Análisis AFLP Del Género Agave Refleja La Clasificación Taxonómica Basada En Caracteres Morfológicos Y Otros Métodos Moleculares

Análisis AFLP del género Agave refleja la clasificación taxonómica basada en caracteres morfológicos y otros métodos moleculares

Katia C. Gil-Vega1, Corina E. Díaz–Quezada1, Alejandro Nava-Cedillo2, Abisaí García-Mendoza3 y June Simpson1

1Departamento de Ingeniería Genética, CINVESTAV, Unidad Irapuato. A.P. 629, Irapuato, Guanajuato, México. [email protected]. 2Instituto Tec- nológico Agropecuario de Aguascalientes. 3Jardín Botánico, Instituto de Biolo- gía, UNAM.

Resumen La utilidad de los marcadores moleculares AFLP para determinar las relaciones taxonómicas en el género Agave y otros miembros de la familia Agavaceae fue explorada. Con este objetivo, 71 especies del género Agave fueron analizadas y comparadas con otros seis géneros de la misma familia. Una muestra de Dasyli- rion sereke de la familia relacionada Nolinaceae fue incluida como un control externo. Todas las muestras fueron obtenidas del Jardín Botánico de la Universi- dad Nacional Autónoma de México. Un total de 355 marcadores AFLP fueron analizados, y con estos datos, la similitud genética entre las muestras fue de- terminada usando el índice de Jaccard. Se construyó un dendrograma basado en estos datos usando el método UPGMA. El dendrograma muestra la separa- ción de los diferentes géneros y dentro del género Agave, los subgéneros Littaea y Agave aparecen como grupos bien definidos. En algunos casos, miembros de las secciones previamente definidos dentro de los subgéneros Agave y Littaea: (Rigidae, Striatae, Polycephalae y Sisalanae) se encontraron también cercanamente asociados. Estos resultados confirman la utilidad de los marcadores AFLP como una herramienta de apoyo para la clasificación taxonómica del gé- nero Agave y la familia Agavaceae y serán útiles para obtener una rápida orien- tación taxonómica aun en materiales que no están en una etapa adecuada de desarrollo para una precisa caracterización morfológica.

Abstract The usefulness of AFLP markers in determining taxonomical relationships in the genus Agave was explored. With this aim 71 species of this genus were analyzed and compared with six other genera of the Agavaceae family. A sample of Dasy- lirion sereke from the related Nolinaceae family was also included as an outlying

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control. A total of 355 AFLP markers were analyzed and with this data the genetic similarity between the samples was determined using the Jaccard index from which a dendrogram was constructed using the UPGMA method. The dendrogram shows the separation of the different genera and within the genus Agave the sub-genera, Littaea and Agave are well defined. In certain cases members of previously defined sections within the subgenera Agave and Littaea: (Rigidae, Striatae, Polycephalae and Sisalanae) were also found to be closely associated. These results confirm the usefulness of AFLP markers as tools to support the taxonomic classification of the Agavaceae and suggests that they will be useful for providing a rapid taxonomic orientation even for materials which are not at an adequate developmental stage for a precise morphological characterization.

Introducción Los avances en la metodología para analizar variabilidad genética a nivel molecular han permitido avances paralelos en los campos de mejoramiento, análisis de diversidad, análisis de filogenias, análisis taxonómicos y en la medicina fo- rense. Avise (2004) comenta de manera exhaustiva respecto a las ventajas de utilizar técnicas moleculares para estudiar la variabilidad genética, y sobre la concordancia general entre los resultados obtenidos con base en métodos mor- fológicos y los basados en técnicas moleculares. Las desventajas más importan- tes del uso de las técnicas moleculares como herramientas para estudiar variabilidad genética son el costo y la experiencia necesaria para implementar estas metodologías. Actualmente existe un gran número de métodos moleculares para identifi- car y analizar variabilidad genética (Avise 2004). En general, los métodos más ampliamente utilizados en estudios taxonómicos y de filogenia están basados en la secuenciación de genes o secuencias específicas o en patrones producidos por enzimas de restricción sobre los ADN (ácido desoxirribonucleico) de los cloro- plastos o mitocondrias. Estos métodos tienen la ventaja de poder estimar la variabilidad genética con relación al tiempo y permiten determinar relaciones filo- genéticas y evolutivas. Sin embargo, estos métodos están restringidos a analizar una pequeña porción del genoma de un organismo (hasta un solo gen) o los ge- nomas de los organelos del organismo. Además, la secuenciación masiva de muestras obtenidas de un gran número de individuos es laboriosa y costosa. Los marcadores tipo polimorfismos en longitud de fragmentos amplifica- dos (AFLP) ofrecen una buena alternativa para estudiar la variabilidad genética. Estos marcadores son altamente reproducibles, la metodología es relativamente sencilla, proveen información completa a través del genoma y es factible analizar un gran número de muestras rápidamente por un costo moderado. Hasta la fecha no se han desarrollado métodos ampliamente aceptados para estimar cambios en patrones de AFLP con relación al tiempo, y la crítica más fuerte es la suposición que los fragmentos observados del mismo tamaño en distintos individuos, efectivamente, pertenecen a fragmentos con secuencias homólogas. Aunque existen muy pocos reportes de investigación conclusivos sobre este último punto, en general los AFLPs han sido utilizados para llevar a

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cabo estudios dentro de poblaciones o entre especies estrechamente relacionadas, pero no a niveles taxonómicos más altos. Sin embargo, los marcadores AFLP son ahora ampliamente usados a nivel de especie y sub-especie para estudios de diversidad y filogenia y están siendo cada vez más aceptados como herramientas para la clasificación taxonómica (Marhold et al., 2004; Sasanuma et al., 2004; Furini y Wunder, 2004). El uso de los métodos moleculares es especialmente útil en estudios de especies con ciclos de vida longevos, perennes y en donde los episodios de flora- ción y reproducción sexual son únicos o escasos. En general, la mayoría de las especies de la familia Agavaceae son de este tipo. Las plantas de la familia Agavaceae se caracterizan por tener hojas fibro- sas formando una densa roseta con dientes laterales y una espina terminal pi- cuda e inflorescencias en el tallo con flores organizadas en estructuras panicu- ladas o espigadas (Bogler y Simpson, 1996). Dahlgren et al., (1985) describieron dos sub-familias de la familia Agavaceae: La Yuccoideae, que contiene dos gé- neros y la Agavoideae, que contiene seis géneros. Esta clasificación se hizo utilizando caracteres morfológicos y es apoyada por estudios realizados usando secuencias de ADN del cloroplasto (Eguiarte et al., 1994; Eguiarte, 1995; Bogler y Simpson, 1995). Dentro de la familia Agavaceae, Agave es el género con mayor número de especies, se estiman alrededor de 200 con aproximadamente 247 taxa. De éstos, alrededor de 150 especies y 186 taxa se encuentran en México (García-Mendoza, 2002). Este género se divide en dos subgéneros, Littaea y Agave, los cuales se dis- tinguen por presentar una estructura floral espigada o paniculada, respectivamente. Dentro de cada subgénero, Gentry (1982) describió 12 grupos de especies para el subgénero Agave y 8 para el subgénero Littaea. (Fig. 1). Los taxónomos de Agave han reconocido ampliamente las dificultades en la clasificación exacta de este género (Gentry, 1982; Granados, 1993), dado que los primeros estudios a este respecto se realizaron utilizando plantas fuera de su hábitat nativo y sin considerar las estructuras florales (Irish e Irish, 2000). La clasificación basada solamente en características morfológicas se complica, de- bido tanto a factores ambientales como al largo ciclo de vida, y la característica de ser monocárpicos, semelparos, esto es, que sólo tienen una floración al cabo de la cual la planta muere (Granados, 1993). Análisis citogenéticos, y más recientemente, análisis de algunos genes del cloroplasto usando secuencias específicas han ayudado a dilucidar algunas de las complejidades taxonómicas en Agave (Gentry, 1982; Eguiarte et al., 1994; Bo- gler y Simpson, 1995, 1996; Eguiarte et al., 2000; Palomino et al., 2003). Otros estudios basados en métodos moleculares se han concentrado en determinar diversidad, para hacer filogenias o diferenciar complejos dentro de una sola o unas pocas especies cercanas (Martínez-Palacios et al., 1999; Colunga- GarcíaMarín et al. 1999; Gil-Vega et al., 2001; Infante et al., 2003; Navarro- Quezada et al., 2003).

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Familia Agavaceae

sub-familia Yuccoideae sub-familia Agavoideae

Beschorneria Yucca Hesperaloë Furcraea

Manfreda

Polianthes

Prochnyanthes

Agave

subgénero Littaea subgénero Agave

Grupo Amolae Grupo Americanae Grupo Campaniflorae Grupo Choritepalae Grupo Crenatae Grupo Filiferae Grupo Deserticolae Grupo Ditepalae Grupo Marginatae Grupo Hiemiflorae Grupo Parviflorae Grupo Marmoratae

Grupo Polycephalae Grupo Parryanae Grupo Rigidae Grupo Striatae Grupo Salmianae Grupo Urceolatae Grupo Sisalanae Grupo Umbelliflorae

Figura 1. Representación esquemática de la clasificación taxonómica de la familia Agavaceae (Gentry, 1982, Dahlgren et al., 1985).

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En la familia Agavaceae se han utilizado diferentes tipos de métodos moleculares incluyendo: isozimas (Martínez-Palacios et al., 1999; Colunga- GarcíaMarín et al., 1999), polimorfismos de ADN amplificado al azar (RAPD´s) (Gil-Vega et al., 2001), AFLP´s (Infante et al., 2003) y la comparación de secuencias de genes cloroplásticos específicos como el que codifica la subunidad grande de la ribulosa bisfosfato carboxilasa rbcL (Eguiarte et al., 1994) y las secuencias espaciadores inter secuencias (ITS) de los genes ribosomales nucleares (Bo- gler y Simpson, 1996). Todos los sistemas basados en métodos moleculares utilizados han sido informativos en especies de Agavaceae, pero cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas, como son la facilidad de análisis, la rapidez, el costo y la proporción del genoma cubierto (González, 1998). Un indicador de la confiabilidad de los métodos moleculares en la clasifi- cación taxonómica es la correlación entre la clasificación de familias, géneros y especies mediante métodos de clasificación morfológica y la clasificación basada en datos de marcadores moleculares. El Jardín Botánico de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) mantiene una de las más extensas y bien caracterizadas colecciones de Agavaceae en el mundo (García-Mendoza, 1992) y por lo tanto, provee una gran oportunidad para analizar y comparar las relaciones dentro del género Agave y otros miembros de la familia Agavaceae usando los métodos clásicos y de marcadores moleculares. Con este objetivo, 71 especies del género Agave fueron analizadas y comparadas con otros seis géne- ros de la familia Agavaceae usando AFLP. Se discutirá la correlación de los resultados obtenidos de los datos AFLP con la taxonomía clásica aceptada.

Materiales y Métodos Material vegetal Se analizaron 71 especies del género Agave (33 del subgénero Agave y 38 del subgénero Littaea), 11 grupos del subgénero Agave están representados, con ex- cepción del grupo Campaniflorae, y siete grupos del subgénero Littaea, con la omisión del grupo Urceolatae. (La omisión de estos grupos se debió a falta de tejido, a dificultades en la extracción de ADN o porque estos individuos falla- ron en la técnica de AFLP). Los taxa analizados están listados en el cuadro 1. Se incluyeron muestras de otros cinco géneros de la sub-familia Agavoideae: Man- freda, Beschorneria, Furcraea, Polianthes y Prochnyanthes y uno de la sub-familia Yuccoideae: Yucca. Dasylirion sereke fue incluida como una muestra de la familia Nolinaceae. (Se eligió a Dasylirion sereke como grupo externo, ya que las familias Nolinaceae y Agavaceae han estado relacionadas, y el género Dasylirion estuvo incluido en la familia Agavaceae según Cronquist [1981], aunque fue removido en el trabajo de Dahlgren et al. [1985]). (Cuadro 1). En total, 95 muestras fueron analizadas y todas fueron obtenidas de plantas de la colección del Jardín Botá- nico de la UNAM.

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Cuadro 1. Taxa incluidos en este estudio, clasificación propuesta por Gentry (1982).

Agave subgénero Agave Grupo Americanae § 1. A. americana L. var. americana RV-1. Concordia, Sinaloa. 2. A. americana L. var. americana AG-5958. N de Saltillo, Coahuila. 3. A. americana L. var. marginata Trel. AG-6254. Jardín Botánico, Distrito Federal. 4. A. asperrima Jacobi subsp. asperrima AG-5948. Gral. Zepeda, Coahuila. 5. A. asperrima Jacobi subsp. asperrima AG-5962. Viesca, Coahuila. 6. A. asperrima Jacobi subsp. potosiensis (H. Gentry) Ullrich AG-5931. Matehuala, San Luis Potosí. ٭ Grupo Crenatae 7. A. bovicornuta H. Gentry JB-s/n 8. A. cupreata Trel. & Berger AG-6519. Tixtla, Guerrero. 9. A. inaequidens K. Koch subsp. inaequidens AG-5910. Valle de Bravo, Estado de México. Grupo Deserticolae † 10. A. deserti Engelm. AG-6135. Tepi, Baja California. Grupo Ditepalae ‡ 11. A. applanata K. Koch ex Jacobi AG-5741. Frijol Colorado, Veracruz. 12. A. chrysantha Peebles Lecher-166. Sierra Ancha, Arizona, U.S.A. 13. A. durangensis H. Gentry AG-5973. Sierra Registro, Durango. 14. A. wocomahi H. Gentry RB-18381. Guachochic, Chihuahua. Grupo Hiemiflorae * 15. A. atrovirens Karw. ex Salm-Dyck var. atrovirens AG-5824. Cuajimoloyas, Tlacolula, Oaxaca. 16. A. atrovirens Karw. ex Salm-Dyck var. mirabilis (Trel.) Gentry AG-5624. San José Cuyachapa, Puebla. 17. A. hiemiflora H. Gentry AG-5849. Ocozocuautla, Chiapas. 18. A. hurteri Trel. AG-6287. Totonicapan, Guatemala. 19. A. isthmensis García-Mend & Palma AG-4177. Ocozocuautla, Chiapas. 20. A. potatorum Zucc. AG-5804. San Marcos Arteaga, Huajuapan, Oaxaca. 21. A. potatorum Zucc AG-6664. Cañada Morelos, Puebla. 22. A. pygmaea H. Gentry AG-6462. La Trinitaria, Chiapas. 23. A. sp. nov. AG-6051. San Pedro Nopala, Teposcolula, Oaxaca. 24. A. thomasae Trel. AG-6281. Sololá, Guatemala. Grupo Marmoratae ○ 25. A. marmorata Roezl JE-2830. Zapotitlán, Puebla Grupo Parryanae □ 26. A. guadalajarana Trel. JB-s/n. Jalisco. 27. A. parrasana A. Berger AG-5960. Sierra de Parras, Coahuila. 28. A. parryi Engelm. var. parryi AG-5968. Cd. de Durango, Durango.

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Grupo Rigidae ◙ 29. A. angustifolia Haw. var. angustifolia AG-5702. Matatlán, Tlacolula, Oaxaca. 30. A. angustifolia Haw. var. angustifolia AG-5766. Xagacia, Villa Alta, Oaxaca. 31. A. angustifolia Haw. var. angustifolia AG-6081. Xochicalco, Morelos. 32. A. angustifolia Haw. var. angustifolia JIC-17883. Tecolotitlán, Jalisco. 33. A. angustifolia AG-7405. Alvarado, Veracruz. 34. A. bredlovei H. Gentry AG-5870. La Trinitaria, Chiapas. 35. A. fourcroydes Lem. CICY-s/n. Mérida, Yucatán. 36. A. karwinskii Zucc. AG-6494. Zapotitlán, Puebla. 37. A. tequilana Weber azul AG-7195. Tequila, Jalisco. 38. A. tequilana Weber siguín AG-6855. Tequila, Jalisco. Grupo Salmianae ● 39. A. mapisaga Trel. var. mapisaga AG-5909. Valle de Bravo, Estado de México. 40. A. salmiana Otto ex Salm-Dyck var. salmiana AG-5634. Teotitlán, Oaxaca. Grupo Sisalanae ⌂ 41. A. grijalvensis Ullrich AG-4216. San Fernando, Chiapas. 42. A. sisalana Perrine AG-7052. Ococingo, Chiapas. Grupo Umbelliflorae ¤ 43. A. shawii ssp. goldmaniana AG-s/n. 44. A. shawii Engelm. subsp. shawii AG-s/n. Baja California. Agave subgénero Littaea Grupo Amolae ☼ 45. A. attenuata Salm-Dyck AG-5666. San Pedro Tenayac, Estado de México. 46. A. nizandensis Cutak AG-5680. La Pedrera, Juchitán, Oaxaca. 47. A. pedunculifera Trel. AG-4838. Tlacotepec, Guerrero. 48. A. aff. pedunculifera JE s/n. Putla, Oaxaca. 49. A. vilmoriniana A. Berger AG-6001. Batopilas, Chihuahua. 50. A. yuccaefolia DC AG-4722. JB UNAM. Grupo Choritepalae ♦ 51. A. bracteosa S. Watson ex Engelm. JB87-54. JB UNAM. 52. A. ellemeetiana Jacobi XM-1442. Huautla, Teotitlán, Oaxaca. 53. A. guiengola H. Gentry AG-6062. Tehuantepec, Oaxaca. Grupo Filiferae Ω 54. A. colimana H. Gentry AG-6415. Aquila, Michoacán. 55. A. filifera AG-4329. JB UNAM. 56. A. ornithobroma H. Gentry JB-88-01966. JB Univ. Guadalajara. 57. A. schidigera Lem. AG-5918. San Luis Potosí.

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Grupo Marginatae ■ 58. A. convallis Trel. AG-5653. Tutla, Huajuapan, Oaxaca. 59. A. funkiana K. Koch & Bouché AG-5758. Tula, Tamaulipas. 60. A. funkiana K. Koch & Bouché AG-5761. Jaumave, Tamaulipas. 61. A. garciae-mendozae R. Galván AG-5923. Álvarez, San Luis Potosí. 62. A. horrida Lem. Ex Jacobi subsp. perotensis Ullrich AG-5723. Perote, Veracruz. 63. A. impresa H. Gentry S. Franco s/n. Aguamilpa, Nayarit. 64. A. kerchovei Lem. JE-2808. Zapotitlán, Puebla. 65. A. lophantha Schiede AG-5738. Almolonga, Veracruz. 66. A. peacockii Croucher AG-5822. Huajuapan, Oaxaca. 67. A. pelona H. Gentry HSG-s/n JB UNAM. 68. A. sp. nov. AG-6510. Guerrero. 69. A. titanota H. Gentry JIC-22824. Miahuatlán, Puebla. 70. A. triangularis Jacobi AG-5818. Chazumba, Huajuapan, Oaxaca. 71. A. victoriae-reginae T. Moore AG-s/n. Durango. 72. A. xylonacantha Salm-Dyck AG-7071. Metztitlán, Hidalgo. Grupo Parviflorae ∞ 73. A. parviflora Torrey subsp. parviflora JB-s/n. JB UNAM. Grupo Polycephalae ∆ 74. A. celsii Hook. var. albicans (Jacobi) H. Gentry AG-4740. Metztitlán, Hidalgo. 75. A. celsii Hook. var celsii F.Basurto-s/n. Xochitlán, Puebla. 76. A. chiapensis Jacobi AG-5861. San Cristóbal de Las Casas, Chiapas. 77. A. obscura AG-5734. Naolinco, Veracruz. 78. A. pendula Schnittsp. AG-5728. Cerro Gordo, Veracruz. 79. A. warelliana Baker AG-6609. Montebello, Chiapas. ە Grupo Striatae 80. A. dasylirioides Jacobi & Bouché AL-72. Malinalco, Estado de México. 81. A. petrophila García-Mendoza & E. Martínez AG-5811. Tonalá, Huajuapan, Oaxaca. 82. A. tenuifolia Zamudio & Sánchez Carranza 1905. Mpio. Jalpan, Querétaro. 83. A. striata Zucc. subsp. falcata (Engelm.) H. Gentry AG-5936. Ramos Arizpe, Coahuila. 84. A. striata Zucc. subsp. striata AG-4877. JB UNAM. 85. A. stricta Salm-Dyck AG-4308. JB UNAM. Otras especies de otros géneros de la familia Agavaceae 86. Beschorneria yuccoides K. Koch subsp. yuccoides AG-1418. El Chico, Hidalgo. 87. Furcraea macdougallii Matuda AG-6506. Petlalcingo, Puebla. 88. Manfreda guttata (Jacobi & Bouché) Rose AG-5972. Durango, Durango. 89. Manfreda nanchititlensis Matuda AG-5902. Nanchititla, Estado de México. 90. Manfreda pubescens (Regel & Ortgies) Verhoek HOH-258. Iguala, Guerrero. 91. Manfreda scabra (Ortega) McVaugh AG-4310. Pedregal de San Angel, Distrito Federal. 92. Polianthes graminifolia Rose ES-876. Calvillo, Aguascalientes. 93. Prochnyanthes mexicana (Zucc.) Rose R. Galván s/n. Guanajuato. 94. Yucca thompsoniana Trel. JB-s/n. JB UNAM.

Familia Nolinaceae 95.- Dasylirion sereke Bogler AG-6022. Urique, Chihuahua.

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Todos los especímenes fueron obtenidos de plantas vivas del Jardín Botánico de la UNAM, y tienen respaldo de Herbario (Herbario Nacional de México), Ciudad de México, México. Se describe el nombre científico, número y lugar de colecta. Extracción de DNA Una sección de aproximadamente 8 x 4 cm fue cortada de la hoja más joven de cada planta cuando fue posible, lavada en una solución de cloro al 4%, cortada en tiras de aproximadamente 1 cm y congelada en nitrógeno líquido. Las muestras fueron almacenadas a -80°C y congeladas hasta que se procesaron. La ex- tracción de DNA se llevó a cabo utilizando 2 g de tejido congelado con el méto- do CTAB (Doyle y Doyle, 1989). Análisis AFLP Los análisis AFLP fueron llevados a cabo siguiendo el protocolo de Vos et al., (1995). Las enzimas utilizadas para digestión fueron EcoRI y MseI. Las muestras fueron marcadas radiactivamente con γ32P y los patrones de bandeo fueron de- tectados por autorradiografía. Dos combinaciones de oligonucleótidos selectivos fueron usadas. El oligonucleótido específico EcoRI permaneció constante (EcoRI + AGG) y se combinó con 2 diferentes oligonucleótidos específicos MseI: MseI + ACC y MseI + AAC. La secuencia de los oligonucleótidos selectivos em- pleados está listada en el cuadro 2.

Cuadro 2. Pares de oligonucleótidos usados en amplificaciones selectivas. Pares de Secuencia No. de oligonucleótidos marcadores EcoRI + AGG 5'- GACTGCGTACCAATTC/AGG-3' 93 (MseI + AAC) (5'- GATGAGTCCTGAGTAA/AAC-3') EcoRI + AGG 5'- GACTGCGTACCAATTC/AGG-3' 262 (MseI + ACC) (5'- GATGAGTCCTGAGTAA/ACC-3') Análisis de datos Los autorradiogramas fueron leídos manualmente tomando en cuenta bandas entre 50-500 pb y los patrones de bandeo AFLP fueron convertidos en un códi- go binario donde 1 = banda presente, 0 = banda ausente. Se asumió que las bandas del mismo peso molecular eran equivalentes. Los datos binarios fueron utilizados para generar una matriz de distancia usando el índice de Jaccard (1908) y se construyó un dendrograma a partir de los datos empleando el méto- do UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean). Los aná- lisis estadísticos se llevaron a cabo usando el programa NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 1998). Un análisis comparativo fue también llevado a cabo utilizando el programa PHYLIP (Felsenstein, 2004), en este caso se utilizó el índice de Nei y Li (1979) (datos no mostrados).

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Figura 2. AFLP de algunos de los individuos analizados con la combinación de EcoRI + AGG y Miel + AGT.

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1 A. americana americana RV-1 § 2 A. americana americana AG-5958 § 6 A. asperrima potosiensis AG-5931 § 3 A. americana marginata 6254 § F 11 A. applanata ‡ 14 A. wocomahi ‡ 5 A. asperrima asperrima 5962 § 4 A. asperrima asperrima 5948 § 13 A. durangensis ‡ 10 A. deserti † 20 A. potatorum 5804 * 21 A. potatorum 6664 * 17 A. hiemiflora * 15 A. atrovirens atrovirens * 16 A. atrovirens mirabilis * 19 A. isthmensis* 27 A. parrasana □ 28 A. parryi parryi □ 22 A. pygmaea * 25 A. marmorata ○ 26 A. guadalajarana □ 40 A. salmiana salmiana ● 39 A. mapisaga mapisaga ● 18 A. hurteri * 24 A. thomasae * 23 A. sp. (nov.) * 44 A. shawii shawii ¤ ٭A. cupreata 8 ٭ A. inaequidens 9 ٭ A. bovicornuta 7 31 A. angustifolia angustifolia AG-6081 ◙ 29 A. angustifolia angustifolia AG-5702 ◙ 30 A. angustifolia angustifolia AG- 5766 ◙ 36 A. karwinskii ◙ 38 A.tequilana siguín ◙ G 37 A.tequilana azul ◙ H 35 A. fourcroydes ◙ 34 A. bredlovei ◙ C 32 A. angustifolia angustifolia JIC-17883◙ 33 A. angustifolia AG-7405 ◙ 12 A. chrysantha ‡ 42 A. sisalana ⌂ 41 A. grijalvensis ⌂ 43 A. shawii goldmaniana ¤ 58 A. convallis ■ 70 A. triangularis ■ 68 A.sp. nov. ■ 63 A. impresa ■ E 72 A. xylonacantha ■ 60 A. funkiana AG-5761 ■ 59 A. funkiana AG-5758 ■ 71 A. victoria-reginae ■ 65 A. lophantha ■ 67 A. pelona ■ 69 A. titanota ■ 55 A. filifera Ω 50 A. yuccaefolia ☼ 46 A. nizandensis ☼ 52 A. ellemeetiana ♦ 45 A. attenuata ☼ 61 A.garciae-mendozae ■ 47 A. pedunculifera ☼ 49 A. vilmoriniana ☼ 48 A. aff. pedunculifera ☼ 51 A. bracteosa ♦ 73 A. parviflora parviflora ∞ 76 A. chiapensis ∆ 79 A. warelliana ∆ 74 A. celsii albicans ∆ D 78 A. pendula ∆ 75 A. celsii celsii ∆ 53 A. guiengola ♦ 57 A. schidigera Ω 56 A.ornithobroma Ω 2 54 A. colimana Ω 77 A. obscura ∆ B 62 A. horrida perotensis ■ 64 A. kerchovei ■ 66 A. peacockii ■ ە A. stricta 85 ە A. petrophila 81 ە A. tenuifolia 82 ە A. striata striata 84 ەA. dasylirioides 80 1 ە A. striata falcata 83 91 Manfreda scabra 88 Manfreda guttata 89 Manfreda nanchititlensis 90 Manfreda pubescens 87 Furcraea macdougalli 93 Prochnyanthes mexicana A 92 Polianthes graminifolia 86 Beschorneria yuccoides 94 Yucca thompsoniana 95 Dasylirion sereke

0.13 0.35 0.56 0.78 1.00 Similaridad Figura 3. Dendograma obtenido utilizando el índice de Jaccard y UPGMA.

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Resultados y Discusión Un ejemplo de la detección de AFLP´s radiactivos de algunas taxa de la familia Agavaceae se muestra en la figura 2. En el presente estudio se analizó un total de 355 marcadores AFLP (con la combinación EcoRI + AGG y MseI + AAC se obtuvieron 93 bandas y con EcoRI + AGG y MseI + ACC, 262 bandas; todas las bandas obtenidas fueron polimórficas). Con estos datos las distancias genéticas fueron calculadas utilizando el índice Jaccard (1908) o el índice de Nei y Li (1979) y el método de UPGMA usando los paquetes de análisis estadísticos NTSYSpc 2.1 y PHYLIP, respectivamente. Los dendrogramas obtenidos fueron esencialmente idénticos con el mismo patrón de agrupamiento. Las únicas dife- rencias observadas eran pequeños re-arreglos dentro de los agrupamientos ma- yores. El dendrograma presentado en la figura 3 fue construido utilizando el índice Jaccard, UPGMA y NTSYSpc2.1. El agrupamiento de muestras observado en el dendrograma concuerda bien con la más aceptada clasificación taxonómica de la familia Agavaceae. Como se esperaba, la especie Dasylirion sereke de la familia Nolinaceae es gené- ticamente la muestra más distante, seguido por Yucca thompsoniana que repre- senta a la subfamilia Yuccoideae de la familia Agavaceae. Estos resultados con- cuerdan con los datos de Eguiarte et al., (1994, 2000) quienes sugieren que Yucca es el taxón más primitivo de la familia. Todos los otros géneros son de la sub- familia Agavoideae. En este caso, Beschorneria yuccoides, representativa del gé- nero Beschorneria, es la más distante al género Agave, mientras los otros géneros (marcados por A en el dendrograma) se encuentran más cercanos genéticamen- te: Manfreda y Furcraea por un lado, y Polianthes y Prochnyanthes unidos en otro grupo; estos dos últimos han sido considerados como géneros paralelos a Agave y colocados en una tribu separada o como muy cercanamente relacionados a Manfreda (Bogler y Simpson, 1996, Eguiarte et al., 2000) y los resultados obtenidos en este trabajo apoyan esta hipótesis. El género Agave, definido como grupo B en el dendrograma, está también más cercanamente relacionado a los otros cuatro géneros de la subfamilia Agavoideae que a Beschorneria. Estudios moleculares utilizando secuencias de ADN de cloroplasto o secuencias ITS (Clary y Simpson, 1995; Bogler y Simpson, 1996; Eguiarte et al., 2000) también apoyan esta asociación, y aunque Thiede (2001) sugirió que Agave, Manfreda, Polianthes y Prochnyanthes deberían estar clasificados dentro de un solo género, esta clasifi- cación da por resultado un género muy grande y difícil de manejar, ya que incluye individuos con morfologías, hábitats y biologías reproductivas muy diferentes (Eguiarte et al., 2000). Basado en estos resultados, García-Mendoza (2002) menciona que es necesario realizar más investigación (taxonómica, biogeográfi- ca, morfológica, ecológica, de evolución, etc.) dentro de estos grupos para pro- poner una clasificación más adecuada, y considera que el género Agave consiste de sólo los subgéneros Agave y Littaea, como está descrito en Gentry (1982). Dentro del subgénero Littaea, se ha sugerido la división entre varios subgrupos o secciones (Gentry, 1982). Uno de estos grupos es la sección Striatae, de- finida como grupo B1 en el dendrograma. Striatae forma un grupo discreto, separado del gran agrupamiento que contiene todas las muestras restantes del género

Análisis AFLP del género Agave refleja la clasificación taxonómica… del tequila, los mezcales y otros agaves

Agave. Esta agrupación apoya las sugerencias de que el grupo Striatae pudiera ser considerado como un género separado dentro de la subfamilia Agavoideae (Bo- gler, com. pers.). Gentry (1982) señala que el grupo Striatae es el que tiene las ca- racterísticas más generalizadas o ancestrales, incluyendo hábitos de crecimiento perenne, inflorescencias tipo espiga, un ovario inferior incompleto, y hojas poco especializadas, poco suculentas y con margen finamente aserrado. Los análisis de AFLP muestran que dentro del grupo B2, los subgéneros Agave y Littaea están bien definidos, confirmando así la clasificación previa de Gentry (1982). Como puede observarse, el subgénero Agave forma un grupo discreto dentro del grupo B2, denotado por una letra C en el nodo correspon- diente. (En el dendrograma los individuos del subgénero Agave están escritos en tonalidades azules/verdes, mientras los del subgénero Littaea se presentan en tonalidades rojas/rosas). Esto nos indica una excelente correlación entre una clasificación hecha morfológicamente y la hecha por marcadores AFLP. Asimismo, nuestros análisis también apoyan en cierta medida la división en subgrupos dentro de los subgéneros Agave y Littaea como está descrito por Gentry (1982). Dentro de Littaea, el grupo Polycephalae está bien definido con la excepción de A. obscura (grupo D, símbolo ∆ en el dendrograma). El grupo E en el dendrograma está compuesto por muestras de la sección Marginateae, sin embargo, otros individuos clasificados como Marginateae se encuentran disper- sados a través del grupo de los Littaea (símbolo ■ en el dendrograma). También se observan asociaciones más débiles entre los grupos Filiferae, Choritepalae y muestras del grupo Amolae. Es importante mencionar que estos dos últimos grupos (Choritepalae y Amolae) también son débiles con base en la taxonomía morfológica, ya que A. guiengola tiene una morfología vegetativa muy distinta de A. bracteosa y A. ellemetiana, y es una especie muy suculenta con dientes en el margen y restringida a un hábitat muy especializado. Lo mismo sucede con el grupo Amolae, cuya heterogeneidad morfológica se refleja en el dendrograma. Dentro del subgénero Agave, un grupo discreto F (con la excepción de A. crysantha) incluye las muestras de los grupos Americanae y Dipetalae (símbolos § y ‡, respectivamente). Americanae y Dipetalae se parecen algo en su morfología ya que son plantas de gran tamaño. Esto es un resultado interesante y da pie a futuras investigaciones a nivel taxonómico. Hay otro grupo discreto (G) que in- ,٭ cluye muestras del grupo Rigidae y del Crenatae (símbolos ◙ y respectivamente), aunque es importante mencionar que en este caso se trata de grupos de plantas muy diferentes morfológicamente; un ejemplo es que las plantas del grupo Rigidae son surculosas mientras las de Crenatae raramente lo son (Gentry, 1982). Dentro de este grupo (G), analizando el grupo Rigidae, se encuentran A. angustifolia, A. fourcroydes y A. tequilana, sobre lo que ha habido referencias previas (Aguirre et al., 2001) de que A. tequilana es en realidad un tipo de A. angustifolia, y Colunga-GarcíaMarín y May Pat (1997) reportan a A. angustifolia como antecesor silvestre de A. fourcroydes, aunque esto está descrito morfológicamente, observamos aquí un nodo (H) que incluye estas tres especies. Se observó una asociación más débil entre muestras del grupo Hiemiflo- rae, pero las asociaciones entre los otros grupos dentro del subgénero Agave no

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estuvieron bien definidas. Es importante resaltar que se necesitan más trabajos antes de hacer una propuesta formal de subdivisiones. Como en el caso de los subgrupos de Littaea mencionados arriba, algunas de estas agrupaciones también están basadas en relaciones débiles entre carac- terísticas morfológicas. A partir de los resultados de grupos específicos tales como los grupos Americanae/Ditepalae del subgénero Agave o el grupo Marginatae del subgénero Littaea, se puede elegir un mayor número de muestras para un estudio más deta- llado, tanto por métodos de AFLP como morfológicos, y de esta manera, confirmar las asociaciones o divisiones dentro de estos grupos. Los especímenes que no mostraron asociaciones cercanas con otros grupos (tales como A. shawii Goldma- niana o A. ellemeetiana) son también candidatos para análisis posteriores.

Conclusiones Este es el primer estudio en la familia Agavaceae que compara la clasificación taxonómica basada en caracteres morfológicos con el agrupamiento basado en distancias genéticas obtenidos con datos de marcadores AFLP. También es el primer estudio que analiza de manera detallada el género Agave e incluye muestras de casi todos los grupos propuestos por Gentry (1982). La clasificación taxonómica generada usando AFLP concuerda muy bien con la clasificación taxonómica aceptada de la familia Agavaceae, basada en caracteres morfológicos, y en particular, del género Agave y de los subgéneros Agave y Littaea. Estos resultados demuestran que los marcadores AFLP son herramientas útiles en combinación con los métodos de clasificación taxonómi- ca para la clasificación de los miembros de la familia Agavaceae. En general, se acepta que los marcadores AFLP son útiles para analizar diversidad y relaciones genéticas a nivel de especies, sub-especies y taxa, y son escasos los trabajos con AFLP para distinguir a nivel de género o familia. Sin embargo, este trabajo muestra una correlación muy marcada en agrupamientos entre análisis por AFLP y la taxonomía morfológica tradicional. Es posible que los métodos de análisis utilizados (índice Jaccard y UPGMA y el índice de Nei y Li y UPGMA) y la gran cantidad de marcadores analizados, minimizan los posibles errores producidos por la suposición de que los fragmentos del mismo peso molecular son homólogos en secuencia y permitan una representación confiable de las relaciones genéticas dentro de la familia Agavaceae. Es necesario explorar más ampliamente esta correlación en la familia Agavaceae y en otras familias para confirmar la habilidad de discriminación de los AFLP a estos niveles. Por otro lado, los marcadores basados en DNA tienen la ventaja de que pueden ser usados para analizar rápidamente un gran número de muestras empleando cantidades mínimas de tejido vegetal, y son especialmente útiles para llevar a cabo clasificaciones rápidas usando tejido inmaduro o tejido que de otra manera es difícil de clasificar. Un pequeño grupo de huellas genéticas tipo estándar de individuos representando cada género y subgénero puede ser desarrollado, contra el cual, nuevas muestras puedan ser fácilmente comparadas, y después se pueden comparar con más detalle especímenes con muestras de

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grupos específicos o especies, y en el momento adecuado, con las características morfológicas.

Agradecimientos Agradecemos al Dr. Luis Herrera-Estrella por sus sugerencias y correcciones al manuscrito. Esta investigación fue apoyada con recursos de la Fundación Gua- najuato Produce y SIHGO, proyecto número 200202609.

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Fotografía: Patricia Colunga

Valle de Tlacolula, Oaxaca.

Katia C. Gil-Vega, Corina E. Díaz-Quezada et al.

Fotografía: Luis E. Eguiarte

Fotografía: Ofelia Vargas

Fotografía: Ofelia Vargas Inflorescencias