INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Clasificación del clado de , un punto de vista integral.

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN (TESIS) QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO

PRESENTA:

ERIKA BERENICE MARTÍNEZ RUIZ

MÉXICO, DF. 2013

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Micología Médica del Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del IPN. Se llevó a cabo bajo la dirección de la Dra. Aída Verónica Rodríguez Tovar y el Dr. Néstor Octavio Pérez Ramírez. Se contó con la colaboración de la Dra. Paulina Estrada de los Santos del Laboratorio de Microbiología Industrial del Departamento de Microbiología de la ENCB, del IPN.

AGRADECIMIENTOS

Gracias al Instituto Politécnico Nacional, porque al ser una de las Instituciones de más alto Reconocimiento a Nivel Nacional y figurar entre las mejores a nivel Internacional, me brindó un lugar en su matrícula, una preparación académica de excelencia y una nueva sangre que con orgullo portaré día con día porque “Soy Politécnico por convicción y no por circunstancia”.

Gracias a la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, que más que una escuela se volvió un segundo hogar en estos últimos 5 años para mí, porque me dio las armas para estar a la altura de los mejores, porque con orgullo intentaré seguir dejando en alto el nombre de mi escuela. Además de brindarnos el apoyo en equipos, instalaciones y materiales para llevar a cabo este proyecto.

Dra. Aída y Dr. Néstor, mis asesores, ¡gracias! porque confiaron en mí en un momento de incertidumbre, porque me apoyaron, me escucharon, me impulsaron a seguir adelante y me transmitieron una parte de sus amplios conocimientos. Gracias también por permitirme trabajar en el laboratorio en un ambiente cordial y de mucho aprendizaje, considerando además que sin su apoyo en todos los sentidos este trabajo no hubiera sido posible.

Gracias especiales a la Dra. Paulina, por su apoyo y paciencia en la colaboración con este trabajo.

Muchas gracias a la Dra. María de los Ángeles por sus grandes enseñanzas a lo largo de la carrera, por su confianza y todo su apoyo.

Gracias a mis sinodales por su tiempo, por sus correcciones y sus comentarios, pues nos permitieron enriquecer este trabajo.

También mi agradecimiento al Programa Integral de Fortalecimiento Institucional (PIFI) y a fundación TELMEX.

DEDICATORIAS

A mis padres, Fernando y Juana, monenita y gorito, este trabajo va dedicado a ustedes, porque han sido mi motor cada día para seguir adelante, porque son mi pilar, mi fuerza, mi orgullo y mi ejemplo de vida. ¡Gracias! No encuentro palabras que puedan expresar la magnitud de mi agradecimiento a ustedes, mis padres. Gracias por estar cada momento a mi lado, por levantarme cuando lo he necesitado, por cargarme cuando caminar ha sido realmente complicado, porque mi vida, mi ahora, no sería nada sin ustedes a mi lado. Gracias por ayudarme a crecer cada día y enseñarme el valor y el amor a la vida, la importancia de ser una persona integral y permitirme aprender de ustedes a cada paso que damos. Los amo inmensamente.

Fer, mi hermano, mi compañero de toda la vida, mi amigo, mi ejemplo, mi orgullo, este trabajo también es para ti. Porque en los momentos más oscuros tu luz me ha iluminado, porque cada día me enseñas a caminar en la ruta del aprendizaje. Gracias por tu apoyo, tus palabras, tus enseñanzas, las risas y demás. Porque con orgullo grito que eres mi hermano y te amo con todo mi corazón.

Para ti Victor, porque has sido mi compañero de aventuras en estos últimos años en la maravillosa carrera de QBP, porque me enseñaste a relajarme un poco cuando el estrés rebasaba mis niveles basales, porque siempre tuviste una palabra de amor, un abrazo o un beso para relajarme y hacerme saber que todo saldría bien, porque siempre estás, en las buenas y en las malas tu apoyo y amor han sido incondicionales. A ti va este trabajo, porque sin duda alguna has sido una de las partes más importantes en nuestro tiempo juntos. Te amo muchísimo.

El que no estés físicamente no implica que no pueda dedicarte este logro hasta la estrella en que te encuentras cuidándome… A ti abue va este gran logro, porque siempre estuviste y estás aquí, porque me cuidaste y aún me cuidas y nos cuidas desde donde estés. Gracias por tus enseñanzas de vida, por tu amor, tu paciencia, tus mimos y cariños. Porque sin estar aquí estás más presente que nunca. Te quiero y extraño tanto.

A mi abu, porque eres dos en una, gracias por mostrarme otro ejemplo de una gran mujer, por todo tu apoyo, tus cariños y palabras. A ti va este logro, porque siempre tienes para nosotros una enorme sonrisa, y que sin saberlo esa sonrisa y ese abrazo tantas veces ha calmado algún malestar en mí. A ti va mi logro, porque sin tu amor, muchas cosas no serían posibles. Te quiero mucho.

A usted, una de nuestras 3 mamás alternas, a usted Seño, también va este trabajo, porque ha caminado con nosotros desde hace tanto tiempo. AL ser una gran mujer nos ha ayudado a todos los integrantes de esta familia de formas inimaginables. Siempre ha tenido la paciencia de escucharnos, apoyarnos, abrazarnos, aconsejarnos y siempre estar con nosotros en cada momento, desde aquellos cotidianos, hasta aquellos de suma felicidad o de terrible tristeza. La quiero muchísimo. Gracias por ser una gran mujer en mi vida. Dedicatoria especial a mi tía Tere porque de no ser por su apoyo incondicional en todo el proceso administrativo esto no habría podido ser posible. Este trabajo también es para ti, porque has sido un gran apoyo toda la vida, por tus sonrisas, por tus alegrías, por tu amor inmenso que nos tienes y que es más que correspondido.

A mi familia en general tía Laura, Yuyú, Angie, Tío Evaristo, Tía Isabel, Tadis, Gaby, Ceci, Jesús, Valery, Desi y nuevos integrantes a esta gran familia, porque de una u otra forma han colaborado para que esto sea posible, algunos con ratos de estudio desde pequeños, otros con palabras de aliento, con momentos de alegrías, con abrazos con porras o dibujos previos a los días de examen. A ustedes mi querida familia va este trabajo.

A Yuri, mi sis, mi lil’ sis desde hace ya más de 8 años, gracias porque hemos compartido una larga historia de alegrías, tristezas, risas a carcajadas y llantos inconsolables. Te quiero muchísimo. Porque siendo tan distintamente iguales sé y sabes que siempre estaremos la una para la otra.

A Marco mi bff desde la primaria, hace ya más de 9 años, porque a pesar de los encuentros y desencuentros esta amistad ha salido adelante. Gracias por siempre estar. ¡¡¡A ti mi querido ISC va este trabajo de tu amiga la QBP!!! Te quiero muchísimo

A ti Nadita, mi amiga, mi hermanita y mi compañera de locuras, a ti va este trabajo, porque sin duda alguna de lo mejor que me llevo de mi estancia en Ciencias Biológicas es el haberte encontrado ahí. Gracias por siempre estar, escuchar, apoyar, reír, llorar y vivir juntas tantas cosas. ¡Te quiero demasiado amiga! y sé que seguiremos siendo cómplices en las aventuras y logros tanto en la vida laboral como en lo personal. Gracias por tu sincera amistad.

¡Ferchiiiita! Hermanita, amiga mía, gracias por estar ahí cada día. Este trabajo va para ti, porque sin ti la estancia en biológicas no hubiera sido lo mismo, por tu apoyo, confianza y amistad sincera. Te quiero muchisisímo y sé bien que seguiremos compartiendo juntas mucho tiempo el camino de la vida.

A ti Vic, mi queridísimo amigo va este trabajo, fuiste una parte importante en mi vida como estudiante de QBP y un apoyo fundamental en esta etapa final. Gracias por tus palabras, por tu apoyo, por tus ratos de espera, por las risas por cada momento vivido. Te quiero muchísimo y no tengo la menor duda que esta amistad continuará por mucho tiempo.

¡¡¡Natyyy!!! No podía faltar una mención especial y una dedicatoria digna de una gran persona como lo eres tú. Por tu apoyo en todos los sentidos, por tus enseñanzas, tu paciencia, tus palabras, tu ayuda en la resolución de problemas, por tu amistad y porque siempre gracias a ti el laboratorio tiene una sonrisa pintada. ¡Gracias! ¡Te quiero mucho!

Pequeñas bailarinas, Ingrid y Alicia, a ustedes va este trabajo, porque ustedes aun siendo más pequeñas en edad, han sido un apoyo más enorme del que pudiera expresarles. Las quiero mucho a ambas, gracias por compartir tantas locuras y buenos ratos, tantas caídas, tantas lesiones, tantos vuelos en el mundo del Ballet. A mis amigos Itzel, Robert, Adriana, Rodo, Marilú, Paola, Arthur, Vivi, Argy, Edgar, Yugi, Reyna, Luisillo, y si alguien me faltara mencionar en esta dedicatoria una disculpa, no es por falta de interés, es sólo que mi mente se encuentra un tanto emocionada y a la vez dispersa. A todos ustedes un enorme Gracias por ser parte de mi vida. Los quiero enormemente.

A todos mis compañeros del laboratorio, de la academia, y por supuesto a mi grupo con el que conviví los último 5 semestres de la carrera, que osamos adoptar el nombre del último grupo que se nos fue asignado, al AQM1, al 1 gracias a todos por formar parte de esto.

A mis maestros, no sólo de la superior, a TODOS mis maestros a lo largo de mi vida Académica, a mis maestros en mi academia de Ballet y demás disciplinas, va a ustedes dedicado este trabajo porque sin ustedes mi educación en diferentes aspectos no hubiera sido la misma.

A todos los que me faltó por mencionar pero que formaron parte de esta aventura titulada “Ser QBP” muchas gracias.

ÍNDICE

Índice de figuras iii Índice de tablas iv Resumen v 1.0 Introducción 1

1.1 Hongos 1 1.2 Clasificación general de los hongos 2 1.3 Levaduras 3 1.3.1 Clasificación e identificación de levaduras 3 1.3.1.1 Identificación fenotípica 4 1.3.1.2 Identificación por métodos moleculares 5 1.3.2 Levaduras patógenas 7 1.3.3 Levaduras en la industria alimenticia 8 1.3.4 Levaduras en la biotecnología 8 1.4 Ogataea polymorpha 10 1.4.1 Cambios en la clasificación del género Ogataea a lo largo 13 del tiempo 2.0 Hipótesis 15 3.0 Justificación 16 4.0 Objetivos 17 4.1 Objetivo general 17 4.2 Objetivos particulares 17 5.0 Materiales y métodos 18 5.1 Esquema general de trabajo 18 5.2 Cepas de levaduras y conservación a largo plazo 19 5.3 Determinación de la morfología colonial y microscópica 19 5.4 Características fisiológicas 19 5.5 Inducción de ascosporas 19 5.6 Obtención del DNA genómico 20

i

5.7 Amplificación por PCR de las secuencias del fragmento ITS 21 y dominio D1/D2 5.8 Secuenciación de amplicones 21 5.9 Construcción de la filogenia 21 6.0 Resultados 23 6.1 Morfología colonial y microscópica 23 6.2 Perfil fisiológico 24 6.3 Obtención de ascosporas 26 6.4 Obtención de DNA genómico 27 6.5 Amplificación por PCR de las secuencias del fragmento ITS 28 y dominio D1/D2 6.6 Análisis filogenético 29 7.0 Discusión 32 8.0 Conclusiones 37 9.0 Perspectivas 38 10.0 Bibliografía 39

ii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Representación esquemática de los tres dominios propuestos 2

Figura 2 Áreas en las que se ha involucrado el trabajo biotecnológico 9

con levaduras

Figura 3 Micrografía de una célula de O. polymorpha gemando 12

Figura 4 Esquema general de trabajo 18

Figura 5 Colonias en medio YPD y morfología microscópica con tinción 24

con cristal violeta

Figura 6 Ascosporas de O. polymorpha ATCC 26012 y ATCC 34438. 26

Seudohifas de ATCC 76760

Figura 7 Electroferograma del DNA genómico extraído 27

Figura 8 Electroferograma de los amplicones obtenidos del dominio 28

D1/D2

Figura 9 Electroferograma de los amplicones obtenidos del fragmento 29

ITS

Figura 10 Relación filogenética entre especies de Ogataea y géneros 30

relacionados, basada en la secuencia del fragmento ITS

Figura 11 Relación filogenética entre especies de Ogatea y géneros 31

relacionaos, basada en la secuencia del dominio D1/D2

iii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Morfología colonial de las cepas de Ogataea sp. 23

Tabla 2 Perfil fisiológico 25

Tabla 3 Pureza del DNA genómico 27

iv

RESUMEN

Introducción. Los organismos pertenecientes al clado de Ogataea, han sufrido cambios en las relaciones filogenéticas, basados principalmente en la determinación parcial de características fenotípicas y genotípicas. La implementación de las técnicas moleculares ha propiciado que los cambios se presenten con mayor frecuencia, por lo que es importante que exista una evaluación fenotípica y genotípica completa que permita el establecimiento de nuevas propuestas taxonómicas.

Objetivo. Revisar la clasificación de tres cepas de Ogataea utilizando un acercamiento polifásico y establecer una nueva propuesta de clasificación mediante el uso de técnicas de microbiología clásica, así como por la descripción de características fisiológicas y moleculares.

Materiales y métodos. Se trabajó con 3 cepas de O. polymorpha (ATCC 26012, ATCC 34438 y ATCC 76760). La descripción morfológica y del morfotipo microscópico se hizo a partir del crecimiento en medio YPD a 37°C/24-48h y por tinción simple de los frotis. El perfil fisiológico se obtuvo con el sistema API®/ID32c. La producción de ascosporas se indujo en caldo YM a 28°C/7 días y se observaron preparaciones en fresco en microscopio de contraste de fases. Se extrajo DNA por la técnica Allers y Lichten 2000 modificada por Rodríguez Tovar 2005, se amplificó el dominio D1/D2 y el fragmento ITS. Se secuenciaron y se realizó el análisis bioinformático para la formación de árboles filogenéticos con el programa MEGA 5.1.

Resultados. Las tres cepas de O. polymorpha presentan colonias con características similares. Las cepas ATCC 34438 y ATCC 76760 son levaduras esféricas y la cepa ATCC 26012 es ovoide. Los microorganismos ATCC 26012 y ATCC 34438 son capaces de producir ascosporas en forma de Saturno, mientras que la cepa ATCC 76760 tiene la capacidad de formar seudohifas. Con los amplicones obtenidos se formaron 2 árboles filogenéticos utilizando el programa MEGA 5.1.

Conclusiones. Las cepas Ogataea polymorpha ATTC 26012, ATCC 34438 y ATCC 76760 pertenecen al clado de Ogataea, quedando excluidas del clado de Candida con el cual habían sido relacionadas anteriormente.

v

1.0 INTRODUCCIÓN

1.1 Hongos

Los hongos son organismos eucariotes, ampliamente distribuidos en la naturaleza y no fototróficos. Hasta el momento se han descrito alrededor de 80 000 especies, pero se estima que en realidad existen cerca de 1 500 000 (Hawksworth, 2001).

Este reino se subdivide en cuatro Phylum: , Basidiomycota, Zygomycota y Chytridiomycota. Las levaduras, que son el objeto de estudio en el presente trabajo, se encuentran clasificadas dentro del Phylum Ascomycota y Basidiomycota (Lutzoni et al., 2004).

Las esporas son las estructuras de reproducción de los hongos. Aquellas que se originan a partir de un proceso de recombinación sexual que, dependiendo del Phylum y la forma del elemento que les da origen, se conocen como:

 Ascosporas- se encuentran contenidas en una estructura, parecida a un saco, conocido como asca

 Basidiosporas- surgen de los esterigmas sobre los basidios, se les puede encontrar contenidos generalmente, dentro del basidiocarpo que es un cuerpo fructífero.

 Zigosporas- resultan de la fusión de dos gametangios compatibles(López et al., 2012)

Las estructuras de reproducción asexual se denominan conidios y se clasifican en tres grandes grupos:

 Taloconidios- si el material de las hifas preexistentes se ve modificado

 Blastoconidios- cuando es material de las hifas se forma con el fin de obtener un conidio y no por una modificación de material preexistente

 Esporangiosporas,- son estructuras originadas en cuerpos denominados esporangios.

1 Esta clasificación de las esporas corresponde a los hongos meiospóricos es decir, a aquellos a los cuales se les ha determinado su forma asexual (López et al., 2012).

A los hongos que sólo se les conoce su reproducción asexual se les llama mitospóricos, y los propágulos formados por ésta se denominan conidios, los cuales, según su forma o el tipo de célula de la que proceden se llaman artroconidios, dictioconidios, blastoconidios, clamidoconidios, fialoconidios, poroconidios, aneloconidios, etcétera (López et al., 2012).

1.2 Clasificación general de los hongos

Actualmente una de las formas de clasificación de los seres vivos más usada y aceptada es la propuesta por Carl Woese y George Fox (1977), en la cual los organismos son agrupados en tres dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya (Figura 1). Los dos primeros dominios abarcan a los organismos procariotes mientras que el último involucra a los organismos eucariotes.

Figura 1. Representación esquemática de los tres dominios propuestos (http://www.diversidadmicrobiana.com del 16 de enero del 2013).

Dentro del dominio Eukarya se encuentra el reino Fungi, donde se encuentran los hongos. Existen dos tipos de hongos, los filamentosos y los levaduriformes.

2 1.3 Levaduras

Son microorganismos unicelulares pertenecientes al grupo de los hongos, que pueden tener diferentes formas: esférica, ovoide, elíptica entre otras. Dependiendo del género y la especie pueden o no desarrollar dimorfismo y formar hifas y su tamaño varía de 1-9 µm de ancho y 2 o más de 20 µm de largo. Algunas de las levaduras solamente presentan la fase asexual. Dependiendo el género, pueden ser aerobias o anaerobias. Algunas de éstas son capaces de fermentar ciertos azúcares, principalmente hexosas y disacáridos (Carrillo y Audisio, 2007).

Se encuentran clasificadas dentro del Phylum Ascomycota y Basidiomycota (Lutzoni et al., 2004). Las que pertenecen al primer Phylum son capaces de formar ascas libres que contienen de 1 a 8 ascosporas; por otro lado las basidiomicéticas producen basidiosporas exógenas en la punta de una protuberancia celular.

Se les puede encontrar en diferentes ambientes como el suelo, sobre la superficie de las plantas, la epidermis de las frutas e incluso el agua. Su localización depende de diversos factores ambientales como el pH, la humedad y la disponibilidad de nutrientes (Carrillo y Audisio, 2007).

Al igual que a la gran mayoría de los microorganismos se les considera de gran importancia tanto por las especies capaces de causar algún daño a los humanos o afectar de manera directa las actividades de los mismos, como por las aportaciones importantes que dejan a diferentes áreas de trabajo y conocimiento. Es por ello que es muy importante clasificar e identificar adecuadamente a estos microorganismos.

1.3.1 Clasificación e identificación de levaduras

La clasificación e identificación de los microorganismos siempre se ha considerado de vital importancia para poder utilizarlas y explotarlas al máximo en diferentes áreas como la biotecnología (Fernández et al., 2000), de ahí la relevancia de caracterizar a las levaduras hasta especie. Desde el punto de vista industrial, el tener identificados a estos microorganismos implica que se puedan

3 explotar al máximo sus características y buscar nuevas especies que promuevan una mejora en los procesos, esto debido a que ciertos grupos microbianos son parte de la microbiota natural de alimentos, bebidas u otros medios. Es por esto, que se considera necesario contar con métodos de identificación rápidos, precisos y fáciles, que permitan realizar una caracterización adecuada de las levaduras (Fernández et al., 2000).

Inicialmente la taxonomía de levaduras se basaba en la morfología comparativa, fisiología y genética clásica, actualmente se ha complementado con los estudios de morfología ultramicroscópica, criterios bioquímicos y estudios de biología molecular. En cuanto a la biología molecular se ha utilizado el análisis de los ácidos nucleicos para la identificación hasta nivel de género y especie, todo esto ayudado de la secuenciación de DNA/RNA y los patrones de restricción (Kurtzman y Mannarelli, 1998).

1.3.1.1 Identificación fenotípica

Para la identificación fenotípica es importante obtener cultivos puros para realizar las pruebas ya estandarizadas (Kurtzman y Fell, 1998). Estas pruebas son un conjunto de características bioquímicas y fisiológicas (Barnett et al., 2000).

Esto puede incluir la descripción de su morfología en diferentes medios de cultivo, la producción o no de hifas y la producción de ascosporas

La inducción de ascosporas solamente se realiza cuando se sospecha o se sabe que la levadura con la que se está trabajando presenta un estado teleomórfico o sexual. La morfología de las ascosporas, incluyendo el tamaño y número por asca y la presencia o ausencia de ornamentaciones, nos pueden indicar que género o especie estamos trabajando (Motaung, 2011)

Es importante conocer qué tipo de fuentes de carbono son capaces de utilizar. Entre las que comúnmente se prueban se incluye a la glucosa, sacarosa, rafnosa, almidón y xilosa. Además se evalúa la asimilación de alcoholes como

4 metanol y eritrol, ácidos orgánicos como ácido succínico y ácido cítrico y compuestos nitrogenados (Kurtzman y Fell, 1998).

1.3.1.2 Identificación por métodos moleculares

Como todos los métodos moleculares de identificación de organismos, las técnicas aplicadas para las levaduras se basan en el estudio del DNA y RNA. Principalmente la secuenciación de amplicones obtenidos por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y su posterior análisis bioinformático es la técnica más utilizada para la identificación. Las secuencias que se utilizan principalmente como marcadores moleculares y para identificación de las levaduras son el dominio D1/D2 del fragmento 26S del rRNA y el fragmento ITS (ITS1-5.8S rRNA-ITS2). El dominio D1/D2 es ampliamente estudiado pues presenta una variabilidad elevada entre especies lo que permite una identificación adecuada de las levaduras (Guillamón et al., 1998); se ha comprobado que presenta diferencias de hasta una única base entre algunos organismos (Kurtzman y Robnett, 1998). Las especies de levaduras ascomicetas han podido ser identificadas en su mayor parte por el análisis de ésta región (Kurtzman y Robnett, 1994). El fragmento ITS es una secuencias de rRNA cistrónico que involucra la parte final del 18S rRNA, el 5.8S y la primera parte del 28S rRNA además de los espacios intergénicos, estos genes se transcriben como una unidad por la RNA polimerasa, es una región que se considera como un marcador universal y código de barras para la identificación de levaduras (Schoch et al., 2012), Son regiones no codificantes y con alto grado de variabilidad, que permiten un reconocimiento a nivel de género y especie. (Esteve et al., 1999).

Otros genes que han sido utilizados para la clasificación de levaduras son el de la actina (ACT 1), el del factor de elongación α (EFα), el de la segunda subunidad de la citocromo oxidasa mitocondrial (COX2), la subunidad mayor de la RNA polimerasa (RPB1) y la segunda subunidad mayor de la RNA polimerasa (RPB2) (Tsui et al., 2008; Kurtzman y Robnett, 1997, 2003).

Otras técnicas empleadas para la clasificación molecular de levaduras son:

5  Polimorfismo longitudinal de los cromosomas o cariotipificación: Esta técnica sirve para la identificación de especies, el análisis de las relaciones anamorfo-teleomorfas entre distintas especies y para la verificación de la sinonimia (Belloch et al., 1997). En este procedimiento, el DNA digerido con endonucleasa de restricción con un patrón de corte poco frecuente se somete a un campo eléctrico a velocidad constante en un gel, promoviéndose que debido a la naturaleza negativa de la molécula pueda emigrar hacia el polo positivo. El avance dependerá del tamaño y carga de ésta. Se visualizan patrones de banda, y en el caso de las levaduras son únicos de especie debido a fenómenos genéticos y evolutivos en los cromosomas (Orberá, 2004)

 Polimorfismo del DNA mitocondrial: El DNA mitocondrial en las levaduras es de tamaño variable de especie a especie, es de forma circular, por ello se le considera una buena opción para realizar la identificación a nivel de especie (Belloch et al., 1997).

 Análisis de microsatélites: Utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplifican regiones de DNA repetidas y adyacentes denominadas micro (repeticiones de 2-10 nucleótidos) o minisatélites (de 15-30 nucleótidos), que se encuentran distribuidas típicamente a los largo del genoma de los organismos eucariotes. Estos se amplifican con iniciadores de oligonucleótidos específicos (Loureiro y Querol, 1999; Libkind, 2007).

 Polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción del rDNA/rRNA (RFLP): Se basa en la diferenciación de los microorganismos mediante el análisis de los patrones de restricción. Entre las levaduras de diferentes especies y cepas, en algunos casos, se observan diferentes patrones, dado que los sitios de corte de las enzimas presentan distintas distancias entre sí; esto permite correlacionar los organismos, promoviendo la identificación (Henrick, 2000). Esta técnica se puede utilizar para estudios ecológicos utilizando el fragmento 18S del rRNA, o el dominio D1/D2 del fragmento 26S del rRNA. Ésta última región es ampliamente estudiada pues presenta una elevada variabilidad entre especies y cepas lo que permite una adecuada identificación de las levaduras (Guillamón et

6 al., 1998). Se ha comprobado que presenta diferencias de hasta una única base entre algunos organismos (Kurtzman y Robnett, 1998). Las especies de levaduras ascomicetas se han identificado en su mayor parte por el análisis de ésta región (Kurtzman y Robnett, 1994), ), también se han utilizado los espaciadores transcritos internos ITS 1 e ITS2 para la identificación y estudios de filogenia, obteniendo buenos resultados. Actualmente se utiliza el PCR-RFLP, en el cual fragmentos específicos del DNA son amplificados y sometidos a tratamiento con enzimas de restricción para así obtener patrones específicos. La diferencia entre las secuencias nucleotídicas entre microorganismos tendrá como resultado la obtención de fragmentos de distintos tamaños, que posteriormente se analizan por técnicas electroforéticas (Orberá, 2004).  Polimorfismo del DNA aleatoriamente amplificado (RAPD), PCR con iniciadores arbitrarios (AP-PCR), Amplificación de la huella del DNA (DAF): El fundamento de ésta técnica es la amplificación del DNA genómico en presencia de único iniciador de pocos oligonucleótidos. Los fragmentos de DNA se amplifican en regiones aleatorias del genoma, pues los iniciadores utilizados son secuencias arbitrarias de DNA sintético. Se manejan bajas temperaturas de hibridación lo que promueve que el iniciador se una a sitios inespecíficos aleatorios en el genoma, lo que permite la amplificación de fragmentos polimórficos de DNA. Se visualizan los productos por técnicas electroforéticas (Orberá, 2004).

Todas estas técnicas de clasificación e identificación sirven para colocar a las levaduras en sus cajones taxonómicos apropiados y no existan confusiones cuando se está trabajando con alguno de estos microorganismos, ya sea porque se encontró causando daño o en una aplicación benéfica para el hombre.

1.3.2 Levaduras patógenas

Se estima que cerca de 30 especies de los 200 hongos patógenos identificados, son levaduras (Fisher y Cook, 1998). Dentro de los especies más relevantes se encuentran Candida albicans, C. tropicalis, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. famata, C. krusei, C. kefyr, C. glabrata C. pelliculosa, C. lusitaniae,

7 Cryptococcus sp, Malassezia sp, Geotrichum candidum, Trichosporon spp., Rhodotorula mucilaginosa y Sporobolomyces spp.(Mendoza, 2005).

Las enfermedades causadas por estas levaduras están relacionadas principalmente con personas que presentan problemas y alteraciones a nivel inmunológico, denominados pacientes inmunocomprometidos (Senet, 1997).

Como ya se mencionó, también existen levaduras que tienen aplicación industrial, tanto en la industria alimentaria como en la biotecnología.

1.3.3 Levaduras en la industria alimenticia

Dentro de la industria alimenticia se reconoce un amplio número de especies capaces de aportar diversos productos para el consumo humano, sin embargo, son pocas las especies que realmente se han aprovechado para este fin, tal es el caso de (www.alimentacion.org.ar del 13 de enero del 2013).

Se ven involucradas en la obtención del vino y cerveza, para la producción de pan, quesos, salsa de soya y como fuentes directas de vitaminas (principalmente de complejo B), proteínas y lípidos (Hernández et al., 2003)

1.3.4 Levaduras en la biotecnología

La biotecnología es el conjunto de técnicas que, mediante la utilización de las propiedades de los seres vivos, logra la producción de bienes y servicios utilizables por los seres humanos (Muñoz, 2001).

Las levaduras son organismos altamente utilizados en este conjunto de técnicas para diferentes fines (Figura 2).

Las aportaciones que se han obtenido a partir del trabajo con estos microorganismos son la elucidación de la glicólisis, la descripción de la naturaleza y función de ciertas enzimas involucradas en el proceso de la respiración, en el metabolismo de los ácidos grasos, proteólisis entre otras rutas metabólicas. Además se han estudiado a fondo los mecanismos de transducción de señales, la

8 mitosis y la meiosis, algunos mecanismos de recombinación, el control de la expresión génica, la función de algunos oncogenes, entre otros (Walker, 1998)

Industrias de la fermentación Ej. Cerveza, bioetanol y productos de Tecnologías fermentación Industria ambientales alimenticia y Ej. química Borremediación, Ej. Saborizantes, manejo de enzimas, desechos, pigmentos, bioabsorción de acidulantes metales Levaduras en la biotecnología

Industria de la Biomedicina salud Ej. estudio del Ej. Vacunas, cáncer, farmacos probióticos, metabólicos, hormonas, desórdenes factores genéticos Investigación de sanguíneos fundamentos biológicos Ej. Bioquímica, biología molecular, genética

Figura 2. Áreas en las que se ha involucrado el trabajo biotecnológico con levaduras. (Walker, 1998).

También se han utilizado para la obtención de aromas, colorantes, pigmentos y saborizantes. Por ejemplo Phaffia rhodozyma es un microorganismo del que se obtiene altas concentraciones del compuesto químico astanxantina, pigmento rojo-rosado de interés piscícola (Echavarri y Johnson, 2004). Uno de los

9 aromas más utilizados es el de rosas, el compuesto químico que lo confiere es el 2- feniletanol, y algunas de las levaduras que se ven involucradas en su producción son Saccharomyces vini y Torulopsis utilis (Estchmann et al., 2002). Kluyveromyces lactis y Yarrowia lipolitica son dos microorganismos frecuentemente utilizados en la industria de los quesos para conferirles el sabor y aroma necesarios (Reyes y Franco, 2006).

Uno de los aportes de mayor importancia que se ha considerado en las últimas décadas es la producción de proteínas heterólogas o de recombinación. Las levaduras se consideran como microorganismos importantes para dicha producción, pues a diferencia de los sistemas procarióticos, la organización eucariota de estas permite que asimilen la mayoría de los cambios post- traduccionales, además son microorganismos de rápido crecimiento y de manipulación genética relativamente fácil. Sin duda una de las levaduras más estudiadas hasta el momento ha sido Saccharomyces cerevisiae, sin embargo, a partir del mejoramiento de las técnicas de transformación celular y manipulación del material genético, se han incrementado el número de especies con las cuales se puede trabajar para cumplir los objetivos planteados, entre éstas se encuentran Ogataea polymorpha, Kluyveromyces lactis, pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis y Yarrowia lipolytica (Buckholz y Gleeson, 1991).

1.4 Ogataea polymorpha

Pertenece a un pequeño grupo de levaduras que son capaces de utilizar el metanol como única fuente de energía y de carbono, es decir organismos metilotróficos. Es considerada como una de las levaduras de mayor importancia a nivel industrial (Gellissen, 2000; 2002). Pertenece al Phylum Ascomycota, clase , orden , familia , subfamilia Saccharomycetoideae

Es un microorganismo ubicuo al que se le puede encontrar principalmente en jugos de frutas en mal estado, en harina de maíz, en el aparato digestivo de

10 algunas especies de insectos y en el suelo. Presenta colonias blancas cremosas y no forma filamentos (Barnett et al., 2000). Es una levadura homotálica y presenta una reproducción asexual por gemación. En su fase sexual presenta ascosporas en forma de “Saturno” (Saturn-shaped) característica clave del clado de Ogataea (Kurtzman, 2011).

Es una levadura capaz de asimilar nitratos y de crecer en una gama amplia de fuentes de carbono. Es termotolerante, presenta cepas capaces de crecer por encima de los 50°C además, algunas de éstas tienen la capacidad de fermentar la xilosa, celobiosa y glucosa para obtener etanol a altas temperaturas. Esta termotolerancia es una de las características que la hacen tan importante en la biotecnología, pues rebasa por mucho la temperatura registrada por la mayoría de las levaduras capaces de hacer fermentación alcohólica (Ryabova et al., 2003; Ishchuk et al., 2009).

Ogataea polymorpha es uno de los sistemas biológicos más importantes en el campo de la investigación básica, pues se ha utilizado para el estudio del metabolismo del metanol, la biogénesis de los peroxisomas, la bioquímica de la asimilación de los nitratos, resistencia a metales pesados y estrés oxidativo, producción de fármacos como la vacuna contra la Hepatitis B y proteínas recombinantes como la insulina o el interferón alfa 2a (IFN α-2ª) (Gellisen, 2002; Krasovska et al., 2007), el aditivo de alimentos fitasa (Gellisen, 2002) y anticoagulantes como la hirudina y saratina (Gellisen, 2002).

Existen tres cepas básicas de O. polymorpha que presentan características específicas, no cuentan con una clara relación entre sí y provienen de orígenes diferentes, éstas han sido las más utilizadas en la investigación básica y en la producción de proteínas recombinantes. La cepa CBS4732 (CCY38-22-2; ATCC 34438, NRRL-Y-5445) fue aislada inicialmente de un suelo irrigado cercano a una destilería en Pernambuco, Brasil (Morais y Maia,1959); la cepa DL-1 (NRRL-Y- 7560; ATCC 26012) fue aislada de suelo (Levine y Cooney, 1973) y NCYC495 (CBS1976; ATAA14754, NRLL-Y-1798) fue obtenida a partir de un concentrado caducado de jugo de naranja en Florida, la cual inicialmente fue nombrada como Hansenula angusta (Wickerham, 1951).

11

P

Figura 3. Micrografía de una célula de O. polymorpha gemando. Presenta un exceso de peroxisomas, bajo condiciones metanólicas. P= peroxisomas (Gellisen et al., 2002).

Inicialmente las levaduras metilotróficas se utilizaban para la producción de proteínas unicelulares a expensas de fuentes de carbono de bajo costo como el metanol; sin embargo el estudio más profundo de la fisiología, bioquímica y ultraestructura permitió que se les explotara en otras áreas del conocimiento. Por ejemplo, se reveló que el metanol era oxidado por peróxido de hidrógeno producto de una alcohol oxidasa localizada en los peroxisomas, explicando así, la excesiva proliferación de peroxisomas en las levaduras capaces de crecer en metanol (Figura 3) (van Dijk et al., 2000).

El género Ogataea incluye especies de levaduras ascosporogénicas que presentan células esféricas, esferoidales, elipsoidales, oblongadas, cilíndricas o elongadas. Son capaces de formar de 1 a 4 ascosporas. Dentro del género la mayoría de las especies son predominantemente heterotálicas. Como ya se mencionó H. polymorpha es homotálica, lo que le permite realizar una interconversión sencilla entre el estado haploide y el diploide (Gellisen, 2002).

12 1.4.1 Cambios en la clasificación del género Ogataea a lo largo del tiempo

Los microorganismos pertenecientes al clado de Ogataea desde que fueron descritos han sufrido cambios en las relaciones filogenéticas, basados principalmente en la determinación parcial de características fenotípicas y genotípicas. Una adecuada clasificación filogenética correlacionaría la mayor cantidad posible de características tanto fenotípicas como genotípicas.

Una vez descritas, en 1970, se consideró que Hansenula angusta era sinónimo de H. polymorpha, tomando en cuenta las características fenotípicas similares (Wickerham, 1970). Después de los estudios de reasociación mediante el análisis DNA/DNA, se propuso que las especies de Hansenula que presentaran ascosporas con forma de Saturno (saturn-shaped) fueran transferidas al género Pichia a pesar de que Ogataea spp. fuera capaz de crecer en nitrato y Pichia no; además se plantea la sinonimia existente entre el género Hansenula y Pichia por la relación que existía en la comparación del DNA y algunas características fenotípicas, además de proponer que las especies de Pichia angusta y Pichia anomala eran las mismas (Kurtzman, 1984).

A mediados de los 90’s se propuso un nuevo género: Ogataea, en el que se incluyó a Ogataea polymorpha (=H. polymorpha) (Yamada et al., 1994). Años más tarde se establece que H. plymorpha y H. angusta son dos especies diferentes así como que Pichia angusta es un microorganismo diferente, dejando de lado la sinonimia propuesta para estos dos géneros. El estudio abarcó hibridaciones genéticas, determinación del cariotipo (patrón cromosómico de una especie que describe las características de sus cromosomas) y análisis de UP-PCR (Universally primed PCR) (Naumov et al, 1997).

En 2000 se nombra a Pichia anomala como Hansenula anomala (Kurtzman, 2000), sin embargo en 2001 se renombra como P. anomala (Naumov et al., 2001).

En el 2000, Barnett y colaboradores proponen renombrar a Ogataea polymorpha como Pichia angusta, sin embargo, esta propuesta no fructífero debido

13 a las pruebas genéticas realizadas que demostraban que no existía relación entre estos géneros, por lo cual la levadura conservó su nombre.

Se propuso una nueva filogenia mediante la secuenciación de algunos marcadores moleculares estableciendo que Ogataea polymorpha es independiente y no pertenece a ningún clado (Kurtzman et al, 2008); hasta este momento se había determinado que las levaduras del género de Ogataea pertenecían al clado del mismo nombre. Finalmente, en 2010, se propone que la cepa ATTC 26012 (O. polymorpha [P. angusta]) es la fase teleomorfa de Candida parapolymorpha esto basado en análisis moleculares (Suh y Zhou, 2010).

Estos cambios en los criterios de clasificación reflejan que la clasificación de Ogataea y la inclusión de la cepa ATCC 26012 en el género Candida no es adecuada. Por esto, en el presente trabajo se propone revisar esta clasificación

14 2.0 HIPÓTESIS

La falta de una metodología sistemática ha complicado la clasificación taxonómica del genero Ogataea; si logramos conjuntar tanto las características fenotípicas como genotípicas, podremos esclarecer las relaciones que existen entre estas levaduras y los miembros del género Candida.

15 3.0 JUSTIFICACIÓN

Se considera importante que se realice una clasificación adecuada de las levaduras, para poder utilizarlas y explotarlas al máximo en diferentes áreas como la biotecnología (Fernández et al., 2000).

Con la implementación de las técnicas moleculares, la clasificación de las levaduras se empezó a modificar debido al establecimiento de nuevas relaciones filogenéticas obtenidas a partir de la secuenciación de algunos marcadores moleculares como las secuencias ITS1 o D1/D2 (Kurtzman y Mannarelli, 1998).

A través del tiempo el clado de Ogataea ha sufrido una serie de modificaciones en cuanto a sus relaciones filogenéticas así como del nombre que recibe cada una de las cepas que pertenecen a éste. Dichas modificaciones se deben a que no existe ningún trabajo que proponga una clasificación adecuada considerando una visión integral, es decir, utilizando las características fenotípicas y moleculares.

Por lo que es importante que exista una evaluación fenotípica y genotípica completa que permita el establecimiento de nuevas propuestas taxonómicas.

16 4.0 OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Revisar la clasificación de tres cepas que pertenecen al clado de Ogataea utilizando un acercamiento polifásico y establecer una nueva propuesta de clasificación mediante el uso de técnicas de microbiología clásica, así como la descripción de características fisiológicas y moleculares.

4.2 Objetivos particulares a) Corroborar las características de morfología colonial y microscópica de tres cepas de levaduras del clado de Ogataea, así como su capacidad para asimilar diversos compuestos. b) Obtener la fase sexual de las levaduras. c) Construir una filogenia con base en secuencias de DNA.

17 5.0 MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Esquema general de trabajo

O. polymorpha ATCC 26012, Conservación de ATCC 34438 y cepas a -70ºC ATCC 76760

Morfología Construcción de Perfil fisiológico Obtención de colonial y filogenia ascosporas microscópica

Extracción de Crecimiento en DNA Crecimiento en medio sólido Crecimiento en (Conservación a YPD a 37°C/24- YPD 37ºC/24h caldo YM a -20ºC) 48h 28°C /7días

Amplificación del Características Sistema dominio D1/D2 y coloniales API®/ID32c del fragmento Preparaciones ITS por PCR en fresco vistas

en microscopio de contraste de fases Morfotipo Secuenciación microscópico por de amplicones tinción simple

Análisis Figura 4. Esquema general de trabajo bioinformático y construcción de árboles NJ

18 5.2 Cepas de levaduras y conservación a largo plazo

Se usaron 3 cepas tipos del clado de Ogataea: Ogataea polymorpha (ATCC 34438), O. polymorpha (ATCC 26012) y O. polymorpha (ATTC 76760). Además se usaron las cepas de referencia de Candida tropicalis ATCC 10231, C. glabrata CBS138, C. dubliniensis ATCC YMA579 y C. parapsilosis ATCC 22019 y una cepa de Saccharomyces cerevisiae para los estudios filogenéticos.

Se conservaron a largo plazo a -70°C en medio BHI con glicerol al 50%, su crecimiento previo se llevó a cabo en medio YPD líquido (extracto de levadura 1 g/100 mL, peptona 2 g/100 mL, dextrosa 2 g/ 100 mL), esterilizado en autoclave a 121 lbs/15 min.

5.3 Determinación de la morfología colonial y microscópica

La observación de la morfología colonial de las levaduras se hizo a partir de las colonias desarrolladas en medio YPD sólido después de 24-48h de incubación a 37°C; así mismo, se observó su morfología microscópica de una colonia aislada por medio de una tinción simple con cristal violeta y obteniendo los frotis de los cultivos anteriormente mencionados.

5.4 Caracterización fisiológica

Las cepas de Ogataea sp. fueron analizadas mediante el sistema de identificación API®/ID32c (Biomérieux) según las indicaciones del fabricante utilizando cultivos provenientes de medio sólido YPD de 24h.

5.5 Inducción de ascosporas

La inducción de ascosporas se llevó a cabo en caldo YM (extracto de levadura 3 g/L, extracto de malta 3 g/L, peptona 5 g/L, glucosa 10 g/L, esterilizado en autoclave a 121 lbs/15 min) incubado a 28°C por 7 días. Las ascosporas se

19 observaran por medio de preparaciones en fresco en un microscopio de contraste de fases (50x)

.

5.6 Obtención del DNA genómico

Para la extracción del DNA se utilizó la técnica de Allers y Lichten 2000, modificado por Rodríguez-Tovar, 2005. Se hizo un cultivo masivo de las levaduras, se cosechó la biomasa y congeló con N2 líquido, se maceró en un mortero estéril hasta la obtención de un polvo fino. Se adicionó de 1 a 2 mL de CTAB nuclear (CTAB al 2%, EDTA 50 mM, Trisma base 200 mM pH 8.0, NaCl 2 M y Polivinil pirrolidona 0.5%) y se mezcló hasta obtener una suspensión homogénea. La muestra fue separada en tubos de 1.5 mL y se adicionaron 2 µL de RNAasa 10 mg/mL. Posteriormente se incubó a 65°C por 1 h. Una vez que la muestra alcanzó la temperatura ambiente, se adicionó 1 volumen (500 µL) de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se mezcló en vórtex hasta la formación de una emulsión. Se centrifugó a 13000 g/10 min a temperatura ambiente y la fase acuosa fue recuperada. Se adicionó 1/10 de volumen de CTAB 10% (CTAB al 10% y NaCl 0.7 M) y se remitieron tres extracciones con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), se conservó la fase acuosa y el sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo, adicionándole un volumen de isopropanol. Mezclado por inversión, se incubó toda la noche. El DNA se recuperó por centrifugación a 13000 g/10 min a 4°C. La pastilla se lavó dos veces con etanol al 70% y se dejó secar. El DNA fue resuspendido en 30 µL de agua desionizada estéril y se conservó a -18°C. La integridad del DNA se observó por un corrimiento electroforético en un gel de agarosa al 1%, el cual se tiñó con una solución de bromuro de etidio y se observó en un transiluminador.

20 5.7 Amplificación por PCR de las secuencias del fragmento ITS y dominio D1/D2

Se amplificó el dominio D1/D2 utilizando los iniciadores NL1 (5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’) y NL4 (5-’ GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’) y el fragmento ITS-5.8S rRN-ITS2 con los iniciadores ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) e ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) (Suh y Zhou, 2010). La mezcla de reacción contenía 25 µL de la mezcla PCR Master Mix

(Fermentas) (Taq polimerasa 0.05 U/µL [2X], dNTP’s o.4mM [2x], buffer 2X,, MgCl2 [4mM]), 1µL de iniciador directo, 1 µL del iniciador reverso (ambos iniciadores utilizados a una concentración 0.1µg/µL), 1µL de DNA (100 ng) y 22 µL de agua. El programa de amplificación fue 5 min a 95°C, 1 min a 94°C, 1 min a 51°C, 1 min a 72°C (35 ciclos a estas tres últimas condiciones), 1 min a 72°C y 4°C pausa. Se utilizó el mismo programa para la obtención de ambas secuencias.

5.8 Secuenciación de amplicones

Los amplicones obtenidos se purificaron con el kit DNA Clean & Concentrator™. Se mandaron secuenciar al Laboratorio de Bioquímica Molecular de la Unidad de Biología, Tecnología y Prototipos (UBIPRO), FES Iztacala perteneciente a la UNAM.

5.9 Construcción de la filogenia

Las secuencias obtenidas se compararon por medio de un análisis en BLAST con el banco de datos del NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ del 4 de abril del 2013). Tomando aquellas secuencias que presentaron una similitud del 97% o superior fueron alineados utilizando el programa MUSCLE 3.57 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ del 5 de abril del 2013). Los árboles filogenéticos fueron construidos utilizando Neighbor joining (NJ) con la distancia de

21 Tamura-Nei (Tamura y Nei, 1993) y 1000 réplicas (bootstrap replicates) con el programa MEGA versión 5.1.

22 6.0 RESULTADOS

6.1 Morfología colonial y microscópica

Después de 24-48h de crecimiento en medio sólido YPD se obtuvieron colonias a las cuales se les describieron las características de morfología colonial (Tabla 1). Además a partir de éstas se realizaron frotis para la observación de la morfología microscópica en los que se pudieron observar levaduras esféricas (O. polymorpha ATCC 34438 y ATCC 76760) y ovoides (O. polymorpha ATCC 26012) (Figura 5).

Tabla 1. Morfología colonial de las cepas de Ogataea sp.

Característica Cepas

O. polymorpha O. polymorpha O. polymorpha 26012 34438 76760

Forma Circular Circular Circular

Tamaño 2mm 3mm 1mm

Color Crema Crema Crema

Borde Entero Entero Entero

Superficie Lisa Lisa Lisa

Luz transmitida Translúcida Translúcida Translúcida

Luz reflejada Brillante Brillante Mate

Elevación Convexa Convexa Convexa

Aspecto Húmedo Húmedo Húmedo

Consistencia Butirosa Butirosa Butirosa

23

a) b) c)

Figura 5. Colonias en medio YPD y morfología microscópica con tinción de cristal violeta. Se observan dos levaduras de forma esférica (b y c) y una de foma ovoide (a). a): O. polymorpha ATCC 26012; b) O. polymorpha ATCC 34438; c) O. polymorpha 76760.

6.2 Perfil fisiológico

Por medio del sistema API®/ID32c se determinó la capacidad de asimilación de 29 compuestos, la susceptibilidad a actidiona y la capacidad de hidrolizar la esculina (Tabla 2). De la cepa ATCC 76760 no se pudo obtener el perfil fisiológico por medio de este sistema.

24 Tabla 2. Perfil fisiológico

Característica O. polymorpha 34438 O. polymorpha 26012

Galactosa - -

Actidiona S R

Sacarosa + +

N-Acetilglucosamina - -

Lactato - -

Arabinosa - -

Celobiosa - +

Rafinosa - -

Maltosa + +

Trehalosa + +

2-ceto gluconato - -

α- metil D-glucosidasa - -

Sorbitol + +

Xilosa - +

Ribosa + +

Glicerol + +

Ramnosa - -

Palatinosa + +

Eritritol + +

Melibiosa - -

Glucuronato - -

Melecitosa + +

GLuconato - -

25 Levulina TE - -

Manitol + +

Lactosa - -

Inositol - -

Glucosa + +

Sorbosa - -

Glucosamina - -

Esculina + +

(+): el organismo es capaz de asimilar el compuesto; (-) el organismo no asimila el compuesto; (S): Susceptible; (R): Resistente.

6.3 Obtención de ascosporas

Se observó formación de ascosporas en las cepas ATCC 34438 y ATCC 26012 (Figuras 6a y 6b) y de seudohifas en la cepa ATCC 76760 (Figura 6c).

a) b) c) Figura 6. Ascosporas de Ogataea polymorpha ATCC 26012 y ATCC 34438. Seudohifas de O. polymorpha ATCC 76760. a): O. polymorpha ATCC 26012; b) O. polymorpha ATCC 34438; c) O. a) b) c) polymorpha ATCC 76760. Fueron obtenidos a partir de un cultivo crecido de caldo YM por 7 días a 28°C.

26 6.4 Obtención de DNA genómico

Se extrajo el DNA genómico y se determinó la pureza de éste mediante la relación de la absorbancia a 260 y 280nm.

Figura 7. Electroferograma del DNA genómico extraído. Gel de agarosa al 1%. 1: O. polymorpha ATCC 26012; 2: O. polymorpha ATCC 34438; 3: O. polymorpha 76760; 4: S. cerevisiae; 5: C. tropicalis ATCC 10231; 6: C. glabrata CBS138; 7: C. dubliniensis ATCC YMA579; 8: C. parapsilosis ATCC 22019.

Tabla 3. Pureza del DNA genómico

Relación 260/280

O. polymorpha ATCC 26012 1.947

O. polymorpha ATCC 34438 1.972

O. polymorpha ATCC 76760 1.133

S. cerevisiae 1.108

C. tropicalis ATCC 10231 1.117

C. glabrata CBS138 1.113

C. dubliniensis ATCC YMA579 1.136

C. parapsilosis ATCC 22019 1.295

27 6.5 Amplificación por PCR de las secuencias del fragmento ITS y dominio D1/D2

Se amplificó la secuencia del dominio D1/D2 y la secuencia completa del ITS por medio de la técnica de PCR. Para las secuencias del dominio D1/D2 se observó que las tres cepas de Ogataea polymorpha así como las cepas de Candida sp. y de Saccharomyces cerevisiae presentan amplicones de un tamaño aproximado de 600pb. Para el fragmento ITS los amplicones obtenidos fueron de 750pb aproximadamente para las cepas de Ogataea polymorpha, de aproximadamente 800pb para S. cerevisiae y de 500pb para las cepas de Candida.

750 600 500

750 500 600

Figura 8. Electroferograma de los amplicones obtenidos del dominio D1/D2. Gel de agarosa al 1%. 1, 1’: marcador molecular de 1kb; 4: S. cerevisiae; 5: O. polymorpha ATCC 26012, 6: O. polymorpha ATCC 34438; 7: O. polymorpha 76760; 2’: C. tropicalis ATCC 10231; 3’: C. glabrata CBS138; 4’: C. dubliniensis ATCC YMA579; 5’: C. parapsilosis ATCC 22019; 6’: testigo negativo.

28

800 750

500 1000

750

500

Figura 9. Electroferograma de los amplicones obtenidos del fragmento ITS. Gel de agarosa 1%. 1: marcador molecular; 2: testigo negativo; 3: S. cerevisiae; 4: O. polymorpha ATCC 26012, 5: O. polymorpha ATCC 34438; 6: O. polymorpha 76760; 7: C. tropicalis ATCC 10231; 8: C. glabrata CBS138; 9: C. dubliniensis ATCC YMA579; 10: C. parapsilosis ATCC 22019.

6.6 Análisis filogenético

Las secuencias de los amplicones obtenidos por medio de la PCR fueron trabajados con el programa Chromas Lite. Se manipularon manualmente y fueron convertidos al formato FASTA para realizar la comparación y alineamiento para posteriormente construir los dos árboles filogenéticos utilizando el programa MEGA versión 5.1.

El análisis filogenético de las secuencias de la región ITS mostró que las especies de Ogataea se agruparon en un solo cluster, no obstante, también se observó que dos cepas de Candida parapolymorpha quedaron integradas en el grupo de especies de Ogataea. Así mismo el análisis filogenético de las secuencias del dominio D1/D2 mostró una distribución similar, en la que las especies de Ogataea se agruparon en un solo cluster, incluyendo también, dos cepas de Candida parapolymorpha.

29 99 Rhodotorula mucilaginosa LEMI 2552 (JX512699) R. glutinis 152b (HF934032) Ogataea polymorpha ATCC 204205 (JX094782) O. polymorpha ATCC 76760 (FJ914919) O. polymorpha NRRL Y-5445 (JF756589) 75 O. polymorpha ATCC 20434 (FJ914916) O. polymorpha ATCC 34438 (FJ914915) O. polymorpha ATCC 34438* O. polymorpha ATCC 14754 (FJ914920) 99 O. polymorpha ATCC 76760* 79 O. angusta ATCC 14755 (FJ914914) O. angusta NRRL Y-2214 (JF756588) O. parapolymorpha NRRL YB-1982 (JF56591) 52 C. parapolymorpha ATCC 58401 (FJ914923) 70 O. polymorpha ATCC 26012* 74 Candida parapolymorpha ATCC 26012 (FJ914922) C. dubliniensis 103819 (HQ457427) 68 C. dubliniensis 103817 (HQ457429) 99 C. dubliniensis 103818 (HQ457428) C. dubliniensis ATCC YMA579* C. tropicalis BR (JN159661) 84 95 98 C. tropicalis S5 (JN159660) C. tropicalis WM10114 (HQ014734) C. tropicalis ATCC 10231* 65 C. parapsilosis ZIM-2448 (HE799670) C. parapsilosis Hb44 (KC422431) 99 C. parapsilosis CTCC A-Y9302 (4HQ398238) C. parapsilosis ATCC 22019* C. boidinii ATCC 62809 (FJ914929) C. glabrata CBS138* 99 Pichia kudriavzevii DY1 (JQ808005) 86 P. kudriavzevii (JQ726607) 61 P. kudriavzevii Y16 (JF715196) Saccharomyces cerevisiae ATCC 200062 (GU256758) 99 S. cerevisiae JP (AB280542) 89 S. cerevisiae NN (AB279752) 89 S. cerevisiae*

0.05 Figura 10. Relación filogenética entre especies de Ogataea y géneros relacionados, basada en la secuencia del fragmento ITS. *, Levaduras analizadas en el presente trabajo; Entre paréntesis el número de acceso de las secuencias en el NCBI. La barra representa una sustitución por cada 500 nucleótidos.

30 Candida tropicalis SA1 (JN185908) 59 C. tropicalis HMY1 (JX532155) 98 C. tropicalis JH8 (HM246692) C. tropicalis ATCC 10231* 90 C. parapsilosis Ph-54 (JN940627) C. parapsilosis Ph-131 (JN940628) 98 99 C. parapsilosis ATCC 22019* C. parapsilosis EXF5728 (JF66622) C. dubliniensis SUMS0393 (FJ011546) C. dubliniensis ATCC 44508 (KC146377) 82 99 C. dubliniensis IF-M5316 (3AB363780) C. dubliniensis ATCC YMA579* Saccharomyces cerevisiae LCBG3D2 (JQ824870) S. cerevisiae AH6 (HM165257) 99 S. cerevisiae* 62 S. cerevisiae C717 (EF116917) Figura 11. Relación C. boidinii UCDFST09467 (JQ762412) filogenética entre Ogataea polymorpha ATCC 204205 (JX094792) especies de Ogatea y géneros relacionaos, 68 O. polymorpha ATCC 76760* basada en la secuencia O. polymorpha ATCC 14754 (FJ914937) del dominio D1/D2. *: Levaduras analizadas en 72 O. polymorpha ATCC 76760 (FJ914936) 82 el presente trabajo. Entre O. polymorpha ATCC 34438 (FJ914932) paréntesis el número de O. polymorpha ATCC 20434 (FJ914933) acceso de las secuencias 68 en el NCBI. La barra O. polymorpha NCCL Y-5445 (GU397333) representa un sustitución por cada 500 nucleótidos 86 O. polymorpha ATCC 34438* 99 O. polymorpha ATCC 26012* C. parapolymorpha ATCC 58401 (FJ914940) 76 Pichia sp. NCCL YB-1982 (EU011621) 36 C. parapolymorpha ATCC 26012 (FJ914939)

O. angusta ATCC 14755 (FJ914931) 90 O. polymorpha NRRL Y-2214 (EF550269)

C. glabrata CBS138* P. kudriavzevii YTHJL (JX848640) 99 P. kudriavzevii Y4 (JX645718) 77 P. kudriavzevii DMIC113897 (JN032661) Rhodotorula glutinis W59 (AB439221) 99 R. mucilaginosa W13 (AB456557)

0.05

31 7.0 DISCUSIÓN

A través del tiempo el clado de Ogataea ha sufrido una serie de modificaciones en cuanto a sus relaciones filogenéticas, dichas modificaciones se deben a que no existe ningún trabajo que proponga una clasificación adecuada considerando una visión integral, es decir, utilizando de forma total las características fenotípicas y genotípicas.

Con la implementación de las técnicas moleculares, la clasificación de las levaduras se empezó a modificar debido al establecimiento de nuevas relaciones filogenéticas, obtenidas a partir de la secuenciación de algunos marcadores moleculares como las secuencias ITS y del dominio D1/D2 (Kurtzman y Mannarelli, 1998).

Ogataea polymorpha pertenece a un pequeño grupo de levaduras que son capaces de utilizar el metanol como única fuente de carbono y energía. Es considerada como una de las levaduras de mayor importancia a nivel industrial (Gellissen, 2000; 2002). Es termotolerante, utiliza metanol, es de fácil manejo, además de que el genoma ya está secuenciado, por todo esto, es importante en la biotecnología (Ryabova et al., 2003; Ishchuk et al., 2009).

Esta levadura también es uno de los sistemas biológicos más importantes en el campo de la investigación básica, pues se ha utilizado para el estudio del metabolismo del metanol, la biogénesis de los peroxisomas, la bioquímica de la asimilación de los nitratos, resistencia a metales pesados y estrés oxidativo, producción de fármacos como la vacuna contra la Hepatitis B y proteínas recombinantes como la insulina o el interferón alfa 2a (IFN α-2ª) (Gellisen, 2002; Krasovska et al., 2007). También se obtiene el aditivo de alimentos fitasa y anticoagulantes como la hirudina y saratina (Gellisen, 2002).

En años recientes, se ha considerado que la evaluación fenotípica es fundamental para complementar la información molecular y con ello establecer nuevas propuestas taxonómicas (Kurtzman y Mannarelli, 1998).

32 Por estas razones se considera relevante que exista una evaluación fenotípica y genotípica completa que permita el establecimiento de nuevas propuestas taxonómicas, pues debido a su interés biotecnológico, es significativo establecer la filogenia para este clado.

A partir del cultivo de tres cepas de Ogataea polymoprha (ATCC 26012, ATCC 34438 y ATCC 76760) proporcionadas por el Departamento de Investigación y Desarrollo de la biofarmacéutica PROBIOMED SA de C.V., se observaron colonias con características morfológicas similares desarrolladas en medio YPD. Se encontraron diferencias en el morfotipo microscópico, pues O. polymorpha ATCC 34438 y O. polymorpha ATCC 76760 presentaron blastoconidios de forma esférica mientras que O. polymorpha ATCC 26012 blastoconidios de forma ovalada.

La morfología colonial y microscópica observada para los tres microorganismos concuerda con la descrita por Barnett et al., (2000), quienes mencionan que las colonias de dicha levadura son blancas cremosas sin formación de filamentos y Gellisen (2002) dijo que las levaduras pertenecientes al género de Ogataea incluía especies que presentan células con diferentes formas como esféricas, elipsoidales, alargadas, entre otras. Ambos equipos de trabajo incluían a las tres cepas dentro del clado de Ogataea.

En las características fisiológicas podemos observar que las cepas de O. polymorpha ATCC 26012 y ATCC 34438 en general presentan capacidad de asimilación de los mismos compuestos analizados con excepción de la celobiosa y xilosa, siendo O. polymorpha ATCC 26012 la única capaz de asimilarlos. Por otro lado, esta misma levadura presentó además, resistencia a actidiona. En el caso de la cepa O. polymorpha ATCC 76760 no se pudo obtener el perfil fisiológico utilizando el sistema API/32ID®, esto pudo deberse a que es una cepa mutante deficiente de peroxisomas (Suh y Zhou, 2010). Dicha mutación podría haber afectado de manera directa su metabolismo impidiéndonos así, determinar su perfil bioquímico de la forma planteada.

Las características fisiológicas de dos de las tres cepas fueron obtenidas, sin embargo, éstas no concuerdan en su totalidad con las reportadas por Suh y Zhou

33 2010, ya que en este trabajo, se determinó que O. polymorpha ATCC 26012 es capaz de asimilar como fuente de carbono la α metil D glucosidasa, la ramnosa, pero no asimiló la arabinosa, estos datos no concuerdan con lo descrito anteriormente; por otro lado, se encontró que O. polymorpha ATCC 34438 no es capaz de asimilar como fuente de carbono a la xilosa, lo que también difiere con lo reportado anteriormente. Para la cepa de O. polymorpha ATCC 76760 no existen reportes de su perfil fisiológico. Estas características, no fueron tomadas en cuenta para la clasificación de estas levaduras, sólo tomaron en cuenta la descripción metabólica con fines de caracterización.

La formación de ascosporas es característica de la reproducción sexual de las levaduras. El clado Ogataea presenta reproducción sexual (Kurtzman, 2011), contrario a lo descrito de manera general para las levaduras del clado Candida, pues éstas, a pesar de contar con la gran mayoría de los genes relacionados en los hongos para llevar a cabo la reproducción sexual (MLT- mating-like-type) no se sabe que sean capaces de seguirlo. En este trabajo se evaluó la capacidad de producción de ascosporas en forma de Saturno de las cepas O. polymorpha ATCC 34438, ATCC 26012 y ATCC 76760, la cual es considerada como una característica relevante en la clasificación de dichos microorganismos, pues se ha reportado que algunas cepas pertenecientes al género Ogataea tienen la capacidad de producir ascosporas de este tipo (Kurtzman, 2011). La cepa O. polymorpha ATCC 76760 descrita como mutante (Suh y Zhou, 2010) no mostró capacidad de formación de ascosporas en la condiciones establecidas en el laboratorio, probablemente se debió a cambios fenotípicos y genotípicos por la mutación.

Dentro del grupo de las Candidas se sabe que la gran mayoría de las especies siguen un ciclo parasexual, es decir que realizará la fusión o apareamiento de células diploides seguido de un mitosis y pérdida de cromosomas, en lugar de seguir la meiosis como lo marcan los ciclos sexuales. Este tipo de ciclo es seguido por algunas levaduras como C. albicans. También existen otras levaduras como C. tropicalis y C. parapsilosis de las cuales no se ha podido reportar su capacidad de fusión o apareamiento. Existen algunos microorganismos de este clado que si son capaces de producir esporas siguiendo un ciclo sexual completo como lo son C.

34 guilliermondii y C. lusitaniae, sin embargo, aun logrando su ciclo sexual, los genes involucrados muestran una amplia diferencia con los que en demás microorganismos están reportados (MAT- mating type) (Butler et al., 2009; Reedy et al., 2009). Por lo tanto, la clasificación previa de Ogataea en el clado de Candida no es viable.

Existen otras características fenotípicas muy importante que permiten realizar la clasificación de las levaduras, tal es el caso de la termotolerancia. Las levaduras del género Ogataea se consideran termotolerantes con capacidad de crecimiento a temperaturas altas, por encima de los 50°C, lo cual difiere de los microorganismos que pertenecen al clado de Candida pues de manera general no se consideran termotolerantes, salvo algunas especies como C. acidothermophilum, Esta característica no se analizó en este trabajo, por lo cual es interesante que se revise en un futuro.

Una de las características clave en las levaduras pertenecientes al clado de Ogataea es la capacidad de utilizar el metanol como única fuente de carbono, ésta es una de las condiciones principales que deben considerarse para la inclusión de microorganismos en este clado. Dentro del clado de Candida, la metilotrofía no es una característica fundamental para incluir a los microorganismos dentro de éste, pues no es un atributo generalizado para todos los microorganismos del clado. Existen algunas levaduras del clado de Candida que son capaces de asimilar metanol como Candida krabiensis, sin embargo, esta levadura fue incluida dentro del clado de Candida considerando además una gran variedad de características tanto fenotípicas como genotípicas, caso contrario a las levaduras analizadas en el presente trabajo.

En estudios anteriores desarrollados por Suh y col., (2006); Tsui y col., (2008) proponen una nueva clasificación taxonómica basada exclusivamente en análisis moleculares, dejando de lado el análisis fenotípico. En 2010, Suh y Zhou establecieron que la cepa O. polymorpha ATCC 26012 no pertenece al clado de Ogataea, proponiendo reubicarla en el clado de Candida y renombrándola como Candida parapolymorpha ATCC 26012, considerando exclusivamente el análisis de secuencias moleculares (ITS y dominio D1/D2), dejando de lado algunas de las

35 características fisiológicas. A pesar de que la O. polymorpha ATCC 26012 se ubicó en el clado de Ogataea, Suh y Zhou (2010) la ubicaron alejada filogenéticamente del resto, por lo tanto la reubicaron taxonómicamente en el clado de Candida además de renombrarla como C. parapolymorpha ATCC 26012. Analizando los dos árboles filogenéticos propuestos en este trabajo, sugerimos que se distinguen grupos bien establecidos, en los cuales se observó que las tres cepas de Ogataea analizadas pertenecen al clado del mismo nombre, presentando una relación filogenéticamente cercana importante con otras cepas de este clado, el cual se encuentra claramente separado del clado de Candida.

Ambos arboles coinciden en que agrupan a las cepas en estudio y otras cepas relacionadas en un solo clado, pero a su vez se distinguen claramente tres subgrupos, lo que coindice con lo reportado por Naumov et al. (1997), quienes describen 3 diferentes especies hermanas dentro del entonces complejo de Hansenula polymorpha. Nuestros datos refuerzan la idea de que se trata de tres especies muy emparentadas dentro del mismo género.

En el presente trabajo, tomamos en cuenta características de las levaduras como la morfología macro y microscópica, la producción de ascosporas en forma de Saturno, el perfil bioquímico y el análisis de dos marcadores moleculares (fragmento ITS y dominio D1/D2), la información obtenida se correlacionó con las características generales de las levaduras pertenecientes al clado Ogataea, por lo cual se propone que las tres levaduras analizadas pertenecen a dicho clado. Esto es de suma importancia, debido al interés biotecnológico de estas levaduras. El trabajar con microorganismos relacionados estrechamente con patógenos (tales como C. albicans, C. glabrata, entre otros) representa una serie de problemas legales, lo cual impediría que fueran explotadas al máximo para fines industriales.

36 8.0 CONCLUSIONES

. Se corroboraron que las características de morfología colonial y microscópica, así como su asimilación de diversos compuestos fueran los establecidos tanto para las cepas trabajadas como las relacionadas con el clado de Ogataea. . Las cepas O. polymorpha ATCC 34438 y ATCC 26012 son capaces de producir ascosporas relacionadas a la fase sexual del organismo y la cepa O. polymorpha ATCC 76760 es capaz de producir seudohifas. . Tomando en cuenta las características fenotípicas y genotípicas, consideramos que las cepas Ogataea polymorpha ATTC 26012, ATCC 34438 y ATCC 76760 pertenecen al clado de Ogataea, quedando excluidas del clado de Candida con el cual habían sido relacionadas. . Proponemos la reubicación de la cepa Candida parapolymorpha como Ogataea parapolymorpha ATCC 26012.

37 9.0 PERSPECTIVAS

Se cuentan con evidencias claras de que las cepas trabajadas pertenecen al clado de Ogataea, sin embargo, consideramos que el poder evaluar ciertas secuencias de genes codificantes que se utilizan comúnmente en la clasificación de las levaduras, enriquecerían el trabajo y nos permitirían tener una mayor visión y argumentos sustentados para mantener la clasificación propuesta. Algunos de los genes que se proponen trabajar son el de la actina (ACT1), la subunidad mayor de la RNA polimerasa (RPB1), la segunda subunidad mayor de la RNA polimerasa (RPB2), citocromo oxidasa (COX2) y el factor de elongación 2 (EF2) debido a que estos genes están reportados que son de gran utilidad en la clasificación de levaduras. Con las secuencias obtenidas consideramos importante realizar una Análisis de secuencias multilocus (MLSA- Multilocus Sequence Analysis) para poder obtener establecer relaciones filogenéticas en un árbol conca tenado que correlacione todas las secuencias amplificadas.

Además de los análisis moleculares, consideramos importante el poder evaluar algunas otras características fenotípicas como la termotolerancia, que nos permitirá contar con más elementos fenotípicos que apoyen la clasificación propuesta.

38 10.0 BIBLIOGRAFÍA

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