of ODQ did not alter the cGMP dosage in the preparations. Both ruthenium complexes bound to reduced and oxidized sGC sites.

Keywords: Vascular reactivity. Ruthenium. Soluble guanylate cyclase. Nitric oxide.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Músculo liso multiunitário e unitário...... 21 Figura 2 Mecanismo de contração e relaxamento do músculo liso...... 22 Figura 3 Síntese de óxido nítrico pela célula endotelial...... 25 Figura 4 Efeitos cardiovasculares do óxido nítrico...... 26 Figura 5 Síntese de óxido nítrico pela célula endotelial...... 27 Figura 6 Compostos imidazólicos conhecidos...... 30 Figura 7 Compostos derivados de rutênio utilizados em pesquisas...... 31 Figura 8 Estruturas moleculares dos metalofármacos FOR011B e FOR811B...... 35 Figura 9 000 (vermelho) e L11B (verde)...... 35 Figura 10 Procedimento de retirada da aorta...... 37 Figura 11 Preparação dos anéis de aorta...... 38 Figura 12 Experimento de reatividade vascular...... 39 Figura 13 Equipamentos...... 40 Figura 14 Linha do tempo do protocolo de análise inicial do efeito relaxante dos metalofármacos em anéis de aorta de ratos...... 41 Figura 15 Linha do tempo de participação do endotélio vascular no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 43 Figura 16 Linha do tempo do protocolo de participação do óxido nítrico no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 43 Figura 17 Linha do tempo do protocolo de participação da guanilato ciclase solúvel no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 44 Figura 18 Linha do tempo do protocolo de participação dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 44 Figura 19 Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio não seletivos no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 45 Figura 20 Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio voltagem dependentes no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 46 Figura 21 Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 46

Figura 22 Linha do tempo do protocolo de participação dos prostanóides no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 47 Figura 23 Linha do tempo do protocolo de participação do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 47 Figura 24 Linha do tempo do protocolo de participação da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 48 Figura 25 Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de cálcio no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 49 Figura 26 Docking molecular entre os ligantes FOR011B (1A), FOR811B (1B) e BAY 41-2272 (1C) e a porção HNOX – Subunidade β1 da GCs...... 96 Figura 27 Mapa 2D das interações do sítio catalítico do ligante FOR011B (1A), FOR811B (1B) e BAY 41-2272 (1C) e a porção HNOX – Subunidade β1 97 da GCs...... Figura 28 Distâncias do ligante BAY 41-2272 e a proteína (PDB 2O09)...... 98 Figura 29 Interação dos resíduos do sítio ativo da proteína (PDB 3L6J) e os ligantes FOR811B (A), FOR811B (B) e cinaciguat (C)...... 99

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Efeito do metalofármaco FOR011B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM...... 54 Gráfico 2 Efeito do metalofármaco FOR011B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM...... 55 Gráfico 3 Comparação entre os efeitos do FOR011B em anéis de aorta pré- contraídos com KCl 60 mM (n=8) e com PHE 1 µM (n=8)...... 56 Gráfico 4 Efeito do metalofármaco FOR811B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM...... 57 Gráfico 5 Efeito do metalofármaco FOR811B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM...... 58 Gráfico 6 Comparação entre os efeitos do FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl (n=8) e com PHE (n=8)...... 59 Gráfico 7 Comparação entre os efeitos do FOR811B e FOR011B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE (n=8) e com KCl (n=8)...... 60 Gráfico 8 Efeito vasodilatador do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM (n=6) e PHE 1 µM (n=6)...... 63 Gráfico 9 Efeito do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=8) e desnudo (E-) (n=8) pré-contraídos com PHE 1 µM...... 64 Gráfico 10 Efeito do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=6) e desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com KCl 60 mM...... 65 Gráfico 11 Efeito do FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=6) e desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com PHE 1 µM...... 66 Gráfico 12 Efeito do FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=6) e desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com KCl 60 mM...... 67 Gráfico 13 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina (n=6)...... 69

Gráfico 14 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina (n=6)...... 70 Gráfico 15 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de L-NAME (n=6)...... 71 Gráfico 16 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de L-NAME (n=6)...... 72 Gráfico 17 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de ODQ (n=6)...... 73 Gráfico 18 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de ODQ (n=6)...... 74 Gráfico 19 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Hidroxicobalamina (n=6)...... 75 Gráfico 20 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Hidroxicobalamina (n=6)...... 76 Gráfico 21 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de L-Cisteína (n=6)...... 77 Gráfico 22 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de L-Cisteína (n=6)...... 78 Gráfico 23 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Wortmaninna (n=6)...... 79 Gráfico 24 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Wortmaninna (n=6)...... 80 Gráfico 25 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Tetraetilamônio (TEA) (n=6)...... 81 Gráfico 26 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Tetraetilamônio (TEA) (n=6)...... 82

Gráfico 27 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de 4-Aminopiridina (4-AP) (n=6)...... 85 Gráfico 28 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de 4-Aminopiridina (4-AP) (n=6)...... 86 Gráfico 29 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Glibenclamida (n=6)...... 87 Gráfico 30 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Glibenclamida (n=6)...... 88 Gráfico 31 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Indometacina (n=6)...... 89 Gráfico 32 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta pré- contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Indometacina (n=6)...... 90 Gráfico 33 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de MDL 12,330A (n=6)...... 91 Gráfico 34 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de MDL 12,330A (n=6)...... 92

Gráfico 35 Efeito vasoconstritor do CaCl2 na presença de PHE 1 µM após depleção do Ca2+ intracelular, na presença de Água (Controle) (n=4), FOR011B (n=6), ou FOR811B (n=7)...... 93

Gráfico 36 Efeito vasoconstritor do CaCl2 na presença de KCl 8 mM após depleção do Ca2+ intracelular, na presença de Água (Controle) (n=4), FOR011B (n=7), ou FOR811B (n=7)...... 94 Gráfico 37 Concentração de GMPc nos grupos Controle (n=4), 011B (n=4), 811B (n=4), 011B+ODQ (n=4) e 811B+ODQ (n=4)...... 95

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Efeito vasodilatador do FOR011B (n=8), FOR811B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41- 2272 (n=6) em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE ou com KCl...... 62 Tabela 2 Efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) e desnudo (E-) pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM...... 68 Tabela 3 Efeito vasodilatador do FOR011B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina, L-NAME, ODQ, hidroxicobalamina, L-cisteína, TEA, glibenclamida, 4-AP, indometacina, MDL 12,330A ou wortmaninna (n=6)...... 91 Tabela 4 Efeito vasodilatador do FOR811B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina, L-NAME, ODQ, hidroxicobalamina, L-cisteína, TEA, glibenclamida, 4-AP, indometacina, MDL 12,330A ou wortmaninna (n=6)...... 94 Tabela 5 Tabela comparativa das distâncias entre os resíduos/ligantes...... 97

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

4-AP 4-aminopiridina

ACh Acetilcolina

AChE Acetilcolinesterase

AMPc Monofosfato cíclico de adenosina

ATP Adenosina trifosfato

ATR Atropina

BH2 Dihidrobiopterina

BH4 Tetrahidrobiopterina

CEPA Comitê de ética em pesquisa animal

CO2 Gás crabônico

COBEA Colégio brasileiro de experimentação animal

DBCA Diretriz brasileira para o cuidado e a utilização de animais para fins científicos e didáticos eNOS Óxido nítrico sintase endotelial

GCs Guanilato ciclase solúvel

GLIB Glibenclamida

GMPc Monofosfato cíclico de guanosina

GTP Trifosfato de guanosina

H2O2 Peróxido de hidrogênio

HCB Hidroxicobalamina

HO Hidroxil

IgG Imunoglobulina G

INDO Indometacina

iNOS Óxido nítrico sintase induzível

IP3 Inositol trifosfato

KCl Cloreto de potássio

LCIS L-cisteína

LFPC Laboratório de farmacologia pré clínica nNOS Óxido nítrico sintase neuronal

NO Óxido nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

NPDM Núcleo de pesquisa e desenvolvimento de medicamentos

O2 Oxigênio

- O2 Superóxido

ODQ 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one

PGI2 Prostaglandina I2

PHE Fenilefrina

PI3K Fosfatidilinositol 3-quinase

PIP2 Bifosfato de fosfatidilinositol

PKG Proteinocinase G

RYR Receptor de rianodina

SERCA Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase

SNP Nitroprussiato de sódio

TEA Tetraetilamônio

UFC Universidade Federal do Ceará

WORT Wortmanina

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 21

1.1 Músculo liso vascular ...... 21

1.2 Função endotelial...... 24

1.3 Via do óxido nítrico ...... 27

1.4 Fármacos doadores de óxido nítrico ...... 29

1.5 Metalofármacos ...... 30

1.6 Justificativa ...... 33

2 OBJETIVOS ...... 34

2.1 Objetivo Geral ...... 34

2.2 Objetivos Específicos...... 34

3 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 35

3.1 Aspectos éticos ...... 35

3.2 Animais ...... 35

3.3 Local de realização do estudo ...... 35

3.4 Metalofármacos ...... 36

3.5 Estudo in vitro ...... 37

3.5.1 Técnica cirúrgica ...... 37

3.5.2 Montagem e estabilização dos anéis de aorta ...... 40

3.5.3 Teste de viabilidade dos anéis de aorta ...... 42

3.5.4 Análise inicial do efeito relaxante dos metalofármacos em anéis de aorta de ratos...... 42

3.5.5 Protocolos experimentais ...... 43

3.5.5.1 Participação do endotélio vascular no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 43

3.5.5.2 Participação do óxido nítrico no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 44

3.5.5.3 Participação da guanilato ciclase solúvel no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 44

3.5.5.4 Participação dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 45

3.5.5.5 Influência da inibição não seletiva dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 46

3.5.5.6 Participação dos canais de potássio voltagem dependentes no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 46

3.5.5.7 Participação dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 47

3.5.5.8 Participação dos prostanóides no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 47

3.5.5.9 Participação do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 48

3.5.5.10 Participação da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 49

3.5.5.11 Participação dos canais de cálcio no efeito vasodilatador dos metalofármacos...... 49

3.6 Determinação de GMPc por ELISA ...... 50

3.7 Docking Molecular ...... 51

3.8 Fármacos e Diluições ...... 52

3.9 Análise Estatística ...... 52

4 RESULTADOS ...... 54 4.1 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM...... 54 4.2 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM...... 58 4.3 Influência do endotélio no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM...... 65 4.4 Influência dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM...... 70 4.5 Influência da via do NO/GCs efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM...... 72 4.6 Influência da presença de Hidroxicobalamina ou L-Cisteína no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM...... 76

4.7 Influência da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM...... 80

4.8 Influência dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM...... 82

4.9 Influência da via da ciclooxigenase no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM...... 88

4.10 Influência da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM...... 90

4.11 Influência dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B na contração induzida por Ca2+ na presença de Fenilefrina ou de alta concentração de K+ após depleção do Ca2+ intracelular...... 94

4.11 Dosagem de GMPc por Elisa ...... 96

5 DISCUSSÃO ...... 100

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 111

7 CONCLUSÃO ...... 112

REFERÊNCIAS ...... 113

1 INTRODUÇÃO

1.1 Músculo liso vascular

Os vasos sanguíneos possuem uma camada de células musculares lisas em sua composição anatômica. Esse tecido pode ser classificado como músculo liso unitário (cada célula contrai de forma independente) e tônico (contração continuamente ativa gerando um tônus basal) (WEBB, 2003).

A estrutura dos vasos em forma de tubo e a disposição das células em circunferência permite que a luz do vaso reduza no momento da contração muscular. Esta musculatura é capaz de se manter contraída por longos períodos com um baixo consumo energético, o que é fundamental para funções vasculares básicas como o tônus, permitindo assim o controle da pressão arterial. A contração muscular lisa ocorre em resposta a estímulos elétricos ou químicos que aumentem a concentração de cálcio intracelular, sem que haja necessariamente uma alteração do potencial de membrana (SHIMOKAWA; SATOH, 2014).

Variações do potencial de membrana podem ser geradas por alterações da atividade da Na+, K+-ATPase na membrana celular, que por sua vez, são capazes de produzir potenciais de ação. Pequenas variações no potencial de repouso podem alterar significativamente o influxo de cálcio através dos canais de cálcio voltagem-dependentes, alterando assim a graduação contrátil. Esse tipo de resposta à pequenas alterações de potencial é característica de músculo liso unitário tônico (Figura 1) (HOROWITZ et al., 1996; WALSH, 2011).

Figura 1 - Músculo liso multiunitário e unitário

Fonte: (GUYTON; HALL, 2017).

Algumas substâncias endógenas e fármacos são capazes de se acoplar mecanicamente ao receptor da célula muscular lisa sem gerar variações no potencial de membrana, nesse caso há aumento nos níveis de um segundo mensageiro intracelular como o monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) ou o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) que irão posteriormente alterar os níveis intracelulares de cálcio (HOROWITZ et al., 1996; WALSH, 2011).

Uma vez a concentração de cálcio intracelular elevada, quatro desses íons se ligam à proteína calmodulina, esse complexo cálcio-calmodulina ativa a cinase da cadeia leve de miosina, que por sua vez fosforila a cadeia leve regulatória da miosina. Uma molécula de adenosina trifosfato (ATP) é então utilizada para fornecer energia à ponte cruzada de miosina que se liga à actina realizando o movimento de catraca, onde o filamento fino é direcionado ao centro. Este ciclo das ponte cruzadas continua até que os níveis de cálcio intracelulares diminuam, inativando a cinase da cadeia leve de miosina e, por sua vez, a miosina fosfatase realiza a desfosoforilação da miosina, encerrando a contração muscular (Figura 2) (PFITZER, 2001).

O músculo liso utiliza duas fontes de íons cálcio distintas, o retículo sarcoplasmático e o meio extracelular. Os receptores do retículo são sensibilizados pela ligação de inositol trifosfato (IP3), que são produzidos a partir do estímulo gerado nos receptores de membrana acoplados à proteína G, essa ativa a fosfolipase C que hidrolisa o fosfolipídeo de membrana bifosfato de fosfatidilinositol (PIP2) em IP3 e diacilglicerol. Essa sensibilização abre os canais 23 de cálcio dependentes de IP3 do retículo sarcoplasmático, aumentando a concentração de cálcio citoplasmática (WALSH, 2011).

Várias substâncias são capazes de ativar os receptores acoplados à proteína G presentes na membrana da célula muscular lisa. As fibras simpáticas do sistema nervoso autônomo inervam o músculo liso vascular e liberam a noraepinefrina como neurotransmissor que se liga aos receptores adrenérgicos α1, ativando fosfolipase C e produzindo IP3, assim como a vasopressina e a angiotensina II (PFITZER, 2001).

Figura 2 - Mecanismo de contração e relaxamento do músculo liso.

Fonte: (PFITZER, 2001).

2+ Ca : íons cálcio, IP3: inositol trifosfato, SR: retículo sarcooplasmático, CaM: Calmodulina, MLCK: cinase de cadeia leve de miosina, ATP: adenosina trifosfato, ADP: adenosina difosfato, Pi: fosfato, MLCP: fosfatase da cadeia leve de miosina.

O retículo sarcoplasmático também possui canais de cálcio dependentes de cálcio, também conhecidos como receptores de rianodina (RYR), que são ativados durante a entrada de cálcio extracelular na célula. No final da contração o cálcio é removido do interior da célula pela SERCA (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) que sequestra o cálcio de volta para o retículo, além do antiportador 3Na+-1Ca2+ e a atividade da Ca2+-ATPase que bombeiam cálcio para o meio extracelular (AMBERG; NAVEDO, 2013).

A partir desses dados, podemos afirmar que substâncias que ajam diminuindo as concentrações intracelulares de cálcio atuarão no relaxamento do músculo liso, como por exemplo os bloqueadores de canais de cálcio que diminuem influxo de cálcio na célula através dos canais de cálcio tipo L, dependentes de voltagem na membrana celular, causando vasodilatação. Assim como fármacos que abrem os canais de potássio, causando hiperpolarização celular e diminuição do influxo de cálcio na célula (WEBB, 2003; AMBERG; NAVEDO, 2013).

Outro possível mecanismo de vasodilatação seria pelo aumento nos níveis de GMPc, por exemplo através da liberação de acetilcolina pelas fibras parassimpáticas, que culmina na produção de óxido nítrico (NO) pelas células endoteliais vasculares. Substâncias que estimulam os receptores adrenérgicos β e aumentam a concentração de AMPc também causam relaxamento do músculo liso vascular por reduzir a atividade da cinase da cadeia leve da miosina e a concentração de cálcio intracelular (SHIMOKAWA; SATOH, 2014).

Dessa maneira, podemos verificar que o controle vasomotor está associado a uma série de mecanismos e estruturas, relacionados ao sistema nervoso autônomo, hormônios endógenos, neurotransmissores, fármacos e células endoteliais vizinhas (BIAN; SHI; FERID, 2011).

1.2 Função endotelial

O tecido endotelial, inicialmente, era tido como uma camada de revestimento por onde substâncias eram difundidas, realizando as trocas entre o sangue e as células circunvizinhas. Hoje, é notória a participação do endotélio no processo de contração e relaxamento do vaso produzindo uma gama de substâncias vasoativas como os prostanóides, NO, peptídeos, fatores de hiperpolarização derivados do endotélio, entre outros (CUNHA et al. 2013). 25

As espécies reativas de oxigênio são moléculas com alta capacidade oxidativa, as mais - conhecidas são o superóxido (O2 ), o radical hidroxil (HO) e o peróxido de hidrogênio (H2O2). A síntese dessas moléculas se dá pela redução incompleta do oxigênio molecular por enzimas que incluem a xantina oxidase, óxido nítrico sintase, NADPH oxidase, citocromo P450 e vias mitocondriais (MIZUNO; JACOB; MASON, 2010). Substâncias antioxidantes como a superóxido dismutase (SOD), catalase e a glutationa peroxidase, o ácido ascórbico, NADPH/NADP+ e NADH/NAD+ controlam os efeitos celulares deletérios das espécies reativas de oxigênio (ANSELM et al., 2007; ANOZIE et al., 2007; CAMPANA et al., 2009). O fator hiperpolarizante derivado do endotélio produz vasodilatação em resposta a uma série de mediadores químicos como a acetilcolina e a bradicinina. Atualmente existem possíveis fatores que seriam responsáveis por esse efeito: 1- epoxieicosanóides sintetizados a partir do ácido araquidônico por uma isoforma do citocromo P450; 2 - propagação eletrotônica da hiperpolarização do endotélio para o músculo liso vascular através de junções intercelulares; 3 - K+ liberado do endotélio, que paradoxalmente hiperpolariza o músculo liso vascular ao ativar canais de potássio retificadores de orientação interna (RANG et al., 2007; CUNHA et al. 2013).

A prostaglandina I2 (PGI2), também conhecida como prostaciclina, por exemplo, é produzida pelas células endoteliais a partir do ácido aracdônico e causa vasodilatação por aumentar os níveis de AMPc, além de diminuir a agregação plaquetária. A PGI2 foi descoberta em 1976 por Bunting, Gryglewski, Moncada e Vane e relaxa o músculo liso por ativação da adenilato ciclase. Peptídeos vasoativos, como o perptídeo C natriurético, também é secretado pelo endotélio e assim como a endotelina são importantes vasoconstrictores (RANG et al., 2007). O fator relaxante derivado do endotélio foi descoberto em 1980 por Furchgott e Zawadzki e, posteriormente, associado à inibição da proliferação e migração de células musculares lisas vasculares, a adesão leucocitária e a agregação plaquetária, além de mediar o relaxamento da musculatura lisa vascular (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; RANG et al., 2007). Uma vasodilatação mais significativa é mediada por um componente do fator relaxante derivado do endotélio, sintetizado a partir da L-arginina, o NO, que ativa a enzima guanilato cliclase solúvel (GCs) aumentando a síntese de GMPc, que diminui a afinidade do miofilamento de miosina ao cálcio. A produção de NO é estimulada pelo atrito do fluxo sanguíneo nas células endoteliais ou pelo estímulo de algum agente vasodilatador como a acetilcolina, ATP, bradicinina, serotonina, substância P e histamina. Existem dois tipos de 26 guanilato ciclase, a solúvel que é citosólica e a particulada que é uma proteína transmembrana. Esta última também é capaz de sintetizar GMPc através da guanosina 5- trifosfato, porém, ao invés de ser estimulada pelo NO, pequenos peptídeos hormonais, como o fator atrial natriurético desempenham esse papel (Figura 3) (ZHAO et al., 2000; TOUSOULIS et al., 2012).

Figura 3 - Síntese de óxido nítrico pela célula endotelial.

Fonte: BRUNTON; CHABNER; KNOLLMAN, 2011.

1.3 Via do óxido nítrico

O NO é uma molécula de gás facilmente difundível através da membrana plasmática e responsável pela regulação de diversos processos endógenos fisiopatológicos (Figura 4). Inicialmente foi descoberto que as células endoteliais respondiam aos agentes vasodilatadores produzindo um fator relaxante derivado do endotélio, que posteriormente foi constatado possuir como principal bioativo o NO (MILLER; MEGSON, 2007).

Figura 4 - Efeitos cardiovasculares do óxido nítrico.

↓ agregação Células Plaquetas ↓ adesão inflamatórias ↓ liberação mediadores

↑↓ apoptose ↓ liberação citocinas ↓ adesão

Endotélio

↑ vasodilatação ↓ proliferação ↓ migração Células do músculo liso vascular

Fonte: MILLER; MEGSON, 2007.

A enzima responsável pela produção do NO é a óxido nítrico sintase (NOS) que pode ser subdividida em três subtipos: induzível (iNOS), neuronal (nNOS) e endotelial (eNOS) (Figura 5). A iNOS é constitutiva, já a eNOS e a nNOS são ativadas pelo aumento da concentração de cálcio dentro da célula através do complexo cálcio-calmodulina, então o NO estimula a GCs a produzir GMPc que por sua vez ativa a proteinocinase G (PKG) que fosforila proteínas reduzindo a concentração de cálcio dentro da célula causando relaxamento muscular (FÖRSTERMANN; SESSA, 2012; GARCIA; SESSA, 2019).

Figura 5 - Síntese de óxido nítrico pela célula endotelial.

Células nervosas

Plasticidade sináptica, regulação da pressão arterial Neurotransmissão atípica, ereção peniana

Células medulares

Defesa imune não específica Mediação inflamatória, choque séptico

Endotélio

Vasodilatação, vasoproteção, prevenção de aterosclerose

Fonte: FÖRSTERMANN; SESSA, 2012.

A duração do NO é fugaz uma vez que reage facilmente com o oxigênio, espécies reativas de oxigênio e com metais. A inibição da NOS é uma estratégia utilizada para inibir a síntese de NO, a utilização de análogos da L-arginina que se liguem no mesmo sítio de ligação são efetivos, porém essa inibição, geralmente, é inespecífica para as isoformas de NOS (RUSSWURM; KOESLING, 2004; IGNARRO, 2019).

A GCs é um dos principais alvos biológicos do NO, pois possui maior sensibilidade à essa substância, além de ser parte integrante do mecanismo de controle fisiológico da pressão arterial fazendo a regulação do tônus do músculo liso vascular. Seu mecanismo envolve inicialmente a descarga de acetilcolina no endotélio, causada por uma estimulação parassimpática, causando um influxo de cálcio na célula endotelial e consequentemente ativando a eNOS. Essa enzima então produz pequenas quantidades de NO que são suficientes para que haja a difusão à musculatura lisa vascular e ativação da GCs, que por consequência 29 age catalizando a conversão de guanosina trifosfato (GTP) em GMPc. Finalmente, o GMPc como segundo mensageiro ativa a proteinoquinase, que iniciam mecanismos de redução da concentração intracelular de cálcio, resultando no relaxamento da musculatura lisa vascular. (MARTIN et al., 2005; IGNARRO, 2009; BRUNTON; CHABNER; KNOLLMAN, 2011).

1.4 Fármacos doadores de óxido nítrico

Algumas substâncias usadas para causar o relaxamento da musculatura lisa são capazes de doar NO através de mecanismos distintos, gerando moléculas de NO de natureza diferentes, portanto com propriedades biológicas diferenciadas (IGNARRO, 2019).

A enzima aldeído redutase mitocondrial presente em grande quantidade no músculo liso venoso, metaboliza a nitroglicerina em NO e possuindo grande potencial venodilatador, principalmente, nas veias e artérias coronarianas gerando um efeito antiangionoso e uma redução da pré-carga cardíaca. Outros nitratos orgânicos, como o dinitrato de isossorbida, não atuam tão significativamente na agregação plaquetária como o NO. Apesar do efeito potente da administração aguda de nitratos orgânicos, a infusão contínua causa tolerância, provavelmente pela produção de espécies reativas de oxigênio inibindo a enzima aldeído redutase mitocondrial (TARKIN; KASKI, 2016; DIVAKARAN; LOSCALZO, 2017).

Os nitritos orgânicos por sua vez não induzem a tolerância apresentada pelos nitratos, mas também necessitam de ativação metabólica, apesar da enzima responsável ainda não ter sido identificada. A combinação de nitritos orgânicos, como o nitrilo de amila, em conjunto com inibidores de fosfodiesterase, como a sildenafila, pode causar uma hipotensão letal, dessa forma os nitritos vêm sendo substituídos pelos nitratos, também por ser de mais fácil administração (TARKIN; KASKI, 2016).

Em casos de hipertensão arterial aguda o nitroprussiato de sódio é utilizado por promover vasodilatação em arteríolas e vênulas. A metabolização do nitroprussiato de sódio produz cinco moléculas de cianeto e uma de NO. Para tratar a hipertensão pulmonar o próprio NO pode ser utilizado de maneira inalatória, assim como nos casos de hipoxemia aguda e reanimação cardiopulmonar. Porém, o NO reage com o oxigênio formando dióxido de nitrogênio, que é um irritante pulmonar, além disso, o NO pode induzir a formação de metemoglobina, molécula que possui Fe3+ no lugar de Fe2+ culminando na não ligação ao 30 oxigênio. Dessa forma, durante a administração de NO inalado os níveis de dióxido de nitrogênio e metemoglobina devem ser monitorados (HOTTINGER et al., 2014).

Uma maneira alternativa para potencialização do efeito do NO é a inibição da enzima que degrada o GMPc, a fosfodiaesterase. A sildenafila inibe a fosfodiesterase 5, prolongando a ação do GMPc induzido pelo NO (SCHADE; KOTTHAUS; CLEMENT, 2010).

1.5 Metalofármacos

Drogas que liberam NO, assim como os nitratos e nitritos orgânico, foram sintetizados com o objetivo de reverter a deficiência na síntese de NO pelo endotélio em pacientes com doenças cardiovasculares. Atualmente, percebe-se um aumento nas publicações de potenciais substâncias capazes de atuar na via do NO, sejam elas orgânicas ou derivadas de metais (FRICKER, 2007; PRIVIERO; WEBB, 2010). A utilização de compostos metálicos como fármacos possui várias vantagens como o variável número de coordenação e geometrias, acessibilidade a diferentes estados redox, características termodinâmicas e cinéticas particulares, assim como as propriedades intrínsecas dos cátions metálicos e seus ligantes (BRUIJNINCX; SADLER, 2008; HAMBLEY,2007; MEGGERS, 2009).

Substâncias que tenham a GCs como alvo, principalmente os compostos metálicos nitrosilados, surgiram com o objetivo de serem liberadores de NO, especialmente em alvos biológicos visando o relaxamento do músculo liso vascular (BERGAMO et al., 2007). Os complexos de rutênio foram primeiramente divulgados na década de 50 (DWYER et al.,1952) e desde então têm sido alvo de diversos outros estudos que evidenciam a liberação de NO, assim como a baixa toxicidade e seu potencial terapêutico como antitumorais, antimaláricos e como reguladores da pressão arterial (KARIDI et al., 2006, CAMPELO, et al, 2012; EKENGARD et al., 2015).

Derivados de rutênio com ligantes piridínicos mostram uma ampla diversidade de aplicações. Esses ligantes mostram uma estabilização satisfatória do centro metálico, assim como um aumento da função redutora (CRAVER et al., 2010; CAO; SOLTAU et al., 2015; ZHENG; CHEN, 2015; ZENG et al., 2016). 31

Os ligantes imidazólicos, apesar de sua estrutura simples, também têm sua importância em relação aos demais radicais. Atualmente a aplicação medicinal desses compostos é bastante variada atuando como antineoplásicos, antifúngicos, antiparasitários, anti- histamínicos, antineuropáticos, bactericidas, anti-inflamatórios, antivirais e anti-hipertensivos (Figura 6) (ANDERSON; LONG, 2010; EBEL et al., 2012; ZHANG et al., 2014).

Figura 6 - Compostos imidazólicos conhecidos.

Fonte: GOUVEIA-JÚNIOR, 2017.

Nos dias atuais complexos de rutênio têm sido largamente utilizados em pesquisas com potencial efeito terapêutico, principalmente relacionado a via do NO (Figura 7). O rutênio é o elemento com a maior capacidade de formar complexos nitrosilados, além de apresentar baixa toxicidade e efeitos reguladores da pressão arterial, antitumorais e antimaláricos (ALVES, 2018).

Figura 7 - Compostos derivados de rutênio utilizados em pesquisas.

Fonte: PAUWELS et al., 2016.

Um estudo anterior com o FOR811A mostrou que este composto foi capaz de relaxar a musculatura lisa brônquica, em um modelo de asma em camundongos, assim como reduziu os níveis de IL-4 (COSTA, 2018). Outra pesquisa, observou o efeito protetor do FOR811A na função renal em modelo de lesão por isquemia reperfusão, além de efeito antioxidante e anti- inflamatório (ALVES, 2018). Em uma pesquisa com os complexos FOR011B e FOR811B foi evidenciado alterações em parâmetros da hemodinâmica renal como: diminuição do ritmo de filtração glomerular, aumento do fluxo urinário, diminuição do clearence osmolar, dos transportes totais e proximais de eletrólitos. Somado a isso, o FOR811B também mostrou efeito protetor na lesão induzida por isquemia/reperfusão renal (SILVA, 2018). A partir desses dados, novas pesquisa vêm objetivando a pesquisa farmacológica com compostos de rutênio, assim como outras pequenas moléculas que apresentem propriedades químicas e farmacológicas biologicamente utilizáveis (GOUVEIA-JÚNIOR, 2017).

1.6 Justificativa

As doenças cardiovasculares são um dos maiores problemas de saúde pública no mundo ocidental (LEVY et.al.,2002). Segundo dados da American Heart Association (ROGER et al., 2011), a prevalência de infarto do miocárdio nos Estados Unidos situa-se em 3,1% na população com mais de 20 anos. No Brasil, as doenças cardiovasculares ainda permanecem como a primeira causa de mortalidade proporcional, responsáveis por 29% dos óbitos em 2010 e o infarto agudo do miocárdio se mantém persistentemente elevada: em média, 16,2%, em 2000, 16,1%, em 2005, e 15,3%, em 2010. Apesar das doenças cardiovasculares estarem diminuindo ao longo do tempo, ainda assim, é a enfermidade com a maior taxa de mortalidade quando comparada a outras doenças crônicas não transmissíveis. Assim, as doenças coronarianas têm um grande impacto financeiro sobre o sistema de saúde, constituindo-se em cerca de 5% dos gastos com internação (SILVA et al., 2018).

A grande maioria dos complexos de rutênio são farmacologicamente interessantes por serem estáveis, hidrossolúveis além de serem compostos com a maior capacidade de formar complexos nitrosilados (CALANDRELLI; TFOUNI, 2005; FERREIRA; TFOUNI, 2010). Tal fato torna esses compostos alvo de interesse visando sua utilização clínica na liberação de NO e consequentemente no tratamento de doenças cardiovasculares como a hipertensão arterial (CALANDRELLI; TFOUNI, 2005). Atualmente nota-se um grande interesse por fármacos com a capacidade de liberar NO, devido à sua importante ação fisiológica, patológica e farmacológica. Existem no mercado substâncias orgânicas e inorgânicas empregadas no tratamento da hipertensão arterial, mas sua utilização é limitada pelos seus efeitos colaterais. Portanto, é vantajosa a realização de pesquisas com o objetivo de caracterizar a ação farmacológica de substâncias com esse potencial (GOUVEIA-JÚNIOR, 2017).

Este trabalho é uma parceria com o grupo de pesquisa Bioinorgânica do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da UFC que tem como objetivo estudar possíveis moléculas de rutênio com o ligante nitrosil, que sejam capazes de atuar na via do NO e que possuam potenciais biológicos para serem utilizados como metalofármacos. Portanto, optou- se pelos complexos FOR011B e FOR 811B já que possuem efeitos promissores previamente relatados e por possuírem ligantes imidazólicos, já que são amplamente utilizados com sucesso na prática clínica. 34

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o efeito farmacológico de complexos de rutênio com ligantes 2- imidazolidinetiona na reatividade vascular in vitro e da interação fármaco-receptor in silico.

2.2 Objetivos Específicos

 Verificar o efeito dos complexos de rutênio na reatividade vascular e definir a CE50.  Analisar a influência do endotélio vascular no efeito dos complexos de rutênio.  Investigar a participação da via do óxido nítrico/guanilato ciclase solúvel no efeito dos complexos de rutênio.  Verificar a influência dos sequestradores de óxido nítrico no efeito dos complexos de rutênio.  Avaliar a influência dos canais de potássio no efeito dos complexos de rutênio.  Verificar a participação da via da ciclooxigenase no efeito dos complexos de rutênio.  Observar a participação da via IP3K no efeito dos complexos de rutênio.  Avaliar a influência da adenilato ciclase no efeito dos complexos de rutênio.  Verificar a participação do cálcio no efeito dos complexos de rutênio.  Determinar a concentração de GMPc nas amostras de tecido vascular.  Caracterizar a interação fármaco-receptor dos complexos de rutênio através da técnica de docking macromolecular.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Aspectos éticos

O projeto de pesquisa intitulado de “Efeito farmacológico de complexos de rutênio com ligantes 2-imidazolidinetiona na reatividade vascular in vitro e da interação fármaco- receptor in silico.” foi submetido a avaliação de um Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) e executado após aprovação número 03/2016 (ANEXO A). Neste estudo foram seguidas as normas de boas práticas indicadas para a realização de pesquisas que envolvem o uso de animais experimentais de acordo com o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e de acordo com a Lei nº 11794 da Diretriz brasileira para o cuidado e a utilização de animais para fins científicos e didáticos (DBCA).

3.2 Animais

Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus, var. albinus, Rodentia, Mammalia) da linhagem Wistar, machos e sadios, pesando de 200 a 250 gramas, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará (UFC). Os ratos foram previamente avaliados para exclusão de doenças e ficaram alojados no biotério de manutenção do Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento de Medicamentos (NPDM) da UFC, mantidos em ciclo claro/escuro (12/12h), a uma temperatura de 25ºC, em gaiolas coletivas convencionais de polipropileno com tampa de metal, com divisórias para ração e água. Cada gaiola abrigou quatro ratos, aos quais foram fornecidos ração e água ad libitum.

3.3 Local de realização do estudo

O estudo foi realizado no Laboratório de Farmacologia Pré-clínica (LFPC) integrante do NPDM – Faculdade de Medicina – UFC, em Fortaleza-Ceará, o qual possui infra-estrutura necessária para realização dos experimentos. 36

3.4 Metalofármacos

Nessa pesquisa foram utilizados dois metalofármacos sintetizados pelo grupo de pesquisa Bioinorgânica do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da UFC, o FOR011B e o FOR811B (Figura 08) (GOUVEIA-JÚNIOR, 2017). Também foram utilizados os radicais isolados (L11B e 000) dos metalofármacos para verificar seu efeito separadamente comparado ao da molécula total (Figura 9).

Figura 8 - Estruturas moleculares dos metalofármacos FOR011B e FOR811B.

Fonte: GOUVEIA-JÚNIOR, 2017.

Figura 9 - 000 (vermelho) e L11B (verde).

Fonte: GOUVEIA-JÚNIOR, 2017 (adaptado).

3.5 Estudo in vitro

3.5.1 Técnica cirúrgica

Para realização do estudo foi realizado experimento de tensão isométrica utilizando a artéria aorta de ratos no equipamento de banho de órgãos isolado. Os animais foram anestesiados com cetamina (80mg/kg) e xilazina (8mg/kg) e o sacrifício foi realizado por exsanguinação dos vasos cervicais. Depois do sacrifício, o rato foi colocado em decúbito dorsal com as patas fixadas para permitir livre acesso ao tórax e abdômen. Com uma tesoura, foi realizada uma incisão no abdômen, logo abaixo do músculo diafragma para permitir acesso à cavidade torácica. Com a secção da musculatura diafragmática e a exposição dos órgãos torácicos foi realizado o piçamento da região superior da aorta que foi seccionada em toda a sua extensão com o auxílio de uma tesoura (Figura10). O fragmento de aorta retirado foi colocado em uma placa de Petri submerso em solução de Krebs-Henseleit para limpeza do tecido sem que houvesse lesão tecidual. Logo em seguida foram desprezadas as extremidades do vaso e a artéria foi dividida em 4 anéis de aproximadamente 4 milímetros cada. Estes montados em clipes triangulares ligados a um gancho metálico através de fios de algodão não elásticos (Figura11). Foram preparadas duas soluções de Krebs-Henseleit, com cálcio (NaCl: 118,0 mmol/L; KCl: 4,7 mmol/L; KH2PO4: 1,2 mmol/L; MgSO4.7H2O: 1,2 mmol/L; NaHCO3: 15,0 mmol/L; CaCl2: 2,5 mmol/L e Glicose: 5,5 mmol/L) (HIPÓLITO et al., 2009; HIPÓLITO et al., 2011) e sem cálcio que tiveram o pH ajustado para 7,4 com solução de ácido acético.

Figura 10 – Procedimento de retirada da aorta.

Fonte: CUNHA, 2012. 1: Animal em decúbito dorsal com exposição de órgãos. 2: Aorta. 3: Retirada da aorta torácica.

Figura 11 – Preparação dos anéis de aorta.

Fonte: CUNHA, 2012. 1 e 2: Lavagem da aorta torácica em solução de Krebs-Henseleit. 3 e 4: Retirada do tecido conectivo e secção da aorta em anéis. 5 e 6: Colocação dos anéis aórticos em clipes metálicos.

3.5.2 Montagem e estabilização dos anéis de aorta

Os anéis de aorta foram levados montados em cubas no equipamento de banho de órgãos preenchidas com 10ml de solução de Krebs-Henseleit e submersas em água destilada à

37ºC e aeradas com carbogênio (95% de Oxigênio (O2) e 5% de dióxido de carbono (CO2). Os anéis eram fixados em haste de metal de modo que o gancho metálico ficasse posicionado em um sensor de força (Figura 12).

Figura 12 – Experimento de reatividade vascular.

Fonte: CUNHA, 2012. 1: Banho de órgãos. 2: Cuba de 10 mL contendo anel aórtico aerado por carbogênio. 3: Ajuste da tensão do fio de algodão. 4: Cilindro de carbogênio.

A tensão dos anéis foi mensurada por um transdutor de força (Force Transducer, MLT0201, ADInstruments, Spain), e o sinal amplificado (Quad Bridge Amp, ML224, ADInstruments, Australia) e transmitido para um conversor analógico-digital (Power Lab, ML8661P, 4130, ADInstruments, Australia), e finalmente registrado por um computador para captação temporal da tensão pelo software de aquisição e processamento de dados (LabChart 8.0 for Windows, ADInstruments, Australia) (Figura 13).

Figura 13 – Equipamentos.

Fonte: CUNHA, 2012. 1: Sensor de tensão. 2: Termostato para controle de temperatura. 3: Amplificador de sinais. 4: Conversor analógico-digital. 5: Software para registro temporal da tensão. 6: Banho de órgãos.

Os fragmentos foram submetidos a um período de estabilização de 60 minutos, onde a tensão basal era constantemente ajustada para 10 mili Newtons (mN) (HIPÓLITO et al., 2009) e a solução de Krebs-Henseleit das cubas trocada a cada 15 minutos.

3.5.3 Teste de viabilidade dos anéis de aorta

Após os 60 minutos de estabilização foram realizados os testes de viabilidade dos fragmentos de aorta através da contração do tecido. Inicialmente foi adicionado cloreto de potássio (KCl) a 60mmol/l objetivando uma contração mínima de 70% acima da tensão basal (ESTRADASOTO et al., 2010). Em seguida foram realizadas 5 lavagens dos anéis de aorta com solução de Krebs-Henseleit e após 5 minutos adicionada a fenilefrina (PHE) a 1 µmol/l (SOARES, 2008; CHEN et al., 2009), seguida pela adição de acetilcolina (ACh) a 10 µmol/l (WONGSAWATKUL et al., 2008; CHEN et al., 2009). Os anéis que apresentaram relaxamento maior ou igual a 80% após a adição de ACh eram considerados fragmento com endotélio íntegro. Em alguns protocolos foi realizada a retirada mecânica do endotélio com um clipe de metal no interior do vaso que era rolado na placa de Petri, nesses casos foi considerado um relaxamento inferior ou igual a 10% (BRITO et al., 2017; ENGHOLM et al., 2016). Para avaliar a integridade do endotélio vascular foi utilizada a fórmula a seguir (CUNHA, 2012).

3.5.4 Análise inicial do efeito relaxante dos metalofármacos em anéis de aorta de ratos.

Esta etapa inicial teve como objetivo avaliar os efeitos relaxantes dos metalofármacos, assim como verificar se estes são dependentes da concentração. Foi realizada a comparação com os controles (nitroprussiato de sódio (SNP) e BAY 41-2272) e com os ligantes isolados da molécula (000 e L11B). Foram realizadas contrações mantidas com PHE (1 µmol/L) e KCl (60 mmol/L) onde foram adicionadas concentrações crescentes e cumulativas dos compostos até a obtenção do relaxamento máximo. Foram utilizadas as seguintes concentrações: FOR011B (10-8 a 3x10-5 43

M), FOR811B (10-8 a 3x10-5 M), L11B (10-8 a 3x10-5 M), 000 (10-8 a 3x10-5 M), SNP (3x10-11 a 6x10-8 M), BAY-41-2272 (10-8 a 3x10-5 M). Neste experimento foram utilizadas diferentes preparações de aorta de rato (n = 8, para os metalofármacos FOR011B e FOR811B; n = 6 para os controles SNP e BAY 41-2272 e para os ligantes 000 e L11B) (Figura 14). Como controle utilizou-se água destilada, veículo para diluição dos metalofármacos estudados.

Figura 14 - Linha do tempo do protocolo de análise inicial do efeito relaxante dos metalofármacos em anéis de aorta de ratos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5 Protocolos experimentais

3.5.5.1 Participação do endotélio vascular no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Antes da montagem no miógrafo, os fragmentos tiveram o endotélio removido através da da rolagem em placa de Petri utilizando com grampo metálico. Foram considerados vasos sem endotélio funcional, os vasos cuja vasodilatação induzida pela acetilcolina forem menor que 10% da vasoconstrição causada pelo KCl (JADHAV et al., 2012; BRITO et al., 2017).

Após a confirmação de endotélio não funcional, foi avaliado o efeito vasodilatador dos FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) (n=8) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (n=8) após vasoconstrição causada por KCl 60 mM (n=8) ou PHE 1 µM (n=8) (Figura 15). Este procedimento foi realizado para verificar se a vasodilatação causada pelos metalofármacos é endotélio- dependente. 44

Figura 15 - Linha do tempo de participação do endotélio vascular no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.2 Participação do óxido nítrico no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com L-NAME (n=6), hidroxicobalamina (HCB) (n=6) e L-cisteína (LCIS) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 16) (BRITO, 2015).

Figura 16 - Linha do tempo do protocolo de participação do óxido nítrico no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.3 Participação da guanilato ciclase solúvel no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com ODQ (1H- [1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 45

3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 17) (FRANÇA-SILVA et al., 2012; ALSULEIMANI, HILEY, 2013; BRITO et al., 2017).

Figura 17 - Linha do tempo do protocolo de participação da guanilato ciclase solúvel no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.4 Participação dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com atropina (ATR) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 18) (CUNHA, 2012).

Figura 18 - Linha do tempo do protocolo de participação dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.5 Influência da inibição não seletiva dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com tetraetilamônio (TEA) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 19) (BRITO et al., 2017; CUNHA et al., 2013).

Figura 19 - Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio não seletivos no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.6 Participação dos canais de potássio voltagem dependentes no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com 4-aminopiridina (4- AP) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (Figura 20) (10-8 a 3x10-5 M) (BRITO et al., 2017; CUNHA et al., 2013).

Figura 20 - Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio voltagem dependentes no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.7 Participação dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com glibenclamida (GLIB) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 21) (BRITO et al., 2017; CUNHA et al., 2013).

Figura 21 - Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.8 Participação dos prostanóides no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com indometacina (INDO) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada 48 uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 22) (CUNHA, 2012).

Figura 22 - Linha do tempo do protocolo de participação dos prostanóides no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.9 Participação do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com wortmanina (WORT) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 23) (CUNHA, 2012).

Figura 23 - Linha do tempo do protocolo de participação do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.10 Participação da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com MDL 12,330A (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 24) (ANDRADE et al., 2015).

Figura 24 - Linha do tempo do protocolo de participação da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5.11 Participação dos canais de cálcio no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Este protocolo tem o objetivo de verificar a influência do efeito vasodilatador dos metalofármacos no influxo de cálcio através de canais de cálcio dependentes de receptor após a depleção do cálcio intracelular.

Após a estabilização foram realizadas seis lavagens com solução de Krebs- Henseleit sem cálcio, em seguida foi adicionado às cubas o EGTA (Ethylene glycol-bis(2- aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid ) (1 mmol/l) um quelante dos íons de cálcio que permaneceu por 15 minutos. Em sequência foi adicionada PHE 1 µM que permaneceu por mais 30 minutos junto ao EGTA. Foram realizadas mais seis lavagens com solução de Krebs- Henseleit sem cálcio e acrescentado o EGTA (1 mmol/l) mais uma vez que permaneceu por 15 minutos e foi retirado com três lavagens com solução de Krebs-Henseleit sem cálcio. Em seguida foi adicionada a PHE 1 µM e os metalofármacos nas primeiras doses correspondentes ao efeito máximo, FOR011B (5,6x10-7 M) (n=6) e o FOR811B (3,16x10-6 M) (n=6), então foi 50 realizada uma curva com cloreto de cálcio (CaCl2 - 0,01 a 3 mM) (CUNHA et al., 2013; HOE et al., 2011).

Figura 25: Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de cálcio no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.6 Dosagem de GMPc por ELISA

A concentração de GMPc foi determinada em anéis de aorta previamente montados no banho de órgãos, onde passaram por um protocolo de pré-contração com Fenilefrina 1 µM na presença ou ausência de ODQ, com posterior adição de água (Controle), ou de um dos complexos de rutênio. A concentração de metalofármaco utilizada foi equivalente a menor concentração capaz de causar efeito vasodilatador máximo. Os grupos tratados ficaram incubados no banho de órgãos tempo suficiente para vasodilatação completa, no grupo Controle ou nos grupos na presença de ODQ, onde não houve vasodilatação, esperou-se tempo similar aos grupos tratados. Após esse tempo, o tecido e uma amostra da solução de Krebs foram coletados, congelados em nitrogênio líquido, e posteriormente armazenados em freezer -80º C.

No dia da análise, foram feitos homogenatos dos anéis de aorta em ácido tricloroacético 5%, em uma concentração de 10 mg de tecido/mL, após isso as amostras foram centrifugadas por 10 minutos, 1500g, 4º C. O sobrenadante foi utilizado para a dosagem, 51 entretanto foi realizado ainda um processo de retirada do ácido tricloroacético com éter saturado de água, conforme recomendações do fabricante do kit.

Para tanto, foi utilizado um Kit para determinação quantitativa de GMPc utilizando um ensaio imunoenzimático competitivo (Cayman Chemical®, Michigan, EUA). A dosagem consistiu na utilização de uma placa de 96 poços sensibilizada com anticorpo monoclonal de Coelho anti-IgG, onde foram adicionadas as amostras ou padrões, uma solução contendo GMPc complexado a acetilcolinesterase (AChE) e um anticorpo (IgG) específico para GMPc, assim o GMPc da amostra e o GMPc complexado a AChE competiram pelo anticorpo específico, que se ligaram ao anticorpo monoclonal anti-IgG na superfície da placa. Após 18 horas de incubação a uma temperatura de 4º C, foi feita a lavagem da placa e foi incubado o reagente de Ellman, um substrato da AChE cujo produto da reação enzimática tem uma coloração amarela, que foi lida em 405 nm, sendo a intensidade da cor é inversamente proporcional à concentração de GMPc na amostra. A curva padrão foi obtida por regressão não linear utilizando uma função logística de 4 parâmetros, cuja equação foi utilizada para determinar a concentração das amostras.. Os resultados foram expressos em pmol/mg de tecido.

3.7 Docking Molecular

As estruturas dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B foram construídas utilizando o software MarvinSketch® v.19.10 (ChemAxon, Hungria). Estas foram otimizadas através do software Avogadro® v.1.2.0 (HANWELL et al., 2012), configurado para utilizar o campo de força Merck Molecular Force Field (MMFF94) (HALGREN et al., 1996).

As estruturas proteicas selecionadas foram obtidas através do repositório RCSB Protein Data Bank (PDB, https://www.rcsb.org/). A estrutura proteica do domínio H-NOX β1 da GCs foi obtida sob o código “2O09”, nomeada como “estrutura cristalina do domínio H- NOX da Nostoc sp. PCC 7120”, classificada como proteína de sinalização, sistema de expressão Escherichia coli BL21(DE3) e organismo Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) (MA et al., 2007). Já a estrutura proteica do domínio H-NOX β1 oxidado da GCs e do cinaciguat foi obtida sob o código “3L6J”, nomeada como “estrutura do cinaciguat (BAY 58-2667) ligada ao domínio H-NOX de Nostoc”, classificada como proteína 52 de sinalização, sistema de expressão Escherichia coli e organismo Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) (MARTIN et al., 2010).

Os resíduos presentes no arquivo PDB da H-NOX ou cinaciguat foram removidos utilizando a interface gráfica do software AutoDockTools® - ADT v.1.5.6 (MORRIS et al., 2009) para que o docking molecular ocorresse sem interferência de outros compostos químicos. Em seguida, tanto para os ligantes (FOR011B ou FOR811B) quanto para as proteínas (H-NOX reduzida ou H-NOX oxidada), adicionou-se hidrogênios polares (Kollman) e cargas parciais (Gasteiger).

O procedimento de docking molecular foi realizado por meio do código HEX® 8.0.0 (RITCHIE; KEMP, 2000) configurado para OPLS Minimisation. Para avaliação dos resultados, considerou-se a localização e geometria de mais baixo valor de energia livre total. As interações do ligante com os resíduos de aminoácidos foram visualizadas no software UCSF Chimera® 1.13.1 (PETTERSEN et al., 2004).

3.8 Fármacos e Diluições

Todos os reagentes utilizados nessa pesquisa foram adquiridos da empresa Sigma Aldrich® (USA). No preparo das soluções dos metalofármacos foi utilizada água destilada como solvente, assim como nas soluções de KCl, PHE, ACH, L-NAME, TEA, 4-AP, WORT, SNP, BAY, MDL e ATR. As soluções de ODQ e GLIB usaram o dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente e a INDO foi solubilizada em uma solução aquosa de NaHCO3 a 5%. Não foram realizados experimentos controle com os diluentes já que suas concentrações na cuba eram mínimas e haver a comprovação de ausência de atividade biológica dessas substâncias (LIMA-ACCIOLY et al., 2006; HIPÓLITO et al., 2009; HIPÓLITO et al., 2011).

3.9 Análise Estatística

Nos ensaios de relaxamento da musculatura lisa vascular, o efeito relaxante (R) das substâncias foi calculado, para cada concentração, em função da máxima contração proporcionada pelo agonista, sendo normalizado e expresso em termos percentuais, conforme a seguinte expressão: 53

onde TA e TS são, respectivamente, as tensões decorrentes da ação do agonista e de uma dada substância. Em seguida, realizou-se a transformação logarítmica (base 10) das concentrações, molar ou µg/mL. Os gráficos foram então elaborados a partir dos valores médios da magnitude do efeito vasodilatador, ou vasoconstritor, calculados para cada concentração da substância (após transformação logarítmica). Tais dados foram usados para construir as curvas concentração-efeito mediante o uso de análise de regressão não linear. Para tanto, tomou-se como base o modelo que utiliza uma função sigmoide do tipo:

onde y corresponde à medida da resposta (efeito relaxante), x ao logaritmo decimal da concentração, a à resposta mínima e b à resposta máxima. A CE50 é definida como a concentração da substância que produz 50% da resposta máxima ou a resposta semimáxima, ou seja, é o valor da concentração que corresponde ao ponto médio entre a resposta mínima e a máxima. O Emax pode ser definido como a máxima resposta proporcionada por uma determinada substância. A maioria dos resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) com a representação do número de observações experimentais (n). A CE50 foi expressa como média e o intervalo de confiança de 95% (IC95%). Comparações entre dois grupos foram realizadas através do teste t de para dados não emparelhados, enquanto para comparações entre três grupos ou mais utilizou-se a análise de variância (ANOVA) associada ao pós-teste de comparações múltiplas de Tukey. Em todas as análises, estabeleceu-se o nível de significância em 0,05 (5%), ou seja, consideraram-se estatisticamente significantes valores de P menores que 0,05. O software GraphPad Prism® versão 7.00 para Windows® (GraphPad Software, San Diego, California, USA, 2016) foi utilizado para a realização dos procedimentos estatísticos e elaboração dos gráficos.

4 RESULTADOS

4.1 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM.

O FOR011B causou uma vasodilatação em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- -2 contraídos com PHE 1 µM de maneira dose dependente. A CE50 do FOR011B foi 9,89 x 10 -2 -2 µM (IC95%: 7,38 x 10 – 13,2 x 10 ), enquanto seu Emax foi 110,95%±1,964. Os dois controles positivos SNP e BAY 41-2272 tiveram um Emax de 105,4%±0,4882 e 107,1%±0,9323, respectivamente. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os Emax do FOR011B, SNP e BAY 41-2272. Os precursores estruturais do FOR011B (000 e L11B) causaram uma vasodilatação nas mesmas condições. O 000 teve uma -1 -1 -1 CE50 de 6,16 x 10 µM (IC95%: 2,88 x 10 – 13,5 x 10 ) e um Emax de 58,96%±2,995, -1 -1 enquanto o L11B teve uma CE50 de 7,27 x 10 µM (IC95%: 24,2 x 10 ) e um Emax de

49,1%±4,441. O FOR011B, assim como o SNP e o BAY 41-2272, tiveram um Emax significativamente maior do que os dois precursores 000 e L11B (P<0,001) (Gráfico 1). Não foi possível calcular a CE50 dos controles positivos com precisão, entretanto pode-se afirmar que ambos tiveram uma CE50 menor que o FOR011B.

Gráfico 1 - Efeito do metalofármaco FOR011B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

1 2 0

* * * 1 0 0

) 8 0

(

o t

n 6 0 e

m F e n ile frin a

a x

a 4 0 S N P

l e

R B A Y 4 1 -2 2 7 2

2 0 0 0 0

L 1 1 B 0 F O R 0 1 1 B

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax dos grupos SNP, BAY 41-2272 e FOR011B, com relação aos grupos 000 e L11B (P<0,001).

Em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM, o efeito vasodilatador do FOR011B foi muito discreto, tendo um Emax de 23,08%±1,667 e uma CE50 de 3,44 x 10-1 µM (IC95%: 0,59 x 10-1 – 45,7 x 10-1). Os controles positivos SNP e BAY 41-

2272 tiveram um Emax de 92,61%±0,963 e 94,36%±2,032, respectivamente. O Emax do

FOR011B foi significativamente menor que o Emax dos dois controles positivos (P<0,001).

Com relação aos precursores estruturais (000 e L11B), foram obtidos Emax de 7,55%±0,5471 e 11,34%±1,045, respectivamente. Ambos os precursores tiveram uma eficácia significativamente menor que o FOR011B (P<0,001) (Gráfico 2).

Gráfico 2 - Efeito do metalofármaco FOR011B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (N=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM.

1 2 0 K C l S N P

1 0 0 B A Y 4 1 -2 2 7 2

0 0 0

) 8 0

L 1 1 B

(

t F O R 0 1 1 B

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0 +*+**+

*** 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax dos grupos FOR011B, 000 e L11B, em relação aos grupos SNP e BAY 41-2272 (P<0,001).

+++ indica diferença estatisticamente significativa do Emax do grupo FOR011B com relação aos grupos 000 e L11B (P<0,001).

O gráfico 3 mostra a comparação entre o efeito vasodilatador do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM e com PHE 1 µM. Observou- se que o Emax do FOR011B em artérias pré-contraídas com PHE 1 µM foi significativamente maior que em artérias pré-contraídas com KCl 60 mM (P<0,001).

Gráfico 3 - Comparação entre os efeitos do FOR011B em anéis de aorta pré-contraídos com KCl 60 mM (n=8) e com PHE 1 µM (n=8).

1 2 0 P H E *** K C l 1 0 0

) 8 0

(

o t

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

lo g [F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax do grupo PHE em relação ao grupo KCl (P<0,001).

4.2 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM.

O FOR811B causou uma vasodilatação em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- -1 contraídos com PHE 1 µM de maneira dose dependente. A CE50 do FOR811B foi 2,16 x 10 -1 -1 µM (IC95%: 1,71 x 10 – 2,72 x 10 ), enquanto seu Emax foi 110,3%±2,019. O SNP e o BAY

41-2272 tiveram um Emax de 105,4%±0,488 e 107,1%±0,932 respectivamente. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas do Emax do FOR811B em relação aos controles positivos em artérias pré-contraídas com PHE 1 µM. Com relação aos precursores estruturais, o 000 teve um Emax de 58,96%±2,995, enquanto o L11B teve um Emax de

49,1%±4,441. Os dois precursores tiveram um Emax significativamente menor que o FOR811B e que os dois controles positivos (SNP e BAY 41-2272) (P<0,001) (Gráfico 04). Não foi possível calcular a CE50 dos controles positivos com precisão, entretanto pode-se afirmar que ambos tiveram uma CE50 menor que o FOR811B.

Gráfico 4 - Efeito do metalofármaco FOR811B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (N=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

1 2 0

*** 1 0 0

) 8 0

(

o t

n 6 0 e

m F e n ile frin a

a x

a 4 0 S N P

l e

R B A Y 4 1 -2 2 7 2

2 0 0 0 0

L 1 1 B 0 F O R 8 1 1 B

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média. *** denota diferença estatisticamente significativa do Emax dos grupos SNP, BAY 41-2272 e FOR811B, quando comparados aos pares com os grupos 000 e L11B (P<0,001). 59

O FOR811B também teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio

íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM, entretanto foi observado um Emax de apenas

62,91%±4,142 e uma CE50 de 5,756 µM (IC95%: 3,559 – 9,462). O Emax do FOR811B foi significativamente menor que o Emax encontrado para o SNP e o BAY 41-2272 (P<0,001), quais foram 92,61%±0,9632 e 94,36%±2,032, respectivamente. Os grupos 000 e L11B tiveram um Emax de 7,55%±0,5471 e 11,34%±1,045, respectivamente, sendo ambos significativamente menores que o Emax do FOR811B (P<0,001) (Gráfico 5).

Gráfico 5 - Efeito do metalofármaco FOR811B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (N=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM.

1 2 0 K C l S N P

1 0 0 B A Y 4 1 -2 2 7 2

0 0 0

) 8 0

L 1 1 B

(

t F O R 8 1 1 B

n 6 0 e

+*+**+

a x

a 4 0

e R

2 0

*** 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax dos grupos FOR811B, 000 e L11B, em relação aos grupos SNP e BAY (P<0,001).

+++ indica diferença estatisticamente significativa do Emax do grupo FOR811B, em relação aos grupos 000 e L11B.

O gráfico 6 mostra a comparação entre o efeito do FOR811B em artérias pré- contraídas com KCl 60 mM e em artérias pré-contraídas com PHE 1 µM. Observou-se um

Emax significativamente maior em artérias pré-contraídas com PHE 1 µM (P<0,001).

Gráfico 6 - Comparação entre os efeitos do FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl (n=8) e com PHE (n=8).

1 2 0 P H E *** 1 0 0 K C l

) 8 0

(

o t

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

lo g [F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax do grupo PHE em relação ao grupo KCl (P<0,001).

O Gráfico 7 mostra os efeitos vasodilatadores dos dois metalofármacos (FOR011B e FOR811B) em anéis de aorta pré-contraídas com PHE 1 µM e com KCl 60 mM. Pode-se observar que o Emax dos dois fármacos em artérias pré-contraídas com PHE foi significativamente maior que o Emax dos mesmos em artérias pré-contraídas com KCl (P<0,001). Observou-se ainda que o FOR811B em artérias pré-contraídas com KCl teve um

Emax maior que o FOR011B em artérias também pré-contraídas com KCl (P<0,001). Não foram observadas diferenças significativas com relação ao Emax ou CE50 dos dois fármacos em artérias pré-contraídas com PHE.

Gráfico 7 - Comparação entre os efeitos do FOR811B e FOR011B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE (n=8) e com KCl (n=8).

1 2 0 F O R 8 1 1 B - P H E

F O R 8 1 1 B - K C l 1 0 0 F O R 0 1 1 B - P H E

F O R 0 1 1 B - K C l

) 8 0

(

o t

n 6 0 e +*+**+

m # # #

a x

a 4 0

e R *** 2 0 + + +

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

lo g [ ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significante do Emax em relação ao grupo FOR811B – PHE (P<0,001);

+++ indica diferença estatisticamente significante do Emax em relação ao grupo FOR011B – PHE (P>0,001);

### denota diferença estatisticamente significante do Emax quando comparado ao grupo FOR011B – KCl (P<0,001).

O gráfico 8 mostra os efeitos vasodilatadores dos dois controles positivos (BAY 41- 2272 e SNP) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM ou

Fenilefrina 0,1 µM. Observou-se uma diminuição do Emax de ambos os controles em preparações contraídas com KCl, quando comparadas às preparações contraídas com PHE (P<0,001).

Gráfico 8 – Efeito vasodilatador do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM (n=6) e PHE 1 µM (n=6).

1 2 0

1 0 0

* * *

) 8 0

(

o t

n 6 0

a x

a 4 0

l S N P - P H E

e R B A Y - P H E 2 0 S N P - K C l

B A Y - K C l 0

- 2 . 0 - 1 . 5 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

l o g [ ] (  M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença significativamente estatística do Emax dos grupos SNP-KCL e BAY-KCl em relação aos grupos SNP-PHE e BAY-PHE.

A tabela 1 resume todos os dados dos metalofármacos (FOR011B e FOR811B), dos precursores (000 e L11B) e dos controles positivos (SNP e BAY 41-2272) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM e com KCl 60 mM.

Tabela 1 - Efeito vasodilatador do FOR011B (n=8), FOR811B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE ou com KCl. Preparações pré-contraídas com PHE

* pCE50 Emax Grupo Média EPM Média EPM

SNP 2,689 1,915 105,40% 0,488

BAY 41-2272 5,208 185,267 107,08% 0,932

FOR011B 1,005 0,068 110,95%a 1,964

FOR811B 0,665 0,054 110,33%a 2,019

L11B 0,139 0,222 49,10%b 4,441

000 0,210 0,136 58,96%b 2,995

Preparações pré-contraídas com KCl

* pCE50 Emax Grupo Média EPM Média EPM

SNP 1,194 0,048 92,61%b 0,963

BAY 41-2272 0,117 0,049 94,36%b 2,032

FOR011B 0,463 0,231 23,08%c,d,e,f 1,667

FOR811B -0,760 0,095 62,91%c,d,f 4,142

L11B -0,068 0,231 11,34%c 1,045

000 0,443 0,256 7,55%c 0,547

Fonte: Dados da pesquisa 64

Dados expressos como média e erro padrão da média (EPM). * pCE50 = -logCE50 a denota diferença estatisticamente significante em relação aos grupos L11B e 000 (PHE) (P<0,001) b denota diferença estatisticamente significante quando comparados aos grupos SNP e BAY 41-2272 (PHE) (P<0,001) c indica diferença estatisticamente significativa em relação aos grupos SNP e BAY 41-2272 (KCl) (P<0,001) d indica diferença estatisticamente significante em relação aos grupos L11B e 000 (KCl) (P<0,001) e indica diferença estatisticamente significante quando comparado ao grupo FOR0811B (KCl) (P<0,001) f indica diferença estatisticamente significante quando comparado aos grupos FOR011B (PHE) e FOR0811B (PHE) (P<0,001)

4.3 Influência do endotélio no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM.

O FOR011B causou um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio desnudo -2 pré-contraídos com PHE 1 µM, cujo Emax observado foi 112,2%±1,678 e CE50 foi 45,6 x 10 µM (IC95%: 40,8 x 10-2 – 50,8 x 10-2). Observou-se, no grupo com endotélio desnudo, um aumento da CE50 (P<0,001) quando comparados com o grupo com endotélio íntegro (Gráfico 9).

Gráfico 9 - Efeito do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=8) e desnudo (E-) (n=8) pré-contraídos com PHE 1 µM.

1 2 0 F e n ile frin a E + 1 0 0 E -

) 8 0

(

o t

n 6 0

e + + +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

+++ indica diferença estatisticamente significante entre o logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

Assim como no grupo com endotélio íntegro, o FOR011B causou apenas um vasorrelaxamento discreto em anéis de aorta com endotélio desnuto pré-contraídos com KCl

60 mM. Foi observado um Emax de 32,31%±1,897 no grupo com endotélio desnudo (Gráfico 10).

Gráfico 10 - Efeito do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=6) e desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com KCl 60 mM.

1 2 0 K C l

E +

1 0 0 E -

) 8 0

(

o t

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0

- 2 . 0 - 1 . 5 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

l o g [ F O R 0 1 1 B ] (  M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

Com relação ao efeito do FOR811B em anéis de aorta com endotélio desnudo pré- - contraídos com PHE 1 µM, foi observado um Emax de 128,2%±2,347 e uma CE50 de 1,91 x 10 1 -1 -1 µM (IC95%: 1,49 x 10 – 2,43 x 10 ). Assim, o Emax do grupo com endotélio desnudo foi significativamente maior que o grupo com endotélio íntegro (P<0,001), enquanto não houve diferença estatisticamente significativa na CE50 dos dois grupos (Gráfico 11).

Gráfico 11 - Efeito do FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=6) e desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com PHE 1 µM.

1 4 0 F e n ile frin a E + *** 1 2 0 E -

1 0 0

)

(

o 8 0

n e

m 6 0

a l

e 4 0 R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significante do Emax em relação do grupo E+ (p<0,001);

O FOR811B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio desnudo pré-contraídos com KCl 60 mM. O Emax observado nessas artérias foi 88,99%±2,372 e a CE50 foi 1,032 µM (IC95%: 0,7657 – 1,395). Quando comparado ao grupo com endotélio íntegro, observou-se que o grupo com endotélio desnudo teve um Emax significativamente maior (P<0,001) (Gráfico 12).

Gráfico 12 - Efeito do FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=6) e desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com KCl 60 mM.

1 2 0 K C l E +

1 0 0 E -

) ***

8 0

(

o t

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significante do Emax em relação do grupo E+ (p<0,001);

A tabela 2 resume os dados de Emax e pCE50 dos experimentos realizados em anéis de aorta com endotélio íntegro e desnudo pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM.

Tabela 2 - Efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) e desnudo (E-) pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM. E+ E- Grupo pCE50 Emax (%) pCE50 Emax (%)

Preparações pré-contraídas com fenilefrina

FOR011B 1,005±0,068 110,95±1,964 0,341±0,0239a 112,2±1,678

FOR811B 0,665±0,054 110,33±2,019 0,719±0,056 128,2±2,347a

Preparações pré-contraídas com KCl

FOR011B 0,463±0,231 23,08±1,667 -0,141±0,198 32,31±2,938

FOR811B -0,760±0,095 62,91±4,142 -0,014±0,059 88,99±2,372a

Fonte: Dados da pesquisa Dados obtidos utilizando um n amostral de 8 anéis de aorta em cada grupo e expressos como média ± erro padrão da média. a denota diferença estatisticamente significante com relação as preparações com endotélio íntegro (E+) (P<0,001);

4.4 Influência dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

O FOR011B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- contraídos com PHE 1 µM na presença de Atropina de forma dose-dependente. O Emax observado nas artérias na presença de Atropina foi de 124,8%±3,072, que foi significativamente maior que o grupo Controle (sem a presença de atropina) (P<0,01), -1 -1 -1 enquanto a CE50 foi 2,21 x 10 µM (IC95%: 1,15 x 10 – 3,15 x 10 ) (Gráfico 13).

Gráfico 13 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina (n=6).

1 4 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 2 0 ** A tro p in a

1 0 0

)

(

o 8 0

n e

m 6 0

a l

e 4 0 R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

** denota diferença estatisticamente significativa no Emax dos dois grupos (P<0,01).

O metalofármaco FOR811B também teve um efeito vasodilatador de forma dose- dependente em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na -1 presença de Atropina, apresentando um Emax de 114%±1,737 e uma CE50 de 1,46 x 10 µM -1 -1 (IC95%: 1,14 x 10 – 1,88 x 10 ). Não foi observada diferença significativa entre o Emax do grupo Controle e do grupo Atropina, entretanto o grupo Atropina teve uma CE50 significativamente menor que o grupo Controle (P<0,05) (Gráfico 14).

Gráfico 14 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le

1 0 0 A tro p in a

) 8 0

(

o t

n 6 0

e +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

+ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,05).

4.5 Influência da via do NO/GCs efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

Foi observado um efeito vasodilatador do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de L-NAME de forma dose-dependente. O -1 Emax observado em tais preparações foi 119,5%±3,729, enquanto a CE50 foi 8,24 x 10 µM -1 -1 (IC95%: 5,84 x 10 – 11,6 x 10 ). Foi observada uma CE50 significativamente maior na presença de L-NAME, quando comparado ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 15).

Gráfico 15 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de L-NAME (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 0 0 L -N A M E

) 8 0

(

o t

n 6 0 + + +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

+++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

O FOR811B também teve um efeito vasodilatador dose-dependente em preparações de aorta com o endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na presença de L-NAME. O -1 Emax do FOR811B nessas preparações foi 114,7%±4,776 e a CE50 foi 4,055 x 10 µM -1 -1 (IC95%: 2,37 x 10 – 6,9 x 10 ). Observou-se uma CE50 significativamente maior na presença de L-NAME, quando comparada ao grupo Controle (P<0,05) (Gráfico 16).

Gráfico 16 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de L-NAME (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le

1 0 0 L -N A M E

) 8 0

(

o t

n 6 0

e +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média. + denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,05).

O FOR011B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- contraídos com PHE 1 µM na presença de ODQ de forma dose-dependente. O Emax observado nessas preparações foi 120,1%±4,543 e a CE50 foi 1,96 µM (IC95%: 1,40 – 2,73). Observou- se um aumento estatisticamente significante na CE50 na presença de ODQ quando comparada ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 17).

Gráfico 17 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de ODQ (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 0 0 O D Q

) 8 0

(

o t

n 6 0 + + +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média. +++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

O FOR811B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- contraídos com PHE 1 µM na presença de ODQ de forma dose-dependente. O Emax observado nessas preparações foi 98,48%±6,403 e a CE50 foi 2,433 µM (IC95%: 1,21 – 4,93). Observou- se um aumento estatisticamente significante na CE50 na presença de ODQ quando comparada ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 18).

Gráfico 18 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de ODQ (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 0 0 O D Q

) 8 0

(

o t

n 6 0

e + + +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média. +++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

4.6 Influência da presença de Hidroxicobalamina ou L-Cisteína no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- contraídos com PHE 1 µM.

Observou-se um efeito vasodilatador de forma dose-dependente induzido pelo FOR011B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na presença de hidroxicobalamina. O Emax observado nessas condições foi 103,4%±3,123 e a -1 -1 -1 CE50 foi 3,61 x 10 µM (IC95%: 2,56 x 10 – 5,09 x 10 ). A presença de hidroxicobalamina aumentou significativamente a CE50 do FOR011B (P<0,001) (Gráfico 19).

Gráfico 19 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Hidroxicobalamina (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le

1 0 0 H id ro x ic o b a la m in a

) 8 0

(

o t

n 6 0

e + + +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

+++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

Observou-se um efeito vasodilatador de forma dose-dependente induzido pelo FOR811B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na presença de hidroxicobalamina. O Emax observado nessas condições foi 107,9%±3,064 e a -1 -1 -1 CE50 foi 3,01 x 10 µM (IC95%: 1,94 x 10 – 4,69 x 10 ). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (Gráfico 20).

Gráfico 20 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Hidroxicobalamina (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 0 0 H id ro x ic o b a la m in a

) 8 0

(

o t

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

O FOR011B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- contraídos com PHE 1 µM na presença de L-Cisteína de forma dose-dependente. O Emax observado nas artérias na presença de L-Cisteína foi de 114,7%±5,4, enquanto a CE50 foi

1,846 µM (IC95%: 1,459 – 2,36), sendo esse último significativamente maior que a CE50 do grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 21).

Gráfico 21 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de L-Cisteína (n=6).

1 4 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 2 0 L -C is te ín a

1 0 0

)

% (

8 0

n e

6 0 m

a + + +

x a

l 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média. +++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

O FOR811B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- contraídos com PHE 1 µM na presença de L-Cisteína de forma dose-dependente. O Emax -1 -1 observado foi de 116,3%±4,32, enquanto a CE50 foi 2,99 x 10 µM (IC95%: 1,92 x 10 – -1 4,67 x 10 ). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes (Gráfico 22).

Gráfico 22 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de L-Cisteína (n=6).

1 4 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 2 0 L -C is te ín a

1 0 0

)

(

o 8 0

n e

m 6 0

a l

e 4 0 R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

4.7 Influência da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- contraídos com PHE 1 µM.

O metalofármaco FOR011B teve um efeito vasodilatador de forma dose-dependente em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de

Wortmaninna, apresentando um Emax de 114,7%±3,389 e uma CE50 de 2,292 µM (IC95%:

1,728 – 3,038). Observou-se que o grupo Wortmaninna teve uma CE50 significativamente maior que o grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 23).

Gráfico 23 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Wortmaninna (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 0 0 W o rtm a n in n a

) 8 0

(

o t

n 6 0 + + +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

+++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

O metalofármaco FOR811B também teve um efeito vasodilatador de forma dose- dependente em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na -1 presença de Wortmaninna, apresentando um Emax de 108,8%±2,11 e uma CE50 de 7,97 x 10 -1 -1 µM (IC95%: 7,03 x 10 – 9,05 x 10 ). Observou-se uma CE50 significativamente maior no grupo Wortmaninna quando comparada ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 24).

Gráfico 24 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Wortmaninna (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le

1 0 0 W o rtm a n in n a

) 8 0

(

o t

n 6 0

e + + +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

+++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

4.8 Influência dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

Foi observado um efeito vasodilatador do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de Tetraetilamônio (TEA) de forma dose- dependente. O Emax observado em tais preparações foi 117,6%±6,18, enquanto a CE50 foi 1,64

µM (IC95%: 1,225 – 2,292). Foi observada uma CE50 significativamente maior na presença de TEA, quando comparado ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 25).

Gráfico 25 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Tetraetilamônio (TEA) (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le

1 0 0 T E A

) 8 0

(

o t

n 6 0

e + + +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

+++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

Foi observado um efeito vasodilatador do FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de Tetraetilamônio (TEA) de forma dose- dependente. O Emax observado em tais preparações foi 107,7%±1,902, enquanto a CE50 foi 2,74 x 10-2 µM (IC95%: 1,73 x 10-2 – 4,17 x 10-2). A presença de TEA reduziu significativamente a CE50 do FOR811B (P<0,001) (Gráfico 26).

Gráfico 26 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Tetraetilamônio (TEA) (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 0 0 T E A

) 8 0

(

o t

n 6 0

e + + +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

+++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

O metalofármaco FOR011B teve um efeito vasodilatador de forma dose-dependente em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de 4- -1 Aminopiridina (4-AP), apresentando um Emax de 117,9%±4,007 e uma CE50 de 2,73 x 10 µM -1 -1 (IC95%: 1,64 x 10 – 4,51 x 10 ). Observou-se que o grupo 4-AP teve uma CE50 significativamente maior que o grupo Controle (P<0,01) (Gráfico 27).

Gráfico 27 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de 4-Aminopiridina (4-AP) (n=6).

1 4 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 2 0 4 -A P

1 0 0

)

(

o 8 0

n e

m 6 0

a + +

a l

e 4 0 R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,01).

O FOR811B teve um efeito vasodilatador de forma dose-dependente em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de 4-Aminopiridina (4-AP), -1 -1 apresentando um Emax de 120,5%±2,325 e uma CE50 de 1,54 x 10 µM (IC95%: 1,15 x 10 – 2,08 x 10-1) (Gráfico 28).

Gráfico 28 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de 4-Aminopiridina (4-AP) (n=6).

1 4 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 2 0 ** 4 -A P

1 0 0

)

(

o 8 0

n e

m 6 0

a l

e 4 0 R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

** denota diferença estatisticamente significativa no Emax dos dois grupos (P<0,01).

Observou-se um efeito vasodilatador de forma dose-dependente induzido pelo FOR011B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na presença de Glibenclamida. O Emax observado nessas condições foi 83,37%±5,971 e a CE50 foi 3,762 µM (IC95%: 2,108 – 6,823). A presença de glibenclamida reduziu significativamente o Emax do FOR011B (P<0,001) (Gráfico 29).

Gráfico 29 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Glibenclamida (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le

1 0 0 G lib e n c la m id a

) 8 0 %

( ***

o t

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significativa no Emax dos dois grupos (P<0,001).

Observou-se, também, um efeito vasodilatador de forma dose-dependente induzido pelo FOR811B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na presença de Glibenclamida. O Emax observado nessas condições foi 112,2%±3,444 e a CE50 foi 1,47 x 10-1 µM (IC95%: 0,87 x 10-1 – 2,43 x 10-1). Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos Controle e Glibenclamida (Gráfico 30).

Gráfico 30 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Glibenclamida (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 0 0 G lib e n c la m id a

) 8 0

(

o t

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

4.9 Influência da via da ciclooxigenase no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

O FOR011B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- contraídos com PHE 1 µM na presença de Indometacina de forma dose-dependente. O Emax -2 observado nessas preparações foi 98,13%±2,292 e a CE50 foi 6,67 x 10 µM (IC95%: 3,63 x -2 -2 10 – 12,02 x 10 ). Observou-se um aumento estatisticamente significante no Emax na presença de indometacina quando comparado ao grupo Controle (P<0,01) (Gráfico 31).

Gráfico 31 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Indometacina (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 0 0 In d o m e ta c in a **

) 8 0

(

o t

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

** denota diferença estatisticamente significativa no Emax dos dois grupos (P<0,01).

O FOR811B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio íntegro pré- contraídos com PHE 1 µM na presença de Indometacina de forma dose-dependente. O Emax -2 observado nessas preparações foi 116,9%±3,355 e a CE50 foi 8,95 x 10 µM (IC95%: 4,66 x -2 -2 10 – 16,91 x 10 ). Observou-se um aumento estatisticamente significante na EC50 do FOR811B na presença de indometacina quando comparado ao grupo Controle (P<0,01) (Gráfico 32).

Gráfico 32 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta pré- contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Indometacina (n=6).

1 4 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 2 0 In d o m e ta c in a

1 0 0

)

(

o 8 0

n e

m 6 0

a + +

a l

e 4 0 R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa

++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,01). Dados expressos como média e erro padrão da média.

4.10 Influência da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

Observou-se um efeito vasodilatador de forma dose-dependente induzido pelo FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de MDL 12,330A. O FOR011B teve, nessas preparações, um Emax de 110,6%±2,163 -2 -2 -2 e uma CE50 de 6,71 x 10 (IC95%: 4,54 x 10 – 9,83 x 10 ). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes com relação (Gráfico 33).

Gráfico 33 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de MDL 12,330A (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le

1 0 0 M D L 1 2 ,3 3 0 A

) 8 0

(

o t

n 6 0

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

Observou-se um efeito vasodilatador de forma dose-dependente induzido pelo FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de MDL 12,330A. O FOR811B teve, nessas preparações, um Emax de 112%±1,476 e -1 -1 -1 uma CE50 de 3,41 x 10 (IC95%: 2,89 x 10 – 4,02 x 10 ) (Gráfico 34).

Gráfico 34 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de MDL 12,330A (n=6).

1 2 0 F e n ile frin a C o n tro le 1 0 0 M D L 1 2 ,3 3 0 A

) 8 0

(

o t

n 6 0

e +

a x

a 4 0

e R

2 0

-2 . 0 -1 . 5 -1 . 0 -0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Fonte: Dados da pesquisa Dados expressos como média e erro padrão da média.

+ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,05).

As tabelas 3 e 4 reportam os dados de pCE50 e Emax com erro padrão da média (EPM) dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B, respectivamente, na ausência (Controle) e na presença dos inibidores avaliados.

Tabela 3 – Efeito vasodilatador do FOR011B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina, L- NAME, ODQ, hidroxicobalamina, L-cisteína, TEA, glibenclamida, 4-AP, indometacina, MDL 12,330A ou wortmaninna (n=6).

* pCE50 Emax (%) Grupo Média EPM Média EPM

Controle 1,005 0,068 110,95 1,964

Atropina 0,656 0,080 124,81b 3,072

L-NAME 0,084c 0,072 119,51 3,729

ODQ -0,292c 0,071 120,05 4,543

Hidroxicobalamina 0,443c 0,077 103,37 3,123

L-Cisteína -0,266c 0,052 114,7 5,4

Wortmaninna -0,360c 0,055 114,67 3,389

TEA -0,215c 0,065 117,6 6,18

Glibenclamida -0,575 0,115 83,37c 5,971

4-AP 0,563b 0,103 117,90 4,007

Indometacina 1,176 0,110 98,13b 2,330

MDL 12,330A 1,173 0,084 110,60 2,16

Fonte: Dados da pesquisa

Dados de pCE50 e Emax expressos como média e erro padrão da média (EPM). b denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,01); c denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,001).

Tabela 4 – Efeito vasodilatador do FOR811B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina, L- NAME, ODQ, hidroxicobalamina, L-cisteína, TEA, glibenclamida, 4-AP, indometacina, MDL 12,330A ou wortmaninna (n=6).

* pCE50 Emax (%) Grupo Média EPM Média EPM

Controle 0,665 0,053 110,33 2,019

Atropina 0,834a 0,053 114,02 1,737

L-NAME 0,392a 0,111 114,72 4,776

ODQ -0,386c 0,118 98,48 6,403

Hidroxicobalamina 0,521 0,079 107,92 3,064

L-Cisteína 0,524 0,098 116,33 4,32

Wortmaninna 0,099c 0,027 108,83 2,110

TEA 1,562b 0,096 107,69 1,902

Glibenclamida 0,834 0,108 112,22 3,444

4-AP 0,811 0,064 120,54b 2,325

Indometacina 1,048b 0,124 116,88 3,355

MDL-12,330A 0,468a 0,037 112,05 1,476

Fonte: Dados da pesquisa

Dados de pCE50 e Emax expressos como média e erro padrão da média (EPM). a denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,05); b denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,01); c denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,001).

4.11 Influência dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B na contração induzida por Ca2+ na presença de Fenilefrina ou de alta concentração de K+ após depleção do Ca2+ intracelular.

Nesse protocolo foi realizada uma curva de concentração resposta de CaCl2 em anéis de aorta com endotélio integro, em meio sem Ca2+, após depleção do Ca2+ intracelular e após incubação com PHE 1 µM ou KCl 60 mM e água (grupo Controle), FOR011B 5,6 x 10-7 M, ou FOR811B 3,16 x 10-6 M. Nos segmentos de aorta pré-incubados com PHE (Gráfico 35), observou-se uma contração dose-dependente induzida pelo Ca2+ nos grupos Controle e FOR011B, entretanto essa contração não foi observada no grupo FOR811B. Observou-se um Emax de 139,3%±8,507 no grupo Controle, 188,8%±20,67 no grupo FOR011B e 25,51%±5,778 no grupo FOR811B, sendo o último significativamente menor que os grupos Controle e FOR011B (P<0,001).

2+ Gráfico 35 – Efeito vasoconstritor do CaCl2 na presença de PHE 1 µM após depleção do Ca intracelular, na presença de Água (Controle) (n=4), FOR011B (n=6), ou FOR811B (n=7).

1 8 0 F e n i l e f r i n a

C o n t r o le 1 6 0

F O R 0 1 1 B 1 4 0 F O R 8 1 1 B

1 2 0

)

% (

1 0 0

ã ç

a 8 0

t n

o 6 0 C

4 0

2 0 * * *

- 2 . 0 - 1 . 5 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5

l o g [ C a C l 2 ] m M

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax quando comparado aos grupos Controle e FOR011B (P<0,001). 95

Nos segmentos de aorta pré-incubados com KCl 80 mM (Gráfico 36), observou-se 2+ uma contração dose-dependente induzida pelo Ca nos três grupos. Observou-se um Emax de 129,1%±5,593 no grupo Controle, 141,2%±4,233 no grupo FOR011B e 159,6%±14,47 no grupo FOR811B, não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes com relação -1 ao Emax. Com relação à CE50, foi observada no grupo Controle uma CE50 de 1,45 x 10 µM -1 -1 -1 (IC95%: 0,78 x 10 – 2,68 x 10 ), no grupo FOR011B observou-se uma CE50 de 5,02 x 10 -1 -1 µM (IC95%: 3,87 x 10 – 6,55 x 10 ), e no grupo FOR811B, foi observada uma CE50 de 1,40 x 10-1 µM (IC95%: 3,3 x 10-1 – 13,5 x 10-1). A presença dos complexos de rutênio diminuiu significativamente o logCE50 do CaCl2, quando comparados ao grupo Controle.

2+ Gráfico 36 – Efeito vasoconstritor do CaCl2 na presença de KCl 8 mM após depleção do Ca intracelular, na presença de Água (Controle) (n=4), FOR011B (n=7), ou FOR811B (n=7).

K C l 1 4 0 C o n tro le

1 2 0 F O R 0 1 1 B F O R 8 1 1 B

1 0 0

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o 8 0 ã

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C 4 0

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-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5

lo g [C a C l2 ] m M

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média. a denota diferença estatisticamente significante na comparação Controle vs FOR011B (P=0,0164); b denota diferença estatisticamente significante na comparação Controle vs FOR811B (P=0,0046).

4.11 Dosagem de GMPc por ELISA

Nos resultados de dosagem das concentrações de GMPc foi observada diferença estatisticamente significante quando comparados os 5 grupos entre si por one-way ANOVA (P=0,0465), entretanto, quando comparados aos pares pelo teste de Tukey não foram observadas diferenças estatisticamente significantes (P>0,05) (Gráfico 37).

Gráfico 37 – Concentração de GMPc nos grupos Controle (n=4), 011B (n=4), 811B (n=4),

011B+ODQ (n=4) e 811B+ODQ (n=4). Dados expressos como média e erro padrão da média. )

o 1.5

e d

1.0

o m

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G 0.0 [ le B B Q Q o 1 1 D D tr 1 1 O O n 0 8 + + o B B C 1 1 1 1 0 8

Fonte: Dados da pesquisa

4.12 Docking Molecular

A partir da análise do Docking molecular (Figura 26), foi observado o desvio existente entre o ligante (FOR011B, FOR0811B e BAY 41-2272) e a proteína (PDB 2O09) sendo calculado um valor de RMSD em torno de 1 Å para todos os ligantes.

Figura 26 - Docking molecular entre os ligantes FOR011B (1A), FOR811B (1B) e BAY 41- 2272 (1C) e a porção HNOX – Subunidade β1 da GCs.

Fonte: Dados da pesquisa.

Os resultados obtidos no Docking molecular da porção HNOX – Subunidade β1 da GCs (PDB 2O09) foram analisados em função energia de interação com o sítio ativo da proteína, bem como a energia de ativação necessária para sua ocorrência. Os valores de energia de ligação encontrados foram de -243,9 Kcal/mol (FOR011B), -333,2 Kcal/mol (FOR811B) e -901,6 Kcal/mol (BAY 41-2272). Foi possível observar os ligantes FOR011B (Figura 27A), FOR0811B (Figura 27B) e BAY 41-2272 (Figura 27C), interagindo sobre os resíduos que agem com o sítio ativo da porção HNOX – Subunidade β1 da GCs (PDB 2O09).

Figura 27 - Mapa 2D das interações do sítio catalítico do ligante FOR011B (1A), FOR811B (1B) e BAY 41-2272 (1C) e a porção HNOX – Subunidade β1 da GCs.

Fonte: Dados da pesquisa.

A Tabela 5 mostra os resultados de distância de ligação entre os resíduos da enzima com os ligantes, sendo notória a maior proximidade dos ligantes FOR011B e FOR811B à proteína.

Tabela 5 - Tabela comparativa das distâncias entre os resíduos/ligantes. Resíduos de Distância dos ligantes aminoácidos FOR011B FOR811B BAY 41-2272 Tyr 2 3.5 Å 3.5 Å 17.9 Å Ala 42 3.6 Å 3.4 Å 20.7 Å Asp 102 2.1 Å 2.0 Å 16.7 Å Gln 114 3.3 Å 3.2 Å 17.7 Å Arg 116 2.8 Å 3.0 Å 9.8 Å Glu 121 3.5 Å 3.1 Å 14.8 Å Arg 138 2.8 Å 3.0 Å 4.6 Å

Fonte: Dados da pesquisa.

Na figura 28, podemos destacar interações do BAY 41-2272 e a porção HNOX – Subunidade β1 da GCs com outros resíduos de aminoácidos importantes no sítio ativo da proteína, com maior proximidade entre a mesma e os resíduos Glu 169, Cys 139 e Arg 168.

Figura 28 - Distâncias do ligante BAY 41-2272 e a proteína (PDB 2O09).

Fonte: Dados da pesquisa.

Foi possível observar as seguintes interações entre a proteína e o ligante FOR011B: Asn100, Ser89, Arg107 e Pro113 (Figura 29A). Entre a proteína e o ligante FOR811B, as interações com os resíduos: Gln114, Glu99, Glu121, Arg116, Gln135 e Ser44 (Figura 29B). Após o redocking, foi possível observar a interação da proteína com os resíduos Asn103, Glu99, His124, Glu121(Figura 29C), bem como entre resíduos como Arg116 e Ser44, visualizados também na interação com o ligante FOR811B, indicando um potencial inibitório para tal ligante. É possível observar também, distâncias pequenas (˂ 3Å) da grande maioria dos resíduos e a proteína, tanto em relação aos ligantes FOR011B e FOR811B, como no caso do redocking.

Figura 29 - Interação dos resíduos do sítio ativo da proteína (PDB 3L6J) e os ligantes FOR811B (A), FOR811B (B) e cinaciguat (C).

Fonte: Dados da pesquisa. 100

5 DISCUSSÃO

Na presente pesquisa foi utilizado o modelo com aortas de ratos para investigação de mecanismo de ação farmacológico de substâncias. Este é um modelo largamente utilizado por pesquisadores em todo o mundo e que apresenta resultados confiáveis (YÜSUF et al., 1994; PATCHARIN et al., 2003; MARTINELLI et al., 2018; SAWABE et al., 2019).

Neste estudo, foi analisado o efeito farmacológico de complexos de rutênio com radicais 2-imidazolidinetiona na reatividade vascular em aortas de ratos e verificada a interação fármaco-receptor entre os complexos e seus possíveis receptores de atuação. Compostos derivados de metais vêm sendo largamente pesquisados, devido as suas características químicas e farmacológicas favoráveis (CRAVER et al., 2010; CAO; ZHENG; CHEN, 2015; SOLTAU, et al., 2015; ZENG, et al., 2016). Ademais, alguns compostos imidazólicos já estão sendo utilizados na prática clínica e mostram importantes efeitos antineoplásicos, antifúngicos, antiparasitários, anti-histamínicos, antineuropáticos, bactericidas, anti-inflamatórios, antivirais e anti-hipertensivos (ANDERSON; LONG, 2010; EBEL et al., 2012; ZHANG, et al., 2014).

Moléculas derivadas de rutênio com radicais piridínicos e imidazólicos têm se mostrado com efeito satisfatório pela sua importante função redutora e a capacidade de doar NO. Essa substância desempenha um papel fisiológico e farmacológico significativo, tal fato faz com que a busca por substâncias capazes de doar NO ou estimular sua produção seja intensificada. Atualmente existem substâncias terapêuticas capazes de atuar na via do NO, porém seus efeitos colaterais são significativos e limitam sua utilização clínica (PRIVIERO; WEBB, 2010; GOUVEIA-JÚNIOR, 2017).

Estudos com compostos de rutênio que possuem radicais nitrogenados mostram que sua reatividade está relacionada com suas propriedades de redução e ligadas com a via do NO (LIMA et al., 2014). Atualmente, esses compostos vêm sendo estudados por sua baixa toxicidade (FRICKER et al., 1997; HUTCHINGS et al., 2005), similaridade com estruturas metálicas endógenas e por serem termodinamicamente estáveis (ALLARDYCE; DYSON, 2001).

Em ensaios in vitro com o FOR0812, em concentrações iniciais de 10µM, não foram encontradas evidências de toxicidade em células muscular lisa de vasos (CABRAL, 2016), 101 assim como estudos com outro complexo de rutênio (BONAVENTURA et al., 2004; BONAVENTURA et al., 2006).

Compostos piridínicos têm mostrado um importante efeito anti-hipertensivo em ratos e anti-inflamatório, inclusive com efeito protetor em modelos animais de lesão renal e hepática, além de reduzir a pressão intraocular, o que estabelece um potencial alvo terapêutico para o glaucoma (FRIEBE; SANDNER; SEIFERT, 2015).

Neste estudo, os metalofármacos pesquisados apresentaram um efeito vasorrelaxante máximo similar aos controles utilizados, SNP e BAY 41-2272. O SNP foi quimicamente caracterizado no século 19 e sua capacidade de reduzir a pressão arterial é conhecida desde 1929 (JOHNSON, 1929) o que tornou essa substância alvo para terapêutica clínica por mais de 50 anos (MORACCA et al., 1962). Seu efeito vasodilatador está relacionado com a liberação de NO e ativação da enzima GCs, aumentando consequentemente a produção de GMPc. Por outro lado, essa ação ativa canais de potássio e a SERCA no músculo liso vascular, levando a uma redução na concentração de cálcio citoplasmática e a um relaxamento do vaso (PEREIRA et al., 2011; LUNARDI et al., 2006; BONAVENTURA et al., 2011).

Na pesquisa de Munhoz e colaboradores (2012) foi descrito um efeito vasorrelaxante inferior do derivado de rutênio estudado (RuBPY) quando comparado ao SNP. Bonaventura e colaboradores em 2005, assim como Rodrigues et al., em 2007, ao estudarem o efeito de um composto derivado de rutênio (15-ANE e TERPY, respectivamente), relataram que o efeito vasodilatador do SNP e do composto foram prejudicados em animais previamente hipertensos.

Apesar do SNP ser considerado por muitos anos como um vasodilatador endotélio- independente, há pesquisas que mostram que seu efeito pode estar relacionado à ativação de canais de cálcio endoteliais, o que aumentaria a atividade da NOS, potencializando seu efeito pela produção de NO (BONAVENTURA et al., 2008).

Marcondes e colaboradores (2002) demonstram que o derivado de rutênio Ru-NO possui um efeito hipotensor mais lento e prolongado quando comparado com o SNP.

Já o BAY 41-2272 atua como um estimulador da GCs se ligando na subunidade α1 da enzima, suas propriedades vasodilatadoras já foram largamente descritas na literatura (BATES et al., 1991; HARRISON; BATES, 1993; MARCHESI et al., 2012). Incialmente seu mecanismo foi descrito como heme-dependente (MARCHESI et al., 2012), porém a heme 102 oxidação com ODQ não bloqueou o efeito vasorrelaxante do BAY 41-2272 (BATES et al., 1991; CLARKE; GAUL, 1993). Na presença da porção heme intacta, a GCs é ativada e libera GMPc. Compostos heme-dependentes são incapazes de ativar essa enzima quando está inativada (porção heme livre ou oxidada). De tal modo, compostos ativadores da GCs são considerados heme-independentes e os estimuladores são heme-dependentes (LIMA et al., 2014). O NO é um estimulador da GCs que se liga ao grupamento contendo Fe2+ reduzido (PLANE et al., 1998).

Uma pesquisa realizada com o composto FOR005 mostrou que este composto foi capaz de gerar uma vasodilatação oito vezes maior que o BAY 41-2272 e produzir quantidades significativas de GMPc (SÁ et al., 2015).

Nesta pesquisa foi encontrada uma redução significativa do efeito vasodilatador máximo dos compostos FOR011B e FOR811B quando pré-contraídos com KCl em comparação com a pré-contração com PHE. A PHE é um vasoconstrictor que atua nos receptores adrenérgicos α ativando a mobilização de cálcio intra e extracelular, já o KCl induz a contração vascular através do influxo de cálcio extracelular, porém bloqueia os canais de potássio, o que pode influenciar no relaxamento da musculatura lisa vascular induzida pelo NO (FEREZIN, et al., 2005).

A fenilefrina, por ser um agonista α-1, estabelece uma ativação de fosfolipase C com síntese de IP3 e DAG, o que culmina no aumento das concentrações de cálcio citoplasmáticas. Somado a este fato, a fenilefrina também exerce uma função redutora, segundo Bonaventura e colaboradores (2004) alguns compostos doadores de NO necessitam de uma reação de redução para que sejam capazes de liberar NO. Este fato pode justificar os achados desse estudo onde o efeito relaxante dos compostos FOR011B e FOR811B foi reduzido significativamente na contração com KCl quando comparado com fenilefrina. Pode-se observar também que os controles utilizados (BAY 41-2272 e SNP) também apresentaram resultados vasodilatadores reduzidos quando pré-contraídos com KCl.

Um estudo realizado por Ceron e colaboradores (2001) com um complexo de rutênio, mostrou que houve vasodilatação em anéis de aorta sem endotélio. Este mesmo estudo afirma que a pré-contração com KCl diminui o efeito vasorrelaxante de compostos nitrosilados (CERON, et al., 2001).

Outras pesquisam também mostram uma redução na eficácia e na potência de compostos derivados de rutênio com o endotélio íntegro. Bonaventura e colaboradores (2009) 103 justificam esse fato através da oxidação do cofator BH4 pela liberação de NO, que culmina na formação de dihidrobiopterina (BH2) e biopterina, causando o desacoplamento da NOS e consequentemente um aumento da produção de superóxidos, que diminuiria o efeito relaxante causado pelo NO (FÖRSTERMANN et al., 2006; BONAVENTURA et al., 2008). Esse fato pode estar relacionado aos resultados encontrados nesta pesquisa, onde a retirada do endotélio aumentou o efeito vasorrelaxante dos compostos FOR011B e FOR811B.

A eNOS é uma enzima essencial para homeostase e remodelamento vascular além da adaptação ao estresse e exercício (GARCIA; SESSA, 2019). O NO é um gás solúvel de curta meia vida (aproximadamente 6 a 30 segundos) sintetizado a partir do aminoácido L-arginina pela eNOS. Várias substâncias (acetilcolina, bradicinina, serotonina) podem aumentar a produção de NO, porém o mecanismo fisiológico responsável por grande parte desta síntese é o atrito do fluxo sanguíneo na parede dos vasos (RUBANI; ROMERO; VANHOUTTE, 1986; JOANNIDES et al., 1995; TOUSOULIS et al., 2012). Uma vez produzido, esse gás é capaz de estimular a enzima GCs a produzir GMPc que culmina por um efeito vasorrelaxante (TOUSOULIS et al., 2012). O NO também pode causar vasorrelaxamento atráves da estimulação de canais de potássio dependentes de cálcio onde o estímulo gera ativação de uma proteína quinase Akt ou proteína quinase B que fosforila a NOS tornando-a sensível ao complexo cálcio-calmodulina (DALE et al., 2011).

A inibição da produção de NO pode ocorrer através da oferta de análogos à L- arginina, como o L-NAME que competem pelo sítio de ligação na NOS de maneira não seletiva (LUSZCZKI et al., 2011; TAKAHASHI et al., 2011; KOPINCOVÁ; PÚZSEROVÁ; BERNÁTOVÁ, 2012).

Os resultados desta pesquisa mostraram uma redução na potência do FOR011B e FOR811B quando pré-incubados com L-NAME. Na pesquisa de Potje e colaboradores (2018) o L-NAME aumentou a potência do derivado de rutênio (TERPY) em aorta de ratos normotensos, porém a potência foi reduzida em aorta de ratos espontaneamente hipertensos. Tal fato evidencia o envolvimento da NOS no efeito vasodilatador dos complexos de rutênio, assim como relata Bonaventura e colaboradores em seu estudo com TERPY (2009).

A GCs é um heterodímero composto pelas subunidades α e β, onde cada uma possui três domínios: 1. N- terminal heme responsável pela sensibilidade ao NO; 2. domínio dimerização e 3. C-terminal domínio catalítico, responsável pela conversão de GTP em GMPc (AKESSON; LUNDQUIST, 1999). Atualmente existem sete mecanismos propostos para o 104 relaxamento mediado pelo GMPc: 1. Inibição da produção de inositol-1,4,5-trifosfato; 2. Aumento do efluxo de cálcio; 3. Desfosforilação da quinase de cadeia leve de miosina; 4. Inibição do influxo de cálcio; 5. Ativação da proteína quinase G; 6. Estimulação das bombas de cálcio da membrana; 7. Abertura dos canais de potássio (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; MONCADA; PALMER; HIGGS, 1991).

Outra maneira de bloquear o efeito vasodilatador estimulado pelo NO é através do ODQ. Estudos comprovam que esta substância é capaz de inibir a atividade da GCs estimulada por NO de forma específica, seu mecanismo envolve a oxidação da porção heme localizada na região N-terminal da subunidade β1 da enzima, fazendo com que o NO não seja mais capaz de ativá-la (STONE et al., 1995; OLESEN et al., 1998; ZHAO et al. 2000). O ODQ não influencia o domínio catalítico da GCs e a re-redução da porção heme da enzima reestabelece completamente a sensibilidade ao NO (ZHAO et al. 2000).

Na atual pesquisa, a pré-incubação com ODQ reduziu a potência do FOR011B e FOR811B de maneira significativa. Várias pesquisas denotam o envolvimento da GCs no mecanismo vasodilatador dos complexos derivados de rutênio, através da redução do efeito desses complexos com a utilização de ODQ (MUNHOZ et al., 2012; TFOUNI et al., 2012; PEREIRA et al., 2013; POTJE et al., 2018).

Em um estudo com dois compostos derivados de rutênio, foi observada uma eficácia vasodilatadora dessas substâncias semelhante ao SNP em aorta de ratos, porém quando pré incubados com ODQ o efeito vasorrelaxante foi reduzido significativamente (SILVA et al., 2018).

Com o intuito de verificar se os complexos de rutênio estão agindo na doação de NO ou na ativação direta da via, foram utilizados dois sequestradores de óxido nítrico. Sabe-se que a hidroxicobalamina reage com NO formando nitrosocobalamina, reduzindo o efeito vasodilatador do NO e de doadores de NO, como o SNP e outros complexos de rutênio em preparações de artérias isoladas (KACZKA et al., 1951; RAJANAYAGAM et al., 1993; BONAVENTURA et al., 2007; CABRAL, 2016). A L-Cisteína atua mais especificamente como sequestradores do íon nitroxil (NO-), a forma reduzida do NO (PINO; FEELISCH, 1994; BONAVENTURA et al., 2007; CABRAL, 2016).

O NO vem sendo largamente estudado desde a sua descoberta como fator relaxante derivado do endotélio por Ignarro e colaboradores (1987), entretanto o ânion nitroxil, que foi ignorado por bastante tempo, está sendi bastante estudado nos últimos tempos como uma 105 molécula de grande importância para o fator hiperpolarizante derivado do endotélio (IRVINE et al., 2008; ANDREWS et al., 2009; EDWARDS et al., 2010). Endogenamente, o NO- pode ser formado diretamente a partir da enzima NOS, principalmente na ausência de um dos seus cofatores, a tetrahidrobiopterina, bem como pode ser formado pela oxidação dos produtos intermediários da sintase de NO, Nω-hidroxi-L-Arginina e hidroxilamina (FUKUTO et al., 2005; DONZELLI et al., 2005; 2008; IRVINE et al., 2008).

Observou-se uma redução de pCE50 na vasodilatação induzida pelo FOR011B na presença dos sequestradores hidroxicobalamina e L-Cisteína, entretanto não foram observadas diferenças na vasodilatação induzida pelo FOR811B, o que sugere que o primeiro complexo de rutênio induz uma liberação de NO e de NO-, enquanto o segundo, provavelmente, não está causando liberação do NO coordenado ao rutênio como mecanismo principal de atuação.

Gouveia Junior (2017) mostrou que o FOR811B libera óxido nítrico quando aplicado um potencial elétrico, ocorrendo a substituição do NO da estrutura por uma molécula de água, entretanto tal reação é dificultada em meio básico, devido ao seu baixo pKa, facilitando a interconversão nitrosil/nitrito. Portanto, nas condições do estudo, duas hipóteses podem ser levantadas quanto à não liberação do NO pelo FOR811B, a primeira diz respeito às condições do meio não estarem favorecendo a liberação do NO, enquanto a segunda é de que pode estar ocorrendo a interconversão nitrosil/nitrito, dificultando ainda mais a liberação, pois a ligação com nitrito é mais estável.

Primariamente, fármacos doadores de NO são utilizados no tratamento da angina aguda em pacientes com doenças coronarianas, crises hipertensivas e outras emergências que necessitam de uma rápida intervenção com efeito de vasorrelaxamento. Recentemente o riociguat, um estimulador da GCs foi aprovado e liberado para o tratamento da hipertensão arterial pulmonar e da hipertensão pulmonar tromboembólica crônica. Outro fármaco que atua na mesma enzima, vericiguat (BAY 1021189), está sendo estudado para tratar pacientes com falência cardíaca e se encontra atualmente em ensaios clínicos de fase III, e assim como o riociguat mostra aumento nas dosagens de GMPc (FRIEBE; SANDNER; SEIFERT, 2015; FRIEBE; SANDNER; SCHMIDTKO, 2017).

A wortmannina é um inibidor da fosfatidilinositol-3 kinase (PI3K) (CHEN et al., 2015; CUNHA, 2012; PARK et al., 1997) e observou-se uma redução significativa da potência do FOR811B e, principalmente, do FOR011B, na presença desse inibidor. Uma das ações da PI3K é a fosforilação da Akt, uma serina/treonina quinase que está envolvida em 106 diversos processos celulares, dentre eles a fosforilação e ativação da eNOS (LORENZ et al., 2004; WANG et al., 2010; CHEN et al., 2015).

Assim, considerando a diminuição da potência do FOR011B em anéis de aorta com endotélio desnudo, bem como na presença de L-NAME, ODQ, hidroxicobalamina, l-cisteína e wortmanina, e considerando também que o FOR011B não tem o grupamento nitrosil coordenado ao rutênio, levantou-se a hipótese de que esse complexo de rutênio esteja estimulando a síntese de NO, e não liberando NO. Outras substâncias que agem diretamente na via PI3K/Akt/NOSe também apresentam diminuição no efeito em artérias com endotélio desnudo, bem como na presença de L-NAME e ODQ (LORENZ et al., 2004; CHEN et al., 2015; ANWAR et al., 2017).

Os canais de potássio têm uma participação singular na regulação do potencial de membrana e, consequentemente, na regulação do tônus da musculatura lisa dos vasos. Uma ativação desses canais causa uma hiperpolarização da membrana, resultando em um relaxamento do músculo liso vascular decorrente da diminuição do influxo de cálcio (KO et al., 2010; STOTT; JEPPS; GREENWOOD, 2014). No músculo vascular existem quatro tipos principais de canais de K+, são eles: (1) canais de K+ sensíveis ao Ca2+; (2) canais de K+ sensíveis ao ATP; (3) canais de K+ retificadores de influxo; (4) canais de K+ dependentes de voltagem (STOTT; JEPPS; GREENWOOD, 2014).

Para avaliar a importância dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos dois complexos de rutênio, foram utilizados três inibidores desses canais: o tetraetilamônio (TEA), um bloqueador não seletivo dos canais de K+; a 4-aminopiridina (4-AP), que age bloqueando os canais de K+ dependentes de voltagem; e a glibenclamida, um bloqueador dos canais de K+ dependentes de ATP (PINTO et al., 2009; CUNHA et al., 2013).

Com relação ao FOR011B, observou-se uma redução de potência no efeito vasodilatador na presença de TEA e 4-AP, e uma redução de efeito máximo na presença de glibenclamida. Quanto ao FOR811B observou-se um aumento de potência na presença de TEA, um aumento de efeito máximo na presença de 4-AP e não foram encontradas diferenças de potência ou eficácia na presença de glibenclamida.

Tais resultados mostram claramente a importância dos canais de K+ para o efeito vasodilatador do FOR011B. Outros trabalhos já mostraram o envolvimento dos canais de potássio para o efeito do SNP e de outros complexos de rutênio (BONAVENTURA et al., 2006; 2007; LIMA et al., 2014) e sabe-se que a via do NO está diretamente relacionada a 107 hiperpolarização das células musculares lisas via abertura de canais de potássio (BOLOTINA et al., 1994; MURPHY; BRAYDEN, 1995; ABDERRAHMANE et al., 1998; PAOLOCCI et al., 2007; PAULO et al., 2013; MÓNICA et al., 2016).

Tanto o NO como o nitroxil agem por vias semelhantes, ambos ativam a guanilato ciclase solúvel, com posterior formação de GMPc e ativação de PKG, resultando na fosforilação de diversas proteínas, entre elas canais de potássio, causando uma ativação dos mesmos (MURPHY; BRAYDEN, 1995; PAULO et al., 2013). Além disso, também já foi observado ativação direta de canais de potássio por óxido nítrico e por ânions nitroxil, entretanto o primeiro parece estar mais envolvido com canais de K+ cálcio dependentes, enquanto o segundo parece ativar canais de K+ dependentes de voltagem e de ATP (BOLOTINA et al., 1994; ABDERRAHMANE et al., 1998; IRVINE et al., 2003; PAOLOCCI et al., 2007; ANDREWS et al., 2009).

Assim, os resultados encontrados com relação ao efeito do FOR011B na presença dos inibidores dos canais de potássio reiteram a hipótese de que esse metalofármaco está causando uma liberação de NO/NO- ou uma ativação na síntese de tais compostos.

Na investigação do mecanismo de ação dos complexos de rutênio FOR011B e FOR 811B foi realizado bloqueio dos receptores muscarínicos com atropina (CORTES et al., 2018), não havendo grande alteração no efeito relaxante dos compostos, evidenciando que, provavelmente, não há envolvimento dessa via.

A enzima adenilato cilclase atua em uma via de relaxamento do músculo liso através da produção a AMPc (LEFKOWITZ; STADEL; CARON, 1983). No intuito de investigar essa via foi utilizado o inibidor dessa enzima MDL 12,330A (TEÓFILO et al., 2018), porém também não houve grande mudança na vasodilatação causada pelo FOR011B e FOR 811B.

A indometacina é um inibidor não seletivo da enzima ciclooxigenase, portanto utilizada na investigação do envolvimento dos prostanóides no relaxamento da musculatura lisa do vaso (CORTES et al., 2018). Na presente pesquisa houve participação dessa via no vasorrelaxamento induzido pelos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B. Foi observada uma pequena redução no efeito máximo vasodilatador do FOR011B quando pré incubado com indometacina, assim como uma redução na potência vasodilatadora do FOR811B. Até o presente momento não há relatos na literatura sobre o possível envolvimento desse tipo de composto na via dos prostanóides. Pode-se perceber também que o efeito observado nessa via foi reduzido quando comparado à outros mecanismos testados (como a via do NO e canais de 108 potássio), evidenciando que o relaxamento da musculatura lisa vascular induzida pelos compostos FOR011B e FOR811B depende majoritariamente de outros fatores.

O Ca2+ é um íon responsável por diversas funções no músculo liso, incluindo a contração muscular, portanto os canais de Ca2+ são de fundamental importância para a contração muscular, visto que controlam o movimento do Ca2+ na célula. O aumento da concentração de Ca2+ no citoplasma da célula muscular lisa pode ocorrer mediante influxo de Ca2+, podendo, este, ser decorrente de canais de Ca2+ dependentes de voltagem (VOCC, do inglês voltage operated calcium channel) ou de receptores (ROCC, do inglês receptor operated calcium channel), ou mediante liberação do Ca2+ armazenado no retículo sarcoplasmático, podendo essa liberação ocorrer por receptores de rianodina ou por receptores de IP3 (AMBERG; NAVEDO, 2013; RAINBOW; MACMILLAN; MCCARRON, 2009).

Com o objetivo de verificar o efeito dos complexos de rutênio no influxo de Ca2+ foram realizados dois protocolos, cada um visando o efeito em um canal específico.

A fenilefrina age ativando os receptores alfa adrenérgicos das artérias, que são receptores acoplados a proteína Gq, cuja ativação leva a formação dos segundos mensageiros trifosfato-1,4,5 de inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG), com consequente influxo de Ca2+ medidado por ROCC, bem como a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares mediada por receptores de IP3 (RANG et al., 2011; CUNHA, 2012).

Os resultados no protocolo de Ca2+ em anéis de aorta pré-incubados com fenilefrina, mostrou que o grupo FOR011B não influenciou na contração induzida por CaCl2, indicando que esse metalofármaco não inibe o influxo de Ca2+ via ROCC, entretanto, foi observado que o FOR811B reduziu significativamente a contração, indicando que o FOR811B reduz o influxo de Ca2+ via ROCC.

O segundo protocolo de Ca2+ teve como objetivo verificar o efeito dos complexos de rutênio em anéis de aorta pré-incubadas com KCl. Sabe-se que altas concentrações de K+ induzem contração do músculo liso medidada por despolarização de membrana, resultando no aumento da concentração intracelular de Ca2+ por influxo via VOCC (GODFRAIND; KABA, 1969; SOMLYO; SOMLYO, 1994; HIPÓLITO et al., 2009).

Os resultados mostraram que nenhum dos complexos de rutênio foi capaz de reduzir o

Emax das contrações induzidas por CaCl2 em artérias pré-incubadas com KCl, mostrando que eles provavelmente não agem bloqueando os canais de Ca2+ dependentes de voltagem. Tal 109 resultado já era de certa forma esperado, já que os complexos de rutênio não tiveram um efeito vasodilatador muito bom em artérias pré-contraídas com KCl 80 mM.

Recentemente, as pesquisas evidenciam que o mecanismo de ação farmacológico dos complexos derivados de rutênio está relacionado com vias ligadas ao NO, seja por doação ou estimulação da síntese, além da participação dos canais de potássio no efeito vasodilatador (PAUWELS et al., 2016; PEREIRA et al., 2017; POTJE et al., 2018). Tais dados corroboram com os achados deste estudo.

Na tentativa de comprovar a participação do NO no mecanismo de ação dos compostos FOR011B e FOR811B, Silva (2018) realizou a dosagem de GMPc urinário em rim de rato isolado, perfundidos com solução salina, nitroglicerina e os compostos estudados. O resultado mostrou que houve um aumento significativo dos níveis de GMPc urinário perfundidos com nitroglicerina, FOR011B e FOR811B quando comparados ao controle.

Outra pesquisa realizada por Alves (2018) com substâncias semelhantes (FOR011A e FOR811A) às utilizadas no presente estudo, também na tentativa de evidenciar a contribuição da via do NO no mecanismo de ação desses compostos, foi constatado um aumento significativo nos níveis de GMPc urinário comparados ao controle. Nesse estudo o composto FOR811A apresentou dosagens de GMPc superiores, inclusive quando comparados aos rins perfundidos com nitroglicerina, com 90 e 120 minutos de perfusão.

No estudo de Cabral (2016), em animais hipertensos tratados com o FOR0812, foi observado um aumento nas dosagens de nitrito plasmático em aorta de ratos, comprovando o envolvimento da via do NO. Nos estudos de Alves (2018) e Silva (2018), citados anteriormente, também observaram um aumento nas dosagens de nitratos e nitratos em rins perfundidos com FOR011A, FOR011B, FOR811A e FOR811B.

Em animais espontaneamente hipertensos (SHR) e com hipertensão renovascular, foi realizado o tratamento dos animais por gavagem com o FOR0812 por quinze dias que reverteu completamente o quadro hipertensivo (MONTENEGRO et al., 2012), assim como Cristiane e colaboradores em 2008, com o mesmo modelo renovascular de hipertensão utilizando outro composto derivado de rutênio. Em um estudo com o TERPY em ratos SHR foi observada uma redução de 34% na aferição da pressão arterial da cauda dos animais, assim como na hipertensão causada por uma dieta com altos níveis de sódio (MUNHOZ et al., 2012). 110

No estudo realizado por Costa (2018), foi analisado o nível de interação fármaco- receptor da molécula FOR811A com a enzima GCs, através de técnicas de docking macromolecular. O resultado mostrou um alto nível de ligação do composto com o resíduo de cisteína da enzima, mais especificamente com a porção distal do gupo Heme, evidenciando o sítio de ligação da molécula com a GCs, desencadeando o mecanismo de ação do FOR811A. neste mesmo estudo o FOR811A foi capaz de reverter a bronconstricção em um modelo de asma em camundongos, assim como no estudo de Castro e colaboradores (2011) com o complexo Ru-NO.

A partir dos dados do Docking molecular foi analisado o desvio existente entre o ligante (FOR011B, FOR0811B e BAY 41-2272) e a proteína (PDB 2O09). O resultado obtido foi aproximadamente de 1 Å de RMSD indica que o desvio padrão médio das interações atingiu um valor ótimo, já que o valor ideal deve estar entre 1,000 Å e 2,000 Å (YURIEV et al., 2015). Tais resultados foram analisados em função da melhor energia de interação com o sítio ativo da proteína (MA et al., 2007), bem como a energia de ativação necessária para sua ocorrência. Os valores de energia de ligação encontrados sugerem uma interação mais estável do controle utilizado e também, evidenciaram que o ligante FOR011B é energeticamente mais favorável que o FOR811B. Uma forma de predizer a função de uma proteína é através da identificação de resíduos de aminoácidos diretamente envolvidos no sítio catalítico (IZIDORO, 2014). Dessa forma, podemos observar que os ligantes FOR011B, FOR0811B e BAY 41-2272, interagem sobre os resíduos que atuam com o sítio ativo da porção HNOX – Subunidade β1 da GCs (PDB 2O09). Com base nos dados apresentados, vários compostos derivados de rutênio têm sido estudados e mostram efeitos satisfatórios e promissores na vasodilatação e como anti- hipertensivos. Esse efeito está majoritariamente ligado a via do NO, seja na liberação ou síntese desse composto, principalmente, através do estímulo da enzima GCs. Há também estudos que evidenciam a participação dos canais de potássio no efeito dos compostos de rutênio, assim como o baixo nível de toxicidade e a alta estabilidade apresentada por essas substâncias (DRAGUTAN; DRAGUTAN; DEMONCEAU, 2017; PAULO et al., 2017; SILVA et al., 2017).

111

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito farmacológico de complexos de rutênio com radicais 2-imidazolidinetiona na reatividade vascular in vitro, sendo verificado o efeito vasodilatador dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B em anéis de aorta de ratos pré contraídos com KCl e fenilefrina.

Foram estudadas diversas vias que podem causar o efeito vasodilatador dos compostos, dentre elas a participação do endotélio, dos receptores muscarínicos, dos canais de potássio, da influência da enzima guanilato ciclase solúvel e adenilato ciclase e da síntese de óxido nítrico.

Este estudo é de fundamental importância, pois a pesquisa com substâncias derivadas de metais com potenciais efeitos terapêuticos é crescente devido as suas vantagens químicas e farmacológicas. Ademais, essas moléculas já foram recentemente alvo de outras pesquisas, porém seu mecanismo de ação não fora desvendado.

A partir dos dados adquiridos nesta pesquisa podemos sugerir estudos futuros que tenham como objetivo uma elucidação completa e detalhada do mecanismo de ação do FOR011B e FOR811B em relação ao influxo de cálcio (microscopia confocal), e interação fármaco-receptor através de técnicas de docking macromolecular. Ademais, também podem ser realizadas pesquisas em artérias de resistência e os efeitos hemodinâmicos desses compostos in vivo.

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7 CONCLUSÃO

Através dos resultados da presente pesquisa podemos concluir que os complexos derivados de rutênio FOR011B e FOR811B apresentaram efeito vasodilatador em aorta de ratos, possivelmente atuando na via do óxido nítrico através do estímulo à enzima guanilato cilcase solúvel, assim como na estimulação da enzima oxido nítrico sintase. Somado a este fato, o FOR011B mostra atuação também nos canais de potássio causando hiperpolarização celular e favorecendo a vasodilatação.

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ANEXO A - FOLHA DE APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ (CEUA-UFC)