Universidad Austral de Facultad de Ciencias Agrarias Escuela de Agronomía

Efecto de Neotyphodium lolli cepas AR37 y AR1, sobre el desarrollo y sobrevivencia de larvas de cuncunilla negra de las praderas ( pallens Bl).

Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al título de Ingeniero Agrónomo

José Nicolás Larraín Widmer

Valdivia – Chile 2009 PROFESOR PATROCINANTE:

______Oscar Balocchi L. Ingeniero Agrónomo, M.Sc.,Ph.D. Instituto de Producción

PROFESORES INFORMANTES:

______Roberto Carrillo Ll. Ingeniero Agrónomo, M.Sc.,Ph.D. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal

______Ignacio López C. Ingeniero Agrónomo, Ph.D. Instituto de Producción Animal

AGRADECIMIENTOS

Al finalizar esta etapa de estudio son muchas las palabras que se vienen a la cabeza al momento de dar las gracias, por el tiempo y la colaboración de un gran número de personas que han ayudado y aportado su granito de arena al terminar este trabajo. Pero principalmente quiero agradecer a las siguientes personas: Al profesor Dr. Roberto Carrillo, por su gran paciencia aportada al momento de preguntas incansables, al profesor Dr. Fernando Mujica, por su gran aporte y comprensión de lo que se quería preguntar, en especial al Laboratorio de Entomología, al Laboratorio de Fitoquímica, al personal del Laboratorio del pabellón de Producción Animal, y como olvidar el gran aporte realizado por un gran profesor y amigo don Oscar Balocchi, el cual con su incansable paciencia respondió a todas las preguntas e inquietudes realizadas por mi parte.

Muchísimas gracias i

INDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN 1

SUMMARY 2

1 INTRODUCCIÓN 3

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5

2.1 Importancia de las praderas en el sur de Chile 5

2.2 Las plagas insectiles como problema en la producción de praderas 5

2.3 Control de plagas insectiles 5

2.3.1 Uso de hongos endófitos en ballicas 5

2.3.2 Origen de los hongos endófitos 6

2.3.3 Simbiosis planta-endófito 7

2.3.4 Ciclo de vida del hongo endófito 7

2.3.5 Sobrevivencia del hongo en la semilla 8

2.3.6 Ubicación del endófito en la planta y concentración de alcaloides 8

2.3.7 Compuestos tóxicos producidos por el hongo endófito 9

2.3.7.1 Endófito AR1 10

2.3.7.2 Endófito AR37 10

2.3.8 Determinación del hongo endófito 12 ii

2.3.9 Ballica perenne cultivar Extreme 13

2.4 Las larvas de hepialidos como plagas agrícolas 13

2.4.1 Ciclo biológico y control de Wiseana cervinata usando endófitos en 13 ballica en Nueva Zelanda

2.4.2 El complejo de larvas de cuncunillas negras que infestan praderas 14 en el sur de Chile

2.4.3 15

3 MATERIAL Y METODO 17

3.1 Material 17

3.1.1 Ubicación del ensayo 17

3.1.2 Duración del estudio 17

3.1.3 Material Vegetal 17

3.1.4 Material Animal 17

3.1.5 Materiales de laboratorio e invernadero 17

3.1.6 Instrumentos 17

3.2 Métodos 18

3.2.1 Descripción de los ensayos 18

3.2.1.1 Recolección de las larvas de cuncunilla negra 18

3.2.1.2 Determinación del estado larval de las cuncunillas 18

3.2.1.3 Ensayo 1: Alimentación de las larvas de cuncunilla negra con follaje 18 de plantas de ballica perenne cortadas mecánicamente iii

3.2.1.4 Ensayo 2: Alimentación directa de cuncunillas negras sobre plantas 19 de ballica perenne

3.2.1.5 Variables evaluadas 19

3.2.1.6 Diseño experimental y análisis 20

4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 22

4.1 Ensayo 1 22

4.1.1 Mortalidad larval 22

4.1.2 Incremento en peso de las larvas 23

4.1.3 Medidas capsula cefálicas y estados de desarrollo de larvas de 24 cuncunillas negras

4.2 Ensayo 2 26

4.2.1 Mortalidad de larvas 27

4.2.2 Peso de las cuncunillas 27

4.2.3 Tamaño y estados de las cuncunillas 29

5 CONCLUSIONES 34

6 BIBLIOGRAFÍA 35

iv

INDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1 Niveles y tipos de alcaloides presentes en cultivares de ballica 10 inglesa

2 Peso (g) de larvas de cuncunillas negras en el ensayo de laboratorio 23

3 Medidas cápsula cefálica de larvas de cuncunillas negras 25 (milímetros)

4 Estadios larvarios de las cuncunillas negras 26

5 Peso inicial, final (g/cuncunillas) y diferencia de peso de las 28 cuncunillas negras el 13 de agosto

Medida de la capsula cefálica (mm/cuncunilla), inicial y final de las 6 29 cuncunillas negras en la evaluación del 13 de agosto Estadios larvarios inicial y final de las cuncunillas negras en 7 30 evaluación del 13 de agosto

8 Peso inicial, final (g/cuncunilla) y diferencia de peso de las 31 cuncunillas negras en la evaluación del 9 de septiembre

Medida de la cápsula cefálica (mm/cuncunilla), inicial y final de las 9 32 cuncunillas negras en la evaluación del 9 de septiembre

Estadios larvarios inicial y final de las cuncunillas negras en la 32 10 evaluación del 9 de septiembre

v

INDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Ciclo del hongo endófito en la planta de ballica perenne 8

Efecto del endófito AR 37 en la producción de macollos en ballica 2 11 inglesa

3 Plagas controladas por el endófito AR 37 en Nueva Zelanda 12

4 Ciclo biológico de Wiseana cervinata 14

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RESUMEN

El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Entomología e invernaderos de la Facultad de Ciencias Agrarias ubicados en el campus Isla Teja de la Universidad Austral de Chile, en la cuidad de Valdivia, durante el periodo marzo a octubre del año 2008.

El objetivo del ensayo fue determinar la mortalidad, velocidad y desarrollo en el crecimiento de larvas de cuncunillas negras (Dalaca pallens), alimentadas con plantas de Lolium perenne L. cultivar Extreme, infestadas con las cepas AR1 y AR37 del hongo endófito Neotyphodium lolii en relación a un testigo sin endófito

Se realizaron dos ensayos paralelos, el primero se llevó a cabo bajo condiciones controladas de temperatura al interior de un laboratorio, utilizando un diseño completamente al azar con una covariable. El segundo ensayo, que se llevó a cabo en un invernadero, consistió en realizar una evaluación en maceteros con tierra como sustrato, y plantas de Lolium perenne, utilizando un diseño de bloques completos al azar generalizado con una covariable.

Los resultados obtenidos demostraron que la presencia de la cepa AR1 y AR37 del hongo endófito (Neotyphodium lolii) en ballica perenne cultivar Extreme no produjeron un aumento en la tasa de mortalidad, ni cambios significativos en el crecimiento y desarrollo de larvas de cuncunilla negra de las praderas (Dalaca pallens).

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SUMMARY

This work was performed at the Laboratory of Entomology and greenhouses in the Faculty of Agricultural Sciences campus located in Isla Teja, Universidad Austral de Chile, in the city of Valdivia, for the period March to October of 2008.

The objective of the study was to determine the mortality rate in the growth and development of larvae of black cutworms (Dalaca pallens), fed on plants of Lolium perenne L. Extreme cultivate infested with strains of AR1 and AR37 endophyte Neotyphodium lolii in relation to a control without endophyte.

Two parallel trials were conducted, the first conducted under controlled conditions of temperature inside a laboratory, using a completely randomized design with a covariate. The second test is conducted in a greenhouse, consisted of an evaluation in pots with soil as substrate, and plants of perennial ryegrass, using a design of randomized blocks, with a covariable.

The results showed that the presence of AR1 and AR37 strain of endophyte (Neotyphodium lolii) in perennial ryegrass cultivar Extreme did not produce an increased mortality rate, no significant change in the growth and development of larvae of black cutworms grasslands (Dalaca pallens).

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1 INTRODUCCION

Las ballicas son un recurso forrajero muy importante para las explotaciones ganaderas tanto a nivel nacional como internacional. Son la base de la alimentación para los diversos tipos de herbívoros ya sean silvestres o domesticados (de uso intensivo) para generar productos usados en el consumo humano. Por lo tanto, es fundamental conocer cuales son los factores que podrían llegar a limitar la producción de dicho recurso, es por esto que se ha investigado a lo largo de los años estos posibles factores, buscando soluciones a estos problemas. Entre los diversos factores estudiados, se ha llegado a la conclusión que uno de los principales problemas es el control de ciertas plagas que afectan negativamente a este tipo de cultivos, donde su ataque disminuye la producción de forraje para los animales. Entre las principales plagas que afectan la producción de forraje de las praderas mejoradas en el sur de Chile, están las cuncunillas negras (complejo de especies del género Dalaca). Probablemente la especie más importante en extensas áreas en el sur de Chile corresponda a Dalaca pallens Bl, insecto que entre los meses de mayo a septiembre causa fuertes pérdidas en la producción de forraje debido a la destrucción total de las plantas o parte de ellas, causando daños cuantitativos y cualitativos que van muchas veces mas allá del período de mayor daño directo. Por lo cual, medidas que reduzcan sus poblaciones y consecuentemente el daño, son relevantes.

En otros países como por ejemplo Nueva Zelanda, en los cuales las larvas de hepialidos también son importantes, por reducir la producción de las praderas, entre otras medidas de combate hacia estos insectos se ha optado por la simbiosis entre algunas especies de hongos y plantas, puesto que los hongos producen diferentes grupos de alcaloides que sin interferir en el ciclo normal de la especie vegetal, afecta diferentes plagas.

Algunas especies de gramíneas presentan relaciones simbióticas con hongos endófitos que entre otras funciones le dan cierta resistencia a la herbivoría (cierta resistencia a insectos que atacan o se alimentan de estos pastos), debido a que producen una serie 4

de compuestos de origen químicos llamados alcaloides que provocan diversos efectos sobre los insectos.

Con esta finalidad se ha traído desde Nueva Zelanda semillas de Lolium perenne cultivar Extreme que contiene inoculado un tipo de hongo endófito denominado AR37 que en el país de origen controla a larvas de hepiálidos, que corresponden a la familia de las especies del complejo de cuncunillas negras en Chile.

La hipótesis de este estudio es que dada la similitud que existe entre la “porina” (Wiseana cervinata), plaga de praderas en Nueva Zelanda y la cuncunilla negra (Dalaca pallens), plaga de praderas del sur de Chile, existe un incremento en la tasa de mortalidad y un efecto negativo sobre el desarrollo de larvas de cuncunilla negra que se alimentan de ballica inglesa cultivar Extreme con presencia del hongo endofito AR37, tal como ha sido reportado para porina en Nueva Zelanda.

Los objetivos de esta investigación son: • Determinar la mortalidad de larvas de cuncunilla negra alimentadas con follaje de Lolium perenne que contiene endófito AR1 y AR37. • Determinar la velocidad de crecimiento y desarrollo de larvas de cuncunilla negra alimentadas con Lolium perenne que contiene endófito AR1 y AR37.

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2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Importancia de las praderas en el sur de Chile La ganadería del sur de Chile, basa su alimentación principalmente en el pastoreo de praderas, que representa el recurso alimenticio más abundante y de menor costo (BALOCCHI, 1999). Es por ello que existe una búsqueda incesante para incorporar cultivares nuevos que sean de buena calidad y que se adapten a las condiciones presentes en la zona sur de nuestro país. Las ballicas anuales, bianuales y perennes constituyen importantes componentes de la flora de las praderas, que se usan en la producción de carne y leche (DEMANET, 2008)

2.2 Las plagas insectiles como problema en la producción de praderas Entre los diversos problemas que afectan a la producción de las praderas en el sur de Chile, los entomológicos son de enorme importancia (DURAN, 1976). Los mas destacados corresponden al complejo de cuncunillas negras (Dalaca spp.), gorgojo argentino (Listronotus bonariensis (Kuschel)), el complejo de larvas de escarabaeidos (Hylamorpha elegans (Burm.), Phytoloemma herrmanni Germ., Schizochelus spp) y las mosquitas tontas (Tana paulseni Phil.) (DURAN, 1976; PRADO, 1991).

2.3. Control de plagas insectiles Para hacer frente a estos problemas se han desarrollado en el país diferentes metodologías para combatir las plagas (culturales, químicas, etc.). En Nueva Zelanda se están desarrollando cultivares resistentes a plagas pertenecientes a las mismas familias que causan problemas en Chile y en el caso de L. bonariensis a la misma especie. Nueva Zelanda ha utilizado hongos endófitos asociados a las especies de distintos tipos de praderas presentes (LANUZA et al., 2003).

2.3.1 Uso de hongos endófitos en ballicas. Las praderas que presentan simbiosis con hongos endófitos deberían presentar una mayor productividad que las praderas sin la presencia del hongo (LATCHL, 1994). Según estudios recientes se señala que gran parte de las semillas provenientes de Nueva Zelanda, vienen con alguna cepa de hongo endófito. En Nueva Zelanda una alta proporción, cercana a un 70% de las 6

ballicas de la isla sur y un 99% de las ballicas en la isla norte, tienen presencia de hongo endófito (COLIN, 1999). Debido a la necesidad que existe en Nueva Zelanda de controlar la plaga L. bonaeriensis Kusch, ya que se produce un gran daño económico por el ataque de esta plaga, afectando cerca de 7 millones de hectáreas (PRESTIDGE et al., 1991). Las semilla que provienen de ese país traen incorporado el hongo en su interior a diferencia de las semillas que provienen de Europa las cuales se encuentran libres del endófito, que en este caso es Neotyphodium lolii (ANASAC, 1999).

Listronotus bonariensis es una especie nativa de America del Sur, que se encuentra presente en su área de origen y en Nueva Zelanda (LANUZA et al., 2003). La presencia de peramina que se produce en algunas cepas de hongos endófitos, permite el control de esta plaga a nivel de campo (ROWAN et al., 1990). Además la peramina es fundamental para el desarrollo de las plántulas sembradas en otoño y primavera, no como fuente nutricional, sino que es en ese periodo donde las larvas cortan las plantas a nivel de cuello produciendo un daño irreparable y con esto la perdida de la planta (DEMANET, 2008).

El daño generado por esta plaga se debe a la actividad minadora de las larvas de esta especie, el cual es irrecuperable para la planta cuando el ataque se produce en estados fenológicos tempranos de las plantas, en etapas posteriores, causan perdida de macollos y la tendedura de las plantas, con esto una disminución del potencial productivo de la pradera (DEMANET, 2008).

2.3.2 Origen de los hongos endófitos. Endófito se denomina a organismos que viven dentro de la planta (ANASAC, 1999). Estos organismos establecen una simbiosis con la planta (FLETCHER y HARVEY, 1981). El hongo puede producir efectos negativos en los herbívoros, como es la disminución en el consumo de forraje por parte de los animales, debido a que estos hongos endófitos generan ciertas sustancias que tienen efectos sobre los herbívoros que consumen estas plantas (ANASAC, 1999). Situación que dependiendo de las condiciones, pueden llegar a causar problemas como el temblor muscular conocido como “ryegrass staggers” o también pueden producir estrés calórico en el bovino (FLETCHER et al., 1999).

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Estos hongos endófitos están ampliamente distribuidos a nivel mundial y los primeros antecedentes de la existencia de estos hongos es de entre los años 1935 y 1941 y los primeros reportes de toxicidad son del año 1959 aproximadamente, pero las asociaciones de toxicidad de estos se comienzan a conocer desde la década del 80 en adelante (TORRES, 1996).

2.3.3 Simbiosis planta-endófito. El hongo endófito N. lolii (anteriormente Acremonium lolii) (TORRES, 1996), establece una relación simbiótica junto con las plantas de ballicas. Siendo ambas partes beneficiadas con dicha unión (TORRES et al., 2003). El beneficio que recibe la planta es que gracias a los alcaloides producidos por el hongo endófito, las ayudan a tolerar el ataque de ciertos insectos como son L. bonariensis, Wiseana cervinata Walk, áfidos y otros insectos plagas de las praderas. (EASTON et al., 2001). Aparte de otorgarle a esta una mayor persistencia, mejor tolerancia a condiciones adversas y resistencia a la sequía (BOUTON et al., 1993), como también mayor crecimiento (EASTON et al., 2001), mientras que el endófito se ve beneficiado por que tiene un lugar donde vivir, alimentarse y diseminarse (GALDAMES, 1990; TORRES et al., 2003).

2.3.4 Ciclo de vida del hongo endófito. Este hongo endófito vive al interior de la planta y permanece durante todo su ciclo al interior de está (DEMANET, 2008). La semilla infectada con micelio germina y el hongo se ubica en la parte inferior de la plántula (3 a 4 cm de altura de la planta) quedándose ahí hasta que en primavera cuando se inicia el periodo reproductivo, se mueve hasta localizarse en la inflorescencia y quedar con la nueva semilla (TORRES et al., 2003). La semilla es la única forma natural en la que se transmite el hongo, ya que en la naturaleza no existe forma alguna de que él hongo endófito colonice una planta por otra vía que no sea la de semilla, ya que no hay infección libre por parte de esté (SIEGEL et al., 1984; WILLIAMS et al., 1984).

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Ciclo del Endófito

El endófito crece El endófito es dentro de la hoja encontrado en el emergida, de la embrión de la semilla germinada semilla infectada

El endófito se concentra en la base de la planta, no en las raíces

El endófito crece por el tallo y se ubica en la semilla, en la parte reproductiva de la planta

FIGURA 1 Ciclo del hongo endófito en la planta de ballica perenne. FUENTE: Adaptado de AGRICOM (2006).

2.3.5 Sobrevivencia del hongo en la semilla. NEILL (1940), encontró que en semillas de ballica inglesa, al cabo de dos años, almacenadas a temperatura ambiente, el micelio estaba muerto. Sin embargo, en estudios posteriores se demostró que el micelio en la semilla de la misma ballica permanece vivo hasta después de quince años, almacenado a bajas temperaturas desde 0 a 5 ºC. (LATCH, 1983).

2.3.6 Ubicación del endófito en la planta y concentraciones de alcaloides. El hongo está ubicado al interior de la semilla, siendo esta la única forma de propagación de este hongo. Teniendo las empresas comercializadoras la posibilidad de producir y comercializar semillas con distinto grado de concentración del hongo. Se considera con bajo nivel de endofito aquellas semillas que presentan una proporción inferior al 5% de 9

endófito y con alto nivel de endófito las semillas que contienen sobre un 70% de este hongo. Este hongo no se transfiere de una planta a otra dada su condición de endófito (SIEGEL et al. 1989).

Los compuestos tóxicos de acuerdo a la cantidad de micelio presente en la planta, se concentran mayormente en la parte inferior de la planta, vainas de las hojas (MUSGRAVE, 1984; SIEGEL et al., 1984) e inflorescencia, no así en láminas, raíces y polen (PRESTIDGE y THOM, 1994). En la etapa reproductiva de la planta, el hongo se moviliza a las semillas para poder diseminarse. Es por esto, que los mayores índices de concentración de toxinas que producen problemas en los animales se presentan en las estaciones de verano y otoño (EASTON, 1999), debido a que el hongo se ubica en la parte reproductiva de la planta, bajando considerablemente las concentraciones del hongo en los periodos de invierno y primavera (LANUZA et al., 2003), lo que indica que esta directamente ligado a la temperatura ambiental. EASTON (1999), señala además que las toxinas de los hongos en los pastos tienden a aumentar bajo condiciones de sequía.

2.3.7 Compuestos tóxicos producidos por el hongo endófito. Un estudio realizado por GALDAMES (1995), indica que los hongos endófitos son los responsables de producir una serie de compuestos, incluyendo diferentes grupos de alcaloides. A estos alcaloides se les responsabiliza por toxicidad a mamíferos, cuyos daños representan cientos de millones de dólares en Estados Unidos, en pérdidas de producción animal al año (POTTINGER et al., 1985). Sin embargo, estas estimaciones no incluyen las posibles pérdidas en la reproducción del ganado que pueden estar asociadas a esta causa (GAY et al., 1986), por otro lado, estos alcaloides proporcionan a la planta tolerancia al ataque de ciertos insectos (TORRES, 1996).

GALDAMES (1995), menciona algunos grupos de alcaloides que se producen por la interacción planta-endófito que son los siguientes: Los ergo alcaloides, en este caso la ergovalina, le otorga tolerancia al ataque de insectos y es un vasoconstrictor que reduce la disipación del calor, tiene un efecto depresor de las concentraciones de prolactina. También en este grupo están las lolinas de las cuales forma parte el lolitrem B, que es una neurotoxina (TORRES et al., 2003), y que entre ambos contribuyen al 10

temblor de las ballicas (FLETCHER et al., 1999). Este alcaloide afecta principalmente a ovejas, pero también lo hace a bovino, caballos y ciervos (MORTIMER y DI MENNA, 1985). También puede llegar a producir stress bovino (FLETCHER et al., 1999) que se manifiesta como una disminución en la ganancia de peso, disminución en la producción de leche, salivación excesiva, aumento de la tasa respiratoria y aumento de la temperatura rectal (HEMKEN et al., 1984). También pueden atribuirse los siguientes problemas a la intoxicación por endófito como: problemas en las extremidades como gangrena o bien cojeras (GARNER y CORNELL, 1978; HEMKEN et al., 1984). Las peraminas que son pirrolpirazinas, son las responsables de dar tolerancia al ataque de L. bonariensis que es el gorgojo argentino de las ballicas (ROWAN et al., 1990).

CUADRO 1 Niveles y tipo de alcaloides presentes en cultivares de ballica inglesa.

Alcaloide Sin endofito Natural NEA2 AR1 AR5 AR37 Peramina Cero Alto Alto Alto Alto Cero Lolitrem B Cero Alto Alto Cero Cero Cero Ergovalina Cero Alto Bajo Cero Bajo Cero Janthitrems Cero Cero Cero Cero Cero Alto FUENTE: Adaptado de DEMANET (2008).

2.3.7.1 Endófito AR1. Este es un hongo endófito el cual tiene la particularidad de no producir lolitrem B ni ergovalina, pero si produce suficiente peramina (LANUZA et al., 2003). Con el fin de tener un eficiente control de L. bonaeriensis (POPAY et al., 1999), pero a la vez evitar los problemas que los otros alcaloides le producen en forma negativa a la salud animal (FLETCHER, 1999). Ensayos realizados con ovinos han demostrado que el uso de AR1 presenta diversas ventajas respecto a las ballicas con endofito normal. Hay un incremento en el nivel de prolactina, menor tasa de respiración, menor temperatura corporal, mayor tasa de crecimiento, mayor ganancia de peso y disminución del temblor muscular (DEMANET, 2007).

2.3.7.2 Endófito AR37. En la selección que se ha ido realizando a lo largo del tiempo se aisló una cepa de endófito que recibe el nombre de AR37 que tiene la particularidad 11

de no producir ninguno de los alcaloides antes mencionados, pero que a pesar de ello, le da tolerancia al ataque de L. bonaeriensis (POPAY y WYATT, 1995), debido a que posee un alcaloide llamado janthitrems. Este alcaloide es producido por Penicillium janthinellum siendo tóxico para los animales. Recientemente en Nueva Zelanda se ha encontrado una cepa de N. lolli que puede producir janthitrems que no son tóxicos para la salud animal (GALLAGHER et al., 1980). No presentaría ningún efecto adverso en el metabolismo animal y en caso de que se produjera algún efecto, estos serian en forma transitoria y leve, pero si controlaría a una serie de insectos plaga (AGRICOM, 2006).

Este es un nuevo endófito proveniente de Nueva Zelanda que tiene la particularidad de poseer cierto alcaloide que no se encuentra en ninguna otra asociación plata-endófito. Esta cepa de N. lolii no produce ergovalina, lolitremos y peramina, pero si janthitrems (DEMANET, 2008).

Tipo de endófito

FIGURA 2 Efecto del endófito AR 37 en la producción de macollos en ballica inglesa. FUENTE: Adaptado de AGRICOM (2006).

En la Figura 2 se ve la diferencia en la producción de macollos por metro cuadrado de superficie en comparación de un hongo endófito AR37 y un hongo endófito normal. 12

El endófito AR37 controla en Nueva Zelanda cinco de las más importantes plagas que afectan las praderas de ese país. Dentro de las cuales se encuentran L. bonariensis (Gorgojo argentino de la ballica), Heteronychus arator Fabr (Escarabajo Negro), Aploneura lentisci Pass (Afido de la raiz), Balanococcus poae Mask(Cochinilla de los pastos) y W. cervinata (Porina). Siendo esta última, una cuncunilla de la familia , de la misma familia del complejo de larvas del género Dalaca que son conocidas en Chile como cuncunillas negras de las praderas (ARTIGAS, 1994).

FIGURA 3 Plagas controladas por el endófito AR37 en Nueva Zelanda. FUENTE: Adaptado de AGRICOM (2006).

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2.3.8 Determinación del hongo endófito. Para determinar el porcentaje de plantas infectadas o el nivel de endófito en la pradera es necesario saber cuantas semillas infectadas hay, ya que es la única forma de predecir cuánto va a haber en la pradera al final del cultivo. Por esto es necesario realizar un análisis para determinar cuantas semillas infectadas hay. Este análisis se desarrolla mediante la observación al microscopio con la técnica descrita por CLARK et al., (1983), utilizando como elemento principal la tinción de Rosa de Bengala.

2.3.9 Ballica perenne cultivar Extreme. Este cultivar de ballica perenne tiene su origen en Nueva Zelanda, la cual ha sido creada y evaluada por semillas Wrightson, desde el año 2002. Salió al mercado en el año 2007, una vez comprobada su alta capacidad productiva, crecimiento invernal y destacado desarrollo de macollos. Es una ballica diploide de floración precoz, con hábito de crecimiento semi-erecto y de hojas de tamaño mediano.

Esta ballica está disponible en tres modalidades: sin endófito para aquellas zonas donde no existe el problema de ataque del gorgojo argentino de las ballicas (L. bonaeriensis), con endófito AR1 para zonas con antecedentes del ataque de este insecto, y por último con endófito AR37, el cual tiene la particularidad de presentar un alcaloide llamado janthitrems, el cual genera protección al ataque de otros insectos y a la vez no provoca problemas de temblor muscular, ni pérdida de productividad en los animales ( DEMANET, 2008).

2.4 Las larvas de hepialidos como plagas agrícolas En general las larvas de hepialidos no constituyen plagas de importancia agrícola. En el hemisferio sur, sin embargo, existen especies pertenecientes a los géneros Wiseana (Nueva Zelanda), Dalaca (Chile), Oxycanus y Oncopera (Australia, Tasmania), que causan importantes daños a los cultivos (NIELSEN et al., 2000). En Chile el complejo del género Dalaca ataca las praderas y está ampliamente distribuida y en gran número a nivel nacional y representa un gran problema por la baja considerable de la producción de forraje como alimento animal (GAJARDO, 1964).

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2.4.1 Ciclo biológico y control de Wiseana cervinata usando endófitos en ballica en Nueva Zelanda. La porina es una especie de cuncunilla endémica de Nueva Zelanda que es de suma importancia por los efectos que produce sobre las praderas de ese país, por el hecho de alimentarse de las especies que la componen, siendo considerada una de las principales plagas de praderas (BARRATT et al., 1991; DUGDALE, 1994). Esta especie vive en el suelo en sus estados larvarios en túneles que construye con el fin de introducirse en las horas de luz y sale a comer a la superficie en la noche haciéndolo en la base del forraje.

En estado adulto la porina vuela pero no con la finalidad de buscar alimento sino de poner huevos sobre la superficie de las praderas en una cantidad superior a los 3000 huevos, en los meses entre octubre y enero en dicho país. Para efectos de control de la porina en Nueva Zelanda se han investigado diferentes métodos de control, que incluyen nemátodos y hongos entomopatógenos (VAN DER MESPEL et al., 1986; NELSON et al., 1996). Las ballicas con cepas de endófito (N. lolii) que producen janthitrems, pueden reducir la sobrevivencia y crecimiento de larvas de porina, aunque los efectos de las diferentes cepas parece ser variable (JENSEN y POPAY, 2004).

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Ciclo de la porina

Polillas/huevo Pupa Primavera/Verano

Daño Abril-Octubre

Cuncunillas 8-9 estadios

FIGURA 4 Ciclo biológico de Wiseana cervinata. FUENTE: AGRICOM (2006).

2.4.2 El complejo de larvas de cuncunillas negras que infestan praderas en el sur de Chile. Dentro de los lepidópteros que se encuentran en Sudamérica, los que tienen alguna implicancia económica por el hecho de que producen algún tipo de alteración al medio agrícola tenemos los del género Dalaca (Walker 1856), dentro de los cuales se encuentran una serie de especies como son, D. crocatus (Ureta, 1956), D. chilensis (Viette, 1950), D. quadricornis Nielsen y Robinson, 1983, D. nigricornis Walker, 1856, D. patriciae Nielsen y Robinson, 1983, D. laminata Nielsen y Robinson, 1983, D. fuscus (Mabille, 1885), D. postvariabilis Nielsen y Robinson, 1983, D. variabilis (Viette, 1950) y por último, la especie D. pallens (Blanchard, 1854). (SCHMIDT y ROBINSON, 1983). Tres de estas especies constituyen plagas de praderas en el sur de Chile: D. pallens, D. chiliensis y D variabilis.

2.4.3 Dalaca pallens. Esta especie corresponde al complejo de insectos conocidos como cuncunillas negras. Es un lepidóptero de la familia de los hepialidos (GAJARDO, 1964), que vive al interior del suelo (CABALLERO, 1955). Durante sus fases larvarias 16

habita en túneles revestidos de seda que van desde 10 a 15 centímetros de profundidad (ISLA, 1959), pudiendo llegar hasta 20 cm de profundidad (SCHMIDT y ROBINSON, 1983). Las larvas salen a alimentarse durante la noche, consumiendo principalmente la parte área de la planta (CABALLERO, 1955). Las principales especies afectados por esta plaga son: trébol rosado (Trifolium pratensen L., pasto ovillo (Dactylis glomerata L. y ballica inglesa (Lolium perenne L.) (ISLA, 1959). También se señala que son afectadas la festuca, trigo y pasto miel (ARTIGAS, 1994). El periodo larvario se extiende a 10 meses, y éstas al momento de nacer pueden secretar una seda finísima con la cual recubren los túneles donde viven (IHL, 1947). Las larvas que se encuentren en los últimos estadios larvarios se ubican al final del túnel o galería donde habitan, para que ahí ocurra la pupación y luego convertirse en Imago entre 28 y 32 días después (GAJARDO, 1964). Los adultos aparecen en los meses de verano y otoño (enero a abril) (ARTIGAS, 1994), teniendo un vuelo crepuscular y nocturno (GAJARDO, 1964), que va desde comienzos de enero hacia fines de marzo, teniendo un máximo de actividad de vuelo entre principios de febrero y principios de marzo (SCHMIDT y ROBINSON, 1983). Los adultos tienen una envergadura alar de entre 25,0 y 35,0 mm, para los machos y para las hembras adultas corresponde entre 35,0 y 45,0 mm (SCHMIDT y ROBINSON, 1983). Las alas son de color castaño claro hasta un gris oscuro con manchas blanquecinas en la base de éstas, en forma de pequeñas líneas (ARTIGAS, 1994). Cada hembra de esta especie tiene la particularidad de poner hasta 2000 huevos de un milímetro de longitud como máximo y lo realizan principalmente al voleo liberándolos cuando realiza el vuelo sobre la superficie del suelo (IHL, 1947). Es una especie univoltina (LOYD et al., 1966 y 1967). Los huevos son algo alargados y de color blanco al inicio, tornándose de color negrusco posteriormente, adquiriendo cierto brillo (IHL, 1947).

CABALLERO (1955), afirma que un total de 70 larvas de cuncunillas por metro cuadrado constituyen una densidad peligrosa para la pradera afectada. Este autor asegura que los destrozos causados por el ataque de cuncunillas son confundidos con el daño ocasionado por heladas o con los originados por un fuerte o excesivo talajeo animal.

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La cuncunilla ataca durante la noche las partes áreas de la planta, principalmente el cuello y las zonas vecinas, también se alimentan de brotes tiernos que salen desde el suelo o que emergen de las partes bajas de las plantas. Como respuesta de lo anterior las plantas se secan en la zona del ataque y así se pueden ver diversas manchas en el campo con características de vegetación seca en sectores, contrastados por los sectores verdes no atacados por la plaga (GAJARDO, 1964).

Esta es una plaga que se encuentra en Chile desde la Cuarta a la Undécima Región (ARTIGAS, 1994) en las zona de Bíobío, Concepción, Ñuble, Maule, Talca, Santiago, Valparaíso y Coquimbo (SCHMIDT y ROBINSON, 1983). Las mayores poblaciones se presentan entre la Novena y la Décima Región (ARTIGAS, 1994). Como en áreas de Chiloé, Llanquihue, Osorno, Valdivia, Cautín y Malleco (SCHMIDT y ROBINSON, 1983).

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3 MATERIAL Y MÉTODO

3.1 Material En esta sección se indican y describen los materiales usados en los ensayos de laboratorio, análisis de las muestras y características del material biológico usado.

3.1.1 Ubicación del ensayo. El presente estudio fue llevado a cabo en el Invernadero y Laboratorio de Entomología del Instituto de Producción y Sanidad Vegetal, Facultad de Ciencias Agrarias, pertenecientes a la Universidad Austral de Chile, Campus Isla Teja, comuna de Valdivia. Ciudad ubicada en los 39º 38` de latitud sur, con 73º 5` de longitud oeste, a una altitud media de 19 metros sobre el nivel del mar.

3.1.2 Duración del estudio. El estudio se realizó entre marzo y octubre de 2008

3.1.3 Material vegetal. Se utilizó el cultivar Extreme de L. perenne, sin y con presencia de diferentes cepas del hongo endófito (N. lolii). Una primera condición correspondió a la ballica perenne sin endófito (testigo), una segunda condición a ballica perenne infestada con el endófito AR1 y una tercera condición a semillas del mismo cultivar infestadas con el endófito AR37.

3.1.4 Material animal. Las larvas de cuncunilla negra pertenecientes al género Dalaca, fueron obtenidas de praderas naturalizadas de la Estación Experimental Santa Rosa, propiedad de la Universidad Austral de Chile.

3.1.5 Materiales de laboratorio e invernadero. Se utilizaron los siguientes materiales: Vasos plásticos de 3,8 cm de altura y 3,8 cm de diámetro; aserrín de mañio; suelo Andisol de la serie Valdivia, tamizado; pizetas para regar las parcelas experimentales; agua potable de la red de la Universidad Austral de Chile; tijeras; pinzas y maceteros de 1 y 5L de capacidad.

3.1.6 Instrumentos. Se utilizaron los siguientes instrumentos: lupa estereoscópica, marca Carl Zeiss. Se utilizó un aumento de 10x5; balanza analítica, marca Sartorius de sensibilidad de 0,1 mg. 19

3.2 Métodos A continuación se describe la metodología usada para la realización de los ensayos.

3.2.1 Descripción de los ensayos. Se realizaron paralelamente dos ensayos, uno de alimentación de cuncunillas negras con follaje de plantas de ballica perenne cortadas mecánicamente y otro de alimentación directa de las cuncunillas negras sobre plantas de ballica perenne. En primera instancia se describen las metodologías que fueron iguales en ambos ensayos.

3.2.1.1 Recolección de las larvas de cuncunilla negra. Las larvas fueron colectadas desde praderas naturalizadas de la Estación Experimental Santa Rosa, para ello se procedió a extraer el suelo con un pala recta hasta una profundidad de 20cm. El suelo fue revisado en el campo con la precaución de generarles el menor daño posible a las cuncunillas. Las larvas fueron colocadas en envases individuales para ser transportadas al laboratorio. En el laboratorio se les midió la cápsula cefálica y se pesó cada una de las larvas. Con esta información se seleccionaron larvas uniformes en cuanto a peso y estadio de desarrollo.

3.2.1.2. Determinación del estadio larval de las cuncunillas. Para determinar el estadio larval de las cuncunillas negras, se midió el ancho de la cápsula cefálica de las larvas mediante una lupa estereoscópica con ocular graduado. Para establecer el estadio se consideró una cápsula cefálica inicial de 0.3 mm y se aplicó la regla de Dyar que establece que la cápsula cefálica de las larvas crece geométricamente por raíz cuadrada de 2 (WIGGLESWORTH, 1972).

3.2.1.3. Ensayo 1: Alimentación de las larvas de cuncunilla negra con follaje de plantas de ballica perenne cortadas mecánicamente. Para disponer del follaje de ballica requerido, en este ensayo se sembraron 9 maceteros de 5 litros de capacidad. Tres maceteros con ballica sin endófito y tres con cada una de las cepas de endófito. Los maceteros fueron mantenidos en invernadero para darle condiciones adecuadas para su crecimiento. De estas plantas se obtuvo el follaje de las ballicas, que se cortó con una tijera y con el cual se alimentaron larvas individuales de cuncunilla negra. Las larvas fueron mantenidas en laboratorio bajo condiciones controladas, estando 20

sometidas a 15ºC y un fotoperiodo de 16/8 horas. Las larvas se colocaron individualmente en contenedores con aserrín de mañío de 3,8 cm de profundidad. Se alimentaron día por medio y cada dos días se registró la mortalidad de las cuncunillas negras en los distintos tratamientos.

El número de cuncunillas que se utilizaron en este ensayo fue de 90 cuncunillas, es decir, un total de 30 cuncunillas por tratamiento.

3.2.1.4 Ensayo 2: Alimentación directa de las cuncunillas negras sobre plantas de ballica perenne. Para este ensayo se sembraron con ballica perenne 135 maceteros de un litro de capacidad. De ellos 45 fueron sembrados con cada tipo de ballica cv. Extreme, sin endófito, endófito cepa AR1 y endófito cepa AR37 (las semillas fueron suministradas por ANASAC, al igual que en el ensayo anterior). Se usaron tres fechas de evaluación y en cada fecha se evaluaron destructivamente 15 maceteros de cada tratamiento. El día 30 de junio a cada macetero se le incorporó una cuncunilla (135 unidades en total). Los maceteros fueron cubiertos con otro envase transparente del mismo tamaño y forma de manera tal de evitar que las cuncunillas escapasen con el fin de que estás permanecieran al interior del envase. Esta cubierta presentó perforaciones en su parte superior para permitir la circulación de aire y el riego de los maceteros.

El suelo usado fue un Andisol (serie Valdivia), obtenido de los primeros 20 cm de una pradera con buen nivel de fertilidad de la Unidad Experimental Vista Alegre propiedad de la Universidad Austral de Chile.

3.2.1.5 Variables evaluadas. Las variables evaluadas fueron las siguientes: Ensayo 1: • Mortalidad de larvas de cuncunilla negra en cada tratamiento. Para ello se registró el número de cuncunillas muertas cada dos días. Esto fue posible dado que al ser una alimentación controlada en placas, las larvas estaban visibles en todo momento. Este ensayo fue realizado en el Laboratorio de Entomología de la Universidad Austral. 21

• Tamaño y peso de las cuncunillas vivas al iniciar y finalizar el ensayo, Todas las larvas vivas fueron pesadas y medidas al finalizar el periodo de alimentación artificial. Este periodo finalizó el 3 de septiembre de 2008.

Ensayo 2: • Después de incorporadas las larvas a los maceteros en tres fechas determinadas se destruyeron 15 maceteros tomados al azar de cada tratamiento y se evalúo el número de larvas vivas, se pesaron y midieron unitariamente el tamaño de la cápsula cefálica de las larvas que presentaron sobrevivencia a esa fecha. Las fechas establecidas correspondieron al 13 de Agosto como primera fecha de evaluación, la segunda evaluación correspondió el 9 de Septiembre y por último la tercera evaluación se realizó el 3 de Octubre del año 2008.

3.2.1.6. Diseño experimental y Análisis de resultados. Para verificar si la tasa de mortalidad de las larvas de cuncunillas para los distintos tratamientos fue diferente, se realizó una prueba de Chi cuadrado, tomando como referencia la prueba de Chi cuadrado para dos variables independientes del libro “Estadística no paramétrica” de Sidney Siegel (SIEGEL, 1956).

Para el ensayo 1 (de laboratorio) se utilizó un diseño completamente al azar con tres tratamientos y 30 repeticiones. Se utilizó el peso inicial como covariable. En el ensayo 2 (de maceteros) se utilizó un diseño experimental de bloques completos al azar generalizado con una covariable.

Los datos de las cuncunillas vivas fueron sometidos a análisis de varianza a través del programa estadístico SAS. Se usó un nivel de significancia del 5%. Para los casos donde existió diferencia significativa se utilizó la prueba de comparación de medias de Duncan para verificar las posibles diferencias estadísticas.

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Modelo Estadístico

a) Diseño completamente al azar con una covariable:

Yijk = µ + Ti + β(Xi – X) + eijk

Yij = Variables dependientes (peso, medida cápsula cefálica, estadios) µ = Efecto de la media poblacional

Ti = Efecto del i-ésimo tratamiento (I = 1,2,3) β(Xi–X) = Efecto de la covariable (peso inicial y diámetro cefálico inicial) eij = Efecto del error experimental

b) Diseño bloques completos al azar generalizado con una covariable:

Yijk = µ + Ti + Bj + (TB)ij + β(Xi – X) + eijk

Yijk = Variables dependientes (peso, medida cápsula cefálica, estadios) µ = Efecto de la media poblacional

Ti = Efecto del i-ésimo tratamiento (I = 1,2,3)

Bj = Efecto del j-ésimo bloque (fechas de medición) (j = 1,2)

(TB)ij = Efecto de la interacción tratamiento por bloque β(Xi–X) = Efecto de la covariable (peso inicial y diámetro cefálico inicial) eijk = Efecto del error experimental

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4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El efecto de la presencia y tipo de endófito (AR1 y AR 37), en ballica perenne cultivar Extreme, sobre larvas de D pallens, se evalúo para ambos tipos de ensayos a través de la mortalidad larval, peso final de las larvas y estadio de desarrollo. Los resultados de los dos ensayos se presentan separadamente para cada una de las variables medidas.

4.1 Ensayo 1: Alimentación de las larvas de cuncunilla negra con follaje de plantas de ballica perenne cortadas mecánicamente.

En este experimento las larvas fueron alimentadas con la parte aérea de la planta, que se proporcionó una vez cortada de la planta. Esta situación pudo ser distinta al ensayo dos en que las plantas fueron consumidas directamente por las larvas, sin embargo, atendiendo a que las larvas de cuncunillas negras transportan material a sus galerías, esto no debiera haber sido un inconveniente en su consumo y sobrevivencia.

4.1.1 Mortalidad larval. De acuerdo a los datos obtenidos se observa que, con un nivel de significancia de 0,05, la tasa de mortalidad de las larvas de cuncunilla negra fue similar para los tres tratamientos en el ensayo desarrollado en el laboratorio (el valor de Chi cuadrado calculado fue 0,29 y el tabulado con un margen de error de 5% fue 5,99). También es importante mencionar que el valor del coeficiente de contingencia (SIEGEL, 1956) obtenido fue de 0,0563, igualmente no significativo.

Los resultados obtenidos indican que las larvas no mostraron una tasa de mortalidad diferente entre los tratamientos. La ausencia de un efecto del endófito AR37 en D. pallens, el cual ha sido efectivo en W. cervinata, una especie de la misma familia que también infesta praderas en Nueva Zelanda, puede deberse a diversos factores; uno de ellos podría ser la ausencia de receptores del alcaloide en D. pallens o bien su presencia en menor número lo cual afectaría la posibilidad de causar mortalidad (GORDON et al., 1996), una segunda causa pudiera estar en la capacidad de detoxificar el compuesto a través de monooxigenasas (URLACHER y EIBEN, 2006) o 24

glutatión S transferasas principalmente (HAYES y PULFORD, 1995). Una tercera causa pudiera estar en la presencia de barreras físicas que impidan llegar a los compuestos del alcaloide del endofito a su sitio de acción (HIGGINS, 2007). También no se descarta que existá una falta de afinidad por parte de los receptores al alcaloide, es decir, que los receptores hayan logrado evolucionar o simplemente no se ven alterados por la interacción del hongo endófito (VAN RIE et al., 1990). Es posible que estas diferentes causas puedan actuar conjuntamente para evitar la mortalidad de las larvas. Tampoco es posible descartar que el efecto de la toxina (alcaloide), se presente en los estadios iniciales del estado larval cuando la cantidad de tóxico por peso de la larva es generalmente menor, por ello aunque el consumo de la larva es menor su efecto puede ser mayor, cosa que no ocurrió en este ensayo en que las larvas utilizadas correspondían a los estadios 4 y 5 al inicio del ensayo.

4.1.2 Efecto de los tratamientos en el incremento en peso de las larvas. Los resultados del Cuadro 2 muestran que las larvas en los distintos tratamientos presentaron pesos estadísticamente similares al término del ensayo y los incrementos en peso en el período para ambos endófitos y para el testigo sin endófito fue similar (P> 0.05).

CUADRO 2 Peso (g) de larvas de cuncunillas negras en el ensayo de laboratorio. Tratamientos Peso inicial Peso final Diferencia de peso Sin endófito 0,03±0,02b 0,06±0,04a 0,03±0,03ª AR1 0,04±0,02ab 0,08±0,03a 0,04±0,02ª AR37 0,05±0,02ª 0,08±0,03a 0,03±0,03ª Significancia 0,0206 0,1694 0,7865 Los valores dentro de columnas, seguidos de diferente letra, presentan diferencias estadísticamente significativas (Duncan, 5%).

El peso inicial en el Cuadro 2, se tomó como covariable, con el fin de que se comporte como variable homogénea dentro del análisis, para darle mayor precisión al estudio. A 25

pesar de que aparece en el cuadro 2 como una variable que presenta diferencias significativas.

En cuanto al peso final de las larvas de cuncunillas se observa que no existió diferencia significativa entre los diferentes tratamientos, esto quiere decir de que en ninguno de los tres tratamientos las cuncunillas pesaron más al momento de realizar la evaluación, en otras palabras, es que estadísticamente los resultados obtenidos en cuanto al peso final fueron iguales. En este sentido es importante mencionar el alto coeficiente de variación que fue de 66,7% para el tratamiento sin endófito, de un 37,5% para el tratamiento AR1 y por último de un 37,5% para el caso del tratamiento AR37, teniendo la particularidad de que mientras mayor sea este coeficiente mas probabilidades hay de que no se encuentre diferencia significativa por el hecho de haber una gran variabilidad dentro de los tratamientos. Estos niveles de variabilidad son altos para un ensayo de ambiente controlado, pero se explican por la alta mortalidad natural de las larvas de cuncunilla negra (CARRILLO, 2009).

Para el caso de la diferencia de peso, que corresponde a la diferencia del peso final e inicial, claramente se puede notar que no existió diferencia estadísticamente significativa entre los tres tratamientos. Esta falta de diferencia podría estar explicada por el alto coeficiente de variación encontrado que fue en el tratamiento sin endófito de un 100%, para el tratamiento AR1 de un 50% y por último para el tratamiento AR37 de un 100%. Por lo que debido a su alto coeficiente de variación para los tres tratamientos existe una gran dispersión de los datos al interior, debido a la gran variabilidad dentro de los grupos.

4.1.3 Efecto de los tratamientos en la velocidad de desarrollo de las larvas de cuncunillas negras. La velocidad de desarrollo de las larvas tampoco se vió afectada por los endófitos. Podría parecer que las larvas que consumieron plantas con el endófito AR1 tuvieron una mayor velocidad de desarrollo pues su valor fue estadísticamente diferente al sin endófito y al con endófito AR37, sin embargo este valor más alto es producto de que la cápsula cefálica se incrementa por raíz cuadrada de 2 y al tener un mayor valor al inicio, al final el valor también es mayor.

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El Cuadro 3 presenta los resultados de las medidas de la cápsula cefálica de las larvas al inicio y término de la etapa de evaluación. En este caso se tomó la variable de la cápsula cefálica inicial como covariable con el fin de dar más precisión al estudio y permitir que todos los tratamientos partan de la misma base y poder hacerlos comparables en cuanto a los resultados. Esto considerando que los valores mostrados en el Cuadro 3 para el caso de la medida de la cápsula cefálica inicial indican que existieron diferencias significativas entre tratamientos y que ésta es entre el tratamiento sin endófito (b) y los con presencia de endófito AR1 (a) y AR37 (a).

CUADRO 3 Medidas (mm) cápsula cefálica de larvas de cuncunillas negras. Tratamientos Cápsula cefálica inicial Cápsula cefálica final Sin endófito 1,58±0,30b 2,34±0,42ª AR1 1,70±0,18a 2,35±0,32ª AR37 1,82±0,28a 2,51±0,28ª Significancia 0,0019 0,2652 Los valores dentro de columnas, seguidos de diferente letra, presentan diferencias estadísticamente significativas (Duncan, 5%).

Para el caso de la medida de la cápsula inicial existió diferencia significativa, lo que es un problema engorroso por no poder darle homogeneidad al inicio del ensayo. Sin embargo, este hecho se produjo al azar al momento de separar las cuncunillas para los tres diferentes tratamientos. Por esta razón es que se tomó esa variable como covariable.

En el Cuadro 3 se observa adicionalmente que para la medida de la cápsula cefálica final de las larvas de cuncunillas negras no existió diferencia significativa debido a que el valor de significancia es superior al 5%. A pesar de que estadísticamente no existió diferencias significativas entre los tratamientos el coeficiente de variación no fue muy alto siendo para el tratamiento sin endófito de un 18%, para el tratamiento AR1 de un 14% y por último para el tratamiento AR37 de un 11%.

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Las variables del Cuadro 4 corresponden a los estadios larvarios, iniciales y finales los cuales se expresan como números enteros. Sin embargo, para efectos de este estudio se indican como promedios con decimales, solo para tener una noción de los resultados y una tendencia de los tratamientos. Por lo que se compara entre tratamientos, para ver la evolución de las cuncunillas.

CUADRO 4 Estadios larvarios de las cuncunillas negras. Tratamientos Estadio inicial Estadio final Sin endófito 5,08±0,67b 6,42±0,67ª AR1 5,47±0,52a 6,33±0,49ª AR37 5,64±0,63a 6,64±0,50a Significancia 0,0005 0,23 Los valores dentro de columnas, seguidos de diferente letra, presentan diferencias estadísticamente significativas (Duncan, 5%).

En el Cuadro 4 se ve que para las variables del estadio inicial, estadísticamente si existen diferencias significativas, ya que dos de los tres tratamientos son iguales entre si, siendo en este caso el tratamiento de AR1 (a) y AR37 (a). No así para el caso del tratamiento sin endófito (b) que se escapa de la igualdad y es diferente a los otros dos. Esto se debe a que esta variable (Estadio inicial) es determinada por la medida de la cápsula cefálica inicial, que tiene su explicación analizando esta variable anterior ya que la medida de la cápsula cefálica inicial también presenta diferencia significativa entre tratamientos. Igual que en el caso anterior fue utilizada como covariable.

Para el caso del estadio final, no existió diferencia significativa entre los tres tratamientos. La desviación estándar mientras mayor sea, hay más posibilidades de que no exista diferencia significativa y eso es debido a que aumenta el coeficiente de variación y con eso hay más variación dentro del margen estudiado.

4.2 Ensayo 2: Alimentación directa de las cuncunillas negras sobre plantas de ballica perenne.

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En forma paralela al ensayo en que se suministro follaje de la parte aérea a las larvas de D. pallens, se realizó otro ensayo en que se permitió a las larvas alimentarse directamente de las plantas. Este ensayo pudo corregir problemas de falta de un suministro adecuado de follaje tanto en cantidad (las larvas comen más al crecer más, por su mayor tamaño corporal) como en calidad, lo cual podría haber enmascarado el efecto de los alcaloides.

4.2.1 Mortalidad de larvas. Previamente a cualquier análisis de varianza realizado se realizó una prueba de Chi cuadrado para verificar si existió diferencia significativa en la tasa de mortalidad de las larvas de cuncunillas entre los diferentes tratamientos. Como resultado de la prueba del Chi cuadrado realizada para el caso del ensayo correspondiente a los maceteros en el invernadero la prueba entregó los siguientes resultados: Para la fecha 1 realizada el 13 de agosto el resultado de la prueba del Chi cuadrado entrega un valor de 1,68, y el valor del coeficiente de contingencia fue 0,1899. Con lo cual se verifica que la tasa de mortalidad de larvas de cuncunillas fue igual para los tres tratamientos estudiados. Para la fecha 2 realizada el 9 de septiembre el valor de la prueba del Chi cuadrado, entrega un valor de 1,8, y el valor del coeficiente de contingencia fue 0,1961. Con lo cual también se deduce que la tasa de mortalidad de larvas de cuncunillas fue igual para los tres tratamientos.

Los resultados concuerdan con los obtenidos en las pruebas con forraje cortado. Las explicaciones para explicarlos, ya fueron dadas en el punto 4.1.1.

4.2.2 Efecto de los tratamientos en el peso de las cuncunillas negras. En el Cuadro 5 se presentan los resultados del peso inicial, final y diferencia de peso de las cuncunillas negras alimentadas con ballica perenne con la condición sin endófito, AR1 y AR37, para el ensayo 2 y la fecha del 13 de Agosto que es cuando se realizó la primera evaluación destructiva de los maceteros. En este análisis se utilizó los valores iniciales como covariable, con esto se buscó hacer homogéneas las variable iniciales con el fin de saber que se está iniciando el ensayo en las mismas condiciones para los tres tratamientos. 29

CUADRO 5 Peso inicial, final (g/cuncunilla) y diferencia de peso de las cuncunillas negras el 13 de agosto. Tratamientos Peso inicial Peso final Diferencia de peso Sin endofito 0,04 ±0,02a 0,34±0,15a 0,31±0,14a AR1 0,03±0,01a 0,32±0,11a 0,29±0,11a AR37 0,04±0,03a 0,28±0,18a 0,24±0,16a Significancia 0,6166 0,5564 0,4751 Los valores dentro de columnas, seguidos de diferente letra, presentan diferencias estadísticamente significativas (Duncan, 5%).

El Cuadro 5 muestra que no existieron diferencias significativas en el peso inicial de las larvas, variando entre 0,033 en el tratamiento AR1 hasta 0,040 g/cuncunilla en el tratamiento AR37 y sin endófito. Esto muestra que las características de peso de las larvas al iniciar el ensayo no fueron diferente entre los tratamientos.

En este caso existió una gran variabilidad dentro de los tratamientos, con un coeficiente de variación del 50% para el tratamiento sin endófito, un 33,3% para el tratamiento AR1 y por último un 75% para el tratamiento del AR37. Al existir mayor variabilidad al interior de cada tratamiento es más difícil encontrar diferencia significativa entre ellos.

Para el peso final no existió diferencia significativa entre los tratamientos. En este caso existió una gran variabilidad dentro de los tratamientos, el coeficiente de variación para el tratamiento sin endófito fue de 44%, para el tratamiento AR1 de 34% y por último para el tratamiento AR37 correspondió a 64%. Por esta razón a pesar que los valores variaron entre 0,28 para el tratamiento AR37 hasta 0,34 g/cuncunilla para el tratamiento sin endófito, el análisis estadístico no detectó las diferencias.

Una situación similar se observó con los resultados de la diferencia de peso que muestran que no existe diferencia significativa en el cuadro 5. El coeficiente de 30

variación de los tratamientos sin endofito, AR1 y AR37 fue de 45%, 38% y 67%, respectivamente.

4.2.3. Efecto en la velocidad de desarrollo de las cuncunillas negras. El Cuadro 6 presenta el resultado de la medida de la cápsula cefálica inicial y final de las cuncunillas negras en el ensayo del invernadero para la primera evaluación del 13 de agosto, donde las larvas se alimentaron con ballica perenne con las tres condiciones de endófito. En este análisis se utilizó los valores de cápsula cefálica inicial como covariable.

CUADRO 6 Medida de la cápsula cefálica (mm/cuncunilla), inicial y final de las Cuncunillas negras en la evaluación del 13 de agosto. Tratamientos Cápsula cefálica inicial Cápsula cefálica final Sin endófito 1,32±0,26a 3,38±0,76b AR1 1,46±0,22a 3,90±0,58a AR37 1,30±0,30a 3,36±0,86b Significancia 0,1910 0,0199 Los valores dentro de columnas, seguidos de diferente letra, presentan diferencias estadísticamente significativas (Duncan, 5%).

En el Cuadro 6 se muestra que la medida de la cápsula cefálica inicial fue igual en los tres tratamientos, es decir, que al inicio del ensayo todas las cuncunillas se encontraban en el mismo estadio larval. A pesar de esta falta de diferencia y para mayor claridad del análisis esta variable fue tomada como covariable para hacerla homogénea al inicio del ensayo.

La medida de la cápsula cefálica final presentó diferencias significativas entre tratamientos. El tratamiento AR1 presentó el mayor valor con 3,9 mm y fue estadísticamente diferente a los tratamientos sin endófito y con endófito AR 37. Estos resultados estarían mostrando que la presencia del endófito AR37 no produjo un efecto depresor del crecimiento de las cuncunillas negras, dado que su desarrollo no fue 31

menor que en el tratamiento sin endófito. El mayor crecimiento que se obtuvo con el endófito AR1 podría deberse al mayor tamaño inicial. Los valores del coeficiente de variación para este caso son de 22,5% para el caso del tratamiento sin endófito, de un 14% para el tratamiento AR1 y de un 26% para el tratamiento AR37.

CUADRO 7 Estadio larvarios inicial y final de las cuncunillas negras en la Evaluación del 13 de agosto. Tratamientos Estadio inicial Estadio final Sin endófito 4,588±0,507b 7,412±0,795a AR1 4,789±0,419a 7,789±0,535a AR37 4,538±0,519b 7,385±0,768a Significancia 0,0002 0,0924 Los valores dentro de columnas, seguidos de diferente letra, presentan diferencias estadísticamente significativas (Duncan, 5%).

Los estadios larvales corresponden a números enteros, pero para efectos de este análisis se presentan los promedios, por esta razón los estadios figuran con decimales y se muestran sólo para tener una noción de los resultados y reflejar la tendencia de los tratamientos.

En el Cuadro 7 se ve que existió diferencia significativa para el caso de los estadios iniciales entre los diferentes tratamientos. Siendo el tratamiento AR1 superior a los otros dos, que son el sin endófito y AR37. Esta diferencia no es concordante con las otras medidas iniciales de las larvas como son el peso y tamaño de cápsula cefálica, donde no existieron diferencias significativas. En términos estrictos significa que las larvas del tratamiento AR1 presentaban al inicio del ensayo un mayor desarrollo que podría haber favorecido ese tratamiento. Sin embargo, en el estadio final no existió diferencias significativas entre los tratamiento.

En el Cuadro 8 se presentan los resultados del peso inicial, final y diferencia de peso de las cuncunillas negras alimentadas con ballica perenne con las tres condiciones de 32

endófito, durante la segunda evaluación realizada el 9 de Septiembre. En este análisis se utilizó los valores del peso inicial como covariable.

CUADRO 8 Peso inicial, final (g/cuncunilla) y diferencia de peso de las cuncunillas negras en la evaluación del 9 de septiembre. Tratamientos Peso inicial Peso final Diferencia de peso Sin endófito 0,04±0,02b 0,46±0,06a 0,42±0,06a AR1 0,03±0,01b 0,40±0,10a 0,38±0,10a AR37 0,07±0,04a 0,51±0,22a 0,44±0,18a Significancia 0,0298 0,3601 0,6121 Los valores dentro de columnas, seguidos de diferente letra, presentan diferencias estadísticamente significativas (Duncan, 5%).

En el Cuadro 8 se observa que para la variable de peso inicial existió diferencia significativa entre tratamientos, a pesar de existir una gran variabilidad dentro de los tratamientos, ya que el coeficiente de variación en este caso fue relativamente alto siendo para el tratamiento sin endófito de un 50%, para el tratamiento AR1 de un 33,3% y por último de un 57% para el tratamiento AR37. Es por eso que al igual que en el estudio de la fecha y ensayo anterior se toma la variable del peso inicial como covariable.

Para el peso final no existió diferencias significativas entre tratamientos entregando coeficientes de variación un poco menores para el caso del tratamiento sin endófito, de un 13%, de un 25% para el tratamiento del AR1 y por último de un 43% para el tratamiento AR37. Esto a pesar de que los valores de los promedios de los pesos finales fluctuaron entre 0.40 a 0.51 g/cuncunilla.

Lo mismo ocurrió para el caso de la diferencia de peso, observándose que no existió diferencias significativas entre tratamientos, a pesar de que el coeficiente de variación para el caso del tratamiento sin endófito es de un 14%, para el tratamiento AR1 de un 26% y por último para el AR37 de un 41%. 33

CUADRO 9 Medida de la cápsula cefálica (mm/cuncunilla), inicial y final de las cuncunillas negras en la evaluación del 9 de septiembre. Tratamientos Cápsula cefálica inicial Cápsula cefálica final Sin endófito 1,30±0,26a 4,06±0,36a AR1 1,39±0,26a 3,83±0,39a AR37 1,40±0,43a 4,50±0,76a Significancia 0,8420 0,0892 Los valores dentro de columnas, seguidos de diferente letra, presentan diferencias estadísticamente significativas (Duncan, 5%).

En el Cuadro 9 se muestra que la medida de la cápsula cefálica inicial no presentó diferencias significativas entre tratamientos. El coeficiente de variación que correspondió al tratamiento sin endófito es de un 20%, para el caso del tratamiento AR1 es de un 19% y para el tratamiento AR37 es de un 31%. Al igual que en los casos anteriores la cápsula cefálica inicial se utilizó como covariable para darle la misma connotación a todo el trabajo.

En el caso de la medida de la cápsula cefálica final tampoco se obtuvo diferencias significativas a pesar de que no existió una gran variabilidad entre tratamientos debido a que el coeficiente de variación es relativamente bajo, cercano a un 10%. Siendo de un 8,9% para el tratamiento sin endófito, de un 10% para el tratamiento AR1 y de un 17% para el tratamiento AR37.

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CUADRO 10 Estadios larvarios inicial y final de las cuncunillas negras en la evaluación del 9 de septiembre. Tratamientos Estadio inicial Estadio final Sin endófito 4,67±0,52a 8,00±0,00a AR1 4,67±0,52a 7,83±0,41a AR37 4,67±0,58a 8,33±0,58a Significancia 0,9244 0,1335 Los valores dentro de columnas, seguidos de diferente letra, presentan diferencias estadísticamente significativas (Duncan, 5%). En el Cuadro 10 se muestra que no existieron diferencias significativas en el estadio inicial de las larvas entre los tratamientos, esto permitió comenzar el ensayo con larvas de características similares.

Para el caso de los estadios finales tampoco se encontraron diferencias significativas entre tratamientos debido a que los valores obtenidos son muy similares entre los tratamientos. Lo anterior es influenciado por el hecho de que esta variable esta ligada a la medida de la cápsula cefálica final (Cuadro 9) y como esta no presentó diferencia significativa, determina así esta otra variable.

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5 CONCLUSIONES

Bajo las condiciones en que se realizó el presente estudio se puede concluir que:

• Se demostró que la presencia de la cepa AR1 y AR37 del hongo endófito (Neotyphodium lolii) en ballica perenne cultivar Extreme no produjeron un aumento en la tasa de mortalidad de larvas de cuncunilla negra de las praderas (Dalaca pallens).

• Lolium perenne cultivar Extreme que contiene el hongo endófito del tipo AR1 y AR37 no produjo efectos detrimentales sobre el crecimiento y desarrollo de larvas de cuncunilla negra, medidos en cambios de peso y dimensiones de la cápsula cefálica.

• Los resultados de este estudio sugieren que el comportamiento de la especie Dallada pallens sería diferente a la especie Neozelandesa “porina” (Wiseana cervinata), en su respuesta a la presencia del hongo endófito AR37 en ballicas perennes.

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