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Análisis Comparativo Del Contenido Proteico De Venenos De Serpientes

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Análisis Comparativo Del Contenido Proteico De Venenos De Serpientes Análisis comparativo del contenido proteico de venenos de serpientes de la familia Viperidae de diferentes regiones de Colombia mediante el empleo de cromatografía líquida y electroforesis Rosa Mery Niño Pérez Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina, Departamento de Toxicología Bogotá D.C., Colombia 2018 Análisis comparativo del contenido proteico de venenos de serpientes de la familia Viperidae de diferentes regiones de Colombia mediante el empleo de cromatografía líquida y electroforesis Rosa Mery Niño Pérez Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Magister en Toxicología Director (a): Dr. Rec. Nat. Claudia Consuelo Rubiano Castellanos Codirector (a): MD, MSc Alba Isabel Rodríguez Pulido Esp. María Carlina Castillo Beltrán Línea de Investigación: Toxinología Grupo de Investigación: Toxicología ambiental Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina, Departamento de Toxicología Bogotá D.C., Colombia 2018 Aprendí que la valentía no es la ausencia de miedo, sino el triunfo sobre el miedo; el hombre valiente no es el que no siente miedo, sino aquel que lo conquista, y que después de escalar una montaña muy alta, descubrimos que hay muchas más por escalar. Nelson Mandela (1918-2013) Agradecimientos A la vida por regalarme esta gran oportunidad, por ponerme en el camino las personas, los medios y las herramientas justo en el tiempo y momento adecuados para cumplir este sueño tan anhelado, ser Toxicóloga. A mis padres y a mi hermoso. Al Instituto Nacional de Salud que por medio del Grupo de Aseguramiento de calidad y del Grupo de Hacienda y Serpentario de la Dirección de Producción me permitieron desarrollar el proyecto y me brindaron los recursos necesarios incluidos los venenos para llevar a buen término los objetivos propuestos. A la Dra. Claudia Consuelo Rubiano Castellanos, docente del departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, directora de este proyecto, por su excelente dirección y por el aporte de nuevos conocimientos relevantes y necesarios para el correcto y adecuado desarrollo del proyecto y por hacer parecer todo tan increíblemente fácil como cuando cursábamos primer semestre de pregrado… A la Dra. MD, MSc Alba Isabel Pulido Coordinadora de la Maestría de Toxicología de la Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, por su acompañamiento, su interés, su entusiasmo y sus pautas para el presto desarrollo y presentación del proyecto. Al profesional especializado MSc Carlos Mario Agudelo Mahecha del Grupo de Aseguramiento de calidad de la Dirección de Producción del Instituto Nacional de Salud, por brindarme sus conocimientos teórico prácticos para el entendimiento y ejecución de las pruebas electroforéticas que se llevaron a cabo en el proyecto. A la profesional especializada I.Q. María Carlina Castillo Beltrán Coordinadora del Grupo de Producción y Desarrollo Tecnológico de la Dirección de Producción del Instituto Nacional de Salud por su acompañamiento como codirectora en el desarrollo del proyecto. Resumen y Abstract IX Resumen Los venenos de las serpientes son mezclas complejas de proteínas, péptidos, enzimas y trazas de moléculas no proteicas, en estas mezclas biológicas sin embargo predominan las moléculas de naturaleza peptídica (péptidos y proteínas), por lo que es posible establecer propiedades moleculares de las mismas basados en su análisis electroforético y cromatográfico. La comparación del contenido proteico de 15 muestras de venenos de serpientes de la familia Viperidae provenientes de diferentes regiones de Colombia se refleja en este documento mediante el empleo de la cromatografía líquida y electroforesis SDS- PAGE. El conocimiento de la ontogenética inter e intraespecies y la variabilidad del veneno individual y la ubicación geográfica, son de gran importancia para el diseño de protocolos de inmunización destinados a producir antivenenos poli-específicos más eficaces. Una consecuencia práctica de la evaluación de la reactividad cruzada de los antivenenos heterólogos es la posibilidad de eludir la disponibilidad restringida de antivenenos específicos de cada especie en algunas regiones. Palabras clave: Cromatografía líquida, SDS-PAGE, Veneno, Viperidae. Abstract Snake venoms are complex mixtures of proteins, peptides, enzymes and traces of non- protein elements, in these biological mixtures, however, proteins predominate, so it is possible to establish the molecular features of the latter based on their electrophoretic and chromatographic analysis. The comparison of the protein content of 15 venoms of snakes of the family Viperidae from different regions of Colombia is reflected in this document by the use of Reverse-phase liquid chromatography (HPLC) and electrophoresis (SDS-PAGE). The knowledge of inter- and intra-species ontogenetics, the individual variability and geographic location venoms has been important for the design of immunization protocols to produce more effective polyspecific antivenins. A practical consequence of the cross- reactivity evaluation of heterologous antivenins is the possibility of circumventing the restricted availability of species-specific antivenoms in some regions. Keywords: Viperidae, Liquid Chromatography, Venom, SDS-PAGE Contenido XI Contenido Pág. Resumen ........................................................................................................................ IX Lista de figuras ............................................................................................................ XIII Lista de tablas .............................................................................................................. XV Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................... XVI Introducción .................................................................................................................... 1 1. Objetivos ................................................................................................................... 9 1.1 Objetivo general............................................................................................... 9 1.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 9 2. Marco teórico .......................................................................................................... 11 2.1 Distribución de las serpientes venenosas en Colombia ................................. 12 2.2 Componentes de los venenos de serpiente de la familia Viperidae ............... 17 2.3 Efecto tóxico y mecanismo de daño del veneno de la familia Viperidae ......... 28 2.4 Venomica, Antivenomica, Toxicovenomica y su interrelación ........................ 34 2.5 Métodos de fraccionamiento, separación, cuantificación e identificación de proteínas de venenos de serpiente .......................................................................... 37 2.5.1 Cromatografía líquida de alta eficiencia .............................................. 37 2.5.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida ................................................ 38 2.5.3 Métodos de Cuantificación de proteínas de venenos de serpiente ...... 39 2.5.4 Estrategias proteomicas para el análisis de venenos de serpiente ...... 41 3. Metodología ............................................................................................................ 45 3.1 Consideraciones generales y obtención de los venenos ................................ 46 3.2 Desarrollo de la metodología analítica .......................................................... 47 3.3 Consideraciones éticas del proyecto .............................................................. 51 4. Resultados y análisis ............................................................................................. 53 4.1 Cuantificación de proteínas ........................................................................... 53 4.2 Perfiles cromatograficos y electroforéticos ..................................................... 56 4.2.1 Género Bothriechis ............................................................................. 57 4.2.2 Género Bothriopsis ............................................................................. 63 4.2.3 Género Bothrops ................................................................................. 65 4.2.4 Género Crotalus .................................................................................. 75 4.2.5 Género Lachesis ................................................................................. 81 XII Análisis comparativo del contenido proteico de venenos de serpientes de la familia Viperidae de diferentes regiones de Colombia mediante el empleo de cromatografía líquida y electroforesis 4.2.6 Género Porthidium .............................................................................. 86 5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................... 5.1 Conclusiones ................................................................................................. 93 5.2 Recomendaciones ......................................................................................... 94 A. Anexo A: Cuantificación de proteínas .................................................................. 97 B. Anexo B: Preparación de soluciones para uso en electroforesis ...................... 99 C. Anexo C: Carta de aceptación del comité de ética ...........................................
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