N° d’ordre : 47/2017-D/S.B

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE HOUARI BOUMEDIENE USTHB

FACULTE DES SCIENCES BIOLOGIQUES

THESE

Présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences

En Sciences Biologiques

Spécialité: Microbiologie de l’Environnement

Par Mme Yamina HADJ RABIA Epse BOUKHALFA

Sujet

Isolement et caractérisation de souches d’Actinobactéries mésohalophiles productrices de métabolites anti -cellulaires .

Soutenue publiquement, le 14/12/2017 , devant le jury composé de :

Mme LARABA DJEBARI Fatima Professeur à l’USTHB Présidente Mr HACENE Hocine Professeur à l’USTHB Directeur de thèse Mr ABDERRAHMANI Ahmed Professeur à l’USTHB Examinateur Mr CHELGHOUM Chabane Professeur à l’USTHB Examinateur Mr KECHA Mouloud Professeur à l’U.A.MBéjaia Examinateur Mr BENCHABANE Messaoud Professeur à l’U.S.D.Blida Examinateur Remerciements . Ce travail de thèse a vu le jour grâce à la contribution de plusieurs personnes de près ou de loin à qui je souhaiterais exprimer avec beaucoup d’enthousiasme mes plus vifs remerciements.

Je tiens tout d’abord à exprimer ma reconnaissance et ma profonde gratitude à mon Directeur de Thèse le professeur HACENE Hocine, pour la confiance qu’il m’a accordée en me proposant ce sujet de thèse passionnant. Je tiens à le remercier pour son écoute, sa grande disponibilité et ses précieux conseils. Son vaste savoir, sa sagesse, sa rigueur et surtout sa bienveillance ont été pour moi une source d’inspiration pour la finalisation de cette thèse. Qu’il trouve dans ce travail l’expression de mon profond respect.

Je tiens à remercier le professeur Robert DURAN, responsable de l’équipe Environnement et Microbiologie de l’université de Pau et des Pays de l’Adour pour sa générosité et pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire ainsi que le professeur Béatrice LAUGA, pour son aide et ses précieux conseils. J’ai été initiée à la biologie moléculaire grâce aux membres de cette équipe et plus particulièrement grâce à Solange KARAMA Ingénieur de laboratoire qui m’a orientée et guidée pas à pas et a été ma complice tout au long de mes stages. Je vous en suis très reconnaissante pour tout ce que vous m’avez apporté scientifiquement et humainement.

Je remercie vivement le professeur Hans-Peter KLENK, Doyen du School of Biology de l’université de Newcastle au Royaume Uni, un systématicien de renommée internationale pour sa grande générosité, sa modestie et sa précieuse collaboration. Qu’il trouve ici l’expression de ma grande gratitude pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et de m’avoir permis d’élargir mes connaissances dans le domaine de la « Systématique Bactérienne » auprès des membres de son équipe particulièrement Dr Maria Del Carmen Montero-Calasanz et Imen Nouioui.

J’adresse également mes remerciements les plus sincères au Dr Véronique EPARVIER, Directeur de Recherche à l’ICSN-CNRS de Gif sur Yvette pour son inestimable aide à la concrétisation de ce travail, sa grande disponibilité, sa gentillesse ainsi que pour ses grandes qualités scientifiques et humaines. Mon accueil au sein de son laboratoire a permis de m’initier à la chimie des substances naturelles ainsi qu’à l’utilisation d’une technologie de pointe en chimie analytique. Je lui suis très reconnaissante et sa contribution a été déterminante pour la finalisation de ce travail de thèse. Merci beaucoup Véronique tout ce que je pourrais t’écrire ne suffira pas pour exprimer ce que je ressens intérieurement.

J’adresse particulièrement mes remerciements à Mme le professeur Fatima LARABA- DJEBARI, Doyenne de la Faculté des Sciences Biologiques, de me faire l’honneur de présider le jury de ma soutenance de thèse après celui du mémoire de magister et pour l’intérêt qu’elle porte à ce travail en dépit de ses nombreuses occupations. Qu’elle reçoive l’expression de ma profonde gratitude.

Je suis particulièrement touchée et honorée par la présence du Professeur Ahmed ABDERRAHMANI en qualité d’examinateur au sein de ce jury de soutenance. Vous êtes un modèle pour moi et auprès de qui j’ai appris énormément de choses dans l’enseignement et la pédagogie ainsi que dans la recherche scientifique. Je vous en suis profondément reconnaissante pour tout.

Je remercie également les professeurs Chabane CHELGHOUM, Mouloud KECHA ainsi que Messaoud BENCHABANE d’avoir bien accepté d’évaluer ce travail de thèse. Je vous en suis reconnaissante.

Un grand merci s’adresse également au :

Professeur Farida NATECHE qui a été à mes côtés depuis mon intégration au sein du laboratoire. Merci de m’avoir toujours soutenue surtout pendant les moments difficiles que j’ai pu avoir, merci de m’avoir toujours protégée et tout le temps défendue et d’avoir été comme une deuxième maman pour moi, je n’oublierai jamais ce que tu as pu faire pour moi.

Docteur Amel Nabila BOUANANE-DARENFED pour sa grande disponibilité, son soutien ainsi que ses encouragements incessants qui ont été pour moi une source de force et de courage pour mener à bien ce travail de thèse. Merci Amel pour tout ce que tu as pu me procurer et merci d’être ma complice dans notre chaleureux petit box. Au docteur Inès QUADRI-TOUNSI, merci pour ton soutien, pour ta précieuse aide, tu as su m’accompagner et m’épauler ces derniers mois sans retenue. Sache que je n’oublierai jamais ce que tu as fait pour moi.

Au docteur Ikram HASSANI-BELKACEM, merci pour ta disponibilité et merci pour avoir toujours répondu positivement à mes sollicitations. Ton sourire et tes encouragements ont été pour moi une force qui m’aidait à aller de l’avant.

Merci au Docteur Rima MEKNACI-MENAD pour avoir été ma grande complice pendant plusieurs années et de m’avoir accompagné sur la paillasse en rendant les difficultés du travail moins pénibles à supporter. Ces grands moments de complicité se font rares de nos jours Rima……

Je remercie également Dr Okba SELAMA, pour son inestimable aide et accompagnement surtout pour les analyses bioinformatiques. Tu as été à mon secours à chaque fois que j’en avais besoin, sache que je te suis profondément reconnaissante.

Un grand merci pour mon amie et collègue le Dr Kenza ANTRI, pour tous ses encouragements et sa disponibilité.

Une pensée particulière au Professeur Yahia KACI pour son écoute attentive ainsi que pour tous ses encouragements.

Mes chaleureux remerciements s’adressent aussi aux autres membres du laboratoire de microbiologie de la FSB, Dr Yamina BENMALEK, Lila MADOUR, Dr Amina Abbas, Dr Meriem Amziane, Dr Lydia Djouadi, Dr khelifa Bouacem et Lynda Bentayeb sans oublier bien sûr tous mes anciens étudiants actuellement doctorants au sein du laboratoire : Fairouz, IKram, Sara, Hanane et Faouzi. Merci pour votre bonne humeur et pour tous vos encouragements.

Une mention spéciale pour Assia Ameur, notre ingénieur de laboratoire de Microbiologie de la FSB, pour toute la convivialité et les très jolis moments de partage qu’elle nous procure depuis son arrivée au laboratoire. Je voudrais également remercier mes ami(e)s et collègues, Aicha, Nesrine, Nadia, Lineda et Khadidja.

Je ne pourrai pas finir sans adresser mes remerciements à tout le personnel de la Faculté des Sciences Biologiques Responsables, Enseignants et Administrateurs ainsi qu’à tous mes enseignants qui ont participé à ma formation académique.

Que toute personne que j’ai omis de remercier me pardonne ce n’est qu’un oubli……..

Merci à tous

Dédicaces

Je dédie ce modeste travail :

À la mémoire de mes grands-parents maternels et paternels.

À mes très chers parents sans qui je ne serai jamais arrivée au stade auquel j’y suis aujourd’hui. Je ne les remercierai jamais assez pour leur soutien, leurs encouragements, leurs sacrifices et surtout pour l’amour qu’ils m’apportent tous les jours. Maman et Papa tout ce que je pourrais vous écrire ne pourra pas exprimer toute la reconnaissance et l’estime que j’ai envers vous. Vous êtes les meilleurs parents qu’un enfant rêverait d’avoir. Que dieu vous garde le plus longtemps possible à mes côtés et vous procure bonne santé Inchaa Allah.

Ce travail est également dédié à :

Ma très chère sœur Souad. Merci de partager mes joies et mes peines petite sœurette, de toujours m’encourager et me soutenir. Que dieu te protège ainsi que ta petite famille avec une pensée particulière pour mon adorable petit neveu Amine

Mes chers frères :

Mohammed Riad. Je te serai toujours reconnaissante d’avoir tout le temps cru en moi et de me rassurer pendant les moments de doute que j’ai pu avoir pendant la réalisation de cette thèse ainsi que pour ton inestimable aide et disponibilité quand j’en avais besoin. Je te souhaite toute la réussite et le bonheur que tu mérites aux côtés de ton épouse Linda et de mes adorables petite nièces Manel et Fadia.

Et Lotfi à qui je souhaite une vie pleine de réussite et de persévérance. Je te remercie pour tout ce que tu as fait pour moi, pour ta disponibilité à mes côtés et d’avoir toujours répondu présent à mes sollicitations.

A mon époux, Fayçal, merci pour ton soutien, ton aide et tes encouragements mais surtout pour ton amour qui me donne la force et le courage de mener à bien tout ce que j’entreprends dans la vie. Merci de me faire sentir au quotidien que je suis une personne capable et je te remercie également pour ta patience et ton intelligence car le déroulement de cette thèse n’a pas été un long fleuve tranquille…..

A mon petit chéri, Mohamed Ilyes âgé aujourd’hui de 4 ans, la prunelle de mes yeux. Je te remercie pour tous les moments de bonheur que tu me procures au quotidien mais surtout je tiens à m’excuser auprès de toi pour avoir supporté et surmonté comme un grand Homme mes absences lors de mes déplacements à l’étranger. Que dieu te protège et te procure longue vie et bonne santé mon chéri.

A toute la famille HADJ RABIA, tantes et oncles, cousins et cousines.

A toutes la famille GHERROUS, tantes et oncles, cousins et cousines.

A toute la famille BOUKHALFA, ma belle-famille, pour leur soutien et leurs encouragements.

A tous les membres de l’équipe Microbiologie que je considère comme ma deuxième famille. Merci pour tous les moments de joie et de bonheur que vous me faites partager au quotidien, merci pour vos encouragements et votre soutien qui m’ont énormément aidé et fait avancer dans ma carrière.

A tous mes étudiants.

Je vous remercie du fond du cœur

Yamina

Liste des tableaux

Tableau 1 : Catégories de micro-organismes halophiles. p 11 Tableau 2 : Chimiotypes retrouvés chez les Actinobactéries. p 21

Tableau 3 : Types de phospholipides chez les Actinobactéries. p 22

Tableau 4 : Nombre approximatif de métabolites bioactifs en fonction de leurs organismes producteurs. p 28 Tableau 5 : Classification des antibiotiques d’après leur structure chimique. p 32 Tableau 6 : Antibiotiques produits par les espèces de Nocardiopsis. p 34 Tableau 7 : Tests biochimiques effectués pour l’identification des souches isolées .p58

Tableau 8: Séquences des amorces dégénérées utilisées pour la recherche des gènes PKS/NRPS. p 66.

Tableau 9: Liste des bases nucléotidiques dégénérées. p 66.

Tableau 10 : Programmes des PCR utilisés pour la recherche des gènes NRPS et PKS. p 67.

Tableau 11 : Résultats des analyses physicochimiques des échantillons de sols. p 78

Tableau 12 : Caractéristiques morphoculturales des souches isolées sur les milieux ISP. p 81

Tableau 13 : Détermination de l’optimum de salinité des souches isolées. p 84

Tableau 14 : Croissance des souches isolées à différents pH . p 85

Tableau 15: Croissance des souches isolées à différentes températures. p 86 Tableau 16: Utilisation des sources de Carbone par les souches isolées. p 87 Tableau 17: Activités enzymatiques des souches isolées. p 87

Tableau 18 : Résultats de la galerie API20E. p 88

Tableau 19: Comparaison de quelques caractères des souches HR1 et HR2 avec les espèces du genre Nocardiopsis. p 94 Tableau 20 : Comparaison de HR4 et HR5 avec les espèces du genre Nocardiopsis les plus proches. p 95 Tableau 21 : Comparaison des caractères morphologiques et biochimiques de la souche HR2’ (Saccharomonospora sp ) avec d’autres espèces du genre Saccharomonospora . p 98 Tableau 22 : Comparaison de la souche HR3 avec les genres et les espèces les plus proches. p 104

Tableau 23: Activité antibactérienne des souches isolées. p 106

Tableau 24 : Activités antifongiques des souches isolées. p 107

Tableau 25 : Masses et temps de rétention des différentes fractions récoltées . p 117

Tableau 26: Données spectroscopiques de la RMN 1H des produits HR4-9 et HR4-10. p 123

Tableau 27: Activité antimicrobienne des composés HR4-9 et HR4-10. p 125

Liste des figures

Figure 1 : Environnements hypersalins dans le monde (a) : la mer morte, (b) : Le lac rose au Sénégal. p 7. Figure 2 : Environnement hypersalins algériens (a) : Sebkha d’Oumache (b) : Chott Merouane. p 9. Figure 3 : Situation géographique des sebkhas et chotts d’Algérie. p 10. Figure 4 : Classification des bactéries halophiles. p 12. Figure 5 : représentation des flux d’eau durant la croissance dans des conditions (a) d’équilibre osmotique, (b) de choc hyper-osmotique, (c) de choc hypo-osmotique. p 17. Figure 6: Schéma taxonomique du phylum Actinobacteria avant 2012 (A) et la taxonomie actuelle du phylum Actinobacteria dans le manuel de Bergey de 2012 (B). p 20. Figure 7 : Régions conservées amplifiées par les amorces dégénérées . p 40. Figure 8 : Quelques exemples de molécules du groupe angucyclines. p 44. Figure 9 : Classification des molécules du groupe angucyclines. p 45. Figure 10 : Les deux voies de biosynthèse du squelette benz [a] anthracène typique du groupe angucycline de produits naturels. p 46. Figure 11: Situation géographique des sites de prélèvements. p 51 Figure12 : Sebkha d’El Goléa. p 52

Figure 13 : Sebkha de Ain Salah. p 52

Figure 14 : Structure du vecteur plasmidique pGEM-T. p 67

Figure 15 : Aspect macroscopique de quelques souches isolées. p 82

Figure 16: Aspects microscopiques de quelques isolats. p 83

Figure 17 : Gel d’électrophorèse de l’amplification de l’ADNr16S des souches isolées. p 89

Figure 18 : Arbre phylogénétique basé sur le gène codant l’ARNr 16S mettant en évidence les résultats de l’identification phylogénétique des 6 souches de Nocardiopsis. p 91

Figure 19 : Arbre phylogénétique basé sur l’analyse des séquences de l’ADNr 16S montrant la relation phylogénétique de la souche HR2' avec les espèces les plus proches. p 97

Figure 20 : Arbre phylogénétique basé sur le gène codant l’ARNr 16S mettant en évidence les résultats de l’identification phylogénétique de la souche HR3. P 100

Figure 21 : Micrographie des chaines de spores de la souche HR3 cultivée sur ISP2 additionné avec 10 % de NaCl et incubée pendant 14 jours à 30°C. p 102

Figure 22 : Résultat de la galerie APIZYM de la souche HR3. P 102 Figure 23 : Résultats de l’analyse de l’acide diaminopimélique ainsi que des sucres pariétaux de la souche HR3. p 103

Figure 24: Quelques résultats des activités antimicrobiennes des souches isolées. p 109

Figure 25 : Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR obtenus à partir de l’ADN isolé à partir des souches. P 110

Figure 26 : Résultats de l’analyse des séquences par le programme blatx. P 112

Figure 27: Cinétiques de l’évolution de la croissance, du pH et des activités antimicrobiennes de la souche HR4. P 114

Figure 28 : Autobiographie de l’extrait butanolique de la souche HR4. P 116

Figure 29 : Chromatogramme de l’HPLC analytique de l’extrait brut de la souche HR4. p 119

Figure 30 : Chromatogramme de l’HPLC préparative de l’extrait brut de la souche HR4. P 120

Figure 31 : Spectre de masse du composé HR4-9. P 121

Figure 32 : Structure chimique du composé HR4-9. P 121

Figure 33 : Spectre de masse du composé HR4-10. P 122

Figure 34 : Structure chimique de l’antibiotique HR4-10. P 122

Figure 35: Clé de corrélation 1H-1H COSY (trait gras), NOE (flèches simples) and 1H-13 C HMBC (flèches pointillées). P 124

Figure 36: Activité antibactérienne des composés HR4-9 (1) et HR4-10 (2) (T):disque témoin avec MeOH. p 126

Liste des Abréviations

°C : Degré Celsius. µg : Microgramme. µl : Microlitre. ADN : Acide désoxyribonucléique. ADNr16S : Acide désoxyribonucléique codant pour la sous unité 16S de l’ARN ribosomal. ARNm : Acide ribonucléique messager. ARNr16S : Acide désoxyribonucléique ribosomal de la sous unité 16S du ribosome. ATCC : American Type Culture Collection. BLAST : Basic Local Alignment Search Tool. CCM : Chromatographie sur Couche Mince. cm : Centimètre. DSMZ : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen. HCl : Chlorure d’Hydrogène. HPLC : Chromatographie en Phase Liquide à Haute Performance. HRESIMS :Haute resolution ElectriSpayInonisation Mass Spectrometry HRMS : Haute Resolution Mass Spetrometry MA : Mycélium Aérien. MeOH : Méthanol MH : Mueller Hinton mL : Millilitre. mm : Millimètre. MS : Mycélium du Substrat. NRI : Réactif I de la nitrate réductase. NRII : Réactif II de la nitrate réductase. NRPS : Non Ribosomial Peptide Synthetase pH : Potentiel d’Hydrogène. PKSI : PolyKetide Synthetase de type I PKSII PolyKetide Synthetase de type II PKSIII PolyKetide Synthetase de type III UV : Ultra-Violet. V/V :Volume à volume.

Table des matières Introduction ...... 1

Chapitre I Revue bibliographique

I. L’extrêmophilie ...... 3 I.1- Les environnements extrêmes et les microorganismes extrêmophiles ...... 3 I.2 Les environnements hypersalés ...... 5 I.3 Les types d’environnements hypersalés ...... 5 I.3.1 Les eaux hypersalines ...... 6 I.3.2 Les sols salins ...... 6 I.4 Les environnements hypersalins en Algérie ...... 8 I.5 Les organismes halophiles, diversité phylogénétique et physiologique ...... 11 I.6 Osmoadaptation des microorganismes halophiles ...... 15 I.6.1 Stratégie d’accumulation des solutés organiques ...... 15 I.6.2 La Stratégie « Salt-in » ...... 15 II. Les Actinobactéries : ...... 18 II.1 Définition et principales caractéristiques ...... 18 II.2 Taxonomie : ...... 18 II.2.1 Critères morphologiques : ...... 19 II.2.2 Critères chimiotaxonomiques : ...... 19 II.2.3 Critères physiologiques et métaboliques : ...... 23 II.2.4 Critères moléculaires : ...... 25 II.3 Taxonomie du genre Nocardiopsis ...... 26 II.4 Ecologie : ...... 27 II.5 Importance des Actinobactéries : ...... 28 II.5.1 Dans le domaine de la biotechnologie ...... 28 II.5.2 Dans le domaine de l’agriculture ...... 29 II.5.3 Dans le domaine de l’environnement ...... 30 III. Les antibiotiques : ...... 31 III.1 Classification : ...... 31 III.1.1 D’après la structure : ...... 31 III.1.2 Autres classifications : ...... 31 III.2 Microorganismes producteurs : ...... 33 III.2.1 Bactéries non mycéliennes et champignons : ...... 33 III.2.2 Actinobactéries : ...... 33 IV. Les polykétides et les peptides synyhétases : ...... 35 IV.1 Les PKS de type I : ...... 35 IV.2 Les PKS de type II : ...... 35 IV.3 Les PKS de type III : ...... 35 IV.4 Les peptides NRPS : ...... 36 IV.5 Les systèmes hybrides NRPS/PKS : ...... 36 V. Criblage de métabolites bioactifs : ...... 37 V.1 Criblage classique : ...... 37 V.2 Criblage moléculaire : ...... 38 V.2.1 Criblage de gènes codant des métabolites secondaires bioactifs : ...... 38 V.3 Production, purification et analyse structurale des antibiotiques : ...... 42 V.4 Données sur les antibiotiques ...... 43 V.4.1 Les angucyclines : ...... 43 V.5 Intérêt de la recherche de nouvelles molécules : ...... 48 Chapitre II Matériel et Méthodes

I. Sites d’études et échantillonnage ...... 50 I.1 Description des sites d’études ...... 50 I.2 Echantillonnage : ...... 50 I.3 Caractérisation physicochimiques des échantillons de sols : ...... 53 II Isolement des souches d’Actinobactéries ...... 53 II.1 Procédure : ...... 53 II.2 Reconnaissance et purification des Actinobactéries : ...... 53 II.3 Conservations des souches d’Actinobactéries ...... 53 II.3.2 Conservation longue durée ...... 54 III ETUDE TAXONOMIQUE DES SOUCHES D’ACTINOBACTERIES ...... 54 III.1 Etude morphologique ...... 54 1II.1.1 Etude macromorphologique ...... 54 III.1.2 Etude micromorphologique : ...... 54 III.2-Eude physiologie et biochimique : ...... 55 III.2.1 Croissance des souches à différentes concentrations en NaCl ...... 55 III.2.2 Influence du pH sur la croissance : ...... 55 III.2.3 Croissance des souches à différentes températures ...... 55 III.2.4 Production de mélanine : ...... 55 III.2.5 Utilisation des glucides et dérivés comme seule source de Carbone ...... 56 III.2.6 Galeries biochimiques API 20 : ...... 56 III.3 Etude moléculaire : ...... 59 III.3.1 Extraction de l’ADN génomique ...... 59 III.3.2 Amplification du gène codant l’ARNr 16S par PCR ...... 59 III.3.3 Electrophorèse des produits de PCR ...... 60 III.3.4 Séquençage des produits d’amplification : ...... 60 III.3.5 Analyse phylogénétique et alignement des séquences : ...... 60 III.4 Caractérisation d’un nouveau taxon ...... 61 III.4.1 Microscopie électronique : ...... 61 III.4.2 Etude chimiotaxonomique de la souche HR3 ...... 61 III.4.3 Etude biochimique : ...... 62 III.4.4 Etude moléculaire : ...... 62 IV Criblage de l’activité antimicrobienne des isolats :...... 63 IV.1 Mise en évidence de l’activité antimicrobienne sur milieu solide ...... 63 IV.1.1 Activité antibactérienne : ...... 63 IV.1.2 Activité antifongique : ...... 64 IV.2 Criblage moléculaire : ...... 64 IV.2.1 Recherche des gènes NRPS, PKS I et PKS II ...... 64 V.1 Croissance et production en milieu liquide: ...... 69 V.1.1 Préculture ...... 69 V.2 Extraction et localisation des antibiotiques ...... 70 V.2.1Culture ...... 70 V.2.2 Extraction à partir du surnageant ...... 70 V.2.3 Extraction à partir du mycélium ...... 70 V.2.4 Tests d’antibiographie : ...... 70 V.2.5 Analyse chromatographique de l’extrait actif : ...... 71 V.2.6 Bioautographie ...... 71 V.3 Purification et caractérisation des antibiotiques produits par la souche HR4 : ...... 72 V.3.1 Protocole d’extraction : ...... 72 V.3.2 Purification des antibiotiques par Chromatographie Liquide Haute Performance : ...... 72 V.3.3 Spectrométrie de Masse Haute Résolution (HRMS) : ...... 73 V.3.4 Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire : ...... 74 V.3.5 Détermination du Pouvoir Rotatoire :...... 75 V.3.6 Activité antimicrobienne des produits HR4-9 et HR4-10 : ...... 76 Chapitre III Résultats et discussion

I. Analyses physicochimiques des échantillons de sol ...... 78 II. Isolement des souches d’Actinobactéries ...... 78 III. Etude taxonomique des isolats : ...... 79 III.1 Etude morphologique : ...... 79 III.1.1 Caractéristiques macromorphologique : ...... 79 III.1.2 Caractéristiques micromorphologiques : ...... 83 III.2 Caractéristiques biochimiques et physiologiques ...... 84 III.2.1 Détermination de l’optimum de salinité pour la croissance : ...... 84 III.2.2 Détermination du pH optimal de croissance : ...... 85 III.2.3 Détermination de la température optimale de croissance : ...... 86 III.2.4 Utilisation des sucres comme seule source de carbone : ...... 87 III.2.5 Recherche des activités enzymatiques : ...... 87 III.2.6 Résultats des galeries API 20E : ...... 88 III.3 Etude moléculaire : ...... 88 III.4 Description du nouveau taxon ...... 99 IV. Criblage des activités antimicrobiennes ...... 106 IV.1 Activité antibactérienne : ...... 106 IV.2 Activité antifongique : ...... 106 IV.3 Screening des gènes PKS et NRPS ...... 107 IV.3.1 Clonage, séquençage et analyses des séquences des gènes NRPS et PKS de l’isolat HR4 : ...... 111 IV.4 Etude des antibiotiques produits par la souche Nocardiopsis.sp HR4 ...... 113 IV.4.1 Etude de la croissance et de la production ...... 113 IV.4.2 Localisation de l’activité antimicrobienne ...... 115 IV.5.1 Analyse et purification par HPLC des antibiotiques produits par la souche HR4 : ...... 117 IV.5.2 Analyses spectroscopiques et spectrométriques des composés produits par la souche HR4: ...... 117 IV.6 Analyses spectroscopiques du produit HR4-9 ...... 121 IV.6.1 Détermination de la structure de l’antibiotique HR4-9 ...... 121 IV.7 Analyses spectroscopiques de l’antibiotique HR4-10 ...... 122 IV.7.1 Détermination de la structure de HR4-10 ...... 122 IV.7.2 Spectre RMN ( 1H et 13 C) ...... 123 IV.8 Activité antimicrobienne des composés HR4-9 et HR4-10 ...... 125

Conclusion et perspectives : ...... 129 Références bibliographiques …………………………………………………………….………132 Annexes

Résumé

L’analyse de deux échantillons de sols provenant de la sebkha d’El Goléa et de Ain Salah considérés comme des environnements extrêmes du Sahara Algérien nous a permis d’isoler un total de 8 souches d’Actinobactéries à une température de 30°C et en présence d’une concentration de 10% en Chlorure de Sodium.

L’étude taxonomique des souches a été utilisée sur la base des caractéristiques morphologiques, physiologiques et moléculaires. Les résultats obtenus ont permis de rattacher 6 isolats au genre Nocardiopsis (HR1, HR2, HR4, HR5, HR6 et HR7), un isolat au genre Saccharomonospora (HR2'). La souche HR3 n’a été rattachée à aucun genre du fait qu’elle se caractérise par une position taxonomique nouvelle et présente un taux de similarité de la séquence du gène de l’ARNr 16S de 94,59% avec Phytoactinopolysora endophytica , 94,52% avec Jiangella guanensis et 94, 24 % avec Haloactinopolyspora alkaliphila.

Le potentiel des souches à produire des métabolites bioactifs a été entrepris par les méthodes classiques et moléculaires en recherchant les gènes codant pour les PKS/NRPS. Ceci nous a permis de sélectionner la souche HR4 considérée comme la plus active.

Après purification des composés élaborés par la souche HR4 par chromatographie liquide à haute pression préparative, les structures chimiques de deux antibiotiques (HR4-9 et HR4-10) ont été déterminées après analyses spectroscopiques (RMN) et spectrométriques (Spectrométrie de masse haute résolution). L’un des antibiotiques en l’occurrence HR4-9 s’est avéré être un nouveau composé ayant une nouvelle configuration et a été nommé le (-)-7- deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O-methylrabelomycin.

Les deux antibiotiques caractérisés font partie de la classe des angucyclinones qui sont des polykétides aromatiques connus pour leurs puissantes activités antibiotique et antitumorale. Aussi, nous décrivons pour la première fois la production de ce type de molécules au sein du genre Nocardiopsis .

Mots clés : Actinobactéries, Halophiles, Taxonomie Antibiotiques et Angucyclinones.

Introduction

Introduction

Il y a quelques décennies, le monde croyait que la science avait triomphé face aux maladies infectieuses et que tout était sous contrôle. Les vaccins et les antibiotiques ont effectivement permis de contrôler de nombreux fléaux. L'apparition de nouvelles maladies et la réémergence d'anciennes ne sont finalement que les signes d'une impressionnante adaptabilité des microorganismes à notre environnement changeant et à nos moyens de défense. En effet, les microorganismes pathogènes ont développé des mécanismes sophistiqués pour inactiver les antibiotiques ce qui nécessite un besoin urgent de découvrir de nouveaux antibiotiques qui cibleraient la multi-résistance émergente (Butler et al., 2013). Par conséquent, la recherche de sources nouvelles d'antibiotiques puissants est devenue une nécessité absolue. Les ressources microbiennes ont apporté tout le temps une contribution incroyable au processus de découverte et de développement de l’antibiothérapie au cours des sept dernières décennies (Demain et Sanchez, 2009 ), en particulier, les actinobactéries qui ont été la source la plus importante de composés naturels bioactifs, comme la Streptomycine, Gentamicine, Vancomycine, Clindamycine, Erythromycine, Amphotéricine, Rifampicine et Tétracycline. De nouvelles molécules avec des applications thérapeutiques potentielles restent à découvrir à partir de ce groupe de bactéries ( Baltz, 2007 ).

Les actinobactéries producteurs de métabolites bioactifs sont abondants dans les sols. Toutefois, au cours des quatre dernières décennies, l'isolement et l'exploitation d'actinobactéries productrices d’antibiotiques et provenant d'environnements conventionnels ont souvent conduit à la redécouverte de composés déjà connus (Walsh, 2003; Tulp et Bohlin, 2005) . C’est pourquoi, l’isolement d’ actinobactéries à partir d’environnements insuffisamment étudiés participerait à la découverte de nouveaux composés avec des activités potentielles qui peuvent être développées comme de nouveaux médicaments (Peraud et al ., 2009; Jose et al ., 2011; Poulsen et al ., 2011; Carr et al ., 2012; Subramani et Aalbersberg, 2012; Hamedi et al., 2013; Jose et al ., 2013; Yuan et al., 2014) . Dans cette perspective, les programmes d'isolement actuels ont été ré-orientés vers des environnements inexplorés, inhabituels et extrêmes tels que les environnements hypersalés (Hamedi et al., 2013, Jose et Jebakumar, 2013b ; Boumehira et al., 2016) . Ces environnements sont des habitats extrêmes typiques, dans lesquels la concentration élevée en sel, l'alcalinité et les faibles concentrations d'oxygène sont des facteurs environnementaux qui limitent leur biodiversité (Ventosa, 2006). Il existe plusieurs études qui ont montré que dans divers milieux hypersalins tels que les lacs salés (Swan et al., 2010; Guan et al ., 2011; Phillips et al ., 2012) , les mines 1

Introduction de sel (Chen et al ., 2007) et les puits de saumure (Xiang et al ., 2008) abritaient une diversité microbienne parmi laquelle se trouve le groupe des Actinobactéries. Cependant, ces environnements hypersalins restent largement inexplorés pour la découverte de nouvelles espèces d'actinbactéries dans de nombreuses régions de par le monde. Dans un travail relativement récent, Hamedi et al. (2013) rapportent que les écosystèmes hypersalinssont une source précieuse d’espèces d’actinobactéries productrices de nouveaux produits d'intérêt industriel, notamment antimicrobiens, cytotoxiques, neurotoxiques, antimitotiques, antiviraux et activités antinéoplasiques comme les : Salinosporamides, Abyssomicines, Sporolides, Marinomycines, Lajollamycine, Tétrodotoxine, Mechercharmycines, Erythronolides et les Ammosamides D (Hamedi et al ., 2013) .

La richesse de l’Algérie en environnements hypersalins est illustrée par le nombre important de chotts et sebkhas largement distribués sur le territoire national, dont la plupart inscrits parmi les zones naturelles d’importance internationale. Ces biotopes constituent donc, un champ d’investigation très étendu en ce qui concerne les études microbiologiques (Hacène et al ., 2004 ; Boutaiba et al ., 2011) qui ont permis de caractériser de nouveaux taxons ainsi que de nouvelles molécules bioactives (Hacène et al ., 1994; 1998; Addou, 2012; 2014 ; 2015).

Le présent travail s’inscrit dans ce contexte et a pour objectif principal l’isolement et la caractérisation à partir de sebkhas du Sud Algérien de nouvelles souches d’Actinobactéries mésohalophiles et halotolérantes autres que les Streptomyces ainsi que la caractérisation de nouveaux métabolites bioactifs à partir des souches isolées.

Pour cela, nous avons d’abord isolé de nouvelles souches d’Actinobactéries halophiles et halotolérantes puis dans un deuxième temps ; étudier de façon approfondie les métabolites élaborés par une des souches potentiellement nouvelles.

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I. L’extrêmophilie I.1- Les environnements extrêmes et les microorganismes extrêmophiles Les environnements extrêmes ont longtemps été considérés comme inertes, en raison des conditions physicochimiques hostiles à la vie humaine, animale ou végétale. La température ambiante, le pH neutre ou proche de la neutralité, une atmosphère à 20 % d’oxygène et une pression de 1 atm sont les conditions considérées comme « normales » du point de vue anthropologique (Satyanarayana et al., 2005). En dehors de ces limites, les paramètres physiques ou chimiques constituent une menace à l’intégrité cellulaire des êtres vivants et sont ainsi considérés extrêmes. On distingue les environnements aux caractères géophysiques extrêmes comme la température, les radiations ionisantes et non ionisantes, les radiations cosmiques et la pression; et les environnements aux caractères géochimiques extrêmes tels que la salinité, le pH, la dessiccation et les composés toxiques (métaux lourds, formes réactives d’oxygène et d’azote) (Kumar et al ., 2011). Les cheminées hydrothermales, les sources chaudes, les marais salants, les lacs de soude alcalins, les solfatares sont des environnements extrêmes peu répandus. A ces écosystèmes naturels, s’ajoutent des environnements extrêmes artificiels comme les installations domestiques ou industrielles d’eau chaude, les aliments séchés ou fermentés en présence de fortes concentrations en sels, les saumures artificielles ….etc. La diversité des espèces vivant dans ces écosystèmes extrêmes est assez restreinte et de nombreux groupes taxonomiques sont inexistants. Ainsi, dans les lacs salés et chauds, et dans les évents hydrothermaux, la présence des plantes supérieures ou de vertébrés n’a jamais été rapportée. Dans les écosystèmes extrêmement chauds, seulement les organismes procaryotes ont été isolés (Jaenicke et Sterner, 2006). Le terme « extrêmophile » a été introduit par Mac Elroy en 1974 pour désigner les microorganismes capables de tolérer des conditions extrêmes, sans qu’elles soient pour autant optimales pour leur croissance ( Mueller et al ., 2005 ). Les extrêmophiles se sont adaptés à se développer dans des conditions de hautes températures dans les sources thermales ou les régions volcaniques, à de faibles températures dans les régions polaires, sous hautes pressions dans les fonds marins, dans des milieux très acides ou très alcalins, ou encore en présence de fortes concentrations en sel (10-30% w/v). Ils sont qualifiés de thermophiles, psychrophiles, barophiles/ pieziophiles, acidophiles et alcalophiles et halophiles respectivement. Certains sont même capables de proliférer à des températures supérieures au point d’ébullition de l’eau comme les Archaea Pyrobaculum et Pyrodictium (Stetter, 1996 ) ou dans des solutions de NaCl à saturation comme les espèces halophiles extrêmes du genre Halobacterium (Brown, 1976 ). Donc la notion extrêmophilie est relative, si pour E. coli une température de 90°C est

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Revue bibliographique très chaude, pour les espèces de Pyrococcus capables de se développer jusqu’à une température à 113°C, une température de 30°C est létale. Les extrêmophiles sont représentés en majeure partie par les microorganismes. Ils appartiennent aux trois domaines de la vie, Archaea , Eucarya et Bacteria. La diversité phylogénétique des extrêmophiles est grande et très complexe à étudier. Certains ordres ou genres ne renferment que des extrêmophiles, tandis que d'autres regroupent des taxons extrêmophiles et d’autres non extrêmophiles. Les extrêmophiles adaptées à la même condition extrême peuvent aussi être dispersés largement dans l'arbre phylogénétique de la vie. Il y a aussi des groupes d'organismes appartenant à la même famille phylogénétique qui se sont adaptées à des conditions extrêmes très diverses ( Rampelotto, 2013 ). Cependant, le caractère extrêmophile n’a pas de valeur taxonomique, même s’il existe une certaine corrélation entre les adaptations environnementales d’un microorganisme et sa position phylogénétique ( António, 2002 ). Une riche diversité physiologique est retrouvée chez les microorganismes de l’extrême, ils peuvent être aérobies, anaérobies, chimioorganotrophes, photoautotrophes, chimiolithotrophes et photohétérotrophes ( Jiang et al ., 2006 ). La découverte des extrêmophiles a changé notre vision sur les limites de la vie ( Atomi, 2005 ), et l’intérêt que suscite l’étude des extrêmophiles est de plus en plus grandissant. Plusieurs raisons justifient cet intérêt, certaines sont fondamentales, d’autres appliquées. L’étude des extrêmophiles a permis d’aborder les questions relatives aux origines de la vie sur la terre. Il est admis que ces environnements étaient beaucoup plus répandus au cours de la première vie sur notre planète et que les organismes isolés à partir de ces sites sont représentatifs des formes de vie archaïques. La description de la biodiversité et l’étude des mécanismes qui régissent l’adaptation cellulaire aux conditions extrêmes sont d’autres aspects importants pour la recherche fondamentale ( Rothschild, 2007 ). Il est important de souligner que le troisième domaine de la vie, les Archaea , a été découvert en partie grâce aux premières études sur les extrêmophiles par Woese et ses collègues. Ces microorganismes étant différents des procaryotes et des eucaryotes au niveau moléculaire, Woese a révisé la taxonomie du vivant en y introduisant un troisième domaine : les Archaea (Woese et al ., 1990 ). Bien que les stratégies moléculaires employées pour survivre dans ces environnements ne soient pas encore entièrement élucidées, il est toutefois connu que ces organismes produisent des biomolécules adaptées et utilisant des voies biochimiques spécifiques qui sont d'un grand intérêt à des fins biotechnologiques. Les extrêmophiles sont doués d’un potentiel énorme à produire des molécules bioactives et des enzymes présentant des caractères qui leur 4

Revue bibliographique permettent d’être utilisées dans les conditions des procédés industriels notamment dans les processus de chauffage ( Rampelotto, 2013 ).

I.2 Les environnements hypersalés Le sel est utilisé depuis la nuit des temps pour conserver les aliments, un procédé appelé salage ou salaison, car on croyait que le sel en forte concentration est létale pour toutes les cellules vivantes ( Lentzen et al ., 2006 ). Pour cette raison, les milieux caractérisés par de fortes salinités sont restés longtemps considérés comme hostiles à toute forme de vie et infertiles, d’où l’appellation de la mer morte. Cette idée a été cependant remise en cause depuis la découverte d’une grande diversité de microorganismes dans les écosystèmes hypersalins. En effet, Beaucoup de micro-organismes sont capables de croître dans des milieux dont la salinité est supérieure à celle de l’eau de mer (35 g/litre). Toutefois, la limite à partir de laquelle on peut qualifier les eaux d'hypersalées est mal définie. Certains auteurs appliquent des limites inférieures arbitraires qui vont de 30 à 120 g/l ( Post et al. , 1983; Por,1980 ) en argumentant que dans les systèmes hypersalés, les fortes concentrations en sels sont un facteur important conduisant à une réduction de la diversité des espèces ( Por, 1980 ). Pour d’autres, la limite est établie entre 100 et 120 g/l ( Litchfied et Gillevet, 2002 ). En dessous de 10%, ce sont divers facteurs environnementaux qui déterminent la diversité des espèces alors qu'au-dessus de 12% la salinité devient le facteur primordial. On appelle plus généralement milieu hypersalé, les milieux dont la teneur en sels dissout est supérieure à celle de l'eau de mer. Lorsque l'on dépasse 100 g/l en sels, les milieux deviennent extrêmes et inhibent la croissance d'une grande majorité de micro-organismes (Rodriguez-Valera, 1988 ). Parmi ces milieux, on trouve divers lacs continentaux des zones désertiques ou subdésertiques, des lagunes maritimes, les marais salants etc. Les eaux sont souvent riches en chlorure de sodium mais il existe également des milieux où s’ajoutent les carbonates ou les sulfates. Ces milieux, bien que restreints à la surface de la planète, sont habités par des formes microbiennes très bien adaptées.

I.3 Les types d’environnements hypersalés Il y a deux types majeurs d’environnements hypersalins biologiquement importants où le facteur salinité détermine et spécifie les populations microbiennes. Il s’agit de l’eau et du sol.

I.3.1 Les eaux hypersalines Les eaux sont considérées comme salines lorsque leur concentration en sels solubles dépasse 0,3% (p/v) et hyper-salines lorsqu’elles présentent des concentrations salines supérieures à celle

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Revue bibliographique de l’eau de mer 3,3% (p/v) (Edgerton et Brimblecome, 1981) . Selon leur origine, ces environnements sont classés en: Environnements thalassohalins lorsqu’ils proviennent de l’évaporation de l'eau de mer. Ils sont favorisés par un écoulement restreint, une température élevée et de basses précipitations (Oren, 2002; 2006) . Leurs sels minéraux sont dans les mêmes proportions que celles contenues dans l’eau de mer, tant que les seuils de précipitation ne sont pas atteints. Des exemples d’environnements analogues sont représentés par les marais salants à Formentera en Espagne et de l’ile de Ré en France, les lacs hypersalés de l’antarctique ainsi que la sebkha Gavish près de la mer rouge (Falb et al ., 2005) . Environnements athalassohalins lorqu’ils ont une composition ionique saline très différente de celle de l’eau de mer. Ils prennent leurs origines des roches géologiques entourant les eaux salines. La composition ionique de ces eaux est influencée par celle des roches, où l’ion magnésium prédomine (Litchfield et Gillevet, 2002; Oren, 2002) . C’est le cas de la Mer Morte, du Grand Lac Salé Utah aux USA, et le lac rose salé au Sénégal (Oren, 2002) . Il existe également des lacs hypersalins alcalins tels que le lac Magadi au Kenya, le lac Wadi Natrun en Egypte, le lac Mono et le lac Owens aux Etats-Unis, avec une composition ionique différente caractérisée par une absence de cations divalents (Mg 2+ et Ca 2+ ).

I.3.2 Les sols salins Les sols salins ou sols halomorphes appelés actuellement sols salsodiques sont caractérisés par une concentration en sels solubles supérieure à 0,2 % (p/v). Ces sols ont une grande extension dans les pays du Maghreb. Cette extension est dûe aux conditions arides ou semi-arides d’une grande partie de cette région où les évaporations sont considérables et les précipitations limitées (Aubert, 1976) . Les sols salins sont observés dans les plaines et vallées et notamment aux abords des chotts et des sebkhas. La figure 3 représente deux sols hypersalins, le sol salin des bassins du Gange (Inde) ainsi qu’un sol salin sur les bords de l’Euphrate (Syrie).

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Figure 1 : Environnements hypersalins dans le monde (a) : la mer morte (Jordanie), (b) : Le lac rose au Sénégal (site1).

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I.4 Les environnements hypersalins en Algérie L’Algérie est riche en zones humides classées sur la liste RAMSAR des zones d’importance internationale (environ 90). Ces milieux qui font partie des ressources les plus précieuses sur le plan de la diversité biologique et de la productivité naturelle en Algérie. Ces zones humides renferment des lacs d’eaux douces et des lacs hypersalins. Parmi ces derniers, on distingue les sebkhas et les chotts. Ces derniers se qualifient d'un point de vue pédologique comme zone subdésertique argileuse dont les sols sont très fortement à excessivement salins, avec une forte conductivité et une texture lourde. La surface, à 1'état sec, est couverte par des polygones d'argiles surmontant en surface une structure fiable avec de nombreux cristaux individualisés de sel. La différence entre les sebkhas et les chotts réside dans le mode d’alimentation. Les sebkhas sont sous la dépendance d’apport des eaux de crues et les Chotts sont alimentés respectivement par les apports de ruissellement et aussi par les nappes artésiennes profondes arrivant jusqu’en surface par des sources et/ou des suintements ( Pouget, 1971 ). Les Chotts seraient de véritables « machines évaporatoires » (Coque, 1962 ). En période pluvieuse normale (hiver, printemps) une couche d’eau de quelques centimètres, saturée en sel (300-400 g/l) recouvre la surface, laissant après évaporation des dépôts de sels, parfois exploitables directement par l’homme. Ces sources hypersalines ont existé depuis des millénaires et ont favorisé la création de routes du sel traversant le Sahara par les longues caravanes de dromadaires. Ce commerce du sel est un élément indispensable à la survie des populations locales qui l’échangeait ou le troquait contre des denrées alimentaires. Après de fortes pluies, les Chotts peuvent constituer de véritables lacs de plusieurs centimètres de profondeur; quelques mois après, l’évaporation très forte assèche complètement la surface. Le vent balayant cette surface desséchée et dénudée peut, dans certaines conditions, entraîner des particules argileuses et des cristaux de sels (Chlorure de sodium, gypse) qui s’accumulent en bordure de la dépression ( Pouget, 1979 ). Plusieurs travaux sur les chotts et sebkhas en Algérie ont été effectués notamment par Hacène et al. (2004), Boutaiba et al. (2011) et Quadri et al. (2016).

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Figure 2 : Environnement hypersalins algériens (a) : Sebkha d’Oumache (Biskra) (b) : Chott Merouane (El Oued) (site2).

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Figure 3 : Situation géographique des sebkhas et chotts d’Algérie.

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I.5 Les organismes halophiles, diversité phylogénétique et physiologique

Les organismes halophiles (du grec Halos =le sel, phile =aimer), ou organismes qui aiment le sel, se sont adaptés à vivre en présence de concentrations très élevées en sel, jusqu’à la saturation et aux fortes pressions osmotiques qui règnent dans leur habitat. Bien que mieux connus ces dernières années, des études ont concerné les organismes halophiles dans les années 1930. Baas Becking (1934) a exploré de nombreux lacs salés et a étudié de nombreux microorganismes halophiles. En 1936, Benjamin Elazari Volcani a été le premier à avoir décrit une population de microorganismes adaptés à vivre dans la mer morte caractérisée par de fortes concentrations en sel et par une composition ionique particulière ( Oren et Ventosa, 1999 ). En inoculant les échantillons de boues d’un lac salé solaire à différents milieux de salinités différentes, Hof (1936), a observé des colonies pigmentées en rouge. Litchfield (1998) classe les organismes halophiles en deux catégories : (1) les Archaea , capables de se développer à des concentrations en sel atteignant les 34 % (w/v), et dont la croissance est impossible à des concentrations inférieures à 10-12 % (w/v). Ces organismes sont considérés comme halophiles obligatoires. La deuxième catégorie regroupe les bactéries et les algues halotolérantes. Différentes autres classifications existent pour classer les organismes en fonction de leur comportement vis-à-vis du sel ( Vreeland, 1987; Ramos-Cormenzana, 1989 ), mais la plus couramment utilisée est celle de Kushner (1978) (Tableau 1). Cette classification tient compte de différents degrés de dépendance au sel (halophiles faibles, modérés et extrême).

Tableau 1 : Catégories de micro-organismes halophiles. (Kushner., 1978)

Catégorie NaCl (M) NaCl (g/l) Gamme optimum Gamme optimum

Non halophiles 0-1 <2 0-60 <10 Faiblement halophiles 0,2–2,0 0,2–0,5 10–115 10–30 Halophiles modérés 0,4–3,5 0,5–2,0 25–200 30–115 Halophiles extêmes 2,0–5,2 >3,0 115–300 >175 Halotolérants 0–>1,0 <0,2 0–>60 <10 Haloversatiles 0–>3,0 0,2–0,5 0–>175 10–30

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10 20 30 [NaCl] %

Figure 4 : Classification des bactéries halophiles (Larsen., 1986).

Groupe 1 : les bactéries légèrement halophiles (Optimum se situant entre 1 à 6%)

Groupe 2 : les bactéries halophiles modérées (Optimum se situant entre 3 à 15%)

Groupe 3 : les bactéries halophiles extrêmes (Optimum se situant entre 15 et 30%)

Les bactéries halotolérantes quant à elles, n’exigent pas le sel pour croître mais en tolèrent des concentrations très élevées (25-30 % (w/v)) ( Oren, 2006 ). Il est important de noter, que la classification des micro-organismes en fonction de leur dépendance au sel devrait être basée sur leur réponse non seulement au chlorure de sodium (NaCl), mais à d'autres ions tels que le potassium, le magnésium et le calcium, particulièrement pour les microorganismes qui vivent dans les environnements « athalassohalins » ( Oren, 2000; 2006 ). Une riche diversité est rencontrée chez les organismes halophiles, ceci est illustré au niveau phylogénétique par l’appartenance des halophiles aux trois domaines de la vie Archaea , Bacteria et Eucarya ; et au niveau physiologique par le fait que les halophiles emploient les même mécanismes générateurs d’énergie retrouvés chez les organismes non halophiles (Oren, 2002 ). On rencontre les archaea hétérotrophes et méthanogènes, les bactéries

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Revue bibliographique lithotrophes, hétérotrophes et photosynthétiques, et les eucaryotes photosynthétiques hétérotrophes ( Das Sarma et Arora, 2002 ), dénitrifiants et réducteurs de soufre ( Oren, 2002 ). Néanmoins, l’étude des organismes halophiles a montré que les voies métaboliques connues ne sont pas toutes utilisées dans les milieux hypersalins. Certains groupes physiologiques n’ont jamais été isolés à de fortes salinités tels que les méthanogènes autotrophes, les microorganismes utilisant la réduction dissimulatrice du sulfate avec oxydation complète et les autotrophes oxydant l’ammoniac ( Pikuta et al ., 2007 ). Halothiobacillus halophilus (anciennement Thiobacillus halophilus ) est la seule bactérie halophile autotrophe oxydant le sulfure à des concentrations allant jusqu’à 24 %(w/v) à avoir été isolée en culture pure ( Wood et Kelly, 1991 ). Parmi les microorganismes halophiles extrêmes figurent les membres des Archaea de l’ordre des Halobacteriales et les méthanogènes (Oren, 2000; 2001 ). Ils requièrent au minimum 1,5 M de NaCl pour se développer, la concentration optimale de croissance est de 3,5- 4 M et certains sont capables de se développer à une concentration saturante de NaCl (5,2 M) ( Ventosa, 2006 ). Le domaine des Bacteria contient de nombreux types de microorganismes halophiles et halotolérantes, réparties sur un grand nombre de sous-groupes phylogénétiques. On retrouve les halophiles dans les phyla Cyanobacteria , Proteobacteria , Firmicutes , Spirochaetes , Bacteroidetes et Actinobacteria , ( Oren, 2008) . Parmi, le groupe des Actinobacteries, plusieurs halophiles ont été isolés à partir de l’eau de mer, les sols et lacs salins, les saumures, les habitats salins et alcalins et autres. Néanmoins la plupart des Actinobacteries halophiles ont été isolées à partir des sols salins. Aussi, le nombre des Actinobacteries tolérant le sel et résistant à la sécheresse ont été isolées à partir des zones arides telles que la péninsule arabe, le plateau Iranien, l’Asie centrale et l’Australie ( Al-Mueini et al., 2007 ). Ainsi, les études culture-dépendantes ont révélé des membres des genres Dietzia, Rhodococcus, Streptomyces, Micromonospora, Salinispora, Marinophilus, Solwaraspora, Salinibacterium, Aeromicrobium, Gordonia, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardiopsis, Pseudonocardia, Actinomadura, Saccharopolyspora, Streptosporangium, Nonomuraea, Williamsia et Verrucosispora (Maldonado et al., 2005; Jensen et al., 2005; Magarvey et al., 2004; Mincer et al., 2005; Riedlinger et al., 2004 ). D'une manière générale, on peut dire que la plupart des halophiles dans le domaine Bacteria sont des halophiles modérés plutôt que des halophiles extrêmes ( Oren, 2002b ).

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Par contre, les organismes halophiles sont faiblement représentés dans le domaine des Eucarya. L’eucaryote le plus répandu dans les environnements hypersalins est l’algue verte Dunaliella salina , où elle y joue un rôle écologique important. On rencontre également les champignons filamenteux dans les environnements hypersalins. Gunde-Cimerman et al ., (2004, 2005), ont isolé des espèces des genres Aspergillus , Penicillium , Wallemia , Scupolariopsis et Alternaria à partir de marais salants en Slovénie. La plupart sont halotolérantes, mais d’autres travaux ont montré l’existence d’espèces halophiles ( Gunde- Cimerman et al. , 2004; Kogej et al. , 2005 ). La présence des levures dans divers marais salants à travers le monde comme la mer morte et le Grand lac salé de l’Utah a été rapportée (Butinar et al. , 2005 ). Les virus sont aussi des habitants des environnements hypersalins comme les virus d’ haloarchaea (halovirus) et les bactériophages ( Ventosa, 2006 ). Phylogénétiquement, les microorganismes halophiles sont généralement apparentés aux taxons non halophiles dans le même ordre ou phylum, néanmoins trois groupes phylogénétiquement proches sont composés exclusivement de taxons halophiles. Il s’agit des Halobacteriaceae (ordre Halobacteriales ) dans le domaine des Archaea ; l’ordre Haloanaerobiales et la famille Halomonadaceae dans le domaine des Bacteria (Mesbah et Wiegle, 2005 ). Au sein du phylum des Actinobacteria , les espèces halophiles sont classées principalement dans les ordres Streptosporangiales, Streptomycetales, Pseudonocardiales, Actinopolysporales et Micrococcales. Cependant, la cohérence phylogénétique et physiologique ne pourrait être établie que dans les genres Nesterenkonia, Nocardiopsis, Salinispora et Streptomonospora qui regroupent presque entièrement des espèces halophiles ou halotolérantes. Quatre des cinq genres de la famille Nocardiopsaceae , incluant les genres Nocardiopsis, Streptomonospora , Haloactinospora et Marinactinospora , contiennent plusieurs espèces halophiles. La majorité des espèces d’Actinobacteries halophiles font partie du genre Nocardiopsis qui regroupe actuellement 52 espèces dont 5 sous-espèces. Le genre Streptomonospora est constitué de cinq espèces qui se développent de façon optimale dans des milieux supplémentés par du NaCl. La famille des Micrococcaceae comporte les genres Nesterenkonia et Kocuria dont les espèces sont halophiles. La famille des Pseudonocardiaceae renferme six genres (Actinopolyspora, Saccharomonospora, Yuhushiella, Prauserella, Saccharopolyspora et Amycolatopsis ) qui contiennent plusieurs des espèces halophiles.

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I.6 Osmoadaptation des microorganismes halophiles Comme les membranes biologiques sont perméables à l'eau, les cellules ne peuvent pas maintenir l'activité de l'eau de leur cytoplasme plus élevée que celle de la saumure environnante, car cela conduirait à une perte rapide de l'eau à l'environnement (Oren, 1999) . Par conséquent, tous les microorganismes halophiles partagent une propriété fondamentale: leur cytoplasme doit être au moins iso-osmotique avec leur milieu environnant ( Oren, 1999 ; Siglioccolo et al. , 2011) . Pour cela , les microorganismes emploient différentes stratégies pour faire face à des concentrations élevées en sel dans leur environnement. Ainsi, les halophiles ont développé des mécanismes différents pour répondre au stress osmotique ( Kanekar et al. , 2012 ).

I.6.1 Stratégie d’accumulation des solutés organiques Le mécanisme des osmolytes organiques est largement répandu parmi les bactéries, les eucaryotes et également chez certains Archaea . En réponse à un stress osmotique, ces organismes accumulent principalement des composés organiques tels que les sucres, les polyols, les acides aminés et/ou les dérivés d'acides aminés, qui sont soit synthétisés par les cellules ou par absorption à partir du milieu. Ces composés à poids moléculaire bas, non ionique, hautement solubles dans l’eau ne perturbent pas le métabolisme même à des concentrations cytoplasmiques élevées. Ils sont définis comme des solutés qui, à des concentrations élevées, permettent aux enzymes de fonctionner efficacement. Les enzymes "classiques" semblent bien fonctionner, en présence de concentrations molaires de ces solutés. Une grande diversité existe dans les types de solutés rencontrés et la liste des solutés osmotiques organiques connus ne cesse de croître ( Oren, 1999) . Ils se répartissent en trois catégories chimiques générales : Les solutés zwitterion, des solutés non chargés et des solutés anioniques. Ces osmolytes ont aussi d'autres rôles dans les cellules notamment la stabilisation des structures macromoléculaires ( Kanekar et al. , 2012 ). Les concentrations intracellulaires de solutés osmotiques organiques sont réglementées en fonction de la salinité du milieu, et la stratégie d'utilisation de solutés compatibles organiques permet ainsi un degré élevé d'adaptabilité des cellules à l'évolution de la concentration en sel de leur environnement. I.6.2 La Stratégie « Salt-in » La composition ionique du cytoplasme diffère généralement fortement de celle du milieu, ce qui dans la plupart des cas contient du NaCl en tant que sel principal. L'environnement intracellulaire est caractérisé par la présence de concentrations molaires de KCl (Oren, 1999) . L'ajustement thermodynamique de la cellule peut être obtenu en augmentant la concentration en sel dans le cytoplasme ( Kanekar et al ., 2012 ). La stratégie « Salt-in» est basée sur 15

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+ - l'accumulation d'ions inorganiques (principalement K et Cl ) à des concentrations élevées dans le cytoplasme des cellules, jusqu’à ce que la pression osmotique à l’intérieur et à l’extérieur de la cellule soit similaire. Les membranes de ces microorganismes sont douées + + d'un grand nombre d’antiports Na / H , pour créer un gradient de protons et l'élimination des + ions Na à partir du cytoplasme. (Karan et al ., 2012) . Cette stratégie semble être limitée à deux groupes phylogénétiquement indépendants: les Archaea halophiles aérobie de la classe Halobacteria qui sont le groupe le plus connu qui utilise cette façon pour faire face à la vie à haute teneur en sel et les bactéries halophiles anaérobies de l'ordre Haloanaerobiales et le genre aérobie Salinibacter (Seckbach et Oren, 2004) .

Chez ces organismes, toutes les enzymes intracellulaires devraient être actives en présence de concentrations molaires en sel ce qui nécessite une adaptation de la machinerie enzymatique intracellulaire. Les protéines doivent conserver leur conformation et leur activité appropriée à des concentrations en sel quasi-saturantes. Le protéome de ces organismes est très acide, et la plupart des protéines se dénaturent lorsqu'elles sont présentes dans une faible teneur en sel. Ces microorganismes ne peuvent survivre généralement dans des milieux de faible teneur en sel (Seckbach et Oren, 2004 ; Oren, 2008 ).

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Figure 5 : Représentation des flux d’eau durant la croissance dans des conditions (a) d’équilibre osmotique, (b) de choc hyper-osmotique, (c) de choc hypo-osmotique (O’Byrne et Booth, 2002).

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II. Les Actinobactéries :

II.1 Définition et principales caractéristiques Les Actinobactéries forment un grand groupe de microorganismes procaryotes appartenant au phylum Actinobacteria . Elles sont définies comme étant des bactéries à Gram positif ayant un pourcentage en "guanine + cytosine" relativement élevé dans leur ADN (G + C > 50 mol %) et dont la majorité tendent à former un véritable mycélium ramifié (Bergey, 2012) . Les Actinobactéries sont des eubactéries chimio-organotrophes hétérotrophes, aérobies strictes ou microaérophiles, dont plusieurs produisent des spores non mobiles ou parfois mobiles. Ces microorganismes présentent un cycle de développement cellulaire asexué similaire à celui des champignons imparfaits ( Locci et Sharples, 1984 ). Ils sont universellement répandus. On les trouve dans différentes niches écologiques telles que : sols, air, fumier, composts, foin, débris végétaux, résidus fibreux de cannes à sucre, pollen des plantes, sédiments marins, lacs, rivières, mers et océans, glaciers, déserts, sols pollués, lacs alcalins, milieux salins (Lechevalier, 1981; Goodfellow et Williams, 1983; Lacey, 1997 ). Ces microorganismes produisent une pléthore de molécules ayant de nombreuses applications dans divers domaines et de ce fait, présentant un fort intérêt pour les industriels (antibactériens, antifongiques, insecticides, herbicides, antiparasites, acaricides, antivirales, anti tumoraux, antimitotiques, anti allergénique, protéases alcalines, glucose isomérase, vitamines ...). Par ailleurs, les Actinobactéries ont un rôle écologique. Ils possèdent la capacité de dégrader des molécules complexes non dégradées par les champignons ou les autres bactéries, contribuant ainsi à la fertilisation des sols.

II.2 Taxonomie : La taxonomie des Actinobactéries a subit de profonds remaniements. En effet, selon le Bergey (1994), les Actinobactéries étaient classées dans le Règne des Procaryotes , la Division des Firmicutes , la classe des Thallobacteria et l’Ordre des Actinomycetales . La classe des Thallobacteria a été remplacée par celle des Actinobacteria dans le Bergey’s Manual of Systematic de 2004. Dans celui de (2012), la définition des Actinobactéries est restée la même (bactéries à Gram positif ayant un G+C supérieur à 55% et présentant une grande variabilité morphologique, la plupart étant mycéliennes). Mais sur la base des données de la biologie moléculaire (notamment le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S), la classification supragénérique des Actinobactéries a subi un profond remaniement. Ce dernier a éliminé les rangs taxonomiques des sous-classes et des sous-ordres, élevant les anciennes sous-classes et sous-ordres aux rangs des classes et des ordres, respectivement ( Gao, 2012 ).

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Le phylum Actinobacteria est actuellement divisé en six classes : Actinobacteria , Acidimicrobiia , Coriobacteriia , Nitriliruptoria , Rubrobacteria et Thermoleophilia . La classe Actinobacteria contient 16 ordres, y compris les deux ordres précédemment proposés, Actinomycetales et Bifidobacteriales (Zhi, 2009 ). L'ordre des Actinomycetales est maintenant réservé aux membres de la famille des Actinomycetaceae , et les autres sous-ordres qui faisaient auparavant partie de cet ordre sont maintenant désignés comme des ordres distincts (Gao, 2012) . Par conséquent, 43 des 53 familles du phylum Actinobacteria sont assignées à une seule classe, Actinobacteria , alors que les cinq autres classes ne contiennent ensemble que 10 familles ( Bergey, 2012 ). Parmi les critères utilisés dans la taxonomie des Actinobactéries nous citons :

II.2.1 Critères morphologiques : Les critères morphologiques peuvent parfois permettre de reconnaitre certains genres ou groupes de genres. Ces critères consistent à apprécier et décrire certains caractères macro et micromorphologiques. II.2.1.1 Caractères macromorphologiques Les principaux caractères ont pour objet de noter la présence et la couleur du mycélium aérien (MA) et du mycélium du substrat (MS), la production (ou non) et la couleur des pigments diffusibles dans le milieu de culture et la sécrétion ou non de pigments mélanoïdes dans des milieux spécifiques. II.2.1.2.- Caractères micromorphologiques Ces caractères sont déterminés par observation directe au microscope optique (10 x 10 et 10 x 40) des cultures poussant sur des milieux gélosés préconisés à cet effet. Afin d’observer certaines structures, il est parfois nécessaire d’amplifier le grossissement ou de faire appel au microscope électronique. Les observations microscopiques consistent à déterminer si le mycélium aérien est fragmenté ou non, stérile ou sporulant et de déterminer si les spores sont isolées ou regroupées, mobiles ou immobiles ornementées ou non, sessiles ou portées par un sporophore. La présence ou non de certaines structures particulières telles que les sporanges (portés par des sporangiophores), les synnemata et les sclérotes doit aussi être signalée.

II.2.2 Critères chimiotaxonomiques : La chimiotaxonomie est un système de classification et d’’identification basé sur des marqueurs chimiques permettant de grouper et de distinguer des microorganismes. Ces déterminations chimiques se montrent surtout efficaces pour délimiter des groupes et des

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Revue bibliographique genres. L’examen des acides aminés de la paroi cellulaire, des glucides, des lipides et des acides nucléiques constituent les principaux caractères utilisés en chimiotaxonomie (O’donnell et al., 1988 ). II.2.2.1 Constituants pariétaux: isomères de l’acide diaminopimélique et acides aminés En fonction des genres d’actinobactéries, l’acide diaminopimélique pariétal peut se présenter sous forme isomérique LL ou DL, ou encore être remplacé par d’autres acides aminés tels que la lysine, l’ornithine ou l’acide diaminobutyrique. La glycine est aussi un acide aminé taxonomiquement important présent chez certains genres uniquement ( Holt et al. , 1994 ). II.2.2.2 Constituants cellulaires: les glucides Les sucres taxonomiquement importants sont les couples « arabinose-galactose », « xylose arabinose» et « rhamnose-galactose » ou encore le madurose (3-0-méthylgalactose), lesquels caractérisent certains genres ( Lechevalier et Lechevalier, 1970a ). En fonction de la composition pariétale en acides aminés et cellulaire en sucres, Becker et al . (1964 et 1965) et Lechevalier et Lechevalier ( 1970a, b ) ont discerné plusieurs chimiotypes de parois cellulaires qui sont taxonomiquement très importants jusqu’à l’heure actuelle (Tableau 2). Tableau 2 : Chimiotypes retrouvés chez les Actinobactéries.

Chimiotype DAP Gly Lys Orn DAB LL DL Ara+Gal Xyl+Ara Rha+Gal Mad

I C + - + ------II D - + + - - - - + - - III B - + ------+ III C - + ------III E - + ------+ - IV A - + - - - - + - - - V - - - + + - - - - - VI - - - + ------VII - - + v - + - - - - VIII - - - - - + - - - - Note : I,II,III,….., VIII : définis par Becker et al., 1965 et Lechavalier et Lechevalier 1970 en se basant sur la forme LL ou DL de l’acide diaminopimélique (DAP), la présence ou non de glycine (Gly), de lysine (Lys), de l’otnithine (Orn) ou de l’acide diaminobutyrique (DAB). A, B, C, D et E : définis par Lechevalier et Lechevalier 1970 en se basant sur les sucres taxonomiquement importants : Arabinose (Ara), Galactose (Gal), Xylose (Xyl), Madurose (Mad) et le Rhmnose (Rha). + : présent - : absent v : variable suivant les espèces d’un même genre.

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Figure 6: Schéma taxonomique du phylum Actinobacteria avant 2012 (A) et la taxonomie actuelle du phylum Actinobacteria dans le Bergey’s Manual of Systematic de 2012 (B).

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II.2.2.3 Constituants membranaires et pariétaux: lipides Il existe des genres qui sont très différents mais qui possèdent le même chimiotype. Pour les distinguer chimiquement, d’autres analyses chimiques concernant la composition de la membrane et de la paroi en lipides sont nécessaires. Les lipides qui sont taxonomiquement importants sont les suivants: II.2.2.3.1 Les phospholipides La composition membranaire en phospholipides est l’un des caractères les plus importants. Elle permet de distinguer entre eux la plupart des genres ayant le même chimiotype. En fonction de cette composition, Lechevalier et al . (1977) ont divisé les Actinobactéries en 5 types de phospholipides: PI à PV (Tableau 3). Tableau 3 : Types de phospholipides chez les Actinobactéries (Lechevalier et Lechevalier, 1970) .

Type de phospholipides Phospholipides caractéristiques P I Aucun P II Phosphatidyl Ethanolamine PE P III Phosphatidyl Choline PC P IV Phospholipide contenant la glucosamine PG P V Phospholipide contenant la Glucosamine PG et phosphatidyl glycérol PGly

II.2.2.3.2 Les ménaquinones Ce sont des lipides solubles situés au niveau de la membrane plasmique et ayant un rôle important dans la respiration. Elles sont impliquées dans le processus de transport des électrons et la phosphorylation oxydative. Leur structure est faite d’un noyau naphtoquinone méthylé (2-méthyl-1-4-naphtoquinone) lié à une chaine latérale isoprénique. Elles sont différenciées en fonction du nombre des unités isoprènes et du degré d’hydrogénation de la chaîne ( Minnikin et al ., 1984 ). La composition membranaire en ménaquinones représente un complément de confirmation des résultats déjà obtenus. Elle n’est obligatoire que lors de la description de nouvelles espèces. II.2.2.3.3 Les acides gras La composition membranaire en acides gras, représente aussi une donnée complémentaire permettant dans certaines situations de distinguer certains genres entre eux ( Minnikin et al .,

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1984; Kroppenstedt et al ., 1990 ). Cette analyse reste obligatoire lors de la description de nouvelles espèces. II.2.2.3.4 Les acides mycoliques La recherche des acides mycoliques concerne seulement les actinobactéries appartenant au chimiotype IV A qui sont distingués entre eux en fonction de leur présence ou de leur absence. Les acides mycoliques sont des lipides pariétaux complexes et insaturés ( Mordarska et al ., 1972 ). Ainsi, dans ce groupe (chimiotype IV A), Nocardia (ayant des acides mycoliques) a été séparé d’ Amycolatopsis et de Pseudonocardia (n’ayant pas d’acides mycoliques), ces derniers étant différenciés entre eux par la composition en phospholipides.

II.2.3 Critères physiologiques et métaboliques : Les Actinobactéries sont subdivisées en deux groupes physiologiques selon la nature oxydative ou fermentative de leur métabolisme : • Les formes oxydatives, aérobie, leur réservoir principale est le sol ; tels que les Streptomyces . • les formes fermentatives, anaérobies strictes ou facultatives, tels que les Actinomyces, ces dernières sont des saprophytes obligatoires des cavités naturelles des hommes et des animaux supérieurs et ils ne sont jamais retrouvés dans le sol (Reponen et al., 1998) . Les Actinobactéries sont généralement hétérotrophes, mais plusieurs espèces sont capables aussi de croissance chimio-autotrophiques Il a été démontré que les Actinobactéries dégradent de manière intensive la chitine (De Boer et al., 1998) , en outre, certains dégradent activement les pesticides d’autres sont capables de dégrader l’amidon, la cellulose et le xylane (Petrosyan et al ., 2003) . Les bactéries de ce phylum sont généralement mésophiles, leur température optimale de croissance est de 25-30°C, (Guiraud, 1998) , et certaines sont capables de se développer à des températures élevées, dans les processus de compostage par exemple ou dans les sebkhas (Addou et al., 2013) . La plupart des Actinobactéries du sol sont neutrophiles néanmoins, des travaux ont montré l’existence d’une large diversité d’Actinobactéries acidophiles qui se développent à des valeurs de pH compris entre 3,5 et 6,5 avec un pH optimal de croissance compris entre 4,5 et 5,5.Ces dernières diffèrent morphologiquement et physiologiquement des espèces

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Revue bibliographique neutrophiles (Basilio,2003) , telles que Streptacidiphilus jiangxiensis (Huang et al., 2004) et Streptacidiphilus oryzae (Wang et al., 2006) . Le métabolisme des Actinobactéries peut être divisé en deux parties : le métabolisme primaire et le métabolisme secondaire. Ces bactéries filamenteuses sont connues pour la richesse de leur métabolisme secondaire.

II.2.4 Critères moléculaires : Pour distinguer les espèces entre elles, les méthodes taxonomiques classiques (caractéristiques morphologiques, chimiques et physiologiques) ne suffisent pas et l’utilisation des méthodes moléculaires fiables est impérative ( Goodfellow et al ., 1988 ) et est à la base de la classification actuelle des microorganismes (Gao, 2012). Les principales techniques moléculaires utilisées pour l’identification des Actinobactéries sont le séquençage de l’ADN codant pour l’ARN ribosomique 16S, l’hybridation ADN-ADN et à un degré moindre, le pourcentage de guanine-cytosine.

II.2.4.1 Séquençage du gène codant pour l’ARN 16S et phylogénie Le gène codant pour l’ARN ribosomique 16S (1500 paires de bases) est considéré à l’heure actuelle comme étant très important. Ce gène est présent chez toutes les cellules procaryotes et permet à travers quelques expérimentations assez simples et rapides de déterminer les relations phylogénétiques et d’identifier la souche étudiée ( Rainey et al ., 1996; Stackebrandt et al ., 1997 ). Cette technique a permis d’ailleurs de retracer toute la phylogénie des Actinobactéries et des autres microorganismes ( Stackebrandt et Schumann, 2006; Wellington et Ul-Hassan, 2009 ; Gao, 2012 ). Du point de vue pratique, après extraction du génome entier, le gène codant pour l’ARN ribosomique 16S est amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction) avant qu’il ne soit séquencé à l’aide d’un séquenceur. Les séquences obtenues sont par la suite comparées à d’autres séquences homologues appartenant aux espèces-types disponibles dans les bases de données génomiques. Pour la confection de l’arbre phylogénétique illustrant les différents liens, des logiciels informatiques sont disponibles gratuitement dans le web. Ainsi, les séquences nucléotidiques sont d’abord traitées à l’aide de programmes informatiques tels que Clustal W et Philip, ensuite d’autres programmes (exemple: MEGA 7) serviront à construire le dendrogramme en employant un ensemble d’algorithmes et de techniques statistiques pour calculer les liens phylogénétiques ( Stackebrandt et al ., 1997; Labeda et Kroppenstedt, 2000 ).

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II.2.4.2 Hybridation ADN-ADN L’hybridation ADN-ADN est basée sur le calcul du taux de réassociation des brins d’ADN (génome entier) entre deux espèces. Ce principe correspond à la définition de l’espèce elle- même. La technique est difficile à réaliser du point de vue pratique. Cependant, elle est précise et souvent indispensable pour la description de nouvelles espèces en fonction du taux de similarité basé sur l’ADNr 16S. En effet, si le pourcentage d’homologie entre deux séquences d’ADN codant pour l’ARNr 16S est supérieur ou égal à 98,65%, seule l’hybridation ADN-ADN renseigne sur l’appartenance ou non des deux souches à la même espèce. Deux souches possédant entre elles un pourcentage inférieur à 98,65% sont classées dans deux espèces différentes, sans pour autant faire l’hybridation ADN-ADN ( Meier-Kolthoff et al ., 2013 ).Pour pouvoir dire que deux souches appartiennent à une même espèce, il faudrait que le pourcentage d’hybridation ADN-ADN soit supérieur ou égal à 70% ( Wayne et al., 1987; Wellington et Ul-Hassan, 2009) .

II.2.4.3 Pourcentage de guanine-cytosine Le pourcentage de guanine–cytosine (GC) n’est obligatoire que lors d’une proposition de création de nouveaux genres. Par ailleurs, il permet de distinguer la lignée des Actinobacteria de celle des Firmicutes dont le pourcentage en GC est inférieur à 55%. En effet, des bactéries non mycéliennes ( Micrococcus, Arthrobacter, Corynebacterium , etc.) ayant des pourcentages en GC supérieurs à 55% sont considérées comme faisant partie de la lignée des Actinobacteria (Stackebrandt et Schumann, 2006; Wellington et Ul-Hassan, 2009 ).

II.3 Taxonomie du genre Nocardiopsis Les membres du genre Nocardiopsis appartiennent au phylum Actinobacteria , Classe Actinobacteria , Ordre Actinomycetales et la famille des Nocardiopsaceae (Sun et al., 2010 ). Ce genre a été décrit pour la première fois par Meyer (1976) lorsque 'Actinomadura dassonvillei (Brocq-Rousseu) Lechevalier et Lechevalier' et l'ancienne 'Nocardia dassonvillei (Brocq-Rousseu) Liegard et Landrieu' ont été transférées du genre ' Actinomadura Lechevalier et Lechevalier' à un nouveau genre nommé « Nocardiopsis ». Sur la base de la position phylogénétique distincte, les caractéristiques morphologiques et les propriétés chimiotaxonomiques affichées par les espèces du genre Nocardiopsis , Rainey et al . (1996) a créé une nouvelle famille pour le genre dénommée « Nocardiopsaceae ». Le genre Nocardiopsis comprend des bactéries aérobies, catalase positive et Gram positives. Les parois cellulaires contiennent de l'acide méso-2,6-diaminopimélique, mais pas de glucides.

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Les hydrolysats de cellules entières ne montrent pas la présence de madurose ou d’acides nocardomycoliques et leurs génomes ont des teneurs élevées en guanine et en cytosine entre 64 et 71 % ( Kroppenstedt et Evtushenko, 2006 ). Bien qu'un grand nombre d'espèces aient été isolées à partir d’écosystèmes variés, la caractéristique la plus frappante est leur nature halotolérante ou halophile. Des isolats ont été obtenus à partir d'habitats salins et hypersalins tels que les sols désertiques et les milieux marins ( Chun et al., 2000; Hamedi et al., 2010; Fang et al., 2011 ). En plus de ces caractéristiques, un développement important et récent dans le domaine de la «Biologie des Nocardiopsis » est la disponibilité des données de séquençage du génome de dix-neuf espèces différentes (Sun et al., 2010; Qiao et al., 2012; Li et al., 2013; Komaki et al., 2014 ). Des analyses génomiques comparatives de dix-sept espèces différentes par Li et al. (2013) ont contribué à résumer les caractéristiques importantes liées à leur spéciation, leur haute adaptabilité environnementale, leur dynamique génomique et leur évolution génétique.

II.4 Ecologie : Les Actinobactéries sont des microorganismes très ubiquitaires, ils constituent un groupe important de bactéries du sol (Zhao et al., 2009 ) représentant 10 à 20 % de la population microbienne totale (Takahashi et Omura, 2003), mais peuvent être retrouvés dans différents autre niches écologiques parmi elles nous citons : Les sols des oasis du Sahara algérien, bien que soumis au climat aride sont révélés riches en Actinobactéries parfois réputés rares de par le monde (Hacène et al., 1993) . Les Actinobactéries sont présentes dans le milieu marin y compris les sédiments marins profonds ainsi que dans les éponges marines (Zhao et al., 2009) . On les trouve aussi dans l’air, fumier, composts, foin, débris végétaux, résidus fibreux de cannes à sucre, pollen des plantes, rivières, glaciers, sols pollués, les rhizosphères des plantes médicinales (Khamma et al., 2010) , dans l’écorce d’arbre ( Pullen et al., 2002 ), des hydrocarbures ou du pétrole les boues activées (Simon et Meunier, 1970 ), d’autres se comportent comme des parasites intracellulaires des spongiaires (Grandhimathi et al., 2007) . Certaines Actinobactéries sont des agents pathogènes pour les êtres humains, les animaux les plantes. Elles ont été aussi isolées à partir des milieux extrêmes tels que les lacs salés, les marais salants et lacs alcalins (Ventosa, 2008), ainsi qu’à partir des environnements chauds (thermophiles).

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II.5 Importance des Actinobactéries : Les Actinobactéries sont économiquement et biotechnologiquement des microorganismes inestimables. Ils ont la capacité de fournir un grand nombre de composés bioactifs (Berdy, 2005) et sont exploités dans divers domaines : II.5.1 Dans le domaine de la biotechnologie

La diversité écologique, morphologique, biochimique des actinobactéries ainsi que leur grande adaptation aux variations environnementales leur permettent d’avoir une grande capacité de synthétiser un éventail de métabolites bioactifs à intérêts. Ces derniers ont de nombreuses applications dans des domaines variés (médicale, pharmaceutique, vétérinaire, agroalimentaire, environnemental……etc.), et de haute valeur commerciale (antibactériens, antifongiques, insecticides, herbicides, antiparasites, acaricides, antivirales, anti tumoraux, antimitotiques, anti allergénique, protéases alcalines, glucose isomérase, vitamines ...). Il existe 23000 métabolites secondaires produits par les microorganismes, plus de10100 sont produits par les actinobactéries (Berdy 2005, Barka, 2016). Parmi ces derniers , le genre Streptomyces produit à lui seul plus de 7 600 composés bioactifs, soit environ 36% de toutes les molécules d’origine microbienne, et 80% de toutes les molécules d’origine actinomycétale (Solecka et al ., 2012 ). Parmi ces antibiotiques, nous pouvons citer la streptomycine, l’actinomycine D, le chloramphénicol, la kanamycine, la néomycine et la novobiocine. Par ailleurs, l’analyse du génome de certaines espèces de Streptomyces telles que S. coelicolor , S. avermilis , S. scabies et S. ambofaciens a révélé que ces espèces possédaient cinq à dix fois plus de voies de biosynthèse que ce qui avait été observé d’après leur production de molécules bioactives. Il existerait donc un réservoir immense et non exploité de diversité métabolique au sein des milliers de souches appartenant au groupe des actinobactéries ( Lautru et al ., 2005; Smirnov et al ., 2008 ). Les genres autres que Streptomyces , appelés parfois « rares », produisent environ 9% des molécules bioactives d’origine microbienne (soit 2 500 composés) et 20% des molécules d’origine actinomycétale (Hacène et al ., 1993) . Au sein de ce groupe, les genres Micromonospora et Nocardia occupent la première place comme producteurs avec près de 10% pour les deux ( Boumehira et al., 2016 ). Les 10% restants reviennent aux autres genres tels que Saccharothrix , Amycolatopsis , Nocardiopsis , Actinomadura , Actinoplanes , Streptosporangium , etc., qui ont montré à travers plusieurs études un grand potentiel de production antibiotiques dont certains présentent un intérêt thérapeutique et sont commercialisés ( Lazzarini et al ., 2001, in Tiwari et Gupta, 2011 ).

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Tableau 4 : Nombre approximatif de métabolites bioactifs en fonction de leurs organismes producteurs (Berdy, 2005). Microorganismes producteurs Nombre de métabolites d’antibiotiques bioactifs Lichens et algues 60 Champignons 8600 Champignons microscopiques 6450 Penicillium/Aspergillus 1950 Basidiomycètes 2000 Bactéries 3800 Pseudomonadaceae 795 Bacillaceae 860 Autres Eubactéries 1050 Actinobactéries 10100 Streptomyces 7630 Autres Actinobactéries rares 2470

II.5.2 Dans le domaine de l’agriculture

Les Actinobactéries représentent un pourcentage élevé de la biomasse microbienne du sol. Ils ont la capacité de produire une large variété d’hydrolases extracellulaires, qui leur confèrent un rôle dans la décomposition de la matière organique dans le sol. Ainsi un grand pouvoir de transformation des substances organiques complexes difficilement ou non dégradables par les autres microorganismes, tels que les polymères complexes, les polysaccharides, les lignocelluloses, la chitine, etc. et contribuent ainsi à la fertilisation des sols ( Holzapfel, 2002). Les activités des antibiotiques destinés à l’agriculture s’étendent à différents domaines comme le contrôle des maladies des végétaux (insecticides, herbicides et régulateurs du métabolisme végétal). La blasticidine S est un puissant fongicide de type nucléotidique, connue pour son activité sur Piricularia oryzae , pathogène chez le riz (Andriambololona, 2010) . Le genre Frankia est très connu en foresterie pour son rôle dans la fixation d’azote atmosphérique en symbiose dans les nodules racinaires de certains arbres dicotylédones (autres que les légumineuses) comme le casuarina, l’orme, l’aulne, etc. Leur pouvoir

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Revue bibliographique antagoniste prononcé leur confère un rôle dans la distribution écologique des microorganismes et dans la lutte biologique contre certains agents phytopathogènes du sol. (Knight, 1997 ). Les Actinobactéries sont employées en agriculture comme des agents biologiques, qui peuvent être utilisés pour tuer les insectes nuisibles et les mauvaises herbes (bio insecticides et bio pesticides) .

II.5.3 Dans le domaine de l’environnement Les Actinobactéries sont impliqués dans certains processus de recyclage. En effet, elles sont vitales pour le recyclage des nutriments et comptent parmi un nombre réduit d’organismes utilisés en bioremédiation, capables de dégrader des composés organiques complexes tels que la chitine et les hydrocarbures. Leur pouvoir antagoniste prononcé leur confère un rôle dans la distribution écologique des microorganismes et dans la lutte biologique contre certains agents phytopathogènes du sol (Goodfellow et Williams, 1983 ). Ils sont aussi capables de dégrader ou de recycler certaines toxines produites par des champignons toxinogènes et réduire aussi leur teneur dans les produits finaux en agro-alimentaire .

III. Les antibiotiques : Les grands progrès réalisés dans le domaine de la chimiothérapie anti-infectieuse, depuis la pénicilline et des sulfamides jusqu’à celui des céphalosporines et des nouvelles quinolones, permet actuellement aux médecins de lutter, d’une façon efficace, contre la plupart des agents infectieux. De nos jours, plusieurs antibiotiques sont connus mais leur utilisation abusive tend à entrainer des cas de résistance parfois alarmants, ce qui a exigé la poursuite des recherches de nouvelles molécules dans ce domaine. A l’heure actuelle, des milliers d’antibiotiques sont découverts, dont seulement, 2% sont utilisés dans les domaines médical, vétérinaire, agro- alimentaire et agricole (Berdy, 2005).

III.1 Classification : Les antibiotiques constituent un groupe hétérogène de molécules biologiquement actives présentant différentes structures chimiques. Ils peuvent être classés selon plusieurs critères : la structure chimique, l’origine, le mécanisme d’action ou le spectre d’activité. ( Berdy et al. , 1987; 2005 )

III.1.1 D’après la structure : Près de 7000 molécules ont été classées par Berdy et al . (1987) et Berdy (2005), puis par plusieurs autres auteurs dans des travaux récents publiés sous forme d’articles. Ainsi, toutes

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Revue bibliographique ces molécules ont été regroupées dans neuf familles et plusieurs sous-familles chimiques (Tableau 5). Ce type de classification est basé uniquement sur la structure chimique des molécules mettant à l’écart tout intérêt thérapeutique et clinique. C’est pour cela que d’autres types de classifications utilisées dans le domaine médical existent.

III.1.2 Autres classifications : Plusieurs autres façons de classer les antibiotiques existent. Comme par exemple pour répondre à un intérêt pratique entre autre dans le domaine médical où la classification chimique importe peu. Les composés bioactifs peuvent être classés en fonction de leur spectre d’action, de leur type d’action, de leur mode d’action, de leur origine ou encore de leur charge électrique. Selon leur spectre d’action, les antibiotiques peuvent avoir un spectre large (ex: tétracyclines), moyen (ex: érythromycine) ou très étroit (ex: novobiocine). Selon le type d’action, les antibiotiques sont classés en bactéricides ou fongicides (tuent les microorganismes) et bactériostatiques ou fongistatiques (inhibent la croissance des microorganismes sans les tuer). En fonction du mode d’action, les antibiotiques sont classés selon la cible moléculaire sur laquelle ils agissent. Les antibiotiques peuvent être à caractère acide (ex: pénicilline), basique (ex: aminosides) ou neutre (ex: nogalamycines, mutactimycines).

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Tableau 5 : Classification des antibiotiques d’après leur structure chimique ( Berdy, 2005). Familles Principales sous -familles Exemples d’antibiotiques Antibiotiques contenant Glucides purs, Streptomycine, nojirimycine, des glucides aminoglycosides gentamicine, kanamycine et glycopeptides et vancomycine Lactones Macrolides, Erythromycine, Macrocycliques polyènes et spiramycine, nystatine macrolactames et amphotéricine B Quinones et Composés polycycliques Tétracyclines, anthracyclines, antibiotiques apparentés linéairement accolés, rubomycine, mitomycine anthraquinones, et saframycine naphtoquinones et benzoquinones Acides aminés Dérivés d’acides aminés, Pénicilline, bacitracine, et peptides homopeptides, peptides valinomycine et et lipopeptides polymyxines Antibiotiques hétérocycliques Hétérocycles non accolés Mildiomycine, herbicidine contenant de l’azote et hétérocycles accolés et phénazines Antibiotiques hétérocycliques Dérivés du furane Monensine et nigéricine contenant de l’oxygène et polyéthers Antibiotiques Composés benzéniques et Chloramphénicol, griséofulvine Aromatiques composés aromatiques et novobiocine accolés Antibiotiques Dérivés du cycloalcane, Cycloheximide, acide Alicycliques des terpènes marasmique et acide et des oligoterpènes fusidique Antibiotiques Dérivés d’alcanes, dérivés Elaiomycine, cérulénine Aliphatiques des acides carboxyliques et fosfomycine aliphatiques et composés contenant du phosphore

Les antibiotiques sont élaborés par divers organismes vivants. Ils peuvent être d’origine fongique, bactérienne ou encore végétale ou animale. Ils peuvent également être produits par des microorganismes hybrides (clonage de gènes), par hémisynthèse ou par synthèse chimique totale.

III.2 Microorganismes producteurs : Lazzarini et al. (2001) rapporte que plus de 60% des antibiotiques d’origine naturelle sont synthétisés par les bactéries (Actinobactéries y compris) et environ 10% par les champignons.

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III.2.1 Bactéries non mycéliennes et champignons : Les bactéries non mycéliennes produisent environ 13% des antibiotiques d’origine microbienne, dont 8% sont sécrétés par les Bacillaceae , 2,3% par les Pseudomonadaceae et 2,7% par d’autres bactéries appartenant à des genres très divers. Parmi les champignons producteurs, nous citerons les genres Aspergillus , Fusarium , Penicillium . Les plus importants antibiotiques étant les bétalactamines (pénicilline er céphalosporine), l’acide fusidique et la griséofulvine.

III.2.2 Actinobactéries : Les Actinobactéries constituent la principale source d’antibiotiques, avec près de 64% des molécules d’origine microbienne. Le genre Streptomyces est de loin le plus grand producteur (Lazzarini et al., 2000 ). En effet, environ 80% des antibiotiques sécrétés par les actinobactéries proviennent de Streptomyces et plusieurs sont commercialisés, à savoir, la streptomycine, la kanamycine, l’oxytétracycline , le chloramphénicol, la novobiocine et la nystatine. Parmi les genres producteurs autres que les Streptomyces , nous pouvons citer Micromonospora , Nocardia , Actinomadura , Saccharothrix et Nocardiopsis . En effet, les Nocardiopsis sp sont capables de produire plusieurs métabolites bioactifs. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs nouvelles espèces de Nocardiopsis ont été décrites et de nombreuses substances intéressantes, telles que des enzymes et des antibiotiques ont été découverts (Tableau 6). La plupart des molécules bioactives produites par les microorganismes sont synthétisées par des polykétides synthétases (PKS) ou par la voie des Non Ribosomial Peptide Synthétases (NRPS) ( Bennur, 2015 ).

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Tableau 6 : Antibiotiques produits par les espèces de Nocardiopsis (Bennur et al., 2015 ).

Espèces de Lieu d’isolement Nature chimique de Germes cibles Nocardiopsis l’antibiotique sensibles N.trehalosi sp . Sol, USA 3-Trehalosamine Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus NRRL12026 pneumonia N.mutabilis Sol, Japon Polyamine S. aureus, Micrococcus luteus, B. subtilis, Escherichia coli, subsp.cryophilis dopsisamine Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Mycobacerium smegmatis, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Pyricularia oryzae, Xanthomonas oryzae, Aspergillus niger, Trichophyton mentagrophytes N.dassonvillei MAD08 Eponge marine, Inde 87 kDa p roteine C.albicans Nocardiopsis sp. Sédiment marin, Thiopepetide TP -161 M.luteus, C.albicans TFS65-07 Norvège N.dassonvillei HR10 -5 Sédiment marin, Chine α-Pyrones, B.subtilis nocapyrones E-G Nocardiopsis sp. YIM Mines, Chine Griseusines (F et G) S.aureus, M.luteus, B.subtilis DT266 N.alkaliphila DSM Sol désertique, Egypte Nocardiopyrone B Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, E. coli 44657 C. albicans, S. aureus Nocardiopsis sp. 236 Sédiment marin, Chine 6-Phenazinediol et 6 - Mycobacterium smegmatis methoxy-phenazinol N.gilva DSM 44841 Sol salin, Chine p-Terphenyl et dérivés, Fusarium avenaceum, Fusarium graminearum, Fusarium Novobiocine culmorum C. albicans, B. subtilis N.terrae YIM 90022 Sol salin, Chine Quinoline alkaloide, N - S. aureus, B. subtilis, E. coli, Pyricularia oryzae acetyl-anthranilic acide

IV. Les polykétides et les peptides synyhétases : Les polykétides synthétases sont des protéines multienzymatiques organisées en modules et domaines produisant des molécules actives appelées polykétides ou polycétides. Les PKS

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Revue bibliographique activent des acides carboxyliques de petite taille (acétate ou malonate). Les polykétides synthétases ont été divisées en trois familles en fonction de leur mécanismes de fonctionnement et de leur organisation structurale en type I, II et III.

IV.1 Les PKS de type I : Les PKS de type I sont divisés en deux groupes : les PKS de type I itératives, qui réutilisent des domaines et les PKS de type I linéaires qui possèdent une organisation modulaire. Les deux groupes de PKS de type I utilisent quatre domaines enzymatiques principaux : - Le domaine acétyltransférase (AT) qui reconnait le substrat et l’active, - Le domaine kétosynthase (KS) qui condense le substrat sur la chaîne, - Le domaine porteur d’acyl (ACP) qui porte la chaîne en cours d’élongation, - Le domaine thioestérase (TE) qui permet la libération du polykétide néosynthétisé de la synthase et peut permettre sa cyclisation. Ils utilisent aussi des domaines secondaires qui modifient le substrat : -Le domaine kétoréductase (KR) qui réduit la fonction cétone en un alcool -Le domaine déhydratase (DH) qui élimine une molécule d’eau et crée une double liaison -Le domaine énoylréductase (ER) qui réduit une double liaison

IV.2 Les PKS de type II : Le système de type II consiste en un complexe de protéine monofonctionnel. Au sein des PKS de type II, on trouve les domaines KS et ACP mais pas le domaine AT. Dans ce cas, le domaine ACP joue le rôle du domaine AT dans la reconnaissance et l’activation du substrat. Le fonctionnement de ces domaines est itératif c’est à dire qu’un même module peut condenser plusieurs fois le substrat. Enfin le composé ainsi synthétisé est libéré par l’action du domaine TE ( Hutchinson, 2003 ).

IV.3 Les PKS de type III : Les PKS de type III sont des enzymes itératives qui sont capables de synthétiser des polykétides, cycliques ou non, à partir de thioester-CoA comme le malonyl-CoA (Shen, 2003). Hormis le domaine ACP, les PKS de type III possèdent les mêmes domaines que les PKS de type II.

IV.4 Les peptides NRPS : La biosynthèse peptidique non ribosomiale est réalisée chez les bactéries et les champignons, par de grands complexes multi-enzymatiques issus de la voie classique de synthèse. Les NRPS sont codées de manière générale par plusieurs gènes structurés en opéron ou clusters au niveau du génome. Ces synthétases sont organisées en modules eux-mêmes 34

Revue bibliographique divisés en domaines portant chacun une activité enzymatique particulière. La taille des protéines peut varier entre un et plus d’une vingtaine de modules. Le produit NRPS est caractérisé par la présence d’acides aminés non protéogéniques et /ou modifiés comme des acides aminés de forme D ou formylés. Les domaines peuvent être classés en domaines principaux (obligatoires et indispensables à la synthèse peptidique) et en domaines secondaires (facultatifs, qui modifient le produit final de la synthétase). Les domaines principaux sont au nombre de quatre ( Schwarzer et al., 2003 ) : – le domaine d’adénylation (A) : il s´sélectionne et active un acide aminé spécifique. L’acide aminé est transformé en aminoacyl adénylate. – le domaine de thiolation (T), aussi appelé domaine PCP (peptidyl carrier protein) : il fixe l’acide aminé sur la synthétase de façon covalente par l’intermédiaire d’une liaison thioester. – le domaine de condensation (C) : il forme la liaison peptidique entre les deux acides aminés de modules adjacents. – le domaine de la thioestérase (Te) : il libère le peptide néoformé. Ce domaine permet également la cyclisation de certains peptides ( Trauger et al., 2000 ). Les domaines secondaires sont les domaines d’épimérisation €, de m éthylation (M), de cyclisation (Cy) de formylation (F), d’oxydation (Ox) ou encore de réduction (Re). Ils permettent d’obtenir des variations structurales au niveau des monomères contenus dans le peptide formé et ainsi d’offrir le panel important d’activités biologiques qui caractérise les molécules d’origine non ribosomiale ( Stachelhaus et al., 2002 ).

IV.5 Les systèmes hybrides NRPS/PKS : Les synthétases hybrides NRPS/PKS possèdent des domaines catalytiques conservés des mécanismes de synthèse NRPS et PKS, ces synthétases portent un domaine kétoacyl-synthase (KS) unique qui permet d’accepter des peptides et non des groupements acyl. Les produits de ces synthétases hybrides sont donc composés à la fois de monomères (issus du mécanisme NRPS) et de chaines d’acides carboxyliques (issus du mécanisme PKS). La yersiniabactine est un métabolite chélateur de fer produit par une synthétase hybride NRPS/PKS ( Pfeifer et al., 2003).

V. Criblage de métabolites bioactifs : V.1 Criblage classique : Pendant près d’un siècle, les microbiologistes ont fait appel à des isolements de microorganismes à partir du sol, de l’eau ou d’aliments avariés. Des milliers de souches 35

Revue bibliographique microbiennes ont été isolées et criblées en vue de mettre en évidence des activités biologiques. Une méthode rapide de criblage combine simultanément l’isolement et la sélection, en éprouvant les propriétés d’une population microbienne hétérogène, telle qu’elle se rencontre dans un prélèvement sol ou d’eau. L’une des premières méthodes utilisées depuis les années 1940 par Waksman appelée Crowed Plate Method, consiste à étaler un volume donné d’une suspension microbienne à la surface d’un milieu gélosé. Après incubation, les souches obtenues sont ensemencées par différentes techniques en présence de germes pathogènes afin de mettre en évidence celles qui sont potentiellement productrices d’une substance bioactive. Les souches actives présentant une zone d’inhibition sont alors purifiées et sélectionnées. Cette technique a été développée et de très nombreuses variantes ont été mises au point comme les techniques des stries croisées, des cylindres d’agar et des disques. L’une des stratégies actuellement suivie est la recherche de nouveaux microorganismes producteurs par criblage de différentes sources biologiques particulières. En effet, de nombreux environnements extrêmes ne sont pas (ou insuffisamment) explorés. Les causes de cette inexploitation sont liées à plusieurs facteurs comme : (1) la difficulté d’obtenir des échantillons, (2) les exigences microbiennes difficiles à cerner ou (3) l’absence de milieux de culture adéquats qui permettraient de reproduire les conditions environnementales in situ . Cependant, malgré ces difficultés, il y a un regain d’intérêt visant l’isolement de ce type de microorganismes ce qui a mené ces dernières années à l’isolement et la description de plusieurs nouveaux taxons. En Algérie, nous n’en sommes qu’au début de ce type de travaux quoiqu’une centaine de nouveaux genres et/ou espèces microbiens et autant de métabolites nouveaux aient été caractérisés ces dix dernières années. Pourtant beaucoup d’écosystèmes Algériens peuvent être considérés comme un vivier de microorganismes, d’où la nécessité d’engager une dynamique vers l’exploration de cette microflore fascinante (Hacène, 2016) .

V.2 Criblage moléculaire : V.2.1 Criblage de gènes codant des métabolites secondaires bioactifs :

L'attention portée aux Actinobactéries dans les applications biotechnologiques résulte de leur polyvalence métabolique qui s'accompagne de la production de métabolites primaires et secondaires d'importance économique comme les antibiotiques, inhibiteurs d'enzymes, agents

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Revue bibliographique antiparasitaires et anticancéreux ( Ayuso-Sacido et Genilloud, 2005 ). Sont inclus dans cette gamme de composés, des métabolites secondaires synthétisés par les voies des polykétides synthétases (PKS) et la Non Ribosomial Peptide Synthétase (NRPS). Une des méthodes les plus efficaces pour évaluer la présence de ces voies biosynthétiques est la détection des gènes PKS et NRPS par amplification par PCR en ayant recours à l’utilisation d’amorces dégénérées. C’est la méthode que nous avons suivi pour le criblage du potentiel de production de métabolites bioactifs par les souches isolées dans ce travail.

Une étude effectuée en 2005 par Ayuso-Sacido et Genilloud (2005), l’auteur a présenté la conception et la validation des amorces de PCR dégénérées ciblées sur les séquences NRPS et PKS-I spécifiques pour les Actinobactéries. Ces amorces ont été appliquées pour la recherche des séquences NRPS et PKS-I dans un groupe de 210 Actinobactéries de référence représentatives de 32 genres.

V.2.1.1 Recherche des gènes NRPS :

Afin de maximiser la diversité des gènes NRPS détectés par amplification PCR, Ayuso- Sacido et Genilloud (2005) ont spécifiquement conçu des amorces pour les séquences NRPS d'Actinobactéries. Sur la base des séquences connues d'ADN disponibles dans GenBank de six clusters de biosynthèse de NRPS caractérisés chez les Actinobactéries et impliqués dans la synthèse de la céphamycine, de la vancomycine, de la balhimycine, de l'actinomycine, de la pristinamycine et de la chloroéremomycine, une paire d'amorces dégénérées a été conçue, il s’agit de l’amorce A3F (avant) et de l’amorce A7R ( Inversé), dérivée des motifs conservés A3 et A7 précédemment identifiés dans les domaines d'adénylation des NRPS (Figure 7a).

V.2.1.2 Recherche des gènes PKS I

La conception d'amorces dégénérées spécifiques à la recherche des gènes PKS-I a été basée sur l'alignement de séquences d'ADN connues de onze clusters de biosynthèse modulaires PKS-I caractérisés chez des Actinobactéries et impliqués dans la synthèse des composés suivants : Rapamycine, Rifamycine, Avermectin, Erythromycine, Oléandomycine, Niddamicine, Pikromycine, FK506, FK520, Nystatine et Pimaricine.

La position et l'extension des domaines KS et AT ont été déduites de la séquence du groupe PKS-I de rapamycine de Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491.

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À partir de l'analyse de l'alignement des séquences nucléotidiques de 106 domaines KS, une région conservée avec une homologie de séquence suffisante a été observée pour concevoir l'amorce dégénérée K1 spécifique du domaine KS (en avant) (Figure 7b). Afin d'assurer la spécificité de l'amplification, la conception de l'amorce inverse était axée sur les domaines AT. En effet, à partir de l'analyse de l'alignement des séquences nucléotidiques de ces derniers, une région conservée a été identifiée, correspondant à la position Gln-250, avec une homologie de séquence suffisante pour concevoir l'amorce dégénérée M6R spécifique pour les méthyl-malonyl-CoA transférases, largement distribuées.

V.2.1.3 Recherche des gènes PKS II : Dans les polykétides synthases de type II (PKS), le complexe enzymatique responsable de la formation de la chaîne polyketide est le PKS minimal, qui contrôle de manière putable le choix de l'unité de démarrage et le nombre d'extensions utilisés dans la synthèse. La PKS minimale est composée de trois enzymes: deux sous-unités de α-Kétoacyl synthase, KS α et KS β, qui catalysent la condensation entre l'acylthioester et le squelette de carbone en croissance et une Acyl Carrier Protein (ACP), qui agit comme ancre pour la chaîne des polyketides pendant la synthèse et les étapes de modifications subséquentes. Les gènes des PKS minimes sont fortement conservés et dans presque tous les cas organisés de manière similaire dans le chromosome. Les amorces dégénérées (KS α/KS β) ont été conçues pour amplifier une partie du gène KS α à partir des clusters de gènes PKS de type II très conservés (Figure 7c).

(a)

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(b)

(c)

Figure 7 : Régions conservées amplifiées par les amorces dégénérées. (a) : NRPS, (b) :PKSI et (c) : PKSII ( Metsä-Ketelä et al., 1999 ; Ayuso-Sacido et Genilloud ,2005 )

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V.2.2 Criblage par métagénomique

La métagénomique, contrairement à la méta-taxonomique (qui est l'analyse de l'ARNr 16S), est l'étude de l'ensemble de l'information génétique de tous les membres du microbiote d'un habitat naturel et ce, en utilisant la technique de séquençage du génome entier. Ce domaine se concentre sur l'analyse génétique directe des génomes microbiens isolés à partir d'environnements aussi divers que l'intestin humain ou les sources géothermale. La métagénomique constitue une alternative au séquençage d'amplicons ciblé dans l'étude de microbiotes non cultivés. En proposant d'accéder directement à l'ensemble du patrimoine génétique des communautés microbiennes, la métagénomique peut offrir un précieux aperçu du mécanisme moléculaire de nouvelles enzymes et de nouveaux biocatalyseurs ainsi que des liaisons génomiques entre la fonction et la structure des communautés. La métagénomique constitue un puissant outil permettant d'expliquer la relation entre les communautés microbiennes associées à un hôte et le phénotype de cet hôte. L’application de cette technique fait partie de l’une de nos perspectives pour la recherche de nouveaux composés bioactifs.

Plusieurs avantages spécifiques sont associés à la capacité de séquençage de l'ensemble de l'information génétique de tous les organismes contenus dans un échantillon complexe, parmi lesquels :

• Des résultats non biaisés ni influencés par certains loci génomiques spécifiques • Une indépendance vis-à-vis des marqueurs génétiques fournissant des informations taxonomiques • Une capacité à étudier des microorganismes très différents tels que les virus • Des estimations précises de la diversité microbienne • La détection de l'abondance des micro-organismes dans des environnements variés • L'analyse de micro-organismes non cultivés • Des informations sur la composition et sur les capacités fonctionnelles d'un écosystème • Des recherches sur les gènes fonctionnels et les clusters La métagénomique fonctionnelle présente un potentiel considérable pour l'industrie alimentaire et pharmaceutique. L'approche par NGS peut permettre l'identification d'enzymes nouvelles renfermant de précieuses propriétés technologiques et susceptibles d'agir dans des conditions extrêmes. Il est possible de recourir au séquençage métagénomique pour découvrir de nouveaux agents bioactifs comme les antimicrobiens ainsi que pour cibler le

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Revue bibliographique développement d'une antibiorésistance. La métagénomique environnementale contribue à se concentrer sur l'écologie fonctionnelle des communautés environnementales allant d'une pièce d'eau à un échantillon de saletés, en passant par les débris aériens. La diversité des microorganismes présents dans le sol est supérieure à n'importe quel autre écosystème microbien. L'analyse métagénomique des sols a jusqu'ici contribué à découvrir de nouvelles ressources microbiennes parmi lesquelles un certain nombre de gènes microbiens codant pour de nouvelles enzymes ou de nouveaux composés bioactifs. Le domaine de la métagénomique a contribué aux recherches sur la composition des communautés, sur les stratégies adaptatives et sur les fonctions biologiques des extrêmophiles.

V.3 Production, purification et analyse structurale des antibiotiques : Malgré leur diversité chimique, les antibiotiques naturels sont biosynthétisés à partir d’un nombre réduit de précurseurs fournis par le métabolisme primaire microbien, tels que les acides gras, les acides aminés et les bases puriques et pyrimidiques. Cette variété structurale dépend des chaines de réactions enzymatiques terminales variées (condensation, polymérisation, méthylation, oxydation et réduction), plutôt que du nombre de voies de biosynthèse de départ qui est d’ailleurs réduit ( Vinig, 1985 ; O’hagan, 1991 ). Généralement, les antibiotiques synthétisés sont caractérisés par une structure chimique ou noyau de base marquant souvent la voie de biosynthèse dont ils dérivent (polykétides, aminosides, etc). Pour la production, des précultures sont tout d’abord préparées et serviront à ensemencer le milieu de production. Ce dernier n’est pas nécessairement identique à celui permettant une bonne croissance des souches et il peut varier d’une souche à une autre ( Dumenil et Sanglier, 1989 ). La production proprement dite est effectuée dans des fermenteurs ou dans Erlenmeyers agités contenant un certain volume bien déterminé du milieu de culture. Il est possible de suivre la cinétique de croissance et de production de l’activité antibiotique en réalisant des contrôles microbiologiques. Ceci permettra d’optimiser la production des produits bioactifs et leur extraction. Plusieurs techniques chromatographiques sont utilisées pour la purification des antibiotiques parmi elles nous citons: - La chromatographie sur couche mince et la révélation microbiologique permettent de séparer les composés qui ont des propriétés physicochimiques voisines, de détecter les composés antimicrobiens, de déterminer leur nombre et leurs rapports frontaux (Rf) et de visualiser aussi leur absorbance sous UV à 254 nm et leur fluorescence à 365 nm.

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- La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est utilisée comme ultime étape de purification puisqu’elle permet la séparation de plusieurs produits, y compris des isomères d’un mélange complexe. Les composés sont détectés par la mesure de leur absorption en lumière UV à des longueurs d’ondes précises. Cependant, la purification est toujours effectuée à 220 nm, longueur qui permet la détection de toutes les molécules. La caractérisation de la structure d’un antibiotique se fait sur un produit pur. Différentes analyses spectroscopiques sont utilisées parmi elles nous pouvons citer : la spectroscopie d’absorption en lumière UV et visible (UV-VIS), la spectrométrie de masse (MS) et la résonance magnétique nucléaire (RMN). Par ionisation des molécules, la spectrométrie de masse fournit le poids moléculaire et des indications sur la structure. Celle à haute résolution, fournit en plus, la formule chimique élémentaire. Les méthodes d’ionisation les plus utilisées sont l’ionisation chimique (IC), l’ionisation par bombardement avec des atomes rapide (FAB) ou par électronébulisation (ElectroSparyIonization). Le couplage LC-MS (Liquid Chromatography-Mass spectrometry) permet aujourd’hui la détermination des masses moléculaires de tous les composants d’un profil chromatographiques ( Rouessac, 1992 ). La résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton et du carbone 13 est une technique qui, en soumettant la molécule à un champ magnétique, permet d’analyser sa conformation et sa stéréochimie. Le spectre RMN se présente sous la forme de pics caractérisant les déplacements chimiques. Il existe des tables de corrélation qui aident à identifier chaque type de proton ou de carbone en fonction de son déplacement chimique (Rouessac, 1992 ). La mise au point de la technique RMN à deux dimensions (RMN 2D) permet d’analyser avec une haute résolution, la structure de molécules. Les spectres 2D aident à interpréter les spectres 1D puisque en une seule expérience, les protons sont couplés entre eux (COSY, 1H-H) ou couplés avec les carbones correspondants (HMBC, 13 C-1H).

V.4 Données sur les antibiotiques L’isolat appartenant au genre Nocardiopsis étudié dans cette thèse produit des métabolites bioactifs faisant partie d’un grand groupe d’antibiotiques : les angucylines. Il est donc commode de présenter quelques données relatives à ce groupe d’antibiotiques.

V.4.1 Les angucyclines : Les angucyclines représentent le troisième groupe de décakétides tétracycliques après les tétracyclines et les anthracyclines. Ils possèdent comme caractéristique structurale commune, un noyau tétracyclique aglycone de type benz[a]anthracène, caractérisé par quatre cycles dont

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Revue bibliographique le quatrième est orienté de manière angulaire ( Rohr et Thiericke, 1992 ; Krohn et Rohr, 1997 ). Les angucyclines sont un groupe de produits naturels bioactifs qui ont été découverts de manière aléatoire lors de criblages de substances antibactériennes et antitumorales. Ces antibiotiques ont connu un développement rapide et, de nouveaux membres sont découverts par des méthodes de criblage plus spécifiques et orientés. Ce sont des métabolites secondaires produits particulièrement par plusieurs souches de Streptomyces et possédant des activités anticancéreuses, antivirales et antibactériennes, et inhibent l’agrégation plaquettaire ( Kharel et al ., 2012 ).

V.4.1.1 Structure et classification : Les angucyclines sont subdivisés en angucyclines proprement dits et en angucyclinones. Le terme angucyclines et angucyclinones ont été introduits en 1984 par Drautz et al . (1986). Ces deux types d’antibiotiques présentent dans leur structure de base, le noyau benz[a]anthracène angulaire qui dérive de la biosynthèse d’une chaîne décakétide formée via la voie polykétide synthetase de type II ( Rohr et Thiericke, 1992 ). Le terme angucycline désigne ceux possédant en plus, des sucres hydrolysables liés au noyau principal par une liaison O- glycosidique, tandis que le terme angucyclinone est attribué à ceux n’ayant pas de sucre ou bien, possédant une partie sucre mais liée au noyau principal par une liaison C-glycosidique ( Rohr et Thiericke, 1992 ). Les premières angucyclines dont la structure a été déterminée sont les tétrangomycines (Dann et al., 1965 ) et le tétrangulol ( Kunstmann et Mitscher, 1966 ). Par la suite, les structures de l’ochromycine ( Bowie, 1967 ), de l’aquamycine ( Nagatsu, 1968 ) et de la rabléomycine ( Lui, 1979 ) ont été décrites (figure 8). Rohr et Thiericke (1992) ont classé les antibiotiques du groupe angucyclines selon le degré d’oxygénation et la formation du C-glycoside. Selon la formation du C-glycoside, les angucyclin(on)es sont divisés en deux types principaux, lesquels sont subdivisés chacun en deux autres types sur la base du degré d’oxygénation (Figure 9 partie encadrée).

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Revue bibliographique

Figure 8 : Quelques exemples de molécules du groupe angucyclines.

Figure 9 : Classification des molécules du groupe angucyclines.

V.4.1.2 Biosynthèse : Les angucyclines et les métabolites apparentés sont des polykétides aromatiques qui représentent un grand groupe de produits naturels avec des structures et des activités biologiques très diversifiées. Malgré la diversité structurelle rencontrée chez les différents polykétides aromatiques, ils résultent tous d’une même voie de biosynthèse qui a été élucidée

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Revue bibliographique pour plusieurs représentants de cette classe de produits naturels (Hopwood, 1997 ). La biosynthèse commence par la condensation d’un nombre spécifique de petits acides carboxyliques par l’action itérative du complexe polykétide synthetase minimal (minPKS), qui consiste en deux kétosynthétases (KS alpha et KS béta et une protéine de transport acyl ACP sur laquelle la chaine polykétide est attachée via un bras phosphopantétheinyl flexible (O’Hagan 1991, Rawlings, 1997 ). Ce complexe d’enzymes catalyse la condensation des précurseurs du kétide monomérique ainsi que le pliage et les cyclisations du noyau (réaction aldole) de la forme finale multicyclique ( Rohr, 1992 ). La chaîne polykétide est pliée par diverses kétoréductases, cyclases et aromatases pour donner différents composés aromatiques. Enfin, des réactions catalysées par des oxygénases, des méthylases et des réductases, ainsi que des réactions non catalysées, modifient l’aglycone formé. La classification des polykétides est basée sur le nombre d’unités acétates (ou propionates) dans un métabolite. Une hypothèse a été proposée pour la biosynthèse des angucycli(on)es. Elle se ferait via un décakétide, qui commence par un acétyl-CoA et neuf unités malonyl-CoA ( Sohrab, 2005 ). Des exceptions sont trouvées pour les brasiliquinonesA-C, dont la biosynthèse débute par des unités propionates ( Tsuda, 1996 ). Des études ont été menées pour connaitre l’origine des atomes de carbone du squelette chimique des molécules. Ces travaux ont révélé deux voies différentes pour la formation du squelette benz [a] anthracène. Un exemple typique est l'urdamycine A, très étudiée, qui dérive d'un intermédiaire décaketide qui se plie de manière angulaire, facilitant les réactions de fermeture du cycle, conduisant ainsi à la formation de la fraction benz [a] anthracène (voie I figure 10). Cette voie a été suggérée pour la formation des intermédiaires benz [a] anthracène et comme voie de biosynthèse de nombreuses autres molécules dérivées des angucyclines / angucyclinone, telles que la vinéomycine A1, la landomycine A, la chrysomycine A, la ravidomycine V, la gilvocarcine V et la kinamycine D. Cependant, dans quelques cas, l'intermédiaire 1 du décaketide nouvellement formé suit un schéma de pliage et de cyclisation différent (voie II), conduisant à la formation d'un intermédiaire anthracyclinone (voie II) (Kharel et al ., 2012).

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Revue bibliographique

Figure 10 : Les deux voies de biosynthèse du squelette benz [a] anthracène typique du groupe angucycline de produits naturels (Kharel et al ., 2012).

V.4.1.3 Microorganismes producteurs : Les organismes producteurs d’angucyclin(on)es appartiennent presque exclusivement au groupe des Actinobactéries. A l’exception de quelques-uns qui sont produits par un nombre réduit de genres d’Actinobactéries, toutes les angucyclin(on)es sont sécrétées par diverses espèces de Streptomyces (Rohr, 1992 )

V.4.1.4 Spectre d’activité et toxicité : Depuis leur découverte, les angucyclines ont révélé un spectre antitumoral important. En plus de cette action, elles ont montré une multitude d’activités biologiques intéressantes. In vivo, les activités cytostatiques des kerriamyvines peuvent prolonger les périodes de survie des souris inoculées avec les tumeurs ascites d’Erlich. Les vinéomycines montrent une activité contre le sarcome 180, une tumeur solide de la souris. Certains membres de ce groupe inhibent remarquablement la croissance des lignées cellulaires résistantes à différents agents cytostatiques commercialisés ( Krohn et Rohr, 1997 ). Il n’y a pas de traitement sans quelque risque de toxicité. Pour lutter contre des maladies dangereuses comme le cancer, les traitements employés doivent être puissants et leurs inconvénients sont proportionnels. Les principaux signes toxiques des angucyclines correspondent à son action prépondérante, en freinant ou en arrêtant la prolifération cellulaire. Elle agit surtout sur les tissus où cette prolifération est la plus active. Ainsi, sa toxicité majeure s’exprime dans la moelle osseuse qui produit les globules sanguins, et détermine une diminution de ces globules.

V.4.1.5 Mode d’action : Peu d’informations sont disponibles sur le mécanisme d’action des angucyclines. Elles exercent leur cytotoxicité par différents mécanismes, par intercalation directe dans l’ADN et

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Revue bibliographique inhibition de la topoisomérase II, ou par le cycle d’oxydoréduction induisant la formation des formes réactives toxiques de l’oxygène ou encore par complexation calcium-dépendante avec la partie sucre mannoprotéines de la paroi cellulaire, entraînant une perturbation de l’intégrité et de la fonction de la membrane cellulaire puis la mort de la cellule ( Krohn et Rohr, 1997 ).

V.4.1.6 Synthèse chimique des angucyclines : Des angucyclines naturelles comme la rubiginone B1 et B2, l’ochromycine et l’urdamycinone ont fait l’objetb d’une synthèse chimique totale ( Lebrasseur, 2004 ). Pour d’autres la synthèse n’est que partielle. Les gènes de biosynthèse de produits naturels sont typiquement groupés et ainsi susceptibles d’être aisément manipulés génétiquement. La biosynthèse combinatoire implique l’exploitation et la manipulation de ces gènes pour créer de nouvelles combinaisons artificielles de gènes. Les microorganismes recombinants résultants synthétisent des métabolites nouveaux ou hybrides en raison de l’effet de nouvelles enzymes sur la voie métabolique. Par conséquent, des molécules nouvelles jamais signalées dans la nature peuvent être produites et utilisées en thérapeutique ( Hutchinson, 1998 ). L’un des domaines émergeant dans le développement de nouvelles molécules polykétides, est la synthèse combinatoire qui consiste à manipuler les systèmes itératifs polykétide synthase de type II (PKS) permettant d’exprimer une variété de combinaisons de la PKS avec des kétoréductases, des cyclases et d’autres enzymes aboutissant à un jeu de conception pour synthétiser de nouveaux métabolites. Dans certaines études, les clusters de gène de biosynthèse de certaines angucyclines comme l’urdamycine, la jadomycine, la pradimicine ainsi que le tétrangulol et la tétrangomycine, ont été clonés, caractérisés et exprimés dans des hôtes hétérologues ( Mets ӓ-Ketel ӓ et al., 2002 ; 2003).

V.5 Intérêt de la recherche de nouvelles molécules : La première idée qui vient à l’esprit lorsque le sujet « découverte d’un nouvel antibiotique » est abordé, est la découverte d’un microorganisme inconnu produisant une molécule inconnue à forte activité antibactérienne.

On estime que seul 1% des microorganismes vivants sur terre a été découvert, ce qui laisse place à la découverte de multitude de nouvelles espèces. Pourquoi ne sont-elles pas encore découvertes ? Soit parce que leur culture est difficile, soit parce que leurs niches écologiques sont des milieux extrêmes (volcan, lac salé, désert …). Ainsi pour ces deux raisons, les chercheurs pensent que ces souches microbiennes encore inconnues doivent posséder des métabolismes particuliers et différents et donc la capacité de produire de nouvelles molécules. 47

Revue bibliographique

Dans l’espoir d’augmenter la probabilité de découverte de nouveaux antibiotiques, les chercheurs ont commencé à s’intéresser ces dernières années à des genres rares provenant de milieux extrêmes ( Hacène et al., 1993; Lazzarini et al., 2000; Naidenova et Vladimirova, 2002; Barakate et al., 2002; Donadio et al., 2002; Moncheva et al., 2002 ). Aussi, de nombreuses campagnes sont menées à travers le monde pour découvrir de nouveaux microorganismes. On considère que les nouveaux taxons devraient contenir de nouveaux gènes pour gouverner de nouveaux métabolites. Par conséquent, le point clé pour trouver de nouveaux composés est l’obtention de nouvelles espèces.

Les Actinobactéries sont connues depuis les années 40 comme grands pourvoyeurs de la plupart des antibiotiques utilisés en médecine, mais la séquence du génome de quelques espèces (principalement, S. coelicolor, S. avermilis, S. scabies, S. ambofaciens) a révélé qu’ils possédaient 5 à 10 fois plus de voies de biosynthèse que ce qui avait été observé d’après leur capacités biosynthétiques, chaque espèce étant connue pour produire 3 ou 4 antibiotiques différents. Cet énorme potentiel, mis en évidence par l’analyse in silico des génomes de Streptomyces séquencés, pourrait conduire à la production de nouveaux métabolites secondaires avec des structures différentes et donc des activités biologiques différentes (Tohyama et al., 2004 ; Lautru et al., 2005 ). Il existe donc un réservoir immense et non exploité de diversité métabolique au sein des milliers d’espèces appartenant au groupe des Actinobactéries.

D’autres moyens de découvrir de nouvelles molécules bioactives sont de développer de nouvelles molécules soit par design moléculaire à partir des cibles moléculaires bactériennes (Singh et al., 2007), soit par modifications chimiques de molécules existantes ou alors par muta synthèse, c'est-à-dire en fournissant à la bactérie des intermédiaires métaboliques différents ( Juguet et al., 2008).

Par ailleurs, il est à noter que beaucoup d’études se concentrent sur l’amélioration des rendements de production des molécules déjà existantes. La technique utilisée est l’ingénierie métabolique (Olano et al., 2008 ) soit en redirigeant les flux de précurseurs métaboliques vers la production de la molécule d’intérêt, soit en dérégulant certaine voie métabolique ou alors en surexprimant les enzymes impliquées dans les étapes goulot d’étranglement des voies métaboliques clés. Il existe d’autres techniques qui utilisent des hôtes hétérologues pour l’expression de métabolites secondaires. Ainsi, l’échinomycine (antitumoral) et son

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Revue bibliographique intermédiaire la triostine A ont été produits dans E. coli par expression du cluster de gènes entier isolé à partir de Streptomyces. lasaliensis (Watanabe et al., 2006 ).

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Matériel et Méthodes

Matériel et méthodes

I.Sites d’études et échantillonnage I.1 Description des sites d’études Les prélèvements de sol ont été effectués à partir de deux sebkhas du sud Algérien: sebkha d’El Goléa (wilaya de Ghardaïa) et la sabkha de Ain Salah (wilaya de Tamanrasset). a)-Sebkha d’El Goléa

El Goléa, ou El Menia, s’étend sur une superficie de 49 000 Km2. C'est une oasis rattachée à la wilaya de Ghardaïa situé au centre du Sahara Algérien. Elle est éloignée de 270 km de Ghardaïa et de 380 km de Timimoun.

Les températures sont très élevées entre Juillet et Aout et dépassent les 60 °C. L'analyse des données météorologiques montrent que le mois le plus froid est décembre avec une température moyenne de l'ordre de 11.25 °C, et le mois le plus chaud est juillet avec 62.25 °C. La sebkha est située à 10 km au sud de la ville. Elle est alimentée essentiellement par les eaux souterraines, les eaux de drainage de la palmeraie, les eaux domestiques de la ville et enfin par les eaux de précipitations qui sont très rares (83mm/an). b)-Sebkha de Ain Salah :

La région de Ain Salah se situe à 700 Km du chef-lieu de la wilaya de Tamanrasset et 400 Km au Sud-est de la wilaya d’Adrar. Elle est limitée au Sud Est par Amguid, à l’Ouest par la commune d’Aulef el Arrabe et au Nord par El Goléa.

Ain Salah se caractérise par un climat désertique chaud selon la classification de Koppen, typique de la zone saharienne hyper-aride. L’été dans cette région est torride, très long et l’hiver est doux, avec une température moyenne annuelle de 27 °C (maxima moyen : 34,8 °C ; minima moyen : 19,2 °C) et une pluviométrie moyenne annuelle de 14 mm à peine. La pluie ne tombe pas tous les ans dans la région, mais elle se produit de préférence en automne (octobre, novembre) alors que le reste de l'année est presque complètement dénué de toute précipitation quelconque en moyenne. Ain Salah, est appelée le « triangle de feu » à cause des maxima quotidiens qui dépassent régulièrement 50°C durant les mois les plus chauds. L'hiver se caractérise par des journées chaudes et des nuits fraîches ( Office national de météorologie ).

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Matériel et méthodes

Figure 11: Situation géographique des sites de prélèvements .

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Matériel et méthodes

Figure12 : Sebkha d’El Goléa (2°52 E / 30°24'N) (3 ).

Figure 13 : Sebkha de Ain Salah (27° 15 ′ N, 2° 31 ′ E) (4).

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Matériel et méthodes

I.2 Echantillons : Les prélèvements des échantillons de sols ont été réalisés en 2012. Ils ont concerné les endroits où la salinité est visible à l’œil nu .

2 échantillons de sol de 400g provenant de chacun des 2 sites ont été prélevés de façon aseptique à une profondeur de quelques centimètres. Les échantillons prélevés sont mis dans des sacs stériles puis ramenés au laboratoire.

I.3 Caractérisation physicochimiques des échantillons de sols : Une partie de chaque échantillon prélevé est destinée pour les analyses physicochimiques. Celles-ci sont effectuées à l’aide d’un appareil multi-paramètre (WTWi 340) qui permet d’effectuer les mesures du pH et de la salinité. Les échantillons ont été conservés à 4°C jusqu’à acheminement au laboratoire.

II Isolement des souches d’Actinobactéries

II.1 Procédure : Le milieu utilisé pour l’isolement des souches d’Actinobactéries est le milieu ISP2 (International Streptomyces Project) n°2 additionné de 10% de NaCl. Pour éliminer les champignons et les bactéries autres que les Actinobactéries, on ajoute au milieu stérilement de l’amphotéricine B et de la gentamycine aux concentrations de 50 µg/mL et 10 µg/mL respectivement.

L’inoculation des échantillons de sols est effectuée par la méthode des suspensions dilutions : 1g d’échantillon de sol est dissout dans 9 ml d’eau distillée stérile puis agités au vortex deux fois pendant 5 mn. A partir de cette suspension, des séries de dilutions décimales (10 -1à 10 -5) sont réalisées. Le milieu ISP2 additionné de 10% de NaCl est ensemencé à raison de 0,1 ml par dilution et par boîtes de Pétri (trois boîtes pour chaque dilution). Les boîtes ainsi ensemencées sont incubées à 30°C pendant 14 à 21 jours.

II.2 Reconnaissance et purification des Actinobactéries : Les boites sont observées directement sous microscope optique aux grossissements 100 puis 400, les colonies d’apparence filamenteuse sous microscope binoculaire à faible grossissement, sont prélevées stérilement avec une aiguille puis repiquées sur le même milieu d’isolement par la méthode des stries. Cette dernière opération est répétée jusqu’à l’obtention de souches pures.

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Matériel et méthodes

II.3 Conservations des souches d’Actinobactéries Deux modes de conservation des isolats ont été suivis

II.3.1-Conservation courte durée

Après purification, les souches isolées sont nommées en utilisant les lettres H et R et numérotées par 1, 2, 3 comme par exemple souche HR1. Elles sont repiquées sur le milieu ISP2 avec 10% de NaCl incliné dans des tubes à vis, incubées à 30°C pendant 14 jours puis conservées à + 4°C.

II.3.2 Conservation longue durée Les souches isolées sont conservées à – 80°C sous forme de suspensions dans les milieux qui ont servi à leur isolement contenant 20 % de glycérol.

III ETUDE TAXONOMIQUE DES SOUCHES D’ACTINOBACTERIES

III.1 Etude morphologique

1II.1.1 Etude macromorphologique L’étude macromorphologique consiste à déterminer la couleur du mycélium aérien (MA) et du mycélium substrat (MS), à apprécier la croissance de la souche d’actinobactérie et à observer la production ou non de pigments diffusibles (autres que les mélanines) dans le milieu. Ces caractéristiques sont notées après 7, 14 et 21 jours d’incubation à 30°C sur les milieux ISP2, ISP3, ISP4 et ISP5 préconisés par Shirling et Gottlieb (1966 ). Les couleurs du MA et du MS sont déterminées à l’aide d’une charte de couleur (Color Name Charts Illustrated with Centroid Color: ISCC-NBS).

La production de pigments mélanoïdes par les isolats est observée après 3 à 5 jours sur les milieux ISP6 et ISP7 (Shirling et Gottlieb, 1966).

La composition des milieux de culture utilisés est donnée dans l’annexe n° 1.

III.1.2 Etude micromorphologique : L’étude micromorphologique consiste à étudier sous microscope photonique l’aspect et la forme du mycélium aérien (M.A), du mycélium de substrat (M.S) , et des spores selon la technique décrite par Cross ( 1989). Cette technique consiste à insérer délicatement une lamelle stérile dans le milieu gélosé ISP2 contenant 10% de NaCl de telle sorte qu’elle forme

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Matériel et méthodes un angle de 45° avec la surface. Une goutte de l’inoculum est déposée contre la lamelle en contact avec le milieu. L’incubation se fait à 30°C pendant 14 jours.

La lecture se fait en déposant la lamelle sur une lame puis cette dernière est examinée sous photo-microscope OPTIKA B-500TPL muni d’un appareil photo HIROCAM MA 88-500.

III.2-Eude physiologie et biochimique : La physiologie des souches isolées consiste à étudier la nutrition, le métabolisme et la croissance des bactéries en fonction des variations (naturelles ou contrôlées) du milieu dans lequel elles vivent.

III.2.1 Croissance des souches à différentes concentrations en NaCl L’optimum de salinité est déterminé sur le milieu ISP2 solide additionné des différentes concentrations en NaCl suivantes : 5%,10%, 15%, 20%, 25%. Un témoin sans sel est également préparé. 0,1 ml de l’inoculum est ensemencé en surface et l’incubation se fait à 30°C pendant 14 jours.

III.2.2 Influence du pH sur la croissance : Pour étudier l’influence du pH sur la croissance, la culture se fait sur le milieu ISP2 solide tamponné additionné de 10% de NaCl. Le pH des milieux est ajusté à différentes valeurs allant de 5 à 11 par incrément de 1 et l’incubation se fait dans les conditions optimales de température et de salinité.

III.2.3 Croissance des souches à différentes températures L’influence de la température sur la croissance est testée en incubant les souches isolées sur le milieu ISP2 solide à différentes températures et ce, dans une gamme qui s’étend entre 4°C et 55°C (4°C, 30°C, 37°C, 40°C et 55°C). Les milieux sont additionnés de NaCl à une concentration de 10 % (w/v), correspondant à la concentration qui a permis l’isolement des souches. La lecture consiste à comparer la croissance des souches dans les différentes conditions.

III.2.4 Production de mélanine : La production de la mélanine a été étudiée sur le milieu ISP7 additionné avec 10% en NaCl qui est ensemencé avec la souche testée.L’examen des boites se fait après 14 jours d’incubation à 30°C.

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Matériel et méthodes

Les cultures qui présentent une coloration brune à brun foncé sont considérées comme produisant des pigments mélanoides (Shirling et Gottlieb 1964) .

III.2.5 Utilisation des glucides et dérivés comme seule source de Carbone La technique consiste à noter la croissance des souches d’actinobactéries sur milieu ISP9 solide additionné de 10% de NaCl contenant un glucide ou un dérivé comme seule source de carbone (Shirling et Gottlieb 1966) . Les souches isolées sont ensemencées en stries. Un résultat positif d’utilisation du glucide se traduit par une croissance nettement meilleure que celle observée sur le milieu témoin (sans source de carbone) laquelle est soit à l’état de traces, soit absente. Les sucres utilisés sont l’arabinose, le fructose, le galactose, le glucose, l’inositol, le mannitol, le mélibiose, le rhamnose, le raffinose, le saccharose, la salicine et le xylose. Les sources de Carbone sont ajoutées au milieu après stérilisation par filtration à une concentration finale de 1%.

Dans cette étude, deux types de galeries biochimiques complémentaires ont été utilisées: classique et API 20 E. La galerie classique utilise des milieux prêts à l’emploi ou préparés par nos soins au laboratoire de Microbiologie à partir de milieux déshydratés. Les tests de la galerie classique sont résumés dans le tableau 7.

III.2.6 Galeries biochimiques API 20 : Les galeries API 20 E (Biomérieux, France) sont un système standardisé contenant respectivement 20 tests biochimiques.

Elles ont été ensemencées selon les recommandations du fournisseur et incubées à 30°C pendant 7 à 14 jours. Les suspensions des souches ont été préparées dans de l’eau distillée stérile additionnée avec 10% de NaCl.

Les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages colorés spontanées ou révélés par l’addition de réactifs. La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau de lecture (Annexe 2).

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Matériel et méthodes

Tableau 7 : Tests biochimiques effectués pour l’identification des souches isolées (Guiraud, 1978)

Tests biochimiques Principe Technique Lecture Catalase La catalase est une enzyme qui a la Le test consiste à déposer sur une Le dégagement immédiat de bulles propriété de décomposer l’eau lame une goutte d’eau oxygénée gazeuses indique un test positif. oxygénée en eau et oxygène : (10V) puis à l’aide d’une pipette

2H 2O2 2H 2O + O 2 boutonnée étaler l’inoculum elle empêche l’accumulation de bactérien.

l’H 2O2 issue de la voie respiratoire oxydative des bactéries.

Nitrate réductase La Nitrate Réducta se catalyse la Réaliser une culture dans un bouillon Le virage immédiat de la couleur du réaction de réduction de nitrates nitraté additionné avec 10% de NaCl. jaune en rouge nous indique que la

- - (NO 3 ) en nitrites (NO 2 ) et chez Incuber pendant 7-14 jours à 30°C, souche est NR(+).

certaines bactéries en azote (N 2). ajouter au moment de la lecture - NO 3- NO 2 N2 quelques gouttes des réactifs de Si le milieu reste inchangé (jaune); Griess NR I (acide sulfanilique) et NR ajouter de la poudre de zinc. Une II (α naphtylamine). coloration rouge traduit un test En l’absence de nitrites, rechercher négatif. la disparition des nitrates par addition de la poudre de zinc (épreuve de Zobell).

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Matériel et méthodes

Hydrolyse de l’amidon Ce test permet de révéler l es germes L’hydrolyse de l’amidon est étudiée L’hydrolyse de l’amidon est mise en possédant une activité amylolitique sur milieu ISP 2 gélosé à 10% de NaCl évidence par l’absence de coloration par le biais d’une amylase. additionné de 1% d’amidon. La autour des colonies. A l’inverse les gélose est répartie dans des boites zones contenant de l’amidon se de Pétri. Après refroidissement les colorent en brun. souches sont ensemencées par spot. Après incubation à 30°C pendant 7 à 14 jours la gélose est recouverte d’une solution de Lugol.

Hydrolyse de la caséine Ce test permet de rechercher les L’hydrolyse de la caséine est étudiée Toute zone claire apparaissant souches qui possèdent une on préparant d’abord un milieu autour des colonies est considérée caséinase contenant 100 ml d’eau distillée + 4g comme une zone d’hydrolyse de la d’agar, pH 7- 7,2. Après autoclavage caséine. 100 mL de lait écrémé sont ajoutés aseptiquement. Le mélange obrenu est coulé dans des boites de Pétri. Les souches sont ensemencées par spot puis observées après 14 jours d’incubation à 30°C.

Hydrolyse de la gélatine La liquéfaction de la gélatine nous Les souches sont ensemencées dans Les tubes sont placés pendant une

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Matériel et méthodes permet de révéler les germes qui des tubes conten ant le milieu ISP2 à nuit au réfrigérateur à 4°C. possèdent des protéases 10 % de NaCl additionné de 15% de Si le milieu reste liquide, ce résultat exocellulaires. gélatine, puis incubées à 30°C indique la présence d’une gélatinase pendant 14 jours.

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Matériel et méthodes

III.3 Etude moléculaire : Les techniques de biologie moléculaire sont employées pour l’identification et la détermination de la position taxonomique des souches isolées par le séquençage du gène codant pour la sous-unité ribosomale 16S. Après extraction de l’ADN, amplification par PCR et contrôle des produits PCR par électrophorèse, ces derniers sont soumis au séquençage.

III.3.1 Extraction de l’ADN génomique L’extraction a été réalisée à partir de 2 ml de culture incubée pendant 7 jours à 30°C dans le milieu ISP2 liquide contenant 10% de NaCl en utilisant Ultra Clean Microbial DNA Isolation kit (MO BIO Laboratories, USA) et, en suivant les instructions du fournisseur. Elle se déroule en 3 étapes:

- la lyse des cellules avec du lysozyme (10 mg/ml) et de l’EDTA (50 mM).

- la destruction des protéines et de l’ARN à l’aide de protéase et ribonucléase.

- la précipitation à l’éthanol 70% et à l’isopropanol, puis l’élution de l’ADN soit dans de l’eau ou dans un tampon approprié selon l’usage prévu.

L’ADN ainsi extrait est conservé à -20°C.

III.3.2 Amplification du gène codant l’ARNr 16S par PCR L’amplification de l’ADNr 16S est réalisée par PCR (Polymerase Chain Reaction) en utilisant le couple d’amorces: 63f (5 ′-AGT GAG CCCTGA AAA TCA TGG ACT -3′) et 1387r (5 ′-GGG CGG CGTG TAC AAGGC-3′) (Eurogentec, Belgique) dans un premier temps pour toutes les souches puis le couple 8f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) et 1510r (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT3’) dans un deuxième temps pour l’isolat HR3.

Le mélange réactionnel contient, pour un volume final de 50 μL:

Amplitaq Gold DNA Master Mix 2 X (Applied Biosystems, CA, USA) (Ampli- Taq Gold DNA Polymerase, 250 U (0.05 U/ μL), Gene Amp PCR Gold Buffer, 30 mM Tris/HCl, pH

8.05, 100 mM KCl, dNTP 400 μM chacun, 5 mM MgCl 2), eau stérile, 20µM de chaque amorce et 5 µL de l’ADN extrait.

L’amplification est réalisée dans un thermocycleur M J Research PTC-200 (Waltham, USA) selon le profil suivant:

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Matériel et méthodes

Une étape initiale de dénaturation à 95°C pendant 10 min, suivie de 35 cycles d’amplification: dénaturation à 95°C pendant 45 s, hybridation à 55°C pendant 45 s et une élongation à 72°C pendant 1 min et une étape finale d’élongation à 72°C pendant 10 min.

III.3.3 Electrophorèse des produits de PCR Pour s’assurer de la qualité et de la spécificité de l’amplification, une électrophorèse des produits de PCR est effectuée sur un gel d’agarose à 1% durant 40 mn sous un courant électrique de 100 V. Cette technique est basée sur le déplacement de particules chargées en solution, sous l’influence d’un champ électrique généré par un courant continu pendant un certain temps. Les molécules d’ADN chargées négativement à pH neutre migrent alors vers l’anode (+) et leur vitesse est inversement proportionnelle à leur taille

Le gel d’agarose est préparé avec du tampon d’électrophorèse (TAE 1X). Ce dernier placé à l’intérieur de la cuve à électrophorèse, en veillant à ce qu’il soit recouvert entièrement par du tampon TAE 1X, puis les échantillons d’ADN amplifiés (Pour que l'échantillon soit maintenu au fond du puits, il est alourdi avec un tampon de charge contenant 0,25% de bleu de bromophénol servant de marqueur de mobilité et 40% (w/v) de saccharose dissout dans de l'eau) et un standard de taille (Ladder) (3 kb DNA Ladder, Promega ) sont déposés dans le gel. L’électrophorèse est lancée après fermeture de la cuve.

Après migration, les fragments d’ADN sont visualisés sur une plaque de trans-illumination sous UV à 300 nm grâce au BET contenu dans le gel et qui s’insère entre la double hélice d'ADN. La particularité de cette molécule est, qu'une fois insérée dans l'ADN, elle devient fluorescente sous excitation ultra-violette. Le gel est ensuite photographié sous UV (Transilluminator, BIORAD).

III.3.4 Séquençage des produits d’amplification : Les fragments amplifiés sont utilisés pour le séquençage. Ce dernier a été réalisé par la société GATC (Allemagne).

III.3.5 Analyse phylogénétique et alignement des séquences : L’alignement des séquences pour la recherche d’homologie avec les séquences les plus proches a été réalisé en utilisant deux programmes: le BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) sur le site NCBI (National Center for Biotechnology Information) (www. ncbi .nlm.nih.gov) et le EZtaxon ( eztaxon -e.ezbiocloud.net)

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Matériel et méthodes

La construction de l’arbre phylogénétique basé sur les séquences des souches isolées et les séquences obtenues dans les bases de données a été construite par l'algorithme de neighbor- joining mis en oeuvre par le logiciel MEGA 7.0 (Tamura et al., 2015) . Les niveaux de confiance de la topologie des arbres phylogénétiques obtenus par la méthode de Neighbor- Joining (MEGA 7.0), ont été estimés par la méthode des analyses de ré-échantillonnage des données avec 1000 réplications.

III.4 Caractérisation d’un nouveau taxon Une souche isolée (HR3) s’est révélée être un nouveau taxon non connu sur la base des analyses génétiques. Nous l’avons donc étudiée de façon approfondie selon les règles de la taxonomie bactérienne fixées par le Comité International de la Systématique des Procaryotes.

Ces règles incluent le maximum de données phénotypiques, moléculaires et phylogénétiques.

III.4.1 Microscopie électronique : L’examen de la structure fine de la souche HR3 a été réalisé au moyen d’un microscope électronique à balayage PHILIPS XL 30 ESEM (Environmental Scanning Electron Microscopy) pourvu de la capacité d’étudier les échantillons en mode environnemental, c’est- à-dire sans traitement de métallisation préalable. Ce mode permet l’observation directe des structures cellulaires dans leur état naturel hydraté ou vivant.

III.4.2 Etude chimiotaxonomique de la souche HR3 III.4.2.1 Préparation de la biomasse cellulaire

La biomasse utilisée pour l’étude chimiotaxonomique est obtenue par culture de la souche HR3 en milieu liquide ISP2 additionné de 10 % (w/v) de NaCl avec une incubation à 30°C pendant 14 jours. Les cellules sont récupérées par centrifugation de la culture liquide. Le culot ainsi obtenu est lyophilisé pendant 48h ; la matière sèche servira pour les analyses ultérieures.

III.4.2.1-1 Détermination de l’isomère de l’acide diaminopimélique

Les hydrolysats cellulaires obtenus en utilisant du HCl 4N à 100 °C pendant16 h ont servi à la détermination de l’isomère de l’acide diaminopimélique (LL ou DL (= méso)) par chromatographie sur couche mince de cellulose (Merck) en utilisant le solvant de Rhuland et al . (1955 ).

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Matériel et méthodes

III.4.2.1-2 Détermination des phospholipides membranaires

La méthode décrite par Minnikin et al. (1979) est employée pour l’analyse des phospholipides membranaires. Ces derniers sont séparés après extraction par chromatographie bidimensionnelle sur couche mince. La révélation se fait par une solution de ninhydrine, le réactif Zinzadze et l’acide molybdophosphorique ( Embley et Wait, 1994 ).

III.4.2.1-3 Analyse des sucres et des acides aminés cellulaires

La biomasse utilisée pour l’identification des acides aminés et des sucres cellulaires est préparée selon la méthode de Lechevalier et Lechevalier (1970) et analysés par chromatographie sur couche mince ( Staneck et Roberts, 1974 ).

III.4.3 Etude biochimique : En plus des tests effectués précedemment, nous avons employé la galerie APIZYM pour la recherche des activités enzymatiques de la souche HR3.

Le système API ZYM est une micro-méthode semi-quantitative de recherche d'activités enzymatiques applicable à différents types d'échantillons (microorganismes, suspensions cellulaires, tissus, liquides biologiques, etc.). Il permet d'étudier rapidement et simultanément 19 activités enzymatiques à partir de très faibles quantités d'échantillon. Il se présente sous la forme d'une galerie de 20 micro-cuves (cupules) dont le fond est constitué d'un support contenant le substrat enzymatique avec son tampon. Ce support est destiné à favoriser le contact entre l'enzyme et le substrat généralement insoluble.

Les tests enzymatiques sont inoculés selon les recommandations du fournisseur avec une suspension bactérienne dense (dans notre cas la suspension de la souche HR3 est préparée dans de l’eau stérile à 10% de NaCl), qui réhydrate les substrats. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés révélés par l'addition de réactifs. La lecture de ces réactions se fait à l'aide du Tableau de lecture (Annexe n° 3).

III.4.4 Etude moléculaire :

III.4.4.1 Détermination du contenu génomique en G+C Le contenu génomique en bases guanine et cytosine est mesuré par une procédure qui comprend les étapes suivantes :

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Matériel et méthodes

1- Isolement de l’ADN : Les cellules sont lysées par french press. L’ADN est purifié sur hydroxyapatite conformément à la méthode décrite Cashion et al . (1977).

2- Dégradation de l’ADN: L’ADN est soumis à une hydrolyse par la P1 nucléase et les nucléotides sont déphosphorylés sous l’action de la phosphatase alcaline bovine ( Mesbah et al . 1989 ). Les déoxyribonucléosides obtenus sont analysés par HPLC ( Tamaoka et Komagata, 1984 ).

3- Le pourcentage G+C est calculé par le ratio du deoxyguanosine (dG) et thymidine (dT) selon la méthode de Mesbah et al . (1989) .

IV CRIBLAGE DE L’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES SOUCHES ISOLEES :

Les souches d’Actinobactéries isolées ont été criblées en vue d’en sélectionner celles qui sont productrices d’antibiotiques. Pour cela, nous avons utilisé deux méthodes : la première est la diffusion sur gélose par la technique des cylindres d’agar et la seconde moléculaire par la recherche des gènes codant les NRPS, PKS I et PKS II.

IV.1 Mise en évidence de l’activité antimicrobienne sur milieu solide

IV.1.1 Activité antibactérienne : L’activité antibactérienne des souches d’Actinobactéries isolées a été recherchée contre des bactéries-cibles obtenues auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC).

Il s’agit de : bactéries à Gram positif ( Staphylococcus aureus ATCC 25923, Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300, Micrococcus luteus ATCC 4698 et Enterococcus faecalis ATCC 29212) et des bactéries à Gram négatif ( Escherichia coli ATCC 25922 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) a)-Inocula des bactéries-cible :

A partir d’une culture de 18h sur milieu gélose nutritive (GN), une suspension de chaque bactérie-cible est préparée dans de l’eau physiologique stérile (0,9%). La densité cellulaire de chaque suspension est ajustée et son opacité doit être égale à 0.5 Mc Farland ce qui correspond à une concentration cellulaire de 10 6 UFC ∕mL

A partir des suspensions des germes-cible préparées et avec un écouvillon stérile on ensemence par des stries très serrés le milieu Mueller Hinton (MH) selon les recommandations du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).

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Matériel et méthodes b)-Technique des cylindres d’agar

Après culture des souches d’Actinobactéries sur milieu ISP 2 solide additionné de 10% de NaCl à 30°C pendant 14 jours ; des cylindres d’agar de 6 mm de diamètre sont découpés à l’aide d’un emporte-pièce. Ces cylindres de gélose sont ensuite déposés à la surface du milieu Mueller Hinton (MH) préalablement ensemencé par le germe-cible. Les boites sont alors maintenues à 4°C pendant une nuit avant d’être incubées pour permettre la diffusion des substances actives tout en empêchant momentanément la croissance des microorganismes cibles. Les zones d’inhibition sont mesurées à l’aide d’une règle graduée millimétrée après 24h d’incubation à 37°C. Des cylindres d’agar témoins du milieu ISP2 solide avec 10% de NaCl ont été utilisés.

IV.1.2 Activité antifongique : L’activité antifongique des isolats est mise en évidence par la technique des cylindres d’agar contre des levures et des champignons filamenteux. Il s’agit de : Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Fusarium oxysporum DSM 62297 T Monilia sp et Colletotrichum sp.

Les levures ont été ensemencées par écouvillonnage comme la technique de l’antibiogramme alors que les champignons-cibles sont déposés au centre de la boite d’un milieu Sabouraud par spot. Des disques d’agar contenant la souche d’Actinobactéries sont déposés sur le milieu préalablement ensemencé avec la levure ou à 1,5 cm du champignon. Des cylindres d’agar témoins du milieu ISP2 solide avec 10% de NaCl ont été utilisés.

L’incubation est faite à 30°C pendant 48h pour les levures et 3 à 5 jours pour les champignons filamenteux.

La souche est considérée comme productrice de molécule antifongique quand il y a apparition d’une zone d’inhibition ou un arrêt de croissance.

IV.2 Criblage moléculaire :

IV.2.1 Recherche des gènes NRPS, PKS I et PKS II Le potentiel génomique de production de métabolites bioactifs par nos isolats a été entrepris en recherchant les gènes qui codent pour les gènes PKS et NRPS. La détection de la présence des gènes NRPS/ PKS I/ PKS II dans le génome de nos isolats a été effectuée en

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Matériel et méthodes utilisant des amorces dégénérées spécifiques de ces gènes par la technique de la PCR (Tableau 8).

Ce sont des amorces dont une ou plusieurs positions sont des acides nucléiques dégénérés, et qui sont représentées par deux nucléotides ou plus de bases substituables. Le tableau I indique les différents acides aminés dégénérés.

Tableau 8: Séquences des amorces dégénérées utilisées pour la recherche des gènes PKS/NRPS.

Amorces Séquence (5 ΄-3΄) Gène amplifié Taille du gène (pb) Référence ’ ’ A3F 5 -GCSTACSYSATSTACA CSTCSGG-3 NRPS 700-800 Ayuso-Sacido (2005 ) ’ ’ A7R 5 -SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3 ' ' K1F 5-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3 PKS I 1200-1400 Ayuso-Sacido (2005 ) ' M6R 5-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3 ' ' KS α 5-TSGCSTGCTTGGAYGC SATC-3 PKS II 600 Metsä-Ketelä et al ( 1999 ) ' ' KS β 5-TGGAANCCGCCGAABCCTCT-3

Tableau 9: Liste des bases dégénérées selon le code IUPAC.

Acide aminé dégénéré Bases substituables

R A ou G

Y C ou T

M C ou A

K T ou G

W T ou A

S C ou G

B C, T ou G

D A, T ou G

H A, T ou C

V A, C ou G

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Matériel et méthodes

L’amplification est réalisée pour un volume de 50 μl de mélange réactionnel dans un thermocycleur (M J Research PTC-200 Thermal Cycler (Waltham, USA)) comportant 96 puits. Le mélange réactionnel utilisé contenait : l’AmpliTaq Gold Master Mix 2X, eau stérile, 20 µM de chaque amorce et 5 µL de l’ADN extrait. Les cycles de PCR employés sont présentés dans le tableau 10

Tableau 10 : Programmes des PCR utilisés pour la recherche des gènes NRPS et PKS.

Amorces

A3F/A7R K1F/M6R KS α/KS β

Etapes (NRPS) (PKS I) (PKS II)

1-Première 94°C 95°C 95°C pendant5 min. dénaturation pendant 5 pendant 5 min. min.

2-Deuxième 94°C 95°C 95°C for 30 sec. dénaturation pendant 1 pendant 30 min. sec.

3-Hybridation 57°C 55°C for 2 58°C pendant 2min pendant 1 min. min.

4-Elongation 72°C 72°C 72°C pendant 4 min. pendant 2 pendant 4 min. min.

5-Cycle Aller à l’étape 2, répéter 35 fois thermique

6-Elongation 72°C 72°C pendant 10 min finale pendant 5 min

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Matériel et méthodes

IV.2.2 Electrophorèse des produits de PCR :

Les produits d’amplification obtenus ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1% ; les bandes ayant une taille de 1200 à 1400, 600 et 700-800 pb ont été classées comme produits d’amplification PKS I, PKS II et NRPS respectivement.

IV.2.3 Purification des fragments amplifiés de la souche HR4 par les amorces dégénérées :

Cette opération consiste à débarrasser le fragment d’intérêt des autres produits PCR (amorces, sels, enzymes, dNTP restants). Elle a été effectuée à partir du fragment obtenu après électrophorèse (à partir du gel d’agarose).

Les morceaux de gels contenant les bandes des fragments désirés sont découpés à l’aide d’un cutter stérilisé et l’ADN est purifié suivant le protocole QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Allemagne). Les bandes à extraire ne doivent pas être exposées longtemps aux U.V afin d’éviter la dégradation des ADN.

IV.2.4 Ligation et clonage :

Les fragments d’ADN issus d´amplification par PCR sont clonés, après purification, directement dans le vecteur pGEM-T de Promega selon les instructions des différents fournisseurs.

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Matériel et méthodes

Figure 14 : Structure du vecteur plasmidique pGEM-T.

Les produits de ligation sont laissés une nuit à 16°C en présence d´une unité de T4 DNA ligase, dans le tampon de ligation correspondant. La quantité d’ADN à ajouter au mélange de ligation se calcule selon la formule suivante:

m=[ng de vecteur]x[rapport de taille (kb):insert/vecteur]x[rapport molaire: insert/vecteur].

IV.2.5 Transformation et sélection des colonies :

La transformation consiste à transférer le vecteur d’intérêt dans une cellule compétente E. coli JM109 (Promega, USA).

La transformation s’effectue par choc thermique dans le milieu SOC selon les recommandations du fournisseur. La sélection des cellules transformées est effectuée selon le test dit « blanc-bleu ».

IV.2.6 Purification de plasmides recombinants :

L’ADN plasmidique a été extrait des cellules transformées d’ E. coli à l’aide du Gene JET Plasmid Miniprep (Kit Fermentas) après culture d’une nuit à 37°C dans le milieu LB complémenté en ampicilline (concentration finale à 100 μg/mL).

IV.2.7 Séquençage :

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Matériel et méthodes

Le séquençage des fragments clonés a été effectué au niveau de GATC (Allemagne). Les échantillons ont été préparés selon les recommandations du laboratoire.

IV.2.8 Analyse des séquences par le blastx

Le BLAST (acronyme de basic local alignment search tool ) est une méthode de recherche utilisée en bio-informatique permettant de trouver les régions similaires entre deux ou plusieurs séquences de nucléotides ou d'acides aminés et de réaliser un alignement de ces régions homologues. Ce programme permet de retrouver rapidement dans des bases de données, les séquences ayant des zones de similitude avec une séquence donnée (introduite par l'utilisateur).

BLAST est utilisé pour trouver des relations fonctionnelles ou évolutives entre les séquences et peut aider à identifier les membres d'une même famille de gènes. Parmi ces programmes, nous avons employé le blastx qui consiste à analyser une séquence nucléotidique traduite en séquence de protéine et à la comparer avec les séquences protéiques disponibles dans les bases de données.

V Etude approfondie de l’activité antimicrobienne de la souche HR4 :

V.1 Croissance et production en milieu liquide:

V.1.1 Préculture La préculture est préparée à partir des spores de la souche HR4 cultivée sur le milieu ISP2 solide contenant 10% de NaCl, raclées avec un écouvillon stérile et inoculées dans des Erlenmeyers de 100 mL contenant 20 mL de milieu ISP2 liquide Les Erlenmeyers sont ensuite incubés à 30°C pendant 48h sous une agitation de 250 rmp.

V.1.2 Cinétiques de croissance et de production

Les cinétiques de production des antibiotiques par la souche HR4 ont été réalisées en vue de déterminer en premier lieu la corrélation entre la croissance et l’activité antimicrobienne et ensuite le moment où la production est maximale. Des fioles d’Erlenmeyer de 250 mL contenant 50 mL de milieu liquide ISP2 additionné de 10% NaCl (pH 7,2) sont ensemencées chacune avec 2 mL de la préculture de l’isolat HR4.

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Matériel et méthodes

Les cultures sont incubées à 30°C et agitées dans un agitateur-incubateur à 250 rpm. Des prélèvements sont effectués toutes les 24 h pendant 14 jours pour tester l’activité antibiotique, et mesurer le pH et la biomasse.

L’activité antibiotique est déterminée par la méthode de diffusion des disques de papier contre S.aureus ATCC 25923 et C.albicans ATCC. Pour cela, des disques de papier stériles de 6 mm de diamètre sont imprégnés avec 100 µL de surnageant de culture. Ils sont séchés puis ensuite déposés à la surface du milieu MH solide préalablement ensemencé avec le germe-cible. Les boites sont mises d’abord à 4°C pendant une nuit avant d’être incubées pour laisser diffuser les substances actives tout en arrêtant momentanément la croissance des germes-cible, puis incubées à 30°C. La lecture des résultats se fait en mesurant le diamètre de l’auréole d’inhibition autour du disque après 24 h (pour la bactérie) et 48 h (pour la levure).

L’évolution de la biomasse durant la fermentation est estimée selon la méthode de Pfefferle et al . (2000). Pour cela, 2 mL de culture sont prélevés toutes les 24 h puis centrifugés à 5000 rpm dans des tubes Eppendorf préalablement tarés. Le surnageant est récupéré pour mesurer le pH du milieu. Le culot (biomasse) est lavé par centrifugation à 3 reprises avec de l’eau distillée. Les tubes (culot sans eau) sont ensuite incubés à 100°C durant 24 h puis pesés pour déterminer le poids de la matière sèche après soustraction du poids de la tare.

V.2 Extraction et localisation des antibiotiques

V.2.1Culture Après culture de la souche dans les conditions les plus favorables, l’extraction est réalisée avec le n-butanol et le méthanol pour le surnageant et le mycélium respectivement.

V.2.2 Extraction à partir du surnageant Après centrifugation de la culture, 50mL de filtrat de culture sont extraits avec 50 mL de n-butanol dans une ampoule à décanter à température ambiante pendant 4 h. La phase organique est séparée de la phase aqueuse. Les extraits sont concentrés à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide, puis repris dans du méthanol (1 mL) et mis dans un Eppendorf pour être testés par antibiographie.

V.2.3 Extraction à partir du mycélium L’extraction des antibiotiques à partir du mycélium est effectuée selon la méthode de Mechlinski (1978). Après centrifugation de 50 mL de culture, le mycélium est recueilli, lavé

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Matériel et méthodes plusieurs fois à l’eau distillée, puis égoutté. Un gramme de mycélium humide est extrait par 20 mL de méthanol, sous agitation durant 2 h à température ambiante. L’extrait méthanolique obtenu après centrifugation est concentré à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif, puis récupéré dans 1 mL de méthanol afin de le tester par antibiographie.

V.2.4 Tests d’antibiographie : Le extraits butanoliques et méthanoliques obtenus sont testés pour déterminer la localisation intra ou extracellulaire de l’activité antibiotique. La méthode de diffusion des disques de papier a été utilisée.

Des disques de papier de 6 mm de diamètre sont imprégnés de 100 µL d’extrait à tester. Ils sont séchés, puis stérilisés sous UV pendant 30 min. Les disques imprégnés sont ensuite déposés à la surface du milieu MH solide préalablement ensemencé avec le germe-cible. Les boîtes sont mises à 4°C pendant 4 h avant d’être incubées à 30°C. La lecture des résultats se fait en mesurant les diamètres des zones d’inhibition.

V.2.5 Analyse chromatographique de l’extrait actif : Deux plaques de gel de silice Kiesel gel HF254-366 type 60 de 20 x 20 cm et des cuves de chromatographie ascendante sont dans ce cas employées. Les plaques sont séchées puis activées à 100°C avant utilisation.

Le système de solvants utilisé est celui recommandé par Hacène et al (1994): n-butanol, acide acétique et eau distillée (120/40/40, v/v/v). L’atmosphère des cuves de chromatographie (qui contiennent 200 mL de système de solvants) est mise à saturer 2 h avant l’introduction des plaques.

Des quantités de 200 μL de l’extrait sont déposées sous forme de spot à 2 cm de la bordure inférieure sur les plaques à l’aide d’une microseringue. Les plaques sont séchées à froid avec un séchoir, puis développées dans les systèmes cités ci-dessus. Lorsque le front du solvant aura parcouru une distance d’environ 17 cm à partir du dépôt, les plaques sont retirées des cuves, séchées à température ambiante puis observées à l’œil nu et sous U.V. à 254 nm. Les tâches qui apparaissent à l’œil nu ou sous UV sont alors délimitées, ce qui permettra de localiser le Rf des composés élaborés par la souche.

V.2.6 Bioautographie La bioautographie ou révélation microbiologique permet de détecter et de localiser les tâches actives présentes dans les extraits en déterminant leur nombre et leur rapport frontal

72

Matériel et méthodes

(Rf) et leur correspondance vis-à-vis des taches observées à l’œil nu et sous UV obtenues précédemment. Les plaques sont mises durant une nuit dans une étuve réglée à 45°C bien aérée afin d’évaporer les solvants de migration. Chaque plaque est ensuite placée horizontalement (en étant maintenue surélevée grâce à des baguettes en verre) dans une boîte en verre (22 x 24 cm) dont l’atmosphère a été rendue humide avec de l’eau stérile (pour éviter la dessiccation du milieu gélosé au cours de l’incubation). Le dispositif est ensuite stérilisé sous UV à 254 nm durant 45 min. Par la suite, 50 mL de milieu MH préalablement ensemencé avec le microorganisme-cible est réparti uniformément sur la plaque de gel de silice. Après solidification du milieu, les boîtes sont mises à 4°C pendant 2 h (diffusion des antibiotiques) puis incubées à 30°C. La lecture se fait après 24 h pour les bactéries et 48h pour les levures.

Les zones d’inhibition des tâches actives sont alors observées et le Rf des antibiotiques est calculé selon la formule suivante:

Rf = Distance de migration entre dépôt et tâche active /distance de migration du solvant

V.3 Purification et caractérisation des antibiotiques produits par la souche HR4 : La purification des antibiotiques produits par la souche a été menée en employant un volume de culture important. 8 litres ont été nécessaires pour réaliser cette opération de purification. La culture de la souche HR4 a été effectuée de la même façon que dans le paragraphe V.1.1.

V.3.1 Protocole d’extraction : Les 8 litres de culture obtenus précédemment ont été centrifugés, le surnagent a été extrait avec le même volume de solvant d’acétate d’éthyle pendant 24 h à température ambiante sous agitation.

La phase organique est ensuite rincée à l’eau milliQ à volume égale dans une ampoule à décanter afin d’éliminer les traces du milieu de culture. Une fois le partage liquide-liquide réalisé, la phase organique est récupérée et du sulfate de sodium anhydre est alors ajouté jusqu’à formation d’un dépôt. Cette étape permet d’éliminer la phase aqueuse résiduelle. La phase organique est filtrée sur papier Wattman et concentrée sous pression réduite grâce à un évaporateur rotatif. L’extrait brut ainsi obtenu est utilisé pour les différentes étapes de purification.

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Matériel et méthodes

V.3.2 Purification des antibiotiques par Chromatographie Liquide Haute Performance : La chromatographie permet la séparation ou la purification d’un ou de plusieurs composés d’un mélange en vue de leur identification et de leur quantification. Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique. La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique. Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.

Les analyses et les séparations par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) de l’extrait brut ont été réalisées sur une chaîne Gilson 322 (Middleton, USA) avec un détecteur UV à barettes de diodes Gilson 171 et un détecteur DEDL prepELS TM II.

Les colonnes analytiques utilisées concernent : une Phenomenex Luna (Torrance, USA) C18 5 µm (4,6x250 mm) et une Phenomenex PFP 5 µm (4,6x250 mm). Les colonnes préparatives sont une Phenomenex Luna C18 5 µm (21,20x 250 mm) et une Phenomenex PFP 5 µm (21,5x 250 mm).

Des gradients sont réalisés à partir d’eau et d’acétonitrile (CH 3CN) pour HPLC. Le gradient est continu, linéaire, allant de 20 à 100% d’acétonitrile dans l’eau (80/20 à 0/1 en 25 min) suivi par un gradient isocratique d’acétonitrile à 100% pendant 10 mn. Le débit de l’éluant est de 21 mL/min. La détection se fait à 220 et 250 nm. Ces conditions de purification ont été déterminées après plusieurs expériences préliminaires. L’extrait est dissout dans 1 mL de méthanol, ultrafiltré à l’aide d’un filtre 0,45 µM, puis introduit dans l’appareil (CLHP) à raison de 150 µL par injection. Les molécules pures ou sous-fractions observées (matérialisées sur le chromatogramme sous forme de pics) sont récoltées, évaporées sous pression à l’aide d’un évaporateur rotatif Heidolph, à une température de 30°C. L’ensemble de l’extrait est ainsi purifié en effectuant plusieurs injections.

V.3.3 Spectrométrie de Masse Haute Résolution (HRMS) : La spectrométrie de masse est une technique permettant de déterminer la masse d’une molécule ou d’une association de molécules et de proposer des formules brutes. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse des molécules chargées (ions) en fonction de leur 74

Matériel et méthodes rapport masse/charge ( m/z ). De plus, la possibilité de la coupler avec les méthodes séparatives comme la chromatographie en phase liquide ou gazeuse, augmente l’efficacité de cette dernière.

Dans notre cas, les spectres de masse haute résolution ESI (Electro Spray Ionisation) ont été réalisés sur un système UPLC Acquity Waters couplé à un spectromètre de masse à trappe d’ions Waters Micromass LCT Premier Time of-Flight (Milford, USA). L’analyse chromatographique a été effectuée sur une colonne BEH C18 (1,7 µm 2,1 x 50 mm) et la détection a été réalisée grâce à un détecteur PDA Waters balayant les longueurs d’onde entre 210 et 410 nm. L’élution a été réalisée avec un débit de 1mL/min et en utilisant 100% de MeOH.

Au niveau du spectre de masse, l’ionisation est réalisée en électronébulisation et l’acquisition est faite sur un analyseur à temps de vol (TOF). Le traitement des données a été réalisé sur le logiciel MassLynx et les échantillons ont été préparés à très faible concentration vu la grande sensibilité de la HRMS et ont été ensuite filtrés sur des filtres Millex PTFE hydrophile 0,2 µm avant analyse.

V.3.4 Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire : La spectroscopie par RMN constitue l'un des plus puissants instruments de détermination de la structure des molécules organiques et inorganiques.

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est fondée sur la mesure de l'absorption de la radiation de radiofréquence (RF) par un noyau atomique dans un champ magnétique fort.

L'absorption de la radiation pousse le spin nucléaire à se réaligner ou à retourner dans la direction de la plus haute énergie. Après avoir absorbé l'énergie, les noyaux atomiques réémettent une radiation RF et retournent à leur état initial de moindre niveau d'énergie.

Les expériences de résonance magnétique nucléaire ont été réalisées avec un spectromètre Bruker (Fremont, USA) Avance 500 MHz en utilisant comme solvant le chloroforme deutéré

CDCl 3. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm (partie par million) et calibrés par rapport au TMS (Tétraméthylsilane). Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz (Hz). La multiplicité des signaux est donnée par les abréviations suivantes : s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet) et m (multiplet).

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Matériel et méthodes

L’exploitation des spectres et les attributions des signaux ont été réalisées en utilisant le logiciel ACD/NMR.

V.3.4.1 RMN unidimensionnelle (RMN 1D)

L’analyse s’effectue par le biais d’une excitation non spécifique par une impulsion de radiofréquence ; cette dernière est restituée par l’échantillon (réponse/relaxation). Cette onde électromagnétique est enregistrée et analysée par transformation de Fourrier. Le spectre RMN est un graphe de l’intensité en fonction du déplacement chimique.

Vu la différence de taille -et par conséquent la densité de charge- des noyaux, la fréquence effective du champ magnétique est 4 fois plus importante pour le proton 1H que le noyau 13 C soit 300 MHz pour 1H et 75 MHz pour 13 C.

V.3.4.2 RMN bidimensionnelle (RMN 2D) :

La RMN 2D permet en fait de montrer les corrélations complexes existant entre le spin A et le spin X. Ces spectres sont particulièrement utiles pour étudier les molécules complexes (plusieurs atomes couplés entre eux, couplage à longue portée….). L’acquisition d’un spectre RMN 2D se fait à partir d’une séquence d’impulsion constituée de trois intervalles de temps distincts et identique à celles utilisées dans les expériences 1D ; on distingue le temps de préparation (préparer le spin à étudier), le temps d’évolution t1 (évolution du spin vers sa position d’équilibre) et le temps de détection t2 (enregistrer l’évolution de l’aimantation). Les expériences diffèrent par les noyaux étudiés et les couplages qui sont mis en jeu. Nous trouvons :

- Corrélation quantique unique hétéronucléaire (HSQC) : elle met en évidence les couplages scalaires 1J C-H

- Corrélation hétéronucléaire Liaison Multiple (HMBC) : elle met en évidence les couplages scalaires 2J C-H et 3J C-H

- Spectroscopie de Corrélation (COSY) : elle met en évidence les protons qui sont couplés de façon scalaire.

- Spectroscopie à effet nucléaire Overhauser (NOESY) : elle met en évidence les signaux de deux noyaux en interaction dipolaire.

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Matériel et méthodes

V.3.5 Détermination du Pouvoir Rotatoire Spécifique : Le pouvoir rotatoire est mesuré à l’aide d’un polarimètre. Cet instrument mesure l’angle de rotation causée par le passage de la lumière polarisée à travers une substance optiquement active. Après son passage, la lumière est polarisée et tourne soit vers la gauche, la substance est dite alors Lévogyre soit vers la droite, elle est dire Dextrogyre.

Les pouvoirs rotatoires [ α]D ont été mesurés à l’aide d’un polarimètre Anton Paar MCP200. La source lumineuse monochromique est la raie D su Sodium, qui est la raie jaune à 589,3 nm. Les expériences ont été réalisées dans des cellules de 100 mm de longueur à 25°C.

V.3.6 Activité antimicrobienne des produits HR4-9 et HR4-10 : Après purification par HPLC, 2 produits différents ont été obtenus. Le test de diffusion par les disques de papier a été utilisé pour tester l’activité antibiotique des deux produits purifiés. Chaque germe-cible a été ensemencé sur milieu MH pour les bactéries et sur Sabouraud pour la levure selon les recommandations du CLSI.

Le méthanol a été utilisé pour dissoudre les composés purifiés. 20 µL de chaque produit (représentant 50 µg) ont été appliqués sur un disque de papier de 6,0 mm de diamètre (Whatman). Les disques ont été séchés pendant une heure avant d'être appliqués sur les boîtes de Pétri préalablement inoculées avec les germes-cibles suivants : S.aureus ATCC 25923, S.aureus ATCC 43300 , E.faecalis ATCC 29212, M.luteus ATCC 4698, E.coli ATCC 25922, P.aeruginosa ATCC 27853 et C.albicans ATCC 10231. Après application des disques, les boites sont mises à 4°C pendant une nuit pour permettre une bonne diffusion du produit et l’arrêt momentané de la croissance du germe-cible. Les boîtes ont été incubées à 37°C et le diamètre de la zone d'inhibition (mm) de chaque composé actif a été mesuré après 24 heures. Des disques de papier avec 20 µL de méthanol ont été utilisés comme témoins négatifs.

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Résultats et discussion

Résultats et discussion

1. Analyses physicochimiques des échantillons de sol Trois paramètres physico-chimiques ont été mesurés : le pH, la Température et la salinité. Les résultats obtenus pour les différents échantillons de sols sont présentés dans le tableau 11.

Il en ressort que les sols des sebkhas étudiées ont un pH relativement alcalin ; il est de 8,58 pour les sols d’El Goléa et de 8.32 pour le sol d’Ain Salah. Concernant la salinité, nous pouvons noter qu’elle est relativement équivalente et élevée dans les deux sites.

Les températures au moment des prélèvements sont de 30°C à la sebkha d’El Goléa et de 32°C à la sebkha de Ain Salah. Pour des raisons techniques, les échantillons ont été effectués au printemps, sachant que la température dépasse les 50° C en saison estivale.

Au vu de ces résultats, on peut dire que ces 2 échantillons sont fortement salins, alcalins et favorisent la croissance de microorganismes haloalcalophiles ou haloalcalotolérants.

Tableau 11 : Résultats des analyses physicochimiques des échantillons de sols.

Sites de prélèvement pH Température Salinité

Sebkha El Goléa 8,58 30°C 27,6 %

Sebkha de Ain 8,32 32°C 29 % Salah

II. Isolement des souches d’Actinobactéries Afin de pouvoir isoler des souches d’Actinobactéries méso-halophiles, nous avons utilisé le milieu ISP2 additionné de 10% de NaCl qui peut favoriser leur croissance. L’utilisation de milieu de culture contenant des agents sélectifs permet de favoriser la croissance des Actinobactéries qui est relativement lente par rapport aux autres microorganismes non mycéliens.

Toutefois, malgré l’emploi de la gentamycine et de l’amphotéricine B, nous avons noté la croissance de plusieurs types de colonies bactériennes autres que les actinobactéries et des mycètes. Toutes les colonies ont été examinées directement sous microscope aux grossissements 100 et 400 afin de pouvoir repérer celles qui corresponderaient aux Actinobactéries en utilisant un microscope inversé (OPTIKA).

Au total 8 souches d’Actinobactéries halophiles et halotolérantes ont été isolées à partir des deux échantillons de sol prélevés à partir des deux sebkhas ciblées dans notre travail.

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Résultats et discussion

4 souches à partir du sol de la sebkha d’El Goléa et 4 souches à partir du sol de la sebkha de Ain Salah.

Les isolats ont été codifiés de la manière suivante :

Sebkha El Goléa : HR1, HR2, HR2 ' et HR6.

Sebkha de Ain Salah : HR3, HR4, HR5 et HR7

Le faible nombre de souches isolées durant notre étude peut être expliqué par l’emploi de conditions de culture particulières : ajoût d’une concentration élevée en NaCl. Addou et al. (2012 ; 2014 ; 2015), utilisant des conditions relativement similaires n’ont pu isoler que 9 souches bactériennes dont trois se sont révélées être de nouveaux taxons.

La plupart des Actinobactéries sont des microorganismes saprophytes qui passent la plupart de leurs cycles de vie en tant que spores semidormantes, en particulier dans des conditions ou les nutriments sont limités (Mayfield, 1972) . Cependant, certains membres de ce phylum se sont adaptés à une gamme d'environnements écologiques particuliers comme les sebkhas. En effet, ils ne sont pas présents uniquement dans des environnements « normaux ». Ils sont plus abondants dans les sols, en particulier dans les sols alcalins et les sols riches en matière organique, où ils constituent une partie importante de la population microbienne. Les souches isolées dans ce travail ont fait l’objet d’une identification et d’un criblage de production des molécules antibactériennes et antifongiques.

III. Etude taxonomique des isolats : III.1 Etude morphologique :

III.1.1 Caractéristiques macromorphologique :

Les caractères macromorphologiques présentés par les huit souches isolées ont été étudiés sur différents milieux. Les résultats figurent dans le tableau 12.

79

Résultats et discussion

La majorité des souches isolées se développent bien sur les milieux ISP préconisés pour l’étude des caractères morphologiques à l’exception des souches HR3 et HR7 qui ne se développent pas sur ISP5 et ISP7 respectivement.

En nous basant sur la taille et la croissance des colonies, nous avons divisé les isolats en 3 groupes : Le premier est représenté par les souches HR1, HR2, HR2’ formant des colonies plates de grande taille (4-5mm) plates. Le deuxième est caractérisé par la formation de colonies de taille moyenne (2-3 mm). Il est représenté par les souches HR4, HR5, HR6 et HR7. Enfin la souche HR3 forme des colonies de très petite taille (1mm). La couleur des mycélia aérien et du substrat est généralement beige, blanc cassé ou crème pour la majorité des souches. Cette caractéristique représente les souches HR1, HR2, HR2 ', HR6 et HR7 qui forment de grandes ou moyennes colonies et n’adhèrent pas au milieu et facilement détachables du milieu avec la pipette Pasteur. Ce caractère est typique chez les Actinobactéries nocardioformes.

La souche HR4 présente des colonies bien incrustées dans le milieu gélosé et nécessitent l’utilisation d’une aiguille stérile pour leurs prélèvements dont le mycélium se fragmente rapidement.

La souche HR5 présente un mycélium aérien de couleur blanc neige avec un mycélium du substrat de couleur jaune. Les colonies sont bombées ancrées dans le milieu de culture.

80

Résultats et discussion

Tableau 12 : Caractéristiques morphoculturales des souches isolées sur les milieux ISP.

ISP1 ISP2 ISP4 ISP5 ISP7

M.A M.S M.A M.S M.A M.S M.A M.S M.A M.S

Blanc Blanc HR1 Blanc Blanc Beige Blanc Blanc Blanc Crème cassé Beige cassé

Marron HR2 Blanc crème Beige Marron Jaune Gris Crème Jaune Beige clair

HR2 ' Blanc Beige Blanc Beige Blanc Beige Blanc Beige Beige Beige

Blanc HR3 Crème Blanc Beige Blanc Blanc Beige Crème Blanc Blanc cassé Marron Beige Beige Marron Blanc- Beige- Beige HR4 Gris Blanc Blanc clair foncé fonce foncé beige marron gris

Beige Beige Blanc Blanc Blanc Beige HR5 Jaune Blanc Pas de croissance clair clair neige cassé cassé jaunâtre Beige HR6 Pas de croissance Blanc Jaune Blanc Beige Blanc Pas de croissance foncé Beige- Jaune Blanc Blanc Blanc Beige HR7 Jaune Blanc jaune Pas de croissance clair grisâtre cassé cassé foncé clair MA : mycélium aérien, MS : mycélium du substrat

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Résultats et discussion

(A) (B)

(C) (D)

(E)

Figure 15 : Aspect macroscopique de quelques souches isolées. (A) : HR1, (B) : HR2, (C) : HR4, (D) : HR3 et (E) : HR5.

82

Résultats et discussion

III.1.2 Caractéristiques micromorphologiques : L’observation des caractères microscopiques a été menée en utilisant la technique de culture sur lamelle et par observation des colonies directement sous microscope photonique. Sur cette base nous pouvons regrouper nos souches en trois groupes distincts :

Le premier comporte les cinq souches suivantes : HR1, HR2, HR4, HR5, HR6 et HR7. Elles sont caractérisées par un mycélium du substrat bien développé sur le milieu ISP2 additionné avec 10% de NaCl, fragmenté, ne portant pas de spores et par un mycélium aérien qui se fragmente en donnant de courtes ou de longues chaînes de spores de forme ovale.

Le deuxième est représenté par la souche HR2’, laquelle est caractérisée par des filaments fins portant à leurs extrémités une spore ou monospore sur le mycélium aérien.

La souche HR3 produit un mycélium du substrat ramifié et fragmenté, le mycélium aérien est bien développé sur le milieu ISP2, il est ramifié et porte de courtes chaînes de spores.

a b

c d

Figure 16: Aspects microscopiques de quelques isolats. (a) : HR4, (b) : HR2, (c) :HR2 ' et (d):HR3 obtenus sous microscope photonique Gx40.

83

Résultats et discussion

III.2 Caractéristiques biochimiques et physiologiques

III.2.1 Détermination de l’optimum de salinité pour la croissance : Afin de déterminer l’optimum de salinité des huit souches, leur croissance a été testée sur le milieu ISP2 solide additionné de différentes teneurs en NaCl. L’incubation a été réalisée à 30°C pendant 14 jours. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 13.

Tableau 13 : Détermination de l’optimum de salinité des souches isolées.

0% 5% 10% 15% 20% 25% HR1 + ++ +++ - - - HR2 + +++ +++ - - - HR2 ' - + ++ + + - HR3 - + ++ + - - HR4 + + + + + - HR5 + ++ ++ - - - HR6 + + ++ + - - HR7 + + + - - -

On observe que outes les souches se développent en absence de sel à l’exception de HR2’ et HR3.

En présence d’une concentration de 5% à 10% de NaCl : toutes les souches se développent de manière optimale à une concentration située autour de 10%. Au-delà de cette concentration (15 et 25%), la croissance de certaines souches est plus faible (15-20%) alors qu’aucune croissance n’est observée à 25% de NaCl.

En reprenant la classification de Kushner (1978), nous pouvons donc classer les souches HR1, HR2, HR4, HR5, HR6 et HR7 comme souches halotolérantes alors que les souches HR2 ' et HR3 sont des souches halophiles modérées.

Il est probable aussi que le choix d’utiliser dès le départ cette concentration (10%) ait favorisé la croissance de souches présentant un optimum à 10% de NaCl.

Pour rappel un microorganisme halophile est un microorganisme qui exige une concentration minimale de sel de 0,2 M pour pouvoir se développer. L’ halotolérance n’exige pas la présence de sel dans le milieu de culture mais peut tolérer sa présence même à des quantités relativement importantes (Oren, 2002). Aussi, plusieurs études ont montré que les sols salins abritaient principalement des microorganismes halotolérants plutôt que des halophiles, 84

Résultats et discussion reflétant probablement une adaptation à des épisodes périodiques de dilution relativement élevée (Quesada et al ., 1982 ; 1983 ; Hacène et al. , 2004) .

La stratégie d'adaptation à la salinité des comprend des tolérances supplémentaires à l'environnement salin en synthétisant par accumulation une quantité élevée de solutés compatibles (Roberts, 2005) qui empêchent la dessiccation par osmorégulation. Aussi, les microorganismes halophiles possèdent également des pompes antiport de Na + / H + pour expulser l’excès en sel de l'intérieur de la cellule.

III.2.2 Détermination du pH optimal de croissance : Afin d’évaluer l’optimum de pH des souches, leur croissance a été testée sur le milieu ISP2 solide additionné avec 10% de NaCl et ajusté à différents pH allant du pH acide passant par le neutre puis l’alcalin (tableau 14). L’incubation a eu lieu à 30°C pendant 14 jours. Tableau 14 : Croissance des souches isolées à différents pH .

pH 5 6 7 8 9 10 11 Souches

HR1 - + ++ ++ + + - HR2 - ++ +++ ++ + + - HR2 ' - - ++ + - - - HR3 - - +++ +++ ++ + - HR4 + + ++ + + - - HR5 - + ++ + + - - HR6 - + ++ ++ - - - HR7 + ++ ++ ++ + + -

D’après les résultats obtenus, nous pouvons constater que toutes les souches se développent à des pH situés entre 7 et 9. Au-delà de cet intervalle, c'est-à-dire aux pH 5, 6, 10 et 11 nous remarquons que la croissance de tous les isolats est inhibée à pH 11 alors que seules les souches HR4 et HR7 sont capables de se développer à pH 5. Nous pouvons donc dire que les souches sont neutrophiles ou légèrement alcalophiles.

La plupart des Actinobactéries telluriques croissent sur des milieux à pH neutre. Ils se développent mieux à un pH compris entre 6 et 9, avec une croissance maximale autour de la neutralité. Cependant, quelques souches ont été isolées à partir de sols acides (pH 3,5) ou alcalins (pH 11) (Kim, 2003).

85

Résultats et discussion

Il a été constaté que toutes les souches halotolérantes isolées de par le monde (qui étaient capables de se développer en présence de 5% de NaCl), contrairement aux souches non halophiles, avaient pu se développer sur des milieux ajustés à pH 10, alors que les souches non halophiles ne possèdaient pas une telle capacité (Mohammadipanah, 2016)

Aussi, les Actinobactéries acidophiles et alcalophiles ont acquis des pompes à protons pour réguler les concentrations des H + à l'intérieur et à l'extérieur de la cellule pour maintenir le pH physiologique à l'intérieur (Kumar et al., 2011) . Les alcalophiles contiennent les polymères de paroi cellulaire à charge négative qui stabilisent la membrane cellulaire en réduisant la densité de charge à la surface cellulaire (Wiegel et Kevbrin, 2004).

III.2.3 Détermination de la température optimale de croissance : Afin de déterminer la température optimale de croissance, les souches ont été cultivées sur le milieu ISP2 solide additionné avec 10% en NaCl et incubées à différentes températures. Le tableau suivant résume les résultats obtenus.

Tableau 15: Croissance des souches isolées à différentes températures. T° 4°C 30°C 37°C 40°C 55°C Souches HR1 - + + + - HR2 - + ++ + + HR2 ' - +++ ++ - - HR3 - + +++ ++ - HR4 - ++ +++ + - HR5 - + + + - HR6 - + ++ ++ - HR7 - + + + -

On note que toutes les souches se développent entre 30 et 40°C. Au-delà de cet intervalle, leur croissance est inhibée à + 4°C, et seule la souche HR2 est capable de croitre à 55°C. Comme d'autres bactéries du sol, les Actinobactéries sont principalement mésophiles, avec une croissance optimale à des températures comprises entre 25 et 30 ° C (Edwards, 1993) . Cependant, des Actinobactéries thermophiles peuvent se développer à des températures allant de 50 à 80 ° C (Tortora et al., 2007) .

86

Résultats et discussion

III.2.4 Utilisation des sucres comme seule source de carbone :

Tableau 16: Utilisation des sources de Carbone par les souches isolées.

Sources de carbone Glucose Saccharose Cellulose Lactose Xylose

Souches HR1 + + + + + HR2 + + + + + HR2 ' + - - - - HR3 + + + + + HR4 + + + + + HR5 + + + + + HR6 + + + + + HR7 + + + + +

Toutes les sources de carbone testées sont utilisées comme seule source de carbone sur le milieu ISP9 solide additionné de 10% de NaCl par les souches d’Actinobactéries faisant l’objet de cette étude à l’exception de la souche HR2’ qui n’utilise que le glucose. Nous pouvons déduire qu’elles possèdent les enzymes hydrolytiques de ces sources de carbone.

III.2.5 Recherche des activités enzymatiques :

Tableau 17: Activités enzymatiques des souches isolées.

Tests Nitrate Catalase Amylase Caséinase Gélatinase Souches réductase HR1 + + + + - HR2 + + + + - HR2' + + - + - HR3 + - - + + HR4 + - - - + HR5 + + - - - HR6 + + - - - HR7 + + - - -

Selon les résultats obtenus, nous pouvons noter que toutes les souches possèdent la catalase alors que la présence des autres activités enzymatiques n’est pas observée pour tous les isolats.

87

Résultats et discussion

III.2.6 Résultats des galeries API 20E : Le tableau ci- après représente les résultats des différents tests de la galerie Api 20E et montre que les souches se caractérisent par la dégradation, la production ou l’utilisation de plusieurs substrats. Tableau 18 : Résultats de la galerie API20E.

Souches HR1 HR2 HR2 ' HR3 HR4 HR5 HR6 HR7

Tests ONPG ------ADH - + - + - - - - LDC - - - - + - - - ODC ------+ + CIT ------

H2S ------Urée + - - - - - + - TDA ------INDOL - - - - + - - - VP - - - - GLU - + - - + - - - MAN + + - - + - - - INO + + + - + - - - SOR - + - - + - - - RHA - + + - - - - - SAC - - + + - - - - MEL ------AMY + + - + - - - - ARA ------

III.3 Etude moléculaire :

Après caractérisation morphologique, physiologique et biochimique ; les souches isolées ont été identifiées par le séquençage du gène codant pour l’ARN ribosomal 16S. Les ARN ribosomaux sont les marqueurs de référence pour l’identification et la classification des souches bactériennes (De Long et al ., 1989) . Ils présentent de nombreux avantages : universalité, forte conservation, grande taille - environ 1 500 nucléotides. Les gènes codant l’ARNr16S sont aisés à séquencer et leur séquence est suffisamment informative pour établir les liens de parenté entre les espèces bactériennes à des fins taxonomiques. L’étude moléculaire a été réalisée sur les huit souches d’Actinobactéries faisant l’objet de cette étude. La Figure 18 montre les bandes de l’ADNr 16S des huit isolats après électrophorèse sur gel d’agarose.

88

Résultats et discussion

MP 1 2 3 4 5 6 7 8

(+) 1500 pb

Figure 17 : Gel d’électrophorèse de l’amplification de l’ADNr16S des souches isolées. 1 :HR1, 2 :HR2, 3 :HR2', 4 :HR3, 5 :HR4, 6 :HR5, 7 :HR6 et 8 :HR7.MP : marqueur de poids moléculaire (+) : Témoin 16S positif.

Le séquençage de l’ADN r16S et l’alignement et la comparaison des séquences a permis de rattacher les isolats aux genres et familles du phylum des Actinobacteria.

Les souches HR1 HR2 HR4 HR5 HR6 et HR7 appartiennent au genre Nocardiopsis. Les isolats sont phylogénétiquement proches entre eux (Figure 18). L’isolat HR1 (1263 pb) présente un taux de similarité de 99,37% avec l’espèce N.lucentensis, l’isolat HR2 (1261 pb) est rattaché à l’espèce N.halotolerans (Al-Zarban et al., 2005) avec un pourcentage de similarité de 99,86%. La souche HR4 est affiliée à l’espèce N.rosea (99,21%) (Li et al., 2006) et les isolats HR5(1261 pb), HR6(1259 pb) et HR7(1262 pb) sont proches phylogénétiquement de l’espèce N.mwathae isolée récemment (Akhwale et al., 2016) avec des taux de 98,73% pour HR6 et HR7 et 98,65% pour HR5. Le genre Nocardiopsis a été initialement décrit par Meyer en 1976. Sur la base des critères morphologiques et biochimiques, Actinomadura dassonvillei (Brocq-Rousseu) Lechevalier et Lechevalier et Nocardia dassonvillei (Brocq-Rousseu) Liegard et Landrieu ont été transférés du genre Actinomadura Lechevalier and Lechevalier au nouveau genre, Nocardiopsis (Nocardia - un genre de l'ordre Actinomycetales , opsis - apparence). Sur la base de la position phylogénétique, des caractéristiques morphologiques et des propriétés chimiotaxonomiques affichées par les espèces de Nocardiopsis , une nouvelle famille pour le genre appelée «Nocardiopsaceae » a été créée (Rainey et al., 1996) . Le genre ' Nocardiopsis ' était phylogénétiquement cohérent et représentait une lignée distincte dans l'ordre 'Actinomycetales '. 89

Résultats et discussion

Le genre Nocardiopsis comprend des espèces aérobies, Gram-positif et catalase-positive. Les colonies sur les milieux organiques sont grossièrement froissées ou pliées. Leurs colonies sont similaires aux membres des genres Nocardia et Actinomadura (Cook et Meyers, 2003). Les mycélia du substrat et aérien sont bien développés et ce dernier se fragmente en donnant des spores. Les espèces de Nocardiopsis, comme la plupart des autres Actinobactéries, sont généralement associées aux sols. Plusieurs études ont montré que ces microorganismes sont présents avec une importante incidence dans les lieux terrestres avec d'autres Actinobactéries. Dans certains sols désertiques (Sahara algérien), les membres du genre Nocardiopsis se sont révélés prédominants. L’analyse de différents types d'échantillons de sol (solution saline, hypersaline, désert et alcalin) a permis de décrire plusieurs nouvelles espèces. La caractéristique la plus remarquable de ces isolats est leur exigence du NaCl pour la croissance ou d’une tolérance envers celui-ci (Hamedi et al., 2013). Cette confirmation conforte nos résultats car 6 isolats sur 8 que nous avons isolés et identifiés appartiennent au genre Nocardiopsis et sont tous caractérisés par leur halotolérance. Le développement du séquençage du gène codant l’ARNr16S a conduit à la détermination d’un seuil de 98,65% pour définir l’espèce bactérienne sur la base de la similarité de séquences géniques alors qu’il était auparavant fixé à 97%. Il est actuellement admis qu’en dessous de 98,65 % d’homologie, deux souches ne peuvent appartenir à la même espèce (Kim et al., 2014).

90

Résultats et discussion

94 HR-6 100 HR-7 99 HR-5

81 Nocardiopsis mwathae (KF976731.1) Nocardiopsis gilva strain YIM 90087 (NR 043029.1)

89 Nocardiopsis rosea (NR 043030.1) 55 98 HR-4

94 Nocardiopsis halophila (AF195411.1) Nocardiopsis chromatogenes (KY427812.1) 67 52 Nocardiopsis compostus (AF360734.1) 79 Nocardiopsis potens (NR 116914.1) Nocardiopsis trehalosi (NR 024958.1)

98 Nocardiopsis lucentensis (JF966688.1) 27 HR-1 100 Nocardiopsis halotolerans (NR 112744.1) 100 HR-2 Nocardiopsis arabia (NR 044080.1) Actinopolyspora halophila (KU713080.1)

0.02

Figure 18 : Arbre phylogénétique basé sur l’analyse de gène codant l’ARNr 16S mettant en évidence les résultats de l’identification phylogénétique des 6 souches de Nocardiopsis . L’enracinement a été réalisé en utilisant la séquence ribosomale d’ Actinopolyspora halophila (KU13080.1)

91

Résultats et discussion

Les résultats préliminaires de l’identification moléculaire basée sur les séquences de l’ADNr16S, montrent que les isolats HR1, HR2, HR4, HR5, HR6 et HR7 partagent avec les plus proches parents phylogénétiques une homologie supérieure ou égale au seuil de 98,65 % fixé pour la définition de l’espèce. Bien que ces données suggèrent une étroite parenté, nous ne pouvons pas conclure sur l’identité des souches isolées. Il est probable qu’elles n’appartiennent pas à la même espèce que leurs plus proches parents phylogénétiques. Il est vrai que les techniques moléculaires de séquençage de l’ADNr 16S sont des outils fiables pour établir les relations évolutionnaires entre les espèces et leur identification, cependant, les évidents avantages de ces techniques ne doivent pas en masquer les limites. Il est admis que le gène codant pour l’ARNr 16S n’est pas suffisamment discriminant au-delà d’une homologie de 98,65 %, et des souches présentant des similarités étroites peuvent appartenir à des espèces différentes. A titre d’exemple Nocardiopsis alba et Nocardiopsis . prasina deux espèces distinctes du genre Nocardiopsis partagent 99,2 % de similarité de la séquence de l’ADN r 16S aussi des taux de similarité de 99,8% entre Nocardiopsis . dassonvillei et Nocardiopsis synnemataformans . (Al Zarban et al ., 2002) et de 99,2% entre N. valliformis et N. exhalans (Yang et al., 2008) ont permis de décrire de nouvelles espèces du genre Nocardiopsis .

Selon les pourcentages de similarité et selon l’arbre phylogénétique (Figure 18), nos souches qui appartiennent au genre Nocardiopsis peuvent être regroupées en deux clusters :

Le premier contiendrait les souches HR1 et HR2. L’isolat HR1 présente des pourcentages de similarité de la séquence de l’ARNr 16S de 99,37% avec N.lucentensis , 98,89% avec N.alba et N.flavescens et 98,65% avec N.aegyptia .

La souche HR2 a un degré de similitude de 99,68% avec N.halotolerans, 98,66% avec N.dassonvillei subsp albirubida et 98,52% avec N.synnematoformans.

Le deuxième comporterait les souches HR4, HR5, HR6 et HR7.

La séquence de l’ARNr16S de la souche HR4 (1239pb) (KC511627) a présenté des pourcentages de similarité de 99,21%, 98,72% et de 98,40% avec N.rosea , N.gilva et N.rhodophea respectivement. Toutefois l’isolat HR4 est dans le même clade que N.rosea et N.gilva et positionné sur une ligne distincte (figure 18) . Aussi, en reprenant les résultats des caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques (Tableau 20) ; on remarque que la souche HR4 se distingue des espèces les plus proches notamment par la couleur du mycélium aérien et du substrat. La couleur du mycélium aérien de la souche HR4 sur le

92

Résultats et discussion milieu ISP 2 est marron gris alors que celui de N.rosea est rose pâle et celui de N.gilva est jaune pale. Aussi, le mycélium du substrat est de couleur marron foncé pour HR4, rose clair pour N.rosea et jaune brillant pour N.gilva . D’autres différences concernent les caractères biochimiques telles que la liquéfaction de la gélatine, la réduction des nitrates et l’utilisation du mannose et du fructose.

Il est à signaler aussi que les espèces N.rosea, N.gilva, N.rhodophea ainsi que N.chromatogenes et N.baichengensis ont été décrites par Li et al. (2006). Elles ont été isolées à partir de sol hypersalin de Chine. La particularité de ces cinq espèces est leur proximité phylogénétique (95,9%-98,7%). En effet, elles présentent des pourcentages allant de 96,1% à 99,9% avec N.halophila . La confirmation de l’appartenance à de nouvelles espèces a été confirmée par les techniques des hybridations ADN-ADN.

Les souches HR5, HR6 et HR7 sont phylogénétiquement très proches entre elles puisqu’elles ont présenté des similarités avec la même espèce. Il s’agit de N.mwathae avec 98, 73% de similarité avec HR 6 et HR 7 et 98,65% avec l’isolat HR5. Les trois souches pourraient appartenir à la même espèce en l’occurrence N.mwathae mais certaines différences sont à noter entre nos souches du point de vue physiologique et production de biomolécules.

Les tableaux 19 et 20 montrent une comparaison de la morphologie et de la physiologie de nos isolats du genre Nocardiopsis avec les espèces les plus proches.

D’après les comparaisons, nous notons plusieurs différences entre nos souches et les espèces phylogénétiques les plus proches.

93

Résultats et discussion

Tableau 19: Comparaison de quelques caractères des souches HR1 et HR2 avec les espèces du genre Nocardiopsis.

1 : N. lucentensis, 2 : N. halotolerans ; 3 : N. dassonvillei subsp. dassonvillei ; 4 : N. dassonvillei subsp. Alborubida , 5 : N. alba 6 : N.synnemataformans

Caractères HR1 1* HR2 2* 3* 4* 5* 6*

Morphologie: Mycélium aérien + + + + + + + + Croissance à : 10 °C - + - + V - - - 45 °C - - + - - - - - 10% NaCl + + + + + + - + 15% NaCl - Nd - + Nd Nd - Nd 20% NaCl - Nd - - Nd Nd - Nd Croissance avec d-Glucose + + + + + + + + l-Arabinose Nd - Nd - + + - - Melibiose - - + + - - - Nd d-Xylose + - + - + + - + Adonitol Nd - Nd - - - - Nd Galactose Nd - Nd + + + - Nd + : positif, - : négatif, nd : non déterminé * de Al-Zarban et al.(2005)

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Résultats et discussion

Tableau 20 : Comparaison de HR4 et HR5 avec les espèces du genre Nocardiopsis les plus proches.

Characteristics 1 N.sp HR4 2 N.rosea* 3 N.gilva* 4N.sp HR5 5N.mwathae* Pigmentation des colonies sur ISP2 Marron grisâtre Rose pale Jaune pale Blanche Blanche Intervalle de température de croissance 25-40 20-60 10-40°C 25-45°C (°C) 30-40°C Optimum de température 30-37 37-40 28-30 35-37°C 30-35°C Tolérance de NaCl pour croissance (%) 0-20 0-18 0-18 0-10% 1-9% Optimum de NaCl (%) 5-10 5-8 5-8 5-10 6-9 Hydrolyse de l'amidon - - - - -

Production de H 2S - - - - - Réduction des Nitrates - + + + - Liquéfaction de la gélatine + - - - - Production de mélanine - - - - - Utilisation des sources de Carbone Fructose - + + Nd nd Galactose - - + Nd + Inositol + - + - nd Maltose + + - Nd nd Mannose + - - - nd Rhamnose - + - - nd Ribose + + - Nd nd Sucrose + + + + nd Xylose + - + + nd + : positif, - : négatif, nd : non déterminé * : de Akhwale et al., (2016)

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Résultats et discussion

La souche HR2' (1236pb) a été rattachée au genre Saccharomonospora et présente 99,32% de similitude avec l’espèce Saccharomonospora halophila et 98,18% avec Saccharomonospora paurometabolica (Figure 19).

Au sein de la famille des Pseudonocardiaceae , le genre Saccharomonospora représente une composante mineure dans l'environnement, vu le faible nombre d'isolats affiliés à ce genre et obtenus avec les méthodes traditionnelles d'isolement, par rapport à d'autres taxons (Embley, 1992). Les Saccharomonospora ont été décrits pour la première fois concernant des souches d’Actinobactéries thermophiles produisant un mycélium aérien ayant une couleur gris vert portant une monospore. (Nonomura et al. , 1971). Le genre est représenté actuellement par 12 espèces. Il est intéressant de noter que plusieurs différences sont à considérer entre notre isolat HR2’ et la souche la plus proche S.halophila (Tableau 21).

A la lumière de ces informations, il apparait, que les isolats HR1, HR2, HR2’, HR4, HR5, HR6 et HR7 doivent être soumis à une étude moléculaire plus approfondie par les techniques d’hybridation ADN/ADN afin d’élucider leur affiliation taxonomique exacte. Stackebrandt et Goebel (1994) ont recommandé que si deux souches partageaient des similitudes de gènes d'ARNr 16S au seuil de 97% ou moins, il n'était pas nécessaire d'entreprendre des expériences d’hybridation ADN-ADN pour prouver qu'elles appartenaient à la même espèce. Ce seuil a été revu à la hausse à 98,7-99,0%. En effet, Meier-Kolthoff et al. (2013) ont conclu qu'un seuil égal ou inférieur à 99,0% était un point critique pour reconnaître des paires apparentées de souches d'Actinobactéries appartenant à différentes espèces génomiques.

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Résultats et discussion

Figure 19 : Arbre phylogénétique basé sur l’analyse des séquences de l’ADNr 16S montrant la relation phylogénétique de la souche HR2' avec les espèces les plus proches.

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Résultats et discussion

Tableau 21 : Comparaison des caractères morphologiques et biochimiques de la souche HR2’ ( Saccharomonospora sp ) avec d’autres espèces du genre Saccharomonospora . *

1, S. halophila ; 2, S. paurometabolica 3 S. azurea ; 4 S. cyanea ; 5 S. glauca; 6 S.viridis et 7 S. xinjiangensis .

Caractères HR2’ 1 2 3 4 5 6 7 Blanc Bleu clair a Bleu clair Jaune- Couleur mycélium aérien Blanc Azure Vert Vert neige Verdâtre Vert blanc Lisse ou Ornementation des spores Lisse Verticillée Lisse verticillée Verticillée Verticillée lisse rugueuse Utilisation des sources de Carbone (1%) l-Arabinose nd + - - + + - Nd Galactose nd + - - Nd - Nd Glucose + + - + + + D Nd

Mannitol + + - - + + D + Mannose nd + - + + Nd - + Melibiose - + - + - Nd Nd Nd Rhamnose + + - - - - - + Xylose nd - - + + + - + Croissance en présence de NaCl (%) 0 - - - + + + + + 5 - - + + - - - - 7 - - + + - - - - 10 + + + - - - - - 20 + + + - - - - - 30 - + ------30 28–30 35-37 28–30 24–40 45–50 45–50 28–40 Optimum de température ( °C)

+ : positif, - : négatif, nd : non déterminé

* : de (Dastager, 2008)

98

Résultats et discussion

III.4 Description du nouveau taxon Les données de l’ARNr16S ont par ailleurs révélé que la souche HR3 (1527pb) (LN831299.1) partage une homologie avec les souches les plus proches décrites, inférieure au seuil des 98,65 %, fixé par les taxonomistes pour la définition d’une espèce. Ce résultat suggère que cette souche occuperait une position phylogénétique nouvelle. En effet, la souche HR3 présente une homologie de 94,59% avec Phytoactinopolyspora endophytica (Li et al., 2015) , 94, 52% avec Jiangella gansuensis (Song et al., 2005) et 94, 24% avec Haloactinopolyspora alkaliphila (Tang et al., 2011) . Les trois espèces les plus proches appartiennent à trois genres différents. Ce résultat indique donc que la souche HR3 occupe une position taxonomique nouvelle au sein de la famille Jiangellaceae . Cette famille a été créée en 2011 au sein du phylum Actinobacteria après avoir décrit le genre Jiangella (Song et al., 2005) . En effet, après sa description, le genre Jiangella était classé au sein de la famille Nocardioidaceae dans le sous-ordre Propionibacterineae actuellement reclassé en tant que l’ordre des Propionibacteriales (Bergey, 2012) . Suite à la description d’un deuxième nouveau genre Haloactinopolyspora (Tang et al., 2011) , les analyses phylogénétiques basées sur le séquençage de l’ARNr 16S de l’ordre Propionibacteriales ont révélé que les genres Jiangella et Haloactinopolyspora (phylogénétiquement proches) forment une branche distincte à la périphérie de la radiation d’évolution occupé par cet ordre. Des analyses phylogénétiques supplémentaires incluant d’autres représentants du phylum Actinobacteria , ont révélé que les genres Jiangella et Haloactinopolyspora ne pouvaient pas être classés au sein de l’ordre des Propionibacteriales ce qui a conduit à la création du sous-ordre Jiangellineae (Tang et al., 2011) actuellement devenu l’ordre des Jiangellales et la famille Jianjellaceae regroupe actuellement trois genres Jiangella , Halopactinopolyspora et Phytoactinopolyspora. A l’heure actuelle, Phytoactinopolyspora contient 2 espèces, Jiangella 5 espèces et Haloactinopolyspora 2 espèces. Les membres de cette famille sont des bactéries à Gram positif, aérobies, regroupant des halophiles et des non halophiles. Le GC% est situé entre 70- 72%. Comme nous l’avons signalé auparavant, la souche HR3 présente un taux de similarité de 94, 59%. Ce taux indique clairement que la souche HR3 représenterait une nouvelle espèce dans un nouveau genre au sein de la famille Jiangellaceae . En effet, selon Yarza et al. (2014) un taux de similarité de séquence du gène codant pour l’ARNr 16S de 94,5 % est le seuil limite établi pour la description d’un nouveau genre. En plus, selon l’arbre phylogénétique montrant la position de la souche HR3 parmi les souches les plus proches, il apparait

99

Résultats et discussion clairement que notre isolat est aligné sur une branche distincte dans l’arbre phylogénétique (Figure 20).

99 Jiangella alba (NR 116547.1) 99 Jiangella muralis (NR 117533.1) 98 Jiangella gansuensis (NR 043041.1) Haloactinopolyspora alkaliphila (NR 133755.1) 81 99 Haloactinopolyspora alba (NR 116875.1)

100 Phytoactinopolyspora alkaliphila (NR 149231.1) 94 Phytoactinopolyspora endophytica (NR 136806.1) HR-3

100 Kribbella antibiotica (NR 029048.1) Kribbella solani (NR 025734.1)

65 Nocardioides nitrophenolicus (AF005024.1) 90 Nocardioides ginsengisegetis (GQ339901.1) 88 Aeromicrobium tamlense (DQ411541.1)

100 Aeromicrobium alkaliterrae (AY822044.1) 99 Aeromicrobium fastidiosum (NR 119352.1) Streptomyces sparsogenes (NR 114812.1)

0.01

Figure 20 : Arbre phylogénétique basé sur le gène codant l’ARNr 16S mettant en évidence les résultats de l’identification phylogénétique de la souche. L’enracinement a été réalisé en utilisant la séquence ribosomale de Streptomyces sparsogenes (NR 114812.1).

100

Résultats et discussion

A partir de ces résultats et pour la validation de la description d’un nouveau taxon, des caractérisations phénotypiques et génétiques supplémentaires ont été effectuées pour la souche HR3. Il s’agit des critères micromorphologiques en réalisant la microscopie électronique ; des critères chimiotaxonomiques qui englobent la détermination de(s) : l’isomère de l’acide diaminopimélique et des sucres pariétaux, phospholipides membranaires ; des critères physiologiques par la galerie APIZYM et des critères moléculaires par la détermination du contenu en GC du génome de la souche HR3. Les résultats obtenus concernant les critères microscopiques (Figure 21), chimiotaxonomiques (Figure 23) et moléculaires sont représentés dans le tableau 22 qui est en même temps un tableau comparatif entre les caractères phénotypiques et moléculaires de la souche HR3 avec les espèces des genres les plus proches. En effet, d’importantes dissemblances distinguent la souche HR3 des espèces apparentées ; notamment par son caractère halophile, ses sucres pariétaux, ses lipides membranaires et par son GC% (67,9) qui est inférieur aux GC% des espèces les plus proches. Pour les résultats de la galerie APIZYM, nous constatons que la souche HR3 présente une activité enzymatique importante puisque sur 19 enzymes recherchées, 14 tests se sont révélés positifs (figure 22). Dans l’étude effectuée par Addou et al. (2012 ; 2015) , deux souches isolées à partir du Chott Melghir de Biskra ont été décrites comme deux nouveaux taxons appartenant à deux nouveaux genres ( Melghirimyces algeriensis et Melghiribacillus algeriensis ). En effet, ces derniers ont présenté des taux de similarité de la séquence de l’ARNr 16S avec les espèces apparentées de 95,38% et 95,4% respectivement.

101

Résultats et discussion

Figure 21 : Micrographie des chaines de spores de la souche HR3 cultivée sur ISP2 additionné avec 10 % de NaCl et incubée pendant 14 jours à 30°C.

Figure 22 : Résultat de la galerie APIZYM de la souche HR3.

102

Résultats et discussion

HR

L-DAP L-

D-DAP

Rham HR3 xyl Arab Man Glu Glu

Gal

Figure 23 : Résultats de l’analyse de l’acide diaminopimélique ainsi que des sucres pariétaux de la souche HR3.

103

Résultats et discussion

Tableau 22 : Comparaison de la souche HR3 avec les genres et les espèces les plus proches. 1 : Phytoactinopolyspora endophytica ; 2 : Jiangella guanensis ; 3 : Haloactinopolyspora alkaliphila ; 4 : Haloactinopolyspora alba

Caractéristiques HR3 1 2 3 4 Mycélium aérien + + - + + Spores Très courtes Longues et courtes - Courtes chaînes Longues chaînes chaînes chaînes Intervalle de température 25 -40°C 15 -35°C 10 -45°C 15 -40°C 15 -45°C Croissance à 0% NaCl - + + + - Croissanec à 12,5% NaCl + - - + + Optimum NaCl 8-10% 2-3% - 2.5 -5.0% 10 -15% Intervalle de pH 7-10 5-9 5-10 06 -11 5-9 Optimum de pH 7-8 7-8 7-8 09 -10 7-8

Réduction des nitrates - + - - - Hydrolyse de l'amidon - - - + - Utilisation des sources de carbone Fructose Nd - - + + Galactose Nd + + + - Glucose - + - - - Inositol - Nd - - + Lactose + + - - + Maltose Nd - - - - Mannitol - + - - - Raffinose Nd + - - - Sorbitol - - - - + Saccharose + + + - + Tréhalose Nd Nd + - +

104

Résultats et discussion

Suite

Sucres de paroi Glu Glu, Gal, Man, Rha Rib, Glu Gal, GlucN, Man GlcN, Man, Glu, Glu, Rha, un sucre Ara, Gal, Rha, un non connu sucre non connu Lip des polaires DPG, PI, PG DPG, PG, PGLs, DPG, PG, PI, PIMs DPG, PG, PI, PIMs, DPG, PGL, PL, PI, GPL, PLs PIMs, PLs PLs, Uls, GL PIMs, GL GC% 67.9 70,4 70 70.6 70.5 + : postif, - : négatif, nd : non déterminé, Ara : arabinose, Gal : galactose, GlcN : glucosamine, Glu : glucose, Man : Mannose, Rha : rhamnose, Rib : ribose, DPG : diphosphatidylglycérol, PC : phosphatidylcholine, PG : phosphatidylglycérol, GL : glycolipide non connu, PGL : phosphoglycolipide non connu, PI : phosphatidylinositol, PIM : phosphotadylinositol mannoside, PL : phospholipide non connu, UL : lipide polaire non connu. * : selon Li et al . (2015)

105

Résultats et discussion

IV. Criblage des activités antimicrobiennes IV.1 Activité antibactérienne : L’activité antibactérienne a été recherchée en testant nos 8 souches contre des bactéries cibles à Gram positif et Gram négatif (tableau 23).

Tableau 23: Activité antibactérienne des souches isolées.

Souches HR1 HR2 HR2 ' HR3 HR4 HR5 HR6 HR7 Bactéries cibles Escherichia coli ------ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ------ATCC 27853 Staphylococcus aureus - - - - 12mm - - 10mm ATCC 25923 Staphylococcus aureus - - - 13mm 11mm - - 10mm MRSA ATCC 43300 Enterococcus faecalis - - - - 13mm - - - ATCC 29212 Micrococcus luteus ATCC - - - - 19mm - - 17mm 4698

- : pas d’activité, + : activité faible, ++ : activité moyenne, +++ : activité importante

Parmi les 8 souches isolées testées, cinq d’entre elles (HR1, HR2, HR2’, HR5 et HR6) ne présentent aucune activité sur toutes les bactéries-cibles testées. En revanche, les 3 autres souches (HR3, HR4 et HR7), ont une action dirigée sur les bactéries à Gram positif seulement. La souche HR4 est celle qui a le plus large spectre. Par contre l’isolat HR7 inhibe la croissance des 2 staphylocoques testés alors que la souche HR3 apparentée à un nouveau taxon est active uniquement sur S.aureus ATCC 43300 résistant à la méthicilline ; ce qui en fait une souche de choix recherchée pour cette activité ciblée sur un germe cible multirésistant. L’étude de cette activité particulière est programmée dans le futur.

IV.2 Activité antifongique :

L’activité antifongique des souches isolées a été faite sur des levures et des champignons filamenteux (Tableau 24).

Parmi les 8 souches testées, nous constatons que la moitié d’entre elles ne présentent aucune action antifongique, les 4 autres présentent une activité variable sur les germes-cibles utilisés.

106

Résultats et discussion

La souche HR4 est active contre 4 germes parmi les 5 testés, la souche HR5 contre 3 et les souches HR6 et HR7 contre 2 seulement.

Il y a lieu de noter que le champignon Colletotrichum sp est le germe-cible le plus résistant parmi les champignons testés puisqu’aucune activité n’a été observée contre ce dernier.

Tableau 24 : Activités antifongiques des souches isolées.

Souches

HR1 HR2 HR2 ' HR3 HR4 HR5 HR6 HR7 Champignons cibles

Saccharomyces 10mm - - - - 13mm 11mm - cerevisiae

Candida albicans - - - - 12mm - - - ATCC 10231

Fusarium - - - - + ++ ++ - oxysporum DSM 62297 T

Monilia sp - - - - + ++ ++ +

Colletotrichum ------sp

- : pas d’activité, + : activité faible, ++ : activité moyenne, +++ : activité importante

IV.3 Screening des gènes PKS et NRPS La recherche des gènes PKS et NRPS par une méthode moléculaire a mis en évidence que l’amplification des gènes NRPS et PKSI (1200-1400 pb, 700-800 pb) (Figure 25 a et b) par les amorces dégénérées a été obtenue pour 7 souches à l’exception de la souche HR3.

Cependant, l’amplification des gènes PKSII (600 pb) par le couple d’amorces KS α/KS β n’a

été obtenue qu’avec la souche HR4 (Figure 25 c).

Le screening moléculaire effectué sur nos souches pour la production de métabolites bioactifs confirme nos tests pour la recherche de l’activité antimicrobienne effectuée sur milieu solide par la technique des cylindres d’agar. Il est admis que les Actinobactéries sont considérées sur le plan économique et biotechnologique comme des procaryotes inestimables. Elles sont à

107

Résultats et discussion l’origine d’un très large éventail de produits bioactifs tels que les antibiotiques. Une large gamme de ces derniers est synthétisée par la voie des polykétides et peptides synthétases (Mets ӓ-Ketel ӓ et al., 1999 ; Ayuso-Sacido et Genilloud, 2005). Ces voies de biosynthèse élaborent des produits naturels ayant une diversité de structure et d’activité remarquables.

Toutefois, il y a lieu de signaler qu’une amplification positive pour les gènes PKS et NRPS a été obtenue avec les isolats HR1, HR2 et HR2’ alors que ces derniers n’ont montré aucune activité antimicrobienne vis-à-vis des germes-cibles. Ce résultat peut être expliqué d’une part par le fait que les souches cibles sont naturellement résistantes et qu’il faudrait élargir le screening à d’autres germes. D’autre part, les gènes PKS et NRPS qui peuvent être amplifiés ne synthétisent pas obligatoirement des substances douées d’une activité antibiotique mais pourraient être impliqués dans des fonctions cellulaires telles que le métabolisme du fer ou le quorum sensing (Finking, 2004) ou encore que ces gènes sont présents dans le génome mais non fonctionnels. Enfin, la composition du milieu de culture et la salinité pourraient influencer directement la production des métabolites bioactifs.

On peut donc conclure d’après ces résultats que la présence d’une activité antimicrobienne sur milieu solide et l’amplification des gènes PKS-NRPS ne semblent pas avoir une corrélation directe. En effet, Sheng et al. (2009) ont également fait le même constat ; en relevant que plusieurs isolats n'avaient pas d'activité antimicrobienne, mais que les gènes PKS-NRPS avaient été amplifiés avec succès en utilisant les mêmes couples d’amorces. Néanmoins, le prescreening des isolats avec des amorces PCR ciblant des gènes codant pour la biosynthèse de composés bioactifs est une approche efficace pour la détection de métabolites secondaires nouveaux et utiles (Metsa-Ketela et al., 1999 ; Courtois, 2003 ; Ginolhac, 2004; Hornung, 2007).

108

Résultats et discussion

a b

c d

Figure 24: Quelques résultats des activités antimicrobiennes des souches isolées. (a) : Micrococcus luteus , (b) : Staphylococcus aureus ; (c) : Monilia sp ; (d) : Fusarium oxysporum

109

Résultats et discussion

a

PM HR1 HR2 HR2’ HR3 PM HR4 HR5 HR6 HR7

700-800 pb

b PM HR1 HR2 HR2’ HR3 PM HR4 HR5 HR6 HR7

1200-1400 pb

c

PM HR1 HR2 HR2’ HR4 HR5 HR6 HR7

600 pb

Figure 25 : Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR obtenus à partir de l’ADN isolé à partir des souches étudiées : (a) amplification sélective des fragments de 700-800 pb en utilisant la paire d’amorce A3F/A7R spécifiques pour les séquences d’adénylation des NRPS. (b) : amplification sélective des fragments de 1200-1400 pb en utilisant le couple d’amorce K1F/M6R spécifique pour des séquences kétosynthase et méthyl- malonyl-CoA transférase des PKSI. (c) : amplification sélective des fragments de 600 pb en utilisant le couple d’amorce KS α/KS β spécifique pour des séquences β-kétoacyl synthase KS α et β-kétoacyl synthase KS β des PKSII.

110

Résultats et discussion

IV.3.1 Clonage, séquençage et analyses des séquences des gènes NRPS et PKS de l’isolat HR4 : Les fragments issus de l’amplification des produits de PCR pour la recherche des gènes PKS et NRPS par l’utilisation d’amorces dégénérées ont été purifiés, clonés et séquencés uniquement pour l’isolat HR4 retenu car étant le plus actif et ayant amplifié les gènes NRPS, PKSI et PKSII.

Après avoir séquencé les fragments N4, PI4 et PII4, leurs séquences ont été analysées et comparées en utilisant le blastX. Ce dernier est un programme informatique qui compare et traduit des séquences nucléotidiques en séquences protéiques, et ainsi détermine la correspondance des séquences après comparaison avec celles disponibles dans les banques de données. Dans notre cas, il s’agirait des synthétases responsables de la synthèse de peptides (NRPS) et de polykétides (PKSI et PKSII).

Après avoir comparé les séquences avec la blastx, il en ressort des résultats que la séquence du produit :

N-4 correspond à une synthéthase NRPS ayant un pourcentage de similarité de 86% avec celle de Streptomyces sp et 79% avec celle de Microbispora sp YIM77549

PI-4 : correspond à une synthétase de type polykétide synthétase type I (PKSI) avec un pourcentage de similarité de 81% avec celle de Nocardiopsis halotolerans .

PII-4 : correspond à une synthétase de type polykétide synthétase de type II (PKSII), similaire à celle de Streptomyces sp OAct 713 avec un pourcentage de 91%.

Donc, cette analyse confirme que les produits que nous avons clonés et séquencés codent en effet des parties de gènes des synthétases attendues (Figure 26).

111

Résultats et discussion

(a)

(b)

(c)

Figure 26 : Résultats de l’analyse des séquences par le programme blatx. (a) : séquence N4, (b) : séquence PI4 et (c) : séquence PII4.

112

Résultats et discussion

IV.4 Etude des antibiotiques produits par la souche Nocardiopsis.sp HR4

IV.4.1 Etude de la croissance et de la production Les cinétiques de croissance et de production des antibiotiques de la souche HR4 en milieu ISP2 liquide additionné de 10% de NaCl sont illustrées dans la figure 27.

Les microorganismes-cibles utilisés sont Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Candida albicans ATCC 10 231 sur lesquels la souche HR4 est active.

Concernant la croissance, on remarque qu’elle débute par une phase d’accélération de J1 à J3 suivie d’une phase exponentielle de 48h (J4-J5), puis d’une phase stationnaire de 2jours (J7- J8). Après 8 jours d’incubation, une chute de la croissance est observée et correspond à une phase de déclin. La culture de la souche HR4 prend une légère couleur brune à la fin de la croissance.

Durant cette croissance, le pH varie peu et oscille entre 7 et 8.

L’activité antibactérienne (anti-S.aureus ) et antilevurienne (anti-Candida ) de cette souche est maximale au 8 ème jour de croissance ; ce qui correspond sur la cinétique de croissance à la fin de la phase stationnaire et le début de la phase de déclin (Figure 27).

Ce type de cinétique est typique au cas des métabolites secondaires. En général, la production des métabolites secondaires par les microorganismes a lieu durant les phases de ralentissement et stationnaire. Durant les phases de déclin, les cellules se lysent et libèrent les quantités d’antibiotiques non encore sécrétés

113

Résultats et discussion

Figure 27: Cinétiques de l’évolution de la croissance, du pH et des activités antimicrobiennes de la souche HR4, contre Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Carré plein) et Candida albicans ATCC 10231(cercle plein).

114

Résultats et discussion

IV.4.2 Localisation de l’activité antimicrobienne a)-Extraction et antibiographie

La souche HR4 a été cultivée sur milieu ISP2 liquide additionné de 10% de NaCl pendant 8 jours à une température de 30°C.

Après centrifugation, le filtrat de culture ainsi que le culot sont récupérés puis extrait par le n- butanol et le méthanol respectivement.

Les extraits obtenus sont concentrés à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif, puis récupérés dans 1 mL de méthanol pour tester leur activité par la méthode des disques de papier contre S.aureus ATCC 2923 et C.albicans ATCC 10231

Les résultats obtenus montrent que l’activité est présente au niveau de l’extrait butanolique seulement. Nous pouvons en déduire que l’activité antimicrobienne de la souche HR4 est extracellulaire. b)-Chromatographie sur couche mince de l’extrait butanolique de l’isolat HR4 :

Les chromatogrammes de l’extrait actif (CCM) obtenu ont été observés sous lumière UV afin de localiser les tâches.

Cette observation nous a permis de détecter 3 fractions différentes représentées par 3 taches (T1, T2 et T3) (spots), ce qui laisse suggérer que l’isolat HR4 élabore 3 produits différents ou plus. c)-Révélation microbiologique par bioautographie :

La révélation microbiologique du chromatogramme par bioautographie révèle d’une façon certaine les fractions responsables de l’activité antimicrobienne. La présence d’une activité de valeur Rf = 0,164 a été notée contre S.aureus ATCC 25923 et une autre activité de valeur Rf= 0,57 contre C.albicans ATCC 10231 (Figure 28).

115

Résultats et discussion

a

T1

T2

T3

b 1 b 2 Zone d’inhibition Zone d’inhibition T3

T 2

Figure 28 : Chromatogramme (a) et bioautographie (b) de l’extrait butanolique de la souche HR4. (b 1) Candida albicans et (b 2) Staphylococcus aureus.

116

Résultats et discussion

IV.5 Purification des antibiotiques produits par la souche HR4 :

La purification des antibiotiques a été réalisée à partir de 8 L de culture de l’isolat HR4 sur milieu ISP2 liquide additionné de 10% de NaCl et incubé à 30°C pendant 8 jours.

Après centrifugation, le surnageant de culture a été extrait avec un même volume du solvant acétate d’éthyle. L’extrait organique obtenu a été évaporé à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif. Nous avons obtenu alors 234 mg d’extrait brut. Ce dernier est utilisé pour les analyses ultérieures de purification et de caractérisations spectroscopiques

IV.5.1 Analyse et purification par HPLC des antibiotiques produits par la souche HR4 : Les fractions sont matérialisées sur le chromatogramme (Figure 29 et 30) par de nombreux pics numérotés jusqu’à 11 selon le temps de rétention (ex : la fraction 9 a un temps de rétention de 27,3 mn).

Le tableau 24 résume l’ensemble des fractions récoltées ainsi que leurs temps de rétention et leurs masses.

Tableau 25 : Masses et temps de rétention des différentes fractions récoltées .

HR4 -1 HR4 -2 HR4 -3 HR4 -4 HR4 -5 HR4 -6 HR4 -7 HR4 -8 HR4 -9 HR4 - HR4 - 10 11 Tr (mn) 7,6 16,5 10,25 20,5 23,3 24 25 27,3 28,2 30 5,75 Masse 0,9 0,6 2,2 1,2 4,5 1,1 6,8 3,8 2,1 2,1 2,3 (mg)

IV.5.2 Analyses spectroscopiques et spectrométriques des composés produits par la souche HR4: Au total 11 fractions ont été récupérées. Ces dernières ont été analysées par spectrométrie de masse haute résolution en mode positif et négatif et par spectrométrie de résonance magnétique nucléaire. Pour la fraction :

HR4-1 : la masse obtenue est trop faible pour une analyse en spectrométrie de masse haute résolution ce qui nécessite des séparations ultérieures afin d’augmenter la quantité pour les analyses spectroscopiques.

HR4-2 : une quantité de moins de 0,7 mg a été obtenue pour cette fraction qui est représentée par un pic très faible en HPLC préparative visible sur le chromatogramme absorbant

117

Résultats et discussion uniquement à 210 et 220 nm. Ceci implique qu’une quantité plus importante est nécessaire pour les analyses ultérieures.

HR4-3 : avec une masse de 2,2 mg, cette fraction est un mélange de composés visibles sur le chromatogramme ; donc une purification ultérieure est nécessaire pour les analyses en spectrométrie de masse et en résonance magnétique nucléaire.

HR4-4 : cette fraction a donné un spectre RMN du proton complexe et l’analyse par spectrométrie de masse haute résolution a révélé la présence de 3 à 4 produits en quantité comparable. Il y a lieu de purifier et de fractionner encore cette fraction.

HR4-5 : après analyse de cette fraction par RMN du proton, le spectre obtenu est assez complexe et l’analyse par SMHR a révélé la présence de deux produits.

HR4-6, HR4-7 et HR4-8 : les trois fractions ont présenté des spectres RMN du proton complexe ainsi que la présence d’un mélange de composés après analyse par SMHR. Ceci implique que ces fractions nécessitent d’être à leur tour purifiées et fractionnées dans le but d’une caractérisation des différents composés qu’elles contiennent. (Les résultats spectroscopiques des différentes fractions sont présentés en annexes 5).

HR4-9 : a été obtenue avec une masse de 2,1 mg, le spectre RMN du proton obtenu pour cette fraction est exploitable et l’analyse par SMHR a révélé un pic majoritaire à 1,58 mn. La fraction est pure et peut être caractérisée.

HR4-10 et HR4-11 : ont été obtenues avec des masses de 2,1 et 2,3 mg respectivement. Bien que les pics en HPLC préparative soient distincts pour les deux fractions et que la résolution soit bonne, leurs spectres RMN du proton sont identiques en tout point de vue et l’analyse par SMHR a montré un pic unique à 1,59 mn. Ceci peut être expliqué par le fait que les produits HR4-10 et HR4-11 présentent une configuration différente autour du noyau aromatique. Les deux fractions sont pures et comportent le même produit.

Sur la base de ces résultats, une caractérisation structurale complète a été menée pour les fractions HR4-9, HR4-10 et HR4-11. Elles ont été retenues à cause de leur pureté et de leur quantité suffisante pour mener les analyses ultérieures. Les autres fractions nécessitent d’être produites en plus grande quantité pour être exploitables mais d’autres étapes de purification sont nécessaires pour une caractérisation spectroscopique complète qui se fera ultérieurement.

L’ensemble de ces résultats montre la richesse en composés produits par cette souche.

118

Résultats et discussion

Figure 29 : Chromatogramme de l’HPLC analytique de l’extrait brut de la souche HR4 sur colonne PFP (gradient de H 2O –CH 3CN est représenté par la ligne rouge) le débit est de 1 mL minute.

119

Résultats et discussion

1 2

5

3 4

7 8

9 10 11 6

Figure 30 : Chromatogramme de l’HPLC préparative de l’extrait brut de la souche HR4 sur colonne PFP montrant les différentes fractions récoltées avec un gradient linéaire de H 2O-CH 3CN (80/20 à 0/1 en 25 mn)

suivi par un gradient isocratique de CH 3CN 100% durant 10 mn (débit de 21 ml/mn).

120

Résultats et discussion

IV.6 Analyses spectroscopiques du produit HR4-9 La molécule HR4-9 a été obtenue comme un composé huileux de couleur jaune. Cette molécule a montré un pic en spectrométrie de masse à haute résolution à 337, 1099 [M-H] -

(calculée pour C 20 H17 O5, 337,1099) correspondant à une formule chimique de C 20 H18O5.

Figure 31 : Spectre de masse du composé HR4-9.

IV.6.1 Détermination de la structure de l’antibiotique HR4-9 En nous basant sur les données de la spectrométrie de masse et l’analyse spectroscopique du proton et du carbone 13, la structure de la molécule HR4-9 a été déterminée comme étant le 7-deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O-methylrabelomycin. Ce même composé a été décrit par Fotso et al. (2008) à partir d’une culture de Streptomyces sp .

Figure 32 : Structure chimique du composé HR4-9.

121

Résultats et discussion

IV.7 Analyses spectroscopiques de l’antibiotique HR4-10 Le composé HR4-10 a été obtenu comme une huile de couleur jaune.

La formule chimique de C 20 H16 O5 a été déterminée par spectrométrie de masse à haute résolution (ElectroSprayIonisation) HRESI-MS qui a donné une masse ionisée [M+H] += 337,

1076 (calculée pour C 20 H17 O5) et correspondant à 13 insaturations.

Figure 33 : Spectre de masse du composé HR4-10.

IV.7.1 Détermination de la structure de HR4-10 En tenant compte des données de la spectrométrie de masse et l’analyse spectroscopique du proton et du carbone 13, la structure de la molécule HR4-10 a été déterminée comme étant le 6-deoxy-8-O-methylrabelomycin ( Shigihara et al ., 1988 ) aussi appelé 8-O- methyltetrangomycin ( Kesenheimer et Groth, 2006 )

Figure 34 : Structure chimique de l’antibiotique HR4-10.

122

Résultats et discussion

IV.7.2 Spectre RMN ( 1H et 13 C) Les spectres 1H et 13 C (tableau 26) montrent la présence de 16 protons et 20 carbones incluant deux carbonyles à δC 196,4 et 184,4 ppm contrairement aux trois carbonyles observés 1 13 sur le spectre carbone pour HR4-10 à δC 196,8 ; 184,3 et 184,4 ppm. Les corrélations H- C sur les spectres HSQC permettent de déterminer pour HR4-9 la présence d’un méthyle relié à un carbone ( δC 29,4 δH 1,47), d’un O-méthyl ( δC 53,8 δH 4,04), de deux méthylènes ( δC 54,1 et 43,9 δH 2,90 ; 3,10 ; 3,18 ; 3,90), d’une méthine O-substituée ( δC 61,4 δH 5,99) et de 5 méthines aromatiques ( δC 134,7 ; 130,2 ; 112,6 ; 127,9 et 118,0 δH 7,47 ; 7,87 ; 7,17 ; 7,49 ; et 7,77). Les spectres protons et carbones des composés HR4-9 et HR4-10 sont très semblables et la seule différence est observée concernant la présence d’un seul carbonyle pour HR4-10. Les corrélations 1H-1H and 13 C-1H en COSY et HMBC entre le proton H-6 à 7,87 ppm et le carbone C-7 à 61,4 ppm montrent la présence d’un groupement hydroxyle en position C-7 pour le composé HR4-9 contrairement à un carbonyle pour HR4-10.

Tableau 26: Données spectroscopiques de la RMN 1H des produits HR4-9 et HR4-10.

HR4 -10 HR4 -9 a b a b Position δC δH (J in Hz) δC δH (J in Hz) 1 196,8, C - 196.4, C -

2 54.1, CH 2 2.81 d (14.9) 54.1, CH 2 2.90 d (14.9) 2.92 d (14.9) 3.10 d (14.9) 3 72.8, C - 72.8, C -

3-CH 3 29.9, CH 3 1.32 s 29.4, CH 3 1.47 m

4 43.9, CH 2 2.99 s 43.9, CH 2 3.18 m 3.90 m 4a 146.4, C _ 146.3, C _ 5 134.6, CH 7.34 d (7.7) 134.7, CH 7.47 d (7.8) 6 129.2, CH 8.12 d (7.7) 130.2, CH 7.87 d (7.8) 6a 132.4, C - 141.4, C - 7 184.3, C - 61.4, CH 5.99 7a 121.0, C - 129.4 - 8 160.0, C - 157.0, C -

8-OCH 3 54.2 3.86 s 53.8 4.04 m 9 117.9, CH 7.12 d (7.7) 112.6, CH 7.17 d (7.8) 10 136.2, CH 7.53 dd (7.7) 127.9, CH 7.49 d (7.8) 11 120.4, CH 7.58 d (7.7) 118.0, CH 7.77 d (7.8) 11a 137.8, C - 132.5, C - 12 184.4, C - 184.4, C - 12a 135.2, C - 133.9, C - 12b 133.7, C 134.1, C

123

Résultats et discussion

Figure 35: Clé de corrélation 1H-1H COSY (trait gras), NOE (flèches simples) and 1H-13 C

HMBC (flèches pointillées).

Les deux composés majeurs isolés et purifiés par HPLC et sur la base des études spectroscopiques, les formules chimiques de C 20 H18 O5 et de C 20 H16 O5 ont été déterminées pour le composé HR4-9 et HR4-10 respectivement.

La structure et la configuration du composé HR4-10 ont été confirmées par comparaison des données spectroscopiques avec celles présentes dans la littérature comme étant le (-)-8-O- 23 methyltetrangomycin (Kesenheimer et al., 2010) d’après le pouvoir rotatoire qui est de [ α] D

= -92.

La structure du composé HR4-9 a été identifiée par comparaison aux données spectroscopiques de la littérature comme étant le 7-deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O- methylrabelomycin (Fotso et al., 2008), mais contrairement au composé déjà décrit, le 23 pouvoir rotatoire du composé HR4-9 est négatif [ α] D = -10, alors que celui isolé par Fotso et 23 al est caracterisé par un pouvoir rotatoire positif qui est de [ α] D = +53 ce qui indique que HR4-9 est un composé différent de celui décrit par Fotso et al (2008).

La comparaison des déplacements chimiques des composés HR4-9 et HR4-10 au niveau des carbones asymétriques en C-1 et C-4 (identiques pour les deux composés), nous permet de déterminer que le HR4-9 a la même configuration relative que la (-)- 8-O- methyltetrangomycin en C-1 et C-4 mais que la configuration en C-7 est différente de la 7-

124

Résultats et discussion deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O-methylrabelomycin. Par conséquent, cette molécule nouvelle a été nommée la (-)-7-deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O-methylrabelomycin.

IV.8 Activité antimicrobienne des composés HR4-9 et HR4-10 Les deux composés purifiés et caractérisés au cours de cette étude ont été testés pour leur activité antimicrobienne par la technique des disques de papier (50µg/disque). Les résultats obtenus sont représentés dans le tableau 27.

Tableau 27: Activité antimicrobienne des composés HR4-9 et HR4-10.

Diamètre de la zone Microorganisme cible d’inhibition (mm) HR4-9 HR4-10 S. aureus ATCC 25923 26 25 S. aureus ATCC 43300 23 25 E. feacalis ATCC 29212 35 39 M. luteus ATCC 4698 41 38 E. coli ATCC 25922 PA PA P. aeruginosa ATCC 27853 PA PA C. albicans ATCC 10231 PA PA PA : Pas d’Activité

Nous constatons que les composés HR4-9 et HR4-10 possèdent une très bonne activité dirigée sur les bactéries à Gram positif uniquement. Aucune activité n’a été observée sur les Gram négatif ou sur la levure C.albicans . Nous remarquons aussi que l’activité antibactérienne est presque équivalente pour les deux produits.

Le composé isolé par Fotso et al. (2008) a été testé par antibiographie en utilisant les disques de papier (50 µg/disque) contre Bacillus subtilis , S.aureus, E.coli , P.aeruginosa , Mycobacterium smegmatis , Mucor miehei et C.albicans . Les résultats obtenus ont montré une faible activité contre S.aureus , P.aeruginosa et Mucor miehei . Ces résultats montrent bien que la molécule décrite par Fotso et al (2008) possède un spectre d’activité différent de notre métabolite bioactif.

Les RMN du proton et du carbone 13 ainsi que les RMN à double dimension ont permis de déterminer la structure des composés HR4-9 et HR4-10. Il s’agit d’une structure aromatique composée de 4 cycles condensés de manière asymétrique, ce qui nous oriente vers le groupe des angucyclines. Ces antibiotiques possèdent comme caractéristique structurale commune,

125

Résultats et discussion un noyau tétracyclique (A, B, C et D) de type benz(a)anthracène, caractérisé par quatre cycles dont le dernier (cycle A) est orienté de manière angulaire (Rohr, 1992).

Figure 36: Activité antibactérienne des composés HR4-9 (1) et HR4-10 (2).

(T):disque témoin avec MeOH

126

Résultats et discussion

Les molécules HR4-9 et HR4-10 possèdent une structure similaire mais avec un H en plus ou en moins en position C-7.

Les antibiotiques de la famille des angucyclines représentent le troisième groupe de décakétides tétracycliques après les tétracyclines et les anthracyclines (Lebrasseur et al., 2004). Les angucylines sont subdivisées en deux sous groupes, celui des angucyclines proprement dits possédant un ou plusieurs sucres liés au noyau aglycone par une liaiason O- glycosidique et celui des angucyclinones n’ayant pas de sucre ou bien, possédant une partie sucre mais liée au noyau principal par une liaison C-glycosidique ( Rohr et Thiericke, 1992 ). La structure de nos deux antibiotiques décrits dans cette étude ne montre pas la présence de sucre dans leur structure; ce sont donc des angucyclinones.

Les angucyclin(on)es sont exclusivement produites par les Actinobactéries, avec le genre Streptomyces comme étant producteur majeur suivi rarement par les genres Nocardia et Saccharopolyspora. Ce groupe de molécules n’a jamais été isolé à partir des espèces du genre Nocardiopsis auquel la souche HR4 fait partie. Nous décrivons donc pour la première fois la production de cette famille d’antibiotiques au sein du genre Nocardiopsis (Hadj Rabia- Boukhalfa et al ., 2017).

En effet, les espèces du genre Nocardiopsis sont connues pour élaborer les tréhalosamines (Dolak et al., 1980) , les polyamines dopsisamine (Takahashi et al., 1986) , 87 kDa protein (Selvin et al., 2009) , les thiopeptides (Engelhatt et al., 2010) , les pyrones et dérivés (), les phénazines et dérivés (Lu et al., 2013) , les p-Terphenyls et derivés (Tian et al., 2013) et les quinolones alkaloids (Tian et al., 2014)

Les angucylin(on)es présentent un spectre d’activité très varié et intéressant, s’étendant des activités antimicrobiennes (antibactériennes, antifongiques et antivirals) jusqu’à l’inhibition de l’agrégation des plaquettes sanguines et l’inhibition d’enzymes. Concernant l’activité antibactérienne, ces molécules sont connues pour inhiber sélectivement les bactéries à Gram positif (Okazaki 1975; Theriault 1986; Rohr 1992; Jakeman 2009; Igarashi 2012 ); cette information a été confirmée par les tests antibactériens que nous avons effectués pour nos deux produits bioactifs. Mais c’est surtout leur activité antitumorale qui a suscité le plus d’intêret (Kharel, 2012). Larsen et O’Shea (1995) ont rapporté que les angucyclinones sans sucres augmentent, in vitro et in vivo , l’activité cytotoxique de la vincristine, un agent chimiothérapeutique utilisé dans le traitement de la leucémie.

127

Résultats et discussion

Même si le mode d’action des angucylinones n’est pas encore clarifié, il existe une relation entre la structure et l’activité cytotoxique. Il est supposé que la partie la plus importante de la molécule est la partie aglycone, en raison des activités antitumorales dues au chromophore. Ceci est conforté par le fait que des angycylinones (sans sucres) naturelles possèdent des activités antitumorales. De plus, des modifications dans la partie sucre des saquayamycines (angucylines avec des résidus glycosidiques) n’entraînent aucun changement dans leur activité cytotoxique, alors qu’une modification dans la structure du noyau aglycone entraîne toujours la perte de l’activité biologique (Patil, 2001).

128

Conclusion

Conclusion

Conclusion et perspectives :

Dans ce présent travail, notre objectif principal concernait l’isolement de souches nouvelles d’Actinobactéries rares autres que les Streptomyces productrices de substances bioactives à partir d’écosystèmes hypersalins. En effet, l’analyse des échantillons provenant deux sebkhas algériennes nous a permis d’isoler 8 souches appartenant au groupe des Actinobacteria et cela sur la base de leurs aspects macroscopiques et microscopiques.

Les souches obtenues ont fait l’objet d’une étude taxonomique polyphasique (morphologie, physiologie, chimiotaxonomie et séquençage de l’ADN ribosomique 16S) qui a permis de les rattacher aux genres Nocardiospsis et Saccharomonospora . L’une d’entre elles se particularise par une position taxonomique nouvelle et représenterait une nouvelle espèce dans un nouveau genre. Les autres souches nécessitent des hybridations ADN-ADN pour statuer sur leur position taxonomique. En effet, après les comparaisons des critères morphologiques et physiologiques de nos souches avec les souches les plus proches ; plusieurs caractères distinctifs ont été relevés, ce qui laisse suggérer que les souches que nous avons isolées pourraient probablement être de nouvelles espèces.

En perspective, pour cette première partie de travaux de thèse, nous comptons de compléter les différentes analyses déjà effectuées par d’autres quant à la description complète du nouveau taxon que nous avons isolé, ainsi que de déterminer de façon précise la position taxonomique des autres isolats en particulier HR4 et HR5 par des hybridations ADN-ADN avec les souches les plus proches.

Le potentiel des souches à produire des métabolites bioactifs a été entrepris par les méthodes classiques et moléculaires en recherchant les gènes codant pour les gènes PKS/NRPS. Ceci nous a permis de sélectionner la souche HR4 considérée comme la plus active, car elle présente une activité antibactérienne et antifongique. Les cinétiques de croissance et de production effectuées pour la souche HR4 ont permis de déterminer que la production est maximale pendant la transition entre la phase stationnaire et la phase d’autolyse. Après purification des composés élaborés par la souche HR4 par chromatographie liquide à haute pression préparative, nous avons pu récolter au total 11 fractions. Ces dernières ont fait l’objet d’analyses spectroscopiques de résonance magnétique nucléaire et

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Conclusion spectrométriques de masse. Les structures chimiques de deux antibiotiques HR4-9 et HR4-10 ont été déterminées.

Le composé HR4-10 a été isolé sous forme d’huile jaunâtre. Sa formule brute a été déterminée par HRESIMS comme étant le C 20 H16 O5. L’analyse des spectres proton et carbone en RMN ainsi que des corrélations en spectroscopie RMN à deux dimensions, nous ont permis de déterminer par comparaison avec la littérature que le composé HR4-10 correspondait à la 8-O-methyltertrangomycin. La configuration de ce composé a été déterminée par comparaison du pouvoir rotatoire avec les données de la littérature et a permis de confirmer que nous avons caractérisé le même composé que celui isolé par Kesenheimer et al. en 2010, à savoir la (-)- 8-O-methyltetrangomycin. Le composé HR4-9 a également été isolé sous forme d’huile jaunâtre. Le spectre HRESIMS en mode négatif a montré un pic à m/z 337,1099 correspondant à une formule brute de C 20 H18 O5. Ce composé a été déterminé comme ayant la même structure que la 7-deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O-methylrabelomycin décrit par Fotso et al en 2008. Mais la comparaison du pouvoir rotatoire et des déplacements chimiques des composés HR4-9 et HR4-10 au niveau des carbones asymétriques en C-1 et C- 4 (identique pour les deux composés), indique que notre composé a la même configuration relative que la (-)- 8-O-methyltetrangomycin en C-1 et C-4 mais que la configuration en C-7 était différente de la 7-deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O-methylrabelomycin. Par conséquent, cette molécule nouvelle a été nommée la (-)-7-deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O- methylrabelomycin. Les deux antibiotiques caractérisés font partie de la classe des angucyclinones qui sont des polykétides aromatiques connus pour leurs puissantes activités antibiotique et antitumorale. Aussi, nous décrivons pour la première fois la production de ce type de molécules au sein du genre Nocardiopsis .

En perspectives à cette deuxième partie de ce travail de thèse, nous comptons de réaliser :

-L’optimisation de la production des antibiotiques en milieu liquide, par la recherche des meilleures conditions (effets des sources carbonées et azotées, éléments minéraux, aération, pH, etc.).

-La détermination, après obtention de quantités suffisantes ou des purifications, des structures chimiques des autres produits élaborés par la souche HR4.

130

Conclusion

- Des tests de toxicité des antibiotiques sécrétés par nos souches contre des lignées cellulaires humaines ou animales, afin de mieux évaluer leur intérêt dans le domaine médical et biotechnologique. -Le séquençage du génome entier de la souche HR4 qui nous informerait sur le potentiel réel de production de métabolites secondaires.

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Site 3 : https://fr.wikipedia.org/wiki/El_Menia

Site 4 : https://fr.wikipedia.org/wiki/In_Salah

156

Annexes

Annexes

Annexe 1 Milieux de culture : Milieu ISP1 :

• Tryptone 5g • Extrait de levure 3g • NaCl 100g • Agar 20g • Eau distillée 1000ml • pH 7-7,2

Milieu ISP2 :

• Glucose 4g • Extrait de levure 4g • Extrait de malt 10g • NaCl 100g • Agar 20g • Eau distillée 1000ml • pH 7-7,2

Milieu ISP4 :

• Amidon 20g

• K2HPO 4 1g

• KNO 3 2g

• MgSO 4 0,5 g

• Ca CO 3 3g • NaCl 100g • Agar 20g • Eau distillée 1000ml • pH 7-7,2

Milieu ISP5 :

• L- asparagine 1g • Glycérol 10g

• K2HPO 4 1g • Solution saline 1ml • NaCl 100g • Agar 20g • Eau distillée 1000ml

Annexes

• pH 7-7,2

Milieu ISP7 :

• Glycérol 15 g • L- asparagine 1g

• K2HPO 4 0,5g

• FeSO 4, 7H 2O 0,01g • NaCl 100g • Agar 20g • Eau distillée 1000ml • pH 7-7,2

Milieu ISP9 :

• (NH 4)2 SO 4 2,64g

• KH 2 P0 4 2,38g

• K2HPO 4 5,65g

• MgSO 4, 7H 2O 1g • Solution saline 1ml • NaCl 100g • Agar 20g • Eau distillée 1000ml • pH 7-7,2

Solution saline :

• FeSO 4, 7H 2O 1g

• Mn Cl 2 0,1g

• ZnSo 4, 7H 2O 0,1g • Eau distillée 100 ml

Annexes

Annexe 2

Tableau A2: Tableau de lecture de la galerie miniaturisée Api 20E Tests Substrat Caractère recherché Résultats Négatif Positif ONPG Ortho-nitro- Beta-galactosidase Incolore Jaune phenylgalactoside ADH Arginine Arginine dihydrolase Jaune Rouge/orangé LDC Lysine Lysine décarboxylase Jaune Orangé ODC Ornithine Ornithine décarboxylase Jaune Rouge/orangé CIT Citrate de sodium Utilisation du citrate Vert pâle/jaune Bleu-vert/vert H2S Thiosulfate de sodium Production d’H 2S Incolore/grisâtre Dépôt noir/ fin liseré URE Urée Uréase Jaune Rouge/orangé TDA Tryptophane Tryptophane désaminase TDA / Immédiat Jaune Marron foncé IND Tryptophane Production d’indole IND / 2 mn, maxi Jaune Anneau rouge VP Pyruvate de sodium Production d’acétoine VP 1 + VP 2 / 10 mn Incolore Rosé- rouge GEL Gélatine de Kohn Gélatinase Non Non diffusion Diffusion du pigment noir GLU Glucose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune MAN Mannitol Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune INO Inositol Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune SOR Sorbitol Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune RHA Rhamnose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune SAC Saccharose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune MEL Melibiose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune AMY Amygdaline Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune ARA Arabinose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune

Annexes

Annexes 3

Tableau de lecture de la galerie ApiZYM

Annexes

Annexe 4

Clonage avec le kit « pGEM-T Vector System » PROMEGA

• Milieux et solutions

Milieu LB Agar

Dans 1L d’eau miliQ : 10 g bacto tryptone

5.0 g bacto yeast extract

5.0 g NaCl

16 g bacto agar pH 7.2

Après autoclavage, et refroidissement du milieu ajouter : 500 μl de IPTG, 500 μl de X-Gal

Et 500 μl d’ampicilline

Milieu SOC Dans 97 ml d’eau miliQ : 2.0 g bacto tryptone

0.5 g bacto yeast extract 1.0 ml NaCl 1M 0.25 ml de KCl 1M

+2 Après autoclavage, et refroidissement du milieu ajouter : 1ml de Mg 2M et 1ml de glucose 2M

Annexes

Annexes

Annexe 5

Spectres des analyses RMN 1H et ULPC-HRMS des fractions récoltées

* HR4-1 (0.9mg)

Annexes

* HR4-2 (< 0,7mg)

Pic très faible sur HPLC, absorbant uniquement à 210 et 220 nm

Masse trop faible pour RMN exploitable

Annexes

* HR4-3 (2.2mg)

Mélange de 2 composés visibles en HPLC semi-préparative.

Séparation ultérieure nécessaire avant RMN et HRMS

Annexes

* HR4-4 (1.2mg)

Spectre RMN proton complexe

Annexes

HRMS mode négatif :

Annexes

HRMS mode positif :

Annexes

Mélange de 3 à 4 composés en quantité comparable

Annexes

* HR4-5 (4.5mg)

RMN du proton assez complexe

Annexes

HRMS modes négatif et positif :

Mélange de 2 composés dont 1 majoritaire

Annexes

* HR4-6 (1.1mg)

Annexes

HRMS modes négatif et positif : Mélange de 2 composés

Annexes

HR4-7 (6.8mg)

Annexes

HRMS modes négatif et positif :

Annexes

* HR4-8 (3.8mg)

HRMS modes négatif et positif :

Annexes

Mélange de molécules : pics à 1,50 et 1,53mn même rapport m/z

Publication

World J Microbiol Biotechnol (2017) 33:126 DOI 10.1007/s11274-017-2292-8

ORIGINAL PAPER

Isolation, purification and chemical characterization of a new angucyclinone compound produced by a new halotolerant Nocardiopsis sp. HR-4 strain

Yamina Hadj Rabia‑Boukhalfa1,2,3 · Yannick Eveno3 · Solange Karama2 · Okba Selama1 · Béatrice Lauga2 · Robert Duran2 · Hocine Hacène1 · Véronique Eparvier3

Received: 25 January 2017 / Accepted: 20 May 2017 © Springer Science+Business Media Dordrecht 2017

Abstract A halotolerant Actinobacteria strain HR-4 was NMR and by comparing with spectroscopic data from the isolated from a salt lake soil sample in Algerian Sahara. literature of the two compounds affirm that they are classi- Analysis of 16S rDNA gene sequence showed that strain fied in the group of Angucyclinones. This is the first report HR-4 belonged to the genus Nocardiopsis. The similarity of a production of this type of molecules by the genus level ranges between 97.45 and 99.20% with Nocardiop- Nocardiopsis. The new natural compound was established sis species and Nocardiopsis rosea being the most closely as (−)-7-deoxy-8-O-methyltetrangomycin with a new related one. Morphological, physiological and phyloge- configuration. netic characteristics comparisons showed significant dif- ferences with the nearest species. These data strongly Keywords Halotolerant · Nocardiopsis · Taxonomy · suggest that strain HR-4 represents novel species. The Antimicrobial activity · Angucyclinone antimicrobial activity of strain HR-4 showed an antibacte- rial activity against Gram-positive bacteria as well as an antifungal one. Two major natural products including a Introduction new one were isolated from the culture broth using vari- ous separation and purification procedures. The chemical Actinobacteria are the most important group of microor- structure established on the basis of spectroscopic studies ganisms for the production of antibiotics and other impor- tant natural substances (Berdy 2005; Barka et al. 2016). The most frequent producers in this group, the Streptomy- Electronic supplementary material The online version of this ces species produce 7600 compounds (74%), while other article (doi:10.1007/s11274-017-2292-8) contains supplementary Actinobacteria represent (26%) altogether 2500 compounds material, which is available to authorized users. (Ilic et al. 2007). In the course of screening for new active * Hocine Hacène molecules, several research studies are currently oriented [email protected] towards isolation of rare and unusual genera of Actinobac-

1 teria from different ecosystems and particularly from halo- Equipe Microbiologie, Laboratoire de Biologie Cellulaire et philic soils (Hacène et al. 1994, 2004; Lazzarini et al. 2001; Moléculaire, Faculté des Sciences Biologique-Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene, BP 32, El Cai 2009; Hamedi et al. 2013). Alia, 16111 Bab Ezzouar Alger, Algeria Nocardiopsis species are generally associated with 2 Equipe Environnement et Microbiologie, Institut Saharan soils. Different types of soil samples (saline Pluridisciplinaire de Recherche sur l’Environnement et les and hypersaline desert) have yielded several novel iso- Matériaux, UMR 5254, Centre national de la recherche lates. The most striking feature of these isolates is their scientifique-Université de Pau et des Pays de l’Adour, Pau, requirement for NaCl or tolerance toward it (Hamedi France 3 et al. 2013; Bennur et al. 2015). Members of this genus CNRS – Institut de Chimie des Substances Naturelles produce an array of natural products like: enzymes, com- - Equipe Métabolites de Microorganismes Symbiotiques-Bi oinspiration, 1 Avenue de la Terrasse, 91198 Gif‑sur‑Yvette, patible solutes, surfactants and bioactive compounds that France may aid their survival under extremophilic conditions

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(Li et al. 2013; Bennur et al. 2014). In fact, Nocardiopsis Physiological characterization species harbor different types of PKS gene clusters that help them in producing of large kinds of natural products Production of melanoid pigments was tested on tyrosine (Becerril-Espinosa et al. 2013; Romanenko et al. 2013). agar (ISP 7) medium (Shirling and Gottlieb 1966). The Our laboratory takes a particular interest in extreme assimilation of carbohydrate as sole carbon source was environments and drug discovery, and many new gen- determined on ISP 9 medium (Shirling and Gottlieb 1966). era, species and substances were described (Hacène et al. Degradation of starch, casein, gelatine and nitrate reductase 1994, 1998, 2000; Addou et al. 2012, 2013). production were determined as described by Locci (1989). In the present work, we describe the identification of Growth at different NaCl concentrations (0, 5, 10, 15, 20 a halotolerant Nocardiopsis strain designated HR-4 iso- and 25%) and different temperatures (20, 25, 30, 35, 40, 45, lated from a salt Saharan soil sample by conventional and 50 and 55 °C) were evaluated on ISP 2 medium. The pH molecular methods. Also, we report the extraction, puri- range of growth was investigated between (4.0 and 12.0 at fication and structure elucidation of the new major natu- intervals of 1 pH unit) on ISP 2 agar medium supplemented ral product from liquid culture broth of this strain, and with 10% of NaCl and incubated at 30 °C for 14 days. for the first time the production of angucyclinones com- pounds by Nocardiopsis species. DNA Extraction, 16S rDNA sequencing, and phylogenetic analysis

DNA was extracted using the Ultra Clean Microbial DNA Materials and methods Isolation kit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA). The strain of Actinobacteria was grown at 30 °C for 7 days with Strain isolation agitation (250 rpm) in a 250 mL flask containing 50 mL of ISP 2 liquid medium supplemented with 10% of NaCl. The Actinobacteria strain designated HR-4 was isolated The 16S rDNA was amplified by PCR using two primers from an Algerian salt lake soil named Sebkha of Ain (Eurogentec, Seraing, Belgium): 63F (5′-AGT​GAG​CCC​ Salah located in Sahara desert. A dry subsample soil TGA​AAA​TCA​TGG​ACT​-3′) and 1387R (5′-GGG​CGG​ (1 g) was suspended in sterile distilled water and decimal WGTG​TAC​AAGGC-3′). The final 50-µL volume of reac- diluted to 10­ −4. Aliquots (0.2 mL) of each dilution were tion mixture contained Amplitaq Gold DNA Master Mix spread on to International Streptomyces Project 2 (ISP 2 X (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) (Ampli- 2) medium agar supplemented with 10% of NaCl (w/v) Taq Gold DNA Polymerase, 250 U (0.05 U/μL), GeneAmp (Shirling and Gottlieb 1966). The medium was supple- PCR Gold Buffer, 30 mM Tris/HCl, pH 8.05, 100 mM KCl, mented with gentamycin (10 µg/L) and amphotericin B dNTP 400 μM each, 5 mM ­MgCl2), sterile water, 20 µM (50 µg/L) to inhibit the growth of the other bacteria and of each primer and 5 µL of the purified DNA. PCR ampli- fungi respectively. The plates were incubated at 30 °C for fication of the 16 rDNA was carried out on M J Research 2 weeks. PTC-200 Thermal Cycler (Waltham, MA, USA). The conditions for thermal cycling were as follows: denatura- tion of the target DNA at 95 °C for 10 min followed by 35 Morphological and cultural characterization cycles of 95 °C for 45S, primer annealing at 55 °C for 45S and primer extension at 72 °C for 1 min. At the end of the The morphological and cultural features were observed cycling, the reaction mixture was held at 72 °C for 10 min by naked-eye examination of 14 day-old cultures and then cooled to 4 °C. The PCR product was detected by grown on various International Streptomyces Project agarose 1% gel electrophoresis and was visualized by ultra- (ISP) media: tryptone yeast extract agar (ISP 1), yeast violet (UV) fluorescence after ethidium bromide staining. extract–malt extract agar (ISP 2), inorganic salts–starch The obtained 16S rDNA gene sequence of strain HR-4 agar (ISP 4) and glycerol–asparagine agar (ISP 5) (Shirl- was compared for similarity level with sequences present ing and Gottlieb 1966). All media were supplemented in the public sequence (NCBI Genbank) databases as well with 10% of NaCl (w/v) and incubated at 30 °C. as in the EzTaxon-e server (Kim et al. 2012). Phylogenetic The micromorphology and sporulation were observed analyses were realized using MEGA version 6 developed by light microscopy (B1 Series, Motic Gx1000). Colors by Tamura et al. (2013). The multiple alignment of the of aerial and substrate mycelia and any soluble pigments obtained 16S rDNA gene sequence against neighbour- produced were also determined with the ISCC-NBS color ing nucleotide sequences, recovered from EzTaxon, was charts (Kelly and Judd 1976). generated using CLUSTAL W (with default parameters) (Thompson et al. 1994). The phylogenetic trees were

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′ ′ constructed using several algorithms: the neighbour-join- A3F/A7R ­(5 -GCSTACSYSATSTACA CSTCSGG-3 ; ′ ′ ing method of Saitou and Nei (1987) with the model of ­5 -SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3 ), respectively, accord- Jukes and Cantor (1969), maximum-likelihood (Felsenstein ing to Ayuso-Sacido and Genilloud (2005). Polyketide 1981) with Kimura’s two-parameter model (Kimura 1980) synthetase II (PKS-II) gene was amplified with the primer ′ ′ and maximum-parsimony (Fitch 1977). Tree topologies pair KS α/KS β ­(5 -TSGCSTGC​TTG​GAYGC SATC-3 ; ′ ′ were evaluated using the bootstrap resampling method with ­5 -TGGAANCCG​CCG​AABCCTCT-3 ), as described by 1000 replicates (Felsenstein 1985). Metsä-Ketelä et al. (1999). The reaction mixtures contained AmpliTaq Gold Master Mix 2X, sterile water, 20 µM of Screening of antimicrobial activity each primer and 5 µL of the purified DNA in a 50 µL reac- tion volume. Control reaction mixture had no Actinobacte- Antimicrobial assay on solid medium rial DNA template. Thermocycling conditions for K1F/M6R and KS α/KS The antagonistic properties of the isolate HR-4 against sev- β consisted of one denaturation step of 5 min at 95 °C; 35 eral bacteria and filamentous fungi were determined by the amplification cycles of 30 s at 95 °C, 2 min at 55 °C for cylinder agar plate method of ISP 2 medium containing K1F/M6R or 2 min at 58 °C for KS α/KS β, 4 min at 72 °C; 10% NaCl. and a final extension for 10 min at 72 °C. The following strains of bacteria and fungi were used: Thermocycling conditions for A3F/A7R consisted of Staphylococcus aureus ATCC 25923, Methicillin-Resist- one denaturation step of 5 min at 94 °C; 30 amplification ant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300, Micro- cycles of 1 min at 94 °C, 1 min at 57 °C, and 2 min at 72 °C; coccus luteus ATCC 4698, Enterococcus faecalis, ATCC and a final extension for 5 min at 72 °C as described by 29212, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aer- Sheng et al. (2009). uginosa ATCC 27853, Saccharomyces cerevisiae ATCC All of the amplification products were examined with 9763, Candida albicans ATCC 10231 from American Type 1% agarose gel electrophoresis, and bands of 1200–1400, of Culture Collection (Manassas, VA, USA) and Fusarium 600 and 800 bp were classified as products of PKS I, PKS oxysporum DSM ­62297T from Deutsche Sammlung von II and NRPS genes respectively. Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ (Braunschweig, Germany). Production, isolation and characterisation of natural products Time course of growth and antibiotic production Fermentation and preparation of crude extract Fermentation of strain HR-4 was carried in order to select the culture time favourable for antibiotic produc- The strain was cultivated in ISP2 liquid medium supple- tion. 500 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL of ISP mented with 10% of NaCl at 30 °C for 8 days. The culture 2 broth medium supplemented with 10% of NaCl were broth (8.0 L was extracted with an equal volume of Ethyl inoculated with 3 mL of 2 days pre-culture. The cultures acetate (EtOAc) for 24 h. The organic solvent was then col- were run at 30 °C for 10 days under agitation at 200 rpm. lected by filtration, washed with­H 2O in a separatory fun- Changes in pH, growth (dry weight of mycelium) and anti- nel, and evaporated, yielding 34 mg of the extract. biotic production were examined daily. The antimicrobial activity in the culture broth was monitored by the conven- Isolation and purification of natural compounds tional agar diffusion assay (well technique) using Staphylo- coccus aureus ATCC 25923 and Candida albicans. Each Analytical and preparative HPLCs were conducted with 6 mm diameter well was filled with 250 µL of culture a Gilson system (Middleton, WI, USA) equipped with supernatant. a 322 pumping device, a GX-271 fraction collector, a 171 diode array detector and a prepELSII detector elec- Detection of PKS I, PKSII and NRPS genes trospray nebuliser. Columns used for these experiments included: a Phenomenex (Torrance, CA, USA) Luna ­C18 Genomic potential for producing bioactive metabolites 5 µm 4.6 × 250 mm, Phenomenex PFP 5 µm 4.6 × 250 mm of the isolate was evaluated by using specific degener- analytical column and Phenomenex Luna ­C18 5 µm ate primers (Eurogentec, Seraing, Belgium). Polyketide 21.2 × 250 mm and PFP 5 µm 21.5 × 250 mm preparative synthetase I (PKS-I), and Non Ribosomal Peptide Syn- column. The flow rate was set to 1 or 17 mL/min, respec- thetase (NRPS) genes were amplified from genomic DNA tively, using a linear gradient of water mixed with an ′ with the primer pairs K1F/M6R ­(5 -TSAAGTCSAAC​ATC​ increasing proportion of acetonitrile (CH­ 3CN). All solvents ′ ′ ′ GGBCA-3 ; ­5 -CGC​AGG​TTSCSGTA​CCA​GTA-3 ) and were HPLC grade.

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Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectra were only moderate growth was seen on Asparagin agar ISP 5 recorded on a Bruker (Fremont, CA, USA) 500 MHz spec- and Tyrosin agar ISP 7 and poor growth was detected on trometer equipped with a 1 mm inverse detection probe. inorganic salt agar ISP 4. The color of substrate mycelium Chemical shifts (δ) are reported as ppm based on TMS was light brown on ISP 1, strong yellowish brown on ISP 2, signal, and coupling constants (J) are reported in Hertz. white on ISP 4 and light brown on ISP 5 and ISP 7. Yeast HR-ESI-MS measurements were performed using a Waters extract malt extract agar ISP 2 supplemented with 10% of Acquity UPLC system (Milford, MA, USA) with column NaCl was used as the optimal medium for the culture of bypass coupled to a Waters Micromass LCT Premier Time- the strain. Substrate and aerial mycelia are well developed of-Flight mass spectrometer (Milford, MA, USA) equipped and the latter fragments into spores which were non motile with an electrospray interface (ESI). Flash chromatography (Fig. 1). was performed on a Grace Reveleris system (Columbia, The physiological properties of strain HR-4 (Table 2) MD, USA) with dual UV and ELSD detection equipped showed that no melanoid pigments were produced on the with an 80 g silica column. For UV-based experiments, used media, and the isolate used the following as carbon effluents were monitored at 254 and 280 nm. sources: glucose, sucrose, cellulose, lactose, xylose, man- Optical rotations were measured on an Anton Paar nitol and inositol but it was not able to use rhamnose, (Graz, Austria) MCP 300 polarimeter in a 100 mm-long melobiose and arabinose. It was found to be positive for 350 µL cells. production of catalase and gelatinase and was found to be negative for the production of nitrate reductase, amylase Biological assays of purified compounds and caseinase.

The disk diffusion assay was used to test the antimicrobial activities of the purified compounds. Methanol (MeOH) was used to dissolve each pure compound and 100 μL of the compound solution (representing 50 μg) were applied to 6.0 mm paper disk. The disk was allowed to dry for 1 h before it was placed on the plate inoculated with the target microorganisms (bacterial strains and C. albicans used above). The plates were incubated at 37 and 30 °C for bacteria and C. albicans respectively. The diameter of the inhibition zone (mm) of each active compound was meas- ured after 24 and 48 h for bacteria and yeast respectively. Disks treated with 100 μL of MeOH were used as negative controls.

Results

Taxonomy

The cultural and morphological characteristics of the strain in different media are given in Table 1. The strain HR-4 showed an excellent growth and abundant aerial myce- lium formation on ISP 2 supplemented with 10% of NaCl. Fig. 1 Scanning optical micrography of spore chains of the strain Good growth was observed on yeast extract agar whereas HR-4 grown on ISP 2 medium for 14 days at 30 °C (G× 1000)

Table 1 Culture characteristics Media Growth Aerial myceluim Substrate mycelium of strain HR-4 on various media Tryptone yeast extract agar ISP 1 Good Light brown Dark beige Yeast malt extract agar ISP 2 Good Grayish brown Dark brown Inorganic salt-starch agar ISP 4 Poor White White Glycerol-asparagin agar ISP 5 Moderate White Light brown Tyrosin agar ISP7 Moderate Light gray Light brown

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Table 2 Physiological Tests Result The similarity analysis based on 16S rDNA sequence characteristics of the strain (1239 bp) of strain HR-4, deposited in GenBank under HR-4 Hydrolisis of accession number KC511627, indicated that the strain was Starch − closely related to members of genus Nocardiopsis (Meyer Casein − 1976) and was closely related to N. rosea DSM ­44842T Gelatin + (99.20%), N. gilva DSM ­44841T (98.72%), N. rhodophea Utilisation of glucides and DSM ­44843T (98.40%) (Li et al. 2006) and N. halophila derivates DSM ­44494T (97.77%) (Al-Tai and Ruan 1994). This asso- Glucose + ciation was supported by the maximum likelihood dendro- Mannose + gram (Fig. 2). Strain HR-4 could be distinguished from Sorbose + the closely species by some phenotypic properties like: Rhamnose − Color of aerial and substrate mycelia, Gelatin liquefaction, Melobiose − Nitrate reduction and the utilization of Mannose and Fruc- Arabinose − tose (Table 3). Sucrose + Cellulose + Antimicrobial activity Lactose + Xylose + Nocardiopsis sp. HR-4 showed a broad antimicrobial activ- Inositol + ity spectrum which is presented in Table 4. Decarboxylation of The strain HR-4 exhibited a variety of antibacterial and Arginin − antifungal activity. It showed a good activity against Gram- Lysin + positive bacteria such as the two strains of S. aureus, E. Ornithin − faecalis and M. luteus. However, no activity against Gram- Catalase + negative bacteria was observed. Also, the strain HR-4 Nitrate reduction − showed a good activity against S. cerevisiae and C. albi- Urease activity − cans but a weak activity was observed on F. oxysporum. H S production − 2 The isolate was screened for the presence of PKS I, PKS Growth at II, and NRPS sequences by specific amplification of chro- 25 °C − mosomal DNA with primer sets K1F/M6R, ­KS /KS , and 30 °C + α β A3F/A7R, respectively, to evaluate its biosynthetic poten- 35 °C + tial in terms of natural compounds production. The strain 40 °C + harbored the PKS I, PKS II and NRPS genes. These genes 45 °C − are established to be associated with a diversity of bioac- Growth at tive natural products (Ayuso-Sacido et al. 2005). pH 4 − pH 5 + Time course of growth and antimicrobial production pH 6 + pH 7 + The kinetics of antimicrobial production, growth and pH pH 8 + were monitored in ISP 2 broth cultures with 10% of NaCl pH 9 + as shown in the (Fig. 3). The activities were detected on the pH 10 − first day of fermentation against S. aureus ATCC 25923, Growth at and on the second day against C. albicans, reaching a max- 0% NaCl + imum the 8th day. The biomass increased from the first day 5% NaCl + to the 8th day, and then decreased after the 9th day. The pH 10% NaCl + kinetics showed slight variation during the incubation. 15% NaCl + 20% NaCl + Isolation and purification of natural product 25% NaCl −

Tests: + positive; − negative The 8.0 L shake flasks culture was extracted at room temperature by maceration using EtOAc; the residue was subsequently extracted using the same volume of EtOAc providing 34 mg of extract, after evaporation of the sol- vents, which corresponds to a yield of 7.9 × 10−5 mg/g

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Fig. 2 Neighbor-joining tree 80 Nocardiopsis halophila (AF195411) based on 16S rDNA sequences 38 Nocardiopsis chromatogenes (AY619715) showing the relations between 82 Nocardiopsis coralliicola strain SCSIO 10427 (JN006759) strain HR-4 and the most related type strains. The evolution- Nocardiopsis compostus KS9 (AF360734) 71 ary distances were computed 62 Nocardiopsis potens DSM 45234 (ANBB01000116) using the maximum composite Nocardiopsis gilva (AY619712) likelihood method and are in the Nocardiopsis sp. HR-4 (KC511627.1 ) units of the number of base sub- 98 stitutions per site. Tree topology 98 Nocardiopsis rosea (AY619713) was constructed using MEGA 80 Nocardiopsis rhodophaea (AY619714) 6.0. Bootstrap values (n = 1000 Nocardiopsis trehalosi (AF105972) replicates) were indicated at 57 Nocardiopsis arabia (EF095149) the nodes. Actinomadura alba strain YIM 45681 (DQ985164) Actinomadura alba strain YIM 45681 (DQ985164) sequence was added as an out group for this tree 0.01

Phenotypic Table 3 Characteristics 1 2 3 characteristics that diffentiate the Nocardiopsis sp HR-4 and Colony pigmentation ISP2 Grayish brown Pale pink Pale yellow the two most closely related Temperature range for growth (°C) 25–40 20–60 10–40 species Optimum temperature for growth 30–37 37–40 28–30 NaCl range for growth (%) 0–20 0–18 0–18 Optimum NaCl for growth (%) 5–10 5–8 5–8 Starch hydrolysis − − −

H2S production − − − Nitrate reduction − + + Gelatin liquefaction + − − Melanin production − − − Carbon source utilization Fructose − + + Galactose − − + Inositol + − + Maltose + + − Mannose + − − Rhamnose − + − Ribose + + − Sucrose + + + Xylose + − +

Strains: 1 Nocardiopsis.sp HR-4; 2 Nocardiopsis rosea DSM ­44842T*; 3 Nocardiopsis gilva DSM ­44841T* Tests: + positive ; − negative *Data from Li et al. (2006)

of cell dry weight. The EtOAc extract was purified by Spectroscopic, spectrometric analysis and antimicrobial prep-HPLC on PFP column with a linear gradient of activity of the natural compounds ­H2O –CH3CN (80/20–0/1 in 25 min) followed by iso- cratic gradient of ­CH3CN 100% during 10 min (flow Compound 1 was obtained as amorphous yellow oil. A rate 21 mL/min) and afforded compound1 (2.3 mg, RT molecular formula of C­ 20H16O5 was determined via HRESI- 28.2–30.0 min) and compound 2 (2.1 mg, RT 27.3 min). MS analysis, which showed a protonated molecular ion at

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Table 4 Antimicrobial activity of the strain HR-4 8-O-methyltetrangomycin (Kesenheimer and Groth 2006) O Target microorganisms Diameter of also named 6-deoxy-8- -methylrabelomycin (Shigihara et inhibition zone al. 1988), structure and configuration were confirmed by (mm) comparison of spectroscopic data with the literature. Gram positive bacteria Compound 2 was isolated as an yellow oil too and gave m z − Staphylococcus aureus ATCC 25923 25 a peak in HRESIMS at / 337.1099 [M − H] (cacld for Staphylococcus aureus ATCC 43300 22 ­C20H17O5, 337.1081) consistent with molecular formula of Enterococcus faecalis ATCC 29212 25 ­C20H18O5. The NMR data (Table 5) obtained for compound Micrococcus luteus ATCC 4698 30 2 indicated that it was similar to compound 1. Contrary Gram negative bacteria to compound 1, compound 2 showed a carbon resonance Escherichia col at δC 61.4 and only two carbonyl signals at δC 179.7 and i ATCC 25922 NA 1 1 Pseudomonas aeruginosa 184.4 ppm (Table 5). In addition, the analyses of H- H and ATCC 27853 NA 1 13 Yeasts H- C correlation on COSY and HMBC spectra showed, Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 18 in position C-7, a carbonyl and hydroxyl in compound 1 Candida albicans ATCC 10231 20 and 2 respectively (Fig. 4). Filamentous fungi According to our antimicrobial tests, we observed that Fusarium oxysporum DSM ­62297T 12 compound 1 and 2 exhibited good antibacterial activities against Gram-positive bacteria only (Table 6). The pres- NA no activity ence of the activity of the culture supernatant against C. albicans and its absence for the two pure compounds shows that the anti-yeast activity is due to another molecule differ- ent from compounds 1 and 2.

Table 5 1H NMR Spectroscopic data for compounds 1 and 2 (recorded in CDCl3)

Position 1 2 δ a δ b δ a δ b C H (J in HZ) C H (J in HZ)

1 196,8, C – 196.4, C –

2 54.1, ­CH2 2.81 d (14.9) 54.1, ­CH2 2.90 d (14.9) 2.92 d (14.9) 3.10 d (14.9) 3 72.8, C – 72.8, C –

3-CH3 29.9, ­CH3 1.32 s 29.4, ­CH3 1.47 m

4 43.9, ­CH2 2.99 s 43.9, ­CH2 3.18 m 3.90 m 4a 146.4, C 146.3, C 5 134.6, CH 7.34 d (7.7) 134.7, CH 7.47 d (7.8) 6 129.2, CH 8.12 d (7.7) 130.2, CH 7.87 d (7.8) 6a 132.4, C – 141.4, C – 7 184.3, C – 61.4, CH 5.99 7a 121.0, C – 129.4 – 8 160.0, C – 157.0, C –

8-OCH3 54.2 3.86 s 53.8 4.04 m 9 117.9, CH 7.12 d (7.7) 112.6, CH 7.17 d (7.8) 10 136.2, CH 7.53 dd (7.7) 127.9, CH 7.49 d (7.8) Fig. 3 Time course of pH, growth and antimicrobial activity on ISP 11 120.4, CH 7.58 d (7.7) 118.0, CH 7.77 d (7.8) 2 medium against Staphylococcus aureus ATCC 25923 (square) and 11a 137.8, C – 132.5, C – Candida albicans ATCC 10231 (diamond) 12 184.4, C – 184.4, C – 12a 135.2, C – 133.9, C – + 12b 133.7, C 134.1, C m/z 337.1076 [M + H] (calcd for ­C20H17O5, 337.1076) and corresponding to 13° of unsaturations. This compound was a Data recorded at 125 MHz identified by 1D and 2D NMR spectroscopy (Table 5) as b Data recorded at 500 MHz (nd not determined)

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It is well known that certain bacterial and fungal genera produce antibiotics as part of their metabolism (Waksman et al. 2010). These substances are mainly secreted against competing micro-organisms and to ensure restricted use of solubilized nutrients (Chater 2006). They also act as molec- ular signals and mediate cellular communication and gene transfer phenoma (Davies 2006; Linares et al. 2006). So, they play a significant role in structuring microbial com- munities (Tarkka et al. 2008). Members of genus Nocar- diopsis Fig. 4 Structure of compounds 1 and 2 also produce a wide array of antimicrobial agents. Screening of samples for Actinobacteria producing bioac- tive compounds have yielded Nocardiopsis species along with other bacteria (Vimal et al. 2009; Augustine et al. Table 6 Antimicrobial activities of compounds 1 and 2 2012; Romanenko et al. 2013). There are many reports on Target microorganism Diameter of inhibition the production and detailed chemical characterization of zones (mm) a range of antibiotics by different species of Nocardiop- 1 2 sis like Polyketides (Li et al. 2013), Phenazine derivatives S. aureus ATCC 25923 25 26 (Dashti et al. 2014) and other chemically distinct antimicro- S. aureus ATCC 43300 25 23 bial compounds (Tian et al. 2013, 2014). E. feacalis ATCC 29212 39 35 The two major compounds were purified by HPLC and M. luteus ATCC 4698 38 41 on the basis of NMR and HRESI-MS analysis, the molecu- E. coli ATCC 25923 NA NA lar formula were determined as C­ 20H16O5 for compound 1 P. aeruginosa ATCC 27853 NA NA and ­C20H18O5 for compound 2. C. albicans ATCC 10231 NA NA The structure and configuration of compound1 were confirmed by comparison of spectroscopic data with the NA no activity literature values as (−)-8-O-methyltetrangomycin based on 23 optical rotation ([α] D = −92 (c 0.1, MeOH)) (Kesenhe- Data about spectroscopic and spectrometric characteri- imer et al. 2010). zation of the two compounds are given in the online Sup- The structure of compound 2 was identified by com- plementary Material. parison with spectroscopic data of the literature as 7-deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O-methylrabelomy- cin (Fotso et al. 2008). But contrary to the described Discussion compound, optical rotation for compound 2 is nega- 23 tive ([α] D = −10 (c 0.1, MeOH)), which indicated On the basis of its morphological physiological and phy- that compound 2 is a new molecule and it was named logenetic characteristics described above, the strain HR-4 (−)-7-deoxy-8-O-methyltetrangomycin. was classified in the genus Nocardiopsis. Strain HR-4 The carbons of molecules 1 and 2 are identical in the could be distinguished from the related species by pheno- region of C-1 to C-4 and are perfectly compatible. There- typic properties, such as the color of aerial and substrate fore, 1 and 2 should have the same C-3 configuration. In mycelia, indeed the aerial mycelium of strain HR-4 on ISP addition, 7-deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O-methylrabelo- 2 medium was greyish brown but that of N. rosea was pale mycin is obtained by reduction of (−)-6-deoxy-8-O-meth- pink and that of N. gilva was pale yellow. Besides, the sub- ylrabelomycin; so we have isolated different compound strate mycelium is dark brown for HR-4, moderate pink for from the one described by Fotso et al. (2008). N. rosea and brillant yellow for N. gilva. Also, on the phys- The data relative to chemical revelations suggested that iological level, the strain HR-4 differs by the temperature the two compounds purified are related to the angucy- range growth. clinone family. To our knowledge, it is the first report of The 16S rDNA gene sequence of strain HR-4 was com- angucyclinones isolated from Nocardiopsis species and pared with those of other Nocardiopsis species. The simi- from halotolerant Nocardiopsis. larity level ranged from 97.45 to 99.20%, N. rosea (Li et al. Angucyclinones and angucylines are aromatic polyke- 2006) being the most closely related species. However, it tide natural products with a tetracyclic benz[a] anthracene is clear from phylogenetic analysis that strain HR-4 repre- skeleton that is distinct from benz[b] anthracene skeleton sents a distinct phyletic line suggesting a new species of the found in tetracyclines and anthracyclines. They are biosyn- genus Nocardiopsis. thesized by type II polyketide synthases. Since the isolation

1 3 World J Microbiol Biotechnol (2017) 33:126 Page 9 of 10 126 of tetrangomycin, the first angucyclinone discovered from diversity, abundance and secondary metabolite biosynthetic Streptomyces rimosus in 1965 (Rohr and Thiericke 1992), potential. Antonie Van Leeuwenhoek 103:809–819 Bennur T, Kumar AR, Zinjarde S, Javdekar V (2014) Nocardiopsis the angucycline and angucyclinone family of natural prod- species as potential sources of diverse and novel extracellular ucts has grown steadily. To date, this family of natural enzymes. Appl Microbiol Biotechnol 98:9173–9185 products has been discovered exclusively from Actinobac- Bennur T, Kumar AR, Zinjarde S, Javdekar V (2015) Nocardiopsis teria, with Streptomyces as the major producers but never species: incidence, ecological roles and adaptations. Microbiol Nocardiopsis Res 174:33–47 from known species (Rohr and Thiericke Berdy J (2005) Bioactive microbial metabolites. J Antibiot 58:1–26 1992; Kharel et al. 2012). 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1 3 Abstract :

The analysis of two soil samples from sebkha El Goléa and Ain Salah considered as extreme environments of the Algerian Sahara allowed us to isolate a total of 8 strains of Actinobacteria at a temperature of 30 ° C and in the presence of a concentration of 10% of Sodium Chloride. The taxonomic study of the strains was carried on the basis of morphological, physiological and molecular characteristics. The results obtained showed that 6 isolates belong to the genus Nocardiopsis (HR1, HR2, HR4, HR5, HR6 and HR7) and one isolate to the genus Saccharomonospora (HR2'). The strain HR3 was not related to any genus because it is characterized by a new taxonomic position and presented a similarity rate of the sequence of the 16S rRNA gene of 94,59% with Phytoactinopolysora endophytica , 94.52% with Jiangella gansuensis and 94, 24 % with Haloactinopolyspora alkaliphila. The potential of strains to produce bioactive metabolites was evaluated by conventional and molecular methods by screening for genes coding for PKS / NRPS. This allowed us to select the strain HR4 considered to be the most active. After purification of the compounds produced by the strain HR4 by preparative high pressure liquid chromatography, the chemical structures of two antibiotics (HR4-9 and HR4-10) were determined after spectroscopic (NMR) and spectrometric (high resolution mass spectrometry) analysis. One of them (HR4-9) is a new compound with a new configuration. The two antibiotics characterized belong the class of angucyclinones which are aromatic polyketides known for their potent antibiotic and antitumor activities. Thus, we describe for the first time the production of this type of molecules in the genus Nocardiopsis.

ﺍﻟﻤﻠﺨﺺ ﺑﺎﻟﻠﻐﺔ ﺍﻟﻌﺮﺑﻴﺔ: ﺍﻟ ﺘﺤﻠﻴﻞ ﻟ ﻌﻴﻨﺘﻴﻦ ﻣﻦ ﺗﺮﺑﺔ ﺳﺒﺨﺔ ﺍﻟﻤﻨﻴﻌﺔ ﻭﻋﻴﻦ ﺻﻼﺡ ﺍﻟﻠﺘﺎﻥ ﺗﻌﺘﺒﺮﺍﻥ ﻣﻦ ﺍﻟﺒﻴﺌﺎﺕ ﺍﻟﻘﺎﺳﻴﺔ ﻓﻲ ﺍﻟﺼﺤﺮﺍء ﺍﻟﺠﺰﺍﺋﺮﻳﺔ ﻗﺪ ﺳﻤﺤﺖ ﻟﻨﺎ ﺑ ﻌﺰﻝ ﻣﺎ ﻣﺠﻤﻮﻋﻪ 8 ﺳﻼﻻﺕ Actinobacteria ﻋﻨﺪ ﺩﺭﺟﺔ ﺣﺮﺍﺭﺓ 30 ° ﻡ ﻓﻲ ﻭﺟﻮﺩ ﺗﺮﻛﻴﺰ 10 ٪ ﻣﻦ ﻛﻠﻮﺭﻳﺪ ﺍﻟﺼﻮﺩﻳﻮﻡ.

ﺗﻢ ﺗﺼﻨﻴﻒ ﺍﻟ ﺴﻼﻻﺕ ﻋﻠﻰ ﺃﺳﺎﺱ ﺍﻟﺨﺼﺎﺋﺺ ﺍﻟﻤﻮﺭﻓﻮﻟﻮﺟﻴﺔ ﻭﺍﻟﻔﺴﻴﻮﻟﻮﺟﻴﺔ ﻭﺍﻟﺠﺰﻳﺌﻴﺔ. ﺍﻟﻨﺘﺎﺋﺞ ﺍﻟﻤﺘﺤﺼﻞ ﻋﻠﻴﻬﺎ ﺳﻤﺤﺖ ﺑﺮﺑﻂ 6 ﻋﺰﻻﺕ ﻟ ﺠﻨﺲ HR6 ،HR5 ،HR4 ،HR2 ،HR1 ) Nocardiopsis ﻭ HR7 )، ﻭﺗﺤﺪﻳﺪ ﺍﻧﺘﻤﺎء 'HR2 ﻟﺠﻨﺲ Saccharomonospora . ﻏﻴﺮ ﺍﻧﻪ ﻟﻢ ﻳﻤﻜﻦ ﺗﺤﺪﻳﺪ ﺍﻧﺘﻤﺎء ﺳﻼﻟﺔ HR3 ﺇﻟﻰ ﺃﻱ ﻧﻮﻉ ﻷﻧﻬﺎ ﺗﺘﻤﻴﺰ ﺑ ﻮﺿﻊ ﺗﺼﻨﻴﻔ ﻲ ﺟﺪﻳﺪ، ﻭﻫﺬﻩ ﺍﻷﺧﻴﺮﺓ ﺣﺎﺻﻠﺔ ﻋﻠﻰ ﺗﺸﺎﺑﻪ ﺗﺴﻠﺴﻞ ﺟﻴﻨﺎﺕ ﺍﻟﺤﻤﺾ ﺍﻟﻨﻮﻭﻱ ﺍﻟﺮﻳﺒﻮﺯﻱ 16S ﻣﻘﺪﺭ ﺏ %94,59 ﻣﻊ Phytoactinopolyspora endophytica , 94.52 ٪ ﻣﻊ gansuensis Jiangella ﻭ 94.24 ٪ ﻣﻊ . . Haloactinopolyspora alkaliphila

ﺇﻣﻜﺎﻧﺎﺕ ﺍﻟ ﺴﻼﻻﺕ ﻹﻧﺘﺎﺝ ﺍﻟﻤﺮﻛﺒﺎ ﺕ ﺍ ﻷﻳﻀ ﻴﺔ ﺍﻟ ﺒﻴﻮﻟﻮﺟﻴﺎ ﺍﻟﻔﻌﺎﻟﺔ ﺗﻤﺖ ﺩﺭﺍﺳﺘﻪ ﺑﺎﻟﻄﺮﻕ ﺍﻟﺘﻘﻠﻴﺪ ﻳﺔ ﻭﺍﻟﺠﺰﻳﺌﻴﺔ ﻣﻦ ﺧﻼﻝ ﺍﻟﺒﺤﺚ ﻋﻦ ﺟﻴﻨﺎﺕ ﺗﺮﻣﻴﺰ PKS/NRPS . ﻫﺬﺍ ﺳﻤﺢ ﻟﻨﺎ ﺑ ﺘﺤﺪﻳﺪ ﺍﻟ ﺴﻼﻟﺔ HR4 ﺍﻟﺘﻲ ﺗﻌﺘﺒﺮ ﺍﻷ ﻛﺜﺮ ﻧﺸﺎﻁﺎ ﻭﻣﻮﺍﺻﻠﺔ ﺍﻟﻌﻤﻞ ﻋﻠﻴﻬﺎ . . ﺑﻌﺪ ﺗﻨﻘﻴﺔ ﺍﻟﻤﺮﻛﺒﺎﺕ ﻣﻦ ﺳﻼﻟﺔ HR4 ﺑﻮﺍﺳﻄﺔ ﺍﻟﺘﺤﻠﻴﻞ ﺍﻻﻋﺪﺍﺩﻱ ﺍﻟﺴﺎﺋﻠﻲ ﺫﻭﺍﻟﻀﻐﻂ ﺍﻟﻌﺎﻟﻲ chromatographie liquide à haute pression préparative ، ﺗﻢ ﺗﺤﺪﻳﺪ ﻜﻠﻫﻴ ﻴﻦ ﻛﻴﻤﻴﺎﺋﻴﻦ ﺍ ﺛﻨﻴﻦ ﻣﻦ ﺍﻟﻤﻀﺎﺩﺍﺕ ﺍﻟﺤﻴﻮﻳﺔ (HR4-9 ﻭ HR4-10 ) ﻭﺫﻟﻚ ﺑﻮﺍﺳﻄﺔ ﺍﻟﺘﺤﻠﻴﻞ ﺍﻟﻄﻴﻔﻲ ﺑﺎﻟﺮﻧﻴﻦ ﺍﻟﻤﻐﻨﺎﻁﻴﺴﻲ ( NMR ) ﻭﺍﻟﻄﻴﻔﻲ (ﺍﻟﻄﻴﻔﻲ ﻋﺎﻟﻴﺔ ﺍﻟﺪﻗﺔ) . ﻣﻊ ﺍﻛﺘﺸﺎﻑ ﺍﻥ ﺍﻟﻤﻀﺎﺩ ﺍﻟ ﺤﻴﻮﻱ HR4-9 ﻣﺮﻛﺐ ﺟﺪﻳﺪ ﺫﻭﺗﻜﻮﻳﻦ ﺟﺪﻳﺪ ﻭﺃﻁﻠﻖ ﻋﻠﻴﻪ ﺍﺳﻢ --7-deoxo-6-deoxy-7-hydroxy-8-O(-) . . methylrabelomycin ﺍﻟﻤﻀﺎﺩﺍﻥ ﺍﻟﺤﻴﻮﻳﻴﻦ ﻳﻨﺘﻤﻴﺎﻥ ﺇﻟﻰ ﻣﺠﻤﻮﻋﺔ angucyclinones ﺍﻟﺘﻲ ﻫﻲ polykétides ﻋﻄﺮﻳﺔ ﺍﻟﻤﻌﺮﻭﻓﺔ ﺑﺄﻧﺸﻄﺘﻬﺎ ﻛﻤﻀﺎﺩﺍﺕ ﺣﻴﻮﻳﺔ ﻗﻮﻳﺔ ﻭﻣﻀﺎﺩﺍﺕ ﺃﻭﺭﺍﻡ . ﻛﻤﺎ ﻧﺬﻛﺮ ﺍﻧﻨﺎ ﺃﻭﻝ ﻣﻦ ﻗﺎﻡ ﺑﺎﻛﺘﺸﺎﻑ ﺇﻧﺘﺎﺝ ﻫﺬﺍ ﺍﻟﻨﻮﻉ ﻣﻦ ﺍﻟﺠﺰﻳﺌﺎﺕ ﻓﻲ ﺟﻨﺲ . . Nocardiopsis