Brucella Abortus Biovar 4 a Été Isolée À Partir Du Lait D'animaux Ayant Présenté Des Résultats Sérologiques Fortement Positifs (N=13)

Académie Universitaire Wallonie – Europe Université de Liège – Faculté de Médecine Vétérinaire Département des Maladies Infectieuses et Parasitaires Service d’Épidémiologie et Analyse de Risques Appliquées aux Sciences Vétérinaires

Institut de Médecine Tropicale d’Anvers Unité de Biostadistique et d’Epidémiologie Département de Sciences Biomédicales

Centro Internacional de Zoonosis Universidad Central del Ecuador

ETUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE BOVINE ET SON IMPACT EN SANTÉ PUBLIQUE DANS LE NORD-OUEST DE L’EQUATEUR

EPIDEMIOLOGICAL STUDY OF BOVINE BRUCELLOSIS AND ITS IMPACT IN PUBLIC HEALTH IN THE NORTHWEST OF ECUADOR

Jorge RON-ROMÁN

Thèse présentée en vue de l’obtention du Grade de Docteur en Sciences Vétérinaires Année académique 2016-2017

Source des illustrations de la couverture : Jorge Ron-Román et Alexandra Angulo-Cruz

Institut de Médecine Tropicale d’Anvers Unité de Biostadistique et d’Epidémiologie Département de Sciences Biomédicales

Centro Internacional de Zoonosis Universidad Central del Ecuador

ETUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE BOVINE ET SON IMPACT EN SANTÉ PUBLIQUE DANS LE NORD-OUEST DE L’EQUATEUR

EPIDEMIOLOGICAL STUDY OF BOVINE BRUCELLOSIS AND ITS IMPACT IN PUBLIC HEALTH IN THE NORTHWEST OF ECUADOR

Promoteur:

Prof. Dr. Claude SAEGERMAN Unité de recherche en Epidémiologie et Analyse de Risque Appliquées aux Sciences Vétérinaires (UREAR-ULg), Fundamental and Applied Research for Animal and Health (FARAH) Center, Département des Maladies Infectieuses et Parasitaires Faculté de Médecine Vétérinaire – Université de Liège

Co-promoteur:

Prof. Dr. ir. Dirk BERKVENS Unité de Biostatistique et d’Epidémiologie Département de Sciences Biomédicales Institut de Médecine Tropicale d’Anvers

Jorge RON-ROMÁN

Thèse présenté en vue de l’obtention du Grade de Docteur en Sciences Vétérinaires Année académique 2016-2017

Dédicace

¡Amen! La louange, la gloire, la sagesse, l'action de grâces, l'honneur, la puissance, et la force, soient à notre Dieu, aux siècles des siècles. !Amen!

Apocalypse 7:12 (La Sainte Bible, Louis Segond, 1910)

Au peuple équatorien: mon plus grand investisseur et sponsor.

À ma épouse et filles: María-Augusta, Emilia et María-Inés.

À mes parents et frères: Jorge, Victoria, Carlitos, Carmita y Rebequita

Dedicatoria

[Texte]

¡Amén! La bendición, la gloria, la sabiduría, la acción de gracias, la honra, el poder y la fortaleza sean a nuestro Dios por los siglos de los siglos. ¡Amén!

Apocalipsis 7:12 (Santa Biblia, Reina & Valera, 1960)

Al pueblo ecuatoriano: mi mayor inversionista y patrocinador.

A mi esposa e hijas: María-Augusta, Emilia et María-Inés.

A mis padres y hermanas: Jorge, Victoria, Carlos, Carmita y Rebeca

RÉSUMÉ

Version française

INTRODUCTION La brucellose, aussi connue en tant que fièvre de Malte ou fièvre ondulante chez l'homme, et comme maladie de Bang ou avortement contagieux chez les bovins, est une infection hautement contagieuse causée par des bactéries du genre Brucella. Malgré les nombreux efforts déployés pour contrôler et éradiquer cette maladie, elle est toujours considérée comme l'une des zoonoses les plus répandues dans le monde. La prévalence est élevée dans les pays ou les régions où les conditions sanitaires sont mauvaises, où les systèmes d'exploitation des animaux sont traditionnels, et lorsqu’aucun système adéquat de surveillance épidémiologique de la maladie n’est mis en place. Son importance est liée à l’impact désastreux en matière de santé publique, ainsi qu’aux pertes économiques qu’elle peut générer.

En santé publique, les pertes économiques sont associées au coût des diagnostics clinique et de laboratoire, aux frais thérapeutiques et aux compensations versées aux patients; en effet, cette affection est reconnue comme maladie professionnelle dans de nombreuses régions du monde. Chez les bovins, l'avortement, la stérilité, la chute de production laitière, les retards dans les programmes d’amélioration génétique et la naissance de veaux faibles sont les causes les plus courantes de pertes économiques. Les restrictions en termes d’échanges commerciaux internationaux des animaux et de produits alimentaires dérivés de ceux-ci ont également un impact économique majeur.

L'homme et les animaux s’infectent, soit par contact direct avec des animaux ou du matériel infecté (fœtus, membranes fœtales ou sécrétions vaginales), soit après consommation de produits laitiers non pasteurisés.

L'une des options les plus fréquemment utilisées pour contrôler la brucellose bovine repose sur la vaccination du bétail avec une souche atténuée de B. abortus Buck 19 (B19). Malheureusement, la stratégie de vaccination ne peut éradiquer à elle seule la maladie. En effet, il est indispensable d'identifier les animaux infectés et de les éliminer de manière adéquate. De gros problèmes se posent suite à la vaccination car ce type de vaccin présente l'inconvénient d’engendrer la production d’anticorps qui interfèrent avec les tests diagnostiques tels que l’agglutination, l’ELISA et le test cutané. Cette caractéristique complique la confirmation d’un diagnostic, interfère avec la

compréhension réelle du problème et avec les moyens permettant d’identifier des options de gestion adaptées aux particularités d'une région ou d'un pays.

La présence de la brucellose dans le cheptel bovin équatorien a été mise en évidence par Salvestroni en 1926. Néanmoins, malgré les efforts consacrés à la recherche sur la brucellose animale en Equateur, le manque de techniques diagnostiques standardisées (présentant une sensibilité et une spécificité élevées), l'insuffisance d'interprétation des résultats et le faible nombre d'isolements et caractérisations de Brucella spp. n’ont pas permis de réellement cerner l’ampleur du problème.

Ce travail visait à générer des informations fiables sur la situation épidémiologique réelle de la brucellose bovine et son impact en santé publique dans le nord-ouest de l'Equateur, et à investiguer les potentiels facteurs de risque d’infection. En effet, ces informations revêtent une importance primordiale pour les organismes officiels en charge de la surveillance de cette zoonose. Quatre objectifs spécifiques ont été définis et sont précisés ci-dessous.

Ce manuscrit est divisé en deux sections principales: d’une part, l’introduction, sous la forme d’une revue de littérature sur Brucella spp. et la brucellose, et d’autre part, la section expérimentale, dans laquelle sont présentées les études réalisées en Equateur chez l’homme et plusieurs espèces animales (travaux de terrain et de laboratoire).

L’introduction résume les informations générales sur l'agent infectieux, l'épidémiologie de la maladie et la réponse immunitaire de l'hôte, ainsi que sur les différentes méthodes de diagnostic direct et indirect. De plus, les systèmes d'élevage pratiqués en Equateur sont décrits afin de mieux cerner le contexte épidémiologique (Objectif 1).

La section expérimentale présente les résultats d’études réalisées chez les espèces animales afin de caractériser l'agent causal, de déterminer la prévalence réelle de l'infection, et d'estimer les paramètres de sensibilité et spécificité des tests diagnostiques utilisés (Objectif 2). Par ailleurs, l’importance zoonotique de la brucellose en Equateur a été investiguée (Objectif 3).

iii

Dans un premier temps, les résultats de l'étude réalisée chez les bovins dans le nord- ouest de l'Equateur, ainsi que les résultats de l'étude de la brucellose chez les chèvres dans deux régions d’Equateur sont développés.

Concernant l’aspect santé publique, les études visaient (i) à déterminer la prévalence réelle de la maladie et les facteurs de risque et à caractériser l'agent causal, (ii) à évaluer la sensibilité et la spécificité des tests diagnostiques utilisés, et (iii) à présenter un rapport de cas d’orchite avec son suivi clinique et sérologique.

Le travail se clôture par la présentation des lignes directrices servant de base à l'élaboration d'une stratégie de surveillance épidémiologique des brucelloses bovine et humaine, adaptée aux conditions du nord-ouest de l'Equateur (Objectif 4).

RESULTATS

1. Une révision de la bibliographie locale a démontré que la brucellose a toujours été une préoccupation en Equateur Sans aucun doute, la compréhension d'un problème constitue la base de la formulation, non seulement, des solutions correctes mais aussi et surtout viables. En ce sens, et dans le cadre de ce travail visant à mieux comprendre, et de manière correcte, la situation épidémiologique de cette zoonose chez l'homme et ses différents hôtes, une revue complète de la littérature s’avérait nécessaire comme point de départ.

La brucellose a toujours été un centre d’intérêt en Equateur, car suite aux premières notifications chez les bovins par Salvestroni en 1926 et chez l’homme par Valenzuela en 1934, de nombreuses études ont été réalisées, principalement chez les espèces animales réservoirs. Le rôle du vétérinaire de terrain vis-à-vis de cette zoonose a d’ailleurs été mis en avant.

dernières ont été réalisées dans le but de rechercher la maladie uniquement chez les groupes à risque. En effet, dans le contexte équatorien, la surveillance de la maladie humaine est uniquement passive et repose sur les déclarations des cas hospitalisés. De plus, les professionnels de la santé publique ne lui accordent que peu d’importance, ce qui est confirmé par la faible place qu’elle occupe tout au long de la formation médicale. Ce manque de sensibilisation des professionnels de la santé représente un frein au dépistage correct de la maladie dans la patientèle de tous les jours, à tel point que ce sont les vétérinaires qui conseillent aux personnes présentant un tableau clinique suspect de se soumettre à des tests diagnostiques.

2.- Détermination de la prévalence apparente et des facteurs de risque de brucellose chez les bovins Les nombreux tests existants permettant de confirmer le diagnostic de brucellose chez l’animal, sont non seulement liés à l’importance zoonotique majeure de la maladie, mais aussi aux problèmes qui persistent quant à la fiabilité des résultats, principalement en termes de sensibilité (Se) et de spécificité (Se). Afin d'obtenir des informations épidémiologiques fiables sur la prévalence réelle de la brucellose bovine par zone (zone1=Sierra et zone2=Costa) et par province, ainsi que sur la performance des tests utilisés pour diagnostiquer la maladie en Equateur, une étude transversale a été menée dans le nord-ouest du pays.

La prévalence estimée était de 2,1%, tandis que les Se et Sp étaient les suivantes, pour chaque test: Se=84% et Sp=98% pour RB, Se=85% et Sp=99% pour SAT-EDTA et Se=89% et Sp=97 pour iELISA. Les facteurs de risque tels que le sexe (OR=3,91 pour les femelles), l'âge (OR=3,14 pour la classe des 25 à 60 mois), la zone (OR=4,19 pour la zone 1) et la province (OR=6,62 dans la province de Pichincha) ont été identifiés grâce à une enquête épidémiologique et un échantillonnage représentatif. L'étude a mis en évidence que la différence de prévalence entre zones d'échantillonnage ne se situait pas au niveau des fermes (21,89% dans la zone 1 et 25,17% dans la zone 2), mais étaient surtout liées à la prévalence intra-troupeau (12,46% dans la zone 1 et 3,28% dans la zone 2). Brucella abortus biovar 4 a été isolée à partir du lait d'animaux ayant présenté des résultats sérologiques fortement positifs (n=13). Elle a présenté des caractéristiques

particulières, à savoir l'inhibition de croissance en milieu coloré avec de la fuchsine (20 mg/ml) et de la safranine (100 pg/ml).

3.- La découverte de la souche vaccinale B-19 chez les chèvres pourrait-elle confirmer la situation anarchique de la vaccination chez les bovins ? Dans le cas des maladies zoonotiques, l’élevage en zone péri-urbaine ou urbaine augmente le risque de transmission suite à la production de déchets tels que urines, matières fécales, sécrétions diverses et avortons qui peuvent contaminer l’environnement.

A ce jour, très peu d’études sérologiques ont ciblé la brucellose caprine en Equateur, la plupart sont d’ailleurs relativement anciennes. Afin d'évaluer la situation épidémiologique actuelle, une étude sérologique transversale a été menée parmi les populations caprines des provinces de Carchi (n = 160 animaux), Pichincha (n = 224 animaux) et Loja (n = 2.024 animaux). L’étude a seulement permis d’identifier deux animaux faiblement positifs, ce qui va à l’encontre d’un rapport qui avait estimé une prévalence de 17,8% chez cette espèce.

Vingt-cinq échantillons de lait se sont révélés positifs au test de l’anneau (Milk Ring Test - MRT) dans la province de Pichincha, ce qui représente une prévalence de 11,16%. Les échantillons positifs ont été mis en culture. Tous les résultats ont été négatifs, à l'exception d'un animal de la région de Quito. Ce dernier a présenté une culture positive pour Brucella abortus souche 19 (B19). Plusieurs hypothèses peuvent être émises pour interpréter un tel résultat inattendu, la plus probable étant l’utilisation accidentelle chez cet animal d'une aiguille utilisée au préalable pour immuniser les bovins avec le vaccin B19. Même si cette observation a déjà été rapportée antérieurement, elle met en évidence la problématique liée à l’utilisation d’un vaccin vivant atténué. Il est indispensable de former et sensibiliser les utilisateurs de vaccins contre la brucellose aux normes relatives à leur transport, reconstitution, stockage, dosage, administration et élimination des déchets, telles que précisées par les fabricants et surtout selon les exigences de l’OIE.

4.- Le rôle des chiens dans la transmission de la brucellose bovine en zone endémique Au cours de cette étude, la prévalence élevée au niveau des troupeaux bovins et des animaux dans la Sierra équatorienne, ajouté à la forte prévalence des avortements chez les bovins, et à la facilité d’isolement de Brucella spp. à partir de leur lait, a rapidement soulevé la question du rôle potentiel des chiens en tant que réservoir de l’infection. Une étude réalisée dans plusieurs élevages bovins localisés dans le canton Mejía province de Pichincha, une zone endémique d’Equateur a été menée dans le but de déterminer si les chiens hébergeaient des Brucella spp.

La majorité des chiens (85,43%) avaient des contacts avec le bétail et ingéré du lait cru. D’autre part, 64,24% d’entre eux mangeaient régulièrement les produits d’avortement. Au total, 43 chiens (30,46%) ont réagi positivement à au moins un test diagnostic. Pris individuellement, les tests ont fourni les résultats suivants: (i) 15,89% des chiens étaient positifs au test d'agglutination rapide au RB, (ii) 11,92% étaient positifs au SAT-EDTA et (iii) 23,85% étaient positifs au test iELISA. Seuls 13 chiens (8,6%) avaient réagi positivement aux trois tests. Quatre bovins (4,30%) étaient positifs aux tests RB et SAT- EDTA. Brucella abortus biotype 4 a été identifié par essais microbiologiques et PCR- 711, à partir des prélèvements de chiens (n= 5) et de bovins (n= 1). Ces observations confirment le rôle biologique que peuvent jouer les chiens dans les maladies ré- émergentes telles que la brucellose.

Les résultats démontrent que le contrôle de la brucellose ne devrait pas se limiter uniquement à l’espèce bovine, chez qui les pertes économiques sont évidentes. Davantage d’attention devrait être portée aux autres espèces animales comme par exemple les chiens de ferme, en tant que réservoirs potentiels de la maladie.

5.- Détermination de la prévalence apparente et des facteurs de risque de brucellose chez l’homme L'évaluation du statut réel de la brucellose chez les réservoirs animaux est influencée par la fiabilité des résultats des tests diagnostiques appliqués. De plus, chez les bovins, l’existence de réactions croisées suite à la vaccination avec la souche vaccinale B19 complique encore l’interprétation des résultats. La prévalence d'anticorps contre l'agent

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causal, ainsi que l'isolement et la caractérisation des souches de Brucella sp. circulant chez l’homme, pourraient non seulement fournir des informations épidémiologiques à propos de cette zoonose, tant au niveau régional que national, mais également évaluer son impact sur la santé publique, car il n’existe aucun vaccin commercial chez l'homme.

Une grande enquête a été réalisée en Equateur, sur base de prélèvements sanguins réalisés chez l’homme dans la partie nord-ouest du territoire (n = 3.733) et accompagnée d’une enquête épidémiologique. Les résultats de trois tests de diagnostic utilisés en parallèle ont permis d’estimer une séroprévalence globale de 1,88% (intervalle de confiance [IC] à 95%: 1,48-2,38). Une régression logistique multivariée a permis d’identifier les principaux facteurs de risque associés à la séropositivité chez l’homme, à savoir : le contact avec un élevage (odds ratio [OR] = 3,0; IC 1,25-7,08), la consommation de fœtus et de placenta (OR = 2,5; IC 1,18 -5,22), et la participation à des activités à risque (OR = 1,8; IC 1,00-3,35). La souche qui crculait était Brucella abortus biotype 4.

Cette étude a souligné que, les contacts avec le bétail, la consommation de foetus et de placenta et les activités professionnelles à risque, sont autant de facteurs jouant un rôle important dans la contamination par Brucella sp. chez les individus dans le nord-ouest de l'Equateur.

5.- Détermination des prévalences réelles de brucellose humaine et bovine et performance des tests diagnostiques utilisés, au moyen du théorème de Bayes Une fois la prévalence apparente de la brucellose estimée chez l'homme et les bovins et les facteurs de risque identifiés, les résultats des tests diagnostiques imparfaits ont été combinés à une information "a priori" (avis d’experts), dans un modèle bayésien, afin d’estimer les performances (Se et Sp) du test utilisé chez l’homme.

La brucellose pourrait certainement être la maladie pour laquelle un grand nombre de tests diagnostiques a été développé pour le diagnostic indirect. Ceux-ci vont d’une simple agglutination rapide sur plaque comme le RB aux tests de polarisation de fluorescence, en passant par l’ELISA (indirect et de compétition). Ils obéissent à la complexité du diagnostic direct basé sur l’isolement de Brucella sp., et au risque élevé

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de contamination lors des manipulations. La performance d’un test indirect basé sur la détection d’Ac contre le LPS dépend non seulement de son principe mais aussi du type d’échantillon sur lequel il est effectué (sang entier, sérum, plasma, lait ou lactosérum).

Dans ce contexte, un modèle Bayésien combinant l’information collectée sur le terrain avec l’information a priori (opinions d’experts) a permis d’estimer la prévalence réelle de la brucellose chez l’homme et dans l’espèce bovine. Notre étude a permis, à l’aide d’une approche bayésienne, d’estimer une prévalence réelle de 1% chez l’homme (intervalle de crédibilité: 0,4 à 1,6) et 2,1% chez les bovins, ainsi que la Se et la Sp des tests utilisés (RB, SAT-EDTA et iELISA). Chez l’homme, les sensibilités des tests iELISA et RBT étaient plus élevées mais très similaires (respectivement 95,1% et 95,0 %,) en comparaison à celle de la SAT-EDTA (60,8 %). Même si tous les tests ont présenté une spécificité élevée (> 99,0 %), celle du SAT-EDTA était la plus importante (99,9 %). Chez les bovins, les Se et Sp étaient les suivantes, pour chaque test: Se=84% et Sp=98% pour RB, Se=85% et Sp=99% pour SAT-EDTA et Se=89% et Sp=97 pour iELISA.

Le modèle a identifié l’iELISA comme étant le meilleur test pour le diagnostic de la brucellose chez l’homme et l’animal. Néanmoins, la Sp du test ELISA dépend du type de conjugué utilisé. Le test RB ne devrait pas être écarté: c’est un des tests les plus utilisés dans le diagnostic de cette maladie car il est facile à réaliser, peu coûteux, ses résultats sont faciles à lire, et il présente une haute Se. Ce test permet d’obtenir une appréciation sérologique rapide, tant au niveau individuel qu’à l’échelle du troupeau.

La stratégie proposée doit se baser sur des données factuelles, dont les décideurs doivent tenir compte pour mettre en place des programmes appropriés de prévention et de contrôle de la brucellose dans le monde entier

6.- Isolement et typage des souches de Brucella abortus chez différents espèces réservoirs en Equateur Des inquiétudes subsistent dans de nombreux pays, dans lesquels la brucellose a été déclarée comme présente suite à la réalisation de méthodes sérologiques sans que les souches de Brucella spp. circulantes n’aient encore pu être identifiées. Comme le

suggèrent la FAO et l’OMS, chaque fois qu’il est possible de le faire, l’identification de l’agent causal doit être entreprise y inclus un biotypage car des souches présentent fréquemment une distribution géographique particulière. Malheureusement, l’isolement des germes n’est pas une tâche aisée, requiert un laboratoire spécialisé et de haute sécurité. C’est la raison pour laquelle le nombre d’isolements rapportés par pays est en relation directe avec le degré de développement de ses laboratoires de références. L’Equateur n’échappe pas à la règle. A l’heure actuelle il n’existe aucune information officielle sur le nombre d’isolements réalisés ni sur la distribution des souches de Brucella spp. circulant en Equateur.

Sur base des stratégies décrites ci-dessus, basées sur l’optimisation des ressources et la diminution des risques de contamination (fréquentes lorsqu’on travaille avec une bactérie présentant un tel risque biologique) 26 souches ont été isolées: 17 chez des bovins, 1 chez un caprin, 4 chez l’homme et 4 chez des chiens. Brucella abortus biotype 4 était majoritaire, une souche isolée chez une chèvre s’est avérée être B. abortus biotype 1 souche vaccinale (B-19) et un isolement chez un cas humain a révélé une souche de terrain B. abortus biotype 1. Quelques-unes de souches de B. abortus biotype 4 isolées chez les bovins et chez l’homme, ainsi que la souche de terrain B. abortus biotype 1 isolée chez deux patients humains, ont présenté certaines particularités lors du typage, notamment l’inhibition de croissance en milieu coloré avec la safranine (100 µg/ml) et la fuchsine (20 µg/ml).

La mise en place en Equateur de l’isolement et du typage microbien au travers des tests bactériologiques, des tests biochimiques et du typage moléculaire ont permis de réaliser 50% des isolements et typages dans le pays d’origine. Le développement de ces capacités permettrait d’éviter le transfert de matériel contaminant vers un pays indemne de brucellose comme par exemple, la Belgique. Ce serait une valeur ajoutée au travail réalisé durant cette thèse. L’utilisation de protocoles standardisés pour l’isolement et le typage de souches selon les procédures décrites et les contrôles d’ADN nous a permis de garantir des résultats ce qui est un plus en terme de développement.

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES L’appréciation erronée de la situation épidémiologique de la brucellose en Equateur, tant chez l’homme que chez les animaux, n’a pas permis de comprendre et d’apprécier l’ampleur du problème représenté par cette zoonose, qui est un aspect fondamental si des solutions adaptées à la réalité doivent être développées. Ce travail de thèse a éclairci, au travers de la revue de la littérature locale et de quatre sections expérimentales, la situation épidémiologique réelle de la brucellose bovine et son impact en santé publique, dans le nord-ouest de l’Equateur. Il a pu mettre en évidence que les brucelloses humaine et animale sont des maladies négligées en Equateur, et apporte l’information de base nécessaire afin de faire évoluer la situation.

La combinaison des résultats obtenus grâce à l’application de tests multiples dans un modèle statistique basé sur le théorème de Bayes, a permis d’estimer les prévalences réelles des brucelloses bovine et humaine et les paramètres (sensibilité et spécificité) de chaque test inclus dans le modèle. Les résultats nous ont permis de conclure que l’iELISA serait un test de choix pour diagnostiquer la maladie, mais que le test au Rose Bengale de devrait pas être mis de côté, au vu de sa réalisation aisée et de son faible coût.

L’information collectée répond à l’appel de l’OIE sur la possible compartimentation d’un territoire comme stratégie de contrôle et d’éradication d’une maladie. De plus, ce travail de thèse déclenche la sonnette d’alarme sur les conséquences de la vaccination anarchique des bovins et sur la circulation de Brucella spp. au sein des diverses espèces réservoirs potentielles.

Pour conclure, l’information récoltée met en évidence que les brucelloses humaine et animale sont toujours un problème en Equateur. Une stratégie contextualisée, adaptée à la situation épidémiologique de chaque zone, devrait être élaborée pour contrôler la brucellose en Equateur.

SUMMARY

English version

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Brucellosis, also known as Malta fever or undulant fever in humans, and Bang disease or contagious abortion in cattle is a highly contagious infection caused by bacteria belonging to the genus Brucella. Despite the numerous efforts made to control and eradicate the disease, it is still considered as one of the most widespread zoonoses worldwide. Prevalence is elevated in countries or regions where sanitary conditions are poor, where animals are still traditionally managed, and where no adequate system of epidemiological surveillance is implemented. The relative importance of the disease is a consequence of its disastrous impact on public health, and to the severe economic losses associated.

In the public health sector, economic losses are associated with clinical and laboratory diagnostic tests, with therapy costs and with compensations paid to patients; indeed, the disease is recognised as a professional disease in numerous regions. In cattle, abortion, sterility, decreased milk production, delays in programmes of genetic improvement and birth of weak calves are the most frequent causes of economic losses. Furthermore, restrictions on international trade of animals and animal products also have a major economic impact.

Humans and animals get infected, either by direct contact with infected animals and materials (foetuses, foetal membranes or vaginal secretions), or after consuming unpasteurised milk products.

One of the most frequent control measures is vaccination with B19 strain (B-19). Unfortunately, vaccination alone cannot eradicate the disease, because it is essential to identify infected animals to eliminate them appropriately. Numerous problems arise after vaccination, because the vaccine has the disadvantage of generating the production of antibodies which interfere with diagnostic tests such as agglutination, ELISA or skin test. That characteristic is a hindrance to a correct diagnosis; interfere with the real comprehension of the problem and with the means to identify the most appropriate management with regards to a specific regional or national context.

Brucellosis was first reported in Ecuadorian cattle by Salvestroni in 1926. Nevertheless, despite all efforts devoted to research on animal brucellosis in the country, the lack of

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standardised diagnostic tests (combination of a high sensitivity with a high specificity), the lack of interpretation of results and the low number of Brucella spp. isolations and characterisations, did not allow understanding the magnitude of the problem.

The present work aimed at generating reliable information on real epidemiological status of bovine brucellosis and on its impact on public health in north western Ecuador; it also meant to identify potential risk factors. Indeed, this information is essential for official institutions in charge of brucellosis surveillance in Ecuador. For this purpose, four specific objectives were defined and described below.

The manuscript is subdivided in two main sections: on one hand, introduction, which consists in a literature review over Brucella spp. and brucellosis, and on the other hand, the experimental section, which presents all studies performed in Ecuador, both in humans in animals (field and laboratory work).

The introduction summarises all general information on the pathogen, epidemiology of the disease and immune response in hosts, as well as characteristics of all diagnostic tests, either direct or indirect. Furthermore, farming systems as existing in Ecuador are described in order to better understand the epidemiological context (Objective 1).

The experimental section summarises the results of studies performed in animals in order to (i) characterise the causing agent, (ii) estimate the real prevalence of the disease, and (iii) assess the sensitivity and specificity of diagnostic tests used in Ecuador (Objective 2). In addition, the zoonotic importance of brucellosis in Ecuador was investigated (Objective 3).

At first, the results of the study performed in cattle in north western Ecuador, as well as the results of the study on brucellosis in goats, as carried out in two regions of Ecuador will be presented

Regarding public health aspects, the results of several studies were presented. The first study aimed at estimating the real prevalence, identifying the risk factors and characterising the pathogen. The second study allowed assessing sensitivity and

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specificity of diagnostic tests used in the Ecuadorian context. An ultimate study presented the clinical and serological follow up of a human case of orchitis .

The document concludes with the proposition of guidelines which could be seen as a basis for developing a strategy of epidemiological surveillance of bovine and human brucellosis, adapted to the context of north western Ecuador (Objective 4).

RESUMEN

Versión en espeñol

INTRODUCCIÓN La brucelosis, también conocida como “Fiebre de Malta”, o “fiebre ondulante” en los humanos, y como “enfermedad de Bang” o “aborto contagioso”, en los bovinos es una enfermedad altamente contagiosa, causada por las bacterias del género Brucella. A pesar de los grandes esfuerzos que se realizan para controlarla y/o erradicarla, siguie siendo considerada como una de las zoonosis más difundida en el mundo, con elevada prevalencia en los países o regiones donde las condiciones sanitarias son deficientes, los sistemas de explotación animal son de tipo tradicional, y no existen sistemas de seguimiento epidemiológico adecuado de la enfermedad. Su importancia, radica entre otras, por las consecuencias nefastas que ocasiona en la salud pública, así como por las graves pérdidas económicas asociadas a esta enfermedad

Las pérdidas económicas en humanos están relacionadas al costo del diagnóstico clínico y de laboratorio, costo del tratamiento, indemnizaciones, y juicios laborales. En el caso de los bovinos, el aborto, esterilidad, disminución de la producción de leche, retrasos en los programas de mejoramiento genético, nacimiento de terneros débiles, son las causas más comunes de pérdidas económicas, pero a estas de deben sumar otras como la restricción en la comercialización internacional de animales y productos alimenticios derivados de estos, debido a las restricciones sanitarias existentes.

El hombre y los animales, adquieren esta infección, sea por el contacto directo con animales o material infectado (fetos, membranas fetales, secreciones vaginales), o por la ingestión de las bacterias contenidas en productos lácteos no pasteurizados.

Una de las opciones más frecuentemente utilizadas para el control de la brucelosis bovina, es la inmunización de los bovinos con la vacuna cepa-19 (B-19). Lamentablemente la sola estrategia de vacunación no podrá erradicar el problema, para ello es necesario la identificación de los animales infectados y su correcta eliminación. Es allí cuando surgen los grandes problemas, pues este tipo de vacuna tiene la desventaja de producir anticuerpos aglutinantes, que interfieren tanto en las pruebas de aglutinación, así como en el iELISA y el "Skin test", lo que dificulta el diagnóstico correcto, interfiriendo en la comprensión real del problema y la búsqueda de soluciones adecuadas.

La presencia de la brucelosis en la ganadería ecuatoriana fue evidenciada por Salvestroni en 1926, posteriormente a pesar de los esfuerzos realizados en los trabajos de investigación relacionados a la brucelosis animal en Ecuador, la falta de técnicas de diagnóstico estandarizadas de alta sensibilidad y especificidad, inadecuada interpretación de resultados, así como el bajo número de aislamientos y tipificaciones de Brucella spp., ha impedido tener una apreciación veraz del problema.

Este trabajo fue realizado con el objetivo de generar información confiable sobre la situación epidemiológica de la brucelosis bovina y su impacto en la salud pública en la región noroeste de Ecuador, y los factores de riesgo que se asocian; conocimiento que ayude a tomar decisiones adecuadas por parte de los Organismos Oficiales responsables de la vigilancia de esta zoonosis en Ecuador, basado en la contextualización de problemas. Con este fin, se establecieron cuatro objetivos específicos.

Este manuscrito de tesis, está dividio en dos grandes secciones: la introducción elaborada para proveer un acercamiento a la literatura existente sobre brucella sp. y la brucellosis, y la sección experimental en la cual se presentan los estudios realizados en humanos y animales en Ecuador, realiados durante las fases de campo y laboratorio.

En la sección de introducción, se abordan aspectos generales sobre el agente causal de la enfermedad, aspectos epidemiológicos y de la respuesta inmunitaria de los hospederos, así como las particularidades de los diferentes métodos utilizados para su diagnóstico directo e indirecto, además se presenta un revisión bibliográfica sobre los sistemas de crianza animal en Ecuador, a fin de establecer la situación actual de la brucelosis (Objetivo 1).

La sección experimental presenta los estudios realizados en animales, con la finalidad de caracterizar el agente causal, determinar la prevalencia real de la infección, y estimar los parámetros de sensibilidad y especificidad de los test de diagnóstico utilizados (Objetivo 2), y para establecer la importancia zoonótica de la brucelosis (Objetivo 3).

Primero, se presentan los resultados obtenidos del estudio realizado en bovinos de la zona nor-oeste del Ecuador: y luego las observaciones realizadas durante el estudio de la brucelosis en los caprinos de dos regiones de Ecuador.

En el caso de los humanos, son presentados los resultados de los estudios para determinar la prevalencia real, factores de riesgo y caracterización de ahente causal, determinació de la sensibilidad y especificidad de las pruebas diagnósticas utilizadas, y la presentación del seguimiento clínico - serológico de un caso de orquitis.

La tesis finaliza con la presentación de líneas directrices que podrían servir de base para el desarrollo de una estrategia para la vigilancia epidemiológica de la brucelosis bovina y humana, adaptada a las condiciones de la región noroeste de Ecuador. (Objetivo 4).

iii

REMERCIEMENTS

A la fin de ce travail de recherche, les souvenirs se bousculent dans ma tête, tous liés à chacune des étapes de la recherche, tant en Equateur qu’en Belgique. Le chemin parcouru fut en réalité long et difficile, mais mené à terme grâce aux personnes qui étaient à mes côtés et qui ont contribué de loin ou de près à alléger cette charge.

Essayer de résumer le vécu de cette période est impossible, car à chaque étape surgissent des images et un/des nom(s) des replis de ma mémoire. Mon plus sincère remerciement et ma plus grande gratitude à chacun et chacune d’entre vous, qui avez pris part à cette aventure, et à la grande équipe de travail à laquelle je me sens fier d’appartenir.

Un remerciement particulier à mes promoteurs, les Professeurs Claude Saegerman (ULg), Dirk Berkvens (IMT-ITG) et Washington Benítez (CIZ), pour leurs conseils avisés, le partage de leurs connaissances et de leur travail, ainsi que leur patience et compréhension. Un tout grand merci, Claude, de m’avoir contaminé par ton enthousiasme et ta passion pour la recherche dans le vaste monde de la brucellose. Dirk, merci de m’avoir ouvert les portes de l’épidémiologie lors du module du CIPSAT, et d’avoir choisi, en accord avec Jef, cette zoonose importante comme thème du M.Sc; en réalité, il n’y avait pas de meilleur choix possible. Cher Dr Benítez, malgré votre façon particulière de stimuler les gens au travail, au final, cela a porté ses fruits; merci pour vos conseils, spécialement lors des longs voyages à Imbabura et Loja.

Au personnel scientifique du CIZ, qui a contribué directement ou indirectement à la réalisation de ce travail de recherche, Maritza Celi, Margoth Barrionuevo, María- Augusta Chávez, Freddy Proaño, María-Fernanda Mera, Lenin Ron et Richar Rodríguez, tous mes remerciements.

Toute ma reconnaissance à chacun des thésards du CIZ qui a travaillé sur la brucellose, ils ont toujours montré un intérêt particulier à mon travail, bien que je n’étais pas leur directeur de thèse: Elsa Miño, Fabián Pico, Maritza Celi, Laura Vizcaíno, Alexandra Angulo, Andrés Tufiño, Jaime Calva, Tania Solís, Marcelo Ibarra, Mayra Ruiz, Luis Pontón, Francisco Benítez, Pablo González, Marco Larrea, Lizbeth Olmedo, Daniela Barzallo, Elizabeth Minda, José-Luis Espinoza et Mayra Faz. Tant le travail de terrain

que le travail de laboratoire que vous avez développé ont permis, non seulement de collecter les informations de base, mais aussi et surtout de valoriser nos capacités. Mes sincères remerciements à Liz, Daniela et Elly, les filles du “ghetto”, pour leur apport scientifique et technique non négligeable à la recherche développée au sein des laboratoires de Microbiologie et Biologie Moléculaire du CIZ. Merci, Mary et Pablito, votre appui inconditionnel, surtout lors du travail coude à coude sur le terrain, et votre amitié restera gravée à jamais dans ma mémoire.

Je voudrais aussi remercier le personnel administratif du CIZ, Luis Simbaña, Paulina Correa et Angel Mosquera, pour son appui logistique toujours opportun. Merci Luchito d’avoir ramassé les pots cassés que nous avions laissés derrière nous, et à toi, Pauly, pour ta joie et sincérité contagieuses.

Je tiens à exprimer ma gratitude au personnel scientifique du CODA-CERVA, et plus particulièrement aux Dr. Karl Walravens, Prof. Jacques Godfroid et Dr. David Fretin, qui m’ont transmis leurs connaissances au travers de leurs compétences, dans le cadre des tests diagnostiques réalisés en Sérologie, Microbiologie et Biologie Moléculaire (Laboratoire de Référence pour la brucellose). Merci à Luc Utterhaegen, Cristel Demedt, Patrick Michel, Martine Marin, Sylvie Malbrecq et Damian Desqueper pour leur enseignement, leurs conseils et la rigueur de travail en regard d’une maladie aussi dangereuse que la brucellose.

A Jef Brandt (IMT-ITG), je dis merci pour ses précieux conseils et sa motivation dans le cadre de la tâche difficile de présentation et publication des résultats. Merci, cher Jef d’être toujours disponible. Anke Van Hul (IMT), pour ton aide précieuse tout le long du sentier tortueux de standardisation de l’iELISA, les portes de la maison te seront toujours grandes ouvertes. Je remercie aussi le personnel scientifique et administratif de l’IMT, Emmanuel Nji Abatih, Danielle Debois et Nadia Ehliger, qui a collaboré pour la finalisation de ce travail.

Ma reconnaissance éternelle au peuple Belge, qui, au travers de ses impôts, contribue au développement de son pays et d’autres, grâce à la collaboration internationale et interuniversitaire. Sans votre soutien économique, canalisé par différentes institutions

qui m’ont ouvert leurs portes au cours de mon travail, la collecte d’informations épidémiologiques très utiles pour l’Equateur et le monde entier n’aurait pas été rendue possible. Je tiens à souligner l’aide précieuse apportée par la Direction générale Coopération au développement et Aide humanitaire (DGD), la Coopération Technique Belge (CTB) et l’Académie de Recherche et d'Enseignement supérieur (ARES-ULg).

Je tiens également à remercier l’Université Centrale d’Equateur et le Centre International sur les Zoonoses (CIZ) pour leur appui logistique et financier, sans lequel ce travail de terrain n’aurait pu être réalisé. Pour le dialogue et le travail collaboratif, je dis merci aux Facultés de Médecine Vétérinaire et des Sciences Chimiques de l’Université Centrale d’Equateur, à l’Agence Equatorienne d’Assurance Qualité de l’Agriculture (AGROCALIDAD), au Ministère de la Santé Publique (MSP), au projet PROCANOR, à l’Entreprise Métropolitaine des Résidus de Quito, à l’Abattoir Municipal d’Ibarra et à l’Hôpital Voz Andes de Quito. Mes sincères remerciements vont aussi à l’Université des Forces Armées (ESPE) pour son appui durant la phase finale de la thèse.

Je remercie les propriétaires et travailleurs des Unités de Production Agricole pour leur participation volontaire et leur grande collaboration tout au long de ce travail.

Merci à toutes celles et ceux qui ont rendu agréables mes séjours en Belgique, Marie- France Humblet, Mario Machado et Laetitia Lempereur. Merci, Marie-France et Mario, pour votre amitié et votre confiance. Je voudrais aussi remercier les personnes suivantes que j’ai connues en Belgique et avec qui j’ai passé de nombreux moments agréables: Amel Adel, Dolf Michielsen, Nicolas Praet, Deko Moleka, Maixent-Cyr-Teddy Bekangba, Emma Resplandy, Zahira Auladin, Ngendakuriyo Pie, Katrien Santy et Abdou Razac Boukary.

Je tiens à remercier les collègues de l’Unité de Recherche en Epidémiologie et Analyse de Risque Appliquées aux Sciences Vétérinaires» (UREAR-ULg), Ludovic Martinelle, Noëmie El Agrebi, Véronique Renault, Quentin Nemery, Fabiana Dal Pozzo et Juana Bianchini pour leurs conseils et compagnie. Un merci particulier à Marie-France Humblet pour son aide dans la rédaction de la thèse en “bon français”.

iii

Ma plus sincère et profonde gratitude à mes parents, Jorge et Victoria, pour leur support émotionnel inconditionnel à chaque étape de ma vie, et à mes frères et soeurs, Carlitos, Carmita et Rebequita, d’avoir été des exemples de travail, de dépassement de soi, de ténacité et de valeurs. Ma reconnaissance spéciale à mon épouse, María-Augusta, un véritable appui et une compagne d’aventure et de travail, et à mes filles, Emilia y María- Inés, pour leur compréhension d’avoir entendu parler continuellement de “vache brucellique”. A mes amis et autres membres de la famille, je dis merci d’avoir toujours été présents et de m’avoir soutenu. Finalement, mon ultime remerciement va au Père Céleste, pour son immense miséricorde et sa bénédiction. A toi la gloire, “mon Père”.

AGRADECIMIENTOS

Al finalizar este trabajo de investigación, los recuerdos se agolpan en mi mente, pensamientos ligados a las actividades realizadas en cada una de las etapas de investigación tanto en Ecuador como en Bélgica. El camino recorrido fue en verdad largo y duro, pero siempre llevadero gracias a las personas que estuvieron a mi lado, y que contribuyeron directa o indirectamente a aligerar la carga.

Tratar de resumir lo vivido en este tiempo, es imposible, pues siempre surgirán de los pliegues de nuestra memoria, imágenes y nombre. Mi más sincero reconocimiento público y gratitud a cada uno de ustedes, quienes fueron parte de esta aventura y del numeroso equipo de trabajo del cual me siento orgulloso de hacer pertenecido.

Un reconocimiento especial a mis estimados promotores, Prof. Claude Saegerman (ULg), Prof. Dirk Berkvens (IMT-ITG), Prof. Washington Benítez (CIZ) por sus consejos oportunos, el compartir de sus conocimientos y mística de trabajo, así como por su paciencia y comprensión. Sin duda, este trabajo ha llegado a feliz término gracias a constante soporte y seguimiento. Muchas gracias Claude por contagiarme de tu entusiasmo y pasión por la investigación en el amplio mundo de la brucelosis. Dirk, gracias por haberme abierto las puestas a la epidemiología durante su módulo del CIPSAT, y haber escogido, junto con Jef, esta importante zoonosis como tema de la M.Sc., en verdad fue la mejor elección. Estimado Dr. Benítez, al parecer su particular forma de estimularme al trabajo al final dio frutos; muchas gracias por sus consejos especialmente en los largos viajes a Imbabura y Loja.

Al personal científico del CIZ, que directa o indirectamente contribuyeron en la realización de este trabajo de investigación: Maritza Celi, Margoth Barrionuevo, María- Augusta Chávez, Freddy Proaño, María-Fernanda Mera, Lenin Ron y Richar Rodríguez, mis agradecimientos.

Un profundo reconocimiento a cada uno de los tesistas de brucelosis del CIZ, quienes tuvieron siempre un espíritu enseñable, a pesar de no haber sido yo su director de tesis: Elsa Miño, Fabián Pico, Maritza Celi, Laura Vizcaíno, Alexandra Angulo, Andrés Tufiño, Jaime Calva, Tania Solís, Marcelo Ibarra, Mayra Ruiz, Luis Pontón, Francisco Benítez, Pablo González, Marco Larrea, Lizbeth Olmedo, Daniela Barzallo, Elizabeth

Minda, José-Luis Espinoza, Mayra Faz. El trabajo prospectivo de campo y laboratorio por ustedes desarrollado, no solo permitió tener información de base, sino y principalmente permitió valorar nuestras capacidades. Mi reconocimiento especial a Liz, Daniela y Elly, las chicas del “gheto”, por su sustancial aporte científico-técnico a la investigación desarrollada en los laboratorios de Microbiología y Biología Molecular del CIZ. Gracias Mary y Pablito por su apoyo incondicional especialmente durante el trabajo de campo, el trabajo hombro a hombro y amistad siempre fueron sus distintivos.

También quisiera agradecer pos el apoyo logístico siempre oportuno del personal administrativo del CIZ: Luis Simbaña, Paulina Correa y Angel Mosquera. Gracias Luchito por limpiar cada desastre que dejábamos a nuestra paso; y a ti Pauly por tu contagiante alegría y sinceridad.

Quisiera dejas constancia de mi reconocimiento al personal científico del CODA- CERVA: Dr. Karl Walravens, Prof. Jacques Godfroid, Dr. David Fretin, quienes gracias a su confianza fue posible la adquisición de conocimientos y destrezas en la realización del gran número de pruebas diagnósticas aplicadas en los laboratorios de Serología, Microbiología y Biología Molecular, en un Laboratorio de Referencia para brucelosis. Gracias Luc Utterhaegen, Cristel Demedt, Patrick Michel, Martine Marin, Sylvie Malbrecq y Damian Desqueper, por sus enseñanzas, consejos y forma de trabajar con una enfermedad tan peligrosa como es la brucelosis.

A Jef Brandt (IMT-ITG) por sus valiosos consejos y motivación durante la siempre difícil tarea de presentación y publicación de resultados. Gracias querido Jef por siempre estar disponible. A Anke Van Hul (IMT) por su valiosa ayuda durante el tortuoso proceso de estandarización del iELISA, las puestas de la casa siempre seguirán abiertas para personas como tú. Al personal científico y administrativo del IMT, que colaboraron para que esta tesis llegue a feliz témino: Emmanuel Nji Abatih, Danielle Debois y Nadia Ehliger.

Un reconocimiento eterno a los habitantes de Bélgica, quienes a través de sus impuestos, contribuyen al desarrollo de su país, así como de otros gracias a la Colaboración Internacional e Inter-universitaria. Sin su aporto económico, canalizado

por diferentes instituciones que me abrieron sus puertas durante este largo tiempo de trabajo, no hubiera sido posible la obtención de información epidemiológica de gran utilidad para el Ecuador y el mundo. Quisiera destacar el importante aporte realizado por: Dirección General de Cooperación Internacional del Gobierno de Bélgica (DGCI), Cooperación Técnica Belga (CTB-BTC), y la Academia de Investigación y de Enseñanza Superior (ARES - ULg).

Quisiera dejar constancia de mi agradecimiento a la Universidad Central del Ecuador y a su Centro Internacional de Zoonosis - CIZ, por su apoyo logístico y financiero, sin el cual el importante trabajo de campo no hubiera sido posible realizar. A cada una de las instituciones que estuvieron dispuestas para el diálogo y trabajo colaborativo: Facultades de Medicina Veterinaria y Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro – AGROCALIDAD, Ministerio de Salud Pública – MSP, Proyecto PROCANOR, Empresa Metropolitana de Rastro de Quito, Camal Municipal de Ibarra, Hospital Voz Andes Quito. A la universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE, por su apoyo durante la fase final de esta tesis.

A los propietarios y trabajadores de las Unidades de Producción Agrícola, por su participación voluntaria y gran colaboración en el transcurso del presente trabajo.

Un agradecimiento a todos aquellos que hicieron posible que mi estadía en Bélgica durante los múltiples viajes haya sido siempre agradable: Marie-France Humblet, Mario Machado, Laetitia Lempereur. Gracias, Marie-France y Mario por su amistad y confianza. Quisiera también agradecer el tiempo y vivenciar compartidas con grander personas que pudo conocer durante el tiempo trnascurrido en Bélgica: Amel Adel, Dolf Michielsen, Nicolas Praet, Deko Moleka y Maixent-Cyr-Teddy Bekangba, Emma Resplandy, Zahira Auladin, Ngendakuriyo Pie, Katrien Santy, Abdou Razac Boukary.

A los compañeros de la «Unité de Recherche en Epidémiologie et Analyse de Risque Appliquées aux Sciences Vétérinaires» (UREAR-ULg), por sus consejos y compañia: Ludovic Martinelle, Noëmie El Agrebi, Véronique Renault, Quentin Nemery, Fabiana

iii

Dal Pozzo, Juana Bianchini. Un especial agradecimiento a Marie-France Humblet, por su valiosa ayuda al poner el texto de la tesis en un “buen francés”.

Mi más profundo y sincero agradecimiento a mis padres, Jorge y Victoria, por su invalorables soporte principalmente emocional durante cada etapa de mi vida; a mis hermana Carlitos, Carmita y Rebequita, por ejemplo de trabajo, superación, tenacidad y valor. Un especial reconocimiento a mi esposa María-Augusta, una verdadera “ayuda idónea” y compañera de aventura y trabajo; a mis hijas Emilia y María-Inés por su comprensión al haber escuchado hablar continuamente de “la vaca brucela”. A mis amigos y demás familiares, gracias por estar siempre presentes.

Finalmente, pero el principal reconocimiento a mi Padre Celestial, por su inmensa misericordia y multitud de bendiciones. A ti la gloria “aba padre”.

TABLE DES MATIERES

Dédicace ...... i Dedicatoria ...... i RÉSUMÉ ...... i

VERSION FRANÇAISE ...... I

SUMMARY ...... xii

ENGLISH VERSION ...... XII

RESUMEN ...... i

VERSIÓN EN ESPEÑOL ...... I

REMERCIEMENTS ...... i AGRADECIMIENTOS ...... i TABLE DES MATIERES ...... i LISTE DES ABREVIATIONS ...... i LISTE DES TABLEAUX DE L’INTRODUCTION ...... i INTRODUCTION ...... 1

PRÉAMBULE ...... 2

INTRODUCTION ...... 5

PARTIE 1: BRUCELLOSES: GÉNÉRALITÉS, ÉPIDÉMIOLOGIE, RÉPONSE IMMUNITAIRE, SIGNES CLINIQUES, DIAGNOSTIC ET

VACCINATION...... 5

1.- Généralités ...... 1

1.1.- Historique ...... 1

1.2.- Synonymes ...... 3

1.3.- Importance en santé publique et impact économique ...... 3

1.4.- Brucella et le bioterrorisme ...... 5

2.- Le genre Brucella ...... 5

2.1.- Généralités ...... 5

2.2.- Structure ...... 7

2.3.- Le Lipopolysaccharide ...... 7

3.- Epidémiologie ...... 8

3.1.- Résistance dans l’environnement ...... 8

3.2.- Modes de transmission ...... 8

3.3.- Espèces animales sensibles ...... 9

3.4.- Distribution géographique ...... 9

3.5.- Vecteurs mécaniques...... 10

3.6.- Groupes humains à risque ...... 10

4.- Réponse immunitaire ...... 11

4.1.- Pathogénie ...... 11

4.2.- Réponse immunitaire de type humoral ...... 12

4.2.1.- Généralités ...... 12

4.2.2.- Réponse immunitaire humorale après vaccination ...... 13

4.3.- Réponse immunitaire de type cellulaire ...... 13

4.3.1.- Généralités ...... 13

5.- Tableau clinique ...... 13

5.1.- Chez l’homme ...... 13

5.2.- Chez les animaux ...... 14

5.2.1.- L'avortement ...... 14

6.- Diagnostic ...... 15

6.1.- Diagnostic chez les animaux ...... 15

6.1.1.- Diagnostic bactériologique ...... 15

6.1.2.- Diagnostic moléculaire ...... 16

6.1.3.- Méthode diagnostique reposant sur la détection de la réponse humorale...... 16

6.1.4.- Méthodes diagnostiques reposant sur la réponse immunitaire de type cellulaire ...... 22

6.2.- Diagnostic chez l’homme ...... 23

6.2.1.- Considérations générales ...... 23

6.2.2.- Diagnostic direct ou bactériologique ...... 23

6.2.3.- Diagnostic indirect ou sérologique ...... 24

7.- Vaccination ...... 24

7.1.- Souche 19 ou B-19 ...... 24

7.2.- Vaccin 45/20 ...... 27

7.3.- Vaccin RB-51 ...... 27

8.- Principes épidémiologiques ...... 28

8.1.- Prévalence (P) ...... 28

8.2.- Incidence (I) ...... 28

8.3.- Facteurs de risque ...... 29 ii

9.- Les caractéristiques des tests de dépistage ...... 30

9.1.- Sensibilité (Se) ...... 30

9.2.- Spécificité (Sp) ...... 31

9.3.- Valeur Prédictive Positive d’un résultat positif (VPP) ...... 31

9.4.- Valeur Prédictive Positive d’un résultat négatif (VPN)...... 31

INTRODUCTION ...... 32

PARTIE 2: LE SYSTÈME D’ÉLEVAGE ET LA SITUATION ACTUELLE DE LA BRUCELLOSE EN EQUATEUR ...... 32

ARTICLE 1 ...... 34

BRUCELLOSIS IN ECUADOR: A CRITICAL REVIEW OF THE CURRENT SITUATION, PROSPECT AND CHALLENGES...... 34

OBJECTIFS ...... 68 SECTION EXPÉRIMENTALE ...... 70

PARTIE 1: ESTIMATION DE LA SENSIBILITÉ ET LA SPÉCIFICITÉ DES TESTS DE DIAGNOSTIC ET ESTIMATION DE LA PRÉVALENCE

RÉELLE DE LA BRUCELLOSE BOVINE DANS LE NORD DE L'ÉQUATEUR ...... 71

ARTICLE 2 ...... 73

BOVINE BRUCELLOSIS IN NORTH-WEST ECUADOR: TYPING OF BRUCELLA SPP., SEROPREVALENCE, AND ASSOCIATED RISK

FACTORS...... 73

PARTIE 2: BRUCELLOSE CAPRINE EN EQUATEUR ...... 99

ARTICLE 3 ...... 101

UNEXPECTED DISCOVERY OF BRUCELLA ABORTUS BUCK B-19 VACCINE IN GOATS FROM ECUADOR...... 101

PARTIE 3: DÉTERMINATION DE LA SÉROPRÉVALENCE, DES FACTEURS DE RISQUE ET DES ESPÈCES ET BIOVARS DE ...... 116

ARTICLE 4 ...... 118

HUMAN BRUCELLOSIS IN NORTH-WEST ECUADOR: TYPIFYING OF BRUCELLA SPP., SERO-PREVALENCE, AND ASSOCIATED RISK

FACTORS ...... 118

PARTIE 4: PERFORMANCE DES TESTS UTILISÉS POUR LE DIAGNOSTIC DE LA BRUCELLOSE HUMAINE EN EQUATEUR ...... 131

ARTICLE 5 ...... 133

BAYESIAN EVALUATION OF THREE SEROLOGICAL TESTS FOR DETECTING ANTIBODIES AGAINST BRUCELLA SPP. AMONG

HUMANS IN THE NORTH-WESTERN PART OF ECUADOR...... 133

PARTI 5: ÉVALUATION DE L'IMPORTANCE ZOONOTIQUE DE LA BRUCELLOSE EN EQUATEUR ...... 167

ARTICLE 6 ...... 169

FIRST REPORT OF ORCHITIS IN MAN, CAUSED BY BRUCELLA ABORTUS BIOTYPE 1 IN ECUADOR ...... 169 iii

DISCUSSION GÉNÉRALE ...... 176 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ...... 198 RÉFÉRENCES ...... 202 ANNEXES ...... 227

POSTER 1 ...... 228

VALIDATION OF DIAGNOSTIC TEST TO DETECT BRUCELLOSIS AND EPIDEMIOLOGICAL SURVEY IN THE ECUADORIAN ANDES 228

POSTER 2 ...... 232

DOGS AS POTENTIAL MECHANICAL VECTOR OF TRANSMISSION OF BRUCELLA SPP. IN DAIRY CATTLE IN THE SIERRA OF

ECUADOR...... 232

LISTE DES ABREVIATIONS

Abréviations

Ac Anticorps Ag Antigène ac Agglutination complète ai Agglutination incomplète Bayes-P Posterior predictive check probability BPAT Buffered Antigen Plate Agglutination Test (=épreuve d'agglutination sur lame à l'antigène tamponné) B-19 Souche vaccinale Buck 19 (également appelée S19) CERVA Centre d’Etude et de Recherche Vétérinaires et Agrochimiques (Belgique) CFT Complement Fixation Test (= test de fixation du complément) CIZ Centro Internacional de Zoonosis (Universidad Central del Ecuador) DIC Deviance Information Criterion (= critère d’information de déviance) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (= acide éthylène diamine tétra-acétique) FAO Fonds des Nations Unies par l’Alimentation et l’Agriculture FCS Fetal Calf Serum (= sérum de foetus bovin) FN Faux négatif FP Faux positif g gramme HRPO Horseradish Peroxydase (= peroxydase de raifort) I Incidence IA Insémination artificielle iELISA Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (= test d’immuno- absorption enzymatique indirecte réalisé sur sérums) iELISA-L Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-L (= test d’immuno- absorption enzymatique indirect réalisé sur le lait IC Intervalle de confiance I Cr Intervalle de crédibilité IgA Immunoglobuline de type A IgG Immunoglobuline de type G

IgM Immunoglobuline de type M km2 kilomètre carré l litre LPS Lipopolysacharide M mole MAGAP Ministère de l’Agriculture et de l’Élevage mg milligramme ml millilitre mM millimole mm millimètre MRT Milk Ring Test (= épreuve de l’anneau sur le lait) msnm Metros sobre el nivel del mar (= mètres d’altitude) MSP Ministère de la Santé Publique N normal (normalité) NBCS Newborn Calf Serum (= sérum de veau nouveau-né) NEca Niveau d’exposition des cas NEco Niveau d’exposition des témoins nm nanomètre OIE Organisation Internationale de la Santé Animale OMS Organisation Mondiale de la Santé OPS Organisation Panaméricaine de la Santé OR Odds Ratio P Prévalence réelle p’ Prévalence apparente PANAFTOSA - Centre Panaméricain de la fièvre aphteuse PBS Phosphate-Buffered Saline (= tampon phosphate salin) PCR Réaction en chaîne par polymérase PCR-711 PCR dirigée sur la séquence d’insertion 711 de Brucella spp. pD Number of parameters estimated (= nombre de paramètres estimés) PNSA Programme National de Santé Animale RB Rose de Bengale (= Épreuve d'agglutination rapide sur plaque)

RB51 Souche vaccinale RB51. Il s’agit d’une souche mutant de la souche 2308 de Brucella abortus. Elle est résistante à la rifampicine qui est l’antibiotique de choix dans le traitement de la brucellose humaine. RE+ Risque dans le groupe exposé RE- Risque dans le groupe non exposé RR Risque Relatif SAT Serum Agglutination Test (= test de séro-agglutination lente, épreuve de Wright) SAT-EDTA Test de séro-agglutination lente en présence d'EDTA SAT-2ME Épreuve de Wright en présence de 2-Mercaptoetanol Se Sensibilité SESA Service Équatorien de Santé Agricole Sp Spécificité ST Skin Test (= test cutané) μg microgramme UI Unité Internationale μl microlitre UCF Unités Formant des Colonies UPA Unité de production Agricole VP Vrais positif VN Vrais négatif VPN Valeur prédictive négative VPP Valeur prédictive positive °C Degré centigrade

iii

LISTE DES TABLEAUX DE L’INTRODUCTION

Tableau 1.1 Tests permettant de différencier les biotypes de Brucella (Alton et al., 1988; Marín & Blasco, 2001)...... 6 Tableau 1.2 Hôtes accidentels de Brucella spp. (Alton et al., 1988; Godfroid et al., 2010; Saegerman et al., 2010) ...... 10 Tableau 1.3 Avantages, inconvénients et paramètres de sensibilité et de spécificité) des tests de diagnostic de la brucellose bovine...... 25 Tableau 1.4 Caractéristiques permettant de distinguer une souche vaccinale ...... 27 B. abortus (souche 19) d'une souche sauvage B. abortus typique (biovar 1) ...... 27 (Alton et al., 1988) ...... 27 Tableau 1.5 Répartition des effectifs dans le cadre d’une étude exposés/non exposés (Toma et al., 2010a) ...... 29 Tableau 1.6 Effectifs dans une étude cas-témoins (Toma et al., 2010a) ...... 30 Tableau 1.7 Définitions des notions de sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive et valeur productive négative d’un test (Toma et al., 2010b) ...... 31 Tableau 4.1 Résultats des tests réalisés dans le cadre du diagnostic de brucellose chez les animaux non vaccinés ...... 177 Tableau 4.2 Estimations de la sensibilité et de la spécificité des tests appliqués dans le cadre du diagnostic de la brucellose bovine ...... 178 Tableau 4.3 Information complémentaire concernant les animaux chez lesquels Brucella abortus biotype 4 a isolée ...... 179 Tableau 4.4 Résultats du suivi des vaccins contre la brucellose bovine utilisés dans la zone d'étude ...... 179

INTRODUCTION

Préambule

La brucellose est une maladie infectieuse causée par des bactéries du genre Brucella, qui peuvent affecter différentes espèces animales telles que les bovins, les moutons, les chèvres, les porcs et les chevaux. Chez ces espèces, des infections chroniques ont été rapportées. Le premier isolement de l'agent causal chez les bovins a été réalisé au Danemark en 1897, mais onze ans après que Bruce Davis ait identifié l'infection chez l’homme suite à l’isolement de Micrococcus mellitensis1, caractérisant ainsi cette infection comme étant une zoonose.

La prévalence et l’incidence de la brucellose chez l'homme sont directement liées à la présence de l'infection au sein des réservoirs animaux. Chez ces derniers, des troubles de la reproduction tels que l’avortement, la rétention du placenta, l’orchite - épididymite et la stérilité sont rapportés. Les pertes économiques causées par la brucellose ne sont pas seulement liées aux effets directs sur la santé humaine et animale, mais aussi à des restrictions en termes de commercialisation des animaux et de leurs produits.

La brucellose bovine est apparue en Equateur suite à l’introduction d’animaux infectés au moment de la conquête espagnole, bien que sa présence n’ait été confirmée officiellement qu’en 1955. La prévalence réelle et la distribution de Brucella sp. chez les bovins sont inconnues en Equateur. Seule une enquête nationale sérologique menée en 1979 a permis de mettre en évidence la présence d'anticorps contre l'agent causal.

Les actions mises en œuvre pour le contrôle et l'éradication de la brucellose dans le monde entier reposent principalement sur la vaccination des animaux et l'abattage des animaux infectés. En raison des réactions croisées liées à la vaccination, et au vu des particularités des tests de laboratoire, la fiabilité du diagnostic de l'infection chez l’homme et les animaux a toujours porté à discussion.

1 Ultérieurement dénommée Brucella melitensis. 3

Actuellement, la brucellose est considérée comme une maladie ré-émergente, en raison de la recrudescence des cas humains liés aux voyages et à l'ingestion de produits laitiers, dans les zones où l'infection est toujours présente parmi les réservoirs animaux.

L'introduction de cette thèse vise, dans un premier temps, à donner une appréciation sur les aspects généraux de l'agent causal et de l'infection chez l'homme et chez les différents réservoirs animaux, ainsi que sur l’épidémiologie de la maladie. Dans la seconde partie, les caractéristiques du système d'élevage en Equateur ainsi qu’une revue de littérature ciblant les études sur les brucelloses humaine et animale en Equateur seront développés.

INTRODUCTION

Partie 1: Brucelloses: généralités, épidémiologie, réponse immunitaire, signes cliniques, diagnostic et vaccination.

1.- Généralités 1.1.- Historique La brucellose serait apparemment connue depuis l'époque d’Hippocrate, c’est-à-dire 400 ans avant Jésus Christ, bien que les premières descriptions détaillées sur cette maladie n’aient été réalisées qu’en 1751 par Cleghorn (Ruiz Castañeda, 1954; Suárez, 2001). La première description clinique fiable de la maladie remonte à 1859 et est attribuée à Marston (Nicoletti, 2002).

Jusqu'en 1875, le mode de transmission de cette infection était toujours inconnu, et représentait une source de polémique entre médecins, vétérinaires et producteurs. En 1870, Franck, et ensuite Lehnert et Brauel, ont provoqué un avortement après avoir placé dans le vagin de vaches saines des fragments de placentas provenant de vaches avortées. En 1875, Saint et Cyr conclurent que l’avortement épizootique des bovins était causé par un agent non encore déterminé. En 1886, Woodhead provoqua l'avortement de vaches et de chèvres en plaçant des sécrétions vaginales provenant de vaches infectées dans leurs voies génitales (OIE, 2000; Young, 1997).

Cette maladie fut d’abord étudiée chez l’homme, et après seulement chez les animaux domestiques. C’est en 1886 que Bruce isola l'agent causal à partir de la rate de soldats morts après avoir contracté cette infection, caractérisée par une fièvre ondulante; il a alors baptisé cet agent Micrococcus melitensis (Nicoletti, 2002). Ce n’est qu’onze ans après, en 1897, que le vétérinaire danois Bang isola l'agent responsable d’avortement infectieux chez le bovin et le surnomma «Bacille de Bang».

En 1897, Wright & Smith mirent au point une méthode de diagnostic sérologique basée sur la propriété d’agglutination des sérums sanguins de patients envers des cultures de Micrococcus melitensis. Wright se fit vacciner avec ces bactéries mortes mais contracta ensuite la maladie (OIE, 2000; Young, 1997).

En 1905, 19 ans après le premier isolement du Micrococcus melitensis, Zammit & Horrocks isolèrent le micro-organisme dans le lait des chèvres, mettant en évidence pour la première fois l'importance épidémiologique que représente les mammifères domestiques dans le cycle de transmission. Cette découverte a permis d’instaurer la première mesure de contrôle, à savoir interdire aux soldats anglais de consommer du lait de chèvre.

En 1911, Schroeder et Cotton, mais aussi Moudre et Traum, isolèrent l'agent causal respectivement dans le lait de vache et à partir d’amygdales d'enfants qui consommaient ce lait. Ils ont ainsi déterminé le rôle épidémiologique que jouent les bovins dans la transmission de cette zoonose (Godfroid et al., 2010; Saegerman et al., 2010).

En 1914, Traum rapporta l'existence d’un troisième membre de l'actuel genre Brucella, à savoir Brucella suis, isolé à partir de fœtus avortés de truies. Néanmoins, ce n’est que dix ans plus tard que Keefer rapporta l'infection chez l'homme (Godfroid et al., 2010; Saegerman et al., 2010).

La relation entre l'agent causal de la fièvre de Malte et la maladie de Bang a été mise en évidence en 1920, au travers des travaux d’Alice Evans. C’est elle-même qui suggéra de baptiser l'agent causal «Brucella» en hommage à David Bruce.

En 1929, Huddleson développa des techniques permettant de différencier B. abortus, B. melitensis et B. suis (Bowden, 1996). La souche vaccinale de B. abortus 19 (B19 ou S19) a été isolée en 1923 par Buck, qui démontra son pouvoir protecteur chez les bovins dès 1930. Les vaccins vivants atténués ont fait leur apparition en 1945 avec la souche Brucella abortus 45/20 mise au point par Mc Ewwen et Priestly et c’est Elberg qui a créé la première souche mutante de Brucella melitensis Rev-1.

Mc Farlane et ses collaborateurs furent les premiers à isoler Brucella ovis en Nouvelle Zélande en 1950. En 1968, Carmichael et Bruner isolèrent pour la première fois Brucella canis (Bowden, 1996).

Depuis la création du genre Brucella, réalisée en 1920 par Meyer et Shaw, jusqu'à 1963 uniquement l'espèce Brucella suis a été ajoutée dans ce genre. Au cours des 30 dernières années, trois nouvelles espèces de Brucella (B. canis, B. ovis, et B. neotomae) ont été officiellement ajoutées à ce groupe. Brucella neotomae, qui, comme toutes les espèces classiques est lisse, ce qui ne fut pas le cas pour les espèces naturellement rugueuses (B. ovis et B. canis) dont le rattachement au genre Brucella fut plus difficile (Saegerman et al., 2010; Suárez, 2001). Plus récemment, de nouvelles espèces sont venues s’ajouter: Brucella ceti et Brucella pinnipedialis chez les mammifères marins (Maquart et al., 2009), Brucella inopinata isolée d’un implant humain (Scholz et al., 2010) et enfin Brucella papionis (Whatmore et al., 2014).

1.2.- Synonymes Au fil des années, la brucellose humaine a acquis plusieurs synonymes, tels que: fièvre ondulante, septicémie de Bruce, fièvre Méditerranéenne, fièvre de Malte, fièvre du Rio Grande (López, 2002), fièvre gastrique, (Mammerickx, 1990), fièvre du Gibraltar, fièvre de Chypre, fièvre sudorale, fièvre caprine, fièvre de Traum ou encore fièvre du Peñon (Kelser & Schoening, 1946). Chez les animaux, elle est connue comme maladie de Bang, avortement contagieux et avortement épizootique. Ces expressions font référence, tantôt aux signes cliniques de la maladie, tantôt à sa localisation géographique.

1.3.- Importance en santé publique et impact économique Malgré les efforts de contrôle et/ou d’éradication, la brucellose est considérée par les organismes internationaux comme la zoonose la plus répandue dans le monde (Gil & Samartino, 2001; OIE, 2016a). Elle est toujours présente à l’état endémique dans de nombreux pays d'Amérique du Sud, dans les pays du bassin méditerranéen, au Moyen- Orient, en Afrique et en Asie occidentale (Lucero et al., 2008).

Cinq des espèces traditionnellement reconnues (B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis et B. canis) peuvent causer une infection chez l'homme (M. Corbel, 2006; Doganay et al.,

2003). Les espèces isolées de mammifères marins présentent aussi un caractère zoonotique (Corbel, 2006; Godfroid et al., 2005).

On estime, qu'au niveau mondial, entre 400 000 et 500 000 nouveaux cas de brucellose humaine sont rapportés annuellement (Alvarez, 2001). Son importance est liée aux conséquences néfastes qu'elle provoque en santé publique et aux importantes pertes économiques associées (Halling et Boyle, 2002; Spînu et al., 1966).

Vu le caractère chronique de la maladie chez l’homme, les pertes économiques sont consécutives aux incapacités liées à la maladie, à une diminution des heures de travail ainsi qu’aux coûts engendrés par le traitement (Bowden, 1996). Une étude réalisée au Pérou a estimé le coût minimal associé au traitement de la brucellose à 255 USD par patient, tandis qu’une étude plus récente a évalué ce chiffre à 1.000 USD voire 4.000 USD pour les cas graves (Gil et Samartino, 2001).

Les pertes économiques engendrées par cette infection varient d'un pays à un autre, selon la prévalence réelle de la maladie et les espèces animales concernées. Ainsi Acha et Szyfres (2003) ont précisé qu'en Amérique latine, la brucellose causait une perte annuelle proche des 600 millions de dollars, et ce, rien que pour ses conséquences sur le cheptel bovin. Elles sont principalement liées aux avortements, à la naissances de veaux faibles, à la stérilité des animaux adultes, aux traitements des infections secondaires dus aux métrites et aux mammites, aux diminutions de production laitière et à l'augmentation de l’intervalle entre les vêlages (Acha et Szyfres, 2003; Blood et al., 1987; Corbel, 2006).

Au Mexique, une perte annuelle de 200 millions d'USD a été estimée (Luna-Martínez et Mejía-Terán, 2002), tandis que les pertes économiques générées par la brucellose animale en Amérique Centrale s'élèvent à 25 millions d'USD par an (Moreno, 2002).

La nécessité de certifier que les animaux destinés à l’exportation sont indemnes de plusieurs maladies, parmi lesquelles on retrouve la brucellose, empêche la

commercialisation d'animaux vers l’Amérique du Nord et les pays de l'Union Européenne (UE), dont les exigences sanitaires sont très strictes.

Il a été suggéré que l'aide, tant scientifique que financière, soit dirigée vers les zones endémiques (Pappas et al., 2006).

1.4.- Brucella et le bioterrorisme Les Brucella spp. sont également des agents potentiels du bioterrorisme qui sont repris dans la catégorie B des agents pathogènes des Centres de prévention et de contrôle d’Atlanta.

2.- Le genre Brucella 2.1.- Généralités Les bactéries du genre Brucella sont de petits coccobacilles, immobiles et sans capsule, qui croissent dans des conditions d’anaérobioe, à 37°C. Certains biotypes ont besoin d’une concentration en CO2 comprise entre 5% et 10% (Alton et al., 1988). Sur base du séquençage de l’ADN ribosomique 16S, le genre Brucella appartient à la subdivision α des Protéobactéries (Mantur et al. 2007), laquelle regroupe des organismes caractérisés par leur pouvoir pathogène intracellulaire affectant les plantes (Agrobacterium et Rhizobiaceae) et les animaux (Brucella, Bartonella ou Rickettsia). Ce sont des bactéries dont la longueur varie entre 0.5 et 1.5 μm et leur diamètre de 0.5 à 0.7 μm (Alton et al., 1988).

Les tests classiques, à savoir le besoin en CO2, la sensibilité aux colorants, la production de

H2S, l’activité uréasique, et les réactions d'agglutination avec des sérums mono-spécifiques (ciblant les épitopes A et M), permettent de confirmer l'identité de ces bactéries et sont également utiles dans la différenciation du biotype des principales sous-espèces de Brucella (FAO & OMS, 1986). Le tableau 1.1 résume les tests permettant de différencier les biotypes de Brucella (Alton et al., 1988; Marín et Blasco, 2001).

Tableau 1.1 Tests permettant de différencier les biotypes de Brucella (Alton et al., 1988; Marín & Blasco, 2001). Agglutination Croissance en présence de a Exigence Production avec sérums b Espèce Biotype en CO de H S Fuchsine 2 2 Thionine Safranine A M basique B. melitensis 1 - - + + + - + 2 - - + + + + - 3 - - + + + + + B. abortus 1 +c + - + + + - 2 +c + - - - + - 3 +c + + + + + - 4 +c + - +d + - + 5 - - + + + - + 6 - - + + + + - 9 + o - + + + + - + B. suis 1 - + + -e - + - 2 - - + - - + - 3 - - + + - + - 4 - - + -f - + + 5 - - + - - - + B. neotomae - + -g - - + - B. ovis + - + -f - - - B. canis - - + -f - - - B. cetaceae - - + + + + - B. pinnipediae + - + + + + - B. abortus 19 - + - + + + - B. abortus RB51 + + - + + - - B. abortus Rev.1 - - - - + - + a Concentration de 20 µg/ml de thionine et de fuchsine basique et 100 µg/ml de safranine ajoutées au milieu sérum dextrose agar b A= sérum mono-spécifique anti-A, B = sérum mono-spécifique anti-B c Positif pour le majorité des souches d Quelque souches isolées au Canada, en Grande-Bretagne et aux USA sont inhibées par la fuchsine basique e Quelque souches résistantes à la fuchsine basique ont été isolées en Amérique du Sud et dans le Sud-Est Asiatique f Négatif pour la majorité des souches g Croissance à une concentration en thionine de 10 µg/ml

L'étude des acides nucléiques a permis de démontrer le faible degré de différence entre les espèces de ce genre (Mellado, 1996). Brucella melitensis, B. abortus, B. suis et B. neotomae présentent presque 100% d'homologie au niveau de leur séquence en poly nucléotides. Brucella ovis, quant à elle, présente 94% d'homologie avec les autres espèces, la différence étant due au fait que 6% des bases du génome sont manquantes chez cette espèce (Moriyón & López-Goñi, 2001; Vizcaíno, Cloeckaert, Verger, Grayon, & Fernández-Lago, 2000). Pour cette raison, il a été proposé de réduire le genre à une seule espèce, à savoir B. melitensis, avec multiples biotypes, mais cette proposition n'a pas encore

été acceptée (Acha & Szyfres, 2003). La nomenclature actuelle reste en vigueur, au vu des différences en matière de préférences d’hôtes selon les espèces, de leur distribution géographique et de leurs caractéristiques métaboliques (Mellado, 1996; Moriyón & López- Goñi, 2001). En conséquence, les deux systèmes taxonomiques sont utilisés.

Les souches de Brucella isolées de mammifères marins semblent ne pas pouvoir s'adapter complètement aux espèces classiques; la création de nouvelles espèces a donc été suggérée (Marín & Blasco, 2001).

2.2.- Structure Parmi les onze espèces de Brucella existantes, neuf d'entre elles (B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. neotomae, B. pinnipedialis, B. ceti, B. microti, B. inopinata and B. papionis) se présentent en phase lisse (s), tandis que deux (B. ovis et B. canis) se présentent en phase rugueuse (r) (Acha & Szyfres, 2003; Alton et al., 1988; Jacques Godfroid et al., 2010; Saegerman et al., 2010) Les espèces de Brucella sont classées comme lisses ou rugueuses en fonction de l'aspect de leurs colonies en culture sur milieu solide. Celui-ci est lié à l'expression particulière de lipopolysaccharides (LPS) de surface par les bactéries. Chez les espèces telles que B. abortus, les LPS-s (lipopolysaccharides lisses) ont une structure en polysaccharide exposant la "chaîne O" (polysaccharide O, PSO), qui est absente chez les espèces rugueuses.

Dans le cytoplasme des bactéries, il existe aussi des antigènes qui semblent jouer un certain rôle dans la réaction d'hypersensibilité retardée (protéines intra-cytoplasmiques).

2.3.- Le Lipopolysaccharide

Le LPS, est constitué de trois régions: (1) le lipide A (2) l'oligosaccharide, appelé noyau et (3) le polysaccharide O ou chaîne O (PSO). Ce PSO est responsable du déclenchement de la réponse immunitaire humorale chez les hôtes réservoirs.

La similitude de cette chaîne O est responsable des réactions croisées avec d'autres bactéries Gram négatives; Yersinia enterocolítica O:9, par exemple, présente une chaîne O identique à celle trouvée chez B. abortus biotype 1. D'autres bactéries telles que Salmonella spp, Vibrio cholerae et Escherichia coli montrent aussi des réactions croisées (Bowden, 1996; M. Corbel, 2006; Doganay et al., 2003).

Les antigènes A et M, définis par Wilson et Mille en 1932, sont des structures présentes dans la chaîne O du LPS-s et dont la distribution quantitative varie d'un biotype à un autre.

3.- Epidémiologie 3.1.- Résistance dans l’environnement Bien que les Brucella soient sensibles au rayonnement solaire direct ainsi qu'aux désinfectants et à la pasteurisation (Davis & Casey, 1973, cités par Bercovich, 2000), leur durée de survie dans l’environnement varie selon le milieu dans lequel elles se trouvent; elle sera de 60 à 140 jours dans le sol humide, 30 jours dans l’urine, 75 jours dans des fœtus avortés, plus de 200 jours dans des sécrétions utérines et 30 à 210 jours dans les matières fécales (Kerimov, 1983, cité par Bercovich, 2000; Carter, 1985).

3.2.- Modes de transmission Les animaux infectés peuvent excréter les bactéries dans l'urine, le lait, les sécrétions vaginales ou le sperme, qui peuvent à leur tour contaminer d'autres animaux du troupeau et l'environnement (pâtures, eau et locaux) (Roux, 1979).

Une vache infectée peut commencer à excréter la bactérie dès le 39ème jour post-infection. Bien que la plus forte excrétion de germes se produise au moment du vêlage ou de l’avortement, les animaux peuvent continuer à excréter les micro-organismes de manière intermittente au cours de longues périodes (Herr et al. et 1990; Philippon et al., 1970, cités par Bercovich, 2000). Selon certaines estimations, 1011 à 1014 bactéries peuvent être éliminées dans l’environnement par gramme de tissu cotylédonaire, principalement au moment du vêlage ou de l’avortement (Saegerman et al., 2010; Godfroid et al., 2010).

Les voies de contamination chez l'homme et les animaux sont:  Contacts directs avec des animaux ou carcasses infectés, des avortons ou lors d’accidents dans des laboratoires (Doganay et al., 2003; Gavazzi, Prigent, Baudet, Banoita, & Daoud, 1997) ;  Ingestion de liquides ou tissus contaminés, tels que membranes foetales et sécrétions utérines, généralement en cas d’avortement (Kang, Gunaseelan, & Abbas, 2014; Saegerman et al., 2010) ;  Pâturage dans un environnement contaminé ou ingestion d'eau contaminée (Saegerman et al., 2010; Godfroid et al., 2010; Kang et al., 2014) ;  Ingestion de matériel contaminé tel le lait ou les produits laitier non pasteurisés, ou encore ingestion d'aliments inhabituels comme du sang ;  Inhalation d'aérosols contaminés, à la ferme ; à l’abattoir ou en laboratoire ;  Voie conjonctivale, suite à un contact direct avec une main ou un gant contaminé, ou via des aérosols contenant des micro-organismes (Nicoletti, 1980) ;  Auto-inoculation accidentelle, en travaillant de manière inadéquate avec des vaccins vivants ;  Voie sexuelle, lors de monte naturelle ou d’insémination artificielle, via le sperme contaminé (Acha & Szyfres, 2003; Carter, 1985; Nicoletti, 1980).

3.3.- Espèces animales sensibles Les différentes espèces du genre Brucella ont une prédilection pour l'une ou l'autre espèce- hôte animale: B. abortus chez les bovins, B. melitensis chez les caprins et B. suis chez les suidés (Tableau 1.2). Toutefois, il n'est pas rare de rencontrer des brebis, chèvres, chiens, chevaux, camélidés (dont les sud-américains), buffles et animaux sauvage infectés par B. abortus; ils peuvent alors jouer le rôle de réservoir et disséminer la maladie (Manthei & Deyoe, 1970, cités par Bercovich, 2000; Corbel, 2006; Robinson, 2003; Roux, 1979; Saegerman et al., 2010).

3.4.- Distribution géographique A l’heure actuelle, la brucellose est distribuée au niveau mondial (Suárez, 2001). Certains pays ont réussi à éradiquer la brucellose bovine grâce à la mise en place de programmes de 9

surveillance épidémiologique et de contrôle; c'est le cas, par exemple, de la Finlande, du Royaume-Uni, de la Norvège, de la Suède, de la Belgique et du Danemark (Godfroid et Käsbohrer, 2002). D’autres pays ont réussi à réduire considérablement l’incidence de la brucellose bovine comme, par exemple, le Japon, la Nouvelle-Zélande, l'Australie ou encore l'Allemagne (Suárez, 2001).

Tableau 1.2 Hôtes accidentels de Brucella spp. (Alton et al., 1988; Godfroid et al., 2010; Saegerman et al., 2010) Morphologie de la Pathogénicité Espèce Biotype Hôtes préférentiels colonie* chez l’homme B melitensis lisse 1-3 ovins, caprin haute B. abortus lisse 1-6, 9 bovins haute B. suis lisse 1-3 porcs, lièvres, rennes haute B. neotomae lisse - néotomas modérée B. ovis rugueux - ovins haute B. canis rugueux - canidés modérée B. pinnipedialis lisse - pinnipèdes oui B. ceti lisse - cétacés oui B. microti lisse - rongeurs non B. inopinata lisse - homme ? B. papionis lisse - babouin ?

3.5.- Vecteurs mécaniques Il existe des vecteurs mécaniques, parmi lesquels des animaux domestiques et sauvages ainsi que l'homme, qui peuvent propager la maladie (Roux, 1979). Il est difficile de déterminer jusqu'à quel degré le passage d'animaux dans les zones urbaines ou dans les parcs peut s’accompagner d’une contamination de ces lieux, mais le risque existe néanmoins.

3.6.- Groupes humains à risque La prévalence de la maladie est influencée par les conditions socio-économiques de chaque pays, région ou localité. Dans les pays en voie de développement, où prédominent les systèmes d’élevage traditionnels et où les infrastructures sanitaires sont déficientes voire inexistantes, cette maladie affecte la population en général, tandis que dans les pays développés, cette maladie présente plutôt un caractère professionnel (Corbel, 2006; Doganay et al., 2003).

Parmi les professions à risque, ce sont les métiers liés à l’agriculture et à l’élevage qui présentent le risque le plus élevé, à savoir les médecins vétérinaires, les ingénieurs agronomes, les travailleurs agricoles, les ouvriers d’abattoirs et de boucherie ainsi que le personnel de laboratoire. Les infections causées par B. abortus et B. suis sont souvent des maladies professionnelles, tandis que B. melitensis affecte la population en général (Acha & Szyfres, 2003).

4.- Réponse immunitaire Brucella spp. entraîne le déclenchement d’une réponse cellulaire (activée par les protéines intra-cytoplasmiques) et humorale (activée par le LPS). L’ampleur et la durée de la réponse dépendent de plusieurs facteurs, parmi lesquels: la virulence de l'agent causal, la dose infectieuse, et les facteurs propres à l’hôte tels que l'âge, le sexe, l’état de grossesse ou le degré d’exposition (Nicoletti, 2001).

4.1.- Pathogénie Brucella spp. est un pathogène intracellulaire facultatif. L’infection de l’hôte par Brucella spp. se déroule en deux étapes au minimum. L’infection initiale voit le nombre de germes augmenter, puis l'étape latente se caractérise par leur survie intracellulaire (Halling & Boyle, 2002).

Après avoir pénétré l’organisme au niveau d’une des voies d’entrée possibles, les bactéries sont phagocytées et véhiculées par voie lymphatique jusqu’aux ganglions régionaux (le plus souvent, rétro-mammaires et sous-maxillaires). Elles sont ensuite distribuées vers les différents organes suite à une bactériémie (Mellado, 1996). Ces bactéries sont phagocytées par les macrophages, mais une fois à l'intérieur des cellules, elles restent pendant plusieurs heures dans des endosomes formés lors de la phase G1 du cycle cellulaire (en fonction du type de cellule-hôte); il s’agit du premier stade de l'infection (De Bolle et al. 2015).

Cette espèce de bactéries dispose de plusieurs mécanismes de défense pour lutter contre les réponses bactéricides de l'hôte. Les espèces avec lipopolysaccharide lisse (LPS-S) sont plus résistantes à la réponse immunitaire, ce qui influence leur survie intracellulaire. Les 11

mécanismes d'évasion consistent en la production d'adénine et de guanine monophosphate, qui vont inhiber la fusion phagosome - lysosome, la production de Cu-Zn superoxyde- dismutase, utilisée lors de la première phase de l'infection intracellulaire et l'activation du système myéloperoxydase (de Bagues et al., 2005).

Chez les animaux non gestants, les germes se localisent dans les ganglions rétro- mammaires, et pendant la gestation, les Brucella envahissent l'utérus, où elles se multiplient à la faveur de la présence en grandes quantités d'érythritol, un hydrate de carbone présent dans le placenta des vaches (De Bolle et al., 2015).

4.2.- Réponse immunitaire de type humoral 4.2.1.- Généralités Le contrôle de l'infection est assuré par les cellules T spécifiques, qui, grâce à la sécrétion de lymphokines, activent les mécanismes bactéricides des macrophages. En même temps que l'immunité cellulaire, une hypersensibilité retardée dirigée contre des antigènes (Ag) protéiques de Brucella spp est déclenchée. La réponse humorale est caractérisée par une augmentation initiale d'immunoglobulines (Ig) de type M (IgM), suivie d'une augmentation des titres en immunoglobulines G (IgG). Cette augmentation se produit dans les 7 à 14 jours suivant l'infection. Dès cet instant, une augmentation des deux types d’Ig peut être observée (MacMillan, 1990 cité par Bercovich, 2000). Chez les bovins, l'infection chronique est caractérisée par une synthèse prolongée d'IgG et des concentrations faibles en IgM (Alton et al., 1988; Bowden, 1996). Les concentrations en anticorps (Ac) de type IgG2 varient d'un bovin à l’autre, alors que celles en IgG1 restent généralement faibles, suite au passage des Ig sériques dans le colostrum. Les IgG1, IgM et IgA se retrouvent dans le lait des animaux infectés (Bowden, 1996). Les Ac sont principalement dirigés contre la chaîne du LPS de Brucella abortus, qui joue ainsi le rôle d’Ag. Les Ac induisent la lyse bactérienne par la voie classique d’activation du complément, ainsi que par phagocytose. Une réaction légèrement retardée est également développée contre les protéines de la membrane externe. Chez les bovins pubères, les Ac sont détectables dès 30 jours et jusqu’à 3-6 mois après l’infection, parfois même durant toute la vie de l’animal.

4.2.2.- Réponse immunitaire humorale après vaccination Après l'administration d'un vaccin chez un animal, la séroconversion est observée 1 à 2 semaines après la vaccination, principalement du type IgM pendant environ 2 semaines. En général, les anticorps après la vaccination, diminuent à des niveaux indétectables après une période de 3 à 8 mois après la vaccination chez les veaux femelles pré-pubères (Olizki 1970, cité par Bercovich, 2000; Bowden, 1996). Du fait que Brucella spp. est un pathogène intracellulaire facultatif, il ne convient pas de se fier uniquement sur les niveaux de circulation des anticorps comme seul indicateur de l'immunité d'un animal. Les animaux vaccinés ou infectés par une souche virulente développent également une réaction d'hypersensibilité plus lente si un extrait de Brucella (protéines intra-cytoplasmiques) est administré (Saegerman et al., 1999).

4.3.- Réponse immunitaire de type cellulaire 4.3.1.- Généralités La réponse immunitaire de type cellulaire est dirigée exclusivement contre des protéines bactériennes. Elle se déroule en quatre étapes : 1) les macrophages infectés produisent des cytokines; 2) les lymphocytes précurseurs se différentient en lymphocytes de type 1; 3) ces lymphocytes de type 1 se différentient en lymphocytes T «helpers» CD4+ et cytotoxiques CD8+ et 4) l’interféron gamma sécrété par ces deux types de lymphocytes induit la lyse bactérienne. Le délai d’installation de l’hypersensibilité retardée spécifique est identique à celui nécessaire au déclenchement de la réponse humorale.

5.- Tableau clinique 5.1.- Chez l’homme Parmi les six principaux biovars, quatre sont fréquemment associés à des manifestations cliniques chez l’homme : B. melitensis, B. suis, B. abortus et B. canis. Ces manifestations cliniques incluent: fièvre, maux de tête, arthralgie, myalgie, douleur dorsale, toux, malaise, anorexie, fatigue et perte de poids. Chez quelques patients, la brucellose peut conduire à des complications de type ostéo-articulaires, voire des désordres gastro-intestinaux, cardiovasculaires, neurologiques, génito-urinaires, pulmonaires ou cutanés. Ces signes 13

cliniques seront plus sévères et fréquents chez des patients infectés par B. melitensis, en raison de sa plus grande pathogénicité.

La majorité des cas de brucellose chronique sont consécutifs à un traitement inadapté, soit à cause de l’utilisation d’antibiotiques inadéquats, soit à cause d'un dosage insuffisant. La forme clinique de la brucellose chronique est caractérisée par des infections localisées; les principaux signes sont: fatigue persistante, malaise et dépression, sans évidence clinique, microbiologique ou sérologique d’une infection active.

5.2.- Chez les animaux Certains facteurs peuvent influencer le tableau clinique, parmi lesquels: l'état immunitaire de l’animal, l'âge, l’existence d’une gestation ainsi que la dose infectante (Blood et al., 1987).

Chez les bovins, la maladie passe souvent inaperçue (Ragan, 2002), le seul signe clinique étant l’avortement au cours de la première gestation, généralement pendant le dernier trimestre (Crawford, Huber, & Adams, 1990; England, Kelly, Jones, MacMillan, & Wooldridge, 2004). Ont également été rapportés: naissance des veaux faibles, rétention placentaire, métrite, orchite (uni - ou bilatérale), synovite (surtout au niveau des membres postérieurs), diminution de la fertilité et de la production laitière.

5.2.1.- L'avortement L'affinité de Brucella spp. pour le placenta a été attribuée à la production en grande quantité d’erythritol, un hydrate de carbone produit par le placenta de la vache, mais que l’on ne retrouve pas chez l’homme (Carter, 1985). Il est notamment capable de stimuler la croissance de ces germes (Mellado, 1996).

Le coût engendré par des avortements à Brucella spp. fluctuerait entre 1.000 et 2.000 USD par animal (Luna-Martínez et Mejía-Terán, 2002). Ceci peut représenter un poste important de pertes économiques à l’échelle d’une ferme (Samartino et Enright, 1993).

6.- Diagnostic 6.1.- Diagnostic chez les animaux 6.1.1.- Diagnostic bactériologique Bien que l'analyse bactériologique reste la seule méthode diagnostique la plus fiable, son coût élevé, sa mise au point difficile et le risque important lié aux manipulations pour l’opérateur, ne permettent pas son utilisation en routine. Son usage est actuellement restreint à des laboratoires de niveau de biosécurité 3 (OIE, 2016a).

Il est important de noter que les résultats de l'examen bactériologique peuvent s’avérer être des faux négatifs, surtout si les échantillons sont contaminés par d'autres bactéries, ou s'ils ont été mal conservés (Alton et al., 1988).

Des Brucella peuvent être isolées à partir du placenta ainsi que du contenu pulmonaire et stomacal des fœtus avortés. Les vaches cessent généralement d'excréter des germes au niveau du tractus utérin après son involution, mais ceux-ci sont néanmoins stockés dans la mamelle. C’est la raison pour laquelle le micro-organisme peut être isolé dans le lait et les sécrétions mammaires d'une vache en production laitière. Le colostrum est également un prélèvement d’intérêt.

6.1.1.1.- Isolement de Brucella L'isolement des bactéries peut être réalisé sur plusieurs milieux de culture ou sur des milieux sélectifs simples, tels que le milieu Farrell (Farrell, 1974) ou le milieu de Thayer- Martin modifié.

Brucella peut être isolée à partir des échantillons suivants: ganglions lymphatiques rétro- pharyngiens, sous-maxillaires et supra-mammaires, ainsi que contenu stomacal du fœtus avorté, tissus fœtaux, placenta ou sécrétions vaginales et mammaires. Les échantillons sont mis en culture après inoculation d'un milieu solide Farrell, et incubés

à une température de 37° C dans une atmosphère dont la concentration en CO2 varie entre 5 et 10%.

6.1.1.2.- Typage de Brucella Les colonies suspectes sont identifiées par observation macroscopique et microscopique, et par analyse biochimique (tests à l’oxydase, la catalase et l’uréase). Les espèces et biotypes sont déterminés grâce à leur dépendance en CO2, leur croissance en milieu coloré (fuchsine, thionine et safranine) et leur agglutination avec des sérums mono-spécifiques A et M.

6.1.2.- Diagnostic moléculaire La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique basée sur la détection moléculaire des séquences spécifiques de Brucella spp., telles que 16S - 23S, ou du gène bcsp31 codant pour la protéine de 31-kDa présent chez cette espèce. Cette méthode est utilisée pour détecter et identifier l’ADN dans les cultures et échantillons cliniques. Cependant, la technique PCR permettant de diagnostiquer la brucellose présente une faible sensibilité par rapport aux méthodes de culture, alors que sa spécificité est proche des 100% (Godfroid et al., 2010).

6.1.3.- Méthode diagnostique reposant sur la détection de la réponse humorale 6.1.3.1.- Aspects généraux Quand Evans a pu mettre en évidence la relation antigénique entre B. abortus et B. melitensis, en 1918, l'utilisation de B. abortus a été généralisée dans le cadre des tests sérologiques. En effet, B. abortus est plus sensible aux agglutinines, et moins exposée aux dissociations pouvant altérer leur réactivité (Ruiz Castañeda, 1954).

Les tests sérologiques utilisés en routine présentent plusieurs avantages, tels leur mise au point relativement aisée ou leur coût acceptable. Néanmoins, des inconvénients sont rapportés, liés principalement à la grande variabilité des résultats qui dépend: (1) du caractère endémique ou non de la zone dont proviennent les échantillons, (2) du seuil de positivité (cut-off) au-delà duquel un résultat est considéré comme positif, et (3), de la standardisation correcte des réactifs et procédures.

6.1.3.2.- Réactions croisées Les Brucella sont des pathogènes qui, de par leur caractère intracellulaire facultatif, sont capables de déclencher une réponse immunitaire humorale et cellulaire. Les tests sérologiques classiques, basés sur la détection d’Ac dirigés contre le LPS lisse (Garin- Bastuji, 1993), présentent des réactions faussement positives avec des bactéries Gram négatives, parce que celles-ci partagent un épitope du LPS (FAO et OMS, 1986; Pouillot et al., 1997).

Plusieurs recherches ont mis en évidence des problèmes dans l'éradication de la maladie suite aux réactions croisées avec, par exemple, Yersinia enterocolitica O:9 et Escherichia coli O:157 (M.J. Corbel, 1985; Saegerman et al., 1999), mais aussi aux infections croisées de bovins par d’autres espèces de Brucella, comme par exemple, B. melitensis (Halling & Boyle, 2002). Un système permettant de discriminer les vrais des faux positifs consiste à évaluer la réponse cellulaire sur base des protéines intra-cytoplasmiques de la bactérie (Pouillot et al., 1997; Saegerman et al., 1999).

6.1.3.3.- Tests de diagnostic sur sérum 6.1.3.3.1.- Test d'agglutination rapide sur plaque “Rose de Bengale” (RB) Le test au rose Bengale (RB) est une réaction d'agglutination sur lame, qui met en contact, d'une part un Ag constitué d'une suspension de B. abortus (souche 99) inactivées par la chaleur et colorées au rose Bengale, dans un tampon (pH 3,5 ± 0,05), et d'autre part le sérum à analyser (OIE, 2016a). Pietz et Schilf ont développé cet Ag acidifié, tamponné et stable en 1967 (Mancera, 2001). Il s’agit d’un test qualitatif. Simple de réalisation, et d’un coût peu élevé, il est très utile comme test de dépistage (Doutre et al., 1977).

Ce test est capable de détecter des Ac de type IgM et IgG, bien que le pH acide permette une très bonne détection des IgG en réduisant les unions non spécifiques avec d'autres Ig (Nielsen, 2002). La concentration en bactéries dans la suspension antigénique est de 8% (v/v) (FAO et OMS, 1986).

Il existe des faux négatifs, lorsque l’infection est très récente, mais aussi des faux positifs, quand il y a présence d'Ac après vaccination, lors de réactions croisées, et d’erreurs dans l'exécution du test, en déclarant positif, par exemple, un échantillon qui contient uniquement de la matière grasse (Blood et al., 1987).

Ce test est plus tardif que le test de séro-agglutination de Wright (SAT), mais il restera positif plus longtemps car il détecte les IgG (Godfroid et Boelaert, 1995)

6.1.3.3.2.- Test d’agglutination sur plaque - BPAT Le test BPAT (Buffered Plate Antigen Test) est similaire au test d'agglutination rapide sur plaque RB. Il utilise une suspension concentrée de B. abortus, souche lisse 1119-3, colorée au vert brillant et au cristal violet (OIE, 2016a). La concentration totale de cellules dans l'Ag doit être de 11% (v/v). C'est un test rapide et relativement simple (FAO et OMS, 1986). Le mélange sérum - Ag doit respecter des proportions 8:3.

6.1.3.3.3.- Test de séro-agglutination lente en tube ou test de Wright (SAT) Ce test, également basé sur l'agglutination d'une suspension de Brucella, met en contact, d'une part, une quantité constante d'Ag, et d’autre part, des dilutions croissantes de sérum. Il met en évidence les IgM, et dans une moindre mesure, les IgG. Il peut être utilisé pour confirmer une infection aiguë. Les titres en Ac sériques sont fournis de manière quantitative, et exprimés en unités internationales (UI) d’agglutination (Godfroid & Boelaert, 1995). Parmi les inconvénients liés à ce test, il faut mentionner les réactions croisées avec d'autres bactéries, ainsi qu’une interférence suite à la vaccination. Lors d’infection chronique, des résultats faussement négatifs peuvent être observés (Blood et al., 1987). Etant donné l’excès d’Ac bloquants qui empêche l’union des Ac agglutinants avec l’Ag, le phénomène de pro-zone peut être observé (résultats négatifs lors des premières dilutions, et positifs pour les suivantes).

Ce test présente des avantages, tels que: (1) être le plus précoce à détecter les Ac agglutinants et (2), permettre, grâce à des dilutions progressives du sérum, d’apprécier le 18

titre complet d'agglutination de chaque échantillon. Différents auteurs mentionnent que les animaux sont considérés comme positifs lorsqu’il y a agglutination complète à une dilution 1/100 pour des animaux non vaccinés et 1/200 pour des animaux vaccinés (entre 3 et 9 mois d'âge); d'autres précisent, par contre, que les animaux sont considérés comme positifs, quand les niveaux d’Ac sont égaux ou supérieurs à 30 UI (EC Directive 64/432/EC, cité par Bercovich, 2000).

Lors de la réalisation du test SAT, l’ajout d’EDTA réduit le risque d’union non spécifique (Garin et al., 1985). D’autre part, le test SAT-2ME est un test SAT modifié, dans lequel une solution de 2-mercaptoetanol (2ME) détruit les ponts disulfures des IgM (FAO et OMS, 1986). L'efficacité de ce test pour détecter les IgG a été remise en question car le 2ME affecterait aussi les IgG. Alternativement, le dithiotréitol (DTT) est également utilisé.

6.1.3.3.4.- Test de fixation de complément (CFT) Le test de fixation du complément (CFT), basé sur la détection d’IgG, est un test important pour le diagnostic de la brucellose (Hill, 1963, cité par Bercovich, 2000). Malgré une lourde mise en œuvre, à cause, notamment, de la nécessité de titrer les réactifs en continu et d’utiliser des globules rouges frais chaque semaine; elle est relativement économique. Il s’agit d’un des tests diagnostiques de routine dont la sensibilité analytique est la plus élevée (Cobos et al., 2001). Il utilise un Ag préparé à partir de la souche lisse de B. abortus 99 ou de la souche 1119-3 (OIE, 2016a).

Ce test est plus tardif que le SAT conventionnel et les titres obtenus confirment plutôt une infection chronique (Blood et al., 1987). Comme il engendre peu de réactions non spécifiques, il est utile pour différencier les animaux vaccinés de ceux infectés naturellement; c’est d’ailleurs la raison pour laquelle il est utilisé pour écarter les résultats faussement positifs obtenus avec le test RB (Godfroid et al., 2010).

6.1.3.3.5.- Test «Enzyme Linked Immunosorbent Assay» indirect (iELISA) Les tests ELISA qui, depuis leurs débuts, ont utilisé divers types d’Ag, comme des bactéries complètes ou du LPS purifié ainsi que divers conjugués, présentent une sensibilité et une spécificité très élevées.

Ces techniques combinent la spécificité de l'union Ag - Ac avec la sensibilité d'un système enzymatique. Les Ag (généralement du LPS) sont passivement immobilisés (adsorbés) dans une phase solide (microplaque); le signal coloré est alors directement proportionnel à la concentration de l'échantillon en Ac (Bautista et Ochoa, 2001).

Ces méthodes peuvent être à la base d'une nouvelle génération de techniques simples, qui pourraient utiliser du matériel et des réactifs peu coûteux (FAO et OMS, 1986).

D’autre part, seuls les tests ELISA utilisant le LPS lisse de B. abortus sont recommandés. L'ELISA indirect (iELISA), spécifique pour la détection d’IgG, fournit des résultats presque équivalents à ceux obtenus avec la CFT. Ce test peut être utilisé pour analyser des échantillons de sérum ou du lait (OIE, 2016a).

Comme tests conventionnels utilisés pour le diagnostic de la brucellose bovine, l'iELISA ne permet pas de distinguer les Ac produits après administration de la souche vaccinale B-19 et ceux produits suite à une infection naturelle. L'iELISA présente une sensibilité supérieure à celle de la CFT, mais sa spécificité est par contre inférieure.

6.1.3.3.6.- Test «Enzyme Linked Immunosorbent Assay» compétitif (cELISA) Le test «Enzyme Linked Immunosorbent Assay» compétitif (cELISA) consiste en la fixation de l’Ag (LPS) de Brucella sur un milieu solide (plaque de polystyrène), suivie par une incubation du sérum avec un Ac monoclonal de souris dirigé contre la chaîne O du LPS. Après incubation et lavage, le conjugué (peroxydase) puis le substrat-chromogène seront déposés sur la plaque.

En l'absence d'Ac dirigés contre Brucella dans le sérum, l'Ac monoclonal se lie à l'Ag, entraînant ainsi un changement de couleur. Si par contre le sérum contient des Ac contre Brucella, il y aura compétition avec les Ac monoclonaux pour les sites de liaison à l'épitope, ce qui inhibera la liaison et n’engendrera pas ou peu d’émission colorée.

Le cELISA est devenu un test diagnostic fiable pour la brucellose car l’utilisation d’Ac monoclonaux empêche les réactions faussement positives; sa sensibilité et sa spécificité sont élevées. L’avantage du cELISA réside dans le fait qu’il peut être utilisé sur plusieurs espèces contrairement à l’iELISA où cela va dépendre du conjugé utilisé.

6.1.3.4.- Tests sur le lait 6.1.3.4.1.- Test de l’anneau coloré sur le lait (MRT) Le test de l’anneau coloré sur le lait ou Milk Ring Test (MRT) détecte la présence d’IgA et d’IgM, lesquelles induisent la formation d'un anneau coloré (généralement de couleur bleue) après incubation de l'échantillon de lait avec l'Ag coloré au moyen d’hématoxyline (Collin, 1976). Les globules gras présents dans le lait jouent un rôle important dans ce test, car s’ils sont présents en quantité insuffisante, les résultats peuvent être faussement négatifs (Sutra, Caffin, & Dubray, 1986). Si les échantillons à analyser contiennent uniquement de la crème ou ont été mal conservés, la lecture est difficile et le pourcentage de faux négatifs augmente significativement.

Le MRT est une technique facile à réaliser et peu coûteuse. Elle permet de détecter la présence de la brucellose dans une zone géographique particulière (Ragan, 2002). Les échantillons de lait peuvent être récoltés dans chaque exploitation de chaque vache individuellement ou, collectivement à partir d’une cruche à lait. La fiabilité des résultats est intimement liée à la quantité d'échantillon car le facteur de dilution (échantillon individuel positif dilué dans le tank à lait) influence le résultat de manière importante (OIE, 2016a); il est pour cela recommandé de prélever une certaine quantité de lait (8 ml) (Bercovich & Lagendijk, 1978).

6.1.3.4.2.- Test iELISA sur le lait (iELISA-L) Le test iELISA sur le lait (iELISA-L) permet de détecter les Ac de type IgG dans ce type d’échantillon; il s’avère être plus sensible que le MRT (Bercovich et Taaijke, 1990). Toutefois, ce test diagnostique est aussi influencé par la concentration en Ac dissous dans l'échantillon, et par l'état de conservation de ce dernier. Des résultats faussement négatifs sont générés lorsque les échantillons analysés contiennent une grande quantité de colostrum (Sutherland et al., 1986).

6.1.4.- Méthodes diagnostiques reposant sur la réponse immunitaire de type cellulaire 6.1.4.1.- Test cutané «Skin test» (ST) Dans le cas de la brucellose, le contact d'un animal avec l'agent infectieux, ou avec le vaccin, engendre le déclenchement d’une réponse immunitaire de type cellulaire, comme mentionné précédemment. Elle se manifeste sous la forme d’une sensibilisation pouvant être révélée par l'injection d'un allergène préparé au départ de ces mêmes germes (Chukwu, 1985; FAO et OMS, 1986).

Le test cutané ou «Skin Test» (ST) consiste en l'injection intradermique d'un extrait protéique cytoplasmique de B. melitensis B-115. Cet extrait est le plus approprié car il contient une quantité minimale de LPS, et évite ainsi la production d'Ac par l'hôte (Bhongbhibhat et al., 1970). Ce type de protéines est partagé par d'autres espèces de Brucella en phases rugueuse et lisse.

Puisque le ST met en évidence la réponse immunitaire de type cellulaire, indépendante de la concentration en Ac circulants, ce test peut être très utile en appui aux méthodes sérologiques. Différents auteurs mentionnent que l'utilisation de ce type d’outil diagnostique permet d'identifier un plus grand nombre d'animaux positifs que les tests sérologiques (Fensterbank et Pardon, 1977; Saegerman et al., 1999).

Sa haute spécificité (OIE, 2016a) permet de détecter des animaux séronégatifs (Bercovich et al., 1993), mais aussi de confirmer le diagnostic chez des animaux séropositifs, ou chez des animaux présentant des résultats difficilement interprétables.

L'immunisation d'animaux avec des vaccins tels le B-19 génère chez ces derniers une réponse faussement positive de longue durée au ST; la réponse inflammatoire est plus importante chez les animaux vaccinés. De ce fait, ce test est recommandé pour le diagnostic de la brucellose chez les animaux non vaccinés (Pouillot et al., 1997; Saegerman et al., 1999).

Dans le tableau 1.3, est présenté de façon résumée les avantages et les inconvénients de chacun des tests utilisés pour le diagnostic de la brucellose chez les bovins, ainsi que les caractéristiques (sensibilité et spécificité) de chacun.

6.2.- Diagnostic chez l’homme 6.2.1.- Considérations générales La suspicion clinique de la maladie doit être confirmée par la mise en évidence d’Ac dans le sang du patient, et/ou par l’isolement de Brucella spp. Comme le tableau clinique de la maladie est non spécifique, il ne permet pas d’établir un diagnostic sur sa base uniquement (Mellado, 1996). Il est dès lors vital que le médecin récolte des informations sur le patient, grâce à une anamnèse détaillée: profession, contacts potentiels avec des animaux, voyages en zone endémique, et ingestion d'aliments potentiellement contaminés, en particulier ceux à base de lait et de produits laitiers non pasteurisés.

6.2.2.- Diagnostic direct ou bactériologique L'isolement de l'agent causal constitue le moyen le plus sûr pour confirmer le diagnostic, car il permet de déterminer l'espèce et le biotype de la bactérie (Mellado, 1996).

6.2.3.- Diagnostic indirect ou sérologique Les méthodes de diagnostic indirect mettent en évidence les titres d'Ac présents dans le sang du patient. Différents méthodes peuvent être employées à cette fin, dont les méthodes de séro-agglutination telles que le RB (souvent utilisée car facile à réaliser) et séro- agglutination de Wright (SAT) (spécificité élevée et facile à réaliser). Lors d’infection chronique, le taux d’Ac agglutinants est faible, ce qui peut générer des résultats négatifs. Il convient alors de recourir au test de Coombs pour démontrer la présence d’Ac non agglutinants (Mellado, 1996).

7.- Vaccination 7.1.- Souche 19 ou B-19 Le vaccin B-19 est un vaccin immunogène vivant atténué élaboré par Buck en 1930. Bien qu'elle soit d’une grande aide dans le contrôle de cette zoonose, la vaccination à elle seule ne permet pas d’éradiquer la maladie. Elle doit être associée à l'identification et à l'élimination des animaux infectés (Roux, 1979).

Bien que B-19 soit le vaccin le plus utilisé dans les programmes de contrôle et d’éradication de la brucellose dans de nombreux pays à travers le monde, il présente des inconvénients devant être pris en considération : risque de provoquer la maladie chez l’homme, risque d'avortement chez l’animal, mais aussi persistance momentanée d'Ac agglutinants qui interfèrent avec le diagnostic (Nicoletti, 1980).

Les Ac produits suite à l’administration de B-19 génèrent des réactions croisées lors de la réalisation de tests diagnostiques, spécialement avec ceux basés sur l'agglutination rapide sur plaque (RB). En effet, la vaccination engendre la production d'Ac dirigés contre le LPS (Schuring et al., 1991, cités par Vargas, 2002).

Tableau 1.3 Avantages, inconvénients et paramètres de sensibilité et de spécificité) des tests de diagnostic de la brucellose bovine. Tests de diagnostic Paramètres Bactériologie RB BPAT SAT SAT-2ME CFT iELISA ST MRT iELISA-L

 Equipement de laboratoire - Équipement de base X X X X - Équipement moyen X X X - Équipement avancé X X X  Procédure - Facile et rapide X X X - Difficulté moyenne X X X X - Grande difficulté X X X  Interprétation de résultats - Subjective X X X X X X X X - Objective X X  Coût - Peu élevé X X X - Moyen X X - Elevé X X X X X  Sensibilité (0.21 – (0.75 – (0.29 – (0.56 – 1)d (0.23 – (0.93 – (0.95)g (0.56)h (0.98)i 0.98)a 0.99)b 1)c 0.97)e 1)f - Présence de RFN - étape précoce de l'infection X X X X - erreurs de lecture X X - existence de «pro-zone» X X X - étapes chroniques de l'infection X - âge des animaux anergiques X - facteur de dilution de l'échantillon X  Spécificité (0.69 - 1)a (0.91 - 1)b (0.99 – (0.99 – 1)d (0.31 – 1)e (0.91 – (0.78 - (0.99)h (0.99)i (1) 1)c 1)f 0.99)g - Présence de RFP - par Ac post-vaccination X X X X X X X X X - par des réactions croisées X X X X X X X X - erreurs de lecture par grasse  Risque de contamination - Moyen X X X X X X X - Élevé X X X Légende : voir page suivante. 25

Légende: a (Nielsen, 2002; Samartino, Gregoret, Gall, & Nielsen, 1999; Van Aert et al., 1984) b (Nielsen, 2002; Samartino et al., 1999; Stemshorn et al., 1985) c (Lord, Rolo, & Cherwonogrodsky, 1989; Nielsen, 2002; Van Aert et al., 1984) d (Lord et al., 1989; Nielsen, 2002; Saravi, Wright, Gregoret, & Gall, 1995; Stemshorn et al., 1985) e (Huber & Nicoletti, 1986; Nielsen, 2002; Saravi et al., 1995; Van Aert et al., 1984) f (Dohoo et al., 1986; Nielsen, 2002; Rojas & Alonso, 1994) g (Pouillot et al., 1997; Saegerman et al., 1999) h-i (J Godfroid & Boelaert, 1995)

(RB) Rose Bengale, (BPAT) “Buffered Plate Agglutination Test”, (SAT) "Serum Agglutination Test", (SAT – 2ME) "Serum Agglutination Test" en présence de 2-mercaptoetanol, (CFT) "Complement Fixation Test", (iELISA) "Enzyme Linked Immunosorbent Assay" indirect, (ST) “Skin test”, (MRT) «Milk Ring Test», (iELISA-L) "Enzyme Linked Immunosorbent Assay" indirect, sur échantillons de lait, (RFN) Résultats Faux Négatifs, (RFP) Résultats Faux Positifs.

L'âge optimal pour vacciner les femelles se situe entre 4 et 8 mois (FAO et OMS, 1986; OIE, 2016a) car les Ac produits disparaitront dans les 4 à 6 mois post-vaccination (Carter, 1985). L'utilisation du vaccin B-19 est interdite chez les mâles car elle induit de la stérilité (Blood et al., 1987). La présence d’Ac maternels justifie la vaccination des animaux au minimum 4 mois après la naissance. Normalement, la dose administrée par voie sous-cutanée est de 5 à 8 x 1010 organismes viables. Alternativement, des doses de 5 à 10 x 109 peuvent être administrées par voie conjonctivale à des bovins de tout âge, ce qui les protègera sans générer une production d’Ac agglutinants détectés par les tests de diagnostic sérologiques (OIE, 2016a); pour ce faire, il faut maximiser le niveau de (bio)sécurité afin de prévenir des contaminations des animaux.

L'immunité conférée par le vaccin B-19 est solide et peut perdurer presque toute la vie reproductrice de l'animal, dans un contexte où les vaches ne sont pas conservées dans le troupeau où la moyenne d’âge des animaux n’est pas trop élevée, c’est-à-dire environ 6 ans dans le contexte européen, contre 15 ans en Equateur (André et al., 2013). Berman et collaborateurs (1952 cités par Nelson, 1975) ont déterminé qu'il n'existait aucune stimulation de l'immunité des animaux s’ils étaient revaccinés avec la souche B-19.

Comme le vaccin est vivant, il doit être administré selon une procédure déterminée, c'est-à-dire en suivant strictement les recommandations du fabricant. Les vaccins lyophilisés sont plus stables que les vaccins sous forme liquide (Blood et al., 1987). Grâce à l'utilisation de milieux de culture spéciaux (voir tableau N° 1.4), la différenciation entre une souche vaccinale de Brucella abortus (B-19) et une souche

«sauvage» de Brucella abortus biotype 1 est possible. Des infections vaccinales ont été rapportées chez des vaches laitières, avec excrétion de bactéries de la souche vaccinale dans le lait (Nicoletti, 1981). Des infections chez le taureau, avec excrétions dans le sperme, ont également été mentionnées (Lambert et al., 1964).

7.2.- Vaccin 45/20 McEwen et Priestly, respectivement en 1938 et en 1940, ont développé un vaccin inactivé 45/20, à partir de tissu cellulaire de la souche rugueuse (45/20) de B. abortus. Comme les souches rugueuses ne possèdent pas les Ag des LPS lisses (lesquels sont responsables des réactions sérologiques post-vaccinales), les animaux vaccinés avec ce type de molécule ne réagiraient pas aux tests sérologiques de routine (FAO et OMS, 1986). Malheureusement, son efficacité est inférieure à celle du B-19 (Roux, 1979). Toutefois, la protection conférée par le vaccin 45/20, administré en deux doses à 6 mois et 9 mois d'âge, était comparable à celle prodiguée par le vaccin B-19.

Tableau 1.4 Caractéristiques permettant de distinguer une souche vaccinale B. abortus (souche 19) d'une souche sauvage B. abortus typique (biovar 1) (Alton et al., 1988) Croissance dans des milieux contenant: Souche Exigence en CO2 Thionine Érythritol Pénicilline (2 µg/ml) (1 mg/ml) (5 UI/ml) Biovar 1 (+) a (+) a (+) (+) a Souche B-19 (-) (-) (-) b (-) Légende: a Habituellement positif dans les isolats primaires. b La taux de mutation à la tolérance à l’érythritol est très élevé. Toutefois, quelques colonies peuvent se développer en présence d’érythritol.

7.3.- Vaccin RB-51 Le vaccin RB-51 a été développé par Schuring et collaborateurs, en 1980 (Halling et Boyle, 2002); il s’agit d’une souche mutante rugueuse de la souche lisse B. abortus 2308 (Schurig et al., 1991) développée après culture sur des milieux contenant des antibiotiques (rifampicine et pénicilline) (Blasco, 2001).

Actuellement, et contrairement au B-19, le vaccin RB-51 ne présente pas l'inconvénient de générer la production d’Ac agglutinants qui interfèrent dans le diagnostic; il peut donc être utilisé même chez des animaux adultes (Díaz et al., 2001; Ragan, 2002; Samartino et al. 2000).

Le vaccin RB-51 a officiellement été approuvé dans des pays comme l'Argentine, le Chili, la Colombie, le Costa Rica, le Mexique, le Paraguay et le Vénézuela. Chaque pays utilise des méthodes diverses. Par exemple, aux Etats-Unis, la dose est constituée de 1 à 3,4 x 1010 bactéries et est administrée entre 4 et 12 mois d'âge (Dorneles et al., 2015) alors que la vaccination des animaux de plus de 12 mois s’effectue uniquement sous l’autorisation de fonctionnaires de l'État avec une dose de 1 x 109 bactéries viables. Dans d'autres pays, la vaccination des animaux est recommandée entre 4 à 12 mois d’âge, en combinaison avec un rappel ultérieur au moyen d’une dose de 1 à 3.4 x1010, afin d’augmenter l'immunité (OIE, 2016a).

Le vaccin RB-51, introduit en Amérique Centrale en 1998, est actuellement le seul vaccin disponible dans la majorité des pays de cette région, bien qu'il soit encore difficile d'évaluer son efficacité (Moreno, 2002).

8.- Principes épidémiologiques 8.1.- Prévalence (P) La prévalence (P) est une mesure permettant de quantifier, au sein d’une population, la proportion d'individus malades à un moment précis ou sur un certain laps de temps. Son estimation est réalisée par le calcul suivant:

Nombre de cas de la maladie dans un contexte précis 푷 = Population à un moment donné

Le contexte précis prend en compte les notions de temps (moment précis vs. période de temps) et d’espace (zone géographique).

8.2.- Incidence (I) L’incidence (I) est définie comme étant le nombre de nouveaux cas d'une maladie qui sont détectés dans une population donnée au cours d’une certaine période. Elle est calculée comme suit:

Nombre de nouveaux cas d′une maladie au cours d′une période donnée 푰 = Population à risque

8.3.- Facteurs de risque Un facteur de risque peut être défini comme une caractéristique détectable ou une circonstance particulière augmentant la probabilité qu'une population soit affectée par un/des événement(s) négatif(s). Le facteur de risque est une mesure statistique qui permet d’estimer, de manière prospective, la survenue d’un événement généralement indésirable dans une population. Les facteurs de risque peuvent être de nature biologique, environnementale, socio-culturelle et économique, mais peuvent également être associés.

Afin de démontrer un lien de causalité, il peut être intéressant de recourir à l'analyse d’informations collectées par le biais d'enquêtes explicatives, en essayant de regrouper les individus analysés en deux catégories: exposés vs. non exposés (études de cohorte, prospectives) ou malades vs. non malades (études cas-témoins, rétro-spectives).

Dans les études de cohorte, fréquemment utilisées étant donné le caractère aléatoire de la sélection des individus, la mesure épidémiologique permettant de détecter et de mesurer la présence/l’importance d'un facteur de risque est appelée «Risque Relatif», également connue sous le terme de Ratio du Risque (RR). Le RR, qui est le rapport du «risque dans le groupe exposé» (RE+) sur le «risque dans le groupe non exposé» (RE-), est calculé de la façon suivante, et à l’aide du tableau 1.5.

푅퐸 + 푹푹 = 푅퐸 −

Tableau 1.5 Répartition des effectifs dans le cadre d’une étude exposés/non exposés (Toma et al., 2010a)

Maladie Total (+) (-)

A Exposés A B A+B 푹푬+= 퐴+퐵

Non C C D C+D 푹푬−= exposés 퐶+퐷

Légende: RE+ risque dans le groupe «exposés» RE- risque dans le groupe «non exposés».

Dans une étude cas-témoin, l'identification des facteurs de risque exige une méthodologie plus rigoureuse, notamment en ce qui concerne la sélection des individus; le rapport des cotes ou Odds Ratio (OR), est généralement utilisé comme mesure épidémiologique. L’OR est défini comme étant le rapport entre l’Odds des cas (Ocas) et l’Odds des témoins (Otem). Le calcul est effectué comme suit, et en fonction du tableau 1.6. Il est bien avéré que pour les maladies ayant une prévalence faible (<10%), les indicateurs épidémiologiques calculés dans des études exposés-non exposés (RR) seront similaires à ceux qui auraient été estimés si l'échantillonnage avait été réalisé pour une étude cas-témoins (OR). 푂푐푎푠 A x D 푶푹 = 푶푹 = 푂푡푒푚 B x C

Tableau 1.6 Effectifs dans une étude cas-témoins (Toma et al., 2010a)

Cas Témoins (maladie +) (maladie -) Exposés A B Non exposés C D Total A+C B+D Odds d’exposition A B 퐴 + 퐶 퐵 + 퐷 푶풄풂풔 = 푶풕풆풎 = 퐶 퐷 퐴 + 퐶 퐵 + 퐷 Légende: Ocas Odds des cas Otem Odds des témoins (contrôles)

9.- Les caractéristiques des tests de dépistage 9.1.- Sensibilité (Se) La sensibilité (Se) d'un test de diagnostic est la probabilité conditionnelle qu’un animal/patient soit testé possitif si l’animal/patient est infecté. Elle correspond à la proportion d’animaux Vrais Positifs (VP) sur l’ensemble des infectés, à savoir VP et Faux Négatifs (FN) (VP+FN), et pourrait être traduite comme étant la capacité à détecter le plus grand nombre d’individus ou de patients infectés. Elle est estimée de la manière suivante: 푉푃 푺풆 = 푉푃 + 퐹푁

9.2.- Spécificité (Sp) La spécificité (Sp) est la probabilité conditionnelle qu’un animal/patient soit testé négatif si l’animal/patient est indemne de maladie. C’est la capacité d'un test de diagnostic à détecter le plus grand nombre d’individus en bonne santé, ou Vrais Négatifs (VN). Elle peut être calculée comme suit, et à l'aide du tableau 1.7.

푉푁 푺풑 = 푉푁 + 퐹푃

Tableau 1.7 Définitions des notions de sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive et valeur productive négative d’un test (Toma et al., 2010b)

Situation réelle Infectés Indemnes TOTAL VP Positive VP FP 푽푷푷 = Reponses 푉푃 + 퐹푃 du test VN Negative FN VN 푽푷푵 = 푉푁 + 퐹푁 VP VN TOTAL 푺풆 = 푺풑 = 푉푃 + 퐹푁 푉푁 + 퐹푃 Légende: Se Sensibilité Sp Spécificité VPP Valeur prédictive positive VPN Valeur prédictive négative.

9.3.- Valeur Prédictive Positive d’un résultat positif (VPP) Il s’agit de la probabilité qu’un résultat positif à un test de diagnostic corresponde à un animal réellement infecté. Elle se calcule de la façon suivante:

푉푃 푽푷푷 = 푉푃 + 퐹푃

9.4.- Valeur Prédictive Positive d’un résultat négatif (VPN) C’est la probabilité qu’un résultat négatif à un test de diagnostic corresponde à un animal/patient vraiment indemne:

푉푁 푽푷푷 = 푉푁 + 퐹푃

INTRODUCTION

Partie 2: Le système d’élevage et la situation actuelle de la brucellose en Equateur

"El sogueo"

Le système de élevage traditionnel appelé "sogueo" consiste en garder les animaux dans les terrains vagues, accotements des routes et autoroutes et dans les lieux publics; limitant son mouvement en tenant l'animal à un piquet par une corde.

Source: Jorge Ron-Román Cantón Mira, provincia del Carchi – Ecuador. 2008

ARTICLE 1

Brucellosis in Ecuador: a critical review of the current situation, prospect and challenges.

Ron-Román J., Saegerman C., Brandt J., Berkvens D., Benítez-Ortíz W.

Article soumis pour publication Revista Científica, FMV - Universidad de Zulia

Préambule Sans aucun doute, la compréhension d'un problème constitue la base de la formulation, non seulement, des solutions correctes mais aussi et surtout viables. En ce sens, et dans le cadre de ce travail visant à mieux comprendre, et de manière correcte, la situation épidémiologique de cette zoonose chez l'homme et ses différents hôtes, une revue complète de la littérature s’avérait nécessaire comme point de départ. Le manque d'information au niveau international ne reflète pas toujours le travail effectué par des chercheurs locaux, qui restent souvent dans l'anonymat le plus total.

Résumé en français Objectifs: la brucellose est une zoonose négligée. La situation actuelle de la brucellose en Equateur est peu connue, ce qui génère un manque de stratégies de prévention et de contrôle au niveau national. Méthodes et résultats: dans le but de rassembler les connaissances préliminaires disponibles à l’heure actuelle, les auteurs ont pris connaissance des publications et rapports officiels nationaux, dont 58 mémoires de thèses. Conclusions et mise en œuvre des résultats: sur base de ces données et d’observations préliminaires propres, des conclusions ont été tirées et une série de recommandations prodiguées afin d’améliorer la situation de la brucellose dans le secteur animal et en santé publique dans le pays.

Brucellosis in Ecuador: review of the current situation, prospects and challenges.

Ron-Román J. (1-2-3*), Saegerman C. (2), Brandt J. (4), Berkvens D. (4) & Benítez-Ortíz W. (1-5).

(1) Centro Internacional de Zoonosis (CIZ), Universidad Central del Ecuador, P.O.Box 17-03-100, Quito Ecuador. (2) Research Unit of Epidemiology and Risk analysis applied to Veterinary Sciences (UREAR-ULg), Fundamental and Applied Research for Animal and Health (FARAH) Center, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, Boulevard de Colonster 20, B42, B-4000 Liege, Belgium. (3) Carrera de Ingeniería en Biotecnología. Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE, Ecuador. (4) Unit of Veterinary Biostatistics and Epidemiology, Department of Biomedical Sciences, Institute of Tropical Medicine, Nationalestraat 155, B-2000 Antwerp, Belgium. (5) Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Central del Ecuador.

* Corresponding author: Jorge Ron-Román, Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE. Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. Av. General Rimiñahui s/n. Sangolquí, Ecuador. P.O.Box 171-5-31B Tel.: + 593.2.398.9400. E-mail address: [email protected] / [email protected] (J. Ron-Román)

Abstract Objectives: Brucellosis is a neglected zoonosis. The brucellosis situation in Ecuador is characterized by little knowledge about the current situation resulting in a lack of prevention and control strategy at national level. Methodology and Results: In an attempt to gather the preliminary available knowledge, the authors reviewed official reports and regional publications at national level, including 58 final year dissertations. Conclusions and application of findings: Based on these data and own preliminary observations, conclusions and recommendations are presented to improve the brucellosis situation both in animal and human compartiments in this country. Keywords: brucellosis, human, animal, Ecuador

INTRODUCTION

Brucellosis, a highly contagious disease, caused by Brucella spp. has been recognised by international organisations like FAO, WHO and OIE as a zoonosis of major importance with a worldwide distribution (Gil & Samartino, 2001; Halling & Boyle, 2002) and, depending of the Brucella species and biovar, with bovines, goats, sheep and pigs as natural reservoirs.

Brucellosis induce important economic losses to the animal production which amount to about 600 million US$ per annum in Latin America (Acha & Szyfres, 2003). Brucellosis can be transmitted to man, which happens usually through direct contact with infected animals or consumption of non-pasteurised dairy products. Therefore in various countries, numerous control and eradication programmes have been set up with the two-sided approach (in function of the epidemiological situation) of vaccination of susceptible animals and/or eradication of infected animals. The latter action is obviously very dependent, in first instance to the true prevalence of brucellosis, to the available laboratory capacity and also on characteristics of laboratory diagnostic tests, which are severely hampered by the lack of a “Gold Standard” test. This is mainly due to interference by cross-reacting antibodies, raised against other pathogens such as Yersinia enterocolitica 0:9 (FAO & OMS, 1986), or by antibodies generated after vaccination (Pouillot et al., 1997; Saegerman et al., 1999, 2004). Consequently, the isolation and correct identification of the pathogen is of utmost importance for a correct diagnosis, but applying these techniques in developed countries is confronted with many difficulties (Alton et al., 1988; Macmillan, 1990).

Brucellosis was reported for the first time in cattle in Ecuador by Salvestroni in 1926 (Alvarado, 1959), whereas the first human case was described by Valenzuela in 1934 (Sánchez, 1997).

MATERIALS AND METHODS The present paper attempts to present the situation of brucellosis in Ecuador, based on a review of the literature and the available information from public and private institutions directly or indirectly involved in diagnosis, prevention, control, or epidemiological surveys of brucellosis, including graduate dissertations presented at

different universities in Ecuador. Only the reference literature was mentioned in the appropriated section of the paper.

RESULTS AND DISCUSSION Animal husbandry systems and consumption habits in Ecuador Ecuador is divided into four regions (i.e. the coastal region, the mountains, the Eastern region and the islands) with different climatological and ecological conditions, which has led to several distinct systems of animal husbandry and production. In 2002, according to the Ecuadorian Animal Health Services (Servicio Ecuatoriano de Sanidad Agropecuaria - SESA) currently the Quality Assurance Agency of Agriculture (Agencia de Aseguramiento de Calidad del Agro – AGROCALIDAD), of the Ministry of Agriculture and Animal Husbandry (Ministerio de Agricultura y Ganadería - MAG) currently the Ministry of Agriculture, Animal Husbandry, Aquaculture and Fisheries (Ministerio de Agricultura Ganadería Acuacultura y Pesca - MAGAP), Ecuador counted 4,486,020 heads of cattle distributed over 427,514 Agricultural Production Units (Unidades de Producción Agrícola - UPAs), 1,527,114 pigs in 440,475 UPAs, 1,127,468 sheep in 178,995 UPAs, 178,367 goats in 16,405 UPAs, 21,662 llamas in 7,610 UPAs, 2,024 alpacas in 206 UPAs and 375,760 equines in 189,289 UPAs (INEC, MAG, & SICA, 2002). The distribution of cattle, goats, sheep and pigs, as shown on Figures 1A, 1B, 1C and 1D.

Concerning bovines, 50.69% (2,274,137 animals), is concentrated in the mountainous region or Sierra, in 339,555 UPAs, representing 79.42% of the national total of UPAs. During 2002, in 54.33% of the UPAs cattle were kept tethered (“sogueo”), 44.22% practiced cattle grazing and in the remaining 1.43% another husbandry system was used. It has to be mentioned that in the traditional system animals are tethered on a pole in fallow land, alongside roads on communal lands. Concerning reproduction practices: in 76.45% of the UPAs, cows are served (freely or controlled) by a stud bull, with artificial insemination (AI) applied in only 0.68% UPAs. In the remainder 24.16% the reproduction prevalence is unknown (INEC et al., 2002).

Figure 1. Animal populations per Canton (INEC et al., 2002) A

Legend: A = Cattle B = Goats C = Sheep D = Pigs

In 2002, dairy production mounted to about 3.5 millons litres per day, with a mean of 4.35 litres/cow/day, of which 58.49% was consumed or processed on the UPAs. In 99% of the UPAs, cows were milked by hand. In 2002, 61.96% of the 808,856 cows in production were concentrated in the Sierra; in that year abortusses were reported in 9.88% of the UPAs, affecting 11.36% of the cows in production (INEC et al., 2002).

This percentage of abortions is in discrepancy with threshold used to classify healthy herds; value of less than 3% is considered as normal (Radostits, 2001).

One of the main characteristics of the production systems in Ecuador is the coexistence of various animal species (both large and small species) in the same UPA. This together with the poor implementation of modern technology, deficient sanitary conditions, the absence of biosecurity measures and of a proper vaccination scheme, contributes to the existence of an environment ideal for the introduction and maintenance of infections and contagious diseases, as suggested by the high percentage of abortions reported. In addition, the causal agents of these diseases can easily be transmitted to humans due to risky alimentary habits such as consumption of blood, colostrum, unpasteurised milk and other dairy products, placenta (locally called “guagua mama - huagra mama”) and foetuses (locally known as “ville”) and due to manipulation of contaminated biomaterials.

Brucellois in anaimal and human compartiments Bovine brucellosis In 1926, Salvestroni was the first to detect and to notify the first case of brucellosis in Ecuadorian cattle (Alvarado, 1959). From then onwards, the major part of the research on animal brucellosis has solely been executed in the veterinary and agronomy faculties of the various universities in the country (Table I). In spite of the efforts, a fair idea of the problem was never obtained because of the lack of standardised diagnostic methods used, difficult interpretation of the results (post vaccinal cross-reactions), inadequacy of sample sizes and too limited collections and identifications of isolates of Brucella spp.

The only survey at a national level was executed by the National Programme of Animal Health (Programa Nacional de Sanidad Animal - PNSA) of MAG, which during 1978 and 1979 organised a serological cattle survey in the Sierra and coastal provinces.

Table I. Main studies about animal brucellosis in Ecuadorian universities Zone of study Diagnostic N° of Authors Animal species N° of herds sampled % positives (number*) tests samples

Vásconez-Lópeez (1960) cattle Quito (1) MRT ND pasteurisation unit 30 – 50 Estupiñan (1967) cattle Pasteurisation MRT ND 384 68.8 units: Quito (1), Cayambe (1), Latacunga (1) Manzano (1974) cattle Tungurahua (1) MRT 409 47 11.4 (4.8 susp) Hudd 1156 47 4.3 (3.1 susp) Maldonado & Salgado (1979) cattle Car (1), Imb (1), RB 989 ND 51.6 Pich (1), Cot (1), IC 989 ND 52.6 Mab (2) LCSP, 1953; cit. by Saltos & cattle Litoral (2) ND 6535 ND 11.5 Saltos (2001) Alvarado (1959) cattle Zaruma (2) Hudd 607 26 3.5 Gómez (1964) cattle Coastal zone (2) Hudd 2400 ND 12 Olleague (1969) cattle El Oro (2) MRT 1231 208 20 - 57 Valdivieso (1969) cattle Machala (2) Hudd 1537 ND 9.9 MRT 1537 ND 5.0 Aragundi(1969) cattle Los Ríos (2) MRT 257 113 33 Galán (1969) cattle Daule (2) Hudd 2015 14 3.5 Centro de Salud Pecuaria cattle Los Ríos (2), MRT ND 496 39 Guayaquil, 1969; cit. by Guayas (2), Chamorro (1972) El Oro (2) Albornoz (1970) cattle Guayas (2) MRT 1200 ND 31.8 García (1970) cattle Manabí (2) MRT 233 ND 5.5 Córdova (1970) cattle Guayas (2) MRT 395 395 33.2 Plaza (1970) cattle Manabí (2) Hudd 800 74 11.3 Santillán (1971) cattle Esmeraldas (2) MRT ND 134 4.1 Mora (1971) cattle Chone (2) Hudd 2011 ND 9.6 Falconí (1972) cattle Manabí (2) MRT 749 206 5.5 Plasa (1977) cattle Manabí (2) Hudd 1000 20 0.4 Cordero (1978) cattle Esmeraldas (2) Hudd 500 43 8.8

Miketta (1980) cattle Esmeraldas (2) Hudd 1009 120 6.5 Nieto (1981) cattle El Oro (2) MRT 119 119 39.5 Arteaga (1983) cattle Manabí (2) Hudd 409 ND 13.2 RB 70 ND 37.1 Loor & Moreira (1986) cattle Portoviejo (2) Hudd / RB 1000 120 4.6 Zambrano & Cedeño (1995) cattle El Carmen (2) Hudd 862 60 3.2 Valdez, Bazurto, & Vera (2000) cattle Manabí (2) SA 202 ND 20 Brito & González (2001) cattle Manabí (2) RB 608 ND 0.9 cELISA 6 ND NR Saltos & Saltos (2001) cattle Manabí (2) Hudd 709 70 10 Demera, Farfán, Ortega, & cattle Manabí (2) Hudd 210 ND 0 Intriago (2002) Zambrano (2002) cattle El Carmen (2) Hudd 1225 ND 2 Bailon & Muñoz (2003) cattle Manabí (2) Hudd 648 ND 13.3 Herrera (2003) cattle Santo Domingo (2) Hudd 500 100 1.4 Vera & Flores (2004) cattle Manabí (2) MRT 807 ND 0 Paredes (2012) cattle Santo Domingo (2) MRT 19 19 5.26 RB 534 0.19 SAT-EDTA 534 0.19 Cuenca (2013) cattle Santo Domingo (2) RB 600 1 0.5 SAT-EDTA 600 0.5 Quinde (1959) cattle Loja (3) Hudd 300 ND 0.7 (susp) Saldaña (1973) cattle Cuenca (3) MRT 186 ND 6.5 SA 145 ND 6.2 Chauvin (1969) cattle Loja (3) Hudd ND ND 0 Segarra (1971) cattle Loja (3) MRT 2500 ND 0.3 Hudd 2500 ND 0.1 Rivadeneira (1980) cattle Cuenca (3) MRT 97 54 1.9 Hudd 9 1 11.1 Delgado & Vega, 1985; cit. by cattle Cañar (3) ND 346 ND 0 Delgado (1992) Fernández & Peña (1991) cattle Cuenca (3) RB 3000 ND 0.7 Vidal (1992) cattle Cuenca (3) Hudd 600 20 1.2 Alvarado (1995) cattle Azuay (3) RB 130 ND 0 Crespo (1999) cattle Cuenca (3) RB 600 ND 1.4 Chamorro (1972) cattle Napo (4) MRT 63 15 14.2

Hudd 63 7 6.4 Rivadeneira (1980) cattle Upano (4) Hudd 850 ND 0.9 Castro & Zhunbio (1989) cattle Morona Santiago Hudd / RB 1329 ND 0.2 (4) Delgado (1989) cattle Morona Hudd / RB 766 ND 0 Santiago(4) Ortiz (1962) goat Guayas (2) Hudd ND ND 0 Albornoz (1970) goat Guayas (2) MRT 800 ND 33.2 Granda (1972) goat Macará (3) Hudd 205 ND 0 (0.2 susp) Tapia (1998) goat Loja (3) Hudd 435 83 0 Sánchez (1997) goat Azuay (3) Hudd 500 ND 1.2 Tobar (1961) goat ND MRT/Hudd 19/375 3/3 0/0 Tobar (1961) pig Slaughterhouse Hudd 200 ND 3 Quito (1) Robalino (1966) pig Slaughterhouse Hudd 1200 ND 2.1 – 11.3 Quito (1) Encalada (1963) pig Guayaquil (2) Hudd 1000 ND 3.4 (7.7 susp) Intriago (1971) pig Portoviejo (2) Hudd 1200 ND 7.9 Demera et al. (2002) pig Manabi (2) Hudd 210 ND 0 Tobar (1961) sheep ND MRT/Hudd 30/388 6/7 0/0 Zambrano (1978) dog Manabí (2) Hudd 400 ND 3.5 Legend: LCSP = Laboratorios del Centro de Salud Pecuaria; SA = Serum Agglutination Test; RB = Rose Bengal; Hudd = Huddleson Agglutination Test; MRT = Milk Ring Test; IC = heat inactivation test; cELISA = competitive Enzyme Linked Immunosorbent Assay; susp = suspected; ND = not determined; NR = results not reported; Car = Carchi; Imb = Imbabura; Pich = Pichincha; Cot = Cotopaxi; Mab = Manabí; * This number refers to the number of zone mentioned in the Figure 2.

Based on the results of 15,473 bovines with the Rose Bengal Test, 3.19% and 5.5% animals were considered positive and suspected respectively. This information allowed SESA in 1999 to characterise three epidemiological regions in Ecuador (Figure 2), i.e. those with high prevalences i.e. the provinces of the northern Sierra with prevalences between 4% and 10.62% (zone 1), likewise the coastal provinces with prevalences between 5.88% and 10.62% (zone 2) and the provinces of the southern Sierra with low prevalences, between 1.3% and 2.6% (zone 3). Since there was no information available from the Amazonian region, SESA assumed that, because of its similar characteristics of animal husbandry with zone 3, prevalences were equally lower in that region. A subsequent study by SESA in 1997 concluded that the disease was absent from the Galapagos Archipelago, since all samples (507 bovines from 4 islands) proved to be negative by Rose Bengal Test (Torres, 2008). According to MAG, the entire cattle population of the islands consisted of 11,104 animals, divided over 297 UPAs (INEC et al., 2002).

In order to predict the true prevalence and the evolution of the disease, similar surveys should be held regularly, yet supported by epidemio-statistical models, underpinned if possible by combined results of multiple diagnostic assays with high specificity and sensitivity.

The assumption that a geographically isolated zone like the Archipelago is free of brucellosis, cannot be based solely on a serological survey of a few percentage of bovines in addition to the application of a single and very restricted assay, rather it should be based on a sufficiently large sampling of all animal species which may be potential reservoirs not only of the traditionally known Brucella spp. It should equally include marine mammals as potential reservoirs of recently described species like Brucella pinnipedialis and Brucella ceti (Godfroid et al., 2010; Pappas et al., 2005).

In Ecuador, the information about the economical impact of the disease is scarce yet professionals and cattle owners agree that losses are considerable, as such, for the year 1967 it was estimated that 26,000 calves were lost due to brucellosis (Laboratorio del Centro de Salud Pecuaria, 1970; cited by García-Carrillo, 1987). Losses during 1983 were estimated at 8,850,900 US$, (Vallejo, 1983; cited by García-Carrillo, 1987),

during 1998 at 2,482,269 US$ (Torres, 2008), and during 2005 at 5,436,908 US$ (Torres, 2008).

Figure 2. Prevalence of bovine brucellosis in Ecuador: epidemiological feature (MAG- SESA, 1999)

Legend: Zone 1 = high prevalence zone on Sierra; Zone 2 = high prevalence zone in coastal area; Zone 3 = low prevalence zone on Sierra; Zone 4 = presumed low prevalence zone in Amazonia; Zone 5 = presumed brucellosis-free zone of the Galapagos Islands.

The available information about studies on animal brucellosis in Ecuador is presented in Table I, data are mainly based on results described in undergraduate dissertations. Little scientific literature is available and even more so rarely published in international journals. The reliability of these data from dissertations is often questionable because of the above mentioned reasons, i.e. lack of standardised diagnostic techniques (e.g. heterogeneous protocols are used with different cut-off’s), the lack of information about vaccinations (e.g. kind of vaccine, age of animal at vaccination, number of animals vaccinated in a herd) and the restricted number of animals sampled.

The studies as presented in Table I can be classified in field studies (in a geographically or administratively defined zone) and studies in slaughterhouses, the latter being very useful to obtain a qualitative indication about the presence or absence of the disease in a geographical zone. However, even these studies should be assessed with caution, often because of poor design (e.g. insufficient number of animals, biased sampling and insufficient information about the animals). In addition, the use of assays which are based on IgM detection i.e. acute infections, and the lack of IgG detecting assays may often lead to subestimations of the disease (or surestimations in case of false positive serological reactions with Gram-negative bacteria, sharing the same epitope on the lipopolysaccharide of Brucella).

In addition to the different production and breeding systems (extensive in the coastal area and semi-intensive in the Andean region), the variability in sensitivity and specificity of the serological assays, used in these surveys, are important contributing factors to the highly variable data on prevalences as presented in Table I. In conclusion, despite most of previous surveys underligned the presence of brucellosis in Ecuador, a validated study, to estimate the prevalence and to determine predisposing and decisive factors, prevailing in every geographical zone of the Ecuadorian territory, should be realised.

Ovine and caprine brucellosis Sheep and goat husbandry is very traditional and up to now the ancestral practices, characterised by poor management and unbalanced nutrition, are still prevailing. Sheep and goats, nicknamed cows of the poor, are the economical subsistence of the small holders. The majority are indigenous breeds (93.38%) are concentrated in the Sierra. Of the national total of animals, 34.17% are kept in UPAs, maximum 2 hectares wide (INEC et al., 2002).

The 44.81% of the goats in Ecuador are kept in UPAs up to 10 hectares. In the southern region goats are free roaming.

In the traditional husbandry system, still in use today, animals are guarded at night in simple corrals close to the dwellings of the owner (Benítez-Ortiz et al., 1982).

There are no specific epidemiological surveillance system and any prevention and/or control of brucellosis in small ruminants, which is highly symptomatic for the poor sanitary conditions in which ovines and caprines are kept. In Ecuador there is certainly no official and apparently no clandestine form of commercialisation of a vaccine against brucellosis in small ruminants.

Limited studies (Table I) have shown that a low percentage of animals have antibodies against Brucella spp. There are no official reports in Ecuador about the occurrence neither of Brucella melitensis nor of Brucella ovis (Lucero et al., 2008; Thimn, 1982), equally there was never any local or regional programme to prevent and/or control brucellosis in small ruminants.

Consumption of milk from sheep is very rare, yet in certain regions, specifically in southern Ecuador; consumption of milk from goats is very common and a substantial part of goat dairies is destined for traditional production of cheese. It is not so uncommon to observe small herds of 3 to 8 goats, roaming in the villages, guarded by the owner and being milked on demand by customers who believe in the curative benefits of goat milk, obviously without any sanitary control whatsoever.

In a prospective survey on caprine brucellosis by the International Centre for Zoonoses (Centro Internacional de Zoonosis - CIZ) there was no evidence of antibodies against Brucella spp (smooth Brucella), found. This study, held in the Zapotillo canton in the Loja Province, comprised 437 randomly selected sera, analysed using the Rose Bengal test (2005, unpublished data).

3.1.Porcine brucellosis The amount and types of studies conducted in pigs, revealed lack of importance that has been given to the brucellosis in this species. The use of Huddleson agglutination test has shown prevalences between 2.1 and 11.3% (Table I). However, the notification of the isolation of Brucella suis (biotype 1) (Lucero et al., 2008; Thimn, 1982), demonstrate not only the importance of brucellosis in this natural reservoir, but in public health, due to the high pathogenicity for humans, attributed to this specific biotype of species of Brucella.

Brucellosis in South American camelids Currently, in comparison with other Andean countries, the camelid population in Ecuador is very small, yet there is a growing interest on behalf of the rural population in llama and alpaca as a valuable alternative for auto-consumption in addition to wool production for handicraft. Unfortunately in Ecuador, as in neighbouring countries there is no information about the prevalence of brucellosis in llamas or alpacas.

Canine brucellosis Equally canine brucellosis has hardly been studied in Ecuador, yet there are two interesting reports. In 1978 (+90), a sero-prevalence of 3.5% was found in 400 dogs from the coastal province of Manabi. Antibodies against Brucella spp. (smooth Brucella), were demonstrated by the Huddleson assay. In 1997, antibodies against Brucella canis were reported in 14.1% of 404 dogs examined. Samples were collected in veterinary clinics in Quito; the authors used Agar Gel Immunodiffusion Test with B. ovis antigen (Martínez & Proaño, 1997).

Currently in CIZ, research has been initiated aiming to determine the seroprevalence of Brucella spp (smooth Brucella strains) in dogs on cattle ranches. Standardised immunodiagnostic assays will be used in addition to attempts to isolate local strains.

Human brucellosis In 1934, Valenzuela was the first to diagnose brucellosis in Ecuador in a patient from the rural zone of Pichincha Province (Valdivieso, 1969).

In Ecuador, until 2007, brucellosis belonged to the group of mandatory notifiable diseases or events which are submitted to epidemiological alertness - EPI 2 (confirmed cases by laboratory or epidemiological link). However since 2008, brucellosis is not included in this list anymore which may deepen the under reporting of cases even more.

Diagnosis is based on clinical findings rather on the results of laboratory assays, specifically the Huddleson Agglutination Test and on the occasional isolation of the pathogen. In practice, there is no epidemio-surveillance of people at risk nor is there any proper notification system.

The course of the official reports from 1990 to 2007 by the National Directorate of Epidemiology of the Ministry of Public Health (Dirección Nacional de Epidemiología, del Ministerio de Salud Pública - MSP) is shown in Figure 3 and studies on human brucellosis, based mainly on graduate dissertations, are summarised in Table II. According to available information from the World Animal Health Information Database (WAHID) of the OIE, 6 cases of human brucellosis were reported in 2005, corresponding to 0.0449 per 100,000 inhabitants and a rank of importance of 5. Incidentally, highly ranked diseases are: salmonellosis (rank 1 with 8,611 cases), leishmaniasis (rank 2 with 1,925 cases), cysticercosis (rank 3 with 161 cases) and leptospirosis (rank 4 with 59 cases). Obviously, to determine the true prevalence of these zoonoses and to assess the risk factors, there is an urgent need for epidemiological studies, not restricted to the population at risk, but in the entire population using more sensitive diagnostic tests.

Control programme of bovine brucellosis in Ecuador MAGAP through SESA designed a control scheme aimed at a progressive decrease of the number of positive bovines in the endemic regions of the country, aiming to arrive finally at the required conditions for total eradication of the disease (MAG-SESA, 1999).

The national strategy focuses on the immunisation of female calves, epidemiological vigilance and stamping out of positive animals.

A strategic plan, considered in the national programme for the control of bovine brucellosis (Programa Nacional de Control de la Brucelosis bovina), has been prepared to be launched. A diagram of the proposed control strategy is presented in Figure 4. In the new programme, a herd will be declared brucellosis-free when the animals of the UPA in question have been submitted to at least two consecutive diagnostic assays, with an interval of 45 to 60 days, both yielding negative results. It should be noted that this is a considerable simplification of the existing required strategy (Godfroid et al., 2010; MAG-SESA, 1999; Saegerman et al., 2010).

Figure 3. Official reports of human brucellosis in Ecuador: incidence from 1990 to 2007 (Cartelle, Holban, Escalante, & Cevallos, 2015).

24 25

15 13

Cases 10 9 9 10 6 5 5 5 5 4 5 5 3 3 2 1 1 1 0 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Year

It is obvious that any control and eradication programme of a given disease can never achieve its goal in the absence of a reference laboratory, where quality control of the biologicals (vaccines and antigens), as well as the repeatability and the reproducibility of standardised diagnostic tests can be guaranteed. In addition, decisions should be scientifically based and made only by a team of professionals, experts in human and animal health and underpinned by laws, regulating all aspects concerned i.e. vaccinations (registration of the selection of strain, way of administration, dose, age at vaccination and possible boost-vaccinations), official recognition of diagnostic laboratories (public or private), law –enforced notification of positive cases (human and animal) and organised culling of positive animals.

A control programme must not emphasise on imposing penalties or on sanctioning cattle owners, rather to the contrary, on incentives e.g. economic benefits for those farms applying pasteurisation and with official declaration of brucellosis-free herds.

Table II. Main studies of human brucellosis at Ecuadorian universities

Zone of study N° of persons % and cases Authors Subjects of study Diagnostic tests (number*) sampled positives León, 1952; cited. by Chamorro ND Quito (1) Hudd ND 1.4 – 2 (1972) Encalada (1963) Slaughterhouse workers Guayaquil (2) Hudd 5 0 Lince & Uriguen, 1965; cited by ND ND ND 566 4.1 García-Carrillo (1987) Intriago (1971) Slaughterhouse workers Portoviejo (2) Hudd 25 4.0 Macías (1977) Hospital pacients Portoviejo (2) Hudd 700 2.4 León, 1979, cited by Delgado, Slaughterhouse workers Guayaquil (2) Hudd 211 10.9 (1992) Encalada, 1980; cited by Delgado, Slaughterhouse workers El Oro (2) ND 235 26 (1992) Zurita, 1980; cited by García- Slaughterhouse workers El Oro (2) ND 235 23.8 Carrillo (1987) Arteaga, Navas, Obando, & Slaughterhouse workers Manabí (2) Hudd 207 0 Zambrano (2002) (Betancourt, Guerrero, & Román, Pregnant women Manabí (2) Huddl 42 0 2002) Alvarez & Pillacela (1985) Reports of health centres Cuenca (3) ND ND 3 cases (1974 – 1983) Delgado, (1992) Workers in slaughterhouses Cuenca (3) Hudd 173 2.3 and meat-processing centres Cuenca (2013) Workers Santo Docmingo RB 70 1.43 SAT-EDTA 70 1.43 Legend: SA = Serum Agglutination Test; Hudd = Huddleson Agglutination Test; ND = Not determined; RB= Rose Bengal Test; SAT-EDTA = Wright Slow Agglutination Test with EDTA; * This number refers to the number of zone mentioned in the Figure 2.

Figure 4. Current official strategy used in Ecuador to certify animal production units officially free from bovine brucellosis and to monitor the disease (Torres, 2008)

Milk Ring Test

- in UPAs

- in industries

- in laboratories Negative Positive

Rose Bengal Rose Bengal

Negative Positive

180 days

Rose Bengal Competitive ELISA Positive Negative

Identification and CERTIFICATE elimination in

of brucellosis-free Herd slaughterhouse

(maximum in 90 days)

Pursuit whit Milk Ring Test, every trimester

Legend: UPA= Agricultural Production Units (Unidades de Producción Agrícola).

In spite of “80 years of active monitoring and diagnosis of brucellosis” (Torres, 2008), there is still no specific legislation regulating the control of brucellosis in Ecuador, i.e. the notification of human and animal cases, the import and commercialisation of vaccines, the use of diagnostic assays, the recognition and authorisation of laboratories and staff, the stamping out procedures and the liability to quarantine transported animals. There only is the fact that brucellosis was listed as a notifiable disease according to the law on animal health, enacted in 1981 (Órgano del Gobierno Del Ecuador, 1981), and according to the general decree of law

on animal health, enacted in 1996 (Órgano del Gobierno Del Ecuador, 1996), which in practice was never properly implemented due to lack of funds. A specific set of rules such as those stipulated by the Directive 98/46 of the European Community is urgently needed.

Vaccination of cattle Currently two types of vaccines are in use for cattle in Ecuador, namely B-19 and RB-51. In 2005, according to official OIE information (OIE, 2016b) 12000 cattle were vaccinated against brucellosis, without indicating the strain being used. However, in that year apparently a higher number of animals should have been vaccinated since in the same year, 47020 doses of RB51 were sold in the country (see Table III for a summary of the available information). Vaccination is applied sub-optimally and practices like intra-muscular application, vaccination of calves, underdosing with strain RB-51 are common, including the supposed “treatment” of seropositive animals by repeated vaccinations. Furthermore, there is no quality control and registration of the vaccines distributed in the country.

The poor vaccination coverage, observed in traditional husbandry systems, mainly due to a lack of coordination in the control programme at national, zonal and regional level and the lack of an official vaccine distribution circuit, together with the existing ignorance and lack of interest for small holdings, plus the careless handling of biologicals and the practice of deferred vaccination of heifers (sometimes at the age of 12 or even 18 months), are likely causes of the persistence of foci of brucellosis. Vaccination thus remains a matter of private initiative, only performed by a small group of cattle owners, who in addition never immunise, animals other than cattle with an appropriated vaccine.

Table III. Characteristics of vaccines used in bovines in Ecuador during 2005

Way of Country of N° of germs N° of doses Vaccine Strain Form ml/dose administ origen per dose distributed ration 9 1 Ecuador B-19 Lyophylised 60 x 10 5 SC ND 2 Ecuador B-19 Liquid ND 5 SC ND 8 3 USA RB-51 Lyophilised 10 x 10 2 SC 47020 Legend: SC = Sub-cutaneous; ND = Not determined; Source: own unpublished observations.

Diagnostic tests, applied in Ecuador Serological tests Just like any other infectious organism, Brucella spp. must secure its survival in its host and thus for this purpose possesses highly developed and complex antigenic and enzymatic structures, which in turn generate equally complex immune responses in the host. Due to the difficulties and occasional risks involved by the direct demonstration of the causal agent, even more so in case of intracellular infection, antibody detection assays were developed and are mostly relied upon.

Currently, the number of serodiagnostic tests, both quantitative and qualitative; to detect antibodies against Brucella spp. far exceeds those developed for most of the other pathogenic agents. However, the sensitivity and specificity of these tests have been a matter of discussion and controversy, since many of them suffer from false positive serological reactions with Gram-negative bacteria, sharing the same epitope on the lipopolysaccharide (LPS) (Buzgan et al., 2010; FAO & OMS, 1986; Gerbier et al., 1997; Godfroid et al., 1994; Pouillot et al., 1997; Saegerman et al., 2004) and with post-vaccination antibodies (Pouillot et al., 1997; Saegerman et al., 1999, 2004).

Concerning the current diagnostic tests used in Ecuador, they exists no control neither of the protocols nor of the antigens used in the laboratories involved. It is even not known which test(s) is (are) employed in a specific situation. Tests used are Huddleson Agglutination Test, Agar Gel Inmuno-difussion Test (AGID), Rose Bengal Test, Wright Slow Agglutination Test (SAT), SAT with EDTA (SAT-EDTA), SAT with 2-mercaptoetanol (SAT-2ME), Agglutination Test with Rivanol (RIV), indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (iELISA), competitive Enzyme Linked Immunosorbent Assay (cELISA) and milk ring test (MRT) (Table IV). Each laboratory uses its own protocols, cut-offs and so called “Gold Standard”, the whole usually covered by a blanket of secrecy.

Isolations of Brucella spp. Isolation of the germ is confronted with many difficulties and requires specialised high- security laboratories. Consequently the number of successful isolations, reported in a given country, is directly related to the standard of its reference laboratories, if present. Ecuador is no exception to this rule and therefore there is no official information neither on the number of isolations performed or on the geographical distribution of the strains. Out of the 794

isolations of Brucella, realised and reported between 1965 and 1977 in 12 American countries, 8 were performed in Ecuador i.e. one of Brucella abortus (biotype 1), 6 of Brucella abortus (biotype 4), and one of Brucella suis (biotype 1) (Lucero et al., 2008; Thimn, 1982).

Recently, some strains from different animal species have been isolated by CIZ and will eventually be characterised (unpublished data).

Table IV. Results of serodiagnosis of bovine brucellosis during 1997-2006, officially reported cases & cases reported by private labs (cases not reported). Official report* Private laboratory** Year Animals Animals Animals Animals analysed positive analysed positive 1997 NA 231 NA NA 1998 NA 172 NA NA 1999 NA 448 NA NA 2000 NA 313 NA NA 2001 NA 337 NA NA 2002 NA 348 6628 689 2003 2583 330 4494 593 2004 2206 332 2274 273 2005 NA NA 3775 605 2006 NA NA 4402 419 Legend: * Official information reported by Ecuador to OIE; ** Private diagnostic; laboratory in Quito, Ecuador; NA = No data available.

CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS From the available information and own observations, brucellosis seems to be a major problem in Ecuador, both in cattle and man. Official documents show the current state of knowledge to be rather poor. This is due mainly to the complex symptomatology of human brucellosis, the underreporting of cases, the lack of epidemiological studies and the scarcity of laboratories and experts involved. In addition, the range of diagnostic tests is restricted in most laboratories and backup from national or international reference centres are nonexistent. Lastly, there is little isolation, identification and characterisation of Brucella spp.

A basic requirement for future control and eradication programmes is the development of up- to-date, practical and efficient maps, suited for every region and indicating the true prevalence of brucellosis in Ecuador and the practices of vaccination. Furthermore, continuous training for professionals and general public awareness campaigns should be organised and evaluated.

It is obvious that information about vaccine quality and registration and reliability of laboratory tests is fundamental for any prevention and/or control or eradication programme.

Hence there is an urgent need for a national reference laboratory, not only responsible for quality control of biologicals (vaccines and antigens) and diagnostic tests, but also equipped for isolating and identifying Brucella spp. and to provide scientific expert opinion.

Finally, a network of professionals, laboratories and institutions should guide private and public organisations to support and streamline their collaboration, trying to avoid the current situation of indiscriminate interventions. It should be supported by a national database, compiling information gathered from systematic nationwide epidemiological surveys and surveillance by regional laboratories under the supervision of a reference laboratory. Systematic mass vaccination campaigns of all domestic potential brucellosis reservoirs should be organised, registered and monitored and this effort should be supported by a national policy.

Elimination of brucellosis from animal production in Ecuador will not only be beneficial for the health of both farmers and consumers, but it will also decrease production losses of dairy products and meat, thereby ensuring a secure and safe source of animal protein for the benefit of the underprivileged rural population of Ecuador.

We once again state that a brucellosis control program must be structured on the basis of the participation of the different actors, among them: livestock owners, veterinary professionals, the livestock industry sector, the government animal health services, the academic research sector, diagnostic laboratories and biologics production laboratories, who may act in accordance with the regulations established by the international organisms in charge of animal health. Moreover a structural link with the public health authority shoud developped (One health approach).

References ACHA P.N., PZYFRES B., 2005. Brucelosis. In: Zoonosis y Enfermedades Transmisibles Comunes Al Hombre y Los Animales. OPS & OMS editors. Nueva Editorial Interamericana, Washington. AGUILAR E., 2008. Casos de brucelosis humana reportados en Ecuador (1990-2007). Epidemiología. Reporte del MSP. EPI-2. Ecuador.

ALBORNOZ G., 1970. Diagnóstico de brucelosis por la prueba de “Ring-test” en la provincia del Guayas a nivel de hacienda. Doctoral Thesis, Universidad Estatal de Guayaquil, Ecuador, 70 p. ALTON G.G., JONES L.M., ANGUS R.D., VERGER J.M., 1988. Techniques for the Brucellosis Laboratory. 1st edn. Institut National de la Recherche Agronomique. Paris, France. ALVARADO C., 1959. Indice brucelósico en bovinos del cantón zaruma. Doctoral Thesis, Universidad Cental del Ecuador, Ecuador, 117 p. ALVARADO L., 1995. Diagnóstico de brucelosis bovina en hembras sexualmente maduras por el método de card test en el cantón Paute, provincia del Azuay. Doctoral Thesis, Universidad de Cuenca, Ecuador, 74 p. ALVAREZ F., PILLACELA C., 1985. Estudio de prevalencia de enfermedades zoonósicas diagnosticadas en a ciudad de Cuenca durante los años 1974 – 1983. Doctoral Thesis, Universidad de Cuenca, Ecuador, 94 p. ARAGUNDI R., 1969. Diagnóstico de brucelosis por la prueba de “Ring Test” en la provincia de Los Ríos. Doctoral Thesis, Universidad Estatal de Guayaquil, Ecuador, 60 p. ARTEAGA A., 1983. Identificación de anticuerpos contra brucelosis en ganado portador y vacunado mediante el uso de antígeno tamponado: Rosa de Bengala en la zona central de la provincia de Manabí. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 53 p. ARTEAGA F., NAVAS C., OBANDO M., ZAMBRANO F., 2002. Estudio del personal en riesgo de brucelosis en la cabecera cantonal de Portoviejo (Matarifes). Informe de Investigación – Diplomado en enfermedades zoonósicas, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 77 p. BAILÓN A., MUÑOZ J., 2003. Prevalencia de brucelosis en bovinos sacrificados en el matadero del cantón Chone, mediante la prueba de seroaglutinación rápida en placa, desde diciembre del 2002 a marzo del 2003. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 80 p. BENÍTEZ-ORTÍZ W., 1982. Proyecto Caprino Zapotillo. Proyecto regional para desarrollo del sur de Ecuador – PREDESUR. Loja, Ecuador. BENÍTEZ-ORTÍZ W., Gómez I., Cruz K., 1986. Ganadería Caprina en Centro Loja. Centro Andino de Tecnología Rural – CATER. Universidad Nacional de Loja. Consejo Nacional de Universidades y Escuelas Politécnicas. Loja. Ecuador.

BETANCOURT R., GUERRERO I., ROMÁN J., 2002. Incidencia de brucelosis en las mujeres embarazadas que acuden a las unidades operativas del Area Nº1 de la dirección de salud de Manabí. Informe de Investigación – Diplomado en Enfermedades Zoonósicas, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 44 p. BRAND A., NOORDHUIZEN J.P.T.M., SCHUKKEN Y.H., 1996. Herd Health and Production Management in Dairy Practice. Wageningen Pers, The Netherlands. BRITO M., González C., 2001. Presencia de brucelosis bovina en el cantón Bolívar, provincia de Manabí. Tesis Licenciatura Enfermería, Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Ecuador, 81 p. CASTRO E., ZHUNIO R., 1989. Prevalencia de brucelosis bovina por los métodos de seroaglutinación en placa y card test, en el cantón Lomón – Indanza. Doctoral Thesis, Universidad de Cuenca, Ecuador, 54 p. CHAMORRO A., 1972. Incidencia de la brucelosis en la provincia de Napo. Doctoral Thesis, Universidad Central del Ecuador, Ecuador, 32 p. CHAUVIN P., 1969. Diagnóstico de brucelosis en bovinos de la provincia de Loja, por el método cromatográfico de Castañeda, controlado por el método de Huddleson. Tesis Doctoral, Universidad Nacional de Loja, Ecuador 50 p. CORDERO J., 1978. Investigación de brucelosis bovina en los cantones Eloy Alfaro y Esmeraldas de la provincia de Esmeraldas. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 86 p. CÓRDOVA G., 1970. Diagnóstico de brucelosis por medio de la prueba Rring Test en la provincia del Guayas a nivel de haciendas. Tesis Doctoral, Universidad de Guayaquil, Ecuador, 52 p. CRESPO T., 1999. Diagnóstico de brucelosis en bovinos hembras sexualmente maduras a nivel de camal de Cuenca, por el método de card test. Doctoral Thesis, Universidad Católica de Cuenca, Ecuador, 73 p. DELGADO K., 1989. Diagnóstico de brucelosis bovina, mediante la prueba de aglutinación rápda y antígeno brucelar amortiguado. Doctoral Thesis, Universidad de Cuenca, Ecuador, 55 p. DELGADO P., 1992. Diagnóstico de brucelosis en trabajadores de centros de procesamiento de cárnicos de Cuenca, mediante seroaglutinación rápida en placa. Doctoral Thesis, Universidad de Cuenca, Ecuador, 61 p. DEMERA T., FARFÁN G., ORTEGA B., INTRIAGO A., 2002. Prevalencia de brucelosis bovina y porcina en los camales de las cabeceras cantorales de la provincia de Manabí.

Informe de Investigación – Diplomado en Enfermedades Zoonósicas. Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 18 p. ENCALADA M., 1963. Investigación de la brucelosis en el cerdo, en muestras tomadas en el matadero municipal de Guayaquil. Doctoral Thesis, ,Universidad Estatal de Guayaquil, Ecuador, 50 p. ESTUPIÑÁN P., 1967. Incidencia de las leches positivas a brucelosis por “Ring-test” en las pasteurizadotas de Quito y Cayambe. Doctoral Thesis, ,Universidad Central del Ecuador, Ecuador, 34 p. FALCONÍ C., 1972. Investigación de brucelosis bovina a nivel de haciendas en la costa norte de Manabí (Cojimíes, Pedernales, 10 de Agosto, Jama, San Vicente y Leonidas Plaza) por el método de milk ring test. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 60 p. FAO, OMS, 1986. Comité Mixte FAO/OMS d’Experts De La Brucellose. Sixieme Rapport. Organisation Mondiale de la Santé. Genève, Switzerland. FERNÁNDEZ F., PEÑA J., 1991. Diagnóstico de brucelosis en bovinos hembras sexualmente maduros a nivel de camal por el método de card test. Doctoral Thesis, Universidad de Cuenca, Ecuador, 52 p. GALÁN J., 1969. Determinación de la incidencia de brucelosis por medio de la prueba se suero aglutinación rápida, en la zona del cantón Daule. Doctoral Thesis, Universidad Estatal de Guayaquil, Ecuador, 63 p. GARCÍA M., 1970. Determinación de la brucelosis bovina, en los principales hatos lecheros del cantón Chone, Rocafuerte y Portoviejo por el método de “ring test”. Doctoral Thesis, Universidad de Portoviejo, Ecuador, 47 p. GARCÍA-CARRILLO C., 1987. Ecuador. In: La Brucelosis De Los Animales En América y Su Relación Con La Infección Humana. OIE. París, Francia, p 124-133. GERBIER G., GARIN-BASTUJI B., POUILLOT R., VÉRY P., CAU C., BERR V., DUFOUR B., MOUTOU F., 1997. False positive serological reactions in bovine brucellosis: evidence of the role of Yersinia enterocolitica serotype O:9 in a field trial. Veterinary Research, 28: 375-383. GIL A., SAMARTINO L., 2000. Zoonosis en los sistemas de producción animal en las áreas urbanas y periurbanas de América Latina. Food and Agriculture Organization. Livestock Information and Policy Branch, AGAL. http://www. Fao. Org/ag/AGA/LSPA/papers/policypapers02 pdf 1-65.

GODFROID J., MICHEL P., UYTTERHAEGEN L., DE SMEDT C., RASSENEUR F., BOELAERT F., SAEGERMAN C., PATIGNY X., 1994. Brucellose enzootique à Brucella suis biotype 2 chaez le sanglier (Sus scrofa) en Belgique. Annales de Médécine Vétérinair, 138: 263-268. GODFROID J., NIELSEN K., SAEGERMAN C., 2010. Diagnosis of brucellosis in livestock and wildlife. Croatian Medical Journal, 51(4): 296-305. GÓMEZ T., 1964. Estudio de la epizootiología y el diagnóstico de la brucelosis bovina en el litoral Ecuatoriano. Doctoral Thesis, Universidad Estatal de Guayaquil, Ecuador, 63 p. GRANDA B., 1972. Incidencia de brucelosis caprina en el cantón Macará por el método de Huddleson. Doctoral Thesis, Universidad Nacional de Loja, Ecuador, 40 p. HALLING S., BOYLE S., 2002. Foreword (Editorial). Veterinary Microbiology, 90: 1-4. HERRERA W., 2003. Diagnóstico de brucelosis en los hatos bovinos, mediante el método de sero aglutinación en la zona de Santo Domingo de los Colorados. Doctoral Thesis, Universidad Laica Eloy Alfaro – Extensión en El Carmen, Ecuador, 66 p. INEC, MAG, & SICA. (2002). ECUADOR - Agricultural Census 1999/2000 – Main Results. Retrieved July 20, 2016, from http://www.fao.org/fileadmin/templates/ess/ess_test_folder/World_Census_Agriculture/ Country_info_2000/Reports_2/ECU_SPA_REP_2000.pdf INTRIAGO W., 1971. Investigación de brucelosis en porcinos sacrificados en el matadero de la ciudad de Portoviejo, mediante la prueba de sero-aglutinación en placa. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 151 p. LOOR S., MOREIRA S., 1986. Prevalencia de brucelosis bovina en el valle del río Portoviejo durante 1984 – 1985. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 58 p. LÓPEZ-MERINO A., 2002. Brucella. www.microbiologia.org.mx/microbiosenlinea/CAPITULO_10/Capitulo10.pdf (accessed on 24th March 2009). LUCERO N.E., AYALA S.M., ESCOBAR G.I., JACOB N.R., 2007. Brucella isolated in humans and animals in Latin America from 1968 to 2006. Epidemiology and infection, 136 (4): 496-503 MACÍAS F., 1977. Investigación de brucelosis humana a nivel de centros de salud y hospital regional de la ciudad de Portoviejo. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 103 p. MACMILLAN A., 1990. Conventional serological tests; In: Animal Brucellosis, Nielsen K., Duncan J., CRC Press, Boca Raton, p. 153-197.

MAG-SESA, 1999. Prevención y control de la brucelosis bovina en Ecuador. Ministerio de Agricultura y Ganadería, Servicio Ecuatoriano de Sanidad Agropecuaria. MALDONADO P.; SALGADO G., 1979. Diagnóstico de la brucelosis con antígeno tamponado y la prueba de inactivación por calor a 65°C, en muestras positivas y sospechosas a la aglutinación rápida en placa. Doctoral Thesis, Universidad Central del Ecuador, Ecuador, 35 p. MANZANO C., 1974. Indice de brucelosis, en tres zonas de la provincia de Tungurahua. Doctoral Thesis, Universidad Central del Ecuador, Ecuador, 30 p. MARTÍNEZ A., PROAÑO M., 1997. Determinación de la prevalencia de brucella canis en las clínicas veterinarias de la ciudad de Quito. Doctoral Thesis, Universidad Central del Ecuador, Ecuador, 77 p. MIKETTA L., 1980. Prevalencia de brucelosis en las ganaderías lecheras del catón Esmeraldas, mediante la prueba de suero-aglutinación en placa. Doctoral Thesis, Universidad de Guayaquil, Ecuador, 71 p. MORA E., 1971. Determinación de la brucelosis bovina por medio de la prueba de sero- aglutinación en placa, en las ganaderías de la parroquia San Antonio, del cantón Chone. Doctoral Thesis, Universidad de Portoviejo, Ecuador, 110 p. NIETO E., 1981. Investigación y diagnóstico de brucelosis en las ganaderías bovinas de los cantones Santa Rosa y Arenillas de la provincia de El Oro, mediante la prueba de ring test. Doctoral Thesis, Universidad de Guayaquil, Ecuador, 95 p. OIE. (2016a). CHAPTER 2.1.4 Brucellosis (Brucella abortus, B. mellitensis and B. suis). Retrieved July 20, 2016, from http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/2.01.04_BRUCELLOSIS .pdf OIE. (2016b). WAHIS Interface. Retrieved July 20, 2016, from http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Countryinformation/Animalpopulation OLLEAGUE O., 1969. Determinación de la incidencia de la brucelosis por medio de la prueba “ring test”, en las ganaderías de la provincia de El Oro. Doctoral Thesis, Universidad Estatal de Guayaquil, Ecuador, 60 p. Órgano del Gobierno Del Ecuador. Registro Oficial, Pub. L. No. 31 de Marzo - 409 (1981). Ecuador. Órgano del Gobierno Del Ecuador. Registro Oficial, Pub. L. No. 10 de Agosto 1008 (1996). Ecuador.

ORTIZ F., 1962. Investigación de la brucelosis caprina en la provincia del Guayas. Doctoral Thesis, Universidad Estatal de Guayaquil, Ecuador, 33 p. PLAZA L., 1970. Diagnóstico del aborto de Bang en el ganado vacuno de los cantones Chone, Rocafuerte y Bolívar. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 145 p. PLAZA J., 1977. Diagnóstico de brucelosis bovina en la población del cantón Puján, provincia de Manabí, mediante la prueba de sero-aglutinación en placa. Doctoral Thesis, Universidad de Guayaquil, Ecuador, 61 p. PAPPAS G., AKRISTIDIS N., BOSILKSVSKI M., TSIANOS E., 2005. Brucelosis. The New England Journal of Medicine, 352: 2325 – 2336. POUILLOT R., GARIN-BASTUJI B., GERBIER G., COCHE Y., CAU C., DUFOUR B., MOUTOU F., 1997. The Brucellin skin test as a tool to discriminate false positive serological reactions in bovine brucellosis. Veterinary Research, 28: 365-374. QUINDE P., 1959. Diagnóstico de la brucelosis bovina de la hoya de Loja. Doctoral Thesis, Universidad Nacional de Loja, Ecuador, 63 p. RADOSTITS O.M., 2001. Herd Health – Food Animal Production Medicine. W.B. Saunders Company, New York. REGISTRO OFICIAL, 1981. Órgano del Gobierno Del Ecuador. Quito, 31 de Marzo de 1981. Número 409. REGISTRO OFICIAL, 1996. Órgano del Gobierno Del Ecuador. Quito, 10 de Agosto de 1996. Número 1.008. RIVADENEIRA R., 1980. Diagnóstico de la brucelosis bovina en las ganaderías lecheras del cantón Cuenca, provincia del Azuay, mediante los métodos “ring-test” sero-aglutinación en placa. Doctoral Thesis, Universidad de Guayaquil, Ecuador, 56 p. RIVADENEIRA B., 1981. Brucelosis y tricomoniasis bovina en el valle del Upano. Doctoral Thesis, Universidad Central del Ecuador, Ecuador, 47 p. ROBALINO A., 1966. Diagnóstico e Incidencia de brucelosis porcina en animales sacrificados en el camal municipal de Quito. Doctoral Thesis, Universidad Central del Ecuador Ecuador, 45 p. SAEGERMAN C., VO T.-K.O., DE WAELE L., GILSON D., BASTIN A., DUBRAY G., FLANAGAN P., LIMET J.N., LETTESON J.- J., GODFROID J. 1999. Diagnosis of bovine brucellosis by skin test: conditions for the test and evaluation of its performance. Veterinary Research, 145: 214-218.

SAEGERMAN C., DE WAELE L., GILSON, D., GODFROID J., THIANGE P., MICHAEL P., LIMBOURG B., VO T.K.-O., LIMET J., LETESSON J-J., BERKVENS D., 2004. Evaliation of tree serum i-ELISA using monoclonal antibodies and protein G as peroxidase conjugate for the diagnosis of bovine brucellosis. Veterinary Microbiology, 100: 91-105. SAEGERMAN C., BERKVENS D., GODFROID J., WALRAVENS K., 2010. Chapter 77: Bovine brucellosis. In: Infectious and Parasitic Disease of Livestock. Lavoisier et Commonwealth Agricultural Bureau – International (ed.), France, p. 971-1001. SALDAÑA H., 1973. Incidencia de brucelosis bovina en el cantón Cuenca, por las pruebas del anillo y suero-aglutinación. Doctoral Thesis, Universidad Central del Ecuador, Ecuador, 25 p. SALTOS J.M., SALTOS J.E., 2001. Prevalencia de brucelosis en los hatos bovinos del catón San Vicente, mediante la prueba de suero-aglutinación macroscópica en placa rápida durante los meses de junio a octubre del 2001. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 133 p. SÁNCHEZ P., 1997. Diagnóstico de brucelosis caprina, en el catón Santa Isabel, mediante el método de aglutinación en placa, año 1996. Doctoral Thesis, Universidad de Cuenca, Ecuador, 108 p. SANTILLÁN F., 1971. Investigación sobre la presencia de brucelosis, mediante la prueba de “ring test” en las ganaderías de la provincia de Esmeraldas. Doctoral Thesis, Universidad Estatal de Guayaquil, Ecuador, 45 p. SEGARRA G., 1971. Investigación de brucelosis en bovinos de Loja, por los métodos de “Ring test” y Huddleson. Doctoral Thesis, Universidad Nacional de Loja, Ecuador, 45 p. TAPIA N., 1988. Prevalencia de brucelosis caprina en el área “Centro Loja”. Doctoral Thesis, Universidad Nacional de Loja, Ecuador, 105 p. THIMN B.M., 1982. Brucellosis in South America. In: Brucellosis, Distribution in Man, Domestic and Wild Animals. Spiringer-Verlag, New York, p. 31-34. TOBAR A., 1961. Estudio de la infección brucelar en ovinos, caprinos y porcinos sacrificados en el camal municipal de Quito. Doctoral Thesis, Universidad Central del Ecuador, Ecuador, 115 p. TORRES H., 2008. Control de Brucelosis Bovina – Programa Nacional. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca (MAGAP), Servicio Ecuatoriano de Saniadad Agropecuaria (SESA). Quito, Ecuador, p. 30.

VALDEZ I., BAZURTO Z., VERA Z., 2000. Diagnóstico de brucelosis en los hatos bovinos del catón San Vicente, mediante prueba de suero-aglutinación macroscópica en placa rápida. Monografía Técnica, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 52 p. VALDIVIESO C., 1969. Determinación de la incidencia de brucelosis por medio de la prueba de sero-aglutinación en placa, en las ganaderías de la zona de Machala. Doctoral Thesis, Universidad Estatal de Guayaquil, Ecuador, 45 p. VÁSCONEZ-LÓPEZ E., 1960. Incidencia de la brucelosis en leches que se consumen en el cantón Quito, determinado por la prueba de “ring test”. Doctoral Thesis, Universiadad Central del Ecuador, Ecuador,171 p. VERA R., FLORES L., 2004. Diagnóstico y prevalencia de brucelosis mediante ring test en los hatos bovinos del cantón Chone en el año 2004. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 70 p. VIDAL L., 1992. Diagnóstico de brucelosis en los bovinos en las parroquias de Tarqui y Victoria del Portete. Doctoral Thesis, Universidad de Cuenca, Ecuador, 106 p. ZAMBRANO I., 1978. Investigación de brucelosis en caninos mediante el método de sero- aglutinación en placa en el cantón Rocafuerte. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 73 p. ZAMBRANO A., CEDEÑO N., 1995. Prevalencia de brucelosis bovina en el cantón El Carmen, zona Suma – Pedernales, por el método de suero-aglutinación. Doctoral Thesis, Universidad Técnica de Manabí, Ecuador, 76 p. ZAMBRANO M., 2002. Actividad realizada en el laboratorio agropecuario de la ULEAM, extensión en El Carme, exámenes ccoproparasitarios – brucelosis – hematozoarios en las diferentes zonas del cantón El Carmen. Informe de Actividades. Universidad Laica “Eloy Alfaro” de Manabí, intención en El Carmen, Ecuador, 67 p.

OBJECTIFS

L'objectif général de cette thèse est de générer de l’information utile pour améliorer la connaissance de l’épidémiologie de la brucellose bovine en Equateur, de son impact sur la santé publique et des facteurs de risques associés à la maladie. Ces connaissances permettront le développement d’outils d’aide à la décision pour les organismes officiels en charge de la prévention et du contrôle de la maladie. Pour atteindre cet objectif général, quatre objectifs spécifiques ont été fixés par rapport à la brucellose animale et humaine dans la région nord-ouest de l'Equateur.

Dans un premier temps, l'information disponible sur la brucellose animale et humaine en Equateur a été recherchée, rassemblée et analysée sous la forme d’une revue de la littérature afin d'établir la situation actuelle de la brucellose en Equateur (Objectif 1; Article 1).

Dans un deuxième temps, des études épidémiologiques ont été menées chez les bovins et les chèvres (deux compartiments animaux), pour caractériser l'agent causal et déterminer la prévalence réelle de la brucellose dans ces réservoirs animaux et estimer la sensibilité et la spécificité des tests de diagnostic utilisés (Objectif 2; Articles 2 et 3). Par ailleurs, l’importance zoonotique de la brucellose en Equateur a également été investiguée (Objectif 3; Articles 4 et 6)

Dans un dernier temps, des lignes directrices sont proposées comme des fondements pour l'élaboration d'une stratégie de surveillance épidémiologique efficace des brucelloses bovine et humaine, adaptée aux conditions de la région nord-ouest de l'Equateur. (Objectif 4; Discussion générale).

SECTION EXPÉRIMENTALE

Partie 1: Estimation de la sensibilité et la spécificité des tests de diagnostic et estimation de la prévalence réelle de la brucellose bovine dans le nord de l'Équateur

Prélévement de sang chez les bovins

Source: Jorge Ron-Román Cantón Espejo, provincia del Carchi – Ecuador 2012

ARTICLE 2

Bovine brucellosis in North-West Ecuador: typing of Brucella spp., seroprevalence, and associated risk factors.

J. Ron-Román, L. Ron-Garrido, C. Saegerman, A. Angulo-Cruz, A. Tufiño-Acosta, Freddy Proaño-Pérez, María-Augusta Chávez-Larrea, W. Benítez-Ortíz, J. Brandt & D. Berkvens.

Article soumis pour publication : PLOS Neglected Tropical Diseases

Préambule Les nombreux tests existants permettant de confirmer le diagnostic de brucellose chez l’animal sont non seulement liés à l’importance zoonotique de la maladie mais aussi aux problèmes qui persistent quant à la fiabilité des résultats, principalement en termes de sensibilité (Se) et de spécificité (Se). A ce jour, il n’existe aucun test sérologique "gold standard". L'utilisation des résultats de tests imparfaits ne peut donner une appréciation réelle de la situatition épidémiologique que s’ils sont combinés à une information a priori, dans le cadre d'un modèle basé sur le théorème de Bayes.

Résumé en français Afin d'obtenir des informations épidémiologiques fiables sur la prévalence réelle de la brucellose bovine par zone (zone1=Sierra et zone2=Costa) et par province (Pichincha, Imbabura, Carchi, Esmeraldas et Manabí), ainsi que sur la performance des tests utilisés pour diagnostiquer la maladie en Equateur, une étude transversale a été menée entre 2005 et 2009 dans le nord-ouest de l’Equateur. Les résultats des tests sérologiques (n=3332) au rose bengale (RB), à la séroagglutination lente en tube en présence d'EDTA (SAT-EDTA), et au test immuno-enzymatique indirect (iELISA) ont été combinés à des informations a priori (avis d’experts) dans un contexte bayésien, lequel a pris en compte la possible dépendance conditionnelle entre les tests.

La prévalence réelle estimée était de 2,2%, tandis que les Se et Sp étaient les suivantes, pour chaque test: Se=84% et Sp=98% pour le RB, Se=85% et Sp=99% pour le SAT- EDTA et Se=89% et Sp=97 pour le test iELISA. Les facteurs de risque tels que le sexe (OR=3,91 pour les femelles), l'âge (OR=3,14 pour la classe des 25 à 60 mois), la zone (OR=4,19 pour la zone 1) et la province (OR=6,62 dans la province de Pichincha) ont été mis en évidence grâce à une enquête épidémiologique diligentée lors de la prise des échantillons. L'étude a mis en évidence que la différence de prévalence entre les zones d'échantillonnage ne se situait pas au niveau des fermes (21,89% dans la zone 1 et 25,17% dans la zone 2), mais étaient surtout liées à la prévalence intra-troupeau (12,46% dans la zone 1 et 3,28% dans la zone 2).

Brucella abortus biovar 1 et 4 a été isolée à partir du lait d'animaux ayant présenté des résultats fortement positifs (n=13). Elle a présenté des caractéristiques particulières, à

savoir l'inhibition de croissance en milieu coloré avec fuchsine (20 mg/ml) et safranine (100 pg/ml).

Les informations recueillies dans le cadre de cette étude pourraient servir de base pour les futurs programmes de contrôle et d'éradication de la brucellose en Equateur, spécialement en contextualisant les mesures prophylactiques et l’épidémiosurveillance selon les particularités régionales et provinciales.

Bovine brucellosis in north-western Ecuador: seroprevalence, identification of circulating Brucella spp. and risk factors

Jorge Ron-Román1, 2, 3, 4, Lenin Ron-Garrido1, Claude Saegerman3, David Fretin5, Alexandra Angulo-Cruz1, Andrés Tufiño-Acosta1, María-Augusta Chávez-Larrea1, 6, Freddy Proaño-Pérez1, 6, Washington Benítez-Ortíz1, 7, Marie-France Humblet8, Jef Brandt2, Dirk Berkvens2*.

1 Centro Internacional de Zoonosis (CIZ), Universidad Central del Ecuador, Quito Ecuador. 2 Department of Biomedical Sciences, Institute of Tropical Medicine, Antwerp - Belgium. 3 Research Unit of Epidemiology and Risk analysis applied to Veterinary Sciences (UREAR-ULg), Fundamental and Applied Research for Animal and Health (FARAH), Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, Belgium. 4 Carrera de Ingeniería Agropecuaria. Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Sangolquí, Ecuador. 5 Department of Bacteriology and Immunology, Veterinary and Agrochemical Research Centre, Brussels - Belgium. 6 Carrera de Ingeniería en Biotecnología. Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Sangolquí, Ecuador. 7 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Central del Ecuador, Quito - Ecuador. 8 Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liege, Belgium.

* Corresponding author: Dirk Berkvens, Institute of Tropical Medicine, Department of Animal Health, Nationalestraat 155, B-2000 Antwerp, Belgium; tel: +32 3 2476393; fax: +32 3 2476268; e-mail: [email protected]

Summary In order to collect reliable epidemiological information on true bovine brucellosis prevalence per area (1: Sierra [mountain], and 2: Costa [Coast]) and per province (Pichincha, Imbabura, Carchi, Esmeraldas y Manabí), as well as the performance of diagnostic tests, a transversal study was performed between 2005 and 2009 in northwestern Ecuador. Results of serological tests (n= 3,332), i.e. Rose Bengal (RB), Slow Agglutination Test with EDTA (SAT-EDTA) and indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (iELISA), were combined with a priori information (expert opinion) in a Bayesian approach, taking into account possible conditional dependence between the tests. The estimated prevalence was 2.2% and sensitivity (Se) and specificity (SP) were as follows: Se=84%, Sp=98% for RB; Se=85%, Sp=99% for SAT- EDTA; Se=89%, Sp=97% for iELISA.

The following risk factors were identified: sex (OR=3.91 for females), age (OR=3.14 for animals aged between 25 and 60 months), area (OR=4.19 for area 1) and province (OR=6.62 for Pichincha). The study highlighted that the difference observed between sampling areas was not related to herd prevalence (21.89% in area 1 vs. 25.17% in area 2), but rather to individual prevalence (12.46% in area 1 and 3.28% in area 2). Brucella abortus biotype 4 was isolated in milk (n = 13 animals) in large numbers, while its growth was inhibited in media coloured with basic fuchsin (20 µg/ml) and safranin (100 µg/ml).

The important information provided by our study should pave the way to future programmes of brucellosis control and eradication in Ecuador. Prophylaxis and epidemiological surveillance should be adapted to regional and provincial specificities.

Keywords: Ecuador, bovine brucellosis, risk factors, Brucella abortus biotype 4, Bayesian approach, Diagnostic tests, True prevalence.

Introduction In Ecuador, a small country of South America, cattle husbandry is the second most important sector contributing to the national economic development, behind oil exportation; this activity is mainly located in rural areas, as reflected by the number of cattle (close to 4.5 million) and of agricultural production units (APU), approaching 1 million (INEC, MAG, and SICA 2000). Nevertheless, Ecuadorian cattle husbandry faces productive and reproductive concerns, as evidenced, for example, by the high rate of abortions (INEC, MAG, and SICA 2000). Brucellosis is one of the main causes of abortion, infertility and reduced animal production; the disease can hinder the economic development of a country, as it directly affects food security of most vulnerable populations. Brucellosis is a disease caused by bacterial species belonging to the genus Brucella spp. (OIE 2016a). Even if several nations (especially developed countries) achieved its eradication, it is still considered as the most widely distributed zoonosis worldwide, as referred to by international organisms such as the World Health Organization (WHO), the Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) and the World Health Animal Organization (OIE) (Pappas et al. 2006; Saegerman et al. 2010; Godfroid, Nielsen, and Saegerman 2010; OIE 2016a). The disease affects several animal species, which play a role as natural reservoir; they are the sole source of infection for humans. Transmission routes are: direct contact with infected animals and indirect contact through the consumption of contaminated animal products (Rivera et al. 2003).

The importance of the disease is related on one hand to the severity of the human cases and on the other hand to its economic consequences. For example, in the United States, the treatment of a patient suffering from brucellosis without severe complications was estimated at 340 USD vs. 4,095 USD for patients developing severe complications (Gil and Samartino 2001).

In natural reservoirs, the disease results in abortions and retained placenta, epididymitis, orchitis, reduced milk production and bursitis (FAO and OMS 1986; Corbel 2006). Economic losses are not only associated with the negative impact on cattle husbandry due to clinical cases, but also with trade restrictions of animals and their products (Acha and Szyfres 2003). Owing to its consequence in public health, economy and food security (Nicoletti 2001; Memish and Balkhy 2004; Doganay et al. 2003) measures are

implemented all around the world for its control and eradication. These may be: complete or partial vaccination of animals, direct or indirect diagnosis of the disease and slaughter of infected animals (Corbel 2006; Godfroid, Nielsen, and Saegerman 2010; Saegerman et al. 2010; OIE 2016a; Olsen and Stoffregen 2005). Programmes implemented in developing countries face specific problems such as vaccine quality, management and unreliable results of diagnostic tests, but also a lack of national policy regarding vigilance and epidemio-surveillance of the zoonosis. Even if it is well accepted that Brucella spp. isolation and typing is the reference test for diagnosis, the lack of laboratories equipped appropriately and of staff sufficiently trained for handling such high-risk pathogen impair its routine application. Currently, direct (PCR) and indirect diagnostic tests (based on humoral immunity) are performed worldwide, advocated for their high sensitivity and specificity (Ouahrani-Bettache, Soubrier, and Liautard 1996; Nielsen 2002; Yu and Nielsen 2010). Unfortunately, as far as Ecuador is concerned, the localised character of the studies performed to date, the use of insensitive diagnostic tests and the absence of a policy for cattle vaccination (Ron-Román et al. 2014) have seriously hampered the assessment of the true situation of the disease. This step is the first one towards implementing future programmes of disease control and eradication.

The aims of the present study were: (i) to describe the occurrence of cattle brucellosis in north-western Ecuador, (ii) to estimate its real prevalence as well as the diagnostic characteristics of the tests used and lastly (iii) to isolate and type Brucella spp. circulating in the area of study.

Materials and methods Type of study and targeted geographic area A transversal study was performed between 2005 and 2009 in five provinces of north- western Ecuador (Figure 1). Unvaccinated cattle (N = 3,332 animals) belonging to 344 animal production units (APUs) located in two climatically distinct geographic areas: the Mountain area (zone 1), which included Pichincha, Imbabura and Carchi provinces, and the Coast (zone 2), including Esmeraldas and Manabí provinces, as well as parts of Pichincha and Imbabura provinces.

Fig. 1: Study area

Cattle sampling In Ecuador, extensive cattle husbandry predominates, but differences are observed between geographical regions (Figure 2.1 ans 2.2 shows the cattle numbers and density distributions in Ecuador). In zone 2 (Coast), large dairy herds are maintained in vast properties where animals are not monitored daily. In contrast, in zone 1 (Mountain), even if husbandry is also extensive, each animal (mainly from dairy herds) is monitored daily, especially for what calving, mating/artificial insemination and vaccination are concerned. Blood was sampled in vacutainer tubes (10cc) from the caudal or jugular vein. Each sample was centrifuged, thereafter serum was distributed in two Eppendorf tubes (2 cc), each tube being identified and conserved at a temperature of -20°C until further analysis. Cattle were Bos taurus type in zone 1 and Bos indicus type in zone 2.

Fig. 2.1: Cattle population per canton

Fig. 2.2: Cattle density per canton

Analysis of blood samples Three diagnostic tests were applied to detect antibodies against Brucella spp. in the samples: Rose Bengal plate agglutination test (RB), Slow Agglutination Test carried out with EDTA (SAT-EDTA), and indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (iELISA). Tests were performed as described by the manufacturer recommendations and in OIE guidelines (Alton et al. 1988; Limet et al. 1988; OIE 2016a).

Isolation and identification of Brucella spp. In order to isolate the bacteria in milk, 50 cc-samples from 52 animals highly positive to at least one diagnostic test were centrifuged at 2,000 g during 15 minutes. Fractions of sediment and cream were sampled with a sterile swab and placed on selective Farrell culture medium (Columbia Agar Base [OXOID CM0331] with 5% heat inactivated horse serum [GIBCO Ref 16050-130] and Brucella Selective Supplement [OXOID SR0083A]). Suspect colonies were sub-cultured in a BASE medium (Columbia Agar Base with 5% horse serum, heat inactivated). The identification of Brucella was achieved through performing the following tests: gross observation of colonies, direct microscopic observation on slide, Gram staining, oxidase [DIFCO-BBL Ref 261181], catalase and urease. Procedures followed protocols previously described (Alton et al. 1988; Godfroid and Boelaert 1995).

Molecular identification of Brucella spp. Colonies identified as being Brucella spp. through biochemical tests underwent two molecular tests (PCR): PCR IS6501 or PCR-IS711 (Primers: IS6501 3’: 5’-gat-aga-agg- ctt-gaa-gct-tgc-gga-c-3’/IS6501 5’: 5’-acg-ccg-gtg-tat-ggg-aaa-ggc-ttt-t-3’) and Real- time PCR Bcsp31 (Primers: BCSP31F ctc-ggt-tgc-caa-tat-caa-tgc; BCSP31R ggg-taa- agc-gtc-gcc-aga-ag-, BCSP31sonde aaa-tct-tcc-acc-ttg-ccc-ttg-cca-tca).

Statistical analyses At first, seroprevalence of the disease per APU, province and region were determined. An animal was considered seropositive when at least one test result was positive (parallel interpretation). An APU was considered positive when it contained at least one positive animal. The possible influence of several criteria, such as sex, age, province and region was investigated through a univariate analysis using a random effects logistic regression (APU as random effect). Variables identified as having a significant

effect in the univariate analysis were further tested in a multivariate model, also using a random effects logistic regression. Secondly, the true prevalence of the disease was estimated by means of a Bayesian analysis, taking into account the characteristics of diagnostic tests (sensitivity [Se] and specificity [Sp]) used in the study and allowing for the presence of conditional dependence (Berkvens et al. 2006; Lesaffre, Speybroeck, and Berkvens 2007). Statistical analyses were performed using R (https://www.r- project.org), WinBUGS (http://www.mrc-bsu.cam.ac.uk/software/bugs/) and Stata/MP 14.1 (StataCorp., 2015).

Results A total of 3,332 bovines (mean age = 41.4 months old; range 1 to 180 months old) were sampled in north-western Ecuador. Animals sampled in Zone 1 (Mountain) represented 38.78% of the total (1,292/3,332), and belonged to 201 APUs (58.42%), while 61.22% of animals (2,040/3,332) originated from 143 APUs located in Zone 2 (Coast). A summary of the data is given in Table 1.

A total of 228 animals (i.e. 6.84%) tested positive to at least one of the three tests (RB, SAT-EDTA and iELISA). The numbers of positive test results are shown in Table 2. Using a Bayesian framework, the true prevalence was estimated as 2.2%. Sensitivity and specificity of each test were calculated as well (RB [Se=0.84; Sp=0.98], SAT- EDTA [Se=0.85; Sp=0.99] and iELISA [Se=0.89; Sp=0.97)] (Table 3). Comparative results of the three tests are presented in Tables 4.1, 4.2 and 4.3.

The univariate analysis of the seroprevalence allowed identification of a significant effect of sex (p < 0.01 OR= 3.91 for females versus males; CI: 2.26-6.78) and age (group 2 [25 to 60 months; p < 0.01; OR=3.14; CI: 2.07-4.77] and group 3 [> 60 months; p < 0.01; OR=2.66; CI: 1.75-4.04] versus animals <24 months). Prevalence, CI and OR, as well as the number of positive animals, are summarised in Table 5.1 for each variable of study.

Table 1: Bovine brucellosis in north-western Ecuador; distribution of APUs and animals, as well as analysis of risk factors (Part 2: zones of study and provinces) Parameter Sample Positive† CI (%) Odds ratio Province N % Mean* N % Mean* Zone 1 (APUs) 201 58.42 - 44 21.89 - (16.38 – 28.25) - Zone 1 1292 38.78 6.43 161 12.46 3.66 (8.37 – 16.54) - (animals) Carchi (APUs) 81 23.55 - 14 17.28 - (9.78 – 27.30) -

Carchi (animals) 418 12.55 5.16 24 5.74 1.71 (2.18 – 9.29) - Imbabura 1 90 26.16 - 15 16.67 - (9.63 – 26.00) 0.95 (APUs) (0.43 – 2.12) Imbabura 1 540 16.21 6.0 41 7.59 2.73 (3.33 – 11.85) 1.35 (animals) (0.55 – 3.28) Pichincha 1 30 8.72 - 15 50.00 - (31.30 – 68.70) 4.78 (APUs) (1.91 - 11.99) Pichincha 1 334 10.02 11.13 96 28.74 6.40 (19.37 – 38.12) 6.62 (animals) (2.99 – 14.65)

Zone 2 (APUs) 143 41.58 - 36 25.17 - (18.29 – 33.11) 1.20 (0.70 – 2.05) Zone 2 2040 61.22 14.27 67 3.28 1.86 (2.00 – 4.58) 0.24 (animals) (0.16 – 0.36) Esmeraldas 48 13.95 - 6 12.5 - (4.73 – 25.25) 0.68 (APUs) (0.24 - 1.91) Esmeraldas 420 12.61 8.75 7 1.67 1.17 (0.17 – 3.17) 0.28 (animals) (0.09 – 0.85) Manabí (APUs) 26 7.56 - 14 53.85 - (3.34 – 73.41) 5.58 (2.13 - 14.61) Manabí 409 12.27 15.73 24 5.87 1.71 (3.68 – 8.05) 1.02 (animals) (0.48 – 2.19) Imbabura 2 41 11.92 - 2 4.90 - (0.6 – 16.53) 0.24 (APUs) (0.05- 1.13) Imbabura 2 620 18.61 15.12 2 0.32 1.0 (0.00 – 0.7) 0.05 (animals) (0.01 – 0.25) Pichincha 2 28 8.14 - 14 50.00 - (30.64 – 69.35) 4.78 (APUs) (1.87 - 12.23) Pichincha 2 591 17.74 21.11 34 5.75 2.43 (2.19 – 9.31) 1.00 (animals) (0.40 – 2.51) Total (APUs) 344 100 - 80 23.26 - (18.90 – 28.10) Total (animals) 3332 100 9.69 228 6.84 2.85 (4.83 – 8.85) Mean*=mean number of animals per APU (sampled or positive) † An animal is considered positive when at least one test result was positive (i.e. parallel interpretation)

Table 2: bovine brucellosis in north-western Ecuador: results of the three immunological tests RB SAT iELISA N - - - 3,104 + - - 50 - + - 28 - - + 70 + + - 5 + - + 8 - + + 7 + + + 60 Total 3,332 RB: Rose Bengal; SAT-EDTA: Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA; iELISA: indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Table 3: Bovine brucellosis in north-western Ecuador: Bayesian analysis statistics and estimation of prevalence and test characteristics of the three immunological tests Statistic Bayes-p 0.49 DIC 47.489 pD 6.289 Prevalence 0.022 (0.013 – 0.031)

RB SAT-EDTA iELISA Sensitivity 0.84 0.85 0.89 (0.68 – 0.97) (0.65 – 0.99) (0.81 – 0.99) Specificity 0.98 0.99 0.97 (0.97 – 0.99) (0.98 – 0.99) (0.97 – 0.98) Bayes-p: posterior predictive check probability, DIC: Deviance Information Criterion; pD: number of parameters estimated; RB: Rose Bengal; SAT-EDTA: Wright’s Slow Agglutination Test; iELISA: indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay In brackets: Bayesian credibility intervals

Table 4.1: bovine brucellosis in north-western Ecuador; contingency tables between RB and SAT-EDTA RB Total SAT-EDTA Negative Positive Negative 3,174 58 3,232 Positive 35 65 100 Total 3,209 123 3,332 RB: Rose Bengal; SAT-EDTA: Wright’s Slow Agglutination Test

Table 4.2: bovine brucellosis in north-western Ecuador; contingency tables between RB and iELISA) RB Total iELISA Negative Positive Negative 3,132 55 3,187 Positive 77 68 145 Total 3,209 123 3,332 RB: Rose Bengal; iELISA: indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Table 4.3: bovine brucellosis in north-western Ecuador; contingency tables between iELISA and SAT-EDTA iELISA Total SAT-EDTA Negative Positive Negative 3,154 78 3,232 Positive 33 67 100 Total 3,187 145 3,332 SAT-EDTA: Wright’s Slow Agglutination Test; iELISA: indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Table 5.1: Bovine brucellosis in north-western Ecuador; distribution of samples and analysis of risk factors (Part 1: sex and age groups) % Parameter Sample Positive p-value Odds ratio (95%CI)

Number % Number % Sex <0.01 - Male 607 18.22 13 2.14 (1.24 – 3.67) - - Female 2,725 81.78 215 7.89 (4.71 – 12.92) - 3.91 (2.26 – 6.78) Age group <0.01 - < 24 months 1,191 35.74 39 3.27 (2.40 – 4.45) - - 25 to 60 1,257 37.73 121 9.63 (5.07 – 17.5) - 3.14 months (2.07 – 4.77)

> 60 months 654 19.63 54 8.26 (3.91 – 16.59) - 2.66 (1.75 – 4.04)

At APU level, no significant difference was observed between the two areas of study (p > 0.05). At animal level, a significant difference (p < 0.01) was observed between them, with a 4.19 OR (95% CI: 2.76-6.36) in zone 1 (Mountain) compared to zone 2. When considering Carchi province as a reference, the following four areas can be discerned (refer to Table 1 for OR and CI): (i) Carchi and Imbabura 1 are identical at APU and animal levels; (ii) Pichinchi 1 has OR significantly above one at both APU and animal levels; (iii) Esmeraldas and Imbabura 2 have OR significantly below one at animal level (no difference at APU level) and (iv) Manabi and Pichincha 2 have OR significantly above one at APU level (no difference at animal level). The multivariate analysis is formally summarised in Table 5.2 allowing ranking of provinces according to the seroprevalence at animal level (females only) and APU level.

Table 5.2 Parallel Animal-level and farm-level seroprevalence (Females only) Province Animal-level Farm-level Prevalence Rank Prevalence Rank Carchi 0.067 b 0.184 b Esmeraldas 0.021 bc 0.127 b Imbabura 1 0.080 b 0.147 b Imbabura 2 0.002 c 0.024 b Manabi 0.068 b 0.538 a Pichincha 1 0.310 a 0.636 a Pichincha 2 0.061 bc 0.481 a

Thirteen bacterial isolations were performed through culture of milk samples. They were identified as Brucella abortus biovar 1 and 4 based on microbiological tests (gross observation, microscope observation and biochemical tests) and molecular analyses

(PCR-IS711 and PCR-Bcsp31). The mean age of females (n=13) of which Brucella spp. was isolated in milk, was 59.69 months (range 36-96 months). Ten cows out of 13 (76.92%) aborted. Cow n#2873 never gave birth to a live calf, but aborted three times during her 60 months of life. These animals were originating from 7 APUs, located in the cantons of Cayambe (N=1), Tulcán (N=3) and Quito (N=9), Pichincha and Carchi provinces (Zone 1-mountain).

Discusion The objectives of our study were to estimate the true prevalence of bovine brucellosis in north-western Ecuador, as well as the characteristics (sensitivity [Se] and specificity [Sp]) of the following diagnostic tests: Rose Bengal (RB), Slow Agglutination Test with EDTA (SAT-EDTA) and indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (iELISA). Only cattle confirmed as not vaccinated were included in the study. Results of diagnostic tests were used for the Bayesian analysis. Furthermore, isolation and molecular typing of the causing agent circulating in the areas of study were performed.

Microbiological characterization of colonies remains the most specific test for the diagnosis of brucellosis (Bricker 2002). Nevertheless, due to difficulties and risks associated with performing this test in the Ecuadorian context, other options should be privileged: detection of antibodies offers possibilities for the diagnosis of bovine brucellosis. The lack of a gold standard for diagnosing animal brucellosis entails the use of an imperfect test, which automatically implies the estimation of a number of variables in excess of the number of degrees of freedom available. The analysis must proceed in a Bayesian framework, allowing the estimation of the true prevalence and the characteristics of diagnostic tests by combining a priori knowledge on parameters (published information or expert opinion) with the data collected experimentally (Enøe, Georgiadis, and Johnson 2000; Branscum et al. 2005; Geurden et al. 2006).

In order to better understand the true status and distribution of the disease, as well as to correctly interpret diagnostic tests results, we considered age and sex of animals sampled. Cattle were confirmed as not vaccinated in order to minimize cross-reactions (Dohoo et al. 1986). Cross-reactions with other Gram negative bacteria (due to the LPS epitope) should be considered (Alton et al. 1988; Godfroid et al. 2002; Saegerman et al.

2010) and they are generally considered as important in a low prevalence context (Corbel 2006).

The apparent prevalence estimated in our study reached 6.84% (228/3,332), and was similar to the official prevalence, i.e. 4-10.62% in the mountain area vs. 5.88%-10.62% in the coastal region, estimated during the unique national sampling campaign carried out previously (MAG-SESA 1999). The majority of positive animals were identified through the combination of several tests, rather than relying on one unique imperfect test, as already mentioned before (Table 1). The diagnostic test results were combined in a parallel fashion (animal is considered to be positive if at least one test results is positive). This increases the sensitivity and decreases the specificity of the overall test, possibly explaining the high proportion of false positive results (apparent prevalence of 6.8% versus true prevalence of 2.2%).

Combining known Se and Sp of diagnostic tests (Nielsen 2002) with data collected in our study allowed us to estimate a 2.2% true prevalence and characterizing each test (Table 3). The Bayesian analysis showed that iELISA offered the highest combination of Se and Sp and thus could be the most appropriate test for the Ecuadorian context. Each diagnostic test presented disadvantages, either due to the previous treatment of samples, protocol standardisation, cut-off determination, results analysis or economic aspects. Nevertheless, iELISA can overcome these disadvantages, reason why it was proposed since long ago in countries where brucellosis remains a problem (Saravi et al. 1995). Sensitivity and Sp of our iELISA test are comparable to previous reports in Ivory Coast (Thys et al. 2005; Sanogo et al. 2013) and Bangladesh (Rahman et al. 2013). Even if the RB test appeared to be the less efficient (Se=84% and Sp=98%), it should not be totally discarded for diagnosing bovine brucellosis, as it is easily performed and read. As previously found in other studies (Saegerman et al. 2010), females had a higher seroprevalence than males and older animals showed a higher prevalence than younger animals. Females remain longer in the herd, which probably explain our observations.

Traditionally, Ecuador is divided in three main zones (excluding the Galapagos Islands) when planning epidemiological studies on bovine brucellosis (MAG-SESA, 1999): Amazonia (not considered here because of low cattle population and low brucellosis

prevalence), Sierra (our zone 1, Mountain) and the coastal area (our zone 2, Coast). As shown in Figure 3, the original division of the study area in coastal and mountainous zones was probably not detailed enough. The differences found between the four proposed zones can possibly be explained (at least partly) by differences in herd sizes, management systems, sanitary programs on the farms, which has been reported previously by (Muma et al. 2007, Ragan 2002). Thus, it is not surprising to observe a higher prevalence at animal level in Pichincha 1, which is known for the highest average herd size (Poulsen et al. 2014). The present findings can serve as a basis for compartmentalisation and zoning of the area as proposed by OIE (2016b). However, it is at present not feasible to offer a full explanation for the differences observed at APU level and at animal level: it appears that prevalence at APU level is higher in the southern part of the study zone (Manabi and Pichincha provinces), whereas at animal level, there is a lower prevalence in the north-western part of the study zone (Esmeraldas province) and a high prevalence in the south-eastern part (Pichincha 1 province). A detailed study of animal movement (e.g. the influence of the impossibility to transport animals between Carchi and Esmeraldas provinces) is proposed.

The lack of control in animal movements between provinces and regions could be responsible for the endemic status of brucellosis in north-western Ecuador as a whole. Animal reservoirs are the primary source of infection for humans. Brucellosis appears to be present in 25% of farms in north-western Ecuador, explaining the high human antibody prevalence in the same area and period of study (2.1% in the Sierra zone vs. 1.4% in the Coastal zone), with slight differences observed when at province level (1.3% in Imbabura vs. 2.9% in Manabí) (Ron-Román et al. 2014).

Although bovine brucellosis has always been an issue in Ecuador, as reflected by the numerous studies and theses performed by different researchers, the true disease status has not been elucidated. Significant variations of prevalence were reported in cattle: 51.6% (Maldonado and Salgado 1979) using the RB test in 989 bovines (provinces of Pichincha, Imbabura, Carchi and Manabí), 0% (Vera and Flores 2004) resulting from the application of a Milk Ring Tests (MRT) on 807 milk samples from the province of Manabí, and 0% (Demera et al. 2002), based on the Huddleson agglutination test performed on 210 bovine blood samples.

Fig. 3. Farm-level and animal-level risk zone

Our study also allowed the isolation and typing the causing agent, i.e. Brucella abortus biovar 1 and 4. Our discovery confirmed the importance of brucellosis in cattle, and draws the attention on the ease with which bacteria can be isolated from milk samples, thereby emphasizing the serious risk for public health in Ecuador. In addition, we identified the primary source of infection in humans, as the biotype isolated in cattle, i.e. Brucella abortus biotype 4, which was also isolated in humans in the same area (Ron-Román et al. 2014), and in the patient had lived in Ecuador until the age of 63 years when he moved to USA (Herrick et al. 2014).

Isolating the causative agent clarified the epidemiological status of the disease and its routes of transmission, as Brucella species and biotypes show specificities in terms of geographic distribution and presence in animal reservoirs (Corbel 2006; Lucero et al.

2008). The isolation process reported here highlighted particular characteristics of the Ecuadorian B. abortus biotype 4 as it did not (or very slowly so) grow on coloured media with basic fuchsin (20 µg/ml), contrary to strains isolated in Canada and the United States (Alton et al. 1988). An unexpected observation was the lack of (or very slow) growth on coloured media with safranin (100 µg/ml). These two characteristics were also observed for Brucella abortus biotype 1 isolated in in humans in Ecuador (Ron-Román et al. 2012), and also in cattle contrary to the assertions of Rodríguez- Hidalgo et al. 2015 (they erroneously named B. abortus biotype 1 as biotype 2 after isolation and Variable Number Tandem Repeat (VNTR) PCR. It is understood that our results must be confirmed (e.g.) by means of reference strains and the use of PCR-31 BCSP (real time PCR) and PCR-EN 711 (711 insertion PCR).

For many authors, abortion should not be considered as the pathognomonic sign of brucellosis. Nevertheless, in Ecuador, 53.85% of animals from which Brucella was isolated (7/13) had aborted at least once. Conserving animals that aborted (until 3 times), or that started their reproductive life with an abortion (Samples N#3135 and 3260), illustrate the ignorance of farmers with regard to brucellosis. It is surprising to observe that (Table 6) 30.6% (11/36) of the reported pregnancy ended in abortion.

Improving the knowledge on biotypes would allow a better comprehension of the disease (Roux 1979). Unfortunately, isolating bacteria is not easy, as it requires a high- security laboratory facility, which is why the number of isolates reported by a country is generally correlated to the level of development of its reference laboratories. Ecuador is no exception, as no official information is available either on the number of isolations performed or on the distribution of circulating strains. According to Thimn (1982), 794 Brucella isolations have been performed in 12 Latin American countries between 1965 and 1977, among them, 220 in Argentina, 160 in Mexico, 114 in Peru and 95 in Chili. Only 8 isolations were realised in Ecuador during the same period: one isolation of B. abortus biotype 1, 6 isolations of B. abortus biotype 4 and one isolation of B. suis biotype 1. Similarly, Lucero et al. 2008 reported that between 1968 and 2006, Ecuador only notified 3 isolations in cattle, one being B. abortus biotype 1 and the two others, B. abortus biotype 4.

Table 6: Additional information on animals in which Brucella spp. was isolated

Zootechnical information Diagnostic test Sample Cow code APU code Zone Province Canton N° SAT- PCR PCR Age N calvings N abortions RB* iELISA* Isolation** EDTA* IS711** Bcsp31** 2628 126 214 1 Pichincha 1 Cayambe 72 3 1 ++ 100 2.4 + + +

2873 U 294 1 Carchi Tulcán 60 0 3 ++ 3200 3.7 + + +

2915 U 303 1 Carchi Tulcán 48 2 0 ++ 1600 2.6 + + +

2917 U 303 1 Carchi Tulcán 50 2 0 ++ 2560 2.8 + + +

3135 147 338 1 Pichincha 1 Quito 36 0 1 + 12800 4.2 + - +

3138 U 338 1 Pichincha 1 Quito 72 3 1 +++ 800 60 + + +

3143 U 338 1 Pichincha 1 Quito 96 4 3 +++ 3200 23.7 + + +

3220 167 341 1 Pichincha 1 Quito 84 4 1 ++ 80 13.0 + + +

3233 31 343 1 Pichincha 1 Quito 70 4 0 +++ 3200 23.0 + + +

3260 11 343 1 Pichincha 1 Quito 40 0 1 + 25600 3.5 + + +

3261 28 343 1 Pichincha 1 Quito 50 1 0 + 100 2.1 + - +

3311 148 344 1 Pichincha 1 Quito 36 1 0 +++ 40 22.0 + - +

3312 163 344 1 Pichincha 1 Quito 62 1 0 +++ 50 14.4 + - +

U: Unknown, *: Indirect diagnosis; **: Direct diagnosis; RB: Rose Bengal; SAT-EDTA: Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA; iELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay; RT: Real-time PCR; IS711: PCR insertion 711

Bovine brucellosis remains an issue in Ecuador, with serious implications for public health, contrary to the statement by Cartelle Gestal et al. 2015 and actions to control and possibly eradicate it should be adapted to its distribution (per region and province). Our study clarified the situation of bovine brucellosis in the area of study and provides evidence for the necessity to adapt brucellosis control programmes to the specificities of each area and/or province. It highlights the urgent need to develop awareness programmes aimed at stockbreeders, traders and laboratory technicians. The general public should be made aware as a previous analysis estimated a 1% true prevalence in humans (unpublished results).

Acknowledgments The authors would like to thank all farmers who participated to the study. Financial support: This work was supported by the Belgian Cooperation within the frameworks of a collaboration between the Institute of Tropical Medicine in Antwerp, Belgium, and the International Centre for Zoonoses (CIZ), Central University of Ecuador. Compliance with ethical standards: CBM/COBI-001 (07-04-2006) Conflict of interest: The authors declare that they have no conflict of interest. Disclaimer: The views expressed in this article are those of the authors and do not necessarily reflect the official policy or position of the Central University of Ecuador. Disclosure: None of the authors has financial or personal conflict of interest related to this study. Refrences

Refrences Acha, P., & Szyfres, B. (2003). Brucellosis. In Pan American Health Organization (Ed.), Zoonosis ans communicables diseases common to mand and animal. (3rd Ed, p. 382). Wahington. Alton, G. ., Jones, L. ., Angus, R. ., & Verger, J. . (1988). Tecniques for the brucellosis laboratory. (I. N. de la recherche Agrpnomique, Ed.) (1st Ed). Paris. Berkvens, D., Speybroeck, N., Praet, N., Adel, A., & Lesaffre, E. (2006). Estimating Disease Prevalence in a Bayesian Framework Using Probabilistic Constraints. Epidemiology, 17(2), 145–153 10.1097/01.ede.0000198422.64801.8d. http://doi.org/10.1097/01.ede.0000198422.64801.8d

Branscum, A., Gardner, I., Wagner, B., McInturff, P., & Salman, M. (2005). Effect of diagnostic testing error on intracluster correlation coefficient estimation. Preventive Veterinary Medicine, 69(1), 63–75. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2005.01.015 Bricker, B. J. (2002). Diagnostic strategies used for the identification of Brucella. Veterinary Microbiology, 90(1), 433–434. http://doi.org/10.1016/S0378- 1135(02)00227-4 Cartelle, M., Holban, A. M., Escalante, S., & Cevallos, M. (2015). Epidemiology of Tropical Neglected Diseases in Ecuador in the Last 20 Years. PloS One, 10(9), e0138311. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0138311 Corbel, M. (2006). Brucellosis in humans and animals. Geneva Switzerland: World Health Organization. Demera, T., Farfán, G., Ortega, B., & Intriago, A. (2002). Prevalencia de brucelosis bovina y porcina en los camales de las cabeceras cantorales de la provincia de Manabí. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Doganay, M., Aygen, B., Corbel, M. J., Roux, J., Shapiro, D. S., Wong, J. D. (2003). Human brucellosis: an overview. International Journal of Infectious Diseases, 7(3), 173–182. http://doi.org/10.1016/S1201-9712(03)90049-X Dohoo, I. R., Wright, P. F., Ruckerbauer, G. M., Samagh, B. S., Robertson, F. J., & Forbes, L. B. (1986). A comparison of five serological tests for bovine brucellosis. Canadian Journal of Veterinary Research = Revue Canadienne de Recherche Vétérinaire, 50(4), 485–93. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3539295 Enøe, C., Georgiadis, M. P., & Johnson, W. O. (2000). Estimation of sensitivity and specificity of diagnostic tests and disease prevalence when the true disease state is unknown. Preventive Veterinary Medicine, 45(1), 61–81. http://doi.org/10.1016/S0167-5877(00)00117-3 FAO, & OMS. (1986). Joint FAO/OMS Comité Mixte d’Experts de la brucelloses 6ème Rapport. Genève (Suisse). Geurden, T., Berkvens, D., Geldhof, P., Vercruysse, J., & Claerebout, E. (2006). A Bayesian approach for the evaluation of six diagnostic assays and the estimation of Cryptosporidium prevalence in dairy calves. Veterinary Research, 37(5), 671–682. http://doi.org/10.1051/vetres:2006029

Gil, A., & Samartino, L. E. (2001). Zoonois en los sistemas de producción animal de las áreas urbanas y periurbanas de América Latina (Livestock Policy Discussi on Pap er No. 2). Godfroid, J., & Boelaert, F. (1995). Prescriptions pour le diagnostic sérologique de la brucellose. Belgium: CODA-CERVA (Ed.), 47. Godfroid, J., Nielsen, K., & Saegerman, C. (2010). Diagnosis of brucellosis in livestock and wildlife. Croatian Medical Journal, 51(4), 296–305. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20718082 Godfroid, J., Saegerman, C., Wellemans, V., Walravens, K., Letesson, J.-J., Tibor, A., … Garin-Bastuji, B. (2002). How to substantiate eradication of bovine brucellosis when aspecific serological reactions occur in the course of brucellosis testing. Veterinary Microbiology, 90(1), 461–477. http://doi.org/10.1016/S0378- 1135(02)00230-4 Herrick, J. A., Lederman, R. J., Sullivan, B., Powers, J. H., & Palmore, T. N. (2014). Brucella arteritis: clinical manifestations, treatment, and prognosis. The Lancet. Infectious Diseases, 14(6), 520–6. http://doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70270-6 INEC, MAG, & SICA. (2002). ECUADOR - Agricultural Census 1999/2000 – Main Results. Retrieved July 20, 2016, from http://www.fao.org/fileadmin/templates/ess/ess_test_folder/World_Census_Agricul ture/Country_info_2000/Reports_2/ECU_SPA_REP_2000.pdf Lesaffre, E., Speybroeck, N., & Berkvens, D. (2007). Bayes and diagnostic testing. Veterinary Parasitology, 148(1), 58–61. http://doi.org/10.1016/j.vetpar.2007.05.010 Limet, J.N., Kerkhofs, P. Wijffels, R. Dekeyser P. 1988. Le diagnostic sérologique de la brucellose bovine par ELISA. Ann. Méd. Vét., 132, pp. 565–575 Lucero, N. E., Ayala, S. M., Escobar, G. I., & Jacob, N. R. (2008). Brucella isolated in humans and animals in Latin America from 1968 to 2006. Epidemiology and Infection, 136(4), 496–503. http://doi.org/10.1017/S0950268807008795 MAG-SESA. (1999). Prevención y control de la brucelosis bovina en Ecuadorle. Quito. Maldonado, P., & Salgado, G. (1979). Diagnóstico de la brucelosis con antígeno tamponado y la prueba de inactivación por calor a 65°C, en muestras positivas y sospechosas a la aglutinación rápida en placa. Universidad Central del Ecuador. Memish, Z. A., & Balkhy, H. H. (2004). Brucellosis and International Travel. Journal of Travel Medicine, 11(1).

Muma, J. B., Godfroid, J., Samui, K. L., & Skjerve, E. (2007). The role of Brucella infection in abortions among traditional cattle reared in proximity to wildlife on the Kafue flats of Zambia. Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics), 26(3), 721–30. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18293620 Nicoletti, P. (2001). Immune Responses and Vaccination. In M. Madkour (Ed.), Madkour’s Brucellosis (pp. 267 – 274). Germany: Springer-Verlag. Nielsen, K. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Veterinary Microbiology, 90(1), 447–459. http://doi.org/10.1016/S0378-1135(02)00229-8 OIE. (2016a). CHAPTER 2.1.4 Brucellosis (Brucella abortus, B. mellitensis and B. suis). Retrieved July 20, 2016, from http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/2.01.04_BRUCEL LOSIS.pdf OIE. 2016b. Terrestrial Animal Health Code. http://www.oie.int/index.php?id=169&L=0&htmfile=chapitre_bovine_brucellosis. htm Olsen, S. C., & Stoffregen, W. S. (2005). Essential role of vaccines in brucellosis control and eradication programs for livestock. Expert Review of Vaccines, 4(6), 915–928. http://doi.org/10.1586/14760584.4.6.915 Ouahrani-Bettache, S., Soubrier, M., & Liautard, J. (1996). IS6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and strains. J. Appl .Bacteriol., 81(2), 154–160. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., & Tsianos, E. V. (2006). The new global map of human brucellosis. The Lancet Infectious Diseases, 6(2), 91–99. http://doi.org/10.1016/S1473-3099(06)70382-6 Poulsen, K. P., Hutchins, F. T., McNulty, C. M., Tremblay, M., Zabala, C., Barragan, V., … Bethel, J. W. (2014). Brucellosis in dairy cattle and goats in northern Ecuador. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 90(4), 712–5. http://doi.org/10.4269/ajtmh.13-0362 Rahman, A. K. M. A., Saegerman, C., Berkvens, D., Fretin, D., Gani, M. O., Ershaduzzaman, M., … Emmanuel, A. (2013). Bayesian estimation of true prevalence, sensitivity and specificity of indirect ELISA, Rose Bengal Test and Slow Agglutination Test for the diagnosis of brucellosis in sheep and goats in

Bangladesh. Preventive Veterinary Medicine, 110(2), 242–252. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2012.11.029 Rivera, D. Y., Rueda, O. E., Calderon, C. P., Mariño, O. C., Gall, D., & Nielsen, K. (2003). [Comparative evaluation of the indirect enzyme-linked immunosorbant assay in milk for the detection of cattle infected with Brucella abortus, in herds located in the province of Cundinamarca, Colombia]. Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics), 22(3), 1065–75. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15005563 Rodríguez-Hidalgo, R. I., Contreras-Zamora, J., Benitez Ortiz, W., Guerrero-Viracocha, K., Salcan-Guaman, H., Minda, E., & Ron Garrido, L. (2015). Circulating Strains of Brucella abortus in Cattle in Santo Domingo De Los Tsáchilas Province - Ecuador. Frontiers in Public Health, 3, 45. http://doi.org/10.3389/fpubh.2015.00045 Ron-Román, J., Ron-Garrido, L., Abatih, E., Celi-Erazo, M., Vizcaíno-Ordóñez, L., Calva-Pacheco, J., … Saegerman, C. (2014). Human Brucellosis in Northwest Ecuador: Typifying Brucella spp., Seroprevalence, and Associated Risk Factors. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 14(2), 124–133. http://doi.org/10.1089/vbz.2012.1191 Ron-Román, J., Saegerman, C., Minda-Aluisa, E., Benítez-Ortíz, W., Brandt, J., & Douce, R. (2012). First report of orchitis in man caused by Brucella abortus biovar 1 in Ecuador. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 87(3), 524–8. http://doi.org/10.4269/ajtmh.2012.11-0341 Roux, J. (1979). [Epidemiology and prevention of brucellosis]. Bulletin of the World Health Organization, 57(2), 179–94. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/312154 Saegerman, C., Berkvens, D., Godfroid, J., & Walravens, K. (2010). Bovine brucellosis. In P. Lefèvre, J. Blancou, R. Chermette, & G. Uilenberg (Eds.), Infectious and parasitic disease of livestock (pp. 991–1021). France: Lovoisier. Sanogo, M., Thys, E., Achi, Y. L., Fretin, D., Michel, P., Abatih, E., … Saegerman, C. (2013). Bayesian estimation of the true prevalence, sensitivity and specificity of the Rose Bengal and indirect ELISA tests in the diagnosis of bovine brucellosis. Veterinary Journal, 195(1), 114–120. http://doi.org/10.1016/j.tvjl.2012.06.007 Saravi, M. A., Wright, P. F., Gregoret, R. J., & Gall, D. E. (1995). Comparative performance of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and

conventional assays in the diagnosis of bovine brucellosis in Argentina. Veterinary Immunology and Immunopathology, 47(1-2), 93–9. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8533303 Thimn, B. M. (1982). Brucellosis in South America. In Brucellosis; Distribution in Man, Domestic And Wild Animals (pp. 31–34). New York: Spiringer-Verlag. Thys, E., Yahaya, M. ., Walravens, K., Baudoux, C., Bagayoko, I., Berkvens, D., & Geerts, S. (2005). Edude de la prévalence de la brucelloses bovine en zone forestière de la Cote d’Ivoire. Rev. Elev. Med. Vet. Pays Trop., 58, 205–209. Vera, R., & Flores, R. (2004). Diagnóstico y prevalencia de brucelosis mediante ring test en los hatos bovinos del cantón Chone en el año 2004. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Yu, W. L., & Nielsen, K. (2010). Review of Detection of Brucella sp. by Polymerase Chain Reaction. Croatian Medical Journal, 51(4), 306. http://doi.org/10.3325/cmj.2010.51.306

SECTION EXPÉRIMENTALE

Partie 2: Brucellose caprine en Equateur

Échantillonage chez les chèvres

Source: Jorge Ron-Román Comunidad Tronco quemado, cantón Zapotillo, provincia de Loja – Ecuador 2011

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ARTICLE 3

Unexpected discovery of Brucella abortus Buck B-19 vaccine in goats from Ecuador.

Jorge Ron-Román, Dirk Berkvens, Daniela Barzallo-Rivadeneira, Alexandra Angulo-Cruz, Pablo González-Andrade, Elizabeth Minda-Aluisa, Washington Benítez-Ortíz, Jef Brandt, Claude Saegerman.

Article soumis pour publication : Tropical Animal Health and Production

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Préambule Comme Brucella melitensis n’a jamais été isolée en Equateur à ce jour, la réalisation d’une étude ciblant plusieurs régions et impliquant un grand nombre d’échantillons s’avérait nécessaire afin d’évaluer la prévalence de la brucellose chez cette espèce réservoir et le cas échant, de tanter d’isoler l'agent causal. De plus, les pratiques des vendeurs embulants de lait de chèvre non pasteurisé pour soigner les malades nous ont posé la question du risque posé par celles-ci en cas de brucellose.

Résumé en français A ce jour, très peu d’études sérologiques ont ciblé la brucellose caprine en Equateur, la plupart sont d’ailleurs relativement anciennes. Afin d'évaluer la situation épidémiologique actuelle, une étude sérologique transversale a été menée parmi les populations caprines des provinces de Carchi (n = 160 animaux), Pichincha (n = 224 animaux) et Loja (n = 2024 animaux). En outre, des échantillons de lait ont été prélevés sur 220 animaux dans la province de Pichincha. Seuls deux résultats positifs (RB négatif et SAT-EDTA ≥ 400 UI / ml) ont été obtenus chez des chèvres en lactation, toutes deux appartenant à la même ferme de Quito. Cette étude démontre une prévalence apparente faible dans la province de Pichincha, et l'absence de la maladie dans les provinces de Carchi et Loja. Vingt-cinq échantillons de laits se sont révélés positifs au test de l’anneau (Milk Ring Test - MRT) dans la province de Pichincha, ce qui représente une prévalence de 11,16%. Les échantillons positifs ont été mis en culture. Tous les résultats ont été négatifs, à l'exception d'un animal de la région de Quito. Cet animal a présenté une culture positive pour Brucella abortus souche 19 (B19). Plusieurs hypothèses peuvent être émises pour interpréter un tel résultat inattendu, la plus probable étant l’utilisation accidentelle chez cet animal d'une aiguille utilisée au préalable pour immuniser le bétail avec le vaccin B19. Cette hypothèse met en avant la nécessité d’implémenter des mesures de biosécurité pour prévenir de tels accidents.

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The unexpected discovery of Brucella abortus Buck 19 vaccine in goats from Ecuador underlines the importance of biosecurity measures

Jorge Ron-Román1, 2, 3, 4, Dirk Berkvens2, Daniela Barzallo-Rivadeneira1, Alexandra Angulo-Cruz1, Pablo González-Andrade1, Elizabeth Minda-Aluisa1, Washington Benítez-Ortíz1, 5, Jef Brandt2, Claude Saegerman6*

1 Centro Internacional de Zoonosis (CIZ), Universidad Central del Ecuador, Quito Ecuador. 2 Department of Biomedical Sciences, Institute of Tropical Medicine, Antwerp - Belgium. 3 Research Unit of Epidemiology and Risk analysis applied to Veterinary Sciences (UREAR-ULg), Fundamental and Applied Research for Animal and Health (FARAH), Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, Belgium. 4 Carrera de Ingeniería Agropecuaria. Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Sangolquí, Ecuador. 5 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Central del Ecuador, Quito - Ecuador. 7 Department of Bacteriology and Immunology, Veterinary and Agrochemical Research Centre, Brussels - Belgium.

Keywords: Brucellosis; Goats; Ecuador; Vaccine; Biosecurity.

*Corresponding author: Research Unit in Epidemiology and Risk Analysis Applied to Veterinary Sciences (UREAR-ULg), Fundamental and Applied Research for Animal and Health (FARAH) Center, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liège, B42, Boulevard de Colonster 20, B-4000 Liège, Belgium; e-mail address [email protected]; Tel.: +32-4-366-45-79; Fax: +32-4-366-42-61.

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Abstract Very few, mostly old and only preliminary serological studies of brucellosis in goats exist in Ecuador. In order to assess the current epidemiological situation, we performed a cross-sectional serological study in the goat populations of Carchi (n = 160 animals), Pichincha (n = 224 animals), and Loja provinces (n = 2 024 animals). Additionally, milk was sampled from 220 animals in Pichincha province. Only two positive serological results (RB negative and SAT-EDTA ≥ 400 IU/ml) were obtained in lactating goats from the same farm in Quito. The present study indicates a low apparent prevalence in Pichincha province and absence in Carchi and Loja provinces. A total of 25 positive milk ring tests (MRT) were obtained in Pichincha province yielding a prevalence of MRT of 11.16%. Subsequent culture was performed on the positive MRT samples. All results were negative, apart from a single sample, obtained from a serological positive goat in Quito, that was positive for Brucella abortus strain 19 (B19). Several hypotheses are forwarded concerning this unexpected result. The most likely hypothesis is the possible accidental use of a needle, previously used for vaccination of cattle with the said vaccine, for the administration of drug treatment to the goat. This hypothesis underlines the necessity of biosecurity measures to prevent this type of accidents.

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Introduction Brucellosis is a worldwide disease with health and economic impacts (Castro et al., 2005). It is widely distributed in humans and animals, especially in developing countries. Its occurrence is related to the existence of animal reservoirs and high infection rates in livestock, especially in goats and sheep (Corbel, 2006).

The main cause of caprine brucellosis is Brucella melitensis (biovars 1, 2 and 3) (Godfroid et al., 2010) but some sporadic cases caused by B. abortus are documented (e.g., Leal-Klevezas et al., 2000). One or more of the following typically characterize the clinical form of the disease: abortion, retained placenta, orchitis, epididymitis and, more rarely, arthritis together with excretion of the organisms in uterine discharges and milk (OIE, 2016a).

Surveillance in goats by indirect diagnostic methods is not a common practice in most countries of South America (PANAFTOSA, 2000), where goat breeding is constrained in its development, because of conditions of overcrowding, poor or non-existent disease control measures and lack of technical assistance, which, together with rudimentary empirical management, permit the transmission of brucellosis (Ortega-Sánchez et al., 2009).

Caprine brucellosis due to Brucella melitensis is present in Mexico, Peru, Argentina, Paraguay and Bolivia (Aznar et al., 2014; PANAFTOSA, 2000). In Ecuador there are no records or Brucella spp. isolates in goats despite the fact that raising goats is a common practice in rural and peri-urban areas. The total number of goats is estimated between 178,000 (INEC et al., 2002) and 191 000 (OIE, 2016b) of which approximately 43 % (78,000) are found in the canton of Zapotillo in Loja province.

The marketing of goat milk in different parts of the Metropolitan District of Quito (two million inhabitants) has become a common activity and forms the basic income of several families engaged in this business. Ecuadorian law prohibits peddling unpasteurized milk, and although vendors work without government regulation, they try as much as possible to maintain minimum health standards, such as collecting animal droppings, washing the udder and selling milk in new and clean bottles.

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The very few serological studies of brucellosis in goats conducted in Ecuador are old and incomplete or preliminary (e.g., Poulsen et al., 2014). In order to determine the seroprevalence of Brucella spp. in goats in three selected areas of Ecuador, as well as isolate the causative agent, we conducted a cross-sectional study (serum and milk samples) in Carchi, Pichincha and Loja provinces.

Materials and methods Selected areas The selection of three areas for this study is based on the potential risks: Bolivar and Mira cantons of Carchi province (presence of bovine brucellosis in cattle and existence of mixed farms) (Ron-Román and collaborators, unpublished data), the urban and peri- urban Metropolitan District of Quito in Pichincha province (business of milk goats in Quito city and high density of inhabitants) and Zapotillo canton of Loja (high density of goats) provinces (Figure 1).

Fig 1: Goat population per Canton and localization of the study areas (INEC et al., 2002). [A]

[B]

[C]

Legend: [A], Bolivar and Mira cantons of Carchi province (presence of bovine brucellosis in cattle and existence of mixed farms); [B], urban and peri-urban Metropolitan District of Quito in Pichincha province (business of milk goats in Quito city and high density of inhabitants); [C], Zapotillo canton of Loja province (high density of goats).

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Sampling design A survey with census sampling at farm level and convenience sampling at animal levels was performed in the three selected areas. In Carchi and Pichincha provinces (small herds), all herds and all animals present in a herd were sampled. In Zapotillo canton of Loja province (large herds), all herds were included and a random selection of 25% of animals present in a herd was sampled.

In Carchi, blood was sampled between December 2012 and February 2013 (n = 160 goats in 12 herds). In urban and peri-urban Quito (Pichincha province), blood and milk were sampled between December 2009 and April 2010 (n = 224 and 220 goats in 12 herds for blood and milk samples, respectively). In Zapotillo canton of Loja province, blood were sampled in July 2011 (n = 2 024 goats in 62 herds).

Samples The goats sampled belonged to native, Nubian and Anglo-Nubian breeds. Jugular vein blood was sampled in vacutainer tubes (10 ml). Each sample was centrifuged; the serum was identified, analysed, and stored at -20 °C. In addition, 100 ml of milk was collected from each lactating goat sampled in peri-urban Quito. All milk samples were identified, stored in a cool box until analysis at the Centro Internacional de Zoonosis (CIZ, International Centre for Zoonoses, Central University of Ecuador).

Blood and milk analysis Serum samples were analysed for the presence of antibodies against Brucella spp. using two diagnostic tests: slide agglutination test with Rose Bengal (RB) and the serum agglutination tube test with EDTA (SAT-EDTA). These tests were performed as previously described (Alton et al., 1988; OIE, 2016a). Milk samples were analysed by applying the modified technique of Milk Ring Test (MRT), also previously described (Díaz et al., 2001).

Isolation and identification of Brucella spp. Milk samples from SAT-EDTA positive (n = 2) and MRT positive animals (n = 23) were centrifuged at 2,000 g for 15 minutes. The supernatant (cream) and sediment were grown in selective Farrell medium (Columbia Agar Base [Oxoid CM0331] with 5% decomplemented horse serum [GIBCO Ref-16050-130] and Brucella selective

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supplement [OXOID SR0083A]) for the isolation of Brucella spp. Replicated colonies with BASE medium (Columbia Agar Base with 5% decomplemented horse serum) were identified and classified by means of: macroscopic and microscopic observation, Gram staining and oxidase [DIFCO-BBL Ref: 261181], catalase and urease tests. The procedures were performed as previously described (Alton et al., 1988; Godfroid & Boelaert, 1995).

Identification and molecular characterization of Brucella spp. Once identified by biochemical tests, the Brucella colonies were analysed molecularly by three different PCR tests: the IS6501 PCR or PCR-IS711 (primers: IS6501 3 ': 5'-gat- aga-agg--gct-gaa ctt tgc-gga-c-3 '/ IS6501 5': 5'-acg-ccg-gtg-tat-ggg-aaa-ggc-ttt-t-3') for genus identification, AMOS PCR (Primers: B. abortus-specific: gac-gaa-cgg-aat-ttt-tcc- aat-ccc; B. melitensis-specific: aaa-tcg-cgt-cct-tgc-tgg-tct-ga; B. ovis-specific: cgg-gtt- ctg-gca-cca-tcg-tcg; B. suis-specific: cgc-cgg-ttt-tct-gaa-ggt-tca-gg; IS711-specific: tgc- cga-tca-ctt-aag-ggc-ctt-cat) (Bricker & Halling, 1994) for species determination and modified AMOS PCR (Primers: RB51/2308: ccc-cgg-aag-ata-tgc-ttc-gat-cc; eri primer 1: gcg-ccg-cga-aga-act-tat-caa; eri primer 2: cgc-cat-gtt-agc-ggc-ggt-ga) (Bricker & Halling, 1995) for the differentiation between vaccine strains and field strains.

Statistical analysis The seroprevalence was estimated with a Binomial exact distribution and computed in Stata SE 12.1. version (StatCorp, College Station, Texas, USA).

Results No serological RB test showed the presence of antibodies in any of the animals tested but some animals originating from Pichincha province (see below) tested positive for the SAT-EDTA.

The study demonstrated the absence of antibodies to Brucella spp in Bolivar and Mira cantons of Carchi province (Number of animals tested [Nt] = 160; seroprevalence of 0 % with 95 % confidence interval [CI]: 0-1.85 %) and Zapotillo canton of Loja province (Nt = 2024; seroprevalence of 0 % with 95 % CI: 0-0.15 %). The seroprevalence of brucellosis in the district of Quito in Pichincha province was quite low (Nt = 224; seroprevalence of 0.89 % with 95 % CI: 0.11-3.19 %).

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Of the 220 MRT that were performed in Pichincha province, 25 were positive (milk prevalence of 11.16 % with 95 % CI: 7.35-16.03 %). Only two goats (out of 47 originating from the same farm in the Tiwinsa sector, urban Quito) were positive in SAT-EDTA (high antibody titres) and in MRT (Table I). From the two seropositive and lactating goats from Quito urban area, one Brucella was isolated on milk. This strain was future characterized and identified as Brucella abortus strain 19 (Table II). A further 23 lactating goats that were positive in MRT were negative in culture.

Table 1: Serology, culture and polymerase chain reaction (PCR) results of two SAT EDTA positive goats Method of diagnostic Sample Herd Province Canton SAT- Isolation PCR AMOS mAMOS N° Code RB EDTA IS711 PCR PCR 178 Tiw 3 Pichincha Quito - 400 - - - - IUA 184 Tiw 3 Pichincha Quito - 3200 + + + + IUA Legend: RB, Rose Bengal test; SAT – EDTA, Serum agglutination test with EDTA; IUA, International Units of Agglutination PCR-IS711, Polymerase chain reaction with insertion 711; AMOS PCR, Abortus, Melitensis, Ovis and Suis; mAMOS PCR, AMOS modified (PCR for the differentiation of vaccine strains from field strains).

Discussion Brucellosis is a contagious infectious disease, caused by bacteria of the genus Brucella spp., which affects both human and several animal species. Caprine brucellosis is mainly due to B. melitensis (Godfroid et al., 2010) and some cases of B. abortus was previously published (e.g. Leal-Klevezas et al., 2000)). The pathogenicity in humans for these two species of Brucella is high (Godfroid et al., 2010; Saegerman et al., 2010).

The use of SAT-EDTA, RB and MRT was previously evaluated for the diagnosis of caprine brucellosis (Falade, 1978). There was a good correlation between SAT-EDTA and RB when both tests were negative but RB failed to detect 80% of sera above 50 IU/ml in SAT-EDTA. Also, owing to the relatively poor milking potential of the goat and the false positive results with MRT, it was concluded that the SAT-EDTA offers a better serological diagnostic tool for caprine brucellosis. This study is in line with this previous information. Unfortunately, studies reporting serological test results in goats should be interpreted with caution, as most of the data have been obtained without isolation of Brucella (Díaz et al., 1999).

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Several preliminary results are available in some Faculties of Veterinary Medicine in Ecuador. In Guayas province (west central part of Ecuador), 33 % of 800 individual milk samples were positive to MRT in 1970 but with no isolation of Brucella (Albornoz, 1970). Three other serological studies with Huddleson agglutination test in Macará (Granda, 1972), Loja (Tapia, 1998) and Azuay (Sánchez, 1997) provinces indicated a zero or very low seroprevalence.

The present study indicates a low prevalence in Pichincha province and absence in Carchi and Loja provinces.

The discovery of the B. abortus strain 19 (B19) in milk from a goat with a positive serology result (SAW-EDTA: 3,200 IU/ml; high IgM level) was unexpected. Several hypotheses can be postulated. The first hypothesis is the improper use of B19 vaccine in goats in addition to its advised use in cattle. The vaccine of choice for goats is Rev 1 and, as recommended, B19 is only mandatory in cattle in Ecuador and common in Pichincha province. The second hypothesis is a use of a needle, which was previously used for B19 vaccination in cattle, for the administration of a drug to goats.

Goats and other species present in a herd are commonly treated by drug injection with the same needle. The second serologically positive goat comes from the same herd, which may form an indication of possible serial use of the same needle. The third hypothesis is the consumption of milk by goats originating from B19 vaccinated cattle. Positive microbiological cultures were obtained during a period of three years from the milk of cows vaccinated with B19 (Meyer & Nelson, 1969), as well as in colostrum (Corner & Alton, 1981). Seropositive titres were observed for a period of one year after B19 vaccination of cows (Manthei, 1952). A study of oral vaccination with B19 showed the need of a large dose (500 billion cells) and all serological test were negative in heifers 82 days after vaccination (Nicoletti & Milward, 1983). Despite the fact that it cannot be excluded, this hypothesis is deemed unrealistic. The fourth hypothesis is the excretion of B19 in the environment by vaccinated bovines and the use of a same pasture by goats. The intermittent excretion of B19 strain was detected by PCR until 9 years in vaccinated cattle mainly in urine and also in milk samples, which confirmed its multiplication and persistence (Pacheco et al., 2012). However, in this study cultures were always negative. For identical reasons (large dose needed and short period of

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positivity in serological tests) this hypothesis also appears improbable. In conclusion, the second hypothesis is retained as the most likely.

Conclusion The study demonstrated the absence of antibodies to Brucella spp in Bolivar and Mira cantons of Carchi province and Zapotillo canton of Loja province, the principal goat producing canton. Isolation of Brucella abortus strain 19 in a goat in Quito district demonstrates the possible cross-infection from vaccinated cattle (B19 vaccination is common here), probably through the accidental use of a needle previously used for vaccination of cattle with B19 vaccine. This finding highlights the necessity of stringent biosecurity measures and quality control of vaccination campaigns.

Acknowledgments This research was funded by the International Centre for Zoonoses, Central University of Ecuador, Quito, Ecuador; the Institute of Tropical Medicine, Antwerp, Belgium and the Research Unit of Epidemiology and Risk analysis applied to Veterinary Sciences, University of Liege, Belgium. The authors thank all farmers who participated in the study.

Compliance with ethical standards

Conflict of interest: The authors declare that they have no competing interests.

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Table 2 Characterization of the caprine Brucella spp. isolate

Growth on colorants Agglutination with serum Bacteriological Urease CO H S Basic Catalase Oxidase 2 2 Thionin Thionin Safranin sample code activity requirement production Fuschin anti A anti M 20 µg 10 µg 100 µg 20 µg Ec-CIZ-Cap-1 + +++ + - +++ - - + + + - (48 hr) (48 hr) (24 hr) B2* + + + + + - - - - + - B9** + + + - + + + + + - + B1*** + + + +a + - - + + + - Legend: EC-CIZ-Cap-1 is the caprine Brucella isolate; * control Brucella abortus biovar 2; ** control Brucella abortus biovar 9; *** control Brucella abortus biovar 1; a positive for most strains.

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References Albornoz, G., 1970. Diagnóstico de brucelosis por la prueba de “Ring-test” en la provincia del Guayas a nivel de hacienda. Universidad Estatal de Guayaquil. Alton, G. et al., 1992. Serological Methods. In INRA, ed. Techniques for the brucellosis laboratory. Paris, pp. 63–131. Anon, 2012. La leche de cabra se vende sin regulaciones Este contenido ha sido publicado originalmente por Diario EL COMERCIO en la siguiente dirección: http://www.elcomercio.com/actualidad/quito/leche-de-cabra-se-vende.html. Si está pensando en hacer uso del m. El Comercio. Available at: http://www.elcomercio.com/actualidad/quito/leche-de-cabra-se-vende.html. Aznar, M.N. et al., 2014. Bovine Brucellosis in Argentina and Bordering Countries: Update. Transboundary and Emerging Diseases, 61(2), pp.121–133. Available at: http://doi.wiley.com/10.1111/tbed.12018 [Accessed July 20, 2016]. Bricker, B.J. & Halling, S.M., 1994. Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR. Journal of clinical microbiology, 32(11), pp.2660–6. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7852552 [Accessed July 19, 2016]. Bricker, B.J. & Halling, S.M., 1995. Enhancement of the Brucella AMOS PCR assay for differentiation of Brucella abortus vaccine strains S19 and RB51. Journal of clinical microbiology, 33(6), pp.1640–2. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7650203 [Accessed July 20, 2016]. Castro, H.A., González, S.R. & Prat, M.I., 2005. Brucelosis: una revisión práctica. Acta bioquím. clín. latinoam, 39(2), pp.203–216. Corbel, M.J., 2006. Brucellosis in humans and animals, Geneva Switzerland: World Health Organization. Corner, L.A. & Alton, G.G., 1981. Persistence of Brucella abortus strain 19 infection in adult cattle vaccinated with reduced doses. Research in veterinary science, 31(3), pp.342–4. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6805054 [Accessed July 20, 2016]. Díaz Aparicio, E., Blasco Martínez, J.M. & Suárez Güemes, F., 1999. Prueba de tarjeta modificada para el diagnóstico de la brucelosis caprina. Vet. Mex, 30(4), p.307. Díaz, E. et al. eds., 2001. Introducción. In Diagnóstico de brucelosis animal. México: INIFAP, pp. 1–16. Falade, S., 1978. A comparison of three serological tests in the diagnosis of caprine

113

brucellosis. Research in veterinary science, 24(3), pp.376–7. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/97740 [Accessed July 20, 2016]. Godfroid, J. & Boelaert, F., 1995. Prescriptions pour le diagnostic sérologique de la brucellose. Belgium: CODA-CERVA (Ed.), 47. Godfroid, J., Nielsen, K. & Saegerman, C., 2010. Diagnosis of brucellosis in livestock and wildlife. Croatian medical journal, 51(4), pp.296–305. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20718082 [Accessed July 20, 2016]. Granda, B., 1972. Incidencia de brucelosis caprina en el cantón Macará por el método de Huddleson. Universidad Nacional de Loja. Leal-Klevezas, D.S. et al., 2000. Use of polymerase chain reaction to detect Brucella abortus biovar 1 in infected goats, MAG, 2016. ECUADOR - Agricultural Census 1999/2000 – Main Results. Proyecto Sistema de Informacion y Censo Agropecuario, p.2. Available at: http://www.fao.org/fileadmin/templates/ess/documents/world_census_of_agricultu re/main_results_by_country/ecuador_2000.pdf [Accessed July 20, 2016]. Manthei, C.A., 1952. Evaluation of vaccinal methods and doses of brucella abortus strain 19. Proceedings of the 56th Annual Meeting of Livestock Sanitation Association, pp.115–125. Meyer, M.E. & Nelson, C.J., 1969. Persistence of Brucella abortus, strain 19 infection in immunized cattle. In Proceedings, annual meeting of the United States Animal Health Association. p. 159. Nicoletti, P. & Milward, F.W., 1983. Protection by oral administration of brucella abortus strain 19 against an oral challenge exposure with a pathogenic strain of Brucella. American journal of veterinary research, 44(9), pp.1641–3. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6414347 [Accessed July 20, 2016]. OIE, 2016a. CHAPTER 2.1.4 Brucellosis (Brucella abortus, B. mellitensis and B. suis). OIE, p.44. Available at: http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/2.01.04_BRUCEL LOSIS.pdf [Accessed July 20, 2016]. OIE, 2016b. WAHIS Interface. Available at: http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Countryinformation/Animalpopulati on [Accessed July 20, 2016]. Ortega Sánchez, J.L. et al., 2009. Seroprevalencia de brucelosis caprina en el municipio de Tlahualilo, Durango. México. REDVET. Revista Electrónica de Veterinaria,

114

10(4). Pacheco, W.A. et al., 2012. Excretion of Brucella abortus vaccine B19 strain during a reproductive cycle in dairy cows. Brazilian journal of microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology], 43(2), pp.594–601. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24031869 [Accessed July 20, 2016]. PANAFTOSA, 2000. Brucelosis y Tuberculosis, situación de los programas en las Américas, Rio de Janeiro, Brasil. Poulsen, K.P. et al., 2014. Brucellosis in dairy cattle and goats in northern Ecuador. The American journal of tropical medicine and hygiene, 90(4), pp.712–5. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24591429 [Accessed July 20, 2016]. Saegerman, C. et al., 2010. Bovine brucellosis. In P. Lefèvre et al., eds. Infectious and parasitic disease of livestock. France: Lovoisier, pp. 991–1021. Sánchez J., P., 1997. Diagnóstico de brucelosis caprina, en el Cantón Santa Isabel, mediante el método de aglutinación en placa, año 1996. Universidad de Cuenca. Available at: http://dspace.ucuenca.edu.ec/handle/123456789/17994 [Accessed July 20, 2016]. Tapia, N., 1998. Prevalencia de brucelosis caprina en el área “Centro Laja.” Universidad Nacional de Loja.

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SECTION EXPÉRIMENTALE

Partie 3: Détermination de la séroprévalence, des facteurs de risque et des espèces et biovars de Brucella spp. chez l’homme en Equateur

Le prise de sang chez les humains

Source: Jorge Ron-Román Comunidad La Esperanza, cantón Pedro Moncayo, provincia de Pichincha – Ecuador 2012

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ARTICLE 4

Human brucellosis in North-West Ecuador: typifying of Brucella spp., sero-prevalence, and associated risk factors

Ron-Román J., Ron-Garrido L., Abatih E., Celi-Erazo M., Vizcaíno-Ordóñez L., Calva-Pacheco J., González-Andrade P., Berkvens D., Benítez-Ortíz W., Brandt J., Fretin D., Saegerman C.

Publié en 2014 Feb. dans : Vector-Borne and Zoonotic Diseases 14(2):124-33

DOI: 10.1089/vbz.2012.1191

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Préambule L'évaluation du statut réel de la brucellose chez les réservoirs animaux est influencée par la fiabilité des résultats des tests diagnostiques appliqués. De plus, chez les bovins, l’existence de réactions croisées suite à la vaccination avec la souche 19 (B-19) complique encore l’interprétation des résultats. La prévalence d'anticorps contre l'agent causal, ainsi que l'isolement et la caractérisation des souches de Brucella sp. circulant chez l’homme, pourraient non seulement fournir des informations épidémiologiques à propos de cette zoonose, tant au niveau régional que national, mais également évaluer son impact sur la santé publique, car il n’existe aucun vaccin commercialé chez l'homme.

Résumé en français En Equateur, la brucellose humaine est sous-estimée et son diagnostic repose uniquement sur la surveillance passive. Depuis 2008, la brucellose a été retirée de la liste des maladies transmissibles dans le pays. Jusqu'à présent, la situation réelle de la brucellose humaine n'a pas encore été déterminée. Les objectifs de cette étude étaient de (i) déterminer la séroprévalence de la maladie, (ii) d'identifier les facteurs de risque associés à la séropositivité chez l’homme, et (iii) d’isoler les souches circulantes de Brucella spp. dans la partie nord-ouest de l'Equateur. Entre 2006 et 2008, une grande enquête de transect a été réalisée en Equateur, sur base de prélèvements sanguins réalisés chez l’homme dans la partie nord-ouest du territoire (n = 3733) et accompagnée d’une enquête épidémiologique. Les résultats de trois tests diagnostic utilisés en parallèle ont permis d’estimer une séroprévalence globale de 1,88% (intervalle de confiance [IC] 95%: 1,48-2,38). Une régression logistique multivariée a permis d’identifier les principaux facteurs de risque associés à la séropositivité chez l’homme: contact avec un élevage (odds ratio [OR] = 3,0; IC 1,25-7,08), consommation de fœtus et de placenta (OR = 2,5; IC 1,18 -5,22), et participation à des activités à risque (OR = 1,8; IC 1,00-3,35). Une variation notable de la séroprévalence a été observée entre les cantons. La souche en circulation était Brucella abortus biotype 4. Cette étude a souligné que, les contacts avec le bétail, la consommation de foetus et de placenta et les activités professionnelles à risque, sont autant de facteurs jouant un rôle important dans la contamination par Brucella sp. chez les individus dans le nord-ouest de l'Equateur. L’implémentation de campagnes de sensibilisation contre la brucellose, en particulier dans les zones rurales où vit 36% de la population, en parallèle à la lutte contre la

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maladie chez les animaux va directement bénéficier à la prévention chez l’homme, comme il n’existe pas de vaccin sûr et efficace contre la brucellose en médecine humaine.

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SECTION EXPÉRIMENTALE

Partie 4: Performance des tests utilisés pour le diagnostic de la brucellose humaine en Equateur

Les enfants, un groupe de risque!

Source: Jorge Ron-Román Cantón Mejía, provincia de Pichincha – Ecuador 2006

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ARTICLE 5

Bayesian evaluation of three serological tests for detecting antibodies against Brucella spp. among humans in the north-western part of Ecuador.

J. Ron-Román, L. Ron-Garrido, E. Abatih, M. Celi-Erazo, L. Vizcaíno-Ordóñez, J. Calva- Pacheco, P. González-Andrade, D. Berkvens, W. Benítez-Ortíz, J. Brandt, D. Fretin and C. Saegerman.

Article en révision dasns : American Journal of Tropical Medicine and Hygiene

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Préambule Une fois la prévalence apparente de la brucellose estimée chez l'homme et les facteurs de risque identifiés (3ème partie du travail expérimental), les résultats des tests diagnostiques imparfaits ont été combinés avec des informations a priori (avis d’experts), dans un modèle bayésien, afin d’évaluer les performances (Se et Sp) du test utilisé chez l’homme.

Résumé en français Dans de nombreux pays, la brucellose reste une zoonose majeure mais négligée, qui est responsable de pertes économiques sévères tant pour le secteur de l’élevage, que pour la santé publique (temps de travail et coûts liés au diagnostic et à des traitements de longue durée). Une condition préalable à tout programme de prévention et / ou de contrôle consiste à estimer la prévalence réelle de la maladie et à identifier la souche de Brucella spp. circulant dans les différents compartiments. Le but de cette étude a été d'estimer la prévalence réelle chez l’homme, via l’utilisation de trois tests sérologiques, en tenant compte de leur sensibilité et spécificité. Les prélèvements ont été réalisés dans le nord- ouest de l'Equateur, et les résultats analysés via une approche bayésienne ajustée pour les dépendances entre tests multiples, dans le but d’éviter toute erreur d'interprétation. En outre, l'agent causal de la brucellose humaine dans cette région a été identifié. Un total de 3733 échantillons humains a été prélevé dans cette région de l'Equateur entre 2006 et 2008. La prévalence de la brucellose humaine et les caractéristiques des tests de diagnostic, à savoir (i) l’agglutination rapide au Rose Bengal (RBT), (ii) la séro- agglutination lente de Wright avec EDTA (SAT-EDTA) et (iii) un test immuno- enzymatique indirect (iELISA), ont été estimées grâce à une approche bayésienne. La prévalence réelle de la brucellose humaine a été estimée à 1% (intervalle de crédibilité: 0,4 à 1,6). Les sensibilités des tests iELISA et RBT étaient plus élevées mais très similaires (respectivement 95,1% et 95,0 %,) en comparaison à celle de la SAT-EDTA (60,8 %). Même si tous les tests ont présenté une spécificité élevée (> 99,0 %), celle du SAT-EDTA était la plus importante (99,9 %). La souche circulant dans cette zone d'étude a été identifiée comme étant Brucella abortus biotype 4. Les tests RBT et iELISA sont recommandés pour estimer la prévalence réelle de la brucellose humaine dans le cadre des programmes de surveillance au vu de leur sensibilité et spécificité élevées. La stratégie proposée doit se baser sur des données factuelles, dont les

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décideurs doivent tenir compte pour mettre en place des programmes appropriés de prévention et de contrôle de la brucellose dans le monde entier

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Bayesian evaluation of three serological tests for detecting antibodies against Brucella spp. among humans in the north-western part of Ecuador

Jorge Ron-Román1,2,3,4, Lenin Ron-Garrido1, Emmanuel Abatih3, Maritza Celi-Erazo1, Laura Vizcaíno-Ordóñez1, Jaime Calva-Pacheco1-5, Pablo González-Andrade1-5, Dirk Berkvens3, Washington Benítez-Ortíz1-6, Jef Brandt3, David Fretin7 and Claude Saegerman2*

1 Centro Internacional de Zoonosis (CIZ), Universidad Central del Ecuador, Quito Ecuador. 2 Research Unit of Epidemiology and Risk analysis applied to Veterinary Sciences (UREAR-ULg), Fundamental and Applied Research for Animal and Health (FARAH) Center, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, Belgium. 3 Department of Biomedical Sciences, Institute of Tropical Medicine, Antwerp - Belgium. 4 Carrera de Ingeniería en Biotecnología. Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Sangolquí, Ecuador. 5 Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Central del Ecuador, Quito - Ecuador. 6 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Central del Ecuador, Quito - Ecuador. 7 Department of Bacteriology and Immunology, Veterinary and Agrochemical Research Centre, Brussels - Belgium.

* Address correspondence to Claude Saegerman, Research Unit of Epidemiology and Risk analysis applied to Veterinary Sciences (UREAR-ULg), Fundamental and Applied Research for Animal and Health (FARAH), Faculty of Veterinary Medicine, University of Liège. Boulevard de Colonster, 20, B43b, B-4000 Liège, Belgium. Tel: 003243664579 ; Fax: 003243664261; E-mail: [email protected]

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Abstract In many countries brucellosis is an important but neglected zoonosis that causes serious economic losses in livestock but also in human (working time and costs related to diagnosis and long treatment durations) compartments. A prerequisite for any preventive and/or control programme consists in the estimation of the true prevalence of the disease and the identification of circulating strain of Brucella sp. in these compartments. The aim of the present study was to estimate this true prevalence together with diagnostic sensitivity and specificity of three serological tests in humans of the north-western part of Ecuador using a Bayesian approach adjusted for the dependencies among the multiple tests to avoid any misinterpretation. In addition, the causal agent responsible for human brucellosis in this region will be identified. Using a total of 3,733 samples collected from humans in the north-western part of Ecuador between 2006 and 2008, the prevalence of human brucellosis and the diagnostic test characteristics of the Rose Bengal fast agglutination test (RBT), Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA (SAT-EDTA) and indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (iELISA) were estimated using a Bayesian approach. The estimated true prevalence of human brucellosis was 1% (credibility interval: 0.4-1.6). The sensitivities of iELISA and RBT were higher and very similar (95.1 and 95.0% respectively) compared to that of SAT-EDTA (60.8%). Even though all tests indicated a high specificity (>99.0%), the specificity of SAT-EDTA was highest (99.9%). The circulating strain in this study area was identified to be Brucella abortus biotype 4. The RBT and the iELISA are recommended for estimating the true prevalence of human brucellosis and/or for surveillance programs following their high sensibilities and specificities. The proposed strategy supports evidence-based medicine for clinicians and policy-makers to ensure appropriate preventive and control programme of brucellosis worldwide.

Key words: Brucellosis, Ecuador, Brucella abortus biotype 4, Bayesian approach, Diagnostic tests, True prevalence.

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INTRODUCTION Brucellosis is an infectious and contagious disease caused by Gram-negative coccobacilli, which can survive in the cells of the immune system. It has a high tendency to cause chronic infections both in humans and in cattle (Orduña et al., 2000; Saegerman et al., 2010; Young, 1997).

In many countries brucellosis is an important disease that causes serious economic losses in cattle production (Corbel, 2006). In Ecuador these losses are estimated at 5.5 million US$ per year (Torres, 2008). In humans, this zoonosis causes mainly loses in working time and costs related to diagnosis and long treatment durations (Bowden, 1996).

Brucellosis is transmitted to man by direct contact with blood, placentas, foetuses or vaginal secretions of infected animals and through consumption of products of animal origin, mainly raw milk, cheese or yoghurt. The disease may show variable symptoms in humans with a tendency for recurrence, even though many times the infection is asymptomatic (Saegerman et al., 2010; Sarguna et al., 2002). The incubation period varies between one and four weeks, in some cases even longer. The disease can develop sub-clinically, acutely or as a lasting condition with variable progress (Díaz et al., 2001).

Despite brucellosis being declared a communicable disease in Ecuador until 2007, the true incidence of human cases remains largely unknown. According to the Ministry of Health (MSP), only 111 human cases were reported between 1990 and 2007 whereas, the National Institute for Statistics and Census (INEC) registered 152 persons hospitalized because of brucellosis between 1995 and 2007.

The most reliable diagnosis in humans consists in detecting the presence of the bacteria by bacteriological examination. However, the high cost and the risk for human contamination during in vitro cultures prevents this method from becoming the standard diagnostic tool. Therefore, common immunological assays such as the Rose Bengal fast agglutination test (RBT), Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA (SAT-EDTA) and indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (iELISA) based on the detection of 138

antibodies against Brucella spp. have mostly been used in combination for an early diagnosis of the disease. Since each diagnostic assay has its characteristic sensitivity (Se) and specificity (Sp), which varies according to its detectable immunoglobulin isotype, the results of the multiple tests have usually been assumed to follow a multinomial distribution and a Bayesian approach used to simultaneously estimate the true prevalence and diagnostic Se and Sp (Berkvens et al., 2006; Branscum et al., 2005; Dendukuri & Joseph, 2001).

An important consideration in the evaluation of multiple diagnostic tests is whether or not the tests can be assumed conditionally independent of each other given the true disease status. It has been demonstrated that the assumption of conditional independence may lead to biased estimates for test characteristics if in fact the tests are conditionally dependent (Vacek, 1985). Since RBT, SAT-EDTA and iELISA are based on sera and considered to be conditionally dependent on each other, any estimation procedure should adjust for the dependencies among the tests (Branscum et al., 2005; Dendukuri & Joseph, 2001).

The aim of the present study was to estimate the true prevalence of human brucellosis together with diagnostic Se and Sp of RBT, SAT-EDTA and iELISA applied to humans in the north-western part of Ecuador using a Bayesian approach. In addition, the causal agent responsible for human brucellosis in this region will be identified.

METHODS Ethical considerations The protocol was thoroughly reviewed and approved for ethics by the Bioethics Committee of the Biomedical Center, Central University of Ecuador. Prior to being included in the study, all participants provided informed written consent. For minors, parents/guardians provided written consent on their behalf.

Description of the study and the study region Between 2006 and 2008 a transect study was conducted, based on blood sampling of people from NW Ecuador together with an epidemiological survey of brucellosis. After informed consent, blood samples were taken from persons inhabiting the high-altitude 139

or Sierra provinces such as Carchi, eastern Imbabura and eastern Pichincha and the coastal provinces such as Esmeraldas, Manabí, western Imbabura and western Pichincha. Selection of the zones was based on their high prevalence of bovine brucellosis i.e. between 4.0% and 10.62% in the Sierra and between 5.88% and 10.62% in the Coast(Torres, 2008) and the occurrence of 41.30% (19 of 46) of the human cases, as reported by MSP between 1997 and 2007 and 51.97% (79 of 152) of the hospitalized brucellosis patients, as reported by INEC in 2008. A map of the study zone is shown on Figure 1.

Figure 1. Location of the study area

Samples A total of 3,733 blood samples were collected from people with occupational hazards. Individuals were divided into two groups: a group of people under high risk for brucellosis infections such as labourers at cattle farms, slaughterhouse workers, meat and organ traders, cattle traders, veterinarians, zoo workers, teachers and students from

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a faculty of animal production and farm and slaughterhouse managers, and a group of people under relatively low risks for brucellosis infections such as agricultural labourers, informal traders, public servants, school and college teachers, students, house workers and transporters.

Diagnostic assays Three serological assays to detect antibodies against Brucella spp. were used: Rose Bengal fast agglutination test (RBT), Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA (SAT-EDTA) and indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (iELISA) (Godfroid & Boelaert, 1995). The protocols are available in Appendix A. Samples were processed and analysed in the laboratory for immunodiagnosis at the International Centre for Zoonoses (CIZ) of the Central University of Ecuador.

Isolation and typing of Brucella spp. The isolation of the causal agent was based on blood cultures - BACTEC (3 repetitions with 30 minutes-intervals) from persons with high serotitres. Blood cultures were done at the “Hospital Vozandes Quito”. Isolated Brucella were typified in CIZ and the Veterinary and Agrochemical Research Centre (VAR-CERVA) by (1) macroscopic and microscopic observation of the colonies in cultures, (2) biochemical assays (oxydase, catalase and urease), (3) production of H2S, (4) CO2 growth requirement, (5) growth in stained media (thionine, basic fuchsin, safranin), (6) agglutination with mono-specific sera A and M and (7) performance of PCR – AMOS (Bricker & Halling, 1994).

Statistical analysis Model building and diagnostics Using the crossed classified test results for the three tests, it was assumed that the resulting cell frequencies/counts followed a multinomial distribution. Using the models developed by Branscum et al. (2005) and Berkvens et al. (2006), the corresponding multinomial cell frequencies were expressed in terms of the true prevalence of human brucellosis in the population, the Se and Sp of RBT, SAT-EDT and iELISA and additional terms to account for the conditional dependence between each pair of tests (Appendix B). In this scenario, including all parameters and possible interactions between the three individual tests requires fifteen parameters to be estimated namely; 141

the prevalence, the sensitivity and specificity of the first test, two conditional Se and two conditional Sp for the second test, and finally four conditional Se and four conditional Sp for the third test. This model is in fact inestimable since the data only allows seven parameters to be estimated. As none of the three tests is considered a gold standard test and the tests are not conditionally independent, constraints have to be imposed on a subset of the parameters in order to reduce the number of parameters to be estimated (Berkvens et al., 2006).

By combining the results of the applied assays (RBT, SAT-EDTA and iELISA), the prevalence of this zoonosis among humans in the north-western part of Ecuador was estimated together with the sensitivity and the specificity of each of the tests. To evaluate the goodness of fit of the models, the Bayesian p-value, Deviance Information Criterion (DIC) (Spiegelhalter et al., 2002) and the number of effectively estimated parameters (pD) (Berkvens et al., 2006) were used as calibrating parameters. Briefly, the DIC ensures that the most parsimonious model is used. It is calculated as DIC = pD + D with D the mean posterior deviance and pD the number of parameters effectively estimated by the model. Models with a smaller DIC should be preferred over models with larger DIC. The Bayesian p-value is a posterior predictive check that detects lack- of-fit of the model to the data. It is based on the difference between the deviance of the observations and the deviance of observations generated randomly from the currently fitted model and should have a value around 0.50. The values of pD and DIC evaluated based on the posterior means of the multinomial probabilities and those based on the posterior means of the parameters should be as close as possible (Berkvens et al., 2006).

Modeling conditional dependence Using the model that assumes conditional independence (CID) among the three tests given the true disease status of individuals as the baseline model, conditional dependence (CD) between each pair of tests was estimated using different parameterizations of the model that assumed CD between tests (Berkvens et al., 2006; Branscum et al., 2005; Nérette et al., 2008). Essentially, in the first parameterization, the CD between iELISA and RBT was modeled and the data used was based on crossed classified test results with iELISA on the first column, RBT on the second column and SAT-EDTA on the third column (Table 1). 142

Table 1: Cross-classified test results for human brucellosis in cattle in the North western part of Ecuador based on RBT, SAT-EDTA and iELISA RBT SAT-EDTA iELISA Number 0 0 0 3,663 0 0 1 7 0 1 0 0 0 1 1 2 1 0 0 11 1 0 1 31 1 1 0 1 1 1 1 18 Total 3,733 Legend: RBT: Rose Bengal test; SAT-EDTA: Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA; iELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay 1=Positive and 0=Negative.

The remaining two parameterizations involving CD between two tests were obtained by switching columns for iELISA with RBT and SAT-EDTA in turn. In addition, three models were constructed with CD between the pairs: iELISA/RBT and iELISA/SAT- EDTA, iELISA/RBT and RBT/SAT-EDTA and between iELISA/SAT-EDTA and RBT/SAT-EDTA respectively (Nérette et al., 2008). Finally a model with CD among all the three tests was considered (all pairs inclusive) separately among infected and non- infected individuals and combined.

The models can be summarized as follows:  Model 1: CID  Model 2: CD between RBT and SAT-EDTA  Model 3: CD between iELISA and RBT  Model 4: CD between iELISA and SAT-EDTA  Model 5: CD between iELISA and SAT-EDTA and between RBT and SAT- EDTA  Model 6: CD between iELISA and RBT and between iELISA and SAT-EDTA  Model 7: CD between iELISA and SAT-EDTA and between RBT and SAT- EDTA  Model 8: CD among all tests for infected subjects i.e. between iELISA and SAT-EDTA, between iELISA and RBT, and between RBT and SAT-EDTA  Model 9: CD among all tests for non-infected subjects i.e. between iELISA and SAT-EDTA, between iELISA and RBT, and between RBT and SAT-EDTA

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 Model 10: CD among all tests i.e. between iELISA and SAT-EDTA, between iELISA and RBT, and between RBT and SAT-EDTA.

Representing the CD between pairs of tests among infected animals by a and among the non-infected population by b , posterior estimates were obtained along with their 95% Credibility intervals (Cr. I.). If the Cr. I. includes zero, it will imply that the data does not provide enough evidence against the null hypothesis of CID whereas if the interval excludes zero, the CID assumption between the two tests will be rejected in favor of the alternative hypothesis of CD. All models were compared using the DIC. To be considered significantly different, the reduction in DIC between any two models should be more than three units. In situations where the difference in DIC was smaller than three units, the models were assumed to be similar and selection was based on parsimony (Spiegelhalter et al., 2002).

Prior distributions for parameters In Ecuador, the prevaleance, sensitivities and specificities of the three tests used are not known. Priors were therefore introdudced based on similar studies among humans in different countries found in the literature. The average prevalence of brucellosis among humans ranged between 0 and 0.2 (Araj & Azzam, 1996; Kadri et al., 2000), sensitivity and specificity ranged between 0.88 and 1 and between 0.93 and 1, respectively for iELISA, 0.49 and 1 and between 0.97 and 1 for SAT-EDTA, respectively and lastly 0.9 and 1 and 0.95 and 1, respectively for RBT (Gómez et al., 2008; Memish et al., 2002; Orduña et al., 2000; Rahman et al., 2012). The lower and upper limits of these ranges were used to define Uniform distributions for the parameters.

Prior information on the eight covariance parameters (four for infected and four for the non-infected individuals) were not available so their ranges were generated based on priors for the sensitivities and specificities for the three tests (See Appendix B). Uniform prior distributions were then assumed based on the ranges (Branscum et al., 2005).

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Model diagnostics All models were run using three chains, a burn-in period of 10,000 iterations and another 20,000 iterations (with thinning applied) to obtain the posterior estimates. Trace plots were simultaneously combined with autocorrelation plots to explore the convergence of the model. A more formal test for convergence, the Brooks, Gelman and Rubin convergence statistic was used to assess model convergence and only properly converged models were further considered (Gelman & Rubin, 1992). The WinBugs code used is found in Appendix B.

Sensitivity analyses Several studies have indicated that for the CD model, the prior information influences the posterior estimates (Branscum et al., 2005; Haley et al., 2011; Praud et al., 2012). The influence of prior information on the posterior estimates was assessed by conducting a sensitivity analysis. This was done by using non-informative priors and slight perturbations (in steps of 10 or 15%) of the prior intervals (Haley et al., 2011).

The following sets of priors were considered:  Non-informative prior (NIP) for the prevalence and information priors (IP) for the Ses and Sps  NIP for the prevalence and for the Ses and IPs for the Sps  NIP for the prevalence and for the Sps and IPs for the Ses  IP for the prevalence and NIP s for the Ses and Sps  IP for the prevalence and for the Ses and NIPs for the Sps  IP for the prevalence and for the Sps and NIPs the Ses  Perturbations of the prior interval.

For each set of alternative prior distributions considered for the parameters, the model was run with the same number of chains and similar diagnostics were preformed. It is also known that inferences based on multinomial data with zero cell frequencies may lead to slow convergence or non-convergence and hence inaccurate results especially when the total sample size is small (Enøe et al., 2000). Since there are no immediate

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corrections or exact methods, the effects of zero-multinomial frequencies on the estimates were evaluated by replacing each zero frequency with a one.

RESULTS Apparent prevalence and correlation analysis The cross classified test results of the three serological tests on the 3,733 samples are shown on Table 1. The apparent prevalence was 0.56% (95% CI: 0.35-0.85) based on SAT-EDTA, 1.63% (95% CI: 1.25-2.09) based on RBT and 1.55% (95% CI: 1.18-2.00) based on iELISA. The prevalence of brucellosis based on the three tests was 1.88% (1.46-2.36) following a parallel interpretation. The prevalence based on RBT was observed to be similar to that obtained based on iELISA. A correlation analysis (Figure 2) yielded a high similarity index of 0.7 between the results obtained based on RBT (Test 1) and iELISA (Test 3). In addition, between RBT (Test 1) and SAT-EDTA (Test 2 and between SAT-EDTA (Test 2) and iELISA (Test 3), the similarity indices appeared to be lower (0.54 and 0.55 respectively).

Figure 2: Similarity analysis of the results of RB, SAT-EDTA and iELISA, for the detection of Brucella spp.

Legend: 1: Rose Bengal test (RB); 2: Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA (SAT-EDTA); 3: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (iELISA). Model selection 146

The estimated DIC, pD and Bayesian p-values for the different models are presented in Table 2. A remarkable observation from the models was the closeness of the Bayesian p-values to 0.5 (values ranged between 0.4817 and 0.5636) indicating that all the models we tested provided acceptable fit to the data. All the DIC values were fairly close to each other with differences smaller than three. Using the conditional independence model as the baseline model (DIC=34.230), the only other model that yielded a slightly higher reduction in DIC compared to the baseline model was Model 9 (DIC=31.955); the model with conditional dependence among the three tests (Table 2). Due to the borderline-significance of the difference in DIC (difference=2.3), the selection of the most appropriate model was based on parsimony and completeness (the fewer the number estimated parameters the better). Model 9 appeared to be more parsimonious since its pD, 4.376 is slightly lower than that of model 10 (pD=4.597) (Table 3). The final model was therefore based on the model with conditional dependence among the three tests for non-infected individuals (Model 9).

True prevalence, accuracy and conditional dependence The posterior mean estimates of the prevalence, the Se, Sp and the dependency coefficients for the three tests among non-infected subjects are shown on Table 3. According to the results, the true prevalence of brucellosis among humans was 1.0 % (95% Credibility Interval: 0.40-1.60). The performances of iELISA and RBT were very similar with estimated Ses and Sps of 95.1% (88.7-99.8), 95.0% (90.3-99.7) and 99.3% (98.7-99.8), 99.2% (98.6-99.7), respectively. SAT-EDTA had the lowest sensitivity of 60.8 % (40.7-96.6) and the highest specificity of 99.9% (99.8-1).

The 95% probability intervals for the conditional dependency coefficients among the three tests for the non-infected humans excluded zero implying that the hypothesis of conditional independence among the three tests is rejected in favour of the alternative hypothesis of conditional dependence. The highest conditional dependence coefficient was observed between the specificities of iELISA and RBT (0.005) whereas a lower conditional dependence was observed between iELISA and SAT-EDTA and between SAT-EDTA and RBT (0.0004) (Table 3).

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Table 2: Deviance information criterion (DIC), number of estimated parameters (pD) and Bayesian p-values for the model assuming conditional independence, models assuming condition dependence between each of two tests, models including pairs of conditional dependence and a model with condition dependence between all the three tests Type of model DIC pD Bayesian p-value Model 1: conditional independence model 34.230 3.822 0.5357 Model 2: conditional dependence between RBT and SAT-EDTA 34.666 4.359 0.5354 Model 3: conditional dependence between iELISA and RBT 34.610 4.888 0.4887 Model 4: conditional dependence between iELISA and SAT-EDTA 34.472 4.259 0.5357 Model 5: conditional dependence: between iELISA and RBT and between SAT-EDTA and RBT 34.480 4.513 0.5021 Model 6: conditional dependence: between iELISA and RBT and between iELISA and SAT-EDTA 34.437 4.690 0.4817 Model 7: conditional dependence: between iELISA and SAT-EDTA and between RBT and SAT-EDTA 32.664 4.226 0.5636 Model 8: conditional dependence: between iELISA and SAT-EDTA and between RBT and SAT-EDTA among infected subjects 35.563 4.525 0.5515 Model 9: conditional dependence: between iELISA and SAT-EDTA and between RBT and SAT-EDTA among non-infected 31.955 4.376 0.4865 subjects Model 10: conditional dependence: between iELISA, SAT-EDTA and between iELISA and RBT and between RBT and SAT- 32.007 4.597 0.5059 EDTA among all subjects Legend: DIC: Deviance information criterion; pD: number of estimated parameters.

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Table 3: Posterior mean estimates and 95% Credibility Intervals of the Prevalence, Sensitivities (Se) and Specificities (Sp) of iELISA, SAT-EDTA and RBT and conditional dependence coefficients between the three tests

Test Parameter Posterior mean (Cr. I.)

RBT Se 0.950 [0.903-0.997]

Sp 0.992 [0.986-0.997]

SAT-EDTA Se 0.608 [0.407-0.966]

Sp 0.999 [0.998-1] iELISA Se 0.951 [0.887-0.998]

Sp 0.993 [0.987-0.998]

Prevalence 0.010 [0.004-0.016] iELISA and SAT-EDTA Conditional dependence 0.0004 [0.00001-0.00156] iELISA and RBT Conditional dependence 0.0046 [0.00022-0.00956]

RBT and SAT-EDTA Conditional dependence 0.0004 [0.00001-0.00147]

DIC 31.916

pD 4.372

Bayesp 0.4817

Legend: RBT: Rose Bengal test; SAT-EDTA: Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA; iELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Cr.I.: Credibility Intervals; Se: Sensitivities; Sp: Specificities; DIC: Deviance information criterion; pD: number of estimated parameters; Bayesp: Bayesian p-values.

Sensitivity analysis When a NIP was used for the prevalence and IPs used for the Ses and Sps, or IPs used for the Sps and NIPs used for the Sps, the results were quite similar. On the other hand, when NIPs were used for the prevalence and the Ses and IPs were used for the Sps, there were slight but non-significant differences in the estimated prevalence and Ses. Similarly, when using an IP for the prevalence and NIPs for the Ses and Sps, or IPs used for the Sps and NIPs were used for the Ses, there were slight but non-significant differences (Cr. Is overlap) in the estimated prevalence and Ses. The results were quite similar when IPs was used for the prevalence and the Ses and NIPs were used for the Sps.

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Decreasing the lower limits of all the prior intervals by 10% had no influence on the estimated parameter values and their 95% Cr. I. However, when both the lower and upper limits of the prior interval were decreased by 10%, the model did not converge (pD=2.57 and DIC=688.54). In addition, the Bayesian p-value was 1 indicating a considerable lack of fit of the data to the model.

Finally, replacing the zero observed frequencies with 1 and running all the different models, none of the models appeared to be doing better than the conditional independence model. However, the model with conditional dependence between the specificities yielded a DIC that was closest to that of the conditional independence model (data not shown). Based on this model, the estimated prevalence, Ses, Sps, and dependence coefficients were quite similar (Cr. Is overlap, data not shown).

Typifying of circulating Brucella spp. in North-West Ecuador From three positive cases, Brucella abortus biotype 4 was isolated. Blood cultures were only positive for patients with higher levels of IgM antibodies (SAT-EDTA). Detailed information about these persons with positive blood cultures (n=22) is given in Table 4 with the characteristics of the isolations, bacteriological data and PCR in Table 5 and Figure 3 respectively. Retrospectively, positive persons were queried about possible symptoms related to brucellosis and results are presented in Table 6.

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Table 4: Results of blood cultures from patients with high serological titres concomitant with brucellosis presumptive clinical symptoms (North-West Ecuador) SAT- iELISA Blood Nº ID Sample code Age Sex Occupation RB EDTA (U/ml) culture (UI/ml) 1 93 SHB-Ma-93 28 M Farmer + - 60 - 2 104 SHB-Ma-104 22 M Farmer + 100 60 - 3 146 SHB-Ma-146 17 M Student + 80 60 - 4 187 SHB-Ma-187 49 F Farmer - 80 - - 5 198 SHB-Ma-198 28 M Farmer - - 30 - 6 325 SHB-Ma-325 49 F Farmer + 100 60 - 7 344 SHB-Ma-344 50 M Farmer - 50 - - 8 372 SHB-Ma-372 39 M Farmer + 100 60 - 9 820 SHB-IA-1 41 M Veterinary + 80 60 - lecturer 10 821 SHB-IA-2 26 M Farmer + 100 60 - 11 822 SHB-IA-3 39 M Farmer + 100 60 - 12 825 SHB-IA-6 41 M Farmer - 100 60 - 13 2202 SHB-Cam-Nor-5 39 F Slaughter- + 50 60 - house worker 14 2330 SHB-Cam-Nor-133 42 M Slaughter- + 40 60 - house worker 15 2331 SHB-Cam-Nor-134 55 M Transporter + - 50 - 16 2343 SHB-Cam-Nor-146 50 F Slaughter- + - 48.6 - house worker 17 2348 SHB-Cam-Nor-151 66 F Slaughter- + 60 60 - house worker 18 2349 SHB-Cam-Nor-152 36 F Slaughter- + 320 14.4 + house worker 19 2353 SHB-Cam-Nor-156 35 M Slaughter- + 100 26.2 - house worker 20 2356 SHB-Ay-10 27 M Veterinary + 1,600 60 + student 21 3144 SHB-Zon-Nor-370 58 M Farmer + 800 60 + 22 3409 SHB-Zon-Nor-635 21 M Farmer + 960 60 - Legend: ID: Identification number; RBT: Rose Bengal test; SAT-EDTA: Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA; iELISA: indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay.

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Table 5: In vitro characteristics of the isolations Agglutination Growth on colorants with serum Sample code Sample code Urease H S CO for growth 2 Basic serology bacteriology* activity 2 production Thionine Thionine Safranin fuchsin 20 A M 20 µg 10 µg 100 µg µg SHB-Cam-Nor-152 Ec-CIZ-Hum1 + + + - - + + - + SHB-Ay-10 Ec-CIZ-Hum2 + + + - - - - - + SHB-Zon-Nor-370 Ec-CIZ-Hum3 + + + + - + + - + B2** + + + - - - - + - B9*** + - + + + + + - + Legend: *: blood culture; **: control Brucella abortus biotype 2; *** : control Brucella abortus biotype 9.

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Table 6: Human brucellosis: symptoms and frequency. Symptoms Positive cases Percentage Muscular pain 29 41.43 Joint pain 25 35.71 Fever 17 24.29 Debility 17 24.29 Headache 16 22.86 Nocturnal 13 18.57 sweating Cardiac problems 10 14.29 Anorexia 4 5.71 Insomnia 4 5.71 No symptoms 17 24.29

Figure 3: PCR – AMOS of Brucella from blood cultures, isolated from positive persons

Legend: MP: Molecular weight marker; B2: control Brucella abortus biotype 2; H1: Human sample 1 (Ec-CIZ-Hum-1); H2: Human sample 2 (Ec-CIZ-Hum-2); *: Samples from complementary studies at CIZ; CB: Blank control.

DISCUSSION Given that the main objective of an epidemiological survey on human brucellosis should include the identification of brucellosis cases together with the determination of the source of infection, i.e. occupational or alimentary (Robinson, 2003), the current study aimed to provide a reliable estimate of the prevalence based on the detection of antibodies against Brucella spp., and the isolation and identification of the causal agent among humans in the north-western part of Ecuador.

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The estimation of the true prevalence and diagnostic test characteristics was done using a Bayesian approach in the absence of a standard reference test and with no knowledge about the true disease status of individuals. The method allowed for the incorporation of prior knowledge about prevalence of human brucellosis, test sensitivities and specificities based on previous studies or expert opinions and also the estimation of the dependence between the three tests conditional on the true disease status. Different models were constructed based on different combinations of the dependencies between the tests. Using appropriate model diagnostic tools such as the DIC, pD and Bayesian p- values, it was demonstrated that the models incorporating the different covariance structures did not perform significantly better that the conditional independence model. However, the model with conditional dependence among non-infected individuals was chosen for completeness.

In the current study an overall seroprevalence of 1.88% (C.I. 1.48 - 2.38) (70 of 3,733) was found in the entire study region, which is in sharp contrast with the official data of the Ecuadorian Ministry of Health (MSP) i.e. only 67 cases between 2003 and 2007. The true prevalence was however estimated to be 1% (Cr. I: 0.4-1.6). The results of the present investigation, of previous studies and the observations described by Ron-Román et al. (2014), indicate a serious underreporting of human brucellosis in Ecuador and a rather high seroprevalence of this zoonosis. In several American countries, human brucellosis does not seem to be very important yet the reported figures may not reflect the real situation. The difficulties related to the diagnosis and the often ambiguous or even absent clinical symptoms are probably the principal reasons for the sub- notification (Robinson, 2003; Alvarez & García, 2000). The highly variable clinical reactions due to brucellosis, contributing to the difficulties in recognising the disease, (Saegerman et al., 2010; Sarguna et al., 2002), were also noted in the present study and underline the need for reliable diagnostic tests (Young, 1997).

The reasonable similarity between the results of RBT and iELISA may be due to the fact that both assays detect IgG and to their similar estimated sensitivity levels. The lower correlation found between RBT and SAT-EDTA and between SAT-EDTA and iELISA may be due to the lower estimated sensitivity of SAT-EDTA plus its ability to rather detect IgM.

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The use of the Bayesian approach is incomplete without an assessment of variations in the prior information and the data on the estimated parameters using a sensitivity analysis (Caraguel et al., 2012; Enøe et al., 2000; Haley et al., 2011). Sensitivity analyses indicated that the use of diffused priors had no significant influence on the estimated prevalence and test sensitivities and specificities. It was also found that replacing the zero frequencies with 1’s yielded estimates that were similar to those based on the original data. This in turn suggests that the results of our study were dominated by the data as compared to the prior information and thus are reliable.

The causal agent, i.e Brucella abortus biotype 4, was isolated and characterized in patients with high level of antibodies. Biotyping Brucella is important for the epidemiological knowledge, since it can reveal geographical characteristics and allow a better understanding of the spread of the disease (Roux, 1979). Unfortunately isolating and typing of Brucella spp. is not always possible since it requires high biosecurity laboratories and trained personnel. Furthermore, the low number of successful isolations in the present study is partly due to the localisation of the bacteria in specific tissues and organs like bone marrow, cerebrospinal fluid (CSF), liver, kidneys and spleen, which renders isolation from blood very unlikely (Doganay et al., 2003).

In the present study 24.29% of the persons with a positive sero-reaction showed no symptoms at all (Table 6). This is lower than the 45.6% reported by Pila-Pérez et al. (1997) and the 99% found in a retrospective study of the symptomatology by Hernández-Bastida and collaborators (1999). This absence of typical symptoms is obviously one of the reasons for underreporting and the lack of data about the disease (Saegerman et al., 2010).

The absence of a National Policy and differential diagnostic tests hinders the development of surveillance and control programmes in high-risk areas. It is thus difficult to have a realistic idea about incidence of the disease. In the past, little attention was given to brucellosis in Ecuador and it is necessary to develop programmes to control (and eventually eradicate) brucellosis in the identified risk areas whereby highly sensitive diagnostic methods will be used both for humans and for animals with the

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objective of obtaining an early warning system and to determine the correct prevalence at national level.

Livestock owners should take preventive measures to control brucellosis through an integrated programme to benefit their workforce. Such a programme should encompass education, routine medical and veterinary evaluation and should provide the means for adequate protection.

In view of the results of this study, there is an urgent need for information campaigns about the risks involved by direct contact with infected animals through blood, meat and excretions and equally about the preventive care as to avoid infection. For the protection of the health of slaughterhouse workers, managers should receive instructions on how to maintain minimum biosecurity levels, including providing protective equipment, this was evidenced by Ron-Román et al. (2012). Also, investigations to isolate and identify the biotypes of Brucella spp., endemic to Ecuador should be continued.

Ecuador cannot be considered an endemic country for human brucellosis based on reported data by Pappas et al. (2006) although the results of the present study, based on factual data, prove quite the opposite. Underreporting and the absence of an active epidemiological vigilance may be the main reason for underestimation in supposedly brucellosis free regions.

Finally, it is of utmost importance that evidence-based information be given to national and international donor organisations involved with future prevention, control and research programmes on brucellosis.

Ethical considerations: Prior to being included in the study, participants were asked for verbal and written consent.

Acknowledgements: We thank the patients for their willingness to participate in this study

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Financial support: This work was supported by the Belgian Cooperation in the framework or the Institutional Collaboration between the Institute of Tropical Medicine in Antwerp, Belgium and the International Centre for Zoonoses (CIZ) of Central University of Ecuador.

Disclaimer: The views expressed in this article are those of the authors and do not necessarily reflect the official policy or position of the Central University of Ecuador. Disclosure: None of the authors has financial or personal conflict of interest related to this study.

Author’s addresses: Jorge Ron-Román, Lenin Ron-Garrido, Maritza Celi-Erazo, Laura Vizcaíno-Ordóñez, Jaime Calva-Pacheco, Pablo González-Andrade, Washington Benítez-Ortíz1, International Center for Zoonoses, Central University of Ecuador, Ciudadela Universitaria, P.O.Box 17-03-100, Quito, Ecuador, E-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]; Jorge Ron-Román, Carra de Ingeniería Agropecuaria, Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Av. General Rumiñahui s/n. Sangolquí, Ecuador. P.O.BOX: 171-5-231. + 593 02.398.9400; [email protected]; Emmanuel Abatih, Dirk Berkvens, Jef Brandt, Department of Biomedical Sciences, Institute of Tropical Medicine, Nationalestraat 155, Antwerpen, Belgium; [email protected], [email protected], [email protected]; David Fretin, Departement of Bacteriology and Immunology, Veterinary and Agrochemical Reserch Centre, Goeselenberg 99, B-1180 Brussels, Belgium, [email protected]; Claude Saegerman, Research Unit of Epidemiology and Risk analysis applied to Veterinary Sciences (UREAR), Department of Infections and Parasitic Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege. Boulevard de Colonster, 20, B43b, B-4000 Liège, Belgium, E-mail: [email protected].

Reprint requests: Jorge Ron-Román, International Center for Zoonoses, Central University of Ecuador. P.O.Box 17-03-100, Quito-Ecuador. Telefax. +59322904801 E-mail: [email protected]

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REFERENCES Araj, G. F., & Azzam, R. A. (1996). Seroprevalence of brucella antibodies among persons in high-risk occupation in Lebanon. Epidemiology and Infection, 117(2), 281–288. http://doi.org/10.1017/S095026880000145X Berkvens, D., Speybroeck, N., Praet, N., Adel, A., & Lesaffre, E. (2006). Estimating Disease Prevalence in a Bayesian Framework Using Probabilistic Constraints. Epidemiology, 17(2), 145–153 10.1097/01.ede.0000198422.64801.8d. http://doi.org/10.1097/01.ede.0000198422.64801.8d Bowden, R. (1996). Temas de Microbiología Veterinaria. In Stanchi, B. Brihuega, P. Martino, E. Gentilini, & E. Reinoso (Eds.), Sur (Primera, pp. 159–175). Buenos Aires Argentina. Branscum, A., Gardner, I., Wagner, B., McInturff, P., & Salman, M. (2005). Effect of diagnostic testing error on intracluster correlation coefficient estimation. Preventive Veterinary Medicine, 69(1), 63–75. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2005.01.015 Bricker, B. J., & Halling, S. M. (1994). Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 32(11), 2660–6. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7852552 Caraguel, C., Stryhn, H., Gagné, N., Dohoo, I., & Hammell, L. (2012). Use of a third class in latent class modelling for the diagnostic evaluation of five infectious salmon anaemia virus detection tests. Preventive Veterinary Medicine, 104(1), 165–173. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2011.10.006 Corbel, M. J. (2006). Brucellosis in humans and animals. Geneva Switzerland: World Health Organization. Dendukuri, N., & Joseph, L. (2001). Bayesian Approaches to Modeling the Conditional Dependence Between Multiple Diagnostic Tests. Biometrics, 57(1), 158–167. http://doi.org/10.1111/j.0006-341X.2001.00158.x Díaz, R., Leiva, J., Rubio, M., & Dorronsoro, L. (2001). Diagnóstico de la brucelosis humana. In E. Díaz, L. Hernández, G. Valero, & B. Arellano (Eds.), Diagnóstico de brucelosis animal (pp. 198–212). México: INIFAP. Doganay, M., Aygen, B., Corbel, M. J., Roux, J., Shapiro, D. S., Wong, J. D., … al., et. (2003). Human brucellosis: an overview. International Journal of Infectious

158

Diseases, 7(3), 173–182. http://doi.org/10.1016/S1201-9712(03)90049-X Enøe, C., Georgiadis, M. P., & Johnson, W. O. (2000). Estimation of sensitivity and specificity of diagnostic tests and disease prevalence when the true disease state is unknown. Preventive Veterinary Medicine, 45(1), 61–81. http://doi.org/10.1016/S0167-5877(00)00117-3 Gelman, A., & Rubin, D. B. (1992). Inference from Iterative Simulation Using Multiple Sequences. Statistical Science, 7(4), 457–472. http://doi.org/10.1214/ss/1177011136 Godfroid, J., & Boelaert, F. (1995). Prescriptions pour le diagnostic sérologique de la brucellose. Belgium: CODA-CERVA (Ed.), 47. Gómez, M. C., Nieto, J. A., Rosa, C., Geijo, P., Escribano, M. A., Muñoz, A., & López, C. (2008). Evaluation of seven tests for diagnosis of human brucellosis in an area where the disease is endemic. Clinical and Vaccine Immunology : CVI, 15(6), 1031–3. http://doi.org/10.1128/CVI.00424-07 Haley, C., Wagner, B., Puvanendiran, S., Abrahante, J., & Murtaugh, M. P. (2011). Diagnostic performance measures of ELISA and quantitative PCR tests for porcine circovirus type 2 exposure using Bayesian latent class analysis. Preventive Veterinary Medicine, 101(1), 79–88. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2011.05.001 Hernández-Bastida, A., García-Ramírez, P., Cruz-Estrada, A., & Rojo, J. (1999). Seroprevalencia de brucelosis en disponentes de sangre del Hospital General de México. Revista Médica Del Hospital General de México, 62(2), 107–112. Kadri, S. M., Rukhsana, A., Laharwal, M. A., & Tanvir, M. (2000). Seroprevalence of brucellosis in Kashmir (India) among patients with pyrexia of unknown origin. Journal of the Indian Medical Association, 98(4), 170–1. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11016178 Memish, Z. A., Almuneef, M., Mah, M. W., Qassem, L. A., & Osoba, A. O. (2002). Comparison of the Brucella Standard Agglutination Test with the ELISA IgG and IgM in patients with Brucella bacteremia. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 44(2), 129–132. http://doi.org/10.1016/S0732-8893(02)00426-1 Nérette, P., Stryhn, H., Dohoo, I., & Hammell, L. (2008). Using pseudogold standards and latent-class analysis in combination to evaluate the accuracy of three diagnostic tests. Preventive Veterinary Medicine, 85(3), 207–225.

159

http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2008.01.011 Orduña, A., Almaraz, A., Prado, A., Gutierrez, M. P., Garcia-Pascual, A., Dueñas, A., … Torres, A. R. (2000). Evaluation of an immunocapture-agglutination test (Brucellacapt) for serodiagnosis of human brucellosis. Journal of Clinical Microbiology, 38(11), 4000–5. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11060059 Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., & Tsianos, E. V. (2006). The new global map of human brucellosis. The Lancet Infectious Diseases, 6(2), 91– 99. http://doi.org/10.1016/S1473-3099(06)70382-6 Pila-Pérez, R., Pila-Peláez, R., Paulino-Basulto, M., Hernández-Pupo, O., Gacía-Peña, J. G., & del Sol-Torres, G. (1997). Estudio clínico de la brucelosis humana. Rev Med Urug, 110–117. Praud, A., Gimenez, O., Zanella, G., Dufour, B., Pozzi, N., Antras, V., … Garin- Bastuji, B. (2012). Estimation of sensitivity and specificity of five serological tests for the diagnosis of porcine brucellosis. Preventive Veterinary Medicine, 104(1), 94–100. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2011.10.014 Rahman, A. K. M. A., Dirk, B., Fretin, D., Saegerman, C., Ahmed, M. U., Muhammad, N., … Abatih, E. (2012). Seroprevalence and Risk Factors for Brucellosis in a High-Risk Group of Individuals in Bangladesh. http://dx.doi.org/10.1089/fpd.2011.1029. Robinson, A. (2003). Guidelines for coordinated human and animal brucellosis surveillance. Rome, Italy: FAO. Ron-Román, J., Saegerman, C., Minda-Aluisa, E., Benítez-Ortíz, W., Brandt, J., & Douce, R. (2012). First report of orchitis in man caused by Brucella abortus biovar 1 in Ecuador. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 87(3), 524–8. http://doi.org/10.4269/ajtmh.2012.11-0341 Roux, J. (1979). [Epidemiology and prevention of brucellosis]. Bulletin of the World Health Organization, 57(2), 179–94. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/312154 Saegerman, C., Berkvens, D., Godfroid, J., & Walravens, K. (2010). Bovine brucellosis. In P. Lefèvre, J. Blancou, R. Chermette, & G. Uilenberg (Eds.), Infectious and parasitic disease of livestock (pp. 991–1021). France: Lovoisier. Sarguna, P., Bilolikar, A. K., Rao, A., & Mathur, D. R. (2002). Brucellosis in

160

association with HIV infection- a case report. Indian Journal of Medical Microbiology, 20(4), 221–2. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17657076 Serra Alvarez, J., & Godoy García, P. (2000). [Incidence, etiology and epidemiology of brucellosis in a rural area of the province of Lleida]. Revista Española de Salud Pública, 74(1), 45–53. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10832390 Spiegelhalter, D. J., Best, N. G., Carlin, B. P., & van der Linde, A. (2002). Bayesian measures of model complexity and fit. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology), 64(4), 583–639. http://doi.org/10.1111/1467- 9868.00353 Torres, H. (2008). Control de Brucelosis Bovina—Programa Nacional. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura Y Pesca (MAGAP), Servicio Ecuatoriano de Saniadad Agropecuaria (SESA). Quito, Ecuador, 30. Vacek, P. M. (1985). The effect of conditional dependence on the evaluation of diagnostic tests. Biometrics, 41(4), 959–68. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3830260 Young, E. J. (1997). Especies de brucella. In G. Mandell, J. Bennett, & R. Dolin (Eds.), Enfermedades Infecciosas, Principio y Practica (Cuarta, pp. 2300–2320). Buenos Aires Argentina: Editorial Medica Paramericana SA.

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Appendix A. Protocols for serological assays

Rose Bengal fast agglutination test (RBT) The RB assay was used with Bengatest® antigen i.e. a concentrated suspension (4% v/v) of B. abortus Weybridge strain 19, heat and phenol (0.5%) inactivated, suspended in an acid buffer and stained with Rose Bengal. Equal quantities (30 µl) of serum and antigen were mixed in a well (4 min) on a glass plate and any degree of agglutination was considered a positive reaction.

Wright’s Slow Agglutination Test with EDTA (SAT-EDTA) For SAT-EDTA, the antigen (Antigen SAW®, Synbiotics code # ASAW) was a concentrated suspension of B. abortus (strain 1119/3), heat and phenol (0.5%) inactivated and suspended in a phenol-buffer at 0.5%. The assay was performed as described by Godfroid and Boelaert13 with serum dilutions of 1/12.5, 1/25, 1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, 1/6400, 1/12800 and 1/25600 in a constant volume (100 µl) of antigen. Quantitative results were given as International Units of Agglutination (IU/ml). A value equal to or above 100 IU/ml, corresponding to 75% transparency of dilution 1/50 was considered as a positive reaction.

Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (iELISA) The assay was performed according to Godfroid & Boelaert, (1995). Smooth B. abortus Weybridge strain 19 lipopolysaccharide (LPS) antigen was incubated on polystyrene plates for 3.5 h at 37°C and overnight at 4ºC. Plates were washed 5 times with a washing solution (NaCl 0.9% + Tween 20 at 0.01%). Then, 50 µl of 1/50 diluted serum in glycine-EDTA-Tween 80 buffer (BB) was added per well and the calibration curve was determined at dilutions 1/270, 1/540, 1/1080, 1/2160, 1/4320, 1/8640. After one hour incubation at ambient temperature, the solutions were discarded, plates were washed 5 times and 50 µl conjugate (Protein G-HRPO, Pirce CD47675, diluted at 1/1500 in G - HRPO + FCS at 2%) was added to each well and left to incubate at ambient temperature for 1 hour. The same washing procedure was repeated and 100 µl substrate solution (i.e. o-PD Ortho-phenylendiamine tablets, SIGMA P-8287, one tablet of 10 mg dissolved in 25 ml citrate phosphate buffer SIGMA P-4809 + 5 µl H2O2 at 30%) was added to each well.

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Plates were left to incubate for 20 min in the dark at ambient temperature. Subsequently the reaction was stopped by adding 25 µl H2SO4 (2M) to each well. Optical densities (OD) were read by a spectrophotometer (STAT FX 2100), with filters between 492nm and 630nm. Mean OD values of the samples and the calibration curve were corrected by subtracting the mean BB from the mean OD. A cut off value, above which a sample was considered positive, was set at or above 20 units. Calculation of the units was based on the reference values of the curve i.e. 1.87 U, 3.75 U, 7.5 U, 15 U, 30 U, and 60 U, for dilutions 1/270, 1/540, 1/1080, 1/2160, 1/4320, 1/8640 respectively.

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Appendix B. WinBUGS Code

#Model specification model { r[1:8] ~ dmulti(p[1:8], n) ## p[1] = p(111); p[8] = p(000); pr = true prevalence; a_ijk = sigma; b_ijk = sigma^prime p[1] <- pr*(se[1]*se[2]*se[3]) + (1-pr)*((1-sp[1])*(1-sp[2])*(1-sp[3])+(1-sp[1])*b23+(1-sp[2])*b13+(1- sp[3])*b12) p[2] <- pr*(se[1]*se[2]*(1-se[3])) + (1-pr)*((1-sp[1])*(1-sp[2])*sp[3]-(1-sp[1])*b23-(1- sp[2])*b13+sp[3]*b12) p[3] <- pr*(se[1]*(1-se[2])*se[3]) + (1-pr)*((1-sp[1])*sp[2]*(1-sp[3])-(1-sp[1])*b23+sp[2]*b13-(1- sp[3])*b12) p[4] <- pr*(se[1]*(1-se[2])*(1-se[3])) + (1-pr)*((1-sp[1])*sp[2]*sp[3]+(1-sp[1])*b23-sp[2]*b13- sp[3]*b12) p[5] <- pr*((1-se[1])*se[2]*se[3]) + (1-pr)*(sp[1]*(1-sp[2])*(1-sp[3])+sp[1]*b23-(1-sp[2])*b13-(1- sp[3])*b12) p[6] <- pr*((1-se[1])*se[2]*(1-se[3])) + (1-pr)*(sp[1]*(1-sp[2])*sp[3]-sp[1]*b23+(1-sp[2])*b13- sp[3]*b12) p[7] <- pr*((1-se[1])*(1-se[2])*se[3]) + (1-pr)*(sp[1]*sp[2]*(1-sp[3])-sp[1]*b23-sp[2]*b13+(1- sp[3])*b12) p[8] <- pr*((1-se[1])*(1-se[2])*(1-se[3])) + (1-pr)*(sp[1]*sp[2]*sp[3]+sp[1]*b23+sp[2]*b13+sp[3]*b12) #Prior specification pr ~ dunif(0,0.2) se[1] ~ dunif(0.88,1) se[2] ~ dunif(0.4,1) se[3] ~ dunif(0.9,1) sp[1] ~ dunif(0.93,1) sp[2] ~ dunif(0.99,1) sp[3] ~dunif(0.95,1) #Lower and upper limits for covariance parameters based on proposed priors ll1 <- max(-(1-se[1])*(1-se[2]), -se[1]*se[2]) 164

ul1 <- min(se[1]*(1-se[2]),(1-se[1])*se[2]) a12 ~ dunif(ll1,ul1) ll2 <- max(-(1-se[1])*(1-se[3]), -se[1]*se[3]) ul2 <- min(se[1]*(1-se[3]),(1-se[1])*se[3]) a13 ~ dunif(ll2,ul2) ll3 <- max(-(1-se[2])*(1-se[3]), -se[2]*se[3]) ul3 <- min(se[2]*(1-se[3]),(1-se[2])*se[3]) a23 ~ dunif(ll3,ul3) ll4 <- max(-(1-sp[1])*(1-sp[2]), -sp[1]*sp[2]) ul4 <- min(sp[1]*(1-sp[2]),(1-sp[1])*sp[2]) b12 ~ dunif(ll4,ul4) ll5 <- max(-(1-sp[1])*(1-sp[3]), -sp[1]*sp[3]) ul5 <- min(sp[1]*(1-sp[3]),(1-sp[1])*sp[3]) b13 ~ dunif(ll5,ul5) ll6 <- max(-(1-sp[2])*(1-sp[3]), -sp[2]*sp[3]) ul6 <- min(sp[2]*(1-sp[3]),(1-sp[2])*sp[3]) b23 ~ dunif(ll6,ul6) ll71 <- -(se[1]*se[2]*se[3]+se[1]*a23+se[2]*a13+se[3]*a12) ll72 <- -((1-se[1])*(1-se[2])*se[3]-(1-se[1])*a23-(1-se[2])*a13+se[3]*a12) ll73 <- -((1-se[1])*se[2]*(1-se[3])-(1-se[1])*a23+se[2]*a13-(1-se[3])*a12) ll74 <- -(se[1]*(1-se[2])*(1-se[3])+se[1]*a23-(1-se[2])*a13-(1-se[3])*a12) ll7 <- max(max(ll71, ll72), max(ll73, ll74)) ul71 <- (1-se[1])*se[2]*se[3]+(1-se[1])*a23-se[2]*a13-se[3]*a12 ul72 <- se[1]*(1-se[2])*se[3]-se[1]*a23+(1-se[2])*a13-se[3]*a12 ul73 <- se[1]*se[2]*(1-se[3])-se[1]*a23-se[2]*a13+(1-se[3])*a12 ul74 <- (1-se[1])*(1-se[2])*(1-se[3])+(1-se[1])*a23+(1-se[2])*a13+(1-se[3])*a12 ul7 <- min(min(ul71, ul72), min(ul73, ul74)) l1l <- min(ll7,ul7) u1l <- max(ll7,ul7) ll81 <- -(sp[1]*sp[2]*sp[3]+sp[1]*b23+sp[2]*b13+sp[3]*b12) ll82 <- -((1-sp[1])*(1-sp[2])*sp[3]-(1-sp[1])*b23-(1-sp[2])*b13+sp[3]*b12) ll83 <- -((1-sp[1])*sp[2]*(1-sp[3])-(1-sp[1])*b23+sp[2]*b13-(1-sp[3])*b12) ll84 <- -(sp[1]*(1-sp[2])*(1-sp[3])+sp[1]*b23-(1-sp[2])*b13-(1-sp[3])*b12) ll8 <- max(max(ll81, ll82), max(ll83, ll84)) ul81 <- (1-sp[1])*sp[2]*sp[3]+(1-sp[1])*b23-sp[2]*b13-sp[3]*b12 ul82 <- sp[1]*(1-sp[2])*sp[3]-sp[1]*b23+(1-sp[2])*b13-sp[3]*b12 ul83 <- sp[1]*sp[2]*(1-sp[3])-sp[1]*b23-sp[2]*b13+(1-sp[3])*b12 ul84 <- (1-sp[1])*(1-sp[2])*(1-sp[3])+(1-sp[1])*b23+(1-sp[2])*b13+(1-sp[3])*b12 ul8 <- min(min(ul81, ul82), min(ul83, ul84)) l2l <- min(ll8,ul8) 165

u2l <- max(ll8,ul8)

r2[1:8] ~ dmulti(p[1:8],n) for ( i in 1:8) { ####d[i] <- r[i]*log(max(r[i],1)/(p[i]*n)) d[i] <-(pow(r[i]-p[i]*n,2)/(p[i]*n)) ####d2[i] <- r2[i]*log(max(r2[i],1)/(p[i]*n)) d2[i] <- (pow(r2[i]-p[i]*n,2)/(p[i]*n)) } bayesp <- step(sum(d[]) - sum(d2[])) }

#data specification list(r=c(18,2,31,7,1,0,11,3663), n=3733) # Specification of initial values for the three chains used

list(pr=0.05, se=c( 0.9 , 0.912 , 0.956 ), sp=c( 0.966 , 0.999 , 0.97 ), a12= 0.0352 ,a13= 0.0176 ,a23= 0.018128 ,b12= 0.000466 ,b13= 0.01398 ,b23= 0.00047 ,r2=c(18,2,31,7,1,0,11,3663))

list(pr=0.15, se=c( 0.93 , 0.638 , 0.9728 ), sp=c( 0.935 , 0.99995 , 0.985 ), a12= 0.00965999999999999 ,a13= 0.011696 ,a23= 0.0037536 ,b12= 0.0000217499999999976 ,b13= 0.00652500000000001 ,b23= 0.0000242499999999973 , r2=c(18,2,31,7,1,0,11,3663))

list(pr=0.1, se=c( 0.98 , 0.858 , 0.9216 ), sp=c( 0.988 , 0.993 , 0.995 ), a12= 0.00716000000000001 ,a13= 0.00843200000000001 ,a23= 0.0280672 ,b12= 0.003416 ,b13= 0.00244 ,b23= 0.002465 , r2=c(18,2,31,7,1,0,11,3663))

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SECTION EXPÉRIMENTALE

Parti 5: Évaluation de l'importance zoonotique de la brucellose en Equateur

Importance de l’enquête épidémiologique

Source: Jorge Ron-Román Comunidad Cabeza de Toro, cantón Zapotillo, provincia Loja – Ecuador 2011

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ARTICLE 6

First report of orchitis in man, caused by Brucella abortus biotype 1 in Ecuador

Ron-Román J., Saegerman C., Minda-Aluisa E., Benitez-Ortiz W., Brandt J., Douce R.

Publié en 2012 Sep dans: American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 5; 87(3) doi: 10.4269/ajtmh.2012.11-0341

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Préambule Les suivis sérologique et épidémiologique d’un cas clinique humain apportent des informations afin de mieux cerner la problématique d'une zoonose. En effet, ce type d'outil nous permet d’avoir un aperçu de la situation d'un point de vue complètement différent, non pas celui du vétérinaire mais plutôt celui du médecin.

Résumé en français Cette étude de cas présente un homme de 44 ans issu d'une communauté rurale du nord de l'Equateur et qui a travaillé dans une ferme d'élevage. Il prenait part aux soins vétérinaires de base, dont l'assistance lors des naissances (ou vêlages), lors de rétentions placentaires et lors d'inséminations artificielles, sans prendre de précautions particulières. En Septembre 2009, il a brusquement développé de l’asthénie et de l’hypersomnie sans cause apparente, ainsi que des signes cliniques tels que fièvre, frissons, et sueurs nocturnes. Le 14 novembre 2009, il a présenté de la douleur et de l'œdème au niveau du testicule droit, signes qui ont coïncidé avec une douleur abdominale. Les recherches clinique, sérologique et bactériologique ont confirmé le premier cas d'orchite unilatérale causée par Brucella abortus biovar 1 chez l'homme, en Équateur. Comme la brucellose est une maladie négligée, une attention particulière devrait lui être accordée dans le cadre des formations médicale et vétérinaire.

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DISCUSSION GÉNÉRALE

4.1.- Etudes préliminaires ayant justifié le travail de thèse Deux études préliminaires ont justifié le présent travail de thèse. Ces études sont citées car elles permettent de mieux percevoir la pertinence des objectifs de la thèse.

4.1.1.-Étude préliminaire dans le canton Mejía, province Pichincha - Equateur, en 2003 (Annexe 1) En 2003, une étude transversale a été réalisée chez les bovins (n = 516) appartenant à 23 Unités de Production Agricole (UPA) dans le canton Mejía, province de Pichincha, Equateur. L'objectif était d’estimer la prévalence de la brucellose bovine et la fiabilité des tests de diagnostic utilisés en Equateur. Les premiers résultats mesurés sur les bovins non vaccinés (n = 99) ont montré une forte prévalence en anticorps (44%) en réponse à sept tests de diagnostic (voir tableau 4.1).

Tableau 4.1 Résultats des tests réalisés dans le cadre du diagnostic de brucellose chez les animaux non vaccinés RB* BPAT* SAT** SAT - EDTA** iELISA** CFT* ST* N° d’observations ------55 ------+ 5 - - + - - - - 2 - - + - - - + 1 - - - + - - - 7 - - - + - - + 1 - - - - - + - 1 - - - - + - - 2 - - - - + - + 1 - - + + - + - 1 - + - - + - - 1 - + + + + - - 1 - + + + + + - 1 - + + + + + + 2 + + + + - + + 0 + + + + + - + 1 + + - - + + - 1 + + + + + + - 10 + + + + + + + 6 TOTAL 99 Légende : *: tests effectués aux CIZ - Equateur, **: tests effectués aux CERVA - Belgiquea, RB: Rose de Bengale, BPAT: Épreuve d'agglutination sur lame à l'antigène tamponné, SAT: Test d’agglutination lente, SAT – EDTA: Test d’agglutination lente en présence d’EDTA, iELISA: Test d’immuno- absorption enzymatique indirect, CFT: Test de fixation du complément ", ST: Test cutané.

Une analyse bayésienne a permis d’estimer la prévalence réelle (28%), son intervalle de crédibilité et les paramètres des tests diagnostiques utilisés, à savoir sensibilité (Se) et spécificité (Sp) (voir tableau 4.2), tout en tenant compte d’une spécificité supérieure à 99% pour le test cutané (ST).

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Tableau 4.2 Estimations de la sensibilité et de la spécificité des tests appliqués dans le cadre du diagnostic de la brucellose bovine Bayes p DIC pD prev I Cr Parámetro ST* RB iELISA SAT-EDTA 0.46 61.68 5.86 0.28 0.16 - 0.45 Se* 0.74 0.48 0.61 0.59 I Cr (2.5%) 0.57 0.28 0.43 0.39 I Cr (97.5%) 0.92 0.68 0.85 0.78 Sp* 1.00 0.91 0.86 0.82 I Cr (2.5%) - 0.86 0.77 0.64 I Cr (97.5%) - 0.97 0.93 0.93 Légende : Bayes p: probabilité de Bayes; DIC: Deviance Information Criterion ou critère d’information de déviance; prev: prévalence estimée; I Cr: intervalle de crédibilité; Se*: sensibilité moyenne; Sp*: spécificité moyenne; ST: Test cutané; RB: Rose Bengale; iELISA: Test d’immuno-absorption enzymatique indirect; SAT – EDTA: Test de séro-agglutination lente en présence d'EDTA; ST*: Test cutané, avec seuil fixé à 2mm.

Les tests microbiologiques ayant permis d’isoler et de caractériser l'agent causal ont contribué à l'étude initiale. L'analyse d’échantillons de lait provenant de 4 animaux séropositifs a permis de mettre en évidence la présence de Brucella abortus biotype 4 dans la zone d'étude. Des informations détaillées sur les animaux chez qui l’agent causal avait été isolé et les résultats des tests diagnostiques sont présentés dans le Tableau 4.3.

En considérant une prévalence en anticorps élevée chez des animaux apparemment non vaccinés, ainsi que l’isolement d’une souche de B. abortus biotype 4 chez un animal vacciné avec la souche B-19, puis revacciné avec la souche RB-51, il était justifié de s’interroger à propos de la qualité des vaccins et des protocoles de vaccination mis en place. Cette étude initiale nous a permis de réaliser que le vaccin produit localement (B- 19) et généralement utilisé jusqu’alors en Equateur, contenait 200 fois moins d’unités formant colonies que les exigences émises par les Organisations Internationales. Il était évident que le contenu ne correspondait pas à ce qui était indiqué sur la fiole (60 x 109 bactéries viables). A l’opposé, le vaccin importé RB51 répondait de manière satisfaisante aux prescriptions (Tableau 4.4).

Les résultats partiels de l'étude ont été présentés sous la forme d’un poster (Annexe 1) au Congrès mondial de brucellose qui s’est tenu à Pampelune, en Espagne, en 2003.

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Tableau 4.3 Information complémentaire concernant les animaux chez lesquels Brucella abortus biotype 4 a isolée Vaccination Test de diagnostic N echantillon 1ère fois Rappel RB BPAT SAT SAT - EDTA iELISA CFT ST* MRT ELISA - L 15 NC NC + + > 100 > 100 > 60 > 25600 3 mm - + 33 NC NC + + > 100 > 100 18 > 25600 1 mm NI + 60 NC NC + + > 100 > 100 18 >25600* 5.5 mm + + 94 B-19 RB-51 + + > 100 > 100 18 6400 1 mm + + Légende : N: nombre; NC: Non connu; NI: résultat non interpretable; RB: Rose de Bengale; BPAT: Épreuve d'agglutination sur lame à l'antigène tamponné; SAT: Test de séro-agglutination; SAT – EDTA: Test de séro-agglutination lente en présence d'EDTA; iELISA: Test d’immuno-absorption enzymatique indirect; CFT: Test de fixation du complement; ST: Test cutané; MRT: Épreuve de l’anneau sur le lait; ELISA-L: Test d’immuno-absorption enzymatique indirect réalisé sur le lait; *: seuil fixé à 2mm.

Tableau 4.4 Résultats du suivi des vaccins contre la brucellose bovine utilisés dans la zone d'étude Concentration Type de Volume Facteur de Volume N Brucella N Brucella N lot initiale pas N UCF vaccin par dose (1) dilution (2) utilisé (3) par ml (4) par dose (5) dose B-19 02-2933 60 x 109 3 ml 1 x 106 0.1 ml 15 0.1 ml 10 0.1 ml 12 0.1 ml 7 11* 1.1 x 108 3.3 x 108 RB-51 2044 1 x 109 2 1 x 106 0.1 ml 220 0.1 ml 240 0.1 ml 180 0.1 ml 230 217.5* 2.17 x 109 4.34 x 109 RB-51 1678 1 x 109 2 1 x 106 0.1 ml 300 0.1 ml 330 0.1 ml 350 0.1 ml 330 327.5* 3.27 x 109 6.54 x 109 Légende : UCF: Unités Formant des Colonies; *Nombre moyen de Brucella par 0,1 ml; la concentration finale du vaccin (5) est obtenue en multipliant le volume par dose administrée (1), par le facteur de dilution (2), par le volume utilisé (3) (0,1 ml), et par le nombre de UCF/ml (*).

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L'étude initiale a permis de confirmer la nécessité de mettre en œuvre une «batterie de tests de diagnostic» afin d’identifier et de localiser un maximum d’animaux positifs, mais a également soulevé des questions quant à la situation épidémiologique de cette zoonose en Equateur. Bien qu’en 2003 l'Equateur disposait déjà d’une technologie de pointe en matière de diagnostics sérologique, microbiologique et moléculaire des brucelloses humaine et animale au travers du Centro Internacional de Zoonosis (CIZ, inclus dans l’Université Centrale de Quito), cela n'a pas suffit en raison principalement d’une vaccination anarchique des bovins. Au moment de cette étude, la prévalence réelle chez les bovins et l’impact en santé publique n’était pas encore clairement établis.

4.1.2.- Étude complémentaire chez les chiens, réalisée en 2008 dans une zone d’endémie de brucellose bovine (Canton Mejía, province de Pichincha) (Annexe 2) En complément aux études réalisées chez les bovins, les caprins et chez l’homme, une étude à petite échelle a été réalisée chez les chiens (n=151) de 34 exploitations laitières situées en zone d’endémie de brucellose bovine (province de Pichincha). Les résultats ont démontré que cette espèce pouvait jouer le rôle de réservoir pour la bactérie (Annexe 2), en particulier via la transmission des souches en phase lisse, comme c’est le cas pour B. abortus. La prévalence s’élevait à 11,92% et 15,89%, après analyse avec respectivement les tests SAT-EDTA et RB. Même l’analyse préliminaire par iELISA, avec utilisation du LPS de B. abortus, a montré que la prévalence pouvait atteindre 23,85%. Les contacts étroits et fréquents avec le bétail (85,43%) ainsi que la consommation de produits d'avortements (64%) expliquent, non seulement la prévalence élevée observée chez les chiens, mais surtout l'isolement de B. abortus biotype 4 chez les chiens abattus (n=5) après consentement de leur propriétaire.

L'étude a montré que les efforts entrepris en Équateur (canton Mejía, province de Pichincha) pour contrôler et éradiquer la brucellose bovine sont mal compris car les éleverus considèrent à tord que les bovins sont le seul réservoir potentiel de la bactérie dans leur exploitation et ce, en raison des pertes financières conséquentes causées par la maladie chez cette espèce.

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4.2.- Rappel des objectifs du travail. Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse avait pour objectif de générer des informations fiables sur la situation épidémiologique de la brucellose bovine et son impact en santé publique dans le nord-ouest de l'Equateur, mais aussi d’identifier de potentiels facteurs de risque de la maladie. Ces données contribuent à rendre plus fiables les informations officielles rapportées par les Organismes en charge de la surveillance de cette zoonose en Equateur, en contextualisant le problème. À cette fin, quatre objectifs spécifiques ont été fixés.

Avant cette thèse, peu de données relatives à la brucellose animale et humaine en Equateur étaient disponibles dans les bases de données bibliographiques internationales. Néanmoins, une revue de la littérature existante, principalement constituée par des thèses réalisées dans les Facultés de Médecine Vétérinaire et d’Ingénierie Agricole des universités équatoriennes, a déjà permis de fournir un premier aperçu de la situation. La brucellose a toujours suscité un intérêt scientifique en Equateur, et ce, malgré le manque évident de ressources techniques pour l’étudier et comprendre son épidémiologie de façon optimale.

Dans le cas de la brucellose, la seule source d’infection pour l’homme est constituée par les réservoirs animaux. Des études visant à estimer la prévalence de cette infection chez les bovins et les caprins et à évaluer la performance des tests diagnostiques utilisés ont été réalisées dans le nord-ouest de l'Equateur. Ces travaux ont également permis de rechercher les potentiels facteurs de risque d’infection.

Des études sur la prévalence et les facteurs de risques chez l'homme ont mis en évidence l'impact de cette infection au sein de la population équatorienne. Néanmoins, ces travaux ont souligné le caractère faiblement prioritaire de cette zoonose dans le cadre du système de santé équatorien.

Enfin, une stratégie possible de surveillance épidémiologique de la brucellose en Equateur, tant chez l’homme que chez les bovins, a été proposée. Il est indispensable que cette stratégie soit adaptée aux conditions du nord-ouest de l'Equateur.

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4.3.-Contextualisation générale du problème de la brucellose dans le nord-ouest de l'Equateur et principaux résultats des travaux réalisés

4.3.1.- Une revue de la bibliographie locale a démontré que la brucellose a toujours été une préoccupation en Equateur En Equateur, grâce à la diversité climatique, l’élevage de différentes espèces animales est pratiqué depuis l’antiquité dans le but premier de subvenir aux besoins des populations rurales, mais aussi pour l’exportation de produits animaux. La répartition et l’élevage des espèces animales telles que les bovins, ovins, caprins, porcins et camélidés est basée sur l’adaptation de différentes races au climat rencontré dans les différentes régions naturelles du pays (plaine côtière, montagne, amazonie et région insulaire) et aux ressources alimentaires dont elles disposent.

D’après l'INEC et al. (2002), l’Equateur comptabilisait en 2002, 4.486.020 bovins, répartis au sein de 427.514 Unités de Production Agricole (UPAs) et 178.367 caprins répartis entre 16.405 UPAs. En ce qui concerne les bovins, 50.69% des animaux se concentraient dans la “Sierra” ou zone montagneuse, dans 339.555 UPAs, ce qui représente 79.42% de l’ensemble des UPAs au niveau national.

Toujours en 2002, si l’on considère le type d’élevage, 54,33% des UPAs pratiquaient le pâturage au piquet, 44,22% le pâturage libre et 1,43% un autre système. Il faut mentionner que le système traditionnel de pâturage au piquet consiste en l’amarrage des animaux à un piquet dans des terrains en friche, le long des chemins et des routes, mais aussi dans des lieux publics. L’animal étant maintenu attaché au piquet au moyen d’une corde, ses mouvements sont limités (INEC et al., 2002).

Une coutume largement implantée en Equateur est la commercialisation d’animaux dans de petites foires aux bestiaux, où différentes espèces partagent des espaces communs, ce qui représente un facteur de risque non négligeable en termes de transmission de maladies (Acha & Szyfres, 2003; Muma et al., 2007). De plus, il existe de grands marchés aux bestiaux, tel celui de de Santo Domingo de los Tsáchilas dans la plaine côtière, pour lesquels les animaux sont déplacés entre régions ce qui constitue un risque additionnel pour la dissémination des maladies.

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La brucellose a toujours été un centre d’intérêt en Equateur, car suite aux premières notifications chez les bovins par Salvestroni en 1926 (Alvarado, 1959) et chez l’homme par Valenzuela en 1934 (Vásconez-Lópeez, 1960), de nombreuses études ont été réalisées, principalement chez les espèces animales réservoirs. Le rôle du vétérinaire de terrain vis-à-vis de cette zoonose a d’ailleurs été mis en avant.

La situation réelle de la brucellose humaine en Equateur, telle que rapportée au niveau international, est erronée. En effet, selon les rapports officiels, soit la maladie ne serait pas présente, soit il n’existerait aucune information fiable sur la situation (Pappas et al., 2006), soit elle serait contrôlée (Cartelle et al., 2015). Cela s’explique par le peu d’études menées chez l’homme. La plupart de ces dernières ont été réalisées dans le but de rechercher la maladie uniquement chez les groupes à risque. En effet, dans le contexte équatorien, la surveillance de la maladie humaine est uniquement passive et repose sur les déclarations des cas hospitalisés ( Ron-Román et al., 2013; Ron-Román et al., 2014). De plus, les professionnels de la santé publique ne lui accordent que peu d’importance, ce qui est confirmé par la faible place qu’elle occupe tout au long de la formation médicale (Ron-Román, 2012, communication personnelle). Ce manque de sensibilisation des professionnels de la santé représente un frein au dépistage correct de la maladie dans la patientèle de tous les jours, à tel point que ce sont les vétérinaires qui conseillent aux personnes présentant un tableau clinique suspect de se soumettre à des tests de diagnostic (Ron-Román et al., 2012).

Selon les Organisations Panaméricaine (OPS) et Mondiale de la Santé (OMS), les connaissances en matière de brucellose humaine en Amérique sont manquantes, notamment à cause des lacunes en matière de diagnostic et du non rapportage de cas. Néanmoins, des données rapportées entre 1994 et 1998 sont disponibles. Au cours de cette période, 29132 cas ont été rapportés par 20 pays d’Amérique; parmi ces notifications, 54,5% émanaient d’Amérique du Sud. Selon les données officielles, l’Equateur a seulement notifié 52 cas humains durant cette période (Cartelle et al., 2015).

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4.3.2.- Détermination de la prévalence apparente et des facteurs de risque de brucellose chez les bovins. Il est fort probable que la prévalence élevée chez l’homme soit consécutive à la présence de l’infection chez au moins un des réservoirs naturels, tels que les bovins, caprins ou ovins, car ce sont des espèces fréquemment rencontrées dans les exploitations en Equateur, comme la circulation de Brucella sp. Notre étude a en effet montré une prévalence élevée de l’infection chez les bovins dans la région ciblée (6,84%; 228/3332; IC:4,83-8,85). Une telle prévalence rejoindrait les rapports officiels émis par l’Agence Equatorienne d’Assurance Qualité de l’Agriculture, AGROCALIDAD (Torres, 2008): des prévalences allant de 0,4% (4/1000) dans la province de Manabí jusqu’à 51,6% (510/989) dans le nord-ouest de l’Equateur avaient été estimées (Maldonado & Salgado, 1979; Plaza, 1977). Des prévalences inter- troupeaux presqu’identiques ont été mesurées dans la zone andine (Sierra; 21,89%; 44/201) et dans la plaine côtière (Costa; 25,17% 36/143). La plus grande différence se situait au niveau de la prévalence intra-troupeau, puisqu’elle atteignait 12,46% (161/1292) en zone andine et 3,28% (67/2040) dans la plaine côtière. Le sexe (OR=3,91; femelle) et l’âge (OR=3,14; classe des 25 à 60 mois) se sont avérés êtres des facteurs de risque, confirmant de la sorte les résultats d’une étude antérieure (Asiimwe et al. 2015).

L’étude a permis de démontrer que la brucellose était présente dans les deux régions (zone andine et plaine côtière), mais que la différence de prévalence au niveau intra- troupeau pouvait être liée au système d’élevage des animaux, ce qui a été mis en évidence antérieurement. Une telle différence de prévalence entre régions avait déjà été observée lors d’études antérieures, qui avaient mis en évidence une prévalence de 51,6% en zone andine (Maldonado & Salgado, 1979) et de seulement 13,3% dans la plaine côtière (Bailon & Muñoz, 2003), au moyen de tests sérologiques (respectivement le test au RB et le test d’Huddleson) comparables à ceux utilisés dans le cadre de cette thèse. Des prévalences très élevées, à savoir 68,8% en zone andine et 57% dans la plaine côtière ont été estimées au moyen du MRT (Estupiñan, 1967; Olleague, 1969). Le MRT est un test largement utilisé pour détecter la présence de brucellose dans les troupeaux laitiers (Ragan, 2002). Malheureusement, la fiabilité de ses résultats dépend de nombreux facteurs principalement liés à la qualité de l’échantillon de lait et à son

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degré de dilution (OIE, 2016a). L’application de ce test, très utile pour le suivi épidémiologique en zone laitière, ne peut donner une idée précise de l’ampleur du problème car ses sensibilité et spécificité sont faibles (Nielsen, 2002) et le type d’échantillon peut générer un biais.

Des biais d’autre nature peuvent être responsables d’une appréciation erronée du problème, comme dans l’étude de Rodríguez-Hidalgo et. al (2015) qui avaient estimé une prévalence de 7,6% dans des fermes confirmées positives antérieurement en cherchant à isoler et typer des souches circulantes de Brucella spp. à Santo Domingo de los Tsáchilas.

En toutes circonstances, il est indispensable de considérer que le diagnostic de la brucellose et l’estimation de la prévalence réelle chez les bovins ne sont pas choses faciles surtout en raison de l’existence de réactions croisées et ce, notamment, après la vaccination avec le vacicn B-19 (Godfroid et al., 2002). Poulsen et collaborateurs (2014) ont justement observé une différence entre la prévalence rapportée chez les bovins non vaccinés (2,6%) et celle estimée en considérant l’ensemble des échantillons collectés (5,5%).

Grâce à l’expérience acquise lors de l’étude de 2003 réalisée en province de Pichincha (zone andine), au cours de laquelle une prévalence élevée en Ac (44%) avait été estimée sur des animaux garantis comme non vaccinés (n=99), le travail développé tout au long de notre recherche a renforcé la nécessité de travailler avec des animaux réellement non vaccinés contre la brucellose, afin de minimiser le problème de réactions croisées avec les tests sérologiques utilisés, dues à la vaccination. Les échantillons bovins récoltés au cours de cette étude antérieure ont été exclus de l’analyse finale.

Il est important de préciser que l’étude présentée ici s’est basée sur le diagnostic chez les animaux à n’importe quel stade de l’infection grâce à trois tests de diagnostic qui détectent des Ac différents: le RB détecte surtout les IgG et IgM, le SAT-EDTA détecte les IgM et l’iELISA détecte les IgG (Alton et al., 1988; Godfroid & Boelaert, 1995; Nielsen, 2002; Saegerman et al., 2010).

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Bien que des tests de diagnostic complémentaires tels que le test de fixation du complément (CFT) et le test cutané (ST) aient été utilisés lors de l’étude antérieure, ceux-ci n’ont pas été incorporés à la batterie de tests réalisés ultérieurement, suite au manque de réactifs (globules rouges de mouton indemne de brucellose pour le CFT et antigène dans le cas du ST). Au contraire des tests sérologiques détectant les Ac (Alton et al., 1988), le ST se base sur l’hypersensibilité de type IV (Bercovich, 2000); il ne présente donc pas de réactions croisées avec d’autres bactéries Gram négatives telle que Yersinia enterocolítica 0:9 (OIE, 2016a; Saegerman et al., 1999; Saegerman et al., 2010). Bien que l’équipement nécessaire à la réalisation de ce test ne soit pas élaboré, le problème principal réside en l’exécution correcte de la procédure. De plus, il nécessite du temps, surtout quand il faut réaliser deux inspections chez chaque animal (Pouillot et al., 1997). Les réactions inflammatoires sévères sont faciles à visualiser et à interpréter. Néanmoins, il faut être attentif aux réactions légères car elles peuvent passer inaperçues (OIE, 2016a). Le site d’injection de l’Ag doit être identifié avec précision et chaque animal doit être examiné minutieusement à la recherche du moindre signe d’inflammation, d’abord par inspection visuelle et palpation, puis en mesurant correctement l’épaisseur de la peau (Saegerman et al., 1999). Dans l’étude de 2003, nous avons observé, non seulement des réactions légèrement positives (épaisseur de la peau comprise entre 2 et 3 mm), mais aussi des réactions très sévères (épaisseur de la peau >12 mm).

Les observations réalisées au cours de ce travail ont permis d’identifier certaines pratiques pouvant jouer un rôle important dans la transmission de la maladie, comme déjà décrit par d’autres auteurs: (a) L’existence de différents systèmes d’élevage bovin dans la zone d’étude, ce qui est un frein à la mise en place d’un programme global de contrôle et/ou éradication de la maladie (Acha & Szyfres, 2003; Arnaud-Bosq, 1977; Sanogo et al., 2008); (b) La forte concentration d’animaux dans les UPAs de la zone 1, facteur qui favorise la dissémination de l’infection au sein d’un même troupeau par l’augmentation des possiblités de contact entre animaux (Domenech et al., 1980); (c) La présence de taureaux utilisés comme mâles reproducteurs d’une UPA déterminée, et leur “prêt/location” temporaire à d’autres; ils sont alors responsables d’un grand nombre d’infections chez les femelles;

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(d) La présence d’autres espèces animales réceptives dans l’UPA: ovins, porcins, chiens, camélidés sud-américains et chevaux; (e) L’achat d’animaux de remplacement dont les statuts sanitaire et vaccinal vis-à-vis de la brucellose sont inconnus; (f) L’absence de quarantaine avant d’introduire de nouveaux animaux dans un troupeau (Blood et al., 1987); (g) La fréquence élevée d’avortements dans les UPAs, et la gestion inappropriée des produits d’avortement; (h) La présence de chiens dans les fermes; ces derniers peuvent jouer le rôle de vecteurs mécaniques de la brucellose dans les exploitations en transférant des morceaux de placenta ou d’avorton d’un endroit à un autre; (i) Le risque d’utiliser du sperme contaminé, si aucun contrôle adéquat du sperme produit localement ou importé n’est réalisé; (j) L’inexistence d’un système uniforme de vaccination; en effet, dans la zone d’étude, il a été observé que certaines UPAs ne pratiquaient pas la vaccination, tandis que d’autres vaccinaient soit avec la souche B-19 soit avec la RB51, en fonction des disponibilités de ces produits dans les magasins vétérinaires; (k) L’élimination incorrecte des animaux positifs et (l) Ne pas écarter la possibilité que les médecins vétérinaires peuvent jouer un rôle dans la dissémination de l’infection (Arnaud-Bosq, 1977).

4.3.3.- La découverte de la souche vaccinale B-19 chez les chèvres pourrait-elle confirmer la situation anarchique de la vaccination chez les bovins? Dans le cas des maladies zoonotiques, l’élevage en zone péri-urbaine ou urbaine augmente le risque de transmission suite à la production de déchets tels que urines, matières fécales, sécrétions diverses et avortons qui peuvent contaminer l’environnement (Samartino et al., 2000; Thys et al., 2006). L’étude ciblant les chèvres dans les provinces de Carchi (n=160), Pichincha (n=224) et Loja (n=2024) a seulement permis d’identifier deux animaux faiblement positifs, ce qui va à l’encontre du rapport de (Poulsen et al., 2014) qui avait estimé une prévalence de 17,8% chez cette espèce. Bien que l’étude ait mis en évidence une faible prévalence en brucellose chez cette espèce, elle tire la sonnette d’alarme suite à l’isolement et au typage de la souche vaccinale B-19 (Brucella abortus biovar 1) habituellement utilisée pour la vaccination

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des bovins. Même si cette observation a déjà été rapportée antérieurement, elle met en évidence la problématique liée à l’utilisation d’un vaccin vivant (Lambert et al., 1964). Il est indispensable de former et sensibiliser les utilisateurs de vaccins contre la brucellose aux normes relatives à leur transport, reconstitution, stockage, dosage, administration et élimination des déchets, telles que précisées par les fabricants et surtout selon les exigences de l’OIE (OIE, 2016a).

Selon Poulsen et. al (2014), la prévalence basée sur le test au RB chez les chèvres (17.8%) serait trois fois supérieure à celle rencontrée chez les bovins (5.5%) dans la même étude; si c’était le cas, la situation de cette zoonose serait simplement incontrôlable. Il s’agit probablement d’une surestimation du problème car les tests d’agglutination au RB ne sont pas très fiables chez cette espèce et nécessitent des modifications du protocole usuel.

4.3.4.- Détermination de la prévalence apparente et des facteurs de risque de brucellose chez l’homme Les travaux de terrain et de laboratoire entrepris au cours de ce travail ont mis en évidence une prévalence apparente chez l’homme de 1,88% (71/3733) (IC: 1,48-2,38) dans le Nord-Ouest du pays. La prévalence estimée grâce à cette épidémiovigilance active va à l’encontre des conclusions du rapport officiel transmis par le service d’Epidémiologie de l’Institut National d’Investigations en Santé Publique (anciennement Ministère de la Santé Publique). Celui-ci mentionnait seulement 14 cas confirmés de brucellose au niveau national pour la période de 2006 à 2008 (Cartelle et al., 2015). Dans notre étude, une variation de la prévalence en fonction de la province d’origine a pu être observée (2,5% dans la province de Carchi ; 2,6% dans la province d’Esmeraldas ; 1,3% dans la province d’Imbabura ; 2,9% dans la province de Manabí et 1,7% dans la province de Pichincha). La recherche active d’indicateurs de la maladie, comme par exemple le taux d’anticorps, permettrait d’avoir un aperçu du statut réel de la maladie chez l’homme (Corbel, 2006; Doganay et al., 2003). Nos observations sont en lien direct avec celles de Ron-Román et al., (2013), qui avaient mentionné antérieurement que les foyers d’infection enregistrés dans cette région entre 2006 et 2008 étaient localisés dans les provinces citées ci-dessus. Elles rejoignent également les résultats d’études de prévalence réalisées auprès de 700 patients d’un hôpital de

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Portoviejo et chez 70 personnes travaillant dans des exploitations bovines de Santo Domingo de los Tsáchilas, avec respectivement 2,4% et 1,43% (Cuenca, 2013; Macías, 1977).

Les observations chez l’homme ont permis d’identifier et de quantifier les facteurs de risque de brucellose tels que: l’âge (OR=4,5 pour la classe d’âge des ≥ 46 ans), le sexe (OR=1,7 pour les hommes), des contacts avec les animaux (OR=3,7), la consommation de placenta et de foetus (OR=2,7) et la consommation de sang frais (OR=2,0). Ces facteurs seraient en lien direct, non seulement avec les modes d’élevage traditionnels toujours existant en Equateur (surtout pour les troupeaux de taille réduite), mais aussi avec les habitudes alimentaires liées à la consommation de produits d’origine animale dans des conditions peu hygiéniques. Cette observation avait déjà été rapportée antérieurement (Ariza et al., 1995; Pasquereau, 1980; Roux, 1979). Tel est le cas d'un patient aux Etats-Unis, qui a déclaré avoir consommé du sang frais des animaux, tout en travaillant dans un abattoir en Equateur (Herrick et al., 2014).

Les personnes interrogées associent généralement les syndromes fébriles, les douleurs musculaires ou articulaires et les céphalées à une simple grippe. De plus, les études épidémiologiques ciblant la brucellose humaine sont rares en Equateur et les méthodes fréquemment utilisées détectent seulement une partie des cas. Considérant tous ces facteurs, il est plus que probable que la prévalence de la brucellose humaine soit fortement sous-estimée.

L’origine d’un syndrome fébrile prolongé chez l’homme est difficilement diagnostiqué. Afin d’établir son étiologie précise, une étude complexe et coûteuse est généralement nécessaire (Buzgan et al., 2010; Hasanjani Roushan et al., 2016). Néanmoins, il est fondamental que le médecin de campagne confronté à un syndrome à étiologie variable suspecte la brucellose et effectue une bonne anamnèse auprès du patient, en collectant des informations sur son occupation, le type et la fréquence de contacts avec les animaux ainsi que sur les habitudes alimentaires. Une étude épidémiologique sur la brucellose ne doit pas seulement inclure des personnes exposées, à savoir en contact régulier avec une ou des sources d’infection,

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mais aussi une population non exposée (habitants de la zone urbaine) (Doganay et al., 2003; Massenet et al., 1993).

A l’heure actuelle, un autre mécanisme d’infection a été identifié dans la population, à savoir que les personnes résidant en zone indemne de brucellose contractent l’infection lorsqu’elles voyagent dans des régions/pays où la maladie présente une prévalence élevée. Dans ce ca, les signes cliniques se déclenchent une fois que les patients retournent chez eux (FAO & OMS, 1986). La cause principale serait liée au fait que les voyageurs adoptent les habitudes alimentaires des régions ou pays visités (Wade et al., 1998). Il est donc primordial que tous les pays mettent en place des plans de prévention et de contrôle contre cette zoonose.

4.3.5.- Détermination des prévalences réelles de la brucellose humaine et bovine et des performances des tests de diagnostic utilisés, au moyen du théorème de Bayes La brucellose pourrait certainement être la maladie pour laquelle le plus grand nombre de tests a été développé pour le diagnostic indirect. Ceux-ci vont d’une simple agglutination rapide sur plaque comme le RB aux tests de polarisation de fluorescence, en passant par l’ELISA (indirect et de compétition). Ils obéissent à la complexité du diagnostic direct basé sur l’isolement de Brucella sp., et au risque élevé de contamination lors des manipulations. La performance d’un test indirect basé sur la détection d’Ac contre le LPS (Alton et al., 1988; Garin-Bastuji, 1993; Godfroid & Boelaert, 1995; Saegerman et al., 2010) dépend non seulement de son principe de base mais aussi du type d’échantillon sur lequel il est effectué (sang entier, sérum, plasma, lait ou lactosérum).

Comme déjà mentionné antérieurement, il n’existe aucun test sérologique de référence (gold standard) pour diagnostiquer la brucellose chez l’homme et les différentes espèces animales (Corbel, 2006; Godfroid et al., 2010). Dans ce contexte, un modèle Bayésien combinant l’information collectée sur le terrain avec l’information à priori (opinions d’experts) a permis d’estimer la prévalence réelle de la brucellose chez l’homme et dans l’espèce bovine. Cette démarche a permis d’éviter de répéter les erreurs commises en appliquant l’équation de Rogan & Gladen (1978) (Lesaffre et al., 2007). En effet, l’application des cette équation aurait conduit à une estimation de la

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prévalence réelle de 7,2% chez les bovins dans le nord de l’Equateur (Poulsen et al. (2014). Dans cette équation, ont été considérées une prévalence apparente de 5,5% et des valeurs de Se et de Sp de respectivement 72,2% et 99,6% (Fosgate et al., 2002). Cette probable surestimation de la prévalence pourrait alarmer les éleveurs qui seraient alors tentés d’adopter des moyens de prévention et de contrôle sans fondement épidémiologique (par exemple, la vaccination anarchique). Au contraire, notre étude a permis, dans un contexte bayésien, d’estimer une prévalence réelle de 1% chez l’homme et 2,1% chez les bovins, ainsi que la Se et la Sp des tests utilisés (RB, SAT-EDTA et iELISA). Le modèle a d’ailleurs identifié l’iELISA comme étant le meilleur test pour le diagnostic de la brucellose chez l’homme et l’animal. Néanmoins, la Sp du test ELISA dépend du type de conjugué utilisé (Saegerman et al., 2004). Le test RB ne devrait toutefois pas être écarté car c’est un des tests les plus utilisé dans le diagnostic de cette maladie car il est facile à réaliser, peu coûteux, ses résultats sont faciles à lire, et il présente une haute Se (Manger, 2002). Ce test permet d’obtenir une appréciation sérologique rapide, tant au niveau individuel qu’à l’échelle du troupeau (OIE, 2016a). Néanmoins, il convient de garder à l’esprit la possibilité de réactions croisées avec des bactéries Gram négatives telle que Yersinia enterocolítica O:9 et après vaccination avec la souche B-19 (Saegerman et al., 1999; Godfroid et al., 2002; Godfroid et al., 2010; Saegerman et al., 2010).

4.3.6.- Le rôle des chiens dans la transmission de la brucellose bovine en zone endémique. L’importance du chien comme réservoir potentiel de l’infection (phase lisse de Brucella) dans les exploitations bovines a été mise en évidence grâce à l’étude ciblant cette espèce, au vu de la haute prévalence mesurée via les tests SAT-EDTA (11,92%; 18/151) et RB (15,89%; 21/151). Une étude de 1978 avait rapporté une prévalence de 3,5% (14/400) en province de Manabí (Zambrano, 1978). Un lien pourrait être établi entre la prévalence élevée rencontrée chez les chiens et le nombre élevé d’avortements chez les bovins en Equateur (INEC et al., 2002), comme confirmé dans ce travail. Ces observations confirment le rôle biologique que peuvent jouer les chiens dans une maladie telle que la brucellose (Baek et al., 2003; Wareth et al., 2016).

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4.3.7.- Isolement et typage des souches de Brucella abortus chez différents réservoirs en Equateur Des inquiétudes subsistent dans de nombreux pays, dans lesquels la brucellose a été déclarée comme présente suite à la réalisation de tests sérologiques sans que les souches de Brucella spp. circulantes n’aient encore pu être identifiées (Roux, 1979). Comme le suggèrent la FAO et l’OMS (FAO & OMS, 1986), chaque fois qu’il est possible de le faire, l’identification de l’agent causal doit être entreprise jusqu’au niveau du biotypage, car des souches présentent fréquemment une distribution géographique particulière. La connaissance plus précise des biotypes impliqués permet de mieux comprendre la propagation de la maladie (Corbel, 2006; Roux, 1979; Saegerman et al., 2010). Malheureusement, l’isolement des germes n’est pas une tâche aisée, requiert un laboratoire spécialisé et de haute sécurité. C’est la raison pour laquelle le nombre d’isolements rapportés par pays est en relation directe avec le degré de développement des laboratoires de références. L’Equateur n’échappe pas à la règle car, à l’heure actuelle, il n’existe aucune information officielle sur le nombre d’isolements réalisés ni sur la distribution des souches de Brucella spp. circulant en Equateur. Selon Thimn (1982), entre 1965 et 1977, 794 isolements de Brucella ont été réalisés dans 12 pays d’Amérique, dont l’Argentine (n=220), le Mexique (n=160), le Pérou (n=114) et le Chili (n=95). En Equateur, seuls 8 isolements ont été rapportés au cours de cette période: un isolement de B. abortus biotype 1, six isolements de B. abortus biotype 4 et un isolement de B. suis biotype 1. Néanmoins, les rapports officiels notifiaient, pour la même époque, une prévalence supérieure à 25% chez les bovins (en cause: B. abortus), de 6 et 15% respectivement chez les caprins (en cause: B. melitensis) et les ovins (en cause: B. ovis et B. melitensis), et enfin, supérieure à 25% chez les porcs (en cause: B. suis). Il est notoire que ces données sont très éloignées de la réalité vu le nombre si faible d’isolements et que de surcroît B. melitensis et B. ovis n’ont encore jamais été identifiés en Equateur. Le même rapport de Thimn (1982) fait référence à l’absence totale d’information concernant la brucellose chez d’autres espèces telles que les chiens, les chevaux et les camélidés sud-américains. De plus, l’équipe de Lucero a rapporté qu’entre 1968 et 2006, seuls 3 isolements avaient été réalisés chez les bovins, dont un de B. abortus biotype 1 et deux de B. abortus biotype 4 (Lucero et al., 2008).

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Concernant la présence de la brucellose chez les porcs, les quelques études existantes sont anciennes (Tobar, 1961; Escalante, 1963; Robalino, 1966) et ont toujours été réalisées grâce à des tests de faible sensibilité, comme le test d’aglutination de Huddleson. Les études récentes, basées sur le même test, n’ont pas montré la présence d'anticorps contre la brucellose dans ce type de réservoir animal (Demera, et al., 2002). A ce jour, aucune souche B. suis n’a été isolée en Equateur.

L’existence à l’état endémique de la brucellose tant chez l’homme que chez les bovins a été mis en exergue au cours de ce travail. De même, l’isolement de l’agent causal a facilitement été identifié chez chacun des réservoirs étudiés. Pour isoler et caractériser l’agent causal, différents échantillons ont été utilisés, selon le réservoir étudié: sang et sperme chez l’homme, lait chez les bovins et les caprins, ainsi qu’organes internes chez les chiens. Tous les échantillons positifs ont présenté une réponse très significative aux tests sérologiques. Dans le contexte équatorien, la présence d’hygroma n’a jamais été observée chez les bovins, raison pour laquelle l’isolement dans ce type de liquide n’a pas été entrepris, contrairement au contexte africain (Bankole et al., 2010; Boukary et al., 2013; Saegeman et al., 2010).

Sur base des stratégies décrites ci-dessus, basées sur l’optimisation des ressources et la diminution des risques de contamination (fréquentes lorsqu’on travaille avec une bactérie présentant un tel risque biologique) (Corbel, 2006; Godfroid et al., 2010; OIE, 2016a; Saegerman et al., 2010), 26 souches ont été isolées: 17 chez les bovins, 1 chez les caprins, 4 chez l’homme et 4 chez les chiens. Brucella abortus biotype 4 était majoritaire. Une souche isolée chez une chèvre s’est avérée être B. abortus biotype 1 souche vaccinale (B-19) et un isolement chez un cas humain a révélé une souche de terrain B. abortus biotype 1. Quelques-unes de souches de B. abortus biotype 4 isolées chez les bovins et chez l’homme, ainsi que la souche de terrain B. abortus biotype 1 isolée chez deux patients humains, ont présenté certaines particularités lors du typage, notamment l’inhibition de croissance en milieu coloré avec la safranine (100 µg/ml) et la fuchsine (20 µg/ml). Ces observations ont déjà été rapportées (Alton et al., 1988), tout comme le profil métabolique différent en réponse au test d’oxydase, comme les souches isolées en Afrique (Sanogo et al., 2013). Ces particularités pourraient être

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responsables de notifications erronées de la présence de B. abortus biotype 2 en Equateur, comme mentionné par Rodríguez-Hidalgo et. al. (2015).

La mise en place en Equateur de l’isolement et du typage microbien au travers des tests bactériologiques (observations macro- et microscopiques), des tests biochimiques

(oxydase, catalase et uréase), des exigences en CO2, de la production d’H2S, de la croissance en présence de colorants (fuchsine, thionine et safranine), de l’agglutination en présence de sérums monospécifiques (A – M) et du typage moléculaire via PCR (711, AMOS, AMOS modifié) ont permis de réaliser 50% des isolements et typages dans le pays d’origine. Le développement de ces capacités diagnotiques permettrait d’éviter le transfert de matériel contaminant dans un pays indemne de brucellose comme la Belgique. C’est une valeur ajoutée au travail réalisé durant cette thèse. L’utilisation de protocoles standardisés pour l’isolement et le typage de souches selon les procédures décrites par Bricker & Halling (1994 et 1995) et l’otention de contrôles d’ADN nous a permis de garantir ces résultats.

4.3.8.- Directives de base pour le Programme National de Contrôle de la Brucellose Bovine en Equateur A l’heure actuelle, l’humanité est confrontée à la mondialisation qui permet, entre autre, la diffusion ou l’échange rapide de connaissances et d’informations entre personnes, pays et continents. La mondialisation commerciale ne permet pas seulement l’échange et les mouvements des produits animaux, mais aussi des agents infectieux, qui peuvent maintenant «voyager» facilement entre zones et/ou pays à statut sanitaire différent vis- à-vis d’une maladie déterminée.

Dans ce contexte, maintenant plus que jamais, l’OIE a lancé un appel aux pays afin qu’ils renforcent leurs systèmes de vigilance et suivi épidémiologiques, afin de détecter de manière précoce les agents infectieux et de proposer des solutions rapides, efficaces et appropriées aux problèmes sanitaires chez les animaux. Les nouvelles stratégies et législations devant être adoptées par les pays membres de l’OIE se doivent d’être coordonnées afin d’éviter les problèmes et de permettre une détection rapide des maladies (Roux, 1979). Selon Luna-Martínez et Mateos (2001), les programmes de contrôle ont répondu, soit à l’enthousiasme d’un groupe de chercheurs, soit à la

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disponibilité des moyens financiers temporaires. Une véritable politique durable ne transparaît pas au travers des programmes de contrôle, ce qui explique pourquoi peu de pays ont réellement mis en place des programmes permanents de prévention et de contrôle de la brucellose.

Premièrement, la lutte contre la brucellose doit se conceptualiser de manière généralisée, à savoir en travaillant sur toutes les espèces animales sensibles et bien évidemment en incluant l’homme. La collaboration entre les organismes officiels de contrôle (MSP et MAG), les laboratoires publics et privés, les propriétaires d’UPAs et les marchands de bestiaux sera le pilier fondamental pour la réussite d’un programme de prévention, de contrôle et d’éradication de la maladie.

La stratégie de prévention, de contrôle et d’éradication de la brucellose dans une zone déterminée repose sur quatre axes: (i) suivi et surveillance épidémiologique de la brucellose, (ii) élimination et indemnisation des animaux infectés, (iii) prévention de l’infection, via la vaccination des animaux sensibles, le contrôle des facteurs de risque et (iv) l’éducation de la population.

(1) Suivi épidémiologique: le suivi efficace de la maladie est fondamental afin d’arriver à la comprendre, et de la sorte, arriver à la prévenir et la contrôler. Petit à petit, l’Equateur a travaillé sur un système national, ou au moins régional, qui assure ce suivi épidémiologique, élément-clé au moment de la prise de décision en santé publique et animale. Lors de l’élaboration d’un programme de contrôle de telle ou telle maladie, il faut se baser sur la connaissance de sa prévalence, des facteurs associés à sa manifestation mais aussi aux moyens requis à mettre en œuvre à l’aide d’études coûts-bénéfices. Un pré-requis du suivi épidémiologique est une identification correcte des exploitations, des animaux et des opérateurs de la filière (Saegerman et al., 2010).

(2) Élimination des animaux infectés: l’élimination des animaux infectés est sans aucun doute le moyen le plus efficace pour contrôler et éradiquer la brucellose au sein d’un troupeau (Vargas, 2002). Comme précisé antérieurement, il est d’une importance capitale qu’une fois les animaux infectés identifiés, de les éliminer correctement. Il

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ne servira à rien de se défaire de l’animal en le vendant à son voisin. A cet égard, le gouvernement central ou les gouvernements provinciaux devront jouer un rôle clef en cherchant la formule idéale pour indemniser les éleveurs des futures pertes engendrées par l’abattage de leurs animaux. Comme l’ont mentionné Blood et al. (1987), il convient de rappeler que la motivation qui incite au contrôle et à l’éradication de la brucellose, plus que les pertes économiques causées dans le secteur de l’élevage, devrait être la perte de vies humaines et les implications en santé publique. Indubitablement, le contrôle définitif de la brucellose chez l’homme dépendra de l’élimination de la maladie chez les réservoirs naturels (OPS & OMS, 2001; Saegerman et al., 2010).

(3) Prévention de l’infection: conformément au principe selon lequel la vaccination à elle seule ne peut venir à bout du problème, l’élimination des animaux infectés y arrivera (Corbel, 2006). Néanmoins, pour réaliser une élimination graduelle chez les animaux, il convient de protéger d’une façon ou d’une autre les animaux sains, et là, la vaccination joue un rôle. Il est évident que beaucoup de travail reste à faire concernant la planification d’un calendrier de vaccination, la formation du personnel sur la gestion correcte des registres et des vaccins (avant, pendant et après l’injection), mais aussi sur le contrôle rigoureux de la qualité des vaccins utilisés. Si un de ces points venait à faillir, l’animal ne serait pas correctement immunisé ou des problèmes d’interprétation des résultats des tests de diagnostic pourraient se poser.

(4) Éducation de la population: l’éducation de la population servira de mécanisme de prévention de la zoonose (Corbel, 2006; Doganay et al., 2003). Les points essentiels à traiter seraient: le danger de consommer le lait et les produits laitiers non pasteurisés, une attention particulière dans la gestion et manipulation des avortons et produits d’avortement, l’importance de la notification des cas humains et animaux (avortements), le danger lié à la manipulation des vaccins, l’éducation du personnel des abattoirs sur l’importance de l’utilisation de gants et d’un équipement de protection et le danger de consommer des aliments et/ou de fumer en manipulant des animaux. La FAO et l' OMS (1986) mettent l’accent sur l’éducation sanitaire des personnes comme moyen de prévention. Il est donc indispensable d’éduquer les propriétaires des UPAs à l’importance de la brucellose, non seulement pour leurs

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animaux et l’économie de leurs exploitations, mais aussi pour leurs proches, leur communauté et le pays en général.

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CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Dans le cadre des zoonoses, à savoir des infections ou maladies transmissibles de l’animal vertébré à l’homme, et inversement, de nombreuses recherches menées de par le monde démontrent que la brucellose est loin d’être sous contrôle, surtout dans les zones où elle est présente sous forme endémique. Toutefois, sa situation et sa distribution réelle ne sont pas clairement établies, notamment dans les régions où les rapports officiels sont basés sur un suivi épidémiologique passif (cas rapportés). L’appréciation erronée de la situation épidémiologique de la brucellose en Equateur, tant chez l’homme que chez les animaux, n’a pas permis de comprendre et d’apprécier l’ampleur du problème représenté par cette zoonose, qui est un aspect fondamental si des solutions adaptées à la réalité doivent être développées. Ce travail de thèse a éclairci, au travers de la revue de la littérature locale et de quatre sections expérimentales, la situation épidémiologique réelle de la brucellose bovine et son impact en santé publique, dans le nord-ouest de l’Equateur. Il a pu mettre en évidence que les brucelloses humaine et animale sont des maladies négligées en Equateur, et apporte l’information de base nécessaire afin de faire évoluer cet état des choses. La complexité du tableau clinique de la maladie chez l’homme, le sous-rapportage des cas, l’absence d’études épidémiologiques, l’utilisation d’un nombre limité de techniques diagnostiques (sans que les résultats soient validés par des laboratoires de référence internationaux), mais aussi le peu d’isolements et de typages de Brucella spp, sont tous des facteurs démontrant que la situation de la brucellose est méconnue en Equateur.

La combinaison des résultats obtenus grâce à l’application de tests multiples de diagnostic dans un modèle statistique basé sur le théorème de Bayes, a permis d’estimer les prévalences réelles des brucelloses bovine et humaine et les paramètres (sensibilité et spécificité) de chaque test inclus dans le modèle. Même si l’utilisation de tests multiples a permis de détecter un plus grand nombre d’animaux infectés, cette stratégie ne sera pas applicable, car trop onhéreux, pour le diagnostic de routine de la maladie en Equateur. Les résultats nous ont permis de conclure que l’iELISA serait le test de choix pour diagnostiquer la maladie, mais le test au Rose Bengale de devrait pas être mis de côté, au vu de sa réalisation aisée et de son très faible coût.

Les observations réalisées au cours de ce travail ont permis de démontrer l’existence de facteurs de risque qui pourraient influencer l’introduction et/ou le maintien de

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l’infection dans les exploitations; elles établissent aussi les bases permettant de contextualiser les actions à inclure dans les futurs programmes de contrôle en fonction de la zone épidémiologique (montagne et plaine côtière). L’information collectée répond à l’appel de l’OIE sur la possible compartimentation d’un territoire comme stratégie de contrôle et d’éradication d’une maladie. De plus, ce travail de thèse déclenche la sonnette d’alarme sur les conséquences de la vaccination anarchique des bovins et sur la circulation de Brucella spp. au sein des diverses espèces réservoirs potentielles. Les études ne devraient pas se limiter à des examens sérologiques, mais au contraire devraient aller jusqu’à l’isolement et au typage de Brucella spp. afin d’améliorer la compréhension des voies de transmission.

Ce travail de thèse met en avant que les efforts développés par les organismes officiels de contrôle et surtout par les propriétaires, se focalisent uniquement sur les bovins, chez qui les pertes économiques sont évidentes. L’existence d’autres réservoirs possibles, tels que, par exemple, les chiens, n’est pas considérée. Les enquêtes épidémiologiques ciblant la brucellose devraient être entreprises chez les réservoirs de l’infection, en standardisant la réalisation et l’interprétation des tests de diagnostic. Ce type d’investigation épidémiologique devrait être entrepris chez toutes les espèces sensibles et au sein de la population humaine (à risque ou non).

La brucellose humaine ne disparaîtra pas tant qu’elle n’est pas éradiquée chez les réservoirs animaux. Comme toute contamination humaine implique l’existence d’un foyer de l’infection, il est indispensable de coordonner les actions entre organismes officiels de contrôle vétérinaires et de santé publique (concept d’une seule santé proné par l’OIE – One Health). Il est fondamental qu’un laboratoire de référence national soit mis sur pied en Equateur, lequel devrait être en charge du contrôle de qualité des réactifs et des vaccins utilisés et des tests de diagnostic utilisés par les laboratoires publics et privés. La collaboration avec les laboratoires internationaux permettrait de disposer de sérums et souches de contrôle, mais favoriserait aussi le partage des connaissances et des savoirs-faire.

Pour conclure, l’information récoltée met en évidence que les brucelloses humaine et animale sont toujours un problème en Equateur. Une stratégie contextualisée, adaptée à

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la situation épidémiologique de chaque zone, devrait être élaborée pour contrôler la brucellose en Equateur.

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RÉFÉRENCES

Acha, P., & Szyfres, B. (2003). Brucellosis. In Pan American Health Organization (Ed.), Zoonosis ans communicables diseases common to mand and animal. (3rd Ed, p. 382). Wahington. Albornoz, G. (1970). Diagnóstico de brucelosis por la prueba de “Ring-test” en la provincia del Guayas a nivel de hacienda. Universidad Estatal de Guayaquil. Alton, G. ., Jones, L. ., Angus, R. ., & Verger, J. . (1988). Tecniques for the brucellosis laboratory. (I. N. de la recherche Agrpnomique, Ed.) (1st Ed). Paris. Alvarado, C. (1959). Indice brucelósico en bovinos del cantón Zaruma. Universidad Cental del Ecuador. Alvarado, L. (1995). Diagnóstico de brucelosis bovina en hembras sexualmente maduras por el método de card test en el cantón Paute, provincia del Azuay. Universidad de Cuenca. Ecuador. Alvarez, F., & Pillacela, C. (1985). Estudio de prevalencia de enfermedades zoonósicas diagnosticadas en a ciudad de Cuenca durante los años 1974 – 1983. Universidad de Cuenca. Ecuador. Alvarez, P. (2001). Situación de la brucelosis en América: panorama general. In Diagnóstico de brucelosis animal (pp. 9–16). Máxico. André, L., De Vel, V., Bcz-Cbl, P., Axelle, B., Renaat, D., Eddy, L., … Guy, V. (2013). Monitoring de la durabilité de la production laitière. Retrieved October 10, 2016, from http://www.ikm.be/content/files/010576_BCZ_Monitor Aragundi, R. (1969). Diagnóstico de brucelosis por la prueba de “Ring Test” en la provincia de Los Ríos. Universidad Estatal de Guayaquil. Ecuador. Araj, G. F., & Azzam, R. A. (1996). Seroprevalence of brucella antibodies among persons in high-risk occupation in Lebanon. Epidemiology and Infection, 117(2), 281–288. http://doi.org/10.1017/S095026880000145X Ariza, J., Corredoira, J., Pallares, R., Viladrich, P. F., Rufi, G., Pujol, M., & Gudiol, F. (1995). Characteristics of and Risk Factors for Relapse of Brucellosis in Humans. Clinical Infectious Diseases, 20(5), 1241–1249. http://doi.org/10.1093/clinids/20.5.1241 Arnaud-Bosq, C. (1977). Modélisation mathématique de l’épimiologie d’une anthropozoonose : la brucellose. Rev.Epidém. et Santé Publ., 25, 387–395. Arteaga, A. (1983). Identificación de anticuerpos contra brucelosis en ganado portador y vacunado mediante el uso de antígeno tamponado: Rosa de Bengala en la zona central de la provincia de Manabí. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador.

Arteaga, F., Navas, C., Obando, M., & Zambrano, F. (2002). Estudio del personal en riesgo de brucelosis en la cabecera cantonal de Portoviejo (Matarifes). Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Asiimwe, B. B., Kansiime, C., & Rwego, I. B. (2015). Risk factors for human brucellosis in agro-pastoralist communities of south western Uganda: a case- control study. BMC Research Notes, 8, 405. http://doi.org/10.1186/s13104-015- 1361-z Aznar, M. N., Samartino, L. E., Humblet, M. F., & Saegerman, C. (2014). Bovine Brucellosis in Argentina and Bordering Countries: Update. Transboundary and Emerging Diseases, 61(2), 121–133. http://doi.org/10.1111/tbed.12018 Baek, B. K., Lim, C. W., Rahman, M. S., Kim, C.-H., Oluoch, A., & Kakoma, I. (2003). Brucella abortus infection in indigenous Korean dogs. Canadian Journal of Veterinary Research = Revue Canadienne de Recherche Vétérinaire, 67(4), 312–4. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14620870 Bailon, A., & Muñoz, J. (2003). Prevalencia de brucelosis en bovinos sacrificados en el matadero del cantón Chone, mediante la prueba de seroaglutinación rápida en placa, desde diciembre del 2002 a marzo del 2003. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Bankole, A. A., Saegerman, C., Berkvens, D., Fretin, D., Geerts, S., Ieven, G., & Walravens, K. (2010). Phenotypic and genotypic characterisation of Brucella strains isolated from cattle in the Gambia. The Veterinary Record, 166(24), 753–6. http://doi.org/10.1136/vr.b4862 Bautista, M., & Ochoa, V. (2001). Técnicas de inmunoenzayo ligadas a enzimas. In E. Díaz, L. Hernández, G. Valero, & B. Arellano (Eds.), Diagnóstico De Brucelosis Animal (pp. 92–95). México. Benítez,-Ortiz, W., Gómez, I., & Cruz, K. (1986). Ganadería Caprina en Centro Loja. (C. A. de T. R. – CATER, Ed.). Loja. Ecuador: Universidad Nacional de Loja. Consejo Nacional de Universidades y Escuelas Politécnicas. Benítez-Ortiz, W. (1982). Proyecto Caprino Zapotillo. Loja, Ecuador: Proyecto regional para desarrollo del sur de Ecuador – PREDESUR. Bercovich, Z. (2000). The use of skin delayed-type hypersensitivity as an adjunct test to diagnose brucellosis in cattle: a review. The Veterinary Quarterly, 22(3), 123–30. http://doi.org/10.1080/01652176.2000.9695040

204

Bercovich, Z., Haagsma, J., van Lipzig, J. H., & Taaijke, R. (1993). Specificity of the skin delayed-type hypersensitivity test in brucellosis free cattle tested with a Brucella allergen. Zentralblatt Für Veterinärmedizin. Reihe B. Journal of Veterinary Medicine. Series B, 40(8), 582–8. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8122447 Bercovich, Z., & Lagendijk, W. (1978). A modified milk ring test for detecting Brucella agglutinins in bulk tank coolers. Tijdschrift Voor Diergeneeskunde, 103(8), 407– 16. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/417422 Bercovich, Z., & Taaijke, R. (1990). Enzyme immunoassay using mouse monoclonal anti-bovine antibodies for the detection of Brucella abortus antibodies in cow milk. Zentralblatt Für Veterinärmedizin. Reihe B. Journal of Veterinary Medicine. Series B, 37(10), 753–9. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2127977 Berkvens, D., Speybroeck, N., Praet, N., Adel, A., & Lesaffre, E. (2006). Estimating Disease Prevalence in a Bayesian Framework Using Probabilistic Constraints. Epidemiology, 17(2), 145–153 10.1097/01.ede.0000198422.64801.8d. http://doi.org/10.1097/01.ede.0000198422.64801.8d Betancourt, R., Guerrero, I., & Román, J. (2002). Incidencia de brucelosis en las mujeres embarazadas que acuden a las unidades operativas del Area No1 de la dirección de salud de Manabí. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Bhongbhibhat, N., Elberg, S., & Chen, T. H. (1970). Characterization of Brucella Skin- Test Antigens. Journal of Infectious Diseases, 122(1-2), 70–82. http://doi.org/10.1093/infdis/122.1-2.70 Birhanu, H., Fikru, R., Said, M., Kidane, W., Gebrehiwot, T., Hagos, A., … Büscher, P. (2015). Epidemiology of Trypanosoma evansi and Trypanosoma vivax in domestic animals from selected districts of Tigray and Afar regions, Northern Ethiopia. Parasites & Vectors, 8. http://doi.org/10.1186/s13071-015-0818-1 Blasco, J. M. (2001). Profilaxis médica de la brucelosis en los rumientes: las vacunas clásicas y las nuevas vacunas. In E. Díaz, L. Hernández, G. Valero, & B. Arellano (Eds.), Diagnóstico De Brucelosis Animal (pp. 158–179). Blood, D., Henderson, J., & Radostits, O. (1987). Enfermedades causadas por diversas especies de Brucella. In Medicina Veterinaria (pp. 522–540). México: Intramericana.

205

Boukary, A. R., Saegerman, C., Abatih, E., Fretin, D., Alambédji Bada, R., De Deken, R., … Thys, E. (2013). Seroprevalence and potential risk factors for Brucella spp. infection in traditional cattle, sheep and goats reared in urban, periurban and rural areas of Niger. PloS One, 8(12), e83175. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0083175 Bowden, R. (1996). Temas de Microbiología Veterinaria. In Stanchi, B. Brihuega, P. Martino, E. Gentilini, & E. Reinoso (Eds.), Sur (Primera, pp. 159–175). Buenos Aires Argentina. Branscum, A., Gardner, I., Wagner, B., McInturff, P., & Salman, M. (2005). Effect of diagnostic testing error on intracluster correlation coefficient estimation. Preventive Veterinary Medicine, 69(1), 63–75. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2005.01.015 Bricker, B. J. (2002). Diagnostic strategies used for the identification of Brucella. Veterinary Microbiology, 90(1), 433–434. http://doi.org/10.1016/S0378- 1135(02)00227-4 Bricker, B. J., & Halling, S. M. (1994). Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 32(11), 2660–6. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7852552 Bricker, B. J., & Halling, S. M. (1995). Enhancement of the Brucella AMOS PCR assay for differentiation of Brucella abortus vaccine strains S19 and RB51. Journal of Clinical Microbiology, 33(6), 1640–2. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7650203 Brito, M., & González, C. (2001). Presencia de brucelosis bovina en el cantón Bolívar, provincia de Manabí. Pontificia Universidad Católica del Ecuador. Buzgan, T., Karahocagil, M. K., Irmak, H., Baran, A. I., Karsen, H., Evirgen, O., & Akdeniz, H. (2010). Clinical manifestations and complications in 1028 cases of brucellosis: a retrospective evaluation and review of the literature. International Journal of Infectious Diseases, 14(6), e469–e478. http://doi.org/10.1016/j.ijid.2009.06.031 Caraguel, C., Stryhn, H., Gagné, N., Dohoo, I., & Hammell, L. (2012). Use of a third class in latent class modelling for the diagnostic evaluation of five infectious salmon anaemia virus detection tests. Preventive Veterinary Medicine, 104(1),

206

165–173. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2011.10.006 Cartelle, M., Holban, A. M., Escalante, S., & Cevallos, M. (2015). Epidemiology of Tropical Neglected Diseases in Ecuador in the Last 20 Years. PloS One, 10(9), e0138311. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0138311 Carter, G. . (1985). Brucelosis. In Bacteriología y Micología Veterinaria (pp. 230–238). México: El Manual Moderno. Castro, E., & Zhunbio, R. (1989). Prevalencia de brucelosis bovina por los métodos de seroaglutinación en placa y card test, en el cantón Lomón – Indanza. Universidad de Cuenca. Ecuador. Castro, H. A., González, S. R., & Prat, M. I. (2005). Brucelosis: una revisión práctica. Acta Bioquím. Clín. Latinoam, 39(2), 203–216. Chamorro, A. (1972). Incidencia de la brucelosis en la provincia de Napo. Universidad Central del Ecuador. Chauvin, P. (1969). Diagnóstico de brucelosis en bovinos de la provincia de Loja, por el método cromatográfico de Castañeda, controlado por el método de Huddleson. Universidad Nacional de Loja. Ecuador. Chukwu, C. C. (1985). Evaluation of brucellin skin test for bovine brucellosis. International Journal of Zoonoses, 12(1), 6–13. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3932248 Cobos, L., Peña, G., Romero, C., Velázquez, F., Velázquez, M., Vicencio, M., … Betancourt, X. (2001). Fijación de Complemento. In E. Díaz, L. Hernández, G. Valero, & B. Arellano (Eds.), Diagnóstico De Brucelosis Animal (pp. 56–79). México. Collin, J. C. (1976). [The role of the different immunoglobulins in the milk ring test used for the detection of brucellosis (author’s transl)]. Annales de Microbiologie, 127B(2), 177–87. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/999126 Corbel, M. (2006). Brucellosis in humans and animals. Geneva Switzerland: World Health Organization. Corbel, M. J. (1985). Recent advances in the study of Brucella antigens and their serological cross-reactions. Vet. Bull., 55, 927–942. Cordero, J. (1978). Investigación de brucelosis bovina en los cantones Eloy Alfaro y Esmeraldas de la provincia de Esmeraldas. Universidad Técnica de Manabí. Córdova, G. (1970). Diagnóstico de brucelosis por medio de la prueba Rring Test en la

207

provincia del Guayas a nivel de haciendas. Universidad de Guayaquil. Ecuador. Corner, L. A., & Alton, G. G. (1981). Persistence of Brucella abortus strain 19 infection in adult cattle vaccinated with reduced doses. Research in Veterinary Science, 31(3), 342–4. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6805054 Crawford, R., Huber, J., & Adams, B. (1990). Epidemiology and surveillance. In K. Nielsen & J. R. Duncan (Eds.), Animal Brucellosis (pp. 131–151). Boca Raton: CRC. Crespo, T. (1999). Diagnóstico de brucelosis en bovinos hembras sexualmente maduras a nivel de camal de Cuenca, por el método de card test. Universidad Católica de Cuenca. Ecuador. Cuenca, D. (2013). Estudio epidemiológico de brucelosis humana y animal en la Hacienda San Antonio, ESPE Santo Domingo. Universidad de las Fuerzas Armadas. De Bolle, X., Crosson, S., Matroule, J.-Y., & Letesson, J.-J. (2015). Brucella abortus Cell Cycle and Infection Are Coordinated. Trends in Microbiology, 23(12), 812– 821. http://doi.org/10.1016/j.tim.2015.09.007 Delgado, K. (1989). Diagnóstico de brucelosis bovina, mediante la prueba de aglutinación rápda y antígeno brucelar amortiguado. Universidad de Cuenca. Ecuador. Delgado, P. (1992). Diagnóstico de brucelosis en trabajadores de centros de procesamiento de cárnicos de Cuenca, mediante seroaglutinación rápida en placa. Universidad de Cuenca. Ecuador. Demera, T., Farfán, G., Ortega, B., & Intriago, A. (2002). Prevalencia de brucelosis bovina y porcina en los camales de las cabeceras cantorales de la provincia de Manabí. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Dendukuri, N., & Joseph, L. (2001). Bayesian Approaches to Modeling the Conditional Dependence Between Multiple Diagnostic Tests. Biometrics, 57(1), 158–167. http://doi.org/10.1111/j.0006-341X.2001.00158.x Díaz, E., Blasco, J. M., & Suárez, F. (1999). Prueba de tarjeta modificada para el diagnóstico de la brucelosis caprina. Vet. Mex, 30(4), 307. Díaz, E., Hernández, L., Valero, G., & Arellano, B. (Eds.). (2001). Introducción. In Diagnóstico de brucelosis animal (pp. 1–16). México: INIFAP. Díaz, R., Leiva, J., Rubio, M., & Dorronsoro, L. (2001). Diagnóstico de la brucelosis

208

humana. In E. Díaz, L. Hernández, G. Valero, & B. Arellano (Eds.), Diagnóstico de brucelosis animal (pp. 198–212). México: INIFAP. Doganay, M., Aygen, B., Corbel, M. J., Roux, J., Shapiro, D. S., Wong, J. D., … al., et. (2003). Human brucellosis: an overview. International Journal of Infectious Diseases, 7(3), 173–182. http://doi.org/10.1016/S1201-9712(03)90049-X Dohoo, I. R., Wright, P. F., Ruckerbauer, G. M., Samagh, B. S., Robertson, F. J., & Forbes, L. B. (1986). A comparison of five serological tests for bovine brucellosis. Canadian Journal of Veterinary Research = Revue Canadienne de Recherche Vétérinaire, 50(4), 485–93. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3539295 Domenech, J., Lucet, P., Vallat, C., & Stewart, B. (1980). La brucellose bovine en Afrique central. II: Étude clinique et épidemiologique: particularités régionales et problèmes de lélevage semi-intensif. Rev. Élev. Méd. Vét. Pays. Trop., 33, 277– 284. Dorneles, E. M. S., Lima, G. K., Teixeira-Carvalho, A., Araújo, M. S. S., Martins-Filho, O. A., Sriranganathan, N., … Lage, A. P. (2015). Immune Response of Calves Vaccinated with Brucella abortus S19 or RB51 and Revaccinated with RB51. PloS One, 10(9), e0136696. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0136696 Dorny, P., Phiri, I. ., Vercruysse, J., Gabriel, S., Willingham, A. ., Brandt, J., … Berkvens, D. (2004). A Bayesian approach for estimating values for prevalence and diagnostic test characteristics of porcine cysticercosis. International Journal for Parasitology, 34(5), 569–576. http://doi.org/10.1016/j.ijpara.2003.11.014 Doutre, M Fensterban, R Sagna, F. (1977). Etude de la brucellose bovine dans un village de Basse-Casamance (Sénégal). Rev. Élev. Méd. Vét. Pays Trop., 30, 345– 351. Encalada, M. (1963). Investigación de la brucelosis en el cerdo, en muestras tomadas en el matadero municipal de Guayaquil. Universidad Estatal de Guayaquil. Ecuador. England, T., Kelly, L., Jones, R. ., MacMillan, A., & Wooldridge, M. (2004). A simulation model of brucellosis spread in British cattle under several testing regimes. Preventive Veterinary Medicine, 63(1), 63–73. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2004.01.009 Enøe, C., Georgiadis, M. P., & Johnson, W. O. (2000). Estimation of sensitivity and

209

specificity of diagnostic tests and disease prevalence when the true disease state is unknown. Preventive Veterinary Medicine, 45(1), 61–81. http://doi.org/10.1016/S0167-5877(00)00117-3 Estupiñan, P. (1967). Incidencia de las leches positivas a brucelosis por “Ring-test” en las pasteurizadotas de Quito y Cayambe. Universidad Central del Ecuador. Falade, S. (1978). A comparison of three serological tests in the diagnosis of caprine brucellosis. Research in Veterinary Science, 24(3), 376–7. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/97740 Falconí, C. (1972). Investigación de brucelosis bovina a nivel de haciendas en la costa norte de Manabí (Cojimíes, Pedernales, 10 de Agosto, Jama, San Vicente y Leonidas Plaza) por el método de milk ring test. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. FAO, & OMS. (1986). Joint FAO/OMS Comité Mixte d’Experts de la brucelloses 6ème Rapport. Genève (Suisse). Farrell, I. D. (1974). The development of a new selective medium for the isolation of Brucella abortus from contaminated sources. Research in Veterinary Science, 16(3), 280–6. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4369280 Fensterbank, R., & Pardon, P. (1977). [Allergic diagnosis of bovine brucellosis. 1. Conditions for the use of a purified protein allergen: brucellin (author’s transl)]. Annales de Recherches Vétérinaires. Annals of Veterinary Research, 8(2), 187–93. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/413466 Fernández, F., & Peña, J. (1991). Diagnóstico de brucelosis en bovinos hembras sexualmente maduros a nivel de camal por el método de card test. Universidad de Cuenca. Ecuador. Fosgate, G. T., Adesiyun, A. A., Hird, D. W., Johnson, W. O., Hietala, S. K., Schurig, G. G., & Ryan, J. (2002). Comparison of serologic tests for detection of Brucella infections in cattle and water buffalo (Bubalus bubalis). American Journal of Veterinary Research, 63(11), 1598–605. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12428673 Galán, J. (1969). Determinación de la incidencia de brucelosis por medio de la prueba se suero aglutinación rápida, en la zona del cantón Daule. Universidad Estatal de Guayaquil. Ecuador. García, M. (1970). Determinación de la brucelosis bovina, en los principales hatos

210

lecheros del cantón Chone, Rocafuerte y Portoviejo por el método de “ring test.” Universidad de Portoviejo. Ecuador. García-Carrillo, C. (1987). La brucelosis de los animales en América y su relación con la infección humana. Office international des épizooties. Garin, B., Trap, D., & Gaumont, R. (1985). Assessment of the EDTA seroagglutination test for the diagnosis of bovine brucellosis. The Veterinary Record, 117(17), 444– 5. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3934838 Garin-Bastuji, B. (1993). Le dépistage de la brucellose des ruminants et ses difficultés. Le cas des sérologie atypiques en brucellose bovine. Point. Vét., 25, 115–124. Gavazzi, G., Prigent, D., Baudet, J. M., Banoita, S., & Daoud, W. (1997). [Epidemiologic aspects of 42 cases of human brucellosis in the Republic of Djibouti]. Médecine Tropicale : Revue Du Corps de Santé Colonial, 57(4), 365–8. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9612778 Gelman, A., & Rubin, D. B. (1992). Inference from Iterative Simulation Using Multiple Sequences. Statistical Science, 7(4), 457–472. http://doi.org/10.1214/ss/1177011136 Gerbier, G., Garin-Bastuji, B., Pouillot, R., Véry, P., Cau, C., Berr, V., … Moutou, F. (1997). False positive serological reactions in bovine brucellosis: evidence of the role of Yersinia enterocolitica serotype O:9 in a field trial. Veterinary Research, 28(4), 375–83. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9257445 Geurden, T., Berkvens, D., Geldhof, P., Vercruysse, J., & Claerebout, E. (2006). A Bayesian approach for the evaluation of six diagnostic assays and the estimation of Cryptosporidium prevalence in dairy calves. Veterinary Research, 37(5), 671–682. http://doi.org/10.1051/vetres:2006029 Gil, A., & Samartino, L. E. (2001). Zoonois en los sistemas de producción animal de las áreas urbanas y periurbanas de América Latina (Livestock Policy Discussi on Pap er No. 2). Godfroid, J., & Boelaert, F. (1995). Prescriptions pour le diagnostic sérologique de la brucellose. Belgium: CODA-CERVA (Ed.), 47. Godfroid, J., Cloeckaert, A., Liautard, J.-P., Kohler, S., Fretin, D., Walravens, K., … Letesson, J.-J. (2005). From the discovery of the Malta fevers agent to the discovery of a marine mammal reservoir, brucellosis has continuously been a re- emerging zoonosis. Veterinary Research, 36(3), 313–326.

211

http://doi.org/10.1051/vetres:2005003 Godfroid, J., & Käsbohrer, A. (2002). Brucellosis in the European Union and Norway at the turn of the twenty-first century. Veterinary Microbiology, 90(1), 135–145. http://doi.org/10.1016/S0378-1135(02)00217-1 Godfroid, J., Michel, P., Uytterhaegen, L., De Smedt, C., Rasseneur, F., Boelaert, F., Saegerman, C., Patrigny, X. (1994). Brucellose enzootique à Brucella suis biotype 2 chaez le sanglier (Sus scrofa) en Belgique. Annales de Médécine Vétérinair, 138, 263–268. Godfroid, J., Nielsen, K., & Saegerman, C. (2010). Diagnosis of brucellosis in livestock and wildlife. Croatian Medical Journal, 51(4), 296–305. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20718082 Godfroid, J., Saegerman, C., Wellemans, V., Walravens, K., Letesson, J.-J., Tibor, A., … Garin-Bastuji, B. (2002). How to substantiate eradication of bovine brucellosis when aspecific serological reactions occur in the course of brucellosis testing. Veterinary Microbiology, 90(1), 461–477. http://doi.org/10.1016/S0378- 1135(02)00230-4 Gómez, M. C., Nieto, J. A., Rosa, C., Geijo, P., Escribano, M. A., Muñoz, A., & López, C. (2008). Evaluation of seven tests for diagnosis of human brucellosis in an area where the disease is endemic. Clinical and Vaccine Immunology : CVI, 15(6), 1031–3. http://doi.org/10.1128/CVI.00424-07 Gómez, T. (1964). Estudio de la epizootiología y el diagnóstico de la brucelosis bovina en el litoral Ecuatoriano. Universidad Estatal de Guayaquil. Ecuador. Granda, B. (1972). Incidencia de brucelosis caprina en el cantón Macará por el método de Huddleson. Universidad Nacional de Loja. Haley, C., Wagner, B., Puvanendiran, S., Abrahante, J., & Murtaugh, M. P. (2011). Diagnostic performance measures of ELISA and quantitative PCR tests for porcine circovirus type 2 exposure using Bayesian latent class analysis. Preventive Veterinary Medicine, 101(1), 79–88. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2011.05.001 Halling, S., & Boyle, S. (2002). Foreword (Editorial). Vet. Microbiol., 90, 1–4. Hasanjani Roushan, M. R., Ebrahimpour, S., & Moulana, Z. (2016). Different Clinical Presentations of Brucellosis. Jundishapur Journal of Microbiology, 9(4), e33765. http://doi.org/10.5812/jjm.33765

212

Hernández-Bastida, A., García-Ramírez, P., Cruz-Estrada, A., & Rojo, J. (1999). Seroprevalencia de brucelosis en disponentes de sangre del Hospital General de México. Revista Médica Del Hospital General de México, 62(2), 107–112. Herrera, W. (2003). Diagnóstico de brucelosis en los hatos bovinos, mediante el método de sero aglutinación en la zona de Santo Domingo de los Colorados. Universidad Laica Eloy Alfaro – Extensión en El Carmen. Ecuador. Herrick, J. A., Lederman, R. J., Sullivan, B., Powers, J. H., & Palmore, T. N. (2014). Brucella arteritis: clinical manifestations, treatment, and prognosis. The Lancet. Infectious Diseases, 14(6), 520–6. http://doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70270-6 Huber, J., & Nicoletti, P. (1986). Comparison of the results of card, rivanol, complement fixation and milk ring test with the isolation rate of Brucella abortus from cattle. Am. J. Vet. Res., 47, 1529–1531. INEC, MAG, & SICA. (2002). ECUADOR - Agricultural Census 1999/2000 – Main Results. Retrieved July 20, 2016, from http://www.fao.org/fileadmin/templates/ess/ess_test_folder/World_Census_Agricu lture/Country_info_2000/Reports_2/ECU_SPA_REP_2000.pdf Intriago, W. (1971). Investigación de brucelosis en porcinos sacrificados en el matadero de la ciudad de Portoviejo, mediante la prueba de sero-aglutinación en placa. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Jimenez de Bagues, M.-P., Dudal, S., Dornand, J., & Gross, A. (2005). Cellular bioterrorism: how Brucella corrupts macrophage physiology to promote invasion and proliferation. Clinical Immunology, 114(3), 227–238. http://doi.org/10.1016/j.clim.2004.07.010 Kadri, S. M., Rukhsana, A., Laharwal, M. A., & Tanvir, M. (2000). Seroprevalence of brucellosis in Kashmir (India) among patients with pyrexia of unknown origin. Journal of the Indian Medical Association, 98(4), 170–1. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11016178 Kang, G. J., Gunaseelan, L., & Abbas, K. M. (2014). Epidemiological Modeling of Bovine Brucellosis in India. Proceedings : ... IEEE International Conference on Big Data. IEEE International Conference on Big Data, 2014, 6–10. http://doi.org/10.1109/BigData.2014.7004420 Kelser, R., & Schoening, H. (1946). Orden “Eubacteriales”, familla “Parvobacteriaceae” (continuación), tribu “Brucelleae”. Organismos del gérnero “Brucella.” In Manual

213

De Bacteriología Veterinaria (pp. 224–240). Madrid - España. Lambert, G., Deyoe, B. L., & Painter, G. M. (1964). POSTVACCINAL PERSISTENCE OF BRUCELLA ABORTUS STRAIN 19 IN TWO BULLS. Journal of the American Veterinary Medical Association, 145, 909–11. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14231083 Leal-Klevezas, D. S., Martı́nez-Vázquez, I. O., Garcı́a-Cantú, J., López-Merino, A., & Martı́nez-Soriano, J. P. (2000). Use of polymerase chain reaction to detect Brucella abortus biovar 1 in infected goats. Veterinary Microbiology (Vol. 75). http://doi.org/10.1016/S0378-1135(00)00200-5 Lesaffre, E., Speybroeck, N., & Berkvens, D. (2007). Bayes and diagnostic testing. Veterinary Parasitology, 148(1), 58–61. http://doi.org/10.1016/j.vetpar.2007.05.010 Loor, S., & Moreira, S. (1986). Prevalencia de brucelosis bovina en el valle del río Portoviejo durante 1984 – 1985. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Lord, V., Rolo, M., & Cherwonogrodsky, J. (1989). Evaluation of humoral immunity to Brucella sp. in cattle by use of an agar gel immunodiffusion test containing polysaccharide antigen. Am. J. Vet. Res., 50, 1813–1816. Lucero, N. E., Ayala, S. M., Escobar, G. I., & Jacob, N. R. (2008). Brucella isolated in humans and animals in Latin America from 1968 to 2006. Epidemiology and Infection, 136(4), 496–503. http://doi.org/10.1017/S0950268807008795 Luna-Martínez, J. E., & Mejía-Terán, C. (2002). Brucellosis in Mexico: Current status and trends. Veterinary Microbiology. http://doi.org/10.1016/S0378- 1135(02)00241-9 Luna-Martínez, J., & Mateos, A. (2001). Campaña de control de la brucelosis. In E. Díaz, L. Hernández, G. Valero, & B. Arellano (Eds.), Diagnóstico de brucelosis animal (pp. 213–216). México. Macías, F. (1977). Investigación de brucelosis humana a nivel de centros de salud y hospital regional de la ciudad de Portoviejo. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador . Macmillan, A. (1990). Conventional serological tests. In K. Nielsen & J. Duncan (Eds.), Animal Brucellosis (pp. 153–197). Boca Raton: CRC. MAG-SESA. (1999). Prevención y control de la brucelosis bovina en Ecuadorle. Quito. Maldonado, P., & Salgado, G. (1979). Diagnóstico de la brucelosis con antígeno

214

tamponado y la prueba de inactivación por calor a 65°C, en muestras positivas y sospechosas a la aglutinación rápida en placa. Universidad Central del Ecuador. Mammerickx, M. (1990). Cronin et l’histoire des brucelloses. Ann. Méd. Vét., 134, 77– 79. Manthei, C. A. (1952). Evaluation of vaccinal methods and doses of brucella abortus strain 19. Proceedings of the 56th Annual Meeting of Livestock Sanitation Association, 115–125. Manzano, C. (1974). Indice de brucelosis, en tres zonas de la provincia de Tungurahua. Universidad Central del Ecuador. Marín, C., & Blasco, J. (2001). Diagnóstico bacteriológico de la bruecelosis animal. In E. Díaz, L. Hernández, G. Valero, & B. Arellano (Eds.), Diagnóstico De Brucelosis Animal (pp. 28–55). Máxico. Martínez, A., & Proaño, M. (1997). Determinación de la prevalencia de brucella canis en las clínicas veterinarias de la ciudad de Quito. Universidad Central del Ecuador. Massenet, D., Djime, O., & Karifene, R. (1993). Enquête séroépidémiologique sur la brucellose, chez le personnel des abattoirs de N’Djamena (TCHAD). Med. Tropical, 53, 253–255. Maquart, M., Le Fleche, P., Foster, G., Tryland, M., Ramisse, F, Djonne, B., Dahouj, S. A., Jacques, I., Neubauer, H., Walravens, K, Godfroid, J., Cloeckaert, A., & Vergnaud, G. (2009) MLVA-16 typing of 295 marine mammal Brucella isolates from different animal and geographic origins identifies 7 major groups within Brucella ceti and Brucella pinnipedialis. BMC Microbiol. , 9, 145. Mellado, A. (1996). Género Brucella, Legionella y Pasteurella. In J. García-Rodríguez & J. Picazo (Eds.), Microbiología Médica (pp. 267–278). España. Memish, Z. A., & Balkhy, H. H. (2004). Brucellosis and International Travel. Journal of Travel Medicine, 11(1). Memish, Z., Almuneef, M., Mah, M. W., Qassem, L. A., & Osoba, A. O. (2002). Comparison of the Brucella Standard Agglutination Test with the ELISA IgG and IgM in patients with Brucella bacteremia. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 44(2), 129–132. http://doi.org/10.1016/S0732-8893(02)00426-1 Meyer, M. E., & Nelson, C. J. (1969). Persistence of Brucella abortus, strain 19 infection in immunized cattle. In Proceedings, annual meeting of the United States

215

Animal Health Association (Vol. 73, p. 159). Mora, E. (1971). Determinación de la brucelosis bovina por medio de la prueba de sero-aglutinación en placa, en las ganaderías de la parroquia San Antonio, del cantón Chone. Universidad de Portoviejo. Ecuador. Moreno, E. (2002). Brucellosis in Central America. Veterinary Microbiology, 90(1), 31–38. http://doi.org/10.1016/S0378-1135(02)00242-0 Moriyón, I., & López-Goñi, I. (2001). Estructura, genética y fisiología del género Brucella. In E. Díaz, L. Hernández, G. Valero, & B. Arellano (Eds.), Diagnóstico De Brucelosis Animal (pp. 17–27). Máxico. Muma, J. B., Godfroid, J., Samui, K. L., & Skjerve, E. (2007). The role of Brucella infection in abortions among traditional cattle reared in proximity to wildlife on the Kafue flats of Zambia. Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics), 26(3), 721–30. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18293620 Nérette, P., Stryhn, H., Dohoo, I., & Hammell, L. (2008). Using pseudogold standards and latent-class analysis in combination to evaluate the accuracy of three diagnostic tests. Preventive Veterinary Medicine, 85(3), 207–225. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2008.01.011 Nicoletti, P. (1980). The epidemiology of bovine brucellosis. Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, 24, 69–98. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6779513 Nicoletti, P. (1981). Prevalence and persistence of Brucella abortus strain 19 infections and prevalence of other biotypes in vaccinated adult dairy cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association, 178(2), 143–5. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6782064 Nicoletti, P. (2001). Immune Responses and Vaccination. In M. Madkour (Ed.), Madkour’s Brucellosis (pp. 267 – 274). Germany: Springer-Verlag. Nicoletti, P. (2002). A short history of brucellosis. Veterinary Microbiology, 90(1), 5–9. http://doi.org/10.1016/S0378-1135(02)00209-2 Nicoletti, P., & Milward, F. W. (1983). Protection by oral administration of brucella abortus strain 19 against an oral challenge exposure with a pathogenic strain of Brucella. American Journal of Veterinary Research, 44(9), 1641–3. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6414347

216

Nielsen, K. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Veterinary Microbiology, 90(1), 447–459. http://doi.org/10.1016/S0378-1135(02)00229-8 Nieto, E. (1981). Investigación y diagnóstico de brucelosis en las ganaderías bovinas de los cantones Santa Rosa y Arenillas de la provincia de El Oro, mediante la prueba de ring test. Universidad de Guayaquil. Ecuador. OIE. (2000). Brucellose. In OIE (Ed.), Histoire De La Surveillance Et Du Contrôl Des Maladies Animales Transmissibles. Office International des Epizooties (pp. 261– 262). Paris - France. OIE. (2016a). CHAPTER 2.1.4 Brucellosis (Brucella abortus, B. mellitensis and B. suis). Retrieved July 20, 2016, from http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/2.01.04_BRUCEL LOSIS.pdf OIE. (2016b). WAHIS Interface. Retrieved July 20, 2016, from http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Countryinformation/Animalpopulati on Olleague, O. (1969). Determinación de la incidencia de la brucelosis por medio de la prueba “ring test”, en las ganaderías de la provincia de El Oro. Universidad Estatal de Guayaquil. Ecuador. Olsen, S. C., & Stoffregen, W. S. (2005). Essential role of vaccines in brucellosis control and eradication programs for livestock. Expert Review of Vaccines, 4(6), 915–928. http://doi.org/10.1586/14760584.4.6.915 OPS, & OMS. (2001). Panel: Zoonosis de importancia para la economía y para la salud públina. Brucelosis y Tuberculosis bovina : Control o eliminación. XII Reunión a nivel ministerial en salud y agricultura. Brasil. Orduña, A., Almaraz, A., Prado, A., Gutierrez, M. P., Garcia-Pascual, A., Dueñas, A., … Torres, A. R. (2000). Evaluation of an immunocapture-agglutination test (Brucellacapt) for serodiagnosis of human brucellosis. Journal of Clinical Microbiology, 38(11), 4000–5. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11060059 Órgano del Gobierno Del Ecuador. Registro Oficial, Pub. L. No. 31 de Marzo - 409 (1981). Ecuador. Órgano del Gobierno Del Ecuador. Registro Oficial, Pub. L. No. 10 de Agosto 1008 (1996). Ecuador.

217

Ortega-Sánchez, J. L., Martínez-Romero, A., García-Luján, C., & Rodríguez-Martínez, R. (2009). Seroprevalencia de brucelosis caprina en el municipio de Tlahualilo, Durango. México. REDVET. Revista Electrónica de Veterinaria, 10(4). Ortiz, F. (1962). Investigación de la brucelosis caprina en la provincia del Guayas. Universidad Estatal de Guayaquil. Ecuador. Ouahrani-Bettache, S., Soubrier, M., & Liautard, J. (1996). IS6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and strains. J. Appl .Bacteriol., 81(2), 154–160. Pacheco, W. A., Genovez, M. E., Pozzi, C. R., Silva, L. M. P., Azevedo, S. S., Did, C. C., … Gambarini, M. L. (2012). Excretion of Brucella abortus vaccine B19 strain during a reproductive cycle in dairy cows. Brazilian Journal of Microbiology : [Publication of the Brazilian Society for Microbiology], 43(2), 594–601. http://doi.org/10.1590/S1517-83822012000200022 PANAFTOSA. (2000). Brucelosis y Tuberculosis, situación de los programas en las Américas (No. 1). Rio de Janeiro, Brasil. Pappas, G., Akritidis, N., Bosilkovski, M., & Tsianos, E. (2005). Brucellosis. New England Journal of Medicine, 352(22), 2325–2336. http://doi.org/10.1056/NEJMra050570 Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., & Tsianos, E. V. (2006). The new global map of human brucellosis. The Lancet Infectious Diseases, 6(2), 91–99. http://doi.org/10.1016/S1473-3099(06)70382-6 Pasquereau, C. (1980). La brucellose. In G. Bretenet, G. Delclos, M. Mombard, R. Lignères, & C. Pasquereau (Eds.), La Santé Anmale (pp. 74–141). Frances. Pila-Pérez, R., Pila-Peláez, R., Paulino-Basulto, M., Hernández-Pupo, O., Gacía-Peña, J. G., & del Sol-Torres, G. (1997). Estudio clínico de la brucelosis humana. Rev Med Urug, 110–117. Plaza, J. (1977). Diagnóstico de brucelosis bovina en la población del cantón Puján, provincia de Manabí, mediante la prueba de sero-aglutinación en placa. Departamento de. Universidad de Guayaquil. Ecuador. Plaza, L. (1970). Diagnóstico del aborto de Bang en el ganado vacuno de los cantones Chone, Rocafuerte y Bolívar. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Pouillot, R., Garin-Bastuji, B., Gerbier, G., Coche, Y., Cau, C., Dufour, B., & Moutou, F. (1997). The Brucellin skin test as a tool to discriminate false positive serological

218

reactions in bovine brucellosis. Veterinary Research, 28(4), 365–74. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9257444 Poulsen, K. P., Hutchins, F. T., McNulty, C. M., Tremblay, M., Zabala, C., Barragan, V., … Bethel, J. W. (2014). Brucellosis in dairy cattle and goats in northern Ecuador. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 90(4), 712–5. http://doi.org/10.4269/ajtmh.13-0362 Praud, A., Gimenez, O., Zanella, G., Dufour, B., Pozzi, N., Antras, V., … Garin- Bastuji, B. (2012). Estimation of sensitivity and specificity of five serological tests for the diagnosis of porcine brucellosis. Preventive Veterinary Medicine, 104(1), 94–100. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2011.10.014 Quinde, P. (1959). Diagnóstico de la brucelosis bovina de la hoya de Loja. Universidad Nacional de Loja. Ecuador. Radostits, O. (2001). Herd Health – Food Animal Production Medicine. New York: W.B. Saunders Company. Ragan, V. E. (2002). The Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS) brucellosis eradication program in the United States. Veterinary Microbiology, 90(1), 11–18. http://doi.org/10.1016/S0378-1135(02)00240-7 Rahman, A. K. M. A., Dirk, B., Fretin, D., Saegerman, C., Ahmed, M. U., Muhammad, N., … Abatih, E. (2012). Seroprevalence and Risk Factors for Brucellosis in a High-Risk Group of Individuals in Bangladesh. http://dx.doi.org/10.1089/fpd.2011.1029. Rahman, A. K. M. A., Saegerman, C., Berkvens, D., Fretin, D., Gani, M. O., Ershaduzzaman, M., … Emmanuel, A. (2013). Bayesian estimation of true prevalence, sensitivity and specificity of indirect ELISA, Rose Bengal Test and Slow Agglutination Test for the diagnosis of brucellosis in sheep and goats in Bangladesh. Preventive Veterinary Medicine, 110(2), 242–252. http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2012.11.029 Rivadeneira, R. (1980). Diagnóstico de la brucelosis bovina en las ganaderías lecheras del cantón Cuenca, provincia del Azuay, mediante los métodos “ring-test” sero- aglutinación en placa. Universidad de Guayaquil. Ecuador. Rivera, D. Y., Rueda, O. E., Calderon, C. P., Mariño, O. C., Gall, D., & Nielsen, K. (2003). [Comparative evaluation of the indirect enzyme-linked immunosorbant assay in milk for the detection of cattle infected with Brucella abortus, in herds

219

located in the province of Cundinamarca, Colombia]. Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics), 22(3), 1065–75. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15005563 Robalino, A. (1966). Diagnóstico e Incidencia de brucelosis porcina en animales sacrificados en el camal municipal de Quito. Universidad Central del Ecuador. Robinson, A. (2003). Guidelines for coordinated human and animal brucellosis surveillance. Rome, Italy: FAO. Rodríguez-Hidalgo, R. I., Contreras-Zamora, J., Benitez Ortiz, W., Guerrero-Viracocha, K., Salcan-Guaman, H., Minda, E., & Ron Garrido, L. (2015). Circulating Strains of Brucella abortus in Cattle in Santo Domingo De Los Tsáchilas Province - Ecuador. Frontiers in Public Health, 3, 45. http://doi.org/10.3389/fpubh.2015.00045 Rogan, W. J., & Gladen, B. (1978). Estimating prevalence from the results of a screening test. American Journal of Epidemiology, 107(1), 71–6. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/623091 Rojas, X., & Alonso, O. (1994). ELISA for the diagnosis and epidemiology of Brucella abortus infection in cattle in Chile. IAEA TECDOC, 77–82. Ron-Román, L., Benitez, W., Speybroeck, N., Ron, J., Saegerman, C., Berkvens, D., & Abatih, E. (2013). Spatio-temporal clusters of incident human brucellosis cases in Ecuador. Spatial and Spatio-Temporal Epidemiology, 5, 1–10. http://doi.org/10.1016/j.sste.2013.02.001 Ron-Román, J., Ron-Garrido, L., Abatih, E., Celi-Erazo, M., Vizcaíno-Ordóñez, L., Calva-Pacheco, J., … Saegerman, C. (2014). Human Brucellosis in Northwest Ecuador: Typifying Brucella spp., Seroprevalence, and Associated Risk Factors. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 14(2), 124–133. http://doi.org/10.1089/vbz.2012.1191 Ron-Román, J., Saegerman, C., Minda-Aluisa, E., Benítez-Ortíz, W., Brandt, J., & Douce, R. (2012). First report of orchitis in man caused by Brucella abortus biovar 1 in Ecuador. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 87(3), 524–8. http://doi.org/10.4269/ajtmh.2012.11-0341 Roux, J. (1979). [Epidemiology and prevention of brucellosis]. Bulletin of the World Health Organization, 57(2), 179–94. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/312154

220

Ruiz Castañeda, M. (1954). [Bovine brucellosis, problem of national interest]. La Prensa Médica Mexicana, 19(11), 255–8. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14357228 Saegerman, C., Berkvens, D., Godfroid, J., & Walravens, K. (2010). Bovine brucellosis. In P. Lefèvre, J. Blancou, R. Chermette, & G. Uilenberg (Eds.), Infectious and parasitic disease of livestock (pp. 991–1021). France: Lovoisier. Saegerman, C., De Waele, L., Gilson, D., Godfroid, J., Thiange, P., Michel, P., … Berkvens, D. (2004). Evaluation of three serum i-ELISAs using monoclonal antibodies and protein G as peroxidase conjugate for the diagnosis of bovine brucellosis. Veterinary Microbiology, 100(1), 91–105. http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2004.02.003 Saegerman, C., Vo, T. K., De Waele, L., Gilson, D., Bastin, A., Dubray, G., … Godfroid, J. (1999). Diagnosis of bovine brucellosis by skin test: conditions for the test and evaluation of its performance. The Veterinary Record, 145(8), 214–8. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10499853 Saldaña, H. (1973). Incidencia de brucelosis bovina en el cantón Cuenca, por las pruebas del anillo y suero-aglutinación. Universidad Central del Ecuador. Saltos, J. M., & Saltos, J. E. (2001). Prevalencia de brucelosis en los hatos bovinos del catón San Vicente, mediante la prueba de suero-aglutinación macroscópica en placa rápida durante los meses de junio a octubre del 2001. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Samartino, L. E., & Enright, F. M. (1993). Pathogenesis of abortion of bovine brucellosis. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 16(2), 95–101. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8319440 Samartino, L. E., Fort, M., Gregoret, R., & Schurig, G. G. (2000). Use of Brucella abortus vaccine strain RB51 in pregnant cows after calfhood vaccination with strain 19 in Argentina. Preventive Veterinary Medicine, 45(3), 193–199. http://doi.org/10.1016/S0167-5877(00)00130-6 Samartino, L., Gregoret, R., Gall, D., & Nielsen, K. (1999). Fluorescence polarization assay: application to the diagnosis of bovine brucellosis in Argentina. J. Immunoassay, 20, 115–120. Sánchez J., P. (1997). Diagnóstico de brucelosis caprina, en el Cantón Santa Isabel, mediante el método de aglutinación en placa, año 1996. Universidad de Cuenca.

221

Retrieved from http://dspace.ucuenca.edu.ec/handle/123456789/17994 Sanogo, M., Abatih, E., Thys, E., Fretin, D., Berkvens, D., & Saegerman, C. (2013). Importance of identification and typing of Brucellae from West African cattle: a review. Veterinary Microbiology, 164(3-4), 202–11. http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2013.02.009 Sanogo, M., Cisse, B., Ouattara, M., Walravens, K., Praet, N., Berkvens, D., & Thys, E. (2008). Etude de la prévalence de la brucellose bovine dans le centre de la Côte d’Ivoire. Rev. Elev. Méd. Vét. Pays Trop., 61, 147–151. Sanogo, M., Thys, E., Achi, Y. L., Fretin, D., Michel, P., Abatih, E., … Saegerman, C. (2013). Bayesian estimation of the true prevalence, sensitivity and specificity of the Rose Bengal and indirect ELISA tests in the diagnosis of bovine brucellosis. Veterinary Journal, 195(1), 114–120. http://doi.org/10.1016/j.tvjl.2012.06.007 Santillán, F. (1971). Investigación sobre la presencia de brucelosis, mediante la prueba de “ring test” en las ganaderías de la provincia de Esmeraldas. Universidad Estatal de Guayaquil. Ecuador. Saravi, M. A., Wright, P. F., Gregoret, R. J., & Gall, D. E. (1995). Comparative performance of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and conventional assays in the diagnosis of bovine brucellosis in Argentina. Veterinary Immunology and Immunopathology, 47(1-2), 93–9. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8533303 Sarguna, P., Bilolikar, A. K., Rao, A., & Mathur, D. R. (2002). Brucellosis in association with HIV infection- a case report. Indian Journal of Medical Microbiology, 20(4), 221–2. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17657076 Scholz, H.C., Nockler, K., Gollner, C., Bahn, P., Vergnaud, G., Tomaso, H., Al Dahouk, S., Kampfer, P., Cloeckaert, A., Maquart, M., Zygmunt, M.S., Whatmore, A.M., Pfeffer, M., Huber, B., Busse, H.J., De B.K. Brucella inopinata sp. nov., isolated from a breast implant infection. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60, 801-808. Schurig, G. G., Roop, R. M., Bagchi, T., Boyle, S., Buhrman, D., & Sriranganathan, N. (1991). Biological properties of RB51; a stable rough strain of Brucella abortus. Veterinary Microbiology, 28(2), 171–188. http://doi.org/10.1016/0378- 1135(91)90091-S

222

Segarra, G. (1971). Investigación de brucelosis en bovinos de Loja, por los métodos de “Ring test” y Huddleson. Universidad Nacional de Loja. Ecuador. Serra Alvarez, J., & Godoy García, P. (2000). [Incidence, etiology and epidemiology of brucellosis in a rural area of the province of Lleida]. Revista Española de Salud Pública, 74(1), 45–53. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10832390 Spiegelhalter, D. J., Best, N. G., Carlin, B. P., & van der Linde, A. (2002). Bayesian measures of model complexity and fit. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology), 64(4), 583–639. http://doi.org/10.1111/1467- 9868.00353 Spînu, I., Vasilesco, T., Pop, A., & Dobresco, A. (1966). [Studies on human morbidity from brucellosis among the personnel of a large abattoir]. Archives Roumaines de Pathologie Expérimentales et de Microbiologie, 25(3), 749–60. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6009231 Stemshorn, B., Forbes, L., Eaglesome, M., Nielsen, K., Robertson, F., & Samagh, B. (1985). A comparison of the standard serological tests for diagnosis of bovine brucellosis. Can. J. Comp. Med., 19, 391–394. Suárez, F. (2001). Introducción. In E. Díaz, L. Hernández, G. Valero, & B. Arellano (Eds.), Diagnóstico de brucelosis animal (pp. 1–8). México. Sutherland, S. S., Evans, R. J., & Bathgate, J. (1986). Application of an enzyme-linked immunosorbent assay in the final stages of a bovine brucellosis eradication program. Australian Veterinary Journal, 63(12), 412–5. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3099740 Sutra, L., Caffin, J. P., & Dubray, G. (1986). Role of milk immunoglobulins in the Brucella milk ring test. Veterinary Microbiology, 12(4), 359–66. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3097917 Tapia, N. (1998). Prevalencia de brucelosis caprina en el área “Centro Laja.” Universidad Nacional de Loja. Thimn, B. M. (1982). Brucellosis in South America. In Brucellosis; Distribution in Man, Domestic And Wild Animals (pp. 31–34). New York: Spiringer-Verlag. Thys, E., Schiere, H., Van Huylebbroeck, G., Mfoukou-Ntsakala, A., Oueadraogo, M., & Geerts, S. (2006). Three approaches for the integrated assessment of urban household livestock production systems: Cases from Sub-Saharan Africa. Outlook

223

on Agriculture, 35, 7–18. Thys, E., Yahaya, M. ., Walravens, K., Baudoux, C., Bagayoko, I., Berkvens, D., & Geerts, S. (2005). Edude de la prévalence de la brucelloses bovine en zone forestière de la Cote d’Ivoire. Rev. Elev. Med. Vet. Pays Trop., 58, 205–209. Tobar, A. (1961). Estudio de la infección brucelar en ovinos, caprinos y porcinos sacrificados en el camal municipal de Quito. Universidad Central del Ecuador. Toma, B., Dufour, B., Bénet, J., Sanaa, M., Shaw, A., & Moutou, F. (2010a). Determination de la cause d’une maladie. In Epidemiologie appliquee á la litte collective contre les amaladies annimales trnasmissibles majeures (3ème ed., pp. 247–298). France: AEEMA. Toma, B., Dufour, B., Bénet, J., Sanaa, M., Shaw, A., & Moutou, F. (2010b). La depistage des maladies infectieuses animales. In Epidemiologie appliquee á la litte collective contre les amaladies annimales trnasmissibles majeures (3ème ed., pp. 105–155). France: AEEMA. Torres, H. (2008). Control de Brucelosis Bovina—Programa Nacional. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura Y Pesca (MAGAP), Servicio Ecuatoriano de Saniadad Agropecuaria (SESA). Quito, Ecuador, 30. Vacek, P. M. (1985). The effect of conditional dependence on the evaluation of diagnostic tests. Biometrics, 41(4), 959–68. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3830260 Valdez, I., Bazurto, Z., & Vera, Z. (2000). Diagnóstico de brucelosis en los hatos bovinos del catón San Vicente, mediante prueba de suero-aglutinación macroscópica en placa rápida. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Valdivieso, C. (1969). Determinación de la incidencia de brucelosis por medio de la prueba de sero-aglutinación en placa, en las ganaderías de la zona de Machala. Universidad Estatal de Guayaquil. Ecuador. Van Aert, A., Brioen, P., Dekeyser, P., Uytterhaegen, L., Sijens, R. J., & Boeyé, A. (1984). A comparative study of ELISA and other methods for the detection of Brucella antibodies in bovine sera. Veterinary Microbiology, 10(1), 13–21. http://doi.org/10.1016/0378-1135(84)90052-X Vargas O, F. J. (2002). Brucellosis in Venezuela. Veterinary Microbiology, 90(1), 39– 44. http://doi.org/10.1016/S0378-1135(02)00243-2 Vásconez-Lópeez, E. (1960). Incidencia de la brucelosis en leches que se consumen en

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el cantón Quito, determinado por la prueba de “ring test.” Universiadad Central del Ecuador. Vera, R., & Flores, R. (2004). Diagnóstico y prevalencia de brucelosis mediante ring test en los hatos bovinos del cantón Chone en el año 2004. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Vidal, L. (1992). Diagnóstico de brucelosis en los bovinos en las parroquias de Tarqui y Victoria del Portete. Universidad de Cuenca. Ecuador. Vizcaíno, N., Cloeckaert, A., Verger, J.-M., Grayon, M., & Fernández-Lago, L. (2000). DNA polymorphism in the genus Brucella. Microbes and Infection, 2(9), 1089– 1100. http://doi.org/10.1016/S1286-4579(00)01263-6 Wade, B., Arteaga, C., Morillon, M., Kraemer, P., Maslin, J., Molinier, S., & Perret, J.- L. (1998). Brucellose d’importation: un neuveau risque pour le vayageur? Médecine Tropicale, 58, 205–206. Wareth, G., Melzer, F., El-Diasty, M., Schmoock, G., Elbauomy, E., Abdel-Hamid, N., … Neubauer, H. (2016). Isolation of Brucella abortus from a Dog and a Cat Confirms their Biological Role in Re-emergence and Dissemination of Bovine Brucellosis on Dairy Farms. Transboundary and Emerging Diseases. http://doi.org/10.1111/tbed.12535 Whatmore, A.M., Davison, N., Cloeckaert, A., Al Dahouk, S., Zygmuny, M.S., Brew, S.D., Perrett, L.L., Koylass, M.S., Vergnaud, G., Quance, C., Scholz, H.C., Dick, E.J., Hubbard, G., Schlabritz-Loutsevitch, N.E. Brucella papionis sp. nov. isolated from baboons (Papio spp.). Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2014, Int J Syst Evol Microbiol. 2014;64(Pt 12):4120-4128. Young, E. J. (1997). Especies de brucella. In G. Mandell, J. Bennett, & R. Dolin (Eds.), Enfermedades Infecciosas, Principio y Practica (Cuarta, pp. 2300–2320). Buenos Aires Argentina: Editorial Medica Paramericana SA. Yu, W. L., & Nielsen, K. (2010). Review of Detection of Brucella sp. by Polymerase Chain Reaction. Croatian Medical Journal, 51(4), 306. http://doi.org/10.3325/cmj.2010.51.306 Zambrano, I. (1978). Investigación de brucelosis en caninos mediante el método de sero-aglutinación en placa en el cantón Rocafuerte. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador. Zambrano, M., & Manabí, U. L. “Eloy A. de. (2002). Actividad realizada en el

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laboratorio agropecuario de la ULEAM, extensión en El Carme, exámenes ccoproparasitarios – brucelosis – hematozoarios en las diferentes zonas del cantón El Carmen.

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ANNEXES

POSTER 1

Validation of diagnostic test to detect brucellosis and epidemiological survey in the Ecuadorian Andes

Ron-Román J., Godfroid J., Saegerman C., Walravens K., Benítez Ortiz W., Brandt J., Utterhaegen L., De Smedt C., Michel P., Berkvens D.

Brucellosis 2003 International Research Conference (56th Brucellosis Research Conference) September 15-17, 2003 – University of Navarra, Pamplona (Spain)

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Préambule Le travail effectué tout au long de cette thèse de doctorat a débuté par une enquête séro- épidémiologique à petite échelle dans la zone qui s’est révélée être à forte prévalence en brucellose bovine. L'objectif initial était d’investiguer la situation de la brucellose bovine sur base du transfert de technologie dans le cadre d’une Coopération Nord - Sud.

Cette coopération entre le Centre d'Études Vétérinaires et Agrochimiques (CODA-CERVA), l'Institut de Médecine Tropicale d'Anvers (IMT-ITG), le Centro Internacional de Zoonosis et l’Université de Liège a permis de développer des outils de diagnostic sérologique, intradermique, microbiologique, moléculaire et épidémiologiques afin d'étudier les brucelloses animale et humaine en Equateur.

Bien que le résumé de ces travaux ait été présenté à la Conférence Internationale sur la Brucellose qui s’est tenue lors de la 56ième Conférence de Recherche sur la Brucellose en 2003, à Pampelune en Espagne, nous avons attendu d’avoir approfondi les études à plus large échelle (visant une plus large représentativité) ciblant la maladie avant de diffuser les résultats.

Résumé en français Une enquête épidémiologique ayant pour objectif de déterminer la prévalence de la brucellose chez les bovins et les travailleurs agricoles a été réalisée dans 23 fermes des Andes équatoriennes entre Octobre 2002 et Avril 2003. Les sérums provenaient de bovins laitiers (n= 516) et de travailleurs agricoles (n= 98) et ont été testés au Rose Bengale (RB), par Agglutination Lente de Wright (SAW) avec EDTA, par le test de Fixation du Complément (CFT) et par un test immuno enzymatique indirect (iELISA). Par ailleurs, le test cutané (ST) réalisé avec un allergène purifié (Brucellergen, Synbiotics) a été réalisé sur les animaux. Des tests microbiologiques ont été réalisés sur 103 échantillons de lait prélevés chez 27 animaux provenant d’exploitations infectées.

Une analyse bayésienne utilisant les résultats des quatre tests (RB, SAW-EDTA, ELISA et ST) pratiqués chez les animaux non vaccinés (n= 99) a été réalisée. Étant donné que le ST présente une Sp de 100%, le taux de prévalence des animaux a été estimé entre 35% et 40%. Les caractéristiques des autres tests ont été évaluées: Se=84% et Sp=100% pour le ST,

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Se=47% et Sp=87% pour l’iELISA, Se=58% et Sp=85% pour le SAW-EDTA, et Se=40% et Sp=90% pour le RB.

Brucella abortus biotype 4 a été isolée dans le lait de 4 animaux. L'un des échantillons provenait d’une vache vaccinée avec B19 et revacciné avec RB51. Six personnes vivant dans les fermes infectées étaient positives aux tests SAW-EDTA, iELISA et CFT. La notification officielle de 183 cas humains rapportés entre 1960 et 2000 laisserait supposer une probable sous-déclaration des cas humains de brucellose en Equateur.

Ces résultats aideront le Centro Internacional de Zoonosis (CIZ) à formuler des recommandations au Ministère de l'Agriculture et de l'Elevage et au Ministère de la Santé Publique en ce qui concerne le diagnostic et la prévention et le contrôle de la brucellose en Equateur.

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VALIDATION OF DIAGNOSTIC TEST TO DETECT BRUCELLOSIS AND EPIDEMIOLOGICAL SURVEY IN THE ECUADORIAN ANDES. Ron-Román J1., Godfroid J2., Saegerman C3., Walravens K2., Benítez Ortiz W1., Brandt J4., Utterhaegen L2., De Smedt C2., Michel P2., Berkvens D4.

(1) Universidad Central del Ecuador, Centro Internacional de Zoonosis (CIZ). Quito, Ecuador. (2) Veterinary and Agrochemical Research Center (CERVA). Brussels, Belgium. (3) Ministry of Health, Consumer’s protection and Environment. Brussels, Belgium. (4) “Prince Leopoldo” Institute of Tropical Medecine, Department of Animal Health. Antwerp, Belgium.

Official reports of human brucellosis in Ecuador (1990 - 2000) Introduction 30 24 Brucellosis, the most widely distributed zoonosis, is 25 highly prevalent in traditional husbandry systems, 20 13 15 where sanitary standards are poor. 10 9 5 In Ecuador, information on brucellosis in man and his 10 5 5 3 5 3 livestock is scarce i.a. because standardised diagnostic 1 1 0 methods are lacking. 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000

Source: MSP (2002)

Materials and Methods Sera from bovines (n=516) and farm workers (n=98) from A Bayesian analysis on the results of RB, SAT-EDTA, 23 dairy farms in the northern Sierra of Ecuador iELISA and ST of non vaccinated animals (n=99) was (Pichincha Province) were analysed by the following carried out. assays: Rose Bengal (RB), Buffered Plate Agglutination Brucella sp. was isolated from milk samples from Test (BPAT), Serum Agglutination Test (SAT-EDTA), seropositive bovines and the strain characterised. Complement Fixation Test (CFT), Indirect Enzyme-linked A vaccine, B-19, locally produced was submitted to Immunosorbent Assay (iELISA) in addition to the Skin aquality control. Test (ST) applied on bovines.

Results Results obtained in the laboratory in Ecuador (CIZ) Brucella abortus biotype 4, was isolated from 4 bovines, corresponded well with those obtained in Brussels one of these being vaccinated with B-19 and boosted with (CERVA), none of the farms appeared to be free of RB-51. The locally available vaccine, proved to contain brucellosis. about 3.3x108 germs (should have been 60x109. Isolated Given a specificity of 100% for the ST, prevalence of strains did not grow in stained media i.e. Basic Fuschin and bovine brucellosis can be estimated between 16% and Safranin. 45%. Estimations of the sensitivity and specificity of each In sharp contrast to the official reports, six persons working assay are respectively 0.74 and 1 for ST, 0.61 and 0.86 for and living in farms were seropositive in SAT-EDTA, iELISA, 0.59 and 0.82 for SAT-EDTA and 0.48 and 0.91 iELISA and CFT. for RB.

B a 2 E 95 B a 2 B a 9

E 94 E 95 B a 9

Poisitive Brucella abortus isolates from bovine milk from Ecuador(E 94 and E95), vs. control samples (B a 2 and B a 9) in Fuschin (left) and Safranin (right). Positive ST (>12 mm)

Conclusion • In contrast to official reports, brucellosis in man and livestock is a seriously underestimated zoonosis in Ecuador. • Multiple tests allow for the detection of most of the infections. • An independent national reference laboratory for quality control of reagents and vaccines and for assisting the authorities on diagnosis, prevention and control of brucellosis, is a major requisite in countries like Ecuador.

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POSTER 2

Dogs as potential mechanical vector of transmission of brucella spp. in dairy cattle in the sierra of Ecuador

Benítez-Capistros F., Ron-Román J., González-Andrade P., Minda-Aluisa E., Berkvens D., Saegerman C., Benítez Ortiz W.

Joint Colloquium on Zoonoses and Neglected Infectious Diseases in Africa – 2011 1 to 4 November 2011 Johannesburgo, South Africa

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Préambule Au cours de cette étude, la prévalence élevée au niveau des troupeaux bovins et des animaux dans la Sierra équatorienne, ajouté à la forte prévalence des avortements chez les bovins, et à la facilité d’isolement de Brucella spp. à partir de leur lait, a rapidement soulevé la question du rôle potentiel des chiens en tant que réservoir de l’infection. Il était indispensable de rechercher l’infection chez cette espèce et d’identifier les espèces et biotypes de Brucella, afin de voir s’il s’agit des mêmes que ceux circulant dans les populations bovine et humaine de la même zone d’étude.

Résumé en français En 2008, une étude réalisée dans plusieurs élevages bovins localisés dans une région endémique d’Equateur a été menée dans le but de déterminer si les chiens hébergeaient des Brucella spp. Des sérums de chiens (n = 151) vivant dans des exploitations bovines (n = 34) du canton Mejía (province de Pichincha) ont été testés grâce à l’utilisation d’anticorps anti- Brucella en phase lisse au moyen de trois tests sérologiques. Cinq chiens hautement positifs ont été euthanasiés et des échantillons de ganglions lymphatiques et de divers organes ont été prélevés dans le but d’isoler l'agent causal. D’autre part, des sérums bovins (n=93) provenant d’une exploitation laitière dans laquelle les chiens avaient réagi positivement ont été analysés au moyen de deux tests sérologiques. De plus, l’isolement de Brucella spp. a été entrepris sur des échantillons de lait provenant des vaches séropositives (n = 7). Les isolats ont été caractérisés au moyen de tests microbiologiques et par PCR-711.

La majorité des chiens (85,43%) avaient des contacts avec le bétail et ingéré du lait cru. D’autre part, 64,24% d’entre eux mangeaient régulièrement les produits d’avortement. Au total, 43 chiens (30,46%) ont réagi positivement à au moins un test diagnostic. Pris individuellement, les tests ont fourni les résultats suivants: (i) 15,89% des chiens étaient positifs au test d'agglutination rapide au RB, (ii) 11,92% étaient positifs au SAT-EDTA et (iii) 23,85% étaient positifs au test iELISA. Seuls 13 chiens (8,6%) avaient réagi positivement aux trois tests. Quatre bovins (4,30%) étaient positifs aux tests RB et SAT-EDTA. Brucella abortus biotype 4 a été identifiée par essais microbiologiques et PCR-711, à partir des prélèvements de chiens (n= 5) et de bovins (n= 1).

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Joint Colloquium on Zoonoses and Neglected Infectious Diseases in Africa – 2011 IMT/DVTD

DOGS AS POTENTIAL MECHANICAL VECTOR OF TRANSMISSION OF BRUCELLA. spp., IN DAIRY CATTLE IN THE SIERRA OF ECUADOR.

Benítez-Capistros, F. ,1-2 Ron-Román, J.,1-3-4 González-Andrade, P.,1 Minda-Aluisa, E., 1 Berkvens, D.,3 Saegerman C.,4 Benítez-Ortíz, W.1-5

1 Centro Internacional de Zoonosis (CIZ), Universidad Central del Ecuador. Quito, Ecuador; 2 Facultad de Ciencias Exáctas y Naturales. Pontificia Universidad Ctálica del Ecuador. Quito, Ecuador; 3 Department of Animal Health, Prince Leopold Institut of Tropical Medicine (ITG- IMT), Antwerp, Belgium; 4 Faculté de Médecine Vétérinaire, Université de Liège, Belgique; 5 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Central del Ecuador. Quito, Ecuador;

Abstract

In 2008 a study in cattle farms in Ecuador was set up to determine whether dogs harboured strains of Brucella spp., endemic at the region. Serum samples from dogs (n=151) living on farms (n=34) in Mejía canton in Pichincha province, Ecuador, were tested for antibodies against smooth Brucella spp., by three immunodiagnostic assays. Highly positive dogs (n=5) were euthanized in order to cultured samples of lymph nodes and organs. From a dairy farm with positive dogs, sera from cows (n=93) were analysed by two immunodiagnostic assays and milk samples from seropositive cows (n=7) were cultured. In addition, isolates were investigated by PCR-711.

85.43% of the dogs had contact with cattle and drank raw milk, 64.24% regularly ate aborted material. In total 43 dogs (30.46%) reacted positive at least to one serodiagnostic test; individual tests showed 15.89% positive reactions when tested by the Rose Bengal test (RB), 11.92% by the Wright’s Slow Agglutination Test” (SAT- EDTA) and 23.85% by the indirect Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (iELISA). Only 13 (8.60%) dogs tested positive in all three tests. Four bovines (4.30%) were positive on RB and SAT-EDTA. Brucella spp. was identified in isolations from dogs (n=5) and bovines (n=1), by routine biochemical assays and PCR-711.

Our results demonstrate that control of brucellosis should not be restricted to bovines, for which economic losses are obvious. Equal attention should be given to other animals, among them dogs living on farms or in the neighbourhood of farms, as potential mechanical vector of transmission of this zoonosis.

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Presses de la Faculté de Médecine Vétérinaire de l’Université de Liège 4000 Liège (Belgique)

D / 2016 / 0480 / 23 ISBN 978-2-87543-095-3

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