MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOV ĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie Odd ělení genetiky a molekulární biologie

Aktuální poznatky v molekulární biologii a epidemiologii viru ch řipky A

Brno 2011 Bc. Silvie Tománková

Pod ěkování

Cht ěla bych pod ěkovat doc. RNDr. V. Růži čkové, CSc. za odborné vedení mé práce, poskytnutou literaturu, p řipomínky k textu a cenné rady b ěhem psaní této práce.

2 OBSAH

Úvod ...... 4 1 Obecná charakteristika ...... 5 1.1 Virus ch řipky typu A ...... 5 2 Proteiny viru ch řipky typu A...... 6 2.1 Hemaglutinin (HA)...... 6 2.2 Neuraminidáza (NA) ...... 6 2.3 Matrixový protein (M1)...... 7 2.4 Membránový protein (M2)...... 8 2.5 Nukleoprotein (NP) ...... 9 2.6 PB1-F2...... 10 2.7 RNA – dependentní RNA polymeráza...... 10 2.7.1 Protein PA ...... 10 2.7.2 Protein PB1...... 11 2.7.3 Protein PB2...... 11 2.8 Nestrukturní fosfoprotein NS1 ...... 11 2.9 Nestrukturní fosfoprotein NS2 ...... 11 3 Reprodukce ch řipkového viru typu A ...... 13 3.1.1 Aktivace polymerázového a transkrip čního komplexu ...... 14 3.1.2 Sbalování a pu čení virových částic ...... 14 4 Antigenní zm ěny ...... 15 4.1 Antigenní drift (antigenní posun)...... 16 4.2 Antigenní shift (antigenní zvrat)...... 16 5 Ch řipkové onemocn ění...... 18 5.1 Klinická manifestace ...... 18 5.2 Patogeneze...... 18 5.3 Lé čba ...... 18 5.3.1 Blokátory iontového kanálu ch řipkového viru ...... 19 5.3.2 Inhibitory virové neuraminidázy...... 20 6 Pandemie ...... 20 6.1 Historický pohled na nejvýznamn ější pandemie ch řipky typu A...... 22 6.1.1 „Špan ělská ch řipka“ H1N1 z roku 1918...... 22 6.1.2 „Asijská ch řipka“ H2N2 z roku 1957...... 22 6.1.3 Ch řipka „Hong Kong“ H3N2 z roku 1968...... 23 6.1.4 „Pta čí ch řipka“ H5N1 (možný budoucí pandemický kmen)...... 24 6.1.5 „Prase čí ch řipka“ H1N1 z roku 2009 ...... 24 7 Diagnostika ch řipkové infekce ...... 26 Záv ěr...... 30 Seznam použitých zkratek...... 31 Seznam použité literatury ...... 33

3 Úvod

Ch řipková infekce je často považována za banální onemocn ění, ale ve skute čnosti bývá příčinou mnoha úmrtí. Jsou známy t ři druhy p ůvodce této nemoci - Influenza A virus, Influenza B virus a Influenza C virus . Tyto obalené viry se segmentovaným RNA-genomem mají schopnost antigenní zm ěny, která jim pomáhá uniknout imunitnímu systému infikovaného hostitele. K přenosu této nákazy z člov ěka na člov ěka dochází kapénkovou infekcí s následným rychlým ší řením tohoto onemocn ění v sezónních epidemiích. Pouze ch řipka typu A m ůže vyvolat infekci v celosv ětovém m ěř ítku (tzv.pandemii), z d ůvodu vytvo ření nového sybtypu ch řipkového viru antigenním zvratem. Schopnost ch řipkového viru typu A zásadn ě zm ěnit svou genetickou informaci p ředstavuje celosv ětový zdravotnický problém. Cílem této práce je poskytnout základní informace týkající se aktuálních poznatk ů v molekulární biologii a epidemiologii viru ch řipky typu A se zvláštním z řetelem na ch řipkové onemocn ění lidí.

4 1 Obecná charakteristika

Ch řipkové viry pat ří do čeledi Orthomyxoviridae. Jsou známy t ři druhy tohoto viru (Influenza A virus, Influenza B virus, Influenza C virus ), které se řadí do rod ů Influenzavirus A, Influenzavirus B a Influenzavirus C. Viry ch řipky byly objeveny ve dvacátém století. V roce 1933 byl izolován virus ch řipky A. W. Smithem, P. Laidlawem a C. H. Andersem. Virus ch řipky B objevil T. Jr. Francis v roce 1939 a virus ch řipky C byl objeven v roce 1950 R. M. Taylorem. Ch řipkové viry jsou obalené a uvnit ř kapsidu mají segmentovaný genom. To znamená, že negativní jedno řet ězcová nukleová kyselina RNA (-ssRNA) je rozd ělena na ur čitý po čet segment ů. Virus ch řipky typu A má stejn ě jako typ B osm segment ů, zatímco virus ch řipky C má segment ů sedm.

1.1 Virus ch řipky typu A

Pr ůměrná velikost ch řipkového viru typu A se pohybuje okolo 120 nm (proto ho lze pozorovat pouze v elektronovém mikroskopu) a velikost genomu je p řibližn ě 15 kb. Tento virus má dva povrchové glykoproteinové antigeny – hemaglutinin (HA) a neuraminidázu (NA). Geny lokalizované na osmi segmentech genomu kódují 11 genových produkt ů, mezi které pat ří (viz. Obr. 1): 1) proteiny polymerázového komplexu: PB1, PB1-F2, PB2 a PA (funkce RNA transkriptázy a replikázy) 2) proteiny: HA (hemaglutinin), NP (nukleoprotein), NA (neuraminidáza), M1 a M2 (matrixové proteiny), NS1 a NS2 (nestrukturní proteiny)

Nomenklatura ch řipkových vir ů typu A je rozd ělena do jednotlivých subtyp ů podle jejich povrchových antigen ů (glykoprotein ů) na povrchu virionu hemaglutininu (H1 - H16) a neuraminidázy (N1 - N9).

5

Obrázek 1: Struktura virionu ch řipky typu A (http://www.nature.com/scitable/topicpage/genetics-of-the-influenza- virus-716)

2 Proteiny viru ch řipky typu A

2.1 Hemaglutinin (HA)

Je membránový protein a hlavní povrchový antigen viru ch řipky typu A. Tento protein zodpovídá za vazbu k receptor ům hostitelské bu ňky (jako receptor slouží kyselina sialová) a za fúzi mezi virionem a hostitelskou bu ňkou (uvoln ění nukleokapsidu do cytoplazmy bu ňky). Aktivní je v podob ě trimeru a je kódován čtvrtým RNA segmentem. Podléhá t řem r ůzným posttransla čním proces ům (proteolytickému št ěpení, glykosylaci a acylaci mastných kyselin). Nov ě syntetizovaný HA je št ěpen, a to tak, že je odstran ěno 14 - 18 AMK, které slouží jako signální sekvence pro jeho transport k bun ěč né membrán ě (Webster et al. , 1992; Isin et al. , 2002). Proteolytickým štěpením HA vznikají dv ě podjednotky (HA1 a HA2), které jsou propojeny disulfidickými vazbami. Toto št ěpení je zp ůsobeno proteázami, které jsou produkovány hostitelskou bu ňkou a jsou podobné trypsinu. Tento d ěj je podmínkou infek čnosti, jelikož fúze viru a bu ňky je zprost ředkována volným amino-koncem HA2. Nešt ěpený HA (HA0) se tedy skládá z HA1 (obvykle 324 AMK + sacharid) a HA2 (obvykle 222 AMK + sacharid + 3 zbytky kyseliny palmitové). B ěhem maturace tvo ří HA homotrimery. V podstat ě každá molekula HA se skládá z globulární hlavy na stopce . Hlava je tvo řena výhradn ě podjednotkou HA1 a je schopná vázat receptor, zatímco stopka je složena z HA2 a částe čně i z HA1.

6 Karboxy-terminální oblast HA2 obsahuje hydrofobní transmembránové sekvence a terminální − cytoplazmatickou sekvenci, kde je p řipojen palmitát /CH 3(CH 2)14 COO / (Webster et al. , 1992). Díky virové RNA polymeráze, která p ři syntéze RNA vytvá ří chybné za řazení nukleotid ů, dochází v genu pro HA k mnoha mutacím, zp ůsobujících antigenní zm ěnu HA. K těmto zm ěnám dochází na definovaných místech trimeru blízko místa absorpce. Výb ěr AMK pro substituci je řízen alespo ň částe čně tlakem imunitního systému, jelikož HA je hlavním cílem imunitní odpov ědi hostitele. HA má vysoce konzervované cysteinové a v ětšinu prolinových zbytk ů. Nejvíce jsou konzervované AMK tvo řící místo pro vazbu receptoru. Zbytek molekuly HA je velmi prom ěnlivý. V sou časné dob ě je známo 16 subtyp ů HA (H1 - H16), které se liší v sekvenci AMK (u HA1 alespo ň z 30%) a zároveň nemají serologickou zk říženou reaktivitu. Některé subtypy mohou zahrnovat n ěkolik kmen ů, které mají částe čnou serologickou zk říženou reaktivitu (Webster et al. , 1992; Fouchier et al. , 2005). Podtypy H1 - H3 se obvykle specializují na konkrétní sacharidy dýchacích cest člov ěka (nastane zde infekce). Jiné subtypy, jako je například H5, p ůsobí v zažívacím traktu pták ů. Pta čí typ HA není v ětšinou nebezpe čný pro člov ěka, potenciální nebezpe čí m ůže nastat, pokud si spolu r ůzné kmeny vym ění geny. To se m ůže stát v případ ě nakažení prasete dv ěma různými ch řipkovými viry (jeden typický pro ptáky a druhý pro člov ěka) – dojde k přeskupení segment ů virové RNA (http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_ the_month/pdb76_1.html).

2.2 Neuraminidáza (NA)

Je integrální membránový glykoprotein s funkcí povrchového antigenu virionu a nachází se mezi výb ěžky HA. V aktivní podob ě se vyskytuje jako tetramer (má čty ři identické podjednotky). NA je k virionu p řichycena vazbou s proteinem M1 v obalu viru. Bylo identifikováno dev ět subtyp ů NA (N1 - N9). Neuraminidáza je zárove ň mutagenní glykoprotein podléhající selekci, která m ůže být zp ůsobena odpov ědí na imunitní systém hostitele (Webster et al. , 1992). Neuraminidáza št ěpí terminální kyselinu sialovou (kyselina N-acetylmuramová) a p řilehlou sacharidovou část glykoprotein ů na povrchu bu ňky, a tím napomáhá pr ůniku viru do hostitelské bu ňky spolu s vyhnutím se nespecifickým inhibitor ům ch řipkového viru. Št ěpení terminální kyseliny sialové z glykosylovaného HA b ěhem virového pu čení umož ňuje následnou exocytózu virion ů z bu ňky. Tato enzymatická aktivita brání vytvá ření agregát ů virion ů mezi sebou nebo s plazmatickou membránou hostitelské bu ňky. Podporuje však uvoln ění a ší ření nov ě vzniklých virových částic (http://www.uniprot.org/uniprot/Q1K9Q1).

7 Bylo prokázáno, že exprese NA na povrchu virových částic zvyšuje infek čnost virionu. Protein NA je nezbytný pro uvoln ění a ší ření nových virion ů, má však také rozhodující roli ve fúzi membrán zprost ředkované HA (Su et al. , 2009).

2.3 Matrixový protein (M1)

Matrixový protein M1 je kódován sedmým segmentem RNA. U infikovaných bun ěk se tento protein vyskytuje jak v cytoplazm ě, tak v jád ře bu ňky (Webster et al. , 1992). M1 protein je po syntéze homooligomerní a tvo ří souvislou vrstvu pod virovým obalem, čímž napomáhá stabilizaci virionu (Zhao et al. , 1998). Pouze nešt ěpený M1 protein je schopný vázat se svou N- terminální doménou (1 - 164 AMK) k záporn ě nabitým lipozom ům a C-terminální částí (165 - 252 AMK) k ribonukleoproteinovému komplexu. Zárove ň má v této form ě schopnost inhibovat transkrip ční aktivitu viru (Baudin et al. , 2001). Tento protein hraje významnou roli v regulaci životního cyklu viru, zárove ň má významnou úlohu p ři ochran ě viru p řed vrozeným imunitním systémem hostitele. M1 protein interaguje s komplementovou částí C1qA, a tím zabra ňuje neutralizaci ch řipkového viru zprost ředkovanou klasickou komplementovou dráhou. Na myším modelu bylo prokázáno, že protein M1 m ůže také napomáhat rychlejšímu ší ření viru v plicích hostitele (Zhang et al. , 2009).

2.4 Membránový protein (M2)

Je kódován sedmým segmentem RNA stejn ě jako matrixový protein M1. M2 protein je integrální transmembránový protein. Jeho membránová doména slouží jako signál pro transport viru k bun ěč nému povrchu. Je p řítomen jako tetramer na povrchu infikované bu ňky, zárove ň se nachází i uvnit ř virionu. Má významnou úlohu jako protonový kanál umož ňující okyselení vnit řku viru b ěhem dekapsidace viru (Webster et al. , 1992). Ukázalo se, že tento iontový kanál hraje významnou úlohu p ři vytvá ření virového filamenta (Rossman et al. , 2010). U tohoto proteinu bylo nalezeno deset míst, které podléhají pozitivní selekci u člov ěka. Sedm t ěchto míst je umíst ěno v extracelulární domén ě, což m ůže být spojeno s tlakem imunitního systému hostitele. Další oblast (aminokyselinová pozice 27) se nachází v transmembránové domén ě a souvisí s rezistencí hostitelských bun ěk k lékům proti ch řipkové infekci. Poslední dv ě místa (aminokyselinová pozice 57 a 89) jsou umíst ěna v cytoplazmatické domén ě. Tyto pozice mohou být d ůležité pro odpov ěď imunitního systému hostitele (Furuse et al. , 2009).

8 2.5 Nukleoprotein (NP)

Je kódován pátým segmentem RNA a významn ě p ůsobí na aktivitu RNA polymerázy. Syntéza tohoto proteinu probíhá v infikované bu ňce ve velké mí ře a je druhým nejvíce zastoupeným proteinem ve virionu ch řipkového viru. Fosforylace tohoto proteinu je závislá na hostitelské bu ňce a m ůže být spojena s omezením spektra hostitel ů pro virus. Nukleoprotein je také hlavním cílem pro cytotoxické T-lymfocyty (Webster et al ., 1992). Nukleoprotein se váže na virovou RNA, kterou chrání p řed nukleázami. Takto se vytvo ří ribonukleoproteinový komplex (RNP), který slouží jako templát pro transkripci a replikaci viru a je nezbytný pro vytvo ření a maturaci nových virion ů v infikovaných bu ňkách. Bylo identifikováno p ět tryptofanových, dva argininové a jeden fenylalaninový zbytek mající zásadní vliv pro vazbu RNA k nukleoproteinu p ři fyziologické teplot ě (Elton et al. , 1999b; Huang et al. , 2001). V rané fázi infekce se nukleoprotein nalézá v jád ře infikované bu ňky, což je nezbytné pro spušt ění infek čního cyklu ch řipkového viru. V pozd ější fázi infekce se nachází p ředevším v cytoplazm ě bu ňky. Tento protein obsahuje n ěkolik sekvencí, které mají funkci signálu pro jadernou lokalizaci (NLS). Díky t ěmto sekvencím na nukleoproteinu je RNA schopna vstoupit do jádra bu ňky. Ukazuje se, že má dva nezávislé NLS sekvence – NLS1 a NLS2 (O'Neill et al. , 1995; Weber et al. , 1998). Bylo dokázáno, že NLS1 zprost ředkovává import vRNA a nov ě syntetizovaných nukleoprotein ů do jádra bu ňky. Poté, co dojde k exportu ven z jádra, dochází k maskování této sekvence a exportované nukleoproteiny a vRNA nemohou být op ět transportovány do jádra. Selektivní expozice NLS1 p ředstavuje významný mechanismus pro regulaci sm ěru transportu vRNA do jádra b ěhem reproduk čního cyklu viru (Wu a Pante, 2009). Zdá se, že interakce M1 proteinu s RNP má za následek „skrytí“ NLS u nukleoproteinu. V rané fázi virové infekce se M1 protein po acidifikaci virionu odlou čí od RNP. Disociace M1 proteinu z RNP odhaluje NLS nukleoproteinu, což má za následek transport protein ů do jádra (Martin a Helenius, 1991; Bui et al. , 1996). Ukazuje se, že nukleoprotein je schopný vázat se in vitro s aktinem. Byla identifikována rezidua nezbytná pro tuto interakci. Interakce nukleoproteinu s F-aktinem m ůže zp ůsobit uchovávání ribonukleoprotein ů v cytoplazm ě (Digard et al. , 1999).

9 2.6 PB1-F2

Je protein dlouhý 87 aminokyselin a je kódován pomocí alternativního čtecího rámce polymerázového genu PB1. Tento protein nebyl nalezen u ch řipkových vir ů n ěkterých živo čich ů, jako je nap říklad prase. V laboratorních podmínkách byla vytvo řena um ělá verze tohoto proteinu, která indukuje apoptózu bun ěk (Chen et al. , 2001). Patogenita PB1-F2 nemusí mít dopad na všechny kmeny ch řipkové viru, byla objevena ovšem ur čitá komorbidita (sou časný výskyt více nemocí) b ěhem sekundární bakteriální infekce. Předpokládá se, že PB1-F2 m ůže p řisp ět k patogenezi a výsledné sekundární bakteriální infekci (McAuley et al. , 2007). Tento protein se nachází na vnit řní a vn ější membrán ě mitochondrií a prost řednictvím nekonven ční cílové sekvence pro mitochondrie v C-terminální oblasti proteinu indukuje apoptózu (Gibbs et al. , 2003). P řítomnost PB1-F2 u mitochondrií zp ůsobuje uvoln ění cytochtomu C, který má za následek apoptózu indukovanou PB1-F2 (Zamarin et al. , 2005). PB1-F2 nebyl nalezen pouze u mitochondrií, ale také v cytoplazm ě a jád ře bu ňky. Zdá se, že PB1-F2 p římo interaguje s virovou PB1 polymerázou. Nedostatek PB1-F2 v pr ůběhu virové infekce m ůže mít za následek zm ěnu lokalizace proteinu PB1 a sníženou polymerázovou aktivitu. Protein PB1-F2 by mohl p ůsobit jako nep římý regulátor činnosti virové polymerázy prost řednictvím jeho interakce s PB1 (Mazur et al. , 2008). Exprese PB1-F2 má ur čitý ú činek na činnost polymerázy, akumulaci proteinu PB1 a replikaci, která je závislá na bun ěč ném typu a virovém kmeni. Narušení čtecího rámce PB1-F2 u sezónního ch řipkového kmene H3N2 neovlivnilo výše uvedené parametry, což nazna čuje, že to pravd ěpodobn ě nejsou univerzální funkce proteinu (McAuley et al. , 2010).

2.7 RNA – dependentní RNA polymeráza

Virová RNA polymeráza je multifunk ční heterotrimer složený z podjednotek PB1, PB2 a PA. Intracelulární transport a sestavení heterotrimerní podjednotky RNA-dependentní RNA polymerázy tvo ří klí čovou sou část reproduk čního cyklu ch řipkového viru. Nedávné výsledky ukazují, že úsp ěšné vytvo ření aktivního polymerázového komplexu je limitujícím faktorem životaschopnosti viru. Bylo zkoumáno vzájemné p ůsobení polymerázových podjednotek a jejich lokalizace v živých bu ňkách. Ukázalo se, že PB1 a PA tvo ří dimer v cytoplazm ě a tento dimer je importován do jádra odd ělen ě (bez PB2). Poté se v jád ře sdruží dimer PB1/PA s PB2 a je vytvo řen trimer RNA-polymerázy. Bylo prokázáno, že mutace v sekvenci PB2 u signálu pro jadernou lokalizaci vede ke snížení p řesunu PB2 do jádra a k abnormální tvorb ě trimerní polymerázy v cytoplazm ě (Huet et al. , 2010).

10 2.7.1 Protein PA

Je kódovaný 3. segmentem RNA a nachází se stejn ě jako PB1 a PB2 v jád ře infikované bu ňky (Webster et al ., 1992).

2.7.2 Protein PB1

Je kódovaný 2. segmentem RNA a lokalizován v jád ře infikované bu ňky. V polymerázovém komplexu je zodpov ědný za elongaci virové mRNA a také za elongaci proteinu z templátové RNA (Webster et al ., 1992).

2.7.3 Protein PB2

Je kódovaný 1. segmentem RNA. Nov ě syntetizovaný protein PB2 migruje do jádra infikovaných bun ěk. Je sou částí proteinového komplexu RNA polymerázy. Podílí se na endonukleolytickém št ěpení a p řisvojení („kradení“) čepi čky z hostitelské mRNA (Webster et al ., 1992). Komplex RNA polymerázy je klí čovým prvkem pro adaptaci v hostiteli. Byla charakterizována činnost pta čího polymerázového komplexu obsahující mutace v konzervativních částech PB2. Bylo zjišt ěno, že u PB2 krom ě mutace E627K zvyšuje činnost polymerázy u lidských bun ěk též mutace T271A. Ukazuje se, že mutace aminokyseliny v pozici 271 v sekvenci PB2 zvyšuje polymerázovou aktivitu a virový r ůst u sav čích hostitel ů (Bussey et al. , 2010).

2.8 Nestrukturní fosfoprotein NS1

Je kódovaný 8. segmentem RNA, nachází se zejména v jád ře infikované bu ňky a hraje roli p ři replikaci viru (Webster et al ., 1992). Bylo prokázáno, že tento protein je schopný fungovat jako antagonista interferonu, a tím napomáhá patogenezi viru. Virová infekce má zna čný význam pro indukci gen ů podílejících se na IFN dráze. Delece genu NS1 p řispívá k vyšší expresi gen ů hostitelské bu ňky souvisejících s IFN, NF-кB a dalších drah podílejících se na obran ě bu ňky proti virové infekci. Je možné, že reakce plicních bun ěk na ch řipkovou infekci je výrazn ě ovlivn ěna sekvencí genu NS1. Ukazuje se, že fosfoprotein NS1 hraje d ůležitou roli v regulaci odpov ědi hostitelských bun ěk na vyvolanou virovou infekcí (Geiss et al. , 2002). Lokalizace NS1 v jadérku sav čích bun ěk u ch řipky typu A vyžaduje p řítomnost signálu pro jadérkovou lokalizaci (NoLS) v C-terminální oblasti. Tento signál je p řítomen pouze u n ěkterých kmen ů vir ů ch řipky, proto dochází k hromad ění NS1 v jadérku jen u jedinců, kte ří

11 byli infikováni virem obsahujícím NoLS. Na druhou stranu bylo prokázáno, že NS1 je nahromad ěný v jadérku pta čích bun ěk i p ři absenci NoLS v C-terminální oblasti u testovaných ch řipkových vir ů. Lokalizace NS1 v jadérku pta čích bun ěk se pravd ěpodobně řídí jiným mechanismem, než je tomu u savc ů (Volmer et al. , 2010).

2.9 Nestrukturní fosfoprotein NS2

Je kódovaný 8. segmentem RNA. Má význam pro export RNA do jádra a hraje roli při replikaci viru stejn ě jako NS1. Hojn ě se vyskytuje v cytoplazm ě infikovaných bun ěk (Webster et al ., 1992). Protein NS2 obsahuje sekvence, které slouží jako jaderný exportní signál (NES) v N-terminální oblasti a je rozhodující pro jaderný export ribonukleového komplexu. Pro jaderný export je nezbytná tvorba exportního komplexu, který je složený z exportního substrátu, bun ěč ného exportního faktoru (CRM1) a proteinu Ran-GTP. Ran je protein vázající GTP, zajiš ťující translokaci RNA a protein ů p řes jaderné póry. Faktor CRM1 je d ůležitý pro proteiny obsahující jaderné exportní signály (NESs) bohaté na leucin. Bylo prokázáno, že protein NS2 interaguje s lidským CRM1 a zárove ň mutace v sekvenci NS2 má za následek znemožn ění tvorby životaschopného virového potomstva. Zdá se, že protein NS2 není rozhodující pro interakci s lidským CRM1, ale pro tvorbu exportního komplexu (Neumann et al. , 2000). Ukazuje se, že protein NS2 má regula ční roli b ěhem virov ě specifické syntézy RNA (Bullido et al. , 2001). Exprese proteinu NS2 ovliv ňuje virovou RNA redukcí akumulace transkrip čních produkt ů a zvýšenou akumulací replika čních produkt ů. Tento efekt je funk čně uchován u viru ch řipky typu A a B a je druhov ě specifický. Protein NS2 m ění množství RNA pomocí specifické zm ěny ve virovém transkrip čním a replika čním mechanismu. Již byla zmín ěna role proteinu NS2 v rámci jaderného exportu virových ribonukleoprotein ů. Delecí NES sekvence nebyla ovlivn ěna schopnost NS2 proteinu regulovat hladinu RNA. Zdá se, že regulace transkripce a replikace ch řipkového viru je nezávislá na funkci tohoto proteinu v rámci exportu nukleoprotein ů (Robb et al. , 2009).

12 3 Reprodukce ch řipkového viru typu A

Pro iniciaci reprodukce ch řipkového viru je nezbytná jeho vazba k hostitelské bu ňce zprost ředkovaná interakcí mezi vazebným místem HA a koncem kyseliny sialové na povrchu bun ěč ného glykoproteinového nebo glykolipidového receptoru. P řichycený virion se procesem receptorov ě zprost ředkované endocytózy p řenese dovnit ř bu ňky ve form ě tzv.endosomu (viz. Obr. 2). Hostitelská bu ňka produkuje v endosomu kyselinu, kv ůli které dochází obvykle k destrukci obsahu endosomu. V tomto p řípad ě ovšem snížené pH aktivuje iontový kanálek viru (M2 protein), který zajiš ťuje rychlejší pronikání iont ů do virionu zp ůsobující rozrušení vazeb mezi proteiny a uvoln ění ribonukleoproteinu od proteinu M1. Zárove ň z d ůvodu nízkému pH dochází ke konforma ční zm ěně HA, která pravd ěpodobn ě usnad ňuje inzerci volného amino- konce HA2 do membrány endosomu. Následuje fúze endosomální a virové membrány, která zajistí uvoln ění ribonukleoproteinu do cytoplasmy bu ňky a m ůže za čít proces infekce (Webster et al. , 1992; Castrucci a Kawaoka, 1995; http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb76_2.ht ml).

Obrázek 2 : „Hemaglutinin v akci“ (http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_ of_the_month/pdb76_2.html). Tři vazebná místa v horní části molekuly se váží na sacharidy na povrchu hostitelské bu ňky. Poté se celý virus přenese dovnit ř bu ňky ve form ě tzv. endosomu. Hostitelská bu ňka produkuje v endosomu kyselinu, zp ůsobující destrukci obsahu endosomu. U viru ch řipky ovšem kyselé prost ředí zp ůsobuje zm ěnu tvaru HA. Oblast, která je ozna čena červen ě, se vyzna čuje silnou afinitou k membrán ě (dochází k inzerci této oblasti do bun ěč né membrány hostitelské bu ňky a následnému uzamknutí viru v bu ňce). V další fázi oblast znázorn ěna žlut ě „p řitáhne“ membrány (virovou a hostitelskou) blíže k sob ě. V záv ěru nová konformace HA zp ůsobí fúzi membrán (mechanismus není zcela znám) a virová RNA se dostává do cytoplazmy hostitelské bu ňky.

13 Při reprodukci ch řipkového viru dochází v jád ře hostitelské bu ňky k primární a sekundární transkripci a k syntéze dvou r ůzných typ ů RNA. Ribonukleoprotein vstupuje díky sekvencím s funkcí signálu pro jadernou lokalizaci přes jaderné póry do jádra infikované bu ňky, kde dochází k primární transkripci genomové (-)RNA. P ři primární transkripci je syntetizována mRNA z genomové (-)RNA ch řipkového viru pomocí RNA-dependentní-RNA polymerázy (O'Neill et al. , 1995). Touto transkripcí jsou produkovány pouze proteiny a virová mRNA, která má na 5´konci „ukradenou čepi čku“ z hostitelské mRNA a na 3´konci polyA. Následnou translací dochází k tvorb ě inicia čních protein ů (Hay a Skehel, 1979). P ři sekundární transkripci dochází k vytvo ření komplementární (+)RNA. Tato RNA slouží jako templát genomu a replikací se vytvo ří (-ss)RNA segmenty potomstva. Tyto molekuly RNA nemají „ukradenou čepi čku“ ani polyA konec. Jakmile je mRNA polyadenylovaná a obsahuje čepi čku, mRNA virového původu, m ůže být exportovaná a translatovaná jako hostitelská mRNA (Skehel a Hay, 1978). Oba typy RNA jsou syntetizovány stejnou transkriptázou, ale produkce nepolyadenylovaného kompletního transkriptu je závislá na syntéze inicia čních protein ů vytvo řených z mRNA (Hay et al. , 1977).

3.1.1 Aktivace polymerázového a transkrip čního komplexu

Pro správný pr ůběh transkripce je velmi d ůležitý mechanismus tzv. „kradení čepi čky“. K transkripci nedochází pokud není p řítomna methylovaná čepi čka (m 7GpppXm) z 5´ konce hostitelské mRNA v komplexu RNA-dependentní-RNA-polymerázy. Methylovaná čepi čka je ve virové polymeráze vázána k podjednotce PB2. „Kradení čepi čky“ zárove ň zajiš ťuje zastavení transkripce a translace hostitelské bu ňky (Bouloy et al. , 1980; Robertson et al. , 1980; Webster et al. , 1992). Pro spušt ění endonukleázové aktivity RNA dependentní RNA polymerázy (RdRp) je nezbytná vazba 5´konce vRNA k RdRp. Tato aktivace je zprost ředkována rozpoznáním specifických bází na 5´ konci vRNA vazebným místem PB1 podjednotky (Li et al. , 1998). Následuje št ěpení hostitelské mRNA v míst ě dinukleotidu CA, mající za následek vznik RNA fragment ů o velikosti 10 - 13 nukleotid ů s koncovými dinukleotidy CA na 3´ konci (= čepi čka), které fungují jako primery pro syntézu virové mRNA (Plotch et al. , 1979; Beaton a Krug, 1981; Li et al. , 2001). Následn ě dochází k vytvo ření vlásenkové smy čky z d ůvodu párování 5´konce a 3´konce vRNA v PB1 podjednotce RdRp. Sou časn ě adenin na 3´konci čepi čky je schopný párovat se s terminálním uracilem na 3´konci vRNA (Duijsings et al. , 2001). Transkripce je zahájena p řidáním guaninu k dinukleotidu CA (vznik CAG) na 3´konci čepi čky RNA primeru vázaného k RdRp. Dochází k rozrušení vazeb mezi 3´a 5´ koncem templátové vRNA a 3´konec

14 je uvoln ěn z podjednotky PB1. Čepi čka, která je sou částí nov ě vznikající mRNA, se b ěhem syntézy uvol ňuje z PB2 vazebného místa (Rao et al. , 2003). Transkripce je p řed časn ě ukon čena polyadenylací a uvoln ěním mRNA (Robertson, 1979).

Primární transkripty jsou p řeloženy do virových protein ů. V rané fázi infekce se překládají zejména NP a NS1 proteiny a zárove ň je blokován p řeklad hostitelské mRNA. Nov ě syntetizované NP a NS1 se p řesouvají do jádra (Hay a Skehel, 1979; Webster et al. , 1992). NP obaluje nov ě syntetizovanou virovou RNA uvnit ř jádra, a tím vytvá ří ribonukleoprotein, který slouží jako templát sekundární transkripci (Webster et al. , 1992; Elton et al. , 1999a; Huang et al. , 2001). V pozdní fázi infekce jsou p řekládány zejména obalové složky virionu NA, HA, M2 a M1 proteiny. HA, NA a M2 proteiny jsou posttranskrip čně zpracovány (p řes drsné endoplazmatické retikulum a Golgiho aparát) a p řepraveny k bun ěč nému povrchu, kde se za člení do bun ěč né membrány hostitelské bu ňky. Export segment ů vRNA z jádra je zprost ředkován sdružením proteinu M1 s virovým ribonukleoproteinem RNP a proteinem NS2 (Hay, 1974; Cros a Palese, 2003; Wu a Pante, 2009). Protein M1 se m ůže k ribonukleoproteinu vázat pouze, pokud je protein M1 obsažen v plné délce a asociace proteinu M1 s ribonukleoproteinem vede k terminaci virové replikace (Baudin et al. , 2001).

3.1.2 Sbalování a pu čení virových částic

Existují dva modely za čle ňování virových RNA segment ů do virionu (selektivní a neselektivní). P ři neselektivním za čle ňování by docházelo k náhodnému kombinování RNA segment ů za čle ňovaných do virionu. Bylo prokázáno, že pro úsp ěšnou tvorbu infek čního virionu je nezbytná p řítomnost osmi rozdílných genomových segment ů, proto je selektivní za čle ňování více efektivní pro tvorbu infek čních virion ů. Významnou úlohu p ři tomto procesu mají jednotlivé signály pro sbalování na genomových segmentech, zajiš ťující správné za člen ění celého genomu do virové partikule (Bancroft a Parslow, 2002; Duhaut a Dimmock, 2002; Fujii et al. , 2003). Ne vždy ovšem dochází ke sbalení všech osmi segment ů a p řesný mechanismus sbalování není zatím zcela objasn ěn. K pu čení ch řipkového virionu dochází na bun ěč né membrán ě hostitelské bu ňky. Virový nukleokapsid se opouzd ří proteinem M1 a zárove ň se zabalí do membrány hostitelské bu ňky, ve které jsou za člen ěny zbývající komponenty ch řipkového viru. Virion je stále vázán k hostitelské bu ňce kv ůli vazb ě HA ke kyselin ě sialové na bun ěč ném povrchu. Tato vazba je v poslední fázi maturace virionu št ěpena neuraminidázou a vznikají viriony, které mohou infikovat zdravé bu ňky organismu (Webster et al. , 1992; Matrosovich et al. , 2004).

15 4 Antigenní zm ěny

Všechny t ři typy ch řipkových vir ů jsou charakteristické schopností antigenní zm ěny zejména povrchových receptor ů hemaglutininu a neuraminidázy za ú čelem uniknout imunitnímu systému hostitele. Tyto zm ěny mohou být zp ůsobeny dv ěma rozdílnými mechanismy (antigenní drift a antigenní shift), jež umož ňují ch řipkovému viru op ětovn ě infikovat jednoho hostitele. Mutace mohou nastat díky nízké p řesnosti RNA-dependentní RNA polymerázy, které chybí 5´- 3´exonukleázová aktivita

4.1 Antigenní drift (antigenní posun)

Je to posunový proces, p ři kterém dochází k drobným zm ěnám (bodovým mutacím) během replikace. Jelikož polymeráza nemá korektorskou aktivitu, dochází zde k hromad ění mutací. Evolu ční selekce a akumulace t ěchto mutací má za následek zm ěnu v hemaglutininu nebo neuraminidáze a protilátky hostitele nejsou schopny je rozpoznat (viz. Obr. 3). Tímto zp ůsobem vznikají b ěžné malé epidemie ch řipky a sezónní typ ch řipky (Zambon, 1999; Potter, 2001; Treanor, 2004).

4.2 Antigenní shift (antigenní zvrat)

Jde o zásadní zm ěnu v genetické informaci vytvá řející nový subtyp ch řipkového viru. Dochází k vým ěně jednoho typu antigenu za jiný. Tato zm ěna je často p říčinou nejen epidemie, ale i pandemie. Antigenní zvrat je typický pro ch řipku typu A (u ch řipky typu B a C tento jev nebyl pozorován). Nový virus m ůže být avirulentní nebo naopak vysoce virulentní. Přirozeným rezervoárem chřipkového viru typu A je divoké vodní ptactvo a byly zde nalezeny všechny podtypy toho viru. Viry jsou ve svých p řirozených rezervoárech tém ěř dokonale adaptované a dochází zde pouze k omezeným zm ěnám AMK. Ch řipka typu A je obvykle nepatogenní u p řirozených hostitel ů (vodní ptactvo) a replikace tohoto viru probíhá v zažívacím traktu zví řat, proto je následný přenos na jiného jedince fekáln ě-orální cestou (Webster et al. , 2007). K antigennímu zvratu m ůže dojít, pokud dva rozdílné ch řipkové viry (nap říklad z různých hostitel ů) infikují jednoho hostitele, kde dojde k přeskupení genomových segment ů těchto vir ů (genetická rekombinace). Jedním z možných hostitelů, který m ůže být infikovaný více ch řipkovými viry je prase. Toto zví ře je schopné p řijmout jak virus pta čí ch řipky, tak virus sav čí ch řipky, jelikož bu ňky dýchacího traktu prasete obsahují receptory pro oba tyto viry. Díky tomu m ůže nap říklad p ůvodn ě pta čí ch řipka nakazit i člov ěka (Zambon, 1999; Potter, 2001; Treanor, 2004).

16 Ch řipkové viry jsou specifické pro ur čité hostitele a není snadný p řenos ch řipkového viru z jednoho živo čišného druhu na jiný díky specifické vazb ě hemaglutininu k receptoru na bun ěč ném povrchu. Antigenní zvrat mající za následek vývoj nového lidského ch řipkového viru typu A vzniká získáním genu kódující hemaglutinin nap říklad od pta čího ch řipkového viru a zajišt ěním p řenosnosti tohoto genu do lidské populace (Naeve et al. , 1984).

Obrázek 3: Zjednodušené schéma antigenní zm ěny ch řipkového viru (http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Antigenic_drift_vs_shift.png)

Nový lidský ch řipkový virus se vytvá ří získáním nového genu kódující hemaglutinin (nap říklad od pta čího ch řipkového viru) a sou časným zajišt ěním p řenosnosti tohoto viru v lidské populaci (viz. Obr. 3). V přírod ě se b ěžn ě nachází 17 r ůzných hemaglutinin ů, z nich ovšem pouze tři (H1 - H3) mohou trvale cirkulovat v lidské populaci. V sou časné dob ě cirkulují v populaci t ři kmeny sezónní ch řipky (H1N1, H1N2, a H3N2) (McCaughey, 2010). Po p řenosu z jednoho hostitele na jiného hostitele (a ť už je to divoké ptactvo, domácí dr ůbež, nebo sav čí hostitel) vykazují ch řipkové viry velmi rychlý vývoj (Ludwig et al. , 1995).

17 5 Ch řipkové onemocn ění

5.1 Klinická manifestace

Ch řipka je akutní virové onemocn ění postihující zejména oblast nosu, krku, pr ůdušek a plic. Toto onemocn ění má tendenci se rychle ší řit v sezónních epidemiích trvajících t ři až p ět týdn ů, pop řípad ě m ůže nastat až pandemie. Sezónní epidemie je charakteristická zvýšenou nemocností a úmrtností v populaci a každoro čním opakováním. Po celém sv ětě mají tyto epidemie každoro čně na sv ědomí 250 000 - 500 000 úmrtí (ve vysp ělých zemích zejména lidé ve v ěku nad 65 let). V oblastech mírného pásma se epidemie vyskytuje zejména během podzimu a zimy. V tropických oblastech dochází k celoro ční cirkulaci tohoto onemocn ění a b ěhem období deš ťů dochází k jedné až dv ěma kulminacím. Infekce je charakteristická náhlým akutním nástupem onemocn ění, hore čkou (38°C a více), kašlem a slabostí. Z dalších symptom ů se projevuje bolest hlavy a sval ů, bolest v krku, obstrukce nosní sliznice nebo ztráta chuti k jídlu. Ne všichni pacienti vykazují výše uvedené symptomy (Govaert et al. , 1998; Monto et al. , 2000; Ebell et al. , 2004; http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html). Tento virus napadá všechny v ěkové skupiny a p říznaky (jak respira ční, tak i systémové) se vyskytují 3-5 dní a inkuba ční doba se pohybuje kolem dvou dn ů. V ětšina lidí se zotaví bez léka řského ošet ření b ěhem 1-2 týdn ů. Ovšem u n ěkterých skupin lidí m ůže vést tato infekce k těžkým komplikacím. Nejb ěžn ější komplikace jsou zápal plic a sekundární bakteriální pneumonie, které mohou mít fatální následky (Couch, 1996; Murray et al. , 2010).

5.2 Patogeneze

Přenos ch řipkové infekce z člov ěka na člov ěka je velmi snadný. Infikované osoby kašláním a kýcháním produkují kapénky, které inhalují lidé v bezprost ředním okolí. Proto dochází k rychlému ší ření virové nákazy zejména na místech, kde se lidé shromaž ďují (jako jsou nap říklad školy). I využívání ve řejné dopravy v období ch řipkové epidemie vede ke zvýšení pravd ěpodobnosti nákazy (Couch, 1996; Troko et al. , 2011; http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html). Během inhalace se mohou n ěkteré virové částice dostat až do dolních cest dýchacích. Primárním místem infekce je ovšem tracheobronchiální v ětvení spolu s nosohltanem. Infekce zp ůsobuje destrukci a deskvamaci (odlupování epitelu) povrchové sliznice. Destrukce epitelu je jeden z faktor ů ur čující závažnost a trvání klinických p říznak ů (Couch, 1996). U vysoce patogenních kmen ů dochází v těle hostitele k produkci interferonu, který zp ůsobuje systémové příznaky nemoci (Moulin et al. , 2011).

18 Díky destrukci epitelu ch řipkovou infekcí m ůže docházet k napadení postiženého jedince bakteriemi zp ůsobující zápal plic. Jedná se zejména o pneumokoky, stafylokoky a G- bakterie (Couch, 1996; van der Sluijs et al. , 2006; Memoli et al. , 2008). Tato komplikace může vést u jedinc ů z rizikových skupin až ke smrti, proto sv ětová zdravotnická organizace doporu čuje o čkování pro tyto jedince. Jedná se zejména o starší osoby (nad 65 let, u kterých vakcinace zmír ňuje komplikace až o 60% a snižuje po čet úmrtí až o 80%), jedince s chronickým onemocn ěním (srdce, ledvin, jater) nebo s oslabeným imunitním systémem, t ěhotné ženy a d ěti ve v ěku od 6 m ěsíc ů po 2 roky. Zárove ň je doporu čeno o čkovat pracovníky ve zdravotnictví a osoby nezbytné pro chod spole čnosti. U zdravých dosp ělých jedinc ů m ůže vakcinace zabránit z 70 – 90 % vzniku ch řipkového onemocn ění (Couch, 1996; http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html).

5.3 Lé čba

Při lé čbě jedinc ů s nekomplikovaným ch řipkovým onemocn ěním se využívá symptomatická terapie, která je zam ěř ena pouze na snížení nebo odstran ění projev ů tohoto onemocn ění. U komplikovaných p řípad ů (jako jsou osoby z rizikových skupin) se využívá lé čba pomocí antivirotik, které mohou zkrátit délku onemocn ění a také snížit klinické projevy. Pro ú činnou terapii je nutné zahájit antivirotickou lé čbu nejpozd ěji 48 hodin od propuknutí prvních projev ů ch řipkového onemocn ění.

V dnešní dob ě existují pro lé čbu tohoto onemocn ění dv ě t řídy antivirotik:

a) blokátory iontového kanálu ch řipkového viru

b) inhibitory ch řipkové neuraminidázy

5.3.1 Blokátory iontového kanálu ch řipkového viru

Do této skupiny látek pat ří látky, jako jsou amantadin a rimantadin, které kvůli blokaci iontového kanálu brání pr ůchodu H + iont ů v proteinu M2 nezbytných pro okyselení vnit řku viru během dekapsidace, a tím zabrá ňují uvoln ění ribonukleoproteinu do cytoplazmy infikované bu ňky (viz. Obr. 4). Tyto látky inhibují reprodukci chřipkového viru typu A a ob ě tyto látky se mohou používat pro prevenci a časnou lé čbu ch řipkového onemocn ění (De Clercq, 2001; http://www.who.int/mediacentre/factsheets/2003/fs211/en/).

19

Obrázek 4: Chemická struktura blokátor ů iontového kanálu ch řipkového viru (De Clercq, 2001)

5.3.2 Inhibitory virové neuraminidázy

Jsou analogy kyseliny sialové a pat ří zde nap říklad zanamivir (Relenza), oseltamivir (Tamiflu) nebo peramivir. Inhibicí virové neuraminidázy blokují uvol ňování nových virion ů z infikované bu ňky (viz. Obr. 5) (De Clercq, 2001; Kohno et al. , 2010; http://www.who.int/mediacentre/factsheets/2003/fs211/en/). Zanamivir snižuje dobu trvání onemocn ění a symptomatické ú činky nemoci a je nejú čin ější p ři podání do 30 hodin od projev ů prvních p říznak ů ch řipky (Monto et al. , 1999). Oseltamivir je ú činný p ři prevenci ch řipkového onemocn ění a zárove ň dosahuje významného antivirového ú činku spolu se snížením klinických projev ů tohoto onemocn ění (Hayden et al. , 1999a; Hayden et al. , 1999b; Treanor et al. , 2000).

Obrázek 5 : Chemická struktura inhibitor ů virové neuraminidázy (De Clercq, 2001)

Jelikož sou časná terapie je nedosta čující z d ůvodu vznikající rezistence na lé čbu antivirotiky, zejména na blokátory ch řipkového iontového kanálu, je snaha najít nová lé čiva

20 (nap říklad polymerázové inhibitory) a studují se možnosti kombinované terapie ch řipkového onemocn ění pro efektivn ější lé čbu. Kombinovaná terapie m ůže snížit riziko vzniku rezistence, zesílit antivirotickou ú činnost a snížit vedlejší ú činky používaných antivirotik. Navíc mohou být tyto látky použity v nižších koncentracích, než p ři použití samostatných látek, a tím se mohou zmírnit nežádoucí ú činky terapie. Nap říklad p ři použití trojkombinace látek oseltamivir, amantadin a ribavirin došlo k synergickému efektu t ěchto látek (Nguyen et al. , 2009). Ovšem p ři použití kombinované terapie je nutná opatrnost, jelikož p ři klinickém výzkumu b ěhem sezónní ch řipky H3N2 bylo ukázáno, že kombinovaná terapie (oseltamivir + zanamivir) nebyla ú činn ější oproti samostatným látkám (Duval et al. , 2010).

6 Pandemie

Ch řipkové pandemie jsou nep ředvídatelné opakující se události (obvykle každých deset až čty řicet let), které mohou mít závažné d ůsledky na lidské zdraví a hospodá řský blahobyt na celém sv ětě. Pandemie je dle WHO rozd ělena do šesti fází s následnými t řemi obdobími po kulminaci pandemie (viz. Tab. 1).

1 Nebyla zaznamenána cirkulace zví řecího ch řipkového viru v žádném zví řeti zp ůsobující infekci u lidí. 2 Zví řecí ch řipkový virus cirkuluje v domácích nebo voln ě žijících zví řatech a je známo, že tento ch řipkový virus zp ůsobil infekci u lidí, a proto je považován za potenciáln ě pandemický. 3 Zví řecí ch řipkový virus nebo lidský-zví řecí ch řipkový rekombinantní kmen zp ůsobil ojedin ělé p řípady nebo malé skupiny lidí s ch řipkovým onemocn ěním, ale nemá za následek přenos z člov ěka na člov ěka dosta čující k udržení úrovn ě ohniska v daném prostoru. 4 Přenos z člov ěka na člov ěka, ze zví řete nebo ch řipkového rekombinantního kmene ( člov ěk-zví ře) je dosta čující pro udržení úrovn ě ohniska v daném prostoru. 5 Stejný ch řipkový virus zp ůsobil trvalý výskyt tohoto onemocn ění ve dvou nebo více zemích v rámci jednoho regionu WHO. 6 Stejný virus zp ůsobuje trvalá ohniska ješt ě nejmén ě v jiné zemi v rámci jiného regionu WHO. Období po Úrove ň ch řipkové pandemie ve v ětšin ě zemí s odpovídajícím dozorem kulminaci (post- klesly pod úrove ň odpovídající kulminaci (bellow peak level). peak period) Nová možná vlna Úrove ň pandemické ch řipkové činnosti op ět roste (ve v ětšin ě zemí s odpovídajícím dozorem). Post-pandemické Úrove ň ch řipkové aktivity se vrátila ve v ětšin ě zemí s odpovídajícím období dozorem na stupe ň sezónního ch řipkového onemocn ění. Tabulka 1 : Jednotlivé fáze pandemie (WHO, 2009)

21

K ch řipkové pandemii dochází, pokud zví řecí ch řipkový virus, na který nemá v ětšina lidí imunitní odpov ěď , získá schopnost trvalého p řenosu z člov ěka na člov ěka mající za následek vznik ohniska nákazy. Takový virus má potenciál pro rozší ření se do celého světa, což vede ke vzniku pandemie. Ch řipková pandemie m ůže na genetické úrovni vzniknou: a) přeskupením – smíchání gen ů lidské a zví řecí ch řipky vytvá řející reasortant viru (člov ěk-zví ře) b) mutací – proces, p ři kterém zm ěna v genu ch řipkového viru umožní infikovat člov ěka a snadný p řenos v lidské populaci (WHO, 2009).

6.1 Historický pohled na nejvýznamn ější pandemie ch řipky typu A

6.1.1 „Špan ělská ch řipka“ H1N1 z roku 1918

Tato pandemie probíhala b ěhem první sv ětové války, která významn ě napomohla ší ření tohoto virového onemocn ění. Poprvé se toto onemocn ění objevilo ve Spojených státech amerických, z d ůvodu rozmíst ění amerických voják ů v Evrop ě b ěhem první sv ětové války došlo k rychlému rozší ření nákazy a vzniku ohnisek nejen v Americe, ale i v Evrop ě a pravd ěpodobn ě i v Asii. Ch řipková infekce je nazývána špan ělskou, jelikož se ve Špan ělsku o této nemoci psalo v hojné mí ře v tisku, zejména po onemocn ění špan ělského krále. Tento ch řipkový subtyp zp ůsobil akutní onemocn ění u 25 - 30% sv ětové populace a infikoval p ředevším mladou část sv ětové populace. Onemocn ění se projevilo ve t řech vlnách. První vlna (tzv. jarní) za čala v březnu 1918, kdy docházelo k celosv ětovému ší ření ch řipkové infekce. Tato vlna byla charakteristická vysokou nemocností, ale „pr ůměrnou“ úmrtností. Druhá vlna probíhala na podzim 1918 (zá ří až listopad) a byla fatální, jelikož v této vln ě došlo k vysoké úmrtnosti. T řetí vlna ude řila v zim ě na po čátku roku 1919, kdy bylo postiženo tímto onemocn ěním p řibližn ě 30 % sv ětové populace. Odhaduje se, že na ch řipkovou nákazu zem řelo 20 - 50 milion ů lidí. Velké procento úmrtí bylo zp ůsobeno sekundární bakteriální pneumonií kv ůli nedostatku antibiotik. Pr ůběh tohoto onemocn ění byl často mén ě než p ět dní a projevoval se silnou imunitní reakcí hostitele (Webster, 1999; Taubenberger et al. , 2001; Taubenberger a Morens, 2006). V dob ě, kdy pandemie propukla, nebyly metody molekulární biologie na takové úrovni, aby se o tomto ch řipkovém kmeni zjistilo více informací. Až pozd ěji Jeffery Taubenberger a jeho kolegové z Ústavu molekulární patologie ve Spojených státech amerických izolovali fragmenty virové genomové RNA a ur čili sekvence jednotlivých RNA segment ů. To vedlo k myšlence, že tato pandemie mohla být pta čího p ůvodu (Taubenberger et al. , 1997).

22 Fylogenetická analýza všech osmi segment ů, zejména segmentu kódujícího protein PB1, ch řipkového kmene H1N1 z roku 1918 p ři srovnání s jinými již prostudovanými kmeny nazna čuje, že tento pandemický kmen vznikl z prase čího kmene H1N1, který mohl být odvozen z pta čího p ředch ůdce z minulosti (Smith et al. , 2009; Anhlan et al. , 2011).

6.1.2 „Asijská ch řipka“ H2N2 z roku 1957

Poprvé se objevila v čínské provincii Kuej-čou v únoru 1957 a b ěhem b řezna stejného roku došlo k rozší ření do dalších provincií. V červnu až červenci byl zaznamenán výskyt ve Spojených státech amerických a Velké Británii. Pandemie kulminovala na podzim roku 1957 a na za čátku roku 1958 nahradil kmen H2N2 dosavadní ch řipkový kmen H1N1. Touto infekcí byly ve více než 50 % postiženy d ěti (5-19 let) a odhaduje se, že na tuto nákazu zem řely přibližn ě 4 miliony lidí (Chang et al. , 2006). Ohrožení byli zejména jedinci s nemocí srdce nebo plic a oproti p ředchozí pandemii (H1N1) nedocházelo tak často k úmrtím zp ůsobených následnou bakteriální infekcí (Louria et al. , 1959). U tohoto kmene byl nahrazen lidský hemaglutinin H1 novým pta čím hemaglutininem H2. Genetická analýza navíc odhalila získání segmentu RNA kódující protein PB1 a NA z voln ě žijícího vodního ptactva (Kawaoka et al. , 1989; Webster et al. , 1992).

6.1.3 Ch řipka „Hong Kong“ H3N2 z roku 1968

Poprvé byl izolován v Hong Kongu v červenci roku 1968. Ší ření tohoto virového onemocn ění prob ěhlo ve dvou vlnách. První vlna nastala roku 1968 zejména v Severní Americe. Byla pozorována snížená závažnost ch řipkového onemocn ění, která byla pravd ěpodobn ě zp ůsobena vyskytujícími se protilátkami proti N2 (z p ředchozí pandemie H2N2), pouze u HA a PB1 došlo k antigennímu zvratu. Genomové segmenty kódující proteiny HA a PB1 jsou pta čího p ůvodu a zbylých šest segment ů je odvozeno od lidských ch řipkových vir ů. Druhá vlna tohoto onemocn ění postihla hlavn ě Evropu a Asii na p řelomu let 1969/1970, kde došlo k vyšší úmrtnosti zp ůsobené pravd ěpodobn ě v ětší odolností NA v ůč i imunitnímu systému infikovaného jedince v kombinaci s genetickým posunem (driftem) NA. V Severní Americe byla zaznamenána většina úmrtí v první vln ě této pandemie (Spojené státy americké 70 %, Kanada 54 % z celkového po čtu ob ětí). V Evrop ě a Asii tomu bylo naopak – ve druhé vln ě došlo k 70 % úmrtí z celkového po čtu ob ětí. Odhaduje se, že p ři této pandemii zem řelo celkov ě kolem dvou milion ů lidí (Viboud et al. , 2005; Chang et al. , 2006).

23 6.1.4 „Pta čí ch řipka“ H5N1 (možný budoucí pandemický kmen)

Zpravidla pta čí kmeny nejsou p řenosné na člov ěka, ale existují samoz řejm ě výjimky, jako je nap říklad kmen H5N1. P ři infekci dr ůbeže nebo člov ěka je tento kmen vysoce patogenní. První p řenos ch řipkové infekce H5N1 z pták ů p římo na člov ěka se objevil v roce 1997 v Hong Kongu. Poté se tento kmen znovu vyskytl v roce 2003 a 2004 op ět v Hong Kongu. V séru infikovaných jedinc ů byla nalezena vysoká koncentrace chemokin ů indukovaných interferonem. Bylo dokázáno, že H5N1 vyvolává tvorbu velkého množství prozán ětlivých cytokin ů a cytokinová dysfunkce významn ě p řispívá k patogenezi tohoto onemocn ění (Claas et al. , 1998). U v ětšina p řípad ů infekce H5N1 u člov ěka byl prokázán p římý nebo nep římý kontakt s infikovanou dr ůbeží (jak živou, tak mrtvou). P ři ší ření infekce z divokého ptactva na dr ůbež, jsou u dr ůbeže pozorovatelné zjevné p říznaky onemocn ění. Ohniska infikované dr ůbeže závažn ě ovlivnila ekonomiku v postižených zemích. Eliminace zdroje infekce je d ůležitým krokem pro snížení rizika výskytu onemocn ění u člov ěka (Buxton Bridges et al. , 2000).

6.1.4.1 Klinické projevy a lé čba

U mnoha pacient ů byl pozorovaný neobvykle agresivní klinický pr ůběh onemocn ění s rychlým zhoršením a vysokou úmrtností. Tato infekce je spojena se závažnými komplikacemi, jako je zápal plic, trávicí obtíže, zvýšená hladina jaterních enzym ů a u n ěkterých osob m ůže dojít až k selhání ledvin. Inkuba ční doba bývá oproti b ěžné sezónní ch řipce delší (2 až 8 dní, v extrémních p řípadech i 17 dní) (Yuen et al. , 1998) Z důvodu významné mortality p ři infekci tímto kmenem a sou časné prodloužené replikaci viru se pro lé čbu využívá zejména oseltamivir, jenž m ůže zkrátit dobu replikace viru, a tím zlepšit vyhlídky na p řežití u infikovaného jedince. P ři lé čbě jedince s těžkými gastrointestinálními p říznaky je nutné zohlednit, že m ůže být narušena absorpce léku (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/avian_influenza/en/index.html).

6.1.4.2 Pandemický potenciál Neustálá cirkulace a existující ohniska ch řipkové infekce H5N1 je závažným problém, jelikož je zde potenciál pro vyvolání pandemie kv ůli možnosti zm ěny formy p řenosu – z člov ěka na člov ěka. Již byl epidemiologicky potvrzen p řenos pta čí ch řipky H5N1 z člov ěka na člov ěka (pouze vzácn ě), což zvyšuje šance na vznik nové ch řipky s pandemickým potenciálem (Buxton Bridges et al. , 2000). Proto, aby ch řipkový kmen mohl stát pandemickým, musí spl ňovat tyto t ři faktory: 1) musí se jednat o nový podtyp ch řipkového viru – imunitní systém člov ěka se s tímto kmenem ješt ě nesetkal (H5N1 spl ňuje) 24 2) infekce člov ěka (H5N1 splňuje) 3) snadné ší ření v lidské populaci (H5N1 zatím nespl ňuje) Existují dva mechanismy, pomocí nichž by mohlo dojít ke zlepšení p řenosu tohoto ch řipkového kmene z člov ěka na člov ěka. Pta čí ch řipkový genom se b ěhem infekce člov ěka nebo prasete p řeskupí. V tomto p řípad ě by došlo k expanzivnímu rozší ření tohoto onemocn ění. Nebo m ůže nastat proces postupné adaptivní mutace. Tento proces nemá za následek rychlé ší ření infekce a dává čas na obranná opat ření (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/avian_influenza/en/index.html; http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/avian_faqs/en/index.html#doeshuman).

6.1.5 „Prase čí ch řipka“ H1N1 z roku 2009

6.1.5.1 Epidemiologie

První p řípad tohoto ch řipkového onemocn ění byl zaznamenán v Mexiku ve vesnici Vera Cruz, následn ě byly nalezeny p řípady v Kalifornii (dv ě d ěti), které již musely být hospitalizovány (CDC, 2009b; CDC, 2009a; Girard et al. , 2010). Tento ch řipkový virus se velmi snadno ší řil, a to p řenosem z člov ěka na člov ěka, a kv ůli moderní doprav ě se brzy rozší řil po celém sv ětě. V mírném pásmu docházelo k ší ření infekce pozvolna oproti rychlosti ší ření v tropech. Vzhledem k po čtu zemí, v nichž byly potvrzeny p řípady lidí s tímto onemocn ěním, prohlásila WHO 11. června 2009 tento kmen za pandemický. Pro tuto pandemii bylo charakteristické, že postihovala zejména mladší v ěkovou skupinu lidí (d ěti, mladí dosp ělí) – 60 % jedinc ů, u kterých byla prokázána tato infekce byli lidé mladší 18 let a pouze 2 % p řípad ů byli vyššího věku (nad 65 let) (Girard et al. , 2010; McCaughey, 2010). Z důvodu toho, že byla postihnuta zejména mladší generace, za čalo se zkoumat, z jaké příčiny nedocházelo k většímu rozsahu nákazy u starší populace. Ukázalo se, že lidé narozeni před rokem 1950 m ěli ve svém séru vysoké titry protilátek. Jednalo se o jedince, kte ří byli očkováni nebo prod ělali infekci ch řipky typu A H1N1 prase čího p ůvodu v roce 1876 (Jersey). Z d ůvodu zk řížené reaktivity protilátek byli tito jedinci „chrán ěni“ proti novému kmeni ch řipky typu A (Hancock et al. , 2009). Onemocn ění m ělo často asymptomatický pr ůběh, ale u d ětí mladších p ěti letech docházelo k vyšší mí ře závažnosti vedoucí často k hospitalizaci. Jako rizikové faktory byly ozna čeny zejména obezita, t ěhotenství a v ohrožení se ocitly osoby se srde čním či plicním onemocn ěním (Girard et al. , 2010; McCaughey, 2010).

25 Inkuba ční doba se pohybovala v rozmezí dvou až sedmi dní a v ětšina lidí infikovaných tímto virem ší řila toto onemocn ění den p řed nástupem symptom ů tohoto onemocn ění (De Serres et al. , 2010). Dosud bylo potvrzeno více než 16 000 úmrtí. Tyto p řípady byly ovšem pouze ze zemí s dostate čným laboratorním zázemím. Ve srovnání s jinými pandemiemi je po čet úmrtí siln ě podhodnocen, díky nov ě zvolenému postupu potvrzující výskyt ch řipkového onemocn ění (http://www.who.int/csr/disease/swineflu/frequently_asked_questions/about_disease/en/).

6.1.5.2 Charakteristika kmene H1N1 2009

Jedná se o nový kmen ch řipkového viru, který do této doby nebyl detekován v lidech ani zví řatech (CDC, 2009a; CDC, 2009b). Sekven ční analýzou nebyla zjišt ěna p řítomnost marker ů spojených s vysokou patogenitou pta čích nebo sav čích ch řipkových vir ů. Byla objevena mutace v genu pro HA v pozici 222, která ovšem nezm ěnila antigenitu ani citlivost na antivirotika. U tohoto kmene se vyskytla sporadická rezistence na oseltamivir (tamiflu). Ta byla zp ůsobena zám ěnou jedné aminokyseliny (H275Y) v aktivním míst ě pro NA. Zárove ň je tato linie zcela odolávala lé čbě pomocí amantadinu a rimantadinu kv ůli mutaci v proteinu M2 (S31N). Vznikající rezistence k léčbě jsou rizikové zejména pro imunokompromitované jedince (Girard et al. , 2010).

6.1.5.3 Původ nákazy, fylogeneze

Tento kmen ch řipky byl antigenn ě odlišný od lidských ch řipkových vir ů a geneticky byl podobný vir ům cirkulujícím u prasat. Z toho d ůvodu je toto ch řipkové onemocn ění často ozna čované jako tzv. „prase čí ch řipka“. Bylo prokázáno, že genom tohoto viru vznikl přeskupením t ří endemicky se vyskytujících ch řipkových vir ů, které již n ějakou dobu cirkulovaly v prasatech. Jedná se o tyto t ři linie: a) Severoamerický H3N2 trojnásobn ě rekombinantní kmen – nese geny pandemických lidských (HA, NA, PB1), prase čích (M, NS, NP) a pta čích kmen ů (PA, PB2) b) klasická H1N1 linie – stabilní prase čí ch řipkový virus c) Euroasijský prase čí H1N1 virus z pta čího zdroje – stabilní prase čí ch řipkový kmen, který vytla čuje klasickou H1N1 linii Při p řeskupování segment ů vznikl kmen H1N1 2009, který obsahuje NA a M z euroasijského kmene, HA, NP a NS z klasického prase čího kmene a PB1, PB2 a PA ze Severoamerického kmene (viz. Obr. 6) (Garten et al. , 2009).

26

Obrázek 6: Fylogenetický p ůvod segment ů ch řipkového kmene 2009 A(H1N1) (Garten et al. , 2009)

V asijské populaci prasat stále kolují spole čně kmeny H3N2 trojnásobn ě rekombinantní kmen, H1N2 rekombinantní kmen, klasický H1N1 kmen a euroasijský prase čí H1N1 virus. Tato ko-cirkulace má velký potenciál pro p řeskupení genomových segment ů mající zna čný vliv na antigenní vývoj (Ghedin et al. , 2009; Girard et al. , 2010).

7 Diagnostika ch řipkové infekce

Většina pacient ů s klinicky nekomplikovaným ch řipkovým onemocn ěním nevyžadují přesné diagnostické ur čení ch řipkového viru. Proto se diagnostické testy provád ějí zejména u:

- hospitalizovaných pacient ů s podez řením na ch řipkové onemocn ění - pacient ů, kte ří zem řeli na akutní onemocn ění a bylo u nich podez ření na ch řipkové onemocn ění - u jedinc ů, u kterých diagnostika ch řipky rozhoduje o klinické pé či

Jednotlivé diagnostické testy se mezi sebou liší v citlivosti a specifi čnosti pro detekci ch řipkových vir ů, v komer ční dostupnosti, času pot řebnému pro zpracování vzorků, nebo schopností rozlišovat mezi jednotlivými ch řipkovými typy a subtypy. V praxi se b ěžn ě využívají tři skupiny r ůzných metod - jedná se o metody založené na detekci antigenu (ELISA – rychlé diagnostické testy a p římé imunofluorescen ční testy), izolaci viru (kultivace v tká ňových

27 kulturách) a detekci nukleové kyseliny (amplifikace nukleových kyselin v četn ě rRT-PCR) (viz. Tab. 2) (http://www.cdc.gov/h1n1flu/guidance/diagnostic_tests.htm). Při srovnání t ěchto t ří metod bylo zjišt ěno, že citlivost PCR byla oproti metod ě ELISA 10 6 - 10 7 vyšší a oproti izolaci viru 10 3 vyšší. Díky moderním molekulárním metodám byla pro identifikaci ch řipkového onemocn ění poprvé v roce 2009 použita reverzní PCR v reálném čase (rRT-PCR). U metody ELISA se se stoupajícím v ěkem testovaného jedince zvyšuje pravd ěpodobnost negativních výsledk ů, proto je ELISA rychlá a spolehlivá diagnostická metoda zejména u kojenc ů a malých d ětí. U starších pacient ů je vhodné zvolit metodu PCR nebo izolaci viru pro vyvarování se v ětšího množství falešn ě negativních výsledk ů, jelikož izolace viru a PCR není ovlivn ěna v ěkem zkoumaného jedince. U metody ELISA negativní výsledek ješt ě neznamená, že testovaný jedinec není infikovaný ch řipkou z d ůvodu zvýšené pravd ěpodobnosti falešn ě negativního výsledku. Testy založené na detekci antigenu navíc nerozlišují jednotlivé podtypy ch řipky typu A. Pokud je u pacienta nutné znát p řesný podtyp ch řipky, je vhodné použít reverzní PCR v reálném čase nebo izolovat virus tká ňové kultury (Steininger et al. , 2002).

Pot řebný čas Citlivost Rozlišení H1N1 Diagnostický test Metoda Dostupnost pro zpracování (k H1N1 (2009) od jiných materiálu 2009) ch řipkových vir ů Přímý diagnostický Detekce Široká 0,5 hodiny 10 - 70% Ne test antigen ů Přímé a nep římé Detekce imunofluorescen ční Široká 2 - 4 hodiny 47 - 93% Ne antigen ů testy Izolace vir ů Izolace Omezená 2 - 10 dní - Ano z tká ňových kultur viru Amplifikace 86 - Detekce nukleových kyselin Omezená 48 - 96 hodin Ano RNA 100% včetn ě rRT-PCR Tabulka 2: Srovnání dostupných diagnostických test ů pro ch řipku typu A (http://www.cdc.gov/h1n1flu/guidance/diagnostic_tests.htm)

Pro testování p řítomnosti ch řipkových vir ů se jako vhodný materiál využívá: - výt ěr z nosohltanu - nosní výplach - endotracheální výplach - bronchoalveolární laváž - kombinování výt ěru z nosu nebo nosohltanu s orofaryngeálním výt ěrem Použitím kombinace výt ěru z nosu a krku s nasofaryngeálním výplachem bylo docíleno významného zvýšení citlivosti p ři detekci ch řipkových vir ů použitím rRT-PCR. Materiál

28 od testovaných jedinc ů je vhodné uchovávat p ři 4 °C. P řed testováním by vzorek nem ěl být uchován ve 4 °C déle než 72 hodin.V ideálním p řípad ě by m ělo testování prob ěhnout do 24 hodin od odebrání materiálu. Pro delší skladování se vzorky ukládají do -70 °C (ovšem již při -20°C se snižuje pravd ěpodobnost detekce viru) (de la Tabla et al. , 2010; http://www.cdc.gov/h1n1flu/guidance/diagnostic_tests.htm).

29 Záv ěr

Ch řipkové onemocn ění postihuje všechny v ěkové skupiny lidí a je charakteristické náhlým akutním nástupem a projevuje se zejména horečkou, kašlem a celkovou slabostí. U n ěkterých jedinc ů mohou b ěhem tohoto onemocn ění nastat komplikace nap říklad v podob ě zápalu plic. V těchto p řípadech se využívá antivirotická lé čba a je vhodné znát podtyp ch řipkového viru, který jsme schopni zjistit pomocí reverzní polymerázové řet ězové reakce v reálném čase. Jako materiál pro tuto analýzu se doporu čuje použít kombinace výt ěru z nosu a krku s nasofaryngeálním výplachem. Z důvodu vznikajících rezistencí na lé čbu se momentáln ě zvažují možnosti kombinované terapie. Ch řipková infekce p ředstavuje závažný celosv ětový problém. V minulosti prob ěhlo několik pandemií s katastrofickými následky, proto se zna čná část výzkumu zam ěř uje na p ředpov ěď možných pandemií. V sou časné dob ě se pandemie zatím nedají ú činn ě p ředvídat, z tohoto d ůvodu je nezbytné pochopení veškerých mechanism ů zp ůsobující antigenní zm ěnu ch řipkového viru. P řestože tato práce je primárn ě zam ěř ená na ch řipkové onemocn ění lidí, je třeba zd ůraznit významnou roli zví řecích hostitel ů a mezihostitel ů v etiologii a epidemiologii tohoto onemocn ění.

30

Seznam použitých zkratek

AMK – amino acid (aminokyselina); A – alanin; E – kyselina glutamová; K – lysin; N – asparagin; S – serin; T – threonin C1qA – complement C1q subcomponent subunit A (protein komplementového komplexu) CRM1 – chromosome region maintenance 1 (jaderný exportin) ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay (enzymová analýza s enzymem vázaným na imunosorbent HA (HA1, HA2) – hemagglutinin (hemaglutinin) INF – interferon (interferon) M1 – matrix protein (matrixový protein) M2 – membrane protein (membránový protein) NA – neuraminidase (neuraminidáza) NES – nuclear export sequence (jaderný exportní signál) NF-κB – nuclear factor κB (jaderný faktor κB) NLS (NLS1, NLS2) – nuclear localization signal ( signál pro jadernou lokalizaci) NoLS – nucleolar localization signal (signál pro jadérkovou lokalizaci) NP – nucleocapsid protein (nukleoprotein) NS (NS1, NS2) – non-structural protein (nestrukturní fosfoprotein) PA – RNA polymerase complex protein (podjednotka virové RNA – dependentní RNA polymerázy) PB1 – RNA polymerase complex protein (podjednotka virové RNA – dependentní RNA polymerázy) PB1-F2 – RNA polymerase complex protein (podjednotka virové RNA – dependentní RNA polymerázy) PB2 – RNA polymerase complex protein (podjednotka virové RNA – dependentní RNA polymerázy) Ran – Ras – related nuclear protein (jaderný protein podobný Ras) GTP – guanosine triphosphate (guanosintrifosfát) RdRp – RNA-dependent RNA polymerase (RNA – dependentní RNA polymeráza) RNA – ribonucleic acid ( ribonukleová kyselina) mRNA – messenger ribonucleic acid (mediátorová ribonukleová kyselina) (-ss)RNA – single-stranded ribonucleic acid (negativní jedno řet ězcová ribonukleová kyselina) 31 vRNA – viral ribonucleic acid (virová ribonukleová kyselina) RNP – ribonucleoprotein (ribonukleoproteinový komplex) rRT-PCR – reverse real time polymerase chain reaction (reverzní /zp ětná/ polymerázová řet ězová reakce v reálném čase) WHO – world health organization (sv ětová zdravotnická organizace)

32 Seznam použité literatury

Anhlan, D., Grundmann, N., Makalowski, W., Ludwig, S., Scholtissek, C. 2011. Origin of the 1918 pandemic H1N1 influenza A virus as studied by codon usage patterns and phylogenetic analysis. Rna. 17 (1): 64-73.

Bancroft, C.T., Parslow, T.G. 2002. Evidence for segment-nonspecific packaging of the influenza a virus genome. J Virol. 76 (14): 7133-9.

Baudin, F., Petit, I., Weissenhorn, W., Ruigrok, R.W. 2001. In vitro dissection of the membrane and RNP binding activities of influenza virus M1 protein. Virology. 281 (1): 102-8.

Beaton, A.R., Krug, R.M. 1981. Selected host cell capped RNA fragments prime influenza viral RNA transcription in vivo. Nucleic Acids Res. 9 (17): 4423-36.

Bouloy, M., Plotch, S.J., Krug, R.M. 1980. Both the 7-methyl and the 2'-O-methyl groups in the cap of mRNA strongly influence its ability to act as primer for influenza virus RNA transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7): 3952-6.

Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. 1996. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. J Virol. 70 (12): 8391-401.

Bullido, R., Gomez-Puertas, P., Saiz, M.J., Portela, A. 2001. Influenza A virus NEP (NS2 protein) downregulates RNA synthesis of model template RNAs. J Virol. 75 (10): 4912-7.

Bussey, K.A., Bousse, T.L., Desmet, E.A., Kim, B., Takimoto, T. 2010. PB2 residue 271 plays a key role in enhanced polymerase activity of influenza A viruses in mammalian host cells. J Virol. 84 (9): 4395-406.

Buxton Bridges, C., Katz, J.M., Seto, W.H., Chan, P.K., Tsang, D., Ho, W., Mak, K.H., Lim, W., Tam, J.S., Clarke, M., Williams, S.G., Mounts, A.W., Bresee, J.S., Conn, L.A., Rowe, T., Hu-Primmer, J., Abernathy, R.A., Lu, X., Cox, N.J., Fukuda, K. 2000. Risk of influenza A (H5N1) infection among health care workers exposed to patients with influenza A (H5N1), Hong Kong. J Infect Dis. 181 (1): 344-8.

Castrucci, M.R., Kawaoka, Y. 1995. Reverse genetics system for generation of an influenza A virus mutant containing a deletion of the carboxyl-terminal residue of M2 protein. J Virol. 69 (5): 2725-8.

CDC 2009a. Outbreak of swine-origin influenza A (H1N1) virus infection - Mexico, March- April 2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 58 (17): 467-70.

CDC 2009b. Swine influenza A (H1N1) infection in two children--Southern California, March- April 2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 58 (15): 400-2.

Claas, E.C., Osterhaus, A.D., van Beek, R., De Jong, J.C., Rimmelzwaan, G.F., Senne, D.A., Krauss, S., Shortridge, K.F., Webster, R.G. 1998. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet. 351 (9101): 472-7.

Couch, R.B. (1996) Orthomyxoviruses, chapter 58. Medical Microbiology, 4th edition, University of Texas Medical Branch at Galveston, Galveston.

33

Cros, J.F., Palese, P. 2003. Trafficking of viral genomic RNA into and out of the nucleus: influenza, Thogoto and Borna disease viruses. Virus Res. 95 (1-2): 3-12.

De Clercq, E. 2001. Antiviral drugs: current state of the art. J Clin Virol. 22 (1): 73-89. de la Tabla, V.O., Masia, M., Antequera, P., Martin, C., Gazquez, G., Bunuel, F., Gutierrez, F. 2010. Comparison of combined nose-throat swabs with nasopharyngeal aspirates for detection of pandemic influenza A/H1N1 2009 virus by real-time reverse transcriptase PCR. J Clin Microbiol. 48 (10): 3492-5.

De Serres, G., Rouleau, I., Hamelin, M.E., Quach, C., Skowronski, D., Flamand, L., Boulianne, N., Li, Y., Carbonneau, J., Bourgault, A., Couillard, M., Charest, H., Boivin, G. 2010. Contagious period for pandemic (H1N1) 2009. Emerg Infect Dis. 16 (5): 783-8.

Digard, P., Elton, D., Bishop, K., Medcalf, E., Weeds, A., Pope, B. 1999. Modulation of nuclear localization of the influenza virus nucleoprotein through interaction with actin filaments. J Virol. 73 (3): 2222-31.

Duhaut, S.D., Dimmock, N.J. 2002. Defective segment 1 RNAs that interfere with production of infectious influenza A virus require at least 150 nucleotides of 5' sequence: evidence from a plasmid-driven system. J Gen Virol. 83 (Pt 2): 403-11.

Duijsings, D., Kormelink, R., Goldbach, R. 2001. In vivo analysis of the TSWV cap-snatching mechanism: single base complementarity and primer length requirements. Embo J. 20 (10): 2545- 52.

Duval, X., van der Werf, S., Blanchon, T., Mosnier, A., Bouscambert-Duchamp, M., Tibi, A., Enouf, V., Charlois-Ou, C., Vincent, C., Andreoletti, L., Tubach, F., Lina, B., Mentre, F., Leport, C. 2010. Efficacy of oseltamivir-zanamivir combination compared to each monotherapy for seasonal influenza: a randomized placebo-controlled trial. PLoS Med. 7(11): e1000362.

Ebell, M.H., White, L.L., Casault, T. 2004. A systematic review of the history and physical examination to diagnose influenza. J Am Board Fam Pract. 17 (1): 1-5.

Elton, D., Medcalf, E., Bishop, K., Digard, P. 1999a. Oligomerization of the influenza virus nucleoprotein: identification of positive and negative sequence elements. Virology. 260 (1): 190- 200.

Elton, D., Medcalf, L., Bishop, K., Harrison, D., Digard, P. 1999b. Identification of amino acid residues of influenza virus nucleoprotein essential for RNA binding. J Virol. 73 (9): 7357- 67.

Fouchier, R.A., Munster, V., Wallensten, A., Bestebroer, T.M., Herfst, S., Smith, D., Rimmelzwaan, G.F., Olsen, B., Osterhaus, A.D. 2005. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 79 (5): 2814-22.

Fujii, Y., Goto, H., Watanabe, T., Yoshida, T., Kawaoka, Y. 2003. Selective incorporation of influenza virus RNA segments into virions. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4): 2002-7.

34 Furuse, Y., Suzuki, A., Kamigaki, T., Oshitani, H. 2009. Evolution of the M gene of the influenza A virus in different host species: large-scale sequence analysis. Virol J. 6: 67.

Garten, R.J., Davis, C.T., Russell, C.A., Shu, B., Lindstrom, S., Balish, A., Sessions, W.M., Xu, X., Skepner, E., Deyde, V., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L., Barnes, J., Smith, C.B., Emery, S.L., Hillman, M.J., Rivailler, P., Smagala, J., de Graaf, M., Burke, D.F., Fouchier, R.A., Pappas, C., Alpuche-Aranda, C.M., Lopez-Gatell, H., Olivera, H., Lopez, I., Myers, C.A., Faix, D., Blair, P.J., Yu, C., Keene, K.M., Dotson, P.D., Jr., Boxrud, D., Sambol, A.R., Abid, S.H., St George, K., Bannerman, T., Moore, A.L., Stringer, D.J., Blevins, P., Demmler-Harrison, G.J., Ginsberg, M., Kriner, P., Waterman, S., Smole, S., Guevara, H.F., Belongia, E.A., Clark, P.A., Beatrice, S.T., Donis, R., Katz, J., Finelli, L., Bridges, C.B., Shaw, M., Jernigan, D.B., Uyeki, T.M., Smith, D.J., Klimov, A.I., Cox, N.J. 2009. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science. 325 (5937): 197-201.

Geiss, G.K., Salvatore, M., Tumpey, T.M., Carter, V.S., Wang, X., Basler, C.F., Taubenberger, J.K., Bumgarner, R.E., Palese, P., Katze, M.G., Garcia-Sastre, A. 2002. Cellular transcriptional profiling in influenza A virus-infected lung epithelial cells: the role of the nonstructural NS1 protein in the evasion of the host innate defense and its potential contribution to pandemic influenza. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (16): 10736-41.

Ghedin, E., Fitch, A., Boyne, A., Griesemer, S., DePasse, J., Bera, J., Zhang, X., Halpin, R.A., Smit, M., Jennings, L., St George, K., Holmes, E.C., Spiro, D.J. 2009. Mixed infection and the genesis of influenza virus diversity. J Virol. 83 (17): 8832-41.

Gibbs, J.S., Malide, D., Hornung, F., Bennink, J.R., Yewdell, J.W. 2003. The influenza A virus PB1-F2 protein targets the inner mitochondrial membrane via a predicted basic amphipathic helix that disrupts mitochondrial function. J Virol. 77 (13): 7214-24.

Girard, M.P., Tam, J.S., Assossou, O.M., Kieny, M.P. 2010. The 2009 A (H1N1) influenza virus pandemic: A review. Vaccine. 28 (31): 4895-902.

Govaert, T.M., Dinant, G.J., Aretz, K., Knottnerus, J.A. 1998. The predictive value of influenza symptomatology in elderly people. Fam Pract. 15 (1): 16-22.

Hancock, K., Veguilla, V., Lu, X., Zhong, W., Butler, E.N., Sun, H., Liu, F., Dong, L., DeVos, J.R., Gargiullo, P.M., Brammer, T.L., Cox, N.J., Tumpey, T.M., Katz, J.M. 2009. Cross-reactive antibody responses to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus. N Engl J Med. 361 (20): 1945-52.

Hay, A.J. 1974. Studies on the formation of the influenza virus envelope. Virology. 60 (2): 398- 418.

Hay, A.J., Lomniczi, B., Bellamy, A.R., Skehel, J.J. 1977. Transcription of the influenza virus genome. Virology. 83 (2): 337-55.

Hay, A.J., Skehel, J.J. 1979. Influenza virus transcription. Br Med Bull. 35 (1): 47-50.

Hayden, F.G., Atmar, R.L., Schilling, M., Johnson, C., Poretz, D., Paar, D., Huson, L., Ward, P., Mills, R.G. 1999a. Use of the selective oral neuraminidase inhibitor oseltamivir to prevent influenza. N Engl J Med. 341 (18): 1336-43.

35

Hayden, F.G., Treanor, J.J., Fritz, R.S., Lobo, M., Betts, R.F., Miller, M., Kinnersley, N., Mills, R.G., Ward, P., Straus, S.E. 1999b. Use of the oral neuraminidase inhibitor oseltamivir in experimental human influenza: randomized controlled trials for prevention and treatment. Jama. 282 (13): 1240-6.

Huang, X., Liu, T., Muller, J., Levandowski, R.A., Ye, Z. 2001. Effect of influenza virus matrix protein and viral RNA on ribonucleoprotein formation and nuclear export. Virology. 287 (2): 405-16.

Huet, S., Avilov, S.V., Ferbitz, L., Daigle, N., Cusack, S., Ellenberg, J. 2010. Nuclear import and assembly of influenza A virus RNA polymerase studied in live cells by fluorescence cross- correlation spectroscopy. J Virol. 84 (3): 1254-64.

Chang, S.C., Cheng, Y.Y., Shih, S.R. 2006. Avian influenza virus: the threat of a pandemic. Chang Gung Med J. 29 (2): 130-4.

Chen, W., Calvo, P.A., Malide, D., Gibbs, J., Schubert, U., Bacik, I., Basta, S., O'Neill, R., Schickli, J., Palese, P., Henklein, P., Bennink, J.R., Yewdell, J.W. 2001. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. Nat Med. 7(12): 1306-12.

Isin, B., Doruker, P., Bahar, I. 2002. Functional motions of influenza virus hemagglutinin: a structure-based analytical approach. Biophys J. 82 (2): 569-81.

Kawaoka, Y., Krauss, S., Webster, R.G. 1989. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics. J Virol. 63 (11): 4603-8.

Kohno, S., Kida, H., Mizuguchi, M., Shimada, J. 2010. Efficacy and safety of intravenous peramivir for treatment of seasonal influenza virus infection. Antimicrob Agents Chemother. 54 (11): 4568-74.

Li, M.L., Ramirez, B.C., Krug, R.M. 1998. RNA-dependent activation of primer RNA production by influenza virus polymerase: different regions of the same protein subunit constitute the two required RNA-binding sites. Embo J. 17 (19): 5844-52.

Li, M.L., Rao, P., Krug, R.M. 2001. The active sites of the influenza cap-dependent endonuclease are on different polymerase subunits. Embo J. 20 (8): 2078-86.

Louria, D.B., Blumenfeld, H.L., Ellis, J.T., Kilbourne, E.D., Rogers, D.E. 1959. Studies on influenza in the pandemic of 1957-1958. II. Pulmonary complications of influenza. J Clin Invest. 38 (1 Part 2): 213-65.

Ludwig, S., Stitz, L., Planz, O., Van, H., Fitch, W.M., Scholtissek, C. 1995. European swine virus as a possible source for the next influenza pandemic? Virology. 212 (2): 555-61.

Martin, K., Helenius, A. 1991. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1): 117-30.

Matrosovich, M.N., Matrosovich, T.Y., Gray, T., Roberts, N.A., Klenk, H.D. 2004. Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epithelium. J Virol. 78 (22): 12665-7.

36

Mazur, I., Anhlan, D., Mitzner, D., Wixler, L., Schubert, U., Ludwig, S. 2008. The proapoptotic influenza A virus protein PB1-F2 regulates viral polymerase activity by interaction with the PB1 protein. Cell Microbiol. 10 (5): 1140-52.

McAuley, J.L., Hornung, F., Boyd, K.L., Smith, A.M., McKeon, R., Bennink, J., Yewdell, J.W., McCullers, J.A. 2007. Expression of the 1918 influenza A virus PB1-F2 enhances the pathogenesis of viral and secondary bacterial pneumonia. Cell Host Microbe. 2(4): 240-9.

McAuley, J.L., Zhang, K., McCullers, J.A. 2010. The effects of influenza A virus PB1-F2 protein on polymerase activity are strain specific and do not impact pathogenesis. J Virol. 84 (1): 558-64.

McCaughey, C. 2010. Influenza: a virus of our times. Ulster Med J. 79 (2): 46-51.

Memoli, M.J., Morens, D.M., Taubenberger, J.K. 2008. Pandemic and seasonal influenza: therapeutic challenges. Drug Discov Today. 13 (13-14): 590-5.

Monto, A.S., Fleming, D.M., Henry, D., de Groot, R., Makela, M., Klein, T., Elliott, M., Keene, O.N., Man, C.Y. 1999. Efficacy and safety of the neuraminidase inhibitor zanamivirin the treatment of influenza A and B virus infections. J Infect Dis. 180 (2): 254-61.

Monto, A.S., Gravenstein, S., Elliott, M., Colopy, M., Schweinle, J. 2000. Clinical signs and symptoms predicting influenza infection. Arch Intern Med. 160 (21): 3243-7.

Moulin, H.R., Liniger, M., Python, S., Guzylack-Piriou, L., Ocana-Macchi, M., Ruggli, N., Summerfield, A. 2011. High interferon type I responses in the lung, plasma and spleen during highly pathogenic H5N1 infection of chicken. Vet Res. 42 (1): 6.

Murray, R.J., Robinson, J.O., White, J.N., Hughes, F., Coombs, G.W., Pearson, J.C., Tan, H.L., Chidlow, G., Williams, S., Christiansen, K.J., Smith, D.W. 2010. Community-acquired pneumonia due to pandemic A(H1N1)2009 influenzavirus and methicillin resistant Staphylococcus aureus co-infection. PLoS One. 5(1): e8705.

Naeve, C.W., Hinshaw, V.S., Webster, R.G. 1984. Mutations in the hemagglutinin receptor- binding site can change the biological properties of an influenza virus. J Virol. 51 (2): 567-9.

Neumann, G., Hughes, M.T., Kawaoka, Y. 2000. Influenza A virus NS2 protein mediates vRNP nuclear export through NES-independent interaction with hCRM1. Embo J. 19 (24): 6751- 8.

Nguyen, J.T., Hoopes, J.D., Smee, D.F., Prichard, M.N., Driebe, E.M., Engelthaler, D.M., Le, M.H., Keim, P.S., Spence, R.P., Went, G.T. 2009. Triple combination of oseltamivir, amantadine, and ribavirin displays synergistic activity against multiple influenza virus strains in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (10): 4115-26.

O'Neill, R.E., Jaskunas, R., Blobel, G., Palese, P., Moroianu, J. 1995. Nuclear import of influenza virus RNA can be mediated by viral nucleoprotein and transport factors required for protein import. J Biol Chem. 270 (39): 22701-4.

37 Plotch, S.J., Bouloy, M., Krug, R.M. 1979. Transfer of 5'-terminal cap of globin mRNA to influenza viral complementary RNA during transcription in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (4): 1618-22.

Potter, C.W. 2001. A history of influenza. J Appl Microbiol. 91 (4): 572-9.

Rao, P., Yuan, W., Krug, R.M. 2003. Crucial role of CA cleavage sites in the cap-snatching mechanism for initiating viral mRNA synthesis. Embo J. 22 (5): 1188-98.

Robb, N.C., Smith, M., Vreede, F.T., Fodor, E. 2009. NS2/NEP protein regulates transcription and replication of the influenza virus RNA genome. J Gen Virol. 90 (Pt 6): 1398-407.

Robertson, H.D., Dickson, E., Plotch, S.J., Krug, R.M. 1980. Identification of the RNA region transferred from a representative primer, beta-globin mRNA, to influenza mRNA during in vitro transcription. Nucleic Acids Res. 8(5): 925-42.

Robertson, J.S. 1979. 5' and 3' terminal nucleotide sequences of the RNA genome segments of influenza virus. Nucleic Acids Res. 6(12): 3745-57.

Rossman, J.S., Jing, X., Leser, G.P., Balannik, V., Pinto, L.H., Lamb, R.A. 2010. Influenza virus m2 ion channel protein is necessary for filamentous virion formation. J Virol. 84 (10): 5078-88.

Skehel, J.J., Hay, A.J. 1978. Nucleotide sequences at the 5' termini of influenza virus RNAs and their transcripts. Nucleic Acids Res. 5(4): 1207-19.

Smith, G.J., Bahl, J., Vijaykrishna, D., Zhang, J., Poon, L.L., Chen, H., Webster, R.G., Peiris, J.S., Guan, Y. 2009. Dating the emergence of pandemic influenza viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28): 11709-12.

Steininger, C., Kundi, M., Aberle, S.W., Aberle, J.H., Popow-Kraupp, T. 2002. Effectiveness of reverse transcription-PCR, virus isolation, and enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of influenza A virus infection in different age groups. J Clin Microbiol. 40 (6): 2051-6.

Su, B., Wurtzer, S., Rameix-Welti, M.A., Dwyer, D., van der Werf, S., Naffakh, N., Clavel, F., Labrosse, B. 2009. Enhancement of the influenza A hemagglutinin (HA)-mediated cell-cell fusion and virus entry by the viral neuraminidase (NA). PLoS One. 4(12): e8495.

Taubenberger, J.K., Morens, D.M. 2006. 1918 Influenza: the mother of all pandemics. Emerg Infect Dis. 12 (1): 15-22.

Taubenberger, J.K., Reid, A.H., Janczewski, T.A., Fanning, T.G. 2001. Integrating historical, clinical and molecular genetic data in order to explain the origin and virulence of the 1918 Spanish influenza virus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416): 1829-39.

Taubenberger, J.K., Reid, A.H., Krafft, A.E., Bijwaard, K.E., Fanning, T.G. 1997. Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus. Science. 275 (5307): 1793-6.

Treanor, J. 2004. Influenza vaccine--outmaneuvering antigenic shift and drift. N Engl J Med. 350 (3): 218-20.

38

Treanor, J.J., Hayden, F.G., Vrooman, P.S., Barbarash, R., Bettis, R., Riff, D., Singh, S., Kinnersley, N., Ward, P., Mills, R.G. 2000. Efficacy and safety of the oral neuraminidase inhibitor oseltamivir in treating acute influenza: a randomized controlled trial. US Oral Neuraminidase Study Group. Jama. 283 (8): 1016-24.

Troko, J., Myles, P., Gibson, J., Hashim, A., Enstone, J., Kingdon, S., Packham, C., Amin, S., Hayward, A., Van-Tam, J.N. 2011. Is public transport a risk factor for acute respiratory infection? BMC Infect Dis. 11 : 16. van der Sluijs, K.F., Nijhuis, M., Levels, J.H., Florquin, S., Mellor, A.L., Jansen, H.M., van der Poll, T., Lutter, R. 2006. Influenza-induced expression of indoleamine 2,3-dioxygenase enhances interleukin-10 production and bacterial outgrowth during secondary pneumococcal pneumonia. J Infect Dis. 193 (2): 214-22.

Viboud, C., Grais, R.F., Lafont, B.A., Miller, M.A., Simonsen, L. 2005. Multinational impact of the 1968 Hong Kong influenza pandemic: evidence for a smoldering pandemic. J Infect Dis. 192 (2): 233-48.

Volmer, R., Mazel-Sanchez, B., Volmer, C., Soubies, S.M., Guerin, J.L. 2010. Nucleolar localization of influenza A NS1: striking differences between mammalian and avian cells. Virol J. 7: 63.

Weber, F., Kochs, G., Gruber, S., Haller, O. 1998. A classical bipartite nuclear localization signal on Thogoto and influenza A virus nucleoproteins. Virology. 250 (1): 9-18.

Webster, R.G. 1999. 1918 Spanish influenza: the secrets remain elusive. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4): 1164-6.

Webster, R.G., Bean, W.J., Gorman, O.T., Chambers, T.M., Kawaoka, Y. 1992. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev. 56 (1): 152-79.

Webster, R.G., Krauss, S., Hulse-Post, D.J., Sturm-Ramirez, K.M. 2007. Evolution of influenza A viruses in wild birds. J. Wildl. Dis. 43 Suppl 3: S1-S6.

WHO. 2009. Pandemic influenza preparedness and response: WHO guidance document. World Health Organization, Geneva.

Wu, W.W., Pante, N. 2009. The directionality of the nuclear transport of the influenza A genome is driven by selective exposure of nuclear localization sequences on nucleoprotein. Virol J. 6: 68.

Yuen, K.Y., Chan, P.K., Peiris, M., Tsang, D.N., Que, T.L., Shortridge, K.F., Cheung, P.T., To, W.K., Ho, E.T., Sung, R., Cheng, A.F. 1998. Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus. Lancet. 351 (9101): 467-71.

Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Xiao, X., Wang, R., Palese, P. 2005. Influenza virus PB1-F2 protein induces cell death through mitochondrial ANT3 and VDAC1. PLoS Pathog. 1(1): e4.

Zambon, M.C. 1999. Epidemiology and pathogenesis of influenza. J Antimicrob Chemother. 44 Suppl B: 3-9.

39

Zhang, J., Li, G., Liu, X., Wang, Z., Liu, W., Ye, X. 2009. Influenza A virus M1 blocks the classical complement pathway through interacting with C1qA. J Gen Virol. 90 (Pt 11): 2751-8.

Zhao, H., Ekstrom, M., Garoff, H. 1998. The M1 and NP proteins of influenza A virus form homo- but not heterooligomeric complexes when coexpressed in BHK-21 cells. J Gen Virol. 79 ( Pt 10): 2435-46.

Internetové zdroje: http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb76_1.html, cit. dne 2.12.2010 http://www.uniprot.org/uniprot/Q1K9Q1, cit. dne 2.12.2010 http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb76_2.html, cit. dne 10.12.2010 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html, cit. dne 3.3.2011 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/2003/fs211/en/, cit. dne 3.3.2011 http://www.who.int/csr/disease/swineflu/frequently_asked_questions/about_disease/en/, cit. dne 13.4.2011 http://www.cdc.gov/h1n1flu/guidance/diagnostic_tests.htm, cit. dne 20.4.2011 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/avian_influenza/en/index.html, cit. dne 5.5.2011 http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/avian_faqs/en/index.html#doeshuman, cit. dne 5.5.2011

Obrázky a tabulky: Obr. 1: http://www.nature.com/scitable/topicpage/genetics-of-the-influenza-virus-716, cit. dne 16.11.2010 Obr. 2: http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb76_2.html, cit. dne 10.12.2010 Obr. 3: http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Antigenic_drift_vs_shift.png, cit. dne 5.1.2011 Obr. 4 a Obr. 5 : De Clercq, E. 2001. Antiviral drugs: current state of the art. J Clin Virol. 22 (1): 73-89. Obr. 6 : Garten, R.J., Davis, C.T., Russell, C.A., Shu, B., Lindstrom, S., Balish, A., Sessions, W.M., Xu, X., Skepner, E., Deyde, V., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L., Barnes, J., Smith, C.B., Emery, S.L., Hillman, M.J., Rivailler, P., Smagala, J., de Graaf, M., Burke, D.F., Fouchier, R.A., Pappas, C., Alpuche-Aranda, C.M., Lopez-Gatell, H., Olivera, H., Lopez, I., Myers, C.A., Faix, D., Blair, P.J., Yu, C., Keene, K.M., Dotson, P.D., Jr., Boxrud, D., Sambol, A.R., Abid, S.H., St George, K., Bannerman, T., Moore, A.L., Stringer, D.J., Blevins, P., Demmler-Harrison, G.J., Ginsberg, M., Kriner, P., Waterman, S., Smole, S., Guevara, H.F., Belongia, E.A., Clark, P.A., Beatrice, S.T., Donis, R., Katz, J., Finelli, L., Bridges, C.B., Shaw, M., Jernigan, D.B., Uyeki, T.M., Smith, D.J., Klimov, A.I., Cox, N.J. 2009. Antigenic and genetic characteristics of swine- origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science. 325 (5937): 197-201. Tab.1 : WHO. 2009. Pandemic influenza preparedness and response: WHO guidance document. World Health Organization, Geneva. Tab. 2 : http://www.cdc.gov/h1n1flu/guidance/diagnostic_tests.htm, cit. dne 20.4.2011

40